RS20060581A - Antitela na domene cd148 koji inhibiraju angiogenezu - Google Patents

Abstract

Opisana su anti-CD148 antitela i njihovi antigen vezujući regioni, kao i farmaceutski preparati koji sadrže takva antitela ili antigen vezujuće regione. Takođe su opisani postupci upotrebe takvih antitela i antigen vezujućih regiona za vezivanje epitopa CD148 i aktivaciju funkcije CD148, kao što je inhibicija angiogeneze. Epitopi koji mogu da se upotrebe za aktivaciju funkcije CD148 i anti-angiogenetičke aktivnosti su takođe opisani, kao i postupci identifikacije jedinjenja koja mogu da ih vežu.

Description

ANTITELA NA DOMENE CD148 KOJI INHIBIRAJU ANGIOGENEZU

Poziv na srodne prijave

Predmetna prijava poziva se na prioritet od U.S. privremene patentne prijave br. 60/564,885, podnesene 23. aprila 2004; U.S. privremene patentne prijave br. 60/565,158, podnesene 23. aprila 2004; privremene patentne prijave br. 60/571,566, podnesene 14. maja 2004; i U.S. privremene patentne prijave br. 60/585,686, podnesene 6. jula 2004.

Oblast pronalaska

Predmetni pronalazak se odnosi na anti-CD148 antitela i na vezivne epitope CD148 koji se koriste za dobijanje takvih antitela Predmetni pronalazak se takođe odnosi na postupke upotrebe takvih antitela za inhibiciju angiogeneze.

Pozadina pronalaska

Angiogeneza, formiranje novih krvnih sudova iz već postojećih, neophodna je za mnoge fiziološke i patološke procese. U normalnim okolnostima, angiogenezu strogo regulišu pro- i anti-angiogenetski faktori, ali u slučaju bolesti kao što su kancer, okularne neovaskularne bolesti, artritis i psorijaza, ovaj proces može da se poremeti. Folkman, J., Nat. Med., 1: 27-31 (1995).

Smatra se da angiogeneza ima značajnu ulogu u održavanju zapaljenske ekspanzije tkiva (panusa) kod reumatoidnog artritisa (Walshet al,Arthritis Res., 3: 147-153 (2001)). Zapravo, postoji veći broj bolesti za koje se zna da su u vezi sa neregulisanom ili nepoželjnom angiogenezom. Videti Carmelietet al.Nature 407: 249-257 (2000). Ovakve bolesti obuhvataju, ali nisu ograničene na, okularnu neovaskularizaciju, kao što su retinopatije (uključujući dijabetičku retinopatiju), makularna degeneracija povezana sa starošću, psorijaza, hemangioblastom, hemangiom, arteroskleroza, zapaljenske bolesti, kao što su reumatoiđne ili reumatičke zapaljenske bolesti, posebno artritis (uključujući reumatoidni artritis), ili drugi hronični zapaljenski poremećaji, kao što je hronična astma, arterijalna ili post-transplantaciona areteroskleroza, endometritis, kao i neoplastične bolesti, na primer takozvani solidni tumori i tečni (ili hematopojetski) tumori (kao što su leukemije i limfomi). Druge bolesti povezane sa nepoželjnom angiogenezom biće poznate stručnjacima u ovoj oblasti.

Iako se za mnoge sisteme signalne transdukcije veruje da su povezani sa regulacijom angiogeneze, jedan nedavno opisan sistem endotelijalnih ćelija obuhvata tirozin kinazu CD148 receptora (koja se označava još i kao DEP-1 ("densitv enhanced phosphatase", fosfataza čije dejstvo pojačava gustina), ECRTP ("endothelial cell receptor tvrosine phosphatase", tirozin fosfataza receptora endotelijalnih ćelija), HPTPn, ili BYP, u zavisnosti od vrste i porekla cDNK).

CD 148 je transmembranski protein sisara, koji pripada klasi površinskih receptora endotelijalnih ćelija koji su poznati kao protein tirozin fosfataze (PTP) receptora pojačanih gustinom tipa III. Fosforilacija tirozina proteina je ključni element u putevima signalne transdukcije koji kontrolišu fundamentalne ćelijske procese, uključujući rast i diferencijaciju, progresiju ćelijskog ciklusa i funkcije citoskeleta. Vezivanje liganda za protein tirozin kinazni receptor (PTK) katalizuje autofosforilaciju tirozinskih ostataka u ciljnim supstratima enzima, dok vezivanje liganda za PTP katalizuje defosforilaciju. Nivo unutarćelijske fosforilacije tirozina ciljnog supstrata određen je ravnotežom između PTK i PTP. PTK igraju značajnu ulogu u pospešivanju rasta ćelija, dok PTP smanjuju aktivnost PTK inhibirajući rast ćelija. Pokazano je da CD 148 pospešuje diferencijaciju prekursorskih eritroidnih ćelija, moduliše funkciju limfocita kada se unakrsno veže sa drugim signalnim proteinima, kao i da inhibira klonalnu ekspresiju ćelijskih linija kancera dojke koje preterano eksprimiraju protein. Kao potvrda njegove uloge kao inhibitora ćelijskog rasta, nedavno je pokazano da je CD148 posrednik inhibitornih signala koji blokiraju angiogenezu, što je esencijalna biološka aktivnost neophodna za migraciju i proliferaciju ćelija, što čini CD148 važnim ciljnim molekulom za tretman kancera aktiviranjem inhibicije angiogeneze u kojoj posreduje CD148 a kojaje povezana sa rastom tumora

Kao i druge proteinske tirozin fosfataze receptora, CD148 ima unutarćelijski karboksilni deo sa katalitičkim domenom, jedan transmembranski domen i vanćelijski amino terminalni domen (koji sadrži pet tandemskih fibronektinskih ponovaka tipa III (FNIII), koji se savijaju slično kao domeni slični Ig domenima). FNIII domeni imaju apsolutnu specifičnost za ostatke fosfotirozina, visok afinitet za proteine - supstrate i specifičnu aktivnost kojaje nekoliko redova veličine veća od aktivnosti PTK Smatra se da FNIII domeni učestvuju u interakcijama protein/protein. Aktivacija CD148 pokreće autofosforilaciju CD148, nakon čega dolazi do transdukcije signala što dovodi do inhibicije angiogeneze.

U U.S. Patentu br. 6,552,169 opisane su polinukleotidne sekvence koje se odnose na humani DEP-1 (CD148), kao i poliklonska antitela dobijena na polipeptide koje ti polinukleotidi kodiraju.

U U.S. Patentu br. 6,248,327 opisana je uloga CD148 u angiogenezi, te je obezbeđen postupak za modulaciju angiogeneze kod sisara primenom preparata koji se specifično vezuju za spoljašnji domen CD148, a opisana je i upotreba monoklonskih antitela koja se specifično vezuju za nepreciziran region spoljašnjeg domena CD148 čime se aktivira anti-angiogenetska aktivnost CD 148.

Delotvorna terapija aktivacije CD148 mogla bi da bude od koristi za široku populaciju pacijenata koji pate od kancera usled toga što većina solidnih tumora zahteva neovaskularizaciju da bi porasla više od 1 - 2 mm u prečniku. Ovakva terapija mogla bi da ima širu primenu kod drugih bolesti povezanih sa angiogenezom, kao što su retinopatije, artritis i psorijaza

Postoji nerazvijena potreba za identifikacijom novih sredstava koja specifično prepoznaju i vezuju CD 148. Takva sredstva bi bila korisna kod dijagnostičkog utvrđivanja i terapeutske intervencije kod patoloških stanja povezanih sa aktivnošću CD148.

U skladu s tim, cilj je predmetnog pronalaska da obezbedi sredstva za specifično vezivanje CD148 koja pokreću aktivnost CD 148. Ovakva sredstva predmetnog pronalaska dolaze u obliku antitela i njihovih fragmenata koji se specifično vezuju za epitope CD148.

Svi patenti, patentne prijave i drugi dokumenti koji su citirani ovde u potpunosti su inkorporirani po referenci.

Detaljan opis pronalaska

Predmetni pronalazak obezbeđuje anti-CD148 antitela, ili njihove antigen vezujuće fragmente, koji se vezuju za epitope CD148 koji imaju ulogu u inhibiciji zapaljenja i/ili angiogeneze, a ta antitela mogu da se koriste za lečenje zapaljenja i bolesti povezanih sa angiogenezom. U konkretnim rešenjima, antitela ili njihovi antigen vezujući fragmenti izvedeni su iz humanih antitela ili njihovih antigen vezujućih fragmenata. U drugim rešenjima, antitela ili njihovi antigen vezujući fragmenti izabrani su iz grupe koja se sastoji od scFv, Fab, F(ab'>2, Fv i jednolančanih antitela, konkretno mogu da budu fragmenti scFv, posebno fuzioni proteini scFv-Fc. U još jednom konkretnom rešenju, antitelo, ili njegov antigen vezujući fragment, je izotip IgG, kao što je IgG2 izotip.

Jedno rešenje predmetnog pronalaska obezbeđuje izolovana anitela ili njihove antigen vezujuće regione koji se vezuju za CD148 epitop definisan FNIII domenima 2, 3, 4 ili 5 u okviru CD148. U konkretnom rešenju, antitela predmetnog pronalaska obuhvataju izolovana anitela ili njihove antigen vezujuće regione koji se specifično vezuju za epitop humanog CD148 koji je definisan jednom ili većim brojem polipeptidnih sekvenci izabranih iz grupe koja se sastoji od aminokiselinskih ostataka 315 do 329, 318 do 332, 321 do 335, 324 do 338, 324 do 329, 324 do 332, 324 do 335, 447 do 725, 533 do 725, 715 do 973, 200 do 536, 533 do 725 i 200 do 725 sekvence čiji jeIDbr.: 33. U još jednom rešenju, antitela predmetnog pronalaska obuhvataju izolovana anitela ili njihove antigen vezujuće regione koji kompetitivno inhibiraju vezivanju prethodno pomenutih monoklonskih antitela za epitop humanog CD148 opisan jednom ili većim brojem polipeptidnih sekvenci izabranih iz grupe koja se sastoji od aminokiselinskih ostataka 315 do 329, 318 do 332, 321 do .335, 324 do 338, 324 do 329, 324 do 332, 324 do 335, 447 do 725, 533 do 725, 715 do 973, 200 do 536, 533 do 725 i 200 do 725 sekvence čiji je ID br.: 33. U konkretnijem rešenju antitela predmetnog pronalaska obuhvataju izolovana anitela ili njihove antigen vezujuće regione koji se specifično vezuju za epitop humanog CD148 koji je definisan jednom ili većim brojem polipeptidnih sekvenci izabranih iz grupe koja se sastoji od aminokiselinskih ostataka 324 do 338 i 321 do 335 sekvence čiji je ID br.: 33, ali koji se ne vezuju za polipeptidnu sekvencu aminokiselinskih ostataka 324-331 sekvence čiji je ID br.: 33. Primeri takvih antitela obuhvataju antitela At-1, At-2, At-3, At-4, At-5, At-6, At-7 i At-8.

Još jedno rešenje predmetnog pronalaska obezbeđuje ćelije hibridoma i ćelije transfektoma koje proizvode anitela, ili njihove antigen vezujuće regione, predmetnog pronalaska, kao i anitela ili njihove antigen vezujuće regione koje proizvode takve ćelije hibridoma i transfektoma Hibridom može da obuhvata B ćeliju dobijenu iz transgene ne-humane životinje čiji genom sadrži transgen humanog teškog lanca i transgen humanog lakog lanca fuzionisane sa imortalizovanom ćelijom. Transfektom može da sadrži nukleinske kiseline koje kodiraju humani teški lanac i humani laki lanac.

Još jedno rešenje predmetnog pronalaska obezbeđuje transgenu ne-humanu životinju koja eksprimira anitelo, ili njegov antigen vezujući region, predmetnog pronalaska, gde transgena ne-humana životinja ima genom koji sadrži transgen humanog teškog lanca i transgen humanog lakog lanca.

Još jedno rešenje predmetnog pronalaska obezbeđuje postupak proizvodnje anitela ili njegovog antigen vezujućeg regiona koji se specifično vezuje za epitop humanog CD148 koji je definisan jednom ili većim brojem polipeptidnih sekvenci izabranih iz grupe koja se sastoji od aminokiselinskih ostataka 315 do 329, 318 do 332, 321 do 335, 324 do 338, 324 do 329, 324 do 332, 324 do 335, 447 do 725, 533 do 725, 715 do 973, 200 do 536, 533 do 725 i 200 do 725 sekvence čiji je ID br.. 33, koji podrazumeva: imunizovanje transgene životinje koja ima genom koji sadrži transgen humanog teškog lanca i transgen humanog lakog lanca epitopom humanog CD 148 definisanim jednom ili većim brojem polipeptidnih sekvenci izabranih iz grupe koja se sastoji od aminokiselinskih ostataka 315 do 329, 318 do 332, 321 do 335, 324 do 338, 324 do 329, 324 do 332, 324 do 335,447 do 725, 533 do 725, 715 do 973, 200 do 536, 533 do 725 i 200 do 725 sekvence čiji je ID br.: 33, ili ćelijom koja eksprimira takav epitop humanog CD148, tako da dođe do proizvodnje antitela u B ćelijama životinje; izolovanje B ćelija životinje; i fuzionisanje B ćelija sa ćelijama mijeloma kako bi se dobile besmrtne ćelije hibridoma koje luče antitelo ili njegov antigen vezujući fragment.

Još jedno rešenje predmetnog pronalaska obezbeđuje farmaceutski preparat koji sadrži antitelo ili njegov antigen vezujući fragment antitela ili njihovih antigen vezujućih fragmenata i nosilac koji je farmaceutski prihvatljiv za upotrebu kod ljudi. Jedno konkretno rešenje obezbeđuje antitelo ili njegov antigen vezujući fragment koji je prisutan u terapeutski delotvornoj količini, na primer, u koncentraciji od najmanje oko 10 ug/ml.

Još jedno rešenje predmetnog pronalaska obezbeđuje postupak inhibiranja angiogeneze koji podrazumeva primenu terapeutski delotvorne količine anitela ili njegovog antigen vezujućeg regiona predmetnog pronalaska kod pacijenta kome je takva terapija nephodna

Još jedno rešenje predmetnog pronalaska obezbeđuje epitope CD148, čijim vezivanjem se aktivira biološka aktivnost u kojoj posreduje CD148. Epitopi CD148 predmetnog pronalaska obuhvataju izolovane polipeptide koji sadrže jednu ili veći broj aminokiselinskih sekvenci izabranih iz grupe koja se žastoji od aminokiselinskih ostataka 315 do 329, 318 do 332, 321 do 335, 324 do 338, 324 do 329, 324 do 332, 324 do 335, 447 do 725, 533 do 725, 715 do 973, 200 do 536, 533 do 725 i 200 do 725 sekvence čiji je ID br.: 33, ili bilo koji fragment ovih sekvenci koji se vezuje za antitelo ili njegov antigen vezujući fragment predmetnog pronalaska, gde polipeptid ne obuhvata aminokiselinske ostatke dobijene iz CD148 osim onih koji su izabrani iz grupe koja se sastoji od aminokiselinskih ostataka 315 do 329, 318 do 332, 321 do 335, 324 do 338, 324 do 329, 324 do 332, 324 do 335, 447 do 725, 533 do 725, 715 do 973, 200 do 536, 533 do 725 i 200 do 725 sekvence čiji je ID br.: 33 ili bilo kog njenog fragmenta koji se vezuje za antitelo ili njegov antigen vezujući fragment predmetnog pronalaska U još jednom rešenju, predmetni pronalazak obezbeđuje izolovani polipeptid koji se suštinski sastoji od jedne ili većeg broja aminokiselinskih sekvenci izabranih iz grupe koja se sastoji od aminokiselinskih ostataka 315 do 329, 318 do 332, 321 do 335, 324 do 338, 324 do 329, 324 do 332, 324 do 335, 447 do 725, 533 do 725, 715 do 973, 200 do 536, 533 do 725 i 200 do 725 sekvence čiji je ID br.: 33 ili bilo kog fragmenta ovih sekvenci koji se vezuje za antitelo ili njegov antigen vezujući fragment predmetnog pronalaska

Još jedno rešenje predmetnog pronalaska obezbeđuje imunotest koji sadrži korake: (a) dovođenja ispitivanog uzorka u dodir sa monoklonskim antitelom ili njegovim antigen vezujućim regionom, čije vezivanje za epitop humanog CD 148 može da bude kompetitivno inhibirano monoklonskim antitelom ili njegovim antigen vezujućim regionom koji se specifično vezuje za epitop humanog CD148 koji je definisan jednom ili većim brojem polipeptidnih sekvenci izabranih iz grupe koja se sastoji od aminokiselinskih ostataka 315 do 329, 318 do 332, 321 do 335, 324 do 338, 324 do 329, 324 do 332, 324 do 335, 447 do 725, 533 do 725, 715 do 973, 200 do 536, 533 do 725 i 200 do 725 sekvence čiji je ID br.: 33 ili bilo kojim njegovim fragmentom koji se vezuje za antitelo ili njegov antigen vezujući region predmetnog pronalaska; i (b) određivanje prisustva humanog CD 148 u ispitivanom uzorku.

Još jedno rešenje predmetnog pronalaska obezbeđuje postupak identifikacije jedinjenja koje se specifično vezuje za epitop humanog CD148 koji je definisan jednom ili većim brojem polipeptidnih sekvenci izabranih iz grupe koja se sastoji od aminokiselinskih ostataka 315 do 329, 318 do 332, 321 do 335, 324 do 338, 324 do 329, 324 do 332, 324 do 335, 447 do 725, 533 do 725, 715 do 973, 200 do 536, 533 do 725 i 200 do 725 sekvence čiji je ID br.: 33, koji podrazumeva: dovođenje ispitivanog jedinjenja u dodir sa epitopom'humanog CD148 koji je definisan jednom ili većim brojem polipeptidnih sekvenci izabranih iz grupe koja se sastoji od aminokiselinskih ostataka 315 do 329, 318 do 332, 321 do 335, 324 do 338, 324 do 329, 324 do 332, 324 do 335, 447 do 725, 533 do 725, 715 do 973, 200 do 536, 533 do 725 i 200 do 725 sekvence čiji je ID br.: 33 tokom dovoljno vremena da se nagradi kompleks i detekciju stvaranja kompleksa detekcijom epitopa CD148 ili datog jedinjenja u kompleksu, tako da, ukoliko se otkrije kompleks, identifikuje se jedinjenje koje se vezuje za epitop CD148.

Još jedno rešenje predmetnog pronalaska obezbeđuje postupak identifikacije jedinjenja koje se specifično vezuje za epitop humanog CD148 koji je definisan jednom ili većim brojem polipeptidnih sekvenci izabranih iz grupe koja se sastoji od aminokiselinskih ostataka 315 do 329, 318 do 332, 321 do 335, 324 do 338, 324 do 329, 324 do 332, 324 do 335, 447 do 725, 533 do 725, 715 do 973, 200 do 536, 533 do 725 i 200 do 725 sekvence čiji je ID br.: 33, koji podrazumeva: obezbeđivanje atomskih koordinata kojima se definiše trodimenzionalna struktura epitopa CD148 definisanog jednom ili većim brojem polipeptidnih sekvenci izabranih iz grupe koja se sastoji od aminokiselinskih ostataka315 do 329, 318 do 332, 321 do 335, 324 do 338, 324 do 329, 324 do 332, 324 do 335, 447 do 725, 533 do 725, 715 do 973, 200 do 536, 533 do 725 i 200 do 725 sekvence čiji je ID br.: 33 i kreiranje ili odabir jedinjenja koja su u stanju da vežu epitop CD148 na osnovu datih atomskih koordinata.

Opis slika

Slike 1A i 1B prikazuju preklapanje nukleotidne sekvence i aminokiselinske sekvence koju ona kodira za varijabilni teški (VH) i varijabilni laki (VL) lanac antitela predmetnog pronalaska, antitela br, 1 (At-1). Osenčeni regioni na slici označavaju CDR1, 2 i 3 (od amino ka karboksi terminalnom kraju, respektivno). Upit i okviri oznake označavaju nukleotidnu i aminokiselinsku sekvencu, respektivno.

Slike 2A i 2B prikazuju preklapanje nukleotidne sekvence i aminokiselinske sekvence koju ona kodira za varijabilni teški (VH) i varijabilni laki (VL) lanac antitela br. 2 (At-2). Osenčeni regioni na slici označavaju CDR1, 2 i 3 (od amino ka karboksi terminalnom kraju, respektivno).

Slike 3A i 3B prikazuju preklapanje nukleotidne sekvence i aminokiselinske sekvence koju ona kodira za varijabilni teški (VH) i varijabilni laki (VL) lanac antitela br. 3 (At-3). Osenčeni regioni na slici označavaju CDR1, 2 i 3 (od amino ka karboksi terminalnom kraju, respektivno).

Slike 4A i 4B prikazuju preklapanje nukleotidne sekvence i aminokiselinske sekvence koju ona kodira za varijabilni teški (VH) i varijabilni laki (VL) lanac antitela br. 4 (At-4). Osenčeni regioni na slici označavaju CDR1, 2 i 3 (od amino ka karboksi terminalnom kraju, respektivno).

Slike 5A i 5B prikazuju preklapanje nukleotidne sekvence i aminokiselinske sekvence koju ona kodira za varijabilni teški (VH) i varijabilni laki (VL) lanac antitela br. 5 (At-5). Osenčeni regioni na slici označavaju CDR1, 2 i 3 (od amino ka karboksi terminalnom kraju, respektivno).

Slike 6A i 6B prikazuju preklapanje nukleotidne sekvence i aminokiselinske sekvence koju ona kodira za varijabilni teški (VH) i varijabilni laki (VL) lanac antitela br. 6 (At-6). Osenčeni regioni na slici označavaju CDR1, 2 i 3 (od amino ka karboksi terminalnom kraju, respektivno).

Slike 7A i 7B prikazuju preklapanje nukleotidne sekvence i aminokiselinske sekvence koju ona kodira za varijabilni teški (VH) i varijabilni laki (VL) lanac antitela br. 7 (At-7). Osenčeni regioni na slici označavaju CDR1, 2 i 3 (od amino ka karboksi terminalnom kraju, respektivno).

Slike 8A i 8B prikazuju preklapanje nukleotidne sekvence i aminokiselinske sekvence koju ona kodira za varijabilni teški (VH) i varijabilni laki (VL) lanac antitela br. 8 (At-8). Osenčeni regioni na slici označavaju CDR1, 2 i 3 (od amino ka karboksi terminalnom kraju, respektivno).

Najbolji načini izvođenja predmetnog pronalaska

Kako bi predmetni pronalazak bio što razumljiviji, prvo će biti definisani određeni pojmovi. Dodatne definicije date su u detaljnom opisu.

Definicije

Jedinice, prefiksi i simboli mogu biti dati u obliku koji je prihvaćen od strane SI. Ukoliko nije drugačije naznačeno, nukleinske kiseline napisane su s leva na desno u orijentaciji 5' ka 3'; aminokiselinske sekvence napisane su s leva na desno u orijentaciji od amino ka karboksilnom kraju. Numerički opsezi koji su ovde dati obuhvataju i brojeve kojima se definišu opsezi i obuhvataju i podržavaju svaku cifru u okviru definisanog opsega. Aminokiseline ovde mogu da budu označene bilo svojim dobro poznatim skraćenicama od po tri slova ili simbolima od jednog slova koje preporučuje Komisija za nomenklaturu IUPAC-IUBMB. Nukleotidi, takođe, mogu da budu označeni svojim opšteprihvaćenim šiframa od jednog slova. Ukoliko nije drugačije naznačeno, reči "jedan" i "neki" treba tumačiti kao "najmanje jedan od". Naslovi odeljaka koji se ovde koriste služe samo u svrhu organizacije teksta te ih ne treba tumačiti kao ograničenje opisane materije. Svi dokumenti, ili delovi dokumenata, koji su citirani u ovoj prijavi, obuhvatajući, bez ograničavanja na, patente, patentne zahteve, članke, knjige i radove, ovde su eksplicitno u celini inkorporirani po referenci za koju god svrhu da se koriste. U slučaju neslaganja između aminokiselinske i nukleotidne sekvence u okviru prijave, oznake na slikama treba uzeti kao referentne.

Standardne tehnike se koriste za rekombinantnu DNK, sintezu oligonukleotida i kulturu i transformaciju tkiva (npr.,elektroporacija, lipofekcija). Enzimske reakcije i tehnike prečišćavanja izvode se prema specifikaciji proizvođača ili na način na koji se uobičajeno izvode u struci, ili kao stoje ovde opisano. Prethodne tehnike i procedure se, uopšteno govoreći, izvode prema uobičajenim postupcima koji su dobro poznati u struci i kao što je opisano u različitim opštim i specifičnim referencama koje su navedene i opisane u ovoj patentnoj prijavi. Videti, npr., Sambrooket al,Molecular Cloning: A Laboratorv Manual (2. izdanje, Cold Spring Harbor Laboratorv Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)) koja je ovde inkorporirana po referenci. Nomenklatura koja se koristi u vezi sa, kao i laboratorijske procedure i tehnike analitičke hernije, sintetske organske hernije, kao i medicinske i farmaceutske hernije koje su ovde opisane su dobro poznate i često korišćene u struci. Standardne tehnike se koriste za hemijsku sintezu, hemijsku analizu, farmaceutsko pripremanje, formulaciju i dopremanje, kao i za tretman pacijenata.

Kada se koriste u skladu sa predmetnom prijavom, osim ako je drugačije naznačeno, smatraće se da sledeći izrazi imaju sledeća značenja: Pojam "humani CD148" je protein koji je označen kao humani ECRTP/DEP u Ostmanet al, Proc Natl Acad Sci USA91: 9680-9684 (1994), ovde inkorporiran po referenci, obuhvatajući i njegove alelske varijante. Pod "vanćelijskim domenom CD148" podrazumeva se deo humanog CD148 koji se nalazi između oko ostatka 36 do 973 (ostaci 1 do 35 su vodeća sekvenca i nisu prisutni u zrelom obliku) NCBI (Nacionalni Centar za Biotehnološke Informacije) redni br. AAB36687 verzija AAB36687.1 GI:1685075, koji je podnet 26. novembra 1996, ovde inkorporiran po referenci i dostupan na internetu na adresi www.ncbi.nih.gov.

Pojam "antitelo" obuhvata i glikozilovane i neglikozilovane imunoglobuline bilo kog izotipa ili podklase ili njihove kombinacije, obuhvatajući humana (uključujući i antitela sa presađenim CDR), humanizovana, himerna, multispecifična, monoklonska, poliklonska antitela i njihove oligomere, bez obzira na to da li su takva antitela dobijena, u potpunosti ili delom, imunizacijom, rekombinantnom tehnologijom, prekoin vitrosintetičkih puteva, ili na neki drugi način. Stoga, pojam "antitelo" obuhvata ona koja su dobijena, eksprimirana, stvorena ili izolovana rekombinantnim tehnikama, kao što su (a) antitela izolovana iz neke životinje (npr. miša) koja je transgena za humane gene za imunoglobuline, ili hibridoma koji je dobijen iz takvih životinja; (b) antitela izolovana iz ćelije domaćina kojaje transficirana tako da eksprimira to antitelo, npr. iz transfektoma; (c) antitela izolovana iz rekombinantnih, kombinatornih biblioteka antitela i (d) antitela koja su dobijena, eksprimirana, stvorena ili izolovana na bilo koji drugi način koji podrazumeva prekrajanje (splajsing) sekvenci gena za imunoglobuline sa drugim sekvencama DNK. Takva antitela imaju varijabilne i konstantne regione dobijene iz matične linije imunoglobulinskih sekvenci dve različite životinjske vrste. U nekim rešenjima, međutim, takva antitela mogu da budu podvrgnutain vitromutagenezi

(ili, kada je životinja transgena za sekvence humanih imunoglobulina,in vivosomatskoj mutagenezi), te aminokiselinske sekvence VH i VL regiona, iako su dobijene iz i srodne sa matičnim linijama VH i VL sekvenci određene vrste (napr. ljudi), ne moraju da postoje u prirodi u okviru repertoara matičnih linija antitela te vrstein vivo.

Potpuno antitelo je glikoprotein koji sadrži najmanje dva teška (H) lanca i dva laka (L) lanca, koji su međusobno vezani disulftdnim vezama, ili njegov antigen vezujući region. Svaki teški lanac se sastoji od varijabilnog regiona teškog lanca (koji je ovde označen skraćenicom VH) i konstantnog regiona teškog lanca, koji se sastoji od tri domena (ovde označenih skraćenicama CH1, CH2 i CH3). Svaki laki lanac se sastoji od varijabilnog regiona lakog lanca (ovde označenog skraćenicom VL) i konstantnog regiona lakog lanca, koji se sastoji od jednog domena (koji je o.vde označen skraćenicom CL). VH i VL regioni dalje mogu da se podele na regione hipervarijabilnosti, označene kao regione koji određuju komplementarnost ("complementaritv determining regions", CDR), koji su razdvojeni regionima čije su sekvence više konzervirane, a koji su označeni kao regioni okvira ("framevvork regions", FR). Svaki VH i VL sastavljen je od tri CDR i četiri FR, koji su, od amino terminalnog kraja ka terminalnom kraju poredani na sledeći način. FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Varijabilni regioni teškog i lakog lanca sadrže vezujući domen koji interaguje sa antigenom. Konstanti regioni antitela mogu da posreduju u vezivanju imunoglobulina za domaćinska tkiva ili faktore, uključujući različite ćelije imunog sistema (npr., efektorske ćelije) i prvu komponentu (Clq) klasičnog puta aktivacije sistema komplementa. Aminokiselinska sekvenca koja je suštinski ista kao CDR teškog ili lakog lanca pokazuje značajnu količinu ili stepen identičnosti sekvence kada se uporedi sa referentnom sekvencom i doprinosi specifičnom vezivanju antigena koji antitelo koje ima referentnu sekvencu specifično vezuje. Definitivno.je poznato ili prepoznatljivo da ovakva identičnost predstavlja aminokiselinsku sekvencu konkretnog humanog monoklonskog antitela. Suštinski iste aminokiselinske sekvence CDR teškog i lakog lanca mogu da imaju, na primer, manje modifikacije ili konzervativne supstitucije aminokiselinskih ostataka, sve dok je održana sposobnost vezivanja posmatranog antigena Pojam "humano monoklonsko antitelo" treba da obuhvati monoklonsko antitelo sa suštinski humanim aminokiselinskim sekvencama CDR, dobijeno, na primer, rekombinantnim postupcima, iz limfocita ili ćelija hibridoma.

Pod pojmom "antigen vezujući region" antitela podrazumeva se jedan ili veći broj fragmenata antitela koji zadržavaju sposobnost za vezivanje za antigen (npr., CD148) koji se specifično vezuje za referentno antitelo, kao što je ovde objašnjeno. "Antigen vezujući regioni" nekog antitela mogu da obuhvataju, na primer, polipeptide koji sadrže pojedinačne teške ili lake lance ili njihove fragmente, kao što su VH, VL i Fd regioni; monovalentne fragmente, kao što su Fv, Fab i Fab' regioni; bivalentne fragmente kao što su F(ab')2; jednolančana antitela, kao što je jednolančani Fv (scFv) region; Fc fragmente; dijatela; Fd (koji se sastoje od VH i CH1 domena), maksitela (bivalentna scFv fuzionisana na amino terminalni kraj Fc (CH2-CH3 domene) IgGl) i domene regiona za određivanje komplementarnosti (CDR). Ovakvi pojmovi su opisani, na primer, u Harlovv & Lane, Antibodies: A Laboratorv Manual, Cold Spring Harbor Laboratorv, N.Y. (1989); Molec. Biologv and Biotechnologv: A Comprehensive Desk Reference (Myers, R. A. (urednik), New York: VCH Publisher, Inc.); Hustonet al,Cell Biophvsics, 22: 189-224 (1993); Pluckthun & Skerra, Meth. Enzvmol., 178: 497-515

(1989) i u Dav, E. D., Advanced Immunochernistrv, drugo izdanje, Wiley-Liss, Inc., New York, N.Y. (1990), koji su ovde inkorporirani po referenci. Pojam "antigen vezujući region" takođe podrazumeva, na primer, fragmente dobijene proteaznom hidrolizom ili redukcijom humanog monoklonskog antitela, kao i postupcima rekombinantne DNK koji su poznati stručnjacima u ovoj oblasti. Stručnjak u ovoj oblasti zna da tačne granice fragmenta humanog monoklonskog antitela mogu da budu različite, sve dok fragment zadržava funkcionalnu aktivnost. Korišćenjem dobro poznatih rekombinantnih postupaka, stručnjak u ovoj oblasti može da konstruiše nukleinsku kiselinu za ekspresiju funkcionalnog fragmenta sa bilo kojim granicama koje su poželjne za konkretnu primenu. Uz to, iako su dva domena Fv fragmenta, VL i VH, kodirana na odvojenim genima, oni mogu da se spoje, upotrebom rekombinantnih postupaka, sintetičkim povezujućim regionom koji omogućava da se dobije jedinstven proteinski lanac u kome su VL i VH regioni upareni tako da se dobija monovalentni molekul (poznat kao jednolančani Fv (scFv); videti Birdet al(1988) Science 242: 423-426; i Hustonet al(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883). Ovakva jednolančana antitela takođe su obuhvaćena pojmom "antigen vezujući region" antitela. Ovi fragmenti antitela dovijaju se uobičajenim tehnikama poznatim stručnjacima u ovoj oblasti, te se ispituju na upotrebnu vrednost isto kao i potpuna antitela Ovakvi fragmenti obuhvataju one koji su dobijeni amino-terminalnim ili karboksi-terminalnim delecijama, ali na takav način da je preostala aminokiselinska sekvenca suštinski identična odgovarajućim položajima u sekvenci koja se prirodno javlja izvedenoj, na primer, iz cDNK sekvence potpune dužine. Antigen vezujući regioni obuhvataju i fragmente antitela koji zadržavaju bar jednu (npr.,1, 2, 3 ili više) sekvenci teškog lanca i bar jednu (npr.,1, 2, 3ili više) sekvenci lakog lanca za konkretan region za određivanje komplementarnosti (CDR) (npr., bar jedan ili veći broj od CDR1, CDR2 i/ili CDR3 iz teškog i/ili lakog lanca). Fuzionisane sekvence koje sadrže CDR za Fc region (ili njegov region koji sadrži konstantni region 2 teškog lanca (CH2) ili konstantni region 3 teškog lanca (CH3)) u opsegu su ove definicije, obuhvatajući, na primer, scFv fuzionisane, posredno ili neposredno, za Fc. Antigen vezujući region obuhvata, ali nije ograničen na, one koji su dobijeni iz antitela ili njihovih fragmenata (npr., enzimskom hidrolizom ili redukcijom disulfidnih veza), one dobijene sintetski pomoću rekombinantnih postupaka (npr., transfektoma), one dobijene pomoćuin vitrosintetskih postupaka (npr., pomoću Merifildovih smola), one dobijene njihovim kombinacijama ili drugim postupcima. Antigen vezujući regioni mogu, takođe, da podrazumevaju višestruke fragmente, kao što su CDR fragmenti, koji su međusobno povezani sintetski, hemijski ili na neki drugi način, u obliku oligomera. Stoga, antigen vezujući regioni predmetnog pronalaska obuhvataju polipeptide, dobijene pomoću jednog od velikog broja različitih postupaka, koji sadrže najmanje jedan CDR iz VH ili VL lanca predmetnog pronalaska (npr., At-1 do At-8).

Pod pojmom "Vlfragment" podrazumeva se fragment lakog lanca humanog monoklonskog antitela koji obuhvata ceo ili deo varijabilnog regiona lakog lanca, uključujući CDR. VL fragment može dalje da obuhvata sekvence konstatnog regiona lakog lanca.

Pod pojmom "Fd fragment" podrazumeva se fragment teškog lanca humanog monoklonskog antitela koji obuhvata ceo ili deo VH varijabilnog regiona teškog lanca, uključujući CDR. Fd fragment može dalje da obuhvata sekvence CH1 konstatnog regiona teškog lanca.

Pod pojmom "Fv fragment" podrazumeva se monovalentni antigen-vezujući fragment humanog monoklonskog antitela, uključujući ceo ili deo varijabilnih regiona teškog i lakog lanca, a koji nema konstantne regione teškog i lakog lanca. Varijabilni regioni teškog i lakog lanca obuhvataju, na primer, CDR. Na primer, Fv fragment obuhvata po ceo ili deo amino terminalnog kraja varijabilnog regiona od po oko 110 aminokiselina iz teškog i lakog lanca.

Pod pojmom "Fab fragment" podrazumeva se monovalentni antigen vezujući fragment antitela koji se sastoji od VL, VH, CL i CH1 domena, koji je veći od Fv fragmenta. Na primer, Fab fragment obuhvata varijabilne regione i cele ili delove prvih konstantnih domena teških i lakih lanaca. Stoga, Fab fragment dodatno obuhvata, na primer, aminokiselinske ostatke od oko 110 do oko 220 teškog i lakog lanca.

Pod pojmom "Fab' fragment" podrazumeva se monovalentni antigen vezujući fragment humanog monoklonskog antitela koji je veći od Fab fragmenta. Na primer, Fab' fragment obuhvata ceo laki lanac, ceo varijabilni region teškog lanca i ceo ili deo prvog i drugog konstantnog regiona teškog lanca. Na primer, Fab' fragment može dodatno da sadrži neke ili sve aminokiselinske ostatke od 220 do 330 teškog lanca.

Pod pojmom "F(ab')2fragment" podrazumeva se bivalentni antigen vezujući fragment humanog monoklonskog antitela koji se sastoji od dva Fab fragmenta povezana disulfidnim mostom u regionu šarke. F(ab')2fragment obuhvata, na primer, ceo ili deo varijabilnih regiona dva teška lanca i dva laka lanca, a može dalje da obuhvata cele ili delove prvih konstantnih domena dva teška lanca i dva laka lanca.

Pod pojmom "dAb fragment" podrazumeva se fragment koji se sastoji od VH domena, kao što je opisano u Wardet al,(1989) Nature 341: 544-546.

Pod pojmom "CDR" podrazumevaju se nesusedna mesta za vezivanje antigena koja se nalaze u okviru varijabilnih regiona polipeptida i teškog i lakog lanca. Ovaj region opisan je u Kabatet al,U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequences of Proteins of Immunological Interest" (1983) i u Chothiaet al,J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987) a dodatno i u MacCallumet al,J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996), koji su ovde inkorporirani po referenci, gde definicije obuhvataju prekplapanja ili podsetove aminokiselinskih ostataka kada se uporede jedan sa drugim. Međutim, primena bilo koje od definicija na CDR antitela ili njegovog funkcionalnog fragmenta treba da bude u okviru pojma, onako kako je on definisan i upotrebljen ovde. Tačni brojevi aminokiselinskih ostataka koji pripadaju određenom CDR će se razlikovati u zavisnosti od strukture CDR. Stručnjaci u ovoj oblasti mogu rutinski da odrede koji ostaci čine konkretan CDR na osnovu aminokiselinske sekvence varijabilnog regiona antitela. Stručnjaci u ovoj oblasti mogu da uporede dve ili više sekvenci antitela definišući regione ili pojedinačne aminokiselinske položaje respektivnih sekvenci koristeći istu definiciju CDR.

Pod pojmom "sa presađenim CDR" podrazumevaju se antitela ili antigen vezujući regioni u kojima su CDR dobijeni iz jedne vrste ubačeni u okvir druge vrste, na primer, mišji CDR presađeni na humani okvir ("humano" antitelo).

Pojam "analog" označava polipeptide koji sadrže segmente od najmanje 25 aminokiselinskih ostataka koji imaju značajnu identičnost delu izvedene aminokiselinske kiseline koja ima najmanje jednu od sledećih osobina: (1) specifično vezivanje za CD148, pod pogodnim uslovima, (2) sposobnost da zaustavi vezivanje CD148 liganada za CD148, ili (3) sposobnost da inhibira angiogenezu u kojoj posreduje CD148. Obično peptidni analozi sadrže konzervativne aminokiselinske supstitucije (ili adicije ili delecije) u odnosu na sekvencu koja se javlja u prirodi. Analozi su, obično, dugački najmanje 20 aminokiselinskih ostataka, poželjno je da budu dugački najmanje 50 aminokiselinskih ostataka ili duži, a često mogu budu dugački koliko su dugački i polipeptidi pune dužine koji se javljaju u prirodi.

Pojam "izolovan" znači odvojen od jednog ili većeg broja jedinjenja koja se nalaze sa antitelom ili polipeptidom u prirodi ili sintetičkoj reakciji upotrebljenoj za dobijanje antitela, uključujući, na primer, reagens, prekursor ili drugi proizvod reakcije, a poželjno je da bude suštinski oslobođen od bilo kog drugog peptida sisara koji bi mogao da utiče na njegovu terapeutsku ili dijagnostičku primenu. Izolovano sredstvo takođe obuhvata suštinski prečišćeno sredstvo. Pojam može da obuhvata molekule koji se javljaju u prirodi, kao što su proizvodi biosintetskih reakcija, ili sintetičke molekule. Antitelo se takođe smatra "izolovanim", na primer, kada je suštinski slobodno od prisustva drugih antitela koja imaju različite specifičnosti za antigene. Takođe, supstancaje "izolovana" ako je vezana ili konjugovana za polipeptid ili drugu supstancu za koju nije vezana u prirodi.

Pod pojmom "značajno čist" podrazumeva se supstanca koja je najzastupljenija prisutna vrsta (t.j. na molarnoj osnovi je zastupljenija nego bilo koja druga pojedinačna vrsta u tom preparatu) i podrazumeva najmanje 50 procenata (na molarnoj osnovi) svih prisutnih makromolekulskih vrsta Uopšteno, značajno čist preparat će sadržati više od oko 80% svih makromolekulskih vrsta prisutnih u preparatu, ili, alternativno više od oko 85%, 90%, 95% i 99%. Supstanca je prečišćena do suštinske homogenosti (vrste koje je kontaminiraju ne mogu da budu detektovane u preparatu korišćenjem konvencionalnih postupaka detekcije), gde se preparat sastoji, suštinski, od samo jedne makromolekulske vrste. Slično tome, supstancaje "izolovana" ako u toku proizvodnje preparata postaje "izolovana" ili "značajno čista" kao što je prethodno opisano, a potom se kombinuje sa drugim sredstvima u dobro definisanom preparatu, uprkos tome što ta supstanca u tom dobro definisanom preparatu neće biti najzastupljenija prisutna vrsta

Kada se koriste u predmetnoj prijavi, pojmovi "specifično vezuje" i "specifično vezivanje" podrazumevaju dajedinjenje najradije ili selektivno prepoznaje i vezuje zreli epitop CD148, bilo pune ili nepotpune dužine, ili njegov ortolog, tako da je njegov afinitet (određen pomoću, npr., afinitetnog ELISA ili BIAcore testa kao što je ovde opisano) ili njegova sposobnost neutralizacije (određena pomoću, npr., neutrališućih ELISA testova koji su ovde opisani, ili pomoću sličnih testova) najmanje 10 puta veća, ali opciono 50 puta veća, 100, 250 ili 500 puta veća, ili čak najmanje 1000 puta veća od afiniteta ili sposobnosti neutralizacije istog ili bilo kog drugog polipeptida, gde je peptidni deo peptitela prvo fuzionisan na humani ostatak Fc za evaluaciju u ovom testu. Obično se antitelo vezuje sa afinitetom od najmanje 1 x 10<7>M"<1>, a vezuje se za prethodno određeni antigen sa afinitetom koji je najmanje dvostruko veći od njegovog afiniteta za vezivanje ne-specifičnog antigena (npr., BSA, kazeina) različitog od prethodno određenog antigena ili njemu veoma srodnog antigena Kada se koriste u predmetnoj prijavi, izrazi antitelo koje "prepoznaje" ili koje je "specifično za" antigen smatraju se ekvivalentnim izrazu "specifično vezuje" antigen. Antitelo koje specifično vezuje navedeni epitop, izoformu ili varijantu humanog CD148 može, međutim, da ima ukrštenu reaktivnost prema drugim srodnim antigenima, npr., iz drugih vrsta (npr., CD 148 homolozi drugih vrsta) a da se i dalje smatra da "specifično vezuje" dati epitop CD148.

