RS20070164A - Polu-meki imunostimulatorni oligonukleotidi c-klase - Google Patents

Polu-meki imunostimulatorni oligonukleotidi c-klase

Info

Publication number
RS20070164A
RS20070164A RSP-2007/0164A RSP20070164A RS20070164A RS 20070164 A RS20070164 A RS 20070164A RS P20070164 A RSP20070164 A RS P20070164A RS 20070164 A RS20070164 A RS 20070164A
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
oligonucleotide
seq
oligonucleotides
free
phosphodiester
Prior art date
Application number
RSP-2007/0164A
Other languages
English (en)
Inventor
Jorg Vollmer
Ulrike Samulowitz
Eugen Uhlmann
Arthur M. Krieg
Original Assignee
COLEY PHARMACEUTICAL GmbH.,
Coley Pharmaceutical Group Inc.,
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by COLEY PHARMACEUTICAL GmbH.,, Coley Pharmaceutical Group Inc., filed Critical COLEY PHARMACEUTICAL GmbH.,
Publication of RS20070164A publication Critical patent/RS20070164A/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/117—Nucleic acids having immunomodulatory properties, e.g. containing CpG-motifs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0043—Nose
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/007—Pulmonary tract; Aromatherapy
    • A61K9/0073—Sprays or powders for inhalation; Aerolised or nebulised preparations generated by other means than thermal energy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C07H21/02—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with ribosyl as saccharide radical
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55561—CpG containing adjuvants; Oligonucleotide containing adjuvants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/17—Immunomodulatory nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/315—Phosphorothioates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/34—Spatial arrangement of the modifications
    • C12N2310/345—Spatial arrangement of the modifications having at least two different backbone modifications

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Otolaryngology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

Predmetni pronalazak se odnosi na specifične polu-meke CpG imunostimulatorne oligonukleotide C-klase koji su korisni za stimulaciju imunskog odgovora. Naročito ovi nukleotidi su korisni za lečenje alergije, kao što je alergijski rinitis i astma, kancer i infektivne bolesti, kao što je hepatitis C.

