RS20080174A - Virus psećeg gripa, sa njim povezani preparati i postupci upotrebe - Google Patents

Abstract

Ovaj pronalazak daje izolovani pseći virus gripa, podvrste H3N8, koji sadrži HA koji ima SEQ ID NO: 4, ili sekvenciju aminokiselina koja je više od 99% identična sa SEQ ID NO: 4, uz uslov da su aminokiseline u položajima 94 i 233 identične sa SEQ ID NO: 4; preparat koji sadrži oslabljeni ili inaktivirani virus; izolovane ili prečišćene proteine HA, NM, NP, M1, NS1, Pa, PB1 i PB2 i njihove fragmente, zatim preparate koji sadrže njih ili nukleinske kiseline, opciono kao deo vektora koji kodira iste; i postupak za izazivanje imuno odgovora na virus psećeg gripa u animalnom biću, koji se sastoji od ordiniranja tom animalnom biću gore pomenutog preparata.

Description

VIRUS PSEĆEG GRIPA, SA NJIM POVEZANI

PREPARATI I POSTUPCI UPOTREBE

IOWA STATE UNIVERSITY RESEARCH FOUNDATION, INC., SAD.

Ova patentna prijava štiti prava U.S. Provisional Patent Application No. 60/727,808, podnete 18. oktobra 2005, i U.S. Utility Patent Application No. 11/539,123, podnete 5. oktobra 2006, čije sadržine su ovde u celini uključene ovim citatima.

TEHNIČKA OBLAST PRONALASKA

Ovaj pronalazak se odnosi na polja virusologije, molekularne biologije i imunologije. Određenije, ovaj pronalazak se odnosi na virus psećeg gripa, kao i na sa njim povezane preparate i postupke upotrebe za izazivanje imuno odgovora kod animalnih bića.

OSNOVA PRONALASKA

Virus gripa je virus RNK koji pripada familiji Orthomyxoviridae. Virusna RNK se sastoji od osam nezavisnih segmenata, koji se lako rekombinuju među virusima gripa dajući nove podvrste.

Nukleoprotein (NP), koji je primarna komponenta nukleokapsida, kodiran je u petom segmentu. NP i matrični protein se koriste za klasifikaciju virusa gripa u grupe A, B ili C. Pošto je NP interni protein, on ne podleže selekciji pod pritiskom imuno sistema domaćina. On vezuje RNK u delu kompleksa transkriptaze, i uključen je u transport jezgro-citoplazma virusne RNK (vRNK).

Neuraminidaza (NM), čepa a-keto vezu koja spaja terminalnu sialičnu kiselinu i sledeći šećerni ostatak, dozvoljavajajući na taj način oslobađanje virusnog izdanka inficirane ćelije, kodirana je u šestom segmentu. Identifikovano je devet podvrsta ovog enzima (N1-N9). Sve podvrste imaju dva strukturna regiona - stablo i glavu. Svi N8 proteini imaju 470 aminokiselina, od kojih je prvih osam visoko konzervirano. Sledeći region je bogat hidrofobnim aminokiselinama i smatra se da predstavlja transmembranski domen. Sledeća 51 aminokiselina čini region stabla, a region glave počinje sa Cys91. Poslednji region sadrži katalitičko mesto enzima. Cisteinski ostaci u regionima glave i stabla imaju tendenciju visoke konzerviranosti. Postoje 6-8 predpostavljenih mesta za N-glikozilaciju.

Hemaglutinin (HA), koji je membranski glikoprotein odgovoran za adsorpciju virusa u ćeliju domaćina, je glavni antigen prema kome su usmerena antitela za neutralizaciju. Njegova antigenska varijacija je glavni uzrok epidemije gripa. Njega kodira četvrti segment. Identifikovano je šesnaest različitih podvrsta (H1-H16). HA ima signalni peptid od 16 aminokiselina i dva polipeptida (HA1 i HA2) spojena disulfidnim mostom. HA1 ima na terminalu amino kraj, dok HA2 ima na terminalu karboksilni kraj. Hidrofobni region u HA2 pripaja HA za virusnu membranu. Cisteinski ostaci imaju tendenciju da budu visoko konzervativni. Postoji šest predpostavljenih mesta za glikolizaciju, koja omogućavaju virusu da maskira njegova antigenska mesta (Skehel et al.,PNAS USA,81_, 1779 (1984)).

Drugi proteini su matrični (M ili M1 i M2), nestrukturni (NS ili NS1 i NS2), PA, PB1 i PB2. Protein M1 je glavna komponenta viriona koji se vezuje za plazmu membrane inficirane ćelije, pomoću dva hidrofobna regiona na N-terminalu proteina, dok je M2 jonski kanal, pa stoga predstavlja integralni protein membrane. NS1 protein se nalazi u jezgru i utiče na ćelijski transport RNK, spajanje i translaciju. NS2 protein se nalazi u jezgru i citoplazmi i ima nepoznatu funkciju. PA protein je transkriptaza i može imati aktivnost proteaze, dok PB1 protein funkcioniše u produžavanju transkripcije, a PB2 protein funkcioniše prilikom vezivanja krune transkripcije.

Globalno, grip predstavlja ekonomski najznačajniju respiratornu bolest humanih bića, svinja, konja i živine (VVright et al., "Orthomyxoviruses" u "Fields Virology", uredn. Knipe et al., Lippincott VVilliam et al., VVilkins, Philadelphia, 2001, str. 1533-1579). Virus gripa je poznat po njegovim kontinualnim genetskim i antigenetskim promenama, što usporava efektivnu kontrolu virusa (VVright et al.,

(2001), videti gore; VVebster et al.,Microbiol. Rev.,56, 152-179 (1992)). Posebnu brigu u prevenciji epidemija i pandemija predstavlja pojava nove podvrste ovog virusa, preko genetskog preuređenja ili transmisije unutar same vrste (VVright et al., (2001), videti gore).

Nedavno je došlo do prodora novih vrsta, npr. mačje i pseće, koje istorijski posmatrano nisu imale virus gripa (Keawcharoen et al.,Emerg. Infect. Dis.,10, 2189-2191 (2004); Cravvford et al.,Science,310, 398-485 (21. oktobar 2005; publikovan on-line 29. septembra 2005); Dubovi et al., "Isolation of equine influenza virus from racing greyhounds with fatal hemorrhagic pneumonia", u

Proceedings of the 47th Annual Meeting of American Association of Veterinar/

Laborator/Diagnosticians,Greensbors, NC, oktobar 2005, str. 158; i Yoon et al.,Emerg. Inf. Dis.11( 12). 1974-1976 (decembar 2006). Prema tome, domaći opseg virusa gripa se širi.

Prodor respiratorne bolesti kod trkaćih pasa rase hrt izazvan je infekcijom sa virusom gripa, koja se odigrala na Floridi 2004. godine, i istočnoj i zapadnoj Ajovi u aprilu 1005, i u Teksasu 2005. Ovu bolest karakteriše brzi početak groznice i kašlja, ubrzano disanje i krvarenje kroz nos. Morbiditet je bio skoro 100% na oba trkališta u Ajovi, iako je smrtnost manja od 5%. lako se veliki procenat zaraženih pasa oporavio, mnogi su podlegli hemoragičnoj pneumoniji. Terapeutsko ordiniranje antibiotika širokog spektra je smanjilo ozbiljnost ove bolesti, ali ju nije stavilo pod kontrolu.

U vezi gore rečenog, predmet ovog pronalaska je virus gripa koji inficira pse. Sledeći predmet ovog pronalaska je davanje materijala i postupaka za izazivanje imuno odgovora na virus gripa kod pasa. Ovi i drugi predmeti i prednosti, kao i druge karakteristike ovog pronalaska postaće jasnije iz detaljnog opisa koji se daje u nastavku.

KRATAK PREGLED PRONALASKA

Ovaj pronalazak daje izolovani virus psećeg gripa, podvrste H3N8, koji sadrži HA sa sekvencijom SEQ ID NO: 4, ili sekvencijom aminokiselina koja je više od 99% identična sa SEQ ID NO:4, pod uslovom da su aminokiseline u položajima 94 i 233 identične sa onima iz SEQ ID NO: 4. Određenije, ovaj pronalazak daje izolovani virus psećeg gripa podvrste H3N8, koji je deponovan u American Type Culture Collection (Manassas, VA) 29. juna 2006., pod brojem Patent Deposit No. PTA-7694. Prema tome, ovaj pronalazak daje takođe preparat koji sadrži oslabljen virus, kao i preparat koji sadrži inaktivirani virus.

Ovaj pronalazak daje takođe izolovane ili prečišćene proteine. U jednoj realizaciji ovaj pronalazak daje izolovani ili prečišćeni HA, koji (i) ima sekvenciju aminokiselina SEQ ID NO: 4, ili (ii) je izveden iz virusa gripa, a koji ima sekvenciju aminokiselina koja je više od 99% identična sa SEQ ID NO: 4, pod uslovom da je sekvencija amino kiselina identična sa SEQ ID NO: 4 u položajima aminokiselina 94 i 233, ili fragment (i) ili (ii), pri čemu taj fragment sadrži najmanje devet susednih aminokiselina, a bar jedna od njih je identična sa aminokiselinom u položaju 94 ili 233 SEQ ID NO: 4.

U sledećoj realizaciji ovaj pronalazak daje izolovani ili prečišćeni NM, koji (i) ima sekvenciju aminokiselina SEQ ID NO: 2, ili (ii) je izveden iz virusa gripa, a sadrži sekvenciju aminokiselina koja je više od 99% identična sa SEQ ID NO: 2, uz uslov da je ta sekvencija aminokiselina identična sa SEQ ID NO: 2 u položajima aminokiselina 68 i 134, ili fragment (i) ili (ii), pri čemu taj fragment sadrži najmanje devet susednih aminokiselina, od kojih je bar jedna identična sa aminokiselinom u položaju 68 ili 134 iz SEQ ID NO: 2.

U još jednoj realizaciji ovaj pronalazak daje izolovani ili prečišćeni NP, koji (i) ima sekvenciju aminokiselina SEQ ID NO: 6, ili (ii) je izveden iz virusa gripa, a ima sekvenciju aminokiselina koja je više od 99% identična sa SEQ ID NO: 6, uz uslov da je ta sekvencija aminokiselina identična sa SEQ ID NO: 6 u položaju aminokiselina 402, ili fragment (i) ili (ii), pri čemu taj fragment sadrži najmanje devet susednih aminokiselina, od kojih je bar jedna identična sa aminokiselinom u položaju 402 iz SEQ ID NO: 6.

