RS20171030A1 - F-fukoidani, desulfonovani f-fukoidani i njihovi derivati, desulfonovane oligo-fukoze kao inhibitori gastrointestinalnih infekcija - Google Patents

Description

F-FUKOIDANI, DESULFONOVANI F- FUKOIDANI I NJIHOVI

DERIVATI, DESULFONOVANE OLIGO-FUKOZE KAO INHIBITORI

GASTROINTESTINALNIH INFEKCIJA

OBLAST TEHNIKE

Ovaj pronalazak se odnosi na prirodne, desulfonovane i obrađene fukoidane, desulfonovane oligosaharide ili oligo-fukoze, koji su izolovani iz prirodnog materijala (F-fukoidana), za upotrebu u lečenju ili profilaksi gastroenteritisa, infekcija koje izazivaju norovirusi ili rotavirusi, Salmonella sp. ili Pseudomonas aeruginosa ili Campylobacter jejuni, vezivanjem za glikane krvnih grupa na mucinu i mucinu sličnim O-glikoproteinima na epitelu gastrointestinalnog trakta sisara, kao i postupak za njihovo pripremanje. Prema MKP pronalazak pripada klasama A61K 31/70, A61K 36/00, A61P 31/12, A61P 31/14, A61P 31/04.

TEHNIČKI PROBLEM

Ovim pronalaskom se rešava problem dobijanja jeftinog, prirodnog i bezbednog preparata, koji ima izraženu aktivnost na neutralizaciju patogena. Odabirom bitnih parametara procesa u svim fazama tehnološkog postupka moguće je izvršiti potpuno desulfonovanje prirodnih sulfonovanih polisaharida, fukoidana, u cilju dobijanja potpuno ili delimično desulfonovanih fukoidana i fragmenata polisaharida. Ovako desulfonovani/modifikovani fukoidani, neočekivano pokazuju poboljšanu antivirusnu i antibakterijsku terapeutsku aktivnost. Esencijalna modifikacija prirodnog F-fukoidana odnosi se nа desulfonovanje polisaharida, budući da se ovakvim demaskiranjem fukoznih liganada postiže bolje vezivanje agensa. Takođe je neočekivano uočeno da se sa smanjenjem broja monosaharidnih jedinica povećava aktivnost desulfonovanog oligosaharida.

Pronalaskom se obezbeđuje efikasan, bezbedan, netoksičan i ekonomičan prirodni proizvod koji se kao takav može koristiti kao dodatak ishrani u preventivne svrhe ali i za suzbijanje nastalih tegoba izazvanih norovirusima, rotavirusima, Salmonella sp. i Pseudomonas aeruginosa ili Campylobacter jejuni, kako kod odraslih osoba tako i kod dece. Ovi polisaharidi i izvedeni oligosaharidi mogu biti korišćeni i u industrijskim uslovima u uzgoju npr. ostriga i drugih namirnica za koje postoji rizik od infekcije navedenim patogenima.

Norovirusi su najčešći uzročnici akutnog gastroenteritisa kod ljudi, rapidno mutiraju, vrlo su zarazni, lako se prenose, a za osetljive populacije mogu biti i fatalni.

Norovirusi, zajedno sa rotavirusima, najčešći su uzroci virusnog akutnog gastoenteritisa u ljudskoj populaciji u zemljama u razvoju ali i u razvijenijim zemljama. Godišnji broj dijareja koje se leče ambulantno, procenjuje se na 8 miliona u razvijenim zemljama, sa 0.5 miliona hospitalizacija i 9 miliona hospitalizacija u zemljama u razvoju, i sa skoro 2 miliona smrtnih slučajeva.

Norovirus-infekcije i njihovi simptomi predstavljaju jedan od najčešćih uzroka smrti u svetu za decu mlađu od tri godine. Samo u 2011. godini u Nemačkoj je prijavljeno više od 15.000 infekcija kod beba (uzrasta od 0 do 12 meseci), a oko 20 miliona infekcija širom sveta. Za više od 200.000 slučajeva smrti odojčadi procenjuje se da je uzrok norovirus-infekcija.

Nemoguće je generalno predvideti broj obolelih u sezoni, jer je uočeno da pojedinih godina taj broj može da premaši i 100 % broja obolelih prethodne godine. Tome treba dodati da se procenjuje da na svaki prijavljeni slučaj može doći oko 300 neprijavljenih, jer se velika većina obolelih koji imaju blage simptome i ne javi lekaru. Tako je recimo 2013.godine u Britaniji procenjeno da je broj obolelih premašio u prvom mesecu epidemije čak 1,2 miliona.

Iako su druge studije pokazale da do 90 % odraslih, do sada testiranih, imaju antitela protiv norovirusa, takođe je otkriveno da je imunitet nepotpun i traje samo oko 6 meseci i na taj način ne pruža zaštitu čak i protiv reinfekcija istim zaraznim sojem.

Norovirusi, rod u porodici Caliciviridae, su jednostavni virusi bez omotača koji sadrže jednolančani RNK genom okružen kapsidom. Kapsid formira jedan veliki strukturni protein.

Postoji sve više dokaza da fukoza, kao strukturni deo antigena histo-krvne grupe ili Lewisovih antigena, biva prepoznata od strane P domena kapsidnog proteina virusa.

Iako je sprovođenje studije o norovirasima i dalje teško zbog činjenice da ne postoje životinjski modeli, ipak je nedavno razvijen model kulture ćelija za procenu njihove patogenosti. Takođe, korišćenjem rekombinantnih virusnih čestica i ispitivanjem na volonterima, otkriveni su antigeni histo-krvnih grupa (HBGA) koji služe kao receptori za noroviruse, kao početni cilj za ulazak virusa i iniciranje procesa infekcije. HBGA su kompleksni oligosaharidi koji su eksprimirani nа površini crvenih krvnih zrnaca, stomačne mukoze, na disajnim putevima, urogenitalnom sistemu i crevnom traktu. HBG antigen Hl, koji je kodiran putem FUT2, alfa-l ,2-fakoziltransferaze, identifikovan je kao najvažnija genetska predispozicija; pojedinci sa homozigotnim zero-mutiranim alelom za FUT2 su se pokazali kao skoro otporni nа gastrointestinalne infekcije norovirusom.

Slično tome, infekcije rotavirusima su drugi najčešći uzrok teške dijareje kod odojčadi i male dece. Rotavirus se sastoji od dvostrukog lanca RNK i pripada porodici Reoviridae. Skoro svako dete u svetu je do svoje pete godine života bilo zaraženo rotavirusom bar jednom. Kao i norovirus, i rotavirus se uglavnom prenosi oralnim putem, a fekalije su izvor zaraze.

U svetu više od 450.000 dece ispod pet godina starosti i dalje umre od rotavirus infekcije svake godine, od kojih većina živi u zemljama u razvoju, a skoro dva miliona postaju teško bolesni. Iako je učestalost i ozbiljnost rotavirus infekcija opala u zemljama koje su uvele rotavirus vakcinu u redovnu imunizaciju dece, razvoj vakcine koja sprečava i norovirus i rotavirus infekcije bio bi veoma dragocen.

Do danas, ne postoji ni vakcina ni uzročna terapija ili lek za gastroenteritis izazvan norovirusom. Kao posledica toga, tretman norovirus gastroenteritisa ograničen je na suportivnu oralnu i eventualno parenteralnu rehidrataciju uz upotrebu elektrolita.

