RS20050355A - Proces za prečišćavanje proteina koji se vezuju za faktor tumorske nekroze - Google Patents

Abstract

Ovde je opisan novi proces purifikacije za proteine koji se vezuju za faktor tumorske nekroze. Pre svega, ovaj proces se odlikuje korišćenjem faze hvatanja na imobilizovanoj metalnoj afinitetnoj hromatograviji (IMAC) gde se bakar koristi kao metal. Ovo je povezano sa prednostima u smislu prinosa, čistoće finalnog proizvoda i primenljivosti u industrijskim količinama.

Description

PROCES ZA PREČIŠĆAVANJE PROTEINA KOJI SE VEZUJU ZA FAKTOR

TUMORSKE NEKROZE

Polje tehnike

Ovaj pronalazak se odnosi na polje prečišćavanja polipeptida. Još određenije, odnosi se na prečišćavanje proteina koji se vezuju za faktor tumorske nekroze.

Stanje tehnike

Alfa faktor tumorske nekroze (TNFA), snažni citokin, izaziva široki spektar bioloških odgovora koji su posredovani vezivanjem za receptore na površini ćelija. Receptor za humani TNF-alfa može da se izoluje iz humane histiocitne ćelijske linije limfoma (videti Stauber i sar., J. Biol. Chem., 263, 19098-104, 1988).

Koristeći monoklonska antitela, jedna druga grupa dobila je dokaze o 2 različita proteina koja se vezuju za TNF, gde oba vezuju i TNF-alfa i TNF-beta specifično i sa visokim afinitetom (videti Brockhaus i sar., Proc. Nat. Acad. Sci. 87: 7380-7384, 1990) kao i izolovanu cDNK za jedan od receptora. Oni su utvrdili da on enkodira protein od 455 amino koselina koji je podeljen u ekstraćelijski domen od 171 reziduuma i citoplazmični domen od 221 reziduuma.

Kasnije je jedna druga grupa (videti Aggarvval i sar. Nature 318: 665-667, 1985) pokazala da alfa i beta faktori tumorske nekroze započinju svoje dejstvo na ćelijsku funkciju vezivanjem za zajedničke receptore na površini ćelija. TNF alfa i TNF beta receptori su različitih veličina i eksprimirani su različito na različitim ćelijskim linijama (videti Engelmann i sar., J. Biol. Chem. 265: 1531-1536, 1990).

TNF alfa receptor I, koji neki nazivaju i TNFR55, je manji od ova 2 receptora. Za oba receptora su klonirane cDNK i određene su nukleinsko kiselinske sekvence (videti Loetscher i sar., Cell 61: 351-359, 1990; Nophar i sar., EMBO J. 9: 3269-3278, 1990; Schall i sar., Cell 61: 361-370, 1990 and Smith i sar., Science 248: 1019-1023, 1990).

Dok su vanćelijski domeni ova dva receptora upadljivo slične strukture, izgleda da su njihovi intraćelijski domeni potpuno različiti. Korišćenjem tehnike Southern blotting za humanu genomsku DNK, korišćenjem cDNK ova 2 receptora kao probe, pokazano je daje svaki od njih enkodiran samo jednim genom.

U cilju prečišćavanja polipeptida, pokušano je sa primenom nekoliko pristupa. Hromatogragija je jedan od načina koji se najšečće koriste, uključujući i afinitetnu hromatografiju u kojoj se susptanca koju treba prečistiti prvo adsorbuje na podlogu ili kolonu odgovarajuće vrste na kojoj se agensi koji imaju afinitet za datu supstancu imobilizuju da je preuzmu i ostave preostale komponente sirove mešavine da prođu nevezano. Ova adsorbovana supstanca se onda eluira pramenom uslova u okruženju kao što su pH i/ili koncentracija soli da se dobije delimično ili potpuno prečišćeni molekul.

Na polju afinitetne hromatografije, tehnika poznata pod imenom IMAC (Imobilizovana metalna afinitetna hromatografija) opisana je kao posebno efikasna u nekim slučajevima (videti revijski članak autora Arnold, Biotechnologv, Tom 9, strana 151-156, februar 1991). IMAC je opisan kao moćna tehnika za prečišćavanje polipeptida koji imaju funkcionalne grupe koje učestvuju u vezivanju metala, kao što su bočni lanci Glu, Tyr, Cys, His, Asp i Met, kao i amino-terminalni amidni azoti i karbonilni kiseonici koji su na osnovnoj strukturi.

lako je ova tehnika moćna, nema uvek potrebnu specifičnost. Na primer, utvrđeno je da je adsorpcija na hromatografsku kolonu sa sadržajem Cu<2+>odlična za polipeptide koji sadrže jedan, ili još bolje više histidina, ali je primećeno da čak i u odsustvu tri amino-kiseline za koje se smatra da su najvažnije za adsorpciju, odnosno histidin, triptofan i cistein, može da dođe do adsorpcije proteina čime se umanjuje specifičnost faze prečišćavanja.

Efikasnost adsorpcije, iako je obično zadovoljavajuća za svrhe prečišćavanja, ne mora biti i optimalna posebno kada treba prečistiti polipeptid glikoprotein. U ovom slučaju veoma često lanci ugljenih hidrata mogu da sakriju aktivna mesta za vezivanje metalnih helata i smanje afinitet za hromatografsku kolonu u fazi adsorpcije.

OPIS PRONALASKA

Utvrđeno je da TNF-vezujući proteini mogu efikasno da se prečišćavaju uz pomoć procesa koji uključuje i fazu imobilizovane metalne afinitetne hromatografije (IMAC) koristeći bakar kao metal. Optimalni uslovi pH i saliniteta za ovu fazu su pH 2,8 do 3,2, po mogućstvu pH 3, i salinitet 14 do 16 mS, po mogućstvu 15 mS.

U skladu sa ovim pronalaskom "TNF-vezujući proteini" označavaju svaki protein koji ima afinitet za TNF-alfa ili TNF-beta i/ili protein koji su svoj ekstra-celularni, solubilni fragment uključuje i protein koji pripada porodici TNF receptora ili njihovom fragmentu.

Evo nekih primera članova porodice TNF receptora:

>Receptor 1 faktora tumorske nekroze (TNFR1), koji se naziva i Superporodica receptora faktora tumorske nekroze, Član 1A (TNFRSF1A), ili Alfa receptor faktora tumorske nekroze (TNFAR) ili TNFR 55-KD ili TNFR 60-KD (videti opis na OMIM*191190

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/kvery.fcgi?db=OMIM)

> Receptor 2 faktora tumorske nekroze (TNFR2), koji se naziva i podporodica receptora faktora tumorske nekroze, Član 1B (TNFRSF1B), ili Receptor faktora tumorske nekroze-beta (TNFBR) ili TNFR 75-KD ili TNFR 80-KD (videti opis na

OMIM<*>191191);

> OX40 Antigen (OX40), koji se naziva i Superporodica receptora faktora tumorske nekroze, Član 4 (TNFRSF4), ili receptor Taks-transkripciono aktiviranog glikoproteina 1 ( TXGP1L) ili Antigen aktivacije limfoida ACT35

(ACT35) ili CD134 (videti opis na OMIM<*>600315);

> CD40L Receptor (CD40), koji se naziva i Superporodica receptora faktora tumorske nekroze, Član 5 (TNFRSF5) ili B-ćelijski površinski antigen CD40, ili

CDw40 ili Bp50 (videti opis na Swiss-Prot Entry No. P25942);

> FASL Receptor (FAS), koji se naziva i Superporodica receptora faktora tumorske nekroze, Član 6 (TNFRSF6), ili Površinski antigen FAS koji posreduje apoptozu ili Apo-1 Antigen ili CD95 (videti opis na Swiss-Prot Entry

