RS20060176A - Ciljanje vaskulature tumora upotrebom radiooznačenog antitela l19 spram fibronektin ed-b - Google Patents

Abstract

Specifični vezujući član koji vezuje humani ED-B, pri čemu je specifični vezujući član označen izotopom odabrano od grupe koja se sastoji od 76Br, 77Br, 123J, 124J, 131J i 211At i sadrži antigen-vezujući položaj koji sadrži VH domen anti tela i VL domen anti tela , pri čemu je VH domen antitela odabran od grupe koja se sastoji od L19 VH domena, i VH domen se sastoji od VH CDR1, VH CDR2 i VH CDR3, pri čemu VH CDR3 je L19 VH CDR3 sa SEQ ID NO. 3, VH CDR1 je opciono L19 VH CDR1 sa SEQ ID NO. 1, i VH CDR2 je opciono L19 VH CDR2 sa SEQ ID NO. 2; i pri čemu je VL domen antitela opciono odabran od grupe koja se sastoji od L19' VL domena, i VL domen se sastoji od VL CDR1, VL CDR2 i VL CDR3, pri čemu VL CDR3 je L19 VL CDR3 sa SEQ ID NO. 6, VL CDR1 je opciono L19 VL CDR1 sa SEQ ID NO. 4, i VL COR2 je opciono L19 VL COR2 sa SEQ ID NO. 5; gde su L19 VH domen i L19 VL domen sekvence otkrivene u Pini et al., (1998) J. Biol. Chem. 273: 21769-21776; pri čemu specifični vezujući član sadrži mini imunoglobulin koji sadrži navedeni VH domen anti tela i VL domen anti tela spojen sa εS2-CH4 i dimerizovan ili sadrži celi IgG1 antitelo molekul; takođe postupci i upotrebe upošljavanja takvog specifičnog vezujućeg člana.

Description

CILJANJE VASKULATURE TUMORA UPOTREBOM RADIOOZNAČENOG

ANTITELA LI9 SPRAM FIBRONEKTIN ED-B

Sadašnji pronalazak se odnosi na ciljanje vaskulature tumora upotrebom radioaktivno označenih molekula. Preciznije, pronalazak se odnosi na upotrebu antitelo molekula koji se vezuju za ED-B fibronektina, i koji su od demonstrirane korisnosti u ciljanju tumora. U različitim realizacijama sadašnjeg pronalaska, antitelo molekuli se upošljavaju u različitim molekularnim formatima. U određenim realizacijama antitelo molekuli sadrže humani IgGl. U drugim realizacijama antitelo molekuli su mini-imunoglobulini, kao što su oni koji se generišu spajanjem scFv antitelo molekula za konstantni CH4 domen sekrecione IgE izoforme koja prirodno sadrži cistein i njegov COOH završetak koji formira kovalentno povezani dimer. Brzina čišćenja krvi,in vlvostabilnost i druge korisne osobine se upošljavaju u različitim aspektima i realizacijama pronalaska, n.pr., kod ciljanja tumora. Različitoin vivoponašanje različitih formata antitelo molekula može se iskorištavati u različite dijagnostičke i/ili terapeutske svrhe, u zavisnosti od kliničkih potreba i bolesti.

Uprkos enormnom potencijalu koje imaju kao terepeutska sredstva, monoklonalna antitela (mAbs) ne-humanog porekla su se pokazala slabo u kliničkim probama kao rezultat njihove imunogeničnosti (1 Shawlert et al., 1985; 2 Miller et al., 1983), slabih farmakokinetičkih osobina (3Hakimi et al., 1991; 4 Stephens et al., 1995) i neefikasnosti u regrutovanju funkcija efektora (5 Riechmann et al., 1988; 6 Junghens et al., 1990). Skorašnji pregled izolovanja fragmenata humanog antitela iz biblioteka prikaza fage (7 McCafferty et al., 1990; 8 Lowman et al., 1991; radi pregleda videti 9 Nilsonn et al., 2000 i 10 Winter et al., 1994) prevazilazi ove probleme, revitalizujući studije i raspaljujući ponovo nade u upotrebu ovih reagensa da se leče glavne bolesti. Svakako, ovi molekuli treba da služe kao idealni blokovi za građenje novih dijagnostičkih i terapeutskih alata (11 Reichert, 2001; 12 Huls et al., 1999). Šta više, ova antitela mogu se učiniti 11 zrelim' ' da postignu afinitete u pikomolarnom rasponu (13 Pini et al., 1998), bar poželjne, ukoliko ne i neophodne, za njihovu kliničku upotrebu.

Klinička primenjivanja fragmenata humanog antitela za selekivnu isporuku dijagnostičkih i terapeutskih sredstava ipak zahtevaju krajnje specifične mete. U slučaju tumora, najpopularnije mete su antigeni ćelijske površine, koji uobičajeno nisu ni preobilni ni stabilni. Uprkos tome, tokom progresije tumora, mikro okruženje koje se nalazi oko ćelija tumora prolazi kroz ekstenzivno modifikovanje koje generiše ''tumorno okruženje<1>' koje predstavlja metu za antitelo-baziranu tumornu terapiju (14 Neri and Zardi, 1998). Tačnije, koncept da je izmenjeno tumorno okruženje samo po sebi karcinogen koji se može ciljati je sve više konsenzus do koga se dolazi. Molekuli koji su sposobni da efektivno isporuče terepeutska sredstva tumornom mikro okruženju tako predstavljaju obećavajuće i važne nove alate za kancernu terapiju (15 Bissel, 2001; 14 Neri and Zardi, 1998).

Fibronektin je komponenta ekstracelularne matrice (ECM) koja se široko ekspresuje u različitim normalnim tkivima i telesnim fluidima. Različite FN izoforme mogu se generisati alternativnim uplitanjem FN pre-mRNK, postupkom koji se modulira citokinima i ekstracelularnim pH (16 Balza et al., 1988; 17 Carnemolla et al., 1989; 18 Borsi et al., 1990; 19 Borsi et al., 1995). Kompletno tip III ponavljanje ED-B, takođe poznato kao ekstratip II ponavljanje B (EIIIB), može biti u potpunosti uključeno ili propušteno u FN molekulu (20 Zardi et al., 1987). ED-B je krajnje konzerviran u različitim vrstama, ima 100% homologiju u svim sisarima koji su do sada proučavani (čovek, pacov, miš, pas) i 96% homologiju sa sličnim domenom kod pileta. FN izoforma koja sadrži ED-B (B-FN) se ne može detektovati imunohistohemijski u normalnim tkivima odraslih, sa izuzetkom tkiva koja su prošla fiziološko remodeliranje (na primer, endometrijum i jajnik) i tokom zarastanja rane (17 Carnemolla et al., 1989; 21 ffrench-Constant, et al., 1989). Nasuprot tome, ekspresija u tumorima i fetusnim tkivima je visoka (17 Carnemolla et al., 1989). Šta više, demonstrirano je da je B-FN marker angiogeneze (22 Castellani et al., 1994) i da endotelijalne ćelije koje vrše invaziju tkiva tumora migriraju zajedno sa ECM vlaknima koja sadrže B-FN (23 Tarli et al., 1999).

Selektivno ciljanje tumorne vaskulature je opisano upotrebom humanog rekombinantnog antitela, scFv (L19) (13 Pini et al., 98), specifičnog za B-FN izoformu (24 Carnemolla et al., 1996; 23 Tarli et al., 99; 25 Viti et al., 99; 26 Neri et al., 97; 27 Demartis et al., 2001). Antitelo se može upotrebiti i uin vivodijagnostičkim (imunoscintigrafija) i u terapeutskim pristupima koji povlače za sobom selektivnu isporuku terapeutskih radionuklida ili toksičnih sredstava tumornoj vaskulaturi. Dodatno tome, Birchler et al., (28 1999) pokazuje da scFv (L19), hemijski spareni za fotosenzibilizator, selektivno akumulira u novo formiranim krvnim sudovima modela zečje angiogenske rožnjače i, nakon zračenja sa svetlošću bliskoj infracrvenom pojasu, posreduje kompletnu i selektivnu okluziju okularne neovaskulature.

U skorije vreme, Nilsson et al. (29 2001) izveštava imunokonjugat scFv(L19) sa ekstracelularnim domenom faktora tkiva posreduje selekivno infarkt u različitim tipovima modela mišjeg tumora. Šta više, fuzioni proteini scFv (L19) i IL-2 ili IL-12 pokazuju pojačanui terapeutsku efikasnost ova dva citokina (30 Halin et al., podneseno; 31 Carnemolla et al., 2002). Videti takođe WO01/62298 za upotrebu spajanja u lečenju organa sa patološkom angiogenezom, uključujući tumore. Konačno, kako L19 reaguje jednako dobro kod mišjeg i humanog ED-B, može se upotrebiti i za pre-klinička i klinička proučavanja.

Videti takođe PCT/GB97/01412, PCT/EP99/03210, PCT/EP01/02062 i PCT/IB01/00382.

Različiti formati antitela pokazuju različito ponašanje u pogleduin vivostabilnosti, prohodnosti i ponašanju u ciljanju tumora (32 Wu et al., 2000). Mini-imunoglobulin ili mali imunoprotein (SIP) je opisan u (33 Li et al., 1997) .

Sadašnji pronalazak se zasniva na pripremanju, karakterizaciji i istraživanjuin vivobiodistribucije L19 humanih antitelo molekula u različitim formatima, scFv, mini-imunoglobulin i kompletni IgGl, i označavanju sa radioizotopima.

Kratak opis slika

Slika 1 prikazuje modele ilustrujući strukture različitih proteina. A: Model strukture domena FN podjedinice. Sekvence proteina koje prolaze alternativno spletanje su naznačene sivim. Kao što je naznačeno, epitop rekombinantnog antitela L19 je lokalkizovan u okviru ponavljanja ED-B.

B-D: Šeme konstrukata koji se upotrebljavaju da se ekspresuje, svaki posebno, Li 9 (scFv) (b) ; LT9-SIP (C); i Ll9-IgGl/K.

Slika 2 prikazuje rast krivih SK-MEL-28 tumora kod nude miševa (trouglovi) i F9 tumora u 129 mišjem soju (kružići). Zapremina (mm<3>) je ukrštena spram vremena (dani). Svaka tačka podataka je prošek šest miševa ± SD.

Slika 3 prikazuje rezultate hromatografije isključivanja veličine na različitim L19 formatima. Na panelima A, B i C su prikazani profili hromatografije isključivanja veličine (Superdex 200) L19 formata scFv, mini-imunoglobulina i IgGl, svakog posebno. Nisu detektivane promene u krivi profila L19-SIP ili Ll9-IgGl kada se napuni plazma pri različitim vremenskim intervalima nakon ubrizgavanja, dok se 3h nakon L19 (scFv) ubrizgavanja primećuje drugi porast više molekularne mase.

Slika 4 prikazuje rezultate eksperimenata biodistribucije u SK-MEL-28 miševima koji nose tumor upotrebom različitih radiojodovanih formata L19 antitelo molekula. Beleže se varijacije %ID/g u tumoru (Slika 4A) i krvi (Slika 4B) u naznačenim vremenskim intervalima nakon i.v. ubrizgavanja. Na Slici 4C tumor-krv odnosi %ID/g su ukršteni. Krive LIO (scFv) su naznačene rombovima, L19 mini-imunoglobulin kvadratićima i L19 IgGl trouglovima.

Slika 5 prikazuje rezultate eksperimenata biodistribucije u F19 miševima koji nose tumor upotrebom radiojodovanog LI9

(scFv) (kvadratići)i L19 mini-imunoglobulina (rombovi). Beleže se varijacije %ID/g u tumoru (A) i krvi (B), u naznačenim različitim vremenskim intervalima nakon i.v. ubrizgavanj a.

Slika 6 prikazuje promenu u U251 oblasti tumora (kvadratni milimetri) tokom vremena (dani) nakon ubrizgavanja fiziološkog slanog rastvora i I-131-L19-SIP svakog posebno.

OPIS PRONALASKA

Sadašnji pronalazak se odnosi na specifično vezivanje članova koji vezuju humani ED-B fibronektina, pri čemu su specifični vezujući- članovi radiooznačeni sa jednim ili više izotopa odabranih od grupe koja se sastoji od<76>Br,<77>Br,123J,1<31>J i<2U>At. Pronalazak takođe obezbeđuje postupke proizvodnje takvih specifičnih vezujućih članova, i njihovu upotrebu u dijagnostičkim i terepeutskim primenama.

Specifični vezujući članovi pronalaska pokazuju povoljne osobine u životinjskim eksperimentima, kao što su isporuka većih doza tumoru upoređeno sa crvenom moždinom, i veća akumulacija tumora.

U jednom aspektu, sadašnji pronalazak obezbeđuje specifični vezujući član koji se vezuj saz humani ED-B fibronektina i koji sadrži L19 VH domen i VL domen, opciono L19 VL domen, pri čemu se specifični vezujući član sastoji od mini-imunoglobulina koji sadrži navedeni antitelo VH domen i antitelo VL domen spojen za<g>s^-CH4 i dimerizovan ili sadrži celi IgGl antitelo molekul, i pri čemu je specifični vezujući član radiooznačen sa izotopom odabranim od grupe koja se sastoji od76Br,<77>Br,<123>J, 131J i211At. Pretpostavljeno, radioizotop je 1" ° 3 J ili ■<1>31J,anajpoželjnije<131>J.

Radiooznaka ili radiooznačeni molekul može se zakačiti za specifični vezujući član i može biti označen na n.pr., tirozin, lizin ili cistein ostatku.

L19 VH domen i L19 VL domen sekvence su određene u Pini et al. (1998)J. Biol. Chem.273: 21769-21776, sekvence koje su ovde u potpunosti inkorporisane putem reference prema Pini et al., kao što je ovde to postavljeno.

Generalno, VH domen se sparuje sa VL domenom da se obezbedi antitelo antigen položaj vezivanja. U pretpostavljenoj realizaciji, L19 VH domen je sparen sa LIO VL domenom, tako da se antitelo antigen položaj vezivanja formira sadržeći i L19 VH i VL domene. U drugim realizacijama, L19 VH je sparen sa bilo kojim VL domenom osim L19 VL. Promiskuitet lakog-lanca je vrlo dobro utvrđen u nauci.

Jedan ili više CDR-ova može biti izet od L19 VH ili VL domena i inkorporisan u odgovarajućem okviru rada. Ovo se dalje razmatra u donjem tekstu. L19 VH CDR-ovi 1, 2 i 3 su prikazani u SEQ ID No.-ima 1, 2, i 3, svakoj posebno.

U pretpostavljenoj realizaciji, specifični vezujući član je L19-SIP, naj<p>oželjnije<123>J-označeni L19-SIP (ovde se na njega poziva kao na J-123-L19-SIP) ili ljl J-označeni L19-SIP(ovde se na njega poziva kao na J-131-119-SIP).

Varijante VH i VL domena i CDR-ova od kojih su ovde postavljene sekvence i koje mogu biti uposlene u specifičnim vezujućim članovima za ED-B mogu biti dobijene sredstvima postupka izmene, mutacije ili pretraživanja sekvence.