Potreba za novim supstancama i kompozicijama pomoću kojih se može efikasno sprečiti i lečiti gastrointestinalna infekcija izazvana norovirusima i patogenima sa sličnim mehanizmom ulaska i vezivanja za tkiva, dovela je do predmeta ovog pronalaska.

STANJE TEHNIKE

Prvo izolovanje ,,fukoidana“ iz morskih braon algi opisano je pre 90 godina (Killing, 1913). Trideset pet godina kasnije, publikovan je dokaz koji pokazuje da se fukani takođe javljaju i kod morskih beskičmenjaka (Vasseur, 1948). Ovi polisaharidi, uglavnom sačinjeni od sulfonovane L-fukoze, lako se ekstrahuju iz ćelijskih zidova braon algi (npr. Phaeophyceae) toplom vodom (Percival i Ross, 1950) ili kiselim rastvorima (Black, 1954) i mogu činiti više od 40 % suve mase izolovanih ćelijskih zidova (Kloareg, 1984). Kod morskih beskičmenjaka, sulfonovani fukani se javljaju u želatinoznoj opni jaja morskih ježeva (Mulloy et al., 1994) i u spoljašnjem zidu morskih krastavaca (Mourão and Bastos, 1987). Već neko vreme je poznato da fukani braon algi, često nazivani i fukoidanima, deluju kao modulatori koagulacije, kao i drugi polisaharidi algi (Chargaff et al., 1936). Preparati fukoidana predloženi su kao alternativa antikoagulansu heparinu, koji sе dobija iz sluzokože sisara; s obzirom na to da su biljnog porekla, manje је verovatnc da sadrže infektivne agense, poput virusa ili priona. Као i heparin, pokazano je da i fukoidani utiču na mnoge biološke aktivnosti poput: upale, proliferacije ćelija i adhezije, virusne infekcije i fertilizacije (Boisson-Vidal et al., 1995).

Ipak, relativno malo studija je interpretiralo biološku aktivnost fukoidana u pogledu molekulske strukture. Skoro sve biološke studije koriste komercijalno dostupni sirovi (grubi) preparat sulfonovanih polisaharida iz Fucus vesiculosus-a, umesto prečišćenog fukoidana (Mulloy et al., 1994). Skorašnji uvidi u strukture fukana iz različitih biljnih i životinjskih vrsta mogu pomoći u objašnjavanju njihovog načina delovanja, bilo kao istraživačkih reagenasa ili kao potencijalnih terapeutika.

Fukoidam algi su prisutni u nekoliko redova, uglavnom Fucales i Laminariales, ali takođe i u redovima: Chordiales, Dictyotales, Dictyosiphonales, Ectocarpales i Scytosiphonales. Zapravo, oni su široko rasprostanjeni među svim braon algama (Phaeophyceae) koje su do sada ispitane. Sa druge strane, čini se da fukoidana nema u zelenim algama (Chlorophyceae), crvenim algama (Rhodophyceae) i zlatnim algama (Xanthophyceae), kao ni u slatkovodnim algama i kopnenim biljkama.

Antikoagulatorne i antitrombozne aktivnosti fukoidanskih frakcija (A. nodosum) povećavaju se sa porastom molekulske mase i sadržaja sulfata. Ipak, frakcije u kojima je nativni obrazac sulfonovanja netaknut, potentnije su od frakcija ekvivalentnih molekulskih težina i ukupnog stepena sulfonovanja u kome je ovaj obrazac prekinut parcijalnim desulfonovanjem (Boisson- Vidal et al., 2000).

Fukoidan i fukoidani male molekulske mase, ali ne desulfonovani fukoidani, inhibiraju Plasmodium berghei razvoj u Hep G2 ćelijama i invaziju sporozoita u jajnim ćelijama kineskog hrčka (Ying et al., 1997).

Specifične enzimske metode mogu biti korišćene za dobijanje krojenih oligosaharida za biološke studije, kao i za dobijanje pojednostavljenih uzoraka iz kojih je moguće zaključiti strukturu originalnog fukoidana. Trenutno primenjivane metode hemijskih modifikacija pred analizu (hidroliza, desulfonovanje, deacetilovanje) često zahtevaju jake bazne ili kisele uslove na visokim temperaturama, koji mogu modifikovati polisaharide. Na primer, acetil grupe su pronađene kod skoro svih fukoidana algi koji su ispitivani poslednjih godina (C. filum, C. okamuranus, F. evanescens) ali mogu biti uklonjene u procesu pripreme (Chizov et al., 1999). Jedna studija pokazala je sulfatazu koja je mogla specifično da deluje na neke sulfatne grupe fukoidana (Daniel et al., 2001). Ovaj enzim, delimično prečišćen iz školjke P. maximus, sposoban je da oslobodi sulfatnu grupu prisutnu u položaju 2 monosulfonovane L-fukoze, ili mono- i disulfonovanih komponenata disaharida iz A. nodosum fukoidana. Zajedno sa α-L- fukozidazom prečišćenom iz istog mekušca, čini se da je moguće povećati degradaciju fukana (Berteau et al., 2002). Ovi enzimi su stoga jedinstveno oruđe za proizvodnju selektivno modifikovanih fukana, koji bi mogli da omoguće direktno određivanje učestvovanja bočnih nizova (grana) i sulfatnih grupa u njihovoj biološkoj aktivnosti.

Kao i mnogi drugi sulfonovani polisaharidi, fukoidani mogu da inhibiraju virusne infekcije ćelija. Ovo je pokazano za Herpes simplex, citomegalovirus, i virus humane imunodeficijencije (Hoshino et al., 1998), kao i za goveđi dijareja virus (Iqbal et al., 2000), verovatno kompeticijom sa HS sa ćelijske površine za vezivanje za virus. Neki podaci 25 ukazuju na terapeutsku primenljivost u kontekstu citomegalovirusne infekcije, ali ovo je striktno i potpuno zavisno od prisustva sulfata na polisaharidu, dok bi obrađeni proizvod trebalo da bude u potpunosti ili bar delimično lišen sulfata, pošto se tako štite (maskiraju) relevantni fukozni ostaci.

Marionneau i saradnici (”Norwalk Virus Binds to Histo-Blood Group Antigens Present on Gastroduodenal Epithelial Cells of Secretor Individuals”, Gastroenterology (2002) 122:1967- 1977), pokazali su da rekombinantne čestice slične norovirusu koriste ugljene hidrate prisutne u gastroduodenalnim epitelnim ćelijama kao ligande.

Dalje, Morrow i saradnici (’Human Milk Oligosaccharides are associated with protection against Diarrhea in Breast-fed Infants”, J. Pediatr. (2004) 145:297-303) uočili su da se dijareja uzrokovana Campylobacter-om i Calicivirus-om ređe javlja kod odojčadi koja su bila hranjena mlekom koje sadiži visoke nivoe 2-povezanog fukoziloligosaharida u ukupnom udelu mlečnih oligosaharida.

