RS20050740A - Postupak za proizvodnju ekstrakta iz listova bršljena - Google Patents

Abstract

Pronalazak se odnosi na postupak za pripremanje ekstrakta iz listova bršljena, upotrebom ekstrakcionog sredstva, pri čemu ekstrakt jeste α-hederin. Prema ovom postupku, određena količina osušenog lišća bršljena se prvo isitni, zatim se posle dodavanja vode vrši fermetiranje, pa onda ekstrahovanje; na kraju, ekstrakt se suši.

Description

Postupak za proizvodnju ekstrakta iz listova bršljena

Ovaj pronalazak se odnosi na proces za pripremanje ekstrakta iz listova bršljena, upotrebom ekstrakcionog sredstva, pri čemu je suvi ekstarkt a-hederin.

Danas se ekstrakti iz listova bršljena uspešno koriste za lečenje oboljenja respiratornog trakta, naročito, pošto ekstrakt ispoljava spazmolitičke, ekspektoralne i antiopstruktivne efekte. Ovi efekti se pripisuju, naročito, terapeutski značajnim sastojcima ekstrakata iz bršljenovog lista, koji pripadaju klasi triterpen saponina. U vezi sa tim, glavni saponini su bidezmozidni hederakozidni C i a-hederin, koji nastaje od njega hidrolizom estra. Jedan drugi saponin koji je otkriven jeste hederagenin.

Pošto iz lišća bršljena ekstrakti mogu da se dobiju različitim postupcima, takvi ekstrakti često imaju različite stepene efikasnosti. To potiče od činjenice da sadržina sastojaka zavisi od pojedinačnog postupka upotrebljenog za dobijanje ekstrakta.

Na osnovu obavljenih studija, prijavilac je našao, da a-hederin naročito deluje na spazmolizu. Utvrđeno je da a-hederin, na specifičan način, inhibira proces uključivanja P-adrenergičnih receptora. Vezivanje nekog liganda za p-adrenergičke receptore inicijalno aktivira sistem adenilatne ciklaze, tako što izaziva opuštanje glatke muskulature bronhijskog sistema, na primer, kao reakcije koja je time prouzrokovana. Na bilo kakvo premašivanje efekta suprotno deluju, između ostalog, postojeći membranski receptori, koji su depresirani time što su uključeni u ćeliju.

U vezi sa tim, bilo je moguće da se utvrdi da a-hederin ne napada direktno P-adre-nergički receptor već, umesto toga, inhibira uključivanje receptor/liganda u ćeliju. Kada je uključivanje receptor/ligandnih kompleksa inhibirano, sistem adenilatne ciklaze se kontinualno aktivira, pojačavajući pritom relaksaciju glatke muskulature u bronhijalna (spazmoliza).

S druge strane, supstance, hederakozid C i hederagenin, nisu u stanju da inhibiraju proces uključivanja. Prema tome, ekstrakti koji imaju veliki sadržaj a-hederina naročito su pogodni za upotrebu kao lekovi.

Mnoštvo postupaka za proizvodnju suvih ekstrakata biljnih materijala opisano je u domenu farmacije, a naročito farmacetskih preparata.

Jedan od postupaka za proizvodnju suvih ekstrakata biljnih materijala, objavljenje, na primer, u DE 101 12 168 Al. Primenom postupka, koji je prikazan u toj publikaciji, navodi se daje moguće da se podesi sadržaj lipofilnih i hidrofilnih supstanci. U vezi sa tim, biljni materijal se najmanje dvaput ekstrahuje sa rastvaračima različite lipofilnosti pa se ekstrakti iz tih ekstarkcija izoluju odvojeno. Ekstrakti se suše odvojeno jedan od drugoga pa se zatim mešaju u željenom odnosu. Na taj način, moguće je podesiti sadržaj lipofilnih i hidrofilnih supstanci. Takođe se pominje da je postupak pogodan za izolovanje suvih ekstrakata bršljena( Hedera helix).

Međutim, nedostatak tog postupka je u činjenici da je potrebno da se izvedu dve odvojene ekstrakcije usled čega je postupak u celini veoma složen.

Zatim, DE 30 25 223 Al prikazuje, farmaceutski preparat koji se zasniva na ekstraktima bršljena i postupak za njegovo pripremanje, a prema tom postupku ekstrakti bršljena, koji sadrže 60, odnosno 90% hederasaponina C, dobijaju se primenom acetona i metanola. Da bi se hederasaponin C, ili hederakozid C, preveli u a-hederin, kao i da bi se pritom dobio ekstrakt koji sadrži samo a-hederin, prema gore pomenutoj prijavi, 90% ekstrakt se hidrolizuje, sa natrijum-hidroksidom ili kalijum-hidroksidom.

