RS20050614A - Ekspresiona kaseta i vektor za prolaznu ili stabilnu ekspresiju egzogenih molekula - Google Patents

Abstract

Predmetni pronalazak obezbedjuje ekspresionu kasetu i vektor koji sadrže kasetu za ekspresiju polinukleotida. Ekspresiona kaseta uključuje promotor/pojačivač, umetnuti region i domen poliadenilacionog signala. Takodje su obezbedjeni ekspresioni sistemi i posrtupci upotrebe ekspresione kasete i vektora.

Description

EKSPRESIONA KASETA I VEKTOR ZA PROLAZNU ILI STABILNU

EKSPRESIJU EGZOGENIH MOLEKULA

OBLAST PRONALASKA

Predmetni pronalazak se odnosi na ekspresione vektore i ekspresione kasete i još određenije na postupke, preparate i sisteme za ekspresiju egzogenog molekula u organizmu.

STANJE TEHNIKE

Uvođenje molekula nukleinske kiseline, polipeptida i malih molekula u ciljne ćelije i tkiva korisiti se i u terapeutskim sistemima isporuke kao i u proizvodnji terapeutskih molekulain vivo.Primenjivost ovog pristupa porasla je sa daljim razumevanjem ćelija domaćina i molekularne biologije ćelijske deobe, diferencijacije i mehanizama ekspresije.

OPIS PRONALASKA

Otkriveno je da je transkripcija koju vodi CMV promotor i koja se prekida sa poliA domenom iz varijante gena hormona rasta čoveka (hGHv) mnogo efikasnija od drugih ekspresionih vektora koji nemaju jedan ili drugi ili oba takva elementa. Prema tome, pronalazak obezbeđuje ekspresionu kasetu i ekspresioni vektor korisne u ekspresiji polinukleotida za koje postoji interes. Ekspresiona kaseta pronalaska uključuje kombinaciju regulatornih elemenata koji obezbeđuju efikasnu transkripciju, efikasnu terminaciju transkripcije i povećanu stabilnost mRNK transkri-bovanih proizvoda. U jednom obliku, ekspresiona kaseta uključuje promotor/pojačivač humanog citomegalovirusa, mesto kloniranja ili polinukleotid za koji postoji interes, i hGHv poliadenilacioni signalni domen. Po potrebi može biti prisutna umetnuta sekvenca promenjive dužine.

Pronalazak obezbeđuje ekspresionu kasetu koja uključuje promotor/pojačivač region humanog CMV trenutnog ranog 1 (hCMV 1E1), polinukleotid za koji postoji interes i signalni domen varijante humanog hormona rasta (hGHv) poliA ili njegovu varijantu. Varijanta poliA signala ima u dužinu najmanje 100 nukleotida i sadrži sekvencu AATAAA, i najmanje je 92% identična sa hGH poliA signalnim domenom.

Pronalazak dalje obezbeđuje ekspresioni vektor koji uključuje ekspresionu kasetu predmetnog pronalaska kao i ćeliju domaćina koja sadrži ekspresionu kasetu ili ekspresioni vektor pronalaska.

Pronalazak dalje obezbeđuje ekspresionu kasetu koja uključuje promotor/pojačivač region humanog CMV trenutnog ranog 1 (hCMV 1E1), umetnutu sekvencu promenjive dužine (VLIVS) koja sadrži donor uplitanja i prijemno mesto uplitanja, polinukleotid za koji postoji interes, i signalni domen varijante humanog hormona rasta (hGHv) poliA ili njegovu varijantu. PoliA signalni domen ili njegova varijanta je najmanje 100 nukleotida dugačka i sadrži sekvencu AATAAA i najmanje je 92% identična sa hGHv poliA signalnim domenom.

Pronalazak takođe obezbeđuje ekspresioni vektor koji uključuje promotor/pojačivač region humanog CMV trenutnog ranog 1 (hCMV 1E1), umetnutu sekvencu promenjive dužine (VLIVS) koja sadrži donor uplitanja i prijemno mesto uplitanja, mesto kloniranja, hGH poli adenilacioni region i selektibilni marker. U jednom aspektu pronalaska hCMV IE1 promotor/pojačivač region je uzvodno (5') u odnosu na mesto kloniranja i hGH poli adenilacioni region je nizvodno (3') u odnosu na mesto kloniranja.

Pronalazak takođe uključuje postupak za isporuku agensa za koji postoji interesin vivo.Postupak uključuje isporuku subjektu preparata koji sadrži ekspresionu kasetu, ekspresiona kaseta uključuje promotor/pojačivač region hCMV IE1; umetnutu sekvencu promenjive dužine koja sadrži donator uplitanja i prijemno mesto uplitanja; polinukleotid koji kodira agens za koji postoji interes; i signalni domen varijante humanog hormona rasta (hGHv) poliA ili njegovu varijantu.

Pronalazak dalje uključuje ekspresioni sistem. Ekspresioni sistem uključuje transfektovanu ili transformisanu ćeliju domaćina sa ekspresionom kasetom pronalaska, gde je ćelija domaćin kultivisana pod takvim uslovima da eksprimira polinukleotid za koji postoji interes; i da ponovo daje agens od interesa.

Detalji jednog ili više oblika pronalaska dati su u pratećim crtežima i opisani su niže. Druge karakteristike, objekti i prednosti pronalaska biće očigledni iz opisa crteža i iz patentnih zahteva. Sve reference koje su ovde navedene inkorporirane su putem reference.

OPIS SLIKA

Slika 1 je mapa plazmida pV10 vektora. Citomegalovirus rani 1 (CMV IE1) promotor/intron (IVS) je generisan putem PCR-a i kloniran na Hindlll i BamH1 mestima. Gen rezistencije na ampicilin, beta laktamaza( bla),je takođe naznačen.

Slika 2 je mapa plazmida pV40. Naznačeni su trenutni rani promotor citomegalovirusa 1 (CMV 1E1), intron (IVS), hGHv poliadenilacioni signalni domen (poliA) od oko 600 baza dužine, i gen rezistencije na ampicilin, beta laktamazu( bla).

Slika 3 je shematski prikaz plazmida pV70. Naznačeni su promotor CMV IE1, IVS uključujući delecioni spoj i donor uplitanja (SD) i prijemna mesta uplitanja (SA), hGHv poliA signalni domen iblagen. Delecioni spoj predstavlja tupi-kraj kao rezultat ligacije BspElVHpal.

Slika 4 je shematski prikaz nastanaka pXLC1 vektora. pXLC1 vektor je konstrusan ko-risteći ekspresioni vektor pV70 i PCR proizvod koji sadrži sekvencu koja kodira laki lanac. PV70 je pretvoren u linearan sa BamHI, PCR proizvod je digestovan sa BamHI i oba su povezani zajedno da generišu pXLC1 vektor.

Slika 5 je shematski prikaz generisanja pXLC.2 vektora.

Slika 6 je shematski prikaza pV60 vektora i nastanka pXHC vektora. pXHC vektor je konstruisan koristeći ekspresioni vektor pV60 i PCR proizvod koji je sadržao veći deo teškog lanca kodirajuće sekvence (52 amino kiseline od N-terminalnog kraja nisu bile uključene). PV60 je pretvoren u linearan sa BamHI, PCR proizvod je digestiran sa BamHI i to dvoje je vezano zajedno,

Slika 7 je shematski prikaz pXHC1 vektora.

Slika 8 je shematski prikaz pXHC3 vektora.

Slika 9 je shematski prikaz pXHC.5 vektora koji je nastao dodavanjem dhfr kasete u pXHC3. Kontrolni elementi ekspresione kasete su izvedeni iz pSI (Promega, genbank prijava #U47121) i uključuju SV40 promotor/pojačivač, veštački intron i SV40 kasnu poliadenilirajuću sekvencu.

Slika 10 je shematski prikaz vektora pV80. Naznačeni su trenutni rani promotor/intron 1 (CMV IE1) citomegalovirusa fragment (IVS) koji uključuje donor uplitanja (SD) i prihvatna mesta uplitanja (SA), hGHv poliadenilirajući domen signala (poliA), gen za rezistenciju na ampicilin, beta laktamazu (bla), veštački intron SV40 promotor/pojačivač i SV40 kasnu poliadenilirajuću sekvencu.

Slike 11A i 11B su shematski prikazi vektora pV90 i odgovarajućih zabeleženih sekvenci. Slika 11A je mapa vektora. Naznačeni su trenutni rani promotor/intron 1 (CMV IE1) citomegalovirusa fragment (IVS) koji uključuje donor uplitanja (SD) i prihvatna mesta uplitanja (SA), hGHv poliadenilirajući domen signala (poliA), gen za rezistenciju na ampicilin, beta laktamazu (bla), veštački intron SV40 promotor/pojačivač i SV40 kasnu poliadenilirajuću sekvencu. Vektoru nedostaje Noti mesto u dhfr ekspresionoj kaseti. Slika 11B je zabeležena sekvenca pV90 vektora. Na slici 11B, sekvenca od nukleotida 1275 do 1866 SEQ ID BR:19 predstavlja hGHv poliA od oko 600 nukleotida u dužinu.

Slika 12 je mapa vektora pSI-DHFR2. SV40 promotor aktiviradhfrgen.

Slika 13 je grafikon koji opisuje relativne specifične produktivnosti transfektovanih grupa. Tri grupe su analizirane iz pCMV-hGHvPA-SEAP i pSEAP2, i jedna za pUC18.

Slika 14 je par grafikona koji pokazuju relativnu specifičnost produktivnosti izolata. Dva-deset gornjih izolata iz svakog konstrukta su prikazani poredani po redosledu.

Slika 15 pokazuje sekvencu u GenBank prijavi br. K00470 (SEQ ID BR:18).

DETALJNI OPIS PRONALASKA

Pranalazak se odnosi na ekspresionu kasetu i vektore koji sadrže ekspresionu kasetu. Ekspresiona kaseta uključuje transkriptorni regulatorni region sposoban da pokrene transkripciju u eukariotskom domaćinu i region terminacije transkripcije. Ekspresione kasete i vektori pronalaska obezbeđuju snažan početak transkripcije i zaustavljanje kao i povećanu stabilnost mRNK proizvoda transkripcije.

Pronalazak obezbeđuje promotor, i po potrebi, pojačivać elemenata iz bilo kojeg soja citomegalovirusa, kao što je ovde opisano ili u referencama kao što je U.S. patent br. 5,658,759, čije je otkriće ovde inkorporirano sa referencom. Na primer, pogodni trenutni rani promotorski regioni CMV korisni u ekspresionoj kaseti pronalaska mogu se dobiti od CMV-pokrenutog promotora p-galaktozidaze, CMV P (MacGregor i sar., Nucl. Acid. Res. 17:2365

(1989)).

Kao što je ovde dalje diskutovano, hGHv domen poliadenilacionog signala obezbeđuje snažan signal zaustavljanja transkripcije kao i povećanje stabilnosti transkripta mRNK. Regulatorni/ekspresioni element može se razdvojiti od hGHv domena signala poliadenilacije pomoću, na primer, polinukleotida za koji postoji interes ili kloniranjem mesta (npr., višestrukim kloniranjem mesta).

U jednom aspektu pronalaska, obezbeđen je polinukleotid koji sadrži ekspresionu kasetu koja uključuje transkripcioni regulatorni region citomegalovirusa (CMV), umetnutu sekvencu promenjive dužine (npr., iz introna A od CMV), polinukleotid za koji postoji interes, i domen signala poliadelinacije. Pronalazak se dalje odnosi na postupak i ekspresiju vektora za proizvodnju i izdvajanje heterolognih polipeptida iz ćelije domaćina.

U drugom aspektu, ekspresiona kaseta pronalaska uključuje, operativno vezan, (i) CMV glavni trenutni rani 1 (IE1) promotor/pojačivač region i umetnutu sekvencu promenjive dužine (npr., izvedenu iz introna A), (ii) polinukleotid za koji postoji interes i (iii) hGHv domen signala poliadenilacije. Termin "operativno vezan" odnosi se na nastavljanje gde su komponente u odnosu koji im omogućuje da funkcionišu na naćin koji im je namenjen (npr., funkcionalno vezane). Tako je, na primer. promotor/pojačivač operativno vezan za polinukleotid za koji postoji interes, vezan za poslednji na takav način da je ekspresija polinukleotida za koji postoji interes dostignuta pod uslovima koji su kompatibilni sa aktivacijom ekspresije iz promotor/pojačivač.

