RS20090413A - Multizimi i njihova upotreba u proizvodnji polinezasićenih masnih kiselina - Google Patents

Multizimi i njihova upotreba u proizvodnji polinezasićenih masnih kiselina

Info

Publication number
RS20090413A
RS20090413A RSP-2009/0413A RSP20090413A RS20090413A RS 20090413 A RS20090413 A RS 20090413A RS P20090413 A RSP20090413 A RS P20090413A RS 20090413 A RS20090413 A RS 20090413A
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
seq
delta
elongase
desaturase
polypeptide
Prior art date
Application number
RSP-2009/0413A
Other languages
English (en)
Inventor
Anthony J. Kinney
Quinn Qun Zhu
Kevin G. Ripp
Howard G. Damude
Original Assignee
E. I. Du Pont De Nemours And Company
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by E. I. Du Pont De Nemours And Company filed Critical E. I. Du Pont De Nemours And Company
Publication of RS20090413A publication Critical patent/RS20090413A/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
    • C12P7/6409—Fatty acids
    • C12P7/6427—Polyunsaturated fatty acids [PUFA], i.e. having two or more double bonds in their backbone
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
    • C12N15/8247—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine involving modified lipid metabolism, e.g. seed oil composition
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0071—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/93—Ligases (6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
    • C12P7/6409—Fatty acids
    • C12P7/6427—Polyunsaturated fatty acids [PUFA], i.e. having two or more double bonds in their backbone
    • C12P7/6434—Docosahexenoic acids [DHA]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y114/00—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14)
    • C12Y114/19—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14) with oxidation of a pair of donors resulting in the reduction of molecular oxygen to two molecules of water (1.14.19)
    • C12Y114/19001—Stearoyl-CoA 9-desaturase (1.14.19.1), i.e. DELTA9-desaturase

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Edible Oils And Fats (AREA)
  • Fodder In General (AREA)

Abstract

Izlozeni su izolovani fragmenti nukleinske kiseline i rekombinantnih konstrukcija, koje sadrže takve fragmente koji kodiraju multizime (tj., pojedinačne polipeptide koji imaju najmanje dve nezavisne i odvojene enzimske aktivnosti) zajedno sa postupkom proizvodnje polinezasićenih masnih kiselina dugog lanca (PUFAs) upotrebom ovih multizima u biljkama i uljastom kvascu.