Varijabilni domen varijanti sekvence amino kiseline bilo kog od VH i VL domena čije su sekvence ovde specifično otkrivene može biti uposlen u skladu sa sadašnjim pronalaskom, kao što se to razmatra. Određene varijante mogu da uključe jednu ili više izmena sekvence amino kiseline (dodavanje, uklanjanje, supstitucija i/ili umetanje ostatka amino kiseline), mogu biti manje od oko 20 izmena, manje od oko 15 izmena, manje od oko 10 izmena ili manje od oko 5 izmena, 4, 3, 2, ili 1. Izmene mogu biti učinjene u jednom ili više regiona okvira za rad i/ili jednom ili više CDR-ova.

Specifični vezujući član prema pronalasku može biti onaj koji se takmiči za vezivanje za antigen sa specifičnim vezujućim članom koji se i vezuje za ED-B i sadrži8 antigen-vezujući položaj formiran od L19 VH domena i L19 VL domena. Takmičenje između vezujućih članova može lako utvrditi u ogledu in vitro, na primer upotrebom ELISA i/ili označavanjem specifičnih reporter molekula za jedan vezujući član koji se može detektovati u prisustvu drugog(ih) neobeleženog(ih) vezujućeg(ih) člana(ova), da se omogući identifikacija specifičnih vezujućih članova koji vezuju isti epitop ili epitop koji se poklapa.

Tako, dalji aspekti sadašnjeg pronalaska upošljavaju specifični vezujući član koji sadrži humani antitelo antigen-vezujući položaj koji se takmiči sa L19 za vezivanje ED-B.

Specifični vezujući član prema sadašnjem pronalasku može vezati ED-B sa bar afinitetom jednakim sa L19, afinitetom vezivanja različitih specifičnih vezujućih članova koji se upoređuju pod odgovarajućim uslovima.

Dodatno antitelo sekvencama, specifični vezujući član prema sadašnjem pronalasku može sadržati druge amino kiseline, n.pr., formirajući peptid ili polipeptid, kao što je umotani domen, ili da pruži molekul druge funkcionalne karakteristike dodatno sposobnosti da vezuje antigen. Specifični vezujući članovi pronalaska mogu nositi oznaku koja se može detektovati, ili mogu biti konjugovani za toksin ili enzim (n.pr., putem peptidil veze ili linkera).

U lečenju poremećaja ili organa patološke antiogeneze, specifični vezujući član pronalaska može biti konjugovan za toksični molekul, na primer biocidni ili citotoksični molekul koji može biti odabran od interleukina-2 (IL-2), doksorubicina, interleukina-12 (IL-12), interferona-y (IFN-y), tumor nekroza faktora a (TNFa) i tkivo faktora

(pretpostavljeno skraćenih tkivo faktora, n.pr., ostataka 1-219). Videti n.pr., WO01/62298.

Specifični vezujući članovi prema pronalasku mogu biti upotrebljeni u postupku lečenja ili dijagnoze humanog ili životinjskog tela, kao što je postupak lečenja (koji može uključiti profilaktičko lečenje) bolesti ili poremećaja kod humanog pacijenta koji se sastoji od davanja navedenom pacijentu parenteralnim davanjem. Stanja koja se mogu lečiti u skladu sa sadašnjim pronalaskom uključuju tumore, posebno čvrste tumore, i druge organe sa patološkom angiogenezom, uključujući, reumatoidni artritis, dijabetičku retinopatiju, sa starošću povezanu makularnu degeneraciju, i angiome.

Specifični vezujući članovi su vrlo odgovarajući za radiooznačavanje sa izotopima odabranim od grupe koja se sastoji od<76>Br,<77>Br,123J,<124>J,131Ji211At i potonju upotrebu u radiodijagnozi i radioterapiji.

Još jedan aspekt obezbeđuje postupak proizvodnje specifičnog vezujućeg člana pronalaska, koji se sastoji od označavanja specifičnog vezujućeg člana sa radioizotopom odabranim od grupe koja se sastoji od<76>Br,<77>Br,<123>J,<124>J,131Ji211At.

Da bi se direktno radioznačio specifični vezujući član, mogu se ciljati tirozin ostatci u molekulu. U ovoj određenoj proceduri, halogenid, n.pr., Br~, J~, At" oksidira sa odgovarajućim oksidantom, n.pr., iodogen® (obložene cevčice), jodo-zrna, hloramin-T (natrijum so N-hloro-p-toluensulfonamida) itd., u prisustvu aktivnog farmaceutskog sastoj ka (API).

Indirektno označavanje sa n.pr., bromom, jodom ili astatinom može biti obavljeno prethodnim označavanjem bi-funkcionalnog halogen nosača, pretpostavljeno izvedenom iz n.pr., derivata benzojeve kiseline, Bolton-Hunter derivata, benzen derivata itd. Nosač može biti transformisan u aktivirane vrste da se konjuguje za s-amino grupu Lizin ostataka ili N-završetka API. Ovaj indirektni postupak takođe obezbeđuje sintetički put za radiooznačavanje peptid jedinjenja hemo-selektivno na sulfhidril grupi ili cistein ostatku. Cistein premošćeni molekuli mogu prvo biti redukovani odgovarajućim reduktivnim sredstvom n.pr., stano(II)hloridom, Tris(2-karboksietil)fosfinom (TCEP) generišući slobodne cistein SH-grupe koje mogu da reaguju sa halogen nosačem. Kao funkcionalne grupe za vezivanje mogu biti uposleni maleimid i a-brom acetamid derivati.

Postupak proizvodnje specifičnog vezujućeg člana prema pronalasku može da se sastoji od ekspresije nukleinske kiseline koja kodira specifični vezujući član pre označavanja specifičnog vezujućeg člana. Tako, kao raniji korak, postupak proizvodnje specifičnog vezujućeg člana može da se sastoji od izazivanja i dopuštanja ekspresije iz kodirajuće nukleinske kiseline, odnosno, nukleinske kiseline koja sadrži sekvencu koja kodira specifični vezujući član. Takava postupak može da se sastoji od kultivisanja ćelija domaćina pod uslovima proizvodnje navedenog specifičnog vezujućeg člana.

Postupak proizvodnje se može sastojati od koraka izolovanja i/ili prečišćavanja proizvoda. Specifični vezujući član može biti izolovan i/ili prečišćen nakon ekspresije iz nukleinske kiseline, i/ili vađenja iz ćelija domaćina. /Alternativno ili dodatno, specifični vezujući član može biti izolovan i/ili prečišćen nakon označavanja.

Postupak proizvodnje može se sastojati od formulisanja proizvoda u sastav koji uključuje bar jednu dodatnu komponentu, kao što je farmaceutski prihvatljiv inertni 'punilac. Tako, (označeni) specifični vezujući član može biti formulisan u sastav koji uključuje bar jednu dodatnu komponentu kao što je farmaceutski prihvatljivi inertni punilac.

Ovi i drugi aspekti pronalaska su u donjem tekstu detaljnije opisani.

TERMINOLOGIJA

Specifični vezujući član

Ovo opisuje član sastavljen od para molekula koji imaju specifičnost vezivanja jedan za drugi. Članovi specifičnog vezujućeg para mogu biti prirodno izvedeni ili u potpunosti ili delimično sintetički proizvedeni. Jedan član para molekula ima oblast na svojoj površini, ili šupljinu, koja se specifično vezuje za i zbog toga je komplementarna određenoj prostornoj ili polarnoj organizaciji drugog člana para molekula. Tako članovi para imaju osobinu vezivanja specifično jedan za drugog. Primeri tipova specifičnih vezujućih parova su antigen-antitelo, biotin-avidin, hormon-hormon receptor, receptor-ligand, enzim-supstrat. Ova prijava se tiče antigen-antitelo tipa reakcija.

Antitelo molekul

Ovo opisuje imunoglobulin bilo prirodan ili delimično ili u celosti sintetički proizveden. Pojam takođe pokriva bilo koji polipeptid ili protein koji sadrži antitelo vezujući domen. Fragmenti antitela koji sadrže antigen vezujući domen su oni kao što su Fab, scFv, Fv, dAb, Fd; i diatela. Sadašnji pronalazak se tiče celih IgGl antitelo molekula i mini-imunoglobulina koji sadrže£S2-CH4 kao što je otkriveno.

Tehnike rekombinantne DNK tehnologije mogu biti upotrebljene da se proizvedu od inicijalnog antitelo molekula drugi antitelo molekuli koji zadržavaju specifičnost originalnog antitelo molekula. Takve tehnike mogu uključiti uvođenje regiona koji utvrđuju komplementarnost (CDR-ovi), antitela konstantnim regionima, ili konstantnim regionima plus regioni okvira za rad, različitog imunoglobulina. Videti, na primer, EP-A-184187, GB 2188638A ili EP-A-239400.

Kako antitelo može biti modifikovano brojnim načinima, pojam ''antitelo molekul'' treba da se shvati kao da pokriva bilo koji specifični vezujući član ili supstancu koja ima antitelo antigen-vezujući domen za traženom specifičnošću. Tako, ovaj pojam pokriva fragmente i derivate antitela, uključujući bilo koji polipeptdd koji sadrži imunoglobulin antigen-vezujući domen, bilo prirodni ili u celosti ili delimično sintetički. Prema tome uključeni su himerični molekuli koji sadrži imunoglobulin vezujući domen, ili ekvivalent, spojeni za drugi polipeptid. Kloniranje i ekspresija himeričnih antitela su opisani u EP-A-0120694 i EP-A-0125023.

Antigen vezujući domen

Ovo opisuje deo antitelo molekula koji sadrži oblast koja se specifično vezuje za i komplementarna je delu ili ćelom antigenu. Gde je antigen veliki, antitelo se može samo vezati za određeni deo antigena, čiji se deo naziva epitop. Antigen vezujući domen može biti obezbeđen putem jednog ili više antitelo varijabilnih domena (n.pr., takozvani Fd fragment antitela koji sadrži VH domen). Pretpostavljeno, antigen vezujući domen sadrži antitelo lakog lanca varijabilnog regiona (VL) i antitelo teškog lanca varijabilnog regiona (VH).

Specifično

Ovo se može upotrebiti da se uputi na situaciju u kojoj jedan član specifičnog vezujućeg para neće pokazati značajno vezivanje za molekula osim za onaj koji je njegov specifični vezujući partner(i). Pojam se takođe može primeniti gde je n.pr., antigen vezujući domen specifičan za određeni epitop koji se nosi od strane brojnih antigena, u kom slučaju će specifični vezujući član koji nosi antigen vezujući domen biti sposoban da se vezuje za različite antigene koji nose epitop.

Sadržati

Ovo se generalno upotrebljava u smislu uključuje, čime se želi kazati dopuštenje prisustva jedne ili više karakteristika ili komponenti.

Izolovano

Ovo se odnosi na stanje u kome će specifični vezujući članovi pronalaska, ili nukleinske kiseline koje kodiraju takve vezujuće članove, generalno biti u skladu sa sadašnjim pronalaskom. Članovi i nukleinska kiselina će biti oslobođeni ili suštinski oslobođeni materijala sa kojim su prirodno povezani kao što su drugi polipeptidi ili nukleinske kiseline sa kojim se mogu naći u svom prirodnom okruženju, ili u okruženju u kojem se pripremaju (n.pr., ćelijska kultura) kada se takvo pripremanje putem rekombinantne DNK tehnologije obavljain vitroiliin vivo.Članovi i nukleinska kiselina mogu biti formulisani sa razredivačima ili adjuvantima i da i dalje zbog praktičnih svrha budu izolovani - na primeri članovi će normalno biti smešani sa želatinom ili drugim nosačima ukoliko se upotrebljavaju obložene mikrotitar ploče za upotrebu u imunoogledima, ili će biti smešani sa farmaceutski prihvatljivim nosačima ili razređivačima kada se upotrebljavaju u dijagnozi ili terapiji. Specifični vezujući članovi mogu biti glikozilovani, bilo prirodnim putem ili putem sistema heterologih eukariotskih ćelija (n.pr., CHO ili NSO (ECACC 85110503)) ćelije, ili mogu biti

(na primer ukoliko su proizvedeni ekspresijom u prokariotskoj ćeliji) neglikozilovani.

Pod ''suštinski kao odakle se polazi'' se razume da će releventni CDR ili VH ili VL domen pronalaska biti bilo identičan ili krajnje sličan specifikovanim regionima od kojih ovde sekvenca polazi. Pod ''krajnje sličnim'<1>se razmatra da je od 1 do 5, pretpostavljeno od 1 do 4 kao što je to 1 do 3 ili 1 ili 2, ili 3 ili 4, supstitucija može biti učinjeno u CDR i/ili VH ili VL domenu.

Sturuktura za nošenje CDR pronalaska će generalno biti od antitelo sekvence teškog ili lakol lanca ili suštinski njegov deo u kome je CDR lociran na lokacija koja korespondira sa CDR prirodno nastalih VH i VL antitelo varijabilnih domena kodiranih putem reorganizovanih imunoglobulin gena. Strukture i lokacije imunoglobulin varijabilnih domena mogu biti utvrđene putem reference prema Kabat, E.7A. et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest. 5th Edition. US Department of Health and Human Services. 1991, i njegovim upotpunjavanjima, sada dostupnim na Internetu (http:/immuno.bme.nwu.edu ili pronađi ''Kabat'' upotrebom bilo kog od pretraživača).

Pretpostavljeno, CDR sekvenca amino kiseline suštinski kako se odavde polazi se nosi kao CDR u humanom varijabilnom domenu ili njegovom značajnom delu. L19 VH CDR3 i/ili L19 VL CDR3 sekvence suštinski kao što se ovde polazi može biti upotrebljena u pretpostavljenim realizacijama sadašnjeg pronalaska i pretpostavljeno je da svaka od njih obavljena kao CDR3 u humanom varijabilnom domenu teškog ili lakok lanca, kao što to može biti slučaj, ili u njegovom značajnom delu.

Značajan deo imunoglobulin varijabilnog domena će sadržati bar tri CDR regiona, zajedno sa njihovim dolazećim regionima okvira za rad. Pretpostavljeno, deo će takođe da uključi bar oko 50% bilo jednog ili drugog ili oba od prvog i četvrtog regiona okvira za rad, gde je 50% C-završetak 50% od prvog regiona okvira za rad i N-završetak 50% četvrtog regiona okvira za rad. Dodatni ostatci na N-završetku ili C-završetku značajnog dela varijabilnog domena mogu biti oni koji nisu normalno povezani sa prirodno nastalima regionima varijabilnog domena. Na primer, konstrukcija specifičnih vezujućih članova sadašnjeg pronalaska napravljena rekombinantnim DNK tehnikama može rezultirati u uvođenju N- ili C-krajnih ostataka kodiranih linkerima koji su uvedeni da olakšaju kloniranje ili druge korake manipulacije. Drugi koraci manipulacije uključuju uvođenje linkera da pridruže varijabilne domene pronalaska daljim sekvencama proteina uključujući imunoglobulin teške lance, druge varijabilne domene ili oznake za proteine kako se to razmatra detaljnije u donjem tekstu.