Pod pojmom "epitop" podrazumeva se onaj deo nekog molekula koji može da bude prepoznat i vezan od strane sredstva za specifično vezivanje, npr., antitela, na jednom ili većem broju vezujućih regiona sredstva za vezivanje. Epitopi obično sadrže hemijski aktivne grupe na površini molekula, kao što su, na primer, aminokiseline ili bočni lanci ugljenih hidrata, a obično imaju i specifične trodimenzionalne strukturne karakteristike kao i specifične odlike naelektrisanja Konformacioni i nekonformacioni epitopi razlikuju se po tome što se vezivanje prvih, ali ne i vezivanje drugih, gubi u prisustvu denaturišućih rastvarača Smatra se da antitelo specifično vezuje antigen kada je konstanta disocijacije manja ili jednaka oko 1 u.M, poželjno je da bude manja ili jednaka oko 100 nM a najpoželjnije da bude manja od 10 nM. Antitela ili antigen vezujući regioni takvih antitela predmetnog pronalaska obuhvataju antitela i njihove antigen vezujuće regione koji se dobijaju upotrebom epitopskih deterimnanti koje su ovde definisane, ili koji se dobijaju korišćenjem epitopskih determinanti koje su značajno identične epitopskim determinantama koje su ovde opisane. U tom kontekstu, izraz "značajna identičnost" označava da sekvence dele dovoljnu identičnost da antitelo koje vezuje modifikovanu epitopsku detenninantu može kompetitivno da inhibira vezivanje antitela za epitopske determinante koje su ovde opisane.

Izraz "kompetitivno inhibira vezivanje" znači da antitelo prepoznaje, vezuje se za ili ima imunospecifičnost za isti ili suštinski isti epitop ili njegov fragment, kao neko drugo antitelo ili njegov antigen vezujući fragment. U kontekstu predmetnog pronalaska, izolovano antitelo ili njegov antigen vezujući region koji kompetitivno inhibira vezivanje monoklonskog antitela koje specifično vezuje epitop humanog CD148 definisan sekvencom aminokiselinskih ostataka izabranih iz grupe koja se sastoji od aminokiselinskih ostataka 315 do 329, 318 do 332, 321 do 335, 324 do 338, 324 do 329, 324 do 332, 324 do 335, 447 do 725, 533 do 725, 715 do 973, 200 do 536, 533 do 725 i 200 do 725 sekvence čiji je ID br.. 33, sposobno je za merljivu kompeticiju za vezivanje za CD148. Uobičajeno je da se kompetitivna inhibicija meri određivanjem količine referentnog antitela ili njegovog antigen vezujućeg fragmenta koji se vezuje za ciljni protein (npr., humani CD148) u prisustvu ispitivanog antitela ili njegovog antigen vezujućeg regiona. Ispitivano antitelo ili ispitivani antigen vezujući region obično su prisutni u višku, na primer, 5, 10,25 ili 50 puta u višku. Kompetitivno vezana antitela ili antigen vezujući regioni će, kada su prisutni u višku, inhibirati specifično vezivanje referentnog antitela ili njegovog antigen vezujućeg regiona za vanćelijski domen humanog CD148 u statistički značajnoj meri, često najmanje 10%, 25%, 50%, 75%, 90% ili više. Testovi kompetitivne inhibicije dobro su poznati u struci. Videti, na primer, Harlovv & Lane (1998), Antibodies, A Laboratorv Manual, Cold Spring Harbor Publications, New York. Kada se koristi ovde, inhibicija vezivanja podrazumeva i delimične i potpune inhibicije/zaustavljanja. Inhibicija i zaustavljanje takođe obuhvataju bilo koje merljivo smanjenje u afinitetu vezivanja konkretnog anti-CD148 antitela za CD 148 kada je u dodiru sa anti-CD148 antitelom predmetnog pronalaska, npr., zaustavljanje vezivanja najmanje za oko 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 99%, ili 100%.

Identifikacija jednog ili većeg broja antitela koja kompetitivno inhibiraju vezivanje monoklonskih antitela koja specifično vezuju epitop humanog CD148 opisan sekvencom aminokiselinskih ostataka izabranih iz grupe koja se sastoji od aminokiselinskih ostataka 447 do 725, 533 do 725, 715 do 973, 324 do 335, 200 do 536, 533 do 725 i 200 do 725 sekvence čiji je ID br.: 33 je jednostavan tehnički zadatak kada se ima u vidu određivanje pomenutih epitopa koji su definisani takvim aminokiselinskim ostacima. Nakon dobijanja antitela koje se specifično vezuje za epitop humanog CD148 definisan sekvencom aminokiselinskih ostataka izabranih iz grupe koja se sastoji od aminokiselinskih ostataka 315 do 329, 318 do 332, 321 do 335, 324 do 338, 324 do 329, 324 do 332, 324 do 335, 447 do 725, 533 do 725, 715 do 973, 200 do 536, 533 do 725 i 200 do 725 sekvence čiji je ID br.: 33, identifikacija antitela koja kompetitivno inhibiraju vezivanje ovih antitela za CD148 jednostavno se izvodi poređenjem sa referentnim antitelom.

Identifikacija ukršteno reaktivnih antitela može jednostavno da se izvede korišćenjem jednog od mnoštva imunoloških skrining testova u kojima može da se proceni kompeticija antitela. Ovakvi testovi su rutinski u struci, a dalje su ovde opisani detaljnije. U.S. patent br. 5,660,827, izdat 26. avgusta 1997, specifično je ovde inkorporiran po referenci, čak i za svrhe koje obuhvataju čak i dalje proširenje znanja o tome kako se dobijaju antitela koja se vezuju za isti ili značajno identičan epitop kao dato antitelo.

Na primer, u slučajevima u kojima su antitela koja treba ispitati dobijena iz različitih životinjskih izvora, ili su različiti izotipovi, može da se upotrebi jednostavan test kompeticije u kome su kontrolna i ispitivana antitela pomešana (ili prethodno adsorbovana) i potom dodata preparatu CD148 antigena koji sadrži epitop CD148 koji je ovde opisan. Protokoli zasnovani na ELISA testovima i Western blotu pogodni su za upotrebu u ovako jednostavnim studijama kompeticije.

U nekim rešenjima, prvo se pomešaju kontrolna antitela sa različitim koncentracijama ispitivanih antietla (npr., 1 : 10 ili 1 : 100) i inkubiraju neko vreme pre nego što se dodaju preparatu antigena. U drugim rešenjima, kontrola i različite koncetracije ispitivanih antitela mogu jednostavno da se pomešaju tokom inkubacije sa preparatom antigena. U svakom slučaju, korišćenjem sekundarnih antitela specifičnih za vrstu ili izotip biće moguće detektovati samo vezana kontrolna antitela, čije će vezivanje biti smanjeno usled prisustva ispitivanog antitela koje prepoznaje suštinski isti epitop.

Prilikom izvođenja studije kompeticije između kontrolnog antitela i bilo kog ispitivanog antitela (bez obzira na vrstu porekla ili izotip), moguće je prvo obeležiti kontrolu obeleživačem koji je moguće detektovati, kao što je, na primer, biotin ili enzimski (ili čak radioaktivni) obeleživač kako bi se omogućila kasnija identifikacija. U ovim slučajevima, prvo se pomešaju ili inkubiraju obeležena kontrolna antitela sa ispitivanim antitelima u različitim odnosima (npr., 1 : 10 ili 1 : 100) te se (opciono nakon odgovarajućeg vremenskog perioda) ispituje reaktivnost obeleženih kontrolnih antitela koja se kasnije poredi sa kontrolnom vrednošću dobijenom u slučaju kada u toku inkubacije nije prisutno nijedno potencijalno kompetirajuće ispitivano antitelo.

Test može da bude i bilo koji test iz mnoštva imunoloških testova zasnovanih na hibridizaciji antitela, a kontrolna antitela bi se detektovala pomoću detekcije njihovih obeleživača, npr., korišćenjem streptavidina u slučaju antitela obeleženih biotinom ili korišćenjem hromogenog supstrata u slučaju primene enzimskog obeleživača (kao što je supstrat 3,3',5,5'-tetrametilbenzidin (TMB) u slučaju primene enzima peroksidaze) ili jednostavnom detekcijom radioaktivnog obeleživača Antitelo koje vezuje isti epitop kao kontrolno antitelo pokazaće efikasnu kompeticiju za vezivanje te će značajno smanjiti vezivanje kontrolnog antitela, što će se ogledati u smanjenju vezanog obeleživača

Reaktivnost (obeleženih) kontrolnih antitela u odsustvu potpuno nevažnog antitela biće najviša kontrolna vrednost. Najniža kontrolna vrednost dobiće se inkubiranjem obeleženih antitela sa neobeleženim antitelima potpuno istog tipa, kada dolazi do kompeticije i smanjenja vezivanja obeleženih antitela U samom testu, značajno smanjenje reaktivnosti obeleženih antitela u prisustvu ispitivanog antitela je pokazatelj da ispitivano antitelo prepoznaje isti epitop, t.j., da ono "ukršteno reaguje" sa obeleženim antitelom.

Izraz "inhibira angiogenezu" podrazumeva statistički značajno smanjenje nivoa angiogeneze u odnosu na kontrolu koja nije tretirana. Primeri smanjenja su od najmanje 5 do 99%, čime obuhvataju najmanje 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% ili 90% redukcije angiogeneze u odnosu na negativnu kontrolu. Široko prihvaćeni funkcionalni testovi angiogeneze kao što je test kornealnog mikrodžepa i test planarne migracije humanih renalnih mikrovaskularnih endotelijalnih ćelija (HRMEC) poznati su u struci. Videti, npr., U.S. patent br. 5,712,291 i 5,871,723. Ukratko, test planarne migracije HRMEC zasniva se na zatvaranju povreda na osnovu koga testom može da se kvantifikuje inhibicija angiogeneze antitelima ili antigen vezujućim regionima predmetnog pronalaskain vitro.U ovom testu, migracija endotelijalnih ćelija se meri kao brzina zatvaranja kružne povrede u jednoslojnoj kulturi ćelija. Brzina zatvaranja povrede je linearna i dinamički regulisana sredstvima koja stimulišu i inhibiraju angiogenezuin vivo.Test mišjeg kornealnog džepa takođe može da se upotrebi za kvantifikaciju inhibicije angiogeneze antitelima ili antigen vezujućim regionima predmetnog pronalaskain vivo.U ovom testu, sredstva koja se ispituju na angiogenetsku i anti-angiogenetsku aktivnost se imobilizuju u oblik sa sporim otpuštanjem u hidronskoj sačmi, koja se implantira u mikrodžepove napravljene u kornealnom epitelu anesteziranih miševa. Vaskularizacija se meri kroz izgled, gustinu i stepen urastanja krvnih sudova iz vaskularizovanog kornealnog limbusa u, u normalnim okolnostima avaskularnu, rožnjaču.

Podrazumeva se da antitela predmetnog pronalaska mogu da budu modifikovana, tako da su značajno identična polipeptidnim sekvencama antitela ili njihovih fragmenata, a da i dalje vezuju epitope CD 148 predmetnog pronalaska. Polipeptidne sekvence su "značajno identične" onda kada imaju, optimalno upoređene pomoću programa kao što su GAP ili BESTFIT korišćenjem fabrički podešenih penalizacija za praznine, najmanje 80 procenata identičnosti sekvence, najmanje 90 procenata identičnosti sekvence, najmanje 95 procenata identičnosti sekvence, ili najmanje 99 procenata identičnosti sekvence. Poželjno je da razlike ostataka koji nisu identični budu upravo u konzervativnim aminokiselinskim supstitucijama. Konzervativne aminokiselinske supstitucije odnose se na mogućnost međusobne zamene ostataka koji imaju slične bočne lance. Na primer, grupa amino kiselina koje imaju alifatične bočne lance obuhvata glicin, alanin, valin, leucin i izoleucin; grupa aminokiselina koje imaju alifatične-hidroksilne bočne lance obuhvata serin i treonin; grupa aminokiselina koje imaju bočne lance koji sadrže amid obuhvata asparagin i glutamin; grupa aminokiselina koje imaju aromatične bočne lance obuhvata fenilalanin, tirozin i triptofan; grupa aminokiselina koje imaju bazne bočne lance obuhvata lizin, arginin i histidin; dok grupa aminokiselina koje imaju bočne lance koji sadrže sumpor obuhvata cistein i metionin. Poželjne grupe konzervativnih aminokiselinskih supstitucija su: valin-leucin-izoleucin, fenilalanin-tirozin, lizin-arginin, alanin-valin, glutaminska-asparaginska i asparagin-glutamin.

Kao što je ovde razmatrano, manje varijacije u aminokiselinskim sekvencama antitela ili imunoglobulinskih molekula smatraju se obuhvaćenim opsegom zaštite predmetnog pronalaska, ukoliko varijacije aminokiselinskih sekvenci zadržavaju najmanje 75%, poželjnije najmanje 80%, 90%, 95% a najpoželjnije 99%. Posebno se misli na konzervativne aminokiselinske supstitucije. Konzervativne supstitucije su one koje se odvijaju u okviru porodice aminokiselina čiji su bočni lanci srodni. Genetski kodirani aminokiselinski ostaci uopšteno se dele u porodice: (1) kisele (aspartat, glutamat); (2) bazne (lizin, arginin, histidin); (3) nepolarne. (alanin, valin, leucin, izoleucin, prolin, fenilalanin, metionin, triptofan); i (4) nenaelektrisane polarne (glicin, asparagin, glutamin, cistein, serin, treonin, tirozin). Poželjnije porodice su: serin i treonin su porodica alifatičnih hidroksi aminokiselina; asparagin i glutamin su porodica aminokiselina koje sadrže amid; alanin, valin, leucin i izoleucin su porodica alifatičnih aminokiselina; a fenilalnin, triptofan i tirozin su porodica aromatičnih aminokiselina. Na primer, realno je očekivati da izolovana supstitucija leucina izoleucinom ili valinom, aspartata glutamatom, treonina serinom ili slična supstitucija neće imati veliki uticaj na sposobnost vezivanja nastalog molekula, posebno ukoliko supstitucija ne pogađa aminokiselinski ostatak u regionu okvira Da li je aminokiselinskom supstitucijom dobijen funkcionalni polipeptid jednostavno se određuje ispitivanjem specifične aktivnosti derivata polipeptida. Takvi testovi su ovde detaljno opisani. Stručnjaci u ovoj oblasti mogu jednostavno da pripreme fragmente ili analoge antitela ili imunoglobulinskih molekula. Poželjni amino i karboksi terminalni krajevi fragmenta ili analoga mogu da se nalaze blizu granica funkcionalnih domena Strukturni i funkcionalni domeni mogu da se identifikuju poređenjem nukleotidne i/ili aminokiselinske sekvence sa javnim ili privatnim bazama podataka sa sekvencama. Poželjno je da se koriste računarski programi za poređenje motiva sekvence ili predviđenih konformacionih domena proteina koji se javljaju u drugim proteinima čije su struktura i/ili funkcija poznate. Poznati su postupci identifikacije proteinskih sekvenci koje se savijaju u poznate trodimenzionalne strukture. Bowieet al,Science 253: 164 (1991). Stoga, primeri koji slede pokazuju da stručnjaci u ovoj oblasti mogu da prepoznaju motive i strukturne konformacije koje mogu da budu upotrebljene za definisanje strukturnih i funkcionalnih domena u skladu sa predmetnim pronalaskom.

Poželjne aminokiselinske supstitucije su one koje: (1) smanjuju podložnost proteolizi; (2) smanjuju podložnost oksidaciji; (3) menjaju afinitet vezivanja za nastajanje proteinskih kompleksa; (4) menjaju afinitet vezivanja i (5) donose ili modifikuju druge fizikohemjske ili funkcionalne osobine takvih analoga. Analozi mogu da obuhvataju različite muteine sekvence koje su različite od peptidnih sekvenci koje se javljaju u prirodi. Na primer, pojedinačne ili višestruke aminokiselinske supstitucije (poželjno je da to budu konzervativne aminokiselinske supstitucije) mogu da se uvedu u sekvencu koja se javlja u prirodi (poželjno je da to bude u delu polipeptida koji nije u domenu/domenima koji grade međumolekulske kontakte). Konzervativna aminokiselinska supstitucija ne bi trebalo značajno da menja strukturne odlike originalne sekvence (npr., supstituisana aminokiselina ne bi trebalo da teži da razbije heliks koji se javlja u originalnoj sekvenci, niti da razori druge vrste sekundarne strukture koji odlikuju originalnu sekvencu). Primeri sekundarnih i tercijarnih struktura poznatih u struci opisani su u Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, urednik, W. H. Freeman and Companv, New York (1984)); Intro dueti on to Protein

Structure (C. Branden & J. Tooze, urednici, Garland Publishing, New York, N.Y.

(1991)); i Thorntonet al,Nature 354: 105 (1991), koji su svi ovde inkorporirani po referenci.

Antitela predmetnog pronalaska mogu da se dobiju i korišćenjem peptidnih analoga ovde opisanih epitopskih determinanti, a ti analozi mogu da se sastoje od nepeptidnih jedinjenja koja imaju osobine analogne osobinama originalnog peptida. Ova vrsta nepeptidnih jedinjenja nazivaju se "peptidni mimetici" ili "peptidomimetici". Fauchere, J. Adv. Drug Res. 15: 29 (1986); Veber & Freidinger TINS str. 392 (1985); i Evanset al,J. Med. Chem. 30: 1229 (1987). Ovakva jedinjenja se često razvijaju uz pomoć računarskog molekularnog modelovanja. Peptidni mimetici koji su strukturno slični terapeutski korisnim peptidima mogu da se upotrebe za postizanje-ekvivalentnog terapeutskog ili profilaktičkog dejstva. Uopšteno govoreći, peptidomimetici su strukturno slični originalnom polipeptidu (npr., polipeptidu koji ima neku biohemijsku osobinu ili farmakološku aktivnost), kao što je humano antitelo, ali imaju jednu ili veći broj peptidnih veza opciono supstituisanih vezama izabranim iz grupe koja se sastoji od: --CH2NH--, --CH2S-, --CH2--CH2-, -CH=CH- (cis i trans), --COCH2-, --CH(OH)CH2~i CH2SO--, postupcima dobro poznatim u struci. Sistematska supstitucija jedne ili većeg broja aminokiselina koncenzusne sekvence D-aminokiselinom iste vrste (npr., D-lizin umesto L-lizina) može da se upotrebi za dobijanje stabilnijih peptida Uz to, ograničeni peptidi koji sadrže koncenzus sekvencu ili varijaciju sekvence značajno identičnu koncenzus sekvenci mogu da se dobiju posupcima poznatim struci (Rizo & Gierasch Ann. Rev. Biochem. 61: 387 (1992), ovde inorporiran po referenci); na primer, dodavanjem unutrašnjih ostataka cisteina koji su u stanju da nagrade intramolekulske disulfidne mostove čime peptid ciklizuje.

Pod pojmom "bispecifičan molekul" obuhvataju se sva sredstva, npr., protein, peptid ili proteinski ili peptidni kompleks, koja imaju najmanje dve različite specifičnosti vezivanja. Na primer, molekul može da se vezuje za, ili da interaguje sa, (a) antigenom na površini ćelije i (b) Fc receptorom na površini efektorske ćelije. Pojmom "multispecifičan molekul" ili "heterospecifičan molekul" obuhvataju se sva sredstva, npr., protein, peptid ili proteinski ili peptidni kompleks, koja imaju više od dve različite specifičnosti vezivanja Na primer, molekul može da se vezuje za, ili da interaguje sa, (a) antigenom na površini ćelije, (b) Fc receptorom na površini efektorske ćelije i (c) najmanje još jednom drugačijom komponentom. Prema tome, predmetni pronalazak obuhvata, ali nije ograničen na, bispecifične, trispecifične, tetraspecifične i druge multispeficične molekule usmerene ka epitopima CD148, kao i ka drugim ciljnim molekulima, kao što su Fc receptori na efektorskim ćelijama Pojmom "bispecifičan molekul" obuhvataju se i dijatela. Dijatela su bivalentni, bispecifični molekuli kod kojih su VH i VL domeni eksprimirani na jednom polipeptidnom lancu, ali uz upotrebu povezujućeg regiona koji je prekratak da bi omogućio sparivanje dva domena na istom lancu, usled čega lanci moraju da se uparuju sa komplementarnim domenima drugog lanca, stvarajući dva antigen vezujuća mesta (videti, npr., Holliger, P.,etal(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448; Poljak, R. J.,et al.(1994) Structure 2: 1121-1123). Bispecifično antitelo obuhvata dva ili više antitela, vezujućih fragmenta antitela (npr., Fab), njihovih derivata, ili antigen vezujućih regiona koji su međusobno povezani, od kojih najmanje dva imaju različite specifičnosti. Ove različite specifičnosti obuhvataju specifičnost vezivanja za Fc receptor na efektorskoj ćeliji, kao i specifičnost vezivanja za antigen ili epitop na ciljnoj ćeliji, npr., tumorskoj ćeliji.

Pojam "humano antitelo" odnosi se na antitelo kod kojeg se i konstanti regioni i regioni okvira sastoje od potpuno ili značajno humanih sekvenci tako da humano antitelo zapravo ne izaziva značajnu imunogenu reakciju kada se primeni kod humanog domaćina, a poželjno je da ne izaziva nikakvu merljivu imunogenu reakciju. Treba da bude jasno da "humano antitelo" ne mora da se sastoji samo od humanih sekvenci, već da može da sadrži i delove ne-humanih sekvenci, pod uslovom da antitelo ne izaziva imunogenu reakciju kada se primeni kod humanog domaćina Na primer, "humano antitelo" obuhvata antitela kod kojih su CDR drugih vrsta, na primer miša, presađeni u humani okvir. U nekim rešenjima, humana antitela se dobijaju iz drugih sisara, uključujući, ali se ne ograničavajući na, miševe, pacove i zečeve. U drugim rešenjima, humana antitela se dobijaju u ćelijama hibridoma iz transgenih životinja koje imaju humani imunoglobulinski repertoar. U drugim rešenjima, potpuno humana antitela se proizvode rekombinantnim tehnikama, kao stoje upotreba transfektoma.

Pod pojmom "humanizovano antitelo" podrazumeva se antitelo čiji suštinski ceo konstantni okvir potiče od čoveka, ali ceo ili deo jednog ili više varijabilnih regiona potiču od neke druge vrste, npr. od miša.

Pojmovi "monoklonsko antitelo" i "preparat monoklonskog antitela", kada se koriste u predmetnoj prijavi, odnose se na preparat molekula antitela jediničnog molekularnog sastava Preparat monoklonskog antitela pokazuje jednu specifičnost vezivanja i afinitet za konkretan epitop. Shodno tome, pojam "humano monoklonsko anitelo" odnosi se na antitela koja pokazuju jednu specifičnost vezivanja, a koja imaju varijabilne i konstantne regione izvedene iz matičnih linija humanih imunoglobulinskih sekvenci. U jednom rešenju, humana monoklonska antitela se proizvode u hibridomu koji obuhvata B ćeliju dobijenu iz transgene ne-humane životinje, npr., transgenog miša, čiji genom sadrži transgen humanog teškog lanca i transgen lakog lanca fuzionisanu na besmrtnu ćeliju.

Pojam "rekombinantan", kada se upotrebljava u predmetnoj prijavi u odnosu na antitela, obuhvata sva humana antitela koja se dobijaju, eksprimiraju, stvaraju ili izoluju rekombinantnim tehnikama, kao što su (a) antitela izolovana iz životinja (npr., miša) koje su transgene za humane gene imunoglobulina ili iz hibridoma dobijenih iz takvih životinja (kao što je dalje opisano u odeljku 1), (b) antitela izolovana iz ćelija domaćina transformisanih tako da eksprimiraju ta antitela, npr., iz transfektoma, (c) antitela izolovana iz rekombinantne, kombinatorne biblioteke humanih antitela i (d) antitela koja se dobijaju, eksprimiraju, stvaraju ili izoluju na bilo koji drugi način koji podrazumeva prekrajanje (splajsing) sekvenci humanih imunoglobulinskih gena sa drugim sekvencama DNK. Ovakva rekombinantna humana antitela imaju varijabilne i konstantne regione dobijene iz matičnih humanih imunoglobulinskih sekvenci. U nekim rešenjima, međutim, ovakva rekombinantna humana antitela mogu da budu podvrgnuta mutageneziin vitro(ili, kada se koristi životinja transgena za sekvence humanog Ig, somatskoj mutacijiin vivo),čime su aminokiselinske sekvence VH i VL regiona tih rekombinantnih antitela sekvence koje, iako izvedene iz i srodne sa matičnim humanim imunoglobulinskim sekvencama, ne moraju da postoje kao takve u prirodi u matičnom humanom repertoaru antitelain vivo.

Kada se koristi u predmetnoj prijavi, "heterologo antitelo" definiše se u odnosu na transgeni ne-humani organizam koji takvo antitelo proizvodi. Ovaj pojam se odnosi na antitelo koje ima aminokiselinsku sekvencu ili nukleotidnu sekvencu kojaje kodira koja odgovara onoj koja se nalazi u organizmu koji se ne sastoji od transgene ne-humane životinje, a uopšteno iz vrste različite od transgene ne-humane životinje.

Kada se koristi u predmetnoj prijavi, "heterohibridno antitelo" se odnosi na antitelo koje ima laki i teški lanac poreklom iz različitih organizama Na primer, antitelo koje ima humani teški lanac povezan za mišji laki lanac je heterohibridno antitelo. Primeri heterohibridnih antitela obuhvataju himerna i humanizovana antitela, o kojima će biti reči.

Kada se koristi u predmetnoj prijavi, "preuključivanje izotipova" se odnosi na pojavu u kojoj se klasa, ili izotip, antitela menjaju iz jedne klase Ig u neku od drugih klasa Ig.

Kada se koristi u predmetnoj prijavi, "nepreuključeni izotip" se odnosi na izotipsku klasu teškog lanca koja se proizvodi kada ne dođe do preuključivanja izotipa; CH gen koji kodira nepreuklj učeni izotip je obično CH gen koji je prvi nishodno od funkcionalno preuređenog VDJ gena. Preuključivanje izotipova može da se podeli na klasično i neklasično preuključivanje izotpiova Klasično preuključivanje izotpiova se odvija rekombinacijom koja zahteva bar jednu sekvencu preuključivanja u transgenu. Neklasično preuključivanje izotpiova može da se odvija, na primer, homologom rekombinacijom između humanog teta-mi i humanog teta-mi (delecija vezana za delta). Alternativni mehanizmi neklasičnog preuključivanja izotipova, kao što su intertransgena i/ili interhromozomalna rekombinacija, među ostalima, mogu takođe da se odvijaju i ostvare preuključivanje izotpiova

Kada se koristi u predmetnoj prijavi, "sekvenca preuključivanja" se odnosi na one DNK sekvence koje su odgovorne za rekombinaciju preuključivanja Sekvenca "donora preuključivanja", obično mi region preuključivanja, biće ka 5' kraju (t.j., ushodno) od regiona konstrukta koji će biti deliran tokom rekombinacije preuključivanja. Region "akceptora preuključivanja" će biti između regiona konstrukta koji će biti deliran i konstantnog regiona koji će ga zameniti (npr., gama, epsilon itd.). Kako ne postoji jedno specifično mesto na kome uvek dolazi do rekombinacije, obično neće biti moguće predvideti konačnu sekvencu gena na osnovu konstrukta

Kada se koristi u predmetnoj prijavi, "raspored glikozilacije" se definiše kao raspored ugljenohidratnih jedinica koje se kovalentno vezuju za protein, preciznije za protein imunoglobulin. Raspored glikozilacije heterologog antitela može da bude opisan kao značajno sličan rasporedu glikozilacije koji se prirodno javlja na antitelima koja proizvodi vrsta ne-humane transgene životinje, gde će stručnjak sa uobičajenim znanjem u ovoj oblasti prepoznati da je raspored glikozilacije heterologog antitela sličniji rasporedu glikozilacije koja se sreće kod vrste ne-humane transgene životinje nego onom koji se sreće kod vrste iz koje su potekli CH geni transgena.

Izraz "koji se javlja u prirodi", kada se upotrebljava ovde da označi objekt, odnosi se na činjenicu da se taj objekt može naći u prirodi. Na primer, polipeptidna ili polinukleotidna sekvenca kojaje prisutna u nekom organizmu (uključujući viruse), koja može da bude izolovana iz prirodnog izvora a koja nije namerno modifikovana od strane čoveka u laboratoriji je sekvenca koja se javlja u prirodi.

Pojam "preuređen" se u predmetnoj prijavi odnosi na konfiguraciju imunoglobulinskog lokusa teškog lanca ili lakog lanca gde se V segment nalazi odmah pored D-J ili J segmenta u konformaciji koja kodira suštinski potpun VH ili VL domen, respektivno. Preuređen genski lokus imunoglobulima može da se identifikuje na osnovu poređenja sa matičnom DNK; preuređeni lokus će imati najmanje jedan rekombinovani element homologije heptamer/nonamer.

Kada se odnosi na V segment, pod pojmom "nepreuređen" ili "matična konfiguracija" ovde se podrazumeva konfiguracija u kojoj V segment nije ' rekombinovan tako da se nađe odmah pored D ili J segmenta

Pod pojmom "transfektom" ovde se obuhvataju rekombinantne eukariotske ćelije domaćini koje eksprimiraju antitelo, kao što su CHO ćelije ili NS/O ćelije.

Pojam "transgena ne-humana životinja" odnosi se na ne-humanu životinju čiji genom sadrži jedan ili veći broj humanih transgena ili transhromozoma teških i/ili lakih lanaca (bilo da su integrisani ili neintegrisani u prirodni DNK te životinje) a koje su sposobne da eksprimiraju potpuno humana antitela. Na primer, transgeni miš može da ima humani transgen lakog lanca i bilo humani transgen teškog lanca bilo humani transhromozom teškog lanca, tako da taj miš proizvodi humana anti-CD148 antitela kada je imunizovan na CD148 i/ili ćelije koje eksprimiraju CD148. Humani transgen teškog lanca može da bude integrisan u hromozomalnu DNK miša, što je slučaj kod transgenih, npr., HuMAb miševa, ili transgen humanog teškog lanca može da se održava izvan hromozoma, što je slučaj kod transhromozomalnih (npr., KM) miševa kao što je opisano u WO 02/43478. Ovakvi transgeni i transhromozomalni miševi su u stanju da proizvode višestruke izotipove humanih monoklonskih antitela na CD 148 (npr., IgG, IgA i/ili IgE) na taj način što podležu V-D-J rekombinaciji i preuključivanju izotipova.

Različiti aspekti predmetnog pronalaska detaljnije su opisani u odeljcima koji

slede.

Proizvodnja antitela na CD148

Predmetni pronalazak može da se predstavi primerima antitela ili njihovih antigen vezujućih regiona koji se vezuju za određene epitope CD148 za koje je utvrđeno da igraju ulogu u aktivaciji posredovanja u zapaljenju i/ili angiogenetske aktivnosti CD148. Takva antitela ili njihovi antigen vezujući regioni obuhvataju anti-CD148 antitela i njihove antigen vezujuće regione čije vezivanje za CD 148 može da bude kompetitivno inhibirano ovde opisanim antitelima ili njihovim antigen vezujućim regionima. Polinukleotidne sekvence koje kodiraju antitela ili njihove antigen vezujuće regione predmetnog pronalaska, kao i polipeptidne sekvence eksprimirane iz takvih polinukleotidnih sekvenci, opisane su u povezanim U.S. privremenim patentnim prijavama 60/564,885 i 60/585,686, čiji je sadržaj ovde inkorporiran po referenci u celosti.

Predmetni pronalazak obezbeđuje anti-CD148 antitela koja se vezuju za epitope koji su suštinski isti kao epitop humanog CD148 definisan jednom ili većim brojem polipeptidnih sekvenci izabranih iz grupe koja se sastoji od aminokiselinskih ostataka 447 do 725, 533 do 725, 715 do 973, 324 do 335, 200 do 536, 533 do 725 i 200 do 725 sekvence čiji je ID br.: 33. U drugom rešenju, predmetni pronalazak obezbeđuje anti-CD148 antitela i njihove antigen vezujuće regione koji se vezuju za epitop humanog CD148, ili suštinski isti epitop, definisan jednom ili većim brojem polipeptidnih sekvenci izabranih iz grupe koja se sastoji od aminokiselinskih ostataka 315 do 329, 318 do 332, 321 do 335, 324 do 338, 324 do 329, 324 do 332, 324 do 335, 447 do 725, 533 do 725, 715 do 973, 200 do 536, 533 do 725 i 200 do 725 sekvence čiji je ID br.: 33. U još jednom rešenju, predmetni pronalazak obezbeđuje izolovano antitelo ili njegov antigen vezujući region koji se specifično vezuje za epitop humanog CD 148, ili suštinski isti epitop, definisan jednom ili većim brojem polipeptidnih sekvenci izabranih iz grupe koja se sastoji od aminokiselinskih ostataka 315 do 329, 318 do 332, 321 do 335, 324 do 338, 324 do 329, 324 do 332, 324 do 335, 447 do 725, 533 do 725, 715 do 973, 200 do 536, 533 do 725 i 200 do 725 sekvence čiji je ID br.: 33. U još jednom rešenju, predmetni pronalazak obezbeđuje monoklonsko antitelo ili njegov antigen vezujući region koji se specifično vezuje za epitop humanog CD148, definisan jednom ili većim brojem polipeptidnih sekvenci izabranih iz grupe koja se sastoji od aminokiselinskih ostataka 315 do 329, 318 do 332, 321 do 335, 324 do 338, 324 do 329, 324 do 332, 324 do 335, 447 do 725, 533 do 725, 715 do 973, 200 do 536, 533 do 725 i 200 do 725 sekvence čiji je ID br.: 33. Ovakva antitela ili njihovi antigen vezujući regioni mogu da se dobiju bilo kojim od mnoštva procesa koji su opisani u daljem tekstu, na primer, imunizovanjem životinje sa najmanje prvim preparatom CD 148 i odabirom antitela iz imunizovane životinje koje značajno ukršteno reaguje sa monoklonskim antitelima predmetnog pronalaska.

Antitela sa takvim kombinacijama osobina mogu jednostavno da se identifikuju na osnovu jednog ili više ili kombinacije testova kompeticija za receptore, ELISA, koprecipitacije i/ili funkcionalnih testova kao i ovde opisanim testovima ukrštene reaktivnosti.

Antitela obuhvaćena predmetnim pronalaskom obuhvataju IgG, IgA, IgGl do 4, IgE, IgM i IgD antitela, npr, IgGlKili IgGll izotipove, ili IgG4Kili IgG4A. izotipove. U jednom rešenju, antitelo predmetnog pronalaska je IgG2 izotip. U jednom rešenju, humana antitela se dobijaju iz ne-humane transgene životinje, npr., transgenog miša, koji je u stanju da proizvede više izotipova humanih antitela na CD 148 (npr, IgG, IgA i/ili IgE) tako što podleže V-D-J rekombinaciji i preuključivanju izotipova Shodno tome, rešenja predmetnog pronalaska obuhvataju ne samo antitela, fragmente antitela i njihove farmaceutske preparate, već i ne-humane transgene životinje, B-ćelije, transfektome ćelija domaćina i hibridome koji proizvode monoklonska antitela. Postupci korišćenja antitela predmetnog pronalaska za otkrivanje ćelije koja eksprimira CD 148 ili srodnog, ukršteno reaktivnog receptora faktora rasta, ili za inhibiciju rasta, diferencijacije i/ili pokretljivosti ćelije koja eksprimira CD148, biloin vitroiliin vivo,takođe su obuhvaćeni predmetnim pronalaskom. Predmetni pronalazak dalje obuhvata farmaceutske preparate koji sadrže antitela predmetnog pronalaska i postupke lečenja fizioloških poremećaja primenom antitela predmetnog pronalaska.

Antitela i antigen vezujući regioni predmetnog pronalaska mogu da se dobiju većim brojem različitih postupaka, uključujući imunizaciju životinja (npr., antigenom koji izaziva proizvodnju antitela koja se specifično vezuju i kompetitivno inhibiraju vezivanje najmanje jednog od antitela At-1 do At-8), upotrebu hibridoma (npr., upotrebu B ćelija iz transgenih ili ne-transgenih životinja), rekombinantne postupke (npr., CHO transfektome; videti Morrison, S. (1985) Science 229: 1202)), iliin vitrosintetske puteve (npr., polipeptidna sinteza na čvrstoj fazi).

U nekim rešenjima, antitela i antigen vezujući regioni su humani ili humanizovani. Postupci za humanizovanje ne-humanih antitela dobro su poznati u struci. Humanizacija može suštinski da se izvrši prema postupku Winter-a i saradnika (Joneset al,Nature, 321: 522 (1986); Riechmannet al,Nature, 332: 323 (1988); Verhoevenet al,Science, 239: 1534 (1988)). Ukratko, humani geni za konstantne regioni se spajaju sa odgovarajućim humanim ili ne-humanim genima za varijabilne regione. Na primer, aminokiselinske sekvence koje predstavljaju antiegn vezujuća mesta (CDR, regione za određivanje komplementarnosti) roditeljskog mišjeg monoklonskog antitela presađene su, na nivou DNK, na humane sekvence okvira varijabilnog regiona. Sekvence humanih gena konstantnih regiona mogu da se nađu uKabat etal.(1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, N.I.H. publikacija br. 91-3242. Humani geni regiona C lako se dobijaju iz poznatih klonova. Izbor izotipa antitela zavisiće od željenih efektorskih funkcija, kao što je fiksacija komplementa, ili aktivnost u ćelijskoj citotoksičnosti zavisnoj od antitela. U nekim rešenjima, koristi se IgG2izotip.

Humana ili humanizovana antitela ili antigen vezujući regioni takođe mogu da se dobiju kroz tehnologije tipa izlaganja, obuhvatajući, ali se ne ograničavajući na, fagni sistem izlaganja, retrovirusni sistem izlaganja, ribozomalni sistem izlaganja i druge tehnike, korišćenjem tehnika koje su u struci dobro poznate, a dobijeni molekuli mogu da se podvrgnu dodatnom sazrevanju, kao što je afinitetno sazrevanje, obzirom da su takve tehnike dobro poznate u struci. Hanes & Plucthau PNAS USA 94: 4937-4942

(1997) (ribozomalni sistem izlaganja), Parmley & Smith Gene 73: 305-318 (1988)

(fagni sistem izlaganja), Scott TIBS 17: 241-245 (1992), Cvvirlaet al.PNAS USA 87: 6378-6382 (1990), Russelet al.Nucl. Acids Research 21: 1081-1085 (1993), Hoganboomet al.Immunol. Revievvs 130: 43-68 (1992), Chisvvell & McCafferty TIBTECH 10: 80-84 (1992) i U.S. patent br. 5,733,743.

Identifikacija pogodnih humanih antitela može da bude olakšana računarskim modeliranjem. Modeliranje je dobro poznato u struci, a koristi se, na primer, da se izbegne dovođenje ne-humanih CDR u neprirodan susedni položaj sa humanim regionima okvira varijabilnog regiona, što bi dovelo do neprirodnih konformacionih napona i pratećeg gubitka afiniteta vezivanja. Računarski uređaji i programi za proizvodnju trodimenzionalnih slika imunoglobulinskih molekula široko su rasprostranjeni. Uopšteno govoreći, u dobijanju molekulskih modela počinje se od rešenih strukutra za lance imunoglobulina ili njihove domene. Aminokiselinska sekvenca lanaca koje treba modelirati se poredi sa sekvencama lanaca ili domena rešene trodimenzionalne strukture, te se biraju lanci ili domeni koji pokazuju najveću sličnost sekvence kao polazne tačke konstrukcije molekulskog modela. Rešene polazne strukture se modifikuju da bi se ostavilo prostora za razlike između stvarnih aminokiselina u imunoglobulinskim lancima ili domenima koji se modeliraju i onih koji se nalaze u polaznim strukturama. Modifikovane strukture se potom spajaju u složeni imunoglobulin. Konačno, model se fino podešava smanjivanjem energije na najmanji mogući nivo i proveravanjem da li se svi atomi nalaze na odgovarajućim rastojanjima jedni od drugih i da li su sve dužine i uglovi veza u okviru hemijski prihvatljivih granica.

Sada je moguće dobiti transgene životinje (npr., miševe) koji su u stanju, nakon imunizacije, da proizvedu potpun repertoar humanih antitela u odsustvu proizvodnje endogenih imunoglobulina. Na primer, homozigotna delecija gena vezujućeg regiona teškog lanca antitela (JH) u himernim i miševima mutiranim za matičnu liniju dovodi do potpune inhibicije endogene proizvodnje antitela Transfer niza gena humane matične linije imunoglobulina u takve miševe mutantne za matičnu liniju dovodi do proizvodnje humanih antitela nakon uvođenja antigena. Videti, npr., Jakobovitset al,Proc. Natl. Acad. Sci USA, 90: 2551 (1993); Jakobovitset al,Nature, 362: 255 (1993); Bruggermannet al,Year in Immunol., 20 7: 33 (1993). Opisani su komercijalno dostupni sojevi transgenih miševa kao što su XenoMouse; videti, Greenet alNature Genetics7: 13-21 (1994).

Rekombinantni postupci za dobijanje antitela ili antigen vezujućih regiona predmetnog pronalaska počinju izolovanjem željenih regiona nukleinske kiseline teških i lakih lanaca imunoglobulina, kao što su one prisutne u bilo kom od At-1 do At-8. Ovakvi regioni obuhvataju, na primer, cele ili delove varijabilnih regiona teških i lakih lanaca. Takvi regioni mogu, konkretno, da obuhvataju najmanje jedan od CDR teških i/ili lakih lanaca, a često najmanje jedan CDR par od At-1 do At-8. Nukleinska kiselina koja kodira antitelo ili antigen vezujući region predmetnog pronalaska može da bude neposredno sintetisana postupcimain vitrosinteze oligonukleotida koji su poznati u struci. Alternativno, mogu da budu sintetisani manji fragmenti koji će potom biti spojeni u veći fragment pomoću rekombinatnih postupaka koji su poznati u struci. Vezujući regioni antitela, kao što su Fab ili F(ab')2mogu da se dobiju hidrolizom potpunog proteina, npr., dejstvom proteaze ili hemijskim razlaganjem. Alternativno, moguće je pripremiti skraćeni gen.

Kako bi se eksprimirala antitela ili njihovi antigen vezujući regioni, DNK koja kodira deo ili cele lake ili teške lance može da se dobije standardnim tehnikama molekularne biologije (npr., amplifikacijom pomoću PCR, mutagenezom upravljenom ka određenom mestu), a potom da se ugradi u ekspresione vektore na taj način da geni budu operativno povezani sa regulatornim sekvencama transkripcije i translacije. Nukleinske kiseline koje kodiraju antitelo ili antigen vezujući region predmetnog pronalaska mogu da se kloniraju u odgovarajući ekspresioni vektor i eksprimiraju u odgovarajućem domaćinu. Odgovarajući sistem vektora i ćelije domaćina može da obezbedi, na primer, koekspresiju i spajanje varijabilnih teških i varijabilnih lakih lanaca najmanje jednog od At-1 do At-8, ili njihovih peptida koji sadrže CDR. Stručnjaci u ovoj oblasti mogu da odrede pogodne sisteme ekspresije.

