BRPI0720477A2 - Anticorpos de cd44 - Google Patents

Description

“ANTICORPOS DE CD44” REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS DE PATENTE E PATENTES RELACIONADAS

Este pedido reivindica o benefício do Pedido de Patente Provisório U.S. No. Serial 60/876109 depositado em 21 de dezembro de 2006; que está incorporado por referência aqui em sua totalidade.

Campo da Invenção

A presente invenção se refere às porções de ligação de antígeno e anticorpos dos mesmos que ligam-se ao CD44 humano. A invenção da mesma forma se refere a moléculas 10 de ácido nucléico que codificam tais porções de ligação de antígeno e anticorpos, métodos de preparar os anticorpos de CD44 e porções de ligação de antígeno, composições que compreendem estas porções de ligação de antígeno ou anticorpos dos mesmos e métodos de usar os anticorpos, porções de ligação de antígeno, e composições ou medicamentos para tratamento.

Antecedente da Invenção

Inflamação, um acúmulo local de fluido, causada por exemplo por, lesão física, in- fecção ou uma resposta imune, é iniciada pelo recrutamento de células inflamatórias, tais como monócitos e células T na matriz extracelular. Naor, D. e outro, (2003) Arthritis Res Ther, 5:105-115. Este recrutamento celular resulta tipicamente na infiltração adicional e au- 20 mento de citocinas, tais como TNF-/?, IL-6 e IL-1/?, na matriz extracelular (lbid). Tal recruta- mento e infiltração de células, junto com vários outros processos celulares, tais como por exemplo, regulamento de crescimento, adesão, diferenciação, invasão e sobrevivência são mediados por moléculas de adesão celular de glicoproteína de transmembrana, uma super- família de receptores de adesão. Membros da família do receptor de adesão celular incluem 25 CD44, uma glicoproteína de transmembrana de classe I amplamente distribuída. CD44 de- sempenha um papel principal em uma variedade de comportamentos celulares, incluindo adesão, migração, ativação, e sobrevivência. Ponta, H. e outro, (2003) Molecular Cell Bio- logy, 4:33-45.

CD44 varia no peso molecular de 80 a 90 kDa e pode gerar perto de 800 isoformas 30 variantes por entrançamento alternativo diferencial. Cichy, J. e outro, (2003) Journal of Cell Biology, 161 :5, 839-843. No momento, várias dúzias de isoformas são conhecidas. CD44 é ubiquamente expresso em muitos tipos de célula incluindo leucócitos, fibroblastos, células epiteliais, ceratinócitos e algumas células endoteliais, com a forma de CD44 padrão (CD44s), que necessita de quaisquer exons variante, sendo a isoforma mais abundantemen- 35 te expressa.

CD44 junto com seu Iigante primário, hialuronano ou ácido hialurônico (HA), um po- lissacarídeo hidrofílico, linear, extracelular, desempenha um papel principal na inflamação. Naor D., (2003) Arthritis Res Ther, 5:105-115 e Aruffo1 A. (1990) Cell 61, 1301 - 1313. Por exemplo, em um estudo in vivo um anticorpo anti-CD44 monoclonal, IRAWB14, que induz atividade de ligação de HA mediada por CD44 na exacerbação dos sintomas inflamatórios em camundongos com artrite induzida por proteoglicano. Pure1 E. e outro, (2001) TRENDS in Molecular Medicine, 7:213-221.

Sumário da Invenção

A presente invenção fornece porções de ligação de antígeno ou anticorpos isolados do mesmo que especificamente ligam CD44 e podem agir como um antagonista de CD44, e composições ou medicamentos compreendendo as referidas porções de ligação de antíge- 10 no ou anticorpo do mesmo. Outro aspecto da presente invenção fornece quaisquer das por- ções de ligação de antígeno ou anticorpos do mesmo como descrito aqui, onde o referido anticorpo ou porção de ligação de antígeno é um anticorpo humano. Em um outro aspecto, o referido anticorpo ou porção de ligação de antígeno é um anticorpo recombinante humano.

A invenção fornece anticorpos que especificamente ligam CD44 compreendendo: (i) uma cadeia leve e/ou pesada, ou (ii) os domínios variáveis da mesma, ou (iii) porções de ligação de antígeno dos mesmos, ou (iv) região(ões) de determinação de complementarida- de (CDR) dos mesmos.

A invenção também fornece anticorpos de CD44 ou porções de ligação de antígeno em que o anticorpo ou porção de ligação de antígeno do mesmo tendo pelo menos uma das propriedades funcionais como descrito abaixo em a) a g).

a) liga-se a CD44 com uma K0 de 1000 nM ou menos como medido por ressonân- cia de plasmônio de superfície;

b) tem uma taxa de dissociação (koff) para CD44 menor que ou igual a 0,01s_1 como medido por ressonância de plasmônio de superfície;

c) liga-se a CD44 com uma EC50 menor que 500 nM, 75 μς/ιτιΙ como medido por

FACS ou ensaio de ligação ELISA;

d) inibe a interação entre CD44 e HA com uma IC50 menor que 500 nM, 75 μg/ml como medido por um ensaio de ligação ELISA;

e) reduz a expressão de superfície in vivo de receptores de CD44 em células infla- matórias, tal como células CD3+ T em uma IC50 menor que aproximadamente 100 nM como

medido por FACS;

f) reduz a expressão de superfície de receptores de CD44 in vitro com uma IC50 menos que 50 nM;

g) tem uma seletividade para CD44 sobre a proteína do receptor 1 de hiauronano endotelial de vaso linfático (LYVE-1) por pelo menos 100 vezes. Em outra modalidade, a

invenção fornece uma molécula de ácido nucléico isolada que compreende uma seqüência de nucleotídeo que codifica qualquer das porções de ligação de antígeno ou anticorpos co- mo descrito aqui. Em uma modalidade particular, a invenção fornece uma molécula de ácido nucléico isolada que compreende uma seqüência de nucleotídeo mencionada em qualquer das SEQ ID NOs descritas aqui. A invenção também fornece um vetor que compreende quaisquer das moléculas de ácido nucléico descritas aqui, em que o vetor opcionalmente compreende uma seqüência de controle de expressão operavelmente ligada à molécula de ácido nucléico.

Outra modalidade fornece uma célula hospedeira que compreende quaisquer dos vetores descritos aqui ou compreendendo qualquer das moléculas de ácido nucléico descri- tas aqui. A presente invenção também fornece uma linha celular isolada que produz qual- quer das porções de ligação de antígeno ou anticorpos como descrito aqui ou que produz a cadeia pesada ou cadeia leve de quaisquer anticorpos ou referidas porções de ligação de antígeno.

Em outra modalidade, a presente invenção fornece um método para produzir um anticorpo de CD44 ou porção de ligação de antígeno do mesmo, compreendendo cultivar quaisquer das células hospedeiras ou linhagens celulares descritas aqui sob condições a- dequadas e recuperar o referido anticorpo ou porção de ligação de antígeno.

A presente invenção da mesma forma fornece um animal transgênico não humano ou planta transgênica compreendendo quaisquer dos ácidos nucléico descritos aqui, em que o animal transgênico não humano ou planta transgênica expressa o referido ácido nucléico.

A presente invenção também fornece um método para isolar um anticorpo ou por- ção de ligação de antígeno do mesmo que liga-se ao CD44, compreendendo a etapa de isolar o anticorpo do animal transgênico não humano ou planta transgênica como descrito aqui.

A invenção fornece composições que compreendem: (i) a cadeia leve e/ou pesada, os domínios variáveis da mesma, ou porções de ligação de antígeno da mesma, ou CRDs da mesma, do referido anticorpo anti-CD44, ou moléculas de ácido nucléico que os codifi- cam; e (ii) um veículo farmaceuticamente aceitável. Composições da invenção podem tam- bém compreender outro componente, tal como agente terapêutico ou um agente diagnósti- co.

A presente invenção da mesma forma fornece uma composição farmacêutica ou medicamento que compreende quaisquer das porções de ligação de antígeno ou anticorpos do mesmo como descrito aqui e opcionalmente um veículo farmaceuticamente aceitável ligado ou na suspensão. Composições da invenção podem também compreender outro componente, tal como agente terapêutico ou agente diagnóstico.

Métodos diagnósticos e terapêuticos são da mesma forma fornecidos pela inven- ção.

A presente invenção da mesma forma fornece um método para tratar recrutamento ou infiltração de célula inflamatória em um mamífero em necessidade do mesmo, compre- endendo a etapa de administrar ao referido mamífero quaisquer das porções de ligação de antígeno ou anticorpos, ou quaisquer das composições farmacêuticas, como descrito aqui.

Outro aspecto da presente invenção fornece quaisquer das porções de ligação de antígeno ou anticorpos do mesmo como descrito aqui, onde o referido anticorpo ou porção de ligação de antígeno é um anticorpo humano. Em um outro aspecto, o referido anticorpo ou porção de ligação de antígeno é um anticorpo recombinante humano.

Breve Descrição dos Desenhos

FIG. 1 é uma representação esquemática de uma Imunoglobulina (IgG).

FIG. 2 é um alinhamento de seqüência de seqüências de aminoácido preditas dos domínios variáveis de cadeia leve e pesada de anticorpos monoclonais anti-CD44 isolados com as seqüências de aminoácido da linha germinativa dos genes de cadeia leve e pesada Iuz correspondentes. Resíduos idênticos entre os clones e as seqüências de linha germina- tiva são mostrados por traços, deleções/inserções são mostradas por marcas misturadas, mutações são listadas, e CDRs são sublinhadas.

FIG. 3 é um gráfico que ilustra o anticorpo 1A9.A6.B9 anti-CD44 que bloqueia a li- gação de HA à proteína de fusão de CD44-lg.

FIG. 4A-4C são gráficos que mostram a ligação de anticorpos anti-CD44 em células quando analisados por classificação de citometria de fluxo (FACS).

FIG. 4A é um gráfico que ilustra a ligação de anticorpos 1A9.A6.B9 e 14G9.B8.B4 anti-CD44 em células T de sangue totais humanas quando analisados por FACS.

FIG. 4B é um gráfico que ilustra a ligação de anticorpos 1A9.A6.B9 e 14G9.B8.B4 anti-CD44 em células T de sangue totais de macaco cinomolgo quando analisados por FACS.

FIG. 4C é um gráfico que ilustra ligação de anticorpos anti-CD44 em células 300-19 transduzidas com o CD44 de ciano e humano quando analisados por FACS.

FIG. 5 é um gráfico que ilustra o estudo de ligação de anticorpo 1A9.A6.B9 anti- CD44 usando as proteínas de fusão de CD44-lg de ciano e humano quando medido por en- saios ELISA.

FIG. 6 mostra um gráfico que ilustra anticorpos 1A9.A6.B9 e 14G9.B8.B4 anti-CD44 que bloqueia a liberação de IL-1/? estimulada por lipopolissacarídeo (LPS) e HA de monóci- tos totais humanos, como quantificados usando ELISA.

FIG. 7 é um gráfico que mostra anticorpos 1A9.A6.B9 e 14G9.B8.B4 anti-CD44 que reduzem a expressão de superfície de receptores de CD44 em células T periféricas CD3+ quando medidas por FACS.

FIG. 8A é um gráfico que mostra a redução de expressão de superfície de recepto- res de CD44 em leucócitos periféricos humanos (linfócitos) por anticorpo 1A9.A6.B9 anti- CD44.

FIG. 8B é um gráfico que mostra a redução de expressão de superfície de recepto- res de CD44 em leucócitos periféricos humanos (monócitos) por anticorpo 1A9.A6.B9 anti- CD44.

FIG. 8C é um gráfico que mostra a redução de expressão de superfície de recepto-

res de CD44 em neutrófilos periféricos humanos (PMNs) por anticorpo 1A9.A6.B9 anti- CD44.

FIG. 9A e 9B mostra gráficos que ilustram o estudo in vivo de dose única de anti- corpo 1A9.A6.B6 anti-CD44 administrado em macacos cinomolgos, quando quantificado usando FACS.

FIG. 10A é um gráfico que ilustra a ligação de 1A9.A6.B9 anti-CD44 em competição direta com anticorpo anti-CD44 MEM 85 usando células T periféricas humanas, quando quantificado usando FACS.

FIG. 10B é um gráfico que ilustra a ligação de 1A9.A6.B9 anti-CD44 em competição direta com anticorpo anti-CD44 MEM 85 usando as células 300-19 transfectadas com CD44 humano como descrito no EXEMPLO 1, quando quantificado usando FACS.

FIG. 11 é um gráfico que ilustra o agregado presente formado (espécies de massa molecular alta (HMMS)) a 50°C (11a), 25°C (11b) e 40°C (11c) quando medido por

SE-HPLC.

FIG. 12 é um gráfico que mostra as espécies de ácido total formado a 50°C (12a),

25°C (12b) e 40°C (12c) quando medido por ICE.

Descrição Detalhada Da Invenção

Definições

Ao longo desta especificação e reivindicações, a palavra " compreender", ou varia- ções tal como "compreende" ou "compreendendo," será entendido para insinuar a inclusão de um número inteiro declarada ou grupo de números inteiros porém não a exclusão de qualquer outra número inteiro ou grupo de números inteiros.

A menos que de outra maneira definido aqui, termos científicos e técnicos usados com relação à presente invenção terão os significados que são geralmente compreendido 30 por aqueles de experiência ordinária na técnica. Além disso, a menos que de outra maneira requerido por contexto, termos singulares incluirão pluralidades e termos plurais incluirão o singular. Geralmente, a nomenclatura usada aqui com relação à cultura de tecido ou célula, biologia molecular, imunologia, microbiologia, genéticas e proteína e química de ácido nu- cléico e hibridização são aqueles geralmente usados na técnica.

A unidade estrutural de anticorpo básico é conhecida por compreender um tetrâme-

ro. Cada tetrâmero é composto de dois pares idênticos de cadeias de polipeptídeo, cada par tendo uma cadeia "leve" (cerca de 25 kDa) e uma cadeia “pesada" (cerca de 50-70 kDa). O porção de amino-terminal de cada cadeia inclui uma região variável de cerca de 100 a 120 ou mais aminoácidos principalmente responsáveis para o reconhecimento de antígeno. A porção de terminal carbóxi de cada cadeia define uma região constante principalmente res- ponsável pela função efetora. Cadeias leves humanas são classificadas como cadeias Ie- 5 ves de capa e lambda. Cadeias pesadas são classificadas como mu, delta, gama, alfa, ou epsilo, e define o isótipo do anticorpo como IgM, IgD, IgG, IgA, e IgE, respectivamente. Dentro de cadeias leves e pesadas, as regiões variáveis e constantes são unidas por uma região "J" de cerca de 12 ou mais aminoácidos, com a cadeia pesada da mesma forma in- cluindo uma região "D" de cerca de 3 ou mais aminoácidos. Veja geralmente, Fundamental 10 Immunology Ch. 7 (Paul, W., ed., 2o ed. Raven Press, N.Y. (1989)). As regiões variáveis de cada par de cadeia pesada/leve (VH e VL), respectivamente, formam o sítio de ligação de anticorpo. Desse modo, um anticorpo IgG intacto, por exemplo, tem dois sítios de ligação. Exceto nos anticorpos bifuncionais ou biespecíficos, os dois sítios de ligação são os mes- mos.

As regiões variáveis da exibição das cadeias pesada e clara exibem a mesma es-

trutura geral de regiões de estrutura relativamente conservadas (FR) unidas por três regiões hiper variáveis, da mesma forma chamadas regiões de determinação de complementaridade ou CDRs. O termo "variável" refere-se ao fato que certas porções dos domínios variáveis diferem-se extensivamente na seqüência entre os anticorpos e são usadas na ligação e es- 20 pecificidade de cada anticorpo particular para seu antígeno particular. A variabilidade, entre- tanto, não é distribuída uniformemente ao longo dos domínios variáveis de anticorpos, po- rém é concentrada nas CDRs, que são separadas pelas FRs altamente conservadas. As CDRs das duas cadeias de cada par são alinhadas pelas FRs, permitindo a ligação a um epitopo específico. A partir de N-terminal a C-terminal, tanto a cadeia leve quanto a pesada 25 compreendem os domínios FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 e FR4. A designação de aminoácidos a cada domínio está de acordo com as definições das Seqüências de Kabat de Proteínas de Interesse Imunológico (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 e 1991)), ou Chothia & Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917; Chothia e outro (1989) Nature 342:878-883. Como aqui usado, um anticorpo que é referido por número é o mesmo como o 30 anticorpo monoclonal que é obtido a partir do hibridoma do mesmo número. Por exemplo, anticorpo monoclonal 1A9.A6.B9 é o mesmo anticorpo como obtido a partir do hibridoma 1A9.A6.B9, ou um subclone do mesmo. Como aqui usado, um fragmento Fd significa um fragmento de anticorpo que consiste nos domínios Vh e CH1; um fragmento Fv consiste nos domínios Vl e Vh de uma única ramificação de um anticorpo; e um fragmento dAb (Ward e 35 outro, (1989) Nature 341 :544-546) consiste em um domínio de VH. Em algumas modalida- des, o anticorpo é um anticorpo de cadeia simples (scFv) em que os domínios de Vl e Vh são emparelhados para formar uma molécula monovalente por um Iigador sintético que os permite ser feitos como uma cadeia de proteína simples. (Bird e outro, (1988) Science 242:423-426 e Huston e outro, (1988) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85:5879-5883). Em algu- mas modalidades, os anticorpos são diacorpos, isto é, anticorpos bivalentes nos quais os domínios de Vh e Vl são expressos em uma cadeia de polipeptídeo simples, porém usando um Iigador que é muito curto para permitir emparelhar entre os dois domínios na mesma cadeia, desse modo forçando os domínios emparelharem com domínios complementares de outra cadeia e criar dois sítios de ligação de antígeno. (Veja por exemplo, Holliger P. e outro,

(1993) Proc. Natl.

Acad. Sei. USA 90:6444-6448, e Poljak R. J. e outro, (1994) Structure 2:1121-1123. Em uma modalidade, um ou mais CDRs de um anticorpo da invenção podem ser incorpora- das em uma molécula covalentemente ou não covalentemente para torná-la uma imunoade- sina que especificamente liga-se ao CD44. Em tais modalidades, a(s) CDR(s) pode(m) ser incorporada(s) como parte de uma cadeia de polipeptídeo maior, pode(m) ser covalente- mente ligada(s) a outra cadeia de polipeptídeo, ou pode(m) ser incorporada(s) não covalen- temente.

No anticorpo, modalidades que têm um ou mais sítios de ligação, os sítios de liga- ção podem ser idênticos um ao outro ou podem ser diferentes.

O termo "análogo" ou "polipeptídeo análogo" como usado aqui refere-se a um poli- peptídeo que compreende um segmento que tem identidade significativa a alguma seqüên- cia de aminoácido de referência e tem substancialmente a mesma função ou atividade como a seqüência de aminoácido de referência. Tipicamente, análogos de polipeptídeo compre- endem uma substituição de aminoácido conservadora (ou inserção ou deleção) com respei- to à seqüência de referência. Análogos podem ser pelo menos 20 ou 25 aminoácidos no comprimento, ou podem ser pelo menos 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150 ou 200 aminoácidos no comprimento ou mais longos e podem ser freqüentemente tão longos quanto o polipeptídeo de tamanho natural. Algumas modalidades da invenção incluem fragmentos de polipeptídeo ou anticorpos de análogo de polipeptídeo com 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15,

16 ou 17 substituições da seqüência de aminoácido da linha germinativa. Fragmentos ou análogos de anticorpos ou moléculas de imunoglobulina podem ser preparados facilmente por aqueles de experiência ordinária na técnica que segue os ensinos desta especificação.

Em uma modalidade, substituições de aminoácido para um anticorpo ou porção de ligação de antígeno de CD44 do mesmo são aquelas que: (1) reduzem a suscetibilidade à proteólise, (2) reduzem a suscetibilidade à oxidação, (3) alteram a afinidade de ligação para formar os complexos de proteína, ou (4) conferem ou modificam outras propriedades funcio- nais ou fisico-químicas de tais análogos, porém ainda mantêm a ligação específica ao CD44. Análogos podem incluir várias substituições à seqüência de peptídeo de ocorrência natural. Por exemplo, substituições de aminoácido simples ou múltiplos, preferivelmente substituições de aminoácido conservadoras, podem ser feitas na seqüência de ocorrência natural, por exemplo na porção do polipeptídeo fora do(s) domínio(s) que formam os conta- tos intermoleculares. Substituições de aminoácido podem da mesma forma ser feitas no(s) domínio(s) que formam contatos intermoleculares que podem melhorar a atividade do poli- 5 peptídeo. Uma substituição de aminoácido conservadora não deve mudar substancialmente as características estruturais da seqüência de origem; por exemplo, um aminoácido de subs- tituição deve alterar a folha β anti-paralela que prepara o domínio de ligação de imunoglobu- Iina que ocorre na seqüência de origem, ou romper outros tipos de estrutura secundária que caracteriza a seqüência de origem. Em geral, glicina e prolina não seriam usadas em uma 10 folha β anti-paralelo. Exemplos de estruturas secundárias e terciárias de polipeptídeo reco- nhecidas na técnica são descritos em Proteins, Structure and Molecular Principies (Creigh- ton, Ed., W. H. Freeman and Company, New York (1984)); Introdution to Protein Structure (C. Branden e J. Tooze1 eds., Gerland Publishing, New York, N.Y. (1991)); e Thornton e ou- tro, (1991) Nature 354:105.

Como aqui usado, o termo "anticorpo" é sinônimo com imunoglobulina e deve ser

entendido como geralmente conhecido na técnica. Em particular, o termo anticorpo não está limitado por qualquer método particular de produzir o anticorpo. Por exemplo, o termo anti- corpo inclui, inter alia, anticorpos recombinantes, anticorpos monoclonais, e anticorpos poli- clonais.

O termo "porção de ligação de antígeno" de um anticorpo (ou simplesmente "porção

de anticorpo” ou "porção"), Como aqui usado, refere-se a um ou mais fragmentos de um anticorpo que mantém a capacidade de especificamente ligar-se a um antígeno (por exem- plo, CD44). Foi mostrado que a função de ligação de antígeno de um anticorpo pode ser realizada por fragmentos de um anticorpo de tamanho natural. Exemplos de fragmentos de 25 ligação abrangidos dentro do termo "porção de ligação de antígeno" de um anticorpo inclu- em: (i) um fragmento Fab, um fragmento monovalente que consiste nos domínios de VL, VH, Cl e CH1; (ii) um fragmento F(ab’)2, um fragmento bivalente que compreende dois fragmen- tos Fab ligados por uma ponte de dissulfeto na região de articulação; (iii) um fragmento Fd que consiste nos domínios de Vh e CH1; (iv) um fragmento Fv que consiste nos domínios Vl 30 e Vh de uma ramificação simples de um anticorpo; (v) um fragmento dAb (Ward e outro, (1989) Nature 341 :544-546), que consiste em um domínio de VH; e (vi) uma região de de- terminação de complementaridade (CDR). Além disso, embora os dois domínios do frag- mento Fv, Vl e VH, sejam codificados por genes separados, eles podem ser unidos, usando métodos recombinantes, por um Iigador sintético que os permite ser feito como uma cadeia 35 de proteína simples em que as regiões de Vl e Vh emparelham-se para formar moléculas monovalentes (conhecidas como Fv de cadeia simples (scFv)); veja por exemplo, Bird e ou- tro, (1988) Science 242:423-426 e Huston e outro, (1988) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85:5879-5883). Tais anticorpos de cadeia simples são da mesma forma pretendidos ser a- brangidos dentro do termo "porção de ligação de antígeno" de um anticorpo. Outras formas de anticorpos de cadeia simples, tais como diacorpos são da mesma forma abrangidos. Dia- corpos são bivalentes, anticorpos biespecíficos nos quais os domínios de Vh e Vl são ex- pressados em uma cadeia de polipeptídeo simples, porém usando um Iigador que é muito curto para permitir emparelhar entre os dois domínios na mesma cadeia, desse modo for- çando os domínios emparelharem-se com domínios complementares de outra cadeia e cri- ando dois sítios de ligação de antígeno (veja por exemplo, Holliger e outro, (1993) Proc. Na- tl. Acad. Sei. USA 90:6444-6448; Poljak e outro, (1994) Structure 2:1 121-1 123).

Ainda também, um anticorpo ou porção de ligação de antígeno do mesmo pode ser parte de moléculas de imunoadesão maiores, formada por associação covalente ou não covalente do anticorpo ou porção de anticorpo com uma ou mais outras proteínas ou peptí- deos. Exemplos de tais moléculas de imunoadesão incluem o uso da região de númeo de estreptavidina para tornar uma molécula de scFv tetramérica (Kipriyanov e outro, (1995) Human Antibodies and Hybridomas 6:93-101) e uso de um resíduo de cisteína, um peptídeo marcador e um rótulo de poliistina C-terminal para tornar as moléculas de scFv bivalentes e biotiniladas (Kipriyanov e outro, (1994) Mol. Immunol. 31 :1047-1058). Outros exemplos in- cluem-se onde uma ou mais CDRs de um anticorpo são incorporadas em uma molécula covalentemente ou não covalentemente para torná-las uma imunoadesão que especifica- mente liga-se a um antígeno de interesse, tal como CD44. Em tais modalidades, a(s) CDR(s) pode(m) ser incorporada(s) como parte de uma cadeia de polipeptídeo maior, po- de(m) ser covalentemente ligada(s) a outra cadeia de polipeptídeo, ou pode(m) ser incorpo- rada^) não covalentemente. Porções de anticorpo, tais como fragmentos F(ab’)2, pode(m) ser preparadas a partir de anticorpos inteiros usando técnicas convencionais, tal como di- gestão de papaína ou pepsina, respectivamente, de anticorpos inteiros. Além disso, anticor- pos, porções de anticorpo e moléculas de imunoadesão podem ser obtidos usando técnicas padrões recombinantes de ADN, como descrito aqui.

A menos que especificamente indicado de outra maneira, o termo "CD44" se refere a CD44 humano. CD44 é um receptor de matriz extracelular multiestrutual e um membro da família clássica de glicoproteínas de transmembrana que regula atividades de célula-célula e célula-matriz. A clonagem e seqüência de um CD44 humano foram relatadas, por exemplo Arrofo, A. (1990) Cell, 16. (No. de Acesso NM_001001391), e é mencionado em SEQ ID NO:1. O termo CD44 é pretendido incluir CD44 humano recombinante e formas quiméricas recombinantes de CD44, que podem ser preparadas por métodos de expressão recombi- nante padrões ou adquiridos comercialmente (por exemplo, R&D Systems Cat. N0.861-PC- 100). Particularmente, CD44 é uma proteína de transmembrana tipo 1 glicolilada de 80-90 kDa codificada por um gene de 60 kb simples compreendendo 20 exons. Dez dos 20 exons, (exons padrões 1s a 10s) são expressos em todas as células positivas de CD44 e codificam o "CD44 padrão" ou "CD44s". Os 10 outros exons (exons variantes 1v a 10v) são submeti- dos ao entrançamento alternativo e codificam seqüências peptídicas inseridas no domínio extracelular de CD44s. O "domínio extracelular de CD44" compreende uma região globular N-terminal estabilizada por 3 ligações de dissulfeto, e é separado da membrana celular por uma estrutura linear e tem aproximadamente 247 resíduos no comprimento e é mencionado em SEQ ID NO:3. (Gadhoum Z. e outro, (2004) Ieukemia & Lynphoma 45(8):1501-1510). Esta escada de ligação de tri-dissulfeto inclui a região globular que exibe o domínio de liga- ção de ácido hialurônico (HA, hialuronato, hialuronano) "domínio de ligação de HA", Iocali- zado dentro do domínio extracelular de CD44s e inclui o "módulo de ligação” que tem apro- ximadamente 100 resíduos no comprimento, (resíduos 32-123 do domínio extracelular de CD44s e como mencionado em SEQ ID NO:5). O "domínio ligação de HA" pode também ser caracterizado como compreendendo pelo menos resíduos de aminoácido Lys38, Arg41, T- yr42, Arg78, Tyr79, AsniOO, Asn101, Arg150, Arg154 e Arg162. (Teriete P. e outro, (2004) Molecular Cell, 13, 483-496).

O termo "anticorpo quimérico” como aqui usado significa um anticorpo que compre- ende regiões de dois ou mais anticorpos diferentes, incluindo anticorpos de espécies dife- rentes. Por exemplo, uma ou mais das CDRs de um anticorpo quimérico pode ser derivado de um anticorpo de CD44 humano. Em um exemplo, as CDRs de um anticorpo humano po- 20 dem ser combinadas com CDRs de um anticorpo não humana, tal como camundongo ou rato. Em outro exemplo, todas as CDRs podem ser derivadas de anticorpos de CD44 huma- nos. Em outro exemplo, as CDRs de mais de um anticorpo de CD44 humano podem ser combinadas em um anticorpo quimérico. Por exemplo, um anticorpo quimérico pode com- preender uma CDR1 da cadeia leve de um primeiro anticorpo de CD44 humano, uma CDR2 25 da cadeia leve de um segundo anticorpo de CD44 humano e uma CDR3 da cadeia leve de um terceiro anticorpo de CD44 humano, e CDRs da cadeia pesada podem ser derivadas de um ou mais outros anticorpos de CD44. Além disso, as regiões de estrutura podem ser deri- vadas de um dos anticorpos de CD44 dos quais uma ou mais das CDRs são consideradas ou de um ou mais anticorpos humanos diferentes. Além disso, o termo "anticorpo quimérico” 30 é pretendido abranger quaisquer das combinações supracitadas onde as combinações en- volveram anticorpos humano e não humanos.

O termo "compete", como aqui usado com respeito a um anticorpo, significa que um primeiro anticorpo, ou uma porção de ligação de antígeno do mesmo, compete para ligação com um segundo anticorpo, ou uma porção de ligação de antígeno do mesmo, onde a Iiga- 35 ção do primeiro anticorpo com seu epítopo cognato é detectavelmente diminuída na presen- ça do segundo anticorpo comparado à ligação do primeiro anticorpo na ausência do segun- do anticorpo. A alternativa, onde a ligação do segundo anticorpo ao seu epítopo é da mes- ma forma detectavelmente diminuída na presença do primeiro anticorpo, pode, porém não necessariamente, ser o caso. Isto é, um primeiro anticorpo pode inibir a ligação de um se- gundo anticorpo a seu epítopo sem aquele segundo anticorpo que inibe a ligação do primei- ro anticorpo ao seu respectivo epítopo. Entretanto, onde cada anticorpo detectavelmente inibe a ligação do outro anticorpo com seu epítopo cognato ou ligante, seja à mesma, maior ou menor extensão, os anticorpos são referidos para “competirem cruzado" um com o outro para ligação de seu(s) epítopo(s) respectivo(s). Tanto os anticorpos de competição quanto o de competição cruzada são abrangidos pela presente invenção. Independente do mecanis- mo por qual tal competição ou competição cruz ocorre (por exemplo, impedimento estérico, mudança conformacional, ou ligação a um epítopo comum, ou porção do mesmo), o técnico versado apreciaria, com base nos ensinamentos fornecidos aqui, que tais anticorpos de competição e/ou competição cruzada são abrangidos e podem ser úteis para os métodos descritos aqui.

Como o termo é usado aqui, uma "substituição de aminoácido conservadora" é a- quela em que um resíduo de aminoácido é substituído por outro resíduo de aminoácido que tem um grupo R de cadeia lateral com propriedades químicas similares (por exemplo, carga ou hidrofobicidade). Em geral, uma substituição de aminoácido conservadora não mudará substancialmente as propriedades funcionais de uma proteína. Em casos onde duas ou mais seqüências de aminoácido diferem-se uma da outra por substituições conservadoras, o percentual de similaridade de seqüência pode ser ajustado para cima para corrigir a nature- za conservadora da substituição. Meios para preparar este ajuste são bem conhecidos por aqueles de experiência na técnica. Pearson, (1994) Methods Mol. Biol. 243:307-31. Exem- plos de grupos de aminoácidos que têm cadeias laterais com propriedades químicas simila- res incluem 1) cadeias laterais alifáticas: glicina, alanina, valina, leucina, e isoleucina; 2) ca- deias laterais de hidroxila alifáticas: serina e treonina; 3) cadeias laterais contendo amida: asparagina e glutamina; 4) cadeias laterais aromáticas: fenilalanina, tirosina, e triptofano; 5) cadeias laterais básicas: lisina, arginina, e histidina; 6) cadeias laterais ácidas: ácido aspárti- co e ácido glutâmico; e 7) cadeias laterais contendo enxofre: cisteína e metionina. Grupos de substituição de aminoácidos conservadora podem ser, por exemplo, valina-leucina- isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina-valina, glutamato-aspartato, e aspa- ragina-glutamina.

Uma substituição conservadora é da mesma forma qualquer mudança que tem um valor positivo na matriz de probabilidade de Iog PAM250 descrita em Gonnet e outro, (1992) Science 256:1443-45. Uma substituição “moderadamente conservadora" é qualquer mudan- ça que tem um valor não negativo na matriz de probabilidade de Iog PAM250.

"Contatar" refere-se a trazer um anticorpo ou porção de ligação de antígeno do mesmo da presente invenção e um CD44 alvo, ou epítopo do mesmo, junto de uma tal ma- neira que o anticorpo pode afetar a atividade biológica do CD44. Tal “contatar" pode ser realizada “in vitro", por exemplo, em um tubo teste, uma placa de petri, ou similar. Em um tubo teste, contatar pode envolver apenas um anticorpo ou porção de ligação de antígeno e CD44 ou epítopo do mesmo ou pode envolver células inteiras. Células podem da mesma 5 forma ser mantidas ou crescidas em placas de cultura de célula e contatadas com porções de ligação de antígeno ou anticorpos dos mesmos neste ambiente. Neste contexto, a capa- cidade de um anticorpo ou porção de ligação de antígeno particular do mesmo afetar um distúrbio relacionado à CD44, isto é, o IC50 do anticorpo, pode ser determinada antes do uso do anticorpo in vivo com organismos vivos mais complexos ser possível. Para células fora 10 do organismo, existem múltiplos métodos, e são bem conhecidos por aqueles versados na técnica, para contatar CD44 do mesmo com as porções de ligação de antígeno ou anticor- pos.

Como aqui usado, o termo "ELISA" refere-se a um ensaio imunossorvente ligado à enzima unido. Este ensaio é bem conhecido por aqueles de experiência na técnica. Exem- pios deste ensaio podem ser encontrados em Vaughan, T.J. e outro, (1996) Nat. Biotech. 14:309-314, bem como nos EXEMPLOS 5, 6, 7 e 11 do presente pedido.