Description

POLU-MEKI IMUNOSTIMULATORNIx0U^ONUKE^QTIDlb-KLASE
Oblast<p>ronalaska
Predmetni pronalazak se uošteno odnosi na imunostimulatorne oligonukleotide sa smanjenim renalnim inflamatornim efektima, njihovi preparate i postupke za primenu imunostimulatornih oligonukelotida. Detaljnije, imunostimulatorni oligonukelotidi su polu-meki oligonukleotidi C-klase koji su posebno efikasni u lečenju alergije i astme, raka i infektivnih bolesti.
Stanje tehnike
Bakterijska DNK ima imunostimulatorne efekte na aktivaciju B-ćelija i prirodnih ćelija ubica, za razliku DNK vertebrata (Tokunaga, T., et al., 1988. Jpn. J. Kancer Res. 79:682-686; Tokunaga, T., et al., 1984, JNCI 72:955-962; Messina, J.P., et al., 1991, J. immunol. 147:1759-1764; i reviewed in Krieg, 1998, In: Applied Oligonukleotide Technologv, CA. Stein i A.M. Krieg, (Eds.), John Wiley i Sons, Inc., New York, NY, pp. 431-448). Sada je poznato da su ovi imuno stimulatroni efekti bakterijske DNK rezultat prisustva nemetilovanih CpG dinukleotida u posebnom kontekstu baza (CpG motivi), koji su uobičajeni u bakterijskoj DNK, ali metilovani i nedovoljno predstavljeni u DNK vertebrata (Krieg et al, 1995 Nature 374:546-549; Krieg, 1999 Biochim. Biophvs. Acta 93321 : 1-10). Imuno stimulatorni efekat bakterijske DNK se može oponašati sintetičkim oligodezoksinukleotidima (ODN) koji sadrže motive CpG. Ovakvi ODN CpG imaju visoko stimulatorni efekat na humane leukocite i leukocite glodara, indukujućo proliferaciju B ćelija; sekreciju citokina i imunoglobulina; liznu aktivnost prirodnih ćelija ubica (NK) i sekreciju IFN-v; i aktivaciju dendritnih ćelija (DC) i drugih antgena prisutnih u ćelijama radi ekprimiranja kostimulatornih molekula i sekrecije citokina, posebno citokina sličnih Th1 koji su važni za stimulisanje razvoja odgovra T ćelija sličnih Th1. Ovi imunostimulatroni efekti nativnih fosfodiestarskih osnova ODN CpG su visoko CpG specifični tako da su efekti dramatično smanjeni ukoliko je CpG motiv metilovan(Krieg et al, 1995 Nature 374:546-549; Hartmann et al, 1999 Proc. Natl. Acad. Sci USA 96:9305-10).
U ranijim ispitivanjim, smatralo se da je imuno stimulatorni motiv CpG onaj za kojim sledi formula purin-purin-CpG-pirimidin-pirimidin (Krieg et al, 1995 Nature 374:546-549; Pisetskv, 1996 J. Immunol. 156:421-423; Hackeretal., 1998 EMBO J. 17:6230-6240; Lipford et al, 1998 Trends in Microbiol. 6:496-500). Međutim, nije jasno mišiji limfociti sasvim dobro reaguju na fosfodiestar motive CpG koji ne dozvoljavaju ovu "formulu" (Yi et al., 1998 J. Immunol. 160:5898-5906), a isto važi i za humane B ćelije i dendritne ćelije (Hartmann et al, 1999 Proc. Natl. Acad. Sci USA 96:9305-10; Liang, 1996 J. Clin. Invest. 98:1119-1129).
Nedavno je opisano nekoliko različitih klasa CpG oligonukleotida. Jedna klasa je snažno aktivira B ćelije, ali relativno je slaba za indukciju IFN-a i aktivaciju NK ćelija; ova klasa je označena kao B-klasa. B klasa CpG oligonukleotida je obično potpuno stabilizovana i obuhvata nemetilovan CpG dinukleotid sa određenim preferetnim sadržajem baza. Videti npr. U.S. Patent Nos. 6,194,388; 6,207,646; 6,214,806; 6,218,371; 6,239,116 i 6,339,068. Sledeća klasa CgG oligonukleotida aktivira B ćelije i NK ćelije i indukuje IFN-a; ova klasa je označena kao C-klasa. C klasa CpG oligonukelotida, prvo okarakterisana, obično je poptuno stabilizovana, obuhvata sekvencu tipa B klase i palindrom bogat sa CG ili blizak palindromu. Ova klasa je opisana kao US. Patentna priajva u toku US 10/224,523 podneta 19 Avgusta 2002 i srodna PCT Patent Application PCT/US02/26468 objavljena kao International Publication Number.VVO 03/015711,
Opis pronalaska
Otkriveno je da imunostimulatrne osobine specifične C-klase CpG oligonukleotida sa selektivnom inkluzijom jedne ili više nestabilizovanih linkova između određenih oligonukleotida koji imaju značajnu aktivnost i posebno su korisni za lečenje alergije ili astme. Nestabilizovani linkovi su preferentno prirodne veze, tj. fosfodiestarske veze ili vezele slične fosfodiestarskim vezama. Ne stabilizovani linkovi su obično, ali ne i obvazno, relativno suscpetibilni destvu nukleaze. Imunostimulatorni oligonukleotidi predmetnog pronalaska sadrže bar jedan nestabilizovan link smešten između 5'C i susednog 3'G, gde su i 5'C i 3'G unutra[nji nukelotidi.
Imunostimulatorni oligonukleotidi predmetnog pronalaska su korisni za indukovanje Th1 slične imune reakcije. Shodno tome, imunostimulatroni oligonukleotidi predmetnog pronalaska su korisni kao adjuvansi za vakcinaciju i korisni su za lečenje kancera, infektivnih bolesti, alergije i astme. Veruje se da se posebno korisni u lečenju stanja koja zahtevaju produženu ili ponovljivu administraciju imunostimulatornog oligonukleotida iz bilo kog razloga, a naričito su korisni za lečenje astme i alergijskih oboljenja kao što je alergijski rinitis.
Predmetni pronalazak se odnosi na imunostimulatorne oligonukleotide sa CpG. U jednom aspektu pronalaska. Jednam aspekt pronalaska se odnosi na oligonukleotid formule: 5' TCJJX1C-G X2N1X3C-GN2CG 3'(SEQ ID NO: 26). Oligonukleotid sadrži najmanje 2 stabilizovana internukleotidna linka."_" predstavlja fosfodiestarski ili sličan fosfodiestar-sličan intemukleotidni link. Nhpredstavlja nukleotide dužine 0-3, N2predstavlja nukleotide dužine 0-9 gde se N odnosi na bilo koji nukleotid. Xl X2, i X3su bilo koji nukleotid. U nekim realizacijama Xi, X2, i X3su T.
U nekim realizacijama, oligonukleotid može da sadrži 5' TC-GTC-GTNiTC-GGCGCNiGCCG 3'(SEQ ID NO: 27). U jednoj od realizacija, oligonukleotid može da sadrži 5' T<*>C_G<*>T<*>C_G<*>T<*>N1<*>T<*>C_G<*>G<*>C<*>G<*>CN1G<*>C<*>C<*>G 3'(SEQ ID NO: 27). U nekim realizacijama Nije dužine 3 ili 2 nukleotida. U drugm realizacijama N1je dužine 0 nukleotida.
Imunostimulatorni oligonukleotid može da sadrži 5'
T<*>C_G<*>T<*>C_G<*>T<*>C_G<*>T<*>T<*>C_G<*>G<*>C<*>G<*>C_G<*>C<*>G<*>C<*>C<*>G 3'(SEQ ID NO: 2), gde<*>
predstavlja a stabilizovan intemukleotidni link. Po potrebi, kada je posebno naznačeno, 5' se odnosi na slobodni 5' kraj oligonukleotida i 3' može da se odnosi na slobodan 3' kraj oligonukleotida.
U sledećoj realizaciji imunostimulatorni oligonukleotid može da sadrži 5' T<*>C_G<*>T<*>C_G<*>T<*>T<*>C_G<*>G<*>C<*>G<*>C<*>G<*>C<*>C<*>G 3'(SEQ ID NO: 3), gde<*>predstavlja stabilizovani intemukleotidni link. Po potrebi, kada je posebno naglašeno, 5 ' može da se odnosi na slobodan 5' kraj oligonukleotida i 3' može da se odnosi na slobodan 3' kraj oligonukleotida.
U narednom aspektu, imunostimulatorni oligonukleotid ima sledeću formulu TC_G X1C-G X2C-G X3TC-GGCGC-G N33 '(SEQ ID NO: 28). N3 je dužine 1-5 nukleotida, gde se N odnosi na bilo koji nukleotid. U jednom realizaciji N3je 5 nukleotida. X1(X2, i X3su bilo koji nukleotid. U određenim realizacijama X1i X3su T.
U jednoj realizaciji, oligonukleotid može da sadrži 5'
TC_GTC_GAC_GATC_GGCGC_GCGCCG3 ' (SEQ ID NO: 4), gde oligonukleotid sadrži najmanje 2 stabilizovana internukleotidna linka i _ predstavlja fosfodiestar ili fosfodiestar-sličan intemukleotidni link. U jednoj realizaciji oligonukleotid može da sadrži 5' TC_G<*>T<*>C_G<*>A<*>C_G<*>A<*>T<*>C_G<*>G<*>C<*>G<*>C_G<*>C<*>G<*>C<*>C<*>G 3' (SEQ ID NO: 4). Po potrebi, kada je posebno naglašeno, 5' može da se odnosi na slobodan 5' kraj oligonukleotida i 3' može da se odnosi na slobodan 3' kraj oligonukleotida.
Prema sledećem aspektu pronalaska, dat je imunostimulatorni oligonukleotid formule: 5' TTC-GX2C-GN1X1.GX3C-GTT 3' (SEQ ID NO: 24). Oligonukleotid sadrži namanje 2 stabilizovana internukleotidna linka i _ predstavlja fosfodiestar ili fosfodiestar-sličan intemukleotidni link. N-ije dužine 1-3 nukleotida, gde se N odnosi na bilo koji nukleotid.X^je pirimidin. X2i X3su bilo koji nukleotidi. U nekim realizacijama X2i X3su T.
U jednom pristupu oligonukleotid može da sadrži 5' TTC_GTC_GTTTX1_GTC_GTT 3'
(SEQ ID NO: 25). U sledećoj realizaciji, oligonukleotid može da sadrži 5' T<*>T<*>C_G<*>T<*>C_G<*>T<*>T<*>rX,_G<*>T<*>C_G<*>T<*>T 3' (SEQ ID NO: 25). U nekim realizacijama, Xije T ili C.
Oligonukleotid može da sadrži 5' T<*>T<*>C_G<*>T<*>C_G<*>T<*>T<*>T<*>T_G<*>T<*>C_G<*>T<*>T 3' (SEQ ID NO: 5), gde<*>predstavlja stabilizovan intemukleotidni link. Po potrebi, kada je posebno naznačeno, 5' može da se odnosi na slobodan 5' kraj oligonukleotida i 3' može da se odnosi na slobodan 3' kraj oligonukleotida.
Oligonukleotid moež da sasrži 5' T<*>T<*>T<*>C_G<*>T<*>C_G<*>T<*>T<*>T<*>C_G<*>T<*>C_G<*>T<*>T 3'(SEQ ID NO: 6), gde<*>predstavlja stabilizovan intemukleotidni link. Po potrebi, kada je posebno naznačeno, 5' može da se odnosi na slobodan 5' kraj oligonukleotida i 3' može da se odnosi na slobodan 3' kraj oligonukleotida. U nekim aspektima pronalaska, oligonukleotid ima jednu od sledećih formula TCGTCGTTCGGCGCGCCG(SEQ IDNO: 3), TCGTCGTCGTTCGGCGCGCGCCG(SEQ IDNO: 2), TCGTCGACGATCGGCGCGCGCCG(SEQ IDNO: 4), TTCGTCGTTTTGTCGTT.(SEQ IDNO: 5), ili TTTCGTCGTTTCGTCGTT.
(SEQ IDNO: 6)
U sledećem aspektu pronalaska oligonukleotid ima jednu od sledećih formula
TCGTCGTC, CGTCGTCG, GTCGTCGT, TCGTCGTT, CGTCGTTC, GTCGTTCG, TCGTTCGG, CGTTCGGC, GTTCGGCG, TTCGGCGC, TCGGCGCG, CGGCGCGC,
GGCGCGCG, GCGCGCGC, CGCGCGCC, ili GCGCGCCG. U drugim aspektima pronalaska, oligonukleotid ima jednu od sledećih formula T<*>C_G<*>T<*>C_G<*>T<*>C,
C_G<*>T<*>C_G<*>T<*>C_G, G<*>T<*>C_G<*>T<*>C_G<*>T, T<*>C_G<*>T<*>C_G<*>T<*>T, C_G<*>T<*>C_G<*>T<*>T<*>C, G*T*C_G*T*T*C_G, T*C_G*T*T*C_G*G, C_G<*>T<*>T<*>C_G<*>G<*>C, G<*>T<*>T<*>C_G<*>G<*>C<*>G, T*T*C_G*G*C*G*C, T*C_G*G*C*G*C_G, C_G*G*C*G*C_G*C, G*G*C*G*C_G*C*G, G*C*G*C_G*C*G*C, C*G*C_G*C*G*C*C, ili G*C_G*C*G*C*C*G.
U drugim aspektima pronalaska, oligonukleotide sadrži: T<*>C_G<*>T<*>C_G<*>T<*>C, gde<*>predstavlja stabilizovan intemukleotidni link i _ predstavlja fosfodiestar ili fosfodiestar-sličan intemukleotidni link. Po potrebi oligonukleotid može da bude 5' t<*>C-G<*>T<*>C-G<*>T<*>C-G<*>T<*>T<*>C-G<*>G<*>C<*>G<*>C- G<*>C<*>G<*>C<*>C 3' (SEQ ID NO.: 21), 5' T<*>C-G<*>T<*>C-G<*>T<*>C-G<*>T<*>T<*>C-G<*>G<*>C<*>G<*>C 3"
(SEQ ID NO.: 22),ili 5' T<*>C-G<*>T<*>C-G<*>T<*>C-G<*>T<*>T<*>C-G<*>G<*>C<*>G<*>C-G<*>C<*>G<*>C 3' (SEQ ID NO.: 23), gde se 5' odnosi na slobodan 5' kraj oligonukleotida i 3' se odnosi na slobodan 3' kraj oligonukleotida. U drugim aspektima oligonukleotid sadrži: T<*>C_G<*>T<*>T<*>C_G<*>G, gde<*>predstavlja stabilizovan intemukleotidni link i _ predstavlja fosfodiestar ili fosfodiestar-slična intemukleotidni link. Po potrebi oligonukleotid može da bude 5' C-G<*>T<*>C-G<*>T<*>C-G<*>T<*>T<*>C-G<*>G<*>C<*>G<*>C-G<*>C<*>G<*>C<*>C<*>G 3'(SEQ IDNO.: 15), 5' G<*>C-G<*>T<*>C-G<*>T<*>T<*>C-G<*>G<*>C<*>G<*>C-G<*>C<*>G<*>C<*>C<*>G 3'(SEQ IDNO.: 16), 5" T*C-G*T*C-G*T*T*C-G*G*C*G*C-G*C*G*C*C*G 3'
(SEQ IDNO.: 17), 5' C-G<*>T<*>C-G<*>T<*>T<*>C-G<*>G<*>C<*>G<*>C-G<*>C<*>G<*>C<*>C<*>G 3'(SEQ IDNO.: 18), 5' G<*>~<P>C-G<*>T<*>T<*>C-G<*>G<*>C<*>G<*>C-G<*>C<*>G<*>C<*>C<*>G 3'(SEQ IDNO.: 19), ili 5' T<*>C- G<*>T<*>T<*>C-G<*>G<*>C<*>G<*>C-G<*>C<*>G<*>C<*>C<*>G 3'(SEQ IDNO.: 20), gde se 5" odnosi na slobodan 5' kraj oligonukleotida i 3' se odnosi na slobodan 3' kraj oligonukleotida.
Opisan je farmaceutskii preparat koji sadrži oligonukleotid pronalaska i farmaceutski prihvatljiv nosač.
U nekim realizacijama preparat je formulisan za nebulizator ili inhalator. Inhalator može biti merodozni inhalator. Alternativno inhalator je inhalator (raspršivač) praha.
U drugim realizacijama, farmaceutski preparat može da sadrži hemoterapeutski agens. U pak, narednim realizacijama, preparat može da sadrži antiviralni agens. Farmaceutskii preparat može o potrebi da sadrži farmaceutski prihvatljiv nosač formulisan za subkutalnu administraciju, oralnu administraciju ili intranazalnu administraciju.
Prema jednoj od realizacija, oligonukleotid je u farmaceutskiom preparatu koji po potrebi sadrži farmaceutski prihvatljiv nosač. U nekim realizacijama, oligonukleotide je formulisan kao aerosol.
U jednoj realizaciji, oligonukleotid sadrži i adjuvans ili citokin.
U jednoj realizaciji oligonukleotid sadrži još i antigen, pri čemu je oligonukleotid, adjuvans za vakcinu.
U jednoj realizaciji, antigen je odabran iz grupe koju čine viralni antigen, bakterijski antigen, funganil antigen, parazitski antigen, i tumorski antigen. U jednoj realizaciji, antigen je kodiran vektorom nukelinske kiseline. U jednoj realizaciji, antigen je peptidni antigen. U jednoj realizaciji, antigen je kovalentno vezan za oligonukleotid ili molekul imunostimulatorne nukelinske kiseline. U narednoj realizaciji, antigen nije kovalentno vezan za oligonukleotid ili molekul imunostimulatorne nukleinske kiseline.
U jednoj realizaciji fosfodiestar ili fosfodiestar-sličan link je fosfodiestar. U jednoj realizaciji, fosfodiestar-sličan link je boranofosfonat ili diastereomerno čist Rp fosforotioat.
U jednoj realizaciji, stabilizovan osnovni lanac obuhvata mnoštvo internukleotidnih linkova odabranih iz grupe koju čine : fosforotioat, fosforoditioat, metilfosfonat, metilfosforotioat, i njihova bilo koja kombinacija. U jednoj realizaciji, stabilizovan osnovni lanac sadrži više internukleotidnih fosforotioat linkova.
U jednoj realizaciji molekul imunostimulatorne nukleinske kiseline ima dužinu od 4-100 nukleotida.
U drugom aspektu pronalaska opisan je postupak lečenja astme administriranjem efikasne količine oligonukleotida pronalska za lečenje astme, subjektu obolelom od astme ili kod kojeg postoji rizik oboljevanja od astme.
U drugom aspektu pronalaska opisan je postupak lečenja alergije administriranjem efikasne količine efikasne količine oligonukleotida pronalska za lečenje aalergije, subjektu obolelom od alergije ili kod kojeg postoji rizik oboljevanja od alergije. U jednoj realizaciji, subjekt je oboleo od alergijskog rinitisa. U jednoj realizaciji, oligonukleotid je administeriran na mukoznu površinu. U drugoj realizaciji, oligonukleotid je administriran u boliku aerosolne formulacije. Po potrebi, oligonukleotid je administriran intranazalno.
Prema narednom aspektu pronalaska opisan je postupak indukovanja proizvodnje citokina. Postupak je izveden administriranjem subjektu ovde opisanog imunostimulatornog CpG oligonukleotida u efektivnoj količini za indukciju citokina odabranog iz grupe koju čine IL-6, IL-8, IL-12, IL-18, TNF, IFN-a, hemokini, i IFN-v.
U sledećem aspektu pronalaska opisan je preparat opisanih CpG imunostimulatornih oligonukleotida u kombinaciji sa antigenom ili drugim terapeutskim jedinjenjem, kao što je anti-mikrobialni agens. Anti-mikrobialni agena može , na primer, da bude anti-viralni agens, anti-parazitski agena, anti-bakterijski agens ili antifungalni agens.
Prema sledećem aspektu pronalaska opisan je nosač za preparat sa kontinuiranim oslobađanjem uključujući ovde opisane CpG imunostimulatorne oligonukleotide.
Preparat može po potrebi da sadrži farmaceutskii nosač ili da bude formulisan kao nosač za oslobađanje. U nekim aspektima, nosač za isporuku je odabran iz grupe koju čine katijonsk lipidi, nosači koji prodiru u ćeliju, proteini, i nosači za kontinuirano oslobađanje. U jednoj realzaciji, nosač za kontinuirano oslobađanjeje biodegradabilni polimer ili mikropartikula.
Prema narednom aspektu pronalaska, opisan je postupak stimulisanja imune reakcije. Postupak obuhvata administriranje efikasne količine CpG imunostimulatornog oligonukleotida subjektu za indukovanje imune reakcije kod subjekta. Preferentno, CpG imunostimulatorni oligonukleotid je administriran oralno, lokalno, u nosaču za kontinualnu distribuciju, mukozno, sistematski, parenteralno, ili intramuskularno. Kada je CpG imunostimulatorni oligonukleotid administriran na mukoznu površinu, može se distribuirati u količini efikasnoj za indukovanje mukoznog imunog odgovora ili sistemskog imunog odgovora. U preferentnim realziacijama, mukozna površina je odabrana iz grupe koju čine oralna, nazalna, rektalna, vaginalna, i okularna površina.
U nekim realizacijama, postupak obuvhata izlaganje subjekta antigenu pri čemu je imuna rekacija antigen-specifičan imunski odgovor. U nekim realizacijama, antigen je odabran iz grupe koju čine tumor antigen, viralni antigen, bakterijski antigen, parazitiski antigen i peptidni antigen.
CpG imunostimulatorni oligonukleotidi mogu da izazovu širok spektar imunskih odgovora. Na primer ovi CpG imunostimulatorni oligonukleotidi mogu se upotrebiti za preusmeravanje Th2 na Th1 imunski odgovor. CpG imunostimulatorni oligonukleotidi takođe se mogu koristiti za aktivaciju imunih ćelija, kao što je limfocitna ćelija (npr., B i T ćelije), dendritna ćelija, i NK ćelija. Aktivacija se može izvestiin vivo, in w'fro,ili ex vivo,tj., izolovanjem imune ćelije iz subjekta, povezivanjem imune ćelija sa efikasnom količinom za aktivaciju imune ćelije CpG imunostimulatorog oligonukleotida i re-administriranje aktivirane imune ćelije subjektu. U nekim realizacijama, dendritna ćelija predstavlja antigen kancera. Dendritna ćelija se možeex vivoizložiti antigenu kancera.
Imunski odgovor izazvan pomoću CpG imunostimulatornih oligonukleotida može takođe da rezultuje u indukciji stvaranja citokina, npr., proizvodnja IL-6, IL-8, IL-12, IL-18, TNF, IFN-a, hemokina, i IFN-v.
U narednoj realizaciji opisani su CpG imunostimulatorni oligonukleotidi koji su korisni za lečenje kancera. Prema drugim aspektima pronalaska, CpG imunostimulatorni oligonukleotidi su takođe korisni u prevenciji kancera (npr., smanjenjem rizika ravvoja kancera) kod subjekta koji je pod rizikom od razvoja kancera. Kancer može biti jedan od kancera žuči, rak dojke, rak grlića materice, horiokarcinoma, kancer debelog creva, endometrijski kancer, rak želuca, intraepitelialne neoplazme, limfome, rak jetre, rak pluća (npr. malih ćelija i ne-malih ćelija), melanom, neuroblastomi, rak usta, rak jajnika, rak pankresa, rak prostate, rektalni kancer j sarkomr, raktiroide, i kancer bubrega, kao i drugi karcinomi i sarkomi. U nekim važnim realizacijama, kancer odabran iz sledeće grupe koju čine rak kostiju, mozga i CNS-a, rak veznog tkiva, rak esofagusa, rak oka, Hodgkin's-ov limfom, rak larinksa, rak usne šupljine, rak kože, i rak testisa.
CpG imunostimulatorni oligonukleotidi se takođe mogu koristiti za povećanje odgovaranja ćelija raka na terapiju (npr., anti-kancer terapija), po potrebi kada je CpG imunostimulatorni oligonukleotid administriran u kombinaciji sa anti-kancer terapijom. Anti-kancer terapija može biti hemoterapija, vakcina (npr.,in vitronapunjena vakcina dendritne ćelije ili vakcina antigen kancera) ili terapija zasnovana da antitelu. Ova terapija takođe može da obuhvati i administriranje antitela specifičnog za antigen površine ćelija , na primer, ćelije kancera (raka), pri čemu imuna rakcija rezultuje u antitelo zavisnoj celularnoj citotoksičnosti (ADCC). U jednoj realizaciji, antitelo se može odabrati iz grupe koju čine Ributaxin, Herceptin, Ouadramet, Panorex, IDEC-Y2B8, BEC2, C225, Oncolvm, SMART M195, ATRAGEN, Ovarex, Bexxar, LDP-03, iort6, MDX-210, MDX-11, MDX-22, OV103, 3622VV94, anti-VEGF, Zenapax, MDX-220, MDX-447, MELIMMUNE-2, MELIMMUNE-I, CEACIDE, Pretarget, NovoMAb-G2, TNT, Gliomab-H, GNI-250, EMD-72000, LymphoCide, CMA 676, Monopharm-C, 4B5, ioregf.r3, ior c5, BABS, anti-FLK-2, MDX-260, ANA Ab, SMART IDIO Ab, SMART ABL 364 Ab i ImmuRAIT-CEA.
Tako, prema nekim aspektima pronalaska, subjektu obolom od kancera ili koji je pod rizikom od oboljevana od kancera je administriran CpG imunostimulatorni oligonukleotid i anti-kancer terapija. U nekim realizacijama, anti-kancer terapija je odabrana iz grupe koju čine hemoterapeutski agens, imunoterapeutski agens i vakcina protiv kancera. U nekim realizacijama lek protiv kancera je taksol ili kombinacija karboplatina i paklitaksela.
U sledećoj realizaciji opisani su postupci usmereni ka prevenciji ili lečenju kancera, subjektu se može administrirati i interferon-a.
Prema drugim aspektima pronalazak se odnosi na postupke za prevenciju bolesti kod subjekta. Postupak obuhvata administriranje subjektu CpG imunostimulatornog oligonukleotida na regularnoj osnovi da bi se pokrenule reakcije imunog sistema radi sprečavanja stvaranja bolesti kod subjekta. Primeri oboljenja ili stanja koja se mogu sprečiti primenom profilaktičkih postupaka predmetnog pronalaska su infekcije izazvane mikrobima (npr., seksualno prenosive boelsti) i anafilaktički šok od alergija izazvanih hranom.
U sledećim aspektima, pronalazak je postupak za indukciju prirodnog imunog odgovora administriranjem subjektu CpG imunostimulatorni oligonukleotid u količini koja je efikasna za aktivaciju prirodnog imunog odgovora.
Prema drugom aspektupronalaska dat je psotupak lečenja ili prevencije viralne ili retroviralne infekcije. Postupak obuhvata administriranje efikasne količine za tretiranje ili prevenciju viralne ili retroviralne infekcije bilo kog preparata pronalaska subjektu obolelom ili pod rizikom od oboljevanja od viralne ili retroviralne infekcije. U nekim realizacijama virus je izazvan virusom hepatitisa npr., hepatitisa B, hepatitisa C, HIV, herpesa virus, ili papillomavirusa.
U narednom aspektu pronalaska opisan je postupak za lečenje ili prevenciju bakterijskih infekcija. Postupak obuhvata administriranje efikasne količine za tretiranje ili prevenciju bakterijske infekcije bilo kog preparata pronalaska subjektu obolelom ili pod rizikom od oboljevanja od bakterijske infekcije. U jednoj realizaciji, bakterijska infekcija je izazvana unutarćelijskom bakterijom.
U narednom aspektu pronalaska opisan je postupak za lečenje ili prevenciju infekcije izazavane parazitima administriranjem efikasne količine za tretiranje ili prevenciju infekcije izazavane parazitima bilo kog preparata pronalaska subjektu obolelom ili pod rizikom od oboljevanja od infekcije izazvane parazitima. U jednoj realizaciji, infekcija je izazvana unutarćelijskim parazitom. U drugoj realizaciji, infekcija je izazvana parazitom koji ne pripada crevnim parazitima.
U nekim realizacijama subjekt je čovek dok je u drugim realizacijama subjekt nehumani kičmenjak (vertebrat) selected iz grupe koju čine pas, mačka, konj, krava, svinja, ćurka, jarac, riba, majmun, pile, pacov, miš, i ovca.
U narednom aspektu pronalaska opisan je postupak za indukciju TH1 imunog odgovora administriranjem subjektu bilo kojeg preparata pronalaska u količini koja je efektivna da izazove TH1 imunu reakciju.
U drugom aspektu, pronalazak se odnosi na postupak za lečenje autoimune bolesti administriranjem efikasne količine za tretiranje ili prevenciju autoimune bolesti bilo kog preparata pronalaska subjektu obolelom ili pod rizikom od oboljevanja od autoimune bolesti.
U narednim realizacijama oligonukleotid je je distribuiran subjektu u količini efektivnoj da indukuje ekpresiju citokina. Po potrebi, citokin je odabran iz grupe koju čine IL-6, TNF a, IFNa, IFNv i IP-IO. U drugim realizacijama, oligonukleotid je distribuiran subjektu u količini efektivnoj da pomeri imunu reakciju na pristrasni odgovor Th1 od pristrasnog odgovora Th2.
U nekim aspektima, pronalazak se odnosi na postupak za lečenje remodelovanja disajnih puteva (adhezija bronhija), koji obuhvata: administriranje subjektu oligonukleotid koji sadrži CG dinukleotid, u količini efektivnoj za lečenje remodelovanja disajnih puteva kod subjekta. U jednoj realziaciji, subjekt je oboleo od astme, hronične opstruktivne boelsti pluća ili je pušač. U drugim realizacijama subjekt ne pokazuje simptome astme.
Primena oligonukleotida pronalaska za stimulaciju imune reakcije je takođe dat kao aspekt pronalaska.
Takođe je opisana i primena oligonukleotida pronalaska za proizvodnju leka za stimulaciju imune reakcije kao i izvođenje bilo kog od postupaka pronalaska.
Svako ograničenje pronalaska može da prati različite realizacije pronalaska, shodno tome, očekivano je da svako od ovih ograničenja pronalaska uključuje bilo koji element ili kombinaciju može da bude obuhvaćeno u svkom aspektu pronalaska.
Kratak o<p>is slika
Slika 1 je serija grafika koji opisuju indukciju IFN-alfa humanim PBMC tretiranim pomoću CpG ODN.
Slika 2 je serija grafika koji opisuju efekte CpG oligodezoksinukleotida SEQ ID NO. 7 protiv antigen-indukovanog povećanja nazalnog otpora kod zamoraca administrirano u dozi od (A) 1 mg/kg i (B) (0.03-0.3 mg/kg). Rezultati su dati kao srednja vrednost ± s.e.m. ((A) = n = 5-8; (B) = n = 14-15).<*>P < 0.05 poredeći sa imunskim odgovorom na izazov antigena grupe tretirane sa test nosačem (t test).
Slika 3 je serija grafika koji opisuju efekte CpG oligodezoksinukleotida SEQ ID NO. 7 na antigen-indukovano kijanje (3A) i trljanje nosa (3B) kod modela alergijskog rinitisa kod miša. Rezultati su dati kao srednja vrednost ± s.e.m. (n = 10).<*>P < 0.05 poredeći sa grupom tretiranom nosačem (Mann- Whitney test).
Slika 4 je serija grafika koji opisuju efekte titracije virusa influenze i određivanje vremenskog toka infekcije. Brojevi ćelija u bronhoalveolarnoj tečnosti lavaža. Rezultati su dati kao srednja vrednost ± s.e.m. (n=5). Miševi inficirani sa 500 EID50su žrtvovani posle 6 dana zbog gubitka težine.
Slika 5 je grafik koji opisuje zaštitne efekte CpG ODN-a na virusom opterećena pluća. Virusno opterećenje je analizirano enzimskom imunoanalizom. Rezultati su dati kao srednja vrednost ± s.e.m. (n=5-10).<*>P < 0.05 poređenjem sa grupom B (Kruskal-VVallis test, Dunn'ov post-test), n.d. = nema podataka.
Slika 6 je serija grafika koji opisuju zaštitne efekte CpG ODNa na virusom-indukovanu inflamaciju disajnih outeva merenjem ukupnih leukocita (6A), ukupnih neutrofila (6B) i ukupnih mononuklearnih ćelija (5C). Brojevi ćelija u bronhoalveolarnoj tečnosti lavaža. Rezultati su dati kao srednja vrednost ± s.e.m. (n=10).<*>P < 0.05 poređenjm sa grupom B (Kruskal-VVallis test, Dunn'ov post-test).
Slika 7 je serija grafika koji opisuju zaštitne efekte CpG ODNa na brojeve ćelija kod antigen-indukovane inflamacije disajnih puteva eozinofila (7A) i neutrofila (7B). Rezultati su dati kao srednja vrednost ± s.e.m. (n = 10-14).<*>P < 0.05 poređenjem sa imunskim odgovorom na izazov antigena grupe tretirane nosačem (Kruskal-VVallis test višestrukog poređenja, Dunn'ov post test).
Slika 8 je serija grafika koji opisuju zaštitne efekte CpG ODNa na CD3<+>(8A) i CD3<+>CD4<+>(8B) bojeve ćeija kod antigen-indukovane inflamacije disajnih puteva. Rezultati su dati kao srednja vrednost ± s.e.m. (n = 8).<*>P < 0.05 poređenjem sa imunskim odgovorom na izazov antigena grupe tretirane nosačem (Kruskal-VVallis test višestrukog poređenja, Dunn'ov post test).
Slika 9 je serija grafika koji opisuju efekte borjeva ćelija u bronhoalveolarnoj tečnosti lavaža 8 sati posle doziranja sa 0.1 mg/kg ODN (9A); 15 sati posle doziranja sa 0.1 mg/lcg ODN (9B); sati posle doziranja sa 1 mg/kg ODN (9C); i 15 sati posle doziranja sa 1 mg/kg ODN (9D). Rezultati su dati kao srednja vrednost ± s.e.m (n = 10).
Slika 10 je serija grafika koji opisuju efekte koncentracija IFN alfa u bronhoalveolarnoj tečnosti lavaža 8 sati posle doziranja sa 0.1 mg/kg ODN (10A); 15 sati posle doziranja sa 0.1 mg/kg ODN (10B); 8 sati posle doziranja sa 1 mg/kg ODN (10C); i 15 sati posle doziranja sa 1 mg/kg ODN (10D).
Slika 11 je serija grafika koji opisuju efekte koncentracija IFN gama u bronhoalveolarnoj tečnosti lavaža 8 sati posle doziranja sa 0.1 mg/kg ODN (110A); 15 sati posle doziranja sa 0.1 mg/kg ODN (1 IB); 8 sati posle doziranja sa 1 mg/kg ODN (HC); i 15 sati posle doziranja sa 1 mg/kg ODN (HD).
Slika 12 je serija grafika koji opisuju efekte koncentracija IP-IO u bronhoalveolarnoj tečnosti lavaža 8 sati posle doziranja sa 0.1 mg/kg ODN (12A); 15 sati posle doziranja sa 0.1 mg/kg ODN (12B); 8 sati posle doziranja sa 1 mg/kg ODN (12C); i 15 sati posle doziranja sa 1 mg/kg ODN (12D).
Slika 13 je serija grafika koji opisuju efekte koncentracija IL-12p40 u bronhoalveolarnoj tečnosti lavaža 8 sati posle doziranja od 0.1 mg/kg ODN (13A); 15 sati posle doziranja sa 0.1 mg/kg ODN (13B); sati posle doziranja sa 1 mg/kg ODN (13C); i 15 sati posle doziranja sa 1 mg/kg ODN (13D).
Slika 14 je serija grafika koji opisuju efekte koncentracija IL-6 u bronhoalveolarnoj tečnosti lavaža 8 sati posle doziranja sa 0.1 mg/kg ODN (14A); 15 sati posle doziranja sa 0.1 mg/kg ODN (14B); 8 sati posle doziranja sa 1 mg/kg ODN (14C); i 15 sati posle doziranja sa 1 mg/kg ODN (14D).
Slika 15 je serija grafika koji opisuju efekte koncentracija TNF alfa u bronhoalveolarnoj tečnosti lavaža 8 sati posle doziranja sa 0.1 mg/kg ODN (15A); 15 sati posle doziranja sa 0.1 mg/kg ODN (15B); 8 sati posle doziranja sa 1 mg/kg ODN (15C); i 15 sati posle doziranja sa 1 mg/kg ODN (15D).
Slika 16 je serija grafika koji opisuju efekte koncentracija IFN gama u serumu 8 sati posle doziranja sa 0.1 mg/kg ODN (16A); 15 sati posle doziranja sa 0.1 mg/kg ODN (16B); 8 sati posle doziranja sa 1 mg/kg ODN (16C); i 15 sati posle doziranja sa 1 mg/kg ODN (16D).
Slika 17 je serija grafika koji opisuju efekte koncentracija IL-6 u serumu 8 sati posle doziranja sa 0.1 mg/kg ODN (17A); 15 sati posle doziranja sa 0.1 mg/kg ODN (17B); 8 sati posle doziranja sa 1 mg/kg ODN (17C); i 15 sati posle doziranja sa 1 mg/kg ODN (17D).
Slika 18 je serija grafika koji opisuju efekte koncentracija TNF alfa u serumu 8 sati posle doziranja sa 0.1 mg/kg ODN (18A); 15 sati posle doziranja sa 0.1 mg/kg ODN (18B); 8 sati posle doziranja sa 1 mg/kg ODN (18C); i 15 sati posle doziranja sa 1 mg/kg ODN (18D).
Slika 19 je serija grafika koji opisuju efekte CpG oligodezoksinukleotida ODN SEQ ID NO: 2 i ODN SEQ ID NO: 7 na antigenom- indukovanu proizvodnju IgE (19A) i lgG2a (19B) kod miševa. Rezultati su dati kao srednja vrednost ± s.e.m. (n = 10).<*>P < 0.05 poređenjem sa antigen aktiviranim, grupom tretiranom nosačem (Kruskal-VVallis test višestrukog poređenja, Dunn'ov post test).
Slika 20 je serija grafika koji opisuju efekte ODN SEQ ID NO: 2 na influencom-indukovano pogoršanje alergijske inflamacije disajnih puteva kod miševa, opisujući ukupne leukocite (20A), eozinofile (20B), neutrofile (20C), mononuclearne ćelije (20D), i telesnu težinu (20E).
Slika 21 AHR Protocol za zamorca.
Slika 22 je serija grafika koji opisuju efekte SEQ ID NO: 7 na otpor disajnih puteva i prilgaodljivost pluća. Za svaku životinju, dobijena je kriva doza-odgovor (na dozu) i reaktivnost disajnih puteva je kvantitativno određena kao površina ispod krive. Zamorciima je intranazalno dat ili nosač (rastvor soli), sam OVA, ili SEQ ID NO:7 u koncentracijama od 10ul/kg, 30 ul/kg, 100 ul/kg, ili 300 ul/kg, i.t. Podaci pokazuju da SEQ ID NO:7 izaziva od doze zavisno smanjenje AUC-otpronosti. Slike 22A i 22B opisuju oslobađanje histamina kao funkciju povećane otpornosi disajnih puteva (22A) ili smanjenje prilagodljivsti pluća (22B). Slike 22C i 22D su grafici koji opisuju povećanje otpornosti pluća (22C) ili smanjenje prilagodljivosti pluća (22D) kao odgovor na tretman rastvorom soli, sam OVA ili SEQ ID NO 7 u naznačenim dozama.
Slika 23 predstavlja sažetak statističke analize (Slika 22) za otpornost disajnih puteva (23A) i prilagodljivost pluća (23B).
Slika 24 je serija grafika koji opisuju efekte SEQ ID NO: 2 na otpronost disajnih puteva i prilagodljivost pluća. Za svaku životinju je dobijena kriva zavisnosti doza-odgovor, i reaktivnost disajnih puteva je kvantitavisno određena kao površina ispod krive. Zamorcima je intranazalno dat ili nosač (rastvor soli), sam OVA, ili SEQ ID NO:2 u koncentracijama od 10 ul/kg, 30 ul/kg, 100 ul/kg, ili 300 ul/kg, i.t. Podaci pokazuju da SEQ ID NO :2 izaziva od doze zavisno smanjenje AUC-otpornosti. Slike 24 A i 24B opisuju oslobađanje histamina kao funkciju povećane otpornosti disajnih puteva (24A) ili smanjenje prilagodljivosti pluća (24B). Slike 24C i 24D su grafici koji opisuju povećanje otpornosti disajnih puteva (24C) ili smanjenje prilagodljivosti pluća (24D) kao odgovor na tretiranje rastvorom soli, OVA-om ili SEQ ID NO 2 pri naznačenim dozama.
Slika 25 predstavlja sažetak statističke analize (Slika 24) za otpornost disajnih puteva (25A) i smanjenje prilagodljivosti pluća (25B)
Slika 26 je sažetak grafika sa Slika 22 i 24. Slika 26A i 26B odgovaraju Slikama 22C i 22D. Slike 26C i 26D odgovaraju Slikama 24C i 24D.
Slika 27 je set grafika koji opisuju nivoe IL-IO (pg/ml) izlučenih iz humanih PBMC (3 donora) nakon izlaganja ovih ćelija oligonukleotidima navedenih svojim SEQ ID No. duž donje X-ose grafika (tačka sa podacima od 3 donora su označene kao ▲ , ■ i x) za 48 sati. Test oligonukleotidi dati na slici Slika 27 obuhvataju SEQ ID NOs: 10, 9,13, 14, 1, i 2. Koncentracija oligonukleotida koja je korišćena za dobijanje određenih tačaka koje se odnose na podatke je označena duže X-ose (uM). Supernatanti su prikupljeni i IL-IO je meren pomoću ELISA. Date su srednje vrednosti količine citokina od svih donora.
Slika 28 je set grafika koji opisuju nivoeTNF-alfa (28 A), interferon-gama (28B), i IL-6 (28C) (uM) izlučenih iz humanih PBMC nakon izlaganja ovih ćelija oligonukleotidima navedenih svojim SEQ ID NO. u ključu grafika. Svaka tačka sa podatkom je izračunata srednja vrednost citokina od tri donora. PBMC su inkubirani sa ODN u naznačenim koncentracijama. Supernatanti su prikupljeni i citokini mereni uz pomoć ELISA. Date su izračunate srednje vrednosti količine citokina od svih donora.
Slika 29 je set grafika koji opsuju TNF-alfa (pg/ml) izlučenih iz humanih PBMC nakon izlaganja ovih ćelija oligonukleotidima u trajanju od 16 sati navedenih svojim SEQ ID NO duž donjeg dela X-ose grafika. Oligonukleotidi prikazani na Slici 29 su oni sa SEQ ID NO: 9, 13, 10, 14, 2, 1, 11, 12, i 3. Koncentracija oligonukleotida upotrebljenih za dobijanje određene tačke sa podacima je označena duž X-ose (uM). Prikazani podaci pokazuju vrednosti sakupljene od tri donora. Ispod SEQ ID Nos je oznaka koja se odnosi na ODN. Css= C-clasa polu-meka, C = C- clasa, B = B-clasa, ne- CpG = ODN bez nemetilatovanog CpG. Supernatanti su prikupljeni i meren je IL-6 uz pomoć ELISA. Date su srednje vrednosti količine citokina svih donora.
Slika 30 je set grafika koji opisuju nivoe IL-6 (pg/ml) izlučenih iz human PBMC nakon izlaganja ovih ćelija oligonukleotidima u trajanju od 24 sata navedenih svojim SEQ ID NO du\ donjeg delaq X-ose na grafiku. Oligonukleotidi prikazani na Slici 30 su oni sa SEQ ID NO: 9, 13, 10, 14, 2, 1, 11, 12, i 3. Koncentracija oligonukleotida upotrebljena ya dobijanje odrejenih tačaka sa podacima je označena duž X-ose (uM). Prikazani podaci predstavljaju vrednosti za tri donora. Ispod SEQ ID NOs je oznaka koja se odnosi na klasu ODN-a. Css= C-clasa polu-meka , C = C-clasa, B = B- clasa, ne- CpG = ODN bez nemetilovanog CpG.
Slika 31 je set grafika kojiopisuju nivoe IFN-gama (pg/ml) izlučenih iz humanih PBMC nakon izlaganja ovih ćelija oligonukleotidima u trjanju od 48 sati navedene svojim SEQ ID NO duž donjeg dela X-ose grafika. Oligonukleotidei prikavani na Slici 31 su oni sa SEQ ID NO: 9, 13, 10, 14, 2, 1, 11,12, i 3. Koncentracija oligonukleotida upotrebljenih za dobijanje određene tačke sa podacima je označena duž X-ose (uM). Prikazani podaci predstavljaju vrednosti za tri donora. Ispod SEQ ID NOs je oznaka koja se odnosi na klasu ODN. Css= C-clasa polu-meka, C = C- clasa, B = B-clasa, ne- CpG = ODN bez nemetilovanog CpG. Prikupljeni su supernatanti i izmeren je IFN-gama pomoću ELISA. Date su srednje vrednosti količine citokina svih donora.
Slika 32 je set grafika koji opisuju nivoe ekspresije (MFI) CD69 na NK ćelije kao indikatore aktivacije NK ćelije (32A) i CD80 (32B) i CD86 (32C) ekspresije na B ćelije posle izlaganja ovih ćelija oligonukleotidima u trajanju od 24 ili 48 sati navedenih svojim SEQ ID NO. u ključu grafika.Svaka tačka predstavlja srednju vrednost intenziteta fluorescence od tri donora. Ćelije su inkubirane sa ODN u naznačenim koncentracijama u trajanju od 24, ili 48 sata. Ćelije su obojene i analizirane protočnom citometrijom.
Slika 33 je set grafika koji opisuju nivoe ekspresije CD69 na NK ćelije kao indikatore aktivacije NK ćelija nakon izlaganja ovih ćelija oligonukleotidima u trajanju od 24 sata datih svojim SEQ ID NO duž donje strane X-ose grafika. Oligonukleotidi prikazani na Slici 33 su oni sa SEQ ID NO: 9, 13, 10, 14, 2, 1, 11, 12, i 3. Koncentracija oligonukleotida upotrebljenih za dobijanje određene tačke je naznačena duž X-ose (uM). Prikazani podaci predstavljaju vrednosti za tri donora. Ispod SEQ ID NOs je oznaka koja se odnosi na klasu ODN. Css= C-clasa polu-meka, C = C-clasa, B = B-clasa, ne- CpG = ODN bez nemetilovanog CpG. Ćelije su obojene antitelima na CD3, CD56, i CD69 i analizirane protočnom citometrijom. Prikazani podaci predstavljaju srednju vrednost intenziteta fluorescencije.
Slika 34 je set grafika koji opisuju ekspresiju CD86 na humani PBMC nakon izlaganja ovih ćelija oligonukleotidima u trajanju od 48 sati navedeni svojim SEQ ID NO duž donjeg dela X-ose grafika. Oligonukleotidi prikazani na Slici 34 su oni sa SEQ ID NO: 9, 13, 10, 14, 2, 1, 11, 12, i 3. Koncentracija upotrebljenih za dobijanje određene tačke sa podacima je označena duž X-ose (uM). Prikazani podaci predstavljaju vrednosti za tri donora. Ispod SEQ ID NOs je oznaka koja se odnosi na klasu ODN. Css= C-clasa polu-meki, C = C-clasa, B = B- clasa, ne- CpG = ODN bez nemetilovanog CpG. Ćelije su obojene antitelima na CD86, CD80, CD19, i CD14 i analizirane protočnom citometrijom. Prikazani podaci predstavljaju srednju vrednost intenziteta fluorescencije.
Slika 35 je set of grafikakoji opisuju ekspresiju CD86 na humani PBMC nakon izlaganja ovih ćelija oligonukleotidima u trajanju od 48 sati, a koji su navedeni svojim SEQ ID NO duž donjeg dela X-ose na grafiku. Oligonukleotidi prikazani na Slici 35 su oni sa SEQ ID NO: 9, 13, 10, 14, 2, 1, 11, 12, i 3. Koncentracija oligonukleotida upotrebljenih za dobijanje određene tačke sa podacima je označena duž X-ose (uM). Prikazani podaci predstavljaju vrednosti za tri donora. Ispod SEQ ID NOs je oznaka koja se odnosi na klasu ODN. Css= C-clasa polu-meki, C = C-clasa, B = B- clasa, ne- CpG = ODN bez nemetilovanog CpG. Ćelije su obojene antitelima na CD86, CD80, CD 19, i CD 14 i i analizirane protočnom ctometrijom. Prikazani podaci predstavljaju srednju vrednost intenziteta fluorescencije.
Slika 36 je set grafika koji opisuju nivoe ekspresije CD86 na plazmacitoidne dendritne ćelije (36A) i CD80 (36B) i CD86 (36C) ekspresije na monocite posle izlaganja ovih ćelija oligonukleotidima navedenim svojim SEQ ID NO. u ključu grafika. Svaka tačka je izračunata srednja vrednost intenziteta fluorescencije od tri donora. Ćelije su inkubirane sa ODN u naznačenim koncentracijama u trajanju od 48 sata. Ćelije su obojene i analizirane protočnom citometrijom.
Slika 37 je set grafika koji opisuju nivoe ekspresije CD86 na monocite nakon izlaganja ovih ćelija oligonukleotidima u trajanju od 48 sati a koji su navedeni svojim SEQ ID NO duž donjeg dela X-ose na grafiku. Oligonukleotidi prikazani na Sllici 37 su oni sa SEQ ID NO: 9, 13, 10, 14, 2, 1, 11, 12, i 3. Koncentracija upotrebljenih za dobijanje određene tačke sa podacima je označena duž X-ose (uM). Prikazani podaci predstavljaju vrednosti za tri donora. Ispod SEQ ID NOs je oznaka koja se odnosi na klasu ODN. Css= C-clasa polu-meki, C = C-clasa, B = B- clasa, ne- CpG = ODN bez nemetilovanog CpG. Ćelije su obojene antitelima na CD86, CD80, CD19, i CD14 i analizirane protočnom citometrijom. Prikazani podaci predstavljaju srednju vrednost intenziteta fluorescencije.
Slika 38 je set grafika koji opisuju ekspresiju CD80 monocite nakon izlaganja ovih ćelija oligonukleotidima u trajanju od 48 sati a koji su navedeni svojim SEQ ID NO duž donjeg dela X-ose na grafiku. Oligonukleotidi na Slici 38 su oni sa SEQ ID NO. 9, 13, 10, 14, 2, 1, 11, 12, i 3. Koncentracija oligonukleotida upotrebljenih za dobijanje određene tačke sa podacima je označena duž X-ose (uM). Prikazani podaci predstavlljaju vrednosti dobijene od tri donora. Ispod SEQ ID NOs je oznaka koja se odnosi na klasu ODN. Css= C-clasa polu-meki, C = C-clasa, B = B-clasa, ne- CpG = ODN bez nemetilovanog CpG. Ćelije su obojene antitelima na CD86, CD80, CD19, i CD14 i analizirane protočnom citometrijom. Prikazani podaci predstavljaju srednju vrednost intenziteta fluorescencije.
Slika 39 je set grafika koji opisuju ekspresiju CD80 na plasmacitoidne dendritne ćelije nakon izlaganja ovih ćelija oligonukleotidima u trajanju od 48 sati a koji su navedeni svojim SEQ ID NO duž donjeg dela X-ose na grafiku. Oligonukleotidei prikazani na Slici 37 su oni sa SEQ ID NO: 9, 13, 10, 14, 2, 1,11,12, i 3. Koncentracija oligonukleotida upotrebljenih za dobijanje određene tačke sa podacima je označena duž X-ose (uM). Prikazani podaci predstavlljaju vrednosti dobijene od tri donora. Ispod SEQ ID NOs je oznaka koja se odnosi na klasu ODN. Css= C-clasa polu-meki, C = C-clasa, B = B- clasa, ne- CpG = ODN bez nemetilovanog CpG. Ćelije su obojene antitelima na CD86, CDI Ic, CD123, i HLA-DR i analizirane protočnom citometrijom. Prikazani podaci predstavlljaju vrednosti dobijene od tri donora.
Slika 40 je set grafika koji opisuju nivoe ekspresije intracelularnog IP-IO u B ćelijama (40B) i monocitima (40A) nakon izlaganja ovih ćelija oligonukleotidima u trajanju od 24 časa a koji su navedeni svojim SEQ ID NO. u ključnom delu grafika. Svaka tačka je izračunata srednja vrednost intenziteta fluorescence iza tri donora. Ćelije su inkubirane sa ODN u naznačenim koncentracijama u trajanju od 24 časa. Ćelije su obojene i analizirane protočnom citometrijom.
Slika 41 je set of grafika koji opisuju nivoe ekspresije intracelularnog IP-10 u monocitima nakon izlaganja ovih ćelija oligonukleotidima u trajanju od 24 časa a koji su navedeni svojim SEQ ID NO duž donjeg dela X-ose na grafiku. Oligonukleotidi prikazani na Slici 41 su oni sa SEQ ID NO: 9, 13, 10, 14, 2, 1, 11, 12, i 3. Koncentracija oligonukleotida upotrebljenih za dobijanje određene tačke sa podacima je označena duž X-ose (uM). Prikazani podaci predstavlljaju vrednosti dobijene od tri donora. Ispod SEQ ID NOs i je oznaka koja se odnosi na klasu ODN. Css= C-clasa polu-meki, C = C-clasa, B = B- clasa, ne-CpG = ODN bez nemetilovanog CpG. Ćelije su obojene antitelima na CD 14, CD 19, i IP-IO i analizirane protočnom citometrijom. Prikazani podaci predstavljaju srednju vrednost intenziteta fluorescencije.
Slika 42 je set of grafika koji opisuju nivoe ekspresije intracelularnog IP-IO u B ćelijama nakon izlaganja ovih ćelija oligonukleotidima u trajanju od 24 časa a koji su navedeni svojim SEQ ID NO duž donjeg dela X-ose na grafiku. Oligonukleotidi prikazani na Slici 42 su oni sa SEQ ID NO: 9, 13, 10, 14, 2, 1, 11, 12, i 3. Koncentracija oligonukleotide upotrebljenih za dobijanje određene tačke sa podacima je označena duž -ose (uM). Prikazani podaci predstavlljaju vrednosti dobijene od tri donora. Ispod SEQ ID NOs je oznaka koja se odnosi na klasu ODN. CsS= C-clasa polu-meki, C = C-clasa, B = B- clasa, ne- CpG = ODN bez nemetilovanog CpG. Ćelije su obojene antitelima na CD 14, CD 19, i IP-IO i analizirane protočnom citometrijom. Prikazani podaci predstavljaju srednju vrednost intenziteta fluorescencije.
Slika 43 je set grafika koji opisuju uporedni prikaz sposobnosti SEQ ID NO.: 2 i njenih fragmenata (SEQ ID NO 15-17) da indukuju sekreciju citokina iz mišijih splenocita. Analizirani su citokini IFNa (43A), IFNy (43B), IP-IO (43C), IL-6 (43D), IL-IO (43E), i TNFa (43F).
Slika 44 je a set of grafika koji opisuju uporedni prikaz sposobnosti SEQ ID NO.: 2 i njenih fragmenata (SEQ ID NO 18-20) da indukuju sekreciju citokina iz mišijih splenocita. Analizirani su citokini IFNa (44A), IFNy (44B), IP-IO (44C), IL-6 (44D), IL-10 (44E), i TNFa (44F).
Slika 45 je set grafika koji opisuju uporedni prikaz sposobnosti SEQ ID NO.: 2 i njenih fragmenata (SEQ ID NO 21-23 da indukuju sekreciju citokina iz mišijih splenocita. Analizirani su citokini IFNa (45A), IFNy (45B), IP-10 (45C)5IL-6 (45D), IL-IO (45E), i TNFa (45F).
Detaljan o<p>is<p>ronalaska
Predmetnim pronalaksom je opisana podgrupa polu-mekih imunostimulatornih poligonukleotida. Ove opisani imunostimulatorni oligonukleotidi pronalaska u nekim realizacijama imaju poboljšane osobine uključujući sličnu ili povećanu potentnost (jačinu), smanjenu sistemsku izloženost bubrega, jetre i slezin i može smanjiti reaktogeničnost na mestu injektiranja. lako se prijavilac ne vezuje za mehanizam, smatra se da su ove poboljšane osobine poevzane sa strateškim postavljanjem imunostimulatornih oligonukleotida ili fosfodiestara ili fosfodiestru-sličnim „internukleotidnim linkovima". Izraz "intemukleotidni link" kao [to je ovde definisan, odnosi se na kovalentno vezivanje osnovnog lanca dva susedna nukelotida u molekulu nukleinske kiseline. Kovalentno vezivanje osnovnog lanca obično može modifikovan ili nemodifikovan fosfatni link, ali su druge modifikacije takođe moguće. Tako, linearni oligonukleotid koji je dužin n nukleotida ima ukupno n-1 intemukleotidni link. Ova kovalentna vezivanja osnovnog lanca mogu bit modifikovani ili nemodifikovani u imunostimulatornim oligonukleoitidima shodno patentnu.
Specifično, fosfodiestar ili fosfordiestru-slični intemukleotidni linkovi uključuju "unutrašnje dinukleotide". Unutrašnji dinukleotid generalno može da označava bilo koji par susednih nukleotida povezanih internukleotidnim linkom, gde ni jedan od nukleotida u paru nukleotida nije terminalni nukleotid, t. nijedan nukleotid u paru nukleotida nije nukleotid koji definiše 5' ili 3' kraj oligonukleotida.
Prema tome, linearni oligonukleotidi imaju ukupno n-1 dinukleotida i samo jedan n-3 dinukleotida. Svaki internukleotid link u unutrašnjem dinukleotidu je unutrašnji intemukleotidni link. Prema tome, linerani oligonukleotid koji ima n nukleotida ima ukupno n-1 internukleotidna linka i samo jedan n-3 unutrašnji intemukleotidni link. Strateški postavljeni fosfodiestar ili fosfodiestru-slični intemukleotidni linkovi, prema tome, odnose se na fosfodiestar ili fosfodiestru-slične internukleotidne linkove postavljene između bilo kojeg para nukleotida u sekvenci nukleinskih kiselina. U nekim realizacijama fosfodiestar ili fosfodiestru-slični intemukleotidni linkovi nisu postavljeni između bilo kog para nukleotida bliskih 5' ili 3' kraju.
Pronalazak je, bar u nekim aspektima, zasnovan na neočekivanom otkriću da specifični polu-meki oligonukleotidi C-klase koji su ovde opisani poseduju važnu imunostimulatornu aktivnost i preferentno su korisni u lečenju alergije ili astme. Ovi molekuli imaju bar istu ili, u mnogim slučajevima, imaju veću imunostimulatornu aktivnost, u mnogim slučajevima, nego odgovarajući potpuno stabilizovani imunostimulatorni oligonukleotidi sa istom nukleotidnom sekvencom.
Polu-meki oligonukleotid je imunostimulatorni oligonukleotid sa delimično stabilizovanim osnovnim lancem, u kojem se fosfodiestar ili fosfodiestru-slični intemukleotidni linkovi pojavljuju samo unutar unutrašnjeg pirimidin-purin (YZ, preferentno CG) dinukleotida. Polu-meki oligonukleotidi generalno poseduju povećanu imunostimulatornu jačinu u odnosu na odgovarajuće potpuno stabilizovane imunostimulatorne oligonukelotide. Usled veće potentnosti polu-mekih oligonukleotida, polu-meki oligonukleotidi se mogu koristiti za sniženje efektivne koncentracije i time za smanjenje efektivnih doza u poređenju sa konvencionalnim optpuno stabilizovanim imunostimulatornim oligonukleotidima da bi se postigao željeni biološki efekat.
Dok potpuno stabilizovani imunostimulatorni oligonukleotidi mogu da pokazati maksimum odnosa doza - odgovor, izgleda da polu-meki oligonukleotidi predmetnog pronalaska imaju krive sa monotonim povećanjem odnosa doza-odgovor (kao što je analizirano stimulacijom TLR9) pri čemu dolazi do prelaza viših koncentracija izvan optimalne koncentracije za odgovarajuće potpuno stabilizovane imunostimulatotrne oligonukleotide. Tako se pretpostavlja da polu-meki oligonukleotidi predmetnog pronalaska mogu da indukuju veću imunostimulaciju nego potpuno stabilizovani imunostimulatorni oligonukleotidi.