No. P25445);

>Lažni Receptor 3 (DcR3), koji se naziva i Superporodica receptora faktora tumorske nekroze, Član 6B (TNFRSF6B) ili Lažni Receptor za FAS Ligand ili

M68 (videti opis na Swiss-Prot Entry No. 095407);

> CD27 Antigen (CD27), koji se naziva i Superporodica receptora faktora tumorske nekroze, Član 7 (TNFRSF7) ili T-ćelijski aktivacijski Antigen S152

(S152) (videti opis na OMIM<*>602250);

> Antigen aktivacije limfoida CD30 (CD 30), koji se naziva i Superporodica receptora faktora tumorske nekroze, Član 8 (TNFRSF8) (videti opis na

OMIM<*>153243)

> Indukovan lifocitnom aktivacijom Activacija (ILA), koji se naziva i Superporodica receptora faktora tumorske nekroze, Član 9 (TNFRSF9) ili CD137 (videti opis na OMIM<*>602250);

> Receptor Smrti 4 (DR4), koji se naziva i Superporodica receptora faktora tumorske nekroze, Član 10A (TNFRSF10A), ili TNF-povezani Receptor 1 liganda za izazivanje apoptoze (TRAILR1) ili AP02 (videti opis na

OMIM<*>603611);

> Receptor smrti 5 (DR5), koji se naziva i Superporodica receptora faktora tumorske nekroze, Član 10B (TNFRSF10B), ili TNF-povezani Receptor 2 liganda za izazivanje apoptoze (TRAILR2) ili Ubica/DR5 ili TRICK2 (videti opis

na OMIM *603612);

> Lažni Receptor 1 (DCR1), koji se naziva i Superporodica receptora faktora tumorske nekroze, Član 10C (TNFRSF10C), ili TNF-povezani Receptor 3 liganda za izazivanje apoptoze (TRAILR3), ili TRAIL Receptor bez intraćelijskog

domena (TRID) (videti opis na OMIM<*>603613);

> Lažni Receptor 2 (DCR2), koji se naziva i Superporodica receptora faktora tumorske nekroze, Član 10D (TNFRSF10D) ili TNF-povezani Receptor 4 liganda za izazivanje apoptoze (TRAILR4) ili TRAIL Receptor sa razgranatim

domenom smrti (TRUNDD) (videti opis na OMIM<*>603014);

> Receptorski Aktivator NF-KAPPA-B (RANK), koji se naziva i Superporodica receptora faktora tumorske nekroze, Član 11A (TNFRSF11A), ili Receptor za diferencijaciju faktora osteoklasta (ODFR) ili PDB2 ili TRANCER (videti opis na

OMIM<*>603499);

> Osteoprotegerin (OPG), koji se naziva i Superporodica receptora faktora tumorske nekroze, Član 11B (TNFRSF11B) ili Faktor inhibicije

osteoklastogeneze (OCIF) (videti opis na OMIM<*>602643);

> Receptor smrti 3 (DR3), koji se naziva i Superporodica receptora faktora tumorske nekroze, Član 12 (TNFRSF12), ili AP03 ili Receptor smrti povezan sa

limfocitom (LARD) (videti opis na OMIM<*>603366);

> Transmembranski Aktivator i Caml Interaktor (TACI), koji se naziva i Superporodica receptora faktora tumorske nekroze, Član 13B (TNFRSF13B)

(videti opis na OMIM<*>604907);

> BAFF Receptor (BAFFR), koji se naziva i Superporodica receptora faktora tumorske nekroze, Član 13C (TNFRSF13C), ili Receptor faktora aktivacije B ćelija (videti opis na OMIM<*>606269);

> Medijator ulaska Herpesvirusa (HVEM), koji se naziva i Superporodica receptora faktora tumorske nekroze, Član 14 (TNFRSF14), ili Mediator A ulaska Herpesvirusa (HVEA) ili TR2 (videti opis na OMIM<*>602746);

> Receptor nervnog faktora rasta (NGFR), koji se naziva i Superporodica receptora faktora tumorske nekroze, Član 16 (TNFRSF16) ili p75(NTR) (videti opis naOMIM*162010);

> Factor maturacije B ćelija (BCMA), koji se naziva i Superporodica receptora faktora tumorske nekroze, Član 17 (TNFRSF17) ili BCM (videti opis na OMIM<*>109545);

> Glukokortikoidom indukovani TNFR-povezani Gen (GITR), koji se naziva i Superporodica receptora faktora tumorske nekroze, Član 18 (TNFRSF18), ili Aktivacijom inducibilni član TNFR porodice (AITR) (videti opis na OMIM<*>603905);

> TRADE, koji se naziva i Superporodica receptora faktora tumorske nekroze,

član 19 (TNFRSF19), ili induktor toksičnosti i JNK ili TROY ili TAJ (videti opis na Swiss-Prot Entry No. 0.9NS68);

> X-povezani ektodiplasin-A2 receptor (XEDAR), koji se naziva i EDA-A2 receptor

(videti opis na Swiss-Prot Entry No. 0.9HAV5) i

> RECEPTOR SMRTI 6 (DR6), koji se naziva i Superporodica receptora faktora tumorske nekroze, član 21 (TNFRSF21) (videti opis na OMIM<*>605732).

U skladu sa preporučenim oblikom ovog pronalaska TNF-vezujući protein se odabira iz rekombinantnog h-TBP-1 (rekombinantni, ekstraćelijski, solubilni fragment humanog TNF Receptora-1, koji obuhvata amino kiselinsku sekvencu koja odgovara fragmentu 20-180 amino kiselina, Nophar i sar.) i rekombinantnog h-TBP-2 (rekombinantni, ekstraćelijski, solubilni fragment TNF Receptora-2, koji obuhvata amino kiselinsku sekvencu koja odgovara 23-257, Smith i sar.). najbolje je da je to rekombinantni hTBP-1 (r-hTBP-1). Za sve druge proteine solublilni, ekstraćelijski domen je indikovan u odgovarajućem Swiss-Prot upisu.

U skladu sa drugim preporučenim oblikom ovog pronalaska, proces prečišćavanja TNF-vezujućeg proteina uključuje fazu "IMAC" kao "fazu hvatanja" i dalje obuhvata naredne faze kao "među-faze": hromatografiju jonskom izmenom (IEC) pri kiselom pH (po mogućstvu između 3 i 4) posle čega sledi hromatografija jonskom izmenom pri baznom pH (po mogućstvu između 8 i 10).

U skladu sa još jednim preporučenim oblikom ovog pronalaska proces purifikacije TNF-vezujućeg proteina dalje obuhvata, kao "fazu glancanja" hromatografiju hidrofobnom interakcijom (HIC).

Najbolje je da svaka od gore pomenutih hromatografija bude praćena ultrafiltracijom.

"Faza hvatanja" u skladu sa ovim pronalaskom označava fazu tokom koje je rekombinantni TNF-vezujući protein izolovan iz sirovog ubranog supernatanta kulture rekombinantnih ćelija domaćina koje ga sadrže. Visoki prinos na kraju inicijalne faze ima velikog uticaja na ukupni učinak i prinos u procesu. U skladu sa ovim pronalaskom, faza hvatanja koja se obavlja na Cu-helat FF i, po mogućstvu elucijom na pH 3,0 daje proizvod čistoće > 40% i prinos od > 80%.

"Među-faze" su faze tokom kojih se najveći deo nečistoća, kao što su drugi proteini i nukleinske kiseline, endotoksini i virusi uklonjeni.

"Faze glancanja" su faze tokom kojih sve preostale nečistoće u tragovima ili sasvim srodne supstance bivaju uklonjene da bi se dobio protein visoke čistoće.

