RS32804A - Gonadotropini za folikulogenezu - Google Patents

Abstract

Ovaj pronalazak obezbedjuje jedan FSH preparat koji ima visok stepen sijalilacije i ispoljava veću efikasnost.

Description

Gonadotropini za folikulogenezu

Oblast tehnike

Ovaj pronalazak se odnosi na polje gonadotropina, a posebno na njihovu upotrebu u tehnologijama asistirane reprodukcije (ART), izazivanja ovulacije (01), intrauterine inseminacije (IUI) i infertilne pacijente muškog pola.

Stanje tehnike

Gonadotropini predstavljaju grupu heterodimernih glikoproteina uključujući hormon koji stimuliše folikule, (FSH), luteinizirajući hormon (LH) i horionski gonadotropin (CG). Ovi hormoni regulišu gonadalnu funkciju kod muškaraca žena.

Svaki od ovih hormona se sastoji od dve ne-kovalentno vezane pod-jedinice jedne a-pod-jedinice, koja je zajednička za FSH, LH i hCG, i jedne 3-pod-jedinice, koja je jedinstvena za svakog od njih, i koja daje biološku specifičnost svakom hormonu.

Kod svih ovih gonadotropina, svaka pod-jedinica ima bočne lance oligosaharida povezane sa asparaginom (N-povezane). Kod zajedničkih a-pod-jedinica humanih hormona, one su spojene na pozicijama 52 i 78. Kod humanog FSH i CG, dva N-povezana bočna lanca oligosaharida su spojena sa p-pod-jedinicom na pozicijama 7 i 24 kod FSH, i na pozicijama 13 i 30 kod hCG. Kod humanog LH, jedan oligosaharid je spojen za poziciji 30 (3-pod-jedinice. hCG osim toga ima četiri bočna lanca oligosaharida povezanih sa serinom (O-povezanih) koji se nalaze u karboksi-terminalnom delu (CTP).

Kao i kod svih glikoproteina, javljaju se varijacije u strukturi oligosaharida u gonadotropinima, što dovodi do čitavog spektra izoforma koji se nalaze u hipofizi i u cirkulaciji. Takođe, postoje i razlike u stepenu "kapiranja" terminalnih ugljenih hidrata od strane sijalinske kiseline. Ovi izofromi se mogu podeliti na osnovu njihovog naelektrisanja koje u velikoj meri određuje broj i distribucija sijaliliranih N-povezanih oligosaharida. Visoko sijalilirarani oblici će imati veću kiselost u odnosu na prosečni pH, pa se stoja nazivaju "kiselim". Manje sijalilirane forme imaju srazmerno više pH vrednosti pa se stoga nazivaju "baznim".

Usled njihovih strukturnih razlika, izoformni oblici gonadotropina se razlikuju po svojoj sposobnosti sa se vezuju za receptore ciljnih ćelija. Stepen sijalilacije utiče na njihovu sposobnost preživljavanja u cirkulaciji. U slučaju FSH, nekoliko grupa je dokazalo da visoko kiseli/sijalilirani izoformi imaju značajno duži polu-život u plazmi na životinjskim modelima, kao što su miš i pacov<1.>

Pokazano je da izoformni profil endogenog FSH kod ljudi varira. Kiseli izoformni oblici sa dugimin vivopolu-životom i relativno niskomin vitrobiološkom snagom su predominantni u serumu dece pre puberteta, kod pacijenata sa hipogonadizmom kao i kod žena tokom folikularne faze. Na suprot tome, manje sijalilirani, bazniji izoformi, sa kratkimin vivopolu-životom i relativno visokomin vitrobiološkom aktivnošću nalaze se tokom puberteta, GnRH terapije i otprilike u sredini ciklusa nadolaska gonadotropina kod žena<2>.

Izoformi FSH sa većim sadržajem sijalilske kiseline duže cirkulišu, zato što terminani ostaci sijalilske kiseline "kapiraju" ostatke galaktoze i tako sprečavaju interakciju sa hepatičkim asijalo-glikoproteinskim receptorima, i eliminaciju iz cirkulacije<3.>

Oligosaharidni (glikanski) delovi spojeni sa proteinima se granaju a svaki terminalni ostatak šećera se posmatra kao antena. Z-broj kao prametar obezbeđuje merilo koje određuje koji deo antene delova ugljenih hidrata u glikoproteinima nosi naelektrisane ostatke, kao što je sijalilska kiselina. Z-broj desijaliliranog FSH je 0. Z-broj potpuno sijaliliranog FSH bi bio negde oko 230 do 280.

Snaga preparata FSH se procenjujein vitrouz pomoć Steelman-Pohlev eseja, na osnovu koga se, pod određenim uslovima, poredi sposobnost preparata da povećaju ovarijalnu masu nezrelih pacova u poređenju sa međunarodnim standardom/referentnim preparatom, kalibriranim u Internacionalnim jedinicama (U)4.

Mnoge grupe su istraživale ulogu glikozilacije i sijalilacije kod uticaja na biološki profil FSH.

D'Antonioi sar.su procenjivali stope metaboličkog klirensa (MCR) kod ženki pacova kiselih (pl < 4.8) i baznih (pl > 4.8) rhFSH izoforma dobijenih hromatofokusiranjem. Kako se očekivalo, utvrđeno je da bazni izoformi imaju brži klirens u odnosu na kisele izoforme(ty2= 0.4 h za bazne, 0.9 h za kisele). Kada su kiseli i bazni oblici poređeni (na bazi mase) u Steelman-Pohlev eseju, bazni izoform je, kako je utvrđeno, bio značajno manje aktivan od kiselog izoforma (ED50= 0.9 ug/pacov za bazni , 0.3 ug/pacov zakiseli). Kada su izoformi poređeni ba osnovu U, nije utvrđena nikakva razlika između ova dva oblika<5>.

Vitt/' sar.su sproveli jednuin vitrostudiju u kojoj je poređeno četiri preparata rekombinantnog humanog FSH različite pl kako bi se utvrdila njihova sposobnost da dovedu do povećanja produkcije estradiola u izolovanim mišjim folikulama. Utvrđeno je da bazni FSH (pl 5.0-5.6) dovodi do bržeg rasta folikula što dalje dovodi do najveće maksimalne veličine folikula i potom do nefraksionisanog rekombinantnog FSH. Srednji (pl 4.5-5.0) i kiseli (pl 3.6-4.6) preparati FSH su bili odgovorni kako za brzinu rasta tako i za maksimalnu veličinu folikula. Pokazalo se da bazni FSH ranije izaziva sekreciju E2 i u manjim dozama nego drugi izoformi. Folikule kultivisane sa kiselim FSH, bez obzira na koncentraciju, lučile su koncentracije E2koje su se mogle izmeriti tek posle produžene inkubacije<6.>

Timossii sar sukoristili hromatofokusiranje za separaciju humanog hipofizealnog FSH na sedam različitih frakcija različite glikozilacije/kiselosti. Ove frakcije su ispitivane kako bi se utvrdila njihova sposobnost da izazovu uzlaznu regulaciju ekspresije aromataze (koja je neophodna za produkciju estradiola), kao i aktivatora plazminogena prema tipu tkiva (tPA)in vitrou granuloznim ćelijama pacova. Odnos bioaktivnosti prema imunorekativnosti (B/l) se, kako je utvrđeno, smanjivao sa opadanjem elucije pH vrednosti izoforma. Autori su zaključili da su bazni izoformi ispoljavali veću sposobnost indukcije ekspresije kako aromataze tako i tPA mRNA i proteina nego kisele varijante.<7>

Zambranoi sar.su frakcionisali humani hipofizni FSH u 9 frakcija različite pl, koristeći hromatofokusiranje a kisele i bazne izoforme su ispitivali koristeći tri imunoeseja i dvain vitroeseja: produkciju estradiola od strane granuloznih ćelija pacova i produkciju cAMP od strane humane fetalne ćelijske loze koja eksprimira FSH receptor. Odnos aktivnosti prema imunorekativnosti u bioesejima (B/l) se smanjivao kako se pl izoforma smanjivala, u svim bioesejima<8>.

U jednoj narednoj studiji, Zambrano /'sar.su poredili afinitet vezivanja nekoliko različitih frakcija kiselih i baznih izoforma humanog hipofizealnog FSH za heterologni sistem receptora (granulozne ćelije pacova) i homologni sistem receptra (rekombinantne humane HEK-293 ćelije koje eksprimiraju humani FSH receptor). Pokazalo se da se afinitet heterolognog receptora za vezivanje povećava zajedno sa pl izoforma, dok sa homolognim receptorom to nije bio slučaj. Produkcija cAMP u HEK-293 ćelijama se takođe povećavala sa povećanjem pl izoforma<9>.

Studije su pokazale da kiseliji oblici FSH ispoljavaju najvišuin vivobioaktivnost (na osnovu mase) kada se procenjuju klasičnim ispitivanjem

povećanja težine ovarijuma.<10,11>Timossii sar.su pretpostavili da bazni oblici mogu biti aktivnijiin vivoali da se zbog kraćeg polu-života taj efekat ne može primetiti kroz povećanje težine ovarijuma pacova. Oni su ispitivali efekte dva preparata na sistem brzog odgovora: uzlaznu regulaciju aktivnosti tPA<12.>Ovi autori su zaključili da rhFSH koji ima manje kiseli profil distribucije

naelektrisanja, pokazuje višuin vitrobioaktivnost i brzinu klirensa iz plazme pa stoga brže izaziva aktivnost tPA enzima nego visoko kiseli preparati FSH.

Gonadotropini igraju ključnu ulogu u reproduktivnom ciklusu, a njihova upotreba je esencijalna kod tehnika asistirane reprodukcije(ART), kao što suin vitrofertilizacija (IVF), IVF zajedno sa intracitoplazamtskim ubrizgavanjem sperme (IVF/ICSI) i transfer embriona (ET), kao i za indukciju ovulacije (Ol) kod anovulatornih pacijentkinja koje se podvrgavajuin vivofertilizaciji bilo prirodnim putem ili putem intrauterine inseminacije (IUI).

ART se obično sprovodi uz korišćenje kontrolisane hiperstimulacije ovarijuma (COH) kako bi se povećao broj ženskih gameta<13>. Standardni režimi<14>koji se primenjuju za COH uključuju fazu silazne regulacije u kojoj se endogeni gonadotropini suprimiraju davanjem agonista hormona koji oslobađa gonadotropin (GnRH) i potom stimulatornu fazu, tokom koje se razvoj (folikulogeneza ) izaziva svakodnevnom administracijom FSH, obično u dozi od 150-225 IJ/dan. Alternativno, stimulacija se započinje posle spontane ili indukovane menstruacije uz istovremeno sprečavanje nepravovremenog nadolaska LH usled administracije agonista GnRH (koja obično počinje oko šestog dana stimulatorne faze). Ukoliko postoji najmanje 3 folikule >16 mm (jedna od 18 mm), daje se jedan bolus hCG (5-10,000 U) kako bi se imitirao prirodni nadolazak LH i izazvala ovulacija. Dobijanje oocita se vremenski određuje za period 36-38 sati posle injekcije hCG.