Nukleinske kiseline koje sadrže polinukleotide predmetnog pronalaska mogu da se koriste u transfekciji pogodnih sisarskih ili ne-sisarskih ćelija domaćina. U nekim rešenjima, za ekspresiju lakih i teških lanaca, ekspresioni vektor(i) koji kodirafju) teški i laki lanac se transficira(ju) u ćeliju domaćina standardnim tehnikama. Različiti oblici pojma "transfekcija" obuhvataju širok spektar tehnika koje se uobičajeno koriste za uvođenje egzogene DNK u prokariotsku ili eukariotsku ćeliju domaćina, kao što su, npr., elektroporacija, taloženje kalcijum fosfatom, transfekcija DEAE-dekstranom i slične. Iako je teorijski moguće eksprimirati anitela predmetnog pronalaska i u prokariotskim i u eukariotskim ćelijama domaćinima, obično se koristi ekspresija antitela u eukariotskim ćelijama, a posebno je poželjno da to budu sisarske ćelije domaćini, zbog toga što je verovatnije da će takve eukariotske ćelije, a posebno sisarske ćelije biti u stanju da sastave i izluče pravilno savijena i imunonološki aktivna antitela ili antigen vezujuće regione.

Ekspresioni vektori obuhvataju plazmide, retroviruse, kozmide, YAC, epizome dobijene iz EBV, i slične. Pogodan je onaj vektor koji kodira funkcionalno potpunu sekvencu humanog CH (konstantnog teškog) ili CL (konstantnog lakog) imunoglobulina, sa odgovarajućim restrikcionim mestima koja su tako uvedena da bilo koja VH ili VL sekvenca može lako da se ugradi i eksprimira. U takvim vektorima, isecanje se obično dešava između mesta donora isecanja u ugrađenom J regionu i mesta akceptora isecanja koje se nalazi pre humanog C regiona, kao i u regionima isecanja koja se nalaze u okviru egzona humanih CH. Poliadenilacija i terminacija transkripcije odigravaju se na nativnim mestima na hromozomu, nishodno od kodirajućih regiona

Ekspresioni vektor i ekspresione kontrolne sekvence se biraju tako da budu kompatibilne sa ćelijom koja se koristi kao domaćin ekspresije. Nukleinske kiseline varijabilnog regiona teškog lanca antitela i nukleinske kiseline varijabilnog regiona lakog lanca antitela predmetnog pronalaska mogu da se ugrade u odvojene vektore, ili se, često, oba gena ugrađuju u isti ekspresioni vektor. Nukleinske kiseline mogu da budu ugrađene u ekspresioni vektor standardnim postupcima (npr., ligacijom komplementarnih restrikcionih mesta na fragmentu nukleinske kiseline koja kodira antitelo, ili ligacijom tupih krajeva ako nisu prisutna restrikciona mesta). Varijabilni regioni teškog i lakog lanca At-1 do At-8, koji su ovde opisani, mogu da se koriste za dobijanje gena za antitela pune dužine bilo kog izotipa antitela, ugrađivanjem u ekspresione vektore koji već sadrže konstantne regione teških lanaca i konstantne regione lakih lanaca željenog izotipa (i podklase) tako da je VH segment operativno povezan sa CH segmentom(ima) u okviru vektora a da je VL segment operativno povezan sa CL segmentom u okviru vektora. Uz to ili alternativno, ekspresioni vektor može da kodira signalni peptid koji olakšava lučenje lanca antitela ili antigen vezujućeg regiona iz ćelije domaćina. Lanac antitela ili antigen vezujućeg regiona može da bude kloniran u vektor tako daje signalni peptid vezan u okvir sa amino terminalnim krajem gena lanca antitela/antigen vezujućeg regiona. Signalni peptid može da bude imunoglobulinski signalni peptid ili heterologi signalni peptid (t.j. signalni peptid proteina koji nije imunoglobulin).

Uz sekvencu koja sadrži CDR, ekspresioni vektori predmetnog pronalaska nose regulatome sekvence koje kontrolišu ekspresiju sekvence u ćeliji domaćinu. Pod pojmom "regulatorna sekvenca" podrazumevaju se promoteri, pojačivači i drugi elementi kontrole ekspresije (npr., signali za poliadenilaciju) koji kontrolišu transkripciju ili translaciju gena lanaca antitela. Takve regulatome sekvence su opisane, na primer, u Goeddel; Gene Expression Technologv. Methods in Enzvmologv 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990). Stručnjaci u ovoj oblasti će imati u vidu da konstrukcija ekspresionog vektora, uključujući odabir regulatornih sekvenci, može da zavisi od faktora kao što su odabir ćelije domaćina koja će biti transformisana, željenog nivoa ekspresije proteina i sličnih. Poželjne regulatome sekvence za ekspresiju u sisarskim ćelijama domaćinima obuhvataju viralne elemente koji dovode do visokog stepena ekspresije proteina u sisarskim ćelijama, kao što su promoteri i/ili pojačivači dobijeni iz citomegalovirusa (CMV), simian virusa 40 (SV40), adenovirusa (npr., glavni kasni promoter adenovirusa - AdMLP ("Adenovirus Major Late Promoter")) i polioma. Alternativno, mogu da se koriste regulatome sekvence koje nisu virusne, kao što je ubikvitinski promoter ili promoter beta-globina.

Uz nukleinske kiseline antitela ili antigen vezujućeg regiona i regulatornih sekvenci, ekspresioni vektori predmentog pronalaska mogu da nose dodatne sekvence, kao što su sekvence koje regulišu replikaciju vektora u ćeliji domaćinu (npr., tačku početka replikacije (origin)) i gene markera koji omogućavaju selekciju. Geni markera koji omogućavaju selekciju olakšavaju selekciju ćelija domaćina u koje je uveden vektor (videti, npr., U.S. patente br. 4,399,216, 4,634,665 i 5,179,017, sve od Axelet al.).Na primer, uobičajeno je da marker za selekciju daje otpornost na lekove, kao što je G418, higromicin ili metotreksat, ćeliji domaćinu u koju je vektor uveden. Poželjni markeri za selekciju obuhvataju gen za dihidrofolat reduktazu (DHFR) (za upotrebu u dhfr- ćelijama domaćinima sa selekcijom/amplifikacijom metotreksatom) i neo gen (za selekciju pomoću G418).

Poželjne sisarske ćelije domaćini za ekspresiju rekombinantnih antitela ili antigen vezujućih regiona predmetnog pronalaska obuhvataju ćelije jajnika kineskog hrčka (CHO ("Chinease hamster ovary")) (uključujući dhfr- CHO ćelije, opisane u Urlaub & Chasin, (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216-4220, korišćene zajedno sa DHFR markerom za selekciju npr., kao što je opisano u R J. Kaufman & P. A. Sharp

(1982) Mol. Biol. 159: 601-621), ćelije mijeloma NS/0, COS ćelije i SP2.0 ćelije. Za upotrebu ćelija mijeloma NS/0 posebno, još jedan poželjan ekspresioni sistem je ekspresioni sistem GS gena opisan u WO 87/04462, WO 89/01036 i EP 338 841. Kada se ekspresioni vektori predmetnog pronalaska uvode u sisarske ćelije domaćine, antitela ili antigen vezujući regioni se dobijaju gajenjem ćelija domaćina u kulturi tokom vremena koje je dovoljno da se omogući ekspresija antitela ili antigen vezujućeg regiona u ćeliji domaćinu, ili, poželjnije, lučenje antitela ili antigen vezujućeg regiona u podlogu u kojoj se gaji kultura ćelija domaćina.

Jednom eksprimirani, antitela ili antigen vezujući regioni predmetnog pronalaska mogu da se prečiste prema standardnim postupcima poznatim struci, uključujući prečišćavanje pomoću HPLC, frakcionom hromatografijom u koloni, gel elektroforezom i sličnim (videti, npr., Scopes, Protein Purification, Springer-Verlag, NY, 1982). U nekim rešenjima, polipeptidi se prečišćavaju pomoću hromatografskih i/ili elektroforetskih tehnika. Primeri postupaka prečišćavanja obuhvataju, ali nisu ograničeni na taloženje amonijum sulfatom; taloženje pomoću PEG; imunoprecipitaciju; denaturaciju toplotom praćenu centrifugiranjem; hromatografiju, uključujući, ali se ne ograničavajući na afinitetnu hromatografiju (npr., Protein-A-Sepharose), jonoizmenjivačku hromatografiju, ekskluzionu hromatografiju i reverzno faznu hromatografiju; gel filtraciju; hromatografiju na hidroksilapatitu; izoelektrično fokusiranje; elektroforezu na poliakrilamidnom gelu; kao i kombinacije ovakvih i drugih tehnika. U nekim rešenjima, polipeptid se prečišćava brzom tečnom hromatografijom proteina ili tečnom hromatografijom pod visokim pritiskom (HPLC).

Pobijanje hibridoma koji proizvode humana monoklonska antitela na CP148

Još jedno rešenje predmetnog pronalaska obuhvata ćeliju hibridoma koja proizvodi antitelo ili njegov antigen vezujući region predmetnog pronalaska Ćelija hibridoma može da sadrži B ćeliju dobijenu iz transgene ne-humane životinje, čiji se genom sastoji od humanog transgena teškog lanca i transgena lakog lanca, fuzionišanu za besmrtnu ćeliju, gde taj hibridom proizvodi merljive količine monoklonskog antitela ili njegovog antigen vezujućeg regiona predmetnog pronalaska.

Mišji splenociti mogu da se izoluju i fuzionišu sa PEG za ćelijsku liniju mišjeg mijeloma na osnovu standardnih protokola. Dobijeni hibridomi se potom ispituju na proizvodnju antitela specifičnih za antigen. Na primer, suspenzija pojedinačnih ćelija limfocita iz slezine imunizovanih miševa fuzionišu se sa jednom šestinom datog broja P3X63-Ag8.653 nesekretujućih ćelija mišjeg mijeloma (ATCC, CRL 1580) sa 50% PEG. Ćelije se zasejavaju u broju od oko 2 x 10<5>u mikrotitar pločice sa ravnim dnom, nakon čega se inkubiraju dve nedelje u selektivnoj podlozi koja sadrži 20% fetalni Klon Serum, 18% kondicionirane podloge "653", 5% origen (IGEN), 4 mM L-glutamin, 1 mM L-glutamin, 1 mM natrijum piruvat, 5 mM HEPES, 0,055 mM 2-merkaptoetanol, 50 jedinica/ml penicilina, 50 mg/ml streptomicina, 50 mg/ml gentamicina i 1 x HAT (Sigrna; HAT se dodaje 24 časa nakon fuzije). Nakon dve nedelje, ćelije se gaje u kulturi u podlozi u kojoj je HAT zamenjen HT-om. Pojedinačna polja se ispituju pomoću ELISA testa na humana monoklonska anti-CD148 IgG i IgM antitela Kada dođe do značajnog rasta hibridoma, podloga se posmatra obično nakon 10 do 14 dana. Hibridomi koji luče antitela se ponovo zasejavaju na ploče, te, ako i dalje daju pozitivan rezultat testa na humana monoklonska IgG anti-CD148 antitela, mogu da se podkloniraju najmanje dva puta pomoću ograničavajućeg razblaženja. Stabilni podklonovi se potom gaje u kulturiin vitroda bi se dobile male količine antitela u podlozi za karakterizaciju.

Pobijanje transfektoma koji proizvode humana monoklonska antitela na CD148

Humana antitela predmetnog pronalaska mogu da se dobiju u transfektomu ćelije domaćina korišćenjem, na primer, kombinacije tehnike rekombinantne PNK i postupaka transfekcije gena kao što je u struci dobro poznato (Morrison, S. (1985) Science 229: 1202). Ćelija transfektoma može da sadrži nukleinske kiseline koje kodiraju humani teški lanac i humani laki lanac, gde ćelije trasfektoma proizvode merljivu količinu monoklonskog antitela ili njegovog antigen vezujućeg regiona predmetnog pronalaska

Na primer, da bi se eksprimirala antitela, ili njihovi antigen vezujući fragmenti, DNK koje kodiraju delove ili cele lake i teške lance mogu da se dobiju standardnim tehnikama molekularne biologije (npr., amplifikacija pomoću PCR, mutageneza upravljena prema određenom mestu) te mogu da se ugrade u ekspresione vektore na takav način da geni budu operativno vezani za kontrolne sekvence transkripcije i translacije. U ovom kontekstu, pod pojmom "operativno vezan" podrazumeva se daje gen antitela povezan u vektor na taj način da kontrolne sekvence transkripcije i translacije u okviru tog vektora vrše svoju predviđenu funkciju regulisanja transkripcije i translacije gena za antitelo. Ekspresioni vektor i kontrolne sekvence ekspresionog vektora biraju se tako da budu kompatibilne sa upotrebljenom ćelijom domaćinom ekspresije. Gen za laki lanac antitela i gen za teški lanac antitela mogu da se ugrade u odvojene vektore, ili se, što je uobičajenije, oba gena ugrađuju u isti ekspresioni vektor. Geni antitela se ugrađuju u ekspresioni vektor standardnim postupcima (npr., ligacijom komplementarnih restrikcionih mesta na fragmentu gena za antitelo, ili ligacijom tupih krajeva ako nisu prisutna restrikciona mesta). Varijabilni regioni teškog i lakog lanca ovde opisanih antitela mogu da se koriste za dobijanje gena za antitela pune dužine bilo kog izotipa antitela, ugrađivanjem u ekspresione vektore koji već sadrže konstantne regione teških lanaca i konstantne regione lakih lanaca željenog izotipa tako daje VH segment operativno povezan sa CH segmentom(ima) u okviru vektora a da je VL segment operativno povezan sa CL segmentom u okviru vektora. Uz to ili alternativno, ekspresioni vektor može da kodira signalni peptid koji olakšava lučenje lanca antitela ili antigen vezujućeg regiona iz ćelije domaćina. Lanac antitela može da bude kloniran u vektor tako daje signalni peptid vezan u okvir sa amino terminalnim krajem gena lanca antitela. Signalni peptid može da bude imunoglobulinski signalni peptid ili heterologi signalni peptid (t.j. signalni peptid proteina koji nije imunoglobulin).

Uz gene lanaca antitela, rekombinantni ekspresioni vektori predmetnog pronalaska nose i regulatome sekcence koje kontrolišu ekspresiju gena lanaca antitela u ćeliji domaćinu. Pod pojmom "regulatorna sekvenca" podrazumevaju se promoteri, pojačivači i drugi elementi kontrole ekspresije (npr., signali za poliadenilaciju) koji kontrolišu transkripciju ili translaciju gena lanaca antitela. Takve regulatome sekvence su opisane, na primer, u Goeddel; Gene Expression Technologv. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990). Stručnjaci u ovoj oblasti će imati u vidu da konstrukcija ekspresionog vektora, uključujući odabir regulatornih sekvenci, može da zavisi od faktora kao što su odabir ćelije domaćina koja će biti transformisana, željenog nivoa ekspresije proteina, itd. Poželjne regulatome sekvence za ekspresiju u sisarskim ćelijama domaćinima obuhvataju viralne elemente koji dovode do visokog stepena ekspresije proteina u sisarskim ćelijama, kao što su promoteri i/ili pojačivači dobijeni iz citomegalovirusa (CMV), simian virusa 40 (SV40), adenovirusa (npr., glavni kasni promoter adenovirusa - AdMLP) i polioma. Alternativno, mogu da se koriste regulatome sekvence koje nisu virusne, kao što je ubikvitinski promoter ili promoter beta-globina.

Uz gene antitela i regulatome sekvence, rekombinantni ekspresioni vektori predmentog pronalaska mogu da nose dodante sekvence, kao što su sekvence koje regulišu replikaciju vektora u ćeliji domaćinu (npr., tačku početka replikacije (origin)) i gene markera koji omogućavaju selekciju. Geni markera koji omogućavaju selekciju olakšavaju selekciju ćelija domaćina u koje je uveden vektor (videti, npr., U.S. patente br. 4,399,216, 4,634,665 i 5,179,017, sve od Axelet al).Na primer, uobičajeno je da marker za selekciju daje otpornost na lekove, kao što je G418, higromicin ili metotreksat, ćeliji domaćinu u koju je vektor uveden. Poželjni markeri za selekciju obuhvataju gen za dihidrofolat reduktazu (DHFR) (za upotrebu u dhfr- ćelijama domaćinima sa selekcijom/amplifikacijom metotreksatom) i neo gen (za selekciju pomoću G418). U poželjnom rešenju predmetnog pronalaska, geni lanaca antitela i regulatome sekvence eksprimirani su u "split dhfr" vektorima PDC323 i PDC324, koji su opisani u Bianchi, A. A. & McGrew, J.T. (2003) "High-level expression of full antibodies using trans-complementing expression vectors," Bioengineering and Biotechnology, 84 (4): 439-444; i McGrevv, J.T. & Bianchi, A.A. (2002) "Selection of cells expressing heteromeric proteins," U.S. patentna prijava br. 20030082735. čiji su sadržaji ovde eksplicitno inkorporirani po referenci.

Za ekspresiju lakih i teških lanaca, ekspresioni vektor(i) koji kodira(ju) teške i lake lance transficira(ju) se u ćeliju domaćina pomoću standardnih tehnika Različiti oblici pojma "transfekcija" obuhvataju širok spektar tehnika koje se uobičajeno koriste za uvođenje egzogene DNK u prokariotsku ili eukariotsku ćeliju domaćina, kao što su, npr., elektroporacija, taloženje kalcijum fosfatom, transfekcija DEAE-dekstranom i slične. Iako je teorijski moguće eksprimirati anitela predmetnog pronalaska i u prokariotskim i u eukariotskim ćelijama domaćinima, obično se koristi ekspresija antitela u eukariotskim ćelijama, a posebno je poželjno da to budu sisarske ćelije domaćini, zbog toga što je verovatnije da će takve eukariotske ćelije, a posebno sisarske ćelije biti u stanju da sastave i izluče pravilno savijena i imunonološki aktivna antitela ili antigen vezujuće regione.

Poželjne sisarske ćelije domaćini za ekspresiju rekombinantnih antitela ili antigen vezujućih regiona predmetnog pronalaska obuhvataju ćelije jajnika kineskog hrčka (CHO ("Chinease hamster ovarv")) (uključujući dhfr- CHO ćelije, opisane u Urlaub & Chasin, (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216-4220, korišćene zajedno sa DHFR markerom za selekciju npr., kao što je opisano u R J. Kaufman & P. A. Sharp

(1982) Mol. Biol. 159: 601-621), ćelije mijeloma NS/0, COS ćelije i SP2.0 ćelije. Za upotrebu ćelija mijeloma NS/0 posebno, još jedan poželjan ekspresioni sistem je ekspresioni sistem GS gena opisan u WO 87/04462, WO 89/01036 i EP 338 841. Kada se rekombinantni ekspresioni vektori koji kodiraju gene antitela uvode u sisarske ćelije domaćine, antitela se dobijaju gajenjem ćelija domaćina u kulturi tokom vremena koje je dovoljno da se omogući ekspresija antitela u ćeliji domaćinu, ili, poželjnije, lučenje antitela u podlogu u kojoj se gaji kultura ćelija domaćina. Antitela mogu da se izoluju iz podloge korišćenjem standardnih postupaka prečišćavanja proteina.

Upotreba delova sekvenci antitela za ekspresiju potpunih antitela

Antitela interaguju sa ciljnim molekulima uglavnom preko aminokiselinskih ostataka koji se nalaze u šest regiona za određivanje komplementarnosti (CDR) teških i lakih lanaca Stoga su aminokiselinske sekvence u okviru CDR mnogo različitije između pojedinačnih antitela nego sekvence izvan CDR. Zbog toga što su sekvence CDR odgovorne za najveći broj interakcija antigen-antitelo, moguće je eksprimirati rekombinantna antitela koja imitiraju osobine specifičnih antitela koja se javljaju u prirodi konstrukcijom ekspresionih vektora koji obuhvataju sekvence CDR iz specifičnih antitela koja se javljaju u prirodi presađene na sekvence regiona okvira iz različitog antitela sa različitim osobinama (videti, npr., Riechmann, L.et al,1998, Nature 332: 323-327; Jones, P.et al,1986, Nature 321: 522-525; i Queen, C.et al,1989, Proc. Natl. Acad. See. U.S.A. 86: 10029-10033). Ovakve sekvence regiona okvira mogu da se dobiju iz javnih DNK baza podataka koje obuhvataju sekvence matičnih linija antitela Ove sekvence matičnih linija razlikovaće se od sekvenci zrelih antitela usled toga što neće sadržati potpuno sastavljene varijabilne gene, koji nastaju u toku spajanja V(D)J tokom sazrevanja B ćelija. Sekvence matičnih linija će se razlikovati od sekvenci visoko afinitetnog sekundarnog repertoara antitela na pojedinačnom nivou, ravnomerno preko varijabilnog regiona Na primer, somatske mutacije su relativno retke u arnino-terminalnom kraju regiona okvira 1 i u karboksi-terminalnom kraju regiona okvira 4. Štaviše. mnoge somatske mutacije ne menjaju značajno osobine vezivanja antitela. Zbog toga nije neophodno da se dobije potpuna sekvenca DNK konkretnog antitela kako bi se dobilo rekombinantno antitelo pune dužine sa osobinama vezivanja sličnim osobinama originalnog antitela (videti PCT/US99/05535, podnet 12. marta 1999, koji je ovde inkorporiran po referenci za koje god svrhe da se koristi). Delovi sekvenci teških i lakih lanaca koji obuhvataju CDR regione obično su dovoljni za ove potrebe. Deo sekvence se koristi da se odredi koji su segmenti gena varijabilnog i povezujućeg regiona matične linije doprineli rekombinovanim genima varijabilnog regiona antitela Sekvenca matične linije se potom koristi kako bi se popunili delovi varijabilnih regiona koji nedostaju. Vodeće sekvence teškog i lakog lanca odvajaju se tokom sazrevanja proteina i nemaju uticaj na osobine konačnog antitela. Stoga je neophodno koristiti odgovarajuće vodeće sekvence matične linije za ekspresione konstrukte. Kako bi se dodaie sekvence koje nedostaju, klonirane sekvence cDNK mogu da se kombinuju sa sintetičkim oligonukleotidima ligacijom ili amplifikacijom pomoću PCR. Alternativno, ceo varijabilni region može da se sintetiše kao skup kratkih, preklapajućih oligonukleotida, koji se potom kombinuju pomoću PCR amplifikacije kako bi se dobio potpuno sintetički klon varijabilnog regiona. Ovaj proces ima određene prednosti, kao što su eliminacija ili ugradnja određenih restrikcionih mesta, ili optimizacija nekih kodona

Nukleotidne sekvence transkripta teškog i lakog lanca hibridoma koriste se za dobijanje skupa preklapajućih sintetičkih oligonukleotida kako bi se dobile sintetičke V sekvence sa identičnim sposobnostima kodiranja aminokiselina kao prirodne sekvence. Sintetičke sekvence teškog i kapa lanca mogu da se razlikuju od sekvenci koje se javljaju u prirodi na tri načina: nizovi ponovljenih nukleotidnih baza se prekidaju kako bi se olakšala sinteza oligonukleotida i amplifikacija pomoću PCR; optimalna mesta inicijacije ugrađuju se prema Kozakovim pravilima (Kozak, 1991, J. Biol. Chem. 266: 19867-19870); aHindlll mesta se ugrađuju ushodno od mesta inicijacije translacije.

I za varijabilni region teškog lanca kao i za varijabilni region lakog lanca, optimizovane kodirajuće, i odgovarajuće nekodirajuće sekvence razbijaju se u delove od po 30 do 50 nukleotida, približno na sredini odgovarajućeg nekodirajućeg oligonukleotida Stoga, za svaki lanac, oligonukleotidi mogu da se spoje u preklapajuće dvolančane skupove koji obuhvataju segmente od 150 do 400 nukleotida. Skupovi se tada koriste kao modeli za dobijanje proizvoda PCR amplifikacije koji obuhvataju 150 do 400 nukleotida. Uobičajeno je da pojedinačni skup oligonukleotida varijabilnog regiona bude razbijen u dva skupa koji se odvojeno amplifikuju kako bi se dobila dva preklapajuća proizvoda PCV. Ovi preklapajući proizvodi se potom kombinuju PCT amplifikacijom kako bi se dobio potpun varijabilni region. Može, takođe, da bude poželjno da se PCR amplifikacijom obuhvati i preklapajući fragment konstatnog regiona teškog ili lakog lanca (uključujući Bbsl mesto kapa lakog lanca, ili Agel mesto u gama teškom lancu) kako bi se dobili fragmenti koji lako mogu da se kloniraju u konstrukte ekspresionog vektora.

Rekonstruisani varijabilni regioni teškog i lakog lanca se potom kombinuju sa sekvencama kloniranog promotera, inicijacije translacije, konstantnog regiona, 3' netransliranim, poliadenilacije i terminacije transkripcije, kako bi se dobili konstrukti ekspresionog vektora Ekspresioni konstrukti teškog i lakog lanca mogu da se spoje u jedan vektor, da se kotransficiraju, serijski transficiraju ili transficiraju odvojeno u ćelije domaćine, koje potom mogu da se fuzionišu kako bi se dobila ćelija domaćin koja eksprimira oba lanca.

Plazmidi koji se koriste u dobijanju ekspresionih vektora za humani IgGic su opisani u daljem izlaganju. Plazmidi su konstruisani tako daje bilo moguće upotrebiti sekvence cDNK V teškog i V kapa lakog lanca amplifikovane pomoću PCR, kako bi se rekonstruisali minigeni potpunih teških i lakih lanaca. Ovi plazmidi mogu da se koriste za ekspresiju potpuno humanih, ili himernih IgGlKili IgG4Kantitela. Slični plazmidi mogu da se konstruišu za ekspresiju drugih tipova teških lanaca, ili za ekspresiju antitiela koja sadrže lambda lake lance.

Stoga, u još jednom rešenju predmetnog pronalaska, strukturne odlike humanog anti-CD148 antitela predmetnog pronalaska se koriste da bi se dobila strukturno srodna humana anti-CD148 antitela koja zadržavaju najmanje jednu funkcionalnu osobinu antitela predmetnog pronalaska, kao što je vezivanje za CD148. Preciznije, jedan ili više regiona CDR anti-CD148 antitela može rekombinantno da se kombinuje sa poznatim humanim regionima okvira i CDR regionima kako bi se dobila dodatna humana anti-CD148 antitela predmetnog pronalaska konstruisana pomoću rekombinantnih tehnika.

Shodno tome, anti-CD148 antitela predmetnog pronalaska mogu da se koriste za dobijanje anti-CD148 antitela pripremanjem anti-CD148 antitela koje sadrži (1) regione okvira humanog teškog lanca i CDR regione humanog teškog lanca i (2) regione okvira humanog lakog lanca i CDR regione humanog lakog lanca, gde to antitelo zadžava sposobnost vezivanja CD148.

Sposobnost antitela da veže CD148 može da se odredi korišćenjem standardnih testova vezivanja (npr., ELISA testova). Kako je dobro poznato u struci da CDR3 domeni lakog i teškog lanca antitela igraju posebno važnu ulogu u specifičnosti/afinitetu vezivanja antitela za antigen, poželjno je da rekombinantna antitela predmetnog pronalaska pripremljena kako je prethodno opisano sadrže CDR3 domene lakog i teškog lanca anti-CD148 antitela. Antitela dalje mogu da sadrže CDR2 anti-CD148 antitela. Antitela dalje mogu da sadrže CDR1 anti-CD148 antitela. Shodno tome, predmetni pronalazak dalje obezbeđuje anti-CD148 antitela koja sadrže: (1) regione okvira humanog teškog lanca, CDR1 region humanog teškog lanca, CDR2 region humanog teškog lanca, CDR3 region humanog teškog lanca, gde je CDR3 region humanog teškog lanca CDR3 region anti-CD148 antitela; i (2) regione okvira humanog lakog lanca, CDR1 region humanog lakog lanca, CDR2 region humanog lakog lanca, CDR3 region humanog lakog lanca, gde je CDR3 region humanog lakog lanca CDR3 region anti-CD148 antitela, gde se to antitelo vezuje za CD148. Antitelo može dalje da sadrži CDR2 teškog lanca i/ili CDR2 lakog lanca anti-CD148 antitela. Antitelo može dalje da sadrži CDR1 teškog lanca i/ili CDR1 lakog lanca anti-CD148 antitela.

Poželjno je da CDR1, 2 i/ili 3 konstruisanih antitela koja su prethodno opisana sadrže tačne aminokiselinske sekvence kao anti-CD148 antitela koja su ovde opisana. Međutim, stručnjaci sa uobičajenim znanjem u ovoj oblasti će imati u vidu daje možda moguće malo odstupanje od tih konkretnih CDR sekvenci bez gubitka sposobnosti tog antitela da se efikasno veže za CD 148 (npr., konzervativne supstitucije). Shodno tome, u jednom rešenju, konstruisano antitelo može da se sastoji od jednog ili više CDR koji su, na primer, 90%, 95%, 98% ili 99,5% identični jednom ili većem broju anti-CD148 antitela.

Opisivanje vezivanja humanih monoklonskih antitela na CD 148

Kako bi se opisalo vezivanje humanih monoklonskih anti-CD148 antitela predmetnog pronalaska, može da se ispita serum imunizovanih miševa, na primer, pomoću ELISA testa. Ukratko, mikrotitar ploče se presvuku prečišćenim CD 148 pri koncentraciji od 0,25 u.g/ml u PBS, a potom blokiraju 5% rastvorom goveđeg serum albumina (BSA) u PBS. Razblaženja plazme miševa imunizovanih na CD148 se dodaju u svako polje, te se ploče inkubiraju 1 do 2 časa na 37° C. Ploče se ispiraju PBS/Tween rastvorom a potom inkubiraju sa poliklonskim reagensom kozjeg anti-humanog IgG specifičnog za Fc konjugovanog sa alkalnom fosfatazom 1 čas na 37° C. Nakon ispiranja, rezultati se razvijaju dodavanjem pNPP supstrata (1 mg/ml) i analiziraju na OD od 405 do 650. Poželjno je da se za fuzije koriste miševi čiji serumi pokažu najviši titar.

ELISA test koji je prethodno opisan može da se koristi za brzo ispitivanje hibridoma koji pokazuju pozitivnu reaktivnost na CD 148 antigen. Hibridomi koji se sa visokim afinitetom vezuju za CD148 biće podklonirani i opisani dalje. Po jedan klon svakog hibridoma, koji zadržava reaktivnost roditeljskih ćelija (određeno pomoću ELISA) može da se odabere za dobijanje ćelijske banke od 5 do 10 bočica, čuvanih na - 140 °C, kao i za prečišćavanje antitela.

Kako bi se prečistila anti-CD148 antitela, odabrani hibridomi mogu da se gaje u dvolitarskim trogrlim bocama za prečišćavanje monoklonskih antitela. Supernatanti mogu da se procede i koncentruju pre afinitetne hromatografije na protein A sefarozi (Pharmacia, Piscataway, N.J.). Eluirani IgG može da se proveri gel elektroforezom i tečnom hromatografijom visokih performansi kako bi se osigurala čistoća. Rastvor pufera može da se zameni PBS rastvorom, a koncentracija može da se odredi pri OD280korišćenjem ekstinkcionog koeficijenta od 1,43. Mogu da se uzmu alikvoti monoklonskih antitela i da se čuvaju na -80 °C.

Kako bi se odredilo da li odabrana humana monoklonska anti-CD148 antitela vezuju jedinstvene epitope, svako antitelo može da se konjuguje sa biotinom korišćenjem komercijalno dostupnih reagenasa (Pierce, Rockford, III). Studije kompeticije korišćenjem neobeleženih monoklonskih antitela i monoklonskih antitela obeleženih biotinom mogu da se izvedu uz upotrebu ploča za ELISA test presvučenih CD148, kao što je prethodno opisano. Monoklonska antitela (MAt) obeležena biotinom mogu da se detektuju pomoću reagensa sa strep-avidin-alkalnom fosfatazom.

Kako bi se utvrdio izotip prečišćenih antitela, mogu da se upotrebe ELISA testovi izotipa Polja mikrotirar ploča mogu da se presvuku sa 10 g/ml anti-humanog Ig preko noći, na 4 °C. Nakon blokiranja pomoću 5% BSA, u pločama se odvija reakcija sa 10 g/ml kontrola monoklonskih antitela prečišćenih izotipova, na sobnoj temperaturi, dva časa. U poljima potom može da se izvede reakcija sa probama konjugovanim sa alkalnom fosfatazom specifičnim bilo za humani IgG bilo za humani IgM. Rezultati u pločama se razvijaju i analiziraju kao što je prethodno opisano.

Da bi se pokazalo vezivanje monoklonskih antitela za žive ćelije koje eksprimiraju CD148, može da se upotrebi protočna citometrija. Ukratko, ćelijske linije koje eksprimiraju CD 148 (gajene pod standardnim uslovima rasta) mešaju se sa različitim koncentracijama monoklonskih antitela u PBS, koji sadrži 0,1% Tween 80 i 20% mišjeg seruma, te se inkubiraju 1 čas na 37° C. Nakon ispiranja, izvodi se reakcija ćelija sa anti-humanim Ig antitelom obeleženim fluoresceinom pod istim uslovima pod kojima je izvedeno prvobitno bojenje antitela. Uzorci mogu da se analiziraju pomoću FACScan instrumenta korišćenjem osobina svetlosti i bočnog rasipanja kako bi se naciljale pojedinačne ćelije. Može da se upotrebi alternativni test korišćenjem fluorescentne mikroskopije (uz, ili umesto) testa protočne citometrije. Ovaj postupak omogućava vizuelizaciju pojedinačnih ćelija, ali može da ima smanjenu osetljivost u zavisnosti od gustine antigena.

Anti-CD148 humana IgG antitela mogu dalje da budu testirana na reaktivnost prema CD148 antigenu pomoću Western blota. Ukratko, mogu da se pripreme ćelijski ekstrakti ćelija koje eksprimiraju CD148 i podrvgnu elektroforezi na poliakrilamidnom gelu sa natrijum dodecil sulfatom (SDS). Nakon elektroforeze, odvojeni antigeni će biti prebačeni na nitrocelulozne membrane, blokirani 20% mišjim serumom i testirani pomoću monoklonskih antitela koja se ispituju. Vezivanje humanog IgG može da se detektuje korišćenjem anti-humanog IgG alkalne fosfataze i da se razvije pomoću BCIP/NBT tableta supstrata (Sigma Chem. Co., St. Louis, Mo.).

Transgene ne- humane životinje koje proizvode humana monoklonska anti-

CD148 antitela

Humana monoklonska antitela protiv polipeptida CD 148 mogu da se dobiju korišćenjem transgenih miševa koji nose delove humanog imunog sistema umesto mišjeg sistema Ovi transgeni miševi, koji se ovde označavaju kao "HuMAb" miševi, sadrže minilokuse humanih gena za imunoglobulin koji kodiraju nepreuređene humane imunoglobulinske sekvence za teške (u,i y) iklaki lanac, zajedno sa ciljanim mutacijama koje inaktiviraju endogene lokuse[ Liklanaca (Lonberg,et al.(1994) Nature 368(6474): 856-859). Shodno tome, miševi pokazuju smanjenu ekspresiju mišjeg IgM ilik, a u odgovor na imunizaciju, uvedeni transgeni humanog teškog i lakog lanca podležu preuključivanju klasa i somatskim mutacijama kako bi se dobila humana monoklonska IgGKantitela visokog afiniteta (Lonberg, N.et al.(1994),supra;pregled dat u Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacologv 113: 49-101; Lonberg, N. & Huszar, D. (1995) Intem. Rev. Immunol. Vol. 13: 65-93, i Harding, F. & Lonberg, N. (1995) Ann. N.Y. Acad. Sci 764: 536-546). Dobijanje HuMAb miševa je detaljno opisano u daljem izlaganju, kao i u Tavlor, L.et al(1992) Nucleic Acids Research 20: 6287-6295; Chen, J.et al.(1993) International Immunologv 5: 647-656; Tuaillonet al.(1993) Proc. Natl. Acad. Sci USA 90: 3720-3724; Choiet al.(1993) Nature Genetics 4: 117-123; Chen, J.et al.(1993) EMBO J. 12: 821-830; Tuaillonet al.

(1994) J. Immunol. 152: 2912-2920;Lonberg era/.,(1994) Nature 368(6474): 856-859; Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacologv 113: 49-101; Tavlor, L.et al.(1994) International Immunologv 6: 579-591; Lonberg, N. & Huszar, D. (1995) Intern. Rev. Immunol. Vol. 13: 65-93; Harding, F. & Lonberg, N. (1995) Ann. N.Y. Acad. Sci 764: 536-546; Fishvvild, D.et al.(1996) Nature Biotechnology 14: 845-851, pri čemu je sadržaj svih navedenih publikacija ovde inkorporiran po referenci u celosti. Dalje videti, U.S. Patente br. 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,789,650; 5,877,397; 5,661,016; 5,814,318; 5,874,299; i 5,770,429; svi od Lonberg & Kay, kao i GenPharm International; U.S. patent br. 5,545,807 od Suraniet al;Međunarodne publikacije br. WO 98/24884, objavljena 11. juna 1998; WO 94/25585, objavljena 10. novembra 1994; WO 93/1227, objavljena 24. juna 1993; WO 92/22645, objavljena 23. decembra 1992; WO 92/03918, objavljena 19. marta 1992, koje su sve ovde inkorporirane po referenci u celosti. Alternativno, transgeni miševi mogu da se upotrebe za dobijanje humanih anti-CD148 antitela.

Kako bi se dobila potpuno humana antitela na CD 148, HuMAb miševi mogu da se imunizuju prečišćenim ili obogaćenim preparatom CD148 antigena i/ili ćelija koje eksprimiraju CD148, kao što je opisano u Lonberg, N.et al.(1994) Nature 368(6474): 856-859; Fishwild, D.et al.(1996) Nature Biotechnology 14: 845-851 i WO 98/24884. Poželjno je da miševi budu stari 6 do 16 nedelja u trenutku primene prve infuzije. Na primer, prečišćen ili obogaćen preparat (5 do 20 ug) CD148 antigena (npr., prečišćen iz LNCaP ćelija koje eksprimiraju CD148) može da se upotrebi za intraperitonealnu imunizaciju HuMAb miševa. U slučaju da imunizacije prečišćenim ili obogaćenim preparatom CD148 antigena ne dovedu do proizvodnje antitela, miševi takođe mogu da budu imunizovani ćelijama koje eksprimiraju CD148, na primer, ćelijskom linijom tumora, kako bi se podstakao imuni odgovor.

Kumulativno iskustvo sa različitim antigenima pokazalo je da HuMAb transgeni miševi dobro odgovaraju kada se prvo imuniziju intraperitonealno (IP) sa antigenom u kompletnom Frojndovom adjuvansu, nakon čega se svake druge nedelje ponovo i.p. imunizuju (do konačnog broja od 6 imunizacija) antigenom u nekompletnom Frojndovom adjuvansu. Imuni odgovor može da se prati celim tokom protokola imunizacije preko plazme dobijene uzimanjem uzoraka krvi retroorbitalno. Plazma može da se ispita ELISA testom (kao što je kasnije opisano), a miševi koji pokazuju dovoljan titar anti-CD148 humanog imunoglobulina mogu da se upotrebe za fuzije. Imuni odgovor miševa može da se pojača primenom antigena 3 dana pre žrtvovanja i uklanjanjem slezine. Očekuje se da će možda biti potrebno izvršiti 2 do 3 fuzije za svaki antigen. Svakim antigenom biće imunizovano nekoliko miševa Na primer, može da bude imunizovano ukupno 12 HuMAb miševa sojeva HC07 i HC012.

U još jednom rešenju predmetni pronalazak obezbeđuje transgene ne-humane životinje, npr., transgene miševe, koji su sposobni za ekspresiju humanih monoklonskih antitela koja se specifično vezuju za CD 148 epitope predmetnog pronalaska. U poželjnom rešenju, transgene ne-humane životinje, npr., transgeni miševi (HuMAb miševi) imaju genom koji sadrži transgene humanog teškog lanca i lakog lanca U jednom rešenju, transgene ne-humane životinje, npr., transgeni miševi, su imunizovani prečišćenim ili obogaćenim preparatom CD148 antigena i/ili ćelija koje eksprimiraju CD148. Poželjno je da su transgene ne-humane životinje, npr., transgeni miševi, sposobni da proizvedu više izotipova humanih monoklonskih antitela na CD148 (npr., IgG, IgA i/ili IgE) podležući V-D-J rekombinaciji i preuključivanju izotipova. Preuključivanje izotipova može da se odigra, npr., kao klasično ili neklasično preuključivanje izotipova.

Dobijanje transgene ne-humane životinje koja odgovara na stimulaciju stranim antigenima stvaranjem repertoara heterologih antitela, zahteva da heterologi transgeni imunoglobulina koji se nalaze u transgenoj životinju funkcionišu korektno kroz ceo put razvoja B ćelija. U poželjnom rešenju, korektna funkcija heterologog transgena teškog lanca obuhvata preuključivanje izotipova. Shodno tome, transgeni predmetnog pronalaska se konstruišu tako da dovedu do preuključivanja izotipova i do jednog ili više od sledećih rezultata: (1) visokog nivoa ekspresije i specifične ekspresije ćelijskog tipa, (2) funkcionalnog preuređenja gena, (3) aktivacije i odgovora na ekskluziju alela,

(4) ekspresije dovoljnog primarnog repertoara, (5) signalne transdukcije, (6) somatske hipermutacije i (7) dominacije transgena lokusa antitela tokom imunog odgovora

Nije neophodno da svi od prethodno navedenih uslova budu ispunjeni. Na primer, u onim rešenjima u kojima su endogeni imunoglobulinski lokusi transgene životinje funkcionalno poremećeni, nije neophodno da transgen aktivira ekskluziju alela. Dalje, u onim rešenjima u kojim transgen sadrži funkcionalno preuređen imunoglobulinski gen za teški i/ili laki lanac, nepotreban je drugi uslov funkcionalnog preuređivanja gena, bar za onaj transgen koji je već preuređen. Za osnove molekularne imunologije pogledati Fundamental Immunologv, 2. izdanje (1989), Paul William E., urednik, Raven Press, N.Y., kojaje ovde inkorporirana po referenci.

U nekim rešenjima, transgene ne-humane životinje koje se koriste za dobijanje humanih monoklonskih antitela predmetnog pronalaska sadrže preuređene, nepreuređene, ili kombinaciju preuređenih i nepreuređenih heterologih transgena teškog i lakog lanca imunoglobulina u matičnoj liniji transgene životinje. Svaki od transgena teških lanaca sadrži najmanje jedan Chgen. Uz to, transgen teškog lanca može da sadrži funkcionalne skevence preuključivanja izotipova, koje su u stanju da podrže preuključivanje izotipa heterologog transgena koji kodira više Chgena u B ćeliji transgene životinje. Sekvence za preuključivanje mogu da budu one koje se javljaju u prirodi u lokusu imunoglobulina matične linije iz vrste koja služi kao izvor transgena Chgena, ili takve sekvence za preuključivanje mogu da budu izvedene iz onih koje se javjaju u vrsti koja treba da primi konstrukt transgena (transgenoj životinji). Na primer, konstrukt humanog transgena koji se koristi za dobijanje transgenih miševa može da pokaže višu frekvenciju preuključivanja izotipova ako sadrži sekvence preuključivanja slične onima koje se javljaju u prirodi u lokusu mišjeg teškog lanca, verovatno zbog toga što su sekvence preuključivanja miša optimizovane za funkcionisanje sa sistemom mišjeg enzima rekombinaze preuključivanja, dok humane sekvence preuključivanja nisu. Sekvence preuključivanja mogu da budu izolovane i klonirane uobičajenim postupcima kloniranja, ili mogu da budu sintetisanede novoiz preklapajućih sintetičkih oligonukleotida kreiranih na osnovu objavljenih informacija o sekvencama imunoglobulinskog regiona preuključivanja (Millset al,Nucl. Acids Res. 15: 7305-7316 (1991); Siderasetal,Intl. Immunol. 1: 631-642 (1989), koji su ovde inkorporirani po referenci u potpunosti). Kod svake od prethodno navedenih transgenih životinja, funkcionalno preuređeni heterologi transgeni teškog i lakog lanca imunoglobulina nalaze se u značajnom delu B ćelija te transgene životinje (najmanje 10 procenata).

