RS20060266A - Flp posredovana rekombinacija - Google Patents

Abstract

Predmetni pronalazak obezbeđuje farmaceutske preparate i postupke korisne za homologu rekombinaciju i stabilnu integraciju polinukleotida u ćeliju dornaćina. Framaceutski preparati i postupci predmetnog pronalaska obezbeđuju brz i efikasan postupak za stabilno integrisanje egzogenog polipeptida u ćeliju domaćina, kao i za selekciju tako transformisanih ćelija.

Description

FLP POSREDOVANA REKOMBINACIJA

Oblast pronalaska

[0001] Predmetni pronalazak se odnosi na rekombinacione vektore i rekombinacione kasete, a posebno na postupke, preparate i sisteme za ekspresiju egzogenog molekula u organizmu ili ćeliji domaćinu.

Pozadina pronalaska

[0002] Uvođenje molekula nukleinskih kiselina, polipeptida i peptida u ciljne ćelije i tkiva koristi se kao terapijski sistem dopremanja, kao i u proizvodnji terapeutskih molekulain vitro.Sa produbljivanjem razumevanja ćelija domaćina i molekularne biologije ćelijske deobe, diferencijacije i mehanizama ekspresije, primenljivost ovakvog pristupa je povećana.

[0003] Pokazalo se da je ciljanje gena pomoću homologe rekombinacije između homologe egzogene DNK i endogenih hromozomalnih sekvenci izuzetetno koristan način stvaranja delecija ili insercija, kao i projektovanja mutacija, ispravljanja genskih mutacija, uvođenja transgena ili dobijanja drugih genetskih modifikacija.

Kratak opis pronalaska

[0004] Predmetni pronalazak obezbeđuje rekombinacionu kasetu koja sadrži region promotera/pojačivača; željeni polinukleotid; poliA signalni domen; FRT rekombinacioni domen; kao i dhfr polinukleotid, gde su region promotera/pojačivača, željeni polinukleotid i poli A signalni domen operativno vezani.

[0005] Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje rekombinacioni vektor koji sadrži rekombinacionu kasetu koja sadrži region promotera/pojačivača; željeni polinukleotid; poliA signalni domen; FRT rekombinacioni domen; kao i dhfr polinukleotid, gde su region promotera/pojačivača, željeni polinukleotid i poliA signalni domen operativno vezani. U jednom rešenju predmetnog pronalaska, vektor sadrži sekvencu predstavljenu kao sekvencu čiji jeTDbroj 1 ili 2. U još jednom rešenju, rekombinacioni vektor dalje sadrži još jedan region promotera/pojačivača; drugi željeni polinukleotid; kao i drugi poliA signalni domen, gde su drugi region promotera/pojačivača, drugi željeni polinukleotid i drugi poliA signalni domen operativno vezani.

[0006] Predmetni pronalazak dalje obezbeđuje ćeliju domaćina koja sadrži jednu ili više kopija stabilno integrisane rekombinacione kasete predmetnog pronalaska. U jednom rešenju, ćelija domaćin je prilagođena za rast u suspenziji i/ili u podlozi bez seruma.

[0007] Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje sistem za rekombinaciju. Sistem za rekombinaciju sadrži ekspresioni plazmid koji sadrži jedan ili više FRT rekombinacionih domena; kao i ćeliju domaćina koja sadrži jedno ili više FRT mesta. U jednom rešenju, ćelija domaćin je CHO ćelija, uključujući, na primer, CHO-DG44 ćeliju. U nekom rešenju, ćelija domaćin je prilagođena za rast u suspenziji i/ili u podlozi bez seruma.

[0008] Predmetni pronalazak dalje obezbeđuje komplet koji sadrži vektor i/ili rekombinacionu kasetu predmetnog pronalaska i ćeliju domaćina koja sadrži FRT mesto.

[0009] Detalji jednog ili više rešenja predmetnog pronalaska dati su u priloženim slikama i opisu koji sledi. Druge osobine, ciljevi i prednosti predmetnog pronalaska biće očigledne iz opisa i slika, kao i iz patentnih zahteva.

Opis slika

[0010] Slika 1 prikazuje ciljno mesto FLP rekombinacije ("FLP Recombination Target", FRT) i proces uvođenja u genom CHO ćelija domaćina. Ekspresioni vektor koji sadrži željeni polinukleotid može da se transficira (stabilno integriše) u genom preko rekombinacije DNK posredovane FLP rekombinazom na FRT mestu.

[0011] Slika 2 prikazuje mapu rekombinacionog vektora predmetnog pronalaska (koji odgovara sekvenci čiji je ID broj 1).

[0012] Slika 3 prikazuje mapu rekombinacionog vektora predmetnog pronalaska (koji odgovara sekvenci čiji je ED broj 2), koji sadrži vektor sa dva mesta insercije (t.j. mesta za višestruko kloniranje koja počinju od 1309 i 6370).

[0013] Slika 4 prikazuje mapu plazmida pFRTlacZeo, koji je upotrebljen za dobijanje CHO-DG44 Flp-In ćelijske linije.

[0014] Slika 5 prikazuje mapu plazmida pFRTlacZeo na kojoj je označena proba koja je upotrebljena za identifikaciju prisustva FRT u ćelijama domaćinima.

[0015] Slika 6 prikazuje reprezentativnu fotografiju na kojoj su 17 od >100 ispitanih ćelijskih linija testirnih pomoću Southern blota. Svaka kolona sadrži 10 u.g genomske DNK iz transficirane ćelijske linije. Kao što se vidi iz prisustva traka različitih veličina, očigledno je da je u mnogim od ovih ćelijskih linija - kandidata za ćelije domaćine FRT sekvenca integrisana u CHO-DG44 na različitim mestima. Štaviše, primer višestrukih mesta integracije FRT, koji se vidi iz prisustva više traka, prikazan je u koloni 11.

[0016] Slika 7 prikazuje potencijalne kandidate koji su ponovo testirani kako bi se potvrdilo prisustvo pojedinačne FRT kasete. Kolona 1 sadrži 1 ng pFRT/lacZeo, koji služi kao pozitivna kontrola. Prikazani su rezultati za 9 od 35 ćelijskih linija - kandidata. Svaka kolona sadrži 10 u.g genomske DNK iz transficirane ćelijske linije. Vide se samo pojedinačne trake, čime je potvrđena pojedinačna integracija. Štaviše, prisustvo traka različitih veličina pokazuje prisustvo različitih mesta integracije FRT mesta. Hibridizacione trake su veoma slabe, što je posledica prisustva samo jedne kopije FRT sekvence u genomu CHO-DG44.

[0017] Slike 8A i 8B prikazuju sekvence nukleotida sekvence čiji je ID broj 1.

[0018] Slike 9A i 9B prikazuju sekvence nukleotida sekvence čiji je ID broj 2.

Detaljan opis pronalaska

[0019] Predmetni pronalazak obezbeđuje rekombinacione kasete i vektore koji su korisni za homologu rekombinaciju i stabilnu integraciju željenog polinukleotida u ćeliju domaćina. Predmetni pronalazak obezbeđuje polinukleotidni konstrukt koji sadrži sekvence homologe endogenom hromozomalnom polinukleotidu koje omogućavaju homologu rekombinaciju na određenom mestu u hromozomskoj DNK ćelije domaćina, zatim polinukleotid koji kodira marker koji omogućava selekciju, a koji može uz to da sadrži još i regulatorne elemente. Postupci, sistemi i preparati predmetnog pronalaska obezbeđuju moćan alat za dobijanje značajnih količina proteina uz minimalan rad uložen u dobijanje stabilne ćelijske linije.

[0020] U jednom rešenju predmetnog pronalaska, obezbeđen je polinukleotid koji sadrži rekombinacionu kasetu koja obuhvata transkripcioni regulatorni region citomegalovirusa (CMV), umetnutu sekvencu varijabilne dužine (od introna A u CMV), željeni polinukleotid, rekombinacioni domen, kao i poliadenilovani signalni domen. Predmetni pronalazak se dalje odnosi na procese i ekspresione vektore za dobijanje i izolovanje heterologih polipeptida iz ćelija domaćina.

[0021] U drugom rešenju, rekombinaciona kaseta predmetnog pronalaska obuhvata, operativno vezane, (i) glavni CMV umereni rani promoterski/pojačivački region 1 ("intermediate early 1", IE1) i ubačenu sekvencu varijabilne dužine (npr., derivat introna A), (ii) željeni polinukleotid, (iii) prvi poliadenilovani signalni domen (npr., BHG ili hGH poliA), (iv) rekombinacioni domen (t.j. FRT mesto), (v) marker koji omogućava selekciju (npr., dhfr) i (vi) drugi poliadenilovani signal (npr., SV40 E poliA). Pojam "operativno vezani" označava takav susedni položaj u kome su komponente u odnosu koji im omogućava da funkcionišu na predviđeni način (t.j. funkcionalno vezani). Tako, na primer, promoter/pojačivač koji je operativno vezan sa željenim polinukleotidom, vezan je za njega na takav način da se ekspresija željenog polinukleotida odvija pod uslovima koji su kompatibilni sa aktivacijom ekspresije od strane promotera/pojačivača.

[0022] U jednom rešenju predmetnog pronalaska, rekombinaciona kaseta obuhvata sekvencu predstavljenu kao sekvencu čiji je ID broj 1, od nukleotida oko br.

1 do nukleotida oko br. 2704 (t.j., od oko 1 do 2700, do 2702, do 2703, do 2705, do 2706, do 2707, ili do 2708). U još jednom primeru, rekombinaciona kaseta sadrži sekvencu od nukleotida oko br. 1 do 2635 (t.j., od oko 1 do 2633, do 2634, do 2636, ili do 2637) sekvence predstavljene kao sekvence čiji je ID broj 2. Rekombinaciona kaseta koja sadrži sekvencu od nukleotida 1 do 2704 ili 1 do 2635 sekvenci čiji su ID brojevi 1 ili 2, respektivno, obuhvata veći broj tačno određenih domena kao što su CMV IE1 promoterski/pojačivački region čija je sekvenca predstavljena od xi do x2u sekvencama čiji su ID brojevi 1 ili 2, gde je xinukleotid od položaja 1 do položaja 70 a x2nukleotid od položaja 770 do položaja 780 (t.j. od oko položaja 63 do oko položaja 776 sekvenci čiji su ID brojevi 1 ili 2). Još jedan domen rekombinacione kasete obuhvata umetnutu sekvencu varijabilne dužine ("variable length intervening sequence", VLIVS) koja sadrži donorsko mesto za splajsing i akceptorsko mesto za splajsing. VLIVS može da bude dugačka bar 50 bp (t.j. bar 100, 150, 200 ili 250 bp dugačka) i može da obuhvata donorska i akceptorska mesta za splajsing iz bilo kog izvora koji je poznat struci. Videti, npr. Varani et al., Annu Rev Biophvs Biomol Struct 27: 407 - 45 (1998) i Koning, Eur J Biochem 219: 25 - 42 (1994). Odgovarajući umetnuti domen može da sadrži ceo intron A genoma CMV bilo kog soja, ili može da sadrži manji fragment koji uključuje 5' sekvencu koja sadrži donorsko mesto za splajsing vezanu za 3' sekvencu koja sadrži akceptorsko mesto za splajsing. Na primer, VLIVS obuhvata nukleotide od okoX3do okoX4sekvence čiji je ID broj 1, gde jeX3nukleotid na položaju od 770 do 780 aX4nukleotid na položaju od 1300 do 1310 (npr., od 776 do 1304 sekvence čiji je ID broj 1). Kao još jedan primer, VLIVS obuhvata nukleotide od okoX3do okoX4sekvence čiji je ED broj 2, gde jeX3nukleotid od 770 do 780 aX4nukleotid od 1300 do 1310 (npr., od 776 do 1309 sekvence čiji je ID broj 2). Umetnuta sekvenca koja prati CMV IE1 promoter/pojačivaČ može da bude i do 317 nukleotida različita u dužini od one prikazane u sekvencama čiji su TD brojevi 1 ili 2. Višestruko mesto za kloniranje može da postoji posle regiona VLIVS (t.j. nishodno od njega) (npr., nukleotidi od 1310 do 1418 sekvence čiji je ID broj 1 obuhvataju NH3I, BamHI, KpnI, EcoRI, PmeI, PstI, EcoRV, Noti, XhoI, Apal, i PmeI mesta; nukleotidi od 1309 do 1332 sekvence čiji je ID broj 2 obuhvataju EcoRV, Noti, XhoI mesta). Drugačija ili dodatna restrikciona mesta mogu da se uvedu u rekombinacionu kasetu korišćenjem tehnika poznatih stručnjacima u ovoj oblasti. Na primer, na slici 3 se vide dva višestruka mesta za kloniranje (videti, npr., mesta za kloniranje koja počinju od oko 1309 i oko 6370) koja omogućavaju kloniranje većeg broja srodnih ili nesrodnih polinukloeotida. Ovaj vektor koji sadrži dve kasete, kao što je prikazano na slici 3, sadrži i terminator između ove dve kasete.