Međutim, nedostatak tog postupka je u njegovoj složenosti, jer su neophodni dodatni stupnjevi, posle dobijanja hederakozida C, radi prevođenja hederakozida, ili hederasaponina, u a-hederin.

G. Wulff, u članku, "Novi pravci razvoja u oblasti saponina [Recent developments in the saponin field]", Deutsche Apotheker Zeitung [German pharmacists' journal], 108 (No. 23), str. 797-808, objavljuje da, ako su sveži listovi bršljena isitnjeni i ostavljeni da stoje u vodi preko noći, onda se posle toga nalazi samo još a-hederin. Smatra se da taj efekat izazivaju enzimi koji su prisutni u svežem lišću.

Međutim, farmaceutska industrija koristi osušene farmaceutske materijale, pošto su oni stabilni i sa njima se lakše radi. Enzimske aktivnosti se ne očekuju u tim osušenim farmaceutskim materijalima.

Zbog toga je predmet ovog pronalaska pronalaženje postupka koji može da se primeni za dobijanje ekstrakta, u nekoliko stupnjeva i bez velikog utroška vremena, naročito suvog ekstrakta, koji je bar u velikoj meri obogaćen a-hederinom.

Prema postupku koji je na početku naveden, predmet pronalaska je u suštini ostvaren pomoću postupka koji sačinjavaju sledeći stupnjevi:

a) sitnjenje neke količine suvog lišća bršljena,

b) fermentisanje, dodavanjem vode, pri čemu se hederakozid C prevodi u a-hederin,

c) ekstrahovanje, dodavanjem sredstva za ekstrahovanje, i

d) u datom slučaju, sušenje ekstrakta.

Na taj način, u potpunosti se postiže suština predmeta pronalaska.

Prema tome, kada se primeni postupak prema pronalasku, moguće je dobiti ekstrakt koji sadrži a-hederin, kao aktivnu supstancu, u obogaćenom obliku, u toku čijeg pripremanja, najveći deo, ili, u datom slučaju, celokupna količina hederakozida C, koja je na početku bila prisutna u lišću bršljena, može biti prevedena u a-hederin.

Pronalazači su pokazali, u svojim sopstvenim eksperimentima, da, kada se upotrebi osušeno lišće bršljena, fermentacioni stupanj omogućava praktično potpunu konverziju hederakozida C u a-hederin. Kao rezultat toga, nisu potrebni dalji stupnjevi, posle ekstrakcije, za tretiranje, nekom daljom reakcijom, sastojaka koji su dobijeni. Na suprot tome, tačnije, kao rezultat umetnutog fermentacionog stupnja, celokupan proces može da se izvede ekonomičnije, kako u pogledu vremena koje se dobij a tako i materijala koji se koriste, što predstavlja veliku prednost u poređenju sa postupcima koji su poznati na osnovu stanja tehnike.

U ovom slučaju, "fermentovanje" označava razlaganje, ili konverziju sastojaka, koji su prisutni u početnoj supstanci, u druge supstance, kada se u početnu supstancu doda neki fermentacioni medij um, na primer neka tečnost, pri čemu su podesni, specifični parametri, na primer, vreme i temperatura, podešeni da odgovaraju fermentacionom procesu.

Pronalazači su otkrili da je naročito pogodno da se u fermentacionom stupnju upotrebi voda. Dodavanje vode stimuliše proces konverzije hederakozida C u a-hederin.

Zbog toga je moguće da se proces, na osnovu pronalaska, upotrebi za proizvodnju ekstrakta čiji je sadržaj a-hederina naročito visok. Ekstrakt koji ima veliki sadržaj a-hederina naročito je poželjan za lečenje oboljenja respiratornog trakta, pošto je istraživanjima koja su, u vezi sa tim, obavili podnosioci ove prijave, na uobičajeni način utvrđeno daje a-hederin odgovarajući (bitan) faktor.

Kao što je prethodno pomenuto, od saponina koji su prisutni u bršljenu, na spazmolitič-ke efekte u bronhijama naročito utiče a-hederin. Kao rezultat velikog sadržaja a-hederina, aktivnost tog ekstrakta je zato znatno poboljšana, u poređenju sa ekstraktima u kojima je još prisutan relativno veliki sadržaj hederakozida C.