O termo "epítopo" inclui qualquer proteína determinante capaz de ligação específica a um receptor de célula T ou imunoglobulina ou de outra maneira interação com uma molé- cula. Determinantes epitópicos geralmente consistem em agrupamentos de superfície qui- micamente ativa de moléculas tais como aminoácidos ou carboidrato ou cadeias laterais de açúcar e geralmente têm características estruturais tridimensionais específicas, bem como características de carga específica. Um epítopo pode ser "linear" ou "conformacional". Em um epítopo linear, todos os pontos de interação entre a proteína e a molécula de interação (tal como um anticorpo) ocorrem linearmente ao longo da seqüência de aminoácido primária da proteína. Em um epítopo conformacional, os pontos de interação ocorrem por resíduos de aminoácido na proteína que são separados um do outro. Entretanto, logo que um epítopo desejado em um antígeno é determinado, anticorpos para esse epítopo podem ser gerados, por exemplo, usando as técnicas descritas na presente invenção. Durante o processo de descoberta, a geração e caracterização de anticorpos podem da mesma forma elucidar in- formação a cerca de epítopos desejáveis. A partir desta informação, é em seguida possível avaliar competitivamente anticorpos para ligação ao mesmo epítopo. Uma abordagem para obter isto é conduzir estudos de competição cruzada para encontrar anticorpos que competi- tivamente ligam-se um ao outro, isto é, os anticorpos competem para ligação ao antígeno. Um processo de alta produtividade para "guardar" anticorpos com base em sai competição cruzada é descrito na Publicação PCT No. WO 03/48731.

O termo "seqüência de controle de expressão” como aqui usado significa seqüên- cias de polinucleotídeo que são necessárias para realizar a expressão e processamento de seqüências de codificação às quais elas são ligadas. Seqüências de controle de expressão incluem a iniciação de transcrição apropriada, terminação, promotor e seqüências de real- çador; sinais de processamento de ARN eficientes tais como entrançamento e sinais de po- liadenilação; seqüências que estabilizam mRNA citoplásmico; seqüências que realçam a eficiência de translação (isto é, seqüência de consenso de Kozak); seqüências que realçam a estabilidade de proteína; e quando desejado, seqüências que realçam a secreção de pro- teína. A natureza de tais seqüências de controle difere dependendo do organismo hospedei- ro; em procariotas, tais seqüências de controle incluem geralmente o promotor, sítio de liga- ção ribossômico, e seqüência de terminação de transcrição; em eucariotos, geralmente, tais seqüências de controle incluem os promotores e seqüência de terminação de transcrição. O termo "seqüências de controle" é pretendido incluir, em um mínimo, todos os componentes cuja presença é essencial para expressão e processamento, e pode da mesma forma incluir componentes adicionais cuja presença é vantajosa, por exemplo, seqüências líder e se- qüências de par de fusão.

Como aqui usado, o termo "linha germinativa" refere-se às seqüências de nucleotí- deo dos genes de anticorpo e segmentos de gene visto que eles são de parentes a descen- dências pelas células germinativas. Esta seqüência de linha germinativa é distinguida a par- tir das seqüências de nucleotídeo que codificam anticorpos em células B maduras que foram alteradas por eventos de hipermutação e recombinação durante o curso da maturação de célula B. Os anticorpos de linha germinativa da presente invenção são designados como g- 1A9.A6.B9, g-2D1.A3.D12 e g-14G9.B8.B4.

Como aqui usado, o termo "anticorpo humano" significa qualquer anticorpo no qual as seqüências de domínio variáveis e constantes são seqüências humanas. O termo abran- ge anticorpos com seqüências derivadas de genes humanos, incluindo aqueles que foram mudados, por exemplo, para diminuir a possível imunogenicidade, aumentar a afinidade, eliminar resíduos de cisteína que podem causar a duplicação indesejável, etc. O termo da mesma forma abrange tais anticorpos produzidos recombinantemente em células não hu- manas, que não poderiam conceder glicosilação típica de células humanas. Estes anticor- pos podem ser preparados em uma variedade de maneiras, como descrito abaixo.

Como aqui usado, o termo "anticorpo humanizado" refere-se a anticorpos de origem não natural, em que os resíduos de aminoácido são substituídos os quais são característi- cos de seqüências de anticorpo das espécies não humanas são substituídos com resíduos encontrados nas posições correspondentes de anticorpos humanos. Este processo de "hu- manização" é pensado reduzir a imunogenicidade em humanos do anticorpo resultante. Se- rá apreciado que anticorpos de origem não humana podem ser humanizadas usando técni- cas bem conhecidas na técnica. Winter e outro, (1993) Immunol. Today 14:43-46. O anticor- po de interesse pode ser criado por técnicas de ADN recombinantes para substituir o CH1, CH2, CH3, domínios de articulação, e/ou o domínio de estrutura com a seqüência humana correspondente. Publicação PCT No. WO 92/02190, e Patente U.S. Nos.: 5.530.101, 5.585.089, 5.693.761, 5.693.792, 5.714.350, e 5.777.085. O termo "anticorpo humanizado", como aqui usado, também inclui dentro de seu significado, anticorpos humanos quiméricos e anticorpos enxertados com CDR. Anticorpos humanos quiméricos da invenção incluem o Vh e Vl de um anticorpo de uma espécie não humano e os domínios CH e CL de um anti- corpo humano. Os anticorpos transplantados com CDR da invenção resultam da substitui- ção de CDRs de Vh e Vl de um anticorpo humano com aqueles do Vh e VL, respectivamen- te, de um anticorpo de um animal diferente de um humano.

O termo "polinucleotídeo isolado" como usado aqui significa um polinucleotídeo de origem genômica, cDNA, ou sintética ou uma combinação dos mesmos, que devido a sua origem o "polinucleotídeo isolado" (1) não está associado com toda ou uma porção de poli- nucleotídeos com que o "polinucleotídeo isolado" é encontrado na natureza, (2) é

operavelmente ligado a um polinucleotídeo ao qual não é ligado na natureza, ou (3) não ocorra na natureza como parte de uma seqüência maior.

O termo "proteína isolada", "polipeptídeo isolado" ou "anticorpo isolado" é uma pro- teína, polipeptídeo ou anticorpo que devido a sua origem ou fonte de derivação: (1) não está associado com componentes naturalmente associados que acompanham em seu estado nativo; (2) está livre de outras proteínas das mesmas espécies; (3) é expresso por uma célu- la de uma espécie diferente; ou (4) não ocorrem na natureza. Desse modo, um polipeptídeo que é, por exemplo, quimicamente sintetizado ou sintetizado em um sistema celular diferen- te da célula da qual origina-se naturalmente será "isolado" de seus componentes natural- mente associados. Uma proteína pode da mesma forma ser tornada substancialmente livre de componentes naturalmente associados por isolamento, usando bem técnicas de purifica- ção de proteína conhecidas na técnica.

Exemplos de anticorpos isolados incluem um anticorpo de CD44 que foi purificado por afinidade usando CD44, e um anticorpo de CD44 que foi sintetizado por uma linhagem celular in vitro.

"In vitro" refere-se a procedimentos realizados em um ambiente artificial tal como, por exemplo, sem limitação, em um tubo teste ou meio de cultura.

"In vivo" refere-se a procedimentos realizados dentro de um organismo vivo tal co- mo, sem limitação, um mamífero, por exemplo, um macaco, camundongo, rato ou coelho.

O termo "KD" refere-se à constante de equilíbrio de afinidade de ligação de uma in- teração anticorpo-antígeno particular. Um anticorpo é referido para especificamente ligar um antígeno quando a K0 é < 1 nM, preferivelmente < 100 nM e ainda mais preferivelmente <10 nM. Uma constante de afinidade de ligação K0 pode ser medida por ressonância de plasmônio de superfície, por exemplo, usando o sistema BIACORE™ como discutido no EXEMPLO 5.

O termo "k0ff" recorre à constante de taxa de dissociação de uma interação anticor- po-antígeno particular. Uma constante de taxa de dissociação koff pode ser medida por res- sonância de plasmônio de superfície, por exemplo, usando o sistema BIACORE™ como discutido no EXEMPLO 5.

O termo "nucleotídeos de ocorrência natural" como aqui usado inclui desoxirribonu- cleotídeos e ribonucleotídeos. O termo "nucleotídeos modificados" como aqui usado inclui, por exemplo, nucleotídeos com grupos de açúcar modificados ou substituídos.

O termo "ligações de oligonucleotídeo” referidas aqui inclui ligações de oligonucleo- tídeos tais como, por exemplo, fosforotioato, fosforoditioato,

fosforoselenoato, fosforodisselenoato, fosforoanilotioato, fosforaniladato, fosforoa- midato, LaPIanche e outro, (1986) Nucl. Acids Res. 14:9081; Stec e outro, (1984) J. Am. Chem. Soc. 106:6077; Stein e outro, (1988) Nucl. Acids Res. 16:3209; Zon e outro, (1991) Anti-Cancer Drug Design 6:539; Zon e outro, Oligonucleotides and Analogues: A Praticai 15 Approach, pp. 87-108 (F. Eckstein, Ed., Oxford University Press, Oxford England (1991)); Patente U.S. No. 5.151.510; Uhlmann e Peyman, (1990) Chemical Reviews 90:543. Um oli- gonucleotídeo pode incluir um rótulo para detecção, se desejado.

"Seqüências operavelmente ligadas" incluem ambas as seqüências de controle de expressão que são contíguas com o gene de interesse e seqüências de controle de expres- são que agem em trans ou em uma distância para controlar o gene de interesse.

O termo "percentual da identidade de seqüência” no contexto das seqüências de ácido nucléico significa os resíduos em duas seqüências que são as mesmas quando ali- nhadas para correspondência máxima. O comprimento da comparação de identidade de seqüência pode ser em uma extensão de pelo menos cerca de nove nucleotídeos, normal- 25 mente pelo menos cerca de 18 nucleotídeos, mais normalmente pelo menos cerca de 24 nucleotídeos, tipicamente pelo menos cerca de 28 nucleotídeos, mais tipicamente pelo me- nos cerca de 32 nucleotídeos, e preferivelmente pelo menos cerca de 36, 48 ou mais nucle- otídeos. Há vários algoritmos diferentes conhecidos na técnica que podem ser usados para medir a identidade de seqüência de nucleotídeo. Por exemplo, seqüências de polinucleotí- 30 deo podem ser comparadas usando FASTA, Gap ou Bestfit que são programas em Wiscon- sin Package Versão 10,0, Genetics Computer Group (GCG), Madison, Wisconsin. FASTA que inclui por exemplo, os programas FASTA2 e FASTA3, fornece alinhamentos e percen- tual de identidade de seqüência das regiões da melhor sobreposição entre as seqüências de investigação e pergunta (Pearson, (1990) Methods Enzymol. 183:63-98; Pearson, (2000) 35 Methods Mol. Biol. 132:185-219; Pearson, (1996) Methods Enzymol. 266:227-258; Pearson, (1998) J. Mol. Biol. 276:71-84. A menos que de outra maneira especificado, parâmetros bá- sicos para um programa particular ou algoritmo são usados. Por exemplo, percentual de identidade de seqüência entre as seqüências de ácido nucléico pode ser determinado usan- do FASTA com seus parâmetros básicos (um tamanho de palavra de 6 e o fator de NOPAM para a matriz de contagem) ou usando Gap com seus parâmetros básicos como fornecido em GCG Versão 6.1.

Uma referência a uma seqüência de nucleotídeo abrange seu complemento a me- nos que de outra maneira especificado. Desse modo, uma referência a um ácido nucléico que tem uma seqüência particular deve ser entendido para abranger seu filamento comple- mentar, com sua seqüência complementar.

O termo "percentual de identidade de seqüência” no contexto de seqüências de a- minoácido significa os resíduos em duas seqüências que são as mesmas quando alinhadas para correspondência máxima. O comprimento de comparação da identidade de seqüência pode estar em uma extensão de pelo menos cerca de cinco aminoácidos, normalmente pelo menos cerca de 20 aminoácidos, mais normalmente pelo menos cerca de 30 aminoácidos, tipicamente pelo menos cerca de 50 aminoácidos, mais tipicamente pelo menos cerca de 100 aminoácidos, e ainda mais tipicamente cerca de 150, 200 ou mais aminoácidos. Há vá- rios algoritmos diferentes conhecidos na técnica que podem ser usados para medir a identi- dade de seqüência de aminoácido. Por exemplo, seqüências de aminoácido podem ser comparadas usando FASTA, Gap ou Bestfit que são programas em Wisconsin Pachage Versão 10.0, Genetics Computer Group (GCG), Madison, Wisconsin.

Identidade de seqüência para polipeptídeos é tipicamente medida usando software de análise de seqüência. Software de análise de proteína compara as seqüências usando medidas de semelhança nomeadas à várias substituições, deleções e outras modificações, incluindo substituições de aminoácido conservadoras. Por exemplo, GCG contém progra- mas tal como "Gap" e "Bestfit" que podem ser usados com parâmetros básicos como espe- cificado pelos programas para determinar a homologia de seqüência ou identidade de se- qüência entre os polipeptídeos intimamente relacionados, tais como polipeptídeos homólo- gos de espécies diferentes de organismos ou entre uma proteína tipo selvagem e um análo- go da mesma. Veja, por exemplo, GCG Versão 6.1 (University of Wisconsin, Wl). Seqüên- cias de polipeptídeo podem ser comparadas usando FASTA que usa parâmetros básicos ou recomendados, veja GCG Versão 6.1. FASTA (por exemplo, FASTA2 e FASTA3) fornece alinhamentos e percentual de identidade de sequencia das regiões da melhor sobreposição entre as seqüências de investigação e pergunta (Pearson, (1990) Methods Enzymol. 183:63- 98; Pearson, (2000) Methods Mol. Biol. 132:185-219). Outro algoritmo preferido quando comparando uma seqüência da invenção a uma base de dados que contém um número grande de seqüências de organismos diferentes é o programa de computação BLAST, es- pecialmente blastp ou tblastn, usando parâmetros básicos quando fornecidos com os pro- gramas. Veja, por exemplo, Altschul e outro, (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410; Altschul e outro, (1997) Nucleic Aeids Res. 25:3389 - 402.

O comprimento das seqüências de polipeptídeo comparado quanto a homologia ge- ralmente será pelo menos cerca de 16 resíduos de aminoácido, normalmente pelo menos cerca de 20 resíduos, mais normalmente pelo menos cerca de 24 resíduos, tipicamente pelo 5 menos cerca de 28 resíduos, e preferivelmente mais que cerca de 35 resíduos. Ao procurar uma base de dados que contém seqüências de um número grande de organismos diferen- tes, é preferível comparar seqüências de aminoácido.

O termo" polinucleotídeo" como referido aqui significa uma forma polimérica de nu- cleotídeos de pelo menos 10 bases no comprimento, ribonucleotídeos ou desoxinucleotí- deos ou uma forma modificada de qualquer tipo de nucleotídeo. O termo inclui formas de filamento único ou duplo.

O termo "polipeptídeo" abrange proteínas nativo ou artificiais, fragmentos de proteí- na e análogos de polipeptídeo de uma seqüência de proteína. Um polipeptídeo pode ser monomérico ou polimérico.

O termo "fragmento de polipeptídeo " como aqui usado refere-se a um polipeptídeo

que tem uma deleção amino-terminal e/ou carbóxi-terminal, porém onde a seqüência de aminoácido restante é idêntica às posições correspondentes na seqüência de ocorrência natural. Em algumas modalidades, fragmentos tem pelo menos 5, 6, 8 ou 10 aminoácidos no comprimento. Em outras modalidades, os fragmentos tem pelo menos 14, pelo menos 20, pelo menos 50, ou pelo menos 70, 80, 90, 100, 150 ou 200 aminoácidos no comprimento.

O termo "célula hospedeira recombinante" (ou simplesmente "célula hospedeira”), como aqui usado, significa uma célula na qual um vetor de expressão recombinante foi in- troduzido. Deve ser entendido que "célula hospedeira recombinante" e "célula hospedeira” significa não apenas a célula objeto particular mas também a descendência de uma tal uma 25 célula. Porque certas modificações podem ocorrer em gerações sucessivas devido à muta- ção ou influências ambientais, tal descendência não pode, na realidade, ser idêntica à célula de origem, porém ainda está incluída dentro do escopo do "célula hospedeira” como aqui usado.

Uma proteína ou polipeptídeo é "substancialmente puro," "substancialmente homo- 30 gêneo", ou "substancialmente purificado" quando pelo menos cerca de 60 a 75% de uma amostra exibem uma única espécie de polipeptídeo. O polipeptídeo ou proteína pode ser monomérico ou multimérico. Uma proteína ou polipeptídeo substancialmente puro pode tipi- camente compreender cerca de 50%, 60%, 70%, 80% ou 90% em p/p de uma amostra de proteína, mais normalmente cerca de 95%, e preferivelmente pode ser mais de 99% puro. 35 Pureza de proteína ou homogeneidade pode ser indicada por vários meios conhecidos na técnica, tal como eletroforese de gel de poliacrilamida de uma amostra de proteína seguido visualizando uma faixa de polipeptídeo no manchamento do gel com uma mancha bem co- nhecida na técnica. Visto que alguém versado na técnica apreciará,

Resolução mais alta pode ser fornecida usando HPLC ou outros meios conhecidos na técnica para purificação.

O termo "similaridade significativa" ou "similaridade de seqüência substancial", ao 5 referir-se a um ácido nucléico ou fragmento do mesmo, significa que quando idealmente alinhada com deleções ou inserções de nucleotídeo apropriadas com outro ácido nucléico (ou seu filamento complementar), há identidade de seqüência de nucleotídeo em pelo me- nos cerca de 85%, preferivelmente pelo menos cerca de 90%, e mais preferivelmente pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% das bases de nucleotídeo, quando 10 medidas por qualquer algoritmo bem conhecido da identidade de seqüência, tal como FASTA1 BLAST ou Gap, como discutido acima.

Como aplicado aos polipeptídeos, o termo "identidade substancial" ou "similaridade significativa" significa que duas seqüências de aminoácido, quando idealmente alinhadas, tais como pelos programas GAP ou BESTFIT que usa pesos de abertura básicos como for- 15 necidos com os programas, compartilha pelo menos 70%, 75% ou 80% de similaridade de seqüência, preferivelmente pelo menos 90% ou 95% de identidade de seqüência, e mais preferivelmente pelo menos 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de seqüência. Em cer- tas modalidades, posições de resíduo que não são idênticas diferem-se por substituições de aminoácido conservadoras.

O termo "ressonância de plasmônio de superfície”, como aqui usado, refere-se a

um fenômeno ótico que permite a análise de interações bioespecíficas de tempo real por detecção de alterações em concentrações de proteína dentro de uma matriz de biosensor, por exemplo, usando o sistema BIACORE™ (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden e Piscataway, N. J.). Para descrições adicionais, veja Jonsson U. e outro, (1993) a Ann. Biol. 25 Clin. 51 :19-26; Jonsson U. e outro, (1991) Biotechniques 1 1 :620-627; Jonsson B. e outro, (1995) J. Mo). Recognit. 8:125-131; e Johnsson B. e outro, (1991) Anal. Biochem. 198:268- 277.

"Quantidade terapeuticamente eficaz" refere-se àquela quantidade do agente tera- pêutico a ser administrado que aliviará até certo ponto um ou mais dos sintomas do distúrbio 30 a ser tratado. Em referência ao tratamento de artrite reumatóide, uma quantidade terapeuti- camente eficaz refere-se àquela quantidade que tem pelo menos um dos seguintes efeitos: reduzir o o dano estrutural das articulações; inibir (isto é, reduzir até certo ponto, preferivel- mente interromper) ao acúmulo de fluido na área da articulação comum; e aliviar até certo ponto (ou, preferivelmente, eliminar) um ou mais sintomas associados com artrite reumatói- 35 de.

"Tratar", "tratando" e "tratamento" referem-se a um método de aliviar ou ab-rogar um distúrbio biológico e/ou seus sintomas auxiliares. Com respeito a uma variedade de do- ença auto-imune, tal como artrite reumatóide, aterosclerose, doenças granulomatosas e es- clerose múltipla, estes termos simplesmente significam que a expectativa de vida de um indivíduo afetado com uma doença de autoimune será aumentada ou que um ou mais dos sintomas da doença será reduzido.

Como aqui usado, o termo "utiliza" com referência a um gene particular significa

que a seqüência de aminoácido de uma região particular em um anticorpo foi derivada fi- nalmente desse gene durante a maturação de célula B. Por exemplo, a frase "uma seqüên- cia de aminoácido de região variável de cadeia pesada que utiliza um gene da família VH-3 humana" refere-se à situação onde a região de Vh do anticorpo foi derivada da família de 10 Vh-3 de segmentos de gene durante a maturação de B-célula. Em células B humanas, há mais de 30 genes variáveis de cadeia pesada funcionais distintas que geram anticorpos. Uso de um gene variável de cadeia pesada particular, portanto, é indicativo de um motivo de ligação preferido da interação anticorpo-antígeno com respeito às propriedades combinadas de ligação ao antígeno e atividade funcional. Como será apreciado, análise de utilização de 15 gene fornece apenas uma avaliação limitada de estrutura de anticorpo. Como células B hu- manas estocasticamente geram transcrições de cadeia leve de capa V-J ou pesada V-D-J, há vários processos secundários que ocorrem, incluindo, sem limitação, hipermutação so- mática, n-adições, e extensões de CDR3. Veja, por exemplo, Mendez e outro Nature Gene- tics 15:146-156 (1997).

Como aqui usado, os vinte aminoácidos convencionais e suas abreviações seguem

o uso convencional. Veja Immunology - A Synthesis (2a Edição, E. S. Golub e D. R. Gren, Eds., Sinauer Associates, Sunderland, MA (1991)).

O termo "vetor", como aqui usado, significa uma molécula de ácido nucléico capaz de transportar outro ácido nucléico ao qual foi unido. Em algumas modalidades, o vetor é um plasmídeo, isto é, uma peça de filamento duplo circular de ADN em que os segmentos de ADN adicionais podem ser ligados. Em uma modalidade, o vetor é um vetor viral, em que os segmentos de ADN adicionais podem ser ligados no genoma viral. Em uma modalidade, os vetores são capazes de replicação autônoma em uma célula hospedeira na qual eles são apresentados (por exemplo, vetores bacterianos tendo uma origem bacteriana de vetores mamíferos epissômico e replicação). Em outra modalidade, os vetores (por exemplo, vetores mamíferos não epissômicos) podem ser integrados no genoma de uma célula hospedeira na introdução na célula hospedeiro, e desse modo são replicados junto com o genoma hospe- deiro. Além disso, certos vetores são capazes de direcionar a expressão de genes aos quais eles são operavelmente ligados. Tais vetores são referidos aqui como "vetores de expressão recombinantes” (ou simplesmente, "vetores de expressão”).

Como aqui usado, os termos "rótulo" ou "rotulado" referem-se a incorporação de outra molécula no anticorpo. Em uma modalidade, o rótulo é um marcador deectável, por exemplo, incorporação de um aminoácido radiorrotulado ou ligação a um polipeptídeo de porções de biotinila que podem ser detectadas por avidina marcada (por exemplo, estrepta- vidina contendo um marcador fluorescente ou atividade enzimática que pode ser detectada por métodos óticos ou colorimétricos). Em outra modalidade, o rótulo ou marcador pode ser terapêutico, por exemplo, uma toxina ou conjugado de fármaco. Vários métodos de rotular polipeptídeos e glicoproteínas são conhecidos na técnica e podem ser usados. Exemplos de rótulos para polipeptídeos incluem, porém não são limitados aos seguintes: radioisótopos ou radionuclídeos, rótulos fluorescentes (por exemplo, FITC, rodamina, lantanídeo fósforos), rótulos enzimáticos, marcadores quimioluminescentes, grupos biotinila, epítopos de polipep- tídeo pré-determinados reconhecidos por um receptor secundário (por exemplo, seqüências de par de ziper de leucina, sítios de ligação para anticorpos secundários, domínios de liga- ção de metal, rótulos de epítopo), agentes magnéticos, tais como quelatos de gadolínio, to- xinas da coqueluche, taxol, citocalasina B, gramicidina D, brometo de etídio, emetina, mito- micina, etoposídeo, tenoposídeo, vincristina, vimblastina, colchicina, doxorrubicina, daunor- rubicina, diidróxi antracina diona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1- desidrotestosterona, glicocorticóides, procaína, tetracaína, lidocaína, propranolol, e puromi- cina e análogos ou homólogos dos mesmos. Em algumas modalidades, rótulos são ligados por ramificações espaçadoras de vários comprimentos para reduzir o impedimento estérico potencial.

A Iisina C-terminal da cadeia pesada do anticorpo anti-CD44 da invenção pode ser clivada quando o anticorpo é recombinantemente produzido como um resultado da atividade de uma ou mais carboxipeptidases quando o anticorpo é expresso em cultura de célula de mamífero (Lewis D. A., e outro, Anal. Chem, 66(5): 585-95 (1994); Harris R. J., J. of Chro- motography A, 705: 129-134 (1995)). Várias variações da estrutura esperada podem ser encontradas em anticorpos recombinantemente produzidos que resultam de tipos conheci- dos ou novos de modificação in vivo (pós-translacional) ou da degradação de proteína es- pontânea (não enzimática), tal como oxidação de metionina, formação de dicetopiperazina, isomerização de aspartato e desamidação de resíduos de asparagina, ou formação de suci- nimida.

Anticorpos anti-CD44 humanos e Caracterização Dos Mesmos

Esta invenção fornece anticorpos humanos isolados, ou porções de ligação de antí- geno dos mesmos, que ligam-se ao CD44 humano. Vários aspectos da invenção referem a tais porções de ligação de antígeno e anticorpos, e composições farmacêuticas dos mes- mos, bem como ácidos nucléicos, vetores de expressão recombinantes e células hospedei- ras para preparar tais porções de ligação de antígeno e anticorpos. Métodos de usar as por- ções de ligação de antígeno e anticorpos da presente invenção para detectar CD44 humano ou inibir a atividade de CD44 humano, ou in vitro ou in vivo, são da mesma forma abrangi- dos pela invenção. Anticorpos anti-CD44 humanos de acordo com modalidades preferidas da presente invenção minimizam as respostas imunogênicas e alérgicas intrínsecas aos anticorpos monoclonais derivados não humanos ou não humanos (Mabs) e desse modo aumenta a eficácia e segurança dos anticorpos administrados. O uso de anticorpos comple- tamente humanos fornece uma vantagem substancial no tratamento de doenças humanas recorrentes e crônicas, tal como artrite reumatóide, Artrite reumatóide Juvenil, aterosclerose, doenças granulomatosas, esclerose múltipla, asma, Doença de Crohn, Espondilite Ancilo- sante, Artrite Psoriática, Psoríase de Placa e câncer, que podem requerer administrações de anticorpo repetidas.

O aminoácido de CD44 e seqüências de nucleotídeo de várias espécies, incluindo humanas, são conhecidas, SEQ ID NO: 1 e 2 (veja, por exemplo, No. Acesso NM_001001391). CD44 humano, ou porções antigênicas dos mesmos, podem ser prepara- dos de acordo com métodos bem conhecidos por aqueles na técnica, ou podem ser adquiri- dos de vendedores comerciais (para por exemplo, de R&D Systems Cat. No. 861-PC-100).

O aminoácido de CD44 e seqüências de nucleotídeo de macaco cinomolgos, não são co- nhecidos na técnica e são descritos aqui, SEQ ID NOs: 5, 7 (aminoácido), 8 e 153 (ácido nucléico).

Em algumas modalidades, anticorpos anti-CD44 humanos são produzidos imuni- zando-se um animal transgênico não humana, por exemplo, um roedor, cujo genoma com- preende genes de imunoglobulina humana para que os genes animal transgênico produza anticorpos humanos. Em algumas modalidades, os anticorpos anti-CD44 e porções de liga- ção de antígeno incluem, porém não são limitadas a, anticorpos ou porções de ligação de antígeno que ligam-se ao sítio de ligação de HA.

Em uma outra modalidade, a presente invenção fornece um anticorpo ou porção de ligação de antígeno, em que o referido anticorpo ou porção de ligação de antígeno compre- ende pelo menos uma CDR selecionada a partir de: uma CDR1 de Vh que é selecionada independentemente de qualquer uma de SEQ ID NOs: 17, 53, 89 e 125 ou uma seqüência que difere de qualquer uma de SEQ ID NOs: 17, 53, 89 e 125 por pelo menos uma substitui- ção de aminoácido conservadora; uma CDR2 de Vh que é selecionada independentemente de qualquer uma de SEQ ID NOs: 19, 55, 91 e 127 ou uma seqüência que difere de qual- quer uma de SEQ ID NOs: 19, 55, 91 e 127 por pelo menos uma substituição de aminoácido conservadora; e uma CDR3 de Vh que é selecionada independentemente de qualquer uma de SEQ ID N0s:21, 57, 93 e 129 ou uma seqüência que difere de qualquer uma de SEQ ID NOs: 21, 57, 93 e 129 por pelo menos uma substituição de aminoácido conservadora. Por exemplo, as seqüências de CDR1, CDR2, e CDR3 de Vh mencionadas acima podem cada qual independentemente diferir-se da SEQ ID NOs relacionadas respectivas por 1, 2, 3, 4 ou substituições de aminoácido conservadoras. Em outra modalidade, a presente invenção fornece um anticorpo ou porção de liga- ção de antígeno do mesmo, em que o referido anticorpo ou porção de ligação de antígeno compreende pelo menos uma CDR selecionada de: uma CDR1 de Vl que é selecionado independentemente a partir de qualquer uma de SEQ ID NOs: 23, 59, 95 e 131 ou uma se- qüência que difere a partir de qualquer uma de SEQ ID NOs: 23, 59, 95 e 131 por pelo me- nos uma substituição de aminoácido conservadora; uma CDR2 de Vl que é selecionada independentemente a partir de qualquer uma de SEQ ID NOs:25, 61, 97 e 133 ou uma se- qüência que difere a partir de qualquer uma de SEQ ID NOs: 25, 61, 97 e 133 por pelo me- nos uma substituição de aminoácido conservadora; e uma CDR3 de Vl que é selecionada independentemente a partir de qualquer uma de SEQ ID NOs:27, 63, 99 e 137 ou uma se- qüência que difere a partir de qualquer uma de SEQ ID NOs: 27, 63, 99 e 135 por pelo me- nos uma substituição de aminoácido conservadora. Por exemplo, as seqüências de CDR1, CDR2, e CDR3 de Vl mencionadas acima podem cada qual independentemente diferir-se das SEQ ID NOs relacionadas respectivas por 1, 2, 3, 4 ou 5 substituições de aminoácido conservadoras.

Em ainda um outro aspecto da presente invenção um anticorpo ou porção de liga- ção de antígeno compreende: uma CDR1 de Vh como mencionada em SEQ ID NO: 17, uma CDR2 de Vh como mencionada em SEQ ID NO: 19, uma CDR3 de Vh como mencionada em SEQ ID NO.21, uma CDR1 de Vl como mencionada em SEQ ID NO:23, uma CDR2 de Vl 20 como mencionada em SEQ ID NO:25, e uma CDR3 de Vl como mencionada em SEQ ID NO:27.

Em ainda um outro aspecto da presente invenção um anticorpo ou porção de liga- ção de antígeno compreende: uma CDR1 de Vh como mencionado em SEQ ID NO:53, uma CDR2 de Vh como mencionado em SEQ ID NO:55, uma CDR3 de Vh como mencionado em 25 SEQ ID NO:57, uma CDR1 de Vl como mencionado em SEQ ID NO:59, uma CDR2 de Vl como mencionado em SEQ ID NO:61, e uma CDR3 de Vl como mencionado em SEQ ID NO:63.

Em ainda um outro aspecto da presente invenção um anticorpo ou porção de liga- ção de antígeno compreende: uma CDR1 de Vh como mencionado em SEQ ID NO:89, uma 30 CDR2 de Vh como mencionado em SEQ ID NO:91, uma CDR3 de Vh como mencionado em SEQ ID NO:93, uma CDR1 de Vl como mencionado em SEQ ID NO:95, uma CDR2 de Vl como mencionado em SEQ ID NO:97, e uma CDR3 de Vl como mencionado em SEQ ID NO:99.

Em ainda outro aspecto da presente invenção um anticorpo ou porção de ligação de antígeno compreende: uma CDR1 de Vh como mencionado em SEQ ID NO: 125, uma CDR2 de Vh como mencionado em SEQ ID NO: 127, uma CDR3 de Vh como mencionado em SEQ ID NO: 129, uma CDR1 de Vl como mencionado em SEQ ID NO: 131, uma CDR2 10

15

; 20

25

30

. 35

de Vl como mencionado em SEQ ID NO: 133, e uma CDR3 de Vl como mencionado em SEQ ID NO: 135

Em uma outra modalidade, a CDR1, CDR2 de Vh e VL, e seqüências de CDR3 mencionadas acima podem da mesma forma cada qual diferir a partir do SEQ ID NOs espe- cífico recitados acima por pelo menos uma substituição de aminoácido conservadora. Por exemplo, as seqüências de CDR1, CDR2, e CDR3 podem cada qual independentemente diferir por 1, 2, 3, 4, ou 5 substituições de aminoácido conservadoras a partir da SEQ ID NOs específica respectiva recitada acima.

A presente invenção também fornece um anticorpo ou porção de ligação de antíge- no do mesmo em que o referido anticorpo ou porção de ligação de antígeno compreende a CDR1 de Vh e VL, a CDR2 de Vh e Vl, e a CDR3 de Vh e Vl como encontrado em qualquer um dos anticorpos 1A9.A6.B9; 2D1.A3.D12; 14G9.B8.B4 e 10C8.2.3.

Em uma outra modalidade, o anticorpo ou porção de ligação de antígeno do mesmo compreendendo um domínio de Vh que é qualquer de SEQ ID NOs: 11, 47, 83 e 119, ou difere a partir de qualquer um de SEQ ID NOs: 11, 47, 83 e 119 tendo pelo menos uma substituição de aminoácido conservadora. Por exemplo, o domínio de Vh pode diferir em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 substituições de aminoácido conservadoras a partir de qualquer de SEQ ID NOs: 11, 47, 83 e 119. Em uma outra modalidade, quaisquer destas substitui- ções de aminoácido conservadoras pode ocorrer nas regiões de CDR1, CDR2, e/ou CDR3.

Um outro aspecto da presente invenção é um anticorpo ou porção de ligação de an- tígeno do mesmo compreendendo um domínio de Vh que é pelo menos 90%, preferivelmen- te 95%, e mais preferivelmente 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntico em seqüência de aminoácido para qualquer de SEQ ID NOs: 11, 47, 83 e 119.