Budući da potpuno stabilizovani imunostimulatorni olignoukleotidi sa manje od 20 nukleotida imaju umerenu imunostimulatornu aktivnost u odnosu na duže (npr. sa 24 oligonukleotida) potpuno stabilizovane oligonukleotide, otkriveno je da polu-meki kratki oligonukleotidi sa npr.16 oligonukleotida imaju imunostimulatornu aktivnost koja je najmanje jednaka imunoatimultornoj aktivnosti potpuno stabilizovanih oligonukleotida sa više od 20 nukleotida.
U nekim slučajevima gde se za 6-mer fosforotioatni oligonukleotid čini da nema imunostimulatornu aktivnost, nađeno je da supstitucija čak i jednog fosfodiestar unutrašnjeg CG internukleotidnog linka, fosforotioatnim Trnkom daje odgovarajući 6-mer sa imunostimulatornom aktivnošću.
Tako da veličina (tj., broj nukleotidnih ostatka cele dužine oligonukleotida) imunostimulatornog oligonukleotida takođe može da doprinesa stimulatornoj aktivnosti oligonukleotida. Za izvođenje apsorpcije u ćelije, imunostimulatorni oligonukelotidi mogu da budu dužine od najmanje 6 nukleotidnih ostataka. Oligonukleotidi veličine veće od 6 nukleotida (čak dugački i kb) mogu da indukuju imunu reakciju u skladu sa pronalaskom ukoliko je prisutno dovoljno imunostimulatornih motiva, budući da su veće nukleinske kiseline degradirane unutar ćelije. Pretpostavlja se predmetnim pronalaskom da kratki polu-meki oligonukleotidi dužine čak 4 nukleotida mogu takođe da budu imunostimulatorni ukoliko se mogu distribuirati u unutrašnjost ćelije. U preferentnim realizacijama predmetnog pronalaska, imunostimulatorni oligonukleotidi su dužine između 4 i 100 nukleotida. U tipičnim realizacijama, imunostimulatorni oligonukleotidi su dužine između 6 i 40 ili 10 i 40 nukleotida. U određenim preferentnim realizacijama prema predmetnom pronalasku, imunostimulatorni oligonukleotidi su dužine između 6 i 19 i 6 i 24 nukleotida.
Takođe se pretpostavlja da prethodno navedene osobine polu-mekih oligonukleotida generalno povećavati sa povećanjem "doze" fosfodiestra ili fosfodiestar-sličnih internukleotidnih linkova uključujući unutrašnje CG dinukleotide. Tako se generalno pretpostavlja da, na primer, za date oligonukleotidne sekvence sa pet unutrašnjih CG dinukleotida, oligonukleotid sa pet unutrašnjih fosfodiestarskih ili fosfodiestar-sličnih CG internukleotidnih linkova je više imunostimulatorno nego oligonuklotidi sa četiri unutrašnja fosfodiestar ili fosfodiestar-sličnih CG internukleotidnih linkova koji je sa druge strane više imunostimulatoran nego oligonukleotidi sa tri unutrašnja fosfodisetar ili fosfodiestar-sličnih CG internukleotidnih linkova, koji su više imunostimulatoran nego oligonukleotidi sa dva unutrašnja fosfodisetar ili fosfodiestar-sličnih CG internukleotidnih linkova, koji su sa druge strane više imunostimulatoran nego oligonukleotidi sa tri unutrašnja fosfodisetar ili fosfodiestar-sličnih CG internukleotidnih linkova. Treba naglasiti da se pretpostavlja da uvođenje čak i jednog unutrašnjeg fosfodisetar ili fosfodiestar-sličnih CG internukleotidnog linkova predstavlja prednost u odnosu na unutrašnje fosfodiestar ioi fosfodiestar-sličnih CG internukleotidnih linkova. dodatak fosfodiestar ili fosfodiestar-sličnim internukleotidnim linkovima, položaj duž oligonukleotida takođe može da utiče na potentnost (jačinu).
Imunostimulatnori oligonukleotidi premetnog pronalaska su generalno zaštićeni od brze degradacije u serumu. Imunostimulatorni oligonukleotidi predmetnog pronalaska su takođe zaštićeni od brze degradacije u brojnim tkivima, sa izuzetkom posebnih tkiva sa specifičnom ili prekomernom aktivnošću nukleaze koji mogu da degradiraju imunostimulatorne oligonukleotide. Ovo rezultuje u redukciji imunostimulatornih oligonukleotida u ovim posebnim tkivima, čija akumulacija može, u suprotnom, da dovede doneželjenih efekata dugotrajne terapije primenom oligonukleotida otpornih na degradaciju. Oligonukleotidi predmetnog pronalaska će generalno da sadrže, uz fosfodiestar ili fosfordiestar-sličnim oligonukleotidnim linkovima na preferentnim unutrašnjim položajima, i 5' i 3' kraje koji su rezistentni na degradaciju. Ovi krajevi rezistentni na degradaciju mogu da obuhvate bilo koju pogodnu modifikaciju koja rezultuje u povećanoj rezistentnosti na digestiju egzonukleazom u odnosu na odgovarajuće nemodifikovane krajeve. Na primer, 5' i 3' krajevi se mogu stabilizovati inkluzijom bar jedne fosfatne modifikacije osnovnog lanca. U preferentnoj realziaciji, bar jedna fosfatna modifikacija osnovnog skeleta na svakom kraju je nezavisno fosforotioat, fosforoditioat, metilfosfonat ili metilfosforotioat intemukleotidni link. U drugoj realizaciji, krajevi otporni na degradaciju su jedna ili više nukleotidnih jedinica povezanih peptidnim ili amidnim linkovima na 3' kraju. Drugi, pak, stabilizovani krajevi, uključuju ali nisu i ograničeni na one opisane u daljem tekstu, su obuhvaćeni predmetnim pronalaskom.
Kao što je prethodno opisano, oligonukelotidi predmetnog pronalaska obuhvata fosfodiestar ili fosfodiestar-slične linkove i po potrebi CG dinukleotide susedne unutrašnjim. Ovi CG dinukleotidi su često deo imunostimulatornih motiva. Nije neophodno, međutim, da oligonukleoti sadrži fosfodiestar ili fosfodiestar-sličan link unutar svakog imunostimulatornog motiva. Dodatno, fosfodiestar ili fosfodiestar-slični linkovi se mogu upoterbiti i za drastičnije renalne digestije ovih na drugi način "stabilizovanih oligonukleotida".
Fosfodiestar internukelotidni link je vrsta linka (veze) koji zavisi od prirodnih nukleinskih kiselina. Fosfodiestar intemukleotidni link obuhvata atom fosfora sa bočno vezanim atomima kiseonika i vezanim sa još dva atom kiseonika, jedan naelektrisan, drugi nenalektrisan. Fosfodiestar intemukleotidni link je posebno preferentan kada je važno smanjiti polu-život oligonukleotida u tkivima.
Fosfodiestar-sličan intemukleotidni link je grupa koja spaja,a sadrži fosfor i koja je hemijski i/ili diastereomerno slična fosfodiestru. Mere sličnosti fosfodiestra uključuje susceptibilnost na digestiju nukleazom i sposobnost da aktivira RNKazu H. Tako su na primer fosfodiestar, ali ne fosforotioat, oligonukleotidi suscpeibilni na digestiju nukleazom, dok i fosfodiestar i fosforotioat oligonukleotidi aktiviraju RNKazu H. U preferentnoj realizaciji, fosfordiestar-sličan oligonukleotidni link je boranofosfatni (ili ekvivalnetno, boranofosfonatni) link. U.S. Patent No. 5,177,198; U.S. Patent No. 5,859,231; U.S. Patent No. 6,160,109; U.S. Patent No. 6,207,819; Sergueev et al., (1998) J Am Chem Soc 120:9417-27. U narednom preferenom pristupu, fosfodiestar-sličan oligonukleotidni link je diastereomerno čist Rp fosforotioat. Pretpostavlja se da diasteromerno čist Rp fosforotioat susceptibilniji na digestiju nukelazom i da bolje aktivira RNKazu H nego smeša diastereomerno čist Sp fosforotioat. Treba napomenuti da za potrebe ovog pronalaska izraz "fosfodiestar-sličan oligonuklotidni link" posebno obuhvata fosforoditioat i metilfosfonat internukelotidne linkove.
Molekuli imunostimulatornog olikonukleotida predmetnog pronalaska mora da ima himerni osnovni lanac. Za potrebe predmetnog pronalaska, himerni osnovni lanac se odnosi na delimično stabilizovan osnovni lanac, gde je poslednji intemukleotidni link fosfodiestar iil fosfodiestar-sličan i gde je bar jedan intemukleotidni link stabilizovan internukelotidni link, pri čemu se razlikuju bar jedan fosfodiestar ili fosfodiestar-sličan link i bar jedan stabilizovan link. Budući da je objavljeno da je boranofosfonatni link stabilizovan u odnosu na fosfodiestarski link, za potrebe himerne prirode osnovnog lanca, boranofosfonatni se može klasifikovati ili kao fosfodiestar-sličan ili kao stabilizovan, u zavisnosti od konteksta. Na primer, himerni osnovni lanad prema predmetnom pronalasku može u jednoj realizaciji da obuhvati bar jedan fosfodiestar (fosfodiestar ili fosfodiestar-sličan) link i bar jedan boranofosfonat (stabilizovan) link. U sledećoj realziaciji himerni osnovni lanac premapredmetnom pronalasku može da obuhvati boranofosfonat (fosfodiestar ili fosfodiestar-sličan) i fosforotioat (stabilizova) link. "Stabilizovan intemukleotidni link" se odnosi na intemukleotidni link koji je relativno rezistentan nain vivo degradaciju(npr. via egzo- ili endo-nukleaze) u odnosu na fosodiestar intemukleotidni link. Preferentni stabilizovani intemukleotidni linkovi su, bez ograničavanja, fosforotioat, fosforoditioat, metilfosfonat i metilfosforotioat. Drugi stabilizovani intemukleotidni linkovi su, bez ograničavanja: peptid, alkil, defosfo i drugi kao što je prethodno opisano.
Modifikovani snovni lanci kao što su fosforotioati mogu se stabilizovati uz pomoć
automatizovanih tehnika primene fosforamidatnih ili H-fosfonatnih hernija. Aril- i alkil-fosfonati se mogu dobit, npr. kao što je opisano u U.S. Patentnu No. 4,469,863; a alkilfosfotriesti (gde je naelektrisana kiseonična grupa alkilovana kao što je opisano u U.S. Patent No. 5,023,243 i European Patent No. 092,574) mogu se dobiti automatskom sintezom na čvrstoj fazi uz pomoć komercijalno dostupnih reagenasa. Opisani su i postupci za dobijanje drugih modifikacija i supstitucija osnovnih lanaca DNK. Uhlmann E et al. (1990) Chem Rev 90;544; Goodchild J (1990) Bioconjugate Chem 1:165. Takođe su poznati postupci za dobijanje himemih oligonukelotida. Na primer patentnni izdati za Uhlmann et al. su opisali ovakve tehnike.
Smeša modifiikovanog ODN osnovnog lanca može se sintetisati uz pomoć komercijalno dostupnih DNK sintesajzera i standardne fosforamiditne hernije. (F. E. Eckstein, "Oligonukleotida and Analogues - A Practical Approach" IRL Press, Oxford, UK. 1991, i M. D. Matteucci i M. H. Caruthers, Tetrahedron Lett. 21, 719 (1980)) Posle kuplovanja, PS linkovi su uvedeni sumporovanjem pomoću Beaucage-ovog reagensa (R. P. Iver, W. Egan, J. B. Regan and S. L. Beaucage, J. Am. Chem. Soc. 112, 1253 (1990)) (0.075 M u acetonitrilu) ili fenil acetil disulfidu (PADS) za čim sledi zaštita anhidridom sirćetne kiseline, 2,6-lutidin u tetrahidrofuranu (1:1:8; v:v:v) i N-metilimidazol (16 % u tetrahidrofuranu). Ovaj korak stavljanja zaštite je izveden posle reakcije sumporovanja da bi se minimiziralo stvaranje neželjenih fosfodiestarskih (PO) veza (linkova) na položajima gde bi trebalo da se nalazi fosforotoatni link. U slučaju uvođenja fosfodiestarskog linka, npr. Na CpGdinukleotidu, intermedijerni fosfor-ll je oksidovan reakcijom sa rastvorom joda u vodi/piridinu. Posle odvajanja od čvrste podloge i konačnog uklanjanja zaštite reakcijom sa koncentrovanim amonijakom (15 sati na 50°C), ODN je analiziran HPLC-om na Gen-Pak Fax koloni (Millipore-VVaters) Na-CI gradijentom (npr. pufer A: 10 mM NaH2P04u acetonitril/vodi = l:4/v:v pH 6.8; pufer B: 10 mM NaH2P04, 1.5 M NaCI u acetonitril/vodi = l:4/v:v; 5 do 60 % B u toku 30 minuta pri 1 ml/min) ili kapilarnom gel elektroforezom. ODN se može prečistiti HPLC-om ili FPLC -om na Source High Performance koloni (Amersham Pharmacia). HPLC-homogene frakcije su kombinovane i desalinizovaneviaC18 colonom ili ultrafiltracijom. ODN je analiziran MALDI-TOF masenom spektrometrijom da bi se potvrdila izračunata masa.
Oligonukleotidi pronlasaka takođe mogu da obuhvate i druge modifikacije. Ovo uključuje nejonske analoge DNK, kao što su alkil- ili aril-fosfati (gde je naelektrisan kiseonik u fosfonatnoj grupi zamenjen alkil ili aril grupom), fosfodieastr ili alkilfosfotriestri, gde je alkilovana naelektrisana kiseonična grupa. Oligonukleotidi koji sadrže diol, kao što je tetraetilenglikol ili heksaetilenglikol, na jednom ili na oba kraja , su takođe potvrdili da su u suštini rezistentni na degradaciju nukleazom.
Oligonukleotidi predmenog pronalaska su nukleinske kiseline koje sadrže specifične sekvence za koje je nađeno da izazivaju imunu reakciju. Ove specifične sekvence koje izazivaju imunu reakciju su označene kao "imunostimulatorni motivi" i oligonukleotidi koji sadrže imunostimulatorne oligonukleotide su označeni kao " molekuli imunostimulatornih nukleinskih kiselina" i ekvivalentno "imunostimulatorne nukleinske kiseline" ili "imunostimulatorni oligonukleotidi". Imunostimulatorni oligonukleotidi pronalaska sadrže bar jedan imunostimulatorni motiv. U perfernentnoj realizaciji imunostimulatorni motiv je kao "unutrašnji imunostimulatorni motiv". Izraz "unutrašnji imunostimulatorni motiv" se odnosi na položaj motiv sekvence sa dužom sekvencom nukleinskih kiselina, koja je duža nego motiv sekvenca za bar jedan nukleotid vezan za oba 5' i 3' kraja imunostimulatorne motiv sekvence.
Imunostimulatorni oligonukleotidi se odnose na imunostimulatorne motive koji su "CpG dinukleotidi"- CpG dinukleotidi mogu biti metilovani ili nemetilovani. Imunostimualtorni oligonukleotidi koji sadrže bar jedan nemetilovan CpG dinukleotid je molekul nukleinske kiseline koji sadrži dinukleotidnu sekvencu nemetilovani citozin-guanin (tj. nemetilovan 5'-citidin za kojim sledi 3'guanozin vezani fosfatnom vezom) i koji aktivira imuni sistem; ovi imunostimulatorni oligonukleotid je CpG oligonukleotid. CpG oligonukleotid je opisan u brojnim patentnim, objavljenim patentnim prijavama i drugim publikaicjama, uključujući U.S. Patent Nos. 6,194,388; 6,207,646; 6,214,806; 6,218,371; 6,239,116; i 6,339,068. Imunostimulatorni oligonukleotid koji sadrži bar jedan metilovan CpG dinukleotid je oligonukleotid koji sadrži dinukleotidnu sekvencu metilovan citotzin-guanin (tj., metilovan 5' citidin za koji sledi 3' guanozin i koji su povezani dosfatnom vezom) i koja aktivira imuni sistem.
Nedavno je opisano da postoje različite klase CpG oligonukleotida. Jedna klas je snažan aktivator B-ćelija ali je relativno slaba u indukovanju IFN-a i aktivaciji NK ćelija. ; ova klasa je označena kao B-klasa. B-klasa CpG oligonukleotida je obično potpuno stabiliozovana i obuhvata nemetilovan CpG dinukelotid unutar određenih preferentnih konteksta baza. Videti npr., U.S. Patent Nos.6,194,388; 6,207,646; 6,214,806; 6,218,371; 6,239,116; i 6,339,068. Druga klasa snažno indukuje IFN-a i aktivira NK ćelije, ali relativno slabo stimuliše B-ćelije; ova klasa je označena kao A klasa. A klasa CpG oligonukleotida obično ima stabilne poli-G sekvence na 5' i 3' krajevima i centralnu palindromnu fosfodiestar sekvencu sa CpG dinukleotidom od najmanje 6 nukleotida. Videti, na primer, objavljenu patentnu prijavu PCt/USOO/26527 (VVO 01/22990).
Sledeća klasa CpG oligonukleotida aktivira B ćelije i NK ćelije i indukuje IFN-a; ova klasa je označena kao C-klasa. C-klasa CpG oligonukleotida, kao što je prvo okarakterisana, obično je u potpunosti stabilisana, obuhvata sekvencu tipa B-klase i palindrom bogat CG parovima ili palindromu-blizak. Ova klasa je opisan u U.S. patentnoj prijavi 10/224,523, u postupku, podnetoj 19 Avgusta 2002 i koja je objavljena kao US2003/0148976 i US10/978.283 podneta 29 Oktobra 2004, sa srodnim PCT priajvama objavljenim kao VVO2005/042018 čiji je celokupni sadržaj ovde inkorporidan referencom. C-klasa olignoukleotida je takođe označen kao tip C CpG Odn. U određenim realizacijama C CpG Odn obuhavata kombinaciju motiva pri čemu je jedan motiv palindrom obogaćen sa CG (CG-obogaćen palindrom) ili neutralizirajući motiv, a drugi motiv je stimulatorni motiv, npr., CpG motiv ili sekvenca TCGTCG.
C CpG ODN može imati formulu: 5' X1DCGHX23'.X,i X2su nezavisno jedna od sekvenci dužine 0 do 10 nukleotida. D je bilo koji nukleotid osim C. C je citozine. G je guanin. H je bilo koji nukelotid osim G. Sekvenca nukleinskih kiselina takođe obuhvata sekvencu nukleinskih kiselina odabranih iz grupe koju čine P i N koji se nlaze na mestu neposredno 5' do Xtili neposredno 3' do X2. N je sekvenca koja neutrališe B-ćelije a koja počinje trinukleotidom CGG i najmanje je dužine od 10 nukleotida. P je GC-obogaćen palindrom koji sadrži sekvencu od najmanje 10 nukleotida.
U nekim realizacijama, imunostimulatorna nukleinska kiselina je 5' NX1DCGHX23', 5' X1DCGHX2N 3', 5' PX1DCGHX23', 51 X1DCGHX2P 3', 5' X|DCGHX2PX33', 5' X1DCGHPX33', 5' DCGHX2PX33', 5' TCGHX2PX33', ili 5' DCGHPX33'. X3je bilo koja sekvenca dužien 0 do 10 nnukleotida. U drugim realizacijama, imunostimulatorna nukleinska kiselina je 5' DCGHP 3'.
Po potrebi, D i/ili H su timin (T).
U drugim realizacijama H je T i X2je CG, CGT, CGTT, CGTTT, ili CGTTTT.
H je T i X2je CG ili CGTTTT prema drugimrealizacijama.
Prema drugim realizacijama, C je nemetilovan.
U nekim realizacijama, N sadrži bar četiri CG dinukleotida i ne više od dva CCg trinukleotida.
Po potrebi P sadrži bar jedan Inozin.
Nukelinska kiselina može da sadrži i poli-T sekvencu na 5' i 3' kraju.
Alternativno C CpG ODN može imati formulu: 5' N1PyGN2P 3'. G je guanin. Nije bilo koja sekvuenca dužine 1 do 6 nukleotida. U nekim realizacijam, Nisadrži bar 50% pirimidina prefernentno bar 50% T. u drugim realizacijama Ntsadrži bar jedan CG motif, bar jedan TCG motiv, bar jedan Cl motiv, bar jedan TCI motiv, barejdan IG motivjli bar jedan TIG motiv. Nije TCGG ili TCGH u drugim realizacijama. H je bilo koji nukleotid osim G.
Py je pirimidin. U nekim realizacijama, Pyje nemetilovan C.
N2 je bilo koja sekvenca dužine 0 do 30 nukleotida . U nekim realizacijama, N2sadrži bar 50% pirimidina ili bar 50% T. U drugim relaiyacijama,. N2ne sadrži bilo koji poli G ili poli A motive.
P je GC-obogaćen palindrom sa sekvencom od najmanje 10 nukleotida. U nekim realizacijama P je potpuno palindromski. U drugim realizacijama P je palindrome sa 1 do 3 konsekutivna nukleotida koja se nalaze između. Po potrebi ovi nukleotidi koji se nalaze između mogu biti TG.U drugim realizacijama, P sadrži najmanje 3, 4, ili 5 C i bar 3, 4, ili 5 G nukleotida. Prema drugim realizacijama P sadrži bar jedan Inozin.
U jednoj realizaciji, GC-obogaćen palindrom sadrži baze i to bar dve trećine G i C. U drugim realizacijama, GC-obogaćen palindrom sadrži baze od bar 81 procenat G i C. U nekim realizacijama GC-obogaćen palindrom sadrži bar 12 nukleotida. GC-obogaćen palindrom može da bude sastavljen isključivo od C i G. U nekim realizacijama GC-obogaćen palindrom može da sadrži bar jedan nukleotid koji nije ni C niti G.
U nekim realizacijama GC-obogaćen palindrom sadrži bar jedan trimer CGG, bar jedan trimer CCG, ili bar ejdan tetramer CGCG. U nekim realizacijama GC- obogaćen palindrom sadrži bar četiri CG dinukleotida. U određenim prefenrentnim realizacijama, GC-obogaćen palindrom ima centralni CG dinukleotid.
U određenim realizacijam, GC-obogaćen palindrom je CGGCGCGCGCCG (SEQ ID
NO: 58), CGGCGGCCGCCG (SEQ ID NO: 59), CGACGATCGTCG (SEQ ID NO: 60)
ili CGACGTACGTCG (SEQ ID NO: 61).
U određenim realizacijama, GC-obogaćen palindrom je CGCGCGCGCGCG (SEQ ID
NO:62), GCGCGCGCGCGC (SEQ ID NO: 63), CCCCCCGGGGGG (SEQ ID NO: 64),
GGGGGGCCCCCC (SEQ ID NO: 65), CCCCCGGGGG (SEQ ID NO: 66) ili
GGGGGCCCCC (SEQ ID NO: 67).
U nekim realizacijama N1PyGN2je sekvenca odabrana iz grupe koju čine TTTTTCG,
TCG, TTCG, TTTCG, TTTTCG, TCGT5TTCGT, TTTCGT, i TCGTCGT.
Prema narednom spektu pronalaska, data je imunostimulatorna nukleinska kiselina dužine 13-100 nukleotida. Nukleinska kiselina je formule: 5' NiPvGvT^P 3'. G/l se odnosi na jedan nukleotid koji je ili G ili I. G je guanin , i I je Inozin.
N-ije bilo koja sekvence dužine 1 do 6 nukleotida. Py je pirimidin. N2 je bilo koja sekvenca dužine 0 do 30 nukleotida .
P je palindrom sa sekvencom dužine od bar 10 nukleotida. U nekim realizacijama, P je GC-obogaćen palindrom. U drugim realizacijama P je IC- obogaćen palindrom. N!PylN2 je u nekim realizacijama TCITCITTTT (SEQ ID NO: 62).
Klasa oligonukleotida koja je ovde označena kao C-klasa oligonukleotida su karakteristično monomerne u rastovorima. Pretpostavlja se da molekuli nukleinskih kiselina mogu formirati intramolekularne dupleka strukture in vitro, čime ih čini stabilnim na digestiju nukleazom. Takođe se pretpostavlja da isti molekuli nukleinskih kiselina mogu formirati intermolekularni dupleks i čak moguće strukture višeg uređenja unutar intraendosomalnog odeljka, gde se pretpostavlja da se vrši njihova biološka aktivnost.
C-klasa modifikovanih oligonukleotida imaju 3 opšte formule. Formula I
Gde je svaka od Z1fZ2, i Z3nezavisno bilo koja sekvenca dužine 0 do 12 nukleotida koja po potrebi obuhvata nenukleotidini linker ili "abasic dSpacer"; svaka odXii X2je nezavisno timidin, dezoksiuridin, dezoksiadenozin ili 5-supstituisan dezoksiuridin; svaka odY,i Y2je nezavisno citozin (C) ili modifikovan citozin; svaka od Rt i R2je nezavisno guanin
(G) ili modifikovan guanin; svaka od N i N'je nezavisno bilo koja sekvenca dužine 0 do 12 nukleotida po potrebi obuhvata nenukleotidini linker ili "abasic dSpacer"; Stje nenukleotidni
linker, "abasic" linker ("dSpacers"), trietilen glikolne jedinice ili heksaetilen glikolne jedinice, koje po poterbi obezbeđuju 2'5'-, 5 '5'-, 3 '3'-, 2'2'-, ili 2'3'- internukleozidne linkove; S2je bilo koja ne palindromna sekvenca dužine 1 do 10 nukleotida ili nenukleotidni linker, "abasic"
linker ("dSpacers"), trietilen glikolne jedinice ili heksaetilen glikolne jedinice; svaka od N-i, N2,
.... Nn, i N1#, N2#;... Nn# je bilo koji nukleotid ili modifikovan nukleotid gde su Nibazni parovi sa N1#, N2bazni-parovi sa N2#, ... i Nnbazni-parovi sa Nn#; k je broj od 0 do 5; n je broj od 2 do 16; p je broj od 1 do 6; i q je broj od 0 do 10, i u slučaju kada je (Nn)...(N2)(N1) S2(Ni#)(N2#)...(Nn#) dužine 10 do 42 nukleotid, S2je dužine 4 do 10 nukleotida, S2je nenukleotidni linker, "abasic" linker ("dSpacers"), trietilen glikolne jedinice ili heksaetilen
glikolne jedinice, i/ili (Nn)...(N2)(N1) S2(N1#)(N2#)...(Nn#) sadrži manje od 2/3 GC.In one embodiment each OfNi, N2,.... Nn, i Nu, N2#,... Nn# je chosen from C, G, ili njihove modifikacije, pri čemu su C bazni-parovi sa G.
U jednoj realizaciji svaka od N1, N2 Nn, ai N1#N2#,... Nn# je odabrana od T, A, ili njihovih modifikacija, i T baznih-parova sa A.
U ovim i drugim realizacijmasvaka od C, G, A, i T može da se odnosi na dezoksinukleotie sa odgovarajućim bazama citozin, guanin, adenin, i timin.
U jednoj realizaciji svaka od N1?N2,.... Nn, i N1S3N2#,... Nn#je odabrana od C, T, A, G, ili njihovih modifikacija, i C baznih-pariova sa G, T baznih-parova sa G, A baznih- parova sa T, i A baznih -parova sa G.
U jednoj realizaciji svaka od N,, N2, .... Nn, i N1#, N2#, ... Nn# je odabrana od nemodifikovanih ili modifikovanih nukleotida koji formiraju Watson-Crick bazne parove.
U jednoj realizaciji svaka od Ni, N2 .... Nn, i N1#, N2#, ... Nn#i je odabrana od nemodifikovanih ili modifikovanih nukleotida koji formiraju ne- VVatson-Crick bazne parove.
U jednoj realizaciji molekul imunostimulatorne nukleinske kliseline obuvhata delimično stabilizovan osnovni lanac sa bar jednom fosfodiestarskom vezom.
U jednoj realizaciji, molekul imunostimulatorne nukleinske kiseline ima osnovni lanac sa bar jednim stabilizovanim internukleotidnim linkom.
U jednoj realizaciji, intemukleotidni linkovi oligonukleotida su svi fosforotioatni linkovi.
U jednoj realizaciji, molekul imunostimulatorne nukleinske kiseline je delimično stabilizovan osnovni lanac sa fosfodiestarskom vezom koja vezue bar jedan od Y:R^ili Y2R2-
U jednoj realizaciji,Y^je C.
U jednoj realizaciji, Ri je G.
U jednoj realizaciji,Y^je C i Rije G.
U jednoj realizaciji,Xiili X2je T.
U jednoj realizaciji, Xtje T, X2je T, Y, je C, R-, je G, i k je 1.
U jednoj realizaciji, Xi je T, X2je T,Y^je C, Ri je G, k je l5p je 1, N i N' i Z3svaki ne sadrži nukleotide, i Z2 je TTTT ili d(UUUU).
U jednoj realizaciji, S2je nenukleotidni linker.
U jednoj realizaciji, S2sadrži bar jedan ostatak "abasic dSpacer"-a.
U jednoj realizaciji, oligonukleotid ima bar jedan razgranat ne nukleozidni link.
U jednoj realizaciji, molekul imunostimulatorne nukleinske kiseline obuhvata najmanje jednu dvostruku jedinicu, najmanje jednu trostruku jedinicu ili najmanje jednu dvostruku i jednu trostruku jedinicu.
U jednoj realizaciji, Sije dvostruka jedinica ili trostruka jedinica.
U jednoj realizaciji, oligonukleotid sadrži bar jedan 2'5'-, 5'5'-, 3'3'-, 2'2'-, ili 2'3'-internukleozidni link.
U jednom aspektu pronalazak opisuje molekul imunostimulatorne nukleinske kiseline Formule II
Gde svaka odZuZ2, i Z3 je nezavisno bilo koja sekvenca dužine od 0 do 12 nukleotida koja po potrebi sadrži nenukleotidni linker ili "abasic dSpacer"; svaka od Xii X2 je nezavisno timidin, dezoksiuridin, dezoksiadenozin ili 5-supstituisan dezoksiuridin; svaka od Yti Y2 je nezavisno citozin (C) ili modifikovan citozin; svaki od Rii R2 je nezavisno guanin (G) ili modifikovan guanin; N je bilo koja sekvenca sa 0 do 12 nukleotida koja po potrebi sadrži nenukleotidni linker ili "abasic dSpacer"; S!je nenukleotidni linker, "abasic" linker ("dSpacers"), Metilen glikolne jedinice ili heksaetilen glikolne jedinice, koje po potrebi obezbeđuju 2'5'-, 5 '5'-, 3 '3<*->, 2'2'-, ili 2'3'- internukleozidne linkove; S2 je bilo koja nepalindromna sekvenca sa 1 do 10 nukleotida ili nenukleotidni linker, "abasic" linker ("dSpacers"), trietilen glikolne jedinice ili heksaetilen glikolne jedinice; svaka od N-,, N2, .... Nn.,, Nn, i NZ, N2<*>, ... Nn./, Nn* je bilo koji nukleotid ili modifiikovan nukleotid gde su N, bazni-parovi sa N-i*, N2bazni-parovi sa N2<*>, ... Nn.-ibazni-parovi sa Nn.i*, i Nnbazni-parovi sa Nn<*>; k je broj od 0 do 5; n je broj od 2 do 16; p je broj od 1 do 6; i q je broj od 0 do 10, i kada je (Nn)...(N2)(N1) S2(N1#)(N2#)...(Nn<*>) dužine 10 do 42 nukleotida, S2je dužine 4 do 10 nukleotida, S2je nenukleotidni linker, "abasic" linker (dSpacers), trietilen glikolna jedinica ili heksaetilen glikolna jedinica, i/ili (Nn)...(N2)(N1) S2(N1#)(N2#)...(Nn#) sadrže manje od 2/3 GC.
U jednoj realizaciji, Zi(Nn)(Nn_i) je TYR, gde je Y , citozin ili modifikovan citozin i R je guanin ili modifikovan guanin.
U jednoj realizaciji svaka od N1tN2 Nn.!, Nn, i Ni<*>, N2\ ... Nn.-i#, Nn<*>je odabrana od C, G, ili njihovih modifikacija, gde je C bazni-par sa G.
U jednoj realizaciji svaka od Ni, N2,.... Nn.!, Nn, i Ni<*>, N2<*>,... Nn-i<*>, Nn* je odabrana od T, A, ili njihovih modifikacija i T je bazni-par sa A.
U ovim i drugim realizacijama, svaka od C, G, A, i T može da se označi kao dezoksinukleotid sa odgovarajućim bazama citozin, guanin, adenin, i timin.
U jednoj realizaciji svaka od N1, N2,.... Nn.-,, Nn, i N^, N)2#,... Nn.!<*>, Nn* je odabrana od C, T, A, G, ili njihovih modifikacija, i C bazni-parovi sa G, T bazni-parovi sa G, A azni parovi sa T5i A bazni parovi sa G.
U jednoj realizaciji svaka od N1tN2,.... Nn.-,, Nn, i N-,*, N2<*>,... Nn.i#, Nn<*>je odabrana od nemodifikovanih ili modifikovanih nukleotida koji formiraju Watson-Crick bazne parove.
U jednoj realizaciji svaka od N^ N2,.... Nn.i, Nn, i N/, N2<*>,... Nn.!<*>, Nn<*>je odabrana od nemodifikovanih ili modifikovanih nukleotida koji formiraju ne- VVatson-Crick bazne parove.
U jednoj realizaciji, molekul imunostimulatorne nukleinske kiseline sadrži delimično stabilizovan osnovni lanac sa bar jednom fosfodiestarskom vezom.
U jednoj realizaciji, molekul imunostimulatorne nukleinske kiseline ima osnovni lanac sa najmanje jednim stabilizovanim internukleotidnim linkom.
U jednoj realizaciji, intemukleotidni linkovi oligonukleotid su svi fosforotioatni linkovi.
U jednoj realizaciji, molekul imunostimulatorne nucleinske kiseline ima delimično stabilizovan osnovni lanac sa fosfodiestarskom vezom koja povezuje najmanje jedan od Y^ R, ili Y2R2.
U jednoj realizaciji, Yi je C.
U jednoj realizaciji, Ri je G.
U jednoj realizaciji, Yije C i Rije G.
U jednoj realizaciji, Xiili X2je T.
U jednoj realizaciji, Xije T, X2je T, Yjje C,R^je G, i k je 1.
U jednoj realizaciji,X^je T, X2je T, Y1je C,R^je G, k je 1 , p je 1 , svaka N i N' i Z3ne sadrži nukleotid, i Z2 je TTTT ili d(UUUU). U jednoj realizaciji, S2je nenukleotidini linker. U jednoj realizaciji, S2sadrži bar jedan ostatak abasic dSpacer-a. U jednoj realizaciji, oligonukleotid sadrži bar jedan razgranat nenukleozidni link.
U jednoj realizaciji, molekul imunostimulatorne nukleinske kiseline sadrži bar jednu dvostruku jedinicu, bar jednu trostruku jedinicu ili barj jednu dvostruku i bar jjednu trostuku jedinicu. U jednoj realivaciji, Stje dvostruka jedinica ilitrostruka jedinica.
U jednoj realizaciji, oligonukleotid sadrži bar jedan 2'5'-, 5'5'-, 3'3'-, 2'2'-, ili 2'3'-internukleozidni link.
U jednom aspektu proanalska, opisan je molekul imunostimulatorne nukleinske kiseline Formule III
gde je U,Z, [(X^ R,)N (X2Y2R2)kZ2]P( S,) W (Nn).... (N3)(N2)(N1) S2(N1#)(N2#)(N3#)...(Nn#); svaka od Zi, Z2, i Z3 je nezavisno bilo koja sekvenca sa 0 do 12 nukleotida koja po potrebi
ima nenukleotidni linker ili abasic dSpacer; svak odX^i X2 je nezavisno timidin, dezoksiuridin, dezoksiadenozin ili 5- supstituisan dezoksiuridin; svaka odY^i Y2 je nezavisno citozin ili modifikovan citozin; svaka od i R2 je nezavisno guanin ili modifikovan guanin; svaka od N i N' je nezavisno bilo koja sekvenca sa 0 do 12 nukleotida koja po potrebi sadrži nenukleotidni linker ili abasic dSpacer; Stje nenukleotidni linker, abasic linker (dSpacers), trietilen glikolna jedinice ili heksaetilen glikolna jedinica, koja po potrebi daje 2'5'-, 5 '5'-, 3 '3'-, 2'2'-, ili 2'3'- internukleozidni link; S2je bilo koja n- palindromna sekvenca sa 1 do 10 nukleotida ili nenukleotidni linker, abasic linker (dSpacers), trietilen glikolna jedinica ili heksaetilen glikolna jedinica; S3je direktan ili indirektan 2'5'-, 5'5'-, 3'3'-, 2'2'-, ili 2 '3'-internukleozidni link, ili nr-nukleotidini linker, dati nenukleotidni linker obuvhata abasic linkere (dSpacers), trietilen glikolne jedinice, ili heksaetilen glikolne jedinice olakšavajući 2'5'-, 5'5'-, 3'3'-, 2'2'-, ili 2'3'- vezivanje m delova sekvence; svaka od N1p N2, .... Nn, i N1#, N2#;... Nn# je bilo koji nukleotid ili modifikovan nukleotid gde su N1bazni-parovi sa N1#, N2bazni-parovi sa N2#, N3bazni- parovai sa N3#, ... i Nnbazni-parovai sa Nn#; k je broj od 0 do 5; m je broj od 2 do 10; n je broj od 2 do 16; p je broj od 1 do 6; i q je broj od O do 10.
U određenim realizacijama,Z^[^^RO N (X2Y2R2)k Z2]p (S^ je n- palindromna sekvenca.
U određenim realizacijama,Z^[ (X1Y1R1) N (X2Y2R2)kZ2]p (Si)q je TCGTCGTTTT
(SEQ ID NO:29), TCGTCGTTDD (SEQ ID NO:30), TCGA, TCGAC, TCGACGTC, ili
TCGACGTCG, gde je D, dSpacer.
U određenim realizacijama,Zs[^^R-O N (X2Y2R2)kZ2]p (S^ je palindromna sekvenca.
U određenim realizacijama,Zy[(X1Y1R1) N (X2Y2R2)kZ2]p (Si)q je TCGACGTCGA (SEQ ID NO:31) ili TCGTCGACGA (SEQ ID NO:32).
In certain embodiments Z:[(X,Y1R1) N (X2Y2R2)kZ2]p (SOq je TCGCGACGTT
(SEQ ID NO:33) ili TCGCGTCGTT (SEQ ID N0.34).
U jednoj realizaciji, (Nn).. -(N^Ni) S2(N1#)(N2#)...(Nn#) Z3obuhvata sekvence
AGCGAAGCT, CAATATTTATTG (SEQ ID NO:35), CCGTTTTGTGG (SEQ ID NO:36), CGGCGCCGTGCCG (SEQ ID NO:37), CGGCGCCGTTGCCG (SEQ ID NO:38), CGGCGDDCGCCG (SEQ ID NO:39), CGGCGDDDTGCCG (SEQ ID NO:40), CGGCGGDDCCGCCG (SEQ ID NO:41), CGGCGTCGCCGCCG (SEQ ID NO:42), CGTCGACGGGACGGG (SEQ ID N0.43), CGTCGACGTGACGGG (SEQ ID N0.44), GAGAGTTGGGCTCTC (SEQ ID NO:45), GTCGAGGAGGT (SEQ ID NO.-46),
TAATADDTATTA (SEQ ID NO:47), TAATATCCATTA (SEQ ID NO:48), ili TAATATTTATTA
(SEQ ID NO:49), gde je D, dSpacer.
U jednoj realizaciji, (Nn)...(N2)(N1) S2(N1#)(N2S)...(Nn#) obuhvata sekvencu
GGCGCGCTGCCG (SEQ ID NO:50).
U jednoj realizaciji, 5' kraj nukleinske kiselina počinje da imunostimulatornim motivom odabranim od (TCG)nN i RDCGYiY2N. Tje timin, Cje nemetilovan citozin, G je guanin, R je purin, D nije C, svaka odY,i Y2je nezavisno pirimidin, n je broj između 1 i 4, uključujući i ova dva, i N je bilo koja sekvenca sa 0-12 baza.
3' kraj terminalnih nukleinskih kiselina u inertovanom ponavaljanju sa mogućnošću formiranja strukture u obliku petlje. Izraz "terminlni" odnosi se na strukture na ili blizu 3' kraja. Tako, kraj u blizini palindroma može da bude postavljen na samom 3' kraju molekula ili alternativno, 3' kraj m ože da sadrži 1 ili više dodatnih nukleotida koji nisu deo invertovane ponovljene strukture. Preferentno, 3' kraj molekula sadrži 3 ili manje nukleotida koji ne čine deo invertovane ponovljene strukture.
U jednoj realizaciji, izraz "invertovano ponavljanje sa mogućnošću formiranja strukture u obliku petlje " kao stoje ovde korišćeno u sekvenci nukleotida koji formira GC-obogaćenu petlju (ili u obliku ukosnice) koja je dužine 2 do 10 konsekutivnih baznih parova, i sadrži bar jednu nesaprenu ili pogrešno sparenu bazu. U pojedinim realizacijama, GC-obogaćena petlja je dužine 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ili 10 konsekutivnih baznih parova. U nekim realizacijama GC-obogaćena petlja sadrži bar 2, 3, ili 4 G-C baznih parova.
U jednoj realizaciji, izraz "invertovano ponavljanje sa mogućnošću formiranja strukture u obliku petlje " kao što je ovde korišćeno u sekvenci nukleotida koji formira AT-obogaćenu petlju (ili u obliku ukosnice) koja je dužine 2 do 10 konsekutivnih baznih parova, i sadrži bar jednu nesaprenu ili pogrešno sparenu bazu. U pojedinim realizacijama, AT-obogaćena petlja je dužine 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ili 10 konsekutivnih baznih parova. U nekim realizacijama AT-obogaćena petlja sadrži bar 2, 3, ili 4 A-T baznih parova.
U nekim slučajevima, bar jedna nesparena ili pogrešno sparena baza spaja krajeve petlje ili "ukosnice". Ovo takođe može da omogući stvaranje sekundarne strukture obezbeđivanjem fleksibilne tačke u molekulu za bazne parove petlje i formiraju "ukosnicu". Alternativno, nesparene ili pogrešno sparene baze mogu da budu unutar petlje. Preferentno, ukoliko je pogrešno sparena baza unutar petlje, tada je petlja dužine bar 3 bazna para. Nesparene ili pogrešno sparene baze mogu biti bilo koji nukleotid. U određenim realizacijama nesparena ili pogrešno sparena baza je T. Nespareni nukleotidi na krajevima dvostrukih lanaca su takođe poznati kao viseći nukelotidi ili klimavi krajevi koji značajno mogu da stabilizuju formiranje dupleksa ili formrianje ukosnice. Freier SM et al. (1983) Effects of 3' dangling kraj stacking on the stabilitv of GGCC i CCGG double helixes.Biochemistry22:6198-206.
Nukleinske kiseline takođe sadrže delimično stabilizovan osnovni lanac sa bar jednim fosfodiestarskim 5'-CpG-3' linkom.
U nekim slučajevima, dvostruko uvijeni deo molekula takođe može da sadrži neprirodne (nestandardne) bazne parove (npr., diaminopiridin pripremljen sa ksantozinom). Lutz MJ et al. (1998) Recognition of a non-standard base pair by thermostable DNA polvmerases.Bioorg Med Chem Lett8:1149-52.
Formule definišu podskup klase CpG oligonukleotida koja je pokazala izuzetne osobine imune stimulacije. U fomulama 5' se odnosi na slobodan 5' kraj oligonukleotida, a 3' se odnosi na slobodan 3' kraj oligonukleotida.
Oligonukleotidi mogu da imaju jedan ili više dostupnih 5 ' ili 3' krajeva. U nekim realizacijama, 3' kraj se može špovezati sa drugim 3' krajem. Budući da je otkrivena i ovde opisana važnost 5' i 3' motiva, takođe je moguće stvoriti modifikovane oligonukleotide da dva takva 5' ili 3' kraja. Ovo se može postići, na primer, vezivanjem dva oligonukleotida preko 3 '-3' linka pri čemu se dobija oligonukleotid koji ima jedan ili dva pristupačna 5' kraja. Ova struktura može da ima formulu kao što je 5'- RDCGY1Y2N-NY2Y1GCDR-S' (gde D nije C; SEQ ID NO:51) ili 5'- (TCG)nN-N(GCT)n-5' (SEQ ID NO:52). 3'3'- ili 5'5'-linkovi mogu biti fosfodiestarski, fosforotioatni, ili drugi modifikovani internukleozidni mostovi. Metode za realizaciju ovih linkova su poznati u tehnici. Na primer, ovakvi linkovi su opisani u Seliger H et al. (1991) Oligonukleotide analogs with terminal 3 '-3'- i 5'-5'-internukleotidic linkages as antisense inhibitors of viral gene expression,Nukleosides & Nukleotides10:469-77 i Jiang Z et al. (1999) Pseudo- cyclic oligonukleotides: in vitro and in vivo properties,Bioorg Med Chem7:2727-35.
U nekim realizacijama, oligonukleotid ima jednu od sledećih struktura:
Pronalazak u jednom od aspekata obuhvata pronalaženje podklase C-klase CpG imunostimulatornih oligonukleotida sa himernim osnovnim lancem koji je visoko efikasan u posredovanju imuno stimulatornih efekata. Ovi CpG oligonukleotidei su korisni terapeutiski i profilaktički za stimulaciju imunog sistema za tertiranje kancera, infektivnih bolesti, alergije, astme, autoimune bolesti, i drugih oboljenja i da pomogne u zaštiti od infekcija posle hemoterapije kancera. Snažni ali i balansiran, ćelijski i humoralni imunski odgovori koji nastaju kao rezultat CpG stimulacije odražavaju prirodni odbrambreni sistrem tela od napada patogena i kanceroznih ćelija.
Pronalazak obuhvata, u jednom aspektu, otkriće CpG imunostimulatornih oligonukleotida sa poboljšanim imuno stimulatornim karakteristikama i smanjenim renalnim inflamatornim efektom. U nekim slučajevima, renalna inflamacija je zapažena kod subjekata kojima je adminsitriran kompletan fosforotioatni oligonukleotid. Pretpostavlja se da ovde opisani himerni oligonukleotidi proizvode manju renalnu nego fosforotioatni oligonukleotid i u potpunosti. Dodatno, ovi oligonukleotidi su visoko efikasni u stimulaciji imunog odgovora. Tako, fosfodiestarski deo molekula nije smanjio njihovo dejstvo.
Preferentni CpG imunostimulatorni oligonukleotidi pripadaju jednoj od sledećih 7 opštih formula:
gde je Ntdužine 1-3 nukleotida pri čemu se N odnosi na bilo koji nukleotid, X-ije pirimidin, X2i X3su bilo koji nukleotid. gde je Xt, pirimidin. gde je X!, pirimidin. gde je N? dužine 0-3 nukleotida, N2 je dužine 0-9 nukleotida, pri čemu se N odnosi na bilo koji nukleotid i X-i, X2, i X3su bilo koji nukleotidi. gde je Nt dužine 0- 3 nukleotida. gdeje N, dužine 0-3 nukleotida.
gde je N3 dužine 1-5
nukleotida pri čemu se N odnosi na bilo koji nukleotid iXuX2, i X3su bilo koji nukleotid.
Po potrebi, kada se precizira u formuli, 5' se odnosi na slobodan 5' kraj oligonukleotida i 3' se odnosi na slobodan 3' kraj oligonukleotida.
Simbol<*>koji se koristi u formulaama, odnosi se na prisustvo stabilizovanog internukleotidnog linka. Simbol _ u ovim strukturam se odnosi na prisustvo fosfodiestar internukleotidnih linkova. Intemukleotidni linkovi koji nisu označeni<*>mogu biti stabilizovani ili nestabilizovani, sve dok oligonukleotideisadrži bar 2-3 fosfodiestar ili fosfodiestar -slična internukleotidna linka. U nekim realizacijama je preferentno da oligonukleotid sadrži 3-6 fosfodiestar ili fosfodiestar-slična linka. U nekim slučajevima, linkovi između CG motiva su fosfodiestarski, a u drugim slučajevima su fosforotioatni ili drugi stabilizovani linkovi.
U nekim realizacijama, oligonukleotid ima jednu od sledećih struktura:
Izrazi "nukleinska kiselina" i "oligonukleotid" takođe obuhvataju nukleinske kiseline ili oligonukleotide sa supstitucijama ili modifikacijam, kao one u bazama i/ili šećerima. Na primer, obuhvataju oligonukleotide sa osnovnim lancem šećera koji je kovalentno vezan pored hidroksilne grupe, za organske grupe male molekuleske težine na 2' položaju i pored fosfatne grupe ili hidroksi grupe na 5' položaju. Ovako modifikovani oligonukleotidei mogu da sadrže 2'-0-alkillovanu riboza grupu. Dodatno, modifikovani oligonukleotidi mogu da sadrže šećere kao što je arabinoza ili 2'-fluoroarabinoza umesto riboze. Shodno tome, oligonukleotidi mogu biti heterogeni u sastavu osnovnog lanca te tako da sadrže bilo koju moguću kombinaciju polimernih jedinica vezanih zajedno kao što je peptid-nukleinska kiselina (koji imaju osnovni lanac amino kiselina sa osnovama nukleinskih kiselina).
Nukleinske kiseline takođe obuhvataju supstituisane purin i pirimidine kao što je C-5 propin pirimidinske i 7-deaza-7-supstituisane purinske modifikovane baze. VVagner RW et al.
(1996) Nat Biotechnol 14:840-4. Purini i pirimidini su, ali nisu i ograničeni na adenin, citozin, guanin, timin, 5-metilcitozin, 5-hidroksi citozin, 5-fluorocitozin, 2-aminopurin, 2-amino-6-hloropurin, 2,6-diaminopurin, hipoksantin, i druge prirodne nukleobaze i one koje se dobijaju sintezom, supstituisane i nesupstituisane aromatične grupe. Druge ovakve modifikaije su dobro poznate prosećnom stručnjaku.
Imunostimulatorni oligonukleotidi predmetnog pronalaska mogu da obuhvate različite hemijske modifikacije i supstitucije u poređenju sa prirodnim RNK i DNK, uključujući fosfodiestarski intemukleotidni most, jedinicu (3-D-riboze i/ili prirodnu nukleotidnu bazu (adenin, guanin, citozin, timin, uracil). Primeri hemijskih modifikacija su dobro poznati prosečnom stručnjaku i opisani su na priemr u Uhlmann E et al. (1990) Chem Rev 90:543; "Protocols for Oligonukleotides and Analogs" Svnthesis i Properties & Svnthesis i Analvtical Technigues, S. Agravval, Ed, Humana Press, Totovva, USA 1993; Crooke ST et al. (1996) Annu Rev Pharmacol Tcodcol 36:107-129; i Hunziker J et al. (1995) Mod Synth Methods 7:331-417. Oligonukleotid prema pronalasku može imati jednu ili više modifikacija, pri čemu je svaka modifikacija locirana na određenom fosfodiestarskom intemukleotidnom mostu i/ili na određenoj jedinici (3-D-riboze i/ili na određenom položaju prirodne nukleotidne baze u poređenju sa oligonukleotidom iste sekvence koji se sastoji od prirodnih DNK ili RNK.
Na primer, pronalazak se odnosi na oligonukleotide koji mogu da sadrže jednu ili više moidifikacija i pri čemu je svaka modifikacija nezavisno odabrana od: a) zamene fosfodiestarskog internukleotidnog mosta lociranog na 3' i/ili 5' kraju nukleotida modifikovanim internukleotidnim mostom, b) zamene fosfodiestar mosta lociranog na 3' i/ili 5' kraju nukleotida, defosfo mostom, c) zamene jedinice fosfata šećera iz osnovnog lanca fosfata šećera drugom jedinicom,
d) zamene jedinice B-D-riboze modifiikovanom jedinicom šećera, i
e) zamene prirodne nukleotidne baze modifikovanom nukleotidnom bazom.
Detaljniji primeri hemijskih modifikacija oligonukleotida su dati u daljem tekstu.
Fosfodiestar intemukleotidni most lociran na 3' i/ili 5' kraju nukleotida se može zameniti modifikovanim internukleotidim mostom, pri čemu je modifiikovan intemukleotidni most na primer odabran od fosforotioat, fosforoditioat, NR<1>R<2->fosforamidat, boranofosfat, a-hidroksibenzil fosfonat, fosfat-(C-i-C21)-0-alkyl estar, fosfat-[(C6-C12)aril-(C1-C2i)-0- alkiljestar, (CrC8)alkilfosfonat i/ili (C6-Ci2)arilfosfonat mostova, (C7-C12)- a-hidroksimethyl-aril (npr., opisani u WO 95/01363), gde je (C6-C12)aril, (C6- C20)aril i (C6-C14)aril po potrebi supstituisan halogenom, alkilom, alkoksi, nitro, cijano, i gde su R1 i R<2>, neyavisno jedan od drugog, vodonik, (CrC18)-alkil, (C6-C2o)-aril, (C6-Ci4)-aril-(CrC8)-alkil, preferentno vodonik, (CrC8)-alkil, preferentno (C1-C4)alkil i/ili metoksietil, ili R<1>i R2 formiraju, zajedno sa atomom azora za koji su vezani, 5-6-člani heterociklični prste koji dodatno sadrži još i heteroatom odabran iz grupe O, S i N.
Zamena fosfodiestarskog mosta lociranog na 3' i/ili 5' kraju nukleotida defosfo mostom (defosfo mostovi su opisani, na primer, in Uhlmann E and Peyman A in "Methods in Molecular Biology", Vol. 20, "Protocols for Oligonukleotides and Analogs", S. Agravval, Ed., Humana Press, Totovva 1993, Chapter 16, pp. 355 ff), gde je defosfo most na primer, odabran od defosfo mostovaformacetal, 3'-tioformacetal, metilhidroksilamin, oksim, metilenedimetil- hidrazo, dimetilensulfon i/ili silil grupa.
Fosfatna jedinica šećera (tj., S-D-riboza i fosfodiestar intemukleotidni most zajedno formiraju fosfatnu jedinicu šećera) osnovnog lanca fosfatnog šećera (tj., osnovni lanac fosfatnog šećera se sastoji od jedinica fosfatnog šećera) može se zameniti drugom jedinicom, pri čemu je druga jedinica pogodna , na primer, za stvaranje oligomera "morfolino- derivata"
(kao što je opisano, na primer, u Stirchak EP et al. (1989) Nucleic Acids Res 17:6129-41), that is, e.g., the replacement by a morpholino-derivative unit; ili to build up a polvamide nucleic acid ("PNA"; as described for example, in Nielsen PE et al. (1994) Bioconjug Chem 5:3-7), that is, e.g., the replacement by a PNA backbone unit, e.g., by 2-aminoethylglycine.
Jedinica B-riboze ili jedinica B-D-2'-dezoksiriboze može se zameniti jedinicom modifikovanog šećera, pri čemu je jedinica modifikovanog šećera, na primer, odabrana od 8-D-riboze, a-D-2'- dezoksiriboze, L-2'-dezoksiriboze, 2'-F-2'-dezoksiriboze, 2'-F-arabinoze, 2'-0-(Ci-C6)alkil- riboze, preferentno 2'-0-(C1-C6)alkil-riboza je 2'-0-methilriboza, 2'-0-(C2-C6)alkenil- riboza, 2'-[0-(C1-C6)alkil-0-(Ci-C6)alkil]-riboza, 2'-NH2-2'-dezoksiriboza, B-D-ksilo-furanoza, a-arabinofuranoza, 2,4-didezoksi-B-D-eritro-hekso-piranoza, i karboskiklični (opisani, na primer, u Froehler J (1992) Am Chem Soc 114:8320) i/ili šećerni analozi sa otovrenim lancem (opisani, na primer, u Vandendriessche et al. (1993) Tetrahedron 49:7223) and/or bicyclosugar analogs (described, for example, in Tarkov M et al. (1993) Helv Chim Acta 76:481).
U nekim preferentnim ralizacijama, šećer je 2'-0-metilriboza, posebno za jedan ili oba nukleotida vezana a fosfodiestar ili fosfodiestar-sličnim internukleotidnim linkom.
Modifikovana bata je bilo koja baza koja se hemijski razlikuje od baze koja se prirodno može naći u DNK i RNK kao što su T, C, G, A, i U, ali koje dele osnovne hemijske strrukture sa bazama koje se mogu naći u prirodi. Modifikovane nukleotidne baze mogu se na primer odabrati od hipoksantina, uracila, dihidrouracila, pseudouracila, 2-tiouracila, 4-tiouracila, 5-aminouracila, 5-(CrC6)-alkiluracila, 5-(C2-C6)- alkeniluracila, 5-(C2-C6)-alkiniluracila, 5-(hidroksimetil)uracila, 5-hlorouracila, 5-fluorouracila, 5-bromuracila, 5-hidroksicitozina, 5-(Ci-C6)-alkilcitozina, 5-(C2-C6)- alkenilcitozina, 5-(C2-C6)-alkinilcitozina, 5-hlorocitozina, 5-fluorcitozina, 5-bromcitozina, N<2->dimetilguanina, 2,4-diamino-purina, 8-azapurina, supstituisan 7-deazapurin, preferentno 7-deaza-7-supstituisan i/ili 7-deaza-8-supstituisan purin, 5-hidroksimetilcitozin, N4-alkilcitozina, npr., N4-etilcitozin, 5- hidroksidezoksicitidin, 5-hidroksimetildezoksicitidin, N4-alkildezoksicitidin, npr., N4-etildezoksicitidin, 6-tiodezoksiguanozin, i dezoksiribonukleotidi nitropirola, C5-propinilpirimidina, i diaminopurina npr., 2,6-diaminopurin, inozin, 5-metilcitozin, 2-aminopurin, 2-amino-6-hloropurm, hipoksantin ili druge modifikacije prirodnih nukelotidnih baza. Ova lista je data ilustrativno i treba je tumačiti tako da ni na koji način neograničava predmetni pronalazak.
Oligonuklotidi mogu da imaju jedan ili više dostupnih 5' krajeva. Moguće je kreirati modifikovane nukleotide koji imaju dva takva 5' kraja. To može biti postignuto, na primer, pripajanjem dva oligonukleotida preko 3'-3' spoja da bi se stvorio oligonukleotid koji ima jedan ili dva dostupna 5' kraja. 3-3' spoj može biti fosfodiestar, fosforotioat ili bilo koji drugi međunukleotidni most. Metode za izvođenje takog spoja su poznate u tehnici. Na primer, takvi spojevi su opisani u Seliger, H.; et al., Oligonucleotid analogs with terminal 3'-3'- i 5'-5' internucleotidic linkages as antisense inhibitors of viral gene expression. Nucleotides & Nucleotides (1991); 10(1-3), 469-77 i Jiang, et al., Pseudo-cvclic oligonucleotides: in vitro and in vivo properties, Bioorganic & Medicinal Chemistrv (1999, 7(12), 2727-2735.
Osim toga, 3'-3' spojeni oligonukleotidi gde spoj između 3'-terminalnih nukleotida nije fosfodiestar, fosforotioat ili drugi modifikovani most, mogu biti dobijeni korišćenjem dodatnog spejsera, kao što su tri-ili tetra- etilenglikol fosfatne grupe (Durand, M. Et al., Triple-helix formation by an oligonucleotide containing one (dA)12 and two (dT)12 sequences bridged by two hexaethylene glycol chains, Biochemistry (1992), 31(38), 9197-204, SAD Patent No. 5658738, i SAD Patent No. 5668265). Altenativno, nenukleotidna veza može biti izvedena od etandiola, propandiola, ili od smanjene deoksiribozne jedinice (dSpacer) (Fontanel, Matie Laurence et al., Sterical recognition by T4 polynucleotide kinase of non-nucleosidic moieties 5'-atached to oligonucleotides; Nucleic Acids Research (1994), 22(11), 2022-7) koristeći standardnu fosforamidit herniju. Nenukleotidna veza može biti inkorporirana jednom ili više puta, ili kombinovana jedna sa drugom dozvoljavajući bilo koje željeno rastvojanje između 3'-krajeva dva ODNs koji treba da budu povezana.