S tim u vezi, ЕР1689348(B1) (2003) otkriva primenu sastava oligosaharida, naročito glikoproteina gde je 2-fukozillaktoza vezana za humani albumin u serumu, u lečenju infekcija. Terapeutski efekat mlečnih oligosaharida je dobro poznat, tako prijava WO2010/120682 otkriva mlečne oligosaharide i njihovu primenu u lečenju infekcija kod sisara. WO2012/092153 otkriva hranljivi sastav koji obuhvata humane mlečne oligosaharide i nukleotide i njihovu pimenu u lečenju i/ili prevenciji enterovirusnih infekcija. WO2014/128057 otkriva sintetički fukozilovani oligosaharid koji se koristi u lečenju ili profilaksi infekcija virusom sličnom norovirusima ili rotavirusima kod sisara. Oligosaharidi opisani ovim patentom ne ukijučuju samo fukozu, već i galaktozu, glukozu, srodne P(l-4) i β(l-3) glikozidne veze, kao i N-acetilgalaktozamin. Mešavina oligosaharida izvedenih iz fukoidana je aktivnija od mlečnih oligosanarida, za oko jedan red veličine, kao što će biti pokazano u opisu pronalaska i u primerima izvođenja.

Najrelevantnija literatura bliska ovoj temi osvrće se samo na potencijalnu primenu u kontekstu infekcija citomegalovirusom. (Wang et al. ”The antiviral activities and mechanisms of marine polysaccharides: an overview.” Mar Drugs. 2012; 12;10(12):2795-816 and Li at al. ’F҆ucoidan: structure and bioactivity” Molecules 2008; 12;13(8):1671-95). Ove primene zavise od nativnog stanja sulfonovanog polisaharida. Prema poznatom stanju tehnike, desulfonovani polisaharidi ili polisaharidi izvedeni iz oligosaharida, očekuje se da su neaktivni u kontekstu sledećih patogena (norovirusi, rotavirusi, Salmonella sp., Pseudomonas aeruginosa i Campylobacter jejuni). Suprotno tome, mi pokazujemo da sulfatni ostaci moraju biti uklonjeni prvenstveno u slučaju norovirusa, da bi demaskirali (otkrili) bitne fukozne ostatke. Štaviše, bioaktivnost polisaharida drastično se povećava kada je polisaharid fragmentisan do nivoa oligosaharida čija je veličina do 20 monomernih jedinica (veći oligosaharidi su i dalje aktivni kao što važi i za prirodne fukoidane).

Veliki broj radova govori o parcijalnoj kiseloj hidrolizi morskih polisaharida i relevantnih polisaharida izolovanih iz braon algi, ali te procedure nisu dovoljno jednostavne i delotvorne da bi se postigli i fragmentacija i potpuno desulfonovanje u jednom koraku. Ovo je važno zato što su proizvodi, desulfonovani oligosaharidi (oligo-fukoze), karakterisani svojom sposobnošću da blokiraju vezivanje norovirusa za humani želudačni mucin. (Pielesz at al. ”Mild acid hydrolysis of fucoidan: characterization by electrophoresis and FT-Raman spectroscopy”. Carbohydr. Res. 2011;27;346( 13): 1937-44 and Kusaykin at al.”Fucoidanases” Glycobiology. 2016; 26(1):3-12).

Postoje mnogobrojni radovi koji opisuju konkretan mehanizam vezivanja relevantnih sojeva norovirusa za terminalnu fukozu koja je deo antigena krvnih grupa, naročito za H krvnu grupu (Fucαl-2Gal) i eventualno za H2 antigen krvne grupe (Fucαl-2Gall 4GlcNAc/Glc). (Koromyslova at al. ”The sweet quartet: Binding of fucose to the norovirus capsid.” Virology. 2015; 483:203-8, Singh at al. "Structural Evolution of the Emerging 2014-2015 GII.17 Noroviruses.” 2015; 23;90(5):2710-5, Chen at al. “Crystallography of a Lewis-binding norovirus, elucidation of strain-specificity to the polymorphic human histoblood group antigens.” Pathog. 2011; 7(7):el002152 and Singh at al. ”Human noroviruses' fondness for histo-blood group antigens.” Virol.2015; 89(4):2024-40).

Rotavirusi, pored norovirusa, drugi su najrelevantniji tip virusa za koji se zna da se vezuju za H antigene/oligosaharide krvnih grupa. Stoga, može se očekivati da se infekcija uzrokovana rotavirusom može sprečiti primenom obrađenih polisaharida. Isto važi za sojeve Pseudomonas-a i Salmonella-e, pošto vezivanje oba može biti blokirano mlečnim oligosaharidom vezanim za H krvnu grupu, 2-fukozillaktozom. (Tan at al. ”Histobloodgroup antigens: a common niche for norovirus and rotavirus.” Expert Rev Mol Med.

2014; 10;16:e5, Weichert at al.”Bioengineered 2'-fucosyllactose and 3-fucosyllactose inhibit the adhesion of Pseudomonas aeruginosa and other enteric pathogens, like Campylobacter jejuni, to human intestinal and respiratory cell lines.” Nutr Res. 2013; 33(10):831-8, Wu at al. ”Interactions of the fucose-specific Pseudomonas aeruginosa lectin, PA-IIL, with mammalian glycoconjugates bearing polyvalent Lewis(a) and ABH bloodgroup glycotopes” Biochimie. 2006; 88(10):1479- 92 and Topin at al. ”Deciphering the glycan preference of bacterial lectins by glycan аrrау and molecular docking with validation by microcalorimetry and crystallography.” PLoS One.2013; 19;8(8):e71149.).

Sledeći radovi opisuju vezivanje norovirusa za antigene krvnih grupa u gastrointestinalnom traktu životinja (školjke, dagnje i ostrige, svinje): Tian at al. ”Norovirus recognizes histoblood group antigens on gastrointestinal cells of clams, mussels, and oysters: a possible mechanism of bioaccumulation.” Food Prot. 2007; 70(9):2140-7, Schaeffer at al. ”Norovirus contamination on French marketed oysters.” Food Microbiol. 2013; 2;166(2):244-8, Thebault at al. ”Infectivity of GI and GII noroviruses established from oyster related outbreaks.” Epidemics. 2013; 5(2):98-110, Maalouf at al. ”Distribution in tissue and seasonal variation of norovirus genogroup I and II ligands in oysters.” H, Zakhour M, Le Pendu J, Le Saux JC, Atmar RL, Le Guyader FS. Appl. Environ. Microbiol.

2010; 76(16):5621-30 and Tian at al. "Binding of recombinant norovirus like particle to histo-blood group antigen on cells in the lumen of pig duodenum.” P, Jiang X, Zhong W, Jensen HM, Brandl M, Bates AH, Engelbrektson AL, Mandrell R. Res Vet Sci. 2007; 83(3):410-8.

U stanju tehnike postoje takođe patenti i prijave koji se konkretno odnose na braon algu Laminaria japonica. Tako CN105147743 (2015) objašnjava primenu laminaria ekstrakta u lečenju EV71 zaraznih bolesti. Patent se odnosi na korisne zdravstvene efekte glukana (poliglukoze) u kontekstu enterovirusa (EV71). CN103665120 (2013) se odnosi na pripremu lektina iz Laminaria japonica, CN102367282(B) (2011), CN102274247(B) (2011) i KR100485686(B) (2003) opisuju pripremu polisaharida izolovanog iz Laminaria japonica, koji nema nikakve veze sa fukoidanom. KR20090127785 (2008) se odnosi na izolovanje fukoidana iz Laminaria japonica. Svi ovi patenti, koji opisuju različite varijante ekstrakcije i prečišćavanja fukoidana, nisu u sukobu sa relevantnim informacijama dostupnim u predloženoj prijavi. US9241951(B2) (2009) Ovaj pronalazak se odnosi na poboljšanje zdravlja gastrointestinalnog trakta, imunitet i performanse direktnom dijetetskom intervencijom koja je sačinjena od glukana i/ili fukana. Za te potrebe uglavnom su korišćene braon alge, konkretno Laminariaceae, Fucaceae i Lessoniaceae.

