MX2009002013A - Proceso para la purificacion de proteinas de fusion fc. - Google Patents

Abstract

La invención se refiere a un proceso para la purificación de una proteína de Fusión Fc que tiene un pI entre 6,9 y 9,5 proteína que comprende la cromatografía de afinidad de la proteína A o G, la cromatografía de intercambio de catión, la cromatografía de intercambio de anión y la cromatografía de hidroxiapatita.

Description

PROCESO PARA LA PURIFICACION DE PROTEINAS DE FUSION FC Campo de la Invención La presente invención se encuentra en el campo de la purificación de las proteínas. Más específicamente, se refiere a la purificación de ls proteínas de Fusión Fe vía la cromatografía de afinidad de la Proteína A o la Proteína G, de la cromatografía de intercambio de catión, de la cromatografía de intercambio de anión y de la cromatografía de hidroxiapatita . Antecedentes de la Invención Las proteínas han llegado a ser comercialmente importantes como drogas que son llamadas generalmente "biológicas." Uno de los desafíos más grandes es el desarrollo de los procesos del costo efectivo y eficiente para la purificación de las proteínas en una escala comercial. Mientras muchos métodos están ahora disponibles para la producción a gran escala de ls proteínas, los productos crudos, tales como los supernacientes del cultivo de la célula, contienen no sólo el producto deseado sino también impurezas, que son difíciles de separar del producto deseado. Aunque los supernacientes del cultivo de la célula de las células que expresan los productos de la proteína recombinante pueden contener menos impurezas si las células crecen en un medio libre de suero, las proteínas de la célula REF. :199899 huésped (HCPs) permanecen todavía para ser eliminadas durante el proceso de purificación. Adicionalmente, las autoridades sanitarias solicitan altos estándares de pureza para las proteínas destinadas a la administración en seres humanos. Muchos métodos de purificación contienen pasos que requieren la aplicación de pH bajo o alto, altas concentraciones de sal u otras condiciones extremas que pueden poner en peligro la actividad biológica de una proteína dada. Por lo cual, para cualquier proteína es un desafío establecer un proceso de purificación que tenga una pureza suficiente mientras que retenga la actividad biológica de la proteína. Varios sistemas cromatográficos son conocidos que son usados extensamente para la purificación de ls proteínas. Los sistemas de cromatografía de intercambio de iones son usados para la separación de ls proteínas, principalmente, por diferencias en la carga. En la cromatografía de intercambio de iones, parches cargados en la superficie de la solución son atraídos por cargas opuestas conectadas a una matriz de cromatografía, a condición de que la fuerza iónica del amortiguador circundante sea baja. La elusión es lograda generalmente aumentando la fuerza iónica (es decir, la conductividad) del amortiguador para competir con la solución para los sitios cargados de la matriz de intercambio de iones. Cambiar el pH, con lo cual se altera la carga de la solución es otra manera de lograr la elusión de la solución. El intercambio en la conductividad o el pH puede ser gradual (elusión gradiente) o progresivo (elusión en etapas) . Los intercambiadores de anión pueden ser clasificados como débiles o fuertes. El grupo de carga en un intercambiador de anión débil es una base débil, que llega a ser desprotonada y, por lo tanto, pierde su carga en un pH alto. DEAE-sefarosa es un ejemplo de un intercambiador de anión débil, donde el grupo amino puede ser cargado positivamente debajo de un pH~ 9 y pierde gradualmente su carga en valores más altos de pH. El dietilaminoetil (DEAE) o el diet il- ( 2-hidroxi-propil ) aminoetil (QAE) tiene cloruro como contra-ión, por ejemplo. Un intercambiador de anión fuerte, por otro lado, contiene una base fuerte, que permanece positivamente cargada a través de la gama de pH usada normalmente para la cromatografía de intercambio de ión (pH 1-14). La Q-sefarosa (Q significa el amonio cuaternario) es un ejemplo para un intercambiador fuerte de anión. Los intercambiadores de catión pueden ser clasificados también como débiles o fuertes. Un intercambiador fuerte de catión contiene un ácido fuerte (tal como un grupo de sulfopropil) que permanece cargado de pH 1 - 14; mientras que un intercambiador débil de catión contiene un ácido débil (tal como un grupo de carboximetilo ) , que pierde gradualmente su carga mientras disminuye el pH por debajo de 4 o 5. El carboximetilo (CM) y sulfopropilo (SP) tiene sodio como contra-ión, por ejemplo. Una resina de cromatografía diferente se basa en una matriz insoluble de fosfato de calcio hidroxilado llamado hidroxiapatita . La cromatografía de hidroxiapatita es un método para purificar las proteínas que utiliza un fosfato insoluble de calcio hidroxilado (Ca5 (P04) 3AH) 2, que forma tanto la matriz como el ligando. Los grupos funcionales consisten en pares de iones de calcio cargados positivamente (los SITIOS C) y los clusters de los grupos de fosfato cargados negativamente (los SITIOS P) . Las interacciones entre la hidroxiapatita y las proteínas son complejas y de multi-modo. En un método de interacción, los grupos amino cargados positivamente sobre las proteínas asociadas con los SITIOS P cargados negativamente y los grupos carboxilo de ls proteínas interactúan por complejacion de coordinación a los SITIOS C (Shepard y colaboradores, 2000) . La hidroxiapatita cristalina fue el primer tipo de hidroxiapatita usada en cromatografía. La cromatografía hidroxiapatita cerámica (CHA) es un desarrollo adicional en la cromatografía de hidroxiapatita. La hidroxiapatita cerámica tiene alta durabilidad, buena capacidad de unión de proteína, y puede ser usada a tasas más altas de flujo y presión que la hidroxiapatita cristalina. (Vola y colaboradores, 1993) . La hidroxiapatita ha sido usada en la separación cromatográfica de ls proteínas, ácidos nucleicos, así como también en los anticuerpos. En la cromatografía de hidroxiapatita, la columna es normalmente equilibrada, y la muestra aplicada, en una concentración baja de amortiguador de fosfato y las proteínas absorbidas son entonces eluidas en un gradiente de concentración de amortiguador de fosfato (Giovannini y colaboradores, 2000) . Aún una manera adicional de purificar las proteínas se basa en la afinidad de una proteína de interés a otra proteína que es inmovilizada a una resina de cromatografía. Los ejemplos para tales ligandos inmovilizados son la proteína A y la Proteína G de las proteínas de la pared de la célula bacteriana, teniendo especificidad para la porción Fe de ciertas inmunoglobulinas . Aunque ambas, la Proteína A y la Proteína G, tengan una fuerte afinidad para los anticuerpos de IgG, ellas tienen afinidades que varían a otras clases de inmunoglobulina y también los isotipos. La proteína A es una proteína de 43.000 Daltons que es producida por las bacterias del estafilococo dorado y tiene cuatro sitios de unión a las regiones Fe de IgG. La proteína G es producida de Estreptococos del grupo G y tiene dos sitios de unión para la región de IgG Fe. Ambas proteínas han sido caracterizadas extensamente por su afinidad para varios tipos de inmunoglobulinas. La proteina L es una proteina bacteriana adicional, originándose en el peptoestreptococo, uniendo a Inmunoglobulinas y a los fragmentos de los mismos que contienen cadenas de Ig livianas (Akerstrom y Bjork, 1989) . La cromatografía de afinidad de la proteína A, la Proteína G y Proteína L son usadas extensamente para el aislamiento y la purificación de las inmunoglobulinas. Desde que los sitios de unión para la Proteína A y la Proteína G residen en la región Fe de una inmunoglobulina, la cromatografía de afinidad de la Proteína A y la Proteína G permite también la purificación de las así llamadas proteínas de Fusión-Fc. Las proteínas de Fusión Fe son proteínas quiméricas que consisten en una región del efector de una proteína, tal como la región de unión de un receptor, fusionado a la región de Fe de una inmunoglobulina que es con frecuencia una inmunoglobulina G (IgG) . Las proteínas de Fusión Fe son usadas extensamente como terapéuticas ya que ellas ofrecen las ventajas conferidas por la región Fe, tales como: - La posibilidad de purificación usando la cromatografía de afinidad de la proteína A o la proteína G con las afinidades que varían según el isotipo IgG. El IgGi, IgG2 y IgG4 humanos, se unen totalmente a la Proteína A y a todos los IgGs humanos inclusive al IgG3 que se une fuertemente a la Proteína G; - Un aumento de la vida media en el aparato circulatorio, ya que la región Fe se une al receptor salvaje FcRn el cual protege de la degradación lisosomal; - Dependiendo del uso médico de la proteína de Fusión Fe, las funciones del efector Fe pueden ser deseables. Tales funciones del efector incluyen la cito-toxicidad celular anticuerpo-dependiente (ADCC) por las interacciones con los receptores de Fe (FcyRs) y la cito-toxicidad complemento-dependiente (CDC) mediante la unión al componente complemento lq (Clq) . Los isoformos de IgG ejercen niveles diferentes de funciones de efector. Los IgGi y IgG3 humanos tienen efectos fuertes ADCC y CDC mientras que el IgG2 humano ejerce efectos ADCC y CDC débiles. El IgG4 humano exhibe un ADCC débil y ningún efecto CDC.

La vida media del suero y las funciones del efector pueden ser moduladas mediante ingeniería de la región Fe para aumentar o reducir su unión a FcRn, FcyRs y Clq respectivamente, dependiendo del uso terapéutico destinado para la proteína de fusión Fe. En ADCC, la región de Fe de un anticuerpo se une a los receptores de Fe (FcyRs) en la superficie de células inmunes del efector tal como las asesinas naturales y los macrófagos, llevando a la fagocitosis o lisis de las células dirigidas.

En CDC, los anticuerpos matan las células dirigidas provocando la cascada del complemento en la superficie de la célula. Los isoformos de IgG ejercen niveles diferentes de las funciones del efector aumentando en la orden de IgG4 < IgG2 < IgGi = IgG3. El IgGi humano despliega ADCC altos y CDC, y es el más adecuada para el uso terapéutico contra células patógenas y del cáncer. Bajo ciertas circunstancias, por ejemplo cuando el reducción de la célula objetivo es indeseable, puede ser requerido la anulación o disminución de las funciones del efector. Al contrario, en el caso de los anticuerpos destinados para el uso de oncología, aumentar las funciones del efector puede mejorar su actividad terapéutica (Cárter y colaboradores, 2006) . Modificar las funciones del efector pueden ser logrado por ingeniería de la región Fe tanto para mejorar o reducir la unión de FcyRs o los factores del complemento. La unión de IgG para el FcyRs activante (FcyRI, FcyRIIa, FcyRIIIa y FcyRIIIb) e inhibitorio (FcyRIIb) o el primer componente del complemento (Clq) depende de los residuos localizados en la región vinculante y el dominio CH2. Dos regiones del dominio CH2 son críticas para FcyRs y la unión del complemento Clq, y tienen las secuencias únicas en IgG2 y IgG4. Por ejemplo la sustitución de los residuos IgG2 en las posiciones 233-236 en el IgGi humano redujo en forma importante a ADCC y CDC (Armour y colaboradores, 1999 y Shields y colaboradores, 2001) . Se han realizado numerosas mutaciones en el dominio CH2 de IgG y su efecto en ADCC y CDC fue probado in vitro (Shields y colaboradores, 2001, Idusogie y colaboradores, 2001 y 2000, Steurer y colaboradores, 1995) . En particular, una mutación a alanina en E333 fue informada para aumentar tanto ADCC como CDC (Idusogie y colaboradores, 2001 y 2000) .

Aumentar la vida media del suero de un anticuerpo terapéutico es otra manera de mejorar su eficacia, permitiendo más altos niveles de circulación, menos frecuente administración y dosis reducidas. Esto puede ser logrado mejorando la unión de la región de Fe a FcR neonatal (FcRn) . FcRn, que se expresa en la superficie de las células endoteliales , une el IgG en una manera dependiente del pH- y lo protege de la degradación. Varias mutaciones localizadas en la interfase entre los dominios CH2 y CH3 han mostrado que aumentan la vida media de IgGi (Hinton y colaboradores, 2004 y Vaccaro y colaboradores, 2005) . La siguiente Tabla 1 resume las mutaciones conocidas de la región Fe de IgG (tomado del sitio web de Invivogen) .