Nedavno je objavljeno da CpG oligonukleotidi ispoljavaju svoje imunostimultorne efekte preko interakcije sa Toll-sličnim receptorima 9 (TLR9). Hemmi H. et al. (2000)Nature408:740-5. Aktivnost koju signalizira TLR9 može stoga biti merena kao odgovor na CpG oligonukleotide ili druge imunostimulatorne oligonukleotide merenjem signala koje se odnose na NF-kB-NF-kB, i pogodne događaje i intermedijare uzovno ili nizvodno od Nt-kB.
Za upotrebu u ovom pronalasku, oligonukleotidi pronalaska mogu biti sintetizovani na nov način koristeći bilo koju od brojnih procedura koje su dobro poznate u tehnici. Na primer. B-cijanoetil fosforoamiditni postupak (Beaucage, S.L., and Caruthers, M.H.,Tet. Let.22:1859, 1981); i nukleotid H-phosphonatni metod (Garegget al, Tet. Let.27:4051-4054, 1986; Froehleret al., Nucl. Acid. Res.14:5399-5407, 1986, ; Gareggera/, Tet. Let.27:4055-4058, 1986, Gaffneyera/, Tet. Let.29:2619-2622, 1988). Ovi hemijski postupci mogu biti izvedeni raznim automatskim postupcima sinteze koji se dostupni na tržištu. Ovi oligonukleotidi su označeni kao sintetički oligonukleotidi.. Izolovani oligonukleotid u opštem slučaju se odnosi na oligonukleotid koji je izdvojen od komponenata sa kojima je normalno povezan u prirodi. Kao primer, izolovani oligonukleotid može biti onaj koji je izdvojen iz ćelije, nukleusa, iz mitohondrije ili iz hromatina.
Oligonukleotidi su delimično rezistentni na degradaciju (na pr., stabilizovani). "Stabilizovani molekul oligonukleotida" označava oligonukleotid koji je relativno rezistentan na degradacijuin vivo(na pr putem egzo- ili endo-nukleaze). Stabilizacija nukleinske kiseline može biti izvedena preko modifikacije osnovnog lanca. Oligonukleotidi koji imaju fosforozioatne spojeve daju maksimalnu aktivnost i štite oligonukleotid od degradacije intraceluiarnom egzo- ili endo-nukleazom. Drugi modifikovani oligonukleotidi uključuju fosfordiestar modifikovane oligonukleotide, kombinaciju fosfordiestar i fosforotioat oligonukleotide, metilfosfonat, metilfosforotioat, fosforoditioat, p-etoksi, i njihove kombinacije.
Modifikovani osnovni lanci kao što su fosforotioati mogu biti sintetizovani korišćenjem automatizovane tehnike koja koristi ili fosforoamidat ili H- fosfonat postupke. Aril-i alkil-fosfonati mogu biti načinjeni, na pr., kao što je opisano u SAD Patentu No. 4,469,863; a alkilfosfotriestri (u kojima je jonizovana kiseonična grupa alkilovana kao što je opisano u SAD Patentu No 5,023,243 i Evropskom Patentu NO. 092,574) mogu biti dobijeni automatizovanom sintezom u čvrstom stanju koristeći komercijalno dostupne reagense. Postupci za dobijanje drugih modifikacija osnovnog lanca DNK i supstitucija su opisani (na pr., Uhlmann, E and Peaman, A.,Chem Rev.90:544, 1990^Goodchild, J.,Bioconjugate Chem.1:165, 1990)
Drugi stabilizovani oligonukleotidi uključuju: nejonske DNK analoge, kao što su alkil- i aril fosfati (u kojima je jonizovani fosfonatnai kiseonik zamenjen alkil ili aril grupom), fosfodiestar i alkilfosfotriestri, u kojima je jonizovana kiselonična grupa alkilovana. Pokazalo se da su oligonukleotidi koji sadrže diol, kao što je tetraetilenglikol ili heksaetilenglikol, na bilo kom ili na oba kraja takođe suštinski rezistentni na degradaciju nukleazom.
U ovom pronalasku je otkriveno da subset CpG imunostimulatornih oligonukleotida ima dramatični imunostimulatorni efekat na humane ćelije kao što su PBMC ćelije, sugerišući da su ovi CpG imunostimulatorni oligonukleotidi efektivna terapeutska sredstva za humanu vakcinaciju, imunoterapiju kancera, imunoterapiju astme, opšte pojačanje imunskih funkcija, pojačanje hematopoeznog oporavka posle zračenja ili hemoterapije, autoimuna oboljenja i druge primene imunomodulacije. Takođe je pokazano daje subset CpG imunostimulatornih oligonukleotida koristanin vivoza lečenje astme i alergijskog rinitisa.
Osoba koja ima alergiju je osoba koja ima rizik raz voja alergijske reakcije kao odgovor na alergen. Alergija se odnosi na stečenu preosetljivost na supstancu (alergen). Alergijska stanja uključuju, bez ograničenja, ekcem, alergijski rinitis ili upalu nosne membrane, polensku groznicu, konjuktivitis, bronhijalnu astmu, urtikariju (koprivnjaču) i alergiju na hranu, i druga nasledno alergična stanja.
Alergije su u opštem slučaju izazvane stvaranjem IgE antitela protiv bezopasnih alergena. Citokini koji su indukovani sistemskom ili mukozalnom administracijom CpG imunostimulatornih oligonukleotida su predominantno klasa nazvana Th1 (primeri su IL-12, IP-10, IFN-a i IFN-v) i ovi indukuju kako humoralni tako i celularni imunski odgovor. Drugi glavni tipovi imunskog odgovora, koji su povezani sa proizvodnjom IL-4 i IL-5 citokina, označeni su kao Th2 imunski odgovori. Na osnovu sposobnosti CpG imunostimulatornih oligonukleotida da pomere imunski odgovor u osobi od predominantnog Th2 (koji je povezan sa prodikcijom IgE antitela i alergije) na uravnoteženi Th2/Th1 odgovor (koji štiti od alergijskih reakcija (odgovora)), efektivna doza za i ndukovanje imunskog odgovora CpG imunostimulatorno oligonukleotida kao samostalne terapije bez alergena ili u kombinaciji sa alergenom može biti administrirana osobi u svrhu lečenja ili prevencije astme i alergije.
Stoga, CpG imunostimulatorni oligonukleotidi imaju značajnu terapeutsku upotrebu u lečenju alergijskih stanja kao što su astma i alergijski rinitis. Th2 citokini, naročito IL-4 i IL-5 su povećani u disajnim putevima astmatične osobe. Ovi citokini podstiču važne aspekte astmatičnog inflamatornog odgovora, uključujući izotopno skretanje IgE , eozinofilnu hemotaksiju i aktivaciju rasta mastocita. Th1 citokini, naročito IFN-y i IL-12, mogu da potisnu stvaranje Th2 klona i produkciju Th2 citokina. Astma se odnosi na poremećaj respiratornog sistema koji se karakteriše inflamacijom, sužavanjem disajnih puteva i povećanom reakcijom disajnih puteva na inhalirano sredstvo. Astma je često, mada ne i isključivo, povezana sa naslednim ili alergijskim simptomima.
Astma se može pogoršati viralnom infekcijom. Kombinacija asrme i viralne infekcije značajno pogoršava simptome kod osobe. Ovde korišćeni oligonukleotidi obezbeđuju značajne koristi za lečenje viralno undukovanog pogoršanja astme. Više primera ovakve terapije je dato u tekstu koji sledi.
Alegijski rinitis je poremećaj koji se javlja kao posledica nazalne mukoze izazvane alergenima kao što je polen ili prašina. Naziv obuhvata medikamentni rinitis, suvi rinitis, i atrofirani rinitis. Postoje dva opšta tipa alergijskog rinitisa, sezonski i trajni. Sezonski alergijski rinitis se normalno odnosi na polenski groznicu i obično ga izazivaju plesni i polen. Trajni alergijski rinitis je obično uzrokovan urođenom osetljivošću na jedan ili više tipova alergena. Ovo stanje se u opštem slučaju produžava tokom godine ili tako dugo dok je osoba izložena alergenu. Oba tipa alergijskog rinitisa uključuju tip1 (IgE posredovan) preosetljivost koja dovodi do inflamacije. Smatra se da ova inflamacija je posledica preterane degranulacije mastocita i bazofila prenošenih krvlju kao odgovor na neke alergene. To dovodi do povećanih nivoa IgE oslobađajući usput inflamatorne medijatore, kao stoje histamin, i hemotaktičnih faktora, kao što su citokini, prostaglandini i leukotrieni, što dovodi do lokalizovane inflamatorne reakcije.
Imunostimulatorni oligonukleotidi mogu biti administrirani kao samostalna terapija bez dodatnih anti-alergijskih i anti-asmatičnih lekova ili terapija, ili u kombinaciji sa takvim lekovima ili terapijom. Tipični anti-alergijski i anti-asmatični lekovi i terapije uključuju korišćenje intranazalnih vazokonstriktora, intranazalnih i sistemskih antihistamina, intranazalnih glukokortikoida, stabilizatora mastocita, kao što su kromolin jedinjenja, i oralna sredstva za smanjenje kongesije.
Alergen se odnosi na supstancu (antigen) koji može da indukuje alergijski ili asmatični odgovor kod osetljive osobe. Lista alergena je ogromna i može da uključi polene, otrov insekata, perut životinja, spore gljiva i lekove(na pr. Penicilin). Primeri prirodnih, životinjskih i biljnih alergena uključuje, bez ograničenja, proteine specifične za sledeće rodove:Canine
( Canisfamiliaris) ; Dermatophagoides ( na pr. Dermatophagoides farinae) ; Felis ( Felis
domesticus) ; Ambrosia ( Ambrosia artemiisfolia; Lolium ( na pr.. Lolium perenne ili Lolium
multiflorum) ; Cryptomeria ( Cryptomeria japonica) ; Alternaria ( Alternaria alternata) ; Alder,
Alnus ( Alnus gultinoasa) ; Betula ( Betula verrucosa) ; Ouercus ( Quercus alba) ; Olea ( Olea
europa) ; Artemisia ( Artemisia vulgaris) ; Plantago ( na pr.. Plantago lanceolata) ; Parietaria ( na
pr., Parietaria officinalis ili Parietaria judaica) ; Blattella ( na pt., Blattella germanicd) ; Apis na
pr., Apis multiflorum) ; Cupressus ( na pr. Cupressus sempervirens, Cupressus arizonica i
Cupressus macrocarpa) ; Juniperus ( na pr. Juniperus sabinoides, Juniperus virginiana,
Juniperus communis i Juniperus ashei) ; Thuya ( na pr. Thuya orientalis) ; Chamaecyparis ( na
pr. Chamaecyparis obtusa) ; Periplaneta ( na pr. Periplaneta americana) ; Agropyron ( na pr.
Agropyron repens) ; Secale ( na pr. Secale cereale) ; Triticum ( na pr. Triticum aestivum) ;
Dactylis na pr. Dactylis glomerata) ; Festuca ( na pr. Festuca elatior) ; Poa ( na pr. Poapratensis
ili Poa compressa) ; Avena ( na pr. Avena sativa) ; Holcus ( na pr. Holcus lanatus) ;
Anthoxanthum ( na pr. Anthoxanthum odoratum) ; Arrhenatherum ( na pr. Arrhenatherum
elatius) ; Agrostis ( ma pr. Agrostis alba) ; Phleum ( na pr. Phleum pratense) ; Phalaris ( na pr.
Phalaris arundinacea) ; Paspalum ( na pr. Paspalum notatum) ; Sorghum ( na pr. Sorghum
halepensis) ; i Bronms ( na pr. Bromus inermis).
Oligonukleotidi su takođe korisni da preusmere imunski odgovor od Th2 imunskog odgovora na Th1 imunski odgovor. To dovodi do stvaranja relativno balansiranog Th1/Th2 okruženja. Preusmeravanje imunskog odgovora od Th2 imunskog odgovora na Th1 imunski odgovor može biti analizirano merenjem nivoa citokina stvorenih kao odgovor na nukleinsku kiselinu (na pr., indukcijom monocitnih ćelija i drugih ćelija da bi se proizveli Th1 citokini, uključujući IL-12, IFNv i GM-CSF). Preusmeravanje ili rebalans imunskog odgovora od Th2 na Th1 odgovor je naročito korisno za lečenje ili prevenciju astme. Na primer, efektivna količina za lečenje astme može biti ona količina koja je potrebna za preusmeravanje Th2 tipa imunskog odgovora koji je povezan sa astmom na Th1 tip odgovora ili na balansirano Th1/Th2 okruženje. Th2 citokini, naročito IL-4 i IL-5 su povećani u disajnim putevima astmatičnih osoba. CpG imunostimulatorni oligonukleotidi pronalaska izazivaju povećanje Th1 citokina što pomaže rebalans imunskog sistema, sprečavajući ili smanjujući nepoželjne efekte koji su povezani sa predominantnim Th2 imunskim odgovorom.
CpG imunostimulatorni oligonukleotidi su takođe korisni u nekim aspektima ovog pronalaska kao vakcina za lečenje alergije i astme osobe sa rizikom razvoja infekcije infekcionim organizmom ili kancerom gde je specifični kancer antigen identifikovan. CpG imunostimulatorni oligonukleotidi mogu se takođe dati bez antigena ili alergena za zaštitu protiv infekcije, alergije ili kancera, i u ovom slučaju ponovljene doze mogu da omoguće duži rok zaštite. Osoba sa rizikom, kako je ovde korišćeno, je osoba koja ima bilo koji rizik izlaganja infekciji koju izaziva patogen ili kancer ili alergen ili rizik razvoja kancera. Na primer, osoba sa rizikom može biti osoba koja planira da putuje u oblast gde je nađen određeni tip infekcionog agensa ili može biti osoba koja je svojim životnim stilom ili medicinskom procedurom izložena telesnim tečnostima koje mogu da sadrže infekcione organizme ili direktno organizmima ili čak i bilo koja osoba koja živi u okolini gde je infekcioni organizam ili alergen identifikovan. Osobe sa rizikom razvoja infekcije takođe obuhvataju opštu populaciju kojoj lekari preporučuju vakcinaciju antigenom određenog infekcionog organizma. Ako je antigen alergen i osoba alergiski odgovara na taj određeni antigen i osoba može biti izložena antigenu, na primer tokom sezone polena, tada je ta osoba sa rizikom izlaganja antigenu. Osoba sa rizikom razvoja alergije na astmu obuhvata one osobe koje su identifikovane da imaju alergiju ili astmu ali koje nemaju aktivno oboljenje za vreme lečenja CpG imunostimulatornim oligonukleotidima, kao i osobe za koje se smatra da imaju rizik razvoja ovih bolesti zbog genetskih faktora ili uticaja okoline.
Osoba sa rizikom razvoja kancera je ona koja ima veliku verovatnoću razvoja kancera. Ove osobe uključuju, na primer, osobe koje imaju genetske anomalije, za koje je pokazano da su u korelaciji sa većom verovatnoćom razvoja kancera ili osobe izložene kanceroznim sredstvima kao što je duvan, azbest, ili drugi hemijski otrovi, ili osoba koja je ranije lečena od kancera i nalazi se u očiglednoj remisiji. Kad se osoba sa rizikom od razvoja kancera leči antigenom specifičnim za taj tip kancera i CpG imunostimulatornim oligonukleotidom, osoba može biti sposobna da uništi ćelije kancera pri njihovoj pojavi. Ako se kod osobe počinje da stvara tumor, osoba će razviti specifični imunski odgovor na antigen tumora.
Osim upotrebe CpG imunostimulatornih oligonukleotida za profilatičko lečenje, pronalazak takođe obuhvata upotrebu CpG imunostimulatornih oligonukleotida za lečenje osoba koje imaju infekciju, alergiju, astmu, ili kancer.
Osoba koja ima infekciju je ona koja je izložena infekcionom patogenu i ima akutne ili hronične nivoe patogena koji se detektuju u telu. CpG imunostimulatorni oligonukleotidi se mogu koristiti sa ili bez antigena da bi se stvorio antigen specifični sistemski ili mukozalni imunski odgovor koji je sposoban da redukuje nivo infekcionog patogena ili da ga iskoreni. Infekciono oboljenje, kako je ovde korišćeno, je oboljenje koje nastaje zbog prisustva stranog mikroorganizma u telu. Naročito je važno razvijaanje efektivne strategije vakcine i lečenja da bi se zaštitile mukozalne površine tela, koje su primarna mesta ulaska patogena.
Osoba koja ima kancer je osoba koja ima detektovane kancerozne ćelije. Kancer može biti maligni ili nemaligni. Kanceri ili tumori obuhvataju, bez ograničenja, kancer žučnog trakta; kancer mozga; kancer grudi; cervikalni kancer; horiokarcinom; kancer debelog creva; endometrijski kancer; ezofagijalni kancer; gastritijski kancer; intraepitelialne neoplazme; limfome; kancer jetre; kancer pluća (na pr. malih ćelija i onih koje nisu male); melanom, neuroblastome; oralni kancer, kancer jajnika; kancer pankreasa; kancer prostate; rektalni kancer; sarkom; kancer kože; testikulmi kancer; tiroidni kancer; i renalni kaner, kao i druge karcinome i sarkome. U jednom pristupu kancer je leukemija kosmatih ćelija, hronična mielogenozna leukemija, leukemija kožnih T-ćelija, višestruki folikularni limfom, maligni melanom, karcinom skvamoznih ćelija, karcinom renalnih ćelija, karcinom prostate, karcinom ćelija bešike, ili karcinom debelog creva.
Osoba označava čoveka ili kičmenjalka uključujući, bez ograničenja, psa, mačku, konja, kravu, svinju, ovcu, kozu, ćurku, kokošku, primate, na pr., majmuna, i ribe (gajene vrste), na pr. losos. Prema tome, pronalazak se takođe može koristiti da se leče kanceri i tumori, infekcije i alergija/astm kod osoba koje nisu ljudi. Kancer je jedan od vodećih uzroka smrti kod životinja pratilaca (t. j., mačaka i pasa ).
Kako je ovde korišćeno izraz lečiti, lečen, ili lečenje, kad je korišćeno u vezi sa poremećajem kao što je infekciono oboljenje, kancer, alergija, ili astma, odnosi se na profilaktičko lečenje koje povećava rezistentnost osobe na razvoj oboljenja (na pr., infekcije patogenom) ili, drugim rečima, smanjuje verovatnoću da će se kod osobe razviti oboljenje (na pr., da se inficira patogenom) kao i lečenje pošto je osoba obolela da bi se borilo protiv oboljenja (na pr., smanji i elimiše infekcija), ili spreči da se bolest pogorša.
U slučajevima kada je CpG imunostimulatorni oligonukleotid administriran sa antigenom, osoba može biti izložena antigenu. Kako je ovde korišćeno, izraz izložen odnosi se na bilo koji aktivni stupanj kontakta osobe sa antigenom ili pasivno izlaganjeosobe antigenuin vivo.Metode aktivnog izlaganja osobe antigenu su dobro poznate u tehnici. U opštem slučaju, antigen je administriran direktno osobi na način kao što je intravenozna, intramuskularna, oralna, transdermalna, mukozalna, intranazalna, intratrahealnaa, ili supkutana administracija. Antigen može biti administriran sistemski ili lokalno. Metode za administraciju antigena i CpG imunostimulatornih oligonukleotida su detaljnije opisane u tekstu koji sledi. Osoba je pasivno izložena antigenu ako antigen postane dostupan izlaganju imunskim ćelijama u telu. Osoba može biti pasivno izložena antigenu, na primer, ulaskom stranog patogena u telo ili razvojem ćelija tumora koje ekspresuju strani antigen na svoju površinu.
Postupci u kojima je osoba pasivno izložena antigenu mogu naročito zavisiti od podešavanja vremena administracijeCpG imunostimulatornog nukleotida. Na primer, osobi sa rizikom razvoja kancera ili infektivne bolesti ili alergijskog ili astmatičnog odgovora može biti redovno administriran CpG imunostimulatorni nukleotid kad je rizik najveći, na pr., tokom sezone alergija ili posle izlaganja sredstvu koje uzrokuje kancer. Osim toga, CpG imunostimulatorni nukleotid može biti administriran putnicima pre njihovog puta u strane zemlje gde će biti izložene riziku infekcije. Slično, CpG imunostimulatorni nukleotid može biti administriran vojnicima ili civilima sa rizikom izlaganja biološkom ratu da bi se indukovao sistemski ili mukozalni imunski odgovor na antigen kad i ako mu je osoba izložena.
Antigen, kako je ovde korušćen, je molekul koji je sposoban da izazove imunski odgovor. Antigeni uključuju, bez ograničenja, ćelije, ekstrakte ćelija, proteine, polipeptide, peptide, polisaharide, konjugovane polisaharide, peptidne i nepeptidne mimike polisaharida i drugih molekula, male molekule, lipide, glikolipide, ugljovodonike, viruse i viralne ekstrakte i muticelularne organizme kao što su paraziti i alergeni. Izraz antigen u širem smislu obuhvata bilo koji tip molekula koji imunski sistem domaćina prepoznaje kao strani. Antigeni uključuju, bez ograničenja, antigene kancera, mikrobne antigene i alergene.
Antigen kancera, kako je ovde korišćen, je jedinjenje, kao što je peptid ili protein, povezan sa površinom ćelije tumora ili kancera i koji je sposoban da provocira imunski odgovor kad je eksprimovan na površini antigena koji predstavlja ćeliju u kontekstu sa MHC molekulom. Antigeni kancera mogu iti pripremljeni od ćelija kancera bilo pravljenjem sirovog ekstrakta ćelija kancera, na primer, kao što je opisano kod Cohen et al., 1994, Cancer research, 54: 1055., parcijalnim prečišćavanjem antigena, rekombinacionom tehnologijom, ili novom sintezom poznatih antigena. Antigeni kancera uključuju, kako je ovde korišćeno, antigene koji su rekombinantno ekspimsovani, njihov imunogeni deo, ili ceo tumor ili kancer. Takvi antigeni mogu biti izolovani ili rekombinantno pripremljeni ili na bilo koji drugi način poznat u tehnici.
Mikrobni antigen, kako je ovde korišćen, je antigen mikroorganizma i obuhvata, bez ograničenja, viruse, bakterije, parazite i gljivice. Takvi antigeni uključuju netaknute mikroorganizme kao i prirodne izolate i fragmente ili njihove derivate i takođe i sintetička jedinjenja koja su identična ili slična antigenima prirodnih mikroorganizama i indukuju imunski odgovor specifičan za taj mikroorganizam. Jedinjenje je slično antigenu prirodnog mikoorganizma ako indukuje imunski odgovor (humoralni i/ili celularni) na prirodni antigen mikroorganizma. Takvi antigeni se rutinski koriste u tehnici i dobro su poznati prosečnom stručnjaku.
Izraz suštinski prečišćen, kako je ovde korišćen, odnosi se na polipeptid koji je suštinski bez drugih proteina, lipida, ugljenih hidrata ili drugih materijala sa kojima je on prirodno povezan. Prosečni stručnjak može da prečisti viralne ili bakterijske polipeptide koristeći standardne tehnike za prečišćavanje proteina. Sištinski prečišćen polipeptid često daje glavnu traku na neredukujućiem poliamidnom gelu. U slučaju parcijalno glikoziliranih polipeptida ili onih koji imaju nekoliko početnih kodona, može biti više traka na neredukujućem poliamidnom gelu, ali će oni obrazovati posebni raspored. Čistoća viralnih ili bakterijskih polipeptida može takođe da se odredi analizom sekvence amino-terminalnih amino kiselina. Drugi tipovi antigena koji nisu kodirani vektorom nukleinske kiseline, kao što su polisaharidi, mali molekuli, mimici itd. uključuni su u opseg pronalaska.
Oligonukleotidi pronalaska se mogu administrirati osobi anti-mikrobnim sredstvom. Anti-mikrobno sredstvo, kako je ovde korišćeno, odnosi se na jedinjenja koja se javljaju u prirodi ili sintetička jedinjenja koja su sposobna da unište ili iinhibiraju infekcione mikroorganizme. Tip anti.mikrobnog sredstva koje se koristi prema pronalasku će zavisiti od tipa mikroorganizma kojim je osoba inficirna ili je na riziku da će se inficirati. Anti-mikrobna sredstva uključuju, bez ograničenja, anti-bakterijska sredstva, anti-viralna sredstva, anti-fungalna sredstva i anti- parazitska sredstva. Izrazi kao što su "anti-bakterijsko sredstvo", "anti-viralno sredstvo", "anti.fungalno sredstvo'V'anti- parazitsko sredstvo" i "paraziticid" imaju dobro poznato značenje za prosečnog stručnjaka i definisani su standardnim medicinskim tekstovima. Ukratko, antri-bakterijsko sredstvo uništava ili inhibira bakterije, i uključuje antibiotike kao i druga slična sintetička ili prirodna jedinjenja koja imaju slične funkcije. Antibiotici su jedinjenja male molekularne tešine koji ćelije, kao što su mikroorganizmi, proizvode kao sekundarne metabolite. U opštem slučaju, antibiotici interferiraju sa jednom ili više bakterijskih finkcija ili struktura koje su specifične za mikroorganizam i koje nisu prisutne u ćelijama domaćina. Anti-viralna sredstva mogu biti izolovana iz priridnih izvora ili sintetozovana i korišćena za uništavanje ili inhibiciju virusa. Anti-fungalna sredstva se koriste za lečenje specifičnih gljivičnih infekcija kao i oportunističkih infekcija i sistemskih gljivičnih infekcija. Anti-parazotske sredstva uništavaju ili inhibiraju parazite.
Primeri anti-parazitskih sredtava, takođe poznatih kao paraziticidi, koji se koriste za humanu administraciju uključuju, bez ograničenja, albendazol, amfotericin B, benznidazol, bitional, hlorohin HCI, hlorokvin fosfat, cindamicin, dehidroemetin, dietilkarbamazin, diloksanid furoat, eflornitin, furazolidaon, glukokortikoide, halofantrin, jodohinol, ivermektin, mebendazol, meflohin, meglumin antimoniat, melarzoprol, metrifonat, metronidazol, niklozamid, nifurtimoks, oksamnihin, paramomicin, pentamidin izetionat, piperazin, prazikvantel, promakvin fosfat, progvanil, pirantel pamoat, pirimetanmin-sulfonamide, pirimetanmin-silfadoksin, hinakrin HCI, kinin sulfat, hinidin glukonat, spiramicin, natrijum stiboglukonat (natrijum antimon glukonat), suramin, tetraciklicn, doksiciklin, tiabendazol, tinidazol, trimetroprim-sulfametoksazol, i triparsamid, od koji se neki koriste sami ili u kombinaciji sa drugima.
Antribakterijska sredstva uništavaju rast ili funkciju bakterija. Velika klasa antibakterijskih sredstava su antibiotici. Antibiotici koji su efektivni za uništavanje ili inhibiciju širokog opsega bakterija, poznati su kao antibiotici širokog spektra. Drugi tipovi antibiotika su prvenstveno efektivni protiv bakterija klasa gram-pozitivnih ili gram-negativnih. Ovi tipovi antibiotika su poznati kao antibiotici uskog spektra. Drugi antibiotici koji su efektivni protiv pojedinačnog organizma ili oboljenja a ne prema drugim tipovima bakterija, poznati su kao antibiotici ograničenog spektra. Antibakterijska sredstva su ponekad klasifikovana prema njihovom primarnom načinu dejstva. U opštem slučaju, antibakterijska sredstva su inhibitori sinteze ćelijskih zidova, inhibitori ćelijskih membrana, inhibitori sinteze proteina, sinteze nukleinskih kiselina ili funkcionalni inhibitori, i kompetitivni inhibitori.
Anitiviralna sredstva su jedinjenja koja sprečavaju infekciju ćelija virusima ili replikacijom virusa unutar ćelije. Ima mnogo manje intiviralnih lekova nego antibakterijskih lekva pošto je proces viralne replikacije toliko blizak replikaciji DNK unutar ćelije domaćina, da su nespecifična antiviralna sredstva često toksična za domaćina. Ima nekoliko stadijuma unutar procesa viralne infekcije koji mogu btdi blokirani ili inhibirani antiviralnim sredstvima. Ovi stadijumi uključuju vezivanje virusa za ćeliju domaćina (imunoglobulin ili vezivni peptidi), skidanje omotača virusa (na pr., amantadin), sinteza ili translacija viralne mRNK (na pr. interferon), replikacija viralne RNK ili DNK (na pr. analozi nukleotida), sazrevanje novih proteina virusa (na pr. inhibitora proteaze), i pupljenje i oslobađanje virusa.
Analozi nukleotida su sintetička jedinjenja koja su slična nukleotidima, ali imaju nekompletnu ili abnormalnu deoksiriboza ili riboza grupu. Jednom kad su analozi nukleotida u ćeliji, oni su fosforolizirani, dajući oblik trifosfata koji se takmiči sa normalnim nukleotidima za inkorporiranje u viralnu DNK ili RNK. Kad je trifosfatni oblik analoga nukleotida inkorporiran u rastući lanac nukleinske kiseline, on izaziva ireverzibilnu asocijaciju sa viralnom polimerazom i prekid lanca. Analozi nukleotida uključuju, bez ograničenja, aciklovir ( korišćen za lečenje virusa herpes simpleks i varićela-zoster virusa); ganciklovir (koristan za lečenje citomegalovirusa), idoksuridin, ribavin ( koristan za lečenje respiratornog sincitijalnog virusa), dideoksiinozin, dideoksicitidin, zidovudin (azidotimidin), imikvimod, i rezimikvimod.
Interferoni su citokini koje luče ćelije inficirane virusom kao i imune ćelija. Interferon funkcioniše vezivanjem za specifične receptore na ćeliji koja je u susedstvu inficirane ćelije, uzrokujući promenu u ćeliji koja je štiti od infekcije virusom, a i (3-interferon takođe indukuju ekpresiju klase I i Klase II MHC molekula na površini inficiranih ćelija, što dovodi do povećane antigen prezentacije za prepoznavanje imunskih ćelija domaćina, a i (3 -interferoni su dostupni kao rekombinovani oblici i korišćeni su za lečenje hroničnih infekcija hepatitisa B i C. Pri dozama koje su efektivne za anti-viralnu terapiju, interferoni imaju teške nuspojave, kao što su groznica, osećanje slobosti i gubitak težine.
Antiviralna sredstva korisna u pronalasku uključuju, bez ograničenja, imunoglobuline, amantadin, interferone, analoge nukleoitida, i inhibitore proteaze. Specifični primeri antiviralnih sredstava uključuju, bez ograničenja, Acemanan,; Aciklovir, Natrijum Aciklovir, Adefovir, Alovudin, Alvircept Sudotox, Amadantin Hidrohlorid, Arantonin; Arildon; Atevirdin Mezilat; Avridin; Cidofovir; Cipamfvlline; Cvtarabine Hidrohloride; Delavirdine Mesilate; Desciclovir; Didanosine; Disoxaril; Edoxudine; Enviradene; Enviroxime; Famciclovir; Famotine Hidrohloride; Fiacitabine; Fialuridine; Fosarilate; Foscarnet Natrijum; Fosfonet Natrijum; Ganciclovir; Ganciclovir Natrijum; ldoxuridine; Kethoxal; Lamivudine; Lobucavir; Memotine Hhdrohloride; Methisazone; Nevirapine; Penciclovir; Pirodavir; Ribavirin; Rimantadine Hidrohloride; Saquinavir Mesilate; Somantadine Hidrohloride; Sorivudine; Statolon; Stavudine; Tilorone Hdrohloride; Trifluridine; Valacvclovir Hidrohloride; Vidarabine; Vidarabine Fosfate; Vidarabine Natrijum Fosfate; Viroxime; Zalcitabine; Zidovudine; and Zinviroxime.
Anti-gljivična sredstva su korisna za lečenje i prevenciju gljivičnih infekcija. Anti-gljivična sredstva se ponekad klasifikuju prema njihovom mehanizmu delovanja. Neka anti-gljivična sredstva deluju kao inhibitori ćelijskih zidova inhbicijom sintaze glukoze. Ova uključuju, bez ograničenja, baziungin/ECB. Druga anti-gljivična sredstva deluju destabilišući celovitost membrane. Ova uključuju, bez ograničenja, imidazole, kao što su klotrimazol, sertakonzol, flukonazol, itrakonazol, ketokonazol, mikonazol, i vorikonakol, kao i FK 463, amfotericin B, BAY 38-9502, MK 991, pradimicin, UK 292, butenafin, i terbinafin. Druga anti-gljivična sredstva deluju cepajući hitin ( na pr. hitinazu) ili imunosupresijom (krem 501)
CpG imunostimulatorni oligonukleotidi mogu biti kombinovani sa drugim terapeutskim sredstvima, kao što su pomagala, da pojačaju imunski odgovor. CpG imunostimulatorni oligonukleotidi i druga terapeutska sredstva mogu biti administrirani istovremeno ili sukcesivno.. Kada su druga terapeutska sredstva administrirana istovremeno ona to mogu biti u istim ili posebnim preparatima, ali su administrirana u isto vreme. Druga terapeutska sredstva su administrirana sukcesivno jedno sa drugim ili sa CpG imunostimulatornim oligonukleotidom, kad je admnistracija drugog terapeutskog sredstva i CpG imunostimulatorniog oligonukleotida vremenski razdvojena. Vremensko razdvajanje između administracija ovih jedinjenja može biti pitanje minuta ili može biti duže. Druga terapeutska sredstva uključuju, bez ograničenja, pomagala, citokine, antitela, antigene, itd.
Jedinjenja pronalaska mogu takođe biti administrirana sa nenukleinskim kiselinama
kao pomagalima. Nenukleinska kiselina kao pomagalo je bilo koji molekul ili jedinjenje izuzev CpG imunostimulatornih oligonukleotida koji su ovde opisani, koji mogu stimulisati humoralni i/ili celularni imunski odgovor. Ove nenukleinske kiseline uključuju, na primer, pomagala koja kreiraju efekat depoa, stimulišu imunitet, i pomagala koja kreiraju u efekat depoa i stimulišu imunski sistem.
CpG imunostimulatorni oligonukleotidi su takođe korisni kao mukozalna pomagala. Ranije je otkriveno da su kako sistemski tako i mukozalni imunitet indukovani mukozalnom distribucijom CpG imunostimulatornih oligonukleotida. Prema tome, oligonukleotidi mogu biti administrirani u kombinaciji sa drugim mukozalnim pomagalima.
Imunski odgovori mogu takođe biti indukovani ili pojačani ko-administracijom ili kolinearnim eksprimovanjem citokina (BuelerS Mulligan, 1996; Chovvetal., 1997; Geissleret al., 1997; lwasaki et al., 1997; Kim et al., 1997) ili B-7-ko-stimulatornim molekulima (Ivvasaki et al., 1997; Tsuji et al., 1997) sa CpG imunostimulatornim oligonukleotidima. Izraz citokin js koristi kao generično ime za različite grupe rastvorljivih proteina i peptida koji deluju kao humoralni regulatori pri nano- i pikomolarnim koncentracijam i koji, bilo pod normalnim ili patološkim uslovima, moduliraju funkcionalne aktivnosti individualnih ćelija ili tkiva. Ovi proteini takođe posreduju u interakciji direktno između ćelija i regulišu procese učestvujući u ekstracelularnom okruženju. Primeri citokina uključuju, bez ograničenja, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-10, IL-12, IL-15, IL-18, faktor stimulacije kolonije granulocita-makrofaga (GM-CSF), faktor stimulacije kolonije granulocita (G-CSF), interferon-Y(v-IFN), IFN-a, faktor nekroze tumora (TNF), TGF-B, FLT-ligand i CD40 ligand.
Oligonukleotidi su takođe korisni za poboljšanje opstanka (preživaljavanje), diferencijacije, aktivacije i sazrevanja dendritskih ćelija. CpG imunostimulatorni oligonukleotidi imaju jedinstvenu sposobnost da promovišu opstanak, diferencijaciju, aktivaciju i sazrevanje dendritskih ćelija.
CpG imunostimulatorni oligonukleotidi takođe povećavaju lizogenu aktivnost prirodnih ćelija ubica NK (naturak killer, NK) i celularnu citotoksičnost koja zavisi od antitela (ADCC). ADDC može biti izvedena korišćenjem CpG imunostimulatornog oligonukleotida u kombinaciji sa antitelom specifičnim za celularnu metu, kao šte je ćelija kancera. Kad je CpG imunostimulatorni oligonukleotid administriran osobi zajedno sa antitelom, imunski sistem osobe je indukovan da uništi ćeliju tumora. Antitela koja su korisna u ADCC prpceduri uključuju antitela koja reaguju sa ćelijama u telu. Mnoga takva antitela specifična za celularne mete su opisana u tehnici i mnoga su komercijalno dostupna.
CpG imunostimulatorni oligonukleotidi mogu takođe biti administrirani u kombinaciji sa anti-kancer terapijom. Anti-kancer terapija obuhvata lekove, zračenje i hirurške procedure. Kako je ovde korišćeno "lek za kancer" odnosi se na sredstvo koje je admnistrirano osobi sa ciljem lečenja kancera. Kako je ovde korišćeno, "lečenje kancera" uključuje prevenciju razvoja kancera, redukciju simptoma kancera i/ili inhibiciju rasta ustanovljenog kancera. U drugim aspektima, lek kancera je administriran osobi sa rizikom razvoja kancera u svrhu smanjenja rizika razvoja kancera. Razni tipovi lekova za lečenje kancera su ovde opisani. Radi specifikacije, lekovi za kancer su klasifikovani kao hemoterapeutska sredstva, imunoterapeurska sredstva, vakcine za kancer, hormonska terapija, i modifikatori biološkog odgovora.
U jednom pristupu, lek za kancer je hemoterapeutsko sredstvo izabrano iz grupe koja sadrži metotreksat, vinkristin, adriamicin, cisplatin, hloroetilnitrozouree koje ne sasrže šećer, 5-fluoracil, mitomicin C, bleomicin, doksorubicin, dikarbazin taksol, fragilin, Maglamin GLA, valrubicin, karmustain i poliferpozan, MMI270, Bay 12-9566, RAF inhibitor famezil transferaze, inhibitor famezil transferaze, MMP, MTA/LY231514, LY264618/Lomotexetol, Glamolec,CI-994, TNP-470, Hvcamtin/Topotecan, PKC412, Valspodar/PSC833, Novantrone/Mitroxantrone, Metaret/Suramin, Batimastat, E7070, BCH-4556, CS-682, 9- AC, AG3340, AG3433, lncel/VX-710, VX-853, ZD0101, ISI641, ODN 698, TA 2516/Marmistat, BB2516/Marmistat, CDP 845, D2163, PD183805, DX8951f, Lemonal DP 2202, FK 317, Picibanil/OK-432, AD 32A/alrubicin, Metastron/derivat stroncijuma, Temodal/Temozolomide, Evacet/liposomalni doxorubicin, Yewtaxan/Placlitaxel, Taxol/Paclitaxel, Xeload/Capecitabine, Furtulon/Doxifluridine, Cyclopax/oralni paclitaxel, Oral Taxoid, SPU-077/Cisplatin, HMR 1275/Flavopiridol, CP-358 (774)/EGFR, CP-609 (754)/RAS inhibito onkogena, BMS-182751/oralna platina, UFT(Tegafur/Uracil), Ergamisol/Levamisole, Eniluracil/776C85/5FU pojačivač, Campto/Levamisole, Camptosar/lrinotecan, Tumodex/Ralitrexed, Leustatin/Cladribine, Paxex/Paclitaxel, Doxil/liposomalni doxorubicin, Caelyx/liposomalni doxorubicin, Fludara/Fludarabine, Pharmarubicin/Epirubicin, DepoCyt, ZDI 839, LU 79553/Bis-Naphtalimide, LU 103793/Dolastain, Caetyx/liposomalni doxorubicin, Gemzar/Gemcitabine, ZD 0473/Anormed, YM 116, jodna zrna, CDK4 and CDK2 inhibitori, PARP inhibitori, D4809/Dexifosamide, lfes/Mesnex/lfosamide, Vumon/Teniposide, Paraplatin/Carboplatin, Plantinol/cisplatin, Vepeside/Etoposide, ZD 9331, Taxotere/Docetaxel, prolek gvanin arabinozida, Taxane Analog, nitrozouree, alkilaciona sredstva kao što su melfelan i ciklofosfamid, Aminoglutethimide, Asparaginase, Busulfan, Carboplatin, Chlorombucil, Cytarabine HCI, Dactinomvcin, Daunorubicin HCI, Estramustine natrijum fosfate, Etoposide (VP 16-213), Floxuridine, Fluorouracil (5-FU), Flutamide, Hydroxyurea (hidroksikarbamid), Ifosfamide, Interferon Alfa-2a, Alfa-2b, Leuprolide acetat (LHRH- analog faktora oslobađanja), Lomustine (CCNU), Mechlorethamine HCI (azotna slačica), Mercaptopurine, Mesna, Mitotane (o.p'-DDD), Mitoxantrone HCI, Octreotide, Plicamvcin, Procarbazine HCI, Streptozocin, Tamoxifen citrat, Thioguanine, Thiotepa, Vinblastine sulfat, Amsacrine (m-AMSA), Azacitidine, Erthropoietin, Hexamethylmelamine (HMM), Interleukin 2, Mitoguazone (metil-GAG; metil glioksal bis-gvanilhidrazon; MGBG), Pentostatin (2'deoksikoformicin), Semustine (metil-CCNU), Teniposide (VM-26) and Vindesine sulfat. U jednom važnom pristupu lek za kancer je taksol. U drugom važnom pristupu lek za kancer je kombinacija karboplatine i paclitaksela.
U drugom pristupu lek za kancer je imunoterapeutsko sredstvo odabrano iz grupe koja sadrži Ributaxin, Herceptin, Quadramet, Panorex, IDEC- Y2B8, BEC2, C225, Oncolvm, SMART M195, ATRAGEN, Ovarex, Bexxar, LDP-03, ior 16, MDX-210, MDX-11, MDX-22, OV103, 3622VV94, anti-VEGF, Zenapax, MDX- 220, MDX-447, MELIMMUNE-2, MELIMMUNE-I, CEACIDE, Pretarget, NovoMAb- G2, TNT, Gliomab-H, GNI-250, EMD-72000, LvmphoCide, CMA 676, Monopharm-C, 4B5, ioregf.r3, iorc5, BABS, anti-FLK-2, MDX-260, ANA Ab, SMART I DIO Ab, SMART ABL 364 Ab i ImmuRAIT-CEA.
Osim toga, metode pronalaska imaju cilj da obuhvate korišćenje više od jednog leka za kancer zajedno sa CpG imunostimulatornim oligonukleotidima. Kao primer, kad je pogodno, CpG imunostimulatorni oligonukleotidi mogi biti administrirani i sa hemoterapeutskim sredstvom i sa imunoterapeutskim sredstvom. Alternativno, lek za kancer može da obuhvati imunoterapeutsko sredstvo i vakcinu za kancer, ili hemoterapeutsko sredstvo i vakcinu za kancer, ili hemoterapeutsko sredstvo, imunoterapeutsko sredstvo i vakcinu za kancer, sve administrirano jednoj osobi u svrhu lečenja osobe koja ima kancer ili rizik razvoja kancera.
Korišćenje CpG imunostimulatornih oligonukleotida zajedno sa imunoterapeutskim sredstvima kao što su monoklonalna antitela je sposobno da poveća dugotrajno preživljavanje preko raznih mehanizama uključujući značajno pojačanje ADCC (kao što je ranije diskutovano), aktivacijom prirodnih ćelija ubica (NK) i povećanje nivoa IFNa. Oligonukleotidi, kafa se koriste u kombinaciji sa monoklonalnim antitelima, služe da smanje dozu antitela koja je potrebna da bi se postigao biološki rezultat.
Kako je ovde korišćeno, izraz "kancer antigen" i "tumor antihen" se uzajamno koriste i odnose na antigene koji su različito eksprimovani ćelijama kancera i mogu time da se iskoriste za ciljanje na ćelije raka. Kancer antigeni su antigeni koji potencijalno mogu da stimulišu vidljivi tumor-specifični imunski odgovor. Neki od tih antigena su kodirani, mada ne i neophodno eksprimovani, normalnim ćelijama. Ovi antigeni mogu biti karakterisani kao oni koji su normalno „ćutljivi" (t. j., ne eksprimiraju se) u normalnim ćelijama, oni koji su eksprimovani samo na određenim stadijumima diferencijacije i oni koji se privremeno eksprimovani kao embrionski i fetalni antigeni. Drugi kancer antigeni su kodirani mutantnim celularnim genima, kao što su onkogeni (na pr., aktivirani ras onkogen), supresor geni (na pr., mutant p53), spojeni proteini nastali od unutrašnje delecije ili hromozomalne translokacije. I drugi kancer antigeni mogu biti kodirani viralnim genima kao što su oni koje nose RNK ili DNK virusa tumora.
CpG imunostimulatorni oligonukleotidi su takođe korisni za lečenje i prevenciju autoimunskih oboljenja. Autoimuno oboljenje je klasa oboljenja u kojoj sopstvena antitela osobe reaguju sa tkivom domaćina ili u kojima imune efektor T ćelije su autoreaktivna na sopstvene endogene peptide i izazivaju destrukciju tkiva. Zbog toga se podiže imunski odgovor na sopstvene antigene subjekta, opisane kao auto antigeni. Autoimunska oboljenja uključuju, bez ograničenja, reumatoidni artritis, Cronovu bolest, multipl sklerozu, sistemski lupus eritematozus (SLE), autoimunski encefalomielitis, miasteniju gravis (MG), Hašimotov tiroiditis, Godpasturov sindrom, pemfigus ( na pr., pemfigus vulgaris), Gravovo oboljenje, autoimunsku hemolitičku anemiju, autoimunsku trombocitopeničnu purpuru, sclerodermu sa antikolagenim antitelima, razna oboljenja vezivnog tkiva, polimiozitis, smrtnu anemiju, idiopatsku Afisonovu bolest, neplodnost povezanu sa autoimunitetom, glomerulonefritis (na pr. krescentni glomerulonefritis, proliferativni glomerilonefritis), bulozni pemfigoid, Sjorgenov sindrom, rezistenciju na insulin, i autoimunski dijabetes melitus.
"Auto-antigen" kako je ovde korišćen odnosi se na antigen normalnog tkiva domaćina. Normalno tkivo domaćina na uključuje ćelije kancera. Stoga imunski odgovor koji se javlja protiv auto-antigena, u kontekstu autoimunskog oboljenja, je neželjeni imunski odgovor i doprinosi destrukciji i oštećenju normalnog tkiva, dok imunski odgovor koji se javlja protiv antigena kancera je željeni imunski odgovor i doprinosi destrukciji tumora ili kancera. Stoga, u nekim aspektima pronalaska namenjenim lečenju autoimunskih poremećaja nije preporučeno da se CpG imunostimulatorni oligonukleotidi administriraju sa auto-antigenima, naročito sa onima koji su meta autoimunskog poremećaja.
U drugim slučajevima, CpG imunostimulatorni oligonukleotidi mogu biti distribuirani sa malim dozama auto-antigena. Brojna ispitivanja na životinjama su pokazala da mukozalna administracija malih doza antigena može da dovede do stanja smanjenog odgovora ili "tolerancije". Aktivni mehanizam je izgleda citokinom izazvana imuna devijacija od Th1 prema predominantno Th2 i Th3 (t.j., TGF-B dominantnom) odgovoru. Aktivno potiskivanje (supresija) distribucijom malih doza antigena može takođe da potigne nepovezani imunski odgovor (pasivna supresija- „bvstander supression") koji je od znatnog interesa u terapiji autoimunskih oboljenja, na primer, reumatoidnog artritisa i SLF. Pasivna supresija uključuje sekreciju Th1-povratno regulatornog, supresor citokina u lokalnom okruženju gde se proinflamatorni i Th1 citokini oslobađaju bilo na antigen-specifični ili antigen-nespecifični način. "Tolerancija" kako je ovde korišćena se odnosi na ovaj fenomen. Zaista, oralna tolerancija je bila efektivna u lečenju brojnih autoimunskih oboljenja kod životinja uključujući: eksperimentalni autoimunski encefalomielitis (EAE), eksperimentalni autoimunski miestenija gravis, kolagenom indukovani artritis (CIA), i dijabetes melitus koji zavisi od insulina. U ovim modelima, prevencija i potiskivanje autoimunskog oboljenja je povezano sa pramenom antigenspecifičnog humoralnog i celularnog odgovora od Th1 ka Th2/Th3 odgovoru.
Pronalazak takođe obuhvata postupak za indukovanje antigen nespecifične aktivacije urođenog imuniteta i širok spektar rezistentnosti na izazove nfekcija upotrebom CpG imunostimulatornih oligonukleotida. Izraz antigen nespecifična aktivacija urođenog imuniteta, kako je ovde korišćen, odnosi se na aktivaciju imunskih ćelija koje nisu B ćelije i, na primer, mogu da obuhvate aktivaciju NK ćelija, T ćelija ili drugih imunskih ćelija koje mogu da odgovore na način koji ne zavisi od antigena, ili neku kombinaciju ovih ćelija. Široki spektar rezistentnosti na infekcijske izazove je indukovan zato što su imune ćelije u aktivnom obliku i spremne da odgovore na bilo koje invaziono jedinjenje ili mikroorganizam. Ćelije ne moraju da budu specifične prema posebnom antigenu. Ovo je naročito korisno u biološkom ratu, i drugim okolnostima koje su ranije opisane kao što su putnici.
CpG imunostimulatorni oligonukleotidi mogu se osobi direktno administrirati ili mogu biti administrirani zajedno sa kompleksom distributorom nukleinske kiseline. Kompleks koji distribuira nukleinsku kiselinu označava molekul nukleinske kiseline povezan sa ( na pr. jonski ili kovalentno; ili učauren unutar) ciljnog sredstva ( na pr. molekula) što rezultuje u većem afinitetu vezivanja za ciljnu ćeliju. Primeri kompleksa distributora nukleinske kiseline obuhvataju nukleinske kiseline povezane sa sterolom ( na pr. holesterolom), lipidom ( na pr. katjonski lipid, virozom ili lipozom), ili specifični agens vezivanja za ciljnu ćeliju ( na pr. ligand koji prepoznaje specifični receptor ciljne ćelije). Preferentni kompleksi mogu biti dovoljno stabilniin vivoda spreče značajno dekuplovanje pre nego što ih prihvati ciljna ćelija. Međutim, kompleksi se mogu cepati pod odgovarajućim uslovima unutar ćelije tako da je oligonukleid oslobođen u aktivnom obliku.
Opisana su sredstva za distribuciju antigena i nukleotida do površine. CpG imunostimulatorni oligonukleotidi i/ili antigen i /ili druga terapeutska sredstva mogu se administrirati sami ( na primer u solani ili puferu) ili korišćenjem bilo kog nosača koji je poznat u tehnici.
Izraz efektivna količina CpG imunostimulatornog oligonukleotida se odnosi na količinu koja je potrebna ili dovoljna da realizuje željeni biološki efekat. Na primer, efektivna količina CpG imunostimulatornog oligonukleotida koji se administrira sa antigenom za indukovanje mukozalnog imuniteta je količina koja je neophodna da izazove razvoj IgA kao odgovor na antigen posle izlaganja antigenu, dok je količina potrebna za indukovanje sistemskog imuniteta ona količina koja je neophodna da izazove razvoj IgG kao odgovor na antigen posle izlaganja antigenu. U kombinaciji sa ovde datim uputstvima, izborom između raznih aktivnih jedinjenja i odmeravanjem faktora kao što su potenca, relativna bioraspoloživost, telesna težina pacijenta, težina nepoželjnih nuzpojava i prioritetni način administracije, može se planirati efektivni profilaktički ili terapeutski režim lečenja čije doze ne izazivaju suštinsku toksičnost a ipak su potpuno efektivne za lečenje određene osobe. Efektivna količina za bilo koju posebnu primenu može da varira u zavisnosti od takvih faktora kao što su oboljenje ili stanje koje se leči, posebni CpG imunostimulatorni oligonukleotidi će se adminstrirati prema veličini osobe, ili težini oboljenja ili stanja. Prosečni stručnjak može empirijski da odredi efektivnu količinu posebnog CpG imunostimulatornog oligonukleotida i/ili antigena i/ili drugog terapeutskog sredstva bez nepotrebnog eksperimentisanja.
Pojedinačne doze jedinjenja koja su ovde opisane za mukozalnu ili lokalnu distrinuciju su tipično u opsegu od oko 0.1 ug do 10 mg po administraciji, što u zavisnosti od primene mogu biti date dnevno, nedeljno ili mesečno ili u bilo kome međuvremenu. Tipičnije, mukozalne ili lokalne doze su u opsegu od oko 10 ug do 5 mg po administraciji, i najtipičnije od oko 100 ug do 1 mg, sa 2 - 4 adminstracije u roku od nekoliko dana ili nedelja. Još tipičnije, doze imunostimulatora su u opsegu od 1 ug do 10 mg po administraciji, i najtipičnije 10 ug do 1 mg, dnevno ili nedeljno. Osobne doze jedinjenja koja su ovde opisana za parenteralnu isporuku u svrhu indukovanja antigen-specifičnog imunskog odgovora, gde je jedinjenje isporučeno sa antigenom ali ne sa drugim terapeutskim sredstvom su tipično 5 do 10 000 puta veće nego efektine mukozalne doze za pomoćne vakcine ili za imunostimulatornu primenu, i još tipičnije 10 do 1 000 puta veće, i najtipičnije 20 do 100 puta veće. Doze jedinjenja koja su ovde opisana za parenteralnu isporuku u svrhu indukovanja urođenog imunskog odgovora ili za povećanje ADCC ili za indukovanje antigen specifičnog imunskog odgovora, kad su CpG imunostimulatorni oligonukleotidi administrirani u kombinaciji sa drugim terapeutskim sredstvima ili u specijalizovanim nosačima, tipično je u opsegu od oko 0.1 pg do 10 mg po administraciji, što u zavisnosti od primene može biti dnevno, nedeljno ili mesečno ili u bilo kome međuvremenu. Još tipičnije, parenteralne doze za ove svrhe su u opsegu od 10 pg do 5 mg po administraciji, i najtipičnije, od oko 100 pg do 1 mg sa 2 - 4 adminstracije u roku od nekoliko dana ili nedelja. U nekim prostipima, međutim, parenteralne doze za ove svrhe mogu biti korišćene u opsegu 5 do 10 000 puta većim od tipičnih doza koje su ranije opisane.
Za bilo koje jedinjenje koje je ovde opisano terapeutski efektivna količina može biti prethodno određena iz životinjskih modela. Terapeutski efektivna količina može takođe biti određena iz humanih podataka za CpG oligonukleotide koji su testirani na ljudima (humane kliničke probe su započete) ili za jedinjenja za koje je poznato da pokazuju sličnu farmakološku aktivnost, kao što su druga pomagala, na pr. LT i drugi antigeni u svrhu vakcinacije. Veće doze se mogu zahtevati za parenteralnu administraciju. Primenjene doze s mogu podesiti na osnovu relativne bioraspoloživosti i potence administriranog jedinjenja. Podešavanje doze radi postizanja maksimalne efikasnosti zasnovano na prethodno ovde opisanim postupcima i drugim postupcima je dobro poznato u tehnici i prosečni stručnjak ga lako može izvesti.
