RS20050501A - Polimerni konjugati citokina,hemokina,faktora rasta, polipeptidnih hormona i njihovih antagonista sa očuvanom aktivnošću vezivanja receptora - Google Patents

Polimerni konjugati citokina,hemokina,faktora rasta, polipeptidnih hormona i njihovih antagonista sa očuvanom aktivnošću vezivanja receptora

Info

Publication number
RS20050501A
RS20050501A YUP-2005/0501A YUP20050501A RS20050501A RS 20050501 A RS20050501 A RS 20050501A YU P20050501 A YUP20050501 A YU P20050501A RS 20050501 A RS20050501 A RS 20050501A
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
cytokine
group
growth factor
antagonist
chemokine
Prior art date
Application number
YUP-2005/0501A
Other languages
English (en)
Inventor
Shyam Bhaskaran
Merry Sherman
Mark Saifer
David Williams
Original Assignee
Mountain View Pharmaceuticals Inc.,
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Mountain View Pharmaceuticals Inc., filed Critical Mountain View Pharmaceuticals Inc.,
Publication of RS20050501A publication Critical patent/RS20050501A/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/20—Interleukins [IL]
    • A61K38/2013—IL-2
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/74—Synthetic polymeric materials
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
    • A61K38/1808—Epidermal growth factor [EGF] urogastrone
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/191—Tumor necrosis factors [TNF], e.g. lymphotoxin [LT], i.e. TNF-beta
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/21—Interferons [IFN]
    • A61K38/212—IFN-alpha
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/22—Hormones
    • A61K38/30—Insulin-like growth factors, i.e. somatomedins, e.g. IGF-1, IGF-2
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/10—Antimycotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/521—Chemokines
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
    • C08G63/00—Macromolecular compounds obtained by reactions forming a carboxylic ester link in the main chain of the macromolecule
    • C08G63/02—Polyesters derived from hydroxycarboxylic acids or from polycarboxylic acids and polyhydroxy compounds
    • C08G63/12—Polyesters derived from hydroxycarboxylic acids or from polycarboxylic acids and polyhydroxy compounds derived from polycarboxylic acids and polyhydroxy compounds
    • C08G63/46—Polyesters chemically modified by esterification
    • C08G63/48—Polyesters chemically modified by esterification by unsaturated higher fatty oils or their acids; by resin acids

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)

Abstract

Obezbeđeni su postupci za sintezu polimernih konjugata citokina, hemokina, faktora rasta, polipeptidnih hormona i njihovih antagonista koji se vezuju za receptor, čiji konjugati zadržavaju neobično veliku biološku aktivnost vezivanja za receptor. Preparati polimernih konjugata prema postupcima predmetnog pronalaska umanjuju ili uklanjaju steričnu inhibiciju interakcija receptor – ligand koja često nastaje usled vezivanja polimera za regione koji se vezuju za receptor citokina, hemokina, faktora rasta, polipeptidnih hormona, kao i njihovih agonističkih ili antagonističkih analoga. Predmetni pronalazak takođe obhezbeđuje konjugate i preparate koji se dobijaju takvim postupcima. Konjugati prema predmetnom pronalasku zadržavaju visok nivo aktivnosti vezivanja za receptor u poređenju sa onima koji se dobijaju tradicionalnim postupcima vezivanja polimera, a koji nisu usmereni tako da se izbegnu domeni koji se vezuju za receptor citokina, hemokina, faktora rasta, polipeptidnih hormona. Konjugati prema predmetnom pronalasku takođe pokazuju produženi polu-život in vivo i on vitro, u poređenju sa nekonjugovanim citokinima, hemokinim,a faktorima rasta i polipeptidnim hormonima. Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje komplete koji sadrže takve konjugate i/ili preparate, kao i postupke za upotrebu takvih konjugata i preparata u raznim dijagnostičkim, prifilaktičkim, terapeutskim primenama i primena u biološkoj obradi.