U još jednoj realizaciji ovaj pronalazak daje izolovani ili prečišćeni M1, koji (i) ima sekvenciju aminokiselina SEQ ID NO: 8, ili (ii) je izveden iz virusa gripa, a ima sekvenciju aminokiselina koja je više od 99% identična sa SEQ ID NO: 8, uz uslov da je ta sekvencija aminokiselina identična sa SEQ ID NO: 8 u položaju aminokiselina 111, ili fragment (i) ili (ii), pri čemu taj fragment sadrži najmanje devet susednih aminokiselina, od kojih je bar jedna identična sa aminokiselinom u položaju 111 iz SEQ ID NO: 8.

Takođe, daje se izolovani ili prečišćeni NS1 koji ima sekvenciju aminokiselina SEQ ID NO: 10.

Dalje, daje se izolovani ili prečišćeni PA protein, koji (i) ima sekvenciju aminokiselina SEQ ID NO: 12, ili (ii) je izveden iz virusa gripa, a ima sekvenciju aminokiselina koja je više od 98% (ili 99%) identična sa SEQ ID NO: 12, uz uslov da je ta sekvencija aminokiselina identična sa SEQ ID NO: 12 u položajima aminokiselina 233, 256, 327 i 561, ili fragment (i) ili (ii), pri čemu taj fragment sadrži najmanje devet susednih aminokiselina, od kojih je bar jedna identična sa aminokiselinom u položaju 233, 256, 327 i 561 iz SEQ ID NO: 12.

Još se daje izolovani ili prečišćeni PB1, koji (i) ima sekvenciju aminokiselina SEQ ID NO: 14, ili (ii) je izveden iz virusa gripa, a ima sekvenciju aminokiselina koja je više od 99% identična sa SEQ ID NO: 14, uz uslov da je ta sekvencija aminokiselina identična sa SEQ ID NO: 14 u položajima aminokiselina 200 i 213, ili fragment (i) ili (ii), pri čemu taj fragment sadrži najmanje devet susednih aminokiselina, od kojih je bar jedna identična sa aminokiselinom u položajima 200i213izSEQIDNO: 14.

Još se daje izolovani ili prečišćeni PB2, koji (i) ima sekvenciju aminokiselina SEQ ID NO: 16, ili (ii) je izveden iz virusa gripa, a ima sekvenciju aminokiselina koja je više od 99% identična sa SEQ ID NO: 16, uz uslov da je ta sekvencija aminokiselina identična sa SEQ ID NO: 16 u položajima aminokiselina 107, 221, 292 i 661, ili fragment (i) ili (ii), pri čemu taj fragment sadrži najmanje devet susednih aminokiselina, od kojih je bar jedna identična sa aminokiselinom u položajima 107, 221, 292 i 661 iz SEQ ID NO: 16.

U smislu gore rečenog, ovaj pronalazak daje još preparat koji sadrži gore-pomenuti protein, kao što je HA ili NM, ili njegov fragment, u količini dovoljnoj da izazove imuno odgovor u animalnom biću, i biološki prihvatljiv nosač.

Daje se takođe izolovana ili prečišćena nukleinska kiselina koja kodira gore-pomenuti protein ili njegov frgament, opciono kao deo vektora, kao što je preparat koji sadrži izolovanu ili prečišćenu nukleinsku kiselinu, koja ekspresira taj protein, kao što je HA ili NM, ili njihov fragment, u količini dovoljnoj da izazove imuno odgovor u animalnom biću, i biološki prihvatljiv nosač.

U skladu sa tim, ovaj pronalazak daje takođe i drugi postupak za izazivanje imuno odgovora na virus psećeg gripa u animalnom biću. Ovaj postupak podrazumeva ordiniranje tom animalnom biću ovog preparata koji sadrži nukleinsku kiselinu.

KRATAK OPIS SLIKA

Slika 1 je delimična sekvencija nukleotida (SEQ ID NO: 1; videti takođe GenBank Acc. No. DQ146420) kodirajućeg domena sekvencije (CDS) NM gena iz podvrste H3N8 virusa psećeg gripa. U skladu sa konvencijom, ova sekvencija je predstavljena sa leva na desno i od vrha ka dnu.

Slika 2 je sekvencia aminokiselina (SEQ ID NO: 2; videti takođe GenBank Acc. No. DO146420) koju kodira SEQ ID NO: 1. U skladu sa konvencijom ova sekvencija je predstavljena u formatu jednog slova, s leva na desno i od vrha ka dnu.

Slika 3 je kompletna sekvencija nukleotida CDS (SEQ ID NO: 3; videti takođe GenBank Acc. No. D0.146419) gena HA iz podvrste virusa psećeg gripa H3N8.

Slika 4 je sekvencija aminokiselina CDS (SEQ ID NO: 4; videti takođe GenBank Acc. No. D0146419) koju kodira SEQ ID NO: 3.

Slika 5 je kompletna sekvencija nukleotida CDS (SEQ ID NO: 5) gena NP iz podvrste virusa psećeg gripa H3N8.

Slika 6 je izvedena sekvencija aminokiselina (SEQ ID NO: 6) koju kodira SEQ ID NO: 5.

Slika 7 je kompletna sekvencija nukleotida CDS (SEQ ID NO: 7) proteina M1 gena iz podvrste virusa psećeg gripa H3N8.

Slika 8 je izvedena sekvencija aminokiselina (SEQ ID NO: 8) koju kodira SEQ ID NO: 7.

Slika 9 je kompletna sekvencija nukleotida CDS (SEQ ID NO: 9) proteina NS1 gena iz podvrste virusa psećeg gripa H3N8.

Slika 10 je izvedena sekvencija aminokiselina (SEQ ID NO: 10) koju kodira SEQ ID NO: 9.

Slika 11 je kompletna sekvencija nukleotida CDS (SEQ ID NO: 11) proteina PA gena iz podvrste virusa psećeg gripa H3N8.

Slika 12 je izvedena sekvencija aminokiselina (SEQ ID NO: 12) koju kodira SEQ ID N011.

Slika 13 je kompletna sekvencija nukleotida CDS (SEQ ID NO: 13) proteina PB1 gena iz podvrste virusa psećeg gripa H3N8.

Slika 14 je izvedena sekvencija aminokiselina (SEQ ID NO: 14) koju kodira SEQ ID NO: 13.

Slika 15 je kompletna sekvencija nukleotida CDS (SEQ ID NO: 15) proteina PB2 gena iz podvrste virusa psećeg gripa H3N8.

Slika 16 je izvedena sekvencija aminokiselina (SEQ ID NO: 16) koju kodira SEQ ID NO: 15.

DETALJAN OPIS PRONALASKA

Ovaj pronalazak je zasnovan na otkriću soja virusa psećeg gripa. Ovaj soj je izolovan iz trkaćih hrtova u istočnoj i zapadnoj Ajovi. Ovaj soj je klasifikovan kao podvrsta H3N8, a označen je kao A/canine/lowa/13628/2005. Prema tome, ovaj pronalazak daje virus koji sadrži HA koji ima SEQ ID NO: 4 ili sekvenciju aminokiselina koja je više od 99% identična sa SEQ ID NO: 4, uz uslov da su aminokiseline u položajima 94 i 233 identične onima iz SEQ ID NO: 4. Dalje, ovaj virus može da sadrži NM, koji ima sekvenciju aminokiselina SEQ ID NO: 2 ili sekvenciju aminokiselina koja je više od 99% identična sa SEQ ID NO: 2, uz uslov da su aminokiseline u položajima 68 i 134 identične onima iz SEQ ID NO: 2. Virus koji sadrži gore pomenuti HA, sam ili u dodatnoj kombinaciji sa gore pomenutim NM, može da sadrži još najmanje jedan od sledećih: NP, koji ima sekvenciju aminokiselina SEQ ID NO:6, ili sekvenciju aminokiselina koja je više od 99% identična sa SEQ ID NO: 6, uz uslov da je aminokiselina 402 identična onoj iz SEQ ID NO: 6; M1, koji ima sekvenciju aminokiselina SEQ ID NO:8, ili sekvenciju aminokiselina koja je više od 99% identična sa SEQ ID NO: 8, uz uslov da je aminokiselina 111 identična onoj iz SEQ ID NO: 8; NS1, koji ima sekvenciju aminokiselina SEQ ID NO:10; PA protein, koji ima sekvenciju aminokiselina SEQ ID NO:12, ili sekvenciju aminokiselina koja je više od 98%

(99%) identična sa SEQ ID NO:12, uz uslov da su aminokiseline 233,256, 327 i 561 identične onima iz SEQ ID NO:12; PB1, koji ima sekvenciju aminokiselina SEQ ID NO:14, ili sekvenciju aminokiselina koja je više od 99% identična sa SEQ ID NO:14, uz uslov da su aminokiseline 200 i 213 identične onima iz SEQ ID NO:14; i/ili PB2, koji ima sekvenciju aminokiselina SEQ ID NO:16, ili sekvenciju aminokiselina koja je više od 99% identična sa SEQ ID NO:16, uz uslov da su aminokiseline 107, 221, 292 i 661 identične onima iz SEQ ID NO:16. Određenije, ovaj pronalazak daje izolovani virus psećeg gripa podvrste H3N8, koji je deponovan u American Type Culture Collection, 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209, U.S.A., 29. juna 2006 , kao Patent Deposit No. PTA-7694.

Virus gripa se može istaložiti podvrgavanjem virusa vodenoj sredini u jednom ili više koraka solubilizacije, do kojih dolazi u prisustvu do 5 mas% polietilenglikola (PEG) sa molarnom masom između 3.000 i 20.000, ili drugog linearnog vlaknastog nenaelektrisanog polimera, u količini ekvivalentnoj moći solubilizacije PEG, odvajanjem nerastvorene frakcije od rastvorne frakcije, pa regenerisanjem virusa iz jedne od ovih frakcija (videti, npr., U.S. Patent No. 3,989,818). Poželjno je da temperatura ne prelazi 35°C, da je pH između 6 i 9, a jonska jačina vodene sredine ispod tačke isoljavanja virusa. Koncentracija virusa u vodenoj sredini, pre insolubilizacije, odgovara titru hemaglutinacije od bar 1 u 32. Dobiju se agregati virusnih čestica, za koje se veruje da pružaju bolji antigenski efekat usled sporog oslobađanja virusnih česica posle vakcinacije. Međutim, ako se žele ne-agregatirane ili manje agregatirane čestice, one se mogu disocirati upotrebom bilo kog pogodnog postupka, kao što je sonikacija.

Virus se može oslabiti ubacivanjem u sistem ćelije sve dok virus ne izgubi njegovu sposobnost da izaziva bolest, ali zadržavajući poptuno njegov imunogeni karakter. Na primer, virus se može serijski propuštati kroz kulturu ćelija koje potiču iz psećih vrsta ili drugih pogodnih vrsta, na temperaturi oko 37°C. Pri ovom propuštanju, virus se sakuplja iz jedne kulture, pa inokulira u medijum koji sadrži svežu kulturu ćelija, u skladu sa postupcima koji su poznati u stanju tehnike. Na primer, virus se može sakupiti iz fluida ćelijske kulture tkiva i/ili ćelija. Opciono, tokom sakupljanja, kultura ćelija može biti sonifikovana da se poboljša oslobađanje virusa. Videti, npr. U.S. Patent No. 5,698,433 i 6,455,298.