Formulacije pronalaska su administrirane u farmaceutski prihvatljivim rastvorima, koji mogu rutinski da sadrže farmaceutski prihvatljive koncentracije soli, pufera, prezervativa, kompatibilnih nosača, pomagala, i po izboru drugih terapeutskih sastojaka.
Za terapeutske svrhe, efektivna količina CpG imunostimulatornog oligonukleotida može biti administrirana osobi na bilo koji način koji raznosi oligonukleotide do željene površine, na pr. mukozalni, sistemski. Administracija farmaceutskg preparata ovog pronalaska može biti izvedena na bilo koji način poznat prosečnom stručnjaku. Preferentni načini administracije obuhvataju, ali nisu njima ograničeni, oralnu, parenteralnu, intramuskularnu, intranazalnu, sublingvalnu, intratrahealnu, iinhalacionu, okularnu, vaginalnu i rektalnu administraciju
Za oralnu administraciju, jedinjenja (t. j., CpG imunostimulatorni nukleotidi, antigeni i druga terapeutska sredstva) mogu lako biti formulisana kombinovanjem jednog ili više aktivnih jedinjenja sa farmaceutski prihvatljivim nosačima koji su dobro poznati u tehnici. Takvi nosači omogućavaju jedinjenjima pronalaska da budu formulisani kao tablete, pilule, dražee, kapsule, tečnosti, gelovi, sirupi, guste smeše, sispenzije i slično, za oralnu ingestiju osobe koja se leči. Farmaceutski preparati za oralnu upotrebu mogu biti dobijeni kao čvrsi ekscipijenti, po izboru mlevenjem dobijene smeše, i procesiranjem smeše granula, posle dodavanja pogodnih dodataka, ako se želi, da bi se dobile tablete ili jezgra dražea. Pogodni dodaci su, naročito, punila kao što su šećeri, ukljičujući laktozu, sukrozu, manitol, ili sorbitol; celulozne preparate kao što su, na primer, kukuruzni škrob, žitni škrob, pirinčani škrob, kromprini škrob, želatin, tragakant guma, metil celuloza, hidroksipropilmetil-celuloza, natrijum karboksimeril celuloza, i/ili polivinilpirolidin (PVP). Po želji, mogu se dodati dezintegraciona sredstva, kao što su umreženi polivinil pirolidin, agar, ili alginična kiselina ili njena so, kao što je netrijum alginat. Po izboru, oralne formulacije mogu takođe bii formulisne u solani ili puferima, t. j., EDTA za neutralisanje unutarnjih kiselih stanja ili mogu biti administrirani bez ikakvih nosača.
Takođe su specifično razmatrani oralni dozni oblici gore pomenute komponente ili komponenti. Komponenta ili komponente mogu biti hemijski modifikovane tako da je oralna distribucija derivata efikasna. U opštem slučaju, razmatrana hemijska modifikacija je dodavanje bar jedne grupe samom molekulu komponente, gde pomenuta grupa dozvoljava (a) inhibiciju proteolize; i (b) apsorpciju i asimilaciju u krvni tok iz stomaka ili creva. Takođe je poželjno povećanje opšte stabilnosti komponente ili komponenti i povećanje cirkulacije u telu. Primeri takvih grupa obuhvataju: polietilen glikol, kopolimere etilen glikola i prolilen glikola, karboksimetil celulozu, dekstran, polivinil alkohol, polivinil pirolidin i poliprolin. Abuchovvski and Daviš, 1981, "Soluble Polimer-Enzvme Adducts" u\ Enzymes as Drugs,Hocenberg and Roberts, eds., Wiley-lnterscience, New York, NY, str 367-383; Nevvmark, et al., 1982, J. Appl. Biochem. 4: 185-189. Drugi polimeri koji se mogu korititi su 1,3-dioksolan i poli-1,3,6-tioksakan. Prioritetni za farmaceutsko korišćenje, kao što je gore pomenuto, su poletilen glikol grupe.
Lokacija gde se komponenta oslobađa može biti stomak, tanka creva (dodenum, jejunum, ili ileum) ili debelo crevo. Prosečnom stručnjaku su dostupne forrmulacije koje se neće rastvoriti u stomaku, ali će osloboditi materijal u doudenumu ili na drugom mestu u crevu. Preferentno, oslobađanje će izbeći štetne efekte stomačne okoline, bilo zaštitom oligonukleotida ili oslobađanjem biološki aktivnog materijala izvan stomačne okoline, kao što su creva.
Da bi se osigurala potpuna gastrična otpornost, bitne su obloge koje su nepropustljive do vrednosti pH najmanje 5.0. Ovo može da obuhvati šećerne obloge, ili obloge koje čine
tabletu lakšom za gutanje. Kapsule se mogu sastojati od tvrdih ljuski (kao što je želatin) za distribuciju suvih terapeutika, t. j. praha; za tečne oblike, mogu se koristiti ljuske od mekog želatina. Materijal ljuske kapsule mogao bi biti gusti škrob ili drugi jestivi papir. Za pilule, pastile, livene tablete ili ili zdrobljene tablete, mogu se koristiti vlažne tehnike.
Terapeutici mogu biti uključeni u formulaciju kao fini multi-partikulati u obliku granula ili kuglica veličine oko 1 mm. Formulacija materijala za administraciju kapsulama može biti takođe kao prah, lako presovani komad ili čak kao tableta. Terapeutici mogu biti pripremljeni kompresijom.
Sva sredstva za bojenje i dodaci za ukus se mogu uključiti. Na primer, nukleotid može biti formulisan (kao enkapsulacijom lipozoma ili mikrosfere) i zatim sadržan u jestivom proizvodu, kao što je ohlađeni napitak koji sadrži sredstva za boju i ukus.
Zapremina terapeutika se može razblažiti ili povećati inertnim materijalom. Ovi razblaživači ukjlučuju ugljene hidrate, naročito manitol, a-laktozu, anhidrovanu laktozu, celulozu, sukrozu, modifikovane dekstrane i škrob. Neke neoganske soli se takođe mogu koristiti kao punila, uključujući kalcijum trifosfat, magnezijum karbonat i natrijum hlorid. Neki komercijalno dotupni razblažovači su Fast-Flo, Emvex, STA-Rx 1500, Encompress i Avicel.
U formulaciju terapeutika u čvrstom doznom obliku mogu biti uključeni dezintegratori. Materijali koji se koriste kao dezintegratori obuhvataju, bez ograničenja, škrob, uključujući komercijalni dezintegrator baziran na škrobu, Explotab. Natrikum škrob glikolat, Amberlit, natrijum karboksimetil celuloza, ultramilopektin, natrijum alginat, želatin, kora pomorandže, karboksimetil celulozna kiselina, pirodni sunđer i bentonit se takođe mogu koristiti. Drugi oblici dezintegratora su nerastvorne karjonske jonoizmenjvačke smole.. Sprašene gume se mogu korisiti kao dezintegratori i kao veziva i one obuhvataju sprašene gume kao što je agar, Karava ili tragakant. Kao dezintegratori su takođe korisni alginska kiselina i njena natrijumova so.
Veziva se mogu koristiti da bi terapeutsko sredstvo moglo da načini tvrdu tabletu i obuhvataju materijale iz prirodnih proizvoda kao što su akacija, tragakant, škrob i želatin. Ostali obuhvataju metil celulozu (MC), etil celulozu (EC) i karboksimetil celulozu (CMC). Polivinil pirolidin (PVP) i hidroksipropilmetil celuloza (HPMC) se mogu koristiti u alkoholnom rastvoru da bi se terapeurici granulirali.
U formulaciju može biti uključeno i antifrikciono sredstvo da bi se sprečilo lepljenje tokom procesa formulacije. Maziva se mogu koristiti kao sloj između terapeutika i zida kalupa, i ona mogu da uključe, bez ograničenja, stearnu kiselinu uključujući njene magnezijum ovei kalcijumove soli, politetrafluoroetilen (PFTE), tečni parafin, biljna ulja i voskove. Rastvorljiva maziva se takođe mogu koristiti kao što je natrijum lauril sulfat, magnezijum lauril sulfat, polietilen glikol različitih molekulskih težina, Carbowax 4 000 i 6 000.
Sredstva za klizanje mogu da poboljšaju tečne osobine leka tokom formulacije i pomognu preuređenju za vreme kompresije. Sredstva za klizanje mogu da obuhvate škrob, talk, pirogensku siliku i hidratisani silikoaluminat.
Da bi se pomoglo rastvaranje terapeutika u vodenom okruženju može se dodati površinski aktivna supstanca kao sredstvo za kvašenje. Površinski aktivna sredstva mogu da uključe anjonske deterdžente kao što je natrijum lauril sulfat, dioktil natrijum sulfosukcinat i dioktil natrijum sulfonat. Katjonski deterdženti se mogu koristiti i to mogu biti benzalkonijum hlorid ili benzotomijum hlorid.. Lista potencijalnih ne-jonskih deterdženata koji se mogu koristiti u formulaciji kao površinski aktivna sretdstva sadrži lauromakrogol 400, polioksil 40 stearat, poliokietilen hidrogenovano ricinusovo ulje 10, 50 i 60, glicerol monostearat, polisorbat 40, 50, 65 i 80, sukrozu estra masne kiseline, metil celulozu i karboksimetil celulozu.Ova sredstva mogu biti prisutna u formulaciji oligonukleotida ili derivata bilo kao sama ili kao smeša različitih odnosa.
Farmaceutski preparati koji se mogu koristiti oralno obuhvataju ,,push-fit"kapsule načinjene od želatina, kao i meke, zatvorene kapsule od želatina i plastifikatora, kao što je glicerol ili sorbitol. „Push-fit" kapsule mogu da sadrže aktivne sastojke u smeši sa punilima kao što je laktoza, veziva kao što su škrobovi, i/ili maziva kao što je magnezijum stearat i, po izboru, stabilizatore. U mekim kapsulama, aktivna jedinjenja mogu biti rastvorena ili suspendovana u pogodnim tečnostima, kao što su masne kiseline, tečni parafin, ili tečni polietilen glikoli. Osim toga, mogu biti dodani i stabilizatori. Mogu se takođe koristiti i mikrosfere formulisane za oralnu administraciju. Takve mikrosfere su dobro definisane u tehnici. Sve formulacije za oralnu administraciju treba da budu u dozama koje su pogodne za takvu administraciju.
Za bukalnu administraciju, preparati mogu da imaju oblik tableta ili pastila koje su formulisane na konvencionalni način.
Za administraciju inhaliranjem, jedinjenja za upotrebu prema ovom pronalasku mogu se konvencionalno distribiurati u obliku aerosolnog spreja iz pakovanja pod pritiskom ili nebulajzera, uz korišćenje pogodnih propelanata, na pr., dihlorodifluorometana, trihlorofluorometana, dihlorotetrafluoroetana, ugljen dioksida ili drugihpogodnih gasova. U slučaju aerosola pod pritiskom dozna jedinica može biti određena dodatkom ventila da bi se distrubuirao odmereni iznos. Kapsule i kartridži od na pr. želatina za upotrebu u inhalatoru ili insuflatoru mogu biti formulisane tako da sadrže prah smeše jedinjenja i prah pogodne baze kao što je laktoza ili škrob.
Ovde je takođe razmatrana i pulmonarna distribucija oligonukleotida (ili njihovih derivata). Oligonukleotid se distribuira plućima sisara pri inhalaciji i prodiranju kroz epitel pluća do krvnog toka. Drugi izveštaji o inhaliranim molekulima uključuju Adjei et al., 1990, Pharmaceutical Research, 7: 565-569; Adjei et al., 1990, International Journal of Pharmaceutics, 63: 135-144 (leuprolid acetat); Brequet et al., 1989 Journal of Cardiovascular Pharmacologv, 13 (suppl. 5): 143-146 (endotelin-1); Hubbard et al., 1989, Annals of Internal Medicine, Vol. IM, str. 206-212 (a1-antitripsin), Smith etal., 1989, J. Clin. Invest., 84: 1145-1146 (a-1-proteinaza); Osvvein et al., 1990, "Aerosolization of Proteins", Proceedings of Svmposium on Respiratorv Drug Deliverv II, Kevstone, Colorado, March, (rekombinanatni humani hormon rasta); Debs et al., 1988, J. Immunol. 140: 3482-3488 (interferon-g i alfa faktor nekroze tumora)i Platz et al., SAD. Patent No 5,284,656 (stimulacioni faktor granulocitnih bakterija). Postupak i preparat za pulmonarnu distribuciju lekova za sistemske efekte opisan je u SAD. Patentu No. 5,451,560, Wong et al., Septembar 19, 1995.
Za korišćenje ovog pronalaska u praksi razmatran je širok opseg mehaničkih uređaja za pulmonarnu distribuciju terapeutskg proizvoda, uključujući, bez ograničenja, nebulajzere, dozno-merne inhalatore, i inhalatore praha, pri čemu su svi poznati prosečnom stručnjaku.
Neki specifični primeri komercijalnodostupnih uređaja pogodnih za praksu ovog jedinjenja su Ultravent nebulajzer, proizvod Mallinckrodt, Inc., St Louis, Missouri; Acorn II nebulajzer, proizvod Marquest Medical Products, Englevvood, Colorado; Ventolin doozno-merni inhalator, proizvod Glaxo Inc., Research Triangle Park, North Carolina; i Spinhaler inhalator praha, proizvod Fisons Corp., Bedford, Massachusetts.
Svi takvi uređaji zahtevaju upotrebu formulacija koje su pogodne za dispergovanje oligonukleotida (ili derivata). Tipično, svaka formulacija je specifična za tip uteđaja koji se koristi i možeda uključi upotrebu odgovarajućeg propelantnog materijala, kao dodatak uopičajenim razblaživačima, dodacima i/ili nosačima koji se koriste u terapiji. Takođe, razmatrano je korišćenje lipozoma, mikrokapsula ili mikrosfera, inkluzionih kompleksa, ili drugih tipova nosača. Hemijski modifikovani nukleoidi se takođe mogu pripremiti u različitim formulacija u zavisnosti od tipa hemijske modifikacije ili tipa uređaja koji se koristi.
Formulacije koje su pogodne za korišćenje sa nebulajzerima, bilo da su mlazni ili ultrazvučni, tipično će sadržati oligonukleotide rasvorene u vodi u koncentracijama od oko 0.1 do 25 mg biološki aktivnog nukleotida po ml rastvora. Formulacije mogu takođe da sadrže pufer ili prosti šećer ( na pr., za stabilizaciju oligonukleotida i regulaciju osmotskog pririska). Formulacije za nebulajzer mogu takođe da sadrže površinski aktivnu materiju, da bi se smanjila ili sprečila površinski indukovana agregacija nukleotida izazvana atomizacijom rastvora pri stvarnju aerosola.
Formulacije za korišćenje u merno-doznim inhalatorima će u opštem slučaju sadržati fino podeljen prah koji sadrži oligonukleotide suspendovane u propelantu uz pomoć površinski aktivne materije. Propelant može biti konvencionalni materijal koji se koristi u ove svrhe, kao što je hlorofluorougljenik, hidrofluorohlorougljenik, hidrofluorougljenik, ili ugljovodonik, uključujući trihlorofluorometan, dihlorofluorometan, dihlorotetrafluoroetanil i 1,1,1,2-tetrafluoroetan, ili njihove kombinacije. Pogodne površinksi aktivne materije obuhvataju sorbitan trioelat i soja lecitin. Kao površinski aktivna materija se može koristiti i oleinska kiselina.
Formulacije za raspodelu iz uređaja za inhaliranje prahom će sadržati fino razdeljen suvi prah koji sadrži oligonukleotide i može takođe da uključi sredstva za povećanje mase, kao što je laktoza, sorbitol, sukroza, ili manitol u količini koja olakšava disperziju praha iz uređaja, na pr., 50 do 90% tež formulacije. Oligonukleotidi bi trebalo najpogodnije da se naprave u obliku čestica sa srednjom veličinom od manje od 100 mm (ili mikrona), naprioritetnije 0.5 do 5 mm, za najefektivniju distribuciju do pluća.
Takođe je razmatrana i nazalna distribucija farmaceutskih preparata ovog pronalaska. Nazalna distribucija omogućava prolaz farmaceutskog preparata ovog pronalaska do krvnog toka direktno posle administracije terapeutskog proizvoda u nos, bez potrebe deponovanja proizvoda u plućima. Formulacije za nazalnu distribuciju obuhvataju one sa dekstranom ili ciklodekstranom.
Za nazalnu administraciju, uređaj koji se koristi je mala, čvrst boca kojoj je dodan raspršivač sa odmerenim dozom. U jednom pristupu, odmerena doza je distriburana uvlačenjem farmaceutskog preparata rastvora ovog pronalaska u komoru određene zapremine, pri čemu ova komora ima otvor koji je dimenzionisan tako da stvori aerosol formulacije stvaranjem spreja kad je tečnost u komori pod pritiskom. Komora je pod pitiskom da bi administrirala farmaceutski preparat ovog pronalaska. U specifičnom pristupu, to je komora sa ventilom. Takav uređaj je komercijalno dostupan.
Alernativno, .plastična boca koja se može stisnusti sa otvorom koji je dimeenzionisan tako kada se stisne stvarajući spraj stvori aerosol formulacije . Otvor se obično nalazi na vrhu boce, i vrh je zašiljen da delimično popuni nazalni prolaz za efikasnu administraciju aerosolne formulacije. Prioritetno, nazalni inhalator će obezbediti odmerenu količinu aerosola formulacije, za administraciju odmerene doze leka.
Kad je poželjno da se distribuiraju sistemski, jedinjenja se mogu formulisati za parenteralnu administraciju injekcijama, na pr., bolus injekcijom ili kontinualnom infuzijom. Formulacije za injekcije mogu biti date u jediničnom doznom obliku, na pr., u ampulama ili u više-doznim kontejnerima, sa dodanim prezevativom. Preparati mogu imati oblik suspenzija, rastvora ili emulzija u ulju ili vodenom nosaču, i mogu da sadrže formulaciona sredstva kao što su ona za stvaranje suspenzija, za stabilizovanje i/ili dispergovanje.
Farmaceutske formulacije za parenteralnu administraciju obuhvataju vodene rastvore aktivnih jedinjenja u obliku koji je rastvorljiv u vodi. Osim toga, mogu biti pripremljene suspenzije aktivnih jedinjenja kao odgovarajuće uljane injekcione suspenzije. Pogodni lipofilni rastvarači ili nosači uključuju masne kiseline kao što je susamovo ulje, ili estre sintetičkih masnih kiselina, kao što je etil oleat ili trigliceridi, ili lipozomi. Vodene injekcione suspenzije mogu da sadrže supstance koje povećavaju viskozitet suspenzije,kao što je natrijum karboksimetil celuloza, sorbitol, ili dekstran. Po izboru, suspenzija može takođe da sadrži pogodne stabilizatore ili sredstva koja povećavaju rastvorljivost jedinjenja da bi omogućila pripremu visoko koncentrovanih rastvora.
Alternativno, aktivna jedinjenja mogu biti u obliku praha za mešanje sa pogodnim nosačem, na pr., sterilnom vodom bez pirogena, pre upotrebe.
Jedinjenja mogu takođe biti formulisana u rektalnim ili vaginalnim preparatima kao što su supozitorije ili retencioni klistiri, na pr., pri čemu sadrže konvencionalne supozitorne baze kako što je kakao buter ili drugi gliceridi.
Osim formulacija koje su ranije opisane, jedinjenja mogu takođe biti formulisana kao depo preparati. Takve formulacije sa dugotrajnim dejstvom mogu biti formulisane sa pogodnim polimerima ili hidrofobnim materijalima (na primer, kao emulzija u prihvatljivom ulju) ili jonoizmenjivačkim smolama, ili kao slabo rastvorljivi derivati, na primer, kao slabo rastvorljiva so.
Farmaceutski preparati mogu takođe da sadrže pogodne nosače ili dodatke, čvrste ili u obliku gela. Primeri takvih nosača ili dodataka obuhvataju, bez ograničenja, kalcijum karbonat, kalcijum fosfat, razne šećere, škrobove, derivate celuloze, želatin, ili polimere kao što je polietilen glikol.
Pogodni tečni ili čvrsti farmaceutski preparati su, na primer, vodeni ili solani rastvori za inhalaciju, mikroenkapsulirani, encochleated, kao prevlake na mikroskopskim zlatnim zrnima, sadržane u lipozomima, nebulizovani, kao aerosoli, kao granule za implantaciju u kožu, ili osušene na oštrom predmetu da bi se zagrebli u kožu. Farmaceutski preparati takođe obuhvataju granule, prahove, tablete, obložane tablete, (mikro)kapsule, supozitorije, sirupe, emulzije, suspenzije, kremove, kapi ili preparate sa produženim dejstvom aktivnog jedinjenja, pri čemu su u ovim preparatima dodaci i aditivi i/ili pomoćna sredstva kao što su dezintegratori, veziva, sredstva za oblaganje, za povećavanje mase, maziva, začini, zaslađivači ili stabilizatori korišćeni kao što je ranije opisano Farmaceutski preparati su pogodni za upotrebu u raznim sistemima za distribuciju leka. Za kratak opis ovih metoda vidi Langer,Science,249:1527-1533,1990, koji je ovde uključen kao referenca.
CpG imunostimulatorni oligonukleotidi i po izboru drugi terapeutici i/ili antigeni mogu se administriratiperse(čisti) ili u obliku farmaceutski prihvatljivih soli. Kada se koriste u medicini, soli moraju biti farmaceutski prihvatljive, ali i one koje nisu farmaceutski prihvatljive se konvencionalno mogu koristiti da bi se dobila farmaceutski prihvatljiva so. Takve soli obuhvataju, bez ograničenja, one koje su dobijene od sledećih kiselina: hlorovodonična, bromovodonična, sumporna, azotna, fosforna, maleinska, sirćetna, salicilna, p-toluen sulfonska, vinska, limunska, metan sulfonska, malonska, sikcinska, naftalen-2-sulfonska, i benznen sulfonska. Takođe, ove soli mogu biti pripremljene kao soli alkalnih ili zemnoalkalnih metala, kao što su natrijumove, kalijumove i kalcijumove soli grupe karboksilnih kiselina.
Pogodni puferi obuhvataju: sirćetnu kiselinu i so (1-2% tež/zapr), limunsku kiselinu i so (1-3% tež/zapr), bornu kiselinu i so (0.5-2.5% tež/zapr); i fosfornu kiselinu i so (0.8-2% tež/zapr). Pogodni prezervativi obuhvataju benzalkonijum hlorid (0.003-0.03% tež/zapr); hlorobutanil (0.3-0.9% tež/zapr); parabene (0.01-0.25% tež/zapr) i timerozal (0.004-0.02% tež/zapr).
Farmaceutski peparati pronalaska sadrže efektivnu količinu CpG imunostimulatornog oligonukleotida i po izboru antogene i/ili druga terapeutska sredstva koja su po izboru uključena u farmaceutski prihvatljiv nosač. Izraz farmaceutski prihvatljiv nosač označava jedan ili više kompatibilnih punila, razblaživača ili supstanci za enkapsuliranje koje su pogodne za administraciju ljudima ili drugim kičmenjacima. Izraz nosač označava organski ili neorganski sastojak, priodni ili sintetički, sa kojim je aktivni sastojak kombinova da bi se olakšala primena. Komponente farmaceutskog preparata su takođe sposobne da budu pomešane sa jedinjenjima ovog pronalaska, i jedna sa drugom, na takav način da nema interakcije koja će suštinski da umanji željenu farmaceutsku efikasnost.
Ovaj pronalazak je dalje ilustrovan Primerima koji slede, a koji se ni na koji način ne mogu smatrati ograničavajućim. Potpuni sadržaj svih referenci (uključujući literaturu, izdate patente, objavljene prijave patenata, i prijave patenata koji su u postupku) koje su citirane u ovoj prijavi ovde su izričito uključene kao referenca.
PRIMERI
Oligonukleotidi (ODNs)
Sledeći oligonukleotidi su korišćeni u primerima
Materijali i Metode (postupci)
Oligonukleotidi (ODNs)
ODNs su nabavljeni od Biospring (Frankfurt, Germanv) ili Sigma Ark (Darmstadt, Germanv) i kontrolisani na identitet i čistoću u Coley Pharmaceutical GmbH (Langenfeld, Gemany). ODNs su razblaženi u solani puferovanoj fosfatom (Sigma, Germany) i čuvane na -20°C. Sva razblaživanja su vršena korišćenjem reanenasa bez pirogena. SEQ ID NO. 15-23 ODNs su sintetizovani u Trilink Biotechnologies.
Prečišćavanje ćelija
Preparati periferalne krvi u tankom sloju na koagulumu od zdravih muških i ženskih donora dobijeni su od Banke krvi Univerziteta u Diseldorfu (Nemačka) i od ovih, PMBC su prečišćeni centrifugiranjem sa Ficoll-Hypaque (Sigma). Prečišćeni PMBC su tada korišćeni bilo kao sveži (za većinu analiza) ili su suspendovani u medijumu za zamrzavanje i čuvane na -70°C. Kad je bilo potrebno, alikvoti ovih ćelija su raskravljeni, prani i ponovo suspendpvani u RPMI 1640 medijumu kulture (Bio VVhittaker, Belgium) kome je dodano 5% (zapr/zapr) toplotno inaktiviranog humanog AB seruma (Bio VVhuttaker, Belgium) ili 10% (zapr/zapt) toplotno inaktiviranog FSCm 2 mM L-glutamina (Bio VVhittaker), 100 U/ml penicilina i 10 pg/ml streptomicina (Invitrogen, Karlsruhe, Germany):
Detekcija citokina
Raskravljeni ili sveži PMBC su zasejani na 48 ćelijske ploče sa ravnim dnom, ili 96 ćelijske ploče sa okruglim dnom, i inkubirane sa ODN u koncentracijama kao što je pokazano u vlažnim inkubatorima na 37°C. Supernatanti kulture su sakupljeni i ukoliko nisu neposredno korišćeni. zamrznuti na -20°C do potrebe. Količina citokina u supernatantima je analizirana korišćenjem komercijalno dostupnog ELISA pribora (Diaclone, USA) ili domaćih ELISA razvijenih upotrebom komercijalno dostupnih antitela (od Becton Dickison/Pharmingen ili
PBL).
Ispitivanja za Primer 13 su izvedena kako sledi:
Iz 6 miševa (muški, BALB/c) izvađene su slezine. Splenociti iz svake slezine su razdvojeni pažljivim provlačenjem kroz ćelijsko sito (veličina pora 70 pm) i zatim spojeni. Splenociti su dodani u ćelije ploča kulture. Dodano je 1x10<7>ćelija u zapremini od 900 pl medijum u svaku ćeliju. Medijum je bio RPMI 1640 koji sadrži 10% fetalnog goveđeg seruma. 100 pl alikvota CpG ODN rastvora u medijumu je dodano u svaku ćeliju da bi se dobila krajnja koncentracija u ćeliji od 0.01-10 pg/ml. Posle inkubacije tokom 36 sati (37 °C, 5% C02inkubator) supernatanti kulture su sakupljeni i analizirani na koncentraciju citokina koristeći Luminex multiplex analizu (IFNv, IP-10, IL-10, IL-6, TNFa) ili ELISA (IFNa).
Indukcija antigen-indukovanog povećanja nazalne rezistencije kod zamoraca
Zamorci (mužjaci, Hartlev) su senzibilizovani antigenom (ovalbumin, 5 mg kako interperitonalno tako i supkutano) dana 0 ispitivanja. Pojačana senzibilizacija (5 mg, intraperitonalno) data je dana 4 ispitivanja. Imunski odgovor kod zamoraca na antigen je izazvan izlaganjem intranazalno administriranim antigenom dva puta nedeljno tokom dve uzastopne nedelje. Prvo izlaganje je bilo dana 14 ispitivanja. SEQ ID NO:7 (broj partije AQE-03J-001-M, 0.03 -1 mg/kg u 150 pl/kg solane) je administriran intranazalno jedanput svake nedelje, dva dana pre prvog nedeljnog imunskog odgovora na antigen.. Sa izuzetkom poslednjeg izlaganja dana 14 ispitivanja, imunski odgovor je izazvan antigenom ovalbuminom (1.5 mg/kg u 150 pl/kg solane). Životinje su prethodno tretirane mepiraminom (10 mg/kg, intraperitonalno) 30 minuta pre provokacije da bi se zaštitile od anafilaksije indukovane histaminom. Dana 24 ispitivanja, zamorcima je data anestezija da bi se omogućimo merenje nazalne rezistencije korišćenjem Buxco respiratornog mehaničkog sistema i softvera. Krajnji imunski odgovor izazvan antigeneom je tada izveden ovalbuminom (2.5 mg u 250 pl solane) aministracijom u nazofaringealni deo. Životinje su prethodno tretirane mepiraminom (3 mg/kg, intraperitonalno) 30 minuta pre izlaganja. Nazalna rezistencija je merena 40 minuta posle izlaganja.
Indukcija antigen-indukovanog povećanja nazalne rezistencije kod miševa
Miševi (mužjaci, BALB/c) su senzibilizovani dana 0 i 7 ispitivanja antigenom (ovalbumin, 100 pg i i. p) sa dodatkom aluminijum hidroksida (Pietce Alum i. p.). Imunski odgovor kod miševa na antigen je izveden svakoga dana izlaganjem intranazalno administriranom antigenu (1 mg u 10 pg solane). Prvo izlaganje je izvedeno dana 14 ispitivanja. SEQ ID NO:7 je administriran intranazalno dva puta. Prva doza je data 2 dana pre prvog imunskog odgovora na antigen. Druga doza je data 7 dana kasnije. Alternativno, budesonid (antiinflamatorni, sintetički kortikosteroid) je administriran intranazalno svakog dana. Prva doza je data 2 dana pre prvog imunskog odgovora na antigen. Svakog dana, doza budesonida je administrirana intranazalno 4 sata pre intranazalnog imunskog odgovora na antigen.. Završne tačke su merene dana 26 ispitivanja (t. j. 7 dana posle druge doze SEQ ID NO: 7. Nazalna tkiva su uzeta za histopatološko određivanje inflamacije. Odvojeni miševi su dobili krajnju dozu antigena i pojave kijanja i trljanja nosa su merene tokom perioda od 10 minuta posle imunskog odgovora.
Statistička analiza
Mann-Whitney test je korišćen za poređenje seta podataka gde populacija koja je poređena nije bila normalna. Dunnitt višestruki test poređenja je korišćen za poređenje seta podataka sa pojedinačnom kontrolom.
Indukcija citokina kod miševain vivo
Miševi (mužjaci, BALB/c) su dozirani sa CpG ODNs (0.1 i 1 mg/kg) ili kontrolnim nosačem (solana, 25 pl) nazalnim ukapavanjem. Bronhoalveolarna lavažna tečnost i serum (odvojen od krvi dobijene kardijačnom punkcijom) su sakupljeni 8 sati i 15 sati posle doziranja. Broj ćelija u bronhoalveolarnoj lavažnoj tečnosti je određen automatizovanim Advia brojačem ćelija. Koncentracija citokina i hemokina u bronhoalveolarnoj lavažnoj tečnosti i serumu određena je koristeći ili ELISA (IFNa, IL-12p40) ili Luminex citokin miltiplex sistem (IFNy, IP-40, IL-1a, IL-1 p, IL-2. IL-4, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-9, IL-10, IL-13, IL-15, IL-17, GM-CSF, RANTES, TNFa). Minimalne koncentracije koje su se mogle detektovati su bile različite za svaku analizu, ali su bile u opsegu od 0.3 12 pg/ml.
Indukcija inflamacije disajnih puteva kod miševa virusom influence
Virus influence (influenca tip A, subtip H1N1, soj PR8 adaptiran za miševe), je poklon od David VVoodhouse, Trudeau Institute, Saranac Lake, NY: Kao prelinminarano ispitivanje titriranja doze influence i određivanje vremena inkubacije infekcije, BALB/c miševi (ženke) su inficirane virusom influence intranazalnim ukapavanjem dana 0 ispitivanja. Miševi su dobili 50, 200 ili 500 infektivnih doza za jaje (EID)50virusa u 40 pl solane. Inflamacija disajnih puteva je analizirana 1, 3, 6, 9 i 14 dana posle infekcije.
Intranazalna administracija CpG ODN i merenje inflamacije disajnih puteva
Miševi su dobili CpG ODN (0.03, 0.3 ili 3 mg/kg) intranazalnim ukapavanjem u 25 ml solane. Svaki miš je doziran dva puta, 6 dan i 2 dana pre infekcije virusom influence (200 EID50, intranazalno). Ova doza virusa je izabrana iz preliminarnih ispitivanja. Inflamacija disajnih puteva i sadržaj virusa u plućima su analizirani 6 dana posle infekcije virusom. Ovo vreme je izabrano iz preliminarnih ispitivanja. Ćelije iz disajnih puteva su regenerisane bronhoalveolarnim lavažom. Ukupni broj leukocita je meren Advia automatizovanim brojačem ćelija (Advia, Bayer Diagnostic, Zurich, Switzerland). Diferencijalno brojanje ćelija je načinjeno svetlosnim mikroskopom preparatima citocentrifuge obojenim sa VVrifht-Giemza bojom. Pluća su odstranjena i homogenizovana sa 300 pl sterilnog PBS, supernatant je sakupljen i naboj virusa analizirana koristeći enzimni pribor za ispitivanje imuniteta (Takara Biomedical, Shiga, Japan) korišćen prema instrukcijama proizvođača. Ova analiza koristi monoklonalna antitela protiv nuklearnog proteina influenze A kao čvrste faze, i poliklonalna antitela anti-influenca detekcije virusa (polvclonal anti-influenza virus detection antibody).
Primer 1:Uticaj na sekreciju IFN- a humanim PBMC tretiranim sa CpG ODN.
Metode.Mononuklearne ćelije humane periferalne krvi iz bilo koja tri (SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6) ili sedam (SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3) donora su inkubirane sa CpG ODN tokom 48 sati prikazanim koncentracijama. Merena je interferon-alfa sekrecija humanim PBMC.
Rezultati.Slika 1 prikazuje povećanu proizvodnju IFN-a posle inkubacije sa CpG ODN. Podaci predstavljaju srednju +/- SEM. Treba zapaziti da apsolutni nivoi u pg/ml se ne mogu porediti direktno, pošto su korišćeni PBMC od različitih donora i rezultati od svakog donora su promenljivi.
Primer 2:Stimulacija TLR9- transfektovanih ćelijain vitro
Metode:HEK 293 ćelije su transfektovane sa humanim TLR9 inkubiranim sa SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID N0:4, SEQ ID N0:5, ili SEQ ID NO:6 tokom 16 sati. Signal je određen očitavanjem luciferaze.
Rezultati:Rezulati su prikazani u Tablici 1. EC50 je izračunat korišćenjem Sigma Plot (Sigma Plot 2002 za Windows verziju 8.0). Indeks maksimalne stimulacije je izzačunat kao odnos između najveće vrednosti od svih koncentracija testiranih na bilo koju ODN i kontrolnog medija.
Primer3 Efekti CpG oligodeoksinukleotida SEQ ID NO:7 na antigen- indukovano povećanje
nazalne rezistencije kod zamoraca
Metode:Da bi se ispitali efekti CpG oligodeoksinukleotida SEQ ID NO:7 na antigen-indukovano povećanje nazalne rezistencije kod zamoraca, zamorci su senzibilizovani antigenom, pa zatim je nazalno izazvan imunski odgovor na antigen. Nazalna rezistencija je merena tokom 40 minuta izazivanja imunskog odgovora.
Rezultati:Slika 2 prikazuje da je izazivanje imunskog odgovora na antigen dovelo do progresivnog povećanja nazalne rezistencije tokom 40 minuta koje je značajno potisnuto kod zamoraca koji su bili tretirani sa SEQ ID NO:7 (0.03 -1 mg/kg).
Primer 4:Efekti CpG oligonukleotida SEQ ID NO:7 kod mišjeg modela alergiiskog rinitisa.
Metode:BALB/c miševi su korišćeni za ispitivanje efekata SEQ ID NO:7 na simptome alergijskog rinitisa. Posle senzibilizacije i izazivanja imunskog odgovora na antigen, nazalna tkiva su uzeta za histopatološka ispitivanja inflamacije. Posebnmi miševima je izazvan imunski odgovor na antigen i pojave kijanja i trljanja nosa su merene tokom perioda od 10 minuta posle izazivanja imunskog odgovora
Rezultati:Antigen provokacija je izazvala kijanje i trljanje nosa . Kao što je prikazano na slici 3, obe pojave su potisnute kod miševa tretiranih sa SEQ ID NO:7.
Primer5: Inflamacija indukovana virusom influence u plućima miševa: Efekti klase C CpG
oligodeoksinukleotida.
Uvod:CpG oligodeoksinukleotidi (ODNs) indukuju imunomodifikujuće citokine koji treba da obezbede anti-astma efekte. Klasa C CpG ODNs indukuje veće titre IFNa nego prethodna klasa B ODNs. Klasa C CpG ODNs može da pruži dodatnu korist supresijom virisom indukovanog pogoršanja astme. Ovo ispitivanje istražuje sposobnost tri klase C CpG ODNs da potisnu količinu virusa (influence) u plućima miševa i inflamaciju disajnih puteva indukovanu virusom.
Metode:Korišćen je virus influence da bi se indukovala inflamacija disajnih puteva kod BALB/c miševa. CpG ODNs su administrirani intranazalno i mereni zaštitni efekti.
Rezultati:Slika 4 prikazuje da je u preliminarni ispitivanjima titracije doze influence i određivanja vremena inkubacije infekcije, virus influence izazvao akumulaciju leukocita u disajnim putevima. Pik inflamacije je postignut posle 6 - 9 dana. Miševi inficirani sa 500 IED50 virusa su pokazali značajan gubitak u težini posle 6 dana i žrtvovani.
Slika 5 prikazuje zaštitne efekte CpG ODNs na količinu virusa i inflamaciju disajnih puteva indukovanu virusom. Prethodno tretiranje sa CpG ODNs pre infekcije virusom influence (200 EID50) redukovalo je količinu virusa u plućima kako je analizirano 6 dana posle infekcije. Slika 6 prikazuje da je infekcija virusom influence izazvala akumulaciju leukocita na u disajnim putevima posle 6 dana. Ovo su predominantno neutrofili i mononuklearne ćelija (monociti, makofagi i limfociti). Bilo je vrlo malo eozinofila. Akumulacija ćelija je značajno potisnuta kod miševa koji su prethodno tretirani bilo kojim od CpG ODNs.
Primer6: Efekti klase C CpG oligodeoksinukleotida na inflamaciju disajnih puteva
indukovanu antigenom kod miševa
Poređena je aktivnost tri klase C CpG oligodeoksinukleotida (ODNs). U ispitivanje je radi poređenja uključena i klasa B CpG ODN SEQ ID NO:7.
Metode:Miševi (mužjaci, BALB/c) su senzibilizovani dana ispitivanja 0 i 7 antigenom (bubašvaba, 10 pg, intraperitonalno) sa dodatkom aluminijum hidroksida (Pierce Alum, intraperitonalno). Kod miševa je izazvan imunski odgovor na antigen izlaganjem nazalno administriranom antigenu (10 pg u 40 pl solane), dva puta nedeljno tokom dve uzastopne nedelje. Prvo izlaganje je izvedeno dana ispitivanja 21. CpG ODNs (1, 10 i 100 yglkg) su administrirani intranazalno jedanput nedeljno, dva dana pre prvog nedeljnog izazivanja imunskog odgovora na antigen.
Inflamacija disajnih puteva je određivana 48 sati posle poslednjeg izazivanj imunskog odgovora na antigen.. Ćelije u disajnim putevima su regenisane bronhoalveolarnim lavažom. Diferencijalni broj ćelija je meren automatizovanim Advia brojačem ćelija. Brojevi T ćelija (Ukupno CD3+ ćelije i CD3+CD4+ ćelije) su mereni tečnom citometrijom.
Rezultati:Izazivanje imunskog odgovora na antigen je dovelo do akumulacije eozinofila i T ćelija u disajnim putevima (slike 7 i 8). Nije bilo akumulacije neutrofila. Svaki od CpG ODNs je izazvao značajno potiskivanje akumulacije eozinofila na najvećoj testiranoj dozi (100 mg/kg) (slika 7). Brojevi T ćelija su takođe manji, mada smanjenja nisu u opštem slučaju statisrički značajna (slika 8).
Primer7 Indukcija citokina klasom CpG oligodeoksinukleotida kod miševain vivo
Poređena je aktivnost tri klase C CpG oligodeoksinukleotida (ODNs). U ispitivanje je radi poređenja uključena i klasa B CpG ODN SEQ ID NO:7.
Metode:Konentracije citokina i hemokina u bronhoalveolarnoj lavažnoj tečnosti i serumu su analizirane kao što je opisano u materijalima i metodama.
Rezultati:Slika 9 prikazuje broj ćelija u bronhalvelarnoj lavažnoj tečnosti. Intranazalno ukapavanje svake od klasa C ODNs, naročito na 1 mg/kg, pokazalo je tendenciju izazivanja vrlo blage akumulacije leukocita u bronhoalvelarnoj lavažnoj tečnosti.
Slike 10-15 prikazuju koncentracije citokina u bronhoalvelarnoj lavažnoj tečnosti. Intranazalno ukapavanje svake od klasa C ODNs j izazvalo merljive titre IFNa, IFNy, IP-10, IL.12p40, IL-6 i TNFa u bronhoalvelarnoj lavažnoj tečnosti. Titri drugih analiziranih sastojaka nisu dostigli merljive koncentracije ili koncentacije iznad fona (tipično < 20 pg/ml, podaci nisu prikazani). Svaka od klasa C ODNs je bila potentnija od klase B ODN SEQ ID NO:7 kao induktora IFNa, IFNy, IP-10, IL.12p40, IL-6 i TNFa. Povećana potenca klase C ODNs je naročito vidljiva na doznom nivou od 0.1 mg/kg. Od naročitog interesa je opažanje da je samo klasa C ODNs bila sposobna da indukuje bilo koji merljivi titar IFNa i IFNy posle doziranja sa 0.1 mg/kg (slika 10).
Slike 15-18 prikazuju koncentracije citokina u serumu. Intranazalno ukapavanje svake od klasa C ODNs izazvalo je merljive titre IFNy, IL-6 i TNFa u serumu. Titri drugih analiziranih sastojaka nisu dostigli merljive koncentracije (tipično <l 20 pg/ml, podaci nisu prikazani). U poređenju sa klasom B CpG SEQ ID NO:7, svaka od tri klase C ODNs je potentniji induktor imunomodifikujućih citokina IFNa, IFNy, IP-10, IL.12p40, IL-6 i TNFa.
Primer8: Efekti CpG oligodeoksinukleotida SEQ ID NO:2 i SEQ ID NO:7 na proizovnju
antigen indukovanog IgE kod miševa
Metode:Miševi (mužjaci BALB/c) su senzibilizovani dana ispitivanja 0 i 7 antigenom (ovalbumin, 10 pg, i. p.) i aluminijum hidroksidom kao pomagalom (Pierce Alum, Lp.). Miševi su dobili SEQ ID NO:2 ili SEQ ID NO:7 dana ispitivanja -2, 0, 5 i 7 (t. j., dva dana pre svake senzibilazcije i na dan senzibilizacije). Miševi su karijačno punktirani dana ispitivanja 18. Serum je sakupljen centrifuguranjem i analiziran sa ELISA na ovalbumin-specifični IgE i lgG2a.
Rezultati:Senzibilizacija antigenom dovela je do titra antigen (ovalbumin) -specifičnih IgE i lgG2a u serumu. Stvaranje IgE je potisnuto kod miševa koji su tretirani sa bilo kojim od SEQ ID NO:2 i SEQ ID NO:7, dok je stvaranje lgG2a potencirano (slika 19).
Zaključci:Podaci primera 8 pokazuju da SEQ ID NO:2 i SEQ ID NO:7 potiskuju stvaranje IgE koji je povezan sa Th2 kao odgovor na antigen senzibilizaciju, i potenciraju stvaranje lgG2a povezanog sa Th1. Rezultati ovog ispitivanja daju dalju evidenciju da ovi CpG mogu da potisnu odgovor tipa Th-2 na izlaganje antigenu kod miševa.
Primer9: Efekti SEQ ID N0:2 na pogoršanu inflamaciju disajnih puteva izazvanu
kombinovanim infekcijom influence i imunskim odgovorom na antigen
Uvod:Klasa C CpG oligodeoksinukleotida SEQ ID N::2 može da potisne naboj virusa influence i virusom izazvanu inflamaciju disajnih puteva kod miševa. Ovo ispitivanje istražuje zaštitne efekte SEQ ID N:2 na pogoršanu inflamaciju disajnih puteva izazvanu kombinovanim infekcijom influence i imunskim odgovorom na antigen.
Metode: Administracija antigena i virusa: Miševi (mužjaci BALB/c) su senzibilizovani dana ispirivanja 0 i 7 antigenom (bubašvaba, 10 pg, intraperitonalno) sa aluminijum hidroksidom kao pomagalom (Pierce, Alum). Imunski odgovor miševa na antigen je izazvan izlaganjem intranazalno adminisitriranom antigenu (10 pg u 40 pl solane), dva puta svake nedelje tokom tri uzastopne nedelje. Prvo izlaganje je izvedeno dana ispitivanja 21. Miševi su inficirani virusom influence (influenca tip A, subtip H1N1, soj adaptiran za miševe PR8,200 EID50u 40 pl solane) intranazalnim ukapavanjem dana ispitivanja 34 (t. j., pre poslednjeg para izlaganja antigenu). Alternativno, imunski odgovor posebne grupe miševa je izazvan samo izlaganjem antigenu ili samo vitusom infekcijom.
SEQ ID No:2 (100 pg/kg) je administriran intranazalno jedanput nedeljno, dva dana pre prvog imunskog odgovora na antigen u nedelji. Inflamacija disajnih puteva je analizirana 48 sati posle poslednje izlaganja antigenu. Ćelije u disajnim putevima su regenerisane bronhoalveolarnim lavažom. Diferencijalni broj ćelija je određen svetlsnom mikroskopijom centrifugiranih preparata obojenih VVright-Giemza bojom
Rezultati:Slika 20 prikazuje da je infekcija samiim virusom influence ili samo izlaganjem antigenu izazvala povećanje ukupnog broja leukocita u bronhoalveolarnoj lavažnoj tećnosti- Kod miševa inficiranih virusom, ova akumulacija ćelija uključuje značajne nukleofile, dok kod miševaizložrnih antigenu, akumulacija uključuje značajne eozinofile. Kad se porede sa miševima koji su bili izloženi samo antigenu, oni koji su bili izloženi antigenu i inficirani virusom su pokazali povećanu akumulaciju leukocita u bronhoalveolarnoj lavažnoj tečnosti.. Ova povećana akumulacija obuhvata i neutrofile i mononuklearne ćelije. Međutim, ovi miševi su pokazali smanjene euzenofilije. Drugi istraživači su slično pokazali da infekcija influencom može da potisne eozinofilije disajnih puteva kod a miševa izloženih antigenu, pa su pretpostavili daje ovo efekat posredovan sa Th1 (na pr., VVohlleben et al., 2003).
Tretiranje sa SEQ ID NO:2 (100 pg/kg) nije potisnulo virusom indukovane neutrofilije (slika 20). Ovoi negativni nalazi su očekivani pošto je u jednom ranijem ispitivanjuveća doza od 300 pg/kg bila najpoželjnija da bi se pokazao anti-virusni efekat. Osim toga, SEQ ID NO:2 (100 pg/kg) je značajno potisnulo antigen-indukovane eozinofilije. Ovi pozitivni nalazi su u saglasnosti sa ranijim ispitivanjima.
SEQ ID NO:2 (100 pg/kg) je znatno potisnuo povećanu inflamaciju disajnih puteva kod miševa koji su i inficirani i virusom i izloženi imunskom odgovoru na antigen. Povećana akumulacija kako neutrofila tako i mononuklearnih ćelija je potisnuta. Osim povećane inflamacije disajnih puteva, miševi koji su i inficirani i virusom i izloženi antigenu pokazali su značajan gubitak težine. Ovo je značajno potisnuto kod miševa tretiranih sa SEQ ID NO:2.
Zaključci:I kod dece i kod odraslih sa astmom, infekcije virusima respiratornog trakta su važni precipitanti za obstrukciju disajnih puteva i šištanje. Uključeni inflamatorni procesi su kompleksni. Međutim, osvežavanje i aktivacija virusom indukovanih neutrofila i monouklearnih ćelija je u povezano sa pogoršanjem obstrukcije disajnih puteva koji doprinosi pogoršanju astme (pregled Gern-a i Busse-a, Nature Immunologv, 2002). Podaci primera 9 pokazuju da SEQ ID NO:2 značajno potiskuje povećanu akumulaciju neutrofila i mononuklearnih ćelija indukovanih kod miševa kombinacijom virusne infekcije i izlaganjemantigenu.
Primer10: Ispitivanja na zamoracima
Primer10a: Izvod AHR protokola zamoraca
Mužjaci zamoraca su senzibilizovani dana ispitivanja 0 i 4 antigenom (ovalbumin, 0.5 ml 1& OVA i.p./s.c. sa aluminijum hidroksidom kao pomagalom. Zamorci su izloženi antigenu inhaliranjem ovalbumin aerosola, dva puta nedeljno tokom dve uzastopne nedelje. Prvo izlaganje je bilo dana ispitivanja 13. CpG ODN ili nosač (solana, 20 pl) su administrirani intranazalno jedanput svake nedelje, dva dana pre prvog nedeljnog izlaganja antigenu. Hiperreaktivnost disajnih puteva je analizirana 24 sata posle poslednjeg izlaganja antigenu merenjem konstrikcije bronhija (povećanje rezistencije u disajnim putevima) na intravenozni metaholin. Za svaku životinju, dobijena je kriva odgovora na metaholin, i reaktivnost disajnih puteva je određena kao površina ispod krive. Slika 21 je šematski prikaz procedure.
Primer 10b:Efekat SEQ ID NO:2 na rezistenciju disajnih puteva i prilagođavanje pluća kod
zamoraca
Metoda:Zamorci su senzibilizovani kao što je opisano u Primeru 10. Prvo izazivanje imunskog odgovora na antigen je izvedeno dana ispitivanja 13. Zamorcima je dat intranazalno ili nosač (solana), sam OVA, ili koncentracije SEQ ID NO:7 od 10 pl/kg, 30 pl/kg, 100 pl/kg ili 300 pl/kg, i.t.
Rezultati:Slika 22 pokazuje da je SEQ ID NO:7 izazvao dozno-zavisnu redukciju u AUC rezistenciji.
Primer 10c:Statistička analiza efekta SEQ ID NO:7 na rezistenciju disajnih puteva i
prilagođavanje pluća kod zamoraca
Metoda:Korišćen je Dunnett-ov test višestrukog upoređivanja je za analizu podataka eksperoienta Primera 10b. Ova metoda omogućava poređenje svih uzoraka sa jednom komtrolnom grupom.
Rezultati:Slika 23 pokazuje pokazuje da je SEQ ID NO:7 izazvao dozno-zavisnu redukciju u AUC rezistenciji.
Primer 10d:Efekat SEQ ID NO:2 na rezistenciju disajnih puteva i prilagođavanje pluća kod
zamoraca
Metoda:Zamorci su senzibilizovani kao što je opisano u Primeru 10. Prvo izazivanje imunskog odgovora na antigen je izvedeno dana ispitivanja 13. Zamorcima je dat intranazalno ili nosač (solana), sam OVA, ili koncentracije SEQ ID NO:2 od 10 pl/kg, 30 pl/kg, 100 pl/kg ili 300 pl/kg, i.t.
Rezultati:Slika 24 pokazuje da je SEQ ID NO:7 izazvao dozno-zavisnu redukciju u AUC rezistenciji.
Primer 10e:Statistička analiza efekta SEQ ID NO:2 na rezistenciju disajnih puteva i
prilagođavanje pluća kod zamoraca
Metoda:Korišćen je Dunnett-ov test višestrukog upoređivanja je za analizu podataka eksperomenta Primera 10d. Ova metoda omogućava poređenje svih uzoraka sa jednom komtrolnom grupom.
Rezultati.Slika 23 pokazuje pokazuje da je SEQ ID NO:2 izazvao dozno-zavisnu redukciju u AUC rezistenciji.
Primer 11:
Nivoi IL-10, TNF-alfa, interferon-gama, i IL-6 (pg/ml) proizvedeni humanim PBMC posle izlaganja ovih ćelija ovde opisanim CpG oligonukleotidima su prikazani na priloženim Slikama 27-31. Test oligonukleidi prikazani na Slici 27 obuhvataju SEQ ID NOs: 10, 9, 13, 14, 1 i 2. Koncentracija oligonukleotida koja je upotrebljena da proizvede pojedinačni podatak označena je duž X-ose (pM).
Kao što je prikazano na Slici 27 svaki od oligunukleotida testiranih u analizi je bio sposoban da izazove različite nivoe i obrasce sekrecije IL-10. Od ovih testiranih, ODN SEQ ID NO 1 i 2 izazvali su dramatično višu indukciju IL-10.
Slika 28 opisuje podatke koji se odnose na TNF-alfa, interferon-gama i IL-6 na tri reprezentativne doze. Detaljniji grafikoni ovih citokina su prikazani na Slikama 29 - 31 sa dodatnim dozama oligonukeotida.
Primer 12:
Nivoi B ćelija, plazmacitoidnih ćelija i aktivacija monocita posle izlaganja ovih ćelija ovde opisanim CpG oligonukleotidima prikazani su na priloženim Slikama 32 - 42. Oligonukleotidi koji su ispitivani označeni su na Slikama sa SEQ ID NO i obuhvataju SEQ ID NO: 9,13, 10,14, 2,1,11, 12 i 3. Koncentracija oligonukleotida koja je upotrebljena da proizvede pojedinačni podatak označena je duž X-ose (pM).
Kao što je prikazano na Slikama 32, 34, 35, 40 i 42, CpG oligonukleotidi koji su testirani u analizi bili su sposobni da aktiviraju B ćelije, kao što je predstavljeno testiranim markerima. Na Slikama 32 i 33 , CpG oligonukleotidi koji su testirani u analizi bili su sposobni da aktiviraju NK ćelije, kao što je predstavljeno testiranim markerima. Na Slikama 36, 37, 40 i 41, CpG oligonukleotidi koji su testirani u analizi bili su sposobni da aktiviraju monocite, kao stoje predstavljeno testiranim markerima. Na Slikama 36 i 39 , CpG oligonukleotidi koji su testirani u analizi bili su sposobni da aktiviraju plazmacitoidne dendritične ćelije, kao što je predstavljeno testiranim markerima.
Svih pet testiranih IDN koji imaju polu-meki osnovni lanac pokazali su povećanu potencu u analizi (IFN-alfa, IP-10, IL-10) u poređenju sa SEQ ID NO:9 (potpuno fosforotioatni osnovni lanac). Potenca ovih polu-mekih ODN je takođe povećana u: aktivaciji monocita (CD80, CD86 ekspresija), aktivaciji pDC (CD86 ekspresija), intracelularni IP-10 (monociti i B ćelije), IL-6 sekreciji, i aktivaciji B ćelija (CD80, CD86 ekspresija). Na primer, približno ekvivalentne ili niže koncentracije većine testiranih ODN dovele su do bolje indukcije površine ćelija markera nego potpuno foosforotioatni SE ID N0.9.
Primer 13:
Cilj ovih ispitivanja je da se ispita biološka aktivnost izabranih fragmenata (pretpostavljenih metabolita) SEQ IN N0.2. Aktivnost je određena merenjem sposobnosti svakoig fragmenta da indukuje sekreciju citokina povezanih sa TLR9 iz splenocita miševain vivo.
Stimulacija sekrecije citokina fragmentima SEQ ID NO:2 je pokazana na priloženim Slikama 43 - 45. Oligonukleotidi koji su ispitiani su označeni na slikama sa SEQ ID NO i uključuju SEQ ID NO: 15-23. Koncentracija oligonukleotida koja je upotrebljena da proizvede pojedinačni podatak označena je duž X-ose (pg/ml).
Kako je prikazano na Slikama 43 - 45 SEQ ID NO: 2 i fragmenti (pretpostavljeni metaboliti, SEQ ID NOs: 15 - 23) koji su testirani, svi su indukovali citokine povezane sa TLR-9, IFNa, IFNv, IP-10, IL-6, i TNFa iz splenocita miševain vitro(slike 43, 44 i 45). Ovi podaci pokazuju da je svaki od fragmenata zadržao biološku aktivnost.