U IgGl antitelo molekulu prema sadašnjem pronalasku, VL domeni mogu biti zakačeni na C-završetku za antitelo konstantni domen lakog lanca uključujući humane Ck ili CA. lance, pretpostavljeno Ck lance.

Dodatno tome da su označeni sa<?6>Br, 77Br,123J,124J,131Ji/ili<211>At, specifični vezujući članovi pronalaska mogu biti označeni sa drugom opažljivom ili funkcionalnom oznakom. Opažljive oznake su opisane u donjem tekstu i uključuju radiooznake kao što su radioizotopi Tehnecijuma, Indijuma, Itrijuma, Bakra, Lutecijuma ili Renijuma, posebno94mTc,99mTc,186Re,188Re,U1ln, 86Y,88Y,177Lu, 64Cui67Cu,

koji mogu biti zakačeni za antitela pronalaska upotrebom konvencionalne hernije poznate u nauci snimanja antitela kao što je to ovde opisano. Drugi radioizotopi kojei se mogu upotrebiti uključuju<203>Pb,<67>Ga,<68>Ga,<43>Sc,<47>Sc,<110m>In,<97>Ru, 62Cu,68Cu,8<6>Y,88Y,90Y,121Sn, 161Tb,153Sm,166Ho,105Rh,177Lu,<72>Lui18F.

Oznake takođe uključuju enzimske oznake kao što je ren peroksidaza. Oznake dalje uključuju hemijske ostatke kao što je biotin koji može biti detektovan putem vezivanja za specifični srodni opažljivi ostatak, n.pr., označeni avidin.

Primer protokola označavanja je kako dalje sledi:

Da se direktno radiooznače specifični vezujući članovi, cisteinom premošćeni molekuli se prvo redukuju odgovarajućim reduktivnom sredstvom n.pr., stano(II)hloridom, Tris(2-karboksietil)fosfinom (TCEP) generišući slobodne cistein SH-grupe koje mogu da reaguju sa izotopima n.pr., Tc ili Re. U ovoj određenoj proceduri, permetalati dobijeni iz instant generator sistema se redukuju redukcionim sredstvom n.pr., stano(II)hloridom u prisustvu pomoćnog liganda n.pr., natrijum tartrata i API (detalji su dati u donjem tekstu u eksperimentalnom delu).

Indirektno označavanje sa n.pr., indijumom, itrijumom, lantanidima ili tehnecijumom i renijumom može biti obavljeno prethodnim konjugovanjem helatujućeg liganda, pretpostavljeno izvedenog iz etilen diamin tetrasirćetne kiseline (EDTA), dietilen triamin pentasirćetne kiseline (DTPA), cikloheksil 1,2-diamin tetrasirćetne kiseline (CDTA), etilenglikol-O,0'-bis(2-aminoetil)-N,N,N1, N' - disirćetne kiseline (HBED), trietilen tetraamin heksasirćetne kiseline (TTHA), 1,4,7,10-tetraazaciklododekan-N,N',N<11>'-tetrasirćetne kiseline (DOTA), 1,4,7-triazaciklononan-N,N',N''-tirsirćetne kiseline (NOTA), 1,4,8,11-tetraazaciklotetradekan-N,N',N'',N'''-tetrasirćetne kiseline (TETA), merkaptoacetildiglicina (MAG2) , mekraptoacetil triglicina (MAG3) , merkaptoacetil glicil cisteina (MAGC), cisteinil glicil cisteina (CGC) u bilo amin ili tiol grupe specifičnog vezujućeg člana. Helatujući ligandi poseduju odgovarajuću grupu za sparivanje n.pr., aktivne estre, meleimide, tiokarbamate ili a-halogenovane acetamid ostatke. Za konjugovanje helatujućih liganada u amin grupe n.pr.,8-NH2-grupe lizin ostataka ne traži, se prethodna redukcija L-19-SIP jedinjenja.

Postupci označavanja specifičnog vezujućeg člana mogu da se sastoje od konjugovanja aktiviranog bi-funkcionalnog halogen nosača koji sadrži radioizotope odabrane od grupe koja se sastoji od<76>Br,77Br, 123J,124J, 131J i211At na lizin ostatku ili N-završetku, i na cistein ostatku specifičnog vezujućeg člana. Postupak može da se sastoji od konjugovanja halogen nosača za lizin ili cistein ostatak specifičnog vezujućeg člana, ili za N-završetak specifičnog vezujućeg člana. Bilo samo jedan ili oba od (i) cistein ostatka i (ii) lizin ostatka ili N-završetka, mogu biti označenbi sa istim ili različitim radioizotopom u skladu sa pronalaskom.

Specifični vezujući članovi sadašnjeg pronalaska su dizajnirani da se upotrebe u postupcima dijagnoze ili lečenja kod humanih ili životinjskih subjekata, pretpostavljeno ljudi. Specifični vezujući članovi su posebno pogodni za upotrebu u postupcima radioterapije i radiodij agnoze.

U skladu sa tim, dalji aspekti pronalaska obezbeđuju postupke lečenja koji se sastoje od davanja specifičnog vezujućeg člana kako je dat, farmaceutskih sastava koji sadrže takav specifični vezujući član, i upotrebu takvog specifičnog vezujućeg člana u proizvodnji medikamenta za davanje, na primer u postupku pravljenja medikamenta ili farmaceutskog sastava koji se sastoji od formulisanja specifičnog vezujućeg člana sa farmaceutski prihvatljivim inertnim puniocem.

Kliničke indikacije u kojima specifični vezujući član pronalaska može biti upotrebljen da se obezbedi terapeutska korist uključuju tumore kao što su bilo koji čvrsti tumor, takođe organi sa patološkom angiogenezom, uključujući reumatoiđni artritis, dijabetička retinopatija, sa starošću povezana makularna degeneracija, i angiomi.

Specifični vezujući članovi prema pronalasku mogu biti upotrebijeni u postupku lečenja humanog ili životinjskog tela, kao što je postupak lečenja (koji može uključiti profilaktički tretman) bolesti ili poremećaja kod humanog pacijenta koji se sastoji od davanja navedenom pacijentu efektivne količine specifičnog vezujućeg člana pronalaska. Pretpostavljeno, lečenje je radioterapija. Stanja koja se mogu tretirati prema sadašnjem pronalasku se razmatraju drugde u ovom tekstu.

Specifični vezujući članovi prema pronalasku mogu bit upotrebljeni u SPECT snimanju, PET snimanju i terapiji. Pretpostavljeni izotopi za SPECT snimanje uključuju<1>23Ji13<1>J. Pretpostavljeni izotop za PET je<124>J.131Jje pretpostavljeni izotop za upotrebu u terapiji.

Usled upotrebe različitih izotopa jednog elementa za snimanje i terapiju biodistribucija svakog posebno imunokonjugata je identična. Ovo je prednost upoređeno sa drugim pristupima koji upotrebljavajuli:LIn-označene derivate za snimanje da bi se predvidela biodistribucija posebnih90Y-ozančenih terapeutskih derivata pošto biodistribucija korespondirajućih<in>In i<90>Y označenih derivat može da bude različita; videti Carrasquillo J.A. et al. (1999) J Nucl Med 40: 268-276.

U skladu sa tim, dalji aspekti pronalaska obezbeđuju postupke lečenja koji se sastoje od davanja specifičnog vezujućeg člana kako je dat, farmaceutskog sastava koji sadrži takav specifični vezujući član, i upotrebu takvog specifičnog vezujućeg člana u proizvodnji medikamenta za davanje, na primer u postupku pravljenja medikamenta ili farmaceutskog sastava koji se sastoji od formulisanja specifičnog vezujućeg člana sa farmaceutski prihvatljivim inertnim puniocem.

U skladu sa sadašnjim pronalaskom, sastavi koji se obezbeđuju mogu biti. dati individuama. Davanje je pretpostavljeno u ''terapeutski efektivnoj količini'<1>, koja je dovoljna da pokaže korisno dejstvo za pacijenta. Takva korist može biti bar ublažavanje bar jednog simptoma. Aktuelna količina koja se daje i brzina i vremenski raspored davanja, će zavisiti od prirode i ozbiljnosti onog što se tretira. Uput za lečenje, n.pr., odluke od doziranju itd., je u okviru odgovornosti lekara opšte prakse i drugih medicinskih doktora. Odgovarajuće doze antitela su dobro poznate u nauci; videti Ledermann J.A. et al. (1991) Int J. Cancer 47: 659-664; Bagshawe K.D. et al.

(1991) Antibodv, Immunoconjugates and Radiopharmaceuticals 4: 915-922.

Sastav se može dati sam ili u kombinaciji sa drugim tretmanima, bilo simultano ili sekvencijalno u zavisnosti od stanja koje se ima tretirati.

Specifični vezujući članovi sadašnjeg pronalaska, uključijući one koji sadrže antitelo antigen-vezujući domen, mogu biti dati pacijento kome je to neophodno putem bilo kog pogodnog puta, uobičajeno ubrizgavanjem u krvotok i/ili direktno na položaj koji se ima tretirati, n.pr., tumor. Pretpostavljeno, specifični vezujući član se daje parenteralno. Precizna doza će zavisiti od brojnih faktora, puta kojim se vrši tretman, veličine i lokacije površine koja se ima tretirati (n.pr., tumor), precizne prirode antitela (n.pr., celokupni IgGl antitelo molekul, mini-imunoglobulin molekul), i prirode bilo koje opažljive oznake ili drugog molekula koji je zakačen za antitelo molekul. Tipična doza antitela će biti u rasponu od 10-50 mg.

Ovo je doza je jedinični tretman odraslog pacijenta, koji može biti proporcionalno podešena za decu i bebe, i takože podešena za durge formate antitela u proporciji za molekularnom težinom. Tretmani se mogu ponavljati dnevno, dva puta nedeljno, nedeljno ili u mesečnim intervalima, prema diskrecionoj odluci lekara.

Specifični vezujući članovi sadašnjeg pronalaska će uobičajeno biti dati u obliku farmaceutskog sastava, koji može da sadrži bar jednu komponentu dodatno specifičnom vezujućem članu.

Tako farmaceutski sastavi prema sadašnjem pronalasku, i za upotrebu u skladu sa sadašnjim pronalaskom, mogu sadržati, dodatno aktivnom sastojku, farmaceutski prihvatljivi inertni punilac, nosač, pufer, stabilizator ili druge materijale dobro poznate stručnjacima iz ove oblasti nauke. Takvi materijali treba da budu netoksični i ne treba da utiču na efikasnost aktivnog sastojka. Tačna priroda nosača i drugog materijala će zavisiti od puta davanja, koji može biti oralni, ili putem ubrizgavanja, n.pr., intravenozno.

Za intravenozno ubrizgavanje, ili ubrizgavanje na položaj bola, aktivni sastojak će biti u obliku parenteralnog prihvatljivog vodenog rastvora koji je oslobođen od pirogena i ima odgovarajući pH, izotoničnost i stabilnost. Stručnjaci iz ove oblasti nauke će biti u stanju da pripreme odgovarajuće sastave upotrebom, na primer, izotoničnih tečnih nosača kao što su ubrizgavanje natrijumhlorida, ubrizgavanje Ringer-a, ubrizgavanje mlečnog Ringer-a. Prezervativi, stabilizatori, puferi, antioksidanti i/ili drugi aditivi mogu biti uključeni, ukoliko se to traži.

Sastav se može dati sam ili u kombinaciji sa drugim tretmanima, bilo simultano ili sekvencijalno u zavisnoti od stanja koje se ima tretirati. Drugi tretmani mogu uključiti davanje odgovarajućih doza lekova za ublažavanje bole kao što su ne-steroidni anti-inflamatorni lekovi (n.pr., aspirin, paracetamol, ubuprofen ili ketoprofen) ili opijati kao što su morfin, ili anti-emetici.

Sadašnji pronalazak obezbeđuje postupak koji se sastoji od izazivanja ili dopuštanja vezivanja specifičnog vezujućeg člana kako se ovde obezbeđuje za ED-B. Kao što je zabeleženo, takvo vezivanje može da se obaviin vivo,n.pr., nakon davanja specifičnog vezujućeg člana, ili nukleinske kiseline koja kodira specifični vezujući član, ili se može obavitiin vitro,na primer ELISA, Wester mrljanje, imunocitohemija, imuno-taloženje ili afinitet hromatografije.

Količina vezivanje specifičnog vezujućeg člana za ED-B može se utvrditi. Kvantifikacija može biti u zavisnost od količine antigena u testiranom uzorku, koji može biti od dijagnostičkog interesa.

Reakcije antitela na uzorku mogu biti utvrđene bilo kojim odgovarajućim sredstvima. Radioimunoogled (RIA) je jedna mogućnost. Radioaktivno označeni antigen se smeša sa neoznačenim antigenom (test uzorak) i dopušta se da se veže za antitelo. Vezani antigen je fizički odvojen od nevezanog antigena i količina radioaktivnog antigena vezanog za antitelo se utvrđuje. Što je više antigena u test uzorku manje radioaktivnog antigena će se vezati za antitelo. Ogled takmičenja u vezivanju može takođe biti upotrebljen sa ne-radioaktivnim antigenom, upotrebom antigena ili analoga vezanog za reporter molekul. Reporter molekul može biti fluorohrom, fosfor ili laserska boja sa spektralno izolovanim karakteristikama absorbcije ili emisije. Odgovarajući fluorohromi uključuju fluorescin, rodamin, fikoeritrin i Texas crveno. Odgovarajuće hromogene boje uključuju diaminobenzidin.

Drugi reporteri uključuju makroraolekularne koloidne čestice ili određeni materijal kao što su lateks zrna koja su obojena, magnetska ili paramagnetska, i biološki ili hemijski aktivna sredstva koja mogu direktno ili indirektno da izazovu opažljive signale koji se mogu vizuelno primetiti, elektronski detektovati ili na drugi način zabeležiti. Ovi molekuli mogu biti enzimi koji katalizuju reakcije koje razvijaju ili menjaju boje ili izazivaju promene u električnim osobinama, na primer. Oni se mogu molekularno ekscitovati, tako da elektronska tranzicija između stanja energije rezultira u karakterističnim spektralnim absorbcijama ili emisijama. Oni mogu uključiti hemijske entitete koji se upotrebljavaju u konjunkciji sa biosenzorima. Biotin/avidin ili biotin/streptavidin i alkalna fosfataza sistemi detekcije mogu biti uposleni.

Signali generisani od strane individualnih antitelo-reporter konjugata mogu biti upotrebijeni da se izvede apsolutni ili relativni podaci koji se mogu kvantifikovati relevantnog vezivanja antitela u uzorcima (normala i test).