"Hromatografija jonskom izmenom" (IEC) je u stanju da razdvaja molekule koji su tek neznanto različiti po naelektrisanju i daje separaciju veoma visoke rezolucije. Frakcije se prikupljaju u prečišćenom, koncentrovanom obliku. Ova separacija se bazira na reverzibilnoj interakciji između naelektrisanih molekula i suprotno naelektrisane hromatografske podloge. Molekuli se vezuju kako se nanose u kolonu. Uslovi se onda menjaju tako da su te vezane supstance različito eluirane. Elucija se obično obavlja promenama u koncentraciji soli ili pH. Promene se vrše postepeno ili s kontinuiranim gradijentom. Za hromatrografiju jonskom izmenom najčešće se koriste kolone Q Sepharose ili SP Sepharose. "Q Sepharose" je kvaterni amoniumski snažni anjonski izmenjivač (naelektrisane grupe: - N<+>(CH3)3), dok je "SP Sepharose" sulfopropil snažni katjojski izmenjivač (naelektrisane grupe: - S03 )

Hidrofobna interakcijska hromatografija (HIC) je jedna upotrebljiva metoda za prečišćavanje i separaciju biomolekula na bazi razlike u njihvoj površinskoj hidrofobičnosti. Proteini i peptidis obično sekvestriraju hidrofobne amino kiseline u domenima udaljenim od površine molekula. Međutim, mnogi biomolekuli koji se smatraju hidrofilnim imaju dovoljno hidrofobnih grupa koje su izložene da se omoguću interakcija sa hidrofobnim ligandima povezanim za hromatografsku matricu. U poređenju sa hromatografijom reverzne faze, gustina liganda na matrici je daleko niža. Ova osobina promoviše visoku selektivnost HIC, a omogućava da uslovi blage elucije pomognu da se očuva biološka aktivnost. Kolona "Butyl Sepharose" se po mogućstvu koristi u skladu sa ovim pronalaskom za fazu hidrofobne interakcijske hromatografije (HIC). U ovoj koloni, grupa n-butil se koristi kao hidrofobni ligand.

U skladu sa ovim pronalaskom, TNF-vezujući proteini se produkuju uz pomoć rekombinantne DNK tehnologije u eukariotskim ćelijama, po mogućstvu sisara. Ovaj rekombinantni proces za njihovu produkciju se dole upisuje u cilju celovitosti.

U inicijalnoj fazi ovog procesa kodiranje DNK sekvence za željeni protein se umeće i ligira u odgovarajući plasmid. Kada se jednom formira, ekspresioni vektor se uvodi u odgovarajuću ćeliju domaćina koja onda eksprimira taj vektor (ili više njih) da se dobije željeni protein.

Ekspresija svakog od rekombinantnih proteina iz ovog pronalaska kako je to pomenuto ovde, može da se odigra i u eukariotskim ćelijama (na pr. kvasnicama, ćelijama insekata ili sisara) ili u prokariotskim ćelijama, korišćenjem odgovarajućeg ekspresionog vektora. Može se koristiti svaka metoda poznata u struci.

Na primer, molekuli DNK koji kodiraju za proteine koji se dobijaju ma kojom od pomenutih metoda, inserciraju se u odgovarajuće konstruisan ekspresioni vektor tehnikama koje su dobro poznate u struci (videti Sambrook i sar., 1989). Dvolančana cDNK je povezana za plazmidne vektore homopolimernim nadovezivanjem ili restrikcionim vezivanjem, što uključuje upotrebu sintetičkih DNK linkera ili tehnika ligacije za zatupljenim krajem: DNK ligaze se koriste za ligaciju DNK molekula, a nepoželjno spajanje se izbegava tretmanom sa alkalnom fosfatazom.

Da bi mogao da se eksprimira željeni protein, ekspresioni vektor treba da obuhvati specifične nukleotidne sekvence sa sadržajem transkripcionih i translacionih regulatornih informacija koje su povezane za DNK kodiranje željenog proteina tako da se omogući genska ekspresija i produkcija tog proteina. Prvo, da bi se gen mogao transkribovati, mora mu prethoditi promoter koji je u stanju da prepozna RNK polimerazu, za koju se polimeraza vezuje i na taj način započinje proces transkripcije. U upotrebi je široki spektar takvih promotera, koji rade sa različitom efikasnošću (snažni i slabi promoteri).

Za eukariotske domaćine, mogu se koristiti različite transkripcione i translacione regulatorne sekvence zavisno od prirode domaćina. Mogu se dobijati iz virusnih izvora, kao što su adenovirus, goveđi papiloma virus, Simian virus ili slični, gde su regulatorni signali praćeni određenim genom koji ima visoki nivo ekspresije. U primere spadaju TK promoter Herpes virus, SV40 rani promoter, kvasni gal4 genski promoter, itd. Može se odabrati transkripciona inicijacija regulatornih signala koja omogućava represiju i aktivaciju, tako da može da se modulira ekspresija tih gena.

DNK molekul koji obuhvata nukleotidnu sekvencu koja kodira za hibridni protein iz ovog pronalaska insertuje se u vektor(e), pošto ima operativno povezane transkripcione i translacione regulatorne signale, koji su u stanju da integrišu željene genske sekvence u ćeliju domaćina. Ove ćelije koje su stabilno transformisane pomoću uvedene DNK mogu da se selektuju i uvođenjem jednog ili više markera koji omogućuju sa se odaberu ćelije domaćina koje sadrže ekspresioni vektor. Ovaj marker može da obezbedi i fototropiju oksotropnom domaćinu, rezistenciju na biocide, na pr. antibiotike, ili teške metale kao što je bakar, ili slično. Markerski gen koji se može odabrati može da bude ili direktno povezan sa DNK genskom sekvencom koja treba da se eksprimira, ili uveden i istu ćeliju ko-transfekcijom. Mogu biti potrebni i dodatni elementi za optimalnu sintezu proteina iz ovog pronalaska.

U važne faktore za određeni plasmid ili virusni vektor spadaju: lakoća sa kojom ćelija primalac, koja sadrži taj vektor može da bude prepoznata i razlikovana i odabrana od onih ćelija primalaca koje ne sadrže taj vektor; broj kopija toga vektora koji su željeni u određenom domaćinu; i da li je poželjno da taj vektor može da se kreće između ćelija domaćina različitih vrsta.

Kada jednom taj vektor (ili ti vektori) ili DNK sekvenca sa sadržajem konstrukta bude propremljen za ekspresiju DNK konstrukta (jednog ili više njih) on se može uvesti u odgovarajuću ćeliju domaćina na bilo koji od mnogobrojnih načina: transformacija, transfekcija, konjugacija, protoplast fuzija, elektroporacija, kalcijum fosfat-precipitacija, direktna mikroinjekcija, i td.

Ćelije domaćina mogu biti prokariotske ili eukariotske. Prednost se daje eukariotskim domaćinima, na pr. ćelijama sisara kao što su ljudi, majmun, miš i jajne ćelije kineskog hrčka (CHO). Jer obezbeđuju post-translacione modifikacije za molekule proteina, uključujući ispravno preklapanje ili glikozilaciju na pravim mestima. Isto tako, kvasne ćelije mogu da sprovedu post-translacijske peptidne modifikacije uključujući glikozilaciju. Postoji čitav niz rekombinantnih DNK strategija koje koriste snažne promoterske sekvence i veliki broj kopija plazmida koji se mogu koristiti za produkciju željenih proteina u kvascu. Kvasac prepoznaje vodeće sekvence na kloniranim genskim produktima sisara i sekretuje peptide koji nose vodeće sekvence (t.j. pre-peptide).