US5646130 (1995) opisuje sulfonovane polisaharide male molekulske mase (manje od 5 kDa) koji sadrže oko 20 monosaharidnih jedinica. Oligosaharidi opisani ovim patentom obuhvataju manuronopiranozu (manozu) i glukuronsku kiselinu. Ovi oligosaharidi se koriste u prevenciji i terapiji ishemijskih vaskularnih bolesti srca i centralnog nervnog sistema indukovanih trombozom, za lečenje moždanog infarkta uzrokovanog akutnom trombozom, kod angine uzrokovane koronarnom ishemijom, za lečenje hiperlipoproteinemije i smanjenje relativne količine holesterola.

US2002019991(A) (1998) opisuje sastave koji sadrže alfa 1,2-fukozu i njihovu primenu u lečenju i prevenciji gastrointestinalnih infekcija uzrokovanih bakterijama Escherichia coli i Vibrio cholerae.

US6126961(A) (1998) opisuje sastav i metod za smanjenje kolonizacije životinjskih creva Salmonella sp. i ostalim bakterijskim patogenima, koji uključuje polisaharid koji sadrži cis- hidroksi šećerne jedinice ili njihove derivate, ili monosaharid ribozu ili ramnozu ili njihove derivate, u hrani za životinje. Polisaharidne cis-hidroksi šećerne jedinice mogu biti pojedinačno ili kombinacija manoze, manoznog derivata, galaktoze, galaktoznog derivata, galaktomanana, galaktozamina, fukoze i arabinoze. Polisaharidi mogu biti inkorporirani u stočnu hranu u obliku gume ili drugih biopolimera.

JP5364352(B) (2003) objašnjava metod za proizvodnju desulfonovanih oligomernih fukoidana i uključuje izlaganje fukoidana fukoidan-asimilativnim bakterijama koje imaju odgovarajuće aktivnosti na desulfonovanje i oligomerizaciju fukoidana, npr. bakterije koje pripadaju rodu Flavobacterium poput Flavobacterium limicola NITE AP-674 ili Luteolibacter algae AP-675, AP-676, ili njihovi ekstrakti. US6140481(B) (1994) opisuje proces proizvodnje desulfonovanog polisaharida sa agensom za sililovanje, i desulfovanog heparina. JP3497209(B) (1993) opisuje metod za izvođenje desulfonovanja sulfonovanih šećera u prisustvu agensa za sililovanje. Kao ovaj agens poželjno je koristiti 2-trimetilsiloksipento-2- en-4-on.

Pomin et al. (”Mild acid hydrolysis of sulfated fucans: a selective 2-desulfation reaction and an alternative approach for preparing tailored sulfated oligosaccharides”, Glycobiology (2005) 15(12):1376-1385), opisuju parcijalno desulfonovanje.

US2005255564(A) (2002) proces patent odnosi se na fragmentaciju sulfonovanih fukana, tj. na enzimski pristup koji ostavlja sulfonovanje netaknutim.

W02014170505(A) i US7846452(B) (A) objašnjavaju pripreme i sastav ekstrakata biljnih vrsta i morskih trava, uključujući Fucus vesiculosus, koji su korisni u regulaciji imuniteta.

CN102936293 (B) (2012) opisuje protokol zasnovan na mikrotalasima, za ekstrakciju i prečišćavanje fukoidana iz Fucus vesiculosus i US9447199(B) (2014) iz braon algi.

JPH01313433 (A) (1988) i EP0606882(A) (1993) opisuju anti-HIV aktivnost, koja je pak veoma zavisna od sulfonovanja fukoidana.

Različite hemijske strukture su predlagane za ovaj polisaharid, još od njegovog otkrića od strane Killing-a. Polisaharid fukoidan egzistira kao homopolimer fukoze (F-fukoidan) ili je heteropolisaharid. Njegov sastav varira u zavisnosti od izvora i sezone. Hemijski sastav većine fukoidanskih polisaharida je složen. Prema svojoj strukturi, F-fukoidani mogu biti podeljeni u dve grupe, u zavisnosti od njihovog izvora: jedna grupa uključuje Laminaria vrste čiji je centralni lanac sačinjen od (1→3) povezanih α-L-fukopiranoznih jedinica; drugu grupu čine fukoidanski polisaharidi izolovani iz Ascophyllum i Fucus vrsta čiji je centralni lanac sačinjen od ponavljajućih (1→3) i (1→4) povezanih α-L-fukopiranoznih jedinica.

Neke male količine α-L-fukopiranoze su (1-2) vezane za fukoze glavnog lanca. Pored fukoze i sulfatnih grupa (F-fukoidana), prisustvo monosaharidnih ostataka poput manoze, galaktoze, glukoze, ksiloze i uronskih kiselina je uočeno kod U-fukoidana. Sulfatni ostaci su pronađeni u visokim količinama, s obzirom na to da je svaka druga fukoza supstituisana. Tako je u eksperimentalnom radu upotrebljen Fucus vesiculosus kao izvor fukana, pronalazak se odnosi na definisane delimično ili potpuno desulfonovane oligosaharide bez namere da se ograniči na ovaj specifični prirodni izvor. Mogući izvori mogu biti sve vrste braon algi i morskih trava, ali takođe i ostale morske životinje ili biljke.

Patent US7838004 B2 (US20060211652 Al) opisuje metod parcijalne hidrolize fukoidana kojim se dobija sulfonovani oblik koji se primenjuje za izradu formule za dečju ishranu (US20060210697 Al). Izvor ovih fukoidana su Japanese mozuku, Japanese kombu i Tongan limu moui.

Iako, sa gore navedenim stanjem tehnike, postoje različiti pristupi tretmanu ili prevenciji infekcija uzrokovanih norovirusima i drugim entero patogenima, još uvek nije pronađena konkretna kompozicija koja bi se pokazala efikasnom u takvom lečenju/profilaksi.

OPIS PRONALASKA

Pronalazak se odnosi na prirodne F-fukoidane, desulfonovane F-fukoidane i nove desulfonovane oligosaharide dobijene desulfonovanjem i fragmentacijom F-fukoidana, koji imaju malu molekulsku masu i optimalne veličine u rasponu od najviše 20 monomernih jedinica fukoze koje su povezane alfa glikozidnom vezom. Као izvor fukoidana korišćene su braon alge Fucus vesiculosus, ali pronalazak nema nameru da se na njih ograniči. Naime, poznato je da je sadržaj oligosaharida u braon algama i drugim plodovima mora između 12 i 20 %, što ih čini pogodnima za izolovanje oligosaharida pod ekonomičnim uslovima.

Fukoidan predstavlja glavnu komponentu u braon algama (kao na primer u F. vesiculosus, gde čini 12 % biomase). Braon alga Laminaria japonica Aresch (Laminariales) je jedna od najvažnijih privrednih algi koja se gaji u Kini, a takođe je široko rasprostranjena u japanskoj i koreanskoj kuhinji. Korišćenje L. japonica je dokumentovano u tradicionalnoj kineskoj medicini više od hiljadu godina. Fukoidan ima prednost jer je dostupan u neograničenim količinama, po maloj ceni, lako se dobija i brzo može biti dostupan na tržištu zbog činjenice da fukoidan polisaharidi nemaju štetne (toksične) efekte na zdravlje ljudi i životinja.