01 se obično sprovodi uz pomoć svakodnevne administracije FSH u dozi od oko 75-150 I J/dan. Može se koristiti silazna regulacija uz pomoć agonista ili antagonista GnRH, iako rede nego onda kada je indikovan ART. hCG se daje kako bi se imitirao nadolazak LH prein vivofertilizacije, što se postiže redovnim seksualnim odnosima ili uz pomoć IUI.

Tipični režimi kod ART i Ol koji su gore opisani iziskuju svakodnevne injekcije gonadotropina tokom dužeg perioda, tj. prosečno tokom 10 dana, pa do 21 dana kod nekih pacijenata. Razvoj preparata FSH veće efikasnosti će omogućiti da se dnevna doza FSH smanji, i/ili će omogućiti skraćenje vremena tretmana (tj. manji broj injekcija), i/ili će omogućiti da se injekcije rede daju. To će učiniti ART i Ol režime daleko pogodnijim i prijatnijim za pacijente.

Takođe, ART uz pomoćin vitrofertilizacije je udružen sa mogućim neželjenim događajima. Na primer, neće svaka folikula proizvesti vijabilne oocite niti će svaki vijabilni oocit biti uspešno oplođen, a neki embrioni ne moraju biti vijabilni. Takođe, kada se izvrši selekcija vijabilnih embriona, njihov transfer u uterus i implantacija ne moraju uvek biti uspešni. Da bi se maksimalno povećale šanse za rađanje živog deteta iz tog razloga je poželjno da se stimuliše rast i sazrevanje nekoliko folikula kako bi se obezbedilo prikupljanje nekoliko oocita.

Nasuprot tome, kod indikacija koje se odnose na Ol, cilj je da se obezbedi najviše tri a po mogućnosti jedan dominantan folikul (kako bi se izbegle višestruke trudnoće).

Kod nekih pacijenata koji se podvrgavaju ART i Ol javlja se smanjeni broj rastućih folikula pri tretmanu uobičajenim preparatima FSH. Ovo predstavlja ograničavajući faktor za uspeh ukoliko se primenjuje ART, obzirom da to ograničava broj embriona raspoloživih za transfer i/ili krioprezervaciju. To takođe može biti ograničavajući faktor za uspeh kod pacijenata koji se podvrgavaju IUI, gde je važno dobiti više od jedne folikule. Grupa pacijenata koji ispoljavaju ovu vrstu odgovora uključuje pacijente stare preko 33-35 godina, pacijente sa povišenim bazalnim FSH, povišenim bazalnim estradiolom ili smanjenim bazalniminhibinom b.

Kod muškaraca, spermatogeneza zavisi od stimulacije Sertolijevih ćelija koju vrši FSH. Nedostatak FSH dovodi do oligospermije a time i do infertiliteta. Lečenje muškog inferitliteta konvencionalnim preparatima FSH iziskuje injekcije FSH tri puta nedeljno tokom 18 meseci.

Razvoj preparata FSH sa pojačanom sposobnošću stimulacije folikulogeneze predstavlja tekuću potrebu. Takođe postoji potrebna za novim preparatima FSH za lečenje pacijenata sa smanjenim odgovorom na FSH. Isto tako su poželjni preparati FSH veće efikasnosti koji omogućavaju kraće terapeutske protokole i/ili smanjene kumulativne doze i/ili rede doziranje kod ART, Ol i muškog infertiliteta.

Kratak prikaz pronalaska

Cilj ovog pronalaska je da se obezbedi preparat gonadotropina koji će se koristiti za indukciju ovulacije i COH, posebno u vezi sa ART.

Kod prvog oblika, ovaj pronalazak obezbeđuje preparat FSH naznačen time daje Z-broj preparata najmanje ili oko 200.

Kod drugog oblika, ovaj pronalazak obezbeđuje preparat FSH, naznačen time da ima prosečnu pl ispod ili oko 3.4.

U trećem obliku, pronalazak obezbeđuje farmaceutski sastav koji obuhvata FSH, naznačen time da FSH ima Z-broj koji je najmanje ili oko 200.

U četvrtom obliku, pronalazak obezbeđuje upotrebu FSH za stimulaciju folikulogeneze, što je naznačeno time da FSH ima Z-broj koji je najmanje ili oko 200.

U petom obliku, ovaj pronalazak obezbeđuje upotrebu FSH u pripremi leka koji se koristi za stimulaciju folikulogeneze, što je naznačeno time da FSH ima Z-broj koji je najmanje ili oko 200.

U šestom obliku, ovaj pronalazak obezbeđuje metodu za indukciju folikulogeneze kod humanih pacijenata, a ta metoda se sastoji od administracije FSH pacijentu, što je naznačeno time da FSH ima Z-broj koji je najmanje ili oko 200.

U sedmom obliku, ovaj pronalazak obezbeđuje metodu za pripremu preparata FSH koji ima Z-broj koji je najmanje ili oko 200, što je metoda koja obuhvata jedan od narednih koraka: • reakcija FSH sa sijalinskom kiselinom davaoca u prisustvu 2,3-sijaliltransferaze; • selekcija pogodnog tipa ćelija za ekspresiju rekombinantnog FSH; • kultivisanje ćelije, poželjno rekombinantne, koja eksprimira FSH pod uslovima koji pogoduju visokim nivoima sijalilacije; i • izolacija izoforma FSH koji imaju visok Z-broj uz pomoć hromatografske tehnike.

U osmom obliku, ovaj pronalazak obezbeđuje upotrebu FSH u lečenju muškog infertiliteta, što je naznačeno time da FSH ima Z-broj koji je najmanje ili oko 200.

U devetom obliku, ovaj pronalazak obezbeđuje upotrebu FSH za pripremu leka koji će se koristiti u lečenju muškog infertiliteta, što je naznačeno time da FSH ima Z-broj koji je najmanje ili oko 200.

U desetom obliku, ovaj pronalazak obezbeđuje metodu za lečenje muškog infertiliteta kod humanog pacijenta, metodu koja podrazumeva administraciju FSH datom pacijentu, što je naznačeno time da FSH ima Z-broj koji je najmanje ili oko 200.

Kratak opis crteža

Slika 1 pokazuje hromatogram za eluciju kroz GlikoSep® C kolonu glikana oslobođenih iz rFSH; kolona 4.6 x 100 mm, pripremljena je korišćenjem smole divinil benzena koja je premazana polimerom (5 m), sa mobilnom fazom acetonitril: voda20:80, sa linearnim gradijentom od 0.25% po minuti amonijum acetata (500 mM) od 5 do 21 minuta, posle čega je usledio linearni gradijent od 0.525% po minutu amonijum acetata (500 mM) od 21 do 61 minuta. X-osa pokazuje vreme retencije u minutima, a Y-osa pokazuje jačinu signala u mV.

Slika 2 pokazuje broj folikula po kategoriji veličine, 8. dana (na Y-osi), kod pacijenata koji su primali kisele ili bazne izoforme FSH sve do dana 7. Talasaste linije predstavljaju rezultat dobijen sa kiselim izoformima, kose linije predstavljaju rezultat dobijen sa baznim izoformima.

Slika 3 pokazuje broj folikula po kategoriji veličine, 10. dana (na Y-osi), kod pacijenata koji su primali kisele ili bazne izoforme FSH do dana 7. Talasaste linije predstavljaju rezultat dobijen sa kiselim izoformima, kose linije predstavljaju rezultat dobijen sa baznim izoformima.

Slika 4 pokazuje prosečne nivoe FSH u serumu kod pacijenata posle poslednje doze kiselih ili baznih izoforma FSH. X-osa predstavlja vreme u satima od prve injekcije FSH, Y osa predstavlja serumsku koncentraciju u imuno-reaktivnim IJ/L. Kvadrati (■) pokazuju serumsku koncentraciju posle injekcija kiselih izoforma; romboidi (♦) pokazuju serumsku koncentraciju posle injekcije baznih izoforma FSH. Koncentracije u serumu su merene uz pomoć imunoeseja, na primer, radio-imunoeseja, uz korišćenje kita koji proizvodi Daiichi Isotope Laboratorv, Japan.

Slika 5 pokazuje sekvencu amino kiselina kod zrelih humanih FSH alfa pod-jedinica .

Slika 6 pokazuje sekvencu amino kiselina kod zrelih humanih FSH beta pod-jedinica.

Detaljni opis pronalaska

Pronalazači su došli do iznenađujućeg otkrića da visoko sijalirani izoformi FSH imaju veću efikasnost u izazivanju folikulogeneze kod humanih pacijenata neko manje sijalilirani izoformi. Upotreba preparat FSH iz ovog pronalaska omogućava korišćenje manjih kumulativnih doza FSH za postizanje istih ili boljih kliničkih rezultata.

Pronalazači su utvrdili da kada se pacijenti leče istim količinama kiselog FSH i baznog FSH, na bazi U koja je određena na osnovu konvencionalnog eseja, broj rastućih folikula kod pacijenata lečenog kiselim FSH je značajno veći.

Kada se pacijenti leče istim količinama kiselog FSH i baznog FSH, koje su određene na osnovu mase, broj folikula kod pacijenata lečenih kiselim FSH je takođe značajno veći.

Neki pacijenti pokazuju smanjeni broj rastućih folikula ukoliko se leče konvencionalnim preparatom FSH. To predstavlja ograničavajući faktor za uspeh pri primeni ART. U pacijente koji pokazuju ovu vrstu odgovora spadaju pacijenti stari preko 33-35 godina, pacijenti sa povišenim bazalnim FSH, povišenim bazalnim estradiolom ili smanjenim bazalniminhibinom b.Preparat FSH prema ovom pronalasku se može ubrizgavati jednom dnevno ili svaki drugi dan kako bi se izazvao bolji odgovor ovarijuma nego sa konvencionalnim preparatima. To povećava šanse za začeće kod ovih pacijenata.