Sadašnji pronalazak dalje se proširuje na specifični vezujući član koji se takmiči za vezivanje za ED-B sa specifičnim vezujućim članom koji se i vezuje za antigen i sadrži V domen uključijući CDR sa amino kiselinom suštinski kao onom koja je ovde polazna, pretpostavljeno VH domen koji sadrži VH CDR3 od SEQ ID NO. 3. Takmičenje između vezujućih članova može se lako ogledatiin vitro,na primer označavanjem specifičnog reporter molekula za jedan vezujući član koji se može detektovati u prisustvu drugog(ih) neoznačenog(ih) vezujućeg(ih) člana(ova), da se omogući identifikacija specifičnih vezujućih članova koji vezju isti epitop ili epitop koji se poklapa. Takmičenje može biti utvrđeno na primer upotrebom ELISA kao što je to opisano kod Carnemolla et al., (24 1996).

Kao što je gore navedeno, postupci proizvodnje specifičnih vezujućih članova prema pronalasku mogu se sastojati od ekspresije kodirane nukleinske kiseline, i mogu opciono uključiti kultivisanje ćelija domaćina pod uslovima proizvodnje specifičnog vezujućeg člana. Specifični vezujući članovi i molekuli i vektori nukleinske kiseline koji kodirajupra ili za upotrebu u sadašnjem pronalasku mogu biti obezbeđeni izolovano i/ili prečišćeno, n.pr., iz njihovog prirodnog okruženja, u suštinski čistom ili homogenom obliku, ili, u slučaju nukleinske kiseline, bez ili suštinski bez nukleinske kiseline ili gena drugog porekla osim sekvence koja kodira polipeptid za traženom funkcij om.

Nukleinska kiselina koja se upotrebljava prema sadašnjem pronalasku može da sadrži DNK ili RNK i može biti u potpunosti ili delimično sintetička. Referenca prema nukleotidnoj sekvenci od koje se ovde polazi obuhvata DNK molekul sa specifikovanom sekvencom, i obuhvata RNK molekul sa specifikovanom sekvencom u kojima je U supstituisan sa T, osim ukoliko kontekst ne zahteva drugačije.

Sistemi kloniranja i ekspresije polipeptida u različitim ćelijama domaćina su dobro poznati. Odgovarajuće ćelije domaćina uključuju bakterijam sisarske ćelije, kvasac i bakulovirus sisteme. Sisarske ćelijske linije dostupne u

nauci za ekspresiju heterologog polipeptida uključuju jajne ćelije kineskog hrčka, HeLa ćelije, ćelije bubrega mladunca hrčka, NSO mišje melanoma ćelije i mnoge druge. Uobičajno, pretpostavljeni bakterijski domaćin jeE. coli.

Ekspresija antitela i fragmenata antitela u prokariotskim ćelijama kao što suE. colije dobro utvrđena u nauci.

Radi pregleda, videti na primer Pluckthun, A. Bio/Technology 9: 545-551 (1991). Ekspresija u eukariotskim ćelijama u kulturi je takođe dostupna stručnjacima iz ove oblasti nauke kao opcija za proizvodnju specifičnog vezujućeg člana, videti skorije preglede, na primer Ref, M.E. (1993) Curr. Opinion Biotech. 4: 573-576; Trill J.J. et al. (1995) Curr. Opinion Biotech 6: 553-560.

Odgovarajući vektori mogu biti odabrani ili konstruisani, sadržeći odgovarajuće regulatorne sekvence, uključujući promoter sekvence, ukidajuće sekvence, sekvence poliadenilacije, sekvence pojačavanja, marker gene i druge sekvence kao odgovarajuće. Vektori mogu biti plazmidi, viralni n.pr., faga, ili fagemid, kao odgovarajući. Za dalje detalje videti, na primer,Molecular Cloning: a Laboratory Manual:3rd edition, Sambrook et al., 2001, Cold Spring Harbor Laboratorv Press. Mnoge poznate tehnike i protokoli manipulacije nukleinskom kiselinom, na primer u pripremanju konstrukta nukleinske kiseline, mutagenezi, sekvenciranju, uvođenju DNK u ćelije i genskoj ekspresiji, i analizi proteina, su opisani detaljno uCurrent Protocolsin Molecular Biology,Second Edition, Ausubel et al. eds., John Wiley&Sons, 1992. Otkrića Sambrook et al. i Ausubel et al. su ovde inkorporisana putem reference.

Postupak proizvodnje specifičnog vezujućeg člana prema pronalasku može dalje da se sastoji od uvođenja kodirajuće nukleinske kiseline u ćeliju domaćina. Uvođenje može da uposli bilo koju dostupnu tehniku. Za eukariotske ćelije, odgovarajuće tehnike mogu da uključe transfekciju kalcijumfosfata, DEAE-Dextran, elektorporaciju, lipozomom-posredovanu transfekciju i transdukciju upotrebom retrovirusa ili drugog virusa, n.pr., vaccinia ili, za ćelije insekta, bakulovirus. Za bakterijske ćelije, odgovarajuće tehnike mogu da uključe kalcijumhlorid transformaciju, elektroporaciju i transfekciju upotrebom bakteriofage.

Uvođenje može biti praćeno izazivanjem ili dopuštanjem ekspresije iz nukleinske kiseline, n.pr., kultivisanjem ćelija domaćina pod uslovima ekspresije gena.

U jednoj realizaciji, nukleinska kiselina pronalaska je integrisana u genom (n.pr., hromozom) ćelije domaćina. Integracija može biti promovisana uključivanjem sekvenci koje promovišu rekomibinaciju sa genomom, u skladu sa standardnim tehnikama.

Dalji aspekti i realizacije sadašnjeg pronalaska će biti očigledne stručnjacima iz ove oblasti nauke u svetlu sadašnjeg otkrića uključujući eksperimentalne primere koji slede. Postupci sinteze i označavanja specifičnih vezujućih članova sadašnjeg pronalaska su potpunije ilustrovani ali nikako putem ograničavanja. Svi pomenuti dokumenti bilo gde u ovom opisu su inkorporisani putem reference.

EKSPERIMENTALNI PRIMERI ASPEKATA I REALIZACIJA SADAŠNJEG

PRONALASKA

1.Pripremanje i karakterizacija specifičnih vezujućih

članova u skladu sa sadašnjim pronalaskom

Sledeći primeri upotrebljavaju radiooznačena peptidna jedinjenja L19-SIP.

1. 1 Sinteza J- 131- L19- SIP ( Hloramin- T postupak)

200 ug L19-SIP u 230 uL PBS (0,2 M PBS, pH 7,4) se postavlja u reakcionu posudu, smeša sa 185 MBq[131J]NaJ, i raguje sa 30 (iL sveže pripremljenog rastvora Hloramin-T (2 mg/mL) u 0,2 M PBS (pH 7,4). Nakon 1 min, 50 ?L rastvora Na2S205(10 mg/mL u PBS 0,2 M, pH 7,4).131 J-označeni L19-SIP se prečisti gel-hromatografijom upotrebom NAP-5 kolone (Amersham, Eluent: PBS), prethodno blokiranom sa 5 mL 0.5% volovskog seruma albumina u PBS.

1. 2 Sinteza J- 131- L19- SIP ( jodogen postupak)

800 ug L19-SIP u 800 U.L PBS (0,2 M PBS, pH 7,4) i 500 MBq [<131>J]NaJ se smeša i postavi u reakcionu posudu (jodogen cev, Pierce Inc.). Smeša se mućka nežno, tokom perioda od 30 min na sobnoj temperaturi.<131>J-označeni L19-SIP se prečisti gel-hromatografijom upotrebom NAP-5 kolone (Amersham, Eluent: PBS), prethodno blokiranom sa 5 mL 0,5 % volovskog seruma albumina u PBS.

1. 3 Sinteza J- 123- L19- SIP ( jodogen postupak)

200 ug L19-SIP u 230 uL PBS (0,2 M PBS, pH 7,4) i 200 MBq [<123>J]NaJ se smeša i postavi u reakcionu posudu (jodogen cev, Pierce Inc.). Smeša se mućka nežno, tokom perioda od 30 mm na sobno] temperaturi. J-oznaceni L19-SIP se prečisti gel-hromatografijom upotrebom NAP-5 kolone (Amersham, Eluent: PBS), prethodno blokiranom sa 5 mL 0,5 % volovskog seruma albumina u PBS.

1. 4 Sinteza J- 124- L19- SIP ( jodogen postupak)

200 ug L19-SIP u 230 uL PBS (0,2 M PBS, pH 7,4) i 200 MBq [<124>J]NaJ se smeša i postavi u reakcionu posudu (jodogen cev, Pierce Inc.). Smeša se mućka nežno, tokom perioda od 30 min na sobnoj temperaturi.<124>J-označeni L19-SIP se prečisti gel-hromatografijom upotrebom NAP-5 kolone (Amersham, Eluent: PBS), prethodno blokiranom sa 5 mL 0,5 % volovskog seruma albumina u PBS.

1. 5 Sinteza ( 3- ( 4- hidroksi- 3-[ 131 J] jodo- f enil) - propionat) -

L19- SIP

500 ug (3-(4-hidroksi-fenil)-N-(sulfonato-sukcinimidil) propionata) se rastvori u 1 mL DMSO. Deset mikrolitara Hloramin-T (5 mg/mL u PBS) se smeša sa 74 MBq[<1>31J]NaJ, neutralisano sa 15 uL PBS (0,2 M, pH 7,4). Jedan mikrolitar (3-(4-hidroksi-fenil)-N-(sulfonato-sukcinimidil)propionat) rastvora se doda Hloraminu-T/[131 J]NaJ rastvora i smeši se dopušta da reaguje 1 min. Reakcija se zaustavi dodavanjem 4 0 uL rastvora Na2S205(10 mg/mL u PBS 0,2 M, pH 7,4),

praćeno trenutnim dodavanjem 200 ug L19-SIP u 230 uL borat pufera (0,2 M PBS, pH 8,5).

(3- (4-hidroksi-3-[131 J] jodo-fenil) -propionat) -L19-S1P se prečisti gel-hromatografijom upotrebom NAP-5 kolone (Amersham, Eluent: PBS), prethodno blokiranom sa 5 mL 0.5 % volovskim serumom albuminom u PBS.

1. 6 MIRD izračunavanja J- 131- L19- SIP

Zasnovano na podacima biodistribucije u miševima koji nose tumor absorbovane doze J-131 označenog L19-SIP mogu biti izračunate MIRD fdormalizmom. Biokinetičko modeliranje se obavlja sa % ID podacima J-131-L19-SIP u humanom glioblastomu (U251) koji nose miševi. Vremena zadržavanja se izračunavaju kao oblasti pod krivom bi-i mono-eksponencijalnih funkcija integrisanih od nula do beskonačno uključujući biološki i fizički polu-život j edinj enj a.

Razmatrajući organe miša i kao izvora radijacije i cilja radijacije absorbovane doze u organu kao same-prema-sebi doze (nem radijacione unakrsne vatre) mogu biti ocenjene na J-131-L19-SIP upotrebom S-vrednosti iz MIRDOSE 3.1 softveru.

Doze u organima miša (mGy/ MBq):

Upotrebom izračunatih vremena zadržavanja u MIRDOSE 3.1 programu humane absorbovane doze se mogu utvrditi za J-131-L19-SIP.

Doze u humanim organima (mGy/ MBq):

Zaključeno je da će crvena koštana srž i reproduktivni organi (jajnici/materica i testisi) biti organi za limitiranje doze. Uprkos tome, terapeutski prozor zasnovan na doziometričnim izračunavanjima izgledaju povoljno i obećavajuće. Pronađen je odnos doze tumora prema dozi crvene koštane srži od 18. Tako, J-131-L19-SIP prikazuje značajne 18-puta veće doze isporučene tumoru nego crvenoj koštanoj srži. 1. 7 Proučavanje tretmana tumora nakon jednog i. v.

ubrizgavanja J- 131- L19-SIP u golim miše vima koji nose tumor

J-131-L19-SIP se ubrizgava jednom intravenozno u gole miševe (telesna težina oko 27 g) koji nose U251 (glioblastom). Istražene doze su 37 MBq i 74 MBq, svaka posebno. Dodatno tome, istražuje se kontrolna grupa životinja (ubrizgan jednom fiziološki slani rastvor. Tokom dana nakon ubrizgavanja, veličina tumora (data u mm<2>) se utvrđuje upotrebom kalipera.

Rast U251 tumora u golim miševima praćen nakon jednog intravenoznog ubrizgavanja fiziološkog rastvor i J-131-L19-SIP, svakog posebno, je prikazan na Slici 6.

Jedno ubrizgavanje J-131-L19-SIP sa 74 MBq po životinji pokazuje izraženo dejstvo na rast U251-tumora što razultira stazom za 18 dana. Isto je istinito za grupu koja prima nižu dozu (37 MBq) osim blagog rasta tumora koji započinje tokom poslednjih 5 dana za grupu koja prima nižu dozu. Za razliku od toga, tumori kontrolne grupe rastu kontinuirano tokom celog perioda posmatranja.

Rezultati ovog istraživanja pokazuju odličan potencijal J-131-L19-SIP za lečenje čvrstih tumora.

1. 8 Snimanje J- 123- L19- SIP nakon jednog i. v. ubrizgavanja

u gole miševe koji nose tumor

Supstanca pronalaska se ubrizgava intravenozno u dozi od oko 9.25 MBq u gole miševe (telesna težina oko 25 g) koji nose F9 (teratokarcinom). Snimanje gama-kamerom se obavlja u rezličitim vremenskim tačkama nakon davanja supstance.

Planarnom scintigrafijom J-123-L19-SIP u golim miševima koji nose F9 (teratokarcinom) nakon ubrizgavanja i 24 sata nakon ubrizgavanja, tumor se može jasno opisati. Na 4 sata nakon ubrizgavanja, osim snažnog unošenja u tumor može se detektovati samo blaga pozadina u ostatku tela (nije vezan za određene organe već izveden iz bazena krvi). Dok je signal u tumoru održan, pozadinski signal u ostatku tela nestaje protekom vremena. Tako, na 24 sata nakon ubrizgavanja samo se može detektovati tumor.

Rezultati ovog istraživanja pokazuju odličan potencijal J-123-L19-SIP za snimanje čvrstih tumora.

2. Dalji primeri i eksperimenti

MATERIJALI I POSTUPCI

Pripremanje i ekspresija scFv, malog imunoproteina ( SIP) i

IgGq konstrukt scFv

Ovaj scFv (L19) (Slika 1A) je afinitetom sazreli (Kd=5.4xl0~ 1:LM) fragment antitela specifično uperen spram ED-B domena fibronektina (13 Pini et al., 1998). Kao kontrola se upotrebljavaju scFv(Dl.3)(7McCafferty et al.; 26 Neri et al., 1997), miš-anti-beli lizozim kokošijeg jajeta scFv. Ovi scFv-ovi se ekspresuju uE. colisoju HB2151 (Maxim Biotech, San Francisco CA) prema Pini et al. (34 1997) .