Description

...POLIMERNI KONJUGATI CITOKINA, HEMOKINA, FAKTORA RASTA,
POLIPEPTIDNIH HORMONA I NJIHOVIH ANTAGONISTA SA OČUVANOM
AKTIVNOŠĆU VEZIVANJA RECEPTORA
Oblast pronalaska
Predmetni pronalazak se odnosi ; na biohemiju proteina i na oblast farmacije i medicine. Posebno, predmetni pronalazak obezbeđuje postupke za proizvodnju konjugata između polimera rastvorljivih u vodi (npr., poli(etilen glikola) i njihovih derivata) i određenih bioaktivnih komponenti, pri čemu konjugati poseduju povišen afinitet vezivanja za receptor u poređenju sa standardnim konjugatima polimera i biološki aktivne komponente. Specifičnije, predmetni pronalazak obezbeđuje postupke za proizvodnju polimernih konjugata određenih proteina koji se vezuju za receptore sa neobično visokim afinitetom vezivanja za receptor. Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje konjugate koji se dobijaju takvim postupcima, preparate koji sadrže ove konjugate, komplete koji sadrže ove konjugate i preparate, kao i postupke za upotrebu konjugata i preparata u sprečavanju nastanka, dijagnostikovanju i lečenju brojnih stanja u medicini i veterinarskoj medicini.
Stanje tehnike
Opis stanja tehnike koji sledi obuhvata interpretacije pronalazača predmetnog pronalaska koje, same po sebi, nisu ranije opisane. Citokini su sekretorni regulatorni proteini koji kontrolišu preživljavanje, rast, diferencijaciju i/ili efektorsku funkciju ćelija na endokrini, parakrini ili autokrini način (revijski prikazano u: Guidebook to Cvtokines and Their Receptors, Nicola, N. A., urednik, str. 1 - 7, Oxford Universitv Press, New York). Hemokini su porodica strukturno povezanih glikopreteina koji poseduju izraženu aktivnost u aktivaciji leukocita i/ili hemotaksiji (revijski prikazano u: Oppenheim, J. J., et al., 1997, Clin. Cancer Res. 3 : 2682 - 2686). Kao i njihovi bliski srodnici, polipeptidni hormoni i faktori rasta, citokini i hemokini započinju svoje regulatorne funkcije vezivanjem za specifične receptorske proteine na površini svojih ciljnih ćelija (revijski prikazanao u: Kossiakoff, A. A., et al., 1998. Adv. Protein Chem. 52 : 67 - 108; Onuffer, J. J. et al., 2002, Trends Pharmacol. Sci. 23 : 459 - 467). Zbog svoje potencije, specifičnosti, male veličine i relativne lakoće proizvodnje u rekombinantnim organizmima, citokini, hemokini, faktori rasta i polipeptidni hormoni, poseduju brojne potencijalne primene kao terapijska sredstva.
Dva ključna činioca koji su posebno otežali razvoj citokina i generalno rekombinantnih proteina kao terapijskih sredstava su njihov kratki poluživot u cirkulaciji i njihova potencijalna antigenost i imunogenost. Kao što se ovde koristi i kao što se generalno koristi u struci, pojam "antigenost" označava sposobnost molekula da se veže za prethodno postojeće antitelo, dok pojam "imunogenost" označava sposobnost molekula da izazove imuni odgovor in vivo, bilo da taj odgovor obuhvata stvaranje antitela ("humoralni odgovor") ili stimulaciju ćelijskih imunih odgovora.
Prilikom primene rekombinantnih terapijskih proteina, često je poželjna intravenska (i.v.) primena kako bi se postigla najviša moguća cirkulišuća aktivnost i kako bi se na minimum sveli problemi biološke raspoloživosti i degradacije. Međutim, poluživot malih proteina nakon i.v. primene je obično ekstremno kratak (videti primere u: Mordenti, J., et al., 1991, Pharm. Res., 8 : 1351 - 1359; Kuvvabara, T., et al., 1995, Pharm. Res. 12 : 1466 - 1469). Proteini sa hidrodinamičkim radijusom koji je veći od radijusa serumskog albumina, sa Stokes-ovim radijusom od oko 36 A i molekulskom masom od oko 66000 daltona (66 kDa) generalno se zadržavaju u cirkulaciji kod osobe sa zdravim bubrezima. Međutim, manji proteini, uključujući citokine kao što su faktor stimulacije kolonija granulocita ("G-CSF"), interleukin-2 ("IL-2"), interferon-alfa ("INF-a") i interferon-gama ("INF-y") bivaju brzo odstranjeni iz cirkulacije putem glomerularne filtracije (Brenner, B. M., et al., 1978, Am. J. Phvsiol. 243 : F455 - F460; Venkatachalam, M. A. et al., 1978, Circ. Res. 43 : 337 - 247; Wilson, G., 1979, J. Gen. Phvsiol. 74 : 495-509; Knauf, M. J., et al., 1988, J. Biol. Chem. 263 : 15064 - 15070; Kita Y., et al., 1990, Drug Des. Deliv. 6 : 157 - 167; Roasting, L., et al., 1998, J. Am. Soc. Nephrol. 9 : 2344 - 2348). Kao rezultat toga, održavanje terapijski korisnih koncentracija malih rekombinantnih proteina u cirkulaciji je problematično nakon injektiranja. Stoga, moraju se primeniti više koncentracije takvih proteina kao i češće injektiranje. Takvi dozni režimi povećavaju cenu terapije, smanjuju verovatnoću saradnje pacijenta i povećavaju rizik od neželjenih pojava, npr., imunih reakcija. I ćelijski i humoralni imuni odgovori mogu da smanje cirkuiišuće koncentracije injektovanih rekombinantnih proteina u tolikom stepenu da spreče primenu efikasne doze ili mogu da dovedu do pojava koje ograničavaju tretman uključujući ubrzani klirens, neutralizaciju efikasnosti i anafilaksu (Ragnhammar, P., et al., 1994. Blood 84 : 4078 - 4087; Wadhwa, M., et al., 1999. Clin. Cancer Res. 7 : 1163 - 1170; Li, J., et al., 2001, Blood 98 : 3241 - 3248; Basser, R.L., et al., 2002, Blood 99 : 2599 - 2602; SchellekenS, H., 2002, Clin. Ther. 24 : 1720 - 1740). Modifikacija rekombinantnih proteina kovalentnim vezivanjem poli(etilen glikola) ("PEG") je ekstenzivno izučavana kao način prevazilaženja gore navedenih nedostataka (revijski prikazano u: Sherman, M. R., et al., 1997, u Poli(ethylen glvcol): Chemistrv and Biological Applications, Harris, J. M., et al., urednici, strane 155 - 169, American Chemical Societv, Washington, D.C.; Roberts, M. J., et al., 2002, Adv. Drug Rev. 54 : 459 - 476). Pokazano je da vezivanje PEG za proteine stabilizuje proteine, poboljšava njihovu biološku raspoloživost i/ili smanjuje njihovu imunogenost in vivo (kovalentno
povezivanje PEG za protein ili druge supstrate se ovde označava, a i u struci je poznato kao "pegilacija"). Dodatno, pegilacijom može da se poveća hidrodinamički radijus proteina u zančajnoj meri. Kada se mali protein kao što je citokin, hemokin, faktor rasta ili polipeptidni hormon poveže sa jednim dugačkim lancem PEG (npr., koji ima molekulsku masu od najmanje 18 kDa), nastali konjugat poseduje hidrodinamički radijus koji je veći od radijusa serumskog albumina, a njegov klirens iz cirkulacije putem bubrežnih glomerula je dramatično smanjen. Kombinovani efekti pegilacije - smanjena proteoliza, smanjeno imunoprepoznavanje i smanjena brzina bubrežnog klirensa - predstavljaju značajne prednosti pegiliranih proteina, kao terapeutskih sredstava.
Još od 1970-ih su pravljeni pokušaji upotrebe kovalentnog vezivanja polimera u cilju poboljšavanja sigurnosti i efikasnosti različitih proteina za farmaceutsku upotrebu
(videti, npr., Daviš, F. F., et al., U.S. patent broj 4,179,337). Neki primeri obuhvataju vezivanje PEG ili poli(etilen oksida) ("PEO") za adenozin deaminazu (EC 3.5.4.4) radi upotrebe u tretmanu ozbiljne kombinovane imunodeficijencije (Daviš, S. et al., 1981, Clin. Exp. Immunol. 46 : 649 - 652; Hershfild, M. S. et al., 1987, N. Eng. J. Med. 316 : 589 - 596), zatim vezivanje za superoksid dismutazu (EC 1.15.1.1) radi tretmana inflamatornih stanja (Saifer, M. et al., U.S. patenti br. 5,006,333 i 5,080,891) kao i vezivanje za urat oksidazu (EC 1.7.3.3) radi eliminacije viška mokraćne kiseline iz krvi i urina (Kelly, S. J., et al, 2001, J. Am. Soc. Nephrol. 12 : 1001 - 1009; Williams, L. D. et al., PCT publikacija br. WO 00/07629 A2 i A3 i U.S. patent br. 6,576,235; Sherman, M. R, et al., PCT publikacija br. WO 01/59078 A2).
PEO i PEG su polimeri koji su sastavljeni od kovalentno povezanih etilen oksidnih jedinica. Ovi polimeri imaju sledeću opštu strukturnu formulu:
R,-(OCH2CH2)n-<R>2
gde R2može biti hidroksil grupa (ili njen reaktivni derivat), a Rimože biti vodonik, kao u dihidroksi PEG ("PEG diol"), metil grupa, kao u monometoksi PEG ("mPEG"), ili neka druga niža alkil grupa, npr., kao u/zo-propoksiPEG ili r-butoksiPEG. Parametarnu opštoj strukturnoj formuli PEG predstavlja broj etilen oksidnih jedinica u polimeru i označen je ovde i u struci kao "stepen polimerizacije". Polimeri iste opšte strukture u kojima Ripredstavlja Ci.7alkil grupu, takođe se označavaju kao oksiran derivati (Yasukhchi, T., et al., U.S. patent broj 6,455,639). PEG-ovi i PEO-ovi mogu biti linearni, razgranati (Fuke, I., et al., 1994, J. Control Release 30: 27-34) ili oblika zvezde (Merrill, E.W., 1993., J. Biometar Sci. Polym. Ed. 5 : 1 - 11). PEG-ovi i PEO-ovi su amfipatični, tj., rastvorljivi su i u vodi i u određenim organskim rastvaračima i mogu da adheriraju na materijale koji sadrže lipide, uključujući obložene viruse i membrane životinjskih i bakterijskih ćelija. Određeni nasumični ili blok ili alternirajući kopolimeri etilen oksida (OCH2CH2) i propilen oksid, koji poseduje sledeću strukturnu formulu:
poseduju svojstva koja su dovoljno slična svojstvima PEG tako da se smatra da ovi kopolimeri mogu biti odgovarajuće zamene za PEG u određenim primenama (videti, npr.,
Hiratani, H., U.S. patent br. 4,609,546 i Saifer, M, et al., U.S. patent br., 5,283,317). Pojam "polialkilen oksidi" i skraćenica "PAO-ovi" se ovde koristi da označi takve kopolimere, kao i PEG-ove ili PEO-ove i poli(oksietilen-oksimetilen) kopolimere (Pitt, C.G., et al., U.S. patent broj 5,476,653). Kao što se ovde koristi, pojam "polialkilen glikoli" i skraćenica "PAG-ovi" se ovde koristi da označi, generički, polimere koji su pogodni za korišćenje u konjugatima prema predmetnom pronalasku, posebno da označi PEG-ove, još određenije PEG-ove koje sadrže samo jednu reaktivnu grupu ("monofunkcionalno aktivirani PEG-ovi").
Ko valentno vezivanje PEG ili drugih polialkilen oksida za protein zahteva prevođenje najmanje jedne krajnje grupe polimera u reaktivnu funkcionalnu grupu. Ovaj proces se često označava kao "aktivacija", a proizvod se naziva "aktivirani PEG" ili aktivirani polialkilen oksid. Monometoksi PEG-ovi u kojima je kiseonik na kraju povezan sa nereaktivnom, hemijski stabilnom metil grupom (kako bi se dobila "metoksil grupa"), a koji na drugom kraju poseduju funkcionalnu grupu koja je reaktivna prema aminogrupama na molekul proteina, najčešće se korisi u ovakvim pristupima. Takozvani, "razgranati" mPEG-ovi, koji sadrže dve ili više metoksil grupe, distalno od aktivirane funkcionalbne grupe, koriste se rede. Primer razgranatog PEG jeste di-mPEG-lizin, u kome je PEG povezan sa obe aminogrupe, a karboksil grupa lizina je najčešće aktivirana esterifikacijom sa N-hidroksisukcinimidom (Martinez, A., et al., U.S. patent br., 5,643,575; Greenwald R. B., et al., U.S. patent broj 5,919,455; Harris, J. M, et al., U.S. patent broj 5,932,462).
Često, aktivirani polimeri reaguju sa biološki aktivnim jedinjenjem koje poseduje funkcionalne nukleofilne grupe koje služe kao mesta povezivanja. Nukleofilna funkcionalna grupa koja se često koristi kao mesto povezivanja jeste epsilon amino grupa lizinskih ostataka. Alfa-amino grupe koje su dostupne rastvaraču, karboksilne grupe, guanidino grupe, imidazolske grupe, odgovarajuće aktivirane karbonilne grupe, oksidirani ugljenohidratne grupe i tiol grupe, takođe se koriste kao mesta povezivanja.
Hidroksilna grupa PEG je aktivirana cijanourat hloridom pre nego što je povezana sa proteinom (Abuchowski, A., et al., 1977, J. Biol. Chem. 252 : 3582 - 3586; Abuchowski, A., et al., 1981, Cancer Treat. Rep. 65 : 1077 - 1081). Upotreba ovog postupka ima nedostatke kao što su toksičnost cijanourat hlorida i njegova nespecifična reaktivnost za proteine koji poseduju funcionalne grupe koje se razlikuju od amina, kao što su cistein koji je dostupan rastavarču ili tirozinski ostaci koji mogu biti ključni za funkciju. Da bi se prevazišli ovi i drugi nedostaci, uvedeno je korišćenje alternativno aktiviranih PEG-ova kao što su sukcinimidil sukcinat derivati PEG ("SS-PEG")
(Abuchowski, A., et al., 1984, Cancer Biochem. Biophvs. 7 : 175 - 186), sukcinimidil karbonat derivati PAG ("SC-PAG") (Saifer, M, et al., U.S. patent broj 5,006,333) kao i aldehidni derivati PEG (Rover, G. P., U.S. patent broj 4,002,531).
Često se nekoliko (npr., 5-10) lanaca jednog ili više PAG-ova npr., jednog ili više PEG-ova molekulske mase od oko 5 do 10 kDa, vezuje sa ciljnim proteinom, preko primarnih aminogrupa (epsilon amino grupa lizinskih ostataka i moguće alfa amino grupe amino - terminalne ("N-terminalne") amino kiseline. U skorije vreme sintetišu se konjugati koji sadrže jedan lanac mPEG veće molekulske mase, npr., 12, 20 ili 30 kDa. Pokazana je direktna korelacija između poluživota konjugata u plazmi i povećanja molekulske mase i/ili povećanja broja lanaca povezanih PEG (Knauf, M-J., et al., gore navedeno; Katre, N.V. 1990, J. Immunol. 144 : 209 - 213; Clark, R., et al., 1996, J. Biol. Chem271 : 21969 - 21977; Leong, S. R. et al., 2001, Cvtokine 16 : 106 - 119). Sa druge strane, kako se broj lanaca PEG koji su povezani sa svakim molekulom proteina povećava, tako se povećava i verovatnoća da će amino grupa u ključnom regionu proteina biti modifikovana, a biološka funkcija proteina oštećena, posebno ukoliko je to protein kojise vezuje za receptor. Za veće proteine koji sadrže mnogo amino grupa i za enzime sa supstratima male molekulske mase podešavanje između produženog trajanja dejstva i smanjene specifične aktivnosti može biti prihvatljiva jer dovodi do ukupnog povećanja biološke aktivnosti konjugata koji sadrže PEG in vivo. Za manje proteine koji funkcionišu putem interakcija sa receptorima na ćelijskoj površini, kao što su citokini, hemokini faktori rasta i polipeptidni hormoni, relativno visok stepen supstitucija smanjuje funkcionalnu aktivnost do: tačke u kojoj se poništava prednost produženja poluživota u cirkulaciji (Clark, R. gore navedeno).
Stoga, konjugacija sa polimerima je dobro ustanovljena tehnologija za produžavanje biološke aktivnosti i za smanjenje imunoreaktivnosti terapijskih proteina v kao što su enzimi. Videt, npr., U.S. privremena patentna prijava br. 60/436,020 podneta 26. 12. 2002. i privremene patentne prijave br. 60/479,913 i 60/479,914 obe podnete 20.
06. 2003, čiji su opisi ovde inkorporirani po referenci u potpunosti). Međutim, konjugacija polimera sa proteinima koji se vezuju za receptor a koji funkcionišu baš putem specifičnog vezivanja za receptore na površini ćelija obično 1) interferira sa takvim vezivanjem, 2) značajno smanjuje jačinu transdukcije signala citokina, hemokina, faktora rasta i polipeptidnih hormonskih agonista i 3) značajno smanjuje kompetitivnu sposobnost citokina, hemokina, faktora rasta i antagonista polipeptidnih hormona. Objavljeni primeri takvih konjugata sa smanjenom aktivnošću vezivanja za receptor obuhvataju polimerne konjugate humanog hormona rasta ("hGH") (Clark, R. gore navedeno), hGH antagonista (Ross, R. J. M., et al., 2001, J. Clin. Endocrinol. Metab. 86 : 1716 - 1723), IFN-a (Bailon, P.,et al., 2001, Bioconjug. Chem 12 : 195 - 202; Wylie, D.C., et al., 2001, Pharm. Res. 18 : 1354 - 1360; Wang, Y. S., et al., 2002, Adv. Drug Deliv. Rev. 54 : 547 - 570) i G-CSF (Kinstler, O., et., PCT publikacija broj WO 96/11953; Bowen, S., et al., 1999, Exp. Hematol. 27 : 425 - 432). U ekstremnom slučaju povezivanje polimera za interleukin-15 ("IL-15") prevodi ovaj faktor rasta koji je sličan IL-2 u inhibitor ćelijske proliferacije. (Pettit, D.K., et al., 1997, J. Biol. Chem. 272 : 2312 - 2318). Bez namere da se vezuje za određenu teoriju mehanizam ovih neželjenih efekata pegilacije može da obuhvati steričnu prenapregnutost receptorskih interakcija sa masivnim PEG grupama, neutralizaciju naelektrisanja ili obe ove stavari.
Stoga, postoji potreba za postupcima za proizvodnju konjugata koji sadrže PAG (PEG i/ili PEO), posebno konjugata između takvih polimera rastvorljivih u vodi i proteina koji se vezuju za receptor, uz očuvanje značajne biološke aktivnosti (od najmanje 40%), skoro potpune biološke aktivnosti (npr., od najmanje 80%) ili praktično potpune biološke aktivnosti (npr., od najmanje 90%). Takvi konjugati poseduju prednosti koje obezbeđuje polimerha komponenta kao što su povišena rastvorljivost, stabilnost, poluživot i biološka rastvorljivost in vivo, i pokazuju značajno povišenu jačinu ili upotrebljivost u poređenju sa konvencionalnim polimemim konjugatima, životinje kod koje su konjugati primenjeni u profilaktičke, terapijske ili dijagnostičke svrhe.
Suština pronalaska
Predmetni pronalazak se odnosi na gore identifikovane potrebe i obezbeđuje postupke za dobijanje konjugata polimera koji su rastvorljivi u vodi, npr., poli(etilen glikola) i njegovih derivata sa biološki aktivnim komponentama, posebno sa proteinima koji se vezuju za receptor, posebno sa terapijski ili dijagnostički biološki aktivnim komponentama, kao što su citokini, hemokini, polipetidni hormoni i polipeptidni faktori rasta. Predmetni pronalazak, takođe, obezbeđuje konjugate koji se dobijaju ovim postupcima, u poređenju sa odgovarajućim ne konjugovanim biološki aktivnim komponnentama, konjugati prema predmetnom pronalasku, poseduju povećanu stabilnost, tj., duže vrem upotrebe i duži poluživot in vivo. Dodatno u poređenju sa konjugatima iste biološki aktivne komponente, pripremljene sa lancima polimera koji su nasumično prikačeni za mesta koja su dostupna rastvaraču duž polipeptidnih lanaca, konjzugati, prema predmetnom pronalasku poseduju povećanu aktivnost vezivanja za receptor, koja može da se meri ili da se koristi in vitro, kao i povećanu potenciju in vivo. Predmetni pronalazak, takođe obezbeđuje, navedene poboljšane konjugate za upotrebu u industrijskoj ćelijskoj kulturi. Dalje, predmetni pronalazak obezubeđuje konjugate koji sadrže navedene konjugate, komplete kojisadrže takve konjugate i preparate i postupke za upotrebu tih konjugata i preparata u različitim profilaktičkim, dijagnostičkim i terapijskim režimima.
U jednom rešenju, predmetni pronalazak obezbeđuije postupke za očuvanje sposobnosti vezivanja za receptor citokina hemokina, faktora rasta ili polipeptidnog hormona koji obuhvata selektivno vezivanje jednog ili više sintetskih polimera rastvorljivih u vodi za amino-terminalnu aminokiselin citokina, hemokina, faktora rasta ili polipeptidnog hormona ili njegovog antagoniste, pri čemu je amino-terminalna aminokiselina, locirana na udaljenom mestu od jednog ili od više domena za vezivanje za receptor citokina, hemokina, faktora rasta ili polipeptidnog hormona ili njegovog antagoniste. U povezanom rešenju, predmetni pronalazak obezbeđuje postupke za očuvanje sposobnosti vezivanja za receptor citokina, hemokina, faktora rasta ili polipeptidnog hormona ili njegovog antagoniste koji obuhvata selektivno vezivanje jednog ili više sintetskih polimera rastvorljivih u vodi an ili u blizini jednog ili više mesta glikozilacije citokina, hemokina, faktora rasta ili polipeptidnog hormona ili njegovog antagoniste, pri čemu je jedno ili više glikozilacionih mesta locirano na određenoj udaljenosti od jednog ili više domena za vezivanje za receptor citokina, hemokina, faktora rasta ili polipeptidnog hormona.
Odgovarajući polimeri za upotrebu u postupcima prema predmetnom pronalasku, obuhvataju, bez ograničenja, jedan ili više poli alkilen glikola (uključujući, bez ograničenja, jedan ili više poli(etilen glikola), jedan ili više monometoksi - poli(etilen glikola), ijedan ili više monohidroksipoli(etilen glikola)), jedan ili više polialkilenoksida, jedan ili više polioksirana, jedan ili višepoliolefinskih alkohola, npr., polivinil alkohol, jedan ili više polikarboksilata, jedan ili više poli(vinilpirolidona), jedan ili više poli(oksietilen - oksimetilena), jedan ili više poli(amino kiselina), jedan ili više poliakriloil - morfolina, jedan ili više kopolimera jednog ili više amida i jednog ili više alkilen oksida, jedan ili više dekstrana i jedne ili više heluronskih kiselina. Polimeri koji su pogodni za upotrebu prema predmetnom pronalasku tipično imaju molekulsku masu između 1 kDa i oko 100 kDa, uključujući posebno molekulske mase između 1 kDa i oko 5 kDa, između 10 kDa i oko 20 kDa, između 18 kDa i 60 kDa, između 12 kDa i 30 kDa, ili oko 10 kDa, oko 20 kDa, ili oko 30 kDa.
Mnoštvo citokina, hemokina, faktora rasta ili polipeptidnih hormona, (kao i analoga koji oponašaju, tj., imaju agonističko dejstvo ili antagonizuju biološka dejstva odgovarajućeg citokina, hemokina, faktora rasta ili polipeptinog hormona, što je posredovano njihovim specifičnim receptorima na površini ćelija) pogodno je za upotrebu pri dobijanju konjugata prema predmetnom pronalasku. Ovde spadaju citokini, hemokini, faktori rasta, ili polipeptidni hormoni, koji imaju strukturu četvorostrukog heliksa, (uključujući bez ograničenja, činilac stimulaciju kolonija granulocita (G-CSF), činilac stimulacije kolonija makrofaga (M-CSF), činilac stimulacije granulocita - makrofaga (GM-CSF), leukemija inhibitorni faktor (LIF), eritropoetin (Epo), trombopoetin (Tpo), faktor stem ćelije (SCF), Flt3 ligand, onkostatin M (OSM), interleukin-2 (IL-2), IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12 (p35 podjedinica), IL-13, IL-15, IL-17, interferon - alfa (IFN-a), interferon - beta (IFN-P)
(uključujući IFN-P-lb), konsenzus interferon, prolaktin i hormon rasta kao i njihove
rauteine, varijante, anaioge i derivate); citokine, hemokine, faktore rasta ili polipeptidne hormone, koji poseduju strukturu p-nabora iliP-cilindra (uključujući bez ograničenja, faktor nekroze tumora - alfa (TNF-a), IL-la, IL-ip, 1L-12 (p40 podjedinica), IL-16, epidermalni faktor rasta (EGF), insulinu sličan faktor rasta 1 (IGF-1), bazni fibroblastni faktor rasta (bFGF), kiseli FGF, FGF-4 i faktor rasta keratinocita (KGF; FGF-7), kao i njihove muteine, varijante, anaioge i derivate); zatim citokine, hemokine, faktore rasta ili polipeptidne hormone koji imaju mešovitu a/p strukturu (uključujući bez ograničenja neutrofilni kativirajući peptid-2 (NAP-2), stromalni ćelijski deriviran faktor-la (SDF-la), IL-8, monocitni hemoatraktantni protein-1 (MCP-1), MCP-2, MCP-3, eotaksin-1, eotaksin-2, eotaksin-3, RANTES, inhibitorni faktor mijeloidnog progenitora-1 (MPIF-1), neurotaktin, faktor inhibicije migracije makrofaga (MIF) i sa rastom povezani onkogen/stimulatorna aktivnost rasta melanoma (GRO-a/MGSA), kao i njihove muteine, varijante, anaioge i derivate). Polipeptidni hormoni koji su pogodni za upotrebu u predmetnom pronalasku, obuhvataju bez ograničenja, insulin i anloge insulina koji oponašaju ili antagonizuju biološke efekte insulina posredovane insulinskim receptorima; prolaktin i anaioge prolaktina koji oponašaju ili antagonizuju biološke efekte prolaktina, posredovane prolaktinskim receptorima; i hormon rasta (posebno humani hormon rasta i njegove anaioge) koji oponašaju ili antagonizuju biološke efekte hormona rasta, posredovane receptorima hormona rasta.
Posebno poželjni citokini, hemokini, faktori rasta ili polipeptidni hormoni koji su pogodni za upotrebu prema predmetnom pronalasku, obuhvataju: IL-2; IL-10, IFN-a, IFN-p (uključujući IFG-p-lb); TNF-a; IGF-1, EGF, bFGF; hGH; prolaktin i insulin. Takođe, posebno su pogodni za upotrebu kompetitivni antagonisti napred navedenih citokina, hemokina, faktora rasta ili polipeptidnih hormona, npr., antagonisti TNF-a, hGH ili prolaktina, kao i muteini, varijane i derivati ovih citokina, hemokina, faktora rasta ili polipeptidnih hormona. U određenim rešenjima, jedan ili više polimera je povezano kovalentno (posebno preko sekundarne aminske veze), za a-amino grupu amino-terminalne aminokiseline na citokinu, hemokinu, faktoru rasta ili polipeptidnom hormonu. U drugim rešenjima, jedan ili više polimera je kovalentno povezano sa hemijski reaktivnom bočnom grupom, (npr., hidroksil grupom, sulfhidrilnom grupom, guanidino grupom, imidazol grupom, aminogrupom, karboksil grupom ili derivatom aldehida) amino-terminalne aminokiseline na citokinu, hemokinu, faktoru rasta ili polipeptidnom hormonu. U dodatnim rešenjima, povezivanje polimera za citokin, hemokin, faktor rasta ili polipeptidni hormon za amino-terminalnu aminokiselinu na ili u blizini jednog ili više mesta glikozilacije oponaša poželjne efekte glikozilacije citokina, hemokina, faktora rasta ili polipeptidnog hormona. U povezanim rešenjima, povezivanje polimera za citokin, hemokin, faktor rasta ili polipeptidni hormon na ili u blizini jednog ili više mesta glikozilacije na citokinu, hemokinu, faktoru rasta ili polipeptidnom hormonu oponaša poželjne efekte hiperglikolizacije citokina, hemokina, faktora rasta ili polipeptidnog hormona, pri čemu pojam "hiperglikolizacija" označava kovalentno vezivanje jednostavnih ili kompleksnih ugljenohidratnih grupa kao dodatak onim grupama koje su prisutne u nativnoj strukturi.
Predmetni pronalazak, takođe obezbeđuje konjugate, koji su dobijeni postupcima prema predmetnom pronalasku. Konjugati, prema predmetnom pronalasku, sadrže izabrani citoki, izabrani hemokin, izabrani faktor rasta, izabrani polipeptidni hormon ili ozabrani njegov antagonist, (kao što su oni koji su gore opisani) koji je povezan sa jednim ili sa više sintetskih u vodi rastvorljivih polimera (kao što su oni koji su opisani gore), pri čemu je jedan ili više polimera povezano za amino-terminalnu aminokiselinu citokina hemokina faktora rasta ili polipeptidnog hormona i pri čemu je amino-terminalna aminokiselna locirana na određenoj udaljenosti od jednog ili više domena za vezivanje za receptor, izabranog citokina, hemokina, faktora rasta ili polipeptidnog hormona. Dodatno, konjugati prema predmetnom pronalasku sadrže izabrani citokin, hemokin, faktor rasta ili polipeptidni hormon ili njegov antagonist, (kao što su oni koji su opisani gore), koji je povezan sa jednim ili sa više sintetskih u vodi rastvorljivih polimera (kao što su oni koji su opisani gore), pri čemu je jedan ili više polimera povezano za jedno ili više mesta glikolizacije izabranog citokina, hemokina, faktora rasta ili polipeptidnog hormona ili njegovog antagoniste i pri čemu je jedno ili više mesta glikolizacije locirano na određenoj udalčjenosti od jednog ili od više domena za vezivanje receptora na citokinu, hemokinu, faktoru rasta ili polipeptidnom hormonu ili njegovom antagonisti. Za polimerne konjugate agonista prema predmetnom pronalasku, poželjno je da mesto (mesta) vezivanja za polimer bude udaljeno od svih domena za vezivanje za receptor. Za polimerne konjugate određenih antagonista, prema predmetnom pronalasku, može biti poželjno da je mesto (mesta) povezivanja polimera udaljeno od određenih domena za vezivanje za receptor koja su od ključne važnosti za uspostavljanje vezivanja, ali ne i neophodno udaljeno od svih domena za vezivanje za receptor koja su od ključne važnosti za transdukciju signala preko agoniste. Predmetni pronalazak takođe
obezbeđuje preparate, posebno farmaceutske preparate koji sadrže jedan ili više konjugata, prema predmetnom pronalasku i jednu li više dodatnih komponenti kao što su jedan ili više farmaceutski prihvatljivih diluenata, ekscipijenata ili nosilaca. Predmetni pronalazak, takođe obezbeđuje komplete koji sadrže jedan ili više konjugata, preparata i/ili farmaceutskih preparata, prema predmetnom pronalasku.
Predmetni pronalazak, takođe, obezbeđuje postupke za sprečavanje nastanka, dijagnostikovanje ili tretiranje fizičkog poremećaja kod životinja, (npr., kod nekog sisara kao što je čovek), koji pati ili kod koga postoji predispozicija za razvoj fizičkog poremećaja. Takvi postupci mogu da obuhvataju primenu, kod životinje efikasne količine jednog ili više konjugata, preparata ili farmaceutskih preparata prema predmetnom pronalasku. Fizički poremećaji koji se na odgovarajući način tretiraju ili čiji se nastanak sprečava primenom postupaka prema predmetnom pronalasku, obuhvataju bez ograničenja, kancere (npr., kancer dojke, materice, prostate, testisa, pluća, leukemiju, limfom, kancer debelog creva, gastrointestinalni kancer, kancer pankreasa, mokraćne bešike, bubrega, kosti, neurološki kancer, kancer glave i vrata, kancer kože, sarkom, adenom, karcinom i mijelom); infektivne bolesti (npr., bakterijske bolesti, gljivične bolesti, parazitske bolesti, i virusne bolesti, (kao što su virusni hepatitis, oboljenje izazvano kardiotropnim virusom, HIV/AIDS i slične)); genetske poremećaje (npr., anemiju, neutropeniju, trombocitopeniju, hemofiliju, patuljasti rast i ozbiljnu kombinovanu imunodeifcijentnu bolest ("SCID"); autoimune poremećaje (npr., psorijazu, sistemske lupus eri tome todes i reumatoidni artritis) i neurodegenerativne poremećaje (npr., razne oblike ili stadijume multiple skleroze, Krojcfeld - Jakobsove bolesti, Alchajmerove bolesti i sličnih).
Druga poželjna rešenja prema predmetnom pronalasku će biti jasna prosečnom stručnjaku na osnovu sledećih crteža i opisa predmetnog pronalaska, kao i patentnih zahteva.
Kratak opis crteža
Slike 1 do 8 prikazuju molekularne modele različitih citokina i faktora rasta koji su dobijeni korišćenjem RasMol softvera (Sayle. R.A., et al., 1995, Trends Biochem. Sci. 20 : 374 - 376) na osnovu kristalografskih podataka. Svaki od modela je predstavljen u "traci" ili u formatu "crtanog filma", izuzev određenih ostataka od posebnog interesa, koji su prikazani u formatu "lopta-i-štap". Ovi formati su opcije koje su izabrane korišćenjem RasMol softvera. Tamni delovi traka predstavljaju domene citokina i faktora rasta za koje je saopšteno da su uključeni u vezivanju za njihove receptore. Za svaku strukturu naznačen je pristupni kod u banci podataka proteina ("PDB") (videti, Laskovvski, R. A., 2001, Nucleic Acid Res. 29 : 221 - 222; Peitsch, M.C., 2002, Bioinformatics 18 : 934 - 938; Schein, C.H. 2002, Curr. Pharm. Des. 8 : 2113 - 2129).
Slika la prikazuje model interferona-a-2a (sekvenca čiji je ID broj 1), kod koga su četiri lizinska ostatka (Lys 31, Lys 121, Lys 131, i Lys 134) za koje je saopšteno da su primarna mesta pegilacije u Roche-ovom PEG-interferonskom proizvodu, PEGASYS<®>, prikazana u formatu "lopta-i-štap" (zasnovano na podacima Bailon, P., et al., gore navedeno). Regioni koji su uključeni u vezivanje za odgovarajući receptor ("Vezna mesta 1 i 2") su identifikovani. Sva četiri lizinska ostaka za koje je saopšteno da su pegilirana u preparatu PEGASYS<®>se nalaze u regionu veznog mesta 1 (PDB kod 1ITF).
Slika lb prikazuje model interferona-a-2b (sekvenca čiji je ID broj 2), kod koga su ostaci za koje je saopšteno da su glavna mesta pegilacije u Schering-Plough-ovom preparatu PEG-Intron<®>(His 34, Lys 31, Lys 121, Tyr 129 i Lys 131) prikazani u formatu "lopta-i-štap" (na osnovu podataka Wylie, D. C, et al., već navedeno). Ovi aminokiselinski ostaci se nalaze u regionu vezujućeg mesta 1.
Slika lc prkazuje model interferon-a-2b, u kome je amino-terminalni cisteinski ostatak ("Cys 1") meta pegilacije prema predmetnom pronalasku, prikazan u formatu "lopta-i-štap". Cys 1 je udaljen od veznih mesta 1 i 2.
Slika ld prikazuje isti model interferona-a-2b, koji je prikazan na Slici lc, koji je jedan lanac PEG od 20 kDa prikačen na N-terminalnom cisteinskom ostatku. ("Cys 1"). Struktura PEG je dobijena korišćenjem adaptacije programa opisanog od strane Lee, L. S., et al., 1999, Bioconjug. Chem. 10 : 973 - 981, pri čemu je slika prikazana u odnosima koji postoje prema proteinu.
Slika 2 prikazuje molekulski model humanog interferona-(3-la (sekvenca čiji je ID broj 3), kod koga je naznačeno nekoliko lizinskih ostataka koji se nalaze unutar ili u blizini domena za vezivanje za receptor (Lys 19, Lys 33, Lys 99 i Lys 134). Dodatno, mesto glikolizacije (Asn,:80) i N-terminalni metionin ostatak ("Met 1") prikazani su u formatu "lopta-i-štap" (zasnovano na podacima Karpusas, M. et al., 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94 : 11813 - 11818; Karpusas, M, et al., 1998, Cell Mol. Life Sci. 54 : 1203 - 1216; Runkel, L., et al, 2000, Biochemistry 39 : 2538 - 2551). Met 1 je udaljen od veznih mesta 1 i2, a nekoliko lizinskih ostataka je locirano u okviru domena za vezivanje za receptor, (PDB ko 1AUI). Struktura interferona-P-lb se razlikuje od strukture interferona-P-la u tome što nedostaje N-terminalni metioninski ostatak i ugljenohidratna grupa, kao i u tome što je serinski ostatak supstituisan sa cisteinskim ostatkom (Cys 17).
Slika 3 prikazuje molekulski model humanog činioca stimulacije kolonija granulocita-makrofaga ("GM-CSF"; sekvenca čiji je ID broj 5), kod koga su tri lizinska ostatka (Lys 72, Lys 107 i Lys 111) koji se nalaze u okviru domena za vezivanje za receptor kao i prvi aminokiselinski ostatak blizu amino terminala koji se vizuelizuje u kristalnoj strukturi ("Arg 4"), prikazani u formatu "lopta-i-štap" (zasnovano na podacima Rozovvski, D.A., et al., 1996, Proteins 26 : 304 - 313). Amino-terminalni region GM-CSF je udaljen od veznih mesta 1 i 2 (PDB kod 2GMF).
Slika 4 prikazuje molekulski model humanog interleukina-2 (IL-2); (sekvenca čiji je ID broj 6), kod koga su aminokiselinski ostaci za koje je saopšteno da su uključeni u vezivanje za svaki od tri receptora (a, p i y) prikazani u formatu "lopta i štap", kao i nekoliko lizinskih ostataka koji se nalaze u okviru ili u blizini domena za vezivanje za receptor. Najbliži aminokiselinski ostatak do amino terminala koji je vizuelizovan u kristalnoj strukturi jeste serin 6 ("Ser 6"), koji je udaljen od domena za vezivanje za receptor (na osnovu podataka Bambrough, P., et al., 1994, Structure 2 : 839 - 851; Petit, D. K. et al., gore navedeno). (PDB kod 3INK).
Slika 5 pokazuje molekulski model humanog epidermalnog faktora rasta ("EGF"; sekvenca čiji je ID broj 7) i formatu "crtanog filma", sa izuzetkom ostataka koji su uključeni u vezivanje za receptor i dva lizinska ostatka (Lys 28 i Lys 48), koji su u blizini regiona za vezivanje za receptor. Bisulfiđne veze unutar lanca su prikazane kao isprekidane linije. Aminokiselinski ostatak koji je najbliži amino terminalu i koji je vizuelizovan u kristalnoj strkturi na kojoj se ovaj model zasniva jeste cistein 6 ("Cys 6")
(na osnovu podataka od Carpenter, G., et al., 1990, J. Biol. Chem. 265 : 7709 - 7712; Lu, H. S., et al., 2001, J. Biol. Chem. 276 : 34913 - 34917). Fleksibilni deo amino-teminala EGF (ostaci 1 - 5) koji nije vizuelizovan u kristalnoj strukturi izgleda da se ne »nalazi u regionu odgovornom za vezivanje za receptor (PDB kod 1JL9).
Slika 6 prikazuje molekulski model baznog fibroblastnog faktora rasta ("bFGF", dekvenca Čiji je ID broj 8) u formatu "crtanog filma" kod koga su ostaci koji su uključeni u vezivanje za receptore i za heparin identifikovani predstavljanjem u foramatu "lopta i štap" (na osnovu podataka iz Shlessinger, J., et al., 2000, Mol. Cell 6 : 743 - 750). Prvih 12 aminokiselinskih ostataka sa amino-terminala nije uključeno u vezivanje za receptor (PDB kod 1FQ9).
Slika 7 prikazuje molekulski model insulinu sličnog faktora rasta - 1 ("IGF-1"; sekvenca čiji je ID broj 9) u formatu "crtanog filma" sa izuzetkom ostataka koji su uključeni u vezivanje za receptor (23 - 25 i 28 - 37) i ostatka glutaminske kiseline 3 ("Glu 3"), koji predstavlja najbliži mainokiselinski ostatak amino - terminalu koji je vizuelizovan u kristalnoj strukturi. Dva lizinska ostatka su identifikovana od kojih je jedan (Lys 27) u blizini domena za vezivanje za receptor, a drugi je udaljen od domena za vezivanje za receptor (na osnovu podataka Brzozowski, A.M., et al., 2002, Biochemistry, 41 : 9389 - 9397). Amino terminal IGF-1 je udaljen od domena za vezivanje za receptor (PDB kod 1GZR).