Pronalazači su takođe došli do iznenađujućeg otkrića da su preparati FSH daleko efikasniji i da omogućavaju redu primenu doza i da se mogu napraviti upotrebom FSH koji ima Z-broj koji je najmanje ili oko 200, a najpoželjnije je da on bude jednak ili približan brojevima 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280 i 290 gde će se redosled preferentnih brojeva povećavati sa povećanjem Z-broja (Z-brojevi između ovih vrednosti su naravno u domenu ovog pronalaska). Za indukciju folikulogeneze, konvencionalni preparati FSH se generalno primenjuju svakoga dana u dozi od oko 75-600 IJ/dan. Kod većine pacijenata se ista kumulativna doza konvencionalnog preparata FSH može davati svaka dva dana uz postizanje istih kliničkih rezultat kao i sa svakodnevnim injekcijama<15>. Izraz "rede doziranje" se koristi kod preparata FSH koji se mogu davati rede nego svaka dva dana a da istovremeno omoguće isti klinički rezultat, u smislu ukupnog folikularnog volumena, kao i konvencionalni preparati koji se daju svakoga dana ili svaki drugi dan.

Termini "kiseli" i "bazni" se široko koriste kod preparata FSH kod kojih postoji različit stepen sijalilacije. Obzirom da je sijalinska kiselina kisela, molekuli koji su više sijalilirani će imati niže pl. Korišćenjem izoelektričnog fokusiranja, hromatofokusiranja ili drugih metoda za separaciju, kao što su hromatografija sa razmenom jona, FPLC i HPLC<16>, može se izvršiti separacija mešavine izoforma na frakcije koje se mogu podeliti na kisele ili bazne, a najpoželjnije je da to bude zasnovano na Z-broju.

Termin "sijalinska kiselina" odnosi na bilo koji član porodice karboksiliranih šećera sa devet ugljenika. Najčešći član porodice sijalinskih kiselina je N-acetilneuraminska kiselina (2-keto-5-acetamido-3,5-dideoksi-D-glicero-D-galaktononulopiranos-1-onska kiselina, koja se često skraćuje kao Neu5Ac, NeuAc, ili NANA). Drugi član ove porodice je N-glikolil-neuraminska kiselina (Neu5Gc ili NeuGc), kod koje je N-acetil grupa NeuAc hidroksilizovana. Treći član porodice sijalinskih kiselina je 2-keto-3-deoksi-nonulosonska kiselina

(KDN).<17>Takođe su obuhvaćene i 9-supstitucionisanih sijalinskih kiselina kao što su 9-0-Ci-C6-acil-Neu5Ac poput 9-0-laktill-Neu5Ac ili 9-0-acetil-Neu5Ac, 9-deoksi-9-fluoro-Neu5Ac i 9-azido-9-deoksi-Neu5Ac. Radi pregleda porodice sijalinskih kiselina videti npr. Varki;Glikobiology 2 1992;25-40; Sijalinske kiseline: Hernija, metabolizam i funkcija, R. Schauer, Ed. (Springer-Verlag, New York (1992)).

Ugljiko-hidratni (alternativno "glikani") delovi su spojeni sa peptidnom osovinom jednog šećera, putem O- ili N-povezane glikozidne veze. Tokom procene ugljiko-hidratnog dela može doći do grananja, što će dovesti do toga da se ajve ugljiko-hidratni delovi sa jedan, dva, tri ili četiri (nekada i više) terminalnih ostataka šećera ili "antena". Takvi ugljiko-hidratni delovi se nazivaju mono- di- tri- ili tetra-ograncima. Indeks antenarnosti kao parametar (Al) obezbeđuje merilio stepena grananja ostataka ugljenih hidrata što takođe daje merilo 3-D veličine ugIjiko-hidratnih delova. Da bi se odredio ovaj parametar, glikoprotein se hemijski tretira kako bi se oslobodili svi ostatci ugljenih hidrata, na primer zagrevanjem hidrazinom, ili se ugljeni hidrat može enzimski cepati, na primer, uz pomoć endoglikozidaze (N-glikanaza)<18>. Izoluje se mešavina ugljenih hidrata. Ukoliko je poželjno, mešavina ugljenih hidrata se obeležava uz korišćenje agensa za radioobeležavanje, hromoforno obeležavanje (tj. UV-vis aktivno), fluoroforno obeležavanje, imunoreaktivno obeležavanje, itd. Obeležena mešavina ugljenih hidrata se potom desijalilizuje uz pomoć enzima sijalidaze kako bi se dobila obeležena neutralna mešavina ugljenih hidrata. (Alternativno, redosled koraka pri obeležavanju desijalilacije se može obrnuti). Obeležena neutralna mešavina ugljenih hidrata se potom odvaja na komponente a upotrebom hromatografske metode se mogu razlikovati različite vrste (mono-, di-, tri- i tetra-ogranci). Hromatografija (normalne- ili obrnute faze) se može izvršiti uz korišćenje bilo koje metode, uključujući, na primer hromatografiju tankog ili debelog sloja, ili visoko-efikasnu tečnu hromatografiju (HPLC). Umesto toga, izolovana neutralna mešavina ugljenih hidrata se može podvrgnuti reakciji sa nekim agensom koji date komponente čini volatilnim, a mešavina se može podvrgnuti gasnoj hromatografiji (GC). Vizuelizacija će se postići korišćenjem metode koja odgovara načinu obeležavanja koji je primenjen i hromatografskoj metodi koja je korišćena. Na primer, ukoliko je za obeležavanje korišćen fluorofor, za detekciju će se koristiti fluorimetar; ukoliko je za obeležavanje korišćen hromofor, za detekciju će se koristiti UV-vis spektrofotometar. Ukoliko nije korišćeno obeležavanje, masena spektrometrija može da se upotrebi za merenje pikova i vremena retencije. Određivanje pikova koji se odnose na mono- di- tri- ili tetra-ogranke različitih vrsta se može izvršiti primenom masene spektrometrija, ili poređenjem sa poznatim standardima.

Hromatogram se potom analizira integrisanjem pikova udruženih sa vrstama ugljenih hidrata sa di- tri- i tetra-ograncima. Procenat ukupnih ugljenih hidrata predstavljenih svakom zasebnom vrstom se potom može koristiti za izračunavanje Al prema sledećoj jednačini:

gde je Al indeks antenarnosti, a Pdi, Pthi Ptetrapredstavljaju ukupne ugljene hidrate sa di-, tri- odnosno tetra-ograncima. Količine drugih komponenata u tragovima (npr. mono-antenarnih) mogu biti prisutne ali ne mogu značajno da doprinesu Al vrednosti.

Visok indeks antenarnosti ukazuje da su ugliko-hidratni delovi veoma razgranati sa mnogo antena. Rekombinantni humani FSH tipično ima Al od oko 220-280, ili prosečno oko 255.

Z-broj kao parametar predstavlja merilo za broj antena ugljiko-hidratnog dela u glikoproteinu koje nose naelektrisane ostatke, kao što je sijalinska kiselina. Da bi se odredio Z-broj, ugljikohidratni delovi se oslobađaju sa peptida kako je gore navedeno i obeležavaju ukoliko je to poželjno. Ta mešavina se potom podvrgava separaciji iz pomoć hromatografije sa razmenom jona, što omogućava separaciju vrsta na osnovu naelektrisanja. Vizuelizacija eluiranih pikova se može postići obeležavanjem, kako je gore pomenuto, ili se može postići korišćenjem neke druge metode, kao što je masena spektrometrija. Hromatogram se potom analizira integrisanjem pikova udruženih sa mono-di- tri- i tetra-naelektrisanim vrstama ugljenih hidrata. Procenat ukupnih ugljenih hidrata predstavljen svakom pojedinačnom vrstom se potom može koristiti za izračunavanje Z-broja prema sledećoj jednačini:

gde je Z zapravo Z-broj, a P'm0no,<p>'di, P'tn i P'tetra predstavljaju procenat ukupnog ugljenog hidrata koji je mono-, di-, tri- odnosno tetra-naelektrisan..

Visok Z-broj ukazuje da veliki broj antena nosi naelektrisane ostatke i da će stoga glikoprotein biti visoko naelektrisan, i u slučaju ostataka sijalinske kiseline -kiseo. Rekombinantni humani FSH tipično ima vrednosti Z-broja u opsegu od oko 150 do oko 190, ili prosečno oko 184.

Pronalazači su došli do iznenađujućeg otkrića da izoformi FSH koji imaju Z-brojeve više od oko 200 pokazuju veću efikasnost u smislu broja folikula, u odnosu na ona zasnovana na U sa "ekvivalentnom dozom" izoforma FSH koji imaju Z-brojeve manje od 200. Pod "ekvivalentnom dozom" se podrazumeva da kada se količina različitih izoforma meri poređenjem, uz pomoć konvencionalnogin vivoeseja, njihova sposobnost da povećavaju ovarijalnu masu kod pacova, U doza ostaje ista. Drugim rečima, ekvivalentne U doze različitih izoforma, kako je utvrđeno kod pacova, imaju različitu kliničku efikasnost kada se primenjuju kod ljudi.

Preparati FSH koji imaju veće Z-brojeve mogu se izolovati na brojne načine. Na primer, partija rekombinantnog FSH se može podvrgnuti izoelektričnom fokusiranju ili hromatofokusiranju kako su opisali, na primer, Muldersi sar. 19,Zambranoi sar. 20,ili Timossii sar. 21Mogu se izolovati frakcije koje imaju različite pl. Preferentni preparati FSH iz ovog pronalaska imaju prosečne pl jednake ili manje od 3.4, a poželjnije je da one budu manje nego jednake 3.3, a posebno je poželjno da one budu manje od 3.2 dok se stepen preferencije povećava sa smanjenjem prosečne pl.

Z-broj kao parametar odražava prosečan stepen sijalilacije populacije vrsta FSH. Moguće je da preparat FSH koji ima visok Z-broj može ipak da ima značajnu srazmeru baznih (manje sijalilovanih) vrsta. Takve bazne vrste mogu da deluju kao antagonisti na FSH receptor, pa su stoga nepoželjne. "Raširenost" prisutnih vrsta se može odrediti izoelektričnim fokusiranjem ili hromatofokusiranjem. Analizom Z-broja se takođe može steći uvid u raširenosti vrsta. Poželjno je da preparat ima manje od oko 4% neutralnih ugljiko-hidratnih vrsta (tj. da glikanski delovi ne nose naelektrisanje), kao i manje od ili oko 16% mono-sijaliliranih vrsta, a poželjnije je da preparat ima manje ili oko 3%, 2% ili 1% neutralnih vrsta i manje od ili oko 15%, 12%, 10%, 8% ili 5% monosijaliliranih vrsta, a stepen preferentnosti se povećava sa smanjenjem procenta.