En ciertas proteínas conocidas de fusión Fe que tienen utilidad terapéutica, las regiones Fe se han fusionado a los dominios extracelulares de ciertos receptores que pertenecen a la superfamilia del receptor del factor de la necrosis del tumor (TNF-R) (Locksley y colaboradores, 2001, Bodmer y colaboradores, 2002, Bossen y colaboradores, 2006) . Una marca de los miembros de la familia de TNFR es la presencia de las pseudo repeticiones ricas en cisteína en el dominio extracelular , tal como se describe, por ejemplo, por Naismith y Sprang, 1998. Los dos receptores de TNF, p55 (TNFRl) y TNFR p75 (TNFR2) son los ejemplos de tales miembros de la superfamilia de TNFR. Etanercept es una proteína de Fusión Fe que contiene la parte soluble del TNFR p75 (por ejemplo, en la patente WO91/03553, y WO 94/06476) . Bajo el nombre comercial Enbrel®, se vende para el tratamiento de la endometriosis, la infección del virus de Hepatitis C, la infección de HIV, artritis soriática, la soriasis, la artritis reumatoidea, el Asma, la espondilitis de Anquilosamiento, el ataque Cardiaco, el Injerto contra la enfermedad el huésped, la fibrosis Pulmonar, la enfermedad de Crohns . Lenercept es una proteina de fusión que contiene los componentes extracelulares del receptor humano de TNF p55 y la porción de Fe del IgG humano, y se piensa para el tratamiento potencial de asepsia severa y la esclerosis múltiple. OX40 es también un miembro de la superfamilia de TNFR. OX40-IgGl y las proteínas de fusión OX40-hIG4mut han sido preparadas para el tratamiento de las enfermedades inflamatorias y autoinmunes tales como la Enfermedad de Crohn . Una proteína de Fusión Fe de la BAFF-R, llamada también BR3, designada BR3-Fc, es un receptor de seducción soluble de una serie de inhibidores de BAFF (el factor activante de la célula B de la familia TNF) , se desarrolla para el tratamiento potencial de las enfermedades autoinmunes tales como la artritis reumatoidea (RA) y lupus eritematoso sistémico (SLE) . BCMA es otro receptor que pertenece a la superfamilia de TNFR. Una proteina de fusión de BCMA-Ig ha sido descrita para inhibir la enfermedad autoinmune (Melchers, 2006) . Otro receptor de la superfamilia TNF-R es TACI, el activador de la transmembrana e interactor CAML (von Bülow y Bram, 1997; EEUU 5.969.102, Gross y colaboradores, 2000), que tiene un dominio extracelular que contiene dos seudo repeticiones ricas en cisteina. TACI se une a dos miembros de la familia del ligando (TNF) del factor de necrosis del tumor. Un ligando es designado BLyS, BAFF, neutroquina-ct, TALL-1, zTNF4, o THANK (Moore y colaboradores, 1999) . El otro ligando ha sido designado como APRIL, ligando-1 de muerte TNRF-1 o ZTNF2 (Hahne y colaboradores, J. Exp.Med. 188: 1185 (1998) . Las proteínas de fusión que contienen formas solubles del receptor de TACI fusionado a una región de IgG Fe son conocidas también y se designaron TACI Fe (WO 00/40716, WO 02/094852) . TACI-Fc inhibe la unión de BLyS y APRIL a las células B (Xia y colaboradores, 2000) . Se desarrolla para el tratamiento de las enfermedades autoinmunes, inclusive del lupus eritematoso sistémico (SLE) , la artritis reumatiodea (RA) y las malignidades hematológicas , así como para el tratamiento de la esclerosis múltiple (MS) . Además de esto, TACI-Fc se desarrolla en mielomas múltiples (MM) (Novak y colaboradores, 2004; Moreau y colaboradores, 2004) y el linfoma de Hodgkin (NHL) , leucemia crónica de linfocito (CLL) y macroglobulemia de aldenstrom (WM) . Dada la utilidad terapéutica de las proteínas de fusión Fe, en particular aquellas que contienen las porciones extracelulares de la superfamilia TNFR, existe una necesidad para cantidades importantes de ls proteínas altamente purificadas que es adecuada para la administración humana. LA PATENTE O02/094852 describe un método para purificar parcialmente TACI-Fc, que comprende la cromatografía de la proteína A seguida por la cromatografía de la exclusión del tamaño S-200. LA PATENTE WO03/059935 revela un proceso de la purificación para un TNFR p75: la proteína de fusión de Fe que usa una combinación de la cromatografía de hidroxiapatita y de la cromatografía de afinidad en la Proteína A. Sin embargo, en el proceso descrito en la patente WO03/059935, la proteína de fusión Fe no une a la hidroxiapatita y así está contenida en el flujo continuo de la columna de hidroxiapatita. Además de esto, el uso de la cromatografía de intercambio de iones no es mencionada para la purificación del TNFR p75: proteína de fusión de Fe. La Patente WO2005/044856 revela un método para quitar agregados de alto peso molecular de preparaciones de anticuerpo por la cromatografía de hidroxiapatita. Un método de purificación que usa la Proteína A, la cromatografía de intercambio de anión y cromatografía de hidroxiapatita son reveladas también. Sin embargo, antes que nada, este método ha sido descrito exclusivamente para anticuerpos y en segundo lugar, no hay revelación del uso de un paso de la cromatografía de intercambio de catión entre la afinidad de la Proteina A y el paso de intercambio de aniones. LA PATENTE O94/06476 propone protocolos hipotéticos de purificación para el receptor soluble de TNF recombinante basado en TNF o la cromatografía de la afinidad de lectin, o la cromatografía de intercambio de anión o catión y en la cromatografía líquida de alto desempeño de fase reversa (RP-HPLC) . La cromatografía de Hidroxiapatita no es mencionada en este documento como un paso adecuado de purificación para receptores solubles de TNF. La patente de los Estados Unidos de Norte América No. 2002/0115175 describe la purificación de las metaloproteasas tal como la enzima alfa de convertasa del TNF. TACE tiene un punto teórico iso-eléctrico de aproximadamente 5,4, como fue calculado, por ejemplo, usando el "EMBL WWW Gateway al Servicio del Punto Iso-eléctrico", disponible en la Internet. TACE es una proteasa que fisiona 8 aminoácidos lejos de la N-TERMINAL de unión de membrana (pro-) TNF alfa. La citoquina TNF alfa es así liberada de la membrana de la célula por lo tanto activada. El proceso para la purificación de TACE revelado en la patente de los Estados Unidos de Norte América No. 2002/0115175 contiene un paso de agarosa de aglutinina del germen del trigo. Las proteínas de fusión de Fe de TACE son descritas en este documento también, pero no han sido purificadas . La patente europea EP 1 561 756 revela que la cromatografía basad en la proteína A o G solo no puede ser suficiente para la separación de contaminantes de ADN de las proteínas y eso con el fin de purificar una proteína, pasos posteriores tales como la cromatografía de intercambio de catión o anión, cromatografía de hidroxiapatita o combinaciones de las mismas pueden ser usadas. Ningún orden específica ha sido propuesta para estos pasos cromatográficos . Adicionalmente , las proteínas de la patente EP 1 561 756 se refieren a los factores hematopoyéticos , citoquinas y anticuerpos. Las proteínas de Fusión Fe no son mencionadas en la patente EP 1 561 756. La patente EP 1 614 693 describe un método para la purificación de anticuerpos basados en la cromatografía de afinidad de la proteína A, la cromatografía de intercambio de anión y la cromatografía intercambio de catión. En este documento, es especificado que los anticuerpos son purificados vía el intercambio de anión y vía cromatografía de intercambio de catión en esa orden, o, alternativamente, vía cromatografía de intercambio de cationes seguida por la cromatografía hidrófoba. La cromatografía hidrófoba puede ser reemplazada por cualquier otro tipo de cromatografía, inclusive la cromatografía de hidroxiapatita . Las proteínas de fusión Fe no son mencionadas en la patente EP 1 614 693. Feng y colaboradores, 2005, revelan los métodos para la purificación de anticuerpos basados en el paso inicial de captura en la Proteína A seguido por los pasos de acabado que puede ser la cromatografía de interacción hidrófoba, la cromatografía de intercambio de anión, la cromatografía de intercambio de catión o, la cromatografía de hidroxiapatita. Sin embargo, Feng y colaboradores sólo describen los métodos para la purificación de anticuerpos y no para las proteínas de Fusión Fe. Además de esto, aparte del paso de afinidad de la Proteína inicial A, ningún orden específica es sugerida en función de quitar sistemáticamente todas las impurezas no deseadas, tales como las proteínas de la célula huésped (HCPs), los agregados, ADN, contaminantes víricos y Proteína A lixiviada. Por lo tanto, hay todavía una necesidad insatisfecha de métodos eficientes de purificación para las proteínas de Fusión Fe que den como resultado tal pureza como para ser adecuadas para la administración humana Sumario de la Invención La presente invención es basada en el desarrollo de un proceso de la purificación para una proteína de fusión Fe. Por lo tanto, en un primer aspecto, la invención se relaciona con un proceso para la purificación de una proteína de fusión Fe, comprendiendo los pasos siguientes: a. Someter un liquido que comprende la proteina de fusión Fe a la cromatografía de afinidad de la Proteína A o la Proteína G; b. Someter el eluato del paso (a) a la cromatografía de intercambio de catión; c. Someter el eluato del paso (b) a la cromatografía de intercambio de anión; y d. Someter el flujo continuor del paso (c) a la cromatografía de Hidroxiapatita y recolectar el eluato para obtener la proteína de fusión Fe purificada . Este proceso es usado para purificar las proteínas de fusión Fe que tienen un punto isoeléctrico (pl) en una gama de entre 7,0 y 9,5. El proceso es usado preferiblemente para purificar las proteínas terapéuticas de fusión Fe, es decir las proteínas de fusión Fe pensadas para la administración humana. Más preferiblemente, es usada para una proteína de fusión Fe que comprende una porción extracelular, en particular un enlace ligando y opcionalmente una porción extracelular inhibitoria, de un miembro de la superfamilia del receptor del factor de necrosis de tumor (TNFR) . Ha sido, sorprendentemente, mostrado que el paso (b) fue adecuado para la eliminación del así llamado Fe libre, es decir los dominios de cadena pesada de la inmunoglobulina que no están fusionados a una fracción terapéutica completa tal como, por ejemplo, una porción extracelular de un enlace ligando de un miembro de la familia TNFR. En un segundo aspecto, la invención se relaciona con una proteina purificada de fusión Fe, preferiblemente una proteina terapéutica de Fusión Fe, más preferiblemente una proteina de fusión Fe que comprende una porción extracelular, en particular una porción extracelular de unión de ligando, de un miembro de la superfamilia del receptor del factor de necrosis de tumor (TNFR) , comprendiendo menos del 1 por ciento o 0,5 por ciento o 0,2 por ciento o 0,1% de la proteina libre de Fe. Ha sido mostrado, además, que la combinación de pasos (a) , (c) y (d) eliminó, apreciablemente , los agregados de la proteina de Fusión Fe, que son terapéuticamente inactivos y no deseables para la administración humana. Por lo tanto, en un tercer aspecto, la invención se relaciona con una composición purificada de la proteina de fusión Fe, preferiblemente una proteina terapéutica de Fusión Fe, más preferiblemente una proteina de fusión Fe que comprende una porción extracelular, en particular una porción extracelular de unión de ligando, de un miembro de la superfamilia del receptor de factor de necrosis de tumor (TNFR), comprendiendo menos del 1 por ciento o menos del 0,5 por ciento de los agregados de la proteina de Fusión Fe y/o menos del 0,5 por ciento o menos del 0,2 por ciento o menos del 0,1 por ciento de la proteina libre de Fe. Un aspecto adicional de la presente invención se relaciona con el uso de la cromatografía de intercambio de catión para la eliminación del Fe libre en una preparación de la proteína de fusión Fe, preferiblemente una preparación terapéutica de la proteína de Fusión Fe, más preferiblemente de una proteína de fusión Fe que comprende una porción extracelular de un miembro de la familia de receptor de factor de necrosis de tumor, o un ligando uniendo y opcionalmente, inhibiendo el fragmento del mismo. Todavía un aspecto adicional de la presente invención se relaciona con el uso de la cromatografía de hidroxiapatita para la eliminación de agregados en una preparación de la proteína de fusión Fe, preferiblemente, las preparaciones de la proteína de fusión Fe terapéuticas, más preferiblemente las proteínas de fusión Fe que comprenden una porción extracelular de un miembro de la superfamilia del receptor del factor de necrosis de tumor (TNFR) , o un ligando uniendo el fragmento del mismo. Breve Descripción de las Figuras La Fig . 1 muestra una SDS-PAGE manchada de plata no reducida de las fracciones diferentes que provienen de la cromatografía del intercambio de catión descrita en el Ejemplo 2. Senda 1: Los marcadores de peso molecular, Senda 2: TACI-Fc purificado, Senda 3: carga, Senda 4: lavado 2, Senda 5: eluato 2, Senda 6: lavado 3, Senda 7: eluato 3, Senda 8: lavado 1, Senda 9: eluato 1, Senda 10: Fe purificado libre; La Fig. 2 muestra el perfil cromatográfico de la cromatografía del intercambio de catión descripto en el Ejemplo 2. Descripción Breve del Listado de Secuencias La SEC ID N°: 1 es una secuencia de la huella dactilar de la cisteína (seudo repetición rica en cisteína) común a los miembros de la superfamilia de TNFR; La SEC ID N° : 2 es la secuencia de largo total del receptor humano de TACI (por ejemplo, descripto en WO 98/39361); La SEC ID N°: 3 es un ejemplo de una secuencia humana de Fe de la invención (por ejemplo, descripta en WO 02/094852) ; La SEC ID N° : 4 es una proteína preferida de Fusión Fe de la invención, que comprende las secuencias derivadas de la porción extracelular de TACI y una porción IgGi humano (por ejemplo, descripta en WO 02/094852); La SEC ID N° : 5 es un polinucleótido que codifica para un polipéptido de la SEC ID N° 2: (por ejemplo, descripta en WO 02/094852) ; La SEC ID N°: 6 es un polinucleótido que codifica para un polipéptido de la SEC ID N° : 3 (por ejemplo, descripta en O 02/094852) ; La SEC ID N°: 7 es un polinucleótido que codifica para un polipéptido de la SEC ID N°: 4 (por ejemplo, descripta en WO 02/094852) . Descripción Detallada de la Invención La presente invención se basa en el desarrollo de un método de purificación para una proteina de fusión Fe terapéutica ejemplar, denominada TACI-Fc, teniendo como resultado una preparación sumamente purificada de TACI-Fc que es adecuada para la administración humana. Por lo tanto, en un primer aspecto, la invención se relaciona con un proceso para purificación de una proteina de fusión Fe, comprendiendo los pasos siguientes: (a) Someter un liquido que comprende la proteina de fusión Fe a la cromatografía de afinidad de la Proteína A o la Proteína G; (b) Someter el eluato del paso (a) a la cromatografía de intercambio de catión; (c) Someter el eluato del paso (b) a la cromatografía de intercambio de anión; y (d) Someter el flujo continuo del paso (c) a la cromatografía de Hidroxiapatita y recolectar el eluato para obtener la proteína de fusión Fe purificada.