Transgeni upotrebljeni za dobijanje transgenih životinja predmetnog pronalaska obuhvataju transgen teškog lanca koji sadrži DNK koja kodira najmanje jedan varijabilni segment gena, jedan segment gena za diverzitet, jedan segment povezujućeg gena i najmanje jedan segment gena za konstantni region. Transgen lakog lanca imunoglobulina sadrži DNK koja kodira najmanje jedan segment gena varijabilnog regiona, jedan segment gena povezujućeg regiona i najmanje jedan segment gena za konstantni region. Segmenti gena koji kodiraju genske segmente lakog i teškog lanca su heterologi za transgenu ne-humanu životinju u smislu da su dobijeni iz, ili odgovaraju DNK koja kodira genske segmente teškog i lakog lanca imunoglobulina iz vrste koja ne odgovara vrsti trangene ne-humane životinje. Transgen može, na primer, da bude konstruisan tako da su pojedinačni genski segmenti nepreuređeni, t.j. da nisu preuređeni tako da kodiraju funkcionalni laki ili teški lanac imunoglobulina. Takvi nepreuređeni transgeni podržavaju rekombinaciju V, D i J genskih segmenata (funkcionalno preuređivanje) a poželjno je i da podržavaju ugradnju celog ili dela genskog segmenta D regiona u nastalom preuređenom teškom lancu imunoglobulina unutar trasngene ne-humane životinje, nakon izlaganja CD 148 antigenu.

Transgeni, takođe. mogu da sadrže i nepreuređeni "minilokus". Ovakvi transgeni obično sadrže značajan deo C, D i J segmenata kao i podgrupu V genskih segmenata. U takvim konstruktima transgena, različite regulatome sekvence, npr., promotori, pojačivači, regioni preuključivanja klasa, sekvence donori isecanja i akceptori isecanja za obradu RNK, signali za rekombinaciju i slične, sadrže odgovarajuće sekvence izvedene iz heterologe DNK. Takve regulatome sekvence mogu da budu ugrađene u transgen iz iste ili vrste srodne vrsti kojoj pripada ne-humana životinja koja se koristi u pronalasku. Na primer, humani genski segmenti imunoglobulina mogu da se ugrade u transgen sa glodarskom pojačivačkom sekvencom za imunoglobuline, za upotrebu u transgenim miševima. Alternativno, u transgen mogu da se ugrade sintetičke regulatome sekvence, gde takve sintetičke regulatome sekvence nisu homologe funkcionalnoj sekvenci DNK za koju se zna da se javlja u prirodi u genomima sisara Sintetičke regulatome sekvence se konstruišu prema pravilima za koncenzus sekvence, kao što su, na primer, ona pravila koja preciziraju dozvoljene sekvence mesta akceptora isecanja ili motiva promotera/pojačivača Na primer, minilokus sadrži deo genomskog lokusa imunoglobulina koji ima najmanje jednu unutrašnju deleciju (t.j. koja se ne nalazi na kraju dela) ne-esencijalnog dela DNK (npr., ubačena sekvenca; intron, ili njegov deo) u odnosu na lokus Ig matične linije koji se javlja u prirodi.

Za dobijanje humanih antitela na CD148 mogu, takođe, da se koriste transgene životinje koje sadrže najmanje jedan, obično 2 do 10, a ponekad i 25 do 50 ili više kopija transgena opisanog u primeru 12 WO 98/24884 (npr., pHCl ili pHC2), uparene sa životinjom koja sadrži jednu kopiju transgena lakog lanca opisanog u primerima 5, 6, 8 ili 14 WO 98/24884, dok se potomstvo pari sa životinjom koja ima Jhdeleciju, opisanom u primeru 10 WO 98/24884, čiji je sadržaj ovde eksplicitno inkorporiran po referenci. Životinje se pare do postizanja homozigotnosti za svaku od ove tri osobine. Takve životinje imaju sledeći genotip: jednu kopiju (po haploidnom kompletu hromozoma) nepreuređenog minilokusa humanog teškog lanca (opisanog u primeru 12 WO 98/24884), jednu kopiju (po haploidnom kompletu hromozoma) preuređenog konstrukta humanog kapa lakog lanca (opisanog u primeru 14 WO 98/24884) i deleciju u svakom endogenom lokusu mišjeg teškog lanca kojom se uklanjaju svi funkcionalni Jhsegmenti (opisanu u primeru 10 WO 98/24884). Takve životinje se pare sa miševima koji su homozigotni za deleciju Jhsegmenata (primer 10 WO 98/24884) kako bi se dobilo potomstvo koje je homozigotno za deleciju Jha hemizigotno za konstrukte humanog lakog i teškog lanca. Dobijenim životinjama ubrizgavaju se antigeni te se one koriste za dobijanje humanih monoklonskih antitela na te antigene.

B ćelije izolovane iz takve životinje su monospecifične u pogledu humanog teškog i lakog lanca jer sadrže samo po jednu kopiju svakog gena. Štaviše, biće monospecifične i u pogledu humanih ili mišjih teških lanaca zato što su obe kopije endogenog gena mišjeg teškog lanca nefunkcionalne usled delecije koja obuhvata Jhregion, uvedene kao što je opisano u primerima 9 i 12 WO 98/24884. Dalje, značajan deo B ćelija će biti monospecifičan u pogledu humanog ili mišjeg lakog lanca zbog toga što će ekspresija pojedinačne kopije preuređenog gena humanog kapa lakog lanca alelno i izotipski isključiti preuređivanje endogenih mišjih gena kapa i lambda lanaca u značajnom delu B ćelija.

Transgeni miš poželjnog rešenja predmetnog pronalaska pokazivače proizvodnju imunoglobulina sa značajnim repertoarom, idealno je da on bude značajno sličan repertoaru nativnog miša. Tako, na primer, u rešenjima u kojima su endogeni Ig geni inaktivirani, ukupna koncentracija imunoglobulina biće u opsegu od 0,1 do 10 mg/ml u serumu, poželjno je da to bude od 0,5 do 5 mg/ml, a idealno da to bude najmanje oko 1,0 mg/ml. Kada je u transgenog miša uveden transgen koji je u stanju da izvede preuključivanje sa IgM na IgG, poželjno je da odnos koncentracija IgG i IgM u zrelom mišu bude oko 10 : 1. Odnos IgG prema IgM će biti mnogo niži kod nezrelih miševa. Uopšteno govoreći, više od oko 10%, a poželjno je da 40 do 80% B ćelija slezine i limfnih čvorova eksprimiraju isključivo humani protein IgG. Repertoar će, u idealnom slučaju, biti približan onom koji se sreće kod netransgenog miša, obično će biti oko 10% njegove vrednosti, a poželjno je da to bude 25 do 50% ili više. Uopšteno govoreći, biće proizvedeno najamnje oko hiljadu različitih imunoglobulina (idealno je da to budu IgG), poželjno je da to bude 104 do IO<6>ili više, što će najviše zavisiti od broja različitih V, D i J regiona uvedenih u genom miša. Ovi imunoglobulini će obično prepoznavati približno jednu polovinu ili više veoma antigenih proteina, npr., proteina A stafilokoka. Obično će imunoglobulini pokazivati afinitet za prethodno odabrane antigene od najmanje oko IO<7>M"<1>, poželjno je da to bude najmanje oko IO<9>M"<1>, a još poželjnije da to bude najmanje 'oko 10<10>M"<1>, 1011 M"<1>, IO<1>2M"<1>, ili više, npr.. do oko 10<13>M"<1>ili više.

U nekim rešenjima, može da bude poželjno da se dobiju miševi sa prethodno određenim repertoarima kako bi se ograničila selekcija V gena zastupljenih u odgovoru antitela na prethodno određeni tip antigena. Transgen teškog lanca koji ima prethodno određen repertoar može da sadrži, na primer, humane gene Vhkoji se poželjno koriste u odgovorima antitela na prethodno određeni tip antigena kod ljudi. Alternativno, neki Vhgeni mogu da budu izbačeni iz definisanog repertoara iz različitih razloga (npr., niska je verovatnoća da će oni kodirati V regione visokog afiniteta za prethodno određeni antigen; slabo su podložni somatskim mutacijama i afinitetnom izoštravanju; ili su imunogeni za neke ljude). Stoga, pre preuređivanja transgena koji sadrži različite genske segmente teških ili lakih lanaca, takvi genski segmenti mogu jednostavno da se identifikuju, npr., hibridizacijom ili sekvenciranjem DNK, da bi se utvrdilo da pripadaju vrsti ili organizmu različitom od onog kome pripada transgena životinja.

Transgeni miševi predmetnog pronalaska mogu da budu imunizovani prečišćenim ili obogaćenim preparatom CD148 antigena i/ili ćelija koje eksprimiraju CD 148, kako je ranije opisano. Miševi će proizvesti B ćelije koje vrše preuključivanje klasa preko intratransgene rekombinacije preuključivanja (cis-preuključivanje) i eksprimiraju imunoglobuline reaktivne prema CD148. Ovi imunoglobulini mogu da budu antitela humane sekvence, gde su polipeptidi lakog i teškog lanca kodirani sekvencama humanog transgena, koje mogu da obuhvataju. sekvence dobijene somatskom mutacijom i rekombinatornim spajanjem V regiona, kao i sekvence kodirane u matičnoj liniji; ovi imunoglobulini humanih sekvenci mogu da budu označeni kao značajno identični polipeptidnoj sekvenci kodiranoj humanim Vlili Vhgenskim segmentom i humanim Jlili Jlsegmentom, čak iako druge sekvence koje ne pripadaju matičnoj liniji nisu prisutne kao posledica somatskih mutacija i diferencijalnog rekombinatornog spajanja V-J i V-D-J. Što se tiče takvih antitela humanih sekvenci, varijabilni regioni svakog lanca su obično najmanje 80% kodirani genskim segmentima V, J i, u slučaju teških lanaca, D, humane matične linije; često je najmanje 85 procenata varijabilnog regiona kodirano humanim sekvencama matične linije prisutnim na transgenu; često je 90 ili 95 ili više procenata sekvence varijabilnih regiona kodirano humanim sekvencama matične linije prisutnim na transgenu. Međutim, kako se sekvence koje ne pripadaju matičnoj liniji uvode somatskim mutacijama i spajanjem VJ i VDJ, antitela humane sekvence će često imati neke sekvence varijabilnog regiona (a rede sekvence konstantnih regiona) koje nisu kodirane humanim genskim segmentima V, D ili J, koji se nalaze u"humanom transgenu(ima) u matičnoj liniji miša. Obično će takve sekvence (ili pojedinačni položaji nukleotida) koje ne pripadaju matičnoj liniji da se gomilaju u ili blizu CDR regiona, ili u regionima u kojima je poznato da dolazi do gomilanja somatskih mutacija.

Antitela humanih sekvenci koja se vezuju za prethodno određeni antigen mogu da nastanu preuključivanjem izotipova, tako da se dobiju humana antitela koja sadrže humanu sekvencu y lanca (kao što su yl, y2a, y2B, ili y3) i humanu sekvencu lakog lanca (kao što je kapa laki lanac). Takva antitela humane sekvence preuključenog izotipa često sadrže jednu ili veći broj somatskih mutacija, obično u varijabilnom regionu i obično u okviru ili u okolini od deset ostataka od CDR, što je rezultat afinitetnog sazrevanja i selekcije B ćelija antigenom, posebno nakon sekundarnog (ili ponovljenog) izlaganja antigenu.

Kada se matična linija miša konstruiše tako da sadrži funkcionalni YAC sa proširenim repertoarom V segmenata, koji suštinski nisu prisutni u humanom Ig transgenu koji sadrži J i C genske segmente, osobina može da se propagira i parenjem uvede u druge genetske pozadine, uključujući pozadine u kojima je funkcionalni YAC sa proširenim repertoarom V segmenata parenjem uveden u matičnu liniju miša koja ima različit humani transgen Ig. Višestruki funkcionalni YAC sa proširenim repertoarom V segmenata mogu da se uvedu u matičnu liniju kako bi se radilo sa humanim transgenima Ig (ili višestrukim humanim transgenima Ig). Iako su ovde navedeni pod imenom YAC transgeni, takvim transgenima, kada su integrisani u genom, može da nedostaje značajan deo sekvenci kvasca, kao što su sekvence neophodne za autonomnu replikaciju u kvascu; ovakve sekvence mogu opciono da se uklone genetskim inžinjeringom, (npr., restrikcionom hidrolizom ili elektroforezom na gelu u pulsirajućem polju ili nekim drugim pogodnim postupkom) kada replikacija u kvascu više nije potrebna (npr., pre uvođenja u ES ćeliju miša ili prozigot miša). Postupci propagiranja osobine ekspresije imunoglobulina humanih sekvenci uključuju uzgoj transgenih miševa koji imaju humani(e) transgen(e) Ig, a koji takođe opciono imaju funkcionalne YAC sa proširenim repertoarom V segmenata. I Vhi Vlgenski segmenti mogu da budu prisutni na YAC. Transgeni miševi mogu, takođe, da se pare sa miševima koji imaju bilo kakvu genetsku pozadinu koja odgovara stručnjaku koji izvodi eksperiment, uključujući one pozadine koje nose druge humane transgene, uključujući humane transgene Ig i/ili transgene koji kodiraju druge humane proteine limfocita. Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje visokoafinitetni imunoglobulin humane sekvence proizveden u transgenom mišu koji ima YAC transgen sa proširenim repertoarom V segmenata. Iako je upravo opisano poželjno rešenje transgene životinje predmetnog pronalaska, zamišljena su i druga rešenja koja obuhvataju (1) transgene životinje koje sadrže nepreuređen transgen teškog i preuređen transgen lakog lanca imunoglobulina, (2) transgene životinje koje sadrže nepreuređen transgen teškog i nepreuređen transgen lakog lanca imunoglobulina; (3) transgene životinje koje sadrže preuređen transgen teškog i nepreuređen transgen lakog lanca imunoglobulina; i (4) transgene životinje koje sadrže preuređen transgen teškog i preuređen transgen lakog lanca imunoglobulina.

Bispecifični/ multispecifični molekuli koji se vezuju za CD148

U još jednom rešenju predmetnog pronalaska, humana monoklonska antitela na CD148, ili njihovi antigen vezujući regioni, mogu da budu derivatizovani ili vezani za još jedan funkcionalni molekul, npr., još jedan peptid ili protein (npr., Fab' fragment) kako bi se dobio bispecifičan ili multispecifičan molekul koji se vezuje za višestruka vezujuća mesta ili ciljne epitope. Na primer, antitelo, ili njegov antigen vezujući region, predmetnog pronalaska može da bude funkcionalno povezano (npr., hemijskim kuplovanjem, genetskom fuzijom, nekovalentnom asocijacijom ili na neki drugi način) za jedan ili veći broj drugih vezujućih molekula, kao što su druga antitela, fragmenti antitela, peptidi ili vezujući mimetici.

Shodno tome, predmetni pronalazak obuhvata bispecifične i multispecifične molekule koji sadrže najmanje jednu prvu specifičnost vezivanja za CD 148 i drugu specifičnost vezivanja za drugi ciljni epitop. U konkretnom rešenju predmetnog pronalaska, drugi ciljni epitop je Fc receptor, npr., FcvRI (CD64) ili humani Fca receptor (CD89). Stoga predmetni pronalazak obuhvata bispecifične i multispecifične molekule koji su u stanju da se vežu i za efektorske ćelije koje eksprimiraju FcyR, FcaR ili FceR (npr., monocite, makrofage ili polimorfonuklearne ćelije (PMN)) i za ciljne ćelije koje eksprimiraju CD148. Ovi bispecifični i multispecifični molekuli usmeravaju ćelije koje eksprimiraju CD 148 ka efektorskim ćelijama, i, kao i humana monoklonska antitela predmetnog pronalaska, pokreću aktivnost efektorskih ćelija u kojima posreduju Fc receptori, kao što su fagocitoza ćelija koje eksprimiraju CD148, ćelijska citotoksičnost zavisna od antitela (ADCC ("antibodv dependant cell-mediated cytotoxicity")), otpuštanje citokina ili nastanak superoksidnog anjona.

Bispecifični i multispecifični molekuli predmetnog pronalaska dalje mogu da uključuju i treću specifičnost vezivanja, uz anti-Fc specifičnost vezivanja i anti-CD148 specifičnost vezivanja U jednom rešenju, ta treća specifičnost vezivanja je anti - deo pojačivačkog faktora (EF), npr., molekul koji se vezuje za površinski protein koji ima ulogu u citotoksičnoj aktivnosti i stoga pojačava imuni odgovor na ciljnu ćeliju. Taj "anti - deo pojačivačkog faktora" može da bude antitelo, funkcionalni fragment antitela ili ligand koji se vezuje za dati molekul, npr., antigen ili receptor, dovodeći do pojačanja uticaja vezivnih determinanti za Fc receptor ili antigen ciljne ćelije. Taj "anti - deo pojačivačkog faktora" može da veže Fc receptor ili antigen ciljne ćelije. Alternativno, anti - deo pojačivačkog faktora može da se veže za neku česticu koja je različita od čestice za koje se vezuju prva i druga specifičnost vezivanja Na primer, anti - deo pojačivačkog faktora može da veže citotcksičnu T ćeliju (npr., preko CD2, CD3, CD8, CD28, CD4, CD40, ICAM-1 ili drugih imunih ćelija koje dovode do pojačanog odgovora na ciljnu ćeliju).

U jednom rešenju, bispecifični i multispecifični molekuli predmetnog pronalaska sadrže, kao specifičnost vezivanja, najmanje jedno antitelo, ili njegov antigen vezujući fragment, uključujući, npr., Fab, Fab', F(ab')2, Fv, ili jednolančani Fv. Dato antitelo takođe može da bude dimer lakog ili teškog lanca, ili bilo koji njegov minimalni fragment kao što je Fv ili jednolančani konstrukt opisan u Ladneret al.U.S. patent br. 4,946,778, čiji je sadržaj ovde eksplicitno inkorporiran po referenci.

U još jednom rešenju, bispecifični i multispecifični molekuli predmetnog pronalaska sadrže specifičnost vezivanja za FcaR ili FcyR prisutan na površini efektorske ćelije, kao i drugu specifičnost vezivanja za antigen ciljne ćelije, npr., CD148.

U jednom rešenju, specifičnost vezivanja za Fc receptor obezbeđenaje humanim monoklonskim antitelom, čije vezivanje nije blokirano humanim imunoglobulinom G (IgG). Kada se koristi u predmetnom pronalasku, izraz "IgG receptor" se odnosi na bilo koji od osam gena v-lanca koji se nalaze na hromozomu 1. Ovi geni kodiraju ukupno dvanaest transmembranskih ili rastvomih izoformi receptora koji su podeljeni u tri klase Fcy receptora: FcyRI (CD64), FcyRII(CD32) i FcyRIII (CD16). U jednom poželjnom rešenju, Fcy receptor je FcyRI visokog afiniteta. Humani FcyRI je molekul mase 72 kDa, koji pokazuje visok afinitet za monomerni IgG (10<8->10<9>M"<1>).

Proizvodnja i opisivanje ovih poželjnih monoklonskih antitela opisani su u Fangeret al.u PCT prijavi WO 88/00052 i u U.S. patentu br. 4,954,617, čiji je sadržaj ovde inkorporiran po referenci. Ova antitela se vezuju za epitop na FcyRI, FcyRII ili FcyRIII na mestu koje je različito od mesta vezivanja Fcy na receptom i, stoga, njihovo vezivanje se ne blokira značajno fiziološkim koncentracijama IgG. Specifična anti-FcyRI antitela korisna u predmetnom pronalasku su MAt 22, MAt 32, MAt 44, MAt 62 i MAt 197. Hibridom koji proizvodi MAt 32 je dostupan preko American Type Culture Collection, ATCC redni br. HB9469. Anti-FcyRI MAt 22, F(ab')2fragmenti MAt 22, mogu da se dobiju preko Medarex, Inc. (Annandale, N.J.). U drugim rešenjima, anti-FcyRI receptor antitelo je humanizovani oblik monoklonskog antitela 22 (H22). Proizvodnja i opisivanje H22 antitela opisani su u Graziano, R. F.et al(1995) J. Immunol 155 (10): 4996-5002 i PCT/US93/10384. Ćelijska linija koja proizvodi H22 antitelo ostavljena je u American Type Culture Collection 4. novembra 1992 pod oznakom HA022CL1 i ima redni br. CRL 11177.

U daljim rešenjima, specifičnost vezivanja za Fc receptor obezbeđuje se antitelom koje se vezuje za humani IgA receptor, npr., Fc-alfa receptor (FcaRI (CD89)) za čije je vezivanje poželjno da ne bude blokirano humanim imunoglobulinom A (IgA). Pod pojmom "IgA receptor" obuhvata se genski proizvod jednog a-gena (FcaRI) koji se nalazi na hromozomu 19. Zna se da ovaj gen kodira nekoliko transmembranskih izoformi različitog isecanja, od 55 do 110 kDa. FcaRI (CD89) se konstitutivno eksprimira na monocitima/makrofagima, eozinofilnim i neutrofilnim granulocitima, ali ne i na populacijama ne-efektorskih ćelija FcaRI ima umeren afinitet (približno jednak 5xl0<7>M"<1>) i za IgAl i IgA2, koji se povećava nakon izlaganja citokinima kao što su G-CSF i GM-CSF (Mortonet al,Critical Reviews in immunologv 16: 423-440 (1996)). Opisana su četiri monoklonska antitela specifična za FcaRI, označena kao A3, A59, A62 i A77, koja vezuju FcaRI izvan IgA ligand vezujućeg domena, na primer, u Monteiroetai,J. Immunol. 148: 1764 (1992).

U još jednom rešenju, antitela predmetnog pronalaska mogu da budu u obliku scFv fragmenta koji je fuzionisan neposredno za Fc deo (CH2 i CH3) humanog izotipa IgGl (koji je ovde označen kao scFv-Fc konstrukt). Dobijanje scFv-Fc fuzija opisano je, na primer, u Frederickset al,Protein Engineering Design and Selection 17: 95-106

(2003), Povverset al,J. Imunological Methods 251: 123-135 (2001), Shuet al,PNAS 90: 7995-7999 (1993) i Havdenet al,Therapeutic Immunologv 1: 3-15 (1994).

FcaRI i FcyRI su receptori pokretači poželjni za upotrebu prema predmetnom pronalasku, zbog toga što su (1) eksprimirani prvenstveno na efektorskim ćelijama imunog sistema, npr., monocitima, PMN, makrofagima i dendritskim ćelijama; (2) eksprimirani u visokim koncentracijama (npr., 5000 do 100000 po ćeliji); (3) posrednici citotoksičnih aktivnosti (npr., ADCC, fagocitoze); (4) posreduju u pojačanoj prezentaciji antigena, uključujući sopstvene antigene, koji su im ciljni molekuli.

U drugim rešenjima, bispecifični i multispecifični molekuli predmetnog pronalaska dalje sadrže specifičnost vezivanja koja prepoznaje, npr., vezuje se za antigen ciljne ćelije npr., CD148. U jednom konkretnom rešenju, specifičnost vezivanja je obezbeđena humanim monoklonskim antitelom predmetnog pronalaska.

Iako su poželjna humana monoklonska antitela, druga antitela koja mogu da se upotrebe u bispecifičnim i multispecifičnim molekulima predmetnog pronalaska su mišja, himerna i humanizovana monoklonska antitela.

Himerna mišja-humana monoklonska antitela (t.j., himerna antitela) mogu da se dobiju tehnikama rekombinantne DNK poznatim u struci. Na primer, gen koji kodira Fc konstantni region mišjeg (ili neke druge vrste) molekula monoklonskog antitela hidrolizuje se dejstvom restrikcionih enzima kako bi se uklonio region koji kodira mišji Fc, i ugradio odgovarajući deo gena koji kodira humani Fc konstantni region (videti Robinsonet al,Međunarodna patentna publikacija PCT/US86/02269; Akira,et al,Evropska patentna prijava 184,187; Taniguchi, M., Evropska patentna prijava 171,496; Morrisonet al,Evropska patentna prijava 173,494; Neubergeret al,Međunarodna prijava WO 86/01533; Cabillyet alU.S. patent br. 4,816,567; Cabillyet al,Evropska patentna prijava 125,023; Betteret al,Science 240: 1041-1043 (1988); Liuet al,PNAS 84: 3439-3443 (1987);Liu et al,1987, J. Immunol. 139: 3521-3526; Sunet al

(1987) PNAS 84: 214-218; Nishimuraet al,Canc. Res. 47: 999-1005 (1987); Woodetal,Nature 314: 446-449 (1985); i Shavvet al,J. Natl Cancer Inst. 80: 1553-1559

(1988)).

Himerna antitela mogu dalje da budu humanizovana supstitucijom sekvenci Fv varijabilnog regiona koje nisu neposredno uključene u vezivanje antigena, odgovarajućim sekvencama iz humanih Fv varijabilnih regiona. Opšti pregled humanizovanih himernih antitela obezbedili su Morrison, Science 229: 1202-1207

(1985) i Oiet al,BioTechniques 4: 214 (1986). Ovi postupci obuhvataju izolovanje, manipulaciju i ekspresiju sekvenci nukleinskih kiselina koje kodiraju sve ili delove Fv varijabilnih regiona iz najmanje jednog od teških ili lakih lanaca Izvori takvih nukleinskih kiselina su dobro poznati stručnjacima u ovoj oblasti i, na primer, mogu da se dobiju iz 7E3, hibridoma koji proizvodi anti-GPIItJIIaantitelo. Rekombinantna DNK koja kodira himerno antitelo ili njegov fragment potom može da se klonira u pogodan ekspresioni vektor. Pogodna humanizovana antitela mogu, alternativno, da se dobiju supsitucijom CDR U.S. patent br. 5,225,539; Joneset al,Nature 321: 552-525 (1986); Verhoevanet al,Science 239: 1534 (1988); i Beidleret al,J. Immunol. 141: 4053-4060 (1988).

CDR regioni datog humanog antitela mogu da budu supstituisani sa najmanje delom ne-humanog CDR ili samo neki od CDR mogu da budu supstituisani ne-humanim CDR. Jedino je neophodno supstitusati onaj broj CDR neohodan za vezivanje humanizovanog antitela za Fc receptor.

Antitelo može da bude humanizovano pomoću bilo kog postupka, kojim je moguće supstituisati najmanje deo CDR humanog antitela CDR regionom dobijenim iz ne-humanog antitela Winter opisuje postupak koji može da se upotrebi za dobijanje humanizovanih antitela predmetnog pronalaska (UK patentna prijava GB 2188638A, podneta 26. marta, 1987., čiji je sadržaj ovde eksplicitno inkorporiran po referenci). Humani CDR mogu da budu supstituisani ne-humanim CDR pomoću oligonukleotidne mutageneze upravljene ka određenom mestu, kao što je opisano u Međunarodnoj prijavi WO 94/10332 naslovljenoj Humanizovana antitela na Fc receptore za imunoglobulin G na mononuklearnim fagocitima.

U okviru duha i obima zaštite predmetnog pronalaska takođe se nalaze i himerna i humanizovana antitela kod kojih su specifične aminokiseline supstituisane, delirane ili dodate. Konkretno, poželjna humanizovana antitela imaju aminokiselinske supstitucije u regionu okvira, kako bi se poboljšalo vezivanje za antigen. Na primer, u humanizovanom antitelu koje ima mišje CDR, aminokiseline koje se nalaze u humanom regionu okvira mogu da budu supstituisane aminokiselinama koje se nalaze u odgovarajićim položajima u mišjem antitelu. Zna se da ovakve supstitucije u nekim slučajevima mogu da poboljšaju vezivanje za humanizovanih antitela za antigen. Antitela kod kojih su aminokiseline dodate, delirane ili supstituisane ovde su označena kao modifikovana antitela ili izmenjena antitela.

Pod pojmom "izmenjeno antitelo" takođe se obuhvataju antitela, kao što su monoklonska antitela, himerna antitela i humanizovana antitela koja su modifikovana, npr., delecijom, adicijom ili supstitucijom delova antitela. Na primer, antitelo može da bude modifikovano delecijom konstantnog regiona i njegovom supstitucijom konstantnim regionom koja za cilj ima produženje poluživota, npr., poluživota u serlimu, stabilnosti ili afiniteta antitela Bilo kakva modifikacija je u okviru obima i duha zaštite predmetnog pronalaska, sve dok bispecifični i multispecifilni molekuli imaju najmanje jedan vezujući region specifičan za FcyRI i pokreću najmanje jednu efektorsku funkciju.

Bispecifični i multispecifični molekuli predmetnog pronalaska mogu da se dobiju hemijskim tehnikama (videti, npr., D. M. Kranzet al,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 5807 (1981), tehnikama "polidoma" (videti U.S. patent br. 4,474,893, od Reading), ili tehnikama rekombinantne DNK.

Konkretno, bispecifični i multispecifični molekuli predmetnog pronalaska mogu da se dobiju konjugacijom konstitutivnih specifičnosti vezivanja, npr., anti-FcR i anti-CD148 specifičnosti vezivanja, korišćenjem postupaka koji su poznati u struci i opisani u primerima datim ovde. Na primer, svaka specifičnost vezivanja bispecifičnog i multispecifičnog molekula može da se dobije odvojeno a nakon čega se te dve specifičnosti međusobno konjuguju. Kada su specifičnosti vezivanja proteini ili peptidi, za kovalentnu konjugaciju može da se upotrebi mnoštvo sredstava za kuplovanje ili unakrsno povezivanje, uključujući protein A, karbodiimid, N-sukcinimidil-S-acetil-tioacetat (SATA), 5,5'-ditiobis(2-nitrobenzoeva kiselina) (DTNB), o-fenilendimaleimid (oPDM), N-sukcinimidil-3-(2-piridilditio)propionat (SPDP) i sulfosukcinimidil 4-(N-maleimidometil) ciklohaksan-l-karboksilat (sulfo-SMCC) (videti, npr., Karpovskvet al.

(1984) J. Exp. Med. 160: 1686; Liu, M Aet al(1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 8648). Drugi postupci obuhvataju one opisane u Paulus (Behring Ins. Mitt. (1985) br. 78, 118-132); Brennanet al(Science (1985) 229: 81-83) i Glennieet al(J. Immunol.

(1987) 139: 2367-2375). Poželjna sredstva za konjugaciju su SATA i sulfo-SMCC, oba dostupna preko Pierce Chemical Co. (Rockford, 111.). Bilo koja "povezujuća" grupa (linker) je opciona. Kada je prisutna, njena hemijska struktura nije značajna, obzirom daje njena prvenstvena uloga u udaljivanju. Povezujuća grupa je poželjno sastavljena od aminokiselina međusobno vezanih peptidnim vezama Stoga je, u poželjnim rešenjima, povezujuća grupa sačinjena od 1 do 20 aminokiselina međusobno vezanih peptidnim vezama, gde su date aminokiseline izabrane od 20 aminokiselina koje se javljaju u prirodi. Jedna ili više ovih aminokiselina mogu da budu glikozilovane, kao što će stručnjacima u ovoj oblasti biti jasno. U još poželjnijem rešenju, ovih 1 do 20 aminokiselina izabrano je iz grupe koja se sastoji od glicina, alanina, prolina, asparagina, glutamina i lizina. Čak još poželjnije je da je povezujuća grupa sačinjena većinom od aminokiselina koje ne dovode do sternih smetnji, kao što su glicin i alanin. Stoga su poželjne povezujuće grupe poliglicmi (posebno (Gly).sub.5, (Gly).sub.8), poli(Gly-Ala) i polialanini. Kombinacije Gly i Ala su takode poželjne. Moguća je upotreba i ne-peptidnih povezujućih grupa. Na primer, mogu da se upotrebe alkilne povezujuće grupe kao što je -NH~(CH.sub.2)s-C(0)--, gde je s = 2 do 20. Ovakve alkilne povezujuće grupe mogu dalje da budu supstituisane bilo kojom grupom koja ne dovodi do sternih smetnji, kao što su niskomolekulske aklil (npr., od Cl do C6), niskomolekulske acil, halogen (npr., Cl, Br), CN, NH2, fenil itd. Primer nepeptidne povezujuće grupe je PEG povezujuća grupa, koja ima molekulsku masu od 100 do 5000 kDa, poželjno je da to bude od 100 do 500 kDa. Peptidne povezujuće grupe mogu da budu izmenjene tako da grade derivate, na način koji je prethodno opisan. Kada su specifičnosti vezivanja antitela (npr., dva humanizovana antitela), ona mogu da budu konjugovana preko sulfahidrilnog vezivanja C-terminalnih regiona šarke dva teška lanca. U posebno poželjnom rešenju, region šarke je modifikovan tako da sadrži neparan broj sulfahidrilnih ostataka, poželjno je da to bude jedan, pre konjugacije. Alternativno, obe specifičnosti vezivanja mogu da budu kodirane na istom vektoru i eksprimirane i sastavljene u istoj ćeliji domaćinu. Ovaj postupak je posebno koristan u slučajevima u kojima je bispecifični i multispecifični molekul fuzioni protein MatxMAt, MatxFab, FabxF(ab')2ili ligand^Fab. Bispecifični i multispecifični molekul predmetnog pronalaska, npr., bispecifični molekul može da bude jednolančani molekul, kao što je jednolančano bispecifično antitelo, jednolančani bispecifični molekul koji sadrži jedno jednolančano antitelo i detrminantu vezivanja, ili jednolančani bispecifični molekul koji sadrži dve determinante vezivanja. Bispecifični i multispecifični molekuli mogu takođe da budu i jednolančani molekuli ili mogu da sadrže najmanje dva jednolančana molekula Postupci dobijanja bi- i multispecifičnih molekula opisani su, na primer, u U.S. patentu br. 5,260,203; U.S. patentu br. 5,455,030; U.S. patentu br. 4,881,175; U.S. patentu br. 5,132,405; U.S. patentu br. 5,091,513; U.S. patentu br. 5,476,786; U.S. patentu br. 5,013,653; U.S. patentu br. 5,258,498; i U.S. patentu br. 5,482,858. Vezivanje bispecifičnih i multispecifičnih molekula za njihove specifične ciljne molekule može da se potvrdi imunosorbentnim testom sa vezanim enzimom ("enzyme linked imunosorbent assay", ELISA), radioimunotestom (PJA), FACS analizom, biotestom (npr., inhibicijom rasta) ili Western blot testom. Svaki od ovih testova, uopšteno govoreći, otkriva prisustvo kompleksa protein - antitelo od posebnog interesa, koristeći obeleženi reagens (npr., antitelo) specifičan za ispitivani kompleks. Na primer, kompleksi FcR-antitelo mogu da se detektuju korišćenjem, npr., antitela ili fragmenta antitela za koje je vezan enzim, a koje prepoznaje i specifično se veže za komplekse FcR-antitelo. Alternativno, kompleksi mogu da se detektuju upotrebom bilo kog od mnoštva drugih imunotestova. Na primer, antitelo može da bude radioaktivno obeleženo i korišćeno u radioimunotestu (RIA) (videti, npr., Weintraub, B., Principles of Radioimmunoassavs, Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Society, March, 1986, koji je ovde inkorporiran po referenci). Radioaktivni izotop može da se detektuje, na primer, upotrebom y brojača ili scintilacionog brojača, ili autoradiografijom. Antitela i njihovi antigen vezujući regioni takođe mogu da budu kombinovani sa vehikulumima za ciljano dopremanje do preciziranog mesta. U jednom rešenju, predmetni pronalazak obezbeđuje antitela ili njihove antigen vezujuće regione koji su vezani za najmanje jedan vehikulum (Fl, F2) preko N-terminalnog kraja, C-terminalnog kraja ili bočnog lanca jednog od aminokiselinskih ostataka peptida. Moguće je upotrebiti i više vehikuluma, npr., po Fc na svakom terminalnom kraju, ili Fc najednom kraju a PEG na drugom kraju ili na bočnom lancu. Jedan poželjan vehikulum je Fc domen. Fc domen može da bude fuzionisan za N ili C terminalni kraj peptida ili i zaN i za C terminalni kraj. Kao što je naznačeno ranije, Fc varijante su pogodni vehikulumi u okviru opsega i duha zaštite predmetnog pronalaska Nativni Fc može da bude mnogostruko modifikovan kako bi se dobila varijanta Fc u skladu sa predmetnim pronalaskom, pod uslovom da se očuva vezivanje za receptor spašavanja. Videti, na primer, WO 97/34631 i WO 96/32478. Kod takvih varijanti Fc, moguće je ukloniti jedno ili više mesta nativnog Fe koji omogućavaju strukturne osobine ili funkcionalnu aktivnost koja nije neophodna za fuzione molekule predmetnog pronalaska. Ova mesta je moguće ukloniti, na primer, supstitucijom ili delecijom ostataka, insercijom ostataka u dato mesto ili isecanjem delova koji to mesto sadrže. Ubačeni ili supstituisani ostaci takođe mogu da budu izmenjene aminokiseline, kao što su peptidomimetici ili D-aminokiseline. Varijante Fc mogu da budu poželjne iz više razloga, od kojih će nekoliko biti opisano ovde. Primeri varijanti Fc obuhvataju molekule i sekvence u kojima. 1. Mesta uključena u nastanak disulfidnih mesta su uklonjena. Ovakvo uklanjanje može da dovede do izbegavanja reakcije sa drugim proteinima koji sadrže cistein, prisutnim u ćeliji domaćinu koja se koristi za dobijanje molekula predmetnog pronalaska. U ove svrhe, segment koji sadrži cistein na N-terminalnom kraju može da bude isečen, ili može da se izvrši delecija ili supstitucija cisteinskih ostataka drugim aminokiselinskim ostacima (npr., alanil, seril). Čak i kada se uklone cisteinski ostaci, jednolančani Fc domeni i dalje mogu da nagrade dimemi Fc domen koji se drži nekovalentnim vezama. 2. Nativni Fc je modifikovan kako bi postao kompatibilniji sa odabranom ćelijom domaćinom. Na primer, moguće je ukloniti PA sekvencu blizu N-terminalnog kraja tipičnog nativnog Fc, koju mogu da prepoznaju digestivni enzimi E. coli kao što je prolin iminopeptidaza. Takođe je moguće dodati N-terminalni metionil ostatak, posebno kada se molekul rekombinantno eksprimira u bakterijskoj ćeliji kao što je E. coli. 3. Deo N-terminalnog kraja nativnog Fc se uklanja kako bi se sprečila heterogenost N-terminalnih krajeva prilikom ekspresije u ćeliji domaćinu. U ove svrhe, moguće je izvršiti deleciju prvih 20 aminokiselinskih ostataka na N-terminalnom kraju, posebno onih na položajima 1, 2, 3, 4 i 5. 4. Uklonjeno je jedno ili veći broj mesta za glikozilaciju. Ostaci koji su obično glikozilovani (npr., asparagin) mogu da prenesu citolitički odgovor. Takvi ostaci mogu da budu uklonjeni delecijom ili supstituisani neglikozilovanim ostacima (npr., alaninom). 5. Mesta koja su uključena u interakciju sa komplementom, kao što je mesto vezivanja Clq, se uklanjaju. Na primer, moguće je izvršiti deleciju ili supstituciju EEK sekvence humanog IgGl. Pokretanje komplementa može da ne bude prednost molekula predmetnog pronalaska te je moguće izbeći ga ovakvom varijantom Fc. 6. Uklanjaju se mesta koja utiču na vezivanje za Fc receptore, osim za receptor spašavanja Nativni Fc može da ima mesta za interakciju sa određenim belim krvnim zrncima, koja nije neophodna za fuzione molekule predmetnog pronalaska te može da se ukloni. 7. Uklanja se mesto za ADCC. ADCC mesta su poznata u struci. Videti, npr., Molec. Immunol. 29 (5): 633-9 (1992) u pogledu ADCC mesta u IgGl. Ova mesta, takođe, nisu neophodna za fuzione molekule predmetnog pronalaska te mogu da se uklone. 8. Kada je nativni Fc dobijen iz ne-humanog antitela, nativni Fc može da bude humanizovan. Obično, da bi se humanizovao nativni Fc, supstituisaće se odabrani ostaci u ne-humanom nativnom Fc ostacima koji se normalno nalaze u humanom nativnom Fc. Tehnike humanizacije antitela dobro su poznate u struci. Alternativni vehikulum bi bio protein, polipeptid, peptid, antitelo, fragment antitela ili mali molekul (npr., peptidomimetičko jedinjenje) koji je u stanju da se veže za receptor spašavanja. Na primer, moguće je upotrebiti polipeptid kao vehikulum, kao što je opisano u U.S. patentu br. 5,739,277, izdatom 14. aprila 1998 od Prestaet al.Peptidi takođe mogu da se odaberu pomoću sistema izlaganja na fagu, prema vezivanju za FcRn receptor za spašavanje. Ovakva jedinjenja koja se vezuju za receptor za spašavanje su takođe obuhvaćena značenjem pojma "vehikulum" i okviru su opsega i duha zaštite predmetnog pronalaska. Ovakvi vehikulumi treba da se odaberu u svrhu produženja poluživota (npr., izbegavanjem sekvenci koje prepoznaju proteaze) i smanjenja imunogenosti (npr., favorizovanjem neimunogenih sekvenci, kao što je opisano u humanizaciji antitela). Kao što je prethodno naznačeno, za Fl i F2 mogu da se upotrebe i polimerni vehikulumi. Trenutno su dostupni mnogi načini vezivanja hemijskih ostataka koji su korisni kao vehikulumi, npr., videti PCT Međunarodnu publikaciju br. WO 96/11953, naslovljenu "Preparati i postupci N-terminalno hemijski modifikovanih proteina", koja je ovde inkorporirana po referenci u celosti. U ovoj PCT publikaciji objavljeno je, između ostalog, selektivno vezivanje polimera rastvomih u vodi za N-terminalni kraj proteina. Poželjni polimerni vehikulum je polietilen glikol (PEG). PEG grupa može da ima bilo koju pogodnu mokelulsku masu i da bude linearna ili račvasta. Poželjno je da prosečna molekulska masa PEG bude u opsegu od oko 2 kiloDaltona ("kDa") do oko 100 kDa, još poželjnije je da to bude od oko 5 kDa do oko 50 kDa, a najpoželjnije od oko 5 kDa do oko 10 kDa. PEG grupe će, obično, biti vezane za jedinjenja predmetnog pronalaska acilacijom ili reduktivnom alkilacijom preko reaktivne grupe na PEG ostatku (npr., aldehidne, amino, tiolske ili estarske grupe) i reaktivne grupe na jedinjenju predmetnog pronalaska (npr., aldehidne, amino ili estarske grupe). Korisna strategija PEGilacije sintetičkih peptida sastoji se od kombinovanja peptida i PEG ostatka preko nastanka konjugacione veze u rastvoru, pri čemu svaki nosi posebnu funkcionalnu grupu kojaje reaktivna prema onoj drugoj. Peptidi mogu lako da se dobiju uobičajenom sintezom na čvrstoj fazi, kao što je poznato u struci. Peptidi se "preaktiviraju" pogodnom funkcionalnom grupom na određenom mestu. Prekursori se prečišćavaju i potpuno opisuju pre reakcije sa PEG ostatkom. Povezivanje peptida i PEG se obično odvija u vodenoj fazi i može lako da se prati reverzno faznom analitičkom HPLC. PEGilovani peptidi mogu jednostavno da se prečiste preparativnom HPLC i opišu analitičkom HPLC, aminokiselinskom analizom i laserskom desorpcionom masenom spektrometrijom. Polisaharidni polimeri su još jedna vrsta polimera rastvornih u vodi koji mogu da se upotrebe za modifikaciju proteina. Dekstrani su polisaharidni polimeri sastavljeni od pojedinačnih podjedinica glukoze koje su uglavnom vezane al-6 vezama. Sam dekstran je dostupan u širokom opsegu molekulskih masa i lako je dostupan u masama od oko 1 kDa do oko 70 kDa. Dekstran je polimer rastvoran vodi pogodan za upotrebu prema predmetnom pronalasku, kao vehikulum, sam ili u kombinaciji sa još jednim vehikulumom (npr., Fc). Videti, na primer, WO 96/11953 i WO 96/05309. Objavljena je upotreba dekstrana kojnjugovanog sa terapeutskim ili dijagnostičkim imunoglobulinima; videti, na primer, Evropsku patentnu publikaciju br. 0 315 456, koja je ovde inkorporirana po referenci. Poželjno je da se koristi dekstran mase od oko 1 kDa do oko 20 kDa kada se dekstran koristi kao vehikulum prema predmetnom pronalasku. U još jednom rešenju, predmetni pronalazak obezbeđuje humano monoklonsko anti-CD148 antitelo, ili njegov fragment, konjugovan za terapeutsku grupu, kao stoje citotoksin, lek ili radioizotop. Kada su konjugovani za citotoksin, ovi konjugati antitela označeni su kao "imunotoksini". Citotoksin ili citotoksično sredstvo obuhvata bilo koje sredstvo koje oštećuje (npr., ubija) ćelije. Primeri obuhvataju taksol, citokalasin B, gramicidin D, etidijum bromid, emetin, mitomicin, etopozid, tenopozid, vinkristin, vinblastin, kolhicin, doksorubicin, daunorubicin, dihidroksi antracin dion, mitoksantron, mitramicin, aktinomicin D, 1-dehidrotestosteron, glukokortikoide, prokain, tetrakain, lidokain, propranolol, kao i puromicin i njihove analoge i homologe. Terapeutska sredstva obuhvataju, ali nisu ograničena na, antimetabolite (npr., metotreksat, 6-merkaptopurin, 6-tioguanin, citarabin, 5-fluorouracil dekarbazin), alkilujuća sredstva (npr., mehloretamin, tioepa hlorambucil, melfalan, karmustin (BSNU) i lomustin (CCNU), ciklotosfamid, busulfan, dibrommanitol, streptozotocin, mitomicin C i cis-dihlordiamin platinu (II) (DDP) cisplatin), antracikline (npr., daunorubicin (ranije daunomicin) i doksorubicin), antibiotike (npr., daktinomicin (ranije aktinomicin), bleomicin, mitramicin i antramicin (AMC)), kao i anti-mitotička sredstva (npr., vinkristin i vinblastin). Drugi primeri terapeutskih citotoksina koji mogu da se konjuguju sa antitelom obuhvataju kalihemicin i duokarmicin. Antitelo predmetnog pronalaska može da bude konjugovano za radioizotop, npr., radioaktivni jod, kako bi se dobili citotoksični radiofarmaceutski preparati za tretman poremećaja povezanih sa CD 148, kao što je kancer. Konjugati antiteia predmetnog pronalaska mogu da se koriste za modifikaciju datog biološkog odgovora, a izraz grupa leka ili ostatak leka ne treba tumačiti kao ograničen na klasična hemijska terapeutska sredstva. Na primer grupa leka može da bude protein ili polipeptid koji ima željenu biološku aktivnost. Takvi proteini mogu da obuhvataju, na primer, enzimski aktivan toksin ili njegov aktivni fragment, kao što je abrin, ricin A, egzotoksin roda Pseudomonas, ili toksin difterije; protein kao što je faktor nekroze tumora ili interferon gama; ili modifikatore biološkog odgovora, kao što su, na primer, limfokini, interleukin-1 (IL-1), interleukin-2 (IL-2), interleukin-6 (IL-6), faktor stimulacije kolonija granulocita makrofaga ("granulocvte macrophage colonv stimulating factor", GM-CSF), faktor stimulacije kolonija granulocita ("granulocvte colonv stimulating factor", G-CSF), ili druge faktore rasta. Tehnike konjugacije ovakvih terapeutskih grupa za antitela dobro su poznate, videti, npr., Arnonet al,"Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", u Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeldet al.