U specifičnom obliku pronalaska, ekspresiona kaseta uključuje sekvencu kao što je postavljena od SEQ ID BR:1 od oko nukleotida 1 do oko nukleotida 1867 (npr., od oko 1 do 1865, 1866, 1867. 1868 ili 1869). Ekspresiona kaseta postavljena iz nukelotida 1 do 1867 iz SEQ ID BR:1 uključuje jedan broj različitih domena kao što je CMV IE1 promotor/pojačivač regiona koji ima sekvencu kao što je postavljeno od oko x, do oko x2iz SEQ ID BR:1, gde je x. nukleotid od 1-20 i x2je nukleotid od oko 715-720 (npr., od oko 1 do 719 iz SEQ ID BR:1). Drugi domen ekspresione kasete uključuje umetnutu sekvencu promenjive dužine (VLIVS) koja sadrži donor uplitanja i prijemno mesto uplitanja. VLIVS može biti najmanje 50 bp dužine (npr., najmanje 100, 150. 200 ili 250 bp dužine) i može uključivati donore uplitanja i prijemnike iz bilokog izvora poznatog u praksi. Vidi, npr., Varani i sar., Annu Rev Biophvs Biomol Struct 27: 407-45 (1998) i Koning, Eur J Biochem 219: 25-42 (1994). Pogodan umetnuti domen može uključivati sve introne A od CMV genoma bilo kog soja ili može uključivati manji fragment koji sadrži 5' sekvencu koja sadrži donorsko mesto uplitanja vezano za 3' sekvencu koja sadrži prijemno mesto uplitanja. Na primer, VLIVS uključuje nukleotide od oko x3do oko x4iz SEQ ID BR:1, gde je x3nukleotid od 715-720 i x„ je nukleotid od oko 1236-1254 (npr., 719 do 1236 od SEQ ID BR:1). Umetnuta sekvenca iz CMV IE1 promotor/pojačivač može varirati u veličini čak za 317 nukleotida od one prisutne u SEQ ID BR:1. Na primer., 317 nukleotida su delecirani od IVS sekvence kao što je opisano kod pV40 i pV70 (vidi, npr., slike 2 i 3, respektivno) da se proizvede VLIVS od SEQ ID BR:1. Prema tome, u drugom aspektu pronalaska ekspresiona kaseta uključuje sekvencu od oko nukleotida 1 do oko 1254 od SEQ ID BR:1 (npr.. CMV IE1 promotor/pojačivač i umetnuta sekvenca). Višestruko mesto kloniranja može biti prisutno nakon (tj. nizvodno od) IVS regiona (npr., nukleotidi 1255-1272 od SEQ ID BR:1 uključuje BamHI mesta i Noti mesto). Različita ili dodatna restrikciona mesta mogu se konstruisati u ekspresionoj kaseti koristeći tehnike poznate onima sa iskustvom u praksi. Ekspresiona kaseta dalje uključuje poliA domen.

PoliA domen signala je izveden od hGHv gena koji može varirati u svojoj 3'UTR sekvenci, npr., od alela do alela. Jedan alel hGHv gena je opisan u GenBank prijava br. K00470 (SEQ ID BR:18), dok je druga sekvenca opisana na slici 11B kao SEQ ID BR:19, koji odgovara nukleotidima 2032 do 2625 od SEQ ID BR:18 (vidi sliku 15). Varijante poliA signalnog domena koje se ne javljaju u prirodi mogu se napraviti tehnikama mutageneze, uključujući one koje se primenjuju na polinukleotide, ćelije ili organizme. PoliA varijanta hGHv gena uključuje poliA signalni domen koji se razlikuje od divljeg tipa hGHv poliA signalnog domena, a još uvek zadržava sposobnost da signalizuje terminaciju transkripcije i/ili stabilizuje mRNK. Na primer, poliadenilacioni domen signala može uključivati sekvencu hGHv poliadenilacionog domena signala kao što je postavljeno u SEQ ID BR:18 ili 19. Neko sa iskustvom u praksi molekularne biologije će takođe shvatiti da sekvenca ne mora da bude svih 600 nukleotida dugačka. Radije je uključena bilo koja sekvenca poliA domena koja uključuje kontinuiranu sekvencu nukleotida od najmanje 100 nt (npr., od najmanje 200, 300, 400, 500 ili 600 nt), uključujući kanoničko mesto AATAAA, od hGHv gena. Sem toga, pronalazak obuhvata sekvence koje variraju od prethodne sekvence sve do 8% (npr., imaju 92% identičnosti sa SEQ ID BR:18 ili 19 ili njihov drugačiji domen). Na primer, polinukleotid od 100 nt u dužinu koji ima 95% identičnosti sa nukleotidima 1-1867 od SEQ ID BR:1 i uključuje sekvencu AATAAA, zadržaće sposobnost da prekida transkripciju.

U drugom aspektu pronalaska obezbeđen je vektor koji sadrži ekspresionu kasetu. Onako kako se ovde koristi "vektor" je molekul nukleinske kiseline (bilo DNK ili RNK) sposoban za autonomnu replikaciju nakon unošenja u prijemnu ćeliju (npr., bakteriju kao što jeE. coli).Plazmidi, virusi i bakteriofagi su primeri vektora. Proces "ekspresije" iz ekspresionog vektora dobro je poznat, i uključuje upotrebu ćelijskih enzima i procesa da se proizvede ekspresioni proizvod iz polinukleotida za koji postoji interes. Ekspresioni vektori su vektori koji su u stanju da posreduju u ekspresiji kloniranog polinukleotida u ćeliji domaćinu, koji mogu ali ne moraju biti istog tipa kao i ćelija koja je uzeta za replikaciju ili propargacioni vektor. Mnogi sisarski ekspresioni vektori mogu se propargirati u uobičajenim bakterijama (prijemnim ćelijama) ali ekspnmiraju polinukleotid za koji postoji interes u sisarskim ćelijama (ćelija domaćin) a ne u ba-kteriji.

Pronalazak obuhvata dizajn i upotrebu vektora koji su u stanju da omoguće efikasnu transkripciju i translaciju polinukleotida kod eukariotskih (npr., sisarske, i najčešće, humane, mišje, majmunske, goveđe, praseće, glodarske ili ovčje ćelije) ćelija. Vektori pronalaska uključuju ekspresionu kasetu, kao što je postavljeno gore, uključujući poliadenilacioni domen signala koji obezbeđuje efikasnu terminaciju transkripcije i stabilnost mRNK.

Vektori pronalaska uključuju: mesto kloniranja za primanje polinukleotida za koji postoji interes; elemente regulacije transkripcije (npr., CMV IE1 promotor/pojačivač regioni) dovoljne da dozvole transkripciju polinukleotida ubačenog u mesto kloniranja u ćeliji domaćinu; translacione elemente dovoljne da dozvole translaciju RNK transkripta pomenutog polinukleotida u ćeliji domaćinu i (ako je potrebno) elemenie replikacije dovoljne da dozvole replikaciju pomenutog vektora u ćeliji domaćinu ili drugoj prijemnoj ćeliji koja je upotrebljena za propagaciju vektora. Vektori pronalaska su sposobni da modulišu takvu ekspresiju prolazno ili stabilno u ćelijama domaćinima.

U specifičnom obliku vektor pronalaska uključuje (1) sekvencu kao što je postavljena u SEQ ID BR:1; (2) sekvencu koja je komplementarna sekvenci postavljenoj u SEQ ID BR:1; (3) sekvencu koja je najmanje 80% (poželjno najmanje 90%; 95%; 98% ili 99%) identična sa SEQ ID BR:1 ili njegovim komplementom; ili (4) vektor koji sadrži SEQ ID BR:1 od oko 1 nukleotida do oko nukleotida 1867 i koji sadrži polinukleotid za koji postoji interes i/ili selektibilni marker.

Vektor koji sadrži SEQ ID BR:1 ima jedan broj različitih domena i kodirajućih regiona. Na primer. CMV IE1 promotor/pojačivač region koji ima sekvencu kao što je postavljeno od oko x, do oko x2od SEQ ID BR:1, gde je x, nukleotid od 1-20 i x2je nukleotid od oko 15-720 (npr., od oko 1 do 719 od SEQ ID BR:1) su prisutni u vektoru. Drgi domen ekspresionog vektora pronalaska uključuje umetnutu sekvencu promenjive dužine (VLIVS) koja sadrži donor uplitanja i prijemno mesto uplitanja. Na primer, IVS uključuje nukleotide od oko X3do oko x4od SEQ ID BR:1, gde x3uključuje nukleotid od 715-720 i x4uključuje nukleotid od 1236-1254 (npr., oko nukleotida 719 do 1236 od SEQ ID BR:1). Mesto višestrukog kloniranja ekspresionog vektora uključuje nukleotide 1255-1272 od SEQ ID BR:1 (npr., BamHI mesta i Noti mesto). Različita ili dodatna mesta restrikcije mogu se konstruisati u ekspresionom vektoru koristeći tehnike koje su poznate onima sa iskustvom u praksi. Ekspresioni vektor dalje uključuje poliA domen signala. PoliA domen signala je hGHv poliA domen signala ili druga varijanta hGHv poliA domena signala. Na primer, poliA domen signala uključuje sekvencu hGHv poliA domena signala kao što je postavljena u SEQ ID BR:19. U vektoru pronalaska je takođe prisutan jedan ili više selektibilnih markera. Na primer, SEQ ID BR:1 uključuje gen za dihidrofolat reduktazu (dhfr) (npr., od oko nukleotida 2568 do oko nukleotida 3132 od SEQ ID BR:1). Vektor pronalaska može uključivati dodatne promotor/pojačivač elemente i regulatorne regione (npr., poliadenilacione domene) u dodatku na one koji su obezbeđeni gore. Takvi dodatni regulatorni elementi i poliadenilacioni domeni mogu biti u susedstvu (npr., mogu biti neposredno pored 5' i 3' krajeva) selektibilnog markera ili polinukleotida za koji postoji interes. Na primer, vektor koji sadrži SEQ ID BR:1 sadrži gen za dihidrofolat reduktazu (dhfr) od oko nukleotida 2568 do oko nukleotida 3132 od SEQ ID BR:1. Dhfr gen je flankovan sa SV40 promotor/pojačivač elementom i SV40 poliadenilacionim regionom (npr., oko nukleotida 1868 do oko nukleotida 2210 i oko nikleotida 3144 do oko nukleotida 3440 od SEQ ID BR:1, respektivno).

Specifični primeri selektivnih markera su oni koji kodiraju proteine koji donose rezistenciju na citostatike ili citocidne lekove. kao što je DHFR protein, koji donosi otpornost na metotreksat (VVigler i sar., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 3567 (1980); O'Hare i sar. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 1527 (1981)); GPF protein, koji donosi otpornost na mikofenolnu kiselinu (Mulligan i Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 2072 (1981)), marker otpornosti na neomicin, koji donosi otpornost na aminoglikozid G-418 (Colberregarapin i sar., J. Mol. Biol. 150: 1 (1981)): higro protein, koji donosi otpornost na higromicin (Santerre i sar., Gene 30: 147 (1984)); i Zeocin™ marker otpornosti (komercijalno dostupan od strane Invitrogen-a). Sem toga, timidin kinaza herpes simpleks virusa (VVigler i sar., Cell 11: 223 (1977)), hipoksantin guanin fosforiboziltransferaza (Szybalska i Szibalski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48: 2026 (1962)) i adenin fosforiboziltransferaza (Lowy i sar., Cell 22: 817 (1980)) mogu se upotrebiti u tk-, hgprt- ili aprt-ćelijama respektivno. Drugi selektivni markeri kodiraju puromicin N-acetil transferazu ili adenozin deaminazu.