Slika 8 pokazuje molekulski model interferona-y ("IFN-y", sekvenca čiji je ID broj 4), koji je homodimer. Kako bi se razjasnile interakcije između dva monopeptidna lanca, jedan monomer ("lanac A") je prikazan u formatu "trake" a drugi ("lanac B") je prikazan u formatu "osovine". Lizinski ostaci (prikazani u svetlu formata "lopta i štap") se javljaju duž polipeptidnog lanca uključujući i regione koji su uključeni u uspostavljanju kontakta između monomera ili su u blizini aminokiselinskih ostataka koji su uključeni u vezivanje za receptor. Aminoterminalni region IFN-y je udaljen od mesta dimerizacije, ali je glutamin 1 (Gln 1) uključen u vezivanje za receptor (Thiel, D. J., et al., 2000, Structure 8 : 927 - 936; PDB kod 1FG9).
Slika 9 prikazuje frakcioniranje ne pegiliranog interferona-a-2b ("IFN"), mono pegiliranog interferona-a-2b ("PEG i-IFN") i di pegiliranog interferona-a^b ("PEG2-IFN") primenom hromatografije sa izmenom katjona, na reakcionu smešu, koja sadrži IFN, mPEG - aldehid od 20 kDa i redukujuće sredstvo.
Slika 10 prikazuje hromato gr afsku analizu sa isključivanjem po veličini reakcione smeše koja frakcionira kao što je prikazano na Slici 9 i analizu izabranih frakcija prikupljenih na jednoj izmenjivačkoj koloni, čiji su rezultati prikazani na slici 9.
Slika 11 prikazuje frakcioniranje reakcione smeše koja sadrži humani IL-2, mPEG-aldehid od 20 kDa i redukujuće sredstvo pomoću hromatografije sa izmenom katjona. Pod naznačenim uslovima za eluiranje rezidualni ne pegilirani IL-2 nije eluiran sa kolone, što se razlikuje od rezultata za interferon-a-2b koji su prikazani na Slici 9.
Slika 12 prikazuje hromato gr afsku analizu sa ekskluzijom po veličini reakcione smeše koja je frakcionirana na način prikazan na Slici 11, kao i analizu izabranih frakcija eluiranih sa te kolone.
Slika 13 prikazujeelektroforetske analize reakcione smeše pegiliranog interleukina-2, ("PEG-IL-2") kao i frakcije iz kolone sa izmenom katjona, čiji je hromato graf prikazan naSlicirl 1.
Detaljanopispronalaska
Osim ukoliko nije definisano drugačije, svi tehnički i naučni pojmovi koji se ovde koriste poseduju isto značenje koje je uobičajeno od strane stručnjaka kojima je ovaj pronalazak i namenjen. Iako se u praksi ili ispitivanju predmetnog pronalasku mogu upotrebiti bilo koji postupci ili materijali koji su slični ili ekvivalentni onima koji su ovde opisani, poželjni postupci i materijali su opisani u tekstu koji sledi.
Definicije
Otprilike.Kao što se ovde koristi kada se odnosi na bilo koju numeričku vrednost, pojam "otprilike" označava vrednosto od ± 10% navedene vrednosti (npr., "oko 50 °C" obuhvata opseg temperatura od 45 do 55 °C, inkluzivno; slično tome "oko 100 mM" obuhvata opseg koncentracija od 90 do 110 mM, inkluzivno).
Aminokiselinski ostatak. Kao što se ovde koristi, pojam "aminokiselinski ostatak" označava specifičnu amino kiselinu, obično dehidriranu kao rezultat njenog učešća u dve peptidne veze u polipeptidnom skeletu ili bočnom lancu, ali takođe i na aminokiselinu koja je uključena u stvaranje jedne peptidne veze, kao što je to slučaj na svakom od krajeva linearnog polipeptidnog lanca. Aminokiselinski ostaci se označavaju šiframa od 3 slova ili šiframa od 1 slova, kako je to uobičajeno u struci.
Antagonista. Kao što se ovde koristi, pojam "antagonista" označava jedinjenje, molekul, grupu ili kompleks, koji smanjuje, značajno smanjuje ili kompletno inhibira biološka i/ili fiziološka dejstva datog citokina, hemokina, faktora rasta ili polipeptidnog hormona na ćeliju, tkivo ili organizam, što je posredovano receptorima za dati citokin, hemokin, faktor rasta ili polipeptidni hormon. Antagonisti mogu da ispolje takva dejstva na različite načine, uključujući, bez ograničenja, kompeticiju sa agonistom za mesta vezivanja ili receptore na površini ćelija. Interakcijom sa agonistom, na takav, način da se smanji, značajno smanji ili inhibira sposobnost agoniste da se veže za receptore na površini ćelije; vezivanjem za i indukovanjem konformacione promene receptora na ćelijskoj površini, tako da receptori zauzmu oblik za koji agonista više ne može da se veže (ili može da se veže sa smanjenim ili značajno smanjenim afinitetom i/ili efikasnošću); indukovanje fizuiološke promene (npr., povećanje koncentracije intracelularnih signalnih kompleksa; povećanje aktivnost transkripcionih inhibitora; smanjenje ekspresije površinskih receptora za ligand itd.) u ćelijama, tkivima ili organizmima, tako da je vezivanje agoniste ili fiziološki signal koji je indukovan putem agoniste nakon njegovog vezivanja za ćeliju smanjen, značajno smanjen, ili kompletno inhibiran; kao i drugim mehanizmima preko kojih antagonisti mogu da ispolje svoja dejstva, a koji su poznati prosečnom stručnjaku. Kao što prosečni stručnjak razume, antagonista može da ima sličnu struktuu sa Ugandom koga antagonizuje (npr., antagonista može biti mutein, varijanta, fragment ili derivat agoniste) ili može posedovati potpuno ne povezanu strukturu sa agonistom.
Biološki aktivna komponenta. Kao što se ovde koristi, pojam "biološki aktivna komponenta" označava jedinjenje, molekul, grupu ili kompleks, koji poseduje određenu biološku aktivnost in vivo, in vitro, ex vivo na ćeliju tkivo, organ ili organizam, a koji je sposoban da se veže sa jednim ili sa više polialkilen glikola čuime se dobijaju konjugati prema predmetnom pronalasku. Poželjne biološki aktivne komponente obuhvataju, bez ograničenja, proteine i polipeptide, kao što su oni koji su opisani ovde.
Vezan. Kao što se ovde koristi, pojam "vezan" označava vezivanje ili povezivanje koje može biti kovalentno, npr., hemijsko povezivanje ili nekovalentno, npr., jonske interakcije, hidrofobne interakcije, vodonične veze, itd. Kovalentne veze mogu biti, npr., estarske, etarske, fosfoestarske, tioestarske, tioetarske, uretanske, amidne, aminske, peptidne, imidne, hidrazonske, hidrazidske, veze ugljenik-sumpor, veze ugljenik-fosfor i si. Pojam "veza" je širi i obuhvata pojmove kao što su "povezan", "konjugovan" i "prikačen".
Konjugat/konjugacija. Kao što se ovde koristi, pojam "konjugat" označava proizvod kovalentnog vezivanja nekog polimera, npr., PEG ili PEO, za biološki aktivnu1 komponentu, npr., ua protein ili glikoprotein. Pojam "konjugacija" označava stvaranje konjugata kao što je definisano u prethodnoj rečenici. U predmetnom pronalasku može biti korišćen bilo koji postupak koji se normalno koristi od strane stručnjaka za konjugaciju polimera sa biološki aktivnim materijalima.
Povezan. Pojam "povezan" kao što se ovde koristi označava povezivanje kovalentnim vezama ili jakim ne kovalentnim interakcijama, tipično i poželjno povezivanje kovalentnim vezama. U predmetnom pronalasku može biti upotrebljen bilo koji postupak koji se normalno koristi od strane stručnjaka za povezivanje biološki aktivnih materijala.
Citokin/hemokin. Kao što se ovde koristi, pojam "citokin" se defmiše kao sekretorni regulatorni protein koji kontroliše preživljavanje rast, diferencijaciju i/ili efektorsku funkciju ćelije na endokrini, parakrini ili autokrini način (revijski prikazano u Nicola, N. A. gore navedeno; Kossiakoff, A. A., et al., gore nacedeno). Analogno tome kao što se ovde koristi, pojam "hemokin" se definiše kao član porodice strukturno povezanih glikproteina sa snažnim aktivnostima aktivacije leukocita i/ili hemotakse (revijski prikazano u Oppenheim, J. J. et al., gore navedeno). Shodno ovim definicijama citokini i hemokini obuhvataju interleukine, faktore stimulacija kolonija, faktore rasta i druge peptidne faktore koji su proizvedeni od strane različitih ćelija uključujući, bez ograničenja one koje su ovde specifično opisane ili predstavljene primerima. Kao i njihovi bliski rođaci, polipeptidni hormoni i faktori rasta, citokini i hemokini započinju svoju regulatornu funkciju vezivanjem za specifične receptorske proteine na površini njihovih ciljnih ćelija.
Oboljenje, poremećaj, stanje. Kao što se ovde koristi, pojmovi "oboljenje" ili "poremećaj" označavaju bilo koje ne željeno stanje kod čoveka>ili životinje uključujući tumore, kancere, alergije, zavisnost, autoimunost, infekciju, trovanje ili oštećenje optimalne mentalne ili telesne funkcije. Pojam "stanja" kao što se ovde koristi obuhvata oboljena i poremećaje, ali se takođe odnosi i na fiziološka stanja. Na primer, fertilnost je fiziološko stanje a ne oboljenje ili poremećaj. Preparati, prema predmetnom pronalasku, koji su opgodni za sprečavanje trudnoće, smanjenjem fertilnosti treba zbog toga da budu opisani kao sredstva za tretman stanja (fertilnosti) a ne za tretman poremećaja ili oboljenja. Druga stanja su poznata prosečnim stručnjacima.
Efikasna količina. Kao što se ovde koristi, pojam "efikasna količina" označava količinu datog konjugata ili preparata koja je neophodna ili dovoljna da se ostvari željeni biološki efekat. Efikasna količina datog preparata ili konjugata prema predmetnom pronalasku, jeste ona količina kojom se postiže ovaj izabrani rezultat, a ta količina može da se odredi na rutinski način od strane stručnjaka korišćenjem testova koji su poznati u struci i/ili koji su opisani ovde bez ne potrebne dodatne eksperimentacije. Na primer, efikasna količina za tretiranje deficijencije imunog sistema bila bi ona količina koja je neophodna da izazove aktivaciju imunog sistema, što vodi razvoju antige-specifičnih imunih odgovora nakon izlaganja antigena. Ovaj pojam je takođe sinonim sa pojmom "dovoljna količina". Efikasna količina za bilo koju primenu može da varira u zavisnosti od činilaca kao što su oboljenje ili stanje koje se tretira, određeni preparat koji se primenjuje, način primene, veličina subjekta i/ili ozbiljnost obolčjena ili stanja. Prosečni stručnjak amože da empirijski odredi efikasnu količinu određenog konjugataili preparata prema predmetnom pronalasku bez nepotrebne eksperimentacije.
Jedan, jedna, jedno. Kada se pojam "jedan", "jedna", "jedno" koristi u ovom opisu, oni označavaju "najmanje jedan" ili "jedan ili više", osim ukolio nije naznačeno drugačije.
PEG. Kao što se ovde koristi, pojam "PEG", označava sve polimere etilen oksida, linearne ili razgranate ili višekrake kao i one koji poseduju terminalnu grupu ili koji su terminalno hidroksilirani. Pojam "PEG" obuhvata one polimere koji su poznati u strucikao poli(etilen glikol), metoksipoli(etilen glikol) ili mPEG ili poli(etilen glikol)-monometil etar, alkoksipoli(etilen glikol), poli(etilen oksid) ili PEO, a-metil-co-hidroksi-poli(oksi -1,2- etandiil) i polioksiran, među ostalim imenima koja se koriste u struci za polimere etilen oksida.
Pegilacija, pegiliran i lažno pegiliran. Kao što se ovde koristi, pojam "pegilacija" označava bilo koji proces kojim se kovalentno povezuje PEG sa biološki aktivnim ciljnim molekulom posebno sa proteinom koji se vezuje za receptor. Tako dobijeni konjugat se označava kao "pegiliran". Kao što se ovde koristi, pojam "lažno pegiliran" označava deo proteina ili druge biološki aktivne komponente u pegilacijonoj reakcionoj smeši sa kojim PEG nije kovalerntno povezan. U svakom slučaju, lažno pegilirani proizvod može da bude izmenjen tokom reakcije il nakon koraka prečišćavanja kao posledica izlaganja redekujućem sredstvu tokom pegilacije, putem reduktivne pegilacije i/ili nakon uklanjanja jednog ili više inhibitornih sredstava, jedinjenja itd., tokom koraka obrade i/ili prečišćavanja.
Polipeptid. Kao što se ovde koristi, pojam "polipeptid" označava molekul koji je sastavljen od monomera, (amino kiselina), koje su linearno povezane amidnim vezama (takođe poznatim i kao peptidnim vezama). Pojam označava molekulski lanac aminokiselina i ne odnosi se na specifičnu dužinu proizvoda. Stoga, peptidi, dipeptidi, tripeptidi, oligopeptidi i proteini su obuhvaćeni definicijom polipeptida. Ovaj pojam se takođe odnosi na proizvode post-ekspresionih modifikacija polipeptida, npr., na proizvode glikolizacije, hiper glikolizacije, alkilacije, fosferilacije i si. Proizvod može biti izveden iz prirodnog biološkog izvora ili može biti izveden rekombinantnom tehnologijom, ali nije neophodno da bude transliran sa za odgovarajuće sekvence nukleinskih kiselina. On može da se obije na bilo koji način uključujući i hemijsku sintezu.
Protein i glikoprotein. Kao što se ovde koristi, pojam "protein" se odnosi na polipeptid koji je generalno veličine od oko 10 ili više, 20 ili više, 25 ili više, 50 ili više, 75 ili više, 100 ili više, 200 ili više, 500 ili više, 1000 ili više, ili 2000 ili više amino kiselina. Proteini generalno poseduju definisanu trodimenzionalnu strukturu, iako nije neophodno da poseduju takvu strukturu i obično se označavaju kao presavijeni, za razliku od peptida ili polipeptida koji obično ne poseduju definisanu trodimenzionalnu strukturu, već mogu da usvoje veliki broj različitih konformacija i označavaju se kao ne savijeni. Peptidi, međuti, mogu da poseduju definisanu trodimenzionalnu strukturu. Kao što se ovde koristi, pojam "glikoprotein" označava protein koji je povezan sa najmanje jednom ugljenohidratnom grupom koja je prikačena za protein preko bočnog lanca koji sadrži kiseonik ili azot, koji pripada nekom aminokiselinskom ostatku, npr., serinskom ostatku ili asparaginskom ostatku.
Udaljen. Kao što se ovde koristi, pojam "udaljen" (kao kod "udaljena n-terminalna kiselina" ili "udaljeno mesto glikolizacije") označava strukturu kod koje je položaj jednog ili više mesta za vezivanje za jedan ili više polimera na proteinu daleko ili prostorno udaljen od jednog ili više regiona za vezivanje za receptor, ili domena proteina, što se procenjuje molekulskim modelovanjem. Konjugacija polimera na takvom udaljenom mestu za vezivanje (obično N-terminalna aminokiselina (za proteine koji se vezuju ta receptor i koji se ovde označavaju kao "udaljeni N-terminal" ili "RN" proteini koji se vezuju za receptor) ili jedna ili više ugljenohidratnih grupa ili mesta za glikozilaciju na glikoproteinu (za proteine koji se vezuju za receptor i koji se zato označavaju kao "udaljena glikozilacija" ili RG proteini koji se vezuju za receptor)) ne dovodi do značajne sterične prenapregnutosti pri vezivanju proteina za svoj raceptor. zato, amino-terminalne aminokiseline il mesta glikozilacije na citokinu, hemokinu, faktoru rasta ili poipeptidnom hormonu je "locirano daleko od jednog ili više domena za vezivanje za receptor", citokina, hemokina, faktora rasta ili poipeptidnog hormona, kada konjugacija (npr., kovalentno povezivanje) u vodi rastvorljivog polimera za aminoterminalnu aminokiselinu ili mesto glikozilacije, respektivno, ne interferira značajno sa sposobnošću citokina, hemokina, faktora rasta ili poipeptidnog hormona da se veže za svoj receptor, posebno za receptore na površini ćelija. Takođe otkriveno je da dati citokin, hemokin, faktor rasta ili poipeptidni hormon može da sadrži više od jednog domena za vezivanje za receptor. U takvim situacijama amino-terminalna aminokiselina ili mesto glikozilacije citokina, hemokina, faktora rasta ili poipeptidnog hormona može da bude locirano na udaljenosti od takvog domena ili od jednog ili od više od jednog od takvih domena a da se pri tome smatra daje još uvek "locirano na udaljenosti od jednog ili od više domena za vezivanje za receptor", sve dok konjugacija amino-terminalne aminokiseline ili mesta glikozilacije ne interferira značajno sa vezivanjem citokina, hemokina, faktora rasta ili poipeptidnog hormona sa njegovim receptorima preko jednog ili više domena za vezivanje za receptor. Da li ili ne konjugacija interferira značajno sa sposobnošću proteina da se veže za receptor može da se proceni korišćenjem u strui poznatih testova vezivanja liganda za receptor sa kojima je upoznat stručnjak.
Postupci za procenu vezivanja liganda za receptor, obuhvataju, bez ograničenja testove kompetitivnog vezivanja, testove radioreceptorskog vezivanja, ćelijske testove, merenja površinske plazmatske rezonance, brojanje scintilacija i ultracentrifugiranje.
Kao što je prikazano na Slici ld ove specifikacije, PEG je dugački i fleksibilni polimer koji zauzima veliku zapreminu u rastvoru u odnosu na protein slične molekulske mase. Iako aminokiselinski ostatak za koji je PEG povezan može biti udaljen od jednog ili od više mesta za vezivanje receptora, delovi ovog polimera mogu da interferiraju, u određenoj meri, sa vezivanjem za reeptor,. Verovatnoća takvog interferiranja se povećava sa povećanjem molekulske mase, a tako i sa zapreminom koju polimer zauzima u rastvoru. Konačno, pegilacija koja je udaljena od regiona za vezivanje za receptor, interferira manje sa vezivanjem za receptor do nasumične pegilacije.
Značajno, značajan. Kao što se ovde koristi, za konjugaciju proteina se kaže da ne interferira "značajno" sa sposobnošću proteina da se vezuje za svoj receptor ukoliko je brzina i/ili snaga vezivanja konjugovanog proteina sa receptorom nije manja od oko 40%, oko 50%, oko 65%, oko 70%, oko 75%, oko 80%, oko 85%, oko 80%, oko 91%, oko 92%, oko 93%, oko 94%, oko 95%, oko 96%, oko 97%, oko 98%, oko 99% ili oko 100% ili više, u odnosu na brzinu vezivanja i/ili snagu vezivanja odgovarajućeg citokina, hemokina, faktora rasta ili polipeptidnog hormona koji nije konjugovan.
Tretman. Kao što se ovde koristi, pojam "tretman", "lečiti", "lečen", ili "tretiranje" označava profilaksu i/ili terapiju. Kada se koristi u kontekstu infektivnog oboljenja, pojam može da označava profilaktički tretman koji pojačava otpornost subjekta prema infekciji odrđenim patogenom, ili drugim rečima koji smanjuje verovatnoću da će subjekat postati inficiran patogenom ili da će pokazati znake oboljenja koji se mogu pripisati infekciji, kao i tretman nakon što je subjekat postao infciran u cilju borbe protiv infekcije, npr., da bi se smanjila ili eliminisala infekcija ili da bi se sprečilo da se stanje pogorša.
Opšta razmatranja
Predmetni pronalazak obezbeđuje postupke, za sintezu polimetnih konjugata proteina koji se vezuju za receptor, koji neočekivano zadržavaju visok afinitet vezivanja za receptor u odnosu na polimerne konjugate istih proteina koji se vezuju za receptor, kod kojih je jedan ili više polimera prikačeno nasumično. Pomoću upotrebe klistalografije x-zracima i na osnovu strukturnih analiza zasnovanih na nuklearnoj magnetnoj rezonanaci, mutacionom analizom i pomoću softvera za molekularno modelovanje pronalazači predmetnog pronalaska su identifikovali ciljna mesta za pegilaciju citokina, hemokina, faktora rasta ili polipeptidnog hormona koja su uključena ili nisu uključena u proces vezivanja za odgovarajuće receptore. Kao jedan od klasa proteina ovi citokini, hemokini, faktori rasta i polipeptidni hormonski agonisti i antagonisti, ovde se označavaju kao proteini koji se vezuju za receptor. Izborom strategije sinteze koja usmerava povezivanje polimera za regione za vezivanje za receptor, koji nisu uključeni u interakcije sa receptorom, izbegavaju se određene neželjene sterične kolizije, a nastali polimerni konjugati zadržavaju neobično visoku potenciju. Navedeni proteini koji se vezuju za receptor koji poseduju aminoterminalni ostatak koji je udaljen od jednog ili više regiona ili domena za vezivanje za receptor su ovde definisani kao proteini koji se vezuju z areceptor "sa udaljenim N-terminalom" ili "RN" proteini koji se vezuju za receptor. Ovde spadaju svi citokini, hemokini, faktori rasta i polipeptidni hormoni ili njihovi antagonisti koji poseduju amino-terminalnu aminokiselinu koja je locirana na odaljenosti od mesta za vezivanje za receptor određenog proteina.
U drugom rešenju, prema predmetnom pronalasku, dobijaju se konjugati koji sadrže jedan ili više sintetskih polimera (jedan ili iše poli(etilen glikola)) koji su kovalentno povezani sa citokinima, hemokinima, faktorima rasta i polipeptidnim hormonima koji imaju prirodna mesta glikozilacije udaljena od jednog ili od više regiona ili domena za vezivanje za receptor. Shodno ovom rešenju, predmetnog pronalaska, biološki aktivne komponente, npr., proteini ovih konjugata pokazuju dobro očuvan afinitet za vezivanje za receptor, kada se sintetski polimeri vezuju za region mesta glikozilacije. Ova potklasa proteina koji se vezuju za receptor se ovde označava kao "RG" proteini koji se vezuju za receptor. Kada se hidrofilni ili antipatični polimer selektivno veže na ili au blizini takvog "udaljenog" mesta glikozilacije, posebno kada je ciljni protein ne glikozilirani oblik proteina koji je prirodno glikoziliran, polimer može da oponaša poželjna dejstva prirodnog ugljenog hidrata, npr., dejstva na agregaciju, stabilnost i/ili rastvorljivost, pa se zato njegovo povezivanje ovdve označava kao "pseudoglikozilacija". Stoga, predmetni pronalazak obezbeđuje postupke za sintezu konjugata u kojima povezivanje sintetskog polimera koje je specifično za mesto efikasno zamenjue prirodne ugljenohidratne grupe. Nastala pseudoglikozilacija doprinosi poboljšanoj rastvorljivosti, smanjenoj sposobnosti stvaranja agregata i usporenom klirensu iz cirkulacije, u poređenju sa drugim ne glikoziliranim oblicima proteina. Ovaj pristup je zato posebno pogodan za dobijanje konjugata preparata proteina koji su stvoreni rekombinantnim DNK tehnikama u prokariotskim ćelijama - domaćinima (bakterijama kao što je E. Coli), jer prokariotski organizmi generalno ne glikoziliraju proteine koje eksprimiraju. Analogno tome, selektivna pegilacija ugljenohidratne grupe glikoproteina može da dovede do "peudo hiperglikozilacije" glikoproteina. Ovaj proces je opisan, npr., od strane C. Bona, et al., u PCT publikaciji broj WO 96/40731, čiji je opis ovde inkorporiran po referenci u potpunosti. Ovaj pristup je posebno pogodan za dobijanje konjugata i preparata proteina koji se stvaraju rekombinantnim DNK tehnikama u eukariotskim ćelijama - domaćinima, (npr., u gljivicama, ćelijama biljaka i životinjskim ćelijama, uključujući insekatske i sisarske ćelije) jer eukariotski organizmi generalno glikoziliraju proteine koje eksprimiraju, ukoliko ovi proteini sadrže prirodne signale za glikozilaciju ili ukoliko se signali za glikozilaciju uvedu rekombinantnom DNK tehnologijom. Navedeni pseudoglikozilirani i pseudo - hiperglikozilirani RG proteini koji se vezuju za receptor su obuhvaćeni obimom zaštite predmetnog pronalaska.
Predmetni pronalazak, takođe obuhvata polimerne konjugacije RN proteina za vezivanje za receptor koji zadržavaju značajnu, skoro kompletnu ili praktično kompletnu aktivnost vezivanja za receptor, kao i pseudoglikozilirane ili pseudo - hiperglikozilirane RG proteine koji se vezuju za receptor, koji zadržavaju značajnu skoro kompletnu ili praktično kompletnu aktivnost vezivanja za receptor. Kao što se ovde koristi, za citokin, hemokin, faktor rasta ili polipeptidni hormon, se kaže da "zadržava značajnu, skoro kompletnu ili praktično kompletnu aktivnost vezivanja za receptor", onda kada je konjugovan sa jednim ili sa više polimera arastvorenih u vodi, prema predmetnom pronalasku, onda kada koncentracija citokina, hemokina, faktora rasta ili polipeptidnog hormona ne interferira značajno sa sposobnošću proteina da se vezuje za svoje receptore, tj., onda kada je brzina i/ili afinitet vezivanja konjugovanog proteina za njegov odgovarajući receptor nije manja od oko 40%, oko 50%, oko 65%, oko 70%, oko 75%, oko 80%, oko 85%, oko 80%, oko 91%, oko 92%, oko 93%, oko 94%, oko 95%, oko 96%, oko 97%, oko 98%, oko 99% ili oko 100% ili više, u odnosu na brzinu vezivanja i/ili afinitet vezivanja ne konjugovanog oblika odgovarajućeg proteinaTakođe, obimom zaštite predmetnog pronalaska su obuhvaćeni polimerni konjugati onih proteina koji se vezuju za receptor koji su klasifikovani kao "RN" ili "RG" proteini koji se vezuju z areceptor. Dva primera ovih poslednjih proteina su interferon-p (posebno interferon-P-lb) i IL-2.
U dodatnim rešenjima, predmetni pronalazak obezbeđuje postupke za sintezu polimernih konjugata proteina koji se vezuju za receptor, koji neočekivano zadržavaju visoku aktivnost vezivanja za receptor u odnosu na polimerne konjugate istih proteina koji se vezuju za receptor u kojima je jedan ili više polimera povezano nasumično. Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje konjugate dobijene takvim postupcima, kao i preparate koji sadrže jedan ili više ovih konjugata prema predmetnom pronalasku, koji dalje mogu da sadrže jednu ili više dodatnih komponenti ili reagenasa, kao što su jedna ili više pugerskih soli, jedan ili više ugljenohidratnih ekscipijenata, jedan ili više nosilaca proteina, jedan ili više enzima, jedan ili više detergenatajedan ili više molekula nukleinske kiseline, jedan ili više polimera, kao što su ne konjugovani PEG ili polialkilen glikol, i slično. Predmetni pronalazak, takođe obezbeđuje komplete koji sadrže konjugate i/ili preparate prema predmetnom pronalasku.
Predmetni pronalazak, takođe obezbeđuje farmaceutske ili veterinarske preparate koji sadrže konjugate prema predmetnom pronalasku i najmanje jedan ekscipijent ili nosilac koji je prihvatljiv za farmaceutsku ili veterinarsku upoterbu. Predmetni pronalazak, takođe obezbeđuje postupke tretiranja ili sprečavanja nastanka mnoštva fizičkih poremećaja korišćenjem takvih preparata, što podrazumeva primenu jednog ili više konjugata ili preparata prema predmetnom pronalasku kod životinje koja pati od ili kod koje postoji predispozicija da nastane fizički poremećej ili stanje.
Dalje, predmetni pronalazak obezbeđuje, stabilizovane proteine koji se vezuju za receptor i postupke njihove proizvodnje u industrijskoj ćelijskoj kulturi, pri čemu se dobijaju proteini sa neočekivano visokim potencijama, što je rezultat kombinovanih efekata značajnog održavanja biološke aktivnosti i produženog trajanja dejstva u industrijskoj upotrebi. Neočekivano visoke potencije konjugata, prema predmetnom pronalasku, mogu da se odslikaju u neobično velikoj proizvodnji biološke mase, neobično visokim nivoima ekspresije rekombinantnih proteina i drugim poboljšanjima efikasnosti biološke prerade.
Postupci
Pronalazači predmetnog pronalaska su otkrili da usmeravanje polimera ka amino-terminalnoj aminokiselini "RN" proteina koji se vezuje za receptor ili u blizinu mesta glikozilacije, "RG" proteina koji se vezuje za receptor, osigurava da polimerbude povezan za mesto koje je udljeno od jednog ili više regiona ili domena za vezivanje za receptor proteina, čime se minimalizuje sterična kolizija pri interakciji sa receptorom od strane prikačenih polimernih molekula. Kao posledica toga, visok procenat aktivnosti vezivanja za receptor, može da se očuva konjugacijom proteina, prema postupcima predmetnog pronalaska, što ne bi bio slučaj ukoliko bi polimer bio vezan u okviru ili u blizini dela molekula koji je uključen u vezivanje za receptor. Ovaj princip koji može da rezultuje u nočekivano visokom stepenu zadržavanja aktivnosti vezivanja za receptor, može da se demonstrira za proteine koji se vezuju za receptor, koji su izabrani iz grupe koju čine bazni fibroblastni faktor rasta ("bFGF" ili "FGF-2"), epidermalni faktor rasta ("EGF"), insulinu sličan faktor rasta - 1 ("IGF-1"), interferon-alfa ("IFN-a"), interferon-beta ("IFN-P", (uključujući IFN-P-lb)), činilac stimulacije kolonija granulocita-makrofaga ("GM-CSF"), činilac stimulacije kolonija monocita ("M-CSF"), Flt 3 ligand, činilac stem ćelije ("SCG"), interleukini 2, 3, 4, 6, 10, 12, 13 i 15, faktor nekroze tumora-a ("TNF-a"), faktor nekroze tumora - (3 ("TNF-(3"), transformišući faktor rasta-a ("TGF-a"), transformišući faktor rasta -13 ("TGF-{3"), faktor rasta keratinocita ("KGF"), humani hormon rasta ("hGH"), prolaktin, placentalni laktogeni hormon, ciliarni nurotrofni faktor ("CNTF"), leptin i strukturalni analozi ovih proteina koji se vezuju za receptor, koji oponašaju dejstvo ovih proteina ili su njihovi antagonisti za vezivanje za receptor. Nasuprot tome, kod selektivnog vezivanja velikog polimera za amino-terminal IFN-7se ne očekuje očuvanje najvećeg dela aktivnosti citokina, jer za takvo vezivanje se očekuje da će interferirati sa vezivanjem aktivnog dimera za odgovarajuće receptore (zasnovano na podaciam Walter, M. R. et al., 1995, Nature 376 : 230 - 235 i Thiel, D. J., et al., gore navedeno).
U povezanom rešenju, prema predmetnom pronalasku, polimeri su vezuju za aminoterminalni ostatak muteina proteina koji se vezuje za receptor, koji funkcionišu kao kompetitivni natagonisti prirodnih proteina tako što se vezuju za jedan ili za više receptora, bez pokretanja transdukcije signala. Primeri ovih proteina su polimerni konjugati hGH antagoniste koji sadrže tačkastu mutaciju G120R (Sundstrom, M., et al., 1996, J. Biol. Chem., 271 : 32197 - 32203) kao i antagonista prolaktina koji sadrži tačkastu mutaciju G129R (Goffin, V., et al., 1997, J. Mammarv Gland. Biol. Neoplasia, 2 : 7 - 17; Chen, W.Y., et al., 1999, Clin. Cancer Res., 5 : 3583 - 3593; Chen, W. Y., PCT publikacija broj WO 99/58142 Al). Drugi antagonisti proteina koji se vezuju za receptor mogu da se dobiju selektivnim tačkastim mutacijama, otkidanjem delova ili delecijama (videti npr., Tchelet, A., et al., 1997. Mol. Cell Endocrinol., 130 : 141 - 152; Peterson, F. C, 1998, Identification of Motifs Associated with the Lactogenic and Somatotropic Actions of hGH, doktorska disertacija, Ohio State Universitv, UMI broj 9822357).
U drugom rešenju, prema predmetnom pronalasku, koje se odnosi na "RG" proteine koji se vezuju za receptor, postupci, prema predmetnom pronalasku rezultuju u povezivanju jednog ili više sintetskih polimera u blizini prirodnog mesta vezivanja ugljenohidratnih grupa ovih proteina koji se vezuju za receptor, koji su glikoproteini. Ovo dovodi do "pseudoglikozilacije" ovih proteina koji se vezuju za receptor, (npr., onda kada su oni eksprimirani pomoću rekombinantnih DNK tehnika u E.Coli ili u dugim prokariotskim ćelijama koje ne sprovode post translacionu glikozilaciju) ili dovodi do "pseudohiperglikozilacije" njihovih glikoproteinskih oblika, (npr., kod prirodno dobijenih glikoproteina ili kod glikoproteina dobijenih u eukariotskim ćelijama - domaćinima, npr., gljivicama, ćelijama biljke i životinjskim ćelijama (uključujući insekatske i sisarske ćelije) koje sprovode post-translacionu glikozilaciju). Primeri ovoga su polimerni konjugati interferona-a i p\ kao i eritropoetina ("Epo") i interleukina-2. Vezivanje sintetskih polimera na ili u blizini mesta prirodne glikozilacije, može da se izvede primenom bilo kog postupka koji je poznat u struci, uključujući mutacioni postupak opisan od R. J. Goodson et al., 1990, Biotechnologv 8 : 3443 - 346; i postupak opisan od R. S. Larson et al., 2001, Bioconjug. Chem. 12 : 861-869, koji obuhvataju prethodnu ■ oksidaciju ugljenog hidrata; opisi ovih referenci su ovde inkorporirani po referenci u njihovoj potpunosti.
Ranije opisana aminoterminalna modifikacija određenih proteina (videti npr., Dixon, H. B. F., 1984, J. Protein Chem. 3 : 99 - 108). Na primer, otkriveno je da N-terminalna modifikacija proteina stabilizuje oređene proteine i povećeva njihovu rezistenciju prema dejstvu aminopeptidaza (Guerra, P. I., et al., 1998, Pharm. Res. 15 : 1822 - 1827), da poboljšava rastvorljivost proteina (Hinds, K., et al., 2000, Bioconjug. Chem. 11 : 195 - 201), da smanjuje naelektrisanje na N-terminalnoj aminogrupi ili da poboljšava homogenost rezultujućih konjugata (Kinstler, O., et al., Evropska patentna prijava broj, EP 0 822 199 A2; Kinstler, O., et al, 2002, Adv. Drug Deliv. Rev. 54 : 477 - 485), između ostalih. Alternativni postupak za povezivanje polimera na a-amino grupu N-terminalnog cisteina ili histidina. adaptacijom postupka koji je poznat u struci kao "nativna hemijska ligacija" opisanje ranije (Roberts, M. J., et al, PCT publikacija broj WO 03/031581 A2 i U.S. patentna prijava broj 2003/0105224). Međutim, ranije nije otkriveno ili opisano postojanje "RN" i "RG" potklasa proteina koji se vezuju za receptor, generalno prihvatljivi postupci za izbor članova ovih klasa, kao i dobijanje i korišćenje polimernih konjugata takvih proteina koji se vezuju za receptor, kao načina da se očuva neočekivano visoka funkcionalna aktivnost "RN" proteina koji se vezuje za receptor.
Stoga, poželjno je odrediti da li dati citokin, hemokin, faktor rasta ili polipeptidni hormon poseduje N-terminal i/ili mesto glikozilacije, koje je udaljeno od mesta za vezivanje za receptor na Ugandu. Sposobnost predviđanja da li dati citokin, hemokin, faktor rasta ili polipeptidni hormon jeste "RN" ili "RG" ligand, pre konjugacije liganda za polimer, značajno smanjuje eksperimentaciju koja je potrebna za dobijanje konjugata polimera i liganda (npr., citokina, hemokina, faktora rasta ili polipeptidnog hormona ili njihovog antagonista koji su konjugovani sa polimerima, npr., sa PEG-ovima) kod kojih je antigenost i imunogenost, smanjena u odnosu na antigenost/imunogenost ne konjugovanog liganda, pri čemu ne dolazi do značajnog smanjenja aktivnosti vezivanja za receptor i fizioloških aktivnosti konjugovanog liganda.
Prema tome, u dodatnim rešenjima predmetni pronalazak obezbeđuje postupke za identifikaciju i izbor proteinskih liganada za vezivanje za receptor (npr., citokina, hemokina, faktora rasta ili polipeptidnog hormona i njihovih antagonista), koji poseduju N-terminal i/ili mesta glikozilacije koja su udaljena od mesta za vezivanje za receptor na proteinskim ligandima (tj., obezbeđuje postupke za identifikaciju i izbor "RN" ili "RG" proteina. U određenim rešenjima, prema predmetnom pronalasku, optimalno mesto za konjugaciju jednog ili više polimera, (jednog ili više PEG-ova), može da se odredi korišćenjem molekulskog modelovanja, npr., posmatranjem trodimentionalne strukture proteina (citokina, hemokina, faktora rasta ili polipeptidnog hormona ili njegovog antagoniste) korišćenjem softvera za molekulsko modelovanje u cilju predviđanja lokacija na kojima jedan ili više polimera mogu da budu vezani za protein, bez ranijeg gubitka biološke aktivnosti ili aktivnosti vezivanja za receptor datog proteina (videti, takođe Schein, C.H., gore navedeno). Analogni pristup je pokazan, npr., za konjugaciju PEG sa CSF u pokušaju da se poboljša njegova otpornost na proteolitičku razgradnju (videti objavljenu U.S. patentnu prijavu 20010016191 Al koju je podneo T.D. Osslund, čiji je opis ovde inkorporiran po referenci u potpunosti). Odgovarajući softver za molekulsko modelovanje koji se koristi u predmetnom pronalasku, kao što je RASMOL (Savle, R.A., et al, gore navedeno), kao i drugi programi koji se koriste u stvaranju banke podataka makromolekulskih struktura koje su deponovane u banci podataka proteina (PDB; videti, Laskowski, R.A., gore navedeno), dobro su poznati u struci i poznati su prosečnom stručnjaku. Korišćenjem takvog softvera za molekulsko modelovanje, može biti predviđena ili određena trodimenzionalna struktura polipeptida, npr., citokina, hemokina, faktora rasta ili polipeptidnog hormona ili njegovog antagonist, sa visokim stepenom poverenja, zasnovanim na kristalografskim analizama liganda i njihovih receptora. Na ovaj način, prosečan stručnjak može lako da odredi koji ligandi su "RN" ili "RG" ligandi koji su pogodni za upotrebu shodno predmetnom pronalasku.