En una modalidad de la invención, el método de purificación no contiene un paso de cromatografía de afinidad lectin, y en particular no comprende el paso de agarosa de aglutinina del germen del trigo. El método de la invención es usado para purificar una proteína de fusión Fe que tiene un pl en una gama que va de 6,9 a 9,5. El "punto isoeléctrico" o "pl" de una proteína es el pH al cual la proteína tiene una carga total neta igual a cero, es decir el pH en el cual, la proteína tiene un número igual de cargas positivas y negativas. La determinación del pl para alguna proteína dada, puede ser hecha según técnicas sólidas, tal como, por ejemplo, el enfoque isoeléctrico. El pl de la proteína de Fe Fusión para ser purificada de acuerdo con la presente invención, puede ser así, por ejemplo cualquiera de, 6,9, 6,95, 7,0, 7,05, 7, 1, 7,15, 7,2, 7,25, 7,3, 7,35, 7,4, 7,45, 7,5, 7,55, 7,6, 7,65, 7,7, 7,75, 7,8, 7,85, 7,9, 7,95, 8,0, 8,05, 8,1, 8,15, 8,2, 8,25, 8,3, 8,35, 8, 4, 8, 45, 8, 5, 8, 55, 8, 6, 8, 65, 8, 7, 8, 75, 8, 8, 8, 85, 8, 9, 8, 95, 9,0, 9,05, 9,1, 9,15, 9,2, 9,25, 9, 3, 9,35, 9,4, 9, 45, 9, 5. Preferiblemente, el pl de la proteína de fusión Fe para ser purificado de acuerdo con la presente invención es 8 a 9 o 8,0 a 9,0, más preferiblemente 8,3 a 8,6. El método de la invención es, preferiblemente, para purificar una proteína de fusión Fe terapéutica, es decir, una proteína de fusión Fe pensada para el tratamiento o la prevención de la enfermedad de un animal o, preferiblemente, para el tratamiento humano. Más preferiblemente, el método de la invención es para purificar una proteína de fusión Fe que comprende una porción extracelular de un miembro del superfamilia del receptor del factor de necrosis de tumor (TNFR) . La porción extracelular es preferiblemente un fragmento de enlace ligando de una parte o dominio extracelular del receptor respectivo. Una proteína preferida de fusión Fe que puede ser purificada de acuerdo con la invención une el ligando e inhibe o bloquea la función del ligando, por ejemplo la activación de receptor. El término "proteína de fusión Fe", como es usado en el presente documento, significa que abarca las proteínas, en particular las proteínas terapéuticas, comprendiendo una fracción de inmunoglobulina derivada, que será llamada en el presente documento la "Fracción Fe", y una fracción derivada de una segunda, proteína no-inmunoglobulina, que será llamada en el presente documento la "fracción terapéutica", sin tomar en consideración si se intenta o no el tratamiento de la enfermedad. El término "Fe libre", como es usado en el presente documento, significa que abarca cualquier parte de la proteína de fusión Fe para ser purificada de acuerdo con la presente invención, que es derivada de la parte de inmunoglobulina de la proteina de fusión Fe y no contiene una porción significativa de una fracción terapéutica de la proteina de fusión Fe. Por lo tanto, el Fe libre puede contener dimeros de una vinculación de IgG, los dominios CH2 y CH3, que no están enlazados ni unidos a porciones significativas de una fracción terapéutica, correspondiendo por ejemplo a la parte de Fe que es generada por la división de la papaina. Los monómeros derivados de la Fracción Fe, pueden ser contenidos también en la fracción libre de Fe. Es entendido que ese Fe libre puede contener todavía varios residuos de aminoácido de la fracción terapéutica, tal como por ejemplo uno a diez (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o 9) aminoácidos que pertenecen a la fracción terapéutica, fusionada a la Fracción-Fc. La Fracción Fe puede ser derivada de una inmunoglobulina humana o animal (Ig) que es preferiblemente un IgG. El IgG puede ser un IgGl , IgG2, IgG3 o IgG . Es preferible también que la Fracción Fe sea derivada de la cadena pesada de una inmunoglobulina, preferiblemente un IgG. Más preferiblemente, la Fracción Fe comprende una porción, tal como, por ejemplo, un dominio, la región constante de una inmunoglobulina de cadena pesada. Tal región constante Ig comprende preferiblemente, por lo menos, un Ig el dominio constante escogido de cualquier vínculo, dominio CH2, CH3, o de cualquier combinación de los mismos. Es preferible que la Fracción Fe comprenda, por lo menos, un dominio CH2 y CH3. Es aún más preferible que la Fracción Fe comprenda una región de vinculo IgG, el dominio CH2 y CH3. La proteina de fusión Fe de la invención puede ser un monómero o dímero. La proteina de fusión Fe puede ser también un seudo-dimero, conteniendo una Fracción Fe dimérica (por ejemplo, un dimero de dos constructos CH2-CH3 de vínculos disulfuro-puente) , de los cuales sólo uno es fusionado a una fracción terapéutica. La proteína de fusión Fe puede ser un heterodímero, conteniendo dos fracciones terapéuticas diferentes, o un homodímero, conteniendo dos copias de una sola fracción terapéutica . De acuerdo con la presente invención, la Fracción Fe puede ser modificada también con el fin de modular las funciones del efector. Por ejemplo las mutaciones siguientes de Fe, según el índice de posiciones de la UE (Kabat y colaboradores, 1991) , puede ser introducido si la Fracción Fe es derivada de IgGl: T250Q/M428L M252Y/S254T/T256E + H433K/N434F E233P/L234V/L235A/ AG236 + A327G/A330S/P331S E333A; K322A. Mutaciones adicionales de Fe por ejemplo pueden ser las sustituciones en las posiciones del índice de la UE escogidas desde 330, 331, 234, o 235, o las combinaciones de las mismas. Una sustitución del aminoácido en la posición del índice de la UE 297 localizado en el dominio CH2 puede ser introducido también en la Fracción Fe en el contexto de la presente invención, eliminando un sitio potencial de fijación del carbohidrato de Enlace-N. El residuo de cisteína en la posición del índice de la UE 220 puede ser reemplazado también con un residuo de serina, eliminando el residuo de cisteína que forma normalmente enlaces de disulfuro con la región constante de la cadena liviana de inmunoglobulina. De acuerdo con la presente invención, es preferible que la Fracción Fe comprenda o consista de la SEQ ID No: 3 o sea codificada por un polinucleótido que comprenda la SEQ ID No: 6. La fracción terapéutica de una proteína de Fusión Fe por ejemplo puede ser o es derivada de EPO, TPO, la Hormona del crecimiento, Interferón-Alfa, Interferón-Beta, Interferón-Gamma, La PDGF-BETA, VEGF, IL IL-lalfa, IL-lbeta, IL-2, IL-4, IL-5, IL-8, IL-10, IL-12, IL-18, proteína de unión IL-18, TGF-BETA, TNF-ALFA, o TNF-BETA. La fracción terapéutica de una proteína de Fusión Fe puede ser derivada también de un receptor, por ejemplo un receptor de transmembrana, preferiblemente es o está derivada del dominio extracelular de un receptor, y en particular de un ligando que se une al fragmento de la parte extracelular o el dominio de un receptor dado. Los ejemplos para los receptores de interés terapéutico son CD2, CD3, CD4, CD8, CDlla, CDllb, CD14, CD18, CD20, CD22, CD23, CD25, CD33, CD40, CD44, CD52, CD80, CD86, CD147, CD164, Receptor IL-2, Receptor IL-4, Receptor IL-6, receptor IL-12, subunidades del receptor IL-18 (IL-18R-alfa, receptor de EGF IL-18R-beta) , receptor de VEGF, integrin alfa 4 10 beta 7, integrin VLA4 , integrinos B2, receptores de TRAIL 1, 2, 3, y 4, ligando RA K, RANK, molécula epitelial de adhesión de célula (EpCAM) , molécula intercelular de adhesión-3 (ICAM-3), CTLA4 (que es un antigeno asociado del linfocito T citotóxico) , receptor Fe Gama I, receptor II o III, HLA-DR 10 beta, antigeno de HLA-DR, o L-selectin. Es altamente preferible que la fracción terapéutica sea derivada de receptor que pertenece a la superfamilia de TNFR. La fracción terapéutica, por ejemplo, puede ser o es derivada del dominio extracelular de TNFR1 (p55) , TNFR2 (p75) , 0X40, Osteoprotegerin, CD27, CD30, CD40, RANK, DR3, ligando de Fa, TRAIL-R1 , TRAIL-R2, TRAIL-R3 , TAIL-R4, NGFR, AITR, BAFFR, BCMA, TACI. De acuerdo con la presente invención, la fracción terapéutica derivada de un miembro de la superfamilia de TNFR comprende preferiblemente, o consiste en todo o en parte, del dominio extracelular del miembro del TNFR, y más preferiblemente comprende un ligando que se une al fragmento de tal miembro TNFR. La siguiente Tabla 5 lista los miembros de la superfamilia de TNFR de la que una fracción terapéutica de acuerdo con la presente invención, puede ser derivada, y sus ligandos respectivos. Un "ligando que se une al fragmento" de un miembro de la familia de TNFR puede ser determinado fácilmente por la persona hábil en el arte, por ejemplo en un ensayo sencillo in vitro que mida la unión entre el fragmento de la proteina de un receptor dado y el ligando respectivo. Tal ensayo, por ejemplo, puede ser un ensayo sencillo in vitro RIA o ELISA sándwich donde una de las proteínas, por ejemplo, el fragmento del receptor, es inmovilizado a un portador (por ejemplo, una placa ELISA) y se incuba, siguiendo el bloqueo adecuado de los sitios de unión de la proteína en el portador, con la segunda proteína, por ejemplo el ligando. Después de la incubación, se detecta la unión de ligando, por ejemplo, por la manera del etiquetado radioactivo del ligando y la determinación de la radioactividad unida, después de un lavado apropiado en un contador de centelleo. La unión del ligando puede ser determinada también con un anticuerpo marcado, o con un primer anticuerpo ligando-específico y un segundo, anticuerpo marcado dirigido contra la parte constante del primer anticuerpo. La unión del ligando así puede ser determinada fácilmente, dependiendo de la etiqueta usada, por ejemplo en una reacción de color. El bloqueo o inhibición de las funciones de unión del ligando puede ser probada mediante ensayos basados en células adecuadas. Preferiblemente, el método de la presente invención es para purificar una proteina de Fusión Fe que comprende una fracción terapéutica derivada de un miembro de la superfamilia de TNFR escogida de aquellos listados en la Tabla 5. Tabla 5: La superfamilia de TNFR (según Locksley y colaboradores, 2001 y Bossen y colaboradores, 2006) Miembro de la Ligando superfamilia TNFR NGFR NGF EDAR EDA-A1 XEDAR EDA-A2 CD40 CD40L Fas FasL Ox40 0X40L AITR AITRL GITR GITRL CD30 CD30L CD40 CD40L HveA LIGHT, LT-alfa Miembro de la Ligando superfamilia TNFR 4-1BB 4-1BBL TNFR2 TNF-alfa, LT-alfa, LT-alfa-beta LT-betaR LIGHT, LT-alfa, LT-alfa-beta DR3 TL1A CD27 CD27L TNFR1 TNF-alfa, LT-alfa, LT-alfa-beta LTBR LT-beta RANK RANKL TACI BlyS, APRIL BCMA BlyS, APRIL BAFF-R BAFF (= BlyS) TRAILR1 TRAIL TRAILR2 TRAIL TRAILR3 TRAIL TRAILR4 TRAIL Fnl4 TWEAK OPG RANKL, TRAIL DR4 TRAIL DR5 TRAIL DcRl TRAIL DcR2 TRAIL DcR3 FasL, LIGHT, TLlA En una modalidad preferida, la proteina de Fusión Fe comprende una fracción terapéutica escogida de un dominio extracelular de TNFR1, TNFR2, o un TNF que se une y opcionalmente inhibe al fragmento de la misma. En una modalidad aún más preferida, la proteina de Fusión Fe comprende una fracción terapéutica escogida de un dominio extracelular de BAFF-R, de BCMA, o de TACI, o un fragmento del mismo que une por lo menos uno de Blys o APRIL.

Un ensayo para probar la capacidad de la unión a Blys o APRIL se describe por ejemplo en Hymowitz y colaboradores, 2006. TACI es preferiblemente humana. La SEC ID N° : 2, que corresponde a la secuencia aminoácida del receptor TACI de largo total humano (también entrada SwissProt 014836) . Más preferiblemente, la fracción terapéutica comprende una porción soluble de TACI, preferiblemente derivada del dominio extracelular de TACI. Preferiblemente, la fracción terapéutica derivada de TACI comprende por lo menos los aminoácidos 33 a 67 de la SEC ID N°: 2 y/o los aminoácidos 70 a 104 de la SEC ID N°: 2. En una modalidad preferida, el dominio extracelular de TACI incluido en la fracción terapéutica, de acuerdo con la invención, comprende o consiste en los aminoácidos 1 a 166 de la SEC ID N° : 2, o los aminoácidos 30 a 166 de la SEC ID N° : 2, o los aminoácidos 30 a 119 de la SEC ID N° : 2, o los aminoácidos 30 a 110 de la SEC ID N°: 2. Todas esas fracciones terapéuticas son preferidas para la preparación de la proteina de Fusión Fe para que sea purificada por el método de la invención y se combine con las fracciones de Fe descriptas en detalle anteriormente, y en particular con una Fracción de Fe que comprende o consiste de la SEC ID N°: 3. Una proteina de Fusión Fe sumamente preferida para ser purificada de acuerdo con la presente invención comprende o consiste en la SEC ID N°: 4 o se codifica por el polinucleótido de la SEC ID N° : 7. Entonces, es altamente preferido que la proteina de Fusión Fe comprenda un polipéptido escogido de: a. los aminoácidos 34 a 66 de la SEC ID N°: 2 ; b. los aminoácidos 71 a 104 de la SEC ID N° : 2 ; c. los aminoácidos 34 a 104 de la SEC ID N°: 2 ; d. los aminoácidos 30 a 110 de la SEC ID N° : 2 ; e. SEC ID N° : 3; f . SEC ID N° : 4 ; g. Un polipéptido codificado por un polinucleótido que hibridiza al complemento de la SEC ID N°: 5 o 6 o 7 bajo condiciones sumamente rigurosas; y h. una muteina de cualquiera de (c) , (d) , (e) , o (f) que tiene por lo menos 80 % o 85 % o 90 % o 95 % de la identidad de la secuencia al polipéptido de (c) , (d) , (e) o (f); en donde el polipéptido se une a por lo menos uno de Blys o APRIL. En una modalidad aún más preferida, la proteina de fusión Fe comprende una región constante de cadena pesada de una inmunoglobulina , más preferiblemente una región constante humana. En una modalidad de la invención, la inmunoglobulina es un IgGl. Es preferible también que la región constante comprenda un vinculo, un dominio CH2 y CH3. En una modalidad adicional, la fracción terapéutica comprende la cisteina rica en seudo-repetición de la SEQ ID No. : 1. De acuerdo con la presente invención, un fluido que comprende una proteina de fusión Fe es primero sometido a la cromatografía de afinidad de la Proteína A o de la Proteína G. El fluido puede ser, preferiblemente, material del cultivo de la célula, por ejemplo células solubilizadas , más preferiblemente supernacientes del cultivo de la célula. El término "supernaciente de cultivo de la célula", tal como es usado en el presente documento, se refiere a un medio en el que las células son cultivadas y en cuál las proteínas son secretadas con la condición de que ellas contengan las señales celulares apropiadas, los así llamados péptidos de señal. Es preferible que la proteína de fusión Fe que expresa las células sea cultivada bajo condiciones de cultivo libres de suero. Así, preferiblemente, el supernaciente del cultivo de la célula está desprovisto de los componentes de los derivados del suero animal. Más preferiblemente, el cultivo de la célula es un medio químicamente definido. La Proteína A usada para la cromatografía de afinidad, por ejemplo, puede ser recombinante . Puede ser modificada también para mejorar sus propiedades (tal como por ejemplo en la resina llamada MabSelect SuRe, comercialmente disponible de la GE Healthcare) . En una modalidad preferida, el paso (a) es llevado a cabo en una resina que comprende agarosa reticulada modificada con la Proteína A recombinante. Una columna comercialmente disponible bajo el nombre Mabselect Xtra (De la GE Healthcare) es un ejemplo de una resina de afinidad que es especialmente adecuada para el paso (a) del método presente. La cromatografía de afinidad de la Proteína A o G es usada, preferiblemente, como un paso de captura, y así sirve para la purificación de la proteína de fusión Fe, en particular la eliminación de las proteínas de la célula huésped y de los agregados de proteína de Fusión Fe, y para la concentración de la preparación de la proteína de fusión Fe. El término "agregados", tal como es usado en el presente documento, significa que se refiere a los agregados de la proteína y abarca a los multímeros (tales como dímeros, tetrámeros o agregados de un orden más alto) de la proteína de fusión Fe para ser purificados y pueden resultar, por ejemplo, en agregados de alto peso molecular. La cromatografía de la afinidad tiene la ventaja adicional de reducir los niveles de agregado de 2 a 4 veces. Al usar la cromatografía de afinidad en las proteínas A y G, los niveles de la proteína de la célula huésped pueden ser reducidos de 100 a 300 veces, s En una modalidad preferida de la invención, la elusión en el paso (a) se lleva a cabo en un pH que oscila de 2,8 a 4,5, preferiblemente de 3,0 a 4,2, más preferiblemente en 3,5, 3,55, 3,6, 3, 65, 3,7, 3, 75, 3, 8, 3, 85, 3,9, 3, 95, 4,0, 4,05, 4,1, o 4,15. La elusión en el paso (a) puede ser llevada también a cabo con un gradiente de pH, preferiblemente un gradiente de pH 4,5 a 2,8. En una modalidad aún más preferida, la elusión en el paso (a) es llevada a cabo en un amortiguador escogido de acetato de sodio o citrato de sodio. Las concentraciones convenientes de amortiguador, por ejemplo, son escogidas de 50 mM o 100 mM o 150 m o 200 mM o 250 m . De acuerdo con la presente invención, el eluato de la Proteína A o la cromatografía de la Proteína G o la Proteína A/G o la Proteína L está sujeta a la cromatografía de intercambio de catión. La cromatografía de intercambio de catión puede ser llevada a cabo en una resina adecuada de intercambio de catión, tal como, por ejemplo, los intercambiadores de catión débiles o fuertes, tal como fue explicado más arriba en los Antecedentes de la Invención. Preferiblemente, el paso (b) es llevado a cabo en una resina de intercambio de catión fuerte. Más preferiblemente, el material de intercambio de catión comprende un metacrilato reticulado modificado con grupos S03. Una columna comercialmente disponible bajo el nombre Fractogel EMD S03 (de Merck) es un ejemplo de una resina de intercambio de catión que es especialmente adecuada para el paso (b) del método presente. Preferiblemente, el eluato da la Proteina A es cargado directamente en la columna de intercambio de catión. Es preferible que la carga sea llevada a cabo con un pH de, por lo menos, una unidad por debajo del pl de la proteina de fusión Fe a ser purificada. Aún más preferible es que después de cargar, la columna sea lavada con un amortiguador que tenga una conductividad de 6 a 10 mS/cm, por ejemplo a, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7, 9, 8, 8, 1, 8, 2, 8, 3, 8, 4, 8, 5, 8, 6, 8, 7, 8, 8, 8, 9, 9, 9, 1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, o 9,9. Más preferiblemente, una conductividad en la gama de 8,2 a 8,6, más preferiblemente 8,4 mS/cm. El paso de lavado es llevado preferiblemente a cabo en un pH en la gama de 5,5 a 7,5, preferiblemente de 6,0 a 7,0.