Description

MULTIZIMIINJIHOVO KORIŠĆENJE U IZRADI POLINEZASIĆENIH
MASNIH KISELINA
Ova prijava zahteva prednost nad U.S. Provisional Application No. 60/909790, koja je prijavljena 3. aprila 2007., i U.S. Provisional Application No. 61/027898, koja je prijavljena 12. februara 2008., čija izlaganja su ovde sadržana u njihovoj celovitosti.
OBLAST TEHNIKE
Ovaj pronalazak je iz oblasti biotehnologije. Određenije, ovaj pronalazak se odnosi na polinukleotidne sekvence, koje kodiraju multizime i na njihovo korišćenje u sintezi polinezasićenih masnih kiselina dugog lanca (PUFA-a).
STANJE TEHNIKE
Značaj PUFA-a je neosporan. Primera radi, određene PUFA-e su važne biološke komponente zdravih ćelija i ocenjuje se: kao "esencijalne" masne kiseline, koje, kod sisara, ne mogu biti sintetisanede novo,a, umesto toga, mogu se dobiti ili hranom ili mogu biti dobijene daljom elongacijom i desaturacijom linolne kiseline (LA; 18:2 omega-6) ili a-linolenske kiseline (ALA; 18:3 omega-3); kao konstituenti plazmatskih membrana ćelija, gde se mogu naći u formama, kao što su fosfolipidi ili triacilgliceroli; kao neophodne za pravilan razvoj (posebno za razvoj dečjeg mozga) i za formiranje i obnavljanje tkiva; i kao prekursori za nekolicinu biološki aktivnih eikozanoida od značaja za sisare (npr., prostaciklini, eikozanoidi, leukotrieni, prostaglandini). Pored toga, visok priliv omega-3 PUFA-a dugog lanca proizvodi protektivne efekte u odnosu na kardiovaskularni sistem (Dverberg et al.,Amer. J. Clin. Nutr.,28:958-966 (1975); Dverberg et al.,Lancet.2(8081):117-119 (1978); Shimokawa, H.,JVorld Rev. Nutr. Diet88: 100-108 (2001); von Schacky et al.,JVorld Rev. Nutr. Diet88:90-99 (2001)). Brojne druge studije dokumentuju povoljne efekte na zdravlje, u velikom rasponu, postignute primenom omega-3 i/ili omega-6 PUFA-a, u odnosu na veliki broj različitih simptoma i bolesti (npr., astma, psorijaza, ekcem, dijabetes, maligne bolesti).
Danas se veliki broj različitih domaćina, uključujući biljke, alge, gljivice i kvasac, istražuje kao sredstvo za komercijalnu proizvodnju PUFA, putem brojnih različitih pristupa. Iako su prirodne sposobnosti organizama domaćina da proizvode PUFA ponekad suštinske u datom postupanju, genetski inženjering je, takođe, dokazao da prirodne sposobnosti nekih domaćina (čak i onih, koji su prirodno ograničeni na proizvodnju LA i ALA masnih kiselina) mogu biti suštinski promenjene, kako bi dovele do visokog nivoa proizvodnje raznih omega-3/omega-6 PUFA-a dugog lanca. Bez obzira da li je to rezultat prirodnih sposobnosti ili rekombinantne tehnologije, svaka od proizvodnji arahidonske kiseline (ARA; 20:4 omega-6), eikozapentaenske kiseline (EPA; 20:5 omega-3) i dokozaheksaenske kiseline (DHA; 22:6 omega-3), zahteva ekspresiju puta delta-5 elongaza/delta-8 desaturaza (koji dejstvuje u nekim organizmima, kao što su euglenoidne vrste i koji su karakterisani proizvodnjom eikozadienske kiseline (EDA: 20:2 omega-6) i/ili eikozatrienske kiseline (ETrA: 20:3 omega-3)) ili puta delta-6 desaturaza/delta-6 elongaza (koji se prvenstveno nalazi u algama, mahovinama, gljivicama, nematodama i ljudima, i koji su naznačeni proizvodnjom gama-linolenske kiseline (GLA: 18:3 omega-6) i/ili stearidonske kiseline (STA; 18:4 omega-3)) (Slika 1). Delta-6 elongaza je, takođe, poznata kao Ci8/20elongaza.
Enzimi delta-8 desaturaza, koji su identifikovani dotle da imaju sposobnost da prevode i EDA u dihomo gama-linolensku kiselinu (DGLA (takođe, poznata kao HGLA); 20:3 n-6) i ETrA u eikozatetraensku kiselinu (ETA; 20:4, n-3). ARA i EPA su naizmenično sintetisane iz DGLA, odnosno ETA, nakon reakcije sa delta-5 desaturazom. Sinteza DHA, međutim, zahteva sledstvenu ekspresiju dodatne C20/22elongaze i delta-4 desaturaze. Najveći broj C20/22elongaze identifikovan je tako daleko da ima primarnu sposobnost da konvertuje EPA u DPA, sa sekundarnom aktivnošću u konverziji arahidonske kiseline (ARA; 20:4 omega-6) u dokozatetraensku kiselinu (DTA; 22:4 omega-6), dok je najveći broj enzima delta-4 desaturaze identifikovan dotle da ima primarnu sposobnost da konvertuje DPA u DHA, sa sekudarnom aktivnošću u konverziji dokozatetraenske kiseline (DTA; 22:4 omega-6) u co-6 dokozapentaensku kiselinu (DPAn-6; 22:5 omega-6).
Na osnovu uloge, koju enzimi C20/22elongaza i delta-4 desaturaza igraju u sintezi DHA, postojao je značajan napor da se identifikuju i okarakterišu ovi enzimi iz različitih izvora. Kao takve, brojne C20/22elongaze bile su prikazane i u objavljenoj literaturi i u patentnoj literaturi (npr.,Pavlovasp. CCMP459 (GenBank Accession No. AAV33630),Ostreococcus tauri(GenBank Accession No. AAV67798) iThalassiosirapseudonana(GenBank Accession No. AAV67800)). Slično, bile su prikazane sledeće delta-4 desaturaze:Euglena gracilis(SEQ ID NO: 13; GenBank Accession No. AAQ19605; Meyer et al,Biochemistry,42(32):9779-9788 (2003));Thalassiosira pseudonana(SEQ ID NO:29; GenBank Accession No. AAX14506; Tonon et al.,FEBS J.,272(13):3401-3412 (2005));Thraustochytrium aureum(SEQ ID NO:27; GenBank Accession No. AAN75707);Thraustochytriumsp. (GenBank Accession No. CAD42496; U.S. Patent 7,087,432);Schizochytrium aggregatum(SEQ ID NO:28; PCT Publication No. WO 2002/090493);Pavlova lutheri(GenBank Accession No. AA098793) iIsochrysis galbana(SEQ ID NO:30; GenBank Accession No. AAV33631; Pereira et al.,Biochem. J.,384(2):357-366 (2004); PCT Publication No. WO 2002/090493)].
Ovlašćenik podnosioca prijave ima brojne patentne prijave, koje se odnose na proizvodnju PUFA-a u uljastim kvascima (t.j.,Yarrowii lipolytici),uključujući, primera radi: U.S. Patente No. 7,238,482 i No. 7,125,672; U.S. Application No. 11/265,761 (prijavljena 2. novembra 2005.); U.S. Application No. 11/264,784 (prijavljena 1. novembra 2005.); U.S. Application No. 11/264,737 (prijavljena 1. novembra 2005.).
U vezi s tim, PCT Publication No. WO 2004/071467 (publikovana 26. avgusta 2004.) se odnosi na proizvodnju PUFA-a u biljkama, dok se PCT Publication No. WO 2004/071178 (publikovanu 26. avgusta 2004.) odnosi na aneksin promotere i njihovu upotrebu u ekspresiji transgena u biljkama. Obe publikacije su prijave ovlašćenika podnosioca prijava, koje su istovremeno u toku.
IZLAGANJE SUŠTINE PRONALASKA
Ovaj pronalazak se odnosi na multizim, koji sadrži pojedinačni polipeptid, koji poseduje najmanje dve nezavisne enzimske aktivnosti, koje se mogu odvojiti.
U drugom ostvarenju, enzimske aktivnosti multizima mogu se odabrati iz grupe, koju sačinjavaju: elongaze masne kiseline, desaturaze masne kiseline, acil transferaze, acil CoA sintaze i tioesteraze. Određenije, enzimske aktivnosti mogu uključiti najmanje jednu elongazu masne kiseline, koja je povezana sa najmanje jednom desaturazom masne kiseline.
U trećem ostvarenju, multizim može uključiti prvu enzimsku aktivnost, koja je povezana sa drugom enzimskom aktivnošću, a navedena veza je odabrana iz grupe, koju sačinjava polipeptidna veza, SEQ ID NO: 198 (EgDHAsvnl linker), SEQ ID NO:200 (EgDHAsyn2 linker), SEQ ID NO:235 (EaDHAsynl linker), SEQ ID NO:438, SEQ ID NO:445, SEQ ID NO:472 i SEQ ID NO.504.
U četvrtom ostvarenju, pronalazak se odnosi na izolovani polinukleotid, koji kodira DHA sintazu, i koji uključuje: (a) nukleotidnu sekvencu, koja kodira polipeptid, koji ima aktivnost DHA sintaze, pri čemu polipeptid ima najmanje 80% aminokiselinskog identiteta, na osnovu Clustal V postupka slaganja, kada se uporedi sa aminokiselinskom sekvencom, kao stoje navedena u: SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:95, SEQ ID NO:96 ili SEQ ID NO:97; (b) nukleotidnu sekvencu, koja kodira polipeptid, koji poseduje aktivnost DHA sintaze, pri čemu nukleotidna sekvenca ima najmanje 80% identiteta sekvence, na osnovu BLASTN postupka slaganja, kada se uporedi sa nukleotidnom sekvencom, kao što je navedena u: SEQ ID NO:ll, SEQ ID NO:205, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:93 ili SEQ ID NO:410; (c) nukleotidnu sekvencu, koja kodira polipeptid, koji ima aktivnost DHA sintaze, pri čemu se nukleotidna sekvenca hibridizuje, pod strogim uslovima, u nukleotidnu sekvencu, kao što je navedena u: SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO:205, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:93 ili SEQ ID NO:410; ili (d) komplement nukleotidne sekvence pod (a), (b) ili (c), pri čemu se komplement i nukleotidna sekvenca sastoje od istog broja nukleotida i 100% su komplementarni.
U petom ostvarenju, pronalazak se odnosi na polinukleotid, koji kodira polipeptid, koji poseduje aktivnost DHA sintaze, pri čemu nukleotidna sekvenca obuhvata: SEQ ID NO:ll, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:93 ili SEQ ID NO:410.
U šestom ostvarenju, pronalazak se odnosi na polipeptid pronalaska, koji poseduje aktivnost DHA sintaze, pri čemu aminokiselinska sekvenca polipeptida uključuje: SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:95, SEQ ID NO:96 ili SEQ ID NO:97.
U sedmom ostvarenju, pronalazak se odnosi na izolovani polinukleotid, koji kodira C20 elongazu, i koji uključuje:
(a) nukleotidnu sekvencu, koja kodira polipeptid, koji poseduje aktivnost C20 elongaze, pri čemu polipeptid ima najmanje 80% aminokiselinskog identiteta, na osnovu Clustal V postupka slaganja, kada se uporedi sa aminokiselinskom sekvencom, kao što je navedena u: SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:95, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:97, SEQ ID NO:202 (domen C20 elongaze EgDHAsvnl), SEQ ID NO:204 (domen C20 elongaze EgDHAsyn2), SEQ ID NO:231 (domen C20 elongaze EaDHAsvnl), SEQ ID NO-.232 (domen C20 elongaze EaDHAsyn2) ili SEQ ID NO:233 (domen C20 elongaze EaDHAsyn3); (b) nukleotidnu sekvencu, koja kodira polipeptid, koji poseduje aktivnost C20 elongaze, pri čemu nukleotidna sekvenca ima najmanje 80% identiteta sekvence, na osnovu BLASTN postupka slaganja, kada se uporedi sa nukleotidnom sekvencom, kao što je navedena u: SEQ ID NO:l 1, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:93, SEQ ID NO: 183, SEQ ID NO: 188, SEQ ID NO:201 (domen C20 elongaze EgDHAsynl), SEQ ID NO:206 (domen C20 elongaze EgDHAsynl<*>), SEQ ID NO:203 (domen C20 elongaze EgDHAsyn2), SEQ ID NO:227 (domen C20 elongaze EaDHAsynl), SEQ ID NO:228 (domen C20 elongaze EaDHAsyn2), SEQ ID NO:229 (domen C20 elongaze EaDHAsyn3) ili SEQ ID NO:230 (domen C20 elongaze EaDHAsyn4); (c) nukleotidnu sekvencu, koja kodira polipeptid, koji poseduje aktivnost C20 elongaze, pri čemu se nukleotidna sekvenca hibridizuje, pod strogim uslovima, u nukleotidnu sekvencu, kao stoje navedena u: SEQ ID NO:ll, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:93, SEQ ID NO: 183, SEQ ID NO: 188, SEQ ID NO:201 (domen C20 elongaze EgDHAsynl), SEQ ID NO:206 (domen C20 elongaze EgDHAsynl<*>), SEQ ID NO:203 (domen C20 elongaze EgDHAsyn2), SEQ ID NO:227 (domen C20 elongaze EaDHAsynl), SEQ ID NO:228 (domen C20 elongaze EaDHAsyn2), SEQ ID NO:229 (domen C20 elongaze EaDHAsyn3) ili SEQ ID NO:230 (domen C20 elongaze EaDHAsyn4); ili (d) komplement nukleotidne sekvence pod (a), (b) ili (c), pri čemu se komplement i nukleotidna sekvenca sastoje od istog broja nukleotida i 100% su komplementarni.
U osmom ostvarenju, pronalazak se odnosi na izolovani polinukleotid, koji kodira delta-4 desaturazu, i koji uključuje: (a) nukleotidnu sekvencu, koja kodira polipeptid, koji poseduje aktivnost delta-4 desaturaze, pri čemu polipeptid ima najmanje 80% aminokiselinskog identiteta, na osnovu Clustal V postupka slaganja, kada se uporedi sa aminokiselinskom sekvencom, kao stoje navedena u: SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:95, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:97, SEQ ID NO:193, SEQ ID NO:215, SEQ ID NO:217, SEQ ID NO:221, SEQ ID NO:239, SEQ ID NO:240, SEQ ID NO:241, SEQ ID NO:246, SEQ ID NO:247, SEQ ID NO:248, SEQ ID NO:249, SEQ ID NO:382, SEQ ID NO:384, SEQ ID NO:386, SEQ ID NO:388, SEQ ID NO:404, SEQ ID NO:406 ili SEQ ID NO:408; (b) nukleotidnu sekvencu, koja kodira polipeptid, koji poseduje aktivnost delta-4 desaturaze, pri čemu nukleotidna sekvenca ima najmanje 80% identiteta sekvence, na osnovu BLASTN postupka slaganja, kada se uporedi sa nukleotidnom sekvencom, kao što je navedena u: SEQ ID NO:ll, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:93, SEQ ID NO:192, SEQ ID NO:214, SEQ ID NO:216, SEQ ID NO:220, SEQ ID NO:236, SEQ ID NO:237, SEQ ID NO:238, SEQ ID NO:242, SEQ ID NO:243, SEQ ID NO:244, SEQ ID NO:245, SEQ ID NO:381, SEQ ID NO:383, SEQ ID NO:385, SEQ ID NO:387, SEQ ID NO:403, SEQ ID NO:405 ili SEQ ID NO:407; (c) nukleotidnu sekvencu, koja kodira polipeptid, koji poseduje aktivnost delta-4 desaturaze, pri čemu se nukleotidna sekvenca hibridizuje, pod strogim uslovima, u nukleotidnu sekvencu, kao što je navedena u: SEQ ID NO:l 1, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:93, SEQ ID NO:214, SEQ ID NO:216, SEQ ID NO:220, SEQ ID NO:236, SEQ ID NO:237, SEQ ID NO:238, SEQ ID NO:242, SEQ ID NO:243, SEQ ID NO:244, SEQ ID NO:245, SEQ ID NO:381, SEQ ID NO:383, SEQ ID NO:385, SEQ ID NO:387, SEQ ID NO:403, SEQ ID NO:405 ili SEQ ID NO:407; ili (d) komplement nukleotidne sekvence pod (a), (b) ili (c), pri čemu se komplement i nukleotidna sekvenca sastoje od istog broja nukleotida i 100% su komplementarni.
U devetom ostvarenju, pronalazak se odnosi na izolovani polinukleotid, koji kodira DHA sintazu, pri čemu navedeni polinukleotid uključuje sekvencu, navedenu u bilo kojoj od: SEQ ID NO:ll, SEQ ID NO:205, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:93 ili SEQ ID NO:410.
U desetom ostvarenju, pronalazak se odnosi na izolovani polinukleotid, koji kodira C20 elongazu, pri čemu navedeni izolovani polinukleotid, koji kodira C20 elongazu, uključuje sekvencu, navedenu u bilo kojoj od: SEQ ID NO: 183, SEQ ID NO:188, SEQ ID NO:201 (domen C20 elongaze EgDHAsvnl), SEQ ID NO:206 (domen C20 elongaze EgDHAsvnl<*>), SEQ ID NO:203 (domen C20 elongaze EgDHAsyn2), SEQ ID NO:227 (domen C20 elongaze EaDHAsvnl), SEQ ID NO:228 (domen C20 elongaze EaDHAsyn2), SEQ ID NO:229 (domen C20 elongaze EaDHAsyn3) ili SEQ ID NO:230 (domen C20 elongaze EaDHAsyn4).
U jedanaestom ostvarenju, pronalazak se odnosi na izolovani polinukleotid, koji kodira delta-4 desaturazu, pri čemu navedeni polinukleotid uključuje sekvencu, navedenu u: SEQ ID NO:192, SEQ ID NO:214, SEQ ID NO:220, SEQ ID NO:236, SEQ ID NO:237, SEQ ID NO:238, SEQ ID NO:242, SEQ ID NO:243, SEQ ID NO:244, SEQ ID NO:245, SEQ ID NO:381, SEQ ID NO:383, SEQ ID NO:385, SEQ ID NO:387, SEQ ID NO:403, SEQ ID NO:405 ili SEQ ID NO:407.
U dvanaestom ostvarenju, pronalazak se odnosi na rekombinantnu konstrukciju, koja sadrži bilo koji od izolovanih polinukleotida pronalaska, koji su operativno povezani sa najmanje jednom regulatornom sekvencom.
U trinaestom ostvarenju, pronalazak se odnosi na ćeliju domaćina, koja, u svom genomu, sadrži rekombinantnu konstrukciju pronalaska. Određenije, ćelija domaćina je rekombinantna mikrobna ćelija domaćina, koja sadrži multizim pronalaska, pri čemu je prva enzimska aktivnost delta-9 elongaza, a druga enzimska aktivnost je delta-8 desaturaza. U drugom aspektu, prva enzimska aktivnost je C20 elongaza, a druga enzimska aktivnost je delta-4 desaturaza.
U četrnaestom ostvarenju, pronalazak se odnosi na transformisaniYarrowiasp., koja sadrži rekombinantnu konstrukciju pronalaska.
U petnaestom ostvarenju, pronalazak se odnosi na postupak za transformaciju ćelije, koji obuhvata transformisanje ćelije sa rekombinantnom konstrukcijom pronalaska i izbor onih ćelija, koje su transformisane sa navedenom rekombinantnom konstrukcijom.
U šesnaestom ostvarenju, pronalazak se odnosi na postupak za proizvodnju transformisane biljke, koji obuhvata transformisanje biljne ćelije sa bilo kojim od polinukleotida pronalaska i regenerisanje biljke iz transformisane biljne ćelije.
U sedamnaestom ostvarenju, pronalazak se odnosi na postupak za proizvodnju kvasca, koji obuhvata transformisanje ćelije kvasca sa bilo kojim od polinukleotida pronalaska i porast kvasca iz transformisane ćelije kvasca.
U osamnaestom ostvarenju, pronalazak se odnosi na biljku, koja, u svom genomu, sadrži rekombinantnu konstrukciju pronalaska. Takođe, od značaja su: semena, dobijena iz takvih biljaka, ulje, koje je dobijeno iz takvog semenja, hrana ili stočna hrana, koja uključuje takvo ulje, i piće, u koje je ugrađeno ulje pronalaska.
U devetnaestom ostvarenju, pronalazak se odnosi na izolovani molekul nukleinske kiseline, koji kodira C20 elongazu, kao što je navedeno u SEQ ID NO: 183, pri čemu je najmanje 147 kodona kodon-optimizovano za ekspresiju uYarromasp.
U dvadesetom ostvarenju, pronalazak se odnosi na izolovani molekul nukleinske kiseline, koji kodira C20 elongazu, kao što je navedeno u SEQ ID NO: 188, pri čemu su najmanje 134 kodona kodon-optimizovana za ekspresiju uYarrowiasp.
U dvadeset-prvom ostvarenju, pronalazak se odnosi na izolovani molekul nukleinske kiseline, koji kodira enzim delta-4 desaturazu, kao što je navedeno u SEQ ID NO: 192, pri čemu je najmanje 285 kodona kodon-optimizovano za ekspresiju uYarrowiasp.
U dvadeset-drugom ostvarenju, pronalazak se odnosi na postupak za izradu multizima, koji uključuje: (a) povezivanje prvog polipeptida sa najmanje jednim drugim polipeptidom, pri čemu svaki polipeptid ima nezavisnu enzimsku aktivnost, koja se može razdvojiti; i (b) procenu da li proizvod iz koraka (a) poseduje nezavisne enzimske aktivnosti, koje se mogu razdvojiti.
U dvadeset-trećem ostvarenju, pronalazak se odnosi na postupak za izmenu profila masnih kiselina biljke uljnog semena, koji uključuje: (a) transformaciju ćelije biljke uljnog semena sa rekombinantnom konstrukcijom pronalaska; (b) regenerisanje biljke iz transformisane ćelije biljke uljnog semena iz koraka (a), pri čemu biljka ima izmenjen profil masnih kiselina.
U dvadeset-četvrtom ostvarenju, pronalazak se odnosi na izolovani polinukleotid, koji kodira DGLA sintazu, i koji sadrži: (a) nukleotidnu sekvencu, koja kodira polipeptid, koji poseduje aktivnost DGLA sintaze, pri čemu je polipeptid naveden u: SEQ ID NO:441, SEQ ID NO:454, SEQ ID NO:461, SEQ ID NO:464, SEQ ID NO:471, SEQ ID NO:515, SEQ ID NO:516, SEQ ID NO:517, SEQ ID NO:518 ili SEQ ID NO:519; (b) nukleotidnu sekvencu, koja kodira polipeptid, koji poseduje aktivnost DGLA sintaze, pri čemu je nukleotida sekvenca navedena u: SEQ ID NO:440, SEQ ID NO:446, SEQ ID NO:453, SEQ ID NO:460, SEQ ID NO:463, SEQ ID NO:470, SEQ ID NO:492, SEQ ID NO:493, SEQ ID NO:494, SEQ ID NO:495 ili SEQ ID NO:496; (c) nukleotidnu sekvencu, koja kodira polipeptid, koji poseduje aktivnost DGLA sintaze, pri čemu se nukleotidna sekvenca hibridizuje pod strogim uslovima u nukleotidnu sekvencu, kao što je prikazana u: SEQ ID NO:440, SEQ ID NO:446, SEQ ID NO:453, SEQ ID NO:460, SEQ ID NO:463, SEQ ID NO:470, SEQ ID NO:492, SEQ ID NO:493, SEQ ID NO:494, SEQ ID NO:495 ili SEQ ID NO:496; ili (d) komplement nukleotidne sekvence pod (a), (b) ili (c), pri čemu se komplement i nukleotidna sekvenca sastoje od istog broja nukleotida i 100% su komplementarni.
U dvadeset-petom ostvarenju, pronalazak se odnosi na postupak za prevođenje linolne kiseline u dihomo gama-linolensku kiselinu, koji obuhvata:
(a) obezbeđivanje rekombinantne mikrobne ćelije domaćina, koja sadrži:
i) DGLA sintazu, koja sadrži:
1) najmanje jedan polipeptid, koji kodira delta-9 elongazu;
2) najmanje jedan polipeptid, koji kodira delta-8 desaturazu i
3) polipeptidnu spojnicu;
pri čemu je spojnica umetnuta između delta-9 elongaze i delta-8 desaturaze i
ii) izvor linolne kiseline i
b) rast ćelije domaćina pod a) pod uslovima, pod kojima je proizvedena dihomo gama-linolenska kiselina.
U dvadeset-šestom ostvarenju, pronalazak se odnosi na postupak za prevođenje a-linolenske kiseline u eikozatriensku kiselinu, koji obuhvata: (a) obezbeđivanje rekombinantne mikrobne ćelije domaćina, koja sadrži:
i) DGLA sintazu, koja sadrži:
1) najmanje jedan polipeptid, koji kodira delta-9 elongazu; 2) najmanje jedan polipeptid, koji kodira delta-8 desaturazu i 3) polipeptidnu spojnicu;
pri čemu je spojnica umetnuta između delta-9 elongaze i delta-8 desaturaze i
ii) izvor a-linolenske kiseline i
b) rast ćelije domaćina pod a) pod uslovima, pod kojima se proizvodi eikozatrienska kiselina.
U dvadeset-sedmom ostvarenju, pronalazak se odnosi na postupak za prevođenje eikozapentaenske kiseline u dokozaheksaensku kiselinu, koji obuhvata: (a) obezbeđivanje rekombinantne mikrobne ćelije domaćina, koja sadrži:
i) DHA sintazu, koja sadrži:
1) najmanje jedan polipeptid, koji kodira C20 elongazu; 2) najmanje jedan polipeptid, koji kodira delta-4 desaturazu i 3) polipeptidnu spojnicu; pri čemu je spojnica umetnuta između C20 elongaze i delta-4 desaturaze i ii) izvor eikozapentaenske kiseline i b) rast ćelije domaćina pod a) pod uslovima, pod kojima je proizvedena dokozaheksaenska kiselina.
U dvadeset-osmom ostvarenju, pronalazak se odnosi na postupak za prevođenje arahidonske kiseline u dokozapentaensku kiselinu, koji obuhvata: (a) obezbeđivanje rekombinantne mikrobne ćelije domaćina, koja sadrži:
i) DHA sintazu, koja sadrži:
1) najmanje jedan polipeptid, koji kodira C20 elongazu; 2) najmanje jedan polipeptid, koji kodira delta-4 desaturazu i 3) polipeptidnu spojnicu; pri čemu je spojnica umetnuta između C20 elongaze i delta-4 desaturaze i ii) izvor arahidonske kiseline i b) rast ćelije domaćina pod a) pod uslovima, pod kojima je proizvedena dokozapentaenska kiselina.
U dvadeset-devetom ostvarenju, pronalazak se odnosi na postupak za identifikaciju polipeptida, koji poseduje poboljšanu aktivnost delta-4 desaturaze, koji obuhvata: a) obezbeđivanje polipeptida delta-4 desaturaze divljeg tipa, izolovanog izEuglene anabene,koji poseduje bazalnu aktivnost delta-4 desaturaze; b) skraćivanje polipeptida divljeg tipa pod a) za oko 1 do oko 200 aminokiselina, da bi se stvorio skraćeni mutant polipeptid, koji poseduje aktivnost delta-4
desaturaze, koja je povećana u poređenju sa bazalnom aktivnošću delta-4 desaturaze.
U tridesetom ostvarenju, pronalazak se odnosi na ćeliju domaćina mikroba, koja proizvodi polinezasićenu masnu kiselinu i ekspresuje polipeptide, koji kodiraju enzime u sledećem sekvencijalnom putu:
1) delta-9 desaturazu,
2) delta-12 desaturazu,
3) delta-9 elongazu,
4) delta-8 desaturazu,
5) delta-5 desaturazu,
6) delta-17 desaturazu,
7) C20/22elongazu i
8) delta-4 desaturazu;
pri čemu polipeptidi sadrže najmanje jedan multizim, a fuzija obuhvata fuziju između najmanje jednog susednog enzimskog para.
BIOLOŠKI DEPOZITI
Sledeći biološki materijali su deponovani sa American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, i nose sledeće oznake, pristupne brojeve i datume deponovanja (Tabela 1).
KRATAK OPIS SLIKA I NABRAJANJA SEKVENCI
Pronalazak se može potpunije razumeti iz sledećeg detaljnog opisa, pratećih slika i spiska sekvenci, koji čine deo ove prijave.
SLIKA 1 jeste reprezentativni put omega-3 i omega-6 masne kiseline, koji je dat za konverziju miristinske kiseline, preko raznih intermedijera, u DHA.
SLIKA 2 prikazuje Clustal W slaganje između dela kodirajuće sekvence EgDHAsyn2 (SEQ ID NO:21), cDNK sekvence delta-4 desaturazeEuglene gracilis(SEQ ID NO:23) (NCBI Accession No. AY278558 (GI 33466345), lokusa AY278558, Meyer et al.,Biochemistry42(32):9779-9788 (2003)) i kodirajuće sekvence delta-4 desaturazeEuglene gracilis(SEQ ID NO:24) (Meyer et al.,supra).
SLIKE 3A i 3B prikazuju Clustal W slaganje između aminokiselinske sekvence EgDHAsynl (SEQ ID NO: 12), EgDHAsyn2 (SEQ ID NO:22) i EgC20elol
(SEQ ID NO:6).
SLIKE 4A i 4B prikazuju Clustal W slaganje N-terminusa EgDHAsynl (SEQ ID NO: 12) i N-terminusa EgDHAsyn2 (SEQ ID NO:22) sa EgC20elol (SEQ ID NO:6), C20-PUFA EloPavlovasp. CCMP459 (SEQ ID NO:2), PUFA elongazom 2Ostreococcus tauri(SEQ ID NO:25) (NCBI Accession No. AAV67798 (GI 55852396), lokusom AAV67798, CDS AY591336; Meyer et al.,J. Lipid Res.45(10): 1899-1909
(2004)) i PUFA elongazom 2Thalassiosire pseudonane(SEQ ID NO:26) (NCBI Accession No. AAV67800 (GI 55852441), lokusom AAV67800, CDS AY591338; Meyer et al.,J. Lipid Res.45(10): 1899-1909 (2004)).
SLIKE 5A, 5B, 5C i 5D prikazuju Clustal W slaganje C-terminusa EgDHAsynl (EgDHAsynl_CT; aminokiseline 253-793 SEQ ID NO: 12; N-terminus EgDHAsynl nije prikazan i označen je sa "...") i C-terminusa EgDHAsyn2
(EgDHAsyn2_CT; aminokiseline 253-793 SEQ ID NO:22, N-terminus EgDHAsyn2 nije prikazan i označen je sa "...") sa delta-4 desaturazom masne kiselineEuglene gracilis(SEQ ID NO: 13), delta-4 desaturazomThraustochytrium aureum(SEQ ID NO:27)
(NCBI Accession No. AAN75707 (GI 25956288), lokusom AAN75707, CDS AF391543), delta-4 desaturazomSchizochytrium aggregatum(SEQ ID NO:28) (PCT Publication No. WO 2002/090493), delta-4 desaturazomThalassiosire pseudonane(SEQ ID NO:29) (NCBI Accession No. AAX14506 (GI 60173017), lokusom AAX14506, CDS AY817156; Tonon et al,FEBS J.272 (13):3401-3412 (2005)) i delta-4 desaturazomIsochrysis galbane(SEQ ID NO:30) (NCBI Accession No. AAV33631 (GI 54307110), lokusom AAV33631, CDS AY630574; Pereira et al.,Biochem. J.,384(2):357-366 (2004) i PCT Publication No. WO 2002/090493).
SLIKA 6 prikazuje slaganje unutrašnjih fragmenata EgDHAsynl (EgDHAsynl_NCT; aminokiseline 253-365 SEQ ID NO: 12) i EgDHAsyn2 (EgDHAsyn2_NCT; aminokiseline 253-365 SEQ ID NO:22), koji obuhvataju i region C20 elongaze i domen delta-4 desaturaze (na bazi homologije) sa C-krajevima C20 elongaza (EgC20elol_CT; aminokiseline 246-298 SEQ ID NO:6; PavC20elo_CT, aminokiseline 240-277 SEQ ID NO:2; OtPUFAelo2_CT, aminokiseline 256-300 SEQ ID NO:25; TpPUFAelo2_CT, aminokiseline 279-358 SEQ ID NO:26) i N-krajevima delta-4 desaturaza (EgD4_NT; aminokiseline 1-116 SEQ ID NO:13; TaD4_NT, aminokiseline 1-47 SEQ ID NO:27; SaD4_NT, aminokiseline 1-47 SEQ ID NO:28; TpD4_NT, aminokiseline 1-82 SEQ IDNO:29; IgD4_NT, aminokiseline 1-43 SEQ IDNO:30).
SLIKA 7 daje mape plazmida za sledeće: (A) pY115 (vidi, takođe, SEQ ID NO:33); (B) Gateway<®>destinacioni vektor pBYlYarrowie lipolytice(vidi, takođe, SEQ ID NO:34); (C) Gateway<®>destinacioni vektor pY159Yarrowie lipolytice(vidi, takođe, SEQ ID NO:38) i (D) pBY-EgC20elol (vidi, takođe, SEQ ID NO:39).
SLIKA 8 pruža mape plazmida za sledeće: (A) pY132 (vidi, takođe, SEQ ID NO:40); (B) pY161 (vidi, takođe, SEQ ID NO:41); (C) pY164 (vidi, takođe, SEQ ID NO:42) i (D) pY141 (vidi, takođe, SEQ ID NO:49).
SLIKA 9 daje mape plazmida za sledeće: (A) pY143 (vidi, takođe, SEQ ID NO:52); (B) pY149 (vidi, takođe, SEQ ID NO:55); (C) pY150 (vidi, takođe, SEQ ID NO:62) i (D) pY156 (vidi, takođe, SEQ ID NO:64).
SLIKA 10 pruža mape plazmida za sledeće: (A) pY152 (vidi, takođe, SEQ ID NO:67); (B) pY157 (vidi, takođe, SEQ ID NO:69); (C) pY153 (vidi, takođe, SEQ ID NO:72) i (D) pY151 (vidi, takođe, SEQ ID NO:76).
SLIKA 11 je mapa pY160 (vidi, takođe, SEQ ID NO:77).
SLIKA 12 prikazuje hromatogram lipidnog profila ćelijskog ekstraktaEuglene anabaene,kao stoje opisano u Primerima.
SLIKE 13A, 13B i 13C prikazuju Clustal W slaganje aminokiselinskih sekvenci za EaDHAsvnl (SEQ ID NO:95), EaDHAsyn2 (SEQ ID NO:96), EaDHAsyn3 (SEQ ID NO:97) i EaDHAsyn4 (SEQ ID NO:98).
SLIKA 14 pruža mape plazmida za sledeće: (A) pY165 (vidi, takođe, SEQ ID NO:99); (B) pY166 (vidi, takođe, SEQ ID NO:100); (C) pY167 (vidi, takođe, SEQ ID NO:101) i (D) pY168 (vidi, takođe, SEQ ID NO:102).
SLIKA 15 daje mape plazmida za sledeće: (A) pKR1061 (vidi, takođe, SEQ ID NO:lll); (B) pKR973 (vidi, takođe, SEQ ID NO: 128); (C) pKR1064 (vidi, takođe, SEQ ID NO: 132) i (D) pKRl 133 (vidi, takođe, SEQ ID NO: 145).
SLIKA 16 pruža mape plazmida za sledeće: (A) pKRl 105 (vidi, takođe, SEQ ID NO:156); (B) pKR1134 (vidi, takođe, SEQ ID NO:161); (C) pKR1095 (vidi, takođe, SEQ ID NO:167) i (D) pKRl 132 (vidi, takođe, SEQ ID NO:170).
SLIKA 17 je mapa KS373 (vidi, takođe, SEQ ID NO:179).
SLIKA 18 prikazuje profile masnih kiselina, izračunati % elongacije i izračunati % desaturacije za klonove (sa izuzetkom pBY-EgC20elol), prikazane u Tabeli 24.
SLIKA 19 prikazuje profile masnih kiselina, izračunati % elongacije i izračunati % desaturacije za hranjenje sa EPA, za kontrolu samog vektora, pY141, pY143, pY149, pY156, pY157 i pY160.
SLIKA 20 prikazuje profile masnih kiselina, izračunati % elongacije i izračunati % desaturacije za hranjenje sa DPA za kontrolu samog vektora, pY141, pY150, pY151, pY152, pY153, pY156, pY157 i pY160.
SLIKA 21 pruža šematski prikaz relativne strukture domena za svaku konstrukciju, opisanu u Tabeli 25.
SLIKA 22 prikazuje profile masnih kiselina, izračunati % elongacije i izračunati % desaturacije za hranjenje sa EPA, ARA i DPA za ćelijeYarrowie,transformisane sa pY141 (EgDHAsvnl; SEQ ID NO:49) i kontrolu samog vektora.
SLIKA 23 prikazuje profile masnih kiselina za pojedinačne embrione iz reprezentativnog dešavanja u somatskim embrionima soje, transformisanim sa ekspresionim vektorima soje pKR973 i pKR1064 (vidi Tabelu 26).
SLIKA 24 prikazuje profile masnih kiselina iz pet najboljih elongacionih dešavanja u embrionima soje, transformisanim sa ekspresionim vektorom soje KS373.
SLIKA 25 daje sažeti prikaz vrednosti BLASTP-a i procenta identičnosti za EgC20elol (Primer 3), EgDHAsvnl (Primer 4) i EgDHAsyn2 (Primer 5).
SLIKA 26 prikazuje profile masnih kiselina iz hranjenja embriona soje sa EPA. Embrioni soje su odabrani od naboljih aktivnosti C20/delta-5 elongaze i delta-4 desaturaze u embrionima soje, transformisanim sa ekspresionim vektorom soje pKRl 105.
SLIKA 27 prikazuje hromatogram lipidnog profila ćelijskog ekstraktaEuglene gracilis,kao što je opisano u Primerima.
SLIKA 28 je mapa pKRl 183 (vidi, takođe, SEQ ID NO:266).
SLIKA 29 sažeto prikazuje sekvence domena DHA sintazeEuglene
anabaene.
SLIKA 30 je mapa pKR1253 (vidi, takođe, SEQ ID NO:270).
SLIKA 31 je mapa pKR1255 (vidi, takođe, SEQ ID NO:275).
SLIKA 32 je mapa pKRl 189 (vidi, takođe, SEQ ID NO:285).
SLIKA 33 je mapa pKR1229 (vidi, takođe, SEQ ID NO:296).
SLIKA 34 je mapa pKR1249 (vidi, takođe, SEQ ID NO:297).
SLIKA 35 je mapa pKR1322 (vidi, takođe, SEQ ID NO:314).
SLIKA 36 prikazuje profile masnih kiselina za pet slučajeva, transformisanih sa pKR1189, koji imaju najniži prosečan sadržaj ALA (srednja vrednost 5 analiziranih somatskih embriona soje) zajedno sa slučajem (2148-3-8-1), koji ima profil masnih kiselina, koji je uobičajen za divlji tip embriona u ovom eksperimentu. Masne kiseline su identifikovane kao: 16:0 (palmitat), 18:0 (stearinska kiselina), 18:1 (oleinska kiselina), LA i ALA. Smeše masnih kiselina su izražene u vidu težinskog procenta (wt.%) ukupnih masnih kiselina.
SLIKA 37 prikazuje profile masnih kiselina za pet slučajeva, transformisanih sa pKRl 183, koji imaju najviši prosečni sadržaj DGLA (srednja vrednost 5 analiziranih somatskih embriona soje). Masne kiseline su identifikovane kao: 16:0 (palmitat), 18:0 (stearinska kiselina), 18:1 (oleinska kiselina), LA, ALA, EDA, ERA, DGLA i ETA. Smeše masnih kiselina su izražene kao težinski procenat (wt. %) ukupnih masnih kiselina.
SLIKA 38 prikazuje prosečne profile masnih kiselina (srednja vrednost za 10 somatskih embriona soje) za 20 slučajeva, transformisanih sa pKR1249 i pKR1253, koji imaju najveću ARA. Masne kiseline su identifikovane kao: 16:0 (palmitat), 18:0 (stearinska kiselina), 18:1 (oleinska kiselina), LA, ALA, EDA, SCI, DGLA, ARA, ERA, JUN, ETA i EPA. Smeše masnih kiselina su izražene kao težinski procenat (wt. %) ukupnih masnih kiselina. Masne kiseline, navedene kao "ostale" uključuju: 18:2 (5,9), 18:3 (5,9,12), STA, 20:0, 20:1 (11), 20:2 (7,11) ili 20:2 (8,11) i DPA.
SLIKA 39 prikazuje tekuće profile masnih kiselina za svaki somatski embrion soje iz jednog slučaja (AFS 5416-8-1-1), koji ima prosečan sadržaj ARA od 17.0% i prosečan sadržaj EPA od 1.5%. Masne kiseline su identifikovane kao: 16:0 (palmitat), 18:0 (stearinska kiselina), 18:1 (oleinska kiselina), LA, ALA, EDA, SCI, DGLA, ARA, ERA, JUN, ETA i EPA. Smeše masnih kiselina su izražene kao težinski procenat (wt. %) ukupnih masnih kiselina. Masne kiseline, navedene kao "ostale", uključuju: 18:2 (5,9), 18:3 (5,9,12), STA, 20:0, 20:1 (11), 20:2 (7,11) ili 20:2 (8,11) i
DPA.
SLIKA 40 prikazuje prosečne profile masnih kiselina (srednja vrednost za 9 ili 10 somatskih embriona soje) za 20 slučajeva, transformisanih sa pKR1249 i pKR1255, koji imaju najveću ARA. Masne kiseline su identifikovane kao: 16:0 (palmitat), 18:0 (stearinska kiselina), 18:1 (oleinska kiselina), LA, ALA, EDA, SCI, DGLA, ARA, ERA, JUN, ETA i EPA; smeše masnih kiselina su izražene kao težinski procenat (wt. %) ukupnih masnih kiselina. Masne kiseline, navedene kao "ostale" uključuju: 18:2 (5,9), 18:3 (5,9,12), STA, 20:0, 20:1 (11), 20:2 (7,11) ili 20:2 (8,11) i DPA.
SLIKA 41 prikazuje profile masnih kiselina iz ishrane embriona sa EPA. Embrioni soje su odabrani od slučajeva sa najboljim aktivnostima C20/delta-5 elongaze i delta-4 desaturaze u embrionima soje, transformisanim sa ekspresionim vektorom soje pKRl 134. Masne kiseline na SLICI 41 su identifikovane kao: 16:0 (palmitat), 18:0 (stearinska kiselina), 18:1 (oleinska kiselina), LA, ALA, EPA, 22:0 (dokozanska kiselina), DPA, 24:0 (tetrakozanska kiselina), DHA i 24:1 (nevonska kiselina). Smeše masnih kiselina, nabrojane na SLICI 41 izražene su u vidu težinskog procenta (wt. %) ukupnih masnih kiselina.
SLIKA 42 prikazuje profile masnih kiselina iz ishrane embriona soje sa EPA. Embrioni soje su odabrani od slučajeva sa najboljim aktivnostima C20/delta-5 elongaze i delta-4 desaturaze iz 20 novih slučajeva, analiziranih za soju, transformisanu sa pKR1105. Masne kiseline na SLICI 42 su identifikovane kao: 16:0 (palmitat), 18:0 (stearinska kiselina), 18:1 (oleinska kiselina), LA, ALA, EPA, 22:0 (dokozanska kiselina), DPA, 24:0 (tetrakozanska kiselina), DHA i 24:1 (nevonska kiselina). Smeše masnih kiselina, nabrojane na SLICI 42, izražene su u vidu težinskog procenta (wt. %) ukupnih masnih kiselina.
SLIKA 43 prikazuje grafikon, koji opisuje relativne aktivnosti slučajeva, transformisanih sa pKR1105 (C20 elongaza i delta-4 desaturaza, pojedinačno ekspresovane) ili pKRl 134 (C20 elongaza i delta-4 desaturaza ekspresovane kao fuzija), kada su embrioni soje hranjeni sa EPA.
SLIKA 44 prikazuje u vidu dijagrama razvoj sojaYarrowia lipolyticaY4305U3.
SLIKA 45 prikazuje mape plazmida za sledeće: (A) pZKLeuN-29E3 i (B) pY116.
SLIKA 46 daje mape plazmida za sledeće: (A) pK02UF8289 i (B) pZKSL-555R.
SLIKA 47 prikazuje mape plazmida za sledeće: (A) pZP3-Pa777U i (B) pY117.
SLIKA 48 daje mape plazmida za sledeće: (A) pZP2-2988 i (B) pZKUE3S.
SLIKA 49 daje mape plazmida za sledeće: (A) pZKL2-5U89GC i (B) pZKLl-2SP98C.
SLIKA 50 pruža mape plazmida za sledeće: (A) pZKUM i (B) pZKD2-5U89A2.
SLIKA 51A prikazuje, u vidu dijagrama, razvoj sojaYarrowia lipolyticaY4184U.
SLIKA 51B pruža mapu plazmida za pEgC20ES.
SLIKA 52 pruža mape plazmida za sledeće: (A) pZUFmEgC20ES i (B) pZKL4-220EA4. SLIKA 52C je šematska slika, koja prikazuje preklapanje 3' regiona domena EaC20E (SEQ ID NO:231) sa 5' regionom domena EaD4 (SEQ ID NO:246) unutar EaDHAsvnl (SEQ ID NO:95).
SLIKA 53A prikazuje slaganje između N-krajeva EaD4S (SEQ ID NO: 193), EaD4S-l (SEQ ID NO:382), EaD4S-2 (SEQ ID NO:384) i EaD4S-3 (SEQ ID NO:386). SLIKA 53B prikazuje slaganje između N-krajeva EgD4S (SEQ ID NO:388), EgD4S-l (SEQ ID NO:404), EgD4S-2 (SEQ ID NO:406) i EgD4S-3 (SEQ ID NO:408).
SLIKA 54 pruža mape plazmida za sledeće: (A) pZKLY-G204, (B) pEgC20ES-K, (C) pYNTGUSl-CNP i (D) pZKLY.
SLIKA 55 daje mape plazmida za sledeće: (A) pZUFmG9G8fu i (B) pZUFmG9A8.
SLIKA 56 je mapa pKR1014.
SLIKA 57 je mapa pKRl 152.
SLIKA 58 je mapa pKRl 151.
SLIKA 59 je mapa pKR1150.
SLIKA 60 je mapa pKRl 199.
SLIKA 61 je mapa pKR1200.
SLIKA 62 je mapa pKRl 184.
SLIKA 63 je mapa pKRl321.
SLIKA 64 je mapa pKR1326.
Na SLIKAMA 65-71, masne kiseline su identifikovane kao: 16:0 (palmitat), 18:0 (stearinska kiselina), 18:1 (oleinska kiselina), LA, ALA, EDA, ERA, DGLA i ETA, a smeše masnih kiselina su izražene kao težinski procenat (wt. %) ukupnih masnih kiselina. Dodatno, elongaciona aktivnost je izražena kao % delta-9 elongacije C18 masnih kiselina (Cl 8% delta-9 elong), izračunata prema sledećoj formuli: ([proizvod]/[supstrat + proizvod])<*>100. Određenije, kombinovani procenat elongacije za LA i ALA je određen kao : ([DGLA + ETA + EDA + ERA]/[LA + ALA + DGLA + ETA + EDA + ERA])* 100. Sjedinjeni procenat desaturacije za EDA i ERA prikazan je kao "C20% delta-8 desat" i određen kao: ([DGLA + ETA]/[DGLA + ETA + EDA + ERA])* 100, a takođe je označen kao ukupan % desaturacije.
SLIKA 65 prikazuje profile masnih kiselina za pet slučajeva, transformisanih sa pKR1014, koji imaju najviši prosečni sadržaj DGLA (srednja vrednost 5 analiziranih somatskih embriona soje).
SLIKA 66 prikazuje profile masnih kiselina za pet slučajeva, transformisanih sa pKR1152, koji imaju najviši prosečni sadržaj DGLA (srednja vrednost 5 analiziranih somatskih embriona soje).
SLIKA 67 prikazuje profile masnih kiselina za pet slučajeva, transformisanih sa pKR1151, koji imaju najviši prosečni sadržaj DGLA (srednja vrednost 5 analiziranih somatskih embriona soje).
SLIKA 68 prikazuje profile masnih kiselina za pet slučajeva, transformisanih sa pKR1150, koji imaju najviši prosečni sadržaj DGLA (srednja vrednost 5 analiziranih somatskih embriona soje).
SLIKA 69 prikazuje profile masnih kiselina za pet slučajeva, transformisanih sa pKR1199, koji imaju najviši prosečni sadržaj DGLA (srednja vrednost 5 analiziranih somatskih embriona soje).
SLIKA 70 prikazuje profile masnih kiselina za pet slučajeva, transformisanih sa pKR1200, koji imaju najviši prosečni sadržaj DGLA (srednja vrednost 5 analiziranih somatskih embriona soje).
SLIKA 71 prikazuje profile masnih kiselina za pet slučajeva, transformisanih sa pKRl 184, koji imaju najviši prosečni sadržaj DGLA (srednja vrednost 5 analiziranih somatskih embriona soje).
SLIKA 72 prikazuje poređenje pojedinačno ekspresovanih delta-9 elongaza sa delta-8 desaturazama u odnosu na ekvivalentnu fuziju delta-9 elongaza-delta-8 desaturaza. Svaka tačka podataka predstavlja prosečan % DGLA ili % EDA za 5-6 embriona (kao % ukupnih masnih kiselina) za sve analizirane slučajeve, a prosečan % DGLA je ucrtan u krivu prema prosečnom % EDA. Pod (A) EgTpom predstavlja EgD9e, ko-ekspresovanu sa TpomD8 (pKR1014), a EgTpomfus predstavlja EgD9e/TpomD8 fuziju (pKRl 199). Pod (B) EgEa predstavlja EgD9e, ko-ekspresovanu sa EaD8
(pKRl 152), a EgEafus predstavlja fuziju EgD9e/EaD8 (pKR1200). Pod (C) EaTpom predstavlja EaD9e, ko-ekspresovanu sa TpomD8 (pKRl 151), a EaTpomfus predstavlja fuziju EaD9e/TpomD8 (pKR1183). Na SLICI (D) EeEa predstavlja EaD9e, ko-ekspresovanu sa EaD8 (pKR1150), a EaEafus predstavlja fuziju EaD9e/EaD8 (pKR1200).
SLIKA 73 prikazuje profile masnih kiselina za pet slučajeva, transformisanih sa pKR1322 (Eksperiment MSE2274), koji imaju najviši prosečni sadržaj ARA i EPA (srednja vrednost 5 analiziranih embriona). Masne kiseline su identifikovane kao: 16:0 (palmitat), 18:0 (stearinska kiselina), 18:1 (oleinska kiselina), 18:2 (5,9), LA, ALA, EDA, ERA, SCI, DGLA, JUN (nazvan, takođe, JUP), ETA, ARA i EPA. Smeše masnih kiselina su izražene kao težinski procenat (wt. %) ukupnih masnih kiselina. Aktivnost elongacije je izražena kao % delta-9 elongacije Cl8 masnih kiselina (%Elo), izračunat prema sledećoj formuli: ([proizvod]/[supstrat + proizvod])* 100. Određenije, sjedinjeni procenat elongacije za LA i ALA je određen kao : ([DGLA + ETA + EDA + ERA + EPA + ARA]/[LA + ALA + DGLA + ETA + EDA + ERA + EPA + ARA])* 100. Sjedinjeni procenat delta-8 desaturacije za EDA i ERA prikazan je kao "%D8" i određen kao: ([DGLA + ETA + EPA + ARA]/[DGLA + ETA + EDA + ERA + EPA + ARA])* 100. Ovo je, takođe, označeno kao ukupan % delta-8 desaturacije. Sjedinjeni procenat delta-5 desaturacije za DGLA i ETA prikazan je kao "%D5" i određen kao: ([EPA + ARA]/[DGLA + ETA + EPA + ARA])* 100. Ovo je, takođe, označeno kao ukupan % delta-5 desaturacije.
SLIKA 74 prikazuje profile masnih kiselina za pet slučajeva, transformisanih sa pKR1326 (Eksperiment MSE2275), koji imaju najviši prosečni sadržaj DGLA i ETA (srednja vrednost 5 analiziranih embriona). Masne kiseline su identifikovane kao: 16:0 (palmitat), 18:0 (stearinska kiselina), 18:1 (oleinska kiselina), LA, ALA, EDA, ERA, DGLA i DGLA i ETA. Smeše masnih kiselina su izražene kao težinski procenat (wt. %) ukupnih masnih kiselina. Aktivnost elongacije je izražena kao % delta-9 elongacije C18 masnih kiselina (Cl8% delta-9 elong), koji je izračunat prema sledećoj formuli: ([proizvod]/[supstrat + proizvod])* 100. Određenije, sjedinjeni procenat elongacije za LA i ALA je određen kao : ([DGLA + ETA + EDA + ERA]/[LA + ALA + DGLA + ETA + EDA + ERA])* 100. Sjedinjeni procenat desaturacije za EDA i ERA prikazan je kao "C20% delta-8 desat" i određen kao: ([DGLA + ETA]/[DGLA + ETA + EDA + ERA])* 100. Ovo je, takođe, označeno kao ukupan % desaturacije.
Opisi sekvenci su sažeto prikazani u ovde priloženom Spisku sekvenci. Spisak sekvenci sadrži jednoslovne kodove za karaktere nukleotidne sekvence, i kodove od jednog i tri slova za aminokiseline, kao što je defmisano u IUPAC-IUB standardima, koji su opisani uNucleic Acids Research13:3021-3030 (1985) i uBiochemical Journal219(2):345-373 (1984).
SEQ ID NO-i:l-519 su prajmeri, kodirajući geni ORF-a, proteini (ili njihovi delovi) ili plazmidi, kao što su označeni u Tabeli 2.
DETALJAN OPIS PRONALASKA
Izlaganje svake ovde navedene reference je ovde obuhvaćeno u svojoj celosti kao referenca.
Ovaj pronalazak se odnosi na multizime, kao što je DHA sintaza. Oni su, između ostalog, korisni za upravljanje biohemijskim putevima za proizvodnju zdravih PUFA-a i, određenije, za proizvodnju dokozaheksaenske kiseline (DHA). Iz tih razloga, predmet pronalaska nalazi mnoge primene. PUFA-e ili njihovi derivati, koji su proizvedeni, ovde izloženim, postupcima, mogu biti upotrebljeni kao hranjive zamene ili suplementi, posebno kao dečje formule, za pacijente koji su podvrgnuti intravenskoj ishrani ili za prevenciju ili lečenje malnutricije.
Alternativno, prečišćene PUFA-e (ili njihovi derivati) mogu biti ugrađeni u ulja za kuvanje, masti ili margarine, koji su formulisani tako da bi, u uobičajenoj upotrebi, primalac primio željenu količinu za dopunu ishrane. PUFA-e mogu, takođe, biti uključene u dečje formule, nutritivne suplemente ili druge hranjive proizvode, a mogu naći primenu i u vidu anti-inflamatornih agenasa ili agenasa za snižavanje holesterola. Opciono, smeše mogu biti korišćene za farmaceutsku upotrebu (humanu ili veterinarsku). U ovom slučaju, PUFA-e se uopšteno primenjuju oralno, ali se mogu primenjivati bilo kojim putem kojim se one mogu uspešno apsorbovati, npr., parenteralno (npr., subkutano, intramuskularno ili intravenski), rektalno, vaginalno ili površinski (npr., kao mast ili losion za kožu).
Kod ljudi ili životinja, nadoknađivanje sa PUFA-ama, proizvedenim rekombinantnim sredstvima, može dovesti do povećanih nivoa dodatih PUFA-a, kao i njihovih metaboličkih sledbenika. Na primer, tretman sa EPA može proizvesti, povećane nivoe ne samo EPA, već, isto tako, i nishodnih metaboličkih proizvoda EPA, kao što su eikozanoidi (t.j., prostaglandini, leukotrieni, tromboksani). Složeni regulatorni mehanizmi mogu učiniti poželjnim da se kombinuju različite PUFA-e, ili da se dodaju različiti konjugati PUFA-a, da bi se prevenirali, kontrolisali ili savladali takvi mehanizmi, kako bi se postigli željeni nivoi specifičnih PUFA-a kod pojedinca.
Definicije
Kao što su korišćene ovde i u priključenim patentnim zahtevima, forme jednine (u engleskom "a", "an" i "the") uključuju referencu u množini, ukoliko kontekst jasno ne nalaže drugačije. Tako, primera radi, referenca koja se odnosi na "biljku", uključuje mnoštvo takvih biljaka, referenca, koja se odnosi na "ćeliju" uključuje jednu ili više ćelija, i njihovih ekvivalenata, koji su poznati licima, stručnim u ovoj oblasti, i tako dalje.
Izraz "pronalazak" ili "ovaj pronalazak", kao što je ovde korišćen, ne bi trebalo shvatiti kao ograničenje na bilo koje specifično ostvarenje pronalaska, već se uopšteno primenjuje na bilo koje i na sva ostvarenja pronalaska, kao što je opisano u patentnim zahtevima i specifikaciji.
U kontekstu ovog izlaganja, korišćeni su brojni termini i skraćenice. Date su sledeće definicije.
"Okvir otvoren za čitanje" ima skraćenicu ORF.
"Lančana polimeraza reakcija" ima skraćenicu PCR.
"Američki tip skupljanja kulture" ima skraćenicu ATCC.
"Polinezasićena masna kiselina(e)" ima skraćenicu PUFA(e). 'Triacilglicerol(i)" ima(ju) skraćenicu TAG(i).
Izrazi "nishodno regulisati ili nishodna regulacija", kao što su ovde korišćeni, odnose se na redukciju ili smanjivanje nivoa ekspresije gena ili polinukleotida.
Izraz "multizim" odnosi se na pojedinačni polipeptid, koji poseduje najmanje dve nezavisne enzimske aktivnosti, koje se mogu razdvojiti. Poželjno, multizim uključuje prvu enzimsku aktivnost, povezanu sa drugom enzimskom aktivnošću.
Izraz "fuzioni protein" je korišćen naizmenično sa izrazom "multizim". Sledstveno tome, izraz "fuzioni protein" se odnosi na pojedinačni polipeptid, koji poseduje najmanje dve nezavisne enzimske aktivnosti, koje se mogu razdvojiti.
Izraz "fuzioni gen" se odnosi na polinukleotid ili gen, koji kodira multizim. Fuzioni gen se može izgraditi spajanjem najmanje dva DNK fragmenta, pri čemu svaki fragment DNK kodira nezavisnu enzimsku aktivnost, koja se može odvojiti. Primer fuzionog gena je opisan ovde, u nastavku, u Primeru 38, u kome je gen fuzije Hibridl-HGLA sintaze konstruisan spajanjem delta-9 elongazeEuglene anabaene(EaD9Elol; SEQ ID NO:252) i delta-8 desaturazeTetruetreptie pomquetensisCCMP1491 (TpomD8; SEQ ID NO: 162), koristeći prolinom bogatu spojnicu DHA sintaze 1Euglene gracilis(EgDHAsvnlLink; SEQ ID NO:197).
"Domen" ili 'funkcionalni domen" je zasebni, neprekinuti deo ili subsekvenca polipeptida, koja može biti povezana sa funkcijom (npr., enzimskom aktivnošću). Kao što je ovde korišćen, izraz "domen" uključuje, ali se njima ne ograničava, biosintetske enzime masne kiseline i delove biosintetskih enzima masne kiseline, koji zadržavaju enzimsku aktivnost.
"DHA sintaza" je primer multizima. Određeno, DHA sintaza uključuje C20 elongazu, vezanu za delta-4 desaturazu, koristeći bilo koju, od ovde opisanih, spojnica. Drugi primer multizima je pojedinačni polipeptid, koji uključuje delta-9 elongazu, povezanu sa delta-8 desaturazom, kao što je razmotreno u nastavku.
Izraz "veza (link)" odnosi se na spajanje ili povezivanje najmanje dva polipeptida, koji poseduju nezavisne enzimske aktivnosti, koje se mogu razdvojiti.
Izraz "spojnica (linker)" odnosi se na vezu ili spoj između dva ili više polipeptida, od kojih svaki poseduju nezavisne enzimske aktivnosti, koje se mogu razdvojiti.
Veza, koja je korišćena za obrazovanje multizima sastavljena je minimalno od jedne polipeptidne veze. S drugog aspekta, veza može biti sastavljena od aminokiselinskog ostatka, kao što je prolin, ili polipeptida. Ukoliko je veza polipeptid, može biti poželjno da veza ima najmanje jedan prolinski aminokiselinski ostatak.
Primer spojnice je prikazan u SEQ ID NO: 198 (prolinom bogata spojnica EgDHAsvnl)
Izraz "masne kiseline" odnosi se na alifatične kiseline dugog lanca (alkanske kiseline) različitih dužina lanaca, od oko C12do C22(mada su poznate i kiseline dužeg lanca i kiseline kraćeg lanca). Preovlađujuće dužine lanaca su između Ci6i C22. Dodatni detalji, koji se odnose na diferencijaciju između "zasićenih masnih kiselina" i "nezasićenih masnih kiselina", "mononezasićenih masnih kiselina" i "polinezasićenih masnih kiselina" (ili "PUFA-a") i "omega-6 masnih kiselina" (00-6 ilin- 6)i "omega-3 masnih kiselina" (omega-3 ilin- 3)dati su u U.S. Patentu 7,238,482.
Masne kiseline su, ovde, opisane jednostavnim sistemom označavanja "X:Y", gde je X ukupan broj atoma ugljenika (C) u pojedinoj masnoj kiselini, a Y je broj dvostrukih veza. Broj, koji sledi oznaku masne kiseline, ukazuje na položaj dvostruke veze od karboksilnog kraja masne kiseline sa "c" dodatkom za c/s-konfiguraciju dvostruke veze (npr., palmitinska kiselina (16:0), stearinska kiselina (18:0), oleinska kiselina (18:1, 9c), petroselinska kiselina (18:1, 6c), LA (18:2, 9c, 12c), GLA (18:3, 6c,9c,12c) i ALA (18:3, 9c,12c,15c)). Ukoliko nije drugačije naznačeno, 18:1, 18:2 i 18:3 se odnose na oleinsku, LA, odnosno ALA masnu kiselinu. Ako nije specifično zabeleženo kao drugačije, smatra se da su dvostruke vezeciskonfiguracije. Na primer, smatralo bi se da su dvostruke veze u 18:2 (9,12) uciskonfiguraciji.
Nomenklatura, koja je korišćena za opisivanje PUFA-a u ovom izlaganju, prikazana je ispod, u Tabeli 3. U koloni, pod naslovom "stenografska oznaka", korišćen je omega-referentni sistem za označavanje broja ugljenika, broja dvostrukih veza i položaja dvostruke veze, koja je najbliža omega ugljeniku, brojčano računajući od omega ugljenika (koji je, za ovu svrhu, označen brojem 1). Ostatak tabele sažeto navodi opšta imena omega-3 i omega-6 masnih kiselina i njihovih prekursora, skraćenice, koje će biti korišćene kroz ostatak specifikacije i hemijski naziv svakog jedinjenja.
Metabolički ili biosintetski put, u biohemijskom smislu, mogu se smatrati serijama hemijskih reakcija, koje se dešavaju unutar ćelije, i koje su katalizovane enzimima, kako bi se postiglo ili formiranje metaboličkog proizvoda, koji bi bio korišćen ili skladišten u ćeliji, ili pokretanje drugog metaboličkog puta (nazvanog, tada, korakom proizvođenja fluksa). Mnogi od ovih puteva su elaborirani i uključuju modifikovanje početne supstance, korak po korak, kako bi se oblikovala u proizvod, koji ima željenu egzaktnu hemijsku strukturu.
Izraz "biosintetski put PUFA" odnosi se na metabolički proces koji konvertuje oleinsku kiselinu u LA, EDA, GLA, DGLA, ARA, DTA, DPAn-6, ALA, STA, ETrA, ETA, EPA, DPA i DHA. Ovaj proces je dobro opisan u literaturi (npr., vidi PCT Publication No. WO 2006/052870). Pojednostavljeno, ovaj proces uključuje elongaciju ugljeničnog lanca preko adicije atoma ugljenika i desaturaciju molekula, putem adicije dvostrukih veza, posredstvom serija specijalnih enzima desaturacije i elongacije (t.j., "enzima biosintetskog puta PUFA"), koji su prisutni u membrani endoplazmatskog retikuluma. Još određenije, "enzimi biosintetskog puta PUFA" odnose se na bilo koji od sledećih enzima (i na gene, koji kodiraju navedene enzime), koji su povezani sa biosintezom PUFA, a koji uključuju: delta-4 desaturazu, delta-5 desaturazu, delta-6 desaturazu, delta-12 desaturazu, delta-15 desaturazu, delta-17 desaturazu, delta-9 desaturazu, delta-8 desaturazu, delta-9 elongazu, C14/16elongazu, C16/18elongazu, Cimo elongazu, C20/22elongazu, DHA sintazu i/ili multizim tekućeg pronalaska.
Izraz "biosintetski put omega-3/omega-6 masne kiseline" odnosi se ne set gena, koji, kada se ekspresuju, pod odgovarajućim uslovima, kodiraju enzime, koji katalizuju proizvodnju ili jedne ili obe omega-3 i omega-6 masne kiseline. Uobičajeno, geni koji su uključeni u biosintetski put omega-3/omega-6 masne kiseline, kodiraju enzime biosintetskog puta PUFA-e. Reprezentativni put je ilustrativno prikazan na Slici 1, dajući konverziju mir istinske kiseline preko raznih intermedijera u DHA, demonstrirajući, na taj način, kako obe masne kiseline i omega-3 i omega-6, mogu biti proizvedene iz zajedničkog izvora. Put se prirodno razdvaja na dva dela, pri čemu će jedan deo proizvesti omega-3 masne kiseline, a drugi deo omega-6 masne kiseline.
Izraz "funkcionalan", kako je ovde korišćen u kontekstu biosintetskog puta omega-3/omega-6 masne kiseline, znači da neki (ili svi) geni u putu, ekspresuju aktivne enzime, što dovodi doin vivokatalize ili konverzije supstrata. Treba imati na umu da "biosintetski put omega-3/omega-6 masne kiseline" ili "funkcionalni biosintetski put omega-3/omega-6 masne kiseline" ne podrazumeva da su potrebni svi geni enzima PUFA biosintetskog puta, s obzirom na to da će brojni proizvodi masnih kiselina zahtevati jedino ekspresiju podgrupe gena ovog puta.
Izraz "put delta-6 desaturaze/delta-6 elongaze" se odnosi na PUFA biosintetski put, koji minimalno obuhvata najmanje jednu delta-6 desaturazu i najmanje jednu C18/20elongazu, omogućujući time biosintezu DGLA i/ili ETA iz LA, odnosno ALA, sa GLA i/ili STA kao intermedijernim masnim kiselinama. Ekspresijom ostalih desaturaza i elongaza, mogu se, isto tako, sintetisati ARA, DTA, DPAn-6, EPA, DPA i
DHA.
Izraz "put delta-9 elongaze/delta-8 desaturaze" se odnosi na PUFA biosintetski put, koji minimalno obuhvata najmanje jednu delta-9 elongazu i najmanje jednu delta-8 desaturazu, omogućujući time biosintezu DGLA i/ili ETA iz LA, odnosno ALA, sa EDA i/ili ETrA, kao intermedijernim masnim kiselinama. Ekspresijom ostalih desaturaza i elongaza, takođe se mogu sintetisati ARA, DTA, DPAn-6, EPA, DPA i DHA. Ovaj put može biti pogodan u nekim ostvarenjima, budući da je biosinteza GLA i/ili STA isključena.
Izraz "intermedijerna masna kiselina" odnosi se na bilo koju masnu kiselinu, koja se proizvede metaboličkim putem masne kiseline, a koja se dalje može prevesti u željeni proizvod masne kiseline na ovom putu, dejstvom enzima drugog metaboličkog puta. Primera radi, kada se, koristeći put delta-9 elongaze/delta-8 desaturaze, proizvede EPA, mogu se proizvesti: EDA, ETrA, DGLA, ETA i ARA, koje se smatraju "intermedijernim masnim kiselinama", budući da se ove masne kiseline dalje mogu prevesti u EPA, dejstvom enzima drugog metaboličkog puta.
Izraz "masna kiselina nus-proizvod" odnosi se na bilo koju masnu kiselinu, proizvedenu metaboličkim putem masne kiseline, koja nije željeni proizvod masne kiseline ovog puta, niti je "intermedijerna masna kiselina" tog puta. Na primer, kada se korišćenjem puta delta-9 elongaze/delta-8 desaturaze, proizvede EPA, takođe se mogu proizvesti skiadonska kiselina (SCI) i juniperonska kiselina (JUP), dejstvom delta-5 desaturaze na EDA, odnosno ETrA. One se smatraju "masnim kiselinama nus-proizvodima", budući da se nijedna ne može dalje konvertovati u EPA, dejstvom enzima drugog metaboličkog puta.
Nazivi "triacilglicerol", "ulje" i "TAGi" se odnose na neutralne lipide, koji su sastavljeni od tri masna acil ostatka, esterifikovana na molekul glicerola (a takvi nazivi će, ovde, tokom tekućeg izlaganja, biti korišćeni naizmenično). Takva ulja mogu sadržavati PUFA-e dugog lanca, kao i kraće zasićene i nezasićene masne kiseline i zasićene masne kiseline dužeg lanca. Zbog toga se "biosinteza ulja" generički odnosi na sintezu TAG-a u ćeliji.
"Procenat (%) PUFA-a u ukupnim lipidnim i uljnim frakcijama" se odnosi na procenat PUFA-a u odnosu na ukupne masne kiseline u ovim frakcijama. Izraz "ukupna lipidna frakcija" ili "lipidna frakcija" odnosi se na zbir svih lipida (t.j., neutralnih i polarnih) unutar uljastog organizma, uključujući tako one lipide, koji su locirani u frakciji fosfatidilholina (PC), frakciji fosfatidiletanolamina (PE) i frakciji triacilglicerola (TAG ili ulje). Prema tome, izrazi "lipid" i "ulje" biće korišćeni naizmenično tokom specifikacije.
Izrazi "efikasnost konverzije" i "procenat konverzije supstrata" odnose se na efikasnost kojom pojedini enzim (npr., desaturaza) može konvertovati supstrat u proizvod. Efikasnost konverzije je izmerena prema sledećoj formuli: ([proizvod]/[supstrat + proizvod])* 100, pri čemu 'proizvod' obuhvata neposredni proizvod i sve proizvode, na tom putu, koji su dobijeni iz njega.
"Desaturaza" je polipeptid, koji može izvršiti desaturaciju, t.j., uvesti dvostruku vezu, u jednoj ili više masnih kiselina, kako bi se proizvela masna kiselina ili prekursor od značaja. Uprkos korišćenju omega-referentnog sistema tokom specifikacije, kako bi se označile specifične masne kiseline, praktičnije je da se aktivnost desaturaze označi brojanjem od karboksilnog kraja supstrata, koristeći delta-sistem. Na primer, delta-8 desaturaze će izvršiti desaturaciju masne kiseline između osmog i devetog atoma ugljenika, brojčano računajući od karboksil-terminalnog kraja molekula, a može, primera
radi, katalizovati konverziju EDA u DGLA i/ili ETrA u ETA. Ostale korisne desaturaze masne kiseline uključuju, na primer: (1) delta-5 desaturaze, koje katalizuju konverziju DGLA u ARA i/ili ETA u EPA; (2) delta-6 desaturaze, koje katalizuju konverziju LA u GLA i/ili ALA u STA; (3) delta-4 desaturaze, koje katalizuju konverziju DPA u DHA i/ili DTA u DPAn-6; (4) delta-12 desaturaze, koje katalizuju konverziju oleinske kiseline u LA; (5) delta-15 desaturaze, koje katalizuju konverziju LA u ALA i/ili GLA u STA; (6) delta-17 desaturaze, koje katalizuju konverziju ARA u EPA i/ili DGLA u ETA i (7) delta-9 desaturaze, koje katalizuju konverziju palmitinske u palmitoleinsku kiselinu (16:1) i/ili stearinske kiseline u oleinsku kiselinu (18:1). U struci, delta-15 i delta-17 desaturaze se, takođe, povremeno označavaju kao "omega-3 desaturaze", "w-3 desaturaze" i/ili "n-3 desaturaze", na osnovu njihove sposobnosti da konvertuju omega-6 masne kiseline u njihove omega-3 duplikate (npr., konverzija LA u ALA, odnosno ARA u EPA). U nekim ostvarenjima, najpoželjnije je da se empirijski odredi specifičnost određene desaturaze masne kiseline putem transformacije pogodnog domaćina sa genom za desaturazu masne kiseline, i merenjem njegovog efekta na profil masnih kiselina domaćina.
Izraz "delta-4 desaturaza" se odnosi na enzim, koji će izvršiti desaturaciju masne kiseline između četvrtog i petog atoma ugljenika, brojčano računajući od karboksil-terminalnog kraja molekula, i koji može, primera radi, katalizovati konverziju DPA u DHA i/ili DTA u DPAn-6. Za tekuće potrebe, izraz "EgDHAsvnl" se odnosi na enzim DHA sintazu (SEQ ID NO: 12), koji je izolovan izEuglene gracilis,kojeg ovde kodira SEQ ID NO: 11. Izraz "EgDHAsyn2" se odnosi na enzim DHA sintazu (SEQ ID NO:22), koji je izolovan izEuglene gracilis,kojeg ovde kodira SEQ ID NO:21. Izraz "EaDHAsvnl" se odnosi na enzim DHA sintazu (SEQ ID NO:95), koji je izolovan izEuglene anabaene,kojeg ovde kodira SEQ ID NO:91. Izraz "EaDHAsyn2" se odnosi na enzim DHA sintazu (SEQ ID NO:96), koji je izolovan izEuglene anabaene,kojeg ovde kodira SEQ ID NO:92. Izraz "EaDHAsyn3" se odnosi na enzim DHA sintazu (SEQ ID NO:97), koji je izolovan izEuglene anabaene,kojeg ovde kodira SEQ ID NO:93. Izraz "EaDHAsyn4" se odnosi na enzim (SEQ ID NO:98), koji je izolovan izEuglene anabaene,kojeg ovde kodira SEQ ID NO:94.
Izraz "elongaza sistem" se odnosi na niz od četiri enzima, koji su odgovorni za produžavanje ugljeničnog lanca masne kiseline, kako bi se proizvela masna kiselina, koja je za dva ugljenika duža od supstrata masne kiseline, na koji deluje elongaza sistem. Određenije, proces elongacije se dešava udruženo sa sintazom masne kiseline, pri čemu je CoA acil nosač (Lassner et al.,Plant Cell 8:281-292(1996)). U prvom koraku, za koji je utvrđeno daje specifičan prema supstratu i, isto tako, ograničavajući što se brzine tiče, malonil-CoA je kondenzovan sa acil-CoA dugog lanca, da bi se proizveo ugljen dioksid (CO2) i (3-ketoacil-CoA (gde je acilni deo bio produžen za dva atoma ugljenika). Sledeće reakcije uključuju redukciju P-hidroksiacil-CoA, dehidraciju u enoil-CoA i drugu redukciju, kako bi se proizveo elongirani acil-CoA. Primeri reakcija, koje kataliziraju elongaza sistemi, su konverzija GLA u DGLA, STA u ETA, LA u EDA, ALA u ETrA i
EPA u DPA.
Za tekuće potrebe, enzim, koji katalizuje prvu reakciju kondenzacije (t.j., konverziju malonil-CoA i acil-CoA dugog lanca u P-ketoacil-CoA) biće označen generički kao "elongaza". Uopšteno, selektivnost elongaza prema supstratu je prilično široka, ali su razdvojene i dužinom lanca i stepenom nezasićenosti. Sledstveno tome, elongaze mogu posedovati različite specifičnosti. Na primer, C14/16elongaza će koristiti C14supstrat (npr., miristinsku kiselinu); C16/18elongaza će koristiti Ci6supstrat (npr., palmitat); C18/20elongaza će koristiti Cissupstrat (npr., GLA, STA), a C20/22elongaza će koristiti C20supstrat (npr., ARA, EPA). Na sličan način, "delta-9 elongaza" je u stanju da katalizuje konverziju LA u EDA i/ili ALA u ETrA.
Važno je naglasiti da neke elongaze imaju široku specifičnost i zato jedan enzim može biti u stanju da katalizuje nekoliko elongaza reakcija. Zato, primera radi, delta-9 elongaza može, takođe, dejstvovati kao C16/18elongaza, C18/20i/ili C20/22elongaza i može posedovati alternativne, ali ne i poželjne, specifičnosti za delta-5 i delta-6 masne kiseline, kao što su EPA, odnosno GLA.
Izraz "C20 elongaza" kao što je ovde korišćen, odnosi se na enzim, koji koristi C20 supstrat, kao što je, primera radi, EPA ili ARA. Izraz "C20/delta-5 elongaza" odnosi se na enzim, koji koristi C20 supstrat sa delta-5 dvostrukom vezom.
Slično, za ove potrebe, izraz "EgD9elo" ili "EgD9e" se odnosi na delta-9 elongazu, izolovanu izEuglene gracilis(vidi SEQ ID NO: 112; vidi, takođe, U.S. Application N. 11/601,563 (prijavljena 16. novembra 2006., koja je publikovana 24. maja 2007., kao US-2007-0118929-A1).
Kao što je ovde korišćena, "nukleinska kiselina" označava polinukleotid i uključuje jednostruki ili dvostruki polimer deoksiribonukleotidnih ili ribonukleotidnih baza. Nukleinske kiseline mogu, isto tako, obuhvatiti fragmente i modifikovane nukleotide. Zato su izrazi "polinukleotid", "sekvenca nukleinske kiseline", "nukleotidna sekvenca" ili "fragment nukleinske kiseline" korišćeni naizmenično, a odnose se na polimer RNK ili DNK, koji je jednostruk ili dvostruk, a opciono sadrži sintetske, ne-prirodne ili izmenjene nukleotidne baze. Nukleotidi (obično se nalaze u svojoj 5'-monofosfatnoj formi) su označeni svojom jednoslovnom oznakom na sledeći način: "A" za adenilat ili deoksiadenilat (za RNK, odnosno DNK), "C" za citidilat ili deoksicitidilat, "G" za gvanilat ili deoksigvanilat, "U" za uridilat, "T" za deoksitimidilat, "R" za purine (A ili G), "Y" za pirimidine (C ili T), "K" za G ili T, "H" za A ili C ili T, "I" za inozin i "N" za bilo koji nukleotid.
Izrazi "subfragment koji je funkcionalno ekvivalentan" i "funkcionalno ekvivalentan subfragment" ovde su korišćeni naizmenično. Ovi izrazi se odnose na deo ili subsekvencu izolovanog fragmenta nukleinske kiseline, u kojem je zadržana mogućnost izmene genske ekspresije ili proizvodnje određenog fenotipa, bez obzira na to da li fragment ili subfragment kodiraju ili ne kodiraju aktivni enzim. Na primer, fragment ili subfragment mogu biti upotrebljeni u dizajniranju himeričnih gena, da bi se proizveo željeni fenotip u transformisanoj biljci. Himerični geni mogu biti dizajnirani za korišćenje u supresiji, povezivanjem fragmenta nukleinske kiseline ili njihovog subfragmenta, bez obzira na to da li on kodira ili ne aktivni enzim, u sens ili antisens orijentaciji u odnosu na promoter sekvencu biljke.
Izraz "konzervisani domen" ili "motiv" označava niz aminokiselina, očuvanih na specifičnim položajima duž poredane sekvence razvojno povezanih proteina. Dok aminokiseline na ostalim položajima mogu varirati između homolognih proteina, aminokiseline koje su veoma očuvane na specifičnim položajima, označavaju aminokiseline, koje su esencijalne za strukturu, stabilnost ili aktivnost proteina. Izrazi "homologija", "homologan", "suštinski sličan" i "suštinski odgovarajući" ovde su korišćeni naizmenično. Oni se odnose na fragmente nukleinske kiseline, u kojima promene u jednoj ili više nukleotidnih baza ne utiču na sposobnost fragmenta nukleinske kiseline da posreduje u genskoj ekspresiji ili proizvodi određeni fenotip. Ovi izrazi se, takođe, odnose na modifikacije fragmenata nukleinske kiseline tekućeg pronalaska, kao što su delecija ili umetanja jednog ili više nukleotida, koje neće suštinski izmeniti funkcionalna svojstva nastalog fragmenta nukleinske kiseline, u odnosu na početni nemodifikovani fragment. Zbog toga se podrazumeva, kao što će to stručna lica proceniti, da pronalazak obuhvata više od specifičnih sekvenci, datih kao primeri.
Pored toga, vešt stručnjak prepoznaje da su suštinski slične sekvence nukleinske kiseline, obuhvaćene ovim pronalaskom, takođe, definisane njihovom sposobnošću hibridizacije (pod umereno strogim uslovima, npr., 0.5X SSC, 0.1% SDS, 60° C) sa sekvencama, koje su ovde prikazane kao primeri, ili sa bilo kojim delom nukleotidnih sekvenci, koje su ovde izložene, i koje su funkcionalno ekvivalentne sa bilo kojom od, ovde izloženih, sekvenci nukleinske kiseline. Strogost uslova se može prilagoditi da bi se istražili srednje slični fragmenti, kao što su homologne sekvence iz udaljeno srodnih organizama, do veoma sličnih fragmenata, kao što su geni, koji udvostručuju funkcionalne enzime iz blisko povezanih organizama. Post-hibridizaciona ispiranja određuju strogost uslova.
Izraz "selektivno hibridizovanje" obuhvata povezanost sa hibridizacijom, pod strogim uslovima hibridizacije, sekvence nukleinske kiseline do specifikovane ciljane sekvence nukleinske kiseline do detektibilno višeg stepena (npr., najmanje 2-puta u odnosu na osnovu), nego što je njena hibridizacija do sekvence nukleinske kiseline, koja nije ciljana i uz suštinsko isključivanje nukleinskih kiselina, koje nisu ciljane. Selektivno hibridizujuće sekvence obično imaju najmanje oko 80% istovetnosti sekvence ili 90% istovetnosti sekvence, sve do uključujući 100% istovetnosti sekvence (t.j., potpuna komplementarnost) jedne sa drugom.
Izraz "strogi uslovi" ili "strogi uslovi hibridizacije" odnosi se na uslove pod kojima će se proba selektivno hibridizovati u svoju ciljnu sekvencu. Strogi uslovi su zavisni od sekvence i biće različiti u različitim okolnostima. Kontrolisanjem strogosti uslova hibridizacije i/ili ispiranja, mogu se identifikovati ciljne sekvence, koje su 100% komplementarne sa probom (homologni probing). Alternativno, strogost uslova se može podesti, kako bi se dozvolilo izvesno nepodudaranje u sekvencama, tako da se otkrivaju niži stepeni sličnosti (heterologni probing). Uopšteno, proba ima manje od približno 1000 nukleotida po dužini, opciono manje od 500 nukleotida po dužini.
Obično, strogi uslovi će biti oni, u kojima je koncentracija soli manja od približno 1.5 M jona Na, obično oko 0.01 do 1.0 M koncentracije Na jona (ili drugih soli), na pH 7.0 do 8.3, a temperatura je najmanje oko 30°C za kratke probe (npr., 10 do 50 nukleotida) i barem oko 60°C za dugačke probe (npr., veće od 50 nukleotida). Strogi uslovi se, isto tako, mogu postići dodavanjem agenasa za destabilizaciju, kao što je formamid. Primeri uslova slabe strogosti uključuju hibridizaciju sa puferskim rastvorom od 30 do 35% formamida, IM NaCl, 1% SDS (natrijum dodecil sulfat), na 37°C, i ispiranje u IX do 2X SSC (20X SSC = 3.0 M NaCl/0.3 M trinatrijum citrat), na 50 do 55°C. Primeri uslova umerene strogosti uključuju hibridizaciju u 40 do 45% formamidu, IM NaCl, 1% SDS, na 37°C, i ispiranje u 0.5X do IX SSC, na 55 do 60°C. Kao primer, uslovi visoke strogosti uključuju hibridizaciju u 50% formamidu, IM NaCl, 1% SDS, na 37°C, i ispiranje u 0.1X SSC, na 60 do 65°C.
Specifičnost je obično funkcija post-hibridazacionih ispiranja sa kritičnim faktorima, koji su jonska jačina i temperatura završnog rastvora za ispiranja. Za hibride DNK-DNK, Tmse može aproksimativno odrediti iz jednačine iz Meinkoth et al.,Anal. Biochem.138:267-284 (1984): Tm= 81.5 °C + 16.6 (log M) + 0.41 (%GC) - 0.61 (% form) - 500/L; gde je M molaritet monovalentnih katjona, %GC je procenat gvanozinskih i citozinskih nukleotida u DNK, %form je procenat formamida u hibridizacionom rastvoru, a L je dužina hibrida u parovima baza. Tmje temperatura (za definisanu jonsku jačinu i pH), pri kojoj se 50% komplementarne ciljne sekvence hibridizuje u savršeno podudarnu probu. Tmse snižava za oko 1°C za svaki 1% nepodudaranja; tako se mogu podesiti Tm, uslovi hibridizacije i/ili ispiranja, da bi se hibridizovali u sekvence željene istovetnosti. Na primer, ukoliko se traži >90% istovetnosti, Tmse može sniziti za 10°C. Uopšteno, strogi uslovi se biraju tako da budu oko 5°C niži od termičke tačke topljenja (Tm) za specifiču sekvencu i njen komplement, pri definisanoj jonskoj jačini i pH. Međutim, izrazito strogi uslovi mogu koristiti hibridizaciju i/ili ispiranje na 1, 2, 3 ili 4°C nižoj temperaturi od termalne tačke topljenja (Tm); umereno strogi uslovi mogu koristiti hibridizaciju i/ili ispiranje na 6, 7, 8, 9 ili 10°C nižoj temperaturi od termalne tačke topljenja (Tm); slabo strogi uslovi mogu koristiti hibridizaciju i/ili ispiranje na 11, 12, 13, 14, 15 ili 20°C nižoj temperaturi od termalne tačke topljenja (Tm). Koristeći jednačinu, smeše za hibridizaciju i ispiranje i željenu Tm, stručna lica u ovoj oblasti će razumeti da su varijacije u strogosti hibridizacije i/ili rastvora za ispiranje, u suštini opisane. Ukoliko željeni stepen nepodudaranja dovodi do Tm, koja je niža od 45°C (vodeni rastvor) ili 32°C (rastvor formamida), poželjno je da se poveća koncentracija SSC, tako da se može koristiti viša temperatura. Opsežan vodič za hibridizaciju nukleinskih kiselina nalazi se u Tijssen,Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology— Hybridization with Nucleic Acid Probes,Part I, Chapter 2 "Overview of principles of hvbridization and the strategv of nucleic acid probe assavs", Elsevier, New York (1993) iCurrent Protocols in Molecular Biology,Chapter 2, Ausubel et al., Eds., Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York (1995). Uslovi hibridizacije i/ili ispiranja mogu se primeniti tokom najmanje 10, 30, 60, 90, 120 ili 240 minuta.
"Istovetnost sekvence" ili "identitet" u kontekstu sekvenci nukleinske kiseline ili polipeptida, odnosi se na baze nukleinske kiseline ili aminokiselinske ostatke u dve sekvence, koje su iste kada se upoređuju do maksimalne podudarnosti preko specifikovanog otvora za poređenje.
Tako, "procenat istovetnosti sekvence" se odnosi na vrednost, koja se utvrđuje poređenjem dve optimalno posložene sekvence preko otvora za poređenje, pri čemu deo sekvence polinukleotida ili polipeptida u otvoru za poređenje, može sadržavati adicije ili delecije (t.j., šupljine), kada se uporedi sa referentnom sekvencom (koja ne sadrži adicije ili delecije) za optimalno slaganje dve sekvence. Procenat se izračunava određivanjem broja položaja, u kojima se identična baza nukleinske kiseline ili aminokiselinski ostatak pojavljuju u obe sekvence, kako bi se dobio broj podudarnih položaja, deljenjem broja podudarnih položaja sa ukupnim brojem položaja u otvoru za poređenje i množenjem rezultata sa 100, da bi se dobio procenat istovetnosti sekvence. Korisni primeri procenta istovetetnosti sekvence uključuju, ali se njima ne ograničavaju, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ili 95%, ili bilo koji procenat celog broja od 50% do 100%. Ove istovetnosti se mogu utvrditi korišćenjem bilo kog od, ovde opisanih, programa.
Poređenja sekvence i izračunavanja procenta istovetnosti ili sličnosti mogu se utvrditi korišćenjem raznih postupaka poređenja, koji su dizajnirani za detekciju homolognih sekvenci, uključujući, ali bez ograničavanja, MegAlign™ program LASERGENE bioinformatičkog kompjuterskog niza (DNASTAR Inc., Madison, WI). U okviru konteksta ove prijave, biće razumljivo da će, kada je za ispitivanje upotrebljen softver za analizu sekvence, rezultati analize biti bazirani na "default vrednostima" referentnog programa, ukoliko nije drugačije utvrđeno. Kao što su ovde korišćene "default vrednosti" će označiti bilo koji set vrednosti ili parametara, koji su izvorno uneseni sa softverom, kada se prvotobitno pokrene.
"Clustal V postupak slaganja" odgovara postupku slaganja obeleženom sa Clustal V (opisan u Higgins i Sharp,CABIOS.5:151-153 (1989); Higgins, D.G. et al.,Comput. Appl. Biosci.8:189-191 (1992)), a nalazi se u MegAlign™ programu LASERGENE bioinformatičkog kompjuterskog niza (DNASTAR Inc., Madison, WI). Za višestruka slaganja, default vrednosti odgovaraju: GAP PENALTY=10 i GAP LENGTH PENALTY=10. Default parametri za razvrstavanja na način slaganja parova i izračunavanje procenta istovetnosti proteinskih sekvenci, korišćenjem Clustal V postupka su: KTUPLE=1, GAP PENALTY=3, WINDOW=5 i DIAGONALS SAVED=5. Za nukleinske kiseline ovi parametri su: KTUPLE=2, GAP PENALTY=5, WINDOW=4 i DIAGONALS SAVED=4. Nakon slaganja sekvenci, korišćenjem Clustal V programa, moguće je da se dobije "procenat istovetnosti" pregledavanjem tabele "udaljenosti sekvenci" u istom programu.
"Clustal W postupak slaganja" odgovara postupku slaganja obeleženom sa Clustal W (opisan u Higgins i Sharp,supra;Higgins, D.G. et al.,supra),a nalazi se u MegAlign™ v6.1 programu LASERGENE bioinformatičkog kompjuterskog niza (DNASTAR Inc., Madison, WI). Default parametri za višestruka slaganja su: GAP PENALTY=10, GAP LENGTH PENALTY=0.2, Delay Divergen Seqs(%)=30, DNA Transition Weight=0.5, Protein Weight Matrix=Gonnet Series, DNA Weight
Matrix=IUB. Nakon slaganja sekvenci, korišćenjem Clustal V programa, moguće je da se dobije "procenat istovetnosti" pregledavanjem tabele "udaljenosti sekvenci" u istom programu.
"BLASTN postupak slaganja" jeste algoritam, kog je obezbedio National Center for Biotechnologv Information (NCBI), kako bi se, korišćenjem default parametara, uporedi vale nukleotidne sekvence.
Stručnjak u ovoj oblasti će ispravno razumeti da su mnogi nivoi istovetnosti sekvence korisni u identifikovanju polipeptida iz drugih vrsta, pri čemu takvi polipeptidi imaju istu ili sliču funkciju ili aktivnost. Korisni primeri procenta istovetetnosti uključuju, ali se njima ne ograničavaju, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ili 95%, ili bilo koji procenat celog broja od 50% do 100%. U stvari, bilo koji ceo broj od 50% do 100% aminokiselinske istovetnosti, može biti koristan u opisivanju ovog pronalaska, kao što je: 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99%. Takođe, od značaja je bilo koji komplement pune-dužine ili parcijalni komplement ovog izolovanog nukleotidnog fragmenta.
"Gen" se odnosi na fragment nukleinske kiseline, koji ekspresuje specifičan protein, a može uključiti ili sam kodirajući region ili kodirajući region zajedno sa regulatornim sekvencama, koje prethode (5' ne- kodirajuće sekvence) i slede (3' ne-kodirajuće sekvence) kodirajuću sekvencu. "Nativni gen" se odnosi na gen kao što se nalazi u prirodi, sa svojim sopstvenim regulatornim sekvencama. "Himerični gen" se odnosi na bilo koji gen, koji nije nativni gen, i koji sadrži regulatirne i kodirajuće sekvence, koje se zajedno ne nalaze u prirodi. Prema tome, himerični gen može sadržavati regulatorne sekvence i kodirajuće sekvence, koje su dobijene iz različitih izvora, ili regulatorne sekvence i kodirajuće sekvence, dobijene iz istog izvora, ali raspoređene na drugačiji način od onog, koji se nalazi u prirodi. "Endogeni gen" se odnosi na nativni gen na svojoj prirodnoj lokaciji u genomu organizma. "Strani" gen se odnosi na gen, koji se normalno ne nalazi u organizmu domaćina, ali je u organizam
domaćina uveden genskim transferom. Strani geni mogu uključiti nativne gene, koji su umetnuti u ne-nativni organizam ili himerične gene. "Transgen" je gen, koji je uveden u genom postupkom transformacije.
Izraz "genom" kada se primenjuje na biljne ćelije, obuhvata ne samo hromosomsku DNK, koja se nalazi unutar nukleusa, već i DNK organele, koja se nalazi unutar subćelijskih komponenti (npr., mitohondrijalna, plastidna) ćelije.
"Kodon-optimizovani gen" jeste gen, koji ima svoju frekvenciju upotrebe kodona, koja je dizajnirana kako bi imitirala frekvenciju poželjne upotrebe kodona ćelije domaćina.
"Alel" je jedan od nekoliko alternativnih oblika gena, koji zauzimaju dati položaj u hromozomu. Kada su svi aleli, koji su prisutni na datom položaju u hromozomu, isti, tada je biljka homozigotna na tom položaju. Ukoliko se aleli, prisutni na datom lokusu u hromozomu, razlikuju, biljka je, na tom lokusu, heterozigotna.
"Kodirajuća sekvenca" se odnosi na DNK sekvencu, koja kodira specifičnu sekvencu aminokiseline. "Regulatorne sekvence" se odnose na nukleotidne sekvence, koje su locirane ushodno (5' ne-kodirajuće sekvence), unutar ili nishodno (3' ne-kodirajuće sekvence) od kodirajuće sekvence, a koje utiču na transkripciju, proizvodnju ili stabilnost RNK ili translaciju povezane kodirajuće sekvence. Regulatorne sekvence mogu uključiti, ali bez ograničavanja na njih: promotere, translacione lider sekvence, introne, sekvence prepoznavanja poliadenilacije, položaje proizvodnje RNK, položaje vezivanja efektora i strukture sa osnovom petlje (stem-loop).
"Promoter" se odnosi na sekvencu DNK, koja je u stanju da kontroliše ekspresiju kodirajuće sekvence ili funkcionalne RNK. Promoter sekvenca se sastoji od proksimalnih i više distalnih ushodnih elemenata, od koji se ovi poslednji često označavaju kao pojačivači. Shodno tome, "pojačivač" je DNK sekvenca, koja može stimulisati aktivnost promotera, a može biti prirođeni element promotera ili heterologni element, koji je umetnut, kako bi pojačao nivo ili tkivnu-specifičnost promotera. Promoteri se mogu dobiti u svojoj celovitosti iz nativnog gena ili mogu biti sastavljeni od različitih elemenata, koji su dobijeni iz različitih promotera, koji se nalaze u prirodi, ili čak sadrže sintetske segmente DNK. Stručna lica u ovoj oblasti shvataju da različiti
promoteri mogu usmeravati ekspresiju gena u različitim tkivima ili ćelijskim tipovima, ili na različitim stepenima razvoja ili u odgovoru na različite uslove sredine. Nadalje se prihvata da, s obzirom na to što u najvećem broju slučajeva nisu u potpunosti definisane tačne granice regulatornih sekvenci, DNK fragmenti nekoliko varijacija mogu imati identičnu promotersku aktivnost. Promoteri koji prouzrokuju da se gen ekspresuje u najvećem broju ćelijskih vrsta i u najvećem broju slučajeva, obično se označavaju kao "konstitutivni promoteri". Stalno se otkrivaju novi promoteri raznih tipova, koji su korisni u ćelijama biljaka; brojni primeri se mogu naći u zbirnom radu Okamuro, J.K. i Goldberg, R.B.Biochemistry ofPlants15:1-82 (1989).
"Translaciona lider (vodeća) sekvenca" se odnosi na sekvencu polinukleotida, koja je locirana između promoterske sekvence gena i kodirajuće sekvence. Translaciona vodeća sekvenca je prisutna u potpuno proizvedenoj mRNK, ushodno od početne translacione sekvence. Vodeća sekvenca translacije može uticati na proizvodnju primarnog transkripta mRNK, stabilnost mRNK ili efikasnost translacije. Opisani su primeri vodećih translacionih sekvenci (Turner, R. i Foster, G.D.,Mol. Biotechnol.3:225-236(1995)).
"3' ne-kodirajuće sekvence", "transkripcioni terminator" ili "terminacione sekvence" označavaju sekvence DNK, koje su locirane nishodno od kodirajuće sekvence, uključujući sekvence prepoznavanja poliadenilacije i druge sekvence, koje kodiraju regulatorne signale, koji su u stanju da utiču na proizvodnju mRNK ili ekspresiju gena. Signal poliadenilacije se uglavnom karakteriše uticajem na adiciju komada poliadenilne kiseline na 3' kraj prekursora mRNK. Primeri korišćenja različitih 3' ne-kodirajućih sekvenci dati su u Ingelbrecht, I.L., et al.Plant Cell 1:671-680(1989).
"RNK transkript" se odnosi na proizvod, koji proističe iz RNK polimerazom-katalizovane transkripcije sekvence DNK. Kada je RNK transkript savršeno komplementarna kopija DNK sekvence, ona se označava kao primarni transkript. RNK transkript se označava kao zrela RNK, kada je RNK sekvenca dobijena iz post-translacionog procesuiranja primarnog transkripta. "Messenger (glasnička) RNK" ili "mRNK" se odnosi na RNK, koja je bez introna i koju ćelija može prevesti u protein. "cDNK" se odnosi na DNK, koja je komplementarna ili sintetisana iz mRNK kalupa,
korišćenjem enzima reverzne transkriptaze. cDNK može biti jednostruka ili prevedena u dvostruku formu, korišćenjem Klenow fragmenta DNK polimeraze I. "Sens" RNK se odnosi na RNK transkript, koji uključuje mRNK i koji se može prevesti u protein unutar ćelije iliin vitro."Antisens RNK" se odnosi na transkript RNK, koji je komplementaran sa celokupnim ili sa delom ciljnog primarnog transkripta ili mRNK, a koji blokira ili smanjuje ekspresiju ciljnog gena (U.S. Patent No. 5,107,065). Komplementarnost antisens RNK može biti sa bilo kojim delom specifičnog genskog transkripta, t.j., na 5' ne-kodirajućoj sekvenci, 3' ne-kodirajućoj sekvenci, intronima ili kodirajućoj sekvenci. "Funkcionalna RNK" se odnosi na antisens RNK, ribozomsku RNK ili drugu RNK, koja se ne može prevesti, ali još poseduje efekat na ćelijske procese. Izrazi "komplement" i "reverzni komplement" korišćeni su, ovde, naizmenično u odnosu na mRNK transkripte, a smatra se da defmišu antisens RNK poruke.
Izraz "operativno povezan" odnosi se na povezivanje sekvenci nukleinske kiseline na pojedinačnom fragmentu nukleinske kiseline, tako da je funkcija jedne pod uticajem druge. Na primer, promoter je operativno povezan sa kodirajućom sekvencu, kada postoji sposobnost da utiče na ekspresiju te kodirajuće sekvence (t.j., kodirajuća sekvenca je pod transkripcionom kontrolom promotera). Kodirajuće sekvence se mogu operativno povezati sa regulatornim sekvencama u sens ili antisens orijentaciji. U drugom primeru, komplementarni RNK regioni pronalaska se mogu operativno povezati, ili direktno ili indirektno, sa 5' ciljne mRNK ili 3' ciljne mRNK, ili je prvi komplementarni region 5', a njegov komplement je 3' ciljne mRNK.
Standardne tehnike rekombinantne DNK i molekularnog kloniranja, koje su ovde korišćene, dobro su poznate u struci, a potpunije su ih opisali Sambrook, J., Fritsch, E.F. i Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratorv Manual; Cold Spring Harbor Laboratorv: Cold Spring Harbor, Y (1989). Postupci transformisanja su dobro poznati stručnjacima u ovoj oblasti, a opisani su u nastavku.
"PCR" ili "lančana polimeraza reakcija" je tehnika sinteze velikih količina specifičnih segmenata DNK, a sastoji se od serija ponovljenih ciklusa (Perkin Elmer Cetus Instruments, Norwalk, CT). Uobičajeno se izvede denaturacija toplotom dvostruke DNK, dva prajmera, koja su komplementarna sa 3' granicama ciljnog segmenta su
grejana na niskoj temperaturi, a zatim je izvedena ekstenzija na srednjoj temperaturi. Jedan niz ova tri uzastopna koraka označava se kao "ciklus".
Izraz "rekombinantan" se odnosi na veštačku kombinaciju dva drugačije razdvojena segmenta sekvence, npr., putem hemijske sinteze ili manipulisanjem izolovanim segmentima nukleinske kiseline tehnikama genetskog inženjeringa.
"Plazmid" ili "vektor" je ekstra-hromozomski element, koji često nosi gene, koji nisu deo centralnog ćelijskog metabolizma, a uglavnom su u formi cirkularnih fragmenata dvostruke DNK. Takvi elementi mogu biti sekvence, koje se autonomno replikuju, sekvence koje se integrišu u genom, fag ili nukleotidne sekvence, linearne ili cirkularne, jednostruke ili dvostruke DNK ili RNK, koje su dobijene iz bilo kog izvora, u kome su brojne nukleotidne sekvence bile spojene ili rekombinovane u jedinstvenu konstrukciju, koja može uvesti ekspresionu kasetu(e) u ćeliju. "Ekspresiona kaseta" se odnosi na fragment DNK, koji sadrži strani gen i poseduje elemente, koji su pridodati stranom genu, koji omogućuju pojačanu ekspresiju tog gena u stranom domaćinu. "Transformaciona kaseta" se odnosi na fragment DNK, koji sadrži strani gen i ima elemente pridodate stranom genu, koji olakšavaju transformaciju pojedine ćelije domaćina.
Izrazi "rekombinanta konstrukcija", "ekspresiona konstrukcija", "himerična konstrukcija", "konstrukcija" i "rekombinantna DNK konstrukcija" korišćeni su, ovde, naizmenično. Rekombinantna konstrukcija sadrži veštačku kombinaciju fragmenata nukleinske kiseline, npr., regulatorne i kodirajuće sekvence, koje se u prirodi ne nalaze zajedno. Na primer, rekombinantna konstrukcija može sadržavati regulatorne sekvence i kodirajuće sekvence, koje su dobijene iz različitih izvora, ili regulatorne sekvence ili kodirajuće sekvence, proistekle iz istog izvora, ali raspoređene na način koji se razlikuje od onog, koji se nalazi u prirodi. Takva konstrukcija se može koristiti sama po sebi ili se može koristiti u konjukciji sa vektorom. Ukoliko se koristi vektor, tada izbor vektora zavisi od postupka, koji će se koristiti za transformisanje ćelija domaćina, kao što je stručnim licima u ovoj oblasti dobro poznato. Na primer, može se upotrebiti plazmidni vektor. Vest stručnjak je dobro upućen u genetske elemente, koji moraju biti prisutni na vektoru, kako bi se postigla uspešna transformacija, selekcija i razmnožavanje ćelija domaćina, koje sadrže bilo koji od izolovanih fragmenata nukleinske kiseline pronalaska. Vest stručnjak će, takođe, prepoznati da će različiti nezavisni slučajevi transformacije dovesti do različitih nivoa i modela ekspresije (Jones et al.,EMBO J.4:2411-2418
(1985); De Almeida et al.,Mol. Gen. Genetics218:78-86 (1989)), i zato se moraju ispitati višestruki slučajevi, kako bi se dobile linije, koje ispoljavaju željeni nivo i model ekspresije. Takvo ispitivanje se, između ostalog, može izvesti uz pomoć Southern analize DNK, Northern analize ekspresije mRNK, immunoblotting analize ekspresije proteina ili analize fenotipa.
Izraz "ekspresija", kao što je ovde korišćen, odnosi se na proizvodnju funkcionalnog završnog proizvoda (npr., mRNK ili proteina [ili prekursora ili zrelog proteina]).
Izraz "uveden" označava obezbeđivanje nukleinske kiseline (npr., ekspresiona konstrukcija) ili proteina u ćeliji. Uveden uključuje povezanost sa inkorporacijom nukleinske kiseline u eukariotsku ili prokariotsku ćeliju, pri čemu nukleinska kiselina može biti inkorporirana u genom ćelije i uključuje povezanost sa prolaznim obezbeđivanjem nukleinske kiseline ili proteina ćeliji. Uveden uključuje povezanost sa postupcima stabilne ili prolazne transformacije, kao i polnog ukrštanja. Iz tih razloga, "uveden" u kontekstu umetanja fragmenta nukleinske kiseline (npr., rekombinantna konstrukcija/ekspresiona konstrukcija) u ćeliju, označava "transfekciju" ili "transformaciju" ili "transdukciju" i uključuje povezanost sa inkorporacijom fragmenta nukleinske kiseline u eukariotsku ili prokariotsku ćeliju, pri čemu fragment nukleinske kiseline može biti ugrađen u genom ćelije (npr., hromozom, plazmid, plastid ili mitohondrijalna DNK), preveden u autonomni replikon, ili prolazno ekspresovan (npr., transfektovana mRNK).
"Zreli" protein se odnosi na post-translaciono proizvedeni polipeptid (t.j., onaj, iz koga su uklonjeni bilo koji pre- ili propeptidi, koji su prisutni u primarnom translacionom proizvodu). "Prekursor" protein se odnosi na primarni proizvod translacije mRNK (t.j., sa pre- i propeptidima, koji su još prisutni). Pre- i propeptidi mogu biti, ali bez ograničenja na njih, intracelularni signali lokalizacije.
"Stabilna transformacija" se odnosi na prenos fragmenta nukleinske kiseline u genom organizma domaćina, uključujući i genome jedra i genome organela, što proizvodi genetski stabilno nasleđe. Suprotno tome, "prolazna transformacija" se odnosi na transfer fragmenta nukleinske kiseline u jedro ili organelu, koja sadrži DNK, u organizmu domaćina, što dovodi do genske ekspresije bez integrisanja ili stabilnog nasleđa. Organizmi domaćina, koji sadrže transformisane fragmente nukleinske kiseline označeni su kao "transgenski" organizmi.