U farmaceutskoj proizvodnji, suvi farmaceutski materijali ("lekovi") imaju prednost, pošto je rad sa njima lakši nego sa svežim farmaceutskim materijalima, između ostalog i zbog stabilnosti.

U oblasti farmaceutske tehnologije, osušene medicinske biljke i delovi medicinskih biljaka, po definiciji se nazivaju farmaceutskim materijalima ("lekovima"; "drugs"). U vezi sa tim, takve medicinske biljke, prisutne kao farmaceutski materijali, koriste se ili u neizmenjenom obliku ili u isitnjenom obliku.

Stručnjak bi očekivao kao iznenađujuće, kada se radi o osušenom lišću bršljena, kao što se koristi u farmaceutskoj industriji, da konverzija u a-hederin može da se postigne jednostavnim dodavanjem vode.

U slučaju postupka u publikaciji, DE 30 25 223 Al, koja je na početku pomenuta. bilo je potrebno da se dodaju hidroksidi alkalnih metala, radi hidrolize, kako bi se aktivirao hemijski proces.

Osim toga, povoljno je da je lišće bršljena isitnjeno, u stupnju a), do < 5 x 5 mm, naročito do < 2 x 2 mm.

Sitnjenje lišća bršljena do navedenih dimenzija, naročito je povoljno da bi se uticalo na sadržaj a-hederina u ekstraktu koji se proizvodi, na osnovu pronalaska. U vezi sa tim, utvrđeno je, da ekstrakcija i fermentacija sastojaka postaju slabiji, sa porastom veličine komada lišća.

Dalje, u procesu na osnovu pronalaska, prednost ima ekstrakciono sredstvo koje sačinjava smeša, delova alkohola i vode.

Naročito je povoljno daje upotrebljen neki C2-Cio-alkohol, a naročito etanol.

Etanol je priznati farmaceutski rastvarač i koristi se na različite načine, kao ekstrakciono sredstvo u oblasti farmaceutske tehnologije. Međutim, razume se da je takođe moguće da se koriste i drugi alkoholi, na primer, propanol, izopropanol. itd., tj. bilo koji alkoholi koji mogu da se upotrebe u smešama voda/alkohol, za ekstrakciju koja se odnosi na pripremanje leka.

Pored toga, prednost je da su frakcije voda/alkohol, u ekstrakcionom sredstvu, u odnosu (m/m), od 10/90 do 90/10, a naročito, u odnosu voda/ alkohol od 70/30.

Na osnovu ovog pronalaska pogodni su mnogobrojni odnosi alkohol/voda, za uspešno izvođenje procesa prema pronalasku. U vezi sa tim, utvrđeno je daje posebno pogodna upotreba ekstrakcionog sredstva u kojem alkoholni udeo iznosi 30%.

Pored toga, prednost je daje odnos lišća bršljena, prema ekstrakcionom sredstvu, od 1:1 do 1:50, a naročito 1:12.

U vezi sa procesom, na osnovu pronalaska, izbor posebnih kvantitativnih odnosa, lišća bršljena koje se obrađuje, i ekstrakcionog sredstva, može da utiče na sadržaj a-hederina u ekstraktu. Prilikom određivanja kvantitativnog odnosa mora se, s druge strane, voditi računa o činjenici, da hederakozid C, u datom slučaju, bude potpuno konvertovan. S druge strane, količina ekstrakcionog sredstva koja se koristi treba da odgovara procesu, tako da se obezbedi uspešna ekstrakcija, sa količinom upotrebljenog ekstrakcionog sredstva, koja je na optimalno niskom nivou. Stručnjaku će biti jasno daje za to moguće upotrebiti mnogobrojne kvantitativne odnose, u procesu na osnovu pronalaska.

Prema jednom od rešenja, za proces na osnovu pronalaska, prednost ima dodavanje, u stupnju b), vodene frakcije, ekstrakcionog sredstva, a naročito, na početku, dodavanja samo polovine vodene frakcije, ekstrakcionog sredstva.