Po uvođenju vektora (jednog ili više), ćelije domaćina se gaje u selektivnoj podlozi, koja se odabira za rast ćelija sa sadržajem vektora. Ekspresija klonirane genske sekvence (ili više njih) dovodi do produkcije željenih proteina.

Purifikacija rekombinantnih proteina dobijenih na taj način obavlja se u skladu sa metodom ovog pronalaska.

Vrlo detaljni oblik ovog pronalaska prikazaćemo u sledećem delu ove specificacije i shematski ga rezimirati na Slici 1.

SKRAĆENICE

TNF Faktor tumorske nekroze

TBP TNF vezujući protein

IDA Iminodisirćetna kiselina

Cu-Chelate FF Bakar-helat brzog protoka

Q-SEPH. FF Q-Sepharose brzog protoka

SP-SEPH. FF SP-Sepharose brzog protoka

Butyl-SEPH FF Butil-Sefaroza brzog protoka

IEC Hromatografija jonske izmene

ACN Acetonitril

CBB Comassie brilijant plavo

DNK Deoksiribonukleinska kiselina

EtOH Etanol

HIC Hidrofobna interakcijska hromatografija

IEF Izo električno fokusiranje

IEMA Imuno-enzimometrijski esej

IFMA Imuno fluorimetrijski esej

I PC kontrola tokom procesa

KD Kilo Dalon

LOQ Granica kvantifikacije

OD optička gustina

Pl Izoelektrična tačka

RP-HPLC Tečna hromatografija visokih performansi referzne faze SDS-PAGE ili SDS Natrijum dodecil sulfat poli akrilamid gel elektroforeza SE-HPLC Tečna hromatografija visokih performansi sa isključivanjem po veličini SMW Standardi molekulske težine

SS Natrijum sulfat

Tris Tris(hidroksimetil)aminometan

BV Zapremina posude (bed)

OPIS SLIKE

Slika 1: Ova slika pokazuje dijagram toka za proces koji se koristi za purifikaciju r-hTBP-1. Od faze havatanja do postizanja r-hTBP-1 mase materijala obavlja se osam koraka, od kojih je najkritičniji faza hvatanja. Svaka faza je dobro opisana i detaljno prikazana u sledećim Primerima

PRIMERI

Materijali

Oprema

Smole i kolone

Hemikalije

Biologiški materijal

Purifikacija r-h.TBP-1 (Onercept) će sada biti detaljno objašnjena.

FAZA 1-FAZA HVATANJA

Opis pufera i rastvora

Pufer za naelektrisanje smole

32 g bakar sulfata rastvara se u 900 ml prečišćene vode, pa posle rastvaranja zapremina vode se dovede do 1 litar.

Acidifikovana voda

0.5 ml sirćetne kiseline dodaje se u 1 litar vode.

Pufer za ekvilibraciiu

1.68 +/- 0.1 ml 85% orto-fosforne kiseline i 11.68+/-0.1 g NaCI rastvaraju se u 900 ml prečišćene vode, pH se podešava na 6.8+/-0.1 sa 50% NaOH rastvorom i zapremina se dovodi na 1 litar.

Rastvor za pranje

1 litar prečišćene vode koristi se kao rastvor za pranje.

Pufer za eluciju( testiran je raspon pH 2. 8 do 3. 2)

6.75+/-0.5 ml 85% orto-fosforne kiseline i 5.84+/-0.1 g NaCI rastvaraju se u 900 ml prečišćene vode, pH se podešava na 3+/-0.1 sa 50% NaOH rastvorom i zapremina se dovodi na 1 litar. Dobija se provodljivost od 15+/-1 mS.

Pufer za regeneraciju

18.61+/-0.1 g EDTA i 58.4+/-1g NaCI rastvaraju se u 900 ml prečišćene vode i zapremina se dovodi na 1 litar.

Rastvor za sanitaciju

40 g NaOH se rastvara u 900 ml prečišćene vode i zapremina se dovodi na 1 litar.

Rstvor za čuvanje

20% etanol ili 0.01 M NaOH se koriste kao rastvor za čuvanje.

Preparacija kolone

8+/-1 ml helirajućeg Sepharose brzog protoka (Amersham Biosciences) kuplira se sa iminodisirćetnom kiselinom smolom i uvodi u hromatografsku kolonu tako da posuda bude visine 4+/-0.5cm. Napunjena kolona se puni sa 10 BV acidifikovane vode a onda unosi u 2 BV 0,2 M bakar sulfata pH 4-4.5. U skladu sa uputstvima proizvođača 2-3 mM natrijum acetata pH 4-4.5 koristi se da se olakša rastvaranje bakar sulfata i da se izbegne precipitacija pri neutralnom pH. Smola se onda pere sa 10 BV acidifikovane vode.

Procedura

Sirovo izdvojeni materijal sa sadržajem r-hTBP-1 (rekombinantni TNF-vezujući protein-1), koji je čuvan na 4°C, zagreva se do sobne temperature; pH se podešava do 6,8 dodavanjem 85% orto-fosforne kiseline kap po kap, a provodljivost se dovodi do 21+/-1 mS dodavanjem NaCI u čvrstom stanju (sirovo izdvojeni materijal se može primeniti i posle preliminarne faze koncentracije ultrafiltracije da se uklone komponente podloge koje bi mogle da negativno utiču na interakciu r-hTBP-1 sa bakrom).

Kolona pripremljena kao što je navedeno gore, prvi put se ekvilibrira ispiranjem sa 15-20 BV pufera za ekvilibraciju, a onda se puni sirovo izdvojenim materijalom r-hTBP-1 radeći na sobnoj temperaturi (22+/-3°C) i pri linearnoj brzini protoka od 200 ml/cm<2>/čas.

Ova kolona se prvo pere puferom za ekvilibraciju sve dok UV signal ne dostigne bazalnu vrednost, a onda se pere sa 12-15 BV vode pa se sve što istekne iz kolone (efluent) baca.

Elucija se obavlja puferom za eluciju, a prikupljanje eluata se započinje kada se detektuje UV. Elucija r-hTBP-1 se obavlja sa 5-6 BV pufera za eluciju. Efluent koji sadrži polu-prečišćeni r-hTBP-1 se onda prikuplja i čuva na -20°C.

Ova kolona se regeneriše sa 3 BV pufera za regeneracija, a efluent kolone se baca. Posle toga, kolona se čisti sa 5 BV rastvora za sanitizaciju.

U cilju čuvanja, kolona se pere sa 5 BV rastvora za čuvanje i čuva u njemu. Podaci o čistoći posle ovog koraka rezimirani su na Tabeli 1, dole.

Obavljanje faze hvatanja ( poređenje sa Zn<2*>IMAC)

Faza hvatanja je prvobitno obavljana na Zn<2+->helate IMAC koloni. Međutim, kapacitet punjenja faze hvatanja za sirovi r-hTBP-1 smatrao se preniskim (250-300 mcg r-hTBP-1 ili 40 zapremina kolone sirovo izdvojenog materijala/ml smole). Zamena cinka bakrom, kao materijalom za naelektrisanje, dovela je do značajnog povećanja kapaciteta punjenja. Tokom ove faze hvatanja Cu<2+>IMAC, naš r-hTBP-1 je vezan za smolu, najkontaminiraniji proteini su eluirani u nevezanu frakciju, a polupročišćeni r-hTBP-1 se dobija u eluciji sa nivoom čistoće koji je pogodan za sledeće korake.

Odabranim uslovima, traženo poboljšavanje kapaciteta vezivanja postignuto je uz neke druge predonosti. Najrelevantniji rezultati koji se odnose na ovaj pronalazak rezimirani su dole.