Claims (63)

1. Oligonukleotid koji sadrži: 5' TC-GTC-GTNJC-GGCGC^GCCG 3' (SEQ ID NO: 27), naznačenome, što oligonukleotid obuhvata najmanje 2 stabilizovana internukleotidna linka, a^predstavlja fosfodiestar ili fosfodiestar-sličneinternukleotidne linkove i gde je Nidužine 0-3 nukleotida, pri čemu se N odnosi na bilo koji nukleotid.
2. Oligonukleotid iz zahteva 1, naznačen time, što je Nidužine 3 nukleotida.
3. Oligonukleotid iz zahteva 1,, naznačen time, što oligonukleotid sadrži 5' T<*>C_G<*>T<*>C_G<*>T<*>C_G<*>T<*>T<*>C_G<*>G<*>C<*>G<*>C_G<*>C<*>G<*>C<*>C<*>G 3' (SEQ ID NO: 2), gde<*>predstavlja stabilizovan intemukleotidni link.
4. Oligonukleotid iz zahteva 3, , naznačen time, što je oligonukleotid, 5' T*C_G*T*C_G*T*C_G*T*T*C_G*G*CH:G*C_G*CtpG i:C*C*G 3' (SEQ ID NO: 2), gde<*>predstavlja stabilizovani intemukleotidni link, gde 5' označava slobodan 5' kraj oligonukleotida i 3' se odnosi na slobodan 3' kraj oligonukleotida.
5. Oligonukleotid iz zahteva 1, , naznačen time, što je Ntdužine 0 nukleotida.
6. Oligonukleotid iz zahteva 1, , naznačen time, što oligonukleotid sadrži 5' T<*>C_G<*>T<*>C_G<*>T<*>T<*>C_G<*>G<*>C<*>G<*>C<*>G<*>C<*>C<*>G 3' (SEQ ID NO. 3), gde<*>predstavlja stabilizovan intemukleotidni link.
7. Oligonukleotid iz zahteva 6, , naznačen time, što je oligonukleotide 5' T<*>C_G<*>T<*>C_G<*>T<*>T<*>CJ3<*>G<*>C<*>G<*>C<*>G<*>C<*>C<*>G 3' (SEQ ID NO: 3), gde<*>predstavlja stabilizovan intemukleotidni link, gde 5' označava slobodan 5' kraj oligonukleotida i 3' označava slobodan 3' kraj oligonukleotida.
8. Oligonukleotid koji sadrži:
5' TC_GTC_GAC_GATC_GGCGC_GCGCCG3' (SEQ ID NO: 4), , naznačen time, što oligonukleotid obuhvata najmanje 2 stabilizovana internukleotidna linka i _ predstavlja fosfodiestar ili fosfodiestar-sličan intemukleotidni link.
9. Oligonukleotid iz zahteva 8,, naznačen time, što je oligonukleotid 5' T<*>C_G<*>T<*>C_G<*>A<*>C_G<*>A<*>T<*>C_G<*>G<*>C<*>G<*>C_G<*>C<*>G<*>C<*>C<*>G 3' (SEQ ID NQ: 4), gde<*>predstavlja stabilizovan intemukleotidni link.
10. Oligonukleotid koji sadrži: 5' TTC_GTC_GTTTXi_GTC_GTT 3' (SEQ ID NO: 25), , naznačen time, što oligonukleotid obuhvata najmanje 2 stabilizovana internukleotidna linkaga i _ predstavlja fosfodiestar ili fosfodiestar-sličan intemukleotidni link, i gde je X-i, pirimidin.
11. Oligonukleotid iz zahteva 10, , naznačen time, što je Xi, T.
12. Oligonukleotid iz zahteva 11, , naznačen time, što oligonukleotid sadrži 5' T<*>T<*>C_G<*>T<*>C_G<*>T<*>T<*>T<*>T_G<*>T<*>C_G<*>T<*>T 3' (SEQ ID NO: 5), gde<*>predstavlja stabilizovan intemukleotidni link.
13. Oligonukleotid iz zahteva 11,, naznačen time, što je oligonukleotid 5' T*TX_G*T*CJ3*T*T*T*T_G*T*C_G*T*T 3' (SEQ ID NO: 5), gde<*>predstavlja stabilizovan intemukleotidni link, pri čemu 5' označava sloboran 5' kraj oligonukleotida, a 3' označava slobodan 3' kraj oligonukleotida.
14. Oligonukleotid iz zahteva 10, , naznačen time, stoje Xi, C
15. Oligonukleotid iz zahteva 14, , naznačen time, što oligonukleotid sadrži 5' T<*>T<*>T<*>C_G<*>T<*>C_G<*>T<*>T<*>T<*>C_G<*>T<*>C_G<*>T<*>T 3' (SEQ ID NO 6), gde<*>predstavlja stabilizovan intemukleotidni link.
16. Oligonukleotid iz zahteva 14, , naznačen time, što je oligonukleotid, 5' T<*>T<*>T<*>C_G<*>T<*>C_G<*>T<*>T<*>T<*>C_G<*>T<A>C_G<*>T<*>T 3' (SEQ ID NO: 6), gde<*>predstavlja stabilizovan intemukleotidni link, pri čemu 5' označava slobodan 5' kraj oligonukleotida, a 3' označava slobodan 3' kraj oligonukleotida.
17. Oligonukleotid , naznačen time, što sadrži TCGTCGTTCGGCGCGCCG (SEQ ID NO: 3).
18. Oligonukleotid , naznačen time, što sadrži: TCGTCGTCGTTCGGCGCGCGCCG (SEQ ID NO: 2).
19. Oligonukleotid , naznačen time, što sadrži: TCGTCGACGATCGGCGCGCGCCG (SEQ ID NO: 4).
20. Oligonukleotid , naznačen time, što sadrži: TTCGTCGTTTTGTCGTT (SEQ ID NO: 5).
21. Oligonukleotid , naznačen time, što sadrži: TTTCGTCGTTTCGTCGTT (SEQ ID NO: 6).
22. Oligonukleotid , naznačen time, što sadrži T<*>C_G<*>T<*>C_G<*>T<*>C, gde<*>predstavlja stabilizovan intemukleotidni link i _ predstavlja fosfodiestar ili fosfodiestar-sličan intemukleotidni link.
23. Oligonukleotid iz zahteva 22, , naznačen time, što je oligonukleotid, 5' T<*>C- G<*>T<*>C-G<*>T<*>C-G<*>T<*>T<*>C-G<*>G<*>C<*>G<*>C-G<*>C<*>G<*>C<*>C 3' (SEQ ID NO.: 21), gde 5' označava slobodan 5' kraj oligonukleotida i 3' označava slobodan 3' kraj oligonukleotida.
24. Oligonukleotid iz zahteva 22, , naznačen time, što je oligonukleotid, 5' T<*>C- G<*>T<*>C-G<*>T<*>C-G<*>T<*>T<*>C-G<*>G<*>C<*>G<*>C 3' (SEQ ID NO.: 22), gde 5' označava slobodan 5' kraj oligonukleotida i 3' označava slobodan 3' kraj oligonukleotida.
25. Oligonukleotid iz zahteva 22, , naznačen time, što je oligonukleotid, 5' T<*>C- G<*>T<*>C-G<*>T<*>C-G<*>T<*>T<*>C-G<*>G<*>C<*>G<*>C-G<*>C<*>G<*>C 3' (SEQ ID NO.: 23), gde 5' označava slobodan 5' kraj oligonukleotida i 3' označava slobodan 3' kraj oligonukleotida.
26. Oligonukleotid , naznačen time, što: sadrži T<*>C_G<*>T<*>T<*>C_G<*>G, gde<*>predstavlja stabilizovan intenukleotidni link i _ predstavlja fosfodiestar ili fosfodiestar-sličan intenukleotidni link.
27. Oligonukleotid iz zahteva 26, , naznačen time, što je oligonukleotid, 5' C- G<*>T<*>C-G<*>T<*>C-G<*>T<*>T<*>C-G<*>G<*>C<*>G<*>C-G<*>C<*>G<*>C<*>C<*>G 3' (SEQ ID NO.: 15), gde 5' označava slobodan 5' kraj oligonukleotida i 3' označava slobodan 3' kraj oligonukleotida.
28. Oligonukleotid iz zahteva 26, , naznačen time, što je oligonukleotid, 5' G<*>T<*>C- G<*>T<*>C-G<*>T<*>T<*>C-G<*>G<*>C<*>G<*>C-G<*>C<*>G<*>C<*>C<*>G 3' (SEQ ID NO.: 16), gde 5' označava slobodan 5' kraj oligonukleotide i 3' označava slobodan 3' kraj oligonukleotida.
29. Oligonukleotid iz zahteva 26, , naznačen time, što je oligonukleotid, 5' T<*>C- G<*>T<*>C-G<*>T<*>T<*>C-G<*>G<*>C<*>G<*>C-G<*>C<*>G<*>C<*>C<*>G 3' (SEQ ID NO.: 17), gde 5' označava slobodan 5' kraj oligonukleotida i 3' označava slobodan 3' kraj oligonukleotida.
30. Oligonukleotid iz zahteva 26, naznačen time, što je oligonukleotid, 5' C- G<*>T<*>C-G<*>T<*>T<*>C-G<*>G<*>C<*>G<*>C-G<*>C<*>G<*>C<*>C<*>G 3' (SEQ ID NO.: 18), gde 5' označava slobodan 5' kraj oligonukleotida i 3' označava slobodan 3' kraj oligonukleotida.
31. Oligonukleotid iz zahteva 26, naznačen time, što je oligonukleotide, 5' G<*>T<*>C-G<*>T<*>T<*>C-G<*>G<*>C<*>G<*>C-G<*>C<*>G<*>C<*>C<*>G 3' (SEQ ID N0.:19);pri čemu 5' označava slobodan 5' kraj oligonukleotida i 3' označava slobodan 3' kraj oligonukleotida.
32. Oligonukleotid iz zahteva 26, naznačen time, što je oligonukleotid, 5' T<*>C-G<*>T<*>T<*>C_G<*>G<*>C<*>G<*>C_G<*>C<*>G<*>C<*>C<*>G 3, (SEQ ID NO.: 20), gde 5' označava slobodan 5' kraj oligonukleotida i 3' označava slobodan 3' kraj oligonukleotida.
33. Farmaceutski preparat koji sadrži oligonukleotid prema jednom od zahteva 1-32 i farmaceutski prihvatljiv nosač.
34. Farmaceutski preparat iz zahteva, naznačen time, što sadrži još i raspršivač.
35. Farmaceutski preparat iz zahteva 33, naznačen time, što sadrži i inhalator.
36. Farmaceutski preparat iz zahteva 35 , naznačen time, što je inalator, merodozni inhalator.
37. Farmaceutski preparat iz zahteva 35, naznačen time, što je inhalator, praškasti inhalator.
38. Farmaceutski preparat iz zahteva 33 , naznačen time, što sadrži još i hemoterapeutski agens.
39. Farmaceutski preparat iz zahteva 33 , naznačen time, što saadrži i anti- viralni agens.
40. Farmaceutski preparat iz zahteva 33 , naznačen time, što je farmaceutski prihvatljiv nosač formulisan za subkutalnu administraciju.
41. Farmaceutski preparat iz zahteva 33 , naznačen time, što je farmaceutski prihvatljiv nosač formulisan za fornul administraciju.
42. Farmaceutski preparat iz zahteva 33 , naznačen time, što je farmaceutski prihvatljiv nosač formulisan za intranazalnu administraciju.
43. Primena oligonukleotida prema jednom od zahteva 1-32 kao lek za stimulaciju imunskog odgovora.
44. Primena oligonukleotida prema jednom od zahteva 1-32 za proizvonju leka za stimulaciju imunskog odgovora.
45. Primena oligonukleotida prema jednom od zahteva 1-32 za proizvonju leka za lečenje astme.
46. Primena prema zahtevu 45, gde je astma egzacerbirana (pogoršana) viralnom infekcijom.
47. Primena oligonukleotida prema jednom od zahteva 1-32 za proizvonju leka za lečenje alergije.
48. Primena oligonukleotida prema jednom od zahteva 1-32 za proizvonju leka za lečenje kancera.
49. Primena prema zahtevu 48, pri čemu je lek upotrebljen sa hemoterapeutskim agensom.
50. Primena oligonukleotida prema jednom od zahteva 1-32 za proizvonju leka za lečenje infektivnih bolesti.
51. Primena oligonukleotida prema jednom od zahteva 1-32 za proizvonju leka zalečenje viralnih oboljenja.
52. Primena prema zahtevu 51, pri čemu je viralno oboljenje, hepatitis.
53. Primena prema zahtevu 52, gde je hepatitis, hepatitis B.
54. Primena prema zahtevu 52, gde je hepatitis, hepatitis C.
55. Primena oligonukleotida prema jednom od zahteva 1-32 za proizvonju leka za lečenje autoimune bolesti.
56. Primena oligonukleotida prema jednom od zahteva 1-32 za proizvonju leka za lečenje remodelovanja disajnih puteva (adhezije bronhija).
57. Primena prema zahtevu 44, pri čemu je lek za upoterbu bez antigena.
58. Primena prema zahtevu 44, pri čemu je lek za upotrebu sa antigenom.
59. Postupak za proizvodnju oligonukleotidnog leka prema jednom od zahteva 1-32 za stimulaciju imunskog odgovora.
60. Postupak za proizvodnju oligonukleotidnog leka prema jednom od zahteva 1-32 za lečenjekancera.
61. Postupak za proizvodnju oligonukleotidnog leka prema jednom od zahteva 1-32 za lečenje astme.
62. Postupak za proizvodnju oligonukleotidnog leka prema jednom od zahteva 1-32 za lečenje alergije.
63. Postupak za proizvodnju oligonukleotidnog leka prema jednom od zahteva 1-32 za lečenje infektivnih bolesti.
RSP-2007/0164A 2004-10-20 2005-10-20 Polu-meki imunostimulatorni oligonukleotidi c-klase RS20070164A (sr)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US62075904P 2004-10-20 2004-10-20
PCT/US2005/037731 WO2006135434A2 (en) 2004-10-20 2005-10-20 Semi-soft c-class immunostimulatory oligonucleotides