Kako je ovde korišćen, izraz "transgenski" se odnosi na biljku ili ćeliju, koja, unutar svog genoma, sadrži heterologni polinukleotid. Poželjno, heterologni polinukleotid je stabilno integrisan u okviru genoma, tako da se polinukleotid prenosi na sledeće generacije. Heterologni genom može biti integrisan u genom sam ili kao deo ekspresione konstrukcije. Transgenski je ovde korišćen kako bi obuhvatio svaku ćeliju, ćelijsku liniju, kalus, tkivo, biljni deo ili biljku, čiji genotip je bio izmenjen prisustvom heterologne nukleinske kiseline, uključujući one transgenike koji su tako izmenjeni inicijalno, kao i one, koji su kreirani polnim ukrštanjem ili bespolnim razmnožavanjem iz početnog transgenika. Izraz "transgenik", kao što je ovde korišćen, ne obuhvata izmene genoma (hromozomske ili ekstra-hromozomske) postignute konvencionalnim tehnikama uzgoja biljaka ili slučajevima, koji se dešavaju u prirodi, kao što su: slučajna unakrsna fertilizacija, ne-rekombinantna virusna infekcija, ne-rekombinantna bakterijska transformacija, ne-rekombinantna transpozicija ili spontana mutacija.
"Antisens inhibicija" se odnosi na proizvodnju antisens RNK transkripata, koji su u stanju da suprimiraju ekspresiju ciljnog proteina. "Ko-supresija" se odnosi na proizvodnju sens RNK transkripata, koji su sposobni da suprimiraju ekspresiju identičnih ili suštinski sličnih stranih ili endogenih gena (U.S. Patent No. 5,231,020). Ko-supresione konstrukcije u biljkama prethodno su dizajnirane fokusiranjem na prekomernu ekspresiju sekvence nukleinske kiseline, koja poseduje homologiju sa endogenom mRNK, u sens orijentaciji, što dovodi do smanjenja svih RNK, koje poseduju homologiju sa prekomerno ekspresovanom sekvencom (Vaucheret et al.,Plant J.16:651-659 (1998); Gura,Nature404:804-808 (2000)). Ukupna efikasnost ovog fenomena je slaba, a stepen redukovanja RNK pokazuje velike varijacije. Skorašnji rad je opisao korišćenje "šnala" struktura, koje inkorporiraju celokupnu mRNK ili deo mRNK, koja kodira sekvencu komplementarne
orijentacije, što dovodi do moguće strukture "osovine petlje"("stem-loop") za ekspresovanu RNK (PCT Publication No. WO 99/53050; PCT Publication No. WO 02/00904). Ovim se povećava frekvencija ko-supresije u povraćenim transgenskim biljkama. Druga varijacija opisuje upotrebu biljnih virusnih sekvenci za usmeravanje supresije ili "umirivanje" proksimalnih kodirajućih sekvenci mRNK (PCT Publication No. WO 98/36083). Oba ova fenomena ko-suprimiranja nisu rasvetljena mehanički, iako genetski dokazi počinju da odgonetaju ovu kompleksnu situaciju (Elmavan et al.,Plant
Cell 10:1747-1757(1998)).
Izraz "uljast" se odnosi na one organizme, koji imaju sklonost da svoje izvore energije čuvaju u formi lipida (Weete, u: Fungal Lipid Biochemistrv, 2<nd>Ed., Plenum, 1980). Klasa biljaka, identifikovanih kao uljaste, uobičajeno se označavaju kao biljke "uljnog semena". Primeri biljaka uljnog semena uključuju, ali se njima ne ograničavaju: soju( GlycineiSoja sp.),lan( Linum sp.),repicu( Brassica sp.),kukuruz, pamuk, šafraniku( Carthamus sp.)i suncokret( Helianthus sp.).
Sadržaj ćelijskog ulja ili TAG-a unutar uljastih mikroorganizama generalno sledi sigmoidnu krivu, pri čemu koncentracija lipida raste dok ne postigne maksimum u kasnoj logaritamskoj ili ranoj stacionarnoj fazi rasta, a zatim postepeno pada tokom kasne stacionarne faze i faze smrti (Yongmanitchai i Ward,Appl. Eviron. Microbiol.57:419-25
(1991)). Izraz "uljasti kvasac" se odnosi na one mikroorganizme, koji su klasifikovani kao kvasci, koji proizvode ulje. Za uljaste mikroorganizme nije neuobičajeno da akumuliraju u vidu ulja višak od oko 25% njihove suve ćelijske težine. Primeri uljastih kvasaca obuhvataju, bez namere da se njima ograniče, sledeće rodove:Yarrowia,
Candida, Rhodotorula, Rhodosporidium, Cryptococcus, TrichosporoniLipomyces.
Kao što je ovde korišćen, izraz "biomasa" se specifično odnosi na utrošeni ili upotrebljeni ćelijski materijal kvasca, koji proizlazi iz fermentacije rekombinantnog produkcionog domaćina, koji proizvodi PUFA-e u komercijalno značajnim količinama, pri čemu je poželjni produkcioni domaćin rekombinantni soj uljastog kvasca,Yarrowia lipolytica.Biomasa može biti u formi punih ćelija, lizata punih ćelija, homogenizovanih ćelija, delimično hidrolizovanog celularnog materijala i/ili delimično prečišćenog celularnog materijala (npr. mikrobno proizvedeno ulje).
Izraz "Euglenophvceae" se odnosi na grupu jednocelularnih bezbojnih ili fotosintetskih flagelata ("euglenoidi"), koji se nalaze kao živući organizmi u svežoj vodi, moru, zemljištu i parazitskom okruženju. Klasa je karakterisana pojedinačnim unićelijama, pri čemu je najveći broj slobodno-plivajući i ima dve flagele (od kojih se jedna ne mora pojaviti na površini), koje se razvijaju iz anteriorne invaginacije, koja je poznata kao rezervoar. Fotosintetski euglenoidi sadrže od jedan do mnogo hloroplasta, zelenih kao trava, koji variraju od sićušnih diskova do rastegnutih ploča ili traka. Bezbojni euglenoidi zavise od osmotrofije ili fagotrofije za prihvatanje hranjivih materija. Oko 1000 vrsta je bilo opisano i klasifikovano u oko 40 rodova i 6 redova. Primeri Euglenophvceae uključuju, ali se ni na koji način njima ne ograničavaju, sledeće rodove:Euglena, EutreptiellaiTetreutreptia.
Izraz "biljka" se odnosi na cele biljke, biljne organe, biljna tkiva, semenje, biljne ćelije, semena i potomke istih. Biljne ćelije obuhvataju, bez ograničavanja, ćelije iz semena, suspenzionih kultura, embriona, meristematskih regiona, tkiva kalusa, listova, korenja, mladica, gametofita, sporofita, polena i mikrospora.
"Potomstvo" obuhvata svaku sledeću generaciju biljke.
Pregled: Mikrobna biosinteza masnih kiselina i triacilglicerola
Uopšteno, akumulacija lipida u uljastim mikroorganizmima pokrenuta je u odgovoru na odnos ukupnog ugljenika prema azotu, koji je prisutan u medijumu za rast. Ovaj proces, koji vodi kade novosintezi slobodnog palmitata (16:0) u uljastim mikroorganizmima, detaljno je opisan u U.S. Patentu 7,238,482. Palmitat je prekursor derivata zasićenih i nezasićenih masnih kiselina dužeg lanca, koji se obrazuju putem dejstva elongaza i desaturaza (Slika 1).
TAG-i (jedinice primarnog skladištenja za masne kiseline) se obrazuju serijama reakcija, koje uključuju: (1) esterifikaciju jednog molekula acil-CoA sa glicerol-3-fosfatom, posredstvom aciltransferaze, da bi se proizvela lizofosfatidna kiselina; (2) esterifikaciju drugog molekula acil-CoA pomoću aciltransferaze, kako bi se proizveo 1,2-diacilglicerol fosfat (obično identifikovan kao fosfatidna kiselina); (3) uklanjanje fosfata pomoću fosfataze fosfatidne kiseline, da bi se proizveo 1,2-diacilglicerol (DAG) i (4) dodavanje treće masne kiseline dejstvom aciltransferaze, da bi se obrazovao TAG. Široki spektar masnih kiselina može su ugraditi u TAG-e, uključujući zasićene i nezasićene masne kiseline i masne kiseline kratkog lanca i dugog lanca.
Biosinteza omega masnih kiselina
Metabolički proces, u kome se oleinska kiselina konvertuje u omega-3/omega-6 masne kiseline dugog lanca, obuhvata elongaciju ugljeničnog lanca kroz adiciju atoma ugljenika i desaturaciju molekula posredstvom adicije dvostrukih veza. Ovo zahteva serije specijalnih desaturacionih i elongacionih enzima, koji su prisutni u membrani endoplazmatskog retikuluma. Međutim, kao što se vidi na Slici 1 i, kao što je opisano u nastavku, često postoje višestruki alternativni putevi za proizvodnju specifične omega-3/omega-6 masne kiseline dugog lanca.
Specifično, svi putevi zahtevaju inicijalnu konverziju oleinske kiseline u LA, prvu od omega-6 masnih kiselina, pomoću delta-12 desaturaze. Zatim, koristeći "put delta-9 elongaza/delta-8 desaturaza" i LA kao supstrat, omega-6 masne kiseline dugog lanca se obrazuju na sledeći način: (1) LA se konvertuje u EDA, pomoću delta-9 elongaze; (2) EDA se konvertuje u DGLA, pomoću delta-8 desaturaze; (3) DGLA se konvertuje u ARA, pomoću delta-5 desaturaze; (4) ARA se konvertuje u DTA, pomoću C20/22elongaze i (5) DTA se konvertuje u DPAn-6, uz pomoć delta-4 desaturaze. Alternativno, "put delta-9 elongaza/delta-8 desaturaza" može koristiti ALA kao supstrat za proizvodnju omega-3 masnih kiselina dugog lanca, na sledeći način: (1) LA se konvertuje u ALA, prvu od omega-3 masnih kiselina, pomoću delta-15 desaturaze; (2) ALA se konvertuje u ETrA, pomoću delta-9 elongaze; (3) ETrA se konvertuje u ETA, pomoću delta-8 desaturaza; (4) ETA se konvertuje u EPA, uz pomoć delta-5 desaturaze; (5) EPA se konvertuje u DPA, pomoću C20/22elongaze i (6) DPA se konvertuje u DHA, pomoću delta-4 desaturaze. Opciono, omega-6 masne kiseline se mogu konvertovati u omega-3 masne kiseline; primera radi, ETA i EPA se proizvode iz DGLA, odnosno ARA, dejstvom delta-17 desaturaze.
Alternativni putevi za biosintezu omega-3/omega-6 masnih kiselina koriste delta-6 desaturazu i Ci8/20elongazu (poznatu, takođe, kao delta-6 elongaza, nazivi se mogu koristiti naizmenično) (t.j., "put delta-6 desaturaza/delta-6 elongaza"). Još određenije, LA i ALA se mogu konvertovati u GLA, odnosno STA, pomoću delta-6 desaturaze; zatim, C13/20elongaza konvertuje GLA u DGLA i/ili STA u ETA.
Smatra se da će pojedine funkcionalne grupe, za koje je neophodno da budu uvedene u organizam specifičnog domaćina, za proizvodnju omega-3/omega-6 masnih kiselina, zavisiti od ćelije domaćina (i njegovog nativnog PUFA profila i/ili profila desaturaza/elongaza), raspoloživosti supstrata i željenog krajnjeg proizvoda (krajnjih proizvoda). Primera radi, ekspresija puta delta-9 elongaza/delta-8 desaturaza može biti poželjna u nekim ostvarenjima, kao suprotnost ekspresiji puta delta-6 desaturaza/delta-6 elongaza, budući da su PUFA-e proizvedene prethodnim putem lišene GLA.
Stručno lice u ovoj oblasti biće u stanju da identifikuje različite kandidate gena, koji kodiraju svaki od enzima, koji su poželjni za biosintezu omega-3/omega-6 masne kiseline. Korisne sekvence desaturaze i elongaze mogu se dobiti iz bilo kog izvora, npr., mogu biti izolovane iz prirodnog izvora (iz bakterija, algi, gljiva, biljaka, životinja, itd.), proizvedene semi-sintetskim putem ili sintetisanede novo.Premda pojedini izvor gena desaturaze i elongaze, koji je uveden u domaćina, nije presudan, motivi za izbor specifičnog polipeptida, koji ima aktivnost desaturaze ili elongaze, uključuju: (1) supstratnu specifičnost polipeptida; (2) da li je polipeptid ili njegova komponenta enzim koji ograničava brzinu; (3) da lije desaturaza ili elongaza esencijalna za sintezu željene PUFA; (4) kofaktore, koje zahtevaju polipeptidi i/ili (5) da li je polipeptid modifikovan nakon njegove proizvodnje (npr., pomoću kinaze ili freniltransferaze). Ekspresovani polipeptid poželjno poseduje parametre, koji su kompatibilni sa biohemijskom sredinom njegove lokacije u ćeliji domaćina (vidi U.S.
Patent 7,238,482 za dodatne detalje).
U dodatnim ostvarenjima, takođe će biti od koristi da se razmotri efikasnost konverzije svake pojedine desaturaze i/ili elongaze. Još određenije, budući da svaki enzim retko dejstvuje sa 100% efikasnošću u konverziji supstrata u proizvod, konačni lipidni profil nepročišćenih ulja, proizvedenih u ćeliji domaćina, uglavnom će biti mešavina raznih PUFA-a, koja se sastoji od željenih omega-3/omega-6 masnih kiselina, kao i od raznih ushodnih intermedijernih PUFA-a. Stoga je efikasnost svake enzimske konverzije, takođe, varijabla za razmatranje, kada se optimizuje biosinteza željene masne kiseline.
Sa svakim od, gore navedenih, razmatranja geni kandidati, koji poseduju aktivnosti odgovarajuće desaturaze i elongaze (npr., delta-6 desaturaze, Ci8/2oelongaze, delta-5 desaturaze, delta-17 desaturaze, delta-15 desaturaze, delta-9 desaturaze, delta-12 desaturaze, Ch/ićelongaze, C16/18elongaze, delta-9 elongaze, delta-8 desaturaze, delta-4 desaturaze, C20/22elongaze i DHA sintaze) mogu se identifikovati prema javno raspoloživoj literaturi (npr., GenBank), patentnoj literaturi i eksperimentalnoj analizi organizama, koji imaju sposobnost proizvodnje PUFA-a. Ovi geni će biti pogodni za uvođenje u specifični organizam domaćina, kako bi omogućili ili pojačali sintezu PUFA od strane organizma.
Multizimi i spojnice
U jednom ostvarenju, ovaj pronalazak se odnosi na multizim, koji sadrži pojedinačni polipeptid, koji poseduje dve nezavisne enzimske aktivnosti, koje se mogu razdvojiti.
Primeri pogodnih enzimskih aktivnosti uključuju: elongaze, desaturaze masne kiseline, transferaze, acil CoA sintaze i tioesteraze. Na primer, pogodne desaturaze masne kiseline uključuju, ali se njima ne ograničavaju: delta-4 desaturazu, delta-5 desaturazu, delta-6 desaturazu, delta-8 desaturazu, delta-9 desaturazu, delta-12 desaturazu, delta-15 desaturazu i/ili delta-17 desaturazu. Primeri pogodnih elongaza uključuju, ali bez ograničavanja na njih: delta-9 elongazu, Cj4/i6elongazu, Cić/is elongazu, C18/20elongazu i/ili C20/22elongazu.
Primeri pogodnih transferaza uključuju, ali bez ograničavanja, acil transferaze, kao što su: glicerol-3-fosfat O-aciltransferaza (takođe se naziva glicerol-fosfat acil transferaza ili glicerol-3-fosfat acil transferaza; GPAT), 2-acilglicerol 0-aciltransferaza, 1-acilglicerol-3-fosfat O-aciltransferaza (takođe se naziva 1-acilglicerol-fosfat aciltransferaza ili aciltransferaza lizo-fosfatidne kiseline; AGP AT ili LPAAT ili LPAT), 2-acilglicerol-3-fosfat O-aciltransferaza, 1-acilglicerolfosfoholin O-aciltransferaza (takođe nazvana lizo-lecitin aciltransferaza ili lizo-fosfatidilholin aciltransferaza; AGPCAT ili LLAT ili LPCAT), 2-acilglicerofosfoholin 0-aciltransferaza, diacilglicerol O-aciltransferaza (takođe nazvana diglicerid aciltransferaza; DAGAT ili DGAT) i fosfolipid:diacilglicerol aciltransferaza (PDAT).
Primer pogodne acil CoA sintetaze uključuje, ali bez ograničavanja, ligazu masne kiselina dugog lanca-CoA (nazvanu, takođe, acil-aktivacijski enzim ili acil-CoA sintetaza).
61
Primer pogodne tioesteraze uključuje, ali bez ograničavanja na nju, oleoil-[acil-nosač-protein] hidrolazu (nazvanu, takođe, acil-[acil-nosač-protein] hidrolaza, acil-ACP-hidrolaza ili acil-ACP-tioesteraza).
Poželjno, tekući multizim posedovao bi enzimske aktivnosti, koje obuhvataju najmanje jednu elongazu masne kiseline, koja je vezana na najmanje jednu desaturazu masne kiseline.
Vezivanje, koje je korišćeno za obrazovanje multizima, minimalno je sastavljeno od jedne polipeptidne veze. S drugog aspekta, vezivanje može biti sastavljeno od jednog aminokiselinskog ostatka, kao što je prolin, ili polipeptida. Može biti poželjno da, ukoliko je veza polipeptid, tada on ima najmanje jedan prolinski aminokiselinski ostatak.
Poželjno, multizim pronalaska sadrži prvu enzimsku aktivnost, povezanu sa drugom enzimskom aktivnošću, a veza je odabrana iz grupe koju sačinjavaju: polipeptidna veza, SEQ ID NO: 198 (EgDHAsvnl spojnica), SEQ ID NO:200 (EgDHAsyn2 spojnica), SEQ ID NO:235 (EaDHAsvnl spojnica), SEQ ID NO:472, SEQ ID NO:504 i modifikovane spojniceYarrowie lipolytice(SEQ ID NOi:438 i 445).
Takođe je unutar okvira ovog pronalaska i postupak za izradu multizima, koji obuhvata: (a) povezivanje prvog polipeptida sa najmanje drugim polipeptidom, pri čemu svaki polipeptid ima nezavisnu enzimsku aktivnost, koja se može razdvojiti; i (b) procenu proizvoda iz koraka (a) na posedovanje nezavisnih enzimskih aktivnosti, koje se mogu razdvojiti.
Kao što je prethodno raspravljeno, enzimske aktivnosti su odabrane iz grupe, koju sačinjavaju: elongaze masne kiseline, desaturaze masne kiseline, acil transferaze, acil CoA sintaze i tioesteraze. Poželjno, enzimske aktivnosti uključuju najmanje jednu elongazu masne kiseline, koja je vezana na najmanje jednu desaturazu masne kiseline.
Prethodno su razmotreni primeri pogodnih desaturaza, elongaza i spojnica.
Iako su prethodno opisani brojni primeri multizima, od posebnog značaja su DHA sintaze (koje uključuju aktivnost C20 elongaze i aktivnost delta-4 desaturaze) i DGLA sintaze (koje uključuju i aktivnost delta-9 elongaze i aktivnost delta-8 desaturaze). Ovde opisani podaci potvrđuju da povezivanje dva domena unutar svake sintaze 62
proizvodi povećanu efikasnost ili fluks, kada se uporedi sa efikasnošću ili fluksom, koji se zapaža kada enzimski domeni postoje kao nezavisni entiteti, t.j., nisu povezani zajedno u multizimu.
Na primer, kada je multizim, koji sadrži domen C20 elongazeEuglene gracilisi delta-4 desaturazuSchizochytrium aggregatum,ekspresovan uYarrowii lipolytici,aktivnost delta-4 desaturaze je približno 2 do 3-puta veća u spojenoj konstrukciji, kada se suprotstavi njenoj aktivnosti kada se ekspresuje zasebno (Primer 28). Na sličan način, kada je fuzija domen C20 elongazeEuglene gracilis- de\ ta- 4desaturazaSchizochytrium aggregatumekspresovana kao multizim u soji, izmeren je povećan fluks EPA u DHA, kada se suprotstavi nezavisnom ekspresovanju dva enzima (Primer 49).
Povećana efikasnost (ili fluks LA u DGLA), takođe je demonstrirana u raznim kreiranim DGLA sintazama. Serije od šest fuzionih konstrukcija delta-9 elongaza/delta-8 desaturaza kreirane su korišćenjem raznih kombinacija delta-9 elongaza, dobijenih izE. gracilis, E. anabaeneUTEX 373 iEutreptiella sp.CCMP389 i delta-8 desaturaza, dobijenih izE. gracilisiE. anabaeneUTEX 373; one su pojedinačno ekspresovane uYarrowii lipolytici(Primer 55, odnosno 56). U svim slučajevima, fuzioni gen je imao veću aktivnost od samog pojedinačnog gena, kada se ekspresuje uYarrowii.Ovi podaci ponovo sugerišu da proizvod delta-9 elongaze može bi direktno sproveden kao supstrat delta-8 desaturaze u fuzionom proteinu. Stručno lice u ovoj oblasti bilo bi u stanju da koristi ova saznanja za kreiranje raznih drugih multizima, koji imaju povećanu efikasnost ili fluks. Sledstveno tome, pronalazak se odnosi na bilo koji multizim, koji je izrađen korišćenjem spojnice, dobijene iz sekvenci pronalaska. Poželjni multizimi su oni, koji kombinuju razne gene biosintetskog puta PUFA.
Identifikacija sekvence novih DHA sintaza
U ovom pronalasku, nukleotidne sekvence, koje kodiraju DHA sintaze, bile su izolovane izEuglene gracilisiEuglene anabaene,kao što je sažeto prikazano ispod u Tabeli 4.
U nekim ostvarenjima, sekvence tekuće DHA sintaze: EgDHAsvnl, EgDHAsyn2, EaDHAsvnl, EaDHAsyn2 i EaDHAsyn3, mogu biti kodon-optimizovane za ekspresiju u pojedinom organizmu domaćina. Kao što je u struci dobro poznato, ovo može biti korisno sredstvo, kako bi se dalje optimizovala ekspresija enzima u zamenjenom domaćinu, budući da upotreba kodona, poželjnih za domaćina, može suštinski povećati ekspresiju stranog gena, koji kodira polipeptid. EgDHAsynl, primera radi, bila je kodon-optimizovana za ekspresiju uYarrowii lipolytici(primer 54), proizvodeći, na taj način, EgDHAsynlS (kao što je razmotreno u U.S. Patentu 7,238,482 i U.S. Patentu 7,125,672).
Stručnjak u ovoj oblasti bio bi u stanju da koristi ova saznanja, kako bi se kreirali razni drugi kodon-optimizovani proteini DHA sintaze, koji su pogodni za optimalnu ekspresiju u alternativnim domaćinima, na bazi sekvenci divljeg tipa EgDHAsvnl, EgDHAsyn2, EaDHAsvnl, EaDHAsyn2 i/ili EaDHAsyn3, koje su prethodno opisane u Tabeli 4. Sledstveno tome, tekući pronalazak se odnosi na bilo koji kodon-optimizovani protein DHA sintaze, koji je dobijen iz sekvence divljeg tipa ovog pronalaska. U nekim poželjnim ostvarenjima, može biti poželjno da se modifikuje deo kodona, koji kodiraju EgDHAsynl, EgDHAsyn2, EaDHAsynl, EaDHAsyn2 i/ili EaDHAsyn3, da bi se povećala ekspresija gena u organizmu domaćina, koji uključuje, ali bez ograničenja, biljku ili deo biljke.
U drugom ostvarenju, ovaj pronalazak se odnosi na izolovani polinukleotid, koji kodira DHA sintazu, i koji uključuje:
(a) nukleotidnu sekvencu, koja kodira polipeptid, koji poseduje aktivnost DHA sintaze, pri čemu polipeptid ima najmanje 80% aminokiselinskog identiteta, na bazi Clustal V postupka slaganja, kada se uporedi sa aminokiselinskom sekvencom kao što je navedena u SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:95, SEQ ID NO:96 ili SEQ ID NO:97; (b) nukleotidnu sekvencu, koja kodira polipeptid, koji poseduje aktivnost DHA sintaze, pri čemu nukleotidna sekvenca ima najmanje 80% identiteta sekvence, na bazi BLASTN postupka slaganja, kada se uporedi sa nukleotidnom sekvencom, kao što je navedena u SEQ ID NO:l 1, SEQ ID NO:205, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:93 ili SEQ IDNO:410; (c) nukleotidnu sekvencu, koja kodira polipeptid, koji poseduje aktivnost DHA sintaze, pri čemu se nukleotidna sekvenca hibridizuje pod strogim uslovima u nukleotidnu sekvencu, kao što je navedena u SEQ ID NO:ll, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:93, SEQ ID NO.205 ili SEQ ID NO:410 ili (d) komplement nukleotidne sekvence pod (a), (b) ili (c), pri čemu se komplement i nukleotidna sekvenca sastoje od istog broja nukleotida i 100% su komplementarni.
U jednom drugom ostvarenju, ovaj pronalazak se odnosi na izolovani polinukleotid koji uključuje: (a) nukleotidnu sekvencu, koja kodira polipeptid, koji poseduje aktivnost DHA sintaze, pri čemu polipeptid ima najmanje 80% aminokiselinskog identiteta, na bazi Clustal V postupka slaganja, kada se uporedi sa aminokiselinskom sekvencom, kao što je navedena u SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:95, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:97 ili SEQ ID NO:411; (b) nukleotidnu sekvencu, koja kodira polipeptid, koji poseduje aktivnost DHA sintaze, pri čemu nukleotidna sekvenca ima najmanje 80% identiteta sekvence, na bazi BLASTN postupka slaganja, kada se uporedi sa nukleotidnom sekvencom kao što je navedena u SEQ ID NO:ll, SEQ ID NO:205, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:93 ili SEQ ID NO:410; (c) nukleotidnu sekvencu, koja kodira polipeptid, koji poseduje aktivnost DHA sintaze, pri čemu se nukleotidna sekvenca hibridizuje pod strogim uslovima u
nukleotidnu sekvencu, kao što je navedena u SEQ ID NO:l 1, SEQ ID NO:205, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:93 ili SEQ ID NO:410 ili (d) komplement nukleotidne sekvence pod (a), (b) ili (c), pri čemu se komplement i nukleotidna sekvenca sastoje od istog broja nukleotida i 100% su komplementarni.
Poželjno, izolovani polinukleotid, koji kodira DHA sintazu, sadrži sekvencu, navedenu u bilo kojoj od: SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO:205, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:93 ili SEQ ID NO:410.
Identifikacija i izolacija homologa
Bilo koja od sekvenci tekuće DHA sintaze (t.j., EgDHAsvnl, EgDHAsyn2, EaDHAsvnl, EaDHAsyn2 i EaDHAsyn3) ili njihovih delova može se upotrebiti za traženje homologa DHA sintaze, u istom ili drugačijem speciesu bakterije, alge, gljivice, euglenoida ili biljke, koristeći softver za analizu sekvence. Uopšteno, takav kompjuterski softver slaže slične sekvence, pripisujući stepene homologije raznim supstitucijama, delecijama i drugim modifikacijama.
Alternativno, bilo koja od sekvenci tekuće DHA sintaze ili njihovi delovi mogu se upotrebiti kao hibridizacioni reagensi za identifikaciju homologa DHA sintaze. Osnovne komponente hibridizacionog testa nukleinske kiseline obuhvataju: probu, uzorak, za koji postoji sumnja da sadrži gen ili fragment gena od značaja, i specifični hibridizacioni postupak. Probe ovog pronalaska su obično sekvence jednostruke nukleinske kiseline, koje su komplementarne sekvencama nukleinske kiseline, koje se detektuju. Probe se mogu "hibridizovati" u sekvencu nukleinske kiseline, koja se detektuje. Iako dužina probe može varirati od 5 baza do desetina hiljada baza, obično je pogodna dužina probe od oko 15 baza do oko 30 baza. Neophodno je da samo deo molekula probe bude komplementaran sa sekvencom nukleinske kiseline, koja se detektuje. Pored toga, nije neophodno da komplementarnost između probe i ciljne sekvence bude savršena. Hibridizacija se dešava između nepotpuno komplementarnih molekula, sa rezultatom da se određena frakcija baza u hibridizovanom regionu ne sparuje sa odgovarajućom komplementarnom bazom.
Hibridizacioni posupci su dobro definisani. Obično proba i uzorak moraju biti pomešani pod uslovima, koji će omogućiti hibridizaciju nukleinske kiseline. Ovo uključuje dovođenje u kontakt probe i uzorka, u prisustvu neorganske ili organske soli, pod uslovima odgovarajuće koncentracije i temperature. Proba i uzorak nukleinskih kiselina moraju biti u kontaktu dovoljno dugo vremena, da se može odvijati bilo koja moguća hibridizacija između probe i uzorka nukleinske kiseline. Koncentracija probe ili ciljnog uzorka u smeši odrediće vreme, koje je potrebno da bi se odvijala hibridizacija. Što je veća koncentracija probe ili ciljnog uzorka, potrebno je kraće inkubaciono vreme hibridizacije. Opciono, može se dodati haotropni agens (npr., gvanidinijum hlorid, gvanidinijum tiocijanat, natrijum tiocijanat, litijum tetrahloroacetat, natrijum perhlorat, rubidijum tetrahloroacetat, kalijum jodid, cezijum trifluoroacetat). Ako se to želi, neki mogu hibridizacionoj smeši dodati formamid, obično 30-50% (v/v).
Mogu se koristiti različiti hibridizacioni rastvori. Uobičajeno, oni sadrže od oko 20 do 60% zapremine, poželjno 30%, polarnog organskog rastvarača. Opšti hibridizacioni rastvor sadrži oko 30-50% v/v formamida, oko 0.15 do 1 M natrijum hlorid, otprilike 0.05 do 0.1 M pufere (npr., natrijum citrat, Tris-HCl, PIPES ili HEPES (pH raspon oko 6-9)), oko 0.05 do 0.2% deterdženta (npr., natrijum dodecilsulfat), ili između 0.5-20 mM EDTA, FICOLL (Pharmacia Inc.) (oko 300-500 kdal), polivinilpirolidon (oko 250-500 kdal) i serumski albumin. Takođe će u uobičajeni hibridizacioni rastvor biti uključen neobeleženi nosač nukleinskih kiselina od oko 0.1 do 5 mg/mL, fragmentovana nukleinska DNK (npr., DNK telećeg timusa ili lososove sperme ili RNK kvasca), i, opciono, oko 0.5 do 2% tež/vol glicina. Takođe mogu biti uključeni drugi aditivi, kao što su agensi za izbacivanje zapremine, koji obuhvataju raznolike polarne, u vodi rastvorljive, agense ili agense koji mogu bubriti (npr., polietilen glikol), anjonske polimere (npr., poliakrilat ili polimetilakrilat) i anjonske saharidne polimere (npr., dekstran sulfat).
Hibridizacija nukleinske kiseline može se adaptirati na različite formate testova. Jedan od najpogodnijih je format sendvič testa. Sendvič test je posebno adaptibilan za hibridizaciju pod uslovima bez denaturacije. Primarna komponenta testa sendvič-tipa jeste čvrsta podloga. Čvrsta podloga je adsorbovala ili kovalentno kuplovala na sebe imobilisanu probu nukleinske kiseline, koja je neobeležena i komplementarna sa jednim delom sekvence.
U dodatnim ostvarenjima, bilo koji od, ovde opisanih, fragmenata nukleinske kiseline DHA sintaze (ili bilo koji njihovi identifikovani homo lozi) mogu se upotrebiti za izolovanje gena, koji kodiraju homologne proteine iz istog ili drugačijeg speciesa bakterije, alge, gljivice, euglenoida ili biljke. Izolovanje homolognih gena, korišćenjem protokola, koji zavise od sekvence, dobro je poznato u struci. Primeri protokola, koji zavise od sekvence, uključuju, ali bez ograničenja istima: (1) postupke hibridizacije nukleinske kiseline; (2) postupke amplifikacije DNK i RNK, kao što je primerom pokazano raznim korišćenjima tehnologija amplifikacije nukleinske kiseline [npr., lančana polimeraza reakcija (PCR), Mullis et al., U.S. Patent 4,683,202; lančana ligaza reakcija (LCR), Tabor et al.,Proc. Acad. Sci.USA 82:1074 (1985); ili amplifikacija zamenom struka (SDA), Walker et al,Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.,89:392 (1992)] i (3) postupke konstruisanja biblioteke i skriniranje pomoću komplemenata.
Primera radi, geni, koji kodiraju proteine ili polipeptide, koji su slični, ovde opisanom, multizimu ili njihovom pojedinačnom domenu (kao što su DHA sintaze), mogli su se izolovati direktno, korišćenjem svih fragmenata ili delova fragmenata tekuće nukleinske kiseline, kao, na primer, hibridizacionim DNK probama, kako bi se skrinirale biblioteke iz, npr., bilo kog poželjnog kvasca ili gljivice, koristeći metodologiju, koja je dobro poznata stručnim licima u ovoj oblasti (pri čemu bi oni organizmi, koji proizvode DTA, DPAn-6, DPA i/ili DHA, bili poželjni). Specifične oligonukleotidne probe, bazirane na sekvencama tekuće nukleinske kiseline mogu biti dizajnirane i sintetisane postupcima, poznatim u struci (Maniatis,supra).Pored toga, celokupne sekvence mogu se koristiti direktno, kako bi se sintetisale DNK probe, postupcima, koji su poznati stručnom tehničaru (npr., tehnike obeležavanja nasumičnih DNK prajmera, translacionog rezanja ili završnog obeležavanja) ili RNK probe, koristeći raspoložive,in vitrotranskripcione sisteme. Pored toga, specifični prajmeri mogu se dizajnirati i upotrebiti za amplifikaciju dela (ili pune dužine) tekućih sekvenci. Nastali proizvodi amplifikacije mogu biti obeleženi direktno, tokom amplifikacionih reakcija ili mogu biti obeleženi nakon reakcija amplifikacije, i upotrebljeni kao probe za izolovanje DNK fragmenata pune dužine, pod uslovima odgovarajuće strogosti.
Uobičajno, u tehnikama amplifikacije PCR-tipa, prajmeri imaju različite sekvence i nisu komplementarni jedni s drugima. U zavisnosti od željenih uslova testa, sekvence prajmera bi bile dizajnirane tako da omoguće i efikasnu i verodostojnu replikaciju ciljne nukleinske kiseline. Postupci dizajniranja PCR prajmera uobičajeni su i dobro poznati u struci (Thein i Wallace, "The use of oligonucleotide as specific hvbridization probes in the Diagnosis of Genetic Disorders" uHuman Genetic Diseases: A Practical Approach,K. E. Daviš Ed., (1986) pp 33-50, IRL:Herndon, VA; i Rvchlik, W., U Methods in Molecular Biolo<g>v, White, B.A. Ed., (1993) Vol. 15, pp 31-39, PCR Protocols: Current Methods and Applications. Humania: Totovva, NJ).
Uopšteno, dva kratka segmenta ovih sekvenci mogu se koristiti u PCR protokolima, za amplifikaciju dužih fragmenata nukleinske kiseline, koji kodiraju homologne gene iz DNK ili RNK. PCR može, takođe, biti izveden na biblioteci kloniranih fragmenata nukleinske kiseline, pri čemu je sekvenca jednog prajmera dobijena iz fragmenata tekuće nukleinske kiseline, a sekvenca drugog prajmera preuzima prednost prisustva traktova poliadenilne kiseline na 3' kraju prekursora mRNK, koji kodira eukariotske gene.
Alternativno, sekvenca drugog prajmera može biti bazirana na sekvencama, dobijenim iz klonirajućeg vektora. Primera radi, vešt tehničar može slediti RACE protokol (Frohman et al,Proc. Natl Acad. Sci. U. SA.,85:8998 (1988)), kako bi se proizvele cDNK, koristeći PCR, da bi se amplifikovale kopije regiona između jedne tačke u transkriptu i 3' ili 5' kraja. Prajmeri, koji su orijentisani u 3' i 5' smerovima, mogu se dizajnirati iz tekućih sekvenci. Koristeći, komercijalno dostupne, 3' RACE ili 5' RACE sisteme (Gibco/BRL, Gaithersburg, MD), mogu se izolovati specifični 3' ili 5' fragmenti cDNK (Ohara et al.,Proc. Natl Acad. Sci. U. SA.,86:5673 (1989); Loh et al.,Science,243:217(1989)).
U drugim ostvarenjima, bilo koji od enzima (npr., multizimi, DHA sintaze ili pojedinačni domeni, koji su ovde opisani) mogu biti modifikovani. Kao što je, stručnim licima u ovoj oblasti dobro poznato,in vitromutageneza i selekcija, hemijska mutageneza, postupci "mešanja gena" ili druga sredstva, mogu se upotrebiti, da bi se postigle mutacije gena, koji postoje u prirodi. Alternativno, multizimi mogu biti sintetisani zamenjivanjem domena, pri čemu funkcionalni domen iz bilo kog enzima može biti zamenjen ili dodat funkcionalnom domenu u zamenjenom enzimu, kako bi se, na taj način, proizveo novi protein.
Identifikacija sekvence novih C20 elongaza
U ovom pronalasku, nukleotidne sekvence, koje kodiraju C20 elongaze bile su izolovane izEuglene gracilisiEuglene anabaene,kao što je sažeto prikazano ispod u Tabeli 5.
Ovaj pronalazak se odnosi na izolovani polinukleotid, koji kodira C20 elongazu, i koji uključuje: (a) nukleotidnu sekvencu, koja kodira polipeptid, koji poseduje aktivnost C20 elongaze, pri čemu polipeptid ima najmanje 80% aminokiselinskog identiteta, na bazi Clustal V postupka slaganja, kada se uporedi sa aminokiselinskom sekvencom, kao što je navedena u: SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:95, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:97, SEQ ID NO:202, SEQ ID NO:204, SEQ ID NO:231, SEQ ID NO:232 ili SEQ ID NO:233; (b) nukleotidnu sekvencu, koja kodira polipeptid, koji poseduje aktivnost C20 elongaze, pri čemu nukleotidna sekvenca ima najmanje 80% identiteta sekvence, na bazi BLASTN postupka slaganja, kada se uporedi sa nukleotidnom sekvencom, kao što je navedena u: SEQ ID NO.ll, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:93, SEQ ID NO:183, SEQ ID NO:188, SEQ ID NO:201, SEQ ID NO:206, SEQ ID NO.203, SEQ ID NO:227, SEQ ID NO:228, SEQ ID NO:229 ili SEQ ID NO:230; (c) nukleotidnu sekvencu, koja kodira polipeptid, koji poseduje aktivnost C20 elongaze, pri čemu se nukleotidna sekvenca hibridizuje pod strogim uslovima u nukleotidnu sekvencu, kao što je navedena u: SEQ ID NO.ll, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:93, SEQ ID NO:183, SEQ ID NO:188, SEQ ID NO:201, SEQ ID NO-.206, SEQ ID NO:203, SEQ ID NO:227, SEQ ID NO:228, SEQ ID N0.229, SEQ ID NO:230; ili (d) komplement nukleotidne sekvence pod (a), (b) ili (c), pri čemu se komplement i nukleotidna sekvenca sastoje od istog broja nukleotida i 100% su komplementarni.
Poželjno, izolovani polinukleotid, koji kodira C20 elongazu, sadrži sekvencu, navedenu u bilo kojoj od: SEQ ID NO: 183, SEQ ID NO: 188, SEQ ID NO:201, SEQ ID NO:206, SEQ ID NO:203, SEQ ID NO:227, SEQ ID NO:228, SEQ ID NO:229 ili SEQ ID NO:230.
Identifikacija sekvence novih delta- 4 desaturaza
U ovom pronalasku, nukleotidne sekvence, koje kodiraju delta-4 desaturaze bile su izolovane izEuglene gracilisiEuglene anabaene,kao što je sažeto prikazano ispod u Tabeli 6.
<*>Napomena: domen 1 delta-4 desaturaze ne uključuje spojnicu bogatu prolmom DHA sintaze, iz koje je dobijen. Suprotno tome, domen 2 delta-4 desaturaze uključuje spojnicu bogatu prolinom DHA sintaze, iz koje je dobijen.
U alternativnim ostvarenjima, sekvence domena tekuće delta-4 desaturaze mogu biti kodon-optimizovane za ekspresiju u organizmu određenog domaćina. Primera radi, domen delta-4 desaturaze EaDHAsyn2Euglena anabaenebio je kodon-optimizovan za ekspresiju uYarrowii lipolytici.Na primer, domen delta-4 desaturaze EgDHAsynlEuglena gracilisbio je, takođe, kodon-optimizovan za ekspresiju uYarrowii lipolytici.Stručnjak u ovoj oblasti bio bi u stanju da iskoristi ova saznanja, kako bi kreirao različite druge proteine delta-4 desaturaze, koji su kodon-optimizovani i pogodni za optimalnu ekspresiju u alternativnim domaćinima, na bazi sekvenci domena delta-4 desaturaze divljeg tipa: EgDHAsynl, EgDHAsyn2, EaDHAsynl, EaDHAsyn2 i/ili EaDHAsyn3, kao što je prethodno opisano u Tabeli 6. Sledstveno tome, tekući pronalazak se odnosi na bilo koji protein delta-4 desaturaze, optimizovan kodonom, koji je dobijen iz sekvence divljeg tipa ovog pronalaska. U nekim poželjnim ostvarenjima, može biti poželjno da se modifikuje deo kodona, koji kodiraju sekvence domena delta-4 desaturaze: EgDHAsynl, EgDHAsyn2, EaDHAsynl, EaDHAsyn2 i/ili EaDHAsyn3, kako bi se povećala ekspresija gena u organizmu domaćina, koji uključuje, ali bez ograničenja, biljku ili deo biljke.
Nadalje, na osnovu zapažanja da izgleda da se C-terminalni deo domena C20 elongaze DHA sintaza preklapa sa N-terminalnim delom domena delta-4 desaturaze, izvršene su funkcionalne analize, kako bi se definisao optimalni funkcionalni domen delta-4 desaturaze. Kao što je ovde opisano u nastavku, u Primerima 51 i 53, studije delecione mutageneze su izvedene korišćenjem kodon-optimizovanih proteinskih sekvenci, EaD4S (SEQ ID NO:193) i EgD4S (SEQ ID NO:388). Proizvedene su sledeće varijante: EaD4S-3 (SEQ ID NO:386), EaD4S-2 (SEQ ID NO:384), EaD4S-l (SEQ ID NO:382), EgD4S-3 (SEQ ID NO:408), EgD4S-2 (SEQ ID NO:406) i EgD4S-l (SEQ ID NO-.404).
Lice, stručno u ovoj oblasti, prepoznaće da, zbog toga što nisu u potpunosti definisane egzaktne granice ovih pojedinih sekvenci delta-4 desaturaze izEuglene gracilisiEuglene anabaene,proteinski fragmenti ili polipeptidi uvećanih ili smanjenih dužina, mogu posedovati uporedivu aktivnost delta-4 desaturaze. Slično, uporediva skraćenja mogla bi jednostavno biti izvršena na bazi sekvenci domena delta-4 desaturaze divljeg tipa: EgDHAsynl, EgDHAsyn2, EaDHAsynl, EaDHAsyn2 i/ili EaDHAsyn3, kao što je prethodno opisano u Tabeli 6, kako bi se proizvela delta-4 desaturaza, koja poseduje dovoljnu količinu aktivnosti delta-4 desaturaze, pri čemu bi bila poželjna ekvivalentna ili povećana aktivnost delta-4 desaturaze.
Stoga se ovaj pronalazak, nadalje, odnosi na izolovani polinukleotid, koji kodira delta-4 desaturazu, i koji uključuje: (a) nukleotidnu sekvencu, koja kodira polipeptid, koji poseduje aktivnost delta-4 desaturaze, pri čemu polipeptid ima najmanje 80% aminokiselinskog identiteta, na bazi Clustal V postupka slaganja, kada se uporedi sa aminokiselinskom sekvencom kao što je navedena u SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:95, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:97, SEQ ID NO:215, SEQ ID N0.217, SEQ ID NO:221, SEQ ID NO:239, SEQ ID NO:240, SEQ ID NO:241, SEQ ID NO:246, SEQ ID NO:247, SEQ ID NO:248, SEQ ID NO.-249, SEQ ID NO:193, SEQ ID NO:382, SEQ ID NO:384, SEQ ID NO:386, SEQ ID NO:388, SEQ ID NO:404, SEQ ID NO:406 ili SEQ ID NO:408; (b) nukleotidnu sekvencu, koja kodira polipeptid, koji poseduje aktivnost delta-4 desaturaze, pri čemu nukleotidna sekvenca ima najmanje 80% identiteta sekvence, na bazi BLASTN postupka slaganja, kada se uporedi sa nukleotidnom sekvencom, kao što je navedena u: SEQ ID NO:ll, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:93, SEQ ID NO:214, SEQ ID NO:216, SEQ ID NO:220, SEQ ID NO:236, SEQ ID NO:237, SEQ ID NO:238, SEQ ID NO:242, SEQ ID NO:243, SEQ ID NO:244, SEQ ID NO:245, SEQ ID NO:192, SEQ ID NO:381, SEQ ID NO:383, SEQ ID NO:385, SEQ ID NO:387, SEQ ID NO:403, SEQ ID NO: 405 ili SEQ ID NO:407; (c) nukleotidnu sekvencu, koja kodira polipeptid, koji poseduje aktivnost delta-4 desaturaze, pri čemu se nukleotidna sekvenca hibridizuje pod strogim uslovima u nukleotidnu sekvencu, kao što je navedena u: SEQ ID NO:ll, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:93, SEQ ID NO:214, SEQ ID NO:216, SEQ ID NO.220, SEQ ID NO:236, SEQ ID N0.237, SEQ ID NO:238, SEQ ID NO:242, SEQ ID NO:243, SEQ ID NO:244, SEQ ID NO:245, SEQ ID NO:192, SEQ ID NO:381, SEQ ID NO:383, SEQ ID NO:385, SEQ ID NO:387, SEQ ID NO:403, SEQ ID NO: 405 ili SEQ ID NO:407; ili (d) komplement nukleotidne sekvence pod (a), (b) ili (c), pri čemu se komplement i nukleotidna sekvenca sastoje od istog broja nukleotida i 100% su komplementarni.
Poželjno, izolovani polinukleotid, koji kodira delta-4 desaturazu, sadrži sekvencu, navedenu u bilo kojoj od: SEQ ID NO:214, SEQ ID NO:220, SEQ ID NO:236, SEQ ID NO:237, SEQ ID NO:238, SEQ ID N0.242, SEQ ID N0.243, SEQ ID NO:244, SEQ ID NO:245, SEQ ID NO: 192, SEQ ID NO:381, SEQ ID NO:383, SEQ ID N0.385, SEQ ID NO:387, SEQ ID NO:403, SEQ ID NO: 405 ili SEQ ID NO:407.
Efekat skraćivanja delta 4-desaturazeEuglene anabaenejeste taj što je enzimska aktivnost povećana u poređenju sa aktivnošću enzima sekvence divljeg tipa. Ovaj rezultat je neočekivan i nepredvidljiv, budući da bi lice uobičajene stručnosti u ovoj oblasti, očekivalo da aktivnost skraćena sekvence neće biti biti bolja, a mogućno će biti manje aktivna od sekvence divljeg tipa. Sledstveno tome, pronalazak obezbeđuje novi postupak za dobijanje delta-4 desaturaze, koja poseduje veću aktivnost od sekvence divljeg tipa, postupak, koji obuhvata: a) obezbeđivanje polipeptida delta-4 desaturaze divljeg tipa, izolovanog izEuglene anabaene,koji poseduje bazalnu aktivnost delta-4 desaturaze i b) skraćivanje polipeptida divljeg tipa pod (a) za oko 1 do oko 200 aminokiselina (a), kako bi se kreirao skraćeni mutant polipeptid, koji poseduje aktivnost delta-4 desaturaze, koja je povećana u poređenju sa bazalnom aktivnošću delta-4 desaturaze. "Bazama aktivnost", kao što je korišćena u ovom kontekstu, definisana je kao aktivnost enzima divljeg tipa, koja je izmerena iliin vivoiliin vi tro,prema standardnim enzimskim protokolima, kao što su ovde opisani.
U drugim ostvarenjima, bilo koji od enzima (npr., multizimi, DHA sintaze, C20 elongaze, delta-4 desaturaze i/ili bilo koji homolozi), koji su ovde identifikovani, mogu biti modifikovani, da bi se proizveli novi /ili poboljšani enzimi PUFA biosintetskog puta. Kao što je stručnim licima u ovoj oblasti dobro poznato,in vitromutageneza i selekcija, hemijska mutageneza, postupci "mešanja gena" ili druga sredstva, mogu se upotrebiti, da bi se postigle mutacije gena, koji postoje u prirodi. Alternativno, multizimi mogu biti sintetisani zamenom domena, pri čemu funkcionalni domen iz bilo kog enzima može biti zamenjen ili dodat funkcionalnom domenu u zamenjenom enzimu, kako bi se, na taj način, proizveo novi protein.
Postupci za proizvodnju raznih omega- 3 i/ ili omega- 6 masnih kiselina
Očekuje se da će uvođenje himeričnih gena, koji kodiraju, ovde opisane, DHA sintaze (t.j., EgDHAsvnl, EgDHAsyn2, EaDHAsvnl, EaDHAsyn2 i EaDHAsyn3 ili druge mutant enzime, kodon-optimizovane enzime ili njihove homologe), pod kontrolom odgovarajućih promotera, dovesti do povećane proizvodnje DTA, DPAn-6, odnosno DPA i/ili DHA, u transformisanom organizmu domaćina. Kao takav, ovaj pronalazak obuhvata postupak za direktnu proizvodnju PUFA-a, koji uključuje izlaganje supstrata masne kiseline (t.j., EPA ili DPA), ovde opisanim, enzimima DHA sintaze (npr., EgDHAsynl, EgDHAsyn2, EaDHAsynl, EaDHAsyn2 i EaDHAsyn3), tako daje supstrat konvertovan u željeni proizvod masne kiseline (t.j., DHA).
Određenije, ovaj pronalazak se odnosi na postupak za transformisanje ćelije domaćina, tako da domaćinska ćelija u svom genomu sadrži rekombinantnu konstrukciju pronalaska.
Primeri pogodnih domaćinskih ćelija uključuju, ali se njima ne ograničavaju, biljke i kvasac. Poželjno, biljne ćelije su dobijene iz biljke uljnog semena, kao stoje soja i slično, a ćelije kvasca su dobijene iz uljastog kvasca, kao stojeYarrowiasp.
Takođe je unutar okvira ovog pronalaska postupak proizvodnje transformisane biljke ili kvasca, koji obuhvata transformisanje biljne ćelije ili ćelije kvasca sa bilo kojim od polinukleotida pronalaska i regenerisanje biljke iz transformisane biljne ćelije ili uzgoj transformisanih ćelija kvasca.
Još određenije, cilj ovog pronalaska jeste da obezbedi postupak za proizvodnju DPAn-6 ili DHA u ćeliji domaćina (npr., biljke, uljasti kvasac), pri čemu ćelija domaćina sadrži: (i) izolovani nukleotidni molekul, koji kodira polipeptid, koji poseduje aktivnost DHA sintaze, pri čemu polipeptid ima najmanje 80% aminokiselinskog identiteta, na bazi Clustal V postupka slaganja, kada se uporedi sa aminokiselinskom sekvencom, kao što je navedena u SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:95, SEQ TD NO:96 ili SEQ ID NO:97 i (ii) izvor ARA ili EPA;
pri čemu je ćelija domaćina rasla pod takvim uslovima da je polipeptid, koji poseduje aktivnost DHA sintaze, ekspresovan, a ARA je konvertovana u DPAn-6 i/ili EPA je konvertovana u DHA i pri čemu je DPAn-6 ili DHA opciono obnovljena.
U alternativnim ostvarenjima, ovaj pronalazak se odnosi na postupak za proizvodnju DTA ili DPA u ćeliji domaćina (npr., biljke, uljasti kvasac), pri čemu ćelija domaćina sadrži: (ii) izolovani nukleotidni molekul, koji kodira polipeptid, koji poseduje aktivnost C20 elongaze, pri čemu polipeptid ima najmanje 80% aminokiselinskog identiteta, na bazi Clustal V postupka slaganja, kada se uporedi sa aminokiselinskom sekvencom, kao što je navedena u: SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:95, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:97, SEQ ID NO:202, SEQ ID NO:204, SEQ ID NO:231, SEQ ID NO:232 ili SEQ ID N0.233 i (ii) izvor ARA ili EPA;
pri čemu je ćelija domaćina rasla pod takvim uslovima daje polipeptid, koji poseduje aktivnost C20 elongaze, ekspresovan, a ARA je konvertovana u DTA i/ili EPA je konvertovana u DPA i pri čemu je DTA ili DPA opciono obnovljena.
Dodatno, pronalazak se odnosi na postupak za proizvodnju DPAn-6 ili DHA, pri čemu ćelija domaćina sadrži : (i) izolovani nukleotidni molekul, koji kodira polipeptid, koji poseduje aktivnost delta-4 desaturaze, pri čemu polipeptid ima najmanje 80% aminokiselinskog identiteta, na bazi Clustal V postupka slaganja, kada se uporedi sa aminokiselinskom sekvencom, kao što je navedena u SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:95, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:97, SEQ ID NO:215, SEQ ID NO:221, SEQ ID NO:239, SEQ ID NO:240, SEQ ID NO:241, SEQ ID NO:246, SEQ ID N0.247, SEQ ID NO:248, SEQ ID NO:249, SEQ ID NO:382, SEQ ID NO:384, SEQ ID NO:386, SEQ ID NO:388, SEQ ID NO:404, SEQ ID NO:406 ili SEQ ID NO:408 i (ii) izvor DTA ili DPA;
pri čemu je ćelija domaćina rasla pod takvim uslovima daje polipeptid, koji poseduje aktivnost delta-4 desaturaze, ekspresovan, a DTA je konvertovana u DPAn-6 i/ili DPA je konvertovana u DHA i pri čemu je DPAn-6 ili DHA opciono obnovljena.
Izvor korišćenog(ih) supstrata ARA, DTA, EPA ili DPA u bilo kom od prethodnih postupaka, može biti proizveden od strane domaćina ili prirodno ili transgenski, ili može biti dobijen egzogeno.
Spajanje pojedinačnih domena, kako bi se obrazovao multizim, mogao bi dovesti do smanjenja intermedijera masnih kiselina. Primera radi, spajanje C20 elongaze sa delta-4 desaturazom u multizim, kao što je DHA sintaza, može dovesti do smanjenja intermedijera masne kiseline DPA, tokom proizvodnje DHA. Na sličan način, spajanje delta-9 elongaze sa delta-8 desaturazom, koristeći EgDHAsvnl spojnicu, da bi se obrazovao multizim, kao što je ovde opisan, može dovesti do proizvodnje DGLA i ETA, uz smanjenjenje EDA i ERA intermedijera.
Alternativno, svaki gen multizima, koji uključuje DHA sintazu i njihov odgovarajući enzimski proizvod, koji je ovde opisan, može biti indirektno korišćen za proizvodnju raznih omega-6 i omega-3 PUFA-a, uključujući npr., DTA, DPAn-6, DGLA, ETA, ARA, EPA, DPA i/ili DHA (SLIKA 1; vidi U.S. Patent 7,238,482). Indirektna proizvodnja omega-3/omega-6 PUFA-a dešava se kada je supstrat masne kiseline indirektno konvertovan u željeni proizvod masne kiseline, uz pomoć intermedijernog(ih) koraka ili puta(eva) intermedijera. Stoga se smatra da, ovde opisane, DHA sintaze (t.j., EgDHAsvnl, EgDHAsyn2, EaDHAsvnl, EaDHAsyn2 i EaDHAsyn3 ili drugi mutant enzimi, kodon-optimizovani enzimi ili njihovi homolozi) mogu biti ekspresovane zajedno sa dodatnim genima, koji kodiraju enzime PUFA biosintetskog puta (npr., delta-6 desaturaze, C18/20elongaze, delta-17 desaturaze, delta-8 desaturaze, delta-15 desaturaze, delta-9 desaturaze, delta-12 desaturaze, Ch/ić elongaze, Ci6/i8elongaze, delta-9 elongaze, delta-5 desaturaze, delta-4 desaturaze, C20/22elongaze, DHA sintaze), da bi se dobili viši nivoi proizvodnje omega-3/omega-6 masnih kiselina dužeg lanca (npr., ARA, DTA, DPAn-6, EPA, DPA i/ili DHA).
Specifični geni, koji su uključeni unutar pojedine ekspresione kasete zavisiće od ćelije domaćina (i njenog PUFA profila i/ili profila desaturaza/elongaza), raspoloživosti supstrata i željenog završnog produkta (produkata).
Povremeno, može biti poželjno da se nus-proizvodi masnih kiselina svedu na minimum. Relativno mnoštvo nus-proizvoda masnih kiselina moglo bi biti smanjeno spajanjem pojedinačnih enzimskih puteva zajedno sa spojnicom, kako bi se formirao multizim. Na primer, prisustvo skiadonske kiseline (SCI) i/ili juniperonske kiseline (JUP)
[uobičajeno se nalaze u lipidima semena golosemenjača (Wolff et al.,Lipids35(l).T-22
(2000)), kao što su oni, koji se nalaze u familijiPinaceae(bor)] moglo bi se smatrati sporednim proizvodom masnih kiselina puta delta-6 desaturaza/delta-6 elongaza ili puta delta-9-elongaza/delta-8 desaturaza. Iako se smatra da ove masne kiseline same poseduju razne karakteristike koje poboljšavaju zdravlje (Nakane ct al.,Biol. Pharm. Buli.23:758-761 (2000)), njihovo prisustvo kao nus-produkata masnih kiselina u izgrađenom putu PUFA, kao na primer u kulturi uljnog semena, može biti nepoželjno, u zavisnosti od primene. Povezivanje delta-9 elongaze zajedno sa delta-8 desaturazom, koristeći spojnicu, kako bi se formirao multizim (DGLA i/ili ETA sintaza), primera radi, moglo bi dovesti do povećanog fluksa preko ovih koraka, koji dovode do smanjene raspoloživosti EDA/ERA intermedijera masnih kiselina do delta-5 desaturaze, i, na taj način, do smanjenih koncentracija SCI i JUP.
Povremeno, delta-6 elongaza može produžiti masne kiseline koje nisu predviđene masne kiseline. Na primer, delta-6 elongaze uopšteno kovertuju GLA u DGLA, ali neke delta-6 elongaze mogu, takođe, konvertovati supstrate koji nisu predviđeni, kao što su LA ili ALA u EDA, odnosno, ETrA. U putu delta-6 desaturaza/delta-6 elongaza, EDA i ETrA bi se smatrale "nus-proizvodima masnih kiselina". Dodavanje delta-8 desaturaze putu delta-6 desaturaza/delta-6 elongaza može obezbediti sredstvo za konverziju "nus- produkata masnih kiselina" EDA i ETrA, nazad u "intermedijere masnih kiselina" DGLA, odnosno, ETA.
U alternativnim ostvarenjima, može biti od koristi da se razori nativna DHA sintaza, C20 elongaza ili delta-4 desaturaza domaćinskog organizma, na osnovi, ovde opisanih, kompletnih sekvenci, komplementa ovih kompletnih sekvenci, suštinskih delova ovih sekvenci, kodon-optimizovanih desaturaza, dobijenih iz njih, i onih sekvenci, koje su sa njima suštinski homologne.
Ekspresioni sistemi, kasete i vektori i transformacija biljke
U jednom ostvarenju, ovaj pronalazak se odnosi na rekombinantnu konstrukciju, koja sadrži bilo koji od izolovanih polinukleotida pronalaska, koji je operativno vezan za najmanje jednu regulatornu sekvencu, pogodnu za ekspresiju u ćeliji domaćina, kao što je biljka. Promoter je DNK sekvenca koja usmerava ćelijsku mašineriju biljke da proizvodi RNK iz susedne kodirajuće sekvence nishodno (3') od promotera. Region promotera utiče na brzinu, razvojni stadij um i ćelijski tip, u kome je izrađen RNK transkript gena. RNK transkript je podvrgnut postupku, da bi se proizvela mRNK, koja služi kao kalup za translaciju RNK sekvence u aminokiselinsku sekvencu kodiranog polipeptida. 5' ne-translatovana vodeća sekvenca jeste region mRNK, ushodno od kodirajućeg regiona proteina, koji može igrati ulogu u inicijaciji i translaciji mRNK. Signal 3' terminacije transkripcije/poliadenilacije jeste ne-translatovani region nishodno od kodirajućeg regiona proteina, koji u biljnoj ćeliji dejstvuje tako da izaziva zaključivanje RNK transkripta i adiciju poliadenilatnih nukleotida na 3' kraj RNK.
Poreklo promotera, koji je odabran kako bi poveo ekspresiju kodirajuće sekvence multizima nije značajno, sve dok on ima dovoljno transkripcione aktivnosti da bi se izvršio pronalazak, pomoću ekspresovanja prevedive mRNK za željene fragmente nukleinske kiseline u željenom tkivu domaćina, u pravo vreme. Heterologni ili ne-heterologni (t.j., endogeni) promoteri mogu biti korišćeni za praktično izvođenje pronalaska. Na primer, pogodni promoteri u biljkama uključuju, ali se njima ne ograničavaju: promoter alfa prim podjedinice beta konglicinina, Kunitz tripsin inhibitor 3 promoter, aneksin promoter, glicinin Gyl promoter, promoter beta podjedinice beta konglicinina, P34/Gly Bd m 30K promoter, albumin promoter, Leg Al promoter i Leg A2 promoter.
Aneksin, ili P34, promoter je opisan u PCT Publication No. WO 2004/071178 (publikovana 26. avgusta 2004.). Nivo aktivnosti aneksin promotera može se porediti sa nivoom aktivnosti mnogih poznatih jakih promotera, kao što su: (1) CaMV 35S promoter (Atanassova et al.,Plant Mol. Biol.37:275-285 (1998); Battraw i Hali,Plam Mol. Biol.15:527-538 (1990); Holtorf et al.,Plant Mol. Biol.29:637-646 (1995); Jefferson et al.,EMBO J.6:3901-3907 (1987); Wilmink et al.,Plant Mol. Biol.28:949-955 (1995)); (2) promoterioleozina Arabidopsisa(Plant et al.,Plant Mol. Biol.25:193-205 (1994); Li, Texas A&M University Ph.D. disertacija, pp. 107-128 (1997)); (3) promoteri proteina ekstenzije ubikvitinaArabidopsisa(Callis et al.,J Biol. Chem.265(21): 12486-93 (1990)); (4) promoter gena ubikvitina paradajza (Rollfinke et al,Gene.211(2):267-76 (1998)); (5) promoter sojinog proteina toplotnog šoka (Schoffl et al.,Mol Gen Genet.217(2-3):246-53 (1989)) i (6) promoter gena H3 histona kukuruza (Atanassova et al.,Plant Mol Biol.37(2):275-85 (1989)).
Druga korisna karakteristika aneksin promotera je njegov ekspresioni profil u semenju u razvoju. Aneksin promoter je najaktivniji u razvojnim semenima u ranim stadijumima (pre 10. dana nakon oprašivanja) i uglavnom je miran u kasnijim stadijumima. Profil ekspresije aneksin promotera razlikuje se od ekspresionih profila mnogih promotera, specifičnih u odnosu na seme, npr., promotera semenih proteina skladištenja, koji često najveću aktivnost pružaju u kasnijim stadijumima razvoja (Chen et al.,Dev. Genet.10:112-122 (1989); Ellerstrom et al,Plant Mol. Biol.32:1019-1027
(1996); Keddie et al.,Plant Mol. Biol.24:327-340 (1994); Plant et al.,( supra) ;Li,( supra)).Aneksin promoter ima konvencionalni)i profil ekspresije, ali ostaje različit u odnosu na druge poznate promotere, specifične za seme. Stoga će aneksin promoter biti vrlo atraktivan kandidat kada se želi nadekspresija ili supresija gena u embrionima, u ranom stadijumu razvoja. Na primer, može biti poželjno da se nadekspresuje gen, koji reguliše rani embrionalni razvoj ili gen, koji je uključen u metabolizam pre sazrevanja semena.
Nakon identifikacije odgovarajućeg promotera, pogodnog za ekspresiju specifične kodirajuće sekvence DHA sintaze, promoter se, potom, operativno povezuje u sens orijentaciji, korišćenjem konvencionalnih sredstava, dobro poznatih stručnim licima u ovoj oblasti.
Standardne tehnike rekombinovanja DNK i molekularnog kloniranja, koje su ovde korišćene, dobro su poznate u struci i potpunije su opisane u Sambrook, J. et al., uMolecular Cloning: A Laboratory Manual;2<nd>ed.; Cold Spring Harbor Laboratorv Press: Cold Spring Harbor, Nevv York, 1989 (dole navedeno "Sambrook et al., 1989") ili Ausubel, F. M., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Seidman, J. G., Smith, J. A i Struhl, K. Eds.; UCurrent Protocols in Molecular Biology;John Wiley and Sons: New York, 1990 (niže navedeno "Ausubel et al., 1990"). Primera radi, genska fuzija može biti konstruisana pomoću spajanja najmanje dva fragmenta DNK u okviru, tako da se ne uvodi stop kodon (fuzija unutar okvira). Nastali fuzioni gen biće takav da svaki fragment DNK kodira najmanje jednu nezavisnu enzimsku aktivnost, koja se može razdvojiti. Čim je izrađena rekombinantna konstrukcija, ona se, zatim, može uvesti u izabranu biljnu ćeliju, postupcima, koji su uobičajeno upućenima u struku, dobro poznati (npr., transfekcija, transformacija i elektroporacija). Poželjne biljne ćelije su ćelije biljaka uljnog semena. Transformisana biljna ćelija je, zatim, kultivisana i regenerisana pod pogodnim uslovima, koji dopuštaju ekspresiju PUFA dugog lanca, koja je, zatim, opciono obnovljena i prečišćena.
Rekombinantne konstrukcije pronalaska mogu se uvesti u jednu biljnu ćeliju; ili, alternativno, svaka konstrukcija može biti uvedena u zasebne biljne ćelije.
Ekspresija u biljnoj ćeliji može biti izvršena na tranzitoran ili stabilan način, kao što je prethodno opisano. Željene PUFA-e dugog lanca mogu biti ekspresovane u semenu. U okviru cilja ovog pronalaska, takođe su i semenje ili biljni delovi, dobijeni iz takvih transformisanih biljaka.
Delovi biljaka obuhvataju diferentovana i nediferentovana tkiva, koja uključuju, ali se njima ne ograničavaju, sledeće: korenje, stabljike, mladice, listove, polen, semenje, tumorsko tkivo i razne forme ćelija i kultura (npr., pojedinačne ćelije, protoplasti, embrioni i tkivo kalusa). Biljno tkivo može biti u biljci ili biljnom organu, tkivnoj ili ćelijskoj kulturi.
Izraz "biljni organ" odnosi se na biljno tkivo ili grupu tkiva, koji konstituišu, morfološki i funkcionalno, različiti deo biljke. Izraz "genom" odnosi se na sledeće: (1) celokupni komplement genetskog materijala (gena i ne-kodirajućih sekvenci), koji je prisutan u svakoj ćeliji organizma, ili virusu ili organeli i/ili (2) kompletan set kromosoma nasleđen kao (haploidna) jedinica od jednog roditelja.
Prema tome, ovaj pronalazak se, takođe, odnosi na postupak transformisanja ćelije, koji obuhvata transformisanje ćelije sa rekombinantnom konstrukcijom pronalaska i selekciju onih ćelija, koje su transformisane sa rekombinantnom konstrukcijom, koja je opisana u patentnim zahtevima.
Takođe je od značaja postupak za proizvodnju transformisane biljke, koji obuhvata transformisanje biljne ćelije sa polinukleotidima ovog pronalaska i regenerisanje biljke iz transformisane biljne ćelije.
Postupci za transformisanje dikota (prvenstveno korišćenjemAgrobacterium tumefaciens)i dobijanje transgenskih biljaka, bili su publikovani, između ostalog, za: pamuk (U. S. Patent No. 5,004,863; U.S. Patent No. 5,159,135); soju (U.S. Patent No. 5,569,834; U.S. Patent No. 5,416,011);Brassicu(U.S. Patent No. 5,463,174); kikiriki (Cheng et al.Plant Cell Rep.15:653-657 (1996); McKently et al.Plant Cell Rep.14:699-703 (1995)); papaju (Ling, K. et al.,Bio/ technology9:752-758 (1991)) i grašak (Grant et al.Plant Cell Rep.15:254-258 (1995)). Za prikaz drugih, uobičajeno korišćenih, postupaka za transformisanje biljke, vidi Newell, C.A.( Mol. Biotechnol.16:53-65
(2000)). Jedan od ovih postupaka transformisanja koristiAgrobacterium rhizogenes(Tepfler, M. i Casse-Delbart, F.Microbiol. Sci.4:24-28 (1987)). Bilo je publikovano transformisanje soje, koristeći direktno oslobađanje DNK, uz korišćenje PEG fuzije (PCT Publication No. WO 92/17598), elektroporacije (Chowrira, G.M. et al.,Mol. Biotechnol.3:17-23 (1995); Christou, P. et al.,Proc. Natl. Acad. Sci.U.S.A. 84:3962-3966 (1987)), mikroinjekcije i bombardovanja čestice (McCabe, D.E. et al.,Bio/ Technology6:923
(1988); Christou et al.,Plant Physiol.87:671-674 (1988)).
Postoje razni postupci za regenerisanje biljaka iz biljnog tkiva. Pojedini postupak regenerisanja zavisiće od polaznog biljnog tkiva i pojedinih biljnih vrsta, koje treba regenerisati. Regenerisanje, razvijanje i kultivisanje biljaka iz pojedinačnog biljnog protoplasta transformanata ili iz raznih transformisanih pređašnjih biljaka, dobro je poznato u struci (Weissbach i Weissbach, u: Methods for Plant Molecular Biologv, (Eds.), Academic: San Diego, CA (1988)). Ovi procesi regeneracije i rasta, obično uključuju korake selekcije transformisanih ćelije i kultivisanja onih individualizovanih ćelija, kroz uobičajene stadijume embrionalog razvoja, do stadijuma ukorenjene mlade biljke. Transgenski embrioni i semenje se regenerišu na sličan način. Nastale transgenske ukorenjene mladice, zatim su posađene u odgovarajući medijum za rast biljke, kao što je zemljište. Poželjno, regenerisane biljke se samo-oprašuju, kako bi se obezbedile homozigotne transgenske biljke. Na drugi način, polen, dobijen iz regenerisanih biljaka, ukršten je sa biljkama izraslim iz semena, linija od poljoprivredne važnosti. Obrnuto, polen iz biljaka ovih važnih linija, upotrebljen je za oprašivanja regenerisanih biljaka. Transgenska biljka ovog pronalaska, koja sadrži željeni polipeptid, kultivisana je korišćenjem postupaka, dobro poznatih licu, upućenom u ovu oblast.
Pored gore razmatranih procedura, stručnjaci u praksi dobro su upoznati sa materijalima standardnih izvora, koji opisuju specifične uslove i postupke za: konstruisanje, manipulaciju i izolovanje makromolekula (npr., molekula DNK, plazmida, itd.); proizvodnju fragmenata rekombinantne DNK i rekombinantnih ekspresionih konstrukcija; i skriniranje i izolovanje klonova. Vidi, primera radi: Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratorv Manual, Cold Spring Harbor: NY (1989); Maliga et al., Methods in Plant Molecular Biologv, Cold Spring Harbor: NY (1995); Birren et al., Genome Analvsis: Detecting Genes, Vol. 1, Cold Spring Harbor: NT (1998); Birren et al., Genome Analvsis: Analvzing DNA, Vol.2, Cold Spring Harbor: NY (1998); Plant Molecular Biologv: A Laboratorv Manual, eds. Clark, Springer: NY (1997).
Primeri biljaka uljnog semena uključuju, ali bez ograničavanja na njih: soju, vrstuBrassica,suncokret, kukuruz, pamuk, lan i šafraniku.
Primeri PUFA-a, koje imaju najmanje dvadeset atoma ugljenika i četiri ili više dvostrukih veza ugljenik-ugljenik, obuhvataju, ali se njima ne ograničavaju, omega-3 masne kiseline, kao što su: EPA, DPA i DHA. Semena, dobijena iz takvih biljaka, takođe se nalaze unutar okvira ovog pronalaska, kao i ulje, dobijeno iz takvog semenja.
Tako se ovaj pronalazak, takođe, odnosi na postupak za izmenu profila masnih kiselina biljke uljnog semena, koji obuhvata: (a) transformisanje biljke uljnog semena sa rekombinantnom konstrukcijom iz patentnog zahteva pronalaska; i (b) regenerisanje biljke iz ćelije transformisane biljke uljnog semena iz koraka (a), pri čemu biljka ima izmenjen profil masnih kiselina.
Ekspresioni sistemi, kasete i vektori mikroba
Ovde opisani, geni i genski proizvodi DHA sintaze (t.j., EgDHAsvnl, EgDHAsyn2, EaDHAsynl, EaDHAsyn2 i EaDHAsyn3 ili drugi mutant enzimi, kodon-optimizovani enzimi ili njihovi homolozi) mogu, isto tako, biti proizvedeni u heterolognim ćelijama mikrobnog domaćina, posebno u ćelijama uljastih kvasaca (npr.,
Yarrowia lipolytica).
Ekspresioni sistemi i ekspresioni vektori mikroorganizama, koji sadrže regulatorne sekvence, koje usmeravaju visoki nivo ekspresije stranih proteina, dobro su poznati stručnim licima u ovoj oblasti. Bilo koji od njih mogao bi biti upotrebljen za konstruisanje himeričnih gena za proizvodnju bilo kog od genskih proizvoda tekućih sekvenci. Ovi himerični geni, mogli bi, zatim, biti uvedeni u odgovarajuće mikroorganizme putem transformacije, kako bi se obezbedila ekspresija, visokog nivoa, kodiranih enzima.
Vektori, koji su korisni za transformisanje pogodnih domaćinskih ćelija mikroba, dobro su poznati u struci. Specifični izbor sekvenci, prisutnih u konstrukciji, zavisi od željenih proizvoda ekspresije( supra),prirode ćelije domaćina i sredstava, namenjenih za razdvajanje transformisanih ćelija u odnosu na ne-transformisane ćelije. Uobičajeno, međutim, vektor sadrži najmanje jednu ekspresionu kasetu, selektivni marker i sekvence, koje omogućuju autonomnu replikaciju ili hromosomsku integraciju. Pogodne ekspresione kasete sadrže region 5' gena, koji kontroliše inicijaciju transkripcije (npr., promoter), kodirajuću sekvencu gena i region 3' DNK fragmenta, koji kontroliše završetak transkripcije (t.j., terminator). Najpoželjnije je kada su oba kontrolna regiona dobijena iz gena transformisanih domaćinskih ćelija mikroba, premda treba prihvatiti da takvi kontrolni regioni zahtevaju da ne budu dobijeni iz gena, prirođenih specifičnim vrstama, koje su odabrane kao produkcioni domaćin.
Kontrolni regioni inicijacije ili promoteri, koji su od koristi, kako bi izveli ekspresiju tekućih multizima, kao što je DHA sintaza ili pojedinačnih domena ORF-a, u željenim ćelijama mikroba domaćina, brojni su i dobro su poznati licima, stručnim u ovoj oblasti. Praktički, svaki promoter, koji je u stanju da usmerava ekspresiju ovih gena u izabranoj ćeliji domaćina, pogodan je za ovaj pronalazak. Ekspresija u ćelijama domaćina mikroba, može se izvesti na tranzitoran ili stabilan način. Tranzitorna ekspresija može se izvesti pomoću indukovanja aktivnosti promotera, koji se može regulisati, a koji je operativno vezan za gen od značaja. Stabilna ekspresija može se postići upotrebom konstitutivnog promotera, koji je operativno vezan za gen od značaja. Primera radi, kada je domaćinska ćelija kvasac, obezbeđeni su transkripcioni i translacioni regioni, koji su funkcionalni u ćelijama kvasca, posebno iz speciesa domaćina (npr., vidi U.S. Patent 7,238,482 i PCT Publication No. WO 2006/052870 za poželjne regulatorne regione transkripcione inicijacije, za korišćenje uYarrowii lipolytici).Može biti upotrebljena bilo koja od brojnih regulatornih sekvenci, u zavisnosti od toga da li se želi konstitutivna ili indukovana transkripcija, u zavisnosti od efikasnosti promotera u ekspresiji ORF-a od značaja, jednostavnosti konstrukcije i sličnog.
Utvrđeno je da nukleotidne sekvence, koje okružuju kodon translacione inicijacije 'ATG', utiču na ekspresiju u ćelijama kvasca. Ako je željeni polipeptid slabo ekspresovan u kvascu, nukleotidne sekvence egzogenih gena mogu se modifikovati, da bi se uključila sekvenca za efikasnu inicijaciju translacije u kvascu, kako bi se postigla optimalna genska ekspresija. Za ekspresiju u kvascu, ovo se može izvesti mutagenezom, neefikasno ekspresovanog gena, koja je usmerena ka položaju, njihovom fuzijom unutar okvira endogenog gena kvasca, poželjno visoko ekspresovanog gena. Alternativno, bilo ko može odrediti konsenzus sekvencu translacione inicijacije u domaćinu i ugraditi ovu sekvencu u heterologne gene, za njihovu optimalnu ekspresiju u domaćinu od značaja.
Terminacioni region se može dobiti iz 3' regiona gena, iz koga je dobijen inicijacioni region ili iz različitog gena. Poznat je veliki broj terminacionih regiona, koji na zadovoljavajući način funkcionišu u različitim domaćinima (i kada se koriste u istim i kada se koriste u različitim rodovima i vrstama, od onih iz kojih su dobijeni). Terminacioni region se uglavnom odabire pre iz razloga praktičnosti, nego zbog bilo koje posebne osobine. Terminacioni kontrolni regioni mogu, isto tako, biti dobijeni iz različitih gena, koji su prirođeni poželjnim domaćinima. U alternativnim ostvarenjima, 3'-region, takođe, može biti sintetski, budući da stručno lice u ovoj oblasti može koristiti raspoloživu informaciju da bi se dizajnirao i sintetisao 3'-region sekvence, koji funkcioniše kao transkripcioni terminator. Opciono, terminacioni položaj može biti nepotreban; međutim, najpoželjnije je ukoliko je uključen.
Kao što stručno lice u ovoj oblasti zna, samo umetanje gena u klonirajući vektor ne obezbeđuje da će se izvesti uspešna ekspresija na potrebnom nivou. Kao odgovor na potrebu za visokim stepenom ekspresije, bili su kreirani mnogi specijalizovani ekspresioni vektori, upravljanjem brojnim različitim genetskim elementima, koji kontrolišu aspekte transkripcije, translacije, proteinske stabilnosti, ograničavanja kiseonika i sekrecije iz ćelije mikroba domaćina. Određenije, neke od molekularnih karakteristika, kojima se manipulisalo, da bi se kontrolisala ekspresija gena, uključuju: prirodu relevantnih sekvenci transkripcionog promotera i terminatora; broj kopija kloniranog gena, kao i to da li je gen nošen u plazmidu ili je integrisan u genom ćelije domaćina; konačnu ćelijsku lokaciju sintetisanog stranog proteina; efikasnost translacije i ispravno presavijanje proteina u organizmu domaćina; unutrašnju stabilnost mRNK i proteina kloniranog gena unutar ćelije domaćina i upotrebu kodona, u okviru kloniranog gena, tako da se njena frekvencija približava frekvenciji poželjne upotrebe kodona ćelije domaćina. Svaki tip modifikacije obuhvaćen je ovim pronalaskom, kao sredstvo daljeg optimizovanja ekspresije, ovde opisanih, DHA sintaza.
Transformisanje ćelija mikrobnog domaćina
Čim je kaseta, koja je pogodana za ekspresiju u odgovarajućoj ćeliji domaćina bila dobijena (npr., himerični gen, koji sadrži promoter, ORF i terminator), ona je stavljena u plazmidni vektor, koji je u stanju da se autonomno replikuje u ćeliji domaćina, ili se direktno integriše u genom ćelije domaćina. Integrisanje ekspresionih kaseta može se odvijati nasumično, unutar genoma domaćina ili može biti ciljano, posredstvom upotrebe konstrukcija, koje sadrže regione, koji su homologni sa genomom domaćina, u dovoljnoj meri da se ciljano pogodi rekombinacija unutar lokusa domaćina.
Kada su konstrukcije usmerene na endogeni lokus, svi ili neki od transkripcionih i translacionih regulatornih regiona, mogu biti dobijeni od strane endogenog lokusa.
Kada se dva ili više gena ekspresuju iz zasebnih replikacionih vektora, poželjno je da svaki vektor ima različite načine selekcije, i može izgubiti homolognost sa drugom(im) konstrukcijama, da bi se održala stabilna ekspresija i sprečilo ponovno razvrstavanje elemenata između konstrukcija. Promišljen izbor regulatornih regiona, načini selekcije i postupci širenja uvedenih konstrukcija mogu biti eksperimentalno određeni, tako da su svi uvedeni geni ekspresovani na potrebnim nivoima, kako bi se omogućila sinteza željenih proizvoda.
Konstrukcije, koje sadrže gen(e) od značaja, mogu biti uvedene u ćeliju mikrobnog domaćina, bilo kojim standardnim postupkom. Ovi postupci uključuju: transformaciju (npr., litijum acetatnu transformaciju[ Methods in Enzymology,194:186-187 (1991]), fuziju protoplasta, biolistički udar, elektroporaciju, mikroinjekciju ili bilo koji drugi postupak, koji uvodi gen(e) od značaja u ćeliju domaćina.
Zbog praktičnosti, ćelija domaćina, kojom se manipulisalo bilo kojim postupkom, da bi prihvatila sekvencu DNK (npr., ekspresiona kaseta) ovde će biti označena kao "transformisana" ili "rekombinantna". Transformisani domaćin imaće najmanje jednu kopiju ekspresione konstrukcije, a može ih imati dve ili više, u zavisnosti od toga da li je ekspresiona kaseta integrisana u genom ili je prisutna na ekstrahromozomskom elementu, koji ima veći broj kopija.
Transformisana ćelija domaćina može se identifikovati raznim postupcima selekcije, kao što je opisano u U.S. Patentima 7,238,482 i 7,259,255 i PCT Publication No. WO 2006/052870.
Nakon transformisanja, supstrate, koji su pogodni za tekuće DHA sintaze (i, opciono, druge PUFA enzime, koji su ko-ekspresovani unutar ćelije domaćina) može proizvesti domaćin ili prirodno ili transgenski, ili oni mogu biti dobijeni egzogeno.
Poželjni mikrobni domaćini za rekombinantnu ekspresiju
Ćelije mikrobnog domaćina za ekspresiju tekućih gena i fragmenata nukleinske kiseline mogu uključiti domaćine, koji rastu na raznim hranjivim podlogama, koje uključuju proste ili složene ugljene hidrate, masne kiseline, organske kiseline, ulja i alkohole i/ili ugljovodonike, u širokom rasponu vrednosti temperature i pH. Na osnovu
potreba zastupnika podnosioca prijave, geni, opisani u ovom pronalasku, biće ekspresovani u uljastom kvascu (i posebno uYarrowii lipolytici) ;međutim, smatra se da će, zbog toga što su transkripcija, translacija i proteinski biosintetski aparat veoma očuvani, bilo koja bakterija, kvasac, alge, euglenoid i/ili fungus biti pogodan mikrobni domaćin za ekspresiju tekućih fragmenata nukleinske kiseline.
Poželjni mikrobni domaćini su, međutim, uljasti organizmi, kao što su uljasti kvasci. Ovi organizmi su prirodno sposobni za sintezu i akumulaciju ulja, pri čemu ulje može činiti više od oko 25% suve težine ćelije, još poželjnije više od oko 30%> suve težine ćelije i najpoželjnije više od oko 40% suve težine ćelije. Rodovi, koji su obično identifikovani kao uljasti kvasac, uključuju, ali se istima ne ograničavaju:Yarrowiu,
Candidu, Rhodotorulu, Rhodosporidium, Cryptococcus, TrichosporoniLipomyces.
Određenije, ilustrativni kvasci, koji sintetišu ulja, uključuju:Rhodosporidium toruloides,
Lipomyces starkeyii, L. lipoferus, Candidu revkaufi, C. pulcherrima, C. tropicalis, C.
utilis, Trichosporon pullans, T. cutaneum, Rhodotorulu glutinus, R. graminisiYarrowiu
lipolyticu(ranije klasifikovana kaoCandida lipolytica).
Najpoželjniji je uljasti kvasacYarrowia lipolytica;a, u daljem ostvarenju, najpoželjniji su sojeviYarrowie lipolytice,označeni sa ATCC #20362, ATCC #8862, ATCC #18944, ATCC #76982 i/ili LGAM S(7)l (Papanikolaou S., i Aggelis G.,Bioresour. Technol.82(l):43-9 (2002)).
Istorijski, razni sojeviY. lipolyticebili su korišćeni za izradu i proizvodnju: izocitrat lijaze; lipaza; polihidroksialkanoata; limunske kiseline; eritritola; 2-oksoglutarne kiseline; gama-dekalaktona; gama-dodekalaktona i piruvične kiseline. Specifična saznanja, koja se mogu primeniti na transformaciju uljastih kvasaca (t.j.,Yarrowie lipolytice)uključuju U.S. Patent 4,880,741 i U.S. Patent 5,071,764 i Chen, D. C. et al.
( Appl. Microbiol. Biotechnol.,48(2):232-235 (1997)). Specifična saznanja, koja se mogu primeniti na inženjering proizvodnje ARA, EPA i DHA uY. lipolytici,data su u: U.S
Patent Application No 11/264784 (PCT Publication No. WO 2006/055322), U.S Patent Application No 11/265761 (PCT Publication No. WO 2006/052870), odnosno u U.S
Patent Application No 11/264737 (PCT Publication No. WO 2006/052871).
Detaljni načini sinteze i transformacije ekspresionih vektora, koji sadrže C20 elongaze i delta-4 desaturaze u uljastom kvascu (t.j.,Yarrowii lipolytici)dati su u PCT Publication No. WO 2006/052871. Poželjni postupak ekspresije gena uYarrowii lipolyticijeste postupak putem integrisanja linearne DNK u genom domaćina. Integrisanje u višestruke lokacije unutar genoma može biti posebno korisno, kada se želi postići visok nivo ekspresije gena [npr., uUra3lokus (GenBank Accession No. AJ306421), lokusLeu2gena (GenBank Accession No. AF260230), lokusLys5gena (GenBank Accession No. M34929), lokusAco2gena (GenBank Accession No. AJ001300), lokusPox3gena (Pox3: GenBank Accession No. XP_503244; ili, Aco3: GenBank Accession No. AJ001301), lokus gena delta-12 desaturaze (U.S. Patent 7,214,491), lokusLipigena (GenBank Accession No. Z50020), lokusLipigena (GenBank Accession No. AJ012632) i/ili lokus Pexl0 gena (GenBank Accession No. CAG81606)].
Terminacioni regioni, koji su u ovom izlaganju, korisni za ekspresione vektoreYarrowieuključuju, primera radi: -100 bp 3' regiona ekstracelularne proteazeYarrowie lipolytice(XPR; GenBank Accession No. Ml7741); terminatore acil-CoA oksidaze (Aco3: GenBank Accession No. AJ001301 i No. CAA04661; Pox3: GenBank Accession No. XP_503244); Pex20 (GenBank Accession No. AF054613) terminator; Pexl6 (GenBank Accession No. U75433) terminator;Lipi(GenBank Accession No. Z50020) terminator;Lip2(GenBank Accession No. AJ012632) terminator i terminator 3-oksoacil-CoA tiolaze (OCT; GenBank Accession No. X69988).
Poželjni selektivni postupci, za korišćenje uYarrowii lipolytici,su otpornost na kanamicin, higromicin i amino glikozid G418, kao i sposobnost rasta na medijumima bez uracila, leucina, lizina, triptofana ili histidina. U alternativnim ostvarenjima, 5-fluoroorotska kiselina (monohidrat 5-fluorouracil-6-karboksilne kiseline; "5-FOA") je korišćena za selekcijuUramutanata. Jedinjenje je toksično za ćelije kvasca, koje poseduju funkcionalan URA3 gen, koji kodira orotidin 5'-monofosfat dekarboksilazu (OMP dekarboksilaza); stoga je, na osnovu ove toksičnosti, 5-FOA posebno korisna za selekciju i identifikacijuUramutant sojeva kvasca (Bartel, P.L. i Fields, S., Yeast 2-Hvbrid System, Oxford University: New York, v. 7, pp 109-147, 1997; vidi, takođe PCT Publication No. WO 2006/052870 za korišćenje 5-FOA uYarrowii lipolytici).Određenije, moguće je najpre izbaciti nativni Ura3 gen, kako bi se proizveo soj, koji poseduje Ura- fenotip, pri čemu se selekcija odvijana bazi otpornosti na 5-FOA. Zatim se grozd sa više himeričnih gena i novim Ura3 genom može integrisati u različit lokus genomaYarrowie,kako bi se proizveo novi soj, koji poseduje Ura+ fenotip. Naredna integracija proizvodi novi Ura3- soj (ponovno identifikovan korišćenjem selekcije na bazi 5-FOA), kada je izbačen uneseni Ura3 gen. Stoga Ura3 gen (u kombinaciji sa selekcijom na bazi 5-FOA) može biti upotrebljen kao selektivni marker u višestrukim etapama transformacije, omogućujući, tako, odmah, da genetske modifikacije budu integrisane u genomYarrowie,na jednostavan način.
Drugi poželjni mikrobni domaćini uključuju uljaste bakterije, alge, euglenoide i druge gljivice; a, u okviru ove široke grupe mikrobnih domaćina, od posebnog značaja su mikroorganizmi, koji sintetišu omega-3/omega-6 masne kiseline (ili oni, koji, za ove potrebe, mogu biti podvrgnuti genetskom inženjeringu [npr., drugi kvasac, kao što jeSaccharomyces cerevisiae]).Tako je, primera radi, transformacijaMortierelle alpine(koja se komercijalno koristi za proizvodnju ARA) sa bilo kojim od tekućih gena DHA sintaze, pod kontrolom induktivnih ili regulisanih promotera, mogla proizvesti transformisani organizam, koji može sintetisati povećane količine PUFA-a. Postupak transformisanjaM. alpineopisali su Mackenzie i saradnici(Ap<p>l Environ. Microbiol,66:4655 (2000). Na sličan način, u U.S. 7,001,772 izloženi su postupci za transformisanje Thraustochvtriales mikroorganizama.
Može se zahtevati ishrana supstratom.
Bez obzira na domaćina, koji je odabran za ekspresiju multizima (npr., DHA sintaze), moraju se ispitati višestruki transformanti, kako bi se dobio soj, koji pokazuje željeni nivo i model ekspresije. Takvo ispitivanje se može izvršiti Southern analizom DNA mrlja (Southern,J. Mol. Biol,98:503 (1975)), Northern analizom ekspresije mRNK (Kroczek,J. Chromatogr. Biomed. Appl,618(1-2):133-145 (1993)), Western i/ili Elisa testovima proteinske ekspresije, analizama fenotipa ili GC analizama PUFA proizvoda.
Naravno, budući da su prirodno proizvedene PUFA-e u uljastom kvascu ograničene na 18:2 masne kiseline (t.j., LA) i, manje uobičajeno, na 18:3 masne kiseline
(t.j., ALA), u još poželjnijim ostvarenjima ovog pronalaska, uljasti kvasac će biti podvrgnut genetskom inženjeringu, kako bi se ekspresovali višestruki enzimi, koji su neophodni za biosintezu PUFA dugog lanca (omogućujući, na taj način, proizvodnju ARA, EPA, DPA i DHA) pored, ovde opisanih, multizima.
U posebno poželjnim ostvarenjima, najmanje jedna dodatna rekombinantna DNK konstrukcija kodira DGLA sintazu, tako da multizim poseduje i aktivnost delta-9 elongaze i aktivnost delta-8 desaturaze. U nekim ostvarenjima, delta-9 elongaza se može izolovati ili dobiti izIsochrysis galbane(GenBank Accesion No. AF390174; IgD9e ili IgD9eS) ili se delta-9 elongaza može biti izolovati ili dobiti izEuglene gracilisiliEuglene anabaene.Primera radi, vidi DGLA sintaze navedene kao: SEQ ID NO:441, SEQ ID NO:447, SEQ ID NO:454, SEQ ID NO:461, SEQ ID N0.464 i SEQ ID NO:471.
Metabolički inženjering biosinteze omega- 3 i/ ili omega- 6 masne kiseline u mikrobima
Postupci za upravljanje biohemijskim putevima dobro su poznati licima stručnim u ovoj oblasti; a očekuje se da će biti moguće brojne manipulacije, kako bi se do maksimuma povećale biosinteze omega-3 i/ili omega-6 masne kiseline u uljastim kvascima, a posebno uYarrowii lipolytici.Ovo upravljanje može zahtevati metabolički inženjering direktno unutar PUFA biosintetskog puta ili dodatno manipulisanje putevima, koji donose ugljenik biosintetskom putu PUFA. Postupci, koji su korisni za željene ushodno-regulišuće biohemijske puteve i nishodno-regulišuće nepoželjne biohemijske puteve, dobro su poznati stručnjacima u ovoj oblasti.
Na primer, biohemijski putevi, koji se takmiče sa putevima biosinteze omega-3 i/ili omega-6 masne kiseline, za energiju ili ugljenik, ili nativni enzimi biosintetskog puta PUFA, koji interferiraju sa proizvodnjom pojedinog PUFA završnog proizvoda, mogu biti uklonjeni prekidanjem gena ili mogu biti nishodno regulisani na druge načine (npr., antisens mRNK).
Detaljno razmatranje manipulacija u okviru biosintetskog puta PUFA, kao načina da se poveća ARA, EPA ili DHA (i postupci, povezani s njima), predstavljeno je u: PCT Publication Nos. WO 2006/055322 [U.S. Patent Publication No. 2006-0094092-Al], PCT Publication No. WO 2006/052870 [U.S. Patent Publication No. 2006-0115881-Al], odnosno PCT Publication No. WO 2006/052871 [U.S. Patent Publication No. 2006-0110806-A1], u vidu poželjnih manipulacija u biosintetskom putu TAG-a i u degradacionom putu TAG-a (i postupci, povezani s njima).
U kontekstu ovog pronalaska, može biti od koristi moduliranje ekspresije biosintetskog puta masne kiseline, bilo kojom od, gore opisanih, strategija. Na primer, ovaj pronalazak obezbeđuje postupke, kojima se geni, koji kodiraju ključne enzime u PUFA biosintetskom putu, uvode u uljaste kvasce, zbog proizvodnje omega-3 i/ili omega-6 masnih kiselina. Posebno će biti korisno ekspresovanje tekućih gena DHA sintaze u uljastim kvascima, koji prirodno ne poseduju biosintetske puteve omega-3 i/ili omega-6 masne kiseline i koordinisanje ekspresije ovih gena, da bi se do maksimuma povećala proizvodnja poželjnih PUFA proizvoda, korišćenjem raznih načina metaboličkog inženjeringa u organizmu domaćina.
Mikrobni fermentacioni procesi za proizvodnju PUFA
Transformisane ćelije domaćina uzgajaju se pod uslovima, koji optimizuju ekspresiju himeričnih gena i proizvode najveći i najekonomičniji prinos željenih PUFA-a. Uopšteno medijumski uslovi, koji mogu biti optimizovani, uključuju: vrstu i količinu izvora ugljenika, vrstu i količinu izvora azota, odnos ugljenika prema azotu, količinu različitih mineralnih jona, nivo kiseonika, temperaturu rasta, pH, dužinu faze proizvodnje biomase, dužinu faze akumulacije ulja i vreme i postupak sakupljanja ćelije.Yarrowia lipolyticase generalno, uzgaja u kompleksnim medijumima (npr., ekstrakt kvasca-pepton-dekstrozni bujon (YPD)) ili definisanim minimalnim medijumima, kojima nedostaju komponente, neophodne za rast, čime se nameće izbor željenih ekspresionih kaseta (npr., Yeast Nitrogen Base (DIFCO Laboratories, Detroit, MI)).
Fermentacioni medijumi u ovom pronalasku moraju sadržavati pogodan izvor ugljenika. Pogodni izvori ugljenika su razjašnjeni u U.S. Patentu 7,238,482. Iako se smatra da izvor ugljenika, koji je korišćen u ovom pronalasku, može obuhvatiti širok varijetet izvora koji sadrže ugljenik, poželjni izvori ugljenika su: šećeri, glicerol i/ili masne kiseline. Najpoželjnija je glukoza i/ili masne kiseline, koje sadrže između 10 i 22 ugljenika.
Snabdevanje azotom može biti iz neorganskog (npr., (NH^SCu) ili organskog (npr., urea ili glutamat) izvora. Pored pogodnih izvora ugljenika i azota, fermentacioni medijumi moraju, isto tako, sadržavati prikladne minerale, soli, kofaktore, pufere, vitamine i druge sastojke, koji su poznati stručnjacima u ovoj oblasti, a koji su pogodni za rast uljastog domaćina i podupiranje enzimskih puteva, neophodnih za proizvodnju PUFA. Posebna pažnja se pridaje nekolicini metalnih jona (npr., Fe , Cu , Mn<+2>, Co<+2>, Zn<+2>, Mg<+2>), koji potpomažu sintezu lipida i PUFA-a (Nakahara, T. et al.,Ind. Appl. Single Cell Oils,D.J. Kyle i R. Colin, eds. pp 61-97 (1992)).
Poželjni medijumi za rast u ovom pronalasku su uobičajeni komercijalno izrađeni medijumi, kao što je Yeast Nitrogen Base (DIFCO Laboratories, Detroit, MI). Mogu se, isto tako, koristiti i drugi definisani ili sintetisani medijumi za rast, a pogodni medijumi za rast transformisanih ćelija domaćina biće poznati licu, stručnom u oblasti mikrobiologije ili fermentacione nauke. Pogodan raspon pH za fermentaciju obično je između približno pH 4.0 i pH 8.0, pri čemu je pH 5.5 do pH 7.5 poželjan kao opseg za početne uslove rasta. Fermentacija se može provoditi u aerobnim ili anaerobnim uslovima, a poželjni su mikroaerobni uslovi.
Uobičajeno, akumulacija visokih nivoa PUFA-a u ćelijama uljastog kvasca zahteva dvo-stepeni proces, budući da metaboličko stanje mora biti "uravnoteženo" između rasta i sinteze/skladištenja masti. Iz tih razloga, najpoželjnije je daje dvo-stepeni proces fermentacije neophodan za proizvodnju PUFA-a, u uljastom kvascu (npr.,Yarrowia lipolyticd).Ovaj pristup je opisan u U.S. Patentu 7,238,482, tako da su predstavljeni razni pogodni dizajnirani programi fermentacionog procesa (t.j., serija, serija sa ishranom i kontinuirani postupak) i okolnosti u toku rasta.
Prečišćavanje i prerada PUFA ulja
PUFA-e se mogu naći u domaćinima mikroorganizmima i biljkama, kao slobodne masne kiseline ili u esterifikovanim oblicima, kao što su: acilgliceroli, fosfolipidi, sulfolipidi ili glikolipidi, a mogu se ekstrahovati iz ćelija domaćina, brojnim i raznolikim načinima, dobro poznatim u struci. Jedan pregled ekstrakcionih tehnika, analiza kvaliteta i prihvatljivosti standarda za lipide kvasca jeste onaj, koji je dao Z. Jackobs( Critical Reviews in Biotechnology,12(5/6):463-491 (1992)). Kratak pregled nishodne proizvodnje je, isto tako, dostupan posredstvom A. Singh i 0. Ward( Adv. Appl. Microbiol,45:271-312 (1997)).
Uopšteno, načini prečišćavanja PUFA-a mogu uključiti ekstrakciju (npr., U.S.
Patent 6,797,303 i U.S. Patent 5,648,564) sa organskim rastvaračima, sonikaciju, ekstrakciju superkritične tečnosti (npr., koristeći ugljen dioksid), saponifikaciju i fizička sredstva, kao što su pritisci, ili njihove kombinacije. Za dodatne detalje, upućujemo na saznanja iz U.S. Patenta 7,238,482. Postupci za izolovanje semenih ulja dobro su poznati u struci: (Young et al., Processing of Fats and Oils, InThe Lipid Handbook,Gunstone et al., eds., Chapter 5 pp 253-257; Chapman & Hali: London (1994)). Na primer, sojino ulje se proizvodi korišćenjem serija koraka, koji uključuju ekstrakciju i prečišćavanje jestivog uljnog proizvoda iz semena, koje nosi ulje. Sojina ulja i sojini nusprodukti se proizvode korišćenjem uopštenih koraka, prikazanih u Tabeli 7.
Određenije, semenje soje se čisti, temperira, ljušti i isecka na listiće, čime se povećava efikasnost ekstrakcija ulja. Ekstrakcija ulja se uglavnom obavlja uz pomoć ekstrakcije rastvaračem (npr., heksanom), ali se, isto tako, može izvesti kombinacijom fizičkog pritiska i/ili ekstrakcije rastvaračem. Nastalo ulje se naziva sirovo ulje. Sirovom ulju mogu biti uklonjene gumaste materije, putem hidratacije fosfolipida i drugih polarnih i neutralnih lipidnih kompleksa, što olakšava njihovo razdvajanje iz nehidratišuće frakcije triglicerida (sojino ulje). Dobijene lecitinske gume mogu biti dalje podvrgnute postupku za izradu komercijalno važnih lecitinskih proizvoda, koji se koriste u brojnim hranjivim i industrijskim proizvodima, kao sredstva za emulgiranje i oslobađanje (t.j., protiv slepljivanja). Ulje, kome su uklonjene gumaste materije, može se dalje rafinisati, da bi se odstranila onečišćenja (pre svega slobodne masne kiseline, pigmenti i zaostale gumaste materije). Rafinisanje se vrši dodavanjem kaustičnog sredstva, koje reaguje sa slobodnim masnim kiselinama, da bi se obrazovao sapun i hidratisani fosfatidi i proteini u sirovom ulju. Voda je korišćena za ispiranje tragova sapuna, koji se formiraju tokom rafmisanja. Nusproizvod sapunske sirovine može biti direktno korišćen za ishranu životinja ili može biti zakiseljen, kako bi se povratile slobodne masne kiseline. Boja se uklanja pomoću adsorpcije sa zemljom za beljenje, čime se uklanja najveći deo jedinjenja hlorofila i karotenoida. Rafinisano ulje može biti hidrogenizovano, čime se dobijaju masti raznovrsnih svojstava topljenja i strukture. Razlomljavanje (frakcionisanje) se može koristiti za uklanjanje stearina iz hidrigenizovanog ulja, putem kristalizacije, pod pažljivo kontrolisanim uslovima hlađenja. Uklanjanje mirisa (uglavnom putem destilacije parom pod vakuumom) je poslednji korak, kome je namena uklanjanje jedinjenja, koja ulju daju miris ili ukus. Drugi vredni nusproizvodi, kao što su tokoferoli i steroli, mogu se odstraniti tokom postupka uklanjanja mirisa. Destilat, kome je uklonjen miris i koji sadrži ove nusprodukte, može se prodati za proizvodnju prirodnog vitamina E i drugih visoko-vrednih farmaceutskih proizvoda. Rafinisana, izbeljena (hidrogenizovana, frakcionisana) ulja i masti, kojima je odstranjen miris, mogu se pakovati i direktno dati u prodaju ili se mogu podvrgnuti daljoj preradi u više specijalizovane proizvode. Detaljnije reference u vezi sa postupkom prerade semena soje, proizvodnjom soj inog ulja i korišćenjem nusproizvoda mogu se naći u Erickson, Practical Handbook of Sovbean Processing and Utilization, The American Oil Chemists' Societv and United Sovbean Board (1995). Sojino ulje je tečno na sobnoj temperaturi, jer ima relativno nizak sadržaj zasićenih masnih kiselina u poređenju sa uljima, kao što su kokosovo ulje, palmino ulje, ulje jezgre palme i kakao puter.