Termini "identičan" ili procenat "identičnosti" u kontekstu dva ili više molekula nukleinske kiseline, odnose se na dve ili više sekvenci ili subsekvenci koje su iste ili imaju preciziran procenat nukleotida koji su isti, kada se porede i poravnavaju radi maksimuma poklapanja putem prozora za poređenje, kao što je mereno koristeći algoritam za poređenje ili ručnim pora-vnavanjem i vizuelnim pregledom. Ova definicija takođe se odnosi na komplement sekvence (npr., komplement sekvence kao što je postavljena u SEQ ID BR:1 ili njen fragment koji sadrži ekspresionu kasetu). Na primer, ekspresiona kaseta i njeni fragmenti uključuju one sa nukleotidnom sekvencom čiji je identitet najmanje 80%, oko 90% i oko 95%, oko 97%, oko 98% ili oko 99% identičan sa proteinom od SEQ ID BR:1 (npr., nukleotidi 1-719, 1-1254, i tome slično od SEQ ID BR:1). Prema tome, ako sekvenca ima neophodnu identičnost sekvence sa punom sekvencom od SEQ ID BR:1 ili njenim domenom onda ona može takođe funkcionisati kao ekspresiona kaseta ili domen pronalaska, respektivno.

Za poređenje sekvence, obično jedna sekvenca deluje kao referentna sekvenca, sa kojom se test sekvence porede. Kada se koristi algoritam za poređenje, test i referentne sekvence se unose u računar, dizajniraju se kordinate subsekvence, ako je neophodno, i dizajniraju se parametri algoritma programa sekvence. Mogu se upotrebiti zadati parametri programa, ili se mogu dizajnirati alternativni parametri. Algoritam poređenja sekvence zatim izračunava procenat identičnosti za test sekvencu u odnosu na referentnu sekvencu, na osnovu dizajniranih ili zadatih parametara programa. "Prozor za poređenje", onako kako se ovde koristi, uključuje referencu na segment bilo kog broja kontinuiranih pozicija odabranih od grupe koja se sastoji od 25 do 600, obično oko 50 do oko 200, još uobičajenije oko 100 do oko 150 u kojima sekvenca može da se uporedi sa referentnom sekvencom od istog broja kontinuiranih pozicija nakon što su dve sekvence optimalno poravnate. Postupci poravnavanja sekvenci za poređenje dobro su poznati u praksi. Optimalno poklapanje sekvenci za poređenje može se sprovoditi, npr., algoritmom lokalne homologije po Smith i VVaterman, Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981), putem algoritma homologije po Needleman i VVunsch, J. Mol. Biol. 48: 443 (1970), putem metoda traženja sličnosti po Pearson i Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444 (1988), putem kompjuterizovane implementacije tih algoritama (GAP, PILEUP, BESTFIT, FASTA i TFASTA u VVisconsin genetics Softvvare Package, Genetics Computer Gropup, 575 Science Dr., Madison, Wl) ili putem ručnog poravnavanja i vizuelnog pregleda.

Jedan primer algoritma koji je pogodan za određivanje procenta identičnosti sekvence (tj., gotovo potpune sličnosti ili identičnosti) je BLAST algoritam, koji je opisan u Altschul, J. Mol. Biol. 215: 403-410, 1990. Softver za obavljanje BLAST analize je javno dostupan preko National Center for Biotechnologv Informtion (na VVorld Wide Web na ncbi.nlm.nih.gov/). Algoritam uključuje prvo identifikovanje visokog rezultata sparivanja sekvenci (HSP-ovi) identifikovanjem kratkih reči dužine W u ispitivanoj sekvenci, koja se ili poklapa ili zadovoljava neke pozitivne vrednosti polazne linije rezultata T kada je poklopljena sa reči iste dužine u bazi podataka sekvence. "T" predstavlja rezultat polazne linije susedne reči. Ti početni pogodci susednih reči deluju kao seme za započinjanje pretraživanja da se nađu duži HSP-ovi koji ih sadrže. Pogođene reči se zatim produžuju u oba pravca duž svake sekvence sve dok se rezultat zbirnog poklapanja može povećati. Zbirni rezultati su izračunati koristeći, za nukleotidne sekvence. parametre M (nagradni rezultat za par poklapanja ostataka; uvek > 0) i N (kazneni rezultat za nepoklapanje ostataka, uvek < 0). Produženje pogodaka reći u svakom pravcu se zausta-vljaju kada: rezultat zbirnog poklapanja pada u količini X od dostignute maksimalne vrednosti: zbirni rezultat ide na nulu ili niže, zbog akumuliranja jednog ili više negativnih rezultata za poklapanje ostataka; ili kada je dostignut kraj svake sekvence. Parametri BLAST algoritma, W. T 1 X određuju osetljivost i brzinu poklapanja. U jednom obliku, da bi se odredilo da li je sekvenca nukleinske kiseline u obimu pronalaska, BLASTN program (za nukleotidne sekvence) je upotrebljen inkorporirajući kao zadate dužine reči (W) od 11, očekivanje (E) od 10, M=5, N=4 i poređenja oba lanca. Za sekvence amino kiseline, BLAST program koristi kao zadate parametre dužinu reči (W) od 3, očekivanje (E) od 10, i BLOSUM62 matircu sume (vidi, npr., Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915, 1989).

BLAST algoritam takođe obavlja statističku analizu sličnosti između dve sekvence (vidi, npr., Karlin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5787, 1993). Jedna mera sličnosti koju obezbeđuje BLAST algoritam je najmanja suma verovatnoće (P(N) koja obezbeđuje naznaku verovatnoće koja je potrebna da se poklope dva nukleotida ili sekvence amino kiseline po principu slučajnosti. Na primer, nukleinska kiselina se smatra sličnom u odnosu na referencu sekvence ako je najmanja suma verovatnoće u poređenju sa test nukleinskom kiselinom u odnosu na referentnu nukleinsku kiselinu manja od oko 0.1, još poželjnije od oko 0.01 i najpoželjnije manje od oko 0.001.

U pronalazak su takođe uključeni polinukletodi koji specifično hibridizuju sa polinukleotidnom sekvencom kao što je postavljena u SEQ ID BR:1 od oko nukleotida 1 do 1867 ili njenim fragmentom. Fraza "selektivno (ili specifično) hibridizuju sa" odnosi se na vezivanje, dupliranje ili hibridizovanje molekula sa posebnim pozivom na polinukleotid pod strogim uslovima hibridizacije. Fraza "uslovi stroge hibridizacije" odnosi se na uslove pod kojima će proba primarno hibridizovati sa svojom ciljnom subsekvencom, obično u kompleksu mešavine nukleinske kiseline, a ne sa drugim sekvencama. Strogi uslovi su zavisni od sekvence i biće različiti u različitim okolnostima, npr., u zavisnosti od dužine probe. Duža sekvenca hibridizuje specifično na višim temperaturama. Opširni vodič za hibridizaciju nukleinskih kiselina može se naći kod Tijssen, tehnike u biohemiji i molekularnoj biologiji - Hibridizacija sa nukleinskim probama, "Pregled principa hibridizacije i strategija ogleda sa nukleinskim kiselinama" (1993). Generalno, strogi uslovi su odabrani da budu 5-10°C niži od temperature tačke topljenja (TJ za specifičnu sekvencu pri definisanoj jonskoj snazi i pH. Tmje temperatura (pri definisanoj jonskoj snazi, pH i koncentraciji nukleotida) pri kojoj 50% proba koje su komplementarne cilju hibridizuje sa ciljnom sekvencom u ravnoteži (pošto su ciljne sekvence date u višku, pri Tm50% proba je zauzeto pri ravnoteži). Strogi uslovi će biti oni u kojima je koncentracija soli manja od oko 1.0 M jona natrijuma, obično oko 0.01 do 1.0 M koncentracija jona natrijuma (ili drugih soli) pri pH 7.0 do 8.3 i temperatura je najmanje 30°C za kratke probe (npr., 10 do oko 50 nukleotida) i najmanje oko 60°C za duge probe (npr., više od oko 50 nukleotida). Strogi uslovi mogu se takođe postići dodavanjem agensa za destabilizaciju kao što je formamid. Za selektivnu ili specifičnu hibridizaciju, pozitivni signal (npr., identifikacija nukleinske kiseline pronalaska) je oko 2 puta pozadina hibridizacije. "Strogi" uslovi hibridizacije koji se koriste da se identifikuju gotovo identične nukleinske kiseline u okviru ovog pronalaska uključuju hibridizaciju u puferu koji sadrži50%formamida, 5xSSC i 1% SDS na temperaturi između 42°C i 65°C, uz ispiranje sa 0.2x SSC i 0.1% SDS na 65°C, za dugačke probe. Međutim, kao što je očigledno nekom sa prosečnim iskustvom u praksi, uslovi hibridizacije mogu se modifikovati u zavisnosti od sastava sekvence. Primerni "umereno strogi uslovi hibridizacije" uključuju hibridizaciju u puferu od 40% formamida, 1 M NaCI i 1% SDS na 37°C, i ispiranje u 1x SSC na 45°C. Pozitivna hibridizacija je najmanje dvostruka pozadina. Oni sa prosečnim iskustvom lako će prepoznati da se mogu primeniti alternativna hibridizacija i uslovi ispiranja da se obezbede uslovi slične strogoće. Prema tome, ekspresiona kaseta pronalaska može uključivati hGHv poliA domen signala koji hibridizuje pod strogim uslovima za ssDNK koja sadrži nukleotidnu sekvencu od SEQ ID BR:18 ili19.

Ekspresiona kaseta može se upotrebiti u obliku čistog konstrukta nukleinske kiseline Alternativno, ekspresiona kaseta može biti uvedena kao deo vektora nukleinske kiseline (npr., ekspresioni vektor kao što su oni opisani prethodno). Takvi vektori uključuju plazmide i virusne vektore. Vektor može uključivati sekvence koje su bočno od ekspresione kasete koje uključuju sekvence homologe eukariotskim genomskim sekvencama, kao što su sisarske genomske sekvence ili virusne genomske sekvence. To će omogućiti uvođenje ekspresione kasete u genom eukariotske ćelije ili virusa putem homologe rekombinacije. Na primer, plazmidni vektor koji sadrži ekspresionu kasetu bočno sa virusnom sekvencom može se upotrebiti da se pripremi virusni vektor pogodan za isporuku ekspresione kasete u kičmenjake, uključujući riblje, ptičje ili sisarske ćelije. Tehnike koje se koriste su dobro poznate iskusnoj osobi.

Termin "polinukleotid za koji postoji interes" namenjen je da obuhvati molekule nukleinske kiseline koji su sposobni da se u najređem slučaju transkribuju. Molekul može biti sens ili antisens orijentisan u odnosu na promotor. Antisens konstrukt može se upotrebiti da inhibira ekspresiju gena u ćeliji u skladu sa dobro poznatim tehnikama. Polinukleotid za koji postoji interes može uključiti heterologni polinukleotid. Termin heterologni plolinukleotid obuhvata bilo koji gen. Heterologni plolinukleotid obično nastaje od strane vrste u poređenju sa regulatornim elementom sa kojim je operativno vezan u ekspresionoj kaseti ili vektoru ili ako potiče od istog izvora, je modifikovani gen u odnosu na svoj originalni oblik. Prema tome, heterologni plolinukleotid operativno vezan za promotor je iz izvora različitog od onog iz kojeg je promotor izveden, ili, ako je izveden iz istog izvora, je modifikovani promotor u odnosu na originalni oblik. Modifikacije heterolognog plolinukleotida mogu se odigrati, npr., putem tretiranja DNK sa restrikcionim enzimom da se generiše fragment DNK koji je sposoban da bude operativno vezan za promotor. Mutageneza usmerena na mesto je takođe korisna za modifikovanje heterolognog plolinukleotida. Heterologni plolinukleotid može takođe uključiti marker gene (npr., koji kodiraju (3-galaktozidazu ili zeleni fluorescentni protein) ili gene čiji proizvodi regulišu ekspresiju drugih gena. Prema tome polinukleotidi koji služe kao matrice za mRNL, tRNK i rRNK su uključenu u ovu definiciju. Heterologni gen može biti alelska varijanta gena divljeg tipa, ili može biti mutantni gen. mRNK će operativno uključiti neke ili sve 5' i/ili 3' transkribovane ali ne translacirane bočne regione koji su prirodni, ili drugačije, vezani sa translaciranom kodirajućom sekvencom.