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS20070164A true RS20070164A (sr) 2009-01-22

Family

ID=37507656

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RSP-2007/0164A RS20070164A (sr) 2004-10-20 2005-10-20 Polu-meki imunostimulatorni oligonukleotidi c-klase

Country Status (28)

Country Link
US (3) US7566703B2 (sr)
EP (1) EP1802757B1 (sr)
JP (1) JP2008516634A (sr)
KR (1) KR20070065392A (sr)
CN (1) CN101084310A (sr)
AR (1) AR051462A1 (sr)
AT (1) ATE527355T1 (sr)
AU (1) AU2005332970A1 (sr)
BR (1) BRPI0516497A (sr)
CA (1) CA2578844A1 (sr)
CR (1) CR9131A (sr)
ES (1) ES2375071T3 (sr)
GT (1) GT200500294A (sr)
IL (1) IL182470A0 (sr)
MA (1) MA29028B1 (sr)
MY (1) MY159370A (sr)
NO (1) NO20072526L (sr)
NZ (1) NZ554753A (sr)
PA (1) PA8650101A1 (sr)
PE (1) PE20061045A1 (sr)
RS (1) RS20070164A (sr)
RU (1) RU2393223C2 (sr)
SV (1) SV2006002279A (sr)
TN (1) TNSN07150A1 (sr)
TW (1) TW200626720A (sr)
UY (1) UY29173A1 (sr)
WO (1) WO2006135434A2 (sr)
ZA (2) ZA200703609B (sr)