Ulja biljaka i mikroba, koja sadrže PUFA-e, a koja su rafinisana i/ili prečišćena, mogu biti hidrogenizovana, čime se dobij aju masnoće sa raznolikim svojstvima topljenja i strukturom. Mnoge prerađene masnoće (uključujući namaze, poslastičarske masti, tvrde putere, margarine, masnoće za pečenje, itd) zahtevaju različite stepene čvrstine na sobnoj temperaturi, a mogu se proizvesti jedino izmenom fizičkih karakteristika izvora ulja. Ovo se najčešće postiže putem katalitičke hidrogenacije.
Hidrogenacija je hemijska reakcija, u kojoj se vodonik dodaje na dvostruke veze nezasićene masne kiseline, uz pomoć katalizatora, kao što je nikl. Na primer, visoko oleinsko sojino ulje sadrži nezasićenu oleinsku, linolnu i linolensku masnu kiselinu, a svaka od njih može biti hidrogenizovana. Hidrogenacija ima dva primarna efekta. Prvi je povećanje oksidativne stabilnosti ulja, kao rezultat redukcije sadržaja nezasićenih masnih kiselina. Drugi efekat su izmenjena fizička svojstva ulja, budući da modifikacije masnih kiselina podižu tačku topljenja, što proizvodi polu-tečne ili čvrste masti na sobnoj temperaturi.
Postoje mnoge promenjive vrednosti, koje utiču na reakciju hidrogenacije, koje redom menjaju sastav konačnog proizvoda. Operativni uslovi, koji uključuju: pritisak, temperaturu, vrstu katalizatora i koncentraciju, mućkanje i dizajn reaktora, nalaze se među važnijim parametrima, koji se mogu kontrolisati. Uslovi selektivne hidrogenacije se mogu upotrebiti, kako bi se hidrogenizovale više nezasićene masne kiseline, pre nego one manje nezasićene. Veoma slaba ili ovlaš hidrogenacija se često koristi za povećanje stabilnosti tečnih ulja. Dalja hidrogenacija prevodi tečno ulje u fizički čvrstu mast. Stepen hidrogenacije zavisi od željenih karakteristika i svojstava topljenja, osmišljenih za pojedini krajnji proizvod. Tečne masnoće (koje se koriste u proizvodnji pečenih proizvoda, čvrstih masti i ulja, koji se upotrebljavaju za komercijalne postupke prženja ili pečenja) i osnovne podloge za izradu margarina su među bezbroj mogućih proizvoda ulja i masti, koje se dobijaju hidrogenacijom. Detaljniji opis hidrogenacije i hidrogenizovanih proizvoda može se naći u Patterson, H. B. W., Hvdrogenation of Fats and Oils: Theorv and Practise. The American Oil Chemists' Societv (1994).
Hidrogenizovana ulja su, na neki način, postala kontroverzna, zbog prisustvatrans- izomeramasnih kiselina, koji proističu iz postupka hidrogenacije. Uzimanje velikih količinafrans-izomera povezano je sa štetnim efektima na zdravlje, uključujući povećane odnose lipoproteina niske gustine u odnosu na lipoproteine visoke gustine u krvnoj plazmi i povećani rizik od koronarne srčane bolesti.
Ulja, koja sadrže PUFA, za korišćenje u prehrambenim namirnicama, proizvodima
zdrave hrane, farmaceutskim proizvodima i hrani za životinje
Trgovačke mreže trenutno vrše snabdevanje ogromnim količinama različite hrane i proizvoda za ishranu, koji sadrže omega-3 i/ili omega-6 masne kiseline (posebno npr., ALA, GLA, ARA, EPA, DPA i DHA). Smatra se da će biljna/semena ulja, izmenjeno semenje i mikrobna biomasa i/ili ulja pronalaska, koja sadrže PUFA, u hrani i hranjivim proizvodima delovati tako da tekućim formulacijama pružaju dejstvo povoljnog uticaja na zdravlje. U poređenju sa drugim biljnim uljima, veruje se da ulja pronalaska, s fizičke tačke gledišta, deluju slično drugim uljima, koja se primenjuju u hrani (na primer, delimično hidrogenizovana ulja, kao što je sojino ulje, u širokoj su upotrebi kao sastojci za lagane namaze, margarin i ulja za pečenje i prženje).
Biljna/semena ulja, izmenjeno semenje i mikrobna biomasa i/ili ulja, koja sadrže omega-3 i/ili omega-6 masne kiseline, biće pogodna za upotrebu u raznovrsnoj hrani i proizvodima za ishranu, uključujući, ali bez ograničavanja na njih: analoge hrane, mesne proizvode, proizvode od žitarica, pečenu hranu, brzu hranu i mlečne proizvode.
Pored toga, ova biljna/semena ulja, izmenjeno semenje i mikrobna biomasa i/ili ulja mogu biti korišćena u formulacijama za pružanje korisnih efekata na zdravlje u medicinskoj hrani, koja uključuje: medicinske hranjive sastojke, dodatke ishrani, dečje formule, kao i farmaceutske proizvode. Stručnjak u oblasti prerade hrane i hranjivih formulacija shvatiće kako se koja količina i sastav biljnih i mikrobnih ulja može dodati hrani ili proizvodu za ishranu. Takva količina će ovde biti označena kao "efektivna" količina, a zavisiće od hrane ili proizvoda za ishranu, ishrane, kojoj je proizvod namenjen kao dodatak, ili medicinskog stanja, kome je medicinska hrana ili medicinski hranjivi sastojak namenjen da ga ispravi ili leči.
Analozi hrane se mogu izraditi korišćenjem postupaka, koji su stručnim licima u ovoj oblasti dobro poznati. Ovde se mogu pomenuti: analozi mesa, analozi sira, analozi mleka i slično. Analozi mesa su izrađeni iz zrna soje, koja sadrže sojin protein ili tofu i druge sastojke, koji su zajedno pomešani, kako bi se simulirale razne vrste mesa. Ove alternative mesu se prodaju kao zamrznuta, konzervisana ili sušena hrana. One su uobičajeno mogu koristiti na isti način kao hrana, koju zamenjuju. Alternative mesu, koje su izrađene od soje, odlični su izvori proteina, gvožđa i vitamina B. Primeri analoga mesa uključuju, ali bez ograničavanja na njih: analoge šunke, analoge kobasica, analoge slanine i slično.
Analozi hrane se mogu klasifikovati kao imitirajući ili zamenjujući, u zavisnosti od njihovih funkcionalnih i kompozicionih karakteristika. Na primer, imitacija sira treba samo da podseća na sir, kojeg treba da zameni. Međutim, proizvod se uopšteno može nazvati zamenom za sir, jedino ukoliko je nutritivno ekvivalentan siru, kojeg zamenjuje, i ukoliko zadovoljava minimalne zahteve u pogledu sastava tog sira. Iz tih razloga će zamena za sir često imati veće nivoe proteina nego imitacija sira, i biće pojačana vitaminima i mineralima.
Analozi mleku ili ne-mlečni proizvodi za ishranu uključuju, ali bez ograničavanja na iste, imitacije mleka i ne-mlečne smrznute slatkiše (npr., one, koji su izrađeni od produkata soje i/ili sojinog proteina).
Mesni proizvodi obuhvataju raznovrsne proizvode. U Sjedinjenim Državama, "meso" uključuje "crvena mesa", dobijena od goveda, svinje i ovce. Pored crvenog mesa postoji, isto tako, meso peradi, koja obuhvata: piliće, ćurke, guske, kokoške, patke, i ribe i ljuskari. Postoji bogat izbor sušenih i prerađenih mesnih proizvoda: svežih, usoljenih i prženih, i usoljenih i kuvanih. Kobasice i viršle su primeri prerađenih mesnih proizvoda. Tako, izraz "mesni proizvodi", kako je ovde korišćen, uključuje, ali bez ograničavanja na njih, prerađene mesne proizvode.
Hranjivi proizvod od žitarica je hranjivi proizvod, dobijen preradom zrna žitarica. Žitno zrno uključuje bilo koju biljku iz familija trava, koja daje jestivo zrno (seme). Najrasprostranjenije zrnevlje je: ječam, kukuruz, proso, ovas, kvinoa( Chenopodiaceaefam., prim prev.), pirinač, raž, proso, pšenica, žito i divlji pirinač. Primeri hranjivih proizvoda od žitarica uključuju, ali bez ograničavanja na njih, celo zrno, mrvljeno zrno, griz, brašno, mekinje, klice, cerealije za doručak, ekstrudirane namirnice, testa i slično.
Proizvod pečene robe obuhvata bilo koji od, gore pomenutih, hranjivih proizvoda od žitarica, a koji je pečen ili prerađen na način, koji se može uporediti sa pečenjem (t.j., sušenje ili očvršćivanje podvrgavanjem toploti). Primeri proizvoda pečene robe uključuju, ali se time ne ograničavaju, hleb, kolače, uštipke, štapiće, testa, hlebne mrvice, pečene kekse, mini-biskvite, mini-krekere i mini-perece. Kao što je prethodno pomenuto, ulja pronalaska mogu biti korišćena kao sastojak.
Proizvod brze hrane uključuje bilo koji od hranjivih proizvoda, koji su opisani prethodno ili u nastavku.
Prženi hranjivi proizvod uključuje bilo koji od hranjivih proizvoda, opisanih prethodno ili u nastavku, koji je pržen.
Proizvod zdrave hrane je bilo koji proizvod, koji pruža povoljno dejstvo na zdravlje. Mnogi proizvodi za ishranu, koji se dobijaju iz uljnog semena, mogu se smatrati zdravom hranom.
Pića mogu biti u tečnom obliku ili u suvoj praškastoj formi.
Na primer, mogu se pomenuti ne-gazirana pića, kao što su: voćni sokovi, sveži, zamrznuti, konzervisani ili koncentrovani; aromatizovani ili jednostavni mlečni napici, itd. Nutritivne formule za odrasle i decu dobro su poznate u ovoj oblasti i komercijalno su dostupne (npr., Similac<®>, Ensurc<®>, Jevitv<®>i Alimentum<®>od Ross Products Division, Abbott Laboratories).
Dečje formule su tečnosti ili praškovi za rekonstituisanje, kojima se hrane bebe i mala deca. "Dečja formula" se ovde definiše kao nutritivni proizvod za unutrašnju upotrebu, koji može zameniti majčino mleko u ishrani odojčadi, a obično je sastavljen od željenog procenta masti, pomešanog sa željenim procentima ugljenih hidrata i proteina u vodenom rastvoru (npr., vidi U.S. Patent No. 4,670,285). Na osnovi ispitivanja sastava, vršenih širom sveta, kao i prema nivoima, koje su ustanovile ekspertske grupe, prosečno majčino mleko se obično sastoji od oko 0.20% do 0.40% ukupnih masnih kiselina
(uzimajući otprilike 50% kalorija iz masti); a uopšteno bi odnos DHA prema ARA bio u rasponu od oko 1:1 do 1:2 (vidi, npr., formulacije Enfamil LIPIL™ (Mead Johnson & Companv) i Similac Advance™ (Ross Products Division, Abbott Laboratories)). Dečje formule imaju posebnu ulogu u ishrani beba, jer su često jedini izvor hranjivih materija za bebe; pa, iako je dojenje još uvek najbolji način ishrane deteta, dečje formule su gotovo dovoljna potpora, koja detetu omogućuje ne samo da preživi, već i da napreduje.
Mlečni proizvod je proizvod, dobijen iz mleka. Analog mleku ili nemlečni proizvod je poreklom iz izvora, koji nije mleko, na primer, iz soj inog mleka, kao što je prethodno razmotreno. Ovi proizvodi obuhvataju, ali se istima ne ograničavaju, punomasno mleko, obrano mleko, fermentisane mlečne proizvode, kao što je jogurt ili kiselo mleko, kajmak, puter, kondenzovano mleko, dehidratisano mleko, kajmak za kafu, krem-kajmak za kafu, sladoled, sir, itd.
Dodatni hranjivi proizvodi u koje se mogu uključiti ulja pronalaska, koja sadrže PUFA-e, su, primera radi, žvakaće gume, poslastice i šećerni prelivi, želatini i pudinzi, tvrde i mekane bombone, pekmezi i želei, beli granulisani šećer, zamene za šećer, slatki sosovi, pene i sirupi i suvo izmešane praskaste mešavine.
Zdravi hranjivi proizvod je bilo koji proizvod za ishranu, koji pruža povoljna dejstva na zdravlje, a uključuju: funkcionalnu hranu, medicinsku hranu, medicinske hranjive sastojke i dodatke ishrani. Pored toga, biljna/semena ulja, izmenjeno semenje i mikrobna ulja pronalaska mogu biti korišćena u standardnim farmaceutskim smešama (npr., ulja, koja sadrže PUFA-e dugog lance, lako su se mogla ugraditi u bilo koji od, gore pomenutih, hranjivih proizvoda, kako bi se na taj način proizvela funkcionalna ili medicinska hrana). Koncentrovanije formulacije, koje sadrže PUFA-e, uključuju: kapsule, praškove, tablete, meke gelove, želatinske kapsule, tečne koncentrate i emulzije, koji se mogu koristiti kao dodaci ishrani kod ljudi ili životinja.
Hrana za životinje ovde se generički definiše kao proizvodi, koji su namenjeni za korišćenje u vidu hrane za životinje ili za mešanje sa hranom za životinje. Biljna/semena ulja, izmenjeno semenje i mikrobna ulja pronalaska mogu biti korišćena kao sastojci razne hrane za životinje.
Određenije, ali bez ograničenja u tom pogledu, očekuje se da se ulja pronalaska mogu upotrebljavati u okviru proizvoda za ishranu kućnih ljubimaca, proizvoda za ishranu preživara i peradi i proizvoda za ishranu vodenih životinja. Proizvodi za ishranu kućnih ljubimaca su oni proizvodi, koji su namenjeni hranjenju ljubimaca (npr., pasa, mačaka, ptica, gmizavaca i glodara). Ovi proizvodi mogu uključiti, prethodno pomenute, proizvode od žitarica i proizvode zdrave hrane, kao i meso i mesne nusproizvode, proizvode od soj inog proteina, proizvode od trave i sena (npr., lucerka, mačji rep, ovas ili stoklas trava, povrće). Proizvodi za ishranu preživara i živine su oni proizvodi, koji su namenjeni da budu hrana za životinje (npr., ćurke, piliće, stoku i svinje). Kao u slučaju prethodno opisane hrane za ljubimce, ovi proizvodi mogu uključiti hranjive proizvode od žitarica i proizvode zdrave hrane, proizvode od sojinog proteina, meso i mesne nusproizvode i proizvode od trave i sena, kao što je gore navedeno. Proizvodi za ishranu vodenih životinja ("vodena hrana") su oni proizvodi, koji su namenjeni za potrebe uzgajanja u vodi, t.j. koji se odnose na razmnožavanje, kultivaciju ili uzgajanje vodenih organizama i/ili životinja u svežim ili morskim vodama.
PRIMERI
Ovaj pronalazak je, nadalje, definisan u sledećim Primerima, u kojima su delovi i procenti težinski, a stepeni su Celzijusevi, ukoliko nije drugačije naznačeno. Trebalo bi prihvatiti da su ovi Primeri, dok označavaju poželjna ostvarenja pronalaska, dati jedino kao ilustracija. Iz prethodne diskusije i ovih Primera, lice, stručno u ovoj oblasti, može utvrditi suštinske karakteristike ovog pronalaska i, bez udaljavanja od njegovog smisla i okvira, može izvesti različite izmene i modifikacije pronalaska, kako bi ga prilagodio različitim upotrebama i uslovima. Stoga će razne modifikacije pronalaska pored onih, koje su ovde prikazane i opisane, biti očigledne stručnjacima u ovoj oblasti, iz prethodnog opisa. Takve modifikacije su, takođe, određene s namerom da spadaju unutar okvira priključenih patentnih zahteva.
Značenje skraćenica je sledeće: "sec" znači sekund(i), "min" znači minut(i), "h" znači sat(i), "d" znači dan(i), "uL" znači mikrolitar(i), "mL" znači mililitar(i), "L" znači litar(i), "uM" znači mikromolarni, "mM" znači milimolarni, "M" znači molarni, "mmol" znači milimol(i), "umol" znači mikromol(i), "g" znači gram(i), "ug" znači mikrogram(i), "ng" znači nanogram(i), "U" znači jedinica(e), "bp" označava par(ove) baza, a "kB" znači kilobaza(e).
OPŠTI POSTUPCI:
Nomenklatura za ekspresione kasete:
Struktura ekspresione kasete biće predstavljena jednostavnim sistemom obeležavanja "X::Y::Z", u kome X opisuje fragment promotera, Y opisuje gen, koji kodira region fragmenta, a Z opisuje fragment terminatora, od kojih su svi operativno povezani jedan za drugog.
Transformacija i kultivacijaYarrowie lipolvtice:
SojeviYarrowie lipolyticesa ATCC Accession Nos. #20362, #76982 i #90812 kupljeni su od American Type Culture Collection (Rockville, MD). SojeviYarrowie lipolyticeobično su uzgajani na 28-30°C, u nekoliko medijuma, prema, dole prikazanim, receptima. Agar ploče su pripremljene, kako je zahtevano, dodavanjem 20 g/L agara u svaki od tečnih medijuma, u skladu sa standardnim postupcima.
YPD a<g>ar medij um ( po litru): 10 g ekstrakta kvasca [Difco], 20 g Bacto peptona [Difco] i 20 g glukoze.
Bazični minimalni medijumi ( MM)( po litru): 20 g glukoze; 1.7 g azotne baze kvasca bez aminokiselina; 1.0 g prolina i pH 6.1 (nije podešavan).
Minimalni medijumi + uracil ( MM + uracil ili MMU) ( po litru): Pripremi MM medijume, kao gore, i dodaj 0.1 g uracila i 0.1 g uridina.
Minimalni medijumi + uracil + sulfonilurea ( MMU+ SU) ( po litru): Pripremi MMU medijume, kao gore, i dodaj 280 mg sulfoniluree.
Minimalni medijumi + leucin ( MM+ leucin ili MMLeu) ( po litru): Pripremi MM medijume, kao prethodno, i dodaj 0.1 g leucina.
Minimalni medijumi + leucin + uracil ( MMLeuUra) ( po litru): Pripremi MM medijume, kao prethodno, i dodaj 0.1 g leucina, 0.1 g uracila i 0.1 g uridina.
Minimalni medijumi + leucin + lizin ( MMLeuLvs) ( po litru): Pripremi MM medijume, kao gore, i dodaj 0.1 g lizina, 0.1 g leucina.
Minimalni medijumi + 5- fluoroorotska kiselina ( MM + 5- FOA) ( po litru): 20
g glukoze, 6.7 g azotne baze kvasca, 75 mg uracila, 75 mg uridina i pogodna količina FOA (Zymo Research Corp., Orange, CA), na bazi testiranja aktivnosti FOA prema
rasponima koncentracija od 100 mg/L do 1000 mg/L (budući se varijacije dešavaju unutar svake serije, dobijene od dobavljača).
Medijumi sa visokim nivoom glukoze ( HGM) ( po litru): 80 glukoze, 2.58 g KH2PO4i 5.36 g K2HPO4, pH 7.5 (nema potrebe za podešavanjem).
TransformacijaYarrowie lipolyticeizvedena je prema postupku Chena, D.C i saradnika( Appl. Microbiol. Biotechnol,48(2):232-235 (1997)), ukoliko nije drugačije naznačeno. Ukratko,Yarrowiaje zasejana na YPD ploču i rasla je tokom približno 18 sati, na 30°C. Sa ploče su sa nekoliko velikih eza sastrugane ćelije, koje su resuspendovane u 1 mL transformacionog pufera, koji sadrži: 2.25 mL 50% PEG-a, prosečne MT 3350; 0.125 mL 2M litijum acetata, pH 6.0; 0.125 mL 2M DTT i (opciono) 50 ug DNK sperme oguljenog lososa. Zatim je približno 500 ng linearizovane plazmid DNK inkubirano u 100 ul resuspendovanih ćelija i držano na 39°C, tokom 1 sata, uz mućkanje na mešalici u 15-minutnim intervalima. Ćelije su postavljene na ploče sa selektivnim medijumima i držane su na 30°C, tokom 2 do 3 dana.
Analiza masnih kiselinaYarrowie lipolvtice:
Za analizu masnih kiselina, ćelije su sakupljene centrifugiranjem, a lipidi su ekstrahovani, kao što je opisano u Bligh, E.G. & Dyer, W.J.( Can. J. Biochem. PhysioL,37:911-917 (1959)). Metil estri masnih kiselina pripremljeni su transesterifikacijom lipidnog ekstrakta sa natrijum metoksidom (Roughan, G. i Nishida L,Arch Biochem Biophys.,276(l):38-46 (1990)) i nakon toga su analizirani pomoću Hewlett-Packard 6890 GC, koji je opremljen kolonom HP-INNOWAX (Hewlett-Packard) od 30 m X 0.25 mm (i.d.). Temperatura sušnice bila je od 170°C (25 min držana) do 185°C sa 3.5 °C/min.
Za direktnu baznu transesterifikaciju, kulturaYarrowie(3 mL) je sakupljena, isprana, jednom, u destilovanoj vodi, i osušena pod vakuumom u Speed-Vac-u, tokom 5-10 minuta. Uzorku je dodat natrijum metoksid (100 ul 1%-tnog rastvora), i uzorak je, potom, mešan i mućkan ljuljanjem, tokom 20 minuta. Nakon što su dodate 3 kapi IM NaCl i 400 ul heksana, uzorak je mešan i okretan. Gornji sloj je odstranjen i podvrnut analizi pomoću GC, kao što je prethodno opisano.
Konstrukcija soja Y4305U3Yarrowie lipolvtice:
Soj Y4305U3Y. lipolyticekorišćenje kao domaćin u Primerima 52, 53 i 54,infra.Sledeći opis je sažeti prikaz konstruisanja soja Y4305U3, koji je dobijen iz
Yarrome lipolyticeATCC #20362. Soj Y4305U3 je u stanju da proizvodi oko 53.2% EPA u odnosu na ukupne lipide, putem ekspresije puta delta-9 elongaza/ delta-8 desaturaza (SLIKA 44)
Razvijanje soja Y4305U3 zahtevalo je konstruisanje soja Y2224 (FOA rezistentni mutant iz autonomne mutacijeUra3gena divljeg tipaYarrowiesoja ATCC #20362), soja Y4001 (koji proizvodi 17% EDA sa Zew-fenotipom), soja Y4001U1 (koji proizvodi 17% EDA saLeu-iUra-fenotipom), soja Y4036 (koji proizvodi 18% DGLA saLeu-fenotipom), soja Y4036U (koji proizvodi 18% DGLA saLeu-iUra-fenotipom), soja Y4070 (koji proizvodi 12% ARA saUra-fenotipom), soja Y4086 (koji proizvodi 14% EPA), soja Y4086U1( Ura3-),soja Y4128 (koji proizvodi 37% EPA), soja Y4128U3( Ura-),soja Y4217 (koji proizvodi 42% EPA), soja Y4217U2( Ura-),soja Y4259 (koji proizvodi 46.5% EPA) i soja Y4259U2( Ura-).
Proizvodnja soja Y2224:Soj Y2224 je izolovan na sledeći način: ćelijeYarrowie lipolyticeATTC #20362 sa ploče YPD agara zasejane su na MM ploču (75 mg/L svakog od uracila i uridina, 6.7 g/L YNB sa amonijum sulfatom, bez aminokiselina i 20 g/L glukoze), koja sadrži 250 mg/L 5-FOA (Zymo Research). Ploče su inkubirane na 28°C, a od nastalih kolonija četiri su zasebno nanesene na MM ploče, koje sadrže 200 mg/mL 5-FOA i MM ploče bez uracila i uridina. Ovo je izvedeno da bi se potvrdilaUra3auksotrofija.
Proizvodnja soja Y4001, da bi se proizvelo oko 17% EDA od ukupnih
lipida:Soj Y4001 je kreiran putem integrisanja konstrukcije pZKLeuN-29E3 (SLIKA 45A). Ova konstrukcija, koja sadrži četiri himerična gena (t.j., delta-12 desaturaza, Ci6/i8elongaza i dve delta-9 elongaze) je integrisana uLeu2lokuse soja Y2224, kako bi se, na taj način, omogućila proizvodnja EDA.
Konstrukcija pZKLeuN-29E3 je sadržavala komponente, prikazane ispod u Tabeli 8.
Plazmid pZKLeuN-29E3 je svaren saAscl/ Sphl,a zatim je korišćen za transformaciju soja Y2224Y. lipolytice(t.j., ATCC #20362Ura3-),u skladu sa Opštim postupcima. Transformisane ćelije su postavljene na ploče sa MMLeu medijumima, i ploče su držane na 30°C, tokom 2 do 3 dana. Odabrane su kolonije i zasejane na MM i MMLeu selektivne ploče. Kolonije, koje su mogle rasti na MMLeu pločama, ali ne na MM pločama, odabrane su kaoLeu-sojevi. Pojedinačne kolonijeLeu-sojeva su upotrebljene za inokulaciju u tečne MMLeu, a tečne kulture su mućkane na 250 rpm/min, tokom 2 dana, na 30°C. Ćelije su sakupljene centrifugiranjem, a lipidi su ekstrahovani. Metil estri masnih kiselina pripremljeni su trans-esterifikacijom, i sledstveno su analizirani sa Hewlett-Packard 6890 GC.
GC analize su pokazale prisustvo EDA u transformisanim ćelijama, koje sadrže 4 himerična gena pZKLeuN-29E3, ali ne i u kontrolnom sojuYarrowieY2224. Najveći broj od 36 odabranihLeu-sojeva proizvodio je oko 12 do 16.9% EDA od količine ukupnih lipida. Tri soja, označena kao sojevi Y4001, Y4002 i Y4003, proizvela su oko 17.4%, 17%o, odnosno 17.5% EDA od ukupne količine lipida.
Pojedinačne kolonije sojeva Y4001, Y4002 i Y4003 upotrebljene su za inokulaciju u tečne MMLeu, a tečne kulture su mućkane na 250 rpm/min, tokom 2 dana, na 30°C. Ćelije su sakupljene centrifugiranjem, resuspendovane su u HGM, a zatim su mućkane na 250 rpm/min, tokom 5 dana. Ćelije su sakupljene centrifugiranjem, a lipidi su ekstrahovani. Metil estri masnih kiselina pripremljeni su trans-esterifikacijom, i sledstveno su analizirani sa Hewlett-Packard 6890 GC. GC analize su pokazale da su sojevi Y4001, Y4002 i Y4003 proizveli oko 24%) EDA od ukupne količine lipida.
Proizvodnja soja Y4001U( Leu-, Ura-) :Soj Y4001U je kreiran putem privremene ekspresije enzimaCrerekombinaza u plazmidu pYl 16 (SLIKA 45B) unutar soja Y4001, da bi se proizveoLeu-iUra-fenotip. Konstrukcija pY116 je sadržavala sledeće komponente:
Plazmid pY116 je upotrebljen za transformaciju sveže poraslih ćelija Y4001, u skladu sa Opštim postupcima. Transformisane ćelije su postavljene na MMLeuUra ploče, koje sadrže 280 (j,g/mL sulfoniluree (hlorimuron etil, E. I. duPont de Nemours & Co., Inc., Wilmington, DE), i ploče su držane na 30°C, tokom 3 do 4 dana. Odabrane su četiri kolonije, a zatim su korišćene za inokulaciju u 3 ml tečnog YPD. Tečne kulture su mućkane na 250 rpm/min, tokom 1 dana, na 30°C. Kulture su razblažene do 1:50,000 sa tečnim MMLeuUra medijumima, a 100 uL je stavljeno na nove YPD ploče. Ploče su držane na 30°C, tokom 2 dana. Kolonije su odabrane i zasejane na MMLeu i MMLeuUra selektivne ploče. Kolonije, koje su mogle rasti na MMLeuUra pločama, ali ne na MMLeu pločama odabrane su i analizirane pomoću GC, da bi se potvrdilo prisustvo C20:2 (EDA). Nekoliko sojeva, od kojih svaki posedujeLeu-iUra-fenotip, proizvelo je oko 17% EDA od ukupne količine lipida i zajednički su označeni kao Y4001U. Jedan od ovih sojeva označen je kao Y4001U1.
Proizvodnja soja Y4036 za proizvodnju oko 18% DGLA od ukupne količine lipida: Konstrukcija pK02UF8289 (SLIKA 46A; SEQ ID NO:324) je proizvedena da bi integrisala četiri himerična gena (koji obuhvataju delta-12 desaturazu, jednu delta-9 elongazu i dve mutant delta-8 desaturaze) u delta-12 lokuse soja Y4001U1, kako bi se, na taj način, omogućila proizvodnja DGLA. Konstrukcija pK02UF8289 je sadržavala sledeće komponente:
Plazmid pK02UF8289 je svaren saAscl/ Sphl,a zatim je korišćen za transformaciju soja Y4001U1, u skladu sa Opštim postupcima. Transformisane ćelije su postavljene na MMLeu ploče, a ploče su držane na 30°C, tokom 2 do 3 dana. Kolonije su odabrane i zasejane na MMLeu selektivne ploče, na 30°C, tokom 2 dana.Ove ćelije su zatim, upotrebljene za inokulaciju u tečne MMLeu medijume, a tečne kulture su mućkane na 250 rpm/min, tokom 2 dana, na 30°C. Ćelije su sakupljene centrifugiranjem, a lipidi su ekstrahovani. Metil estri masnih kiselina pripremljeni su trans-esterifikacijom, i sledstveno su analizirani sa Hewlett-Packard 6890 GC.
GC analize su pokazale prisustvo DGLA u transformisanim ćelijama, koje sadrže 4 himerična gena pK02UF8289, ali ne i u matičnom Y4001U1 soju. Najveći broj od 96 odabranih sojeva proizvodio je između 7% i 13% DGLA od ukupne količine lipida. Šest sojeva, koji su označeni kao: Y4034, Y4035, Y4036, Y4037, Y4038 i Y4039, proizvelo je oko 15%, 13.8%, 18.2%, 13.1%, 15.6%, odnosno 13.9% DGLA od ukupne količine lipida.
Proizvodnja soja Y4036U( Leu-, Ura3-) :Konstrukcija pYl 16 (SLIKA 45B; SEQ ID NO:323) je korišćena za privremenu ekspresiju enzimaCrerekombinaza u soju Y4036. Ovim je iz genoma oslobođenUra3gen, umetnut u LoxP.
Plazmid pY116 je upotrebljen za transformaciju soja Y4036, u skladu sa Opštim postupcima. Nakon transformisanja, ćelije su postavljene na MMLeuUra ploče, a ploče su držane na 30°C, tokom 2 do 3 dana. Pojedinačne kolonije, koje su porasle na MMLeuUra pločama, odabrane su i zasejane u YPD tečne medijume. Tečne kulture su mućkane na 250 rpm/min, tokom 1 dana, na 30°C, za izvlačenje plazmida pYl 16. Ćelije iz poraslih kultura zasejane su na MMLeuUra ploče. Nakon dva dana na 30°C, pojedinačne kolonije su ponovno zasejane na MMLeuUra, MMU i MMLeu ploče. Odabrane su one kolonije koje su mogle rasti na MMLeuUra pločama, ali ne na MMU ili MMLeu pločama. Jedan soj saLeu-iUra-fenotipovima označen je kao Y4036U( Ura-,
Leu-).
Proizvodnjasojeva Y4069 i Y4070, kako bi proizvodili oko 12% ARA od ukupne količine lipida: Konstrukcija pZKSL-555R (SLIKA 46B; SEQ ID NO:331) je proizvedena da bi integrisala tri gena delta-5 desaturaze uLyslokuse soja Y4036U, kako bi se, na taj način, omogućila proizvodnja ARA. Plazmid pZKSL-555R sadržavao je sledeće komponente:
Plazmid pZKSL-555R je svaren saAsclISphl,a zatim je korišćen za transformaciju soja Y4036U, u skladu sa Opštim postupcima. Transformisane ćelije su postavljene na MMLeuLvs ploče, a ploče su držane na 30°C, tokom 2 do 3 dana. Pojedinačne kolonije su, zatim, ponovno zasejane na MMLeuLvs ploče, a nastale kolonije su korišćene za inokulaciju u tečne MMLeuLvs. Tečne kulture su, potom, mućkane na 250 rpm/min, tokom 2 dana, na 30°C. Ćelije su sakupljene centrifugiranjem, a lipidi su ekstrahovani. Metil estri masnih kiselina pripremljeni su trans-esterifikacijom, i sledstveno su analizirani sa Hewlett-Packard 6890 GC.
GC analize su pokazale prisustvo ARA u transformisanim ćelijama, koje sadrže 3 himerična gena pZKSL-555R, ali ne i u matičnom Y4036U soju. Najveći broj od 96 odabranih sojeva proizvodio je -10% ARA od ukupne količine lipida. Četiri soja, označena kao Y4068, Y4069, Y4070 i Y4071, proizvela su oko 11.7%, 11.8%, 11.9%, odnosno 11.7% ARA od ukupne količine lipida. Dalje analize su pokazale da tri himerična gena pZKSL-555R nisu bila integrisana uLys5položaj u Y4068, Y4069, Y4070 i Y4071 sojevima. Svi sojevi su posedovaliLys+fenotip.
Konačni genotip soja Y4070, s obzirom na divlji tipYarrowie lipolyticeATCC #20362 bio je:Ura-, nepoznat 1-, nepoznat 3-, Leu+, Lys+,GPD::FmD12::Pex20, YATl::FmD12::OCT, YATl::ME3S::Pexl6, GPAT::EgD9e::Lip2, EXP1: :EgD9eS: :Lip 1, FBAINm: :EgD9eS: :Lip2, FBAINm: :EgD8M::Pex20, EXPl::EgD8M::Pexl6, FBAIN::EgD5::Aco, EXP1 ::EgD5S::Pex20, YATl::RD5S::OCT.
Proizvodnja soja Y4086, da bi proizvodio oko 14% EPA od ukupnih lipida: Konstrukcija pZP3-Pa777U (SLIKA 47A; SEQ ID NO:338) je proizvedena da bi integrisala tri gena delta-17 desaturaze uPox3lokuse (GenBank Accession No. AJ001301) soja Y4070, kako bi se, na taj način, omogućila proizvodnja EPA. Plazmid pZP3-Pa777U sadržavao je sledeće komponente:
Plazmid pZP3-Pa777U je svaren saAscl/ Sphl,a zatim je korišćen za transformaciju soja Y4070, u skladu sa Opštim postupcima. Transformisane ćelije su postavljene na MM ploče, a ploče su držane na 30°C, tokom 2 do 3 dana. Pojedinačne kolonije su, zatim, ponovno zasejane na MM ploče, a nastale kolonije su korišćene za inokulaciju u tečne MMLeuLvs. Tečne kulture su mućkane na 250 rpm/min, tokom 2 dana, na 30°C. Ćelije su sakupljene centrifugiranjem, a lipidi su ekstrahovani. Metil estri masnih kiselina pripremljeni su trans-esterifikacijom, i sledstveno su analizirani sa Hewlett-Packard 6890 GC.
GC analize su pokazale prisustvo EPA u transformisanim ćelijama, koje sadrže 3 himerična gena pZP3-Pa777U, ali ne i u matičnom Y4070 soju. Najveći broj od 96 odabranih sojeva proizveo je 10-13% EPA od ukupne količine lipida. Dva soja, označena kao Y4085 i Y4086, proizvela su oko 14.2%, odnosno 13.8% EPA od ukupne količine lipida.
Konačni genotip soja Y4086, s obzirom na divlji tipYarrowie lipolyticeATCC #20362 bio je:Ura3+, Leu+, Lys+, nepoznat 1-, nepoznat 2-, YALI0F24167g-,GPD::FmD12::Pex20, YATl::FmD12::OCT, YATl::ME3S::Pexl6, GPAT::EgD9e::Lip2, EXP1 ::EgD9eS::Lipl, FBAINm::EgD9eS::Lip2, FBAINm::EgD8M::Pex20, EXPl::EgD8M::Pexl6, FBAIN::EgD5::Aco, EXPl::EgD5S::Pex20, YATl::RD5S::OCT, YAT1 ::PaD17S::Lipl, EXPl::PaD17::Pexl6, FBAINm::PaDl7::Aco.
ProizvodnjasojaY4086U1( Ura3-) :Soj Y4086U1 je kreiran putem privremene ekspresije enzimaCrerekombinaza u konstrukciji pYl 17 (SLIKA 47B: SEQ ID NO:343) unutar soja Y4086, da bi se proizveoUra-fenotip. Ovim je iz genoma oslobođenUra3gen, umetnut u LoxP. AHAS enzim mutiraneYarrowieu plazmidu pYl 17, preneo je SU<R>, koji je korišćen kao pozitivni skrining marker.
Plazmid pYl 17 je dobijen iz plazmida pYl 16 (opisansuprai u U.S. Patent Application No. 11/635258), umetanjem mutant AHAS gena, zaposednutogPacl- Swalpoložajima u pY116, koji je svaren saPacl- Swal,zamenjujući na taj način LEU selektivni marker sulfonilurea markerom. Konstrukcija pYl 17 je, na taj način, sadržavala sledeće komponente:
Plazmid pY117 je upotrebljen za transformaciju soja Y4086, u skladu sa Opštim postupcima. Nakon transformisanja, ćelije su postavljene na MMU+SU (280 pg/mL sulfoniluree; takođe poznata kao hlorimuron etil, E. I. duPont de Nemours & Co., Inc., Wilmington, DE) ploče, i ploče su držane na 30°C, tokom 2 do 3 dana. Pojedinačne SU<R>kolonije, koje su porasle na MMU+SU pločama, odabrane su i zasejane u YPD tečne medijume, a tečne kulture su mućkane na 250 rpm/min, tokom 1 dana, na 30°C, kako bi se izvukao pYl 17 plazmid. Ćelije iz poraslih kultura su zasejane na MMU ploče. Nakon dva dana na 30°C, pojedinačne kolonije su ponovno zasejane na MM i MMU ploče. Izabrane su one kolonije, koje su mogle rasti na MMU pločama, ali ne na MM pločama. Od ovih sojeva, dva soja saUra-fenotipovima označena su kao Y4086U1 i Y4086U2{ Ura-).
Proizvodnja soja Y4128 za proizvodnju oko 37% EPA od ukupne količine lipida: Konstrukcija pZP2-2988 (SLIKA 48A; SEQ ID NO:345) je proizvedena da bi integrisala jedan gen delta-12 desaturaze, dva gena delta-8 desaturaze i jedan gen delta-9 elongaze uPox2lokuse (GenBank Accession No. AJ001300) soja Y4086U1, kako bi se na taj način, omogućio viši nivo proizvodnje EPA. Plazmid pZP2-2988 je sadržavao sledeće komponente:
Plazmid pZP2-2988 je svaren saAscl/ Sphl,a zatim je korišćen za transformaciju soja Y4086U1, u skladu sa Opštim postupcima. Transformisane ćelije su postavljene na MM ploče, a ploče su držane na 30°C, tokom 2 do 3 dana. Pojedinačne kolonije su ponovno zasejane na MM ploče, a nastale kolonije su korišćene za inokulaciju u tečne MMLeuLvs. Tečne kulture su mućkane na 250 rpm/min, tokom 2 dana, na 30°C. Ćelije su sakupljene centrifugiranjem, resuspendovane su u HGM, a zatim su mućkane na 250 rpm/min, tokom 5 dana. Ćelije su sakupljene centrifugiranjem, a lipidi su ekstrahovani. Metil estri masnih kiselina pripremljeni su trans-esterifikacijom, i sledstveno su analizirani sa Hewlett-Packard 6890 GC.
GC analize su pokazale da je najveći broj od 96 odabranih sojeva proizveo 12-15.6% EPA od ukupne količine lipida. Dva soja, označena kao Y4128 i Y4129, proizvela su oko 37.6%, odnosno 16.3% EPA od ukupne količine lipida.
Konačni genotip soja Y4128, s obzirom na divlji tipYarrowie lipolyticeATCC #20362 bio je:YALI0F24167g-, Pexl0-, nepoznat 1-, nepoznat 2-,GPD::FmD12::Pex20, YATl::FmD12::OCT, GPM/FBAIN::FmD12S::OCT, YATl::ME3S::Pexl6, GPAT::EgD9e::Lip2, EXPl::EgD9eS::Lipl, FBAINm::EgD9eS::Lip2, FBA::EgD9eS::Pex20, FBAINm::EgD8M::Pex20, EXPl::EgD8M::Pexl6, GPDIN::EgD8M::Lipl, YATl::EgD8M::Aco, FBAIN::EgD5::Aco, EXPl::EgD5S::Pex20, YATl::RD5S::OCT, YATl::PaD17S::Lipl, EXPl::PaD17::Pexl6, FBAINm::PaD17::Aco. Soj Y4128Yarrowie lipolyticedeponovan je sa American Type Culture Collection 23. avgusta 2007., i nosi oznaku ATCC PTA-8614.
Proizvodnja Y4128Usojeva: Da bi se razorio Ura3 gen u soju Y4128, kreirana je konstrukcija pZKUE3S (SLIKA 48B; SEQ ID NO:351), kako bi integrisala himerični gen EXPl::ME3S::Pex20 uUra3gen soja Y4128. Plazmid pZKUE3S je sadržavao sledeće komponente:
Plazmid pZKUE3S je svaren saSphllPacI,a zatim je korišćen za transformaciju soja Y4128, u skladu sa Opštim postupcima. Nakon transformisanja, ćelije su postavljene na MM + 5-FOA selektivne ploče, a ploče su držane na 30°C, tokom 2 do 3 dana.
Ukupno 24 transformisana soja, koja su porasla na MM + 5-FOA selektivnim pločama, odabrana su i ponovna zasejana na sveže MM + 5-FOA ploče. Ćelije su sastrugane sa ploča, a lipidi su ekstrahovani. Metil estri masnih kiselina pripremljeni su trans-esterifikacijom, i sledstveno su analizirani sa Hewlett-Packard 6890 GC.
GC analize su pokazale daje prisutno između 10-15% EPA u svim ćelijama, transformisanim sa pZKUE3S, sa ploča. Sojevi označeni kao: Y4128U1, Y4128U2, Y4128U3, Y4128U4, Y4128U5 i Y4128U6 proizveli su 12.9%, 14.4%, 15.2%, 15.4%, 14%, odnosno 10.9% EPA (zajednički, Y4128U).
Razilaženje u % EPA, koji je kvantitativno određen u Y4128 (37.6%) u odnosu na Y4128U (prosečno 13.8%) zasnovano je na različitim uslovima rasta. Određenije, ranija kultura je analizirana nakon dva dana rasta u tečnoj kulturi, dok je poslednja kultura analizirana nakon rasta na agar ploči. Podnosioci prijave su zapazili 2-3 puta veći porast u % EPA, kada se uporede rezultati sa agar ploča sa onima u tečnoj kulturi. Stoga, premda rezultati nisu direktno uporedivi, oba soja, Y4128 i Y4128U pokazuju visok nivo proizvodnje EPA.
Proizvodnja soja Y4217 za proizvodnju oko 42% EPA od ukupne količine lipida: Konstrukcija pZKL2-5U89GC (SLIKA 49A; SEQ ID NO:348) je proizvedena da bi integrisala jedan gen delta-9 elongaze, jedan gen delta-8 desaturaze, jedan gen delta-5 desaturaze i jedan gen diacilglicerol holinfosfotransferazeYarrowie lipolytice(CPT1) uLip2lokuse (GenBank Accession No. AJ012632) soja Y4128U3, kako bi se na taj način omogućio viši nivo proizvodnje EPA. Plazmid pZKL2-5U89GC sadržavao je sledeće komponente:
Plazmid pZKL2-5U89GC je svaren saAsclISphl,a zatim je korišćen za transformaciju soja Y4128U3, u skladu sa Opštim postupcima. Transformisane ćelije su postavljene na MM ploče, a ploče su držane na 30°C, tokom 3 do 4 dana. Pojedinačne kolonije su ponovno zasejane na MM ploče, a nastale kolonije su, potom, korišćene za inokulaciju u tečne MM. Tečne kulture su mućkane na 250 rpm/min, tokom 2 dana, na 30°C. Ćelije su sakupljene centrifugiranjem, resuspendovane su u HGM, a zatim su mućkane na 250 rpm/min, tokom 5 dana. Ćelije su sakupljene centrifugiranjem, a lipidi su ekstrahovani. Metil estri masnih kiselina pripremljeni su trans-esterifikacijom, i sledstveno su analizirani sa Hewlett-Packard 6890 GC.
GC analize su pokazale daje najveći broj od odabranih 96 sojeva proizveo 32-39.9% EPA od količine ukupnih lipida. Šest sojeva, označenih kao: Y4215, Y4216, Y4217, Y4218, Y4219 i Y4220, proizvelo je oko 41.1%, 41.8%, 41.7%, 41.1%, 41%, odnosno 41.1% EPA od ukupne količine lipida. Konačni genotip svakog soja, s obzirom na divlji tipYarrowie lipolyticeATCC #20362 bio je:YALI0C18711g-, Pexl0-, YALI0F24167g-, nepoznat 1-, nepoznat 3-,GPD::FmD12::Pex20, YATl::FmD12::OCT, GPM/FBAIN::FmD 12S::OCT, YAT1::ME3S::Pexl 6, EXP1: :ME3S::Pex20, GPAT::EgD9e::Lip2, EXPl::EgD9eS::Lipl, FBAINm::EgD9eS::Lip2, FBA::EgD9eS::Pex20, GPD::EgD9eS::Lip2, FBAINm::EgD8M::Pex20, FBAIN::EgD8M::Lip 1, EXPl::EgD8M::Pexl6, GPDIN::EgD8M::Lipl, YATl::EgD8M::Aco, FBAIN::EgD5::Aco, EXPl::EgD5S::Pex20, YATl::EgD5S::Aco, YAT1::RD5S::0CT, YATl::PaD17S::Lipl, EXPl::PaD17::Pexl6, FBAINm::PaDl 7::Aco, YAT1 ::YICPT1 ::ACO.
Proizvodnja soja Y4217U2( Ura3-) :Da bi se razorio Ura3 gen u soju Y4217, konstrukcija pZKUE3S (SLIKA 48B; SEQ ID NO:351) je korišćena za integrisanje himeričnog gena EXPl::ME3S::Pex20 uUra3gen soja Y4217. Nakon transformisanja, ćelije su postavljene na MM + 5-FOA selektivne ploče, i ploče su držane na 30°C, tokom 3 do 4 dana.
Ukupno 6 transformisanih ćelija, koje su porasle na MM + 5-FOA pločama, odabrano je i ponovno zasejano na MM ploče i MM + 5-FOA ploče. Svih 6 sojeva imalo jeUra-fenotip (t.j., ćelije su mogle rasti na MM + 5-FOA pločama, ali ne na MM pločama). Ćelije su sastrugane sa MM + 5-FOA ploča, a lipidi su ekstrahovani. Metil estri masnih kiselina pripremljeni su trans-esterifikacijom, i sledstveno su analizirani sa Hewlett-Packard 6890 GC.
GC analize su pokazale daje prisutno 18.7% do 28.6% EPA u svim ćelijama, transformisanim sa pZKUE3S, poraslim na MM + 5-FOA pločama. Dva soja, označena kao Y4217U1 i Y4217U2, proizvela su 22.5%, odnosno 28.6% EPA.
Proizvodnja soja Y4259 za proizvodnju oko 46.5% EPA od ukupne količine lipida: Konstrukcija pZKLl-2SP98C (SLIKA 49B; SEQ ID NO:352) je proizvedena da bi integrisala jedan gen delta-9 elongaze, jedan gen delta-8 desaturaze, jedan gen delta-12 desaturaze ijedan gen diacilglicerol holinfosfotransferazeYarrowie lipolytice(CPT1) uLipi lokuse(GenBank Accession No. Z50020) soja Y4127U2, kako bi se, na taj način, omogućio viši nivo proizvodnje EPA. Plazmid pZKLl-2SP98C sadržavao je sledeće komponente:
Plazmid pZKLl-2SP98C je svaren saAsclISphl,a zatim je korišćen za transformaciju soja Y4217U2, u skladu sa Opštim postupcima. Transformisane ćelije su postavljene na MM ploče, a ploče su držane na 30°C, tokom 3 do 4 dana. Pojedinačne kolonije su ponovno zasejane na MM ploče, a nastale kolonije su, zatim, korišćene za inokulaciju u tečne MM. Tečne kulture su, zatim, mućkane na 250 rpm/min, tokom 2 dana, na 30°C. Ćelije su sakupljene centrifugiranjem, resuspendovane su u HGM, a zatim su mućkane na 250 rpm/min, tokom 5 dana. Ćelije su sakupljene centrifugiranjem, a lipidi su ekstrahovani. Metil estri masnih kiselina pripremljeni su trans-esterifikacijom, i sledstveno su analizirani sa Hewlett-Packard 6890 GC.
GC analize su pokazale daje najveći broj od 72 odabrana soja proizveo 40-44% EPA od količine ukupnih lipida. Šest sojeva, označenih kao Y4259, Y4260, Y4261, Y4262, Y4263 i Y4264 proizvelo je oko 46.5%, 44.5%, 44.5%, 44.8%, 44.5%, odnosno 44.3%) EPA od ukupne količine lipida.
Konačni genotip Y4259 soja, s obzirom na divlji tipYarrowie lipolyticeATCC #20362 bio je: YALI0C1871 lg-, Pexl0-, YALI0F24167g-,nepoznat 1-, nepoznat 3-, nepoznat 8-,GPD::FmD12::Pex20, YATl::FmD12::OCT,
GPM/FBAIN::FmD12S::OCT, EXPl::FmD12S::Aco, YATl::ME3S::Pexl6, EXPl::ME3S::Pex20 (2 kopije), GPAT::EgD9e::Lip2, EXPl::EgD9eS::Lipl, FBAINm::EgD9eS::Lip2, FBA::EgD9eS::Pex20, GPD::EgD9eS::Lip2, YATl::EgD9eS::Lip2, FBAINm::EgD8M::Pex20, FBAIN::EgD8M::Lipl (2 kopije), EXPl::EgD8M::Pexl6, GPDIN::EgD8M::Lipl, YATl::EgD8M::Aco, FBAIN::EgD5::Aco, EXPl::EgD5S::Pex20, YATl::EgD5S::Aco, YATl::RD5S::OCT, YATl::PaD17S::Lipl, EXPl::PaD17::Pexl6, FBAINm::PaDl 7::Aco,
YATl::YICPTl::ACO,GPD::YICPTl::ACO.
ProizvodnjasojaY4259U2( Ura3-) :Da bi se razorio Ura3 gen u soju Y4259, konstrukcija pZKUM (SLIKA 50A; SEQ ID NO:353) je korišćena za integrisanjeUra3mutant gena uUra3gen soja Y4259. Plazmid pZKUM je sadržavao sledeće komponente:
Ukupno 3 transformisana soja, koja su porasla na MM + 5-FOA pločama, odabrana su i ponovno zasejana na MM ploče i MM + 5-FOA ploče. Sva 3 soja imala suUra-fenotip (t.j., ćelije su mogle rasti na MM + 5-FOA pločama, ali ne na MM pločama). Ćelije su sastrugane sa MM + 5-FOA ploča, a lipidi su ekstrahovani. Metil estri masnih kiselina pripremljeni su trans-esterifikacijom, i sledstveno su analizirani sa Hevvlett-Packard 6890 GC.
GC analize su pokazale daje prisutno 31.4%, 31% i 31.3% EPA u#l, #2 i #3 sojevima, transformisanim sa pZKUM, poraslim na MM + 5-FOA pločama. Ova tri soja su označena kao sojevi Y4259U1, Y4259U2, odnosno Y4259U3 (zbirno Y4259U).
Proizvođenje Y4305 soja za proizvodnju oko 53% EPA od ukupne količine lipida: Konstrukcija pZKD2-5U89A2 (SLIKA 50B; SEQ ID NO:355) je proizvedena da bi integrisala jedan gen delta-9 elongaze, jedan gen delta-5 desaturaze, jedan gen delta-8 desaturaze i jedan gen delta-12 desaturaze u lokuse diacilglicerol aciltransferaze( DGAT2)soja Y4259U2, da bi se na taj način omogućio viši nivo proizvodnje EPA. Plazmid pZKD2-5U89A2 je sadržavao sledeće komponente:
Plazmid pZKD2-5U89A2 je svaren saAscVSphl,a zatim je korišćen za transformaciju soja Y4259U2, u skladu sa Opštim postupcima. Transformisane ćelije su postavljene na MM ploče, a ploče su držane na 30°C, tokom 3 do 4 dana. Pojedinačne kolonije su ponovno zasejane na MM ploče, a nastale kolonije su korišćene za inokulaciju u tečne MM. Tečne kulture su mućkane na 250 rpm/min, tokom 2 dana, na 30°C. Ćelije su sakupljene centrifugiranjem, resuspendovane su u HGM, a zatim su mućkane na 250 rpm/min, tokom 5 dana. Ćelije su sakupljene centrifugiranjem, a lipidi su ekstrahovani. Metil estri masnih kiselina pripremljeni su trans-esterifikacijom, i sledstveno su analizirani sa Hevvlett-Packard 6890 GC.
GC analize su pokazale da je najveći broj od 96 odabranih sojeva proizveo 40-46% EPA od ukupne količine lipida. Četiri soja, koja su označena kao Y4305, Y4306, Y4307 i Y4308 proizvela su oko 53.2%, 46.4%, 46.8%, odnosno 47.8% EPA od ukupne količine lipida. Kompletni lipidni profil Y4305 je sledeći: 16:0 (2.8%), 16:1 (0.7%), 18:0 (1.3%), 18:1 (4.9%), 18:2 (17.6%), ALA (2.3%), EDA (3.4%), DGLA (2.0%), ARA (0.6%), ETA (1.7%) i EPA (53.2%). Ukupan lipidni % težine suve ćelije (dcvv) je bio 27.5.
Konačni genotip soja Y4305, s obzirom na divlji tipYarrowie lipolyticeATCC #20362 bio je: SCP2- (YALI0E01298g), YALI0C1871 lg-, Pexl0-, YALI0F24167g-,nepoznat 1-, nepoznat 3-, nepoznat 8-,GPD::FmD12::Pex20, YATl::FmD12::OCT, GPM/FBAIN::FmD12S::OCT, EXPl::FmD12S::Aco, YATl::FmD12S::Lip2, YATl::ME3S::Pexl6, EXPl::ME3S::Pex20 (3 kopije), GPAT::EgD9e::Lip2, EXP1::EgD9eS::Lip 1, FBAINm::EgD9eS::Lip2, FBA::EgD9eS::Pex20, GPD::EgD9eS::Lip2, YATl::EgD9eS::Lip2, YATl::E389D9eS::OCT, FBAINm::EgD8M::Pex20, FBAIN::EgD8M::Lip 1 (2 kopije), EXPl::EgD8M::Pexl6, GPDIN::EgD8M::Lipl, YATl::EgD8M::Aco, FBAIN::EgD5::Aco, EXPl::EgD5S::Pex20, YATl::EgD5S::Aco, EXPl::EgD5S::ACO, YATl::RD5S::OCT, YATl::PaD17S::Lipl, EXPl::PaD17::Pexl6, FBAINm::PaDl7::Aco, YATl::YICPTl::ACO, GPD::YICPTl::ACO.
Proizvodnja soja Y4305U3( Ura3-) :Da bi se razorio Ura3 gen u soju Y4305, konstrukcija pZKUM (SLIKA 50A; SEQ ID NO:353) je korišćena za integrisanjeUra3mutant gena uUra3gen soja Y4305. Ukupno 8 transformisanih ćelija, koje su porasle na MM + 5-FOA pločama, odabrane su i ponovno zasejane na MM ploče i MM + 5-FOA ploče, zasebno. Svih 8 sojeva imalo jeUra-fenotip (t.j., ćelije su mogle rasti na MM + 5-FOA pločama, ali ne na MM pločama). Ćelije su sastrugane sa MM + 5-FOA ploča, a lipidi su ekstrahovani. Metil estri masnih kiselina pripremljeni su trans-esterifikacijom, i sledstveno su analizirani sa Hevvlett-Packard 6890 GC.
GC analize su pokazale daje prisutno 37.6%, 37.3% i 36.5% EPA u pZKUM transformisanim ćelijama #1, #6 i #7, poraslim na MM + 5-FOA pločama. Ova tri soja označena su kao Y4305U1, Y4305U2, odnosno Y4305U3 sojevi (zbirno, Y4305U).
Konstrukcija Y4184U sojaYarrowie lipolvtice
Soj Y4184UY. lipolyticekorišćenje kao domaćin u Primerima 32, 33, 34 i 51,infra.Soj Y4184U je dobijen izY. lipolyticeATCC #20362 i u stanju je da proizvodi oko 31% EPA, u odnosu na ukupne lipide, putem ekspresije puta delta-9 elongaza/ delta-8 desaturaza.
Razvijanje soja Y4184U zahtevalo je konstruisanje soja Y2224, soja Y4001, soja Y4001U, soja Y4036, soja 4036U i soja Y4069{ supra).Dalje razvijanje soja Y4184U (dijagramski prikazan na SLICI 51 A) zahtevalo je konstruisanje: soja Y4084 (koji proizvodi 14% EPA), soja Y4084U1( Ura-),soja Y4127 (koji proizvodi 18% EPA), soja Y4127U2( Ura-),soja Y4158 (koji proizvodi 25% EPA), soja Y4158U1( Ura-)i soja 4184 (koji proizvodi 30.7% EPA). Iako ovde nisu elaborirani detalji, koji se odnose na transformaciju i selekciju sojeva, koji proizvode EPA, a koji su razvijeni nakon soja Y4069, postupci, koji su korišćeni za izolovanje soja Y4084, soja Y4084U1, soja Y4127, soja Y4127U2, soja Y4158, soja Y4158U1, soja Y4184 i soja Y4184U, bili su kao što su opisani tokom konstruisanja soja Y4305,supra.
Ukratko, konstrukcija pZP3-Pa777U (SLIKA 47A; SEQ ID NO:338) je korišćena da bi integrisala tri gena delta-17 desaturaze uPox3lokuse (GenBank Accession No. AJ001301) soja Y4069, dovodeći, na taj način, do izolovanja soja Y4084 (koji proizvodi 14% EPA). Soj Y4084U1 je kreiran putem privremene ekspresije enzimaCrerekombinaza u konstrukciji pY117 (SLIKA 47B; SEQ ID NO:343) unutar soja Y4084, da bi se proizveoUra-fenotip. Konstrukcija pZP2-2988 (SLIKA 48A; SEQ ID NO:345) je, zatim, korišćena za integrisanje jednog gena delta-12 desaturaze, dva gena delta-8 desaturaze i jednog gena delta-9 elongaze uPox2lokuse (GenBank Accession No. AJ001300) soja Y4084U1, dovodeći, na taj način, do izolovanja soja Y4127 (koji proizvodi 18% EPA). Soj Y4127Yarrowie lipolyticedeponovan je 29. novembra 2007., sa American Type Culture Collection i nosi oznaku ATCC PTA-8802.
Soj Y4127U2 je kreiran razaranjemUra3gena u soju Y4127 preko konstrukcije pZKUE3S (SLIKA 48B; SEQ ID NO:351), koja sadrži himerični EXPl::ME3S::Pex20 gen, kao metu zaUra3gen. Konstrukcija pZKLl-2SP98C (SLIKA 49B; SEQ ID NO:352) je upotrebljena za integrisanje jednog gena delta-9 elongaze, jednog gena delta-8 desaturaze, jednog gen delta-12 desaturaze i jednog gena diacilglicerol holinfosfotransferaze (CPT1)Yarrowie lipolyticeuLipi lokuse(Gen Bank Accession No. Z50020) soja Y4127U2, dovodeći, na taj način, do izolovanja soja Y4158 (koji proizvodi 25% EPA).Ura-derivat (t.j., soj Y4158U1) je, zatim, kreiran, putem transformisanja sa konstrukcijom pZKUE3S (SLIKA 48B; SEQ ID NO:351), koja sadrži himerični EXPl::ME3S::Pex20 gen, kao metu zaUra3gen. Konačno, konstrukcija pZKL2-5U89GC (SLIKA 49A; SEQ ID NO:348) je korišćena za integrisanje jednog gena delta-9 elongaze, jednog gena delta-8 desaturaze, jednog gena delta-5 desaturaze i jednog CPT1Yarrowie lipolyticeuLip2lokuse (GenBank Accession No. AJ012632) Y4158U1, dovodeći, na taj način, do izolovanja soja Y4184.
Kompletni lipidni profil Y4184 je sledeći: 16:0 (3.1%), 16:1 (1.5%), 18:0 (1.8%), 18:1 (8.7%), 18:2 (31.5%), ALA (4.9%), EDA (5.6%), DGLA (2.9%), ARA (0.6%), ETA (2.4%) i EPA (28.9%). Ukupni lipidni % težine suve ćelije (dcvv) je bio 23.9.
Konačni genotip soja Y4184, u odnosu na divlji tipYarrowie lipolyticeATCC #20362 bio je:nepoznat 1-, nepoznat 2-, nepoznat 4-, nepoznat 5-, nepoznat 6-, nepoznat 7-,YATl::ME3S::Pexl6, EXPl::ME3S::Pex20 (2 kopije), GPAT::EgD9e::Lip2, FBAINm::EgD9eS::Lip2, EXPl::EgD92S::Lipl, FBA::EgD9eS::Pex20, YATl::EgD9eS::Lip2, GPD::EgD9eS::Lip2, GPDIN::EgD8M::Lipl, YATl::EgD8M::Aco, EXPl::EgD8M::Pexl6, FBAINm::EgD8M::Pex20, FBAIN::EgD8M::Lip 1 (2 kopije), GPM/FBAIN::FmD12S::Oct, EXPl::FmD12S::Aco, YATl::FmD12::Oct, GPD::FmD12::Pex20, EXPl::EgD5S::Pex20, YATl::EgD5S::Aco, YATl::Rd5S::Oct, FBAIN::EgD5::Aco, FBAINm::PaD17::Aco, EXPl::PaD17::Pexl6, YATl::PaD17S::Lipl, YAT1::YICPT1::AC0, GPD::YICPTl::Aco.
Da bi se razorio Ura3 gen u soju Y4184, konstrukcija pZKUM (SLIKA 50A; SEQ ID NO:353) je korišćena za integrisanjeUra3mutant gena uUra3gen soja Y4184.
Ukupno 11 transformisanih sojeva, koji su porasli na MM + 5-FOA pločama, odabrano je i ponovno zasejano na MM ploče i MM + 5-FOA ploče, odvojeno. Svih 11 sojeva imalo jeUra-fenotip (t.j., ćelije su mogle rasti na MM + 5-FOA pločama, ali ne na MM pločama). Ćelije su sastrugane sa MM + 5-FOA ploča; lipidi su ekstrahovani, a metil estri masnih kiselina pripremljeni su trans-esterifikacijom, i sledstveno su analizirani sa Hewlett-Packard 6890 GC.
GC analize su pokazale daje prisutno 11.2%, 10.6% i 15.5% EPA u #7, #8 i #10 sojevima, transformisanim sa pZKUM, koji su porasli na MM + 5-FOA pločama. Ova tri soja označena su kao Y4184U1, Y4184U2, odnosno Y4184U4 (zbirno, Y4184U).
PRIMER 1
Uslovi rasta, lipidni profil i izolacija mRNKEuglene gracilis
Euglena gracilisje dobijena iz laboratorije Dr Richarda Triemera sa Michigan State Universitv (East Lansing, MI). Od 10 mL aktivno porasle kulture, alikvot od 1 mL je prenesen u 250 mL medijumaEuglene gracilis(Eg) u staklenoj boci od 500 mL. Eg medij um je izrađen sjedinjavanjem 1 g natrijum acetata, 1 g goveđeg ekstrakta (Kat. Br. U126-01, Difco Laboratories, Detroit, MI), 2 g Bacto<®>triptona (0123-17-3, Difco Laboratories) i 2 g Bacto<®>ekstrakta kvasca (Kat. Br. 0127-17-9, Difco Laboratories) u 970 mL vode. Nakon filterskog sterilisanja, aseptično je dodato 30 mL supernatanta zemlja-voda (Kat. Br. 15-3790, Carolina Biological Supplv Companv, Burlington, NC), kako bi se proizveo konačni Eg medijum. KultureEuglene gracilissu rasle na 23°C, sa ciklusom od 16 h svetla i 8 h mraka tokom 2 nedelje bez mućkanja.
Posle 2 nedelje, 10 mL kulture je uzeto za analizu lipida i centrifugirano je na 1,800 x g, tokom 5 minuta. Sabijena kuglica je jednom isprana vodom i recentrifugirana. Nastala kuglica je sušena tokom 5 minuta pod vakuumom, resuspendovana je u 100 uL trimetilsulfonijum hidroksida (TMSH) i inkubirana na sobnoj temperaturi, uz mućkanje, tokom 15 minuta. Posle ovog, dodato je 0.5 mL heksana i bočice su inkubirane 15 minuta na sobnoj temperaturi, uz mućkanje. Metil estri masnih kiselina (5 uL, koji su injicirani iz heksanskog sloja) su izdvojeni i kvantitativno određeni, korišćenjem gasnog hromatografa Hewlett-Packard 6890, koji je opremljen kapilarnom kolonom od rastopljene silike Omegawax 320 (Supelco Inc., Kat. Br 24152). Temperatura sušnice je programirana tako da se drži na 220°C tokom 2.7 minuta, povećavana je brzinom 20°C/min na 240°C, na kojoj je držana dodatnih 2.3 minuta. Nosač gasa je opskrbljen Whatmanovim generatorom vodonika. Vremena retencije su upoređena sa onima za metil estre komercijalno dostupnih standarda (Nu-Chek Prep, Inc., Kat. Br. U-99-A), a dobijeni hromatogram prikazanje na SLICI 27.
Preostala 2-nedeljna kultura (240 mL) je sabijena u kuglicu centrifugiranjem na 1,800 x g, tokom 10 minuta, isprana je jednom vodom i re-centrifugirana. Ukupna RNK je ekstrahovana iz nastale kuglice, korišćenjem RNA STAT-60™ reagensa (TEL-TEST, Inc., Friendsvvood, TX) i sledeći dati protokol proizvođača (upotreba 5 mL reagensa, RNK rastvorena u 0.5 mL vode). Na ovaj način, iz kuglice je dobijen 1 mg ukupne RNK (2 mg/mL). mRNK je izolovana iz 1 mg ukupne RNK, koristeći purifikacioni komplet mRNK (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ), sledeći dati protokol proizvođača. Na ovaj način dobij eno je 85 ug mRNK.
PRIMER 2
Sinteza, konstruisanje i sekvencioniranje bibliotekecDNK Euglene gracilis
Biblioteka cDNK je proizvedena korišćenjem kompleta Cloneminer™ cDNA Library Construction Kit (Kat. Br. 18249-029, Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA) i sledeći dati protokol proizvođača (Verzija B, 25-0608). Koristeći postupak bez radioaktivnog obeležavanja, cDNK je sintetisana iz 3.2 ug mRNK (opisano prethodno), uz upotrebu Biotin-a«B2-01igo(dT) prajmera. Nakon sinteze prvog i drugog struka, dodat jeattBladapter; izvršeno je povezivanje, a cDNK je frakcionisana prema veličini, korišćenjem hromatografije na koloni. DNK iz frakcija 7 i 8 (veličina u rasponu od -800-1500 bp) je ukoncentrisana, rekombinovana u pDONR™222, i transformisana u ćelijeE. coliElectroMAX™ DH10B™ TI Phage-Resistant (Invitrogen Corporation). BibliotekaEuglene gracilisnazvana je eeglc.
Za sekvencioniranje, klonovi su najpe povraćeni iz arhiviranih glicerol kultura, koje su uzgojene i zamrznute u pločama sa 384 reakcione čašice sa medijumima za zamrzavanje. Koristeći automatski piker kolonija QPix (Genetix), ćelije su odabrane, a zatim korišćene za inokulaciju u ploče sa 96 dubokih reakcionih čašica, koje sadrže LB + 50 ug/mL kanamicina. Nakon rasta na 37°C, tokom 20 sati, ćelije su centrifugiranjem oblikovane u kuglice i čuvane su na -20°C. Plazmidi su, zatim, izolovani na Eppendorf 5Prime robotu, korišćenjem modifikovanog miniprep postupka alkalne lize u formatu od 96 reakcionih čašica (Eppendorf PerfectPrep). Ukratko, višestruki filteri i vakuumi su korišćeni za olakšavanje uklanjanja ćelijskih krhotina nakon acetatne precipitacije. Plazmid DNK je, posle toga, vezana na drugu filter ploču, direktno iz filtrata, isprana je, osušena i eluirana.
Plazmidi su sekvencionirani s kraja u pločama sa 384 reakcione čašice, korišćenjem vektorom prajmerovanog M13F univerzalnog prajmera (SEQ ID NO.l) i kita za sekvencioniranje ABI BigDve version 3 Prism. Za reakciju sekvencioniranja, korišćeno je 100-200 ng kalupa i 6.4 pmola prajmera, a sledeći reakcioni uslovi su ponovljeni 25 puta: 96°C tokom 10 sekundi, 50°C tokom 5 sekundi i 60°C tokom 4 minuta. Nakon čišćenja na bazi etanola, reakcioni proizvodi ciklusa sekvencioniranja, razdvojeni su i detektovani na automatskim sekvencerima Perkin-Elmer ABI 3700.
PRIMER 3
Identifikacija homologa enzima elon<g>acije C20- PUFA iz eefilc biblioteke cDNK
Euglene gracilis
Klonovi cDNK, koji kodiraju homologe enzima elongacije C20-PUFA (t.j., "C20-PUFA Elo") identifikovani su izvođenjem BLAST (Basic Local Alignement Search Tool; Altschul et al.,J. Mol. Biol.215:403-410 (1993)) pretraživanja sličnosti sa sekvencama, sadržanim u BLAST "nr" bazi podataka (koja obuhvata sve ne-redundantne GenBank CDS translacije, sekvence, dobijene iz 3-dimenzionalne strukture Brookhaven Protein Data Bank, poslednje glavno otpuštanje baze podataka SWISS-PROT proteinske sekvence, baza podataka EMBL i DDBJ). cDNK sekvencama, dobijenim u Primeru 2, ispitana je sličnost sa svim javno raspoloživim DNK sekvencama, sadržanim u "nr" bazi podataka, korišćenjem BLASTN algoritma, koji je obezbedio National Center for Biotechnologv Information (NCBI). DNK sekvence su prevedene u sve okvire za čitanje i upoređena je sličnost sa svim javno raspoloživim proteinskim sekvencama, sadržanim u "nr" bazi podataka, koristeći BLASTX algoritam (Gish i States,Nat. Genet.3:266-272
(1993)), koji je obezbedio NCBI. Zbog praktičnosti, P-vrednost (verovatnoća) posmatranja slaganja sekvence cDNK sa sekvencom, koja je sadržana u pretraženim bazama podataka, i to jedino slučajnog slaganja, kao što je izračunata pomoću BLAST-a, ovde je izražena u vidu "pLog" vrednosti, koje predstavljaju negativni logaritam prikazane P-vrednosti. U skladu s tim, veća pLog vrednost znači veću verovatnoću da cDNK sekvenca i BLAST "hit" predstaljaju homologne proteine.
BLASTX pretraživanje, koje koristi nukleotidne sekvence iz klona eeglc.pk005.pl4.f, otkrilo je sličnost proteina, kodiranog od strane cDNK sa C20-PUFA Elo izPavlovasp. CCMP459 (SEQ ID NO:2) (NCBI Accession No. AAV33630 (GI 54307108), lokus AAV33630, CDS AY630573; Pereira et al.,Biochem. J.384:357-366
(2004)). Sekvenca dela umetka cDNK iz klona eeglc.pk005.pl4.f prikazana je u SEQ ID NO:3 (5' kraj umetka cDNK). Sledstveno tome, dobijena je puna sekvenca umetka (t.j., eeglc.pk005.pl4.f:fis), prikazana u SEQ ID NO:4. Sekvenca za kodirajuću sekvencu (CDS) prikazana je u SEQ ID NO:5. Sekvenca za odgovarajuću izvedenu aminokiselinsku sekvencu prikazana je u SEQ ID NO:6.
Sekvencioniranje punog umetka (FIS) izvedeno je korišćenjem modifikovanog transpozicijskog protokola. Klonovi, koji su identifikovani u FIS-u, povraćeni su iz arhiviranih glicerolskih zaliha, u vidu pojedinačnih kolonija, a plazmid DNK je izolovana putem alkalne lize. Plazmidni kalupi su prebačeni putem transpozicionog kita Template Generation Svstem (TGS II) (Finnzvmes Oy, Espoo, Finska), prateći protokol proizvođača. Prebačena DNK je transformisana u elektro-kompetentnim ćelijama EH10B (Edge BioSystems, Gaithersburg, MD), putem elektroporacije. Višestruki transformanti su nasumično izabrani iz svake transpozicione reakcije, pripremljena je plazmid DNK, a kalupi su sekvencionirani kao gore (ABI BigDye v3.1), spolja u odnosu na položaj gde se odvija transpozicija, koristeći jedinstvene prajmere SeqE (SEQ ID NO:7) i SeqW (SEQ ID NO:8).
Sekvencioni podaci su sakupljeni (softver ABI Prism Collections) i povezani korišćenjem Phrap sequence assembly program-a (P. Green, University of Washington, Seattle). Povezane sklopove je pregledao redaktor - Consed sequence editor (D. Gordon, University of Washington, Seattle), za konačno izdavanje.
Aminokiselinska sekvenca, navedena u SEQ ID NO:6, procenjena je pomoću BLASTP, dajući pLog vrednost od 61.22 (E vrednost od 6e-62) u odnosu na Elo C20-PUFAPavlovasp. CCMP459 (SEQ ID NO:2). Aminokiselinska sekvenca, navedena u SEQ ID NO:6 je 45.1% identična sa Elo C-20 PUFA-ePavlovasp. CCMP459 (SEQ ID NO:2), koristeći Jotun Hein postupak. Izračunavanja procenta identičnosti sekvence, izvršena Jotun Hein postupkom (Hein, J.J.,Meth. Enz.,183:626-645 (1990)) urađena su korišćenjem MegAlign™ v6.1 programa LASERGENE bioinformatičkog kompjuterskog niza (DNASTAR Inc., Madison, WI) sa default parametrima za slaganje parova (KTUPLE=2). Aminokiselinska sekvenca, navedena u SEQ ID NO:6 je 40.4% identična sa sekvencom Elo C20-PUFAPavlovasp. CCMP459 (SEQ ID NO:2), koristeći Clustal V postupak. Izračunavanja procenta identičnosti sekvence, izvršena Clustal V postupkom (Higgins, D.G. i Sharp, P.M.,Comput. Appl. Biosci.,5:151-153 (1989); Higgins et al.,Comput. Appl. Biosci.,8:189-191 (1992)), urađena su korišćenjem MegAlign™ v6.1 programa LASERGENE bioinformatičkog kompjuterskog niza( supra)sa default parametrima za slaganje parova (KTUPLE=1, GAP PENALTY=3, WINDOW=5 i DIAGONALS SAVED=5 i GAP LENGTH PENALTY=10). Rezultati i verovatnoće BLAST-a pokazuju da fragment tekuće nukleinske kiseline (SEQ ID NO:5) kodira cei oviti gen Elo C20-PUFAEuglene gracilis,ovde nazvan EgC20elol.
SLIKA 25 sažeto prikazuje vrednosti BLASTP-a i procenta identičnosti za EgC20elol (Primer 3), EgDHAsvnl (Primer 4,infra)i EgDHAsyn2 (Primer 5,infra).
PRIMER 4
Identifikacija DHA sintaze 1 ( EgDHAsvnl) iz ee<g>lc bibliotekecDNK Euglene gracilis
Klonovi cDNK, koji kodiraju dodatne homologe Elo C20-PUFA identifikovani su izvođenjem BLAST pretraživanja sličnosti sa sekvencama, sadržanim u BLAST "nr" bazi podataka, kao što je opisano u Primeru 3.
BLASTX pretraživanje, koje koristi nukleotidne sekvence iz klona eeglc.pk016.e6.f (nazvanog takođe pKR1049) otkrilo je sličnost proteina, kodiranog od strane cDNK sa Elo C20-PUFA izPavlovasp. CCMP459 (SEQ ID NO:2) (NCBI Accession No. AAV33630 (GI 54307108), lokus AAV33630, CDS AY630573; Pereira et al.,Biochem. J.384:357-366 (2004)). Sekvenca dela umetka cDNK iz klona eeglc.pk016.e6.f prikazana je u SEQ ID NO:9 (5' kraj umetka cDNK). Sledstveno tome, dobijena je puna sekvenca umetka (eeglc.pk016.e6.f:fis), kao što je opisano u Primeru 3 i prikazano u SEQ ID NO: 10. Kodirajuća sekvenca je prikazana u SEQ ID NO:ll; odgovarajuća izvedena aminokiselinska sekvenca prikazana je u SEQ ID NO:12.
Aminokiselinska sekvenca, navedena u SEQ ID NO: 12, procenjena je pomoću BLASTP-a, kao stoje opisano u Primeru 3. Zanimljivo je daje utvrđeno da SEQ ID NO: 12 slična obema Elo C20-PUFA i delta-4 desaturazi masne kiseline. N-kraj SEQ ID NO:12 (od približno 16-268 aminokiseline) daje pLog vrednost od 60.30 (E vrednost od 5e-61; 124/258 identičnih aminokiselina; 48% identičnosti) u odnosu na Elo C20-PUFAPavlovasp. CCMP459 (SEQ ID NO:2). C-kraj SEQ ID NO:12 (od približno 253-793 aminokiseline) daje E vrednost od 0.0 (535/541 identičnih aminokiselina; 98% identičnosti) u odnosu na delta-4 desaturazu masne kiseline izEuglene gracilis(SEQ ID NO:13) (NCBI Accession No. AAQ19605 (GI 33466346), lokus AAQ19605, CDS AY278558; Meyer et al.,Biochemistry42(32):9779-9788 (2003)). Rezultati i verovatnoće BLAST-a pokazuju da fragment tekuće nukleinske kiseline (SEQ ID NO:l 1) kodira celoviti gen fuzije Elo C20-PUFA/delta-4 desaturaza masne kiselineEuglene gracilis,ovde nazvan DHA sintaza 1Euglene gracilis(EgDHAsynl).
Sekvenca aminokiseline EgDHAsynl (SEQ ID NO: 12) je 47.8% identična sa Elo C-20 PUFA izPavlovasp. CCMP459 (SEQ ID NO:2) i 98.9% identična sa delta-4 desaturazom masne kiseline izEuglene gracilis(SEQ ID NO: 13), koristeći Jotun Hein postupak, kao stoje opisano u Primeru 3. Aminokiselinska sekvenca EgDHAsynl (SEQ ID NO:12) je 41.2% identična sa Elo C-20 PUFA izPavlovasp. CCMP459 (SEQ ID NO:2) i 98.9%) identična sa delta-4 desaturazom masne kiseline izEuglene gracilis(SEQ ID NO:13), koristeći Clustal V postupak, kao stoje opisano u Primeru 3.
SLIKA. 27 sažeto prikazuje vrednosti BLASTP-a i procenta identičnosti za EgDHAsynl (Primer 4), EgC20elol (Primer 3,supra)i EgDHAsyn2 (Primer 5,infra).
PRIMER 5
Identifikacija DHA sintaze 2 ( EgDHAsyn2) iz eeglc biblioteke cDNKEuglene gracilis
Približno 17,000 klonova iz eeglc biblioteke cDNKEuglene gracilispostavljeno je na tri velika kvadrata (24 cm x 24 cm) petri šofja (Corning, Corning, NY), od kojih svaka sadrži LB + 50 ug/mL kanamicin agar medijuma. Ćelije su rasle preko noći na 37°C, a ploče su, zatim, ohlađene do sobne temperature.
Podizanja kolonije:
Biodin B membrana od 0.45 um (Kat. Br. 60207, Pali Corporation, Pensacola, FL) je odrezana na dimenzije od približno 22 cm x 22 cm, i membrana je pažljivo postavljena na površinu agara, da bi se izbegli mehurići vazduha. Nakon inkubacije od 2 minuta na sobnoj temperaturi, membrani je naznačena orijentacija, podignuta je pincetama i, onom stranom na kojoj se nalaze kolonije, stavljena je na filter papir, natopljen sa 0.5 M natrijum hidroksidom i 1.5 M natrijum hloridom. Nakon denaturacije, tokom 4 minuta, natrijum hidroksid je neutralisan stavljanjem membrane na filter papir, natopljen sa 0.5 M Tris-HCL (pH 7.5) i 1.5 M natrijum hloridom, u toku 4 minuta. Ovaj korak je ponovljen, a membrana je kratko isprana u 2X SSC puferu (20X SSC je 3M natrijum hlorid, 0.3 M natrijum citrat; pH 7.0) i osušena na vazduhu na filter papiru.
Hibridizacija:
Membrane su pre-hibridizovane na 65°C u 200 mL hibridizacionog rastvora, tokom 2 sata. Hibridizacioni rastvor je sadržavao: 6X SSPE (20X SSPE je 3M natrijum hlorid, 0.2 M natrijum fosfat, 20 mM EDTA; pH 7.4), 5X Denhardtov reagens (100X Denhardtov reagens je 2% (tež/v) Ficoll, 2% (tež/v) polivinilpirolidon, 2% (tež/v) acetilovani bovini serumski albumin), 0.5% natrijum dodecil sulfat (SDS), 100 ug/mL DNK sperme oguljenog lososa i 5% dekstran sulfata.
DNK proba je izrađena korišćenjemNcolINotlfragmenta DNK, prečišćenog na agaroza gelu, koji sadrži EgDHAsvnl<*>iz pY141 (opisan ovde u Primeru 10), koji je obeležen saP<32>dCTP, koristeći sistem RadPrime DNA Labeling System (Kat. Br. 18428-011, Invitrogen, Carlsbad, CA), sledeći instrukcije proizvođača. P<32>dCTP, koji nije ugrađen, izdvojen je korišćenjem NICK kolone (Kat. Br. 17-0855-02, Amersham Biosciences, Piscataway, NJ), sledeći instrukcije proizvođača. Proba je denaturisana tokom 5 minuta, na 100°C, stavljena je na led tokom 3 minuta; zatim je polovina dodata u hibridizacioni rastvor.
Membrana je hibridizovana sa probom preko noći, na 65°C, uz blago mućkanje, a zatim je, sledećeg dana, isprana, dva puta, sa 2X SSC, koji sadrži 0.5% SDS (5 minuta svaki) i dva puta sa 0.2X SSC, koji sadrži 0.1% SDS (15 minuta svaki). Nakon ispiranja, hiperfilm (Kat. Br. RPN30K, Amersham Biosciences) je izložen membrani, preko noći, na -80°C.
Na osnovu razvrstavanja ploča sa izloženim hiperfilmom, pozitivne kolonije su prenesene korišćenjem tupog kraja Paster pipete u 1 mL vode, a zatim su mućkane. Urađeno je nekoliko razblaženja, koja su postavljena na male okrugle Petri šolje (82 mm), koje sadrže LB medijume plus 50 pg/mL kanamicina, da bi se dobilo oko 100 reakcionih čašica sa izolovanim kolonijama na pojedinačnoj ploči. Podizanja su izvedena kao što je prethodno opisano, s izuzetkom korišćenja krugova NvtranN membrane circles (Kat. Br. 10416116, Schleicher & Schuell, Keene, NH), a hibridizacija je izvršena u 100 mL, koristeći preostalu radioaktivno obeleženu probu. Na ovaj način identifikovan je jedan pozitivni klon (sa oznakom eeglc-1). Plazmid iz eeglc-1 može se, takođe označiti kao pLF116.
Pojedinačni pozitivni klon je uzgojen na 37°C, u tečnim medijumima LB + 50 ug/mL kanamicina, a plazmid je prečišćen korišćenjem kompleta OJAprep<®>Spin Miniprep (Qiagen Inc., Valencia, CA), sledeći protokol proizvođača. Plazmidni umetak je sekvencioniran, kao stoje opisano u Primeru 2, sa kompletom za sekvencioniranje ABI BigDve version 3 Prism, koristeći vektorski prajmerovan M13F univerzalni prajmer (SEQ ID NO:l), vektorski prajmerovan M13rev prajmer (SEQ ID NO: 14) i poli(A) priveskom prajmerovane Wobble T oligonukleotide. Ukratko, Wobble T prajmer je ekvimolarna mešavina od 21mer poli(T)A, poli(T)C i poli(T)G, korišćena za sekvencu 3' kraja cDNK klonova. Na osnovu podataka o inicijalnoj sekvenci, dobijena je, na sličan način, sekvenca dodatnog unutarnjeg fragmenta, koristeći oligonukleotide: oEUGel4-l (SEQ ID NO: 15), EgEloD4Mut-5 (SEQ ID NO: 16), oEUGel4-2 (SEQ ID NO: 17), EgDHAsyn5' (SEQ ID NO:18) i EgDHAsyn3' (SEQ ID NO:19). Na ovaj način, dobijena je puna sekvenca umetka eeglc-1, koja je prikazana u SEQ ID NO:20. Kodirajuća sekvenca je prikazana kao SEQ ID NO:21, dok je odgovarajuća izvedena aminokiselinska sekvenca prikazana kao SEQ ID NO:22.
Aminokiselinska sekvenca, navedena u SEQ ID NO:22, procenjena je pomoću BLASTP-a, kao što je opisano u Primeru 3. Kao u slučaju EgDHAsynl, takođe je utvrđeno daje SEQ ID NO:22 slična obema Elo C20-PUFA i delta-4 desaturazi masne kiseline. N-kraj SEQ ID NO:22 (od približno 41-268 aminokiseline) daje pLog vrednost od 61.0 (E vrednost od le-61; 118/231 identičnih aminokiselina; 51% identičnosti) u odnosu na Elo C20-PUFAPavlovasp. CCMP459 (SEQ ID NO:2). C-kraj SEQ ID NO:22 (od približno 253-793 aminokiseline) daje E vrednost od 0.0 (541/541 identičnih aminokiselina; 100% identičnost) u odnosu na aminokiselinsku sekvencu delta-4 desaturaze masne kiseline izEuglene gracilis(SEQ ID NO: 13). BLAST rezultati i verovatnoće pokazuju da fragment tekuće nukleinske kiseline (SEQ ID NO:21) kodira celoviti gen fuzije Elo C20-PUFA/delta-4 desaturaza masne kiselineEuglene gracilis,ovde nazvan DHA sintaza 2Euglene gracilis(EgDHAsyn2).
Sekvenca aminokiseline EgDHAsyn2 (SEQ ID NO:22) je 48.2% identična sa Elo C-20 PUFA izPavlovasp. CCMP459 (SEQ ID NO:2) i 100% identična sa delta-4 desaturazom masne kiseline izEuglene gracilis(SEQ ID NO: 13), koristeći Jotun Hein postupak, kao što je opisano u Primeru 3. Aminokiselinska sekvenca EgDHAsyn2 (SEQ ID NO:22) je 41.2% identična sa Elo C-20 PUFA izPavlovasp. CCMP459 (SEQ ID NO:2) i 100% identična sa delta-4 desaturazom masne kiseline izEuglene gracilis(SEQ ID NO: 13), koristeći Clustal V postupak, kao što je opisano u Primeru 3.
SLIKA 25 sažeto prikazuje vrednosti BLASTP-a i procenta identičnosti za EgDHAsyn2 (Primer 5), EgC20elol (Primer 3,supra)i EgDHAsynl (Primer 4,supra).
PRIMER 6
Analiza primarne strukture EgC20eloL EgDHAsvnl i EgDHAs<y>n2
Dajući 100% aminokiselinske identičnosti između C-kraja EgDHAsyn2 (SEQ ID NO:22) i delta-4 desaturazeEuglene gracilis(SEQ ID NO: 13), izvršeno je slaganje nukleotidne sekvence između kodirajuće sekvence EgDHAsyn2 (SEQ ID NO:21), cDNK sekvence delta-4 desaturazeEuglene gracilis(SEQ ID NO:23) (NCBI Accession No. AY278558 (GI 33466346), lokus AY278558, Meyer et al.,Biochemistry42(32):9779-9788 (2003)) i kodirajuće sekvence delta-4 desaturazeEuglene gracilis(SEQ ID NO:24)
(Meyer et al,supra).Slaganje sekvence je izvršeno Clustal W postupkom (korišćenjem MegAlign™ v6.1 programa LASERGENE bioinformatičkog kompjuterskog niza (DNASTAR Inc.) sa default parametrima za višestruko slaganje (GAP PENALTY=10, GAP LENGTH PENALTY=0.2, Delay Divergen Seqs(%)=30, DNA Transition Weight=0.5, Protein Weight Matrix=Gonnet Series, DNA Weight Matrix=IUB). Slaganje je prikazano na SLICI 2. Kodirajuća sekvenca delta-4 desaturazeEuglene gracilisnazvana je EgD4_CDS (SEQ ID NO:24); cDNK sekvenca delta-4 desaturazeEuglene
gracilis jenazvana EgD4_cDNA (SEQ ID NO:23), a kodirajuća sekvenca DHA sintaze 2Euglene gracilis jenazvana EgDHAsyn2 CDS (SEQ ID NO:21).
5' kraj (kada se sekvence razlikuju) i 3' kraj (kada su sekvence identične) slaganja, skraćeni su kako bi se podesilo slaganje na jednoj strani. SLIKA. 2 ilustrativno pokazuje da se sekvence veoma razlikuju od početka cDNK delta-4 desaturazeEuglene gracilisdo 83 bp ushodno od početnog položaja kodirajuće sekvence (CDS). Iz slaganja je jasno da su nukleotidne sekvence za EgD4_cDNA i EgDHAsyn2_CDS identične od 83 bp ushodno od CDS startnog položaja cDNK sekvence delta-4 desaturazeEuglene gracilis(SEQ ID NO:23), koja je ekvivalentna nukleotidu 674 EgDHAsyn2_CDS (SEQ ID NO:21) sve do kraja sekvenci. Na egzaktnoj tački razilaženja,Notipoložaj se može naći u sekvenci cDNKEuglene gracilis(nukleotidi 656-663 SEQ ID NO:23) i budući da su, u originalnom kloniranju cDNK delta-4 desaturazeEuglene gracilis,korišćeniNotispojnice (vidi Meyer et al.,supra),verovatno je daje ono stoje klonirano bilo nepotpuni transkript za EgDHAsyn2, koji nije pune dužine.
Aminokiselinska sekvenca EgDHAsynl (SEQ ID NO: 12) je upoređena sa EgDHAsyn2 (SEQ ID NO:22) i EgC20elol (SEQ ID NO:6), koristeći Clustal W postupak, kao što je prethodno opisano, a slaganje je prikazano na SLIKAMA 3A i 3B. U poređenju sa EgDHAsynl i EgDHAsyn2, EgC20elol ima deleciju 7 aminokiselina (t.j., A L D L A [V/I] L) i 2 druge aminokiselinske supstitucije (t.j., W47R, T48I; na bazi brojčanog označavanja za EgDHAsynl) na N-kraju. Nakon aminokiseline 289 EgC20elol, sekvence se veoma razlikuju kada se uporede sa DHA sintazama. EgDHAsynl i EgDHAsyn2 imaju dodatnih 498 aminokiselina na njihovim C-terminalnim krajevima sa homologijom sa delta-4 desaturazama masne kiseline, dok EgC20elol završava nakon samo 9 dodatnih aminokiselina. Aminokiselinske sekvence EgDHAsynl (SEQ ID NO: 12) i EgDHAsyn2 (SEQ ID NO:22) imaju 8 aminokiselinskih razlika između 2 sekvence (t.j., V25I, G54V, A305T, L310P, V380I, S491N, I744T, R747P; na bazi brojčanog označavanja za EgDHAsynl). Poslednje četiri razlike se nalaze u domenu delta-4 desaturaze.
SLIKE 4A i 4B prikazuju Clustal W slaganje N-kraja EgDHAsynl (SEQ ID NO: 12) i N-kraja EgDHAsyn2 (SEQ ID NO:22) sa EgC20elol (SEQ ID NO:6), Elo C20-PUFAPavlovasp. CCMP459 (SEQ ID NO:2), PUFA elongazom 2Ostreococcus tauri
(SEQ ID NO:25) (NCBI Accession No. AAV67798 (GI 55852396), lokus AAV67798, CDS AY591336; Meyer et al,J. Lipid Res.45(10): 1899-1909 (2004)) i PUFA elongazom 2Thalassiosire pseudonane(SEQ ID NO:26) (NCBI Accession No. AAV67800 (GI 55852441), lokus AAV67800, CDS AY591338; Meyer et al.,J. Lipid Res., supra).Na slikama 4A i 4B, proteiniPavlove, OstreococcusaiThalassiosiresu obeleženi kao: PavC20elo, OtPUFAelo2, odnosno TpPUFAelo2.
SLIKE 5A, 5B, 5C i 5D prikazuju Clustal W slaganje C-kraja EgDHAsynl (EgDHAsynl_CT: aminokiseline 253-793 SEQ ID NO:12; N-kraj EgDHAsynl nije prikazan i označen je sa "...") i C-kraja EgDHAsyn2 (EgDHAsyn2_CT: aminokiseline 253-793 SEQ ID NO:22; N-kraj EgDHAsyn2 nije prikazan i označen je sa "...") sa delta-4 desaturazom masne kiselineEuglene gracilis(SEQ ID NO: 13), delta-4 desaturazomThraustochytrium aureum(SEQ ID NO:27) (NCBI Accession No. AAN75707 (GI 25956288), lokus AAN75707, CDS AF391543), delta-4 desaturazomSchizochytrium aggregatum(SEQ ID NO:28) (PCT Publication No. WO 2002/090493), delta-4 desaturazomThalassiosire pseudonane(SEQ ID NO:29) (NCBI Accession No. AAX14506 (GI 60173017), lokus AAX14506, CDS AY817156; Tonon et al.,FEBS J.272 (13):3401-3412 (2005)) i delta-4 desaturazomIsochrysis galbane(SEQ ID NO:30)
(NCBI Accession No. AAV33631 (GI 54307110), lokus AAV33631, CDS AY630574; Pereira et al.,Biochem. J.384(2):357-366 (2004) i PCT Publication No. WO 2002/090493). Na SLIKAMA 5A, 5B, 5C i 5D, proteiniEuglene, Thraustochytriuma, ThalassiosireiIsochrysisasu obeleženi kao: EgD4, TaD4, TpD4, odnosno IgD4.
Na SLICI 6 je prikazano slaganje unutarnjih fragmenata EgDHAsynl (obeležena kao "EgDHAsyn 1 _NCT.pro"; aminokiseline 253-365 SEQ ID NO:12) i EgDHAsyn2 (obeležena kao "EgDHAsyn2_NCT.pro"; aminokiseline 253-365 SEQ ID NO:22), koji obuhvataju i region C20 elongaze i domen delta-4 desaturaze (na bazi homologije), sa C-krajevima C20 elongaza (EgC20elol_CT.pro, aminokiseline 246-298 SEQ ID NO:6; PavC20elo_CT.pro, aminokiseline 240-277 SEQ ID NO:2; OtPUFAelo2_CT.pro, aminokiseline 256-300 SEQ ID NO:25; TpPUFAelo2_CT.pro, aminokiseline 279-358 SEQ ID NO:26) i N-krajevima delta-4 desaturaza (EgD4_NT.pro, aminokiseline 1-116 SEQ ID NO:13; TaD4_NT.pro, aminokiseline 1-47 SEQ ID NO:27; SaD4JNT.pro, aminokiseline 1-47 SEQ ID NO:28; TpD4_NT.pro, aminokiseline 1-82 SEQ ID NO:29; IgD4_NT.pro, aminokiseline 1-43 SEQ ID NO:30). Konzervisani motiv na C-kraju svih domena C20 elongaze (t.j., VLFXXFYXXXY (SEQ ID NO: 180)) je, takođe, prisutan na N-kraju EgD4 i dalje potpomaže EgD4, delujući kap nepotpuna DHA sintaza.
Na C-kraju domena C20 elongaze za svaki EgDHAsvnl, EgDHAsyn2 i EgC20elol, nalazi se ponovljena sekvenca, koja sadrži NG motiv (t.j., KNGK (SEQ ID NO: 186), PENGA (SEQ ID NO: 187), PENGA (SEQ ID NO: 187) i PCENGTV (SEQ ID NO:191); imenovani NG se ponavlja, a na SLICI 6 je naznačen linijama ispod sekvence). Iako se uzorak nalazi sa visokom verovatnoćom pojavljivanja, snimak NG ponovljenog regiona, korišćenjem Prosite, prikazuje poslednji NG motiv (t.j., NGTV) u ovom regionu, kao potencijalni N-glikozilacijski položaj. Nakon ponovnog NG regiona, obe, i EgDHAsvnl i EgDHAsyn2, sadrže region bogat probnom (obeležen kao "spojnica bogata prolinom" na SLICI 6), koji može delovati kao spojnica između domena C20 elongaze i delta-4 desaturaze. Spojnica može igrati ulogu u održavanju domena C20 elongaze i delta-4 desaturaze u ispravnoj strukturnoj orijentaciji, kako bi se omogućila efikasna konverzija EPA u DHA. Iako je prolinom bogata spojnica prikazana na SLICI 6 kao proširenje od P304 do V321 (na bazi brojčanog označavanja za EgDHAsynl), ponovni NG region je, takođe, donekle bogat prolinom i može, isto tako, igrati ulogu u funkcionisanju ove spojnice.
Sekvence nukleotida i odgovarajuće aminokiseline za prolinom bogatu spojnicu EgDHAsynl, kao što je definisano na SLICI 6, navedene su u SEQ ID NO: 197, odnosno SEQ ID NO: 198. Sekvence nukleotida i odgovarajuće aminokiseline za prolinom bogatu spojnicu EgDHAsyn2, kao što je definisano na SLICI 6, navedene su u SEQ ID NO: 199, odnosno SEQ ID NO:200.
Sekvence nukleotida i odgovarajuće aminokiseline za domen C20 elongaze EgDHAsynl iz EgDHAsynl navedene su u SEQ ID NO:201, odnosno SEQ ID NO:202. Sekvence nukleotida i odgovarajuće aminokiseline za domen C20 elongaze EgDHAsyn2 navedene su u SEQ ID NO:203, odnosno SEQ ID NO:204.
PRIMER 7
Konstrukcija pDMW263
Plazmid pY5-30 (koji je prethodno opisan u U.S. Patentu 7,259,255) (čiji sadržaji su ovde uključeni posredstvom reference)) jeste čunkasti plazmid koji se može replikovati i uE. colii uYarrowii lipolytici.Plazmid pY5-30 sadrži sledeće: autonomnu replikacionu sekvencuYarrowie(ARS18); izvor replikacije CoIEl plazmida; ampicilin-rezistentni gen (Amp<R>) za selekciju uE. coli,LEU2 genYarrowieza selekciju uYarrowiii himerični TEF:GUS::XPR gen. Plazmid pDMW263 (SEQ ID NO:31) je kreiran iz pY5-30, zamenom TEF promotera FBAINm promoteromYarrowie lipolytice(U.S. Patent 7,202,356), koristeći postupke, koji su stručnom licu u ovoj oblasti, dobro poznati. Ukratko, FBAIN promoter je lociran na 5' ushodnom netranslatovanom regionu ispred 'ATG' translacionog inicijacionog kodona enzima fruktoza-bifosfat aldolaze (E.C. 4.1.2.13), kogakodira fbalgen. Ovaj promoter je neophodan za ekspresiju i uključuje deo 5' kodirajućeg regiona, koji ima intron. Modifikovani promoter, FBAINm, ima 52 bp deleciju između ATG translacionog kodona inicijacije i introna FBAIN promotera (uključujući time samo 22 aminokiseline N-kraja) i novi translacioni konsenzus motiv nakon introna. Tabela 20 sažeto prikazuje komponente pDMW263 (SEQ ID NO:31; opisan, takođe u PCT Publication No. WO 2007/061845).
PRIMER 8
Konstruisanje ekspresionog vektora pY115 i Gateway<®>destinacionih vektora pBYl i
pY159Yarrowie lipolvtice
NcoVSaRfragment DNK iz pDMW263 (SEQ ID NO:31) (vidi konstrukciju u Primeru 7), koji sadrži FBAINm promoterYarrowie lipolytice,kloniran je uNcoVSaRfragment DNK iz pDMW237 (SEQ ID NO:32), prethodno opisan u PCT Publication No. WO 2006/012325 (čiji sadržaji su ovde uključeni posredstvom reference). pDMW237 sadrži gen sintetske delta-9 elongaze, koji je dobijen izIsochrysis galbanei kodon-optimizovan za ekspresiju uYarrowii lipolytici(IgD9e). Na ovaj način je proizveden plazmid pY115 (SEQ ID NO:33; SLIKA 7A). Na SLICI 7A, modifikovani FBAINm promoter je nazvan FBA1 + Intron. Modifikovani FBAINm promoter na drugim slikama označen je ili kao FBA1 + Intron ili YAR FBA1 PRO + Intron; ovi izrazi su korišćeni naizmenično sa FBAINm.
Plazmid pY115 (SEQ ID NO:33) je svaren saNcol/ Notl,a nastali krajevi DNK su punjeni, koristeći Klenow. Nakon punjenja, da bi se obrazovali tupi krajevi, fragmenti DNK su obrađeni intestinalnom alkalnom fosfatazom teleta i odvojeni, korišćenjem elektroforeze na agaroza gelu. 6989 bp fragment, koji sadrži FBAINm promoterYarrome lipolytice,isečen je sa agaroza gela i prečišćen, korišćenjem kompleta za ekstrakciju QIAquick<®>Gel Extraction Kit (Qiagen Inc., Valencia, CA), sledeći protokol proizvođača. Prečišćeni 6989 bp fragment je povezan sa rfA kasetom, koristeći sistem Gateway Vector Coversion System (Kat. Br. 11823-029, Invitrogen Corporation), sledeći protokol proizvođača, kako bi se obrazovao Gateway<®>destinacioni vektorYarrowie lipolyticepBYl (SEQ ID NO:34; SLIKA 7B).
U konstruisanju pBYl, napunjeniNcolpoložaj obezbeđuje ATG start za inicijaciju translacije. Tako su geni, preneseni u ovaj ekspresioni vektor, ekspresovani kao fuzioni proteini, a moraju biti u ispravnom okviru nakon kloniranja sa Gateway<®>. Isto tako, 5' netranslatovana sekvenca rezultira dodatnim aminokiselinama, koje su dodate na N-kraj nastalog proteina. Iz ovog razloga, izrađen je drugi Gateway<®>destinacioni vektor, kome je uklonjen ATG start kodon, dobijen iz vektora, omogućujući tako započinjanje translacije iz umetnutog gena.
FBAINm promoter je amplifikovan iz plazmida pY115 (SEQ ID NO:33), korišćenjem PCR-a, sa oligonukleotidnim prajmerima oYFBAl (SEQ ID NO:35) i oYFBAl-6 (SEQ ID NO:36). Prajmer oYFBAl (SEQ ID NO:35) je dizajniran da bi uveoBglUpoložaj na 5' kraj promotera, a prajmer oYFBAl-6 (SEQ ID NO:36) je dizajniran da bi uveoNotipoložaj na 3' kraj promotera, dok seNcolpoložaj, a tako i ATG start kodon, uklanjaju. Nastali PCR fragment je svaren saBgllliNotii kloniran uBgM/ Notlfragment pYl 15, koji sadrži vektorsku osovinu, kako bi se obrazovao pY158 (SEQ ID NO-.37).
Plazmid pY158 (SEQ ID NO:37) je svaren saNoti,a nastali krajevi DNK su napunjeni. Nakon punjenja, da bi se obrazovali tupi krajevi, fragmenti DNK su obrađeni intestinalnom alkalnom fosfatazom teleta i odvojeni, korišćenjem elektroforeze na agaroza gelu. 6992 bp fragment, koji sadrži FBAINm promoterYarrowie Upolytice,isečen je sa agaroza gela i prečišćen, korišćenjem kompleta za ekstrakciju QIAquick<®>Gel Extraction Kit (Qiagen Inc., Valencia, CA), sledeći protokol proizvođača. Prečišćeni fragment od 6992 bp, povezan je sa rfA kasetom, koristeći sistem Gateway Vector Coversion System (Kat. Br. 11823-029, Invitrogen Corporation), sledeći protokol proizvođača, kako bi se obrazovao Gateway<®>destinacioni vektorYarrowie lipolyticepY159 (SEQ ID NO:38; SLIKA 7C).
PRIMER 9
Konstrukcija ekspresionih vektora pBY- EgC20elol ( EgC20elol). pY132 ( EgDHAsvnl).
pY161 ( EgDHAsvnl) i pY164 ( EgDHAsvn2)Yarrowie li polvtice
Plazmid je prečišćen iz klonova eeglc. pk005.pl4.f (Primer 3), eeglc.pk016.e6.f (Primer 4) i eeglc-1 (Primer 5), korišćenjem kompleta QIAprep<®>Spin Minprep Kit (Qiagen Inc., Valencia, CA), sledeći protokol proizvođača. Koristeći mešavinu Gateway<®>LR Clonase™ II enzyme mix (Kat. br. 11791-020, Invitrogen Corporation) i sledeći protokol proizvođača, cDNK umeci iz eeglc.pk001.pl4.f (koji sadrži EgC20elol) i eeglc.pk016.e6.f (koji sadrži EgDHAsynl) su preneseni u pBYl (SEQ ID NO:34; SLIKA 7B), kako bi se obrazovao pBY-EgC20elol (SEQ ID NO:39, SLIKA 7D), odnosno pY132 (SEQ ID NO:40; SLIKA 8A). cDNK umetak iz eeglc-1 (koji sadrži EgDHAsyn2) nije prenesen u pBYl, budući da bi to dovelo do krivog translacionog okvira, koji se ekspresuje.
Koristeći mešavinu Gateway<®>LR Clonase™ II enzyme mix (Kat. br. 11791-020, Invitrogen Corporation) i sledeći protokol proizvođača, cDNK umeci iz eeglc.pk016.e6.fi eeglc-1 su preneseni u pY159 (SEQ ID NO:38; Primer 8), kako bi se obrazovao pY161 (SEQ ID NO:41, SLIKA 8B), odnosno pY164 (SEQ ID NO:42;
SLIKA 8C).
PRIMER 10
Konstrukcija ekspresionih vektora pYl41 ( EgDHAsvnl*). pY143
( EgDHAsvnl* C20EloDoml) i pY149 ( EgDHAsvnl* C20EloDom2Linker)Yarrowie
lipolvtice
EgDHAsynl je amplifikovan iz klona eeglc.pk001.e6.f sa oligonukleotidnim prajmerima EgEPAEloDom-5 (SEQ ID NO:43) i oEUG el4-3 (SEQ ID NO:44), koristeći Phusion™ High-Fidelity DNA Polymerase (Kat. Br. F553S, Finnzymes Oy, Finska) sledeći protokol proizvođača. Nastali fragment DNK je kloniran u klonirajući vektor pCR-Blunt<®>, koristeći komplet za kloniranje Zero Blunt<®>PCR Cloning Kit (Invitrogen Corporation), sledeći protokol proizvođača, kako bi se proizveo pKR1062 (SEQ ID NO:45).
InterniNcolpoložaj na nukleotidima 619-624 je uklonjen iz EgDHAsynl u pKR1062, koristeći komplet Quickchange® Site Directed Mutagenesis kit (Kat. Br. 200518, Stratagene, La Jolla, CA), sa oligonukleotidima EgEloD4Mut-5 (SEQ ID NO:46) i EgEloD4Mut-3 (SEQ ID NO:47), prateći protokol proizvođača. Nakon obimnog sekvencioniranja, klon sa odstranjenimNcolpoložajem (t.j., mutacija ccatgg u ccttgg) i bez izvršenih daljih nukleotidnih izmena, odabran je za dalje razmatranje. Ovaj klon je označen kao pLF115-7 (SEQ ID NO:48). Nukleotidna sekvenca za EgDHAsynl, koja ima uklonjenNcolpoložaj (EgDHAsynl<*>) je navedena u SEQ ID NO:205. Odgovarajuća aminokiselinska sekvenca je identična SEQ ID NO: 12.
Konstruisanje plazmida pY141. koji ekspresuje E<g>DHAsvnl<*>:NcoVNotlfragment DNK iz pLFl 15-7 (SEQ ID NO:48), koji sadrži EgDHAsynl (SEQ ID NO:205; bez internogNcolpoložaja; na nt 621 CDS EgDHAsynl; ccatgg u ccttgg), kloniranje uNcol/ Notlfragment DNK iz pY115, koji sadrži FBAINm promoterYarrowie lipolytice,da bi se proizveo pY141 (SEQ ID NO:49; SLIKA 8D). Tako plazmid pY141 sadrži EgDHAsvnl<*>gen pune dužine (obeležen kao "EgDHAsynl(-NcoI)" na SLICI), pod kontrolom FBAINm promoteraYarrowie lipolytice(PCT Publication No. WO 2005/049805; U.S. Patent 7,202,356, obeležen kao "Fbal+Intron" na SLICI) i Pex20 terminatorne sekvence izPex20genaYarrowie(GenBank Accession No. AF054613). Konstruisanje plazmida pY143, koji ekspresuje EgDHAsvnl- C20EloDoml: Nukleotidna sekvenca za domen C20 elongaze EgDHAsvnl<*>(EgDHAsvnlC20 EloDoml) u pY141 navedena je u SEQ ID NO:206 (identična sa SEQ ID NO:201, ali je odstranjeniVcolpoložaj). Odgovarajuća aminokiselinska sekvenca je identična sa SEQ ID NO:202.
EgDHAsyn 1 C20EloDom 1 (SEQ ID NO:206) je amplifikovan iz pLFl 15-7 sa oligonukleotidnim prajmerima EgEPAEloDom-5 (SEQ ID NO:43) i EgDPAEloDom-3 (SEQ ID NO:50), koristeći Phusion™ High-Fidelity DNA Polymerase (Kat. Br. F553S, Finnzymes Oy, Finska), sledeći protokol proizvođača. Nastali fragment DNK je kloniran u klonirajući vektor pCR-Blunt<®>, koristeći komplet za kloniranje Zero Blunt<®>PCR Cloning Kit (Invitrogen Corporation), sledeći protokol proizvođača, kako bi se proizveo pHD16(SEQ ID NO:51).
NcoVNoilfragment DNK iz pHD16 (SEQ ID NO:51), koji sadrži EgDHAsynlC20EloDoml (bez internogNcolpoložaja) kloniranje uNcol/ Notlfragment DNK iz pY115, koji sadrži FBAINm promoterYarrowie lipolytice,da bi se proizveo pY143 (SEQ ID NO:52; SLIKA 9A). Plazmid pY143 sadrži N-terminalni domen EgDHAsynl<*>(EgDHAsynlC20EloDoml) i ne uključuje spojnicu bogatu prolinom ili domen delta-4 desaturaze.
Konstruisanje plazmida pY149. koji ekspresuje EgDHAsvnlC20EloDom2Linker: Domen C20 elongaze EgDHAsynl<*>(SEQ ID NO:206) i spojnica bogata prolinom (SEQ ID NO:197) amplifikovani su iz pLF115-7 (SEQ ID NO:48) sa oligonukleotidnim prajmerima EgEPAEloDom-5 (SEQ ID NO:43) i oEUGsyn6-2 (SEQ ID NO:53), koristeći Phusion™ High-Fidelity DNA Polymerase (Kat. Br. F553S, Finnzymes Oy, Finska), sledeći protokol proizvođača. Nastali fragment DNK je kloniran u klonirajući vektor pCR-Blunt<®>, koristeći komplet za kloniranje Zero Blunt<®>PCR Cloning Kit (Invitrogen Corporation), sledeći protokol proizvođača, kako bi se proizveo pKR1071 (SEQ IDNO:54).
NcoVEcIU2llfragment DNK iz pKR1071 (SEQ ID NO:54) kloniran je uNcoVNotlfragment DNK iz pY115 (gde jeNotipoložaj bio ispunjen), koji sadrži FBAINm promoterYarrowie lipolytice,da bi se proizveo pY149 (SEQ ID NO:55; SLIKA 9B). Plazmid pY149 sadrži gen fuzije EgDHAsvnlC20EloDoml/prolinom bogata spojnica (t.j., EgDHAsvnlC20EloDom2Linker; SEQ ID NO:207), ali ne sadrži domen delta-4 desaturaze. Aminokiselinska sekvenca EgDHAsvnl C20EloDom2Linker-a je navedena u SEQ ID NO:208. Pored aminokiselina iz domena C20 elongaze EgDHAsvnl<*>i spojnice bogate prolinom, dodate su dodatne 4 aminokiseline (t.j., SCRT) iza regiona spojnice, kao rezultat načina na koji je fragment sintetisan i kloniran.
PRIMER 11
Konstrukcija ekspresionih vektoraYarrowie lipolvticeza proizvodnju novih C20
elongaza/ delta- 4 desaturaza fuzionih proteina
Da bi se sintetisali novi fuzioni proteini C20 elongaza/delta-4 desaturaza jedinstveniSbjlpoložaj je dodat 3' kraju domena C20 elongaze EgDHAsvnl<*>, iza regiona spojnice bogate prolinom (EgDHAsvnl C20EloDom3Linker). EgDHAsvnlC20EloDom3 je amplifikovan iz pLF 115-7 (SEQ ID NO:48) sa oligonukleotidnim prajmerima EgEPAEloDom-5 (SEQ ID NO:43) i oEUGsyn6-3 (SEQ ID NO:56), koristeći Phusion™ High-Fidelity DNA Polvmerase (Kat. Br. F553S, Finnzymes Oy, Finska), sledeći protokol proizvođača. Nastali fragment DNK je kloniran u klonirajući vektor pCR-Blunt<®>, koristeći komplet za kloniranje Zero Blunt<®>PCR Cloning Kit (Invitrogen Corporation), sledeći protokol proizvođača, kako bi se proizveo pKRl091 (SEQ ID NO:57).