U domen ovog pronalaska spadaju preparati FSH sa povećanom efikasnošću kod folikulogeneze što dovodi do povećanog stepena sijalilacije na jednom ili više dodatatnih mesta glikozilacije na proteinu. Takva mesta se mogu uvesti substitucijom ostataka u osnovnoj proteinskoj strukturi FSH ostatcima serina, treonia, lizina ili asparagina, korišćenjem, na primer, mutageneze. Primer metode koja se može koristiti za generisanje takvih mutantskih formi FSH dat je u Primeru 7. Kodin vivoglikozilacije, uvedeno mesto treba da bude takvo da formira jedno "mesto A/-glikozilacije", sa sledećom sekvencom: N-X'-S/T/C-X", što je naznačeno time daje X' ostatak bilo koje amino kiseline izuzev prolina, X" ostatak bilo koje amino kiseline koja može a ne mora biti identična X' a poželjno je da se ona razlikuje od prolina, N je asparagin a S/T/C predstavlja ostatak koji može da bude serin, treonin ili cistein , poželjno je da to bude serin ili treonin, dok je treonin najpoželjniji. Kiseli izoformi (pl<<>3.4) takvih molekula FSH spadaju u domen ovog pronalaska. Takvi modifikovani molekuli FSH, koji nose dodatna mesta glikozilacije opisani su na primer u WO 01/58493 (Maxygen). Posebno su poželjne sledeće mutacije: Kod (3-pod-jedinica : E4N, A70N, L73N, V78N, G100N, Y103N, F19N/I21T, L37N/Y39T, D41N/A43T, E55N/A43T, E59N/V61T i R97N/L99T;

Kod a-pod-jedinica : E9N, F17T, F17N, R67N, V68T, E56N, H83N, i F33N/R35T;

Što je naznačeno time da A predstavlja alanin, D predstavlja asparaginsku kiselinu, E predstavlja glutaminsku kiselinu, F predstavlja fenilalanin, G je glicin, H je histidin, I je izoleucin, L is leucin, N je asparagin, R je arginin, T je treonin, V je valin, Y je tirozin, a oznaka "E4N" predstavlja zamenu glutaminske kiseline (E) asparaginom (N) na položaju 4. Što se tiče brojanja sekvenci, sekvenca amino kiseline humanog FSH alfa se označava brojevima prema zreloj sekvenci prikazanoj na Slici 5 ili kao SEQ ID NO:1. Sekvenca amino kiselina humanog FSH beta se označava brojevima prema zreloj sekvenci prikazanoj na Slici 6 ili kao SEQ ID NO: 2.

U domen ovog pronalaska takođe spadaju preparati FSH sa povećanom efikasnošću za folikulogenezu što dovodi do povećanog stepena sijalilacije najednom ili više dodatatnih mesta glikozilacije prisutnih na dodatnom peptidu. Termin "dodatni peptid" podrazumeva bilo koji peptid koji obuhvata mesto glikozilacije, a koji može biti povezan sa amino i/ili karboksilnim krajem a- i/ili 6-pod-jedinica FSH bez štetnog uticaja na FSH aktivnost dobijenog molekula. Na primer, 3-pod-jedinica hCG je značajno veća on one koja se nalazi kod drugih gonadotropina, zbog približno 34 dodatne amino kiseline na C-terminalnom kraju koji se ovde naziva karboksilni terminalni deo (CTP). Kod urinarnog hCG, CTP sadrži četiri oligosaharida nalik na mucin sa O-vezom. Ovaj CTP može biti povezan sa 6-pod-jedinicom FSH, a poželjno je da to bude na karboksilnom terminalnom delu p-pod-jedinice FSH, što dovodi do molekula koji ima FSH aktivnost i ima dodatna četiri mesta glikozilacije. Kiseli izoformi (pl<<>4.4) takvih FSH molekula spadaju u domen ovog pronalaska. Takvi molekuli su opisani u WO 93/06844 (molekuli koji imaju modifikovana mesta glikozilacije opisani su u WO 90/09800 (VVashington Universitv).

Radi ovog opisa, preparati FSH koji imaju dodatna mesta glikozilacije će se označavati kao FSH<gly+>. Ukoliko su dodatna mesta glikozilacije dodata, Z-broj kao parametar se ne može više korsititi za poređenje sa "normalnim" preparatima FSH (tj. onima koji imaju četiri mesta glikozilacije), obzirom da je ovaj parametar normalizovan (on predstavlja zbir procenata). Kada se FSH<gly+>preparat podvrgne analizi vrsta glikana, Z<+->broj kao parametar se može izračunati na način koji je analogan Z-broju. Preparati FSH<gly+>iz ovog pronalaska imaju Z<+->brojeve koji su veći ili oko 200, a poželjno je da budu veći ili oko 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, a stepen preferentnosti se povećava sa povećanjem Z<+->broja.

FSH<gly+>preparati iz ovog pronalaska imaju značajno niže pl profile u odnosu na normalne FSH. Posebno su poželjni zbog njihove veće efikasnosti oni FSH<gly+>preparati koji imaju prosečne pl' manje od ili oko 4.4, a preferentnij isu oni koji imaju prosečne pl' manje od ili oko 4.2, 4.0, 3.8, 3.6, 3.4, 3.3 i 3.2, a stepen preferentnosti se povećava sa smanjenjem prosečne pl.

Kod svih aspekata ovog pronalaska preferentan je rekombinantan FSH. Za lečenje humanih pacijenta preferentan je humani rekombinantni FSH. Preparati iz ovog pronalaska se mogu izolovati iz konvencionalnog rekombinantnog FSH, ili se mogu izolovati iz FSH<gly+>preparata.

Jedan od aspekata ovog pronalaska je da se obezbedi metoda za obogaćenje sadržaja sijalinske kiseline uz pomoć metode koju pronalazači nazivaju "sijalilsko pojačanje". Rekombinantan FSH (preferentan) ili rekombinantni FSH<gly+>preparati (takođe preferentni) urinarnog FSH se mogu podvrgnuti sijalilskom pojačavanju tako što će biti tretirani nekim enzimom, kao što je glikozil transferaza, a posebno sijalil-transferaza, u prisustvu sijalinske kiseline donatora, na primer CMP-sijalinske kiseline, kako je opisano u WO 98/31826 (Cytel Corporation). Primeri rekombinantnih sijalil transferaza, se mogu naći u, na primer, US Patentu br. 5,541,083 (Universitv of California; Amgen). Dokumentovano je najmanje 15 različitih sijalil transferaza sisara a cDNK njih trinaest je klonirano. Ove cDNK se mogu koristiti za rekombinantnu produkciju sijalil transferaza, koje se potom mogu koristiti kod metoda ovog pronalaska.

Sijalil transferaza koja je upotrebljena će moći da izvrši transfer sijalinske kiseline do sekvenci GalB1, 4GlcNAc, koje predstavljaju najčešće penultimatne delove koji leže u osnovi terminalne sijalinske kiseline na sijaliliranim glikoproteinima. Primer sijalil protease koja se može koristiti je ST3Gal III, koja se takođe naziva (2,3)-sijaliltransferaza (EC 2.4.99.6). Ovaj enzim katalizuje transfer sijalinske kiseline do Gal of a Gal-P-1,3-glikosylNAc ili Gal-p-1,4-glikosylNAc glikozida.<22>Sijalinska kiselina je povezana sa ostatkom galaktozila (Gal) formiranjem jedne a-veze između dva saharida. Veza saharida se nalazi između pozicije 2 na NeuAc i pozicije 3 na Gal. Ovaj specifični enzim se može izolovati uz jetre pacova<23>; poznato je da humana cDNK<24>i genomske<25>sekvence DNK olakšavaju proizvodnju ovog enzima putem rekombinantne ekspresije. Kod preferentnih vidova, za metode sijalilacije se korsite ST3Gal III (najpoželjije od pacova), ST3Gal IV, ST3Gal I, ST6Gal I, ST3Gal V, ST6Gal II, ST6GalNAc I, ili ST6GalNAc II, poželjnije ST3Gal III, ST6Gal I, ST3Gal IV, ST6Gal II ili ST3Gal V, a posebno poželjno ST3Gal III od pacova.

Poželjno je da količina sijalil transferaze bude u opsegu od oko 50 mU po mg FSH ili manje, poželjno na nivou od ili oko 5-25 mU po mg FSH. Pod poželjnim uslovima, koncentracija sijalil transferaze biće na nivou od ili oko 10-50 mU/ml, a koncentracija FSH će biti na nivou ili oko 2 mg/ml.

Takođe je moguće proizvesti obogaćeni FSH u kiselim izoformima

transfekcijom ćelije, rekombinantne ili druge, koja eksprimira FSH, sa genom koji enkodira sijalil transferazu, a ekspresija tog gena je moguća u ćeliji. Taj gen može da sadrži sekvence koje kodiraju genome (tj. sa intronima) ili može da obuhvata sekvence koje kodiraju cDNK. Umesto toga, ukoliko taj ćelijski genom sadrži endogene sekvence koje enkodiraju sijaliltransferazu, element koji izaziva ekspresiju FSH se može uneti u genom ćelije. Ekspresija sijaliltransferaze se može povećati insercijom ne-nativnih regulatornih sekvenci koje su aktivne u ćeliji i koje su u operativnoj vezi sa endogenim sekvencama koje enkodiraju sijaliltransferaze. Isto tako je moguća i insercija gena koja može da se amplifikuje u operativnu vezu sa sekvencama koje enkodiraju sijaliltransferaze, tako da to dovede do amplifikacije genomskih sekvenci koje enkodiraju sijaliltransferazu. Ove manipulacije se mogu vršiti upotrebom homologne rekombinacije, kako je na primer, opisano u EP 0 505 500 (Applied Research Svstems ARS Holding N.V.).

Stepen sijalilacije preparata FSH se takođe može povećati selekcijom ćelije za ekspresiju rekombinantnog FSH za koju se zna da pogoduje sijalilaciji. U takve ćelije spadaju hipofizne ćelije i ovarijalne ćelije kineskog hrčka koje eksprimiraju visoke nivoe sijaliltransferaza. Preparat FSH pripremljen u takvoj ćeliji se može dalje podvrguti nekoj metodi izolacije, koja je ovde pomenuta, da bi se izolovali izoformi koji imaju visok stepen sijalilacije.

Stepen sijalilacije nekog preparata FSH se takođe može povećati kultivacijom ćelije koja eksprimira FSH, najbolje rekombinantan FSH, pod uslovima koji pogoduju visokom nivou sijalilacije. Pogodan uticaj na sijalilaciju može imati ukoliko se u podlogu za kulturu dodaju inhibitori neuraminidaze i/ili direktni intracelularni prekursori za sintezu sijalinske kiseline, kao što je acetilmanozamin. Preparat FSH pripremljen pod takvim uslovima kultivacije može se dalje podvrgnuti nekoj metodi izolacije, kako je ovde pomenuto, da bi se izolovali izoformi koji imaju visok stepen sijalilacije . Ukoliko se koristi pojačavanje sijalila, poželjno je da pre enzimatske sijalilacije preparat FSH ima visku Al, što će omogućiti da se mnoge antene spoje sa ostatcima sijalinske kiseline. Poželjno je da takav FSH ima Al of veći ili oko 220, a još je poželjnije da Al bude na nivou od ili oko 240, a posebno je poželjno da ima Al veću od oko 270. FSH koji imaju više Al se mogu na primer izolovati korišćenjem afinitetne hromatografije na Sefarozi izvedenoj iz konkanavalina-A (Con-A, elucijom sa gradijentom metil-glukoze, ili uz pomoć preparativne HPLC.