Mini-imunoglobulin

Da se konstruiše L19 mali imunoprotein (L19-SIP) gen (Slika 1C) DNK sekvenca koja kodira scFv (L19) se pojačava reakcijom polimeraza lanca (PCR) upotrebom Pwo DNK Polimeraze (Roche), prema proizvođačkim preporukama, sa prajmerima BC-618 (gtgtgcactcggaggtgcagctgttggagtctggg - SEQ ID No. 8) i BC-619

(gcctccggatttgatttccaccttggtcccttggcc - SEQ ID No. 9), koji sadrže ApaLI i BspEI položaje restrikcije, svaki posebno. Pojačavanje proizvoda je umetanje ApaLI/BspEI u pUT-sSIP vektor, što obezbeđuje scFv gen sa signalom izlučivanja, koji se traži za islučivanje proteina u ekstracelularni medijum. Vektor pUT-sSIP se dobija iz prethodno opisanog pUT-SIP dugačkog (33 Li et al., 1997) nakon supstituisanja humanog konstantnog yl-CH3 domena sa CH4 domenom humane IgE izoforme za izlučivanje IgE-S2 (es2-CH4; 35 Batista et al., 1996). CH4 je domen koji dopušta dimerizaciju u IgE molekulu i ss2 izoforma sadrži cistein na karboksizavršetku, što stabilizuje IgE dimer kroz inter-lančanu disulfidnu vezu. U konačnom SIP molekulu ScFv(L19) se spaja sa eS2_CH4 domenom sa kragkim GGSG linkerom. SIP gen se onda iseca iz plazmida pUT-sŠIP-L19 sa Hindlll i EcoRI enzimima restrikcije i kloniraju se u sisarski vektor ekspresije pcDNK3 (Invitrogen, Groningen, Holandija), koji sadrži

citomegalovirus (CMV) promoter, da bi se dobio konstrukt pcDNK3-Ll9-SIP.

DNK sekvenca koja kodira scFv(D1.3) se pojačava upotrebom prajmera BC-721 (ctcgtgcactcgcaggtgcagctgcaggagtca - SEQIDNo. 10) i BC-732 (ctctccggaccgtttgatctcgcgcttggt - SEQ ID No. 11) i umetnutog ApaLI/BspEI u pUT-sSIP vektor. D1.3-SIP gen se onda iseca iz pUT-sSIP-Dl.3 sa Hindlll i EcoRI enzimima restrikcije i klonira u pcDNK3, da bi se dobio konstrukt pcDNK3-Dl.3-SIP.

Ovi konstrukti se upotrebljavaju da se izmene infekcijom , (transfekcija) SP2/0 mišje ćelije mijeloma (ATCC, American Type Culture Collection, Rockville, MD, USA) upotrebom FuGENE 6 Transfection Reagent-a (Roche), praćeno protokolom za susedne ćelije, optimizovano od strane proizvođača. Transfektomi se odgajaju u DMEM sa dodatkom 10% FCS i odabiru upotrebom 750 ug/mL Geneticin-a (G418, Calbiochem, San Diego, CA).

IgGl

Da se pripremi potpuni IgGl, varijabilni region L19 teškog lanca (L19-VH), zajedno sa njegovom peptidnom sekvencom izlučivanja, se iseca sa Hindlll i XhoI od prethodno opisanog L19-pUTeSIP i umeću u pUC-IgGl vektor, koji sadrži potpuni humani yl konstantni gen teškog lanca. Rekombinantni IgGl gen se onda iseca iz pUC-IgGl-Ll9-VH sa Hindlll i EcoRI i klonira u pcDNK3, da se dobije konstrukt pcDNK3-L19-IgGl.

Za pripremanje potpuno g L19 lakog lanca, L19-VL se pojačava iz L19-pUT-eSIP (gore opisan) sa PCR upotrebom prajmera BC-696 (tggtgtgcactcggaaattgtgttgacgcagtc - SEQ ID No. 12) i BC-697 (ctctcgtacgtttgatttccaccttggtcc - SEQ ID No. 13), koji sadrže ApaLI i BsiWI položaje restrikcije, svaki posebno. Nakon svarivanja sa ApaLI i BsiWI, pojačani proizvod se umeće u vektor pUT-SEC-hCk koji sadrži signalnu sekvencu izlučivanja i sekvencu humanog konstantnogKlakog lanca. Rekombinantni gen lakog lanca se onda iseca iz pUT-SEC-hCk-L19-Vl sa Hindlll i XhoI i umeće u pCMV2A, sisarski vektor ekspresije, izveden iz pcDNK3' vektora uklanjanjem

otpornog gena'na G418, da se dobije konstrukt pCMV2A-L19-K.

Ekvimolarne količine ovih konstrukata se upotrebljavaju da se ko-transfektuju SP2/0 mišje ćelje mijeloma kao što je to u gornjem tekstu opisano. Geneticinom odabrani klonovi se pretražuju u ELISA za sposobnost da izluče himerični imunoglobulin, potpun sa teškim i lakim lancima.

Svi DNK konstrukti se prečišćavaju upotrebom Maxiprep sistema od Qiagen-a (Hilden, Nemačka), i DNK sekvence oba vlakna konstrukata su potvrđene upotrebom ABI PRISM dRhodamin Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction pribora (Perkin Elmer, Foster City, CA). Svi enzimi restrikcije (RE) su od Roche Diagnostics (Milan, Italija), sa izuzetkom BsiWI (New England Biolabs, Beverly, MA). Nakon RE svarivanja, vade se umetci i vektori iz agaroza gela upotrebom Qiaquick postupka (Qiagen) .

Prečišćavanje i kontrola kvaliteta antitela

Hromatografija imunoafiniteta se obavlja da se prečiste različita antitela prema postupku opisanom kod Carnemolla et al., (24 1996).

ED-B konjugovan sa Sepharose 4B (Amersham Pharmacia Biotech., Uppsala, Švedska) praćenjem proizvođačkih instrukcija (24 Carnemolla et al., 96) se upotrebljava da se imunoprečiste svi različiti formati L19 antitela, dok se kolona belog lizozima kokošijeg jajeta (Sigma, St. Louis, SAD) konjugovana sa Sepharose 4B (Amersham Pharmacia) upotrebljava za Dl.3 antitela-

Imuno prečišćeni formati antitela L19-SIP i Ll9-IgGl ne traže dalje prečišćavanje i dijalizuju se spram PBS, pH 7,4, na +4°C. Pošto je scFvs koji se dobija iz hromatografije imunoafiniteta sačinjen od dva oblika, monomernog i dimernog, neophodan je drugi korak prečišćavanja, kao što je to opisano od strane Demartis et al., (27 2001), da se izoluje potonji oblik. Šarže različitih formata antitela se pripremaju i anliziraju upotrebom SDS-PAGE pod redukovanim i ne-redukovanim uslovima, imunohemije, hromatografije isključivanja veličine (Superdex 200, Amersham Pharmacia Biotech) i ELISA eksperimenata.

Natrijum dodecil sulfat- poliakrilamid gel elektroforeza

( SDS- PAGE), ogled enzimom vezanog imunoabsorbanta ( ELISA),

hromatograf i ja isključivanja veličine i imunohemija

ELISA eksperimetni pretraživanja na tretiranom medijumu kulture se obavlja prema Carnemolla et al. (24 1996). Da se otkrije ekspresija različitih formata L19 antitela, rekombinantni fragment 7B89 (24 Carnemolla et al., 1996), koji sadrži ED-B domen FN-a, koji uključuje epitop prepoznat od strane L19, se imobiliše na Maxisorp imunopločama (Nunc, Roskilde, Danska). Da se detektuju Dl.3 antitela u ELISA eksperimentima, , lizozim kokošijeg jajeta belog pileta (Sigma) se imobiliše na NH2 površini EIA ploča (Costar, Cambridge, MA). Peroksidazom-konjugovani zečji anti humani IgE (Pierce, Rockford, IL), razblažen prema proizvođačkim preporukama, se upotrebljava kao sekundarno antitelo da se detektuju SIP-ovi. Peroksidazom-konjugovani zečji anti humani IgG (Pierce) se upotrebjava u slučaju IgGl. Za scFv-ove koji sadrže označenu sekvencu FLAG, mišje anti-humano FLAG monoklonalno antitelo (M2, Kodak) i peroksidazom-konjugovano kozje anti-miš antetelo (Pierce) se upotrebljavaju kao sekundarna i tercijarna antitela, svako posebno. U svim slučajevima imunoreaktivnost sa imobilisanim antigenom se detektuje upotrebom supstrata ABTS za peroksidazu (Roche) i meri se fortometrijska absorbanca na 405 nm.

Superdex 200 (Amersham Pharmacia) hromtografija kolone se upotrebjava da se analiziraju profili gel filtriranja prečišćenih antitela matičnim uslovima upotrebom brze proteinske tečne hromatografije (FPLC; Amersham Pharmacia). Imunohistohemija različitih kriostat sekcija tkiva sa obavlja kao što je to opisano kod Castellani et al., (22 1994) i 4-18% gradijent SDS-PAGE se obavlja prema Carnemolla et al., (17 1989) pod reduktivnim ili ne-reduktivnim uslovima.

Životinje i ćelijske linije

Aritmični-goli miševi (8 nedelja stari/goli CD1 ženke) se dobijaju od Harlan Italy (Correzzana, Milano, Italija), miševi sa 129 (klon SvHsd) nizom (8-10 nedelja stari, ženka) se dobijaju od Harlan UK (Oxon, Engleska). Mišje embrionalne ćelije tetrakarcinoma (F9), humane melanoma izvedene ćelije (SK-MEL-28) i mišje mijeloma ćelije (SP2/0) se kupuju od American Type Culture Collection (Rockville, MD). Da se izazovu tumori, golim miševima se potkožno ubrizgavaju 3xl0<6>F9 ćelije. Zapremina tumora se utvrđuje sledećom formulom: (d)<2>xDxO,52, gde su d i D, svaki posebno, izmereni sa kaliperom. Udomljavanje, tretmani i ubijanje životinja se obavlja u skladu sa državnom legislativom (Italijanski zakon br. 116 od 27.januara 2992.god.) u vezi sa zaštitom životinja koje se upotrebljavaju u naučne svrhe.

Radiojodovanje rekombinantnih antitela

Radiojodovanje proteina se postiže praćenjem Chizzonite indirektnog postupka (36 Riske et al., 1991) upotrebom IODO-GEN prethodno obloženih cevčica za jodovanje (Pierce) da se aktivira Na J (NEN Life Science Products, Boston,MA) prema proizvođačkim preporukama. U objavljenim eksperimentima, 1.0 mCi Na<125>J se upotrebljava za 0,5 mg proteina. Radiooznačeni molekule se odvajaju od slobodnog<125>J upotrebom PD10 (Amersham Pharmacia) kolona prethodno tretiranih sa 0,25 % BSA i ekvilibrisani u PBS. Radioaktivnost uzoraka se utvrđuje upotrebom kristalnog y-brojača (Packard Instruments, Milano, Italija). Ogled imunoreaktivnosti radiooznačenog proteina se obavlja na 200uL ED-B Sefaroza kolone zasićene sa 0.25% BSA u PBS. Poznata količina radiojodovanog antitela, u 200yL 0,25% BSA u PBS, se nanosi na vrh i dopušta se da prodre u kolonu. Kolona se onda ispira sa 1,5 mL 0,25% BSA u PBS da se uklone ne-specifično vezana antitela. Konačno, iminoreaktivni vezani materijal se elutuje upotrebom 1,5 mL 0.IM TEA, pH. 11. Radioaktivnost nevezanog i vezanog materijala izračunava i izračunava se procenat imunoreaktivnih antitela. Imunoreaktivnost je veća od 90%.

Da se dalje analiziraju radiojodovana antitela poznata količina radiooznačenog proteina u 200 uL se napuni na Superdex 200 kolonu. Zpremina zadržavanja različitih proteina ne varira nakon radiojodovanja. Za tri radiojodovana formata L19 antitela i njihove negativne kontrole, vađenje radioaktivnosti iz Superdex 200 kolone je 100% (Slika 3A, 3B i 3C).

Eksperimenti biodistribucije

Da se blokira ne-specifično akumuliranje<125>Joda u stomaku i koncentracija u tiroidi, 30 minuta pre ubrizgavanja radiooznačena antitela miševa oralno primaju 20 mg natrijumperhlorata (Carlo Erba, Italija) u vodi. Ovaj postupak se ponavlja u 24h intervalima tokom trajanja eksperimenata biodistribucije. Miševima koji nose tumor se ubrizgava u repnu venu 0,1 nmola različitih radiooznačenih antitela (korespondirajuče sa 6 ug za swFv-ove, 8 ug za SIP-ove i 18 ug za IgG-ove) u 100 uL slanog rastvora. Tri životinje se ubijaju u određenoj vremenskom trenutku, različiti organi uključujući tumor se isecaju, mere, broje na y-brojaču i onda fiksiraju sa 5% formaldehidom u PBS, pH 7,4, da bi se sproveli postupci mikroautoradiografija, izvedeni prema Tarli et al. (23 1999).

Uzimaju se uzorci krvi takođe za plazma preparat da se utvrdi stabilnost radiooznačenih molekula u krvotoku upotrebom već opisanih testa imunoreaktivnosti i analize gel filtriranja. U oba slučaja upotrebljava se 200 uL plazme. Radioaktivni sadržaj različitih organa se izražava u procentima ubrizgane doze po gramu (%ID/g). Parametri oslobađanja krvi od radiojodovanih antitela se usklađuju sa procedurom minimizacije najmanjih kvadrata, upotrebom Macintosh Program Kaleidagraph-a (Synergy Software, Reading PA, SAD) i jednačine:

X (t) = A eksp (-(alfa t)) + B eksp (-(beta t) gde je

X (t) %ID/g radiooznačenog antitela u vremenu t. Ova jednačina opisuje bi-eksponencijalnog profila oslobađanja krvi, u kojoj je amplitutuda beta eliminacione faze definisana kao B x 100 / (A + B). Alfa i beta su parametri brzine u odnosu na polu-živote korespondirajućih faza oslobađanja krvi. Tl/2 (alfa faza) = ln2/alfa = 0,692 .../alfa Tl/2 (beta faza) = ln2/alfa = 0,692 .../alfa. X (0) se uzima da je jednako sa 405, korespondirajući sa zapreminom krvi od 2,5 mL u svakom mišu.

REZULTATI

Pripremanje antitela

Upotrebom varijabilnih regiona L19 (13 Pini et al., 1998) različitih formata antiteal (scFv, mini-imunoglobulin i kompletni humani IgGl) i njihovog ponašanjain vivou ciljanju tumoralne vaskulature.

Slika 1 prikazuje konstrukte koji se upotrebljavaju da ekspresuju različite L19 formate antitela. Slični konstrukti se pripremaju upotrebom varijabilnih regiona scFv specifičnog za ne-relavantni antigen (Dl.3; 7 McCaffertv; 26 Neri et al. , 1997).