NcoVEcIU61lfragment DNK iz pKR1091 (SEQ ID NO:57), koji sadrži EgDHAsynlC20EloDom3Linker, kloniranje uNcoVNotlfragment DNK iz pYl 15 (gde jeNotipoložaj bio punjen, kako bi obrazovao tupi kraj), koji sadrži FBAINm promoterYarrowie lipolytice,da bi se proizveo pY155 (SEQ ID NO:58).
Da bi se sintetisali novi fuzioni proteini C20 elongaza/delta-4 desaturaza jedinstveniSbflpoložaj je dodat na 5' kraj raznih delta-4 desaturaza. U svakom slučaju,Sbflpoložaj je lociran iza ATG start položaja svake kodirajuće sekvence, što je dovelo do dodavanja i/ili zamene nekoliko aminokiselina na N-kraju delta-4 desaturaze, kodirane genima.
Konstrukcija plazmida pY156. koji ekspresuje EgDHAsynl- C20EIoDom3-IgD4<*>: Delta-4 desaturazaIsochrysis galbane(SEQ ID NO:209; IgD4) je amplifikovana iz pRIG6 (prethodno opisana u PCT Publication No. WO 2002/090493) sa oligonukleotidima0RIG6-I (SEQ ID NO:59) i oRIG6-2 (SEQ ID NO:60), koristeći Phusion™ High-Fidelity DNA Polymerase (Kat. Br. F553S), sledeći protokol proizvođača. Nastali fragment DNK, koji sadrži CDS IgD4 i identičan je sa SEQ ID NO:209, s izuzetkom stojeSbflpoložaj dodat na 5' kraj nakon start kodona (IgD4<*>; SEQ ID NO:210) kloniranje u klonirajući vektor pCR-Blunt<®>, koristeći komplet za kloniranje Zero Blunt<®>PCR Cloning Kit (Invitrogen Corporation), sledeći protokol proizvođača, kako bi se proizveo pKR1067 (SEQ ID NO:61). Aminokiselinska sekvenca za IgD4<*>iz pKR1067 navedena je u SEQ ID NO:211 i identična je onoj za IgD4 (SEQ ID NO:30), s izuzetkom što su prve 4 aminokiseline (t.j., MCNA) zamenjene sa MALQ, zbog dodavanjaSbflpoložaja nukleotidnoj sekvenci.
NcoVNotlfragment DNK iz pKR1067 (SEQ ID NO:61), koji sadrži IgD4<*>, kloniran je uNcoVNotlfragment DNK iz pY115, koji sadrži FBAINm promoterYarrowie lipolytice,da bi se proizveo pY150 (SEQ ID NO:62; SLIKA 9C). Na SLICI 9C, IgD4<*>je obeležen kao "Ig d4 DS". Na ovaj način, IgD4<*>je mogao biti ekspresovan sam uYarrowii.
XbaVSbflfragment DNK iz pKRl091 (SEQ ID NO:57;supra),koji sadrži EgDHAsynlC20EloDom3Linker, kloniran je uXbaVSbflfragment DNK iz pKR1067 (SEQ ID NO:61), koji sadrži IgD4<*>, da bi se proizveo pKR1097 (SEQ ID NO:63). Fuzija unutar okvira izvedena je između EgDHAsynlC20EloDom3Linker-a i IgD4<*>, koji su odeljeni regionom spojnice bogate prolinom (naziva se EgDHAsynlC20EloDom3-IgD4; SEQ ID NO.-212). Aminokiselinska sekvenca za EgDHAsynlC20EloDom3-IgD4 navedena je u SEQ ID NO:213.
NcoVNotlfragment DNK iz pKR1097 (SEQ ID NO:63), koji sadrži EgDHAsynlC20EloDom3-IgD4, kloniranje uNcoVNotlfragment DNK iz pY115, koji sadrži FBAINm promoterYarrowie lipolytice,da bi se proizveo pY156 (SEQ ID NO:64; SLIKA 9D). Na SLICI 9D, EgDHAsynlC20EloDom3-IgD4 je obeležena kao "EGel-IGd4".
Konstruisanje plazmida pY152, koji ekspresuje EgDHAsynl- D4Doml*: Region C-kraja EgDHAsvnl<*>(SEQ ID NO:205), koji sadrži domen delta-4 desaturaze (EgDHAsvnlD4Doml; SEQ ID NO:214; odgovarajuća aminokiselinska sekvenca za EgDHAsvnlD4Doml je navedena u SEQ ID NO:215), polazeći upravo iza kraja regiona spojnice, bogate prolinom, amplifikovan je iz pLF 115-7 (kao što je opisano u Primeru 10) sa oligonukleotidima oEGslne6-l (SEQ ID NO:65) i oEUGel4-3 (SEQ ID NO:44), koristeći Phusion™ High-Fidelity DNA Polvmerase (Kat. Br. F553S), sledeći protokol proizvođača. Oligonukleotid oEGslne6-l (SEQ ID NO:65) uveo je ATG start kodon na 5' kraj PCR proizvoda, što je praćenoSbflpoložajem. Nastali fragment DNK kloniranje u klonirajući vektor pCR-Blunt<®>, koristeći komplet za kloniranje Zero Blunt<®>PCR Cloning Kit (Invitrogen Corporation), sledeći protokol proizvođača, kako bi se proizveo pKR1069 (SEQ ID NO:66). Nove CDS i aminokiselinske sekvence, koje sadrže EgDHAsvn 1 D4Dom 1 iz pKE.1069 (t.j., EgDHAsvnlD4Doml<*>) navedene su u SEQ ID NO:216, odnosno SEQ ID NO:217. Aminokiselinska sekvenca za EgDHAsvnlD4Doml<*>
(SEQ ID NO:217) identična je sa onom za EgDHAsvnlD4Doml (SEQ ID NO:215), s izuzetkom što su prve 2 aminokiseline (t.j., SG) bile zamenjene sa MAL, zbog dodavanjaSbflpoložaja u nukleotidnoj sekvenci.
NcoVNotlfragment DNK iz pKR1069 (SEQ ID NO:66), koji sadrži EgDHAsvnlD4Doml<*>, kloniran je uNcoVNotlfragment DNK iz pY115, koji sadrži FBAINm promoterYarrome lipolytice,da bi se proizveo pY152 (SEQ ID NO:67; SLIKA 10A). Na SLICI 10A, EgDHAsvn 1 D4Dom 1 * je obeležen kao "EUG d4 (fus test)". Na ovaj način, EgDHAsvnlD4Doml<*>je mogao biti ekspresovan sam uYarrowii.
Konstruisanje plazmida pY157, koji ekspresuje EgDHAsvnl- C20EloDom3-E<g>D4Doml:XbaVSbflfragment DNK iz pKR1091 (SEQ ID NO:57), koji sadrži EgDHAsynlC20EloDom3-Linker, kloniran je uXbaVSbflfragment DNK iz pKR1069, koji sadrži EgDHAsyn 1 D4Dom 1 *, da bi se proizveo pKR1099 (SEQ ID NO:68). Na ovaj način, izvršena je fuzija unutar okvira između EgDHAsynlC20EloDom i EgDHAsynlD4Doml<*>, koji su odeljeni regionom spojnice bogate prolinom (nazvan EgDHAsyn 1 C20EloDom3-EgD4Dom 1; SEQ ID NO:218). Aminokiselinska sekvenca EgDHAsynlC20EloDom3-EgD4Doml (SEQ ID NO:219) je gotovo identična sa EgDHAsynl, izuzev što je jedna aminokiselina (t.j., G323L, na bazi brojčanog označavanja za EgDHAsvnl) zamenjena zbogSbflklonirajućeg položaja i fuzionog spajanja.
NcoVNotlfragment DNK iz pKR1099 (SEQ ID NO:68), koji sadrži EgDHAsvn 1 C20EloDom3-EgD4Dom 1, kloniran je uNcoVNotlfragment DNK iz pY115, koji sadrži FBAINm promoterYarrowie lipolytice,da bi se proizveo pY157 (SEQ ID NO:69; SLIKA 10B). Na SLICI 10B, EgDHAsvnl C20EloDom3-EgD4Doml je obeležena kao "EGel-EGd4 fus".
Konstruisanje plazmida pY153, koji ekspresuje EgDHAsvnl * D4Dom2: Region C-kraja EgDHAsvnl, koji sadrži domen delta-4 desaturaze i neki od domena C20 elongaze (EgDHAsvnlD4Dom2; SEQ ID NO:220; odgovarajuća aminokiselinska sekvenca za EgDHAsvnlD4Dom2 je navedena u SEQ ID NO:221), koji odgovara aminokiselinskoj sekvenci, identifikovanoj kao EgD4 (SEQ ID NO:13; Meyer et al.,Biochemistry42(32):9779-9788 (2003)) amplifikovan je iz pLF 115-7 (opisan u Primeru 10) sa oligonukleotidima oEUGel4-4 (SEQ ID NO:70) i oEUGel4-3 (SEQ ID NO:44), koristeći Phusion™ High-Fidelity DNA Polymerase (Kat. Br. F553S), sledeći protokol proizvođača. Nastali fragment DNK kloniran je u klonirajući vektor pCR-Blunt<®>, koristeći komplet za kloniranje Zero Blunt<®>PCR Cloning Kit (Invitrogen Corporation), sledeći protokol proizvođača, kako bi se proizveo pKR1073 (SEQ ID NO:71).
PciVNotlfragment DNK iz pKR1073 (SEQ ID NO:71), koji sadrži EgDHAsynlD4Dom2, kloniran je uNcoVNotlfragment DNK iz pY115, koji sadrži FBAINm promoterYarrowie lipolytice,da bi se proizveo pY153 (SEQ ID NO:72; SLIKA 10C). Na SLICI 10C, EgDHAsynlD4Dom2 je obeležena kao EUG d4 (HZ). Na ovaj način, EgDHAsynD4Dom2 je mogao biti sam ekspresovan uYarrowii.
Konstruisanje plazmida pY160, koji ekspresuje EgDHAsynl- C20EloDom3-SaD4*_: Delta-4 desaturazaSchizochytrium aggregatum(SEQ ID NO:222; SaD4) amplifikovana je iz pRSA-1 (prethodno opisan u PCT Publication No. WO 2002/090493) sa oligonukleotidima oRSAl-1 (SEQ ID NO:73) i oRSAl-2 (SEQ ID NO:74), koristeći Phusion™ High-Fidelity DNA Polymerase (Kat. Br. F553S), sledeći protokol proizvođača. Nastali fragment DNK, koji sadrži CDS SaD4 i identičan je sa SEQ ID NO:222, s izuzetkom što jeSbflpoložaj bio dodat na 5' kraj nakon start kodona (SaD4<*>; SEQ ID NO:223), kloniran je u klonirajući vektor pCR-Blunt<®>, koristeći komplet za kloniranje Zero Blunt<®>PCR Cloning Kit (Invitrogen Corporation), sledeći protokol proizvođača, kako bi se proizveo pKR1068 (SEQ ID NO:75). Aminokiselinska sekvenca za SaD4<*>iz pKR1068 navedena je u SEQ ID NO:224 i identična je sa onom za SaD4 (SEQ ID NO:28), s izuzetkom što su prve 3 aminokiseline (t.j., MTV) bile zamenjene sa MALQ, zbog dodavanjaSbflpoložaja u nukleotidnoj sekvenci.
NcoVNotlfragment DNK iz pKR1068 (SEQ ID NO:75) (parcijalni proizvod digestije da bi se izbegao unutarnjiNcolpoložaj), koji sadrži SaD4<*>, bio je kloniran uNcoVNotlfragment DNK iz pY115, koji sadrži FBAINm promoterYarrowie lipolytice,da bi se proizveo pY151 (SEQ ID NO:76; SLIKA 10D). Na SLICI 10D, SaD4<*>je obeležena kao "RSA d4 DS". Na ovaj način, SaD4<*>je mogao biti sam ekspresovan u
Yarrowii.
SbjVNotlfragment DNK iz pKR1068 (SEQ ID NO:75), koji sadrži SaD4<*>, kloniran je uSbjVNotlfragment DNK iz pY157 (SEQ ID NO:69), koji sadrži EgDHAsynlC20EloDom3Linker, da bi se proizveo pY160 (SEQ ID NO:77; SLIKA 11). Na ovaj način, izvršena je fuzija u okviru između EgDHAsynlC20EloDom3 i SaD4<*>, koji su odeljeni regionom spojnice bogate prolinom (t.j., EgDHAsynlC20EloDom3-SaD4; SEQ ID NO:225). Aminokiselinska sekvenca za EgDHAsynlC20EloDom3-SaD4 navedena je u SEQ ID NO:226.
PRIMER 12
Uslovi rasta, lipidni profil i izolacija mRNKEuglene anabaene
Euglena anabaenaje dobijena iz laboratorije Dr Richarda Triemera na Michigan State University (East Lansing, MI). Približno 2 mL kulture uzeto je za analizu lipida i centrifugirano na 1,800 x g, tokom 5 minuta. Sabijena kuglica je jednom isprana vodom i re-centrifugirana. Nastala kuglica je sušena tokom 5 minuta, pod vakuumom, resuspendovana je u 100 uL trimetilsulfonijum hidroksida (TMSH) i inkubirana na sobnoj temperaturi, uz mućkanje, tokom 15 minuta. Posle ovog, dodato je 0.5 mL heksana i bočice su inkubirane 15 minuta na sobnoj temperaturi, uz mućkanje. Metil estri masnih kiselina (5 uL, koji su injicirani iz heksanskog sloja) su izdvojeni i kvantitativno određeni, korišćenjem gasnog hromatografa Hewlett-Packard 6890, koji je opremljen kapilarnom kolonom od rastopljene silike Omegawax 320 (Supelco Inc., Kat. Br. 24152). Temperatura sušnice programirana je tako da se drži na 170°C tokom 1.0 minuta, povećavana je brzinom 5°C/min na 240°C, na kojoj je držana dodatni 1.0 minut. Nosač gasa je opskrbljen Whatmanovim generatorom vodonika. Vremena retencije su upoređena sa onima za metil estre komercijalno dostupnih standarda (Nu-Chek Prep, Inc., Kat. Br. U-99-A), a dobijeni hromatogram prikazan je na SLICI 12. Prisustvo EPA i DHA u profilu masnih kiselina sugerisalo je da biEuglena anabaenabila dobar izvor biosintetskih gena PUFA dugog lanca, kao što su, ali bez ograničavanja na njih, C20 elongaze, delta-4 desaturaze i/ili DHA sintaze.
Preostalih 5 mL aktivno porasle kulture preneseno je u 25 mL AF-6 medijuma (Watanabe & Hiroki, NIES-Collection List of Strains, 5. izdanje, National Institute for Environmental Studies, Tsukuba, 127 pp (2004)), u staklenom balonu od 125 mL. KultureEuglene anabaenesu rasle na 22°C, sa ciklusom od 16 sati svetla i 8 sati mraka, tokom 2 nedelje, uz veoma blago mućkanje.
Nakon 2 nedelje, kultura (25 mL) je prenesena u 100 mL AF-6 medijuma u staklenom balonu od 500 mL, a kulture su uzgajane tokom 1 meseca, kao što je prethodno opisano. Nakon ovog vremena, dva alikvota od 50 mL su prenesena u dva zasebna staklena balona od 500 mL, koji sadrže 250 mL AF-6 medijuma, a kulture su uzgajane tokom dva meseca, kao što je gore opisano (dajući ukupno -600 mL kulture). Nakon ovoga, kulture su sabijene u kuglice centrifugiranjem na 1,800 x g, tokom 10 minuta, isprane su jednom vodom i re-centrifugirane. Ukupna RNK je ekstrahovana iz jedne od nastalih kuglica, korišćenjem RNA STAT-60™ reagensa (TEL-TEST, Inc., Friendswood, TX) i sledeći protokol proizvođača (upotreba 5 mL reagensa, RNK rastvorena u 0.5 mL vode). Na ovaj način, iz kuglice je dobij eno 340 ug ukupne RNK (680 ug/mL). Preostala kuglica je zamrznuta u tečnom azotu i čuvana na -80°C. mRNK je izolovana iz celih 340 pg ukupne RNK, koristeći purifikacioni komplet mRNK (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ), sledeći protokol proizvođača. Na ovaj način dobij eno je 9.0 ug mRNK.
PRIMER 13
Sinteza cDNKEuglene anabaene ,konstruisanje biblioteke i identifikacija DHA sintaza
iz cDNK biblioteke euglc
Biblioteka cDNK je proizvedena korišćenjem kompleta Cloneminer™ cDNA Library Construction Kit (Kat. Br. 18249-029, Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA) i sledeći protokol proizvođača (Verzija B. 25-0608). Koristeći postupak bez radioaktivnog obeležavanja, cDNK je sintetisana iz 5.12 ug mRNK (Primer 12), uz upotrebu Biotin-atfB2-01igo(dT) prajmera. Nakon sinteze prvog i drugog struka, dodat jeattBladapter; izvršeno je povezivanje, a cDNK je frakcionisana prema veličini, korišćenjem hromatografije na koloni. DNK iz frakcija su ukoncentrisane, rekombinovane u pDONR™222, i transformisane u ćelijeE. coliElectroMAX™ DH10B™ TI Phage-Resistant (Invitrogen Corporation). BibliotekaEuglene anabaene jenazvana euglc.
Približno 17,000 klonova iz euglc biblioteke cDNK postavljeno je na tri velika kvadrata (24 cm x 24 cm) petri šolja (Corning, Corning, NY), od kojih svaka sadrži LB + 50 pg/mL kanamicin agar medijuma. Ćelije su porasle, prenesene su u Biodvne B membranu i hibridizovane su sa obeleženimNcoVNotlfragmentom DNK, koji sadrži EgDHAsvnl<*>iz pY141, tačno kao što je opisano u Primeru 5. Na ovaj način, identifikovano jeli pozitivnih klonova (označenih kao euglc-1 do euglc-11).
Uzgojeni su pozitivni klonovi, a DNK je prečišćena i sekvencionirana kao što je opisano u Primeru 2, koristeći vektorom-upućen M13F univerzalni prajmer (SEQ ID NO:l), vektorom upućen M13-28Rev prajmer (SEQ ID NO:14) i poli(A) priveskom usmerene Wobble T oligonukleotide. Na bazi podataka o inicijalnoj sekvenci, dobijena je, na sličan način, dodatna sekvenca internog fragmenta, korišćenjem oligonukleotida: EaDHAsyn5' (SEQ ID NO:78), EaDHAsyn5'2 (SEQ ID NO:79), EaDHAsyn5'3 (SEQ ID NO:80), EaDHAsyn5'4 (SEQ ID NO:81), EaDHAsyn3' (SEQ ID NO:82), EaDHAsyn3'2 (SEQ ID NO:83), EaDHAsyn3'3 (SEQ ID NO:84), EaDHAsyn3'4 (SEQ ID NO:85) i EaDHAsyn3'5 (SEQ ID NO:86). Na ovaj način, dobijena su pune insert sekvence euglc klonova.
Sekvence su slagane i upoređene korišćenjem Sequencher-a™ (verzija 4.2, Gene Codes Corporation, Ann Arbor, MI), i, na taj način su se klonovi mogli kategorizovati u jednu od četiri različite grupe, na osnovi insert sekvence (identifikovane kao EaDHAsynl do EaDHAsyn4). Reprezentativni klonovi, koji sadrže cDNK za svaku klasu sekvence, odabrani su za dalje analiziranje, a sekvence svakog reprezentativnog plazmida (t.j., pLF117-l, pLF117-2, pLF117-3 i pLF117-4) prikazani su kao SEQ ID NO:87, SEQ ID NO:88, SEQ ID NO:89, odnosno SEQ ID NO:90. Sekvenca pLF117-l, koja je prikazana pomoću trake NNNN predstavlja region poliA priveska, koji nije sekvencioniran. Kodirajuće sekvence za EaDHAsvnl, EaDHAsyn2, EaDHAsyn3 i EaDHAsyn4 prikazane su kao SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:93, odnosno SEQ ID NO:94. Odgovarajuće aminokiselinske sekvence za EaDHAsynl, EaDHAsyn2, EaDHAsyn3 i EaDHAsyn4 prikazane su kao SEQ ID NO:95, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:97, odnosno SEQ ID NO:98.
Sekvence aminokiselina za EaDHAsynl (SEQ ID NO:95), EaDHAsyn2 (SEQ ID NO:96), EaDHAsyn3 (SEQ ID NO:97) i EaDHAsyn4 (SEQ ID NO:98) procenjene su uz pomoć BLASTP-a, kao što je opisano u Primeru 3, i kao što je to bilo u slučaju EgDHAsynl (SEQ ID NO: 12) i EgDHAsyn2 (SEQ ID NO:22), utvrđeno je, takođe, da su sve četiri sekvence EaDHAsyn, bile slične obema i C20-PUFA Elo i delta-4 desaturazama masne kiseline. Svaki od N-krajeva EaDHAsynl (SEQ ID NO:95), EaDHAsyn2 (SEQ ID NO:96), EaDHAsyn3 (SEQ ID NO:97) i EaDHAsyn4 (SEQ ID NO:98) dao je pLog vrednost od 58.5 (E vrednost od 3e-59; 114/247 identičnih aminokiselina; 46% identiteta) u odnosu na Elo C20-PUFAPavlovasp. CCMP459 (SEQ ID NO:2). C-krajevi EaDHAsynl (SEQ ID NO:95), EaDHAsyn2 (SEQ ID NO:96), EaDHAsyn3 (SEQ ID NO:97) i EaDHAsyn4 (SEQ ID NO:98) dali su E vrednosti od 0.0 (378/538 identičnih aminokiselina; 70% identiteta), 0.0 (378/538 identičnih aminokiselina; 70%) identiteta), 0.0 (379/538 identičnih aminokiselina; 70% identiteta), odnosno 0.0 (368/522 identičnih aminokiselina; 70% identiteta), u odnosu na aminokiselinsku sekvencu delta-4 desaturaze masne kiseline izEuglene gracilis(SEQ ID NO: 13). BLAST rezultati i verovatnoće pokazuju da fragmenti tekuće nukleinske kiseline kodiraju celokupne C20-PUFA Elo/delta-4 desaturaze masne kiselineEuglene anabaene.
Sekvence aminokiselina za EaDHAsynl (SEQ ID NO:95), EaDHAsyn2 (SEQ ID NO:96), EaDHAsyn3 (SEQ ID NO:97) i EaDHAsyn4 (SEQ ID NO:98) upoređene su korišćenjem Clustal W postupka, kao što je opisano u Primeru 6, a slaganje je prikazano na SLIKAMA 13A, 13B i 13C. Zanimljivo je da zbog pojedinačne bp delecije u nukleotidnoj sekvenci, C-kraj nastale aminokiselinske sekvence EaDHAsyn4 (približno poslednjih 35 aminokiselina) je veoma različit i manji od druga tri EaDHAsyn proteina.
Kada se uporede sa aminokiselinskom sekvencom EgDHAsynl (SEQ ID NO: 12), korišćenjem BLASTP-a, sekvence aminokiselina EaDHAsynl (SEQ ID NO:95), EaDHAsyn2 (SEQ ID NO:96), EaDHAsyn3 (SEQ ID NO:97) i EaDHAsyn4 (SEQ ID NO:98) bile su 70% (558/791), 70% (558/791), 70% (559/791), odnosno 70% (548/775) identične.
Kao u slučaju EgDHAsynl (SEQ ID NO: 12) i EgDHAsyn2 (SEQ ID NO:22), sve četiri sekvence EaDHAsyn poseduju region spojnice, bogat prolinom (od približno P300 do T332, na bazi brojčanog označavanja za EaDHAsynl). Čini se da je spojnica neznatno duža od one za EgDHAsynl (SEQ ID NO: 12) ili EgDHAsyn2 (SEQ ID NO:22). Sve četiri sekvence EaDHAsyn, takođe gube ponavljanje NG motiva, koji se nalazi ushodno od prolinom bogatog motiva EgDHAsynl i EgDHAsyn2; ali, ovaj region, kao što je to bilo u slučaju EgDHAsynl i EgDHAsyn2, takođe je neznatno bogat prolinom u sve četiri sekvence EaDHAsyn i može igrati ulogu u funkciji spojnice.
Nukleotidne sekvence domena C20 elongaze EaDHAsynl, EaDHAsyn2, EaDHAsyn3 i EaDHAsyn4 navedene su u SEQ ID NO:227, SEQ ID NO:228, SEQ ID NO:229, odnosno SEQ ID NO:230. Aminokiselinske sekvence domena C20 elongaze EaDHAsvnl, EaDHAsyn2 i EaDHAsyn3 navedene su u SEQ ID NO:231, SEQ ID NO:232, odnosno SEQ ID NO:233. Sekvenca aminokiselina domena C20 elongaze EaDHAsyn4 identična je onoj zaEaDHAsynl.
Sekvence nukleotida i aminokiselina za spojnicu, bogatu prolinom EaDHAsynl navedene su u SEQ ID NO:234, odnosno SEQ ID NO:235. Nukleotidne i aminokiselinske sekvence za spojnice, bogate prolinom EaDHAsyn2, EaDHAsyn3 i EaDHAsyn4 identične su sa onima za EaDHAsynl.
Nukleotidne sekvence domena 1 delta-4 desaturaze svakog od EaDHAsynl, EaDHAsyn2 i EaDHAsyn4 navedene su u SEQ ID NO:236, SEQ ID NO:237, odnosno SEQ ID NO:238. Aminokiselinske sekvence za domene delta-4 desaturaze EaDHAsynl, EaDHAsyn2 i EaDHAsyn4 navedene su u SEQ ID NO:239, SEQ ID NO:240, odnosno SEQ ID NO:241. Nukleotidna i aminokiselinska sekvenca domena 1 delta-4 desaturaze EaDHAsyn3 identična je onoj zaEaDHAsynl.
Nukleotidne sekvence domena 2 delta-4 desaturaze EaDHAsynl, EaDHAsyn2, EaDHAsyn3 i EaDHAsyn4, uključujući spojnicu, bogatu prolinom i deo 3' kraja domena C20 elongaze, navedene su u SEQ ID NO:242, SEQ ID NO:243, SEQ ID NO:244, odnosno SEQ ID NO:245. Aminokiselinske sekvence za domene delta-4 desaturaze EaDHAsvnl, EaDHAsyn2, EaDHAsyn3 i EaDHAsyn4 navedene su u SEQ ID NO:246, SEQ ID NO:247, SEQ ID NO:248, odnosno SEQ ID NO:249.
SLIKA 29 sažeto prikazuje sekvence domena DHA sintazeEuglene
anabaene.
PRIMER 14
Konstruisanje ekspresionih vektoraYarrowie lipolvticepY165, pY166, pY167 i pY168
Koristeći mešavinu Gateway<®>LR Clonase™ II enzvme mix (Kat. Br. 11791-020, Invitrogen Corporation) i sledeći protokol proizvođača, cDNK umeci iz pLF117-l (SEQ ID NO:87), pLF117-2 (SEQ ID NO:88), pLF117-3 (SEQ ID NO:89) i pLF117-4 (SEQ ID NO:90) su preneseni u pY159 (SEQ ID NO:38; Primer 8), da bi se obrazovao pY165 (SEQ ID NO:99, SLIKA 14A), pY166 (SEQ ID NO: 100; SLIKA 14B), pY167 (SEQ ID NO:101; SLIKA 14C), odnosno pY168 (SEQ ID NO:102; SLIKA 14D). Stoga, svaki plazmid sadrži EaDHAsyn gen pune dužine, pod kontrolom FBAINm promoteraYarrowie lipolytice(PCT Publication No. WO 2005/049805; U.S. Patent 7,202,356; obeležen kao "Yar Fbal Pro+Intron" na SLICI) i Pex20 terminatorne sekvence izPex20genaYarrowie(GenBank Accession No. AF054613).
PRIMER 15
Konstrukcija soiinog ekspresionog vektora pKR1061 za ko- ekspresiju DHA sintaze 1
Euglene gracilis( EgDHAsvnl) sa delta- 17 desaturazomSaprolegnie dicline( SdD17)
Ovaj Primer opisuje konstruisanje sojinog vektora za ko-ekspresiju EgDHAsynl (SEQ ID NO:12) sa SdD17 i selektivnim markerom higromicin fosfotransferazom (hpt).
EgDHAsynl je amplifikovana iz pKR1049 (klon eeglc.pk016.e6.f) sa oligonukleotidnim prajmerima oEGel2-l (SEQ ID NO: 103) i oEUG el4-3 (SEQ ID NO:44), koristeći Phusion™ High-Fidelity DNA Polymerase (Kat. Br. F553S, Finnzymes Oy, Finska), prateći protokol proizvođača. Nastali fragment DNK je kloniran u pCR-Blunt<®>klonirajući vektor, korišćenjem kompleta Zero Blunt<®>PCR Cloning Kit (Invitrogen Corporation), sledeći protokol proizvođača, da bi se proizveo pKR1055 (SEQ ID NO: 104).
Polazni plazmid pKR72 (ATCC Accession No. PTA-6019; SEQ ID NO: 105, 7085 bp sekvenca), derivat pKS123, koji je ranije opisan u PCT Publication No. WO 2002/008269 (čiji sadržaji su ovde uključeni posredstvom reference), sadrži gen higromicin B fosfotransferaze (HPT) (Gritz, L. i Davies, J.,Gene25:179-188 (1983)), koji je zaposednut T7 promoterom i transkripcionim terminatorom (kaseta T7prom/HPT/T7term) i bakterijskim izvorom replikacije (ori) za selekciju i replikaciju u bakterijama (npr.,E. coli).Pored toga, pKR72, takođe, sadrži HPT, zaposednut sa 35S promoterom (Odell et al.,Nature313:810-812 (1985)) i NOS 3' transkripcionim terminatorom (Depicker et al.,J. Mol. Appl. Genet.,1:561-570 (1982)) (kaseta 35S/HPT/NOS3') za selekciju u biljkama, kao što je soja. pKR72, takođe, sadržiNotirestrikcioni položaj, zaposednut promoterom za a' subjedinicu p-konglicinina (Beachv et al.,EMBO J.4:3047-3053 (1985)) i 3' transkripcionim terminacionim regionom gena fazeolina (Doyle et al.,J. Biol. Chem.261:9228-9238 (1986)), omogućujući, na taj način, snažnu, tkivno-specifičnu ekspresiju gena, kloniranih uNot\položaj, u semenju soje.
pcon/Vort/Phas3' kaseta u plazmidu pKR72 (SEQ ID NO.T05, koji ima ATCC Accession No. PTA-6019) je amplifikovana, korišćenjem oligonukleotidnih prajmera oCon-1 (SEQ ID NO:106) i oCon-2 (SEQ ID NO:107), koristeći VentR<®>DNA Polymerase (Catalog No. M0254S, New England Biolabs Inc., Beverly, MA), prateći protokol proizvođača. Nastali fragment DNK je svarens& Xbali kloniranu Xbalpoložaj pUC19, kako bi se proizveo pKR179 (SEQ ID NO: 108).
EgDHAsynl je oslobođena iz pKR1055 (SEQ ID NO: 104) digestijomsa Notii klonirana uNotipoložaj plazmida pKR179 (SEQ ID NO: 108), da bi se proizveo pKR1057 (SEQ ID NO: 109).
Sbfl.fragment pKR1057 (SEQ ID NO: 109), koji sadrži Pcon/EgDHAsynl/Phas3' kasetu, kloniranjeu Sbfl položajpKR328 (SEQ ID NO:110; koji je opisan u PCT Publication No. WO 2004/071467 i čiji sadržaji su ovde uključeni posredstvom reference), koji sadrži SdD17, da bi se proizveo vektor pKR1061 (SEQ ID NO:lll). Šematski prikaz pKR1061 dat je na SLICI 15A.
PRIMER 16
Konstrukcija ekspresionog vektora pKR973 soje za ko- ekspresiju delta- 8 desaturaze
Pavlove lutheri( PavD8) sa delta- 9 elongazomEuglene gracilis( EgD9elo) i delta- 5
desaturazomMortierelle alpine( MaD5)
Delta- 9elongaza Euglene gracilis( EgD9elo) :
Klon iz biblioteke cDNK Euglene (eeglc), nazvan eeglc.pk001.n5f, koji sadrži delta-9 elongazuEuglene gracilis(EgD9elo; SEQ ID NO: 112, koji je opisan u U.S. Application No. 11/601,563 (prijavljena 16. novembra 2006., koja je publikovana 24. maja 2007. kao US-2007-0118929-A1; Attorney DocketNo. BB-1562), čiji sadržaji su ovde uključeni posredstvom reference), korišćen je kao kalup za amplifikaciju EgD9elo sa oligonukleotidnim prajmerima oEugELl-1 (SEQ ID NO: 113) i oEugELl-2 (SEQ ID NO: 114), koristeći VenfR<®>DNA Polymerase (Kat. Br. M0254S, New England Biolabs Inc., Beverly, MA), prateći protokol proizvođača. Nastali fragment DNK je kloniran u pCR-Blunt<®>klonirajući vektor, korišćenjem kompleta Zero Blunt<®>PCR Cloning Kit (Invitrogen Corporation), sledeći protokol proizvođača, da bi se proizveo pKR906 (SEQ ID NO:l 15).
Plazmid pKR906 je svaren saNoti,a fragment, koji sadrži delta-9 elongazuEuglene gracilis,kloniranje u plazmid pKR132 (SEQ ID NO: 116; koji je opisan u PCT Publication No. WO 2004/071467), da bi se proizveo vektor pKR953 (SEQ ID NO: 117).
Delta- 5 desaturazaMortierelle alpine ( MaD5):
Vektor pKR287 (SEQ ID NO:l 18; koji je opisan u PCT Publication No. WO 2004/071467, publikovanoj 26. avgusta 2004.; čiji sadržaji su ovde uključeni posredstvom reference), koji sadrži delta-5 desaturazuMortierelle alpine(MaD5; SEQ ID NO:119, koja je opisana u U.S. Patentu No. 6,075,183 i PCT Publication Nos. WO 2004/071467 i WO 2005/047479, čiji sadržaji su ovde uključeni posredstvom reference) zaposednut je Gyl promoterom glicinina soje i leguminA2 3' terminacionim regionom graška (kaseta Gyl/MaD5/legA2). Vektor pKR287 je svaren saSbJl/ BsiWl,a fragment, koji sadrži kasetu Gyl/MaD5/legA2, kloniran je uSbjl/ BsiWlfragment pKR277 (SEQ ID NO:120; koji je opisan u PCT Publication No. WO 2004/071467, čiji sadržaji su ovde uključeni posredstvom reference), da bi se proizveo vektor pK952 (SEQ ID NO: 121).
Vektor pKR457 (SEQ ID NO: 122), koji je ranije opisan u PCT Publication No. WO 2005/047479 (čiji sadržaji su ovde uključeni posredstvom reference), sadržiNotipoložaj, zaposednut promoterom Kunitz tripsin inhibitora soje (KTi) (Jofuku et al.,Plant Cell1:1079-1093 (1989)) i KTi 3' terminacionim regionom, čija izolacija je opisana u U.S. Patentu No. 6,372,965, koji je praćen transkripcionim terminatorom albumina soje, koji je prethodno opisan u PCT Publication No. WO 2004/071467 (kaseta Kti/A/bđ/Kti3'Salb3'). Preko brojnih koraka sub-kloniranja, sekvence, koje sadržeAspl\%restrikcione položaje, dodate su na 5' i 3' krajeve kasete Kti/A/orI/Kti3'Salb3', da bi se proizvela SEQ ID NO: 123.
Delta- 8 desaturazaPavlove lutheri ( PavD8):
Pavlova lutheri(CCMP459) je dobijena iz Culture of Marine Phvtoplankton (CCMP, West Boothbay Harbor, ME) i uzgojena u balonima od 250 mL, koji sadrže 50 mL F/2-Si medijuma (izrađenog koristeći F/2 Family Medium Kit-KIT20F2 i Filtered Seqwater-SEA2 iz CCMP), na 26°C, uz mućkanje na 150 rpm. Kulture su prenošene na novi medijum na nedeljnoj bazi, koristeći razblaženje 1:4 (stara kultura:novi medijum).
Kulture iz 28 balona (1400 mL) su sjedinjene, a ćelije su sabijene u kuglice centrifugiranjem na 1,800 x g, tokom 10 minuta, isprane su jednom vodom i re-centrifugirane. Ukupna RNK je ekstrahovana iz nastale kuglice, korišćenjem RNA STAT-60™ reagensa (TEL-TEST, Inc., Friendswood, TX), sledeći protokol proizvođača. Na ovaj način, iz kuglice je dobij eno 2.6 mg ukupne RNK (2.6 mg/mL). mRNK je izolovana iz 1.25 mg ukupne RNK, koristeći puriflkacioni komplet mRNK (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ), sledeći protokol proizvođača. Na ovaj način, dobijeno je 112 u.g mRNK.
cDNK je sintetisana iz 224 ng mRNK, koristeći SuperScript™ First-Strand Synthesis System za RT-PCR Kit (Invitrogen™ Life Technologies, Carlsbad, CA), sa obezbeđenim oligo(dT) prajmerom, u skladu sa protokolom proizvođača. Nakon RNase H tretmana kao po protokolu, delta-8 desaturazaPavlove lutheri(PavD8; SEQ ID NO:124, koja je opisana u U.S. Patent Application No. 11/737772 (prijavljena 20. aprila 2007.; Attorney Docket No. BB-1566) čiji sadržaji su ovde uključeni posredstvom reference) je amplifikovana iz nastale cDNK sa oligonukleotidnim prajmerima PvDES5'Not-l (SEQ ID NO.T25) i PvDES3'Not-l (SEQ ID NO: 126), koristeći, dole opisane, uslove.
cDNK (2 uL) iz, gore opisane, reakcije sjedinjena je sa 50 pmol PvDES5'Not-l (SEQ ID NO:125), 50 pmol PvDES3'Not-l (SEQ ID NO: 126), 1 uL PCR nukleotidne mešavine (10 mM, Promega, Madison, WI), 5 uL 10X PCR pufera (Invitrogen Corporation), 1.5 uL MgCl2(50 mM, Invitrogen Corporation), 0.5 uL Taq polymerase (Invitrogen Corporation) i vodom do 50 uL. Reakcioni uslovi su bili: 94°C,
tokom 3 minuta, a nakon toga 35 ciklusa od 94°C, tokom 45 sekundi, 55°C tokom 45 sekundi i 72°C tokom 1 minuta. PCR je završen na 72°C, tokom 7 minuta, a zatim je držan na 4°C. PCR reakcija je analizirana elektroforezom na agaroza gelu na 5 uL i utvrđena je DNK traka sa molekulskom težinom oko 1.3 kb. Preostali proizvod je odvojen elektroforezom na agaroza gelu, a DNK je prečišćena koristeći Zvmoclean™ Gel DNA Recoverv Kit (Zymo Research, Orange, CA), sledeći protokol proizvođača.
PavD8, zaposednutNotipoložajima, kloniranje uNotipoložaj modifikovane Kti/7Vođ/Kti3'Salb3' kasete (SEQ ID NO: 123), a zatim je fragment DNK svaren saAsp7l$i kloniran uSbflpoložaj pKR952 (SEQ ID NO:121), da bi se proizveo pKR970 (SEQ ID NO: 127).
Plazmid pKR953 (SEQ ID NO: 117) je svarensaPstl,a fragment, koji sadrži delta-9 elongazuEuglene gracilis,kloniranje uSbflpoložaj pKR970 (SEQ ID NO: 127), da bi se proizveo vektor pKR973 (SEQ ID NO: 128; SLIKA 15B).
Na ovaj način, delta-8 desaturazaPavlove lutherimogla je biti ko-ekspresovana sa delta-5 desaturazomMortierelle alpinei delta-9 elongazomEuglene gracilis,iza snažnih promotera, specifičnih u odnosu na seme.
PRIMER 17
Konstrukcija sojinog ekspresionog vektora pKR1064 za ko- ekspresiju DHA sintaze 1
Euglene gracilis( EgDHAsvnl) sa delta- 17 desaturazomSaprolegnie dicline ( SđDl7 )
Ovaj Primer opisuje konstruisanje sojinog vektora za ko-ekspresiju EgDHAsvnl sa SdD17 i selektivnim markerom acetolaktat sintazom (ALS).
Pstlfragment, koji sadrži Ann/Sddl7/BD30 kasetu iz pKR271 (SEQ ID NO.-129, koji je opisan u PCT Publication No. WO 2004/071467 i čiji sadržaji su ovde uključeni posredstvom reference), kloniranje uSbflpoložaj pKR226 (SEQ ID NO: 130, koji je, takođe, opisan u PCT Publication No. WO 2004/071467), da bi se proizveo vektor pKR886r (SEQ ID NO: 131). Na ovaj način, delta-17 desaturazaSaprolegnie dicline(SdD17) je klonirana iza aneksin promotera, koji je snažan i specifičan za seme.
Sbflfragment pKR1057 (SEQ ID NO: 109), koji sadrži pcon/EgDHAsynl/Phas3' kasetu, kloniranje uSbflpoložaj pKR886r (SEQ ID NO: 131), koji sadrži SdD17, da bi se proizveo vektor pKR1064 (SEQ ID NO: 132). Šematski prikaz pKR1064 dat je na SLICI 15C.
PRIMER 18
Konstrukcija ekspresionog vektora pKR1133 soje za ko- ekspresiju DHA sintaze 1
Euglene gracilis( EgDHAsvnl) sa delta- 9 elongazomEuglene gracilis( EgD9elo) i delta-5 desaturazomMortierelle alpine( MaD5)
Glicinin Gyl promoter je PCR-om amplifikovan iz pZBL119 (SEQ ID NO:133, koji je opisan u PCT Publication No. WO 2004/071467, i čiji sadržaji su ovde uključeni posredstvom reference), koristeći prajmere oSGly-2 (SEQ ID NO: 134) i oSGly-3 (SEQ ID NO: 135). Nastali PCR fragment bio je subkloniran u intermedijerni klonirajući vektor pCR-Script AMP SK(+) (Stratagene), u skladu sa protokolom proizvođača, da bi se proizveo plazmid pPSgly32 (SEQ ID NO: 136).
PstVNotlfragment plazmida pSGly32 (SEQ ID NO: 136), koji sadrži Gyl promoter, kloniranjeu Pstl/ Notlfragment iz plazmida pKR 142 (SEQ ID NO:137, koji je opisan u PCT Publication No. WO 2004/071467 i čiji sadržaji su ovde uključeni posredstvom reference), koji sadrži: leguminA2 3' terminacioni region transkripcije, ampicilin rezistentni gen i bakterijski ori, pa bi se proizveo pKR264 (SEQ ID NO: 138). Stoga, vektor pKR264 sadržiNotipoložaj, zaposednut promoterom za glicinin Gyl gen i leguminA2 3' transkripcionim terminacionim regionom (Gyl/JVcft//legA2 kaseta).
EgDHAsynl je oslobođena iz pKR1055 (SEQ ID NO:104; Primer 15) digestijom saNotii klonirana je uNotipoložaj plazmida pKR264 (SEQ ID NO: 138), da bi se proizveo pKRl 128 (SEQ ID NO:139).
Notifragment pKS129 (SEQ ID NO:140, koji je opisan u PCT Publication No. WO 2004/071467, i čiji sadržaji su ovde uključeni preko reference), koji sadrži MaD5, kloniran je uNotipoložaj pKR457 (SEQ ID NO: 122; Primer 16), da bi se proizveo pKR606 (SEQ ID NO:141).
Vektor pKR606 (SEQ ID NO: 141) je svaren saBsiWl,i nakon punjenja, da bi se krajevi zatupili, fragment, koji sadrži kasetu Gyl/MaD5/legA2 kloniran je u napunjeniNgoMIpoložaj pKR277 (SEQ ID NO: 120), da bi se proizveo pKR804 (SEQ ID NO: 142).
BsiWlfragment iz pKR1128 (SEQ ID NO: 139), koji sadrži kasetu Gyl/EgDHAsynl/legA2, kloniranje uBsiWpoložaj pKR804 (SEQ ID NO: 142), da bi se proizveo pKRl 130 (SEQ ID NO: 143).
Plazmid pKR953 (SEQ ID N0:117) je svaren saBsiWl;krajevi su zatupljeni punjenjem, a pKR953 je, zatim, svaren saBamHl.NapunjeniBsiWl/ BamHlfragment pKR953, koji sadrži kasetu Salb/EgD9elo/Phas3', kloniranje uPmeVBamHlpoložaje pNEB193 (New England Biolabs, Ipswich, MA), da bi se proizveo pKRl 131 (SEQ ID NO: 144).
Plazmid pKRl 131 (SEQ ID NO: 144) je svaren saPstl,a fragment, koji sadrži delta-9 elongazuEuglene gracilis,kloniran je uSbflpoložaj pKR1130 (SEQ ID NO-.143), da bi se proizveo vektor pKRl 133 (SEQ ID NO:145; SLIKA 15D).
Na ovaj način, DHA sintaza 1Euglene gracilisje mogla biti ko-ekspresovana sa delta-5 desaturazomMortierelle alpinei delta-9 elongazomEuglene gracilis,iza snažnih promotera, specifičnih za seme.
PRIMER 19
Konstrukcija ekspresionog vektora pKRl 105 soje za ko- ekspresiju domena C20 elongaze
DHA sintaze 1Euglene gracilis( EgDHAsvnl C20EloDoml) sa delta- 4 desaturazom
Schizochvtrium aggregatum( SaD4)
p,con/7Vof//Phas kaseta je PCR-om amplifikovana iz pKS123 (SEQ ID NO: 146; koji je opisan u PCT Publication No. WO 2004/071467, i čiji sadržaji su ovde uključeni posredstvom reference), koristeći prajmere oKti5 (SEQ ID NO: 147) i oKti6 (SEQ ID NO: 148). Nastali PCR fragment je svaren saBsiWli kloniran uBsimpoložaj pKR124 (SEQ ID NO.T49; koji je opisan u PCT Publication No. WO 2004/071467 i čiji sadržaji su ovde uključeni posredstvom reference), koji sadrži bakterijski izvor replikacije i selekcije, da bi se proizveo plazmid pKR193 (SEQ ID NO: 150).
EgDHAsvnlC20Elodoml je oslobođen iz pHD16 (SEQ ID NO:51; Primer 10) digestijom saNotii kloniranje uNotipoložaj plazmida pKR193 (SEQ ID NO: 150), da bi se proizveo pKRl 103 (SEQ IDNO:151).
BsiWlfragment, koji sadrži EgDHAsvnlC20Elodoml, oslobođen je iz pKR1103 (SEQ ID NO:151) i kloniranje uBsiWlpoložaj pKR226 (SEQ ID NO.130; Primer 17), da bi se proizveo vektor pKRl 104 (SEQ ID NO: 152).
Vektor pKR300 (SEQ ID NO: 153; koji je opisan u PCT Publication No. WO 2004/071467, publikovanoj 26. avgusta 2004., čiji sadržaji su ovde uključeni posredstvom reference) sadrži delta-4 desaturazuSchizochytrium aggregatum(SaD4), koja je opisana u U.S. Patentu 7,045,683 i PCT Publication No. WO 02/090493, čiji sadržaji su ovde uključeni posredstvom reference), zaposednutuNotirestrikcionim položajima.Asclpoložaj, prisutan unutar SaD4, odstranjenje bez uticaja na odgovarajuću aminokiselinsku sekvencu, kako bi se proizvela nova sekvenca (SEQ ID NO: 154), koja ostaje zaposednutaNotipoložajima.Notifragment (SEQ ID NO: 154) je kloniran uNotipoložaj plazmida pKR457 (SEQ ID NO: 122, Primer 16), kako bi se proizveo pKRl 102 (SEQ ID NO: 155).
Plazmid pKRl 102 (SEQ ID NO: 155) je svarensa Pstl,a fragment, koji sadrži SaD4, kloniranje uSbfl.položaj pKRl 104 (SEQ ID NO:152), da bi se proizveo pKRl 105 (SEQ ID NO: 156; SLIKA 16A). Na ovaj način, domen C20 elongaze DHA sintaze 1Euglene gracilisje mogao biti ko-ekspresovan sa delta-4 desaturazomSchizochytrium aggregatum,iza snažnih promotera, specifičnih za seme.
PRIMER 20
Konstrukcija ekspresionog vektora pKR1134 soje za ekspresiju fuzije domena C20
elongaze DHA sintaze 1Euglene gracilis / delta- 4desaturazeSchizochvtrium aggregatum
( EgDHAsvnl C20EloDom3- SaD4)
EgDHAsvnlC20EloDom3 je amplifikovan iz pKRl 091 sa oligonukleotidnim prajmerima EgEPAEloDom-5 (SEQ ID NO:43) i oEUGsyn6-4 (SEQ ID NO: 157), koristeći Phusion™ High-Fidelity DNA Polymerase (Kat. Br. F553S, Finnzymes Oy, Finska), prateći protokol proizvođača. Nastali fragment DNK je kloniran u pCR-Blunt<®>klonirajući vektor, korišćenjem kompleta Zero Blunt<®>PCR Cloning Kit (Invitrogen Corporation), sledeći protokol proizvođača, da bi se proizveo pKR1107 (SEQ ID NO:158).
Plazmid pKR1107 (SEQ ID NO: 158) je svaren saNoti,a fragment, koji sadrži EgDHAsynlC20EloDom3, ponovno je povezan, kako bi se obrazovao pKR1112 (SEQ ID NO: 159).
XbaVPstlfragment DNK iz pKRl 112 (SEQ ID NO.T59), koji sadrži EgDHAsynlC20EloDom3, kloniranje\ xXbaVPstlfragment DNK iz pKRl068 (SEQ ID NO:75; Primer 11), koji sadrži SaD4, kako bi se proizveo pKR1115 (SEQ ID NO:160). Na ovaj način, ponovno je kreiran EgDHAsynlC20Elodom3-SaD4, koji je bez unutrašnjegSbflpoložaja, ali koji kodira identičnu aminokiselinsku sekvencu kao što je ona koja je opisana u Primeru 11.
EgDHAsvnl C20Elodom3-SaD4 je oslobođena iz pKRl 115 (SEQ ID NO: 160) digestijom saNotii klonirana je uNotipoložaj plazmida pKR1104 (SEQ ID NO: 152), koji sadrži ALS selektivni marker, da bi se proizveo pKR1134 (SEQ ID NO: 161; SLIKA 16B).
PRIMER 21
Konstrukcija sojinog ekspresionog vektora pKR1095 za ko- ekspresiju delta- 8 desaturaze
Tetruetreptie pomguetensisCCMP 1491 ( TpomD8) sa delta- 17 desaturazomSaprolegnie
dicline( SdD17)
Ovaj Primer opisuje kostruisanje vektora soje za ko-ekspresuju TpomD8 sa SdD17 i selektivnim markerom higromicin fosfotransferazom (hpt).
ĆelijeTetruetreptie pomquetensisCCMP1491 (iz 1 litra kulture) nabavljene su iz Provasoli-Guillard National Center for Culture of Marine Phvtoplakton (CCMP)
(Bigelow Laboratorv for Ocean Sciences, West Boothbav Harbor, Maine). Ukupna RNK je izolovana korišćenjem trizol reagensa (Invitrogen, Carlsbad, CA), u skladu sa protokolom proizvođača. Sabijena ćelijska kuglica je resuspendovana u 0.75 mL trizol reagensa, izmešana je sa 0.5 mL staklenih zrna od 0.5 mm, i homogenizovana je u Biospec mini beadbeater-u (Bartlesville, OK) na najvećem pojačanju tokom 3 minuta. Mešavina je centrifugirana u Eppendorf centrifugi, tokom 30 sekundi, na 14,000 rpm, da bi se odstranile krhotine i staklena zrna. Supernatant je ekstrahovan sa 150 uL mešavine hloroforma i izoami alkohola u odnosu 24:1. Gornja vodena faza je korišćena za izolovanje RNK.
Za izolovanje RNK, vodena faza je izmešana sa 0.375 mL izopropilnog alkohola i ostavljena je da se inkubira na sobnoj temperaturi, tokom 5 minuta. Precipitirana RNK je sakupljena centrifugiranjem na 8,000 rpm i držana je na 4°, tokom 5 minuta. Sabijena kuglica je isprana jednom sa 0.7 mL 80% etanola i sušena je na vazduhu. Tako je dobij eno 95 ug ukupne RNK izTetruetreptie pomquetensisCCMP 1491.
Ukupna RNK (0.95 ug ukupne RNK u 1 uL) je korišćena kao kalup za sintetisanje dvostruke cDNK. Korišćen je komplet Creator™ SMART™ cDNA Librarv
Construction Kit od BD Bioscience Clontech (Palo Alto, CA). Ukupna RNK (1 uL) je pomešana sa 1 uL SMART IV oligonukleotida (SEQ ID NO: 181) 1 pL adapter prajmera iz Invitrogenovog 3'-RACE kita (SEQ ID NO: 182) i 2 uL vode. Smeša je zagrevana do 75°C, tokom 5 minuta, a zatim je hlađena na ledu, tokom 5 minuta. Mešavini je dodato: 2 uL 5X pufera prvog struka, 1 uL 20 mM DTT, 1 uL dNTP mešavine (10 mM svakog od: dATP, dCTP, dGTP i dTTP) i 1 pL PowerScript reverzne transkriptaze. Uzorak je inkubiran na 42°C, tokom 1 h. Nastale cDNK prvog struka, zatim su korišćene kao kalupi za amplifikaciju.
Delta-8 desaturazaTetruetreptie pomquetensisCCMP1491 (TpomD8; SEQ ID NO:162, koji je opisan u U.S. Patent Application No. 11/876,115 (prijavljena 22. oktobra 2007.; Attornev Docket No. BB-1574) čiji sadržaji su ovde uključeni posredstvom reference) amplifikovana je iz cDNK, sa oligonukleotidnim prajmerima TpomNot-5 (SEQ ID NO:163) u TpomNot-3 (SEQ ID NO: 164), koristećiTaqpolimerazu (Invitrogen Corporation), sledeći protokol proizvođača.
cDNKTetruetreptie pomquetensisCCMP1491 (1 pL) je sjedinjena sa 50 pmol TpomNot-5 (SEQ ID NO: 163), 50 pmol TpomNot-3 (SEQ ID NO: 164), 1 uL PCR nukleotidne mešavine (10 mM, Promega, Madison, WI), 5 uL 10X PCR pufera (Invitrogen Corporation), 1.5 pL MgCh (50 mM, Invitrogen Corporation), 0.5 uL Taq polimeraze (Invitrogen Corporation) i vodom do 50 pL. Reakcioni uslovi su bili: 94°C, tokom 3 minuta, a nakon toga 35 ciklusa od 94°C, tokom 45 sekundi, 55°C tokom 45 sekundi i 72°C tokom 1 minuta. PCR je završen na 72°C, tokom 7 minuta, a zatim je držan na 4°C. 5 pL PCRreakcione smeše analizirano je elektroforezom na agaroza gelu, i utvrđena je DNK traka sa molekulskom težinom oko 1.3 kb.
Preostali proizvod je odvojen elektroforezom na agaroza gelu, a DNK je prečišćena koristeći Zvmoclean™ Gel DNA Recoverv Kit (Zymo Research, Orange, CA), sledeći protokol proizvođača. Nastala DNK je klonirana u pGEM<®->T Easy Vector (Promega), sledeći protokol proizvođača, da bi se proizveo pLF 114-10 (SEQ ID NO: 165).
TpomD8 je oslobođena iz pLFl 14-10 (SEQ ID NO: 165), digestijom saNotii klonirana je uNotipoložaj plazmida pKR179 (SEQ ID NO: 108; Primer 15), da bi se proizveo pKR1002 (SEQ ID NO: 166).
Pstlfragment iz pKRl 002 (SEQ ID NO: 166), koji sadrži kasetu Pcon/TpomD8/Phas3', kloniranje uSbflpoložaj pKR328 (SEQ ID NO:110; Primer 15), koji sadrži SdD17, da bi se proizveo vektor pKR1095 (SEQ ID NO: 167). Šematski prikaz pKR1095 je dat na SLICI 16C.
PRIMER 22
Konstrukcija ekspresionog vektora pKR1132 soje za ko- ekspresiju delta- 8 desaturaze
Tetruetreptie pomguetensisCCMP1491 ( TpomD8) sa delta- 9 elongazomEuglene
gracilis ( EgD9elo) idelta- 5 desaturazomMortierelle alpine( MaD5)
TPomD8 je oslobođena iz pLFl 14-10 (SEQ ID N0.165; Primer 21), digestijom saNotii klonirana je uNotipoložaj plazmida pKR264 (SEQ ID NO.T38; Primer 18), da bi se proizveo pKRl 127 (SEQ ID NO: 168).
BsiWlfragment iz pKR1127 (SEQ ID NO: 168), koji sadrži kasetu Gyl/TPomD8/legA2, kloniranje uBsiWlpoložaj pKR804 (SEQ ID NO:142; Primer 18), da bi se proizveo pKRl 129 (SEQ ID NO: 169).
Plazmid pKRl 131 (SEQ ID NO: 144; Primer 18) je svaren saPstl,a fragment, koji sadrži delta-9 elongazuEuglene gracilis,kloniran je uSbjlpoložaj pKR1129 (SEQ ID NO:169), da bi se proizveo pKR1132 (SEQ ID NO:170; SLIKA 16D). Na ovaj način, delta-8 desaturazaTetruetreptie pomquetensisje mogla biti ko-ekspresovana sa delta-5 desaturazomMortierelle alpinei delta-9 elongazomEuglene gracilis,iza snažnih promotera, specifičnih za seme.
PRIMER 23
Konstrukcija sojinog ekspresionog vektora KS373 za ekspresiju fuzije delta- 9 elongaza
Euglene gmc/ fo/ spojnicaDHA sintaze 1Euglene gracilis /delta- 8 desaturazaPavlove
/ «^ erf ( EgD9elo- EgDHAsvnlLink- PavD8)
Fuzija unutar okvira između delta-9 elongazeEuglene gracilis(EgD9elo; Primer 16; SEQ ID NO:l 12), spojnice, bogate prolinom, DHA sintaze 1Euglene gracilis(EgDHAsynlLink; SEQ ID NO: 171, opisana u Primeru 6 i prikazana na SLICI 6) i delta-8 desaturazePavlove lutheri(PavD8; Primer 16; SEQ ID NO: 124), konstruisana je korišćenjem, dole opisanih, uslova.
Izvršena je inicijalna fuzija unutar okvira između EgD9elo i EgDHAsynlLink (EgD9elo-EgDHAsynlLink),zaposednuta Ncolpoložajem na 5' kraju iNotipoložajem na 3' kraju, PCR amplifikacijom. EgD9elo (SEQ ID NO:112) je amplifikovana oligonukleotidima MVVG507 (SEQ ID NO: 172) i MVVG509 (SEQ ID NO: 173), koristeći Phusion™ High-Fidelity DNA Polymerase (Kat. Br. F553S, Finnzvmes Oy, Finska), sledeći protokol proizvođača. EgDHAsynlLink (SEQ ID NO:171) je amplifikovana na sličan način oligonukleotidima MWG510 (SEQ ID NO:174) i MVVG511 (SEQ ID NO:175). Dva nastala PCR proizvoda su sjedinjena i re-amplifikovana, koristeći MWG507 (SEQ ID NO.T72) i MWG511 (SEQ ID NO: 175), da bi se obrazovao EgD9elo-EgDHAsynlLink. Sekvenca EgD9elo-EgDHAsynlLink prikazana je u SEQ ID NO: 176. EgD9elo-EgDHAsynlLink ne sadrži stop kodon unutar okvira, ushodno odNotipoložaja na 3' kraju i, stoga, DNK fragment, kloniran uNotipoložaj, može proizvesti fuziju unutar okvira sa EgD9elo-EgDHAsynlLink.
Plazmid KS366 (SEQ ID NO: 177) sadrži jedinstveneNcoliNotirestriktivne položaje, zaposednute promoterom a' subjedinice p-konglicinina (Beachy et al.,EMBO J.4:3047-3053 (1985)) i 3' transkripcionim terminacionim regionom fazeolin gena (Doyle et al.,J. Biol. Chem.261:9228-9238 (1986)). Za razliku od zamene jedinstvenogNotipoložaja u pKR72 (SEQ ID NO: 105) jedinstvenim višestrukim klonirajućim položajemNcolINotl,Bcon/NcoINotI/Phas3' kaseta u KS366 je identična onoj, koja je nađena u pKR72 (SEQ ID NO: 105), s izuzetkom što su položaji za zaposedanjeHindlllzamenjeniBamHlpoložajima. Bcon/NcoINotI/Phas3' kaseta KS366 je klonirana uBamHlpoložaj pBluescript II SK(+) vektora (Stratagene).
NcoVNotlfragment DNK, koji sadrži EgD9elo-EgDHAsynlLink (SEQ ID NO: 176) je kloniran uNcoVNotlfragment DNK iz KS366 (SEQ ID NO: 177), koji sadrži promoter a' subjedinice P-konglicinina, da bi se proizveo KS366-EgD9elo-EgDHAsynlLink (SEQ ID NO: 178).
Notifragment, koji sadrži PavD8 (proizveden kao što je opisano u Primeru 16) kloniranje uNotifragment KS366-EgD9elo-EgDHAsynlLink (SEQ ID NO:178), da bi se proizveo KS373 (SEQ IDNO:179; SLIKA 17).
PRIMER 24
Konstrukcija alternativnih ekspresionih vektora soje za ekspresiju DHA sintaza, domena
C20 elon<g>aze. domena delta- 4 desaturaze. sintetskih fuzionih proteina C20
elongaza/ delta- 4 desaturaza i drugih sintetskih elongaza/ desaturaza fuzionih proteina
Pored, ovde opisanih, gena, promotera, terminatora i genskih kaseta, stručno lice u ovoj oblasti, može proceniti da se i druge kombinacije promotera/gena/ terminator kaseta mogu sintetisati na način, koji je sličan onom, koji je ovde opisan za ekspresiju EgDHAsvnl. Na sličan način, može biti poželjno da se ekspresuju drugi geni PUFA (kao što su oni, koji su opisani u Tabeli 23), za ko-ekspresiju sa bilo kojom od DHA sintaza ovog pronalaska ili domenima DHA sintaze (t.j., domen C20 elongaze ili domen delta-4 desaturaze, ekspresovani pojedinačno). Dodatno, mogle su biti izrađene i ekspresovane sintetske fuzije između domena elongaze i domena desaturaze, odvojenih pogodnim regionom spojnice. Na primer, mogla je biti izrađena i ekspresovana sintetska fuzija između C20 elongaze (ili domena C20 elongaze iz DHA sintaze) i pogodne delta-4 desaturaze (ili domena delta-4 desaturaze iz DHA sintaze). Alternativno, mogle su biti korišćene druge elongaze ili desaturaze, kao što je, ali bez ograničenja, ovde opisana, sintetska fuzija između delta-9 elongaze i delta-8 desaturaze, uz razdvajanje spojnicom iz DHA sintaze (t.j., Primer 23).
Na primer, PCT Publication Nos. WO 2004/071467 i WO 2004/071178 opisuju izolaciju brojnih sekvenci promotera i transkripcionih terminatora, za korišćenje u embrio-specifičnoj ekspresiji u soji. Nadalje, PCT Publication Nos. WO 2004/071467, WO 2005/047479 i WO 2006/012325 opisuju sintezu višestrukih kombinacija promoter/gen/terminator kaseta, povezivanjem pojedinačnih promotera, gena i transkripcionih terminatora zajedno u jedinstvene kombinacije. Uopšteno,Notipoložaj, zaposednut od strane pogodnog promotera (kao što su oni, koji su navedeni, ali bez ograničavanja istima, u Tabeli 21) i transkripcionog terminatora (kao što su oni, koji su navedeni, ali bez ograničavanja na njih, u Tabeli 22) korišćen je za kloniranje željenog gena.Notipoložaji mogu biti dodati genu od značaja, kao što su oni koji su navedeni, ali njima nisu ograničeni, u Tabeli 23, koristeći PCR amplifikaciju sa oligonukleotidima, koji su dizajnirani tako da uvodeNotipoložaje na 5' i 3' krajeve gena. Nastali PCR proizvod je, zatim, svarensa Notii kloniran u pogodnu promoter/Mtfl/terminator kasetu.
Pored toga, PCT Publication Nos. WO 2004/071467, WO 2005/047479 i WO 2006/012325 opisuju dalje zajedničko povezivanje pojedinačnih genskih kaseta u jedinstvene kombinacije, zajedno sa pogodnim kasetama selektivnih markera, kako bi se postigla željena fenotipska ekspresija. Premda je ovo urađeno uglavnom korišćenjem različitih restriktivnih enzimskih položaja, stručno lice u ovoj oblasti, može proceniti da se mogu koristiti brojni postupci, kako bi se postigla željena kombinacija promoter/gen/ transkripcioni terminator. Radeći na takav način, može se postići bilo koja kombinacija kaseta embrio-specifični promoter/gen/transkripcioni terminator. Stručno lice u ovoj oblasti, može, takođe, proceniti da ove kasete mogu biti locirane na pojedinačnim DNK fragmentima ili na višestrukim fragmentima, gde je ko-ekspresija gena posledica ko-transformacije višestrukih fragmenata DNK.
PRIMER 25
Proizvodnja i sistem model transformisanja kultura somatskih embriona soje sa
ekspresionim vektorima soje
Uslovi kulture:
Kulture suspenzije embriogene soje (cv. Jack) držane su u 35 mL tečnog medijuma SB196( infra),na rotacionoj mućkalici, 150 rpm, 26°C, sa hladnim, belim fluorescentnim svetlima sa fotoperiodom 16:8 sati dan/noć, pri intenzitetu svetlosti od 60-85 pE/m2/s. Kulture su supkultivisane svakih 7 dana do 2 nedelje, inokulacijom približno 35 mg tkiva u 35 mL svežeg tečnog SB196 (poželjni interval supkultivisanja je svakih 7 dana).
Suspenzione embriogene kulture soje transformisane su sa ekspresionim plazmidima soje, postupkom bombardovanja čestica hicem (Klein et al.,Nature327:70
(1987)), koristeći DuPont Biolistic PDS1000/HE instrument (helium retrofit), za sve transformacije.
Inicijacija suspenzione embriogene kulture soje:
Kulture soje se iniciraju dva puta svakog meseca, sa periodom od 5-7 dana između svake inicijacije. Zahvaćene su mahune sa nezrelim semenima iz raspoloživih biljaka soje 45-55 dana nakon sadnje. Semenje je uklonjeno iz mahuns i stavljeno u sterilisanu magenta kutiju. Semena soje su sterilisana njihovim mućkanjem tokom 15 minuta u 5%-tnom rastvoru Clorox-a, sa 1 kapi sapuna slonovače (t.j., 95 mL autoklavisanc dcstilovanc vode plus 5 mL Cloroxa i 1 kap sapuna, dobro promešani). Semenje je isprano korišćenjem 2 1-litarske boce sterilne destilovane vode i semena, koja su manja od 4 mm, stavljena su na pojedinačna mikroskopska stakalca. Mali kraj semena je odrezan, a kotiledone su gnječenjem izbačene izvan omotača semena. Kada su kulture bile pripremljene za proizvođenje transformacije, kotiledone su prenesene na ploče, koje sadrže SB1 medijum (25-30 kotiledona po ploči). Ploče su umotane vlaknastom trakom i čuvane su na 26°C, sa hladnim belim fluorescentnim svetlima sa fotoperiodom 16:8 sati dan/noć, pri intenzitetu svetlosti od 60-80 uE/m2/s, tokom osam nedelja, sa izmenom medijuma nakon 4 nedelje. Kada su kulture bile pripremljene za eksperimente sistem modela, kotiledone su prenesene na ploče, koje sadrže SB199 medijum (25-30 kotiledona po ploči), tokom 2 nedelje, a zatim su prenesene u SB1, tokom 2-4 nedelje. Uslovi svetla i temperature su isti kao što su gore opisani. Nakon inkubacije na SB1 medijumu, sekundarni embrioni su izrezani i stavljeni u tečne medijume SB196, tokom 7 dana.
Izrada DNK za bombardovanje:
Intaktni plazmid ili fragment DNK plazmida, koji sadrže gene od značaja, kao i selektivni marker gen, korišćeni su za bombardovanje. Fragmenti iz ekspresionih plazmida soje, čije konstruisanje je ovde opisano, dobijeni su gel izolacijom svarenih plazmida. U svakom slučaju, korišćeno je 100 pg plazmid DNK u 0.5 mL specifične enzimske mešavine, opisane u nastavku. Plazmidi su svareni saAscl(100 jedinica) u NEBuffer-u 4 (20 mM Tris-acetat, 10 mM magnezijum acetat, 50 mM kalijum acetat, 1 mM ditiotreitol, pH 7.9), 100 pg/mL BSA i 5 mM beta-merkaptoetanolu, na 37°C, tokom 1.5 sati. Nastali fragmenti DNK razdvojeni su gel elektroforezom na 1% SeaPlaque GTG agarozi (BioWhitaker Molecular Applications), a fragmenti DNK, koji sadrže genske kasete, izrezani su iz agaroza gela. DNK je prečišćena iz agaroze, korišćenjem digestivnog enzima GELase, sledeći protokol proizvođača.
Alikvot od 50 uL sterilne destilovane vode, koji sadrži 3 mg zlatnih čestica (3 mg zlata), dodat je u 30 pL 10 ng/pL DNK rastvora (intaktni plazmid ili fragment DNK, pripremljen kao što je ovde opisano), 25 pL 5M CaCb i 20 pL 0.1 M spermidina. Smeša je mućkana 3 minuta na nivou 3 vorteks mućkalice i okretana je tokom 10 sekundi u stonoj mikrofugi. Supernatant je odstranjen, nakon čega je sledilo ispiranje sa 400 pL 100% etanola i još jedno kratko centrifugiranje. 400 ul etanola je uklonjeno, a sabijena kuglica je resuspendovana u 40 pL 100% etanola. Pet pL DNK suspenzije je razdeljeno u svaki leteći disk Biolistic PDS1000/HE disk instrumenta. Svaki alikvot od 5 pL sadrži približno 0.375 mg zlatnih čestica po bombardovanju (npr., po disku).
Za transformacije sistem modela, protokol je identičan, sa izuzetkom nekoliko manjih izmena (t.j., 1 mg zlatnih čestica je dodat u 5 pL 1 pg/pL DNK rastvora; 50 pL 2.5M CaCb je korišćeno; sabijena kuglica je konačno resuspendovana u 85<p>L 100% etanola, čime je dobijeno 0.058 mg zlatnih čestica po bombardovanju).
Priprema tkiva i bombardovanje sa DNK:
Približno 150-200 mg suspenzione embriogene kulture, koja je stara 7 dana, stavljeno je u praznu, sterilnu petrijevu šolju dimenzije 60 x 15 mm, a šolja je prekrivena plastičnom mrežom. Komora je ispražnjena u vakuum od 27-28 inča žive, a tkivo je bombardovano sa jednim ili dva hica po ploči, sa pritiskom membranske rupture, postavljenim na 1100 PSI. Tkivo je postavljeno približno 3.5 inča od zaslona zadržavanje/stopiranje. Uslovi model sistema transformacije su identični osim što je korišćeno 100-150 mg embriogenog tkiva; pritisak rupture je podešen na 650 PSI, a tkivo je postavljeno približno 2.5 inča od zaslona za zadržavanje.
Selekcija transformisanih embriona:
Transformisani embrioni su odabrani, korišćenjem higromicina (kada je gen higromicin B fosfotransferaze (HPT) upotrebljen kao selektivni marker) ili hlorsulfurona (kada je gen acetolaktat sintaze (ALS) korišćen kao selektivni marker).
Nakon bombardovanja, tkivo je stavljeno u sveže SB196 medijume i kultivisano je kao što je gore opisano. Šest do osam dana nakon bombardovanja, SB196 je zamenjen svežim SB196, koji sadrži 30 mg/L higromicina ili 100 ng/mL hlorsulfurona, u zavisnosti od upotrebljenog selektivnog markera.. Selektivni medijumi su jednom nedeljno osvežavani. Četiri do šest nedelja posle selekcije, zapažen je rast zelenog, transformisanog tkiva iz netransformisanih, nekrotskih embriogenih grozdova.
Sazrevanje embriona:
Za proizvođenje transformacija, izolovano, zeleno tkivo je uklonjeno i inokulisano u ploče sa višestrukim reakcionim čašicama, da bi se proizvele nove, klonski razmnožene, transformisane embriogene suspenzione kulture. Transformisani embriogeni grozdovi su kultivisani na pločama sa višestrukim reakcionim čašicama, tokom četiri-šest nedelja, na 26°C, u SB196, pod hladnim, belim fluorescentnim (Phillips cool white Econowatt F40/CW/RS/EW) i Agro (Phillips F40 Agro) sijalicama (40 vati), sa fotoperiodom od 16:8 sati, sa intenzitetom svetlosti od 90-120 pE/m<2>s. Nakon ovog vremena, grozdovi embriona su preneseni u čvrste agar medijume, SB166, tokom jedne-dve nedelje, a zatim su supkultivisani u medijumu SB103, tokom 3-4 nedelje, da bi embrioni sazrevali. Nakon sazrevanja na pločama u SB103, pojedinačni embrioni su odstranjeni iz grozdova, osušeni i podvrgnuti ispitivanju promena u njihovim smešama masnih kiselina, kao što je opisanosupra.
Za sistem model transformacija, embrioni su sazrevali u tečnom medijumu za histodiferencijaciju i sazrevanje soje (SHaM tečni medijumi; Schmidt et al.,Cell Biology and Morphogenesis24:393 (2005)), koristeći modifikovanu proceduru. Ukratko, nakon 4 nedelje selekcije u SB196, kao što je gore opisano, grozdovi embriona su prebačeni u 35 mL SB228 (SHaM tečni medijumi) u Erlenmajerovoj tikvici od 250 mL. Tkivo je držano u SHaM tečnim medijumima, na rotacionoj mućkalici, na 130 rpm i 26°C sa hladnim, belim fluorescentnim svetlima, sa fotoperiodom od 16:8 sati dan/noć, sa intenzitetom svetlosti od 60-85 pE/m2/s, tokom 2 nedelje kako su embrioni sazrevali. Embrioni su sazrevali tokom 2 nedelje u SHaM tečnim medijumima i ekvivalentni su po veličini i sadržaju masnih kiselina sa embrionima, koji su kultivisani na SB166/SB103, tokom 5-8 nedelja.
Nakon sazrevanja u SHaM tečnim medijumima, pojedinačni embrioni su odstranjeni iz grozdova, osušeni i podvrgnuti ispitivanju promena u njihovim smešama masnih kiselina, kao što je opisanosupra.
Recepti za medijume:
SB 196 - FN Lite tečni proliferacioni medijum ( po litru)
2 MS sulfat 100x matični rastvor 3 FN Lite halidi 100x Matični rastvor 4 FN Lite P, B, Mo 100x Matični rastvor
SB1 čvrsti medijum ( po litru)
1 pakovanje MS soli (Gibco/ BRL - Kat. Br. 11117-066) 1 mL B5 vitamina 1000X matični rastvor 31.5 g glukoze
2 mL 2,4-D (20 mg/L konačna koncentracija)
pH5.7
8 g TC agara
SB 199 čvrsti medijum ( po litru) 1 pakovanje MS soli (Gibco/ BRL - Kat. Br. 11117-066) 1 mL B5 vitamina 1000X matični rastvor
30 g saharoze
4 mL 2,4-D (40 mg/L konačna koncentracija)
pH 7.0
2 gm Gelrita
SB 166 čvrsti medijum ( po litru) 1 pakovanje MS soli (Gibco/ BRL - Kat. Br. 11117-066) 1 mL B5 vitamina 1000X matični rastvor
60 g maltoze
750 mg MgCl2heksahidrata
5 g aktivisanog uglja
pH5.7
2 g gelrita
SB 103 čvrsti medijum ( po litru) 1 pakovanje MS soli (Gibco/ BRL - Kat. Br. 11117-066) 1 mL B5 vitamina 1000X matični rastvor
60 g maltoze
750 mg MgCl2heksahidrata pH5.7
2 g gelrita
SB 71- 4 čvrsti medijum ( po litru) 1 boca Gamborgove B5 solitežisaharoza (Gibco/ BRL - Kat. Br.
21153-036)
pH5.7
5 g TC agara
2, 4- D Matični rastvor
Dobijen u pripremnoj formi od Phvtotecha Kat Br. D 295 - koncentracija 1 mg/mL
B5 vitaminski Matični rastvor ( po 100 mL)
Čuvaj alikvote na -20°C
10 g mio-inozitola
100 mg nikotinske kiseline
100 mg piridoksin HC1
1 g tiamina
Ukoliko se rastvor ne rastvara dovoljno brzo, primeni malu dozu toplote preko vruće ploče sa mešanjem.
SB 228 - Histodiferencijacija & sazrevanje soje ( SHaM) ( po litru)
Zapreminu podesi do 900 mL
pH5.8
Autoklav
Dodaj ohlađenim medijumima (<30°C):
<*>glutamin (konačna koncentracija 30 mM) 4% 110 mL
<*>Napomena: Konačna zapremina biće 1010 mL nakon dodavanja glutamina. Budući da se glutamin razgrađuje relativno brzo, može biti poželjno da se dodaje neposredno pre korišćenja medijuma. Istek roka je 2 nedelje nakon dodavanja glutamina; bazni medijumi mogu biti držani duže bez glutamina. MS Mikro 1000X - matični rastvor # 2 ( po litru) FeEDTA 100X - matični rastvor # 3 ( po litru)
Podesi zapreminu
Rastvor je fotosenzitivan. Boca(e) mora biti umotana u foliju da bi se sprečila svetlost.
Autoklav
Ca 100X - matični rastvor # 4 ( po litru)
B5 vitamin 1000X - matični rastvor # 5 ( po litru) 4% glutamin - matični rastvor # 6 ( po litru)
Postepeno dodavaj, uz mešanje i primeni blagu toplotu.
Ne prelazi 35°C.
Podesi zapreminu
Filterski steriliši
Čuvaj zamrznuto<*>
<*>Napomena: Zagrevaj odmrznuti matični rastvor u kupatilu na 31°C, do potpunog rastvaranja kristala.
PRIMER 26
Selekcija na bazi hlorsulfurona ( ALS) i regeneracija biljke
Selekcija na bazi hlorsulfurona ( ALS) :
Nakon bombardovanja, tkivo je podeljeno između 2 balona sa svežim SB196 medijumima i kultivisano je, kao što je opisano u Primeru 25. Šest do sedam dana nakon bombardovanja, SB196 je zamenjen svežim SB196, koji sadrži selektivni agens od 100 ng/mL hlorsulfurona (matični rastvor hlorsulfurona je 1 mg/mL u 0.01 N amonijum hidroksidu). Selektivni medijumi su osvežavani jednom nedeljno. Četiri do šest nedelje nakon selekcije, može se zapaziti rast zelenog, transformisanog tkiva, koje je poraslo iz netransformisanih, nekrotskih embriogenih grozdova. Izolovano, zeleno tkivo je odstranjeno i inokulisano u ploče sa više reakcionih čašica, koje sadrže SB196, a embrioni su sazrevali, kao što je opisano u Primeru 25.
Regenerisanje somatskih embriona soje u biljke:
Kako bi se dobile cele biljke iz embriogenih suspenzionih kultura, tkivo se mora regenerisati. Embrioni su sazrevali, kao što je opisano u Primeru 25. Nakon subkultivišanja na medijumu SB103, tokom 3 nedelje, pojedinačni embrioni se mogu odstraniti iz grozdova i ispitati na promene u njihovim smešama masnih kiselina, kao što je ovde opisano. Trebalo bi napomenuti da bilo koji detektibilan fenotip, koji proizlazi iz ekspresije gena od značaja, može biti ispitan u ovom stadijumu. Ovo bi moglo uključiti, ali bez ograničenja, izmene u profilu masnih kiselina, profilu i sadržaju proteina, sadržaju ugljenih hidrata, brzini rasta, održivosti ili sposobnosti da se normalno razviju u biljku soje.
Zreli pojedinačni embrioni su isušeni njihovim stavljanjem u prazne, male petrijeve šolje (35 x 10 mm), tokom približno 4 do 7 dana. Ploče su zapečaćene vlaknastom trakom (stvarajući komoru male vlažnosti). Isušeni embrioni su stavljeni u SB71-4 medijum, gde su ostavljeni da bi proklijali pod istim uslovima kultivisanja, kao što su prethodno opisani. Proklijale mladice uklonjene su iz germinativnog medijuma i temeljito su isprane vodom, a zatim su posađene u Redi-Earth, na podlozi sa 24 ćelijska pakovanja, pokrivenoj kupolom od providne plastike. Nakon 2 nedelje kupola je skinuta, a biljke su očvrsnule za presađivanje naredne nedelje. Ako biljke izgledaju čvrsto, presađuju se u 10" lonac sa Redi-Earth, sa do 3 biljčice po loncu. Nakon 10 do 16 nedelja, zrelo semenje je pobrano i otcepljeno i analiziran im je sadržaj masnih kiselina.
PRIMER 27
Funkcionalna analiza DHA sintazaEuglene gracilisiEuglene anabaeneuYarrowii
lipolvtici
Svaki od ekspresionih vektora, opisanih ispod, u Tabeli 24, transformisanje uYarrowii lipolyticisoja Y2224 (uracil ura3 auksotrofni sojYarrowie lipolytice),kao što je opisano prethodno u Opštim postupcima.
Pojedinačne kolonije transformantYarrowie lipolytice,koje sadrže pogodan ekspresioni vektorYarrowie(vidi Tabelu 24), rasle su u 3 mL MM, bez uracila, koji je dopunjen sa 0.2% tergitola, na 30°C, u toku 1 dana. Nakon ovoga, 0.05 mL je preneseno u 3 mL istog medijuma, koji je dopunjen ili bez masne kiseline ili EPA do 0.175 mM. Inkubacija je trajala 16 sati na 30°C, sa 250 rpm, nakon čega su centrifugiranjem dobijene sabijene kuglice. Ćelije su isprane jednom vodom, sabijene su u kuglice centrifugiranjem i osušene na vazduhu. Kuglice su transesterifikovane (Roughan, G. i Nishida, I.,Arch. Biochem. Biophys.276(l):38-46 (1990)) sa 500 pL 1% natrijum metoksida, tokom 30 minuta, na 50°C, nakon čega je dodato 500 pL IM natrijum hlorida i 100 pL heptana. Nakon temeljitog mešanja i centrifugiranja, metil estri masnih kiselina (FAME-i) su analizirani pomoću GC, kao što je opisanosupra(vidi Opšte postupke).
Profil masnih kiselinaYarrowie,uz ekspresovanje pBY-EgC20elol, nije pokazao elongaciju EPA u DPA. Profili masnih kiselina, izračunati % elongacije i izračunati % desaturacije za preostale klonove prikazani su na SLICI 18. Procenat C20 elongacije (% C20 Elong) je izračunat deljenjem zbira težinskog procenta (tež. %) za DPA i DHA sa zbirom tež. % za EPA, DPA i DHA i množenjem sa 100, da bi se izrazio kao %. Na sličan način, procenat delta-4 desaturacije (% D4 Desat) je izračunat deljenjem tež.% DHA sa zbirom tež.% za DPA i DHA i množenjem sa 100, da bi se izrazio kao %. Srednje vrednosti su označene sa Ave., a sledi ih odgovarajući naslov.
U sažetku na SLICI 18, sve DHA sintaze, osim one EaDHAsyn4 funkcionisale su i kao C20 elongaze (koje produžavaju EPA u DPA) i kao delta-4 desaturaze (vrše desaturaciju DPA u DHA) uYarrowii.EaDHAsyn4, koja je sadržavala suštinski različitu aminokiselinsku sekvencu na C-kraju, zbog izmene okvira u nukleotidnoj sekvenci, imala je znatno slabiju funkciju elongacije, a aktivnost desaturaze nije detektovana. Ekspresovanje EgDHAsynl u pY132 dosledno je dovodilo do veće aktivnosti uYarrowii,u poređenju sa drugim EgDHAsynl konstrukcijama, verovatno zbog činjenice da je EgDHAsynl ekspresovana kao fuzija unutar okvira između neke vektorske sekvence, 5' UTR EgDHAsynl i kodirajuće sekvence EgDHAsynl. Kreirana proistekla fuzija može dovesti do povećane aktivnosti, zbog pojačane ekspresije uYarrowiiili zbog svojstvenog smanjenja aktivnosti samog enzima. Kada je ekspresovana samo kodirajuća sekvenca EgDHAsynl<*>(t.j., bez 5'UTR; vidi pY141), aktivnost je veća nego kada je 5'UTR prisutan, ali nije translatovan kao fuzija (t.j., vidi pY161). Ovakvo utvrđeno stanje je verovatno posledica smanjenja ekspresije EgDHAsynl, zbog prisustva 5'UTR.
PRIMER 28
Funkcionalna analiza nezavisnih domena C20 elongaze i delta- 4 desaturaze EgDHAsvnl
i poređenje sa heterolognim fuzijama
Svaki od ekspresionih vektora, opisanih, ispod, u Tabeli 25 (i kontrole - samog vektora), transformisan je uYarrowii lipolyticisoja Y2224, kao što je opisano u Primeru 27. Sa EPA i/ili DPA su hranjene transformisane ćelijeYarrowie.Šematski prikaz relativne strukture domena za svaku konstrukciju u Tabeli 25 dat je na SLICI 21.
Profili masnih kiselina transformisanih ćelija su sledstveno analizirani kao što je opisano u Primeru 27.
Rezultati ishrane sa EPA same vektorske kontrole, pY141, pY143, pY149, pY156, pY157 i pY160, prikazani su na SLICI 19. Profili masnih kiselina pY150, pY151, pY152 i pY153, koji ekspresujuYarrowiu,pokazali su odsustvo elongacije EPA u DPA i nisu prikazani na SLICI 19.
Rezultati ishrane sa DPA same vektorske kontrole, pY141, pY150, pY151, pY152, pY153, pY156, pY157 i pY160, prikazani su na SLICI 20. Profili masnih kiselina pY143 i pY149, koji ekspresujuYarrowiu,pokazali su odsustvo desaturacije DPA u DHA i nisu prikazani na SLICI 20.
Procenat C20 elongacije (% C20 Elong), procenat delta-4 desaturacije (% D4 Desat) i srednje vrednosti izračunati su, kao što je opisano u Primeru 27.
U sažetim prikazima na SLICI 19 i SLICI 20, kada je EgDHAsvnl C20Elo domen ekspresovan sam (sa ili bez spojnice; t.j., pY143 i pY149), srednji procenat C20 elongacije povećava se za oko 40% u poređenju sa nativnom EgDHAsvnl<*>(pY141; SEQ ID NO:49). Suprotno se dešava sa domenom delta-4 desaturaze EgDHAsvnl, kada nema aktivnosti sa EgDHAsvn 1 D4Dom 1 (pY152; SEQ ID NO:67; vidi SLIKU 20) i oko 50% je manja sa EgDHAsvnlD4Dom2 (pY153; SEQ ID NO:72; vidi SLIKU 20), kada se ekspresuju zasebno u poređenju sa EgDHAsvnl * (pY141; SEQ ID NO:49, vidi SLIKU 20), hranjenim sa DPA. IgD4 nema aktivnosti delta-4 desaturaze kada se ekspresuje zasebno (pY150; SEQ ID NO:62; vidi SLIKU 20) ili kao fuzija (pY156; SEQ ID NO:64; vidi SLIKE 19 i 20) i čak izaziva približno 50% smanjenje aktivnosti elongacije, kada je spojen u fuziju sa domenom EgDHAsvnl C20 elongaze (pY156; SEQ ID NO:64; vidi SLIKA 19), moguće zbog nekorektnog savijanja. Kao suprotnost, SaD4, koja je ekspresovana zasebno (pY151; SEQ ID NO:76; vidi SLIKU 20) ima približno istu aktivnost delta-4 desaturaze kao nativna EgDHAsvnl<*>(pY141; SEQ ID NO:49; vidi SLIKU 20). Interesantno je da se aktivnost delta-4 desaturaze SaD4 povećava približno 2- puta kada se spoji sa domenom C20 elongaze EgDHAsvnl (pY160; SEQ ID NO:77; vidi SLIKU 20). Kada je spojena sa domenom C20 elongaze EgDHAsvnl i hranjena sa EPA (pY160; SEQ ID NO:77; vidi SLIKU 19), aktivnost delta-4 desaturaze je približno 3- puta veća nego kada je hranjena sa DPA (pY160; SEQ ID NO:77; vidi SLIKU 20), što sugeriše da povezivanje dva domena dovodi do povećane efikasnosti ili fluksa, moguće zbog usmeravanja supstrata.
PRIMER 29
Supstratna specifičnost EgDHAsvnl*
Sa GLA, STA, EDA, ERA, DGLA, ETA, ARA, EPA i DPA hranjene se ćelijeYarrowie,transformisane sa pY141 (EgDHAsvnl<*>; SEQ ID NO:49) i sam vektor, kao kontrola, a profili masnih kiselina su analizirani kao što je opisano u Primeru 27.
Rezultati za ishranu sa EPA, ARA i DPA prikazani su na SLICI 22. Profili masnih kiselina zaYarrowiu,hranjenu sa: GLA, STA, EDA, ERA, DGLA i ETA, pokazali su odsustvo elongacije i nisu prikazani na SLICI 22. Procenat C20 elongacije (%C20 Elong) i procenat delta-4 desaturacije (%D4 Desat) i prosečne vrednosti su izračunate kao što je opisano u Primeru 27, kada su hranjene sa EPA ili DPA. Kada su hranjene sa ARA, procenat C20 elongacije (% C20 Elong) je izračunat deljenjem zbira tež.% za dokozatetraensku kiselinu [DTA; 22:4 (7,10,13,16)] i omega-6 dokozapentaensku kiselinu [DPAn-6; 22:5(4,7,10,13,16)] sa zbirom tež.% za ARA, DTA i DPAn-6 i množenjem sa 100, da bi se izrazio kao %. Slično, procenat delta-4 desaturacije (% D4 Desat) za ishranu sa ARA, izračunat je deljenjem tež.% za DPAn-6 sa zbirom tež.% za DTA i DPAn-6 i množenjem sa 100, da bi se izrazio kao %.
U sažetom prikazu sa SLIKE 22, EgDHAsvnl<*>produžava i ARA i EPA, iako ima blagu prednost (približno je 40% aktivniji) u slučaju EPA. Proizvodu elongacije ARA (t.j., DTA) takođe je izvršena desaturacija na delta-4 položaju sa EgDHAsvnl, da bi se proizvela DPAn-6, a aktivnost je približno 40% veća za DTA nego za DPA.
PRIMER 30
Ko- ekspresiia DHA sintaze 1Euglene gracilissa delta- 8 desaturazomPavlove lutheri ,
delta- 5desaturazom Mortierelle alpine .delta- 17desaturazom Saprolegnie diclinei delta-9 elongazomEuglene gracilisu embrionima soje, transformisanim sa ekspresionim
vektorima soie pKR973 i pKR1064
Zreli somatski embrioni soje su dobar model za zigotne embrione. Dok su u globularnom embrionalnom stanju u tečnoj kulturi, somatski embrioni soje sadrže veoma male količine triacilglicerola ili skladištenih proteina, koji su uobičajeni za sazrevajuće, zigotne embrione soje. U ovom razvojnom stepenu, odnos ukupnih triacilglicerida prema ukupnim polarnim lipidima (fosfolipidi i glikolipid) je oko 1:4, kao u tipičnim zigotnim embrionima soje, u razvojnom stadij umu, od kog je pokrenuta inicijacija kulture somatskog embriona. U globularnom stadijumu, isto tako, mRNK-e za značajne proteine semena, a'-podjedinicu p-konglicinina, kunitz tripsin inhibitor 3 i semeni lecitin su u suštini odsutne. Usled prenosa u medijume bez hormona, kako bi se omogućila diferencijacija u stadijum sazrevanja somatskog embriona, triacilglicerol postaje najobilnija klasa lipida. Uz to, mRNK-e za a'-podjedinicu p-konglicinina, kunitz tripsin inhibitor 3 i semeni lecitin postaju vrlo bogate porukama, u ukupnoj populaciji mRNK. Na ovoj osnovi, sistem somatskih embriona soje ponaša se veoma slično zigotnim embrionima soje u sazrevanju,in vivo,pa je, stoga, dobar i brz sistem model za analiziranje fenotipskih efekata modifikacije ekspresije gena, na putu biosinteze masnih kiselina (vidi PCT Publication No. WO 2002/00904, Primer 3). Najvažnije je daje sistem model, takođe, prediktivan za smešu masnih kiselina semenja iz biljaka, dobijenih iz transgenskih embriona.
Analiza masnih kiselina transgenskih somatskih embriona soje, koje ekspresuju pKR973
ipKR1064
Embriogene suspenzione kulture soje (cv. Jack) su transformisane saAsclfragmentima pKR973 i pKR1064 (fragmenti, koji sadrže ekspresione kasete), kao što je opisano za proizvodnju u Primeru 25 i kao što je sažeto prikazano u Tabeli 26.
Podgrupa embriona soje, razvijenih iz svakog slučaja (deset embriona po slučaju) prikupljena je i prebačena u staklene bočice za GC, a metil estri masnih kiselina su pripremljeni transesterifikacijom. Za transesterifikaciju, 50 pL trimetilsulfonijum hidroksida (TMSH) i 0.5 mL heksana dodato je embrionima u staklenim bočicama i inkubirano je na sobnoj temperaturi, uz mućkanje, tokom 30 minuta. Metil estri masnih kiselina (5 pL, koji su injicirani iz heksanskog sloja) su izdvojeni i kvantitativno određeni, korišćenjem gasnog hromatografa Hewlett-Packard 6890, koji je opremljen kapilarnom kolonom od rastopljene silike Omegawax 320 (Kat. Br. 24152, Supelco Inc.). Temperatura sušnice je programirana tako da se drži na 220°C tokom 2.6 minuta, povećana je brzinom 20°C/min na 240°C, na kojoj je držana dodatnih 2.4 minuta. Nosač gasa je opskrbljen Whatmanovim generatorom vodonika. Vremena retencije su upoređena sa onima za metil estre komercijalno dostupnih standarda (Nu-Chek Prep, Inc.). Slučajevi koji su imali dobar fenotip, bili su ponovno analizirani uz pomoć GC, koristeći identične uslove, s izuzetkom što je temperatura sušnice držana na 150°C tokom 1 minuta, a zatim je povećana do 240°C, na 5°C.
Profili masnih kiselina za pojedinačne embrione iz reprezentativnog slučaja prikazani su na SLICI 23. Masne kiseline su identifikovane kao: 16:0 (palmitat), 18:0 (stearinska kiselina), 18:1 (oleinska kiselina), 18:2 (LA), GLA, 18:3 (ALA), EDA, DGLA, ARA, ERA, JUN, EPA, 22:3 (10,13,16) (dokozatrienska kiselina), DTA, DPA i DHA; a smeše masnih kiselina, navedene na SLICI 23, izražene su u vidu težinskog procenta (tež. %) ukupnih masnih kiselina.
Aktivnost EgDHAsvnl je izražena kao procenat C20 elongacije (%C20 Elong) i/ili procenat delta-4 desaturacije (% D4 Desat), što je izračunato prema sledećoj formuli: ([proizvod]/[supstrat + proizvod])* 100.
Određenije, procenat elongacije za EPA prikazanje kao % C20 Elong, koji je određen kao: ([DPA + DHA]/[EPA + DPA + DHA])* 100. Procenat delta-4 desaturacije za DPA prikazanje kao % D4 Desat, koji je određen kao: ([DHA]/[DPA + DHA])* 100. Druge kiseline koje se mogu elongirati ili desaturisati nisu uključene u ovo izračunavanje.
Pored elongacije i desaturacije proizvoda EPA i ARA, izgleda da se u soji, takođe, uz pomoć EgDHAsvnl elongira DGLA, tako što je izrađena značajna količina masne kiseline 22:3(10,13,16). Masna kiselina je identifikovana kao 22:3(10,13,16), budući daje, pomoću GC-MS utvrđeno da ima masu za 22:3, a imala je MS profil, koji se slaže sa onim za 22:3 (10,13,16).
PRIMER 31
Ekspresija fuzije delta- 9 elongazaEuglene sracilis / delta - SdesaturazaPavlove lutheri
( EgD9elo- EgDHAsynlLink- PavD8) u embrionima soje, koji su transformisani
ekspresionim vektorima soje KS373
Embriogena suspenziona kultura soje (cv. Jack) je transformisana sa KS373 (SEQ ID NO:179; SLIKA 17) i KS120 (koji je opisan u PCT Publication No. WO 2004/071467 i čiji sadržaji su ovde uključeni posredstvom reference), kao što je opisano za sistem model u Primeru 25. KS 120 uključuje selekciju na bazi higromicina. KS373, koji je proizveden u Primeru 23, omogućio je ekspresiju fuzionog proteina, koji sadrži delta-9 elongazuEuglene gracilisi delta-8 desaturazuPavlove lutheri,pri čemu su dva domena povezana spojnicom DHA sintaze 1Euglene gracilis(t.j., EgDHAsvnILink).
Dobijeni su profili masnih kiselina za pet pojedinačnih embriona iz 31 slučaja, kao što je opisano u Primeru 30. Rezultati iz pet najboljih slučajeva elongacije prikazani su na SLICI 24. Masne kiseline su identifikovane kao: 16:0 (palmitat), 18:0 (stearinska kiselina), 18:1 (oleinska kiselina), 18:2 (LA), GLA, 18:3 (ALA), EDA, DGLA, ERA i ETA; a smeše masnih kiselina, navedene na SLICI 24, izražene su u vidu težinskog procenta (tež. %) ukupnih masnih kiselina.
Aktivnost EgD9elo-EgDHAsynlLink-PavD8 je izražena kao procenat delta-9 elongacije (% D9 Elong) i/ili procenat delta-8 desaturacije (% D8 Desat), što je izračunato prema sledećoj formuli: ([proizvod]/[supstrat + proizvod])* 100.
Određenije, procenat delta-9 elongacije je prikazan kao % D9 Elong, koji je određen kao: ([EDA + ERA + DGLA + ETA]/[LA + ALA + EDA + ERA + DGLA + ETA])<*>100. Procenat delta-8 desaturacije je prikazan kao % D8 Desat, koji je određen kao: ([DGLA + ETA]/[EDA + ERA + DGLA + ETA])* 100.
Najbolji slučajevi % D9 Elong imali su prosečnu elongaciju od 22.1% sa prošekom %D8 Desat od 92.7%. Elongacija je neznatno slabija od one, koja se viđa kada se delta-9 elongaza ekspresuje zasebno u embrionima soje, iako bi ovo moglo biti posledica malog broja posmatranih slučajeva. Za razliku od elongacije, desaturacija je značano veća u slučaju kada je PavD8 spojena u fuziju sa EgD9elo i EgDHAsvn ILink, nego kada je PavD8 ekspresovana sama u embrionima soje, kada se postiže gotovo 100% konverzija u nekim slučajevima. Ova povećana konverzija uz pomoć delta-8 desaturaze mogla bi biti posledica povećane efikasnosti ili fluksa, moguće zbog dovođenja supstrata.
PRIMER 32
Sinteza i funkcionalna analiza kodon- optimizovanog gena C20 elongaze ( EgC20ES) iz
Euglene gracilisuYarrowii lipolvtici
Kodonska upotreba domena C20 elongaze EgDHAsynl (EgDHAsvnlC20EloDoml)Euglene gracilis(t.j., koji odgovara aminokiselinama 1-303 SEQ ID NO: 12) optimizovana je za ekspresiju uYarrowii lipolytici,na način, sličan onom, koji je opisan u PCT Publication No. WO 2004/101753 i U.S. Patentu 7,125,672. Specifično, kodon-optimizovani gen C20 elongaze (označen sa "EgC20ES", i koji ima nukleotidnu sekvencu kao što je navedena u SEQ ID NO: 183 i aminokiselinsku sekvencu, kao što je navedena u SEQ ID NO: 184) dizajniran je na osnovu kodirajuće sekvence domena C20 elongaze EgDHAsvnl (SEQ ID NO:201), u skladu sa modelom korišćenja kodonaYarrowie(PCT Publication No. WO 2004/101753), kosenzus sekvencom oko 'ATG' translacionog kodona inicijacije i opštim pravilima stabilnosti RNK (Guhanivogi, G. i J. Brevver,Gene,265(1-2):11-23 (2001)). Pored modifikacije položaja inicijacije translacije, 163 bp od 909 bp kodirajućeg regiona je modifikovano (17.9%), a 147 kodona je optimizovano (48.5%). Nijedna od modifikacija u kodon-optimizovanom genu nije menjala aminokiselinsku sekvencu kodiranog proteina (t.j., SEQ ID NO:184 je 100% identična u sekvenci sa aminokiselinama 1-303 SEQ ID NO: 12). Dizajnirani gen EgC20ES (SEQ ID NO: 183) je sintetisan od strane GenScript Corporation (Piscataway, NJ) i kloniran u pUC57 (GenBank Accession No. Y14837), da bi se proizveo pEgC20ES (SLIKA 51B; SEQ ID NO: 185).
Da bi se analizirala funkcija kodon-optimizovanog gena EgC20ES, konstruisan je plazmid pZuFmEgC20ES (SLIKA 52A; SEQ ID NO:360), koji sadrži himerični FBAINm::EgC20ES::Pex20 gen. Plazmid pZuFmEgC20ES je sadržavao sledeće komponente:
Plazmid pZuFmEgC20ES je transformisan u soj Y4184U4Yarrowie lipolytice,kao što je opisano u Opštim Postupcima. Transformisani sojevi su odabrani na MM pločama. Nakon 2 dana rasta na 30°C, 10 transformisanih sojeva, koji su porasli na MM pločama, bili su odabrani i ponovljeno zasejani na sveže MM ploče. Čim je poraslo, 10 sojeva je pojedinačno inokulisano u 3 ml tečnog MM, na 30°C i mućkani su na 250 rpm/min, tokom 2 dana. Ćelije su sakupljene centrifugiranjem; lipidi su ekstrahovani, a metil estri masnih kiselina pripremljeni su trans-esterifikacijom, i redom su analizirani sa Hevvlett-Packard 6890 GC.
GC analize su pokazale da se nalazi oko 6.2% EPA i 2.8% DPA od količine ukupnih lipida, proizvedenih u svih deset transformisanih sojeva, pri čemu je utvrđeno da je efikasnost konverzije EPA u DPA u ovih 10 sojeva bila oko 31% (izračunato kao što je opisano u Primeru 27). Stoga, ovi eksperimentalni podaci pokazuju da sintetska C20 elongazaEuglene gracilis,koja je kodon-optimizovana za ekspresiju uYarrowii lipolytici(t.j., EgC20ES, kao što je navedena u SEQ ID NO:183) aktivno konvertuju EPA u DPA.
PRIMER 33
Sinteza i funkcionalna analiza kodon- optimizovanog gena C20 elongaze ( EaC20ES) iz
Euglene anabaeneuYarrowii lipolvtici
Kodonska upotreba domena C20 elongaze EaDHAsyn2 (SEQ ID NO:228)Euglene anabaene(t.j., koji odgovara aminokiselinama 1-299 SEQ ID NO:96) optimizovana je za ekspresiju uYarrowii lipolytici,na način, sličan onom, koji je opisan u PCT Publication No. WO 2004/101753, U.S. Patentu 7,125,672 i, gore, u Primeru 32. Specifično, kodon-optimizovani gen C20 elongaze (označen sa "EaC20ES", i koji ima nukleotidnu sekvencu kao što je navedena u SEQ ID NO: 188 i aminokiselinsku sekvencu, kao što je navedena u SEQ ID NO: 189) dizajniran je na osnovu kodirajuće sekvence domena C20 elongaze EaDHAsyn2 (SEQ ID NO:92), u skladu sa modelom korišćenja kodonaYarrowie(PCT Publication No. WO 2004/101753), kosenzus sekvencom oko 'ATG' kodona translacione inicijacije i opštim pravilima stabilnosti RNK
(Guhanivogi, G. i J. Brevver,Gene,265(1-2):11-23 (2001)). Pored modifikacije položaja inicijacije translacije, 143 bp od 897 bp kodirajućeg regiona je modifikovano (15.9%), a 134 kodona su optimizovana (44.8%). Nijedna od modifikacija u kodon-optimizovanom genu nije menjala aminokiselinsku sekvencu kodiranog proteina (t.j., SEQ ID NO: 189 je 100% identična u sekvenci sa aminokiselinama 1-299 SEQ ID NO:96). Dizajnirani gen EaC20ES (SEQ ID NO: 188) je sintetisan od strane GenScript Corporation (Piscataway, NJ) i kloniran u pUC57 (GenBank Accession No. Y14837), da bi se proizveo pEaC20ES (SEQ IDNO:190).
Da bi se analizirala funkcija kodon-optimizovanog gena EaC20ES, konstruisan je plazmid pZuFmEaC20ES (SEQ ID NO:361), koji sadrži himerični FBAINm::EaC20ES::Pex20 gen. Plazmid pZuFmEaC20ES (SEQ ID NO:361) je po konstrukciji identičan sa konstrukcijom plazmida pZuFmEgC20ES (SEQ ID NO:360; SLIKA 52A), s izuzetkom korišćenja EaC20ES (SEQ ID NO: 188) umesto EgC20ES (SEQ ID NO: 183).
Plazmid pZuFmEaC20ES (SEQ ID NO:361) je transformisan u soj Y4184U4Yarrowie lipolytice,kao što je opisano u Opštim Postupcima. Transformisani sojevi su odabrani na MM pločama. Nakon 2 dana rasta na 30°C, 20 transformisanih sojeva, koji su porasli na MM pločama, bili su odabrani i ponovljeno zasejani na sveže MM ploče. Čim je poraslo, 20 sojeva je pojedinačno inokulisano u 3 ml tečnog MM, na 30°C i mućkani su na 250 rpm/min, tokom 2 dana. Ćelije su sakupljene centrifugiranjem; lipidi su ekstrahovani, a metil estri masnih kiselina pripremljeni su trans-esterifikacijom, i sledstveno su analizirani sa Hewlett-Packard 6890 GC.
GC analize su pokazale da se nalazi oko 7.4% EPA i 1% DPA od količine ukupnih lipida, proizvedenih u svih 20 transformisanih sojeva, pri čemu je utvrđeno daje efikasnost konverzije EPA u DPA u ovih 20 sojeva bila oko 11% (izračunato kao što je opisano u Primeru 27). Tako su ovi eksperimentalni podaci pokazali da sintetska C20 elongazaEuglene anabaene,koja je kodon-optimizovana za ekspresiju uYarrowii lipolytici(t.j., EaC20ES, kao što je navedeno u SEQ ID NO: 188) aktivno konvertuju EPA u DPA.
PRIMER 34
Sinteza i funkcionalna analiza kodon- optimizovanog gena delta- 4 desaturaze ( EaD4S) iz
Euglene anabaeneuYarrowu lipolvtici
Kodonska upotreba domena delta-4 desaturaze EaDHAsyn2 (SEQ ID NO.243)Euglene anabaene(t.j., koji odgovara aminokiselinama 259-841 SEQ ID NO:96) optimizovana je za ekspresiju uYarrowii lipolytici,na način, sličan onom, koji je opisan u PCT Publication No. WO 2004/101753, U.S. Patentu 7,125,672 i, prethodno, u Primerima 32 i 33. Specifično, kodon-optimizovani gen delta-4 desaturaze (označen sa "EaD4S", i koji ima nukleotidnu sekvencu kao što je navedena u SEQ ID NO: 192 i aminokiselinsku sekvencu, kao što je navedena u SEQ ID NO: 193) dizajniran je na osnovu kodirajuće sekvence domena delta-4 desaturaze EaDHAsyn2 (SEQ ID NO:92), koji je, isto tako, obezbeđen kao SEQ ID NO: 194 (nukleotid) i SEQ ID NO: 195 (aminokiselina). Pored modifikacije položaja translacione inicijacije, 307 bp od 1752 (uključujući stop kodon TAA) bp kodirajućeg regiona je modifikovano (17.5%), a 285 kodona je optimizovano (48.8%). Dodatno,Ncolpoložaj je uveden oko translacionog start kodona izmenom druge aminokiseline domena delta-4 desaturaze divljeg tipa (t.j., aminokiselinski ostatak 260 SEQ ID NO:96 ili aminokiselinski ostatak 2 SEQ ID NO: 195) od leucinskog ostatka u valinski ostatak u sintetskom genu EaD4S; stoga je aminokiselinska sekvenca EaD4S navedena u SEQ ID NO: 193. Dizajnirani gen EaD4S (SEQ ID NO: 192) je sintetisan od strane GenScript Corporation (Piscataway, NJ) i kloniran u pUC57 (GenBank Accession No. Y14837), da bi se proizveo pEaD4S (SEQ ID NO: 196).
Da bi se analizirala funkcija kodon-optimizovanog gena EaD4S, konstruisan je plazmid pZKL4-220EA4 (SLIKA 52B; SEQ ID NO:362), kako bi se integrisala dva himerična gena C20 elongaze i himerični gen EaD4S u lokus sličan lipazi 4 (GenBank Accession No. XM_503825) soja Y4184U4Yarrowie lipolytice.Plazmid pZKL4-220EA4 je sadržavao sledeće komponente:
Plazmid pZKL4-220EA4 je svaren saAscl/ Sphl,a zatim je transformisan u soju Y4184U4Yarrowie lipolytice,kao što je opisano u Opštim Postupcima. Transformisani sojevi su odabrani na MM pločama. Nakon 5 dana rasta na 30°C, 8 transformisanih sojeva, koji su porasli na MM pločama, bili su odabrani i ponovljeno zasejani na sveže MM ploče. Čim su porasli, ovi sojevi su pojedinačno inokulisani u 3 ml tečnog MM, na 30°C i mućkani su na 250 rpm/min, tokom 2 dana. Ćelije su sakupljene centrifugiranjem; resuspendovane su u HGM, a zatim su mućkane na 250 rpm/min, tokom 5 dana. Ćelije su sakupljene centrifugiranjem, lipidi su ekstrahovani, a metil estri masnih kiselina pripremljeni su trans-esterifikacijom, i sledstveno sa analizirani sa Hevvlett-Packard 6890 GC.
GC analize su pokazale da se nalazi prosečno 0.4% DHA i 10.2% DPA od količine ukupnih lipida, proizvedenih u svih 8 transformisanih sojeva, pri čemu je utvrđeno da je efikasnost konverzije DPA u DHA u ovih 8 sojeva bila oko 4.2%
(izračunato kao što je opisano u Primeru 27). Tako su ovi eksperimentalni podaci pokazali da je sintetska delta-4 desaturazaEuglene anabaene,koja je kodon-optimizovana za ekspresiju uYarrowii lipolytici(t.j., EaD4S, kao što je navedeno u SEQ ID NO: 192) aktivna, ali deluje sa relativno slabom efikasnošću konverzije.
PRIMER 35
Ko- ekspresija domena C20 elongaze DHA sintaze 1Euglene gracilis
( EgDHAsvnlC20EloDoml) sa delta- 4 desaturazomSchizochvtrium aggregatum ( SaD4)
u embrionima soje, transformisanim sa sojinim ekspresionim vektorom pKRl 105
Primer koji sledi opisuje proizvodnju transgenskih primeraka soje, koji ekspresuju EgDHAsvnlC20EloDoml i SaD4, koji bi, kada su proizvedeni u biljkama, mogli biti ukršteni sa primercima soje, koji proizvode EPA, da bi se proizvele biljke, koje proizvode DHA.
Embriogena suspenziona kultura soje (cv. Jack) transformisana je saAsclfragmentom pKRl 105 (SEQ ID NO:156; SLIKA 16A; fragment, koji sadrži ekspresionu kasetu), a embrioni su sazrevali, kao što je opisano za proizvodnju u Primeru 25, ali sa sledećom izmenom. Nakon sazrevanja na SB103, tokom 10-12 dana, pojedinačni grozd embriona za svaki primerak, prenesen je u 4 mL tečnih medijuma SB148 (recept ispod), koji sadrži 0.02% tergitola i 0.33 mM EPA u mikrotitarskoj ploči sa šest reakcionih položaja.
SB 103 čvrsti medijum ( po litru)
1 pakovanje MS soli (Gibco/ BRL - Kat. Br. 11117-066)
1 mL B5 vitamina 1000X matični rastvor
60 g maltoze
pH5.7
Grozdovi su pažljivo razbijeni, da bi se oslobodili pojedinačni embrioni, a mikrotitarske ploče su mućkane na rotacionoj mućkalici na 150 rpm i na 26°C, pod hladnim, belim fluorescentnim svetlima, sa fotoperiodom od 16:8 sati dan/noć, pri intenzitetu svetlosti od 60-85 pE/m2/s, tokom 48 sati. Nakon 48 sati, embrioni su isprani vodom i osušeni, a pet embriona po primerku prebačeno je u staklene bočice za GC. Metil estri masnih kiselina su pripremljeni transesterifikacijom sa TMSH i kvantitativno su određeni, korišćenjem gasnog hromatografa Hewlett-Packard 6890, koji je opremljen kapilarnom kolonom od rastopljene silike Omegawax 320 (Kat. Br. 24152, Supelco Inc.), kao što je opisano u Primeru 30. Temperatura sušnice programirana je tako da se drži na 150°C tokom 1 minuta, a zatim je povećana do 240°C, na 5°C. Vremena retencije su upoređena sa onima za metil estre komercijalno dostupnih standarda (Nu-Chek Prep, Inc.).
Na ovaj način, analizirana su 122 slučaja, transformisana sa pKR1105. Od 122 analizirana primerka, za 49 je dokazano da su elongirali EPA (aktivnost C20/delta-5 elongaze), a od njih, za 41 primerak je dokazano da je vršio desaturaciju DPA (aktivnost delta-4 desaturaze), da bi se proizvela DHA. Primerci sa najboljim aktivnostima C20/delta-5 elongaze i delta-4 desaturaze su unapređeni, a profili masnih kiselina, proisteklih iz ishrane embriona sa EPA, prikazani su na SLICI 26.
Masne kiseline na SLICI 26 identifikovane su kao: 16:0 (palmitat), 18:0 (stearinska kiselina), 18:1 (oleinska kiselina), LA, ALA, EPA, 22:0 (dokozanska kiselina), DPA, 24:0 (tetrakozanska kiselina), DHA i 24:1 (nevonska kiselina), a smeše masnih kiselina, navedene na SLICI 26, izražene su u vidu težinskog procenta (tež. %) ukupnih masnih kiselina. Aktivnost EgDHAsvnlC20EloDoml je izražena kao procenat C20/delta-5 elongacije (% C20/delta-5 elong), što je izračunato prema sledećoj formuli: ([proizvod]/[supstrat + proizvod])* 100. Određenije, sjedinjeni procenat elongacije EPA prikazan je kao "% C20/delta-5 elong", koji je određen kao: ([DPA + DHA]/[EPA + DPA + DHA])* 100.
