RS49562B - Insulinotropski kompleksi, kompozicije i postupci - Google Patents

Abstract

Polipeptid formule R1-X-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyl-Leu-Y-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Z-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-R2, R1 izabrano od L- histidina, D-histidina, desamino-histidina, 2-amino-histidina, β-hidroksi-histidina, homo-histidina, alfa-fluormetil-histidina, i alfa-metil-histidina; X je izabrano od Val, Ile, i alfa-metil-Ala; Y je izabrano od Glu, Gln, Ala, Thr, Ser, i Gly; Z je izabrano od Glu, Gln, Ala, Thr, Ser, i Gly; R2 je izabrano od NH2, i Gly-OH; Pod uslovom da polipeptid ima izoelektričnu tačku u opsegu od 6.0 do 9.0. Prijava sadrži još 9 nezavisnih i 5 zavisnih patentnih zahteva. <patent>

Description

Ovaj pronalazak se odnosi na oblast farmaceutske 1 organske hernije1

obezbedjuje nova Jedlnjenja, 1 njihove farmaceutske sraese, koje su korisne

za povećavanje ekspresije insulina iz sisarskih ćelija pankreasa B-tipa nalik

na ostrvcaiza lecenje dijabetes melitusa (Šećerne bolesti) kod sisara u

početnoj fazi sazrevanja.

Sekrecije endokrina iz ostrvaca pankreasa nisu samo pod kompleksnom

kontrolom metabolita koje stvara krv (glikoza, amino kiseline, kateholamine,

itd.}, već takodje i pod lokalnim uticajlma parakrina. Glavni hormoni

ostrvaca pankreasa (glukagon, insulin i somatostatin) su u interakciji medju

njihovim specifičnim tipovima ćelija (A, B, 1 D ćelijama, respektivno)

radi moduliranja sekreclonih reakcija posredovanih napred pomenutim

metabolitima. Mada Je sekrecija insulina pretežno kontroUsana nivoima

gllkoze u krvi, somatostatin lnhibira glikozom-posredovane sekrecione

reakcije insulina. Osim predložene regulacije sekrecije insulina unutar

parakrinskih ostrvaca, postoji dokaz koji podržava postojanje

insulinotropskih faktora u crevima. Ovaj pojam proizlazi iz opservacija

da Je glikoza koja se uzima oralno znatno potentniji stlmulator

sekrecije insulina nego sto Je to uporedna količina gllkoze koja se daje

intravenski.

Ljudski hormon glukagon Je peptldnl hormon sa 29 amino kiselina koji se

stvara u A-ćelljama pankreasa. Ovaj hormon spada u visegensku familiju

strukturno vezanih peptlda koji obuhvataju sekretin, želuđačnl lnhibicioni

peptid, vazoaktlvni intestinalni peptid i glicentin. Ovi peptidi na

različite načine regulisu metabolizam ugljenih hidrata, gastrointestinalnu

pokretljivost i sekrecionu preradu. Medjutlm, glavna priznata delovanja

glukagona pankreasa treba da potpomognu gllkogenolizuiglikoneogenezu

Jetre, sto rezultira povećanjem nivoa šećera u krvi. U pogledu ovoga,

delovanja glukagona su kontra regulaclona onim insulinskim, i mogu doprineti

hiperglikemijl koja prati dijabetes melitus (šećernu bolest) [(Lund, P.K.,

et a].. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 79:345-349 (1982)].

Ustanovljeno Je da Je glukagon sposoban da se vezuje za specifične

receptore koji se nalaze na površini ćelija koje proizvode lnsulin. Glukagon, kada je vezan za ove receptore, stimuliSe brzu sintezu cAMP ovim ćelijama. Ustanovljeno je da cAMP potom stimuliSe ekspresiju insulina

[Korman. L.Y.. et al.. Diabetes, 34:717-722 (198S)]. lnsulin deluje tako sto

Inhibira sintezu glukagona [Ganong, W. F., Revleu of Medical Physiology,

Lange Publications, Los Altos, Californla, p. 273 (1979)3. Stoga Je

ekspresija glukagona oprezno regulisana insullnom, i konačno nivoom serumske

gllkoze.

Gen glukagona Je inicijalno prenet iz prekursora sa 360 baza u parovima

radi obrazovanja pollpeptida, preproglukagona [Lund, et al., Proc. Natl.

Acad. Sci. U.S.A. 79:345-349 (1982)]. Ovaj polipeptid Je kasnije preradjen

radi obrazovanja proglukagona. Patzelt, C., et al., Nature, 282:260-266

(1979), su demonstrirali da Je proglukagon naknadno rascepan u glukagon 1

u drugi polipeptid. Kasniji rad Lund-a, P.K., et al., Lopez-a L.C., et al.,

Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 80:5485-5489 (1883), 1 Bell-a, G.I., et al..