En una modalidad aún más preferida, la columna de intercambio de catión es eluidas a un pH en la gama de 7,0 a 8,5, preferiblemente 7,25 o 7,3 o 7,35 o 7,4 o 7,45 o 7,5 o 7,55 o 7,6 o 7,65 o 7,7 o 7,7 o 7,75 o 7,8 o 7,85 o 7,9 o 7,95 u 8,0 u 8,05 u 8,1 u 8,15 u 8,2 u 8,25 u 8,3 u 8,35 u 8,4 o 8,45 u 8,5. La elusión puede ser llevada, preferiblemente, a cabo en una conductividad en una gama de 15 a 22 mS/cm. Por ejemplo la conductividad puede ser escogida desde 16, 17, 18, 19, 20, 21, o 22 mS/cm. Un amortiguador preferido para el elusión es un amortiguador de fosfato. En una modalidad sumamente preferida, el paso (b) comprende los siguientes pasos posteriores: b. 1. Lavar la resina de intercambio de catión con un amortiguador que tiene un pH en una gama de 6,0 a 7,0 y una conductividad en una gama de 6 a 10 mS/cm; y b. 2. Eluir la columna a un pH en una gama de 7,0 a 8,5 y una conductividad en una gama de 15 a 22 mS/cm. Un amortiguador preferido para el paso (b.l) es de 75 a 125 mM de fosfato de sodio. Sorprendentemente, se ha encontrado en el marco de la presente invención que el paso (b) elimina eficientemente el Fe libre. Por lo tanto, de acuerdo con la presente invención, la cromatografía de intercambio de catión puede ser usada, preferiblemente, para la eliminación o la reducción del Fe libre en una gama de 5 a 15 veces. Ventajosamente, el paso (b) del método de la presente invención reduce también la concentración de ls proteínas de la célula huésped de la preparación de la proteína de fusión Fe, por ejemplo, en una gama de 1 a 2 veces, contribuyendo así, apreciablemente, a la eliminación de la proteína de la célula huésped (HCP) . De acuerdo con la presente invención, el eluato del paso de intercambio de catión es entonces sujeto a una cromatografía de intercambio de anión. La cromatografía de intercambio de anión puede ser llevada a cabo en una resina adecuada de intercambio de anión, tales como, por ejemplo, intercambiadores de anión débiles o fuertes, como fue explicado más arriba en los Antecedentes de la Invención. Preferiblemente, el paso (c) es llevado a cabo en una resina de intercambio de anión fuerte. Más preferiblemente la resina de intercambio de anión comprende poliestiren/divinil benceno modificado con N+(CH3)3. Una columna comercialmente disponible bajo el nombre SOURCE 30Q (de la GE Healthcare) es un ejemplo de una resina de intercambio de anión que es especialmente adecuada para el paso (c) del método presente.

Preferiblemente, el eluato de la cromatografía de intercambio de catión, es decir del paso (b) , es diluido o es dializado en un amortiguador apropiado de carga antes de cargarlo en la columna de intercambio de anión. La columna del intercambio de anión también es equilibrada preferiblemente con el amortiguador de la carga. Un pH preferido para el amortiguador de la carga es una unidad por debajo del pl. Los valores convenientes del pH oscilan de 6,0 a 8,5, preferiblemente de 7,0 a 8,0, por ejemplo 7,0, 7,05, 7,1, 7,15, 7,2, 7,25, 7,3, 7,35, 7,4, 7,45, 7,5, 7,55, 7,6, 7,65, 7,7, 7, 75, 7,8, 7, 85, 7,9, 7, 95, o 8,0. Una conductividad preferida para el amortiguador de la carga está en la gama de 3,0 a 4,6 mS/cm. Un amortiguador apropiado de equilibrio/carga, por ejemplo, puede ser fosfato de sodio en una concentración que oscila de 5 a 35, preferiblemente de 20 a 30 mM. La concentración del amortiguador por ejemplo puede estar en 10, 15, 20, 25, 30 mM. En el marco de la presente invención, se recolecta el flujo continuo (llamado también retro-transmisión) de cromatografía de intercambio de anión, que comprende la proteína de fusión Fe de interés. El paso (c) del método de la invención reduce aún más los agregados 3 a 5 veces y las proteínas de la célula huésped 30 a 70 veces. Dé un paso (c) del método de la invención reduce aún más agregados de 3 a 5 veces y proteínas de célula huésped de 30 a 70 veces. De acuerdo con la presente invención, el flujo continuo de la cromatografía de intercambio de anión del paso (c) entonces es usado para la purificación adicional por la cromatografía de hidroxiapatita . Cualquier resina de hidroxiapatita puede ser usada para llevar cabo el paso (D) del método de acuerdo con la invención. En una modalidad preferida, el paso (d) es llevado a cabo en una resina de hidroxiapatita cerámica de hidroxiapatita de Tipo 1 ó 2. La resina de hidroxiapatita puede tener las partículas de cualquier tamaño tal como 20, 40 o 80 µ?. En una modalidad sumamente preferida, la resina cerámica de hidroxiapatita comprende las partículas que tienen un tamaño de 40 µ?. Una resina de hidroxiapatita que es especialmente adecuada para el paso (d) del método presente es una columna comercialmente disponible bajo el nombre Hidroxiapatita CHT de tipo 1, de 40 µ?. En una modalidad preferida, el flujo continuo del paso (c) es cargado directamente en la resina de hidroxiapatita, es decir sin la dilución o la diálisis previos en un amortiguador apropiado de la carga. La carga es llevada preferiblemente a cabo en un pH de 6,5 a 7,5, tal como 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,1, 7,2, 7,3, o 7,4, y preferiblemente 7,0. En una modalidad aún más preferida, la elusión en el paso (d) es llevado a cabo en la presencia de fosfato de sodio de 2 a 10 mM, preferiblemente entre 1,75 a 5,25 mM, tal como por ejemplo en 2, 2,25, 2,5, 2.75, 3, 3,25, 3,5, 3,75, 4, 4,25, 4,5, 4,75, 5.

En otra modalidad aún más preferida, la elusión en el paso (d) es llevado a cabo en un pH en una gama de 6,0 a 7,0, por ejemplo en 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9. En otra modalidad preferida, la elusión en el paso (d) es llevado a cabo en la presencia de cloruro de potasio de 0,4 a 1 M, preferiblemente entre 0,45, 0,5, 0,55, 0,6, 0,65, 0,7, 0,75, 0,8, 0,85, 0,9, 0,95 M, más preferiblemente en 0,6 M. De acuerdo con la presente invención, el eluato del paso (d) es recolectado, conteniendo la preparación finalmente purificada de la proteina de fusión Fe. Los materiales adecuados de la matriz, es decir los materiales del portador para las resinas cromatográficas usados en los pasos (a) a (c) , que pueden ser usados con respecto a la presente invención por ejemplo puede ser la agarosa (sefarosa, superosa) dextran (sephadex), el polipropileno, metacrlato celulosa de, poliestireo/divinil benceno, o lo similar. Los materiales de la resina pueden estar presentes en formas reticuladas diferentes, dependiendo del uso especifico. El volumen de la resina, la longitud y el diámetro de la columna para ser usados, asi como la capacidad dinámicas y la tasa del flujo dependen de varios parámetros tales como el volumen del liquido a ser tratado, la concent ación de la proteina en el liquido para ser sujeta al proceso de la invención, etc. La determinación de estos parámetros para cada paso está bien dentro de las habilidades medias de una persona hábil en el arte. En una modalidad preferida del proceso presente de purificación, uno o más pasos de ultra-filtración son realizados. La ultra-filtración es útil para la eliminación de pequeñas moléculas orgánicas y sales en los eluatos que resulta de los pasos cromatrográficos previos, para equilibrar la proteina de fusión Fe en el amortiguador a granel, o para concentrar la proteina de fusión Fe a la concentración deseada. Tal ultrafiltración por ejemplo puede ser realizada en membranas de ultrafiltración, con tamaños de poro que permitan la eliminación de los componentes que tiene pesos moleculares por debajo de 5, 10, 15, 20, 25, 30 o más kDa. Preferiblemente, la ultra-filtración es llevada a cabo entre los pasos (b) y (c) , y/o después del paso (d) . Más preferiblemente, se llevan a cabo dos pasos de ultra-filtración, uno entre los pasos (b) y (c) y uno después del paso (D) . Si la proteina purificada según el proceso de la invención es pensada para la administración a humanos, es ventajoso incluir uno o más pasos de eliminación del virus en el proceso. Preferiblemente, un paso de filtración de eliminación de virus se lleva a cabo después del paso (d) .

