RS32703A - Novi geni za glifozat n-acetiltransferazu (gat) - Google Patents

Abstract

Novi proteini, uključujući proteine sposobne da katalizuju acetilaciju glifozata i druge strukturalno povezane proteine. Takođe, novi polinukleotidi sposobni da kodiraju ove proteine, sastavi koji uključuju jedan ili više ovih proteina i/ili polinukleotidi, rekombinantne ćelije i transgenske biljke koje čine ova nova jedinjenja, metodi diversifikacije koji uključuju nova jedinjenja, i metodi upotrebe jedinjenja. Neki od novih metoda i jedinjenja mogu biti korišćeni da pruže organizmu, kao što je biljka, otpornost na glifozat.

Description

NOVI GENI ZA GLIFOZAT N-ACETILTRANSFERAZU (GAT)

POZIV NA SRODNE PATENTNE PRIJAVE

Ova patentna prijava ima pravo prvenstva i prednost po osnovu Privremene patentne prijave broj U.S. 60/244,385, podnete 30. oktobra 2000. godine, čiji sadržaj je u celosti ugrađen u ovaj dokument kao u dispozitivu.

OBJAVA O AUTORSKOM PRAVU PREMA 37 C.F.R. § 1.71 (E)

Deo saopštenja pronalaska u ovom patentnom dokumentu sadrži materijal koji je predmet zaštite autorskog prava. Vlasnik autorskog prava ne osporava drugim licima pravo vernog reprodukovanja patentnog dokumenta ili patentnog pronalaska putem izrade fotokopija, a u obliku u kojem se oni nalaze u dokumentaciji ili arhivi Patentnog zavoda, ali u svakom drugom smislu zadržava sva autorska prava.

POZADINA PRONALASKA

Selektivnost useva prema određenim herbicidima može da se postigne tako što će se u useve ugraditi geni koji kodiraju odgovarajuće enzime koji metabolišu herbicid. U nekim slučajevima, ovi enzimi i nukleinske kiseline koje ih kodiraju nastaju u samoj biljci. U drugim, pak, slučajevima oni se dobijaju iz drugih organizama, npr. mikroorganizama.Videti u,npr, Padgette i sar. (1996) "Newweed control opportunities: Development of sovbean with a Round UP Ready™ gene" u Herbicide- Resistant Crops (Duke, ed.), str. 54-84, CRC Press, Boca Raton; i Vasil

(1996) "Phosphinothricin-resistant crops" u Herbicide- Resistant Crops (Duke, ed.), str. 85-91. Transgenske biljke su, u biti, i koncipirane tako da ispolje čitav niz gena, poreklom iz drugih organizama, koji im obezbeđuju sposobnost da tolerišu herbicide, tj. da ih metabolišu. Primera radi, acetohidroksikiselinska sintaza, za koju je otkriveno da biljke koje je eksprimiraju čini otpornim na više tipova herbicida, ugrađena je u različite biljke( videtiu, npr., Hattori i sar. (1995) Mol Gen Genet 246:419. Među gene koji obezbeđuju otpornost na herbicide spadaju: gen koji kodira himerni protein citohroma P4507A1 pacova i NADPH-citohromska P450 oksidoreduktaza kvasca (Shiota i sar. (1994) Plant Phvsiol 106:17), geni za glutation reduktazu i superoksid dizmutazu (Aono i sar. (1995) Plant Cell Phvsiol 36: 1687), kao i geni za različite fosfotransferaze (Datta i sar. (1992) Plant Mol Biol 20:619).

Jedan od herbicida koji je, u ovom smislu, ekstenzivno ispitivan je N-fosfonometilglicin, poznat pod češćim nazivom glifozat. Glifozat je herbicid koji, po obimu prodaje, zauzima prvo mesto u svetu. Prema prognozama, vrednost prodaje glifozata bi, do 2003. godine, trebalo da dostigne 5 mlrd US.$. To je herbicid širokog spektra koji uništava širokolisne biljke i trave. Efikasan komercijalni nivo otpornosti transgenskih biljaka na glifozat postignut je ugradnjom modifikovanogAgrobacteriumskoggena CP4 5-enolpiruvilšiki-mat-3-fosfat sintaze (u daljem tekstu EPSP sintaze ili EPSPS). Transgen se smešta u hloroplast, u kojem - nezavisno od prisustva glifozata - nastavlja da sintetiše EPSP iz fosfoenolpiruvinske kiseline (PEP) i šikimat-3-fosfat, dok prirodnu EPSP sintazu glifozat inhibiše. Bez transgena, biljke prskane glifozatom brzo umiru zbog inhibicije EPSP sintaze, koja preseca silaznu reakciju, neophodnu za biosintezu aromatičnih ammo kiselina, hormona i vitamina. Monsanto, npr., prodaje transgensku, CP4 glifozat-rezistentnu soju pod imenom "Round UP Ready™."

U prirodi, najčešće mikroflora iz zemljišta metaboliše i razgrađuje glifozat. Osnovni metabolit glifozata u zemljištu je identifikovan kao aminometilfosfonska kiselina (AMPA), koja se na kraju pretvara u amonijak, fosfat i ugljen dioksid. Na SI. 8 je predstavljena metabolička shema procesa razgradnje glifozata u zemljištu preko reakcije AMPA. Alternativni metabolički pravac razgradnje glifozata, koji koriste neke bakterije iz zemljišta, sarkozinska reakcija, javlja se kao posledica inicijalnog cepanja veze C-P i daje neorganski fosfat i sarkozin (v. SI. 9).

Drugi primer uspešnog kombinovanja herbicid/transgenska kultura predstavlja glufozinat (fosfinotricin) i klasa Libertv Link™, koju plasira Aventis. Glufozinat je, takođe, herbicid širokog spektra, a meta mu je enzim glutamat sintaza hloroplasta. Otporne biljke u sebi nose zaprečni gen izStreptomyces hygroscopicusi stiču rezistenciju zahvaljujući N-acetilacionoj aktivnosti zapreke, kojom se glufozinat modifikuje i oduzima mu se toksičnost.

U PCT prijavi br. VVO00/29596 govori se o enzimu koji je u stanju da acetiliše primami amin AMPA. Ne navodi se da li je enzim u stanju da acetiliše jedinjenje koje sadrži sekundarni amin (npr. glifozat).

I pored toga što su, kako je izneto, na raspolaganju različite strategije rezistencije, i drugi pristupi bi mogli imati značajnu komercijalnu vrednost. Ovde izneti pronalazak uvodi, npr. nove polinukleotide i polipeptide za obezbeđivanje otpornosti na herbicide, kao i brojne druge korisne aspekte koji će izaći na videlo tokom analize pronalaska.

REZIME PRONALASKA

Cilj izloženog pronalaska je da obezbedi metode i reagense pomoću kojih će organizam, npr. biljka, postati otporan na glifozat. Ovaj i ostali ciljevi pronalaska postižu se pomoću jednog ili više oblika pronalaska, opisanih u daljem tekstu.

Jedan od oblika pronalaska uvodi nove polipeptide koji se ovde nazivaju GAT polipeptidi. GAT polipeptide karakteriše međusobna strukturna sličnost, npr. u smislu sličnosti sekvenci kad se GAT polipeptidi uzajamno poravnaju. Neki od GAT polipeptida poseduju glifozat N-acetiltransferaznu aktivnost, tj. sposobnost da katalizuju acetilaciju glifozata. Takođe, neki od GAT polipeptida mogu da katalizuju acetilaciju analoga glifozata i/ili metabolita glifozata, npr. aminometilfosfonsku kiselinu.

Prezentuju se, takođe, i novi polinukleotidi, u daljem tekstu GAT polinukleotidi. GAT polinukleotide karakteriše njihova sposobnost da kodiraju GAT polipeptide. U nekim oblicima pronalaska, GAT polinukleotid se ugrađuje, radi bolje ekspresije biljke, zamenjivanjem jednog ili više roditeljskih kodona ekvivalentnim kodonom, što se obično koristi kod biljaka sa srodnim roditeljskim kodonom. U drugim formulacijama, GAT polinukleotid se modifikuje uvođenjem nukleotidne sekvence koja kodira N-terminalni tranzitni peptid hloroplasta.

GAT polipeptidi, GAT polinukleotidi i glifozat N-acetiltransferazna aktivnost se detaljnije opisuju u daljem tekstu. Pronalaskom su, nadalje, obuhvaćeni i određeni fragmenti ovde opisanih GAT polipeptida i GAT polinukleotida.

Pronalazak obuhvata neprirodne varijante ovde opisanih polipeptida i polinukleotida, u kojima je izvršeno mutiranje jedne ili više aminokiselina kodiranog polipeptida.

Pronalazak, nadalje, daje sklop nukleinske kiseline koji sadrži polinukleotid iz pronalaska. Sklop može da bude vektor, npr. vektor transformacije biljke. U nekim aspektima će vektor iz pronalaska sadržati T-DNK sekvencu. Sklop može, po izboru, da obuhvati i regulatomu sekvencu (npr. promotera), operativno vezanu na GAT polinukleotid, gde je promoter heterologan u odnosu na polinukleotid i sposoban da izazove ekspresiju kodiranog peptida dovoljnu da pojača otpornost na glifozat biljne ćelije, transformisane sklopom nukleinske kiseline.

U nekim aspektima pronalaska, GAT polinukleotid finkcioniše kao izborni marker, npr. kod biljaka, bakterija, aktinomiceta, kvasaca, algi ili gljivica. Na primer, organizam transformisan vektorom koji obuhvata GAT polinukleotidni selektabilni marker, može se birati prema sposobnosti da se razvija i raste u prisustvu glifozata. GAT markerski gen može da se koristi za selekciju ili traženje transformisanih ćelija koje eksprimiraju taj gen.

Osim toga, pronalazak daje vektore sa zbirom genski određenih karakteristika, tj. vektore koji kodiraju GAT i koji sadrže i drugu polinukleotidnu sekvencu koja, ćeliji ili organizmu koji eksprimira drugi peptid na aktivnom nivou, dodaje prepoznatljivu fenotipsku karakteristiku. Prepoznatljiva fenotipska karakteristika može da funkcioniše kao izborni marker, npr. prenoseći rezistenciju na herbicide, otpornost na štetnike ili dajući neku vrstu vidljivog markera.

U jednom od oblika ovaj pronalazak daje sklop koji čine dva ili više polinukleotida pronalaska.

Sklopovi koji sadrže 2 ili više GAT polinukleotida ili kodiranih polipeptida predstavljaju karakteristiku pronalaska. U nekim slučajevima, ovi sklopovi predstavljaju prave datoteke nukleinski kiselina, i sadrže, npr., najmanje 3 ili više nukleinskih kiselina. Sklopovi dobijeni razbijanjem nukleinskih kiselina iz ovog pronalaska pomoću restrikcione endonukleaze, DNKze ili RNKze, ili fragmentisanjem nukleinskih kiselina na drugi način, npr. mehaničkim kidanjem, hemijskim cepanjem, itd., takođe predstavljaju karakteristiku ovog pronalaska, kao i sklopovi dobijeni inkubacijom nukleinske kiseline iz pronalaska sa dezoksiribonukleotidnim trifosfatima i polimerazom nukleinske kiseline kakva je, npr. termostabilna polimeraza nukleinske kiseline.

Ćelije genski izmenjene vektorom ovog pronalaska, ili koje na neki drugi način sadrže nukleinsku kiselinu iz pronalaska, predstavljaju jedan od aspekata ovog pronalaska. U najznačajnijem obliku ovog pronalaska, ćelije eksprimiraju polipeptid kodiran nuklelnskom kiselinom.

U nekim od oblika, ćelije koje sadrže nukleinske kiseline iz pronalaska su biljne ćelije. Genski izmenjene biljke, biljne ćelije i tkiva takvih biljaka, koje sadrže nukleinsku kiselinu iz pronalaska, takođe predstavljaju karakteristiku ovog pronalaska. U nekim oblicima, genski izmenjene biljke, biljne ćelije ili tkiva takvih biljaka eksprimiraju egzogeni polipeptid sa glifozat N-acetiltransferaznom aktivnošću, kodiran nukleinskom kiselinom ovog pronalaska. Pronalazak, osim toga, daje i genski izmenjeno seme dobijeno od genski izmenjenih biljaka iz ovog pronalaska.

Pronalazak, nadalje, daje genski izmenjene biljke ili biljna tkiva sa pojačanom otpornošću na glifozat zahvaljujući ekspresiji polipeptida sa glifozat N-acetiltransferaznom aktivnošću i polipeptida kod kojeg je tolerancija na glifozat ostvarena drugim mehanizmom, npr. 5-enolpiruvilšikimat-3-fosfat sintazom i/ili glifozat oksidoreduktazom, otpornim na glifozat. Pronalazak, dalje, daje genski izmenjene biljke ili biljna tkiva sa pojačanom otpornošću na glifozat, kao i sa otpornošću na drugi herbicid, koja je rezultat ekspresije polipeptida sa glifozat N-acetiltransferaznom aktivnošću, peptida koji otpornost na glifozat ostvaruje drugim mehanizmom, npr. na glifozat otpornom EPSP sintazom i/ili glifozat oksidoreduktazom i polipeptida koji daje otpornost na drugi herbicid, npr. mutirana hidroksifenilpiruvatdioksigenaza, na sulfonamid otporna acetolaktatna sintaza, acetohidroksikiselinska sintaza otporna na sulfonamid, acetolaktatna sintaza otporna na imidazolinon, acetohidroksikiselinska sintaza otporna na imidazolinon, fosfinotricin acetil transferaza i mutirana protoporfirinogen oksidaza.

Pronalazak obuhvata, takođe, genski izmenjene biljke ili biljna tkiva sa pojačanom otpornošću na glifozat i otpornošću na drugi herbicid zbog ekspresije polipeptida sa glifozat N-acetiitransferaznom aktivnošću i polipeptida koji daje otpornost na drugi herbicid, npr. mutirana hidroksifenilpiruvatdioksigenaza, acetolaktatna sintaza otporna na sulfonamid, acetohidroksikiselinska sintaza otporna na sulfonamid, acetolaktatna sintaza otporna na imidazolinon, acetohidroksikiselinska sintaza otporna na imidazolinon, fosfinotricin acetil transferaza i mutirana protoporfirinogen oksidaza.

Pronalazak daje i opis metoda za dobijanje polipeptida iz pronalaska, uvođenjem nukleinskih kiselina koje ih kodiraju u ćelije, a potom njihovim eksprimiranjem i izdvajanjem iz ćelija ili hranljive podloge. U pogodnim oblicima, ćelije koje eksprimiraju polipeptide iz pronalaska su transgenske biljne ćelije.

Karakteristike pronalaska su polipeptidi koji se specifično vezuju poliklonalnim antiserumima, koji reaguju na antigen izdvojen iz SEQ ID br: 6-10 i 263-514, ali ne i na prirodne srodne sekvence, npr. peptid zastupljen subsekvencom br. CAA70664 (GenBank), kao ni na antitela dobijena primenom antigena izdvojenog iz jedne od ili više SEQ ID br: 6-10 i 263-514, i/ili koja se specifično vezuju na te antigene, a koja se ne vezuju specifično na prirodni polipeptid koji odgovara subsekvenci br. CAA70664 (GenBank).

Drugi aspekt pronalaska se odnosi na metode diversifikacije polinukleotida u cilju dobijanja novih GAT polinukleotida i polipeptida rekombinovanjem ili mutiranjem nukleinskih kiselina iz pronalaskain vitroiliin vivo.U jednoj formulaciji, rekombinacija daje najmanje jednu DNK datoteku rekombinantnih GAT polinukleotida. Tako dobijene datoteke su suština pronalaska, kao i ćelije koje sadrže te datoteke. Osim toga, ključne elemente pronalaska čine metodi za dobijanje modifikovanog GAT polinukleotida mutiranjem nukleinske kiseline, kao i rekombinantni i mutantni GAT polinukleotidi i polipeptidi, dobijeni metodima iz pronalaska.

U nekim aspektima pronalaska se diversifikacija postiže rekursivnim rekombinovanjem, što se može postićiin vivo, in vitro, in silico,ili kombinovanjem postupaka. Neki od detaljnije opisanih primera metoda su metodi porodičnog mešanja i metodi sintetičkog mešanja.

Pronalazak daje metode za dobijanje transgenskih biljaka ili biljnih ćelija, otpornih na glifozat, koji obuhvataju transformaciju biljke ili biljne ćelije polinukleotidom koji kodira glifozat N-acetiltransferazu, i mogućnost regeneracije transgenske biljke iz transformisane biljne ćelije. U nekim aspektima je polipeptid - GAT polipeptid, eventualno GAT polinukleid dobijen iz bakterije. U nekim fazama pronalaska, metod može da podrazumeva gajenje transformisane biljke ili biljne ćelije u koncentraciji glifozata koja sprečava razvoj divlje biljke iste vrste, a ne ometa razvoj transformisane biljke. Metod može da obuhvati i gajenje transformisane biljke ili biljne ćelije, ili potomstva takve biljke ili biljne ćelije u rastućim koncentracijama glifozata i/ili u koncentraciji glifozata koja je smrtonosna za divlje biljke ili biljne ćelije iste vrste.

Transgenske biljke otporne na glifozat, a dobijene ovim metodom, mogu da se reprodukuju, npr. ukrštanjem sa drugom biljkom, tako da će bar deo potomaka ukrštanja ispoljavati otpornost na glifozat.

Pronalazak, takođe, daje i metode za selektivno suzbijanje korova na poljima pod kulturom, koji obuhvataju sejanje semena/sadnju biljaka otpornih na glifozat, transformisanih pomoću gena koji kodira glifozat N-acetiltransferazu, uz prskanje useva i korova količinama glifozata dovoljnim za suzbijanje korova, bez većeg uticaja na sam usev.

U sastavu pronalaska su i metodi za suzbijanje korova na poljima i sprečavanje pojave korova otpornih na glifozat na poljima s kulturom; ovi metodi podrazumevaju sejanje semena/sadnju biljaka otpornih na glifozat zbog toga što su transformisani pomoću gena koji kodira glifozat N-acetiltransferazu i gena koji kodira polipeptid koji daje otpornost na glifozat na drugi način, npr. EPSP sintazu otpornu na glifozat i/ili glifozat oksido-reduktazu otpornu na glifozat, te prskanje useva i korova na polju količinom glifozata dovoljnom za suzbijanje korova, a bez značajnijeg uticaja na usev.

Pronalazak, nadalje, deje metode za suzbijanje korova na polju i sprečavanje pojave korova otpornih na glifozat na polju pod kulturom; ovi metodi obuhvataju sejanje semena/sadnju biljaka otpornih na glifozat zbog transformacije pomoću gena koji kodira glifozat N-acetiltransferazu, gena koji kodira polipeptid koji na drugi način daje otpornost na glifozat, npr. EPSP sintazu otpornu na glifozat i/ili glifozat oksido-reduktazu otpornu na glifozat, kao i gena koji kodira polipeptid koji daje otpornost na drugi herbicid, npr. mutiranu hidroksifenilpiruvat dioksigenazu, acetolaktatnu i acetohidroksikiselinsku sintazu otporne na sulfonamid, acetolaktatnu i acetohidroksikiselinsku sintazu otporne na imidazolinon, fosfinotricin acetil transferazu i mutiranu protoporfirinogen oksidazu, nakon čega se i kultura i korovi na polju prskaju količinom glifozata i drugog herbicida, npr. inhibitora hidroksifenilpiruvat dioksigenaze, sulfonamida, imidazolinona, bialafosa, fosfinotricina, azafenidina, butafenacila, sulfozata, glufozinata i protoks inhibitora - dovoljnom za suzbijanje korova bez značajnijeg uticaja na kulturu.

Pronalazak, dalje, prezentuje metode za suzbijanje korova na poljima i sprečavanje pojave korova otpornih na herbicide na poljima pod kulturom; metodi podrazumevaju korišćenje semena/biljaka otpornih na glifozat zbog transformacije genom koji kodira glifozat N-acetiltransferazu i gena koji kodira polipeptid koji obezbeđuje otpornost na drugi herbicid, npr. mutiranu hidroksifenilpiruvat dioksigenazu, acetolaktatnu i acetohidroksikiselinsku sintazu otporne na sulfonamid, acetolaktatnu i acetohidroksikiselinsku sintazu otporne na imidazolinon, fosfinotricin acetil transferazu i mutiranu protoporfirinogen oksidazu, nakon čega se i kultura i korovi prskaju količinom glifozata i drugog herbicida, npr. inhibitora hidroksifenilpiruvat dioksigenaze, sulfonamida, imidazolinona, bialafosa, fosfinotricina, azafenidina, butafenacila, sulfozata, glufozinata i protoks inhibitora - dovoljnom za uništavanje korova bez značajnijeg uticaja na kulturu.

Pronalazak daje i metode za dobijanje genetski izmenjene biljke otporne na glifozat, koji podrazumevaju umetanje u genom biljne ćelije molekula rekombinantne DNK dvostrukog niza, koji se sastoji od: (i) promotera, koji u biljnim ćelijama funkcioniše tako da dovodi do stvaranja RNK sekvence; (ii) strukturalne DNK sekvence koja dovodi do stvaranja RNK sekvence koja kodira GAT; (iii) 3' ne-translatirane regije koja u ćeliji funkcioniše tako da dovodi do vezivanja niza poliadenil nukleotida na 3' završetak RNK sekvence; u slučaju da je promoter heterologan u odnosu na strukturalnu DNK sekvencu i podešen da izazove ekspresiju kodiranog polipeptida, dovoljnu da pojača otpornost na glifozat biljne ćelije transformisane molekulom DNK; dobijanje transformisane biljne ćelije; i regenerisanje genetski transformisane biljke sa povećanom otpornošću na glifozat iz transformisane biljne ćelije.

Osim toga, pronalazak daje i metode za dobijanje useva/kultura, koji podrazumevaju gajenje biljke, otporne na glifozat pošto je transformisana pomoću gena koji kodira glifozat N-acetiltransferazu, pod uslovima takvim da biljka da plod, i ubiranje plodova takve biljke. Ovi metodi često obuhvataju prskanje biljaka glifozatom u koncentracijama dovoljnim da suzbiju korov. Biljke korišćene za primere su pamuk, kukuruz i soja.

Pronalazak, takođe, navodi računare, medijume koje računar čita i integrisane sisteme, uključujući baze podataka koje sadrže podatke sekvenci sa nizovima atributa koji odgovaraju SEQ ID br: 1-514. Ovakvi integrisani sistemi mogu da obuhvate jedan ili više kompleta uputstava za selektovanje, sklapanje, translaciju, reverznu translaciju ili ispitivanje svakog pojedinog ili više nizova atributa koji odgovaraju SEQ ID br: 1-514, uzajamno i/ili u odnosu na svaku drugu sekvencu nukleinske ili amino kiseline.

KRATAK OPIS SLIKA

Slika 1 ilustruje N-acetilaciju glifozata koju katalizuje glifozat N-acetiltransferaza (GAT).

Slika 2 ilustruje mas-spektroskopsko detektovanje N-acetilglifozata koji je produkovala tipska Bacillus kultura koje eksprimira urođenu GAT aktivnost.

Slika 3 ilustruje relativnu identičnost između GAT sekvenci izolovanih iz različitih sojeva bakterija i yitl iz Bacillus subtilis.

Slika 4 daje mapu plazmida pMAXY2120 za ekspresiju i izdvajanje GAT enzima iz kultura E. coli.

Slika 5 prikazuje mas-spektrometrijski rezultat, koji pokazuje povećano produkovanje N-acetilglifozata u vremenu u tipičnoj GAT enzimskoj reakcionoj smeši.

Slika 6 predstavlja dijagram kinetičkih podataka GAT enzima, na osnovu kojeg je izračunata vrednostKmod 2,9 mM za glifozat.

Slika 7 predstavlja dijagram kinetičkih podataka preuzetih iz podataka Slike 6, na osnovu kojih se izračunata vrednost KMod 2 j.tM za Acetil CoA.

Slika 8 je shema koja opisuje razgradnju glifozata u zemljištu nizom AMPA metaboličkih reakcija.

Slika 9 shematski prikazuje sarkozinski niz reakcija za razgradnju glifozata,

Slika 10 je matrica BLOSUM62.

Slika 11 je mapa plazmida pMAXY2190.

Slika 12 ilustruje sklop T-DNK sagatselektibilnim markerom.

Slika 13 prikazuje kvaščev vektor ekspresije sagatselektibilnim markerom.

DETALJNI OPIS PRONALASKA

Ovde izloženi pronalazak se odnosi na novu klasu enzima koji ispoljavaju aktivnost N-acetiltransferaze. U jednom od aspekata, pronalazak se odnosi na novu klasu enzima sa sposobnošću acetilacije glifozata i analoga glifozata, npr. enzima koji poseduju glifozat N-acetiltransferaznu (GAT) aktivnost. Te enzime karakteriše sposobnost acetilovanja sekundarnog amina iz jedinjenja. U nekim od aspekata pronalaska, to jedinjenje je herbicid, npr. glifozat, što shematski ilustruje SI. 1. Jedinjenje može da bude i analog glifozata ili metabolički produkt razgradnje glifozata, npr. aminometilfosfonska kiselina, lako acetilacija glifozata predstavlja ključnu katalitičku fazu u jednom od nizova metaboličkih reakcija katabolizma glifozata, enzimska acetilacija glifozata pomoću prirodnih, izolovanih ili rekombinantnih enzima nije do sada opisana. Nukleinske kiseline i polipeptidi iz pronalaska, dakle, daju novi biohemijski način za postizanje otpornosti na herbicide.

U jednom aspektu, pronalazak prezentuje nove gene koji kodiraju GAT polipeptide. Među karakteristike pronalaska spadaju izolovani i rekombinantni GAT polinukleotidi koji odgovaraju prirodnim polinukleotidima, kao i rekombinantni i konstruisani, npr. izmenjeni GAT polinukleotidi. GAT polinukleotide primerom pokazuju SEQ ID br: 1-5 i SEQ ID br: 11-262. Specifične GAT polinukleotidne i polipeptidne sekvence date su kao primeri radi boljeg ilustrovanja pronalaska, i nemaju za cilj ograničavanje domena klase GAT polinukleotida i polipeptida opisanih i/ili navedenih u ovom izlaganju.

Pronalazak, osim toga, prikazuje metode za generisanje i selektovanje izmenjenih DNK datoteka za dobijanje daljih GAT polinukleotida, uključujući polinukleotide koji kodiraju GAT polipeptide sa poboljšanim i/ili pojačanim karakteristikama, npr. izmenjenom Kmza glifozat, ubrzanom katalizom, povećanom stabilnošću, itd., zasnovanim na slekciji polinukleotidnog elementa datoteke, u cilju dobijanja opisanih novih ili poboljšanih aktivnosti. Ti polinukleotidi su se pokazali posebno korisnim za produkovanje genetski izmenjenih biljaka otpornih na glifozat.

GAT polipeptidi iz ovog pronalaska ispoljavaju novu enzimsku aktivnost. Konkretno, pre ovog pronalaska nije bila uočena enzimska acetilacija sintetičkog herbicida glifozata. Stoga ovde opisani polipeptidi, npr. ilustrovani SEQ ID br: 6-10 i SEQ ID br: 263-514, definišu novi biohemijski niz reakcija za eliminaciju toksičnosti glifozata, koji in vivo funkcioniše npr. kod biljaka.

Sledstveno tome, nukleinske kiseline i polipeptidi iz pronalaska značajno doprinose stvaranju biljaka otpornih na glifozat, jer daju nove nukleinske kiseline, polipeptide i biohemijske procese za postizanje selektivnosti za herbicid i transgenskim biljkama.

DEFINICIJE

Pre detaljnog izlaganja pronalaska, podrazumeva se da ovaj pronalazak nije ograničen samo na određene sklopove ili biološke sisteme koji, razume se, mogu da variraju. Takođe se podrazumeva da je terminologija koja se ovde koristi namenjena isključivo opisivanju konkretnih aspekata, i ne treba je smatrati faktorom ograničenja. Oblici jednine 'jedan', 'neki' i 'taj' korišćeni u ovom izlaganju i patentnim zahtevima, označavaju množinske odrednice, ukoliko sadržaj izlaganja očigledno ne upućuje drugačije. Na primer, kad se govori o 'sredstvu' podrazumeva se da je reč o kombinaciji dva ili više sredstava, pominjanje 'genskog fuzionog sklopa' podrazumeva smešu sklopova, i slično.

Ukoliko nije drugačije definisano, svi tehnički i naučni pojmovi korišćeni u ovom izlaganju imaju uobičajeno značenje za ljude iz struke kojoj pripada pronalazak, lako se svaki od metoda ili materijala, sličnih ili jednakih onima koji se ovde iznose, može u praksi koristiti za ispitivanje iznetog pronalaska, ovde su opisani specifični primeri odgovarajućih materijala i metoda.

U opisivanju i pri definisanju patentnih zahteva za ovaj pronalazak, koristiće se terminologija sa značenjem u skladu sa sledećim definicijama.

Za svrhe izlaganja ovog pronalaska, pojam 'glifozat' podrazumeva svaki oblik N-fo-sfonometilglicina sa herbicidnim svojstvom (uključujući i soli pomenutog jedinjenja), kao i druge oblike koji dovode do stvaranja anjona glifozata u biljkama. Pojam 'analog glifozata' označava svaki strukturni analog glifozata sa sposobnošću da inhibiše EPSP sintazu u koncentraciji koja obezbeđuje herbicidnu efikasnost analoga glifozata.

U smislu u kojem se ovde koristi, pojam 'glifozat-N-acetiltransferazna aktivnost' ili 'GAT aktivnost' označava sposobnost katalizovanja acetilacije sekundarne aminske grupe glifozata, što ilustruje, npr. SI. 1. 'Glifozat-N-acetiltransferaza' ili 'GAT označava enzim koji katalizuje acetilaciju aminske grupe glifozata, analoga glifozata, i/ili primarnog metabolita glifozata (tj. AMPA ili sarkozina). U nekim pogodnim oblicima pronalaska, GAT je u stanju da prenese acetil-grupu iz AcetiICoA na sekundarni amin glifozata i na primarni amin AMPA. Ovde opisani primeri GATova aktivni su od pH 5-9, s tim što optimalnu aktivnost ispoljavaju u rasponu pH 6,5-8,0. Aktivnost se može kvantifikovati pomoću različitih kinetičkih parametara, struci dobro poznatih, npr. k^, Kmi K^/Km. Ovi kinetički parametri mogu da se odrede na način opisan u Primeru 7.

Pojmovi 'polinukleotid', 'nukleotidna sekvenca' i 'nukleinska kiselina' koriste se za označavanje polimera nukleotida (A, C, T, U, G, itd., ili prirodnih ili veštački dobijenih analoga nukleotida), npr. DNK ili RNK, ili njihovog reprezentativnog dela, npr. niza atributa, itd., zavisno od konteksta u kojem se koristi. Dati polinukleotid i komplementarni nukleotid može da se odredi iz bilo koje specifikovane nukleotidne sekvence.

Slično tome, 'pojam 'aminokiselinska sekvenca' označava polimer amino kiselina (proteine, polipeptide, itd.) ili niz atributa koji predstavlja aminokiselinski polimer, zavisno od konteksta. Pojmovi 'protein', 'polipeptid' i 'peptid' se ovde koriste naizmenice.

Polinukleotid, polipeptid ili druga komponenta je 'izolovana' kad se delom ili u celini razdvoji od komponenata sa kojima je normalno povezana (drugim proteinima, nukleinskim kiselinama, ćelijama, sintetskim reagensima, itd.). Nukleinska kiselina ili polipeptid su 'rekombinantni' ukoliko su dobijeni veštačkim putem ili manipulacijom, iii ako su izdvojeni iz veštačkog ili manipulisanog proteina ili nukleinske kiseline. Na primer, polinukleotid umetnut u vektor ili neku drugu heterolognu lokaciju, npr. u genom rekombinantnog organizma, tako da nije u vezi sa nukleotidnim sekvencama koje, normalno, zauzimaju bočne pozije polinukleotida u prirodnom obliku, predstavlja rekombinantni polinukleotid. Proteini eksprimirani in vivo ili in vitro iz rekombinantnog polinukleotida predstavljaju primer rekombinantnog polipeptida. Isto tako, rekombinantna je i polinukleotidna sekvenca koja se ne javlja u prirodi, npr. varijanta prirodnog gena.

Pojmovi 'glifozat N-acetiltransferazni polipeptid' i 'GAT polipeptid' koriste se naizmenično za označavanje bilo koje od porodica novih polipeptida iz ovog pronalaska.

Pojmovi 'glifozat N-acetiltransferazni polinukleotid<1>i 'GAT polinukleotid' se naizmenično koriste za označavanje polinukleotid koji kodira GAT polipeptid.

'Podsekvenca' ili 'fragment' označavaju svaki od delova celovite sekvence.

Brojčana obeležja aminokiselinskih ili nukleotidnih polimera odgovaraju brojčanim obeležjima odabranih aminokiselinskih polimera ili nukleinskih kiselina, ako pozicija date monomerne komponente (aminokiselinski reziduum, inkorporisani nukleotid, itd.) takvog polimera odgovara poziciji istog reziduuma u izabranom referentnom polipeptidu ili polinukleotidu.

Vektor je struktura koja olakšava ćelijsku transdukciju pomoću odabrane nukleinske kiseline ili ekspresije nukleinske kiseline i ćeliji. Vektori obuhvataju, npr. plazmide, kozmide, viruse, YACove, bakterije, polilizine, vektore integracije hromozoma, epizomne vektore, itd.

'Gotovo celokupna dužina polinukleotidne ili aminokiselinske sekvence' označava bar 70%, obično ne manje od 80%, ili tipično 90 i više procenata sekvence.

U smislu u kojem se ovde koristi, pojam 'antitelo' označava protein koji obuhvata jedan ili više polipeptida, u velikoj meri ili delimično kodiranih imunoglobulinskim genima ili fragmentima imunoglobulinskih gena. U grupu poznatih gena spadaju kapa, lambda, alfa, gama, delta, epsilon i mi geni konstantne regije, kao i mnoštvo gena imunoglobulinske varijabilne regije. Laki lanci se klasifikuju kao kapa ili lambda, a teški kao gama, mi, alfa, delta ili epsilon, i zauzvrat definišu imunoglobulinske klase IgG, IgM, IgA, IgD, odnosno IgE. Tipična strukturna jedinica imunoglobulina (antitela) sadrži tetramer. Svaki tetramer čine dva identična para polipeptidnih lanaca, a svaki par se sastoji od jednog 'lakog'

(-25 kD) i jednog 'teškog' (-50-70 kD) lanca. N-završetak svakog lanca definiše varijabilnu regiju od oko 100-110 ili više amino kiselina, odgovornih prvenstveno za prepoznavanje antigena. Pojmovi varijabilni laki lanac (VL) i varijabilni teški lanac (VH) odnose se na te lake, odnosno teške lance. Antitela postoje u obliku netaknutih imunoglobulina ili u obliku određenog broja dobro karakterisanih fragmenata, dobijenih razgradnjom pomoću različitih peptidaza. Tako, npr. pepsin razlaže antitelo ispod disulfidnih veza u zoni sastava, i produkuje F(ab)'2, dimer Fab-a koji je sam laki lanac vezan na VH-CH1 disulfitnom vezom. F(ab)'2 se može redukovati u blagim uslovima, u cilju kidanja disulfidne veze u zoni spoja, čime se F(ab)'2 dimer konvertuje u Fab' monomer. Fab' monomer je, u stvari, Fab koji sadrži

deo regije spoja{ videti,u Fundamental Immunologv, 4<th>Edition, W.E. Paul (ed.), Raven Press, N.Y. (1998) detaljniji opis drugih fragmenata antitela). Dok se različiti fragmenti antitela definišu u smislu razlaganja celovitog antitela, ljudi iz struke će shvatiti prednost saznanja da se ti Fab' fragmentti mogu sintetisatide novo,bilo hemijskim putem, bilo korišćenjem metodologije rekombinantne DNK. Stoga pojam antitelo, u značenju u kojem se ovde koristi, označava i fragmente antitela dobijene modifikovanjem celih antitela, ili sintetisanede novouz pomoć metodologija rekombinantne DNK. Antitela obuhvataju jednolančana antitela, uključujući i jednolančana Fv (sFv) antitela, u kojima su varijabilni teški i varijabilni laki lanac međusobno povezani (direktno ili preko peptidne veze) i formiraju kontinuiran polipeptid.

Pojam 'peptid tranzita hloroplasta' predstavlja aminokiselinsku sekvencu koja je preneta zajedno sa proteinom i usmerava protein ka hloroplastu ili drugom tipu plastida u ćeliji u kojoj je protein proizveden. 'Sekvenca tranzita hloroplasta' označava nukleotidnu sekvencu koja kodira peptid tranzita hloroplasta.

'Signalni peptid' je aminokiselinska sekvenca translatirana zajedno sa proteinom i usmerava protein na sekretorni sistem (Chrispeels, J.J., (1991) Ann Rev Plant Phvs Plant Mol Biol 42:21-53). Ako protein treba da se usmeri na vakuolu, može se dodati i vakuolami nišanski signal( supra),ili ako ga treba upraviti na endoplazmatski reikulum, može mu se dodati signal retencije retikuluma endoplazme{ supra).Ukoliko, pak, protein treba usmeriti na ćelijsko jedro, treba skloniti sve signalne peptide i zameniti ih signalom za lokalizaciju jedra (Raikhel, N.

(1992) Plant Phys 100:1627-1632).

Primenjeni na polinukleotide, pojmovi 'diversifikacija' i 'diverzitet' označavaju proces stvaranja mnoštva modifikovanih oblika roditeljskog polinukleotida, ili mnoštva roditeljskih polinukleotida. U slučaju da polinukleotid kodira polipeptid, diverzitet nukleotidne sekvence polinukleotida može da rezultuje diverzitetom kod odgovarajućeg kodiranog polipeptida, npr. raznolikim skupom polinukleotida koji kodiraju mnoštvo varijanti polipeptida. U nekim oblicima pronalaska, ovaj diverzitet sekvenci koristi se za pretraživanje/selekciju DNK datoteke diversifikovanih polinukleotida radi pronalaženja varijanti sa željenim funkcionalnim atributima, npr. polinukleotida koji kodira GAT polipeptid sa jače ispoljenim funkcionalnim karakteristikama.

Pod pojmom 'kodiranje' podrazumeva se sposobnost nukleotidne sekvence da kodira jednu ili više amino kiselina. Termin ne zahteva ni pokretački ni zaustavni kodon. Aminokiselinska sekvenca može da se kodira u bilo koji od šest različitih okvira čitanja, koje obezbeđuju polinukleotidna sekvenca i njen komplement.

U smislu u kojem se ovde koristi, pojam 'veštačka varijanta' označava polipeptid sa GAT aktivnošću, kodiran modifikovanim GAT nukleotidom, npr. modifikovanim oblikom neke od SEQ ID br: 1-5 i SEQ ID br: 11-262, ili prirodnim GAT nukleotidom izolovanim iz mikroorganizma. Modifikovani polinukleotid, iz kojeg se dobija veštačka varijanta ekspresijom u pogodnog domaćina, dobija se kad čovek interveniše modifikujući GAT polinukleotid.

Pojam 'sklop nukleinske kiseline' ili 'polinukleotidni sklop' označava molekul nukleinske kiseline jednostrukog ili dvostrukog niza, izolovan iz prirodnog gena ili modifikovan kako bi zadobio segmente nukleinskih kiselina, a kakav se na drugi način ne bi javio u prirodi. Pojam sklop nukleinske kiseline je sinonim za termin 'ekspresiona kaseta' , u slučaju da sklop nukleinske kiseline sadrži kontrolne sekvence neophodne za eksprimiranje kodirajuće sekvence izloženog pronalaska.

Termin 'kontrolne sekvence' definisan je u ovom izlaganju tako da obuhvata sve komponente neophodne ili korisne za ekspresiju polipeptida ovog pronalaska. Svaka kontrolna sekvenca može da bude bilo urođena, bilo tuđa nukleotidnoj sekvenci koja kodira polipeptid. Te kontrolne sekvence obuhvataju lidera, sekvencu poliadenilacije, propeptidnu sekvencu, promotera, sekvencu signalnog peptida i zaustavljača transkripcije, i ne samo njih. Kontrolne sekvence treba da sadrže, mimimum, promotera i zaustavne signale transkripcije i translacije. Kontrolne sekvence mogu posedovati linkere radi uvođenja specifičnih restrikcionih mesta, koja olakšavaju ligaciju kontrolnih sekvenci sa kodirajućom regijom nukleotidne sekvence koja kodira polipeptid.

Pojam 'operativno vezano' definiše se u ovom izlaganju kao konfiguracija, u kojoj je kontrolna sekvenca smeštena na odgovarajući način na poziciju koja odgovara kodirajućoj sekvenci DNK sekvance, tako da kontrolna sekvenca usmerava ekspresiju polipeptida.

U smislu ovog pronalaska pojam 'kodirajuća sekvenca' treba da obuhvati nukleotidnu sekvencu, koja neposredno određuje aminokiselinsku sekvencu svog proteinskog produkta. Granice kodirajuće sekvence određene su obično otvorenim okvirom čitanja, koji najčešće počinje sa ATG startnim kodonom. Kodirajuća sekvenca tipično obuhvata DNK, cDNK i/ili rekombinantnu nukleotidnu sekvencu.

U kontekstu ovog izlaganja, pojam 'ekspresija' podrazumeva svaku od etapa u produkciji polipeptida, uključujući ne samo transkripciju, post-transkripcionu modifikaciju, translaciju, post-translacionu modifikaciju i sekreciju, već i druge komponente.