Faza hvatanja r-hTBP-1, koja se obavlja hromatografijom metal-helat, pokazuje sledeće karakteristike:1.Koncentracija:25-30-struka koncentracija r-hTBP-1, u poređenju sa sirovo izdvojenim materijalom (videti Table 1).2.Purifikaciia:Ova faza je delotvorna za smanjenje zagađivača, kao što je prikazano na Tabeli 1.3.Količina:Ova metoda je pogodna za proizvodnju većih količina;4.Produktivnost:Faza povraćaja je zadovoljavajuća kao što je prikazano na Tabeli 2. Štaviše, ova faza je veoma brza, može se reprodukovati i lako se obavlja. Smola se može ponovo koristiti po odgovarajućem čišćenju i ponovnom naelektrisanju. Štaviše, glavne prednosti korišćenja Cu<2+>u odnosu na Zn<2+>mogu se rezimirati na sledeći način • Veći kapacitet punjenja: 1ml Cu-smole vezuje1-1.2 mg r-hTBP-1 u odnosu na 0,25-0,5 mg/ml Zn-smole; • Poboljšanje nivoa čistoće materijala posle faze hvatanja sa 30-35% koliko se dobija Zn-smolom do 40-50% sa Cu-smolom kao što je prikazano na Tabeli 2 (kvantitativni

RP-HPLC).

• Smanjenje broja faza pranja sa 3 kada se radi o Zn-smoli do 1 sa Cu-smolom sa smanjenjem tajanja rada i potrošnje pufera.

FAZA 2 - HROMATOGRAFIJA JONSKOM IZMENOM NA SP SEPHAROSE FF

Opis pufera i rastvora

Ekvilibracija pufera

1,68 ml 85% orto-fosforne kiseline i 17.53 g NaCI dodaje se u 900 ml vode mešajući. pH se podešava do 3,0 +/-0.1 sa 50% NaOH, a zapremina se podešava na 1 litar.

Pufer za pranje

0,68 ml 85% orto-fosforne kiseline dodaje se u 900 ml vode, mešajući. pH se podešava do 4,0 +/-0.1 sa 50% NaOH a zapremina se podešava na 1 litar.

Elucioni pufer

3.37 ml 85% orto- fosforne kiseline i 17.53 g NaCI dodaju se u 900 ml vode, mešajući. pH se podešava do 4,0 ±0,1 uz pomoć 50% NaOH and zapremina se podešava do 1 litar.

Regeneracijski pufer

3,37 ml 85% orto-fosforne kiseline i 116,8 g NaCI dodaju se u 900 ml vode, mešajući. pH se podešava do 6,0±0,1 sa 50% NaOH, a zapremina se podešava do 1 litar.

Rastvor za sanitaciju

20 g NaOH rastvara se u 900 ml vode, mešajući, a zapremina se podešava do

1 litar.

Rastvor za čuvanje

200 ml apsolutnog etanola se dodaje u 800 ml vode mešajući.

Preparacija kolone

Kolona se puni sa SP-Sepharose FF smolom, u skladu sa uputstvima proizvođača, sa visinom od 6-6,5 cm.

Kolona se potom sanitarno priprema pranjem sa 3 BV NaOH 0,5M posle čega se koristi 3BV vode.

Ekvilibracija kolona se postiže ispiranjem sa 4-5 BV ekvilibracijskog pufera. pH i provodljivost efluenta kolone se proveravaju (pH 3,0 +0,1, provodljivost 29,5 ± 0,5 mS/cm) pa se kolona eventualno dodatno ekvilibrira ako izmerene vrednosti nisu u indikovanom rasponu.

Napomena: Alternativeno, ekvilibracijski pufer se može zameniti sa 25mM fosfatnog pufera pH 2.8 +/-0.1 bez NaCI; pufer za pranje se može eliminisati; regeneracijski pufer se može zameniti sa NaCI 1.5M; a rastvor za čuvanje se može zameniti sa 10mM NaOH.

Procedura

Sve operacije se obavljaju na temperaturi od 2-8°C pri brzini protoka od 40-50 ml/cm/čas.

Zamrznuti r-hTBP-1 dobijeni elucijom iz faze hvatanja tope se bilo na sobnoj temperaturi ili 6 ±2°C. pH se podešava sa 3,7 ± 0,2 do 3 ±0,1 dodavanjem 85% fosforne kiseline, a provodljivost se podešava sa 14 ±3 mS/cm do 22±3 mS/cm dodavanjem čvrstog natrijum hlorida, pa se rastvor puni u kolonu. Pošto se punjenje završi, kolona se ispire sa 3 BV ekvilibracijskog pufera, posle čega sledi 4 BV pufera za pranje. Alternativeno, pranje puferom za pranje se može eliminisati (videti Napomenu gore).

Onda se započinje elucija puferom za eluciju. r-hTBP-1 počinje da eluira posle 180-220 ml. Ovaj prvi deo se baca, a ubira se narednih 3.5 BV koji predstavljaju polu-pročišćeni r-hTBP-1. Uzima se uzorak eluirane frakcije (5 x 0.5 ml) za I PC i čuva se na 6 ±2°C ali ne duže od 3 dana.

Pošto se elucija završi, kolona se ispire sa oko 3 BV regeneracijskog pufera. Ova frakcija (1x1 ml) se uzorkuje i odbacuje.

Za čuvanje, kolona se ispire sa 3 BV EtOH 20% (ili, alternativeno sa 10mM NaOH) i čuva na 6+/-2°C.

Rezulati sedam eksperimenata ove faze dati su na TABELI 2:

Na sledećoj Tabeli 3 prikazan je učinak kombinacije faza IMAC i SP-Sepharose FF.

FAZA 3 - ULTRAFILTRACIJA SP ELUATA

Procedura

Sve operacije rade se na sobnoj temperaturi (23 ±3°C).

Ultrafilter čuvan u NaOH pere se vodom do pH 7,0 +0,5. Ovaj ultrafilter zajedno sa membranom puni se sa r-hTBP-1 rastvorom. Rastvor se koncentriše do 50 ml. Retencirana frakcija se razblažuje sa 200 ml vode pa ponovo koncentriše do 50 ml. Faza pranja koja je gore opisana ponavlja se još tri puta.

Proverava se provodljivost permeata. Ako je < 0,5 mS/cm započinje se sa narednom fazom.

Ako je vrednost provodljivosti >0,5 mS/cm ovu fazu pranja ponoviti još jednom.

200 ml 50 mM Tris (pri pH 9,0±0,1 i sa provodljivošću od 0,55±0,1 mS/cm) dodaje se u retenciranu frakciju i ponovo koncentruje do 50 ml rastvora.

Gore opisana operacija ponavlja se još tri puta, i ako je to potrebno, nastavlja se sve dok pH i provodljivost frakcije permeata ne budu 9,0 ±0,2 odnosno 0,55 ±0,1 mS/cm.

Retencirana frakcija se prikuplja , a ultrafiter se pere sa tri alikvota od 100 ml 50 mM Tris (pri pH 9,0 ±0,1 sa provodljivošću od 0,6 ±0,1 mS/cm) gde se dodaje frakcija pranja.

Ultrafilter se pere i čisti (faza sanitacije) sa 0.1 M NaOH (ili, alternativno, 0,5 M NaOH) recikliranjem u trajanju od ne više od 30 minuta. Sam ultrafilter se ispire vodom sve dok pH permeata ne bude 7,0±0,5. Ovaj ultrafilter se onda čuva na 0,01 M ili, alternativno, 0,05 M NaOH na 23±3°C.

FAZA 4 - HROMATOGRAFIJA JONSKOM IZMENOM NA Q- SEPHAROSE FF

Puferi i rastvori

Ekvilibracijski pufer: 50mM Tris pH 9,0±0,1, provodljivost 0,55±0,1 mS/cm

Eluciiski pufer: 250mM Tris pH 9,0±0,1, 50 mM NaCI provodljivost 7,2±0,5 mS/cm Re<g>eneracijski pufer: 250mM Tris pH 6,0±0,1, 2 M NaCI or, alternativno, 1,5M NaCI Rastvor za sanitizaciju: 0.5M NaOH.