(urednici), str. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrometal,"Antibodies For Drug Delivery", u Controlled Drug Delivery (2. izdanje), Robinsonet al.(urednici), str. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", u Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pincheraet al.(urednici), str. 475-506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", u Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwinet al.

(urednici), str. 303-16 (Academic Press 1985) i Thorpeet al,"The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev., 62: 119-58

(1982).

Farmaceuteski preparati

Farmaceutski preparati anti-CD148 antitela su obuhvaćeni obimom i duhom zaštite predmetnog pronalaska. Farmaceutski preparati koji sadrže antitela detaljno su opisani, na primer, u U.S. patentu br. 6,171,586 od Lamet al,izdatom 9. januara 2001. Takvi preparati sadrže terapeutski ili profilaktički efikasnu količinu antitela, njegovog fragmenta, varijante, derivata ili fuzije, kao što je ovde opisano, u smeši sa farmaceutski prihvatljivim nosiocem i/ili farmaceutski prihvatljivom solju. U poželjnom rešenju, farmaceutski preparati sadrže antitela koja se vezuju za epitope CD148 koji aktiviraju CD148 aktivnost u smeši sa farmaceutski prihvatljivim nosiocem i/ili farmaceutski prihvatljivom solju. Uobičajeno je da sredstva za specifično vezivanje budu dovoljno prečišćena za primenu kod životinje.

Farmaceutski prihvatljivi nosioci

Kada se koristi u predmetnom pronalasku, pojam "farmaceutski prihvatljiv nosilac" obuhvata bilo koji i sve rastvarače, disperzione podloge, omotače, antibakterijska i antifungalna sredstva, izotonična i sredstva odlaganja apsorpcije, i slična sredstva koja su fiziološki kompatibilna U nekim rešenjima, nosilac je pogodan za intravensku, intramuskularnu, potkožnu, parenteralnu, spinalnu ili epidermalnu primenu (npr., injekcijom ili infuzijom). U zavisnosti od puta primene, aktivno jedinjenje, t.j. antitelo, bispecifični i multispecifični molekul, može da bude obloženo materijalom koji štiti dato jedinjenje od dejstva kiselina i drugih prirodnih uslova koji bi mogli da inaktiviraju jedinjenje. U još jednom konkretnom rešenju, farmaceutski preparati se formulišu sa nosiocem koji je farmaceutski prihvatljiv za ljude.

Primeri pogodnih vodenih i nevodenih nosilaca koji mogu da se upotrebe u farmaceutskim preparatima predmetnog pronalaska obuhvataju vodu, etanol, poliole (kao što je glicerol, propilen glikol, polietilen glikol i slični), i njihove pogodne smeše, biljna ulja, kao što je maslinovo ulje, i organski estri pogodni za injekcije, kao što je etil oleat. Željena fluidnost može da se održava, na primer, upotrebom omotača, kao što je lecitin, održavanjem potrebne veličine čestice u slučaju disperzija i korišćenjem surfaktanata.

Ovi preparati mogu takođe da sadrže adjuvanse kao što su konzervansi, sredstva za vlaženje, emulgatori i sredstva za dispergovanje. Sprečavanje prisustva mikroorganizama može da se obezbedi i procedurama sterilizacije koje su prethodno opisane kao i uvođenjem različitih antibakterijskih i antifungalnih sredstava, na primer, parabena, hlorbutanola, fenolsorbinske kiseline i sličnih. Takođe, može da bude poželjno da se u preparate uvedu izotonična sredstva, kao što su šećeri, natrijum hlorid i slična. Uz to, produžena apsorpcija farmaceutskog oblika pogodnog za injekcije može da se postigne uvođenjem sredstava koja odlažu apsorpciju, kao što su aluminijum monostearat i želatin.

Izraz "farmaceutski prihvatljiva so" odnosi se na so koja zadržava željenu biološku aktivnost jedinjenja iz kog je nastala a ne dovodi do neželjenih toksikoloških dejstava (videti, npr., Berge, S. M.,etal.(1977) J. Pharm. Sci. 66: 1-19). Primeri takvih soli obuhvataju adicione soli kiselina i adicione soli baza. Adicione soli kiselina obuhvataju one soli dobijene iz netoksičnih neorganskih kiselina, kao što su hlorovodonična, azotna, fosforna, sumporna, bromovodonična, jodovodonična, fosforasta, i slične, kao i iz netoksičnih organskih kiselina kao što su alifatične mono- i dikarboksilne kiseline, fenil-supstituisane alkanske kiseline, hidroksi alkanske kiseline, aromatične kiseline, alifatične i aromatične sulfonske kiseline i slične. Adicione soli baza obuhvataju one dobijene iz alkalnih i zemnoalkalnih metala, kao što su natrijum kalijum, magnezijum, kalcijum i slični, kao i iz netoksičnih organskih amina, kao što su N,N'-dibenziletilendiamin, N-metilglukamin, hloroprokain, holin, dietanolamin, etilendiamin, prokain i slične.

Farmaceutski preparati predmetnog pronalaska mogu da sadrže supstance za formulaciju za modifikovanje, održavanje ili konzervaciju, na primer, pH, osmolalnosti, viskoznosti, bistrine, boje, izotoničnosti, mirisa, sterilnosti, stabilnosti, brzine rastvaranja ili oslobađanja, adsorpcije ili penetracije preparata. Pogodne supstance za formulaciju obuhvataju, ali nisu ograničene na, aminokiseline (kao što su glicin, glutamin, asparagin, arginin ili lizin); antimikrobne supstance; antioksidanse (askorbinsku kiselinu, natrijum sulfit ili natrijum hidrogen sulfit); pufere (kao što je boratni, bikarbonatni, Tris-HCl, citratni, fosfatni, ili drugi pufer organske kiseline); sredstva za bubrenje (kao što su manitol ili glicin), helatore (kao što je etilendiamin tetrasirćetna kiselina (EDTA)), sredstva za kompleksiranje (kao što su kofein, polivinilpirolidon, beta-ciklodekstrin ili hidroksipropil.beta-ciklodekstrin); punioce; monosaharide, disaharide i druge ugljene hidrate (kao što su glukoza, manoza i dekstrani); proteine (kao što su serum albumin, želatin ili imunoglobulini); boje, arome i razređivače; emulgatore; hidrofilne polimere (kao što je polivinilpirolidon); polipeptide niske molekulske mase; protiv jone koji grade soli (kao što je natrijum); konzervanse (kao što su benzalkonijum hlorid, benzoeva kiselina, salicilna kiselina, timerosal, fenetil alkohol, metilparaben, propilparaben, hlorheksidin, sorbinska kiselina ili vodonik peroksid); rastvarače (kao što su glicerin, propilen glikol ili polietilen glikol); šećerne alkohole (kao što su manitol i sorbitol); sredstva za suspendovanje; surfaktante ili sredstva za vlaženje (kao što su pluronici, PEG, estri sorbitana, polisorbati kao što su polisorbat 20, polisorbat 80, triton, trometamin, lecitin, holesterol, tiloksapal); stabilizatore (saharozu ili sorbitol); sredstva za povećanje toničnosti (kao što su halidi alkalnih metala, poželjno je da to budu natirjum ili kalijum hlorid, manitol, sorbitol); vehikulume za dopremanje; razblaživače; ekscipijente i/ili farmaceutske adjuvanse (Remington's Pharmaceutical Sciences, 18. izdanje, A. R. Gennaro, urednik, Mack Publishing Companv, 1990).

Optimalni farmaceutski sastav odrediće stručnjak u ovoj oblasti u zavisnosti od, na primer, predviđenog puta primene, oblika dopremanja i željene doze. Videti, na primer, Remington's Pharmaceutical Sciences,supra.Takvi preparati mogu da utiču na fizičko stanje, stabilnost, brzinu otpuštanjain vivoi brzinuin vivoklirensa specifičnog antitela.

Primami vehikulum ili nosilac u farmaceutskom preparatu može, po svojoj prirodi, da bude bilo voden ili ne-voden. Na primer, pogodan vehikulum ili nosilac može da bude voda za injekcije, fiziološki rastvor soli ili veštačka cerebrospinalna tečnost, a mogu da mu se dodaju druge supstance koje se uobičajeno koriste u preparatima namenjenim za parenteralnu primenu. Neutralni puferisani fiziološki rastvor ili fiziološki rastvor pomešan sa serum albuminom su dalji primeri vehikuluma. Drugi primeri farmaceutskih preparata sadrže Tris pufer pH vrednosti oko 7,0 do 8,5, ili acetatni pufer pH vrednosti oko 4,0 do 5,5, a dalje mogu da sadrže sorbitol ili njegovu pogodnu zamenu. U jednom rešenju predmetnog pronalaska, preparati vezujućih sredstava mogu da se pripreme za čuvanje mešanjem odabranog preparata sa željenim stepenom prečišćenosti i opcionih sredstava za formulaciju (Remington's Pharmaceutical Sciences,supra)u obliku liofilizovanog kolača ili vodenog rastvora. Dalje, proizvod vezujućeg sredstva može da bude formulisan kao liofilizat korišćenjem pogodnih ekscipijenata kao što je saharoza.

Farmaceutski preparati mogu da budu odabrani za parenteralnu primenu. Alternativno, preparati mogu da budu odabrani za inhalaciju ili enteralnu primenu, kao što je oralna, auralna, oftalmološka, rektalna ili vaginalna Priprema takvih farmaceutski prihvatljivih preparata je u okviru uobičajene prakse u struci.

Formulacioni sastojci prisutni su u koncentracijama koje su prihvatljive za mesto primene. Na primer, obično se koriste puferi kako bi se preparat održao na fiziološkom pH ili na nešto nižem pH, obično u okviru pH opsega od oko 5 do oko 8.

Kada se jedinjenja predmetnog pronalaska primenjuju kao farmaceutska sredstva, kod ljudi i životinja, mogu da se primenjuju sama ili kao farmaceutski preparat koji sadrži, na primer, od 0,01 do 99,5% (a poželjnije je od 0,01 do 90%) aktivnog sastojka u kombinaciji sa farmaceutski prihvatljivim nosiocem. Kao primer, farmaceutski preparati predmetnog pronalaska mogu da sadrže anti-CD148 antitelo ili njegov antigen vezujući region u koncentraciji od oko 1 mg/ml do oko 30 mg/ml, ili, alternativno, od oko 5 mg/ml do oko 39 mg/ml.

U nekim rešenjima, humana monoklonska antitela predmentog pronalaska mogu da se formulišu tako da obezbeđuju pravilnu distribucijuin vivo.Na primer, krvno - moždana barijera (BBB, "blood-brain barrier") izuzima mnoga hidrofilna jedinjenja. Kako bi se obezbedio prolazak terapeutskih jedinjenja predmetnog pronalaska kroz BBB (tamo gde je to poželjno), ona mogu da se formulišu, na primer, kao lipozomi, videti, npr., U.S. patente br. 4,522,811; 5,374,548; i 5,399,331. Lipozomi mogu da sadrže jednu ili više grupa koje se selektivno prenose u specifične ćelije ili organe, čime se pojačava dostava leka na ciljno mesto (videti, npr., V. V. Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol. 29: 685). Primeri grupa koje ciljaju obuhvataju folat ili biotin (videti, npr., U.S. patent br. 5,416,016 od Lowet al.) ;manozide (Umezawaet al,(1988) Biochem. Biophvs. Res. Commun. 153: 1038); antitela (P. G. Bloemanet al.(1995) FEBS Lett 357: 140: M. Owaiset al.(1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39: 180); surfaktantnireceptor proteina A (Briscoe et al.(1995) Am. J. Phvsiol. 1233: 134), čije različite vrste mogu da čine formulacije predmetnog pronalaska, kao i sastojke molekula predmetnog pronalaska; str. 120 (Schreieret al.(1994) J. Biol. Chem. 269: 9090); videti takođe K. Keinanen; M. L. Laukkanen (1994) FEBS Lett. 346: 123; J. J. Killion; I. J. Fidler

(1994) Immunomethods 4: 273. U jednom rešenju predmetnog pronalaska, terapeutska jedinjenja predmetnog pronalaska su formulisana kao lipozomi; u poželjnijem rešenju, lipozomi sadrže grupu za ciljanje. U najpoželjnijem rešenju, terapeutska jedinjenja predmetnog pronalaska u lipozomima primenjuju se bolus injekcijom u mesto u blizini tumora ili infekcije. Preparat mora da bude dovoljno tečan da je moguće lako istiskivanje kroz špric. Mora da bude stabilan u uslovima proizvodnje i čuvanja i mora da bude konzerviran od kontaminirajućeg dejstva mikroorganizama kao što su bakterije ili gljive.

Terapeutski delotvome doze

Bez obzira na odabrani put primene, jedinjenja predmetnog pronalaska, koja mogu da se koriste u pogodnom hidratisanom obliku i/ili u farmaceutskim preparatima predmetnog ponalaska, formulišu se u farmaceutski prihvatljive dozne oblike uobičajenim postupcima poznatim stručnjacima u ovoj oblasti. Poželjno je da "terapeutski delorvorna doza" inhibira rast tumora najmanje oko 20%, još poželjnije je da ga inhibira najmanje oko 40%, čak još poželjnije najmanje oko 60% a još poželjnije najmanje oko 80%, u odnosu na pacijente koji ne primaju tretman. Sposobnost jedinjenja da inhibira kancer može da se proceni u životinjskom model sistemu koji omogućava predviđanje delotvornosti prema humanim tumorima Alternativno, ova osobina preparata može da se proceni ispitivanjem sposobnosti jedinjenja za ovakvu inhibiciju uin vitrotestovima poznatim stručnjacima u ovoj oblasti. Terapeutski delorvorna doza terapeutskog jedinjenja može da smanji veličinu tumora, ili da na drugi način ublaži simptome pacijenta. Stručnjak sa uobičajenim znanjem u ovoj oblasti biće u stanju da odredi takve količine na osnovu faktora kao što su veličina pacijenta, ozbiljnost simptoma i konkretan odabrani preparat ili odabrani put primene.

Terapeutski delotvorna doza farmaceutskog preparata koji treba da se primeni u terapiji će zavisiti od, na primer, terapeutskog konteksta i ciljeva Stručnjak u ovoj oblasti će imati u vidu da će pogodne dozne koncentracije biti različite u zavisnosti, delimično, od indikacije zbog koje se primenjuje antitelo ili njegov antigen vezujući fragment, puta primene i veličine (telesne mase, telesne površine ili veličine organa) i stanja (starosti i opšteg zdravlja) pacijenta Shodno tome, klinički lekar može da prilagodi dozu i put primene kako bi se obezbedilo optimalno terapeutsko dejstvo.

Poželjno anti-CD148 antitelo ili njegov antigen vezujući fragment u stanju je da se u značajnoj meri veže za CD148 u rastvoru, u koncentracijama manjim od 1 uM, poželjno je da to bude manje od 0,1 (jM, a još poželjnije je da to bude manje od 0,01 uM. Pod izrazom "u značajnoj meri" podrazumeva se da se uočava smanjenje u proliferaciji i migraciji endotelnih ćelija od najmanje 50 procenata, modulacijom u prisustvu anti-CD148 antitela ili njegovog antigen vezujućeg fragmenta, a 50% smanjenje je ovde označeno kao IC50 vrednost.

Terapeutski delotvorna količina anti-CD148 antitela ili njegovog antigen vezujućeg fragmenta predmetnog pronalaska je obično ona količina koja kojaje, kada je primenjena u fiziološki podnošljivom preparatu, dovoljna da se postigne koncentracija u plazmi od oko 0,01 ug/ml do oko 300 ug/ml (na osnovu cmax podataka nakon pojedinačne doze antitela). U još jednom rešenju, koncentracije mogu da budu od oko 1 u,g/ml do oko 75 ug/ml. U još jednom rešenju, koncentracije mogu da budu od oko 15 u.g/ml do oko 50 u,g/ml. Doze mogu, naravno, da se razlikuju u zavisnosti od učestalosti i trajanja primene.

Terapeutski delotvorna količina anti-CD148 antitela ili njegovog antigen vezujućeg fragmenta predmetnog pronalaska u obliku polipeptida je obično količina polipeptida kojaje, kada je primenjena u fiziološki podnošljivom preparatu, dovoljna da se postigne koncentracija u plazmi od oko 0,001 u,g/ml do oko 10 ug/ml, m°d°ko 0,05 ug/ml do oko 1,0 ug/ml. Na osnovu mase polipeptida od oko 15000 g po molu, (t.j. 15000 Da), koncentracija u plazmi izražena kao molarnost može da bude, na primer, od oko 0,0001 uM do oko 1 mM. Drugačije rečeno, doza, u odnosu na telesnu masu, može da bude od oko 0,01 mg/kg do oko 30 mg/kg, ili od oko 0,05 mg/kg do oko 20 mg/kg u jednoj ili više dnevnih doza, tokom jednog ili više dana Uobičajena doza može da bude u opsegu od oko 0,1 mg/kg do oko 100 mg/kg ili više, u zavisnosti od prethodno pomenutih faktora. U drugim rešenjima, doza može da bude od 1 mg/kg do oko 100 mg/kg; ili 5 mg/kg do oko 100 mg/kg.

Za bilo koje jedinjenje, terapeutski delotvorna doza može prvobitno da se proceni bilo u testovima kulture ćelija, bilo u životinjskim modelima kao što su miševi, pacovi, zečevi, psi, svinje ili majmuni. Životinjski model takođe može da se upotrebi za određivanje pogodnog opsega koncentracije i puta primene. Ovakve informacije mogu da se koriste za određivanje korisnih doza i puteva primene kod ljudi.

Tačna doza će biti određena u svetlu faktora koji se odnose na pacijenta kome je neophodna terapija. Doziranje i primena se prilagođavaju kako bi obezbedili dovoljne koncentracije aktivnog jedinjenja ili kako bi održavali željeno dejstvo. Faktori koji mogu da budu uzeti u obzir obuhvataju ozbiljnost bolesti, opšte zdravlje pacijenta, starost, težinu i pol pacijenta, vreme i učestalost primene, kombinaciju(e) lekova, reaktivnu osetljivost i odgovor na terapiju. Dugotrajni farmaceutski preparati mogu da se primenjuju svakih 3 do 4 dana, svake nedelje, ili na dve nedelje, u zavisnosti od poluživota i brzine klirensa konkretne formulacije.

Učestalost doziranja će zavisiti od farmakokinetičkih parametara molekula vezujućeg sredstva u upotrebljenoj formulaciji. Uobičajeno je da se preparat primenjuje dok se ne dostigne doza koja dovodi do željenog efekta Preparat, stoga, može da se primeni u pojedinačnoj dozi, ili u više doza (istih ili različitih koncentracija/doza) tokom vremena, ili kao kontinualna infuzija. Dalje fino podešavanje pogodne doze se vrši rutinski. Pogodne doze mogu da se odrede upotrebom pogodnih podataka o odgovoru na terapiju u zavisnosti od doze.

Stvarne dozne koncentracije aktivnih jedinjenja u farmaceutskim preparatima predmetnog pronalaska mogu da se menjaju kako bi se dobila ona količina aktivnog sastojka koja je delotvorna u postizanju željenog terapeutskog odgovora kod datog pacijenta, preparata i načina primene, a koja nije toksična za pacijenta. Odabrana doza će zavisiti od mnoštva farmakokinetičkih faktora uključujući aktivnost konkretnog upotrebljenog preparata predmetnog pronalaska, trajanje terapije, druge lekove, jedinjenja i/ili supstance upotrebljene u kombinaciji sa konkretnim upotrebljenim preparatom, starost, pol, težinu, stanje, opšte zdravlje i prethodnu medicinsku istoriju pacijenta koji je pod terapijom i slične faktore koji su dobro poznati u medicinskoj praksi.

Lekar ili veterinar koji poseduje uobičajeno znanje u ovoj oblasti može jednostavno da odredi i prepiše delotvomu količinu potrebnog farmaceutskog preparata. Na primer, lekar ili veterinar može da počne sa dozama primenjenog jedinjenja predmetnog pronalaska u koncentracijama nižim od onih koje su potrebne za postizanje željenog terapeutskog efekta a potom da postupno povećava dozu dok se ne postigne željeni efekat. Uopšteno govoreći, pogodna dnevna doza preparata predmetnog pronalaska će biti najniža doza delotvorna u postizanju terapeutskog efekta. Takva delotvorna doza će obično zavisiti od faktora koji su prethodno opisani. Poželjno je da primena bude intravenska, intramuskularna, intraperitonealna, ili potkožna, poželjno je da mesto primene bude blizu ciljnog mesta. Ukoliko je to poželjno, delotvorna dnevna doza terapeutskog preparata može da bude primenjenja kao dve, tri, četiri, pet, šest ili više pod-doza primenjenih odvojeno u pogodnim vremenskim intervalima tokom dana, opciono, u jediničnim doznim oblicima. Iako je moguće primeniti jedinjenje predmetnog pronalaska pojedinačno, poželjno je da se ono primeni kao farmaceutska formulacija (preparat).

Preparat mora da bude sterilan i u dovoljnoj meri tečan (fluidan) da preparat može da se primeni špricem. Uz vodu, nosilac može da bude izotonični puferisani fiziološki rastvor, etanol, poliol (na primer, glicerol, propilen glikol i tečni polietilen glikol, i slični), kao i njihove pogodne kombinacije. Odgovarajuća fluidnost može da se održava, na primer, upotrebom omotača kao što je lecitin, održavanjem potrebne veličine čestica u slučaju disperzija, kao i upotrebom surfaktanata U mnogim slučajevima, poželjno je da se u preparat uvedu i izotonična sredstva, na primer, šećeri, polialkoholi kao što su manitol ili sorbitol i natrijum hlorid. Dugoročna apsorpcija preparata koji se primenjuju injekcijama može da se postigne uvođenjem sredstva koje odlaže apsorpciju, na primer, aluminijum monostearata ili želatina, u preparat.

Kada je aktivno jedinjenje pogodno zaštićeno, kao što je prethodno opisano, ono može da se primeni oralno, na primer, sa inertnim razblaživačem ili sa svarljivim jestivim nosačem.

Postupci primene preparata (npr., humanih antitela, multispecifičnih i bispecifičnih molekula) predmetnog pronalaska poznati su u struci. Pogodne doze upotrebljenih molekula će zavisiti od starosti i telesne mase pacijenta i konkretnog upotrebljenog leka. Molekuli mogu da se kupluju sa radionuklidima, kao što su 1311, 90Y, 105Rh, indijum-111 itd, opisanim u Goldenberg, D. M.etal.(1981) Cancer Res. 41: 4354-4360, kao i u EP 0365 997. U još jednom rešenju predmetni pronalazak se odnosi na imunokonjugat koji sadrži antitelo prema predmetnom pronalasku, vezano za radioizotop, citotoksično sredstvo (npr., kalihemicin i duokarmicin), citostatik, ili hemoterapijski lek. Preparati (npr., humana antitela, multispecifični i bispecifični molekuli) predmetnog pronalaska mogu da budu kuplovani i sa anti-infektivnim sredstvima

Putevi primene

Put primene farmaceutskog preparata je u skladu sa poznatim postupcima, npr. oralno, injecijom intravenski, intraperitonealno, intracerebralno (intra-parenhimalno), intracerebroventrikularno, intramuskularno, intra-okulamo, intraarterialno, intraportalno, intralezijskim putem, intramedularno, intratekalno, intraventrikularno, transdermalno, potkožno, intraperitonealno, intranazalno, enteralno, topijski, sublingvalno, uretralno, vaginalno, ili rektalno, pomoću sistema sa produženim oslobađanjem ili implanta Kada je to poželjno, preparati mogu da se primene bolus injekcijom, ili kontinualno infuzijom ili implantom.

Alternativno ili dodatno, preparat može da se primeni lokalno, implantacijom membrane, sunđera ili drugog pogodnog materijala na koji je željeni molekul adsorbovan ili enkapsuliran. Ako se koristi implant, on može da se usadi u bilo koje pogodno tkivo ili organ, a dopremanje željenog molekula može da bude difuzijom, bolusom sa vremenski programiranim otpuštanjem, ili kontinualnom primenom.

U nekim slučajevima može da bude poželjno da se farmaceutski preparat upotrebiex vivo.U takvim slučajevima, ćelije, tkiva ili organi koji su eksplantirani iz pacijenta se izlažu dejstvu farmaceutskog preparata, nakon čega se ćelije, tkiva i/ili organi reimplantiraju u pacijenta.

U drugim slučajevima, vezujuće sredstvo predmetnog pronalaska, kao što je antitelo ili njegov antigen vezujući region, mogu da se dopremaju implantacijom određenih ćelija koje su modifikovane genetskim inžinjeringom, upotrebom postupaka poput onih koji su ovde opisani, kako bi eksprimirale i izlučivale polipeptide. Takve ćelije mogu da budu humane ili životinjske ćelije, i mogu da budu autologe, heterologe ili ksenogenične. Opciono, ćelije mogu da budu imortalizovane. Kako bi se smanjila mogućnost imunog odgovora, ćelije mogu da budu enkapsulirane da bi se izbegla infiltracija u okolna tkiva. Materijali za enkapsulaciju su obično biokompatibilne, semipermeabilne polimeme kapsule ili membrane koje omogućavaju oslobađanje proteinskog(ih) proizvoda ali sprečavaju uništenje ćelija dejstvom imunog sistema pacijenta ili drugih štetnih faktora iz okolnih tkiva.

Terapeutski preparati mogu da budu primenjeni pomoću medicinskih pomagala poznatih u struci. Na primer, u poželjnom rešenju, terapeutski preparat predmetnog pronalaska može da bude primenjen uređajem za davanje hipodermičnih injekcija bez igle, kao što su uređaji opisani u U.S. patentnima br. 5,399,163; 5,383,851; 5,312,335; 5,064,413; 4,941,880; 4,790,824; ili 4,596,556. Primeri dobro poznatih implanta i modula korisnih prema predmetnom pronalasku obuhvataju: U.S. patent br. 4,487,603, koji opisuje mikro-infuzionu pumpu koju je moguće implantirati, za otpuštanje lekova kontrolisanom brzinom; U.S: patent br. 4,486,194, koji opisuje terapeutsko pomagalo za primenu lekova kroz kožu; U.S. patent br. 4,447,233, koji opisuje infuzionu pumpu za lekove namenjenu za dopremanje lekova pri precizno određenoj brzini infuzije; U.S. patent br. 4,447,224, koji opisuje infuzioni aparat koji je moguće implantirati sa promenljivim protokom namenjen za kontinualno dopremanje lekova; U.S. patent br. 4,439,196, koji opisuje osmotski sistem za dopremanje lekova koji ima odeljke sa više pregrada; kao i U.S. patent br. 4,475,196, koji opisuje osmotski sistem dopremanja lekova Ovi patenti su ovde inkorporirani po referenci. Mnogi drugi ovakvi implanti, sistemi dopremanja i moduli poznati su stručnjacima u ovoj oblasti.

Kada se razmišlja o parenteralnoj primeni, terapeutski preparat za upotrebu prema predmetnom pronalasku može da bude u obliku vodenog rastvora prihvatljivog za parenteralnu primenu slobodnog od prisustva pirogena, koji sadrži željeno vezujuće sredstvo u farmaceutski prihvatljivom vehikulumu. Posebno pogodan vehikulum za parenteralne injekcije je sterilna destilovana voda u kojoj je vezujuće sredstvo formulisano kao sterilni, izotonični rastvor, koji je konzervisan na pogodan način. Još jedan preparat može da obuhvata formulaciju željenog molekula sa nekim sredstvom, kao što su mikrosfere za injekcije, bio-erodibilne čestice, polimerna jedinjenja (kao što su polimlečna kiselina ili poliglikolna kiselina), granulice ili lipozomi, koje može da obezbedi kontrolisano ili produženo oslobađanje proizvoda, a koja može da bude primenjena kao depo injekcija. Može da se koristi i hijaluronska kiselina, koja može da produži prisustvo u cirkulaciji. Druga pogodna sredstva za uvođenje željenog molekula obuhvataju implantabilna sredstva za dopremanje.

U još jednom rešenju, farmaceutski preparati pogodni za parenteralnu primenu mogu da budu formulisani u vodenim rastvorima, poželjno je da to bude u fiziološki kompatibilnim puferima kao što je Henkov rastvor, Ringerov rastvor ili puferisani fiziološki rastvor. Vodene suspenzije za injekcije mogu da obuhvataju supstance koje povećavaju viskoznost suspenzije, kao što je natrijum karboksimetil celuloza, sorbitol ili dekstran. Dodatno, suspenzije aktivnih jedinjenja mogu da se pripreme u obliku uljanih suspenzija za injekcije. Pogodni lipofilni rastvarači ili vehikulumi obuhvataju masna ulja, kao što su ulje sušama, ili sintetičke estre masnih kiselina, kao što su etil oleat, trigliceridi ili lipozomi. Za dopremanje mogu, takođe, da se koriste i polikatjonski amino polimeri. Opciono, suspenzija može da sadrži i pogodne stabilizatore ili sredstva povećanja rastvorljivosti jedinjenja, čime se omogućava priprema veoma koncentrovanih rastvora

U još jednom rešenju, farmaceutski preparat može da bude formulisan za inhalaciju. Na primer, vezujuće sredstvo može da bude formulisano kao suvi prah za inhalaciju. Inhalacioni rastvori molekula polipeptida ili nukleinskih kiselina mogu da budu formulisani sa propelentom za dopremanje u obliku aerosola. U još jednom rešenju, rastvori mogu da budu nebulizovani. Pulmološka primena je dalje opisana u PCT prijavi br. PCT/US94/001875, koja opisuje pulmološko dopremanje hemijski modifikovanih proteina.

Farmaceutski preparati za oralnu primenu takođe mogu da budu formulisani pomoću faraceutski prihvatljivih nosilaca dobro poznatih struci, u dozama pogodnim za oralnu primenu. Ovakvi nosioci omogućavaju formulaciju farmaceutskih preparata u obliku tableta, pilula, dražeja, kapsula, tečnosti, gelova, sirupa, kaša, suspenzija i sličnih, koje pacijent može oralno da unese. U jednom rešenju predmetnog pronalaska, vezujući molekuli koji se primenjuju na ovaj način mogu da budu formulisani sa ili bez onih nosilaca koji se obično koriste u pripremi čvrstih doznih oblika kao što su tablete i kapsule. Na primer, kapsula može da bude pripremljena tako da se aktivni sastojak preparata oslobodi u onoj tački gastrointestinalnog trakta u kojoj je biodostupnost najveća a presistemska degradacija najmanja Mogu da se uvrste i dodatna sredstva koja olakšavaju apsorpciju molekula vezujućeg sredstva Mogu da se upotrebe još i sredstva za razblaživanje, arome, voskovi niske tačke topljenja, biljna ulja, lubrikanti, sredstva za suspendovanje, sredstva za dezintegraciju tableta i vezivna sredstva.

Farmaceutski preparati za oralnu primenu mogu da se dobiju kombinovanjem aktivnih jedinjenja sa čvrstim ekscipijentom i daljom obradom dobijene smeše granula (opciono, nakon mlevenja) kako bi se dobile tablete ili srži dražeja. Mogu da se dodaju pogodna dodatna sredstva, ukoliko je to poželjno. Pogodni ekscipijenti obuhvataju ugljenohidratne ili proteinske punioce, kao što su šećeri, uključujući laktozu, saharozu, manitol i sorbitol; škrob iz kukuruza, pšenice, pirinča, krompira ili drugih biljaka; celulozu, kao što je metilceluloza, hidroksipropilmetilceluloza ili natrijum karboksimetilceluloza; gume, uključujući arabiku i tragakant; kao i proteine, kao što su želatin i kolagen. Ako je poželjno, mogu da se dodaju i sredstva za dezintegraciju ili solubilizaciju, kao što su unakrsno vezani polivinil pirolidon, agar i alginska kiselina ili njena so, kao što je natrijum alginat.

Srži dražeja mogu da se koriste zajedno sa odgovarajućim omotačima, kao što su koncentiovani rastvori soli, koji mogu da sadrže još i gumu arabiku, talk, polivinilpirolidon, karbopol gel, polietilen glikol i/ili titanijum dioksid, rastvore za lakiranje i pogodne organske rastvarače ili smeše rastvarača. Boje ili pigmenti mogu da se dodaju tabletama ili omotačima dražeja za identifikaciju proizvoda ili kako bi se označila količina aktivnog sastojka, t.j. doza.

Farmaceutski preparati koji mogu da se primene oralno takođe obuhvataju i pritisni-uklopi kapsule načinjene od želatina, kao i mekane, zatvorene kapsule od želatina i omotača, kao što je glicerol ili sorbitol. Pritisni-ukopi kapsule mogu da sadrže aktivne sastojke u smeši sa puniocima ili vezivnim sredstvima, kao što su laktoza ili škrob, lubrikantima, kao što su talk ili magnezijum stearat i, opciono, stabilizatorima. U mekih kapsula, aktivno jedinjenje može da bude rastvoreno ili suspendovano u pogodnim tečnostima, kao što su masna ulja, tečnosti ili tečni polietilen glikol sa ili bez stabilizatora.

Još jedan farmaceutski preparat može da obuhvati delotvornu količinu vezujućeg sredstva u smeši sa netoksičnim ekscipijentima koji su pogodni za proizvodnju tableta. Rastvaranjem tableta u sterilnoj vodi, ili drugim pogodnim vehikulumima, mogu da se pripreme rastvori u jediničnom doznom obliku. Pogodni ekscipijenti uključuju, ali nisu ograničeni na, inertne razblaživače, kao što su kalcijum karbonat, natrijum karbonat ili bikarbonat, laktoza, ili kalcijum fosfat; ili vezujuća sredstva, kao što su škrob, želatin, ili akacija; ili lubrikante, kao što su magnezijum stearat, stearinska kiselina ili talk.

Dodatni farmaceutski preparati će biti očigledni stručnjacima u ovoj oblasti, uključujući formulacije koje podrazumevaju molekule vezujućeg sredstva u formulacijama sa sredstvima koja omogućavaju dugotrajno ili kontrolisano oslobađanje. Tehnike za formulisanje različitih sredstava koja omogućavaju dugotrajno ili kontrolisano oslobađanje kao što su lipozomni nosioci, bio-erodibilne mikročestice ili porozne granulice i depo injekcije, takođe su poznate stručnjacima u ovoj oblasti. Videti, na primer, PCT prijavu br. PCT/US93/00829, koja opisuje kontrolisano oslobađanje iz poroznih polimernih mikročestica za dopremanje farmaceutskih preparata Dodatni primeri preparata sa dugotrajnim oslobađanjem obuhvataju i polupropustljive polimerne matrikse u obliku, na primer, filmova ili mikrokapsula. Matriksi sa dugotrajnim oslobađanjem mogu da obuhvataju poliestre, hidrogelove, polilaktide (S.A.D. 3,773,919 i EP 058,481), kopolimere L-glutaminske kiseline i gama etil- L-glutamata (Sidmanet al,Biopolimers, 22: 547 - 556 (1983)), poli (2-hidroksietil-metakrilata) (Langeret al,J Biomed. Mater. Res., 15: 167 - 277 (1981) i Langer, Chem. Tech., 12: 90 - 105 (1982)), etilen vinil acetat (Langer et al.,supra)ili poli-D(-)-3-hidroksibuternu kiselinu (EP 133,988). Preparati sa dugotrajnim oslobađanjem takođe mogu da obuhvataju lipozome, koji mogu da budu pripremljeni na bilo koji od nekoliko načina koji su poznati u struci. Videti, npr., Eppsteinet al,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3688 - 3692; EP 036,676; EP 088,046 i EP 143,949.

Farmaceutski preparat namenjen za upotrebuin vivoprimenom obično mora da bude sterilan. Ovo se može postići filtracijom kroz sterilne filtracione membrane. U slučajevima u kojima je preparat liofilizovan, sterilizacija pomoću ovog postupka može da se izvrši ili pre liofilizacije, ili nakon liofilizacije i ponovnog rastvaranja. Preparat za parenteralnu primenu može da se čuva u liofilizovanom obliku ili u obliku rastvora. Uz to, preparati za parenteralnu primenu se, uopšteno govoreći, čuvaju u sudovima u kojima je moguć sterilan prilaz, na primer, u kesi sa rastvorom za intravensku primenu ili u bočici čiji je čep moguće probušiti iglom zahipodermične injekcije.

Kada je farmaceutski preparat formulisan, može da se čuva u sterilnim bočicama u obliku rastvora, suspenzije, gela, emulzije, čvrste supstance ili dehidratisanog ili liofilizovanog praha. Ovakve formulacije mogu da se čuvaju ili u obliku koji je spreman za neposrednu upotrebu ili u obliku (npr., liofilizata) koji se ponovno rastvara (rekonstituiše) pre upotrebe.

U specifičnom rešenju, predmetni pronalazak se odnosi na komplete za dobijanje pojedinačnih doznih jedinica. Svaki od kompleta može da sadrži po jednu bočicu sa suvim proteinom i po jednu bočicu sa vodenom formulacijom. Obimom i duhom zaštite predmetnog pronalaska obuhvaćeni su i kompleti koji sadrže pojedinačne, kao i unapred napunjene špriceve sa više komora (npr., špriceve sa tečnošću i liošpriceve).

Terapije kombinovanim preparatima

U još jednom rešenju, predmetni pronalazak obezbeđuje preparat, npr., farmaceutski preparat, koji sadrži jedno ili kombinaciju humanih antitela, ili njihovih antigen vezujućih regiona prema predmetnom pronalasku, formulisanih zajedno sa farmaceutski prihvatljivim nosiocem. U još jednom rešenju, preparati sadrže kombinaciju više (npr., dva ili više) izolovanih humanih antitela ili njihovih antigen vezujućih regiona prema predmetnom pronalasku. U specifičnijem rešenju, svako od antitela, ili njihovih antigen vezujućih regiona u preparatu se vezuje za različit, prethodno određen epitop CD 148,

U jednom rešenju, humana monoklonska anti-CD148 antitela koja imaju komplementarne aktivnosti se koriste u kombinaciji, npr., kao farmaceutski preparat, koji sadrži dva ili više humanih monoklonskih anti-CD148 antitela Na primer, humano monoklonsko antitelo koje inhibira angiogenezu ili rast ćelija koje eksprimiraju CD 148 može, takođe, da se kombinuje sa humanim antitelom koje posreduje u veoma delotvornom usmrćivanju ciljnih ćelija u prisustvu efektroskih ćelija

U još jednom rešenju, predmetni pronalazak sadrži jedno ili kombinaciju bispecifičnih ili multispecifičnih molekula prema predmetnom pronalasku (npr., koji sadrže najmanje jednu specifičnost vezivanja za Fc receptor i najmanje jednu specifičnost vezivanja za CD148).

Predmetni pronalazak, stoga, obuhvata primenu antitela, ili njihovih antigen vezujućih regiona prema predmetnom pronalasku, kod istog pacijenta, u kombinaciji sa jednim ili više dodatnih pogodnih sredstava, od kojih se svako primenjuje prema režimu pogodnom za sam taj medikament. Ovim se obuhvata istovremena primena sredstva specifičnog vezivanja predmetnog pronalaska i jednog ili više pogodnih sredstava. Kada se koriste u predmetnom pronalasku, izrazi "istovremena prijava" i "istovremeno primenjen" obuhvataju suštinski simultanu primenu jednog ili više antitela prema predmetnom pronalasku i jednog ili više dodatnih pogodnih sredstava.

Kada se koristi u predmetnom pronalasku, izraz "neistovremena primena" podrazumeva primenu jednog ili više antitela ili njihovih antigen vezujućih regiona prema predmetnom pronalasku i jednog ili više dodatnih pogodnih sredstava, u različito vreme, u bilo kom redosledu, bez obzira na to da li se primene preklapaju ili ne. Ovim se obuhvataju, ali ne ograničavaju na, uzastupnu primenu (kao što je pretretman, posttretman ili preklapajući tretman) sastojaka preparata, kao i režimi u kojima se lekovi daju naizmenično, ili u kojima se jedna komponenta primenjuje dugoročno a druga(e) se primenjuju povremeno. Komponente mogu da se primenjuju u istom ili u različitim preparatima, kao i istim ili različitim putevima primene.