Em uma outra modalidade, o anticorpo ou porção de ligação de antígeno do mesmo compreende um domínio de Vl que é qualquer de SEQ ID NOs: 15, 51, 87 e 123, ou difere a partir de qualquer de SEQ ID Nos: 15, 51, 87 e 123 tendo pelo menos uma substituição de aminoácido conservadora. Por exemplo, o domínio de Vl pode diferir em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7,

8, 9, ou 10 substituições de aminoácido conservadoras a partir de qualquer de SEQ ID NOs:

15, 51, 87 e 123. Em uma outra modalidade, quaisquer destas substituições de aminoácido conservadoras pode ocorrer nas regiões de CDR1, CDR2, e/ou CDR3.

Um outro aspecto da presente invenção é um anticorpo ou porção de ligação de an- tígeno do mesmo compreendendo um domínio de Vl que é pelo menos 90%, preferivelmen- te 95%, e mais preferivelmente 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntico em seqüência de aminoácido a qualquer dentre SEQ ID NOs: 15, 51, 87 e 123.

Em outro aspecto da presente invenção o anticorpo ou porção de ligação de antí- geno do mesmo é selecionada a partir do grupo que consiste em: a) um anticorpo ou porção de ligação de antígeno do mesmo que compreende um domínio de Vh como mencionado SEQ ID NO:11, e um domínio de Vl como mencionado em SEQ ID NO: 15; b) um anticorpo ou porção de ligação de antígeno do mesmo que compreende um domínio de Vh como mencionado em SEQ ID NO:47, e um domínio de Vl como mencionado em SEQ ID N0:51;

c) um anticorpo ou porção de ligação de antígeno do mesmo que compreende um domínio de Vh como mencionado em SEQ ID NO:83 e um domínio de Vl como mencionado em SEQ ID NO:87; e d) um anticorpo ou porção de ligação de antígeno do mesmo que compreende um domínio de Vh como mencionado em SEQ ID NO:119 e um domínio de Vl como men- cionado em SEQ ID NO:123.

Em uma outra modalidade, para quaisquer dos anticorpos ou porções de ligação de 10 antígeno dos mesmos como descrito acima em grupos a) a d) os domínios de Vh e/ou Vl podem diferir a partir da SEQ ID NOs específica recitada aqui por pelo menos uma substitui- ção de aminoácido conservadora. Por exemplo, os domínios de Vh e/ou Vl podem diferir a partir da SEQ ID NO recitada por 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 substituições de aminoácido conservadoras. Em uma outra modalidade, quaisquer destas substituições de aminoácido 15 conservadoras pode ocorrer nas regiões de CDR1, CDR2, e/ou CDR3.

Em ainda outro aspecto, a presente invenção é um anticorpo ou porção de ligação de antígeno do mesmo que é selecionado a partir do grupo que consiste em: a) um anticor- po ou porção de ligação de antígeno do mesmo que compreende uma cadeia pesada que é pelo menos 90%, preferivelmente 95%, e mais preferivelmente 96%, 97%, 98%, 99% ou 20 100% idêntica em seqüência de aminoácido a SEQ ID NO:9, e uma cadeia leve que é pelo menos 90%, preferivelmente 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica em seqüência de aminoácido a SEQ ID NO: 13; b) um anticorpo ou porção de ligação de antígeno do mesmo que compreende uma cadeia pesada que é pelo menos 90% idêntica em seqüência de ami- noácido a SEQ ID NO:45, e uma cadeia leve que é pelo menos preferivelmente 95% 96%, 25 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica a SEQ ID NO:49; c) um anticorpo ou porção de ligação de antígeno do mesmo que compreende uma cadeia pesada que é pelo menos 95%, mais pre- ferivelmente 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica a SEQ ID NO:81, e uma cadeia leve que é 95%, preferivelmente 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica a SEQ ID NO:85; e d) um anticorpo ou porção de ligação de antígeno do mesmo que compreende uma cadeia 30 pesada que é pelo menos 90% idêntica para SEQ ID NO:117, e uma cadeia leve que é pre- ferivelmente 95%, mais preferivelmente 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica a SEQ ID NO:121.

Em outra modalidade, a presente invenção é um anticorpo ou porção de ligação de antígeno do mesmo que é selecionada a partir do grupo que consiste em: a) um anticorpo ou porção de ligação de antígeno do mesmo que compreende uma cadeia pesada mencio- nada em SEQ ID NO:9, e uma cadeia leve como mencionado em SEQ ID NO: 13; b) um anticorpo ou porção de ligação de antígeno do mesmo que compreende uma cadeia pesada como mencionado em SEQ ID NO:45 e uma cadeia leve como mencionado em SEQ ID NO:49; c) um anticorpo ou porção de ligação de antígeno do mesmo que compreende uma cadeia pesada mencionada em SEQ ID NO:81, e uma cadeia leve como mencionado em SEQ ID NO:85; e d) um anticorpo ou porção de ligação de antígeno do mesmo que compre- 5 ende uma cadeia pesada que é mencionada em SEQ ID NO:117, e uma cadeia leve que é mencionada em SEQ ID NO: 121.

Em algumas modalidades, a Iisina C-terminal da cadeia pesada do anticorpo anti CD44 da invenção é clivada (Lewis D. A., e outro, Anal. Chem, 66(5): 585 - 95 (1994); Harris R. J., J. de Chromotography, 705: 129-134 (1995)).

Em várias modalidades da invenção, a(s) cadeia(s) pesada(s) e/ou leve(s) dos anti-

corpos anti-CD44 ou porção de ligação de antígeno do mesmo pode opcionalmente incluir uma seqüência de sinal.

A invenção também fornece anticorpos de CD44 ou porções de ligação de antígeno do mesmo em que o anticorpo ou porção de ligação de antígeno do mesmo, ou CDR(s) do mesmo como descrito tem pelo menos uma de várias propriedades funcionais como descrito abaixo em A) a G).

A) por exemplo, em uma modalidade, os anticorpos ou porções de ligação de antí- geno do mesmo ligam-se a CD44 com uma K0 de 1000 nM ou menos como medido através de ressonância de plasmônio de superfície. Em uma outra modalidade, o anticorpo ou por-

ção liga-se a CD44 com uma K0 menor que 500 nM ou preferivelmente, menor que 100 nM, menor que 50 nM, menor que 20 nM, menor que 10 nM, menor que 5 nM, menor que 4 nM, menor que 3 nM, menor que 2 nM, menor que 1 nM, menor que 900 pM, menor que 800 pM, menor que 700 pM, menor que 600 pM, menor que 500 pM, ou menor que 100 pM, como medido por ressonância de plasmônio de superfície. Tipicamente, não há limite inferior no 25 valor de KD. Para propósitos práticos, entretanto, o limite inferior pode ser assumindo a cer- ca de 1 pM.

B) Em outra modalidade, os anticorpos ou porções de ligação de anticorpo do mesmo têm uma taxa (koff) para CD44 menor que ou igual a 0,01s1 como medido por resso- nância de plasmônio de superfície. Por exemplo, em certas modalidades o anticorpo ou

porção tem uma Koff para CD44 menor que 0,005s1, menor que 0,004s'1, menor que 0,003s1, menor que 0,002s1, ou menor que 0,001s'1. Tipicamente, não há limite inferior para o valor de k0ff. Para propósitos práticos, entretanto, o limite inferior pode ser assumido em cerca de 1x10'7s~1.

C) Em uma outra modalidade os anticorpos ou porções de ligação de antígeno do mesmo ligam-se a CD44 com um EC50 menor que 500 nM, 75 μg/ml como medido por en- saio de ligação de ELISA ou FACS. Em uma outra modalidade, o anticorpo ou porção liga- se a CD44 com um EC50 menor que 100 nM, menor que 50 nM, menor que 20 nM, menor que 10 nM, menor que 1 nM, menor que 500 pM, ou menor que 100 pM, como medido por ELISA. Preferivelmente, o anticorpo ou porção liga-se a CD44 com um EC50 menor que 10 nM, 1,5 μg/ml. Tipicamente, entretanto, não há limite inferior no valor de EC5O- Para propósi- tos práticos, entretanto, o limite inferior pode ser assumido em cerca de 1 pM.

D) Em ainda outra modalidade, os anticorpos ou porções de ligação de antígeno do

mesmo inibem a interação entre CD44 e HA com um IC50 menor que 500 nM, 75 μg/ml co- mo medido por um ensaio de ligação ELISA . Em uma outra modalidade, o anticorpo ou porção liga-se a CD44 com um IC50 menor que 100 nM, menor que 50 nM, menor que 20 nM, menor que 10 nM, menor que 5 nM, menor que 4 nM, menor que 3 nM, menor que 2 10 nM, menor que 1 nM, menor que 500 pM, ou menor que 100 pM, como medido por um en- saio de ligação ELISA .

E) Em ainda outra modalidade, os anticorpos ou porções de ligação de antígeno do mesmo reduzem a expressão de superfície in vivo e monócitos e em um IC50 menor que cerca de 100 nM, como medido por FACS.

F) Em outra modalidade, os ou anticorpos porções de ligação de antígeno reduzem

a expressão de superfície de receptores de CD44 in vitro com um IC50 menor que 50 nM, menor que 20 nM, menor que 10 nM, menor que 1 nM, menor que 500 pM, ou menor que 100 pM, menor que cerca de 20 nM, menor que cerca de 10 nM, ou menor que cerca de 5 nM) como medido por FACS. Preferivelmente, o anticorpo ou porção de ligação de antígeno 20 reduz a expressão de superfície de receptores de CD44 com um IC50 menor que 30 nM, 4,5 μg/ml. Para propósitos práticos, entretanto, o limite inferior pode ser assumido ser cerca de

1 pM.

G) Em outra modalidade, o anticorpo anti-CD44 ou porções de ligação de antígeno do mesmo têm seletividade para CD44 sobre proteína de hiauronano endotelial de vaso Iin- fático 1 (LYVE-1) por pelo menos 100 vezes.

Em uma modalidade, a invenção fornece anticorpos monoclonais anti-CD44 huma- nos (mAbs), designados como: 1A9.A6.B9; 2D1.A3.D12; 14G9.B8.B4; e 10C8.2.3; e as li- nhagens celulares de hibridoma que os produzem. TABELAS 1 e 9-12 do pedido mostram os identificadores de seqüência (SEQ ID NOs:) dos ácidos nucléico codificando as cadeias 30 pesadas e leves de tamanho natural, as seqüências de aminoácido deduzidas de tamanho natural correspondente, e o nucleotídeo e seqüências de aminoácido deduzidos das regiões variáveis de cadeia leve e pesada.

Em modalidades, anticorpos são IgGs designados como: 1A9.A6.B9; 2D1.A3.D12; 14G9.B8.B4; e 10C8.2.3. As seqüências de aminoácido específicas das porções de ligação de antígeno ou anticorpos do mesmo ou domínios de anticorpo da presente invenção são descritas nas Tabelas 9, 10, 11 & 12, e FIG. 2.

Em uma modificação de modalidade, o Vl do anticorpo de CD44 compreende uma ou mais substituições de aminoácido relativo à seqüência de aminoácido de linha germinati- va do gene humano. Em algumas modalidades, o Vl do anticorpo anti-CD44 compreende 1,

2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 substituições de aminoácido relativo à seqüência de aminoácido de linha germinativa. Em uma modalidade, uma ou mais daquelas substituições a partir da 5 linha germinativa está nas regiões de CDR da cadeia leve. Em uma modalidade, as substi- tuições de aminoácido relativo à linha germinativa estão em uma ou mais das mesmas posi- ções como as substituições relativas à linha germinativa em qualquer um ou mais dos anti- corpos de Vl 1A9.A6.B9; 2D1.A3.D12; 14G9.B8.B4; e 10C8.2.3. Por exemplo, o Vl de um anticorpo anti-CD44 da invenção pode conter uma ou mais substituições de aminoácido 10 comparadas à linha germinativa encontrada no anticorpo de Vl 1A9.A6.B9. Em algumas modalidades, as mudanças de aminoácido estão em uma ou mais das mesmas posições, porém envolvem uma substituição diferente do que no anticorpo de referência.

Em uma modalidade, mudanças de aminoácido relativo à linha germinativa ocorrem em uma ou mais das mesmas posições como em qualquer do Vl de anticorpos 1 A9.A6.B9; 15 2D1.A3.D12; 14G9.B8.B4 e 10C8.2.3, porém as mudanças podem representar substituições de aminoácido conservadoras em tal(is) posição(ões) relativo ao aminoácido no anticorpo de referência. Por exemplo, se uma posição particular em um destes anticorpos for mudada relativo à linha germinativa e for glutamato, alguém pode substituir aspartato nessa posição. Similarmente, se uma substituição de aminoácido comparada à linha germinativa for serina, 20 alguém pode conservativamente substituir treonina em serina nessa posição. Substituições de aminoácido conservadoras são supra discutidas.

Em algumas modalidades, a cadeia leve do anticorpo anti-CD44 humano compre- ende a seqüência de aminoácido de Vl de anticorpo 1A9.A6.B9 (SEQ ID NO:15); 2D1.A3.D12 (SEQ ID NO:51); 14G9.B8.B4 (SEQ ID NO:87) ou 10C8.2.3 (SEQ ID NO: 123) 25 ou a referida seqüência de aminoácido tendo até 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 substituições de aminoácido conservadoras e/ou um total de até 3 substituições de aminoácido não con- servadoras. Em algumas modalidades, a cadeia leve compreende a seqüência de aminoáci- do desde o princípio do CDR1 para o final do CDR3 de qualquer um dos anticorpos anterio- res.

Em algumas modalidades, a cadeia leve pode compreender regiões CDR1, CDR2 e

CDR3 selecionadas a partir da cadeia leve CDR1, CDR2 e CDR3, respectivamente, inde- pendentemente da cadeia leve de anticorpos 1A9.A6.B9; 2D1.A3.D12; 14G9.B8.B4 e 10C8.2.3, ou regiões de CDR cada qual tendo menor que 4 ou menor que 3 substituições de aminoácido conservadoras e/ou um total de três ou menos substituições de aminoácido não 35 conservadoras. Em algumas modalidades, a cadeia leve do anticorpo anti-CD44 compreen- de uma cadeia leve CDR1, CDR2, e CDR3 cada das quais são independentemente selecio- nadas a partir das regiões CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve do anticorpo monoclonal 1Α9.Α6.Β9 (SEQ ID N0:13); 2D1.A3.D12 (SEQ ID NO:49); 14G9.B8.B4 (SEQ ID NO:85) ou 10C8.2.3 (SEQ ID NO: 121). Em certas modalidades, a cadeia leve do anticorpo anti-CD44 compreende as regiões CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve de um anticorpo compreen- dendo a seqüência de aminoácido da região de Vl de um anticorpo selecionado a partir de 5 1 A9.A6.B9 (SEQ ID NO:15); 2D1.A3.D12 (SEQ ID NO:51); 14G9.B8.B4 (SEQ ID NO:87) ou 10C8.2.3 (SEQ ID N0.123) ou as referidas regiões de CDR cada qual tendo menor que 4 ou menor que 3 substituições de aminoácido conservadoras e/ou um total de três ou menos substituições de aminoácido não conservadoras.

Um anticorpo anti-CD44 da invenção pode compreender uma cadeia leve de capa 10 humana ou uma Iambda humana ou uma seqüência de aminoácido derivadas destas. Em algumas modalidades compreendendo uma cadeia leve de capa, o domínio variável de ca- deia leve (Vl) é codificado em parte por um gene da família de VK1, V.2 ou Vk3 humano. Em certas modalidades, a cadeia leve utiliza uma seqüência de aminoácido humana, ou de ma- caco ou combinação do mesmo.

Com respeito às cadeias pesadas, em uma modalidade, os domínios variáveis (Vh)

são codificados, em parte, por um gene humano. Em algumas modalidades, a seqüência de Vh do anticorpo anti-CD44 contém uma ou mais substituições de aminoácido, deleçãos ou inserções (adições) relativo à seqüência de aminoácido de linha germinativa. Em algumas modalidades, o domínio variável da cadeia pesada compreende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20 11, 12, 13, 14, 15, 16, ou 17 mutações a partir da seqüência de aminoácido de linha germi- nativa. Em algumas modalidades, a(s) mutação(ões) são substituições não conservadoras, deleçãos ou inserções, comparadas à seqüência de aminoácido de linha germinativa. Em algumas modalidades, as mutações estão nas regiões de CDR da cadeia pesada. Em algu- mas modalidades, as mudanças de aminoácido são feitas em uma ou mais das mesmas 25 posições como as mutações a partir de linha germinativa em qualquer um ou mais dos anti- corpos de Vh 1A9.A6.B9; 2D1.A3.D12; 14G9.B8.B4 ou 10C8.2.3. Em outras modalidades, as mudanças de aminoácido estão em uma ou mais das mesmas posições porém envolvem uma mutação diferente do que no anticorpo de referência.

Em algumas modalidades, a cadeia pesada compreende a seqüência de aminoáci- 30 do de Vh de anticorpo 1A9.A6.B9 (SEQ ID NO: 11); 2D1.A3.D12 (SEQ ID NO:47); 14G9.B8.B4 (SEQ ID NO:83) ou 10C8.2.3 (SEQ ID NO:119) a referida seqüência de amino- ácido de Vh tendo até 1, 2, 3, 4, 6, 8, ou 10 substituições de aminoácido conservadoras e/ou um total de até 3 substituições de aminoácido não conservadoras. Em algumas modalida- des, a cadeia pesada compreende a seqüência de aminoácido desde o princípio do CDR1 35 ao final do CDR3 de qualquer um dos anticorpos anteriores.

Em uma modalidade, a cadeia pesada compreende as regiões CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada de anticorpo 1A9.A6.B9; 2D1.A3.D12; 14G9.B8.B4 ou 10C8.2.3 ou as referidas regiões de CDR cada qual tendo menor que 8, menor que 6, menor que 4, ou menor que 3 substituições de aminoácido conservadoras e/ou um total de três ou menos substituições de aminoácido não conservadoras. Em algumas modalidades, as regiões de CDR de cadeia pesada são independentemente selecionadas a partir das regiões de CDR de anticorpos 1 A9.A6.B9; 2D1.A3.D12; 14G9.B8.B4 ou 10C8.2.3. Em outra modalidade, a cadeia pesada compreende regiões de CDR independentemente selecionadas a partir de duas ou mais regiões de Vh selecionadas a partir de 1A9.A6.B9 (SEQ ID N0:1 1); 2D1.A3.D12 (SEQ ID NO:47); 14G9.B8.B4 (SEQ ID NO:83) ou 10C8.2.3 (SEQ ID N0:119).

Em outra modalidade, o anticorpo compreende uma cadeia leve e uma cadeia pe- sada. Em uma outra modalidade, as CDRs de cadeia leve e as CDRs de cadeia pesada são do mesmo anticorpo.

Um tipo de substituição de aminoácido que pode ser feita é mudar uma ou mais cis- teínas no anticorpo, que pode ser quimicamente reativa, a outro resíduo, tal como, sem limi- tação, alanina ou serina. Em uma modalidade, há uma substituição de uma cisteína não canônica. A substituição pode ser feita em uma região de CDR ou estrutura de um domínio variável ou no domínio constante de um anticorpo. Em algumas modalidades, a cisteína é canônica.

Outro tipo de substituição de aminoácido que pode ser feita é mudar quaisquer sí- tios proteolíticos potenciais no anticorpo. Tais locais podem ocorrer em uma região de CDR ou estrutura de um domínio variável ou no domínio constante de um anticorpo. Substituição de resíduos de cisteína e remoção de sítios proteolíticos pode diminuir o risco de qualquer heterogeneidade no produto de anticorpo e desse modo aumentar sua homogeneidade. Ou- tro tipo de substituição de aminoácido é eliminar pares de asparagina-glicina, que forma sí- tios de desamidação potenciais, alterando-se um ou ambos os resíduos.

Em modalidades da invenção, as cadeias pesadas e leves dos anticorpos anti- CD44 podem opcionalmente incluir uma seqüência de sinal.

Em um aspecto, a invenção fornece quatro anticorpos monoclonais anti-CD44 hu- manos inibitórios preferidos e as linhagens celulares de hibridoma que os produzem. TABELA 1 lista os identificadores de seqüência (SEQ ID NOs:) dos ácidos nucléico que co- dificam as porções compreendendo domínio de tamanho natural e variáveis de cadeias pe- sadas e leves, e as seqüências de aminoácido correspondentes ou deduzidas.

TABELA 1

ANTICORPOS ANTI-CD44 HUMANO Anticorpo IDENTIFICADOR DE SEQUENCIA Monoclonal (SEQ ID NO:) Domínio Variável Compreendendo Porção Tamanho Natural Pesada Leve Pesada Leve Proteína DNA Proteína DNA Proteína DNA Proteína DNA 1A9.A6.B9 11 12 15 16 9 10 13 14 2D1.A3.D12 47 48 51 52 45 46 49 50 14G9.B8.B4 83 84 87 88 81 82 85 86 10C8.2.3 119 120 123 124 117 118 121 122 Em algumas modalidades, a invenção fornece variantes de cadeia pesadas e leves de anticorpos monoclonais 1A9.A6.B9; 2D1.A3.D12; 14G9.B8.B4 ou 10C8.2.3. Como discu- tido em maiores detalhes no EXEMPLO 3 da presente invenção, numerosas mutações de variantes de cadeia leve e pesada foram feitas para emparelhar aquelas nas regiões de 5 CDR de linha germinativa. Por exemplo em uma modalidade da presente invenção, g- 1A9.A6.B9, g - 2D1.A3.D12, g-14G9.B8.B4 e g-10C8.2.3 são as versões de linha germinati- va de 1A9.A6.B9, 2D1.A3.D12, 14G9.B8.B4, e 10C8.2.3, respectivamente. Os aminoácidos específicos que foram mutados para chegar nas versões de linha germinativa são evidentes para aqueles de experiência na arte comparando as seqüências da linha germinativa vs. um 10 anticorpo de linha não germinativa. Por exemplo, a invenção fornece uma substituição de aminoácido na cadeia pesada de anticorpo 2D1.A3.D12, em que treonina no resíduo 28 é mudada para uma isoleucina. Uma mutação de segundo ponto está na cadeia leve de anti- corpo 2D1.A3.D12, e substitui a glutamina no resíduo 38 com uma histidina.

Como será apreciado, análise de utilização de gene fornece apenas uma avaliação 15 limitada de estrutura de anticorpo. Como células B humanas estocasticamente geram trans- crições de cadeia leve de capa V-J ou pesada V-D-J, há vários processos secundários que ocorrem, incluindo, sem limitação, hipermutação somática, n-adições, e extensões de CDR3. Veja, por exemplo, Mendez e outro, (1997) Nature Genetics 15:146-156 e Pedido de Patente de Publicação U.S. No. 2003-0070185. Desta maneira, para também examinar es- 20 truturas de anticorpo da presente invenção, seqüências de aminoácido preditas dos anticor- pos foram geradas a partir do cDNAs obtidos a partir do

clones. Além disso, seqüências de aminoácido N-terminais foram obtidas através do sequenciamento de proteína. TABELA 2 abaixo de ilustra o uso de segmento de gene de linha germinativa e isótipos dos quatro anticorpos derivados de hibridoma anti-CD44.

TABELA 2

Clone Cadeia pesada Cadeia leve Isótipo Vh D Jh Vl Jk 1A9.A6.B9 3-33 D4-17 JH6b L6 JK4 igG2 2D1.A3.D12 1-03 nd JH6b L19 JK1 igd 14G9.B8.B4 1-03 D3-10 JH5b A27 JK4 igGi 10C8.2.3 3-21 D6-19 JH6b A27 JK4 igG4 nd = não determinado

Em uma modalidade alternada, a invenção se refere a um anticorpo ou porção de ligação de antígeno do mesmo que especificamente liga-se a CD44 humano e tem uma utili- zação de gene de Vh e Vl selecionada a partir do grupo que consiste em 1) Vh D4-17 e VlL6; 2) Vh D3 -10 e VLA27; e 3) Vh D6-19 e VLA27.

Outra modalidade fornece quaisquer do anticorpos ou porções de ligação de antí- geno descritas acima que é um fragmento de Fab, um fragmento de F(ab’)2, um fragmento de Fv, um fragmento de Fv de cadeia simples, um fragmento de Vh de cadeia simples, um fragmento de Vl de cadeia simples, um anticorpo humanizado, um anticorpo quimérico ou um anticorpo bispecífico.

Em uma outra modalidade é fornecido um anticorpo derivado ou porção de ligação de antígeno compreendendo quaisquer dos anticorpos ou porções do mesmo como descrito aqui e pelo menos uma entidade molecular adicional. Por exemplo, a pelo menos uma enti- dade molecular adicional pode ser outro anticorpo (por exemplo, um anticorpo biespecífico 15 ou um diacorpo), um agente de detecção, um rótulo, um agente citotóxico, um agente far- macêutico, e/ou uma proteína ou peptídeo que podem mediar associação do anticorpo ou porção de ligação de antígeno com outra molécula (tal como uma região de núcleo de es- treptavidina ou um rótulo de poliistidina) e/ou uma proteína de portador (por exemplo, uma albumina de proteína de sangue ou transferrina) ligada ou fundida (proteína de fusão) ao 20 anticorpo ou porção de ligação de antígeno. Por exemplo, agentes de detecção úteis com que um anticorpo ou porção de ligação de antígeno da invenção podem ser que derivatiza- dos incluem compostos fluorescentes; entre outros, fluoresceína, isotiocianato de fluoresce- ína, rodamina, cloreto de 5-dimetilamina-1-naftalenossulfonila, ficoeritrina, lantanídeo fósfo- ro. Um anticorpo pode da mesma forma ser rotulado com enzimas que são úteis para detec- 25 ção, tal como, por exemplo, rábano picante peroxidase, β-galactosidase, luciferase, fosfata- se alcalina, glicose oxidase. Em uma outra modalidade os anticorpos ou porções de ligação de antígeno do mesmo da presente invenção podem ser rotulados com biotina, ou com um epítopo de polipeptídeo pré-determinado reconhecido por um repórter secundário (por e- xemplo, seqüências de pares de ziperda leucina, sítios de ligação para anticorpos secundá- 30 rios, domínios de ligação de metal, rótulos de epítopo). Em ainda uma outra modalidade da presente invenção, quaisquer dos anticorpos ou porções de ligação de antígeno do mesmo podem da mesma forma ser derivadas com um grupo químico tal como polietileno glicol (PEG), um grupo metila ou etila, ou um grupo carboidrato.

Em algumas modalidades, os anticorpos de CD44 ou porções de ligação de antíge- no descritos aqui são ligados a um suporte sólido ou partícula. Tais partículas podem ser usadas para usos diagnósticos in vivo ou in vitro.

Classe e Subclasse de Anticorpos anti-CD44 A classe (por exemplo, IgG, IgM, IgE, IgA, ou IgD) e subclasse (por exemplo IgGI1 lgG2, lgG3, ou lgG4) de anticorpos de CD44 podem ser determinadas por qualquer método conhecido na arte. Em geral, a classe e subclasse de um anticorpo podem ser determinadas usando anticorpos que são específicos para uma classe particular e subclasse de anticorpo. Tais anticorpos estão comercialmente disponíveis. A classe e subclasse podem ser determi- nadas por ELISA, ou Mancha do Oeste bem como outras técnicas. Alternativamente, a clas- se e subclasse podem ser determinadas através de sequenciamento de toda ou uma porção dos domínios constantes das cadeias pesadas e/ou leves dos anticorpos, comparando suas seqüências de aminoácido às seqüências de aminoácido conhecidas de várias classes e subclasses de imunoglobulinas, e determinando a classe e subclasse dos anticorpos. Os anticorpos de CD44 da presente invenção podem ser uma molécula de IgG, uma de IgM, uma de IgE, uma de IgA, ou uma de IgD. Por exemplo, os anticorpos de CD44 podem ser um IgG que é uma subclasse de IgGI, lgG2, lgG3, ou lgG4.

Um aspecto da invenção fornece um método para converter a classe ou subclasse de um anticorpo de CD44 a outra classe ou subclasse. Em algumas modalidades, uma mo- lécula de ácido nucléico que codifica um Vl ou Vh que não inclui seqüências que codificam Cl ou Ch é isolada usando métodos bem conhecidos na arte. A molécula de ácido nucléico em seguida é operativamente ligada a uma seqüência de ácido nucléico que codifica um Cl ou Ch a partir de uma classe de imunoglobulina desejada ou subclasse. Isto pode ser obtido usando um vetor ou uma molécula de ácido nucléico compreendendo uma cadeia de Cl ou Ch, como descrito acima. Por exemplo, um anticorpo de CD44 que foi originalmente IgM pode ser classe trocada a um IgG. Além disso, a mudança de classe pode ser usada para converter uma subclasse de IgG a outra, por exemplo, de IgGI a lgG2. Outro método para produzir um anticorpo da invenção compreendendo um isótipo desejado compreende as etapas de isolar um ácido nucléico codificando uma cadeia pesada de um anticorpo de CD44 e um ácido nucléico codificando uma cadeia leve de um anticorpo de CD44, isolar a seqüência codificando a região de VH, ligando a seqüência de Vh a uma seqüência que codi- fica um domínio constante de cadeia pesada do isótipo desejado, expressar o gene de ca- deia leve e a construção de cadeia pesada em uma célula, e coletar o anticorpo de CD44 com o isótipo desejado.

Espécies e Seletividade Molecular

Em outro aspecto da invenção, os anticorpos anti-CD44 demonstram igualmente espécies e seletividade molecular. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CD44 liga-se a um CD44 de humano e primata. Preferivelmente, o anti-CD44 liga-se a CD44 humano, e de macaco cinomolgo. Seguindo os ensinamentos da especificação, alguém pode determi- nar a seletividade de espécies para o anticorpo anti-CD44 usando métodos bem conhecidos na arte. Por exemplo, alguém pode determinar a seletividade de espécies usando uma Man- cha do Oeste, citometria de fluxo, um ELISA, uma imunoprecipitação ou um RIA. (Veja, por exemplo, EXEMPLO 5).

Em outra modalidade, o anticorpo anti-CD44 tem uma seletividade para CD44 so- bre a proteína de receptor de hiauronano endotelial de vaso linfático 1, (LYVE-1) por pelo 5 menos 100 vezes. (Veja EXEMPLO 11) Alguém pode determinar a seletividade do anticorpo anti-CD44 para CD44 usando métodos bem conhecidos na arte seguindo os ensinos da es- pecificação. Por exemplo, alguém pode determinar a seletividade usando uma Mancha do Oeste, citometria de fluxo, uma ELISA, uma imunoprecipitação ou um RIA.

Afinidade de liaacão de Anticorpos Anti-CD44 ao CD44 Em uma modalidade, o anticorpo anti-CD44 liga-se a CD44 mamífero preferivel-

mente o humano com alta afinidade.

Em uma modalidade, o anticorpo anti-CD44 liga-se dentro do domínio de ligação HA.

Em outra modalidade, os anticorpos anti-CD44 ligam-se com afinidade alta a um polipeptídeo consistindo na seqüência de aminoácido mencionada em SEQ ID NO:3

(fusão de IgG de domínio extracelular) ou em SEQ ID NO: 154 (fusão de IgG extra- celular de macaco), e preferivelmente liga-se com afinidade alta a um polipeptídeo que con- siste na seqüência de aminoácido do domínio de ligação de HA.

Em outra modalidade, o anticorpo anti-CD44 liga-se a CD44, ou mais preferivel- 20 mente ao domínio de ligação de HA1 com uma K0 de 500 nM ou menor. Em ainda outras modalidades, o anticorpo liga-se a CD44, ou mais preferivelmente ao domínio de ligação de HA de CD44, com uma K0 de 2 x 10'8 M, 2 x 10'9 M, ou 5 x 10-10 M ou menos. Em uma outra modalidade ainda mais preferida, o anticorpo liga-se a CD44, no domínio de ligação de HA com uma K0 de 2,5 x 10'12 M ou menor. Em algumas modalidades, o anticorpo liga-se a 25 CD44 com substancialmente a mesma K0 como anticorpo 1A9.A6.B9; 2D1.A3.D12; 14G9.B8.B4; ou 10C8.2.3.

Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CD44 tem uma baixa taxa de constante da taxa de dissociação (k0ff). Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CD44 liga-se a CD44, ou mais preferivelmente ao domínio de ligação de HA de CD44, com uma K0ff de 1,0 30 x 10'3 s-1 ou menor ou uma K0ff de 5,0 x 10‘4 s-1 ou menor. Em ainda outras modalidades, a k0ff é substancialmente a mesma como um anticorpo descrito aqui, incluindo um anticorpo selecionado a partir de 1A9.A6.B9; 2D1.A3.D12; 14G9.B8.B4; e 10C8.2.3. Em algumas mo- dalidades, o anticorpo liga-se a CD44, com substancialmente a mesma koff como um anti- corpo que compreende as regiões de CDR de uma cadeia pesada, ou as regiões de CDR de 35 uma cadeia leve, a partir de um anticorpo selecionado a partir de 1A9.A6.B9; 2D1.A3.D12; 14G9.B8.B4; e 10C8.2.3. Em algumas modalidades, o anticorpo liga-se a CD44, ou mais preferivelmente ao Domínio de ligação de HA de CD44, com substancialmente a mesma koff como um anticorpo que compreende um domínio variável de cadeia pesada tendo a se- qüência de aminoácido da região de Vh encontrada em SEQ ID NOs: 9, 45, 81 e 117 um domínio variável de cadeia leve tendo a seqüência de aminoácido da região de Vl encontra- da em SEQ ID NOs: 13, 49, 85 ou 121. Em ainda outra modalidade, o anticorpo liga-se a 5 CD44, ou mais preferivelmente ao domínio de ligação de HA de CD44, com substancialmen- te a mesma koff como um anticorpo que compreende as regiões de CDR de um domínio va- riável de cadeia leve tendo a seqüência de aminoácido da região de Vl encontrada em SEQ ID NOs: 15, 49, 85 ou 121; ou as regiões de CDR de um domínio variável de cadeia pesada tendo a seqüência de aminoácido da região de Vh encontrada em SEQ ID NOs: 9, 45, 81 e 10 117.

A afinidade de ligação e taxa de dissociação de um anticorpo anti-CD44 para CD44 podem ser determinados por métodos conhecidos na arte. A afinidade de ligação pode ser medida por ELISAs, RIAsI, citometria de fluxo (FACS), ressonância de plasmônio de super- fície, tal como BIACORE™. A taxa de dissociação pode ser medida por ressonância de 15 plasmônio de superfície. Preferivelmente, a afinidade de ligação e taxa de dissociação são medidas por ressonância de plasmônio de superfície. Mais preferivelmente, a afinidade de ligação e taxa de dissociação são medidas usando BIACORE™. Alguém pode determinar se um anticorpo tem substancialmente o mesmo K0 como um anticorpo anti-CD44 usando-se métodos conhecidos na arte. EXEMPLO 5 fornece um método para determinar constantes 20 de afinidade de anticorpos monoclonais anti-CD44.