Rastvor za čuvanje: 20% Etanol ili 10 mM NaOH.

Procedura

Sve operacije se obavljaju u sledećim uslovima:

Temperatura: 2-8°C ili, alternativno, sobna temperatura; Linearna brzina protoka: 80-90 ml/cm<2>/čas

pH r-hTBP-1 posle ultrafiltracije se proverava i, ako se razlikuje od vrednosti pH 9,0 ±0,1, podešava se sa 1M Tris ili 3M HCI. Provodljivost se takođe proverava.

Kolona se pakuje (puni) Q-Sepharose FF smolom, u skladu sa uputstvima proizvođača, do visine od 13 cm.

Kolona Q-Sepharose se zatim čisti ispiranjem sa 3 BV NaOH 0,5 M posle čega se koristi 6 BV vode. Zatim se kolona ispire sa 4 BV elucionog pufera i ekvilibrira sa 7-8 BV ekvilibracijskog pufera, a proveravaju se pH i provodljivost kolonvv efluenta (pH 9,0 ±0,2, provodljivost 0,55 ±0,1 mS/cm). Ekvilibracija kolone se na kraju radi kontinuirano ako merene vrednosti nisu u indikovanom rasponu.

Ova kolona se onda puni ultrafiltriranim r-hTBP-1 koji je pripremljen kako je gore navedeno. Pošto se punjenje završi, kolona se ispire sa 3 BV ekvilibracijskog pufera.

Elucija se započinje elucijskim puferom. Čisti h-hTBP-1 počinje da eluira posle 1BV; prikupljenje r-hTBP-1 se započienje posle prvog BV u skladu sa hromatografskim profilom; zatim se elucija završava sa 5-6 BV.

Kolona se ispire sa 3 BV regeneracijskog pufera, uzorak (1 x 1ml) a onda se odbacuje. Kolona se opet ispire sa 3 BV 0.5 M NaOH, ispire se vodom sve dok pH efluenta ne bude između 7 i 8. Na kraju se ova kolona ispire sa 3 BV EtOH 20 % i čuva na 2-8°C.

FAZA 5-NANOFILTRACIJA NA DV 50 PALL

U držač diska instalira se oslonac od nerđajućeg čelika, a DV50 filter (prečnika 47 mm) se postavlja na taj oslonac. Pali Ultipor<®>VF Grade DV50 je filtersko punjenje koje se normalnmo koristi za uklanjanje virusa. Nekoliko kapi vode se dodaje na vrh ovog diska. Postavljaju se odgovarajući zaptivi, a držač diska se čvtsto zatvara. Sistem se puni sa 50 ml Q elucionog pufera, zatvara i povezuje sa izvorom azota.

Na početku ispiranja, otvara se dovod azota pod inicijalnim pritiskom od 0,5 bara, a zatim se otvara ventil lociran na držaču diska da bi se ceo sistem pročistio.

Čim se prva kap tečnosti pojavi na ventilu na držaču diska, on se čvrsto zatvara, pa se otvara dovod azota pod odgovarajućim pritiskom, odnosno, 3,0-3,5 bara.

Membrana se zatim ispira sa svih 50 ml pufera, da bi se obezbedilo da membrana bude vlažna i da se eliminiše vazduh, ako ga ima, između listova membrane i da bi na filteru mogao da se uradi test integriteta.

Sistem se puni materijalom koji dolazi iz prethodne faze, i postupak se obavlja na sledeći način: na početku filtracije otvara se dovod azota pod inicijalnim pritiskom od 0,5 bara, a zatim se otvara ventil lociran na držaču diska da bi se ceo sistem pročistio. Čim se prva kap tečnosti pojavi na ventilu na držaču diska, on se čvrsto zatvara, pa se otvara dovod azota pod odgovarajućim pritiskom, odnosno 1,5-2,5 bara.

Pritisak azota se drži na 1,5-2,5 bara , a potom se rastvor filtrira.

Ovaj filtrirani rastvor se prikuplja u posudu na kraju filtracijr, izvor azota se zatvara, a onda se otvara ventil da se eliminiše višak azota.

Na kraju ove filtracije, sistem se pere sa 5-10 ml elucionog pufera iz prethodne faze, pod istim radnim pritiskom od 1,5-2,5 bara.

Rastvor za pranje se skuplja u istoj posudi u koju je prikupljen i fitrirani rastvor i uzorkovan za IPC.

FAZA 6-HIDROFOBNA INTERAKCIJA BUTIL SEPHAROSE FF

Puferi i rastvori

Ekvilibraciiski pufer: 200 mM Tris-HCI pH 7,5+0,1, 1 M Na2S04 provodljivost 90±5 mS/cm

Eluciiski pufer: 200 mM Tris-HCI pH 7,5+0,1, 0,7 M Na2S04, provodljivost 75±5 mS/cm Regeneracijski rastvor: Prečišćena voda

Rastvor za sanitizaciju:1M NaOH

Rastvor za čuvanje: 20% etanol ili 10 mM NaOH

Procedura

Sve operacije se obavljaju na temperaturi od 23 ±3°C and pri linearnoj brzini protoka od 80-90 ml/cm/čas. Čvrsti Na2S04se dodaje u Q-Sepharose eluat, posle 100 KD ultrafiltracije mešajući, do 1M. Posle toga, rastvaranje soli je gotovo, a pH se podešava do 7,5 +0,1 uz pomoć 3M HCI. Ova kolona se onda ispire sa 3 BV NaOH 1M posle čega se koristi 4BV prečišćene vode.

Ova kolona se ispire ponovo sa 5-6 BV ekvilibracijskog pufera. I pH i provodljivost efluenta (pH 7,5+0,2, provodljivost 90±5 mS/cm) se proveravaju, a kontinuirano se obavlja ekvilibracija kolone, ako su izmerene vrednosti izvan indikovanog opsega.

Rastvor pripremljen kako je gore opisano puni se u kolonu i pošto se punjenje završi, kolona se ispire sa 3 BV ekvilibracijskog pufera. Pranje ekvilibracijskim puferom se nastavlja.

Posle pranja sa 2-3 BV, proteini počinju da eluiraju. Ova frakcija sadrži r-hTBP-1, otprilike 10-12% od ukupne količine, kontaminirane kontaminantima ćelijske kulture. Ovo pranje se produžava dok elucija proteina ne dostigne plato dajući široki vrh (oko 2

BV).

Zatim se započinje elucija sa elucionim puferom. Prvih 1-2 BV se objedinjuje, sa uzorkom pranja, budući da sadrži malu količinu kontaminanta i neposredno posle toga, započinje se sa prikupljanjem r-hTBP-1.

Prečišćeni r-hTBP-1 eluira odmah pošto se nastavi sa kontaminiranim materijalom i elucijom sa narednih 2.5-3 BV. Ovo prikupljanje (kolekcija) se prekida kada vrednost UV apsorbance dostigne 0,5 % maksimuma. Posle kolekcije r-hTBP-1, ova frakcija (5x0,5ml) se uzorkuje i čuva na 2-8°C, ali ne duže od 3 dana.

Sama kolona se ispire sa 3 BV prečišćene vode , a frakcija se prikuplja.

Sanitacija kolone se obavlja sa 3 BV 1 M NaOH, a ispire se vodom sve dok pH efluenta ne bude između 7 i 8.

Zatim se kolona kolona ispire ponovo sa zapreminom tri kolone etanola 20 % i čuva se na sobnoj temperaturi ne duže od 2 nedelje.