Prema tom rešenju, alkoholna frakcija ekstrakcionog sredstva i, u datom slučaju, drugog ekstrakcionog sredstva, dodaju se samo posle fermentacije. Sa tačke gledišta procesnog inženjerstva, povoljnije je dodavanje alkoholnih frakcija ekstrakcionog sredstva, posle fermentacije sa vodenim frakcijama, tako da, količina ekstrakcionog sredstva koja se koristi za različite šarže, može u svakom slučaju da ranije bude lako i precizno izračunata, i upotrebljena. Pojedinačne zapreminske frakcije vode i alkohola, mogu onda, u svakom slučaju, da se dodaju odvojeno, jedna od druge, ili dopunjavajući jedna drugu, u stupnjevma b) i c).

U vezi sa tim, naročito je povoljno da se, za fermentaciju, dodaje frakcija vode koja odgovara polovini količine ekstrakcionog sredstva, čime se proces čini još uspešnijim. Ipak, nije isključena mogućnost da se takođe mogu dodavati i druge količine vode, sa ciljem da se potpomogne fermentacija, ili suprotno, da se utiče na proces konverzije hederakozida C u a-hederin.

Pored toga, povoljno je da se stupanj b) izvede u periodu od 1 min do 120 min, prvenstveno u periodu od 60 min.

Promenom vremena fermentacije, moguće je na drugi način regulisati sadržaj a-hede-ina u ekstraktu, u vezi sa procesom na osnovu pronalaska.

U vezi sa tim, prednost ima naročito fermentacija koja se izvodi na temperaturi između 10 i 40 °C, naročito na 30 °C.

Prema jednom drugom rešenju procesa, na osnovu pronalaska, prednost ima ekstrakcija, u stupnju c), koja se izvodi uz predbubrenje i izluživanje (perkolaciju).

Oba postupka su konvencionalne metode, na osnovu stanja tehnike, a naročito u oblasti farmaceutskih preparata na bazi biljaka. Stupnjevi, predbubrenja i izluživanja mogu da se primene radi postizanja iscrpne ekstrakcije iz lišća bršljena. Prema tome, posle fermentacije sa vodenim frakcijama, u smešu se dodaju odgovarajuće alkoholne frakcije, posle čega se vrši predbubrenje. Preostali deo ekstrakcionog sredstva, čije su pojedinačne frakcije prethodno bile upotrebljene pri fermentciji i u drugim ekstrakcionim stupnjevi-ma, povoljno je da se dodadu za izluživanje (perkolaciju).

U vezi sa tim, predbubrenje se prvenstveno izvodi u periodu od 1 h do 30 h, a naročito u periodu od 6 h.

U razvoju procesa, na osnovu pronalaska, u stupnju d) se sušenje izvodi prvenstveno otparavanjem tankog filma pa zatim sprej-sušenjem.

Oba postupka su konvencionalni postupci sušenja, ali je utvrđeno da je otparavanje tankog filma blag način otparavanja, kada se radi o pripremanju farmaceutskih preparata, skoro isto kao što sprej-sušenje, kako je pokazalo iskustvo, može da se upotrebi za sušenje tečnih preparata, radi stvaranja finalnih proizvoda u prahu, za koje je naročito karakteristična činjenica, da oni, na primer, lako mogu da se opet mešaju sa vodom dajući preparate gotove za upotrebu.

Takođe, prednost je data primeni procesa, na osnovu pronalaska, kojim se reguliše sadržaj a-hederina i hederakozida u ekstraktu bršljenovog lista.

Pored toga, moguće je da se primeni postupak, na osnovu pronalaska za selektivno regulisanje sadržaja a-hederina u ekstraktu. U vezi sa tim, postupak, na osnovu pronalaska može da se primeni, ili za potpunu konverziju hederakozida u a-hederin, u ekstraktu bršljenovog lista, ili još, samo za delimično prevođenje hederakozida u a-hederin.

Prema tome, moguće je, na primer, da se na početku samo neki određeni deo farmaceutskog biljnog materijala ("leka") podvrgne fermentaciji sa vodom, pa da se zatim doda preostali deo biljnog materijala za ekstrakciju, pošto se fermentacija završi. Na taj način je moguće selektivno pripremiti suve ekstarkte, u kojima nije sav hederakozid C preveden u a-hederin.

Šta više, na taj način je moguće, na specifičan nači, regulisati sadržaj a-hederina u ekstraktu. To je poželjno, na primer, kada udeo a-hederina u ekstraktu ne treba da bude suviše veliki, ali pre, kada određeni deo hederakozida C treba još da bude prisutan.

Pored toga, pronalazak se odnosi na ekstrakt iz lišća bršljena, koji je pripremljen primenom procesa na osnovu ovog pronalaska.