U ovom kontekstu pojam 'vektor ekspresije' obuhvata molekul DNK, linearan ili cirkularan, sa segmentom koji kodira polipeptid ovog pronalaska, koji je funkcionalno vezan za drugi segment koji omogućava njegovu transkripciju.

Termin 'ćelija domaćin' u smislu ovog izlaganja, podrazumeva sve tipove ćelija podložne transformaciji sklopom nukleinske kiseline.

Pojam 'biljka' podrazumeva cele biljke, istaknute vegetativne organe/strukture (npr. listove, stabljike i lukovice), korenje, cvetove i cvetne organe/strukture (npr. podlistak, čašični listić, laticu, prašnik, prosti tučak, prašnice i ovule), seme (uključujući embrion, endosperm i omotač semena), i plod (zreo tučak), biljno tkivo (npr. vaskularno tkivo, osnovno tkivo i si.) i ćelije (npr. zaštitne ćelije, jajne ćelije, trihome i si.), kao i njihovo potomstvo. Klasa biljaka koje se mogu koristiti u okviru metoda pronalaska, u principu, obuhvata klase viših i nižih biljaka, podložnih metodima transformacije, uključujući angiosperme (monokotiledonske i dikotiledonske biljke), gimnosperme, paprati i višećelijske alge. Obuhvata biljke sa različitim brojem garnitura hromozoma, uključujući aneuploidne, poliploidne, diploidne, haploidne i hemizigotne biljke.

Pojam 'heterologan' u smislu ovog pronalaska, opisuje odnos između dva ili više elemenata, koji ukazuje da se ti elementi u prirodi normalno ne mogu naći jedan pored drugog. Tako je, npr., polinukleotidna sekvenca 'heterologna u odnosu' na neki organizam ili drugu polinukleotidnu sekvencu ako potiče od druge vrste ili je, ako potiče od iste vrste, modifikovana u odnosu na svoj izvorni oblik. Na primer, promoter funkcionalno vezan na heterolognu kodirajuću sekvencu označava kodirajuću sekvencu vrste koja se razlikuje od vrste iz koje je izdvojen promoter ili, ako potiče od iste vrste, predstavlja kodirajuću sekvencu koja prirodno nije u vezi sa promoterom (npr. genetski stvorena kodirajuća sekvenca ili alela koja pripada drugom ekotipu ili varijanti). Primer heterolognog polipeptida je polipeptid transgenskog organizma eksprimiran iz rekombinantnog polinukleotida. Heterologni polinukleotidi i polipeptidi predstavljaju oblike rekombinantnih molekula.

Još čitav niz pojmova je ovde definisan ili karakterisan na drugi način.

GLIFOZAT N- ACETILTRANSFERAZE

U jednom aspektu, pronalazak obelodanjuje novu porodicu izolovanih ili rekombinantnih enzima, ovde nazvanih 'glifozat N-acetiltransferaze', 'GATovi', ili 'GAT enzimi'. GATovi su enzimi koji raspolažu GAT aktivnošću, poželjno dovoljnom aktivnošću da prenesu određen nivo otpornosti na glifozat transgenim biljkama, stvorenim da eksprimiraju GAT. Neki od primera GATova obuhvataju GAT polipeptide, detaljnije opisane u daljem tekstu.

Otpornost na glifozat posredstvom GATa je, razume se, kompleksna funkcija GAT aktivnosti, nivoa ekspresije GATa u transgenoj biljci, konkretne biljke, karaktera i ritma primene herbicida, itd. Stručnjak može, bez suvišnog eksperimentisanja, da odredi nivo GAT aktivnosti potreban za postizanje otpornosti na glifozat u konkretnom kontekstu.

GAT aktivnost se može okarakterisati uz pomoć konvencionalnih kinetičkih parametara - kcat, Km, i K^/Km. kcatse može smatrati merom brzine acetilacije, pogotovo u visokim koncentracijama supstrata, Kmsluži za merenje afiniteta GATa za svoje supstrate (npr. AcetiICoA i glifozat), dok K^/Kmpredstavlja meru katalitičke efikasnosti koja uzima u obzir i afinitet supstrata i brzinu katalize - parametar od posebnog značaja u situaciji u kojoj koncentracija supstrata bar delimično ograničava brzinu. Obično je GAT sa višim k^tilik^ JKuefikasniji katalizator od GATa sa nižim k^ ili k^/Ku. GAT sa nižom vrednošću Kmje efikasniji katalizator od GATa sa višom vrednošću Km. Dakle, da bi se utvrdilo da li je jedan GAT efikasniji od drugog, mogu se uporediti kinetički parametri ta dva enzima. Relativni značaj kcat, kcat/KMi Kmvariraće u zavisnosti od konteksta u kojem se očekuje da GAT funkcioniše, npr. od predviđene efikasne koncentracije glifozata u odnosu na vrednost Kmza glifozat. GAT aktivnost se, takođe, može karakterisati i nizom funkcionalnih karakteristika, npr. stabilnošću, podložnošću inhibiciji ili aktiviranju od strane drugih jedinjenja, itd.

GLIFOZAT N- ACETILTRANSFERAZNI POLIPEPTIDI

U jednom aspektu, pronalazak obelodanjuje novu porodicu izolovanih ili rekombinantnih polipeptida, ovde nazvanih 'glifozat N-transferazni polipeptidi' ili 'GAT polipeptidi'. GAT polipeptide karakteriše njihova strukturna sličnost sa novom porodicom GATova. Mnogi od GAT polipeptida su GATovi, ali ne svi. Razlika je u tome što su GATovi definisani prema funkciji, dok su GAT polipeptidi definisani prema strukturi. Podskup GAT polipeptida čine GAT polipeptidi koji poseduju GAT aktivnost, najbolje na takvom nivou koji će omogućiti prenošenje otpornosti na glifozat na transgensku biljku koja eksprimira protein na efikasnom nivou. Neki pogodni GAT polipeptidi predviđeni za prenošenje otpornosti na glifozat imaju vrednost kcatbar 1 min"<1>, ili još bolje - najmanje 10 min'<1>, 100 min"<1>ili 1000 min"<1>. Drugi pogodni GAT polipeptidi predviđeni za prenos otpornosti na glifozat imaju Kmdo 100 mM, ili još bolje - do 10 mM, 1 mM ili 0,1 mM. Kod drugih pogodnih GAT polipeptida, predviđenih za prenos otpornosti na glifozat, vrednost K^/Kmje najmanje 1 mM"<1>min"<1>, ili još bolje - najmanje 10mM'<1>min"<1>, 100 mM"1min"1, 1000 mM"<1>min"1, ili 10 000mM"<1>min"<1>.

Tipski GAT polipeptidi su izolovani i karakterisani iz različitih sojeva bakterija. Jedan od primera izolovanog i karakterisanog monomernog GAT polipeptida ima molekularni radijus od oko 17 kD. Tipski GAT enzim, izolovan iz sojaB. licheniformis,SEQ ID br. 7, ima Kmza glifozat od oko 2,9 mM, a K™ za acetiICoA oko 2 uM, dok mu je vrednost k^, jednaka 6/min.

Termin 'GAT polipeptid' označava svaki polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja se može optimalno poravnati sa aminokiselinskom sekvencom, izabranom iz grupe koju čine SEQ ID br: 6-10 i 263-514, da bi se dobio skor sličnosti od najmanje 430 primenom BLOSUM62 matrice, kazne za postojanje prekida od 11, i kazne za ekstenziju prekida od 1. Neki od aspekata pronalaska odnose se na GAT polipeptide, koji sadrže aminokiselinsku sekvencu koja se može optimalno poravnati sa aminokiselinskom sekvencom izabranom iz grupe koju čine SEQ ID br. 6-10 i 263-514, da se dobije skor sličnosti od najmanje 440, 445, 450, 455, 460, 465, 470, 475, 480, 485, 490, 495, 500, 505, 510, 515, 520, 525, 530, 535, 540, 545, 550, 555, 560, 565, 570, 575, 580, 585, 590, 595, 600, 605, 610, 615, 620, 625, 630, 635, 640, 645, 650, 655, 660, 665, 670, 675, 780, 685, 690, 695, 700, 705, 710, 715, 720, 725, 730, 735, 740, 745, 750, 755 ili 760 pomoću BLOSUM62 matrice, kazne za postojanje prekida od 11, i kazne za ekstenziju prekida od 1.

Jedan od aspekata pronalaska odnosi se na GAT polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja se može optimalno poravnati sa SEQ ID br: 457 da se dobije skor sličnosti od najmanje 430 primenom BLOSUM62 matrice, kazne za postojanje prekida od 11, i kazne za ekstenziju prekida od 1. Neki od aspekata pronalaska odnose se na GAT polipeptide koji sadrže aminokiselinsku sekvencu koja se može optimalno poravnati sa SEQ ID br: 457 da se dobije skor sličnosti od najmanje 440, 445, 450, 455, 460, 465, 470, 475, 480, 485, 490, 495, 500, 505, 510, 515, 520, 525, 530, 535, 540, 545, 550, 555, 560, 565, 570, 575, 580, 585, 590, 595, 600, 605, 610, 615, 620, 625, 630, 635, 640, 645, 650, 655, 660, 665, 670, 675, 780, 685, 690, 695, 700, 705, 710, 715, 720, 725, 730, 735, 740, 745, 750, 755 ili 760 pomoću BLOSUM62 matrice, kazne za postojanje prekida od 11, i kazne za ekstenziju prekida od 1.

Jedan aspekt pronalaska odnosi se na GAT polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja se može optimalno poravnati sa SEQ ID br: 445 da se dobije skor sličnosti od najmanje 430 pomoću BLOSUM62 matrice, kazne za postojanje prekida od 11, i kazne za ekstenziju prekida od 1. Neki od aspekata pronalaska odnose se na GAT polipeptide koji sadrže aminokiselinsku sekvencu koja se može optimalno poravnati sa SEQ ID br: 445 da se dobije skor sličnosti od najmanje 440, 445, 450, 455, 460, 465, 470, 475, 480, 485, 490, 495, 500, 505, 510, 515, 520, 525, 530, 535, 540, 545, 550, 555, 560, 565, 570, 575, 580, 585, 590, 595, 600, 605, 610, 615, 620, 625, 630, 635, 640, 645, 650, 655, 660, 665, 670, 675, 780, 685, 690, 695, 700, 705, 710, 715, 720, 725, 730, 735, 740, 745, 750, 755 ili 760 pomoću BLOSUM62 matrice, kazne za postojanje prekida od 11, i kazne za ekstenziju prekida od 1.

Jedan aspekt pronalaska odnosi se na GAT polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja se može optimalno poravnati sa SEQ ID br: 300 da se dobije skor sličnosti od najmanje 430 pomoću BLOSUM62 matrice, kazne za postojanje prekida od 11, i kazne za ekstenziju prekida od 1. Neki od aspekata pronalaska odnose se na GAT polipeptide koji sadrže aminokiselinsku sekvencu koja se može optimalno poravnati sa SEQ ID br: 300 da se dobije skor sličnosti od najmanje 440, 445, 450, 455, 460, 465, 470, 475, 480, 485, 490, 495, 500, 505, 510, 515, 520, 525, 530, 535, 540, 545, 550, 555, 560, 565, 570, 575, 580, 585, 590, 595, 600, 605, 610, 615, 620, 625, 630, 635, 640, 645, 650, 655, 660, 665, 670, 675, 780, 685, 690, 695, 700, 705, 710, 715, 720, 725, 730, 735, 740, 745, 750, 755 ili 760 pomoću BLOSUM62 matrice, kazne za postojanje prekida od 11, i kazne za ekstenziju prekida od 1.

Dve sekvence se 'optimalno poravnavaju' kad se poravnaju, radi ocene sličnosti uz pomoć matrice supstitucije definisane aminokiseline (npr. BLOSUM62,), kazne za postojanje prekida i kazne za ekstenziju prekida, tako da se dođe do najvišeg mogućeg skora za dati par sekvenci. Matrice supstitucije amino kiselina i njihova primena u kvantifikovanju sličnosti između dveju sekvenci, bliske su struci i opisane u, npr. Davhoff i sar. (1978) 'A model of evolutionary change in proteins.' U 'Atlas of Protein Sequence and Structure', sv. 5, dodatak 3 (ed. M.O. Davhoff), str. 345-352. Natl Biomed Res Found, VVashington, DC i Heinikoff i sar. (1992) Proc Natl Acad Sci USA 89:10915-10919. BLOSUM62 matrica (SI. 10) se često koristi kao obavezna ocenjivačka matrica supstitucije u protokolima poravnavanja sekvenci, npr. u Gapped BLAST 2.0. Kazna za postojanje prekida dodeljuje se za uvođenje pojedinačnog aminokiselinskog prekida u jednoj od poravnanih sekvenci, dok se kazna za ekstenziju prekida daje za svaku dalju aminokiselinsku poziciju, umetnutu u već otvoren prekid. Poravnanje je definisano aminokiselinskim pozicijama svake od sekvenci na kojima poravnanje počinje i završava i, po izboru, umetanjem prekida ili višestrukih prekida u jednu ili više sekvenci, da bi se došlo do najvišeg mogućeg skora. lako se optimalno poravnanje i ocenjivanje može postići manuelno, proces znatno olakšava korišćenje kompjuterskog algoritma poravnanja, npr. Gapped BLAST 2.0, opisanog u Altschul i sar. (1997) Nucleic Acid Res. 25:3389-3402, a koji je javnosti dostupan na vebsajtu Nacionalnog centra za biotehnološke informacije ( htto:// vavw. ncbi. nlm. nih. cov/). Optimalna poravnanja, uključujući i višestruka poravnanja, mogu da se pripreme pomoću, npr. PSI-BLAST, dostupnog preko vebsajta, i opisanog u Altschul i sar. (1997) Nucleic Acid Res. 25:3389-3402.

Kad se govori o aminokiselinskoj sekvenci optimalno poravnanoj sa referentnom sekvencom, aminokiselinski reziduum 'odgovara' poziciji u referentnoj sekvenci sa kojom kod poravnanja formira par. 'Pozicija' je označena brojem koji sekvencijalno identifikuje svaku od aminokiselina u referentnoj sekvenci, na osnovu njene pozicije u odnosu na N-završetak. Npr., u SEQ ID br: 300, pozicija 1 je M, pozicija 2 je I, dok je pozicija 3 - E. Kad je test sekvenca optimalno poravnana sa SEQ ID br: 300, za reziduum iz test sekvence koji se poravnava sa E na poziciji 3, kaže se da 'odgovara poziciji 3' SEQ ID br: 300. Zbog brisanja, umetanja, kresanja, fuzija, itd., koje se sve moraju uzeti u obzir pri određivanju optimalnog poravnanja, obično broj aminokiselinskih reziduuma u test sekvenci, određen prostim brojanjem od N-završetka, ne mora da se podudari sa brojem njemu odgovarajuće pozicije u referentnoj sekvenci. U slučaju da je u poravnanoj test sekvenci izvršeno, npr., brisanje, u njoj neće postojati amino kiselina koja odgovara poziciji u referentnoj sekvenci na mestu brisanja. Ukoliko je u poravnanoj referentnoj sekvenci izvršeno umetanje, takav umetak neće odgovarati ni jednoj od aminokiselinskih pozicija u referentnoj sekvenci. Ukoliko su izvršena kresanja ili fuzije, mogu se pojaviti - bilo u referentnoj, bilo u poravnanoj sekvenci - intervali aminokiselina koji ne odgovaraju ni jednoj od amino kiselina u odgovarajućoj sekvenci.

Pojam 'GAT polipeptid' se, takođe, odnosi na svaki polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja se min. 40% podudara sa aminokiselinskom sekvencom izabranom iz grupe koju čine SEQ ID br: 6-10 i 263-514. Neki aspekti pronalaska odnose se na GAT polipeptide sa aminokiselinskom sekvencom koja se bar 60%, 70%, 80%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% podudara sa aminokiselinskom sekvencom izabranom iz grupe koju čine SEQ ID br: 6-10 i 263-514.

Jedan aspekat pronalaska se odnosi na GAT polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja se najmanje 40% podudara sa SEQ ID br: 457. Neki od aspekata pronalaska odnose se na GAT polipeptide sa aminokiselinskom sekvencom koja se bar 60%, 70%, 80%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% podudara sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID br: 457.

Jedan aspekat pronalaska se odnosi na GAT polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja se najmanje 40% podudara sa SEQ ID br: 445. Neki od aspekata pronalaska odnose se na GAT polipeptide sa aminokiselinskom sekvencom koja se bar 60%, 70%, 80%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% podudara sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID br: 445.

Jedan aspekat pronalaska se odnosi na GAT polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja se najmanje 40% podudara sa SEQ ID br: 300. Neki od aspekata pronalaska odnose se na GAT polipeptide sa aminokiselinskom sekvencom koja se bar 60%, 70%, 80%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% podudara sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID br: 300.

Pojam 'GAT polipeptid' se, dalje, odnosi na svaki polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja se najmanje 40% podudara sa reziduumima 1-96 aminokiselinske sekvence izabrane iz grupe koju čine SEQ ID br: 6-10 i 263-514. Neki aspekti pronalaska odnose se na polipeptide sa aminokiselinskom sekvencom koja se bar 60%, 70%, 80%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% podudara sa reziduumima 1-96 aminokiselinske sekvence izabrane iz grupe koju čine SEQ ID br: 6-10 i 263-514.

Jedan aspekat pronalaska odnosi se na polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja se najmanje 40% podudara sa reziduumima 1-96 SEQ ID br: 457. Neki od aspekata pronalaska odnose se na GAT polipeptide sa aminokiselinskom sekvencom koja se bar 60%, 70%, 80%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% podudara sa reziduumima 1-96 SEQ ID br: 457.

Jedan aspekat pronalaska odnosi se na GAT polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja se najmanje 40% podudara sa reziduumima 1-96 SEQ ID br: 445. Neki od aspekata pronalaska odnose se na GAT polipeptide sa aminokiselinskom sekvencom koja se bar 60%, 70%, 80%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% podudara sa reziduumima 1-96 SEQ ID br: 445.

Jedan aspekat pronalaska odnosi se na GAT polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja se najmanje 40% podudara sa reziduumima 1-96 SEQ ID br: 300. Neki od aspekata pronalaska odnose se na GAT polipeptide sa aminokiselinskom sekvencom koja se bar 60%, 70%, 80%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% podudara sa reziduumima 1-96 SEQ ID br: 300.

Pojam 'GAT polipeptid' se, osim toga, odnosi na svaki polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja se najmanje 40% podudara sa reziduumima 51-146 aminokiselinske sekvence izabrane iz grupe koju čine SEQ ID br: 6-10 i 263-514. Neki od aspekata pronalaska odnose se na polipeptide sa aminokiselinskom sekvencom koja se bar 60%, 70%, 80%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% podudara sa reziduumima 51-146 aminokiselinske sekvence izabrane iz grupe koju čine SEQ ID br: 6-10 i 263-514.

Jedan aspekat pronalaska odnosi se na polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja se najmanje 40% podudara sa reziduumima 51-146 SEQ ID br: 457. Neki od aspekata pronalaska odnose se na GAT polipeptide sa aminokiselinskom sekvencom koja se bar 60%, 70%, 80%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98%o ili 99% podudara sa reziduumima 51-146 SEQ ID br: 457.

Jedan aspekat pronalaska odnosi se na GAT polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja se najmanje 40% podudara sa reziduumima 51-147 SEQ ID br: 445. Neki od aspekata pronalaska odnose se na GAT polipeptide sa aminokiselinskom sekvencom koja se bar 60%, 70%, 80%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% podudara sa reziduumima 51-146 SEQ ID br: 445.

Jedan aspekat pronalaska odnosi se na GAT polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja se najmanje 40% podudara sa reziduumima 51-146 SEQ ID br: 300. Neki od aspekata pronalaska odnose se na GAT polipeptide sa aminokiselinskom sekvencom koja se bar 60%, 70%, 80%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% podudara sa reziduumima 51-146 SEQ ID br: 300.

U smislu ovog izlaganja, pojam 'identičnost' ili 'procentualna identičnost', kad se govori o određenom paru poravnatih aminokiselinskih sekvenci, odnosi se na procentualnu podudarnost aminokiselinske sekvence dobijenu pomoću Clustal W analize (verzija W 1.8, European Bioinformatics Institute, Cambridge, UK), brojanjem identičnih parova u poravnanju i deljenjem tog broja identičnih parova sa većom vrednošću (i) dužine poravnate sekvence, i (ii) 96, i primenom obaveznih Clustal W parametara za dobijanje sporih /tačnih parnih poravnanja - kazne za otvoren prekid: 10, kazne za ekstenziju prekida: 0,10, matrice težine proteina: Gonnet niz, matrice težine DNK: IUB, Toggle Slow/Fast poravnanja parova = SLOVV ili FULL poravnanje.

U drugom aspektu, pronalazak daje izolovan ili rekombinantni polipeptid koji sadrži najmanje 20, ili alternativno 50, 75, 100, 125 ili 140 susednih amino kiselina aminokiselinske sekvence izabrane iz grupe koju čine SEQ ID br: 6-10 i 263-514.

U svom drugom aspektu, pronalazak daje izolovan ili rekombinantni polipeptid koji sadrži najmanje 20, ili alternativno 50, 100 ili 140 susednih amino kiselina SEQ ID br: 457. - U drugom aspektu, pronalazak daje izolovan ili rekombinantni polipeptid koji sadrži najmanje 20, ili alternativno 50, 100 ili 140 susednih amino kiselina SEQ ID br: 445.

U drugom aspektu, pronalazak daje izolovan ili rekombinantni polipeptid koji sadrži najmanje 20, ili alternativno 50, 100 ili 140 susednih amino kiselina SEQ ID br: 300.

U svom drugom aspektu, pronalazak donosi polipeptid, koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID b.: 6-10 i 263-514.

Pojedini odabrani GAT polipeptidi iz ovog pronalaska karakterisani su na sledeći način. Kad se optimalno poravnaju sa referentnom aminokiselinskom sekvencom, selektovanom iz grupe koju čine SEQ ID br: 6-10 i 263-514, najmanje 90% aminokiselinskih reziduuma u polipeptidu, koji odgovaraju sledećim pozicijama, povinuje se sledećim ograničenjima: (a) na pozicijama 2, 4, 15, 19, 26, 28, 31, 45, 51, 54, 86, 90, 91, 97, 103, 105, 106, 114, 123, 129, 139 i/ili 145 aminokiselinski reziduum je B1; (b) na pozicijama 3, 5, 8, 10, 11, 14, 17, 18, 24, 27, 32, 37, 38, 47, 48, 49, 52, 57, 58, 61, 62, 63, 68, 69, 79, 80, 82, 83, 89, 92, 100, 101, 104, 119, 120, 124, 125, 126, 128, 131, 143 i/ili 144 aminokiselinski reziduum je B2, gde je B1 aminokiselina selektovana iz grupe koju čine A, I, L, M, F, W, Y I V, a B2 je aminokiselina selektovana iz grupe koja se sastoji od R, N, D, C, Q, E, G, H, K, P, S i T. Kada se koriste za definisanje amino kiseline ili aminokiselinskog reziduuma, slovne odrednice A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W i Y imaju svoje standardno značenje prihvaćeno u stručnim krugovima i prikazano u Tabeli 2.

Neki odabrani GAT polipeptidi iz ovog pronalaska karakterisani su na sledeći način. Kad se optimalno poravnaju sa referentnom aminokiselinskom sekvencom, selektovanom iz grupe koju čine SEQ ID br: 6-10 i 263-514, najmanje 80% aminokiselinskih reziduuma u polipeptidu, koji odgovaraju sledećim pozicijama, povinuje se sledećim ograničenjima: (a) na pozicijama 2, 4, 15, 19, 26, 28, 51, 54, 86, 90, 91, 97, 103, 105, 106, 114, 129, 139 i/ili 145 aminokiselinski reziduum je Z1; (b) na pozicijama 31 i/ili 45 aminokiselinski reziduum je Z2; (c) na pozicijama 8 i/ili 89 aminokiselinski reziduum je Z3; na pozicijama 82, 92, 101 i/ili 120 aminokiselinski reziduum je Z4; (e) na pozicijama 3, 11, 27 i/ili 79 aminokiselinski reziduum je Z5; (f) na poziciji 123 aminokiselinski reziduum je Z1 ili Z2; (g) na pozicijama 12, 33, 35, 39, 53, 59, 112, 132, 135, 140 i/ili 147 aminokiselinski reziduum je Z1 ili Z3; (h) na poziciji 30 aminokiselinski reziduum je Z1 ili Z4; (i) na poziciji 6 aminokiselinski reziduum je Z1 ili Z6; (j) na pozicijama 81 i/ili 113 aminokiselinski reziduum je Z2 ili Z3; (k) na pozicijama 138 i/ili 142 aminokiselinski reziduum je Z2 ili Z4; (I) na pozicijama 5, 17, 24, 57, 61, 124 i/ili 126 aminokiselinski reziduum je Z3 ili Z4; (m) na poziciji 104 aminokiselinski reziduum je Z3 ili Z5; (o) na pozicijama 38, 52, 62 i/ili 69 aminokiselinski reziduum je Z3 ili Z6; (p) na pozicijama 14, 119 i/ili 144 aminokiselinski reziduum je Z4 ili Z5; (q) na poziciji 18 aminokiselinski reziduum je Z4 ili Z6; (r) na pozicijama 10, 32, 48, 63, 80 i/ili 83 aminokiselinski reziduum je Z5 ili Z6; (s) na poziciji 40 aminokiselinski reziduum je Z1, Z2 ili Z3; (t) na pozicijama 65 i/ili 96 aminokiselinski reziduum je Z1, Z3 ili Z5; (u) na pozicijama 84 i/ili 115 aminokiselinski reziduum je Z1, Z3 ili Z4; (v) na poziciji 93 aminokiselinski reziduum je Z2, Z3 ili Z4; (w) na poziciji 130 aminokiselinski reziduum je72,Z4 ili Z6; (x) na pozicijama 47 i/ili 58 aminokiselinski reziduum je Z3, Z4 ili Z6; (y) na pozicijama 49, 68, 100 i/ili 143 aminokiselinski reziduum je Z3, Z4 ili Z5; (z) na poziciji 131 aminokiselinski reziduum je Z3, Z5 ili Z6; (aa) na pozicijama 125 i/ili 128 aminokiselinski reziduum je Z4, Z5 ili Z6; (ab) na poziciji 67 aminokiselinski reziduum je Z1, Z3, Z4 ili Z5; (ac) na poziciji 60 aminokiselinski reziduum je Z1, Z4, Z5 ili Z&; i (ad) na poziciji 37 aminokiselinski reziduum je Z3, Z4, Z5 ili Z6, gde je Z1 amino kiselina selektovana iz grupe koju čine A, I, L, M i V, Z2 je amino kiselina selektovana iz grupe koju čine F, VV i Y, Z3 je amino kiselina selektovana iz grupe koju čine N, Q, S i T, Z4 je amino kiselina selektovana iz grupe koju čine R, H i K, Z5 je amino kiselina selektovana iz grupe koju čine D i E, a Z6 je amino kiselina selektovana iz grupe koju čine C, G i P.

Neki od odabranih GAT polipeptida iz ovog pronalaska karakterisani su na sledeći način. Kad se optimalno poravnaju sa referentnom aminokiselinskom sekvencom, selektovanom iz grupe koju čine SEQ ID br: 6-10 i 263-514, najmanje 90% aminokiselinskih reziduuma u polipeptidu, koji odgovaraju sledećim pozicijama, povinuje se sledećim ograničenjima: (a) na pozicijama 1, 7, 9, 13, 20, 36, 42, 46, 50, 56, 64, 70, 72, 75, 76, 78, 94, 98, 107, 110, 117, 118, 121 i/ili 141 aminokiselinski reziduum je B1; (b) na pozicijama 16, 21, 22, 23, 25, 29, 34, 41, 43, 44, 55, 66, 71, 73, 74, 77, 85, 87, 88, 95, 99, 102, 108, 109, 111, 116, 122, 127 133, 134, 136 i/ili 137 aminokiselinski reziduum je B2, gde je B1 amino kiselina selektovana iz grupe koju čine A, I, L, M, F, W, Y i V, a B2 je amino kiselina selektovana iz grupe koju čine R, N, D, C, Q, E, G, H, K, P, S i T.

Neki od odabranih GAT polipeptida iz ovog pronalaska karakterisani su na sledeći način. Kad se optimalno poravnaju sa referentnom aminokiselinskom sekvencom, selektovanom iz grupe koju čine SEQ ID br: 6-10 i 263-514, najmanje 90% aminokiselinskih reziduuma u polipeptidu, koji odgovaraju sledećim pozicijama, povinuje se sledećim ograničenjima: (a) na pozicijama 1, 7, 9, 20, 36, 42, 50, 64, 72, 75, 76, 78, 94, 98, 110, 121 i/ili 141 aminokiselinski reziduum je Z1; (b) na pozicijama 13, 46, 56, 70, 107, 117 i/ili118 aminokiselinski reziduum je Z2; (c) na pozicijama 23, 55, 71, 77, 88 i/ili 109 aminokiselinski reziduum je Z3; (d) na pozicijama 16, 21, 41, 73, 85, 99 i/ili 111 aminokiselinski reziduum je Z4; (e) na pozicijama 34 i/ili 95 aminokiselinski reziduum je Z5; (f) na pozicijama 22, 25, 29, 43, 44, 66, 74, 87, 102, 108, 116, 122, 127, 133, 134, 136 i/ili 137 aminokiselinski reziduum je Z6, gde je Z1 amino kiselina selektovana iz grupe koju čine A, I, L, M i V, Z2 amino kiselina selektovana iz grupe koju čine F, W i Y, Z3 amino kiselina selektovana iz grupe koju čine N, Q, S i T, Z4 amino kiselina selektovana iz grupe koju čine R, H i K, Z5 amino kiselina selektovana iz grupe koju čine D i E, a Z6 amino kiselina selektovana iz grupe koju čine C, G i P.

Neki od odabranih GAT polipeptida iz ovog pronalaska karakterisani su na sledeći način. Kad se optimalno poravnaju sa referentnom aminokiselinskom sekvencom, selektovanom iz grupe koju čine SEQ ID br: 6-10 i 263-514, najmanje 80% aminokiselinskih reziduuma u polipeptidu, koji odgovaraju sledećim pozicijama, povinuje se sledećim ograničenjima: (a) na poziciji 2 aminokiselinski reziduum je I ili L, (b) na poziciji 4 aminokiselinski reziduum je E ili D; (c) na poziciji 4 aminokiselinski reziduum je V, A ili I; (d) na poziciji 5 aminokiselinski reziduum je K, R ili N; (e) na poziciji 6 aminokiselinski reziduum je P ili L; (f) na poziciji 8 aminokiselinski reziduum je N, S ili T; (g) na poziciji 10 aminokiselinski reziduum je E ili G; (h) na poziciji 11 aminokiselinski reziduum je D ili E; (i) na poziciji 12 aminokiselinski reziduum je T ili A; (j) na poziciji 14 aminokiselinski reziduum je E ili K; (k) na poziciji 15 aminokiselinski reziduum je I ili L; (I) na poziciji 17 aminokiselinski reziduum je H ili Q; (m) na poziciji 18 aminokiselinski reziduum je R, C ili K; (n) na poziciji 19 aminokiselinski reziduum je I ili V; (o) na poziciji 24 aminokiselinski reziduum je Q ili R; (p) na poziciji 26 aminokiselinski reziduum je L ili I; (q) na poziciji 27 aminokiselinski reziduum je E ili D; (r) na poziciji 28 aminokiselinski reziduum je A ili V; (s) na poziciji 30 aminokiselinski reziduum je K, M ili R; (t) na poziciji 31 aminokiselinski reziduum je Y ili F; (u) na poziciji 32 aminokiselinski reziduum je E ili G; (v) na poziciji 33 aminokiselinski reziduum je T, A ili S; (w) na poziciji 35 aminokiselinski reziduum je L, S ili M; (x) na poziciji 37 aminokiselinski reziduum je R, G, E ili Q; (y) na poziciji 38 aminokiselinski reziduum je G ili S; (z) na poziciji 39 aminokiselinski reziduum je T, A ili S; (aa) na poziciji 40 aminokiselinski reziduum je F, L ili S; (ab) na poziciji 45 aminokiselinski reziduum je Y ili F; (ac) na poziciji 47 aminokiselinski reziduum je E, Q ili G; (ad) na poziciji 48 aminokiselinski reziduum je G ili D; (ae) na poziciji 49 aminokiselinski reziduum je K, R, E ili Q; (af) na poziciji 51 aminokiselinski reziduum je I ili V; (ag) na poziciji 52 aminokiselinski reziduum je S, C ili G; (ah) na poziciji 53 aminokiselinski reziduum je I ili T; (ai) na poziciji 54 aminokiselinski reziduum je A ili V; (aj) na poziciji 57 aminokiselinski reziduum je H ili K; (ak) na poziciji 58 aminokiselinski reziduum je Q, K, N ili P; (al) na poziciji 59 aminokiselinski reziduum je A ili S; (am) na poziciji 60 aminokiselinski reziduum je E, K, G, V ili D; (an) na poziciji 61 aminokiselinski reziduum je H ili Q; (ao) na poziciji 62 aminokiselinski reziduum je P, S ili T; (ap) na poziciji 63 aminokiselinski reziduum je E, G ili D; (aq) na poziciji 65 aminokiselinski reziduum je E, D, V ili Q; (ar) na poziciji 67 aminokiselinski reziduum je Q, E, R, L, H ili K; (as) na poziciji 68 aminokiselinski reziduum je K, R, E ili N; (at) na poziciji 69 aminokiselinski reziduum je Q ili P; (au) na poziciji 79 aminokiselinski reziduum je E ili D; (av) na poziciji 80 aminokiselinski reziduum je G ili E; (aw) na poziciji 81 aminokiselinski reziduum je Y, N ili F; (ax) na poziciji 82 aminokiselinski reziduum je R ili H; (ay) na poziciji 83 aminokiselinski reziduum je E, G ili D; (az) na poziciji 84 aminokiselinski reziduum je Q, R ili L; (ba) na poziciji 86 aminokiselinski reziduum je A ili V; (bb) na poziciji 89 aminokiselinski reziduum je T ili S; (bc) na poziciji 90 aminokiselinski reziduum je L ili I; (bd) na poziciji 91 aminokiselinski reziduum je I ili V; (be) na poziciji 92 aminokiselinski reziduum je R ili K; (bf) na poziciji 93 aminokiselinski reziduum je H, Y ili Q; (bg) na poziciji 96 aminokiselinski reziduum je E, A ili Q; (bh) na poziciji 97 aminokiselinski reziduum je L ili I; (bi) na poziciji 100 aminokiselinski reziduum je K, R, N ili E; (bj) na poziciji 101 aminokiselinski reziduum je K ili R; (bk) na poziciji 103 aminokiselinski reziduum je A ili V; (bi) na poziciji 104 aminokiselinski reziduum je D ili N; (bm) na poziciji 105 aminokiselinski reziduum je L ili M; (bn) na poziciji 106 aminokiselinski reziduum je L ili I; (bo) na poziciji 112 aminokiselinski reziduum je T ili I; (bp) na poziciji 113 aminokiselinski reziduum je S, T ili F; (bq) na poziciji 114 aminokiselinski reziduum je A ili V; (br) na poziciji 115 aminokiselinski reziduum je S, R ili A; (bs) na poziciji 119 aminokiselinski reziduum je K, E ili R; (bt) na poziciji 120 aminokiselinski reziduum je K ili R; (bu) na poziciji 123 aminokiselinski reziduum je F ili L; (bv) na poziciji 124 aminokiselinski reziduum je S ili R; (fcw) na poziciji 125 aminokiselinski reziduum je E, K, G ili D; (bx) na poziciji 126 aminokiselinski reziduum je Q ili H; (by) na poziciji 128 aminokiselinski reziduum je E, G ili K; (bz) na poziciji 129 aminokiselinski reziduum je V, I ili A; (ca) na poziciji 130 aminokiselinski reziduum je Y, H, F ili C; (cb) na poziciji 131 aminokiselinski reziduum je D, G, N ili E; (cc) na poziciji 132 aminokiselinski reziduum je I, T, A, M, V ili L; (cd) na poziciji 135 aminokiselinski reziduum je V, T, A ili I; (ce) na poziciji 138 aminokiselinski reziduum je H ili Y; (cf) na poziciji 139 aminokiselinski reziduum je I ili V; (cg) na poziciji 140 aminokiselinski reziduum je L ili S; (eh) na poziciji 142 aminokiselinski reziduum je Y ili H; (ci) na poziciji 143 aminokiselinski reziduum je K, T ili E; (cj) na poziciji 144 aminokiselinski reziduum jeK, E ili R; (ck) na poziciji 145 aminokiselinski reziduum je L ili l; i (cl) na poziciji 146 aminokiselinski reziduum je T ili A.

Neki od odabranih GAT polipeptida iz ovog pronalaska karakterisani su na sledeći način. Kad se optimalno poravnaju sa referentnom aminokiselinskom sekvencom, selektovanom iz grupe koju čine SEQ ID br: 6-10 i 263-514, najmanje 80% aminokiselinskih reziduuma u polipeptidu, koji odgovaraju sledećim pozicijama, povinuje se sledećim ograničenjima: (a) na pozicijama 9, 76, 94 i 110 aminokiselinski reziduum je A; (b) na poziciji 29 i 108 aminokiselinski reziduum je C; (c) na poziciji 34 aminokiselinski reziduum je D; (d) na poziciji 95 aminokiselinski reziduum je E; (e) na poziciji 56 aminokiselinski reziduum je F; (f) na poziciji 43, 44, 66, 74, 87, 102, 116, 122, 127 i 136 aminokiselinski reziduum je G; (g) na poziciji 41 aminokiselinski reziduum je H; (h) na poziciji 7 aminokiselinski reziduum je I; (i) na poziciji 85 aminokiselinski reziduum je K; (j) na poziciji 20, 36, 42, 50, 72, 78, 98 i 121 aminokiselinski reziduum je L; (k) na poziciji 1, 75 i 141 aminokiselinski reziduum je M; (I) na poziciji 23, 64 i 109 aminokiselinski reziduum je N; (m) na poziciji 22, 25, 133, 134 i 137 aminokiselinski reziduum je P; (n) na poziciji 71 aminokiselinski reziduum je Q; (o) na poziciji 16, 21, 73, 99 i 111 aminokiselinski reziduum je R; (p) na poziciji 55 i 88 aminokiselinski reziduum je S; (q) na poziciji 77 aminokiselinski reziduum je T; (r) na poziciji 107 aminokiselinski reziduum je W; i (s) na poziciji 13, 46, 70, 117 i 118 aminokiselinski reziduum je Y.

Neki od odabranih GAT polipeptida iz pronalaska karakterisani su na sledeći način. Kad se optimalno poravnaju sa referentnom aminokiselinskom sekvencom, selektovanom iz grupe koju čine SEQ ID br: 6-10 i 263-514, aminokiselinski reziduum u polipeptidu, koji odgovara poziciji 28 je V ili A. Valin na poziciji 28 obično prati niži Km, dok alanin na toj poziciji obično podrazumeva viši kcat. Ostale odabrane GAT polipeptide karakteriše što imaju I27 (tj. I na poziciji 27), M30, S35, R37, S39, G48, K49, N57, Q58, P62, Q65, Q67, K68, E83, S89, A96, E96, R101, T112, A114, K119, K120, E128, V129, D131, T131, V134, R144, 1145 ili T146, ili bilo koja kombinacija navedenog.

Neki od odabranih GAT polipeptida pronalaska sadrže aminokiselinsku sekvencu selektovanu iz grupe koju čine SEQ ID br: 6-10 i 263-514.

Pronalazak, nadalje, daje GAT polinukleotide koji kodiraju odabrane GAT polipeptide iz napred izloženog, kao i njihove komplementarne nukleotidne sekvence.

Neki aspekti ponalaska se posebno odnose na podsetove svake od opisanih kategorija GAT polipeptida sa GAT aktivnošću. Ti GAT polipeptidi se smatraju najpogodnijim za uspostavljanje otpornosti na glifozat kod biljke. Ovo izlaganje daje i primere željenih nivoa GAT aktivnosti.

U jednom od aspekata GAT polipeptidi sadrže aminokiselinsku sekvencu kodiranu rekombinantnim ili izolovanim oblikom prirodne nukleinske kiseline, izolovane iz prirodnog izvora, npr. nekog soja bakterija. Prirodni polinukleotid koji kodiraju ovakve GAT polipeptide, mogu biti ciljano traženi standardnim metodima koje struka poznaje. Polipeptidi koje definiše SEQ ID br: 6 do SEQ ID br: 10 otkriveni su, npr., ekspresionim kloniranjem sekvenci iz sojevaBacillus,koji ispoljavaju GAT aktivnost, što će se detaljnije opisati u daljem izlaganju.

Pronalazak, takođe, obuhvata izolovane ili rekombinantne polipeptide kodirane izolovanim ili rekombinantnim polinukleotidom, koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja hibridizuje pod strogo kontrolisanim uslovima duž gotovo čitave dužine nukleotidne sekvence, selektovane iz grupe koju čine SEQ ID br: 1-5 i 11-262, njihovi komplementi, kao i nukleotidna sekvenca koja kodira aminokiselinsku sekvencu, selektovanu iz grupe koju čine SEQ ID br: 6-10 i 263-514, i njihovi komplementi.