Ukoliko se želi, soj gripa se može ubaciti najmanje jedanput u alantoičku šupljinu embriona jaja, kao što su kokošja jaja, u prisustvu seruma, kako bi se dobio virus rezistentan prema serumu (videti npr., U.S. Patent No. 3,953,592; Kilbourne et al.,J. Exp. Med.Hl, 387 (1960); Kilbourne,Science,160, 74-75 (april 1968) i Laver et al.,Virology,30, 493-501 (1966)). Veoma snažna vakcina gripa, sa niskom pirogenošću i niskom endotoksičnošću, može se dobiti tretiranjem koncentrovanog alantoičkog fluida, koji sadrži oslabljeni virus, redom, sa butilacetatom i etilacetatom, pa zatim brzim uparavanjem (videti, npr., U.S. Patent No. 4,000,257). Ovakav virus se može ordinirati intranazalno, kao vakcina.

Kada se inokulira u domaćina, virus se razmnožava do neke mere, tako da je potreban mali početni inokulum. Virus mora biti inokulozan, a inficiranje sa osetljivim kontaktima treba da se drži na minimumu.

Alternativno, virus može da se inaktivira ukidanjem replikacije i virulencije. Ovo se može obaviti hemijskim i fizičkim sredstvima. Hemijska inaktivacija se može ostvariti tretmanom virusa sa enzimom, formaldehidom, p-propiolaktonom ili njegovim derivatom, etileniminom ili njegovim derivatom, organskim rastvaračem (npr. halogenovani ugljovodonik) i/ili deterdžentom (npr. Tween<®>, Triton X<®>, natrijum-dezoksiholat, sulfobetain ili cetiltrimetilamonijumove soli). Ako je potrebno, hemijski aktivirani preparati se mogu neutralisati. Na primer, ako se koristi formaldehid za deaktiviranje preparata, ovaj preparat se može neutralisati sa tiosulfatom. Ako je potrebno, vrednost pH se zatim može vratiti na vrednosti oko 7. Alternativno, virus se može ekstrahovati smešom etra i etanola, razdvojiti vodena i organska faza, a zaostali etar se uklanja iz virusne suspenzije pod sniženim pritiskom (videti, npr. U.S. Patent No. 4,431,633). Pogodno je da se fizička inaktivacija obavlja podvrgavanjem virusa energetski bogatom zračenju, kao što je ultravioletno svetio, y-zračenje ili X-zraci. Inaktivirani oblici zahtevaju relativno visoku količinu inokuluma, pa stoga i odgovarajuće veću količinu antigenskog materijala, što treba proizvesti, testirati i distribuirati.

U vezi sa gore rečenim, ovaj pronalazak takođe daje preparat koji sadrži oslabljen ili inaktivirani virus. Ovaj virus treba da je prisutan u količini dovoljnoj da izazove imuno odgovor, a poželjno i da pruži zaštitu nakon izlaganja. Obično, preparatu se dodaje adjuvant, kao što je Tvveen<®>, Špan<®>'Freund-ov kompletni adjuvant, saponin,Con/ nebacterium parvum(Coparvax<®>), aluminijum-fosfat, aluminijum-hidroksid ili njihove smeše, naročito ukoliko preparat sadrži inaktivirani virus. Za stabilizaciju preparata mogu se dodati hidrolizati proteina i/ili aminokiselina (videti, npr ,U.S. Patent No., 4,537,769). Alternativno, preparat se može formulisati kao emulzija ulja u vodi, korsteći ulje, kao što je Marcol i/ili Arlacel.

Mogu se takođe dobiti rekombinantni sojevi gripa, kao što je iz kombinacije "prekomerno oslabljenog" (tj. broj propuštanja zbog slabljenja je znatno veći nego što se normalno zahteva za uklanjanje patogentosti) polaznog soja gripa A, npr. A2, sa virulentnim slojem gripa, koji se ovde daje (videti, npr., U.S. Patent No., 3,991,179; takođe videti U.S. Patent No., 4,009,258; 4,278,662; 4,318,903; 4,338,296 i 4,693,893). Poželjno je da rekombinantni soj ima karakteristike rasta prekomerno oslabljenog soja, kuplovano sa antigenskim svojstvima, npr., proteini HA i NM iz virulentnog soja. Selekcija sojeva virusa gripa za formulaciju vakcine je opisana u U.S. Patent No. 5,162,112. Rekombinantni sojevi se mogu formulisati kao preparati za indukovanje imuno odgovora.

Za stabilizaciju virusa gripa u preparatu, koji se čuva u frižideru, mogu se koristiti saharoza, arginin monohidrohlorid, mononatrijum-monohidrat glutaminske kiseline i hidrolizati želatina. Videti, npr. U.S. Pat. App. Pub. No. 2006/0110406.

U vezi sa gore pomenutim, ovaj pronalazak takođe daje izolovan ili prečišćen HA. Daje se takođe takav HA koji ili ima sekvenciju aminokiselina SEQ ID NO: 4, ili se izvodi iz virusa gripa i ima sekvenciju aminokiselina koja je više od 99% identična sa SEQ ID NO: 4, uz uslov da je ta sekvencija aminokiselina identična sa SEQ ID NO. 4 aminokiselinama u položajima 94 i 233. Fragment HA koji sadrži najmanje devet (kao što je 9, 12, 15, 18, 21 ili 24) susednih aminokiselina, od kojih je bar jedna identična sa aminokiselinom u položaju 94 ili 233 iz SEQ ID NO: 4.

Daje se takođe izolovani ili prečišćeni NM. Daje se takođe ovaj NM koji ima sekvenciju aminokiselina SEQ ID NO: 2, ili se izvodi iz virusa gripa i ima sekvenciju aminokiselina koja je više od 99% identična sa SEQ ID NO: 2, uz uslov da je ta sekvencija aminokiselina identična sa SEQ ID NO. 2 po aminokiselinama u položajima 68 i 134. Fragment NM koji sadrži najmanje devet susednih aminokiselina, od kojih je bar jedna identična sa aminokiselinom u položaju 68 ili 134 iz SEQ ID NO: 2.

Dalje, daje se takođe izolovani ili prečišćeni NP. Daje se takođe ovaj NP koji ima sekvenciju aminokiselina SEQ ID NO: 6, ili se izvodi iz virusa gripa i ima sekvenciju aminokiselina koja je više od 99% identična sa SEQ ID NO: 6, uz uslov da je ta sekvencija aminokiselina identična sa SEQ ID NO. 6 po aminokiselini u položaju 402. Fragment NP koji sadrži najmanje devet susednih aminokiselina, od kojih je bar jedna identična sa aminokiselinom u položaju 402 iz SEQ ID NO: 6.

Dalje, daje se još izolovani ili prečišćeni M1. Daje se takođe ovaj M1 koji ima sekvenciju aminokiselina SEQ ID NO: 8, ili se izvodi iz virusa gripa i ima sekvenciju aminokiselina koja je više od 99% identična sa SEQ ID NO: 8, uz uslov da je ta sekvencija aminokiselina identična sa SEQ ID NO. 8 po aminokiselini u položaju 111. Fragment M1 koji sadrži najmanje devet susednih aminokiselina, od kojih je bar jedna identična sa aminokiselinom u položaju 111 iz SEQ ID NO: 8.

Daje se još i izolovani ili prečišćeni NS1, koji ima sekvenciju aminokiselina SEQ ID NO: 10.

Daje se izolovani ili prečišćeni PA protein. Daje se takođe onaj PA koji ima sekvenciju aminokiselina SEQ ID NO: 12, ili se izvodi iz virusa gripa i ima sekvenciju aminokiselina koja je više od 98% (ili 99%) identična sa SEQ ID NO: 12, uz uslov da je ta sekvencija aminokiselina identična sa SEQ ID NO. 12 po aminokiselinama u položajima 233, 256, 327 i 561. Fragment PA koji sadrži najmanje devet susednih aminokiselina, od kojih je bar jedna identična sa aminokiselinom u položaju 233, 256, 327 i 561 iz SEQ ID NO: 12.

Daje se izolovani ili prečišćeni PB1. Daje se takođe onaj PB1 koji ima sekvenciju aminokiselina SEQ ID NO: 14, ili se izvodi iz virusa gripa i ima sekvenciju aminokiselina koja je više od 99% identična sa SEQ ID NO: 14, uz uslov da je ta sekvencija aminokiselina identična sa SEQ ID NO. 14 po aminokiselinama u položajima 200 i 213. Fragment PB1 koji sadrži najmanje devet susednih aminokiselina, od kojih je bar jedna identična sa aminokiselinom u položaju 200 i 213izSEQ ID NO: 14.

Daje se izolovani ili prečišćeni PB2. Daje se takođe onaj PB2 koji ima sekvenciju aminokiselina SEQ ID NO: 16, ili se izvodi iz virusa gripa i ima sekvenciju aminokiselina koja je više od 99% identična sa SEQ ID NO: 16, uz uslov da je ta sekvencija aminokiselina identična sa SEQ ID NO. 16 po aminokiselinama u položajima 107, 221, 292 i 661. Fragment PB2 koji sadrži najmanje devet susednih aminokiselina, od kojih je bar jedna identična sa aminokiselinom u položaju 107, 221, 292 i 661 iz SEQ ID NO: 16.

Gornji proteini i njihovi fragmenti se mogu prečistiti (kuplovati sa hemijskim ili fizičkim fragmentacijama za generisanje fragmenata) ili sintetizovati u skladu sa postupcima koji su poznati u stanju tehnike. Videti, npr. Meienhofer, "Hormonal Proteins and Peptides" 2:46, Academic Press, NY (1965), za sintezu proteina u fazi rastvora. Mogu se koristiti automatizovani sistemi za obavljanje ovih tehnika, u skladu sa instrukcijama proizvođača. Terapeutske količine se mogu rekombinantno proizvesti i prečistiti.