[0023] Uz to, stručnjaci u ovoj oblasti će imati u vidu da je moguće supstituisati, dodati ili delirati 1 ili više nukleotida sa krajeva određenih domena a da se pri tome ne utiče na funkcionalnost domena i/ili kasete i/ili vektora kao celine. Na primer, varijacija od 1 do 10 nukleotida sa bilo kog kraja bilo kog od domena koji su ovde identifikovani će verovatno sadržati funkcionalni domen za predviđenu upotrebu domena, kasete i/ili vektora predmetnog pronalaska.

[0024] Rekombinaciona kaseta, dalje, sadrži poliA signalni domen. PoliA signalni domen može da bude dobijen iz humanih izvora (npr., poliA signal humanog hormona rasta ("human growth hormone", hGH poliA)) ili iz goveda (npr., poliA signal goveđeg hormona rasta ("bovine growth hormone", BGH poliA)), kao i iz drugih životinjskih izvora. PoliA signalni domen može da bude izveden iz hGH gena, čija 3'UTR sekvenca može da varira npr. od alela do alela. Jedan alel hGH gena opisan je u GenBank red. br. K00470 (sekvenca čiji je ID broj 3). Primer poliA signalnog domena BGH obuhvata sekvence prikazane od nukleotida oko br. 1143 do oko br. 1668 sekvence čiji je ID broj 1, kao i od nukleotida od oko br. 1375 do oko br. 1600 sekvence čiji je ID broj 2. Varijante poliA signala koje se ne javljaju u prirodi mogu da se dobiju tehnikama mutageneze, uključujući one koje se primenjuju na polinukleotide, ćelije ili organizme. Varijanta poliA signalnog domena hGH gena obuhvata poliA signalni domen koji je različit od divljeg tipa ("wild type") hGH poliA signalnog domena ali koji je zadržao sposobnost da signalizuje terminaciju transkripcije i/ili da stabilizuje iRNK. Na primer, poliadenilovani signalni domen može da obuhvata sekvencu hGHv poliadenilovanog signalnog domena. Obuhvaćen je bilo koji poliA signalni domen koji sadrži neprekidnu sekvencu od bar 100 nt (t.j., od bar 200, 300, 400, 500 ili 600 nt) hGHv gena, uključujući kanonsko mesto

AATAAA.

[0025] Uz to, predmetni pronalazak obuhvata sekvence koje odstupaju od gorenavedenih sekvenci do 8% (t.j., koje su 92% identične sekvenci čiji je ID broj 3 ili njenom zasebnom domenu). Na primer, predmetnim pronalaskom je obuhvaćen polinukleotid koji je 95% identičan nukleotidima od 1 do 2704 sekvence čiji je ID broj 1 ili od 1 do 2635 sekvence čiji je ED broj 2.

[0026] U drugom rešenju predmetnog pronalaska obezbeđen je vektor koji sadrži rekombinacionu kasetu. Kada je upotrebljen u predmetnoj prijavi, pojam "vektor" označava molekul nukleinske kiseline (bilo DNK bilo RNK) koji je sposoban za autonomnu replikaciju nakon uvođenja u ćeliju - primaoca (npr., u bakterijsku ćeliju ili u ćeliju sisara kakva je CHO ćelija). Primeri vektora su plazmidi i virusi. Proces "ekspresije" ekspresionog vektora je dobro poznat i podrazumeva upotrebu ćelijskih enzima i procesa za dobijanje proizvoda ekspresije željenog polinukleotida. Ekspresioni vektori su vektori sposobni za posredovanje u ekspresiji kloniranog polinukleotida u ćeliji domaćinu, koja može i ne mora biti iste vrste kao ćelija koja je korišćena za replikaciju ili propagaciju vektora. Mnogi sisarski ekspresioni vektori mogu da se propagiraju u uobičajenim bakterijama (ćelije primaoci) ali da eksprimiraju željeni polinukleotid u sisarskim ćelijama (ćelije domaćini) a ne u bakterijama.

[0027] Vektori predmetnog pronalaska obuhvataju: mesto za kloniranje, za primanje željenog polinukleotida; transkripcione regulatorne elemente (npr., regione CMV IE1 promotera/pojačivača) koji su dovoljni da omoguće transkripciju polinukleotida ubačenog na mesto za kloniranje u ćeliji domaćinu; translacione elemente koji su dovoljni da omoguće translaciju RNK transkripta datog polinukleotida u ćeliji domaćinu i (ukoliko je poželjno) replikacione elemente koji su dovoljni da omoguće replikaciju datog vektora u ćeliji domaćinu, ili nekoj drugoj ćeliji primaocu koja se koristi za propagaciju tog vektora. Vektori predmetnog pronalaska su u stanju da obezbede takvu ekspresiju, bilo prolazno bilo trajno, u ćelijama domaćinima (npr., homologom rekombinacijom u genom ćelije domaćina).

[0028] U specifičnom rešenju, vektor predmetnog pronalaska obuhvata (1) sekvencu koja je prikazana kao sekvenca čiji je redni broj 1 ili 2; (2) sekvencu koja je komplementarna sekvenci koja je prikazana kao sekvenca čiji je redni broj 1 ili 2; (3) sekvencu koja je bar 80% (ili bar 90%; 95%; 98%, ili 99%) identična sekvenci čiji je redni broj 1 ili 2; ili (4) sekvencu koja sadrži sekvencu čiji je ID broj 1 ili 2 od nukleotida oko br. 1 do nukleotida oko br. 2704 ili 2635, respektivno, a koji sadrži željeni polinukleotid i/ili marker koji omogućava selekciju.

[0029] Vektor predmetnog pronalaska obuhvata sekvencu čiji je redni broj 1 ili2,ili jedan ili više sledećih domena, uz obavezan uslov da sadrži FRT mesto. Na primer, u vektoru je prisutan CMV IE1 promoterski/pojačivački region čija je sekvenca predstavljena od oko xido oko x2u sekvenci čiji je ID broj 1, gde je xi nukleotid od br. 1 do br. 70 a x2nukleotid od 770 do 780 (npr., od oko br. 1 do br. 776 sekvence čiji je ID broj 1). U još jednom rešenju predmetnog pronalaska, u vektoru je prisutan CMV IE1 promoterski/pojačivački region čija je sekvenca predstavljena od oko xido oko x2u sekvenci čiji je ED broj 2, gde je xinukleotid od 1 do 60 a x2nukleotid od 770 do 780 (npr., od oko 1 do oko 776 sekvence čiji je ID broj 1). Još jedan domen ekspresionog vektora predmetnog pronalaska obuhvata umetnutu sekvencu varijabilne dužine (VLIVS) koja sadrži donorsko mesto za splajsing i akceptorsko mesto za splajsing. Na primer, VLIVS obuhvata nukleotide od okoX3do okoX4sekvence čiji je ID broj 1, gde jeX3nukleotid od 770 do 780 aX4nukleotid od 1300 do 1310 (npr, od 776 do 1304 sekvence čiji je ED broj 1). Kao još jedan primer, VLIVS obuhvata nukleotide od oko x3do okoX4sekvence čiji je ED broj 2, gde jeX3nukleotid od 770 do 780 a xanukleotid od 1300 do 1310 (t.j. od 776 do 1309 sekvence čiji je ED broj 2). Višestruko mesto za kloniranje može da postoji posle regiona VLIVS (t.j. nishodno od njega) (t.j., sekvenca nukleotida od 1310 do 1418 sekvence čiji je ID broj 1 obuhvata NEE3I, BamJEI, KpnI, EcoRI, PmeI, PstI, EcoRV, Noti, XhoI, Apal, i PmeI mesta; sekvenca nukleotida od 1309 do 1332 sekvence čiji je ID broj 2 obuhvata EcoRV, Noti, XhoI mesta). Drugačija ili dodatna restrikciona mesta mogu da se uvedu u ekspresioni vektor korišćenjem tehnika poznatih stručnjacima u ovoj oblasti. Uz to, ekspresioni vektor sadrži i poliA signalni domen.

[0030] PoliA signalni domen može da bude dobijen iz humanih izvora (npr., poliA signal humanog hormona rasta (hGH poliA)) ili iz goveda (npr., poliA signal goveđeg hormona rasta (BGH poliA)), kao i iz drugih životinjskih izvora. PoliA signalni domen može da bude izveden iz hGH gena, čija 3'UTR sekvenca može da varira npr. od alela do alela. Jedan alel hGH gena opisan je u GenBank red. br. K00470 (sekvenca čiji je ED broj 3). Primer poliA signalnog domena BGH obuhvata sekvence prikazane od nukleotida oko br. 1143 do oko br. 1668 sekvence čiji je ED broj 1, kao i od nukleotida od oko br. 1375 do oko br. 1600 sekvence čiji je ED broj 2. U vektoru predmetnog pronalaska takođe je prisutan i jedan ili više markera koji omogućavaju selekciju.

[0031] Rekombinacione kasete i vektori predmetnog pronalaska imaju jasne prednosti nad ranijim rekombinacionim kasetama i vektorima. Na primer, kasete i vektori predmetnog pronalaska omogućavaju stabilnu integraciju željenog polinukleotida u ćeliju domaćina koja sadrži jedno ili više FRT mesta, dok korišćenje dhfr markera za selekciju, koji je u prirodi auksotrofan, omogućava jednostavnu i efikasnu selekciju transformisanih ćelija domaćina. Selekcija uspešno transficiranih ćelijskih linija se obično zasniva na integrisanom marekeru za selekciju koji donosi rezistenciju na citotoksična sredstva (npr., rezistenciju na antibiotike). Ne-auksotrofhi markeri za selekciju prenose rezistenciju na supstance koje bi u normalnim uslovima ubile organizam (t.j. ćeliju). Kada se takva citotoksična supstanca primeni na organizme, preživeće samo oni koji sadrže marker za selekciju. Na ovaj način, uobičajeni markeri za selekciju zahtevaju dodavanje egzogene supstance za selekciju rezistentnih ćelija. Ove citotoksične supstance moraju da se dodaju kulturi u pravilnim koncentracijama, što zahteva dodatni rad tehničara ili istraživača. Na primer, ukoliko se doda previše citotoksične supstance, mogu da budu ubijeni i organizmi koji sadrže marker za selekciju, čime se smanjuje efikasnost transfekcije/transformacije i prinos. Suprotno tome, predmetni pronalazak obezbeđuje marker za selekciju koji ne zahteva dodavanje citotoksične supstance, već su ćelije koje sadrže ovakav marker za selekciju (t.j dhfr) sposobne da rastu u definisanoj podlozi koja ne sadrži specifični aditiv koji je neophodan za rast organizama koji ne sadrže takav marker za selekciju. Dihidrofolat reduktaza (DHFR) je enzim koji zahteva prisustvo NADPH (EC 1.5.1.3), koji katalizuje sintezu tetrahidrofolata, metabolita koji je neophodan za sintezu dTMP, glicina i purina. U odsustvu polinukleotida koji kodira DHFR, ćelije moraju da se gaje na podlozi koja sadrži dTMP, glicin i/ili purine. Ukoliko je u ćeliji prisutan marker za selekciju, DHFR, egzogeni purini mogu da se uklone, te će ćelije koje sadrže DHFR marker nastaviti da rastu i da se dele, dok će one koje ne sadrže DHFR odumreti. Shodno tome, predmetni pronalazak omogućava lakšu selekciju organizama (t.j. ćelija) koji su transficirani/transformisani.