Jedan pogodan način za praksu predmetnog pronalaska jeste kovalentno vezivanje u vodi rastvorljivog polimera sa a amino grupom N-terminalnog aminokiselinskog ostatka proteina, putem reduktivne alkilacije Šifovih baza dobijenih sa polimerima koji poseduju jednu aldehidnu grupu, npr., kao što je opisao G.P. Rover (U.S. patent broj 4,002,531), ali ne i kao što je opisano kod J.M. Harris et al.. (U.S. patent broj 5,252,714), jer poslednji navedeni pronalazači su zaštitili samo polimere koji su izvedeni tako da na oba kraja imaju aldehidne grupe, koji predstavljaju sredstva za ukršteno vezivanje, tako da su ne podesni za sintezu dugodelujućih proteina za vezivanje za receptor koji zadržavaju značajnu aktivnost vezivanja za receptor.
Usmeravanje reduktivne alkilacije Šifovih baza PEG - monoaldehida ka a amino grupi N-terminalne aminokiseline proteina koji se vezuje za receptor i usmeravanje od epsilon amino grupa njihovih lizinskih ostataka može da se postigne korišćenjem brojnih postupaka koji su zasnovani na opisima datim u J.T. Edsall (u glavama 4 i 5 rada Proteins Amino Acids and Peptides as Ions and Dipolar Ions, 1943, str. 75-115 i str. 115-139, Reinhold Publishing Corporation, New York), čiji je opis ovde inkorporiran po referenci u potpunosti. Očekuje se da konstanta disocijacije kiseline "pKa" a amino grupe N-terminalne aminokiseline polipeptida, bude ispod 7,6, dok pKavrednosti epsilon amino grupa lizinskih ostataka u polipeptidima bude oko 9,5. Edsall (1943, gore navedeno) jasno navodi da se aldehidi kombinuju sa amino grupom aminokiseline "samo nalakalnoj strani njihove izoelektrične tačke".
Stoga, na osnovu opisa predmetnog pronalaska i informacija koje su lako dostupne u struci, prosečan stručnjak prepoznaje da (1) selektivna reakcija aldehida sa a-amino grupom proteina biva pospešena pri pH vrednosti koja je ispod 9,5 (otprilike jednako pKavrednosti epsilon amino grupa u proteinu); (2) brzina reakcije aldehida sa epsilon amino grupama biva smanjena ukoliko je pH vrednost reakcione smeše manja i kreće se ka 7,6 (otprilike jednako pKavrednosti a amino grupe proteina); (3) brzina reakcije aldehida sa a amino grupom biva manja od brzine reakcije aldehida sa epsilon amino grupama kada je pH vrednost reakcione smeše manja i kreće se ka 7,6 i (4) selektivnost za reakciju sa a amino grupom biva poboljšana smanjenjem pH vrednosti ka 6,6. S obzirom da je poslednja navedena vrednost otprilike za jedan stepen pH vrednosti ispod pKaa amino grupe i 3 jedinice pKaepsilon amino grupa, otprilike 10% a amino grupa i oko 0,1% epsilon amino grupa se nalazi u njihovom reaktivnom ne protinizovanom stanju. Zato, pri pH vrednosti od 6,6 udeo ne protonisanih a amino grupa je 100 puta veća od udela ne protonisanih epsilon amino grupa. Stoga, dobija se veoma mali porast selektivnosti sa daljim smanjenjem pH vrednosti reakcione smeše, npr., do vrednosti od 5,6 gde teotretski, 1% a amino grupa i 0,01% epsilon amino grupa se nalazi u njihovom reaktivnom, ne protonizovanom stanju. Stoga, u određenim rešenjima, prema predmetnom pronalasku, proteinski ligandi, posebno "RN" ili "RG" ligandi, uključujući citokine, hemokine, faktore rasta ili polipeptidne hormone, se konjuguju sa jednim ili sa više polimera formiranjem smeše između liganada i jednog ili više polimera pri pH vrednosti od oko 5,6 do oko 7,6; pri pH vrednosti od oko 5,6 do oko 7,0; pri pH vrednosti od oko 6,0 do oko 7,0; pri pH vrednosti od oko 6,5do oko 7,0; pri pH vrednosti od oko 6,6 do oko 7,6; pri pH vrednosti od oko 6,6 do oko 7,0; ili pri pH vrednosti od oko 6,6. Stoga, postupci prema predmetnom pronalasku se značajno razlikuju od onih koji su poznati u struci, kod kojih se povezivanje polimera sa a amino grupama na N-terminalnim aminokiselinskim ostacima liganda izvodi pri pH vrednosti od oko 5,0 (Kinstler, O., et al., 2002, Adv. Drug Deliv. Rev. 54: 477-485; Evropska patentan publikacija broj EP 0 822 199 A2; U.S. patenti broj 5,824,784 i 5,985,265; Roberts, M.J. et al., 2002, gore navedeno; Delgado, C, et al., U.S. objavljena patentna publiakcija broj 2002/0127244 Al), do se vezivanje polimera za epsilon amino grupe lizinskih ostataka u ligandu u polipeptidnoj osnovi liganda izvodi pri pH vrednosti od 8,0 (Kinstler, O., et al., EP 0 822 199 A2; U.S. patenti 5,824,784 i 5,985,265). Na isti način postupci prema predmetnom pronalasku se takođe značajno razlikuju od enzimskih postupaka koji se koriste za povezivanje alkilaminskih derivata poli(etilen glikola) sa odgovarajućim proteinima korišćenjem transglutaminaze, što se izvodi pri pH vrednosti od 7,5 (Sato, H., 2002, Adv. Drug Deliv. Rev. 54 : 487 - 504).
redukcijom nastalih Šifovih baza sa blagim redukujućim sredstvima, kao što je natrijum cijanoborhidrid, ili piridin boran (Cabacungan, J.C., et al., 1982, Anal. Biochem. 124: 272-278), dobijaju se sekundarne aminske veze koje čuvaju pozitivno naelektrisanje N-terminalne a amino grupe proteina, pri fiziološkim pH vrednostima. Takve veze koje zadržavaju isto naelektrisanje kao i nativni protein, verovatnije zadržavaju svoju biološku aktivnost od alternativnih hemisjkih veza koje neutrališu naelektrisanje, npr., formiranjem amidnih veza (Burg, J., et al., PCT publikacija broj WO 02/49673 A2; Kinstler, O., et al., Evropska patentna aplikacija broj EP 0 822 199 A2; Kinstler, O., et
al., 1996, Pharm. Res., 13 : 996 - 1002; Kita, Y., et al., gore navedeno) ili uretanske veze (Gilbert, C.W., et al., U.S. patent broj 6,042.822; Grace, M., et al., 2001, J. Interferon Cvtokine Res. 21 : 1103 - 1115; Youngster, S., et al., 2002, Curr. Pharm. Des. 8 : 2139-2157).
Stručnjacima su poznati alternativni pristupi selektivnom vezivanje polimera za N-terminalne aminokiselinske ostatke. Ovde spadaju postupci za vezivanje hidrazida, hidrazina, semikarbazida ili drugih polimera koji sadrže amin za N-terminalne serinske ili treoninske ostatke koji su oksidativno otcepljeni sa aldehida pomoću perjodata (Dixon, H.B.F., gore navedeno; Geoghegan, K. F., U.S. patent broj 5,362,852; Gaertner, H.F., et al., 1996, Bioconju. Chem. 7: 38-44; Drummond, R.J., et al., U.S. patent broj 6,423,685).
Odgovarajući polimeri
U određenim rešenjima, prema predmetnom pronalasku, poželjno je da se minimalizuje formiranje intramolekulskih i inermolekulskih ukrštenih veza pomoću polimera kao što je PEG tokom reakcije u kojoj se polimer vezuje sa biološki aktivnom komponentom kako bi se dobili konjugati, prema predmetnom pronalasku. Ovo može da se postigne korišćenjem polimera koji su aktivirani samo na jednom kraju (ovde označenih kao "monofunkcionalno aktivirani PEG-ovi" ili "monofunkcionalni aktivirani PAG-ovi") ili polimemih preparata u kojima je procenat bifunkcionalno aktiviranih (ovde označenih u slučaju linearnih PEG-ova kao "bis-aktivirani PEG dioli" ili multifunkcionalnih aktiviranih polimera manjih od oko 30%, poželjnije manji od oko 10%. ili najpožljnije manjih od oko 2% (w/v). Korišćenje aktiviranih polimera koji su u potpunosti ili skoro u potpunosti monofunkcionalni, može da minimalizuje formiranje sledećeg: intramolekulskih ukrštenih veza sa pojedinačnim molekulima proteina, "zvonastih" struktura, u kojima se jedan kraj molekula povezuje sa jednim proteinskim molekulom ili sa dva proteinska molekula ili sa većim agregatima ili gelovima.
Aktivirani oblici polimera koji su pogodni za upotrebu u postupcima i preparatima prema predmetnom pronalasku, obuhvataju bilo koji linearni ili razgranati monofunkcionalno aktivirani oblik polmera koji je poznat u struci, npr., obuhvaćeni su oni polimeri sa molekulskim masama (isključujući masu aktivirajuće grupe) u opsegu od oko 1 kDa do oko 100 kDa. Odgovarajući opsezi moleklskih masa, obuhvataju bez ograničenja, mase od oko 5 kDa do oko 30 kDa, mase od oko 10 kDa do oko 20 kDa, mase od oko 18 kDa do oko 60 kDa, mase od oko 12 kDa do oko 30 kDa, mase od oko 5 kDa, oko 10 kDa, oko 20 kDa, oko 30 kDa. U slučaju linearnih PEG-ova, molekulske mase od oko 10 kDa, 20 kDa, ili oko 30 kDa, odgovaraju stepenima polimerizacije (n) od oko 230, oko 450 ili oko 680 monomernih jedinica etilen oksida, respektivno. Za upotrebu in vitro odgovarajući opsezi molekulskih masa aktiviranih polimera obuhvataju mase od oko 1 do 5 kDa. Treba primetiti da je nogo pre otkrivanja "RN" i "RG" klasa proteina za vezivanje za receptor, prvo primećena prednost vezivanja terapijskih proteina za polimere koji iamju relativno visoke molekulske mase (tj., mase veće od oko 20 ili 30 kDa) (Saifer, M., et al., PCT publikacija broj WO89/01033 Al, objavljena 09. 02. 1989, koja je inkorporirana prema referenci u celosti).
U drugim rešenjima, prema predmetnom pronalasku, konjugati proteina koji se vezuju za recepor sa neobično visokim rocentom zadržane biološke aktivnosti, mogu da dobiju za korišćenje u in vitreo uslovima u ćelijskoj kulturi, povezivanjem monofunkcionalno aktiviranih polimera od oko 1 kDa, 2 kDa, 5 kDa, shodno postupcima prema predmetnom pronalasku. Za takve in vitro primene može biti poželjan ovaj manji opseg molekulskih masa.
Opciono, linearni polimer može da poseduje linearnu grupu najednom kraju ili na oba kraja, tako da nastaje reaktivni polimer. U određenim rešenjima prema predmetnom pronalasku poželjno je da se koristi N-hidroksisukcinimidil estar derivata monopropilenske kiseline PEG, kao što je opisano u J.M. Harris, et al., U.S. patent broj 5,672,662, koja je ovde inkorporirana u potpunosti po referenci ili neka druga PEG-monokarboksilana kiselina koja je aktivirana sa N-hidroksisukcinimidom. U određenim drugim rešenjima, poželjno je da se koriste ili monosukcinimidil karbonatni derivati PEG ("SC-PEG") kao što je opisano u M. Saifer et al., U.S. patent broj 5,006,333; 5,080,891; 5,283,317 i 5,468,478 ili mono-p-nitrofenil karbonatni derivat PEG, kao što je opisano u S.J. Kelly et al., gore navedeno; i L.D. Williams et al., U.S. patent broj 6,576,235; i u M.R. Sherman et al., PCT publikacija broj WO 01/59078 A2. Štaviše, drugi tipovi reaktivnih grupa mogu da se upotrebe za sintezu olimernih konjugata proteina. Ovi derivati obuhvataju, bez ograničenja, monoaldehidne derivate PEG-ova (Royer, G.P., U.S. patent broj 4,002,531; Harris, J.M. et al., U.S. patent 5,252,714), monoaminski, mono-trimonofenilski karbonat, monokarbonil-imidazolski, mono-trihlorofenil karbonatski, mono - trifluorofenil karbonatski, monohidrazidski, monosemikarbamidski, monokarbazatski, monotiosemikarbazidski, monojodoacetamidski, monomaleimidski, mono - ortopiridil disulfatski, mono - oksimski, mono - fenilglioksalski, mono - tiazolidin - 2 - tionski, monotioestarski, monothiolski, monotriazinski i monovinilsulfonski derivat PEG-ov. U dodatnim rešenjima, citokini, hemokini, faktori rasta i polipeptidni hormoni mogu da se povežu sa jednim ili sa više polimera kao što je opisano u važećem U.S. patentu broj 10/669,597, čiji je opis ovde u potpunosti inkorporiran prema referenci.
Bioaktivne komponente
Kao što je naglašeno ranije, konjugati prema predmetnom pronalasku sadrži jedan PAG ili PAO, a posebno jednolančani PEG, koji je kovalentno povezan sa jednom ili sa više biološki aktivnih komponenti. Biološki aktivne komponente za koje je kovalentno povezan jedan ili više polimera ili (njihovih lanaca) su ovde označeni različito sa ekvivalentnim značenjem kao "konjugovane biološki aktivne komponente", ili "modifikovane biološke aktivne komponente". Ovi pojmovi treba da se razlikuju od pojmova "nekonjugovane biološki aktivne komponente", "inicijalne biološki aktivne komponente", ili "nemodifikovane biološki aktivne komponente", pri čemu se svi ovi pojmovi odnose na biološki aktivne komponente za koje polimeri nisu kovalentno povezani. Treba, međutim, razumeti da "nekonjugovane", "nemodifikovane" ili "inicijalne" biološki aktivne komponente, mogu da sadrže druge nepolimerne konjugacije ili modifikacije u poređenju sa molekulom divljeg tipa ili sa nativnim molekulom, a da se pri tome još uvek smatraju "nekonjugovanim", "nemodifikovanim" ili "inicijalnim" shodno predmetnom pronalasku, jer su biološki aktivne komponente "nekonjugovane", "nemodifikovane" ili "inicijalne" u odnosu na vezivanje polimera kao što je to slučaj sa biološki aktivnim komponentama koje se ovde označavaju kao "lažno pegilirane".
Pojam "stabilizujuća" biološki aktivna komponenta (ili "postupci stabilizacije" ili "stabilizovana biološki aktivna komponenta") označava da je biološki kativna komponenta stabilizovana, shodno postupku prema predmetnom pronalasku (to je biološki aktivna komponenta za koje je polimer kovalentno veza shodno postupcima prema predmetnom pronalasku). Takve stabilizovane biološki aktivne komponente pokazuju određene izmenjene biohemijske i biofizičke karakteristike u poređenju sa biološki aktivnom komponentom koja nije stabilizovana (tj., sa biološki aktivnom komponentom za koju polimer nije kovalentno vezan). U takve izmenjene biohemijske i biofizičke parametre spadaju, posebno za proteine koji se vezuju za receptor, smanjena podložnost ka proteolitičkoj razgradnji, a posebno održavanje aktivnosti proteina koji se vezuju za receptor, tokom inkubacije pod osređenim teškim uslovima u okolini ili tokom eksperimenta. U određenim rešenjim aprema predmetnom pronalasku izmenjeni biohemijski i biofizički parametri obuhvataju, npr., produžavanje poluživota u cirkulaciji in vivo, povećanu biološku raspoloživost, produženo trajanje dejstva in vitro i slično.
Bilo koji protein koji se vezuje za receptor (tipično citokin, hemokin, faktor rasta ili polipeptidni hormon) koji poseduje biološku (tj. fiziološku, biohemijsku ili farmaceutsku) aktivnost koja je udružena sa delovima molekula koji su udaljeni od amino terminala ili od prirodnog ili od mutacijom uvedenog mesta glikozilacije, mogu biti pogodni za korišćenje kao inicijalna komponenta u predmetnom pronalasku. Takve biološki aktivne komponente obuhvataju, bez ograničenja, peptide, polipeptide, proteine i si. biološki aktivne komponente takođe obuhvataju fragmente, gluteine i derivate takvih peptida, polipeptida, proteina i sličnih, posebno one fragmente, proteine i derivate koji poseduju biološku (tj. fiziološku, biohemijsku ili farmaceutsku) aktivnost.
Odgovarajući peptidi, polipeptidi, proteini, glikoproteini i si. koji su korisni kao biološki aktivne komponente, prema predmetnom pronalasku, obuhvataju bilo koji peptid, polipeptid, ili protein koji poseduje jednu ili više dostupnih amino grupa, tiol grupa ili drugih grupa koje su udaljene od regiona za vezivanje za receptor, biološki aktivne komponente i za koje se polimeri mogu selektivno vezati. Takvi peptidi, polipeptidi, proteini, glikoproteini i si., obuhvataju citokine, hemokine, faktore rasta ili polipeptidne hormone, koji mogu posedovati bilo koju strukturu (Nicola, N. A., gore navedeno; Schein, C. H., gore navedeno).
Na primer, odgovarajući peptidi, polipeptidi i proteini od interesa obuhvataju, bez ograničenja klasu citokina, koji poeduju strukture koje se sastoje od 4 a heliksa (i potklasu sa dugim lancem i potklasu sa kratkim lancem) (radi revijskog prikaza videti Schein, D. H., gore navedeno). Mnoštvo takvih proteina sa 4 heliksa su pogodni za upotrebu prema predmetnom pronalasku, uključujući bez ograničenja, interleukine, npr., IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12 (p35 podjedinica), IL-13, IL-15 i IL-17; činioce stimulacije kolonija, npr., činilac stimulacije kolonije makrofaga (M-CSF) i činilac stimulacije granulocita-makrofaga (GM-SCF; Rozavvski, D.A., et al., 1996, Proteins, 26 : 304 - 313); interferone, npr., IFN-a, IFN-p (uključujući IFN-p-lb) i konsenzus IFN, leukemija inhibitorni faktor (LIF); eritropoetin (Epo), trombopoetin (Tpo); faktor rasta i razvoja megakariocita (MGDF); faktor stem ćelije (SCF), koji je takođe u praksi poznat kao Steel Factor (Morrissev, P.J., et al., 1994, Cell Immunol. 157 : 118 - 131; McNiece, I. K., et al.. 1995, J. Leukoc. Biol. 58 : 14 - 22); onkostatm M (OSM); protein koji aktivira fosfolipazu (PLAP); neurotrofne faktore, kao i njihove peptidne mimetike. Iako su prolaktin i hormon rasta klasični hormoni koji cirkulišu u telu za razliku od citokina koji se obično proizvode u blizini njihovih ciljnih ćelija, prolaktin i hormon rasta spadaju u istu strukturnu kalsu kao citokini sa strukturom od 4 a heliksa (Nicola, N.A., gore navedeno; Goffin, V., et al., gore navedeno) tako da su oni slično pogodne mete za vezivanje polimera i za proizvodnju konjugata prema predmetnom pronalasku. Takođe, za upotrebu prema predmetnom pronalasku su pogodni analozi, muteini, antagonisti, varijante i derivati ovih peptida i oni su stoga obuhvaćeni obimom zaštite predmetnig pronalaska.
Proteini koji se vezuju za receptor sa dugim lancem koji spadaju u strukturne klase P-ploče ili P-cilindar (radi revijskog prikaza videti Schein, C.H., gore navedeno) su takođe pogodni za upotrebu u dobijanju preparata i konjugata, prema predmetnom pronalasku. Ovde spadaju, bez ograničenja, porodica citokina faktora nekroz tumora, npr., TNF-a, TNF-P i Fas ligandi, koji poseduju p-žele cilindričnu strukturu; IL-1 (uključujući IL-la i IL-1B) i FGF (uključujući bazni faktor rasta fibroblasta (bFGF), kiseli FGF, FGF-4 i faktor rasta keratinocita (KGF; FGF-7)), koji prikazuju P-trolisno savijeni (Schein, C.H., et al., gore navedeno; Schlessinger, J., et al., gore navedeno) IL-12, IL-16, epidermalni faktor rasta (EGF; Lu, H.S., et al., gore navedeno) kao i faktore rasta izvedene iz trombocita (PDGF-ovi), transformišući faktori rasta (uključujući transformišući faktor rasta-a i uključujući transformišući faktor rasta-P (TGF-P)) i faktore rasta nerva koji poseduju cistin-čvor strukture. Za uptrebu prema predmetnom pronalasku, su takođe pogodni nalozi, muteini, antagonisti, varijante i derivati ovih peptida, polipeptida i proteina, koji su stoga obuhvaćeni obimom zaštite predmetnog pronalaska.
Dodatna strukturna klasa proteina, koji se poželjno koriste u konjugatima i preparatima, prema predmetnom pronalasku, jesu disulfidnim mostovima bogata smeša, ot/p citokina, hemikina i faktora rasta (radi revijskog prikaza videti, Schein, C.H., gore navedeno), uključujući bez ograničenja: EGH familiju, koja poseduje P-meander strukturu, IL-8; RANTES; peptid za aktivaciju neutrofila - 2 (NAP-2); iz stromalanih ćelija derivirani faktor-1 a (SDF-la); proteini hemoatraktzanti monocita (MCP-1, MCP-2, MCP-3); eotaksini (npr., eotaksin-1, eotaksin-2, eotaksin-3); inhibitorni faktor mijeloidnog progenitora-1 (MPIF-1); neurotaktin, faktor inhibicije migracije makrofaga (MIF); sa rastom povezani onkogen/stimulatorna aktivnost rasta melanoma (GRO-a/MGSA); somatomedini; kao i insulin i insulinu slični faktori rasta (npr., IGF-1 i IGF-2). Sroda strukturna klasa proteina koji se koriste u konjugatima i preparatima, prema predmetnom pronalasku, jesu citokini sa mozaičnom strukturom, što podrazumeva faktore rasta kao što su IL-12 i faktor rasta hepatocita (Nicola, N.A., gore navedeno). Takođe, za upotrebu u praksi predmetnog pronalaska su pogodni analozi, muteini, antagonisti, varijante i derivati ovih peptida polipeptida, i proteina, koji su takođe obuhvaćeni obimom zaštite predmetnog pronalaska.
Drugi proteini od interesa, obuhvataju, bez ograničenja: hormone rasta, posebno humani hormon rasta (hGH); videti Tchelet, A., et al., gore navedeno) i njihovi antagonisti (videti, npr., Sundstrom, M., et al., gore navedeno), prolaktin i njegovi antagonisti, horionski gonadotropin, folikul stimulirajući hormon, tiroidni stimulirajući hormon, pigmentni hormoni, faktor rasta keratinocita, hipotalamični osolbađajući faktori, antidiuretski hormoni i antagonisti vezivanja za receptor, citokina, hemokina, faktora rasta i polipeptidnih hormona, svih gore nabrojanih strukturnih klasa. Mnogi od ovih proteina postije i u glikoziliranom i u ne glikoziliranom obliku. Ne glikozilirani oblici, mogu da se dobiju proizvodnjom, korišćenjem rekombinantnih DNK tehnologija u prokariotima ili korišćenjem hemijske sinteze. Takvi ne glikozilirani proizvodi se nalaze u okviru peptida i proteina koji su pogodne biološki aktivne komponente, prema predmetnom pronalasku. Konačno, iako neka antitela deluju kao agonisti ili antagonisti vezivanja za receptor (videti., iMorris, J. C, et al, 2000, Ann. Rheum. Dis. 59 (dodatak 1): i 109-i 114), takvi imunoglobulini nisu pogodni kandidati za vezivanje polimera na N-terminalu, prema predmetnom pronalasku, tj., oni nisu RN proteini koji se vezuju za receptor, jer aminoterminalni regioni i lakih i teških čanaca učestvuju u prepoznavanje antigena.
Od posebne važnostiu kao biološki aktivne komponente koje se koriste za dobijanje polimernih konjugata prema predmetnom pronalasku, jesu interferon-a, interferon-(3 (uključujući INF-p-lb), IL-2, IL-4, IL-10, TNG-a, HGH, prolaktin, insulin, IGF-1, EGF, PFGF i eritropoetin (Epo). Takođe, od posebnog značaja jesu muteini i fragmenti takvih biološki aktivnih komponenti, posebno oni koji su sposobni da se vezuu za receptor odgovarajućeg polipeptida divljeg tipa ili intaktnog polipeptida, bez obzira da liovo vezivanje indukuje biološki ili fiziološki efekat. U određenim rešenjima, muteini i fragmenti biološki aktivnih komponenti mogu da deluju kao antagonisti odgovarajućih liganada, koji smanjuju, značajno smanjuju ili u potpunosti inhibiraju vezivanje liganada za njihove receptore i/ili aktivnost liganada na ciljnim ćelijama, tkivima i/ili organizmima. Drugi antagonisti kojei mogu a ne moraju biti strukturni analozi, muteini, varijante ili derivati liganada od interesa su takođe pogodni za dobijanje konjugata prema predmetnom pronalasku. Posebno, bez obzira da li dati mutein, fragment, varijanta, derivat ili antagonista antagonizuje biološke i/ili fiziološke efekte datog liganda, on može biti određen bez ne potrebne eksperimentacije, korišćenjem testova za biološke/fiziološke efekte samog liganda, čije su varijante dobro poznate u struci i/ili dobro opisane ovde.
Strukture (primarne, sekundarne, tercijarne i tamo gde je to primenjivo, kvaternerne) ovih ili drugih polipeptida od interesa, koji se poželjno koriste, prema predmetnom pronalasku, su dobro poznate u struci i poznate su stručnjacima, posebno u svetlu struktura koje su ovde obezbeđene i u referencama koje su ovde citirane, koje su u potpunosti inkorporirane po referenci.
Konjugati
Predmetni pronalazak obezbeđuje, stabilne konjugate, biološki aktivnih komponenata, posebno citokina, hemokina, faktora rasta i polipeptidnih hormona, koji se upotrebljavaju u mnoštvu primena. Takvi konjugati, prema predmetnom pronalasku, posduju brojne prednosti u odnosu na one koji su prethodno poznati u struci, kao što je prikazano u sledećim poređenjima, koja nisu ograničavajuća i koja su data kao primer u struci poznatih konjugata: H. Hiratam (Evropski patent br. EP 0 098 110 i U.S. patent br. 4,609,546) opisuje konjugate kopolimera etilen oksida i propilen oksida ("PEG-PPG", koji je član opšte klase PAG-ova) sa proteinima, uključujući interferone i interleukine, pri čemu nije opisana preferencija za izbegavanje proteina koji su uključeni u vezivanje za receptor. U ovim referencama, interferoni a,(3 i y se smatraju ekvivalentnim metama za povezivanje PAG, što nije slično sa predmetnim pronalaskom, gde se interferon - y ne smatra pogodnom metom za N-terminalno vezivanje, jer aminoterminal se nalazi u okviru regiona za vezivanje receptora ovog citokina. Dodatno, Hiratani opisuje konjugate koji su sintetisani isključivo sa PAG-ovima od 1 do 10 kDa, dok postupci prema predmetnom pronalasku preferiraju vezivanje u vodi rastvorljivih sintetskih polimera sa molekulskim masama koje prelaze 10 kDa za terapijske primene. Analogno tome, N.V., Katre ((1990) J. Immunol. 144 : 209 - 213) opisuje da povezivanje većeg broja niti mPEG od 5 kDa za humani rekombinantni IL-2 produžava poluživot dobijenih konjugata u cirkulaciji miševa i zečeva. Međutim, ova referenca ne opisuje i ne prepoznaje prednost malog broja dugačkih niti PEG ili povezivanje jedne niti velike molekulske mase PEG za aminoterminal IL-2, kao što je obetbeđeno prema predmetnom pronalasku.
G. Shaw (U.S. patent broj 4,904,584 i PCT publikacija broj WO 89/05824 A2) opisuje postupke za indukciju povezivanja specifičnog za mesto sa aminima reaktivnih polimera, uvođenjem, zamenom ili delecijom lizinskih ostatakau ciljnom proteinu, posebno u Epo, G-CSF i IL-2. Međutim, za razliku od opisa predmetnog pronalaska, ove reference ne opisuju da polimeri koji su reaktivni sa aminima mogu da reaguju sa bilo kojim aminom u ciljnom proteinu, koji nije epsilon aminogrupa lizinskih ostataka, što jasno pravi razliku između ovih opisa i predemtnog pronalaska.
D.E. Nitecki et al, (U.S. patent broj 4,902,502) opisuje višestruko pegilirane IL-2 konjugate koji se dobijaju iz različitih hloroformat derivata PEG koji su namenjeni reakciji sa epsilon aminogrupama lizinskih ostataka. Za razliku od postupaka, prema predmetnom pronalasku, ova referenca ne opisuje postupak za izbegavanje pegilacije lizinskih ostataka u regionima IL-2 proteina koji su uključeni u vezivanje za receptor, niti pokazuje uvid daje izbegavanje takvih mesta poželjno.
N. Katre et al., (U.S. patent broj 5,206,344) opisuje PEG-IL-2 konjugate u kojima je PEG vezan za epsilon aminogrupu lizinskih ostataka, za neuparenu sulfhidril grupu prirodnog cisteinskog ostatka na položaju 125 (računajući od aminoterminala) ili za sulfhidril grupu cisteinskog ostatka, koji je mutacijom uveden između prvog i dvadesetog ostatka od aminoterminala IL-2. Među muteinima koji su opisani u '344 patentunalazi se i "des-ala-1" IL-2, tj., mutein u kome je aminoterminalni alanin izbrisan i nije pegiliran. Za razliku od predmetnog pronalaska, patent '344 ne opisuje ni jedan postupak za izbegavanje vezivanja PEG za aminokiselinske ostatke koji su uključeni u vezivanje za receptor, niti opisuje bilo koji uvid da bi takav pristup mogao biti poželjan. Konzistentno sa ovom napomenom, a nasuprot predmetnom pronalasku, širok spektar tačaka vezivanja koje predlaže patent '344 ne sugeriše da vezivanje PEG za aminoterminal IL-2 može biti posebno poželjno.
S. P. Monkarsh et al., 1997, Anal. Biochem. 247 : 434 - 440 i S-P. Monkarsh et al., 1997, u Harris, J.M., et al., urednici, Poli(etilen glikol): Chemistrv and Biological Appliscations, str., 207 - 216, American Chemical Societv, Vašington D.C.; opisuju da reakcija interferona-a-2a sa trostrukim molarnim viškom aktiviranog PEG molekulske mase od 5300 Da proizvodi 11 položajnih izomera monoPEG - interferona, kojima odgovara 11 visinskih ostataka u interferonu - a - 2a. Nije saopšten ni jedan PEG intereferon u kome je PEG povezan sa a-aminogrupom na aminoterminalu interferona. 11 položajnih izomera koji su saopšteni u ovim referencama, pokazuju antivirusne aktivnodti u ćelijskim kulturama koje se kreću od oko 6% do oko 40% u odnosu na ne modifikovani interferon, a antiproliferativne aktivnosti u ćelijskim kulturama se nalaze u opsegu od oko 9% do 29% u odnosu na ne modifikovani interferon. Ovi rezultati jasno pokazuju da nasumična pegilacija lizinskih ostataka, koja je izvedena od strane ovih istraživača, interferira sa funkcijama interferona-a-2a koje su posredovane putem njegovog recepta, za razliku od konjugata koji su dobijeni postupcima, prema predmetnom pronalasku. Dodatno, za razliku od konjugata, prema predmetnom pronalasku, u ovim referencama nije saopšten N-terminalno pegilirani interferon konjugat. 0. Nishimura et al., (U.S. registracija pronalasaka broj H1662) opisuje konjugate interferona - a, interferona -yi IL-2 koji se dobijaju reduktivnom alkilacijom aktiviranih polietilen glikol metil aldehida sa natrijum cijanoborhidridom pri pH vrednosti od 7,0 (za interferonske konjugate) ili pri pH vrednosti 7,15 (za IL-2 konjugate). Konjugati koji su dobijeni ovim postupcima gube do 95% od biološke aktivnosti u odnosu na nemodifikovane proteine, očigledno usled prisustva multiplih mesta vezivanja polimera, pri čemu je saopšteno da se sva mesta nalaze na epsilon aminogrupi lizinskih ostataka (Slike 1 i 4 predmetnog pronalaska). D. K. Pettit et al., gore navedeno, opisuje polimerne konjugate interleukina-15 (IL-15). Konjugovani IL-15 koji je opisan u ovoj referenci, međutim, ne samo da gubi svoj kapacitet za promociju rasta koji je sličan IL-2, kao rezultat vezivanja polimera za lizinske ostatke u regionima proteina, koji su uključeni u vezivanje receptora, već takođe, pokazuje antagonizam pre nego agonizam. Navedeni autori zaključuju da selektivna inhibicija vezivanja IL-15 za jedan od nekoliko ćelijskih površinskih receptora može biti posledica konjugacije polimera i da takva inhibicija ne samo da može da smanji vezivanje za receptor, već može da obrne biološki efekat datog proteina. Izbegavanjem vezivanjem polimera za delove proteina koji se vezuje za receptor su uključeni u interakcije sa određenim receptorima, predmetni pronalazak izbegava ovu neželjenu posledicu vezivanja polimera.
J. Hakimi et al., (U.S. patenti br. 5,792,834 i 5,834,594) opisuje sa uretanom povezane PEG konjugate proteina, uključujući interferon-a, IL-2, IL-1 i antagonistu IL-1 receptora, za koje je saopšteno da su dobijeni kako bi se smanjila imunogenost, povećala rastvorljivost i povećao biološki poluživot odgovarajućih proteina. U ovim referencama PEG je povcezan sa "raličitim slobodnim aminogrupama", bez reference za N-terminalnu pegilaciju i bez opisa da N-terminalne a-aminogrupe mogu i treba da budu pegilirane. Ovi patenti takođe tvrde da konjugati koji su opisani u njima "poseduju barem jedan deo" originalne biološke aktivnosti početnih proteina, čime ukazuju na mogući značajni gubitak biološke aktivnosti. Ovaj rezujtata je konzistentan sa upotrebom bezciljnih postupaka pegilacije koji su tamo opisani. Za razliku od predmetnog pronalaska, ovi patenti ne opisuju nijedan pokušaj poboljšanja zadržavanja biološke aktivnosti njihovih konjugata, izmenom selektivnosti pegilacionog procesa koji je opisan tamo.
O. B. Kinstler et al., (Evropska patentna publikacija broj EP 0 822 199 A2) opisuje proces reakcije poli(etilen glikola) sa a-aminogrupom aminokiseline na aminoterminalu polipeptida, posebno na konsenzus interferonu i G-CSF, koji su dva proteina koje proizvodi Amgen Inc., koji je podnosilac ove patentne prijave. Ova publikacija ukazuje da "pH vrednost koja je dovoljno kisela da bi selektivno aktivirala a-aminogrupu" je neophodna karakteristika opisanog procesa. Nasuprot tome, u predmetnom pronalasku je otkriveno da smanjenje pH vrednosti smanjuje reaktivnost aminogrupa sa PEG aldehidima, kao i da je a-aminogrupa reaktivnija onda kada nije protonisana, tj., pri pH koja je iznad njene pKa. Stoga, podnosioci predmetnog pronalaska su pronašli da nijedna pH vrednost nije dovoljno ka kiselom da bi selektivno aktivirala a-aminogrupu, bilo kog RN citokina , prema predmetnom pronalasku. Objašnjenja zavisnosti reaktivnosti N-terminale a-amino grupe sa aldehidima od pH vrednosti je data u J.T. Edsall, gore navedeno i R.S. Larsen et al., 2001, Bioconjug. Chem. 12: 861-869; što je kompatibilnije sa iskustvom, prema predmetnom pronalasku. Dalje, Kinstler et al., saopštavaju da je upotreba N-terminalne pegilacije polipeptida, radi povećenja homogenosti dobijenih konjugata dovodi do povećanja homogenosti rezultujućih konjugata i do zaštite aminoterminala od degradacije od strane proteinaza, ali ne opisuju da N-terminalna pegilacija može da sačuva veći deo biološke aktivnosti vezivanja za receptor određenih proteina koji se vezuju za receptor (videti, npr., PCT publikacija broj WO 96/11953; Evropski patent broj EP 0 733 067, i U.S. patenti br. 5,770,777; 5,824,784 i 5,985,265, koje je sve podneo Kinstler, 0. B., et al.).
Evropska patentna prijava čiji je podnosilac Kinstler et al., (EP 0 822 199 A2) takođe generalizuje koristi od N-terminalne pegilacije kod svih polipeptida, što nije bilo iskustvo istraživača predmetnog pronalaska. Specifično, usled toga što aminoterminali molekula antitela se nalaze proksimalno od antigen kombinujućeg regiona proteina antitela (Chapman, A.P., 2002, Adv. Drug. Deliv. Rev. 54 : 531 - 545), N-terminalna pegilacija antitela je neočekivano pogubna po biološku aktivnost u poređenju sa nasumičnom pegilacijom lizinskih ostataka kao što je opisao Larsen, R.S., et al, gore navedeno. Slično tome N-terminalna pegilacija proteina koji se vezuju za receptor, koji ne spadaju u kategoriju RN proteina koji se vezuju za receptor, npr., kao što je interferon-y (videti Sliku 8), ispoljava veću inhibitornu interakciju sa receptorima, nego nasumična pegilacija lizinskih ostataka takvih proteina koji se vezuju za receptor.
Stoga, kao što je naznačeno gore, postupci prema predmetnom pronalasku, se razlikuju od onih koje je opisao Kinstler et al., u publikacijama koje su ovde citirane, po tome što konjugati postupci prema predmetnom pronalasku se dobijaju konjugacijom jednog ili više citokina, hemokina, faktora rasta, polipetidnih hormona ili njihovih antagonista, koji su izabrani kao RN proteini koji se vezuju za receptor sa jednim ili sa više polimer, tako što se stvara smeše između liganada i jednog ili više polimera, pri pH vrednosti od 5,6 do 7,6; pri pH vrednosti od 5,6 do 7,0; pri pH vrednosti od 6,0 do 7,0; pri pH vrednosti od 6,5 do 7,0; pri pH vrednosti od 6,6 do oko 7,6; pri pH vrednosti od 6,6 do oko 7,0; ili pri pH vrednosti od 6,6. Nasuprot tome postupci Kinstlera et al., se zasnivaju na konjugaciji liganada ispod 5,5 za koju su podnosioci predmetnog pronalaska pronašli da je suboptimalna ili inferiorna za dobijanje preparata liganada koji su selektivno konjugovani sa polimera na udaljenim N-terminalnim aminokiselinama i/ili na udaljenim glikozilacionim mestima.
R. B. Pepinsky et al., (PCT publikacija broj WO 00/23114 i U.S. patentna prijava broj 2003/0021765 Al) opisuju polimerne konjugate glikoziliranog interferona-[3-1 a koji su aktivniji od ne glikoziliranog intetferona-(3-lb, što se procenjuje antivirusnim testom. Ova referenca takođe opisuje da polialkilen glikol može da se poveže sa interferono-(3-la upotrebom mnoštva vezujućih grupa na različitim mestima, uključujući amino-terminal, karboksi-terminal i ugljenohidratnu grupu glikoziliranog proteina. U ovoj publikaciji nije opisano, međutim, da opisani postupci mogu biti generalizovani na druge proteine: "ova ispitivanja ukszuju da uprkos konzervaciji sekvence između interferona-(3-1 a i interferona-(3-lb, oni predstavljaju različite biohemijske entitete i zato mnogo od onoga što se zna o interferonu-|3-lb ne može da se primeni na interferon-(3-la, kao i obrnuto". Nasuprot tome predmetni pronalazak opisuje zajedničke osobine koje poseduju RN i RG proteini koji se vezuju za receptor, kao što je to definisano ovde. Shodno predmetnom pronalasku i interferon-(3-1 a i interferon-(3-lb su RN proteini koji se vezuju za receptor. Dodatno, interferon-(3-lb je RG protein koji se vezue za receptor. Shodno tome, nasuprot postupcima WO 00/23114, postupci prema predmetnom pronalasku su stabilni za dobijanje stabilnih biološki aktivnih konjugata i interferona-(3-lb i interferona-(3-la.