Más Preferiblemente, el paso de filtración de eliminación de virus es un paso de nano-filtración donde el filtro tiene un tamaño nominal de poro de 20nm. El método de la presente invención, y en particular los pasos particulares (a) , (c) , (d) en combinación con la nano-filtración eliminan eficientemente la carga del virus a un LRV combinado (el valor de la reducción log) hasta aproximadamente 15 a 25. Para facilitar el almacenamiento o transporte, por ejemplo el material puede ser congelado y puede ser descongelado antes y/o después de cualquier paso de purificación de la invención. De acuerdo con la presente invención, la proteina de fusión Fe recombinante puede ser producida en sistemas de expresión eucariótica, tal como la levadura, la célula de insecto, o de los mamíferos, teniendo como resultado las proteínas que contiene Fe glicosiladas . De acuerdo con la presente invención, es más preferido que se exprese la proteína de fusión Fe en las líneas de células mamíferas tales como las líneas de células de animal, o en las líneas de células humanas. Las células de hámster de ovario del hámster chino (CHO) o las líneas de célula de mieloma de ratón NSO son ejemplos de las líneas de célula que son especialmente convenientes para la expresión de la proteína de fusión Fe para ser purificado. La proteína de fusión Fe también puede ser producida preferiblemente en líneas humanas de célula, tales como, por ejemplo la línea humana de célula fibrosarcoma HT1080, la línea PERC6 célula retinoblastoma humana, o la línea de célula de ' riñon embriónica 293 humana, o una línea de célula permanente de amniocito descrita por ejemplo en EP 1 230 354 . Si la proteína de fusión Fe para ser purificada es expresada por las células mamíferas que la secretan, el material que empieza el proceso de purificación de la invención es el superpaciente del cultivo de célula, también llamada cosecha o cosecha cruda. Si las células son cultivadas en un medio que contiene suero animal, el supernaciente del cultivo de célula contiene también las proteínas del suero como las impurezas. Preferiblemente, la proteína de fusión Fe que expresa y secreta las células se cultiva bajo condiciones libres de suero. La proteína de fusión Fv puede ser producida también en un medio químicamente definido. En este caso, el material de inicio del proceso de purificación de la invención es el supernaciente del cultivo de célula libre de suero que contiene principalmente las proteínas de la célula huésped como las impurezas. Si los factores del crecimiento se añaden al medio del caldo de cultivo de la célula, tal como la insulina, por ejemplo, estas proteínas serán eliminadas durante el proceso de purificación también. Para crear la proteína soluble y secretada que contiene Fe, que se libera en el superpaciente del cultivo de célula, se usa el péptido de señal natural de la fracción terapéutica de la porteina de fusión Fe o preferiblemente un péptido de señal heterólogo, es decir un péptido de señal derivado de otra proteina secretada que es eficiente en el sistema particular de expresión usado, tal como por ejemplo el péptido bovino o humano de señal de Hormona del crecimiento, o el péptido de señal de inmunoglobulina . Como se mencionara anteriormente, una proteina preferida que contiene Fe para ser purificada de acuerdo con la presente invención es una proteina de fusión que tiene una fracción terapéutica derivada de TACI humano (SEC ID N°: 2), y en particular un fragmento derivado de su dominio extracelular (aminoácidos 1 a 165 de la SEC ID N°: 2). Un fragmento preferido comprende los aminoácidos 30 a 110 de la SEC ID N°: 2. En los siguientes, las fracciones terapéuticas derivadas del dominio extracelular de TACI se denominarán "TACI solubles "o "sTACI". Una Fracción de Fe preferida comprende la SEC ID N°: 3, teniendo como resultado una proteina de fusión Fe de acuerdo con la SEC ID N° : 4, llamada TACI-Fc. El término TACI-Fc, como se utiliza en la presente, también abarca las muteinas de TACI-Fc. El término "muteinas", como se usa en la presente, se refiere a los análogos de sTACI o TACI-Fc, en los cuales uno o más residuos de aminoácido de sTACI o TACI-Fc es reemplazado por residuos de aminoácidos diferentes, o se elimina, o uno o más residuos de aminoácido se añaden a la secuencia original de sTACI o TACI-Fc sin cambiar considerablemente la actividad de los productos resultantes como comparado con sTACI o TACI-Fc original. Estas luteinas se preparan por la síntesis conocida y/o por técnicas de mutagénesis de sitio dirigido, o por cualquier otra técnica conocida conveniente por lo tanto. Las muteínas de acuerdo con la presente invención incluyen las proteínas codificadas por un ácido nucleico, tal como el ADN o el RNA, que hibridiza al complemento de un ADN o el RNA, que codifica un sTACI o TACI-Fc según cualquiera de la SEC ID N°: 2 o 4 bajo condiciones rigurosas. Un ejemplo para una secuencia de ADN que codifica un TACI-Fc es la SEC ID N°: 7. El término las "condiciones rigurosas" se refieren a las condiciones de hibridación y de lavado subsiguientes, que aquellas personas con habilidad ordinaria en el arte convencionalmente refieren como "rigurosas". Vea Ausubel y colaboradores, Current Protocols in Molecular Biology, supra, Interscience, N.Y., §§6,3 y 6,4 (1987, 1992). Sin limitación, los ejemplos de las condiciones rigurosas incluyen las condiciones de lavado de 12-20°C debajo de la Tm calculada del híbrido bajo el estudio en, por ejemplo, 2 x SSC y 0,5% de SDS durante 5 minutos, 2 x SSC y 0,1% SDS durante 15 minutos; 0,1 x SSC y 0,5% SDS a 37°C durante 30-60 minutos y entonces, un 0,1 x SSC y 0,5% SDS a 68°C durante 30-60 minutos. Aquellas personas de habilidad ordinaria en esta arte entienden que esas condiciones de rigor dependen también de la longitud de las secuencias de ADN, las sondas oligonucleotidas (tal como las bases 10-40) o las sondas de oligonucleótido mezcladas. Si las sondas mezcladas se usan, es preferible usar cloruro tetrametil amónico (TMAC) en vez de SSC. Vea Ausubel, supra. En otra modalidad, por lo tanto, cualquiera de tales muteinas tiene por lo menos 50 %, por lo menos 60 %, por lo menos 70 %, por lo menos 75 %, por lo menos 80%, por lo menos 85 %, por lo menos 90%, o por lo menos 95 % de identidad o de homología. La identidad refleja una relación entre dos o más secuencias de polipéptido o dos o más secuencias de polinucleótido, determinado comparando las secuencias. En general, la identidad se refiere a un nucleótido exacto al nucleótido o un aminoácido al correspondiente aminoácido de dos polinucleótidos o dos secuencias de polipéptido, respectivamente, sobre la longitud de las secuencias a ser comparadas . Para las secuencias donde no hay una correspondencia exacta, un "porcentaje de identidad" puede determinarse. En general, las dos secuencias para ser comparadas son alineadas para dar una correlación máxima entre las secuencias. Esto puede incluir los "espacios" en una o en ambas secuencias, para mejorar el grado de la alineación. Un % de identidad puede ser determinado sobre la longitud entera de cada una de las secuencias a ser comparadas (la asi llamada alineación global) , lo cual es especialmente conveniente para las secuencias de la misma longitud o muy semejante, o sobre longitudes más cortas y definidas (la asi llamada alineación local) , que es más adecuada para las secuencias de largo no igual . Los métodos para comparar la identidad y la homología de dos o más secuencias son bien conocidas en la técnica. Así por ejemplo, los programas disponibles en el Paquete del Análisis de la Secuencia de Wisconsin, versión 9,1 (Devereux J y colaboradores, 1984), por ejemplo los programas BESTFIT y GAP, pueden ser usados para determinar el % de identidad entre dos polinucleótidos y el % de identidad y el % de homología entre dos secuencias del polipéptido. BESTFIT usa el algoritmo de "homología local" de Smith y aterman (1981) y encuentra la única mejor región de similitud entre dos secuencias. Otros programas para determinar la identidad y/o la similitud entre las secuencias son conocidos también en la técnica, por ejemplo la familia de BLAST de los programas (Altschul S F y colaboradores, 1990, de Altschul F S y colaboradores, 1997, accesible por la página de bienvenida del NCBI en www.ncbi.nlm.nih.gov) y FASTA (Pearson W R, 1990) . Cualquiera de tales muteinas tiene, preferiblemente, una secuencia de aminoácidos suficientemente duplicada de sTACI o TACI-Fc, tal como para tener una actividad de unión ligando substancialmente semejante como una proteina de la SEQ No: 2 o 4. Por ejemplo una actividad de TACI es su capacidad de unión a Blys o APRIL (Hymowitz y colaboradores, 2006) . Considerando que la muteina tiene una substancial actividad de unión APRIL o Blys, pueden considerarse que tiene una actividad substancialmente semejante a TACI. Por lo tanto, puede determinarse fácilmente, por una persona hábil en la técnica, si cualquier muteina dada tiene substancialmente la misma actividad que una proteina de la SEQ ID No.: 2 o 4 por medio de una experimentación rutinaria. Los cambios preferidos para las muteinas de acuerdo con la presente invención son lo que se conoce como sustituciones "conservadoras". Las sustituciones conservadoras de aminoácidos de sTACI o TACI-Fc, pueden incluir aminoácidos sinónimos dentro de un grupo que tiene propiedades fisicoquímicas suficientemente semejantes de que la sustitución entre miembros del grupo preservará la función biológica de la molécula (Grantham, 1974). Es claro que las inserciones y las supresiones de aminoácidos pueden ser hechas también en las secuencias arriba definidas sin alterar su función, especialmente si las inserciones o las supresiones sólo implican unos pocos aminoácidos, por ejemplo, abajo de treinta, abajo de veinte, o preferiblemente abajo de diez, y no quitan o desplazan aminoácidos que son críticos a un conformación funcional, por ejemplo, residuos de cisteína. Las proteínas y muteinas producidas por tales supresiones y/o inserciones están dentro del alcance de la presente invención . Preferiblemente, los grupos conservadores de aminoácido son aquellos definidos en la Tabla 2. Más preferiblemente, los grupos sinónimos de aminoácidos son aquellos definidos en la Tabla 3; y aún más preferiblemente los grupos sinónimos de aminoácidos son aquellos definidos en la Tabla 4. TABLA 2 Los Grupos preferidos de Aminoácidos Sinónimos Aminoácido Grupci sinónimo Ser Ser, Thr, Gly, Asn Arg Arg, Gln, Lys, Glu, His Leu lie, Phe, Tyr, Met, Val, Leu Pro Gly, Ala, Thr, Pro Thr Pro, Ser, Ala, Gly, His, Gln, Ala Gly, Thr, Pro, Ala Val Met, Tyr, Phe, lie, Leu, Val Gly Ala, Thr, Pro, Ser, Gly lie Met, Tyr, Phe, Val, Leu, lie Phe Trp, Met, Tyr, lie, Val, Leu, Phe Tyr Trp, Met, Phe, lie, Val, Leu, Tyr Cys Ser, Thr, Cys His Glu, Lys, Gln, Thr, Arg, His Gln Glu, Lys, Asn, His, Thr, Arg, Gln Asn Gln, Asp, Ser, Asn Lys Glu, Gln, His, Arg, Lys Asp Glu, Asn, Asp Glu Asp, Lys, Asn, Gln, His, Arg, Glu Met Phe, lie, Val, Leu, Met Trp Trp TABLA 3 Los Grupos más Preferidos de Aminoácidos Sinónimos Aminoácido Grupo sinónimo Ser Ser Arg His, Lys, Arg Leu Leu, lie, Phe, Met Pro Ala, Pro Thr Thr Ala Pro, Ala Val Val, Met, lie Gly Gly lie lie, Met, Phe, Val, Phe Met, Tyr, lie, Leu, Tyr Phe, Tyr Cys Cys, Ser His His, Gln, Arg Gln Glu, Gln, His Asn Asp, Asn Lys Lys, Arg Asp Asp, Asn Glu Glu, Gln Met Met, Phe, lie, Trp Trp TABLA 4 Los Grupos más Preferidos de Aminoácidos Sinónimos Aminoácido Grupo sinónimo Ser Ser Arg Arg Leu Leu, lie, Met Pro Pro Thr Thr Ala Ala Val Val Gly Gly lie lie, Met, Leu Phe Phe Tyr Tyr Cys Cys, Ser His His Gln Gln Asn Asn Lys L Asp Asp Glu Glu et Met, lie, Leu Trp Met Un derivado funcional puede ser preparado de una proteina purificada de la Fusión-Fc de acuerdo con la presente invención. Los "derivados funcionales" usados como en el presente documento cubren derivados de la proteina de fusión Fe para ser purificados de acuerdo con la presente invención, o que pueden ser preparados de los grupos funcionales que ocurren como cadenas laterales en los residuos o en los grupos N- o C-terminal, por medios conocidos en la técnica, y son incluidos en la invención mientras que ellos permanezcan farmacéuticamente aceptables, es decir ellos no destruyen la actividad de la proteina la que es substancialmente semejante a la actividad de la porteina de fusión Fe inmodificada tal como fue definido más arriba, y no confiere propiedades tóxicas a las composiciones que lo contienen. Los derivados funcionales de una porteina de fusión Fe, por ejemplo, pueden ser conjugados a polímeros para mejorar las propiedades de la proteína, tal como la estabilidad, la vida media, bio-disponibilidad, la tolerancia por el cuerpo humano, o por inmuno-genecidad. Para lograr esta meta, TACI-Fc puede ser ligada por ejemplo al polietilenglicol (PEG). La PEGilación puede ser llevada a cabo por métodos conocidos, descritos, por ejemplo, en la patente WO 92/13095. Los derivados funcionales pueden también, por ejemplo, incluir ésteres alifáticos de los grupos carboxilo, amidas de los grupos carboxilo por la reacción con amoniaco o con aminas primarias o secundarias, los derivados de N-acilo de grupos libres de amino de los residuos de aminoácido formados con fracciones de acilo (por ejemplo, grupos alcanoil o grupos aroilo carbocíclico ) o los derivados O-acilo de grupos libres de hidroxilo (por ejemplo aquellos residuos de serilo o treonilo) formado con fracciones de acilo. En un tercer aspecto, la invención se relaciona con una proteína purificada por el proceso de purificación de acuerdo con la invención. En lo siguiente, tal proteína es llamada también "proteína de fusión Fe purificada". Tal proteína purificada que contiene Fe preferiblemente es una proteína altamente purificada conteniendo Fe. La proteína sumamente purificada de la Fusión-Fc es determinada, por ejemplo, por la presencia de una sola banda en un gel manchado de plata y gel de PAGE SDS no-reducido después de cargar la proteína con una cantidad de 2 meg por senda. La proteína purificada de la Fusión-Fc puede ser definida también como eluyendo como un solo pico en HPLC. La preparación de la proteína de fusión Fe obtenida del proceso de purificación de la invención puede contener menos del 20 por ciento de impurezas, preferiblemente menos del 10 por ciento, 5 por ciento, 3 por ciento, 2 por ciento o 1 por ciento de impurezas, o puede ser purificado a homogeneidad, es decir estar libre de cualquier contaminante proteinoso perceptible, tal como se determinan por ejemplo, por manchado de plata SDS-PAGE o HPLC, como fue explicado más arriba. La proteína purificada que contiene Fe puede ser pensada para uso terapéutico, en particular para la administración a pacientes humanos. Si la proteína purificada que contiene Fe es administrada a pacientes, es administrado, preferiblemente, en forma sistémica, y preferiblemente subcutáneamente o intramuscularmente, o tópicamente, es decir localmente. La administración rectal o intratecal puede ser también conveniente, dependiendo del uso médico específico de la proteína purificada que contiene Fe. Para este fin, en una modalidad preferida de la presente invención, la proteína purificada que contiene Fe puede ser formulada en una composición farmacéutica, es decir junto con un portador f rmacéuticamente aceptable, excipientes o lo similar . La definición "farmacéuticamente aceptable" significa que abarca cualquier portador, que no interfiere con la eficacia de la actividad biológica del ingrediente activo y que no es tóxico para el huésped al que es administrado. Por ejemplo, para la administración parenteral, la(s) proteina(s) activa (s) puede (n) ser formulada (s) en una forma de dosis unitaria para inyectar en vehículos tales como salina, solución de dextrosa, albúmina de suero y solución de Ringer.

Los ingredientes activos de la composición farmacéutica de acuerdo con la invención pueden ser administrados a un individuo en una variedad de maneras. Las rutas de la administración incluyen las rutas intradérmica, la transdérmica (por ejemplo, en formulaciones de liberación lenta), intramuscular, intraperitoneal , intravenosa, subcutánea, oral, intracraneal, epidural, tópico, rectal, e intranasal. Cualquier otra ruta terapéuticamente eficaz de la administración puede ser usada, por ejemplo, la absorción a través de los tejidos epiteliales o endoteliales o por la terapia génica en donde una molécula de ADN que codifica al agente activo es administrada al paciente (por ejemplo, vía un vector) , que causa que el agente activo sea expresado y secretado in vivo. Además, la(s) proteína (s) de acuerdo con la invención puede (n) ser administrada ( s ) junto con otros componentes de agentes biológicamente activos, tales como surfactantes farmacéuticamente aceptables, excipientes, portadores, diluyentes y vehículos.