Prednost imaju ekstrakti sa velikim sadržajem a-hederina, na primer, u vezi sa lečenjem oboljenja respiratornog trakta, pošto, kada je a-hederin prisutan u veoma koncentrovanom obliku, on je najaktivniji sastojak iz lišća koji je prisutan u veoma koncentrovanom obliku.

Osim toga, pronalazak se odnosi na upotrebu ekstrakta, naročito suvog ekstrakta, koji je pripremljen prema pronalasku, za proizvođenje leka, a naročito, za proizvođenje leka za lečenje oboljenja respiratornog trakta.

Pronalazak se takođe odnosi na lek koji sadrži ekstrakt koji je pripremljen primenom postupka na osnovu pronalaska.

U vezi sa tim, farmaceutski preparat može da bude u obliku, kapsula, tableta, tableta obloženih šećerom, supozitorija, granula, prahova, rastvora, kremova, emulzija, aerosolova, masti i ulja. U vezi sa tim, naročitu prednost imaju oblici za oralnu primenu. U vezi sa tim, farmaceutski preparat može da sadrži pomoćne supstance, koje se uobi-čajeno koriste u proizvodnji lekova. Izvestan broj pogodnih supstanci može da se nađe, na primer, u knjizi, A. Kibbe, Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3<će>izdanje, 2000, American Pharmaceutaical Association and Pharmaceutical Press.

Dalje prednosti daju opis i priložene slike, na kojima:

Fig. la prikazuje hromatogram uzorka koji nije bio podvrgnut fermentaciji, a Fig. lb prikazuje hromatogram uzorka koji je bio podvrgnut fermentaciji.

Razume se, da sastojci koji su prethodno navedeni, i oni koje će u daljem biti još objašnjeni, mogu da se uzmu ne samo u kombinaciji koja je u svakom od slučaja specificirana, već takođe i u drugim kombinacijama, ili kao takvi, a da se ne odstupi od suštine ovog pronalaska.

Primer

Ekstrakcioni postupak koji je prethodno prikazan u stanju tehnike, sastoji se od višeste-penog ekstrakcionog postupka, prema kojem se u osušeni farmaceutski materijal ("lek"), posle sitnjenja sečenjem, dodaje 30% etanol (m/m). U tom slučaju, odnos hederakozid C/a-hederin u suvom ekstraktu približno odgovara onom u farmaceutskom materijalu. Analize ekstrakata koji su proizvedeni prošlih godina pokazuju daje sadržaj hederakozida C, približno od 5 do 20%, u celokupnom ekstarktu, dok a-hederina iznosi od oko 1 do 5%, u celokupnom ekstraktu. Na osnovu postupaka poznatih na osnovu stanja tehnike, potrebno bi, dakle, bilo da se nađe postupak prema kojem u ekstrakcioni postupak može da se uključi konverzija hederakosina C u a-hederin. Sa tim ciljem na umu, pre svega su prvo izvedeni preliminarni eksperimenti: 1. Ekstenzivno i intentivno sitnjenje svežih, još neosušenih listova, uz kasnije sušenje farmaceutskor materijala

Da bi se ispitao uticaj, prerade na farmaceutski materijal, posle branja, a zatim i na ekstrakt, sveže bršljenovo lišće je pažljivo ručno obrano. Svo lišće je sakupljeno u isto vreme i sa istog mesta, pa je posle branja podvrgnuto metodološki različitim procesima. Uzorci su zatim analizirani na sledeći način: jedan uzorak, čija količina odgovara količini od oko 200 mg osušenog farmaceutskog materijala, sprašen je u mlinu, pa je 1 h mućkan zajedno sa 30 ml 45%) (v/v) etanola. Posle prenošenja smeše, u hromatografsku kolonu, ona je ispirana (perkolacija) sa svežim 45% (v/v) etanolom, sve do zapremine od 100 ml. Da bi se dobili različiti uzorci, vršene su promene u vremenu sitnjenja i sušenja: Uzorak 1: Sveži listovi su sečeni na komade veličine 3x3 mm pa su sušeni samo

posle perioda od 12 sati.

Uzorak 2: Sveži listovi su sečeni na komade veličine 3x3 mm pa su odmah sušeni.

Uzorak 3: Neisečeni listovi su, posle branja, osušeni na 50 °C pa su samo sitnjeni na komade veličine približno 3x3 mm, neposredno pre ekstrakcionog procesa..