Z. Wei et al., (U.S. patent 6.077.939) opisuju postupke za vezivanje u vodi rastvorljivih polimera (posebno PEG) za N-terminal a ugljenikovog atoma polipeptida (posebno etitropoetina), gde je amin na a ugljeniku N-terminalne aminokiseline prvo transaminiran do a karbonil grupe koja zatim reaguje sa PEG derivatom kako bi se dobio oksimska ili hidrazonska veza. S obzirom da je cilj opisa ove reference, razvijanje postupka koji bi bio prihvatljiv na proteine generalno, nije dato razmatranje o očuvanju aktivnosi vezivanja za receptor koja može da rezultuje iz izbora aminoterminala kao mesta pegilacije određenih proteina koji se vezuju za receptor. Stoga, za razliku od opisa Wei-a, predmetni pronalazak ne zahteva uklanjanje N-terminalne a aminogrupe, već, nasuprot tome, može da očuva naelektrisanje N-terminalne a aminogrupe pri neutralnoj pH vrednosti putem formiranja sekundarne aminske veze između proteina i polimera. C.W. Gilbert et al., (U.S. patent broj 6,042,822; Evropski patent broj EP 1 039 922) opisuje poželjnost smeše položajnih izomera PEG - interferona-a-2b, gde je posebno poželjan izomer poseduje PEG koji je vezan za histidiniski ostatak interferona-a-2b, posebno za histidin-34 i pokazuje daje PEG veza za histidin-34 nestabilna. S obzirom da se histidin-34 nalazi na površini interferona-a-2b u regionu koji mora da dođe u blizak kontakt sa receptorom za interferon kako bi došlo do inicijacije prevođenja signala (videti Sliku lb predmetne specifikacije), nestabilnost veze između PEG i histidina-34 koja je opisana u ovim referencama, izgleda da je kritična za funkciju PEG interferonskog konjugata koji je tamo opisan. Značajno čist sa histidinom povezani proteinski polimerni konjugati su opisani od S. Lee et al., U.S. patent broj 5,985,263. Nasuprot tome, predmetni pronalazak pokazuje da jedan poželjni konjugat PEG-interferonski konjugat, gde je PEG stabilno vezan na mestu koje je udaljeno od domena za vezivanje za receptor interferonske komponente.
P. Bailon et al., (2001, Bioconjug. Chem. 12 : 195 - 202), opisuje da interferon-a-2a. koji je pegiliran sa jednim molekulom di-mPEG-lizina od 40 kDa po molekulu interferona se sastoji od 4 glavna položajna izomera. Ova referenca opisuje da je približno sav PEG povezan amidnim vezama za lizine 31, 121, 131, ili 134, od kojih se svaki nalazi unutar ili u blizini domena za vezivanje za receptor interferona-a-2a (ostaci 29-35 i 123-140 prema Bailon et al, videti Sliku la predmetne specifikacije. N-terminalna pegilacija nije saopštena od Bailon et al. Antivirusna aktivnost izolovane smeše pozicionih izomera PEG-interferona protiv infekcije Madin-Darby goveđih ćelija bubrega in vitro sa virusom vezikularnog stomatitisa saopšteno je daje 7% od one koju poseduje ne konjugovani interferon-a-2a koji je testiran. Izraziti gubitak koji je primećen za ove PEG-interferonske konjugate koji ne sadrže N-terminalni pegilirani interferon, na taj način jasno razlikuje konjugate Bailon et al, od onih prema predmetnom pronalasku.
R.B. Pepinsky et al., (2001, J. Pharmacol. Exp. Ther. 297: 1059-1066), opisuje sintezu konjugata iz (1) glikoziliranog interferona-(3-la koji poseduje N-terminalni metioninski ostatak i (2) PEG aldehida od 20 kDa. Konjugat, koji je u refernci označen kao monopegiliran na N-terminalnom metioninu, zadržava potpunu biološku aktivnost, po navodima, u antivirusnom testu, dok vezivanje PEG veće molekulske mase, smanjuje ili eliminiše antivirusnu aktivnost. Iako ovi autori opisuju da je njihov izbor N-terminalnog mesta za pegilaciju glikoziliranog interferon-P-la bilo diktirano raspoloživošću reagenasa za pegilaciju specifičnu za mesto i molekulskim modelovanjem, oni priznaju da 'neki efekti jesu specifični za proizvod". Štaviše, nasuprot predmetnom pronalasku, tamo saopštena zapažanja nisu generalizovana tako da uključuju klasu proteina koji se vezuje za receptor koji su ovde definisani kao RN proteini koji se vezuj u za receptor.
J. Burg et al., (PCT publikacija broj WO 01/020127 A2) opisuje proizvodnju alkoksiPEG konjugata eritropoetinskih glikoproteina, gde jedna do tri niti metoksiPEG reaguje sa sulfhidril grupama koje su hemijski uvedene modifikacijom epsilon aminogrupa na površini glikoproteina. Za razliku od predemtnog pronalaska, ova referenca ne opisuje bilo koji pokušaj vezivanja PEG za slobodnu a aminogrupu N-terminalne aminokiseline eritropoetina ili izbegavanje modifikacije lizinskih ostataka u regionima eritropoetinskog glikoproteina koji su od ključne važnosti za interakcije sa receptorima za eritropoetin.
J. Burg et al, (PCT publikacija broj WO 02/49673 A2) opisuje sintezu N-terminalnih sa amindom povezanih PEG konjugata prirodnih ili muteinskih eritropoetinskih glikoproteina postupkom koji koristi N-terminalne peptidne ekstenzije koje se mogu selektivno cepati i koje se cepaju pre pegilacije a nakon reveerzibilne citrakonilacije svih epsilon aminogrupa lizinskih ostataka glikoproteina. Opisani prikaz procesa u više koraka u ovoj referenci je imao za cilj stvaranje procesa pegilacije koji je selektivan za slobodnu a-aminogrupu N-terminalne aminokiseline u cilju dobijanja homogenih monopegiliranih konjugata, čime i se izbegla potreba za razdvajanjem monopegiliranih konjugata od višestruko pegiliranih derivata. Ovaj postupak se razlikuje od postupaka prema predmetnom pronalasku, u brojnim i važnim stavkama uključujući, bez ograničenja: (1) pristup opisan od Burg et al. je aograničen na eritropoetinske glikoproteine za koje se alkoksiPEG vezuje putem amidnih veza, dok je predmetni pronalazak primenjljiv na mnoštvo biološki aktivnih komponenti koje su konjugovane korišćenjem moštva sintetskih polimera; (2) predmetni pronalazak se odnosi i na glikozilirane i na ne glikozilirane RN i RG proteine koji se vezuju za receptor, dok Burg et al. opisuju samo konjugacije glikoproteina; (3) predmetni pronalazak obuhvata i alkoksiPEG-ove, kao što je mPEG, kao i monofunkcionaino-aktivirane hidroksiPEG-ove, dok Burg et al. opisuju samo upotrebu alkoksi PEG-ova; (4) u predmetnom pronalasku, poželjnije su sekundarne aminske veze između polimera i proteina od amidnih veza koje koristi Burg et al., jer su ove prethodne stabilnije i zadržavaju pozitivno naelektrisanje aminogrupe. U analognom radu iste grupe, J. Burg et al., (U.S. patent broj 6,340,742) opisuje se proizvodnja amidnim vezama povezanih konjugata eritropoetinskih glikoprotein, gde se jedna do tri niti alkoksiPEG vezuju za jednu do tri aminogrupe na proteinu. Za razliku od predmetnog pronalaska, ova referenca ne saopštava refrerencu za a amino grupu N-terminalne kiseline ili za aminogrupe koje se ne nalaze u regionima koji su uključeni u interakcije sa receptorima.
C. Delgado et al., (U.S. patenet broj 6,384,195) opisuje konjugate faktora za stimulaciju kolonija granulocita/makrofaga koji su dobijeni korišćenjem reaktivnog polimera koji je predstavljen kao tresil monometoksiPEG i koji je tamo označen kao "TMPEG". Ova referenca ukazuje da kada TMPEG stupi u kontakt sa rekombinantnim humanim GM-CSF, "modifikovani materijal sadrži vrste koje nemaju aktivnost kao i vrste sa većom aktivnošću od nemodifikovanog materijala". Kao što prosečan stručnjak lako uviđa, vrste bez . Kao što prosečan stručnjak lako uviđa, vrste bez aktivnosti su neželjene u smeši polimer/biološki aktivne komponenta konjugata, posebno u preparatima za terapeutsku upotrebu koji sadrže takve konjugate, jer oni mogu da doprinesu rizicima primene konjugata kod pacijenta, koji ima potrebu za takvom primenom bez doprinosa poželjnim efektima. Kao što je ovde naglašeno, predmetni pronalazak prevazilazi ovo ograničenje u struci barem delimično tako što izbegava modifikaciju GM-CSF i drugih proteina koji se vezuju za receptor na mestima tih proteina koja su uključena u aktivnost vezivanja za receptor, pa se tako smanjuje ili eliminiše sinteza molekulskih vrsta bez aktivnosti. Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje postupke za frakcioniranje i prečišćavanje konjugata koji imaju različite veličine, naelektrisanja i/ili različit stepen zaštite naelektrisanja na proteinu od strane polimera (videti slike 9-12).
Treba primetiti da U.S. patent broj 6,384,195 ne pominje N-ternminalnu pegilaciju GM-CSF, pa stoga i ne prepoznaje prednosti postupaka prema predmetnom pronalasku. Konačno, U.S. patent broj 6,384,195 pokazuje referencu za konjugate u kojima je više od jednog PEG povezan za svaki molekul GM-CSF, bez bilo kakvog razmatranja, gde na molekulu GM-CSF su povezani ovi molekuli PEG (kada se izuzmu mesta vezivanja za lizinske ostatke). Izjavljivanjem preference za konjugate sa do 6 molekuula po molekulu GM-CSF,ova referenca izjavljuje preferencu za konjugate u kojima PEG može biti povezan za sve moguće lizinske ostatke, čime se osigurava da PEG bude vezan i u položajima koje sterički ometaju blizak pristup proteina do njegovih receptora na površini ćelije (videti Sliku 3 predmetne specifrikacije). Nasuprot tome predmetni pronalazak ukazuje na nepoželjnost vezivanja PEG za lizinske ostatke, izuzev onda kada su lizinsk ostaci udaljeni od domena proteina koji se vezuje za receptor, koji su neophodni za interakciju sa receptorima, a time i za transdukciju asignala (u slučaju agonista) ili u slučaju kompetitivne inhibicije transdukcije signala ( u slučajevima antagoniste).
T. Nakamura et al., (PCT publikacija broj WO 02/32957 Al) opisuje da povećanje molekulske mase PEG koji je povezan za epsilon mainogrupu lizinskog ostatka na položaju 52 eritropoetinskog glikoproteina povećava eritropoetski efekat konjugata in vivo, i smanjuje afinitet konjugata za eritropoetinski receptor. Za razliku od predmetnog pronalaska ova referenca opisuje povezivanje PEG na aminoterminalu ili blizu mesta glikozilacije, niti prepoznaje bilo koju prednost takvog vezivanja. Stoga, predmetni pronalazak obezbeđuje konjugate i postupke za sintezu konjugata biološki aktivnih komponenti koje su povezane sa sintetskim polimerom, koji poseduju strukturne i funkcionalne prednosti u odnosu na one koji su prethodno opisani.
Preparati
Predmetni pronalazak obezbeđuje konjugate ili komlekse koji sadrže jednu ili više biološki aktivnih komponenti, poželjno jedan ili više citokina, hemokina, faktora rasta ili polipeptidnih hormona, koji su povezani sa jednim ili sa više stabilizujućih polimera kao što je jedan ili više PEG. Tipično, takvi konjugati se dobijaju postupcima prema predmetnom pronalasku, koji su opisani ivde, međutim konjugati koji poseduju strukture i aktivnosti koje se razlikuju od onih koji su opisani ovde, smatraju se ekvivalentnim ukoliko su dobijeni postupcima prema predmetnom pronalasku, pa su zato obuhvaćeni obimom zaštite prema predmetnom pronalasku. U povezanim rešenjima, predmetni pronalazak, takođe obezbeđuje preparate koji sadrže jedan ili više takvih konjugata ili kompleksa. Preparati prema ovom rešenju predmetnog prnalaska sadrže jedan ili više (npr., jedan, dva, tri, četiri, pet, deset itd.) gore opisanih konjugata ili kompleksa prema predmetnom pronalasku. U određenim rešenjima preparati mogu da sadrže jednu ili više dodatnih komponenti, kao što su jedna ili više puferskih soli, jedan ili više halotropnih sredstava, jedan ili vive detergenata, jedan ili više proteina (npr., albumin ili jedan ili više enzima), jedan ili više nevezanih polimera, jedno ili više osmotski aktivnih sredstava i si. Preparati prema ovom rešenju predmetnog pronalaska mogu da se nalaze u bilo kom obliku, uključujući čvrsti oblik (npr., suvi prah) ili rastvor (posebno u obliku fiziološki kompatiilnog rastvora puferovane soli koji sadrži jedan ili više konjugata prema predmetnom pronalasku).
A. Farmaceutski preparati
Određeni preparati prema predmetnom pronalasku su posebno formulisani kao farmacutski preparati z aupotrebu u profilaktičke, dijagnostičke ili terapijske svrhe. Takvi preparati tipičnio sadrže jeadan ili više konjugata, kompleksa ili konjugata prema predmetnom pronalasku i jedan ili više prihvatljivih farmaceutskih nosilaca ili ekscipijenata. Pojam "farmaceutski prihvatljiv nosilac ili ekscipijent", kao što se ovde koristi, ozančava ne toksični čvrsti, polučvrsti ili tečni punilac, diluent, materijal za
enkapsulaciju ili pomoćno sredstvo za formulisanje bilo kog tipa koje može biti tolerisano od strane recipisjentne životinje, uključujući čoveka ili drugog sisara u čiji se organizam uvodi farmaceutski preparat, bez neželjenih efekata koji mogu da rezultuju njegovim davanjem.
Farmaceutski preparati prema predmetnom pronalasku mogu da se primene kod recipijenta putem bilo kog pogodnog načina primene, kao što je oralni, rektalni,
parenteralni, intrasistemski, vaginalni, intraperitonealni, topijski (u vidu praškova, masti, kapljica ili transdermalnih flastera), bukalni način primene, npr., u vidu oralnog ili nazalnog spreja ili inhalacijom. Pojam "parenteralno", kao što se ovde koristi, označava načine primene koji obuhvataju intravensku, intraarterijsku, intramuskularnu, intraperitonealnu, intracisternalnu, subkutanu i intra-artikularnuinjekciju i infuziju.
Farmaceutski preparati koji su obezbeđeni predmetnim pronalaskom, za parenteralnu injukciju, mogu da sadrže farmaceutski prihvatljive sterilne vodene ili ne vodene raastvore, disperzije, suspenzije ili emulzije, kao i sterilne praškove za rekonstituciju u sterilne injektibilne rastvore ili disperzije, neposredno pre upotrebe. Primeri odgovarajućih vodenih i ne vodenih, nosilaca, diluenata, rastvarača ili vehikuluma uključuju vodu, etanol, poliole (kao što je glicerol i slični, propilen glikol, poli(etilen glikol)), karboksimetilcelulozu i odgovarajuće njene smeše, biljna ulja (kao što je maslinovo), kao i injektibilne organske estre kao što je etil oleat. Odgovarajuća fluidnost može da se održava na primer, upotrebom oblagajućih materijala kao što je lecitin, održavanjem potrebne veličine čestica u slučaju disperzija i upotrebom surfatanata.
Takvi farmaceutski preparat prema predmetnom pronalasku mogu takođe da sadrže adjuvanse kao što su sredstva za vlaženje, emulgujuća sredstva i dispergujuća sredstva. Sprečavanje nastanka dejstva mikroorganizama može da se osigura uključivanjem različitih antibakterijskih i antifungalnih sredstava, npr., parabena, benzil alkohola, hlorobutanola, fenola, sorbinske kiseline i slično. Takođe može biti poželjno da budu uključena osmotska sredstva kao što su šećeri, natrijum hlorid i slično. Produžena apsorpcija injektibilnih farmaceutskih oblika može da se ostvariuključivanjem sredstava koja odlažu apsorpciju, kao što su aluminij um monostearat, hidrogelovi, gelatin. U nekim slučajevima, kako bi se produžilo dejstvo lekova poželjno je da se uspori apsorpcija iz subkutane ili intramuskularne injekcije. Ovo može da se postigne korišćenjem tečnih suspenzija, kristalnog ili amorfnog materijala sa malom rastvorljivošću u vodenim telesnim tečnostima. Brzina apsorpcije leka tada zavisi od njegove brzine rastvaranja, koja, sa svoje strane, može da zavisi od njegovog fizičkog oblika. Alternativno, odložena apsorpcija, parenteralno primenjenog leka može da se postigne rastvaranjem ili suspendovanjem leka u uljastom vehikulumu.
Injektibilni depo oblici se dobijaju formiranjem mikroenkapsuliranih matrica leka u biološki razgradljivim polimerima, kao što su poliaktid-glikolid. U zavisnosti od odnosa leka i polimernog nosioca, kao i prirode određenog polimernog nosioca koji se koristi, može da se kontroliše brzina otpuštanja leka. Primeri, drugih biološki razgradljivih polimera obuhvataju biokompatibilne poli(osrtoestre) i poli(anhidride). Injektibilne depo formulacije se takođe dobijaju zatvaranjem leka u lipozomu ili mikroemulzije koje su kompatibilne sa telesnim tkivima.
Injektibilne formulacije mogu biti stabilizovane, npr., filtracijom kroz filtere koji zadržavaju bakterije, ili inkorporacijom sredstava za formulaciju u obliku sterilnih čvrstih preparata koji mogu biti rastvoreni ili dispegovani u sterilnoj vodi ili u drugim sterilnim injektibilnim podlogama neposredno pre upotrebe.
Čvrsti dozni oblici za oralnu primenu obuhvataju kapsule, tableta, pilule, praškove i granule. U takvim čvrstim doznim oblicima, aktivna jedinjenja se mešaju sa najmanje jednim farmaceutski prihvatiljivim recipijentom ili nosiocem, kao što su natrijum citrat ili kalcijum fosfat i/ili sa (a) puniocima ili ekstenderima kao što su škrobovi, laktoza, sukroza, glukoza, manitol i slicijumska kiselina, (b) sa veznicima kao što su, npr., karboksimetil celuloza, alginati, gelatin, polivinilpirolidon, sukroza i guma akacije, (c) sa humektantima kao što je glicerol. (d) sa sredstvima za dezintegraciju, kao što su agar-agar, kalcijum karbonat, škrob krompija ili manioke, algininska kiselina, određeni silikati i natrijum karbonat, (e) sa sredstvima za održavanje rastvora kao što je parafin, (f) sa akceleratorima apsorpcije, kao što su kvaternarna amonijum jedinjenja, (g) sa sredstvima za vlaženje kao što su, npr., cetil alkohol i glicerol monostearat, (h) sa adsorbentima kao što su kaolin i bentonit glina, kao i (i) sa lubrikantima kao što su talk, kalcijum stearat, magnezijum stearat, čvrsti PEG-ovi, natrijum lauril sulfat, i njihove smeše. U slučaju kapsula tableta i pilula, dozni oblik takođe može da sadrži sredstva za puferovanje.
Čvrsti preparati sličnog tipa mogu da se koriste kao punioci u mekim i čvrstim gelatinskim kapsulama, korišćenjem ekscipijenata kao što je laktoza (mlečni šećer), kao i PEG-ovi visokih molekulskih masa i slično.
Čvrsti dozni oblici tableta, dražeja, kapsula, pilula i granula, mogu da se pripreme sa oblogama i omotačima kao što su enterične ili hronomodulišuće obloge, kao i sa drugim oblogama koje su dobro poznate u struci farmaceutske formulacije. Oni opciono mogu da sadrže sredstva za opacifikaciju, takođe, mogu biti takvog sastava da otpuštaju samo aktivni sastojak ili poželjno da otpuštaju aktivni sastojak u određenom delu gastrointestinalnog trakta, opciono, na odloženi način. Primeri preprata za oblaganje koji mogu da se koriste obuhvataju polimerne supstance i voskove. Aktivna jedinjenja takođe mogu da se nalaze u mikroinkapsuliranom obliku, ukoliko je to poželjno sa jednim ili sa više gore pomenutih ekscipijenata.
Tečni dozni oblici za oralnu primenu obuhvataju farmaceutski prihvatljive emulzije, rastvore, suspenzije,sirupe i eliksire. Kao dodatak aktivnim jedinjenjima, tečni dozni oblici mogu da sadrže inertne diluente koji se uobičajeno koriste u struci, kao što su na primer, voda ili drugi rastvarači, sredstva za solubilizaciju i emulzifikatori, kao što su etil alkohol, izopropil alkohol, etil karbonat, etil acetat, benzil alkohol, benzil benzoat, propilen glikol, 1,3-butilen glikol, dimetil formamid, ulja (posebno, ulje semena pamuka, kikirikija, kukuruza, klica, masline, ricinusa i sušama), glicerol, tetrahidrofluril alkohol, poli(etilen glikoli) i estri masnih kiselina, sorbitana i njihove smeše.
Kao dodatak inertnim diluentima oralni preparati takođe mogu da sadrže adjuvans, kao što su sredstva za vlaženje, sredstva za emulgaciju i suspendovanje, zaslađivače, veštačke arome, i parfemska sredstva.
Suspenzije, kao dodatak aktivnim jedinjenjima mogu da sadrže sredstva za suspendovanje kao što su, na primer, etoksilirani izostearil alkoholi, polioksietilen sorbitol, i sorbitan estri, mikrokristalna celuloza, aluminijum metahidroksid, bentonit, agar-agar, tragakant, i njihove smeše.
Topijska primena obuhvata primenu na kožu ili sluzokožu, uključujući i površine pluća i oka. Preparati za topijsku primenu, uključujući i one za inhalaciju, mogu da se pipreme kao suvi prašak koji može da bude pod pitiskom ili bez pritiska. U preparatima sa praškom bez pritiska, aktivni sastojski u fino podeljenom obliku mogu da se koriste u smeši sa farmaceutski prihvatljivim inertnim nosiocem sa česticama većeg promera, koji sadrži čestice veličeine do, npr., 100 um u prečniku. Odgovarajući inertni nosioci obuhvataju šećere, kao što su laktoza i sukroza.Poželjno, najmanje 95% (masenih) čestica aktivnog sastojka ima efektivnu veličinu čestica u opsegu od 0,01 do 10 mikrometara.
Alternativno, farmaceutski preparat može biti pod pritiskom i sadržati komprimovani gas kao što je azot ili gasni propilant u tečnom stanju. Podloga.propilanta u tečnom stanju, a i ukupni preparat mogu, poželjno, biti takvi da aktivni sastojci ne budu rastvoreni u njima u nekom značajnom stepenu. Preparat pod pritiskom takođe može da sadrži povrđinski ktivno sredstvo. Površinski aktivno sredstvo može biti tečno ili čvrsto ne jonsko, površinski aktivno sredstvo ili može biti čvrsto anjonsko površinsko aktivno sredstvo. Poželjno je da se koristi čvrsto anjonsko površinski aktivno sredstvo u obliku natrijumove soli.
Dalji oblik topijske primene jeste primena na oko. U ovom načinu primene, konjugati i preparati prema predmetnom pronalasku se dopremaju u farmaceutski prihvatljivom oftalničkom vehikulumu, tako da se aktivna jedinjenja održavaju u kontaktu sa očnom površinom tokom dovoljno dugog vremenskog perioda, da bi se jedinjenjima omogućilo da penetriraju konjuktivu ili rožnjaču i da dospeju do unutrašnjih regiona oka, npr., do prednje komore, zadnje komore, staklastog tela, očne vodice, tečnosti u staklastom telu, do rožnjače, do dužice/ciljanog tela, do sočiva, do horoidee kroz retine, i do beonjače. Farmaceutski prihvatljivi oftalmički vehikulum može biti mast, biljno ulje ili enkapsulirajući materijal.
Preparati za rektalnu ili vaginalnu primenu su poželjno, supozitorije koje mogu da se pripreme mešanjem konjugata ili preparata prema predmetnom pronalasku sa odgovarajućim ne iritirajućim ekscipijentima ili nosiocima, kao što su buter kakaoa, PEG ili vosak za supozitorije, koji su u čvrstom stanju na sobnoj temperaturi, ali prelaze u tečno stanje na temperaturi tela i stoga se tope u šupljini rektuma ili vagine i otpuštaju lekove.
Farmaceutski preparati koji se koriste u terapijskim postupcima prema predmetnom pronalasku, takođe, mogu da se primene u obliku lipozoma. Kao što je poznato u struci, lipozomi se generalno izvode iz fosfolipida i drugih lipidnih supstanci. Lipozomi se formiraju pomoću mono- ili multi-lamelarnih hidriranih tečnih kristala koji se disperguju u vodenoj podlozi. Može da se upotrebi bilo koji netoksični, fiziološki prihvatljivi lipid koji može da se metabolizuje i koji je sposoban da stvara lipozome. Kao dodatak, jednom ili većem broju konjugata ili preparata prema predmetnom pronalasku, farmaceutski preparati, prema predmetnom pronalasku, u obliku lipozoma takođe mogu da sadrže jedan ili više stabilizatora, konzervanasa, ekscipijenata i slično. Poželjni lipidi su fosfo lipidi i fosfatidil holini (lecitini), kao prirodni tako i sintetski. Postupci za dobijanje lipozoma su poznati u struci (videti, npr., Zaplinskv, S. et al., U.S. patent broj 5,395,619). lipozomi koji sadrže fosfolipide koji su konjugovani sa PEG, najčešće sa fosfatidil etanolamin koji je povezan sa monometoksi-PEG, imaju poželjna svojstva, ukjlučujući produženo vreme poluživota u cirkulaciji sisara (Fisher, D., U.S. patent broj 6,132,763).
B. Upotrebe
Kao što je ovde i na drugim mestima naznačeno, postupci, konjugati i preparati prema predmetnom pronalasku, se poželjno koriste u postupcima za održavanje biološke aktivnosti komponenti, bez interferiranja sa sposobnošću bioloških komponenti da se vežu za svoje receptore. Određeni takvi postupci, prema predmetnom pronalasku, mogu da obuhvate, dopremanje jednog ili više konjugata ili preparata do ćelija, tkiva, organa ili organizama. Posebno, predmetni pronalazak obezbeđuje kontrolisano dopremanje jedne ili više komponenti, kompleksa ili preparata do ćelija, tkiva organa ili organizama, čime obezbeđuje da korisnik ima sposobnost da reguliše, vremenski i prostorno, količinu određene komponente koja se otpušta radi ispoljavanja aktivnosti na ćelijama, tkivima, organima ili organizmima.
Generalno, takvi postupci prema predmetnom pronalasku, obuhvataju jedno ili više aktivnosti. Na primer, jedan takav postupak prema predmetnom pronalasku, obuhvata: (a) pripremanje jednog ili više konjugata ili preparata prema predmetnom pronalasku, kao što je ovde detaljno opisano i (b) omogućavanje kontakta jedne ili više ćelija, tkiva, organa ili organizama sa jednim ili sa više konjugata ili preparata, u uslovima koji pogoduju vezivanju jednog ili više preparata ili konjugata, prema predmetnom pronalasku, za ćelije tkiva organe ili organizme. aOnda kada se biološki aktivne komponente konjugata i/ili konjugata, prema predmetnom pronalasku, vežu za (ili u nekim slučajevima intemalizuju) ćelije, tkiva, organe ili organizme, komponente nastavljeju dea ispoljavaju njihove željene biološke funkcije. Na primer, peptidne komponente mogu da se vežu za receptore ili za druge komponente na ili unutar ćelija, tkiva, organa, ili organizama. Da participiraju u metaboličkim reakcijama unutar ćelija, tkiva, organa ili prganizama; da ispoljavaju, pospešuju ili aktiviraju ili smanjuju ili inhibiraju jednu ili više enzimskih aktivnosti unutar ćelija, tkiva, organa ili organizama; da obezbeđuju nedostajući strukturnu komponentu ćelijama, tkivima, organima ili organizmima; da obezbeđuju jednu ili više nutritivnih potreba ćelija, tkiva, organa ili organizama; da inhibiraju, tretiraju, otklanjaju ili na drugi način ublažavaju jedan ili više procesa ili simptoma oboljenja ili fizičkog poremećaja i tome slečno.
U dodatnim rešenjima, konjugati ili preprarati prema predmetnom pronalasku,mogu da se koriste u industrijskoj ćelijskoj kulturi, zbog neočekivano visoke potencije biološki kativnih komponenti konjugata, koja se dobija kao rezultat kombinovanih efekata, značajnog zadržavanja njihove biološke aktivnosti i produžavanja trajanja dejstva čak i u teškim uslovima industrijske upotrebe. Ove neočekivano visoke potencije konjugata, prema predmetnom pronalasku, mogu da dovedu do neobično visoke proizvodnje biološke mase, do neobično visokih nivoa ekspresije rekombinantnih proteina i do drugih poboljšanja u efikasnosti biološke obrade.
C. Dozni režimi
Konjugati, kompleksi ili konjugati prema predmetnom pronalasku, mogu da se primene in vitro, ex vivo ili in vivo, na ćelije, tkiva, organe ili organizme kako bi se do njih dopremila jedna ili više bioloških komponenti (tj., jedan ili više citokina, hemokina, faktora rasta ili polipeptidnih hormona ili njihovih antagonista). Stručnjak zna da efikasne količine datog aktivnog jedinjenja, kompleksa ili preparata mogu da se odrede empirijski ili mogu da se odrede u čistom obliku ili, tamo gde takav oblik postoji u obliku farmaceutski prihvatljive formulacije ili prekursora leka. Jedinjenja, konjugati, kompleksi ili preparati, prema predmetnom pronalasku, mogu da se primene kod životinje (npr., kod sisara, kao što je čovek) koji je pacijent kome je potreban veterinarski ili farmaceutski preparat pomenutih jedinjenja u kombinaciji sa jednim ili više farmaceutski prihvatljivih ekscipijenata. Nivo terapijski efikasne doze za bilo kog određenog pacijenta zavisi od mnoštva činilaca uključujući tip i stepen ćelijskog odgovora, koji treba da se postigne; indentitet i/ili aktivnost specifičnih jedinjenja, konjugata, kompleksa ili preparata, koji se koriste; starosnu dob, telesnu masu ili površinu tela, opšte zdravstveno stanje, pol, kao i način ishrane pacijenta; vreme primene, način primene i brzinu ekskrecije datih jedinjenja; trajanje tretmana; druge lekove koji se koriste u kombinaciji ili zajedno sa specifičnim jedinjenjima, komleksima, konjugatima ili preparatima; i slične faktore koji su dobro poznati prosečnom stručnjaku u farmaceutskoj i medicinskoj struci. Na primer, u okviru kompetencije stručnjaka jeste da se počne sa nivoima doza datog jedinjenja, konjugata, kompleksa ili preparata prema predmetnom pronalasku, koji su manji od onih koji su potrebni za postizanje željenog terapijskog efekta, i da se postepeno povećavaju doze do postizanja željenog efekta.
Dozni režimi, takođe mogu da budu organizovani na način koji je specifičan za pacijenta, kako bi se obezbedila prethodno određena koncentracija datog aktivnog jedinjenja u krvi, što se određuje tehnikama koje su prihvaćene i koje su rutinske u struci, npr., upotrebom hromatografije sa ekskluzijom po veličini, jonoizmenjivačke hromato grafije ili tečne hromatografije reverzne faze visoke performanse (HPLC), biološkim testovima ili imunotestovima. Stoga, dozni režimi kod pacijenata mogu da se podese tako da se postignu relativno konstantninivoi jedinjenja u krvi, što se određuje upotrebom HPLC ili imunoloških testova, shodno postupcima koji su rutinski i poznati prosečnom stručnjaku u medicinskoj, farmaceutskoj i/ili farmakološkoj struci.
D. Dijagnostičke i terapijske upotrebe
Dijagnostička upotreba konjugata prema predmetnom pronalasku, može da obuhvati lociranje ćelije ili tkiva, koja poseduju neobično visok stepen vezivanja citokina, hemokina, faktora rasta ili polipeptidnih hormona, npr., kancerskog tkiva koje je u okviru telaživotinje, posebno čoveka, primenom konjugata ili preparata, prema predmetnom pronalasku, pri čemu je konjugat (ili jedna ili više komponenti, tj., biološki aktivna komponenta i/ili sintetski polimer) obeležen ili sadrži jednu ili više oznaka koje se mogu detektovati, tako da je omogućena detekcija, npr., optička, radiometrijska, fluorescentna ili rezonantnadetekcija shodno postupcima poznatim u struci. Na primer, većima kancera ne-sitnoćelijskih kancera pluća eksprimira neobično visoku koncentraciju receptora za epidermalni faktor rasta (Bunn, P. A., et al., 2002, Semin. Oncol. 29 (dodatak 14) : 38 - 44). Stoga, u drugom aspektu predmetnog pronalaska, preparati i konjugati, prema predmetnom pronalasku, mogu da se koriste u dijagnostičkim ili terapeutskim postupcima, npr., u dijagnozi, lečenju ili sprečavanju nastanka različitih fizičkih poremećeja kod životinje, posebno sisara kao što je čovek, koji je predisponiran za nastanak ili koji pati od takvog poremećaja. U ovim rešenjima, cilj terapije je da se uspori ili spreči nastanak razvoja poremećaja i/ili da se indukuje emisija ili da se održi emisija poremećaja i/ili da se smanje ili minimalizuju sporedni efekti drugih terapijskih režima.
Stoga, konjugati, kompleksi i preparati prema predmetnom pronalasku mogu da se koriste za zaštitu od, za supresiju i az tretman fizičkih poremećaja kao što su infekcije ili oboljenja. Pod pojmom "zaštita" od fizičkog poremećaja, kao što se ovde koristi smatra se "sprečavanje nastanka", "supresija", "tretman". Pojam "sprečavanje nastanka" obuhvata primenu kompleksa ili preparata, prema predmetnom pronalasku, pre indukcije oboljenja ili fizičkog poremećaja, dok pojam "supresija" podrazumeva primenu konjugata ili preparata pre kliničke pojave oboljenja. Stoga, pojmovi "sprečavanje nastanka" i "supresija" fizičkog poremećaja se tipično koriste kod životinje koja je predisponirana ili podložna razvoju poremećaja, ali koja još uvek ne boluje od njega. Pojam "tretman" fizičkog poremećaja, međutim obuhvata primenu terapeutskog preparata il konjugata, prema predmetnom pronalasku, nakon pojava oboljenja. Treba razumeti da kod čoveka i u veterinarskoj medicini, nije uvek moguće praviti razliku između "sprečavanja nastanka" i "supresije" fizičkog poremećaja. U drugim slučajevima, krajnjiinduktivni događaj ili događaji mogu biti nepoznati ili latentni tako da ni pacijent ni lekar ne moraju biti svesni induktivnog događaja, sve do kasnijeg perioda nakon pojave oboljenja. Stoga, uobičajeno je da se koristi pojam "profilaksa", koji se razlikuje od pojma "tretman" kako bi se obuhvatili pojmovi "sprečavanje nastanka" i "supresija", kao što su definisani ovde. Pojam "zaštita" koji se koristi shodno postupcima prema predmetnom pronalasku, zato ima značenje koje obuhvata pojam "profilaksa". Postupci prema ovom rešenju predmetnog pronalaska, mogu da sadrže jedan ili više koraka, koji dozvoljavaju lekaru da postigne gore opisane terapijske ciljeve. Jedan takav postupak, prema predmetnom pronalasku, obuhvata, na primer: (a) identifikaciju životinje (poželjno sisara kao što je čovek), koji pati od ili koji je predisponiran za nastanak žizičkog poremećaja; i (b) primenu kod životinjeefikasne količine jednog ili više konjugata, kompleksa ili preparata prema predmetnom pronalasku koji su opisani ovde, tako da ta primena konjugata, kompleksa ili preparata sprečava nastanak, odlaže ili omogućava dijagnozu razvoja, ili leči ili indukuje remisiju ili održava remisiju fizičkog poremećaja kod životinje.
Kao što se ovde koristi, životinja koja je "predisponirana za razvoj" fizičkog poremećaja, po definiciji jeste životinja koja ne pokazuje mnoštvo ispoljenih fizičkih simptoma poremećaja, ali koja je genetski fiziološki ili na neki drugi način u riziku za razvoj poremećaja. U postupcima prema predmetnom pronalasku, identifikacija životinja (kao što je sisar, uključujući čoveka) koja je predisponirana za, u riziku za razvoj ili koja pati od datog fizičkog poremećaja, može da se postigne upotrebom standardnih u struci poznatih opstupaka koji su poznati prosečnom lekaru, a koji obuhvataju, na primer, radiološke testove, biohemijske testove (npr., testove relativnih vrednosti određenih peptida, proteina, elektrolita itd., u uzorku kojije dobijen od životinje), hirurške postupke, genetske pretrage, porodičnu namnezu, afizičku palpaciju, patološke ili histološke testove (npr., mikroskopsku procenu tkiva ili uzoraka telesnih tečnosti ili briseva, imunološki testovi, itd.,), ispitivanje telesnih tečnosti (npr., krvi, seruma, plazme, cerebralne tečnosti, urina, pluvačke, spermei si.,), tehnike slikanja (npr., radiološkog, fluoroscentnog, optičkog, rezonantnog slikanja, (npr., korišćenjem nuklearne magnetne rezonance ("NMR") ili rezonance elektronskog spina ("ESR")), itd. Kada je životinja identifikovana primenom jednog ili više ovih postupaka, ona se može agresivno i/ili proaktivno tretirati da bi se sprečio nastanak, suprimirao, odložio ili izlečio fizički poremećaj.
Fizički poremećaji, čiji nastanak može da se spreči, koji mogu da se dijagnostikuju ili leče sa konjugatima, kompleksima, preparatima i postupcima prema predmetnom pronalasku, obuhvataju bilo koje fizičke poremećaje kod kojih biološki aktivna komponenta (tipično, citokin, faktor rasta, hemokin ili polipeptidna hormonska komponenta ili njen antagonista) konjugata ili preparata, može da se koristi u sprečavanju nastanka, dijagnozi ili tretmanu. Ovi poremećaji, obuhvataju bez ograničenja, različite kancere (npr., kancere dojke, kancere materice, kancere jajnika, kancere prostate, kancere testisa, leukemije, limfome, kancere pluća, neurološke kancere, kancere kože, kancere glave i vrata, kancere kosti, kancere debelog creva i druge gastrointestinalne kancere, kancere pankreasa, kancere bubrega i druge karcinome, sarkome, adenome i mijelome); jatrogena oboljenja; infektivna oboljenja (npr., bakterijska oboljenja, gljivična oboljenja, virusna oboljenja (uključujući hepatitis, oboljenja izazvana kardiotropnim virusima, HIV/SIDA i slično), parazitska oboljenja i slična; genetske poremećaje (npr., cistična fibroza, amijelotrofična lateralna skleroza, mišićnu distrofiju, Gošeovu bolest, Pompovu bolest, ozbiljni kombinovani imunodeficijentni poremećaj, patuljasti rast i slično), anemiju neutropeniju, trombocitopeniju, hemofiliju i druge poremećaje krvi; neurodegenerativne poremećaje (npr., multiplu sklerozu, Krojcfeld-Jakobovu bolest, Alchajmerovu bolest i slično); enzimske poremećaje (npr., giht, uremiju, hiperholesterolemiju i slične); poremećaje neodređene ili multifokalne etiologije (npr., kardiovaskularne bolesti, hipertenziju, imflamatornu bolest creva i slične); autoimune poremećaje (npr., sistemski lupus eritematodes, reumatoidni artritis, psorijazu, i slične) kao i druge poremećaje od medicinskog značaja, sa kojima je upoznat prosečan stručnjak. Konjugati, kompleksi, preparati i postupci, prema predmetnom pronalasku, takođe mogu da se upotrebe u sprečavanju nastanka progresije bolesti, kao na primer, u hemoprevenciji progresije premalignih lezija u maligne lezije.