Da se dobiju SIP-ovi i IgGl, SP2/0 mišje mijeloma ćelije se transfektuju sa konstruktom prikazanim na Slici 1 i stabilni transfektomi (proizvodi transfekcije) se odabiru-upotrebom G418. Najbolji proizvođači se utvrđuju sa ELISA i ovi klonovi se proširuju za prečišćavanje antitela. Prečišćavanje sva tri L19 formata antitela se zasnivaju na hromatografiji imunoafiniteta upotrebom rekombinantnog ED-B konjugovanog sa sefarozom. Prinosi su oko 8 mg/L za scFv(L19), 10 mg/L za L19-SIP, 3 mg/L za Ll9-IgGl. Za kontrolu proteina se upotrebljava scFv (Dl.3) specifičan za neh-jaje lizozim, i, upotrebom varijabilnih regiona scFv Dl.3 se konstruiše. Ova dva antitela se prečiste na lizozimu kokošujeg jajeta konjugovanom sa sefarozom. Preinosi su 8 do 5 mg/L, za svaki pojedinačno. Kao kontrola za Ll9-IgGl se upotrebljava komercijalno dostupan humani IgGl/K(Sigma).

SDS-PAGE analiza sva tri prečišćena L19 formata se obavlja, i pod redukovanim i ne-redukovanim uslovima. Za scFV(L19), očigledna masa je, kao što se to i očekuje, oko 28 kDa i. pod redukovanim i ne-redukovanim uslovima (nije prikazano). L19-SIP pokazuje molekularnu masu od oko 80 kDa pod ne-redukovanim uslovima, i ma masu od oko 40 kDa pod redukovanom uslovima. Rezultati demonstriraju da više od 95% matičnog molekula egzistira kao kovalantno-vezani dimer. Ll9-IgGl pokazuje, kao što se i očekuje, glavni pojas od oko 180 kDa pod ne-redukovanim uslovima, dok, pod redukovanim uslovima, pokazano je da dva sloja korespondiraju sa teškim lancem od oko 55 kDa i lakim lancem od oko 28 kDA. Dobijaju se profili elucije tri L19 formata antitela analizirani putem hromatografije isključenja veličine (Superdex 200). U sva tri slučaja opažena je jedna najviša vrednost sa normalnom distribucijom,i predstavlja više od 98%. Upotrebom standardne krive kalibracije, očigledne molekularne mase su 60 kDa za scFv(L19), 80 kDa za L19-SIP i 180 kDa za L19-IgGl. Dodatno tome, molekularni agregati koji su često prisutni u rekombinantnim proteinskim preparatima koji mogu da učine nevažećim rezultate dobijene u in vivo studijama demonstriraju se kao odsutni. SDS-PAGE i hromatografija isključenja veličine (Superdex 200) obavljeni na prečišćenoj kontroli proteina daju slične rezultate.

Upotrebom ova tri različita L19 formata antitela, imunohistohemijske analize se obavljaju na kriostat sekcijama SK-MEL-28 humanog melanoma izazvanog kod golih miševa, i na F9 mišjem tetrakarcinomu izazvanom u 129 soju miševa. Optimalni rezultati se dobijaju pri koncentraciji koja ide toliko nisko do 0,25-0,5 nM. Sva tri prečišćena L19 antitela prepoznaju identične strukture.

In vivo stabilnost radiooznačenih L19 formata antitela

Za in vivo studije biodistribucije, upotrebljavaju se SK-MEL-28 humani melanom i F9 mišji tetrakarcionom. SK-MEL-28 tumor ima relativno sporu brzinu rasta dok, F9 tumor raste brzo (Slika 2). Prema tome, upotreboa SK-MEL-28 tumora omogućava dugotrajne eksperimente (sve do 144h), dok se F9 tumor izaziva za kratke studije biodistribucije (sve do 48h). Svi eksperimenti biodistribucije se obavljaju kada su tumori otprilike 0,1-0,3 cm<3>. Radi upoređivanja različitih formata antitela, ubrizgavaju se ekvimolarne količine (0,1 nmol) u 100 uL sterilnog slanog rastvora. Pre ubrizgavanja, radiojodovana jedinjenja se filitriraju 0,22 um i proverava se imunoreaktivnost i profil gel filtriranja (videti Materijale i postupke). Imunoreaktivnost radiooznačenih proteina je uvek veća od 90%.

Slika 3 A-C daje profile analize gel filtriranja (Superdex 200) radiojodovanih L19 formata antitela.

Uzorci krvi koji se uzimaju od tretiranih životinja u različitim vremenskim intervalima od ubrizgavanja i prisutna radioaktivnost u plazmi se analiziraju na imunoreaktivnost i hromatografijom gel filtriranja. Profili gel filtriranja pokazuju jedan glavni vrh, koji ima molekularnu masu ubrizganog proteina, za sva tri L19 formata antitela. Samo profil scFv otkriva drugi vrh koji ima višu molekularnu masu, sugerišući formiranje agregata (Slika 3 D-F). Dalje, formiranje velike molekularne mase agregata koji se ne elutuju sa Superdex 200 kolone, se primećuje za scFv(L19)2. Tačnije, dok je vađenje sa Superdex 200 kolone 90-100% od nanete radioaktivnosti i za L19-SIP i L19-IgG, prinos napunjene radioaktivnost scFv(Ll9)2 je oko 55%. Ostala radioaktivnost se vadi samo nakon pranja kolone hromatografije sa 0,5M NaOH, dimonstrirajući da su veliki agregati blokirani na filteru kolone (Tabela 1).

Tabela 1 takođe daje rezultate testa imunoreaktivnosti obavljenog u plazmi (videti Materijale i postupke). Tokom trajanja eksperimenata, L19-SIP i L19-IgGl održavaju jednaku imunoreaktivnost u plazmi kao početni reagensi. Nasuprot tome, skoro 3 sata nakon ubrizgavanja imunoreaktivnost scFv(L19)2 u plazmi se smanjuje na manje od 40%.

Komparativni eksperimenti biodistribucije

Tabele 2 a, b, c i Slika 4 daju rezultate dobijene u eksperimentima biodistribucije sa radiooznačenim L19 antitelima u SK-MEL-28 tumoru koji nose miševi.

Tabele 2 a, b, c pokazuju, u različitim vremenima od i.v. ubrizgavanja radiooznačenih antitela, prošek (+SD) od %ID/g tkiva i organa, uključujući tumore.

Na Slici 4 su opisane varijacije %ID/g različitih formata antitela u tumoru (A) i krvi (B) u različitim vremenima eksperimenata, kao i odnose (C) između %ID/g u tumoru i krvi. Sva tri L19 formata antitela selekivno se akumuliraju u tumoru i odnos %ID/g tumora i drugih organa se dat u Tabeli 3.

Kao što je demonstrirano mikroautoradiografijom, antitela se akumuliraju samo na vaskulaturi tumora, dok se ne primećuje akumulacija na vaskulaturi normalnih organa. Nasuprot tome, nije pronađena specifična akumulacija radiojodovanih kontrolnih molekula bilo u tumorima ili normalnim tkivima (Tabele 2 a, b, c).

Sva tri L19 formata antitela pokazuju čišćenje koje je posredovano uglavnom od strane bubrega, kao što se to utvrđuje brojanje uzoraka urina. Kao što se i očekuje, brzina čišćenja je brža za scFv(L19)2 a sporija za kompletni L19-IgGl. Usklađivanje krive sa bioeksponencijalnom funkcijom daje prinos vrednosti polu-života koje su date u Tabeli 4.

Slika 5 opisuje varijacije u %ID/g (±SD) tumora i krvi dobijene sa radiojodovanim scFv(L19)2 i L19-SIP upotrebom F9 teratokarcinom modela tumora. Usled velike angiogenske aktivnost F9 teratokarcinoma, akumulacija radioaktivnih molekula u ovom tumoru je 3 do 4 puta veća, 3 i 6 h nakon i.v. ubrizgavanja nego u SK-MEL-28 tumoru i stalno je veća tokom 48-časovnog trajanja eksperimenta. Kao i za SK-MEL-28 tumor, putem mikroautoradiografije potvrđena je specifična akumulacija u vaskulaturi tumora, dok nije viđena nikakva specifična akumulacija u tumoru nakon ubrizgavanja kontrolnih molekula. U Tabeli 5 su dati %ID/g od L19(scFv) i L19SIP, u različitim vremenskim tačkama ankon i.v. ubrizgavanja u F9 tumore i druge organe.

Sinteza redukovanog L19- SIP

Rastvoru od 375 ug (5 nmol) L19-SIP u 422 uLK PBS se doda 50uL TCEP-rastvora (14,3mg TCEPxHCl/5mL vodenog Na2HP04, 0,1M, pH = 7,4). Reakciona smeša se nežno mućka lh na 37°C. Redukovani L19-SIP se prečisti gel-hromatografijom upotrebom NAP-5 kolone (Amersham, Eluant: PBS). SDS-PAGE analiza izolovanog proizvoda dokazuje kvantitativnu transformaciju L19-SIP do redukovanog L19-SIP.

Prinos: 100,3ug/200uL PBS (26,7%).

Sinteza Tc- 99m- L19- SIP

3,0 mg dinatrijum-L-tartrata se postavi u posudu praćeno dodavanjem 100,3uf redukovanog L19-SIP u 200uL PBS i rastvor se razbaži sa lOOuL Na2HP04-puf erom (IM, pH = 10,5). Dodaju se 85uL Tc-99m generator eluata (24h) i lOuL SnCl2-rastvora (5mg SnCl2/lmL 0,1M HC1). Reakciona smeša se mućka 0,5h na 37°C. Tc-99m-označeni L19-SIP se prečišćava gel-hromatograf i j om upotrebom NAP-5 kolone (Amersham, Eluant:

PBS) .

Sinteza Tc- 99m- MAG2- L19- SIP karboksi metil- t- butil disulfida

Rastvor 21,75mL (0,312 mol) 1-markapto-sirćetne kiseline, 43,5mL (0,312mol) trietilamina i lOOg (0,312mol) N-(terc-butiltio)-N-N'-di-BOC-hidrazina u 11 EtOH (aps.) se zagreva pod refluksom (N2-atmosfera) 60h. EtOH isparava pod redukovanim pritiskom do konačne zapremina od oko 200 mL. Ostatak se sipa u 1,81 H20 i pH rezultirajuće suspenzije se podešava na 7,14 upotrebom 5 molarnog NaOH. Di-BOC-hidrazin se odvaja filtriranjem i pH rezultirajućeg rastvora se podesi na 2,2 upotrebom polu-koncentrovane HC1. Sirovi materijal se ekstrakuje iz vode 3x sa 600 ml, CH2C12. Kombinovani organski slojevi se osuše preko MgS04i rastvarač isparava pod redukovanim pritiskom dajući prinos od 41,1 g (80%) kao žuto ulje. Materijal je dovoljno čist za dalju sintezu.

N- ( benziloksikarbonil- Gly) Gly t- butil estar ( Z-( N- Gly) Gly

t- butil estar

Rastvor od 35,02g (114mmol) Z-Gly-Osukcinimida i 15g (114mmol) Gly-0-<t>Bu u 1,41 CH2C12se meša pod N2-atmosferom na sobnoj temperaturi 20h. Organski sloj se opere 3x sa 250mL 1% vodene limunove kiseline, 2x sa 200mL polu-zasićenog vodenog NaHC03i lx sa 200mL vode. Organski sloj se osuši preko anhidrovanog MgS04. Isparavanje CH2C12pod redukovanim pritiskom daje prinos od 36,5g (99%) Z-Gly-Gly-0-fcBu kao žuto ulje. Sirovi materijal je dovoljno čist za dalju sintezu.

Gly- Gly t- butil estar

36,5g (113 mmol) Z-Gly-Gly-0<t>Bu se rastvori u 11 THF praćeno dodavanjem 3,65 g paladijuma na uglju (10%). Smeša se meša pod H2atmosferom (latm) tokom 3h na sobnoj temperaturi. Suspenzija se pročisti sa N2, filtrira (PTFE-filter: 0,45um) i filtrat se koncentriše pod redukovanim pritiskom dajući prinos od 20,3g (95%) Gly-Gly-0-<t>Bu kao žuto ulje. Sirovi proizvod je dovoljno čist za dalju sintezu.

Karboksi metil- t- butil disulfid glicil glicin t- butilestar

Rastvor od 23,85g (115,6 mmol) DCC u 430 mL CH2C12se u kapima doda rastvoru od 21,76 g (115,6 mmol) Gly-Gly-0-<t>Bu, 20,84 g (115,6 mmol) karboksi metil-t-butil disulfida i 13,3 g (115,6 mmol) NHS u 1L CH2C12. Rezultirajuća suspenzija se meša preko noći pod N2-atmosferom na sobnoj temperaturi. Nakon filtriranja rezultirajući rastvor se opere 3x sa 400mL polu-zasićenog vodenog NaHC03i lx sa 400mL vode. Osušeni organski sloj (MgS04) isparava pod redukovanim pritiskom. Sirovi proizvod se prečisti hromatografijom na silika gelu upotrebom rastvarač gradijenta u rasponu od CH2Cl2/MeOH 99:1 do CH2Cl2/MeOH 98,5:1,5. Izoluje se 26,lg (64%) kao žuto ulje.

Merkaptoacetil glicil glicin

26,32g (75,09mmol) karboksi metil-t-butil-disulfid glicil glicin t-butil estra se rastvara u 233mL TFA pod N2-atmosferom. Rezultirajući sastav se meša 20 minuta na sobnoj temperaturi. TFA isparava pod redukovanim pritiskom (5-10 x 10~<2>mbar) i rezultirajuće ulje se osuši pod mešanjem dodatnih 2h (5-10 x 10~<2>mbar). Nakon dodavanja 250 mL Et20 beli taloži se beli prah i suspenzija se meša 3h. Materijal se odvaja filtriranjem i ponovo suspenduje u lOOmL Et20. Rezultirajuća suspenzija se meša preko noći, proizvod se odvaja filtriranjem i materijal se osuši na sobnoj temperaturi pod redukovanim pritiskom dajući prinos 20,46g (92,5%) kao beli prah.

Merkaptoacetil glicil glicin NHS estar

Merkaptoacetil glicil glicin (lg, 3,4 mmol) i N-hidroksisukcinimid (391 mg, 3,4 mmol) se kombinuju u suvoj bočici sa okruglim dnom i rastvaraju se u anhidrovanom DMF (4 mL). DCC (700 mg, 3,4 mmol) u anhidrovanom dioksanu (2 mL) se doda tkom mešanja reakcione smeše.Uokviru 15 minuta talog (DCU) započinje da se formira. Nakon 1 sat talog se uklanja vakuum filtriranjem. Talog se opere sa hladnim dioksanom. Dioksan se uklanja iz filtrata. Proizvod se taloži iz preostalog DMF rastvora dodavanjem dietiletra. Proizvod se izoluje filtriranjem, opere sa hladnim dietiletrom, i osuši u vakuum eksikatoru preko noći. Prinos: 1,33 (99%).