Alternativno, proteini, a naročito HA i NM, se mogu izolovati selektivnom solubilizacijom, uz ostavljanje rezidualnih subvirusnih čestica, koje se sastoje od nedirnute membrane lipid/protein, koja okružuje sve druge nebitne virusne komponente. Razlika u veličini/gustini solubilizovanih proteina i rezidualnih subvirusnih čestica, dozvoljava obavljanje separacije zasnovane na razlikama u fizičkohemijskim svojstvima, pomoću centrifugiranja i frakcionacije sa gradijentom, sedimentacije, hromatografije na molekulskim sitima ili peletiranjem u ultracentrifugi. Selektivna solubilizacija HA i NM se može postići tretmanom virusa sa katjonskim deterdžentom (videti, npr., U.S. Patent No. 4,140,762; u nastavku "patent 762"). Fluid koji sadrži celokupni virus, dobijen iz kulture ćelije, može se tretirati sa enzimom za digestiju DNK, posle čega sledi dodavanje katjonskog deterdženta i izolovanje proteina površinskih antigena (videti, npr. U.S. Patent No. 5,948,410). Ovaj fluid se može podvrgnuti nekolikim koracima ultracentrifugiranja, ili se virus može fragmentirati u prisustvu amfifilnog nejonskog deterdženta, posle čega sledi filtriranje da se uklone nepoželjne supstance (videti, npr. U.S. Patent No., 6,048,537). Alternativno, membransko filtriranje i hemijsko cepanje mogu da se upotrebe za dobijanje virusnog proteina (videti, npr. U.S. Paten No. 4,327,182). Druge procedure su opisane u U.S. Patent No. 4,064,232 i 4,057,626. Poželjno je da se virus umnoži pre tretmana, koji je kao primer dat u "patentu 762" (red.2, 11. 10 i dalje).

Može se obaviti mapiranje da se identifikuje epitop koji indukuje imuno odgovor virusnog proteina, tj. "mapiranje epitopa". Ovo mapiranje obuhvata fragmentaciju proteina u peptide koji se preklapaju (kao što su peptidi koji sadrže 9, 12, 15, 18, 21 ili 24 aminokiseline). Protein se može fragmentirati sa proteolitiskim enzimom. Zatim se testiraju proteini pojedinačno, u pogledu njihovog svojstva da vezuju antitelo izvučeno iz prirodnog proteina, ili da indukuju aktivaciju T-ćelije ili B-ćelije. Alternativno, mogu se odabrati hidrofilni regioni proteina, zato što su hidrofilni ostaci često na površini proteina, pa su stoga dostupni antitelu. Može se takođe obaviti kristalografska analiza X-zracima kompleksa antigen-antitelo. Potencijalni vezivni motivi za pripajanje HLA, koji su sekvencije peptida, za koje se zna da verovatno vezuju i MHC molekule, mogu da se identifikuju iz sekvencije aminokiselina proteina. Poželjno je da se odabrani epitop bude onaj koji deli malo ili ni malo identiteta sekvencije sa sekvencijama koje su široko rasprostranjene u animalnom biću, kome se ordinira preparat koji sadrži ili ekspresuje fragment proteina.

Daje se takođe izolovana ili prečišćena nukleinska kiselina, koja kodira gore opisani protein ili njegov fragment, opciono kao deo vektora. Nukleinska kiselina koja kodira HA može da sadrži sekvenciju nukleotida SEQ ID NO: 3 ili njen fragment koji kodira najmanje devet susednih amino kiselina (9, 12, 15, 18, 21 ili 24). Ukoliko se želi, može se pripremiti trovalentna vakcina zasnovana na HA, gde jedan od ovih HA sadrži sekvenciju aminokiselina SEQ ID NO: 4 (videti, npr. U.S. Patent No. 5,762,939 i 6,245,532; videti, npr. U.S. Patent No. 6,740,325 za tetravalentnu vakcinu). Nukleinska kiselina koja kodira NM može imati sekvenciju nukleotida SEQ ID NO: 1, ili njen fragment koji kodira namjanje devet susednih aminokiselina (videti, npr. U.S. Patent No. 6,605,457 i U.S. Pat. App. Pub. No. 2003/0129197), dok nukleinska kiselina koja kodira NP može imati sekvenciju nukleotida SEQ ID NO: 5, ili njen fragment, koji kodira najmanje devet susednih aminokiselina, a nukleinska kiselina koja kodira M1 protein može imati sekvenciju nukleotida SEQ ID NO: 7, ili njen fragment koji kodira najmanje devet susednih aminokiselina, nukleinska kiselina koja kodira NS1 protein može imati sekvenciju nukleotida SEQ ID NO: 9, nukleinska kiselina koja kodira PA može imati sekvenciju nukleotida SEQ ID NO: 11, ili njen fragment koji kodira najmanje devet susednih aminokiselina, nukleinska kiselina koja kodira PB1 može imati sekvenciju nukleotida SEQ ID NO: 13, ili njen fragment koji kodira najmanje devet susednih aminokiselina, nukleinska kiselina koja kodira PB2 može imati sekvenciju nukleotida SEQ ID NO: 15, ili njen fragment koji kodira najmanje devet susednih aminokiselina. Onaj ko je uobičajeno verziran u stanje tehnike shvata da usled degeneracije genetskog koda postoje i brojne druge sekvencije nukleotida koje kodiraju ovakve sekvencije aminokiselina.

Gornje nukleinske kiseline, koje mogu biti DNK ili RNK, i njihovi fragmenti, mogu se sintetizovati (videti, npr. "Oligonukleotide Svnthesis" Gait urednik, 1984). Ti molekuli mogu da sadrže nukleotide/baze koji se ne nalaze u prirodi, a koje kodiraju željenu sekvenciju aminokiselina. Na primer, mogu se metilovati baza ili šećer. Pored toga, skelet molekula nukleinske kiseline se može modifikovati, npr. fosforotioatni skelet, metilfosfonat, metilfosforotioat i njihove kombinacije.

Alternativno, izolovana vRNK se može podvrgnuti reversnoj transkriptazi da bi se dobio hibrid RNK/DNK, iz koga se RNK odvoji digestijom, a zaostala DNK se tretira da bi se dobila dsDNK, koja ima kraj nalik ukosnici, a tretira se sa specifičnom nukleazom jednostruke spirale da se dobije bimolekulska kopija dvostruke spirale vRNK (videti, npr. U.S. Patent No. 4,357,421). Videti npr. U.S. Pat. App. Pub. No. 2006/0166321 za upotrebu tandemskih transkripcionih kaseta u dobijanju gripa, a u odsustvu virusa helpera.

Opciono nukleinska kiselina je deo vektora DNK, koji sadrži najmanje jedan promoter, u kom slučaju je sekvencija nukleotida operativno povezana sa promoterom, koji može biti isti ili različit. Pored promotera, deo DNK vektora mogu biti i druge kontrolne sekvencije, kao što su za terminaciju signala i slično.

Na primer, nukleinska kiselina se može uvesti u pogodan rekombinantni vektor ekspresije, kao što su oni prilagođeni bakterijama, kao što jeE. coli i Salmonella typhi,kvascima, kao što jeSaccharomyces cerevisiaeiliPichia pastoris,ili vlaknastim gljivicama, kao što jeAspergillus nidulans.Bakterije, kvasci i gljivice mogu rasti u kontinualnoj kulturi. Polipeptid, koji se stvara tokom kulture, može se zatim izolovati i prečistiti. Alternativno, molekul nukleinske kiseline se može uvesti u Poxviridae (npr. vektori na bazi kokošje kuge), Herpesviridae (npr. vektori virusa na bazi pseudo besnila, vektori virusa na bazi herpesa ćurki, vektori na bazi herpesa mačaka, vektori na bazi virusa infektivnog laringotraheitisa i vektori na bazi virusa herpesa goveda), Adenoviridae (npr. goveđi adenovirus (npr. serotip 3), humani adenovirus (npr. serotip 4 ili 7) i pseći adenovirus (npr. serotip 2; CAV2; videti npr. U.S. Patent No. 6,090,393) ili vektor ekspresije virusa insekata, kao što je rekombinantni baculovirus (npr.Autographa californicavirus polihidroze jezgra (AcNPV)), koji se za uzvrat mogu koristiti za inficiranje osetljivih kultivisanih ćelija SF9, koje se izvode iz insektaSpodotera frugiperda.Ostali virusni vektori su vaccinia (videti, npr. U.S. Patent No. 4,722,848), adenovirus, virus nalik addenovirusu, virus povezan sa adenovirusom, retrovirus i boginje (videti, npr. Hruby,Vet. Parasitol.29, 281.282

(1988); Uiu, "AIDS Research revievvs", Dekker, Inc., 1991, str. 403.416), koji se mogu ordinirati preko zagrebane kože ili injekcijom, opciono i kao lipozomska formulacija. Ostali vektori su Bacille-Calmette-Guerin (BCG; Stover et al.,Nature,351, 456-460 (1991)), vektori toksina detoksinisanog antraksa i slično. Ćelije sisara, kao što su ćelije jajnika kineskog hrčka (CHO), čak i ćelije biljaka se mogu koristiti za ekspresiju polipeptida iz odgovarajućeg konstrukta. Onaj ko je uobičajeno verziran u stanje tehnike zna da izbor ćelije domaćina utiče na prirodu post-translacionog procesuiranja (npr. glikozilovanje, faltanje i slično), što za uzvrat, može da utiče na imunogenecitet polipeptida i tehnike prečišćavanja koje slede.

Ekspresija se može postići u bilo kojoj odgovarajućoj ćeliji domaćina transformisanoj/transficiranoj sa vektorom eskpresije. Primeri pogodnih ćelija domaćina su, ali bez ograničavanja, one koje su opisane gore. Dakle, ovaj pronalazak daje takođe ćeliju domaćina transformisanu/transficiranu sa vektorom ekspresije.

Supernatanti iz sistema domaćin/vektor koji izlučuju protein ili njegov fragment u medijum kulture, mogu se uklopiti u matricu prečišćavanja, kao što je afinitetna kolona ili jonoizmenjivačka kolona. Jedan ili više koraka HPLC sa reversnom fazom može da se upotrebi za dalje prečišćavanje rekombinantnog proteina ili njegovog fragmenta.

Dobijanje proteina ili njegovog fragmenta kao fuzionog proteina može da stabilizuje dobijanje. Ovo se može ostvariti ligiranjem sekvencija polinukleotida koji kodira dva ili više proteina (ili njegovih fragmenata) u odgovarajući vektor ekspresije sa ili bez peptidnog linkera. Poželjno je da su riding frejmovi sekvencija polinukleotida u fazi, tako da se stvara jedan protein koji zadržava biološku aktivnost svakog proteina (ili njegovog fragmenta). Peptidni linker od 1. do oko 50. aminokiseline može da se koristi za razdvajanje nastalih proteina (ili njegovih fragmenata), tako da se obezbedi da se svaki protein (ili njegov fragment) ispravno savije u njegovu prirodnu sekundarnu, tercijarnu i kvaternernu strukturu (videti, npr. Maratea et al., Gene,49, 39-46 (1985); Murphv et al.,PNAS USA,83, 8258-8262 (1986); U.S. Patent No. 4,935,233 i U.S. Patent No. 4,751,180). Svojstvo prihvatanja fleksibilne produžene konformacije, nesposobnost prihvatanja sekundarne strukture koja može da stupa u interakciju sa funkcionalnim aminokiselinama bilo na jednom ili na oba proteina, i nedostatak hidrofobnih ili naelektrisanih ostataka koji bi mogli reagovati jedan sa drugim, ili oba proteina, su faktori koji se uzimaju u razmatranje prilikom selekcije peptidnog linkera. Linkeri nisu potrebni kada krajevi proteina, koji treba da se sastave, ne sadrže bitne regione, tako da se krajevi mogu koristiti za razdvajanje funkcionalnih domena i sprečavanje sternih smetnji. Poželjne sekvencije peptidnog linkera sadrže ostatke Gly, Asn i Ser. Mogu se koristiti i drugi skoro neutralni ostaci, kao što su Thr i Ala.