Polinukleotid za koji postoji interes može po potrebi dalje uključivati vezane transkripcione kontrolne elemente koji su normalno vezani sa transkribovanim molekulima, na primer, transkripcioni stop signali, poliadenilacioni domeni i nizvodni pojačivački elementi. Polinukleotid za koji postoji interes može kodirati ili poslužiti kao matrica za terapeutski proizvod, koji može biti, na primer, peptid, polipeptid, protein ili ribonukleinska kiselina. Polinukleotid za koji postoji interes obično je sekvenca DNK (kao što je cDNK ili genomska DNK) koja kodira polipeptidni proizvod kao što su enzimi (npr., p-galaktozidaza); derivati krvi; hormoni; citokini; interleukini; interferoni; TNF; faktori rasta (npr., IGF-1); rastvorljivi receptorski molekuli (npr., rastvorljivi TNF receptorski molekuli); neurotransmiteri ili njihovi prekursori; trofički faktori kao što su BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3 i NT5; apoliproteini kao što su ApoAI i ApoAlV; distrofin ili minidistrofin; tumor supresujući proteini kao što su p53, Rb, RaplA, DCC i k-rev; faktori uključeni u koagulaciju kao što su faktori VII, VIII i IX; ili alternativno celi ili deo prirodnih ili veštačkih imunoglobulina (npr., fab i ScFv, ili laki ili teški lanac kloniranog IgG).

Polinukleotid za koji postoji interes može takođe uključivati matricu za generisanje antisens molekula, čija transkripcija u ciljnoj ćeliji omogućuje ekspresiju gena ili transkripciju ćelijskih mRNK koje treba da se kontrolišu. Takvi molekuli mogu, na primer, biti transkribovani u ciljnoj ćeliji u RNK koje su komplementarne ćelijskim mRNK i mogu tako blokirati njihovu translaciju u protein, u skladu sa tehnikama koje su poznate u praksi. Posebno se antisens molekuli mogu upotrebiti da blokiraju translaciju inflamatornih ili kataboličnih citokinina u tretmanu artritisa i gubitku tkiva uzrokovanom tim citokinima.

Polinukleotidna sekvenca za koju postoji interes obično će kodirati polipeptid koji ima dijagnostičku ili terapeutsku upotrebu. Polipeptid se može proizvesti u bioreaktorimain vitrokoristeći različite ćelije domaćine (npr., COS ćelije ili CHO ćelije ili njihove derivate) koji sadrže ekspresionu kasetu pronalaska. Alternativno, ekspresiona kaseta i/ili vektor pronalaska mogu se upotrebiti za isporuku gena, isporuku proteina i/ili gensku terapiju.

Pronalazak može takođe biti upotrebljen za ekspresiju toksičnih faktora i polipeptida. Ovi poslednji mogu biti, posebno, ćeljiski otrovi (kao što su toksin difterije, toksin pseudomonasa i ricin A), proizvodi koji indukuju osetljivost na spoljni' agens (npr., timidin kinaza i citozin deaminaza) ili alternativno faktori sposobni da indukuju smrt ćelije (npr., Grb3-3 i anti-ras ScFv).

Pod terapeutskom upotrebom podrazumeva se upotreba koja može obezbediti oslobađanje od bolesti ili poremećaja, izlečenje bolesti ili poremećaja, i/ili smanjenje jačine bolesti ili poremećaja. Dijagnostička upotreba uključuje upotrebu molekula sposobnih da odrede ili obezbede informacije koje se odnose uzroke ili vezu molekula sa procesom bolesti ili određivanje prisustva ili otsustva bolesti ili poremećaja. Dijagnostički agens ne doprinosi direktno smanjenju bolesti ili poremećaja.

Polinukleotid za koji postoji interes može takođe kodirati antigeni polipeptid za upotrebu u vidu vakcine. Antigeni polipeptidi ili molekuli nukleinske kiseline su izvedeni iz patogenih organizama kao što su, na primer, bakterije ili virusi. Na primer, antigeni polipeptidi uključuju antigene determinante prisutne u genomima ili produktima gena patogenih organizama, na primer. virusni hemoragični septicemi, bakterijska bolest bubrega, vibrosis i furunkulozis. Antigeni polipeptidi mogu se odabrati iz regiona genoma virusa hepatitisa C i genskih produkata, na primer.

Onako kako se ovde koristi "izolovani", kada se odnosi na molekul ili preparat, kao što je, npr., vektor ili ekspresiona kaseta pronalaska, ili polinukleotid za koji postoji interes, znači da je molekul ili preparat izdovojen iz najmanje jednog drugog jedinjenja kao što je protein, DNK, RNK ili drugih kontaminanata sa kojima je vezanin vivoili u stanju koje se prirodno javlja. Na taj način, polinukleotid za koji postoji interes smatra se izolovanim kada je izolovan iz bilo koje druge komponente sa kojom je prirodno vezan. Izolovani preparat može, međutim, takođe biti gotovo potpuno čist. Izolovani preparat može biti u homogenom stanju. On može biti u suvom/liofiliziranom ili vodenom rastvoru. Čistoća i homogenost mogu se odrediti, npr., koristeći tehnike analitičke hernije, kao što su. npr., elektroforeza na poliakrilamidnom gelu (PAGE), elektroforeza na agaroznom gelu ili tečna hromatografija pod visokim pritiskom (HPLC).

Onako kako se ovde koriste termini "molekul nukleinske kiseline" i "polinukleotid" koriste se naizmenično, i uključuju oligonukleotide (tj., kratke polinukleotide). Oni se takođe odnose na sintetičke i/ili molekule nukleinskih kiselina koji se ne javljaju prirodno (npr., koji sadrže nukleotid ili analoge ili modifikovane kosture ostataka ili veza). Termini se takođe odnose na deoksiribonukleinske ili ribonukleinske oligonukleotide bilo u obliku jednog lanca ili u dvolančanom obliku. Termini obuhvataju nukleinske kiseline koje sadrže analoge prirodnih nukleotida. Termini takođe obuhvataju strukture nalik na nukleinske kiseline sa sinetićkim kosturom. Analozi veza DNK obezbeđeni pronalaskom uključuju fosfodiestar, fosfortioat, fosforditioat, metilfosfonat, fosforamid, alkil fosfortriestar, sulfamat, 3'-tioacetal, metilen (metilmino), 3'N-karbamat, morfolino karbamat i peptide nukleinskih kiselina (PNA-ove); vidi Oligonukleotidi i analozi, Praktičan pristup, izd. F. Eckstein, IRL Press at Oxford Universitv Press (1991); Antisens strategije, Annais of the New York Academv of Sciences, volumen 600, Izd. Baserga i Denhardt (NYAS 1992); Milligan (1993) J. Med. Chem. 36: 1923-1937; Antisense Research and Application (1993, CRC Press). PNA-ovi sadrže ne-jonske kosture, kao što su N-

(2-aminoetil) glicin jedinice. Fosfortioat veze opisane su u WO 97/03211; WO 98/39154; Mata

(1997) Toxicol. Appl. Pharmacol. 144: 189-197. Drugi sintetički kosturi obuhvaćeni terminom uključuju metil-fosfonat veze ili izmenjeni metilfosfonat i fosfodietar veze (Strauss-Soukup (1997) Biochemistrv 36: 8692-8698), i benzil-fosfonat veze (Samstag (1996) Antisense Nucleic Acid Drug Dev 6: 153-156).

Onako kako se koristi ovde "rekombinant" se odnosi na polinukleotid sintetizovan ili manipulisan na drugi načinin vitro,(npr.. "rekombinantni polinukleotid"), na postupke korišćenja rekombinantnih polinukleotida da se proizvedu produkti u ćelijama ili drugim biološkim sistemima, ili polipeptid ("rekombinantni protein") kodiran putem rekombinantnog polinukleotida. ReKombinantni polinukleotidi obuhvataju molekule nukleinske kiseline iz različitih izvora vezane u ekspresionu kasetu ili vektor za ekspresiju, npr., fuzioni protein; ili one proizvedene inducinbilnim ili konstitutivnim polipeptidom (npr., ekspresiona kaseta ili vektor pronalaska operativno vezan sa heterolognim polipeptidom, kao što je sekvenca koja kodira polipeptid).

U tipičnom ekspresionom sistemu, proizvodnja polipeptida iz heterolognog polinukleotida je ili regulisana ili nije regulisana putem modulisanja transkripcije iz transkripcionog promotora koji je operativno vezan uzvodno od polinukleotida koji kodira heterologni polipeptid. Međutim, regulacija se takođe mora odvijati nizvodno na pravi način sa ciljem da se obezbedi odgovarajuća translaciona stabilnost i stabilnost mRNK. U jednom aspektu pronalaska, varijanta humanog hormona rasta (hGHv) poliadenilacioni (poliA) domen signala je obezbeđen nizvodno (3') od polinukleotida za koji postoji interes, prisutan u ekspresionoj kaseti ili vektoru pronalaska. hGHv poliA domen signala uključuje sekvencu izvedenu iz genetičke sekvence hormona koji nije humani. Sekvenca hGHv poliadenilacionog domena signala obezbeđuje snažnu transkripcionu terminaciju i obezbeđuje povećanu stabilnost mRNK u eukariotskim ćelijama. Ovaj hGHv poliadenialcioni domen signala obezbeđuje drugačije prednosti u odnosu na prethodne ekspresione kasete i/ili vektore uključujući one koje mogu koristiti CMV promotor/pojačivač.

Translacioni elementi mogu takođe biti prisutni i namenjeni su da obuhvate specijalizovane sekvence (kao što su mesta vezivanja ribozoma i kodoni za inicijaciju) koji su neophodni da dozvole translaciju RNK transkripta u protein. Elementi translacije mogu takođe uključivati konsenzus sekvence, lider sekvence, signale uplitanja i tome slično, koji služe da olakšaju ili pojačaju obim translacije, ili povećaju stabilnost produkta ekspresije. Na primer, hGHv poliadenialcioni domen signala obezbeđuje povećanu stabilnost mRNK. Vektori pronalaska mogu posedovati potčinjene transkripcione regione, kao što su introni, poliadenilacioni signali, Shine/Dalgamo signali translacije i Kozak konsenzus sekvence (Shine i sar., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 71: 1342-1346 (1974); Kozak, Cell 44: 283-292 (1986)).

Termin "replikacioni elementi" je namenjen da obuhvati specijalizovane sekvence (kao što su oridžini replikacije) koje su neophodne da omoguće replikaciju vektora u prijemnoj ćeliji. Generalno, takvi vektori će sadržati najmanje jedan oridžin replikacije dovoljan da dozvoli autonomnu stabilnu replikaciju vektora u prijemnoj ćeliji.

Da se olakša selekcija i održavanje vektora pronalaska, u vektor se mogu uključiti jedan ili više selektibilnih markera (kao što su polinukleotidi koji donose otpornost na antibiotike, ili ćelijski kapacitet da se raste na minimalnom medijumu ili prisustvo toksičnog metabolita).

U daljem obliku, predmetni pronalazak odnosi se na ćelije domaćine koje sadrže gore opisane konstrukte (npr., ekspresionu kasetu ili vektor pronalaska). Ekspresiona kaseta pronalaska može se upotrebiti da se rekombinantno modifikuje ćelija domaćin putem transfekcije ćelije domaćina ili transformisanja ćelija domaćina da se eksprimira željeni polinukleotid za koji postoji interes. Onako kako se ovde koristi termin "rekombinantno modifikovan" označava uvođenje ekspresione kasete ili vektora pronalaska u živu ćeliju ili ekspresioni sistem. Obično je ekspresiona kaseta koja sadrži polipeptid za koji postoji interes prisutna u vektoru (npr., plazmid). Ekspresioni sistem uključuje živu ćeliju domaćina u koju se uvodi polinukleotid za koji postoji interes, čiji produkt je bio eksprimiran, kao što je ovde opisano.