Poznati radovi se odnose na hidrolizu polisaharida iz morskih algi i njihovu fragmentaciju ali ni jedan od njih ne opisuje jednostavan i efikasan proces gde se u jednom koraku vrši parcijalna fragmentacija i potpuno desulfonovanje fukoidana. Desulfonovani F-fukoidani, desulfonovani oligosaharidi nastali iz njih, oligo-fukoze, koji su, pored prirodnih polisaharida, prioritetni predmet ovog pronalaska, posebni su po svojoj sposobnosti da kompetitivno blokiraju vezivanje norovirusa i drugih entero patogena. sa sličnom rutom infekcije koji koriste vezivanje za H antigene krvnih grupa. Postupak kojim sе dobijaju ovako dobro definisani desulfonovani poli- i oligosaharidi je ekonomičan, jednostavan i efikasan - potpuno desulfonovanje samostalno ili kobinovano sa fragmentacijom polisaharida može se vršiti u samo jednom koraku.

Ekstrakcija F-fukoidana iz mrkih algi Fucus vesiculosus, vršena je na uobičajen način koji se primenjuje za ekstrakciju drugih sulfatnih oligosaharida iz makroalgi, koji započinje toplom vodom, a taloženje se vrši solima ili organskim rastvaračima.

Ovaj tip ekstrakcije obezbeđuje prinos fukoidan polisaharida od 0.26 % do 20 % u odnosu na suvu biomasu algi. Fizičko-hemijske karakteristike ekstrahovanih fukoidan polisaharida zavise od strogosti parametara primenjenih tokom ekstrakcije, kao što su: temperatura, vreme reakcije, koncentracija hemikalija, ali i od inherentnih faktora algi, kao što su vrsta i veličina algi, lokalna klima i faktori životne sredine.

Prema predmetnom pronalasku, postupak za proizvodnju desulfonovanih F-fukoidana odnosi se na jedinstven hemijski postupak primenom neutralne, suve pirimidinium soli, tretiranjem smešom dimetil sulfoksida/piridina (5:12, v:v) na 100 °C tokom 9 h da bi se oslobodio sulfat solvolizom. Proizvod je ekstenzivno dijalizovan radi uklanjanja organskih reagenasa i osušen u rtacionom vakuum uparivaču.

Prema predmetnom pronalasku, postupak za proizvodnju desulfonovanih oligosaharida niske molekulske mase iz fukoidana odnosi se na desulfonovanje/ffagmentac-ju koja se vrši parcijalnom hidrolizom katalizovanom neorganskim ili organskim kiselinama ili rastvorljivom polistirenesulfonskom kiselinom visoke molekulske mase koja omogućava razdvajanje oligo- fukoza niske molekulske mase iz kiseline dijalizom/ultrafiltracijom. Stalnim uklanjanjem proizvoda i zagrevanjem na grafitnom ugljeniku njihova veličina se može kontrolisati isključenjem odgovarajućih membrana za dijalizu ili ultrafiltraciju. Ceo proces je kontinuiran i lako se može prilagoditi industrijskom procesu.

Prema predmetnom pronalasku, obrada F-fukoidana zavisno od delimične hidrolize kiselinom obuhvata sledeće korake: neutralizaciju posle sušenja vakuumskim isparavanjem isparljivih kiselina (koje treba neutralisati nakon kiselinom katalizovanog desulfonovanja pri čemu zaostaje sumporna kiselina). Takođe može da obuhvata i subfrakcionisanje ultrafiltriranjem radi obogaćivanja relevantne frakcije oligosaharida, ili čvrsto-tečnu ekstrakciju (Solid Phase Extraction, SPE) na grafitnom ugljeniku (Carbograph kertridži). Dodatne alternative mogu sadržati primenu gel propusne hromatografije (GPC) za subfrakcionisanje glikana ili odstranjivanje glikanske frakcije, frakcionisanjem po grupama. Slično, dalje frakcionisanje glikana može se postići polarno faznom hromatografijom na amino-, amid- ili diol-fazama (HILIC).

Iako je poznata antivirusna aktivnost fukoidana, mora se naglasiti da su ove aktivnosti veoma zavisne od stepena sulfonovanja (CMV, HIV), a njihov mehanistički način delovanja nije vezan za kompeticiju ugljenih hidrata na krvnim grupama. Prirodni (sulfonovani) fukoidan, u poređenju sa desulfonovanim ili obrađenim derivatima, je manje aktivan kada su u pitanju patogeni koji izazivaju gastroenteritis.

Norovirusi relevantnih sojeva naročito se vezuju za terminalnu fukozu koja je deo antigena krvnih grupa, posebno za Н1 antigen (Fucαl -2Galβl -3GlcNAc) i eventualno H2 antigen (Fucαl -2Gall -4GlcNAc).

Rotavirusi su, pored norovirusa, drugi najvažniji tip virusa za koji se zna da se vezuje za H antigene/oligosaharide krvnih grupa. Stoga, može se očekivati da se i rotavirus infekcija može sprečiti primenom opisanih polisaharida. Isto važi i za Pseudomonas aeruginosa, Campylobacter jejuni i Salmonella sp. sojeve, jer vezivanja oba ova soja mogu biti blokirana od strane mlečnog oligosaharida 2-fukozillaktoze, koji je vezan za H antigen krvne grupe.

Mikrobno proizvedeni mlečni oligosaharidi, poput 2-fukozillaktoze, trenutno očekuju odobrenje za izlazak na tržište kao aditivi u dečijim formulama jer su pokazali određenu zaštitnu vrednost.

Novost ovog pronalaska, odnosi se nа dokumentovane dokaze da sulfatna grupa polifukoze ne igra ulogu u blokiranju norovirusa, naprotiv, povoljnije je kada se ona ukloni, s obzirom na to da manje supstituisana fukoza postaje na ovaj način više dostupna. Struktura desulfonovanog polisaharida ili oligosaharida blokira viralno vezivanje kompeticijom sa ugljenim hidratima vezanim na krvnim grupama. Prema pronalasku, bioaktivnost desulfonovanih polisaharida se povećava.

Terapeutska aktivnost ovog dosulfonovanog oligosaharida može biti primenjena na sve varijante norovirusa koje imaju značaj u humanoj infekciji (GII.4 iz 1974 ili 2012, GII.10 i GII.17), ali i na one viruse koji koriste slične ili identične ulazne rute vezivanjem za oligosaharide krvnih grupa na epitelu, kao što su rotavirusi. Za opisani antivirusni agens meta je norovirus, ali i rotavirus ili drugi entero patogeni koji koriste slične puteve infekcije, kao što su Salmonella sp., Pseudomonas aeruginosa i Campylobacter jejuni. Pored ovog

mehanizma infekcije, svi ovi patogeni mogu izazvati infekciju i vezivanjem za glikane krvnih grupa na mucinu i mucinu sličnim O-glikoproteinima na epitelu gastrointestinalnog trakta.

Prema pronalasku, desulfonovani polisaharidi i oligosaharidi imaju jaku inhibitornu moć delovanja protiv vezivanja norovirusa i njihovih divergentnih sojeva za epitel. Posebno, humani patogeni GII.4 (Sydney 2012), GII.4 (CHDC 1974), GII.17 i GII.10 ispitivani su kao virusu slične čestice (VLP) sa fukoidanom dobijenim iz biljke u studiji direktnog vezivanja ili inhibicije vezivanja za ljudski želudačni mucin (definisan Lewis-ovom krvnom grupom) i/ili u studijama inhibicije i vezivanja uz korišćenje neoglikolipida koji potiču od oligosaharida iz humanog mleka vezivanjem za kapsid.