[0032] FLP sistem predmetnog pronalaska omogućava stabilnu integraciju i ekspresiju željenog polinukleotida u bilo kojoj željenoj sisarskoj ćeliji u specifičnom genomskom položaju. Ćelijska linija FLP ćelija domaćina nastaje transficiranjem pojedinačnog FLP rekombinacionog ciljnog (FRT) domena u genom izabrane ćelijske linije ćelija domaćina; ta dobijena ćelijska linija se zatim koristi za FLP transfekcije/rekombinacije koje slede. Jednom kada je nastala ćelijska linija ćelija domaćina, bilo koji željeni polinukleotid može stabilno da se integriše u genom ćelije domaćina preko DNK rekombinacije na FRT mestu posredovane FLP rekombinazom, videti sliku 1. Željeni polinukleotid može efikasno da bude ubačen u genom ćelije domaćina supstitucijom, uvek u identičnom položaju i orijentaciji. Kako sve transficirane ćelije imaju željeni polinukleotid integrisan na istoj genomskoj lokaciji, izolacija klonalnih ćelijskih linija je nepotrebna zbog toga što su sve transficirane ćelije genetski identične.

[0033] Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje ćelijsku liniju ćelija domaćina nastalu transficiranjem ćelija jajnika kineskog hrčka ("Chinease Hamster Ovarv", CHO)-DG44 rekombinacionim ciljnim mestom (t.j. FRT rekombinacionim mestom). Ova CHO-DG44 ćelijska linija nema funkcionalni gen za dihidrofolat reduktazu (dhfr gen), te zahteva egzogeni glicin, purine i timidin (pirimidin) za rast. Ovakva ćelijska linija bi trebalo da bude gajena u podlozi kojoj su dodati nukleozidi. Nakon transfekcije rekombinacionom kasetom/vektorom predmetnog pronalaska, koji sadrži funkcionalni dhfr gen, selekcija se postiže gajenjem ćelija u podlozi kojoj nisu dodati purini i timidin. Nastankom ćelijske linije ćelija domaćina, dobijanje ćelija koje eksprimiraju željeni(e) polinukleotid(e) može da bude veoma brzo.

[0034] Predmetni pronalazak dalje obezbeđuje rekombinacioni sistem koji sadrži rekombinacionu kasetu i/ili vektor predmetnog pronalaska i ćelijsku liniju ćelija domaćina koja sadrži FRT mesto. U jednom rešenju predmetnog pronalaska ćelija domaćin je CHO ćelija ili ćelija nastala iz CHO ćelije, koja sadrži FRT mesto ubačeno rekombinacijom u genom ćelije domaćina. Ovaj sistem (t.j. CHO ćelija, ili ćelija nastala iz CHO ćelije i rekombinaciona kaseta/vektor) obezbeđuje moćan način dobijanja između 10 i 40 mg/ml rekombinantnog proteina u CHO ćeliji domaćinu za manje od 6 nedelja (t.j. koji ima ICA od 15 x IO<7>(ćelijskih dana)/ml u toku desetodnevnog rada bioreaktora). Uz to, dobijanje ovakvih stabilnih ćelijskih linija zahteva minimalan rad.

[0035] Postupci i preparati predmetnog pronalaska omogućavaju laku integraciju željenog polinukleotida na prethodno određeno endogeno polinukleotidno ciljno mesto u ćeliji domaćinu. Ovo endogeno polinukleotidno ciljno mesto može da bude kako polinukleotid koji se javlja u prirodi (t.j. polinukleotid koji se javlja u genomu ćelije domaćina i koji nije uveden rekombinacijom), tako i polinukleotid koji je prethodno uveden u ćeliju domaćina kako bi se omogućila selekcija, ekspresija ili rekombinacija u organizam domaćina. Kad se koriste u predmetnoj prijavi, pojmovi "prethodno određeni endogeni ciljani polinukleotid" i "prethodno određeno ciljno mesto" odnose se na polinukleotidne sekvence sadržane u ciljnoj ćeliji. Ovakva prethodno određena ciljna mesta sadrže, na primer, hromozomalne sekvence (npr., strukturne gene, intronske sekvence, 5' ili 3' nekodirajuće sekvence, regulatorne sekvence uključujući promotere i pojačivače, mesta učestale rekombinacije ("recombination hotspots"), ponavljane sekvence, integrisane proviralne sekvence, ukosnice, palindrome), kao i epizomalne ili ekstrahromozomalne sekvence (npr., plazmide sposobne za replikaciju, ili viralne ili parazitske replikacione intermedijere) uključujući sekvence hloroplastne i mitohondrijalne DNK. Pod pojmovima "prethodno određena" ili "prethodno selektovana" podrazumeva se da ciljna sekvenca može da bude selektovana na osnovu informacija o predviđenoj sekvenci, kao i da nije ograničena na specifična mesta koja prepoznaju određene rekombinaze specifične za mesto ("site specific recombinases") (npr. FLP rekombinaza ili CRE rekombinaza). U nekim rešenjima, prethodno određeno endogeno polinukleotidno ciljno mesto će biti različito od polinukleotida koji se prirodno javlja u matičnoj liniji (t.j. egzogeni polinukleotid, parazitska, mikoplazmalna ili viralna sekvenca). Egzogeni polinukleotid je polinukleotid koji je uveden (npr., rekombinantnim tehnikama molekularne biologije) u ćeliju domaćina. Na primer, egzogeni polinukleotidi koji su uneseni mikroinjekcijom ili transfekcijom u ćeliju su egzogeni polinukleotidi. Pojam "koji se prirodno javlja", kada se u predmetnoj prijavi odnosi na objekat, odnosi se na činjenicu da takav objekat može da se nađe u prirodi. Na primer, polinukleotid koji je prisutan u organizmu (uključujući i virus) koji može da se izoluje iz prirodnog izvora a koji čovek nije modifikovao je polinukloeotid koji se javlja u prirodi.

[0036] Rekombinacioni domen u rekombinacionoj kaseti/vektoru predmetnog pronalaska usmerava rekombinacionu kasetu/vektor ka specifičnoj lokaciji na hromozomu u genomu domaćina, pomoću homologije koja postoji između rekombinacionog domena i odgovarajućeg prethodno određenog endogenog polinukleotidnog ciljnog mesta i uvodi željenu genetsku modifikaciju pomoću procesa poznatog kao "homologa rekombinacija".

[0037] "Homolog" ili "homologija" podrazumeva dve ili više sekvenci nukleinskih kiselina koje su ili identične ili dovoljno slične (t.j. 97% identične ili više) da su u stanju da hibridizuju jedna s drugom ili da podlegnu intermolekulskoj razmeni. Procenat identičnosti sekvence izračunava se uz izuzeće malih adicija ili delecija koje ukupno čine manje od 25% referentne sekvence. Referentna sekvenca može da bude deo veće sekvence, kao što je deo gena ili bočna sekvenca, ili deo hromozoma sa ponavljanom sekvencom. Međutim, referentna sekvenca je dugačka bar 12-18 nukleotida, dugačka bar 30 nukleotida, i može da bude dugača bar oko 50 algoritam poravnavanja na osnovu homologije, Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443 (1970), postupak traženja sličnosti, Pearson & Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444 (1988), implementacije ovih algoritama u računarskim sistemima (GAP, PJJLEUP, BESTFIT, FASTA, i TFASTA u softversom paketu Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI), kao i manuelno poravnavanje i vizuelno poređenje.

[0040] Za određivanje procenta identičnosti predmetnog pronalaska (t.j. identičnosti ili značajne sličnosti) koristi se BLAST algoritam, opisan u Altschul, J. Mol. Biol. 215: 403 - 410, 1990. Softver za izvođenje BLAST analiza je javno dostupan preko National Center for Biotechnologv Information (čija se internet stranica nalazi na adresi: ncbi.nlm.nih.gov/). Ovaj algortam podrazumeva, prvo, identifikaciju parova sekvenci visoke podudarnosti ("high scoring sequence pairs", (HSP)) pomoću identifikacije kratkih delova sekvence ("reči") dužine W u ispitivanoj sekvenci, koje se ili u potpunosti podudaraju, ili zadovoljavaju zadati kriterijum praga podudarnosti sekvence (T) kada se poravnaju sa kratkim delovima sekvence, iste dužine, iz baze podataka. "T" se označava kao prag podudarnosti susedne reči ("neighbourhood word score treshold"). Ova prva poklapanja susednih reči služe kao početne tačke za traženje dužih HSP koji ih sadrže. Poklapanja delova sekvenci se zatim produžavaju duž svake sekvence, dokle god se povećava kumulativna vrednost preklapanja pri poravnavanju. Kumulativne vrednosti preklapanja za nukleotidne sekvence se računaju upotrebom parametara M (pozitivna vrednost koja se dodeljuje za svaki par podudarnih ostataka; uvek je > 0) i N (negativna vrednost, koja se dodeljuje za svaki par ostataka koji nisu podudarni; uvek je < 0). Produžavanje poklapanja dela sekvence u svakom pravcu se zaustavlja kada: kumulativna vrednost preklapanja pri poravnavanju padne za vrednost X ispod svoje maksimalne postignute vrednosti; kumulativna vrednost dostigne 0 ili nižu vrednost, usled nagomilavanja jednog ili više nepodudarnih ostataka kojima je dodeljena negativna vrednost; ili kada se stigne do kraja sekvence Parametri BLAST algoritma, W, T i X određuju osetljivost i brzinu poravnavanja i obuhvataju sledeće parametre za poređenje nukleotida: dužinu kratkog dela sekvence ("reči") od 11, očekivanje ("expectation", E) od 10, M = 5, N = 4. Za aminokiselinske sekvence, BLAST program koristi dužinu "reči" (W) od 3, očekivanje (E) od 10 i BLOSUM62 matriks za dodeljivanje vrednosti (videti, npr. Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. SAD 89: 10915, 1989).

[0041] BLAST algoritam vrši i statističku analizu sličnosti između dve sekvence (videti, npr., Karlin, Proc. Nat'l. Acad. Sci. SAD 90: 5873 - 5787, 1993). Jedna mera sličnosti dobijena iz BLAST algoritma je najmanja zbirna verovatnoća (P(N)), koja predstavlja verovatnoću slučajnog poklapanja dve nukleotidne ili aminokiselinske sekvence. Smatra se da je nukleinska kiselina slična referentnoj sekvenci ako je najmanja zbirna verovatnoća manja od 0,1. Na primer, ona može da bude manja od oko 0,01, ili manja od oko 0,001.