Ćelije domaćini su ćelije u kojima ekspresiona kaseta (uključujući vektor sadržan u ekspresionoj kaseti) može biti propargirana i polinukleotid koji kodira proizvode može biti eksprimiran. Ćelija domaćin takođe uključuje bilo koje potomstvo subjekta ćelije domaćina ili njenih derivata. Mora da se shvati da ne može svo potomstvo biti identično roditeljskoj ćeliji pošto mogu da se odigraju mutacije koje se javljaju tokom replikacije. Međutim, takvo potomstvo je uključeno kada se upotrebljava termin "ćelija domaćin". Ćelije domaćini, koje su korisne u pronalasku, uključuju bakterijske ćelije, ćelije gljiva (npr.. ćelije kvasca), ćelije biljaka i ćelije životinja. Na primer, ćelije domaćini mogu biti više eukariotske ćelije, kao što su sisarske ćelije, ili niže eukariotske ćelije, kao što su ćelije kvasca, ili ćelije domaćini mogu biti prokariotske ćelije, kao što su bakterijske ćelije. Uvođenje konstrukta u ćeliju domaćina može biti izvedeno putem kalcijum fosfatne transfekcije, DEAE-dekstranom posredovane transfekcije ili elektroporacijom (Daviš, L, Dibner, M., Battev, I., Basic Methods in Molecular Biologv (1986)). Kao respektivni prmeri odgovarajućih domaćina mogu se pomenuti: ćelije gljiva, kao što je kvasac, ćelije insekata kao što jeDrosophilaS2 iSpodopteraSf9, ćelije životinja kao što su CHO, COS ili Bovves melanomi; ćelije biljaka i tome slično. Selekcija odgovarajućeg domaćina je predviđena da bude u obimu posla onih koji imaju iskustvo u praksi iz ovde pomenutih tehnika.

Ćelije domaćini za upotrebu u predmetnom pronalasku su eukariotske ćelije domaćini (npr., sisarske ćelije). U jednom aspektu pronalaska ćelije domaćini su produktivne sisarske ćelije adaptirane da rastu u ćelijskoj kulturi. Primeri takvih ćelija koje se uobičajeno koriste u industriji su CHO, VERO, BHK, HeLa, CV1 (uključujući Cos, Cos-7), MDK, 293, 3T3. C127, ćelijske linije mijeloma (posebno mišjih), PC12 i W138 ćelije. Ćelije ovarijuma kineskog hrčka (CHO), koje se široko koriste za proizvodnju nekoliko kompleksnih rekombinantnih proteina, npr., citokinina, faktora zgrušavanja i antitela (Brasel i sar., Blood 88: 2004-2012 (1996); Kaufman i sar., J. Biol. Chem 263: 6352-6362 (1988); McKinnon i sar., J. Mol Endocrinol 6: 231-239

(1991); Wood i sar., J. Immunol 145: 3011-3016 (1990)). Dihidrofolat reduktaza (DHFR) deficijentne mutantne ćelijske linije (Urlaub i sar., Proc Natl Acad. Sci USA 77: 4216-4220

(1980)) su CHO ćelije domaćini od izbora zbog efikasne DHFR selektivnog i amplifikativnog ekspresionog genskog sistema koji omogućuje visok nivo ekspresije rekombinantnog proteina u tim ćelijama (Kaufman. Meth Enzvmol 185: 527-566 (1990)). Sem toga, ove ćelije su lake za manipulisanje kao pričvršćene u kulturi ili u suspenziji i pokazuju relativno dobru genetičku stabilnost. CHO ćelije i rekombinantni proteini koji se eksprimiraju u njima su ekstenzivno okarakterisani i dokazali su se kao dobri za upotrebu u kliničkom pripremanju od strane regulatornih agencija. Sem toga, predviđeno je da ćelije domaćini izvedeni iz bilo koje od gore pomenutih ćelijskih linija i koje imaju željene fenotipove mogu takođe da se upotrebe. Na primer, Izvedene ćelije domaćini uključuju ćelije (npr., DG44 ćelijsku liniju), koja je selektivno kultivisana za željeni fenotip (npr., pozitivni i/ili negativni selekcioni procesi).

U jednom aspektu pronalaska, obezbeđen je ekspresioni sistem zain vitroproizvodnju agensa kodiranog sa polinukleotidom za koji postoji interes. Kao što je opisano ovde, polinukleotid za koji postoji interes može kodirati polipeptid ili farmaceutsku, medicinsku, nutricionu i/ili industrijsku vrednost. Na primer, polipeptid za koji postoji interes može kodirati lek baziran na polipeptidu. Tipično će takav polipeptid biti eksprimiran kao izvanćelijski proizvod. Na primer, polipeptidi koji se mogu proizvesti koristeći ekspresionu kasetu i/ili vektor pronalaska, uključuju, ali nisu ograničeni na, Flt3 veznik, CD40 veznik, eritropoetin, trombopoetin, kalcitonin, Fas veznik, veznik za aktivator receptora NF-kapa B (RANKL), veznik zaTNF-vezani apoptozis (TRAIL), ORK/Tek, timični stroma-izvedeni limfoprotein, stimulišući faktor kolonije granulocita, stimulišući faktor kolonije granulocita-makrofaga, faktor rasta mast ćelija, faktor rasta stim ćelija, epidermaini faktor rasta, RANTES, hormon rasta, insulin, insulinotropin, faktor rasta nalik na insulin, paratiroidni hormon, interferoni (npr., beta interferon), faktor rasta nerava, glukagon, interleukini 1 do 18, faktor stimulacije kolonija, limfotoksin-p, faktor nekrozisa tumora, inhibitorni faktor leukemije, onkostatin-M, različiti ligandi za površinske molekule ćelija Elk i Hek (kao što su ligandi i eph-vezane kinaze, ili LERKS) i antitela lakog ili teškog lanca.

Receptori za bilo koji od gore pomenutih proteina mogu takođe biti eksprimirani koristeći otkrivene postupke i preparate, uključujući oba oblika receptora faktora nekrozisa tumora (označene kao p55 i p75), interleukin-1 receptore (tip 1 i 2), interleukin-4 receptor, interleukin-15 receptor, interleukin-17 receptor, interleukin-18 receptor, receptor faktora stimulacije kolonije makrofaga, receptor faktora stimulacije kolonije granulocita, receptore za onkostatin-M i inhibitorni faktor leukemije, receptor ili aktivator NF-kapa B (RANK), receptore za TRAIL, BAFF receptor. limfotoksin beta receptor, TGFP receptor tipova I i II i receptore koji uklljučuju smrtne domene, kao što su Fas i receptor indukcije apoptoze (AIR).

Drugi proteini koji se mogu eksprimirati koristeći ekspresionu kasetu i/ili vektore pronalaska uključuju klaster diferenciranih antigena (označenih kao CD proteini), na primer, oni otkriveni u Tipiziranje leukocita VI (Proceedings of the Vith International VVorkshop and Conference; Kishimoto, Kikutani i sar., izd.; Kobe Japan, 1966), ili CD molekuli otkriveni na sledećim radnim sastancima. Primeri takvih molekula uključuju CD27, CD30, CD39, CD40 i njihovi veznici (CD27 veznik, CD30 veznik i CD40 veznik). Nekoliko od tih članova porodice TNF receptora, koji takođe uključuju 41BB i OX40; veznici su često članovi TNF porodice (kao što su 41 BB veznik i 0X40 veznik); shodno tome, članovi TNF i TNFRporodice mogu takođe biti eksprimirani koristeći predmetni pronalazak.

Polipeptidi koji su enzimatski aktivni mogu takođe biti eksprimirani u skladu sa pronalaskom. Primeri uključuju članove porodice metaloproteinaza-dezintegracije, različite kinaze, glukocerebrosidaza, supraoksid dismutaza, aktivator tkivnog plazminogena, faktor VII, faktor IX, apoliprotein E, apliprotein A-J, globini, IL-2 antagonist, alfa-1 antitripsin, TNF-alfa enzim pretvaranja (TACE), i brojni drugi enzimi. Veznici za enzimski aktivne proteine mogu se takođe eksprimirati koristeći kasetu i vektor pronalaska.

Preparati pronalaska i postupci su takođe korisni za ekspresiju drugih tipova rekombinantnih proteina i polipeptida, uključujući molekule imunoglobulina ili njegovih himeričnih antitela (npr., antitelo koje ima humani konstantni region sjedinjen sa mišjim regionom vezivanja antigena) ili njegovih fragmenata. Dobro su poznate su brojne tehnike kojima se mogu manipulisati DNK koje kodiraju molekule imunoglobulina da se dobije DNK kodirajući rekombinantni proteini kao što su jednolančana antitela, antitela sa pojačanim afinitetom, ili drugi polipeptidi zasnovani na antitelima (vidi na primer, Larrick i sar., Biotechnologv 7: 934-938

(1989); Reichmann i sar., Nature 332: 323-327 (1988); Roberts i sar., nature 328: 731-734

(1987); Verhoeven i sar., Science 239: 1534-1536 (1988); Chaudharv i sar., Nature 339: 394-397 (1989)). Klonirana humanizovana antitela uključuju ona specifično vezana za limfotoksin beta receptori integrine kao što su VLA-1, VLA-4 i avP6. Takva antitela mogu biti agonisti ili antagonisti.

Različiti fuzioni proteini mogu se takođe eksprimirati koristeći otkrivene postupke i preparate. Primeri takvih fuzionih proteina uključuju proteine eksprimirane kao fuzioni sa delom molekula imunoglobulina, proteine eksprimirane kao fuzioni proteini sa ziper grupom i nove polifunkcionalne proteine kao što su fuzioni proteini citokina i faktor rasta (npr., GM-CSF i IL-3, MGF i IL-3) W0 93/08207 i WO 96/40918 opisuju preparate različitih rastvorljivih oligomernih oblika molekula označenog kao CD40L, uključujući imunoglobulinski fuzioni protein i zipe fuzioni protein, respektivno; tehnike koje su tu razmatrane primenjive su na druge proteine.

Kada se protein za koji postoji interes eksprimira, ekspresioni proizvod (npr., protein ili polipeptid) može biti prečišćen koristeći standardne tehnike iz prakse. Na primer, kada polinukleotid za koji postoji interes kodira fuzioni polipeptid koji sadrži marker za prečišćavanje, polipeptid može biti prečišćen koristeći antitela koja se specifično vezuju za marker. U jednom aspektu oligonukleotid koji kodira marker molekul vezan je za 5' ili 3' kraj polinukleotida za koji postoji interes koji kodira željeni polipeptid; oligonukleotid može kodirati poliHis (kao što je heksaHis), ili druge "marker" kao što je FLAG. HA (hemaglutinin virus influence) ili mic za koji postoje komercijalno dostupna antitela. Ovaj marker je obično fuzionisan za polipeptid nakon ekspresije polipeptida i može poslužiti kao sredstvo za afinitetno prečišćavanje željenog polipeptida iz ćelije domaćina. Afinitetno prečišćavanje može biti praćeno, na primer, kolonskom hromatografijom koristeći antitela protiv markera kao afinitetnu matricu. Po potrebi, marker se može nakon toga ukloniti iz prečišćenog polipeptida različitim načinima kao što je proteolitičko isecanje.

Ekspresiona kaseta i vektori pronalaska mogu se upotrebiti da obezbede stabilni transfer polinukleotida za koji postoji interes u ćeliju domaćina. Stabilni transfer označava da se polinukleotid za koji postoji interes kontinuirano održava u domaćinu. Ekspresiona kaseta ili vektor pronalaska mogu takođe obezbediti prolaznu ekspresiju polinukleotida za koji postoji interes u ćeliji domaćinu. Privremeno transfektirane ćelije domaćini gube egzogenu DNK tokom replikacije i rasta.