Pronalazak, nadalje, obuhvata sve polinukleotide sa GAT aktivnošću, kodiranom fragmentom nekog od opisanih GAT-kodirajućih polinukleotida.

Pronalazak još predstavlja fragmente GAT polipeptida koji se mogu sastaviti u celinu i obrazovati funkcionalni GAT polipeptid. To spajanje može da se postignein vitroiliin vivo,a može da podrazumevac/silifrans(tj. intramolekularno ili intermolekularno) spajanje. Sami fragmenti mogu, ali ne moraju, da poseduju GAT aktivnost. Dva ili više segmenata GAT polipeptida mogu da se razdvoje pomoću inteina; uklanjanjem inteinske sekvence c/s-spajanjem dobija se funkcionalan GAT polipeptid. U drugom primeru, kodirani GAT polipeptid može da se eksprimira u obliku dva ili više zasebnih fragmenata; frans-spajanjem tih segmenata ponovo se dobija funkcionalan GAT polipeptid. Različiti aspektic/sitransspajanja, kodiranja gena i uvođenja međusekvenci detaljnije su opisani u U.S. patentnim prijavama br. 09/517,933 i 09/710,686, koje su referentni sastavni deo ovog izlaganja.

Pronalazak, generalno obuhvata sve polipeptide kodirane modifikovanim GAT polinukleotidom, dobijenim mutacijom, rekombinacijom rekursivne sekvence, i/ili diversifikacijom ovde opisanih polinukleotidnih sekvenci. U nekim aspektima pronalaska, GAT polipeptid je modifikovan supstitucijom, brisanjem i umetanjem jedne ili više amino kiselina, ili kombinovanjem jednog ili više tipova modifikacija. Supstitucije mogu da budu konzervativne ili ne-konzervativne, mogu da menjaju ili ne menjaju funkciju, a mogu da dopunjuju postojeće novim funkcijama. Umetanja i brisanja mogu da budu znatna, npr. u slučaju kresanja značajnog fragmenta sekvence, ili kod fuzije dodatne sekvence, bilo u unutrašnjost, bilo na N ili C završetku. U nekim od formulacija pronalaska, GAT polipeptid je deo fuzionog proteina, koji sadrži funkcionalnu dopunu, npr. sekrecioni signal, peptid tranzita hloroplasta, obeležje prečišćenosti, ili bilo koju od brojnih drugih funkcionalnih grupa, koje će stručnjak uočiti, a koje su detaljnije opisane drugde u izlaganju.

Polipeptidi pronalaska mogu da sadrže jednu ili više modifikovanih amino kiselina. Prisustvo modifikovanih amino kiselina može da bude korisno za, npr. (a) produžavanjein vivopoluživota polipeptida; (redukovanje ili pojačavanje antigenosti polipeptida; (c) poboljšavanje stabilnosti polipeptida pri skladištenju. Amino kiseline se modifikuju, npr. u toku ili posle translacije prilikom rekombinantne produkcije (npr. N-vezanom glikozilacijom na N-X-S/T svojstva u toku eksprimiranja u ćelije sisara) ili se modifikuju sintetičkim sredstvima.

Neki od primera modifikovanih amino kiselina obuhvataju glikozilisane amino kiseline, sulfatisane amino kiseline, prenilisane (npr. fernesilisane, geranilgeranilisane) amino kiseline, acetilisane amino kiseline, acilisane amino kiseline, PEG-ilisane amino kiseline, biotinilisane amino kiseline, karboksilovane amino kiseline, fosforilisane amino kiseline i slično. Stručnjacima je na raspolaganju širok dijapazon literaturnih podataka iz područja modifikacije amino kiselina. U VValker (1998) Protein Protocols on CD- ROM Human Press, Tovvata, NJ, dati su primeri protokola.

U ovom izlaganju opisani su rekombinantni metodi za dobijanje i izolovanje GAT polipeptida pronalaska. Pored rekombinantnog načina, polipeptidi se mogu produkovati direktnom sintezom peptida pomoću metoda čvrste faze (npr. Stevvart i sar. (1969) Solid- Phase Peptide Svnthesis, WH Freeman Co, San Francisco; Merrifield J (1963) J Am Chem Soc 85:2149-2154). Sinteza peptida može da se obavlja manuelnim metodima ili kompjuterski. Kompjuterizovana sinteza može da se postigne, npr., primenom Applied Biosvstems 431A Peptide Synthesizer-a (Perkin Elmer, Foster City, Calif.), prema uputstvima proizvođača. Subsekvence se mogu, npr., hemijski odvojeno sintetisati, a potom kombinovati primenom hemijskih metoda za dobijanje čitavih GAT polipeptida. Peptidi, takođe, mogu da se pribave iz raznih izvora.

U drugom aspektu pronalaska, GAT polipeptidi pronalaska se koriste za dobijanje antitela, koja imaju npr. dijagnostičku primenu u smislu npr. aktivnosti, distribucije i ekspresije GAT polipeptida u, na primer, različitim tkivima transgenske biljke.

GAT homologni polipeptidi za indukovanje antitela ne zahtevaju biološku aktivnost; polipeptid ili oligopeptid, međutim, mora biti antigen. Peptidi korišćeni za indukovanje specifičnih antitela mogu da imaju aminokiselinsku sekvencu koja se sastoji od najmanje 10 amino kiselina, ili još bolje - od najmanje 15 ili 20 amino kiselina. Kratki elementi GAT polipeptida mogu da se spoje drugim proteinom, npr. hemocijaninom (morskog) prilepka, a dobiju antitela na himerni molekul.

Stručnjaci poznaju metode za dobijanje poliklonalnih i monoklonalnih antitela, a mnoga antitela mogu da se nabave.Videti,npr. Coligan (1991) Current Protocols in Immunologv Wiley/Greene, NY; Harlow and Lane (1989) Antibodies: A Laboratorv Manual Cold Springs Harbor Press, NY; Stites i sar. (eds) Basic and Clinical Immunologv (4<th>ed.) Lange Medical Publications, Los Altos, CA, i navedene reference; Goding (1986) Mono- clonal Antibodies: Principles and Practice (2<nd>ed.) Academic Press, New York, NY; Kohler and Milstein (1975) Nature 256:495-497. Metodima pogodnim za pripremu antitela pripada i selekcija DNK datoteka rekombinantnih antitela u bakteriofazima ili sličnim vektorima.Videti,Huse i sar. (1989) Science 246:1275-1281, i Ward i sar. (1989) Nature 341:544-546. Specifična monoklonalna i poliklonalna antitela i antiserumi će se obično vezati sa Kood najmanje oko 0,1yM,radije od najmanje 0,01 p.M ili bolje, ili još bolje, najtipičnije i najpovoljnije - 0,001 uM ili bolje.

Više detalja o produkciji antitela i odgovarajućim tehnikama može da se nađe u Borrebaeck (ed.) (1995) Antibodv Engineering, 2<nd>Edition Freeman and Company, NY (Borrebaeck); McCafferty i sar. (1996) Antibodv Engineering. A Practical Approach IRL at Oxford Press, Oxford, England (McCafferty), i Paul

(1995) Antibodv Engineering Protocols Humana Press, Tovvata, NJ (Paul).

Varijacije sekvence

GAT polipeptidi iz pronalaska obuhvataju konzervativno modifikovane varijacije sekvenci ovde prikazane kao SEQ ID br: 6-10 i 263-514. Te konzervativno modifikovane varijacije podrazumevaju supstitucije, adicije ili brisanja, kojima se menja, dodaje ili oduzima jedna amino kiselina ili mali procenat amino kiselina (tipično manje od oko 5%, tipičnije manje od oko 4%, 2% ili 1%) u ma kojoj od SEQ ID br: 6-10 i 263-514.

Konzervativno modifikovana varijacija (npr. brisanje), recimo, 146 aminokiselinskog polipeptida, ovde identifikovanog kao SEQ ID br: 6, imaće dužinu od najmanje 140 amino kiselina, ili bolje od bar 141 amino kiseline, ili još bolje od bar 144 amino kiseline, a najbolje - najmanje 146 amino kiselina, što odgovara brisanju manje od 5%, 4%, 2% ili oko 1% ili manje polipeptidne sekvence.

Drugi primer konzervativno modifikovane varijacije (npr. 'konzervativno supstituisana varijacija') polipeptida ovde identifikovanog kao SEQ ID br: 6, sadržaće 'konzervativne supstitucije', u skladu sa šest supstitucionih grupa definisanih u Tabeli 2, u do oko 7 reziduuma (tj. manje od oko 5%) 146 aminokiselinskog polipeptida.

Homolozi sekvence GAT polipeptida ovog pronalaska, uključujući konzervativno supstituisane sekvence, mogu da postoje kao deo sekvenci većeg polipeptida, što se javlja npr. u GAT polipeptidu, u fuziji GAT sa signalnom sekvencom, npr. sekvencom usmerenom na hloroplast, ili po dodavanju jednog ili više domena za prečišćavanje proteina (npr. poli his segmenata, FLAG markerskih segmenata, itd.). Potonji slučaj je kad dodatni funkcionalni domeni imaju mali ili nikakav efekat na aktivnost GAT dela proteina, ili mogu da se uklone postupcima postsintezne obrade, npr. tretiranjem proteazom.

Definisanje polipeptida prema imunoreaktivnosti

Zbog toga što polipeptidi ovog pronalaska predstavljaju novu klasu enzima definisane aktivnosti, tj. acetilacije glifozata, polipeptidi takođe nose i nove strukturne karakteristike, koje se mogu prepoznati npr. u imunološkim testovima. Karakteristični za pronalazak su stvaranje antiseruma koji specifično vezuju polipeptide ovog pronalaska, kao i polipeptidi koje ti antiserumi vezuju.

Pronalazak obuhvata GAT polipeptide koji se specifično vezuju za, ili koji su specifično imunoreaktivni s antitelom ili antiserumima na imunogen, koji čini aminokiselinska sekvenca izabrana iz jedne ili više SEQ ID br: 6 do SEQ ID br: 10. Da bi se eliminisala ukrštena reaktivnost sa drugim GAT homolozima, antitelo ili antiserum se suptrahuje srodnim proteinima, npr. proteinima ili peptidima koji odgovaraju raspoloživim pristupnim brojevima GenBanke (do dana podnošenja ove prijave), primer kojih su CAA70664, Z99109 i Y09746. Kad pristupni broj odgovara nukleinskoj kiselini, dobija se polipeptid kodiran nukleinskom kiselinom i koristi se za svrhe supstrakcije antitela/antiseruma. Na SI. 3 je dat tabelarni prikaz relativnog identiteta između primernih GAT polipeptida i najsrodnije sekvence kojom raspolaže GenBank, Viti. Funkcija prirodne Yitl još nije rasvetljena, ali se pokazalo da enzim poseduje primetnu GAT aktivnost.

U jednom od tipičnih formata, imunološki test koristi poliklonalni antiserum na jedan ili više polipeptida, koji čini jedna ili više sekvenci koje odgovaraju jednoj ili više SEQ ID br: 6-10 i 263-514, ili njihovoj značajnoj podsekvenci (tj. najmanje 30% dužine celokupne sekvence). Potpun set potencijalnih polipeptidnih imunogena dobijen iz SEQ ID br: 6-10 i 263-514, u daljem tekstu se zbirno naziva 'imunogeni polipeptidi'. Dobijeni antiserumi se slobodno selektuju tako da ispoljavaju nisku ukrštenu reaktivnost sa drugim srodnim sekvencama, a bilo koja ukrštena reaktivnost se eliminiše imunoapsorpcijom sa jednom ili više srodnih sekvenci, a pre korišćenja poliklonalnog antiseruma u imunološkom testu.

Da bi se dobili antiserumi za primenu u imunološkom testu, produkuje se jedan ili više imunogenih polipeptida i prečišćava na ovde opisan način. Na primer, u bakterijskoj ćelijskoj liniji može da se produkuje rekombinantni protein. Miševi srodne genske konstitucije (u testu korišćeni zbog ponovljivosti rezultata zbog toga što su miševi genski gotovo identični) imunizuju se imunogenim proteinom/proteinima u kombinaciji sa standardnim adjuvansom, npr. Frojndovim adjuvansom, prema standardnom protokolu imunizacije miša( videtiu Harlovv i Lane

(1988) Antibodies. A Laboratorv Manual, Cold Spring Harbor Publications, New York, standardni opis dobijanja antitela, formata imunološkog testa i uslova koji se mogu koristiti za određivanje specifične imunoreaktivnosti). Alternativno se jedan ili više sintetičkih ili rekombinantnih polipeptida, dobijenih od ovde izloženih sekvenci, konjuguje na noseći protein i koristi kao imunogen.

Poliklonalni serumi se prikupljaju i titriraju na imunogeni polipeptid u okviru imunološkog testa, npr. imunološkog testa čvrste faze sa jednim ili više imunogenih proteina imobilisanih na čvrstom nosaču. Biraju se poliklonalni antiserumi sa titrom 10<6>ili većim, spajaju i suptrahuju srodnim polipeptidima, npr. iz GenBank, da bi dali suptrahovane titrirane poliklonalne antiserume.

Takvi suptrahovani titrirani poliklonalni antiserumi se ispituju na ukrštenu reaktivnost na srodne polipeptide. Poželjno je da se pri ovom određivanju koriste bar dva imunogena GATa, najbolje zajedno sa najmanje dva srodna polipeptida, radi identifikacije antitela koja imunogeni protein(i) specifično vezuju.

U ovom komparativnom testu, određuju se karakteristični uslovi vezivanja za suptrahovane titrirane poliklonalne serume koji daju najmanje 5-10 puta veći odnos signal :šum za vezivanje titriranih poliklonalnih antiseruma na imunogene GAT polipeptide u odnosu na vezivanje za srodne polipeptide. Naime, striktnost reakcije vezivanja se podešava dodavanjem ne-specifičnih kompetitora, npr. albumina ili nemasnog sušenog mleka, ili podešavanjem uslova soli, temperature, i si. Ovako određeni uslovi vezivanja koriste se i u naknadnim testovima za utvrđivanje da li je test polipeptid specifično vezan sastavljenim suptrahovanim poliklonalnim antiserumima. Konkretno, test polipeptidi koji, pod karakterističnim uslovima vezivanja, daju najmanje 2-5 puta veći odnos signal.šum od kontrolnih polipeptida, i najmanje oko Vi vrednosti odnosa signal:šum u odnosu na imunogeni polipeptid(e), ispoljavaju znatan stepen strukturne sličnosti sa imunogenim polipeptidom u odnosu na poznati GAT, te je stoga polipeptid ovog pronalaska.

U drugom primeru, za detektovanje test polipeptida koristi se format imunoloških testova kompetitivnog vezivanja. Kao što je već rečeno, iz smeše akumuliranih antiseruma se, imunoapsorpcijom sa kontrolnim GAT polipeptidima, odstranjuju antitela koja ukršteno reaguju. Imunogeni polipeptid(i) se imobilišu na čvrstom nosaču, koji se potom izlaže suptrahovanim akumuliranim serumima. U analizu se dodaju test proteini da bi se nadmetali za vezivanje na akumulirane suptrahovane antiserume. Sposobnost test proteina da se izbore sa imobilisanim proteinima za vezivanje na suptrahovane akumulirane antiserume, upoređuje se sa sposobnošću dodatih imunogenih polipeptida da se nadmeću za vezivanje (imunogeni polipeptidi se uspešno nadmeću sa imobilisanim imunogenim polipeptidima za vezivanje na smešu antiseruma). Zatim se, standardnim proračunavanjem, izračunava procenat ukrštene reaktivnosti test proteina.

U paralelnom testu, sposobnost kontrolnih proteina da se nadmeću za vezivanje na akumulirane suptrahovane antiserume može da se određuje u odnosu na sposobnost imunogenih polipeptida da se izbore za vezivanje na antiserume. I ovde se, primenom standardnih proračuna, izračunava procenat ukrštene reaktivnosti kontrolnih polipeptida. U slučaju da je ukrštena reaktivnost test polipeptida bar 5-10 puta viša, kaže se da se test polipeptidi specifično vezuju na akumulirane suptrahovanih antiseruma.

Imunoapsorbovani i akumulirani antiserumi mogu da se koriste u opisanom imunološkom testu kompetitivnog vezivanja za poređenje nekog test polipeptida sa imunogenim polipeptidom/polipeptidima. U cilju sprovođenja ovog upoređivanja, testira se širok dijapazon koncentracija svakog od dva polipeptida, količina svakog polipeptida potrebna za 50% inhibiciju vezivanja suptrahovanih antiseruma na imobilisani protein određuje se standardnim metodima. Ako je potrebna količina test polipeptida manja od dvostruke potrebne količine imunogenog polipeptida, smatra se da se test polipeptid specifično vezuje za antitelo na imunogeni protein, pod uslovom da je količina najmanje 5-10 puta veća od one za kontrolni polipeptid.

Za konačno određivanje specificiteta, akumulacija antiseruma može da se imunoadsorbuje simunogenimpolipeptidom/polipeptidima (pre nego s kontrolnim polipeptidima), do nivoa registrovanja malog vezivanja Pobijene suptrahovane akumulacije antiseruma imunogenog polipeptida na imunogeni polipeptid/de (korišćen(e) u imunoadsorpciji), ili potpunog odsustva vezivanja. Zatim se testira reaktivnost ovih potpuno imunoadsorbovanih antiseruma sa test polipeptidom. Ako se uočava slaba reaktivnost ili odsustvo reaktivnosti (tj. ne više od dvostruke vrednosti odnosa signal.šum za vezivanje potpuno imunoadsorbovanih antiseruma na imunogeni polipeptid), smatra se da je test polipeptid specifično vezan antiserumima, pobuđenim prisustvom imunogenog proteina.

GLIFOZAT N- ACETILTRANSFERAZNI POLINUKLEOTIDI

U jednom aspektu, pronalazak donosi novu porodicu izolovanih ili rekombinantnih polinukleotida, u daljem tekstu 'glifozat N-transferazni polinukleotidi' ili 'GAT polinukleotidi'. Sekvence GAT polinukleotida karakteriše sposobnost da kodiraju GAT polipeptid. Pronalazak obuhvata sve nukleotidne sekvence koje kodiraju bilo koji od opisanih novih GAT polipeptida. U nekim aspektima pronalaska, pogodniji je GAT polinukleotid koji kodira GAT polipeptid sa GAT aktivnošću.

U jednom aspektu, GAT polinukleotid sadrži rekombinantne ili izolovane oblike prirodnih nukleinskih kiselina izolovanih iz nekog organizma, npr. bakterijskog soja. Primerni GAT polinukleotidi, npr. SEQ ID br: 1 do SEQ ID br: 5 otkriveni su ekspresionim kloniranjem sekvenci sojevaBacillus,koji ispoljavaju GAT aktivnost. Ukratko, pregledom na urođenu sposobnost za N-acetilaciju glifozata obuhvaćeno je oko 500 sojevaBacillusiPseudomonas.Sojevi su prenoćili u LB, sakupljeni centrifugiranjem, permeabilisani u razblaženom toluenu, zatim isprani i ponovo suspendovani u reakcionoj smeši pufera, 5 mM glifozata i 200 u.M acetiICoA. Inkubacija ćelija u reakcionoj smeši trajala je između 1 i 48 sati, a u tom vremenu je reakciona smeša dopunjena istom zapreminom metanola. Ćelije su, potom, peletirane centrifugiranjem, a supernatant je filtriran pre analize jonskom mas-spektrometrijom. Proizvod reakcije je pozitivno identifikovan kao N-acetilglifozat poređenjem mas-spektrometrijskog profila reakcione smeše sa N-acetilglifozatnim standardom (SI.2). Detekcija produkta je zavisila od uključivanja oba supstrata (acetiCoA i glifozata), a prekinuta toplotnim denaturisanjem bakterijskih ćelija.

Pojedinačni GAT polinukleotidi su, zatim, klonirani funkcionalnim skriningom iz identifikovanih sojeva. Pripremljena je genomska DNK i delimično razložena pomoću Sau3A1 enzima. Fragmenti od oko 4Kb su klonirani u vektor ekspresijeE. coli itransformisani u elektrokompetentnuE. coli.Pojedinačni klonovi sa GAT aktivnošću identifikovani su mas-spektrometrijom, posle opisane reakcije, s tom razlikom što je toluensko ispiranje zamenjeno permeabilizacijom pomoću PMBS. Sekvencirani su genomski fragmenti i identifikovan predpostavljeni otvoreni okvir čitanja koji kodira GAT polipeptid. Identitet GAT gena je potvrđen eksprimiranjem otvorenog okvira čitanja uE. colii detektovanjem visokih nivoa N-acetilglifozata u reakcionim smešama.

U drugom aspektu pronalaska, GAT polinukleotidi su dobijeni diversifikacijom, npr. rekombinovanjem i/ili mutiranjem jednog ili više prirodnih, izolovanih ili rekombinantnih GAT polinukleotida. Kao što je detaljnije objašnjeno u ovom tekstu, često se mogu proizvesti izmenjeni GAT polinukleotidi koji kodiraju GAT polipeptide, sa funkcionalnim atributima, npr. jačom katalitičkom funkcijom, povećanom stabilnošću, višim nivoima ekspresije, značajno boljim od atributa GAT polinukleotida koji je korišćen kao supstrat ili roditeljski polinukleotid u procesu diversifikacije.

Polinukleotidi iz pronalaska imaju spektar različitih primena, npr. za rekombinantno produkovanje (tj. ekspresiju) GAT polipeptida iz pronalaska; kao transgeni (npr. za prenošenje otpornosti na herbicide kod transgenskih biljaka; kao izborni markeri za transformaciju i održavanje plazmida; kao imunogeni; kao dijagnostičke sonde za utvrđivanje prisustva komplementarnih ili delimično komplementarnih nukleinskih kiselina (i detektovanje prirodnih nukleinskih kiselina koje kodiraju GAT); kao supstrati za dalju diversifikaciju, npr. reakcije rekombinovanja ili mutacije u cilju stvaranja novih i/ili poboljšanih GAT homologa, i si.

Treba obratiti pažnju na činjenicu da određene, specifične, važne i verovatne primene GAT polinukleida na zahtevaju da polinukleotid kodira polipeptid sa znatnom GAT aktivnošću. Na primer, GAT polinukleotidi koji ne kodiraju aktivne enzime, mogu da budu dragoceni izvori roditeljskih polinukleotida, za primenu u procedurama difersifikacije u cilju dobijanja varijanti GAT polinukleotida, ili ne-GAT polinukleotida, sa željenim funkcionalnim svojstvima (npr. većom vrednošću k^tili kcat/Kjvi, malim Km, visokim stepenom termostabilnosti i otpornosti na druge faktore okruženja, velikom brzinom transkripcije ili translacije, otpornošću na proteolitičko cepanje, smanjivanje antigenosti, itd.). Nukleotidne sekvence, na primer, koje kodiraju varijante proteaze sa malom primetnom aktivnošću ili bez nje, korišćene su kao roditeljski polinukleotidi u eksperimentima mešanja DNK radi stvaranja potomstva koje kodira visoko aktivne proteaze (Ness i sar. (1999) Nature Biotechnology 17:893-96).

Polinukleotidne sekvence, dobijene metodima stvaranja diverziteta ili rekursivnog rekombinovanja sekvenci ('RSR) (npr. mešanje DNK) odlike su ovog pronalaska. Metodi mutacije i rekombinacije, koji koriste opisane nukleinske kiseline, takođe, spadaju u elemente pronalaska. Na primer, jedan metod pronalaska podrazumeva rekursivno rekombinovanje jedne ili više nukleotidnih sekvenci, kako je ovde opisano, sa jednim ili više dodatih nukleotida. Faze rekombinovanja se mogu, po izboru, sprovoditiin vivo, ex vi- vo, in silicoiliin vitro.Pomenuto stvaranje diverziteta ili rekursivno rekombinovanje sekvenci produkuje najmanje jednu datoteku rekombinantnih modifikovanih GAT polinukleotida. Pronalaskom su obuhvaćeni polipeptidi kodirani članovima ove datoteke.

U pronalasku su, takođe, proanalizirane primene polinukleotida, koji se u izlaganju nazivaju oligonukleotidi, a koji obično imaj bar 12 baza, pogodnije bar 15, a još pogodnije bar 20, 30 ili 50 i više baza, koje hibridizuju, pod strogo ili ekstremno strogo đefinisanim uslovima, u GAT polinukleotidne sekvence. Polinukleotidi mogu da se koriste kao sonde, prajmeri, sens i antisens agensi i si., prema izloženim metodima.

Prema iznetom pronalasku, GAT polinukleotidi, kao i nukleotidne sekvence koje kodiraju GAT polipeptide, fragmenti GAT polipeptida, srodni fuzioni proteini, ili funkcionalni ekvivalenti pomenutih, koriste se u molekulima rekombinantne DNK koji usmeravaju ekspresiju GAT polipeptida u pogodne ćelije domaćine, npr bakterijske ili biljne ćelije. Zbog urođene degenerisanosti genetskog koda, ostale sekvence nukleinske kiseline, koje kodiraju uglavnom iste ili funkcionalno ekvivalentne aminokiselinske sekvence, mogu da se koriste za kloniranje i eksprimiranje GAT polinukleotida.

Pronalazak prikazuje GAT polinukleotide koji kodiraju produkte transkripcije i/ili translacije, koji se potom povezuju i, na kraju, produkuju funkcionalne GAT polipeptide. Povezivanje može da se postigne in vivo ili in vitro, a može da obuhvati cis ili trans povezivanje. Supstrat za povezivanje mogu da budu polinukleotidi (npr. transkripti DNK) ili polipeptidi. Primer cis povezivanja polinukleotida je kad se odstrani intron ubačen u sekvencu kodiranja, a dve bočne eksonske regije se povežu i daju sekvencu koja kodira GAT polipeptid. Trans povezivanje ilustruje kodiranje GAT polipeptida razdvajanjem kodne sekvence na dva ili više fragmenata, koji se mogu odvojeno transkribovati, a zatim povezati i obrazovati potpunu sekvencu za kodiranje GATa. Primena sekvence-pojačivača povezivanja (kojom se može dopuniti sklop iz pronalaska), može da olakša povezivanje, nezavisno od toga da li je ono cis ili trans tipa. Opis cis i trans polipeptida je izložen u ovom tekstu, a detaljniji opis cis i trans povezivanja može da se nađe u patentnim prijavama US br. 09/517,933 i 09/710,686.

Neki od GAT polinukleotida, dakle, ne kodiraju direktno celovit GAT polipeptid, već pre kodiraju fragment ili fragmente GAT polipeptida. Ovi GAT polinukleidi mogu da se koriste za eksprimiranje funkcionalnog GAT polipeptida putem mehanizma, koji podrazumeva povezivanje, a gde povezivanje može da nastane bilo na nivou polinukleotida (npr. intron/ekson), i/ili polipeptida (npr. intein/ekstein). Ovo može da bude korisno za, npr. kontrolu ekspresije GAT aktivnosti, pošto će funkcionalni GAT polipeptid biti eksprimiran tek kad su eksprimirani svi potrebni fragmenti, a u okruženju koje dopušta da procesi povezivanja daju funkcionalan proizvod. U drugom primeru, uvođenje jedne ili više sekvenci insertovanja u GAT polinukleotid može da olakša rekombinovanje sa polinukleotidom niske homologije; primena introna ili inteina u ulozi sekvence umetanja olakšava uklanjanje posredničke sekvence, čime se uspostavlja funkcija kodirane varijante.

Modifikovanje kodne sekvence u cilju pojačavanja njenog eksprimiranja u određenog domaćina može, kako je stručnjacima poznato, da bude od velike koristi. Genetski kod raspolaže sa komotna 64 moguća kodona, a većina organizama uglavnom koristi podset tih kodona. Kodoni koje jedna vrsta najčešće koristi nazivaju se optimalnim kodonima, a oni koji se ne koriste prečesto klasifikuju se kao retko ili slabo korišćeni kodoni( v.u, npr., Zhang SP i sar (1991)Gene105:61-72). Kodoni se mogu tako supstituisati da predstavljaju odraz češće primene kodona domaćina, što se ponekad naziva 'optimizacijom kodona' ili 'kontrolom kodonskog uticaja vrste'.

Mogu da se pripreme i optimizovane kodne sekvence sa kodonima koje određeni prokariotski ili eukariotski domaćin smatra pogodnijim( takođeu Murrav, E. i sar. (1989)Nuc Acids Res17:477-508). u cilju, npr., ubrzavanja translacije ili dobijanja transkripata rekombinantne RNK sa željenim svojstvima, npr. dužim poluživotom u odnosu na transkripte dobijene iz ne-optimizovane sekvence. Kodoni za zaustavljanje translacije mogu, takođe, da se modifikuju tako da reflektuju domaćinov izbor. Na primer, najpogodniji zaustavni kodoni za S.crevisiaei sisare su UAA odnosno UGA. Najpogodniji zaustavni kodon za monokotiledonske biljke je UGA, dok insektima i E. coli više odgovara da kao zaustavni kodon koriste UAA (Dalphin ME i sar. (1996) Nuc Acids Res 24:216-218). Metodologija za optimizaciju nukleotidne sekvence za ekspresiju u biljke može da se nađe u US patentu br. 6,015,891, i tamo navedenim referencama.

Jedan oblik pronalaska obuhvata GAT polinukleotid sa optimalnim kodonima za ekspresiju u odgovarajućeg domaćina, tj. transgensku biljku domaćina. Ovo je posebno povoljno prilikom uvođenja GAT polinukleotida barkerijskog porekla u transgensku biljku radi, npr., prenošenja otpornosti na glifozat na biljku.

U cilju menjanja GAT polinukleotida iz raznoraznih razloga, npr. - radi uvođenja promena koje modifikuju kloniranje, obradu i/ili ekspresiju genskog proizvoda, i ne samo njih, polinukleotidne sekvence iz pronalaska mogu da se prerađuju. Stručnoj javnosti poznatim metodima, npr. direkcionom mutagenezom, mogu se uvesti, npr. promene radi umetanja novih restriktivnih mesta, menjanja načina glikozilacije, promene izbora kodona, uvođenja mesta povezivanja, itd. Polinukleotidi ovog pronalaska obuhvataju sekvence koje kodiraju nove GAT polipeptide, sekvence komplementarne kodnim sekvencama, nove fragmente kodne sekvence i njihove komplemente. Polinukleotidi mogu da budu u obliku RNK ili DNK, a obuhvataju mRNK, cRNK, sintetske RNK i DNK, genomsku DNK i cDNK. Polinukleotidi mogu da imaju jedan ili dva niza, a ako su sa jednim nizom, taj niz može biti kodirajući i nekodirajući (anti sens, komplementarni). Osim toga, polinukleotidi mogu, ali ne moraju da sadrže sekvencu koja kodira GAT polipeptid (i) izolovana, (ii) u kombinaciji sa drugom kodirajućom sekvencom radi kodiranja, npr. fuzionog proteina, pre-proteina, prepro-proteina i si., (iii) u kombinaciji sa nekodirajućim sekvencama - npr. intronima ili inteinima - kontroliše elemente kao što je promoter, pojačivač, prekidni elemenat, ili 5" i/ili 3' ne-translatirane regije sposobne za ekspresiju kodirajuće sekvence u pogodnog domaćina, i/ili (iv) u blizini vektora ili domaćina u kojem je GAT polinukleotid heterologan gen. Sekvence se, osim toga, mogu kombinovati sa tipičnim kompozicionim formulacijama nukleinskih kiselina, uključujući i njihovo prisustvo u nosačima, puferima, adjuvansima, ekscipijensima i slično.

Polinukleotidi i oligonukleotidi pronalaska mogu da se dobiju standardnim metodima čvrste faze, prema poznatim sintetičkim metodima. Obično se fragmenti do oko 100 baza pojedinačno sintetišu, zatim sastavljaju (npr. metodima enzimske ili hemijske ligacije ili polimerazom posredovanim metodima) da obrazuju željenu kontinuiranu sekvencu. Na primer, polinukleotidi i oligonukleotidi pronalaska mogu da se dobiju hemijskom sintezom, korišćenjem klasičnog forsforamiditnog metoda koji su opisali Beaucage i sar. (1981)Tetrahedron Letters22:1859-69, ili metoda iz Matthes i sar. (1984)EMBO J.3:801-05, koji se obično primenjuju u kompjuterizovanim sintetičkim metodima. Prema fosforamiditnom metodu, oligonukleotidi se sintetišu u npr. automatskom uređaju za sintezu DNK, prečišćavaju, očvršćavaju, vezuju i kloniraju u odgovarajuće vektore.

Osim toga, svaka od nukleinskih kiselina može da se nabavi iz različitih komercijalnih izvora, npr. The Midland Certified Reagent Companv ( mcrc( S) oliaos. com), The Great American Gene Companv ( http:// vv\ yw, aenco. corTi), ExpressGen Inc. ( www. exoressaen. com), Operon Technologies Inc. (Alameda, CA) i mnogih drugih. Takođe se i peptidi i antitela mogu nabaviti od mnogih dobavljača, npr. PeptidoGenic ( pkim■ ©ccr. et com), HTI Bio-products, Inc.

( hup:// vvvvvv. hiibio com), BMA Biomedicals Ltd (Vel. Britanija), Bio Svnthesis, Inc., i drugih.

Polinukleotidi se, takođe, mogu sintetisati poznatim postupcima, opisanim u literaturi. Videti u Carruthers i sar.Cold Spring Harbor Symp Quant Biol 47:411-418

(1982) i Adams i sar.,J Am Chem Soc105:661 (1983). Fragmenti DNK dvostrukog niza mogu da se dobiju sintetisanjem komplementarnog niza i stapanjem oba niza pod odgovarajućim uslovima, ili dodavanjem komplementarnog niza pomoću DNK polimeraze sa pogodnom prajmerskom sekvencom.

Opšti tekstovi koji opisuju molekularno-biološke postupke od koristi za predmet ovog pronalaska, uključujući mutagenezu, obuhvataju Berger i Kimmel, Guide to Mole- cular Cloning Technigues, Methods in Enzvmologv, sv. 152 Academic Press, Inc., San Diego, CA ('Berger'); Sambrook i sar., Molecular Cloning

- A Laboratorv Manual (2<nd>Ed.), sv. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratorv, Cold Spring Harbor, New York, 1989 ('Sambrook'), i Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel i sar., eds., Current Protocols, a joint venture between Greene Publishing Associates and John Wiley & Sons, Inc., (dopunjeno 2000.)

('Ausubel'). Primeri dovoljni za usmeravanje stručnjaka krozin vitrometode, uključujući reakciju lanca polimeraze (PCR), reakciju lanca ligaze (LCR), pojačavanje Qj3-replikaze i druge metode posredovane RNK polimerazom (npr. NASBA), koji se mogu naći u Berger, Sambrook i Ausubel, kao i u Mullis i sar.

(1987) US Patent br. 4,683,202; PCR Protocols A Guide to Methods and Applications (Innis i sar., eds.) Academic Press Inc. San Diego, CA (1990); Arnheim & Levinson (October 1, 1990) Chemical and Engineering News 36-47; The Journal of NIH Research (1991) 3:81-94; Kwoh i sar. (1989) Proc Natl Acad Sci USA 86:1173; Guatelli i sar. (1990) Proc Natl Acad Sci USA 87:1874; Lomell i sar.

(1989) J Clin Chem 35:1826; Landegren i sar. (1988) Science 241:1077-1080; Van Brunt (1990) Biotechnologv 8:291-294; Wu i VVallace (1989) Gene 4:560; Barringer i sar. (1990) Gene 89:117, i Sooknanan i Malek (1995) Biotechnologv 13:563-564. Unapređeni metodi zain vitrokloniranje amplifikovanih nukleinskih kiselina opisani su u VVallace i sar., US Patent br. 5,426,039. Poboljšani metodi za amplifikovanje velikih nukleinskih kiselina pomoću PCR ukratko su opisani u Cheng i sar. (1994) Nature 369:684-685 i pratećim referencama, a u njima su dobijani PCR amplikoni do 40 kb. Stručnjaci će pravilno proceniti činjenicu da gotovo svaka od RNK može da se konvertuje u DNK dvostrukog niza, pogodnu za restrikcionu razgradnju, PCR ekspanziju i sekvenciranje uz pomoć reverzne transkriptaze i polimeraze. Videti u Ausubel, Sambrook i Berger, svisupra.

Varijacije sekvence

Poznavaoci struke će uočiti da, zbog degeneracije genetskog koda, može da se produkuje mnoštvo nukleotidnih sekvenci koje kodiraju GAT polipeptide iz ovog pronalaska, i da su neki od njih u znatnoj meri identični sekvencama nukleinske kiseline koje se u ovom izlaganju jasno opisuju.

Analiza tabele kodona (Tabela 1) pokazuje, na primer, da svi sledeći kodoni - AGA, AGG, CGA, CGC, CGG i CGU kodiraju amino kiselinu arginin. Na svakoj poziciji u nukleinskim kiselinama pronalaska, na kojoj je kodonom specifikovan arginin, kodon može da se zameni ma kojim od gore opisanih odgovarajućih kodona, ne menjajući kodirani polipeptid. Podrazumeva se da U u RNK sekvenci odgovara T u sekvenci DNK.

Na primer, ako se koristi sekvenca nukleinskih kiselina koja odgovara nukleotidima 1-15 SEQ ID br: 1, odnosno ATG ATT GAA GTC AAA, nema varijacija ove sekvence uključuje AGT ATC GAG GTG AAG, koje su obe sekvence koje kodiraju aminokiselinsku sekvencu MIEVK, što odgovara aminokiselinama 1-5 SEQ ID br: 6.

Ove 'neme varijacije' su jedna od vrsta kasnije diskutovanih 'konzervativno modifikovanih varijacija'. Stručnjaku će biti jasno da svaki kodon u nukleinskoj kiselini (s izuzetkom AUG, obično jedinim kodonom za metionin), može da se modifikuje standardnim tehnikama da kodira funkcionalno identičan polipeptid. Shodno tome, svaka od nemih varijacija nukleinske kiseline koja kodira polipeptid podrazumeva se u svakoj od opisanih sekvenci. Pronalazak daje sve i svaku moguću varijaciju sekvence nukleinske kiseline koja kodira polipeptid ovog pronalaska, a koja se može napraviti selekcijom kombinacija koje se baziraju na mogućim izborima kodona. Ovakve kombinacije se prave prema standardnim tročlanim genetskim kodovima (tripletima, npr. kao u Tabeli 1), što je primenjeno na sekvence nukleinske kiseline koja kodira GAT homologni peptid pronalaska. Sve takve varijacije svake od izloženih nukleinskih kiselina specifično su date i opisane u pogledu sekvence kombinovane sa genetskim kodom. Kako je već pomenuto, svaka od varijanti se može proizvesti.

Grupa od dva ili više kodona koji, translatirani u istom kontekstu, kodiraju istu aminokiselinu, nazivaju se ovde 'sinonimnim kodonima'. Kao što je već rečeno, u nekim aspektima pronalaska se GAT polinukleotid obrađuje u cilju optimizovane primene kodona u željenom organizmu-domaćinu, npr. biljci. Pojmovi 'optimizovan' ili 'optimalan' nisu ograničeni samo na najbolju moguću kombinaciju kodona, već prosto ukazuju da kodirajuću sekvencu, kao celinu, karakteriše poboljšano korišćenje kodona u odnosu na pre-kursorski polinukleotid iz kojeg je dobijena.Tako u jednom od aspekata pronalazak daje metode za produkovanje varijante GAT polinukleotida, zamenom najmanje jednog roditeljskog kodona u nukleotidnoj sekvenci sinonimnim kodonom, koji je najpogodniji za primenu u željenom organizmu-domaćinu, npr. biljci, srodnoj roditeljskom kodonu.

Pojam 'konzervativno modifikovane varijacije' ili, prosto, 'konzervativne varijacije' konkretne sekvence nukleinske kiseline, odnosi se na one nukleinske kiseline koje kodiraju identične ili u osnovi identične sekvence amino kiselina, ili, u slučaju da nukleinska kiselina ne kodira aminokiselinsku sekvencu, na u osnovi identične sekvence. Stručnjak će shvatiti da pojedine supstitucije, brisanja ili adicije, koje menjaju, dodaju ili brišu jednu amino kiselinu ili mali procenat aminokiselina (obično manje od 5%, uobičajenije manje od 4%, 2% ili 1% i manje) u kodiranoj sekvenci predstavljaju 'konzervativno modifikovane varijacije', gde promene imaju za posledicu brisanje amino kiseline, adiciju amino kiseline, ili supstituciju amino kiseline hemijski sličnom amino kiselinom.

Tabele funkcionalne supstitucije, koje navode funkcionalno slične amino kiseline, dobro su poznate ljudima od struke. Tabela 2 definiše šest grupa, koje sadrže amino kiseline koje su uzajamni 'konzervativni supstituti'.

Tako 'konzervativno supstituisane varijacije' nabrojanih polipeptidnih sekvenci iz ovog pronalaska obuhvataju supstitucije malog procenta amino kiselina polipeptidne sekvence, obično manje od 5%, uobičajenije manje od 2%, a često manje od 1%, konzervativno selektovanim amino kiselinama iste grupe konzervativne supstitucije.

Na primer, konzervativno supstituisana varijacija polipeptida, identifikovanog kao SEQ ID br: 6, sadržaće 'konzervativne supstitucije', prema šest gore definisanih grupa, u najviše 7 reziduuma (tj. 5% amino kiselina) u 146 aminokiselinskom polipeptidu.