[0042] Predmetni pronalazak takođe uključuje polinukleotide koji specifično hibridizuju sa polinukleotidnom sekvencom koja je prikazana kao polinukleotidna sekvenca čiji je ID broj 1 ili 2, ili sa njihovim domenima. Izraz "selektivno (ili specifično) se hibridizuje sa" odnosi se na vezivanje, formiranje dupleksa, ili hibridizaciju molekula sa konkretnim referentnim polinukleotidom, pod precizno definisanim uslovima hibridizacije. Izraz "precizno definisani uslovi hibridizacije" odnosi se na uslove pod kojima će proba prvenstveno hibridizovati sa svojom ciljnom sekvencom u kompleksnoj smeši nukleinskih kiselina, ali neće hibridizovati sa drugim sekvencama. Precizno definisani uslovi hibridizacije su zavisni od sekvence, te će biti različiti pod različitim okolnostima, npr., u zavisnosti od dužine probe. Duže sekvence specifično hibridizuju pri višim temperaturama. Detaljna uputstva za hibridizaciju nukleinskih kiselina mogu da se nađu u Tijssen, Techniques in Biochemistrv and Molecular Biologv—Hvbridization with Nucleic Probes, "Overview of principles of hvbridization and the strategv of nucleic acid assavs" (1993). Uopšteno govoreći, precizno definisani uslovi hibridizacije se biraju tako da temepratura bude za oko 5 - 10 °C niža od termalne tačke topljenja ("thermal melting point", Tm) specifične sekvence pri definisanoj jonskoj sili i pH. Tmje temperatura pri kojoj (pri definisanoj jonskoj sili, pH i nukleinskoj koncentraciji) 50% proba komplementarnih ciljnoj sekvenci hibridizuje sa ciljnom sekvencom, u ravnoteži (pošto je ciljna sekvenca prisutna u vušku, na Tm50% proba je spareno, u ravnoteži). Precizno definisani uslovi hibridizacije su oni u kojima je koncentracija soli manja od oko 1,0 M natrijumovog jona, obično oko 0,01 do 1,0 M natrijumovog jona (ili drugih soli), na pH od 7,0 do 8,3 a temperatura je bar oko 30 °C za kratke probe (od 10 do oko 50 nukleotida) i bar oko 60 °C za dugačke probe (duže od 50 nukleotida). Precizno definisani uslovi hibridizacije takođe mogu da se postignu i dodatkom sredstava za destabilizaciju, kao što je formamid. Pozitivan rezultat za selektivnu ili specifičnu hibridizaciju (t.j. za identifikaciju nukleinske kiseline predmetnog pronalaska) je hibridizacija koja je oko 2 puta veća od pozadinske hibridizacije. Za svrhe predmetnog pronalaska, precizno definisani uslovi hibridizacije podrazumevaju izvođenje hibridizacije pri temperaturi od oko 42 °C, u hibridizacionom rastvoru koji sadrži 25 mM KP04(pH 7,4), 5X SSC, 5X Denhartovog rastvora, 50 ng/mL denaturisane, ultrazvučno obrađene DNK sperme lososa, 50% formamida, 10% dekstran sulfata, i 1 - 15 ng/mL probe, dok se ispiranja vrše pri temperaturi od oko 50°C, upotrebom rastvora za ispiranje koji sadrži 2X SSC i 0,1% natrijum dodecil sulfata. Strogo precizno definisani uslovi podrazumevaju izvođenje hibridizacije pri temperaturi od oko 42°C u hibridizacionom rastvoru koji sadrži 25 mM KPO4(pH 7,4), 5X SSC, 5X Denhartovog rastvora, 50 ug/mL denaturisane, ultrazvučno obrađene DNK sperme lososa, 50% formamida, 10% dekstran sulfata i 1 - 15 ng/mL probe dok se za ispiranja vrše pri temperaturi od oko 65 °C, upotrebom rastvora za ispiranje koji sadrži 0,2X SSC i 0,1% natrijum dodecil sulfata.

[0043] Postupci i preparati predmetnog pronalaska korisni su za modifikaciju ćelije domaćina insercijom u, delecijom ili supstitucijom endogenog polinukleotida pomoću homologe rekombinacije korišćenjem rekombinacione kasete ili vektora predmetnog pronalaska.

[0044] Rekombinaciona kaseta/vektor predmetnog pronalaska može da sadrži marker za selekciju. "Marker" ili "marker za selekciju" je marker koji omogućava izdvajanje retkih transficiranih ćelija koje eksprimiraju taj marker iz mnoštva tretiranih ćelija u populaciji. Specifični primeri markera za selekciju su oni koji donose rezistenciju na citostatike ili citocidalna sredstva, kao što je DHFR protein, koji daje rezistenciju na metotreksat (Wigler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. SAD 77: 3567 (1980); O'Hare et al., Proc. Natl. Acad. Sci. SAD 78: 1527 (1981)); GPF protein, koji donosi rezistenciju na mikofenolnu kiselinu (Mulligan & Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. SAD 78: 2072 (1981)); neomicinski marker za rezistenciju koji donosi rezistenciju na aminoglukozid G-418 (Colberre-Garapin et al., J. Mol. Biol. 150: 1 (1981)); higro protein, koji donosi rezistenciju na higromicin (Santerre et al., Gene 30: 147 (1984)); i Zeocin™ marker za rezistenciju (komercijalno dostupan preko Invitrogen). Uz to, timidin kinaza herpes simpleks virusa (Wigler et al., Cell 11: 223 (1977)), hipoksantin-guanin fosforiboziltransferaza (Szvbalska & Szvbalski, Proc. Natl. Acad. Sci. SAD 48: 2026 (1962)), i adenin fosforiboziltransferaza (Lowy et al., Cell 22: 817 (1980)) mogu da se upotrebe u tk-, hgprt- ili aprt- ćelijama, respektivno. Drugi markeri za selekciju kodiraju puromicin N-acetil transferazu ili adenozin deaminazu.

[0045] Posebnu prednost donosi dhfr marker. DHFR je enzim neophodan za sintezu pirimidina. Ćelijama koje nemaju funkcionalan DHFR ili koje ne eksprimiraju DHFR za rast su neophodni pirimidini. Ćelija domaćin koja je dhfr- može da se transficira dfhr vektorom čime joj se vraća sposobnost sinteze pirimidina. Kada se ukloni podloga koja sadrži egzogene pirimidine, preživeće samo one ćelije koje sadrže egzogeno dodati dfhr gen. Nasuprot tome, selekcija je teža ukoliko se koriste markeri za selekciju zasnovanu na sposobnosti rasta u prisustvu citotoksičnih sredstava. Na primer, ukoliko je ćelija transficirana "genom za rezistenciju", upotrebljavaju se različite koncentracije citotoksičnih sredstava kako bi se selektovale one ćelije koje sadrže taj gen za rezistenciju. U nekim slučajevima, može da se primeni previše ili premalo citotoksičnog sredstva, čime selekcija postaje neefikasna i/ili nepouzdana.

[0046] Sekvence čiji su ID brojevi 1 i 2 sadrže gen za dihidrofolat reduktazu (dhfr gen) (t.j. sadrže sekvencu od nukleotida oko br. 2007 do oko br. 2567 sekvence čiji je ID broj 1, i od nukleotida oko br. 1939 do oko br. 2499 sekcence čiji je ID broj 2). Rekombinaciona kaseta/vektor predmetnog pronalaska može da sadrži i dodatne promoterske/pojačivačke elemente kao i regulatorne regione (t.j. poliadenilovane domene). Ovakvi dodatni regulatorni elementi i poliadenilovani domeni mogu da budu bočni geni markera za selekciju ili željenog polinukleotida (t.j. da se nalaze odmah do 5' ili 3' kraja ovih gena). U ovim vektorima, dhfr gen prati SV40 poliadenilovani region (t.j. sekvenca od nukleotida oko br. 2568 do oko br. 2704 i nukleotida oko br. 2500 do oko br. 2635 sekvence čiji je ID broj 2, respektivno).

[0047] Rekombinaciona kaseta i/ili vektor predmetnog pronalaska sadrže rekombinacioni domen dugačak bar od oko 10 do 100 nukleotida, obično bar od oko 20 do 100 nukleotida, ali koji može da bude i duži (npr., dugačak bar oko 250 do 500 nukleotida, ili oko 500 do 2000 nukleotida, ili duži). Dužina rekombinacionog regiona zasniva se, delimično, na homologiji sa prethodno određenim endogenim ciljnim polinukleotidom. Shodno tome, stručnjak u ovoj oblasti može da odabere dužinu homologog dela na osnovu sastava sekvence i kompleksnosti sekvence(i) prethodno određenog(ih) endogenog(ih) ciljnog(ih) polinukleotida i na osnovu uputstava poznatih u struci. Rekombinacioni domen ima bar jednu sekvencu koja suštinski odgovara, ili je suštinski komplementarna prethodno određenom endogenom polinukleotidu (t.j. DNK sekvenci polinukleotida koji se nalazi u ciljnoj ćeliji domaćinu, kao što je hromozomski, motohondrijalni, hloroplastni, viralni, epizomalni ili mikoplazmalni polinukleotid). Ovakve nukleotidne sekvence rekombinacionog domena služe kao ciljna mesta za homologo sparivanje sa prethodno određenim endogenim ciljnim polinukleotidom(ima). Kada se željeni polinukleotid u vektoru usmerava na genom ćelije domaćina, oblasti homologije se obično nalaze na ili blizu 5' i/ili 3' kraja željenog polinukleotida (Berinstein et al. (1992) Molec. Cell. Biol. 12: 360, koja je ovde inkorporirana po referenci). Bez ograničavanja na bilo koju konkretnu teoriju, smatra se da dodavanje rekombinaza omogućava efikasno usmeravanje ("targeting") sa nukleotidnim sekvencama rekombinacionog domena koje imaju kratke segmente homologije (t.j. dugačke oko 10 do 1000 baznih parova). U predmetnom pronalasku, rekombinacioni domen je FRT mesto.

[0048] Uobičajeno je da nukleotidna sekvenca rekombinacionog domena ima visok stepen homologije sa prethodno određenim endogenim ciljnim polinukleotidom, i obično će mu biti identična. Nukleotidna sekvenca rekombinacionog domena predmetnog pronalaska je obično dugačka oko 10 do 35 nukleotida, ali može da bude dugačka oko 20 do 100 nukleotida, ili oko 100 do 500 nukleotida, iako će stepen homologije nukleotidne sekvence između rekombinacionog domena i prethodno određenog endogenog ciljnog polinukleotida određivati optimalne i minimalne dužine (npr., sekvence bogate C - G parovima su obično termodinamički stabilnije te će, uopšteno govoreći, zahtevati manje dužine rekombinacionih domena). Stoga, i dužina rekombinacionog domena, kao i stepen homologije sekvence mogu da se odrede u odnosu na konkretnu prethodno određenu sekvencu.

[0049] Rekombinaciona kaseta predmetnog pronalaska i/ili vektor predmetnog pronalaska uvode se u ćeliju domaćina koja nosi prethodno određeni endogeni ciljni polinukleotid, obično uz bar jedan protein rekombinazu (npr., Flp rekombinazu). U nekim okolnostima, rekombinaciona kaseta ili vektor se inkubira sa Flp ili drugim rekombinazama pre uvođenja u ćeliju domaćina, kako bi rekombinaciona kaseta ili rekombinacioni vektor mogli da se "napune" proteinom(ima) rekombinazom(ama).

[0050] Rekombinaze su proteini koji, kada se unesu zajedno sa željenim polinukleotidom koji sadrži rekombinacioni domen, dovode do merljivog povećanja frekvencije rekombinacije i/ili frekvencije lokalizacije između željenog polinukleotida i prethodno određenog endogenog ciljnog polinukleotida. Stoga, u jednom rešenju, mogu da se postignu povećanja frekvence rekombinacije u opsegu od 10 do 1000 puta.