Identificação de Epítopos de CD44 Reconhecidos por Anticorpos Anti-CD44

A invenção fornece um anticorpo monoclonal anti-CD44 humano que liga-se a CD44 e compete ou compete cruzado com e/ou liga o mesmo epítopo como: (a) um anticor- po selecionado a partir de 1A9.A6.B9; 2D1.A3.D12; 14G9.B8.B4; e 10C8.2.3; (b) um anti- 25 corpo que compreende um domínio variável de cadeia pesada tendo uma seqüência de a- minoácido do domínio variável encontrada em SEQ ID NOs: 9, 45, 81 e 1 17; (c) um anticor- po que compreende um domínio variável de cadeia leve tendo uma seqüência de aminoáci- do do domínio variável encontrada em SEQ ID NOs: 13, 49, 85 ou 121; ou (d) um anticorpo que compreende igualmente um domínio variável de cadeia pesada como definido em (b) e 30 um domínio variável de cadeia leve como definido em (c). Se dois anticorpos reciprocamen- te competem entre si para ligar-se a CD44, eles são referidos para competirem cruzado.

Alguém pode determinar se um anticorpo liga-se ao mesmo epítopo ou compete cruzado para ligação com um anticorpo anti-CD44 usando-se métodos conhecidos na arte. Em uma modalidade, alguém permite ao anticorpo anti-CD44 da invenção ligar-se a CD44 35 sob condições de saturação e em seguida mede a capacidade do anticorpo teste ligar-se a CD44. Se o anticorpo teste é capaz de ligar-se a CD44 ao mesmo tempo que o anticorpo anti-CD44, em seguida o anticorpo teste liga-se a um epítopo diferente como o anticorpo anti-CD44, Entretanto, se o anticorpo teste não é capaz de ligar-se a CD44 ao mesmo tem- po, em seguida o anticorpo teste liga-se ao mesmo epítopo, um epítopo de sobreposição, ou um epítopo que está em proximidade íntima ao epítopo ligado pelo anticorpo anti-CD44 hu- mano. Esta experiência pode ser realizada usando um ELISA, um RIA, BIACORE™, ou ci- tometria de fluxo (FACS).

Para testar se um anticorpo anti-CD44 compete cruzado com outro anticorpo anti- CD44, alguém pode usar o método de competição descrito acima em duas direções, isto é, determinar se o anticorpo de referência bloqueia o anticorpo teste e vice-versa. Em uma modalidade, a experiência é realizada usando uma ELISA. Métodos de determinar K0 são discutidos também abaixo.

Inibição de Atividade de CD44 por Anticorpos Anti-CD44

Em outra modalidade, a invenção fornece um anticorpo anti-CD44 que inibe a sina- lização mediada por CD44. Em outras modalidades, a invenção fornece um anticorpo anti- CD44 que inibe a sinalização co-estimuladora para linfócitos e monócitos através de CD44. Em ainda outra modalidade, a invenção fornece um anticorpo anti-CD44 que bloqueia a pro- dução de citocina, e particularmente citocinas tais como TNF-α, IL-6 E IL-1 β. Em uma outra modalidade, a invenção fornece um anticorpo anti-CD44 que inibe a ligação de HA ao recep- tor de CD44. Em uma modalidade, o receptor de CD44 é humano. Em ainda outra modali- dade, o anticorpo anti-CD44 é um anticorpo humano. O IC50 pode ser medido em um ensaio de ligação de Iigante por ELISA, RIA, ou outros ensaios e ensaios com base em célula tais como ensaios de FACS ou células que expressam CD44. Em uma modalidade, o anticorpo ou porção de ligação de antígeno do mesmo inibe a ligação de Iigante entre HA e CD44 com um IC50 não maior do que 5 μg/ml, preferivelmente não maior do que 1 μg/ml, preferivelmen- te maior do que 0,5 μg/ml, ainda mais preferivelmente não maior do que 0,20 μg/ml como medido por um ensaio ELISA. EXEMPLO 4 fornece um método para determinar a inibição por anticorpos monoclonais de ligação de CD44 ao HA.

Em outra modalidade, a invenção fornece um anticorpo anti-CD44 que previne a li- gação de CD44 ao HA. Em uma modalidade, o anticorpo anti-CD44 inibe induzido por HA: (i) recrutamento de leucócito; (ii) interações de matriz celular e interações diretas entre célu- 30 Ias, tais como por exemplo, leucócitos e células endoteliais; (iii) regulação de função celular de leucócitos; (iv) metabolismo de HA; e/ou (v) a contribuição de CD44 à reunião, organiza- ção e remodelagem de matriz. Alguém pode determinar se um anticorpo anti-CD44 pode prevenir, inibir ou reduzir a ativação de CD44 na presença de HA determinando-se a libera- ção de citocina inflamatória a partir de leucócitos ativados por lipopolíssacarídeo (LPS) e 35 HA. Ensaios para detectar a ativação de CD44 e/ou ligação de HA a CD44 são descritos nos EXEMPLOS 4, 5, 6 e 7. Em uma modalidade, alguém determinaria os níveis de ativação de CD44 usando um ensaio de citocina. Em algumas modalidades, o IC5o, medido usando um ensaio de ligação de competição de HA, é não mais que 5/vg/ml, preferivelmente não mais do que 1 //g/ml, mais preferivelmente do que 0,5 //g/ml, ainda mais preferivelmente não mais do que 0,20 //g/ml.

Redução de Expressão de Célula de Superfície por Anticorpos Anti-CD44

Em outro aspecto da invenção, o anticorpo causa uma sub-regulação de expressão de CD44 de superfície de célula após incubação com o anticorpo. Em uma modalidade, a incubação pode ter um período de tempo curto (por exemplo, 4 horas) ou um período de tempo mais longo (por exemplo, 24 horas). Particularmente, a presente invenção fornece um anticorpo anti-CD44 que induz a sub-regulação de expressão de CD44 em circulação de linfócitos, e preferivelmente, em linfócitos de T CD3+. Uma sub-regulação de expressão de CD44 de superfície de célula pode ser medida usando FACS. Em modalidades particulares da invenção, o anticorpo pode causar preferivelmente uma diminuição de 6% de expressão de CD44 de superfície de célula, preferivelmente uma diminuição de 10%, ou mais preferi- velmente uma sub-regulação de 20%, ou até mesmo mais preferivelmente diminuição de pelo menos 50% de expressão de CD44 de superfície de célula como medido por FACS. O EXEMPLO 8 exemplifica um tipo de ensaio de FACS que mede a sub-regulação de expres- são de CD44 de superfície de célula em leucócito e células T em duas espécies: humano e macaco cinomolgo.

Métodos de Produção de Anticorpos

Os anticorpos monoclonais da presente invenção podem ser produzidos por uma variedade de técnicas, incluindo metodologia de anticorpo monoclonal convencional, por exemplo, a técnica de hibridização de célula somática padrão de Kohler e Milstein (1975) Nature 256: 495. Embora os procedimentos de hibridização de célula somática sejam prefe- ridos, em princípio, outras técnicas para produzir anticorpo monoclonal podem ser emprega- das, por exemplo, transformação viral ou oncogênica de linfócitos B.

O sistema animal preferido para preparar hibridomas é o sistema de murino.

A produção de hibridoma no camundongo é um procedimento muito bem estabele- cido. Os protocolos de imunização e técnicas para isolamento de esplenócitos imunizados para fusão são conhecidos na arte. Os pares de fusão (por exemplo, células de mieloma de murino) e procedimentos de fusão são também conhecidos.

Os anticorpos quiméricos ou humanizados da presente invenção podem ser prepa- rados com base na seqüência de um anticorpo monoclonal de murino preparado como des- crito acima. O DNA que codifica as imunoglobulinass de cadeia pesada e leve pode ser obtido a partir do hibridoma de murino de interesse e planejado para conter sequencias de imunoglobulina de não murino (por exemplo, humano) usando técnicas de biologia molécula padrões. Por exemplo, para criar um anticorpo quimérico, as regiões variáveis de murino podem ser unidas às regiões constantes humanas que usam métodos conhecidos na arte (Patente U.S. No. 4.816.567). Para criar um anticorpo humanizado, as regiões de CDR de murino podem ser inseridas em uma estrutura humano usando métodos conhecidos na arte, Patentes U.S. Nos. 5.225.539, 5.530.101; 5.585.089; 5.693.762; e 6.180.370.

Em uma modalidade preferida, os anticorpos da invenção são anticorpos monoclo- 5 nais humanos. Tais anticorpos monoclonais humanos direcionados contra CD44 podem ser gerados usando partes de carregamento de camundongo transgênico ou transcromossômi- co do sistema imune humano em lugar do sistema de camundongo. Este camundongo transgênico e transcromossômico inclui camundongos referidos aqui como o HuMAb Mou- se® e KM Mouse®, respectivamente, e são coletivamente referidos aqui como "camundon- 10 gos de Ig humano".

O HuMAb Mouse® (Medarex, Inc.) contém minilocos de gene de imunoglobulinas humana que codificam as seqüências de imunoglobulinas de cadeia leve κ e pesada huma- na sem nova disposição (μ e γ), junto com mutações alvejadas que inativam o loco de ca- deia κ e μ endógena (veja, por exemplo, Lonberg, e outros (1994) Nature 368: 856-859). Consequentemente, os camundongos exibem expressão reduzida de camundongo IgM ou κ, e com em resposta a imunização, os transgenes de cadeia pesada e leve humanos intro- duzidos sofrem mudança de classe e mutação somática para gerar IgGK monoclonal huma- no de alta afinidade (Lonberg, N. e outros (1994), supra; revisado em Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101 ; Lonberg, N. e Huszar, D. (1995) In- tern. Rev. Immunol. 13: 65-93, e Harding, F. e Lonberg, N. (1995) Ann. N.Y. Acad. Sei. 764:536-546). A preparação e uso do HuMAb Mouse®, e as modificações genômicas car- regadas por tais camundongos, é descrito também em Taylor, L. e outros (1992) Nucleic Acids Research 20:6287-6295; Chen, J. e outros (1993) International Imunologia 5: 647-656; Tuaillon e outros (1993) Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 90:3720 - 3724; Choi e outros (1993) Natue Genetics 4:117-123; Chen, J. e outros (1993) EMBO J. 12: 821-830; Tuaillon e outros

(1994) J. Immunol. 152:2912-2920; Taylor, L. e outros (1994) International Immunology 6: 579-591; e Fishwild, D. e outros (1996) Nature Biotecnologia 14: 845-851. Veja também, as Patentes U.S. Nos.: 5.545.806; 5.569.825; 5.625.126; 5.633.425; 5.789.650; 5.877.397; 5.661 .016; 5.814.318; 5.874.299; e 5.770.429; Patente U.S. No. 5.545.807; Publicações de PCT Nos.: WO 92/03918, WO,

93/12227, WO 94/25585, WO 97/13852, WO 98/24884 e WO 99/45962; e WO 01/14424.

Em outra modalidade, anticorpos humanos da invenção podem ser elevados usan- do um camundongo que carrega as seqüências de imunoglobulina humana em transgenes e transcromossomas, tal como um camundongo que carrega um transgene de cadeia pesada humano e um transcromossoma de cadeia leve humano. Tais camundongos, referidos aqui como "KM mice™", são descritos em detalhes na Publicação PCT No. WO 02/43478. Entretanto também, sistemas de animal transgênico alternativo que expressam ge- nes de imunoglobulinas humanos estão disponíveis na técnica e podem ser usados para elevar anticorpos anti-CD44 da invenção. Por exemplo, um sistema transgênico alternativo referido como Xenomouse™ (Abgenix, Inc.) pode ser usado; tais camundongos são descri- 5 tos em, por exemplo, Patentes U.S.A. Nos.: 5.939.598; 6.075.181; 6.1 14.598; 6.150.584; e 6.162.963.

Além disso, sistemas de animal transcromossômico alternativos que expressam genes de imunoglobulinas humanos estão disponíveis na técnica e podem ser usados para elevar anticorpos anti-CD44 da invenção. Por exemplo, os camundongos que carregam um 10 transcromossoma de cadeia pesada humano e um trancromossoma de cadeia leve humano, referido como "camundongos TC" podem ser usados; tais camundongos são descritos em Tomizuka e outros (2000) Proc. Natl. Acad. Sei.

U.S.A. 97:722-727. Além disso, vacas que carregam os transcromossomas de ca- deia pesada e leve humanos foram descritas na técnica (Kuroiwa e outros (2002) Nature Biotechnology 20:889-894) e podem ser utilizadas para carregar anticorpos anti-CD44 da invenção.

Os anticorpos monoclonais humanos da invenção também podem ser preparados usando camundongos de SCID nos quais células imunes humanas foram reconstituídas tal que uma resposta de anticorpo humana possa ser gerada na imunização. Tais camundon- gos são descritos, por exemplo, na Patente U.S.A. ,Nos.: 5.476.996; e 5.698.767.

Imunização de Camundongos de Ia Humano

Produção de Anticorpos e Linhagens de Célula de Produção de Anticorpos

Após imunização de um animal com um antígeno de CD44, anticorpos e/ou células de produção de anticorpos podem ser obtidas a partir do animal. Em algumas modalidades, 25 o soro anticorpo anti-CD44 é obtido a partir do animal sangrando ou sacrificando o animal. O soro pode ser usado quando for obtido a partir do animal, uma fração de imunoglobulinas pode ser obtida a partir do soro, ou os anticorpos anti-CD44 podem ser purificados a partir do soro.

Em algumas modalidades, as linhagens de célula imortalizadas de produção de an- 30 ticorpos são preparadas a partir de células isoladas a partir do animal imunizado. Após a imunização, o animal é sacrificado e Iinfonodo e/ou células B esplênicas são imortalizadas por qualquer meio conhecido na técnica. Métodos de imortalizar células incluem, porém não estão limitados a, os transfectar com oncogenes, os infectar com um vírus oncogênico e os cultivar sob condições que selecionam para células imortalizadas, os submetendo aos com- 35 postos carcinogênicos ou de mutação, os fundindo com uma célula imortalizada, por exem- plo, uma célula de mieloma, e inativando um gene supressor de tumor. Veja, por exemplo, Harlow and Lane, supra. Se fusão com células de mieloma for empregada, as células de mieloma preferivelmente não segregam polipeptídeos de imunoglobulinas (uma linhagem celular não secretória). As células imortalizadas são avaliadas usando CD44, uma porção disto, ou uma célula que expressa CD44. Em uma modalidade preferida, a porção de CD44 compreende: (i) o sítio de ligação de HA de CD44; (ii) compreende a seqüência de aminoá- cido truncada ou completa apresentada em SEQ ID N0:1 e/ou SEQ ID N0:2; ou (iii) combi- nações destes. Em uma modalidade, a avaliação inicial é realizada usando um imunoensaio ligado a enzima (ELISA) ou um radioimunoensaio. Um exemplo de avaliação de ELISA é fornecido na Publicação PCT No. WO 00/37504.

As células de produção de anticorpos anti-CD44, por exemplo, hibridomas, são se- lecionadas, clonadas e também avaliadas quanto às características desejáveis, incluindo crescimento robusto, alta produção de anticorpo e características de anticorpo desejáveis, como descrito também abaixo. Os hibridomas podem ser expandidos in vivo em animais singênicos, em animais que necessitam de um sistema imune, por exemplo, camundongo nu, ou em cultura de célula in vitro. Os métodos de selecionar, clonar e expandir os hibri- domas são bem conhecidos por aqueles de experiência ordinária na técnica.

Em uma modalidade, o animal imunizado é um animal não humano que expressa genes de imunoglobulina humanos e as células B esplênicas são fundidas a uma linhagem celular de mieloma a partir das mesmas espécies como o animal não humano. Em uma modalidade mais preferida, o animal imunizado é um camundongo Kirin TC Mouse™ e a linhagem celular de mieloma é um mieloma de camundongo não secretório. Em uma moda- lidade ainda mais preferida, a linhagem celular de mieloma é Sp2/0-Ag14 (Coleção de Cultu- ra do Tipo Americano (ATCC) CRL-1581) e a linhagem celular de hibridoma de camundongo é 1376.3.2d1.A3.D12 (ATCC No.PTA-6928), 1376.3.1A9.A6.B9 (ATCC No.PTA-6929) ou 1376.2.14G9.B8.B4 (ATCC No.PTA-6927). Veja, por exemplo, EXAMPLE 1.

Desse modo, em uma modalidade, a invenção fornece métodos para produzir uma linhagem celular que produz um anticorpo monoclonal humano ou porções de ligação de antígeno do mesmo direcionados a CD44 compreendendo: (a) imunizar um animal transgê- nico não humano descrito aqui com CD44, uma porção de CD44 ou uma célula ou tecido que expressam CD44; (b) permitir o animal transgênico montar uma resposta imune a CD44; (c) isolar as células de produção de anticorpos a partir do animal transgênico; (d) i- mortalizar as células de produção de anticorpos; (e) criar populações monoclonais individu- ais das células de produção de anticorpos imortalizadas; e (f) avaliar as células de produção de anticorpo imortalizado para identificar um anticorpo direcionado a CD44. Em uma moda- lidade, a etapa (f) compreende avaliar as células de produção de anticorpos imortalizadas para identificar um anticorpo direcionado ao sítio de ligação de HA de CD44, e opcionalmen- te, que não liga externamente o Sítio de ligação de HA de CD44.

A avaliação das células de produção de anticorpos imortalizadas para identificar um anticorpo direcionado ao sítio de ligação de HA de CD44 pode ser obtida testando-se os anticorpos produzidos pela ligação de célula a um peptídeo que compreende a seqüência de aminoácido do sítio de ligação de HA de CD44.

Em outro aspecto, a invenção fornece hibridomas que produzem um anticorpo anti- CD44 humano. Em uma modalidade, o anticorpo anti-CD44 humano produzido pelo hibri- doma é um antagonista de CD44. Em ainda outra modalidade, o anticorpo anti-CD44 hu- mano produzido pelo hibridoma (i) se liga ao sítio de ligação de HA de CD44; (ii) não liga externamente ao sítio de ligação de HA ; (iii) não se ligue ao sítio de ligação de IM7; ou (iv) combinações destes. Mikecz e outros, (1999) Arthritis Rheumatism 42: 659, 668, Zheng

(1995) J. Cell Biol. 130: 485-495, Peach e outros, (1993) J. Cell Biol. 122: 257-264 e Patente U.S.A. No. 6.001.356. Em uma modalidade, os hibridomas são hibridomas de camundongo, como descrito acima. Em outras modalidades, os hibridomas são produzidos em outros mamíferos.

Em uma modalidade da invenção, as células de produção de anticorpos são isola- das e expressadas em uma célula hospedeira, por exemplo, células de mieloma. Em ainda outra modalidade, um animal transgênico é imunizado com CD44, células primárias, (por exemplo, células do sangue periférico ou baço) são isoladas de um animal transgênico imu- nizado e células individuais produzindo anticorpos específicos para o antígeno desejado são identificadas. O mRNA poliadenilado de cada célula individual é isolado e a reação em ca- deia de polimerase de transcrição reversa (RT-PCR) é realizada usando iniciadores de sen- tido que anelam-se às seqüências de região variável, por exemplo, degenerar iniciadores que reconhecem a maioria ou todas as regiões de FR1 de genes de região variável de ca- deia leve e pesada humana e iniciadores de anti-sentido que anelam-se às sequencias de região de união ou constante. Os cDNAs dos domínios variáveis de cadeia pesada e leve são então clonados e expressados em qualquer célula hospedeira adequada, por exemplo, uma célula de mieloma, como anticorpos quiméricos com respectivas regiões constantes de imunoglobulina, tal como os domínio constantes κ ou λ e cadeia pesada. Veja Babcook, J.

S. e outros (1996) Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 93: 7843-48. Os anticorpos anti-CD44 po- dem então ser identificados e isolados como descrito aqui.

Métodos Recombinantes de Produção de Anticorpos

Um anticorpo, ou porção de ligação de anticorpo, da invenção pode ser preparado por expressão recombinante de genes de cadeia leve e pesada de imunoglobulinas em uma célula hospedeira. Por exemplo, para expressar um anticorpo recombinantemente, uma célula hospedeira é transfectada com um ou mais vetores de expressão recombinantes que carregam fragmentos de DNA de codificação das cadeias leves e pesadas de imunoglobuli- na do anticorpo tal que as cadeias leves e pesadas sejam expressas na célula hospedeira e, preferivelmente, segregadas no meio no qual as células hospedeiras são cultivadas, a partir de qual meio os anticorpos podem ser recuperados. As metodologias de DNA recombinante padrões são utilizadas para obter genes de cadeia pesada e leve de anticorpo, para incorpo- rar estes genes em vetores de expressão recombinante e introduzir os vetores em células hospedeiras, tal como aquelas descritas em Sambrook, Fritsch e Maniatis (eds), Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Segunda Edição, Cold Spring Harbor, N.Y., (1989), Ausubel, F. M. e outros (eds.) Current Protocols in Molecular Biology1 Greene Publishing Associates, (1989) e na Patente U.S. No. 4.816.397.

Mutações e Modificações

Para expressar os anticorpos de CD44 da presente invenção, os fragmentos de DNA de codificação de regiões de Vh e Vl podem primeiro ser obtidos usando quaisquer dos métodos descritos acima. Várias, modificações, por exemplo, mutações, deleções, e/ou adições podem também ser introduzidas nas sequencias de DNA usando métodos padrões conhecidos por aqueles de experiência na técnica. Por exemplo, a mutagênese pode ser realizada usando métodos padrões, tais como mutagênese mediada por PCR, na qual os nucleotídeos mutados são incorporados nos iniciadores de PCR tal que o produto de PCR contenha as mutações desejadas ou mutagênese direcionada ao sítio.

Um tipo de substituição, por exemplo, que pode ser feita é para mudar uma ou mais cisteínas no anticorpo, que pode ser quimicamente reativo, a outro resíduo, tal como, sem limitação, alanina ou serina. Por exemplo, pode haver uma substituição de uma cisteína não canônica. A substituição pode ser feita em uma região de esqueleto ou CDR de um domínio variável ou no domínio constante de um anticorpo. Em algumas modalidades, a cisteína é canônica.

Os anticorpos também podem ser modificados, por exemplo, nos domínios variá- veis das cadeias pesadas e/ou leves, por exemplo, para alterar uma propriedade de ligação do anticorpo. Por exemplo, uma mutação pode ser feita em uma ou mais das regiões de CDR para aumentar ou diminuir o K0 do anticorpo para CD44, aumentar ou diminuir a koff, ou alterar a especificidade de ligação do anticorpo. As técnicas em mutagênese direcionada ao sítio são bem conhecidas na técnica. Veja, por exemplo, Sambrook e outros e Ausubel e outros, supra.

Uma modificação de mutação também pode ser feita em uma região de esqueleto ou domínio constante para aumentar a meia-vida de um anticorpo de CD44. Veja, por e- xemplo, Publicação PCT No. WO 00/09560. Uma mutação em uma região de esqueleto ou domínio constante também pode ser feita para alterar a imunogenicidade do anticorpo, para fornecer um sítio para ligação covalente ou não covalente a outra molécula, ou alterar tais propriedades como fixação de complemento, ligação de FcR e citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC). De acordo com a invenção, um único anticorpo pode ter mutações em qualquer um ou mais dos CDRs ou regiões de esqueleto do domínio variável ou no domínio constante.

Em um processo conhecido como "linha de germinação", certos aminoácidos nas seqüências de Vh e Vl podem ser mutados para compatibilidade com aqueles encontrados naturalmente em seqüências de Vh e Vl de linha germinativa. Em particular, as seqüências 5 de aminoácido das regiões de esqueleto nas seqüências de Vh e Vl podem ser mutadas para compatibilidade com as seqüências de linha germinativa para reduzir o risco de imuno- genicidade quando o anticorpo é administrado. As seqüências de DNA de linha germinativa para genes de Vh e Vl humanos são conhecidas na técnica (veja, por exemplo, o banco de dados de sequencia de linha germinativa humana "Vbase"; veja também Kabat, E. A., e ou- 10 tros (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edição, U.S. Depart- ment of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242; Tomlinson e outros (1992) J. Mol. Biol. 227:776-798; e Cox e outros, (1994) Eur. J. Immunol. 24:827-836.

Outro tipo de substituição de aminoácido que pode ser feita é para remover sítios proteolíticos potenciais no anticorpo. Tais sítios podem ocorrer em uma região de esqueleto 15 ou CDR de um domínio variável ou no domínio constante de um anticorpo. A substituição de resíduos de cisteína e a remoção de sítios proteolíticos podem diminuir o risco de heteroge- neidade no produto de anticorpo e desse modo pode aumentar sua homogeneidade. Outro tipo de substituição de aminoácido é eliminar os pares de asparagina-glicina, que formam sítios de desamidação potenciais, alterando-se um ou ambos os resíduos. Em outro exem- 20 pio, a Iisina de terminal C da cadeia pesada de um anticorpo de CD44 da invenção pode ser clivada. Em várias modalidades da invenção, as cadeias pesadas e leves dos anticorpos de CD44 podem opcionalmente incluir uma seqüência de sinal.

Uma vez que os fragmentos de DNA de codificação dos segmentos de Vh e Vl da presente invenção são obtidos, estes fragmentos de DNA podem ser também manipulados 25 através de técnicas de DNA recombinantes padrão, por exemplo, para converter os genes de região variável para genes de cadeia de anticorpo de tamanho natural, para genes de fragmento Fab, ou para um gene de scFv. Nestas manipulações, um fragmento de DNA de codificação de Vl ou Vh é operativamente unido a outro fragmento de DNA codificando outra proteína, tal como uma região constante de anticorpo ou um Iigador flexível. O termo "ope- 30 rativamente unido", como usado neste contexto, é pretendido significar que os dois fragmen- tos de DNA são unidos tal que as seqüências de aminoácido codificadas pelos dois frag- mentos de DNA permaneçam no esqueleto.

O DNA isolado codificando a região de Vh pode ser convertido para um gene de cadeia pesada de tamanho natural operativamente unindo-se o DNA de codificação de Vh a outra molécula de DNA codificando as regiões constantes de cadeia pesada (CH1, CH2 e CH3). As seqüências de genes de região constante de cadeia pesada humana são conhe- cidas na técnica (veja, por exemplo, Kabat, E. A., e outros (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edição, U.S. Department of Health and Human Services, Pu- blicação de NIH No. 91-3242) e os fragmentos de DNA abrangendo estas regiões podem ser obtidos por amplificação de PCR padrão. A região constante de cadeia pesada pode ser uma região constante de IgGI, lgG2, lgG3, lgG4, IgA, IgE, IgM ou IgD, porém mais preferi- 5 velmente é uma região constante de IgGI ou lgG2. A seqüência de região constante de IgGI pode ser quaisquer dos vários alelos ou alotipos conhecidos por ocorrer entre indivíduos diferentes, tal como Gm(1), Gm(2), Gm(3), e Gm(17). Estes alotipos representam substitui- ção de aminoácido de ocorrência natural nas regiões constantes de IgGI. Para um gene de cadeia pesada de fragmento Fab, o DNA de codificação de Vh pode ser operativamente uni- 10 do a outra molécula de DNA que codifica somente a região constante de CH 1 de cadeia pesada. A região constante de cadeia pesada CH 1 pode ser derivada a partir de quaisquer dos genes de cadeia pesada.

O DNA isolado que codifica a região de Vl pode ser convertido para um gene de cadeia leve de tamanho natural (bem como um gene de cadeia leve de Fab) operativamente 15 unindo-se o DNA de codificação de Vl a outra molécula de DNA que codifica a região cons- tante de cadeia leve, CL. As seqüências de genes de região constante de cadeia leve hu- mana são conhecidas na técnica (veja, por exemplo, Kabat, E. A., e outros (1991) Sequen- ces of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edição, U.S. Department of Health and Human Services, Publicação de NIH No. 91 - 3242) e os fragmentos de DNA abrangendo 20 estas regiões podem ser obtidos por amplificação de PCR padrão. A região constante de cadeia leve pode ser uma região constante de capa ou lambda. A região constante de capa pode ser quaisquer dos vários alelos conhecidos por ocorrer entre indivíduos diferentes, tal como lnv(1), lnv(2), e lnv(3). A região constante de lambda pode ser derivada de quaisquer dos três genes de lambda.

Para criar um gene de scFv, os fragmentos de DNA de codificação de Vh e Vl são

operativamente unidos a outro fragmento codificando um Iigador flexível, por exemplo, codi- ficando a sequencia de aminoácido (Gly4 -Ser)3, tal que as sequencias Vh e Vl possam ser expressadas como uma proteína de cadeia única contígua, com as regiões de Vl e Vh uni- das pelo Iigador flexível (Veja, por exemplo, Bird e outros, (1988) Science 242:423-426; Hus- 30 ton e outros, (1988) Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 85:5879-5883; McCafferty e outros, (1990) Nature 348:552-554. O anticorpo de cadeia única pode ser monovalente, se somente um único Vh e Vl forem empregados, bivalentes, se dois Vh e Vl forem empregados, ou poliva- lente, se mais de dois Vh e Vl forem empregados. Os anticorpos biespecíficos ou polivalen- tes podem ser gerados os quais especificamente se liguem a CD44 e a outra molécula.

Em outra modalidade, um anticorpo de fusão ou immunoadesína podem ser feitos o

qual compreenda todo ou uma porção de um anticorpo de CD44 da invenção unido a outro polipeptídeo. Em outra modalidade, somente os domínios variáveis do anticorpo de CD44 são unidos ao polipeptídeo. Em outra modalidade, o domínio de Vh de um anticorpo de CD44 é unido a um primeiro polipeptídeo, ao mesmo tempo em que o domínio de Vl de um anticorpo de CD44 é unido a um segundo polipeptídeo que se associa com o primeiro poli- peptídeo de uma maneira tal que os domínios de Vh e Vl possam interagir com outro para 5 formar um sítio de ligação de antígeno. Em outra modalidade preferida, o domínio de Vh é separado do domínio de Vl por um Iigador tal que os domínios de Vh e Vl possam interagir um com o outro. O anticorpo de VH-ligador-VL é em seguida unido ao polipeptídeo de inte- resse. Além disso, anticorpos de fusão podem ser criados nos quais dois (ou mais) anticor- pos de cadeia única estejam unidos um ao outro. Isto é útil se alguém quiser criar um anti- 10 corpo divalente ou polivalente em uma cadeia de polipeptídeo única, ou se alguém quiser criar um anticorpo biespecífico.

Em outras modalidades, outros anticorpos modificados podem ser preparados u- sando anticorpo de CD44 que codifica moléculas de ácido nucléico. Por exemplo, "corpos de capa" (III e outros, (1997) Protein Eng. 10: 949-57), "Minicorpos" (Martin e outros, (1994) 15 EMBO J. 13: 5303-9), "Diacorpos" (Holliger e outros, (1993) Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 90: 6444 - 6448), ou "Janusinas" (Traunecker e outros, (1991) EMBO J. 10:3655-3659 e Trau- necker e outros, (1992) Int. J. Cancer (Suppl.) 7:51-52) podem ser preparados usando técni- cas biológicas moleculares padrão seguindo os ensinos da especificação.

Os anticorpos biespecíficos ou fragmentos de ligação de antígeno podem ser pro- 20 duzidos por uma variedade de métodos incluindo fusão de hibridomas ou união dos frag- mentos de Fab. Veja, por exemplo, Songsivilai & Lachmann, (1990) Clin. Exp. Immunol. 79:315-321, Kostelny e outros, (1992) J. Immunol. 148:1547-1553. Além disso, anticorpos biespecíficos pode ser formados como "diacorpos" ou "Janusinas". Em algumas modalida- des, o anticorpo biespecífico se liga a dois epítopos diferentes de CD44. Em algumas mo- 25 dalidades, os anticorpos modificados descritos acima são preparados usando um ou mais dos domínios variáveis ou regiões de CDR a partir de um anticorpo de CD44 humano forne- cido aqui.

Vetores e Células Hospedeiras

Para expressar os anticorpos e porções de ligação de antígeno da invenção, os 30 DNAs que codificam cadeias leves e pesadas parciais ou de tamanho natural, obtidas como descrito aqui, são inseridos em vetores de expressão tal que os genes sejam operativamen- te unidos às seqüências de controle transcricional e translacional. Neste contexto, o termo "operativamente unido" é pretendido significar que um gene de anticorpo é ligado em um vetor tal que as seqüências de controle transcricionais e translacionais dentro do vetor sir- 35 vam a sua pretendida função de regular a transcrição e translação do gene de anticorpo. O vetor de expressão e as seqüências de controle de expressão são escolhidos serem compa- tíveis com a célula hospedeira de expressão utilizada. Por exemplo, os vetores de expres- são incluem plasmídeos, retrovírus, adenovírus, vírus adeno-associados (AAV)1 vírus de planta tal como vírus em mosaico da couve-flor, vírus em mosaico de tabaco, cosmídeos, YACsI, epissomas derivados de EBV. O gene de anticorpo é ligado em um vetor tal que as seqüências de controle transcricional e translacional dentro do vetor sirvam a sua função 5 pretendida de regular a transcrição e translação do gene de anticorpo. O vetor de expres- são e as seqüências de controle de expressão são escolhidos por serem compatíveis com a célula hospedeira de expressão utilizada. O gene de cadeia leve de anticorpo e o gene de cadeia pesada de anticorpo podem ser inseridos em vetores separados. Em uma modalida- de preferida, ambos os genes são inseridos no mesmo vetor de expressão. Os genes de 10 anticorpo são inseridos no vetor de expressão através de métodos padrões (por exemplo, ligação de sítios de restrição complementares no fragmento e vetor de gene de anticorpo, ou ligação de extremidade cega se nenhum sítio de restrição estiver presente).

Um vetor conveniente é um que codifica uma seqüência de imunoglobulina de Ch ou Cl humana funcionalmente completa, com sítios de restrição apropriados criados de for- ma que qualquer seqüência de Vh ou Vl possa ser inserida facilmente e expressada, como descrito acima. Em tais vetores, o entrançamento normalmente ocorre entre o sítio doador de união na região J inserida e o sítio aceitante de união que precede o domínio C humano, e também nas regiões de união que ocorrem dentro dos exons de Ch humanos. A termina- ção de transcrição e a poliadenilação ocorrem em sítios cromossômicos nativos a jusante das regiões de codificação. O vetor de expressão recombinante também pode codificar um peptídeo de sinal que facilite a secreção da cadeia de anticorpo de uma célula hospedeira. O gene de cadeia de anticorpo pode ser clonado no vetor tal que o peptídeo de sinal esteja unido no esqueleto ao terminal de amino da cadeia de imunoglobulinas. O peptídeo de sinal pode ser um peptídeo de sinal de imunoglobulinas ou um peptídeo de sinal heterólogo (isto é, um peptídeo de sinal a partir de uma proteína de não imunoglobulinas).