U sledećem primeru, ako su četiri supstitucije lokalizovane u regiji koja odgovara amino kiselinama 21 do 30 SEQ ID br: 6, primeri konzervativno supstituisanih varijacija ove regije

RPN QPL EAC M, obuhvataju:

KPQ QPV ESC M i

KPN NPL DAC V i slično, u skladu sa konzervativnim supstitucijama navedenim u Tabeli 2 (u gornjem primeru su konzervativne supstitucije podvučene). Navedeni spisak proteinskih sekvenci, zajedno sa gornjom tabelom supstitucije, daje tačan spisak svih konzervativno supstituisanih proteina.

Konačno, dodavanje sekvenci koje ne menjaju kodiranu aktivnost molekula nukleinske kiseline, npr. dodavanje ne-funkcionalne ili ne-kodirajuće sekvence, predstavlja konzervativnu varijaciju osnovne nukleinske kiseline.

Stručnjak će zapaziti da mnoge konzervativne varijacije prezentovanih sklopova nukleinskih kiselina daju funkcionalno identične sklopove. Na primer, kako je već pomenuto, zahvaljujući degeneraciji genetskog koda, 'neme supstitucije' (tj. supstitucije u sekvenci nukleinske kiseline koje ne dovode do promena u kodiranom polipeptidu) predstavljaju karakteristikusvakesekvence koja kodira amino kiselinu, koje se podrazumevaju. 'Konzervativne aminokiselinske supstitucije' u jednoj ili nekoliko amino kiselina aminokiselinske sekvence supstituišu se različitim amino kiselinama sa veoma sličnim svojstvima, i lako se prepoznaju, budući veoma slične iznetom sklopu. Takve konzervativne varijacije svake od iznetih sekvenci karakterišu ovaj pronalazak.

Ne-konzervativne modifikacije konkretne nukleinske kiseline su modifikacije koje supstituišu bilo koju amino kiselinu koja nije karakterisana kao konzervativna supstitucija. Na primer, svaka supstitucija koja izlazi izvan granica pomenutih šest grupa iz Tabele 2. Ove modifikacije uključuju supstitucijje baznih ili kiselih amino kiselina neutralnim amino kiselinama (npr. Asp, Glu, Asn ili Gln sa Val, lle, Leu ili Met), aromatičnih amino kiselina baznim ili kiselim amino kiselinama (npr. Phe, Tyr ili Trp sa Asp, Asn, Glu ili Gln), ili drugu supstituciju koja ne zamenjuje amino kiseline sličnim amino kiselinama.

Hibridizacija nukleinske kiseline

Nukleinske kiseline 'hibridizuju' kad se kombinuju, obično u rastvoru. Nukleinske kiseline hibridizuju pod dejstvom različitih, dobro karakterisanih fizičkih i hemijskih sila, npr. vezivanje vodonikom, isključivanje rastvarača, slaganje baza i si. Opširan i detaljan vodič za hibridizaciju nukleinskih kiselina daje Tijssen (1993)

Laboratory Techniques in Biochemistn/and Molecular Bioiogy - Hybridization with

Nucleic Acid Probes,deo I, glava 2, 'Overvievv of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays', (Elsevier, New York), kao i Ausubel( supra).Hames i Higgins (1995)Gene Probes 1,IRL Press at Oxford Universitv Press, Oxford, Engleska (Hames i Higgins 1) i Hames i Higgins (1995)Gene Probes2, IRL Press at Oxford Universitv Press, Oxford, Engleska (Hames i Higgins 2) daju detaljne opise sinteze, markiranja, detektovanja i kvantifikacije DNK i RNK, uključujući oligonukleide.

'Strogi uslovi hibridizacionog pranja' u kontekstu eksperimenata hibridizacije nukleinskih kiselina, npr. južne i severne hibridizacije, zavise od sekvence i razlikuju se pod različitim parametrima okruženja. Detaljan vodič za hibridizaciju nukleinskih kiselina daju Tijssen (1993)( supra)i Hames i Higgins 1 i Hames i Higgins 2( supra).

U smislu ovog pronalaska, u principu 'veoma striktni' uslovi hibridizacije i pranja izabrani kao 5°C ili manje od termičke tačke topljenja (Tm) specifične sekvence pri definisanoj jonskoj snazi i pH (kako će se pokazati, veoma striktni uslovi se mogu pominjati i komparativno). Tmje temperatura (u uslovima definisane jonske snage i vrednosti pH) na kojoj 50% test sekvence hibridizuje u savršeno ekvivalentnu sondu. Odabrani veoma striktni uslovi podrazumevaju, u tom slučaju, jednakost sa Tmza konkretnu sondu.

Tmdupleksa nukleinskih kiselina označava temperaturu na kojoj se dupleks 50% denaturiše, pod datim uslovima, i tako predstavlja direktnu meru stabilnosti hibrida nukleinske kiseline. Tm, dakle, odgovara temperaturi koja odgovara sredini procesa tranzicije iz heliksa u slučajnu spiralu; zavisi od dužine, sastava nukleotida i jonske snage za duge nizove nukleotida.

Posle hibridizacije se ne-hibridizovan materijal nukleinske kiseline može odstraniti nizom ispiranja, čija striktnost može da se podesi u zavisnosti od željenih rezultata. Blaži uslovi ispiranja (npr., veći salinitet i niža temperatura) povećavaju osetljivost, ali mogu da produkuju ne-specifične hibridizacione signale i izrazite nepoželjne, interferentne signale. Oštriji uslovi (npr. manja koncentracija soli i viša temperatura, bliža temperaturi hibridizacije) stišavaju neželjene interferentne signale, obično zadržavajući samo specifični signal.Videtiu Raplev, R. i VValker, J.M. eds.,Molecular Biomethods Handbook(Humana Press, Inc. 1998) (u daljem tekstu 'Raplev i VValker'), u celosti referencom ugrađen u ovo izlaganje.

Tmdupleksa RNK-DNK može da se proceni pomoću sledeće jednačine 1: Tm(°C)=81,5°C + 16,6 (logi0M) + 0,41 (%G + C) - 0,72 (%f) - 500/n,

gde je M molarnost monovalentnih katjona (obično Na+), (%G + C) označava procenat guanozinskih (G) i citozinskih (C) nukleotida, (%f) je procenat obrazovanih, a n broj nukleotidnih baza (tj. dužina) hibrida.VidetiRaplev i VValker

[ supra).

Procena Tmdupleksa RNK-DNK može da se izvrši uz pomoć jednačine 2 koja glasi: Tm(°C)=79,8°C + 18,5 (log10M) + 0,58 (%G + C) - 11,8 (%G + C)<2>- 0,56 (%f) — 820/n, gde je M molarnost monovalentnih katjona (obično Na+), (%G + C) je procenat guanozinskih (G) i citozinskih (C) nukleotida, (%f) je procenat formamida, a n broj nukleotidnih baza (tj. dužina) hibrida.Id.

Jednačine 1 i 2 su tipično tačne samo kad su u pitanju hibridni dupleksi duži od oko 100-200 nukleotida.Id.

Tmsekvenci nukleinskih kiselina, kraćih od 50 nukleotida, može da se izračuna na sledeći način:

Tm (°C) = 4(G + C) + 2(A + T),

gde A (adenin), C, T (timin) i G predstavljaju brojeve odgovarajućih nukleotida.

Primer striktnih uslova hibridizacije za hibridizaciju komplementarnih nukleinskih kiselina sa više od 100 komplementarnih reziduuma na filteru, u okviru južnog ili severnog blota, predstavlja hibridizacija preko noći u 50%-nom formalinu sa 1 mg heparina na 42°C. Primer striktnih uslova ispiranja je 0,2x SSC na 65°C tokom 15 minuta(wćfe//opisSSC pufera u Sambrook,supra).Često pranju striktnih uslova prethodi pranje pod blažim uslovima, u cilju odstranjivanja interferentnog signala sonde. Primer ispiranja u blažim uslovima je 2x SSC na 40°C tokom 15 minuta.

Najčešće, odnos signal:šum 2,5x-5x ili veći od registrovanog u vezi nesrodne sonde u određenom hibridizacionom testu ukazuje na detekciju specifične hibridizacije. Detekcija najmanje striktne hibridizacije između dveju sekvenci, u smislu ovog pronalaska, ukazuje na relativno veliku strukturnu sličnost ili homologiju u odnosu na, npr., nukleinske kiseline ovog pronalaska iz ovde navedenih spiskova sekvenci.

Kako se može uočiti, pod 'veoma striktnim' uslovima podrazumeva se izbor oko 5°C ili niže temperature od termičke tačke topljenja (Tm) za specifičnu sekvencu, pri definisanoj jonskoj snazi i vrednosti pH. Ciljne sekvence, koje su srodne ili identične nukleotidnoj sekvenci od interesa (npr. 'sondi), mogu da se identifikuju pod visoko striktnim uslovima. Manje striktni uslovi su pogodni za sekvence sa nižim nivoom komplementarnosti.Videti, npr.,Raplev i VValker,supra.

Komparativna hibridizacija može da se koristi za identifikovanje nukleinskih kiselina ovog pronalaska, a takav komparativni metod hibridizacije je najpogodniji metod za razlikovanje nukleinskih kiselina ovog pronalaska. Detektovanje visoko striktne hibridizacije između nukleotidnih sekvenci, u smislu ovog pronalaska, ukazuje na prilično veliku strukturnu sličnost/homologiju u odnosu na, npr. nukleinske kiseline iz priloženih lista sekvenci. Visoko striktna hibridizacija između dveju nukleotidnih sekvenci, pokazuje stepen sličnosti ili homologije strukture, sastava nukleotidne baze, organizacije i reda intenziteta, koji je veći od stepena koji se detektuje striktnim hibridizacionim uslovima. Konkretno, detektovanje visoko striktne hibridizacije, u smislu izloženog pronalaska, ukazuje na izraženu strukturnu sličnost ili strukturnu homologiju (npr. nukleotidne strukture, sastava baze, organizacije i razmera) u odnosu na, npr. nukleinske kiseline iz priloženih lista sekvenci. Poželjno je, na primer, da se identifikuju test nukleinske kiseline koje hibridizuju u primere nukleinskih kiselina iz ovog izlaganja, pod striktnim uslovima.

Mera striktne hibridizacije je, otuda, sposobnost hibridizovanja u jednu od nukleinskih kiselina sa priložene liste (npr. sekvence nukleinske kiseline SEQ ID br.

1 do SEQ ID br: 5 i SEQ ID br: 11 do SEQ ID br: 262 i njihove komplementarne polinukleotidne sekvence), pod visoko striktnim uslovima (ili vrlo striktnim uslovima, ili ultra-visoko striktnim uslovima hibridizacije, ili pak uslovima hibridizacije ultra-ultra visoke striktnosti). Uslovi striktne hibridizacije (kao i visoko striktne, ultra-visoko striktne, ili ultra-ultra visoko striktne) i ispiranja mogu lako da se empirijski odrede za svaku testnu nukleinsku kiselinu. Na primer, pri određivanju visoko striktnih uslova hibridizacije i ispiranja, uslovi hibridizacije i ispiranja se postepeno pooštravaju (npr., povećavanjem temperature, smanjivanjem koncentracije soli, povećavanjem koncentracije deterdženta i/ili podizanjem koncentracije organskih rastvarača, npr. formalina, pri hibridizaciji ili ispiranju), sve dok se ne zadovolji selektovana garnitura kriterijuma. Uslovi hibridizacije i ispiranja se, npr., postepeno pooštravaju sve dok se sonda, koja sadrži jednu ili više sekvenci nukleinske kiseline selektovane iz SEQ ID br:1 do SEQ ID br: 5 i SEQ ID br: 11 do SEQ ID br. 262 i njihovih komplementarnih polinukleotidnih sekvenci, ne veže za savršeno pogođenu (identičnu) komplementarnu metu (opet nukleinsku kiselinu, koja sadrži jednu ili više sekvenci nukleinske kiseline selektovane iz SEQ ID br: 1 do SEQ ID br: 5 i SEQ ID br 11 do SEQ ID br: 262 i njihovih komplementarnih polinukleotidnih sekvenci), sa odnosom signal.šum od najmanje oko 2,5x, a po izboru oko 5x ili višestruko većim od onog koji je registrovan pri hibridizaciji sonde na nepodudarnu metu. U ovom slučaju, nepodudarna meta je nukleinska kiselina koja odgovara nukleinskoj kiselini (koja ne pripada priloženoj listi sekvenci), koja se u nekoj od javnih baza podataka - npr. GenBank™ - nalazila u vreme podnošenja predmetne prijave.Takve sekvence stručnjak može da identifikuje u Gen-Bank. Primeri ovakvih nukleinskih kiselina su označeni pristupnim brojevina Z99109 i Y09476. Stručnom licu neće biti teško da identifikuje u, npr. bazi GenBank, i druge slične sekvence.

Za testnu nukleinsku kiselinu se kaže da se specifično hibridizuje na nukleinsku kiselinu - sondu, ako hibridizuje na sondu bar upola onoliko kako hibridizuje na savršeno podudarnu komplementarnu metu, tj. sa odnosom signal:šum bar '? snage hibridizacije sonde na metu, pod uslovima pod kojima se savršeno podudarna sonda vezuje na savršeno podudarnu komplementarnu metu sa odnosom signal.šum, koji je najmanje oko 2x-10x, a ponekad 20x, 50x ili više od onog, registrovanog pri hibridizaciji bilo kojeg od nepodudarnih polinukleotida sa pristupnim brojevima Z99109 i Y09476.

Ultra-visoko striktni uslovi hibridizacije i ispiranja su oni u okviru kojih se sthktnost uslova hibridizacije i ispiranja povećava dok vrednost odnosa signahšum za vezivanje sonde na savršeno podudarnu komplementarnu ciljnu nukleinsku kiselinu ne postane bar 10x ili veća od vrednosti koja se registruje pri hibridizaciji na neku od nepodudarnih ciljnih nukleinskih kiselina sa GenBank pristupnim brojevima Z99109 i Y09476. Za ciljnu nukleinsku kiselinu, koja hibridizuje na sondu pod takvim uslovima, sa odnosom signal: šum od bar<1>/2onog registrovanog sa savršeno podudarnom komplementarnom ciljnom nukleinskom kiselinom, kaže se da se vezuje na sondu pod ultra-visoko striktnim uslovima.

Slično tome, viši nivoi striktnosti mogu da se odrede postepenim podizanjem uslova hibridizacije i/ili ispiranja za odgovarajući test hibridizacije. Primer su nivoi kod kojih se striktnost uslova hibridizacije i ispiranja podiže do postizanja vrednosti odnosa signakšum za vezivanje sonde na savršeno podudarnu komplementarnu ciljnu nukleinsku kiselinu bar 10x, 20x, 50x, 100x ili 500x i više puta veću od vrednosti koja se registruje za hibridizaciju na neku od nepodudarnih ciljnih nukleinskih kiselina sa GenBank pristupnim brojevima Z99109 i Y09476. Za ciljnu nukleinsku kiselinu, koja hibridizuje na sondu pod takvim uslovima, sa odnosom signal:šum od barV2onog registrovanog sa savršeno podudarnom komplementarnom ciljnom nukleinskom kiselinom, kaže se da se vezuje na sondu pod ultra-ultra visoko striktnim uslovima.

Pronalazak karakterišu ciljne nukleinske kiseline, koje hibridizuju na nukleinske kiseline predstavljene sa SEQ ID br: 1 do SEQ ID br: 5 i SEQ ID br: 11 do SEQ ID br: 262 pod visoko, ultra-visoko i ultra-ultra visoko striktnim uslovima. Primeri takvih nukleinskih kiselina obuhvataju one sa jednim ili nekoliko nemih ili konzervativnih supstitucija nukleinske kiseline u odnosu na datu sekvencu nukleinske kiseline.

Nukleinske kiseline, koje ne hibridizuju uzajamno pod striktnim uslovima, još uvek su suštinski identične, ukoliko su suštinski identični peptidi koje one kodiraju. Ovo nastaje, npr., kad je za pravljenje kopije nukleinske kiseline korišćena maksimalna degeneracija kodona koju dozvoljava genetski kod, ili kad su se stvorili antiserumi/antiserum na jednu ili više SEQ ID br: 6 do SEQ ID br. 10 i SEQ ID br: 263 do SEQ ID br: 514, koji su suptrahovani pomoću polipeptida kodiranih poznatim nukleotidnim sekvencama, uključujući i onu sa GenBank pristupnim brojem CAA70664. Više detalja0imunološkoj identifikaciji polipeptida pronalaska u daljem izlaganju. Osim toga, za razlikovanje dupleksa sa sekvencama sa manje od 100 nukleotida, može da se koristi TMAC1 hibridizaciona procedura, koju poznaju prosečni poznavaoci struke.Videti u,npr., Sorg, U. i sar.Nucleic Acids Res(Sept. 11, 1991) 19(17) referencom obuhvaćena u celini.

U jednom aspektu, pronalazak daje nukleinsku kiselinu koja sadrži jedinstvenu podsekvencu u nukleinskoj kiselini, selektovanoj iz SEQ ID br: 1 do SEQ ID br: 5 i SEQ ID br: 11 do SEQ ID br: 262. Jedinstvena podsekvenca je jedinstvena u odnosu na nukleinsku kiselinu, koja odgovara nekom od GenBank pristupnih brojeva Z99109 i Y09476. Takve jedinstvene podsekvence mogu da se odrede poravnavanjem neke od SEQ ID br: 1 do SEQ ID br: 5 i SEQ ID br: 11 do SEQ ID br: 262 sa kompletnom garniturom nukleinskih kiselina zastupljenih GenBank brojevima Z99109 i Y09476 ili drugim srodnim sekvencama iz javnih baza podataka, koje su se u tim bazama nalazile u vreme podnošenja predmetne prijave. Poravnavanje se može obaviti pomoću BLAST algoritma podešenog na fiksne parametre. Svaka jedinstvena podsekvenca je korisna, npr., kao sonda za identifikovanje nukleinskih kiselina pronalaska.

Pronalazak, osim toga, obuhvata i polipeptid, koji sadrži jedinstvenu podsekvencu u polipeptidu, selektovanom iz SEQ ID br: 6 do SEQ ID br: 10 i SEQ ID br: 263 do SEQ ID br: 514. U ovom slučaju, jedinstvena podsekvenca je jedinstvena u odnosu na polipeptid koji odgovara GenBank broju CAA70664. I ovde se polipeptid poravnava sa sekvencom broja CAA70664. Skreće se pažnja da je, ako sekvenca odgovara ne-translatiranoj sekvenci, npr. pseudo genu, odgovarajući polipeptid proizveden, jednostavno,in silicotranslacijom sekvence nukleinske kiseline u aminokiselinsku sekvencu, a okvir čitanja izabran tako da odgovara okviru čitanja homolognih GAT polinukleotida.

Pronalazak, takođe, daje ciljnu nukleinsku kiselinu koja, pod striknim uslovima, hibridizuje u jedinstveni kodni oligonukleotid, koji kodira jedinstvenu podsekvencu u polipeptidu, selektovanom iz SEQ ID br: 6 do SEQ ID br: 10 i SEQ ID br: 263 do SEQ ID br: 514, gde je jedinstvena podsekvenca jedinstvena u odnosu na polipeptid koji odgovara bilo kojem od kontrolnih polipeptida. Jedinstvene sekvence se određuju na prethodno opisan način.

U jednom primeru, striktni uslovi su odabrani tako da kodnom oligonukleotidu savršeno komplementarni oligonukleotid hibridizuje u kodni oligonukleotid sa bar 2,5x do 10x, a još bolje bar 5-10x, višom vrednošću odnosa signakšum od vrednosti za hibridizaciju savršeno komplementarnog oligonukleotida na kontrolnu nukleinsku kiselinu, koja odgovara ma kojem od kontrolnih polipeptida. Mogu da se izaberu takvi uslovi da se dobiju više vrednosti za odnos signakšum u konkretnom korišćenom testu, npr. oko 15x, 20x, 30x, 50x i više. U ovom primeru, ciljna nukleinska kiselina hibridizuje na jedinstveni oligonukleotid sa odnosom signakšum bar 2x višim u odnosu na hibridizaciju kontrolne nukleinske kiseline na kodirajući oligonukleotid. I ovde je moguće selektovati veće vrednosti odnosa signakšum, npr. oko 2,5x, 5x, 10x, 20x, 30x, 50x i više. Konkretni signal će zavisiti od markera korišćenog u odgovarajućem testu, npr, fluorescentnog, kolorimetričkog, radioaktivnog ili sličnog markera.

Vektori, promoteri i ekspresioni sistemi

Pronalazak obuhvata rekombinantne sklopove, koji sadrže jednu ili više sekvenci nukleinske kiseline iz prethodnog opširnog opisa. Sklopovi podrazumevaju vektor, plazmid, kozmid, fag, virus, veštački bakterijski hromozom (BAC), veštački hromozom kvasca (YAC) i slično, u koje je umetnuta sekvenca nukleinske kiseline iz pronalaska, orijentisana unapred ili unazad. U pogodnom aspektu ovog oblika, sklop obuhvata i regulativne sekvence, uključujući, npr. promoter, funkcionalno vezan na sekvencu. Svet struke poznaje veliki broj pogodnih vektora i promotera, koji su i komercijalno dostupni.

Opšti radovi koji opisuju molekularno-biološke tehnike, koje su za ovo izlaganje korisne, uključujući primenu vektora, promotera i mnoge druge relevantne teme, obuhvataju Berger i Kimmel, Guide to Molecular Cloning Technigues, Methods in Enzvmologv, sv. 152 Academic Press, Inc., San Diego, CA (Berger); Sambrook i sar., Molecular Cloning - A laboratorv Manual (2nd Ed.), Sv. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratorv, Cold Spring Harbor, New York, 1989 ('Sambrook') i Current Protocols in Molecular Biologv, F M. Ausubel i sar., eds. Current Protocols, a joint venture Betvveen Greene Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc., (dopunjeno tokom 1999) ('Ausubel'). Primeri protokola dovoljni za usmeravanje poznavalaca struke kroz metodein vitroamplifikacije, uključujući reakciju lanca polimeraze (PCR), reakciju lanca ligaze (LCR), amplifikaciju Qp-replikaze, kao i druge tehnike posredovane RNK polimerazom (npr. NASBA), za npr. produkciju homolognih nukleinskih kiselina, mogu se naći u Berger, Sambrook i Ausubel, kao i u Mullis i sar., (1987), US patent br. 4,683,202, PCR Protocols A Guide to Methods and Applications ( Innis i sar. eds.), Academic Press Inc. San Diego, CA (1990) (Innis), Arnheim i Levinson (October 1, 1990) C& EN 36-47; The Journal of NIH Research (1991) 3, 81-94; Kwoh i sar. (1989) Proc Natl Acad Sci USA 86, 1173; Guatelli i sar. (1990) Proc Natl Acad Sci USA 87, 1874; Lomell i sar. (1989) J Clin Chem 35, 1826; Landegren i sar. (1988) Science 241, 1077-1080; Van Brunt (1990) Biotechnologv 8, 291-294; Wu i VVallace, (1989) Gene 4, 560; Barringer i sar. (1990) Gene 89, 117, i Sooknanan i Malek (1995) Biotechnologv 13: 563-564. Usavršene metode za kloniranjein vitroamplifikovanih nukleinskih kiselina daje VVallace i sar., US patent br. 5,426,039. Usavršene metode za PCR amplifikovanje velikih nukleinskih kiselina i dobijanje PCR amplikona do 40 kb sumira Cheng i sar. (1994) Nature 369:684-685, sa svojim literaturnim referencama. Poznavaocu je jasno da se uglavnom sve RNK mogu konvertovati u DNK dvostrukog niza, pogodnu za restrikcionu obradu, PCR ekspanziju i sekvenciranje pomoću reverzne transkriptaze i polimeraze.V.Ausubel, Sambrook i Berger, svesupra.

Izloženi pronalazak se, takođe, odnosi i na obrađene ćelije domaćina koje su transdukovane (transformisane ili transfektovane) vektorom iz pronalaska (npr. vektorom kloniranja ili vektorom ekspresije), kao i na proizvodnju polipeptida iz pronalaska rekombinantnim putem. Vektor može da bude, npr. plazmid, virusna čestica, fag, itd. Obrađene ćelije domaćini mogu da se odgaje na konvencionalnoj hranljivoj podlozi, adekvatno modifikovanoj za aktiviranje promotra, selektovanje transformanta ili amplifikaciju GAT homolognog gena. Uslovi gajenja, tj. temperatura, pH i slični, ne razlikuju se od uslova korišćenih za ćelije domaćina selektovane za ekspresiju, i poznavalac materije će ih prepoznati iz opisa i navedenih referenci, npr. Sambrook, Ausubel i Berger, kao i Freshnev (1994) Culture of Animal Cells, A Manual of Basic Technigue, third edition, Wiley-Liss, New York, sa pripadajućim literaturnim referencama.

GAT oilipeptidi ovog pronalaska mogu da se produkuju u ćelijama ne-životinjskog porekla, npr. ćelijama biljaka, kvasaca, gljivica, bakterija i si. Pored Sambrook, Berger i Ausubel, detaljne informacije u vezi kultivisanja ne-životinjskih ćelija mogu da se nađu kod Payne i sar. (1992) Plant Cell and Tissue Culture in Liguid Svstems John Wiley & Sons, Inc. New York, NY; Gamborg i Phillips (eds)(1995) Plant Cell. Tissue and Organ Culture; Fundamental Methods Springer Lab Manual, Springer-Verlag (Berlin Heidelberg New York), kao i u Atlas i Parks (eds) The Handbook of Microbiological Media (1993) CRC Press, Boca raton, FL.

Polinukleidi ovog pronalaska mogu da se ugrade u čitav niz različitih ekspresionih vektora, pogodnih za eksprimiranje polipeptida. Takvi, pogodni vektori obuhvataju sekvence hromozomske, ne-hromozomske i sintetske DNK, npr. derivate SV40, bakterijske plazmide, DNK faga, bakulovirus, plazmide kvasaca, vektore dobijene kombinovanjem plazmida i DNK faga, virusne DNK npr. DNK vakcinije, adenovirusa, varičela virusa, pseudorabiesa, adenovirusa, parvovirusa, retrovirusa i mnogih drugih. Može da se koristi svaki vektor koji transdukuje genski materijal u ćeliju, i koji se - ako je potrebna replikacija - može replikovati i funkcionalno opstati u ćeliji-domaćinu.

Kad se polinukleotid pronalaska ugradi u ekspresioni vektor, oprativno se vezuje na odgovarajuću sekvencu kontrole transkripcije (promotera) radi usmeravanja sinteze mRNK. Primeri takvih sekvenci za kontrolu transkripcije, posebno pogodnih za primenu kod transgenskih biljaka, obuhvataju promotere mozaičkog virusa karfiola (CaMV), mozaičkog virusa biljaka iz porodiceScrophularia(FMV) i virusa pegavosti jagode (SVBV), navedene u US privremenoj patentnoj prijavi br. 60/245,354. Među promotere, za koje se zna da kontrolišu ekspresiju gena u prokariotskim i eukariotskim ćelijama ili njihovim virusima, i koje mogu da se koriste u nekim od oblika pronalaska, spadaju i promoter SV40, lac ili trp promoterE. coli,promoter lambda PLfaga. Ekspresioni vektor može da sadrži mesto vezivanja ribozoma za inicijaciju translacije, kao i terminator transkripcije. Takođe, vektor može da sadrži odgovarajuće sekvence za amplifikovanje ekspresije, npr. pojačivač. Osim toga, ekspresioni vektori ovog pronalaska mogu, po izboru, da sadrže jedan ili više izbornih markerskih gena da bi se dobio fenotipski kvalitet za selekciju transformisanih ćelija domaćina, npr. otpornost eukariotske ćelijske kulture na dihidrofolatnu reduktazu ili neomicin, ili rezistencijuE. coli natetraciklin ili ampicilin.

Vektori iz ovog pronalaska mogu da se koriste za transformisanje pogodnog domaćina tako da mu omoguće da eksprimira protein ili polipeptid ovog pronalaska. Primeri domaćina pogodnih za ekspresiju obuhvataju: bakterijske ćelije, npr.E. coli, B. subtilis, StreptomycesiSalmonella typhimurium;ćelije gljivica, npr.Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris i Neurospora crassa;ćelij insekata, npr.DrosophilaiSpodoptera frugiperda;ćelije sisara, npr. CHO, COS, BHK, HEK 293 ili Bowes melanoma; kao i biljne ćelije ili transferisana živa biljna tkiva, itd. Podrazumeva se da sve ćelije ili ćelijske linije ne moraju da budu u stanju da produkuju potpuno funkcionalne GAT polipeptide; mogu se, na primer, dobiti antigenski fragmenti GAT polipeptida. Pronalazak se ne ograničava na korišćene ćelije domaćina.

Zavisno od predviđene primene za GAT polipeptid, u bakterijskim sistemima mogu se selektovati brojni ekspresioni vektori. U slučaju da su za komercijalnu proizvodnju ili indukciju antitela potrebne, na primer, velike količine GAT polipeptida ili njihovih fragmenata, poželjni su vektori koji usmeravaju ekspresiju fuzionih proteina visokog stepena i koji se mogu lako prečistiti. Vektori ovog tipa obuhvataju višenamenske vektore ekspresije i kloniranjaE. coli,npr. BLUESCRIPT (Stratagene), kod kojih sekvenca za kodiranje GAT polipeptida može da bude vezana u vektorski unutrašnji okvir sekvencama za aminoterminalni Met i 7 narednih reziduuma beta-galaktozidaze, tako da se dobije hibridni protein; ili u pIN vektore (Van Heeke & Schuster (1989) J Biol Chem 264:55035509), pET vektor (Novagen, Madison Wl) i si.

Slično tome, za produkovanje GAT polipeptida ovog pronalaska u kvasnoj gljiviciSaccharomyces cerevisiae,može koristiti izvestan broj vektora, koji sadrže konstitutivne ili pobudljive promotere, npr, alfa faktor, alkohol oksidazu i PGH, detaljnije u Ausubel i sar.( supra)i Grant i sar. (1987) Methods in Enzvmologv 153:516544.

Kod ćelija domaćina sisara, mogu da se koriste različiti eskspresioni sistemi, uključujući i one na bazi virusa. U slučaju da se, kao ekspresioni vektor, koristi adenovirus, kodirajuća sekvenca npr. GAT polipeptida može da se veže u adenovirusni kompleks transkripcije/translacije, koji grade kasni promoter i tripartitna vodeća sekvenca. Umetanjem kodirajuće regije GAT polipeptida u neesencijalne regije E1 ili E3 genoma virusa, dobiće se funkcionalan virus, sposoban da eksprimira GAT u inficiranim ćelijama domaćina (Logan i Shenk,

(1984)Proc Natl Acad Sci USA81:3655-3659). Osim toga, pojačivači transkripcije npr. pojačivač virusa Rousovog sarkoma (RSV), mogu da se koriste u cilju pojačavanja ekspresije u ćelijama domaćina sisara.

Slično tome, ekspresija kod biljnih ćelija može da se pokrene iz transgena, integrisanog u hromozomu biljke, ili citoplazmatski - iz epizomske ili virusne nukleinske kiseline. U slučaju stabilno integrisanih transgena, često je poželjno da se dobiju sekvence sposobne da pokreću konstitutivnu ili induktibilnu ekspresiju GAT polinukleotida pronalaska pomoću, npr. virusnih, npr. CaMV, ili biljnih regulativnih sekvenci. U literaturi je prikazam veliki broj regulativnih sekvenci iz biljaka, uključujući i sekvence koje ekspresiju usmeravaju na vrstom tkiva određen način, npr. ToRB7, patatin B33, GRP genski promoteri, rbcS-3A promoter i si. Ekspresija visokog nivoa može, alternativno, da se postigne prolaznim eksprimiranjem egzogenih sekvenci biljnog virusnog vektora, npr. TMV, BMV, itd. Transgenske biljke, koje konstitutivno eksprimiraju GAT polinukleotid pronalaska biće, normalno, pogodnije, kao i regulativne sekvence selektovane tako da garantuju konstitutivnu stabilnu ekspresiju GAT polipeptida.

U nekim oblicima pronalaska priprema se sklop GAT polinukleotida pogodan za transformaciju biljnih ćelija. Na primer, željeni GAT polipeptid može da se ugradi u rekombinantnu ekspresionu kasetu, da olakša uvođenje gena u biljku i posledičnu ekspresiju kodiranog polipeptida. Ekspresiona kaseta se, normalno, sastoji od GAT polinukleotida ili njegovog funkcionalnog fragmenta, operativno vezanog na promotersku sekvencu i druge sekvence koje regulišu pokretanje translacije, koji će usmeriti ekspresiju sekvence u predviđena tkiva transformisane biljke (npr. čitavu biljku, listove, seme).

Može da se koristi, na primer, jako ili slabo konstitutivni biljni promoter, koji će usmeriti ekspresiju GAT polipeptida u sva tkiva biljke. Ti promoteri su aktivni u gotovo svim uslovima i fazama razvoja ili diferencijacije ćelija. Među konstitutivne promotere spadaju i 1'- ili 2'- promoter, dobijen iz T-DNKAgrobacterium tumefaciens,i drugi regioni pokretanja transkripcije različitih biljaka, poznati ljudima iz struke. U situacijama kad je prejaka ekspresija GAT polinukleotida štetna po biljku ili, pak, nepoželjna, stručnjak će - na osnovu analize ovog pronalaska - zapaziti da se, za dobijanje nižih nivoa ekspresije, mogu koristiti slabi konstitutivni promoteri. Ukoliko, pak, visoki nivoi ekspresije ne štete biljci, može da se primeni jaki promoter, npr. t-RNK ili neki od pol III promotera, ili pak jaki pol II promoter, npr. CaMV promoter.

Alternativno, biljni promoter može da bude okruženjem kontrolisan. Takvi promoteri se u ovom izlaganj nazivaju 'pobudni' promoteri. Uslovi okruženja, koji mogu da proizvedu transkripciju pobudnim promoterima, obuhvataju napad patogenog organizma, anaerobne uslove ili prisustvo svetlosti.

Promoteri korišćeni u izloženom pronalasku mogu da budu 'tkivno specifični' i, kao takvi, pod kontrolom razvoja, tako da se polinukleotid eksprimira samo u nekim od tkiva, npr. listovima ili semenu. U oblicima u kojima se jedna ili više sekvenci nukleinskih kiselina, endogenih za biljni sistem, ugrađuje u sklop, endogeni promoteri (ili njihove varijante) iz tih gena mogu da se koriste za usmeravanje ekspresije gena u transfektiranu biljku. Promoteri specifični za tkiva mogu, takođe, da se primene za usmeravanje ekspresije heterolognih polinukleotida.

Generalno gledano, konkretni promoter u ekspresionoj kaseti kod biljaka, zavisiće od predviđene primene. Pogodnim se smatra ma koji od brojnih promotera, koji usmeravaju transkripciju u biljnoj ćeliji. Promoteri mogu da budu konstitutivni ili pobudni. Osim prethodno pomenutih promotera, među promotere bakterijskog porekla, koji funkcionišu u biljkama, spadaju i promoter oktopin sintaze, promoter nopalin sintaze, kao i drugi promoteri dobijeni iz prirodnog Ti plazmida( Videti uHerrara-Estrella i sar. (1983) Nature 303:209-213. Među proteine virusa spadaju 35S i 19S RNK CaMV (Odell i sar. (1985) Nature 313:810-812). ostali biljni promoteri su 1,3-bifosfat karboksilazni promoter male podjedinice i fazeolinski promoter. Mogu, takođe, da se koriste i promoterske sekvence iz gena E8 i drugih gena. Detaljan opis izolacije i sekvenciranja promotera E8 dat je u Deikman i Fischer (1988) EMBO J 7:3315-3327.

U cilju identifikacije potencijalnih promotera, 5' elementi genomskog klona analizirani su na sekvence karakteristične za sekvence promotera. Na primer, u elemente promoterske sekvence spada koncenzusna sekvenca TATA kutije (TATAAT), koja je obično locirana 20 do 30 baznih parova uzlazno od mesta početka transkripcije. Dalje uzlazno od TATA kutije, na pozicijama - 80 do -100 kod biljaka, obično postoji promoterski element sa nizom adenina, koji okružuju trinukleotid G (ili T), opisan u Messing i sar. (1983) Genetic Engineering in Plants, Kosage i sar. (eds.) pp. 221-227.

Za pripremanje polinukleotidnih sklopova pronalaska, npr. vektora, mogu da se koriste i sekvence koje ne pripadaju promoteru ili pridruženom polinukleotidu. Ukoliko je poželjna normalna ekspresija polipeptida, može da se uključi regija poliadeniiacije na 3'-završetku regije kodiranja GAT. Regija poliadenilacije može da se dobije iz, npr. različitih biljnih gena ili iz T-DNK.

Sklop može, takođe, da sadrži i markerski gen, koji na biljne ćelije prenosi izborni fenotip. Marker može, na primer, da kodira otpornost na biocide, konkretno otpornost na antibiotike, npr. otpornost na kanamicin, G418, bleomicin, higromicin, kao i otpornost na herbicide, npr. otpornost na hlorosulforon ili fosfinotricin (aktivnu komponentu herbicida bialafos i Basta).

Efikasnoj translaciji sekvence kodiranja GAT polinukleotida ovog pronalaska, mogu da pomognu specifični inicijacioni signali. Ovi signali mogu da obuhvate, npr. ATG inicijacioni kodon i susedne sekvence. U slučajevima kad su kodirajuća sekvenca GAT polipeptida, njen kodon inicijacije i uzlazne sekvence umetnuti u pogodan ekspresioni vektor, obično nema potrebe za dodatnim signalima kontrole translacije. Međutim, u slučajevima gde je umetnuta samo kodirajuća sekvenca (npr. sekvenca kodiranja zrelog proteina) ili njen deo, moraju se obezbediti egzogeni signali kontrole transkripcije zajedno da inicijacionim kodonom. Osim toga, inicijacioni kodon se mora nalaziti u pravilnom okviru čitanja, kako bi se garantovala transkripcija čitavog umetka. Egzogeni transkripcioni elementi i inicijacioni kodoni mogu da budu različitog, kako prirodnog tako i sintetskog, porekla. Efikasnost ekspresije može da se poveća uključivanjem pojačivača, koji odgovaraju korišćenom ćelijskom sistemu (Scharf D et al. (1994) Results Probi Cell Differ 20:125-62; Bittner i sar. (1987) Methods in Enzvmol 153:516-544).

Sekvence sekrecije/ lokalizacije

Polinukleotidi ovog pronalaska, takođe, mogu da se stapaju, npr. unutar okvira, na nukleinske kiseline koje kodiraju sekvence sekrecije/lokalizacije, da usmeravaju ekspresiju polipeptida u željeni ćelijski odeljak, membranu ili organelu ćelije sisara, ili da usmere sekreciju polipeptida u periplazmatski prostor ili u hranljivu podlogu za kulturu ćelija. Ove sekvence, dobro poznate stručnjacima, obuhvataju peptide-vodiče sekrecije, sekvence usmeravanja na organele (npr. nuklearne sekvence lokalizacije, ER retencione signale, mitohondrijske tranzitne sekvence, hloroplastne tranzitne sekvence), sekvence membranske lokalizacije/učvršćivanja (npr. sekvence prekida tranzita, GPI fiksacione sekvence), i slično.

U progodnom obliku, polinuklein pronalaska se stapa u okvir sa N-terminalnom sekvencom hloroplastnog tranzita (ili sekvencom peptida hloroplastnog tranzita), dobijenom iz gena koji kodira polipeptid, normalno upravljen na hloroplast. Te sekvence su obično bogate serinom i treoninom, a sa manjkom aspartata, glutamata i tirozina, a normalno poseduju centralni domen sa mnogo pozitivno naelektrisanih amino kiselina.

Domaćini ekspresije

Drugi oblici pronalaska se odnose na ćelije domaćine koje sadrže prethodno opisane sklopove. Ćelija domaćin može da bude eukariotska ćelija, npr. ćelija sisara, ćelija kvasca ili biljna ćelija, ili može da bude prokariotska, npr. bakterijska ćelija. Uvođenje sklopa u ćeliju-domaćina može da se postigne kalcijum-fosfatnom transfekcijom, transfekcijom posredovanom DEAE-Dextranom, elektroporisanjem ili nekim drugim uobičajenim načinom (Daviš, L, Dibner, M. i Battev, I. (1986) Basic Methods in Molecular Biologv).

Soj ćelija domaćina bira se prema potrebi, a na osnovu sposobnosti da modulira ekspresiju umetnutih sekvenci ili da obradi eksprimirani protein na željeni način. Te modifikacije proteina obuhvataju, ali se ne ograničavaju na, acetilaciju, karboksilaciju, glikozilaciju, fosforilaciju, lipidaciju i acilaciju. Post-translaciona obrada, koja čepa 'pre' ili 'prepro' oblike proteina može, takođe, da igra važnu ulogu u pravilnom umetanju, preklapanju i/ili funkcionisanju. Različite ćelije-domaćini, npr.E. coli, Bacillussp., kvasci ili ćelije sisara, npr. CHO, HeLa, BHK, MDCK, 293, WI38, itd., poseduju specifičnu ćelijsku mašineriju i karakteristične mehanizme za, npr., post-translacione aktivnosti i mogu biti odabrane sa ciljem da se obezbedi željena modifikacija i obrada uvedenog, stranog proteina.