U sledećoj tabeli prikazana su hromatografska ispitivanja, u pogledu sadržaja a-hederina i hederakozida C:

Rezultati su međusobno uporedivi i znatno se ne razlikuju jedan od drugoga, i pored toga što izgleda da postoji blago pomeranje odnosa hederakozid C/a-hederin, na stranu a-hederina, u slučaju kada je lišće sečeno u svežem stanju.

U daljim ispitivanjima, promene su vršene u pogledu veličine do koje su listovi bršljena sitnjeni i vremena kada je sadržaj određivan: Uzorak 1: Sveži listovi su fino izdrobljeni i odmah ekstarhovani sa 45%

(v/v) etanolom.

Uzorak 2: Sveži listovi su fino izdrobljeni, pa ekstarhovani sa 45% (v/v)

etanolom posle 45 min.

Uzorak 3: Nesečeni listovi su, posle branja, osušeni na 50 °C, pa su sitnjeni

neposredno pre ekstrakcionog procesa.

Rezultati hromatografskih ispitivanja, koji se odnose na sadržaj a-hederina i hederakozida C, prikazani su u sledećoj tabeli 2:

Iz tabele se može videti da se intenzivnim sitnjenjem skoro sav hederakozid C prevodi u a-hederin.

2. Fermentacija, osušenog i isitnjenog farmaceutskog materijala (" leka"). pre ekstrakcije

U cilju da se razori celovitost ćelija, proces konverzije hederakozida C u a-hederin, stimulisana je podrobnim sitnjenjem i dodavanjem vode. To je provereno sledećim eksperimentom: Celo, suvo bršljenovo lišće, koje je prethodno sadržavalo 7.94% hederakozida C i 0. 59% a-hederina, obrađeno je na sledeći način: Uzorak 1: Na 200 mg podrobno isitnjenog lišća dodato je 20 ml vode. Pošto je voda otparena u vakuumu, smeša je kao obično, ekstrahovana sa 45% (v/v) etanolom.

Uzorak 2: Farmaceutski materijal je tretiran kao uzorak 1, ali je umesto vode

upotrebljen 30% (m/m) etanol.

Hromatografski rezultati koji se odnose na sadržaj a-hederina i hederakozida C prikazani su u sledećoj tabeli 3:

Kao što iz podataka može da se vidi, hederakozid C je potpuno konvertovan u a-hederin, dodavanjem vode u isitnjeni farmaceutski materijal.

Fig. 1 prikazuje hromatograme uzorka 1 (fig. lb) i uzorka 2 (fig.la) koji su dobijeni pomoću HPLC. Na slikama, pik koji je dobijen za supstancu hederakozid C, obležen je kao "HC", dok je pik dobijen za a-hederin, u svakom od slučajeva obeležen kao "a-H". Kao što može da se vidi, upoređivanjem pikova na fig. la i lb, sadržaj hederakozida C je skoro potpuno smanjen, na račun a-hederina, što pokazuje daje sav hederakozid C bio konvertovan.

Iako je fermentacija u 30% (m/m) etanolu takođe dovela do smanjenja hederakozida C, obim tog smanjenja je izrazito manji.

U drugim ispitivanjima, pokazano je da su za obim (veličinu) konverzije, od presudnog značaja, stepen sitnjenja farmaceutskog materijala i količina upotrebljene vode: iako ekstrakcioni eksperimenti, pri radu sa fragmentima lista približne veličine 5x5 mm, koji su, kao što je opisano, fermentisani u vodi, pokazuju obogaćenje a-hederinom, na račun hederakozida C, konverzija je bila nepotpuna pošto su mnoge ćelije bile neoštećene. Eksperiment, samo sa blagim sprejovanjem (prskanjem) sa vodom, fino isitnjenog lišća, takođe je doveo do nepotpune konverzije hederakozida C.

Sledeće varijante ekstrakcionog postupka izvedene su radi obrazovanja uspešnog ekstrakcionog protokola, na osnovu gorepomenutih, prethodno dobij enih nalaza, koji se odnose na konverziju hederakozida C u a-hederin: Ekstrakt 1: 3.0 g isitnjenih listova bršljena (5x5 mm) ekstrahovano je sa 12-strukom količinom 30% (m/m) etanola (normalna ekstrakcija).

Ekstrakt 2: 3.0 g istitnjenih listova bršljena (5x5 mm) prekriveno je vodom,

u hromatografskoj koloni. Posle 1 h, voda je odlivena preko slavine za izlivanje, pa je zatim lišće ekstrahovano sa 12-strukom količinom 30% (m/m) etanola.