Para la administración parenteral (por ejemplo, intravenosa, subcutánea, intramuscular) , la proteina activa (s) puede (n) ser formulada (s) como una solución, suspensión, emulsión o polvo liofilizado conjuntamente con un vehículo parenteral farmacéuticamente aceptable (por ejemplo, agua, salina, solución de dextrosa) y los aditivos que mantienen la isotonicidad (por ejemplo, manitol) o la estabilidad química (por ejemplo, conservantes y amortiguadores) . La formulación es esterilizada mediante técnicas utilizadas comúnmente. Las cantidades terapéuticamente efectivas de la(s) proteína (s) activa (s) será una función de muchas variables, inclusive el tipo de la proteína de fusión Fe, la afinidad de la proteína de fusión Fe para su ligando, la ruta de administración, la condición clínica del paciente. Una "cantidad terapéuticamente efectiva" es aquella que cuando es administrada, la porteína de fusión Fe tiene como resultado la inhibición de su ligando de la fracción terapéutica de la proteína de Fusión-Fc, como fue explicado más arriba y refiriéndonos especialmente a la Tabla 5 de más arriba . La dosis administrada, como dosis únicas o múltiples, a un individuo, variarán dependiendo de una variedad de factores, inclusive de las propiedades farmacocinéticas de la proteína de Fusión-Fc, la ruta de administración, las condiciones de paciente y sus características (el sexo, la edad, el peso, la salud, la estatura) , la extensión de los síntomas, los tratamientos concurrentes, la frecuencia del tratamiento y el efecto deseado. El ajuste y la manipulación de las gamas establecidas de dosis están bien dentro de la capacidad de aquellas personas hábiles en la técnica, así como también los métodos in vitro e in vivo para determinar la inhibición de su ligando natural de la fracción terapéutica en un individuo. La proteína purificada que contiene Fe puede ser usada en una cantidad de 0,001 a 100 mg/kg o 0,01 a 10 mg/kg del peso corporal, o de 0,1 a 5 mg/kg de peso corporal o de 1 a 3 mg/kg de peso corporal o de 2 mg/kg de peso corporal. En modalidades aún más preferidas, la proteína purificada que contiene Fe es administrada a diario o cada dos días o tres veces a la semana o una vez a la semana. Las dosis diarias son, generalmente, dadas como dosis divididas o en forma de liberación prolongada, efectiva para obtener los resultados deseados. Las segundas o subsiguientes administraciones pueden ser realizadas en una dosis que sea la misma, menor que o mayor que la inicial o la dosis previa administrada al individuo. Una segunda o subsiguiente administración puede ser administrada durante o antes del comienzo de la enfermedad. La presente invención se relaciona también con una composición purificada de la proteina de fusión Fe que comprende una porción extracelular de un miembro de la superfamilia del receptor del factor de necrosis de tumor (TNFR) obtenida mediante un método de acuerdo con la invención tal como el descrito con todo detalle más arriba, en donde la composición comprende menos del 2 por ciento o menos del 1,5 por ciento o menos del 1 por ciento o menos del 0,7 por ciento o menos del 0,6 por ciento o preferiblemente menos del 0,5 de Agregados de proteina. La composición de la invención comprende preferiblemente una proteina completamente intacta de fusión Fe que no pierda más de 1 o 2 aminoácidos en su TERMINAL N- o C-, y más preferiblemente que no pierda ningún aminoácido en su TERMINAL N- o C- . La presente invención se relaciona además con una composición purificada de la proteina de fusión Fe que comprende una porción extracelular de un miembro de la superfamilia del receptor del factor de necrosis de tumor (TNFR) obtenida mediante un método de acuerdo con la invención, en donde la composición comprenda menos del 1 por ciento o menos del 0,8 por ciento o menos del 0,5 por ciento o menos del 0,1 por ciento del Fe libre definido más arriba.

Tal proteina de fusión Fe, por ejemplo, puede ser derivada de OX40, un miembro de la superfamilia TNFR. Tales proteínas de función OX40, por ejemplo, la OX40-IgGl y la OX40-hIG4 Mut, puede ser usada, preferiblemente, para el tratamiento y/o la prevención de enfermedades inflamatorias y las autoinmunes tal como la Enfermedad de Crohn. La proteina de fusión Fe que comprende una fracción terapéutica es escogida preferiblemente de un dominio extracelular de TNFR1, TNFR2, o un fragmento de unión TNF del mismo . En una modalidad preferida, tal proteina de fusión Fe es Etanercept, una proteina de fusión Fe que contiene la parte soluble del TNFR p75 (por ejemplo, en las patentes WOWO91/03553, 94/06476) . El etanercept purificado de acuerdo con la invención puede ser usado por ejemplo para el tratamiento y/o la prevención de la Endometriosis , la infección de virus de la Hepatitis C, la infección de HIV, la artritis soriática, la soriasis, el reuma articular, el Asma, la espondilitis anquilosante, la falla Cardiaca, el injerto contra la enfermedad del huésped, la fibrosis Pulmonar, la enfermedad de Crohn. La lenercept es una proteina de fusión que contiene los componentes extracelulares del receptor humano de TNF p55 y la porción Fe del IgG humano, y es pensado para el tratamiento potencial de las sepsis y de las esclerosis múltiples severas. En una modalidad aún más preferida, la proteina de fusión Fe comprende una fracción terapéutica escogida de un dominio extracelular de BAFF-R, de BCMA, o de TACI, o un fragmento de los mismos uniendo, por lo menos, a uno de Blys O APRIL. Una proteina de fusión Fe derivada de la BAFF-R, purificada de acuerdo con la presente invención, puede ser usada preferiblemente para el tratamiento y/o la prevención de enfermedades autoinmunes tales como el reuma articular (RA) y la eritematosis de lupus sistémica (SLE) . Una proteina de fusión de BCMA-Ig, purificada de acuerdo con la presente invención, puede ser usada, preferiblemente, para el tratamiento y/o la prevención de las enfermedades autoinmunes . Una proteina de fusión Fe derivada de TACI (TACI-Fc) comprende preferiblemente un polipéptido escogido de: a. Los aminoácidos 34 a 66 de SEQ ID No.: 2; b. Los aminoácidos 71 a 104 de SEQ ID No.: 2; c. Los aminoácidos 34 a 104 de SEQ ID No.: 2; d. Los aminoácidos 30 a 110 de SEQ ID No. : 2; e. SEQ ID No. : 3; f . SEQ ID No. : 4 ; g. Un polipéptido codificado por un polinucleotido que hibridiza al complemento de la SEQ ID No. : 5 o 6 o 7 bajo condiciones sumamente rigurosas; y h. Una muteína de cualquiera de (c) , (d) , (e) , o (f) teniendo por lo menos un 80 por ciento o 85 por ciento o un 90 por ciento o un 95 por ciento de la secuencia de identidad al polipéptido de (c) , (d) , (e) o (f); en donde el polipéptido une a, por lo menos, uno de Blys o APRIL. La TACI-Fc purificada puede ser usada, preferiblemente, para la preparación de un medicamento para el tratamiento y/o la prevención de varias enfermedades o desórdenes. Tales enfermedades o desórdenes son escogidos, preferiblemente, de los desórdenes autoinmunes tales como el lupus eritematoso sistémico (SLE) , el reuma articular (RA) , asi como para el tratamiento de la esclerosis múltiple (MS) . La TACI-Fc purificada puede ser usada también para el tratamiento del cáncer, las afecciones hematológicas tales como el mieloma múltiple (MM) y/o el linfoma no-Hodgkin (NHL) , la leucemia linfocitica crónica (CLL) y la macroglobulemia de Waldenstrom (WM) . Ahora, habiendo descrito completamente esta invención, será apreciado por aquellas personas hábiles en la técnica que la misma puede ser realizada dentro de una gran variedad de parámetros equivalentes, concentraciones y condiciones sin apartarse del espíritu y el alcance de la invención y sin una experimentación indebida. Mientras que esta invención ha sido descrita con respecto a modalidades específicas de la misma, será entendido que es capaz de modificaciones adicionales. Esta solicitud es pensada como para cubrir cualesquiera variaciones, usos o adaptaciones de la invención, siguiendo, en general, los principios de la invención e incluyendo tales salidas de la revelación presente como pudiesen surgir dentro de la práctica conocida o acostumbrada dentro de la técnica a la cual la invención pertenece y puede ser aplicada a las características esenciales aquí en el presente anteriormente establecidas como sigue dentro del alcance de las reivindicaciones del apéndice. Todas las referencias citadas en el presente documento, incluyendo los artículos de revistas o resúmenes, solicitudes de patentes de los Estados Unidos de Norte América o extranjeras publicadas o no publicadas, las patentes emitidas de los Estados Unidos de Norte América o extranjeras o cualesquiera otras referencias, están incorporados enteramente para referencia en el presente documento, inclusive todos los datos, las tablas, las figuras y el texto presentados en las referencias citadas. Adicionalmente, el contenido entero de las referencias citadas dentro de las referencias citadas en el presente documento también está incorporado enteramente para referencia. La referencia a pasos de método conocidos, los pasos de métodos convencionales, los métodos conocidos o los métodos convencionales no son de ninguna manera una admisión que algún aspecto, descripción o modalidad de la presente invención sea revelada, enseñada o sugerida en la técnica pertinente.

La descripción que antecede de las modalidades especificas, asi, revelarán completamente la naturaleza general de la invención, que otros pueden, aplicando los conocimientos dentro de la habilidad de la técnica (incluyendo el contenido de las referencias citadas en el presente documento), modificar fácilmente y/o adaptar para varias aplicaciones tales modalidades especificas, sin una experimentación indebida, sin apartarse del concepto general de la presente invención. Por lo tanto, tales adaptaciones y modificaciones son pensadas como para estar dentro del significado de una gama de equivalentes de las modalidades reveladas, basado en la enseñanza y guia presentadas en el presente documento. Debe ser entendido que la fraseología o la terminología en el presente documento son para el propósito de descripción y no de limitación, tanto que la terminología o fraseología de la memoria descriptiva presente sean interpretadas por el artesano hábil a la luz de las enseñanzas y la guía presentadas en el presente documento, en combinación con el conocimiento de una persona de habilidad común en la técnica. EJEMPLOS : PURIFICACION DE TACI-Fc HUMANO RECOMBINANTE DEL SUPERNACIENTE DE LA CELULA CHO LIBRE DE SUERO Glosario BV: Volumen de cama CHO: Ovario de Hámster chino DSP: Proceso corriente descendente EDTA: Acido Tetraacético de etilendiamina ELISA: Ensayo de InmunoSorbente enlace de enzima HAC: Cromatografía de Hidroxiapatita HCP: Proteína de Célula huésped HPLC: Cromatografía Líquida de alto Desempeño id: diámetro interno K: potasio KD: Kilo Dalton MES: Ácido 2-Morfolinetanosulfónico Na: Sodio NaAc: Acetato de sodio N/D: No determinado PA-SE-HPLC: Cromatografía Líquida de Alto Desempeño de Exclusión Medida de la proteína A Ppm: Partes por millón RO: Osmosis inversa RT: Temperatura ambiente SDS-PAGE: Electroforesis de Gel de Poliacrilamida dodecil Sulfato de sodio SE-HPLC: Cromatografía Líquida de alto Desempeño de Exclusión de Medida T°C: Temperatura TMAC: Cloruro de tetra-metil Amonio UV: Ultravioleta WFI : Agua Para Inyección WRO: Osmosis de agua Inversa Ejemplo 1; Paso de Captura: Purificación de Afinidad en la Proteina A El material de inicio fue una cosecha clarificada de un clon de la célula CHO que expresa TACI-Fc al cultivarlo bajo condiciones libres de suero y almacenado congelado hasta el uso . El paso de la captura en una columna MabSelect Xtra™ (GE Healthcare 17-5269-03) fue llevado a cabo de acuerdo con el protocolo siguiente en una columna que tiene una altura de cama de 17 cm. Todas las operaciones fueron realizadas a la temperatura ambiente, excepto la solución de carga, que fue mantenida a una temperatura por debajo de los 15°C. La señal UV a 280 nm fue registrada. Sanitización La columna fue sanitizada con, por lo menos, 3BV de 0,1M de ácido acético + un 20 por ciento de etanol en flujo inverso a 250cm/h. El flujo fue detenido durante 1 hora. Paso de lavado La columna fue lavada con, por lo menos, 2BV de agua RO en flujo inverso a 250cm/h. Equilibrio La columna fue equilibrada con, por lo menos, 5BV de 25 mM fosfato de sodio + 150 mM de NaCl a un pH7,0 (hasta que los parámetros de conductividad y el pH estén dentro de la gama especificada: pH 7,0 ± 0,1, la conductividad a 18 + 2 mS/cm) en flujo descendente a 450cm/h. Carga La columna fue cargada con una cosecha clarificada mantenida a una temperatura por debajo de los 15°C a una capacidad de hasta 15 mg total TACI-Fc determinada mediante el ensayo Biacore por mi de resina empacada a una tasa del flujo de 350cm/h. Paso de lavado Lavar la columna con, por lo menos, 2BV de amortiguador de equilibrio a 350cm/h, luego con, por lo menos, 4BV de amortiguador de equilibrio (hasta que la señal de UV regrese a la linea de base) a 450cm/h. Elusión El material fue eluido con diferentes amortiguadores de elusión como se muestra en la Tabla I a una tasa de flujo de 350 cm/h. La fracción de eluato fue recolectada desde el comienzo del aumento de la señal UV a 6,0 ± 0,5BV de elusión. El eluato fue incubado durante 1 hora a temperatura ambiente en un pH por debajo de 4,1 (ajustado mediante la adición de una solución ácido cítrico, si fuese necesario) y entonces el pH fue ajustado a 5,0 ± 0,1 mediante la adición de un 32 por ciento de solución de NaOH.

Regeneración La columna fue regenerada con, por lo menos, 3BV de 50 raM de NaOH + 1M de NaCl en flujo inverso a 450cm/h, se detuvo el flujo durante 15 minutos, entonces se reinicia el flujo a 450 cm/h en, por lo menos, 3BV (hasta que la señal de UV vuelva a la línea de base) . Desde este paso, la columna fue operada en el modo flujo inverso . Paso de lavado La columna fue lavada con, por lo menos, 2BV de agua RO a 450cm/h. Higieniza ción La columna fue santitizada con, por lo menos, 3BV de amortiguador de higienización a 250cm/h, se detuvo el flujo y la columna incubó durante 60 minutos. Pasos del Lavado Final La columna fue lavada con, por lo menos, 1BV de agua RO a 250cm/h, luego con, por lo menos, 3BV de amortiguador de equilibrio a 250cm/h y finalmente con, por lo menos, 2BV de agua RO a 250cm/h. Finalmente, la columna fue almacenada después del enjuague con, por lo menos, 3BV de etanol al 20 por ciento a 250cm/h.