[0051] Rekombinaza je član porodice rekombinacionih proteina sličnih Rec-A proteinu, koji svi imaju sve, ili bar većinu istih funkcija, posebno: (i) sposonost proteina rekombinaze da se pravilno veže za željeni polinukleotid koji sadrži rekombinacioni domen na homologoj ciljnoj sekvenci i da ga dovede u pravilan položaj, i (ii) sposobnost kompleksa proteina rekombinaze/polinukleotida koji se usmerava da efikasno nađe komplementarnu endogenu sekvencu i da se za nju veže. Najbolje okarakterisani recA protein je izE. coli.Uz divlji tip proteina E. coli, identifikovano je i više mutantnih proteina sličnih recA (npr. recA803; videti Madiraju et al., Proc. Natl. Acad. Sci. SAD 85 (18): 6592 (1988); Madiraju et al., Biochem. 31: 10529 (1992); Laverv et al., J. Biol. Chem. 267: 20648 (1992)). Uz to, mnogi organizmi imaju rekombinaze slične recA sa sposobnostima transfera lanaca (npr., Fugisawa et al., Nucl. Acids Res. 13: 7473 (1985); Hsieh et al., Cell 44: 885

(1986); Hsieh et al., J. Biol. Chem. 264: 5089 (1989); Fishel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. SAD 85: 3683 (1988); Cassuto et al., Mol. Gen. Genet. 208: 10 (1987); Ganea et al., Mol. Cell Biol. 7: 3124 (1987); Moore et al., J. Biol. Chem. 19: 11108 (1990); Keene et al., Nucl Acids Res. 12: 3057 (1984); Kimeic, Cold Spring Harbor Symp. 48: 675 (1984); Kimeic, Cell 44: 545 (1986); Kolodner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. SAD 84: 5560 (1987); Sugino et al., Proc. Natl. Acad. Sci. SAD 85: 3683 (1985); Halbrook et al., J. Biol. Chem. 264: 21403 (1989); Eisen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. SAD 85: 7481 (1988); McCarthy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. SAD 85: 5854 (1988); Lowenhaupt et al., J. Biol. Chem. 264: 20568 (1989), koje su ovde inkorporirane po referenci). Primeri ovakvih proteina rekombinaza obuhvataju, ali nisu ograničeni na recA, recA803, uvsX, i druge recA mutante i rekombinaze slične recA (Roca, A. I. Crit. Rev. Biochem. Molec. Biol. 25: 415 (1990)), sepl (Kolodner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. S.AD 84: 5560 (1987); Tishkoffet al., Molec. Cell. Biol. 11:2593, (1991)), RuvC (Dunderdale et al., Nature 354: 506 (1991)), DST2, KEM1, XRN1 (Dykstra et al., Molec. Cell. Biol. 11: 2583 (1991)), STP.alfa./DSTl (Clark et al., Molec. Cell. Biol. 11: 2576 (1991)), HPP-1 (Moore et al., Proc. Natl. Acad. Sci. SAD 88: 9067

(1991)), druge ciljne rekombinaze (Bishop et al., Cell 69: 439 (1992); Shinohara et al., Cell 69: 457 (1992)), koje su sve ovde inkorporirane po referenci. RecA može da se izoluje izE. coli,na primer iz sojevaE. colikao što su JC12772 i JC15369 (koji mogu komercijalno da se nabave). Ovi sojevi sadrže sekvence koje kodiraju recA na "odbeglom" replikacionom plazmidnom vektoru koji je u ćeliji prisutan u velikom broju kopija. Protein recA803 je mutant divljeg tipa recAkoji ima visoku aktivnost. U struci je poznato više primera proteina rekombinaza, na primer, iz Drosophila, kvasaca, biljaka, humanih i ne-humanih sisarskih ćelija, sa biološkim osobinama sličnim osobinama recA (t.j. rekombinaze slične recA), kao što su Rad51 iz sisara i kvasaca, i Pk-rec iz hipertermofilne arheobakterijePyrococcus sp(videti Rashid et al., Nucleic Acid Res. 25 (4): 719 (1997), koji je ovde inkorporiran po referenci). Rekombinaza može, zapravo, da bude kompleks proteina. Definicijom rekombinaze obuhvaćeni su i proteini ili fragmenti rekombinaza koji zadržavaju biološke aktivnosti rekombinaza, kao i varijante ili mutanti rekombinaza divljeg tipa koji zadržavaju biološku aktivnost, kao što je recA380 mutant izE. colisa pojačanom rekombinaznom aktivnošću.

[0052] RecA gradi homologe spojeve između homologih sekvenci, a smatra se i da igra ulogu u procesu traženja homologih sekvenci između egzogenog polinukleotidnog lanca (t.j. željenog polinukleotida koji sadrži rekombinacioni domen) i endogenog polinukleotidnog lanca (t.j. prethodno određenog ciljnog polinukleotida), formirajući relativno stabilne heteroduplekse u oblastima visoke homologije. Shodno tome, rekombinaze mogu da katalizuju reakciju homologe rekombinacije i između lanaca koji su značajno, ali ne savršeno, homologi. Stoga, rekombinacioni vektor/kaseta može da se koristi za uvođenje supstitucija, insercija i delecija nukleotida u endogene sekvence DNK, čime se uvode odgovarajuće supstitucije, insercije i delecije aminokiselina u proteine eksprimirane sa endogenih sekvenci DNK.

[0053] U jednom rešenju, kao rekombinaza se koristi recA ili rad51. Na primer, protein recA se obično dobija iz bakterijskih sojeva koji proizvode divlji tip recA proteinaE. coliili mutantni recA803 protein u velikim količinama. Alternativno, protein recA može komercijalno da se nabavi preko, na primer, Pharmacia (Piscataway, N. J.).

[0054] FLP rekombinaza je protein koji katalizuje reakciju rekombinacije specifične za mesto. FLP protein je kloniran i eksprimiran uE. coli(videti, npr., Cox, Proc. Natl. Acad. Sci. SAD, 80: 4223 - 4227, 1983), i prečišćena skoro do homogenosti (videti, npr., Meyer-Leon et al., Nucl. Acids Res., 15: 6469 - 6488, 1987). FLP rekombinaze su komercijalno dostupne ili ih stručnjaci u ovoj oblasti mogu sami dobiti iz, na primer, roda Saccharomyces.

[0055] FRT mesto je identifikovano kao sekvenca koja sadrži dva ponovka od po 13 baznih parova, koji su razdvojeni sekvencom za razdvajanje ("spacer") od 8 baznih parova: na primer, sekvenca koja sadrži 5'-GAAGTTCCTATTC TCTAGAAAGTATAGGAACTTC-3'(sekvenca čiji je ID broj 1 od nukleotida u položaju 1966 do 1999 i sekvenca čiji je ID broj 2 od 1882 do 1937; sekvenca predstavljena iskošenim slovima predstavlja sekvencu za razdvajanje). Nukleotidi regiona za razdvajanje mogu da budu zamenjeni bilo kojom drugom kombinacijom nukleotida, uz uslov da dva ponovka od 13 baznih parova budu razdovjena sa bar 8 nukleotida. Tačna sekvenca regiona za razdvajanje nije od kritičnog značaja, iako će stručnjaci u ovoj oblasti zapaziti da je, za neke primene, poželjno da region za razdvajanje bude asimetričan, dok za druge primene može da se upotrebi palindromska sekvenca. Uopšteno gledano, regioni za razdvajanje prisutni u rekombinacionom domenu i u FRT mestu ćelije domaćina biće međusobno identični. Rekombinacioni domen predmetnog pronalaska i FRT mesto ćelije domaćina mogu da sadrže sekvencu koja je predstavljena od nukleotida 1966 do nukleotida 1999 sekvence čiji je ID broj 1 i od nukleotida 1898 do nukleotida 1931 sekvence čiji je ID broj 2.

[0056] Procesi posredovani rekombinazama su dalje opisani u sledećim publikacijama: WO 00/63365; WO 99/60108; WO 00/56872; WO 99/37755; SAD Pat. br. 5,948,653, 6,074,853, 5,763,240, 5,929,043 i 5,989,879, koje su sve ovde inkorporirane u potpunosti po referenci. Podrazumeva se da preparati i postupci predmetnog pronalaska koriste rekombinaze kakve su ovde opisane kao i druge koje su dobro poznate stručnjacima u ovoj oblasti.

[0057] Kao što je prethodno razmatrano, rekombinaciona kaseta i vektor sadrže regulatorne elemente. U jednom rešenju predmetnog pronalaska, ovi promoterski i, opciono, pojačivački elementi potiču od bilo kog soja citomegalovirusa, kao što je opisano ovde ili u referencama kao što je SAD Patent br. 5,658,759, koji je ovde inkorporiran po referenci. Na primer, pogodni CMV umereni rani promoterski regioni koji su korisni za upotrebu u rekombinacionim kasetama predmetnog pronalaska mogu da se dobiju iz CMV promovisanog P-galaktozidaznog ekspresionog vektora, CMVP (MacGregor et al., Nucl. Acids Res. 17: 2365 (1989)).

[0058] Rekombinaciona kaseta može da se koristi u obliku golog konstrukta nukleinske kiseline. Alternativno, rekombinaciona kaseta može da se uvede kao deo vektora nukleinske kiseline (t.j. rekombinacionog vektora kao što su oni koji su prethodno opisani). Takvi vektori obuhvataju plazmidne i viralne vektore.

[0059] Pod pojmom "željeni polinukleotid" podrazumevaju se molekuli nukleinskih kiselina koji mogu da se transkribuju. Molekul može da bude iste ili komplementarne orijentacije u odnosu na promoter ("sens" ili "antisens" orijentacije). Antisens konstrukti mogu da se koriste za inhibiciju ekspresije gena u ćeliji, prema dobro poznatim tehnikama. Željeni polinukleotid može da obuhvata heterologi polinkleotid. Heterologi polinukleotid obično potiče iz druge vrste u odnosu na vrstu iz koje potiču regulatorni elementi sa kojima je operativno vezan u rekombinacionoj kaseti ili vektoru, ili, ukoliko potiče iz iste vrste, modifikovan je u odnosu na originalni oblik. Stoga, heterologi polinukleotid koji je operativno vezan za promoter potiče iz različitog izvora od onog iz kojeg je potekao promoter, ili je, ukoliko potiče iz istog izvora, modifikovan u odnosu na originalni oblik. Heterologi polinukleotidi mogu da se modifikuju, npr., tretiranjem DNK restrikcionim enzimom da bi se dobio fragment DNK koji može operativno da se veže za promoter, čime se polinukleotid modifikuje u odnosu na svoj originalni oblik. Za modifikaciju heterologih polinukleotida takođe je korisna i mutageneza upravljena ka određenom mestu ("site directed mutagenesis"). Heterologi polinukleotidi mogu da sadrže i gene za markere (npr., gene koji kodiraju (B-galaktozidazu ili zeleni fluorescentni protein) ili gene čiji proizvodi regulišu ekspresiju drugih gena. Stoga su u ovu definiciju uključeni polinukleotidi koji služe kao osnova za prepisivanje iRNK, tRNK i rRNK. Heterologi geni mogu da budu bilo koje alelne varijante gena divljeg tipa, ili mogu da budu imitirani geni. iRNK može opciono da sadrži deo ili sve 5' i/ili 3' bočne sekvence koje su transkribovane ali nisu translirane, koje se javljaju u prirodi ili koje su na drugi način vezane za kodirajuću sekvencu koja se translira.

[0060] Željeni polinukleotid može opciono da sadrži još i spregnute elemente za kontrolu transkripcije koji su u normalnim uslovima vezani za transkribovane molekukle, na primer, signale za zaustavljanje transkripcije ("stop" signale), poliadenilovane domene i nishodne pojačivačke elemente. Željeni polinukleotid je obično DNK sekvenca (na primer, cDNK ili genomska DNK) koja kodira polipeptidni proizvod kao što su enzimi (npr., P-galaktozidaza); hormoni; citokini; interleukini; interferoni; TNF; faktori rasta (npr., IGF-1); rastvorni molekuli receptora (npr., rastvorni molekuli TNF receptora); neurotransmiteri i njihovi pekursori; tropni faktori kao što su BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3 i NT5; apolipoproteini kao što su ApoAI i ApoAIV; distrofin i minidistrofin; proteini za supresiju tumora kao što su p53, Rb, RaplA, DCC i k-rev; faktori koagulacije kao što su faktori VII, VIII i IX; ili, alternativno, ceo ili deo prirodnog ili veštačkog imunoglobulina (npr., Fab ili ScFv, ili laki ili teški lanac kloniranog IgG).

[0061] Željeni polinukleotid može još da sadrži i osnovu ("template") za dobijanje antisens molekula, čija transkripcija u ciljnoj ćeliji omogućava ekspresiju ili transkripciju ćelijske iRNK koju treba kontroli sati. Takvi molekuli mogu, na primer, da budu transkribovani u ciljnoj ćeliji u RNK molekule komplementarne ćelijskim iRNK, i na taj način blokiraju njihovu translaciju u proteine, prema tehnikama koje su poznate u struci. Konkretno, antisens molekuli mogu da se koriste za zaustavljanje translacije zapaljenskih ili kataboličkih citokina u lečenju artritisa i gubitka tkiva izazvanog ovim citokinima.