Terapija kombionovanim preparatima sa faktorima rasta može da obuhvata citokine, limfokine, faktore rasta, ili druge faktore hematopjeze kao što su M-CSF, GM-CSF, TNF, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IFN, TNFO, TNF1, TNF2, G-CSF, Meg-CSF, GM-CSF, trombopojetin, faktor matičnih ćelija i eritropojetin. Drugi preparati mogu da uključuju poznate angiopojetine, na primer, Ang-1, -2, -4, ~Y, i/ili humani polipeptid sličan Ang, i/ili vaskularni endotelijalni faktor rasta (VEGF). Faktori rasta obuhvataju angiogenin, morfogenetski protein kosti-1, morfogenetski protein kosti-2, morfogenetski protein kosti-3, morfogenetski protein kosti-4, morfogenetski protein kosti-5, morfogenetski protein kosti-6, morfogenetski protein kosti-7, morfogenetski protein kosti-8, morfogenetski protein kosti-9, morfogenetski protein kosti-10, morfogenetski protein kosti-11, morfogenetski protein kosti-12, morfogenetski protein kosti-13, morfogenetski protein kosti-14, morfogenetski protein kosti-15, receptor morfogenetskog proteina kosti IA, receptor morfogenetskog proteina kosti IB, neurotropni faktor dobijen iz mozga, cilijarni neurotropni faktor, receptor cilijarnog neurotropnog faktora, neutrofilni hemotaktički faktor indukovan citokinom 1, neutrofilni hemotaktički faktor indukovan citokinom 2, neutrofilni hemotaktički faktor indukovan citokinom 2, faktor rasta endotelijalnih ćelija, endotelin 1, faktor rasta epidermisa, neutrofilni atraktant izveden iz epitela, faktor rasta fibroblasta 4, faktor rasta fibroblasta 5, faktor rasta fibroblasta 6, faktor rasta fibroblasta 7, faktor rasta fibroblasta 8, faktor rasta fibroblasta 8b, faktor rasta fibroblasta 8c, faktor rasta fibroblasta 9, faktor rasta fibroblasta 10, kiseli faktor rasta fibroblasta, bazni faktor rasta fibroblasta, receptor neurotropnog faktora izvedenog iz ćelijske linije glija-1, receptor neurotropnog faktora izvedenog iz ćelijske linije glija-2, protein povezan s rastom, protein povezan s rastom-1, protein povezan s rastom-2, protein povezan s rastom-3, epidermalni faktor rasta koji vezuje heparin, faktor rasta hepatocita, receptor faktora rasta hepatocita, faktor rasta sličan insulinu I, receptor faktora rasta sličnog insulinu, faktor rasta sličan insulinu II, vezujući protein faktora rasta sličnog insulinu, faktor rasta keratinocita, faktor inhibicije leukemije, receptor faktora inhibicije leukemije-1, faktor rasta nerava, receptor faktora rasta nerava, neurotrofin-3, neurotrofin-4, faktor rasta placente, faktor rasta placente 2, faktor rasta endotelijalnih ćelija izveden iz krvnih pločica, faktor rasta izveden iz krvnih pločica, faktor rasta izveden iz krvnih pločica A lanca, faktor rasta izveden iz krvnih pločica AA, faktor rasta izveden iz krvnih pločica AB, faktor rasta izveden iz krvnih pločica B lanca, faktor rasta izveden iz krvnih pločica BB, receptor faktora rasta izvedenog iz krvnih pločica-1, receptor faktora rasta izvedenog iz krvnih pločica-2, faktor stimulacije rasta pre-B ćelija, faktor matičnih ćelija, receptor faktora matičnih ćelija, transformišući faktor rasta-1, transformišući faktor rasta-2, transformišući faktor rasta-1, transformišući faktor rasta-1.2, transformišući faktor rasta-2, transformišući faktor rasta-3, transformišući faktor rasta-5, latentni transformišući faktor rasta-1, vezujući protein I transformišućeg faktora rasta-1, vezujući protein II transformišućeg faktora rasta-I, vezujući protein III transformišućeg faktora rasta-I, receptor faktora nekroze tumora tipa I (TNF--R1), receptor faktora nekroze tumora tipa II (TNF--R2), receptor aktivatora plazminogena urokinaznog tipa, vaskularni endotelijalni faktor rasta i njihove himerne proteine i biološki ili imunološki aktivne fragmente.

Biće uzeto u obzir da antitela ili njihovi antigen vezujući regioni prema predmetnom pronalasku mogu da se primenjuju sa jednim ili većim brojem sredstava protiv zapaljenja Kada se ovde koristi, izraz "sredstva protiv zapaljenja" uopšteno se odnosi na bilo koje sredstvo koje smanjuje zapaljenje ili otok kod pacijenta. Ovde je naveden izvesan broj primera sredstava protiv zapaljenja, ali će biti uzeto u obzir da mogu da postoje dodatna pogodna sredstva protiv zapaljenja koja ovde nisu navedena, ali koja su obuhvaćena obimom i duhom zaštite predmetnog pronalaska.

Sredstvo protiv zapaljenja može da bude, na primer, jedinjenje koje inhibira interakciju citokina zapaljenja sa njihovim receptorima. Primeri inhibitora citokina korisnih u kombinaciji sa sredstvima za specifično vezivanje prema predmetnom pronalasku obuhvataju, na primer, antagoniste (kao što su antitela) TGF-beta, kao i antagoniste (kao što su antitela) usmerene protiv interleukina koji imaju ulogu u zapaljenju. Takvi interleukini su ovde opisani, a poželjno uključuju, ali nisu ograničeni na, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-9, IL-1 I, IL-12, IL-13, IL-17 i IL-18. Videti Feghali,et al,Frontiers in Biosci., 2: 12-26 (1997). Primeri atnagonista - antitela takođe obuhvataju antitela usmerena protiv glikoproteina sa ćelijske površine mase 21-28 kD CD52 (kao što je CamPath<®>, Berlex Laboratories), IL-8 (i anti-IL8-RB antitela), B-FGF (i anti-B-FGF receptor antitela), anti-TWEAK antitela (i anti-TWEAK receptor (tj., TWEAKR) antitela), anti-Adam/Dezintegrin antitela, anti-eph receptor, anti-efrin antitela i anti-PDGF-BB antitela.

Specifična antitela ili njihovi antigen vezujući regioni prema predmetnom pronalasku mogu, takođe, da budu primenjeni u kombinaciji sa inhibitorima protein Kinaze A tipa 1 kako bi se pojačala proliferacijaT ćelija kod pacijenata inficiranim HIV virusom koji primaju anti-retrovirusnu terapiju.

Faktori rasta nerava (NGF) takođe mogu da se kombinuju sa antitelima ili njihovim antigen vezujućim regionima prema predmetnom pronalasku za terapiju određenih stanja. Takva stanja obuhvataju neurodegenerativne bolesti, povrede kičmene moždine i multiplu sklerozu. Druga stanja koja mogu da se leče ovom kombinacijom su glaukom i dijabetes.

Poželjna kombinovana terapija se odnosi na antitela ili njihove antigen vezujuće regione predmetnog pronalaska koji su primenjeni kod pacijenta u kombinaciji sa jednim ili većim brojem pogodnih IL-1 inhibitora. Inhibitori IL-1 obuhvataju, ali nisu ograničeni na, receptor vezujuće peptide IL-1, antitela upravljena protiv IL-1 ili IL-1 beta ili IL-1 receptora tipa I, kao i rekombinantne proteine koji sadrže cele ili delove recepotra za IL-1 ili njegovih modifikovanih varijanti, uključujući genetski modifikovane muteine, multimerne oblike i formulacije sa produženim otpuštanjem. Specifični antagonisti obuhvataju IL-Ira polipeptide, inhibitore konvertujućeg enzima (ICE) IL-1 beta, antitela na IL-1 receptor antagonističkog tipa I, IL-1 vezujuće oblike IL-1 receptora tipa I i IL-1 receptora tipa II, antitela na IL-1, uključujući IL-1 alfa i IL-1 beta, kao i druge članove IL-1 porodice, kao i terapeutik poznat pod imenom IL-1 Trap (Regeneration). IL-Ira polipeptidi obuhvataju oblike opisane u U.S. patentu br. 5,075,222 i modifikovane oblike i varijante uključujući one opisane u U.S. patentu br. 5,922,573, WO 91/17184, WO 92 16221 i WO 96 09323. Inhibitori IL-1 konvertujućeg enzima (ICE) IL-I beta obuhvataju peptidilne i niskomolekulske inhibitore ICE uključujući one opisane u PCT patentnim prijavama WO 91/15577; WO 93/05071; WO 93/09135; WO 93/14777 i WO 93/16710; i u Evropskoj patentnoj prijavi 0 547 699. Ne-peptidilna jedinjenja uključuju ona opisana u PCT patentnoj prijavi WO 95/26958, U.S. patentu br. 5,552,400, U.S. patentu br. 6,121,266, i u Dolleet al,J. Med. Chem., 39, str. 2438-2440 (1996). Dodatni ICE inhibitori su opisani u U.S. patentnima br. 6,162,790, 6,204,261, 6,136,787, 6,103,711, 6,025,147, 6,008,217, 5,973,111, 5,874,424, 5,847,135, 5,843,904, 5,756,466, 5,656,627, 5,716,929. IL-1 vezujući oblici IL-1 receptora tipa I i IL-1 receptora tipa II opisani su u U.S. patentnima br. 4,968,607, 4,968,607, 5,081,228, Re 35,450, 5,319,071 i 5,350,683. Drugi pogodni antagonisti IL-1 obuhvataju, ali nisu ograničeni na, peptide izvedene iz IL-1 koji su u stanju da se kompetitivno vežu za IL-1 signalni receptor, IL-1 R tipa I. Dodatni saveti u pogledu određenih antagonista IL-1 (i drugih citokina) mogu da se nađu u U.S. patentu br. 6,472,179.

Uz to, pogodni su i inhibitori TNF, koji obuhvataju, ali nisu ograničeni na, receptor-vezujuće pepudne fragmente TNF-alfa, antisens nukleotide ili ribozime koji inhibiraju proizvodnju TNF-alfa, antitela usmerena protiv TNF-alfa, kao i rekombinantne proteine koji sadrže cele ili delove receptora za TNF-alfa ili njihovih modifikovanih varijanti, uključujući genetski modifikovane muteine, multimerne oblike i formulacije sa produženim otpuštanjem. Takođe su pogodni inhibitori TACE (Konvertujući enzim faktora nekroze tumora - alfa ("Tumor Necrosis Factor-alpha Converting Enzvme")), kao što su TAPI (Immunex Corp.) i GW-3333X (Glaxo Welcome Inc.). Takođe su pogodni molekuli koji inhibiraju nastanak IgA-alfa-lAT kompleksa, kao što su peptidi opusani u EP 0 614 464 B, ili antitela na ovaj kompleks. Dodatni korisni molekuli obuhvataju, ali nisu ograničeni na, disaharide koji inhibiraju TNF-alfa, sulfonovane derivate glukozamina, ili druge slične ugljene hidrate opisane u U.S. patentu br. 6,020,323. Dalji pogodni molekuli obuhvataju peptidne inhibitore TNF-alfa opisane u U.S. patentima br. 5,641,751 i 5,519,000 i peptide koji sadrže D-aminokiseline opisane u U.S. patentu br. 5,753,628. Uz to, pogodni su još i inhibitori konvertujućeg enzima TNF-alfa WO 01/03719 opisuje dalja pogodna dodatna sredstva koja mogu da se koriste u skladu sa predmetnim pronalaskom.

Dalje, pogodna jedinjenja obuhvataju, ali nisu ograničena na, male molekule kao što je talidomid ili analozi talidomida, pentoksifilin, ili inhibitore matriksne metaloproteinaze (MMP) ili druge male molekule. MMP inhibitori pogodni za ovu svrhu obuihvataju, na primer, one opisane u U.S. patentima br. 5,883,131, 5,863,949 i 5,861,510, kao i merkapto alkil peptidilna jedinjenja koja su opisana u U.S. patentu br. 5,872,146. Drugi mali molekuli koji su u stanju da smanje proizvodnju TNF-alfa obuhvataju, na primer, molekule opisane u U.S. patentima br. 5,508,300, 5,596,013 i 5,563,143. Dodatni pogodni mali molekuli obuhvataju, ali nisu ograničeni na, MMp inhibitore opisane u U.S. patentima br. 5,747,514 i 5,691,382, kao i derivate hidroksaminske kiseline kao što su oni opisani u U.S. patentu br. 5,821,262. Dalji pogodni molekuli obuhvataju, na primer, male molekule koji inhibiraju fosfodiesterazu IV i proizvodnju TNF-alfa, kao što su derivati supstituisanih oksima (WO 96/00215), sulfonamidi kinolina (U.S. patent br. 5,834,485), derivati aril furana (WO 99/18095) i heterobiciklični derivati (WO 96/01825; GB 2 291 422 A). Takođe su korisni derivati tiazola koji suprimiraju TNF-alfa i INF-gama (WO 99/15524), kao i derivati ksantina koji suprimiraju TNF-alfa i druge proinflamatorne citokine (videti, na primer, U.S. patente br. 5,118,500, 5,096,906 i 5,196,430). Dodatni mali molekuli korisni za tretman ovde opisanih stanja uključuju one opisane u U.S. patentu br. 5,547,979.

Dalji primeri lekova i tipova lekova koji mogu da se primene u terapiji kombinovanim lekovima obuhvataju, ali nisu ograničeni na, antivirusne lekove, antibiotike, analgetike (npr., acetaminofen, kodein, propoksifen napsilat, oksikodon hidrohlorid, hidrokodon bitartarat, tramadol), kortikosteroide, antagoniste citokina zapaljenja, antireumatske lekove koji modifikuju bolest ("Disease-Modifving Anti-Rheumatic Drugs", DMARD), nesteroidne antiinflamatorne lekove (NSAID) i sporodelujuće antireumatske lekove (SAARD).

Primeri antireumatskih lekova koji modifikuju bolest (DMARD) obuhvataju, ali nisu ograničeni na: Rheumatrex™ (methotreksat); Enbrel® (etanercept); Remicade®

(infliksimab); Humira™ (adalimumab); Segard® (afelimomab); Arava™ (leflunomid); Kineret™ (anakinra); Arava™ (leflunomid); D-penicilamin; Miokrizin; Plakvenil; Ridaura™ (auranofin); Solganal; lenercept (Hoffman-La Roche); CDP870 (Celltech); CDP571 (Celltech), kao i antitela opisana u EP 0 516 785 BI, U.S. patentu br. 5,656,272, EP 0 492 448 Al; onercept (Serono; CAS reg. br. 199685-57-9); MRA (Chugai); Imuran™ (azatioprin); NFKB inhibitore; Cytoxan™ (ciklofosfamid); ciklosporin; hidroksihlorkvin sulfat; minociklin; sulfasalazin; i jedninjenja zlata kao što su oralno zlato, natrijum tiomalat zlata i aurotioglukoza.

Dalji pogodni molekuli obuhvataju, na primer, rastvorne TNFR dobijene iz vanćelijskih regiona molekula TNF-alfa receptora različitih od p55 i p75 TNFR, kao što su, na primer, TNFR opisani u WO 99/04001, uključujući TNFR-Ig dobijene iz ovog TNFR. Dodatni pogodni inhibitori TNF-alfa pogodni su za upotrebu kako je ovde opisano. One obuhvataju ne samo upotrebu antitela na TNF-alfa ili TNFR kao što je ovde opisano, već i upotrebu peptida dobijenog iz TNF-alfa koji može da posluži kao kompetitivni inhibitor TNF-alfa (kao što su oni opisani u U.S. patentu br. 5,795,859 ili U.S. patentu br. 6,107,273), fuzionih proteina TNFR-IgG, kao što je onaj koji sadrži vanćelijski deo p55 TNF-alfa receptora, rastvomog TNFR različit of IgG fuzionog proteina, ili drugih molekula koji smanjuju koncentraciju endogenog TNF-alfa, kao što su inhibitori konvertujućeg enzima TNF-alfa (videti, npr., U.S. patent br. 5,594,106) ili mali molekuli ili inhibitori TNF-alfa, od kojih je određen broj ovde opisan.

U pogledu antitela na TNF, iako će doza optimalno biti određena od strane iskusnog medicinskog radnika u skladu sa specifičnim potrebama konkretnog pacijenta, jedan primer poželjnog opsega doza antitela na TNF-alfa je 0,1 do 20 mg/kg, a još poželjniji je opseg od 1 do 10 mg/kg. Još jedan poželjan opseg doza anti-TNF-alfa antitela je 0,75 do 7,5 mg/kg telesne mase.

Predmetni pronalazak takođe može da koristi sredstvo za specifično vezivanje i bilo koji, jedan ili veći broj, od nesteroidnih protivzapaljenskih lekova (NSAID). NSAID duguju svoje dejstvo, bar delimično, inhibiciji sinteze prostaglandina Goodman & Gilman, The Pharmacological Basis of Therapeutics, MacMillan 7. izdanje (1985). NSAID mogu da se podele u devet grupa: (1) derivati salicilne kiseline; (2) derivati propanske kiseline; (3) derivati sirćetne kiseline; (4) derivati fenaminske kiseline; (5) derivati karboksilne kiseline; (6) derivati buterne kiseline; (7) oksikami; (8) pirazoli; i (9) pirazoloni. Primeri NSAID obuhvataju, ali nisu ograničeni na: Anaprox™, Anaprox DS™ (naproksen natrijum); Ansaid™ (flurbiprofen); Arthrotec™ (diklofenak natrijum + mizoprostil); Cataflam.TM./Voltaren™ (diklofenak kalijum); Cfinoril™ (sulindak); Davpro™ (oksaprozin); Disalcid™ (salsalat); Dolobid™ (diflunisal); EC Naprosvn™

(naproksen natrijum); Feldene™ (piroksikam); Indocin™, Indocin SR™ (indometacin); Lodine™, Lodine XL™ (etodolak); Motrin™ (ibuprofen); Naprelan™ (naproksen); Naprosvn™ (naproksen); Orudis™, (ketoprofen); Oruvail™ (ketoprofen); Relafen™

(nabumeton); Tolectin™, (tolmetin natrijum); Trilisate™ (holin magnezijum trisalicilat); Cox-l inhibitore; Cox-2 Inhibitore kao što je Vioxx™ (rofekoksib); Arcoxia™ (etorikoksib), Celebrex™ (celekoksib); Mobic™ (meloksikam); Bextra.TM.

(valdekoksib), Dvnastat™ parakoksib natrijum, Prexige™ (lumirakoksib) i nambumeton. Dodatni pogodni NSAID obuhvataju, ali nisu ograničeni na, sledeće: epsilon.-acetamidokaprinska kiselina, S-adenozilmetionin, 3-amino-4-hidroksibutema kiselina, amiksetrin, anitrazafen, antrafenin, bendazak, bendazak lizinat, benzidamin, beprozin, broperamol, bukolom, bufezolak, ciprokvazon, kloksimat, dazidamin, deboksamet, detomidin, difenpiramid, difenpiramid, difizalamin, ditazol, emorfazon, fanetizol mezilat, fenflumizol, floktafenin, flumizol, fluniksin, fluprokvazon, fopirtolin, fosfozal, gvaimezal, gvaiazolen, izoniksirn, lefetamin HC1, leflunomid, lofemizol, lotifazol, lizin kloniksinat, mezeklazon, nabumeton, niktindol, nimezulid, orgotein, orpanoksin, oksaceprolm, oksapadol, paranilin, perizoksal, perizoksal citrat, pifoksim, piproksen, pirazolak, pirfenidon, prokvazon, proksazol, tielavin B, tiflamizol, timegadin, tolektin, tolpadol, triptamid i one označene šiframa proizvođača kao što su

480156S, AA861, AD1590, AFP802, AFP860, A177B, AP504, AU8001, BPPC, BW540C, CHINOIN 127, CN100, EB382, EL508, F1044, FK-506, GV3658, ITF182, KCNTEI6090, KME4, LA2851, MR714, MR897, MY309, ONO.sub.3144, PR823, PV102, PV108, R830, RS2131, SCR152, SH440, SIR133, SPAS510, S027239, ST281, SY6001, TA60, TAI-901 (4-benzoil-l-indankarboksilna kiselina), TVX2706, U60257, UR2301 i WY41770. Strukturno srodni NSAID koji imaju slično analgetsko i antiinflamatorno dejstvo kao NSAID takođe su obuhvaćeni ovom grupom.

Pogodni SAARD ili DMARD obuhvataju, ali nisu ograničeni na, alokupreid natrijum, auranofin, aurotioglukozu, aurotiogllikamid, azatioprin, brekvinar natrijum, bucilamin, kalcijum 3-aurotio-2-propanol-l-sulfonat, hlorambucil, hlorokvin, klobuzarit, kuproksolin, ciklofosfamid, ciklosporin, dapson, 15-deoksispergvalin, diacerein, glukozamin, soli zlata (npr., zlatna so ciklokvina, zlato natrijum tiomalat, zlato natrijum tiosulfat), hidroksihlorkvin, hidroksiurea, kebuzon, levamizol, lobenzarit, melitin, 6-merkaptopurin, metotreksat, mizoribin, mikofenolat mofetil, mioral, azotni plikavac, D-penicilamin, piridinol imidazoli kao što su SKNF86002 i SB203580, rapamicin, tioli, timopojetin i vinkristin. Strukturno srodni SAARD ili DMARD koji imaju slična analgetska ili antiinfiamatorna dejstva takođe su obuhvaćeni ovom grupom.

Inhibitori kinaza u signalnim kaskadama su takođe pogodna sredstva za kombinovanje sa sredstvom za specifično vezivanje predmetnog pronalaska Oni obuhvataju, ali nisu ograničeni na, sredstva koja su u stanju da inhibiraju P-38 (tzv. "RK" ili "SAPK-2", Leeet al,Nature, 372: 739 (1994)). P-38 je opisana kao serin/treonin kinaza (videti Hanet al,Biochimica Biophvsica Acta, 1265: 224-227

(1995)). Pokazano je se inhibitori P-38 utiču na vanćelijski stimulus i lučenje IL-1 i TNF-alfa iz ćelije, što podrazumeva blokiranje signalne transdukcije kroz inhibiciju kinaze koja učestvuje u signalnom putu.

Dodamo su korisni MK2 inhibitori, kao i tpl-2 inhibitori. Uz to, takođe su korisni i inhibitori T-ćelija, uključujući, na primer, ctla-4, CsA, Fk-506, 0X40, OX40R-Fc, 0X40 antitelo, 0X40 ligand, 0X40 ligand antitelo, lck i ZAP70. Takođe su pogodni retinoidi, uključujući oralne retinoide, kao i antagonisti TGF-beta

Dalja sredstva pogodna za kombinacije sa sredstvom za specifično vezivanje prema predmetnom pronalasku obuhvataju, na primer, bilo koji, jedan ili veći broj, od derivata salicilne kiseline, njihovih prolekova - estara ili farmaceutski prihvatljivih soli. Takvi derivati salicilne kiseline, prolekovi - estri i farmaceutski prihvatljive soli obuhvataju. acetaminosalol, aloksiprin, aspirin, benorilat, bromosaligenin, kalcijum acetilsalicilat, holin magnezijum trisalicilat difiusinal, etersalat, fendosal, gentisinsku kiselinu, glikol salicilat, imidazol salicilat, lizin acetilsalicilat, mezalamin, morfolin salicilat, 1-naftil salicilat, olsalazin, parsalmid, fenil acetilsalicilat, fenil salicilat, salacetamid, salicilamid O-sirćetnu kiselinu, salsalat i sulfasalazin. Strukturno srodni derivati salicilne kiseline koji imaju slična analgetska i antiinflamatorna dejstva takođe su obuhvaćeni ovom grupom. Dodatno pogodna sredstva obuhvataju, na primer, derivate propionske kiseline, njene prolekove - estre ili farmaceutski prihvatljive soli. Derivati propionske kiseline, njeni prolekovi - estri ili farmaceutski prihvatljive soli obuhvataju: alminoprofen, benoksaprofen, bukloksinsku kiselinu, karprofen, deksindoprofen, fenoprofen, flunoksaprofen, fluprofen, flurbiprofen, furkloprofen, ibuprofen, ibuprofen aluminijum, ibuproksam, indoprofen, izoprofen, ketoprofen; loksoprofen, miroprofen, naproksen, oksaprozin, piketoprofen, pimeprofen, pirprofen, pranoprofen, protizinsku kiselinu, piridoksiprofen, suprofen, tiaprofensku kiselinu i tioksaprofen. Strukturno srodni derivati propionske kiseline koji imaju slično analgetsko ili antiinflamatorno dejstvo takođe su obuhvaćeni ovom grupom. Za upotrebu su takođe pogodni derivati sirćetne kiseline, njeni prolekovi - estri ili farmaceutski prihvatljive soli. Derivati sirćetne kiseline, njeni prolekovi - estri i farmaceutski prihvatljive soli obuhvataju: acemetacin, alklofenak, amfenak, bufeksamak, cinmetacin, klopirak, delmetacin, diklofenak natrijum, etodolak, felbinak, fenklofenak, fenklorak, fenklozinsku kiselinu, fentiazak, furofenak, glukametacin, ibufenak, indometacin, izofezolak, izoksepak, lonazolak, metiazinsku kiselinu, oksametacin, okspinak, pimetacin, proglumetacin, sulindak, talmetacin, tiaramid, tiopinak, tolmetin, zidometacin i zomepirak. Strukturno srodni derivati sirćetne kiseline koji imaju slično alangetsko i antiinflamatorno dejstvo takođe su obuhvaćeni ovom grupom. Dalje su za ovde opisanu upotrebu korisni derivati fenaminske kiseline, njeni prolekovi - estri ili farmaceutski prihvatljive soli. Derivati fenaminske kiseline, njeni prolekovi - estri i farmaceutski prihvatljive soli obuhvataju: enfenaminsku kiselinu, etofenamat, flufenaminsku kiselinu, izoniksin, meklofenaminsku kiselinu, meklofenamat natrijum, medofenaminsku kiselinu, mefanaminsku kiselinu, nifluminsku kiselinu, talniflumat, terofenamat, tolfenaminsku kiselinu i ufenamat. Strukturno srodni derivati fenaminske kiseline koji imaju slično alangetsko i antiinflamatorno dejstvo takođe su obuhvaćeni ovom grupom

Takođe su pogodni za upotrebu derivati karboksilne kiseline, njeni prolekovi - estri ili farmaceutski prihvatljive soli i oni obuhvataju: klidanak, diflunisal, flufenisal, inoridin, ketorolak i tinoridin. Strvokturno srodni derivati karboksilne kiseline koji imaju slično alangetsko i antiinflamatorno dejstvo takođe su obuhvaćeni ovom grupom. Dodatno su pogodni derivati buteme kiseline, njeni prolekovi - estri ili farmaceutski prihvatljive soli. Derivati buteme kiseline, njeni prolekovi - estri ili farmaceutski prihvatljive soli obuhvataju: bumadizon, butibufen, fenbufen i ksenbucin. Strukturno srodni derivati buteme kiseline koji imaju slično alangetsko i antiinflamatorno dejstvo takođe su obuhvaćeni ovom grupom.

Oksikami, njihovi prolekovi - estri ili farmaceutski prihvatljive soli su takođe pogodni. Oksikami, njihovi prolekovi - estri ili farmaceutski prihvatljive soli obuhvataju: droksikam, enolikam, izoksikam, piroksikam, sudoksikam, tenoksikam i 4-hidroksil-l,2-benzotiazin 1,1-dioksid 4-(N-fenil)-karboksamid. Strukturno srodni oksikami koji imaju slično alangetsko i antiinflamatorno dejstvo takođe su obuhvaćeni ovom grupom. Pirazoli, njihovi prolekovi - estri ili farmaceutski prihvatljive soli su takođe pogodni. Pirazoli, njihovi prolekovi - estri ili farmaceutski prihvatljive soli koje mogu da se upotrebe obuhvataju: difenamizol i epirizol. Strukturno srodni pirazoli koji imaju slično alangetsko i antiinflamatorno dejstvo takođe su obuhvaćeni ovom grupom. Dalje, pogodni su i pirazaloni, njihovi prolekovi - estri ili farmaceutski prihvatljive soli. Pirazaloni, njihovi prolekovi - estri ili farmaceutski prihvatljive soli koje mogu da se upotrebe obuhvataju: apazon, azapropazon, benzpiperilon, feprazon, mofebutazon, morazon, oksifenbutazon, fenilbutazon, pipebuzon, propilfenazon, ramifenazon, suksibuzon i tiazolinobutazon. Strukturno srodni pirazaloni koji imaju slično alangetsko i antiinflamatorno dejstvo takođe su obuhvaćeni ovom grupom.

Takođe su pogodni prolekovi - estri ili njihove farmaceutski prihvatljive soli za lečenje bolesti u kojima posreduje TNF. Kortikosteroidi, njihovi prolekovi - estri ili farmaceutski prihvatljive soli obuhvataju hidrokortizon i jedinjenja koja su izvedena iz hidrokortizona, kao što su 21-acetoksi-pregnenoIon, alklomerason, algeston, amcinonid, beklometazon, beta-metazon, betametazon valerat, budezonid, hloroprednizon, klobetazol, klobetazol propionat, klobetazon, klobetazon butirat, klokortolon, kloprednol, kortikosteron, kortizon, kortivazol, deflazakon, desonid, dezokskimerazon, deksametazon, diflorazon, diflukortolon, difluprednat, enoksolon, fluazakort, flukloronid, flumetazon, flumetazon pivalat, flunizolid, flucinolon acetonid, fluocinonid, fluorocinolon acetonid, fluokortin butil, fluokortolon, fluorokortolon heksanoat, diflukortolon valerat, fluorometolon, fluperolon acetat, flupredniden acetat, fluprednizolon, flurandenolid, formokortal, halcinomd, halometazon, halopredon acetat, hidrokortamat, hidrokortizon, hidrokortizon acetat, hidro-kortizon butirat, hidrokortizon fosfat, hidrokortizon 21-natrijum sukcinat, hidrokortizon tebutat, mazipredon, medrizon, meprednizon, metilprednikolon, mometazon furoat, parametazon, prednikarbat, prednizolon, prednizolon 21-diedriaminoacetat, prednizolon natrijum fosfat, prednizolon natrijum sukcinat, prednizolon natrijum 21-m-sulfobenzoat, prednizolon natrijum 21-stearoglikolat, prednizolon tebutat, prednizolon 21-trimetilacetat, prednizon, prednival, predniliden, predniliden 21-dietilaminoacetat, tiksokortol, triamcinolon, triamcinolon acetonid, tnamcinolon benetonid i triamcinolon heksacetonid. Strukturno srodni kortikosteroidi koji imaju slično alangetsko i antiinflamatorno dejstvo takođe su obuhvaćeni ovom grupom

Antimikrobna sredstva (i njihovi prolekovi - estri ili farmaceutski prihvatljive soli) takođe su pogodni za upotrebu u kombinacijama kao što je ovde opisano. Pogodna antimikrobna sredstva obuhvataju, na primer, ampicilin, amoksicilin, aureomicin, bacitracin, ceftazidim, ceftriakson, cefotaksim, cefahlor, cefaleksin, cefradin, ciprofloksacin, klavulinsku kiselinu, kloksacilin, dikloksacilan, eritromicin, fluidoksacilan, gentamicin, gramicidin, meticilan, neomicin, oksacilan, penicilin i vankomicin. Strukturno srodna antimikrobna sredstva koja imaju slično alangetsko i antiinflamatorno dejstvo takođe su obuhvaćeni ovom grupom

Dodatna pogodna jedinjenja obuhvataju, ali nisu ograničena na: BN 50730; tenidap; E 5531; tiapafant PCA 4248, nimezulid; panavir; rolipram; RP 73401; peptid T; MDL 201,449A; (lR,3S)-Cis-l-[9-(2,6-diamin-opurirul)]-3-hidroksi-4-ciklopenten hidrohlond; (11^3R)-trans-l-[9-(2,6-diamino)purinJ-3-acetoksiciklopentan; (1R,3R)-trans-l-[9-adenil)-3-azido-ciklopentan hidrohlorid i (lR,3R)-trans-l-[6-hidroksi-purin-9-il)-3-azidociklopentan.

Pronađeno je da IL-4 može da izazove zapaljenski efekat u nekim slučajevima, kao što je astma, u kojim preterana ekspresija IL-4 u plućima izaziva hipertrofiju ćelija epitela i nagomilavanje limfocita, eozinofila i neutrofila. Ovakav odgovor dobro predstavlja glavne odlike prozapaljenskog odgovora pokrenutog drugim Th2 citokinima. Kao što je prethodno naznačeno, inhibitori IL-4 su takođe korisni prema predmetnom pronalasku. Uz to, biće uzeto u obzir da određeni imunosupresivni lekovi takođe mogu da se koriste u lečenju artritisa, uključujući, ali se ne ograničavajući na inhibitore iNOS i 5-lipoksigenaze.

Pokazano je da đumbir ima određena antiinflamatorna svojstva, te je stoga pogodan za upotrebu kao antiinflamatorno sredstvo prema predmetnom pronalasku, kao što je i hondroitin.

Farmaceutski preparati predmetnog pronalaska mogu da se primene u terapiji kombinacijom lekova, t.j. u kombinaciji sa drugim sredstvima i terapijama, u terapiji bolesti koje su povezane sa aktivacijom CD 148. Antitela i antigen vezujući regioni prema predmetnom pronalasku mogu takođe da se koriste u kombinaciji sa drugim sredstvima i terapijama u lečenju kancera i tumora. Takva sredstva obuhvataju, ali nisu ograničena na,in vitrosintetički pripremljene hemijske preparate, antitela, antigen vezujuće regione, radionuklide kao i njihove kombinacije i konjugate. Sredstvo može da bude agonist, antagonist, alosterični modulator, toksin, ili, još uopštenije, može da deluje tako da inhibira ili stimuliše svoj ciljni molekul (npr., aktivacija ili inhibicija receptora ili enzima) i time podstiče ćelijsku smrt ili zaustavlja rast ćelija. Druge terapije takođe obuhvataju, na primer, radijacionu terapiju, hemoterapiju i ciljne terapije anti-tumorskim sredstvima, i si. U konkretnom rešenju, humana anti-CD148 antitela ili njihovi antigen vezujući fragmenti mogu da se primene u kombinaciji sa jednim ili većim brojem terapeutskih sredstava, npr., anti-angiogenetskim sredstvom, anti-neoplastičnim sredstvom, hemoterapeutikom, imunosupresivnim sredstvom, antiinfiamatornim sredstvom, ili sredstvom protiv psorijaze. Humana anti-CD148 ili njihovi antigen-vezujući fragmenti, takođe, mogu da se primene u kombinaciji sa drugim poznatim terapijama, kao što su fizičke terapije, npr., radijaciona terapija, hipertermija, transplantacija (npr., presađivanje koštane srži), hirurške intervencije, terapija sunčevom svetlošću ili fototerapija. Dodatne kombinovane terapije koje nisu ovde eksplicitno navedene takođe su obuhvaćene opsegom i duhom zaštite predmetnog pronalaska

Primeri anti-neoplastičnih sredstava uključuju, na primer, doksorubicin (adriamicin), cisplatin bleomicin sulfat, karmustatin, hlorambucil i ciklofosfamid ureu, koji su, sami po sebi, delotvorni jedino u koncentracijama koje su toksične ili subtoksične za pacijenta. Cisplatin se primenjuje intravenski u dozi od 100 mg/m<2>jednom u Četiri nedelje, dok se adriamicin primenjuje intravenski u dozi od 60 do 75 mg/m<2>jednom u svakih 21 dan. Drugi primeri antitumorskih sredstava uključuju HERCEPTIN™ (trastuzumab), koji može da se koristi za lečenje kancera dojke i drugih vrsta kancera i PJTUKSAN™ (rituksimab), ZEVALIN™ (ibritumomab tiuksetan) i LVMPHOCIDE™ (epratuzumab), koji može da se koristi za terapiju ne-Hodžginsovog limfoma i drugih oblika kancera, GLEEVAC™ koji može da se koristi za terapiju hronične mijeloidne leukemije i gastrointestinalnih tumora strome i BEXXAR™ (jod 131 tositumomab) koji može da se koristi za terapiju ne-Hodžginsovog limfoma.

Druga anti-neoplastična sredstva koja mogu da se koriste u kombinovanoj hemoterapiji obuhvataju, na primer, sredstva za alkilovanje, uključujući: azotne plikavce, kao što su mehloretamin, ciklofosfamid, ifosfamid, melfalan i hlorambucil; nitrozouree kao što su karmustin (BCNU), lomustin (CCNU) i semustin (metil-CCNU); etilenirnine/metilmelamin kao što su trietilenmelamin (TEM), trietilen, tiofosforamid (tiotepa), heksametilmelamin (HMM, altretamin); alkil sulfonate kao što je busulfan; triazine kao što je dakarbazin (DTIC); antimetabolite uključujući analoge folne kiseline kao što su metotreksat i trimetreksat, analoge pirimidina kao što .je 5-fluoruracil, fluordeoksiuridin, gemcitabin, citozin arabinozid (AraC, citarabin), 5-azacitidin, 2,2'-difluordeoksicitidin-, analoge purina kao što su 6-merkaptopurin, 6-tioguanin, azatioprin, 2'-deoksikoformicin (pentostatin), eritrohidroksinoniladenin (EHNA), fludarabin fosfat i 2-hlordeoksiadenozin (kladribin, 2-CdA); prirodne proizvode uključujući antimitotičke lekove kao što su paklitaksel, vinka alkaloide uključujući vinblastin (VLB), vinkristin i vinorelbin, taksoter, estramustin i estramustin fosfat; pipodofilotoksine kao što su etopozid i tenipozid; antibiotike kao što su aktimomicin D, daunomicin (rubidomicin), doksorubicin, mitoksantron, idarubicin, bleomicini, plikamicin (mitramicin), mitomicinC i aktinomicin; enzime kao što je L-asparaginaza; modifikatore biološkog odogovora kao što su interferon-alfa, IL-2, G-CSF i GM-CSF; različita sredstva uključujući koordinativne komplekse platine kao što su cisplatin i karboplatin, antracenedione kao što je mitoksantron, supstituisane uree kao što je hidroksiurea, derivate metilhidrazina uključujući N-metilhidrazin (M1H) i prokarbazin, adrenokortikalne supresore kao što su mitotan (o,p'-DDD) i aminoglutetimid; hormone i antagoniste uključujući adrenokortikosteroidne antagoniste kao što su prednizon i ekvivalenti, deksametazon i aminoglutetimid; progestine kao što su hidroksiprogesteron kaproat, medroksiprogesteron acetat i megestrol acetat; estrogene kao što su dietilstilbestrol i ekvivalenti etinil estradiola; antiestrogene kao što je tamoksifen; androgene uključujući testosteron propionat i fluoksimesteron/ekvivalente; antiandrogene kao što su flutamid, analozi gonadotropin-oslobadaj ućeg hormona i leuprolid; kao i nesteroidne antiandrogene kao što je flutamid.

Primeri anti-angiogenetskih sredstava uključuju ERBITUX™ (IMC-C225), KDR (receptor kinaznog domena) inhibitore (npr., antitela i antigen vezujuće regione koji se specifično vezuju za receptor kinaznog domena), anti-VEGF sredstva (npr., antitela i antigen vezujuće regione koji se specifično vezuju za VEGF, ili rastvorne VEGF receptore ili njihove ligand vezujuće domene) kao što su AVASTIN™ ili VEGF-TRAP™ kao i sredstva protiv VEGF receptora (npr., antitela i antigen vezujuće regione koji se specifično vezuju za njega), EGFR inhibitore (npr, antitela i antigen vezujuće regione koji se specifično vezuju za njega) kao što su ABX-EGF (panitumumab), IRESSA™ (gefitinib), TARCEVA™ (erlotinib), anti-Angl i anti-Ang2 sredstva (npr., antitela i antigen vezujuće regione koji se specifično vezuju za njih ili njihove receptore npr., Tie2/Tek), kao i inhibitore anti-Tie-2 kinaze (npr., antitela i antigen vezujuće regione koji se specifično vezuju za nju). Farmaceutski preparati predmetnog pronalaska mogu, još, da obuhvataju jedno ili veći broj sredstava (npr., antitela, antigen vezujuće regione, ili rastvorne receptore) koji specifično vezuju i inhibiraju aktivnost faktora rasta kao što su antagonisti faktora rasta hepatocita (HGF, takođe poznat kao faktor rasipanja) i antitela i antigen vezujuće regione koji se specifično vezuju za njegov receptor "c-met".

Druga anti-angiogenetska sredstva obuhvataju Campath, IL-8, B-FGF, Tek antagoniste (Cerettiet al,U.S. publikacija br. 2003/0162712; U.S. patent br. 6,413,932), anti-TWEAK sredstva (npr., antitela ili antigen vezujući regione koji se specifično vezuju, ili rastvorne antagoniste TWEAK receptora; videti, Wiley, U.S. patent br. 6,727,225), dizintegrinske domene ADAM za antagonizaciju vezivanja integrina za njegove ligande (Fanslovvet al,U.S. publikacija br. 2002/0042368), specifično vezujući anti-eph receptor i/ili anti-efrinska antitela ili antigen vezujući regioni (U.S. patent br. 5,981,245; 5,728,813; 5,969,110; 6,596,852; 6,232,447;

6,057,124 i članove njihovih patentnih familija), kao i anti-PDGF-BB antagoniste (npr., antitela ili antigen vezujuće regione koji se specifično vezuju) kao i antitela ili antigen vezujuće regione koji se specifično vezuju za PDGF-BB ligande, i inhibitore PDGFR kinaze (npr., antitela i antigen vezujuće regione koji se specifično vezuju za nju). Drugi primeri anti-angiogenetskih sredstava obuhvataju antagoniste Ang-1 i CD148 (i njihovih receptora), VEGF (Avastin, VEGF-TRAP, itd.), VEGF receptore, i IL-8, B-FGF, i male molekule inhibitore KDR i drugih posrednika angiogeneze.