Mogu se odabrati još neke sekvencije aminokiselina za poboljšanje ekspresije i/ili imunogeniciteta proteina ili njegovog fragmenta. Na primer, protein, ili njegov fragment, se može fuzionisati uz vezujući protein teškog lanca imunoglobulina G (IgG) ili ćeliju koja predstavlja antigen (APC), kao što su ligandi IL-D, GM-CSF, IL-1, TNF, IL-4, CD40L, CTLA4, CD28 ili FLT-3. Mogu se koristiti tehnike, kao što je upotreba dehidratacionog agensa, npr. dicikloheksilkarbodiimida (DCCI), ili stvaranje veza između sulfhidril grupa, epsilon amino grupa, karboksil grupa i slično. Ukoliko se želi, u fuzioni protein može se uvesti mesto cepanja, kako bi se omogućilo razdvajanje proteina (ili njegovog fragmenta) od sekvencija koje se ne nalaze u prirodi. Primeri mesta za cepanje su, ciljana sekvencija za proteolitski enzim, ili ukoliko metionin nije prisutan u proteinu (ili njegovom fragmentu), metionin koji za uzvrat može da se čepa sa cijanogen-bromidom. To su metode poznate u stanju tehnike. Protein ili njegov fragment se može modifikovati glikozilovanjem ili drugom derivatizacijom (npr. acetilovanjem ili karboksilovanjem), takođe u skladu sa postupcima poznatim u stanju tehnike.

Protein (ili njegov fragment) može da se ekspresujein situiz pogodnog sistema za ekspresiju. Bilo koji DNK konstrukt, koji je efikasan u proizvodnji kodiranog proteina ili njegovog fragmenta u željenoj sredini, može da se upotrebi za ekspresiju proteina ili njegovog fragmenta, kao što je opisano gore.

Alterntaivno, molekul nukleinske kiseline može da se ponaša kao efikasan sistem ekspresijein situ,ako se injektuje u animalno biće kao "gola DNK" (videti, npr. Ulmeret al.,Science,259, 1745-1749(1993); i Cohen,Science,259, 1691-1692

(1993)). Oslobađanje DNK se može olakšati upotrebom bupivicaine-a, polimera i peptida; alternativno, mogu se koristiti katjonski kompleksi lipida, čestice ili pritisak (videti, npr. U.S. Patent No., 5,922,687).

Primeri sekvencija aminokiselina koje su najmanje oko ili su više od 95% identične sa, kao što je najmanje oko ili više od 96%, 97%, 98% ili 99% identične sa SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 ili 16, su sekvencije aminokiselina koje sadrže jednu ili više supstitucija, inserata, adicija i/ili izbacivanja. Identitet sekvencije se može odrediti poravnavanjem sekvencija peptida i primenom javno dostupnih kompjuterskih algoritama, kao što je BLASTP (Pearson et al.,PNAS USA85, 2444-2448 (1988); Pearson,Methods Enzymol.,183, 63-98 (1990) i Altschul et al.,Nucl. Acids Res.25, 3389-3402 (1997)). Softver BLASTP je dostupan na FTP serveru ustanove National Center for Biotechnologv Information (NCBI) ili NCBI, National Librarv of Medicine, zgrada 38A, soba 8N805, Bethesda, MD 20894. Kada se sekvencije polipeptida poravnaju, identifikuje se broj identičnih aminokiselina duž poravnatih delova, a broj identičnih aminokiselina se podeli sa ukupnim brojem aminokiselina posmatranog polipetida i rezultat pomnoži sa 100, određujući tako procenat identičnosti sekvencije.

U tom smislu, onaj ko je uobičajeno verziran u stanje tehnike, zna da fragment date sekvencije aminokiselina može biti najmanje oko ili više od 95% identičan, kao što je 96%, 97%, 98% ili 99% identičan, sa sekvencijom aminokiselina. Tako, fragmenti treba sa su obuhvaćeni sa "sekvencijom aminokiselina koja je najmanje oko ili više od 95% (ili 96%, 97%, 98% ili 99%) identična sa SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 ili 16. Poželjno je da ovakvi fragmenti zadržavaju imunogenicitet proteina čitave dužine. Funkcionalni fragmenti se mogu generisati mutacionom analizom nukleinske kiseline koja kodira protein i naknadnom ekspresijom dobijenog mutant-proteina ili hemijskom/enzimatskom digestijom proteina.

Modifikacije, kao što su supstitucije, insertovanja, adicije i/ili izbacivanja, mogu da se uvedu u nukleinsku kiselinu ili u protein (ili njegov fragment) u skladu sa postupcima poznatim u stanju tehnike (videti npr., Adelman et al.,DNA, 2,183

(1983), za mutagenezu sa oligonukleotidom usmerenu na specifično mesto). Poželjno je da modifikacija suštinski ne umanjuje imunogenicitet fragmenta proteina; poželjno je da imunogenicitet ostane isti ili da poraste, relativno prema nemodifikovanom proteinu.

"Konzervativna supstitucija" je ona kod koje se supstituiše aminokiselina sa drugom aminokiselinom sličnih svojstava, tj. slične sekundarne strukture i hidropatičke prirode. Supstitucije aminokiseline se mogu napraviti na bazi sličnosti u polarnosti, naelektrisanju, rastvorljivosti, hidrofobnosti, hidrofilnosti i/ili amfipatičkoj prirodi ostataka. Na primer, negativno naelektrisane aminokiseline, kao što su asparaginska i glutaminska kiselina, mogu da se zamene, kao što i pozitivno naelektrisane aminokiseline, kao što su lizin i arginin, mogu da se zamene, dok aminokiseline koje na čelu imaju nenaelektrisane polarne grupe, a imaju slične vrednosti hidrofilnosti, mogu da se zamene. U tom smislu, leucin. izoleucin i valin mogu da se zamene, mogu da se zamene i glicin i alanin, mogu da se zamene asparagin i glutamin, a mogu se zameniti serin, treonin, fenilalanin i tirozin. Druge grupe aminokiseleina, koje se mogu zameniti su: (1) ala, pro, gly, glu, asp, gln, asn, ser i thr; (2) cvs, tyr i thr; (3) val, ile, leu, met, ala i phe; (4) lys, arg i his; i (5) phe, tyr, trp i his.

U vezi sa gore rečenim, daje se takođe preparat koji sadrži izolovanu ili prečišćenu kombinaciju protein/nukleinska kiselina ili njihovih fragmenata, i biološki prihvatljiv nosač. Nukleinska kiselina ili njen fragment može biti i deo vektora. Videti, npr., U.S. Patent No. 4,029,763, koji se odnosi na vakcinu gripa koja sadrži kao aktivni sastojak NM, i U.S. Patent No. 4,140,762, koji se odnosi na vakcinu gripa koja sadrži kao aktivne sastojke HA i NM. u U.S. Patent No. 4,826,687 se opisuje dodatak muramildipeptida u vakcinu koja sadrži HA i NM. Ako se želi, u preparat protein/nukleinska kiselina ili njihov fragment, mogu se dodati polipeptidi koji suštinski odgovaraju aminokiselinama 148-162, 163-166 i/ili 215-239 u M1 (videti, npr., U.S. Patent No. 5,136,019; 5,616,327 i 5,741,493). U preparatu se može koristiti bilo koji pogodan, biološki prihvatljiv nosač. Na primer, protein(i)/nukleinska(e) kiselina(e)/njihovi fragmenti mogu se resuspendovati u razblaživaču, npr. u 0,9% rastvoru natrijum-hlorida, koji opciono može biti puferovan sa, na primer, fosfatnim puferom. Saharoza, koja zaostane prilikom prečišćavanja virusa, može se ukloniti dijalizom. Za uklanjanje bilo kakvih zaostalih katjonskih deterdženata mogu se upotrebiti dijaliza ili gel hromatografija. Poželjno je da je protein ili njegov fragment prisutan u količini dovoljnoj da u animalnom biću izazove imuno odgovor (tj. ćelijski ili humoralni). Nosač koji se često bira u farmaceutske svrhe i za antigene je poli(d,l-laktid-ko-glikolid) (PLGA). PLGA je biodegradabilni poliestar i može se koristiti za kontrolisano oslobađanje antigena (Eldridge et al.,Cur. Topics Micro. Immuno.,146, 59-66 (1989); videti, takođe U. S. Patent No. 6,090,393). Pokazano je da zahvat antigena u PLGA mikrosferama, prečnika 1-10 pm, ima zapažen adjuvantski efekat prilikom oralnog ordiniranja.

Ukoliko se želi, mogu se dodati agens za prezervaciju ili agens za inaktivaciju, kao što je formaldehid. Konvencionalni sadržaj agensa za prezervaciju/ inaktivaciju je 1 deo na 10.000 delova.

Ako se želi, sa proteozomima se može kombinovati jedan ili više proteina (ili njihovih imunogenih fragmenata), kao što je gore-opisani HA. Videti, npr., U.S.Patent No. 6,743,900 i U.S. Pat. App. Pub. No. 2004/0156867.

Imunogenicitet se može poboljšati uključivanjem konvencionalnih imunoloških adjuvanata, kao što je aluminijum-hidroksid (npr. oko 0,2%), ili aluminijum-fosfat, aluminijum (videti, npr. U.S. Pat. No. 6,372,223, 6,635,246, 6,861,244 i 7,052,701 i U.S.Pat. App. Pub. No. 2004/0096464 i 2006/0147468), hitosan (videti, npr. U.S. Patent No.6,136,606 i 6,534,065), stipsa, kao šo je u obliku aluminijum-hidroksida, aluminijum-fosfata ili alunninijum-oksida, mineralna ulja (npr., Bayol F<®>i Marcol 52<®>), Freund-ov kompletni adjuvant, Freund-ov nekompletni adjuvant, muramildipeptid, monofosforil lipid A i saponini, uključujući i Quil A komponentu. Imunogenicitet se može takođe poboljšati dodavanjem citokina, kao što je interleukin, ili konjugovanjem proteina ili njihvih fragmenata. Poželjno je da se protein ili njegov fragment konjuguje sa makromolekulskim nosačem, kao što je protein (npr. serum albumina, keyhole limpet hemocijanin, imunoglobulin, troglobulin i ovalbumin), polisaharid (npr. sefaroza funkcionalizovana lateksom, agaroza, perlice celuloze i slično), fosfolipid, polimerne aminokiseline (npr. poliglutaminska kiselina, polilizin i slično), ili kopolimeri aminokiselina (videti, np. U.S. Patent No. 5,136,019 i 5,612,037). Alternativno, protein ili njegov fragment se može enkapsulirati sa proteolipozomom ili lipidnim vezikulumom.