[0062] Željeni polinukleotid obično kodira polipeptid sa dijagnostičkom ili terapeutskom primenom. Polipeptid može da se proizvede u bioreaktorima,in vitro,upotrebom različitih ćelija domaćina (npr., COS ćelija ili CHO ćelija, ili njihovih derivata) koje sadrže rekombinacionu kasetu predmetnog pronalaska.

[0063] Pod terapeutskom primenom podrazumeva se primena koja može da dovede do olakšanja simptoma neke bolesti ili poremećaja, do izlečenja bolesti ili poremećaja, i/ili smanjenja ozbiljnosti bolesti ili poremećaja. Dijagnostička primena obuhvata upotrebu molekula korisnih u određivanju ili prikupljanju informacija o uzroku ili odnosu nekog molekula i procesa koji odlikuju neku bolest, ili u utvrđivanju prisustva i odsustva neke bolesti ili poremećaja. Dijagnostičko sredstvo ne doprinosi direktno poboljšanju bolesti ili poremećaja.

[0064] Željeni polinukleotid može, takođe, da kodira i antigeni polipeptid koji može da se koristi kao vakcina. Polinukleotidi koji kodiraju antigene polipeptide se razvijaju iz patogenih organizama kao što su, na primer, bakterije i virusi. Na primer, antigeni polipeptidi sadrže antigene determinante prisutne u polipeptidima patogenih organizama. Shodno tome, moguće je dobiti vakcine protiv organizama kakvi su uzročnci virusne hemoragične septikemije, bakterijske bolesti bubrega, vibrioze i furunkuloze.

[0065] Kada se koristi u predmetnoj prijavi, "izolovan", kada se odnosi na molekul ili preparat kao što je, na primer, vektor ili rekombinaciona kaseta predmetnog pronalaska, ili željeni polinukleotid, znači da je molekul ili preparat odvojen od bar jednog drugog jedinjenja, kao što je protein, DNK, RNK ili druge nečistoće za koje je vezanin vivoili u stanju u kome se javlja u prirodi. Shodno tome, željeni polinukleotid se smatra izolovanim kada je izolovan od bilo koje druge komponente sa kojom je prirodno udružen. Izolovani preparat može da bude suštinski čist. Izolovani preparat može da bude u homogenom stanju. On može da bude suv/liofilizovan ili u vodenom rastvoru. Čistoća i homogenost mogu da se odrede, npr., korišćenjem tehnika analitičke hernije kao što su, npr., poliakrilamidna gel elektroforeza (PAGE), agarozna gel elektroforeza ili tečna hromatografija pri visokom pritisku (HPLC).

[0066] Kada se koristi u predmetnoj prijavi, izraz "rekombinantan" označava polinukleotid koji je sintetisan ili kojim je na neki drugi način manipulisanoin vitro(npr., "rekombinantni polinukleotid"), postupke upotrebe rekombinantnih polinukleotida za dobijanje proizvoda u ćelijama ili drugim biološkim sistemima, ili polipeptid ("rekombinantni protein") kodiran rekombinantnim polinukleotidom Rekombinantni polinukleotidi obuhvataju molekule nukleinskih kiselina iz različitih izvora vezane u rekombinacionu kasetu ili vektor za ekspresiju, npr. fuzionog proteina; ili one koji su dobijeni inducibilnom ili konstitutivnom ekspresijom polipeptida (npr., rekombinacionu kasetu ili vektor predmetnog pronalaska operativno vezanu za heterologi polinukleotid, kao što je sekvenca koja kodira polipeptid).

[0067] U uobičajenom ekspresionom sistemu, dobijanje polipeptida iz heterologog polinukleotida ili nije regulisano, ili je regulisano modulacijom transkripcije pomoću transkriprionog promotera koji je operativno vezan ushodno od polinukleotida koji kodira heterologi polipeptid. Međutim, proces mora da bude pravilno regulisan i nishodno, kako bi se obezbedila pravilna terminacija transkripcije i stabilnost iRNK. U jednom rešenju predmetnog pronalaska, poliadenilovani signalni (poliA) domen se dodaje nishodno (ka 3' kraju) od željenog polinukleotida prisutnog u rekombinacionoj kaseti ili vektoru predmetnog pronalaska. U jednom rešenju se koristi hGHv poliA signalni domen, koji obuhvata sekvencu izvedenu iz genske sekvence humanog hormona rasta. Sekvenca hGHv poliadenilovanog signalnog domena obezbeđuje snažnu terminaciju transkripcije i povećanu stabilnost iRNK u eukariotskim ćelijama. Ovaj hGHv poliadenilovani signalni domen obezbeđuje jasnu prednost nad prethodno upotrebljavanim rekombinacionim kasetama i/ili vektorima, uključujući one koji mogu da upotrebljavaju CMV promoter/pojačivač.

[0068] Translacioni elementi takođe mogu da budu prisutni; oni obuhvataju specijalizovane sekvence (kao što su mesta za vezivanje ribozoma i inicijacioni kodoni) koje su neophodne da omoguće translaciju RNK transkripta u protein. Translacioni elementi mogu još da obuhvataju i koncenzusne sekvence, vodeće sekvence ("leader sequence"), signale za splajsing i slične, koje služe za omogućavanje ili pojačavanje translacije, ili za povećanje stabilnosti eksprimiranog proizvoda. Vektori predmetnog pronalaska mogu da sadrže dodatne regione transkripcije, kao što su introni, poliadenilovani signali, Sajn - Delgarnovi translacioni signali i Kozakove koncenzusne sekvence (Shine et al, Proc. Natl. Acad. Sci. (SAD) 71: 1342 - 1346 (1974); Kozak, Cell 44: 283 - 292 (1986)).

[0069] Podrazumeva se da izraz "replikacioni elementi" obuhvata specijalizovane sekvence (kao što su mesta početka replikacije ("origin")) koje su neophodne da omoguće replikaciju vektora u ćeliji recipijentu. Uopšteno govoreći, ovakvi vektori sadrže bar jedno mesto početka replikacije koje je dovoljno da omogući autonomnu stabilnu replikaciju vektora u ćeliji recipijentu.

[0070] U dalejm rešenju, predmetni pronalazak se takođe odnosi na ćelije domaćine koje sadrže prethodno opisane konstrukte (t.j., rekombinacionu kasetu ili vektor predmetnog pronalaska). Rekombinaciona kaseta predmetnog pronalaska može da se upotrebi za modifikaciju ćelije domaćina preko transfekcije ćelije domaćina ili transformacije ćelije domaćina kako bi eksprimirala željeni polinukleotid. Kada se koristi u predmetnoj prijavi, izraz "rekombinantno modifikovan" označava uvođenje rekombinacione kasete ili vektora predmetnog pronalaska u živu ćeliju ili ekspresioni sistem. Rekombinaciona kaseta koja sadrži željeni polinukleotid je obično prisutna u vektoru (npr., plazmidu). Ekspresioni sistem uključuje živu ćeliju domaćina u koju je uveden željeni polipeptid čiji proizvod treba da se eksprimira, kao što je ovde opisano.

[0071] Ćelije domaćini su ćelije u kojima mogu da se propagiraju rekombinacione kasete (uključujući i vektore koji sadrže rekombinacione kasete) i u kojima mogu da se eksprimiraju polinukleotidi koji kodiraju proizvode. Ćelije domaćini takođe obuhvataju sve potomke dotične ćelije domaćina ili ćelije koje su iz njih izvedene. Podrazumeva se da svi potomci ne moraju da budu identični roditeljskim ćelijama s obzirom da tokom replikacije može da dođe do mutacija. Međutim, kada se koristi izraz "ćelije domaćini" podrazumeva se i takvo potomstvo. Ćelije domaćini koje mogu da se koriste u predmetnom pronalasku obuhvataju bakterijske ćelije (npr.,E. coli),ćelije gljiva (npr., ćelije kvasaca), biljne ćelije i životinjske ćelije. Na primer, ćelije domaćini mogu da budu ćelije viših eukariota, kao što su ćelije sisara, ili nižih eukariota, kao što su ćelije kvasca; ćelije domaćini mogu da budu i prokariotske ćelije, kao što su bakterijske ćelije. Uvođenje konstrukta u ćeliju domaćina može efikasno da se izvrši pomoći kalcijum fosfatne transfekcij e, transfekcij e posredovane DEAE-dekstranom, ili elektroporacije (Daviš, L., Dibner, M., Battev, I., Basic Methods in Molecular Biologv (1986)). Kao ilustrativni primeri pogodnih ćelija domaćina mogu da se navedu: ćelije gljiva, kao što je kvasac; ćelije insekata kao što su Drosophila S2 i Spodoptera Sf9; životinjske ćelije kao što su CHO, COS ili ćelije Bausovog melanoma; biljne ćelije i slične. Izbor odgovarajućeg domaćina, na osnovu uputstava koja su ovde data, u okviru je sposobnosti stručnjaka u ovoj oblasti.

[0072] Ćelije domaćini koje se upotrebljavaju u predmetnom pronalasku obuhvataju eukariotske ćelije domaćine (npr., ćelije sisara). U jednom rešenju predmetnog pronalaska ćelije domaćini su proizvodne ćelije sisara koje su adaptirane za rast u ćelijskoj kulturi. Primeri ovakvih ćelija, koje se obično koriste u struci uključuju CHO, VERO, BHK, HeLa, CV1 (uključujući Cos; Cos-7), MDCK, 293, 3T3, C127, ćelijske linije mijeloma (posebno mišje), PC12 i W138 ćelije. Ćelije jajnika kineskog hrčka (CHO) se često koriste za dobijanje nekoliko kompleksnih rekombinantnih proteina, npr., citokina, faktora koagulacije i antitela (Brasel et al., Blood 88: 2004 - 2012 (1996); Kaufman et al., J.Biol Chem 263: 6352 - 6362 (1988); McKinnon et al., J Mol Endocrinol 6: 231 - 239 (1991); Wood et al., J. Immunol 145: 3011 - 3016 (1990)). Mutantne ćelijske linije deficijentne u dihidrofolat reduktazi (Urlaub et al., Proc Natl Acad Sci SAD 77: 4216 - 4220 (1980)) su CHO ćelije domaćini koje se najčešće koriste zbog toga što efikasni DHFR sistem za selekciju i amplifikaciju ekspresije gena omogućava visok stepen ekspresije rekombinantnog proteina u ovim ćelijama (Kaufman, Meth Enzvmol 185: 527 - 566 (1990)). Uz to, ovim ćelijama se lako manipuliše, bilo da rastu u kulturi na čvrstoj podlozi ili u suspenziji, a pokazuju i relativno visoku genetsku stabilnost. CHO ćelije i rekombinantni proteini eksprimirani u njima su detaljno okarakterisani, a njihova upotreba u kliničkoj proizvodnji je odobrena od strane nadležnih agencija. Uz to, smatra se da mogu da se koriste i ćelije domaćini koje su izvedene iz bilo koje polazne ćelijske linije a koje imaju željeni fenotip. Na primer, izvedene ćelije domaćini obuhvataju CHO ćelije (npr. ćelijsku liniju DG44) koje su odgajene uz selekciju za određeni fenotip (npr., procesima pozitivne i/ili negativne selekcije). U jednom rešenju, CHO ćelije su adaptirane na rast u podlozi bez seruma a mogu takođe, ili nezavisno, da budu adaptirane za rast u suspenziji (videti, npr. Sinacore et al., Biotechnol. Bioengin, 52: 518 - 528 (1996); i Haldankar et al., Biotechnol. Prog. 15: 336 - 346 (1999)). Ćelijama adaptiranim na rast u suspenziji se lakše rukuje i moguće je postići veće gustine. Prednost upotrebe ćelije adaptiranih na rast u podlozi bez seruma leži u olakšanom prečišćavanju rekombinantnog proteina iz supernatanta zaostalog iznad ćelijske kulture.