Za dugoročnu, visoko produktivnu proizvodnju rekombinantnih proteina mogu da se koriste stabilni ekspresioni sistemi. Na primer, biljne ćelije, kulture tkiva ili tkiva, npr. izdanci, lisni diskovi, koji stabilno eksprimiraju polipeptid pronalaska, transdukuju se primenom ekspresionih vektora sa virusnim izvorima replikacije ili endogenim ekspresionim elementima i izbornim markerskim genom. Po uvođenju vektora, ćelije se mogu pustiti da se razvijaju u obogaćenoj podlozi onoliko dugo koliko odgovara tipu ćelija, npr. 1 ili više sati za bakterijske ćelije, 1-4 dana za biljne ćelije, 2-4 sedmice za neke kulture biljnih tkiva, pre prenošenja na selektivne podloge. Svrha izbornog markera je da prenese otpornost na selektovane ćelije, a njegovo prisustvo omogućava razvoj i izdvajanje ćelija koje uspešno eksprimiraju uvedene sekvence. Na primer, transgenske biljke koje eksprimiraju polipeptide pronalaska mogu da se direktno selektuju po otpornosti na herbicid, glifozat. Otporni embrioni, dobijeni iz stabilno transformisanih kultura biljnih tkiva, mogu da se razmnože primenom, npr., metodom tkivne kulture koja odgovara tipu ćelija.

Ćelije domaćini, transformisane nukleotidnom sekvencom koja kodira polipeptid pronalaska, mogu da se uzgaje pod uslovima pogodnim za ekspresiju i izdvajanje kodiranog proteina iz ćelijske kulture. Zavisno od sekvence i/ili korišćenog vektora, rekombinantna ćelija može da proizvede protein ili njegov fragment, koji se može izlučiti, vezati na membranu ili ostati unutar ćelije.

Podrazumeva se, prema stručnim saznanjima, da je ekspresione vektore, koji sadrže GAT polinukleotide pronalaska, moguće konstruisati tako da imaju signalne sekvence koje usmeravaju sekreciju zrelih polipeptida kroz membranu prokariotske ili eukariotske ćelije.

Dodatne polipeptidne sekvence

Polinukleotidi ovog pronalaska mogu, dalje, da sadrže kodirajuću sekvencu stopljenu u okviru na markersku sekvencu koja, npr., olakšava prečišćavanje kodiranog polipeptida. Takvi domeni koji olakšavaju prečišćavanje obuhvataju peptide koji helatišu metal, npr. histidin-triptofanske module koji omogućavaju prečišćavanje na imobilisanom metalu, sekvencu koja vezuje glutation (npr. GST), hemaglutininsko (HA) obeležje (koje odgovara epitopu izdvojenom iz proteina hemaglutinina influence; VVilson i sar. (1984) Cell 37:767), sekvence proteina koji vezuje maltozu, FLAG epitopa korišćenog u FLAGS ekstenziono/afinitetnim sistemima prečišćavanja (lmunex Corp, Seattle, WA), kao i mnoge druge. Uključivanje polipeptidne linker sekvence koju čepa proteaza između domena prečišćavanja i GAT homologne sekvence olakšava prečišćavanje. Jedan ekspresioni vektor, namenjen ovde opisanim kombinacijama i metodima, obezbeđuje ekspresiju fuzionog proteina koji sadrži polipeptid pronalaska, fuzionisan za poli-histidinsku regiju, razdvojen mestom cepanja enterokinazom. Histidinski reziduumi omogućavaju prečišćavanje na IMIAC-u (afinitetna hromatografija jona imobilisanog metala, opisana u Porath i sar. (1992) Protein Expression and Purification 3:263-281), dok mesto cepanja enterokinazom omogućava razdvajanje GAT homolognog peptida od fuzionog proteina. Za eksprimiranje stranih polipeptida kao fuzionih proteina sa glutation S-transferazom (GST) mogu, takođe, da se koriste pGEX vektori (Promega; Madison, Wl). Obično su ti fuzioni proteini rastvorljivi i lako mogu da se razdvoje od liziranih ćelija adsorpcijom na ligand-agarozne perlice (npr. glutation-agarozne u slučaju GST-fuzije), nakon čega se eluiraju u prisustvu slobodnog liganda.

Produkovanje i izdvajanje polipeptida

Posle transdukcije pogodnog soja domaćina i razvoja soja do odgovarajuće gustine ćelija, na pogodan način (npr. promenom temperature ili hemijskim putem) pobuđuje se selektovani promoter, pa se ćelije opet puste da se razvijaju određeno vreme. Ćelije se obično prikupljaju centrifugiranjem, razdvajaju fizičkim ili hemijskim sredstvima, a dobijeni sirovi ekstrakt se čuva za dalje prečišćavanje. Mikrobne ćelije, korišćene u ekspresiji proteina, mogu da se razdvoje na svaki pogodan način, npr. ciklusima smrzavanja/ otapanja, izlaganjem visokofrekventnim zvučnim talasima, mehaničkim putem, ili primenom sredstava za lizu, ili na neki drugi, struci poznat način.

Mnogobrojne literaturne reference obrađuju kultivisanje i produkovanje mnogih ćelija, npr. ćelija bakterijskog, biljnog, životinjskog (posebno sisara) i arhebakterijskog porekla.Videti u npr.Sambrook, Ausubel i Berger (supra), kao i u Freshnev (1994) Culture of Animal Cells. a Manual of Basic Technigue, third edition, Wiley-Liss, New York sa pripadajućim referencama; Doyle i Griffiths (1997) Mammalian Cell Culture: Essential T echnigues John Wiley and Sons, NY; Humason (1979) Animal Tissue Technigues, fourth edition W.H. Freeman and Company; i Ricciardelli, i sar. (1980) In Vitro Cell Dev Biol 25:1016-1024. Za kulturu i regeneraciju biljnih ćelija,videtiPayne i sar. (1992) Plant Cell and Tissue Culture in Liguid Svstems John Wiley & Sons, Inc. New York, NY; Gamborg i Phillips (eds) (1995) Plant Cell, Tissue and Organ Culture, Fundamental Methods Springer Lab Manual, Springer-Verlag (Berlin Heidelberg New York); Kones, ed.

(1984) Plant Gene Transfer and Expression Protocols, Humana Press, Totowa, New Jersey and Plant Molecular Biology (1993) R.R.D. Croy, Ed. Bios Scientific Publishers, Oxford, U.K. ISBN 0 12 198370 6. Hranljive podloge za ćelijske kulture uopšte date su u Atlas i Parks (eds) The Handbook of Microbiological Media (1993) CRC Press, Boca Raton, FL. Dodatne informacije o kulturi ćelija date su u komercijalnoj literaturi, npr. Life Science Research Cell Culture Catalogue (1998) Sigma-Aldrich, Inc. (St Louis, MO) ('Sigma-LSRCCC') i npr. The Plant Culture Catalogue sa dodatkom (1997) Sigma-Aldrich, Inc. (St Louis, MO) ('Sigma-PCCS'). Više detalja u pogledu transformacije biljne ćelije i produkovanja transgenskih biljaka izneto je u daljem tekstu. Polipeptidi ovog pronalaska mogu da se izdvoje i prečiste iz kultura rekombinantnih ćelija bilo kojim od mnogobrojnih metoda koje struka poznaje, uključujući amonijum sulfatno ili etanolsko taloženje, kiselinsku ekstrakciju, anjon- ili katjon-izmenjivačku hromatografiju, fosfoceluloznu hromatografiju, hromatografiju hidtrofobne interakcije, afinitetnu hromatografiju (npr. korišćenjem bilo kojeg od pomenutih sistema obeležavanja), hidroksiapatitnu i lektinsku hromatografiju. Pri dovršavanju konfiguracije zrelog proteina, mogu se koristiti, po želji, faze ponovnog savijanja proteina. U završnim fazama prečišćavanja može da se koristi tečna hromatografija visoke performanse (HPLC). Pored već pomenutih referenci, struka poznaje čitav niz različitih metoda prečišćavanja, uključujući npr. one opisane u Sandana (1997) Bioseparation of Proteins, Academic Press, Ine; kao i Bollag i sar.

(1996) Protein Methods. 2<nd>Edition Wiley-Liss, NY; VValker (1996) The Protein Protocols Handbook Humana Press, NJ; Harris i Angal (1990) Protein Purification Applications: A Pracitcal Approach IRL press at Oxford, Oxford, England; Scopes

(1993) Protein Purification: Principles and Practice 3<rd>Edition Springer Verlag, NY; Janson i Ryden (1998) Protein Purification: Principles. High Resolution Methods and Applications, Second Edition Wiley-VCH, NY; i VValker (1998) Protein Protocols on CD-ROM, Humana Press, NJ.

U nekim slučajevima poželjno je da se GAT polipeptid pronalaska proizvede u velikim količinama, pogodnim za industrijsku i/ili komercijalnu primenu. U tim slučajevima se primenjuju procedure fermentacije na veliko. Ukratko, GAT polinukleotid, npr. polinukleotid koji sadrži neku od SEQ ID br: 1-5 i 11-262, ili druge nukleinske kiseline koje kodiraju GAT polipeptide pronalaska, može da se klonira u ekspresioni vektor. US patent br. 5,955,310 VVidner i sar. "METHODS FOR PRODUCING A POLYPEPTIDE IN A BACILLUS CELL" govori o vektoru sa dvojcem promotera i stabilišućim sekvencama operativno vezanim na sekvencu koja kodira polipeptid. Posle umetanja potrebnog polinukleotida u vektor, vektor se transformiše u bakterijskog domaćina, npr.Bacillus subtilissoj PL1801IIE (amyE, apr, npr, spollE::Tn917). Uvođenje ekspresionog vektora u ćelijuBacillusamože da se postigne, npr. transformacijom protoplasta (v. npr. Chang i Cohen (1979) Molecular General Genetics 168:111), korišćenjem kompetentnih ćelija (v. npr. Young i Spizizin (1961) Journal of Bacteriologv 81:823, ili Dubnau i Davidoff-Abelson (1971) Journal of Molecular Biologv 56:209), elektroporacijom (v. npr. Shikegavva i Dower (1988) Biotechnigues 6:742), ili konjugacijom (v. npr. Koehler i Thorne (1987) Journal of Bacteriologv 169:5271), v. takođe Ausubel, Sambrook i Berger,supra.

Transformisane ćelije se kultivišu u hranljivoj podlozi, pogodnoj za produkovanje polipeptida poznatim metodima. Na primer, ćelije se mogu kultivisati kultivacijom uz mešanje suda, fermentacijom malih ili velikih razmera (kontinuiranom, šaržnom, dopunjavanom šaržnom ili fermentacijom u čvrstom stanju) u laboratorijskom ili industrijskom fermentoru, a na pogodnoj podlozi i pod uslovima koji omogućavaju eksprimiranje i/ili izolovanje polipeptida. Kultivisanje se odvija na pogodnoj hranljivoj podlozi, koja sadrži izvore ugljenika i azota, kao i neorganske soli, primenom poznatih procedura. Odgovarajuće podloge se mogu nabaviti iz komercijalnih izvora ili pripremati prema publikovanim recepturama (u npr. katalozima The American Type Culture Collection). Izlučeni polipeptid može da se izdvoji direktno iz podloge.

Dobijeni polipeptid se može izolovati poznatim metodima. Iz hranljive podloge polipeptid može da se izoluje, na primer, konvencionalnim postupcima npr. centrifugiranjem, filtriranjem, ekstrakcijom, sušenjem prskanjem, evaporacijom ili taloženjem, i dr. Izolovani polipeptid se može dalje prečišćavati raznim poznatim postupcima, npr. hromatografijom (npr. jonoizmenjivačkom, afinitetnom, hidrofobnom, hromatofokusnom i hromatografijom isključivanja (određenih) dimenzija), procedurama elektroforeze (npr. preparativnim izoelektričnim fokusiranjem), postupkom diferencijalne rastvorljivosti (npr. taloženje amonijum sulfatom), ili ekstrakcijom (v. npr. Bollag i sar. (1996) Protein Methods 2<nd>Edition Wiley-Liss, NY; VValker (1996) The Protein Protocols Handbook Humana Press, NJ; Bollag i sar. (1996) Protein Methods 2<nd>Edition Wiley-Liss, NY; VValker (1996) The Protein Protocols Handbook Humana Press, NJ).

Sistemi transkripcije/translacije bez ćelija mogu da se koriste za produkovanje polipeptida uz korišćenje DNKa i RNKa ovog pronalaska. Komercijalno je dostupno nekoliko takvih sistema. Opšti vodič kroz protokolein vivotranskripcije i translacije može da se nađe u Tymms (1995) In vitro Transcription and Translation Protocols: Methods in Molecular Biologv sv. 37, Garland Publishing, NY.

SUPSTRATI I FORMATI ZA REKOMBINOVANJE SEKVENCI

Pored primene u standardnim metodima kloniranja, navedenim u npr. Ausubel, Berger i Sambrook, tj. u produkovanju daljih GAT polinukleotida i polipeptida sa željenim svojstvima, polinukleotidi pronalaska mogu da se koriste i kao supstrati u različitim procedurama generisanja diversiteta, npr. mutaciji, rekombinaciji i rekursivnim reakcijama rekombinovanja. Stručna literatura obuhvata niz različitih protokola za generisanje diversiteta. Procedure mogu da se koriste zasebno i/ili da se kombinuju u cilju produkovanja jedne ili više varijanti polinukleotida ili garniture polinukleotida, kao i varijanti kodiranih proteina. Pojedinačno i zbirno, ove procedure obezbeđuju moćne, široko primenljive mehanizme za generisanje diversifikovanih polinukleotida i garnitura polinukleotida (uključujući npr. DNK datoteke) korisne za manipulaciju ili brzu evoluciju polinukleotida, proteina, putanja reakcija, ćelija i/ili organizama sa novim i/ili poboljšanim karakteristikama. Procesom menjanja sekvence mogu da se postignu, npr. supstitucije jednog nukleotika, supstitucije više nukleotida, umetanje ili brisanje regiona sekvence nukleinske kiseline.

lako se, u diskusiji koja sledi, radi formiranja jasnije slike, povlače razlike između, i prave klasifikacije proceduralnih metoda, proceduralni metodi se često uzajamno ne isključuju, jer se različiti metodi mogu koristiti samostalno ili u kombinaciji, paralelno ili u nizu, a u cilju dobijanja varijanti sa različitom sekvencom.

Rezultat svake od opisanih procedura za generisanje diversiteta može da bude stvaranje jednog ili više polinukleotida, koji se mogu selektovati ili analizirati na polinukleotide koji kodiraju proteine sa željenim svojstvima ili koji prenose takva svojstva. Nakon diversifikacije primenom jednog ili više ovde pomenutih ili struci poznatih metoda, svi produkovani polinukleotidi se mogu selektovati prema željenoj aktivnosti ili svojstvu, npr. izmenjenom Km za glifozat, izmenjenom Km za acetiICoA, korišćenju alternativnih kofaktora (npr. propionil CoA), povećanom Kcat, itd. Ove aktivnosti mogu obuhvate i identifikovanje svake prirnetne aktivnosti nekim od testova, npr. u kompjuterskom ili kompjuterski čitljivom formatu. Na primer, GAT homolozi sa pojačanom specifičnom aktivnošću mogu da se detektuju testiranjem konverzije glifozata u N-acetilglifozat, npr. masenom spektrometrijom. Alternativno, poboljšana sposobnost prenošenja otpornosti na glifozat može da se testira uzgajanjem bakterija, transformisanih nukleinskom kiselinom pronalaska, na agaru sa rastućim koncentracijama glifozata ili prskanjem transgenskih biljaka, u koje je ugrađena nukleinska kiselina pronalaska, glifozatom. Mogu se procenjivati različita srodna (i čak nesrodna) svojstva, serijski ili paralelno, po izboru stručnjaka. Više detalja u pogledu rekombinacije i selekcije na otpornost na herbicide može da se

nađe u, npr. "DNA SHUFFLING TO PRODUCE HERBICIDE RESISTANT CROPS"

(USSN 09/373,333) od avgusta 1999.godine.

Opisi različitih procedura za generisanje diversiteta, u koje spada porodično mešanje i metodi za generisanje modifikovanih sekvenci nulekinske kiseline, koje kodiraju više enzimskih domena, mogu da se nađu u sledećim publikacijama i citiranim referencama: Soong i sar. (2000) 'Molecular breeding of viruses' Nat Genet 25(4):436-39; Stemmer i sar. (1999) 'Molecular breeding of viruses for targeting and other clinical properties' Tumor Targeting 4:1-4; Ness i sar. (1999) 'DNA shuffling of subgenomic sequences of subtilisin' Nature Biotechnologv 17:893-896; Chang i sar. (1999) 'Evolution of cvtokine using DNA family shuffling' Nature Biotechnology 17:793-797; Minshull i Stemmer (1999) 'Protein evolution by molecular breeding' Current Opinion in Chemical Biology 3:284-290; Christians i sar. (1999) 'Direct evolution of thymidine kinaze for AZT phosphorvlation using DNA family shuffling' Nature Biotechnology 17:259-264; Crameri i sar. (1998) 'DNA shuffling of a family genes from diverse species accelerates directed evolution' Nature 391:288-291; Crameri i sar. (1997) 'Molecular evolution of an arsenate detoxification pathway by DNA shuffling' Nature Biotechnology 15:436-438; Zhang i sar. (1997) 'Directed evolution of an effective fucosidase from a galactosidase by DNA shuffling and screening' Proc Natl Acad Sci USA 94:4504-4509; Patten i sar. (1997) 'Application of DNA Shuffling to Pharmaceuticals and Vaccines' Current Opinion in Biotechnology 8:724-733; Crameri i sar. (1996) 'Construction and evolution of antibody-phage libraries by DNA shuffling' Nature Medicine 2:100-103; Crameri i sar. (1996) 'Improved green fluorescent protein by molecular evolution using DNA shuffling' Nature Biotechnology 14:315-319; Gates i sar. (1996) 'Affinity selective isolation of liganda from peptide librariea through display on a lac repressor 'headpiece dimer" Journal of Molecular Biology 255:373-386; Stemmer (1996) 'Sexual PCR and Assembly PCR' U: The Encyclopedia of Molecular Biology. VCH Publishers, New York. str. 447-457; Crameri i Stemmer (1995) 'Combinatoriai multiple cassette mutagenesis creates ali the permutations of mutant and wildtype cassettes' BioTechniques 18:194-195; Stemmer i sar. (1995) 'Single-step assembly of a gene and entire plasmid from large numbers of oiigo-deoxy-ribonucleotides' Gene, 164:49-53; Stemmer (1995) 'The Evolution of Molecular Computation' Science 270:1510; Stemmer (1995) 'Searching Sequence Space' Bio/Technology 13:549-553; Stemmer (1994) 'Rapid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling' Nature 370:389-391, i Stemmer (1994) 'DNA shuffling by random fragmentation and reassembly: In vitro recombination for molecular evolution' Proc Natl Acad Sci USA 91: 10747-10751.

Mutacioni metodi za generisanje diversiteta obuhvataju, npr., mutagenezu usmerenu na (određeno) mesto (Ling i sar, (1997) 'Approaches to DNA mutagenesis: an overview' Anal Biochem 254(2): 157-178; Dale i sar. (1996) 'Oligonucleotide directed random mutagenesis using the phosphorothioate method' Methods Mol Biol 57:369-374; Smith (1985) 'In vitro mutagenesis' Ann Rev Genet 19:423-462; Botstein & Shortle (1985) 'Strategies and applications of in vitro mutagenesis' Science 229:1193-1201; Čarter (1986) 'Site-directed mutagenesis' Biochem J 237:1-7, i Kinkel (1987) 'The efficiency of oligonucleotide directed mutagenesis' u Nucleic Acids & Molecular Biology (Eckstein, F. i Lilley, D.M.J. eds., Springer Verlag, Berlin)); mutagenezu uz pomoć klišea koji sadrže uracil (Kunkel

(1985) 'Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection' Proc Natl Acad Sci USA 82:488-492; Kunkel i sar. (1987) 'Rapid and efficient site-specific mutagenesis vvithout phenotypic selection' Methods in Enzymol 154:367-382, i Bass i sar. (1988) 'Mutant Trp repressors with new DNA-binding specificities' Science 242:240-245); oligonukleotidom usmerenu mutagenezu (Methods in Enzymol 100:468-500 (1983), Methods in Enzymol 154:329-350 (1987); Zoller & Smith (1982) 'Oligonucleotide-directed mutagenesis using M13-derived vectors: an efficient and general procedure for the production of point mutations in any DNA fragment' Nucleic Acids Res 10:6487-6500; Zoller & Smith (1983) 'Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragments cloned into M13 vectors' Methods in Enzvmol 100:468-500, i Zoller & Smith (1987) 'Oligonucleotide-directed mutagenesis: a simple method using tvvo oligonucleotide primers and a single-stranded DNA template' Methods in Enzvmol 154:329-350), mutagenezu fosforotioatom modifikovane DNK (Taylor i sar. (1985) 'The use of phosphorothioate-modified DNA in restriction enzyme reactions to prepare nicked DNA' Nucl Acids Res 13:8749-8764; Taylor i sar. (1985) 'The rapid generation of oligonucleotide-directed mutations at high grequency using phosphorothioate-modified DNA' Nucl Acids Res 13:8765-8787; Nakamaye & Eckstein (1986) 'Inhibition of restriction endonuclease Nci I cleavage by phosphorothioate groups and its application to oligonucleotide-directed mutagenesis' Nucl Acids Res 14:9679-9698; Sayers i sar. (1988) 'Y-T Exonuclease in phosphorothioate-based oligonucleotide-directed mutagenesis' Nucl Acids Res 16:791-802, i Sayers i sar.

(1988) 'Strand specific cleavage of phosphorothioate-containing DNA by reaction with restriction endonucleases in the presence of ethidium bromide' Nucl Acids Res 16:803-814); mutagenezu pomoću prekinute dupleks DNK (Kramer i sar. (1984) 'The gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed mutation construction' Nucl Acids Res 12:9441-9456, Kramer & Fritz (1987) Methods in Enzymol 'Oligonucleotide-directed construction of mutations via gapped duplex DNA' 154:350-367; Kramer i sar. (1988) 'Improved enzymatic in vitro reactions in the gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed construction of mutations' Nucl Acids Res 16:7207; i Fritz i sar. (1988) 'Oligonucleotide-directed construction of mutations: a gapped duplex DNA procedure vvithout enzvmatic reactions in vitro' Nucl Acids Res 16:6987-6999).

U ostale pogodne metode spada i reparacija tačke nepodudaranja (Kramer i sar. (1984) 'Point Mismatch Repair' Cell 38:879-887), mutageneza pomoću nereparisanih sojeva domaćina (Čarter i sar. (1985) 'Improved oligonucleotide site-directed mutagenesis using M13 vectors' Nucl Acids Res 13:4431^443, i Čarter

(1987) 'Improved oligonucleotide-directed mutagenesis using M13 vectors' Methods in Enzvmol 154:382-403), deleciona mutageneza (Eghtedarzadeh & Heinkoff

(1986) 'Use of oligonucleotides to generate large deletions' Nucl Acids Res 14:5115), restrikcija-selekcija i restrikcija-selekcija i restrikcija-prečišćavanje (VVells i sar. (1986) 'Importance of hydrogen-bond formation in stabilizing the transition state of subtilisin' Phil Trans R Soc Lond A 317:415-423), mutageneza sintezom celovitog gena (Nambiar i sar. (1984) Total svnthesis and cloning of a gene coding for the ribonuclease S protein' Science 223:1299-13001; Sakamar i Khorana (1988) 'Total synthesis and expression of a gene for the a-subunit of bovine rof outer segment guanine nucleotide-binding protein (transducin)' Nucl Acids Res 14:6361-6372; VVells i sar. (1985) 'Cassette mutagenesis: an efficient method for generation of multiple mutations at defined sites' Gene 34:315-323; i Grundstrom i sar. (1985) 'Oligonucleotide-directed mutagenesis by microscale 'shot-gun' gene synthesis' Nucl Acida Res 13:3305-3316), reparacija prekida dvostrukog lanca (Mandecki

(1986); Arnold (1993) 'Protein engineering for unusual environments' Current Opinion in Biotechnology 4:450-455. 'Oligonucleotide-directed double-strand break repair in plasmids of escherichia coli: a method for site-specific mutagenesis' Proc Natl Acad Sci USA, 83:7177-7181). Više detalja o mnogim od pomenutih metoda može da se nađe u Methods in Enzymology, sv. 154, gde su takođe opisani korisni načini za uočavanje i rešavanje problema kod različitih metoda mutageneze.

Više o različitim metodima generisanja diversiteta može da se nađe u sledećim US patentima, PCT publikacijama i EPO publikacijama: US pat. br. 5,605,793 Stemmer (25. februar 1997), "Methods for In Vitro Recombination;" US Pat. br. 5,811,238 Stemmer i sar. (22. septembar 1998) "Methods for Generating Polynucleotides having Desired Characteristics by Iterative Selection and Recombination;" US Pat. br. 5,830,721 Stemmer i sar. (3. novembar 1998) "DNA Mutagenesis by Random Fragmentation and Reassembly;" US Pat. br. 5,834,252 Stemmer i sar. (10. novembar 1998) "End-Complementary Polymerase Reaction;" US Pat. br. 5,837,458 Minshull i sar. (17. novembar 1998) "Methods and Compositions for Cellular and Metabolic Engineering," WO 95/22625, Stemmer i Crameri, "Mutagenesis by Random Fragmentation and Reassembly;" WO 96/33207, Stemmer i Lipschutz "End Complementarv Polymerase Chain Reaction;" WO 97/20078, Stemmer i Crameri "Methods for Generating Polynucleotides having Desired Characteristics by Iterative Selection and Recombination;" WO 97/35966, Minshull i Stemmer "Methods and Compositions for Cellular and Metabolic Engineering," WO 99/41402, Punnonen i sar. "Targeting of Genetic Vaccine Vectors;" WO 99/41383, Punnonen i sar. "Antigen Librarv Immunization;" WO 99/41369, Punnonen i sar. "Genetic Vaccine Vector Engineering;" WO 99/41368, Punnonen i sar. "Optimization of lmmunomodulatory Properties of Gene Vaccines;" EP 752008, Stemmer i Crameri "DNA Mutagenesis by Random Fragmentation and Reassembly;" EP 0932670, Stemmer "Evolving Cellular DNA Uptake by Recursive Sequence Recombination;" WO 99/23107, Stemmer i sar. "Modification of Virus Tropism and Host Range by Viral Genome Shuffling;" WO 99/21979, Apt i sar. "Human Papillomavirus Vectors;" WO 98/31837, del Cardayre i sar. "Evolution of VVhole Cells and Organisms by Recursive Sequence Recombination," WO 98/27230, Patten i Stemmer "Methods and Compositions for Polvpeptide Engineering;" WO 98/13487, Stemmer i sar. "Methods for Optimization of Gene Therapy by Recursive Sequence Shuffling and Selection;" VVO 00/00632 "Methods for Generating Highly Diverse Libraries;" VVO 00/09679 "Methods for Obtaining in Vitro Recombined Polynucleotide Sequence Banks anf Resulting Sequences;" VVO 98/42832, Amold i sar. "Recombination of Polynucleotide Sequences Using Random or Defined Primers;" VVO 99/29902, Arnold i sar. "Methods for Creating Polynucleotide and Polypeptide Sequences;" VVO 98/41653, Vind "An in Vitro Method for Construction of a DNA Librarv;" VVO 98/41622, Borchert i sar. "Method for Constructing a Library Using DNA Shuffling", kao i VVO 98/42727, Pati i Zarling "Sequence Alterations Using Homologous Recombination;" VVO 00/18906, Patten i sar. "Shuffling of Codon-Altered Genes;" VVO 99/04190, del Cardayre i sar. "Evolution of VVhole Cells and Organisms by Recursive Recombination;" VVO 00/42561, Crameri i sar. "Oligonucleotide Mediated Nucleic Acid Recombination;" VVO 00/42559, Selifonov i Stemmer "Methods of Populating Data Structures for Use in Evolutionarv Simulations;" VVO 00/42560, Selifonov i sar. "Methods dor Making Character Strings, Polynucleotices & Polypeptides Having Desired Characteristics;" VVO 01/23401, VVelch i sar. "Use of Codon-Varied Oligonucleotide Synthesis for Synthetic Shuffling," i PCT/US01/06775 "Single-Stranded Nucleic Acid Template-Mediated Recombination and Nucleic Acid Fragment Isolation" od Affholtera.

Neke od US patentnih prijava daju detaljnije informacije o metodima generisanja diversiteta, npr. "SHUFFLING OF CODON ALTERED GENES", Patten i sar., od 28. septembra 1999. (USSN 09/407,800); "EVOLUTION OF VVHOLE

CELLS AND ORGANISMS BY RECURSIVE SEOUENCE RECOMBINATION", del

Cardavre i sar., od 15. jula 1998. (USSN 09/166,188), i 15. jula 1999. (USSN 09/354,922); "OLIGONUCLEOTIDE MEDIATED NUCLEIC ACID RECOMBINATION", Crameri i sar., od 28. septembra 1999. (USSN 09/408,392), i

"OLIGONUCLEOTIDE MEDIATED NUCLEIC ACID RECOMBINATION", Crameri i

sar. od 18. januara 2000. (PCT/USOO/01203); "USE OF CODON-BASED

OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS FOR SYNTHETIC SHUFFLING", VVelch i sar.

od 28. septembra 1999., (USSN 09/408,393); "METHODS FOR MAKING

CHARACTER STRINGS, POLYNUCLEOTIDES & POLYPEPTIDES HAVING

DESIRED CHARACTERISTICS", Selifonov i sar., od 18. januara 2000.

(PCT(US00/01202), kao i npr. "METHODS FOR MAKING CHARACTER STRINGS,

POLYNUCLEOTIDES & POLYPEPTIDES HAVING DESIRED

CHARACTERISTICS", Selifonov i sar. od 18. jula 2000. (USSN 09/618,579);

"METHODS OF POPULATING DATA STRUCTURES FOR USE IN

EVOLUTIONARY SIMULATIONS", Selifonov i Stemmer (PCT/US00/01138), od 18. januara 2000., i "SINGLE-STRANDED NUCLEIC ACID TEMPLATE-MEDIATED RECOMBINATION AND NUCLEIC ACID FRAGMENT ISOLATION", Affholter (USSN 60/186,482) od 2. marta 2000.godine

Ukratko, nekoliko različitih opštih kategorija metoda modifikovanja sekvence, npr. mutacija, rekombinacija, itd., primenljivo je na ovaj pronalazak i opisano u navedenim referencama. Znači, menjanje komponentnih sekvenci nukleinske kiseline, da bi se dobili sklopovi modifikovanih genskih fuzija, može da se vrši prema nekom od opisanih protokola, bilo pre sastavljanja sekvenci, bilo posle faze sastavljanja. Sledeće izlaganje ilustruje neke od različitih tipova pogodnih formata za generisanje diversiteta u kontekstu ovog pronalaska, uključujući i neke formate za generisanje diversiteta na bazi rekombinovanja.

Nukleinske kiseline se mogu rekombinovati in vitro na bilo koji od načina, diskutovanih u referencama, uključujući razgradnju nukleinske kiseline, koja će se rekombinovati, pomoću DNKze, nakon čega sledi ligacija i/ili PCR grupisanje nukleinskih kiselina. Na primer, može da se koristi seksualna PCR mutageneza, u kojoj se na nasumičnu (ili pseudo nasumičnu, ili čak ne-nasumičnu) fragmentaciju molekula DNK nastavlja in vitro rekombinacija, na bazi sličnosti sekvence, između molekula DNK sa različitim, ali srodnim DNK sekvencama, posle čega sledi fiksiranje proizvoda ukrštanja ekstenzijom, u okviru reakcije lanca polimeraze (PCR). Ovaj proces i i njegove varijante opisani su u navedenim referencama, npr. u Stemmer (1994) Proc Natl Acad Sci USA 91:10747-10751.

Na sličan način se nukleinske kiseline mogu rekursivno kombinovati in vivo, npr. omogućavanjem pojave rekombinacije između nukleinskih kiselina u ćeliji. U navedenim referencama su prikazani mnogi slični formati rekombinacije in vivo. Takvi formati, kao mogućnost, obezbeđuju direktnu rekombinaciju između nukleinskih kiselina od značaja, ili mogućnost rekombinacije između vektora, virusa, plazmida, itd. koji sadrže takve nukleinske kiseline, kao i niz drugih formata. Detaljne prikaze tih postupaka daju navedene reference.

Mogu da se koriste i metodi rekombinovanja čitavog genoma, što znači da se rekombinuju čitavi genomi ćelija ili drugih organizama, i kao mogućnost - u rekombinovane genomske smeše smeste komponente željene DNK datoreke (npr. geni koji odgovaraju putanjama reakcije iz ovog pronalaska). Ovi metodi imaju široku primenu, npr. u situacijama kada je identitet ciljnog gena nepoznat. Detaljan opis ovih metoda daje, npr., WO 98/31837, del Cardavre i sar. "Evolution of VVhole Cells and Organisms by Recursive Sequence Recombination" , kao i npr. PCT/US99/15972, del Cardavre i sar. pod istim nalsovom "Evolution of VVhole Cells and Organisms by Recursive Sequence Recombination". Svaki od ovih procesa i metoda za rekombinovanje, rekursivno rekombinovanje i rekombinovanje čitavog genoma, samostalno ili u kombinacijama, može da se koristi za generisanje modifikovanih sekvenci nukleinske kiseline i/ili modifikovanih genskih fuzionih sklopova ovog pronalaska.

Takođe, mogu da se koriste metodi sintetičkog rekombinovanja, u kojima se oligonukleotidi, koji odgovaraju metama od interesa, sintetišu i ponovo grupišu u reakcijama PCR ili ligacije, kojima su obuhvaćeni oligonukleotidi koji odgovaraju više nego jednoj roditeljskoj nukleinskoj kiselini, čime se generišu nove, rekombinovane nukleinske kiseline. Oligonukleotidi mogu da se dobiju standardnim metodima adicije nukleotida, ili pak npr. tri-nukleotidnim sintetičkim pristupom. Više detalja o tim pristupima daju već pomenute reference, npr. VVO 00/42561, Crameri i sar. "Oligonucleotide Mediated Nucleic Acid Recombination;" VVO 01/23401, VVelch i sar. "Use of Codon-Varied Oligonucleotide Svnthesis for Svnthetic Shuffling;" VVO 00/42560, Selifonov i sar. "Methods for making Character Strings, polvnucleotides and Polvpeptides having Desired Characteristics," kao i VVO 00/42559, Selifonov i Stemmer "Methods for Populating Data structures for Use in Evolutionarv Simulations."

Mogu da se primene metodi rekombinovanjain silicou kojima se u računaru koriste genetički algoritmi za rekombinovanje nizova sekvenci, koje odgovaraju homolognim (ili čak ne-homolognim) nukleinskim kiselinama. Dobijeni nizovi rekombinovanih sekvenci mogu da se konvertuju u nukleinske kiseline sintezom nukleinskih kiselina koje odgovaraju rekombinovanim sekvencama, npr. istovremeno sa metodima sinteze oligonukleotida/pregrupisavanja gena. Ovim pristupom mogu da se generišu nasumične, delimično nasumične ili predviđene varijante. Mnogi detalji u veziin silicorekombinovanja, uključujući korišćenje genetičkih algoritama, genetičkih operatera i sličnog u kompjuterskim sistemima, kombinovanih sa generisanjem odgovarajućih nukleinskih kiselina (i/ili proteina), kao i kombinacija projektovanih nukleinskih kiselina i/ili proteina (npr. na osnovu selekcije mesta ukrštanja), kao i projektovani, pseudo-nasumični ili nasumični metodi rekombinovanja, opisani su u VVO 00/42560, Selifonov i sar. "Methods for Making Character Strings, Polvnucleotides and Polvpeptides having Designed Characteristics" i VVO 00/42559, Selifonov i Stemmer "Methods for Populating data Structures for Use in Evolutionarv Simulations." Navedene patentne prijave daju veoma detalja, opširan opis metoda rekombinovanjain silico.Ova metodologija je primenljiva na pronalazak zbog toga što obezbeđuje rekombinovanje sekvenci nukleinskih kiselina i/ili sklopove fuzije gena, koji kodiraju proteine koji učestvuju u različitim metaboličkim reakcijama (npr. karotenoidnim biosintetičkim reakcijama, ektoinskim biosintetičkim reakcijama, polihidroksialkanoatnim biosintetičkim reakcijama, i si.) in silico, i/ili generisanje odgovarajućih nukleinskih kiselina ili proteina.

Na sličan način, mogu da se koriste mnogi metodi za postizanje prirodnog diversiteta, npr. hibridizacijom različitih nukleinskih kiselina ili fragmenata nukleinskih kiselina na klišee jednostrukog niza, posle koje sledi polimerizacija i/ili ligacija radi regenerisanja sekvence pune dužine, nakon čega može da sledi razgradnja klišea i prikupljanje rezultantnih modifikovanih nukleinskih kiselina. U jednom metodu, koji koristi kliše jednostrukog niza, populacija fragmenata dobijena iz genomskih datoteka, stapa se i učvršćuje sa delovima ili, često, gotovo punom dužinom ssDNK ili RNK, koji odgovaraju suprotnom nizu. Grupisanju kompleksnih himernih gena iz ove populacije posreduje uklanjanje nukleazne baze nehibridizovanih krajeva fragmenta, polimerizacija u cilju popunjavanja prekida između fragmenata i posledične jednolančane ligacije. Roditeljski polinukleidni niz može da se ukloni razgradnjom (npr. ako sadrži RNK ili uracil), magnetskom separacijom pod uslovima denaturisanja (ako je markiran tako da omogućava takvu

separaciju), kao i drugim metodima separacije/prečišćavanja. Alternativno, roditeljski lanac može da se pre-prečisti sa himemim nizovima i ukloni tokom sledstvenih faza pretraživanja/analize i obrade. Više detalja o ovom pristupu u, npr. "Single-Stranded Nucleic Acid Template-Mediated Recombination and Nucleic Acid Fragment Isolation," Affholter, PCT/US01/06775.

U drugom pristupu, molekuli jednostrukog niza se pretvaraju u DNK dvostrukog niza (dsDNK), a dsDNK molekuli se vezuju na čvrstu osnovu vezivanjem uz posredovanje liganda. Posle odvajanja nevezane DNK, selektovani molekuli DNK se oslobađaju sa podloge i uvode u pogodnu ćeliju domaćina da bi generisali sekvencu s obogaćenom datotekom, koja hibridizuje na sondu. Tako produkovana datoteka obezbeđuje željeni supstrat za dalju diversifikaciju uz pomoć neke od opisanih procedura.

Svaki od prethodnih opštih formata rekombinovanja može da se primenjuje aizmeničnim ponavljanjem (npr. jedan ili više ciklusa mutacija/rekombinacija ili drugih metoda generisanja diversiteta, posle kojeg može da sledi jedan ili više metoda selekcije) u cilju generisanja raznovrsnije garniture rekombinantnih nukleinskih kiselina.

Predlažu se, takođe, i metodi mutageneze pomoću prekidanja polinukleotidnog lanca (v. npr. US pat. br. 5,965,408 "Method of DNA reassemblv by interrupting synthesis", Short, i navedene reference), koji mogu da se primene na ovaj pronalazak. U tom pristupu, DNK dvostrukog niza, koja odgovara jednom ili više gena sa zajedničkim regijama sličnosti sekvence, kombinuju se i denaturišu i prisustvu ili odsustvu gen-specifičnih prajmera. Polinukleotidi s jedostrukim nizom se stapaju i inkubiraju u prisustvu polimeraze i reagensa za prekidanje lanca (npr. UV, gama ili rentgenskog zračenja; etidijum bromida ili drugog interkalatora; proteina koji vezuju DNK - npr. vezivnih proteina jednostrukog niza, faktora aktivacije transkripcije ili histona; policikličnih aromatičnih ugljovodonika; trovalentnog hroma ili njegovih soli, ili skraćene polimerizacije posredstvom brzog termocikliranja i si.), posledica čega je produkovanje parcijalnih dupleks molekula. Ovi molekuli, koji sadrže, npr. delimično produžene lance, zatim se denaturišu i ponovo stapaju narednim ciklusima replikacije ili parcijalne replikacije, čime se dobijaju polinukleotidi sa zajedničkim različitim stepenima sličnosti sekvenci, diversifikovani u odnosu na polaznu populaciju molekula DNK. Produkti ili parcijalni skupovi proizvoda mogu da se, u jednoj ili više faza procesa, amplifikuju. Polinukleotidi dobijeni opisanim metodom prekidanja lanca predstavljaju supstrate, pogodne za bilo koji od opisanih formata rekombinovanja.

Takođe, diversitet nukleinskih kiselina ili u populacijama nukleinskih kiselina može da se generiše primenom procedure rekombinovanja nazvane "rastuće kresanje u cilju stvaranja hibridnih enzima" (ITCHY), prikazane u Ostermeier i sar. (1999) "A combinatorial approach to hybrid enzymes independent of DNA homology" Nature Biotech 17:1205. Ovaj pristup može da se koristi za generisanje polazne DNK datoteke varijanti koje mogu da posluže kao supstrat za jedan ili više in vivo ili in vitro metoda rekombinacije. V. u Ostermeier i sar. (1999) "Combinatorial Protein Engineering by Incremental Truncation," Proc Natl Acad Sci USA, 96:3562-67; Ostermeier i sar. (1999) "Incremental Truncation as a Strategy in the Engineering of Novel Biocatalvsts," Biological and Medicinal Chemistry, 7:2139-44.