Resultados Tabla I : Resultados usando diferentes amortiguadores de elusión Corrida amortiguador de elusion Rendimiento Agregados HCPs # TACI-Fc (%) (%) 1 50mM NaAc pH 3,7 47,7 30,3 5558 2 lOOmM NaAc pH 3,8 55,7 25,2 n/d 3 200mM NaAc pH 3,8 58,0 28,2 n/d 4 lOOmM NaAc pH 3,7 68 30,0 n/d 0,2M NaAc+150rtiM NaCl pH4 75,1 3,8 n/d 6 lOOmM NaAc p H3,7 84,6 22 3491 7 250itM NaAc pH 3,7 82,8 18,7 3318 8 lOOmM Na citrate pH 3,7 79,2 8,8 4710 9 250mM Na citrate pH 3,7 71,9 23 2347 lOOmM Na citrate pH 3,75 82,8 8,5 1576 11 lOOmM Na citrate pH 3,75 66,6 9,0 664 12 lOOmM NaAc pH 3,85 83,3 15,0 n/d 13 lOOitiM Na citrate p H3,75 81,0 9,1 3490 14 lOOmM Na citrate p H3,65 75,1 14,6 2580 14 lOOmM Na citrate p H3,75 44,7 18,4 3783 16 lOOnM Na citrate p H3,75 47,1 15,8 3217 17 lOOmM Na citrate p H3,75 50,7 9,4 2349 Corrida Amortiguador de elusion Rendimiento Agregados HCPS # TACI-Fc (%) (%) (FFm) 18 lOOniM Na citrate p H3,75 58,0 10,4 2550 19 lOOmM Na citrate p H3,75 67,1 28,7 2372 lOOmM Na citrate p H3,75 65,6 17,5 2353 21 lOOmM Na citrate pH3,75 75,6 19,4 1807 22 lOOmM Na citrate pH3,75 57,1 20,7 2465 23 lOOmM Na citrate pH3,75 51,9 18,4 2030 24 lOOmM Na citrate pH3,75 58 11,5 1746 lOOmM Na citrate pH3,75 41,8 22,9 3029 26 lOOmM Na citrate pH3,9 39,4 6,0 2424 27 lOOmM Na citrate pH3,9 31,0 8,8 2936 28 lOOmM Na Ac pH4,l 28,3 25,0 3311 29 lOOmM Na citrate pH3,9 46,4 9,1 n/d lOOmM NaAc pH4,l 42,8 13,4 n/d 31 lOOmM Na citrate pH3,75 57,5 26,5 n/d 32 lOOmM NaAc pH4,2 38,1 10,1 n/d 33 lOOmM Na citrate pH3,9 43,3 8,3 2011 34 lOOmM Na citrate pH3,9 63,6 6,6 1749 lOOmM Na citrate pH3,9 65,7 7,3 1689 36 lOOmM Na citrate pH3,9 62,7 7,4 1609 37 lOOmM Na citrate pH3,9 61,6 7,4 1479 38 lOOmM Na citrate pH3,9 60,6 7,4 1623 39 lOOmM Na citrate pH3,9 64,6 8,0 1497 Conclusiones El TACI-Fc 5 en la cosecha clarificada fue capturado directamente en una columna MabSelect Xtra a una capacidad dinámica de 15g total de TACI-Fc 5 por L de resina empacada a una tasa del flujo de 350 cm/h. Las condiciones de elusión, especialmente el pH, fue optimizado para llevar al máximo la recuperación del producto al proporcionar una reducción significativa en niveles agregados. Un amortiguador de elusión de pH 0,1 de citrato de sodio pH 3,9 fueron escogidos dando aproximadamente de 5-10 por ciento de niveles agregados comenzando desde aproximadamente el 25-40 por ciento en la cosecha clarificada y sin ninguna turbulencia observada. Los niveles de HCP fueron, típicamente, 1500-2000ppm. Los niveles de HCP fueron medidos mediante ELISA usando un anticuerpo policlonal. El anticuerpo fue generado contra las proteínas de la célula huésped derivada del supernaciente del cultivo de células clarificado y concentrado de las células CHO no-transfectadas .

Ejemplo 2: Cromatografía de Intercambio de Catión El eluato del paso de captura en la Proteína A, dializado en el amortiguador cargado convenientemente, fue usado como material de inicio para la cromatografía del intercambio de catión. Un Fractogel EMD S03~ columna (Merck 1.16882.0010) que tiene una altura de cama de 10 cm fue usado en este paso. Una columna Fractogel SO3" con una altura de cama de 15 cm también puede ser usada. En el último caso, la capacidad dinámica y la tasa de flujo puede necesitar adaptación, la cual está bien dentro del conocimiento rutinario de una persona hábil en la técnica. Todas las operaciones fueron realizadas a la temperatura ambiente y la tasa del flujo fue mantenida constante a 150 cm/h. La señal del UV a 280 nm fue registrada todo el tiempo. Paso de lavado La columna fue lavada con, por lo menos, 1BV de WRO (osmosis inversa de agua) . Higienización Entonces, la columna fue saneada con por lo menos 3BV de NaOH 0,5M + 1,5M de NaCl en el modo de flujo ascendente. Enj uague La columna fue enjuagada con, por lo menos, 4BV de WRO en el modo de flujo descendente. Equilibrio La columna fue equilibrada con, por lo menos, 4BV de 100 mM de citrato de sodio pH5,0 (o hasta que sea alcanzado el objetivo de conductividad de 12±1 mS/cm y de pH 5,0 ± 0,1). Carga La columna fue cargada con material post-captura a pH 5,0 (pH en 5,0+0,1, conductividad en 12±1 mS/cm) y en una capacidad de no más de 50 mg TACI-Fc, como fue determinado por el ensayo SE-HPLC por mi de resina empacada. Paso de lavado La columna entonces fue lavada con, por lo menos, 5BV de 100 mM de fosfato de sodio pH6,5. Elusión La columna fue eluida con diferentes amortiguadores y bajo condiciones diferentes como se informa en las tablas II - IV de más abajo. Regeneración e higienización La columna fue regenerada y fue saneada con 4BV de NaOH 0,5M + lr5M de NaCl en el modo de flujo ascendente. Entonces, el flujo fue detenido durante 30 minutos. La regeneración y la sanitisación pueden ser llevados también a cabo usando 4 BV de NaOH 0,5M + 1,5M de NaCl en el modo de flujo ascendente, seguido por una pausa de 30 minutos. Enjuague La columna fue enjuagada con, por lo menos, 4BV de WRO. Almacenar La columna fue almacenada en, por lo menos, 3BV de etanol al 20 por ciento. Resultados Tabla II : Efecto del nivel del pH de elusión y nivel de la conductividad HCP en la carga: 189 ppm pH conductividad (1 Recuperación de HCPs HCP (x) mS/cm) TACI-Fc (ppm) Eliminación 6,5 15,0 25% 118 1,6 7,3 22,5 100% 50 3,8 8,0 15,0 95% 34 5,5 7,3 22,5 100% 56 3,4 7,3 33,0 98% 133 1,4 7,3 22,5 96% 45 4,2 7,3 22,5 97% 53 3,6 7,3 12,0 54% 79 2,4 6,3 22,5 83% 47 4,1 8,0 30,0 96% 108 1,8 8,2 22,5 97% 46 4,2 6,5 30,0 91% 116 1,6 7,3 22,5 93% 48 3,9 7,3 22,5 95% 40 4,8 La tabla III muestra la recuperación de TACI-Fc y la remoción del HCP cuando se carga a una capacidad de 10 y 32 mg de TACI-Fc por MI de resina y se eluye en un amortiguador de fosfato a una conductividad de entre 12 a 33 mS/cm. La recolección del pico fue hecha desde el principio del aumento UV por 10 + 0,5 BV.

III: El efecto del pH de elusión óptimo y de la conductividad al en niveles de HCP de capacidad de carga: 201 ppm La tabla IV muestra el efecto de un paso del lavado con 50 o 100 o 150 mM de fosfato de sodio pH 6,5 en la recuperación de TACI-Fc y la remoción de HCP.

Tabla IV: El efecto de las condiciones del paso de lavado en el nivel de HCP en el desempeño de la columna en la carga: 190ppm y niveles agregados: 2,0 por ciento Concentración Rendimiento del Rendimiento Agregados HCPs en del fosfato en TACI-Fc en el del TACI-Fc en el eluato el lavado (mM) lavado en eluato eluato (ppm) lavado 1 50 0,7% 99% 2,8% 62 lavado 2 100 2,1% 98% 2,9% 59 lavado 3 150 9,1% 90% 2,7% 49 La Fig. 1 muestra un gel no-reducido de SDS-PAGE manchado en plata, de las muestras derivadas de los experimentos usando las condiciones de los tres pasos del lavado mostrado en la Tabla IV en la remoción del Fe libre. La Fig. 2 muestra los cromatogramas superpuestos de los experimentos del paso del lavado con fosfato de sodio en concentraciones diferentes. El paso del lavado fue optimizado a un pH 6,5 con concentraciones crecientes de fosfato de sodio (50 a 150mM) . Como puede ser visto en la Fig. 1, una concentración de amortiguador de lavado de 150 mM (lavado 3, senda 6) dio como resultado pérdidas de TACI-Fc. Una concentración de amortiguador de lavado de 50 mM (lavado 1, senda 8) dio como resultado un pico de TACI-Fc puro, sin embargo, el eluato contenia trazas de Fe libre. Un paso del lavado con 100 mM de de fosfato de sodio a un pH 6,5 tuvieron como resultado un 98 por ciento de recuperación en el pico principal de elusión y sólo un 2 por ciento de pérdidas en el lavado (Fig. 2) . La remoción de HCP fue de 3,2 dobleces. El análisis de fracciones de lavado y eluato mediante SDS-PAGE muestra que el paso de lavado contenia Fe Libre con algún TACI-Fc intacto en concentraciones de amortiguador de 100 mM o más altas (Fig. 1, sendas 4 y 6) . Una concentración de 100 mM o más es necesario para quitar completamente el Fe Libre de la fracción de eluato (Fig. 1, sendas 5 y 7) .

Conclusiones Un paso de intercambio de catión fue desarrollado como un segundo paso de purificación, después del paso de captura. El eluato de la captura estuvo en un pH bajo (5,0) y a baja conductividad y podría ser cargado directamente en el intercambiador de catión. Una resina Fractogel EMD S03- fue escogida con una capacidad de carga de 50 mg/ml. El Fe libre del producto de la degradación no bio-activa podría ser quitado eficientemente en un paso de lavado con 0,1 de fosfato de sodio a un pH 6,5. Las condiciones de elusión fueron optimizadas para mejor remoción de HCPs y para alta recuperación de TACI-Fc (179 mM de fosfato de sodio a un pH de 8,0, una conductividad 20,7 mS/cm) . Alternativamente, la elusión puede ser llevada a cabo en 10 BV de 20 mM de fosfato de sodio y 180 mM de NaCl a un pH 8,0 desde el comienzo del enjuague en una absorbancia a 280 nm. Ejemplo 3: Cromatografía de Intercambio de anión El material de inicio usado para este paso de purificación fue el eluato del paso de intercambio de catión en Fractogel S03" (Ver el Ejemplo 2) , dializado o diluido en un amortiguador cargado convenientemente. Este paso de cromatografía de intercambio de aniones fue llevado a cabo en una columna SOURCE 30Q (GE Healthcare 17-1275-01) con una altura de cama de 10 cm. Una columna SOURCE 30Q con una altura de cama de 15 cm puede también ser usada en este paso. En el último caso, la capacidad dinámica y la tasa del flujo pueden necesitar una adaptación, que está bien dentro del conocimiento rutinario de una persona hábil en la técnica. Todas las operaciones fueron llevadas a cabo a temperatura ambiente y con la señal UV a 280 nm fueron registradas. Los pasos fueron llevados a cabo a una tasa de flujo de tanto 150 como 200cm/h. Enjuague Primero, la columna fue enjuagada con, por lo menos, 1 BV de agua RO a una tasa de flujo de 150cm/h. Higienización Entonces, la columna fue saneada con por lo menos 3 BV 0,5M de NaOH + 1,5M de NaCl . Paso del lavado La columna fue lavada con, por lo menos, 3 BV, preferiblemente de 4 a 10 BV, 0,5M de fosfato de Na a un pH de 7,5 a una tasa de flujo de 200cm/h. Equilibrio La columna fue equilibrada con, por lo menos, 5 BV de 10, 15, 20, 25, o 30 iM de fosfato de sodio a un pH de 7,5. Opcionalmente, la columna puede ser pre-equilibrada con 3 BV de 0,5M de fosfato de sodio a un pH de 7,5. La carga, el lavado y la recolección concomitante de TACI-Fc por medio del flujo continuo La columna fue cargada con el material del intercambio post-catión diluido para obtener una concentración de fosfato de 10 a 30 mM, con un pH 7,5, en una capacidad de no más de 50 mg de TACI-Fc como fue determinado mediante el ensayo SE-HPLC por mi de resina empacada, reuniendo el flujo desde el inicio del aumento del UV hasta el fin del paso del lavado, que es llevado a cabo en 4±0,5 BV de amortiguador de equilibrio . Regeneración/higienización La columna fue regenerada y fue saneada con por lo menos 3 BV de 0,5M de NaOH + 1,5M de NaCl en el modo del flujo inverso (hasta que la señal de UV regrese a la linea de base) a una tasa del flujo de 150cm/h. A fines de la regeneración, la bomba es detenida durante 30 minutos. Paso de lavado La columna fue lavada con, por lo menos, 3, BV de agua RO a una tasa de flujo de 200cm/h. Almacenar La columna es almacenada en, por lo menos, 3 BV de etanol al 20 por ciento (V/V) a una tasa del flujo de 150cm/h. Resultados La Tabla V siguiente resume los resultados obtenidos con los procesos de purificación descriptos más arriba.

Tabla V: Efecto de la carga de la concentración de fosfato Conclusiones El paso del intercambio de aniones en una columna SOURCE 30Q en el modo de flujo continuo fue optimizado para llevar al máximo la remoción de HCPs y agregados. Cargando el eluato de intercambio de cationes tanto diluido como diafiltrado en 20 mM de amortiguador de fosfato de sodio a un pH de 7,5 dio el mejor término medio entre la recuperación del producto (90%) y la reducción de HCPs (desde aproximadamente 2000ppm a 44ppm) y los agregados (desde aproximadamente un 25% a un 5,6%). Fue usada una capacidad dinámica de 50 mg de TACI-Fc por mi de resina empacada a una tasa de flujo de 150-200cm/h.

Ejemplo 4: Cromatografía de Hidroxiapatita El material de inicio usado para este paso de purificación fue por flujo continuo de cromatografía de intercambio de aniones (ver el Ejemplo 3) . Fue usado una columna de 40 µp? (Biorad 157-0040) de Tipo 1 de Hidroxiapatita de Cerámica CHT, con una altura de cama de 10 cm. Todas las operaciones fueron llevadas a cabo a temperatura ambiente. La tasa de flujo fue mantenida constante en 175 cm/h y fue registrada la señal UV en 280 nm. Todas las soluciones fueron filtradas estériles y el equipo se sanitizó con hidróxido de sodio antes del uso. La columna fue almacenada en una solución de 0,5 de NaOH cuando no estaba en uso. Pasos del lavado inicial (Enjuague y pre-equilibrio) La columna fue lavada con, por lo menos, 1 BV de 20 m de amortiguador de fosfato de sodio a un pH de 7,5, y luego con, por lo menos, 3 BV de amortiguador de 0,5M de fosfato de sodio a un pH de 7,5 para bajar el pH. Equilibrio La columna fue equilibrada con, por lo menos, 5 BV de 20 mM de amortiguador de fosfato de sodio a un pH de 7,5 (o hasta que el objetivo de conductividad de 3,0±0,3 mS/cm y el pH 7,5 ± 0,1 fueran alcanzados).