Sinteza Tc- 99m- MAG2- £- HN ( Lys) - L19- SIP

200 ug (2,66 nmol) ne-redukovanog L19-SIP u 111 uL PBS se razblaži sa 300 uL natrijum borat pufera (0,1M, pH 8,5) i dijalizuje 2 x 1 h sa 200 mL fosfat pufera (0,1M, pH8,5) upošljavanjem Slide-A-Lazer 10,000 MWCO (Pierce Inc., Rockford, IL, SAD). 50 uL merkaptoacetil glicil glicin NHS estar rastvora (0,50 mg rastvoreno u 500 uL fosfat pufera, 0,1M, pH 8,5)se doda i reakciona smeša se zagreva 3 h na 37°C. Reakciona smeša se dijalizuje 2xlhilxl7h (preko noći) sa 200 mL fosfat puferom (0,1M, pH 8,5) svaki put, upošljavanjem Slide-A-Lazer 10,000 MWCO (Pierce Inc., Rockford, IL, SAD). 3,0 mg dinatrijum-L-tartrata se doda posudi prećeno dodavanjem 90 uL Tc-99m generator eluata (eluirano dnevno) i doda se 25uL SnCl2-rastvora (5mg SnCl?/lmL 0,1M HC1). Reakciona smeša se mućka 0,5h na 37°C. Tc-99m-označeni L19-SIP se prečisti gel-hromatografijom upotrebom NAP-5 kolone (Amersham, Eluent: PBS).

Specifična aktivnost: 15,2 MBq/nmol.

Imunoreaktivnost: 81, 1% Sinteza Re- 188- L19- SIP

3,0 mg dinatrijum-L-tartrata postavljenog u posudu praćeno dodavanjem 150ug redukovanog L19-SIP-SH u 310uL PBS i rastvor se razblaži sa lOOuL vodenog Na2HP04-puferom (IM, pH = 10,5). Dodaje se lOOuL Re-188 generator eluata i 50uL SnCl2-rastvora (5mg SnCL2/lmL 0,1M HC1). Reakciona smeša se mućka l,5h na 37°C. Re-188-označeni L19-SIP se prečisti gel-hromatografijom upotrebom NAP-5 kolone (Amersham, Eluent: PBS).

Sinteza redukovanog L19- SIP za specifičnu konjugacij u EDTA,

CDTA, TETA, DTPA, TTHA, HBED, DOTA, NOTA, D03A, i helatora

sličnog tipa za Cistein- SH grupu

50uL TCEP-rastvora (14,3mg TCEPxHCl/5mL vodenog Na2HP04, 0,1M, pH = 7,4) se doda rastvoru 375ug (5 nmol) L19-SIP u 422uL PBS. Reakciona smeša se nežno mućka lh na 37°C. Redukovani L19-SIP se prečisti gel-hromatografijom upotrebom NAP-5 kolone (Amersham, Eluent: natrijumacetat pufer, 0,1M, pH 5,0). SDS-PAGE analize izolovang proizvoda dokazuju kvantitativnu transformaciju L19-SIP u redukovani L19-SIP. Prinos: 105,7ug/200uL (28,2%).

Sinteza In- 111- MX- DTPA~ Maleimid- S ( Cys) - L19- SIP- R

( R = redukovan)

105 ug (2,8 nmol) redukovanog L19-SIP u 200 uL natrijumacetat pufera (0,IM, pH 5) reaguje sa 50ul rastvorenog 1,4,7-triaza-2-(N-maleimido etilen p-amino)benzil-1,7-bis(karboksimetil)-4-karboksimetil 6-metil heptana (0,25mg DTPA-Maleimida u 500uL natrijumacetat pufera 0,1MpH5) 3 h na 37°C. Reakciona smeša se dijalizuje 2x1 h sa 200mL natrijumacetat pufera (0,1M, pH 6) upošljavanjem Slide-A-Lyzer 10,000 MWC0 (Pierce Inc., Rockford, IL, SAD). Doda se 80 uL [In-lll]InCl3rastvora (HC1, IN, 40 MBq, Amersham Inc.) i reakciona smeša se zagreva na 37°C tokom 30 minuta.

In-11 označeni DTPA-Maleimid-S(Cys)-L19-SIP se prečisti gel-hromatografijom upotrebom NAP-5 kolone (Amersham, Eluent: PBS).

Sinteza MX- DTPA- Maleimid ( 1, 4, 7'- triaza- 2-( N- maleimido

etilen p- amino) benzil- 1, 1- bis ( karboksimetil)- 4-

karboksimetil 6- metil heptan)

512 mg (1 mmol) {[3-(4-amino-fenil)-2-(bis-karboksimetil-amino) propil]-[2- (bis-karboksimetil-amino) -propil]-amino}-sirćetne kiseline (Macrocyclics Inc. Dallas, TX, SAD) i 707mg (7 mmol) trietilamina se rastvori u 3 mL suvog DMF. 400 mg (1,5 mmol) 3-(2,5-diokso-2,5-dihidro-pirol-l-il)-ppropionska kiselina 2,5-diokso-pirolidin-l-il estra (Aldrich) u 1 mL suvog DMF se doda ukapanjem. Rastvor se meša 5 h na 50°C. Polako se doda 30 mL dietiletra. Reakciona smeša se meša daljih 30 min. Talog se sakuplja filtriranjem. Sirovi proizvod se prečisti sa RP-HPLC (acetonitril- : voda- : trifluorosirćetna kiselina / 3 : 96,9 : 0,1 -> 99,9 : 0 : 0,1). Prinos: 61% (405 mg, 0,61 mmol). MS-ESI: 664 = M<+>+1.

Sinteza In- lll- MX- DTPA- £- HN( Lys) - L19- SIP

200 ug (2,66 nmol) ne-redukovanog L19-SIP u 111 uL PBS se razblaži sa 300 uL natrijum borat pufera (0,1M, pH 8,5) i dijalizuje se 2 x 1 h sa 200 mL natrijum borat pufera (0,1M, pH 8,5) upošljavanjem Slide-A-Lyzer 10,000 MWCO (Pierce Inc., Rockford, IL, SAD). 50 uL 1,4,7-triaza-2-(p-izotiocijanato)benzil-1,7-bis(karboksimetil)-4-karboksimetil-6-metil heptan (MX-DTPA) rastvora (0,33 mg MX-DTPA rastvoren u 500 uL natrijum borat pufera, 0,1M, pH 8,5) se dodaje i reakciona smeša se zagreva 3 h na 37°C. Reakciona smeša se dijalizuje 2xlhilxl7h (preko

noći) sa 200 mL natrijumacetat pufera (0,1M, pH 6,0) svaki put, upošljavanjem Slide-A-Lyzer 10,000 MWCO (Pierce Inc., Rockford, IL, SAD). 80 uL [In-lll]InCl3rastvora (HC1, IN, 40 MBq, Amersham Inc.) se doda i reakciona smeša se zagreva na 37°C 30 min. In-111 označeni MX-DTPA-s-HN(Lys)-L19-SIP se prečisti gel-hromatograf i j om upotrebom NAP-5 kolone (Amersham, Eluent:

PBS) .

Sinteza In- 111 - DOTA- C- Benzil- p- NCS - e- HN( Lys)- L19- SIP

200 ug (2,66 nmol) ne-redukovanog L19-SIP u 108 uL PBS se razblaži sa 300 uL natrijum borat pufera (0,1M, pH 8,5) i dijalizuje 2 x 1 h sa 200 mL natrijum borat pufera (0,1M, pH 8,5) upošljavanjem Slide-A-Lyzer 10,000 MWCO (Pierce Inc., Rockford, IL, SAD). Dodaju se rastvoru 50 uL 1,4,7,10 tetraaza-2-(p-izotiocijanato)benzil ciklododekan-1,4,7,10-tetrasirćetne kiseline (benzil-p-SCN-DOTA, Macrocyclics Inc., Dallas TX, SAD), rastvor (1,5 mg benzil-p-SCN-DOTA rastvoren u 5 mL natrijum borat pufera, 0,1M, pH8,5) i reakciona smeša se zagreva 3 h na 37°C. Reakciona smeša se dijalizuje 2xlhilxl7h (preko noći) sa 200 mL natirjumacetat pufera (0,1M, pH 6,0) u svakom slučaju,

upošljavanjem Slide-A-Lyzer 10,000 MWCO (Pierce Inc., Rockford, IL, SAD).

80 uL [In-lll]InCl3rastvora (HC1, IN, 40 MBq, Amersham Inc.) se doda i reakciona smeša se zagreva na 37°C 30 min. In-111 označeni DOTA-C-Benzil-p-NCS-s-HN(Lys)-L19-SIP se prečisti gel-hromatografijom upotrebom NAP-5 kolone (Amersham, Eluent: PBS).

Sinteza Y- 88- MX- DTPA- s- HN( Lys)- L19- SIP

200 ug (2,66 nmol) ne-redukovanog L19-SIP u 108 uL PBS se razblaži sa 300 uL natrijum borat pufera (0,1M, pH 8,5) i dijalizuje 2 x 1 h sa 200 mL natrijum borat pufera (0,1M, pH 8,5) upošljavanjem Slide-A-Lyzer 10,000 MWCO (Pierce Inc., Rockford, IL, SAD). Dodaje se 50 uL MX-DTPA rastvora (0,33 mg MX-DTPA rastvoren u 500 uL natrim borat pufera, 0,1M, pH 8,5) i reakciona smeša se zagreje 3 h na 37°C. Reakciona smeša se dijalizuje 2xlhilxl7h (preko noći) sa 200 mL natrijumacetat pufera (0,1M, pH 6,0) u svakom slučaju, upošljavanjem Slide-A-Lyzer 10,000 MWCO (Pierce Inc., Rockford, IL, SAD).

100 uL [Y-88]YC13rastvora (HCL, IN, 75 MBq, Oak Ridge National Lab.) se dodaje i reakciona smeša se zagreje na

37°C 30 min. Y-88 označeni MX-DTPA-s-HN(Lys)-L19-SIP se prečisti gel-hromatografijom upotrebom NAP-5 kolone (Amersham, Eluent: PBS).

Sinteza Lu- 111 - DOTA- C- Benzil- p- NCS - e- HN( Lys) - L19- SIP

200 ug (2,66 nmol) ne-redukovanog L19-SIP u 120 uL PBS se rastvori sa 300 uL natrijum borat pufera (0,1M, pH 8,5) i dijalizuje 2 x 1 h sa 200 mL natrijm borat pufera (0,1M, pH8,5) upošljavanjem Slide-A-Lyzer 10,000 MWC0 (Pierce Inc., Rockford, IL, SAD). Dodaje se 50 uL benzil-p-SCN-DOTA rastvor (1,5 mg rastvoren u 5 mL natrijum borat pufera, 0,1M, pH 8,5) i reakciona smeša se zagreje 3 h na 37°C. Reakciona smeša se dijalizuje 2xlhilxl7h (preko noći) sa 200 mL natrijumacetat pufera (0,1M, pH 6,0) u svakom slučaju, upošljavanjem Slide-A-Lyzer 10,000 MWCO (Pierce Inc., Rockford, IL, SAD).

200 uL [Lu-177]LuCl3rastvora (HC1, IN, 80 MBq, NRH-Petten, Holandija) se dodaje i reakciona smeša se zagreva na 37°Ctokom 30 min. Lu-177 označeni DOTA-C-Benzil-p-NCS-s-HN(Lys)-L19-SIP se prečisti gel-hromatografijom upotrebom NAP-5 kolone (Amersham, Eluent: PBS).

Distribucija u organima i izlučivanje In- 111- MX- DTPA- L19-SIP nakon jednog i. v. ubrizgavanja u gole miševe koji nose

tumor

Označeni peptidi pronalaska se ubrizgaju intravenozno u dozi od oko 37 kBq u životinje koje nose F9 (teratokarcinom)(telesna težina oko 25 g). Koncentracija radioaktivnosti u različitim organima, i radioaktivnost u izlučevini, se meri upotrebom y brojača u različitim vremenskim tačkama nakon davanja supstance.

Biodistribucija In-lll-MX-DTPA-L19-SIP u golim miševima koji nose F9 (teratokarcinom) je prikazana u Tabeli 6.

Distribucija u organima i izlučivanje Tc- 99m- L19- SIP nakon

jednog i. v. ubrizgavanja u gole miševe koji nose tumor

Označeni peptidi se ubrizgavanju intravenozno u dozi od oko 56 kBq u životinje koje nose F9 (teratokarcinom) (telesna težina oko 25 g). Koncentracija radioaktivnosti u različitim organima, i radioaktivnost u izlučevinama se meri upotrebom y brojača u različitim vremenskim tačkama nakon davanja supstance. Dodatno tome, pronađen je odnos tumor prema krvi u različitim vremenskom tačkama na osnovu koncentracije peptida u tumoru i krvi.

Biodistribucija Tc-99m-L19-SIP u golim miševima koji nose F9 (teratokarcinom) (srednja vrednost + SD, n=3) je prikazana u Tabeli 8.

Radiooznačeni peptidi dokazuju da poseduju povoljne osobine u životinjskim eksperimentima. Na primer, Tc-99m-L19-SIP i In-lll-MX-DTPA-s-HN(Lys)-L19-SIP prikazuje visoku akumulaciju u tumoru od 17,2 (Tc-99m) ili 12,9 (In-111) % ubrizgane doze po gramu (ID/g) na 1 sat posle ubrizgavanja (p.i.). Zabaleženo je značajno zadržavanje tumora od 9,4 (Tc-99m) ili 13,0 (In-111) % ID/g na 24 sata p.i.. Tako, unošenje u tumor je značajno veće upoređeno sa drugim poznatim In-111 ili Tc-99m označenim fragmentima antitela (n.pr., Kobayashi et al., J. Nuc. Med., Vol. 41(4), pp. 755 - 762, 2000; Verhaar et al., J. Nuc. Med., Vol. 37(5), pp. 868 - 872, 1996). Čišćenje jedinjenja iz krvi vodi do tumor/krv odnosa od 13:1 i 6:1 svaki posebno, na 24 h p.i..

Najznačajnije In-lll-MX-DTPA-e-HN(Lys)-L19-SIP prikazuje značajno niži unos u bubreg i zadržavanje (22,5% ID/g) nego drugi sa In-111 označeni rekombinantni fragment antitela koji se vu velikoj meri zadržava (120% ID/g) kao što je opisano od strane Klobayashi et al. na 24 h p.i. Zadržavanje u bubregu je vrlo uobičajen problem i uobičajeno škodi upotrebi lantanid označenim jedinjenjima u radioterapij i.

Eksperimentalni rezultati demonstriraju odličan potencijal radioimunokonjugata koji su ovde opisani za dijagnostičke i terapeutske primene, pretpostavljeno unete u pacijenta parenteralnim davanjem.

RAZMATRANJE

Obzervacija da citotoksični antikancerni lekovi lokalizuju efikasnije u normalnim tkivima nego u tumorima (37 Bosslet et al., 1998) ubrzala je talas studija koje istražuju mogućnost selektivne isporuke leka tumorima. Efektivno ciljanje tumora, ipak, ima dva glavna rekvizita: 1) cilj u tumoru koji je specifičan, obilan, stabilan i lako dostupni za ligand molekule koji dolaze u krvotok, i 2) ligand molekul sa odgovarajućim farmakokinetičkim osobinama koji je lako može difuzovati iz krvotoka ka tumor i sa visokim afinitetom za cilj da se obezbedi njegovo efikasno i selektivno akumuliranje u tumoru.