Além dos genes de cadeia de anticorpo, os vetores de expressão recombinantes da invenção carregam seqüências reguladoras que controlam a expressão dos genes de ca- deia de anticorpo em uma célula hospedeira. Será apreciado por aqueles versados na téc- nica que o desígnio do vetor de expressão, incluindo a seleção de seqüências reguladoras 30 pode depender de tais fatores como a escolha da célula hospedeira a ser transformada, o nível de expressão de proteína desejada, e assim sucessivamente. As seqüências regulado- ras preferidas para expressão de célula hospedeira de mamífero incluem elementos virais que direcionam níveis altos de expressão de proteína em células de mamífero, tal como promotores e/ou realçadores derivados a partir de LTRs retrovirais, citomegalovírus (CMV) 35 (tal como o promotor/realçador de CMV), Vírus Símio 40 (SV40) (tal como o promo- ter/realçador de SV40), adenovírus, (por exemplo, promotor tardio principal de adenovírus (AdMLP)), polioma e promotores de mamífero fortes tal como imunoglobulinas nativas e promotores de actina. Para descrição adicional de elementos reguladores virais, e seqüên- cias destes, veja, por exemplo, Patentes U.S. Nos. 5.168.062, 4.510.245 e 4.968.615. Os métodos para expressar anticorpos em plantas, incluindo uma descrição de promotores e vetores, bem como transformação de plantas, são conhecidos na arte. Veja, por exemplo, 5 Patente U.S. No. 6.517.529. Os métodos para expressar polipeptídeos em células bacteria- nas ou células fúngicas, por exemplo, células de levedura, são também bem conhecidos na arte.

Além dos genes de cadeia de anticorpo e seqüências reguladoras, os vetores de expressão recombinantes da invenção podem carregar seqüências adicionais, tal como se- 10 qüências que regulam a replicação do vetor em células hospedeiras (por exemplo, origens de replicação) e genes marcadores selecionáveis. O gene marcador selecionável facilita a seleção de células hospedeira nas quais o vetor foi introduzido (veja, por exemplo, Patentes U.S. Nos. 4.399.216, 4.634.665 e 5.179.017). Por exemplo, tipicamente o gene de marcador selecionável confere resistência aos fármacos, tal como G418, higromicina ou metotrexato, 15 em uma célula hospedeira na qual o vetor foi introduzido. Os genes marca dores selecioná- véis preferidos incluem o gene de diidrofolato reductase (DHFR) (para uso em células de hospedeiras de dhfr com seleção/amplificação de metotrexato), o gene de neomicna fosfo- transferase (para seleção de G418), e o gene de glutamato sintetase.

As moléculas de ácido nucléico que codificam anticorpos de CD44 e vetores que compreendem estes moléculas de ácido nucléico podem ser utilizadas para transfecção de uma célula hospedeira de mamífero, planta, bacteriana ou de levedura adequada. A trans- formação pode ser por qualquer método conhecido para introduzir polinucleotídeos em uma célula hospedeira. Os métodos para introdução de polinucleotídeos heterólogos em células de mamífero são bem conhecidos na arte e incluem transfecção mediada por dextrana, pre- cipitação de fosfato de cálcio, transfecção mediada por polibreno, fusão de protoplasto, elec- troporação, encapsulação do polinucleotídeos(s) em lipossomas, e microinjeção direta do DNA nos núcleos. Além disso, as moléculas de ácido nucléico podem ser introduzidas em células de mamífero através de vetores virais. Os métodos de transformação de células são bem conhecidos na arte. Veja, por exemplo, Patentes U.S. Nos. 4.399.216, 4.912.040, 4.740.461, e 4.959.455. Os métodos de transformar células de planta são bem conhecidos na arte, incluindo, por exemplo, transformação mediada por Agrobacterium, transformação biolística, injeção direta, eletroporação e transformação viral. Os métodos de transformar células bacterianas e de levedura também são bem conhecidos na arte.

As linhagens de célula de mamífero disponíveis como hospedeiras para expressão são bem conhecidas na técnica e incluem muitas linhagens de célula imortalizadas disponí- veis a partir da Coleção de Cultura de Tipo Americana (ATCC). Por exemplo, estes incluem células ovário de hamster chinês (CHO), células de NSO, células de SP2, células de HEK- 293Τ, células de NIH-3T3, células de HeLa1 células de rim de hamster (BHK)1 células de rim de macaco verdes africano (COS), células de carcinoma hepatocelular humano (por exem- plo, Hep G2), células de A549, e várias outras linhagens de célula. As linhagens de célula de preferência particular são selecionadas através de determinação de quais linhagens de 5 célula têm níveis de expressão altos. Outras linhagens de célula que podem ser utilizadas são linhagem celular de inseto, tal como células de Sf9 ou Sf21. Quando vetores de ex- pressão recombinantes que codificam genes de anticorpo são introduzidos em células hos- pedeiras de mamífero, os anticorpos são produzidos cultivando-se as células hospedeiras durante um período de tempo suficiente para permitir a expressão do anticorpo nas células 10 hospedeira ou, mais preferivelmente, secreção do anticorpo no meio de cultura no qual as células hospedeiras são desenvolvidas. Os anticorpos podem ser recuperados a partir do meio de cultura usando métodos de purificação de proteína padrões. As células hospedei- ras de planta incluem, por exemplo, Nicotiana, Arabidopsis1 duckweed, milho, trigo, batata, e assim por diante. As células hospedeiras bacterianas incluem E. coli e espécies de Strep- 15 tomyces. As células hospedeiras de levedura incluem espécies de Schizosaccharomyces pombe, Saccharomyees eerevisiae e Piehia pastoris.

Além disso, a expressão de anticorpos da invenção a partir de linhagens de célula de produção pode ser aumentada usando várias técnicas conhecidas. Por exemplo, a glu- tamina sintetase (o sistema de GS) e sistemas de expressão de gene de DHFR são aborda- 20 gens comuns por aumentar a expressão sob certas condições. Os clones de célula de ex- pressão elevada podem ser identificados usando técnicas convencionais, tal como clona- gem por diluição limitada e tecnologia de Microdrop. O sistema de GS é descrito nas Paten- tes Européias Nos. EP 0 216 846, EP 0 256 055, EP 0 323 997 e EP 0 338 841.

É provável que os anticorpos expressos através de linhagens de célula diferentes ou em animais transgênicos tenham glicosilação diferente de outro. Porém, todos os anti- corpos codificados pelas moléculas de ácido nucléico fornecidas nisto, ou compreendendo as seqüências de aminoácido fornecidas nisto são parte da presente invenção, independen- te da glicosilação dos anticorpos.

Bibliotecas de Exibição de Faqo A invenção fornece um método para produzir um anticorpo anti-CD44 ou porção de

ligação de antígeno do mesmo que compreende as etapas de sintetizar uma biblioteca de anticorpos humanos em fago, avaliar a biblioteca com CD44 ou uma porção do mesmo, iso- lar o fago que liga CD44, e obter o anticorpo a partir do fago. Por via de exemplo, um méto- do para preparar a biblioteca de anticorpos para uso em técnicas de exibição de fago com- 35 preende as etapas de imunizar um animal não humano que compreende Iocos de imunoglo- bulinas humanas com CD44 ou uma porção antigênica do mesmo para criar uma resposta imune, extraindo células de produção de anticorpos a partir do animal imunizado; isolando RNA que codifica cadeias pesadas e leves de anticorpos da invenção a partir das células extraídas, transcrevendo de modo reverso o RNA para produzir cDNA, ampliando o cDNA usando iniciadores, e inserindo o cDNA em um vetor de exibição de fago tal que os anticor- pos sejam expressados no fago. Os anticorpos anti-CD44 recombinantes da invenção po- dem ser obtidos deste modo.

Os anticorpos humanos anti-CD44 recombinantes da invenção podem ser isolados avaliando-se uma biblioteca de anticorpo combinatório recombinante. Preferivelmente a bi- blioteca é uma biblioteca de exibição de fago de scFv, gerada usando cDNAs de Vl e Vh humano preparados a partir de mRNA isolado a partir de células B. Os métodos para prepa- 10 rar e avaliar tais bibliotecas são conhecidos na arte. Os kits para gerar bibliotecas de exibi- ção de fago estão comercialmente disponíveis (por exemplo, Pharmacia Recombinant Pha- ge Antibody System, catálogo no. 27-9400-01; e o kit de exibição de fago Stratagene Surf- ZAP™, catálogo no. 240612). Também há outros métodos e reagentes que podem ser usa- dos na geração e avaliação de bibliotecas de exibição de anticorpo (veja, por exemplo, Pa- 15 tente U.S. No. 5.223.409; Publicação PCT Nos. WO 92/18619, WO 91/17271, WO 92/20791, WO 92/15679, WO 93/01288, WO 92/01047, e WO 92/09690; Fuchs e outros

(1991) Bio/Technology 9:1370-1372; Hay e outros, (1992) Hum. Antibod. Hibridomas 3:81- 85; Huse e outros (1989) Science 246:1275-1281; McCafferty e outros, (1990) Nature 348:552-554; Griffiths e outros, (1993) EMBO J. 12:725-734; Hawkins e outros, (1992) J.

Mol. Biol. 226:889-896; Clackson e outros, (1991) Nature 352:624-628; Grama e outros,

(1992) Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 89:3576-3580; Garrad e outros, (1991) Bio/Technology 9:1373-1377; Hoogenboom e outros, (1991) Nuc. Acid Res. 19:4133-4137; e Barbas e ou- tros, (1991) Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 88:7978-7982.

Em uma modalidade para isoíar e produzir anticorpos anti-CD44 humanos com as 25 características desejadas, um anticorpo anti-CD44 humano como descrito aqui é primeiro usado para selecionar as seqüências de cadeia pesada e leve humanas tendo atividade de ligação similar a CD44, usando os métodos de impressão de epítopo descritos na Publica- ção PCT No. WO 93/06213. As bibliotecas de anticorpo utilizadas neste método são prefe- rivelmente bibliotecas de scFv preparadas e avaliadas como descrito na Publicação de PCT 30 No. WO 92/01047, McCafferty e outros, Nature 348:552-554 (1990); e Griffiths e outros, EMBO J. 12:725-734 (1993). As bibliotecas de anticorpo de scFv preferivelmente são avali- adas usando CCR2 humano como o antígeno.

Uma vez que domínios de Vl e Vh humanos iniciaisl são selecionados, as experiên- cias de "mistura e compatibilidade" são realizadas nas quais pares diferentes dos segmen- tos de Vh e Vl inicialmente selecionados são avaliados quanto à ligação de CD44 para sele- cionar combinações de pares de Vl/Vh preferidas. Adicionalmente, para também melhorar a qualidade do anticorpo, os segmentos Vl e Vh do par(s) de VL/VH preferido podem ser muta- dos aleatoriamente, preferivelmente dentro da região de CDR3 de Vh e/ou VL, em um pro- cesso análogo ao processo de mutação somática in vivo responsável pela maturação de afinidade de anticorpos durante uma resposta imune natural. Esta maturação de afinidade in vitro pode ser realizada ampliando-se domínios de Vh e Vl usando iniciadores de PCR 5 complementares ao Vh CDR3 ou Vl CDR3, respectivamente, cujos iniciadores foram "refor- çados" com uma mistura aleatória das quatro bases de nucleotídeo em certas posições tal que os produtos de PCR resultantes codifiquem os segmenta Vh e Vl nos quais mutações aleatórias tenham sido introduzidas nas regiões de CDR3de Vh e/ou VL. Estes segmentos de Vl e Vh aleatoriamente mutados podem ser re-avaliados quanto à ligação a CD44.

Seguinte à avaliação e isolamento de um anticorpo anti-CD44 da invenção a partir

de uma biblioteca de exibição de imunoglobulina recombinante, os ácidos nucléicos que codificam o anticorpo selecionado podem ser recuperados da embalagem de exibição (por exemplo, do genoma de fago) e subclonados em outros vetores de expressão por técnicas de DNA recombinantes padrão. Se desejado, o ácido nucléico pode também ser manipula- 15 do para criar outras formas de anticorpo da invenção, como descrito abaixo. Para expressar um anticorpo humano recombinante isolado avaliando-se uma biblioteca combinatória, o DNA que codifica o anticorpo é clonado de em um vetor de expressão recombinante e intro- duzido em uma célula hospedeira de mamífero, como descrito acima.

Anticorpos Desimunizados Em outro aspecto da invenção, os anticorpos ou porções de ligação de antígeno

dos mesmos podem ser desimunizados para reduzir a sua imunogenicidade usando as téc- nicas descritas em, por exemplo, Publicação PCT Nos.: W098/52976 e WOOO/34317.

Anticorpos Derivados e Rotulados

Um anticorpo anti-CD44 ou porção de ligação de antígeno da invenção pode ser derivado ou unido a outra molécula (por exemplo, outro peptídeo ou proteína). Em geral, os anticorpos ou porção de ligação de antígeno dos mesmos são derivados tal que a ligação de CD44 não seja adversamente afetada pela derivação ou rotulação. Consequentemente, os anticorpos e porções de ligação de antígeno da invenção são pretendidos incluir ambas as formas intactas e modificadas dos anticorpos de CD44 humanos descritas aqui. Por exem- pio, um anticorpo ou porção de ligação de antígeno da invenção pode ser unida funcional- mente (através de acoplamento químico, fusão genética, associação não covalente ou de outro modo) a uma ou mais outras entidades moleculares, tal como outro anticorpo (por e- xemplo, um anticorpo biespecífico ou um diacorpo), um agente de detecção, um rótulo, um agente citotóxico, um agente farmacêutico, uma proteína ou peptídeo que possa mediar a associação do anticorpo ou porção de ligação de antígeno com outra molécula (tal como uma região núcleo de estreptavidina ou um rótulo de poliistidina) e/ou uma proteína veículo (por exemplo, proteína de sangue, albumina ou transferrina). Um tipo de anticorpo derivado é produzido por reticulação de dois ou mais anticor- pos (do mesmo tipo ou de tipos diferentes, por exemplo, para criar os anticorpos biespecífi- cos). Os reticuladores adequados incluem aqueles que são heterobifuncionais, tendo dois grupos distintamente reativos separados por um espaçador apropriado (por exemplo, éster 5 de m-maleimidobenzoil-N-hidroxissucinimida) ou homobifuncional (por exemplo, substrato de dissucinimidila). Tais Iigadores são comercialmente disponíveis a partir de Pierce Che- mical Company, Rockford, IL.

Outro tipo de anticorpo derivado é um anticorpo rotulado. Os agentes de detecção úteis com os quais um anticorpo ou porção de ligação de antígeno da invenção pode ser 10 derivado incluem compostos fluorescentes, incluindo, por exemplo, fluoresceína, isotiociana- to de fluoresceína, rodamina, cloreto de 5-dimetilamina-1-naftalenossulfonila, ficoeritrina, fósforos de lantanídeo. Um anticorpo também pode ser rotulado com enzimas que são úteis para detecção, tal como, por exemplo, rábano picante peroxidase, /?-galactosidase, Iucifera- se, fosfatase alcalina, glicose oxidase. Quando um anticorpo é rotulado com uma enzima 15 detectável, é detectada adicionando-se reagentes adicionais que a enzima usa para produzir um produto de reação que pode ser discernido. Por exemplo, quando o rábano picante pe- roxidase do agente está presente a adição de peróxido de hidrogênio e diaminobenzidina leva a um produto de reação colorido que é detectável. Um anticorpo também pode ser ro- tulado com biotina, e detectado através de medição indireta de ligação de avidina ou estrep- 20 tavidina. Um anticorpo também pode ser rotulado com um epítopo de polipeptídeo prede- terminado reconhecido por um repórter secundário (por exemplo, sequencias de par de zí- per de leucina, sítios de ligação para anticorpos secundários, domínios de ligação de metal, rótulos de epítopo). Em algumas modalidades, os rótulos são unidos por braços espaçado- res de vários comprimentos para reduzir o impedimento estérico potencial. Um anticorpo de 25 CD44 também pode ser derivado com um grupo químico tal como polietileno glicol (PEG), um grupo de metila ou etila, ou um grupo de carboidrato. Estes grupos são úteis para me- lhorar as características biológicas do anticorpo, por exemplo, para aumentar a meia vida do soro.

Composições Farmacêuticas e Administração Esta invenção também fornece uma composição farmacêutica para o tratamento de

infiltração de célula anormal em um mamífero, incluindo um humano, compreendendo uma quantidade de um anticorpo de CD44 ou porção de ligação de antígeno do mesmo, como descrito aqui, que seja eficaz no tratamento de infiltração de célula anormal, e um veículo farmaceuticamente aceitável. As composições preferidas proporcionam um benefício tera- 35 pêutico a pacientes com uma das mais de uma variedade de doenças inflamatórias e autoi- munes, tal como artrite reumatóide, Artrite reumatóide Juvenil, aterosclerose, doença granu- lomatosa, esclerose múltipla, asma, Doença de Crohn1 Espondilite Ancilosante, Artrite Pso- riática, Psoríase de Placa e câncer. Os anticorpos e porções de ligação de antígeno da presente invenção podem ser incorporados em composições farmacêuticas adequadas para administração a um paciente como descrito, por exemplo, na publicação PCT WO 2006/096488 e referências citadas a- qui. Tipicamente, a composição farmacêutica compreende um anticorpo ou porção de liga- ção de antígeno da invenção e um veículo farmaceuticamente aceitável adaptado para man- ter a estabilidade, solubilidade e bioatividade da proteína. Como usado aqui, "veículo far- maceuticamente aceitável" significa qualquer e todos os solventes, meios de dispersão, re- vestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes de retardamento de absorção e isotônicos, e similares que sejam fisiologicamente compatíveis. Alguns exemplos de veí- culos farmaceuticamente aceitáveis são salinas, salina tamponada de fosfato, dextrose, gli- cerol, etanol e similares, bem como combinações destes. Em muitos casos, será preferível incluir os agentes isotônicos, por exemplo, açúcares, poliálcoois tais como manitol, sorbitol, ou cloreto de sódio na composição. Os exemplos adicionais de substâncias farmaceutica- mente aceitáveis são agentes umectantes ou quantidades menores de substâncias auxilia- res, tal como agentes umectantes ou emulsificantes, preservativos, tampões incluindo ami- noácidos, e agentes de quelação, por exemplo, EDTA, DTPA, DFM e misturas dos mesmos, que realçam a vida de prateleira ou eficácia do anticorpo. Em uma modalidade, uma com- posição farmacêutica inclui um IgG1 preferivelmente um IgGI ou lgG2, anticorpo monoclonal e um agente de quelação farmaceuticamente aceitável. Uma concentração molar represen- tativa do anticorpo varia de cerca de 0,0006 milimolares a cerca de 1,35 milimolares e a concentração molar do agente de quelação varia de cerca de 0,003 milimolar a cerca de 50 milimolares e a relação molar de anticorpo para agente de quelação varia a partir de cerca de 0,00001 a cerca de 2000.

As composições desta invenção podem estar em uma variedade de formas, por e- xemplo, formas de dosagem líquida, semi-sólida e sólida, tal como soluções líquidas (por exemplo, soluções injetáveis e infusíveis), dispersões ou suspensões, comprimidos, pílulas, pós, Iipossomas e supositórios. A forma preferida depende do modo pretendido de adminis- tração e aplicação terapêutica. As composições preferidas típicas estão na forma de solu- ções injetáveis ou infusíveis, tal como composições similar àquelas usadas para imunização passiva de humanos. O modo preferido de administração é parenteral (por exemplo, intra- venosa, subcutânea, intraperitoneal, intramuscular). Em uma modalidade preferida, o anti- corpo é administrado por infusão ou injeção intravenosa. Em outra modalidade preferida, o anticorpo é administrado através de injeção intramuscular ou subcutânea. As formulações para injeção podem ser apresentadas na forma de dosagem de unidade, por exemplo, em ampolas ou em recipientes de multi-dose, com ou sem um preservativo adicionado. As composições podem tomar tais formas como suspensões, soluções, ou emulsões em veícu- Ios oleosos ou aquosos, e podem conter os agentes formuladores tal como agentes de sus- pensão, estabilizantes e/ou dispersantes. Alternativamente, o ingrediente ativo pode estar na forma de pó para constituição com um veículo adequado, por exemplo, água livre de pi- rogênio estéril, antes do uso.

5 As composições terapêuticas devem ser tipicamente estéreis e estáveis sob as

condições de fabricação e armazenamento. A composição pode ser formulada como uma solução, microemulsão, dispersão, lipossoma, ou outra estrutura ordenada adequada para alta concentração de fármaco. As soluções injetáveis estéreis podem ser preparadas incor- porando-se o anticorpo de CD44 na quantidade exigida em um solvente apropriado com um 10 ou uma combinação de ingredientes enumerados acima, como exigido, seguido por esterili- zação filtrada. Geralmente, as dispersões são preparadas incorporando-se o composto ativo em um veículo estéril que contém um meio de dispersão básico e os outros ingredientes exigidos a partir daqueles enumerados acima. No caso de pós estéreis para a preparação de soluções injetáveis estéreis, os métodos preferidos de preparação são secagem a vácuo 15 e liofilização que produz um pó do ingrediente ativo mais qualquer ingrediente desejado adi- cional de uma solução previamente estéril-filtrada do mesmo. A fluidez apropriada de uma solução pode ser mantida, por exemplo, pelo uso de um revestimento tal como lecitina, pela manutenção do tamanho de partícula exigido no caso de dispersão e pelo uso de tensoati- vos. A absorção prolongada de composições injetáveis pode ser realizada incluindo-se na 20 composição um agente que retarde a absorção, por exemplo, sais de monoestearato e gela- tina.

Os anticorpos ou porções de ligação de antígeno da presente invenção podem ser administrados por uma variedade de métodos conhecidos na arte, embora para muitas apli- cações terapêuticas, a rotina/modo preferido de administração seja infusão subcutânea, in- tramuscular, ou intravenosa. Como será apreciado pelo técnico versado, a rotina e/ou modo de administração variarão, dependendo dos resultados desejados.

Em certas modalidades, as composições de anticorpo da presente invenção podem ser preparadas com um veículo que protegerá o anticorpo contra liberação rápida, tal como uma formulação de liberação controlada, incluindo implantes, emplastros transdérmicos, e 30 sistemas de liberação microencapsulados. Os polímeros biodegradáveis, biocompatíveis podem ser usados, tal como acetato de vinil etileno, polianidridos, ácido poliglicólico, colá- geno, poliortoésteres, e ácido polilático. Muitos métodos para a preparação de tais formula- ções geralmente são conhecidos por aqueles versados na técnica. Veja, por exemplo, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems J. R. Robinson, ed., Marcel 35 Dekker, Inc., Nova Iorque, 1978.

Compostos ativos adicionais também podem ser incorporados nas composições.

Em certas modalidades, um anticorpo de CD44 inibidor da invenção é co- formulado com e/ou co-administrado com um ou mais agentes terapêuticos adicionais. Es- tes agentes incluem, sem limitação, anticorpos que ligam outros alvos, agentes anti-tumor, agentes anti-angiogênese, inibidores de transdução notáveis, agentes anti-proliferativos, agentes quimioterapêuticos, ou análogos de peptídeo que inibem CD44. Tais terapias de 5 combinação podem requerer dosagens mais baixas do anticorpo de CD44 inibidor bem co- mo os agentes co-administrados, desse modo evitando possíveis toxicidades ou complica- ções associadas com as várias monoterapias.

Os compostos presentes também podem ser usados em co-terapias (pré- tratamento, pós-tratamento ou tratamento simultâneo), parcialmente ou completamente, a- 10 lém de outro antiinflamatórios ou DMARDS, incluindo, porém não limitado a ciclosporina, ácido zoledrônico, efalizumabe, alefacepte, etodolaco, lornoxicam, OM-89, valdecoxibe, toci- lizumabe, abatacepte, meloxicam, etanercepte, nambumetona, rimexolona, 153Sm-EDTMP, prosorba, salicilato de imidazol, oprelvecina, ácido hilaurônico, naproxeno, piroxicam, díace- reína, lumericoxibe, rofecoxibe tacrolimus, aceclofenaco, actarite, tenoxicam, rosiglitazona, 15 deflazacorte, adalimumabe, leflunomida, risedronato sódico, misoprostol e diclofenaco, SK- 1306X, infliximabe, anacinra, celecoxibe, diclofenaco, etoricoxibe e felbinaco, reumacona, golimumabe, denosumabe, ofatumumabe, anticorpo 10rT1, pelubiprofeno, licofelona, temsi- rolimus, eculizumabe, iguratimode, acetato de metilprednisolona, ibuprofeno, triancinolona acetonida, nabumetona, oxaprozina, hcl de oxicodona, fentanil, sulindaco, piridoxina, aceta- 20 minofeno, alendronato, indometacina, glicosamina, olopatadina, omeprazol, Azatioprina, Sulfasalazina, Hidroxicloroquina, Ciclosporina e prednisona. Outros antiinflamatórios ade- quados incluem aqueles designados por número de código da companhia tal como 480156S, AA861, AD1590, AFP802, AFP860, AI77B, AP504, AU8001, BPPC, BW540C, CHINOIN 127, CN100, EB382, EL508, F1044, FK-506, GV3658, ITF 182, KCNTEI6090, 25 KME4, LA2851, MR714, MR897, MY309, ON03144, PR823, PV102, PV108, R830, RS2131, SCR152, SH440, SIR133, SPAS510, SQ27239, ST281, SY6001, TA60, TAI-901 (ácido 4- benzoil-1 -indancarboxílico), TVX2706, U60257, UR2301 e WY41770, CP - 481715, ABN- 912, MLN-3897, HuMax-IL-15, RA-1, paclitaxel, Org-37663, Org 39141, AED-9056, AMG- 108, fontolizumabe, pegsunercepte, pralnacasana, apilimode, GW - 274150, A-001, 681323 30 (GSK) K-832, R-1503, ocrelizumabe, DE-096, Cpn10, THC+CBD (GW Pharma), 856553 (GSK), ReN-1869, imunoglobulinas, mm-093, amelubante, SCIO-469, ABT-874, LenkoVAX, LY-2127399, TRU-015, KC-706, amoxapinete e dipiridamol, TAK-715, PG 760564, VX-702, prednisolona e dipiridamol, PMX-53, belimumabe, prinaberel, CF-101, tgAAV-TNFR:Fc, R- 788, prednisolona e SSRI, CP-690550 e PMI-001.

Em outra modalidade, os agentes terapêuticos adicionais incluem os agentes bioló-

gicos. Em uma modalidade adicional, um ou mais agentes biológicos são selecionados a partir de um antagonista do fator-alfa de necrose de tumor (TNF-σ), um antagonista da inter- Ieucina-Ialfa (IL-Ισ), um antagonista CD28 e um antagonista de CD20. Em ainda uma mo- dalidade adicional, um ou mais agentes biológicos são selecionados a partir do grupo que consiste em etanercepte (ENBREL™), adalimumabe (HUMIRA™), infliximabe (REMICADE™), anacinra (KINERET™), abatacepte (ORENCIA™), rituximabe (RITUXAN™) e certolizumabe pegol (CIMZIA™).

Os exemplos de outro farmaceuticamente agentes ativos que podem ser emprega- dos em combinação com compostos de fórmula (eu) e os seus sais e solvatos para terapia de artrite reumatóide incluem: imunossupressores tal como antolmetina guacil, mizoribina e rimexolona; anti-TNF. alfa, agentes tais como etanercepte, infliximabe, diacereína; inibidores de tirosina cinase tal como leflunomida; os antagonistas de calicreína tal como subreum; agonistas de interleucina 11 tal como oprelvecina; agonistas de beta interferona 1; agonistas de ácido hialurônico tal como NRD-101 (Aventis); antagonistas de receptor de interleucina 1 tal como anacinra; os antagonistas de CD8 tal como cloridrato de amiprilose; os antagonis- tas de proteína precursora beta amilóide tal como reumacona; inibidores de metaloprotease matriz tal como cipemastate e outros fármacos antirreumatóides de modificação de doença (DMARDs) tais como metotrexato, sulfassalazina, ciclosporina A, hidroxicloroquina, aurano- fina, aurotiogiucose, ouro thiomalate de sódio e penicilamine.

As composições da invenção podem incluir uma "quantidade terapeuticamente efi- caz" ou uma "quantidade profilaticamente eficaz" de um anticorpo ou porção de ligação de antígeno da invenção. Uma "quantidade terapeuticamente eficaz" refere-se a uma quantida- de eficaz, em dosagens e durante períodos de tempo necessário, alcançar o resultado tera- pêutico desejado. Uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo ou porção de liga- ção de antígeno pode variar de acordo com fatores tal como o estado de doença, idade, sexo, e peso do indivíduo, e a capacidade do anticorpo ou porção de anticorpo para extrair uma resposta desejada no indivíduo. Uma quantidade terapeuticamente eficaz também é um no qual qualquer efeito tóxico ou prejudicial do anticorpo ou porção de ligação de antí- geno é excedido em valor pelos efeitos terapeuticamente benéficos. Uma "quantidade profi- laticamente eficaz" se recorre a uma quantidade eficaz, a dosagens e durante períodos de tempo necessário, alcançar o resultado profilático desejado. Tipicamente, desde que uma dose profilática é empregada em indivíduos antes de ou em um estágio mais cedo de doen- ça, o profilaticamente quantidade eficaz pode ser menos que a quantidade terapeuticamente eficaz.

Os regimes de dosagem podem ser ajustados para fornecer a resposta desejada ó- tima (por exemplo, uma resposta terapêutica ou profilática). Por exemplo, um único bolo pode ser administrado, podem ser administradas várias doses divididas com o passar do tempo ou a dose pode seja proporcionalmente reduzido ou aumentado como indicado pelas exigências da situação terapêutica. É especialmente vantajoso para formular composições de parenteral em forma de unidade de dosagem para facilidade de administração e unifor- midade de dosagem. Forma de unidade de dosagem como usado nisto recorre a unidades fisicamente discretas servidas como dosagens unitárias para os indivíduos mamíferos a ser tratados; cada unidade que contém uma quantidade predeterminada de composto ativo cal- 5 culou para produzir o efeito terapêutico desejado em associação com o veículo farmacêutico exigido. A especificação para a unidade de dosagem forma da invenção é ditado por e dire- tamente dependente em (um) as características sem igual do anticorpo de CD44 ou porção de ligação de antígeno do mesmo e o particular efeito terapêutico ou profiláctico ser alcan- çado, e (b) as limitações inerente na técnica de compor um tal anticorpo para o tratamento 10 de sensibilidade em indivíduos.

Uma faixa não Iimitante exemplar, para uma quantidade terapeuticamente ou profi- laticamente eficaz de um anticorpo ou porção de anticorpo da invenção é 0,025 a 50 mg/kg, mais preferivelmente 0,1 a 50 mg/kg, mais preferivelmente 0,1-25, 0,1 a 10 ou 0,1 a 3 mg/kg. Em uma modalidade, o anticorpo ou porção de anticorpo da invenção é administra- 15 do em uma formulação como uma solução aquosa estéril tendo um pH que varia a partir de aproximadamente 5.0 a aproximadamente 6.5 e compreendendo a partir de aproximada- mente 1 mg/ml a aproximadamente 200 mg/ml de anticorpo, a partir de aproximadamente 1 mílimolar a aproximadamente 100 milimolar de, por exemplo, histidina, acetato, ou tampão de sucinato, a partir de aproximadamente 0.01 mg/ml a aproximadamente 10 mg/ml de po- 20 Iissorbato 80, a partir de aproximadamente 100 milimolar a aproximadamente 400 milimolar de trealose, e a partir de aproximadamente 0.01 milimolar a aproximadamente 1.0 milimolar de diidrato de dissódio de EDTA. As composições da presente invenção podem compreen- der um farmaceuticamente opcionalmente antioxidante aceitável e/ou agente de quelação. Antioxidantes adequados incluem, porém não limitado a, metionina, tiossulfato de sódio, 25 catalase, e platina. Por exemplo, a composição pode conter metionina em uma concentra- ção que varia a partir de 1 mM a aproximadamente 100 mM, e em particular, é aproximada- mente 27 mm. Isto será notado que valores de dosagem podem variar com o tipo e severi- dade da condição ser aliviado. É ser entendido mais adiante que para qualquer indivíduo particular, deveriam ser ajustados regimes de dosagem específicos com o passar do tempo 30 de acordo com a necessidade individual e o julgamento profissional de alguém que adminis- tra ou supervisiona a administração das composições, e essas faixas de dosagem fixadas aqui são apenas exemplares e não são pretendidas limitar o escopo ou prática da composi- ção reivindicada.

Outro aspecto da presente invenção fornece equipamentos que compreendem um anticorpo de CD44 ou porção de ligação de antígeno da invenção ou uma composição que compreendem tal um anticorpo ou porção de ligação de antígeno. Um kit pode incluir, além do anticorpo ou composição, diagnóstico ou agentes terapêuticos. Um kit também pode in- cluir instruções para uso em um método diagnóstico ou terapêutico. Em uma modalidade preferida, o kit inclui o anticorpo ou uma composição que compreende isto e um agente di- agnóstico que podem ser usados em um método descrito abaixo. Em outro modalidade pre- ferida, o kit inclui o anticorpo ou uma composição que compreende isto e um ou agentes 5 mais terapêuticos que podem ser usados em um método descrito abaixo.

Métodos diagnósticos de uso

Em outro aspecto, a invenção fornece em vivo e in vitro métodos diagnósticos. Os anticorpos anti-CD44 podem ser usados para detectar CD44 em uma amostra biológica in vitro ou em vivo. Em uma modalidade, a invenção fornece um método para diagnosticar a 10 presença ou local de uma células De expressão de CD44 do mesmo em um indivíduo em necessidade, enquanto compreendendo as etapas de injetar o anticorpo no indivíduo, de- terminando a expressão de CD44 no indivíduo localizando onde o anticorpo ligou-se, en- quanto comparando a expressão no indivíduo com isso de um indivíduo de referência nor- mal ou padrão, e diagnosticando a presença ou local das células. Os anticorpos anti-CD44 15 também podem ser usados como um marcador para inflamação e/ou para a infiltração de células imunes, tal como monócitos e células de T, em um tecido.

Os anticorpos anti-CD44 podem ser usados em um imunoensaio convencional, in- cluindo, sem limitação, um ELISA, um RIA, citometria de fluxo, imunoistoquímica de tecido, um manchamento do oeste ou uma imunoprecipitação. Os anticorpos anti-CD44 da inven- 20 ção podem ser usados para detectar CD44 a partir de humanos. Em outra modalidade, os anticorpos anti-CD44 podem ser usados para detectar CD44 a partir de macacos de cino- molgo ou macacos reso.