[0073] U jednom rešenju predmetnog pronalaska, obezbeđen je ekspresioni sistem zain vi troproizvodnju sredstva koje kodira željeni polinukleotid. Kao što je prethodno razmatrano, željeni polinukleotid može da kodira polipeptid koji ima farmaceutsku, medicinsku, nutricionu i/ili industrijsku vrednost. Na primer, željeni polipeptid može da kodira lek koji se zasniva na polipeptidu. Ovakav polipeptid će se obično eksprimirati kao vanćelijski proizvod. Na primer, polipeptidi koji mogu da se dobiju upotrebom rekombinacione kasete i/ili vektora predmetnog pronalaska obuhvataju, ali nisu ograničeni na Flt3 ligand, CD40 ligand, eritropojetin, trombopojetin, kalcitonin, Fas ligand, ligand za aktivator receptora NF-kapa B ("ligand for receptor activator of NF-kappa B", RANKL), ligand koji indukuje apoptozu srodan TNF ("TNF-related apoptosis-inducing ligand", TRAIL), ORK/Tek, limfopojetin iz strome timusa, faktor stimulacije kolonija granulocita, faktor stimulacije kolonija granulocita i makrofaga, faktor rasta mastocita, faktor rasta matičnih ćelija, faktor rasta epiderma, RANTES, hormon rasta, insulin, insulinotropin, insulinu slične faktore rasta, paratiroidni hormon, interferone (npr., interferon beta), faktore rasta neurona, glukagon, interleukine od 1 do 18, faktore stimulacije kolonija, limfotoksin-p\ faktor nekroze tumora (TNF), faktor inhibicije leukemije, onkostatin-M, različite ligande molekula sa površine ćelija Elk i Hek (kao što su ligandi za kinaze srodne eph, LERKS), kao i lake i teške lance antitela.

[0074] Receptori (ili njihovi rastvorljivi fragmenti) bilo kog od prethodno pomenutih proteina takođe mogu da se eksprimiraju pomoću postupaka i preparata predmentog pronalaska, uključujući oba oblika faktora nekroze tumora (koji se označavaju kao p55 i p75), receptore interleukina-1 (tip 1 i 2), receptor interleukina-4, receptor interleukina-15, receptor interleukina-17, receptor interleukina-18, receptor faktora stimulacije kolonija granulocita i makrofaga, receptor faktora stimulacije kolonija granulocita, receptore za onkostatin-M i faktor inhibicije leukemije, aktivator receptora NF-kapa B (RANK), receptore za TRATL, receptor za BAFF, receptor za limfotoksin beta, receptore za TGF(3 tipove I i II, i receptore koji obuhvataju domene smrti, kao što su Fas ili receptor koji indukuje apoptozu ("Apoptosis-Inducing receptor", AIR).

[0075] Drugi proteini koji mogu da se eksprimiraju upotrebom rekombinacionih kaseta i/ili vektora predmetnog pronalaska obuhvataju antigene grupa za diferencijaciju (koji su poznati kao CD ("cluster of differentiation") proteini): na primer, one opisane u Leukocvte Tvping VI (Proceedings of the VIth International VVorkshop and Conference; Kishimoto, Kikutani et al., urednici; Kobe, Japan, 1996), ili CD molekule opisane na radionicama koje su usledile. Primeri ovakvih molekula obuhvataju CD27, CD30, CD39, CD40, i njihove ligande (CD27 ligand, CD30 ligand i CD40 ligand). Nekoliko ovih molekula su članovi familjije receptora TNF, koja uključuje još i 41BB i OX40; ligandi su često članovi familije TNF (kao što su 41BB ligand i OX40 ligand); shodno tome, članovi familija TNF i TNFR takođe mogu da budu eksprimirani pomoću predmetnog pronalaska.

[0076] Polipeptidi koji imaju enzimsku aktivnost takođe mogu da se eksprimiraju prema predmetnom pronalasku. Primeri ovakvih polipeptida obuhvataju članove familije metaloproteinaza - dezintegrina, različite kinaze, glukocerebrozidaze, superoksid dizmutaze, aktivator tkivnog plazminogena, faktor VIII, faktor IX, apolipoprotein E, apolipoprotein A-I, globine, IL-2 antagonist, alfa-1 antitripsin, TNF-alfa konvertujući enzim (TACE) i brojne druge enzime. Korišćenjem rekombinacionih kaseta i vektora predmetnog pronalaska mogu da se eksprimiraju i ligandi enzimski aktivnih proteina.

[0077] Preparati i postupci predmetnog pronalaska su takođe korisni u ekspresiji drugih vrsta rekombinantnih proteina i polipeptida, uključujući imunoglobulinske molekule ili njihove fragmente, kao i himerna antitela (npr., antitela koja imaju humani konstantni region vezan za mišji antigen vezujući region) ili njihove fragmente. Poznate su brojne tehnike kojima je moguće manipulisati DNK molekulima koji kodiraju imunoglobuilinske molekule, kako bi se dobile DNK koje kodiraju rekombinantne proteine, kao što su jednolančana antitela, antitela sa povećanim afinitetom, ili drugi polipeptidi zasnivani na antitelima (videti, npr., Larrick et al., Biotechnology 7: 934 - 938 (1989); Reichmann et al., Nature 332: 323 - 327 (1988); Roberts et al., Nature 328: 731 - 734 (1987), Verhoeven et al., Science 239: 1534 - 1536 (1988); Chaudhary et al., Nature 339: 394 - 397 (1989)). Klonirana humanizovana antitela uključuju ona antitela koja se specifično vezuju za receptor beta limfotoksina i integrine kao što su VLA-1, VLA-4 i av(36. Ovakva antitela mogu da budu agonisti i antagonisti.

[0078] Upotrebom preparata i postupaka predmetnog pronalaska takođe mogu da se eksprimiraju različiti fuzioni proteini. Primeri takvih fuzionih proteina obuhvataju proteine koji su eksprimirani kao fuzionisani sa delom imunoglobulinskog molekula, proteine koji su eksprimirani kao fuzionisani sa motivom rajsferšlusa ("zipper"), kao i nove polifunkcionalne proteine kao što je fuzioni protein citokina i faktora rasta (npr., GM-CSF i IL-3, MGF i IL-3). U WO 93/08207 i WO 96/40918 opisani su preparati različitih rastvornih oligomernih oblika molekula koji je označen kao CD40L, uključujući fuzioni protein sa imunoglobulinom i fuzioni protein sa rajsfešlusom, respektivno; tehnike koje su u tim publikacijama razmatrane su primenljive i na druge proteine.

[0079] Kada je željeni polinukleotid eksprimiran, proizvod ekspresije (npr., protein ili polipeptid) može da bude prečišćen korišćenjem standardnih tehnika poznatih struci. Na primer, ukoliko željeni polinukleotid kodira fuzioni protein koji sadrži marker za prečišćavanje, polipeptid može da se prečisti upotrebom antitela koja se specifično vezuju za taj marker. U jednom rešenju, oligonukleotid koji kodira molekul markera se vezuje za 5' ili 3' kraj željenog polinukleotida koji kodira željeni polipeptid; taj oligonukleotid može da kodira poliHis (kao što je heksaHis), ili neki drugi marker, kao što su FLAG, HA (hemaglutinin Influenza virusa) ili myc, za koje postoje komercijalno dostupna antitela. Ovaj marker se obično fuzioniše sa polipeptidom tokom ekspresije polipeptida, i može da omogući afinitetno prečišćavanje željenog polipeptida iz ćelije domaćina. Afinitetno prečišćavanje može da se izvrši, na primer, hromatografijom u koloni, pri čemu se kao afinitetni matriks koriste antitela na taj marker. Marker kasnije može opciono da se ukloni iz prečišćenog polipeptida na različite načine, kao što je proteolitičko cepanje.

[0080] Rekombinaciona kaseta i vektori predmetnog pronalaska mogu da se koriste za obezbeđivanje stabilnog transfera željenog polinukleotida u ćeliju domaćina. Stabilan transfer podrazumeva kontinualno održavanje željenog polinukleotida u ćeliji domaćinu.

[0081] Vektori koji sadrže željeni polinukleotid mogu da budu uneseni u ćeliju dobro poznatim postupcima, u zavisnosti od vrste ćelije domaćina. Na primer, mikroinjekcije se često koriste za ciljne ćelije, iako mogu da se koriste i tretman kalcijum fosfatom, elektroporacija, lipofekcija, biolistika ili transfekcija zasnovana na virusima. Drugi postupci transformacije ćelija sisara uključuju upotrebu Polibrena, fuziju protoplasta i druge (videti, u principu, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratorv Manual, 2. izdanje, 1989, Cold Spring Harbor Laboratorv Press, Cold Spring Harbor, N.Y, koja je ovde inkorporirana po referenci).

[0082] U još jednom rešenju, predmetni pronalazak obezbeđuje komplet. Ovaj komplet sadrži rekombinacionu kasetu i/ili vektor predmetnog pronalaska. Komplet može da sadrži još i ćeliju domaćina koja sadrži ciljnu sekvencu (t.j., FRT mesto). Ovakva ćelija domaćin se obično pakuje u jedan ili više zatvorenih sudova (npr., pakete, bočice, epruvete, ili mikrotitar ploče), koji u nekim rešenjima mogu da sadrže još i hranljive podloge. Komplet obično sadrži literaturu koja opisuje osobine ćelije domaćina (npr., njen genotip) i/ili uputstva za njenu upotrebu u transformaciji. U nekim rešenjima, komplet sadrži i jedan ili više polinukleotida koji sadrže rekombinacionu kasetu i/ili vektor predmetnog pronalaska, a može da sadrži i enzime (npr., Flp rekombinazu) u odvojenim sudovima.

Primeri

[0083]Dobijanje rekombinacionekasete/vektora. Plazmid pFRT/lacZeo (Invitrogen Inc., kataloški br. V6015-20; videti sliku 4) linearizovan je Sapi restrikcionom endonukleazom (1 jedinica Sapi endonukleaze na 1 |j.g plazmida) i izložen njenom dejstvu oko 16 časova inkubacijom na 37 °C. Ćelija domaćin upotrebljena za transfekciju je ćelijska linija DG44 ćelija jajnika kineskog hrčka deficijentna za dihidrofolat reduktazu (DHFR) (Urlaub et al., Cell 33, 405 - 412

(1983)). Upotrebljeno je približno 2 x IO<6>vijabilnih CHO-DG44 ćelija domaćina po pojedinačnoj transfekciji. Ćelije domaćini su izložene elektroporezi na 280V, 960 pF, korišćenjem 500 ng linearizovanog plazmida pFRT/lacZeo po transfekciji.

[0084] Uspešni transfektanti su selektovani iz podloge koja sadrži 200 u.g/ml antibiotika Zeocina™ (Invitrogen, Inc. kataloški br. # R250-01). Kolonije koje su uspešno rasle na selektivnoj podlozi su izolovane prebacivanjem u ploče za kulturu sa po 24 polja. Ovi izolati su zatim razmnoženi u pločama za kulturu sa po 6 polja, sve dok nisu postali dovoljno brojni da bi se transficirane ćelije prebacile u T225 erlenmajere. Iz ćelija je izolovana genomskaDNK (5 x IO<6>).

[0085] Genomska DNK iz >100 ćelijskih linija ispitana je Southern blotom, kako bi se potvrdilo prisustvo pojedinačne kopije FRT sekvence. Sekvenca probe obuhvata FRT sekvencu i 5' kraj fuzionog gena beta-galaktozidaze (videti sliku 5). Od

>100 ćelijskih linija koje su ispitane, za ispitivanja ekspresije proteina izabrano je samo 35 ćelijskih linija sa pojedinačnom kopijom FRT integracionog mesta (videti slike 6 i 7).

[0086]Kloniranje repoter gena.Rekombinaciona kaseta/vektor koji sadrži CMV IE1, fragment introna A i poliA signalni domen poređeni su sa komercijalno dostupnim rekombinacionim vektorom.