Metodi mutacije koji rezultuju menjanjem pojedinih nukleotida ili grupa susednih ili ne-susednih nukleotida, mogu uspešno da se primene za uvođenje nukleotidnog diversiteta u sekvence nukleinske kiseline i/ili fuzione genske sklopove ovog pronalaska. U navedenim referencama se mogu naći mnogi metodi mutageneze, a više detalja u vezi ovih metoda - primenljivih na pronalazak - daju i sledeće reference.

Na primer, PCR podložna grešci može da se koristi za generisanje varijanti nukleinske kiseline. U ovom metodu, PCR se obavlja u uslovima niske preciznosti kopiranja DNK polimeraze, takvim da se duž čitave dužine PCR produkta dobija veliki procenat mutacija tačaka. Primeri ovih metoda mogu da se nađu u gornjim referencama, kao i u npr. Leung i sar. (1989) Technigue 1:11-15 i Caldwell i sar.

(1992) PCR Methods Applic 2:28-33. Na sličan način, može da se koristi PCR grupisanja, i procesu koji obuhvata grupisanje PCR produkta iz smeše malih DNK fragmenata. U istoj reakcionoj smeši može da se istovremeno javi veliki broj različitih PCR reakcija, a produkti jedne reakcije pokreću produkte druge reakcije.

Mutageneza koju usmeravaju oligonukleotidi može da se koristi za uvođenje mutacija specifičnih za mesto u sekvencu nukleinske kiseline od interesa. Primere ovog metoda daju gornje reference, kao i npr. Reidhaar-Olson i sar. (1988) Science 241:53-57. Isto tako, kasetna mutageneza može da se koristi u procesu kojim se zamenjuje mali region molekula DNK dvostrukog niza sintetičkom oligonukleotidnom kasetom, koja se razlikuje od prirodne sekvence. Oligonukleotid može da sadrži, npr. potpuno i/ili delimično randomizovane prirodne sekvence.

Mutageneza rekursivnog skupa predstavlja proces u kojem se algoritam za mutagenezu proteina koristi za produkovanje različitih populacija fenotipski srodnih mutanata, čiji se članovi razlikuju po aminokiselinskoj sekvenci. Ovaj metod koristi autokorektivni mehanizam za praćenje uzastopnih ciklusa kombinatorne kasetne mutageneze. Primeri ovog pristupa mogu da se nađu u Arkin & Youvan (1992) Proc Natl Acad Sci USA 89:7811 -7815.

Mutageneza eksponencijalneg skupa može da se koristi za generisanje kombinatornih DNK datoteka sa visokim procentom jedinstvenih i funkcionalnih mutanta. Male grupe reziduuma u interesnoj sekvenci paralelno se randomizuju, na svakoj od promenjenih pozicija, radi identifikacije amino kiselina koje vode funkcionalnim proteinima. Primeri procedura u Delgrave & Youvan (1993) Biotechnologv Research 11:1548-1552.

Mutageneza in vivo može da se koristi za generisanje nasumičnih mutacija u svakoj od kloniranih DNK od interesa, reprodukovanjem DNK, npr. soja E. coli koji nosi mutacije, u jednoj ili više reakcija reparacije DNK. Ovi 'mutatorni' sojevi imaju veći nivo nasumične mutacije u poređenju sa prirodnim roditeljskim sojem. Reprodukovanje DNK u jedan ili više sojeva generisaće, na kraju, nasumične mutacije u DNK. Ove procedure su opisane u navedenim referencama.

Druge procedure za uvođenje diversiteta u genom, npr. genome bakterija, gljivica, životinja ili biljaka, mogu da se koriste zajedno sa prethodno opisanim i/ili nekim od metoda iz referenci. Na primer, pored opisanih metoda, predlažu se metodi koji produkuju multimere nukleinskih kiselina, pogodne za transformaciju u niz različitih vrsta (v. u npr. Schellenberger, US pat. br. 5,756,316 i navedene reference). Transformacija pogodnog domaćina takvim multimerima, koji se sastoje od uzajamno divergentnih gena (npr. izdvojenih iz prirodnog diverziteta ili primenom mutageneze usmerene na mesto, PCR podložne grešci, propuštanja kroz mutagene bakterijske sojeve, i si.), izvor je diversiteta nukleinskih kiselina za diversifikaciju DNK, npr. gore pomenutim procesom in vivo rekombinacije.

Alternativno, mnoštvo monomernih polinukleotida sa zajedničkim regionima delimične sličnosti sekvence, može da se transformiše u vrstu-domaćina i da ga ćelija domaćin rekombinuje in vivo. Sledstveni ciklusi deobe ćelije mogu da se koriste za generisanje DNK datoteka, koje obuhvataju pojedinačnu, homolognu populaciju, ili kolekciju monomernih polinukleotida. Alternativno, monomerna nukleinska kiselina može da se dobije standardnim metodima, npr. PCR i/ili kloniranjem, i da se rekombinuje u bilo kojem od formata rekombinovanja, uključujući opisane formate rekursivnog rekombinovanja.

Opisani su i metodi za generisanje ekspresionih datoteka za više vrsta (pored navedenih referenci, videti i u npr. Peterson i sar. (1998) US pat. br. 5,783,431 "METHODS FOR GENERATING AND SCREENING NOVEL METABOLIC PATHWAYS," kao i u Thompson i sar. (1998) US pat. br. 5,842,485

"METHODS FOR GENERATING AND SCREENING NOVEL METABOLIC

PATHWAYS"), kao i njihova primena u identifikovanju proteinskih aktivnosti od interesa (Videti, takođe, Short (1999) US pat. br. 5,958,672 "PROTEIN ACTIVITY

SCREENING OF CLONES HAVING DNA FROM UNCULTIVATED

MICROORGANISMS"). Ekspresione DNK datoteke za više vrsta obuhvataju, u principu, datoteke koje sadrže cDNK ili genomske sekvence mnoštva vrsta ili sojeva, operativno vezane na pogodne regulativne sekvence, a u ekspresionoj kaseti. cDNK i/ili genomske sekvence se mogu nasumično povezivati u cilju pojačavanja diversiteta. Vektor može da bude i transportni vektor, pogodan za transformaciju i ekspresiju u više od jedne vrste organizma domaćina, npr. bakterijske vrste, eukariotske ćelije. U nekim slučajevima, datoteka se predodređuje, selektovanjem sekvenci koje kodiraju protein od interesa unapred ili selektovanjem onih koje hibridizuju na nukleinsku kiselinu od interesa. Ovakve datoteke mogu da se obezbede i koriste kao supstrati za bilo koji od ovde opisanih metoda.

Opisane procedure su, uglavnom, usmerene na povećavanje diversiteta nukleinskih kiselina i/ili kodiranih proteina. U mnogim slučajevima, međutim, nisu svi diversiteti korisni, npr. funkcionalni, i doprinose tek povećanju razmera mase varijanti koje treba pretražiti ili analizirati da bi se identifikovao tek mali broj povoljnih varijanti. U nekim područjima primene, poželjno je unapred analizirati i pretražiti datoteke (npr. amplifikovane, genomske, cDNK, normalizovane datoteke, itd), ili druge supstratne nukleinske kiseline pre diversifikacije, npr. procedurama mutageneze na bazi rekombinovanja, ili drugačije skrenuti supstrate prema nukleinskim kiselinama koje kodiraju funkcionalne produkte. U slučaju dobijanja antitela, npr., proces generisanja diversiteta može da se usmeri prema antitelima sa mestima vezivanja funkcionalnog antigena, korišćenjem in vivo-rekombinacionih zbivanja pre manipulacije pomoću nekog od opisanih metoda. Rekombinovane CDR, dobijene iz cDNK datoteka B ćelije mogu, npr., da se amplifikuju i grupišu u regijama okvira (npr. Jirholt i sar. (1998) "Exploiting sequence space: shuffling in vivo formed complementaritv determining regions into a master framevvork" Gene 215:471) pre diversifikovanja nekim od opisanih metoda.

Datoteke mogu da se skrenu ka nukleinskim kiselinama koje kodiraju proteine sa željenim enzimskim aktivnostima. Na primer, posle identifikovanja klona koji ispoljava određenu aktivnost iz datoteke, klon se može mutagenisati nekim od poznatih metoda za uvođenje DNK promena. Datoteka koja sadrži mutagenizovane homologe analizira se i pretražuje na željenu aktivnost, koja može biti ista ili se razlikovati od inicijalno određene aktivnosti. Primer takve procedure prikazuje se u US pat. br. 5,939,250 za "PRODUCTION OF ENZYMES HAVING DESIRED ACTIVITIES BY MUTAGENESIS," Short (1999). Željene aktivnosti se mogu identifikovati bilo kojim od metoda koje struka poznaje. Na primer, VVO 99/10539 navodi da se genske datoteke mogu analizirati i pretraživati kombinovanjem ekstrakata genske datoteke sa komponentama dobijenim iz metabolički bogatih ćelija i identifikovanjem kombinacije koja ispoljava željenu aktivnost. Takođe se (u npr. VVO 98/58085) sugeriše da klonovi sa željenim aktivnostima mogu da se identifikuju umetanjem bioaktivnih supstrata u uzorke datoteke i detektovanjem bioaktivne fluorescencije, koja odgovara produktu željene aktivnosti, pomoću fluorescentnog analizatora, npr. flovv-citometra, CCDa, fluorometra ili spektrofotometra.

Datoteke se, takođe, mogu skrenuti ka nukleinskim kiselinama određenih karakteristika npr. hibridizacijom na odabranu sondu nukleinske kiseline. Patentna prijava VVO 99/10539, npr., iznosi stav da se polinukleotid, koji kodira željenu aktivnost (npr. enzimsku aktivnost, na primer: lipaznu, esteraznu, proteaznu, glikozidaznu, glikozil transferaznu, fosfataznu, kinaznu, oksigenaznu, peroksidaznu, hidrolaznu, hidrataznu, nitrilaznu, transaminaznu, amidaznu ili acilaznu) može identifikovati među genomskim DNK sekvencama na sledeći način. Molekuli DNK jednostrukog niza iz populacije genomske DNK hibridizuju se na ligandom konjugovanu sondu. Genomska DNK može da se dobije iz kultivisanih, kao i iz nekultivisanih mikroorganizama, ili iz prirodnog uzorka. Alternativno, genomska DNK može da se dobije iz višećelijskog organizma ili iz njegovog tkiva. Sinteza drugog niza može da se sprovede direktno iz hibridizacione sonde korišćene za prihvat, uz prethodno oslobađanje iz prihvatnog medijuma ili bez njega, ili nekom od mnoštva strategija koje struka poznaje. Alternativno, izolovana populacija genomske DNK jednostrukog niza može da se fragmentiše bez daljeg kloniranja, i koristi neposredno u, npr. pristupu na bazi rekombinovanja, koji koristi kliše jednostrukog niza, kao što je prethodno opisano.

"Ne-stohastičke" metode generisanja nukleinskih kiselina i polipeptida navodi VVO 00/46344, Short "Non-Stochastic Generation of Genetic Vaccines and Enzvmes." Ti metodi, uključujući i ponuđene metode ne-stohastičkog pregrupisavanja polinukleotida i mutageneze saturisanja mesta, mogu da se primene i na ovaj pronalazak. Opisana je i nasumična ili polunasumična mutageneza sa umrtvljenim ili degenerisanim oligonukleotidima, u npr. Arkin i Youvan (1992) "Optimizing nucleotide mixtures to encode specific subsets of amino acids for semi-random mutagenesis"Biotechnology10:297-300; Reidhaar-Olson i sar. (1991) "Random mutagenesis of protein sequences using oligonucleotide cassettes" Methods Enzvmol 208:564-86; Lim i Sauer (1991) "The role of internal packing interactions in determining the structure and stabilitv of protein" J Mol Biol 219:359-76; Brever i Sauer (1989) "Mutational analvsis of the fine specificitv of binding of monoclonal antibodv 51F to lambda repressor" J Biol Chem 264:13355-60, i "VValk-Through Mutagenesis" (Crea, R; US pat. br: 5,830,650 i 5,798,208, kao i EP pat. 0527809 B1.

Lako je proceniti da se svaki od navedenih metoda za obogaćivanje datoteke pre diversifikacije može koristiti i za analizu i izdvajanje produkata, ili datoteka produkata, produkovanih metodima generisanja diversiteta. Svaki od opisanih metoda može da se praktikuje rekursivno ili u kombinaciji u cilju menjanja nukleinskih kiselina, npr. polinukleotida za kodiranje GAT.

Kompleti reagensa i alata za mutagenezu, konstrukciju datoteke i druge metode generisanja diversiteta komercijalno su dostupni i mogu da se nabave od firmi npr. Stratagen (npr. OuickChange™ site-directed mutagenesis kit i Chameleon™ double-stranded, site-directed mutagenesis kit), Bio/Can Scientific, Bio-Rad (npr. koji koristi opisani Kunkelov metod), Boehringer Mannheim Corp., Clonetech Laboratories, DNA Technologies, Epicentre Technologies (npr. 5 prime 3 prime komplet), Genpak Ine, Lemargo Ine, Life Technologies (Gibco BRL), New England Biolabs, Pharmacia Biotech, Promega Corp., Ouantum Bio-technologies, Amersham International plc (npr. koji koristi opisani Ecksteinov metod), ili Anglian Biotechnologv Ltd. (koristi pomenuti CarterAA/inter metod).

Navedene literaturne reference nude mnoge mutacione formate, među njima i rekombinovanje, rekursivno rekombinovanje, rekursivnu mutaciju i kombinacije rekombinovanja sa drugim oblicima mutageneze, kao i mnoge modifikacije ovih formata. Nezavisno od korišćenog formata za generisanje diversiteta, nukleinske kiseline ovog pronalaska mogu da se rekombinuju (međusobno ili sa srodnim ili, čak, nesrodnim sekvencama) tako da daju drugačiju garnituru rekombinantnih nukleinskih kiselina za primenu u sklopovima genske fuzije i modifikovanim sklopovima genske fuzije ovog pronalaska, među njima i, npr. garniture homolognih nukleinskih kiselina, kao i odgovarajuće polipeptide.

Mnoge od opisanih metodologija za generisanje modigfikovanih polinukleotida, generišu i mnogobrojne različite varijante roditeljske sekvence ili sekvenci. U nekim pogodnim oblicima pronalaska, koristi se metod modifikacije (npr. neki oblik mešanja) za gnerisanje datoteke varijanti, koja se potom analizira i pretražuje na modifikovane polinukleotide ili skupove modifikovanih polinukleotida koji kodiraju neki od željenih funkcionalnih atributa, npr. veću GAT aktivnost. Primeri enzimskih aktivnosti koje se mogu tako analizirati i pretraživati su npr. brzina katalize (konvencionalno iskazana preko kinetičkih konstanti, npr. kcati Km), specifičnost za supstrat, podložnost aktivaciji ili inhibiciji supstratom, produktom ili drugim jedinjenjima (npr. inhibitorima ili aktivatorima).

Primer selekcije na željenu enzimsku aktivnost podrazumeva uzgajanje ćelija domaćina u uslovima koji inhibišu raszvoj i/ili opstanak ćelija koje nedovoljno eksprimiraju enzimsku aktivnost od interesa, npr. GAT aktivnost. Korišćenjem ovog procesa selekcije, eliminišu se svi modifikovani polinukleotidi, osim onih koji kodiraju željenu enzimsku aktivnost. U nekim oblicima pronalaska, npr., ćelije domaćini se ostavljaju da stoje u uslovima koji inhibišu razvoj ćelija ili njihov opstanak u odsustvu dovoljnih nivoa GAT, npr. koncentracije glifozata koja ubija ili inhibiše razvoj prirodne biljke iste vrste kojoj nedostaje i koja ne eksprimira GAT polinukleotid. Pod ovim uslovima, opstaće i razvijaće se samo ćelija domaćin, koja sadrži modifikovanu nukleinsku kiselinu koja kodira enzimsku aktivnost ili aktivnosti, sposobne da katalizuju stvaranje dovoljnih nivoa produkta. Neki od oblika pronalaska podrazumevaju više ciklusa analiza i pretraživanja pri rastućim koncentracijama glifozata ili analoga glifozata.

U nekim oblicima pronalaska je, za detektovanje acetilacije glifozata, analoga ili metabolita glifozata, korišćena mas-spektrometrija. Primena mas-spektrometrije je detaljnije opisana u Primerima koji slede.

Zbog podesnosti i visoke propusne moći, često je poželjno da se analiza i pretraživanje, odnosno selektovanje željenih modifikovanih nukleinskih kiselina vrši na mikroorganizmu, npr. bakteriji kao E. coli. S druge strane, u slučajevima, kad je krajnji cilj generisanje modifikovane nukleinske kiseline u cilju ekspresije u biljnom sistemu, biljne ćelije ili biljke su pogodnije.

U nekim pogodnim oblicima pronalaska, propusna moć se povećava analizom i pregledanjem kolekcija ćelija domaćina, koje eksprimiraju različite modifikovane nukleinske kiseline, bilo kao samostalne, bilo kao deo genskog fuzionog sklopa. Sve kolekcije koje pokazuju znatnu aktivnost mogu da se razviju/isprave radi identifikovanja pojedinačnih klonova koji eksprimiraju poželjnu aktivnost.

Stručnjaku je jasno da će izbor odgovarajućeg testa, metoda pregleda i selekcije zavisiti od željenog organizma domaćina. Obično je korisno primeniti test koji se može izvoditi u formatu visoke propusne moći.

U testovima velike propusne moći može se dnevno analizirati i pregledati i do nekoliko hiljada različitih varijanti. Na primer, svako od udubljenja na mikrotitarskoj ploči može da se koristi za sprovođenje zasebnog testa ili, ukoliko je potrebno da se prate efekti koncentracije i vremena inkubacije, za testiranje jedne varijante može da služi svakih 5-10 udubljenja.

Pored fluidnih pristupa, kao što je već navedeno, ćelije se mogu jednostavno uzgajati na pločama s podlogama, selektivnim na željenu enzimsku ili metaboličku funkciju. Ovaj pristup omogućava jednostavan visokopropustan metod za pregled.

Za analiziranje hemizma u fazama rastvora razvijen je i dostupan niz robot-sistema. Među njih spadaju kompjuterizovane radne stanice, npr. kompjuterizovani aparat za sintezu (Takeda Chemical Industries, LTD, Osaka, Japan), kao i brojni robotizovani sistemi sa robotizovanim rukama (Zvmate II, Zvmark Corporation, Hopkinton, MA; Orca, Hevvlett-Packard, Palo Alto, CA), koji podražavaju manuelne operacije pri sintezi. Svako od pomenutih sredstava može da se koristi za potrebe ovog pronalaska. Stručnjak će razumeti prirodu i primenljivost modifikacija (ako postoje) ovih sredstava u smislu njihovog prilagođavanja radu u integrisanom sistemu.

Na tržištu se mogu nabaviti sistemi za pregledanje velike propusne moći (npr. Zvmark Corp., Hopkinton, MA; Air Technical Industries, Mentor, OH; Beckman Instruments, Inc. Fullerton, CA; Precision Svstems, Inc., Natick, MA, itd.). Ti sistemi, obično, kompjuterizuju čitave procedure, uključujući i pipetiranje uzorka i reagensa, razmeravanje tečnosti, oročavanje trajanja inkubacije, i završno očitavanje mikroploče u detektoru za (konkretni) test. Ovi sistemi, koji se mogu konfigurisati, obezbeđuju veliku propusnost, brzo pokretanje (procedure), visok stepen fleksibilnosti i prilagođavanja specifičnim potrebama.

Proizvođači ovih sistema prilažu detaljne protokole za različite visokopropusne uređaje. Tako, npr. Zvmark Corp. daje tehničke biltene sa opisom sistema za pregled za detektovanje modulacija genske transkripcije, vezivanje liganda i si. Konstruisani su i uređaji za mikrofluidnu manipulaciju reagensima (npr. Caliper Technologies, Mountain View, CA).

Optičke slike koje čita (i, kao mogućnost, beleži) kamera ili drugi uređaj (npr. fotodiodni ili uređaj za memorisanje podataka), mogu dalje da se obrađuju u svakom od iznetih oblika, npr. digitalizacijom slike i/ili čuvanjem i analiziranjem slike na kompjuteru. Komercijalno je dostupna široka gama periferne opreme i softvera za digitalizaciju, čuvanje i analiziranje digitalizovanih video ili optičkih slika, npr. primenom PCja (Intel x86 ili kompjuteri na bazi pentijumskom čipu kompatibilnog DOS™, OS™, VVINDOVVS NT™ ili VVINDOVVS 95™), kompjuteri na bazi MACINTOSH™ ili UNIX (npr radne stanice SUN™).

Jedan od konvencionalnih sistema prenosi svetlost od test uređaja do CCD kamere, često korišćene u struci. CCD kamera sadrži čitav niz elemenata slike (piksela). Svetlost iz uzorka se formira u sliku na CCD. Određeni pikseli, koji odgovaraju regijama uzorka (npr. pojedina mesta hibridizacije na nizu bioloških polimera) uzorkuju se radi očitavanja svetlosnog intenziteta za svaku od pozicija. Radi brže obrade, obrađuje se istovremeno više piksela. Za vizuelni pregled nekog uzorka, npr. fluorescentnim metodom ili metodom mikroskopije tamnih polja, opisani aparat i metodi pronalaska se koriste s lakoćom.

DRUGI POLIPEPTIDNI ARANŽMANI

Pronalazak obuhvata i aranžmane/sklopove koji sadrže dva ili više polinukleotida pronalaska (npr. kao supstrate za rekombinovanje). Aranžman može da čini datoteka rekombinantnih nukleinskih kiselina, gde datoteka sadrži najmanje 2, 3, 5, 10, 20, 50 ili više polinukleotida. Polinukleotidi se mogu klonirati u ekspresione vektore, čime se dobijaju ekspresione DNK datoteke.

Pronalazak obuhvata i aranžmane dobijene razgradnjom jednog ili više polinukleotida pronalaska pomoću restrikcione endonuklease, RNKze ili DNKze (kao, npr. u nekim od opisanih formata rekombinovanja), kao i aranžmane dobijene fragmentisanjem ili mehaničkim isecanjem jednog ili više polipeptida pronalaska (sonikacijom, vorteksovanjem i si.), koji se mogu koristiti kao supstrati za rekombinovanje u okviru pomenutih metoda. Aranžmani koje čine setovi oligonukleotida, koji odgovaraju većem broju nukleinskih kiselina pronalaska, mogu da se koriste kao supstrati za rekombinovanje i istaknuta su karakteristika pronalaska. U cilju komfora, ove fragmentisane, isečene ili oligonukleotidom sintetisane smeše nazivaju se garniturama fragmentisane nukleinske kiseline.

Pronalazak obuhvata i aranžmane produkovane inkubiranjm jedne ili više garnitura fragmentisane nukleinske kiseline u prisustvu ribonukleotidnih i dezoksiribonukleotidnih trifosfata i polimeraze nukleinske kiseline. Ovako doijen aranžman obrazuje rekombinacionu smešu za mnoge pomenute formate rekombinovanja. Polimeraza nukleinske kiseline može da bude RNK polimeraza, DNK polimeraza ili RNK-vođena DNK polimeraza (npr. 'reverzna transkriptaza'); polimeraza može da bude, npr. termostabilna DNK polimeraza (npr. VENT, TAQ i si.).

INTEGRISANI SISTEMI

Pronalazak govori o kompjuterima, kompjuterski čitljivim mediujumima i integrisanim sistemima koji sadrže karakterne nizove koji odgovaraju informacijama o sekvencama za polipeptide i nukleinske kiseline pronalaska, uključujući, npr. ovde nabrojane sekvence, kao i različite neme supstitute i konzervativne supstitute navedenih sekvenci.

Za detektovanje homologije ili sličnosti između različitih karakternih nizova mogu da se koriste različiti metodi i genetički algoritmi, a mogu se koristiti i za obavljanje drugih željenih funkcija, npr. kontrolu dokumenata, formiranje baze za prezentacije saznanja, uključujući sekvence i si. U primerima se navodi i prethodno diskutovan BLAST.

Tako različiti tipovi homologijje i sličnosti različitih (nivoa) striktnosti i dužine mogu da se detektuju i prepoznaju na ovde opisanim integrisanim sistemima. Na primer, brojni metodi za određivanje homologije su konstruisani za komparativnu analizu sekvenci biopolimera, za proveru pisanja pri obradi teksta, kao i za pristup podacima iz različitih baza podataka. Razumevanje interakcija komplementa parova dvostrukog heliksa između 4 glavne nukleo baze u prirodnim polinukleotidima, mogu da se koriste i modeli koji simuliraju stapanje komplementarnih homolognih nizova polinukleotida, kao osnova za poravnavanje sekvenci i druge operacije koje se obično obavljaju na karakterinim nizovima koji odgovaraju ovde iznetim sekvencama (npr. obrada teksta, sklapanje slika koje čine karakterni nizovi sekvenci ili podsekvenci, izradu rezultatskih tabela, itd.). Primer softverskog paketa sa GAovima za izračunavanje sličnosti sekvenci je BLAST, koji se može prilagoditi ovom pronalasku unošenjem karakternih nizova koji odgovaraju predmetnim sekvencama.

Takođe i standardne kompjuterske aplikacije, npr. softver za obradu teksta (npr. Microsoft Word™ ili Corel VVordPerfect™), softver baze podataka (npr. Microsoft Excel™, Corel OuattroPro™, ili programi baze podataka npr. Microsoft Access™ ili Paradox™) mogu da se prilagode ovom pronalasku unošenjem karakternih nizova koji odgovaraju GAT homolozima pronalaska (nukleinskim kiselinama ili proteinima ili oboje). Integrisani sistemi, npr., mogu da obuhvate navedene softvere sa odgovarajućim informacijama o karakternim nizovima, koji se koriste npr. povezani korisničkim interfejsom (GUI u standardnim operativnim sistemima tipa Windows, Macintosh ili LINUX sistema) za manipulisanje karakternih nizova. U sisteme pronalaska može da se ugradi i specijalizovani program za poravnavanje, npr. BLAST, radi poravnavanja nukleinskih kiselina ili proteina (ili odgovarajućih karakternih nizova).

Integrisani sistemi za analizu ovog pronalaska obično obuhvataju digitalni kompjuter sa GA softverom za poravnavanje sekvence, kao i setove podataka koji se sastoje od navedenih sekvenci, unete u softverski sistem. Kompjuter može da bude npr. PC (Intel x86 ili kompjuteri na bazi pentijumskom čipu kompatibilnog DOS™, OS™, VVINDOVVS NT™ ili VVINDOVVS 95™,WINDOWS 98™, na bazi LINUXa, MACINTOSH™, Power PC ili na bazi UNIX (npr. radne stanice SUN™), ili neki drugi komercijalno dostupan, poznat stručnoj javnosti. Softver za poravnavanje ili drugu vrstu manipulisanja sekvencama može da se nabavi ili ga stručnjak može sam formirati pomoću strandardnih jezika programiranja, kao što su VisualBasic, Fortran, Java i si.

Svaki kontroler ili kompjuter može da ima svoj monitor, često katodni (CRT) displej, ravnu displej tablu (npr. aktivni matrični LCD, običan LCD) ili drugo. Kompjuterske ploče su često smeštene u kućištu, zajedno sa velikim brojem integrisanih čipova, npr. mikroprocesorskim, memorijskim, interfejsnim i si. kolima. U kućištu mogu da se smeste i glavni memorijski disk, drajv za diskete, visokokapacitetni pokretni drajv, npr. CD-ROM, kao i druge uobičajene periferijske elemente. Elementi za unos podataka - tastatura ili miš, omogućavaju korisniku da unosi podatke i da selektovuje sekvence za poređenje ili manipulaciju na drugi način u odgovarajućem kompjuterskom sistemu.

U kompjuteru se obično nalazi odgovarajući softver koji prima instrukcije od korisnika, bilo u obliku unosa podataka u definisana parametarska polja, npr. u GUI, ili u obliku unapred programiranih instrukcija, npr. unapred programiranih za različite specifične operacije. Softver potom prevodi te instrukcije na jezik koji usmerava funkcije za obavljanje i sprovođenje željene operacije.

Softver može da obuhvati i izlazne elemente za kontrolu sinteze nukleinske kiseline (npr. na osnovi sekvence ili poravnavanja iznetih sekvenci), ili drugih operacija koje se odvijaju posle poravnanja, ili pak drugih operacija koje se obavljaju uz primenu karakternog niza koji odgovara ovde navedenim sekvencama. Oprema za sintezu nukleinske kiseline može da predstavlja, dakle, komponentu jednog ili više pomenutih integrisanih sistema.

U jednom od svojih aspekata, pronalazak daje komplet potrebne opreme koji sadrži, u odgovarajućem obliku, metode, kompozicije, sisteme i instrumentarijum za potrebe ovog pronalaska. Komplet opreme pronalaska može da se sastoji od jednog ili više elemenata: (1) ovde pomenutih aparata, sistema, komponenata sistema ili aparata; (2) uputstava za praktičnu primenu ovde opisanih metoda i korišćenjeapara\ aili komponentiaparata,i/ili za korišćenje opisanih kompozicija; (3) jedne ili više GAT kompozicija ili komponenti; (4) suda za prihvat i čuvanje komponenata ili kompozicija, i (5) materijala za pakovanje.

U svom daljem aspektu, izneti pronalazak omogućava korišćenje nekog od pomenutih aparata, komponenti aparata, kompozicije ili kompleta opreme i reagensa za praktično izvođenje nekog/svakog od pomenutih metoda ili testova, kao i korišćenje nekog aparata ili kompleta opreme za obavljanje testova i primenu opisanih metoda.

ĆELIJE I ORGANIZMI DOMAĆINI

Ćelije domaćini mogu biti eukariotične (npr. eukariotična ćelija, biljna ćelija, životinjska ćelija, protoplast ili tkivna kultura). Domaćinske ćelije mogu da

podrazumevaju i mnoštvo ćelija, npr. čitav organizam. Ćelije domaćini, alternativno, mogu da budu prokariotične i da obuhvataju ne samo bakterije (tj. gram pozitivne bakterije, purpurne bakterije, zelene sumporne bakterije, zelene ne-sumporne bakterije, cinobakterije, spirohete, termatogale, flavobakterije i bakteroides), već i arhebakterije (tj. Korarcheota, Thermoproteus, Pvrodictium, Thermococcales, metanogene, Archaeoglobus, i ekstremne halofile).

Transgenske biljke ili biljne ćelije koje sadrže GAT nukleinske kiseline i/ili eksprimiraju GAT polipeptide ovog pronalaska, karakteristika su pronalaska. Transormacija biljnih ćelija i protoplasta može da se sprovede na svaki od načina koje poznaju stručnjaci za biljnu molekularnu biologiju, pa tako i pomoću ovde opisanih metoda, i ne samo pomoću njih. VidetiMethods in Enzymology,sv. 153( Recombinant DNA Part D),VVu i Grossman (eds.) 1987, Academic Press, referencom zastupljen u ovom izlaganju. U značenju u kojem je ovde primenjen, termin 'transformacija' označava menjanje genotipa ćelije domaćina uvođenjem sekvence nukleinske kiseline, npr. 'heterologne' ili 'strane' sekvence nukleinske kiseline. Heterologna sekvenca nukleinske kiseline ne mora da potiče iz drugačijeg izvora, ali će, u jednoj tački, ćeliji u koju se uvodi biti potpuno strana.

Uz Berger, Ausubel i Sambrook, korisne opšte reference za kloniranje, kultivisanje i regenerisanje biljnih ćelija obuhvataju i Jones (ed) (1995) Plant Gene Transfer and Expression Protocols - Methods in Molecular Biologv. sv. 49 Humana Press Towata NJ; Payne i sar. (1992) Plant Cell and Tissue Culture in Liguid Svstems John Wiley & Sons, Inc. New York, NY (Payne), i Gamborg i Phillips (eds)

(1995) Plant Cell, Tissue and Organ Culture: Fundamental Methods Springer Lab Manual, Springer-Verlag (Berlin, Heidelberg, New York (Gamborg). Različite podloge za kulturu ćelija opisane su u Atlas i Parks (eds) The Handbook of Microbiological Media (1993) CRC Press, Boca Raton, FL (Atlas). Dalje informacije za kulturu biljnih ćelija mogu da se nađu u komercijalno dostupnoj literaturu, npr. u Life Science Research Cell Culture Catalogue (1998) Sigma-Aldrich, Ine (St Louis, MO) (Sigma-LSRCCC) i, npr. Plant Culture Catalogue sa dodacima (1997), takođe Sigma -Aldrich, Ine (St Louis, MO) (Sigma-PCCS), kao i u Croy (ed) (1993) Plant Molecular Biology Bios Scientific Publishers, Oxford, U.K. U jednom od oblika pronalaska, pripremaju se rekombinantni vektori koji sadrže jedan ili više GAT polinukleotida, pogodnih za transformaciju biljne ćelije. Sekvenca DNK kojom se kodira željeni GAT polipeptid, npr. selektovana među SEQ ID br: 1-5 i 11-262, prikladno je primenjena za sklapanje rekombinantne ekspresione kasete, koja se može uvesti u željenu biljku. U smislu ovog pronalaska, eskpresiona kaseta obično sadrži odabrani GAT polinukleotid, operativno vezan na promotersku sekvencu i druge regulatorne sekvence za pokretanje transkripcije i translacije, dovoljne da usmere transkripciju GAT sekvence u predviđena tkiva (npr. celu biljku, listove, korenje, itd.) transformisane biljke.

Jako ili slabo konstitutivni biljni promoter, koji usmerava ekspresiju GAT nukleinske kiseline u sva tkiva biljke može, npr., da se efikasno primeni. Ti promoteri su aktivni u gotovo svim prirodnim uslovima i na svim nivoima ćelijskog razvoja ili diferencijacije. Primeri konstitutivnih promotera su 1'- ili 2'-promoterAgrobacterium tumefaciens,kao i druge inicijacione regije iz različitih biljnih gena koje struka poznaje. U slučaju da preterano eksprimiranje GAT polipeptida štet biljci, stručnjak će se opredeliti za primenu slabog konstitutivnog promotera da bi se postigla ekspresija slabog intenziteta. Ukoliko visoki nivoi ekspresije ne štete biljci, može da se koristi jaki promoter, npr. t-RNK, drugi pol III promoter ili jaki pol II promoter (npr. promoter CaMV, 35S promoter).

Biljni promoter može, alternativno, da bude pod prirodnom kontrolom, kontrolom okruženja. To su tzv. 'pobudljivi' promoteri. Primeri prirodnih uslova koji mogu da menjaju transkripciju pomoću pobudljivih promotera obuhvataju napad patogenih organizama, aerobne uslove ili prisustvo svetlosti. U nekim slučajevima, poželjno je korišćenje promotera specifičnih za tkivo, razvojem-kontrolisanih, tako da se GAT polinukleotid eksprimira samo u nekim tkivima ili nekim fazama razvoja, npr. listova, korenova, izdanaka, itd. Endogeni promoteri gena vezanih za otpornost na herbicide i srodni fenotipi su od posebne koristi za pokretanje ekspresije GAT nukleinskih kiselina, npr. P450 monooksigenaze, glutation-S-transferaze, hemoglutation-S-transferaze, glifozat oksidaze i 5-enolpiruvilšikimat-2-fosfat sintaze.

Promoteri specifični za tkivo mogu da se koriste za usmeravanje ekspresije strukturno heterolognih gena, uključujući i ovde opisani GAT polinukleotid. Promoteri, tako, mogu da se koriste u rekombinantnim ekspresionim kasetama za pokretanje ekspresije nekog gena, čija je ekspresija u transgenskim biljkama pronalaska poželjna, npr. GAT i/ili drugih gena koji prenose otpornost na herbicide ili herbicidnu podnošljivost, gena koji utiču na druge korisne karakteristike, npr. heterozu. Slično tome, elementi pojačivači, npr. dobijeni iz 5' regulatorne sekvence ili introna heterolognog gena, mogu da se koriste za poboljšanje ekspresije strukturno heterolognog gena, npr. GAT polinukleotida.

Konkretni promoter korišćen u ekspresionoj kaseti kod biljaka zavisiće, u principu, od predviđene primene. Pogodnim se može smatrati svaki od niza promotera koji usmeravaju transkripciju u biljnim ćelijama. Promoter može da bude konstitutivan ili pobudljiv. Pored navedenih promotera, u promotere bakterijskog porekla koji funkcionišu u biljkama, spadaju promoter oktopin sintaze, promoter nopalin sintaze, kao i drugi promoteri izdvojeni iz Ti plazmida.Videti uHerrera-Estrella i sar. (1983) Nature 303:209. Među promotere virusnog porekla spadaju 35S i 19S RNK promoteri CaMV.( Videti,Odell i sar. (1985) Nature 313:810. Ostali biljni promoteri obuhvataju promoter male podjedinice ribuloza-1,3-bifosfat karboksilaze i fazeolinski promoter. Promoterska sekvenca iz gena E8( Videti,Deikman i Fischer (1988) EMBO J 7:3315) kao i drugi geni pokazali su se korisnim. Razmatranjem su obuhvaćeni i promoteri specifični za monokotiledonske vrste (McEIrov D., Brettel R.I.S. 1994. Foreign gene expression in transgenic cereals. Trends Biotech., 12:62-68). Novi promoteri sa korisnim karakteristikama mogu da se identifikuju iz svakog virusnog, bakterijskog ili biljnog izvora, metodima koje struka poznaje, npr. analizom sekvence, poklapanjem pojačivača ili promotera, i si.

U pripremanju ekspresionih vektora pronalaska, s uspehom se koriste sekvence različite od promotera, kao i geni za kodiranje GAT. Ako je cilj adekvatna ekspresija polipeptida, iz prirodnog gena, različitih gena drugih biljaka, ili iz T-DNK može da se izdvoji regija poliadenilacije. Takođe mogu da se koriste signalni/lokalizacioni peptidi koji, npr. olakšavaju translokaciju eksprimiranog polipeptida u unutrašnje organele (npr. hloroplaste) ili ekstraćelijsku sekreciju.

Vektor koji sadrži GAT polinukleotid može, takođe, da sadrži i markerski gen, koji biljnim ćelijama prenosi izborni fenotip. Marker može, npr. da kodira podnošljivost za biocide, konkretno pondnošljivost za antibiotike (npr. kanamicin, G418, bleomicin, higromicin) ili podnošljivost za herbicide (npr. hlorosulfuron ili fosfinotricin). Geni-reporteri, korišćeni za praćenje ekspresije gena i lokalizaciju proteina preko produkata reakcije koja se može vizuelizovati (npr. beta-glukuronidaze, beta-galaktozidaze, hloramfenikol acetiltransferaze) ili direktnom vizuelizacijom samog genskog produkta (npr. zelenog fluorescentnog proteina, GFP; Sheen i sar. (1995) The Plant Journal 8:777), mogu da se koriste za npr. praćenje tranzitorne ekspresije gena u biljnim ćelijama. Tranzitorni ekspresioni sistemi mogu da se primene na biljne ćelije, npr., u cilju izdvajanja kultura biljnih ćelija na aktivnost(i) herbicidne podnošljivosti.

TRANSFORMACIJA BILJKE

Protoplasti

Stručna javnost raspolaže brojnim protokolim za dobijanje protoplasta sklonih transformisanju iz različitih vrsta biljaka, kao i za posledičnu transformaciju kultivisanih protoplasta. Primeri u Hashimoto i sar. (1990) Plant Phvsiol 93:857; Fovvke i Constabel (eds) (1994) Plant Protoplasts; Saunders i sar. (1993) Application of Plant In Vitro Svmposium UPM 16-18, i Lvznik i sar. (1991) BioTechnigues 19:295, a svi su ovde inkorporisani referencama.

Hloroplasti

Hloroplasti su mesta dejstva za neke od aktivnosti tolerancije na herbicide, a u nekim slučajevima se GAT polinukleotid fuzioniše sa peptidom hloroplastne tranzitne sekvence čime olakšava translokaciju genskih produkata u hloroplast. U takvim slučajevima, korisna bi bila transformacija GAT polinukleotida u hloroplast biljnih ćelija domaćina. Postoje brojni metodi za transformaciju i ekspresiju hloroplasta V. npr. Daniell i sar. (1998) Nature Biotechnologv 16:346; O'Neill i sar.

(1993) The Plant Journal 3:729; Maliga(1993) TIBTECH 11:1). Ekspresioni sklop sadrži sekvencu regulacije transkripcije, koja funkcioniša kod, biljaka operativno vezana na polinukleotid koji kodira GAT polipeptid. Ekspresione kasete, koje su koncipirane tako da funkcionišu u hloroplastima (npr. ekspresiona kaseta sa GAT polinukleotidom), sadrže sekvence neophodne za obezbeđivanje ekspresije u hloroplaste. Obično se na bočnim pozicijama kodirajuće sekvence nalaze dve regije homologije sa genomom hloroplastida, sa zadatkom da realizuju homologno rekombinovanje sa genomom hloroplasta; često se, u sastavu bočnih plastidnih DNK sekvenci nalazi i izborni markerski gen, koji olakšava selekciju genetski stabilno transformisanih hloroplasta dobijenim transplastonskim biljnim ćelijama (V. npr. Maliga (1993) i Daniell (1998) i priključene literaturne reference).

Opšti metodi transformacije

DNK sklopovi pronalaska mogu da se uvedu u genom željene biljke domaćina pomoću niza različitih konvencionalnih metoda. Metodi za transformisanje mnogobrojnih viših biljaka dobro su poznati i opisani u tehničkoj i naučnoj literaturi.Videtinpr. Payne, Gamborg, Croy, Jones, itd.supra,kao i u npr. VVeising i sar. (1988) Ann Rev Genet 22:421.