Aktivnost SaD4 je izražena kao procenat delta-4 desaturacije (% delta-4 desat), što je izračunato prema sledećoj formuli: ([proizvod]/[supstrat + proizvod])* 100. Određenije, sjedinjeni procenat desaturacije DPA prikazanje kao "% delta-4 desat", koji je određen kao: (DHA/[DPA + DHA])* 100.
PRIMER 36
Identifikacija delta- 9 elongaze izEuglene anabaeneUTEX 373
Ovaj primer opisuje identifikaciju delta-9 elongaza iz biblioteke cDNKEuglene anabaeneUTEX 373. Ovaj rad je, takođe, opisan u U.S. Provisional Application No. 60/911,925 (prijavljena 16. aprila 2007.; Attorney Docket No. BB-1613; čiji sadržaji su ovde uključeni posredstvom reference).
UzgojEuglene anabaeneUTEX 373 i izrada RNK
Amplifikovana euglc biblioteka cDNK je postavljena na ploče, a kolonije su podignute, kao što je opisano u Primeru 13. DNK proba je izrađena korišćenjem Ncol/NotI fragmenta DNK, prečišćenog na agaroza gelu, koji sadrži gen delta-9 elongazeEuglene gracilisiz pKR906 (SEQ ID NO: 115; Primer 16 i WO 2007/061845, koji je publikovan 31. maja 2007.; Attorney Docket No. BB-1562; čiji sadržaji su ovde uključeni posredstvom reference), koji je obeležen sa P<32>dCTP, korišćenjem sistema obeležavanja RadPrime DNA Labeling System (Kat. Br. 18428-011, Invitrogen, Carlsbad, CA), sledeći instrukcije proizvođača.
Ispitana su izdignuća kolonija, a pozitivne kolonije su identifikovane i potvrđene kao što je opisano u Primeru 13. Plazmid DNK je izolovana i sekvencionisana tačno kao što je opisano u Primeru 2, a sekvence su slagane i upoređene korišćenjem Sequencher-a™ (verzija 4.2, Gene Codes Corporation, Ann Arbor, MI). Na ovaj način, klonovi su se mogli kategorizovati u jednu od dve različite grupe, na osnovi umetnute sekvence (označene kao EaD9Elol i EaD9Elo2). Reprezentativni klonovi, koji sadrže cDNK za svaku klasu sekvence, odabrani su za dalje analiziranje, a sekvence svakog reprezentativnog plazmida (pLF121-l i pLF121-2) prikazane su u SEQ ID NO:250, odnosno SEQ ID NO:251. Sekvenca, koja je prikazana pomoću NNNN trake predstavlja region poliA priveska, koji nije bio sekvencionisan. Kodirajuće sekvence za EaD9Elol i EaD9Elo2 prikazane su u SEQ ID NO:252, odnosno SEQ ID NO:253. Odgovarajuće aminokiselinske sekvence za EaD9Elol i EaD0Elo2 prikazane su u SEQ ID NO:254, odnosno SEQ IDNO:255.
PRIMER 37
Identifikacija delta- 5 desaturaze izEuglene anabaeneUTEX 373
Ovaj Primer opisuje identifikaciju delta-5 desaturaze izEuglene anabaeneUTEX 373. Ovaj rad je, takođe, opisan u U.S. Provisional Application No. 60/915733 (prijavljenaa 3. maja 2007.; Attornev Docket No. BB-1614; čiji sadržaji su ovde uključeni posredstvom reference).
Amplifikovana euglc biblioteka cDNK je postavljena na ploče, a kolonije su podignute, kao što je opisano u Primeru 13. DNK proba je izrađena korišćenjem Ncol/NotI DNK fragmenta, prečišćenog na agaroza gelu, koji sadrži gen delta-5 desaturazeEuglene gracilis(EgD5; SEQ ID NO:267) iz pDMW367, koji je prethodno opisan u PCT Publication No. WO 2007/136877 (publikovana 29. novembra 2007.; Attornev Docket No. BB1629; čiji sadržaji su ovde uključeni posredstvom reference), koji je obeležen sa P<32>.
Izdignuća kolonija su ispitana, a pozitivne kolonije su identifikovane i potvrđene, kao što je opisano u Primeru 13. Plazmid DNK je izolovana i sekvencionirana tačno kao što je opisano u Primeru 2, a sekvence su slagane i upoređene korišćenjem Sequencher-a™ (verzija 4.2, Gene Codes Corporation, Ann Arbor, MI).
Reprezentativni klon, koji sadrži cDNK (pLF119), prikazan je u SEQ ID NO:256, a gen sadržan unutar cDNK je nazvan EaD5Desl. Kodirajuća sekvenca za EaD5Desl je prikazana u SEQ ID NO:257. Odgovarajuća aminokiselinska sekvenca za EaD5Desl prikazana je u SEQ ID NO:258.
PRIMER 38
Konstrukcija ekspresionog vektora soje pKR1183 za ekspresiju gena fuzije delta- 9
elongazaEuglene anabaene - delta - SdesaturazaTetruetreptie pomguetensisCCMP 1491
( Hibridl- HGLA sintaza)
Fuzija unutar okvira između delta-9 elongazeEuglene anabaene(EaD9Elol; SEQ ID NO:252; Primer 36), spojnice, bogate prolinom, DHA sintaze 1Euglene gracilis(EgDHAsvnILink; SEQ ID NO: 197; Primer 6) i delta-8 desaturazeTetruetreptie pomqutensisCCMP1491 (TpomD8; SEQ ID NO:162; Primer 21; vidi, takođe, istovremenu prijavu, koja je u toku, ovlašćenika podnosioca prijave, koja ima U.S. Patent Application No. 11/876115 (podnesena 22. oktobra 2007.; Attornev Docket No. BB-1574)), konstruisana je korišćenjem, dole opisanih, uslova.
Izvršena je inicijalna fuzija unutar okvira između EaD9Elol i EgDHAsvnlLink (EaD9elo-EgDHAsynILink), zaposednutihNcolpoložajem na 5' kraju iNotipoložajem na 3' kraju, PCR amplifikacijom. EaD9Elol (SEQ ID NO:252) je amplifikovana iz pLF121-l (SEQ ID NO:250) sa oligonukleotidima EaD9-5Bbs (SEQ ID NO:259) i EaD9-3fusion (SEQ ID NO:260), koristeći Phusion™ High-Fidelity DNA Polymerase (Kat. Br. F553S, Finnzymes Oy, Finska), sledeći protokol proizvođača. EgDHAsynlLink (SEQ ID NO:197) je amplifikovana, na sličan način, iz pKR1049 (Primer 4) sa oligonukleotidima EgDHAsynlLink-5fusion (SEQ ID NO:261) i MWG511 (SEQ ID NO: 175). Dva nastala PCR proizvoda su sjedinjena i re-amplifikovana, koristeći EaD9-5Bbs (SEQ ID NO:259) i MWG511 (SEQ ID NO:175), da bi se obrazovala EaD9Elol-EgDHAsynILink. Sekvenca EaD9Elol-EgDHAsynILink prikazana je u SEQ ID NO:262. EaD9Elol-EgDHAsynlLink ne sadrži stop kodon unutar okvira, ushodno odNotipoložaja na 3' kraju i, stoga, DNK fragment, kloniran uNotipoložaj, može proizvesti fuziju unutar okvira sa EgD9elol-EgDHAsynILink, ukoliko je izabran ispravan okvir. EaD9Elol-EgDHAsyn ILink je kloniran u pCR-Blunt<®>klonirajući vektor, korišćenjem kompleta Zero Blunt<®>PCR Cloning Kit (Invitrogen Corporation), sledeći protokol proizvođača, da bi se proizveo pLF124 (SEQ ID NO:263).
BbslINotlDNK fragment pLF124 (SEQ ID NO:263), koji sadrži EaD9Elol-EgDHAsynlLink, kloniranje uNcoVNotlDNK fragment iz KS366 (SEQ ID NO:177; Primer 23), koji sadrži promoter a' subjedinice P-konglicinina, da bi se proizveo pKRl 177 (SEQ ID NO:264).
BammDNK fragment pKR1177 (SEQ ID NO:264), koji sadrži EaD9Elol-EgDHAsynlLink, kloniranje uBamHlDNK fragment pKR325, koji je prethodno opisan u PCT Publication No. WO 2006/012325 (čiji sadržaji su ovde uključeni posredstvom reference), kako bi se proizveo pKRl 179 (SEQ ID NO:265).
Notifragment iz pLF114-10 (Primer 21; SEQ ID NO: 165), koji sadrži TpomD8, kloniran je uNotifragment pKR1179 (SEQ ID NO:265), da bi se proizveo pKR1183 (SEQ ID NO:266; SLIKA 28). Na Slici 28, fuzioni gen (Hibridl-HGLA sintaza) je nazvan EAd9ELONG-TPOMd8DS.
PRIMER 39
Konstrukcija ekspresionog vektora soje pKR1253 za ekspresiju gena fuzije delta- 9
elongazaEuglene anabaene - delta - SdesaturazaTetruetreptie pomguetensisCCMP 1491
( Hibridl- HGLA sintaza") sa delta- 5 desaturazomEuglene gracilis
Preko brojnih koraka subkloniranja,Notipoložaj je dodat na 5' kraj delta-5 desaturazeEuglene gracilis(EgD5; SEQ ID NO:267) iz pDMW367, a ovajNotifragment, koji sadrži EgD5 je kloniran uNotipoložaj pKR457 (SEQ ID NO: 122; Primer 16), kako bi se proizveo pKR1237 (SEQ ID NO:268).
Asclfragment pKR1183 (SEQ ID NO:266; Primer 38), koji sadrži Hibridl-HGLA sintazu, kloniranjeu Asclfragment pKR277 (SEQ ID NO: 120, koji je prethodno opisan u PCT Publication No. WO 2004/071467 i publikovan 26. VIII 2004.; Attorney Docket No. BB-1538 (čiji sadržaji su ovde uključeni posredstvom reference), da bi se proizveo pKR1252 (SEQ ID NO:269).
Bsimfragment pKR1237 (SEQ ID NO:268), koji sadrži gen EgD5, kloniran je uBsimpoložaj pKR1252 (SEQ ID NO:269), da bi se proizveo pKR1253 (SEQ ID NO:270; SLIKA 30).
PRIMER 40
Konstrukcija vektora soje pKRl 139 za ekspresiju delta- 5 desaturazeEuglene anabaene
Ovaj primer opisuje kloniranje delta-5 desaturaze izEuglene anabaeneUTEX 373 u ekspresioni vektor soje. Ovaj zadatak je, takođe, opisan u U.S. Provisional Application No. 60/915733 (prijavljena 3. maja 2007.; Attorney Docket No. BB-1614; (čiji sadržaji su ovde uključeni posredstvom reference)).
EaD5Desl (SEQ ID NO:257) je amplifikovana iz pLFl 19 (SEQ ID NO:256, Primer 37) sa oEAd5-l-l (SEQ ID NO:271) i oEAd5-l-2 (SEQ ID NO:272), koristeći Phusion™ High-Fidelity DNA Polymerase (Kat. Br. F553S, Finnzvmes Oy, Finska), sledeći protokol proizvođača. Nastali PCR proizvod je kloniran u pCR-Blunt<®>klonirajući vektor, korišćenjem kompleta Zero Blunt<®>PCR Cloning Kit (Invitrogen Corporation), sledeći protokol proizvođača, da bi se proizveo pKRl 136 (SEQ ID NO:273).
Noti fragment pKR1136 (SEQ ID NO:273), koji sadrži EaD5Desl, kloniran je uNotifragment pKR974, koji je prethodno opisan u PCT Publication No. VVO 2007/136877, publikovanoj 29. novembra 2007. (Attorney Docket No. BB-1629 (čiji sadržaji su ovde uključeni posredstvom reference), da bi se proizveo pKRl 139 (SEQ ID NO:274).
PRIMER 41
Konstrukcija ekspresionog vektora soje pKR1255 za ekspresiju gena fuzije delta- 9
elongazaEuglene anabaene - delta -%desaturazaTetruetreptie pomguetensisCCMP1491
( Hibridl- HGLA sintaza) sa delta- 5 desaturazomEuglene gracilisi delta- 5 desaturazom
Euglene anabaene
Plazmid pKR1139 (SEQ ID NO:274; Primer 40) je svaren saSbfl,a fragment, koji sadrži EaD5Desl, kloniranje uSbfl.položaj pKR1253 (SEQ ID NO:270; Primer 39), da bi se proizveo pKR1255 (SEQ ID NO:275; SLIKA 31).
PRIMER 42
Konstrukcija ekspresionog vektora soje pKR1189 za nishodno regulisanje ekspresije
Fad3 soje
Ovaj primer opisuje ekspresioni vektor soje, koji je dizajniran za smanjenje ekspresije fad3 u soji.
Polazni vektor pKR561 (SEQ ID NO:276) je sastavljen umetanjemBsiWlfragmenta pKR268 (koji je prethodno opisan u PCT Publication No. VVO 04/071467), koji sadrži aneksin promoter, uBsiWlpoložaj pKR145, koji je opisan u PCT Publication No. VVO 04/071467.
Plazmid XF1, koji je opisan u PCT Publication No. VVO 93/11245 (koja je publikovana 10. juna 1993.; takođe U.S. Patent No. 5,952,544; čiji sadržaji su ovde uključeni posredstvom reference), sadrži( fadJ)gen delta-15 desaturaze soje (SEQ ID NO:277; GenBank Accession No. L22964; takođe nazvan GmFAD3B).
Deo 5' kraja fad3 gena je amplifikovan iz XF1 sa Phusion™ High-Fidelity DNA Polvmerase (Kat. Br. F553S, Finnzvmes Oy, Finska), sledeći protokol proizvođača, koristeći HPfad3-l (SEQ ID NO:278) i HPfad3-2 (SEQ ID NO:279), da bi se proizveo fragment DNK, nazvan HPfad3AB (SEQ ID NO:280).
Deo 3' kraja fad3 gena je amplifikovan iz XF1 sa Phusion™ High-Fidelity DNA Polymerase, koristeći HPfad3-3 (SEQ ID NO:281) i HPfad3-l (SEQ ID NO:278), kako bi se proizveo fragment DNK, nazvan HPfad3A'-2 (SEQ ID NO:282).
HPfad3AB i HPfad3A'-2 su sjedinjeni i amplifikovani korišćenjem Phusion™ High-Fidelity DNA Polymerase, sa HPfad3-l (SEQ ID NO:278), da bi se proizveo HPfad3ABA'-2 (SEQ ID NO:283). HPfad3ABA'-2 (SEQ ID NO:283) posedujeNotipoložaj i na 5' i na 3' kraju DNK fragmenta. Nastali PCR proizvod je kloniran u pCR-Blunt<®>klonirajući vektor, korišćenjem kompleta Zero Blunt<®>PCR Cloning Kit (Invitrogen Corporation), sledeći protokol proizvođača, kako bi se proizveo pLF129 (SEQ IDNO:284).
Notifragment pLF129 (SEQ ID NO:284), koji sadrži fad3 šnalu, kloniranje uNotifragment pKR561 (SEQ ID NO:276), da bi se proizveo pKRl 189 (SEQ ID NO:285; SLIKA 32). Na SLICI 32, A i A' domeni za fad3 označeni su oznakom TRI, dok je domen B označen sa TR2.
PRIMER 43
Konstrukcija ekspresionog vektora soje pKR1249 za nishodno regulisanje Fad3 soje i
Fad3c soje
NotVHinaT. ilfragment pLF129 (SEQ ID NO:284), koji sadrži TRI i TR2 domene fad3, kao što je naznačeno na SLICI 32, kloniran je uNotllHindlllfragment osovine pLF129 (SEQ ID NO:284), kako bi se proizveo pKR1209 (SEQ ID NO:286).
Kodirajuća sekvenca GmFad3C (GenBank Accession No. AY204712)
(Bilyeu et al.,Crop Sci.43:1833-1838 (2003); Anai et al.,Plant Sci.168:1615-1623
(2005)) prikazana je u SEQ ID NO:287, a odgovarajuća aminokiselinska sekvenca je prikazana u SEQ ID NO:288. Deo fad3c gena je amplifikovan iz biblioteke cDNK soje, opisane u PCT Publication No. VVO 93/11245 (koja je publikovana 10. juna 1993.; takođe U.S. Patent No. 5,952,544) (čiji sadržaji su ovde uključeni posredstvom reference) sa Phusion™ High-Fidelity DNA Polymerase (Kat. Br. F553S, Finnzymes Oy, Finska), sledeći protokol proizvođača i koristeći fad3c-5 (SEQ ID NO:289) i fad3c-3 (SEQ ID NO:290). Nastali DNK fragment je kloniran u pCR-Blunt<®>klonirajući vektor, korišćenjem kompleta Zero Blunt<®>PCR Cloning Kit (Invitrogen Corporation), sledeći protokol proizvođača, da bi se proizveo pKR1213 (SEQ ID NO:291).
EcoRY/ Xholfragment pKR1213 (SEQ ID NO:291), koji sadrži fragment fad3c, kloniranje uMfl(napunjen)/*7ralpoložaj pKR1209 (SEQ ID NO:286), da bi se proizveo pKR1218 (SEQ ID NO:292).
NotVHindOlfragment pLF129 (SEQ ID NO:284), koji sadrži samo TRI domen iz fad3, kao što je naznačeno na SLICI 32, kloniran je uNotl/ Hindlllfragment osovine pLF129 (SEQ ID NO:284), kako bi se proizveo pKR1210 (SEQ ID NO:293).
EcoR\/ Xho\fragment pKR1213 (SEQ ID NO:291), koji sadrži fragment fad3c, kloniranje u JVofI(napunjen)/*fcoI položaj pKR1210 (SEQ ID NO:293), da bi se proizveo pKR1219 (SEQ ID NO:294).
Xhol( napunjen)/ Hindlllfragment pKR1218 (SEQ ID NO:292), koji sadrži fragment fad3c, kao i domene TRI i TR2 fad3, kloniran je uMlul( napuD. jen)/ HindHlpoložaj pKR1219 (SEQ ID NO:294), koji sadrži fragment fad3c, i, jedino domen TRI fad3, kako bi se proizveo pKR1225 (SEQ ID NO:295). Na ovaj način, formirana je nova šnala, koja uključuje fad3 i fad3c, a zaposednuta jeNotipoložajima.
Notifragment pKR1225 (SEQ ID NO:295), koji sadrži novu šnalu, koja uključuje fad3 i fad3c, kloniranje uNotifragment pKR561 (SEQ ID NO:276; Primer 42), da bi se proizveo pKRl229 (SEQ ID NO:296; SLIKA 33). Na ovaj način, fad3/fad3c šnala može biti ekspresovana iz snažnog promotera, specifičnog za seme, sa selekcijom u biljkama na bazi higromicina.
BsiWlfragment pKR1225 (SEQ ID NO:295), koji sadrži novu šnalu, koja uključuje fad3 i fad3c, kloniranje uBsimfragment pKR226 (SEQ ID NO: 130; Primer 17), da bi se proizveo pKR1249 (SEQ ID NO:297; SLIKA 34). Na SLICI 34, pKR1249 je obeležen sa pKR1249_PHP33240. Na ovaj način, fad3/fad3c šnala može biti ekspresovana iz snažnog promotera, specifičnog za seme, sa selekcijom u biljkama na bazi hlorsulfurona (ALS).
PRIMER 44
Konstrukcija ekspresionog vektora soje pKR1322 za ekspresiju gena fuzije delta- 9
elongaza Euglene anabaene - delta - SdesaturazaTetruetreptie pomguetensisCCMP 1491-
delta- 5 desaturazaEuglene anabaene( EaD9Elol- TpomD8- EaD5Desl fusion)
Ovaj primer opisuje konstruisanje gena fuzije unutar okvira između delta-9 elongazeEuglene anabaene(EaD9Elol; SEQ ID NO:252, Primer 36), delta-8 desaturazeTetruetreptie pomguetensisCCMP1491 (TpomD8; SEQ ID NO:162; Primer 21) i delta-5 desaturazeEuglene anabaene(EaD5Desl; SEQ ID NO:257; Primer 37). Svaki domen je odvojen EgDHAsvnl spojnicom (EgDHAsvnl Link; SEQ ID NO: 197; Primer 6).
EaD9Elo 1 -EgDHAsvn 1 Link (SEQ ID NO:262; Primer 38) je amplifikovana iz pLF124 (SEQ ID NO:263) sa oligonukleotidima oEAd9ell-l (SEQ ID NO:298) i oLINK-1 (SEQ ID NO:299), koristeći Phusion™ High-Fidelity DNA Polymerase (Kat. Br. F553S, Finnzymes Oy, Finska), sledeći protokol proizvođača. EaD9Elol-EgDHAsynlLink je zaposednuta saNotina 5' kraju iEaglna 5' i 3' krajevima, a ne sadrži stop kodon unutar okvira ushodno odEaglpoložaja na 3' kraju. Stoga, fragment DNK, koji je kloniran uEaglpoložaj može proizvesti fuziju unutar okvira sa EgD9elo-EgDHAsynlLink-om, ukoliko je izabran ispravan okvir. Nastali DNK fragment, koji sadrži EaD9Elol-EgDHAsynILink, kloniran je u pCR-Blunt<®>klonirajući vektor, korišćenjem kompleta Zero Blunt<®>PCR Cloning Kit (Invitrogen Corporation), sledeći protokol proizvođača, kako bi se proizveo pKR1298 (SEQ ID NO:300).
Izvršena je fuzija unutar okvira između TpomD8 i EgDHAsynlLink (TpomD8-EgDHAsynlLink), koja jesadržavala Notipoložaj na 5' kraju iEaglpoložaje na 5' i 3' krajevima, posredstvom PCR amplifikacije. TpomD8 (SEQ ID NO: 162) je amplifikovana iz pLFl 14-10 (SEQ ID NO:165) sa oligonukleotidima oTPd8-l (SEQ ID NO:301) i oTPd8fus-l (SEQ ID NO:302), koristeći Phusion™ High-Fidelity DNA Polymerase (Kat. Br. F553S, Finnzymes Oy, Finska), sledeći protokol proizvođača. EgDHAsynlLink (SEQ ID NO: 197) je amplifikovana, na sličan način, iz pKR1049 (Primer 4) sa oligonukleotidima oLINK-2 (SEQ ID NO:303) i oLINK-1 (SEQ ID NO:304). Dva nastala PCR proizvoda su sjedinjena i re-amplifikovana, koristeći oTPd8-1 (SEQ ID NO:301) i oLINK-1 (SEQ ID NO:304), kako bi se obrazovao TpomD8-EgDHAsynlLink (SEQ ID NO:305). TpomD8-EgDHAsynILink je kloniran u pCR-Blunt<®>klonirajući vektor, korišćenjem kompleta Zero Blunt<®>PCR Cloning Kit (Invitrogen Corporation), sledeći protokol proizvođača, da bi se proizveo pKR1291 (SEQ ID NO:306).
Eaglfragment pKR1291, koji sadrži TpomD8-EgDHAsynILink, kloniranje uNotipoložaj pBluescript II SK(+) vektora (Stratagene), da bi se obrazovao ili pKR1301 (SEQ ID NO:307) u jednoj orijentaciji ili pKR1301R (SEQ ID NO:308) u suprotnoj orijentaciji.
Plazmid pKRl 301 (SEQ ID NO:307) je svaren saMfel/ BamUl,DNK fragment, koji sadrži TpomD8-EgDHAsynILink, potpuno je napunjen, a nastali fragment DNK je ponovno povezan, kako bi se obrazovao pKR1311 (SEQ ID NO:309).
Plazmid pKR1301R (SEQ ID NO:308) je svaren saEcoRl,a fragment, koji sadrži 5' kraj TpomD8-EgDHAsynILink (nazvan TPOMD8TR2) i osovinu vektora, ponovno je povezan, kako bi se obrazovao pKR1304 (SEQ ID NO:310).
Eaglpoložaj pKR1298 (SEQ ID NO:300), koji sadrži EaD9Elol-EgDHAsynlLink, kloniran je uEaglpoložaj pKR1304 (SEQ ID NO:310), da bi se proizveo pKR1309 (SEQ ID NO:311).
Notipoložaj pKR1298 (SEQ ID NO:300), koji sadrži EaD9Elol-EgDHAsynILink, kloniran je uEaglpoložaj pKR1304 (SEQ ID NO:310), da bi se proizveo pKR1309 (SEQ ID NO:311).
Notifragment pKR1136 (SEQ ID NO:273; Primer 40), koji sadrži EaD5Desl, kloniranje uEaglpoložaj pKR1311 (SEQ ID NO:309), kako bi se proizveo pKR1313 (SEQ ID NO:312).
Mfel/ Ecll36llfragment pKR1313 (SEQ ID NO:312), kloniran je uEcoRNIMfelpoložaje pKR1309 (SEQ ID NO:311), da bi se proizveo pKR1315 (SEQ ID NO:313).
Notifragment pKR1315 (SEQ ID NO:313), kloniranje uNotipoložaj pKR72 (SEQ IDNO-.105; Primer 15), da bi se proizveo pKR1322 (SEQ ID NO:314; SLIKA 35).
Na SLICI 35, EaD9Elol-TpomD8-EaD5Desl fuzija je obeležena kao EAd9el+TPd8ds+EAd5ds fusion.
PRIMER 45
Nishodna regulacija soj inih gena fad3 i fad3c u somatskim embrionima soje putem
transformacije sa pKRl 189 ili pKR1229
Ovaj primer opisuje transformaciju i ekspresiju u somatskim embrionima soje pKRl 189 (SEQ ID NO:285, Primer 42), koji sadrži konstrukciju fad3 šnale ili pKR1229 (SEQ ID NO:296; Primer 43), koji sadrži konstrukciju fad3 i fad3c šnale. Obe konstrukcije, takođe, imaju gen higromicin fosfotransferaze za selekciju na bazi higromicina.
Embriogena suspenziona kultura soje (cv. Jack) je transformisana sa pKRl 189 (SEQ ID NO:285) ili pKR1229 (SEQ ID NO:296), a embrioni su sazrevali u tečnom medijumu za histodiferencijaciju i sazrevanje soje (SHaM tečni medijumi; Schmidt et al,Cell Biology and Morphogenesis,24:393 (2005)), kao što je opisano u Primeru 25, i kao što je prethodno opisano u PCT Publication No. VVO 2007/136877, publikovanoj 29. novembra 2007. (čiji sadržaji su ovde uključeni posredstvom reference).
Nakon sazrevanja na SHaM tečnim medijumima, pojedinačni embrioni su uklonjeni iz grozdova i osušeni i ispitane su izmene u njihovim smešama masnih kiselina, kao što je opisano u Primeru 1. U svakom slučaju, podgrupa embriona soje (t.j., pet embriona po slučaju), transformisanih sa pKRl 189 (SEQ ID NO:285) ili pKR1229 (SEQ ID NO:296), sakupljena je i analizirana.
Na ovaj način, analiziranje 41 primerak, transformisan sa pKRl 189 (SEQ ID NO:285; Eksperiment 2148) ili pKR1229 (SEQ ID NO:296; Eksperiment 2165). Profili masnih kiselina za pet primeraka, koji imaju najniži prosečni sadržaj ALA (prošek 5 analiziranih embriona) zajedno sa primerkom (2148-3-8-1), koji poseduje profil masnih kiselina, koji je tipičan za embrione divljeg tipa u ovom ekspreimentu, prikazani su na SLICI 36. Na SLICI 36, masne kiseline su identifikovane kao: 16:0 (palmitat), 18:0 (stearinska kiselina), 18:1 (oleinska kiselina), LA i ALA. Smeše masnih kiselina, izražene su u vidu težinskog procenta (tež. %) ukupnih masnih kiselina.
Sadržaj ALA u somatskim embrionima, koji ekspresuju ili konstrukciju fad3 šnale (broj primerka 2148, SLIKA 36) ili konstrukciju fad3c šnale (primerak broj 2165, SLIKA 36), pokazao je najmanje 50% smanjenje kada se uporedi sa tipičnim embrionima divljeg tipa (SLIKA 36). Ovim se jasno pokazuje da je bilo koja konstrukcija šnale funkcionalne u smanjenju sadržaja ALA u embrionima soje.
PRIMER 46
Somatski embrioni soje, transformisani sa pKR1183 za ekspresiju gena fuzije delta- 9
elongazaEuglene anabaene - delt &- 8desaturazaTetruetreptie pomguetensisCCMP 1491
( Hibridl- HGLA sintaza)
Ovaj primer opisuje transformaciju i ekspresiju u somatskim embrionima soje pKRl 183 (SEQ ID NO:266; Primer 38), koji sadrže gen fuzije delta-9 elongazaEugleneanabaene- delta- SdesaturazaTetruetreptie pomqutensisCCMP 1491 (Hibridl-HGLA sintaza) i gen higromicin fosfotransferaze za selekciju na bazi higromicina.
Embriogena suspenziona kultura soje (cv. Jack) transformisana je sa pKRl 183 (SEQ ID NO:266), a embrioni su sazrevali u tečnom medijumu za histodiferencijaciju i sazrevanje soje (SHaM tečni medijumi; Schmidt et al,Cell Biology and Morphogenesis,24:393 (2005)), kao što je opisano u Primeru 25, i kao što je ranije opisano u PCT Publication No. VVO 2007/136877, publikovanoj 29. novembra 2007. (čiji sadržaji su ovde uključeni posredstvom reference).
Nakon sazrevanja na SHaM tečnim medijumima, podgrupa embriona soje (t.j., četiri embriona po slučaju), transformisanih sa pKR1183 (SEQ ID NO:266), sakupljena je i analizirana, kao što je ovde opisano.
Na ovaj način, analizirano je 20 primeraka, transformisanih sa pKR1183 (SEQ ID NO:266; Eksperiment 2145). Profili masnih kiselina za pet primeraka, koji imaju najveći prosečni sadržaj DGLA (prosečno 5 analiziranih embriona) prikazani su na SLICI 37. Na SLICI 37, masne kiseline su identifikovane kao: 16:0 (palmitat), 18:0 (stearinska kiselina), 18:1 (oleinska kiselina), LA, ALA, EDA, ERA, DGLA i ETA. Smeše masnih kiselina, izražene su u vidu težinskog procenta (tež. %) ukupnih masnih kiselina.
PRIMER 47
Embrioni soje, transformisani sa ekspresionim vektorima soje pKR1253 za ekspresiju
gena fuzije delta- 9 elongazaEuglene anabaene - delta - SdesaturazaTetruetreptie
pomguetensisCCMP 1491 ( Hibridl- HGLA sintaza) sa delta- 5 desaturazomEuglene
gracilisi pKR1249 za nishodno regulisanje Fad3 soje i Fad3c soje
Embriogena suspenziona kultura soje (cv. Jack) je transformisana saAsclfragmentima pKR1249 (SEQ ID NO:279; Primer 43) i pKR1253 (SEQ ID NO:270; Primer 39), kao što je opisano u Primeru 25. Podgrupa embriona soje, razvijenih iz svakog primerka (deset embriona po primerku), sakupljena je i ubačena u staklene bočice za GC, a metil estri masnih kiselina (FAME-i) pripremljeni su transesterifikacijom i analizirani pomoću GC, kao stoje opisano u Primeru 1. Vremena retencije su upoređena sa onima za metil estre komercijalno dostupunih standarda (Nu-Chek Prep, Inc.).
Na ovaj način, analizirana su 142 slučaja, transformisana sa pKR1249 (SEQ ID NO:297) i pKRl253 (SEQ ID NO:270) (eksperiment nazvan Heal 25). Od 142 analizirana slučaja, za 90 je utvrđeno da su proizveli ARA u najmanje jednom od deset analiziranih embriona, u relativnom višku, većem od 1.0% ukupnih masnih kiselina. Od njih, za 64 je utvrđeno da su proizveli ARA u najmanje jednom od deset analiziranih embriona, u relativnom višku većem od 10.0% ukupnih masnih kiselina. Od njih, za 44 slučaja je utvrđeno da su proizveli ARA u najmanje jednom od deset analiziranih embriona, u relativnom višku većem od 20.0% ukupnih masnih kiselina.
Prosečni profili masnih kiselina (prošek od 10 embriona) za 20 slučajeva, koji imaju najvišu ARA, prikazani su na SLICI 38. Masne kiseline su identifikovane kao: 16:0 (palmitat), 18:0 (stearinska kiselina), 18:1 (oleinska kiselina), LA, ALA, EDA, SCI, DGLA, ARA, ERA, JUN, ETA i EPA; a smeše masnih kiselina, navedene na SLICI 38, izražene su u vidu težinskog procenta (tež. %) ukupnih masnih kiselina. Na SLICI 38, masne kiseline, navedene kao "ostale", uključuju: 18:2 (5,9), 18:3 (5,9,12), STA, 20:0, 20:1 (11), 20:2 (7,11) ili 20:2 (8,11) i DPA. Svaka od ovih masnih kiselina prisutna je u relativnom višku manjem od 2.0% ukupnih masnih kiselina. Prošek ukupnih omega-3 masnih kiselina (ukupno n-3) jeste zbir prosečnih vrednosti svih omega-3 masnih kiselina).
Tekući profili masnih kiselina za svaki embrion iz jednog slučaja (AFS 5416-8-1-1), koji ima prosečan sadržaj ARA od 17.0% i prosečan sadržaj EPA od 1.5%, prikazani su na SLICI 39. Masne kiseline su identifikovane kao: 16:0 (palmitat), 18:0 (stearinska kiselina), 18:1 (oleinska kiselina), LA, ALA, EDA, SCI, DGLA, ARA, ERA, JUN, ETA i EPA; a smeše masnih kiselina, navedene na SLICI 39, izražene su kao težinski procenat (tež. %) od ukupnih masnih kiselina. Na SLICI 39, masne kiseline, navedene kao "ostale", uključuju: 18:2 (5,9), 18:3 (5,9,12), STA, 20:0, 20:1 (11), 20:2 (7,11) ili 20:2 (8,11) i DPA. Svaka od ovih masnih kiselina prisutna je u relativnom višku manjem od 2.0% ukupnih masnih kiselina. Ukupne omega-3 masne kiseline (ukupno n-3) su zbir svih omega-3 masnih kiselina).
Budući da su sadržaji ALA uopšteno 1.5- do 3-puta veći u somatskim embrionima soje nego što su prisutni u semenu (t.j., 15%-30% u embrionima (vidi, na primer, tipični embrion divljeg tipa na SLICI 36), u zavisnosti od uslova sazrevanja i vremena, u odnosu na 7-10% u semenu (Bilveu et al., 2005, Crop Sci. 45:1830-1836), očekivano je da će uopšteno sadržaji omega-3 kiselina i, specifično, sadržaji EPA, biti značajno niži u semenu nego u somatskim embrionima.
PRIMER 48
Embrioni soje, transformisani sa ekspresionim vektorima soje pKR1255 za ekspresiju
gena fuzije delta- 9 elongazaEuglene anabaene - de \ ta -%desaturazaTetruetreptie
pomguetensisCCMP 1491 ( Hibridl- HGLA sintaza) sa delta- 5 desaturazomEuglene
gracilisi i delta- 5 desaturazomEuglene anabaenei pKR1249 za nishodno regulisanje
Fad3 soje i Fad3c soje
Embriogena suspenziona kultura soje (cv. Jack) je transformisana saAsclfragmentima pKR1249 (SEQ ID NO:297; Primer 43) i pKR1255 (SEQ ID NO:275; Primer 41), kao što je opisano u Primeru 25. Podgrupa embriona soje, razvijenih iz svakog primerka (deset embriona po primerku), sakupljena je i ubačena u staklene bočice za GC, a metil estri masnih kiselina (FAME-i) pripremljeni su transesterifikacijom i analizirani pomoću GC, kao što je opisano u Primeru 1. Vremena retencije su upoređena sa onima za metil estre komercijalno dostupunih standarda (Nu-Chek Prep, Inc.).
Na ovaj način, analizirano je 197 slučajeva, transformisanih sa pKR1249 (SEQ ID NO:297) i pKR1255 (SEQ ID NO:275) (eksperiment nazvan Heal 26). Od 197 analiziranih slučajeva, za 128 je utvrđeno da su proizveli ARA u najmanje jednom od deset analiziranih embriona, u relativnom višku većem od 1.0% ukupnih masnih kiselina. Od njih, za 105 je utvrđeno da su proizveli ARA u najmanje jednom od deset analiziranih embriona, u relativnom višku većem od 10.0% ukupnih masnih kiselina. A od njih, za 83 je utvrđeno da su proizveli ARA u najmanje jednom od deset analiziranih embriona, u relativnom višku većem od 20.0% ukupnih masnih kiselina.
Prosečni profili masnih kiselina (prošek od 9 ili 10 embriona) za 20 slučajeva, koji imaju najviše ARA, prikazani su na SLICI 40. Masne kiseline su identifikovane kao: 16:0 (palmitat), 18:0 (stearinska kiselina), 18:1 (oleinska kiselina), LA, ALA, EDA, SCI, DGLA, ARA, ERA, JUN, ETA i EPA; a smeše masnih kiselina, navedene na SLICI 40, izražene su u vidu težinskog procenta (tež. %) od ukupnih masnih kiselina. Na SLICI 40, masne kiseline, navedene kao "ostale", uključuju: 18:2 (5,9), 18:3 (5,9,12), STA, 20:0, 20:1 (11), 20:2 (7,11) ili 20:2 (8,11) i DPA. Svaka od ovih masnih kiselina prisutna je u relativnom obilju manjem od 2.0% od ukupnih masnih kiselina. Prošek ukupnih omega-3 masnih kiselina (ukupno n-3) jeste zbir prosečnih vrednosti svih omega-3 masnih kiselina).
PRIMER 49
Ekspresija fuzije domen C20 elongaze DHA sintaze 1Euglene gracilisl & oiia - Adesaturaza
Schizochvtrium aggregatum( EgDHAsvnl C20EloDom3- SaD4\ transformisane sa
ekspresionim vektorom soje pKRl 134
Embriogena suspenziona kultura soje (cv. Jack) je transformisana saAsclfragmentom pKRl 134 (SEQ ID NO: 161; Primer 20; fragment, koji sadrži ekspresionu kasetu), a embrioni su sazrevali kao što je opisano za proizvodnju u Primeru 25. Ishrana supstratom EPA i analiza izvedene su kao što je opisano u Primeru 35.
Na ovaj način, analizirano je 198 slučajeva, transformisanih sa pKR1134 (eksperiment nazvan Heal24). Od 198 analiziranih slučajeva, za 193 je utvrđeno da su elongirali EPA (aktivnost C20/delta-5 elongaze), a svi oni su vršili desaturaciju DPA (aktivnost delta-4 desaturaze), kako bi se proizvela DHA do nekog stepena. Slučajevi sa najboljim aktivnostima C20/delta-5 elongaze i delta-4 desaturaze, unapređeni su, a profili masnih kiselina, proistekli iz ishrane embriona sa EPA, prikazani su na SLICI 41.
Masne kiseline na SLICI 41 identifikovane su kao: 16:0 (palmitat), 18:0 (stearinska kiselina), 18:1 (oleinska kiselina), LA, ALA, EPA, 22:0 (dokozanska kiselina), DPA, 24:0 (tetrakozanska kiselina), DHA i 24:1 (nevonska kiselina); a smeše masnih kiselina, navedene na SLICI 41, izražene su u vidu težinskog procenta (tež. %) od ukupnih masnih kiselina. Aktivnost EgDHAsvnl C20EloDoml je izražena kao procenat C20/delta-5 elongacije (% C20/delta-5 elong), koji je izračunat prema sledećoj formuli: ([proizvod]/[supstrat + proizvod])* 100. Određenije, sjedinjeni procenat elongacije za EPA prikazan je kao "% C20/delta-5 elong" koji je određen kao: ([DPA + DHA]/[EPA + DPA + DHA])* 100.
Aktivnost SaD4 je izražena kao procenat delta-4 desaturacije (% delta-4 desat), koji je izračunat prema sledećoj formuli: ([proizvod]/[supstrat + proizvod])* 100. Određenije, sjedinjeni procenat desaturacije za DPA prikazan je kao "% delta-4 desat" koji je određen kao: (DHA/[DPA + DHA])* 100.
Pored analizirana 122 slučaja soje, koji su transformisani sa pKRl 105 (eksperiment nazvan Heal23), kao što je opisano u Primeru 35, analizirano je još 20 slučajeva, budući daje Primer 35 bio napisan, dajući ukupno 142 analizirana slučaja. Od 20 novih analiziranih slučajeva, za 18 je utvrđeno da su elongirali EPA (aktivnost C20/delta-5 elongaze), a 17 od njih, takođe su vršili desaturaciju DPA (aktivnost delta-4 desaturaze), da bi se proizvela DHA do nekog stepena. Slučajevi sa najboljim aktivnostima C20/delta-5 elongaze i delta-4 desaturaze od 20 novih analiziranih slučajeva soje, transformisanih sa pKR1105, unapređeni su, a profili masnih kiselina, proistekli iz ishrane embriona sa EPA, prikazani su na SLICI 42.
Relativne aktivnosti primerka, transformisanih sa pKR1105 (C20 elongaza i delta-4 desaturaza, ekspresovane pojedinačno) ili pKR1134 (C20 elongaza i delta-4 desaturaza, ekspresovane kao fuzija), upoređene su ucrtavanjem %DHA (tež. %) u odnosu na %DPA (tež. %), za sve slučajeve, u kojima su embrioni bili hranjeni sa EPA. Rezultati su uneseni ucrtavanjem u dijagram na SLICI 43. Na SLICI 43, Heal23 je naziv eksperimenta, u kome je transformisan pKR1105, a Heal24 je eksperiment u kome je transformisan pKR1134. Iz SLIKE 43, jasno je da su, sveukupno, koncentracije DHA bile povećane, dok su koncentracije DPA smanjene (tako nisko da su nemerljive), kada se izvede fuzija C20 elongaze sa delta-4 desaturazom. Tako je spajanje 2 nezavisna enzima zajedno u vidu jednog fuzionog proteina, uz razdvajanje regionom spojnice, povećalo fluks od EPA do DHA.
PRIMER 50
Ekspresija gena fuzije delta- 9 elongazaEuglene anabaene - delta - 8desaturaza
Tetruetreptie pomgutensisCCMP 1491- delta- 5 desaturazaEuglene anabaene
( EaD9Elol- TpomD8- EaD5Desl fusion)
Embriogena suspenziona kultura soje (cv. Jack) je transformisana sa pKR1322 (SEQ ID N0.314), a embrioni su sazrevali i analizirani su profili masnih kiselina, kao što je ovde opisano.
Somatski embrioni soje, koji su transformisani sa pKR1322 (SEQ ID NO:314) elongiraće LA u EDA, EDA će biti desaturirana u DGLA, a DGLA će, dalje, biti desaturirana u ARA. Budući da soja divljeg tipa, takođe, sadrži ALA, nešto ALA će biti elongirano do ERA, ERA će biti desaturirana do ETA, a ETA će, dalje, biti desaturirana u EPA.
Biljke soje, koje ekspresuje fuzioni gen iz pKR1322, mogu se regenerisati iz embriona, kao što je opisano u Primeru 26 i može se dobiti semenje.
U podlogama, koje sadrže visok nivo ALA ili u kojima su delta-15 desaturaza i ili delta-17 desaturaza bile ko-ekspresovane, predomoniraće EPA. Obrnuto, ARA će biti povećana korišćenjem niskog nivoa ALA na podlozi (na primer ukrštanjem sa biljkom niskog nivoa ALA ili niskim linom) ili izbacivanjem endogenog fad3 gena, kao što je ovde opisano. Intermedijeri masnih kiselina (t.j., EDA i DGLA ili ERA i ETA) biće niži kada se koristi fuzija, nego kada su pojedinačne aktivnosti transformisane nezavisno (t.j., ne kao fuzija).
Druge kombinacije gena (uključujući kombinacije spojnice) mogu se spojiti zajedno na način, sličan onom, koji je opisan u Primeru 24. Slično, mogu se izraditi druge kombinacije promotera/gena fuzije/terminatora.
PRIMER 51
Određivanje funkcionalnog domena u sintetskoj delta- 4 desaturazi, koja je dobijena iz
Eu glene anabaenei kodon- optimizovana za ekspresiju uYarrowii lipolytici( EaD4S)
Kao što je šematski prikazano u vidu dijagrama na SLICI 52C, izgleda da se C-terminalni deo domena C20 elongaze EaDHAsvnl (obeležen na slici kao "EaC20E") preklapa sa N-terminalnim delom domena delta-4 desaturaze EaDHAsvnl (obeležen kao "EaD4" na slici). Ovo je sugerisano poređenjem sekvenci.
Da bi se definisao funkcionalni domen delta-4 desaturaze u EaD4S (SEQ ID NO.T92; Primer 34), proizvedena su tri EaD4S<*>mutanta sa različitim N-terminalnim skraćivanjima. Specifično, pZuFmEaD4S (SEQ ID NO:364) je konstruisan putem zameneNcoVNotlfragmenta pZuFmIgD9ES (SEQ ID NO:365) saNcoVNotlfragmentom EaD4S pEaD4S (SEQ ID NO: 196; Primer 34).Ncolpoložaj je uveden u pZuFmEaD4S (SEQ ID NO:364) mutagenezom usmerenom ka položaju, koristeći parove prajmera YL921 i YL922 (SEQ ID NOi:366, odnosno 367), YL923 i YL924 (SEQ ID NOi:368, odnosno 369) i YL925 i YL926 (SEQ ID NOi:370, odnosno 371), da bi se proizveo: pZuFmEaD4S-Ml (SEQ ID NO:372), pZuFmEaD4S-M2 (SEQ ID NO:373), odnosno pZuFmEaD4S-M3 (SEQ ID NO:374). Plazmidi pZuFmEaD4S-Ml, pZuFmEaD4S-M2 i pZuFmEaD4S-M3 su svareni saNcol,a zatim su sami povezani, da bi se proizvele konstrukcije pZuFmEaD4S-l (SEQ ID NO:375), pZuFmEaD4S-2 (SEQ ID NO:376) i pZuFmEaD4S-3 (SEQ ID NO:377).NcoVNotlfragmenti, koji sadrže različita skraćenja EaD4S iz pZuFmEaD4S-l, pZuFmEaD4S-2, pZuFmEaD4S-3, korišćeni su za proizvodnju: pZKL4-220EA4-l (SEQ ID NO:378), pZKL4-220EA4-2 (SEQ ID NO.-379) i pZKL4-220EA4-3 (SEQ ID NO:380) konstrukcija. Ove tri konstrukcije su sasvim istovetne kao pZKL4-220EA4 (SEQ ID NO:362 i SLIKA 52B, kao što je opisano u Tabeli 28 Primera 34), s izuzetkom što je kodirajući region EaD4S bio skraćen u N-terminalnom regionu. Specifično, umesto kodirajuće sekvence EaD4S duge 583 aminokiselina (SEQ ID NO: 193), skraćeni polipeptid EaD4S<*>je bio dužine 547 aminokiselina u pZKL-220EA4-1 (t.j., SEQ ID NO:382), 527 aminokiselina po dužini u pZKL4-220EA4-2 (t.j., SEQ ID NO:384) i 512 aminokiselina po dužini u pZKL4-220EA4-3 (t.j., SEQ ID NO:386). N-terminalni region ovih polipeptida (koji odgovaraju aminokiselinama 1-90 SEQ IDNO:193) poredan je na SLICI 53 A.
Plazmidi pZKL4-220EA4 (SEQ ID NO:362), pZKL4-220EA4-l (SEQ ID NO:378), pZKL4-220EA4-2 (SEQ ID NO:379) i pZKL4-220EA4-3 (SEQ ID NO:380) svareni su saAscl/ Sphl,a zatim su transformisani u soju Y4184U4Yarrowie lipolytice,kao što je opisano u Opštim Postupcima. Transformisani sojevi su odabrani na MM pločama. Nakon 5 dana rasta na 30°C, 5 transformisanih sojeva, koji su porasli na MM pločama iz svake konstrukcije, bili su odabrani i ponovljeno zasejani na sveže MM ploče. Čim su porasli, ovi sojevi su pojedinačno inokulisani u 3 ml tečnog MM, na 30°C i mućkani su na 250 rpm/min, tokom 2 dana. Ćelije su sakupljene centrifugiranjem; resuspendovane su u HGM, a zatim su mućkane na 250 rpm/min, tokom 5 dana. Ćelije su sakupljene centrifugiranjem, lipidi su ekstrahovani, a metil estri masnih kiselina pripremljeni su trans-esterifikacijom, i sledstveno sa analizirani sa Hewlett-Packard 6890
GC.
GC rezultati su prikazani ispod u Tabeli 29. Smeše DPA i DHA su predstavljene kao % od ukupih masnih kiselina. Efikasnost konverzije ("Efikas. konv.") je izmerena prema sledećoj formuli: ([DHA]/[DPA + DHA])* 100. Aktivnost delta-4 desaturaze svake skraćene EaD4S<*>(t.j., polipeptida od 547 aminokiselina, 527 aminokiselina ili 512 aminokiselina u transformantimaYarrowiepZKL4-220EA4-l, pZKL4-220EA4-2, odnosno pZKL4-220EA4-3) upoređena je sa onom za EaD4S (t.j.,Yarrowiatransformanti pZKL4-220EA4) u koloni, koja je obeležena sa "% delta-4 aktivnosti".
Ovi podaci su pokazali da 37 N-terminalnih aminokiselina EaD4S (t.j., aminokiseline 1-37 SEQ ID NO: 193) ima negativan efekat na aktivnost delta-4 desaturaze. Povišena aktivnost delta-4 desaturaze je izmerena, u odnosu na EaD4S, u svakom od skraćenih proteina EaD4S<*>, iako je polipeptid EaD4S<*>od 547 aminokiselina (SEQ ID NO:382) superioran u aktivnosti u poređenju sa polipeptidima EaD4S<*>, koji gube dodatne aminokiseline iz njihovog N-kraja (t.j., SEQ ID NOi:384 i 386).
PRIMER 52
Sinteza i funkcionalna analiza kodon- optimizovanog gena delta- 4 desaturaze ( EgD4S) iz
Eu glene gracilisuYarrowii lipolvtici
Kodonsko korišćenje domena delta-4 desaturaze EgDHAsvnl (SEQ ID NO:221)Euglene gracilis(koji odgovara aminokiselinama 253-793 SEQ ID NO: 12) optimizovano je za ekspresiju uYarrowii lipolytici,na način, sličan onom, koji je opisan u PCT Publication No. VVO 2004/101753, U.S. Patentu 7,125,672 i, ovde, u Primerima 32, 33 i 34. Specifično, kodon-optimizovani gen delta-4 desaturaze (označen sa "EgD4S"; SEQ ID NO:387) dizajniranje na osnovu kodirajuće sekvence domena delta-4 desaturaze EgDHAsvnl, u skladu sa modelom upotrebe kodonaYarrowie(PCT Publication No. VVO 2004/101753), konsenzus sekvencom oko 'ATG' kodona inicijacije translacije i opštim pravilima stabilnosti RNK (Guhanivogi, G. i J. Brewer,Gene,265(1-2): 11-23 (2001)). Pored modifikacije položaja inicijacije translacije, 282 bp od 1623 bp kodirajućeg regiona je modifikovano (17.4%), a 270 kodona je optimizovano (49.9%). Kodon-optimizovani kodirajući region EgD4S je 1623 bp po dužini, kodirajući, tako, polipeptid od 540 aminokiselina (SEQ ID NO:388). Stoga je EgD4S za jednu aminokiselinu kraći po dužini od domena delta-4 desaturaze EgDHAsvnl divljeg tipa (t.j., SEQ ID NO:221; specifično, leucinski ostatak, koji odgovara aminokiselini na poziciji 2 SEQ ID NO: 13, je odstranjen u EgD4S (SEQ ID NO:388). Dizajnirani gen EgD4S (SEQ ID NO:387) je sintetisan od strane GenScript Corporation (Piscataway, NJ) i kloniran u pUC57 (GenBank Accession No. Y14837), da bi se proizveo pEgD4S (SEQ IDNO-.389).
Da bi se analizirala funkcija kodon-optimizovanog gena EgD4S, konstruisan je plazmid pZKL4-220Eg4 (SEQ ID NO:390), kako bi se integrisala dva himerična gena C20 elongaze i himerični gen EgD4S u lokus sličan lipazi 4 (GenBank Accession No. XM_503825) soja Y4305U3Yarrowie lipolytice.Plazmid pZKL4-220Eg4 (SEQ ID NO:390) je bio identičan po konstrukciji sa plazmidom pZKL4-220Ea4 (SEQ ID NO:362; SLIKA 52B; Tabela 28 Primera 34), s izuzetkom što je EgD4S (SEQ ID NO:387) upotrebljen umesto EaD4S (SEQ ID NO: 192).
Plazmid pZKL4-220Eg4 je svarensa AsclISphl,a zatim je transformisan u soj Y4305U3Yarrowie lipolytice,kao što je opisano u Opštim Postupcima. Transformisani sojevi su odabrani na MM pločama. Nakon 5 dana rasta na 30°C, 14 transformisanih sojeva, koji su porasli na MM pločama, bili su odabrani i ponovno zasejani na sveže MM ploče. Čim su porasli, ovi sojevi su pojedinačno inokulisani u 3 ml tečnih MM, na 30°C i mućkani su na 250 rpm/min, tokom 2 dana. Ćelije su sakupljene centrifugiranjem, resuspendovane su u HGM, a zatim su mućkane na 250 rpm/min, tokom 5 dana. Ćelije su sakupljene centrifugiranjem, lipidi su ekstrahovani, a metil estri masnih kiselina pripremljeni su trans-esterifikacijom, i sledstveno sa analizirani sa Hewlett-Packard 6890
GC.
GC analize su pokazale da se nalazilo prosečno 4.9% DHA i 17.8% DPA od količine ukupnih lipida, proizvedenih u svih 14 transformisanih sojeva, pri čemu je utvrđeno daje efikasnost konverzije DPA u DHA bila oko 21.5% (izračunato kao stoje opisano u Primeru 27). Tako su ovi eksperimentalni podaci pokazali daje sintetska delta-4 desaturazaEuglene gracilis,koja je kodon-optimizovana za ekspresiju uYarrowiilipolytici(t.j., EgD4S, kao što je navedeno u SEQ ID NO:387) bila aktivna u konverziji
DPA u DHA.
PRIMER 53
Određivanje funkcionalnog domena u sintetskoj delta- 4 desaturazi, koja je dobijena iz
Eu glene gracilisi kodon- optimizovana za ekspresiju uYarrowii lipolvtici( EgD4S)
Na način sličan onom koji se zapaža kod EaDHAsvnl (SLIKA 52C), izgleda da se C-terminalni deo domena C20 elongaze EgDHAsvnl preklapa sa N-terminalnim delom domena delta-4 desaturaze EgDHAsvnl, na osnovi poređenja sekvenci.
Da bi se definisao funkcionalni domen delta-4 desaturaze u EgD4S (SEQ ID NO:387), proizvedena su tri EgD4S mutanta sa različitim N-terminalnim skraćivanjima.Ncolpoložaj je uveden u pEgD4S (SEQ ID NO:389; Primer 52) mutagenezom usmerenom ka položaju, koristeći parove prajmera YL935 i YL936 (SEQ ID NOi:391, odnosno 392), YL937 i YL938 (SEQ ID NOi:393, odnosno 394) i YL939 i YL940 (SEQ ID NOi:395, odnosno 396), da bi se proizvele konstrukcije: pEgD4S-Ml (SEQ ID NO:397), pEgD4S-M2 (SEQ ID NO:398), odnosno pEgD4S-M3 (SEQ ID NO:399).NcoVNotlfragmenti, koji sadrže različita skraćenja EgD4S iz pEgD4S-Ml, pEgD4S-M2 i pEgD4S-M3, korišćeni su za proizvodnju konstrukcija pZKL4-220Eg4-l (SEQ ID NO:400), pZKL4-220Eg4-2 (SEQ ID NO:401) i pZKL4-EgD4-3 (SEQ ID NO:402). Ove tri konstrukcije su sasvim istovetne kao pZKL4-220Eg4 (SEQ ID NO:390; Primer 52), s izuzetkom što je kodirajući region EgD4S bio skraćen u N-terminalnom regionu. Specifično, umesto kodirajuće sekvence EgD4S duge 540 aminokiselina (SEQ ID NO:388), skraćeni polipeptid EgD4S<*>je bio dug 513 aminokiseline u pZKL-220Eg4-l (t.j., SEQ ID NO:404), 490 aminokiselina po dužini u pZKL4-220Eg4-2 (t.j., SEQ ID NO:406) i 474 aminokiselina po dužini u pZKL4-220Eg4-3 (t.j., SEQ ID NO:408). N-terminalni region ovih polipeptida (koji odgovaraju aminokiselinama 1-80 SEQ ID NO:388) poredan je na SLICI 53B.
Plazmidi pZKL4-220Eg4 (SEQ ID NO:390), pZKL4-220Eg4-l (SEQ ID NO.-400), pZKL4-220Eg4-2 (SEQ ID NO:401) i pZKL4-EgD4-3 (SEQ ID NO:402) svareni susa AscVSphl,a zatim su, pojedinačno, transformisani u soj Y4035U3Yarrowie lipolytice,kao što je opisano u Opštim Postupcima. Transformisani sojevi su odabrani na MM pločama. Nakon 5 dana rasta na 30°C, 4 transformisana soja, koja su porasla na MM pločama iz svake konstrukcije, bila su odabrana i ponovljeno zasejana na sveže MM ploče. Čim su porasli, ovi sojevi su pojedinačno inokulisani u 3 ml tečnih MM, na 30°C i mućkani su na 250 rpm/min, tokom 2 dana. Ćelije su sakupljene centrifugiranjem, resuspendovane su u HGM, a zatim su mućkane na 250 rpm/min, tokom 5 dana. Ćelije su sakupljene centrifugiranjem, lipidi su ekstrahovani, a metil estri masnih kiselina pripremljeni su trans-esterifikacijom, i sledstveno sa analizirani sa Hevvlett-Packard 6890
GC.
GC rezultati su prikazani ispod, u Tabeli 30. Smeše DPA i DHA su predstavljene kao % od ukupih masnih kiselina. Efikasnost konverzije ("Efikas. konv.") je izmerena prema sledećoj formuli: ([DHA]/[DPA + DHA])* 100. Aktivnost delta-4 desaturaze svakog skraćenog EgD4S<*>(t.j., polipeptida od 513 aminokiselina, 490 aminokiselina ili 474 aminokiselina uYarrowiatransformantima pZKL4-220Eg4-l, pZKL4-220Eg4-2, odnosno pZKL4-220Eg4-3) upoređena je sa onom za EgD4S (t.j.,Yarrowiatransformanti pZKL4-220Eg4) u koloni, koja je obeležena sa "% delta-4 aktivnosti".
Ovi podaci su pokazali da 28 N-terminalnih aminokiselina EgD4S<*>nije od značaja (t.j., vidi pZKL4-220Eg4-l, gde je prvih 28 aminokiselina EgD4S bilo skraćeno, a skraćeni protein, naveden kao SEQ ID NO:404, zadržao je punu aktivnost delta-4 desaturaze). Redukovana aktivnost delta-4 desaturaze izmerena je u transformantima sa pZKL4-220EgD4-2 i pZKL4-220EgD4-3, kada su dodatne aminokiseline bile skraćene sa 5' dela proteina EgD4S, proizvodeći, tako, SEQ ID NO:406 i SEQ ID NO:408.
PRIMER 54
Sinteza i funkcionalna analiza kodon- optimizovanog gena EgDHAsvnl ( EgDHAsvnl S)
izEuglene gracilisuYarrowii lipolvtici
Plazmid pZKLY-G204 (SLIKA 54A; SEQ ID NO:409) je dizajniran tako da integriše himerični gen, koji sadrži kodirajući region kodon-optimizovane EgDHAsvnl (t.j., EgDHAsvnl S, navedene kao SEQ ID NOi:410 i 411) u lokus lipaze 7 (GenBank Accession No. AJ549519) soja Y4305U3Yarrowie lipolytice.Pored modifikacije položaja translacione inicijacije, 417 bp od 2382 bp kodirajućeg regiona je modifikovano (17.5%), a 391 kodon od ukupno 794 kodona je bilo optimizovano (49.2%). Aminokiselinska sekvenca kodon-optimizovane EgDHAsvnl S (SEQ ID NO:411) je 100% identična u sekvenci kao što je ona EgDHAsvnl (SEQ ID NO: 12).
Da bi se proizveo pZKLY-G204,Kpnlpoložaj je uveden u pEgC20ES (SEQ ID NO:185; vidi SLIKU 51B, Primer 32), da bi se proizveo pEgC20ES-K (SEQ ID NO:412; SLIKA 54B) mutagenezom, usmerenom ka položaju, koristeći oligonukleotide YL973 i YL974 (SEQ ID NOi:413, odnosno 414), kao prajmere, i pEgC20ES, kao kalup.PmelINcolfragment, od 732 bp, koji sadrži YAT1 promoter (Patent Publication US 2006/0094102-A1) pYNTGUSl-CNP-a (SLIKA 54C; SEQ ID NO:415),Ncol/ Kpnlfragment pEgC20ES-K, koji sadrži kodon-optimizovani N-terminalni deo EgDHAsvnlS iKpnl/ Ncolfragment, od 1512 bp, pEgD4S (SEQ ID NO:389; Primer 52), koji sadrži kodon-optimizovani C-terminalni deo EgDHAsvnl S, bili su izolovani, a zatim korišćeni za zamenuPmel/ Notlfragmenta pZKLY (SLIKA 54D; SEQ ID NO:416), kako bi se proizveo pZKLY-G204 (SLIKA 54A). Stoga je pZKLY-G204 sadržavao sledeće komponente:
Plazmid pZKLY-G204 je svarensa AsclISphl,a zatim je transformisan u soju Y4305U3Yarrowie lipolytice,kao što je opisano u Opštim Postupcima. Transformisani sojevi su odabrani na MM pločama. Nakon 5 dana rasta na 30°C, 8 transformisanih sojeva, koji su porasli na MM pločama, bili su odabrani i ponovljeno zasejani na sveže MM ploče. Čim su porasli, ovi sojevi su pojedinačno inokulisani u 3 ml tečnih MM, na 30°C i mućkani su na 250 rpm/min, tokom 2 dana. Ćelije su sakupljene centrifugiranjem, resuspendovane su u HGM, a zatim su mućkane na 250 rpm/min, tokom 5 dana. Ćelije su sakupljene centrifugiranjem, lipidi su ekstrahovani, a metil estri masnih kiselina pripremljeni su trans-esterifikacijom, i sledstveno sa analizirani sa Hewlett-Packard 6890
GC.
GC analize su pokazale da se nalazi oko 5.0% DHA, 13.5% DPA i 26.5 % EPA od količine ukupnih lipida, proizvedenih u svih 8 transformisanih sojeva. Utvrđeno je da je efikasnost konverzije EPA u DPA i DHA bila oko 41%, i određeno je da je efikasnost konverzije DPA u DHA bila oko 27%, u svih osam sojeva (izračunato kao što je opisano u Primeru 27). Stoga su ovi eksperimentalni podaci pokazali da je sintetska DHA sintazaEuglene gracilis,koja je kodon-optimizovana za ekspresiju uYarrowii lipolytici(t.j., EgDHAsvnlS, kao što je navedeno u SEQ ID NO:410) uključivala i aktivnost C20 elongaze i aktivnost delta-4 desaturaze. EgDHAsvnlS je mogla koristiti EPA kao supstrat za proizvodnju DHA.
PRIMER 55
Kreiranje gena fuzija delta- 9 elongaza/ delta- 8 desaturaza za ekspresiju uYarrowii
lipolvtici
Da bi se poboljšala enzimska aktivnost delta-9 elongaze i delta-8 desaturaze uYarrowii lipolytici,kreirane su serije od šest genskih fuzija delta-9 elongaza/delta-8 (multizimi) u ovom Primeru, koristeći dve varijante sekvenci spojnice (t.j., SEQ ID NO:438 [GPARPAGLPPATYYDSLAV] i SEQ ID NO:445 [GAGPARPAGLPPATYYDSLAVMGS], koje su dobijene iz spojnice bogate prolinom EgDHAsvnl (SEQ ID NO: 198; PARPAGLPPATYYDSLAV).
Ovaj rad je zahtevao: identifikaciju pogodnih delta-9 elongaza i delta-8 desaturaza za ekspresiju uYarrowii lipolyticii konstruisanje: plazmida pZUFmG9G8fu (koji sadrži gen fuzije EgD9ES/EgD8M), plazmida pZuFmG9G8fu-B (koji sadrži gen fuzije EgD9ES/EgD8M), plazmida pZUFmG9A8 (koji sadrži gen fuzije EgD9ES/EaD8S), plazmida pZUFmA9G8 (koji sadrži gen fuzije EaD9ES/EgD8M), plazmida pZUFmA9A8 (koji sadrži gen fuzije EaD9ES/EaD8S) i plazmida pZUFmR9G8 (koji sadrži gen fuzije E389D9eS/EgD8M). Svi plazmidi su delili zajedničku vektorsku osovinu, tako da su se razlikovali jedino na osnovu gena fuzije, koji je svaki od njih sadržavao.
Funkcionalna analiza aktivnosti svakog gena fuzije ispitana jeinfra,u Primeru 56.
Opis sintetskih gena delta- 9 elongaze i delta- 8 desaturaze. kodon- optimizovanih za
ekspresiju uYarrowii lipolvtici
Podnosioci prijave su izvršili značajne analize raznih delta-9 elongaza i delta-8 desaturaza, kako bi se odredili oni enzimi, koji poseduju optimalnu supstratnu specifičnost i/ili supstratnu selektivnost, kada se ekspresuju uYarrowii lipolytici.Na osnovu ovih analiza, geni opisani dole u Tabeli 32 i kodon-optimizovani geni, dobijeni iz njih (na bazi postupaka U.S. Patenta 7,125,672) identifikovani su kao poželjni za ekspresiju uY. lipolytici.Oni geni, koji su istaknuti masnim slovima u tekstu, sledstveno su korišćeni za kreiranje gena fuzija delta-9 elongaza/delta-8 desaturaza.
Napomene za Tabelu 32, koja sledi:
<*>EgD9e je opisana kao "EgD9elo" u ovdašnjem Primeru 16.
<*>EaD9e je označena kao "EaD9Elol" u U.S. privremenoj patentnoj prijavi br. 60/911925 i u ovdašnjem Primeru 36.
<*>EgD8 je označena kao "Eg5" u U.S. Patentu 7,256,033.
<*>EgD8S je označena kao "D8SF" u U.S. Patentu 7,256,033
<*>EgD8M je označena kao "EgD8S-23" u U.S. patentnoj prijavi br. 11/635258.
Efikasnost konverzije LA u EDA EgD9eS, E389D9eS i EaD9eS je prikazana je u svakoj od, prethodno navedenih, prijava. Ukratko, međutim, kada je svaka delta-9 elongaza ekspresovana kao himerični gen u soju Y2224Yarrowie lipolytice(SLIKA 44), pod kontrolom FBAINm promoteraYarrowie(PCT Publication No. WO 2005/049805; U.S. Patent 7,202,356) i Pex20 terminatorne sekvece iz Pex20 genaYarrowie(GenBank Accession No. AF054613), nezavisno su izmerene sledeće konverzije supstrata: EgD9eS (20.1%); EaD9eS (13%) i E389D9eS (12%). Svi sintetski kodon-optimizovani geni funkcionisali su sa većom efikasnošću konverzije supstrata od odgovarajućeg gena divljeg tipa.
U.S. Patent 7,256,033 prikazuje delta-8 desaturazuE. gracilis("EgD8"), koji je u stanju da vrši desaturaciju EDA i EtrA u DGLA, odnosno ETA, kao i sintetsku delta-8 desaturazu, dobijenu iz EgD8 i kodon-optimizovanu za ekspresiju uYarrowii lipolytici("EgD8S"). Uprkos upotrebljivosti EgD8 i EgD8S, sintetski izgrađena mutant delta-8 desaturaza, koja je ovde identifikovana kao EgD8M (SEQ ID NOi:327 i 328) korišćena je u poželjnijim ostvarenjima za ekspresiju uYarrowii lipolytici.Kao što je opisano u U.S. Patent Application No. 11/635258, "EgD8M" (u prijavi identifikovan kao "EgD8S-23") je kreiran izvođenjem višestrukih rundi ciljanih mutacija unutar EgD8S. Efekat svake mutacije na aktivnost delta-8 desaturaze nastalog mutanta ispitan je kako bi se utvrdila funkcionalna ekvivalentnost sa aktivnošću delta-8 desaturaze EgD8S (SEQ ID NO:426). Kao rezultat ove izrade, mutant EgD8M (SEQ ID NO:328) sadrži sledeće 24 aminokiselinske mutacije s obzirom na sintetsku sekvencu kodon-optimizovane EgD8S, navedenu kao SEQ ID NO:426: 4S u A, 5K u S, 12T u V, 16T do K, 17T u V, 66P u Q, 67SuA, 108SuL, 117G u A, 118YuF, 120L u M, 121M u L, 125Q u H, 126M u L, 132V u L, 133L u V, 162L u V, 163V u L, 293L u M, 407A u S, 408V u Q, 418A u G, 419G u A i 422L u Q. Slaganje u vidu sparivanja sekvenci proteina EgD8M i EgD8S, koristeći default parametre programa Vector NTI<®>'s AlignX (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA), pokazalo je 94.3% istovetnosti sekvenci i 97.9% konsenzusa između dva proteina tokom dužine od 422 aminokiseline. Utvrđeno je da je srednja vrednost konverzije supstrata EDA u DGLA, pomoću ove mutant delta-8 desaturaze, 37%, kada je EgD8M ekspresovan u soju Y4001Yarrowie lipolytice(SLIKA 44), pod kontrolom FBAINm promoteraYarrowie(PCT Publication No. VVO 2005/049805; U.S. Patent 7,202,356) i Pex20 terminatorne sekvece iz Pex20 genaYarrowie(GenBank Accession No. AF054613).
Kada je EaD8S ekspresovan u soju Y4001UYarrowie lipolytice(SLIKA 44), pod kontrolom FBAINm promoteraYarrowieU.S. Patent 7,202,356) i Pex20 terminatorne sekvece iz Pex20 genaYarrowie(GenBank Accession No. AF054613), nađena je 41% efikasnost konverzije u DGLA sa endogenom EDA kao supstratom.
Proizvodnja konstrukcije pZUFmEgD9ES- Na. koja sadrži EgD9ES
Plazmid pZuFmEgD9ES (SEQ ID NO:431), koji je prethodno opisan u Patent Publication US 2007-0117190 Al, sadrži himerični FBAINm::EgD9ES::Pex20 gen, izvor replikacije CoIEl plazmid, ampicilin-rezistentni gen (Amp<R>) za selekciju uE. coli,autonomnu replikacionu sekvencuYarrowie(ARS18; GenBank Accession No. A17608) i Ura3 genYarrowie(GenBank Accession No. AJ306421).
Narlpoložaj je uveden u pZuFmEgD9ES, da bi se proizveo pZuFmEgD9ES-Na (SEQ ID NO:432) koristeći oligonukleotide YL989 i YL990 (SEQ ID NOi:433, odnosno 434), kao prajmere, i pZuFmEgD9ES, kao kalup. UvedeniNarlpoložaj (t.j., GGCGCC) lociran je neposredno pre translacionog stop kodona EgD9ES; prema tome, kodirajući region EgD9ES je rastegnut sa dve dodatne aminokiseline (t.j., glicinom i alaninom).
Proizvodnja konstrukcije pZUFmG9G8fu, koja sadrži gen fuzije EgD9ES/ EgD8M
N-terminalni deo EgD8M (SEQ ID NO:327) je amplifikovan uz pomoć PCR-a, koristeći oligonukleotide YL991 i YL992 (SEQ ID NOi:435, odnosno 436), kao prajmere i pK02UFm8A (SEQ ID NO:437) kao kalup. Oligonukleotid YL991 je sadržavaoNarlpoložaj na svom 5' kraju i DNK sekvencu, koja kodira modifikovanu varijantu spojnice, bogate prolinom, EgDHAsvnl (t.j., GPARPAGLPPATYYDSLAV, kao što je navedeno u SEQ ID NO:438 u odnosu na PARPAGLPPATYYDSLAV, kao što je navedeno u SEQ ID NO: 198). Ova spojnica je posedovala dodatni glicin na 5' kraju, u odnosu na spojnicu, bogatu prolinom, EgDHAsvnl (SEQ ID NO: 198).
NarllBgRlsvareni PCR proizvod, koji sadrži 5' deo EgD8M iBgllllNotI svareni fragment pK02UFm8A, koji sadrži 3' deo EgD8M, korišćen je za zamenuNarllNotI fragmenta pZUFmEgD9ES-Na, da bi se proizveo pZUFmG9G8fu (SLIKA 55A), koji je, otuda, sadržavao sledeće komponente:
Proizvodnja konstrukcije pZuFmG9G8fu- B, koja sadrži gen fuzije EgD9ES/ EgD8M
BamHI položaj (t.j, GGATCC) je uveden u pZUFmG9G8fu, da bi se proizveo pZUFmG9G8fu-B (SEQ ID NO:442) koristeći oligonukleotide YL1043 i YL1044 (SEQ ID NOi:443, odnosno 444), kao prajmere, i pZuFmG9G8fu, kao kalup.BamHlpoložaj je lociran neposredno iza translacionog start kodona ATG, i nalazio se u okviru za čitanje EgD8M, što je dovelo do umetanja dve aminokiseline (t.j., glicina i serina) između aminokiselinskog ostatka metionina i preostalog dela polipeptida EgD8M. Ova modifikacija je bila uzrok da region spojnice između EgD9ES i EgD8M postane peptid, koji ima sekvencu, navedenu kao SEQ ID NO:445 (t.j, GAGPARPAGLPPATYYDSLAVMGS); sekvenca nukleotida i translatovane aminokiseline gena fuzije EgD9ES/EgD8M pune dužine navedena je kao SEQ ID NOi:446, odnosno 447.
Proizvodnja konstrukcije pZUFmG9A8, koja sadrži gen fuzije EgD9ES/ EaD8S
Plazmid pEaD8S (SEQ ID NO:448) je stvoren kada je gen EaD8S (SEQ ID NO:429) bio kloniran u pUC57 (GenBank Accession No. Y14837). Zatim,BamHlpoložaj je uveden u pEaD8S, koristeći oligonukleotide YL1059 i YL1060 (SEQ ID NOi:449, odnosno 450), kao prajmere, i pEaD8S, kao kalup, da bi se proizveo pEaD8S-B (SEQ ID NO:451). UvedeniBamHI položaj (t.j, GGATCC) je lociran neposredno pre translacionog start kodona EaD8S u pEaD8S-B i u istom je okviru za čitanje sa EaD8S.
BamHlINotlfragment pEaD8S-B, koji sadrži EaD8S, korišćen je za zamenuBamHlINotlfragmenta pZUFmG9G8fu-B (SEQ ID NO:442), da bi se proizveo pZUFmG9A8 (SEQ ID NO:452; SLIKA 55B) (uvodeći, tako EaD8S umesto EgD8M). Region spojnice između EgD9ES i EaD8S bio je peptid, koji ima sekvencu navedenu u SEQ ID NO:445 (t.j, GAGPARPAGLPPATYYDSLAVMGS). Tako je plazmid pZUFmG9A8 sadržavao gen fuzije EgD9ES/EaD8S, zaposednut FBAINm promoteromYarrowie lipolyticei Pex20 terminatorom (GenBank Accession No. AF054613). Sekvenca nukleotida i translatovane aminokiseline gena fuzije EgD9ES/EaD8S pune dužine navedena je kao SEQ ID NOi:453, odnosno 454.
Proizvodnja konstrukcije pZUFmA9G8. koja sadrži gen fuzije EaD9ES/ EgD8M
Plazmid pZUFmEaD9ES (SEQ ID NO:455) je sadržavao EaD9ES gen, zaposednut FBAINm promoteromYarrowie lipolyticei Pex20 terminatorom (GenBank
Accession No. AF054613).Narlpoložaj je uveden u plazmid, da bi se proizveo pZUFmEaD9ES-Na (SEQ ID NO:456), koristeći oligonukleotide YL1049 i YL1050 (SEQ ID NOi:457, odnosno 458), kao prajmere, i pZUFmEaD9ES, kao kalup. UvedeniNarlpoložaj (t.j, GGCGCC) je lociran neposredno pre translacionog stop kodona EaD9ES, i u istom je okviru za čitanje EaD9ES.
Nco l/ NarI fragment pZUFmEaD9ES-Na (SEQ ID NO:456), koji sadrži EaD9ES, korišćen je za zamenuNcolINarlfragmenta pZUFmG9G8fu-B (SEQ ID NO:442), kako bi se proizveo pZUFmA9G8 (SEQ ID NO:459) (uvodeći, na taj način, EaD9ES umesto EgD9ES). Region spojnice između EaD9ES i EgD8M bio je peptid, koji ima sekvencu navedenu u SEQ ID NO:445 (t.j, GAGPARPAGLPPATYYDSLAVMGS). Tako je plazmid pZUFmA9G8 sadržavao gen fuzije EaD9ES/EgD8M, zaposednut FBAINm promoteromYarrowie lipolyticei Pex20 terminatorom (GenBank Accession No. AF054613). Sekvenca nukleotida i translatovane aminokiseline gena fuzije EaD9ES/EgD8M pune dužine navedena je kao SEQ ID NOi:460, odnosno 461.
Proizvodnja konstrukcije pZUFmA9A8, koja sadrži gen fuzije EaD9ES/ EaD8S
BamH l/ NotI fragment pEaD8S-B (SEQ ID NO:451), koji sadrži EaD8S, korišćenje za zamenuBamHlINotlfragmenta pZUFmA9G8 (SEQ ID NO:459), da bi se proizveo pZUFmA9A8 (SEQ ID NO:462) (uvodeći, tako EaD8S umesto EgD8M). Region spojnice između EaD9ES i EaD8S bio je peptid, koji ima sekvencu navedenu u SEQ ID NO:445 (t.j, GAGPARPAGLPPATYYDSLAVMGS). Tako je plazmid pZUFmA9A8 sadržavao gen fuzije EaD9ES/EaD8S, zaposednut FBAINm promoteromYarrowie lipolyticei Pex20 terminatorom (GenBank Accession No. AF054613). Sekvenca nukleotida i translatovane aminokiseline gena fuzije EaD9ES/EaD8S pune dužine navedena je kao SEQ ID NOi:463, odnosno 464.
Proizvodnja konstrukcije pZUFmR9G8, koja sadrži gen fuzije E389D9eS/ EgD8M
Plazmid pE389S (SEQ ID NO:465) je kreiran kada je gen E389D9eS (SEQ ID NO:358) bio kloniran u pUC57 (GenBank Accession No. Y14837). Zatim,Narlpoložaj je uveden u pE389S, da bi se proizveo pE389S-Na (SEQ ID NO:466), koristeći oligonukleotide YL1051 i YL1052 (SEQ ID NOi:467, odnosno 468), kao prajmere, i pE389S, kao kalup. UvedeniNarl(t.j, GGCGCC) položaj je lociran neposredno pre translacionog stop kodona i bio je u istom okviru za čitanje E389D9eS.
Nco l/ NarI fragment pE389S-Na, koji sadrži E389D9eS, korišćen je za zamenuNco l/ Nar Ifragmenta pZUFmG9G8fu-B, koji sadrži EgD9ES, da bi se proizveo pZUFmR9G8 (SEQ ID NO:469) (uvodeći, tako E389D9eS umesto EgD9ES). Region spojnice između E389D9eS i EgD8M bio je peptid, koji ima sekvencu navedenu u SEQ ID NO:445 (t.j, GAGPARPAGLPPATYYDSLAVMGS). Tako je plazmid pZUFmR9G8 sadržavao gen fuzije E389D9eS/EgD8M, zaposednut FBAINm promoteromYarrowie lipolyticei Pex20 terminatorom (GenBank Accession No. AF054613). Sekvenca nukleotida i translatovane aminokiseline pune dužine gena fuzije E389D9eS/EgD8M navedena je kao SEQ ID NOi:470, odnosno 471.
PRIMER 56
Funkcionalna analiza gena fuzija delta- 9 elongaza/ delta- 8 desaturaza u soju Y2224
Yarrowie lipolvtice
Plazmidi iz Primera 55 [t.j, pZUFmEgD9ES (SEQ ID NO:431), pZUFMEgD9ES-Na (SEQ ID NO:432), pZUFMG9G8fu (SEQ ID NO:439), pZUFmG9G8fu-B (SEQ ID N0.442), pZUFmG9A8 (SEQ ID NO:452), pZUFmA9G8 (SEQ ID NO:459), pZuFmA9A8 (SEQ ID NO:462) i pZUFmR9G8 (SEQ ID NO:469)] pojedinačno su transformisani u soju Y2224Yarrowie lipolytice,kao što je opisano u Opštim Postupcima. Transformisani sojevi su odabrani na MM pločama. Nakon 2 dana rasta na 30°C, osam transformisanih sojeva iz svake reakcije transformacije zasejano je na nove MM ploče i inkubirano tokom dodatna 2 dana na 30°C. Čim su porasli, ovi sojevi su pojedinačno inokulisani u 3 ml tečnih MM, na 30°C i mućkani su na 250 rpm/min, tokom 2 dana. Ćelije su sakupljene centrifugiranjem, supernatant je odstranjen i dodato je 3 mL HGM. Ovi sojevi su rasli u inkubatoru na 30°C, uz mućkanje na 250 rpm, tokom dodatnih 5 dana. Ćelije su sakupljene centrifugiranjem, lipidi su ekstrahovani, a metil estri masnih kiselina pripremljeni su trans-esterifikacijom, i sledstveno sa analizirani sa Hevvlett-Packard 6890 GC.
GC analize su pokazale da postoje obe aktivosti, i delta-9 elongaze i delta-8 desaturaze u svim sojevima, koji imaju gen fuzije delta-9 elongaza/delta-8 desaturaza. Rezultati su sažeto prikazani ispod, u Tabeli 34. Aktivnost delta-9 elongaze je izračunata deljenjem zbira težinskog procenta (tež %) za EDA i DGLA sa zbirom tež % za LA, EDA i DGLA i množenjem sa 100, da bi se izrazila kao procenat; na sličan način, aktivnost delta-8 desaturaze je izračunata deljenjem tež % za DGLA sa zbirom tež % za EDA i DGLA i množenjem sa 100, da bi se izrazila kao procenat.
Aktivnosti delta- 9 elongaze i delta- 8 desaturaze uYarrowii .transformisane raznim
genskim fuzijama
U sažetku Tabele 34, podaci su pokazali da je svih šest fuzionih gena posedovalo aktivnosti delta-9 elongaze i delta-8 desaturaze; tako, fuzioni proteini iz fuzionih gena efikasno omogućuju ekspresiju dva nezavisne enzimske aktivnosti, koje se mogu odvojiti. Još važnije, spajanje dva nezavisna enzima zajedno u vidu jednog fuzionog proteina, uz razdvajanje regionom spojnice, povećavalo je fluks iz LA u DGLA. U svim slučajevima, fuzioni gen je imao veću aktivnost nego najmanje jedan od pojedinačnih gena, kada je ekspresovan zasebno uYarrowii.Ovi podaci su sugerisali da proizvod delta-9 elongaze može biti direktno proveden kao supstrat delta-8 desaturaze u fuzionom proteinu.
Još specifičnije, u slučaju gena fuzije EgD9ES/EgD8M (t.j, pZuFmG9G8fu-B) i gena fuzije EgD9ES/EaD8S (t.j,PZuFmG9A8), delta-9 elongaza EgD9ES (21% konverzija) je vršila aktivnost na način, koji se može porediti sa onim kada se EgD9ES ekspresuje zasebno (20% konverzija [podaci pZuFmEgD9ES i Primer 55]). Suprotno tome, međutim, aktivnost delta-8 desaturaze EgD8M uYarrowii,koja ekspresuje pZuFmG9G8-B je bila otprilike 97% efikasnija nego kada se EgD8M ekspresuje zasebno (73% prema 37% konverzije [Primer 55]). Slično, aktivnost delta-8 desaturaze EaD8S uYarrowii,koja ekspresuje pZuFmG9A8 je bila otprilike 63% efikasnija nego kada se EaD8S ekspresuje zasebno (67% prema 41%> konverzije [Primer 55]).
U slučaju gena fuzije EaD9ES/EgD8M (t.j, pZuFmA9G8) i gena fuzije EaD9ES/EaD8S (t.j, pZuFmA9A8), aktivnost delta-9 elongaza EaD9ES je bila oko 15%, odnosno 38%> efikasnija, nego kada se EaD9ES ekspresuje zasebno (15%, odnosno 18% konverzije prema 13%) konverzije [Primer 55]). Isto tako, aktivnost delta-8 desaturaze EgD8M uYarrowii,koja ekspresuje pZuFmA9G8 je bila otprilike 46%) efikasnija nego kada se EgD8M ekspresuje zasebno (54% prema 37% konverzije [Primer 55]). Slično, aktivnost delta-8 desaturaze EaD8S uYarrowii,koja ekspresuje pZuFmA9A8 je bila otprilike 32% efikasnija nego kada se EaD8S ekspresuje zasebno (58% prema 41% konverzije [Primer 55]).
Konačno, u slučaju gena fuzije E389D9eS/EgD8M (t.j, pZuFmR9G8), aktivnost delta-9 elongaza E389D9eS je bila oko 50% efikasnija, nego kada se E389D9eS ekspresuje zasebno (18%o prema 12% konverzije [Primer 55]). Isto tako, aktivnost delta-8 desaturaze EgD8M uYarrowii,koja ekspresuje pZuFmR9G8 je bila otprilike 89% efikasnija nego kada se EgD8M ekspresuje zasebno (70% prema 37% konverzije [Primer 55]).
Tabela 34, takođe je pokazala da je modifikovana spojnica GAGPARPAGLPPATYYDSLAVMGS (SEQ ID NO:445) bila poželjna kada se suprotstavi spojnici, navedenoj kao SEQ ID NO:438 uYarrowii lipolytici,kada se geni delta-9 elongaze i delta-8 desatuaze spajaju zajedno.
Stručnom licu u ovoj oblasti biće očigledno da drugi geni desaturaze i elongaze PUFA, koji su poželjni za ekspresiju uYarrowii lipolytici(uključujući, na primer, bilo koji od onih gena, koji su opisani u Tabelama 8-19) mogu biti spojeni zajedno na način, sličan onom, koji je prethodno opisan, i ekspresovani uYarrowii lipolytici.Poželjni promoteri i terminatori, koji su pogodni za konstruisanje ekspresione kasete (u kojoj ekspresovani ORF kodira multizim) mogu biti odabrani od onih, koji su opisani u Tabelama 8-19. Pretpostavlja se da bi se povećana efikasnost ili fluks mogla zapaziti u fuzionom genu kada se suprotstavi situaciji kada se jedan (ili oba) pojedinačna gena ekspresuju odvojeno.
PRIMER 57
Kreiranje genskih fuzija delta- 9 elongaza/ delta- 8 desaturaza za ekspresiju u soji
Da bi se okarakterisale fuzije multizima između delta-9 elongaza i delta-8 desaturaza u soji, kreirane su serije delta-9 elongaza/delta-8 multizima. Domeni delta-9 elongaze i delta-8 desaturaze su razdvojeni prolinom bogatom spojnicom EgDHAsvnl (SEQ ID NO: 198). Zbog poređenja, takođe su kreirane konstrukcije koje ko-ekspresuju pojedinačne gene delta-9 elongaze i delta-8 desaturaze. Korišćene delta-9 elongaze uključuju EgD9elo (Primer 16; SEQ ID NO: 112; ovde takođe označena kao EgD9e i EgD9E, ali su one identične) i EaD9elol (SEQ ID NO:252; Primer 36; ovde takođe označena kao EaD9E i EaD9e, ali su sve one identične). Korišćene delta-8 desaturaze uključuju TpomD8 (SEQ ID NO:162; Primer 21) i delta-8 desaturazu Euglena anabaene (EaD8Des3; SEQ ID NO:427; ovde takođe označena kao EaD8, ali su one identične; opisana u U.S. Provisional Application No. 60/910831 (prijavljena 10. aprila 2007.; Attorney Docket No. BB-1615).
U ovom Primeru i Primeru 23, koji opisuje sintezu fuzije EgD9elo-EgDHAsynlLink-PavD8, dodatni nukleotidi su dodati na 3' kraj sekvence prolinom bogate spojnice EgDHAsynl, da bi se omogućilo kloniranje, kada se izrađuju fuzije za sve konstrukcije. Tako su dodatne 4 aminokiseline uključene između kraja prolinom bogate spojnice EgDHAsynl (SEQ ID NO: 198; PARPAGLPPATYYDSLAV) i početka upotrebljene delta-8 desaturaze (t.j, SEQ ID NO:472;
PARPAGLPPATYYDSLAVSGRT).
Plazmid pKRl 183 (SEQ ID NO:266), koji sadrži fuziju delta-9 elongaza Euglene anabaene-delta-8 desaturaza Tetruetreptie pomquetensis (Hibridl-HGLA sintaza; takođe nazvana EaD9e/TpomD8) opisan je u Primeru 38.
Ostali plazmidi, koji su opisani u ovom primeru, uključuju: pKRl014 (opisan u U.S. Patent Application No. 11/876,115 (prijavljena 22. oktobra 2007.; Attornev Docket No. BB-1574; koji sadrži EgD9e i TpomD8, ekspresovane pojedinačno), pKR1152 (koji sadrži EgD9e i EaD8, ekspresovane pojedinačno), pKR1151 (koji sadrži EaD9e i TpomD8, ekspresovane pojedinačno), pKR1150 (koji sadrži EaD9e i EaD8, ekspresovane pojedinačno), pKRl 184 (koji sadrži gensku fuziju EaD9e/EaD8), pKRl 199 (koji sadrži fuziju gena EgD9e/TpomD8) i pKR1200 (koji sadrži gensku fuziju EgD9e/EaD8). Sažeti prikaz izrađenih konstrukcija i pojedinih gena, testiranih zajedno sa proizvedenim SEQ ID NOi za nukleotidne i aminokiselinske sekvence, prikazan je u Tabeli 35.
Funkcionalna analiza aktivnosti svake fuzije gena testirana je u nastavku, u Primeru 60.
Konstruisanje pKR1014
Vektor pKR123r, koji je prethodno opisan u PCT Publication No. WO 2004/071467 (publikovana 26. avgusta 2004.) sadržiNotipoložaj, zaposednut promoterom Kunitz inhibitora tripsina soje (KTi3)(Jofuku et al,Plant Cell 1:1079-1093
(1989)) i KTi 3' terminacionim regionom, čija izoloacija je opisana u U.S. Patentu No. 6,372,965 (kaseta KTi3/JVM/KTi3'). TpomD8 (SEQ ID NO.T62; Primer 21) je oslobođena iz pLFl 14-10 (SEQ ID NO:165; Primer 21), digestijom saNotii klonirana je uNotipoložaj pKR123r, da bi se proizveo pKR1007 (SEQ ID NO:473).
Vektor pKR912, koji je prethodno opisan u US-2007-0118929-A1 i publikovan 24. maja 2007, sadrži gen higromicin B fosfotransferaze, zaposednut 35S promoterom (Odell et al.Nature313:810-812 (1985)) i NOS 3'transkripcionim terminatorom (Depicker et al,J. Mol. Appl. Genet.1:561-570 (1982)) (kaseta 35S/hpt/NOS3') za selekciju u biljkama, kao što je soja. Vektor pKR912, takođe, sadrži EgD9e (SEQ ID NO:112), zaposednut promoterom a' subjedinice P-konglicinina (Beachy et al,EMBO J.4:3047-3053 (1985)) i 3' transkripcionim terminacionim regionom gena fazeolina (Doyle et al,J. Biol. Chem.261:9228-9238 (1986)), omogućujući, na taj način, snažnu, tkivno-specifičnu ekspresiju EgD9e u semenju soje.
Plazmid pKR1007 (SEQ ID NO:473) je svaren sa Pstl, a fragment, koji sadrži delta-8 desaturazu Tetruetreptie pomquetensis kloniranje u Sbfl položaj pKR912, da bi se dobio pKR1014 (SEQ ID N0.474). Na ovaj način, delta-8 desaturaza Tetruetreptie pomqutensis je ko-ekspresovana sa delta-9 elongazom Euglene gracilis iza snažnih promotera, specifičnih za seme. Šematski prikaz pKR1014 je dat na SLICI 56. Na SLICI 56, TpomD8 je nazvana delta-8 desaturaza Tetruetreptie pomqutensis 1491, a EgD9e je nazvan eug ell.
Konstrukcija pKRl 151
Da bi se uveliNotiiNcolrestriktivni položaji na 5' kraju kodirajućih sekvenci iNotipoložaj na 3' kraj kodirajućih sekvenci, EaD8 (SEQ ID NO:427) je amplifikovan sa oligonukleotidnim prajmerima EaD8-5 (SEQ ID NO:475) i EaD8-3 (SEQ ID NO.-476), koristeći Phusion™ High-Fidelity DNA Polymerase (Kat. Br. F553S, Finnzymes Oy, Finska), sledeći protokol proizvođača. Nastali fragment DNK je kloniran u pCR-Blunt<®>klonirajući vektor, korišćenjem kompleta Zero Blunt<®>PCR Cloning Kit
(Invitrogen Corporation), sledeći protokol proizvođača, da bi se proizveo pLF 120-3 (SEQ ID NO:477).
Vektor pLF 120-3 (SEQ ID NO:477) je svaren sa Noti, a fragment, koji sadrži EaD8, kloniran je uNotipoložaj pKR457 (SEQ ID NO: 122; Primer 16), da bi se proizveo pKRl 138 (SEQ ID NO:478).
Vektor pKR1138 (SEQ ID NO:478) je svaren sa BsiVVI, a fragment, koji sadrži EaD8, kloniranje u BsiVVI položaj pKR912, da bi se dobio pKR1152 (SEQ ID NO:479). Šematski prikaz pKR1152 je dat na SLICI 57. Na SLICI 57, EaD8 je nazvan EaD8Des3, a EgD9e je nazvan eug ell.
Konstrukcija pKRl 152
Da bi se uveli Noti i Ncol restriktivni položaji na 5' kraj kodirajućih sekvenci i Noti položaj na 3' kraj kodirajućih sekvenci, EaD9e je PCR-om amplifikovana iz pLF121-l (SEQ ID NO:250; Primer 36) sa oligonukleotidnim prajmerima oEAd9ell-l (SEQ ID NO.-298; Primer 44) i oEAd9ell-2 (SEQ ID NO:480), koristeći Phusion™ High-Fidelity DNA Polymerase (Kat. Br. F553S, Finnzymes Oy, Finska), sledeći protokol proizvođača. Nastali fragmenti DNK klonirani su u pCR-Blunt klonirajući vektor, korišćenjem kompleta Zero Blunt PCR Cloning Kit (Invitrogen Corporation), sledeći protokol proizvođača, da bi se proizveo pKR1137 (SEQ ID NO:481).
EaD9e je oslobođena iz pKR1137 (SEQ ID NO:481), digestijom sa Noti i klonirana je u Noti položaj pKR72 (SEQ ID NO: 105; Primer 15), da bi se proizveo pKRl 140 (SEQ ID NO:482).
TpomD8 je oslobođena iz pLFl 14-10 (SEQ ID NO:165; Primer 21), digestijom saNotii klonirana je uNotipoložaj plazmida pKR457 (SEQ ID NO:122; Primer 16), kako bi se proizveo pKR1145 (SEQ ID NO:483).
Vektor pKRl 145 (SEQ ID NO:483) je svaren sa BsiVVI, a fragment, koji sadrži TpomD8, kloniranje u BsiVVI položaj pKRl 140 (SEQ ID NO:482), da bi se dobio pKRl 151 (SEQ ID NO:484). Šematski prikaz pKRl 151 dat je na SLICI 58. Na SLICI 58, s TpomD8 je nazvan delta-8 desaturaza Tetruetreptie pomquetensis 1491, a EaD9e je nazvana EAd9elong.
Konstrukcija pKRl 150
Vektor pKRl 138 (SEQ ID NO:478) je svaren sa BsiVVI, a fragment, koji sadrži EaD8, kloniranje u BsiVVI položaj pKR1140 (SEQ ID NO:482), kako bi se dobio pKRl 150 (SEQ ID NO:485). Šematski prikaz pKR1150 dat je na SLICI 59. Na SLICI 59, EaD8 je nazvana EaD8Des3, a EaD9e je nazvana EAd9elong.
Konstrukcija pKRl 199
NcoVNotlDNK fragment KS373 (SEQ ID NO: 179; Primer 23), koji sadrži EgD9elo-EgDHAsynlLink, kloniranje uNcoVNotlfragment DNK iz pKRl 177 (SEQ ID NO:264; Primer 38), koji sadrži promoter za a' subjedinicu (3-konglicinina, da bi se proizveo pKRl 190 (SEQ ID NO:486).
Notifragment iz pLF 114-10 (SEQ ID NO: 165; Primer 21), koji sadrži TpomD8, kloniran je uNotifragment pKRl 190 (SEQ ID NO:486), da bi se proizveo pKRl 195 (SEQ ID NO:487).
BamHlDNK fragment pKR1195 (SEQ ID NO:487), koji sadrži gen fuzije EgD9e/TpomD8, kloniran je uBamRlfragment DNK pKR325, koji je prethodno opisan u PCT Publication No. VVO 2006/12325, da bi se proizveo pKRl 199 (SEQ ID NO:488). Šematski prikaz pKR1199 dat je na SLICI 60. Na SLICI 60, EgD9e/TpomD8 je nazvan EGd9elong-TPOMd8DS.
Konstrukcija pKR1200
Notifragment iz pLF120-3 (SEQ ID NO:477), koji sadrži EaD8, kloniranje uNotifragment pKR1190 (SEQ ID NO:486), da bi se proizveo pKR1196 (SEQ ID NO:489).
BamHlDNK fragment pKR1196 (SEQ ID NO:489), koji sadrži gen fuzije EgD9e/EaD8, kloniran je uBamHlfragment DNK pKR325, koji je prethodno opisan u PCT Publication No. VVO 2006/12325, da bi se proizveo pKR1200 (SEQ ID NO:490). Šematski prikaz pKR1200 dat je na SLICI 61. Na SLICI 61, EgD9e/EaD8 je nazvan EGd9ELONG-E Ad8DS.
Konstrukcija pKRl 184
Notifragment iz pLF 120-3 (SEQ ID NO:477), koji sadrži EaD8, kloniranje uNotifragment pKRl 179 (SEQ ID NO:265) da bi se proizveo pKRl 184 (SEQ ID NO:491). Šematski prikaz pKR1184 dat je na SLICI 62. Na SLICI 62, EaD9e/EaD8 je nazvan EAd9ELONG-EAd8DS.
PRIMER 58
Konstrukcija ekspresionog vektora soje pKR1321 za ekspresiju<g>ena fuzije delta- 8
desaturazaTetruetreptie pomguetensisCCMP 1491- delta- 9 elon<g>azaEu<g>lene anabaene
( TpomD8- EaD9Elol fusion)
Ovaj primer opisuje konstruisanje gena fuzije unutar okvira između delta-8 desaturazeTetruetreptie pomguetensisCCMP1491 (TpomD8; SEQ ID NO:162; Primer 21) i delta-9 elongazeEuglene anabaene(EaD9e; SEQ ID NO:252; Primer 36). Svaki domen je odvojen EgDHAsvnl spojnicom, sa 4 dodatne aminokiseline uključene između kraja, prolinom bogate, spojnice EgDHAsvnl i početka EaD9e, kao što je opisano u Primeru 57 (t.j., SEQ ID NO:472; PARPAGLPPATYYDSLAVSGRT).
Plazmid pKR1301 (SEQ ID NO:307; Primer 44) je svaren saEcoRl,a fragment DNK, koji sadrži 3' kraj TpomD8-EgDHAsynILink (nazvan TpomD8+LlTRl) je ponovno povezan, da bi se obrazovao pKR1303 (SEQ ID NO:497).
Noti fragment pKRl 137 (SEQ ID NO:481; Primer 57), koji sadrži EaD9e, kloniran je uEaglpoložaj pKR1303 (SEQ ID NO:497), da bi se proizveo pKR1308 (SEQ ID NO:498). Na ovaj način, EaD9e je spojen sa 3' krajem TpomDS.
Kaseta Gyl/Pavelo/legA2 je oslobođena iz plazmida pKR336 (opisan u PCT Publication Nos. WO 04/071467; čiji sadržaji su ovde uključeni posredstvom reference), digestijom sa Pstl/BamHI i klonirana je u Pstl/BamHI položaj pKR268 (opisan u PCT Publication Nos. WO 04/071467), da bi se proizveo pKR393 (SEQ ID NO:499). Pavelo gen je oslobođen iz pKR393 (SEQ ID NO:499) digestijom sa Noti, a vektor je ponovno povezan, da bi se obrazovao pKR407 (SEQ ID NO:500).
TpomD8 je oslobođena iz pLF 114-10 (SEQ TD NO: 165; Primer 21), digestijom saNotii klonirana je uNotipoložaj plazmida pKR407 (SEQ ID NO:500), kako bi se proizveo pKR1018 (SEQ ID NO:501).
Plazmid pKR1018 (SEQ ID NO:501) je svaren sa Hindlll/EcoRI, a fragment, koji sadrži 5' kraj Tpomd8, kloniranje u Hindlll/EcoRI položaj pKR1308 (SEQ ID NO:498), da bi se dobio pKR1312 (SEQ ID NO:502). Na ovaj način, ponovno je uspostavljena sekvenca TpomD8 i obrazovana je fuzija TpomD8/EaD9e.
Noti fragment pKR1312 (SEQ ID NO:502), koji sadrži fuziju TpomD8/EaD9e, kloniranje u Noti položaj pKR72 (SEQ ID NO: 105; Primer 23), da bi se proizveo pKR1321 (SEQ ID NO.503). Šematski prikaz pKR1321 dat je na SLICI 63. Na SLICI 63, TpomD8/EaD9e se naziva TPd8ds/EAd9el fusion.
PRIMER 59
Konstrukcija ekspresionog vektora soje pKR1326 za ekspresiju gena fuzije delta- 9
elongazaEuglene anabaene -delta- 8 desaturazaTetruetreptie pomguetensisCCMP 1491,
koristeći prolinom bogatu spojnicu DHAsvnl Euglene anabaene
Ovaj primer opisuje konstruisanje gena fuzije unutar okvira između delta-9 elongazeEuglene anabaene(EaD9e; SEQ ID NO:252, Primer 36) i delta-8 desaturazeTetruetreptie pomquetensisCCMP1491 (TpomD8; SEQ ID NO:162; Primer 21). Svaki domen je odvojen, prolinom bogatom, spojnicom EaDHAsvnl (SEQ ID NO:235), ali sa 3 dodatne aminokiseline, uključene između kraja, prolinom bogate, spojnice EaDHAsvnl (EaDHAsvnlLink) i početka EaD9e (t.j, SEQ ID NO:504; PGGPGKPSEIASLPPPIRPVGNPPAAYYDALATGRT). Kloniranje je izvršeno kao što je, na sličan način, opisano u Primeru 57.
Inicijalna fuzija unutar okvira između EaD9e i EaDHAsvnlLink (EaD9elo-EgDHAsvnlLink) je izvršena PCR amplifikacijom, a bila je zaposednuta Noti iNcolpoložajem na 5' kraju iNotipoložajem na 3' kraju. EaD9e (SEQ ID NO:252) je amplifikovana iz pLF121-l (SEQ ID NO:250) sa oligonukleotidima oEAd9ell-l (SEQ ID NO:298) i EaLinkl (SEQ ID NO:505), koristeći Phusion™ High-Fidelity DNA Polymerase (Kat. Br. F553S, Finnzvmes Oy, Finska), sledeći protokol proizvođača. EaDHAsynlLink (SEQ ID NO:234) je amplifikovana na sličan način, iz pLFl 17-1 (SEQ ID NO:87; Primer 13) sa oligonukleotidima EaLink2 (SEQ ID NO:506) i EaLink3 (SEQ ID NO:507). Dva proistekla PCR proizvoda su sjedinjena i ponovno amplifikovana, korišćenjem oEAd9ell-l (SEQ ID NO:298) i EaLink3 (SEQ ID NO:507), da bi se obrazovala EaD9e-EaDHAsynILink. Sekvenca EaD9e-EaDHAsynILink je prikazana u SEQ ID NO.508. EaD9e-EaDHAsynlLink je klonirana u pCR-Blunt<®>klonirajući vektor, korišćenjem kompleta Zero Blunt<®>PCR Cloning Kit (Invitrogen Corporation), sledeći protokol proizvođača, kako bi se proizveo pKR1305 (SEQ ID NO:509).
EaglDNK fragment pKR1305 (SEQ ID NO:509), koji sadrži EaD9e-EaDHAsynlLink, kloniranje uNotipoložaj pKR1304 (SEQ ID NO:310; Primer 44), da bi se proizveo pKR1317 (SEQ ID NO:510). Na ovaj način, 5' kraj TpomD8 je spojen sa EaD9e-EaDHAsyn 1 Link-om.
EcoRI/Asp718 fragment pKRl 127 (SEQ ID NO:168; Primer 22), koji sadrži 3' kraj TpomD8, kloniranje u EcoRI/Asp718 fragment pKR1317 (SEQ ID NO:510), koji sadrži EaD9e-EaDHAsynILink, da bi se proizveo pKR1320 (SEQ ID NO:511).
Notifragment iz pKR1320 (SEQ ID NO:511), koji sadrži fuziju, kloniranje uNotifragment pKR72 (SEQ ID NO:105; Primer 15), da bi se proizveo pKR1326 (SEQ ID NO:512). Šematski prikaz pKR1326 dat je na SLICI 64. Na SLICI 64, EaD9e/TpomD8 sa, prolinom bogatom, spojnicom EaDHAsynl naziva se EAd9el-TPOMd8ds L2fusion.
PRIMER 60
Funkcionalna analiza genskih fuzija delta- 9 elongaza/ delta- 8 desaturaza u soji
Ovaj primer opisuje transformisanje i ekspresiju u somatskim embrionima soje pKR1014 (SEQ ID NO:474), pKR1152 (SEQ ID NO:479), pKR1151 (SEQ ID NO:484), pKRl 150 (SEQ ID N0.485), pKRl 199 (SEQ ID NO:488), pKR1200 (SEQ ID NO:490) i pKR1184 (SEQ ID NO:491), čije sinteze su prethodno opisane u Primeru 57. Funkcionalne analize pKR1183 (SEQ ID NO:266) i KS373 (SEQ ID NO: 179) su prethodno opisane u Primerima 46, odnosno 31.
Embriogena suspenziona kultura soje (cv. Jack) je transformisana sa svakim od prethodnih vektora, a embrioni su sazrevali u tečnom medijumu za histodiferencijaciju i sazrevanje soje (SHaM tečni medijumi; Schmidt et al,Cell Biology and Morphogenesis,24:393 (2005)) kao što je opisano u Primeru 25 i prethodno opisano u PCT Publication No. WO 2007/136877, publikovanoj 29. novembra 2007. (čiji sadržaji su ovde uključeni posredstvom reference).
Nakon sazrevanja u SHaM tečnim medijumima, podgrupa transformisanih embriona soje (t.j, 5-6 embriona po slučaju) sakupljena je i analizirana, kao što je ovde opisano.
Na ovaj način, analizirano je približno 30 slučajeva, transformisanih sa pKR1014 (SEQ ID NO:474), pKR1152 (SEQ ID NO:479), pKR1151 (SEQ ID NO:484), pKR1150 (SEQ ID NO:485), pKR1199 (SEQ ID NO:488), pKR1200 (SEQ ID NO:490) ili pKRl 184 (SEQ ID NO:491). Pet slučajeva, koji imaju najveći prosečni sadržaj DGLA
(prošek od 5 analiziranih embriona) prikazano je na SLIKAMA 65, 66, 67, 68, 69, 70, odnosno 71. Na Slikama 65-71, masne kiseline su identifikovane kao: 16:0 (palmitat), 18:0 (stearinska kiselina), 18:1 (oleinska kiselina), LA, ALA, EDA, ERA, DGLA i ETA. Smeše masnih kiselina su izražene u vidu težinskog procenta (tež. %) od ukupnih masnih kiselina. Tabela 36 sažeto prikazuje vektor, korišćene gene, broj eksperimenta (MSE#) i odgovarajuće SLIKE.
Na SLIKAMA 65-71, aktivnost elongacije je izražena kao % delta-9 elongacije Cl8 masnih kiselina (Cl8% delta-9 elong), koji je izračunat prema sledećoj formuli: ([proizvod]/[supstrat + proizvod])* 100. Određenije, sjedinjeni procenat elongacije za LA i ALA određenje kao: ([DGLA + ETA + EDA + ERA]/[LA + ALA + DGLA + ETA + EDA + ERA])* 100.
Na SLIKAMA 65-71, sjedinjeni procenat desaturacije za EDA i ERA prikazan je kao "C20 % delta-8 desat", koji je utvrđen kao: ([DGLA + ETA]/[DGLA + ETA + EDA + ERA]) 100. Ovo je, takođe, označeno kao ukupan % desaturacije.
Poređenje pojedinačno ekspresovanih delta-9 elongaza sa delta-8 desaturazama u odnosu na ekvivalentnu fuziju delta-9 elongaza-delta-8 desaturaza prikazano je na SLICI 72. Na SLICI 72, svaka tačka podataka predstavlja prosečan % DGLA ili % EDA za 5-6 embriona (kao % ukupnih masnih kiselina) za sve analizirane slučajeve, a prosečan % DGLA je ucrtan u dijagram prema prosečnom % EDA. Na SLICI 72A, EgTpom predstavlja EgD9e, koja je ko-ekspresovana sa TpomD8 (pKRl 014), a EgTpomfus predstavlja fuziju EgD9e/TpomD8 (pKRl 199). Na SLICI 72B, EgEa predstavlja EgD9e, koja je ko-ekspresovana sa EaD8 (pKR1152), a EgEafus predstavlja fuziju EgD9e/EaD8 (pKR1200). Na SLICI 72C, EaTpom predstavlja EaD9e, ko-ekspresovanu sa TpomD8 (pKRl 151), a EaTpomfus predstavlja fuziju EaD9e/TpomD8 (pKR1183). Na SLICI 72D, EaEa predstavlja EaD9e, ko-ekspresovanu sa EaD8 (pKRl 150), a EaEafus predstavlja fuziju EaD9e/EaD8 (pKR1200).
PRIMER 61
Funkcionalne analize gena fuzija delta- 9 elongaza/ delta- 8 desaturaza/ delta- 5 desaturaza
Ovaj primer opisuje transformisanje i ekspresiju u somatskim embrionima soje pKR1322 (SEQ ID NO:314; Primer 50), koji sadrži trostruku fuziju EaD9Elol-TpomD8- EaD5Desl triple fusion (takođe nazvana EaD9e/TpomD8/EaD5). Svaki domen je razdvojen spojnicom EgDHAsvnl, sa dodatne 4 aminokiseline (t.j, SEQ ID NO:472;
PARPAGLPPATYYDSLAVSGRT).
Embriogena suspenziona kultura soje (cv. Jack) je transformisana sa pKR1322, a embrioni su sazrevali u tečnom medijumu za histodiferencijaciju i sazrevanje soje (SHaM tečni medijumi; Schmidt et al,Cell Biology and Morphogenesis,24:393
(2005)) kao što je opisano u Primeru 25 i prethodno opisano u PCT Publication No. VVO 2007/136877, publikovanoj 29. novembra 2007. (čiji sadržaji su ovde uključeni posredstvom reference).
Nakon sazrevanja u SHaM tečnim medijumima, podgrupa transformisanih embriona soje (t.j, 5 embriona po slučaju), sakupljena je i analizirana, kao što je ovde opisano.
Na ovaj način, analizirano je približno 30 slučajeva, transformisanih sa pKR1322 (Eksperiment MSE2274), a pet slučajeva, koji imaju najveći prosečni sadržaj ARA i EPA (prošek 5 analiziranih embriona) prikazano je na SLICI 73. Na SLICI 73 masne kiseline su identifikovane kao: 16:0 (palmitat), 18:0 (stearinska kiselina), 18:1 (oleinska kiselina), 18:2 (5,9), LA, ALA, EDA, ERA, SCI, DGLA, JUN (takođe se naziva JUP), ETA, ARA i EPA. Smeše masnih kiselina su izražene u vidu težinskog procenta (tež. %) ukupnih masnih kiselina.
Na SLICI 73, aktivnost elongacije je izražena kao % delta-9 elongacije Cl8 masnih kiselina (% Elo), koji je izračunat prema sledećoj formuli: ([proizvod]/[supstrat + proizvod])* 100. Određenije, sjedinjeni procenat elongacije za LA i ALA određenje kao: ([DGLA + ETA + EDA + ERA + EPA + ARA]/[LA + ALA + DGLA + ETA + EDA +
ERA + EPA + ARA])* 100.
Na SLICI 73, sjedinjeni procenat delta-8 desaturacije za EDA i ERA prikazan je kao "%D8", koji je utvrđen kao: ([DGLA + ETA + EPA + ARA]/[DGLA + ETA + EDA + ERA + EPA + ARA])* 100. Ovo je, takođe, označeno kao ukupan % delta-8 desaturacije.
Na SLICI 73, sjedinjeni procenat delta-5 desaturacije za DGLA i ETA prikazan je kao "%D5", koji je utvrđen kao: ([EPA + ARA]/[DGLA + ETA + EPA + ARA])* 100. Ovo je, takođe, označeno kao ukupan % delta-5 desaturacije.
U sažetku SLIKE 73, sva tri domena su funkcionalna. Ova fuzija bi mogla biti označena ili kao EPA sintaza ili ARA sintaza.
PRIMER 62
Funkcionalne analize genskih fuzija delta- 9 elongaza/ delta- 8 desaturaza i delta- 8
desaturaza/ delta- 9 elongaza
Ovaj primer opisuje transformisanje i ekspresiju u somatskim embrionima soje ili pKR1326 (SEQ ID NO:512), koji sadrži fuziju EaD9Elol- TpomD8 fusion (takođe se naziva EaD9e/TpomD8), razdvojenu spojnicom EaDHAsvnl, sa dodatne 3 aminokiseline (t.j, SEQ ID NO:504; PGGPGKPSEIASLPPPIRPVGNPPAAYYDALATGRT) ili pKR1321 (SEQ ID NO:503; Primer 58), koji sadrži TpomD8/EaD9e fuziju, razdvojenu spojnicom EgDHAsvnl.
Embriogena suspenziona kultura soje (cv. Jack) je transformisana sa pKR1326 ili pKR1321, a embrioni su sazrevali u tečnom medijumu za histodiferencijaciju i sazrevanje soje (SHaM tečni medijumi; Schmidt et al,Cell Biologyand Morphogenesis,24:393 (2005)) kao što je opisano u Primeru 25 i prethodno opisano u PCT Publication No. VVO 2007/136877, publikovanoj 29. novembra 2007. (čiji sadržaji su ovde uključeni posredstvom reference).
Nakon sazrevanja u SHaM tečnim medijumima, podgrupa transformisanih embriona soje (t.j, 5 embriona po slučaju), sakupljena je i analizirana, kao što je ovde opisano.
Na ovaj način, analizirano je približno 30 slučajeva, transformisanih sa pKRl326 (Eksperiment MSE2275), a pet slučajeva, koji imaju najveći prosečni sadržaj DGLA i ETA (prošek 5 analiziranih embriona) prikazano je na SLICI 74. Na SLICI 74 masne kiseline su identifikovane kao: 16:0 (palmitat), 18:0 (stearinska kiselina), 18:1 (oleinska kiselina), LA, ALA, EDA, ERA, DGLA i DGLA, i ETA. Smeše masnih kiselina su izražene u vidu težinskog procenta (tež. %) od ukupnih masnih kiselina.
Na SLICI 74, aktivnost elongacije je izražena kao % delta-9 elongacije Cl8 masnih kiselina (Cl8 % delta-9 elong), koji je izračunat prema sledećoj formuli: ([proizvod]/[supstrat + proizvod])* 100. Određenije, sjedinjeni procenat elongacije za LA i ALA određenje kao: ([DGLA + ETA + EDA + ERA]/[LA + ALA + DGLA + ETA + EDA + ERA])* 100.
Na SLICI 74, sjedinjeni procenat desaturacije za EDA i ERA prikazanje kao "C20 % delta-8 desat", koji je utvrđen kao: ([DGLA + ETA]/[DGLA + ETA + EDA + ERA])* 100. Ovo je, takođe, označeno kao ukupan % desaturacije.
U sažetku SLIKE 74, EaDHAsvnl spojnica funkcioniše slično kao EgDHAsvnl spojnica. Za bilo koji od slučajeva, transformisanih sa pKR1321, gde je TpomD8 bio spojen sa EaD9e sa EgDHAsvnl spojnicom, nije detektovana aktivnost.