[0087] Sektretorna alkalna fosfataza (SEAP) korišćena je kao model sekretornog proteina za utvrđivanje stepena ekspresije, dok je kao ćelijska linija domaćin korišćena ćelijska linija CHO-DG44 Flp-In. Sekvenca koja kodira SEAP dobijena je iz pSEAP2 ekspresionog plazmida (Clontech, Palo Alto, CA) pomoću amplifikacije lančanom reakcijom polimeraze (PCR). 5' prajmer je konstruisan tako da sadržiKpnlmesto, a 3' prajmer je konstruisan tako da sadržiBglilmesto.

[0088] PCR je izvršen uz sledeće uslove: 3 u,g pSEAP2 plazmida (Clontech, Palo Alto, CA); po 1 u.M 5' i 3' prajmera (videti gore); 0.25 mM dNTPs (Promega, Madison, WI); 2 jedinice Vent® polimeraze (New England Biolabs, Beverlv, MA); IX Vent® pufer za polimeraznu reakciju (New England Biolabs, Beverlv, MA). PCR je izveden u reakcionoj zapremini od 100 ul Izvršeno je oko 30 PCR ciklusa na 95 °C u toku 30 sekundi, na 55 °C tokom 45 sekundi i na 75 °C tokom 2 minuta, zatim na 75 °C tokom 10 minuta, a zatim čuvano na 4 °C. Dobijen je PCR proizvod veličine od oko 1,6 kb koji odgovara regionu koji kodira SEAP. PCR proizvodi su prečišćeni iz PCR smeše upotrebom kompleta za prečišćavanje Wizard® PCR purification kit (Promega, Madison, WI), i eluirani pomoću dH20. PCR proizvod je izložen dejstvu endonukleazeKpnl(New England Biolabs, Beverlv, MA), a zatimBgHl(New England Biolabs, Beverlv, MA).

[0089] Deset ng pFRT/dhfr-1 plazmida, koji je prethodno izložen digestiji endonukleazamaKpnliBamHl,vezan je za digestirani SEAP PCR proizvod. Sekvencirani su region koji kodira SEAP i tačke spojeva. Kao što je i očekivano, rezultati su se poklapali sa hipotetičkom, predviđenom sekvencom. Plazmid je nazvan

pFRT/SEAP.

[0090] Transfekcij a reporter gena za SEAP u Flp-In ćelijsku liniju domaćina izvršena je elektroporacijom. Deset u.g pFRT/SEAP spojeno je sa 90 ug pOG44 (Invitrogen, Carlsbad, CA), plazmidom za ekspresiju Flp rekombinaze. DNK je precipitirana etanolom, isprana u 70% etanolu i osušena. Za transfekciju je upotrebljeno 2 x IO<6>vijabilnih ćelija ćelijske linije. Ćelije i DNK su pomešane u sterilnim uslovima u 800 ul sterilnog HeBS (20 mM Hepes pH = 7,05, 137 mM NaCl, 5 mM KC1, 0,7 mM Na2HP04, 6 mM dekstroza) i prebačeni u kivetu od 0,4 cm (BioRad, Hercules, CA). Elektroporacija je izvršena korišćenjem Gene Pulser®

(Biorad, Hercules, CA) podešenog na 0.28kV i 950 uFd. Nakon pulsa elektroporacije, ćelije su inkubirane u kiveti tokom 5 do 10 minuta na sobnoj temperaturi. Nakon toga, ćelije su prebačene u kivetu za centrifugiranje koja je sadržala 10 ml alfa-MEM i nukleozide (Gibco, Gaithersburg, MD) sa 10% dijalizovanog fetalnog goveđeg

seruma (dFBS) (Hvclone, Logan, UT) i centrifugirane na 1000 rpm tokom 5 minuta. Resuspendovani talog je zasejan na ploče sa po 6 polja u alfa-MEM bez nukleozida, sa 10% dFBS i inkubiran na 36 °C sa 5% C02u inkubatoru sa održavanjem vlažnosti približno 2 nedelje, nakon čega su se formirale kolonije.

[0091] Stabilni transfektanti su analizirani kao izolati. Izolati su dobijeni odabiranjem pojedinačnih kolonija nakon transfekcije. Pojedinačne kolonije su izdvajane aspiracijom direktno iznad kolonije pomoću P200 Pipetman™ podešenog na 50 ul. Aspirirane kolonije su zatim prvo prebacivane u ploču sa 24 polja. Kada je u polju postignuto >50% konfluentnog rasta, podloga je zamenjena hemijski definisanom ProCH04 podlogom (Cambrex, Walkersville, MD), kojoj je dodato 4 mM L-glutamina (Cambrex, Walkersville, MD), te su ćelije prebačene u ploče sa po 6 polja. Specifična produktivnost je određivana u pločama sa po 6 polja blizu ili po postizanju konfluentnog rasta.

[0092] Specifična produktivnost određivana je SEAP testom, supstitucijom podloge svežom podlogom, zatim uzimanjem uzorka podloge i brojanjem ćelija nakon 4 dana. Titar proizvoda je normalizovan za broj ćelija na kraju perioda od 4 dana, a produktivnost je izražena kao SEAP aktivnost po ćeliji.

[0093] Kondicionirana podloga je analizirana pomoću Great EscAPe™ SEAP Reporter Svstem 3 (Clontech, Palo Alto, CA). U ovom testu se za detekciju aktivnosti SEAP u kondicioniranoj podlozi koristi fluorescentni supstrat. Korišćen je komplet u formatu od 96 polja, prema uputstvima proizvođača. Svi standardi i uzorci su razblaženi svežom podlogom, umesto dobijenim puferom za razblaživanje. Umesto jednog očitavanja nakon 60 minuta, vrednosti su očitavane nakon 10 minuta i ponovo nakon 40 minuta, te su ti podaci upotrebljeni za izražavanje SEAP aktivnosti u relativnim jedinicama flurescencije u minuti (RFU/min). Sa čitačem ploča Cvtofluor II™ (PerSeptive Biosvstems, Framingham, MA) korišćen je emisioni filter na 460 nm umesto preporučenih 449 nm.

[0094] Vrednosti RFU/min su normalizovane u odnosu na standardnu krivu zasnovanu na standardima dobijenim u kompletu. S obzirom da dobijeni standard nije kvantifikovan, sve vrednosti su relativne. Ove relativne vrednosti su normalizovane u odnosu na brojeve ćelija i period inkubacije, kako bi se dobile relativne specifične produktivnosti (SEAP aktivnost po ćeliji na dan).

[0095] Opisano je više rešenja predmetnog pronalaska. Uprkos tome, podrazumeva se da je moguće izvršiti različite modifikacije a da se pri tome ne odstupi od duha i opsega zaštite predmetnog pronalaska. Shodno tome, druga rešenja potpadaju u opseg zaštite sledećih patentnih zahteva.

Claims (30)

1. Rekombinaciona kaseta naznačena time što sadrži region promotera/pojačivača; željeni polinukleotid; poliA signalni domen; FRT rekombinacioni domen; i dhfrpolinukleotid, gde su region promotera/pojačivača, željeni polinukleotid i poliA signalni domen operativno vezani.

2. Rekombinaciona kaseta prema zahtevu 1, naznačena time što region promotera/pojačivača sadrži humani CMV umereni rani 1 (hCMV IE1).

3. Rekombinaciona kaseta prema zahtevu 2, naznačena time što hCMV IE1 region promotera/pojačivača sadrži sekvencu predstavljenu od oko xido okoX2sekvenci čiji su ID brojevi 1 ili 2, gde je xinukleotid od položaja 1 do položaja 70, a x2nukleotid od položaja 770 do položaja 780.

4. Rekombinaciona kaseta prema zahtevu 1, naznačena time što dalje sadrži umetnutu sekvencu varijabilne dužine (VLIVS) koja sadrži donorsko mesto za splajsing i akceptorsko mesto za splajsing.

5. Rekombinaciona kaseta prema zahtevu 4, naznačena time što VLIVS sadrži intron A hCMV IE1 gena.

6. Rekombinaciona kaseta prema zahtevu 4, naznačena time što VLIVS sadrži intron A hCMV IE1 gena koji ima deleciju između donorskog mesta za splajsing i akceptorskog mesta za splajsing introna A.

7. Rekombinaciona kaseta prema zahtevu 6, naznačena time što VLIVS sadrži sekvencu od oko x3do okoX4sekvence čiji je ID broj 1, gde je x3nukleotid od 770 do 780 aX4nukleotid od 1300 do 1310 sekvence čiji je ID broj 1; ili od oko x5do okoX6sekvence čiji je ID broj 2, gde jeX5nukleotid od 770 do 780 aX6nukleotid od 1300 do 1310 sekvence čiji je ID broj 2.

8. Rekombinaciona kaseta prema zahtevu 1, naznačena time što željeni polinukleotid kodira terapeutsko sredstvo.

9. Rekombinaciona kaseta prema zahtevu 1, naznačena time što poliA signalni domen sadrži najmanje 100 uzastopnih nukleotida sekvence čiji je ID broj 3.

10. Rekombinaciona kaseta prema zahtevu 9, naznačena time što poliA signalni domen sadrži sekvencu čiji je ID broj 3.

11. Rekombinacioni vektor naznačen time što sadrži rekombinacionu kasetu iz zahteva 1.

12. Rekombinacioni vektor prema zahtevu 11, naznačen time što dalje sadrži drugi region promotera/pojačivača; drugi željeni polinukleotid; i drugi poliA signalni domen, gde su drugi region promotera/pojačivača, drugi željeni polinukleotid i drugi poliA signal operativno vezani.

13. Rekombinacioni vektor prema zahtevu 12, naznačen time što dalje sadrži umetnuti domen između drugog regiona promotera/pojačivača i drugog željenog polinukleotida.

14. Ćelija domaćin naznačena time što sadrži rekombinacioni vektor iz zahteva 11.

15. Ćelija domaćin prema zahtevu 14, naznačena time što je ćelija domaćin adaptirana za rast u suspenziji.

16. Ćelija domaćin prema zahtevu 14, naznačena time što je ćelija domaćin adaptirana za rast u podlozi bez seruma.

17. Ćelija domaćin prema zahtevu 15, naznačena time što je ćelija domaćin adaptirana za rast u podlozi bez seruma.

18. Ćelija domaćin naznačena time što sadrži rekombinacionu kasetu iz zahteva 1.

19. Ćelija domaćin prema zahtevu 18, naznačena time što je ćelija domaćin adaptirana za rast u suspenziji.

20. Ćelija domaćin prema zahtevu 18, naznačena time što je ćelija domaćin adaptirana za rast u podlozi bez seruma.

21. Ćelija domaćin prema zahtevu 19, naznačena time što je ćelija domaćin adaptirana za rast u podlozi bez seruma.

22. Rekombinacioni sistem naznačen time što sadrži: rekombinacionu kasetu iz zahteva 1; i ćeliju domaćina koja sadrži FRT mesto.

23. Rekombinacioni sistem prema zahtevu 22, naznačen time što je ćelija domaćin CHO ćelija.

24. Rekombinacioni sistem prema zahtevu 23, naznačen time što je CHO ćelija CHO-DG44 ćelija.

25. Rekombinacioni sistem prema zahtevu 22, naznačen time što je ćelija domaćin adaptirana za rast u suspenziji.

26. Rekombinacioni sistem prema zahtevu 22, naznačen time što je ćelija domaćin adaptirana za rast u podlozi bez seruma.

27. Rekombinacioni sistem prema zahtevu 22, naznačen time što je ćelija domaćin dobijena iz CHO-DG44 ćelije.

28. Rekombinacioni sistem prema zahtevu 22, naznačen time što je ćelija domaćin dhfr".

29. Komplet naznačen time što sadrži vektor iz zahteva 10 i ćeliju domaćina koja sadrži FRT mesto.

30. Komplet prema zahtevu 29, naznačen time što je ćelija domaćin dhfr" CHO ćelija domaćin, Čiji genom sadrži FRT mesto.