Terapeutski postupci prema predmetnom pronalasku, stoga, koriste jedan ili više konjugata, kompleksa ili preparata, prema predmetnom pronalasku, ili jedan ili više farmaceutskih preparata, prema predmetnom pronalasku, koji mogu da se primene kod životinje koja ima potrebu za njihovom upotrebom na mnogo načina, uključujući oralnu, rektalnu, parenteralnu (uključujući intravensku, intra-arterijsku, intra-muskularnu, intraperitonealnu, intra-cistenalnu, subkutanu, i intra-artikularnu injekciju i infuziju), intrasistemsku, vaginalnu, intraperitonealnu, topijsku (u vidu praškova, ulja, kapljica, ili transdermlnih flastera), bukalnu primenu, kao i primenu oralnih ili nazalnih sprejeva ili inhalaciju. Prema predmetnom pronalasku, efikasna količina konjugata, kompleksa ili preparata, može da se primeni in vitro, ex vivo, ili in vivo na ćelije ili na životinje koje pate od ili su predisponirane za nastanak određenog poremećaja, čime se sprečava nastanak, odlaže, dijagnostikuje ili leči poremećaj kod životinja. Kao što se ovde koristi pojam "efikasna količina konjugata (ili kompleksa ili preparata)" odnosi se na količinu
koja omogućava da konjugat (ili kompleks ili preparat) ispoljava biološku aktivnost biološki aktivne komponente (npr., citokina, hemokina, faktora rasta ili polipeptidnih hormona ili njegovog natagoniste) konjugata, kompleksa ili preparata, čime se sprečava nastanak, odlaže, dijagnostikuje, tretira ili leči fizički poremećaj kod životinje kojoj je
konjugat, kompleks ili preparat, prema predmetnom pronalasku, dat. Stručnjak razume da efikasne količine konjugata, kompleksa ili preparata prema predmetnom pronalasku,
mogu da se odrede empirijski, upotrebom standardnih postupaka, koji su dobro poznati prosečnom stručnjaku u farmaceutskoj ili medicinskoj struci; videti, na priemer, Beers, M-H., et al, urednici, 1999, Merck Manual of Diagnosis and Therapv, 17. izdanje, Merck and Co., Rahway, NJ; Hardman, J.G., et al., urednici, 2001, Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10. izdanje, McGraw-Hill Medical Publishing Division, Nju Jork; Speight, T.M., et al., urednici, 1997, Avery's Drug Treatment, 4. izdanje, Aids International, Aukland, Novi Zeland; Katzung, B.G., urednik, 2000, Basic and Clinical Pharmacology, 8. izdanje, Lange Medical Books/McGraw-hill, Nju Jork;
koje su ovde inkorporirane u celosti, prema referenci.
Treba razumeti da kada se primeni kod humanog pacijenta, ukupna dnevna, nedeljna ili mesečna doza konjugata, kompleksa i preparata prema predmetnom pronalasku, je određena od strane ordinirajućeg lekara na osnovu medicinskog rasuđivanja, na primer, zadovoljavajući rezultari se dobijaju primenom određenih konjugata, kompleksa i preparata prema predmetnom pronalasku, u odgovarajućim dozama koje zavise od specifičnog biološki aktivnog jedinjenja koje se koristi, pri čemu su doze poznate ordinirajućem stručnjaku ili se mogu lako odrediti empirijski korišćenjem samo rutinske eksperimentacije. Shodno ovom aspektu predmetnog pronalaska, konjugati, kompleksi i preparati mogu da se primene jednom u podeljenim dozama, npr., jednom ili dva puta dnevno, jednom ili dva puta nedeljno ili jednom ili dva puta mesečno itd. Odgovarajući dozni režimi za različite načine primene (npr., za parenteralnu, subkutanu, intramuskularnu, intraokularnu, intranazalnu primenu, itd.) mogu takođe lako da se odrede empirijski, korišćenjem samo rutinske eksperimentacije ili su već poznati ordinirajućem lekaru, a u zavisnosti od identiteta biološki aktivne komponente, (tj., od citokina, hemokina, faktora rasta, polipeptidnog hormona ili njegovog antagoniste) konjugata, kompleksa i preparata.
U dodatnim rešenjima, konjugati, kompleksi i preparati prema predmetnom pronalasku mogu da se koriste da bi specifično usmerili dijagnostičko ili terapeutsko sredstvo do ćelije, tkiva, organa ili organizma, koje eksprimira receptor koji vezuje, inkorporira ili na drugi način preuzima biološki aktivnu komponentu, tj., citokin, hemokin, faktor rasta, polipeptidni hormon ili njegovog antagonistu, konjugata, kompleksa ili preparata. Postupci prema ovom rešenju predmetnog pronalaska obuhvataju, na primer, uspostavljanje kontakta ćelije, tkiva, organa ili organizma sa jednim ili više konjugata, kompleksa i preparata, prema predmetnom pronalasku, što dodatno obuhvata jedno ili više dijagnostičkih ili terapeutskih sredstava, tako da konjugati, kompleksi ili preparati budu vezani ili preuzeti od strane ćelije, tkiva, organa ili organizma, čime se doprema dijagnostičko ili terapeutsko sredstvo do ćelije, tkiva, organa ili organizma. Dijagnostičko ili terapijsko sredstvo koje se koristi shodno ovom rešenju predmetnog pronalaska može biti bez ograničenja, najmanje jedno sredstvo koje je izabrano iz grupe koju čine nukleinska kiselina, organsko jedinjenje, protein ili peptid, antitelo, enzim, glikoprotein, lipoprotein, neki element, lipid, saharid, izotop, ugljeni hidrat, kontrastno sredstvo, detektabilna proba ili bilo koja njihova kombinacija koje može biti obeleženo na detektibilan način kao što je ovde opisano. Terapijsko sredstvo koje se koristi u ovom aspektu predmtnog pronalaska može da ispolji terapijski efekat na ciljnu ćeliju, tkivo, organ ili organizam, pri čemu je efekat izabran iz grupe koju čine bez ograničenja, korekcija gefektnog gena ili proteina, dejstvo leka, toksični efekat, efekat stimulacije rasta, efekat inhibicije rasta, metabolički efekat, katabolički efekat, anabolički efekat. antivirusni efekat, antifungalni efekat, antibakterijski efekat, hormonski efekat, neurohumoralni efekat, stimulatorni efekat na diferencijaciju ćelije, inhibitorni efekat na diferencijaciju ćelije, neuromodulatorni efekat, antineoplastični efekat, anti - tumorski efekat, efekat stimulacije inhibicije insulina, efekat stimulacije koštane srži, efekat stimulacije pluripotentne matične ćelije, efekat stimulacije imunog sistema, kao i bilo koje drugi poznati terapijski efekat koji može da bude obezbeđen terapijskim sredstvom koje se dopremi do ćelije (ili tkiva, organa ili organizma) putem sistema za dopremanje shodno ovom rešenju prema predmetnom pronalasku. Takva dodatna terapijska sredstva mogu da se izaberu iz grupe koju čine, bez ograničenja, poznata ili nova jedinjenja ili preparati uključujući antibiotike, steroide, citotoksična sredstva, vazoaktivne lekove, antitela i druga terapijska sredstva. Neograničavajući primeri takvih sredstava obuhvataju antibiotike i druge lekove koji se koriste u tretmanu bakterijskog šoka, kao što je gentamicin, tobramicin, nafcilin, parenteralni cefalosporini, itd., adrenalne kortikosteroide i njihove anaioge, kao što je deksametazon, koji sprečavaju ćelijsku ozledu izazvanu endotoksinima; vazoaktivne lekove, kao što su blokatori a-adrenergičnih receptora (npr., fenoksibenzamin), agonisti (3-adrenergičkih receptora (npr., izoproterenol) i dopamin.
Konjugati, kompleksi i preparati prema predmetnom pronalasku mogu takođe da se koriste za dijagnozu oboljenja i za praćenje terapijskog odgovora. U određenim takvim postupcima, konjugati, kompleksi i preparati prema predmetnom pronalasku, mogu da sadrže jednu ili više detektabilnih oznaka (kao što su one koje su opisane na drugom mestu ovde). U specifičnim postupcima ovi detektabilno obeleženi konjugati, kompleksi i preparati prema predmetnom pronalasku, mogu da se koriste za detekciju ćelije, tkiva, organa ili organizama, koji eksprimiraju receptore za, ili koji na drugi način preuzimaju, biološki aktivnu komponentu (tj., citokin, hemokin, faktor rasta, polipeptidni hormon ili njegov analog) konjugata, kompleksa i preparata. U jednom primeru takvog postupka ćelija, tkivo, organ ili organizam, uspostavlja kontakt sa jednim ili sa više kompleksa, konjugata ili preparata, prema predmetnom pronalasku, u uslovima koji pospešuju vezivanje ili preuzimanje konjugata od strane ćelije, tkiva, organa ili organizma (npr., vezivanjem konjugata za receptor na površini ćelija ili pinocitozom ili difuzijom konjugata u ćeliju), a zatim detekciju konjugata koji je vezan ili inkorporiran u ćeliju korišćenjem načina za detekciju koji je specifičan za oznaku koja je upotrebljena (npr., fluoroscentna detekcija za fluoroscentno obeležene konjugate; snimanje magnetnom rezonancom za magnetno obeležene konjugate; radio snimanje za radio obeležene konjugate; itd.). Druge upotrebe takvih detektabilno obeleženih konjugata, mogu da obuhvate na primer, snimanje ćelije, tkiva, organa ili organizma ili unutrašnje strukture životinje (uključujući čoveka) primenom efikasne količine obeleženog oblika jednog ili više konjugata prema predmetnom pronalasku i merenjem detektabilne radijecije koja je udružena sa ćelijom, tkivom, organom ili organizmom (ili životinjom). Postupci detekcije različitih tipova oznaka i njihova upotreba pri dijagnostičkim i terapijskim snimanjima je dobro poznata prosečnom stručnjaku i opisana je na drugom mestu ovde.
U drugom rešenju, konjugati i preparati prema predmetnom pronalasku, mogu da se koriste u postupcima za modulaciju koncentracije ili aktivnosti specifičnih receptora za biološki aktivnu komponentu konjugata na površini ćelije koja eksprimira takav receptor. Pod pojmom "moduliranje" aktivnosti datog receptora podrazumeva se da konjugat nakon vezivanja za receptor ili aktivira ili inhibira fiziološku aktivnost (npr., intracelularnu signalnu kaskadu) koja je posredvana putem receptora. Iako nije namera da se vezujemo za bilo koje posebno mehanicističko objašnjenje regulatorne aktivnosti konjugata, prema predmetnom pronalasku, navedeni konjugati mogu da antagonizuju fiziološku aktivnost ćelijskog receptora, vezivanjem za receptor putem biološki aktivne komponente konjugata, čime se blokira vezivanje prirodnog agoniste (npr., ne konjugovane biološki aktivne komponente) i čime se sprečava aktivacija receptora prirodnim agonistom, pri čemu ne dolazi do indukcije značajne aktivacije fiziološke aktivnosti samog receptora. Postupci prema ovom rešenju predmetnog pronalaska mogu da obuhvate jedan ili više koraka, na primer, uspostavljanje kontakta ćelije (što može da se uradi in vitro, ex vivo ili in vivo) sa jednim ili sa više konjugata prema rpedmetnom pronalasku, u uslovima u kojima se taj konjugat (tj., biološki aktivna komponenta konjugata) vezuje za receptor biološki aktivne komponente na ćelijskoj površini, ali ne dovodi do značajne aktivacije receptora. Takvi postupci su korisni mnoštvu dijagnostičkih i terapijskih primena, kao što prosečan stručnjak može lako da zaključi.
Kompleti
Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje komplete koji sadrže konjugate i/ili preparate prema predmetnom pronalasku. Takvi kompleti obično sadrže nosilac, kao što je kutija, kartonska kutija, tuba ili slično, u kome je dobro zatvoren jedan ili više kontejnera, kao što su bočice tube, ampule, bočice, špricevi i slično, pri čemu prvi kontejner sadrži jedan ili više konjugata i/ili preparata prema predmetnom pronalasku. Kompleti koji su obuhvaćeni ovim rešenjem prema predmetnom pronalasku, mogu dalje da sadrže jednu ili više dodatnih komponenti (npr., reagenasa i jedinjenja) koji su neophodni za izvođenje jedne ili više posebnih primena konjugata ili preparata prema predmetnom pronalasku, tako da je jedna ili više komponenti korisno za dijagnozu, tretman ili sprečavanje nastanka., određenog jedinjenja ili fizičkog poremećaja (npr., jedan ili više dodatnih terapijskih jedinjenja ili preparata, jedan ili više dijagnostičkih reagenasa, jedan ili više nosilaca ili ekscipijenata, i tome slično), jednan ili više dodatnih konjugata prema predmetnom pronalasku, i tome slično.
Prosečnom stručnjaku je jasno da druge odgovarajuće adaptacije i modifikacije postupaka i primena koje su ovde opisane mogu da se naprave bez odstupanja od obima zaštite predmetnog pronalaska ili bilo kog njegovog rešenja. Pošto je sada detaljno opisan predmetni pronalazak, isti će biti jasnije shvaćen referenciranjem na primere koji slede, koji su ovde ukjlučeni isključivo u cilju ilustracije i ni na koji način ne ograničavaju obim zaštite predmetnog pronalaska.
Primeri
Primer 1: Konjugati PEG-intereferon-a
Interferon-a je komercijalno važan medicinski protein sa prometom na svetskom tržištu koji je 2001. godine premašio 2 milijarde S.A.D. dolara, pre svega zbog tretmana pacijenata obolelih od infekcija uzrokovanih virusom hepatitisa C ("HCV"). U Sjedinjenim Američkim Državama, između tri i četiri miliona ljudi je hronično inficirano hepatitisom C, a svake godine se zabeleži oko 10000 smrtnih ishoda povezanih sa HCV (Chander, G., et al., 2002, Hepatologv 36 : 5135 - 5144). U pokušaju da se poboljša korisnost IFN-a, obe kompanije koje su primarno odgovorne za njegov razvoj i snabdevanje tržišta (Schering-Plough Corp. i F. Hoffmann - La roche AG) su razvile i komercijalno plasirale konjugate IFN-a sa monometoksipoli(etilen glikolom) ili sa "mPEG". U svakom slučaju, mPEG je povezan sa svakim molekulom IFN-a na samo jednoj tački vezivanja. U svakom slučaju, proizvod sadrži smešu položajnih izomera sa značajno smanjenom aktivnošću vezivanja za receptor, u poređenju sa ne modifikovanim interferonom. U svakom slučaju, povećanje biološke raspoloživosti i trajanje ejstva konjugata in vivo, više nego kompenzuje smanjenje biološke aktivnosti in vitro, koje nastaje zbog PEG konjugacije, što se meri poboljšanom kliničkom efektivnošću jedne injekcije konjugata nedeljno u poređenju sa tri injekcije ne modifikovanog proteina nedeljno, radi tretmana hronične infekcije sa HCV (Manns, M.P., et al., 2001, Lancet 358: 985-965).
U PEG-interferon-a-2a konjugatu proizvođača Hoffmann - La Roche, pod imenom Pe<g>as<y>s<®>, dva lanca mPEG od 20 kDa su povezani za isti lizinski veznik (takozvani "razgranati PEG") koji se primamo povezuje za jedan od Lys 31, Lys 121, Lys 131 ili Lys 134 (Bailon, P., et al., gore navedeno), pri čemu su svi navedeni u okviru ili u blizini domena za vezivanje za receptor interferona-a-2a (videti vezno mesto 1 na Slici la i sekvencu čiji je ID broj 1).
U PEG-interferon-a-2b konjugatu proizviđača Schering-Plough Corp. jedan lanac mPEG od 12 kDa je povezan predominantno za histidinski ostatak na položaju 34 (His 34; Wylie, D.C., et al., gore navedeno; Gilbert, C.W., et al., U.S. patent broj 6,042,822; Wang, Y.S., et al., gore navedeno) koji se nalazi u regionu koji je važan za vezivanje za receptor (videti Sliku 1B). Druga mesta povezivanja PEG u PEG-Intron proizvodu od Schering-Plough (Lys 121, Tyr 129 i Lys 131) su takođe viđena u okviru ili u blizini Vezujućeg mesta 1 (Slika lb i sekvenca čiji je ID broj 2).
Za razliku od ova dva komercijalna proizvoda, konjugati prema predmetnom pronalasku, poseduju jedan lanac u vodi rastvorljivog sintetskog polimera PEG ili mPEG, koji je povezan za N-terminalni aminokiselinski ostatak, koji je udaljen od regiona za vezivanje za receptor proteina (videti prostorne odnose između Cys-1 i Vezujućeih mesta na Slikama lc i ld), što pokazuje da je IFN-a "RN" citokin. Slike 9 i 10, prikazuju jonoizmenjivačke hromatograme, i ekskluzivne hromatograme, respektivno, jednog primera PEG- IFN-a konjugata. Reakciona smeša sadrži IFN-a-2b u kome je dodatni metioninski ostatak prisutan na aminoterminalu, nalazi se pre Cys-1, koji je prvi ostatak prirodne sekvence. Reaktivni PEG je PEG aldehid od 20 kDa, koji je prisutan u koncentraciji od 0,2 mM. Redukujuće sredstvo je natrijumcijanobor hidrid u koncentraciji od 14 mM. Tok reakcije je praćen periodično hromatografijom sa ekskluzijom po veličini, tokom inkubacije na 4 °C. Iako je IFN-a dovoljno rastvorljiv da bi bio pegiliran u uslovima koji su opisani, drugi citokin, npr., IFN-(3, su manje rastvorljivi i potrebno ih je pegilirati u prisustvu surfaktanta, kao što je opisano za IFN-a od strane C.W. Gilbert et al., (U.S. patent broj 5,711,944) i za interone a i P od strane R.B., Greemvvald et al., (U.S. patentbroj 5,738,846).
Kolona za izmenu katjona koja se koristi za frakcionisanje koje je prikazano na Slici 9 je TopvPearl MD-G SP (1 x 6,8 cm; Tosoh Biosep, Montgomervvill, PA), koja je razvijena linearnim gradijentom od 0 - 0,4 M NaCl u 20 mM natrijum acetatnom puferu, pH vrednosti 4,6, pri brzini protoka od 0,5 ml/minutu. Kolona za ekskluziju po veličini je korišćenja kako bi se dobili podaci prikazani na Slici 10 i to je bila Superdex<®>200 (HR 10/30; Amersham Biosciences, Piscataway, NJ), koja je eluirana pri brzini protoka od 0,5 ml/minutu u 20 mM natrijum acetatnom puferu, koji sadrži 150 mM NaCl, pH vrednost 4,6. Stručnjacima su poznati drugi pogodni jonoizmenjivački i po veličini ekskluzivni hromatografski medijumi i uslovi frakcioniranja. Analiza aminoterminalne aminokiselin pomoću automatizovane Edman degradacijom prečišćenom monoPEG-IFN-a-2b prema predmetnom pronalasku, pokazuje da je više od 90% PEG prikačeno za N-terminalni ostatak. Analiza je izvedena od strane Commonwealth Biotechnologies, Inc. (Richmond,
VA).
Primer 2: Konjugati PEG-interleukin-2
Interleukin-2 (IL-2) je citokin koji pokazuje imunomodulatornu aktivnost protiv određenih kancera, uključujući karcinom bubrežnih ćelija i maligni melanom. Međutim, klinička efikasnost je slaba sa rezultatom koji je takav da samo mali deo pacijenata iskusi delimičan ili potpuni odgovor (Weinreich, D.M., et al., 2002, J. Immunother. 25: 185-187). IL-2 ima kratak poluživot u cirkulaciji, što je povezano sa njegovim niskim stepenom indukcije remisije kod pacijenata sa kancerom. Pokušaji da se IL-2 učini efikasnijim, nasumičnom pegilacijom lizinskih ostataka se nije pokazalo kao optimalno (Chen, S.A., et al., 2000, J. Pharmacol. Exp. Ther. 293 : 248 - 259). Pokušaji da se selektivno poveže PEG za IL-2 na mestu glikozilacije (Goodson, R. J., et al., gore navedeno) ili na neesencijalnom cisteinu (Cys 125) ili na muteinima IL-2 koji sadrže cistein između ostataka 1 i 20 (Katre, N., et al., U.S. patent broj 5,206,344)nisu doveli do klinički korisnih proizvoda.
Slika 4 prikazuje distribuciju lizinskih ostataka u odnosu na regione za vezivanje receptora IL-2, gde se vidi da se mnogi sa površine dostupni lizinski ostaci nalaze u regionima koji su uključeni vezivanje receptora. Ustvari, L.ys 35 i Lys 43 su identifikovani kao neophodni za interakciju sa a receptorom IL-2, što sugeriše mehanizam za inaktivaciju IL-2 pegilacijom lizinskih ostataka (videti sekvencu čiji je ID broj 6). Slika 4 takođe prikazuje da N-terminalni region IL-2 je udaljen od regiona proteina za vezivanje receptora, što pokazuje da IL-2 ima strukturnu RN citokina. Naš zaključak da je IL-2 "RN" citokin je kompatibilan sa zapažanjem H. Sato et al., (2000, Bioconjug. Chem. 11 : 502 - 509), koji koristi enzimsku transglutaminaciju da bi povezao jedan ili dva lanca mPEG od 10 kDa za jedan ili 2 glutaminska ostatka ("Q") u sekvenci AQQIVM koju su ovi autori uveli u IL-2 mutein kao N-terminalnu ekstenziju. Sato et al, saopštavaju da njihov konjugat koji je pegiliran blizu amino-terminala, transglutaminacijom njihovog muteina, zadržava veću biološku aktivnost od konjugata dobijenih nasumičnom konjugacijom lizina u IL-2 muteinu. Radi revijskog prikaza analognih pristupa pegilaciji drugih proteina videti Sato, H., 2002, gore navedeno. Na osnovu prostorne udaljenosti aminoterminala IL-2 od regiona proteina za vezivanje receptora, koji su prikazani na Slici 4, može se razumeti da glikozilaciono mesto na ostatku Thr-3 (nije prikazano), čini IL-2 jednim od "RG" proteina koji se vezuju za receptor, kao što je to definisano ovde. Stoga, IL-2 je i RN citokin i RG citokin.
Slike U i 12 prikazuju katjon izmenjivačke i po veličini ekskluzione hromatograme, respektivno, jednog primera PEG-IL-2 konjugata prema predmetnom pronalasku, koji je pegiliran putem N-terminalno selektivne, reduktivne alkilacije, kao u Primeru 1. Uslovi koji se koriste za frakcioniranje su isti kao oni koji su opisani na Slikama 9 i 10, respektivno. Slika 13 prikazuje poliakrilamid gel elektroforetsku analizu istog konjugata u prisustvu natrijum dodecil sulfata ("SDS-PAGE"), pre i posle njegovog prečišćavanja jonoizmenjivačkom hromatografijom, kao što je prikazano na Slici 11. Gel sadrži gradijent od 4 - 12% ukupnog akrilamida u Bis-Tris puferu kataloški broj NP0335, Invitrogen, Carlsbad, CA). Uzorci od kojih svaki sadrži oko 1-2 ug proteina, su zagrevanoi na temperaturi od oko 90 °C tokom 10 minuta pre analize. Analiza je tekla na konstantnom naponu od 117-120 tokom 135 minuta uz hlađenje. Jedan deo gela je obojen sa Sypro<®>Ruby protein gel bojom (Molecular Probes, Eugene, OR) a drugi deo je obojen na PEG pomoću adaptacije postupka opisanog od strane C.E. Childs ((1975) Microchem. J. 20 : 190 - 192) i B. Skoog (1979, Vox Sang 37 : 345 - 349). Analiza aminoterminalne aminokiseline automatizovanom Edman degradacijom prečišćenog monoPEG-IL-2 u svakoj od dve maksimalne vrednosti na Slici 11 je pokazala daje više od 90% PEG prikačeno na N-terminalnom ostatku. Analiza je izvedena od strane Commonwealth Biotechnologies, Inc. (Richmond, VA).
Primer 3: Sinteza i analiza N-terminalno pegiliranih EGF i IGF-1
Epidermalni faktor rasta (EGF; sekvenca čiji je ID broj 7) i insulinu sličan faktor rasta-1 (IGF-1; sekvenca čiji je ID broj 9) su izabrani za N-terminalnu pegilaciju na osnovu molekulskih modela prikazanih na Slikama 5 i 7, respektivno, koji pokazuju da su EGF i IGF-1 RN faktori rasta. Rastvor PEG aldehida od 5 kDa koncentracije 3 mM je dobijen rastvaranjem PEG-propion aldehida od 5 kDa (NOF Corporation, Tokyo) u 1 mM HC1 u konačnoj koncentraciji od 15 mg/ml. Boran piridin je dobijen razblaživanjem 35 ul rastvora boran piri dina koncentracije 8 M (Aldrich) u 0,3 ml acetonitrila uz dodatak 0,15 ml vode čime je dobijena konačan koncentracija od 0,58 M. Pufer koji sadrži 0,2 M koncentraciju natrijum fosfata i natrijum acetata, pH vrednosti 6,3, dobijen je i filtriran kroz sterilni filter sa veličinom pora od 0,1 um. Rekombinantni humani EGF od proizvođača Invitrogen Corp. (Carlsbad, CA) je rastvoren u vodi u koncentraciji od 1 mg/ml. U zapreminu od 0,6 mm ovog rastvora, dodato je 70 ul, 3 mM aldehidnog rastvora, 35 ul fosfat acetatnog pufera i 30 ul 0,58 M boran piridin rastvora, pa je smeša stavljena u frižider. Jednake količine smeše su analizirane upotrebom HPLC sa ekskluzijom po veličini na Superdex 75 HR 10/30 koloni u natrijum karbonatnom puferu, pH vrednosti 10,1, koja sadrži 100 uM NaCl rastvor od četiri dana inkubacije na 4-8 °C, a eluat je praćen apsorbancom na 280 nm i indeksom refrakcije. Nakon injektiranj 0,5 ml reakcione smeše koja je bila inkubirana tokom 5 dana, frakcije su prikupljene od centra najveće maksimalne vrednosti apsorbance na 280 nm. pH vrednost ovog grupnog uzorka je sman jena na otprilike 5,5 dodavanjem sirćetne kiseline. Ponovna analiza ovog grupnog uzorka proizvoda korišćenjem HPLC sa ekskluzijom po veličini, ukazuje da je 100% proteina u položaju koji odgovara PEGi- EGF ("mono-PEG-EGF"), kao i da je koncentracija proteina u ovom grupnom uzorku oko 0,32 mg/ml. Analiza pomoću SDS-PAGE je potvrdila da se sav protein sastoji od mono-PEG konjugata EGF. Grupni uzorak proizvoda je filtriran kroz filter za sterilizaciju sa veličinom pora od 0,2 um (Corning svringe filter), pre ispitivanja biološkim testom zasnovanim na ćelijama, kao što je opisano u Primeru 4. PEG konjugat EGF od 10 kDa je sintetisan, prečišćen i analiziran sličnim postupkom, stim daje korišćen PEG-propion aldehid od 10 kDa proizvođača NOF Corporation umesto PEG-aldehida od 5 kDa. Krajnja koncentracija proteina PEG konjugata od 10 kDa je oko 0,6 mg/ml.
Uzorci rekobinantnog humanog insulinu sličnog faktora RATA-1 ("igf-1"), proizvođača Invitrogen Corp. je reagovao sa PEG aldehodom od 5 kDa i od 10 kDa, postupcima koji su opisani za odgovarajuće EGF konjugate. Proizvod reakcije PEG aldehida od 5 kDa sa IGF-1 i prečišćavanje konjugata kao što je opisano za PEG-EGF je proizvelo mono-PEG-IGF-1 konjugat čistoće od oko 99% a krajnja konjcentracija proteina je oko 0,2 mg/ml. SDS-PAGE analize su potvrdile daje protein predominantno u obliku mono-PEG konjugata. Elektroforetska analiza je takođe, pokazala prisustvo tragova di-PEG konjugata kada je nanos na gelu bio veliki. HPLC analiza sa ekskluzijom po veličini, datog proizvoda reakcije PEG-aldehida od 10 kDa i IGF-1 pokazuje da se proizvod satoji od 95% mono-PEG konjugata i od oko 5% di-PEG konjugata, a ukupna koncentracija proteina je oko 0,23 mg/ml.
Primer 4: Biološki testovi za iN-terminamo pegilirani EGF i IGF-1
Procena da li N-terminaina pegilacija EGF i IGF-1 umanjuje kapacitet vezivanja za receptor odgovarajućih faktora rasta izvedena je testovima u ćelijskoj kulturi. Za ispitivanje PEG-EGF, korišćeni su 3T3 fibroblasti kao što je prethodno opisano za EGF (Crouch, M.F., et al., 2001, J. Cell Biol. 152 : 263 - 273). Za ispitivanje PEG-IGF-1, korišćene su ćelije jajnika kineskog hrčka (CHO ćelije), kao što je ranije opisano za IGF-1 (Amoui, M., et al., 2001, J. Endokrinol. 171 : 153 - 162; Morris, A.E., et al., 2000, Biotechnol. Prog. 16: 693-697). Grupni uzorci proizvoda PEG-EGF i PEG-IGF-1 koji su dobijeni na način koji je opisan u Primeru 3 su sterilisani filtracijom, propuštanjem kroz Corning svringe filter sa veličinom pore od o,2 um, a potom su ispitivani u biološkom testu u ćelijama. U kulture 3T3 ćelija u podlozi koja sadrži niži procenat seruma od onog koji je potreban za optimalni rast dodata su serijska razblaženja sterilno filtriranog EGF i mono-PEG konjugata sintetisanih sa PEG od 5kDa i lOkDa. Ćelije su kultivisane pod standardnim uslovima (37 °C, 5% CO2u vazduhu) a brojene su sa Coulter brojačem (Model Zl, Miami, FL) tokom nekoliko intervala u toku jedne nedelje. Relativno u odnosu na broj ćelija koji je određen u odsustvu dodatog faktora rasta, broj ćelija je rastao za najmanje isti procenat sa mono-PEG konjugatima prema predmetnom pronalasku, kao i sa ne modifikovanim EGF. Slično tome, u kulturi CHO ćelija u podlozi koja sadrži niži stepen seruma koji je potreban za optimalni rast dodata su serijska razblaženja sterilno filtriranih mono-PEG konjugata IGF-1 i ne modifikovanom IGF-1, a ćelije su inkubirane i brojene kao što je opisano gore za ispitivanje EGF kulture. Kao što je opisano za EGF i njegove N-terminalne mono-PEG konjugate, broj ćelija koji je primećen nakon nekoliko dana se povećavao za najmanje isti procenat uz upotrebu mono-PEG konjugata IGF-1 i uz upotrebu ne modifikovanog faktora rasta. Stoga, i EGF i IGF-1 su pokazali da su potpuno funkcionalni nakon N-terminalne pegilacije, kao što se i očekivalo za proteine, kod kojih je PEG povezan na aminoterminalnom ostatku koji je udaljen od regiona za vezivanje za receptor.
Primer 5: Članovi i oni koji to nisu, klase "RN" proteina koji se vezuju za receptor
Slike 2, 3 i 5 - 8 prikazuju površinsku distribuciju lizinskih ostataka proteina koji se vezuju za receptor interferona-P, činioce stimulacije kolonija granulocita-makrofaga ("GM-CSF"), epidermalnog faktora rasta ("EGF"), baznog faktora rasta fibroblasta ("bFGF", koji je u struci poznat i kao "FGF-2"), insulinu sličnog faktora rasta-1 ("IGF-1") i interferona-y ("IFN-y") u odnosu na njihove regione za vezivanje za receptor, a takođe prikazuju i koji su od ovih proteina "RN" citokini i faktori rasta. Dodatno, Slika 2 pokazuje daje IFN-P "RG" citokin.
Slika 2 prikazuje lizinske ostatke koji su distribuirani u okviru regiona Veznog mesta-1 i Veznog mesta-2 interferona-(3, dok je aminoterminal polipeptidnog lanca udaljen od regiona za vezivanje za receptor proteina, što pokazuje da je iFN-(3 "RN" citokin (videti sekvencu čiji je ID broj 3).
Slika 3 prikazuje lizinske ostatke koji su raspoređeni u okviru regiona Vezujućeg mesta-1 koje se vezuje za a receptor, kao i Vezujućeg mesta-2 koje se vezuje za (3 receptor GM-CSF, dok je aminoterminal polipeptidnog lanca udaljen od regiona za vezivanje za receptor proteina, što ukazuje da je GM-CSF jedan "RN" citokin (videti sekvencu čiji je ID broj 5).
Slika 5 prikazuje lizinske ostatke koji su raspoređeni duž polipeptidnog lanca epidermalnog faktora rasta (EGF), uključujuće lizinske ostatke koji se nalaze u ili u blizini regiona za vezivanje za receptor proteina, dok je aminoterminal polipeptidnog lanca udaljeniji od regiona za vezivanje za receptor proteina (videti sekvencu čiji je ID broj 7).
Slika 6 prikazuje nekoliko lizinskih ostataka baznog fibroblastnog faktora rasta (bFGF) koji su uključeni u vezivanje za receptor ili za heparin, što je u oba slučaja neophodno za transdukciju signala posredovanu sa bFGF (Schlessinger, J., et al., gore navedeno). Aminoterminal bFGF je udaljen od regiona za vezivanje heparina bFGF i može biti dovoljno udaljen od mesta za vezivanje za receptor, što bFGF čini jednim RN faktorom rasta (videti sekvencu čiji je ID broj 8).
Slika 7 prikazuje da se nekoliko lizinskih ostataka insulinu sličnog faktora rasta-1 (IGF-1) nalazi u okviru ili u blizini regiona za vezivanje za receptor polipeptida, dok je aminoterminal IGF-1 udaljen od domena za vezivanje za receptor, što pokazuje da je IGF-1 jedan RN faktor rasta (videti sekvencu čiji je ID broj 9).
Slika 8 prikazuje da IFN-y postoji u obliku homodimera u kome dva polipeptidna lanca imaju brojne interakcije. Nekoliko lizinskih ostataka svakog polipeptida se nalazi u blizini aminokiselinskih ostataka IFN-y koji su uključeni u vezivanje za receptore ili koji se nalaze u spojnoj površini za dimerizaciju. Prikaz u obliku "lopta-i-štap" aminokiselinskog ostatka Gln-1 ima cilj da odslika činjenicu o funkcionalnoj važnosti ovog N-terminalnog ostatka. Kristalna struktura na kojoj se zasniva ova slika, obuhvata dodatni metioninski ostatak, označen kao "Met 0", koji nije prisutan u prirodnom proteinu (videt sekvencu čiji je ID broj 4). S obzirom da su N-terminalni ostaci IFG-7udaljeni od spojne površine za dimerizaciju, N-terminalnom pegilacijeom može da se izbegne inhibitorni efekat pegilacije lizina na homodimerizaciju IFN-y. Sa druge strane interakcije dimera sa receptorima će najverovatnije biti inhibirane vezivanjem polimera za aminoterminal, posebno kada se prikače dugi lanci polimera.
IFN-y, IL-10 i faktor stem ćelije su primeri citokina koji funkcionišu kao homo dimeri (Walter, M.R., et al., gore navedeno; Josephson, K., et al., 200, J.Biol. Chem. 275: 13552-13557; Thiel, D.J., et al., gore navedeno; McNiece, I.K., et al., gore navedeno). Dimerizacije proteina koji se vezuju za receptor predstavlja poseban problem za karakterizaciju njihovih N-terminalnih mono pegiliranih konjugata, jer različite moguće molekulske strukture mogu biti prisutne u preparatima konjugatam slične ili identične veličine i oblika. Na primer, dimer koji se sastoji od jednog di pegiliranog monomera i jedan ne pegilirani monomer (PEG2- proteini + proteini) teško je ili nemoguće razliovati od dimera koji se sastoji od 2 N-terminalno pegilirana monomera (PEGi- proteini)2upotrebom većine analiza koje se zasnivaju na veličini dimernog konjugata (npr., upotrebom hromatografije sa ekskljuzijom po veličini ili evaluacijom koeficijenta sedimentacije, brojnanjem scintilacija ili na osnovu koeficijenta difuzije), pri čemu potencija vezivanja za reeptor ova dva konjugata, od kojih svaki sadrži prosečno po jedan PEG po proteinskom monomeru, može biti vrlo različita.
Za dugolančane proteine koji se vezuju za receptor konformacije (3 ploče koji formiraju homotrimere; kao što su faktor nekroze tumora a (TNF- a), broj izomera PEG3- protein3je čak veći od onog kod proteina koji se vezuju za receptor koji se javljaju u rastvoru homodimera. S obzirom da je hemijska modifikacija TNF u blizini aminoterminala pokazana kao inaktivirajuća po ovaj citokin (Utsumi, T., et al., 1992, Mol. Immunol. 29 : 77 - 81), TNF-a može da ne zadrži značajnu aktivnost kada se pegilira sa reagensima i pod određenim uslovima koji su selektivni za N-terminalni ostatak. Međutim, TNF-a antagonisti kao što je Apo2L/TRAIL (Hymowitz, S. G., et al., 2000, Biochemistry 39 : 633 - 640) je pogodan za pegilaciju korišćenjem predmetnog pronalaska.
Za karakterizaciju konjugata citokina koji funkcionišu kao oligomeri, potrebna je kombinacija analitičkih postupaka. Analiza aminotermianlne sekvence može da detektuje prisustvo monomera sa slobodnim N-terminalnim a aminogrupama, a elektroforetska analiza disociranih monomera (npr., SDS-PAGE ili kapilarna elektroforeza) može da otkrije prisusto ne pegiliranih i multiplo pegiliranih monomera proteina koji se vezuje za receptor. Bez takvog dokaza sinteza monopegiliranih konjugata takvih homodimer- i homotrimer- formiraj ućih proteina ne može da se nedvosmisleno prikaže.
Ovi primeri, posebno oni grafički prikazani na slikama 1 - 8, obezbeđuju osnovu koja se lako vizuelizuje za razumevanje potencijalne uloge sterične kolizije protein-receptor interakcija zbog pegilacije proteina koji se vezuje za receptor, unutar ili u blizini domena za vezivanje za receptor, ovih biološki aktivnih komponenti. Velika zapremina koja je okupirana od strane veoma ekspendiranih i fleksibilnih PEG lanaca (videti Sliku ld) takođe dovodi do sterične kolizije asocijacije monomera određenih proteina koji se vezuju za receptor u funkcionalnim homodimerima ili homotrimerima ukoliko je PEG povezan u regionima koji su neophodni za interakcije između monomera. Stoga, usmeravanje pegilacije na mesta koja su udaljena od regiona za vezivanje za receptor, proteina koji se vezuje za receptor smanjuje verovatnoću da pegilacije interferira sa intermolekulskim interakcijama koje su neophodne za njihovu funkciju. Sledeći postupak prema predmetnom pronalasku, očekuje se realizacija vićih koristi od pegilacije proteina koji se vezuju za receptor. Nastali konjugati kombinuju očekivane koristi, koje obuhvataju poboljšanu rastvorljivost poboljšanu biološku raspoloživost, veću stabilnost i smanjenu imunogenost uz neočekivano visok stepen zadržavanja biološke aktivnosti.
Predmetni pronalazak je opisan uz referenciranje na određena rešenja i njegove određene primere. Postupci prema predmetnom pronalasku se na sličan način mogu primeniti na određene peptide koji se vezuju za receptor i proteine koji se razlikuju od citokina, hemokina, faktora rasta, i polipeptidnih hormona i njihovih antagonista kao i od drugih reagenasa za konjugaciju. Stoga, obim zaštite predmetnog pronalaska nije ograničen opisanim rešenjima. već je ograničen samo obimom patentnih zahteva. Prosečni stručnjaci jasno vide daje moguće praktikavati druga rešenja bez odstupanja od obima zaštite predmetnog pronalaska. Sve takve varijacije se smatraju obuhvaćenim obimom zaštite predmetnog pronalaska.
Sve publikacije, aptenti i patentne prijave koje su pomenute u ovoj specifikaciji su indikativne za nivo veštine stručnjaka kojima je ovaj pronalazak i namenjen, i ovde su inkorporirane po referenci u istom stepenu kao u svakoj pojedinačnoj publikaciji, patentu ili patentnoj prijavi koja je specifično i pojedinačno navedena, kao inkorporirana po referenci.