DNK se, npr., mogu direktno uvesti u genomsku DNK biljne ćelije primenom metoda kao što su elektroporacija i mikroinjektovanje protoplasta biljne ćelije, ili se DNK sklopovi mogu uvesti direktno u biljno tkivo balističkim metodima, npr. bombardovanjem česticama DNK. Alternativno se DNK sklopovi mogu kombinovati sa pogodnim bočnim regijama T-DNK, a zatim uvesti u konvencionalni domaćinski vektorAgrobacterium tumefaciens.Funkcije virulencijeAgrobacteriumdomaćina usmeriće umetanje sklopa i obližnjeg markera u DNK biljne ćelije kad se biljna ćelija inficira bakterijama.

Metodi mikroinjektovanja su struci dobro poznati i detaljno obrađeni u naučnoj i patentnoj literaturi. Uvođenje sklopova DNK pomoću polietilen glikolne precipitacije opisano je u Paszkovvski i sar. (1984) EMBO J 3:2727. Metodi elektroporisanja opisani su u Fromm i sar. (1985) Proc Natl Acad Sci USA 82:5824; dok su metodi balističke transformacije opisani u Klein i sar. (1987) Nature 327:70 i Weeks i sar. Plant Phvsiol 102:1077.

U nekim oblicima su metodi transformacije posredstvomAgrobacteriumakorišćeni za transfer GAT sekvenci iz pronalaska u transgenske biljke. Transformacija posredstvomAgrobacteriumase ekstenzivno koristi za transformisanje dikotiledonskih biljaka, iako na isti način mogu da se transformišu i neke monokotiledonske biljke. Npr., Agrobacrer/um-posredovanu transformaciju pirinča opisuje Hiei i sar. (1994) Plant J 6:272; US pat. br. 5,187,073; US pat. br. 5,591,616; Li i sar. (1991) Science in China 34:54, kao i Rainieri i sar. (1990) Bio/ Technologv 8:33. Opisani su i kukuruz, ječam, tritikal (hibrid pšenica/ječam) i asparagus, transformisani uz posredstvoAgrobacteriuma(Xu i sar. (1990) Chinese

J Bot 2:81).

Metodi transformacije posredstvom Agrobacteriuma koriste se sposobnošću tumor-indukujućeg (Ti) plazmidaA. tumefaciensda se integriše u genom biljne ćelije, da kotransferiše nukleinsku kiselinu od interesa u biljnu ćeliju. Obično se produkuje ekspresioni vektor u kojem se nukleinska kiselina od interesa, npr. GAT polinukleotid pronalaska, vezuje u plazmid koji se autonomno replikuje, koji sadrži takođe i T-DNK sekvence. Tipično T-DNK sekvence oivičavaju ekspresionu kasetnu nukleinsku kiselinu od interesa i obuhvataju integracione sekvence plazmida. Pored ekspresione kasete, T-DNK obično sadrži markersku sekvencu, npr. gene otpornosti na antibiotike. Plazmid sa T-DNK i ekspresionom kasetom se potom transfektuje u ćelije Agrobacteriuma. Takođe tipično, za ostvarivanje transformacije biljnih ćelija bakterijaA. tumefaciensposeduje i neophodnevir regijena plazmidu ili integrisane u hromozomu. Diskusiju o transformaciji uz posredovanje Agrobacteriuma,videti uFiroozabadv i Kuehnle (1995) Plant Cell Tissue and Organ Culture: Fundamental Methods, Gamborg i Phillips (eds).

Regeneracija transgenskih biljaka

Transgenske biljne ćelije dobijene metodima transformacije biljke, uključujući i prethodno diskutovane metode, mogu da se kultivišu da daju čitavu biljku sa transformisanim genotipom (tj. GAT polinukleotidom), a time i željenim fenotipom, npr. stečenom otpornošću (tj. tolerancijom) na glifozat ili analog glifozata. Takvi metodi regeneracije se oslanjaju na manipulisanje određenih fitohomnona u hranljivoj podlozi za tkivne kulture, obično se oslanjajući na biocidni i/ili herbicidni marker, uveden zajedno sa željenim nukleotidnim sekvencama. Alternativno, može da se izvrši selekcija na otpornost na glifozat koju je preneo GAT polinukleotid pronalaska. Regeneraciju biljke iz kulture protoplasta opisuje Evans i sar. (1983) Protoplasts Isolation and Culture. Handbook of Plant Cell Culture, str. 124-176, Macmillan Publishing Companv, New York, i Binding (1985) Regeneration of Plants, Plant Protoplasts, str. 21-73, CRC Press, Boca Raton. Regeneracija se može postići iz biljnih kalusa, eksplanta, organa ili njihovih delova. Ove metode regeneracije su opisane u Klee i sar. (1987) Ann Rev of Plant Phys 38:467.Videti /,npr. Payne i Gamborg. Posle transformacije s Agrobacteriumom, eksplanti se obično prenose na selekcionu podlogu. Stručnjak će znati da selekciona podloga zavisi od izbornog markera, kotransfektovanog u izdvojeno biljno tkivo. Po isteku određenog vremena, transformisana tkiva će početi da formiraju izdanke. Kad su izdanci dostigli 1-2 cm dužine, treba ih preneti u odgovarajuću podlogu za koren i izdanak. U podlozi za razvoj korena i izdanaka treba da se održava selekcioni pritisak.

Obično će, u roku od 1-2 sedmice, transformisana tkiva obrazovati korenove i biljčice. Kad biljčice dostignu visinu od oko 3-5 cm, stavljaju se u sterilnu zemlju u posude od (prirodnih) vlakana. Stručnjaci će znati da se za dobijanje transfomnisanih biljaka različitih vrsta koriste različiti postupci aklimatizovanja. Na primer, pošto se razvije koren i izdanak, kalem i somatski embrioni transformisanih biljaka se prenose na podlogu da bi obrazovali biljčice. Opis selekcije i regeneracije transformisanih biljaka u, npr. Dodds i Roberts (1995) Experiments in Plant Tissue Culture, 3<rd>Ed. Cambridge University Press.

Postoje i metodi za Agrobacteriumsku transformaciju Arabidopsis pomoću vakuumske infiltracije (Bechtold N., Ellis J. i Pelletier G., 1993, In planta Agrobacterium mediated gene transfer by infiltration of adult Arabidopsis thaliana plants. CR Acad Sci Pariš Life Sci 316:1194-1199), kao i prostim potapanjem biljaka u cvetu (Desfeux, C, Clough S.J., i Bent A.F., 2000, Female reproductive tissues are the primarv target of Agro-bacterium-mediated transformation by the Arabidopsis floral-dip method. Plant Physiol. 123:895-904). Korišćenjem ovih metoda dobija se transgensko seme, a kultura tkiva je nepotrebna.

Za mnoge biljne varijetete tek treba da se razviju efikasni protokoli transformacije posredstvom Agrobacteriuma. Na primer, za komercijalno najznačajnije kulture pamuka još nema podataka o uspešnoj transformaciji tkiva, povezanoj sa regeneracijom transformisanog tkiva radi produkovanja transgenske biljke. Uprkos tome, pristup koji može da se koristi kad su ove biljke u pitanju, obuhvata stabilno uvođenje polinukleotida u srodnu biljnu vrstu, putem transformacije uz posredstvo Agrobacteriuma, proveru/potvrdu operativnosti, i potom prenos transgena u željeni komercijalni soj, pomoću metoda standardnog polnog ukrštanja ili povratnog ukrštanja. U slučaju pamuka, npr., Agrobacterium može da se koristi za transformisanje Coker linijeGossypium hirustum(tj. Cokerovih linija 310, 312, 5110 Deltapine 61 ili Stoneville 213), a potom transgen može da se uvede u drugu, komercijalno značajniju, kulturuG. hirustum,povratnim ukrštanjem.

Transgenske biljke ovog pronalaska mogu se karakterisati genotipski ili fenotipski da bi se utvrdilo prisustvo GAT polinukleotida pronalaska. Za genotipsku analizu mogu da se koriste brojni poznati metodi, uključujući i PCR amplifikovanje genomske DNK i hibridizaciju genomske DNK specifično markiranim sondama. Fenotipska analiza podrazumeva, npr. opstanak/preživljavanje biljaka ili biljnih tkiva izloženih odabranom herbicidu, npr. glifozatu.

U suštini, svaka biljka može da se transformiše GAT polinukleotidima pronalaska. Biljke pogodne za transformaciju i ekspresiju novih GAT polinukleotida pronalaska obuhvataju vrste od poljoprivrednog i hortikulturnog značaja. Među takve vrste spadaju i članovi porodica kao što su Graminae (npr. kukuruz, raž, tritikal, ječam, proso, pirinač, pšenica, zob, itd.), Leguminosae (npr. grašak, pasulj, sočivo, kikiriki, naut, jam pasulj, krmna grahorica, soja, detelina, lucerka, grahorica, lotos, vistarija, španska i slatka grahorica), Compositae (najveća porodica vaskularnih biljaka, koja obuhvata najmanje 1000 rodova, i u koju spadaju važne komercijalne kulture kao što je suncokret) i Rosaciae (malina, kajsija, badem, breskva, ruža, itd.) kao i razne vrste oraha (orah, pekan, lešnik, itd.), kao i šumskodrveće ( Pinus, Quercus, Pseudotsuga, Seguoia, Populus,itd.).

Ostale biljke interesantne za modifikaciju GAT polinukleotidima pronalaska su, pored prethodno pomenutih, i biljke iz rodova:Agrostis, Allium, Antirrhinum, Apium, Arachis, Asparagus, Atropa, Avena(npr. ovas),Bambusa, Brassica,

Bromus, Browaalia, Camellia, Cannabis, Capsicum, Cicer, Chenopodium,

Chichorium, Citrus, Coffea, Coix, Cucumis, Cucurbita, Cynodon, Dactylis, Datura,

Daucus, Digitalis, Dioscorea, Elaeis, Eleusine, Festuca, Fragaria, Geranium,

Gossypium, Glycine, Helianthus, Heterocallis, Hevea, Hordeum(npr. ječam),

Hyoscyamus, Ipomoea, Lactuca, Lens, Lilium, Linum, Lolium, Lotus, Lycopersicon,

Majorana, Malus, Mangifera, Manihot, Medicago, Nemesia, Nicotiana, Onobrychis,

Oryza(npr. pirinač),Panicum, Pelargonium, Pennisetum ( npr. proso), Petunia,

Pisum, Phaseolus, Phleum, Poa, Prunus, Ranunculus, Raphanus, Ribes, Ricinus,

Rubus, Saccharum, Salpigiossis, Secale(npr. raž),Senecio, Setaria, Si napis, Solanum, Sorghum, Stenotaphrum, Theobroma, Thfolium, Trigonella, Triticum(npr. pšenica),Vicia, Vigna, Vitis, Zea(npr. kukuruz),Olyreae, Pharoideae,i mnoge druge. Kao što se uočava, biljke iz porodiceGraminaepredstavljaju posebno istaknute ciljne biljke za metode ovog pronalaska.

Među najčešće biljne kultura na koje cilja pronalazak spadaju kukuruz, pirinač, tritikal (pšenica/ječam), raž, pamuk, soja, (jestivi) sirak, pšenica, ovas, ječam, proso, suncokret, repica, grašak, sočivo, kikiriki, jam pasulj, krmna grahorica, soja, detelina, lucerka, grahorica, lotos, vistarija, španska i slatka grahorica, kao i razne vrste oraha (orah, pekan, itd.).

U jednom svom aspektu, pronalazak iznosi metod za dobijanje ploda, gajenjem biljne kulture tolerantne na glifozat (kao rezultat transformacije genom koji kodira glifozat N-acetiltransferazu) pod takvim uslovima da biljka da plod koji se bere. Najpogodnije je da se glifozat aplikuje na biljku ili u njenoj neposrednoj blizini, u koncentraciji koja efikasno suzbija korov, ne sprečavajući razvoj biljke, niti sazrevanje ploda. Glifozat se može aplikovati pre sadnje ili u bilo kojem trenutku posle sadnje, sve do berbe, uključujući i taj trenutak. Glifozat se može aplikovati jednokratno ili više puta. Vreme i raspored primene glifozata, količina, način primene, kao i drugi parametri razlikovaće se u zavisnosti od specifičnog karaktera kulture i uslova gajenja, a stručnjaku neće biti teško da ih odredi. Pronalazak, nadalje, prezentuje rod biljke, dobijen ovim metodom.

Pronalazak obezbeđuje i reprodukovanje/razmnožavanje biljke koja sadrži GAT polinukleotidni transgen. Na primer, biljka može da bude monokotiledonska ili dikotiledonska; u jednom aspektu reprodukcija podrazumeva ukrštanje biljke sa GAT polinukleotidnim transgenom, sa drugom biljkom, tako da bar deo potomstva ispoljava podnošljivost na glifozat.

U jednom aspektu, pronalazak iznosi metod za selektivno suzbijanje korova na polju na kojem se uzgaja kultura. Metod podrazumeva sejanje semena kulture/sadnju biljaka sa tolerancijom na glifozat, kao posledicom transformacije genom koji kodira GAT, npr. GAT polinukleotid, i aplikovanje na kulturu i korove količine glifozata dovoljne da suzbije korove, bez značajnijeg nepovoljnog uticaja na kulturu. Treba naglasiti da nije neophodno da kultura bude apsolutno neosetljiva na herbicid, sve dotle dok je korist od inhibicije korova veća od negativnog uticaja glifozata ili njegovog analoga na kulturu ili njen rod.

U drugom, pak, aspektu, pronalazak omogućava korišćenje GAT polinukleotida kao izbornog markerskog gena. U ovom obliku pronalaska, prisustvo GAT polinukleotida u ćeliji ili organizmu prenosi na ćeliju ili organizam uočljivo fenotipsko obeležje otpornosti na glifozat, čime omogućava odabir ćelija ili organizama, transformisanih željenim genom, vezanim na GAT polinukleotid. GAT polinukleotid se, dakle, može uvesti u sklop nukleinske kiseline, npr. vektor, što omogućava identifikovanje domaćina (npr. ćelije ili transgenske biljke) koji sadrži sklop nukleinske kiseline, tako što se domaćin uzgaja u prisustvu glifozata, a onda selektuje na osnovu sposobnosti da preživi i/ili razvija se brzinom koja je upadljivo veća u odnosu za preživljavanje i/ili razvoj domaćina koji ne poseduje sklop nukleinske kiseline. GAT polinukleotid može da se koristi kao izborni marker kod brojnih različitih domaćina, osetljivih na glifozat, uključujući biljke, većinu bakterija (iE. coli),aktinomicete, kvasce, alge i gljivice. Jedna od prednosti korišćenja rezistencije na herbicide kao markera kod biljaka, umesto konvencionalne rezistencije na antibiotike, jeste u tome što se eliminiše briga dela javnosti da bi rezistencija na antibiotik mogla 'pobegne' u okruženje. Eksperimentalni podaci, koji pokazuju primenu GAT polinukleotida kao izbornog markera kod različitih domaćinskih sistema, opisani su u ovoj specifikaciji u odeljku Primeri.

Selekcija GAT polinukleotida koji transgenskim biljkama prenose povećanu

rezistenciju na glifozat

Datoteke nukleinskih kiselina koje kodiraju GAT, diversifikovane u skladu sa opisanim metodima, mogu da se selektuju prema svojoj sposobnosti da transgenskim biljkama prenesu rezistenciju na glifozat. Posle jednog ili više ciklusa diversifikacije i selekcije, modifikovani GAT geni mogu da se koriste kao selekcioni markeri u cilju lakšeg produkovanja i procene transgenskih biljaka i kao način prenošenja herbicidne rezistencije na eksperimentalne ili poljoprivredne biljke. Posle diversifikacije jedne ili više SEQ ID br; 1 do SEQ ID br: 5, da se dobije DNK datoteka diversifikovanih GAT polinukleotida, može da se izvrši inicijalna funkcionalna procena, eksprimiranjem datoteke sekvenci kodiranja GAT uE. coli.Potom se eksprimirani GAT polipeptidi mogu prečistiti ili delimično prečistiti, na već opisan način, i pregledati i analizirati na poboljšanu kinetiku pomoću mas-spektrometrije. Posle jednog ili više preliminarnih ciklusa diversifikacije i selekcije, kloniraju se polinukleotidi koji kodiraju poboljšane GAT polipeptide u biljni ekspresioni vektor, operativno vezan na, npr. jaki konstitutivni promoter, npr. CaMV 35S promoter. Ekspresioni vektori sa modifikovanim GAT nukleinskim kiselinama se transformišu, najčešće Agrobacterium-posredovanom transformacijom, u biljke domaćineArabidopsis thaliana.Arabidopsis domaćini se lako transformišu, tako što se cvasti zamoče u rastvore Agrobacteriuma i puste da se razvijaju i daju seme. U periodu od oko 6 sedmica dobiju se hiljade semenki. Seme se sakupi sa svih zamakanih biljaka i poseje u zemlju. Na ovaj način se može, za potrebe procene, generisati nekoliko hiljada samostalno transformisanih biljaka, što predstavlja visokopropusni (HTP) format transformacije biljke. Zbirno gajene, iz semena izrasle mlade biljke se prskaju glifozatom; biljčice s ispoljenom rezistencijom na glifozat preživeće proces selekcije, dok će ne-transgenske biljke i biljke sa nepovoljnije modifikovanim GAT nukleinskim kiselinama tretiranje herbicidom oštetiti ili uništiti. Osim toga, GAT nukleinske kiseline koje prenose poboljšanu rezistenciju na glifozat mogu da se dobiju, npr. PCR amplifikacijom pomoću T-DNK prajmera oko umetaka datoteka, koje mogu da se koriste za dalje procedure diversifikacije ili za produkovanje dodatnih transgenskih biljaka iste ili druge vrste. Ukoliko se želi, mogu da se sprovedu dalji ciklusi diversifikacije i selekcije, uz primenu rastućih koncentracija glifozata u svakoj od uzastopnih selekcija. Na taj način mogu da se dobiju GAT nukleotidi i polipeptidi, koji prenose rezistenciju na koncentracije glifozata koje se koriste na poljima.

Rezistencija na herbicide

Mehanizam rezistencije na glifozat iz ovog pronalaska može da se . kombinuje sa drugim, stručnjacima poznatim, modusima rezistencije na glifozat, da se dobiju biljke i biljna tkiva sa nadmoćnom rezistencijom na glifozat. Biljke koje tolerišu glifozat mogu da se produkuju dodavanjem u genom biljke kvaliteta sposobnosti da produkuje viši nivo 5-enolpiruvilšikumat-3-forfat sintaze (EPSP), što je daleko detaljnije opisano u US patentima br. 6,248,876 B1; 5,627,061; 5,804,425; 5.633,435; 5,145,783; 4,971,908; 5,312,910; 5,188,642; 4,940,835; 5,866,775; 6,225,114 B1; 6,130,366; 5,310,667; 4,535,060; 4,769,061; 5,633,448; 5,510,471; Re. 36,449; Re. 37,287 E, i 5,491,288, i u međunarodnim publikacijama VVO 97/04103; VVO 00/66746; VVO 01/66704 i VVO 00/66747, koji su kao referentni literaturni izvori sastavni deo ovog izlaganja. Rezistencija na glifozat je, takođe, preneta na biljke, koje eksprimiraju gene kodiranja enzima glifozat oksidoreduktaze, što je potpunije opisano u US patentima br. 5,776,760 i 5,463,175, referentnim literaturnim izvorima navedenim kao sastavni deo ovog izlaganja.

Mehanizam rezistencije na glifozat ovog pronalaska mogu da se, dalje, kombinuju sa ostalim modusima rezistencije na herbicide, radi dobijanja biljaka i biljnih tkiva rezistentnih na glifozat i još jedan ili više herbicida. Na primer, hidroksifenilpiruvatdioksigenaze su enzimi koji katalizuju reakciju, u kojoj se para-hidroksifenilpiruvat (HPP) transformiše u homogenizat. Jedinjenja koja inhibišu ovaj enzim, i koja se vezuju na enzim da bi inhibisala transformaciju HPPa u homogenizat, koriste se kao herbicidi. Biljke sa većom otpornošću na herbicide opisuju US patenti br. 6,245,968 B1; 6,268,549 i 6,069,115, kao i međunarodna publikacija VVO 99/23886, koji svi čine sastavni deo ovog izlaganja kao referentni literaturni izvori.

Sulfonilurea i imidazolinonski herbicidi takođe inhibišu razvoj viših biljaka, tako što blokiraju acetolaktatnu sintazu (ALS) ili acetohidroksikiselinsku sintazu (AHAS). Dobijanje biljaka sa tolerancijom na sulfonilureu i imidazolinon potpunije je opisano u US patentima br. 5,605,011; 5,013, 659; 5,141,870; 5,767,361; 5,731,180; 5,304,732; 4,761,373; 5,331,107; 5,928,937 i 5,378,824, kao i u VVO 96/33270, koji svi čine sastavni deo ovog izlaganja kao referentni literaturni izvori.

Glutamin sintaza (GS) je esencijalni enzim, neophodan za razvoj i život većine biljnih ćelija. Inhibitori GS deluju toksično na biljne ćelije. Herbicidi glufozinatnog tipa formulisani su na osnovi tog toksičnog efekta, koji je posledica inhibicije GS u biljkama. Ti herbicidi su neselektivni; oni inhibišu razvoj i rast svih različitih navedenih biljnih vrsta i dovode do njihovog potpunog uništenja. Proces za dobijanje biljaka, koje sadrže egzogenu fosfinotricin acetiltransferazu opisuju US patenti br: 5,969,213; 5,489,520: 5,550,318; 5,874,265; 5,919,675; 5,561,236; 5,648,477; 5,646,024; 6,177,616 Bi i 5,879,903, koji svi čine sastavni deo ovog izlaganja kao referentni literaturni izvori.

Protoporfirinogen oksidaza (protoks) je neophodna za produkovanje hlorofila, koji je, pak, neophodan za opstanak biljke. Protoks enzim služi kao meta za čitav niz različitih herbicidnih jedinjenja.. I ti herbicidi inhibišu rast i razvoj svih različitih navedenih biljnih vrsta, i dovode do njihovog potpunog razaranja. Proces za dobijanje biljaka sa protoks aktivnošću, koje su rezistentne na takve herbicide opisuju US patenti br. 6,288,306 B1; 6,282,837 B1 i 5,767,373, kao i VVO 01/12825, koji svi čine sastavni deo ovog izlaganja kao referentni literaturni izvori.

PRIMERI

Sledeći primeri su samo ilustrativni, nikako ograničavajući. Stručnjak će prepoznati niz nekritičnih parametara koji se mogu menjati, u cilju dobijanja u osnovi sličnih rezultata.

PRIMER 1: IZOLOVANJE NOVIH PRIRODNIH GAT POLINUKLEOTIDA

Ekspresionim kloniranjem sekvenci iz sojevaBacillussa GAT aktivnošću, otkriveno je pet prirodnih GAT polinukleotida (tj. GAT polinukleotida koji se prirodno javljaju u organizmu koji nije genetički modifikovan). Njihove nukleotidne sekvence su utvrđene i ovde date kao SEQ ID br: 1 do SEQ ID br: 5. Ukratko, zbirka od više od 500 sojevaBacillusiPseudomonasanalizirana je i pretražena na urođenu sposobnost da N-acetiliše glifozat. Sojevi su prenoćili u LB, prikupljeni centrifugiranjem, permeabilisani u razblaženom toluenu, zatim ispirani i ponovo suspendovani u reakcionoj smeši pufera, 5 mM glifozata i 200 uM acetiICoA. Ćelije su inkubirane i reakcionoj smeši između 1 i 48 sati, u kojem periodu je reakciji dodata ista zapremina metanola. Ćelije su, zatim, peletirane centrifugiranjem, a supernatant je filtriran pre mas-spektrometrijske analize modaliteta roditeljskog jona. Proizvod reakcije je pozitivno identifikovan kao N-acetilglifozat, poređenjem mas-spektrometrijskog profila reakcione smeše sa N-acetilglifozatnim standardom (SI. 2). Detektovanje proizvoda reakcije zavisilo je od uključivanja oba supstrata (acetiICoa i glifozata), a poništavano toplotnim denaturisanjem bakterijskih ćelija.

Individualni GAT nukleotidi su, zatim, klonirani iz identifikovanih sojeva pomoću funkcionalnog skrininga. Pripremljena je genomska DNK je i delimično razgrađena enzimom Sau3A1. Fragmenti od oko 4 Kb klonirani su u ekspresioni vektorE. colii transformisani u elektrokompetentnuE. coli.Posle reakcije slične prethodnoj, s tom razlikom što je ispiranje toluenom zamenjeno permeabilizacijom sa PMBS, mas-spektrometrijom su identifikovani individualni klonovi koji ispoljavaju GAT aktivnost. Genomski fragmenti su sekvencirani i identifikovan je predpostavljeni otvoreni okvir čitanja koji kodira DAT polipeptid. Identitet GAT gena je potvrđen eksprimiranjem otvorenog okvira čitanja uE. colii detektovanjem visokih nivoa N-acetilglifozata izdvojenih iz reakcione smeše.

PRIMER 2: KARAKTERIZACIJA GAT POLIPEPTIDA IZOLOVANOG IZ SOJA B6

B . LICHENIFORMIS .

Genomska DNK iz soja B6B. licheniformisje prečišćena, delimično razgrađena sa Sau3A1, a fragmenti od 1-10 Kb su klonirani u ekspresioni vektorE. coli.Klon sa umetkom od 2,5 KB preneo je glifozat N-acetiltransferaznu (GAT) aktivnost na domaćinaE. coli.,što je potvrđeno mas-spektrometrijskom analizom. Sekvenciranjem umetka je otkriven jedan potpun otvoreni okvir sa 441 baznim parom. Posledično kloniranje tog otvorenog okvira čitanja potvrdilo je da on kodira GAT enzim. Plazmid, pMAXY2120, prikazan na SI. 4, sa genom koji kodira GAT enzim B6, prenet je u soj XL1 BlueE. coli.U Luria bujon je uveden 10% inokulum saturisane kulture, pa je kultura inkubirana 1 sat na 37°C. Ekspresija GAT je indukovana dodavanjem IPGT u koncentraciji od 1 mM. Kultura je inkubirana još 4 sata, nakon čega su ćelije prikupljene centrifugiranjem i ćelijska peleta ohlađena i odložena na temperaturi od - 80°C.

Liza ćelija je postignuta dodavanjem u 0,2 g ćelija 1 ml pufera sledećeg sastava: 25 mM HEPES, pH 7,3, 100 mM KCI i 10% metanola (HKM) plus 0,1 mM EDTA, 1 mM DTT, 1 mg/ml lizozima kokošjeg jajeta, i koktela inhibitora proteaze, dobavljenog od Sigme i korišćenog prema preporukama proizvođača. Posle 20-minutne inkubacije na sobnoj temperaturi (npr. 22-25°C), liza je dovršena kratkotrajnom sonikacijom. Lizat je centrifugiran, a dobijeni supernatant desaliniran propuštanjem kroz Sephadex G25 ekvilibrisan sa HKM. Za parcijalno prečišćavanje korišćena je afinitetna hromatografija na CoA Agarosi (Sigma). Kolona je ekvilibrisana sa HKM, a izbistreni ekstrakt je propušten pod hidrostatičkim pritiskom. Nevezujući proteini su odstranjeni ispiranjem kolone sa HKM, a GAT je eluiran pomoću HKM sa 1 mM Koenzima A. Ova procedura je obezbedila četvorostruko prečišćavanje. U ovoj fazi, oko 65% obojenosti proteina, registrovanog na SDS poliakrilamidnom gelu sa sirovim lizatom, pripadalo je GAT, dok je 20% obojenosti dala vektorom kodirana hloramfenikol acetiltransferaza.

Prečišćavanje do homogenosti postignuto je gel filtracijom parcijalno prečišćenog proteina kroz Superdex 75 (Pharmacia). Mobilna faza bila je HKM, a u njoj je GAT aktivnost eluirana u zapremini koja odgovara molekularnom radijusu od 17 kD. Materijal je, prema rezultatu Coomassie bojenja 3 ug-skog uzorka GAT, podvrgnutog SDS poliakrilamidnoj gel elektroforezi na 12%-nom akrilamidnom gelu debljine 1 mm, bio homogen. Postignuta je prečišćenost uz šestostruko povećanje specifične aktivnosti.

Vidljivi Kmza glifozat je određen na reakcionim smešama sledećeg sastava: Ace-til CoA (200 uM) za saturaciju, različite koncentracije glifozata i 1 uM prečišćenog GAT u puferu sa 5 mM morfolina podešenog na pH 7,7 sirćetnom kiselinom i 20% etilen glikolom. Inicijalne brzine reakcije određivane su kontinuiranim praćenjem hidrolize tioestarske veze Acetil CoA na 235 nm (E = 3,4 OD/mM/cm). Uočena je hiperbolična kinetika saturacije (SI. 5), a iz nje je dobijena vrednost za evidentni Kmod 2,9 ± 0,2 (SD) mM.

Vrednost evidentnog Kmza Acetil CoA određivana je na reakcionim smešama koje su sadržale 5 mM glifozata, različite koncentracije Acetil CoA i 0,19 iiM GAT u puferu sa 5 mM morfolina, podešenog na pH 7,7 sirćetnom kiselinom i 50% etanolom. Inicijalne brzine reakcije su određivane pomoću mas-spektrometrijske detekcije N-acetilglifozata. U instrument je više puta injektovano po 5 ul, a brzine reakcije su dobijene iscrtavanjem grafikona odnosa vremena reakcije i zona integrisanog vrha (SI. 6). Uočena je hiperbolična kinetika saturacije (SI. 7) a iz nje je dobijena vrednost evidentnog KMod 2 \ iM. Na osnovu vrednosti Vmaxdobijenih pri poznatoj koncentraciji enzima, izračunavanjem je dobijena vrednost k^t od 6/min.

PRIMER 3: PROCES MAS- SPEKTROMETRIJSKE ANALIZE I PREGLEDA

Sa mikrotitarske ploče sa 96 rupa uziman je uzorak (5 ul), brzinom od jednog uzorka svakih 26 sekundi, a potom injektovan bez razdvajanja u mas-spektrometar (Mi-cromass Ouattro LC, mas spektrometar sa tri četvoropola). Uzorak se uvodi u mas-spektrometar mobilnom fazom voda/metanol (50 : 50), brzinom protoka od 500 Ul/min. Svaki od injektovanih uzoraka se jonizuje procesom negativne elektrosprej jonizacije (napon igle, -3,5 KV; napon konusa, 20 V; temperatura izvora, 120°C; temperatura desolvacije, 250°C; protok gasa konusa, 90 l/h, i protok gasa za desolvaciju, 600 l/h. Prvi četvoropol vrši selekciju molekulskih jona (m/z 210), nastalih tokom procesa, na razbijanje sudaranjem (CID) na drugom četvoropolu, na kojem je pritisak podešen na 5 x 10~<4>mBar, a energija sudara na 20 Ev. Treći četvoropol je tu samo radi toga da omogući jednom od kćerinskih jona (m/z 124), nastalom od roditeljskih jona (m/z 210), da dospe u detektor radi beleženja signala. Prvi i treći četvoropol su podešeni na rezoluciju uređaja, dok fotomultiplikator radi na 650 V. Za poređenje se koriste standardi čistog N-acetilglifozata, a vršna integracija za procenu koncentracija. Ovim metodom može da se detektuje manje od 200 Nm N-acetilglifozata.

PRIMER 4: DETEKCIJA PRIRODNIH ILI GAT ENZIMA SLABE AKTIVNOSTI

Prirodni ili slabo aktivni GAT enzimi, po pravilu, imaju k^ približno 1 min"<1>i Kmza glifozat od 1,5-10 Mm. Kmza acetil CoA je, po pravilu, manje od 25 uM.

Bakterijske kulture se gaje na obogaćenoj podlozi, u dubokim petri šoljama sa 96 rupa, a 0,5 ml ćelija stacionarne faze se prikuplja centrifugiranjem, ispira sa 5 mM morfolin acetata pH 8, i ponovo suspenduje u 0,1 ml reakcione smeše, koja sadrži 200 uM amonijum acetil CoA, 5 mM amonijum glifozata, kao i 5 ug/ml PMBS (Sigma) u 5 mM morfolin acetata, pH 8. PMBS premeabiliše ćelijsku membranu, što omogućava samo supstratima i produktima da pređu iz ćelije u pufer, ne oslobađajući celokupni sadržaj ćelije. Reakcije se odvijaju 1-48 sati, na temperaturi 25-37°C. Reakcije se prekidaju dodavanjem iste zapremine 100% etanola i celokupna smeša se filtrira na 0,45 um MAHV filter ploči Multiscreen (Millipore). Uzorci se analiziraju pomoću mas-spektrometra (opis gore) i porede sa sintetičkim standardima N-acetilglifozata.

PRIMER 5: DETEKCIJA VISOKO AKTIVNIH GAT ENZIMA

Visokoaktivni GAT enzimi, po pravilu, imaju kca, do 400 min'<1>i Kmispod 0,1 mM glifozata.

Geni za kodiranje GAT enzima se kloniraju u ekspresioni vektorE. coli,npr. pQE80 (Oiagen) i uvode u sojeveE. coli,npr. XL1 Blue (Stratagene). Kulture se gaje u 150 ml obogaćene podloge (npr. LB sa 50 ug/ml karbenicilina) u plitkim polistirenskim šoljama sa 96 rupa i U-dnom, do kasnelog faze, pa se razblažuju u odnosu 1:9 svežom podlogom, koja sadrži 1 mM IPTG (USB). Posle 48-časovne indukcije, ćelije se sakupe, ispiraju sa 5 mM morfolin acetata pH 6,8, pa ponovo suspenduju u istoj zapremini tog morfolinskog pufera. Reakcije se obavljaju sa do 10 ul ispranih ćelija. Na višim nivoima aktivnosti, ćelije se prvo razblažuju do 1:200 i 5 ul se dodaje u 100 ul reakcione smeše. Za merenje GAT aktivnosti, može da se koristi reakciona smeša korišćena za merenje slabe aktivnosti. Za merenje visoko aktivnih GAT enzima, međutim, koncentracija glifozata se smanjuje na 0,15-0,5 mM, pH na 6,8, a reakcije se odvijaju 1-4 sata na temperaturi od 37°C. Izvođenje reakcije i detekcija MS su već opisani.

PRIMER 6: PREČIŠĆAVANJE GAT ENZIMA

Prečišćavanje enzima se postiže pomoću afinitetne hromatografije ćelijskih lizata na CoA-agarozi i gel-filtracijom na Superdex-75. Količine do 10 mg prečišćenog GAT enzima dobijaju se na sledeći način: 1 L LB sa 50 ug/ml karbenicilina inokuliran je sa 100 ml kultureE. coli,koja nosi GAT polinukleotid na pQE80 vektoru, a prenoćila je u LB sa 50 ug/ml karbenicilina. Posle 1 sata, dodaje se 1 mM IPGT, a kultura gaji sledećih 6 sati. Ćelije se sakupljaju centrifugiranjem. Liza se postiže suspendovanjem ćelija u 25 mM HEPES (pH 7,2, 100 mM KCI, 10% metanolu (HKM), 0,1 mM EDTA, 1 mM DTT, koktelu inhibitora proteaze (Sigma-Aldrich) i 1 mg/ml lizozima kokošijeg jajeta. Posle 30 minuta na sobnoj temperaturi, ćelije su nakratko izložene energiji zvučnih talasa (sonikacijj). Čestice materijala su odstranjene centrifugiranjem, a lizat propušten kroz sloj koenzim-A-Agaroze. Kolona je isprana sa količinom HKM nekoliko puta većom od zapremine sloja, a GAT je eluiran sa količinom HKM sa 1 mM acetiICoA, 1,5 puta većom od zapremine sloja. GAT u eluatu je koncentrisan zadržavanjem iznad Centricon YM 50 ultrafiltracione membrane. Dalje prešišćavanje se postiže propuštanjem proteina kroz kolonu Superdex 75, nizom injekcija od po 0,6 ml. Vršna GAT aktivnost eluira pri zapremini koja odgovara molekulskoj težini od 17 kD. Ovaj metod obezbeđuje prečišćavanje GAT enzima do homogenosti, uz izdvajanje > 85%. Slična procedura se koristi za dobijanje količina od 0,1 do 0,4 mg čak 96 izmešanih varijanti odjednom. Zapremina indukovane kulture se smanji na 1-10 ml, CoA afinitetna hromatografija obavlja na 0,15-mililitarskim kolonama pakovanim u MAHV filter ploču (Millipore), a Superdex 75 hromatografija se izostavlja.

PRIMER 7: STANDARDNI PROTOKOL ZA ODREĐIVANJE Kcat I Km

Određivanje K^ti Kmza glifozat za prečišćeni protein vrši se kontinuiranim spektrofotometrijskim testom, u kojem se prati hidroliza sulfoesterske veze acetiICoA na 235 nm. Reakcije se obavljaju na sobnoj temperaturi (oko 23°C) u udubljenjima test ploče sa 96 rupa, a završna 0,3 ml sadrže sledeće komponente: 20 mM HEPES, pH 6,8, 10% etilen glikol, 0,2 mM acetil koenzima A, kao i različite koncentracije amonijum glifozata. Pri poređenju kinetike dva GAT enzima, oba enzima se moraju testirati pod istim uslovima, npr. na 23°C. Kcatse izračunava na osnovu Vmaxi koncentracije enzima, određene Bradford testom. Kmse izračunava na osnovu inicijalnih reakcionih brzina dobijenih od koncentracija glifozata u rasponu od 0,125 do 10 mM, primenom Lineavveaver-Burke transformacije Michaelis-Menten jednačine. K^/Kmse određuje deljenjem određene vrednosti za Kca, sa utvrđenom vrednošću KM.

Primenom ove metodologije određeni su kinetički parametri za jedan broj GAT polipeptida, primerom zastupljenih u ovom izlaganju. Na primer, utvrđeno je da su vrednosti Kcat, Km, i K^/Kmza GAT polipeptide koji odgovaraju SEQ ID br: 445, 322 min"<1>, 0,5 mM odnosno 660 mM"<1>min"<1>, pod opisanim uslovima testa. Vrednosti Kcat, Km, i Kcat/K«određene za GAT polipeptide koji odgovaraju SEQ ID br: 457, 118 min"<1>, 0,1 mM odnosno 1184 mM"<1>min"<1>pod prethodno opisanim uslovima testa. Za GAT polipeptide koji odgovaraju SEQ ID br: 300, utvrđene vrednosti Keat, Km, i K^i/Km su 296 min"<1>, 0,65 nM odnosno 456 mM"<1>min"<1>, pod opisanim uslovima testa. Stručnjak može da, na osnovu ovih vrednosti, potvrdi da test GAT aktivnosti daje kinetičke parametre za GAT, podesne za poređenje sa ovde izloženim vrednostima. Na primer, uslovi korišćeni za poređenje aktivnosti GAT treba da daju kinetičke konstante za SEQ ID br: 300, 445 i 457 (u granicama normalne eksperimentalne varijanse) iste kao ove, iznete u ovom izlaganju, ukoliko su uslovi pod kojima se obavlja poređenje test GATa sa GAT polipeptidima - uslovi izloženi u ovom primeru. Ovom metodologijom su određeni kinetički parametri za određen broj varijanti GAT polipeptida i predstavljeni u Tabelama 3, 4 i 5.

Kmza acetiICoA se meri mas-spektrometrijskim metodom sa učestalim uzorkovanjem tokom reakcije. Acetil koenzim A i glifozat (amonijumove soli) stavljaju se, u obliku 50-struko koncentrovanih osnovnih rastvora, u udubljenje za uzorak mas-spektrometrijske ploče. Reakcije se pokreću dodavanjem enzima, adekvatno razblaženog u isparljivom puferu, npr. morfolino acetatu ili amonijum karbonatu, pH 6,8 ili 7,7. Uzorak se više puta injektuje u instrument, a inicijalne brzine se izračunavaju na osnovu grafika vremena zadržavanja i površine pika. Km se izračunava kao za glifozat.

PRIMER 8: SELEKCIJA TRANSFORMISANEE . COLI

Produkovanigatgen (himera sa urođenimB. licheniformismestom vezivanja ribozoma (AACTGAAGGAGGAATCTC, SEQ ID br: 515) prikačenim direktno na 5' završetak sekvence kodiranja GAT) transformisan je u ekspresioni vektor pMAXY2190 (SI. 11). Ovim postupkom je iz plazmida eliminisan His markerski domen, a zadržan B-laktamazni gen koji prenosi rezistenciju na antibiotike ampicilin i karbenicilin. pMAXY2190 je elektroporisan (BioRad Gene Pulser) u ćelije E.coliXL1 Blue (Stratagene). Ćelije su suspendovane u SOC obogaćenu podlogu i ostavljene 1 sat da miruju. Zatim su ćelije blago peletirane, jedamput isprane sa M9 mimimalnim podlogama bez aromatičnih amino kiselina (12,8 g/l Na2HP04■ H20, 3,0 g/l KH2P04, 0,5 g/l NaCI, 1,0 g/l NH4CI, 0,4% glukoze, 2 mM MgS04, 0,1 mM CaCI2, 10 mg/l tiamina, 10 mg/l prolina, 30 mg/l karbenicilina), pa ponovo suspendovane u 20 ml iste M9 podloge. Pošto su prenoćile na 37°C i 250 rpm, jednake zapreminećelija su zasejane na M9 podlogu ili M9 plus 1 mM glifozatne podloge. pQE80 vektor bezgatgena je uveden u ćelijeE. colii zasejan, radi dobijanja pojedinačnij kolonija za potrebe obavljanja poređenja. Rezultati su sumarno predstavljeni u Tabeli 6, i jasno pokazuju da GAT aktivnost omogućava selekciju i razvoj transformisanih ćelijaE. coli,sa manje od 1% zaostalih. Treba obratiti pažnju na činjenicu da, za GAT aktivnost dovoljnu da dozvoli razvoj transformisanih ćelija, nije bila potrebna indukcija pomoću IPGT. Transformacija je potvrđena ponovnom izolacijom pMAXY2190 izE. coli kultivisaneu prisustvu glifozata.