Ekspresiona kaseta pronalaska može se upotrebiti da se isporuči terapeutski agens čoveku ili životinji koji imaju potrebu za tretmanom. Alternativno, ekspresiona kaseta pronalaska može se upotrebiti da se isporuči agens koji kodira potencijalno imunogene polipeptidein vivoza svrhu vakcine, subjektu (npr., čoveku), posebno za vakcinaciju domaćih životinja uključujući životinje kao što su riba, prase, konj, govedo, pas i vrste mačaka.

Ekspresiona kaseta pronalaska može se davati direktno kao konstrukt čiste nukleinske kiseline koji obično sadrži bočne sekvence homologe sa genomom ćelije domaćina. Uzimanje konstrukta čiste nukleinske kiseline od strane ćelija vertebrata je pojačano sa nekoliko poznatih tehnika uključujući biolističku transformaciju i lipofekciju.

Alternativno se ekspresiona kaseta može davati kao deo vektora uključujući plazmidni vektor ili virusni vektor.

Obično su ekspresiona kaseta ili vektor kombinovani sa farmaceutski prihvatljivim nosačem ili razblaživačem da se proizvede farmaceutski preparat. Pogodni nosači i razblaživači uključuju izotonične rastvore soli uključujući, na primer, fosfatni puferski rastvor soli. Preparat koji sadrži ekspresionu kasetu ili vektor može se formulisati za različite tipove davanja uključujući, na primer, intramuskularno davanje.

Kada se preparat koji sadrži ekspresionu kasetu ili vektor upotrebi u injektabilnom obliku, on je obično pomešan sa nosačem koji je farmaceutski prihvatljiv za injektabilni preparat za direktno injekciranje na mestu koje treba da se tretira. Farmaceutski prihvatljivi nosač ili razblaživač može biti, na primer, sterilni izotonični rastvor. Preparat koji sadrži ekspresionu kasetu ili vektor može se takođe formulisati u oralno aktivnom obliku.

Aktualna formulacija koja se upotrebljava može se lako odrediti od strane osobe sa iskustvom i variraće u zavisnosti od prirode supstance koja treba da se daje i načina davanja.

Doza supstance koja je upotrebljena može se doterati u skladu sa različitim parametrima, posebno u skladu sa supstancom koja je upotrebljena, starošću, težinom i stanjem subjekta koji treba da se tretira, načina davanja koji je upotrebljen i potrebnog kliničkog režima. Lekar će biti u stanju da odredi potreban način davanja i doziranja za bilo koji određeni subjekt i stanje.

PRIMERI

Konstrukcija pV10 vektora

Dodatni detalji za konstrukciju pV10 opisani su na slici 1. Genomska DNK je izolovana iz humanih diploidnih fibroblasta zaraženih sa humanim citomegalovirusom soja AD169 (ATCC br VR-538) i upotrebljena kao matrica za PCR amplifikaciju regiona CMV neposrednog ranog gena I promotor/pojačivač (CMV IE1 P/E) (vidi sliku 11 (B) (SEQ ID BR:1) za detalje od 5'UTR od CMV IE1 gena). Promotor je amplifikovan koristeći prajmere koji sadržeHindlllmesto na 5' terminusu (tttAAGCTTGACATTGATTATTGACTAG; SEQ ID BR:2; restrikciono mesto podvučeno) iBamHImesto na 3' terminusu (ttttGGATCCCTGTCAAGGACGGTGACTGC; SEQ ID BR:3; restrikciono mesto podvučeno). Terminalni "t" nukleotidi koji prethode restrikcionom mestu su uključeni u oligonukleotid dizajniran da olakša digestiju restrikcionim enzimom i eliminisani su u koraku kloniranja.

Sve PCR reakcije su izvedene u DNK mašini PTC-200 Pelier Thermal Cycler (MJ Research, Watertown, MA). Ukupna reakciona zapremina bila je 100 jal; 1X NEB vent polimerazni pufer (10 mM KCI, 20 mM tris pH 8.8 na 25°C, 10 mM (NH)4S04, 2 mM MgS04, 0.1% triton X-100), 2.5 mM dNTP-ova, 2 jedinice Vent DNK polimeraze (New England Biolabs, Beverlv, MA), 1 u.g svakog parametra, u,g genomske DNK izolovane iz CMV inficiranih ćelija kao matrice. Reakcioni uslovi su bili sledeći: 99°C tokom 1 minuta, 55°C tokom 30 sekundi. 75°C tokom 1.5 minuta tokom 15 ciklusa. Nastali fragment ja digestiran sa restrikcionim enzimimaBamHIiHindlll(New England Biolabs) i subklonirani u vektor za kloniranje pUC19 digestiran saBamHIiHindlll.Analiza sekvence za koju je postojao interes je određena i bila je konzistentna sa publikovanom sekvencom kloniranog CMV IE1 promotor/pojačivač regiona.

Konstrukcija pV40 vektora

Konstrukcija pV40 vektora izneta je na slici 2. 3'UTR od hGHv gena uključujući poliA signal je amplifikovana sa PCR iz genomske DNK izolovane iz humanih fibroblasta. (+) lanac 5' prajmera (TTTTGGATCCCTGCCCGGGTGGCATCC; SEQ ID BR:20) koji je sadržao terminalnoBamHIrestrikciono mesto i (-) lanac ili 3' prajmer koji sadrži terminalnoEcoRImesto (TTTTGAATCATGAGAGGACAGTGCCAAGC; SEQ ID BR:21). PCR uslovi bili su isti kao što je opisano za konstrukt pV10. Nastali PCR fragment je digestiran saBamHIiEcoRI,prečišćen na gelu i vezan u vektor pV10 digestiran saBamHIiEcoRI.Nastali plazmid, označen pV40, je potvrđen putem analize sa restrikcionim enzimima. Naknadno sekvenciranje je naznačilo da postoji mali broj nukleotidnih razlika između 3'UTR od ovog hGHv gena (SEQ ID BR:19) i publikovane hGHv sekvence gena u GenBank prijavi br. K00470 (SEQ ID BR:18). Bar neke od pramena su rezultat alelskog variranja.

Konstrukcija pV70 vektora

pV40 vektor je digestiran saBspEIiHpallda se ukloni deo od 317 nukleotida regiona introna A (IVS) (vidi, npr., slike 2 i 3). pV60 je generisan ligacijom tupih krajeva u BspEI-Hpal od dhfr kodirajućeg regiona od pV40. Ekspresioni vektor pV70 sadrži glavni trenutni rani 1 (hCMV IE1) promotor/pojačivač region humanog citomegalovirusa da reguliše transkripciju. On takođe sadrži hCMV IE1 5'UTR i intron A, dok intron sadrži deleciju od 317 baznih parova. Radi terminacije transkripcije, vektor sadrži varijantni poliadenilacioni region humanog hormona rasta (hGHv poliA), SEQ ID BR:19. Konstrukcije pV40, pV60 i pV70 date su u detaljima niže i dalje su opisane na slikama.

A. Generisanje pXLC1

Pcr proizvod koji je sadržao laki lanac kodirajuće sekvence za antitelo digestiran je saBamHIi kloniran u jedinstvenoBamHImesto u ekspresionom vektoru pV70 (slika 3). Kodirajući region lakog lanca je ubačen u jedinstvenoBamHImesto između 5'UTR sekvence na 3' kraju od hCMV IE1 introna i 5' kraju od hGHv poliA regiona. Plazmid je označen kao pXLC1. Slika 4 pokazuje shematski generisanje pXLC.1 vektora.

B. Dodavanje neo kasete - pXLC2

Ekspresiona kaseta neomicin transferaze (neo) je uvedena u pXLC1 da deluje kao selektibilni marker (slika 5). Neo kaseta je proizvedena kaoBamHI/ EcoRIfragment iz komercijalno dostupnog plazmida nazvanog pGT-N28 (New England Biolabs, katalog #307-28). U ovom plazmidu,neogen pokreće se sa promotorom fosfoglicerat kinaze (PGK) i prekida na PGK poli-adenilacionom mestu.BamHIkraj na 5' krajuneokasete je pretvoren uNarlkraj koristeći sledeće adaptor oligose:

EcoRI

BamHI kompatibilni GATCGATGAATTCGG (SEQ ID BR:4)

CTACTTAAGCCGC (SEQ ID BR:5)Narlkompatibilan

Sa tim linkerima, takođe je dodato novoEcoRImesto. Adaptor je prvo vezan zaBamHI/ EcoRIisečenineofragment i pretvoreniBamHI/ EcoRIfragment je zatim kloniran u pXLC.1 digestiran saNarliEcoRI.Na taj način neo ekspresiona kaseta je ubačena na 3' kraj sekvence lakog lanca plazmida. Plazmid je označen kao pXLC2 (slika 5).

Konstrukcija ekspresionog vektora teškog lanca - pXHC5

A. RT-PCR teškog lanca

Teški lanac je amplifikovan putem RT-PCR reakcije koristeći 5' PCR prajmer / 111GGATCCATGTACTGGGTGAAGCAG (SEQ ID BR:6), gde je sekvenca predstavljena italikom dodati linker region saBamHImestom, a podvučene baze odgovaraju drugom metioninu u teškom lancu kodirajuće sekvence. 3' PCR prajmer koji je upotrebljen,GCCCGGATCCTCATTTACCCGGAGACAG(SEQ ID BR:7), takođe sadrži dodatni linker region saBamHImestom (italik) i sekvencu koja odgovara teškom lancu kodirajuće sekvence uključujući kodon za terminaciju (podvučen). Dobijen je očekivani PCR proizvod od 1268 baznih parova.

B. Konstrukcija pXHC

Pošto je 5' PCR prajmer koji je upotrebljen hibridizovao sa drugim ATG kodonom u kodirajućem region radije nego sa inicijacionim ATG kodirajućim regionom koji je sadržan u PCR proizvodu, kodirajući region teškog lanca bio je nekompletan.BamHIfragment, koji je sadržao nekompletni teški lanac, kloniran je u plazmid pV60 (slika 6). Taj vektor je identičan sa pV70 (opisan gore) sem što on sadržidhfrkodirajući region na mestu delecije introna. Kodirajući region teškog lanca je ubačen u jedinstvenoBamHImesto između 5' netranslacirane sekvence na 3' kraju od hCMV IE1 introna i 5' kraju od hGHv varijante poli A regiona. Ovaj plazmid, sa nekompletnim teškim lancem, označen je kao pXHC.

C. Kompletiranje kodirajuće sekvence teškog lanca - pXHC1

Kodirajući region koji je nedostajao iz sekvence teškog lanca je ubačen u pXHC da generiše plazmid označen kao pXHC.1 (slika 7). Da bi se to uradilo, fragment je generisan sa PCR-om koristeći plazmid koji je sadržao kodirajuću sekvencu za antitelo kao matricu. Upotrebljeni 5' PCR prajmer bio je: PstlBamHI

TTTTCTGCAGTCACCGTCCTTGACACGGGATCCATGGACIGGkCCTTGGAGGG(SEQ

ID BR:8). Sekvenca u italiku odgovara pXHC sekvenci 5' odBamHImesta i sekvenca koja je onnačena kurzivom odgovara sekvenci dve početne baze pre kodona inicijacije u sekvenci teškog lanca. 3' prajmer koji je upotrebljen bio je CTGAGGAGACGGTGACCAGGGT-CCCTTGGCCCC (SEQ ID BR:9). Ovaj prajmer hibridizuje sa krajem prvog egzona, teškog lanca varijabilnog regiona. PCR proizvod od 445 baznih parova je dobijen kao što je očekivano i isečen saPstliStul. Pstl/ Stulfragment je kloniran u pXHC isečak saPstliStulda se dobije pXHC.l.