Ekstrakt 3: U 3.0 g isitnjenih listova bršljena (5x5 mm) dodata je voda iz 12

delova ekstrakcionog sredstva (30% (m/m) etanol). Posle fermentacije od 1 h, dodata je etanolska frakcija od 12 delova ekstrakcionog sredstva, radi ekstrahovanja lišća.

Hromatografske analize su dale rezultate prikazane u sledećoj tabeli 4:

Pošto je u ovim ekstrakcijama farmaceutski materijal bio isitnjen samo na 5 x 5 mm, konverzija nije bila potpuna. Na osnovu tabele, može biti jasno da je otakanje fermentacione vode (ekstrakt 2) dovelo do gubitka sastojaka.

Kombinovanje prethodno opisanih preliminarnih eksperimenata omogućilo je razvoj jednog drugog eksrakcionog procesa, koji može da se upotrebi za regulisanje sadržaja a-hederina i ekstraktu suvog bršljenovog lista.

3. Ekstrakcioni proces za pripremanje ekstrakata, iz suvog bršljenovog lista, čiji sadržaj a- hederina može da se reguliše

Posle korišćenja kvalitetne procene, radi ispitivanja kvaliteta ekstrakta, deo farmaceutskog materijala (DAC lišće bršljena) je dobro isitnjeno u mlinu, sa zaštitnim sitom koje obezbeđuje da je veličina fragmenata najviše 2x2 mm. Osim toga, prosejani materijal je ispitivan i optički, radi uklanjanja većih komada i nečistoća.

U isitnjeni uzorak dodata je vodena frakcija od 6 delova ekstrakcionog sredstva (30% (m/m) etanol). Ova smeša je fermentirana 60 min, na 30 °C, uz povremeno mešanje, radi homogenizovanja smeše.

Zatim je dodata 96% etanolska frakcija od 6 delova ekstrakcionog sredstva, pa je smeša homogenozovana mešanjem.

Posle 6-časovne faze predbubrenja, eluat je odvojen, a farmaceutski materijal ("lek"), koji je posle toga ostao, izlužen je sa preostalih 6 delova ekstrakcionog sredstva.

Sjedinjeni eluati su profiltrirani još jedanput, kako bi se uklonile sitne čestice farmaceutskog materijala, pa su homogenizovani, pre nego što su osušeni do konzistencije guste paste, postupkom otparavanja tankog filma, na 55 °C i 150 mbara. Ova pasta je homogenizovana, pa osušena sprej-sušenjem, na od 45 do 60 °C, dajući osušeni ekstrakt bršljenovog lista.

Da bi se ispitao ovaj proizvodni proces, pripremljeni su sledeći ekstrakti: obradom listova bršljena, koji su sadržavali 3.91% hederakozida C i 0.20% a-hederina, pripremljen je ekstrakt, s jedne strane, prema konvencionalnom postupku (sitnjenjem osušenog uzorka, zatim direktnim dodavanjem 30% (m/m) etanola, pa ekstrakcijom), a s druge strane, prema novom postupku. Hromatografski rezultati koji se odnose na sadržaj a-hederina i hederakozida, prikazani su sledećoj tabeli 5:

Kao što se iz tabele može videti, novi ekstrakcioni postupak omogućava potpunu konverziju hederakozida C, koji je prisutan u lišću, u a-hederin.

Pošto ukupan sadržaj saponina, obračunat kao hederakozid C, jeste takođe istog reda veličine, moguće je, poznavanjem odgovarajuće koncentracije saponina u farmaceutskom materijalu ("leku"), a vodeći računa o faktoru obogaćivanja, od približno 2 do 3, proceniti finalni sadržaj a-hederina u ekstraktu.

Prema tome, da bi se samo jedan deo hederakozida C, prisutan u farmaceutskom materijalu, preveo u a-hederin, moguće je da se samo određena frakcija farmaceutskog materijala fermentira sa vodom, dok se svi drugi parametri drže konstantnim. Zatim se preostali farmaceutski materijal i etanol izlažu 6-časovnom pred-bubrenju, pa se posle 60-minutne fermentacije dolazi do kraja.