Metoda pojačavanja sijalilacije iz ovog pronalaska može se sa boljim uspehom primenjivati na preparatima FSH koji su tako modifikovani da indukuju jedno ili više dodatnih mesta glikozilacije (FSH<9ly+>preparati). Takvi preparati FSH<9ly+>se mogu takođe razdvojiti na one frakcije koje imaju visoke Al pre pojačavanja sijalilom.

Ovaj pronalazak obuhvata preparate FSH dobijene ekspresijom FSH u ćelijama koje nosu sposobne za sijalialciju, gde se FSH potom podvrgava pojačavanju uz pomoć sijalila. Na primer, WO 99/13081 (Akzo Nobel N.V.) opisuje ekspresiju divljeg tipa FSH i muteina u uni-celularnom eukariotuDictyostelium,posebno muteina koji imaju dodatna mesta glikozilacije.Dictyosteliumnije sposoban da vrši sijalilaciju gliakna. Ovaj pronalazak obuhvata preparate FSH dobijene tako što su divlji tip FSH ili muteini eksprimirani uDictyosteliumupodvrgnuti pojačavanju uz pomoć sijalila.

Posle pojačavanja uz pomoć sijalila, preparatima FSH koji imaju željeni stepen sijalilacije mogu se izolovati hromatografijom sa razmenom jona, izoelektričnim fokusiranjem, hromatofokusiranjem ili hromatografijom na Konkanavalinu-A (Con-A).

FSH iz ovog pronalaska ima Z-broj od najmanje ili oko 200, poželjnije najmanje ili oko 210, posebno poželjno najmanje oko 220, a sasvim posebno poželjno najmanje oko 230, 240, 250, 260 ili 270, a stepen preferentnosti se povećava sa povećanjem Z-broja. Potpuno sijalilizovan FSH ima Z-broj od ili oko 230 do ili oko 280, u zavisnosti od indeksa antenarnosti. Veoma preferentni preparati FSH prema ovom pronalasku imaju Z-broj od ili oko 230 do ili oko 280.

Preparati FSH iz ovog pronalaska su pripremljeni tako da konzistentno imaju Z-broj od najmanje ili oko 200, ili preferentne Z-brojeve koji su gore pomenuti. FSH iz ovog pronalaska se može izolovati iz neke mešavine izoforma uz pomoć jednog broja metoda koje su poznate stručnjacima u ovoj oblasti. Na primer, za separaciju izoforma na osnovu pl mogu se koristiti izoelektrično fokusiranje, hromatofokusiranje ili hromatografija sa razmenom jona. Različite frakcije se mogu analizirati po pitanju sadržaja sijalinske kiseline, i može se izvršiti selekcija željenih frakcija za upotrebu. Primer pogodnih uslova za hromatografiju sa razmenom jona dat je u primerima. Takva metoda separacije se može koristiti za izolaciju FSH iz ovog pronalaska iz konvencionalno proizvedenog rFSH ili urinarnog FSH (uFSH), ili se može koristiti za izolaciju željenih izoforma iz FSH tretiranih sijalil transferazom ili drugim rekombinantnim tehnikama koje su gore pomenute.

U jednom obliku, ovaj pronalazak obezbeđuje farmaceutsku formulaciju koja sadrži FSH prema ovom pronalasku (tj. koja ima Z-broj od najmanje ili oko 200, preferentne vrednosti minimalnog Z-broja su gore navedene). Takve farmaceutske formulacije se mogu koristi za stimulaciju folikulogeneze, na primer zajedno sa indukcijom ovulacije ili tehnikama asistirane reprodukcije (ART). Obzirom daje FSH iz ovog pronalaska posebno efikasan za indukciju razvoja i sazrevanja više folikula, on je posebno pogodan za upotrebu kod ART, kada je poželjno prikupiti više oocita.

Umesto toga, uz pažljivo prilagođavanje doze, FSH iz ovog pronalaska se može koristiti za indukciju mono-folikulogeneze za Ol, ili paucifolikulogeneza (do oko tri folikule) za IUI, kodin vivofertilizacije. Mono-folikulogeneza se takođe može postići smanjenim dozama FSH, ili režim doziranjem od odnosu na konvencionalne preparate FSH. Na primer, kod Ol neki od preparata FSH iz ovog pronalaska se mogu davati u dozama od 225-400 U svaka tri dana , ili u nižim dozama, u zavisnosti od odgovora pacijenta. Odgovor pacijenta se može pratiti ultrazvukom.

The FSH iz ovog pronalaska će obično biti formulisan u vidu faramceutskog sastava, koji će takođe sadržati razblaživač i ekscipijent. Osoba koja je stručnjak iz ove oblasti je svesna da postoji čitav spektar takvih razblaživača ili eksicipijenata koji su pogodni za formulaciju farmaceutskog preparata.

FSH iz ovog pronalaska je obično formulisan kao jedinična doza u čvrstom obliku spremnom za rastvaranje kako bi se dobio sterilni rastvor za injekcije za intramuskularnu ili subkutanu upotrebu. Čvrsta materija je obično rezultat liofilizacije. U uobičajene ekscipijente i nosače spadaju saharoza, laktoza, natrijum hlorid, puferi kao što su monobazni natrijum fosfat i dibazni natrijum fosfat. Ovaj rastvor se može pripremiti razblaživanjem sa vodom za injekcije neposredno pre injekcije.

FSH iz ovog pronalaska se takođe može formulisati u vidu rastvora za injekcije koji sadrži bilo koji od eksicipijenata i pufera koji su gore navedeni kao i dugih koji su poznati stručnjacima.

FSH iz ovog pronalaska se može koristiti za režim kontrolisane ovarijalne hiperstimulacije (COH). Standardni režimi<26>COH obuhvataju fazu silazne regulacije tokom koje se endogeni luteinizirajući hormon (LH) silazno reguliše administracijom agonista hormona koji oslobađa gonadotropin (GnRH), posle čega sledi faza stimulacije tokom koje se razvoj folikula (folikulogeneza ) indukuje svakodnevnom administracijom hormona koji stimuliše folikule (FSH), obično u dozi od ili oko 75-600 IJ/dan, poželjno o opsegu od ili oko 150-225 IJ/dan. Umesto toga, stimulacije se započinje sa FSH posle spontane ili indukovane menstruacije, posle čega sledi administracija GnRH-antagonista (koja obično počinje oko šestog dana faze stimulacije). Ukoliko postoje najmanje 3 folukule >16 mm (jedna od 18 mm), daje se jedan bolusf hCG (5-10,000 U) kako bi se imitirao prirodan nadolazak LH i izazvala ovulacija. Injekcija hCG se obično daje bilo kog dana od 10 do 14, ali se može dati i kasnije, u zavisnosti od toga kada su zadovoljeni gore navedeni parametri. Dobijanje oocita je vremenski predviđeno za period 36-38 sati posle injekcije hCG.

FSH iz ovog pronalaska se takođe može koristiti za Ol i IUI. Na primer, stimulacija FSH preparatima iz ovog pronalaska se započinje posle spontane ili indukovane menstruacije, u dnevnoj dozi od 75-150 U. Kada 1 ili 3 folikule dostignu prečnik od najmanje 16 mm, daje se jedan bolus hCG kako bi se izazvala ovulacija. Inseminacija se vršiin vivo,redovnim polnim odnosom ili se vrši IUI.

Obzirom da FSH iz ovog pronalaska ima veću efikasnost u odnosu na poznate preparate FSH, u režimima kao što je onaj koji je gore opisan mogu da se koriste manje U doze FSH, i/ili oni mogu biti modifikovani smanjenjem perioda stimulacije FSH, uz postizanje istog ili boljeg odgovora, u smislu broja i vijabilnosti folikula. Na primer, upotrebom preparata FSH iz ovog pronalaska, adekvatna folikulogeneza se može postići dozom FSH od oko 50-150 U, poželjno u opsegu od ili oko 50-100, još poželjnije u opsegu od ili oko 50-75 U FSH. Doziranje FSH je obično dnevno ili polu-dnevno. Period doziranja može da bude manji ili oko 14 dana, a poželjno je da bude 12 dana ili oko 12 dana, a još je poželjnije je da bude oko 11 ili 10 dana.

Kod Ol, preparati FSH iz ovog pronalaska se mogu davati u dozama od 25-150 U FSH/dan, poželjno, 50-125 U FSH/dan.

Za lečenje muškog infertiliteta, preparat FSH iz ovog pronalaska se može davati u dozi od 3 X 150 do 300 IJ/nedeljno sve dok spermatogeneza ne dostigne nivoe koji su odgovarajući za inseminaciju, ili redovnim seksualnim odnosom ili uz pomoć ART tehnika.

Pronalazači su dalje utvrdili se zbog povećane efikasnosti, preparati FSH koji imaju Z-broj od najmanje ili oko 200 se mogu davati rede nego preparati FSH koji imaju Z-broj manji od 200. (Radi ovog opisa, termini FSH+200, FSH<+210>, FSH+22° itd. će se koristiti za označavanje preparata FSH koji imaju Z-brojeve u opsegu od ili oko 200-210, 211-220, 221-230, itd.) To znači da pacijenti kojima bi normalno trebalo, na primer 150 U konvencionalnog FSH svakoga dana kako bi se postigla adekvatna folikulogeneza, mogu da postignu isti rezultat sa, na primer, 225 U FSH<+200>, svaka tri dana , ili 300 U FSH+200, svaka četiri dana. Zbog veće efikasnosti FSH+200, u poređenju sa konvencionalnim preparatima FSH, gore navedene doze se mogu smanjiti kod onih pacijenata koji pokažu dobar odgovor. Sa preparatima FSH iz ovog pronalaska koji imaju Z-brojeve koji nisu manji ili iznose oko 230, moguće je davanje injekcija tek svakog petog, šestog ili sedmog dana, u zavisnosti od odgovora pacijenta. Odgovor se može proceniti uz pomoć ultrazvuka , i/ili merenjem nivoa estradiola u serumu. Drugi pogodni režimi su sledeći: 100 U FSH<+210>svaka dva dana ; 200 U FSH<+210>svaka tri dana ; 275 ili 300 U FSH<+210>svaka četiri dana ; 80-100 U FSH<+220>svaka dva dana ; 180-200 U FSH<+220>svaka tri dana ; 260-300 U FSH<+220>svaka četiri dana ; 75-100 U FSH<+230>svaka dva dana , 170-200 U FSH<+230>svaka tri dana ; i 250-300 U FSH<+230>svaka četiri dana ; 275-400 U FSH+250svakih pet dana; 375-450 U FSH<+250>svakih šest dana; 450-525 U FSH<+250>svakih sedam dana.