D. Uklanjanje intronskog dhfr - pXHC3

pXHC1 je sadržaodhfrgen u hCMV IE1 intronu. Zahvaljujući potencijalnim problemima sa amplifikacijom koja je nađena kod te konfiguracije,dhfrgen je uklonjen iz introna i ekspresiona kaseta je ubačena 3' od kasete teškog lanca (slika 8). Prvi korak bio je uklanjanjedhfrgena iz introna. Ovo je obavljeno putem isecanja kodirajuće sekvence teškog lanca iz pXHC1 kao Pstl/EcoRI fragmenta i njenim kloniranjem u pXLC.1 plazmid isečen sa istim enzimima. Korak kloniranja jednostavno je zamenio laki lanac sa teškim lancem u plazmidu. Nastali plazmid bio je identičan sa pXHC.1 sem što je intron koji je sadržaodhfrgen zamenjen sa intronom sa delecijom kao što je opisano gore za pXLC1. Ovaj plazmid sa teškim lancem označen je kao pXHC3 (slika 8).

E. Ubacivanje dhfr kasete - pXHC5

Drugi korak u izmenidhfrkonfiguracije bio je ubacivanjedhfrekspresione kasete 3' od ekspresione kasete teškog lanca (slika 9).dhfrekspresiona kaseta je izvedena iz plazmida pSI-DHFR naBglll/ BAMHIfragmentu i uključuje rani promotor SV40,dhfrgen i poli A region SV40. Ovaj fragment je kloniran uEcoRImesto locirano na 3' kraju od hGHv poli A regiona pXHC3 koristeći sledeće adaptorske oligos:

Sali

EcoRI kompatibilni AATTCGTCGACA (SEQ ID BR:10)

GCAGCTGTCTAG (SEQ ID BR:11) BamHI/Bglll kompatibilan

Ovaj adaptor je prvo vezan za EcoRI isečeni plazmid i zatim je Bglll/ BamHI dhfr kaseta vezana za prilagođeni plazmid. Ovaj plazmid je označen kao pXHC.5 (slika 9).

Karakterizacija pXLC2 i pXHC5

Oba plazmida analizirana su koristeći restrikcione enzime da se potvrdi prisustvo i orijentacija ubačenih fragmenata. Sem toga, kodirajući region plazmida je sekvenciran da se potvrdi da se nisu akumulirale mutacije tokom koraka PCR i kloniranja.

Prisustvo funkcionalnog neo selektabilnog markera je potvrđeno transfektovanjem pXLC2 u CHO ćelije i pokazivanjem rezistencije na G418. Sposobnost da se radi dvostruka selekcija pokazana je kada su plazmidi pXLC2 i pXHC5 ko-transfektovani u DG44 CHO domaćina bez seruma. Kolonije su porasle iz kotransfektovanog dvostrukog selekcionog medijuma (a-MEM 10% dFBS sa 400 mg/ml G418). Pod istim uslovima, bilo koja selekcija je sama takođe bila u stanju da ubije transfektovane ćelije (a-MEM 10% dFBS sa 400 mg/ml G418).

Konstrukcija vektora: pV80 i pV90

pV80 je generisan iz ekspresione kasete teškog lanca vektora pXHC5 (slika 10). Kodirajuća sekvenca teškog lanca je isečena iz pXHC.5 koristećiBamHI.Kostur je vezan tako da se ponovo zaokruži naBamHImestu.

U pV80 vektoru napravljene su izmene da se generiše pV90 (slika 11).Notimesto nađeno u pV80 konstruktu na poziciji 3166 (na kraju kodirajućeg regionadhfr,vidi priložene sekvence) je uništeno. Da se to obavi, plazmid je digestiran saNotii viškovi su "napunjeni" koristeći Klenovv polimerazu. Kao rezultat, ponovo vezani plazmid izgubio je Noti mesto na poziciji 3166. NovoNotimesto je zatim kreirano na mestu kloniranja putem digestiranja vektora saBamHIi uvođenjemNotilinkera napravljenog spajanjem sledećeg 14-mer samog sa sobom: GATCCGCGGCCGCG (SEQ ID BR:12). Kada su spojeni zajedno, vezujuća sekvenca je:

Noti

BamHI kompatibilni GATCCGCGGCCGC (SEQ ID BR:13)

CGCCGGCGCCTAGG(SEQ ID BR:14) BamHI kompatibilan

Ovaj korak kloniranja obnovio jeBamHImesta na bilo kojoj straniNotimesta. OvaBamHImesta mogu biti korisna u genetičkoj analizi stabilnih ćelijskih linija generisanih sa ovim vektorom. Sekvenca klonirajućeg mesta pV90 potvrđena je analizom sekvence.

U pV80 vektoru polinukleotid (npr., kodirajuća sekvenca) može se klonirati uBamHImesto GGATCCCTGCCCGGGT (SEQ ID BR:15). Sekvenca prikazana kurzivom predstavljaBamHImesto. U pV90 vektoru polinukleotid (npr., kodirajuća sekvenca) može se klonirati uBamHIiliNotimestoGGATCCGCGGCCGCGGATCCCTGCCCGGGT(SEQ ID BR:16). Ovde, sekvenca prikazana u kurzivu predstavljaBamHImesto a podvučena sekvenca predstavljaNotimesto. Za optimalne rezultate kada se koristiNotimesto, "C" se mora dodati pre početka kodona u PCR prajmerima da bi se najbolje poklopila Kozak sekvenca (npr.,

GGATCC GCGGCCGC CATG (SEQ ID BR:17)).

Restrikciona mesta u pV80 i pV90

pV80 i pV90 su identični sa izuzetkom Noti restrikcionih mesta: pV80 ima jedno Noti mesto na poziciji 3166 (kraj kodirajućeg regionadhfr)a pV90 ima jedno Noti mesto na poziciji 1260 (klonirajuće mesto).

Uobičajena restrikciona mesta, od kojih se dva rede nalaze, uključuju ona pobrojana u tabeli 1.

Sledeća uobičajena mesta isecanja enzima nisu bila nađena:

Kloniranje reporter gena

Ekspresiona kaseta/vektor uključujući CMV IE1, fragment introna A i hGHv poliA konstrukt je upoređena sa komercijalno dostupnim SV40 zasnovanim visoko ekspresivnim vektorom.

Izlučena alkalna fosfataza (SEAP) je upotrebljena kao reporter za poređenje plazmida. Ekspresioni vektor zasnovan na SV40, pSEAP2-kontrolni (kat. # 6052-1, Clontech), eksprimira SEAP pod kontrolom ranog promotora SV40 i pojačivača SV40. Sekvenca koja kodira SEAP praćena je sa kasnim poliadenilacionim signalom SV40 da se osigura odgovarujuće, efikasno procesiranje SEAP transkripta u eukariotskoj ćeliji. Sintetički bloker transkripcije (TB), sastavljen od susednih poliadenilacionih i transkripcionih mesta pauze, lociran uzvodno od MCS, redukuje pozadinsku transkripciju. Vektor inkorporira jedan broj karakteristika koje poboljšavaju osetljivost SEAP povećavajući efikasnost ekspresije SEAP ili pojačavajući sposobnost vektora. One uključuju: poboljšano Kozak konsenzus mesto inicijacije transkripcije; uklanjanje malog introna SV40, koji može uzrokovati skriveno uplitanje redukovane ekspresije kod nekih gena i/ili ćelijskih tipova: prebacivanje sa ranog na kasni signal poliadenilacije od SV40, koji obično uzrokuje petostruko povećanje nivoa mRNK; prošireno višestruko mesto kloniranja (MCS); kompaktnu veličinu plazmida; i uklanjanje spoljašnjih sekvenci iz 3' ne translaciranog regiona SEPA mRNK. Genbank broj prijave U89938.

Sa ciljem da se generiše pCMV-hGHvPA-SEAP plazmid, SEAP kodirajuća sekvenca je ekstrahovana iz pSEAP2-kontrolnog plazmida putem PCR i klonirana u pV110 vektor. pV110 plazmid je derivat pV90 (nemadhfrekspresione kasete, različiti poliveznik, ali inače isti). pCMV-hGHvPA-SEAP plazmid konstrukt je potvrđen sekvenciranjem.

Domaćin koji je upotrebljen za transfekcije bila je ćelijska linija ovarijuma kineskog hrčka DG44 deficijentna za dihidrofolat reduktazu (DHFR) (Urlaub i sar., Cell 33, 405-412 (1983)). CMVSEAP i pSEAP2-kontrolni reporter plazmidi su ko-transfektovani sa plazmidom koji kodira dihidrofolat reduktazu (dhfr) tako da stabilni transfektanti mogu da se selekcionišu (pSI-DHFR.2, slika 12). Svaka transfekcija je sadržala 50 ug reporter plazmida i 5 u.g pSI-DHFR.2. Celokupna DNK je pripremljena putem Megaprep kita (Oiagen). Pre transfekcije, DNK je istaložena sa ETOH, isprana u 70% EtOH, osušena, resuspendovana u HEBS (20 mM Hepes, pH 7.05, 137 mM NaCI, 5mM KCI, 0.7 mM Na2HPOđ, 6 mM dekstroze) i kvantifikovana pre transfekcije. Negativne kontrole uključile su pUC18 (ATCC br. 37253) kao reporter kontrolu i bez transfekcije DNK kao transfekcionu kontrolu (tabela 3).

Ćelije i DNK su transfektovane putem elektroporacije u 0.8 ml HEBS koristeći kivete od0.4 cm (BioRad) na 0.28 kV i 950 mF. 5E6 ćelija je upotrebljeno za svaku transfekciju. Nakon koraka elektroporacije, ćelije su ostavljene da se inkubiraju u kiveti tokom 5-10 minuta na sobnoj temperaturi. Zatim su prenete u epruvetu za centrifugiranje koja je sadržala 10 ml alfa MEM sa nukleozidima i 10% dFBS i istaložena na 1K RPM tokom 5 minuta. Resuspendovani

taloži su zasejani u ploče sa 6 bunarčića u alfa MEM bez nukleozida sa 10% dFBS i inkubirani na 36°C sa 5% C02u inkubatoru sa vlažnom atmosferom sve dok se nisu formirale kolinije.

Približno 2 nedelje nakon transfekcije, formirale su se kolonije u transfekcijama koje su sadržale samo pSIDHFR.2 plazmid. Stabilni transfektanti su analizirani bilo kao grupe ili kao izolati. Specifična produktivnost je određena u ogledima gde je medijum zamenjen sa svežim medijumom i 24 časa kasnije medijum je prikupljen i ćelije su prebrojane. Titar produkta je normalizovan za broj ćelija na kraju 24 časovnog ogleda i produktivnost je izražena kao SEAP po ćeliji.

Kondicioni medujum je analiziran koristeći Great AscAPe™ SEAP reporter Svstem 3 (Clontech). Ovaj ogled koristi fluorescentni supstrat da detektuje aktivnost SEAP u kondicionom medijumu. Upotrebljen je kit u formatu sa 96 bunarčića u skladu sa uputstvima proizvođača, sa sledećim izuzecima. Pufer za ogled iz kita je zamenjen sa 1.5 M dietanolaminom, 0.75 mM MgCI2, 15 mM L-homoargininom i 10% Emerald II (kat. # 9761, Applied Biosvstems). Svi standardi i uzorci su razblaženi su razblaženi u svežem medijumu radije nego u puferu za razblaživanje koji je obezbeđen. Umesto da se obavlja jedno čitanje nakon 60 minuta, obavljeno je više čitanja u intervalima od 10-20 minuta i upotrebljeno da se izrazi aktivnost SEAP kao relativna jedinica fluorescencije po minutu (RFU/min). Emisioni filter koji je upotrebljen za čitanje ploča (Cvtofluor II, PerSeptive Biosvstems) bio je 460 nm umesto preporučenih 449 nm.

Vrednosti RFU/min bile su nominalizovane do standardne krive na osnovu standarda obezbeđenog sa kitom. Pošto obezbeđeni standard nije kvantifikovan, sve vrednosti su relativne. Ove relativne vrednosti su normalizovane do ćeliskih brojeva i inkubacionog perioda da se generiše relativna specifična produktivnost (SEAP aktivnost po ćeliji dnevno).

Skupovi. Nakon pojavljivanja kolonija, ćelije su sakupljene iz svake transfekcije. Skupovi su zasejani na - 2 X 105 ćelija po bunarčiću u ploče sa 6 bunarčića. Sledećeg dana medijum je zamenjen sa 2 ml svežeg medijuma. Nakon 24 časa ćelije su prebrojane i uzorak medijuma je upotrebljen da se proceni SEAP aktivnost. Rezultati iz zbirnih ogleda su prikazani na slici 13.