Families Citing this family (79)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030109469A1 (en) * 1993-08-26 2003-06-12 Carson Dennis A. Recombinant gene expression vectors and methods for use of same to enhance the immune response of a host to an antigen
US6239116B1 (en) * 1994-07-15 2001-05-29 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules
US20030026782A1 (en) * 1995-02-07 2003-02-06 Arthur M. Krieg Immunomodulatory oligonucleotides
US6429199B1 (en) * 1994-07-15 2002-08-06 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules for activating dendritic cells
US7935675B1 (en) * 1994-07-15 2011-05-03 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules
US6207646B1 (en) * 1994-07-15 2001-03-27 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules
EP0855184A1 (en) * 1997-01-23 1998-07-29 Grayson B. Dr. Lipford Pharmaceutical composition comprising a polynucleotide and an antigen especially for vaccination
US6406705B1 (en) 1997-03-10 2002-06-18 University Of Iowa Research Foundation Use of nucleic acids containing unmethylated CpG dinucleotide as an adjuvant
CA2328406A1 (en) * 1998-05-14 1999-11-18 Hermann Wagner Methods for regulating hematopoiesis using cpg-oligonucleotides
IL139813A0 (en) * 1998-05-22 2002-02-10 Loeb Health Res Inst At The Ot Methods and products for inducing mucosal immunity
US20030022854A1 (en) 1998-06-25 2003-01-30 Dow Steven W. Vaccines using nucleic acid-lipid complexes
ATE464907T1 (de) * 1999-02-17 2010-05-15 Csl Ltd Immunogene komplexe und methoden in bezug auf diese
US6949520B1 (en) * 1999-09-27 2005-09-27 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Methods related to immunostimulatory nucleic acid-induced interferon
US7585847B2 (en) * 2000-02-03 2009-09-08 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Immunostimulatory nucleic acids for the treatment of asthma and allergy
WO2001097843A2 (en) * 2000-06-22 2001-12-27 University Of Iowa Research Foundation Methods for enhancing antibody-induced cell lysis and treating cancer
CN1604795B (zh) 2001-08-17 2010-05-26 科勒制药股份公司 具有提高的活性的组合基序免疫刺激寡肽
US7276489B2 (en) * 2002-10-24 2007-10-02 Idera Pharmaceuticals, Inc. Modulation of immunostimulatory properties of oligonucleotide-based compounds by optimal presentation of 5′ ends
AU2003230806B2 (en) * 2002-04-04 2009-05-07 Zoetis Belgium S.A. Immunostimulatory G,U-containing oligoribonucleotides
US7807803B2 (en) 2002-07-03 2010-10-05 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Nucleic acid compositions for stimulating immune responses
US20040053880A1 (en) 2002-07-03 2004-03-18 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Nucleic acid compositions for stimulating immune responses
US7605138B2 (en) 2002-07-03 2009-10-20 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Nucleic acid compositions for stimulating immune responses
US7569553B2 (en) 2002-07-03 2009-08-04 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Nucleic acid compositions for stimulating immune responses
US7576066B2 (en) * 2002-07-03 2009-08-18 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Nucleic acid compositions for stimulating immune responses
AR040996A1 (es) 2002-08-19 2005-04-27 Coley Pharm Group Inc Acidos nucleicos inmunoestimuladores
CN1753687A (zh) 2002-10-29 2006-03-29 科勒制药集团股份有限公司 Cpg寡核苷酸在治疗丙型肝炎病毒感染中的应用
WO2004053104A2 (en) 2002-12-11 2004-06-24 Coley Pharmaceutical Group, Inc. 5’ cpg nucleic acids and methods of use
EP1608403A2 (en) * 2003-04-02 2005-12-28 Coley Pharmaceutical Group, Ltd. Immunostimulatory nucleic acid oil-in-water formulations for topical application
EA200600069A1 (ru) * 2003-06-20 2006-08-25 Коли Фармасьютикал Гмбх Низкомолекулярные антагонисты toll-подобных рецепторов (tlr)
AU2004275876B2 (en) * 2003-09-25 2011-03-31 Coley Pharmaceutical Gmbh Nucleic acid-lipophilic conjugates
SG122973A1 (en) 2003-10-30 2006-06-29 Coley Pharm Gmbh C-class oligonucleotide analogs with enhanced immunostimulatory potency
US20050239733A1 (en) * 2003-10-31 2005-10-27 Coley Pharmaceutical Gmbh Sequence requirements for inhibitory oligonucleotides
US20050256073A1 (en) * 2004-02-19 2005-11-17 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Immunostimulatory viral RNA oligonucleotides
US20060019916A1 (en) * 2004-04-02 2006-01-26 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Immunostimulatory nucleic acids for inducing IL-10 responses
KR100958505B1 (ko) * 2004-07-18 2010-05-17 씨에스엘 리미티드 면역자극 복합체 및 향상된 인터페론-감마 반응을 유도하기위한 올리고뉴클레오티드 제제
MY159370A (en) * 2004-10-20 2016-12-30 Coley Pharm Group Inc Semi-soft-class immunostimulatory oligonucleotides
CN101171033A (zh) * 2005-03-04 2008-04-30 戴纳瓦克斯技术公司 包含具免疫刺激序列iss之寡核苷酸的疫苗：其中iss与抗原缀合并通过缓冲条件和其他赋形剂稳定
US20060213010A1 (en) * 2005-03-22 2006-09-28 Davis David T Mattress sled
WO2006110607A2 (en) * 2005-04-08 2006-10-19 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Methods for treating infectious disease exacerbated asthma
US20090117132A1 (en) * 2005-07-07 2009-05-07 Pfizer, Inc. Anti-Ctla-4 Antibody and Cpg-Motif-Containing Synthetic Oligodeoxynucleotide Combination Therapy for Cancer Treatment
CN101310019A (zh) * 2005-09-16 2008-11-19 科利制药公司 具有磷酸二酯主链的免疫刺激性单链核糖核酸
WO2007031877A2 (en) * 2005-09-16 2007-03-22 Coley Pharmaceutical Gmbh Modulation of immunostimulatory properties of short interfering ribonucleic acid (sirna) by nucleotide modification
US7662949B2 (en) 2005-11-25 2010-02-16 Coley Pharmaceutical Gmbh Immunostimulatory oligoribonucleotides
DK1991678T4 (da) * 2006-02-15 2020-10-19 Rechtsanwalt Thomas Beck Sammensætninger og fremgangsmåder til oligonukleotid-formuleringer
KR101251707B1 (ko) 2006-09-27 2013-04-11 콜리 파마슈티칼 게엠베하 면역 자극 활성이 증강된 소수성 Ｔ 유사체를 함유하는 ＣｐＧ 올리고뉴클레오티드 유사체
US20090142362A1 (en) * 2006-11-06 2009-06-04 Avant Immunotherapeutics, Inc. Peptide-based vaccine compositions to endogenous cholesteryl ester transfer protein (CETP)
DK2573176T3 (en) 2007-05-04 2016-08-01 Index Pharmaceuticals Ab Tumor growth retardant compounds and methods of use thereof
DK2179039T3 (en) 2007-08-13 2019-01-07 Zoetis Belgium S A RNA sequence motifs associated with defined internucleotide bonds that induce specific immunomodulatory profiles
EP2278979A4 (en) 2008-05-21 2012-09-26 Us Gov Health & Human Serv PROCESS FOR TREATING PNEUMOCONIOSIS WITH OLIGODEOXYNUCLEOTIDES
WO2009154565A1 (en) * 2008-06-18 2009-12-23 Index Pharmaceuticals Ab Combination therapies against cancer
EP2350282A1 (en) * 2008-11-04 2011-08-03 Index Pharmaceuticals AB Increased expression of specific antigens
US8053422B2 (en) 2008-12-04 2011-11-08 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Anti-cancer oligodeoxynucleotides
MY160201A (en) 2008-12-09 2017-02-28 Coley Pharm Group Inc Immunostimulatory oligonucleotides
US8552165B2 (en) * 2008-12-09 2013-10-08 Heather Davis Immunostimulatory oligonucleotides
ES2534947T3 (es) 2009-03-25 2015-04-30 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Composiciones para la estimulación de resistencia inmunitaria innata de mamíferos a patógenos
CA2771863A1 (en) 2009-08-26 2011-03-17 Selecta Biosciences, Inc. Compositions that induce t cell help
CN102712927B (zh) * 2009-12-16 2017-12-01 库尔纳公司 通过抑制膜结合转录因子肽酶，位点1(mbtps1)的天然反义转录物来治疗mbtps1相关疾病
WO2011150258A1 (en) 2010-05-26 2011-12-01 Selecta Biosciences, Inc. Dose selection of adjuvanted synthetic nanocarriers
EA201390660A1 (ru) 2010-11-05 2013-11-29 Селекта Байосайенсиз, Инк. Модифицированные никотиновые соединения и связанные способы
US20130028857A1 (en) 2011-07-29 2013-01-31 Selecta Biosciences, Inc. Synthetic nanocarriers comprising polymers comprising multiple immunomodulatory agents
CN110743008A (zh) 2013-03-14 2020-02-04 哈佛大学的校长及成员们 基于纳米颗粒的组合物
WO2015013673A1 (en) 2013-07-25 2015-01-29 Aurasense Therapeutics, Llc Spherical nucleic acid-based constructs as immunostimulatory agents for prophylactic and therapeutic use
EP3556353A3 (en) 2014-02-25 2020-03-18 Merck Sharp & Dohme Corp. Lipid nanoparticle vaccine adjuvants and antigen delivery systems
AU2015269412B2 (en) 2014-06-04 2020-03-12 Exicure Operating Company Multivalent delivery of immune modulators by liposomal spherical nucleic acids for prophylactic or therapeutic applications
US20150374815A1 (en) 2014-06-25 2015-12-31 Selecta Biosciences, Inc. Methods and compositions for treatment with synthetic nanocarriers and immune checkpoint inhibitors
WO2016044839A2 (en) 2014-09-19 2016-03-24 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Compositions and methods for treating viral infections through stimulated innate immunity in combination with antiviral compounds
US11213593B2 (en) 2014-11-21 2022-01-04 Northwestern University Sequence-specific cellular uptake of spherical nucleic acid nanoparticle conjugates
LT3240801T (lt) 2014-12-31 2021-02-25 Checkmate Pharmaceuticals, Inc. Kombinuota navikų imunoterapija
BR112017025562A2 (pt) 2015-05-29 2018-08-07 Merck Sharp & Dohme Corp. métodos para tratar câncer em um indivíduo e para tratar um indivíduo humano diagnosticado com câncer
EP3301179B1 (en) 2015-07-09 2019-06-05 National Institute for Materials Science Immunostimulating oligonucleotide complex
HUE054422T2 (hu) * 2015-07-20 2021-09-28 Zoetis Services Llc Liposzómás adjuváns készítmények
US10456459B2 (en) * 2015-07-20 2019-10-29 Zoetis Services Llc Liposomal adjuvant compositions
WO2017173334A1 (en) 2016-04-01 2017-10-05 Checkmate Pharmaceuticals, Inc. Fc receptor-mediated drug delivery
WO2018039629A2 (en) 2016-08-25 2018-03-01 Northwestern University Micellar spherical nucleic acids from thermoresponsive, traceless templates
WO2018077385A1 (en) * 2016-10-25 2018-05-03 Biontech Rna Pharmaceuticals Gmbh Dose determination for immunotherapeutic agents
US12460208B2 (en) 2017-04-18 2025-11-04 Parr Biotechnology Co., Ltd. Immunomodulatory polynucleotides and uses thereof
CN108728444A (zh) * 2017-04-18 2018-11-02 长春华普生物技术股份有限公司 免疫调节性多核苷酸及其应用
WO2018201090A1 (en) 2017-04-28 2018-11-01 Exicure, Inc. Synthesis of spherical nucleic acids using lipophilic moieties
US12246031B2 (en) 2018-02-13 2025-03-11 Checkmate Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for tumor immunotherapy
MX2020010410A (es) 2018-04-09 2021-01-15 Checkmate Pharmaceuticals Empaquetado de oligonucleotidos en particulas similares a virus.

Family Cites Families (134)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4806463A (en) * 1986-05-23 1989-02-21 Worcester Foundation For Experimental Biology Inhibition of HTLV-III by exogenous oligonucleotides
US5194428A (en) * 1986-05-23 1993-03-16 Worcester Foundation For Experimental Biology Inhibition of influenza virus replication by oligonucleotide phosphorothioates
US5264423A (en) 1987-03-25 1993-11-23 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Inhibitors for replication of retroviruses and for the expression of oncogene products
US5276019A (en) * 1987-03-25 1994-01-04 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Inhibitors for replication of retroviruses and for the expression of oncogene products
US5004810A (en) * 1988-09-30 1991-04-02 Schering Corporation Antiviral oligomers
US5399676A (en) * 1989-10-23 1995-03-21 Gilead Sciences Oligonucleotides with inverted polarity
US5177198A (en) 1989-11-30 1993-01-05 University Of N.C. At Chapel Hill Process for preparing oligoribonucleoside and oligodeoxyribonucleoside boranophosphates
US5587361A (en) 1991-10-15 1996-12-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides having phosphorothioate linkages of high chiral purity
US5514788A (en) * 1993-05-17 1996-05-07 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotide modulation of cell adhesion
US5166195A (en) 1990-05-11 1992-11-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense inhibitors of the human immunodeficiency virus phosphorothioate oligonucleotides
CA2084987C (en) 1990-06-11 2007-02-13 Gilead Sciences, Inc. Nucleic acid ligands
EP0468520A3 (en) 1990-07-27 1992-07-01 Mitsui Toatsu Chemicals, Inc. Immunostimulatory remedies containing palindromic dna sequences
US6605708B1 (en) 1993-07-28 2003-08-12 Hybridon, Inc. Building blocks with carbamate internucleoside linkages and oligonucleotides derived therefrom
US5859231A (en) 1993-09-03 1999-01-12 Duke University Synthesis of oligonucleotides with boranophosphonate linkages
DE4338704A1 (de) * 1993-11-12 1995-05-18 Hoechst Ag Stabilisierte Oligonucleotide und deren Verwendung
US5596091A (en) * 1994-03-18 1997-01-21 The Regents Of The University Of California Antisense oligonucleotides comprising 5-aminoalkyl pyrimidine nucleotides
US6727230B1 (en) * 1994-03-25 2004-04-27 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Immune stimulation by phosphorothioate oligonucleotide analogs
WO1995026204A1 (en) 1994-03-25 1995-10-05 Isis Pharmaceuticals, Inc. Immune stimulation by phosphorothioate oligonucleotide analogs
MY114769A (en) * 1994-04-18 2003-01-31 Aviron Inc Non-splicing variants of gp350/220
US5696248A (en) 1994-06-15 1997-12-09 Hoechst Aktiengesellschaft 3'-modified oligonucleotide derivatives
US6207646B1 (en) * 1994-07-15 2001-03-27 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules
US6239116B1 (en) * 1994-07-15 2001-05-29 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules
US20030026782A1 (en) 1995-02-07 2003-02-06 Arthur M. Krieg Immunomodulatory oligonucleotides
DE69535905D1 (de) * 1994-07-15 2009-02-26 Coley Pharm Group Inc Immunomodulatorische Oligonukleotide
US7935675B1 (en) 1994-07-15 2011-05-03 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules
US6429199B1 (en) * 1994-07-15 2002-08-06 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules for activating dendritic cells
US20030050263A1 (en) * 1994-07-15 2003-03-13 The University Of Iowa Research Foundation Methods and products for treating HIV infection
US6160109A (en) 1995-10-20 2000-12-12 Isis Pharmaceuticals, Inc. Preparation of phosphorothioate and boranophosphate oligomers
EP0855184A1 (en) * 1997-01-23 1998-07-29 Grayson B. Dr. Lipford Pharmaceutical composition comprising a polynucleotide and an antigen especially for vaccination
AU738513B2 (en) * 1997-02-28 2001-09-20 University Of Iowa Research Foundation, The Use of nucleic acids containing unmethylated CpG dinucleotide in the treatment of LPS-associated disorders
US6406705B1 (en) * 1997-03-10 2002-06-18 University Of Iowa Research Foundation Use of nucleic acids containing unmethylated CpG dinucleotide as an adjuvant
US6426334B1 (en) 1997-04-30 2002-07-30 Hybridon, Inc. Oligonucleotide mediated specific cytokine induction and reduction of tumor growth in a mammal
WO1998052581A1 (en) * 1997-05-20 1998-11-26 Ottawa Civic Hospital Loeb Research Institute Vectors and methods for immunization or therapeutic protocols
US6589940B1 (en) 1997-06-06 2003-07-08 Dynavax Technologies Corporation Immunostimulatory oligonucleotides, compositions thereof and methods of use thereof
US20040006034A1 (en) * 1998-06-05 2004-01-08 Eyal Raz Immunostimulatory oligonucleotides, compositions thereof and methods of use thereof
WO1999001154A1 (en) * 1997-07-03 1999-01-14 University Of Iowa Research Foundation Method for inhibiting immunostimulatory dna associated responses
EP1009413B1 (en) 1997-09-05 2007-02-14 The Regents Of The University Of California Use of immunostimulatory oligonucleotides for preventing or treating asthma
JP2002510644A (ja) 1998-04-03 2002-04-09 ユニバーシティ オブ アイオワ リサーチ ファウンデーション 免疫治療用オリゴヌクレオチドおよびサイトカインを用いる免疫系刺激のための方法および産物
EP1077708A1 (en) 1998-05-06 2001-02-28 University Of Iowa Research Foundation Methods for the prevention and treatment of parasitic infections and related diseases using cpg oligonucleotides
CA2328406A1 (en) 1998-05-14 1999-11-18 Hermann Wagner Methods for regulating hematopoiesis using cpg-oligonucleotides
IL139813A0 (en) 1998-05-22 2002-02-10 Loeb Health Res Inst At The Ot Methods and products for inducing mucosal immunity
WO2000006588A1 (en) 1998-07-27 2000-02-10 University Of Iowa Research Foundation STEREOISOMERS OF CpG OLIGONUCLEOTIDES AND RELATED METHODS
WO2000014217A2 (en) 1998-09-03 2000-03-16 Coley Pharmaceutical Gmbh G-motif oligonucleotides and uses thereof
US6207819B1 (en) * 1999-02-12 2001-03-27 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compounds, processes and intermediates for synthesis of mixed backbone oligomeric compounds
FR2790955B1 (fr) * 1999-03-19 2003-01-17 Assist Publ Hopitaux De Paris Utilisation d'oligonucleotides stabilises comme principe actif antitumoral
US6977245B2 (en) * 1999-04-12 2005-12-20 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Oligodeoxynucleotide and its use to induce an immune response
DE60013591T2 (de) 1999-04-29 2005-02-03 Coley Pharmaceutical Gmbh Screening nach modulatoren der funktion von immunstimulatorischer dna
WO2000067787A2 (en) 1999-05-06 2000-11-16 The Immune Response Corporation Hiv immunogenic compositions and methods
EP1377554A1 (en) 1999-06-16 2004-01-07 University Of Iowa Research Foundation Antagonism of immunostimulatory cpg-oligonucleotides by 4-aminoquinolines and other weak bases
US6514948B1 (en) * 1999-07-02 2003-02-04 The Regents Of The University Of California Method for enhancing an immune response
TR200200797T2 (tr) * 1999-09-25 2002-10-21 University Of Iowa Research Foundation İmmünostimülatör nükleik asitler
US6949520B1 (en) * 1999-09-27 2005-09-27 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Methods related to immunostimulatory nucleic acid-induced interferon
DE60131430T2 (de) * 2000-01-14 2008-10-16 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Oligodeoxynukleotide und ihre verwendung zur induktion einer immunreaktion
WO2001095935A1 (en) 2000-01-20 2001-12-20 Ottawa Health Research Institute Immunostimulatory nucleic acids for inducing a th2 immune response
AU783687B2 (en) 2000-01-26 2005-11-24 Idera Pharmaceuticals, Inc. Modulation of oligonucleotide CpG-mediated immune stimulation by positional modification of nucleosides
US7585847B2 (en) 2000-02-03 2009-09-08 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Immunostimulatory nucleic acids for the treatment of asthma and allergy
US20020156033A1 (en) 2000-03-03 2002-10-24 Bratzler Robert L. Immunostimulatory nucleic acids and cancer medicament combination therapy for the treatment of cancer
US20040131628A1 (en) 2000-03-08 2004-07-08 Bratzler Robert L. Nucleic acids for the treatment of disorders associated with microorganisms
WO2001097843A2 (en) * 2000-06-22 2001-12-27 University Of Iowa Research Foundation Methods for enhancing antibody-induced cell lysis and treating cancer
US20020165178A1 (en) 2000-06-28 2002-11-07 Christian Schetter Immunostimulatory nucleic acids for the treatment of anemia, thrombocytopenia, and neutropenia
US20020198165A1 (en) 2000-08-01 2002-12-26 Bratzler Robert L. Nucleic acids for the prevention and treatment of gastric ulcers
US20020091097A1 (en) * 2000-09-07 2002-07-11 Bratzler Robert L. Nucleic acids for the prevention and treatment of sexually transmitted diseases
CA2419894A1 (en) * 2000-09-15 2002-03-21 Coley Pharmaceutical Gmbh Process for high throughput screening of cpg-based immuno-agonist/antagonist
JP2004509970A (ja) 2000-09-26 2004-04-02 ハイブリドン・インコーポレイテッド 位置的化学変化による免疫刺激オリゴヌクレオチドアナログの免疫刺激活性の調節
AU2001297693A1 (en) 2000-12-08 2002-09-12 Coley Pharmaceutical Gmbh Cpg-like nucleic acids and methods of use thereof
US20030055014A1 (en) * 2000-12-14 2003-03-20 Bratzler Robert L. Inhibition of angiogenesis by nucleic acids
AU2002231336B2 (en) * 2000-12-27 2007-06-28 Surefire Medical, Inc. D/B/A Trisalus Life Sciences Immunomodulatory polynucleotides and methods of using the same
US20030050268A1 (en) 2001-03-29 2003-03-13 Krieg Arthur M. Immunostimulatory nucleic acid for treatment of non-allergic inflammatory diseases
US7105495B2 (en) 2001-04-30 2006-09-12 Idera Pharmaceuticals, Inc. Modulation of oligonucleotide CpG-mediated immune stimulation by positional modification of nucleosides
US20030129605A1 (en) 2001-05-04 2003-07-10 Dong Yu Immunostimulatory activity of CpG oligonucleotides containing non-ionic methylphosophonate linkages
US8114418B2 (en) 2001-06-21 2012-02-14 Dynavax Technologies Corporation Chimeric immunomodulatory compounds and methods of using the same—IV
US20040132677A1 (en) 2001-06-21 2004-07-08 Fearon Karen L. Chimeric immunomodulatory compounds and methods of using the same-IV
US20030003970A1 (en) * 2001-06-28 2003-01-02 Alan Johnson Portable communications device
WO2003012061A2 (en) 2001-08-01 2003-02-13 Coley Pharmaceutical Gmbh Methods and compositions relating to plasmacytoid dendritic cells
CN1604795B (zh) 2001-08-17 2010-05-26 科勒制药股份公司 具有提高的活性的组合基序免疫刺激寡肽
WO2003031573A2 (en) 2001-10-05 2003-04-17 Coley Pharmaceutical Gmbh Toll-like receptor 3 signaling agonists and antagonists
US20030139364A1 (en) 2001-10-12 2003-07-24 University Of Iowa Research Foundation Methods and products for enhancing immune responses using imidazoquinoline compounds
WO2003035836A2 (en) * 2001-10-24 2003-05-01 Hybridon Inc. Modulation of immunostimulatory properties of oligonucleotide-based compounds by optimal presentation of 5' ends
US7276489B2 (en) * 2002-10-24 2007-10-02 Idera Pharmaceuticals, Inc. Modulation of immunostimulatory properties of oligonucleotide-based compounds by optimal presentation of 5′ ends
JP4000251B2 (ja) * 2001-10-31 2007-10-31 富士通株式会社 光信号交換装置およびその制御方法
AU2002366710A1 (en) * 2001-12-20 2003-07-09 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of USE OF CpG OLIGODEOXYNUCLEOTIDES TO INDUCE ANGIOGENESIS
US20030232443A1 (en) 2002-06-18 2003-12-18 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense modulation of centromere protein B expression
AU2003230806B2 (en) 2002-04-04 2009-05-07 Zoetis Belgium S.A. Immunostimulatory G,U-containing oligoribonucleotides
MXPA04010415A (es) * 2002-04-22 2005-02-17 Bioniche Life Sciences Inc Composiciones oligonucleotdias y su uso para la modulacion de respuestas inmunes.
AU2003243409A1 (en) * 2002-06-05 2003-12-22 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Method for treating autoimmune or inflammatory diseases with combinations of inhibitory oligonucleotides and small molecule antagonists of immunostimulatory cpg nucleic acids
JP2005532067A (ja) 2002-07-03 2005-10-27 コーリー ファーマシューティカル グループ，インコーポレイテッド 刺激性免疫応答用の核酸組成物
US20040053880A1 (en) * 2002-07-03 2004-03-18 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Nucleic acid compositions for stimulating immune responses
US7576066B2 (en) * 2002-07-03 2009-08-18 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Nucleic acid compositions for stimulating immune responses
US7605138B2 (en) 2002-07-03 2009-10-20 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Nucleic acid compositions for stimulating immune responses
US7807803B2 (en) 2002-07-03 2010-10-05 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Nucleic acid compositions for stimulating immune responses
US7569553B2 (en) * 2002-07-03 2009-08-04 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Nucleic acid compositions for stimulating immune responses
WO2004007743A2 (en) 2002-07-17 2004-01-22 Coley Pharmaceutical Gmbh Use of cpg nucleic acids in prion-disease
AU2003263963A1 (en) * 2002-08-01 2004-02-23 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Method of treating inflammatory arthropathies with suppressors of cpg oligonucleotides
AR040996A1 (es) * 2002-08-19 2005-04-27 Coley Pharm Group Inc Acidos nucleicos inmunoestimuladores
AU2003278845A1 (en) 2002-09-19 2004-04-08 Coley Pharmaceutical Gmbh Toll-like receptor 9 (tlr9) from various mammalian species
CN1753687A (zh) * 2002-10-29 2006-03-29 科勒制药集团股份有限公司 Cpg寡核苷酸在治疗丙型肝炎病毒感染中的应用
WO2004053104A2 (en) * 2002-12-11 2004-06-24 Coley Pharmaceutical Group, Inc. 5’ cpg nucleic acids and methods of use
JP2006516099A (ja) 2002-12-23 2006-06-22 ダイナバックス テクノロジーズ コーポレイション 分枝状の免疫調節化合物及び該化合物の使用方法
ES2381309T3 (es) * 2002-12-23 2012-05-25 Dynavax Technologies Corporation Secuencia de oligonucleótidos inmunoestimuladores y métodos para usar los mismos
KR101123489B1 (ko) * 2003-01-16 2012-03-28 이데라 파마슈티칼즈, 인코포레이티드 개질된 면역자극성 디뉴클레오티드를 이용한 올리고뉴클레오티드-기재 화합물의 면역자극 특성의 조절
EP1608403A2 (en) 2003-04-02 2005-12-28 Coley Pharmaceutical Group, Ltd. Immunostimulatory nucleic acid oil-in-water formulations for topical application
WO2004094671A2 (en) 2003-04-22 2004-11-04 Coley Pharmaceutical Gmbh Methods and products for identification and assessment of tlr ligands
CN102604957B (zh) * 2003-06-11 2015-10-07 艾德拉药物股份有限公司 稳定的免疫调节寡核苷酸
EA200600069A1 (ru) 2003-06-20 2006-08-25 Коли Фармасьютикал Гмбх Низкомолекулярные антагонисты toll-подобных рецепторов (tlr)
MXPA06000619A (es) * 2003-07-15 2006-04-11 Hybridon Inc Estimulacion sinergistica del sistema inmune usando oligonucleotidos inmunoestimuladores y/o compuestos inmunomeros en conjunto con citocinas y/o agentes quimioterapeuticos o terapia de radiacion.
AU2004275876B2 (en) * 2003-09-25 2011-03-31 Coley Pharmaceutical Gmbh Nucleic acid-lipophilic conjugates
US20050215501A1 (en) * 2003-10-24 2005-09-29 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Methods and products for enhancing epitope spreading
SG122973A1 (en) 2003-10-30 2006-06-29 Coley Pharm Gmbh C-class oligonucleotide analogs with enhanced immunostimulatory potency
US20050239733A1 (en) 2003-10-31 2005-10-27 Coley Pharmaceutical Gmbh Sequence requirements for inhibitory oligonucleotides
US20050100983A1 (en) * 2003-11-06 2005-05-12 Coley Pharmaceutical Gmbh Cell-free methods for identifying compounds that affect toll-like receptor 9 (TLR9) signaling
KR101138131B1 (ko) * 2003-12-08 2012-04-23 이데라 파마슈티칼즈, 인코포레이티드 작은 올리고뉴클레오티드-기초 화합물에 의한 면역자극특성의 조절
US20050256073A1 (en) 2004-02-19 2005-11-17 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Immunostimulatory viral RNA oligonucleotides
US7668561B2 (en) * 2004-02-27 2010-02-23 Qualcomm Incorporated Apparatus and method for controlling reverse link interference among access terminals in wireless communications
AU2005222909B2 (en) 2004-03-12 2010-03-11 Idera Pharmaceuticals, Inc. Enhanced activity of HIV vaccine using a second generation immunomodulatory oligonucleotide
US20060019916A1 (en) * 2004-04-02 2006-01-26 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Immunostimulatory nucleic acids for inducing IL-10 responses
CA2567789A1 (en) * 2004-06-08 2006-08-03 Coley Pharmaceutical Gmbh Abasic oligonucleotide as carrier platform for antigen and immunostimulatory agonist and antagonist
NZ552522A (en) * 2004-06-15 2009-04-30 Idera Pharmaceuticals Inc Immunostimulatory oligonucleotide multimers
EP1776105A2 (en) * 2004-07-18 2007-04-25 Coley Pharmaceutical Group, Ltd Methods and compositions for inducing innate immune responses
KR100958505B1 (ko) * 2004-07-18 2010-05-17 씨에스엘 리미티드 면역자극 복합체 및 향상된 인터페론-감마 반응을 유도하기위한 올리고뉴클레오티드 제제
MY159370A (en) * 2004-10-20 2016-12-30 Coley Pharm Group Inc Semi-soft-class immunostimulatory oligonucleotides
CA2594810C (en) * 2005-01-12 2013-05-21 Amcol International Corporation Detersive compositions containing hydrophobic benefit agents pre-emulsified using colloidal cationic particles
CN101160401A (zh) * 2005-02-24 2008-04-09 科勒制药集团公司 免疫刺激寡核苷酸
WO2006110607A2 (en) * 2005-04-08 2006-10-19 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Methods for treating infectious disease exacerbated asthma
US20060241076A1 (en) 2005-04-26 2006-10-26 Coley Pharmaceutical Gmbh Modified oligoribonucleotide analogs with enhanced immunostimulatory activity
US20070093439A1 (en) * 2005-10-25 2007-04-26 Idera Pharmaceuticals, Inc. Short immunomodulatory oligonucleotides
US7662949B2 (en) * 2005-11-25 2010-02-16 Coley Pharmaceutical Gmbh Immunostimulatory oligoribonucleotides
DK1991678T4 (da) * 2006-02-15 2020-10-19 Rechtsanwalt Thomas Beck Sammensætninger og fremgangsmåder til oligonukleotid-formuleringer
US8027888B2 (en) 2006-08-31 2011-09-27 Experian Interactive Innovation Center, Llc Online credit card prescreen systems and methods
WO2008033432A2 (en) 2006-09-12 2008-03-20 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Immune modulation by chemically modified ribonucleosides and oligoribonucleotides
KR101251707B1 (ko) 2006-09-27 2013-04-11 콜리 파마슈티칼 게엠베하 면역 자극 활성이 증강된 소수성 Ｔ 유사체를 함유하는 ＣｐＧ 올리고뉴클레오티드 유사체
CA2664156A1 (en) 2006-09-27 2008-04-03 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Compositions of tlr ligands and antivirals
RU2009115687A (ru) 2006-10-26 2010-11-10 Коли Фармасьютикал Гмбх (De) Олигорибонуклеотиды и их применения
US20090142362A1 (en) * 2006-11-06 2009-06-04 Avant Immunotherapeutics, Inc. Peptide-based vaccine compositions to endogenous cholesteryl ester transfer protein (CETP)
KR20100068422A (ko) * 2007-10-09 2010-06-23 콜리 파마슈티칼 게엠베하 변경된 당 잔기를 함유하는 면역자극성 올리고뉴클레오티드 유사체

Also Published As

Publication number Publication date
RU2393223C2 (ru) 2010-06-27
US7795235B2 (en) 2010-09-14
EP1802757A2 (en) 2007-07-04
JP2008516634A (ja) 2008-05-22
AR051462A1 (es) 2007-01-17
CA2578844A1 (en) 2006-12-21
ZA200703609B (en) 2008-10-29
RU2007118681A (ru) 2008-11-27
CR9131A (es) 2007-10-22
TNSN07150A1 (en) 2008-11-21
MY159370A (en) 2016-12-30
UY29173A1 (es) 2006-05-31
NZ554753A (en) 2010-03-26
CN101084310A (zh) 2007-12-05
WO2006135434A3 (en) 2007-05-10
IL182470A0 (en) 2007-09-20
GT200500294A (es) 2006-04-05
BRPI0516497A (pt) 2008-09-09
PA8650101A1 (es) 2006-08-03
US20060140875A1 (en) 2006-06-29
US20090137519A1 (en) 2009-05-28
US20110201672A1 (en) 2011-08-18
SV2006002279A (es) 2006-07-07
EP1802757B1 (en) 2011-10-05
ATE527355T1 (de) 2011-10-15
ES2375071T3 (es) 2012-02-24
MA29028B1 (fr) 2007-11-01
NO20072526L (no) 2007-07-20
KR20070065392A (ko) 2007-06-22
ZA200803752B (en) 2010-03-31
TW200626720A (en) 2006-08-01
PE20061045A1 (es) 2006-11-07
WO2006135434A2 (en) 2006-12-21
US7566703B2 (en) 2009-07-28
AU2005332970A1 (en) 2006-12-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US7566703B2 (en) Semi-soft C-class immunostimulatory oligonucleotides
EP1991678B1 (en) Compositions and methods for oligonucleotide formulations
EP2290078B1 (en) Immunostimulatory nucleic acids
AU2008309264B2 (en) Immune stimulatory oligonucleotide analogs containing modified sugar moieties
BRPI0717510B1 (pt) análogos de oligonucleotídeo cpg contendo análogos t hidrofóbicos com atividade imunoestimulatória intensificada e composição farmacêutica que os compreende
CN101160401A (zh) 免疫刺激寡核苷酸
ZA200500963B (en) Immunostimulatory nucleic acids
MX2007004782A (en) Semi-soft c-class immunostimulatory oligonucleotides
HK1154903A (en) Immunostimulatory nucleic acids
HK1154903B (en) Immunostimulatory nucleic acids
HK1076226B (en) Immunostimulatory nucleic acids
HK1076226A (en) Immunostimulatory nucleic acids