Preparat koji može da izazove imuno odgovor, može se dobiti u obliku suspenzije ili se može liofilizovati. Ukoliko je liofilizovan, poželjno je da se doda jedan ili više stabilizatora. Pogodni stabilizatori su, na primer, saharoza, fosfat, glutamat i albumin (SPGA, Bovarnick,J. Bacteriol.59, 509 (1950)), ugljenihidrati (npr. sorbitol, manitol, škrob, dekstran i glukoza), proteini (npr. albumin i kazein) ili njihovi proizvodi degradacije, agensi koji sadrže protein (npr. goveđi serum ili obrano mleko) i puferi (npr., fosfati alkalnih metala).

Alternativno, preparat se može formulisati kao preparat za kontrolisano oslobađanje. Oslabljeni/inaktivisani virus ili rekombinantni vektor se mogu mikrokapsulirati sa polimerima, kao što su polikarbonati, poliestri, poliuretani, poliortoestri i poliamidi. Izbor određenog polimera zavisi od brojnih faktora, uključujući reproduktibilnost sinteze polimera i mikroenkapsuliranja, cenu i materijala i procesa, toksikološki profil, zahteve za varijabilnom kinetikom oslobađanja i fizičko-hemijsku kompatibilnost polimera i virus/vektora.

Preparati koji su ovde opisani mogu se koristiti sami ili u kombinaciji sa drugim aktivnim sastojcima/preparatima. Primeri su preparati koji mogu da izazovu imuno odgovor za pseći distemper, infektivni pseći hepatitis (CAV-1 i CAV-2), besnilo, parainfluencu, virus pseće korone, boginje, leptospirozu i Bordetella-u. Opisani su polifenoli koji inhibiraju infekciju gripa u humanim bićima (videti, npr. U.S. Patent No., 5,173,922; u nastavku "patent '922"). U skladu sa tim, dodatak polifenola, kao što su epigalokatehingalat, epikatehingalat, epigalokatehin, epikatehin, slobodni teaflavin, teaflavin monogalat A, teaflavin monogalat B i/ili teaflavin digalat, mogu biti od koristi (videti patent '922). Inhibitori NM su opisani u U.S. Patent No., 5,453,533. Upotreba citokina, kao imunopotencijatora, i enkapsulacija u lipozomima, opisani su u U.S. Patent No. 5,919,480.

Količina nukleinske kiseline u preparatu može široko da varira. Na primer, konentracija može da se kreće od manje od oko 0,1 mas%, pa do oko 20-50 mas% ili više, a obično najmanje oko 2 mas%. Koncentracija proteina u preparatu može takođe široko da varira. Na primer, koncentracija može da se kreće od manje od oko 0,1 mas%, pa do oko 20-50 mas% ili više, obično najmanje oko 2 mas%. Zapremina fluida i viskoznost se uzimaju u obzir prilikom određivanja konačne koncentracije.

U skladu sa tim, daje se takođe i postupak za izazivanje imuno odgovora na virus psećeg gripa u animalnim bićima. Osetljivost animalnog bića prema infekciji može se oceniti korišćenjem testa za smanjenje neutralizacije plaka (U.S. Patent No. 4,215,073) ili testa hemaglutinacije. Ovaj postupak se sastoji od ordiniranja animalnom biću gore-opisanog preparata, koji sadrži izolovani ili prečišćeni /protein/nukleinska kiselina ili njihov fragment. Ukoliko preparat sadrži nukleinsku kiselinu (ili njen fragment) kao deo vektora, poželjno je da se protein (ili njegov fragment) ekspresuje u dovoljnoj količini da izazove imuno odgovor u animalnom biću. Na primer, može se ordinirati jedna doza od oko 9 do oko 43 intemacionlne jedinice po kg telesne mase animalnog bića. Za veće sisare, jedna doza može da sadrži od oko 600 do oko 3.000 internacionalnih jedinica po kg telesne mase. Za preparate vakcine dobijene kultivisanjem virusa u alantoičkoj šupljini oplođenih jaja, sakupljanje virusa i, ukoliko se to želi, stabilizacija sakupljenog virusa sa stabilizatorom, kao što je pepton ili saharoza, a zatim distribucijom u staklene fiole za naknadno sušenje smrzavanjem, efikasna jedinična doza vakcine može da sadrži najmanje 10<7>EID50(doza 50% inficiranih jaja) virusa. U ovakvoj situaciji vakcina osušena smrzavanjem se rekonstituiše dodavanjem vode ili drugog farmaceutski prihvatljivog razblaživača neposredno pred ordiniranje, na primer u obliku spreja za nos ili kapi za nos. Ukoliko se želi, vakcina se može ordinirati u dve uzastopne doze u intervalu od nedelju dana.

Preparat se može ordinirati štencima kao jedna doza u starosti od 12 nedelja, ili uz ponavljanje od 6. nedelje starosti (npr. 6, 9 i 12. nedelje) ili nedeljno počev od 4. nedelje, pa dalje. Efikasnu dozu i način ordiniranja određuje priroda preparata, priroda proizvoda ekspresije, LD50i, ukoliko se koristi rekombinantni vektor, nivo ekspresije vektora, kao i rasa psa, njegova starost, pol, masa i stanje. Poželjne doze virusa ili rekombinantnog vektora mogu da se kreću od oko 10<3>do oko 10<6>pfu. Doza za živi oslabljeni soj može biti najmanje oko 10<3>TCID50.

Ovi preparati se mogu ordinirati parenteralno (tj. injekcijom (npr. kroz kožu, potkožno ili intramuskularno) ili putem inficiranja, kao što je nazalno) ili enteralno (tj. oralnim ordiniranjem). Upotreba agensa za geliranje i muko- ili bio-adheziva, za poboljšanje imuno odgovora kod intradermalno ordiniranih imunogenih preparata, opisana je u U.S. Pat. App. Pub. No. 2005/0255121. Ukoliko se želi, preparat za izazivanje imuno odgovora može se ordinirati kroz vodu za piće ili kroz sirup sa Chu et al. (U.S. Pat. App. Pub. No. 2006/0171960, publikovanoj 3. avgusta 2006.). Oralno ordiniranje ima prednost zato što se izbegava intramuskularna injekcija, koja zahteva više vremena i napora, a za uzvrat može kod animalnog bića da izazove stres i nelagodnost. Nelagodnost, za uzvrat, može kod trkaćih pasa da utiče na njihove performanse. Alternativno, preparat koji sadrži rekombinantni vektor sa ekspresijom najmanje jednog epitopa koji izaziva imuno odgovor, može se primeniti direktno na kožu, za lokalizovanu ekspresiju i izazivanje imuno odgovora.

Efikasnost preparata, koji može da izazove imuno odgovor, može se pokazati izlaganjem štenadi virulentnom soju psećeg virusa gripa. Netretirani psi treba da dobiju kliničke znake karakteristične za pseću virusnu infekciju gripa, dok tretirani psi ne treba da ih dobiju.

Rekombinantni vektori i produkti ekspresije iz njih mogu se upotrebiti za stvaranje antitela, kao što su poliklonalna antitela (pAB) i monoklonalna antitela (mAb), u skladu sa metodama poznatim u stanju tehnike (Harlovv i Lane, "Antibodies: A Laboratorv Manual", Harbor Laboratorv Press, Cold Spring Harbor Laboratorv Press, Cold Spring Harbor, NY (1988); Shepherd i Dean, "Monoclonal Antibodies: A Practical Approach", Oxford Universitv Press, U.S.A., (2000); i Harris i Adair, "Antibodv Therapeutics", CRC Press, Inc., Boca Raton, FL (1997)). Antitela, a naročito mAb, mogu se koristiti u testovima vezivanja i dijagnostičkim kompletima/testovima za određivanje prisustva/odsustva antigena virusa psećeg gripa, ili da li je ili nije stimulisan imuno odgovor na virus. Antitela se mogu takođe koristiti za regenerisanje materijala pomoću imuno-adsorpcione hromatografije.

Antitela mogu takođe da obezbede pasivnu imunozaciju. Na primer, delimično prečišćeni imuno serumi animalnog bića domaćina, ili iz soja ćelija hibridoma, mogu se injektirati animalnom biću. Ova antitela daju terapeutski efekat preko vezivanja za i neutralizacije infektivnog virusa gripa.

Daje se takođe preparat koji sadrži anti-idiopatsko antitelo, a koje ima interni imidž epitopa gore pomenutog proteina, kao što je protein koji se sastoji od sekvencije aminokiselina SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 3.

Onaj ko je uobičajeno verziran u stanje tehnike zna da se može pripremiti anti-idiopatsko antitelo, koje ima interni imidž epitopa, kao što su ona ovde opisana. Videti, npr. Herlyn et al.Science,232, 100-102 (1986). Postupci za dobijanje monoklonalnih i poliklonalnih anti-idiopatskih antitela, koja imaju interni imidž polipeptida, opisana su, na primer u U. S. Pat. App. Pub. No. 5,053,224. Ukratko, poliklonalna antiidiopatska antitela se mogu dobiti iz imunozovanih životinja sa monoklonalnim idiopatskim antitelima protiv polipeptida, pa testirana na reaktivnost sa polipeptidom i testiranjem antiseruma, koji reaguje sa idiopatskim antitelima u polipeptidu. Monoklonalna antitela (mAb) mogu se takođe dobiti iz tih životinja korišćenjem standardizovanih tehnika imortalizacije ćelija animalnog bića koje izlučuju antitela, uz testiranje kultura sa idiopatskim antitelima u kompeticiji sa polipeptidom. lako su mAb poželjna, mogu takođe da se koriste poliklonalna antitela (pAb), koja se dobijaju u brojnim sisarskim sistemima.

Daje se takođe i sledeći postupak za izazivanje imuno odgovora na CIV u psima. Ovaj postupak se sastoji od ordiniranja psu efikasne količine preparata koji sadrži anti-idiopatsko antitelo, kao što je opisano gore.

Izolovani i prečišćeni molekuli nukleinske kiseline, ili vektori koji ih sadrže, mogu da se koriste za generisanje DNK za probe/prajmere, koji se mogu koristiti za detekciju prisustva ili odsustva DNK podložne hibridizaciji, ili za pojačavanje DNK, kao što je cDNK.