A invenção fornece um método para detectar CD44 em uma uma amostra biológica compreendendo contatar a amostra biológica com um anticorpo anti-CD44 da invenção e 25 descobrindo o anticorpo encadernado. Em uma modalidade, o anticorpo anti-CD44 está di- retamente rotulado com um rótulo detectável. Em outra modalidade, o anticorpo anti-CD44 (o primeiro anticorpo) é sem etiqueta e um segundo anticorpo ou outra molécula que podem ligar o anticorpo anti-CD44 estão rotuladas. Como é conhecido bem a um de capacidade na técnica, um segundo anticorpo é escolhido que pode especificamente ligar as espécies par- 30 ticulares e classe do primeiro anticorpo. Por exemplo, se o anticorpo anti-CD44 for um IgG humano, em seguida o anticorpo secundário poderia ser um anti-humano-lgG. Outras molé- culas que podem ligar a anticorpos incluem, sem limitação, Proteína A e Proteína G ambos das quais são comercialmente disponíveis, por exemplo, de Pierce Chemical Company.

Em outra modalidade, CD44 pode ser analisado em uma amostra biológica por um imunoensaio de competição que utiliza padrões de CD44 rotulado com uma substância de- tectável e um anticorpo anti-CD44 sem etiqueta. Neste ensaio, são combinados a amostra biológica, os padrões de CD44 rotulados e o anticorpo anti-CD44 e a quantidade de CD44 rotulado salto padrão para o anticorpo sem etiqueta é determinado. A quantidade de CD44 na amostra biológica é inversamente proporcional à quantidade de CD44 rotulado salto pa- drão para o anticorpo anti-CD44.

Alguém pode usar os imunoensaios descritos no pedido para vários propósitos. Por 5 exemplo, os anticorpos anti-CD44 podem ser usados para detectar CD44 em células cultas. Em uma modalidade, os anticorpos anti-CD44 são usados para determinar a quantidade de CD44 na superfície de células que foram tratadas com vários compostos. Este método pode ser usado para identificar compostos que modulam CD44 proteína níveis. De acordo com este método, uma amostra de células é tratada com um composto teste durante um período 10 de tempo enquanto outra amostra for esquerda sem tratar. Se a expressão de CD44 total será medida, as células são Iisadas e a expressão de CD44 total é usando medido um dos imunoensaios descritos acima. A expressão de CD44 total nas células tratadas versus não tratadas é comparada para determinar o efeito do composto teste.

Um imunoensaio preferido por medir expressão de CD44 total é citometria de fluxo 15 ou imunoistoquímica. Se a expressão de CD44 de superfície de célula for, as células não são lisadas, e os níveis de superfície de célula de CD44 são medidos usando um dos imu- noensaios descritos acima. Um imunoensaio preferido para determinar níveis de superfície de célula de CD44 inclui as etapas de rotular as proteínas de superfície de célula com um rótulo detectável, tal como biotina ou 1251, imunoprecipitar o CD44 com um anticorpo anti- 20 CD44 e em seguida detectar o CD44 rotulado.

Outro imunoensaio preferido para determinar a localização de CD44, por exemplo, níveis de superfície celular, é usar a imunoistoquímica. Um imunoensaio preferido para de- tectar níveis de superfície de célula de CD44 inclui liganção de um anticorpo anti-CD44 rotu- lado com um fluoróforo apropriado, tal como fluoresceína ou ficoeritrina, e detectar o anti- 25 corpo primário usando citometria de fluxo. Em outra modalidade, o anticorpo anti-CD44 é não rotulado e um segundo anticorpo ou outra molécula que pode ligar o anticorpo anti- CD44 é rotulada. Métodos tais como ELISA, RIA, citometria de fluxo, manchamento do oes- te, imunoistoquímica, rotulagem de superfície celular de proteínas de membrana integrais e imunoprecipitação são bem conhecidos na técnica (veja, por exemplo, Harlow e Lane, su- 30 pra). Além disso, os imunoensaios podem ser aumentados quanto a avaliação de alta produ- tividade para testar um número grande de compostos para ativação ou inibição de CD44.

Os anticorpos anti-CD44 da invenção podem da mesma forma ser usados para de- terminar os níveis de CD44 em um tecido ou em células derivadas a partir do tecido. Em algumas modalidades, o tecido é um tecido doente. Em algumas modalidades, o tecido é 35 uma biópsia de tecido. Em algumas modalidades do método, um tecido ou uma biópsia é cortada do mesmo a partir de um paciente. O tecido ou biópsia é em seguida empregado em um imunoensaio para determinar, por exemplo, expressão de CD44 total, níveis de superfí- cie celular de CD44 ou localização de CD44 pelos métodos discutidos acima. Tais métodos podem ser usados para determinar se um tecido expressa níveis altos de CD44 que poderi- am ser indicativos que o tecido é um alvo para tratamento com anticorpo anti-CD44.

Os anticorpos da presente invenção podem da mesma forma ser usados in vivo pa- ra identificar tecidos e órgãos que expressam CD44. Em algumas modalidades, os anticor- pos anti-CD44 são usados para identificar células de expressão de CD44. Uma vantagem de usar os anticorpos anti-CD44 humanos da presente invenção é que eles podem ser usa- dos seguramente in vivo sem eliciar uma resposta imune significativa ao anticorpo na admi- nistração, ao contrário de anticorpos de origem não humana ou com anticorpos humaniza- dos ou quiméricos.

O método compreende as etapas de administrar um anticorpo anti-CD44 detecta- velmente rotulado ou uma composição os compreendendo a um paciente em necessidade de um tal teste diagnóstico e submetendo o paciente à análise de imageamento para deter- minar o local dos tecidos de expressão de CD44. Análise de imageamento é bem conhecida na técnica médica, e inclui, sem limitação, análise de radiografia, imageamento de resso- nância magnética (MRl) ou tomografia computadorizada (CT). O anticorpo pode ser rotulado com qualquer agente adequado para imageamento in vivo, por exemplo um agente de con- traste, tal como bário que pode ser usado para análise de radiografia ou agente de contraste magnético, tal como um

Gadolínio quelato que pode ser usado para MRI ou CT. Outros agentes de rotula- gem incluem, sem limitação, radioisótopos, tal como "Tc. Em outra modalidade, o anticorpo anti-CD44 será não rotulado e será imageado administrando-se um segundo anticorpo ou outra molécula que é detectável e pode ligar o anticorpo anti-CD44. Em modalidade, uma biópsia é obtida a partir do paciente para determinar se o tecido expressa o CD44 interesse.

Em uma modalidade, o anti-CD44 detectavelmente rotulado compreende um fluoró-

foro.

Em ainda uma modalidade adicional, os anticorpos anti-CD44 da presente invenção podem da mesma forma ser usados para determinar a redução na expressão de superfície celular de CD44 em células. Em uma modalidade preferida, as células são linfócitos e mo- nócitos.

Métodos Terapêuticos de Uso

Em outra modalidade, a invenção fornece um método para inibir atividade de CD44 administrando um anticorpo de CD44 do mesmo a um paciente em necessidade. Quaisquer dos anticorpos ou porções de ligação de antígeno do mesmo descrito aqui pode ser usado terapeuticamente. Em uma modalidade, o anticorpo de CD44 é um anticorpo quimérico ou humanizado. Em uma modalidade preferida, o CD44 é humano e o paciente é um paciente humano. Alternativamente, o paciente pode ser um mamífero, por exemplo, um macaco, que expressa um CD44 cujo anticorpo de CD44 reage cruzado com ele. O anticorpo pode ser administrado a um CD44 de expressão de mamífero não humano como um modelo animal de doença humana. Tais modelos animais podem ser úteis para avaliar a eficácia terapêuti- ca de anticorpos desta invenção.

Em outra modalidade, um anticorpo de CD44 ou porção de anticorpo do mesmo pode ser administrado a um paciente que expressa inadequadamente níveis altos de CD44. O anticorpo pode ser administrado uma vez, porém mais preferivelmente é administrado múltiplas vezes por eficácia ideal. O anticorpo pode ser administrado de três vezes diaria- mente a uma vez a cada seis meses ou muito mais tempo. A administração pode ser em um horário tal como três vezes, duas vezes diariamente, uma vez diariamente, uma vez a cada dois dias, uma vez a cada três dias, uma vez semanalmente, uma vez cada duas semanas, uma vez todos os meses, uma vez cada dois meses, uma vez cada três meses e uma vez cada seis meses. O anticorpo também pode ser administrado continuamente por uma mini- bomba. O anticorpo pode ser administrado por uma rotina mucosal, bucal, intranasal, inalá- vel, intravenosa, subcutânea, intramuscular, parenteral, ou intratumor. O anticorpo pode ser administrado uma vez, pelo menos duas vezes ou durante pelo menos o período de tempo até que a condição seja tratada, aliviada ou curada. O anticorpo geralmente será adminis- trado contanto que a condição esteja presente. O anticorpo geralmente será administrado como parte de uma composição farmacêutica como supra descrito. A dosagem de anticorpo geralmente estará na faixa de 0,1 a 100 mg/kg, mais preferivelmente 0,5 a 50 mg/kg, mais preferivelmente 1 a 20 mg/kg, e ainda mais preferivelmente 1 a 10 mg/kg. A concentração de soro do anticorpo pode ser medida por qualquer método conhecido na técnica.

Esta invenção também fornece um método para o tratamento de infiltração de célu- la anormal em um mamífero, incluindo um humano, compreendendo administrar ao referido mamífero uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo de CD44 ou porção de ligação de antígeno, como descrito aqui, que é eficaz no tratamento de infiltração de célula anormal.

Terapia de gene

As moléculas de ácido nucléico que codificam os anticorpos e porções de anticorpo do mesmo da presente invenção podem ser administradas a um paciente em necessidade de terapia de gene. A terapia pode ser in vivo ou ex vivo. Em uma modalidade preferida, moléculas de ácido nucléico que codificam uma cadeia pesada e uma cadeia leve é admi- nistrada a um paciente. Em uma modalidade mais preferida, as moléculas de ácido nucléico são administradas tal que elas são estavelmente integradas em cromossomas de células B porque estas células são especializadas para produzir anticorpos. Em uma modalidade pre- ferida, células B precursoras são transfectadas ou infectadas e re-transplantadas em um paciente em necessidade do mesmo. Em outra modalidade, células B precursoras ou outras células são infetadas em vivo usando um vírus conhecido para infectar o tipo de célula de interesse. Vetores típicos usados para terapia de gene incluem lipossomas, plasmídeos, e vetores virais. Vetores virais exemplares são retrovírus, adenovírus e vírus adeno- associados. Depois da infecção in vivo ou ex vivo, níveis de expressão de anticorpo podem 5 ser monitorados retirando uma amostra do paciente tratado e usando qualquer imunoensaio conhecido na arte ou descrito aqui.

Em uma modalidade preferida, o método de terapia de gene compreende as etapas de administrar uma molécula de ácido nucléico isolada codificando a cadeia pesada ou uma porção de ligação de antígeno do mesmo de um anticorpo de CD44 e expressar a molécula de ácido nucléico. Em outra modalidade, o método de terapia de gene compreende as eta- pas de administrar uma molécula de ácido nucléico isolada que codifica a cadeia leve ou uma porção de ligação de antígeno do mesmo de um anticorpo de CD44 e expressar a mo- lécula de ácido nucléico. Em um método mais preferido, o método de terapia de gene com- preende as etapas de administrar uma molécula de ácido nucléico isolada que codifica a cadeia pesada ou uma porção de ligação de antígeno do mesmo e uma molécula de ácido nucléico isolada codificando a cadeia leve ou a porção de ligação de antígeno do mesmo de um anticorpo de CD44 da invenção e expressar as moléculas de ácido nucléico. O método de terapia de gene também pode compreender a etapa de administrar outro agente terapêu- tico, tal como quaisquer dos agentes discutidos no presente pedido com relação à terapia de combinação.

Para que esta invenção possa ser entendida ainda melhor, os exemplos seguintes são mencionados. Estes exemplos são apenas para propósitos de ilustração e não serão interpretados como Iimitantes do escopo da invenção de qualquer maneira.

EXEMPLOS

Nos exemplos seguintes e preparações, "BSA" quer dizer albumina de soro bovino;

“EDTA" quer dizer ácido etilenodiaminotetraacético; “DMSO" quer dizer "sulfóxido de dimeti- la; “MOPS" significa ácido propanossulfônico 3-(N-morfolino); “MES" quer dizer ácido de 2- (N -Morfolino)etanossulfônico; “PBS" quer dizer solução salina tamponada de fosfato; “dPBS" significa solução salina tamponada de fosfato de Dulbecco; ΉΕΜΑ" quer dizer me- 30 tacrilato de 2-hidróxi-etila; “DMEM" quer dizer meio de Eagle Modificado de Dulbecco; “FBS" quer dizer soro bovino fetal; “NEAA" quer dizer aminoácidos dispensáveis; “HEPES" quer dizer ácido de N-2 -hidroxietilpiperazina-N'-2-etanossulfônico; e "DMF" quer dizer dimetil formamida.

EXEMPLO 1

Geração de Hibridomas de Produção de Anticorpo Anti-CD44

Os anticorpos preferidos de acordo com a invenção foram preparados, seleciona- dos, e analisaram como segue: Imunização e geração de hibridoma: A proteína de fusão de CD44-lg humana recombinante purificada (SEQ ID NO:1), linhagem de pré-célula B de murino, 300-19 (Reth, M. G. e outros, Nature 312 29: 418-42, 1984; Alt, F. e outros, Cell 27: 381-390, 1981), transfectadas para expressar CD44 humano e uma linhagem celular de leucemia monocítica humana, THP-1 (ATCC Cat. No. TIB-202), que naturalmente expressa CD44 humano, foram empregados como imunógenos.

Os anticorpos monoclonais completamente humanos para CD44 humano foram preparados usando cepas de HCo7 e HCo12 de camundongo transgênico de Ig humano, bem como a cepa transcromossômica/transgênica humana, KM (Mederex, Inc.). Todas es- tas cepas expressam anticorpos completamente humanos que são indistinguíveis de anti- corpos isolados de humanos. Nestas cepas de camundongo, o gene de cadeia leve de capa de camundongo endógeno foi homozigoticamente rompido como descrito em Chen e outros

(1993) EMBO J. 12:811 - 820 e o gene de cadeia pesada de camundongo endógeno foi ho- mozigoticamente rompido como descrito no EXEMPLO 1 de Publicação de PCT WO 01/09187. Cada uma destas cepas de camundongo carregam um transgene de cadeia leve de capa humano, KCo5, como descrito em Fishwild e outros (1996) Nature Biotechnology 14:845-851. A cepa HCo7 carrega o transgene de cadeia pesada humano HCo7 como des- crito nas Patentes U.S.A. Nos.: 5.545.806; 5.625.825; e 5.545.807. A cepa de HCo12 carre- ga transgene de cadeia pesada humano HCo12 como descrito no EXEMPLO 2 de Publica- ção de PCT WO 01/09187. A cepa KM carrega um míni-cromossomo humano como descri- to em lshida. E outros, (2002), Cloning and Stem Cells, 4: 91-102.

Para gerar anticorpos monoclonais completamente humanos para CD44, camun- dongos HuMab da cepa HCo7, HCo12 e KM, foram imunizados com células de THP-1, CD44-Fc recombinante purificado ou transfectantes 300-19 que expressam CD44 humano. Os esquemas de imunização geral para camundongos HuMab são descritos em Lonberg, N. e outros (1994) Nature 368(6474): 856-859; Fishwild, D. e outros (1996) Nature Biotechno- Iogy 14: 845-851 e Publicação de PCT WO 98/24884. Os camundongos tinham 6-16 sema- nas de idade na primeira infusão de antígeno. Uma preparação recombinante purificada de antígeno de CD44-Fc (5-20/yg), uma preparação de células de THP-1 ou células 300-19 transfectadas (1 x 107 de células) foi usada para imunizar os camundongos HuMab intraperi- tonealmente (IP), subcutaneamente (Sc) ou por injeção de pata (fp).

Os camundongos transgênicos foram imunizados com antígeno em adjuvante Ribi intraperitonealmente e subcutaneamente em intervalos de 1-4 semanas (até um total de 8 imunizações). A resposta imune foi monitorada em sangue tomado por sangramento retro orbital. O soro foi avaliado por FACS (como descrito abaixo), e camundongos com títulos suficientes de imunoglobulina humana anti-CD44 foram empregados para fusões. Os ca- mundongos foram reforçados intravenosamente com antígeno 3 e 2 dias antes de sacrifício e da remoção do baço e/ou linfonodos. Tipicamente, 10-20 fusões para cada antígeno fo- ram realizadas. Um total de 81 camundongos HCo7, HCo12 e KM foram imunizados. Vá- rias dúzias de que camundongos foram imunizadas para cada antígeno.

Seleção de camundongos HuMab Produzindo Anticorpos anti-CD44:

5 Para selecionar camundongos HuMab de produção de anticorpos que ligam CD44,

soros de camundongos imunizados foram avaliados através de citometria de fluxo (FACS) para ligação a uma linhagem celular que expressa CD44 humano de tamanho natural, e não a uma linhagem celular de controle que não expressa CD44: Brevemente, as células 300-19 expressando CD44 foram incubadas com soro a partir de camundongos imunizados diluídos 10 em 1:20. As células foram lavadas e a ligação de anticorpo específico foi detectada com IgG Ab anti-humano rotulado por FITC. As análises citométricas de fluxo foram realizadas em um instrumento de citometria de fluxo FACS (Becton Dickinson, San Jose, CA). Os ca- mundongos que desenvolveram os títulos mais altos de anticorpos anti-CD44 foram empre- gados para fusões. As fusões foram realizadas como descrito abaixo e os sobrenadantes 15 de hibridoma foram testados quanto à atividade anti-CD44 por FACS.

Geração de Hibridomas que Produzem Anticorpos Monoclonais Humanos para

CD44:

Os esplenócitos de camundongo e/ou linfócitos de linfonodo, isolados a partir dos camundongos de HuMab, foram fundidos usando polietileno glicol (PEG) ou eletrofusão (E- fusão, Cyto Pulse™ technology, Cyto Pulse™ Science, Inc., Glen Burnie, MD) à linhagem celular de mieloma de camundongo, SP2/0 (ATCC, CRL-1581, Vendor, City, State), usando protocolos recomendados pelo fabricante ou padrão. Brevemente, suspensões de célula única de linfócitos esplênicos e/ou de linfonodo a partir de camundongos imunizados foram fundidas entre um-terço e número igual de células de mieloma de camundongo de não se- gregação Sp2/0 usando 50% de PEG (Sigma, St. Louis, MO) ou E-fusão, respectivamente. As células foram semeadas em aproximadamente 1x105 de esplenócitos/caviade (PEG) ou 2x104 de esplenócitos/cavidade (E-fusão) em placa de microtítulo de fundo plano, e incuba- das durante 10-14 dias em meio seletivo que contém 10% de soro bovino fetal, 10% de meio condicionado de P388D1 (ATCC, CRL-TIB-63), 3-5% de (IGEN) em DMEM (Mediatech, Herndon, VA1 Cat.No. CRL 10013, com glicose elevada, L-glutamina e piruvato de sódio), 5 mM de HEPES, 0,055 mM de 2-mercaptoetanol, 50 mg/ml de gentamicina e 1x HAT (Sigma, Cat. No. CRL - P-7185). Após 1-2 semanas, as células foram cultivadas em meio no qual o HAT foi substituído com HT. Aproximadamente 10-14 dias após a semeação de célula, os sobrenadantes de poços individuais foram avaliados primeiro se eles continham anticorpos gama, capa humanos. Os sobrenadantes que foram marcados positivos para gama, capa humano foram em seguida avaliados subseqüentemente por FACS (descrito acima) para anticorpos de IgG monoclonais anti-CD44 humano. Os hibridomas de segregação de anti- 10

15

corpo foram transferidos para placas de 24 poços, avaliados e, se confirmado positivo para anticorpos anti-CD44 monoclonais IgG humano, foram subclonados pelo menos duas vezes por diluição limitada. Os subclones estáveis foram em seguida semeados in vitro para gerar quantidades pequenas de anticorpo em meio de cultura de tecido para caracterização adi- cional.

Os hibridomas foram depositados no dia 10 de agosto de 2005, de acordo com o Tratado de Budapeste com a Coleção de Cultura de Tipo americana (ATCC), 10801 Blvd. University, Manassas, VA 20110-2209, e de acordo com as condições de depósito sob 37 C. F. R. §§1.801-1.809. Além disso, vetores que contêm cDNA que corresponde a mAb 10C8.2.3 foram depositados com o ATCC no dia 15 de junho de 2006, de acordo com as mesmas condições, sob designações de ATTC PTA-7658 e 7659. Todas as restrições em acesso público para os depósitos serão irrevogavelmente removidas em concessão de uma patente neste pedido e os depósitos serão substituídos se amostras viáveis não puderem ser dispensadas pelo depósito.

Os hibridomas foram nomeados os seguintes números de acessão:

TABELA 3

Anticorpo Designação de Linhagem celular Designação de ATCC Designação de Cepa de Hibridoma de Camundongo 1A9.A6.B9 1376.3.1A9.A6.B9 ATCC No.PTA-6927 LN 15922 2D1.A3.D12 1376.3.2d1.A3.D12 ATCC No.PTA-6929 LN 15920 14G9.B8.B4 1376.2.14G9.B8.B4 ATCC No.PTA-6928 LN 15921 EXEMPLO 2

Clonagem de cDNA de CD44 de Cinomolqo e Humano para Gerar Linhagens de Célula Estáveis e Proteínas de Fusão de CD44-lg Clonagem de cDNA de CD44 humano:

CD44 humano (SEQ ID NO:1) foi clonado de a partir de cDNA de baço humano (Clontech Lab. Inc., Mountain View, CA, Cat. No. 639312) com os seguintes iniciadores: 5' - atggacaagttttggtggcacgcagcctgg-3' (SEQ ID NO: 155) e 5' - ttacaccccaatcttcatgtccaca-3' (SEQ ID NO: 156). O produto de PCR foi re-ampliado usando os seguintes iniciadores para 25 adicionar sítios de restrição Xhol e Xbal: 5'-gactcgaggccaccatggacaagttttggtggc-3' (SEQ ID: 157) e 5' - gatctagatcactattacaccccaatcttcatgtcc-3' (SEQ ID NO: 158). Este segundo pro- duto de PCR foi ligado em um vetor de expressão mamífero de pMIG e seqüência de CD44 foi verificada em ambos os postos. Hawley e outros, (1994) Gene Thera. 1 :136-138. clonagem de cDNA de CD44 de Cinomolgo:

O gene de CD44 de cinomolgo foi ampliado por PCR a partir de cDNA cino PBMC

com os seguintes iniciadores: 5'-atggacaagttttggtgg-3' (SEQ ID NO: 159) e 5' - gttacacccca- atcttcatgtcca-3' (SEQ ID NO: 160). Produto de PCR foi ligado em vetor PCR2.1 TOPO (Invi- trogen, City, Carlsbad, CA, Cat. No. K4510-20). Dezenove clones foram seqüenciados e a seqüência de cinoCD44 foi determinada por seqüência de consenso de todos os clones an- teriores. A seqüência de ácido nucléico de dois clones, 5-2 (SEQ ID NO: 153) e 5-8 (SEQ ID NO:8) é mostrada. O CD44 de cinomolgo verificado por seqüência (SEQ ID NO:8) foi subclonado em um vetor de expressão de mamífero pMIG. Hawley e outros, (1994).

Linhagem celular de super-expressão 300-19 de CD44 de Cinomolgo e Humana

300-19:

Ambos pMIG-humano CD44 e pMIG-cinoCD44 foram transfectados em células 293T/17 (ATCC No. CRL-11263) com reagente de transfecção FUGENE 6 (Hoffman-La Ro- che Inc., Nutley, NJ, Cat. No. 11815091001) geraram retrovírus de CD44 humano e ci- noCD44. Ambos os retrovírus foram subseqüentemente transduzidos em células 300-19 para gerar linhagens de célula de expressão de CD44 humano e CD44 de cino.

Clonagem de proteína humana de fusão CD44-loG1:

O domínio extracelular de CD44 humano foi expresso como uma proteína de fusão 15 Igd humana (SEQ ID NO:3). O cDNA que codifica o domínio extracelular maduro de CD44 foi ampliado por PCR (kit de PCR de Klentaq, Clontech Lab Inc., Mountain View, CA, Cat. No.639108) a partir de cDNA de leucócito humano (Clontech Lab. Inc.) e subclonado em um vetor de expressão de mamífero - PCDMamp que contém uma seqüência líder CD5 e um rótulo de IgGI humano. Os seguintes iniciadores de PCR foram designados para a seqüên- 20 cia publicada da forma de CD44 padrão (G. R. Screaton, e outros, (1992) PNAS 89:12160- 12164)

(CD44+C: AGTGAGACTAGTCAGATCGATTTGAATATAACCTGCCGCTTTG) (SEQ ID NO:161),

(CD44-D: AT CACT GAGAT CTT CTGG AATTTG G G GT GT CCTT AT AG) (SEQ ID NO:162).

O cDNA de CD44lgG1 completo foi seqüenciado e verificado em ambas as cepas.

Clonagem de Proteína de CD44-lgG1 de Cinomolgo:

O domínio extracelular de CD44 de cinomolgo foi expresso como uma proteína de fusão de Fe de IgGI humano (SEQ ID NO:5). O cDNA que codifica o domínio extracelular 30 maduro de cino CD44 foi ampliado por PCR a partir do vetor de pMIG-cinoCD44 e subclo- nado em um vetor de expressão mamífero internamente pLNp que contém uma seqüência líder CD5, um rótulo de IgGI humano bem como sítios de restrição Xhol e Hpal. Os iniciado- res de PCR foram projetados para alinhar com domínio extracelular de CD44 humano com sítios de restrição Xhol e EcoRV. As seqüências de iniciadores são como segue: 5' - 35 atcggcgatccagatcgatttgaatataacc-3' (SEQ ID NO: 163), 5' - ctgtgcctcgagccattctgga- atttggggtgtcc-3' (SEQ ID NO: 164). O cDNA de IgGI extaceluar de CD44 de cino completo foi a seqüência verificada em ambas filamentos. A condição de PCR para toda a clonagem anterior usou platino Taq polimerase (In- vitrogen, Cat. No. 11304-011) seguido por protocolo padrão de PCR: 3 minutos a 95°C; 25x (30 segundos a 55°C, 1 minuto a 78° C); 7 minutos a 72°C.

Domínio extracelular de expressão e purificação de CD44 humano e cinoCD44:

Ambas as proteínas de fusão de CD44lgG1 humano (SEQ ID NO:3) e cinoCD44

IgGI (SEQ ID NO: 5) foram expressas usando o Freestyle 293 Expression System (Invitro- gen, Cat. No. K9000-01) de acordo com os protocolos do fabricante.

A proteína de fusão foi purificada em contas de agarose de Proteína A. (Pierce, Rockford, IL1 Cat. No. 15918-014). Após o meio de cultura ter sido coletado, os comprimi- dos de inibidor de protease (Hoffman La-Roche Cat. No. 1 697 498,1 comprimido/50 ml de meio), tampão Tris (pH 8,0, concentração final, 10 mM) e azida de sódio (concentração final, 0,02%) foram adicionado e filtrados através de um filtro de 0,22 mícron. Um ml de 50% de lama de contas de Proteína A foi adicionado a cada meio de 100 ml. Girar a mistura de meios/lama durante pelo menos 2 horas a 4°C. O giro em 1000xg durante 10 minutos resul- tou em pelota de agarose. O sobrenadante foi removido cuidadosamente e a pelota de aga- rose foi re-suspensa em 2-3 volumes de tampão de lavagem (0,1 M de Tris HCL pH 7,5, 0,1 M de NaCI) e aplicado a coluna. A coluna foi lavada com 20 volumes de leito de tampão de lavagem e eluída com 5 volumes de leito de tampão de eluição (ImmunoPure IgG Elution Buffer, Pierce, Cat. No. 21004) em um tubo que contém 1/2 volume de coluna de 1 M de Tris pH 8. O tampão foi permutado em PBS, enquanto usando concentradores de Amicon 10.000 MW de redução (Millipore, Billerica, MA) de acordo com o protocolo do fabricante. EXEMPLO 3

Seqüências de Anticorpos anti-CD44 Preparados de acordo com a Invenção Para analisar a estrutura de anticorpos produzidos de acordo com a invenção, áci- dos nucléicos foram clonados codificando fragmentos de cadeia pesada e leve a partir de hibridomas produzindo anticorpos monoclonais anti-CD44. A clonagem e seqüenciamento foram realizados como segue:

MRNA de PoIy(A)+ foi silado usando um Mini kit RNeasy (Qiagen, San Diego, CA) e cDNA sintetizado a partir do mRNA com o kit de RT-para-PCR de Advantage (BD Biosci- 30 ences, Franklin Lakes, NJ) usando iniciação de oligo(dT). Os cDNA iniciados por oligo(dT) para clone 1A9.A6.B9, 2D1.A3.D12, e 14G9.B8.B4 foram ampliados usando iniciadores de- generados listados nas TABELAS 4, 5, e 6, respectivamente. A amplificação foi obtida u- sando Polimerase de Alta fidelidade (Roche) e uma Máquina de DNA PTC-200 (MJ Resear- ch) com ciclagem como segue: 2'@95°C; 25x (20"@95°C, 30"@52°C, 2'@72°C); 10'@72°C. 35 Amplicons de PCR foram clonados no pCR2.1 TOPO (Invitrogen, Carlsbad, CA Cat.

No. K4500-01) e transformados em células quimicamente competentes TOPIO (Invitrogen) usando o protocolo padrão. Os clones foram seqüências verificadas usando substância

* química de Grills 16th BDTv3.1/dGTP (Applied Biosystems lnc) e um Analisador de DNA 3730x1 (Applied Biosystems Inc., Foster, CA). Todas as seqüências foram analisadas por alinhamentos para o 'diretório de seqüência V BASE' (Tomlinson, e outros, (1992) J. Mol. Biol., 227, 776-798; Hum, (1995) Mol. Genet., 3, 853-860; EMBO J., 14, 4628-638.

TABELA 4: Iniciadores Degenerados (5' a 3') para 1A9.A6.B9

VH3c SUTR F ATTYRGTGATCAGSACTGAACASAG (SEQ ID NO: 165} G 3UTR R TACGTGCCAAGCATCCTCGC (SEQ ID NO:166) VK3 5UTR F ATCAATGCCTGKGTCAGAGCYyTG (SEQ ID NO;167) K 3UTR R AGGCTGGAACTGAGGAGCAGGTG (SEQ ID NO: 168) TABELA 5: Iniciadores Degenerados (5' a 3') para 2D1.A3.D12

VH1a 5 UTR F CCCTGAGAGCATCAYMYARMAACC (SEQ ID NO; 169) G 3UTR R TACGTGCCAAGCATCCTCGC (SEQ ID N0:170) VK1a 5 UTR F GSARTCAGWCYCWVYCAGGACACAGC (SEQ ID NO:171) K 3UTR R AGGCTGGAACTGAGGAGCAGGTG (SEQ ID NO: 172) TABELA 6: Iniciadores Degenerados (5' a 3') para 14G9.B8.B4

VH 1a 5UTR F CCCTGAGAGCATCAYMYARMAACC {SEQ ID NO: 173) G 3UTR R TACGTGCCAAGCATCCTCGC (SEQ ID NO:174) VK3 5UTR F ATCAATGCCTGKGTCAGAGCYYTG (SEQ ID NO: 175) K 3UTR R AGGCTGGAACTGAGGAGCAGGTG (SEQ ID NO: 176} Utilização de gene:

A TABELA 7 apresenta a utilização de gene evidenciada por clones de hibridoma

selecionados de anticorpos de acordo com a invenção.

TABELA 7

Clone Cadeia Pesada Cadeia Leve Isótpo Vh D JH Vl Jk 1A9A6.B9 333 D4-17 JH6b L6 JK4 lgG2 2D1.A3.D12 1-03 nd JH6b L19 . JK1 IgGi 14G9.B8.B4 1-03 D3-10 JH5b A27 JK4 IgGi 10C823 3-21 D6-19 JH6b A27 JK4 igG4 nd = não determinado Análise de Mutação e Seqüência:

Como será apreciado por aqueles versados na arte, análise de utilização de gene

fornece apenas uma avaliação limitada de estrutura de anticorpo. Como as células B nos animais de KM estocasticamente geram transcrições de cadeia leve e capa V-J e pesada V- D-J, há vários processos secundários que ocorrem, incluindo, sem limitação, hipermutação somática, deleções, N-adições, e extensões de CD3. Por exemplo, veja Mendez e outro, 20 (1997) Nature Genetics 15:146-156 e Publicação PCT WO 98/24893. Consequentemente, para também examinar a estrutura de anticorpo, geramos seqüências de aminoácido predi- tas dos anticorpos de cDNAs obtidos dos clones.

FIG. 2 mostra o alinhamento de seqüências de aminoácido preditas dos domínios variáveis de cadeia pesada e leve de anticorpos monoclonais anti CD44 isolados com se- qüências de aminoácido de linha germinativa dos genes de cadeia pesada e leve corres- pondentes.

TABELAS 9-12 fornecem as seqüências de aminoácido preditas e de nucleotídeo das cadeias leve de capa e pesada de anticorpos 1A9.A6.B9 (TABELA 9), 2D1.A3.D12 (TABELA 10), 14G9.B8.B4 (TABELA 1 1), e 10C8.2.3 (TABELA 12) com as regiões variá- veis para cada um dos anticorpos mostrados em maiúscula.

Geramos um anticorpo mutado 2D1.A3.D12. A cadeia pesada no anticorpo

2D1.A3.D12 foi transformada para mudar um resíduo de treonina na posição 28 em uma isoleucina. A cadeia leve de anticorpo 2D1.A3.D12 na posição 38 foi mutada mudando um resíduo de glutamina em uma histidina.