Različiti preparati fukoidana iz mrkih algi ispoljavaju inhibitornu moć, pri čemu je ustanovljeno značajno povećanje aktivnosti nakon desulfonovanja polisaharida solvolizom, smešom DMSO/piridin (5:12, v:v), u toku 9 h na 100 °C ili prerade nativnog materijala delimičnom hidrolizom u 0.01 M HCl (60 °C, 4 h), koja rezultira potpunim desulfonovanjem i parcijalnom fragmentacijom. Hlorovodonična kiselina može biti zamenjena drugim kiselinama (na primer mravljom ili sirćetnom kiselinom) koje se koriste u obliku 0.1 M rastvora (60 °C tokom noći) ili koristeći variranje parametara koji rezultiraju sličnom fragmentacijom i desulfonovanjem. Druga varijanta istovremene fragmentacije i desulfonovanja, koja se takođe bazira na parcijalnoj hidrolizi kiselinom, koristi rastvor polistiensulfonske kiseline (PSSA) visoke molekulske mase koja omogućava separaciju proizvoda (oligofukoze) na osnovu veličine molekula, kontinuiranom dijalizom na grafitnom ugljeniku. Desulfonovanje se takođe može postići tretmanom sa sulfatazama, a delimična fragmentacija polisaharida primenom fokoidanaza.

Pronalazak se zasniva na osnovnim dokazima da strukturni elementi prirodnog polisaharida (fukoidana) vrše konkurentne inhibicione efekte na norovirusni kapsid koji se vezuje za humani gastrički mucin. Pronalazak se potvrđuje tehnički na ELISA testovima koristeći VLP najrelevantnijeg srodnika norovirus soja, koji su svi pokazali slično, jako vezivanje za želudačni mucin i blokirani su sličnim efektivnim dejstvom pomoću polisaharida nezavisnih od krvnih grupa i njihovih obrađenih proizvoda.

Strukture aktivnih glikana i parcijalne strukture fukoidana dobijene su primenom MALDI masene spektrometrije (MS i MS/MS) prirodnih i permetilovanih oligosaharida, a pored toga i analizom veza primenom GC-MS. Aktivna frakcija sa najvišim inhibitornim efektom se sastoji od oligosaharida sa do 20 monosaharidnih jedinica, ikozasaharida, i sadrži sledeće strukturne elemente:

Fucl-2Fuc, Fucl-3Fuc, Fucl-4Fuc, Fucl-2Fucl-3Fuc, Fucl-2(Fucl-3)Fuc, Fucl-2(Fucl-4)Fuc, Fucl-3(Fucl-2)Fuc and Fucl-2Fucl-3(Fucl-4)Fuc. Kvantitativno dominantni oligomer fukoze varira između reda veličine od pet do 10 monomernih jedinica. Anomerna konfiguracija svih fukoza je alfa. Bilo koji od prethodno definisanih strukturnih elemenata nisu identični niti u vezi sa poznatim strakturama krvnih grupa Н1 ili H2. Naprotiv, čak L-Fucαl-2-L-Fuc (fukoza identična sa 6-deoksigalaktozom) se upadljivo razlikuje u strukturi u odnosu na L-Fuc 1 -2-D-Gal, jer subterminalni šećer je L nasuprot D konfiguracije.

Prema pronalasku, desulfonovani ili delimično desulfonovani oligosaharidi koji se nalaze u optimalnom opsegu veličine do 20 monosaharidnih jedinica, pokazalo se da su visoko potentni inhibitori vezivanja norovirusa za gastrointestinalni epitel kod ljudi.

NAJBOLJI NAČIN ZA PRIMENU PRONALASKA

Stoga, fukoidan, desulfonovani fukoidan i fukoidan derivati, desulfonovani oligosaharidi koji su predmet ovog pronalaska efikasni su u sprečavanju i/ili lečenju infekcija koje su izazvane patogenima kao što su norovirusi, rotavirusi, Salmonella sp., Pseudomonas aeruginosa ili Campylobacter jejuni.

Pronalazak se odnosi na upotrebu prirodnih fukoidana, desulfonovanih fukoidana ili njihovih derivata, desulfonovanih oligosaharida kao profilaktičkih i terapeutskih sredstava (aditiva hrani) i može se primeniti i tokom faza epidemije u bolnici, ili izvan nje, u cilju sprečavanja infekcije izazvane norovirusima, jer blokira vezivanje virusa za gastrointestinalni epitel. Fukoidan, desulfonovani fukoidan ili njegovi derivati, desulfonovani oligosaharidi mogu se koristiti kao profilaktička i terapeutska sredstva (aditivi hrani) i tokom drugih infekcija uzrokovanih drugim patogenima poput rotavirusa, Salmonella sp., Pseudomonas aeruginosa i Campylobacter jejuni, koji generalno imaju istu ulaznu rutu koja je posredovana ugljenohidratnim strukturama sličnim onim iz krvnih grupa. Kontaminacija ostriga norovirusom takođe može biti sprečena ispiranjem ostriga rastvorima prirodnih, desulfonovanih ili ovako dobijenih fukoidana, što ih čini izuzetno korisnim za primenu u industriji (ostriga).

Sledeći primeri ilustruju inventivni koncept, u skladu sa opisom pronalaska naznačenom u ovom patentu, u pogledu kompetitivnog afiniteta desulfonovanih oligosaharida i obezbeđivanja inhibicije vezivanja patogena svaki put kada je infekcija posredovana oligosaharidnim strukturama naiik onima iz krvnih grupa, kako bi se smanjilo intestinalno zadržavanje patogena kao što su norovirusi ili rotavirusi, Salmonella sp., Pseudomonas ceruginosa i Campylobacter jejuni. Bitno je naglasiti da ovi primeri obezbeđuju ilustraciju pronalaska, i ništa u njima ne treba uzeti kao ograničenje ukupnog obima pronalaska.

Pronalazak će biti dalje ilustrovan primerima izvođenja bez namere da se na njih ograniči.

Primer 1 - Vezivanje GII.4 virusu sličnih patogena (VLP) na imobilizovani nativni F- fukoidan

A, Vezivanje GII.4 (Sydney 2012) virusu sličnih patogena (VLP) za imobilizovani nativni F-fukoidan

Fukoidan je imobilisan sušenjem iz rastvora amonijum hidrogenkarbonata na polistirenskim pločama za mikrotitraciju. Blokiranje je vršeno primenom 5 % BSA/PBS). VLP su dispergovani u 0.05 % Tween20/PBS (10 μg/ml u skladu sa sadržajem proteina). Uslovi inkubacije ovog testa vezivanja bili su 1 h na 37 °C za VLP, primarno antitelo (anti GII.4, monoklonalno antitelo kunića, 1:3000), kao i za sekundarno antitelo (anti-Ig alkalna fosfataza kunića, 1:5000). Podloga p-nitrofenilfosfat (5 mg/ml) inkubirana je obično tokom 30 min na sobnoj temperature, a pojava boje je merena na 405 nm. Na slici (Slika 1.) su prikazani rezultati dvojnog određivanja pri različitim koncentracijama fukoidana.

B, C, Vezivanje GII.4 (Sydney 2012) virusu sličnih patogena za želudačni mucin (HGM) pri pH 7.4 (B) i pH 1.5 do 5.5 (C); (Slika 2.)