Obeleženi proteini ili njihovi fragmenti, kao i obeležene nukleinske kiseline ili njihovi fragmenti, mogu se koristiti u testovima. Postupci testova su fluoroimunotestovi (Smith et al.,Ann. Clin. Biochem.18, 253-275 (1981), radioimunotestovi (RIA), imunosorbent testovi povezani sa enzimom (ELISA) i tehnika imunotesta sa multiplikacijom enzima (EMIT; videti, npr. "Enzvme lmmunoassay", uredn. Maggio, CRC Press, Inc., Boca Raton /FL), 1980, str. 141-150, 234-235 i 242-243). Ove metode se mogu koristiti za detekciju prisustva virusa i dijagnozu stanja infekcije.

Sam virus se može koristiti kao vektor. Upotreba virusa kao vektora je unutar okvira veštine u stanju ehnike.

PRIMER

Primer koji sledi služi za ilustraciju ovog pronalaska. Nije namera da ovaj primer na bilo koji način ograniči obim ovog pronalaska. Primer opisuje identifikaciju i delimičnu karakterizaciju virusa psećeg gripa.

Izbijanje akutne respiratorne bolesti, koje karakterišu kašalj, groznica, ubrzano disanje i hemoragično pražnjenje iz nosa, dešavalo se aprila 2005. kod hrtova na dva trkališta locirana u istočnoj i zapadnoj Ajovi. lako se veliki procenat pasa oporavio, mnogi su podlegli hemoragičnoj pneumoniji.

Pluća zaraženih pasa su pokazivala obilno crveno do crveno-crno obojenje, sa umereno do značajno opipljivom čvrstoćom i blagim fibrinoznim pleuritisom. Sekcije pluća karakteriše ozbiljna hemoragična interstcijalna do bronhointersticijalna pneumonija. Opažene su nejednake intersticijalne promene sa alveolarnim septičnim zadebljanjima, koagulumima šlajma u alveolama i povezanom atelektazom u alveolama. Opažena je intenzivna fokalna piogranulomatozna bronhointersticijalna pneumonija sa dilatacijom vazdušnih puteva degenerisanim ćelijama i šlajmom. Vidljivi su bili rasejani vaskulitis i vaskularni trombovi.

Mikrobiološko testiranje na konvencionalne virusne i bakterijske agense nije otkrilo bilo kakve značajne patogene, izuzevStreptococcus equi,podvrstezooepidemicus,prisutne u plućnim tkivima svih ispitanih životinja. Dva od četiri testirana uzorka pluća bila su pozitivna na virus gripa, koristeći lančanu reakciju reversne transkriptaze/polimeraze u realnom vremenu (RT-PCR; Harmon et al., "Development of a PCR-based differential test for H1N1 i H3N2 swine influenza viruses", uProceedings of the 42nd Annual Meeting of American Association of Veterinar/Laborator/Diagnosticians,San Diego, CA, oktobar 1999, str. 44). Imunohistohemija, uz korišćenje monoklonalnog antitela (mAb) specifičnog na NP virusa gripa (Vincent et al.,J. Vet. Invest.,9, 191.195 (1997)) dala je pozitivan rezultat u virusnim lezijama pluća oba plućna krila, prilikom zahvatanja antigena pomoću ELISA (Directgen™ Flu A, Becton/Dickinson, Sparks, MD), prilikom testiranja uzoraka. Uzorci bronhoalveolarnog ispiranja iz dvaju pozitivno testiranih pluća pomoću PCR, bili su pozitivni na virus gripa.

Pokušalo se sa izazivanjem virusa, zato što je detekcija virusa gripa u plućima pasa predstavljala neočekivano opažanje, a postojao je samo jedan izveštaj o infekciji virusom gripa kod pasa (Dubovi et al., "Isolation of equine influenza virus from racing grevhounds with fatal hemorragic oneumonia", uProceedings of the

47nd Annual Meeting of American Association of Veterinary Laboratory

Diagnosticians,Greensboro,NC, oktobar 2004, str. 158.). Virus, koji je u stanju da izazove aglutinaciju crvenih krvnih zrnaca u ćelijama pevca, izolovan iz ćelija bubrega psa Madin-Darby (MDCK), iz pluća i fluida prilikom isprianja bronhoalveola, u jednoj od dve životinje kod kojih je detektovan virus gripa pomoću imunohistohemijskog testa (IHC) i PCR. Izolat je određen pomoću PCR, kao virus gripa podvrste H3. Izolat virusa je bio podvrste H3N8, koristeći testove inhibicije HA i inhibicije NM. Izolat virusa je prepoznat preko antiseruma protiv raznih konjskih virusa grupa H3, uključujući Miami ((A/Eq/MI/1/63-H3N8) 640-1280), AK((A/Eq/AK/29759/91-H3N8) 320-640) i Kentucky ((A/Eq/Kentucky/81-H3N8) 160-320).

Sekvencioniranje HA i NA gena iz oba izolata je otkrilo 100% i 99,8% identičnost, respektivno, između ta dva izolata. Filogenetički, HA gen iz ovog izolata bio je genetski blizak (96-98% homologije nukleotida) sa HA genom nedavnog konjskog virusa grupa H3N8 (Macken et al., "The value of a database in surveillance and vaccine selection" u publikaciji "Options for the Control if Influenza", IV deo, uredn. Osterhaus et al., Elsevier Science, Amsterdam, 2001, str. 103-106). NA gen iz ovih izolata pokazivao je takođe 96-98% homologiju sa NA genom nedavno otkrivenog konjskog virusa gripa H3N8. Pošto su hrtovi sa dva trkališta, koja su geografski udaljena u Ajovi, istovremeno podlegli ovoj bolesti, bez prisustva obolelih konja, ukazivalo je da je izolat virusa gripa soj prilagođen psima, koji se može ustaliti i širiti među psima. Verovatno je ozbiljnosti bolesti dorpineo i S.zooepidemicus,koji je impliciran kod respiratornih bolesti i problema povezanih sa septikemijom kod mnogih različitih animalnih vrsta (Wood et al.,J. Clin. Microbiol.,43, 120-126 (2005) i Gillespie et al., "The General Staphvlococcus and Streptococcus" u knjizi "Hagan and Bruner's Infectious Diseases of Domestic Animals", 7th edition, Comstock/Cornell University Press, Ithaca, NY, 1981, str. 164-180).

Svi citati, uključujući publikacije, patentne prijave i patente, koji su ovde navedeni, time su uključeni kao citati u istom iznosu kao da su pojedinačni citati i specifično naznačeni, a uključeni su ovde u celini.

Upotreba pojedinih termina u kontekstu opisivanja ovog pronalaska (a naročito u kontekstu patentnih zahteva koji slede) treba da se shvati i u jednini i u množini, ukoliko se to ovde posebno ne naglasi, ili jasno ne protivreči kontekstu. Navođenjem opsega vrednosti, ovde se samo želi pružiti skraćeni postupak za upućivanje na individualnosti svake posebne vrednosti koja pada u opseg, ukoliko se drugačije ovde ne naglasi, tako da je svaka posebna vrednost uključena u ovu prijavu, kao da je pojedinačno ovde citirana. Svi postupci, koji su ovde opisani mogu se obaviti bilo kojim pogodnim redosledom, ukoliko se drugačije ne naglasi ili ukoliko jasno ne protivreči kontekstu. Upotrebom bilo kog ili svih primera, ili jezika iz primera (npr. "kao što je") koji se ovde daju, namera je da se samo bolje rastvetli ovaj pronalazak, a ne da se postave ograničenja na obim ovog pronalaska, ukoliko se drugačije ne kaže. Nikakav jezik u ovoj prijavi ne treba da se uzme kao indikacija nekog elementa koji se ne štiti, kao bitnog praktikovanju ovog pronalaska.

Poželjne realizacije ovog pronalaska su ovde opisane, uključujući najbolji način koji je poznat pronalazačima, za realizaciju ovog pronalaska. Podrazumeva se da su ilustrovane realizacije samo primer, i ne treba da se uzmu kao ograničenje obima ovog pronalaska.

Claims (40)

1. Izolovan je pseći virus gripa, podvrste H3N8, naznačen time, što sadrži hemaglutin (HA) koji ima SEQ ID NO: 4, ili sekvenciju aminokiselina koja je više od 99% identična sa SEQ ID NO: 4, uz uslov da su aminokiseline u položajima 94 i 233 identične sa SEQ ID NO: 4.

2. Izolovan je pseći virus gripa prema Zahtevu 1, naznačen time, što sadrži neuraminidazu (NM) koja ima sekvenciju aminokiselina SEQ ID NO: 2, ili sekvenciju aminokiselina koja je više od 99% identična sa SEQ ID NO. 2, uz uslov da su aminokiseline u položajima 68 i 134 identične sa SEQ ID NO: 2.

3. Izolovan je pseći virus gripa prema Zahtevima 1 ili 2, naznačen time, što sadrži još i najmanje jedan od sledećih: nukleoprotein (NP) koji ima sekvenciju aminokiselina SEQ ID NO: 6, ili sekvenciju aminokiselina koja je više od 99% identična sa SEQ ID NO: 6, uz uslov daje aminokiselina u položaju 402 identična sa SEQ ID NO: 6; matrični protein 1 (M1), koji ima sekvenciju aminokiselina SEQ ID NO: 8, ili sekvenciju aminokiselina koja je više od 99% identična sa SEQ ID NO: 8, uz uslov da je aminokiselina u položaju 111 identična sa SEQ ID NO: 8; nestrukturni protein 1 (NS1), koji ima sekvenciju aminokiselina SEQ ID NO: 10; protein PA, koji ima sekvenciju aminokiselina SEQ ID NO:12, ili sekvenciju aminokiselina koja je više od 98% identična sa SEQ ID NO: 12, uz uslov da su aminokiseline u položajima 233, 256, 327 i 561 identične sa SEQ ID NO: 12; PB1, koji ima sekvenciju aminokiselina SEQ ID NO: 14, ili sekvenciju aminokiselina koja je više od 99% identična sa SEQ ID NO: 14, uz uslov da su aminokiseline u položajima 200 i 213 identične sa SEQ ID NO: 14; i/ili PB2, koji ima sekvenciju aminokiselina SEQ ID NO: 16, ili sekvenciju aminokiselina koja je više od 99% identična sa SEQ ID NO: 16, uz uslov da su aminokiseline u položajima 107, 221, 292 i 661 identične sa SEQ ID NO: 16.

4. Izolovani virus psećeg gripa prema Zahtevu 1, naznačen time, što je oslabljen.

5. Preparat, naznačen time, što sadrži izolovani virus psećeg gripa prema Zahtevu 4 u dovoljnoj količini da izazove imuno odgovor.