Mutagênese, nas regiões de Vh (I28T) e Vk (H38Q) do clone 2D1.A3.D12, foi con- 15 duzida com os iniciadores listados na TABELA 8 usando o Kit de Mutagênenese Direciona- da ao Sítio QuickChange de Stratagen, de acordo com as instruções do fabricante. Muta- ções foram confirmadas através de sequenciamento automatizado, e inserções mutageniza- das foram subclonadas em vetores de expressão. Mutagênese de Anticorpo Anti-CD44 2D1.A3.D12 foi conduzida como segue:

TABELA 8: Iniciadores mutagênicos (5’ a 3’) para 2D1.A3.D12 2D1 VH I28T AAGGCTTCTGGATACACCTTCACTAGCTATGCT ! SEQ ID NO:177} }-- VH I28T R AGCATAGCTAGTGAAGgTGTATCCAGAAGCCTT (SEQ ID 2D1 KOi178} 2D1 VL H38Q TTAGCCTGGTATCAGCAgAAACCAGGGAAAGCC (SEQ ID NO;179} 2D1 VL H38Q R GGCTTTCCCTGGTTTcTGCTGATACCAGGCTAA (SEQ ID NO:180} TABELA 9: Seqüências de proteína e ADN de anticorpo 1A9.A6.B9

DESCRIÇÃO:

SEQUENCIA: Seqüência de ADN CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGG de cadeia pesada de TCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCGTCTGGATTCACCTTCAGTAGCTAT células de hibridoma GGCATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTG (domínio variável em GCAGTTATATGGTATGATGGAAGTAATAAATTCTATGCAGACTCCGTG maiúscula) AAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTAT CTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGT GCGAGGAGAAGTGACTACAGGGGCTACTACGGTATGGACGTCTGGGGC CAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAgcctccaccaagggcccatcg gtcttccccctggcgCcctgctccaggagcacctccgagagcacagcg gccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtg tcgtggaactcaggcgctctgaccagcggcgtgcacaccttcccagct gtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtg ccctccagcaacttcggçacccagacctacacctgcaacgtagatcac aagcccagcaacaccaaggtggacaagacagttgagcgcaaatgttgt gtcgagtgcccaccgtgcccagcaccacctgtggcaggaccgtcagtc ttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacc cctgaggtcacgtgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaceccgag gtccagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaag acaaagccacgggaggagcagttcaacagcacgttccgtgtggtcagc gtcctcaccgttgtgcaccaggactggctgaacggcaaggagtacaag tgcaaggtctccaacaaaggcctcccagcccccatcgagaaaaccatc tçcaaaaccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgccc ccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctg gtcaaaggcttctaccccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaat gggcagccggagaacaactacaagaccacacctcccatgctggactcc gacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcagg tggcageaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctg cacaàccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaa (SEO ID NO: 10) Seqüência de proteí¬ QVQL VESGGGWQPGRSLRLS CAASGFTFS S Y GMHWVRQAPGKGLEWV na derivada (por AVIWYDGSNKFYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYC translação) de cadeia ARRSDYRGYYGMDVWGQGTTVTVSSastkgpsvfplapcsrstsesta pesada de células de algc lvkdy f pepvtvsvmsgal t sgvht f pavlqs sglys 1 s s wt v hibridoma (domínio pssnfgtqtytcnvdhkpsntkvdktverkccvecppcpappvagpsv variável em maiúscu¬ f lfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevqfnwyvdgvevhnak la) tkpreeqfnstfrwsvltwhqdwlngkeykckvsnkg lpapiekti sktkgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesn gqpennykttppmldsdgsfflyskl tvdksrwqqgnvfscsvmheal hnhytqkslslspgk (SEQ ID NO: 9) Seqüência de ADN de Seqüência de Cadeia Leve de Tamanho Natural de 1A9.A6.B9 - Se¬ cadeia leve de células qüência de Nucleotídeo de hibridoma (domínio GAAATTGTGTTGACACAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGG variável em maiúscula GAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTATCAACTAC TTAGCCTGGTACCAACAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATC TATGATGCATCCAACAGGGCCTCTGGCATCCCAGCCAGGTTCAGTGGC AGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTAGAGCCT GAAGATTTTGCAGTTTATTACTGTCAGCAGCGTCGCAACTGGCCGCTC ACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAACgaac tgt g gc t gc a ccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctgga actgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggcc aaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccag gagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagc agcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctac gcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagc ttcaacaggggagagtgt ÍSEO ID NO: 14) Seqüência de proteína derivada (por trans- lação) de cadeia leve de células de hibrido- ma (domínio variável em maiúscula)

EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVINYLAWYQQKPGQAPRLLI YDASNRASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRRNWPL TFGGGTKVEIKrtvaapsvf ifppsdeqlksgtaswcllnnf yprea kvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstItlskadyekhkvy acevthqglsspvtksfnrgec (SEQ ID NO: 13)

TABELA 10: Seqüências de proteína e ADN de anticorpo 2D1.A3.D12

DESCRIÇÃO: SEQUENCIA: Seqüência de ADN CAGGTCCAACTTGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCC de cadeia pesada de TCAGTGAAGGTTTCCTGCAAGGCTTCTGGATACATCTTCACTAGCTAT células de hibridoma GCTATGGATTGGGTGCGCCAGGCCCCCGGACAAAGGCTTGAGTGGATG (domínio variável em GGGTGGATCAACGCTGCCATTGGTAGCACAAAATATTCACAGAAGTTC maiúscula) CAGGGCAGAGTCACCATTACCAGGGACACATCCGCGAGCACAGC.CTAC ATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAAGACACGGCTGTGTATTACTGT GCGAGAGACGGGTGGGAGGACTACTACTACCACGGTATGGACGTCTGG GGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAgc c t C cac caag gg c c C a tcggtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggggcaca gcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacg gtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccg gctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgacc gtgccctccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaacgtgaat cacaagcccagcaacaccaaggtggacaagaaagttgagcccaaatct tgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctg gggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctc atgatctcccggacccctgaggtcacatgdgtggtggtggacgtgagc cacgaaigaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggag gtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacg taccgtgtggtca:gcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaat ggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagccccc atcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacag gtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtc agcctgá.cctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtg gagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacâagaccacgcct ccçgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcacc gtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtg atgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctg tctccgggtaaa (SEQ ID NO: 46) Seqüência de proteí¬ QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYIFTSYAMHWVKQapUQKLüWM na derivada (por GWINAAIGSTKYSQKFQGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYC translação) de cadeia ARDGWÉD Y YYHGMD VWGQGTTVTVS Sas t kgp svfplapsskstsggt pesada de células de aalgclvkdyfpepvtvsvmsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvt hibridoma (domínio vpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapell variável em maiúscu¬ ggpsvf lfppkpkdtlmisrtpevtcvwdvshedpevkfnwyvdgve la) vhnaktkpreeqynstyrwsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpap iekt iskakgqprepqvyt lppsrdel tknqvsltclvkgfypsdiav ewesngqpennykttppvldsdgsff lyskltvdksrwqqgnvfscsv mhealhnhytqksIslspgk (SEQ ID NO: 45) Seqüência de ADN GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCTTCCGTGTCTGCATCTÜTAUGA de cadeia clara de GACAGAGTCACCATCACTTGTCGGGCGAGTCAGGGTATTAGTAGCTGG células de hibridoma TTAGCCTGGTATCAGCATAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATC (domínio variável em TATGCTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGC maiúscula) AGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCT GAAGATTTTGCAACTTACTATTGTCAACAGGCTAATAATTTCCCGTGG ACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACgaac tgtggc tgca ccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctgga actgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggcc aaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccag gagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagc agcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctac gcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagc ttcaacacfQaaraaaatcrt (SEQ ID NO: 50) Seqüência de proteí-a DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQHKPGKAÉÍCLLI derivada (por transla- YAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQANNFPW ção) de cadeia leve TFGQGTKVEIKrtvaapsvf i f ppsdeqlksgtas wc I lnnfyprea de células de hibrido¬ kvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvy ma (domínio variável acevthqglsspvtksfnrgec (SEQ ID NO: 49) em maiúscula) TABELA 11: Seqüências de proteína e ADN de anticorpo 14G9.B8.B4

DESCRIÇÃO: SEQUENCIA: seqüência de ADN CAGGTCCAGCTTGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGtíGÇC de cadeia pesada de TCAGTGAAGGTTTCCTGCAAGGCTTCTGGATACACCTTCACTAACTAT células de hibridoma GCTATGCATTGGGTGCGCCAGGCCCCCGGACAAAGGCTTGAGTGGATG (domínio variável em GGATGGATCAACACTGGCAATGGTAACACAAAATATTCACAGAAGTTC maiúscula) CAGGGCAGAGTCACCATTACCAGGGACACATCCGCGAGCACAGCCTAC ATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAAGACACGGCTGTGTATTACTGT GCGAGGTTTTACTCTGGTTCGGGGAGTCCCTGGGGCCAGGGAACCCTG GTCACCGTCTCGTCAgcctccaccaagggcccatcggtcttccccctg geaccctcctccaagagcacctctgggggcacagcggccctgggctgc ctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactca ggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcc tcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagc ttgggcacccagacctacatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaac accaaggtggacaagaaagttgagcccaaatcttgtgacaaaactcac acatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtc ttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacc cctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgag gtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaag acaaagccgcgggággagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagc gtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaag tgcáaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatc tccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgccc ccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctg gtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaat gggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactcc gacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcagg tggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctg cacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaa (SEQ ID NO: 82) Seqüência de proteí¬ QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYAMHWVRQAPGQRIíÜWM na derivada (por trans- GWINTGNGNTKYSQKFQGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYC lação) de cadeia pe¬ ARFYSGSGSPWGQGTLVTVSSastkgpsvfplapsskstsggtaalgc sada de células de lvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslsewtvpsss hibridoma (domínio lgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapellggpsv variável em maiúscu¬ f I f ppkpkdt Imi sr tpevtc vwdvshedpevkf nwyvdgvevhnak la) tkpreeqynstyrwsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiekti skakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesn gqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmheal hnhytqksIslspgJc (SEQ ID NO: 81) Seqüência de ADN gaaattgtgttgacgcagtctccaggcaccctgtctttgtctccaüuu de 14G9.B8.B4 ca¬ GAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCAGC deia de Iuz de células TACTTAGCCTGGTACCAGCAGAÃACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTGCTC de hibridoma (domí¬ ATCTATGGTGCATCCAGCAGGGCCACTGGCATCCCAGACAGGTTCAGT nio variável em mai¬ GGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGACTGGAG úscula) CCTGAAGATTTTGCAGTGTATTACTGTCAGCAGTATGGTAGCTCACCG OTrACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAACgaac t g tggc t gcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatct ggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagag gccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcc caggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctc agcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaàgtc tacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaag agcttcaacagqggagagtqt (SEQ ID NO: 86) Seqüência de proteí- na derivada (por translação) de cadeia leve de células de hibridoma (domínio variável em maiúscu- la)

EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLL IYGAS SRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSP LTFGGGTKVEIKrtvaapsvfifppsdeqlksgtaswcllnnfypre akvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltls kadyekhkv yacevthqglsspvtksfnrgec (SEQ ID NO: 85)

TABELA 12: Seqüências de proteína e ADN de anticorpo 10C8.2.3

DESCRIÇÃO: SEQUENCIA: Seqüência de ADN GAGGTGCAGCTGATGGAGTCTGGGGGAGGCCTGGTCAAGCCTGGGGGG de cadeia pesada de TCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGCTAT células de hibridoma AGCATGAACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTC (domínio variável em TCATCCATTACTGTTAGAAGTAGTTACATATACTACGCAGACT CAGTG maiúscula) AAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCACTGTAT CTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGT GCGAGAGTCCTCGCTATAGCAGTGCCTGGTACCTCCTACTACTACTAC GGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCT CAgct tccaccaagggcccatccgtcttccccctggcgccctgctccaggagc acctccgagagcacagccgccctgggctgcctggtcaaggactacttc cccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgacoagcggc gtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctc agcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacgaagacctac acctgcaacgtagatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagaga gttgagtccaaatatggtcccccatgcccatcatgcccagcacctgag ttcctggggggaccatcagtcttcctgttccccccaaaacccaaggac actctcatgatctcccggacccctgaggtcacgtgcgtggtggtggac gtgagccaggaagaccccgaggtccagttcaactggtacgtggatggc gtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagttcaac agcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactgg ctgaacggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaaggcctcccg tcctccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagag ccacaggtgtacaccctgcccccatcccaggaggagatgaccaagaac caggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctaccccagcgacatc gccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagacc acgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcagg ctaaccgtggacaagagcaggtggcaggaggggaatgtcttctcatgc tccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacacagaagagcctc tccctgtctctgggtaaa ÍSEO ID NO: 118) Seqüência de proteí¬ EVQLMES GGGLVKPõGS LRLS CAASG FTFS S Y SMNW V RQAPG KGLE W V na derivada (por S SITVRS S YIYYAD S VKGRFTIS RDNAKNS L YLQMN S LRAEDTAV YY C translação) de cadeia ARVLAIAVPGTSYYYYGMDVWGQGTTVTVSSastkgpsvfplapCsrs pesada de células de tsestaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglysl hibridoma (domínio sswtvpssslgtktytcnvdhkpsntkvdkrveskygppcpsepape variável em maiúscu¬ f lggpsvf Ifppkpkdtlmisrtpevtcvwdvsqedpevqfnwyvdg la) vevhnaktkpreeqfnstyrwsvltvlhqdwlngkeykckvsnkglp ssiektiskakgqprepqvytlppsqeemtknqvsltelvkgfypsdi ave we s ngqpe rmy k t tppv Idsdgsfflysr 11 vdks rwqe gnv f s c svmhealhnhytcrkslslslqk (SEQ ID NO: 117) Seqüência de ADN GAAATTGTGTTUACUUAUTCTCCAiiUCm/UUTüTCTTTUTCrULAGGU de cadeia leve de GAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCAGC células de hibridoma TACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTC (domínio variável em ATCTATGGTGCATCCAGCAGGGCCACTGGCATCCCAGACAGGTTCAGT maiúscula) GGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGACTGGAG CCTGAAGATTTTGCAGTGTATTACTGTCAGCAGTATGGTAGCTCACGG CTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAAcgaactgtgget gcaceatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatct ggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagag gccaaagtacagtggaaggtggataacgccctceaatcgggtaactcc caggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctc agcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtc tacgcctgcgaagteacccatcagggcctgagctcgccegtcaeaaag agcttcaacaggggagagtgt (SEQ ID NO: 122) Seqüência de proteí¬ EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLL na derivada (por IYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSR translação) de cadeia LTFGGGTKVEIKrtvaapsvf i fppsdeqlksgtaswc llnnfypre leve de células de a kvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstysIsstItIskadyekhkv hibridoma (domínio yacevthqglsspvtksfnrgec (SEQ ID NO: 121) variável em maiúscu¬ la) Domínios variáveis de anticorpos anti-CD44 foram clonados em vetores de expres- são como segue:

Os domínios variáveis foram ampliados a partir de cDNA clonado de pCR2.1 usan- do iniciadores listados na TABELA 13, 14, e 15. Amplificação foi obtida usando a polimerase 5 Pfx Platinum (Invitrogen) e uma Máquina PTC-200 ADN (MJ Research) com ciclagem como segue: 2 minutos a 94°C; 20x (30 segundos a 94°C, 45 segundos a 55°C, 1 minuto a 68°C); minutos a 68°C. Os domínios variáveis foram em seguida clonados em vetores de expres- são que contêm domínios constantes do isótipo apropriado. Estes clones foram verificados por seqüência usando química Grills 16a BDTv3.1/dGTP (Applied Biosystems Inc) e um ana- 10 Iisador de ADN 3730x1 (AppIiedBiosystems).

TABELA 13: Iniciadores de domínio variáveis (5' a 3') para 1A9.A6.B9 H3 11 CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGG (SEQ ID NO: 181) G1/2 VH TGGAGGCTGAGGAGACGGTGAC (SEQ ID NO: 182) R K L6 GAAATTGTGTTGACACAGTCTCCAG (SEQ ID NO: 183) JK4 R tatattccttaattaagttattctactcacGTTTGATCTCCACCTTGGTCCC T (SEQ ID NO:184) TABELA 14: Iniciadores de domínio variável (5’ a 3’) para 2D1.A3.D12

H1 03 CAGGTCCAGCTTGTGCAGTCTG (SEQ ID NO: 185) G1/2 VH R TGGAGGCTGAGGAGACGGTGAC (SEQ ID NO: 186) K 012 GACATCCAGATGACCCAGTCTCC (SEQ ID NO: 18 7) JK1 R tatattccttaattaagttattctactcacGTTTGATTTCCACCTTGGTCCCT (SEQ ID NO:188) TABELA 15: Iniciadores de domínio variável (5’ a 3’) para 14G9.B8.B4

H1 03 CAGGTCCAGCTTGTGCAGTCTG (SEQ ID NO: 18 9) G1/2 VH TGGAGGCTGAGGAGACGGTGAC (SEQ ID NO: 190) R K A27 GAAATTGTGTTGACGCAGTCTCCAG (SEQ ID NO: 191) JK4 R tatattccttaattaagttattctactcacGTTTGATCTCCACCTTGGTCCC T ÍSEQ ID NO:192) EXEMPLO 4

Anticorpos anti-CD44 humanos foram avaliados quanto a sua capacidade de inibir a interação entre HA (Sigma, Cat. No. H5388) e proteína de CD44 humana (SEQ ID NO:3) como descrito no EXEMPLO 2.

Ensaios de ligação foram conduzidos em placas de ensaio ELISA de 96 poços (pla- cas de 96 poços Immunolux HB Maxisorp, Nunc. Cat. No. 442404). Em primeiro dia, 100 μΙ de HA de crista de galo diluídos em 50 mM de tampão de Nabicarb, pH 9,6 em 2,5 mg/ml 10 foram adicionados aos poços de ensaio na placa e incubados a 4 0C durante a noite. Apro- ximadamente, 24 horas depois, as placas revestidas com HA foram lavadas quatro vezes usando 300 μΙ de tampão de PBS com 0,05% de Tween-20 (Sigma, Cat. No. P1379). As placas foram em seguida bloqueadas adicionando 200 μΙ de BSA a 3% em PBS a cada poço e incubadas durante 2 horas a 37 °C. As placas bloqueadas foram em seguida lavadas com 15 PBS com 0,05% de Tween-20. Em uma placa de polipropileno de 96 poços separada (Falco, Cat. No. 351190), anticorpos anti-CD44 1A9.A6.B9;

2D1.A3.D12; 14G9.B8.B4; e 10C8.2.3 foram diluídos em PBS com BSA a 1% em várias concentrações foram misturados com proteína de fusão de CD44-lg humana em uma concentração final de 0,6 μg/ml em um volume de 50 μΙ. A mistura foi incubada em tempera- 20 tura ambiente durante 60 minutos e em seguida transferida para as placas revestidas com HA e incubada em temperatura ambiente durante uma hora. As placas foram lavadas com PBS com 0,05% de Tween-20. IgG-HRP anti-humano (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, State, Cat,. No. NA933) diluídas 1:500 entre BSA a 1% (para detectar CD44-lg que é ligado a HA) foram adicionadas a cada poço e incubadas em temperatura ambiente. As pia- cas foram em seguida lavadas novamente e 50 μΙ de TMB (substrato de peroxidase de mi- cropoço de TMB1 KPL1 52-00-02) foram adicionados e incubados durante cerca de 10 minu- tos. As reações foram em seguida interrompidas com 50 μΙ de solução de interrupção e valo- res de OD450 foram medidos em uma leitora de placa. Figura 3 ilustra a representação gráfi- 5 ca de anticorpo de CD44 1A9.A6.B9 que bloqueia a interação entre HA e proteína de fusão de CD44-lg. TABELA 16 mostra as IC50’s dos anticorpos anti-CD44.

TABELA 16

Clone de Anticorpo IC50 ^g/mL) 1 A9.A6.B9 0,41 ±0,03(n=3) 2D1.A3.D12 0,33 ±0,01 (n=2) 14G9.B8.B4 0,43 ± 0,01 (n=3) 10C8.2.3 0,64 (n=2) IM7 1,85 ±0,35 (n=9) 515 0,32 (n=1) EXEMPLO 5

Determinação de Constantes de Liaacão de Anticorpos Monoclonais Anti-CD44 Conduzimos outro ensaio in vitro para demonstrar a afinidade de ligação dos anti-

corpos da invenção para CD44.

Estudos de ligação demonstraram que Abs anti-CD44 ligam-se a CD44 em células transfectadas em uma análise de ligação de equilíbrio tem uma constante de ligação de 0,98 μg/mL (6,8 nM, veja FIGS. 4 A-C1 especificamente Figura 4C). As células 300-19 que foram 15 transduzidas com vetor retroviral que codifica proteína de CD44 humana e foram lavadas duas vezes por PBS. As células 300-19 foram em seguida ressuspensas em tampão de FACS [PBS, (Sigma, Cat. No. D-8537; Azida a 0,02% (Sigma, Cat. No. S-2000); 5 μg/ml de citocalasina B, (Sigma, Cat. No.C-6762) e Soro Bovino Fetal a 2% (Gibco, City, Cat. No. 16140-071)] em densidade de célula de 1x106 de células/ml. Transferimos 400 μΙ de cé- 20 lulas 300-19 de expressão de CD44 (2x105 /400 μΙ) em tubos Nunc-lmmuno, (VWR, Cat No. 443990), adicionamos 5 μΙ de FITC de IgG anti-hu (Jackson, Cat. No. 109-095-098) e 1A9.A6.B9 em várias concentrações e tubos incubados em placa agitadora (Thermolyne, rotomix tipo 48200) durante 3 horas em temperatura ambiente com agitação continuada. Depois de 3 horas, as células foram lavadas duas vezes com tampão de FACS. As células 25 foram ressuspensas em 250 μΙ de paraformaldeído a 1%, (Electron Microscopy Science, Ft. Washington, PA, Cat. No. 15710). Ostubos foram lidos usando Becton Dickinson FACSCa- Iibur e os dados foram analisados usando CeIIQuest Pro (Becton Dickinson). (Veja Figura 4C).

Anticorpos anti-CD44 da mesma forma ligam-se às proteínas de CD44 de ciano e CD44 humanas expressas em célula CD3+ T periféricas (veja Figuras 4A e 4B). Especifica- mente, sangue periférico humano foi coletado de voluntários humanos normais em tubos vacutainer com heparina (Becton Dickinson, Cat No. 366480). Adicionamos 100 μΙ de san- gue humano coletado aos tubos Nunc-Immuno (VWR Cat No. 443990). Adicionamos Abs 5 anti-CD44 em cada tubo para alcançar as concentrações finais de 0,2 μg/ml a 20 μg/ml. De- pois disso, adicionamos 10 μΙ de anti-CD3-PerCP (BD Pharmingen, Cat. No. 347344) e 10 μΙ de anti-CD 14-APC (BD Pharmingen, Cat No. 555399) a cada tubo. Incubamos durante 30 minutos em gelo, seguido por centrifugação em 1200 rpm durante 10 minutos, e removemos o sobrenadante. Adicionamos 100 μΙ de tampão de lavagem de FACS (PBS-Sigma D8537; 10 azida a 0,02%, Sigma Cat. No. S2002 e soro bovino fetal a 2%, Gibco Cat. No. 16140-071) bem como adicionamos 50 μΙ/cavidade de anticorpo específico de IgG Fc anti humano de cabra rotulado por FITC secundário (Jackson Cat. No. 109-095-098) a diluição de 1:100 ve- zes. Incubamos durante 25 minutos a 4°C no escuro. Depois de 25 minutos de incubação adicionamos 2 mis de solução de Iise de FACS (BD Pharmingen, diluído 1:10 em água), 15 vortexamos e novamente incubamos durante 10 minutos em temperatura ambiente. Depois de 10 minutos de incubação, centrifugamos em 1200 rpm durante 10 minutos e removemos o sobrenadante, lavamos as células com tampão de lavagem de FACS, seguido por centri- fugação e remoção do sobrenadante. As células foram em seguida fixadas com 250 ml de 1% de paraformaldeído (Electron Microscope Science, Ft Washington, PA Cat. No. 15710) e 20 Iemos usando Becton Dickson FACS Calibur, e analisamos usando CeIIQuest Pro (Becton Dickinson).

Estudos de Ligação de ELISA:

Estudos de ligação de ELISA demonstraram que 1A9.A6.B9 liga-se a proteína de fusão de CD44-lg de cino e humanas revestida com placas de 96 poços (veja Figura 5). Pa- ra começar o ensaio, 50 μΙ de proteína de fusão de CD44-lg em 1 μς/ml de PBS foram adi- cionados a uma placa de ensaio de 96 poços (placa Immuno Maxisorp, Nunc. Cat. No. 442404) e incubados durante a noite a 4°C. No dia seguinte, as placas foram lavadas quatro vezes com PBS, 0,05% de Tween-20. As placas foram em seguida bloqueadas por BSA a 3% em PBS durante 2 horas a 37 °C, 200 μΙ por poço e lavadas novamente. Anticorpo anti CD44 1A9.A6.A9 foi diluído em várias concentrações com PBS e BSA a 1%, e foi adiciona- do às placas e incubadas durante uma hora em temperatura ambiente. As placas foram la- vadas e 50 μΙ de anticorpo HRP de cadeia leve de capa anti-humano (Amersham Bioscien- ce, Cat. No. NA 933), diluídas 1 :2000 entre BSA a 1% em PBS foram adicionados a cada poço e incubados em temperatura ambiente durante mais uma hora. As placas foram Iava- das novamente, e 50 μg/ml de substrato de peroxidase de micropoço de TMB (Cat. No. KPL S2-00-02)) foram adicionados e incubados durante 5 a 10 minutos. Reações de ELISA fo- ram interrompidas com solução de interrupção e valores de QD450 foram medidos por uma leitora de placa.

Estudos de ligação BIAcore:

Ressonância de plasmônio de superfície foi usada para medir a interação molecular em um chip sensor CM5 revestido com proteína de fusão de CD44-Fc humana (12 μg/ml, 10 5 mM de Acetato, pH 4,0) na superfície. Abs anti-CD44 em concentração de 5, 3, 2, 1, 0,5 e 0,25 μg/ml foi avaliado através de método direto. Padrões de IgGI e lgG2 humanos foram usados para conferir a ligação base e não específica. Porção inicial da fase de associação e dissociação das curvas é usada para calcular as constantes de taxa de afinidade e é relata- da na TABELA 17.

TABELA 17

Dados de ligação Biacore para Anticorpos anti-CD44

Anticorpo Kd de Afinidade x k0ff de taxa de dissoci¬ Anti-CD44 10'9(M) ação x 10^ 1/s 1A9.A6.A9 0,6 5,76 2D1.A3.D12 2,01 6,53 14G9.B8.B4 4,88 52,9 EXEMPLO 6

Anticorpos Monoclonais Anti-CD44 Bloqueiam a Produção de Citocina Inflamatória de Células Mononucleares de Sangue Periférico Humano (PBMC)

Anticorpos anti-CD44 foram da mesma forma avaliados quanto a sua capacidade

de bloquear a liberação de IL-Iyff estimulada HA (Sigma, Cat. No. H5388) de PBMC humana purificada (veja FIG. 6). Sangue periférico humano foi coletado a partir de voluntários huma- nos normais em tubos vacutainer com heparina (Becton Dickinson, Cat. No. 366480). PBMCs foram isoladas usando tubos Sigma Accuspin (Sigma, Cat. No. A7054) de acordo 20 com as instruções do fabricante. As células purificadas foram lavadas duas vezes com RPMI 1640 (Gibco, Cat. No. 11875-093) e ressuspendas em 5 x 106 em RPMI e adicionadas a uma placa de ensaio de 96 poços (Costar, Cat. No.3596),100 μΙ de PBMCs por poço. As PBMCs humanas foram em seguida estimuladas por HA (Sigma, Cat. No. H1751) na pre- sença de várias concentrações de anticorpos anti-CD44 1A9.A6.B9; 2D1.A3.D12; 25 14G9.B8.B4; e 10C8.2.3 em RPMI. Especificamente, 100 μΙ de solução de matéria-prima de HA (10 μg/ml em RPMI) foram misturados com PBMCs e 20 μΙ de anticorpos anti-CD44 1A9.A6.B9; 2D1.A3.D12; 14G9.B8.B4; e 10C8.2.3 em várias concentrações. As placas de ensaio foram incubadas durante 24 horas a 37°C em atmosfera umedecida (incubadora de CO2 Narco 6300). As placas foram em seguida centrifugadas durante 10 minutos em 1200 30 rpms. Os sobrenadantes foram em seguida removidos a partir de cada poço e medidos por ELISA de IL-Iyff de acordo com o protocolo do fabricante (kit IL-1/ff Quantikine ELISA, R&D Cat. No.DLB.O). (Veja, TABELA 18).

TABELA 18

Ab monoclonal anti-CD44 no ensaio de liberação de IL-1/? usando PBMC purificada humana estimulada por HA

Clone de Anticorpo IC50 ^g/mL) 1A9.A6.A9 0,83 ±0,61 (n=6) 2D1.A3.D12 0,23 ±0,23 (n=1) 14G9.B8.B4 0,35 ± 0,02 (n=3) 10C8.2.3 0,40 (n=1) IM7 1,62 ±0,93 (n=4) 515 1,46 (n=1) EXEMPLO 7

Anticorpos Monoclonais Anti CD44 Bloqueiam a Produção de Citocina de Células T Periféricas Humanas

Anticorpos monoclonais anti-CD44 bloquearam a produção de IL-2 e IFN-γ de célu- las T periféricas humana estimuladas por anticorpos anti-CD3 e anti-CD28. Sangue periféri- co humano foi coletado de voluntários humanos normais em tubos vacutainer com heparina (Becton Dickinson, Cat. No. 366480). O sangue foi em seguida misturado com volume igual de anticorp anti-CD3 (UCTH1, R&D, Cat. No.MABIOO) e anti-CD28 (R&D, Cat. No.AF-342- PB) diluído em PBS em tubos de polipropileno Falcon (Falcon Cat. No.2059). As concentra- ções finais de anticorpos th anti-CD3 e anti-CD28 foram cerca de 1 μg/ml e 10 ng/ml respec- tivamente. Em placas de poliestireno de 96 poços (Costar, Cat. No.3596), 10 μΙ de anticor- pos anti-CD44 1A9.A6.B9; 2D1.A3.D12; e 14G9.B8.B4 em várias concentrações, foram adi- cionados a cada poço e em seguida misturados com 200 μΙ de sangue total humano que foi pré-misturado com anticorpos anti-CD3 e anti-CD28, incubados a 37°C durante 24 horas. Soro foi removido e testado por ensaios ELISA de IFN-γ e IL-2 (R&D, Cat. Nos. DIF50 e D2050, respectivamente). (Veja TABELA 19 abaixo).

TABELA 19

Abs Anti-CD44 Bloqueia a Liberação de IL-2 e IFN-γ de Sangue Periférico Humano Ativado por Anticorpos Anti-CD3 e Anti-CD28

Anticorpos Anti-CD-44 IC 50 (μς/ιτιΙ) IL-2 IFN-γ 1 A9.A6.A9 0,58 ±0,21 (n = 6) 2,46±1,46n = 7 14G9 B8.34 Inativo (n = 10) Inativo (n = 10) 2D1 WT/H38Q 0,46 ± 0,06 (n = 5) 2,45±2,2(n=2) EXEMPLO 8

Redução de Expressão de Superfície de CD44

Análises de citometria de fluxo (FACS) foram realizadas para detectar uma redução de expressão de superfície de CD44 pelo anticorpo anti-CD44. Incubamos cada anticorpo anti-CD44 com sangue total humano sob condição in vitro durante aproximadamente 12 ho- ras, e detectamos o nível de expressão de superfície de CD44 reduzido em leucócitos peri- féricos humanos (veja FIG. 7). Dez μΙ de anticorpos anti-CD44 1A9.A6.B9; 2D1.A3.D12; 14G9.B8.B4; e 10C8.2.3 em várias concentrações foram adicionados uma placa de ensaio de poliestireno de base plana de 96 poços (Costar, Cat. No.3596). Sangue periférico huma- no foi coletado de voluntários humanos normais em tubos vacutainer com heparina (Becton Dickinson, Cat. No. 366480). Cem μΙ por cavidade de sangue humano foram em seguida misturados com anti-CD44 Ab1 incubados a 37°C durante 24 horas em atmosfera umedecida (incubadora de C02 Narco 6300). Vinte μΐε de anticorpo de detecção de CD44, G-44-26-PE (BD PharMingen, Franklin Lakes, NJ, Cat. No. 555479), 10 μΙ de anticorpo anti-CD3-perCP (BD PharMingen, Cat. No. 347344) e 10 μΙ de anticorpo anti-CD 14-APC (BD PharMingen, Cat. No. 555399) foram em seguida adicionados aos poços, e mantidos em gelo durante 30 a 40 minutos no escuro. Cem μΙ de sangue foram em seguida removidos das placas e trans- feridos para tubos nunc-immuno (VWR, Chester Ocidental, PA, Cat. No. 443990) e 2 mis de solução de Iise de FACS (BD Pharmingen Cat. No. 349202) foram adicionados a uma dilui- ção de 1:10 de água, vortexados e fixados aparte durante 10 minutos em temperatura ambi- ente. Depois de 10 minutos, o sangue foi centrifugado em 1200 rpms durante 10 minutos e as células foram lavadas com tampão de lavagem de FACS (PBS, azida a 0,02%, Sigma, Cat. No. S2002 e Soro Bovino Fetal a 2% (Gibco, Cat. No. 16140-071). O sangue foi centri- fugado novamente em 1200 rpms durante 10 minutos, e lavado com tampão de lavagem de FACS. As células foram em seguida fixadas com 250 ml de paraformaldeído a 1% (Electron Microscopy Science, Cat. No. 15710) e os tubos foram lidos usando calibur de FACS e os dados foram analisados usando o software Cellquest. (Veja TABELAS 20 e 21). Figura 8 mostra os resultados de FACS em uma concentração de 10 μg/ml de anticorpo 1A9.A6.B9 para (a) Linfócitos, (b) monócitos, e (c) PMNs. O resultado do anticorpo 1A9.A6.B9 é mos- trado em cinza e a expressão da linha de referência em preto.

TABELA 20

Abs Anti-CD44 reduzem a expressão de superfície de CD44 em células CD3+ T pe- riféricas de cinomolgos e humanos

Células CD3+ T periféricas humanas Células CD3+ T periféricas de cino¬ molgos IC50 (Mg/ml) IC50 ^g/ml) 1 A9.A6.B9 2,8 ±1,3 (n=6) 0,82 ±0,16 (n=3) 14G9.B8.B4 0,93 + 0,85 (n=4) 0,39 ±0,18 (n=3) 2D1.A3.D12 >20 >20 (n=4) (n=4) 10C8.2.3 >20(n=2) IM7 1,5 ±0,71 (n=2) 9,9 (n=1) 515 Inativo* menor que 40% de inibição em 20 μ9/ηηΙ TABELA 21

1A9.A6.B9 Reduz a Expressão de CD44 em Leucócitos em Sangue Periférico de Cinomolgos e Humanos (Veja FIGS. 8A-8C)

Leucócitos IC50 ^g/ml) Humano Cinomolgos Células T 2,6 ±1,0 (n=10) 1,1 ±0,5 (n=5) Monócitos 3,3 ±0,3 (n=3) N.R. Células B 2,4± 1,1 NT. (n=4) N. R. = Nenhuma resposta

N.T. = não testado

EXEMPLO 9

Estudo in vivo em dose única de Anticorpo anti-CD44 1A9.A6.B9 Induz uma Dimi- nuição Dependente de Dose na Expressão de CD44 em Células CD3+ T Periféricas em Ma- cacos Cinomolgos

Redução de expressão de superfície de CD44 de linfócitos (veja FIG. 9A) e monóci- tos (veja FIG. 9B) induzida através de anticorpos anti-CD44, foi examinada pela administra- ção de uma única dose intravenosa de 1A9.A6.B9 (10 mg/ml em 25 mM de acetato de só- dio, 140 mM de NaCI1 0,2 mg/ml de polissorbato-80, PH5,5) em 1, 10 e 100 mg/kg (2 ani- mais machos e 2 fêmeas por grupo de dose) em macacos cinomolgos fornecidos por Char- les River Primatas, BRF (Bio Research Facility, House Texas). Amostras de sangue (~ 2 ml) foram coletadas duas vezes por venipunção femoral a partir de pré-tratamento em duas ve- zes em macacos jejuados e 2, 24, 48, 168, 336 e 504 horas pós-dose para análise citométri- ca de fluxo de três cores (CD3+, CD14+, CD44+).