D, Varijacija uslova blokiranja kod određivanja vezivanja GII.4 za HGM (5 % obrano mleko/PBS prema 5 % BSA/PBS) (Slika 3.)

Primer 2 - Inhibicija vezivanja GII.4 (Sydney, 2012) VLP-a za humani želudačni mucin (HGM) od strane nativnog F-fukoidana, i desulfonovanog F-fukoidana izolovanog iz Fucus vesiculosus

Tri probe sa fiksnom koncentracijom inhibitora (10 mg/ml). (Slika 4.)

Primer 3 - Inhibicija vezivanja GII.4 (Sydney 2012) VLP-a za HGM (10 μg/ml) od strane obrađenog F-fukoidana (obrađenog delimičnom hidrolizom u 0.01 M HCl, tokom 4 h na 60 °C, praćena neutralizacijom)

Tri probe sa fiksnom koncentracijom inhibitora (5 mg/ml). (Slika 5.)

Primer 4 - Inhibicija vezivanja GII.4 (Sydney, 2012) VLP-a za HGM od strane različitih šarži/preparata nativnog i obrađenog fukoidana

Uzorak F-fukoidana čuvanog preko 10 godina na 5 °C i svež uzorak (oba uzorka iz Sigme) ispitana su u duplikatu (videti “stare” i “nove” šarže) nakon delimične hidrolize kiselinom (0.01 N HCl, 60 °C, 4 h), neutralizacije i rastvaranja u puferu za vezivanje za kapsid (0.01 % Tween-20/PBS) različite koncentracije. (Slika 6.)

Primer 5 - Inhibicija vezivanja GII.4 (2012) (A) i GII.17 (2015) (B) VLP za HGM od strane obrađenog fukoidana

Fukoidan iz Fucus vesiculosus obrađen je delimičnom hidrolizom kiselinom (0,01 N HCl tokom 4 h na 60 °C), neutralisan i rastvoren nakon sušenja u puferu za vezivanje za kapsid (0.01 % Tween-20/PBS). (Slika 7.)

Primer 6 - Vremenska kinetika obrađivanja fukoidana u razblaženoj hlorovodoničnoj kiselini zasnovana na testu inhibicije vezivanja sa GII.4 (Sydney, 2012) VLP-om Fukoidan iz Fucus vesiculosus inkubiran je sa 0.01 N HCl na 60°C tokom sve dužih vremenskih perioda (0-16 h), neutralisan primenom NaOH i ispitan na inhibitornu aktivnost u okviru određivanja vezivanja VLP-a sa GII.4 kapsidima kao što je prethodno opisano. (Slika 8.) Primer 7 - Komparativna evaluacija različitih radnih procedura

Radne procedure su uključivale ekstrakciju čvrste faze na grafitnom ugljeniku (Carbograph ulošci od 150 mg) i ultrafiltraciju na celufoznim membranama (membrana 10 kDa). Inhibitorna aktivnost obrađenog fukoidana (koncentracije su navedene na grafikonu, Slika 9.) ispitanaje probom vezivanja VLP-a sa GII.4 kao što je prethodno opisano.

Primer 8 - Upotreba različitih kiselina, njihove koncentracije i vreme inkubacije

Parametri su bili sledeći: 0.01 M HCJ (4 h, 60 °C), 0.1 M mravlja kiselina (FA) (16 h, 60 °C), 0.1 M sirćetna kiselina (AA) (16 h, 60 °C). Inhibitorna aktivnost obrađenog fukoidana (5 ml/mg) ispitana je probom vezivanja VLP-a sa GII.4 kapsidima kao što je prethodno opisano. (Slika 10.)

Primer 9 - Inhibicija vezivanja GII.4 VLP-a za HGM od strane fukoidana obrađenog polistirensulfonskom kiselinom (PSSA)

Količina od 30 mg fukoidana rastvorena je u 3 ml vode koja sadrži 46.7 μl PSSA, to je presuto u kesicu za dijalizu (prečnika 1 cm, dužine 12 cm, membrane 6-8 kDa) i zagrevana do 60 °C tokom 18 h. Filtrat je stalno kružio preko grafitnog ugljenika od 580 mg (pri protoku od 24 ml/h). Eluiranje sa grafitnog ugljenika vršeno je primenom 80 % acetonitrila u vodi. Veći deo filtrirane oligofukoze ostao je nevezan u kesici za dijalizu (65 %), dok je 35 % ispran sa GC kolone. Svaka frakcija je testirana zasebno (filtrat: 7 mg/ml; GC eluent: 2.9 mg/ml). (Slika 11.)

Primer 10 - Frakcionisanje obrađenih fukoidana na BioGel -P2

Frakcionisanje na BioGel-P2 koloni (9,2 ml, 1,4 х 6 cm) prikazano je zajedno sa rezultatima inhibicije vezivanja koje vrše glikani u frakcijama eluiranim pri 5 - 9 ml u određivanju vezivanja VLP na HGM. Insert (gornji panel) prikazuje rezultate kolorimetrijskog određivanja šećera (određivanje fenola-sumporne kiseline). (Slika 12.) Primer 11 - MALDI masena spektrometrija obrađenih fukoidana

A, MALDI masena spektrometrija na Ultrafextreme TOF/TOF instrumentu permetilovanih obrađenih fukoidana posle ultrafiltracije. Spektar pozitivnih jona (MSl). Uvećanje mase od 74 odgovara metilovanoj deoksiheksozi (označena sa ,,F"). Detektovani su oligosaharidi sa najviše oko 20 jedinica monosaharida. (Slika 13.)

B, MALDI-MS/MS spektra (Post-Source Decay spektra u režimu LIFT) nonamerne oligofukoze pri m/z 1551. Uvećanje mase od 174 odgovara metilovanoj deoksiheksozi (označena sa ,,F"). (Slika 14.)

Primer 12 - GCMS analiza vezivanja delimično metilovanih alditol acetata (PMAA) iz obrađenih fukoidana

Na GC hromatogramu je identifikovano šest različitih PMAA (TIC, celokupna struja jona) korišćenjem spektara potpunog snimanja i praćenjem pojedinačnih jona pri m/z 118, 175 (terminalna fukoza, Fuc), m/z 190 i 247 (2-Fuc, 3-Fuc), m/z 203 (4-Fuc), m/z 262 (2,3-Fuc), kao i m/z 275 (3,4-Fuc). (Slika 15.)

Claims (18)

PATENTNI ZAHTEVI

1. Prirodni F-fukoidani, desulfonovani F-fukoidani i obrađeni F-fukoidani koji sadrže delimično ili potpuno desulfonovane oligosaharide ili njihove fizioioški prihvatljive soli, naznačeni time, što se sastoje od monosaharidnih jedinica fukoze kao jedinog konstituenta, koje su povezane alfa glikozidnim vezama.

2. Prirodni F-fukoidani, desulfonovani F-fukoidani i obrađeni F-fukoidani koji sadrže delimično ili potpuno desulfonovane oligosaharide ili njihove fiziološki prihvatljive soli, prema zahtevu 1., naznačeni time, što se sastoje od oligosaharidnih struktura ili strukturnih elemenata Fucl-2Fuc, Fuc1-3Fnc, Fucl-4Fuc, Fucl-2Fucl-3Fuc, Fucl-2(Fucl-4)Fuc, Fucl-2(FucJ-3)Fuc, Fucl-3(Fucl-2)Fuc i Fncl-2Fucl-3Fnc(Fucl-4)Fuc.