Zbog svojih distinktivnih karakteristika mikrookruženje tumora je moguće pan-tumoralna meta. U stvari, progresija tumora izaziva (i potom su joj potrebne) značajne modifikacije u komponentama mikro-okruženja tumora, posebno one u ekstracelularnoj matrici (ECM). Molekuli koji čine ECM čvrstih tumora razlikuju se i kvantitativno i kvalitativno od onih kod normalnog ECM. Šta više, mnogi od ovih tumor ECM komponenti se dele od strane svih čvrstih tumora, računajući na opšte osobine i funkcije kao što je invazija ćelija (i normalnih ćelija i tumornih tkiva i ćelija kancera u normalnim tkivima) i angiogeneza.Od brojnih molekula koji čine modifikovani tumor ECM, sadašnji pronalazači su fokusirali pažnju na FN izoformu koja sadrži ED-B domen (B-FN).

B-FN je široko ekspresovan u ECM svih čvrstih tumora koji su do sada testirani i konstantno je povezan sa angiogenskim procesima (22 Castellani et al., 1994), ali se inače ne može detektovati u normalnim odraslim tkivima (17 Carnemolla et al., 1989). Ciljana isporuka terapeutskih sredstava subendotelijalnom ECM prevazilazi probleme koji su povezani sa interstitialnom hipertenzijom čvrstih tumora (38 Jain et al. 1988; 39 Jain, 1997; 40 Jain RK, 1999).

L19 (13 Pini et al. 1998; 25 Viti, Canc.Res., 23 Tarli, et al., 1999), scFv sa visokim afinitetom (Kd=5, 4xl0"~nM) za ED-B domen FN-a, selektivno i efikasno se akumulirain vivooko tumorne neo-vaskulature i sposoban je da selektivno transportuje i koncentriše u tumoru masu bilo kod od brojnih terapeutskih molekula za koji je konjugovan (28 Birchler et al., 1999; 29 Nilsson, et al., 2001; 30 Halin et al., 2002; 31 Carnemolla et al., 2002). Sposobnost L19 da selektivno cilja tumore je takođe demonstrirana kod pacijenata koji koriste scinigrafičke tehnike.

Sadašnji opis izveštava o označavanju malog imunoproteina (SIP) sa radioizotopima, upotrebi radiooznačenog SIP, i performansama i farmakokinetici tri različita L19 formata humanog antitela u vaskularnom ciljanju tumora: scFv, mini-imunoglobulin/mali imunoprotein i kompletni humani IgGl. SIP molekul se dobija spajanjem scFv(L19) za eCH4 domen sekretorne izoforme S2humanog IgE. sCH4 je domen koji dopušta dimerizaciju IgE molekula i S2izoforma sadrži cistein na COOH završetku koji kovalentno stabilizuje dimer kroz interlančanu disulfidnu vezu (35 Batista et al., 1996). IgE vezujući položaji za FcsRI su smešteni u CH3 domenu (41 Turner and Kinet, 1999; 42 Vangelista et al., 1999; 43 Garman et al., 2000), tako da scFv spojen za sCH4 domen u skladu sa realizacijama sadašnjeg pronalaska ne aktivira bilo koje signaliziranje koje vodi do reakcija hipersenzitivnosti.

Proučava se rad ova tri formata u dva različita modela tumora kod miša: U mišjem F9 teratokarcinomu i humanom SK-MEL-28 melanomu. Prvi je tumor sa brzim rastom koji, kada se jednom implantira, ubija životinje za oko dve nedelje. SK-MEL-28 tumor, na drugoj strani, prikazuje vifaznu krivu rasta, sa ranom, brzom, fazom rasta praćenu sa drugom, sporijom, fazom. Prethodno je pokazano da količina ED-B u F9 teratokarcinomu ostaje stabilna tokom rasta tumora (23 Tarli, et al., 1999); nasuprot tome, ED-B se akumulira u SK-MEL-28 melanomu proporcionalno sa sposobnošću tumora da raste (23 Tarli et al., 1999), sa obilnim ED-B koji je pronađen u prvoj fazi i manjom količinom u drugoj. Upotreba SK-MEL-28 melanoma tumora dopušta dugotrajne studije biodistribucije bez dramatičnih varijacija tumorne mase (Slika 2) koja može da dovede do povećanja pogrešne interpretacije rezultata.

Komparativne studije tri L19 formata antitela u pogledu stabilnostiin vivopokazuje da L19-SIP i L19-IgGl održavaju tokom trajanja eksperimenata (144h), istu imunoreaktivnost i molekularnu masu u plazmi kao i pre ubrizgavanja. Nasuprot tome, scFv(L19) brzo gubi svoju imunoreaktivnost u palzmi i generiše agregate koji su isuviše veliki da prodru u kolonu hromatografije gel filtriranjem. Takva agregacija scFv je najverovatnije odgovorna za odnos između %ID/g tumora i pluća, pošto agregati mogu da se akumuliraju u mikrovaskulaturi pluća (Tabela 3). Za sva tri formata, čišćenje krvi je posredovano putem bubrega, prikazujući bifaznu krivu sa a i P fazom, kako je dato u Tabeli 4, što je obrnuto proporcionalno molekularnoj veličini.

Akumuliranje različitih formata antitela u tumorima koji se proučavaju je konsekvenca brzine čišćenja iin vivostabilnosti molekula. Upotrebom scFv, maksimalni procenat ubrizgane doze po gramu (%ID/g) je primećen 3h nakon ubrizgavanja radiooznačenog antitela i poto se brzo smanjuje. Upotrebom SIP, %ID/g u tumorima je 2-5 puta viša neko od scFv, dostižući maksimum 4-6 sati nakon ubrizgavanja. Ovaj obrazac je primećen i kod F9 i SK-MEL-28 tumora. Nasuprot tome, akumiliranje IgGl u tumorima se povećava konstantno tokom eksperimenata. Ipak, zbog njegovo sporog čišćenja, tumor-krv odnos %ID/g nakon 144 sata je samo oko 3, upoređeno sa odnosom od 10 za scFV i 70 za SIP nakon istog perioda vremena (Slika 4).

Iste distinktivne osobinein vivostabilnosti, čišćenja i ovavljanja ciljanja tumora prikazane od tri formata antitela koji se ovde proučavaju mogu se iskoristiti za različite dijagnostičke i/ili terapeutske svrhe, u zavisnosti od kliničkih potreba i bolesti. Na primer, radiooznačena antitela koja pokazuju dobre tumor-organ i tumor-krv odnose ubrzo nakon ubrizgavanja su neophodna zain vivodijagnostičku imunoscintigrafiju, uglavnom zbog kratkog polu-života izotopa i upotrebljavaju se u takvoj analizi.

Različiti pristupi su mogući kod upotrebe antitela kao nosača za terapeutska sredstva: isporuka supstanci koje prikazuju svoja terapeutska dejstva nakon dostizanja njihovih meta (n.pr., fotosenzibilatori koji se aktiviraju samo tek kada stignu do meta), za koje je relevantna apsolutna količina koja se isporučuje tumoru; isporuka supstanci koje vrše njihova terapeutska i toksična dejstva i pre nego što stignu do mete (n.pr., p-emiter Itrijum-90), kojima posebno pažnja mora biti data odnosu površine pod krivama akumulacije u tumoru i krvi kao funkcija vremena, da bi se minimizirala sistemska toksičnost i da se maksimizuje anti-tumorno terapeutsko dejstvo.

L19-SIP, na primer, izgleda da nudi najbolji kompromis molekularne stabilnosti, brzine čišćenja i akumulacije u tumoru. Slični fuzioni proteini sastavljeni od scFv fragmenata antitela vezanih za dimerizujući domen su već opisani (44 Hu et al., 1996; 33 Li et al. , 1997), ali u oba slučaja humani ylCH3 se uptrebvljava kao dimerizujući domen. Upotreba humanog eS2CH4 domena obezbeđuje lakn način dobijanja kovalentne stabilizacije dimera. Dodatno tome, disulfidni most koji se formira od strane C-krajnjeg cistein ostataka može biti lako redukovan u dovoljno blagim uslovima da se sačuva celokupna struktura molekula, tako obezbeđujući reaktivne grupe kojima se lako pristupa za radiooznačavanje ili hemijsku konjugaciju. Ova karakteristika izgleda posebno obećavajuća u pogledu kliničkog potencijala.

L19-IgGl se sakuplja obilno u tumorima, i iako ovo akumuliranje ima nedostatke usled spore brzine čišćenja u kriv, postupak iz tri koraka da se uklone cirkulišuća antiela se može upotrebiti da se dopusti njegova upotreba ne samo u terapeutske svrhe veš takože i za dijagnostičku imunoscintigrafiju (45 Mangani et al., 2000).

Claims (28)

1. Specifični vezujući član koji vezuje humani ED-B,naznačen time,što je specifični vezujući član označen izotopom odabranim od grupe koja se sastoji od<76>Br,7<7>Br, 123J, 124J,131Ji21<1>At i sadrži antigen-vezujući položaj koji sadrži VH domen antitela i VL domen antitela, pri čemu je VH domen antitela odabran od grupe koja se sastoji od L19 VH domena, i VH domen se sastoji od VH CDRl, VH CDR2 i VH CDR3, pri čemu VH CDR3 je L19 VH CDR3 sa SEQ ID NO. 3, VH CDRl je opciono L19 VH CDRl sa SEQ ID NO. 1, i VH CDR2 je opciono L19 VH CDR2 sa SEQ ID NO. 2; i pri čemu je VL domen ■antitela opciono odabran od grupe koja se sastoji od L19 VL domena, i VL domen se sastoji od VL CDRl, VL CDR2 i VL CDR3, pri čemu VL CDR3 je L19 VL CDR3 sa SEQ ID NO. 6, VL CDRl je opciono L19 VL CDRl sa SEQ ID NO. 4, i VL CDR2 je opciono L19 VL CDR2 sa SEQ ID NO. 5; gde su L19 VH domen i L19 VL domen sekvence otkrivene u Pini et al., (1998) J.Biol. Chem. 273: 21769-21776; pri čemu specifični vezujući član sadrži mini imunoglobulin koji sadrži navedeni VH domen antitela i VL domen antitela spojen sa£S2-CH4 i dimerizovan ili sadrži celi IgGl antitelo molekul.

2. Specifični vezujući član prema zahtevu 1,naznačen time,što sadri VH CDR-ove sa sekvencama amino kiseline SEQ ID N0.1, SEQ ID NO. 2 i SEQ ID NO. 3, čiji se specifični vezujući član takmiči za vezivanje za ED-B sa ED-B-vezujućim domenom antitela koje sadrži L19 VH domen i L19 VL domen.

3. Specifični vezujući član prema zahtevu 1 ili zahtevu2, naznačen time,što sadrži L19 VH domen.

4. Specifični vezujući član prema zahtevu 3,naznačen time,što sadrži L19 VL domen.

5. Specifični vezujući član prema bilo kom od prethodnih zahteva,naznačen time,što je mini-imunoglobulin koji sadrži ss2-CH4 .

6. Specifični vezujući član prema zahtevu 5,naznačen time,što su VH domen antitela i VL domen antitela u okviru scFV antitelo molekula spojeni za sS2-CH'4 .■

7. Specifični vezujući član prema zahtevu 6,naznačen time,što je scFv antitelo molekul spojen sa es2-CH4 putem linker peptida.

8. Specifični vezujući član prema zahtevu 7,naznačen time,što linker peptid ima sekvencu amino kiseline GGSG (SEQ ID NO. 7).

9. Specifični vezujući član prema bilo kom od zahteva 1 do 4,naznačen time,što sadrži celi IgGl antitelo molekul.

10. Specifični vezujući član prema bilo kom od zahteva 1 do 9,naznačen time,što je izotop 131J.

11. Postupak proizvodnje specifičnog vezujućeg č]ana prema bilo kom od zahteva 1 do 10,naznačen time,što se postupak sastoji od označavanje specifičnog vezujućeg člana sa izotopom odabranim od grupe koja se sastoji od<76>Br,<77>Br, 123J, 124J, 131Ji211At.

12. Postupak prema zahtevu 11,naznačen time,što se označavanje sastoji od oksidiranja halogenida odabranog od grupe koja se sastoji od<76>Br~,77Br~,<1>23J",124J~,131J"i<211>At~ u prisustvu specifičnog vezujućeg člana.

13. Postupak prema zahtevu 11,naznačen time,što se označavanje sastoji od konjugovanja aktiviranog bi-funkcionalnog halogen nosača koji sadrži radioizotop odabran od grupe koja se sastojiod<76>Br,<77>Br,<1>23J,124J,131Ji21<1>At za lizin ili cistein ostatak ili za N završetak specifičnog vezujućeg člana.

14. Postupak prema bilo kom od zahteva 11 do 13,naznačen time,što se postupak sastoji od ekspresovanja nukleinske kiseline koja kodira specifični vezujući član pre označavanj a.

15. Postupak prema zahtevu 14,naznačen time,što se sastoji od kultivisanja ćelija domaćina pod uslovima proizvodnje specifičnog vezujućeg člana.

16. Postupak prema bilo kom od zahteva 11 do 15,naznačen time,što se dalje sastoji od izolovanja i/ili prečišćavanja specifičnog vezujućeg člana.

17. Postupak prema bilo kom od zahteva 11 do 16,naznačen time,što se dalje sastoji od formulisanja specifičnog vezujućeg člana u sastav koji uključuje bar još jednu dodatnu komponentu.

18. Postupak prema bilo kom od zahteva 11 do 17,naznačen time,što se dalje sastoji od vezivanja specifičnog vezujućeg člana za ED-B ili fragment ED-B.

19. Postupak,naznačen time,što se sastoji od vezivanja specifičnog vezujućeg člana koji vezuje ED-B prema bilo kom od zahteva 1 do 10 sa ED-B ili fragmentom ED-B.

20. Postupak prema zahtevu 18 ili zahtevu 19,naznačen time,što se navedeno vezivanje obavljain vivo.

21. Postupak prema bilo kom od zahteva 18 do 20,naznačen time,što se sastoji od utvrđivanja količine vezivanja specifičnog vezujućeg člana za ED-B ili fragment ED-B.

22. Sastav,naznačen time,što se sastoji od specifičnog vezujućeg člana prema bilo kom od zahteva 1 do 10, za upotrebu u postupku lečenja humanog ili životinjskog tela terapij om.đ

23. Sastav prema zahtevu 22,naznačen time,što se upotrebljava u postupku lečenja organa sa patološkom angiogenezom.

24. Sastav prema zahtevu 22,naznačen time,što se upotrebljava u postupku lečenja tumora.

25. Sastav prema bilo kom od zahteva 1 do 10,naznačen time,što se upotrebljava u postupku dijagnoze.

26. Upotreba specifičnog vezujućeg člana prema bilo kom od zahteva 1 do 10 u proizvodnji medikamenta za lečenje organa sa patološkom angiogenezom.

27. Upotreba specifičnog vezujućeg člana prema bilo kom od zahteva 1 do 10 u proizvodnji medikamenta za lečenje tumora.

28. Upotreba specifičnog vezujućeg člana prema bilo kom od zahteva 1 do 10 u proizvodnji dijagnostičkog reagensa.