Izolati. Izolati su dobijeni "sakupljanjem" kolonija iz transfekcija. "Sakupljanje" je obavljeno usisavanjem direktno preko kolonije sa P200 Pipetman™ postavljenim na 50 ml. Usisane kolonije su prenete brzo na ploče sa 48 bunarčića i zatim na ploče sa 6 bunarčića kada je bio dovoljan broj ćelija. Specifična produktivnost je procenjena na pločama sa 6 bunarčića pri gustini ćelija gotovo jedna do druge koristeći 24 časovni ogled opisan gore (slika 14).

Kao što je sumarizovano na slikama 13 i 14, ekspresioni vektor zasnovan na kombinaciji CMV IE promotora i hGHv poliA signalnog domena je bio daleko superiorniji u odnosu na komercijalno dostupni vektor koji je hvaljen zbog visokih ekspresionih sposobnosti.

Opisan je jedan broj oblika pronalaska. Ipak, mora da se shvati da se mogu napraviti različite modifikacije a da se pri tome ne otstupi od duha i obima pronalaska. Prema tome, drugi oblici su u okviru sledećih patentnih zahteva. 1. Ekspresiona kaseta, naznačena time što sadrži humani CMV trenutni rani 1 (hCMV IE1) promotor/pojačivač region;

polinukleotid za koji postoji interes; i

varijantu humanog hormona rasta (hGHv) poliA signalni domen ili njgovu varijantu, gde (hGHv) poliA signal ima najmanje 100 nukleotida u dužinu i sadrži sekvencu AATAAA, i poliA varijanta je najmanje 92% identična sa hGH poliA signalnim domenom.

2. Ekspresiona kaseta prema zahtevu 1, naznačena time što humani CMV IE1 promotor/pojačivač region sadrži sekvencu kao što je postavljena od oko x, do oko x2iz SEQ ID BR:1, gde x, označava nukleotid između oko 1-20 od SEQ ID BR:1 i x2označava nukleotid između oko 715-720 od SEQ ID BR:1. 3. Ekspresiona kaseta prema zahtevu 1, naznačena time što dalje sadrži umetnutu sekvencu promenjive dužine (VLIVS) koja sadrži donor spajanja i prijemno mesto spajanja. 4. Ekspresiona kaseta prema zahtevu 3, naznačena time što VLIVS sadrži intron A od hCMV IE1 gena. 5. Ekspresiona kaseta prema zahtevu 3, naznačena time što VLIVS sadrži intron A od hCMV IE1 gena koji ima deleciju između primaoca sjedinjavanja i donora sjedinjavanja introna A. 6. Ekspresiona kaseta prema zahtevu 5, naznačena time što VLIVS sadrži sekvencu od oko x3do x4od SEQ ID BR:1, gde x3označava nukleotid između oko 715-720 od SEQ ID BR:1 i x4označava nukleotid između oko 1236-1254 od SEQ ID BR:1. 7. Ekspresiona kaseta prema zahtevu 1, naznačena time što polinukleotid za koji postoji interes kodira terapeutski agens. 8. Ekspresiona kaseta prema zahtevu 1, naznačena time što poliA domen signala sadrži najmanje 100 kontinuiranih nukleotida od SEQ ID BR:19. 9. Ekspresiona kaseta prema zahtevu 8, naznačena time što poliA domen signala sadrži SEQ ID BR:19.

10. Ekspresiona kaseta prema zahtevu 1, naznačena time što dalje sadrži DHFR gen.

11. Ekspresioni vektor naznačen time što sadrži ekspresionu kasetu prema bilo kom od zahteva 1 do 10.

12. Ćelija domaćin, naznačena time što sadrži ekspresioni vektor prema zahtevu 11.

13. Ćelija domaćin, naznačena time što sadrži ekspresionu kasetu prema bilo kom od zahteva 1 do 10.

Claims (48)

1. Ekspresiona kaseta, naznačena time što sadrži humani CMV trenutni rani 1 (hCMV IE1) promoterski / pojačivački region; polinukleotid od interesa; kao i varijantu poli-A signalnog domena humanog hormona rasta (hGHv) ili neku drugu njegovu varijantu, pri čemu hGHv poli-A signalni domen ima dužinu od najmanje 100 nukleotida i sadrži sekvencu AATAAA, i što je najmanje 92% identičan sa hGH poli-A signalnim domenom.

2. Ekspresiona kaseta prema zahtevu 1, naznačena time što hCMV IE1 promoterski / pojačivački region sadrži sekvencu koja je predstavljena kao segment od oko Xido oko X2sekvence ID br. 1, pri čemu Xjoznačava nukleotide od 1 do 20 sekvence ID br. 1, a X2označava nukleotide od 715 do 720 sekvence ID br. 1.

3. Ekspresiona kaseta prema zahtevu 1, naznačena time što hCMV IE1 promoterski / pojačivački region sadrži sekvencu koja je predstavljena kao sekvenca ID br. 1.

4. Ekspresiona kaseta prema zahtevu 1, naznačena time što hCMV IE1 promoterski / pojačivački region sadrži sekvencu koja je komplementarna sekvenci predstavljenoj kao sekvenca ID br. 1.

5. Ekspresiona kaseta prema zahtevu 1, naznačena time što hCMV IE1 promoterski / pojačivački region sadrži sekvencu koja je najmanje 80% identična sa sekvencom ID br. 1 ili sa njoj komplementarnom sekvencom.

6. Ekspresiona kaseta prema zahtevu 5, naznačena time što hCMV IE1 promoterski / pojačivački region sadrži sekvencu koja je najmanje 90% identična sa sekvencom ID br. 1 ili sa njoj komplementarnom sekvencom.

7. Ekspresiona kaseta prema zahtevu 6, naznačena time što hCMV IE1 promoterski / pojačivački region sadrži sekvencu koja je najmanje 95% identična sa sekvencom ID br. 1 ili sa njoj komplementarnom sekvencom.

8. Ekspresiona kaseta prema zahtevu 7, naznačena time što hCMV IE1 promoterski / pojačivački region sadrži sekvencu koja je najmanje 97% identična sa sekvencom ID br. 1 ili sa njoj komplementarnom sekvencom.

9. Ekspresiona kaseta prema zahtevu 8, naznačena time što hCMV IE1 promoterski / pojačivački region sadrži sekvencu koja je najmanje 98% identična sa sekvencom ID br. 1 ili sa njoj komplementarnom sekvencom.

10. Ekspresiona kaseta prema zahtevu 9, naznačena time što hCMV IE1 promoterski / pojačivački region sadrži sekvencu koja je najmanje 99% identična sa sekvencom ID br. 1 ili sa njoj komplementarnom sekvencom.

11. Ekspresiona kaseta prema zahtevu 1, naznačena time što hCMV IE1 promoterski / pojačivački region sadrži nukleotide od 1 do 1867 sekvence ID br. 1.

12. Ekspresiona kaseta prema zahtevu 1, naznačena time što dalje sadrži umetnutu sekvencu varijabilne dužine (VLIVS), koja sadrži donorsko i akceptorsko mesto za isecanje.

13. Ekspresiona kaseta prema zahtevu 12, naznačena time što VLIVS sadrži intron AhCMVEl gena.

14. Ekspresiona kaseta prema zahtevu 12, naznačena time što VLIVS sadrži intron A hCMV El gena koji ima deleciju između akceptorskog i donorskog mesta za isecanje introna A.

15. Ekspresiona kaseta prema zahtevu 12, naznačena time što VLIVS sadrži sekvencu od oko X3do oko X4sekvence ID br. 1, pri čemu X3označava nukleotide od 715 do 720 sekvence ID br. 1, a Xioznačava nukleotide od 1236 do 1254 sekvence ID br. 1

16. Ekspresiona kaseta prema zahtevu 1, naznačena time što dalje sadrži dodatni promoterski / pojačivački element ili regulatorni region.

17. Ekspresiona kaseta prema zahtevu 16, naznačena time što je promoterski / pojačivački element SV40 promoterski / pojačivački element.

18. Ekspresiona kaseta prema zahtevu 16, naznačena time što je regulacioni region SV40 poliadenilacioni region.

19. Ekspresiona kaseta prema zahtevu 1, naznačena time što dalje sadrži selektibilni marker.

20. Ekspresiona kaseta prema zahtevu 19, naznačena time što je selektibilni marker izabran iz grupe koju čine dihidrofolat reduktaza, GPF, neomicin, higromicin, Zeocin™, timidin kinaza herpes simpleks virusa, hipoksantin - guanin fosforiboziltransferaza, adenin fosforiboziltransferaza, puromicin N-acetil transferaza ili adenozin deaminaza.

21. Ekspresiona kaseta prema zahtevu 19, naznačena time što je selektibilni marker dihidrofolat reduktaza.

22. Ekspresiona kaseta prema zahtevu 1, naznačena time što polinukleotid od interesa kodira terapeutsko sredstvo.

23. Ekspresiona kaseta prema zahtevu 1, naznačena time što se polinukleotid od interesa nalazi u antisens orijentaciji u odnosu na promoter.

24. Ekspresiona kaseta prema zahtevu 1, naznačena time što je polinukleotid od interesa heterologi polinukleotid.

25. Ekspresiona kaseta prema zahtevu 1, naznačena time što polinukleotid od interesa dalje obuhvata elemente za kontrolu transkripcije.

26. Ekspresiona kaseta prema zahtevu 25, naznačena time što su elementi za kontrolu transkripcije izabrani iz grupe koju čine signali za obustavljanje transkripcije, poliadenilacioni domeni i distalni pojačivački elementi.

27. Ekspresiona kaseta prema zahtevu 1, naznačena time što polinukleotid od interesa kodira polipeptid za dijagnostičku ili terapeutsku upotrebu.

28. Ekspresiona kaseta prema zahtevu 1, naznačena time što polinukleotid od interesa kodira antigeni polipeptid za upotrebu u vidu vakcine.

29. Ekspresiona kaseta prema zahtevu 1, naznačena time što poli-A signalni domen sadrži najmanje 100 uzastopnih nukleotida sekvence ID br. 19.

30. Ekspresiona kaseta prema zahtevu 29, naznačena time što poli-A signalni domen sadrži sekvencu ID br. 19.

31. Ekspresiona kaseta prema zahtevu 1, naznačena time što se nalazi u obliku ogoljenog konstrukta nukleinske kiseline.

32. Polinukleotid, naznačen time što specifično hibridizuje sa segmentom polinukleotidne sekvence od nukleotida 1 do 1867 sekvence ID br. 1 ili sa fragmentom ovog segmenta.

33. Ekspresioni vektor, naznačen time što sadrži ekspresionu kasetu iz bilo kog od zahteva 1-31.

34. Ćelija domaćin, naznačena time što sadrži ekspresioni vektor iz zahteva 33.

35. Ćelija domaćin, naznačena time što sadrži ekspresionu kasetu iz bilo kog od zahteva 1-31.

36. Postupak proizvodnje polipeptida, naznačen time što obuhvata propagaciju ćelije domaćina iz zahteva 34 ili 35, kao i ekspresiju polinukleotida od interesa.

37. Postupak dopremanja terapeutskog sredstva u organizmu životinje kojoj je takav tretman potreban, naznačen time što obuhvata propagaciju ćelije domaćina iz zahteva 34 ili 35, kao i ekspresiju polinukleotida od interesa.

38. Postupak genske terapije životinje kojoj je takav tretman potreban, naznačen time što obuhvata propagaciju ćelije domaćina iz zahteva 34 ili 35, kao i ekspresiju polinukleotida od interesa.

39. Genski vektor pV40.

40. Genski vektor pV60.

41. Genski vektor pV70.

42. Genski vektor pV80.

43. Genski vektor pV90.

44. Genski vektor pXLC. 1.

45. Genski vektor pXLC.2.

46. Genski vektor pXHC. 1.

47. Genski vektor pXHC.3.

48. Genski vektor pXHC.5.