Zbog toga je moguće da se postupak prema pronalasku, upotrebi za znatno menjanje sadržinskog spektra ekstrakta suvog lista bršljena, bez velikog utroška vremena i sredstava, putem uvođenja fermentacije. U svakom slučaju, kao što je potvrđeno velikim brojem publikacija o aktivnosti a-hederina, selektivno menjanje sadržaja a-hederina u suvom ekstraktu, ili leku (medikamentu), ima pozitivan efekat na aktivnost ekstrakta.

Claims (26)

1. Postupak za proizvodnju ekstrakta iz listova bršljena, upotrebom ekstrakcionog sredstva, sa ekstraktom koji sadrži a-hederin, naznačen time, što ga sačinjavaju sledeći stupnjevi; a) sitnjenje određene količine osušenih listova bršljena, b) fermentacija u dodatoj vodi, pri čemu hederakozid C biva preveden u a-hederin, c) ekstrahovanje, dodavanjem ekstrakcionog sredstva, i d) u datom slučaju, sušenje ekstrakta.

2. Postupak, prema zahtevu 1, naznačen time, što se listovi bršljena sitne, u stupnju a), do < 5 x 5 mm.

3. Postupak, prema zahtevu 2, naznačen time, što se listovi bršljena sitne, do < 2 x 2 mm.

4. Postupak, prema nekom od zahteva 1 do 3, naznačen time, što se kao ekstrakciono sredstvo koristi smeša, koju čine alkoholne i vodene frakcije.

5. Postupak, prema nekom od zahteva 1 do 4, naznačen time, što upotrebljeni alkohol u ekstrakcionom sredstvu jeste C2-Cio-alkohol.

6. Postupak, prema zahtevu 5, naznačen time, što upotrebljeni alkohol jeste 96% etanol.

7. Postupak, prema nekom od zahteva 1 do 6, naznačen time, što su frakcije voda/alkohol, u ekstrakcionom sredstvu, u odnosu (m/m) od 10/90 do 90/10.

8. Postupak, prema zahtevu 7, naznačen time, što odnos voda/alkohol iznosi 70/30.

9. Postupak, prema nekom od zahteva 1 do 8, naznačen time, što odnos listova bršljena prema, ekstrakcionom sredstvu, jeste od 1:1 do 1:50.

10. Postupak, prema zahtevu 9, naznačen time, što odnos listova bršljena prema, ekstrakcionom sredstvu, jeste 1:12.

11. Postupak, prema nekom od zahteva 1 do 9, naznačen time, što je vodena frakcija ekstrakcionog sredstva upotrebljena u stupnju b).

12. Postupak, prema zahtevu 11, naznačen time, što je vodena frakcija, polovine ukupne količine ekstrakcionog sredstva, dodata u stupnju b).

13. Postupak, prema nekom od zahteva 10 do 12, naznačen time, što je dodata vodena frakcija od 6 delova ekstrakcionog sredstva.

14. Postupak, prema nekom od zahteva 1 do 13, naznačen time, što se stupanj b) izvodi u periodu od 1 min do 120 min.

15. Postupak, prema zahtevu 14, naznačen time, što se stupanj b) izvodi u periodu od 60 min.

16. Postupak, prema nekom od zahteva 1 do 15, naznačen time, što se stupanj b) izvodi na temperaturi od 10 do 40 °C.

17. Postupak, prema zahtevu 16, naznačen time, što se stupanj b) izvodi na temperaturi od 30 °C.

18. Postupak, prema nekom od zahteva 1 do 17, naznačen time, što se ekstrakcioni stupanj c) izvodi putem predbubrenja i izluživanja (perkolacije).

19. Postupak, prema zahtevu 18, naznačen time, što se predbubrenje izvodi u periodu od 1 h do 30 h.

20. Postupak, prema zahtevu 19, naznačen time, što se predbubrenje izvodi u periodu od 6 h.

21. Postupak, prema nekom od zahteva 1 do 20, naznačen time, što se sušenje u stupnju d) izvodi putem otparavanja tankog sloja, pa zatim sprej-sušenjem.

22. Postupak, prema nekom od zahteva 1 do 21, za regulisanje sadržaja a-hederina i hederakozida u ekstraktu bršljenovog lista.

23. Ekstrakt iz listova bršljena, naznačen time, što se priprema primenom postupka, prema nekom od zahteva 1 do 22.

24. Upotreba ekstrakta, prema zahtevu 23, za proizvodnju leka (medikamenta).

25. Upotreba, prema zahtevu 24, naznačena time, što se lek koristi za tretiranje oboljenja respiratornog trakta.

26. Lek, koji sadrži ekstrakt, prema zahtevu 25.