Termin "veća efikasnost", koji je ovde korišćen a uvezi sa delovanjem na folikulogenezu obuhvata svako merljivo poboljšanje ili povećanje broja i/ili vijabilnosti kod nekog pojedinca, na primer, u poređenju sa brojem i/ili vijabilnošću folikula kod jednog ili više pacijenata lečenih ekvivalentnom dozom (IJ/IJ), što se utvrđuje konvencionalnim esejom povećanjem težine ovarijuma kod pacova, na FSH koji imaju Z-broj manji od 200. Poželjno je da to poboljšanje ili povećanje budu statistički značajni, a poželjno je da vrednost verovatnoće bude <0.05. Metode za određivanje statističkog značaja rezultata su dobro poznate i dokumentovane u stručnim izvorima a može se koristiti bilo koja odgovarajuća metoda.

Ovaj pronalazak će biti ilustrovan sledećim primerima koji nisu i jedini.

Primer 1

Određivanje Z-broja

Mapiranje glikana omogućava određivanje Z-broja glikoproteina.

Glikanski delovi su oslobođeni iz rekombinantnog humanog FSH, uz pomoć potpuno automatizovanog instrumenta Oxford GlikoSciences GlikoPrep® 1000 ili ekvivalentnog, sa hidrazinom na 100°C tokom 5 sati.

Glikanske vrste su odvojene od ne-reaktivnog hidrazina i hidrazida amino kiselina uz pomoć kolone sa staklenim perlama. Elucija glikanskih vrsta je izvršena reagensom na bazi natrijum acetata.

Glikanske vrste su acetilirane acetatnim anhidridom. Višak reagensa je uklonjen uz pomoć mešovite kolone za razmenu jona. Sve neredukovane glikanske vrste su prikupljene u razblaženom rastvoru acetatnog pufera.

Glikanske vrste su prikupljene na filteru od 0.5 m (Oxford GlikoSciences) i liofilizovane. Osušene glikanske vrste su obeležene reakcijom sa reduktantima koji imaju fluorofor (na primer, 2-aminobenzamid ili 2-AB) pod kiselim uslovima, tokom 120 min na 65°C.

Obeležene glikanske vrste su odvojene od viška reagensa uz pomoć hidrofilne adsorpcione membrane koja zadržava glikansku vrstu. Glikanske vrste su dobijene u vodi i čuvane zamrznute do hromatografske separacije.

Obeležene glikanske vrste su odvojene uz pomoć hromatografije sa razmenom jona. Hromatograski postupak je izveden na sledeći način: • Kolona je GlikoSep® C kolona , 4.6 x 100 mm, pripremljena smolom divinil benzena sa premazom od polimera (5 m)

• Mobilna faza ima brzinu protoka od 0.4 ml/min:

Mobilna faza A: Acetonitril (hromatografski gradus)

Mobilna faza B: Amonijum acetat 500 mM, pH 4.5

Mobilna faza C: Ultračista voda

• Detekcija se vrši fluorimetrom podešenim naX. t,.: 330 nm iX.. 'rexcitation emission 420 nm;

• Elucija se vrši pod sledećim uslovima elucije :

Inicijalni uslovi: 20 % faze A, 80% faze C

Linearni gradijent faze B (0.25 % po min) od 5 do 21 min, 20% faze A je konstantno

Linearni gradijent faze B (0.525 % po min) od 21 do 61 min, 20% faze

A je konstantno.

• Kolona se održava na temperaturi od 30±2°C.

Elucija glikanskih vrsta se vrši prema njihovom nalektrisanju neutralnihje prikazan na Slici 1.

Kod dobijenog hromatograma, pikovi su grupisani prema opsegu vremena retencije koja odgovaraju stupnjevima sijalilacije navedenim na Tabeli 1. Rezultati su za svaku grupu gliakna izraženi u vidu procenta ukupne površine različitih grupa glikana (neutralni, mono-, di-, tri- i tetra-) a Z-broj je izračunat proporcionalno za različite vrste (Pg|jkan)<:>

Primer 2

Odeđivanje indeksa antenarnosti (Al)

Ovi glikani su oslobođeni iz osnovne strukture peptida uz pomoć hidrazinolize, a potom su fluorescentno obeleženi uz pomoć 2-aminobenzamida (2-AB), kako je detaljno opisano u Primeru 1.

Glikani obeleženi sa 2-AB su desijalilirani enzimatski uz pomoć sijalidaze{ Vibrio cholerae)u 250 mM amonijum acetata, pH 5.5 koji sadrži 20 mM kalcijum hlorida tokom 18 sati na 37°C. Približno 0.05 U siajalidaze je upotrebljeno kod glikana sa početnom količinom od 100ngrhFSH.

Desijalilirani glikani su osušeni u vakumu i čuvani na -20°C pre separacije uz pomoć preparativne HPLC obrnute faze, pod sledećim uslovima : • Kolona je bila GlikoSep® R kolona ;

• Mobilna faza je imala brzinu protoka 0.7 ml/min.

Eluent A: amonijum acetat 50 mM, pH 6.0;

Eluent B: amonijum acetat 50mM, pH 6.0 koji sadrži 8% acetonitrila; • Detekcija je izvršena fluorimetrom podešenim na Xekscitacya= 330 nm ;

Emisija<=>420 nm.

• Temperatura kolone: 30°C.

Pre nanošenja na kolonu, osušeni uzorci su rekonstituisani eluentom A, a primenjeno je (200 |al) : 50\ i\ovog rastvora.

Korišćen je sledeći gradijent:

t = 0 (min) 55%A ; 45%B

t=15(min) 55%A ; 45%B

t = 70(min) 0%A;100%B

t = 75(min) 0%A;100%B

t = 76 (min) 55%A ; 45%B

Pikovi su određeni za di- tri-i tetra- antenarnost, uz pomoć Elektrosprej masene spektrometrije (ESMS) i Laserske desorpcijone jonizacije potpomognute matriksom i Time-Of-Flight masene spektrometrije (MALDI-TOF MS).

Rezultati su izraženi kao relativni procenti P di-antenarosti; tri-antenarosti i tetra-antenarosti, dok 100% predstavlja zbir svih glikana. Al se potom izračunava uz pomoć sledeće jednačine:

što je naznačeno time da je Al indeks antenarnosti, a Pdi, Ptri i Ptetrapredstavljaju procente ukupnog ugljenog hidrata sa di-, tri- odnosno tetra - ograncima.

Primer 3

Separacija FSH na frakcije zasnovana na stepenu sijalilacije

Rekombinantan FSH je razdvojen na kisele i bazne frakcije uz pomoć hromatografije sa razmenom jona na DEAE-Sefarozi FF.

• Kolona koja je korišćena je imala 0 1.6 x 20 cm ( XK Pharmacia ili equivalent) za purifikaciju laboratorijskog kvaliteta (približno 60 mg bruto proteina), i 0 3.4 x 40 cm (Vantadge Amicon ili ekvivalent) kod purifikacija

za širu upotrebu, pakovana sa DEAE -Sefarozom FF smole;

• Mobilna faza je imala brzinu protoka 150-250 cm/sat

Puferza ekvilibraciju 1: 2M Tris-HCI pH 7.0±0.1 ;

Puferza ekvilibraciju 2: 25 mM Tris-HCI pH 7.0+0.1, provodljivost 2.15+1.5 mS/cm;

Elucioni pufer 1: 25mM Tris pH 7.0±0.1, 35 mM NaCI, provodljivost 5.8 +0.4 mS/cm (Ovaj pufer eluira baznije izoforme.);

Elucioni pufer 2: 25mM Tris pH 7.0±0.1, 150mM NaCI, provodljivost 18.3 ±0.5 mS/cm (Ovaj pufer eluira kiselije izoforme.);

Rastvor za regeneraciju : 0.5M NaOH, 1M NaCI

Rastvor za čuvanje : 10 mM NaOH

• Ova kolona je održavana na 23±3°C° ili 5 ±3 °C

FSH je pripremljen za nanošenje na kolonu na sledeći način:

Smrznuti ukupni rhFSH je otopljen na 5±3°C. Po završetku otapanja, rastvor (3-4 mg rhFSH, što je procenjeno na osnovu optičke gustine na 276.4 nm, po ml smole ) je razblažen sa 2M Tris-HCI pH 7.0+0.1 u sledećim srazmerama : 1 deo pufera i 79 delova ukupne rhFSH. Finalna koncentracija tris-HCI bila je

25 mM. Vrednost pH je podešena na 7.0±0.1 uz pomoć HCI 1M.

Ova kolona je pripremljena ispiranjem sa 3 zapremine (BV) of NaOH 0.5 M i potom 6 BV vode. Ekvilibracija je izvršena ispiranjem sa 4-5 BV pufera za ekvilibraciju 1, sve dok nije izmerena pH vrednost od približno 7. Ispiranje je potom nastavljeno sa 7-8 BV pufera za ekvilibraciju 2.

Jedan uzorak rhFS, pripremljen kako je gore navedeno unetje u kolonu. Po završenom unošenju , kolona je isprana sa 3 BV pufera za ekvilibraciju 1. Potom je započeta elucija sa elucionim puferom 1 a prikupljanje bazne frakcije je započeto kada je vrednost absorbance (276.4 nm) počela da raste, i dostigla 20+1 BV. Eluent je tada zamenjen elucionim puferom 2, a prikupljanje kisele frakcije je započeto čim je vrednost absorbance (276.4 nm) počela da raste, i dostigla 3+1 BV.

Frakcije su potom podvrgnute ultrafiltraciji kako bi se one koncentrisale, uz pomoć ćelije za ultrafiltraciju tipa 8400 (Amicon ili ekvivalent) opremljene YM3 membranom za baznu frakciju i YM10 membranom za kiselu frakciju. Sve operacije su izvršene na temperaturi od 5±3°C.

Primer 4

Klinička studija sa izoformima FSH

Procenjena je komparativna efikasnost dve eksperimentalne partije rhFSH na dobrovoljcima.

Dva preparata FSH su dobijena podelom rhFSH na dve frakcije, uz pomoć

hromatografije sa razmenom jona, kako je gore opisano u Primeru 3. Šarža A je smatrana "kiselom" i imala je Z-broj od 220 (tj. kiselu frakciju iz Primera 3), do je Šarža B smatrana "baznom" i imala je Z-broj od160 (tj. baznu frakciju iz Primera 3).