Claims (65)

1. Multizim, koji sadrži pojedinačni polipeptid, koji poseduje najmanje dve nezavisne enzimske aktivnosti, koje se mogu odvojiti.
2. Multizim iz patentnog zahteva 1, u kome su enzimske aktivnosti odabrane iz grupe, koju sačinjavaju: elongaze masne kiseline, desaturaze masne kiseline, acil transferaze, acil CoA sintaze i tioesteraze.
3. Multizim iz patentnog zahteva 1, u kome enzimske aktivnosti obuhvataju najmanje jednu elongazu masne kiseline, koja je povezana sa najmanje jednom desaturazom masne kiseline.
4. Multizim iz patentnog zahteva 2 ili 3, u kome je desaturaza masne kiseline odabrana iz grupe, koju sačinjavaju: delta-4 desaturaza, delta-5 desaturaza, delta-6 desaturaza, delta-8 desaturaza, delta-9 desaturaza, delta-12 desaturaza, delta-15 desaturaza ili delta-17 desaturaza.
5. Multizim iz patentnog zahteva 2 ili 3, u kome je elongaza masne kiseline odabrana iz grupe, koju sačinjavaju: delta-9 elongaza, C14/16elongaza, C16/18elongaza, Ci8/20 elongaza ili C20/22elongaza.
6. Multizim iz patentnog zahteva 1, 2 ili 3, u kome je prva enzimska aktivnost povezana sa drugom enzimskom aktivnošću, a navedena veza je odabrana iz grupe, koju sačinjava: polipeptidna veza, SEQ ID NO:198 (EgDHAsvnl linker), SEQ ID NO:200 (EgDHAsyn2 linker) i SEQ ID NO:235 (EaDHAsvnl linker), SEQ ID NO:438, SEQ ID NO:472, SEQ ID NO:445 i SEQ ID NO.504.
7. Izolovani polinukleotid, koji kodira DHA sintazu, i koji uključuje: (a) nukleotidnu sekvencu, koja kodira polipeptid, koji ima aktivnost DHA sintaze, pri čemu polipeptid ima najmanje 80% aminokiselinskog identiteta, na osnovu Clustal V postupka slaganja, kada se uporedi sa aminokiselinskom sekvencom, kao što je navedena u: SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:95, SEQ ID NO:96 ili SEQ ID NO:97; (b) nukleotidnu sekvencu, koja kodira polipeptid, koji poseduje aktivnost DHA sintaze, pri čemu nukleotidna sekvenca ima najmanje 80% identiteta sekvence, na osnovu BLASTN postupka slaganja, kada se uporedi sa nukleotidnom sekvencom, kao što je navedena u: SEQ ID N0:11, SEQ ID NO:205, SEQ ID N0:21, SEQ ID N0:91, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:93 ili SEQ ID NO:410; (c) nukleotidnu sekvencu, koja kodira polipeptid, koji poseduje aktivnost DHA sintaze, pri čemu se nukleotidna sekvenca hibridizuje, pod strogim uslovima, u nukleotidnu sekvencu, kao što je navedena u: SEQ ID NO:l 1, SEQ ID NO:205, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:93 ili SEQ ID NO:410; ili (d) komplement nukleotidne sekvence pod (a), (b) ili (c), pri čemu se komplement i nukleotidna sekvenca sastoje od istog broja nukleotida i 100% su komplementarni.
8. Polinukleotid iz patentnog zahteva 7, u kome nukleotidna sekvenca obuhvata: SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:93 ili SEQ ID NO:410.
9. Polinukleotid iz patentnog zahteva 7, u kome aminokiselinska sekvenca polipeptida uključuje: SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:95, SEQ ID NO:96 ili SEQ ID NO:97.
10. Izolovani polinukleotid, koji kodira C20 elongazu, i koji uključuje: (a) nukleotidnu sekvencu, koja kodira polipeptid, koji poseduje aktivnost C20 elongaze, pri čemu polipeptid ima najmanje 80%» aminokiselinskog identiteta, na osnovu Clustal V postupka slaganja, kada se uporedi sa aminokiselinskom sekvencom, kao što je navedena u: SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:95, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:97, SEQ ID NO:202 (domen C20 elongaze EgDHAsvnl), SEQ ID NO:204 (domen C20 elongaze EgDHAsyn2), SEQ ID NO:231 (domen C20 elongaze EaDHAsvnl), SEQ ID NO:232 (domen C20 elongaze EaDHAsyn2) ili SEQ ID NO:233 (domen C20 elongaze EaDHAsyn3); (b) nukleotidnu sekvencu, koja kodira polipeptid, koji poseduje aktivnost C20 elongaze, pri čemu nukleotidna sekvenca ima najmanje 80% identiteta sekvence, na osnovu BLASTN postupka slaganja, kada se uporedi sa nukleotidnom sekvencom, kao što je navedena u: SEQ ID NO:l 1, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:93, SEQ ID NO: 183, SEQ ID NO: 188, SEQ ID NO.201 (domen C20 elongaze EgDHAsynl), SEQ ID NO:206 (domen C20 elongaze EgDHAsynl<*>), SEQ ID NO:203 (domen C20 elongaze EgDHAsyn2), SEQ ID NO:227 (domen C20 elongaze EaDHAsvnl), SEQ ID NO:228 (domen C20 elongaze EaDHAsyn2), SEQ ID NO:229 (domen C20 elongaze EaDHAsyn3) ili SEQ ID NO:230 (domen C20 elongaze EaDHAsyn4); (c) nukleotidnu sekvencu, koja kodira polipeptid, koji poseduje aktivnost C20 elongaze, pri čemu se nukleotidna sekvenca hibridizuje, pod strogim uslovima, u nukleotidnu sekvencu, kao stoje navedena u: SEQ ID NO:ll, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:93, SEQ ID NO:183, SEQ ID NO:188, SEQ ID NO:201 (domen C20 elongaze EgDHAsynl), SEQ ID NO:206 (domen C20 elongaze EgDHAsynl<*>), SEQ ID NO:203 (domen C20 elongaze EgDHAsyn2), SEQ ID NO:227 (domen C20 elongaze EaDHAsynl), SEQ ID NO:228 (domen C20 elongaze EaDHAsyn2), SEQ ID NO:229 (domen C20 elongaze EaDHAsyn3) ili SEQ ID NO:230 (domen C20 elongaze EaDHAsyn4); ili (d) komplement nukleotidne sekvence pod (a), (b) ili (c), pri čemu se komplement i nukleotidna sekvenca sastoje od istog broja nukleotida i 100% su komplementarni.
11. Izolovani polinukleotid, koji kodira delta-4 desaturazu, i koji uključuje: (a) nukleotidnu sekvencu, koja kodira polipeptid, koji poseduje aktivnost delta-4 desaturaze, pri čemu polipeptid ima najmanje 80% aminokiselinskog identiteta, na osnovu Clustal V postupka slaganja, kada se uporedi sa aminokiselinskom sekvencom, kao stoje navedena u: SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:95, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:97, SEQ ID NO:193, SEQ ID NO:215, SEQ ID NO:217, SEQ ID NO:221, SEQ ID NO-.239, SEQ ID NO:240, SEQ ID NO:241, SEQ ID NO:246, SEQ ID NO:247, SEQ ID NO:248, SEQ ID NO:249, SEQ ID NO:382, SEQ ID NO:384, SEQ ID NO:386, SEQ ID NO:388, SEQ ID NO:404, SEQ ID NO:406 ili SEQ ID NO:408; (b) nukleotidnu sekvencu, koja kodira polipeptid, koji poseduje aktivnost delta-4 desaturaze, pri čemu nukleotidna sekvenca ima najmanje 80% identiteta sekvence, na osnovu BLASTN postupka slaganja, kada se uporedi sa nukleotidnom sekvencom, kao što je navedena u: SEQ ID NO:ll, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:93, SEQ ID NO:192, SEQ ID NO:214, SEQ ID NO:216, SEQ ID NO:220, SEQ ID NO:236, SEQ ID NO:237, SEQ ID NO:238, SEQ ID NO:242, SEQ ID NO:243, SEQ ID NO:244, SEQ ID NO:245, SEQ ID NO:381, SEQ ID NO:383, SEQ ID NO:385, SEQ ID NO:387, SEQ ID NO:403, SEQ ID NO:405 ili SEQ ID NO:407; (c) nukleotidnu sekvencu, koja kodira polipeptid, koji poseduje aktivnost delta-4 desaturaze, pri čemu se nukleotidna sekvenca hibridizuje, pod strogim uslovima, u nukleotidnu sekvencu, kao što je navedena u: SEQ ID NO:l 1, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:93, SEQ ID N0.214, SEQ ID NO:216, SEQ ID NO:220, SEQ ID NO:236, SEQ ID N0.237, SEQ ID NO:238, SEQ ID NO:242, SEQ ID NO:243, SEQ ID NO:244, SEQ ID NO:245, SEQ ID NO: 192, SEQ ID NO:381, SEQ ID NO:383, SEQ ID NO:385, SEQ ID NO:387, SEQ ID NO:403, SEQ ID NO:405 ili SEQ ID NO:407; ili (d) komplement nukleotidne sekvence pod (a), (b) ili (c), pri čemu se komplement i nukleotidna sekvenca sastoje od istog broja nukleotida i 100% su komplementarni.
12. Izolovani polinukleotid, koji kodira DHA sintazu, pri čemu navedeni polinukleotid uključuje sekvencu, navedenu u bilo kojoj od: SEQ ID NO:ll, SEQ ID NO:205, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:93 ili SEQ ID NO:410.
13. Izolovani polinukleotid, koji kodira C20 elongazu, pri čemu navedeni polinukleotid uključuje sekvencu, navedenu u bilo kojoj od: SEQ ID NO: 183, SEQ ID NO: 188, SEQ ID NO:201 (domen C20 elongaze EgDHAsvnl, SEQ ID NO:206 (domen C20 elongaze EgDHAsynl<*>), SEQ ID NO:203 (domen C20 elongaze EgDHAsyn2), SEQ ID NO:227 (domen C20 elongaze EaDHAsynl), SEQ ID NO:228 (domen C20 elongaze EaDHAsyn2), SEQ ID NO:229 (domen C20 elongaze EaDHAsyn3) ili SEQ ID NO:230 (domen C20 elongaze EaDHAsyn4).
14. Izolovani polinukleotid, koji kodira delta-4 desaturazu, pri čemu navedeni polinukleotid sadrži sekvencu navedenu u: SEQ ID NO: 192, SEQ ID NO:214, SEQ ID NO:220, SEQ ID NO:236, SEQ ID NO:237, SEQ ID NO:238, SEQ ID NO:242, SEQ ID NO:243, SEQ ID NO:244, SEQ ID NO:245, SEQ ID NO:381, SEQ ID NO:383, SEQ ID NO:385, SEQ ID NO:387, SEQ ID NO:403, SEQ ID NO:405 ili SEQ ID NO:407.
15. Rekombinantna konstrukcija, koja sadrži bilo koji od izolovanih polinukleotida iz patentnih zahteva 7-14, koji su operativno povezani sa najmanje jednom regulatornom sekvencom.
16. Ćelija domaćina, koja, u svom genomu, sadrži rekombinantnu konstrukciju iz patentnog zahteva 15.
17. Ćelija domaćina iz patentnog zahteva 16, pri čemu je navedena ćelija odabrana iz grupe, koju sačinjavaju biljke i kvasac.
18. TransformisaniYarrowiasp, koji sadrži rekombinantnu konstrukciju iz Patentnog zahteva 15.
19. Postupak za transformaciju ćelije, koji obuhvata transformisanje ćelije sa rekombinantnom konstrukcijom iz patentnog zahteva 15 i odabir onih ćelija, koje su transformisane sa navedenom rekombinantnom konstrukcijom.
20. Postupak za proizvodnju transformisane biljke, koji obuhvata transformisanje biljne ćelije sa bilo kojim od polinukleotida iz patentnih zahteva 7-14 i regenerisanje biljke iz transformisane biljne ćelije.
21. Postupak iz patentnog zahteva 20, u kome je biljka biljka soje.
22. Postupak za proizvodnju kvasca, koji obuhvata transformisanje ćelije kvasca sa bilo kojim od polinukleotida iz patentnih zahteva 7-14 i porast kvasca iz transformisane ćelije kvasca.
23. Biljka, koja, u svom genomu, sadrži rekombinantnu konstrukciju iz patentnog zahteva 15.
24. Biljka iz patentnog zahteva 23, pri čemu je biljka biljka uljnog semena.
25. Biljka iz patentnog zahteva 23 ili 24, pri čemu je biljka soja.
26. Seme dobijeno iz biljke iz patentnog zahteva 23 ili 24.
27. Seme dobijeno iz biljke iz patentnog zahteva 25.
28. Ulje, dobijeno iz semena iz patentnog zahteva 26.
29. Ulje, dobijeno iz semena iz patentnog zahteva 27.
30. Hrana ili stočna hrana, koja sadrži ulje iz patentnog zahteva 26.
31. Hrana ili stočna hrana, koja sadrži ulje iz patentnog zahteva 27.
32. Piće koje uključuje ulje iz patentnog zahteva 26.
33. Piće koje uključuje ulje iz patentnog zahteva 27.
34. Izolovani molekul nukleinske kiseline, koji kodira C20 elongazu, kao što je navedeno u SEQ ID NO: 183, pri čemu je najmanje 147 kodona kodon-optimizovano za ekspresiju uYarrowiasp.
35. Izolovani molekul nukleinske kiseline, koji kodira C20 elongazu, kao što je navedeno u SEQ ID NO: 188, pri čemu je najmanje 134 kodona kodon-optimizovano za ekspresiju uYarrowiasp.
36. Izolovani molekul nukleinske kiseline, koji kodira enzim delta-4 desaturazu, kao što je navedeno u SEQ ID NO: 192, pri čemu je najmanje 285 kodona kodon-optimizovano za ekspresiju uYarrowiasp. multizim, koji sadrži elongazu, povezanu sa desaturazom.
37. Postupak za izradu multizima, koji uključuje: (a) povezivanje prvog polipeptida sa najmanje jednim drugim polipeptidom, pri čemu svaki polipeptid ima nezavisnu enzimsku aktivnost, koja se može razdvojiti; i (b) procenu da li proizvod iz koraka (a) poseduje nezavisne enzimske aktivnosti, koje se mogu razdvojiti.
38. Postupak iz patentnog zahteva 37, pri čemu su enzimske aktivnosti odabrane iz grupe, koju sačinjavaju: elongaze masne kiseline, desaturaze masne kiseline, acil transferaze, acil CoA sintaze i tioesteraze.
39. Postupak iz patentnog zahteva 37, u kome enzimske aktivnosti obuhvataju najmanje jednu elongazu masne kiseline, koja je povezana sa najmanje jednom desaturazom masne kiseline.
40. Postupak iz patentnih zahteva 38 ili 39, u kome je desaturaza masne kiseline odabrana iz grupe, koju sačinjavaju: delta-4 desaturaza, delta-5 desaturaza, delta-6 desaturaza, delta-8 desaturaza, delta-9 desaturaza, delta-12 desaturaza, delta-15 desaturaza ili delta-17 desaturaza.
41. Postupak iz patentnih zahteva 38 ili 39, u kome je elongaza masne kiseline odabrana iz grupe, koju sačinjavaju: delta-9 elongaza, Ch/ić elongaza, C16/18elongaza, Ci8/20 elongaza ili C20/22elongaza.
42. Postupak iz patentnih zahteva 37, 38 ili 39, u kome je veza odabrana iz grupe, koju sačinjava: polipeptidna veza, SEQ ID NO: 198 (aminokiselinska sekvenca spojnice EgDHAsvnl), SEQ ID NO:200 (EgDHAsyn2 linker), SEQ ID NO:235 (EaDHAsvnl linker), SEQ ID NO:435, SEQ ID NO:438, SEQ ID NO:472 i SEQ ID NO:504.
43. Postupak za izmenu profila masnih kiselina biljke uljnog semena, koji uključuje: (a) transformaciju ćelije biljke uljnog semena sa rekombinantnom konstrukcijom iz patentnog zahteva 15; i (b) regenerisanje biljke iz transformisane ćelije biljke uljnog semena iz koraka (a), pri čemu biljka ima izmenjen profil masnih kiselina.
44. Postupak iz patentnog zahteva 43, pri čemu je biljka uljnog semena soja.
45. Potomstvo biljke iz patentnog zahteva 23.
46. Rekombinantna mikrobna ćelija domaćina, koja sadrži multizim iz Patentnog zahteva 6, pri čemu je prva enzimska aktivnost delta-9 elongaza, a druga enzimska aktivnost je delta-8 desaturaza.
47. Rekombinantna mikrobna ćelija domaćina, koja sadrži multizim iz Patentnog zahteva 6, pri čemu je prva enzimska aktivnost C20 elongaza, a druga enzimska aktivnost je delta-4 desaturaza.
48. Rekombinantna ćelija domaćina iz Patentnog zahteva 46 ili 47, pri čemu je ćelija domaćina uljasti kvasac.
49. Postupak za prevođenje linolne kiseline u dihomo gama-linolensku kiselinu, koji obuhvata: (a) obezbeđivanje rekombinantne mikrobne ćelije domaćina, koja sadrži: i) DGLA sintazu, koja sadrži: 1) najmanje jedan polipeptid, koji kodira delta-9 elongazu; 2) najmanje jedan polipeptid, koji kodira delta-8 desaturazu i 3) polipeptidnu spojnicu; pri čemu je spojnica umetnuta između delta-9 elongaze i delta-8 desaturaze i ii) izvor linolne kiseline; i b) rast ćelije domaćina pod a) pod uslovima, pod kojima je proizvedena dihomo gama-linolenska kiselina.
50. Postupak za prevođenje a-linolenske kiseline u eikozatriensku kiselinu, koji obuhvata: (a) obezbeđivanje rekombinantne mikrobne ćelije domaćina, koja sadrži: i) DGLA sintazu, koja sadrži: 1) najmanje jedan polipeptid, koji kodira delta-9 elongazu; 2) najmanje jedan polipeptid, koji kodira delta-8 desaturazu i 3) polipeptidnu spojnicu; pri čemu je spojnica umetnuta između delta-9 elongaze i delta-8 desaturaze i ii) izvor a-linolenske kiseline i b) rast ćelije domaćina pod a) pod uslovima, pod kojima se proizvodi eikozatrienska kiselina.
51. Postupak za prevođenje eikozapentaenske kiseline u dokozaheksaensku kiselinu, koji obuhvata: (a) obezbeđivanje rekombinantne mikrobne ćelije domaćina, koja sadrži: i) DHA sintazu, koja sadrži: 1) najmanje jedan polipeptid, koji kodira C20 elongazu; 2) najmanje jedan polipeptid, koji kodira delta-4 desaturazu i 3) polipeptidnu spojnicu; pri čemu je spojnica umetnuta između C20 elongaze i delta-4 desaturaze i ii) izvor eikozapentaenske kiseline; i b) rast ćelije domaćina pod a) pod uslovima, pod kojima je proizvedena dokozaheksaenska kiselina.
52. Postupak za konverziju arahidonske kiseline u dokozapentaensku kiselinu, koji obuhvata: (a) obezbeđivanje rekombinantne mikrobne ćelije domaćina, koja sadrži: i) DHA sintazu, koja sadrži: 1) najmanje jedan polipeptid, koji kodira C20 elongazu; 2) najmanje jedan polipeptid, koji kodira delta-4 desaturazu i 3) polipeptidnu spojnicu; pri čemu je spojnica umetnuta između C20 elongaze i delta-4 desaturaze i ii) izvor arahidonske kiseline i b) rast ćelije domaćina pod a) pod uslovima, pod kojima je proizvedena dokozapentaenska kiselina.
53. Postupak iz patentnog zahteva 49 ili 50, u kome DGLA sintaza ima aminokiselinsku sekvencu, koja je odabrana iz grupe, koju sačinjavaju: SEQ ID NO:441, SEQ ID NO:447, SEQ ID NO:454, SEQ ID NO:461, SEQ ID NO:464, SEQ ID NO:471, SEQ IDNO:515, SEQ ID NO:516, SEQ ID NO:517, SEQ ID NO:518iSEQ ID NO:519.
54. Postupak iz patentnog zahteva 51 ili 52, u kome DHA sintaza ima aminokiselinsku sekvencu, odabranu iz grupe, koju sačinjavaju: SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:95, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:97 i SEQ ID NO:411.
55. Postupak iz bilo kog od patentnih zahteva 49-52, pri čemu polipeptidna spojnica ima aminokiselinsku sekvencu, odabranu iz grupe, koju sačinjavaju: SEQ ID NO: 198, SEQ ID NO:200, SEQ ID N0.235, SEQ ID NO:438, SEQ ID NO:445, SEQ ID NO:472 i SEQ ID NO:504.
56. Postupak iz patentnog zahteva 49 ili 50, u kome delta-9 elongaza ima aminokiselinsku sekvencu, odabranu iz grupe, koju sačinjavaju: SEQ ID NO:254, SEQ ID NO:255, SEQ ID NO:319, SEQ ID NO:359, SEQ ID NO:420, SEQ ID NO:422 i SEQ ID NO:513.
57. Postupak iz patentnog zahteva 49 ili 50, u kome delta-8 desaturaza ima aminokiselinsku sekvencu, odabranu iz grupe, koju sačinjavaju: SEQ ID NO:328, SEQ ID NO:424, SEQ ID NO:426, SEQ ID NO:428, SEQ ID NO:430 i SEQ ID NO:514.
58. Postupak iz patentnog zahteva 51 ili 52, u kome C20 elongaza ima aminokiselinsku sekvencu, odabranu iz grupe, koju sačinjavaju: SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:95, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:97, SEQ ID NO:202, SEQ ID NO:204, SEQ ID NO:231, SEQ ID NO:232, SEQ ID NO:233, SEQ ID NO:184 i SEQ ID NO:189.
59. Postupak iz patentnog zahteva 51 ili 52, u kome delta-4 desaturaza ima aminokiselinsku sekvencu, odabranu iz grupe, koju sačinjavaju: SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:95, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:97, SEQ ID NO:215, SEQ ID N0.221, SEQ ID NO:239, SEQ ID NO:240, SEQ ID NO:241, SEQ ID NO:246, SEQ ID NO:247, SEQ ID NO:248, SEQ ID NO:249, SEQ ID NO:382, SEQ ID N0.384, SEQ ID NO:386, SEQ ID NO:388, SEQ ID NO:404, SEQ ID NO:406, SEQ ID NO.408 i SEQ ID NO:193.
60. Postupak za identifikaciju polipeptida, koji poseduje poboljšanu aktivnost delta-4 desaturaze, koji obuhvata: a) obezbeđivanje polipeptida delta-4 desaturaze divljeg tipa, izolovanog izEuglene anabene,koji poseduje bazalnu aktivnost delta-4 desaturaze; i b) skraćivanje polipeptida divljeg tipa pod a) za oko 1 do oko 200 aminokiselina, da bi se stvorio skraćeni mutant polipeptid, koji poseduje aktivnost delta-4 desaturaze, koja je povećana u poređenju sa bazalnom aktivnošću delta-4 desaturaze.
61. Postupak iz patentnog zahteva 60, u kome je polipeptid divljeg tipa skraćen na N-terminalnom delu polipeptida.
62. Postupak iz patentnog zahteva 60, u kome je polipeptid divljeg tipa skraćen za oko 1 do oko 70 aminokiselina.
63. Ćelija domaćina mikroba, koja proizvodi polinezasićenu masnu kiselinu i ekspresuje polipeptide, koji kodiraju enzime u sledećem sekvencijalnom putu: 1) delta-9 desaturazu, 2) delta-12 desaturazu, 3) delta-9 elongazu, 4) delta-8 desaturazu, 5) delta-5 desaturazu, 6) delta-17 desaturazu, 7) C20/22elongazu i 8) delta-4 desaturazu; pri čemu polipeptidi sadrže najmanje jedan multizim, a fuzija obuhvata fuziju između najmanje jednog susednog enzimskog para.
64. Mikrobni domaćin iz patentnog zahteva 63, pri čemu je polinezasićena masna kiselina odabrana iz grupe, koju sačinjava co-3 masna kiselina i co-6 masna kiselina.
65. Izolovani polinukleotid, koji kodira DGLA sintazu, i koji sadrži: (a) nukleotidnu sekvencu, koja kodira polipeptid, koji poseduje aktivnost DGLA sintaze, pri čemu je polipeptid naveden u: SEQ ID NO:441, SEQ ID NO:447, SEQ ID NO:454, SEQ ID NO:461, SEQ ID NO:464, SEQ ID NO:471, SEQ ID NO:515, SEQ ID NO:516, SEQ ID N0:517, SEQ ID N0:518 ili SEQ ID NO:519; (b) nukleotidnu sekvencu, koja kodira polipeptid, koji poseduje aktivnost DGLA sintaze, pri čemu je nukleotida sekvenca navedena u: SEQ ID NO:440, SEQ ID NO:446, SEQ ID NO:453, SEQ ID NO:460, SEQ ID NO:463, SEQ ID NO:470, SEQ ID NO.-492, SEQ ID NO:493, SEQ ID NO:494, SEQ ID NO:495 ili SEQ ID NO:496; (c) nukleotidnu sekvencu, koja kodira polipeptid, koji poseduje aktivnost DGLA sintaze, pri čemu se nukleotidna sekvenca hibridizuje pod strogim uslovima u nukleotidnu sekvencu, kao što je prikazana u: SEQ ID NO:440, SEQ ID NO:446, SEQ ID NO:453, SEQ ID NO:460, SEQ ID NO:463, SEQ ID NO:470, SEQ ID NO:492, SEQ ID NO:493, SEQ ID N0.494, SEQ ID N0.495 ili SEQ ID NO:496; ili (d) komplement nukleotidne sekvence pod (a), (b) ili (c), pri čemu se komplement i nukleotidna sekvenca sastoje od istog broja nukleotida i 100% su komplementarni.
RSP-2009/0413A 2007-04-03 2008-04-03 Multizimi i njihova upotreba u proizvodnji polinezasićenih masnih kiselina RS20090413A (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US90979007P 2007-04-03 2007-04-03
US2789808P 2008-02-12 2008-02-12
PCT/US2008/004377 WO2008124048A2 (en) 2007-04-03 2008-04-03 Multizymes and their use in making polyunsaturated fatty acids