Para detectar a expressão de CD44 por análise de FACS analisam, 100 μΙ de san- gue periférico foram misturado com qualquer combinação de 20 μΙ de CD14-FITC (Clone M5E2, BD-Pharm. Cat. No. 67509), 20 μΙ de CD3-PerCP (BD-Pharm, Cat. No. 13043) e 10 μΙ de CD44-PE (IM7, BD-Pharm. Cat. No. 8900), ou combinação de 20 μΙ de CD14-FITC (Clone M5E2, BD-Pharm. Cat. No. 67509), 20 μΙ de CD3-PerCP (BD-Pharm, Cat. No.

13043) e 10 μΙ de Rt lgG2b-PE (IM7, BD-Pharm. Cat. No. 60254). O anticorpo foi misturado com o sangue usando um vórtice em uma velocidade moderada a baixa durante 1 segundo.

O sangue com anticorpos foi incubado durante 20 a 30 minutos a 4 °C, adicionando 1,5 ml de 1:10 de solução de Iise de FACS (B. D. Pharmingen, San Diego, a CA) a cada tubo. Ca- da tubo foi misturado no vórtice em velocidade baixa/moderada durante 1-3 segundos. Os 10 tubos foram incubados em temperatura ambiente durante aproximadamente 12 minutos no escuro. Para garantir a Iise completa, a opacidade de cada tubo foi conferida, e um adicional de 500 μΙ de Iise de FACS foi adicionada aos tubos que pareceram nublados. Um adicional de 2 ml de tampão de mancha de BD (BD PharMingen, San Diego, CA, Cat. No. 55465C) foi adicionado; os tubos foram retampados e misturados por inversão dos tubos. Os tubos fo- 15 ram colocados em seguida em um balde oscilante e centrifugados em 250 x g durante 6-7 minutos em temperatura ambiente. As pelotas de célula foram lavadas através de tampão de mancha. Cem μΙ do tampão cytofix (PBS com 4% em p/v de paraformaldeído) foram adi- cionados às células. As amostras foram mantidas a 4°C no escuro até que elas fossem ad- quiridas no FACSCalibur. Cem ul do tampão cytofix (PBS com paraformaldeído a 4% em 20 P/V) foram adicionados às células. As amostras foram armazenadas nos tampões cytofix a 4°C no escuro. Cem ul de PBS foram adicionados a todos os tubos antes das células serem analisadas em um FACSCalibur. Um total de 20.000 eventos em linfócitos controlados foi coletado.

EXEMPLO 10 Estudos de Classificação de Epítopo

Análise de ligação de competição foi realizada usando BIAcore™.

Experiências de Mapeamento de Epítopo em BIAcore:

Mapeamento de epítopo de anticorpos de CD44, 1A9.A6.B9, 2D1.A3.D12 e 14G9.B8.B4 foi realizado conduzindo-se o ensaio de competição em BIAcore™ (veja 30 TABELA 22 para concentrações de anticorpo e mapa de epítopo da TABELA 23). O instru- mento de análise de interação bioespecífico de Biosensor (BIAcore 2000) com ressonância de plasmônio de superfície foi usado para medir as interações moleculares em um chip de sensor CM5. Mudanças nos índices refrativos entre dois meios, vidro e dextrana carboxime- tilada, causadas pela interação de moléculas à lateral de dextrana do chip de sensor, foram 35 medido e informadas como mudanças em unidades de refletância arbitrárias (RU) como detalhado nas notas de aplicação do fabricante.

A superfície de dextrana carboximetilada de uma célula de fluxo em um chip de sensor foi ativada através de derivação com 0,05 M de N-hidroxissucinimida mediada por

0,2 M de N-etil-N'-(dimetilaminopropil) carbodiimida durante 7 minutos. CD44-lg em uma concentração de 30 μ9/ιηΙ, em 10 mM de acetato de Na, pH 3,5, foi manualmente injetado na célula de fluxo em uma taxa de 5 μΙ/min e covalentemente imobilizado à superfície de 5 célula de fluxo com a quantidade desejada de RU’s. A desativação de ésteres de N- hídroxissucinimida não reagidos foi realizada usando 1M de cloridrato de etanolamina, pH 8,5. Depois da imobilização, as células de fluxo foram limpas de qualquer material não rea- gido ou pobremente ligado com 5 injeções de regeneração de 5 μΙ de 50mM de NaOH até que uma linha de referência estável seja alcançada. Célula de fluxo 2 mediu aproximada- 10 mente 62 RU e célula de fluxo 3 mediu aproximadamente 153 RU. Para célula de fluxo 1, a superfície absoluta ativada, 35 μΙ de 10mM de tampão de acetato de Na foram injetados durante a imobilização no lugar de antígeno. Célula de fluxo 4 continha aproximadamente 200 RU’s de CTLA4-lg imobilizado, um controle de antígeno irrelevante.

A experiência de mapeamento de epítopo foi realizada usando tampão de diluente/ 15 fluente (HBS-EP). A taxa de fluxo foi de 5 μΙ/min e a temperatura de instrumento foi 20°C. Depois da ligação de cada par de anticorpos, a superfície de célula de fluxo foi em seguida regenerada à linha de referência usando uma injeção de 5 μΙ de 50 mM de NaOH. Anticor- pos purificados em tampão fluente foram diluídos em 30 μg/ml e injetados em um volume de 25 μΙ.

A superfície de célula de fluxo foi saturada com um anticorpo primário e foi imedia-

tamente seguida com uma injeção de um segundo anticorpo. A ligação do segundo anticor- po foi em seguida avaliada como "ligação", "não ligação" ou "ligação parcialmente” à super- fície de CD44-lg imobilizada. Depois que uma avaliação de ligação é feita, a superfície é regenerada e o mesmo anticorpo primário é reinjetado seguido pelo próximo anticorpo no 25 painel. Este esquema de injeção é continuado até que todos os anticorpos no painel tenham sido avaliados quanto a sua ligação a CD44-lg. Outro anticorpo é escolhido como o primário e os outros anticorpos são avaliados como os anticorpos secundários que ligam-se a CD44- Ig. Especificamente, quando o anticorpo anti-CD44 14G9.B8.B4, foi testado como o anticor- po primário, ele foi co-injetado com um segundo anticorpo visto que a taxa de dissociação 30 para 14G9.B8.B4 é rápida com respeito à ligação.

Depois que todos os anticorpos foram testados como injeções primárias contra to- dos os anticorpos no painel, uma matriz reduzida que combina padrões de ligação similares em um grupo de epítopo é preparada. Um mapa topológico pode ser em seguida desenhado de acordo com a matriz reduzida. A matriz de ligação pode ser interpretada em termos de 35 um mapa de superfície topológico do antígeno, CD44-lg, mostrando interferência entre os epítopos diferentes. Um tal mapa mostra apenas relações funcionais e não necessariamente suporta qualquer correspondência à estrutura física atual da superfície de antígeno. Análise de ligação de competição em BIAcore mostrou que o epítopo reconhecido através de 1A9.A6.B9 e 14G9.B8.B4 de mAbs sobrepõe-se com o epítopo reconhecido por anticorpo 515. Além disso, o estudo em BIAcore™ mostrou que 1A9.A6.B9 e 14G9.B8.B4 mAbs não sobrepuseram-se com o anticorpo IM7.

TABELA 22

Anticorpos Concentração Final

IM7 (BD Bioscience, Lagos de Frankilin, 1,0 mg/mL

NJ, Cat. No. 553134)

515 (BD Bioscience, Cat. No. 550990) 1,0 mg/ml

1A9.A6.B9 1,5 mg/ml

14G9.B9.B4 1,0 mg/ml

TABELA 23

Mapeamento de Epítopo de Competição de Anticorpos de CD44

IM7 (BD) 1A9.A6.B9 515 (BD) 14G9.B8.B4 Rmáx IM7 (BD) X O O O 233 1A9.A6.B9 0 X X X 226 515 (BD) 0 X X X 170 14G9.B8.B4 0 X X X 144 X = competição observada O = competição não observada

EXEMPLO 11

Seletividade de Anticorpo Anti-CD44

Medimos a afinidade de ligação de anticorpo CD44 versus uma proteína receptora

1 de hiauronano de endotélios de vaso linfático (LYVE-1) (R&D, Cat. No. 2089-Ly) e consta- tamos que o anticorpo anti-CD44 tem mais que 100 vezes de seletividade para CD44 em LYVE-1 (veja TABELA 24). Uma placa ELISA de 96 poços (placa Immuno Maxisorp, Nunc Cat. No. 442404) foi revestida com 50 ng de proteína de fusão de CD44-lg ou LYVE-1 e in- cubadas durante a noite a 4°C. As placas foram em seguida lavados por PBS, 0,05% de Tween-20 e bloqueadas por BSA a 3% em PBS durante duas horas em temperatura ambi- ente. Os anticorpos anti-CD44 ou anticorpo anti-LYVE-1 (R&D, Cat. No. AF 2089) foram diluídos em BSA a 1% em PBS em várias concentrações e adicionados às placas. As placas de ELISA foram incubadas em temperatura ambiente durante 1,5 hora. As placas foram la- vadas e 50 μΙ de qualquer anticorpo de HRP de cadeia leve de capa anti-humano (Bethyl, Cat. No. A80-115P.6) para anticorpo anti-CD44 ou IgG - HRP anti-cabra para anticorpo anti- LYVE-1 (Cappel/ICN, Cat. No. 55363), diluídos 1:2000 em 1% de BSA em PBS foram adi- cionados a cada poço e incubados em temperatura ambiente durante mais uma hora. As placas foram lavadas novamente, e 50 μg/ml de TMB foram adicionados incubados durante 5 a 10 minutos. Reações de ELISA foram interrompidas com solução de interrupção e valo- res de OD450 foram medido por uma leitora de placa.

TABELA 24

Seletividade de anticorpos anti-CD44

Anticorpos CD44-lg (EC50 μg/ml) LYVE-1 (EC50 Mg/ml) 1 A9.A6.B9 0,011 nenhuma reatividade cruzada em 10 μg/ml 2D1.A3.D12 0,024 nenhuma reatividade cruzada às 10 μg/ml 14G9.B8.B4 0,018 nenhuma reatividade cruzada em 10 μg/ml LYVE-1 Ab »10 0,1 EXEMPLO 12

Estudos de Competição de Ligação de Anticorpos Anti-CD44 MEM-85 e 1A9.A6.B9 Conduzimos estudos de FACS para determinar se os anticorpos anti-CD44 huma- nos de acordo com a invenção ligam-se ao mesmo ou sítio distinto na molécula de CD44 como anticorpo anti-CD44 comercialmente disponível MEM-85 (Caltag Laboratories, Burlin- game, CA, Cat. No. MHCD4404-4).

Realizamos o ensaio de ligação de competição de CD44 com base em FACS tam- bém usado em células T periféricas humanas CD3+ e células 300-19 transduzidas com mo- lécula de CD44 humana em um vetor retroviral. Sangue periférico humano foi coletado a partir de voluntários humanos normais em tubos vacutainer com heparina (Becton Dickin- son, Cat No. 366480).

Estudo de FACS de Célula T Periférica Humana:

Sangue periférico humano foi coletado de voluntários humanos normais em tubos vacutainer com heparina (Becton Dickinson, Cat No. 366480). Adicionamos 100 μΙ de san- gue humano coletado em tubos Nunc-Immuno (VWR Cat. No. 443990), depois disso adicio- namos 10 μΙ de anti-CD44 Ab 1A9.A6.B9 em cada tubo para alcançar concentrações finais de 0,2 μg/ml a 20 μg/ml. Os tubos foram incubados durante 5 minutos em gelo. Depois da incubação de 5 minutos, adicionamos 20 μΙ de Ab de detecção de CD44 (MEM-85, Cat. No. MHCD4404-4) e anti-CD3-PerCP (BD Pharmingen, Cat. No.347344), 10 μΙ de anti-CD14- APC (BD Pharmingen, Cat. No. 555399), e 10 ml de anti-CD4-APC (BD Pharmingen Cat. No. 555349) a cada tubo e mantidos em gelo durante 30 a 40 minutos, no escuro. Adicio- namos 2 mis de solução de Iise de FACS (BD Pharmingen, Cat. No. 349202, diluídos 1:10 em água), vortexados e incubados durante 10 minutos em temperatura ambiente. Células lavadas com tampão de lavagem de FACS, (PBS Sigma Cat. No. D8537, azida a 0,02%, Sigma Cat. No. S2002 e soro de bezerro fetal a 2%, Gibco Cat. No. 16140-071) seguido por centrifugação e removemos o sobrenadante. As células foram em seguida fixadas com 250 μΙ de 1% de paraformaldeído (Electron Microscope Science, Ft Washington, PA Cat. No. 15710). Os tubos foram lidos usando Becton Dickson FACS Calibur e analisamos os dados usando CeIIQuest Pro (Becton Dickinson).

Células 300-19 Transduzidas com Estudo de FACS de Molécula de CD44 Humana: Cem mis de células 300-19 em 106 de célula/ml foram adicionadas em tubos Nunc-

Immuno (VWR. Cat. No. 443990). Células foram em seguida misturadas com 10 μΙ de Ab anti-CD44 para obter a concentração final de 0 a 10 μg/ml (veja FIG. 10A) e incubadas em gelo durante 5 minutos. Depois da incubação, adicionamos 20 μΙ de detecção de CD44 Ab MEM-85 (Caltag Laboratories, Burlingame, CA, Cat. No. MHCD4404-4) aos tubos e incuba- 10 mos as células em gelo durante 30 a 40 minutos. Lavar com tampão de lavagem de FACS (PBS Sigma D8537, azida a 0,02%, Sigma S2002 e soro de bezerro fetal a 2%, Gibco Cat. No. 16140-071). Centrifugamos em 12000 rpm durante 10 minutos e eliminamos o sobrena- dante. Fixamos as células com 250 ml de 1% de paraformaldeído (Electron Microscope Sci- ence, Ft Washington, PA Cat. No. 15710). Os tubos foram lidos usando Becton Dickson 15 FACS Calibur e analisamos os dados usando CeIIQuest Pro (Becton Dickinson).

Análise de ligação de competição de FACS mostrou que o epítopo reconhecido a- través de 1A9.A6.B9 de mAb sobrepõe com o epítopo reconhecido pelo anticorpo MEM-85, que foi mapeado ao domínio de LINK em molécula de CD44. Bajorath, J. e outro, (1998) JBC, 273:338-343 (Veja FIGS. 10A-B).

EXEMPLO 13

Duas formulações Iiofilizadas (secas por congelamento) de 1A9.A6.B9 (HIS Iio & CIT lio) foram preparadas como pela Tabela 25, abaixo. As formulações continham 20 mg/mL de 1A9.A6.B9, histidina ou tampão de citrato, polissorbato 80, EDTA, e diidrato de trealose. Uma formulação líquida (HIS líquido) foi da mesma forma preparado, como mos- 25 trado na Tabela 25 abaixo (1A9.A6.B9). A composição da formulação líquida foi: 10 mg/mL de 1A9.A6.B9, 20 mM de tampão de histidina, 0,2 mg/mL de polissorbato 80, 0,05 mg/mL de EDTA, 84 mg/mL de diidrato de trealose e 0,1 mg/mL de L-metionina.

Tabela 25: Componentes de formulação para 1A9.A6.B9 líquido e formulações Iio

Formulação 1A9.A6.B9 I Histidina (mM) Citrato (mM) PS80 (mg/mL) Trealose Sacarose EDTA (mg/mL) Metionina (mg/ml) CL (mg/mL) (mg/mL) (mg/mL) (HIS líquido) 10 5,5 20 - 0,2 84 - 0,05 0,1 (HIS lio) 20 5,5 20 - 0,2 - 80 0,05 - (CIT lio) 20 5,5 - 5 0,2 - 80 0,05 - Cada uma das formulações preparadas acima foi mantida a 2 - 8°C e aceleramos as condições de estabilidade (25 e 40°C) durante 52 semanas (a formulação Iiofilizada con- tendo tampão de citrato foi mantida apenas 22 semanas). Amostras foram analisadas em 4,

8, 13, 22 e 52 semanas. A cada ponto de tempo, as amostras foram analisadas visualmente quanto a presença de particulados, mudança na cor, e clareza. Medidas de pH foram da mesma forma administradas. A presença de agregados foi monitorada por SE-HPLC. Todas 5 as formulações testadas permaneceram visualmente claras, incolores e livres de partículas e não mostrou nenhuma mudança significante no pH. Além disso, mais que 97% de recupe- ração de monômero de mAb (< 3% de formação de agregado) foram obtidos para todas as formulações da Tabela 25, e a formulação líquida que foi testada como um controle depois de ser submetida ao armazenamento a 2 - 8°C e 25°C durante 52 semanas bem como a 10 40°C durante 22 semanas (Figura 11 a, b & c) como medido por SE-HPLC usando 2 colunas em série (GS SW3000XL e GS SW2000XL) usando uma fase móvel que é 200 mM de tam- pão de Fosfato em pH 7,0. A taxa de fluxo foi mantida em 0,7 mL/min com um tempo de funcionamento de 40 min.

Cada uma das formulações foi analisada imageando-se a focalização iso-elétrica 15 capilar (iCE) para avaliar a formação de variantes de carga de 1A9.A6.B9 (espécies ácidas, de origem, e básicas) depois de 52 semanas de armazenamento refrigerado (2-8°C) e sob condições de temperatura aceleradas (25°C durante 52 semanas bem como a 40°C durante 22 semanas). A separação destas espécies carregadas foi feita dentro de um capilar e a visualização e quantificação destas espécies usando um detector de UV e câmara de CCD. 20 Os resultados do ensaio de iCE (espécies ácidas) são ilustrados na Figura 12 a, b & c. Os resultados demonstram que todas as formulações tiveram formação de espécies ácidas si- milares depois do armazenamento a 2 - 8°C e 25°C durante 52 semanas. A 40°C as formu- lações Iiofilizadas informaram a formação de espécies ácidas mais baixas que o controle.

Cada uma das formulações foi da mesma forma analisada através de SDS-PAGE 25 para avaliar a formação de variantes de tamanho superior e inferior de mAb depois de 52 semanas de armazenamento refrigerado (2-8°C) e sob condições de estabilidade aceleradas (25°C durante 52 semanas bem como a 40°C durante 22 semanas). Este método fornece uma medida boa de pureza de mAb, incluindo níveis de formação de grampo e formação de agregado com o passar do tempo. Os resultados do ensaio de SDS-PAGE são ilustrados na 30 Tabela 26, 27 & 28.

Cada uma das formulações foi da mesma forma analisada para avaliar a formação de oxidação de metionina na posição de metionina-256 na cadeia pesada depois de 52 se- manas de armazenamento refrigerado (2-8°C) e sob condições de estabilidade aceleradas (25°C a 52 semanas ou 40°C durante 22 semanas). Os produtos de anticorpo monoclonal 35 foram digeridos com Lys-C e um fragmento de peptídeo contendo metionina e sua forma oxidada respectiva foi monitorada. Tabelas 26, 27 & 28 mostram os resultados do ensaio de oxidação de metionina. Cada uma das formulações foi da mesma forma analisada para avaliar a bioativida- de relativo depois de 52 semanas de armazenamento refrigerado (2-8°C) e sob condições de estabilidade aceleradas (25°C durante 52 semanas bem como a 40°C durante 22 sema- nas). Os resultados do ensaio de bioatividade são ilustrados nas Tabelas 26, 27 & 28.

TABELA 26: Dados de Estabilidade obtidos a 5 C

Ponto de Tem- 22 semanas 52 semanas Formulação HIS-líquido HIS-Iio CIT-Iio HIS-líquido HIS-Iio CIT-Iio SDS-PAGE % Impurezas 0,8 0,5 0,7 0,6 0,6 Não anali¬ >50K sado % de Impure¬ 0 0 0 0 0 Não anali¬ zas 25K-50K sado % de Impure¬ 0 0 0 0 0 Não anali¬ zas <25K sado % de Impure¬ 0,8 0,5 0,7 0,6 0,6 Não anali¬ zas Total sado Oxidação met-256 3,1 3,2 3,4 Não anali- Não anali- Não anali- RflHn sarln <saHn CGE REDUZIDO % de Pureza 98,8 98,7 98,8 98,7 98,8 Não anali- esarln % de Fragmen¬ 1.2 1,3 1,2 1,3 1,2 Não anali¬ to sado BioEnsaio 95% Não anali¬ Não anali¬ Não anali¬ Não anali¬ Não anali¬ sado sado sado sado sado Tabela 27: Dados de Estabilidade obtidos a 25 C

Ponto de Tem- 22 semanas 52 semanas Formulação HIS-líquido HIS-Iio CIT-Iio HIS-líquido HIS-Iio CIT-Iio SDS-PAGE % de Impure¬ 1,0 0,6 2,4 1,4 0,3 Não anali¬ zas >50K sado % de Impure¬ 0,9 0,1 0,2 0,6 0 Não anali¬ zas 25K-50K sado % de Impure¬ 0,1 0,0 0,1 0,0 0,0 Não anali¬ zas <25K sado % de Impure¬ 2,0 0,7 2,7 2,0 0,3 Não anali¬ zas sado Total Oxidação met-256 Não anali¬ Não anali¬ Não anali¬ Não anali¬ Não anali¬ Não anali¬ sado sado sado sado sado sado BioEnsaio Não anali¬ Não anali¬ Não anali¬ Não anali¬ Não anali¬ Não anali¬ sado sado sado sado sado sado Tabela 28: Dados de Estabilidade obtidos a 40 C

Ponto de Tempo 22 semanas Formulação HIS-líquido HIS-Iio CIT-Iio SDS-PAGE % de Impurezas 2,0 0,6 1,1 >50K % de Impurezas 4,1 0,2 0 25K-50K % de Impurezas 1,5 0 0 <25K % de Impurezas 7,6 0,9 1,1 Total Oxidação met-256 8,8 3,5 3,4 CGE (Reduzido) % de Pureza 91,2 98,9 98,9 % de Fragmento 8,3 1,1 1,1 BioEnsaio 86 73 92 EXEMPLO 14

Afinidade de ligação de 1A9.A6.B9 para CD44 de macaco cinomologo e humano a- través da Análise em Biacore™

Outra análise em BIAcore™ foi conduzida para demonstrar a afinidade de ligação

do anticorpo 1A9.A6.B9 em CD44 de cinomolgo e humano. CD44-lg humano (55 RU, 86 RU) e CD44-lg de cino (99 RU, 116 RU) foram imobilizados em chips CM-5 em uma concen- tração de 10 ug/ml em 10 mM de Acetato de Na pH 3.5. Concentrações variadas de 1A9.A6.B9, (100 ug/ml a 0,1 ug/ml em diluições de meio-log) foram fluídas sobre o chip em uma taxa de fluxo de 5 ul/minuto. O chip foi em seguida regenerado com 50 mM de NaOH e lavado com HBS-EP (BIAcore 22-0512-44). Análise foi realizada no Biacore 2000. Os dados 5 foram analisados usando o software BIAEvaIuation (n=2).

Tabela 29. Análise cinética de 1A9.A6.B9

Ig de CD44 Kd(x10'3) (1/s) Kd (pM) Humano 0,39 51 (n=3) Cinomolgos 0,53 150(n=3) Todas as referências citadas nesta especificação, incluindo sem limitação todos os documentos, publicações, patentes, pedidos de patente, apresentações, textos, relatórios, manuscritos, panfletos, livros, posições da internet, artigos de jornal, periódicos, folhas im- 10 pressas de fato de produto, e similares, por este meio incorporados por referência nesta especificação em suas totalidades. A discussão das referências aqui é pretendida resumir meramente as afirmações feitas pelos seus autores e nenhuma admissão é feita a qual qualquer referência constitui a técnica anterior e os requerentes reservam o direito de desa- fiar a precisão e pertinência das referências citadas.

Embora a invenção precedente tenha sido descrita em algum detalhe por meio de

ilustração e exemplo para propósitos de clareza de entendimento, ficará facilmente evidente para àqueles de capacidade ordinária na técnica levando em conta os ensinamentos desta invenção que certas mudanças e modificações podem ser feitas a isso sem afastar-se do espírito ou escopo das reivindicações anexas.

Claims (25)

1. Anticorpo humano isolado ou porção de ligação de antígeno do mesmo que es- pecificamente liga CD44 humano, CARACTERIZADO pelo fato de compreender uma se- qüência de aminoácido de domínio de variável de cadeia pesada (Vh) compreendendo uma região de CDR1, CDR2, e CDR3 selecionado a partir do grupo, consistir em: a) uma CDR1 de Vh como mencionado em SEQ ID NO: 17, uma CDR2 de Vh como mencionado em SEQ ID NO:19, e uma CDR3 de Vh como mencionado em SEQ ID NO:21; b) uma CDR1 de Vh como mencionado em SEQ ID NO:53, uma CDR2 de Vh como mencionado em SEQ ID NO:55, e uma CDR3 de Vh como mencionado em SEQ ID NO:57; c) uma CDR1 de Vh como mencionado em SEQ ID NO:89, uma CDR2 de Vh como mencionado em SEQ ID NO:91, e uma CDR3 de Vh como mencionado em SEQ ID NO:93; e d) uma CDR1 de Vh como mencionado em SEQ ID NO: 125, uma CDR2 de Vh co- mo mencionado em SEQ ID NO:127, uma CDR3 de Vh como mencionado em SEQ ID NO:129.

2. Anticorpo humano isolado ou porção de ligação de antígeno, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de também compreender uma seqüência de aminoácido de domínio de variável de cadeia leve (Vl) compreendendo uma região de CDR1, CDR2, e CDR3 selecionado a partir do grupo, consistir em: a) uma CDR1 de Vl como mencionado em SEQ ID NOs:23, uma CDR2 de Vl como mencionado em SEQ ID NOs:25, e uma CDR3 de Vl como mencionado em SEQ ID NO:27; b) uma CDR1 de Vl como mencionado em SEQ ID NOs:59, uma CDR2 de Vl como mencionado em SEQ ID NOs:61, e uma CDR3 de Vl como mencionado em SEQ ID NO:63; c) uma CDR1 de Vl como mencionado em SEQ ID NOs:95, uma CDR2 de Vl como mencionado em SEQ ID NOs:97, e uma CDR3 de Vl como mencionado em SEQ ID NO:99; e d) uma CDR1 de Vl como mencionado em SEQ ID NOs: 131, uma CDR2 de Vl como mencionado em SEQ ID NOs: 133, e uma CDR3 de Vl como mencionado em SEQ ID NO: 135.

3. Anticorpo isolado ou porção de ligação de antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato de compreender uma CDR1 de Vh menciona- da em SEQ ID NO:17, uma CDR2 de Vh como mencionado em SEQ ID NO: 19, uma CDR3 de Vh como mencionado em SEQ ID NO:21, uma CDR1 de Vl como mencionado em SEQ ID NO:23, uma CDR2 de Vl como mencionado em SEQ ID NO:25, e uma CDR3 de Vl como mencionado em SEQ ID NO:27.

4. Anticorpo isolado ou porção de ligação de antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato de compreender uma CDR1 de Vh menciona- da em SEQ ID NO:89, uma CDR2 de Vh como mencionado em SEQ ID N0.91, uma CDR3 de Vh como mencionado em SEQ ID N093, uma CDR1 de Vl como mencionado em SEQ ID NO:95, uma CDR2 de Vl como mencionado em SEQ ID NO:97, e uma CDR3 de Vl como mencionado em SEQ ID NO:99.

5. Anticorpo ou porção de ligação de antígeno do mesmo, de acordo com a reivindi- cação 1, CARACTERIZADO pelo fato da seqüência de aminoácido de domínio de Vh ser selecionada a partir do grupo que consiste em: SEQ ID NOs: 11, 47, 83 e 119, ou diferir-se de qualquer uma dentre SEQ ID NOs: 11, 47, 83 e 119 tendo uma substituição de aminoáci- do conservadora.

6. Anticorpo ou porção de ligação de antígeno do mesmo, de acordo com a reivindi- cação 1, CARACTERIZADO pelo fato de compreender um domínio de Vh que é pelo menos 95% idêntico na seqüência de aminoácido a qualquer uma dentre SEQ ID NOs:11, 47, 83 e 119.

7. Anticorpo ou porção de ligação de antígeno do mesmo, de acordo com a reivindi- cação 2, CARACTERIZADO pelo fato da seqüência de aminoácido de domínio de Vl ser selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 15, 51, 87 e 123, ou diferir-se a partir de qualquer uma dentre SEQ ID NOs: 15, 51, 87 e 123 tendo uma substituição de a- minoácido conservadora.

8. Anticorpo ou porção de ligação de antígeno do mesmo, de acordo com a reivindi- cação 2, CARACTERIZADO pelo fato de compreender um domínio de Vl que é pelo menos 95% idêntico na seqüência de aminoácido a qualquer uma dentre SEQ ID NOs:15, 51, 87 e 123.

9. Anticorpo ou porção de ligação de antígeno do mesmo, de acordo com a reivindi- cação 7, CARACTERIZADO pelo fato da seqüência de aminoácido de domínio de (Vh) e a seqüência de aminoácido de domínio de (Vl) ser selecionadas a partir do grupo que consiste em: a) um domínio de Vh como mencionado em SEQ ID ΝΟ.Ί1 e um domínio de Vl co- mo mencionado em SEQ ID NO: 15; b) um domínio de Vh como mencionado em SEQ ID NO:47 e um domínio de Vl co- mo mencionado em SEQ ID NO:51; c) um domínio de Vh como mencionado em SEQ ID NO:83 e um domínio de Vl co- mo mencionado em SEQ ID NO:87; e d) um domínio de Vh como mencionado em SEQ ID NO.H9 e um domínio de Vl como mencionado em SEQ ID NO:123.

10. Anticorpo ou porção de ligação de antígeno do mesmo, de acordo com a reivin- dicação 9, CARACTERIZADO pelo fato de compreender um domínio de Vh como mencio- nado em SEQ ID NO:11 e um domínio de Vl como mencionado em SEQ ID NO:15.

11. Anticorpo ou porção de ligação de antígeno do mesmo, de acordo com a reivin- dicação 9, CARACTERIZADO pelo fato de compreender um domínio de Vh como mencio- nado em SEQ ID NO:83 e um domínio de Vl como mencionado em SEQ ID NO:87.

12. Anticorpo humano isolado que especificamente liga-se a CD44, CARACTERIZADO pelo fato de compreender uma seqüência de aminoácido de cadeia pe- sada e uma seqüência de aminoácido de cadeia leve selecionadas a partir do grupo que consiste em: a) uma cadeia pesada como mencionado em SEQ ID NO:9, e uma cadeia leve co- mo mencionado em SEQ ID NO:13; b) uma cadeia pesada como mencionado em SEQ ID NO:45, e uma cadeia leve como mencionado em SEQ ID NO:49; c) uma cadeia pesada como mencionado em SEQ ID NO:81, e uma cadeia leve como mencionado em SEQ ID NO:85; e d) uma cadeia pesada como mencionado em SEQ ID NO: 117, e uma cadeia leve como mencionado em SEQ ID NO:121.

13. Anticorpo humano isolado ou porção de ligação de antígeno do mesmo, de a- cordo com a reivindicação 12, CARACTERIZADO pelo fato de compreender uma cadeia pesada como mencionado em SEQ ID NO:9 e uma cadeia leve como mencionado em SEQ ID NO: 13.

14. Anticorpo humano isolado ou porção de ligação de antígeno do mesmo, de a- cordo com a reivindicação 12, CARACTERIZADO pelo fato de compreender uma cadeia pesada como mencionado em SEQ ID NO:9 e uma cadeia leve como mencionado em SEQ ID NO: 13.

15. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 9, CARACTERIZADO pelo fato de ser um IgG.

16. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 15, CARACTERIZADO pelo fato do IgG ser um IgG2.

17. Composição farmacêutica, CARACTERIZADA pelo fato de compreender a por- ção de ligação de antígeno ou anticorpo, de acordo com a reivindicação 1 e opcionalmente um veículo farmaceuticamente aceitável.

18. Método de tratar, prevenir ou aliviar os sintomas de um distúrbio mediado por CD44 em um indivíduo em necessidade do mesmo com uma porção de ligação de antígeno ou anticorpo de anti-CD44 do mesmo, CARACTERIZADO pelo fato de compreender a etapa de administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de uma porção de ligação de antígeno ou anticorpo, de acordo com a reivindicação 1.

19. Método de tratamento, de acordo com a reivindicação 17, CARACTERIZADO pelo fato do distúrbio mediado por CD44 ser uma doença inflamatória ou autoimune.

20. Método de tratamento, de acordo com a reivindicação 18, CARACTERIZADO pelo fato da doença ser selecionada a partir do grupo que consiste em artrite reumatóide, artrite reumatóide juvenil, aterosclerose, doença granulomatosa, esclerose múltipla, asma, doença de Crohn, espondilite ancilosante, artrite psoriática, psoríase de placa e câncer.

21. Molécula de ácido nucléico isolada, CARACTERIZADA pelo fato de compreen- der uma seqüência de nucleotídeo que codifica a cadeia pesada ou uma porção de ligação de antígeno da mesma e/ou a cadeia leve ou uma porção de ligação de antígeno da mesma de um anticorpo, de acordo com a reivindicação 1.

22. Vetor compreendendo a molécula de ácido nucléico, de acordo com a reivindi- cação 21, CARACTERIZADO pelo fato do vetor opcionalmente compreender uma seqüên- cia de controle de expressão operavelmente ligada à molécula de ácido nucléico.

23. Célula hospedeira, CARACTERIZADA pelo fato de compreender o vetor, de acordo com a reivindicação 22.

24. Linhagem celular de hibridoma que produz um anticorpo humano, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato do hibridoma ser selecionado a partir do grupo que consiste em 2D1.A3.D12 (ATCC No.PTA-6929) (LN 15920), 1A9.A6.B9 (ATCC No.PTA-6927) (LN 15922) e 14G9.B8.B4 (ATCC No.PTA-6928) (LN 15921).

25.Linhagem celular de hibridoma, de acordo com a reivindicação 24, CARACTERIZADA pelo fato do hibridoma ser 1A9.A6.B9 (ATCC No.PTA-6927) (LN 15922).