Dodatna anti-angiogenetska/anti-tumorna sredstva uključuju: SD-7784 (Pfizer, SAD); cilengitid (Merck KGaA, Nemačka, EPO 770622); pegaptanib oktanatrijum (Gilead Sciences, SAD); Alfastatin (BioActa, Velika Britanija); M-PGA (Celgene, SAD, US 5712291); ilomastat, (Arriva, SAD, US 5892112); emaksanib (Pfizer, SAD, US 5792783); vatalanib (Novartis, Švajcarska); 2-metoksiestradiol (EntreMed, SAD); TLC ELL-12 (Elan, Irska); anekortav acetat (Alcon, SAD); alfa-D148 Mab (Amgen, SAD); CEP-7055 (Cephalon, SAD); anti-Vn Mab (Crucell, Holandija) DAC: antiangiogenetik (ConjuChem, Kanada); Angiocidin (InKine Pharmaceutical, SAD); KM-2550 (Kyowa Hakko, Japan); SU-0879 (Pfizer, SAD); CGP-79787 (Novartis, Švajcarska, EP 970070); ARGENT tehnologija (Ariad, SAD); YIGSR-Stealth (Johnson & Johnson, SAD); framgment fibrinogena-E (BioActa, Velika Britanija); inhibitor angiogeneze (Trigen, Velika Britanija); TBC-1635 (Encysive Pharmaceuticals, SAD); SC-236 (Pfizer, SAD); ABT-567 (Abbott, SAD); Metastatin (EntreMed, SAD); inhibitor angiogeneze, (Tripep, Švedska); maspin (Sosei, Japan); 2-metoksiestradiol (Oncology Sciences Corporation, SAD); ER-68203-00 (IVAX, SAD); Benefin (Lane Labs, SAD); Tz-93 (Tsumura, Japan); TAN-1120 (Takeda, Japan); FR-111142 (Fujisawa, Japan, JP 02233610); faktor krvnih pločica 4 (RepliGen, SAD, EP 407122); antagonist faktora rasta vaskularnog endotela (Borean, Danska); terapija kancera (University of South Carolina, SAD); bevacizumab (pINN) (Genentech, SAD); inhibitori angiogeneze (SUGEN, SAD); XL 784 (Exelixis, SAD); XL 647 (Exelixis, SAD); MAb, alfa5beta3 integrin, druge generacije (Applied Molecular Evolution, SAD & Medlmmune, SAD); genska terapija, retinopatija (Oxford BioMedica, Velika Britanija); enzastaurin hidrohlorid (USAN) (Lilly, SAD); CEP 7055 (Cephalon, SAD & Sanofi-Synthelabo, France); BC 1 (Genoa Institute of Cancer Research, Italija); inhibitor angiogeneze (Alchemia, Australija); VEGF antagonist (Regeneron, SAD); rBPI 21 i antiangjogenetici izvedeni iz BPI (XOMA, SAD); PI 88 (Progen, Australija); cilengitid (pINN) (Merck KGaA, Nemačka; Munich Technical University, Nemačka, Scripps Clinic and Research Foundation, SAD); cetuksimab (INN) (Aventis, Francuska); AVE 8062 (Ajinomoto, Japan); AS 1404 (Cancer Research Laboratorv, Novi Zeland); SG 292 (Telios, SAD); Endostatin (Boston Childrens Hospital, SAD); ATN 161 (Attenuon, SAD); ANGIOSTATIN (Boston Childrens Hospital, SAD); 2-metoksiestradiol (Boston Childrens Hospital, SAD); ZD 6474 (AstraZeneca, Velika Britanija); ZD 6126 (Angiogene Pharmaceuticals, Velika Britanija); PPI 2458 (Praecis, SAD); AZD 9935 (AstraZeneca, Velika Britanija); AZD 2171 (AstraZeneca, Velika Britanija); vatalanib (pINN), (Novartis, Švajcarska & Schering AG, Nemačka): inhibitori puta tkivnog faktora (EntreMed, SAD); pegaptanib (Pinn) (Gilead Sciences, SAD); ksantorizol (Yonsei University, Južna Koreja); vakcina, zasnovana na genima, VEGF-2 (Scripps Clinic and Research Foundation, SAD); SPV5.2 (Supratek, Kanada); SDX 103 (Universitv of Califomia at San Diego, SAD); PX 478 (ProlX, SAD); METASTATIN (EntreMed, SAD); troponin I (Harvard University, SAD); SU 6668 (SUGEN, SAD); 0X1 4503 (OXiGENE, SAD); o-guanidini (Dimensional Pharmaceuticals, SAD); motuporamin C (British Columbia Universitv, Kanada); CDP 791 (Celltech Group, Velika Britanija); atiprimod (pINN) (GlaxoSmithKline, Velika Britanija); E 7820 (Eisai, Japan); CYC 381 (Harvard Universitv, SAD); AE 941 (Aeterna, Kanada); vakcina, angiogeneza (EntreMed, SAD); inhibitor aktivatora urokinaze plazminogena (Dendreon, SAD); oglufanid (pINN) (Melmotte, SAD); HTF-lalfa inhibitori (Xenova, Velika Britanija); CEP 5214 (Cephalon, SAD); BAY RES 2622 (Bayer, Nemačka); Angiocidin (InKine, SAD); A6 (Angstrom, SAD); KR 31372 (Korea Research Institute of Chemical Technologv, Južna Koreja); GW 2286 (GlaxoSmithKline, Velika Britanija); EHT 0101 (ExonHit, Francuska); CP 868596 (Pfizer, SAD); CP 564959 (OSI, SAD); CP 547632 (Pfizer, SAD); 786034 (GlaxoSmithKline, Velika Britanija); KRN 633 (Kirin Brewery, Japan); Sistem dopremanja leka, intraokularni, 2-metoksiestradiol (EntreMed, SAD); angineks (Maastricht University, Holandija & Minnesota University, SAD); ABT 510 (Abbott, SAD); AAL 993 (Novartis, Švajcarska); VEGI (ProteomTech, SAD); inhibitori faktora nekroze tumora - alfa (National Institute on Aging, SAD); SU 11248 (Pfizer, SAD & SUGEN SAD); ABT 518 (Abbott, SAD); YH16 (Yantai Rongchang, Kina); S-3APG (Boston Childrens Hospital, SAD & EntreMed, SAD); MAb KDR, (ImClone Systems, SAD); MAb alfa5 betal (Protein Design, SAD); inhibitor KDR kinaze (Celltech Group, Velika Britanija & Johnson & Johnson, SAD); GFB 116 (South Florida Universitv, SAD & Yale University, SAD); CS 706 (Sankyo, Japan); kombretastatin A4 prolek (Arizona State University, SAD); hondroitinazu AC (IBEX, Kanada); BAY RES 2690 (Bayer, Nemačka); AGM 1470 (Harvard University, SAD, Takeda, Japan & TAP, SAD); AG 13925 (Agouron, SAD); Tetratiomolibdat (University of Michigan, SAD); GCS 100 (Wayne State University, SAD) CV 247 (Ivy Medical, Velika Britanija); CKD 732 (Chong Kun Dang, Južna Koreja); MAb faktora rasta vaskularnog endotela (Xenova, Velika Britanija); irsogladin (INN) (Nippon Shinyaku, Japan); RG 13577 (Aventis, Francuska); WX 360 (Wilex, Nemačka); skvalamin (pINN) (Genaera, SAD); RPI 4610 (Sirna, SAD); terapija kancera (Marinova, Australija); inhibitori heparanaze (InSight, Izrael); KL 3106 (Kolon, Južna Koreja); Honokiol (Emory University, SAD); ZK CDK (Schering AG, Nemačka); ZK Angio (Schering AG, Nemačka); ZK 229561 (Novartis, Švajcarska, & Schering AG, Nemačka); XMP 300 (XOMA, SAD); VGA 1102 (Taisho, Japan); modulatori VEGF receptora (Pharmacopeia, SAD); antagoniste VE-kaderin-2 (ImClone Systems, SAD); Vazostatin (National Institutes of Health, SAD); vakcinu, Flk-1 (ImClone Systems, SAD); TZ 93 (Tsumura, Japan); TumStatin (Beth Israel Hospital, SAD); skraćeni rastvorni FLT 1 (faktor rasta vaskularnog endotela 1) (Merck & Co, SAD); Tie-2 ligande (Regeneron, SAD); inhibitor trombospondina 1 (Allegheny Health, Education and Research Foundation, SAD).

Farmaceutski preparati predmetnog pronalaska mogu takođe da obuhvataju jedan ili veći broj inhibitora sredstava faktora rasta, kao što su antagonisti faktora rasta hepatocita (HGF, takođe poznat kao faktor rasipanja, i njegovog receptora "c-met").

Efektorske ćelije specifične za ciljne ćelije, npr., efektorske ćelije vezane za preparate (npr., humana antitela, multispecifične i bispecifične molekule) predmetnog pronalaska mogu, takođe, da se koriste kao terapeutska sredstva Efektorske ćelije za ciljanje mogu da budu humani leukociti kao što su makrofagi, neutrofili ili monociti. Druge ćelije obuhvataju eozinofile, ćelije prirodne ubice i druge ćelije koje nose receptore za IgG ili IgA. Ukoliko je to poželjno, efektorske ćelije mogu da se dobiju iz pacijenta kome je namenjena terapija Efektorske ćelije specifične za ciljne ćelije mogu da se primene kao suspenzija ćelija u fiziološki prihvatljivom rastvoru. Broj ćelija koje će biti primenjene može da bude u redu veličine od IO<8>do IO<9>ali će se razlikovati u zavisnosti od svrhe terapije. Uopšteno govoreći, količina će biti dovoljna da se postigne lokalizacija oko ciljne ćelije, npr., tumora koji eksprimira CD148 i da se izvrši usmrćivanje pomoću, npr., fagocitoze. Putevi primene takođe mogu da se razlikuju.

Terapija efektorskim ćelijama specifičnim za ciljnu ćeliju može da se primeni zajedno sa drugim tehnikama uklanjanja ciljnih ćelija. Na primer, anti-tumorska terapija korišćenjem preparata (npr., humanih antitela, multispecifičnih i bispecifičnih molekula) predmetnog pronalaska i/ili efektorskih ćelija koje nose ove preparate može da se koristi zajedno sa hemoterapijom. Uz to, kombinovana imunoterapija može da se koristi kako bi se prema odbacivanju tumorskih ćelija usmerile dve različite populacije citotoksičnih efektorskih ćelija Na primer, andti-CD148 antitela vezana za FcyRJ ili anti-CD3 mogu da se koriste zajedno sa vezujućim sredstvima specifičnim za IgG ili IgA receptor.

Bispecifični i multispecifični molekuli predmetnog pronalaska mogu, takođe, da se koriste za modulaciju koncentracija FcaR ili FcyR na efektorskim ćelijama, kao, na primer, pokrivanjem i uklanjanjem receptora sa površine ćelije. Smeše anti-Fc receptora takođe mogu da se koriste u ove svrhe.

Preparati (npr., humana antitela, multispecifični i bispecifični molekuli) predmetnog pronalaska koji imaju mesta za vezivanje komplementa, kao što su delovi IgGl, IgG2, IgG3 ili IgM koji vezuju komplement, takođe mogu da se koriste u prisustvu komplementa. U jednom rešenju,ex vivoterapija populacije ćelija koja sadrži ciljne ćelije vezujućim sredstvom predmetnog pronalaska i odgovarajućim efektorskim ćelijama može da se dopuni dodavanjem komplementa ili seruma koji sadrži komplement. Fagocitoza ciljnih ćelija obloženih vezujućim sredstvom predmetnog pronalaska može da se poboljša vezivanjem proteina komplementa U još jednom rešenju ciljne ćelije obložene preparatima (npr., humanim antitelima, multispecifičnim i bispecifičnim molekulima) predmetnog pronalaska mogu, takođe, da budu lizirane komplementom. U još jednom rešenju, preparati predmetnog pronalaska ne aktiviraju komplement.

Preparati (npr., humana antitela, multispecifični i bispecifični molekuli) predmetnog pronalaska mogu, takođe, da se primene zajedno sa komplementom. Shodno tome, duhom i opsegom zaštite predmetnog pronalaska obuhvaćeni su preparati koji sadrže humana antitela, multispecifične ili bispecifične molekule i serum ili komplement. Ovi preparati imaju tu prednost u tome što se komplement nalazi u neposrednoj blizini humanih antitela, multispecifičnih ili bispecifičnih antitela. Alternativno, humana antitela, multispecifični i bispecifični molekuli predmetnog pronalaska i serum ili komplement mogu da se primene odvojeno.

Opsegom i duhom zaštite predmetnog pronalaska obuhvaćeni su i kompleti koji sadrže preparate (npr., humana antitela, multispecifične i bispecifične molekule) predmetnog pronalaska i uputstvo za upotrebu. Komplet dalje može da sadrži najmanje jedno dodatno sredstvo, kao što je komplement, ili jedno ili veći broj dodatnih antitela predmetnog pronalaska (npr., humano antitelo koje ima komplementarnu aktivnost i vezuje epitop u CD148 antigenu potpuno različit od onog koji vezuje prvo humano antitelo).

U drugim rešenjima, pacijent može dodatno da bude tretiran sredstvom koje modulira, npr., pojačava ili inhibira, aktivnost ili ekspresiju Fca ili Fcy receptora, na primer, pacijent se tretira citokinom. Citokini koje je poželjno primeniti tokom terapije multispecifičnim molekulom obuhvataju faktor stimulacije kolonije granulocita (G-CSF), faktor stimulacije kolonija granulocita - makrofaga (GM-CSF), interferon gama (IFN-y) i faktor nekroze tumora (TNF).

U još jednom rešenju, pacijent može dodatno da bude tretiran preparatom limfokina. Ćelije kancera koje ne eksprimiraju CD148 u velikoj meri mogu da budu podstaknute da to čine pomoću preparata limfokina. Preparati limfokina, takođe, mogu da izazovu ujednačeniju ekspresiju CD148 među ćelijama tumora, što može da dovede do povećanja delotvornosti terapije. Preparati limfokina koji su pogodni za primenu obuhvataju interferon gama, faktor nekroze tumora i njihove kombinacije. Oni mogu da se primene intravenski. Pogodne doze limfokina su 10000 do 1000000 jedinica/pacijentu.

Preparati (npr., humana antitela, multispecifični i bispecifični molekuli) predmetnog pronalaska mogu, takođe, da se upotrebe u ciljanju ćelija koje eksprimiraju FcyR ili CD148, na primer, za obeležavanje takvih ćelija. Za takvu upotrebu, vezujuće sredstvo može da bude vezano za molekul koji je moguće detektovati. Stoga, predmetni pronalazak obezbeđuje postupke zaex vivoiliin vitrolokalizaciju ćelija koje eksprimiraju Fc receptore, kao što su FcyR ili CD 148. Obeleživač koji je moguće detektovati može da bude, npr., radioizotop, fluorescentno jedinjenje, enzim ili kofaktor enzima.

U jednom rešenju, predmetni pronalazak obezbeđuje postupke otkrivanja prisustva CD148 antigena u uzorku, ili merenja količine CD 148 antigena, koji podrazumevaju dovođenje uzorka, kao i kontrolnog uzorka, u dodir sa humanim monoklonskim antitelom ili njegovim antigen vezujućim regionom, koji se specifično vezuje za CD148, pod uslovima koji omogućavaju nastanak kompleksa između antitela ili njegovog dela i CD148. Potom se otkriva nastanak kompleksa, gde je razlika u nastanku kompleksa u ispitivanom uzorku, u poređenju sa nastankom kompleksa u kontrolnom uzorku pokazatelj prisustva CD 148 antigena u uzorku.

U još jednom rešenju, predmetni pronalazak obezbeđuje postupak otkrivanja prisustva ili kvantifikovanja količine ćelija koje eksprimiraju Fcin vivoiliin vitro.Postupak podrazumeva (i) primenu preparata (npr., multi- ili bispecifičnog molekula) predmetnog pronalaska ili njegovog fragmenta, konjugovanog za marker za detekciju; (ii) izlaganje pacijenta načinu detekcije datog markera za detekciju kako bi se identifikovale oblasti koje sadrže ćelije koje eksprimiraju Fc.

Upotreba i postupci predmetnog pronalaska

Predmetni pronalazak obezbeđuje antitela ili njihove antigen vezujuće regione koji se vezuju za epitope CD148 koji su korisni u terapiji bolesti i patoloških stanja ljudi. Sredstva koja pokreću aktivnost CD148, ili druge ćelijske aktivnosti, mogu da se koriste u kombinaciji sa drugim terapeutskim sredstvima da bi se njihovo terapeutsko dejstvo pojačalo, ili da bi se smanjili mogući neželjeni efekti.

U jednom rešenju, predmetni pronalazak obezbeđuje reagense i postupke korisne u terapiji bolesti i stanja koje se odlikuju neželjenim ili poremećenim nivoima CD 148 aktivnosti u ćeliji. Ove bolesti obuhvataju kancer i druga hiperproliferativna stanja, kao što su hiperplazija, psorijaza, kontaktni dermatitis, imunološki poremećaji i neplodnost.

Preparati (npr., humana antitela, multispecifični i bispecifični molekuli) predmetnog pronalaska mogu prvo da se ispitaju na aktivnost vezivanja kojaje u vezi sa terapeutskom ili dijagnostičkom upotrebomin vitro.Na primer, preparati predmetnog pronalaska mogu da se ispitaju pomoću ELISA testa i testova protočne citometrije koji su ovde opisani. Štaviše, može da se ispita aktivnost ovih molekula u pokretanju najmanje jedne aktivnosti efektorske ćelije posredovane efektorom, uključujući citolizu ćelija koje eksptimiraju CD148. Protokoli ispitivanja fagocitoze posredovane efektorskim ćelijama opisani su u daljem izlaganju.

Preparati (npr., humana antitela, multispecifični i bispecifični molekuli) predmetnog pronalaska imaju dodatnu upotrebnu vrednost u terapiji i dijagnostifikovanju bolesti povezanih sa CD148. Na primer, humana monoklonska antitela, multispecifični i bispecifični molekuli mogu da se koriste za podsticanje defosforilacije pokrenute od strane CD148 u ćeliji koja eksprimira CD148, zainhibiciju rasta ćelije koja eksprimira CD148 ili za inhibiciju angiogeneze ćelije koja eksprimira CD 148. Anti-CD148 antitela prema predmetnom pronalasku mogu da budu korisna u lečenju bilo koje bolesti zavisne od angiogeneze, obuhvatajući, ali se ne ograničavajući na, okularne neovaskularizacije, kao što su retinopatije (uključujući dijabetsku retinopatiju), srodnu makularnu degradaciju, psorijazu, hemangioblastom, hemangiom, arteriosklerozu, zapaljenske bolesti, kao što su reumatoidne ili reumatske zapaljenske bolesti, posebno artritis (uključujući reumatoidni artritis), ili druge hronične zapaljenske poremećaje, kao što su hronična astma, arterijska ili posttransplantaciona arterioskleroza, endometrioza, kao i neoplastične bolesti, na primer, takozvane solidne tumore i tečne (ili hematopojetične) tumore (kao što su leukemije i limfomi). Druge bolesti povezane sa nepoželjnom angiogenezom biće poznate stručnjacima u ovoj oblasti.

U konkretnom rešenju, humana antitela i njihovi derivati koriste sein vivoza terapiju, prevenciju ili dijagnozu mnoštva različitih neoplastičnih bolesti povezanih sa CD 148. Primeri bolesti povezanih sa CD 148 obuhvataju mnoštvo različitih kancera, kao što su kancer bešike, dojke, materice/grlića materice, debelog creva, pankreasa, kolorektuma, bubrega, želuca, jajnika, prostate, bubrežnih ćelija, skvamocelarni, pluća (nesitnoćelijski), jednjaka i kancer glave i vrata

Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje postupak terapije kancera kod životinja, uključujući ljude, koji podrazumeva primenu, kod životinje, količine antitela ili njegovog antigen vezujućeg regiona delotvome u inhibiciji rasta ćelija kancera, obuhvatajući procese proliferacije ćelija, invazivnosti i metastaza u biološkim sistemima. Postupci obuhvataju upotrebu jedinjenja predmetnog pronalaska kao inhibitora rasta ćelija kancera Poželjno je da se postupci koriste za inhibiciju ili smanjenje rasta ćelija kancera, invazivnosti, metastaza ili učestalosti pojave tumora kod živih životinja, kao što su sisari. Sisari obuhvataju, na primer, ljude i druge primate, kao i životinje kućne ljubimce kao što su psi i mačke, laboratorijske životinje kao što su pacovi, miševi i zečevi, i domaće životinje kao što su konji, svinje, ovce i goveda

Tumori ili neoplazme obuhvataju rast tkivnih ćelija u kome je umnožavanje ćelija nekontrolisano i progresivno. Neke takve izrasline su dobroćudne, dok su druge nazvane zloćudnim i mogu da dovedu do smrti organizma. Maligne neoplazme ili kanceri se razlikuju od dobroćudnih izraslina po tome što, osim što pokazuju agresivnu ćelijsku proliferaciju, mogu da izvrše invaziju u okolna tkiva i da metastaziraju. Štaviše, maligne neoplazme se odlikuju većim gubitkom diferencijacije (pokazuju veću diferencijaciju) i organizacije u odnosu jedna prema drugoj kao i u odnosu na okolna tkiva Ova osobina naziva se još i "anaplazija".

Neoplazme koje mogu da se tretiraju predmetnim pronalaskom obuhvataju solidne tumore, t.j. karcinome i sarkome. Karcinomi obuhvataju one maligne neoplazme koje su nastale iz ćelija epitela koje su se infiltrirale (izvršile invaziju) okolnih tkiva i iz kojih nastaju metastaze. Adenokarcinomi su karcinomi nastali iz žlezdanog tkiva, ili koji grade prepoznatljive žlezdane strukture. Još jedna široka kategorija kancera obuhvata sarkome, tumore čije su ćelije usađene u fibrilarnu ili homogenu supstancu kao što je embrionsko vezivno tkivo. Predmetni pronalazak omogućava i tretman kancera mijeloidnog ili imfoidnog sistema, uključujući leukemije, limfome i druge kancere koji obično nemaju oblik tumorske mase, već su raspoređeni u vaskularnom ili limforetikularnom sistemu.

Tipovi kancera ili tumorskih ćelija osetljivih na tretman prema predmetnom pronalasku obuhvataju, na primer, tumor koji proizvodi ACTH, akutnu limfocitičnu anemiju, akutnu nelimfocitičnu anemiju, kancer adrenalne srži, kancer bešike, kancer mozga, kancer dojke, kancer grlića materice, hroničnu limfocitičnu leukemiju, hroničnu mijelocitičnu leukemiju, kolorektalni kancer, kožni limfom T ćelija, kancer endometrijuma, kancer ezofagusa, Evingov sarkom, kancer žučne kese, leukemiju vlasastih ćelija, kancer glave i vrata, Hodžkinsov limfom, Kaposijev sarkom, kancer bubrega, kancer jetre, kancer pluća (sitnoćelijski i nesitnoćelijski), malignu peritonealnu efuziju, malignu pleuralnu efuziju, melanom, mezoteliom, multipli mijelom, neuroblastom, gliom, ne-Hodžkinsov limfom, osteosarkom, kancer jajnika, kancer (germinativnih ćelija) jajnika, kancer pankreasa, kancer penisa, kancer prostate, retinoblastom, kancer kože, sarkom mekih tkiva, skvamocelarne karcinome, kancer želuca, kancer testisa, kancer štitne žlezde, tropoblastične neoplazme, kancer materice, kancer vagine, kancer vulve i Vilmsov tumor.

Predmetni pronalazak se ovde posebno opisuje u vezi sa tretmanom određenih vrsta eksperimentalno određenih kancera. U ovim ilustrativnim tretmanima, korišćeni su standardni najmodernijiin vitroiin vivomodeli. Ovi postupci mogu da se koriste za identifikaciju sredstava za koja može da se očekuje da će biti delotvorna u terapeutskim režimimain vivo.Međutim, podrazumevaće se da postupak predmetnog pronalaska nije ograničen na tretman ovih vrsta tumora, već da obuhvata bilo koji solidni tumor nastao iz bilo kog sistema organa Kanceri čija je invazivnost ili metastaziranje povezano sa aktivnošću CD148 posebno su podložni inhibiciji, ili čak može da se pokrene njihova regresija upotrebom sredstava prema predmetnom pronalasku.

Predmetni pronalazak može i da se primenjuje združivanjem jedinjenja predmetnog pronaaska, kao što je peptitelo, u kombinaciju sa još jednim hemoterapeutskim sredstvom protiv kancera, kao što je bilo koje uobičajeno korišćeno hemoterapeutsko sredstvo. Kombinacija sredstva specifičnog vezivanja sa takvim drugim sredstvima može da pojača hemoterapeutski protokol. Stručno lice će brzo uvideti da je moguće uvrstiti brojne hemoterapeutske protokole u postupak prema predmetnom pronalasku. Može da se uporebi bilo koje hemoterapeutsko sredstvo, uključujući sredstva za alkilovanje, antimetabolite, hormone i antagoniste, radioizotope, kao i prirodne proizvode. Na primer, jedinjenje predmetnog pronalaska može da se primeni uz antibiotike kao što su doksorubicin i drugi analozi antraciklina, azotne plikavce kao što je ciklofosfamid, analoge pirimidina kao što je 5-fluoruracil, cisplatin, hidroksiureu, taksol i njegovi prirodni i sintetički derivati, i si. Još jedan primer, u slučaju mešovitih tumora, kao što je adenokarcinom dojke, gde tumori obuhvataju ćelije zavisne od gonadotropina i ćelije nezavisne od gonadotropina, jedinjenje može da se primeni zajedno sa leuprolidom ili goserelinom (sintetičkim peptidnim analozima LH-RH). Drugi antineoplastični protokoli uključuju upotrebu tetraciklinskog jedinjenja sa još jednim modalitetom terapije, npr., hirurškom intervencijom, radijacijom itd., koje se ovde još nazivaju i "povezani antineoplastični modaliteti". Stoga, postupak predmetnog pronalaska može da se upotrebi uz takve uobičajene režime uz dobrobit smanjenih neželjenih efekata i povezane delotvornosti.

Predmetni pronalazak obezbeđuje preparate i postupke korisne u tretmanu širokog spektra kancera, uključujući solidne tumore i leukemije. Vrste kancera koje mogu da budu tretirane obuhvataju, ali nisu ograničene na: adenokarcinom dojke, prostate i debelog creva; sve oblike bronhogenetskog karcinoma pluća; mijeloid; melanom; hepatom; neuroblastom; papilom; apudom; horistom; branhiom; maligni karcinoidni sindrom; karcinoidnu bolest srca; karcinome (npr., Valker, bazalnih ćelija, bazoskvamocelarni, Praun-Pirs, duktusni, Erlihov tumor, Krebs 2, Merkel ćelija, mucinusni, nesitnoćelijski kancer pluća, sitnoćelijski, papilarni, skirozni, bronhiolarni, bronhogenetski, skvamocelarni i prelaznih ćelija); histiocistične poremećaje; leukemiju; malignu histiocitozu; Hodžkinsovu bolest; imunoproliferativni sitnoćelijski karcinom pluća; ne-Hodžkinsov limfom; plazmacitom; retikuloendoteliozu; melanom; hondroblastom; hondrom, hondrosarkom; fibrom; fibrosarkom; tumore džinovskih ćelija; histiocitom; lipom; liposarkom; mezoteliom; miksom; miksosarkom; osteom; osteosarkom; hordom; kraniofaringiom; disgerminom; hamartom; mezenhimom; mezonefrom; miosarkom; ameloblastom; cementom; odontom; teratom; timom; tofoblastični tumor. Dalje, mogu da se tretiraju i sledeće vrste kancera: holangiom; holesteatom; ciklindrom; cistadenokarcinom; cistadenom; tumor granuloznih ćelija; ginandroblastom; hepatom; hidradenom; tumor ćelija ostrvaca; tumor Lejdigovih ćelija; papilom; tumor Sertolijevih ćelija; tumor tekalnih ćelija; leiomioma; leiomiosarkom; mioblastom; miom; miosarkom; rabdomiom; rabdomiosarkom; ependimom; ganglioneurom; gliom; meduloblastom; meningiom; neurilemom; neuroblastom; neuroepiteliom; neurofibrom; neurom; paragangliom; nehromafmski paragangliom; angiokeratom; angiolimfoidnu hiperplaziju sa eozinofilijom; sklerotični angiom; angiomatozu; glomangiom; hemangioendoteliom; hemangiom; hemangiopericitom; hemangiosarkom; limfangiom; limfangiomiom; Iimfangiosarkom; pinealom; karcinosarkom; hondrosarkom; filoidni cistosarkom; fibrosarkom; hemangiosarkom; leiomiosarkom; leukosarkom; liposarkom; Iimfangiosarkom; miosarkom; miksosarkom; karcinom jajnika; rabdomiosarkom; sarkom; neoplazme; nerofibromatoze; i displaziju cerviksa.

Još jedno rešenje predmetnog pronalaska koristi supstance i postupke predmetnog pronalaska da spreči i/ili tretira bilo koje hiperproliferativno stanje kože, uključujući psorijazu i kontaktni dermatitis, kao i druge hiperproliferarivne bolesti. Poželjno je da se sredstva za specifično vezivanje specifična za CD148 koriste u kombinaciji sa drugim farmaceutskim sredstvima za terapiju ljudi koji pokazuju ove kliničke simptome. Sredstva za specifično vezivanje mogu da se dopreme korišćenjem bilo kog od različitih nosilaca, kroz puteve primene koji su ovde opisani, kao i kroz druge puteve koji su dobro poznati stručnjacima u ovoj oblasti.

Druga rešenja predmetnog pronalaska obuhvataju tretman različitih retinopatija (uključujući dijabetsku retinopatiju i starosnu makularnu degradaciju) u kojima učestvuje angiogeneza, kao i bolesti/poremećaje ženskih reproduktivnih organa kao što su endometrioza, uterusni fibroidi i druga stanja povezana sa disfunkcionalnom vaskularnom proliferacijom (uključujući endometijski mikrovaskularni rast) tokom ženskog reproduktivnog ciklusa.

Još jedno rešenje predmetnog pronalaska odnosi se na tretman abnormalnog vaskularnog rasta, uključujući cerebralne arteriovenske malformacije (AVM), povrede i oporavak gastronitestinalne mukoze, ulcere mukoze gastroduodenuma kod pacijenata sa istorijom pepričkog ulcera, uključujući ishemiju kojaje rezultat infarkta, širok spektar plućnih vaskularnih poremećaja kod bolesti jetre i portalne hipertenzije kod pacijenata sa nehepatičnom portalnom hipertenzijom.

Još jedno rešenje predmetnog pronalaska je prevencija kancera korišćenjem preparata i postupaka koje obezbeđuje predmetni pronalazak. Takvi reagensi obuhvataće sredstva za specifično vezivanje kao što su antitela, ili njihovi antigen vezujući regioni, CD 148.

Identifikacija molekula koji vezuju CD 148 epitop

CD 148 epitopi i antitela predmetnog pronalaska modu da se koriste za identifikaciju sredstava koja pokreću CD148 aktivnost, što može da bude korisno u lečenju određenih fizioloških poremećaja, obuhvatajući, ali se ne ograničavajući na, inhibiciju angiogeneze. U jednom rešenju predmetnog pronalaska obezbeđen je postupak identifikacije jedinjenja koje se specifično vezuje za epitop humanog CD148 definisan jednom ili većim brojem polipeptidnih sekvenci izabranih iz grupe koja se sastoji od aminokiselinskih ostataka 447 do 725, 533 do 725, 715 do 973, 324 do 335, 200 do 536, 533 do 725 i 200 do 725 sekvence čiji je ID broj: 33, koji podrazumeva dovođenje ispitivanog jedinjenja u dodir sa epitopom humanog CD148 definisanim jednom ili većim brojem polipeptidnih sekvenci izabranih iz grupe koja se sastoji od aminokiselinskih ostataka 447 do 725, 533 do 725, 715 do 973, 324 do 335, 200 do 536, 533 do 725 i 200 do 725 sekvence čiji je ID broj: 33, tokom vremena koje je dovoljno da dođe do stvaranja kompleksa, i detekcije nastanka kompleksa detekcijom CD148 epitopa ili jedinjenja u kompleksu, tako da, ukoliko se otkrije prisustvo kompleksa, identifikuje se jedinjenje koje se vezuje za CD148 epitop. Na primer, ćelije transficirane DNK koje kodiraju posmatrane proteine mogu da se tretiraju različitim lekovima, čime mogu da se izvrše koimunoprecipitacije. Obzirom daje CD148 uključen u transdukciju fizioloških signala povezanih sa inhibicijom fizioloških poremećaja poput angiogeneze, identifikacija sredstava koja mogu da pokrenu CD148 aktivnost obezbediće sredstva koja mogu da se koriste u terapiji fizioloških poremećaja ili u razvoju terapeutskih sredstava na osnovu jedinjenja "vodiča". Sredstvo može da aktivira CD148 vezujući se za epitope CD148 koji su ovde definisani na takav način da pokreće defosforilaciju CD148. Sredstva koja mogu da se upotrebe za aktivaciju CD148 obuhvataju peptide, antitela, nukleinske kiseline, jedinjenja suporotnog smisla (antisens jedinjenja) ili ribozime. Nukleinske kiseline mogu da kodiraju antitelo ili jedinjenje suprotnog smisla. Peptid može da se sastoji od najmanje 4 aminokiselilne sekvence vezujućeg proteina. Alternativno, peptid može da se sastoji od 4 do 30 aminokiselina (ili od 8 do 30 aminokiselina) koje su najmanje 75% identične kontinualnom delu aminokiselinske sekvence vezujućeg proteina. Sredstva mogu da se ispituju korišćenjem transficiranih ćelija domaćina, ćelijskih linija, ćelijskih modela ili životinja, kao što je ovde opisano, tehnikama koje su dobro poznate stručnjacima sa uobičajenim znanjem u ovoj oblasti, kao što je opisano u U.S. patentnima br. 5,622,852 i 5,773,218 kao i u PCT objavljenoj prijavi br. W0 97/27296 i W0 99/65939, koje su ovde, svaka za sebe, inkorporirane po referenci. Modulirajuće dejstvo sredstva može da se ispitain vivoiliin vitro.Sredstva koja će biti testirana mogu da se obezbede u obliku fagne biblioteke ili kombinatorne bibiloteke. Primer postupka ispitivanja sredstva je merenje dejstva koje to sredstvo ispoljava na nastanak proteinskih kompleksa.

Epitopi CD 148 predmetnog pronalaska mogu takođe da se koriste za proizvodnju strukturnih analoga željenih biološki aktivnih polipeptida ili malih molekula sa kojima oni interaguju (npr., agonista, antagonista, inhibitora) kako bi se dobili lekovi koji su, na primer, aktivniji ili stabilniji oblici polipeptida, ili koji, na primer, pojačavaju ili utiču na funkciju polipeptidain vivo.Jedno rešenje predmetnog pronalaska obezbeđuje postupak identifikacije jedinjenja koje se specifično vezuje za epitop humanog CD 148 definisan jednom ili većim brojem polipeptidnih sekvenci izabranih iz grupe koja se sastoji od aminokiselinskih ostataka 447 do 725, 533 do 725, 715 do 973, 324 do 335, 200 do 536, 533 do 725 i 200 do 725 sekvence čiji je ID broj: 33, koji podrazumeva obezbeđivanje atomskih koodrinata koje definišu trodimenzionalnu strukturu epitopa CD148 definisanog jednom ili većim brojem polipeptidnih sekvenci izabranih iz grupe koja se sastoji od aminokiselinskih ostataka 447 do 725, 533 do 725, 715 do 973, 324 do 335, 200 do 536, 533 do 725 i 200 do 725 sekvence čiji je ID broj: 33 i projektovanje ili odabir jedinjenja koja su u stanju da vežu epitope CD148 na osnovu datih atomskih koordinata. Neki pristupi racionalnom projektovanju lekova obuhvataju analizu trodimenzionalne strukture, pronalaženje alanina, molekulsko modelovanje i upotrebu anti-id antitela Ove tehnike su dobro poznate stručnjacima u ovoj oblasti. Takve tehnike obuhvataju obezbeđivanje atomskih koordinata koje definišu trodimenzionalnu strukturu proteinskog kompleksa koga pravi dati prvi polipeptid i dati drugi polipeptid i projektovanje ili odabir jedinjenja koja su u stanju da se umešaju u interakciju između prvog polipeptida i drugog polipeptida na osnovu datih atomskih koordinata.

Nakon identifikacije supstance koja moduliše ili utiče na aktivnost polipeptida, ta supstanca može da bude dalje ispitana. Štaviše, ona može da bude proizvedena i/ili upotrebljena u preparatu, t.j. u pripremi preparata, ili formulaciji kao što je medikament, farmaceutski preparat ili lek. Ovi preparati mogu da se primene kod pacijenata.

Supstanca koja je identifikovana kao modulator funkcije polipeptida može, po svojoj prirodi, da bude peptidna ili ne-peptidna Ne-peptidni mali molekuli se često pripremaju za mnoge farmaceutskein vivoupotrebe. Shodno tome za farmaceutsku upotrebu može da se pripremi mimetik ili imitator supstance (posebno peptida).

Projektovanje mimetika poznatog farmaceutski aktivnog preparata je poznat pristup razvoju farmaceutskih preparata zasnovanog najedinjenju koje je "vodič". Ovaj pristup je poželjan u slučajevima u kojima se aktivno jedinjenje teško dobija ili je skupo za sintezu, ili je nepogodno za upotrebu u konkretnom postupku primene, npr., čisti peptidi su nestabilna aktivna sredstva za preparate za oralnu primenu jer ih proteaze u sistemu organa za varenje brzo razlažu. Projektovanje, sinteza i ispitivanje mimetika obično se koristi kako bi se izbeglo ispitivanje velikog broja slučajno izabranih molekula na ciljnu osobinu.

Kada se farmakofora pronađe, njena struktura se modeluje prema njenim fizičkim osobinama, npr., stereohemiji, vezivanju, veličini i/ili naelektrisanju, korišćenjem podataka iz širokog spektra izvora, npr., spektroskopskih tehnika, podataka dobijenih difrakcijom X zraka i pomoću NMR. U ovom procesu modelovanja mogu da se upotrebe računarska analiza, mapiranje sličnosti (kojom se modeluje naelektrisanje i/ili zapremina farmakofore, umesto veza između atoma) i druge tehnike.

Potom se bira molekul koji će služiti kao osnova, na koji mogu da se presade hemijske grupe koje imitiraju farmakoforu. Molekul - osnova i hemijske grupe koje se na njega presađuju mogu da se izaberu tako daje mimetik lak za sintezu, daje velika verovatnoća da će biti farmakološki prihvatljiv, kao i da se neće lako degradiratiin vivo,a da zadržava biološku aktivnost jedinjenja vodiča Alternativno, u slučajevima u kojima je mimetik zasnovan na peptidima, dalja stabilnost može da se postigne ciklizacijom peptida čime se povećava njegova rigidnost. Mimetik ili mimetici pronađeni na osnovu ovog pristupa potom mogu da se ispitaju da se vidi da li poseduju ciljanu osobinu, ili do koje mere se ona ispoljava. Potom može da se izvrši dalja optimizacija ili modifikacija kako bi se došlo do jednog ili više konačnih mimetika zain vivoili klinička ispitivanja

Testovi vezivanja

Imunološki testovi vezivanja obično upotrebljavaju "hvatačko" sredstvo za specifično vezivanje, a često i imobilizaciju analiziranog ciljnog antigena. Hvatačko sredstvo je grupa koja se specifično vezuje za analit. U jednom rešenju predmetnog pronalaska, hvatačko sredstvo je antitelo ili njegov antigen vezujući region koji se specifično vezuje za CD148 epitope predmetnog pronalaska Ovi imunološki testovi vezivanja dobro su poznati u struci (Asai, urednik, Methods in Cell Biologv, tom 37, Antibodies in Cell Biologv, Academic Press, Inc., New York (1993)).

U imunološkim testovima vezivanja često se koristi sredstvo za obeležavanje koje će pokazati postojanje vezanog kompleksa nastalog između sredstva za hvatanje i antigena Sredstvo za obeležavanje može da bude jedan od molekula koji čini vezani kompleks, t.j. može da bude obeleženo sredstvo za specifično vezivanje ili obeleženo antitelo na specifično sredstvo za vezivanje. Alternativno, sredstvo za obeležavanje može da bude treći molekul, često još jedno antitelo, koje se vezuje za vezani kompleks. Sredstvo za obeležavanje može da bude, na primer, antitelo na specifično sredstvo za vezivanje koje nosi obeleživač. Drugom antitelu, specifičnom za vezani kompleks, može da nedostaje obeleživač, ali može da se veže za četvrti molekul specifičan za vrstu antitela čiji je član drugo antitelo. Na primer, drugo antitelo može da bude modifikovano prisustvom grupe koja omogućava detekciju, na primer, biotinom, koje potom može da bude vezano za četvrti molekul, kao što je streptavidin obeležen enzimom. Drugi proteini koji su u stanju da specifično vežu konstantne regione imunoglobulina, kao što su protein A ili protein G takođe mogu da se koriste kao sredstva za obeležavanje. Ovi proteini za vezivanje su normalni činioci ćelijskog zida streptokoka i pokazuju jaku neimunogenu reaktivnost sa konstantnim regionima imunoglobulina iz različitih vrrsta. Akerstrom, J. Immunol., 135: 2589-2542 (1985); Chaubert, Mod. Pathol., 10: 585-591 (1997).

U ovim testovima, koraci inkubacije i/ili ispiranja mogu da budu neophodni nakon svake kombinacije reagenasa Koraci inkubacije mogu da se razlikuju u trajanju, od oko 5 sekundi do nekoliko časova, poželjno je da to bude od oko 5 minuta do oko 24 časa Ipak, vreme inkubacije zavisiće od formata testa, analizirane supstance, zapremine rastvora, koncentracija i si. Obično će se testovi izvoditi pri sobnoj temperaturi, iako mogu da se izvode u širokom opsegu temperatura.

A. Testovi nekompetitivnog vezivanja

Imunološki testovi vezivanja mogu da budu nekompetitivnog tipa. Ovi testovi imaju određenu količinu vezane analizirane supstance koja se neposredno meri. Na primer, u jednom poželjnom "sendvič" testu, sredstvo za hvatanje (antitelo) može neposredno da se veže za čvrsti supstrat na mestu na kom je on imobilizovan. Ova imobilizovana sredstva za hvatanje potom hvataju (vezuju) antigen prisutan u ispitivanom uzorku. Protein koji je na ovaj način imobilizovan se zatim vezuje za sredstvo za obeležavanje, kao što je drugo antitelo koje nosi obeleživač. U još jednom poželjnom "sendvič" testu, drugom antitelu nedostaje obeleživač, ali može da se veže za obeleženo antitelo specifično za vrstu antitela iz koje je izvedeno drugo antitelo. Drugo antitelo takođe može da bude modifikovano grupom koja može da se detektuje, kao što je biotin, za koji specifično može da se veže treći obeleženi molekul, kao što je streptavidin. Videti Harlow & Lane, Antibodies, A Laboratorv Manual, poglavlje 14, Cold Spring Harbor Laboratorv, NY (1988), koji je ovde inkorporiran po referenci.

B. Testovi kompetitivnog vezivanja

Imunološki testovi vezivanja mogu da budu kompetitivnog tipa. Količina analizirane supstance prisutna u uzorku meri se posredno, merenjem količine dodatog analita kojaje istisnuta ili odvojena od sredstva za hvatanje (antitela) analitom prisutnim u uzorku. U jednom poželjnom testu kompetitivnog vezivanja, poznata količina analizirane supstance, obično obeležene, se dodaje uzorku, koji se potom dovodi u dodir sa sredstvom za hvatanje. Količina obeleženog analita vezanog za antitelo obrnuto je proporcionalna koncentraciji analita prisutnog u uzorku (videti See, Harlow & Lane, Antibodies, A Laboratorv Manual, poglavlje 14, str. 579-583,supra).

U drugom poželjnom testu kompetitivnog vezivanja, sredstvo za hvatanje imobilizovano je na čvrstom supstratu. Količina proteina vezanog za sredstvo za hvatanje može da se odredi bilo merenjem količine proteina prisutnog u kompleksu protein/antitelo, ili, alternativno, merenjem količine preostalog nekompleksiranog proteina. Harlow & Lane,supra.

U još jednom poželjnom testu kompetitivnog vezivanja koristi se inhibicija haptenom. U ovom slučaju, poznata analizirana supstanca imobiliše se na čvrstom supstrata Uzorku se dodaje poznata količina antitela, te se uzorak dovodi u dodir sa imobilizovanom analiziranom supstancom. Količina antitela vezanog za imobilizovanu analiziranu supstancu može da se odredi bilo detekcijom bilo u imobilizovanoj frakciji, bilo u frakciji koja ostaje u rastvoru. Detekcija može da bude neposredna, u slučajevima u kojima je antitelo obeleženo, ili posredna, nakon dodavanja obeležene grupe koja se specifično vezuje za antitelo kao što je prethodno opisano.

C. Upotreba testova kompetitivnog vezivanja

Testovi kompetitivnog vezivanja mogu da se koriste za određivanja ukrštene reaktivnosti kako bi se vestom stručnjaku omogućilo da ustanovi da li je protein ili enzimski kompleks koji je prepoznat od strane peptitela predmetnog pronalaska željeni proten a ne molekul koji ukršteno reaguje, ili da ustanovi da li je peptitelo specifično za antigen i ne vezuje se nesrodne antigene. U testovima ove vrste, antigen može da bude imobilizovan na čvrstu podlogu, nakon čega se dodaje nepoznata smeša proteina, koja kompetira vezivanju peptitela za imobilizovani protein. Kompetirajući molekul takođe vezuje jedan ili više antigena koji nisu srodni datom antigenu. Sposobnost proteina da kompetiraju vezivanju peptitela za imobilisani antigen poredi se sa vezivanjem istog proteina imobilisanog za čvrstu podlogu, kako bi se odredila ukrštena reaktivnost proteinske smeše.

D. Drugi testovi vezivanja

Predmetni pronalazak obezbeđuje i postupke Western blota za detekciju ili kvantifikaciju prisustva epitopa CD 148 ili njegovog fragmenta u uzorku. Tehnika, uopšteno govoreći, podrazumeva odvajanje proteina uzorka gel elektroforezom na osnovu molekulske mase i prebacivanje proteina na odgovarajuću čvrstu podlogu, kao što je nitrocelulozni filter, najlonski filter ili filter od derivatizovanog najlona. Uzorak se inkubira sa antitelima ili njihovim antigen-vezujućim regionima koji se specifično vezuju za epitop CD148, te se detektuje nastali kompleks. Ova peptitela mogu da budu neposredno obeležena ili mogu kasnije da se detektuju korišćenjem obeleženih antitela koj a se vezuj u za dato peptitelo.