Carga La columna fue cargada con el flujo continuo en SOURCE 30Q con cloruro de calcio añadido a 0,1 mM de la concentración final de una solución de stock en 0,5M y el pH fue ajustado a 7,0 por la adición de un 85% de ácido orto-fosfórico, en una capacidad de NMT 50 mg de TACI-Fc como se determinó mediante el ensayo por SE-HPLC por mi de resina empacada. Es también posible cargar el flujo continuo SOURCE 30Q sin cloruro de calcio, con el pH ajustado a 7,0, en la columna de hidroxiapatita . El paso del lavado La columna fue lavada con, por lo menos, 4 BV de 3,4 o 5 mM de fosfato de sodio, 10 mM de MES, 0,lmM de CaCl2 a un pH de 6,5. En estos pasos, es también posible usar el mismo amortiguador sin cloruro de calcio. Elusión La columna fue eluida con 5, 4, 3 o 2 mM del fosfato de sodio (ver Tabla VI), 10 mM de MES, 0,1 mM de CaCl2, y amortiguador de KC1 0,6, 0,7, 0,8 o 0,9 M a un pH de 6,5, (ver Tabla VII) desde el principio del aumento de UV para BV diferente (ver Tablas VI y VII) . Es también posible usar el mismo amortiguador sin cloruro de calcio para el elusión. Enj uague La columna fue enjuagada con: - por lo menos 1BV de 20 mM de amortiguador de fosfato de sodio pH 7,5; - al menos, 3BV de 0,5M de amortiguador de fosfato de sodio pH 7,5; y - con, por lo menos, 1BV de 20 m del amortiguador fosfato de sodio pH 7,5. Almacenar La columna fue almacenada en, por lo menos, 3BV de 0,5M de NaOH. Resultados La tabla VI muestra el efecto de la concentración de fosfato (de 2 a 5 mM) en el amortiguador de elusión en la remoción de los agregados y la recuperación del producto. Las fracciones del pico de Elusión fueron aunadas y analizadas mediante SE-HPLC para la concentración de TACI-Fc y los niveles de agregado. Tabla VI : Efecto de la concentración de fosfato en el amortiguador de elusión Conc. de fosfato BV de elusion Rendimiento de TACI-Fc Agregados (mM) 5 12 73% 0,49% 13 74% 0,52% 14 68% 0,65% 15 77% 0,67% 16 77% 0,70% 17 70% 0,73% 18 76% 0,85% Conc. de fosfato BV de elusion Rendimiento de ACI-Fc Agregados (p?) 4 12 68% 0,34% 13 67% 0,29% 14 66% 0,36% 15 67% 0,39% 16 66% 0,38% 17 66% 0,32% 18 66% 0,40% 3 12 70% 0,46% 13 76% 0,42% 14 73% 0,51% 15 71% 0,52% 16 69% 0,55% 17 69% 0,50% 18 70% 0,53% 2 12 65% 0,19% 13 66% 0,00% 14 66% 0,18% 15 68% 0,14% 16 66% 0,17% 17 71% 0,19% 18 65% 0,16% La tabla VII muestra el efecto de la concentración de KC1 en el amortiguador de elusión en la remoción de agregados y en la recuperación del producto. Dos concentraciones del fosfato del 'sodio fueron investigadas: 2 y 3 mM. Las fracciones del pico de Elusión fueron aunadas y fueron analizadas mediante SE-HPLC para la concentración de TACI-Fc y los niveles de agregado.

Tabla VII : Efecto de la concentración de cloruro de potasio en el amortiguador de elusión Conc. de fosfato Conc. De BV de Rendimient agregados (mM) KC1 (M) elusión o de TACI- Fc 3 0,6 10 102% 0,48% 11 109% 0,46% 12 106% 0,43% 13 105% 0,42% 14 103% 0,43% 3 0,7 10 96% 0,42% 11 97% 0,40% 12 98% 0,41% 13 96% 0,40% 14 96% 0,43% 3 0,8 10 106% 0,58% Conc. de fosfato Conc. De BV de Rendimient agregados (p?) KC1 (M) elusión o de ACI- Fc 11 110% 0,55% 12 112% 0,57% 13 101% 0,59% 14 110% 0,57% 2 0,6 10 71% 0,29% 11 79% 0,28% 12 80% 0,29% 13 80% 0,29% 14 81% 0,26% 2 0,9 10 64% 0,27% 11 72% 0,25% 12 73% 0,29% 13 70% 0,33% 14 66% 0,24% Conclusiones : La cromatografía de Hidroxiapatita proporciona una manera segura y eficiente de reducir los niveles de agregado de TACI-Fc. Empezar desde el material purificado de la cromatografía del intercambio de aniones (ver el Ejemplo 3) con niveles acumulados de aproximadamente de 5-8%, la cromatografía de hidroxiapatita puede reducir estos niveles a por debajo de 0,8% con una recuperación de TACI-Fc del 85-90%. RESULTADOS GENERALES Un proceso de la purificación del cuatro-paso para el TACI-Fc ha sido desarrollado teniendo como resultado TACI-Fc sumamente purificado con una reducción general de agregados a menos de 1 % (0,2 - 0,8 % en cinco experimentos), la reducción general de HCPs a acerca de 5-10ppm y una reducción general de niveles libres de Fe a menos de 0,5 % (0,2 y 0,1 % en dos experimentos) .

REFERENCIAS l. Akerstrom and Bjork, J Biol Chem. 1989 Nov 25;264 (33) :19740-6. 2. Altschul S F et al, J Mol Biol, 215, 403-410, 1990 3. Altschul S F et al, Nucleic Acids Res., 25:389-3402, 1997 4. Armour KL. et al., 1999. Recombinant human IgG molecules lacking Fcgamma receptor I binding and monocyte triggering activities. Eur J Immunol . 29 ( 8 ): 2613-24 5. Black et al., US 2002/0115175 6. Bodmer et al., TIBS 27(1), 19-24 7. Boschetti, E., Jungbauer, Sep. Sci. & Tech. 2 No. 15, Acad. Press (2000) 53 8. Boschetti et al., Genetic Engineering Vol . 20, No. 13, July, 2000 9. Bossen et al., JBC 281(2), 13964-13971 10. Bram and von Bulow, US 5,969,102 (1999) 11. Bram et al., WO 98/39361 12. Cárter PJ. , 2006. Potent antibody therapeutics by design . Nature Reviews Immunology. Advance online publication 13. Devereux J et al, Nucleic Acids Res, 12, 387-395, 1984 14. Feng et al., Bioprocessing 2005, 1-7 15. Giovannini, Biotechnology and Bioengineering 73:522-529 (2000) 16. Grantham et al., Science, Vol . 185, pp. 862-864 (1974) 17. Gross et al., Nature 404(27), 995-999 18. Gross et al., WO 00/40716 19. Hinton PR. et al., 2004. Engineered human IgG antibodies with longer serum half-lives in primates. J Biol Chem. 279(8) : 6213-6 20. Hymowitz et al., JBC 280(8), 7218-7227 21. Idusogie EE. et al., 2000. apping of the Clq binding site on rituxan, a chimeric antibody with a human IgGl Fe. J Immunol. 164 (8 ): 4178-84 22. Idusogie EE. et al., 2001. Engineered antibodies with increased activity to recruit complement. J Immunol. 166 (4) :2571-5 23. Ishihara, EP 1 614 693 24. Kabat, E. A. , u, T. . , Perry, H. M . , Gottesman, K. S., and Foeller, C. (1991), Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed., National Institutes of Health, Bethesda, MD 25. Kochanek et al., EP 1 230 354 26. Locksley et al . , Cell 104, 487-501, 2001 27. Melchers, Ann. Rheum. Dis 2003, 62, 25-27. 28. Moore et al., Science 285: 260-3 29. Moreau et al., Blood 103(8), 3148-3157 30. Naisraith and Sprang, TIBS 23, 74-79, 1998 31. Novak et al . , Blood 103(2), 689-694 32. Rixon et al., WO 02/094852 33. Pearson, Methods Enzymol. 1990;183:63-98 34. Porath, J. Carlsson, I. Olsson, and G. Belfrage, Nature (London) 258, 598-599 (1975) 35. Porath and B. Olin, Biochemistry 22, 1621-1630 (1983) 36. Puren et al., Proc Nati Acad Sci U S A. 1999 Mar 2; 96 (5) :2256-61 37. Shepard, J. of Chromatography 891:93- 98 (2000) 38. Shields RL. et al. , 2001. High resolution mapping of the binding site on human IgGl for Fe gamma RI, Fe gamma RII, Fe gamma RUI, and FcRn and design of IgGl variants with improved binding to the Fc gamma R. J Biol Chem. 276(9): 6591-604. 39. Smith et al., WO 91/03553 40. Smith et al., WO 94/06476 41. Stanker, J. Immunological Methods 76:157-169 (1985) (10 mM to 30 mM sodium phosphate elusion gradient) 42. Steurer W. et al., 1995. Ex vivo coating of islet cell allografts with murine CTLA4/Fc promotes graft tolerance. J Immunol. 155 (3) : 1165-74 43. Sun et al., WO 2005/044856 44. Takeda et al., EP 1 561 756 45. Tarditi, J. Chromatography 599:13-20 (1992) 46. Vaccaro C. et al., 2005. Engineering the Fc región of immunoglobulin G to modulate in vivo antibody levéis. Nat Biotechnol. 23 ( 10 ): 1283-8 47. Vigers et al., Nature. 1997 Mar 13 386 ( 6621 ) : 190-4 48. Vedantham et al., WO 03/59935 49. Vola et al., BioTechniques 14:650-655 (1993) 50. von Bülow and Bram, Science 228 : 138 (1997) 51. Xia et al., J. Exp. Med. 2000, 137-143.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (28)

1. REIVINDICACIONES
2. Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. El método para purificar una proteina de Fusión Fe que tiene un punto de isoeléctrico (pl) de 6,9 a 9,5, caracterizado porque comprende los pasos siguientes: a) Someter un fluido que comprende la proteína de Fusión Fe a cromatografía de afinidad de la Proteína A o la Proteína G; b) Someter el eluato del paso (a) a la cromatografía de cambio del catión; c) Someter el eluato del paso (b) a la cromatografía de cambio del anión; d) Someter el flujo continuo del paso (c) a la cromatografía de hidroxiapatita y recolectar el eluato para obtener la proteína purificada de Fusión Fe. 2. El método según la reivindicación 1, caracterizado porque la elusión en el paso (a) se lleva a cabo a un pH que oscila entre 2,8 a 4,5.
3. 3. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el paso (b) comprende además : b. 1. Lavar la resina de intercambio de catión después de cargar con un amortiguador que tiene un pH que oscila entre 6 a 7 y una conductividad que oscila de 6 a 10 mS/cm; y b. 2. Eluir la columna en un pH que oscila de 7,3 a 8,2 y una conductividad que oscila de 15 a 22 mS/cm.
4. 4. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque en el paso (c) , el equilibrio y la carga son llevados a cabo en un amortiguador que tiene una conductividad de 3 a 4,6 mS/cm y un pH de una unidad por debajo del valor de pl de la proteina de Fusión Fe.
5. 5. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la elusión en el paso (d) se lleva a cabo en la presencia de fosfato de sodio en una concentración que oscila de 3 a 10 mM.
6. 6. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la elusión en el paso (d) se lleva a cabo en la presencia de cloruro de potasio que oscila entre 0,4 a 1 . 7. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la elusión en el paso (d) se lleva a cabo a un pH que oscila de 6 a
7. 7.
8. 8. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el paso (a) se lleva a cabo en una resina que comprende azarosa reticulada modificada con la Proteina recombinante A o la Proteina G.
9. 9. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el paso (b) se lleva a cabo en una resina fuerte de intercambio de catión .
10. 10. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque la resina comprende un metacrilato reticulado modificado con los grupos S03-,
11. 11. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el paso (c) se lleva a cabo en una resina fuerte de intercambio de anión.
12. 12. El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque la resina comprende poliestiren/divinil benceno modificado con N+(CH3)3.
13. 13. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el paso (d) se lleva a cabo en una resina cerámica de hidroxiapatita .
14. 14. El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque la resina cerámica de hidroxiapatita comprende las partículas que tienen un tamaño de 40 µ .
15. 15. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque comprende además por lo menos un paso de ultrafiltración .
16. 16. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque el paso de ultrafiltración se lleva a cabo entre los pasos (b) y (c) y/o después del paso (d) .
17. 17. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque comprende además formular la proteina de la Fusión Fe en una composición farmacéutica.
18. 18. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque de la proteina de Fusión Fe tiene un pl entre 8 y 9.
19. 19. El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque la proteina de Fusión Fe tiene un pl entre 8,3 y 8,6.
20. 20. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la proteina de Fusión Fe comprende una porción de ligando de un miembro de la superfamilia del receptor del factor de necrosis del tumor (TNFR) .
21. 21. El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque la porción de unión del ligando es escogida de un dominio extracelular de TNFR1, TNFR2, o un TNF que se une al fragmento del mismo.
22. 22. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 20, caracterizado porque la porción de unión del ligando escogido de un dominio extracelular de BAFF-R, de BCMA, de TACI, o de un fragmento del mismo que se une a, por lo menos, uno de Blys o APRIL.
23. 23. El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque la proteina de Fusión Fe comprende un polipéptido escogido de (a aminoácidos 34 a 66 de la SEC ID N° : 2; (b aminoácidos 71 a 104 de la SEC ID N°: 2, (c aminoácidos 34 a 104 de la SEC ID N° : 2 (d aminoácidos 30 a 110 de la SEC ID N° : 2 (e de la SEC ID N° : 3; (f de la SEC ID N° : 4; (g un polipéptido codificado por un polinucleótido que hibridiza al complemento de la SEC ID N°: 5 o 6 o 7 bajo condiciones sumamente rigurosas; y (e) una muteina de cualquiera de (c) , (d) , (e) , o (f) teniendo por lo menos un 80 % o 85 % o 90 % o 95 % de la secuencia de identidad al polipéptido de (c) , (d) , (e) o (f ) ; en donde el polipéptido se une a por lo menos uno de Blys o APRIL.
24. 24. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la proteina de Fusión Fe comprende una región constante de la cadena pesada de una inmunoglobulina .
25. 25. El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado poque la región constante es una región constante humana.
26. 26. El método de conformidad con la reivindicación 24 o 25, caracterizado porque la inmunoglobulina es un IgGl.
27. 27. El método de conformidad con cualquiera de reivindicaciones 23 a 25, caracterizado porque la región constante comprende la vinculación, CH2 y un dominio CH3.
28. 28. Una composición purificada de la proteina de la Fusión Fe obtenida por un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la proteina de Fusión Fe comprende un polipéptido escogido de (a) aminoácidos 34 a 66 de la SEC ID N° : 2; (b) aminoácidos 71 a 104 de la SEC ID N°: 2; (c) aminoácidos 34 a 104 de la SEC ID N°: 2; (d) aminoácidos 30 a 110 de la SEC ID N°: 2; (e) de la SEC ID N° : 3; (f ) de la SEC ID N° : ; (g) un polipéptido codificado por un polinucléotido que hibridiza al complemento de la SEC ID N°: 5 o 6 o 7 bajo condiciones sumamente rigurosas; y (e) una muteina de cualquiera de (c) , (d) , (e) o (f ) teniendo por lo menos un 80 % o 85 % o 90 % o 95 % de la identidad de la secuencia al polipéptido de (c) , (d) , (e) o (f) ; en donde el polipéptido se une a por lo menos uno de Blys o APRIL, y en donde la composición comprende menos del 1 % o menos del 0,5% de agregados de proteina, y en donde la composición comprende menos del 1% o menos de 0,5% o menos del 0,1% de la proteina libre de Fe.