PRIMER 9: SELEKCIJA TRANSFORMISANIH BILJNIH ĆELIJA

Transformacija biljnih ćelija posredovana Agrobacteriumom nastaje na niskim nivoima efikasnosti. Da bi se omogućilo reprodukovanje transformisanih ćelija, a istovremeno inhibisalo bujanje netransformisanih ćelija, potreban je izborni marker. Kao dobri primeri izbornih markera koji se koriste kod biljaka služe antibiotički markeri za kanamicin i higromicin, kao i genbarkoji modifikuje herbicid, - a koji eliminiše toksičnost herbicidnog jedinjenja fosfinotricina (Methods in Molecular Biologv, 1995, 49:9-18). Ovde se pokazuje da GAT aktivnost služi kao efikasan izborni marker za biljnu transformaciju. Evoluiranigat gen(0_5B8) kloniran je između promotera biljke (pojačani virus venskog srastanja jagode) i ubikvinonskog terminatora i uveden u T-DNK regiju binarnog vektora pMAXY3793, pogodnog za transformaciju biljnih ćelija prekoAgrobacterium tumefaciensEHA105 (SI. 12). Da bi potvrda transformacije bila moguća, analizom izdvojivi GUS marker se nalazio u T-DNK. Transgenski uzdanci duvana su dobijeni uz pomoć glifozata kao jedinog agensa selekcije.

Pazušni pupoljciNicotiana tabacumL. Xanthi su podkultivisani na napola razblaženoj MS podlozi sa saharozom (1,5%) i Gelriteom (0,3%), pod 16-satnim osvetljenjem (35-42 uEinstein m"<2>s'<1>, hladnim, belim fluorescentnim lampama) na 24°C, svake 2-3 sedmice. Mladi listovi su odšeni sa biljaka posle 2-3 sedmice supkulture, i isečeni na segmente dimenzija 3x3 mm.A. tumefaciensEHA105 je inokuliran u LB podlogu, u kojoj je prenoćio do gustine A600=1,0. Ćelije su peletirane 5 minuta brzinom od 4000 rpm i ponovo suspendovane u trostrukoj zapremini tečne podloge za dovršavanje kultivacije, sačinjene od Murashige i Skoog (MS) podloge (pH 5,2) sa 2 mg/l N6-benziladenina (BA), 1% glukoze i 400 uM acetisiringona. Parčići lista su potpuno potopljeni u 20 mlA. tumefa- ciensu petri šoljama dimenzija 100x 25 mm, tokom 30 minuta, osušeni autoklaviranim filter papirom, pa preneti na čvrstu dokultivacionu podlogu (0,3% Gelrite) i inkubirani na prethodno opisan način. Posle 3 dana dokultivisanja, 20-30 segmenata je preneto na baznu podlogu za indukovanje izdanaka (BSI), sačinjenu od MS čvrste podloge (pH 5,7), 2 mg/l BA, 3% saharoze, 0,3% Gelrite, 0-200 uM glifozata i 400 ug/ml Timentina.

Posle 3 nedelje, izdanci su bili jasno vidljivi na tkivnim kulturama smeštenim na podloge bez glifozata, potpuno nezavisno od prisustva ili odsustvagafgena. Transfer T-DNK iz oba sklopa potvrđen je GUS histohemijskim bojenjem listova regenerisanih izdanaka. Koncentracije glifozata iznad 20 uM potpuno su inhibisale obrazovanje izdanaka iz tkivnih kultura bezgatgena. Tkivne kulture inficiraneA.tumefacienssa gaf sklopom reprodukovale su izdanke pri koncentracijama glifozata do čak 200 uM (najviši testirani nivo). Transformacija je potvrđena GUS histohemijskim bojenjem i PCR fragmentnirn amplifikovanjemgatgena, korišćenjem prajmera koji su se stapali na promotera i 3' regije. Rezultati su sumirani u Tabeli 7.

PRIMER 10: GLIFOZATNA SELEKCIJA TRANSFORMISANIH ĆELIJA KVASCA

Selekcioni markeri za transformaciju kvasca su obično auksotropni geni, koji omogućavaju razvoj transformisanih ćelija na podlozi koja ne sadrži specifičnu amino kiselinu ili nukleotid. Pošto jeSaccharomyces crevisiaeosetljiva na glifozat, GAT može takođe da se koristi kao izborni marker. Da bi se ovo dokazalo, iz T-DNK vektora pMAXY3793 kloniran je evoluiranigatgen (0_6D10) (kao i u Primeru 9), kao Pstl-Clal fragment koji sadrži čitavu kodirajuću regiju i vezan je u p424TEF razgrađen Pstl-Clal (Gene, 1995, 156:119-122), (SI. 13). Ovaj plazmid sadrži izvor replikacijeE. coli igen koji prenosi rezistenciju na karbenicilin, kao i TRP1, triptofan auksotrofni izborni marker za transformaciju kvasaca.

Sklop sagatje transformisan u E. coli XL1 Blue (Stratagene) i zasejan na LB karbenicilinsku (50 ug/ml) agar podlogu. Pripremljena je plazmidna DNK i korišćena za transformisanje soja kvasca YPH499 (Stratagene), uz pomoć garniture za transformaciju (Bio 101). Jednake količine transformisanih ćelija su zasejane na CSM-YNB-glukoznu podlogu (Bio 101), bez ikakvih aromatičnih amino kiselina (triptofan, tirozin i fenilalanin), uz dodatak glifozata. U cilju poređenja, p424TEF bezgatgena je, takođe, uveden u YPH499 i zasejan na opisani način. Rezultati pokazuju da GAT aktivnost funkcioniše kao efikasan izborni marker. Prisustvo vektora sagatu glifozatom selektovanim kolonijama može da se potvrdi ponovnim izolovanjem plazmida i skraćenom restrikcionom analizom.

Mada je izloženi pronalazak opisan, u cilju razumevanja i jasnoće, dosta detaljno, poznavaocima aktuelnog stanja nauke će, na osnovu čitanja ovog otkrića, biti jasno da je moguće sprovoditi različite promene forme i detalja pronalaska, a bez odstupanja od stvarnom domena pronalaska. Na primer, sve prethodno opisane procedure, metodi, sklopovi, aparature i sistemi mogu da se kombinuju na različite načine. Pronalazak ima za cilj da obuhvati sve ovde opisane metode i reagense, kao i polinukleotide, polipeptide, ćelije, mikroorganizme, biljke, biljne kulture, itd, produkte ovih novih metoda i reagensa.

Sve publikacije, patenti, patentne prijave ili drugi dokumenti navedeni u ovoj prijavi obuhvaćeni su referencom u celini i na način kao da je svaka pojedina publikacija, patent, patentna prijava ili drugi dokument, pojedinačno navedena sa svim detaljima koji je identifikuju, kao literaturna referenca od značaja za ovaj dokument.

Claims (43)

1. Izolovani ili rekombinantni polinukleotid koji kodira polipeptid koji ima glifozat N-acetiltransferaznu aktivnost i sadrži: (a) nukleotidnu sekvencu koja kodira aminokiselinsku sekvencu, koja se može optimalno poravnati sa sekvencom selektovanom iz grupe koju čine SEQ ID br: 300, SEQ ID br: 445 i SEQ ID br: 457, da da, primenom BLOSUM62 matrice, kazne za postojanje prekida od 11 i kazne za ekstenziju prekida od 1, skor sličnosti od najmanje 460; ili (b) nukleotidnu sekvencu koja kodira najmanje 20 susednih amino kiselina aminokiselinske sekvence selektovane iz grupe koju čine SEQ ID br. 300, SEQ ID br. 445 i SEQ ID br. 457. ili (c) nukleotidnu sekvencu čiji komplement hibridizuje pod striktnim uslovima duž gotovo celokupne nukleotidne sekvence koja kodira aminokiselinsku sekvencu selektovanu iz grupe koju čine SEQ ID br: 300. SEQ ID br: 445 i SEQ ID br: 457. iil (d) nukleotidnu sekvencu koja kodira aminokiselinsku sekvencu SEQ ID br: 6-10 i SEQ ID br: 263-514, ili (e) nukleotidnu sekvencu koja kodira polipeptid karakterisan time što se najmanje 80% pozicija povinuje sledećim ograničenjima: (a) na poziciji 2 aminokiselinski reziduum je I ili L; (b) na poziciji 3 aminokiselinski reziduum je E ili D; (c) na poziciji 4 aminokiselinski reziduum je V, A ili l; (d) na poziciji 5 aminokiselinski reziduum je K, R ili N; (e) na poziciji 6 aminokiselinski reziduum je P ili L; (f) na poziciji 8 aminokiselinski reziduum je N, S ili T; (g) na poziciji 10 aminokiselinski reziduum je E ili G; (h) na poziciji 11 aminokiselinski reziduum je D ili E; (i) na poziciji 12 aminokiselinski reziduum je T ili A; (j) na poziciji 14 aminokiselinski reziduum je E ili K; (k) na poziciji 15 aminokiselinski reziduum je I ili L; (I) na poziciji 17 aminokiselinski reziduum je H ili Q; (m) na poziciji 18 aminokiselinski reziduum je R, C ili K; (n) na poziciji 19 aminokiselinski reziduum je I ili V; (o) na poziciji 24 aminokiselinski reziduum je Q ili R; (p) na poziciji 26 aminokiselinski reziduum je L ili I; (q) na poziciji 27 aminokiselinski reziduum je E ili D; (r) na poziciji 28 aminokiselinski reziduum je A ili V; (s) na poziciji 30 aminokiselinski reziduum je K, M ili R; (t) na poziciji 31 aminokiselinski reziduum je Y ili F; (u) na poziciji 32 aminokiselinski reziduum je E ili G; (v) na poziciji 33 aminokiselinski reziduum je T, A ili S; (w) na poziciji 35 aminokiselinski reziduum je L, S ili M; (x) na poziciji 37 aminokiselinski reziduum je R, G, E ili Q; (y) na poziciji 38 aminokiselinski reziduum je G ili S; (z) na poziciji 39 aminokiselinski reziduum je T, A ili S; (aa) na poziciji 40 aminokiselinski reziduum je F, L ili S; (ab) na poziciji45 aminokiselinski reziduum je Y ili F; (ac) na poziciji 47 aminokiselinski reziduum je R, Q ili G; (ad) na poziciji 48 aminokiselinski reziduum je G ili D; (ae) na poziciji 49 aminokiselinski reziduum je K, R, E ili Q; (af) na poziciji 51 aminokiselinski reziduum je I ili V; (ag) na poziciji 52 aminokiselinski reziduum je S, C ili G; (ah) na poziciji 53 aminokiselinski reziduum je I ili T; (ai) na poziciji 54 aminokiselinski reziduum je A ili V; (aj) na poziciji 57 aminokiselinski reziduum je H ili N; (ak) na poziciji 58 aminokiselinski reziduum jeQ, K, N ili P; (al) na poziciji 59 aminokiselinski reziduum je A ili S; (am) na poziciji 60 aminokiselinski reziduum je E, K, G, V ili D; (an) na poziciji 61 aminokiselinski reziduum je H ili Q; (ao) na poziciji 62 aminokiselinski reziduum je P, S ili T; (ap) na poziciji 63 aminokiselinski reziduum je E, G ili D; (aq) na poziciji 65 aminokiselinski reziduum je E, D, V ili Q; (ar) na poziciji 67 aminokiselinski reziduum je Q, E, R. L, H ili K; (as) na poziciji 68 aminokiselinski reziduum je K, R, E ili N; (at) na poziciji 69 aminokiselinski reziduum je Q ili P; (au) na poziciji 79 aminokiselinski reziduum je E ili D; (av) na poziciji 80 aminokiselinski reziduum je G ili E; (aw) na poziciji 81 aminokiselinski reziduum je Y, N ili F; (ax) na poziciji 82 aminokiselinski reziduum je R ili H; (ay) na poziciji 83 aminokiselinski reziduum je E, G ili D; (az) na poziciji 84 aminokiselinski reziduum je Q, R ili L; (ba) na poziciji 86 aminokiselinski reziduum je A ili V; (bb) na poziciji 89 aminokiselinski reziduum je T ili S; (bc) na poziciji 90 aminokiselinski reziduum je L ili I; (bd) na poziciji 91 aminokiselinski reziduum je I ili V; (be) na poziciji 92 aminokiselinski reziduum je R ili K; (bf) na poziciji 93 aminokiselinski reziduum je H, Y ili Q; (bg) na poziciji 96 aminokiselinski reziduum je E, A ili Q; (bh) na poziciji 97 aminokiselinski reziduum je L ili I; (bi) na poziciji 100 aminokiselinski reziduum je K, R, N ili E; (bj) na poziciji 101 aminokiselinski reziduum je K ili R; (bk) na poziciji 103 aminokiselinski reziduum je A ili V; (bi) na poziciji 104 aminokiselinski reziduum je D ili N; (bm) na poziciji 105 aminokiselinski reziduum je L ili M; (bn) na poziciji 106 aminokiselinski reziduum je L ili I; (bo) na poziciji 112 aminokiselinski reziduum je T ili I; (bp) na poziciji 113 aminokiselinski reziduum je S, T ili F; (bq) na poziciji 114 aminokiselinski reziduum je A ili V; (br) na poziciji 115 aminokiselinski reziduum je S, R ili A; (bs) na poziciji 119 aminokiselinski reziduum je K, E ili R; (bt) na poziciji 120 aminokiselinski reziduum jeK ili R; (bu) na poziciji 123 aminokiselinski reziduum je F ili L; (bv) na poziciji 124 aminokiselinski reziduum je S ili R; (bw) na poziciji 125 aminokiselinski reziduum je E, K, G ili D; (bx) na poziciji 126 aminokiselinski reziduum je Q ili H; (by) na poziciji 128 aminokiselinski reziduum je E, G ili K; (by) na poziciji 129 aminokiselinski reziduum je V, I ili A; (ca) na poziciji 130 aminokiselinski reziduum je Y, H, F ili C; (cb) na poziciji 131 aminokiselinski reziduum je D, G, N ili E; (cc) na poziciji 132 aminokiselinski reziduum je I, T, A, M, V ili L; (cd) na poziciji 135 aminokiselinski reziduum je V, T, A ili I; (ce) na poziciji 138 aminokiselinski reziduum je H ili Y; (cf) na poziciji 139 aminokiselinski reziduum je I ili V; (cg) na poziciji 140 aminokiselinski reziduum je L ili S; (ch) na poziciji 142 aminokiselinski reziduum je Y ili H; (ci) na poziciji 143 aminokiselinski reziduum je K, T ili E; (cj) na poziciji 144 aminokiselinski reziduum je K, E ili R; (ck) na poziciji 145 aminokiselinski reziduum je L ili I; i (cl) na poziciji 146 aminokiselinski reziduum je T ili A. (a) na poziciji 9, 76, 94 i 110 aminokiselinski reziduum je A; (b) na poziciji 29 i 108 aminokiselinski reziduum je C; (c) na poziciji 34 aminokiselinski reziduum je D; (d) na poziciji 95 aminokiselinski reziduum je E; (e) na poziciji 56 aminokiselinski reziduum je F; (f) na poziciji 43, 44, 66, 74, 87, 102, 116, 122, 127 i 136 aminokiselinski reziduum je G; (g) na poziciji 41 aminokiselinski reziduum je H; (h) na poziciji 7 aminokiselinski reziduum je I; (i) na poziciji 85 aminokiselinski reziduum je K; (j) na poziciji 20,36, 42, 50, 72, 78, 98 i 121 aminokiselinski reziduum je L; (k) na poziciji 1, 75 i 141 aminokiselinski reziduum je M; (I) na poziciji 23, 64 i 109 aminokiselinski reziduum je N; (m) na poziciji 22, 25, 133, 134 i 137 aminokiselinski reziduum je P; (n) na poziciji 71 aminokiselinski reziduum je Q; (o) na poziciji 16, 21, 73, 99 i 111 aminokiselinski reziduum je R; (p) na poziciji 55 i 88 aminokiselinski reziduum je S; (q) na poziciji 77 aminokiselinski reziduum je T; (r) na poziciji 107 aminokiselinski reziduum je W; i (s) na poziciji 13, 46, 70, 117 i 118 aminokiselinski reziduum je Y.

2. Izolovani ili rekombinantni polinukleotid prema zahtevu 1, (i) karakterisa n time, što polipeptid katalizuje acetilaciju glifozata sa kcat/KMza glifozat od najmanje 10 mM"<1>min"\ i/ili (ii) što polipeptid katalizuje acetilaciju aminometilfosfonske kiseline; i/ili (iii) što se najmanje 80% pozicija polipeptida povinuje sledećim ograničenjima (a) na poziciji 9, 76, 94 i 110 aminokiselinski reziduum je A; (b) na poziciji 29 i 108 aminokiselinski reziduum je C; (c) na poziciji 34 aminokiselinski reziduum je D; (d) na poziciji 95 aminokiselinski reziduum je E; (e) na poziciji 56 aminokiselinski reziduum je F; (f) na pozicijama 43, 44, 66, 74, 87, 102, 116, 122, 127 i 136 aminokiselinski reziduum je G; (g) na poziciji 41 aminokiselinski reziduum je H; (h) na poziciji 7 aminokiselinski reziduum je I; (i) na poziciji 85 aminokiselinski reziduum je K; (j) na pozicijama 20, 36, 42, 50, 72, 78, 98 i 121 aminokiselinski reziduum je L; (k) na pozicijama 1, 75 i 141 aminokiselinski reziduum je M; (I) na pozicijama 23, 64 i 109 aminokiselinski reziduum je N; (m) na pozicijama 22, 25, 133, 134 i 137 aminokiselinski reziduum je P; (n) na poziciji 71 aminokiselinski reziduum je Q; (o) na pozicijama 16, 21, 73, 99 i 111 aminokiselinski reziduum je R; (p) na pozicijama 55 i 88 aminokiselinski reziduum je S; (q) na poziciji 77 aminokiselinski reziduum je T; (r) na poziciji 107 aminokiselinski reziduum je W, i (s) na pozicijama 13, 46, 70, 117 i 118 aminokiselinski reziduum je Y.

3. Izolovani ili rekombinantni polinukleotid prema zahtevu 1 ili2, karakteri — san t i m e što polipeptid sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID br: 300, SEQ ID br: 445 ili SEQ ID br: 457.

4. Izolovani ili rekombinantni polinukleotid prema zahtevu 3, koji sadrži nukleotidnu sekvencu SEQ ID br: 48, SEQ ID br: 193 ili SEQ ID br: 205. ili njihov komplement.

5. Polinukleotid prema bilo kojem od zahteva 1-3, karakterisan time (a) što je roditeljski kodon zamenjen sinonimnim kodonom, koji je pogodniji za primenu kod biljaka srodnih roditeljskom kodonu; i/ili (b) što navedeni polinukleotid nadalje sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira N-terminalni hloroplastni tranzitni peptid.

6. Sklop nukleinske kiseline koji sadrži polinukleotid prema bilo kojem od zahteva 1-5, gde navedeni sklop sadrži promoter operativno vezan za navedeni polinukleotid, gde je promoter heterologan u odnosu na polinukleotid i u stanju da izazove ekspresiju kodiranog polipeptida dovoljnu da pojača toleranciju na glifozat biljne ćlije, transformisane sklopom nukleinske kiseline.

7. Sklop prema zahtevu 6, koji nadalje sadrži drugu polinukleotidnu sekvencu koja kodira drugi polipeptid, koji na ćeliju ili organizam koji aktivno eksprimiraju drugi polipeptid, prenosi uočljivo fenotipsko obeležje; i/ili karakterisan time što sklop sadrži sekvencu T-DNK.; i/ili karakterisan time što je polinukleotid operativno vezan na regulativnu sekvencu; i/ili karakterisan time što je sklop vektor biljne transformacije.

8. Ćelija koja sadrži najmanje jedan polinukleotid prema bilo kojem od zahteva 1-5 ili najmanje jedan sklop prema bilo kojem od zahteva 6 ili 7, k a r a k t e r i s a - na time što je polinukleotid koji kodira glifozat N-acetiltransferaznu aktivnost heterologan u odnosu na ćeliju.

9. Ćelija prema zahtevu 8, karakterisana time što je ćelija biljna ćelija.

10. Transgenska biljka ili seme proizvedeno iz nje ili transgenska biljna tkivna kultura koja sadrži ćeliju iz zahteva 9, karakterisana time što biljka ili tkivna kultura eksprimira polipeptid sa glifozat N-acetiltransferaznom aktivnošću.

11. Transgenska biljka, seme ili biljna transgenska tkivna kultura prema zahtevu 10, karakterisana time što je biljka ili tkivna kultura selektovana iz rodova:Eleusine, Lollium, Bambusa, Brassica, Dacrylis, Sorghum, Pennisetum, Zea, Oryza, Triticum, Secale, Avena, Hordeum, Saccharum, Coix, Glycine i Gossypium.

12. Transgenska biljka, seme ili biljna transgenska tkivna kultura prema zahtevu 10iil 11, karakterisana time što biljka ili biljna tkivna kultura ispoljava pojačanu rezistenciju na glifozat u poređenju sa originalnom biljkom, sojem ili kulturom.

13. Izolovani ili rekombinantni polipeptid koji ima glifozat N-acetiltransferaznu aktivnost, karakterisan time (a) što navedeni polipeptid sadrži aminokiselinsku sekvencu koja se može optimalno poravnati sa sekvencom selektovanom iz grupe koju čine SEQ ID br: 300, SEQ ID br: 445 i SEQ ID br: 457, da se dobije, primenom BLOSUM62 matrice, kazne za postojanje prekida 11 i kazne za ekstenziju prekida 1, skor sličnosti od najmanje 460, ili (b) što navedni polipeptid sadrži najmanje 20 susednih aminokiselina aminokiselinske sekvence selektovane iz grupe koju čine SEQ ID br: 300, SEQ ID br: 445 i SEQ ID br: 457, ili (c) što se navedeni polipeptid kodira nukleotidnom sekvencom koja, pod striktnim uslovima, hibridizuje duž gotovo celokupnog komplementa nukleotidne sekvence koja kodira aminokiselinsku sekvencu selektovanu iz grupe koju čine SEQ ID br: 300, SEQ ID br: 445 i SEQ ID br: 457; (d) što navedeni polipeptid ima KMza glifozat od najmanje oko 2 mM ili manje; Kmza acetiICoA od najmanje 200 uM ili manje; i kcatjednako najmanje 6/minut; ili (e) što se najmanje 80% pozicija polipeptida povinuje sledećim ograničenjima: (a) na poziciji 2 aminokiselinski reziduum je I ili L; (b) na poziciji 3 aminokiselinski reziduum je E ili D; (c) na poziciji 4 aminokiselinski reziduum je V, A ili I; (d) na poziciji 5 aminokiselinski reziduum je K, R ili N; (e) na poziciji 6 aminokiselinski reziduum je P ili L; (f) na poziciji 8 aminokiselinski reziduum je N, S ili T; (g) na poziciji-10 aminokiselinski reziduum je E ili G; (h) na poziciji 11 aminokiselinski reziduum je D ili E; (i) na poziciji 12 aminokiselinski reziduum je T ili A; (j) na poziciji 14 aminokiselinski reziduum je E ili K; (k) na poziciji 15 aminokiselinski reziduum je I ili L; (I) na poziciji 17 aminokiselinski reziduum je H ili Q; (m) na poziciji 18 aminokiselinski reziduum je R, C ili K; (n) na poziciji 19 aminokiselinski reziduum je I ili V; (o) na poziciji 24 aminokiselinski reziduum je Q ili R; (p) na poziciji 26 aminokiselinski reziduum je L ili I; (q) na poziciji 27 aminokiselinski reziduum je E ili D; (r) na poziciji 28 aminokiselinski reziduum je A ili V; (s) na poziciji 30 aminokiselinski reziduum je K, M ili R; (t) na poziciji 31 aminokiselinski reziduum je Y ili F; (u) na poziciji 32 aminokiselinski reziduum je E ili G; (v) na poziciji 33 aminokiselinski reziduum je T, A ili S; (w) na poziciji 35 aminokiselinski reziduum je L, S ili M; (x) na poziciji 37 aminokiselinski reziduum je R, G, E ili Q; (y) na poziciji 38 aminokiselinski reziduum je G ili S; (z) na poziciji 39 aminokiselinski reziduum je T, A ili S; (aa) na poziciji 40 aminokiselinski reziduum je F, L ili S; (ab) na poziciji45 aminokiselinski reziduum je Y ili F; (ac) na poziciji 47 aminokiselinski reziduum je R, Q ili G; (ad) na poziciji 48 aminokiselinski reziduum je G ili D; (ae) na poziciji 49 aminokiselinski reziduum je K, R, E ili Q; (af) na poziciji 51 aminokiselinski reziduum je I ili V; (ag) na poziciji 52 aminokiselinski reziduum je S, C ili G; (ah) na poziciji 53 aminokiselinski reziduum je I ili T; (ai) na poziciji 54 aminokiselinski reziduum je A ili V; (aj) na poziciji 57 aminokiselinski reziduum je H ili N; ((ak) na poziciji 58 aminokiselinski reziduum jeQ, K, N ili P; (al) na poziciji 59 aminokiselinski reziduum je A ili S; (am) na poziciji 60 aminokiselinski reziduum je E, K, G, V ili D; (an) na poziciji 61 aminokiselinski reziduum je H ili Q; (ao) na poziciji 62 aminokiselinski reziduum je P, S ili T; (ap) na poziciji 63 aminokiselinski reziduum je E, G ili D; (aq) na poziciji 65 aminokiselinski reziduum je E, D, V ili Q; (ar) na poziciji 67 aminokiselinski reziduum je Q, E, R, L, H ili K; (as) na poziciji 68 aminokiselinski reziduum je K, R, E ili N; (at) na poziciji 69 aminokiselinski reziduum je Q ili P; (au) na poziciji 79 aminokiselinski reziduum je E ili D; (av) na poziciji 80 aminokiselinski reziduum je G ili E; (aw) na poziciji 81 aminokiselinski reziduum je Y, N ili F; (ax) na poziciji 82 aminokiselinski reziduum je R ili H; (ay) na poziciji 83 aminokiselinski reziduum je E, G ili D; (az) na poziciji 84 aminokiselinski reziduum je Q, R ili L; (ba) na poziciji 86 aminokiselinski reziduum je A ili V; (bb) na poziciji 89 aminokiselinski reziduum je T ili S; (bc) na poziciji 90 aminokiselinski reziduum je L ili I; (bd) na poziciji 91 aminokiselinski reziduum je I ili V; (be) na poziciji 92 aminokiselinski reziduum je R ili K; (bf) na poziciji 93 aminokiselinski reziduum je H, Y ili Q; (bg) na poziciji 96 aminokiselinski reziduum je E, A ili Q; (bh) na poziciji 97 aminokiselinski reziduum je L ili I; (bi) na poziciji 100 aminokiselinski reziduum je K, R, N ili E; (bj) na poziciji 101 aminokiselinski reziduum je K ili R; (bk) na poziciji 103 aminokiselinski reziduum je A ili V; (bi) na poziciji 104 aminokiselinski reziduum je D ili N; (bm) na poziciji 105 aminokiselinski reziduum je L ili M; (bn) na poziciji 106 aminokiselinski reziduum je L ili I; (bo) na poziciji 112 aminokiselinski reziduum je T ili I; (bp) na poziciji 113 aminokiselinski reziduum je S, T ili F; (bq) na poziciji 114 aminokiselinski reziduum je A ili V; (br) na poziciji 115 aminokiselinski reziduum je S, R ili A; (bs) na poziciji 119 aminokiselinski reziduum je K, E ili R; (bt) na poziciji 120 aminokiselinski reziduum jeK ili R; (bu) na poziciji 123 aminokiselinski reziduum je F ili L; (bv) na poziciji 124 aminokiselinski reziduum je S ili R; (bw) na poziciji 125 aminokiselinski reziduum je E, K, G ili D; (bx) na poziciji 126 aminokiselinski reziduum je Q ili H; (by) na poziciji 128 aminokiselinski reziduum je E, G ili K; (by) na poziciji 129 aminokiselinski reziduum je V, I ili A; (ca) na poziciji 130 aminokiselinski reziduum je Y, H, F ili C; (cb) na poziciji 131 aminokiselinski reziduum je D, G, N ili E; (cc) na poziciji 132 aminokiselinski reziduum je I, T, A, M, V ili L; (cd) na poziciji 135 aminokiselinski reziduum je V, T, A ili I; (ce) na poziciji 138 aminokiselinski reziduum je H ili Y; (cf) na poziciji 139 aminokiselinski reziduum je I ili V; (cg) na poziciji 140 aminokiselinski reziduum je L ili S; (ch) na poziciji 142 aminokiselinski reziduum je Y ili H; (ci) na poziciji 143 aminokiselinski reziduum je K, T ili E; (cj) na poziciji 144 aminokiselinski reziduum je K, E ili R; (ck) na poziciji 145 aminokiselinski reziduum je L ili I; i (cl) na poziciji 146 aminokiselinski reziduum je T ili A.

14. Izolovani ili rekombinantni polinukleotid prema zahtevu 13, karakterisan time (i) što polipeptid katalizuje acetilaciju glifozata sa IWKmza glifozat od najmanje 10 mivr'min"1, i/ili (ii) što polipeptid katalizuje acetilaciju aminometilfosfonske kiseline; i/ili (iii) što se najmanje 80% pozicija povinuje sledećim ograničenjima (a) na poziciji 9, 76, 94 i 110 aminokiselinski reziduum je A; (b) na poziciji 29 i 108 aminokiselinski reziduum je C; (c) na poziciji 34 aminokiselinski reziduum je D; (d) na poziciji 95 aminokiselinski reziduum je E; (e) na poziciji 56 aminokiselinski reziduum je F; (f) na poziciji 43, 44, 66, 74, 87, 102, 116, 122, 127 i 136 aminokiselinski reziduum je G; (g) na poziciji 41 aminokiselinski reziduum je H; (h) na poziciji 7 aminokiselinski reziduum je I; (i) na poziciji 85 aminokiselinski reziduum je K; 0) na poziciji 20,36, 42, 50, 72, 78, 98 i 121 aminokiselinski reziduum je L; (k) na poziciji 1, 75 i 141 aminokiselinski reziduum je M; (I) na poziciji 23, 64 i 109 aminokiselinski reziduum je N; (m) na poziciji 22, 25, 133, 134 i 137 aminokiselinski reziduum je P; (n) na poziciji 71 aminokiselinski reziduum je Q; (o) na poziciji 16, 21, 73, 99 i 111 aminokiselinski reziduum je R; (p) na poziciji 55 i 88 aminokiselinski reziduum je S; (q) na poziciji 77 aminokiselinski reziduum je T; (r) na poziciji 107 aminokiselinski reziduum je W; i (s) na poziciji 13, 46, 70, 117 i 118 aminokiselinski reziduum je Y.

15. Izolovani ili rekombinantni polipeptid prema zahtevu 14, karakterisan time što polipeptid sadrži aminokiselinsku sekvencu selektovanu iz grupe koja čine SEQ ID br: 300, SEQ ID br: 445 i SEQ ID br: 457.

16. Polipeptid prema zahtevu 14 ili 15, koji nadalje sadrži N-terminalni hloroplastni tranzitni peptid, i/ili koji nadalje sadrži sekrecionu sekvencu ili lokalizacionu sekvencu.

17. Polipeptid koji specifično vezuje poliklonalnim antiserumima na jedan antigen, gde antigen sadrži aminokiselinsku sekvencu selektovanu iz grupe koju čine SEQ ID br: 300, SEQ ID br: 445 i SEQ ID br. 457.

18. Metod za dobijanje polipeptida koji ima glifozat N-acetiltransferaznu aktivnost koji metod se sastoji u gajenju ćelije prema zahtevu 8 ili 9 ili biljke, semena ili biljne tkivne kulture prema zahtevima 10-12.

19. Metod za produkovanje transgenskih biljaka, njihovog semena ili biljnih ćelija otpornih na glifozat koji podrazumeva: (a) transformisanje biljke ili biljne ćelije polinukleotidom koji kodira glifozat N-acetiltransferazu, i (b) po izboru, regenerisanje transgenske biljke iz transformisane biljne ćelije.

20. Metod prema zahtevu 19, karakterisan time što polinukleotid je polinukleotid prema bilo kojem od zahteva 1-5lil je uključen u sklop prema zahtevu 6 ili 7.

21. Metod prema zahtevu 19 ili 20 koji nadalje podrazumeva gajenje transformisane biljke ili biljne ćelije u koncentraciji glifozata koja inhibiše rast prirodne biljke iste vrste, a ta koncentracija ne inhibiše rast transformisane biljke, karakterisan time što je navedeno gajenje u rastućim koncentracijama glifozata, i/ili karakterisan time što je navedeno gajenje u koncentraciji glifozata koja je smrtonosna za prirodne biljke ili biljne ćelije iste vrste.

22. Metod prema bilo kojem od zahteva 19-21, koji dalje podrazumeva reprodukovanje navedene transgenske biljke ukrštanjem navedene transgenske biljke drugom biljkom, na način da bar deo potomstva dobijenog ukrštanjem pokazuje toleranciju na glifozat.

23. Metod za selektivno suzbijanje korova na parcelama pod kulturom, koji podrazumeva: (a) Sejanje ili sadnju semena odnosno biljaka sa tolerancijom na glifozat kao posledicom transformacije polinukleotidom koji kodira glifozat N-acetiltransferazu, i (b) prskanje kulture i korova na parceli količinom glifozata dovoljnom da suzbije korov, bez značajnijeg uticaja na kulturu.

24. Metod prema zahtevu 23, k a r a k t e r i s a n time što je polinukleotid koji kodira glifozat N-acetiltransferazu polinukleotid prema bilo kojem od zahteva 1-5 ili sklop prema zahtevima 6-7.

25. Transgenska biljka ili transgenska biljna tkivna kultura sa pojačanom tolerancijom na glifozat, karakterisana time što biljka ili tkivna kultura eksprimiraju polipeptid sa glifozat N-acetiltransferaznom aktivnošću i (a) najmanje jedan polipeptid koji daje toleranciju na glifozat nekim drugim mehanizmom i/ili (b) najmanje jedan polipeptid, koji daje toleranciju na neki drugi herbicid.

26. Transgenska biljka ili transgenska biljna tkivna kultura prema zahtevu 25, karakterisana time što je polipeptid sa glifozat N-acetiltransferaznom aktivnošću eksprimiran iz polinukleotida prema bilo kojem od zahteva 1-5.

27. Transgenska biljka ili transgenska biljna tkivna kultura prema zahtevu 25 ili 26, karakterisana time (a) što najmanje jedan polipeptid koji daje toleranciju na glifozat nekim drugim mehanizmom je 5-enolpiruvilšikimat-3-fosfat sintaza tolerantna na glifozat ili glifozat oksidoreduktaza tolerantna na glifozat; i/ili (b) što najmanje jedan polipeptid, koji daje toleranciju na neki drugi herbicid je mutirana hidroksifenilpiruvat dioksigenaza, aceto-laktatna sintaza otporna na sulfonamid, acetohidroksikiselinska sintaza otporna na sulfonamid, acetolaktatna sintaza otporna na imidazolinom, acetohidroksikiselinska sintaza otporna na imidazolinon, fosfinotricin acetil transferaza ili mutirana protoporfirinogen oksidaza.

28. Metod za suzbijanje korova na poljima pod kulturom, koji se sastoji od: (a) sejanja/sadnje semena ili sadnica prema bilo kojem od zahteva 25 - 27, i (b) primene glifozata na poljima sa kulturom i korovom na efikasan način, u količini dovoljnoj da inhibiše rast korova u polju, a bez značajnijeg uticaja na kulturu, i (c) opciono, primene na poljima pod kulturom i korovom istovremeno ili vremenski naizmenično glifozata i opciono, drugog herbicida.

29. Metod prema zahtevu 28, k a r a k t e r i s a n time što se drugi herbicid primenjuje i što je selektovan iz grupe koju čine inhibitor hidroksifenilpiruvat dioksigenaze, sulfonamid, imidazolinom, bialafos, fosfinotricin, azafenidin, butafenacil, sulfozat, glufozinat i protoks inhibitor.

30. Metod prema zahtevu 29, k a r a k t e r i s a n time što se navedeni drugi herbicid primenjuje istovremeno ili sekvenciono. (a) što najmanje jedan polipeptid koji daje toleranciju na glifozat nekim drugim mehanizmom je 5-enolpiruvilšikimat-3-fosfat sintaza tolerantna na glifozat ili glifozat oksidoreduktaza tolerantna na glifozat; i/ili (b) što najmanje jedan polipeptid, koji daje toleranciju na neki drugi herbicid je mutirana hidroksifenilpiruvat dioksigenaza, aceto-laktatna sintaza otporna na sulfonamid, acetohidroksikiselinska sintaza otporna na sulfonamid, acetolaktatna sintaza otporna na imidazolinom, acetohidroksikiselinska sintaza otporna na imidazolinon, fosfinotricin acetil transferaza ili mutirana protoporfirinogen oksidaza.

28. Metod za suzbijanje korova na poljima pod kulturom, koji se sastoji od: (a) sejanja/sadnje semena ili sadnica prema bilo kojem od zahteva 25 - 27, i (b) primene glifozata na poljima sa kulturom i korovom na efikasan način, u količini dovoljnoj da inhibiše rast korova u polju, a bez značajnijeg uticaja na kulturu, i (c) opciono, primene na poljima pod kulturom i korovom istovremeno ili vremenski naizmenično glifozata i opciono, drugog herbicida.

29. Metod prema zahtevu 28, k a r a k t e r i s a n time što se drugi herbicid primenjuje i što je selektovan iz grupe koju čine inhibitor hidroksifenilpiruvat dioksigenaze, sulfonamid, imidazolinom, bialafos, fosfinotricin, azafenidin, butafenacil, sulfozat, glufozinat i protoks inhibitor.

30. Metod prema zahtevu 29, k a r a k t e r i s a n time što se navedeni drugi herbicid primenjuje istovremeno ili sekvenciono.

31. Biljna ćelija koja sadrži metabolički produkt glifozata koji je N-acetilglifozat.

32. Biljna ćelija prema zahtevu 31,karakterisana time što pomenuti metabolički produkt predstavlja produkt polipeptida koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja se najmanje 80% podudara sa aminokiselinskom sekvencom navedenom u SEQ ID br: 300, 445, ili 457.

33. Biljna ćelija koja eksprimira GAT polipeptid, karakterisana ti me što navedena biljna ćelija proizvodi N-acetilglifozat kada se tretira glifozatom.

34. Biljna ćelija prema zahtevu 33, k a r a k t e r i s a n a t i m e što navedeni GAT polipeptid sadrži aminokiselinsku sekvencu koja se najmanje 80% podudara sa aminokiselinskom sekvencom navedenom u SEQ ID br: 300, 445, ili 457.

35. Metod za procenjivanje aktivnosti GAT polipeptida u tkivu biljke koji uključuje tretiranje biljke glifozatom i ispitivanje tkiva te biljke na prisustvo N-acetilglifozata.

36. Metod prema zahtevu 35, karakterisan t i m e što navedeni GAT polipeptid sadrži aminokiselinsku sekvencu koja se najmanje 80% podudara sa aminokiselinskom sekvencom navedenom u SEQ ID br: 300, 445, ili 457.

37. Metod za otkrivanje prisustva GAT polipeptida u tkivu biljke koji uključuje ispitivanje tkiva biljke na prisustvo N-acetilglifozata.

38. Metod prema zahtevu 37, k a r a k t e r i s a n time što navedeni GAT polipeptid sadrži aminokiselinsku sekvencu koja se najmanje 80% podudara sa aminokiselinskom sekvencom navedenom u SEQ ID br: 300, 445, ili 457.

39. Metod prema zahtevu 37, karakterisan t i m e što pomenuti metod uključuje ispitivanje biljnog tkiva upotrebom imunološkog testa.

40. Metod prema zahtevu 39, k a r a k t e r i s a n time što navedeni polipeptid sadrži aminokiselinsku sekvencu koja se najmanje 80% podudara sa aminokiselinskom sekvencom navedenom u SEQ ID br: 300, 445, ili 457.

41. Metod za otkrivanje prisustva polinukleotida koji kodira GAT polipeptid koji uključuje ispitivanje biljnog tkiva upotrebom PCR amplifikovanja.

42. Metod prema zahtevu 41, karakterisan time što navedeni polinukleotid kodira GAT polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja se najmanje 80% podudara sa aminokiselinskom sekvencom navedenom u SEQ ID br: 300, 445, ili 457.

43. Metod za utvrdjivanje da li GAT polipeptid daje otpornost glifozatu kod transgenskih biljaka, koji podrazumeva: transformisanje bijke GAT polinukleotidom koji kodira GAT polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja se najmanje 80% podudara sa aminokiselinskom sekvencom navedenom u SEQ ID br: 300, 445, ili 457; tretiranje transformisane biljke glifozatom; i utvrdjivanje da li je zbog tretiranja glifozatom biljka oštećena ili uginula.