6. Izolovani virus psećeg gripa prema Zahtevu 1, naznačen time, što je inaktiviran.

7. Preparat, naznačen time, što sadrži izolovani virus psećeg gripa prema Zahtevu 6 u dovoljnoj količini da izazove imuno odgovor.

8. Izolovani virus psećeg gripa podvrste H3N8, naznačen time, što je deponovan u ustanovi American Type Culture Collection, kao Patent Deposit No. PTA-7694.

9. Izolovani ili prečišćeni HA, koji (i) ima sekvenciju aminokiselina SEQ ID NO: 4, ili (ii) je izveden iz virusa gripa a ima sekvenciju aminokiselina koja je više od 99% identična sa SEQ ID NO: 4, uz uslov da je ta sekvencija aminokiselina identična sa SEQ ID NO: 4 u položajima aminokiselina 94 i 233, ili fragment (i) ili (ii), naznačen time, što taj fragment sadrži najmanje devet susednih aminokiselina od kojih je najmanje jedna identična sa aminokiselinom u položaju 94 ili 233 u SEQ ID NO: 4.

10. Preparat, naznačen time, što sadrži izolovani ili prečišćeni HA ili njegov fragment prema Zahtevu 9, u količini dovoljnoj da izazove imuno odgovor u animalnom biću, i biološki prihvatljiv nosač.

11. Postupak za izazivanje imuno odgovora na virus psećeg gripa u animalnom biću, naznačen time, što se taj postupak sastoji od ordiniranja tom animalnom biću preparata prema Zahtevu 10, nakon čega se izazove imuno odgovor na virus psećeg gripa u tom animalnom biću.

12. Izolovana ili prečišćena nukleinska kiselina koja kodira HA ili njegov fragment, prema Zahtevu 9, naznačena time, što je opciono deo nekog vektora.

13. Izolovana ili prečišćena nukleinska kiselina prema Zahtevu 12, naznačena time, što ta nukleinska kiselina kodira HA i ima sekvenciju nukleotida SEQ ID NO: 3, ili njen fragment, a kodira najmanje devet susednih aminokiselina.

14. Preparat, naznačen time, što sadrži izolovanu ili prečišćenu nukleinsku kiselinu prema Zahtevu 12 ili 13, koja ekspresira HA ili njegov fragment, u količini dovoljnoj da izazove imuno odgovor u animalnom biću, i biološki prihvatljiv nosač.

15. Postupak za izazivanje imuno odgovora na virus psećeg gripa u animalnom biću, naznačen time, što se taj postupak sastoji od ordiniranja tom animalnom biću preparata prema Zahtevu 14, nakon čega se u tom animalnom biću izazove imuno odgovor na virus psećeg gripa.

16. Izolovani ili prečišćeni NM, koji (i) ima sekvenciju aminokiselina SEQ ID NO: 2, ili (ii) je izveden iz virusa gripa a ima sekvenciju aminokiselina koja je više od 99% identična sa SEQ ID NO: 2, uz uslov da je ta sekvencija aminokiselina identična sa SEQ ID NO: 2 u položajima aminokiselina 68 i 134, ili fragment (i) ili (ii), naznačen time, što taj fragment sadrži najmanje devet susednih aminokiselina od kojih je najmanje jedna identična sa aminokiselinom u položaju 68 ili 134 u SEQ ID NO: 2.

17. Preparat, naznačen time, što sadrži izolovani ili prečišćeni NM ili njegov fragment prema Zahtevu 16, u količini dovoljnoj da izazove imuno odgovor u animalnom biću, i biološki prihvatljiv nosač.

18. Postupak za izazivanje imuno odgovora na virus psećeg gripa u animalnom biću, naznačen time, što se taj postupak sastoji od ordiniranja tom animalnom biću preparata prema Zahtevu 17, nakon čega se u tom animalnom biću izazove imuno odgovor na virus psećeg gripa.

19. Izolovana ili prečišćena nukleinska kiselina koja kodira NM ili njegov fragment prema Zahtevu 16, naznačena time, što je opciono deo nekog vektora.

20. Izolovana ili prečišćena nukleinska kiselina prema Zahtevu 19, naznačena time, što ta nukleinska kiselina kodira NM i ima sekvenciju nukleotida SEQ ID NO: 1, ili njen fragment, a kodira najmanje devet susednih aminokiselina.

21. Preparat, naznačen time, što sadrži izolovanu ili prečišćenu nukleinsku kiselinu prema Zahtevu 19 ili 20, koja ekspresira NM ili njegov fragment, u količini dovoljnoj da izazove imuno odgovor u animalnom biću, i biološki prihvatljiv nosač.

22. Postupak za izazivanje imuno odgovora na virus psećeg gripa u animalnom biću, naznačen time, što se taj postupak sastoji od ordiniranja tom animalnom biću preparata prema Zahtevu 21, nakon čega se u tom animalnom biću izazove imuno odgovor na virus psećeg gripa.

23. Izolovani ili prečišćeni NP, koji (i) ima sekvenciju aminokiselina SEQ ID NO: 6, ili (ii) je izveden iz virusa gripa a ima sekvenciju aminokiselina koja je više od 99% identična sa SEQ ID NO: 6, uz uslov da je ta sekvencija aminokiselina identična sa SEQ ID NO: 6 u položaju aminokiseline 402, ili fragment (i) ili (ii), naznačen time, što taj fragment sadrži najmanje devet susednih aminokiselina od kojih je najmanje jedna identična sa aminokiselinom u položaju 402 u SEQ ID NO: 6.

24. Izolovana ili prečišćena nukleinska kiselina koja kodira NP ili njegov fragment prema Zahtevu 23, naznačena time, što opciono predstavlja deo nekog vektora.

25. Izolovana ili prečišćena nukleinska kiselina prema Zahtevu 24, naznačena time, što ta nukleinska kiselina kodira NP i ima sekvenciju nukleotida SEQ ID NO: 5, ili njegov fragment, a kodira najmanje devet susednih aminokiselina.

26. Izolovani ili prečišćeni M1, koji (i) ima sekvenciju aminokiselina SEQ ID NO: 8, ili (ii) je izveden iz virusa gripa a ima sekvenciju aminokiselina koja je više od 99% identična sa SEQ ID NO: 8, uz uslov da je ta sekvencija aminokiselina identična sa SEQ ID NO: 8 u položaju aminokiseline 111, ili fragment (i) ili (ii), naznačen time, što taj fragment sadrži najmanje devet susednih aminokiselina od kojih je najmanje jedna identična sa aminokiselinom u položaju 111 u SEQ ID NO: 8.

27. Izolovana ili prečišćena nukleinska kiselina koja kodira M1 ili njegov fragment prema Zahtevu 26, naznačena time, što opciono predstavlja deo nekog vektora.

28. Izolovana ili prečišćena nukleinska kiselina prema Zahtevu 27, naznačena time, što ta nukleinska kiselina kodira M1 i ima sekvenciju nukleotida SEQ ID NO: 7, ili njegov fragment, a kodira najmanje devet susednih aminokiselina

29. Izolovani ili prečišćen NS1, naznačen time, što ima sekvenciju aminokiselina SEQ ID NO: 10.

30. Izolovana ili prečišćena nukleinska kiselina koja kodira NS1 pema Zahtevu 29, naznačena time, što opciono predstavlja deo nekog vektora.

31. Izolovana ili prečišćena nukleinska kiselina prema Zahtevu 30, naznačena time, što ta nukleinska kiselina kodira NS1 i ima sekvenciju nukleotida SEQ ID NO: 9.

32. Izolovani ili prečišćeni protein PA, koji (i) ima sekvenciju aminokiselina SEQ ID NO: 12, ili (ii) je izveden iz virusa gripa a ima sekvenciju aminokiselina koja je više od 98% identična sa SEQ ID NO: 12, uz uslov da je ta sekvencija aminokiselina identična sa SEQ ID NO: 12 u položajima aminokiselina 233, 256, 327 i 561, ili fragment (i) ili (ii), naznačen time, što taj fragment sadrži najmanje devet susednih aminokiselina od kojih je najmanje jedna identična sa aminokiselinom u položaju 233, 256, 327 ili 561 u SEQ ID NO: 12.

33. Izolovana ili prečišćena nukleinska kiselina koja kodira PA ili njegov fragment prema Zahtevu 32, naznačena time, što opciono predstavlja deo nekog vektora.

34. Izolovana ili prečišćena nukleinska kiselina prema Zahtevu 33, naznačena time, što ta nukleinska kiselina kodira PA i ima sekvenciju nukleotida SEQ ID NO: 11, ili njegov fragment, a kodira najmanje devet susednih aminokiselina.

35. Izolovani ili prečišćeni PB1, koji (i) ima sekvenciju aminokiselina SEQ ID NO: 14, ili (ii) je izveden iz virusa gripa a ima sekvenciju aminokiselina koja je više od 99% identična sa SEQ ID NO: 14, uz uslov da je ta sekvencija aminokiselina identična sa SEQ ID NO: 14 u položajima aminokiselina 200 i 213, ili fragment (i) ili (ii), naznačen time, što taj fragment sadrži najmanje devet susednih aminokiselina od kojih je najmanje jedna identična sa aminokiselinom u položaju 200 ili 213 u SEQ ID NO: 14.

36. Izolovana ili prečišćena nukleinska kiselina koja kodira PB1 ili njegov fragment prema Zahtevu 35, naznačena time, što opciono predstavlja deo nekog vektora.

37. Izolovana ili prečišćena nukleinska kiselina prema Zahtevu 36, naznačena time, što ta nukleinska kiselina kodira PB1 i ima sekvenciju nukleotida SEQ ID NO: 13, ili njegov fragment, a kodira najmanje devet susednih aminokiselina.

38. Izolovani ili prečišćeni PB2, koji (i) ima sekvenciju aminokiselina SEQ ID NO: 16, ili (ii) je izveden iz virusa gripa a ima sekvenciju aminokiselina koja je više od 99% identična sa SEQ ID NO: 16, uz uslov da je ta sekvencija aminokiselina identična sa SEQ ID NO: 16 u položajima aminokiselina 107, 221, 292 i 661, ili fragment (i) ili (ii), naznačen time, što taj fragment sadrži najmanje devet susednih aminokiselina od kojih je najmanje jedna identična sa aminokiselinom u položaju 107, 221, 292 ili 661 u SEQ ID NO: 16.

39. Izolovana ili prečišćena nukleinska kiselina koja kodira PB2 ili njegov fragment prema Zahtevu 38, naznačena time, što opciono predstavlja deo nekog vektora.

40. Izolovana ili prečišćena nukleinska kiselina prema Zahtevu 39, naznačena time, što ta nukleinska kiselina kodira PB2 i ima sekvenciju nukleotida SEQ ID NO: 15, ili njegov fragment, a kodira najmanje devet susednih aminokiselina. IOWA STATE UNIVERSITY RESEARCH FOUNDATION, INC., S.A.D.