Claims (164)

1. Postupak sinteze konjugata jednog ili više sintetskih polimera rastvorljivih u vodi sa citokinom, hemokinom, faktorom rasta ili polipeptidnim hormonom, ili njihovim antagonistom, naznačen time što je očuvana veća aktivnost vezivanja za receptor navedenog citokina, hemokina, faktora rasta ili polipeptidnog hormona ili njegovog antagoniste nego što se očuva kada su takvi polimeri nasumično povezani, koji obuhvata: (a) izbor citokina, hemokina, faktora rasta ili polipeptidnog hormona u kome je amino-terminalna aminokiselina locirana na udaljenosti od jednog ili od više domena koji se vezuju za receptor navedenog citokina, hemokina, faktora rasta ili polipeptidnog hormona ili njegovog antagoniste; i (b) selektivno vezivanje jednog ili više navedenih polimera za navedenu amino-terminalnu aminokiselinu.
2. Postupak prema zahtevu 1, naznačen time što su jedan ili više navedenih polimera izabrani iz grupe koju čine jedan ili više polialkilen glikola, jedan ili više polialkilen oksida, jedan ili više polivinil alkohola, jedan ili više polikarboksilata, jedan ili više poli(vinilpirolidona), jedan ili više poli(oksietilen-oksimetilena), jedna ili više poli(aminokiselina), jedan ili više poliakriloilmorfolina, jedan ili više kopolimera jednog ili više amida i jednog ili više alkilen oksida, jednog ili više dekstrana i jedne ili više hijaluronskih kiselina.
3. Postupak prema zahtevu 1, naznačen time što navedeni citokin, hemokin, faktor rasta ili polipeptidni hormon ili njegov antagonista poseduje strukturu petlje sa četiri heliksa.
4. Postupak prema zahtevu 3, naznačen time što je navedeni citokin, hemokin, faktor rasta ili polipeptidni hormon ili njegov antagonista izabran iz grupe koju čine činilac stimulacije kolonija makrofaga (M-CSF), činilac stimulacije kolonija granulocita - makrofaga (GM-CSF), leukemija inhibitorni faktor (LIF), trombopoetin (Tpo), eritropoetin (Epo), faktor matične ćelije (SCF), Flt3 ligand, onkostatin M (OSM), interleukin-2 (IL-2), IL-3, IL-4, IL-5, IL-6. IL-7, TL-9, IL-10, IL-11, IL-12 (p35 podjedinica), IL-13, IL-15, IL-17, interferon - alfa (IFN-a), interferon - beta (IFN-p), konsenzus interferon, prolaktin i hormon rasta, kao i njihovi muteini, antagonisti, varijante, analogi i derivati.
5. Postupak prema zahtevu 1, naznačen time što navedeni citokin, hemokin, faktor rasta ili polipeptidni hormon ili njegov antagonista poseduje strukturu (3-nabora ili P-cilindra.
6. Postupak prema zahtevu 5, naznačen time što je navedeni citokin, hemokin, faktor rasta ili polipeptidni hormon ili njegov antagonista izabran iz grupe koju čine faktor nekroze tumora - alfa (TNF-a), IL-la, IL-ip, IL-12 (p40 podjedinica), IL-16, epidermalni faktor rasta (EGF), bazni fibroblastni faktor rasta (bFGF), kiseli FGF, FGF-4 i faktor rasta keratinocita (KGF; FGF-7), kao i njihovi muteini, antagonisti, varijante, analogi i derivati.
7. Postupak prema zahtevu 1, naznačen time što navedeni citokin, hemokin, faktor rasta ili polipeptidni hormon ili njegov antagonista poseduje mešovitu a/p strukturu.
8. Postupak prema zahtevu 7, naznačen time što je navedeni citokin, hemokin, faktor rasta ili polipeptidni hormon ili njegov antagonista izabran iz grupe koju čine neutrofilni aktivirajući peptid-2 (NAP-2), stromalni ćelijski deriviran faktor-la (SDF-la), IL-8, monocitni hemoatraktantni protein-1 (MCP-1), MCP-2, MCP-3, eotaksin-1, eotaksin-2, eotaksin-3, RANTES, inhibitorni faktor mijeloidnog progenitora-1 (MPIF-1), neurotaktin, faktor inhibicije migracije makrofaga (MIF) i sa rastom povezani onkogen/stimulatorna aktivnost rasta melanoma (GRO-a/MGSA), kao i njihovi muteini, varijante, analogi i derivati.
9. Postupak prema zahtevu 1, naznačen time što je navedeni citokin, hemokin, faktor rasta ili polipeptidni hormon ili njegov antagonista izabran iz grupe koju čine interferon - alfa. interferon - beta, IL-2, IL-4, IL-10. TNF-alfa, IGF-1, EGF, bFGF, insulin, antagonista TNF-alfa, antagonista hGH i antagonista prolaktina.
10. Postupak prema zahtevu 9, naznačen time što je navedeni citokin IL-2.
11. Postupak prema zahtevu 9, naznačen time što je navedeni citokin interferon - alfa.
12. Postupak prema zahtevu 9, naznačen time što je navedeni citokin TNF - alfa.
13. Postupak prema zahtevu 9, naznačen time što je navedeni citokin antagonista TNF - alfa.
14. Postupak prema zahtevu 9, naznačen time što je navedeni faktor rasta EGF.
15. Postupak prema zahtevu 9, naznačen time što je navedeni faktor rasta IGF - 1.
16. Postupak prema zahtevu 1, naznačen time što je navedeni polimer kovalentno povezan sa alfa amino grupom navedene aminoterminalne kiseline.
17. Postupak prema zahtevu 16, naznačen time što se navedeno kovalentno vezivanje navedenog polimera za navedenu alfa amino grupu ostvaruje preko sekundarne aminske veze.
18. Postupak prema zahtevu 1, naznačen time što se navedeni polimer vezuje za reaktivnu hemijsku grupu bočnog lanca navedene amino-terminalne aminokiseline.
19. Postupak prema zahtevu 18, naznačen time što je navedeni reaktivni bočni lanac izabran iz grupe koju čine hidroksilna grupa, sulfidrilna grupa, guanidino grupa, imidazolska grupa, amino grupa, karboksilna grupa i aldehidna grupa.
20. Postupak prema zahtevu 1, naznačen time što je navedeni polimer rastvorljiv u vodi polialkilen glikol.
21. Postupak prema zahtevu 20, naznačen time što je navedeni polialkilen glikol izabran iz grupe koju čine poli(etilen glikol), monometoksipoli(etilen glikol) i monohidroksipoli(etilen glikol).
22. Postupak prema zahtevu 21. naznačen time što je navedeni polialkilen glikol monometoksipoli(etilen glikol).
23. Postupak prema zahtevu 21, naznačen time što je navedeni polialkilen glikol monohidroksipoli(etilen glikol).
24. Postupak prema zahtevu 20, naznačen time što navedeni polialkilen glikol ima molekulsku masu između oko 1 kDa i oko 100 kDa, uključujući ove vrednosti.
25. Postupak prema zahtevu 24. naznačen time što navedeni polialkilen glikol ima molekulsku masu između oko 1 kDa i oko 5 kDa, uključujući ove vrednosti.
26. Postupak prema zahtevu 24, naznačen time što navedeni polialkilen glikol ima molekulsku masu između oko 10 kDa i oko 20 kDa, uključujući ove vrednosti.
27. Postupak prema zahtevu 24, naznačen time što navedeni polialkilen glikol ima molekulsku masu između oko 18 kDa i oko 60 kDa, uključujući ove vrednosti.
28. Postupak prema zahtevu 24, naznačen time što navedeni polialkilen glikol ima molekulsku masu između oko 12 kDa i oko 30 kDa, uključujući ove vrednosti.
29. Postupak prema zahtevu 28, naznačen time što navedeni polialkilen glikol ima molekulsku masu od oko 20 kDa.
30. Postupak prema zahtevu 24, naznačen time što navedeni polialkilen glikol ima molekulsku masu od oko 30 kDa.
31. Postupak prema zahtevu 4, naznačen time što je navedeni polipeptidni hormon ili njegov antagonista izabran iz grupe koju čine prolaktin i analogi prolaktina koji imitiraju ili antagonizuju biološke efekte prolaktina posredovane prolaktinskim receptorima.
32. Postupak prema zahtevu 4, naznačen time što je navedeni polipeptidni hormon ili njegov antagonista izabran iz grupe koju čine hormon rasta i analogi hormona rasta koji imitiraju ili antagonizuju biološke efekte hormona rasta posredovane receptorima za hormon rasta.
33. Postupak prema zahtevu 4, naznačen time što je navedeni citokin, hemokin, faktor rasta ili polipeptidni hormon ili njegov antagonista izabran iz grupe koju čine neglikozilirani eritropoetin i analogi eritropoetina koji imitiraju ili antagonizuju biološke efekte eritropoetina posredovane eritropoetinskim receptorima.
34. Postupak prema zahtevu 1, naznačen time što vezivanje navedenog polimera za navedeni citokin, hemokin, faktor rasta ili polipeptidni hormon ili njegovog antagonistu preko amino-terminalne aminokiseline imitira poželjne efekte glikozilacije ili hiperglikozilacije navedenog citokina, hemokina, faktora rasta ili polipeptidnog hormona ili njegovog antagoniste.
35. Postupak prema zahtevu 1, naznačen time što se navedena aktivnost vezivanja za receptor meri jednim ili sa više postupaka" koji su izabrani iz grupe koju čine ultracentrifugiranje, ćelijski testovi, testovi kompetitivnog vezivanja, radioreceptorski testovi, rezonanca površinske membrane i dinamičko rasejanje svetlosti.
36. Konjugat naznačen time što je proizveden postupkom prema zahtevu 1.
37. Farmaceutski preparat naznačen time što sadrži jedan ili više konjugata prema zahtevu 36 i jedan ili više farmaceutski prihvatljivih ekscipijenata ili nosilaca.
38. Konjugat koji sadrži citokin, hemokin, faktor rasta ili polipeptidni hormon ili njegovog antagonsitu koji je povezan sa jednim ili sa više sintetskih polimera rastvorljivih u vodi, naznačen time što je navedeni citokin, hemokin, faktor rasta ili polipeptidni hormon ili njegov antagonista izabran zato što pripada grupi proteina i polipeptida koji se vezuju za receptor kod kojih je amino-terminalna aminokiselina locirana na udaljenosti od jednog ili od više domena za vezivanje za receptor i kod kojih je jedan ili više navedenih polimera povezano sa navedenom amino-terminalnom aminokiselinom.
39. Konjugat prema zahtevu 38, naznačen time što je jedan ili više polimera izabrano iz grupe koju čine jedan ili više polialkilen glikola, jedan ili više polialkilen oksida, jedan ili više polivinil alkohola, jedan ili više polikarboksilata, jedan ili više poli(vinilpirolidona), jedan ili više poli(oksietilen-oksimetilena), jedna ili više poli(aminokiselina), jedan ili više poliakriloilmorfolina, jedan ili više kopolimera jednog ili više amida i jednog ili više alkilen oksida, jednog ili više dekstrana i jedne ili više hijaluronskih kiselina.
40. Konjugat prema zahtevu 38, naznačen time što navedeni citokin, hemokin, faktor rasta ili polipeptidni hormon ili njegov antagonista poseduje strukturu petlje sa četiri heliksa.
41. Konjugat prema zahtevu 40, naznačen time što je navedeni citokin, hemokin, faktor rasta ili polipeptidni hormon ili njegov antagonista izabran iz grupe koju čine činilac stimulacije kolonija makrofaga (M-CSF), činilac stimulacije kolonija granulocita - makrofaga (GM-CSF), leukemija inhibitorni faktor (LIF), trombopoetin (Tpo), eritropoetin (Epo), faktor matične ćelije (SCF), Flt3 ligand, onkostatin M (OSM), interleukin-2 (IL-2), IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12 (p35 podjedinica), IL-13, IL-15, IL-17, interferon - alfa (IFN-a), interferon - beta (IFN-(3), konsenzus interferon, prolaktin i hormon rasta, kao i njihovi muteini, antagonisti, varijante, analogi i derivati.
42. Konjugat prema zahtevu 38, naznačen time što navedeni citokin, hemokin, faktor rasta ili polipeptidni hormon ili njegov antagonista poseduje strukturu P-nabora ili p-cilindra.
43. Konjugat prema zahtevu 42, naznačen time što je navedeni citokin, hemokin, faktor rasta ili polipeptidni hormon ili njegov antagonista izabran iz grupe koju čine faktor nekroze tumora - alfa (TNF-a), IL-la, IL-1P, IL-12 (p40 podjedinica), IL-16, epidermalni faktor rasta (EGF), bazni fibroblastni faktor rasta (bFGF), kiseli FGF, FGF-4 i faktor rasta keratinocita (KGF; FGF-7), kao i njihovi muteini, antagonisti, varijante, analogi i derivati.
44. Konjugat prema zahtevu 38, naznačen time što navedeni citokin, hemokin, faktor rasta ili polipeptidni hormon ili njegov antagonista poseduje mešovitu a/p strukturu.
45. Konjugat prema zahtevu 44, naznačen time što je navedeni citokin, hemokin, faktor rasta ili polipeptidni hormon ili njegov antagonista izabran iz grupe koju čine neutrofilni aktivirajući peptid-2 (NAP-2), stromalni ćelijski deriviran faktor-1 a (SDF-la), IL-8, monocitni hemoatraktantni protein-1 (MCP-1), MCP-2, MCP-3, eotaksin-1, eotaksin-2, eotaksin-3, RANTES, inhibitorni faktor mijeloidnog progenitora-1 (MPIF-1), neurotaktin, faktor inhibicije migracije makrofaga (MIF) i GRO/stimulatoma aktivnost rasta melanoma (GRO-a/MGSA), kao i njihovi muteini, varijante, analogi i derivati.
46. Konjugat prema zahtevu 38, naznačen time što je navedeni citokin, hemokin, faktor rasta ili polipeptidni hormon ili njegov antagonista izabran iz grupe koju čine interferon - alfa, interferon - beta, IL-2, IL-4, IL-10, TNF-alfa, IGF-1, EGF, bFGF, hGH, insulin i prolaktin, kao i njihovi antagonisti.
47. Konjugat prema zahtevu 46, naznačen time što je navedeni citokin IL-2.
48. Konjugat prema zahtevu 46, naznačen time što je navedeni citokin interferon - alfa.
49. Konjugat prema zahtevu 46, naznačen time što je navedeni citokin TNF - alfa.
50. Konjugat prema zahtevu 46, naznačen time što je navedeni citokin antagonista TNF - alfa.
51. Konjugat prema zahtevu 46, naznačen time što je navedeni faktor rasta EGF.
52. Konjugat prema zahtevu 46, naznačen time što je navedeni faktor rasta IGF -1.
53. Konjugat prema zahtevu 38, naznačen time što je navedeni polimer kovalentno povezan sa alfa amino grupom navedene aminoterminalne kiseline.
54. Konjugat prema zahtevu 53, naznačen time što se navedeno kovalentno vezivanje navedenog polimera za navedenu alfa amino grupu ostvaruje preko sekundarne aminske veze.
55. Konjugat prema zahtevu 38, naznačen time što se navedeni polimer vezuje za reaktivnu hemijsku grupu bočnog lanca navedene amino-terminalne aminokiseline.
56. Konjugat prema zahtevu 55, naznačen time što je navedeni reaktivni bočni lanac izabran iz grupe koju čine hidroksilna grupa, sulfidrilna grupa, guanidino grupa, imidazolska grupa, amino grupa, karboksilna grupa i aldehidna grupa.
57. Konjugat prema zahtevu 38, naznačen time što je navedeni polimer rastvorljiv u vodi polialkilen glikol.
58. Konjugat prema zahtevu 57, naznačen time što je navedeni polialkilen glikol izabran iz grupe koju čine poli(etilen glikol), monometoksipoli(etilen glikol) i monohidroksipoli(etilen glikol).
59. Postupak prema zahtevu 58, naznačen time što je navedeni polialkilen glikol monometoksipoli(etilen glikol).
60. Konjugat prema zahtevu 58, naznačen time što je navedeni polialkilen glikol monohidroksipoli(etilen glikol).
61. Konjugat prema zahtevu 57, naznačen time što navedeni polialkilen glikol ima molekulsku masu između oko 1 kDa i oko 100 kDa, uključujući ove vrednosti.
62. Konjugat prema zahtevu 61, naznačen time što navedeni polialkilen glikol ima molekulsku masu između oko 1 kDa i oko 5 kDa, uključujući ove vrednosti.
63. Konjugat prema zahtevu 61, naznačen time što navedeni polialkilen glikol ima molekulsku masu između oko 10 kDa i oko 20 kDa, uključujući ove vrednosti.
64. Konjugat prema zahtevu 61, naznačen time što navedeni polialkilen glikol ima molekulsku masu između oko 18 kDa i oko 60 kDa, uključujući ove vrednosti.
65. Konjugat prema zahtevu 61, naznačen time što navedeni polialkilen glikol ima molekulsku masu između oko 12 kDa i oko 30 kDa, uključujući ove vrednosti.
66. Konjugat prema zahtevu 65, naznačen time što navedeni polialkilen glikol ima molekulsku masu od oko 20 kDa.
67. Konjugat prema zahtevu 61, naznačen time što navedeni polialkilen glikol ima molekulsku masu od oko 30 kDa.
68. Konjugat prema zahtevu 40, naznačen time što je navedeni polipeptidni hormon ili njegov antagonista izabran iz grupe koju čine prolaktin i analogi prolaktina koji imitiraju ili antagonizuju biološke efekte prolaktina posredovane prolaktinskim receptorima.
69. Konjugat prema zahtevu 40, naznačen time što je navedeni polipeptidni hormon ili njegov antagonista izabran iz grupe koju čine hormon rasta i analogi hormona rasta koji imitiraju ili antagonizuju biološke efekte hormona rasta posredovane receptorima za hormon rasta.
70. Konjugat prema zahtevu 41, naznačen time što je navedeni citokin, hemokin, faktor rasta ili polipeptidni hormon ili njegov antagonista izabran iz grupe koju čine neglikozilirani eritropoetin i analogi eritropoetina koji imitiraju ili antagonizuju biološke efekte eritropoetina posredovane eritropoetinskim receptorima.
71. Konjugat prema zahtevu 38, naznačen time što vezivanje navedenog polimera za navedeni citokin, hemokin, faktor rasta ili polipeptidni hormon ili njegovog antagonistu preko amino-terminalne aminokiseline imitira poželjne efekte glikozilacije ili hiperglikozilacije navedenog citokina, hemokina, faktora rasta ili polipeptidnog hormona ili njegovog antagoniste.
72. Farmaceutski preparat naznačen time što sadrži konjugat prema zahtevu 38 i farmaceutski prihvatljivi nosilac ili ekscipijent.
73. Komplet naznačen time što sadrži farmaceutski preparat prema zahtevu 37.
74. Komplet naznačen time što sadrži konjugat prema zahtevu 38.
75. Komplet naznačen time što sadrži konjugat prema zahtevu 40.
76. Komplet naznačen time što sadrži farmaceutski preparat prema zahtevu 72.
77. Postupak sinteze konjugata jednog ili više sintetskih polimera rastvorljivih u vodi sa citokinom, hemokinom, faktorom rasta ili polipeptidnim hormonom, ili njihovim antagonistom, naznačen time što je očuvana veća aktivnost vezivanja za receptor navedenog citokina, hemokina, faktora rasta ili polipeptidnog hormona ili njegovog antagoniste nego što se očuva kada su takvi polimeri nasumično povezani, koji obuhvata: (c) izbor citokina, hemokina, faktora rasta ili polipeptidnog hormona u kome je prirodno ili genetskim inženjeringom dobij eno mesto glikozilacije locirano na udaljenosti od jednog ili od više domena koji se vezuju za receptor navedenog citokina, hemokina, faktora rasta ili polipeptidnog hormona ili njegovog antagoniste; i (d) selektivno vezivanje jednog ili više navedenih polimera za navedeno mesto glikozilacije ili za ugljenohidratnu podjedinicu prikačenu za njega.
78. Postupak prema zahtevu 77, naznačen time što su jedan ili više navedenih polimera izabrani iz grupe koju čine jedan ili više polialkilen glikola, jedan ili više polialkilen oksida, jedan ili više polivinil alkohola, jedan ili više polikarboksilata, jedan ili više poli(vinilpirolidona), jedan ili više poli(oksietilen-oksimetilena), jedna ili više poli(aminokiselina), jedan ili više poliakriloilmorfolina, jedan ili više kopolimera jednog ili više amida i jednog ili više alkilen oksida, jednog ili više dekstrana i jedne ili više hijaluronskih kiselina.
79. Postupak prema zahtevu 77, naznačen time što navedeni citokin, hemokin, faktor rasta ili polipeptidni hormon ili njegov antagonista poseduje strukturu petlje sa četiri heliksa.
80. Postupak prema zahtevu 79, naznačen time što je navedeni citokin, hemokin, faktor rasta ili polipeptidni hormon ili njegov antagonista izabran iz grupe koju čine činilac stimulacije kolonija makrofaga (M-CSF), činilac stimulacije kolonija granulocita - makrofaga (GM-CSF), leukemija inhibitorni faktor (LIF), trombopoetin (Tpo), eritropoetin (Epo), faktor matične ćelije (SCF), Flt3 ligand, onkostatin M (OSM), interleukin-2 (IL-2), IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12 (p35 podjedinica), IL-13, IL-15, IL-17, interferon - alfa (IFN-a), interferon - beta (IFN-P), konsenzus interferon, prolaktin i hormon rasta, kao i njihovi muteini, antagonisti, varijante, analogi i derivati.
81. Postupak prema zahtevu 77, naznačen time što navedeni citokin, hemokin, faktor rasta ili polipeptidni hormon ili njegov antagonista poseduje strukturu P-nabora ili P-cilindra.
82. Postupak prema zahtevu 81, naznačen time što je navedeni citokin, hemokin, faktor rasta ili polipeptidni hormon ili njegov antagonista izabran iz grupe koju čine faktor nekroze tumora - alfa (TNF-a), IL-la, IL-ip, IL-12 (p40 podjedinica), IL-16, epidermalni faktor rasta (EGF), bazni fibroblastni faktor rasta (bFGF), kiseli FGF, FGF-4 i faktor rasta keratinocita (KGF; FGF-7), kao i njihovi muteini, antagonisti, varijante, analogi i derivati.
83. Postupak prema zahtevu 77, naznačen time što navedeni citokin, hemokin, faktor rasta ili polipeptidni hormon ili njegov antagonista poseduje mešovitu a/p strukturu.
84. Postupak prema zahtevu 83, naznačen time što je navedeni citokin, hemokin, faktor rasta ili polipeptidni hormon ili njegov antagonista izabran iz grupe koju čine neutrofilni aktivirajući peptid-2 (NAP-2), stromalni ćelijski deriviran faktor-1 a (SDF-la), IL-8, monocitni hemoatraktantni protein-1 (MCP-1), MCP-2, MCP-3, eotaksin-1, eotaksin-2, eotaksin-3, RANTES, inhibitorni faktor mijeloidnog progenitora-1 (MPIF-1), neurotaktin, faktor inhibicije migracije makrofaga (MIF) i GRO/stimulatorna aktivnost rasta melanoma (GRO-a/MGSA), kao i njihovi muteini, varijante, analogi i derivati.
85. Postupak prema zahtevu 77, naznačen time što je navedeni citokin, hemokin, faktor rasta ili polipeptidni hormon ili njegov antagonista izabran iz grupe koju čine interferon - alfa, interferon - beta, IL-2, IL-4, IL-10, TNF-alfa, IGF-1, EGF, bFGF, hGH, prolaktin, insulin, kao i njihovi antagonisti.
86. Postupak prema zahtevu 85, naznačen time što je navedeni citokin IL-2.
87. Postupak prema zahtevu 85, naznačen time što je navedeni citokin interferon - alfa.
88. Postupak prema zahtevu 85, naznačen time što je navedeni citokin TNF - alfa.
89. Postupak prema zahtevu 85, naznačen time što je navedeni citokin antagonista TNF - alfa.
90. Postupak prema zahtevu 85, naznačen time što je navedeni faktor rasta EGF.
91. Postupak prema zahtevu 85, naznačen time što je navedeni faktor rasta IGF -1.
92. Postupak prema zahtevu 77, naznačen time što je navedeni polimer rastvorljiv u vodi polialkilen glikol.
93. Postupak prema zahtevu 92, naznačen time što je navedeni polialkilen glikol izabran iz grupe koju čine poli(etilen glikol), monometoksipoli(etilen glikol) i monohidroksipoli(etilen glikol).
94. Postupak prema zahtevu 93, naznačen time što je navedeni polialkilen glikol monometoksipoli(etilen glikol).
95. Postupak prema zahtevu 93, naznačen time što je navedeni polialkilen glikol monohidroksipoli(etilen glikol).
96. Postupak prema zahtevu 92, naznačen time što navedeni polialkilen glikol ima molekulsku masu između oko 1 kDa i oko 100 kDa, uključujući ove vrednosti.
97. Postupak prema zahtevu 96, naznačen time što navedeni polialkilen glikol ima molekulsku masu između oko 1 kDa i oko 5 kDa, uključujući ove vrednosti.
98. Postupak prema zahtevu 96, naznačen time što navedeni polialkilen glikol ima molekulsku masu između oko 10 kDa i oko 20 kDa, uključujući ove vrednosti.'
99. Postupak prema zahtevu 96, naznačen time što navedeni polialkilen glikol ima molekulsku masu između oko 18 kDa i oko 60 kDa, uključujući ove vrednosti.
100. Postupak prema zahtevu 96, naznačen time što navedeni polialkilen glikol ima molekulsku masu između oko 12 kDa i oko 30 kDa, uključujući ove vrednosti.
101. Postupak prema zahtevu 100, naznačen time što navedeni polialkilen glikol ima molekulsku masu od oko 20 kDa.
102. Postupak prema zahtevu 96, naznačen time što navedeni polialkilen glikol ima molekulsku masu od oko 30 kDa.
103. Postupak prema zahtevu 77, naznačen time što je navedeni polipeptidni hormon ili njegov antagonista izabran iz grupe koju čine prolaktin i analogi prolaktina koji imitiraju ili antagonizuju biološke efekte prolaktina posredovane prolaktinskim receptorima.
104. Postupak prema zahtevu 77, naznačen time što je navedeni polipeptidni hormon ili njegov antagonista izabran iz grupe koju čine hormon rasta i analogi hormona rasta koji imitiraju ili antagonizuju biološke efekte hormona rasta posredovane receptorima za hormon rasta.
105. Postupak prema zahtevu 77, naznačen time što je navedeni citokin, hemokin, faktor rasta ili polipeptidni hormon ili njegov antagonista izabran iz grupe koju čine neglikozilirani eritropoetin i analogi eritropoetina koji imitiraju ili antagonizuju biološke efekte eritropoetina posredovane eritropoetinskim receptorima.
106. Postupak prema zahtevu 77, naznačen time što vezivanje navedenog polimera za navedeni citokin, hemokin, faktor rasta ili polipeptidni hormon ili njegovog antagonistu na ili u blizini jednog ili više mesta glikozilacije imitira poželjne efekte glikozilacije ili hiperglikozilacije navedenog citokina, hemokina, faktora rasta ili polipeptidnog hormona ili njegovog antagoniste.
107. Konjugat naznačen time što je proizveden postupkom prema zahtevu 77.
108. Farmaceutski preparat naznačen time što sadrži jedan ili više konjugata prema zahtevu 107 ijedan ili više farmaceutski prihvatljivih ekscipijenata ili nosilaca.
109. Konjugat koji sadrži citokin, hemokin, faktor rasta ili polipeptidni hormon ili njegovog antagonsitu koji je povezan sa jednim ili sa više sintetskih polimera rastvorljivih u vodi, naznačen time što je navedeni citokin, hemokin, faktor rasta ili polipeptidni hormon ili njegov antagonista izabran zato što pripada grupi proteina i polipeptida koji se vezuju za receptor kod kojih je mesto glikozilacije locirano na udaljenosti od jednog ili od više domena za vezivanje za receptor i kod kojih je jedan ili više navedenih polimera povezano za ili u blizini jednog ili više mesta glikozilacije ili za ugljenohidratnu podjedinicu koja je za njega prikačena.
110. Konjugat prema zahtevu 109, naznačen time što je jedan ili više polimera izabrano iz grupe koju čine jedan ili više polialkilen glikola, jedan ili više polialkilen oksida, jedan ili više polivinil alkohola, jedan ili više polikarboksilata, jedan ili više poli(vinilpirolidona), jedan ili više poli(oksietilen-oksimetilena), jedna ili više poli(aminokiselina), jedan ili više poliakriloilmorfolina, jedan ili više kopolimera jednog ili više amida i jednog ili više alkilen oksida, jednog ili više dekstrana i jedne ili više hijaluronskih kiselina.
111. Konjugat prema zahtevu 109, naznačen time što navedeni citokin, hemokin, faktor rasta ili polipeptidni hormon ili njegov antagonista poseduje strukturu petlje sa četiri heliksa.
112. Konjugat prema zahtevu 111, naznačen time što je navedeni citokin, hemokin, faktor rasta ili polipeptidni hormon ili njegov antagonista izabran iz grupe koju čine činilac stimulacije kolonija makrofaga (M-CSF), činilac stimulacije kolonija granulocita - makrofaga (GM-CSF), leukemija inhibitorni faktor (LIF), trombopoetin (Tpo), eritropoetin (Epo), faktor matične ćelije (SCF), Flt3 ligand, onkostatin M (OSM), interleukin-2 (IL-2), IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12 (p35 podjedinica), IL-13, IL-15, IL-17, interferon - alfa (IFN-a), interferon - beta (IFN-P), konsenzus interferon, prolaktin i hormon rasta, kao i njihovi muteini, antagonisti, varijante, analogi i derivati.
113. Konjugat prema zahtevu 109, naznačen time što navedeni citokin, hemokin, faktor rasta ili polipeptidni hormon ili njegov antagonista poseduje strukturu p-nabora ili p-cilindra.
114. Konjugat prema zahtevu 113, naznačen time što je navedeni citokin, hemokin, faktor rasta ili polipeptidni hormon ili njegov antagonista izabran iz grupe koju čine faktor nekroze tumora - alfa (TNF-a), IL-la, IL-ip, IL-12 (p40 podjedinica), IL-16, epidermalni faktor rasta (EGF), bazni fibroblastni faktor rasta (bFGF), kiseli FGF, FGF-4 i faktor rasta keratinocita (KGF; FGF-7), kao i njihovi muteini, antagonisti, varijante, analogi i derivati.
115. Konjugat prema zahtevu 109, naznačen time što navedeni citokin, hemokin, faktor rasta ili polipeptidni hormon ili njegov antagonista poseduje mešovitu a/p strukturu.
116. Konjugat prema zahtevu 115, naznačen time što je navedeni citokin, hemokin, faktor rasta ili polipeptidni hormon ili njegov antagonista izabran iz grupe koju čine neutrofilni aktivirajući peptid-2 (NAP-2), stromalni ćelijski deriviran faktor-la (SDF-la), IL-8, monocitni hemoatraktantni protein-1 (MCP-1), MCP-2, MCP-3, eotaksin-1, eotaksin-2, eotaksin-3, RANTES, inhibitorni faktor mijeloidnog progenitora-1 (MPIF-1), neurotaktin, faktor inhibicije migracije makrofaga (MIF) i sa rastom povezani onkogen/stimulatorna aktivnost rasta melanoma (GRO-a/MGSA), kao i njihovi muteini, varijante, analogi i derivati.
117. Konjugat prema zahtevu 109, naznačen time što je navedeni citokin, hemokin, faktor rasta ili polipeptidni hormon ili njegov antagonista izabran iz grupe koju čine interferon - alfa, interferon - beta, IL-2, IL-4, IL-10, TNF-alfa, IGF-1, EGF, bFGF, hGH, prolaktin, insulin, kao i njihovi antagonisti.
118. Konjugat prema zahtevu 117, naznačen time što je navedeni citokin IL-2.
119. Konjugat prema zahtevu 117, naznačen time što je navedeni citokin interferon - alfa.
120. Konjugat prema zahtevu 117, naznačen time što je navedeni citokin TNF - alfa.
121. Konjugat prema zahtevu 117, naznačen time što je navedeni citokin antagonista TNF - alfa.
122. Konjugat prema zahtevu 117, naznačen time što je navedeni faktor rasta EGF.
123. Konjugat prema zahtevu 117, naznačen time što je navedeni faktor rasta IGF - 1.
124. Konjugat prema zahtevu 109, naznačen time što je navedeni polimer rastvorljiv u vodi polialkilen glikol.
125. Konjugat prema zahtevu 124, naznačen time što je navedeni polialkilen glikol izabran iz grupe koju čine poli(etilen glikol), monometoksipoli(etilen glikol) i monohidroksipoli(etilen glikol).
126. Postupak prema zahtevu 125, naznačen time što je navedeni polialkilen glikol monometoksipoli(etilen glikol).
127. Konjugat prema zahtevu 125, naznačen time što je navedeni polialkilen glikol monohidroksipoli(etilen glikol).
128. Konjugat prema zahtevu 124, naznačen time što navedeni polialkilen glikol ima molekulsku masu između oko 1 kDa i oko 100 kDa, uključujući ove vrednosti.
129. Konjugat prema zahtevu 128, naznačen time što navedeni polialkilen glikol ima molekulsku masu između oko 1 kDa i oko 5 kDa, uključujući ove vrednosti.
130. Konjugat prema zahtevu 128, naznačen time što navedeni polialkilen glikol ima molekulsku masu između oko 10 kDa i oko 20 kDa, uključujući ove vrednosti.
131. Konjugat prema zahtevu 128, naznačen time što navedeni polialkilen glikol ima molekulsku masu između oko 18 kDa i oko 60 kDa, uključujući ove vrednosti.
132. Konjugat prema zahtevu 128, naznačen time što navedeni polialkilen glikol ima molekulsku masu između oko 12 kDa i oko 30 kDa, uključujući ove vrednosti.
133. Konjugat prema zahtevu 132, naznačen time što navedem polialkilen glikol ima molekulsku masu od oko 20 kDa.
134. Konjugat prema zahtevu 128, naznačen time što navedeni polialkilen glikol ima molekulsku masu od oko 30 kDa.
135. Konjugat prema zahtevu 109, naznačen time što je navedeni polipeptidni hormon ili njegov antagonista izabran iz grupe koju čine prolaktin i analogi prolaktina koji imitiraju ili antagonizuju biološke efekte prolaktina posredovane prolaktinskim receptorima.
136. Konjugat prema zahtevu 109, naznačen time što je navedeni polipeptidni hormon ili njegov antagonista izabran iz grupe koju čine hormon rasta i analogi hormona rasta koji imitiraju ili antagonizuju biološke efekte hormona rasta posredovane receptorima za hormon rasta.
137. Konjugat prema zahtevu 109, naznačen time što je navedeni citokin, hemokin, faktor rasta ili polipeptidni hormon ili njegov antagonista izabran iz grupe koju čine neglikozilirani eritropoetin i analogi eritropoetina koji imitiraju ili antagonizuju biološke efekte eritropoetina posredovane eritropoetinskim receptorima.
138. Konjugat prema zahtevu 109, naznačen time što vezivanje navedenog polimera za navedeni citokin, hemokin, faktor rasta ili polipeptidni hormon ili njegovog antagonistu na ili u blizini navedenog mesta glikozilacije imitira poželjne efekte glikozilacije ili hiperglikozilacije navedenog citokina, hemokina, faktora rasta ili polipeptidnog hormona ili njegovog antagoniste.
139. Farmaceutski preparat naznačen time što sadrži konjugat prema zahtevu 109 i farmaceutski prihvatljivi nosilac ili ekscipijent.
140. Komplet naznačen time što sadrži konjugat prema zahtevu 107.
141. Komplet naznačen time što sadrži farmaceutski preparat prema zahtevu 108.
142. Komplet naznačen time što sadrži konjugat prema zahtevu 109.
143. Komplet naznačen time što sadrži farmaceutski preparat prema zahtevu 139.
144. Postupak za prevenciju, dijagnostikovanje ili lečenje fizičkog poremećaja kod životinje koja boluje od ili koja je predisponirana za nastanak navedenog fizičkog poremećaja, naznačen time što obuhvata primenu kod navedene životinje efikasne količine konjugata iz bilo kog od zahteva 36, 38, 107 i 109.
145. Postupak za prevenciju, dijagnostikovanje ili lečenje fizičkog poremećaja kod životinje koja boluje od ili koja je predisponirana za nastanak navedenog fizičkog poremećaja, naznačen time što obuhvata primenu kod navedene životinje efikasne količine farmaceutskog preparata iz bilo kog od zahteva 37, 72, 108 i 139.
146. Postupak prema zahtevu 144, naznačen time što je navedena životinja sisar.
147. Postupak prema zahtevu 145, naznačen time što je navedena životinja sisar.
148. Postupak prema zahtevu 146 ili zahtevu 147, naznačen time što je navedeni sisar čovek.
149. Postupak prema zahtevu 144, naznačen time što je navedeni fizički poremećaj izabran iz grupe koju čine kancer, infektivna bolest, neurodegenerativni poremećaj, autoimuni poremećaj i genetski poremećaj.
150. Postupak prema zahtevu 149, naznačen time što je navedeni kancer izabran iz grupe koju čine kancer dojke, kancer materice, kancer jajnika, kancer prostate, kancer testisa, kancer pluća, leukemija, limfom, kancer debelog creva, gastrointestinalni kancer, kancer pankreasa, kancer mokraćne bešike, kancer bubrega, kancer kosti, neurološki kancer, kancer glave i vrata, kancer kože, sarkom, karcinom, adenom i mijelom.
151. Postupak prema zahtevu 149, naznačen time što je navedena infektivna bolest izabrana iz grupe koju Čine bakterijska bolest, gljivična bolest, virusna bolest i parazitska bolest.
152. Postupak prema zahtevu 151, naznačen time što je navedena virusna bolest izabrana iz grupe koju čine hepatitis B, hepatitis C, bolest izazvana kardiotropnim virusom i HIV/AIDS.
153. Postupak prema zahtevu 149, naznačen time što je navedeni autoimuni poremećaj izabran iz grupe koju čine sistemski eritematozni lupus, reumatoidni artritis i psorijaza.
154. Postupak prema zahtevu 149, naznačen time što je navedeni genetski poremećaj izabran iz grupe koju čine anemija, neutropenija, trombocitopenija, hemofilija, patuljasti rast i ozbiljna kombinovana imunodeficijentna bolest ("SCID").
155. Postupak prema zahtevu 149, naznačen time što je navedeni neurodegenerativni poremećaj multipla skleroza.
156. Postupak prema zahtevu 149, naznačen time što je navedeni neurodegenerativni poremećaj Krojcfeld - Jakobsova ili Alchajmerova bolest.
157. Postupak prema zahtevu 145, naznačen time što je navedeni fizički poremećaj izabran iz grupe koju čine kancer, infektivna bolest, neurodegenerativni poremećaj, autoimuni poremećaj i genetski poremećaj.
158. Postupak prema zahtevu 157, naznačen time što je navedeni kancer izabran iz grupe koju čine kancer dojke, kancer materice, kancer jajnika, kancer prostate, kancer testisa, kancer pluća, leukemija, limfom, kancer debelog creva, gastrointestinalni kancer, kancer pankreasa, kancer mokraćne bešike, kancer bubrega, kancer kosti, neurološki kancer, kancer glave i vrata, kancer kože, sarkom, karcinom, adenom i mijelom.
159. Postupak prema zahtevu 157, naznačen time što je navedena infektivna bolest izabrana iz grupe koju čine bakterijska bolest, gljivična bolest, virusna bolest i parazitska bolest.
160. Postupak prema zahtevu 159, naznačen time što je navedena virusna bolest izabrana iz grupe koju čine hepatitis B, hepatitis C, bolest izazvana kardiotropnim virusom i HIV/AIDS.
161. Postupak prema zahtevu 157, naznačen time što je navedeni autoimuni poremećaj izabran iz grupe koju čine sistemski eritematozni lupus, reumatoidni artritis i psorijaza.
162. Postupak prema zahtevu 157, naznačen time što je navedeni genetski poremećaj izabran iz grupe koju čine anemija, neutropenija, trombocitopenija, hemofilija, patuljasti rast i ozbiljna kombinovana imunodeficijentna bolest ("SCID").
163. Postupak prema zahtevu 157, naznačen time što je navedeni neurodegenerativni poremećaj multipla skleroza.
164. Postupak prema zahtevu 157, naznačen time što je navedeni neurodegenerativni poremećaj Krojcfeld - Jakobsova ili Alchajmerova bolest.
YUP-2005/0501A 2002-12-26 2003-12-23 Polimerni konjugati citokina,hemokina,faktora rasta, polipeptidnih hormona i njihovih antagonista sa očuvanom aktivnošću vezivanja receptora RS20050501A (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US43602002P 2002-12-26 2002-12-26
US47991403P 2003-06-20 2003-06-20
PCT/US2003/041162 WO2004060300A2 (en) 2002-12-26 2003-12-23 Polymer conjugates of cytokines, chemokines, growth factors, polypeptide hormones and antagonists thereof with preserved receptor-binding activity