FAZA 7 - 10 KP ULTRAFILTRACIJA

Pomešani ćelijski tip 8400, sa sve membranom, nanosi se sa Butil-Sepharose eluatom. Ovaj rastvor se koncentriše do oko 25 ml, pod pritiskom azota od 3 bara. Retencirana frakcija se razblažuje sa oko 100 ml vode pa se ponovo koncentruje do 25 ml. Faza pranja koja je gore opisana ponavlja se još tri puta. Proverava se i provodljivost permeata: ako je < 0.3 mS/cm onda se može započeti naredna faza. Ako je vrednost provodIjivosti >0,3 mS/cm, faza pranja treba da se ponovi.

100 ml pufera se dodaje u retenciranu frakciju i ponovo koncentrauje sve do 25 ml rastvora. Ova operacija se ponavlja tri puta i, po potrebi, sve dok pH i provodljivost frakcije permeata ne bude 7,1 ±0,2 odnosno 5,8 +0,2 mS/cm.

Ova retencirana frakcija se onda odbacuje, i nanosi na manju ultrafiltraciju mešanog ćelijskog tipa 8050, zajedno sa membranom. Ovaj retencirani deo se koncentriše do minimnalne zapremine (oko 3-5 ml). Ova retencirana frakcija se prikuplja, a ultrafilter sa osnovnim (balk) puferom se pere dodavanjem frakcija za pranje u koncentrovani r-hTBP-1. Finalna zapremina se podešava da bi se dobila finalna koncentracija od oko 20-30 mg/ml po OD 280 nm (s= 0.71).

Ovi ultrafilteri se peru, a sanitacija se obavlja uz pomoć 0,2 M NaOH recikliranjem u trajanju od najmanje 30 minuta. Ultrafilteri se onda ispiraju vodom sve dok permeat ne dostigne pH vrednost od 7,0 ±0,5. Zatim se ultrafilteri čuvaju u NaOH 0,01 M na6±2°C.

FAZA 8-MIKROFILTRACIJA

Špric za jednokratnu upotrebu se povezuje za 0,22\ ifilter, puni se sa koncentrovanim rastvorom r-hTBP-1, filtrira i pere dva puta sa 1 ml osnovnog pufera tako što se objedinjuju ispirci sa filtriranim balkom. Dobijeni rastvor se uzorkuje u cilju analitičkog testiranja (15 x 0,2 ml) i čuva se na -20°C.

Rezultati su zadovoljavajući sa tačke gledišta kvantifikacije i čistoće, što je ilustrovano na tabelama dole (Tabele 4 do 6) što oslikava rezultate odgovarajućeg broja replikacija ovog procesa (PROLAZ).

Najkritičniji proces ovog pronalaska jeste inicijalna faza hromatografije na Cu<+2>helatnoj koloni. Štaviše, važno je i da kombinacija SP Sepharose hromatografije pri kiselinskom pH bude praćena sledećim Q Sepharose pri baznom pH. U takvim uslovima, upadljivo dobri rezultati su dobijeni podvrgavanjem sirovo izdvojenog materijala produkcije CHO r-hTBP-1 (Onercept). Posebno je pokazano da je faza hvatanja u stanju da obezbedi 25-30-struki koncentrat r-hTBP-1, da delotvorno smanji kontaminante, da daje zadovoljavajući prinos proteina i da može da se prilagodi uslovima industrijske proizvodnje na veliko.

Još više iznenađuje činjenica da su dobijeni podaci izvanredne čistoće i kada je počeni materijal sirovi supernatant iz ćelijske kulture koja sadrži serum, i kada dolazi iz kulture koja ne sadrži serum, kao što će biti pokazano dole.

Primenom faza analognog procesa na drugi TNF receptor, r-hTBP-2, dobiajju se slični podaci o kvantifikaciji i čistoći.

ANALITIČKI PROTOKOLI

1 Kvantitativne RP- HPLC- radne procedure

Sledeći metod je korišćen za kvantifikaciju r-hTBP-1 u svim uzorcima za prečišćavanje. Ova metoda koristi C8 kolonu sa vodenim TFA i n-propanolom; dobija se dobra rezolucija između r-hTBP-1 i kontaminanta ćelijske kulture. Ovaj r-hTBP-1 se može resiti u jednom ili dva pika (vršne vrednosti) zavisno od serije kolone. Sama procedura je opisana dole.

1. 1 Oprema, materijali i metoda

- Analtički HPLC Sistem (Merck ili ekvivalentni)

- Dinamički mikser (Merck ili ekvivalentni)

- Kolona: SUPELCOSIL LC-308 0 0.46x5 cm - cod 5-8851 - Supelco

- Eluent A: 0.1% vodeni TFA

- Eluent B: 0.1% TFA u vodi / n-propanol 50:50

- Eluent C: Acetonitril

- Temperatura: 23±3°C

- UV Detekcija: 214 nm

- Vreme injekcije (ubrizgavanja): 62 minuta

- Ubrizgana zapremina: 10-100 uJ

- Standard: BTC10 , 1.53 mg/ml by OD 280 nm (e= 0.71) ubrizgano na 10 i 20 uJ

- Gradijent:

1. 2 Izračunavanje

Količina r-hTBP-1 u svakom uzorku za purifikaciju dobijena je na sledeći način: zračunati faktor odgovora (RF) za standard (BTC10) u skladu sa formulom:

RF= TBP1 mcg/ ml

TBP1 površina pika (vršne vrednosti)

Pomnožiti površinu pika r-hTBP-1 za svaki uzorak sa RF standarda da se dobije koncentacija uzorka u mcg/ml kako je dole prikazano:

TBP1 mcg/ml = TBP1 površina pika X RF standard

Molimo da obratite pažnju na sledeće:

• BTC 10 koji se koristi kao standard odabran je na bazi dostupnosti; • Vreme retencije pika r-hTBP-1 može da se promeni sa svakom pripremom novog pufera (1-3 min);

• Koncentrovani uzorak treba da se razblaži u eluantu A.

2. Fluorimetrijski RP- HPLC- Radna procedura

Na osnovu prethodnih iskustava sa drugim rekombinantnim proteinima urađena je RP-HPLC analiza sa fluorimetrijskom detekcijom da se proceni nivo čistoće kontaminanata rezidualne ćelijske kulture i u r-hTBP-1 balkovima i u procesu uzorkovanja, budući da nijedna imunohemijska metoda nije bila na raspolaganju kada je započeta studija purifikacije.

Ova metoda se pokazala korisnom za praćenje uklanjanja kontaminanata iz ćelijske kulture u poslednjoj fazi purifikacije, t.j. Butil Sepharose hromatografiji pa je to utvrđeno u samoj selekciji operativnih uslova gore navedene faze, jer bi mogla da se koristi za analizu uzoraka tokom samog procesa gde onda nisu potrebni nikakvi specijalni materijali i/ili aparati. Metoda RP-HPLC je brza (vreme prolaza 62 minuta) i daje rezultate uporedive sa imunoesejem kada je ovaj test postao dosupan. Budući da standard za imunoesej još uvek nije dostupan, rastvor BSA koji proizvodi Pierce korišćen je kao standard da se proceni nivo kontaminacije u uzorcima. Kao kvantitativni RP-HPLC, ova test daje dobru rezoluciju između r-hTBP-1 i površine BSA.