3. Prirodni F-fukoidani, desulfonovani F-fukoidani i obrađeni F-fukoidani koji sadrže delimično ili potpuno desulfonovane oligosaharide ili njihove fiziološki prihvatljive soli, prema zahtevima 1. i 2., naznačeni time, što poseduju antivirusnu aktivnost u formi polisaharida i oligosaharida molekulske težine ispod 3 kDa.

4. Prirodni F-fukoidani, desulfonovani F-fukoidani i obrađeni F-fukoidani koji sadrže delimično ili potpuno desulfonovane oligosaharide ili njihove fiziološki prihvatljive soli, prema zahtevima 1. do 3., naznačeni time, što polisaharidi ili oligosaharidi, ispoljavaju inhibitorno dejstvo na vezivanje norovirusa/patogena za glikane krvnih grupa na mucinu

epitela domaćina.

5. Prirodni F-fukoidani, desulfonovani F-fukoidani i obrađeni F-fukoidani koji sadrže delimično ili potpuno desulfonovane oligosaharide ili njihove fiziološki prihvatljive soli, prema zahtevima 1. do 4., naznačeni time, što inhibiraju vezivanje patogena za oligosaharide krvne grupe H na epitelu gastrointestinalnog trakta, a ti patogeni izazivaju infekcije kao što su infekcije norovirusima ili rotavirusima, sojevima Salmonella sp., Pseudomonal aeruginosa i Campylobacter jejuni.

6 Prirodni F-fukoidani, desulfonovani F-fukoidani i obrađeni F-fukoidani koji sadrže delimično ili potpuno desulfonovane oligosaharide ili njihove fiziološki prihvatljive soli, prema zahtevima 1. do 5., naznačeni time, što strukture koje nisu u vezi sa krvnim grupama, elementi fukoidana ili oligofukoza dobijenih iz fukoidana, ispoljavaju kompetitivnu aktivnost i u skladu sa tim, inhibitorna dejstva na vezivanje enteropatogenih norovirusa ili rotavirusa, sojeva Salmonella sp., Pseudomonas aeruginosa i Campylobacter jejuni za mucine humanog epitela pozitivnih H- i Lewis-b krvnih grupa.

7. Prirodni F-fukoidani, desulfonovani F-fukoidani i obrađeni F-fukoidani koji sadrže delimično ili potpuno desulfonovane oligosaharide ili njihove fiziološki prihvatljive soli, prema zahtevima 1. do 6., naznačeni time, što su izolovani iz Fucus vesiculosus, braon algi, morske trave i drugih morskih živorinja ili biljaka, desulfonovani i/ili obrađeni delimičnom hidrolizom fukoidan polisaharida koji sadrži sledeće strukturne elemente: 15Fucl-2Fuc, Fucl-3Fuc, Fucl-4Fuc, Fucl-2Fucl-3Fuc, Fucl-2(Fucl-4)Fuc, Fucl-2(Fucl-3)Fuc, Fucl-3(Fucl-2)Fuc i Fucl-2Fucl-3Fuc(Fucl-4)Fuc i koji ispoljavaju aktivnost bilo u nativnom stanju kada su sulfonovani, bilo kao delimično ili potpuno desulfonovani nakon solvolize ili obrade parcijalnom kiselom hidrolizom.

8. Postupak za dobijanje desulfonovanih oligosaharida niske molekulske mase izolovanih iz fukoidana delimičnom, kiselinom katalizovanom hidrolizom, prema zahtevima 1. dc 7., naznačen time, što se desulfonovanje obrađenih oblika fukoidana postiže neorganskim ili organskim kiselinama pri povišenim temperaturama i tokom vremena reakcije koja omogućavaju efikasno desulfonovanje i istovremenu fragmentaciju do nivoa oligosaharida, u opsegu veličina između 2 i 20 monosaharidnih jedinica.

9. Postupak za dobijanje desulfonovanih oligosaharida niske molekulske mase izolovanih iz fukoidana delimičnom, kiselinom katalizovanom hidrolizom, prema zahtevima 1. do 7., naznačen time, što se postupak za dobijanje tih obrađenih oblika fukoidana vrši kombinovanjem hemijskog desulfonovanja/fragmentacije i enzimskih tretmana fukoidanazama i sulfataznma.

10. Postupak za dobijanje desulfonovanih oligosaharida niske molekulske mase izolovanih iz fukoidana, prema zahtevima 1. do 7., naznačen time, što je postupak za dobijanje tih obrađenih oblika fukoidana, desulfonovanje u kome se primenjuje isključivo enzimska obrada fukoidanazama i sulfatazama.

11. Postupak za dobijanje desulfonovanih oligosaharida niske molekulske mase izolovanih iz fukoidana delimičnom, kiselinom katalizovanom hidrolizom, prema zahtevima 1. do 7., naznačen time, što se desulfonovanje/fragmentacija vrši dijalizom zagrejane reakcione smeše rastvorljivom polistirensulfonskom kiselinom visoke molekulske mase, pri čemu se kontinuirano odvajaju oligosaharidni proizvodi masa nižih od definisanog otvora membrane.

12. Postupak za dobijanje desulfonovanih F-fukoidan polisaharida, prema zahtevima 1. do 7., naznačen time, što se desulfonovanje vrši solvolizom neutralisanih, suvih F-fukoidana sa smešom dimetil sulfoksid/piridin, 5:12 (v:v) u toku 9 h na 100 °C, nakon čega se vrši ekstenzivna dijaliza organskih agenasa i sušenje.

13. Prirodni, desulfonovani i obrađeni fukoidani ili njihove fiziološki prihvatljive soli, prema zahtevima 1. do 12., naznačeni time, što se koriste u profilaksi ili lečenju oboljenja izazvanih delovanjem norovirusa, bilo kao dodatak ishrani ili dodatak u proizvodnji prehrambenih proizvoda.

14. Prirodni, desulfonovani i obrađeni fukoidani ili njihove fiziološki prihvatljive soli, prema zahtevima 1. do 12., naznačeni time, što se koriste u profilaksi ili lečenju oboljenja izazvanih delovanjem rotavirusa, bilo kao dodatak ishrani ili dodatak u proizvodnji prehrambenih proizvoda.

15. Prirodni, desulfonovani i obrađeni fukoidan: ili njihove fiziološki prihvatljive soli, prema zahtevima 1. do 12., naznačeni time, što se koriste u profilaksi ili lečenju oboljenja izazvanih delovanjem Salmonella-e, bilo kao dodatak ishrani ili dodatak u proizvodnji prehrambenih proizvoda.

16. Prirodni, desulfonovani i i obrađeni fukoidani ili njihove fiziološki prihvatljive soli, prema zahtevima 1. do 12., naznačeni time, što se koriste u profilaksi ili lečenju oboljenja izazvanih delovanjem Pseudomonas-a, bilo kao dodatak ishrani ili dodatak u proizvodnji prehrambenih proizvoda.

17. Prirodni, desulfonovani i obrađeni fukoidani ili njihove fiziološki prihvatljive soli, prema zahtevima 1. do 12., naznačeni time, što se koriste u profilaksi ili lečenju oboljenja izazvanih delovanjem Campylobacter-a, bilo kao dodatak ishrani ili dodatak u proizvodnji prehrambenih proizvoda.

18. Prirodni, desulfonovani i obrađeni fukoidani ili njihove fiziološki prihvatljive soli, prema zahtevima 1. do 12., naznačeni time, što se koriste u tretmanu organizama na industrijskim farmama, koji se koriste u prehrambenoj industriji.