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS20050501A true RS20050501A (sr) 2007-08-03

Family

ID=32717815

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
YUP-2005/0501A RS20050501A (sr) 2002-12-26 2003-12-23 Polimerni konjugati citokina,hemokina,faktora rasta, polipeptidnih hormona i njihovih antagonista sa očuvanom aktivnošću vezivanja receptora

Country Status (19)

Country Link
US (2) US20040136952A1 (sr)
EP (1) EP1628618A4 (sr)
JP (2) JP2006519170A (sr)
KR (1) KR101162908B1 (sr)
AU (1) AU2003303636B2 (sr)
BR (1) BR0317752A (sr)
CA (1) CA2511815A1 (sr)
CR (1) CR7895A (sr)
EA (1) EA013535B1 (sr)
EC (1) ECSP055931A (sr)
GE (1) GEP20084487B (sr)
IS (1) IS7931A (sr)
MX (1) MXPA05006945A (sr)
NO (1) NO20053555L (sr)
NZ (1) NZ541122A (sr)
PL (2) PL396711A1 (sr)
RS (1) RS20050501A (sr)
TW (1) TWI364295B (sr)
WO (1) WO2004060300A2 (sr)

Families Citing this family (87)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7052686B2 (en) 2000-09-29 2006-05-30 Schering Corporation Pegylated interleukin-10
US20070025958A1 (en) * 2000-10-27 2007-02-01 Hadden John W Vaccine immunotherapy
CA2950109C (en) 2000-10-27 2019-02-19 John W. Hadden Vaccine immunotherapy for immune suppressed patients
US20070154399A1 (en) * 2000-10-27 2007-07-05 Hadden John W Immunotherapy for immune suppressed patients
EA008866B1 (ru) * 2002-12-26 2007-08-31 Маунтин Вью Фамэсьютикэлс, Инк. ПОЛИМЕРНЫЙ КОНЪЮГАТ МОДИФИКАЦИЙ ИНТЕРФЕРОНА-β, ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЕ ПРОДУКТЫ НА ЕГО ОСНОВЕ И СПОСОБ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ
NZ541122A (en) * 2002-12-26 2008-09-26 Mountain View Pharmaceuticals Polymer conjugates of cytokines, chemokines, growth factors, polypeptide hormones and antagonists thereof with preserved receptor-binding activity
SI1625156T1 (sl) * 2003-05-12 2013-02-28 Affymax, Inc. Peptidi, ki se veĹľejo k eritropoetinskemu receptorju
WO2004100997A2 (en) 2003-05-12 2004-11-25 Affymax, Inc. Spacer moiety for poly(ethylene glycol) -modified peptides
JP2007530440A (ja) * 2003-05-12 2007-11-01 アフィーマックス・インコーポレイテッド 新規ポリ（エチレングリコール）修飾化合物およびその用途
AU2004309083B2 (en) * 2003-12-30 2010-11-11 Augustinus Bader Tissue regeneration method
JP2007530569A (ja) * 2004-03-23 2007-11-01 アムジエン・インコーポレーテツド 化学修飾タンパク質組成物及び方法
CA2573262C (en) * 2004-07-16 2015-02-10 Nektar Therapeutics Al, Corporation Conjugates of a gm-csf moiety and a polymer
EA200700990A1 (ru) * 2004-11-11 2008-04-28 Афимакс, Инк. Новые пептиды, которые связывают рецептор эритропоэтина
WO2006062685A2 (en) * 2004-11-11 2006-06-15 Affymax, Inc. Novel peptides that bind to the erythropoietin receptor
EP1674113A1 (en) * 2004-12-22 2006-06-28 F. Hoffmann-La Roche Ag Conjugates of insulin-like growth factor-1 (IGF-1) and poly(ethylene glycol)
WO2006074179A2 (en) * 2005-01-04 2006-07-13 University Of Rochester Blockade of elr+cxc chemokines as a treatment for inflammatory and autoimmune disease
WO2007009208A1 (en) * 2005-06-02 2007-01-25 Cangene Corporation Poly(ethylene glocol) modified human gm-csf with increased biological activity
US7919461B2 (en) 2005-06-03 2011-04-05 Affymax, Inc. Erythropoietin receptor peptide formulations and uses
US8324159B2 (en) * 2005-06-03 2012-12-04 Affymax, Inc. Erythropoietin receptor peptide formulations and uses
US7550433B2 (en) 2005-06-03 2009-06-23 Affymax, Inc. Erythropoietin receptor peptide formulations and uses
WO2007014167A2 (en) * 2005-07-22 2007-02-01 Five Prime Therapeutics, Inc. Compositions for and methods of treating epithelial diseases with growth factors
CA2627939A1 (en) * 2005-12-15 2007-06-21 Laboratoires Serono S.A. New chemokine antagonists
EP2444499A3 (en) 2006-05-02 2012-05-09 Allozyne, Inc. Amino acid substituted molecules
CL2007002502A1 (es) * 2006-08-31 2008-05-30 Hoffmann La Roche Variantes del factor de crecimiento similar a insulina-1 humano (igf-1) pegilados en lisina; metodo de produccion; proteina de fusion que la comprende; y su uso para tratar la enfermedad de alzheimer.
AU2007291501B2 (en) * 2006-08-31 2012-07-12 F. Hoffmann-La Roche Ag Method for the production of insulin-like growth factor-I
CA2664304C (en) * 2006-09-28 2017-08-22 Schering Corporation Use of pegylated il-10 to treat cancer
US20100035814A1 (en) * 2006-11-09 2010-02-11 Novo Nordisk A/S N-Terminal Pegylated Prolactin Receptor Molecules
EP1935428A1 (en) * 2006-12-22 2008-06-25 Antisense Pharma GmbH Oligonucleotide-polymer conjugates
HUE027603T2 (en) * 2007-04-20 2016-10-28 Sigma-Tau Rare Disease Ltd Stable, recombinant adenosine deaminase
CA2707840A1 (en) 2007-08-20 2009-02-26 Allozyne, Inc. Amino acid substituted molecules
WO2009070639A1 (en) 2007-11-28 2009-06-04 Irx Therapeutics, Inc. Method of increasing immunological effect
EP2274624B1 (en) * 2008-04-03 2011-11-09 F. Hoffmann-La Roche AG Pegylated insulin-like-growth-factor assay
JP5763535B2 (ja) 2008-06-24 2015-08-12 バイオアクティブ サージカル インコーポレイテッド 幹細胞または他の生理活性材料が組み込まれた外科手術用縫合糸
AU2009200540A1 (en) * 2008-07-03 2010-01-21 Induce Biologics Inc. Use of immobilized antagonists for enhancing growth factor containing bioimplant effectiveness
MY156568A (en) * 2008-07-31 2016-03-15 Pharmaessentia Corp Peptide-polymer conjugates
KR20110042107A (ko) 2008-08-07 2011-04-22 바이오엑티브 써지컬, 아이엔씨. 의료 장치 및 이식물을 위한 줄기 세포 포획 및 고정화 코팅
US8716446B2 (en) 2008-08-25 2014-05-06 Biopolymed Inc. Biopolymer conjugates comprising an interleukin-11 analog
US8492503B2 (en) 2008-09-11 2013-07-23 Nektar Therapeutics Polymeric alpha-hydroxy aldehyde and ketone reagents and conjugation method
EP2341942A1 (en) 2008-09-19 2011-07-13 Nektar Therapeutics Polymer conjugates of therapeutic peptides
US8518888B2 (en) * 2008-10-14 2013-08-27 Csl Limited Method of treatment of gastrointestinal-type cancer with antagonistic antibodies to IL-11R
EP3348281B1 (en) * 2008-12-17 2023-07-05 Merck Sharp & Dohme Corp. Mono- and di-peg il-10 production; and uses
US8648046B2 (en) * 2009-02-26 2014-02-11 Oncolix, Inc. Compositions and methods for visualizing and eliminating cancer stem cells
US8754035B2 (en) * 2009-02-26 2014-06-17 Oncolix, Inc. Compositions and methods for visualizing and eliminating cancer stem cells
MX2011012147A (es) 2009-05-15 2012-06-19 Irx Therapeutics Inc Inmunoterapia de vacuna.
JP2011026294A (ja) * 2009-06-26 2011-02-10 Canon Inc 化合物
US20110081398A1 (en) * 2009-10-01 2011-04-07 Tyco Healthcare Group Lp Multi-mechanism surgical compositions
US20110081701A1 (en) * 2009-10-02 2011-04-07 Timothy Sargeant Surgical compositions
US8968785B2 (en) * 2009-10-02 2015-03-03 Covidien Lp Surgical compositions
CN103097543A (zh) 2009-12-08 2013-05-08 伊尔克斯治疗有限公司 逆转朗格汉斯细胞免疫抑制的方法
SG186302A1 (en) * 2010-06-16 2013-02-28 Abbott Lab Comparison of protein samples
US20130195799A1 (en) * 2010-08-19 2013-08-01 Peg Biosciences, Inc. Synergistic biomolecule-polymer conjugates
ES2866674T3 (es) * 2010-11-12 2021-10-19 Nektar Therapeutics Conjugados de una fracción de IL-2 y un polímero
KR101309566B1 (ko) * 2010-12-10 2013-09-17 포항공과대학교 산학협력단 히알루론산-단백질 컨쥬게이트 및 이의 제조 방법
WO2012128810A1 (en) 2011-03-23 2012-09-27 Abbott Laboratories Methods and systems for the analysis of protein samples
WO2012140650A2 (en) 2011-04-12 2012-10-18 Hepacore Ltd. Conjugates of carboxy polysaccharides with fibroblast growth factors and variants thereof
WO2013020079A2 (en) * 2011-08-04 2013-02-07 Nektar Therapeutics Conjugates of an il-11 moiety and a polymer
WO2013167750A2 (en) * 2012-05-11 2013-11-14 Prorec Bio Ab Method for diagnosis and treatment of prolactin associated disorders
EP2986306A4 (en) 2013-04-18 2016-12-07 Armo Biosciences Inc METHOD FOR USE OF INTERLEUKIN-10 FOR THE TREATMENT OF ILLNESSES AND SUFFERING
US20160068583A1 (en) * 2013-04-24 2016-03-10 Armo Biosciences, Inc. Interleukin-10 Compositions and Uses Thereof
ES2688206T3 (es) 2013-06-17 2018-10-31 Armo Biosciences, Inc. Procedimiento de evaluación de la identidad y la estabilidad de proteínas
CN105658232A (zh) 2013-08-30 2016-06-08 阿尔莫生物科技股份有限公司 使用白细胞介素-10治疗疾病和病症的方法
EP3068425B1 (en) 2013-11-11 2021-01-27 Armo Biosciences, Inc. Methods of using interleukin-10 for treating diseases and disorders
UY35874A (es) * 2013-12-12 2015-07-31 Novartis Ag Un proceso para la preparación de una composición de proteínas pegiladas
CU20140003A7 (es) * 2014-01-08 2015-08-27 Ct De Inmunología Molecular Biofarmacuba Conjugado que comprende eritropoyetina y una estructura polimérica ramificada
WO2015187295A2 (en) 2014-06-02 2015-12-10 Armo Biosciences, Inc. Methods of lowering serum cholesterol
EA029942B1 (ru) * 2014-06-16 2018-06-29 Общество С Ограниченной Ответственностью "Форт" (Ооо "Форт") Стабильная фармацевтическая композиция на основе конъюгатов биологически активных белков с полиэтиленгликолем, содержащих азогруппу
WO2016060996A2 (en) 2014-10-14 2016-04-21 Armo Biosciences, Inc. Interleukin-15 compositions and uses thereof
AU2015336101A1 (en) 2014-10-22 2017-04-20 Armo Biosciences, Inc. Methods of using interleukin-10 for treating diseases and disorders
US11559567B2 (en) 2014-11-06 2023-01-24 Pharmaessentia Corporation Dosage regimen for pegylated interferon
US10618970B2 (en) 2015-02-03 2020-04-14 Armo Biosciences, Inc. Method of treating cancer with IL-10 and antibodies that induce ADCC
EP3265479A4 (en) * 2015-03-03 2018-11-14 Avalon Biologics Limited Compositions and methods for pegylated il-11
MA41957A (fr) * 2015-03-11 2018-02-28 Nektar Therapeutics Conjugués d'une fraction d'il-7 et d'un polymère
CA2986755A1 (en) 2015-05-28 2016-12-01 Armo Biosciences, Inc. Pegylated interleukin-10 for use in treating cancer
US10398761B2 (en) 2015-08-25 2019-09-03 Armo Biosciences, Inc. Methods of using combinations of PEG-IL-10 and IL-15 for treating cancers
AU2016335860B2 (en) 2015-10-08 2023-08-10 Nektar Therapeutics Combination of an IL-2Rbeta-selective agonist and a long-acting IL-15 agonist
US9758786B2 (en) 2016-02-09 2017-09-12 Autotelic, Llc Compositions and methods for treating pancreatic cancer
US12036283B2 (en) 2017-05-15 2024-07-16 Nektar Therapeutics Long-acting interleukin-15 receptor agonists and related immunotherapeutic compositions and methods
EP3630162A1 (en) * 2017-05-24 2020-04-08 Novartis AG Antibody-cytokine engrafted proteins and methods of use
AU2018300069C1 (en) 2017-07-11 2025-11-20 Synthorx, Inc. Incorporation of unnatural nucleotides and methods thereof
WO2019023295A1 (en) * 2017-07-27 2019-01-31 Saint Louis University Fatty acid modified human epidermal growth factor
WO2019028419A1 (en) 2017-08-03 2019-02-07 Synthorx, Inc. CYTOKINE CONJUGATES FOR THE TREATMENT OF PROLIFERATIVE AND INFECTIOUS DISEASES
US20200299349A1 (en) 2017-11-21 2020-09-24 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Partial agonists of interleukin-2
CA3100005A1 (en) 2018-05-14 2019-11-21 Werewolf Therapeutics, Inc. Activatable cytokine polypeptides and methods of use thereof
AU2019271148B9 (en) 2018-05-14 2025-05-29 Werewolf Therapeutics, Inc. Activatable interleukin-2 polypeptides and methods of use thereof
KR20260039812A (ko) 2019-02-06 2026-03-20 신톡스, 인크. Il-2 콘쥬게이트 및 이의 사용 방법
KR20220023988A (ko) 2019-05-14 2022-03-03 웨어울프 세라퓨틱스, 인크. 분리 모이어티 및 이의 사용 방법
BR112022009110A2 (pt) 2019-11-14 2022-07-26 Werewolf Therapeutics Inc Polipeptídeos de citocina ativáveis e métodos de uso destes

Family Cites Families (96)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4179337A (en) * 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
US4002531A (en) * 1976-01-22 1977-01-11 Pierce Chemical Company Modifying enzymes with polyethylene glycol and product produced thereby
GB1578348A (en) * 1976-08-17 1980-11-05 Pharmacia Ab Products and a method for the therapeutic suppression of reaginic antibodies responsible for common allergic
JPS6023084B2 (ja) * 1979-07-11 1985-06-05 味の素株式会社 代用血液
US6610830B1 (en) * 1980-07-01 2003-08-26 Hoffman-La Roche Inc. Microbial production of mature human leukocyte interferons
NZ198445A (en) * 1980-09-25 1984-05-31 Genentech Inc Production of human fibroblast interferon by recombinant dna technology
EP0098110B1 (en) * 1982-06-24 1989-10-18 NIHON CHEMICAL RESEARCH KABUSHIKI KAISHA also known as JAPAN CHEMICAL RESEARCH CO., LTD Long-acting composition
US4462940A (en) * 1982-09-23 1984-07-31 Cetus Corporation Process for the recovery of human β-interferon-like polypeptides
US4462946A (en) * 1982-10-12 1984-07-31 Goldsworthy Engineering, Inc. Apparatus and method for producing reinforced plastic composite articles of non-uniform shape and non-uniform volume
US4588585A (en) * 1982-10-19 1986-05-13 Cetus Corporation Human recombinant cysteine depleted interferon-β muteins
WO1985003934A1 (fr) * 1984-03-06 1985-09-12 Takeda Chemical Industries, Ltd. Proteine modifiee chimiquement et son procede de preparation
US4732863A (en) * 1984-12-31 1988-03-22 University Of New Mexico PEG-modified antibody with reduced affinity for cell surface Fc receptors
US4917888A (en) * 1985-06-26 1990-04-17 Cetus Corporation Solubilization of immunotoxins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation
US4766106A (en) * 1985-06-26 1988-08-23 Cetus Corporation Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation
US5206344A (en) * 1985-06-26 1993-04-27 Cetus Oncology Corporation Interleukin-2 muteins and polymer conjugation thereof
US4816440A (en) * 1985-09-26 1989-03-28 Cetus Corporation Stable formulation of biologically active proteins for parenteral injection
US5037969A (en) * 1986-07-03 1991-08-06 Takeda Chemical Industries, Ltd. Glycosyl derivatives and use thereof
US4894330A (en) * 1986-12-23 1990-01-16 Cetus Corporation Purification of recombinant beta-interferon incorporating RP-HPLC
US5080891A (en) * 1987-08-03 1992-01-14 Ddi Pharmaceuticals, Inc. Conjugates of superoxide dismutase coupled to high molecular weight polyalkylene glycols
US5006333A (en) * 1987-08-03 1991-04-09 Ddi Pharmaceuticals, Inc. Conjugates of superoxide dismutase coupled to high molecular weight polyalkylene glycols
JPH01128871A (ja) * 1987-11-13 1989-05-22 Kanzaki Paper Mfg Co Ltd 感熱記録体用基材
US5004605A (en) * 1987-12-10 1991-04-02 Cetus Corporation Low pH pharmaceutical compositions of recombinant β-interferon
US4904584A (en) * 1987-12-23 1990-02-27 Genetics Institute, Inc. Site-specific homogeneous modification of polypeptides
US4847325A (en) * 1988-01-20 1989-07-11 Cetus Corporation Conjugation of polymer to colony stimulating factor-1
US6132763A (en) * 1988-10-20 2000-10-17 Polymasc Pharmaceuticals Plc Liposomes
US5349052A (en) * 1988-10-20 1994-09-20 Royal Free Hospital School Of Medicine Process for fractionating polyethylene glycol (PEG)-protein adducts and an adduct for PEG and granulocyte-macrophage colony stimulating factor
GB8824591D0 (en) * 1988-10-20 1988-11-23 Royal Free Hosp School Med Fractionation process
US5091176A (en) * 1988-11-02 1992-02-25 W. R. Grace & Co.-Conn. Polymer-modified peptide drugs having enhanced biological and pharmacological activities
US4902502A (en) * 1989-01-23 1990-02-20 Cetus Corporation Preparation of a polymer/interleukin-2 conjugate
US5122614A (en) * 1989-04-19 1992-06-16 Enzon, Inc. Active carbonates of polyalkylene oxides for modification of polypeptides
US5324844A (en) * 1989-04-19 1994-06-28 Enzon, Inc. Active carbonates of polyalkylene oxides for modification of polypeptides
US5166322A (en) * 1989-04-21 1992-11-24 Genetics Institute Cysteine added variants of interleukin-3 and chemical modifications thereof
JPH04218000A (ja) * 1990-02-13 1992-08-07 Kirin Amgen Inc 修飾ポリペプチド
US5219564A (en) * 1990-07-06 1993-06-15 Enzon, Inc. Poly(alkylene oxide) amino acid copolymers and drug carriers and charged copolymers based thereon
JP3051145B2 (ja) * 1990-08-28 2000-06-12 住友製薬株式会社 新規なポリエチレングリコール誘導体修飾ペプチド
US5252714A (en) * 1990-11-28 1993-10-12 The University Of Alabama In Huntsville Preparation and use of polyethylene glycol propionaldehyde
US5595732A (en) * 1991-03-25 1997-01-21 Hoffmann-La Roche Inc. Polyethylene-protein conjugates
JP3417558B2 (ja) * 1991-05-10 2003-06-16 ジェネンテク，インコーポレイテッド 配位子作用薬および拮抗薬の選択
US5281698A (en) * 1991-07-23 1994-01-25 Cetus Oncology Corporation Preparation of an activated polymer ester for protein conjugation
US5362852A (en) * 1991-09-27 1994-11-08 Pfizer Inc. Modified peptide derivatives conjugated at 2-hydroxyethylamine moieties
ZA933926B (en) * 1992-06-17 1994-01-03 Amgen Inc Polyoxymethylene-oxyethylene copolymers in conjuction with blomolecules
US5382657A (en) * 1992-08-26 1995-01-17 Hoffmann-La Roche Inc. Peg-interferon conjugates
US5581476A (en) * 1993-01-28 1996-12-03 Amgen Inc. Computer-based methods and articles of manufacture for preparing G-CSF analogs
US5395619A (en) * 1993-03-03 1995-03-07 Liposome Technology, Inc. Lipid-polymer conjugates and liposomes
CA2119089A1 (en) * 1993-03-29 1994-09-30 David Banner Tumor necrosis factor muteins
US5605976A (en) * 1995-05-15 1997-02-25 Enzon, Inc. Method of preparing polyalkylene oxide carboxylic acids
US5643575A (en) * 1993-10-27 1997-07-01 Enzon, Inc. Non-antigenic branched polymer conjugates
US5919455A (en) * 1993-10-27 1999-07-06 Enzon, Inc. Non-antigenic branched polymer conjugates
KR960705579A (ko) * 1993-11-10 1996-11-08 에릭에스. 딕커 개선된 인터페론 중합체 결합체(Improved interferon polymer conjugates)
US5951974A (en) * 1993-11-10 1999-09-14 Enzon, Inc. Interferon polymer conjugates
US5446090A (en) * 1993-11-12 1995-08-29 Shearwater Polymers, Inc. Isolatable, water soluble, and hydrolytically stable active sulfones of poly(ethylene glycol) and related polymers for modification of surfaces and molecules
US5449090A (en) * 1994-03-11 1995-09-12 Martin Yale Industries, Inc. Label dispenser
CN1229385C (zh) * 1994-03-31 2005-11-30 安姆根有限公司 刺激巨核细胞生长和分化的组合物及方法
US5889153A (en) * 1994-05-20 1999-03-30 Hisamitsu Pharmaceutical Co., Inc. Protein or polypeptide, method for producing the same and intermediate compound therefor
US5730990A (en) * 1994-06-24 1998-03-24 Enzon, Inc. Non-antigenic amine derived polymers and polymer conjugates
US20030053982A1 (en) * 1994-09-26 2003-03-20 Kinstler Olaf B. N-terminally chemically modified protein compositions and methods
US5824784A (en) * 1994-10-12 1998-10-20 Amgen Inc. N-terminally chemically modified protein compositions and methods
US5738846A (en) * 1994-11-10 1998-04-14 Enzon, Inc. Interferon polymer conjugates and process for preparing the same
US5770577A (en) * 1994-11-14 1998-06-23 Amgen Inc. BDNF and NT-3 polypeptides selectively linked to polyethylene glycol
US5932462A (en) * 1995-01-10 1999-08-03 Shearwater Polymers, Inc. Multiarmed, monofunctional, polymer for coupling to molecules and surfaces
EP1131131A1 (en) 1995-04-23 2001-09-12 Electromagnetic Bracing Systems, Inc. Transdermal active drug delivery system and method
US5756593A (en) * 1995-05-15 1998-05-26 Enzon, Inc. Method of preparing polyalkyene oxide carboxylic acids
US5672662A (en) * 1995-07-07 1997-09-30 Shearwater Polymers, Inc. Poly(ethylene glycol) and related polymers monosubstituted with propionic or butanoic acids and functional derivatives thereof for biotechnical applications
US5747639A (en) * 1996-03-06 1998-05-05 Amgen Boulder Inc. Use of hydrophobic interaction chromatography to purify polyethylene glycols
EP1731174A3 (en) * 1996-08-02 2007-01-17 Ortho-McNeil Pharmaceutical, Inc. Polypeptides having a covalently bound N-terminal polyethylene glycol via hydrazone or oxime bond
JP3814903B2 (ja) * 1996-12-25 2006-08-30 株式会社日立製作所 映像・データ表示方法及び装置
US5990237A (en) * 1997-05-21 1999-11-23 Shearwater Polymers, Inc. Poly(ethylene glycol) aldehyde hydrates and related polymers and applications in modifying amines
ATE375363T1 (de) * 1997-07-14 2007-10-15 Bolder Biotechnology Inc Derivate des wachstumshormons und verwandte proteine
US6017876A (en) * 1997-08-15 2000-01-25 Amgen Inc. Chemical modification of granulocyte-colony stimulating factor (G-CSF) bioactivity
US5981709A (en) * 1997-12-19 1999-11-09 Enzon, Inc. α-interferon-polymer-conjugates having enhanced biological activity and methods of preparing the same
US5985263A (en) 1997-12-19 1999-11-16 Enzon, Inc. Substantially pure histidine-linked protein polymer conjugates
JP2002505338A (ja) * 1998-03-05 2002-02-19 カイロン コーポレイション 生物学的に活性な分子の血清半減期を増加するための方法
KR100358276B1 (ko) * 1998-03-24 2002-10-25 닛폰 유시 가부시키가이샤 옥시란 유도체 및 이의 제조방법
WO1999055377A2 (en) * 1998-04-28 1999-11-04 Applied Research Systems Ars Holding N.V. Polyol-ifn-beta conjugates
ES2245114T3 (es) * 1998-08-06 2005-12-16 Mountain View Pharmaceuticals, Inc. Conjugados de peg-oxidasa de urato y su uso.
DK1656952T3 (da) * 1998-10-16 2014-01-20 Biogen Idec Inc Polyalkylenglycolkonjugater af interferon beta-1A og anvendelser deraf
JO2291B1 (en) * 1999-07-02 2005-09-12 اف . هوفمان لاروش ايه جي Erythropoietin derivatives
AU2223401A (en) * 1999-12-24 2001-07-09 Kyowa Hakko Kogyo Co. Ltd. Branched polyalkylene glycols
US7052686B2 (en) * 2000-09-29 2006-05-30 Schering Corporation Pegylated interleukin-10
US6887462B2 (en) * 2001-04-09 2005-05-03 Chiron Corporation HSA-free formulations of interferon-beta
US6908963B2 (en) * 2001-10-09 2005-06-21 Nektar Therapeutics Al, Corporation Thioester polymer derivatives and method of modifying the N-terminus of a polypeptide therewith
JP2005517648A (ja) 2001-12-07 2005-06-16 インターミューン インコーポレイテッド 肝炎ウイルス感染症を治療するための組成物および方法
AU2002357806A1 (en) 2001-12-11 2003-06-23 Sun Bio, Inc. Novel monofunctional polyethylene glycol aldehydes
EE05509B1 (et) * 2002-01-18 2012-02-15 Biogen@Idec@Ma@Inc Aktiveeritud polalkleenglkoolpolmeer ja seda sisaldavad kompositsioonid
NZ540490A (en) * 2002-09-09 2007-10-26 Nektar Therapeutics Al Corp Water-soluble polymer alkanal conjugates with human growth hormone
US20040062748A1 (en) * 2002-09-30 2004-04-01 Mountain View Pharmaceuticals, Inc. Polymer conjugates with decreased antigenicity, methods of preparation and uses thereof
US8129330B2 (en) * 2002-09-30 2012-03-06 Mountain View Pharmaceuticals, Inc. Polymer conjugates with decreased antigenicity, methods of preparation and uses thereof
EP1565205A4 (en) * 2002-11-18 2006-07-05 Maxygen Inc Interferon-alpha polypeptides and conjugates
US20040142870A1 (en) * 2002-11-20 2004-07-22 Finn Rory F. N-terminally monopegylated human growth hormone conjugates, process for their preparation, and methods of use thereof
US8828373B2 (en) * 2002-11-20 2014-09-09 Nof Corporation Polyalkylene glycol derivative and modified bio-related substance
JP4412461B2 (ja) * 2002-11-20 2010-02-10 日油株式会社 修飾された生体関連物質、その製造方法および中間体
US8003117B2 (en) * 2002-11-20 2011-08-23 Nof Corporation Polyalkylene glycol derivative and modified bio-related substance
TWI281864B (en) * 2002-11-20 2007-06-01 Pharmacia Corp N-terminally monopegylated human growth hormone conjugates and process for their preparation
EA008866B1 (ru) * 2002-12-26 2007-08-31 Маунтин Вью Фамэсьютикэлс, Инк. ПОЛИМЕРНЫЙ КОНЪЮГАТ МОДИФИКАЦИЙ ИНТЕРФЕРОНА-β, ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЕ ПРОДУКТЫ НА ЕГО ОСНОВЕ И СПОСОБ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ
NZ541122A (en) * 2002-12-26 2008-09-26 Mountain View Pharmaceuticals Polymer conjugates of cytokines, chemokines, growth factors, polypeptide hormones and antagonists thereof with preserved receptor-binding activity
JP2009524598A (ja) * 2005-12-30 2009-07-02 ファーマエッセンティア コーポレイション 薬剤−高分子結合体

Also Published As

Publication number Publication date
PL380269A1 (pl) 2007-01-08
IS7931A (is) 2005-07-04
EA200501051A1 (ru) 2007-02-27
JP2011051991A (ja) 2011-03-17
CR7895A (es) 2007-03-21
AU2003303636A1 (en) 2004-07-29
WO2004060300A2 (en) 2004-07-22
WO2004060300A3 (en) 2006-07-13
NO20053555D0 (no) 2005-07-20
PL396711A1 (pl) 2011-12-19
KR101162908B1 (ko) 2012-07-06
AU2003303636B2 (en) 2010-08-05
CA2511815A1 (en) 2004-07-22
EP1628618A4 (en) 2009-09-09
TW200501979A (en) 2005-01-16
MXPA05006945A (es) 2005-12-14
TWI364295B (en) 2012-05-21
BR0317752A (pt) 2005-11-22
NZ541122A (en) 2008-09-26
US20080058246A1 (en) 2008-03-06
JP2006519170A (ja) 2006-08-24
US20040136952A1 (en) 2004-07-15
EA013535B1 (ru) 2010-06-30
NO20053555L (no) 2005-09-23
EP1628618A2 (en) 2006-03-01
KR20050089860A (ko) 2005-09-08
ECSP055931A (es) 2006-11-24
GEP20084487B (en) 2008-09-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101162908B1 (ko) 수용체-결합 활성이 보존된, 사이토카인, 케모카인,성장인자, 폴리펩티드 호르몬 및 이들의 길항제의 중합체접합체
US9125880B2 (en) Polymer conjugates of interferon-beta with enhanced biological potency
JP2005525302A (ja) 化学的に修飾されたヒト成長ホルモンコンジュゲート
ZA200505393B (en) Polymer conjugates of cytokines, chemokines, growth factors, polypeptide hormones and antagonists thereof with preserved receptor-binding activity
HK1165725B (en) Polymer conjugates of interferon-beta with enhanced biological potency
HK1165725A (en) Polymer conjugates of interferon-beta with enhanced biological potency
HK1088822B (en) Polyethylene glycol conjugates of interferon-beta-1b with enhanced in vitro biological potency