Nature 302:716-718 (1983) Je pokazao da Je molekul proglukagona cepan

neposredno posle ostataka llzin-arginln dipeptlda. Proučavanja proglukagona

koji proizvodi kanalska riba mačak (Ictalurus punctata) pokazala su da je

glukagon iz ove životinje takodje proteolltlčkl cepan posle susednih

ostataka lizin-arginin dipeptlda [Andreus P. C., et al., J. Biol. Chem.,

260:3910-3914 (1985), Lopez, L.C, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.,

80:5485-5489 (1983)]. Bell, G.I., et al., gore, su otkrili da Je proglukagon

kod sisara cepan na lizin-arginin ili arginin-arglnin dlpeptidiraa, 1

demonstrirali da je molekul proglukagona sadržavao tri lzolovana i veoma

homologna molekula peptlda koji su označeni kao glukagon, peptid 1 nalik na

glukagon (GLP-1) 1 peptid 2 nalik na glukagon (GLP-2). Lopez, et al., su

zaključili da je peptid 1 nalik na glukagon bio dugačak 37 amino klselinska

ostatka i da Je peptid 2 nalik na glukagon bio dugačak 34 amino klselinska

ostatka. Analogna proučavanja strukture preproglukagona kod pacova otkrila

su sličan Sablon proteolltlčkog cepanja izmedju susednih dipeptldnih ostataka

lizln-arginina 111 arglnina-arginina,Sto rezultira obrazovanjem glukagona,

GLP-1iGLP-2 IHeinrich, G., et al., Endocrinol., 115:2176-2181 (1984)].

Ustanovljeno Je da su sekvence CLP-1 kod ljudi, pacova, govečeta, i hrčka

identične [Ghiglione, M., et al., Diabctologia, 27:599-600 (1984)].

Zaključak do koga su došli Lopez, et al., u pogledu veličine GLP-1 je

potvrdjen radom Uttenthal-a. L.O., et al., J. Clin. Endocrlnol. Metabol.,

61:472-479 (1985). Uttenthal, et al., su Ispitivali molekulske oblike GLP-1

koji su bili prisutni u ljudskom pankreasu. Njihovo istraživanje pokazuje da

su GLP-1 1 GLP-2 prisutni u pankreasu kao peptidl 37 amino kiselina 1 34

amino kiseline, respektlvno.

Sličnost izmedju GLP-1 i glukagona Je ukazala skorašnjim Istraživačima

da bi GLP-1 mogao imati biološku aktivnost. Mada su neki istraživači otkrili

da bi GLP-1 mogao lndukovatl moždane ćelije pacova da slntetlzuju cAMP

[Hooseln, N.M., et al., Febs Lett. 178:83-86 (1984)]. drugi istraživači nisu

uspeli da identlfikuju bilo kakvu fiziološku ulogu za GLP-1 (Lopez, L.C.,

et al.). Neuspeh u identifikaciji bilo kakve fiziološke uloge za GLP-1

uticao Je na neke istraživače da postave pitanje da 11 Je GLP-1 bio u stvari

hormon i da li bi povezanost izmedju glukagona i GLP-1 mogla biti predmet

primene.

Varijante GLP-1 (7-37) i njegovi analozi su takodje prikazani. Ove

varijante i analozi obuhvataju, na priaer, Gln<8->GLP-1 (7-37), D-Gln<8->GLP-1

(7-37), acetil-Lls<9->GLP-l (7-37), Thr<ia->Lis<18->GLP-1 (7-37), Lls<18->GLP-1

(7-37) 1 slične, 1 njihove derivate uključujući, na primer, kiselinske

adicione soli, soli karboksllata, estri nižeg alkila, i amidl [videti,

na pr., W0 91/11457]. Opste gledano, poznato Je da različiti prikazani oblici

GLP-1 st1mulisu sekreclju Insulina (lnsullnotropsko delovanje) i obrazovanje

cAMP [videti, na pr., Mojsov, S., Int. J. Peptide Protein Research,

40:333-343 (19S2)].

Značajnije, vise autora Je pokazalo vezu izmedju laboratorijskog

eksperimentisanja i lnsulinotropskih reakcija slsara, posebno ljudskih,

na egzogenu prlmenu GLP-1, naročito GLP-1 (7-3B)NHa1 GLP-1 (7-37)

[videti. na pr., Nauck. M.A.. et al., Diabetologia, 38:741-744 (1993)i

Gutniak, M., et al.. New England J. of Medicine, 328(20):1316-1322 (1992);

Nauck, M.A., et al., J. Clin. Invest., 91:301-307 (1993); 1 Thorens. B.,

et al., Diabetes, 42:1219-1225 (1993)].