Pri korišćenju konvencijalnog eseja povećanja težine ovarijuma kod pacova, ampule šarže A i šarže B su napunjene tako da svaka sadrži približno 150 U FSH each.

Karakteristike ove dve šarže su predstavljene na Tabeli 2. Treba pomenuti da obzirom da su bočice punjene uz pomoć U, stvarna količina FSH u ampulama koje su sadržavale baznu šaržu B iznosila je oko 250% one koja se nalazila u kiseloj Šarži A (oko 24 |ag prema oko 9 /ag).

Specifična bioaktivnost je izračunata deljenjem bioaktivnosti izražene u U sa težinom proteina.

Grupa pacijenata se sastojala od 32 pre-menopauzalne žene dobrovoljca. Ove pacijentkinje su izložene silaznoj regulaciji hipofize svakodnevnom primenom injekcija dekapeptila (0.1 mg). Posle 14 dana je urađen ultrazvučni pregled a ukoliko nije bilo cista, započeta je stimulacija uz pomoć rFSH (150 IJ/dan) iz šarže A ili šarže B. Folikularni rast je svakodnevno procenjivan ultrazvukom i na osnovu koncentracija E2u serumu.

Tokom FSH stimulacije folikule će se razvijati i njihov prečnik će se povećavati. Folikule su kod svih pacijentkinja merene i brojane 8 i 10 dana stimulacije i beležen je broj folikula čija je veličina iznosila 0-10 mm, 11-15 mm i 16-25 mm. Na Slici 2, je prikazan broj folikula po pacijentkinji iz svake od ovih kategorija koje su podeljene na grupe lečene kiselim odnosno baznim izoformima 8. dana. Na slici 3 je dat isti dijagram koji se odnosio na 10. dan.

Rezultati ove studije su pokazali da iako se u grupi koja je primala bazne izoforme veličina folikula vremenom povećavala redovno, kod grupe koja je primala kisele izoforme došlo je do razvoja drugog kohorta folikula nešto sporije nego kod prve grupe, sa posledičnim snažnim povećanjem formacije folikula koja je bila približno dvostruka u odnos na baznu grupu. Veličina ovog drugog kohorta se povećavala od 8. do 10 dana. Rezultat toga je bio da je kod grupe pacijentkinja tretirane "kiselim" FSH, 10. dana bilo prosečno ukupno 18 folikula većih od 11 mm, dok je kod grupe tretirane "baznim" izoformom prosečan broj folikula većih od 11 mm 10. dana bio samo 11.

Prosečan ukupan broj folikula 10. dana kod "kisele" grupe je 28, dok je kod "bazne" grupe 19.

Prosečan ukupan folikularni volumen (TFV) po pacijentkinji je određivan uz pomoć ultrazvuka. TFV je kod grupe koja je primala "kiseli" FSH bio je 30% viši od onoga kod grupe koja je primala "bazni" FSH.

Nivoi FSH u serumu kod pacijenata, mereni radioimunoesejom, bili su viši kod bazne grupe, što se i očekivalo od ubrzigane mase proteina; međutim ta razlika je iznosila samo oko 30% (videti Sliku 4), u poređenju sa razlikom u primenjenoj količini koja je iznosila 250%, što je u skladu sa većom metaboličkom izdržljivošću kiselih oblika.

Primer 5

Separacija FSH na frakcije zasnovana na Indeksu antenarnosti (Al)

Preparati FSH sa indeksima antenarnosti višim od normalnih mogu se izolovati uz pomoć HPLC ili afinitetnom hromatografijom sa Sefarozom derivatizovanom iz konkanavalina A (Con-A).

Primer 6

"Sijalilsko pojačanje " uz pomoć sijalil transferaze

Rekombinantni humani FSH ("početni materijal"; 10 mg) je rastvoren u puferu (0.1 M HEPES, pH 7.5) u koncentraciji od 4.3 mg/ml. U ovoj rastvor je dodatna rekombinantna sijalil transferaza pacova (ST3Gallll) do koncentracije od 100 mU/ml, i citidin-5'-monofosfat-N-acetil neuraminska kiselina (CMP-NeuAc) kao donator sijalinske kiseline u koncentraciji od 20 mM. Umesto toga, sijalinska kiselina donator se može dobitiin situuz pomoć 20 mM NeuAc i 2 mM CMP u prisustvu CMP-sinteaze sijalinske kiseline. Reakcija je inkubirana na 37°C tokom 24 sata. Frakcije obogaćene sijalinskom kiselinom izolovane su uz pomoć tehnika opisanih u Primeru 3.

Sijalilsko pojačanje se takođe može sprovesti uz pomoć početnog materijala koji se sastoji od FSH koji ima pojačan indeks antenarnosti, a koji je pripremljen u skladu sa Primerom 5.

Umesto toga, sijalilsko pojačanje se može izvršiti sa početnim materijalom FSH koji već ima povećan Z-broj, u poređenju sa konvencionalnim rekombinanantnim FSH. Takav početni materijal se može izolovati uz pomoć tehnika iz Primera 3.

Primer 7

Dobijanje mutanata FSH

cDNK a- i P-pod-jedinice humanog FSH su subklonirane u pDONR vector (Invitrogen). Korišćen je OuikChange™ Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene) za uvođenje N-povezanih mesta glikozilacije u a- i p-pod-jedinice FSH. OuikChange™ sistem koristi dva sintetička prajmera oligonukleotida koji sadrže željene mutacije. Sledeći parovi oligonukleotida su korišćeni za uvođenje N-povezanih mesta glikozilacije: CC TTG TAT ACA

TAC CCA AAC GCC ACC CAG TGT CAC i GTG ACA CTG GGT GGC GTT TGG GTA TGT ATA CAA GG za V78N, GC TGT GCT CAC CAT AAC GAT TCC TTG TAT ACA TAC C i GGT ATG TAT ACA AGG AAT CGT TAT GGT GAG CAC AGC za A70N, GAT CTG GTG TAT AAG AAC CCA ACT AGG CCC AAA ATC CA i TGG ATT TTG GGC CTA GTT GGG TTC TTA TAC ACC AGA TC za D41N/A43T, TGT ACT GTG CGA GGC CTG AAC CCC AGC TAC TGC TCC i GGA GCA GTA GCT GGG GTT CAG GCC TCG CAC AGT ACA za G100N, G AAC GTC ACC TCA AAC TCC ACT TGC TG i CA GCA AGT GGA GTT TGA GGT GAC GTT C za E56N, i CAG GAA AAC CCA

ACC TTC TCC CAG CC i GG CTG GGA GAA GGT TGG GTT TTC CTG za

F17T. Sekvence DNK mutantnih cDNK su potvrđene uz pomoć ABI PRISM BigDve™ Terminator v3.0 Ready Reaction Cycle Sequencing Kit i potom analizom uz pomoć genetičkog analizatora ABI PRISM 310.

pCI vector ekspresije sisara (Promega) je konvertovan u vektor sa izlaznim (GATEWAY) odredištem uz pomoć sistema GATEWAY Vector Conversion Sistem (Invitrogen). a- i B-mutanti zajedno sa divljim tipom pod-jedinica su subklonirani u vektor sa pCI ekspresijom uz pomoć Gateway™ Cloning Technology (Invitrogen). Vekor koji eksprimira pCI sadrži neposredni pojačivač/promoter humanog citomegalovirusa za regulaciju ekspresije ubačenog gena, uzlazni intron gen za unapređenje ekspresije i signal za majmunski virus 40 kasne poliadenilacije nizlazno od insertovanog gena radi prekida transkripcije. E56N i F17T alfa mutanti u pCI su ko-transfekcionisani sa divljim tipom FSH p u pCI dok su A70N, G100N, V78N i D41N/A43T P-mutanti u pCI ko-transfekcionisani sa divljim tipom a-pod-jedinice u pCI. Kao kontrola, divlji tip P-pod-jedinice FSH u pCI i a-pod-jedinica u pCI su ko-transfekcionisani. Plazmidi su privremeno transfekcionisani u HEK293 ćelije (ATTC, CRL-10852) uz pomoć metode sa kalcijum fosfatom (na primer, kako je opisano u WO 96/07750). Umesto toga, je pCI plazmid koji sadrži divlji tip P-pod-jedinice ili V78N p-mutant ko-transfekcionisan sa divljim tipom a-pod-jedinice u pCI. Ovi plazmidi se takođe mogu privremeno ili stabilno transfekcionisani u CHO ćelije. Jedan dan posle transfekcije medijum je zamenjen sa DMEM/F12 (Invitrogen, 11320-033) koji sadrži 1 ug/ml insulina (Invitrogen, 18140-020), 6.8 ng/ml natrijum selenita (Sigma, S5261) i 12.2 ng/ml gvožđe citrata (Sigma, F3388). Jedan dan posle promene medijuma, kondicionirani medijum je prikupljen i centrifugiran tokom 5 min na približno 800 xgna 4°C kako bi se uklonilo svi ostatci ćelija. Supernatant je uklonjen icentrifugiran na 16,000 x g u Biofuge fresco (Heraeus Instruments) tokom 5 minuta a potom je medijum dalje prečišćavan filtriranjem preko Acrodisc filtera od 0.45 pm (Gelman Sciences, 4184). Prečišćeni ćelijski ekstrakt je

dodat, 1 M Tris, pH 7.4 da bi se dobila finalna koncentracija od 50 mM Tris a Tween 20 je dodat za finalnu koncentraciju od 0.1% Tween20.

Mutanti FSH su purifikovani od ćelijskog ekstrakta uz pomoć imuno-afinitetne hromatografije na Sefarozi derivatizovanoj sa anti-FSH monoklonim antitelima imobilisanim uz pomoć divinil sulfona (Immuno-smola anti-FSH-McAb-DVS-Sefaroza). Takve smole se mogu proizvesti metodama koje su poznate stručnjacima, na primer, kako je navedeno u WO 88/10270.

Ova smola je ekvilibrirana u puferu za ekvilibraciju, koji se sastojao od 0.1M Tris-HCI, 0.3M NaCI pufera sa pH=7.5, na 4°C. Kolona je napunjena količinom U FSH (prema radio-imunoeseju, RIA) koja odgovara 80-90% ukupne sposobnosti FSH za vezivanje u koloni.

Proteini koji nisu zadržani su eluirani puferom za ekvilibraciju (videti gore) sve dok OD28oeluata nije bio niži od 0.02.

Apsorbovani mutantni FSH je eluiran iz imunosmole uz pomoć 1M rastvora amonijaka na 4°C. Eluati koji odgovaraju otprilike četvorostrukom volumenu imunosmole su objedinjeni, pH je podešena na 9.0 dodavanjem glacijalne sirćetne kiseline na 4°C, ubrzo posle prikupljanja a rastvor je ultrafiltriran u aparatu Amicon (referentne karakteristike membrane 10,000 Da) i koncentrisan do male zapremine.