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS20090413A true RS20090413A (sr) 2010-06-30

Family

ID=39650608

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RSP-2009/0413A RS20090413A (sr) 2007-04-03 2008-04-03 Multizimi i njihova upotreba u proizvodnji polinezasićenih masnih kiselina

Country Status (14)

Country Link
US (2) US8828690B2 (sr)
EP (1) EP2129777B1 (sr)
JP (1) JP2010523113A (sr)
CN (2) CN104152423A (sr)
BR (1) BRPI0808577A2 (sr)
CA (1) CA2679988A1 (sr)
DK (1) DK2129777T3 (sr)
ES (1) ES2559312T3 (sr)
HU (1) HUE028692T2 (sr)
MX (1) MX2009010574A (sr)
RS (1) RS20090413A (sr)
RU (2) RU2517608C2 (sr)
UA (1) UA103595C2 (sr)
WO (1) WO2008124048A2 (sr)

Families Citing this family (48)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103451246B (zh) 2004-04-22 2018-02-16 联邦科学技术研究组织 用重组细胞合成长链多不饱和脂肪酸
EP2357244A3 (en) 2004-04-22 2011-11-23 Commonwealth Scientific and Industrial Research Organisation Synthesis of long-chain polyunsaturated fatty acids by recombinant cells.
RU2009111266A (ru) 2006-08-29 2010-10-10 Коммонвелт Сайентифик энд Индастриал Рисерч Организейшн (AU) Синтез жирных кислот
US8119860B2 (en) * 2007-04-16 2012-02-21 E. I. Du Pont De Nemours And Company Delta-9 elongases and their use in making polyunsaturated fatty acids
US8957280B2 (en) * 2007-05-03 2015-02-17 E. I. Du Pont De Nemours And Company Delta-5 desaturases and their use in making polyunsaturated fatty acids
WO2009016208A2 (de) * 2007-07-31 2009-02-05 Basf Plant Science Gmbh Elongasen und verfahren zur herstellung mehrfach ungesättigter fettsäuren in transgenen organismen
US20090117253A1 (en) * 2007-10-03 2009-05-07 E. I. Du Pont De Nemours And Company Peroxisome biogenesis factor protein (pex) disruptions for altering polyunsaturated fatty acids and total lipid content in oleaginous eukaryotic organisms
US20110008868A1 (en) 2008-04-03 2011-01-13 E.I. Du Pont De Nemours And Company Multizymes
US8168858B2 (en) 2008-06-20 2012-05-01 E. I. Du Pont De Nemours And Company Delta-9 fatty acid elongase genes and their use in making polyunsaturated fatty acids
BRPI0921467B1 (pt) 2008-11-18 2021-12-14 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Processo para a produção de óleo compreendendo ácido eicosapentaenóico (epa), ácido docosapentaenóico (dpa) e ácido docosahexaenóico (dha)
AU2009335903B2 (en) 2008-12-18 2016-04-14 E. I. Du Pont De Nemours And Company Reducing byproduction of malonates in a fermentation process
WO2010147907A1 (en) 2009-06-16 2010-12-23 E. I. Du Pont De Nemours And Company High eicosapentaenoic acid oils from improved optimized strains of yarrowia lipolytica
US8399226B2 (en) * 2009-06-16 2013-03-19 E I Du Pont De Nemours And Company High eicosapentaenoic acid oils from improved optimized strains of Yarrowia lipolytica
EP2475679B1 (en) * 2009-06-16 2016-02-10 E. I. du Pont de Nemours and Company Improved optimized strains of yarrowia lipolytica for high eicosapentaenoic acid production
CA2763424C (en) 2009-06-16 2018-06-12 E.I. Du Pont De Nemours And Company Improvement of long chain omega-3 and omega-6 polyunsaturated fatty acid biosynthesis by expression of acyl-coa lysophospholipid acyltransferases
BRPI1008189A2 (pt) 2009-06-30 2015-08-25 Du Pont Planta transgenica semente transgenica obtida a partir da planta transgencia semente transgencia metodo de produção de uma planta transgenica metodo de produção de sementes transgenicas metodo de produto e ou subproduto da semente transgenica e semente transgenica obtida pelo metodo
US9493520B2 (en) * 2009-07-17 2016-11-15 Basf Plant Science Company Gmbh Fatty acid desaturases and elongases and uses thereof
US8188335B2 (en) * 2009-07-17 2012-05-29 Abbott Laboratories Δ9-elongase for production of polyunsaturated fatty acid-enriched oils
AR078829A1 (es) 2009-10-30 2011-12-07 Du Pont Plantas y semillas con niveles alterados de compuesto de almacenamiento, construcciones relacionadas y metodos relacionados con genes que codifican proteinas similares a las aldolasas bacterianas de la clase ii del acido 2,4- dihidroxi-hept-2-eno-1,7-dioico
CA2779551C (en) 2009-11-03 2018-05-01 Dsm Ip Assets B.V. Composition comprising cells and a polyunsaturated fatty acid having at least 20 carbon atoms (lc-pufa)
WO2011054801A1 (en) 2009-11-03 2011-05-12 Dsm Ip Assets B.V. Vegatable oil comprising a polyunsaturaded fatty acid having at least 20 carbon atoms
WO2011062748A1 (en) 2009-11-23 2011-05-26 E.I. Du Pont De Nemours And Company Sucrose transporter genes for increasing plant seed lipids
CA2784711A1 (en) 2009-12-24 2011-06-30 E.I. Du Pont De Nemours And Company Plant membrane bound o-acyl transferase (mboat) family protein sequences and their uses for altering fatty acid compositions
US20110178105A1 (en) 2010-01-15 2011-07-21 E.I. Du Pont De Nemours And Company Clinical benefits of eicosapentaenoic acid in humans
US8765404B2 (en) * 2010-03-02 2014-07-01 Massachusetts Institute Of Technology Microbial engineering for the production of fatty acids and fatty acid derivatives
CA2790836A1 (en) 2010-03-03 2011-09-09 E.I. Du Pont De Nemours And Company Plant seeds with altered storage compound levels, related constructs and methods involving genes encoding oxidoreductase motif polypeptides
WO2011133610A1 (en) 2010-04-22 2011-10-27 E. I. Du Pont De Nemours And Company Method for obtaining polyunsaturated fatty acid-containing compositions from microbial biomass
CN103080320A (zh) 2010-07-01 2013-05-01 纳幕尔杜邦公司 涉及编码pae以及pae样多肽的基因并具有改变的贮藏化合物水平的植物种子、相关的构建体和的方法
KR20140008295A (ko) 2010-08-26 2014-01-21 이 아이 듀폰 디 네모아 앤드 캄파니 돌연변이 델타-9 연장효소 및 다중불포화 지방산의 제조에서의 그들의 용도
AU2011293180B2 (en) * 2010-08-26 2017-03-02 E. I. Du Pont De Nemours And Company Recombinant microbial host cells for high eicosapentaenoic acid production
JP2013535988A (ja) 2010-08-26 2013-09-19 イー・アイ・デュポン・ドウ・ヌムール・アンド・カンパニー 変異ｈｐｇｇモチーフおよびｈｄａｓｈモチーフδ５デサチュラーゼおよび多価不飽和脂肪酸の製造におけるそれらの使用
CA2824584A1 (en) 2010-12-30 2012-07-05 E. I. Du Pont De Nemours And Company Use of saccharomyces cerevisiae suc2 gene in yarrowia lipolytica for sucrose utilization
US20130040340A1 (en) 2011-02-07 2013-02-14 E. I. Du Pont De Nemours And Company Production of alcohol esters in situ using alcohols and fatty acids produced by microorganisms
WO2012109545A2 (en) 2011-02-11 2012-08-16 E. I. Du Pont De Nemours And Company Method for obtaining a lipid-containing composition from microbial biomass
US20120247066A1 (en) 2011-04-01 2012-10-04 Ice House America, Llc Ice bagging apparatus and methods
JP2014516537A (ja) 2011-05-26 2014-07-17 イー・アイ・デュポン・ドウ・ヌムール・アンド・カンパニー 組換え油性微生物における、その中のオイル含量を増加させるためのカレオシンの発現
WO2013109793A1 (en) * 2012-01-18 2013-07-25 Kinectus LLC Systems and methods for establishing communications between mobile device users
EP2807258B1 (en) * 2012-01-23 2017-04-26 E. I. du Pont de Nemours and Company Down-regulation of gene expression using artificial micrornas for silencing fatty acid biosynthestic genes
WO2013185184A2 (en) 2012-06-15 2013-12-19 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Production of long chain polyunsaturated fatty acids in plant cells
CA2877334A1 (en) 2012-06-19 2013-12-27 E. I. Du Pont De Nemours And Company Mutant acyl-coa:lysophosphatidylcholine acyltransferases
EP2935591B1 (en) 2012-12-21 2017-07-05 E. I. du Pont de Nemours and Company Down-regulation of a polynucleotide encoding a sou2 sorbitol utilization protein to modify lipid production in microbial cells
EP3082405A4 (en) 2013-12-18 2017-12-13 Commonwealth Scientific and Industrial Research Organisation Lipid comprising long chain polyunsaturated fatty acids
SG11201610596PA (en) 2014-06-27 2017-01-27 Commw Scient Ind Res Org Lipid comprising docosapentaenoic acid
CN107406838A (zh) 2014-11-06 2017-11-28 纳幕尔杜邦公司 Rna引导的内切核酸酶向细胞中的肽介导的递送
US10393225B2 (en) * 2015-01-05 2019-08-27 Goodrich Corporation Integrated multi-function propulsion belt for air cushion supported aircraft cargo loading robot
CN110087481A (zh) 2016-12-15 2019-08-02 帝斯曼知识产权资产管理有限公司 包含硅酸盐和含具有至少20个碳原子的多不饱和脂肪酸(lc-pufa)的微生物细胞和/或植物细胞的共混物制剂
US11519009B2 (en) 2017-01-09 2022-12-06 University Of Massachusetts Complexes for gene deletion and editing
CN115820586B (zh) * 2022-09-06 2025-07-22 中国农业科学院油料作物研究所 一种溶血磷脂酰胆碱酰基转移酶、核酸分子及其应用

Family Cites Families (31)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH07501701A (ja) 1991-12-04 1995-02-23 イー・アイ・デユポン・ドウ・ヌムール・アンド・カンパニー 植物由来の脂肪酸不飽和化酵素遺伝子
US5547868A (en) * 1993-06-09 1996-08-20 Regents Of The University Of California Cholesterol disposal fusion enzymes
US6075183A (en) * 1997-04-11 2000-06-13 Abbott Laboratories Methods and compositions for synthesis of long chain poly-unsaturated fatty acids in plants
US5968809A (en) * 1997-04-11 1999-10-19 Abbot Laboratories Methods and compositions for synthesis of long chain poly-unsaturated fatty acids
US6403349B1 (en) 1998-09-02 2002-06-11 Abbott Laboratories Elongase gene and uses thereof
US6677145B2 (en) 1998-09-02 2004-01-13 Abbott Laboratories Elongase genes and uses thereof
ATE353952T1 (de) 1998-12-07 2007-03-15 Univ Washington Desaturasen und verfahren ihrer anwendung zur synthese von mehrfach ungesättigten fettsäuren
US6825017B1 (en) * 1998-12-07 2004-11-30 Washington State University Research Foundation Desaturases and methods of using them for synthesis of polyunsaturated fatty acids
CA2397655C (en) * 2000-01-19 2012-06-05 Craig M. Ruecker Solventless extraction process
EP1911837B1 (en) * 2000-09-28 2011-05-25 Bioriginal Food & Science Corp. FAD5-2 fatty acid desaturase family member and uses thereof
DE10102338A1 (de) * 2001-01-19 2002-07-25 Basf Plant Science Gmbh Verfahren zur Expression von Biosynthesegenen in pflanzlichen Samen unter Verwendung von neuen multiplen Expressionskonstrukten
DE10102337A1 (de) * 2001-01-19 2002-07-25 Basf Plant Science Gmbh Verfahren zur Herstellung mehrfach ungesättigter Fettsäuren, neue Biosynthesegene sowie neue pflanzliche Expressionskonstrukte
EP1392823B1 (en) 2001-01-25 2011-11-30 Abbott Laboratories Desaturase genes and uses thereof
GB0107510D0 (en) 2001-03-26 2001-05-16 Univ Bristol New elongase gene and a process for the production of -9-polyunsaturated fatty acids
US7045683B2 (en) * 2001-05-04 2006-05-16 Abbott Laboratories Δ4-desaturase genes and uses thereof
BR0317304A (pt) * 2002-12-19 2005-11-08 Univ Bristol Processo para a produção de compostos, sequência de ácido nucleico isolada, sequência de aminoácidos, construção gênica, vetor, e, organismo
US20040172682A1 (en) 2003-02-12 2004-09-02 Kinney Anthony J. Production of very long chain polyunsaturated fatty acids in oilseed plants
WO2004090123A2 (de) * 2003-04-08 2004-10-21 Basf Plant Science Gmbh Δ-4-desaturasen aus euglena gracilis, exprimierende pflanzen und pufa enthaltende öle
US7214491B2 (en) * 2003-05-07 2007-05-08 E. I. Du Pont De Nemours And Company Δ-12 desaturase gene suitable for altering levels of polyunsaturated fatty acids in oleaginous yeasts
US7238482B2 (en) * 2003-05-07 2007-07-03 E. I. Du Pont De Nemours And Company Production of polyunsaturated fatty acids in oleaginous yeasts
US7125672B2 (en) 2003-05-07 2006-10-24 E. I. Du Pont De Nemours And Company Codon-optimized genes for the production of polyunsaturated fatty acids in oleaginous yeasts
DK1654344T3 (en) * 2003-08-01 2019-02-04 Basf Plant Science Gmbh PROCEDURE FOR MANUFACTURING MULTI-Saturated FAT ACIDS IN TRANSGENES
US7659120B2 (en) 2003-11-12 2010-02-09 E. I. Du Pont De Nemours And Company Δ 15 desaturases suitable for altering levels of polyunsaturated fatty acids in oleaginous plants and yeast
US7504259B2 (en) 2003-11-12 2009-03-17 E. I. Du Pont De Nemours And Company Δ12 desaturases suitable for altering levels of polyunsaturated fatty acids in oleaginous yeast
EP2623584B1 (de) * 2004-02-27 2019-04-10 BASF Plant Science GmbH Verfahren zur Herstellung mehrfach ungesättigter Fettsäuren in transgenen Pflanzen
EP2357244A3 (en) 2004-04-22 2011-11-23 Commonwealth Scientific and Industrial Research Organisation Synthesis of long-chain polyunsaturated fatty acids by recombinant cells.
CN103451246B (zh) * 2004-04-22 2018-02-16 联邦科学技术研究组织 用重组细胞合成长链多不饱和脂肪酸
US7256033B2 (en) * 2004-06-25 2007-08-14 E. I. Du Pont De Nemours And Company Delta-8 desaturase and its use in making polyunsaturated fatty acids
US7189559B2 (en) * 2004-11-04 2007-03-13 E. I. Du Pont De Nemours And Company Mortierella alpina lysophosphatidic acid acyltransferase homolog for alteration of polyunsaturated fatty acids and oil content in oleaginous organisms
US7470532B2 (en) 2005-10-19 2008-12-30 E.I. Du Pont De Nemours And Company Mortierella alpina C16/18 fatty acid elongase
AU2006316610B2 (en) 2005-11-23 2012-06-14 E. I. Du Pont De Nemours And Company Delta-9 elongases and their use in making polyunsaturated fatty acids

Also Published As

Publication number Publication date
UA103595C2 (uk) 2013-11-11
WO2008124048A8 (en) 2011-11-03
WO2008124048A2 (en) 2008-10-16
JP2010523113A (ja) 2010-07-15
CN104152423A (zh) 2014-11-19
US20080254191A1 (en) 2008-10-16
BRPI0808577A2 (pt) 2019-09-24
EP2129777A2 (en) 2009-12-09
US20150031096A1 (en) 2015-01-29
MX2009010574A (es) 2009-10-22
HUE028692T2 (en) 2016-12-28
RU2009140397A (ru) 2011-05-10
WO2008124048A3 (en) 2009-02-05
US8828690B2 (en) 2014-09-09
CN101765658A (zh) 2010-06-30
RU2014102130A (ru) 2015-08-27
CN101765658B (zh) 2013-11-20
RU2517608C2 (ru) 2014-05-27
EP2129777B1 (en) 2015-10-28
CA2679988A1 (en) 2008-10-16
AU2008236723A1 (en) 2008-10-16
DK2129777T3 (en) 2016-01-25
ES2559312T3 (es) 2016-02-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP2129777B1 (en) Multizymes and their use in making polyunsaturated fatty acids
JP5123861B2 (ja) Δ９エロンガーゼおよびそれらの多価不飽和脂肪酸製造における使用
EP2121737B1 (en) Delta-8 desaturases and their use in making polyunsaturated fatty acids
EP2140007B1 (en) Delta-5 desaturases and their use in making polyunsaturated fatty acids
US8119860B2 (en) Delta-9 elongases and their use in making polyunsaturated fatty acids
EP2390339B1 (en) Delta-8 desaturases and their use in making polyunsaturated fatty acids
AU2008236723B2 (en) Multizymes and their use in making polyunsaturated fatty acids
AU2013245497A1 (en) Multizymes and their use in making polyunsaturated fatty acids