Preciznije, osnovni nedostaci, identif1kovani da izazivaju hlperglikemlju

kod dijabetesa u početnoj fazi sazrevanja, su pogoršana sekrecija endogenog

Insulina 1 otpornost na dejstva Insulina od strane mišica 1 Jetre

lCalloway. J.S.. Diabetes Care, 13:1209-1239, (1990)1. Ovaj poslednjl

nedostatak rezultira u prekomernom dobljanju gllkoze lz Jetre. Stoga,

posto normalan pojedinac osiobadJa gllkozu brzinom od približno 2rag/kg/

minut, kod pacijenata sa dijabetesom u početnoj fazi sazrevanja ova

količina obično prelazi 2.5mg/kg/minut, sto rezultira čistim viskom od

najmanje 70 grama gllkoze na 24 časa. Činjenica da postoje veoma velike

korelacije izmedju dobijanja gllkoze iz Jetre, stalna glikoza u krvi i

sveukupna metabolička regulacija kako Je pokazano merenjima glikohemogloblna

[Galloway, J.A., gore; 1 Galloway, J.A., et al., Clin. Therap., 12:460-472

(1990)], sasvim Je očigledno da regulisanje stalno prisutne gllkoze u krvi

predstavlja sine quo non za postizanje potpune normalizacije metabolizma

dovoljne da se spreči hlpergllkemiJeka komplikacija. S obzirom na činjenicu

da današnji oblici insulina retko normallzuju dobiJanje gllkoze lz Jetre

bez dobijanja značajne hiperlnsullnealje i hipoglikemije (Galloway, J. A.,

i Galloway, J.A., et al., gore) potrebni su alternativni prilazi.

Intravenske infuzije CLIP-1 (7-36)NHa radi dobijanja dva puta normalnih

koncentracija seruma, pokazalo se da izazivaju efekte prikazane u tabeli

dole:

Medjutim,dugoročna stabilnost CLP-1, posebno GLP-1 kao komponenta

farmaceutske smese za davanje sisarima, Je u pitanju. U stvari, kada se

skladište na niskoj temperaturi od 4°C, nusproizvodi GLP-1 (7-37) su

pronadjeni najranije 11 aesecl nakon dobijanja uzoraka (Hojsov, S., gore).

Stoga, postoji potreba za stabilnijim Jedinjenjem GLP-1 koje se bezbedno

moze davati sisarima kojima Je potreban takav tretman.

Stavise, biološki polu-zivot molekula GLP-1, posebno onih molekula

na koje utiče aktivnost dipeptidil-peptidaze IV (DPP IV), Je sasvim kratak.

Na prlmer, biološki polu-život GLP-1 (7-37) Je samo 3 do 5 minuta 1 na njega

dalje utiče njegova brza apsorpcija nakon parenteralnog davanja si saru.

Stoga, takodje postoji potreba za Jedinjenjem GLP-1 koje usporava apsorpciju

nakon takvog davanja.

Prema tome, ovaj pronalazak resava problem nestabilnosti seruma i

kratkog polu-života seruma u vezi sa prirodnim GLP-1 molekulima. Osim toga,

Jedlnjenja ovog pronalaska takodje obezbedjuju usporenu apsorpciju nakon

parenteralnog davanja i, dakle, trebalo bi da produže biološke polu-zlvote.

Takodje su obezbedjene farmaceutske smese Jedlnjenja ovog pronalaska, kao 1

postupci za upotrebu takvih Jedlnjenja.

Ovaj pronalazak obezbedjuje kompleks koji se sastoji od katjona

dvovalentnog metala povezan sa Jedinjenjem 1 sposoban da se kotalozi sa

Jedinjenjem formule:

u kojoj:

RJe odabranolzgrupe koja se sastoji od L-histidlna, D-hlstldina,

desamino-histldina, 2-amlno-hist Idi na, B-hldroksi-hlstidina, homohistidina,

alfa-fluormetll-histidina.ialfa-metll-hlstldina;

XJe odabranolzgrupe koja se sastoji od Ala,Gly,Val,Thr, Ile, ialfa-metll-Ala;

Y Je odabrano iz grupe koja se sastoji od Glu, Gln, Ala, Thr, Ser, i Gly;

Z Je odabrano lz grupe koja se sastoji od Glu, Gln, Ala, Thr, Ser, 1 Gly;

RaJe odabrano lz grupe koja se sastoji od NH^1Gly-OH; pod uslovom da

Jedinjenje ina izoelektrlćnu tacku u opsegu od oko 6.0 do oko 9.0 i dalje

pod uslovom da kada Rfje Hls, X Je Ala, Y Je Glu, a Z Je Glu, Rg mora biti

NH .

a

Ovim pronalaskom Je takodje obezbedjena farmaceutska smesa koja

obuhvata Jedinjenje ovog pronalaska u kombinaciji sa Jednim Ili vise

farmaceutski prihvatljivih nosača, razblažlvaca, ili ekscipljenata.