Koncentrisani mutantni FSH rastvor je potom podvrgnut koraku obrnute faze na HPLC, uz pomoć VVaters Prep LC 500A tečnog hromatografa opremljenog UV detektorom i pripremnim generatorom za gradijente. Pre nanošenja na kolonu , pH rastvora je podešena na oko 5.6. Rastvor je unet u Ciskolonu obrnute faze (Prepak 500 Cispatrone VVaters) koja je prethodno ekvilibrirana uz pomoć 0.05 M pufera od amonijum acetata pH=5.6 na sobnoj temperaturi. Brzina protoka je bila 100 ml/min a eluat je praćen na 280 nm.

Mutantni FSH je eluiran gradijentom izopropanol od najviše 50% mobilne faze. Frakcije su proveravane analitičkom hromatografijom gasne faze (GPC) i radioimunoesejem (RIA). Organski rastvaračje uklonjen destilacijom u vakumu na najmanje na temperaturi ispod 40°C, a rastvor je zamrznut i liofilozovan.

Mutantni preparati FSH eksprimirani u CHO ćelijama su podvrgnuti hromatografiji sa razmenom jona, kako je opisano u Primeru 3, kako bi se izolovale frakcije koje imaju Z+-brojeve jednake ili veće od180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, i veće.

Mutantni preparati FSH eksprimirani u CHO ili HEK293 ćelijama podvrgnuti su sijalilskom pojačavanju, kako je opisano u primeru 6. Posle sijalilskog pojačavanja, mutantni FSH je podvrgnut hromatografiji sa razmenom jona , prema Primeru 3, kako bi se izolovale frakcije koje imaju Z<+->brojeve veće od 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, i veće.

References:

<1>Wide, L;The regulation of metabolic clearance of human FSH in mice by variation of the molecular structure ofthe hormone; Acta Endocrinologica1121986; 336-344;<2>Chappeletal. ; Endocr. Rev.41983;179-211; Padmanabhanetal. ; J. Clin. Endocrinol. Met.671988;465-473; Wideetal. ; J. Clin. Endocrinol. Met.701990;271-276; Anobileetal.

Glycoform composition of serum gonadotropins through the normal menstrual cycle and in

the post- menopausal state; Mol. Human Reproduct.41998;631-639

<3>Morelletal. ; J. Biol. Chem.2461971;1461-1467; Ashvvelletal. ; Annu. Rev. Biochem.511982;531-554<4>Steelman & Pohley;Assay ofthe follicle stimulating hormone based on the augmentation with human chorionic gonadotropin; Endocrinology531953;604-616<5>D'Anton ioet al. ; Biological characterisation of recombinant human follicle stimulating hormoneisoforms;Human Reproduction141999;1160-1167<6>Vittet al. ; Isoforms of human recombinant follicle- stimulating hormone: comparison of effects on murine follicle developmentIn Vitro;Biol. Reproduct.591998;854-861<7>Timossiet al. ; Differential effects ofthe charge variants of human follicle- stimulating hormone; J. Endocrinol.1652000;193-205<8>Zambranoet al. ; Studies on the relative in- vitro biological potency ofthe naturally- occurring isoforms of intrapituitary follicle stimulating hormone; Mol. Hum. Reprod. 2 1996;563-71<9>Zambranoet al. ; Receptor binding activity and in vitro biological activity ofthe human FSH

charge isoforms as disclosed by heterologous and homologous assay systems: implications

forthe structure- function relationship ofthe FSH variants; Endocrine101999;113-121

<10>Wideef al. ; Influence ofthe assay method used on the selection ofthe most active forms of FSH from the human pituitary; Acta Endocrinol.(Copenhagen)1137986; 17-22<11>Mulderset al. ; Prediction ofthe in vivo biological activity of human recombinant follicle stimulating hormone using quantitative isoelectric focussing; Biologicals257997; 269-281<12>Timossiet al. ; A less acidic human follicle- stimulating hormone preparation induces tissue- type plasminogen activator enzyme activity earlier than a predominantly acidic analogue in Phenobarbital- blocked pro- oestrous rats; Mol. Human Reproduct.4 7998; 1032-1038<13>Healyetal. ; Lancet 3437994; 1539-1544

<14>for example, atechnique is described in EP 0 170 502 (Serono Laboratories, Inc.)

<15>Buckleret al. ; Ovulation induction with low dose alternate day recombinant follicle stimulating hormone; Hum. Reprod.147999; 2969-73<16>Hardet al. ; Isolation and structure determination of the intact sialylation N- linked

carbohydrate chains of recombinant human follitropin expressed in Chinese hamseter ovary

cells, Eur. J. Biochem.1931990;263-271

<17>Nadanoetal. ; J. Biol. Chem.2611986;11550-11557; Kanamorietal. ; J. Biol. Chem.265

1990; 21811-21819<18>Swedlowara/.; Deglycosylation of gonadotropins with an endoglycosidase; Proc. Soc. Experiment. Biol.&Med.1811986;432-437

<19>Muldersef al. ; Biologicals251997;269-281

<20>Zambranoetal. ; Mol. Hum. Reprod.21996;563-571

<21>Timossietal. ; Neuroendocrinology 67 1998;153-163

22 Wenetal. ; J. Biol. Chem.2671992;21011; Van den Eijndenetal. Enzymatic amplification

involving glycosyltransferases forms the basis for the increased siže of asparagine- linked

glycans at the surface ofNIH 3T3 cells expressing the N- ras proto- oncogene; J. Biol. Chem.

2661991;21674

<23>VVeinsteinet al. J. Biol. Chem.2571982;13845

<24>Sasakietal. J. Biol. Chem.2681993;22782-22787; Kitagavva & Paulson;J. Biol. Chem.

269 7994;1394-1401

<25>Kitagavvaetal. ; J. Biol. Chem.2711996;931-938

<26>for example, a conventional technique is described in EP 0 170 502 (Serono Laboratories, Inc.)

Claims (1)

1. Bilo koji FSH preparat, naznačen time da je Z-broj preparata najmanje ili oko 200. FSH preparat iz zahteva 1, naznačen time da je Z-broj preparata najmanje ili oko 210. FSH preparat iz zahteva 1, naznačen time da je Z-broj preparata najmanje ili oko 220. FSH preparat iz zahteva 1, naznačen time da je Z-broj preparata najmanje ili oko 230. FSH preparat iz zahteva 1, naznačen time da je Z-broj preparata najmanje ili oko 240. FSH preparat iz zahteva 1, naznačen time da je Z-broj preparata najmanje ili oko 250. FSH preparat iz zahteva 1, naznačen time da je Z-broj preparata najmanje ili oko 260. Farmaceutska sastav FSH, naznačen time da FSH ima Z-broj koji je najmanje ili oko 200. Farmaceutski sastav iz zahteva 8, naznačen time da je FSH ima Z-broj koji je najmanje ili oko 210. Farmaceutski sastav iz zahteva 8, naznačen time da FSH ima Z-broj koji je najmanje ili oko 220. Farmaceutski sastav iz zahteva 8, naznačen time da FSH ima Z-broj koji je najmanje ili oko 230. Farmaceutski sastav iz zahteva 8, naznačen time da FSH ima Z-broj koji je najmanje ili oko 240. Farmaceutski sastav iz zahteva 8, naznačen time da FSH ima Z-broj koji je najmanje ili oko 250. Farmaceutski sastav iz zahteva 8, naznačen time da FSH ima Z-broj koji je najmanje ili oko 260. Farmaceutski sastav iz bilo kog zahteva od 8 do 14, za upotrebu kod kontrolisane hiperstimulacije ovarijuma. Upotreba nekog FSH preparata u folikulogenezi, naznačenog time da ima FSH ima Z-broj koji je najmanje ili oko 200. Upotreba prema zahtevu 16, naznačena time da FSH ima Z-broj koji je najmanje ili oko 210. Upotreba prema zahtevu 16, naznačena time da FSH ima Z-broj koji je najmanje ili oko 220. Upotreba prema zahtevu 16, naznačena time da FSH ima Z-broj koji je najmanje ili oko 230. Upotreba prema zahtevu 16, naznačena time da FSH ima Z-broj koji je najmanje ili oko 240. Upotreba prema zahtevu 16, naznačena time da FSH ima Z-broj koji je najmanje ili oko 250. Upotreba prema zahtevu 16, naznačena time da FSH ima Z-broj koji je najmanje ili oko 260. Upotreba FSH u preparatu medikamenta koji se koristi za folikulogenezu, naznačena time da FSH ima Z-broj koji je najmanje ili oko 200. Upotreba prema zahtevu 23, naznačena time da FSH ima Z-broj koji je najmanje ili oko 210. Upotreba prema zahtevu 23, naznačena time da FSH ima Z-broj koji je najmanje ili oko 220. Upotreba prema zahtevu 23, naznačena time da FSH ima Z-broj koji je najmanje ili oko 230. Upotreba prema zahtevu 23, naznačena time da FSH ima Z-broj koji je najmanje ili oko 240. Upotreba prema zahtevu 23, naznačena time da FSH ima Z-broj koji je najmanje ili oko 250. Upotreba prema zahtevu 23, naznačena time da FSH ima Z-broj koji je najmanje ili oko 260. Metoda za pripremu nekog FSH preparata koji ima Z-broj koji je najmanje ili oko 200, ta metoda obuhvata korak stupanja FSH u reakciju sa sijalilskom kiselinom donatorom u prisustvu 2,3-sialiltransferaze. Metoda iz zahteva 30, naznačena time da FSH ima Z-broj koji je najmanje ili oko 210. Metoda iz zahteva 30, naznačena time da FSH ima Z-broj koji je najmanje ili oko 220. Metoda iz zahteva 30, naznačena time da FSH ima Z-broj koji je najmanje ili oko 230. Metoda iz zahteva 30, naznačena time da FSH ima Z-broj koji je najmanje ili oko 240. Metoda iz zahteva 30, naznačena time da FSH ima Z-broj koji je najmanje ili oko 250. Metoda iz zahteva 30, naznačena time da FSH ima Z-broj koji je najmanje ili oko 260. Metoda iz bilo kog zahteva od 30 do 36, naznačena time daje donator sijalilske kiseline CMP-sijalilska kiselina. Metoda iz bilo kog zahteva od 30 do37, naznačena time da sialiltransferase potiče od pacova ST3Gal III. Metoda za pripremu nekog FSH preparata koji ima Z-broj koji je najmanje ili oko 200, metoda obuhvata korak primene hromatografije sa razmenom jona.