2. 1 Oprema , materijali i metode

- Analitički HPLC Sistem (Merck ili ekvivalentni)

- Dinamički mikser

- Fluorimetrijski detektor ( Varian ili ekvivalentni)

- Kolona: Akvapore RP-300, 7u, Brownlee, 0 0.46x22 cm - cod 0711-0059, Applied Biosistem

- Eluent A: 0.1% vodeni TFA

- Eluent B: 0.1% TFA u Acetonitrilu

- Temperatura: 23±3°C

-Xekscitacija: 220 nm

-Xemisija: 330 nm

- Zapremina ubrizgavanja: 10-100 |il

- Vreme ubrizgavanja: 62 minuta

- Standard: BSA (Pierce) 2 mg/ml razblaženo 1:100, 10 i 20 uJ ubrizgano; - Kontrola: BTC10 , 1.53 mg/ml po OD 280 nm (s= 0.71). budući da je ubrizgano 200

u.l;

- r-hTBP-1 uzorci: 1-5 mg/ml po OD 280 nm (e= 0.71).

- Gradijent:

2. 2 Izračunavanje

Količina kontaminacije u svakom uzorku Butil purifikacije dobija se na sledeći način:

• Izračunati faktor odgovora (RF) za standard (BSA) u skladu sa formulom:

RF = BSA mcg ubrizgano

BSA površina pika

Pomnožiti površine pikova svakog uzorka sa RF standarda i sa 1000 čime će se dobiti količina kontaminanata u ubizganom uzorku u ng. Kada se podeli ova vrednost sa vrednošću ubrizgane r-hTBP-1 u kontaminaciji u delova na milion (ppm), dobija se, u skladu sa the formulom:

Kontaminanata ppm = površine pikova kontaminanata x RF BSA x 1000

mg ubrizganog TBP1

Molimo da obratite pažnju da:

• Testirani uzorak mora da se razblaži u eluantu A.

• Kontaminacija kontrolnog uzorka kreće se u rasponu između 190 i 240 ppm.

3. Analiza i karakterizacija r- hTPB- 1 Balka

Analitička metoda koja je ovde dalje opisana uspostavljena je i korišćena da se karakterizuje balk r-hTBP-1 koji se dobija novom procedurom purifikacije.

3. 1 SE- HPLC

Ova metoda je razvijena sa ciljem da se kvantifikuje količina dimera i agregata u finalnom balku. Ova metoda može da pravi razliku između r-hTBP-1 monomera njegovih dimera i/ili agregata. Ovo je dokazano testiranjem nekih uzoraka r-hTBP-1 po tretmanu UV , što je metoda za koju je šire poznato da generište agregatne oblike molekula. Ukratko, ova metoda se obavlja na sledeći način:

3. 1. 1 Oprema , materijali i metode

Oprema: Analitički HPLC Sistem

Kolona: TSK G2000 SWXLcod. 08021 (TosoHaas)

Mobilna faza: 0.1 M natrijum fosfat pH 6.7, 0.1M natrijum sulfat

Temperatura: 23±3°C

UV detekcija: 214 nm

Zapremina ubrizgavanja: 10-100 ul što odgovara 20-30 mcg r-hTBP-1 (poOD) Vreme ubrizgavanja: 30 minuta

Standard: BTC10, 1.53 mg/ml po OD 280 nm (e= 0.71) ubrizgano 10-20 uJ r-hTBP-1 bulk: diluted to 1-2 mg/ml po OD 280 nm (e= 0.71) ubrizgano 10-20 ul Čistoća uzorka izražena je kao % čistoće r-hTBP-1 koeficijent vrh/ukupna površina.

3. 2 IE- HPLC

Ova metoda je razvijena da se proceni sastav izoforma u finalnom balku sa ciljem da se zameni hromatofokusirajuća tehnika koja se po pravilu koristi za gorenavedenu svrhu. Za razliku od hromatofokusiranja, analiza IEC ima više prednosti jer je brža od gornje, iziskuje manje materijala (150-200 mcg umesto 1-2-mg), koristi zajedničke pufere i ne iziskuje prethodni tretman test uzorka. Budući da je r-hTBP-1 jedan glikoprotein, kao supstanca takve prirode, odlikuje se različitim izoformima od kojih svaki ima različitu izoelektričnu tačku koja određuje različito ponašanje kada se testira analizom jonske izmene. Dobija se 12 različitih pikova, od kojih svaki odgovara po jednoj varijanti glikozilacije. Ovom metodom, svi izoformi r-hTBP-1 su izolovani i u potpunisti određeni. Ukratko, ova metoda se obavlja na sledeći način:

3. 2. 1 Oprema , materijali i metoda

Analitički inertni HPLC Sistem

Gradijent:

4. Kvantifikaciia r- hTBP- 1 po OD

Koncentracija r-hTBP-1 balka proizvedenog u skladu sa ovim pronalaskom određivana je optičkom gustinom (OD) na 280 nm korišćenjem koeficijenta molarne ekstinkcije (e) koji se izračunava interno na r-hTBP-1 balk koji se produkuje tokom inicjalne faze purifikacije r-hTBP-1. Korišćena su tri reprezentativna r-hTBP1 balka proizvedena novim procesom purificacije i dobijena je vrednost s=0.776. Ovaj novi koeficijent ekstinkcije će se koristiti za proizvodnju u većim količinama i fazi produkcije. Budući da je koncentracija balka u rasponu od 20-30 mg/ml, neophodno je da se materijal razblaži do 1 mg/ml balk puferom (40 mM PBS pH 7.1 +0.2, 10 mM NaCI), pre nego što se testira apsorbanca na 280 nm.

5. Određivanje proteina metodom Bradforda

Bradfordova metoda je korišćena za kvantifikcaiju ukupnih proteina u r-hTBP-1 balku (videti Bradford, MM.Analytical Biochemistn/72:248-254, 1976 i Stoscheck, CM..Methods in Enzymology 182:50-69, 1990). U ovom testu se kao standard koristi

BSA.

6. In vitro Bioesej

Biološka raspoloživost r-hTBP-1 sastoji se u njegovoj sposobnosti da vezuje TNFa. Ovaj test je korišćen da se testiraju (eseji) i u uzorcima u procesu i za ceo balk.

Claims (9)

1. Proces za izolaciju čistih TNF-vezujućih proteina koji obuhvata eluiranje sirovog rastvora TNF-vezujućih proteina na Imobilizovanu metalnu afinitetnu hromatografiju (IMAC) korišćenjem bakra kao metala.

2. Proces za purifikaciju rekombinantnih TNF-vezujućih proteina, koji obuhvata fazu hvatanja (capture), Imobilizovanu metalnu afinitetnu hromatografiju korišćenjem bakra kao metala.

3. Proces u skladu sa zahtevima 1 ili 2, naznačeno time da se elucija sa IMAC kolone obavlja pri vrednostima pH između 2.8 i 3.2.

4. Proces u skladu sa sa svim prethodnim zahtevima, naznačeno time da se elucija sa IMAC kolone obavlja pri vrednostima saliniteta između 14 i 16 mS.

5. Proces u skladu sa sa svim prethodnim zahtevima, koji dalje obuhvata sve naredne faze, kao međufaze: Hromatografiju jonske izmene (IEC) pri kiselinskom pH, po mogućstvu između 3 i 4, posle čega sledi hromatografija jonskom izmenom pri baznom pH, po mogućstvu između 8 i 10.

6. Proces u skladu sa sa svim prethodnim zahtevima, koji dalje obuhvata, kao fazu poliranja, Hidrofobnu Interakcijsku Hromatografiju (HIC).

7. Proces u skladu sa sa svim prethodnim zahtevima, naznačeno time da svaka faza hromatografije bude praćena fazom ultrafiltracije.

8. Proces u skladu sa sa svim prethodnim zahtevima, naznačeno time da TNF-vezujući protein bude rekombinantni h-TBP-1.

9. Proces za proizvodnju TNF-vezujućeg proteina koji obuhvata izolovanje ili prečišćavanje proteina u skladu sa procesom koji su pomenuti u ma kom od prethodnih zahteva.