E. Dijagnostički testovi

Derivativna vezujuća sredstva, kao što su peptidi ili peptitela ili njihovi fragmenti, prema predmetnom pronalasku korisna su za dijagnostifikovanje stanja ili bolesti odlikovanih ekspresijom CD 148 ili podjedinica, ili za testove kojima se prate pacijenti koji primaju terapiju aktivatorima CD148, njihovim fragmentima, agonistima ili inhibitorima CD148 aktivnosti. Dijagnostički testovi za CD 148 uključuju postupke u kojima se koristi antitelo i obeleživač da bi se detektovao CD148 u humanim telesnim tečnostima ili ekstraktima ćelija ili tkiva Antitela predmetnog pronalaska mogu da se koriste sa ili bez modifikacije. U poželjnom dijagnostičkom testu, antitela će biti obeležena vezivanjem, npr., obeleživača ili molekula reportera Poznat je širok spektar obeleživača i molekula reportera, a neki od njih su ovde već opisani. Konkretno, predmetni pronalazak je koristan za dijagnozu bolesti kod ljudi.

U struci je poznato mnoštvo protokola za merenje CD 148 proteina korišćenjem antitela specifičnih za dati protein. Primeri obuhvataju imunosorbentni test vezan za enzim (ELISA, "Enzvme Linked Immunosorbent Assay"), radioimunotest (RIA) i sortiranje ćelija aktivirano fluorescencijom (FACS, "Fluorescence Activated Cell Sorting"). Imunotest sa dva mesta zasnovan na monoklonskim antitelima, u kome se upotrebljavaju monoklonska antitela koja reaguju na dva.ne-interferirajuća epitopa na CD148 je poželjan test, ali može da se upotrebi i test kompetitivnog vezivanja. Ovi testovi su opisani, na primer, u Maddoxe/o/.,J. Exp. Med., 158: 1211 (1983).

Kako bi se obezbedila osnova za dijagnozu, obično se utvrđuju normalne ili standardne vrednosti za humanu ekspresiju CD148. Ovo određivanje može da se izvrši kombinovanjem telesnih tečnosti ili ćelijskih ekstrakata normalnih pojedinaca, poželjno je da to budu ljudi, sa antitelom na CD148, u uslovima koji su pogodni za nastanak kompleksa, dobro poznatim u struci. Standarni nastanak kompleksa može da se kvantifikuje upoređivanjem sa vezivanjem antitela za poznate količine proteina CD148, a kontrolnim uzorcima i uzorcima uzetim od bolesnih pojedinaca Potom mogu da se porede standardne vrednosti dobijene iz normalnih uzoraka sa vrednostima uzoraka dobijenim iz pojedinaca za koje je moguće da pate od bolesti. Odstupanje između standardnih vrednosti i vrednosti uzoraka dobijenih iz pacijenta ukazuju na ulogu CD 148 u toj bolesti.

Za dijagnostičke primene, u nekim rešenjima, antitela ili njihovi antigen vezujući regioni obično će biti obeleženi grupom koja omogućava detekciju. Grupa koja omogućava detekciju može da bude bilo koja grupa koja je u stanju da proizvede, bilo posredno bilo neposredno, signal koji je moguće detektovati. Na primer, grupa koja može da se detektuje može da bude radioizotop, kao što su3H,4C,3<2>P,<35>S, ili12<5>I, fluorescentno ili hemiluminescentno jedinjenje, kao što su fluorescein izotiocijanat, rodamin ili luciferin; ili enzim, kao što su alkalna fosfataza, beta-galaktozidaza ili peroksidaza iz renaBayer etal,Meth. Enz., 184: 138-163, (1990).

Predmetni pronalazak dalje je opisan primerima koji slede, a koji ne treba da budu tumačeni kao dalje ograničenje. Sadržaj svih slika i svih referenci, patenata i objavljenih patentnih prijava, navedenih u predmetnoj prijavi ovde je eksplicitno inkorporiran po referenci.

Primeri

Primer 1: Dobijanje antitela na epitope CD148

Roditeljeske verzije regiona teškog i lakog lanca antitela predmetnog pronalaska identifikovani su korišćenjem procedure ispitivanja koja sledi. Fagne biblioteke rekombinantnog scFv (jednolančani varijabilni fragment, "single chain variable fragment") dobijene od Cambridge Antibodv Technologies (CAT) ispitane suin vitrona ciljne proteine huCD148. Preko 10000 klonovaje ispitano, dobijeno iz sistema izlaganja u fagima (nakon 2. i 3. runde) nakon čega je identifikovano više od 250 jedinstvenih scFv antitela koja specifično vezuju huCD148. Od ovih reagenasa, 83 je izabrano za dalje ispitivanje, na osnovu predviđanja njihovog terapeutskog potencijala. Na primer, izolovano je nekoliko antitela koja kompetiraju za vezivanje istog epitopa kao i N24, izmereno kompetitivnim ELISA testom ili na osnovu izveštaja dobijenog pomoću TRF (fluorescencija na osnovu vremena, "time resolved fluorescence"). Druga antitela su odabrana na osnovu njihovog visokog odnosa signala u odnosu na šum, što je određeno pomoću ELISA ili TRF (npr., vezivanje ciljnog molekula u odnosu na vezivanje streptavidina), ili zato što su ukršteno reagovala sa mišjim ortologom CD148. Sva anti-CD148 antitela su ispitana na sposobnost ukrštenog reagovanja sa muCD148 (zain vivoispitivanja na miševima) kao i vezivanja huCD148 koji eksprimiraju ćelije. Eksprimirano je osam antitela - humanih scFv N24 analoga koji pokazuju najviši relativni stepen kompeticije sa N34, bilo kao IgG4, maksitela (bivalentni scFv-Fc) ili kao obe vrste, kao i sedam drugih klonova, te je potvrđena aktivnost vezivanja i specifičnost. Klonirano je originalno mišje antitelo N24, a VHi Vlgeni su podklonirani u različite "platforme" antitela kako bi se koristili kao pozitivne kontrole u komparativnim testovima vezivanja (t.j. ELISA ili FACS) i funkcionalnim testovimain vivoiin vitro.Izvršena su prvobitna funkcionalna ispitivanja vodećih "prvih 14" antitela

- kandidata. Osam od ovih klonova reagovali su kao agonisti huCD148 u testuin vitro

planarne migracije. Štaviše, 4 od ovih vodećih klonova koji ukršteno reaguju sa muCD148 inhibiraju FGF-2 indukovanu angiogenezu u testu mišjeg kornealnog džepain vivo.Osam antitala opisanih u Slikama 1 do 8 bila su u stanju da inhibiraju angiogenezu i u testu ćelijske migracije humanog endotela i u testu kornealnog džepa, sa najmanje 20% sposobnošću u poređenju sa kontrolamain vitro,pri koncentraciji od 20 ug/ml.

Antitela dobijena u skladu sa prethodno opisanom procedurom opisana su na slikama 1 do 8. Slike 1A i 1B prikazuju preklapanje nukleotidne sekvence kao i aminokiselinske sekvence koju ona kodira za varijabilni region teškog (VH) i varijabilni region lakog (VL) lanca antitela prema predmetnom pronalasku, antitela br. 1 (At-1). Osenčeni regioni na slici označavaju CDR1, 2 i 3 (od amino ka karboksi terminalnom kraju, respektivno). Upit i okviri oznake označavaju nukleotidnu i aminokiselinsku sekvencu, respektivno.

Slike 2A i 2B prikazuju preklapanje nukleotidne sekvence i aminokiselinske sekvence koju ona kodira za varijabilni teški (VH) i varijabilni laki (VL) lanac antitela br. 2 (At-2). Osenčeni regioni na slici označavaju CDR1, 2 i 3 (od amino ka karboksi terminalnom kraju, respektivno).

Slike 3A i 3B prikazuju preklapanje nukleotidne sekvence i aminokiselinske sekvence koju ona kodira za varijabilni teški (VH) i varijabilni laki (VL) lanac antitela br. 3 (At-3). Osenčeni regioni na slici označavaju CDR1, 2 i 3 (od amino ka karboksi terminalnom kraju, respektivno).

Slike 4A i 4B prikazuju preklapanje nukleotidne sekvence i aminokiselinske sekvence koju ona kodira za varijabilni teški (VH) i varijabilni laki (VL) lanac antitela br. 4 (At-4). Osenčeni regioni na slici označavaju CDR1, 2 i 3 (od amino ka karboksi terminalnom kraju, respektivno).

Slike 5A i 5B prikazuju preklapanje nukleotidne sekvence i aminokiselinske sekvence koju ona kodira za varijabilni teški (VH) i varijabilni laki (VL) lanac antitela br. 5 (At-5). Osenčeni regioni na slici označavaju CDR1, 2 i 3 (od amino ka karboksi terminalnom kraju, respektivno).

Slike 6A i 6B prikazuju preklapanje nukleotidne sekvence. i aminokiselinske sekvence koju ona kodira za varijabilni teški (VH) i varijabilni laki (VL) lanac antitela br. 6 (At-6). Osenčeni regioni na slici označavaju CDR1, 2 i 3 (od amino ka karboksi terminalnom kraju, respektivno).

Slike 7A i 7B prikazuju preklapanje nukleotidne sekvence i aminokiselinske sekvence koju ona kodira za varijabilni teški (VH) i varijabilni laki (VL) lanac antitela br. 7 (At-7). Osenčeni regioni na slici označavaju CDR1, 2 i 3 (od amino ka karboksi terminalnom kraju, respektivno).

Slike 8A i 8B prikazuju preklapanje nukleotidne sekvence i aminokiselinske sekvence koju ona kodira za varijabilni teški (VH) i varijabilni laki (VL) lanac antitela br. 8 (At-8). Osenčeni regioni na slici označavaju CDR1, 2 i 3 (od amino ka karboksi terminalnom kraju, respektivno).

Primer 2: Mapiranje vezujućih epitopa CD148

Sintetisani su sintetički peptidni 15-meri koji odgovaraju spoljašnjem domenu prvobitne sekvence humanog CD 148, a potom kovalentno povezani N-vezom za delove na PVDF membranama Sastav različitih peptidnih sekvenci preklapao se za po 3 aminokiseline.

Membrane koje sadrže peptide prvo su inkubirane u MeOH 10 minuta, isprane 3 puta u PBST te inkubirane preko noći sa 4% mlekom u PBST. Nakon 3 ispiranja u PBST membrane su inkubirane 3 sata sa 1 uM anti-CD148 antitelima razbleženim 4% mlekom. Membrane su ponovo isprane 3 puta a potom inkubirane 1 čas bilo sa anti-humanim Fc-HRP ili anti-mišjim Fc-HRP (Jackson). Nakon 3 ispiranja u PBST vezivanje je detektovano upotrebom Super Signal kompleta od Pierce.

Membrane koje sadrže peptide su regenerisane za nove eksperimente tako što su odmah isprane dva puta vodom (nakon jedne upotrebe) a potom inkubirane preko noći u DMF. Nakon 2 ispiranja, membrana je isprana puferom za regeneraciju A (1% SDS, 0.1% b-merkaptoetanol, 8M urea) nekoliko časova, a potom je isprana 2 puta u puferu za regeneraciju B (50% EtOH, 10% sirćetna kiselina). Efikasnost koraka regeneracije je proverena bojenjem membrane samo pomoću sekundarnog antitela i razvijanjem boje. Nakon završetka procesa regeneracije, membrane su isprane MeOH, osušene i čuvane na20°C.

Vezivanje At-1, At-2, At-3 i At-5, mišjeg anti-CD148 antitela i anti-CD148 antitela (Biosource) za membrane koje sadrže peptide ispitano je u skladu sa procedurom kojaje prethodno opisana, dajući sledeće rezultate: Mišje antitelo vezivalo se za peptide 114 do 117 u membrani br. 1 i 90 do 93 u membrani br. 2 (114 & 90: GPVDPSSGQQSRDTE (ostaci 315 do 329), 115 & 91: DPSSGQQSRDTEVLL (ostaci 318 do 332), 116 & 92: SGQQSRDTEVLLVGL (ostaci 321 do 335), 117 & 93: QSRDTEVLLVGLEPG (ostaci 324 do 338)), koji imaju zajednički epitop QSRDTE (ostaci 324 do 329). Mišje antitelo se vezivalo još i za oktapeptid QSRDTEVLL (ostaci 324 do 332).

At-1 je vezivalo peptide 116 i 117 u membrani br. 1 i peptide 92 i 93 u memrani br. 2 (116 & 92: SGQQSRDTEVLLVGL (ostaci 321 do 335), 117 & 93: QSRDTEVLLVGLEPG (ostaci 324 do 338)), koji imaju zajednički epitop QSRDTEVLLVGL (ostaci 324 do 335), ali nje vezivalo oktapeptid QSRDTEVL (ostaci 324 do 331). Ni jedno od ostalih ispitivanih antitela nije se vezivalo za ove membrane koje sadrže peptide. Tako se At-1 vezuje za peptid koji ima sekvencu aminokiselinskih ostataka 324 do 338 i 321 do 331, ali ne i za oktapeptid sekvence aminokiselinskih ostataka 324 do 331 humanog CD148.

Na osnovu rezultata mapiranja peptida, najmanji neophodni epitop mišjeg anti-CD148 antitela sužen je na 6 aminokiselina QSRDTE (ostaci 324 do 329). Najmanji neophodni epitop At-1 takođe je određen, i dugačak je 12 aminokiselinskih ostataka QSRDTEVLLVGL (ostaci 324 do 335). Kako ni jedno drugo antiCD148 antitelo nije pokazalo vezivanje za membrane koje sadrže peptide, određeno je da su epitopi ovih antitela zavisni od strukture.

Primer 3: Konstrukcija i ispitivanje FLAG, polihistidinsk ih i Fc fuzionih

proteina

Sledeći konstrukti su podklonirani u »412 sisarski ekspresioni vektor, pri čemu su na N-terrninalni kraj fuzionisane i vodeća sekvenca IgK i Flag poli-histidinski obeleživač; huCD148-ECTO (ostaci 36 do 973); huCD148-NFnIII (osteci 36 do 210); huCD148-FnIII2_3 (ostaci 175 do 536); huCD148-FnIII4_5 (ostaci 533 do 725); huCD148-Cterm: (ostaci 715 do 973). Ovi klonovi su prolazno transficirani u COS PKB (E5) ćelije i prečišćeni korišćenjem IMAC kolone.

Vezivanje različitih anti-CD148 antitela je ispitano korišćenjem 2 različita ELISA postupka. Prvi postupak je neposredni ELISA na Ni-NTA pločama. Ni-NTA ploče (Invitrogen) su obložene sa 4 razblaženja (1:10 do 1:10.000) datih 5 proteina u 3% BSA u PBS i inkubirane preko noći na 4°C. Ploče su isprane pomoću PBST i inkubirane sa 1 ug/ml At-2-huIgG4, At-5-huIgG4, mišjeg anti-CD148 antitela i 143-41 (Biosource) 2 časa na sobnoj temperaturi. Nakon dodatnog ispiranja, ploče su inkubirane sa anti-hu-IgG4-HRP (Zymed) ili anti-rnišji-FC-HRP (Jackson) 1 čas na sobnoj temperaturi. Potom su ponovo isprane te je signal razvijen dodavanjem 100 ul lOmg ABTS (Amersham) sa 45ml 0,05M limunske kiseline pH 4,0 i 77ul 30% H202.

Drugi postupak je posredni ELISA. Maxisorp ploče su obložene sa 5 ug/ml anti-huFc ili anti-muFc (Jackson) preko noći na 4°C. Ploče su isprane pomoću PBST i blokirane 3% BSA u PBS 1,5 čas. Nakon dodatnog ispiranja, ploče su inkubirane sa 5 u.g/ml At-2-huIgG4, At-5-huIgG4, mišjeg anti-CD148 antitela i 143-41 (Biosource) 2 časa na sobnoj temperaturi. Ploče su ponovo isprane i inkubirane sa 2 razblaženja (1:10, 1:100) datih 5 proteina 2 časa na sobnoj temperaturi, ponovo isprane i inkubirane sa anti-FLAG M2-HRP (Sigma) 1 čas na sobnoj temperaturi.

Kao što je i očekivano, na osnovu mapiranja peptida, mišje anti-CD148 antitelo je vezivalo protein huCD148-FnIII2_3 (ostaci 175 do 536). Komercijalno antitelo 143-41 (Biosource) vezuje se za protein huCD148-NFnIII (ostaci 36do210). Uz to, At-5 se vezuje i za protein huCD148-FnIII4_5 (ostaci 533 do 725) kao i za protein huCD148-Cterm (ostaci 715 do 973).

Zbog toga što je prinos proteina korišćenjem ovog postupka bio veoma nizak, FLAG poli-his obeleživač je zamenjen Fc obeleživačem. Konstrukti su ponovo transficirani u CHO PBK E5 ćelije, prečišćeni na koloni proteina A te je ispitivano vezivanje anti-CD148 antitela drugim ELISA postupkom. Maxisorp ploče su obložene sa 5 ug/ml anti-huFc (Jackson) preko noći na 4°C, isprane i blokirane u 3% mleku u PBS 1,5 čas. Ploče su ponovo isprane i inkubirane sa 5 ug/ml različitih CD148-Fc konstrukata 2 časa na sobnoj temperaturi. Nakon dodatnih ispiranja, ploče su inkubirane sa lug/ml At-2-huIgG4, At-5-huIgG4, At-l-huIGg4, mišjeg anti-CD148 antitela i 143-41 (Biosource) 2 časa na sobnoj temperaturi. Ploče su ponovo isprane i inkubirane sa anti-huIgG4-HRP (Zymed) ili anti-mišjim Fc-HRP (Jackson) 1 čas na sobnoj temperaturi.

Pet CD148 konstrukata obeleženih bilo Flag, Poli-His obeleživačima ili Fc obeleživačem eksprimirano je prolazno u 293 E5 ćelijama i prečišćeni pomoću IMAC kolone i kolone proteina A, respektivno. Vezivanje anti-CD148 klonova za različite konstrukte ispitano je pomoću ELISA, kao što je opisano u postupcima. Humani klon anti CD148, At-5, vezivao je i FnIII4_5 (ostaci 533 do 725) deo i C-term deo (ostaci 715 do 973) kada su korišćeni konstrukti obeleženi Flag, Poli-His obeleživačima kao i FnIII4 5 (ostaci 533 do 725) kada su korišćeni konstrukti obeleženi Fc obeleživačem. On takođe vezuje i protein ECTO domena pune dužine (ostaci 36 do 973) obeležen pomoću oba obeleživača Humani klon anti-CD148, At-2, pokazao je vezivanje za protein ECTO domena pune dužine (ostaci 36 do 973) obeležen pomoću oba obeleživača i nizak stepen vezivanja za FnIII4_5 (ostaci 533 do 725) obeležen Fc obeleživačem, ali nije pokazao vezivanje za bilo koji od ostala 3 konstrukta. Humani klon anti CD148, At-1 upotrebljen je samo u ELISA testu sa Fc konstruktima. Vezivao je samo FnIII2_3 deo (ostaci 175 do 536). Komercijalni mišji anti-CD148 143-41 (Biosource) vezivao je protein ECTO domena pune dužine (ostaci 36 do 973) obeležen pomoću oba obeleživača i NFnlll deo (ostaci 36 do 210) u svim testovima, ali nije vezivao ni jedan od ostala 3 konstrukta Mišje anti-CD148 antitelo korišćeno je kao pozitivna kontrola u svim testovima obzirom da se zna da ono prepoznaje okapeptid u ostacima 324 do 332. Mišje anti-CD148 antitelo prepoznavalo je FnIII2_3 deo (ostaci 175 do 536) u svim testovima i protein ECTO domena pune dužine (ostaci 36 do 973) obeležen Fc obeleživačem.

Na osnovu kombinovanih rezultata sva tri ELISA testa zaključeno je da komercijalno mišje anti-CD148 143-41 (Biosource) antitelo prepoznaje strukturno zavisni epitop koji se nalazi između ostataka 36 do 210. At-5 je prepoznavalo i FnIII4_5 (ostaci 533 do 725) deo kao i C-term deo (ostaci 715 do 973). Ovi delovi između sebe imaju preklapanje od 11 aminokiselina. Stoga, ovih 11 aminokiselina mogu da budu neophodne za vezivanje At-5.

Primer 4: Konstrukcija i ispitivanje fuzionih proteina sa avidinom

Sledeći konstrukti su podklonirani u pCep4-Avidin-N vektor: huCD148-NFnIII (ostaci 36 do 210); huCD148-FnIII2_3 (ostaci 36 do 536); huCD148-FnIII4_5 (2)

(ostaci 36 do 715); huCD148-FnIII4_5 (ostaci 36 do 725); huCD148-ECTO (ostaci 36 do 973); huCD148FnIII2 3_4_5 (ostaci 200 do 725); huCD148FnIII3 4 5 (ostaci 447 do 725); huCD148-FnIII4_5 (samo) (ostaci 533 do 725); huCD148-FnIII_5 (ostaci 616 do 725); huCD148-FnIII_5.5 (ostaci 672 do 725).

Svi avidinski ekspresioni konstrukti su transficirani u 293 T ćelije pomoću Lipofectamine 2000 (Invitrogen) prema uputstvu proizvođača. Kondicionirana podloga sakupljena je 2 dana nakon transfekcije, te je određena koncentracija proteina fuzionisanog za avidin pomoću biotinskih granulica (Spherotech Inc.). Za svaki konstrukt upotrebljeno je 5ul granulica. Granulice su prethodno blokirane inkubacijom sa 3% BSA 30 min na sobnoj temperaturi, isprane jednom pomoću 0,2% BSA u PBS a potom dodate u 200ul svake od kondicioniranih podloga tokom inkubacije dodatnih 1 čas. Nakon 2 ispiranja, dodato je lug/ml anti-Avidin-FITC (Vector) i inkubirano 30 minuta, nakon čega su perlice ponovo isprane, resuspendovane u 500ul pufera za ispiranje, te su vrednosti očitane pomoću FACS. Na osnovu rezultata nivoa ekspresije određena je količina kondicionirane podloge koju treba upotrebni u testovima vezivanja. Protokol za test vezivanja isti je kao onaj koji je prethodno opisan, samo što se umesto anti-Avidn-FITC, dodaje lug/ml FITC obeleženih anti-CD148 At-2 i At-5 antitela. Varijanta ovog testa obuhvata koinkubaciju proteina fuzionisanog sa avidinom sa posmatranim antitelom obeleženim pomoću FITC i sa viškom od 50x neobeleženog antitela kako bi se utvrdilo da li neobeleženo antitelo može efikasno da kompetira ili spreči vezivanje antitela obeleženog pomoću FITC koje se • ispituje. Ovaj test kompeticije upotrebljen je i može da se upotrebljava da bi se utvrdilo da li bilo koje antitelo može da kompetira za vezivanje za isti epitop kao neko drugo antitelo.

I At-2 i At-5 su prepoznavali konstrukte huCD148-ECTO pune dužine (ostaci 36 do 973) kao i huCD148-FnIII4_5 (ostaci 36 do 725). Međutim, ni jedno od ovuh antitela nije se vezivalo za konstrukte huCD148-NFnIII (ostaci 36 do 210), huCD148-FnIII2_3 (ostaci 36 do 536) i huCD148-FnIII4_5 (2) (ostaci 36 do 715). At-5 se takođe vezivalo za konstrukte huCD148FnIII2_3_4_5 (ostaci 200 do 725); huCD148FnIII3_4_5 (ostaci 447 do 725) i huCD148-FnIII4_5 (samo) (ostaci 533 do 725) ali ne i za konstrukte huCD148-FnIII_5 (ostaci 616 do 725) i huCD148-FnIII_5.5 (ostaci 672 do 725). At-2 je vezivalo konsturukte huCD148FnIH2 3 4 5 (ostaci 200 do 725); huCD148FnIII3_4_5 (ostaci 447 do 725) ali nije vezivalo konstrukte huCD148-FnIII4_5 (samo) (ostaci 533 do 725), huCD148-FnIII_5 (ostaci 616 do 725) i huCD148-FnIII_5.5 (ostaci 672 do 725).

U kompetitivnom testu, At-2 je moglo u potpunosti da inhibira vezivanje At-5, i za konstrukt huCD148-ECTO i za konstrukt FnIII4_5. At-5 je bilo u stanju da potpuno kompetira vezivanju At-2 za konstrukt huCD148-ECTO ali je samo delimično inhibiralo vezivanje At-2 za konstrukt huCD148-FnIII4_5.

Obzirom da i At-2 i At-5 vezuju konstrukte huCD148-ECTO potpune dužine (ostaci 36 do 973) i huCD148-FnIII4_5 (ostaci 36 do 725) ali ne .vezuju konstrukt huCD148-FnIII4_5 (2) (ostaci 36 do 715) koji se od huCD148-FnIII4_5 (ostaci 36 do 725) konstrukta razlikuje samo za 11 aminokiselinskih ostataka u C-terminalnom kraju i obzirom da ni jedno od ovih antitela ne prepoznaje ni jedan peptid u pripremljenim membranama sa peptidima, zaključeno je daje ovih 11 aminokiselinskih ostataka - ostaci 715 do 725 - neophodno, ali ne i dovoljno, za vezivanje ovih antitela. Na osnovu rezultata vezivanja ovih antitela za konstrukte huCD148FnIII2 3 4 5 (ostaci 200 do 725), huCD148FnIII3_4_5 (ostaci 447 do 725), huCD148-FnIII4 5 (samo) (ostaci 533 do 725), huCD148-FnIII_5 (ostaci 616 do725) i huCD148-FnHI_5.5 (ostaci 672 do 725) određeno je daje najmanja oblast vezivanja za At-5 od ostatka 533 do 725 a za At-2 od ostatka 447 do 725.

Primer 5: Anti- angiogenetska a ktivnost anti-CD148 antitela u testu planarne

migracije

Test planarne migracije ćelija endotela (zatvaranja povreda) korišćen je za kvantifikaciju inhibicije angiogenezein vitroza sva antitela opisana na slikama 1 do 8, suštinski onako kako je opisano u U.S. patentu br. 6,248,327, koji je ovde inkorporiran u celosti po referenci. U ovom testu, migracija ćelija se meri kao brzina zatvaranja kružne povrede u jenoslojnoj kulturi ćelija. Brzina zatvaranja povrede je linearna i dinamički regulisana sredstvima koja stimulišu i inhibiraju angiogenezuin vivo.

Primarne humane renalne ćelije mikrovaskularnog endotela, HRMEC, su izolovane, uzgajene u kulturi i i korišćene u trećem prolazu nakon otapanja, kao što je opisano u Martinetai,In Vitro Cell Dev Biol 33: 261, 1997. Kopije kružnih oštećenja, "povreda", (600 do 800 mikrona u prečniku) stvaraju se u konfluentnim jednoslojnim kulturama HRMEC korišćenjem prese za bušenje sa silikonskim vrhom. U vreme nanošenja oštećenja, podlozi (DMEM + 1% BSA) se dodaje 20 ng/ml PMA (forbol-12-miristat-13-acetata), samog ili u prisustvu 5 do 50 ug/ml kontrole ili At-1 do At-8. Zaostala površina povrede meri se u funkciji vremena (0 do 12 časova) uz upotrebu mikroskopa i računarskih programa za analizu slike (Bioquant, Nashville, TN). Relativna brzina migracije se računa za svako sredstvo i kombinaciju sredstava linearnom regresijom funkcije površine zaostale povrede u zavisnosti od vremena

Svako od antitela At-1, At-2, At-3, At-4, At-5, At-6, At-7 i At-8 inhibiralo je endotelijalnu migraciju izazvanu PMA, pri čemu je odgovor zavisio od doze, čime je značajno smanjena brzina migracije do nestimulisanih nivoa koji se nalaze u opsegu od 15 do 50 ug/ml.

Primer 6: Anti- angiogenetska aktivnost anti- CD148 antitela u testu kornealnog

džepa

Sposobnost antitela predmetnog pronalaska da inhibiraju angiogenezuin vivoodređena je u testu kornealnog džepa kod miša, suštinski onako kako je opisano u U.S. patentu br. 6,248,327. U ovom testu, sredstva kojaje trebalo ispitati na angiogenetsku ili anti-angiogenetsku aktivnost imobilizovana su u oblik sa sporim otpuštanjem u hidronskoj sačmi, kojaje implantirana u mikrodžepove načinjene u epitelijumu rožnjače anesteziranih miševa Vaskularizacija se meri na osnovu izgleda, gustine i stepena urastanja krvnih sudova iz vaskularizovanog kornealnog limusa u komeu koja je, u normalnim uslovima, avaskularna.

Sunđeraste sačme polivinil alkohola koje sadrže FGF-2 (50 ng/sačmi), bFGF i IgG (12 ug/sačmi, kontrola), ili bFGF i At-1 do 8 (12 ixg/sačmi). Sačma je hirurški presađena u stromalne mikrodžepove u rožnjači, načinjene mikro disekcijom 1 mm medijalno od lateralnog kornealnog limbusa mužjaka C57BL/6 miševa starih 6 do 8 nedelja Sačma se hirurški usađuje u kornealne stromalne mikrodžepove, načinjene mikro disekcijom 1 mm medijalno od lateralnog kornealnog limbusa mužjaka C57BL miševa. Nakon pet dana, na vrhuncu neovaskularnog odgovora na FGF-2, rožnjače se fotografišu pomoću MZ9.5 steriomikroskopa (Leica) pri incipijentnom uglu od 35-50° od polarne ose u meridijanu koji sadrži sačmu. Slike se prevode u digitalni format i obrađuju pomoću subtraktivnih filtera boje (Adobe Photoshop 4.0) kako bi se detaljno predstavili ustanovljeni mikrosudovi na osnovu sadržaja hemoglobina. Program za analizu slike (Bioquant, Nashville, TN) se koristi za računanje udela komealne slike kojaje vaskularizovana, gustine sudova u okviru vaskularizovane oblasti, kao i gustine sudova u ukupnoj rožnjači.

At-2, At-4, At-5 i At-7 si inhibirali bFGF-indukovanu kornealnu angiogenezu, značajno smanjujući vaskularnu gustinu na značajno manju vrednost od one koja se dobija upotrebom samo FGF.

Claims (37)

1. Izolovano antitelo, ili njegov antigen vezujući region, naznačeno time što se specifično vezuje za epitop humanog CD148 definisan jednom ili većim brojem polipeptidnih sekvenci izabranih iz grupe koja se sastoji od aminokiselina 315 do 329, 318 do 332, 321 do 335, 324 do 338, 324 do 329, 324 do 332, 324 do 335, 447 do 725, 533 do 725, 715 do 973, 200 do 536, 533 do 725 i 200 do 725 sekvence čiji je ID broj: 33.

2. Izolovano antitelo, ili njegov antigen vezujući region, prema zahtevu 1 naznačeno time što to antitelo ili njegov antigen vezujući region inhibira angiogenezu.

3. Izolovano antitelo, ili njegov antigen vezujući region, prema zahtevu 1 naznačeno time što je to antitelo ili njegov antigen vezujući region monoklonsko antitelo.

4. Izolovano antitelo, ili njegov antigen vezujući region, prema bilo kom od zahteva 1 do 3 naznačeno time što je to antitelo ili njegov antigen vezujući region humano antitelo ili njegov antigen vezujući region.

5. Izolovano antitelo, ili njegov antigen vezujući region, prema bilo kom od zahteva 1 do 4, naznačeno time što je to antitelo ili njegov antigen vezujući region fragment antitela izabran iz grupe koja se sastoji od scFv, Fab, F(ab')2, Fv i jednolančanih antitela.

6. Izolovano antitelo, ili njegov antigen vezujući region, prema bilo kom od zahteva 1 do 5, naznačeno time što to antitelo ili njegov antigen vezujući region sadrži scFv fragment.

7. Izolovano antitelo, ili njegov antigen vezujući region, prema bilo kom od zahteva 1 do 6, naznačeno time što to antitelo ili njegov antigen vezujući region sadrži, ili jeste, fuzioni protein scFv-Fc.

8. Izolovano antitelo, ili njegov antigen vezujući region, naznačeno time što kompetitivno inhibira vezivanje monoklonskog antitela iz bilo kog od zahteva 1 do 7 za epitop humanog CD148 definisan definisan jednom ili većim brojem polipeptidnih sekvenci izabranih iz grupe koja se sastoji od aminokiselina 315 do 329, 318 do 332, 321 do 335, 324 do 338, 324 do 329, 324 do 332, 324 do 335, 447 do 725, 533 do 725, 715 do 973,200 do 536, 533 do 725 i 200 do 725 sekvence čiji je ID broj: 33.

9. Izolovano antitelo, ili njegov antigen vezujući region, prema zahtevu 8, naznačeno time što to antitelo ili njegov antigen vezujući region inhibira angiogenezu.

10. Izolovano antitelo, ili njegov antigen vezujući region, prema zahtevima 8 ili 9 naznačeno time što je to antitelo ili njegov antigen vezujući region monoklonsko antitelo.

11. Izolovano antitelo, ili njegov antigen vezujući region, prema bilo kom od zahteva 8 do 10 naznačeno time što je to antitelo ili njegov antigen vezujući region humano antitelo.

12. Izolovano antitelo, ili njegov antigen vezujući region, prema bilo kom od zahteva 8 do 11, naznačeno time što je to antitelo ili njegov antigen vezujući region fragment antitela izabran iz grupe koja se sastoji od scFv, Fab, F(ab')2, Fv i jednolančanih antitela.

13. Izolovano humano antitelo, ili njegov antigen vezujući region, prema bilo kom od zahteva 8 do 12 naznačeno time što to antitelo ili njegov antigen vezujući region sadrži scFv fragment.

14. Izolovano antitelo, ili njegov antigen vezujući region, prema bilo kom od zahteva 8 do 13, naznačeno time što to antitelo ili njegov antigen vezujući region sadrži, ili jeste, fuzioni protein scFv-Fc.

15. Ćelija hibridoma naznačena time što proizvodi antitelo ili njegov antigen vezujući region iz bilo kog od zahteva 1 do 14.

16. Ćelija transfektoma naznačena time što proizvodi antitelo ili njegov antigen vezujući region iz bilo kog od zahteva 1 do 14.

17. Izolovano antitelo, ili njegov antigen vezujući region, prema bilo kom od zahteva 1 do 14, naznačeno time što je proizvedeno u hibridomu koji uključuje B ćeliju dobijenu iz transgene ne-humane životinje koja ima genom koji sadrži transgen humanog teškog lanca i transgen humanog lakog lanca, fuzionisanu za imortalizovanu ćeliju.

18. Izolovano antitelo, ili njegov antigen vezujući region, prema bilo kom od zahteva 1 do 14, naznačeno time što je proizvedeno u transfektomu koji sadrži nukleinske kiseline koje kodiraju humani teški lanac i humani laki lanac.

19. Monoklonsko antitelo ili njegov antigen vezujući region naznačen time što je proizveden u ćeliji hibridoma iz zahteva 15 ili u ćeliji transfektoma iz zahteva 16.

20. Transgena ne-humana životinja koja eksprimira antitelo, ili njegov antigen vezujući region, iz bilo kog od zahteva 1 do 14, naznačena time što data transgena ne-humana životinja ima genom koji sadrži transgen humanog teškog lanca i transgen humanog lakog lanca.

21. Postupak proizvodnje antitela, ili njegovog antigen vezujućeg regiona, koje se specifično veže za epitop humanog CD148 definisan sekvencom aminokiselina izabranih iz grupe koja se sastoji od aminokiselina 315 do 329, 318 do 332, 321 do 335, 324 do 338, 324 do 329, 324 do 332, 324 do 335, 447 do 725, 533 do 725, 715 do 973, 200 do 536, 533 do 725 i 200 do 725 sekvence čiji je ID broj: 33, naznačen time što podrazumeva: imunizaciju transgene ne-humane životinje koja ima genom koji sadrži transgen humanog teškog lanca i transgen humanog lakog lanca epitopom humanog CD 148 definisanim sekvencom aminokiselina izabranih iz grupe koja se sastoji od aminokiselina 315 do 329, 318 do 332, 321 do 335, 324 do 338, 324 do 329, 324 do 332, 324 do 335, 447 do 725, 533 do 725, 715 do 973, 200 do 536, 533 do 725 i 200 do 725 sekvence čiji je ID broj: 33, ili ćelijom koja eksprimira takav epitop humanog CD148, tako da se u B ćelijama te životinje proizvedu antitela; izolovanje B ćelija životinje; i fuzionisanje B ćelija sa ćelijama mijeloma kako bi se dobile besmrtne ćelije hibridoma koje luče antitelo ili njegov antigen vezujući region.

22. Farmaceutski preparat naznačen time što sadrži antitelo, ili njegov antigen vezujući region, iz bilo kog od zahteva 1 do 14 ili 17 do 19 i nosilac koji je ■ farmaceutski prihvatljiv za ljude.

23. Farmaceutski preparat prema zahtevu 22, naznačen time što je dato antitelo, ili njegov antigen vezujući region, prisutno u terapeutski delotvornoj količini.

24. Farmaceutski preparat prema zahtevu 22 ili 23, naznačen time što je dato antitelo, ili njegov antigen vezujući region, prisutno u koncentraciji koja je najmanje oko 10 ug/ml.

25. Farmaceutski preparat prema bilo kom od zahteva 22 do 24, naznačen time što je dato antitelo, ili njegov antigen vezujući region, IgG antitelo ili njegov antigen vezujući region.

26. Antitelo ili antigen vezujući region, prema bilo kom od zahteva 1 do 14 ili 17 do 19, naznačeno time što se koristi u terapiji.

27. Antitelo ili antigen vezujući region, prema zahtevu 26 za upotrebu koja je tamo naznačena, naznačeno time što se dato antitelo, ili njegov antigen vezujući region, upotrebljava u inhibiciji angiogeneze.

28. Upotreba antitela ili antigen vezujućeg regiona, iz bilo kog od zahteva 1 do 14 ili 17 do 19, naznačena time što je za dobijanje farmaceutskog preparata za inhibiciju angiogeneze.

29. Antitelo ili antigen vezujući region, prema zahtevu 26 ili 27, za upotrebu koja je tamo naznačena, ili za upotrebu iz zahteva 28, naznačeno time što je dato antitelo, ili njegov antigen vezujući region, IgG antitelo ili njegov antigen vezujući region.

30. Antitelo, ili antigen vezujući region, prema bilo kom od zahteva 26, 27 ili 29 za upotrebu koja je tamo naznačena, ili za upotrebu iz zahteva 28 ili 29, naznačeno time što dato antitelo, ili njegov antigen vezujući region, sadrži scFv, Fv, Fab', Fab, dijatelo, linearno antitelo ili F(ab')2 antigen vezujući fragment antitela.

31. Izolovani poli<p>eptid naznačen time što se sastoji od aminokiselinske sekvence izabrane iz grupe koja se sastoji od aminokiselina 315 do 329, 318 do 332, 321 do 335, 324 do 338, 324 do 329, 324 do 332, 324 do 335, 447 do 725, 533 do 725, 715 do 973, 200 do 536, 533 do 725 i 200 do 725 sekvence čiji je ID broj: 33 ili bilo kog njenog fragmenta koji se vezuje za antitelo iz bilo kog od zahteva 1 do 14 ili 17 do 19.

32. Izolovani polipeptid naznačen time što se suštinski sastoji od aminokiselinske sekvence izabrane iz grupe koja se sastoji od aminokiselina 315 do 329, 318 do 332, 321 do 335, 324 do 338, 324 do 329, 324 do 332, 324 do 335, 447 do 725, 533 do 725, 715 do 973, 200 do 536, 533 do 725 i 200 do 725 sekvence čiji je ID broj: 33 ili bilo kog njenog fragmenta koji se vezuje za antitelo iz bilo kog od zahteva 1 do 14 ili 17 do 19.

33. Izolovani polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od aminokiselina 315 do 329, 318 do 332, 321 do 335, 324 do 338, 324 do 329, 324 do 332, 324 do 335, 447 do 725, 533 do 725, 715 do 973, 200 do 536, 533 do 725 i 200 do 725 sekvence čiji je ID broj: 33 ili bilo koji njen fragment koji se vezuje za antitelo iz bilo kog od zahteva 1 do 14 ili 17 do 19, naznačen time što taj polipeptid ne obuhvata aminokiseline dobijene iz CD148 osim onih koje su izabrane iz grupe koja se sastoji od aminokiselina 315 do 329, 318 do 332, 321 do 335, 324 do 338, 324 do 329, 324 do 332, 324 do 335, 447 do 725, 533 do 725, 715 do 973, 200 do 536, 533 do 725 i 200 do 725 sekvence čiji je ID broj: 33.

34. Imunotest naznačen time što podrazumeva korake: (a) dovođenja ispitivanog uzorka u dodir sa monoklonskim antitelom, ili njegovim antigen vezujućim regionom, koje može da bude kompetitivno inhibirano u svom vezivanju za humani CD 148 monoklonskim antitelom, ili njegovim antigen vezujućim regionom, koje se specifično vezuje za epitop humanog CD148 definisan jednom ili većim brojem polipeptidnih sekvenci izabranih iz grupe koja se sastoji od aminokiselina 315 do 329, 318 do 332, 321 do 335, 324 do 338, 324 do 329, 324 do 332, 324 do 335, 447 do 725, 533 do 725, 715 do 973, 200 do 536, 533 do 725 i 200 do 725 sekvence čiji je ID broj: 33, i (b) određivanja prisustva humanog CD148 u ispitivanom uzorku.

35. Imunotest prema zahtevu 34, naznačen time što antitelo ili njegov antigen vezujući region aktivira inhibiciju angiogeneze koju indukuje CD148.

36. Postupak identifikacije jedinjenja koje se specifično vezuje za epitop humanog CD 148 definisan jednom ili većim brojem polipeptidnih sekvenci izabranih iz grupe koja se sastoji od aminokiselina 315 do 329, 318 do 332, 321 do 335, 324 do 338, 324 do 329, 324 do 332, 324 do 335, 447 do 725, 533 do 725, 715 do 973, 200 do 536, 533 do 725 i 200 do 725 sekvence čiji je ID broj: 33 naznačen time što podrazumeva: dovođenje ispitivanog jedinjenja u dodir sa epitopom humanog CD148 definisanim jednom ili većim brojem polipeptidnih sekvenci izabranih iz grupe koja se sastoji od aminokiselina 315 do 329, 318 do 332, 321 do 335, 324 do 338, 324 do 329, 324 do 332, 324 do 335, 447 do 725, 533 do 725, 715 do 973, 200 do 536, 533 do 725 i 200 do 725 sekvence čiji je ID broj: 33 tokom vremena dovoljnog da nastane kompleks i detekciju nastanka kompleksa detekcijom epitopa CD148 ili jedinjenja u datom kompleksu, tako da, ukoliko se otkrije kompleks, identifikuje se jedinjenje koje se vezuje za epitop CD148.

37. Postupak identifikacije jedinjenja koje se specifično vezuje za epitop humanog CD148 definisan jednom ili većim brojem polipeptidnih sekvenci izabranih iz grupe koja se sastoji od aminokiselina 315 do 329, 318 do 332, 321 do 335, 324 do 338, 324 do 329, 324 do 332, 324 do 335, 447 do 725, 533 do 725, 715 do 973, 200 do 536, 533 do 725 i 200 do 725 sekvence čiji je ID broj: 33 naznačen time što podrazumeva: obezbeđivanje atomskih koordinata koje definišu trodimenzionalnu strukturu epitopa CD148 definisanog jednom ili većim brojem polipeptidnih sekvenci izabranih iz grupe koja se sastoji od aminokiselina 315 do 329, 318 do 332, 321 do 335, 324 do 338, 324 do 329, 324 do 332, 324 do 335, 447 do 725, 533 do 725, 715 do 973, 200 do 536, 533 do 725 i 200 do 725 sekvence čiji je ID broj: 33, i projektovanje ili odabir jedinjenja koja su u stanju da vežu epitop CD148 na osnovu datih atomskih koordinata.