Ovaj pronalazak dalje obezbedjuje postupak za pojačavanje ekspresije

insulina koji obuhvata obezbedjlvanje efikasne količine Jedlnjenja ovog

pronalaska slsarskoj ćeliji pankreasa B-tipa nalik na ostrvce, kao 1

postupak za lecenje diabetes melltusa (šećerne bolesti) u početnoj fazi

sazrevanja, koji obuhvata davanje sisaru, kome Je potrebno takvo lecenje,

efikasne količine Jedlnjenja ovog pronalaska.

Jedan aspekt ovog pronalaska obezbedjuje kompleks koji se sastoji od

molekula GLP-1 sa izoelektričnom tačkoa u opsegu od oko 6.0 do oko 9.0,

kompleks i ran katjonoa dvo valentnog metala.

Kako je upotrebiJen u ovom opisu pronalaska, termin "solekul GLP-111

se odnosi na GLP-1 koji se prirodno Javlja (7-38)NH2, GLP-1 (7-37), prirodni

i neprirodni funkcionalni analozi i njihovi derivati, i njihove soli.

Amino klselinska sekvenca GLP-1 (7-36}NH2Je dobro poznata u tehnici, ali

Je dole prikazana onako kako to najviše odgovara čitaocu:

ZaGLP-1 (7-37), funkcionalnost aaida krajnje karboksl grupe Arg<38>Je

zamenjena sa Gly na poziciji 37 molekula GLP-1 (7-3B)NHa.

Poredtoga., postojanje 1 dobiJanje mnoštva zaštićenih, nezaštićenih,

i dellmićno zaštićenih prirodnih i neprirodnih funkcionalnih analogai

derivata GLP-1 (7-36)NH21 molekuli GLP-1 (7-37) su opisani u tehnici

[videti, na pr. , američki patenti br. 5,120.712 1 5,118,666, koji su ovde

obuhvaćeni referencom, 1 Orskov, C., et al., J. Biol. Chem., 264(22): 12826-12829 (1989) i W0 91/11457 (Buckley, D.I., et al., objavljeni 8.

avgusta, 1991. god.)].

Kao sto Je poznato u tehnici, ostaci amino kiselina mogu biti u svom

zaštićenom obliku u kome1amino i karboksi grupe poseduju odgovarajuće

zaštitne grupe, dellmićno zaštićen oblik u kome ili amino ili karboksi grupe

poseduju odgovarajuće zaštitne grupe, ili nezaštićeni oblik u kome niti

amino ni karboksi grupe ne poseduju odgovarajuću zaštitnu grupu. Brojne

reakcije radi obrazovanja 1 uklanjanja takvih zaštitnih grupa su opisane

u lzvesnom broju standardnih dela uključujući, na prlmer, "Protective

Groups ln Organlc Chemlstry<M>, Plenum Press (London i New York, 1973);

Green, T.H., "Protective Groups in Organlc Synthesis", Uiley (New York,

1981); i "The Peptides", tom I, Schr&der 1 Lttbke, Acadeaic Press

(London i New York, 1965).

Reprezentativne amino zaštitne grupe obuhvataju, na prlmer, formi1,

acetll, izopropll, butokslkarbonil, fluorenilaetokslkarbonll,

karbobenziloksi, i slične.

Reprezentativne karboksi zaštitne grupe obuhvataju, na prlmer, benzil

estar, metil estar, etil estar, t-butll estar, p-nltro fenil estar, i slične.

Pored zaštićenih oblika u kojimaiamino 1 karboksi grupe poseduju

odgovarajuće zaštitne grupe, termin "zaštićen" se takodje odnosi na one

molekule GLP-1 u kojima Je aktivnost dipeptldll-peptldaze IV suprotstavljena

ili lnhlblrana [videti, na pr., Mentlein, R., et al., Eur. J. Biochem.,

214:829-835 (1993)]. Pored GLP-1 (7-36)NH , molekuli koji su zaštićeni od

— a

aktivnosti DPP IV su poželjni, 1 Gly<8->GLP-1 (7-36)NHa, Val<8->GLP-l(7-37)OH,

a-metil-Ala<8->GLP-l(7-36)NHa, i Gly<8->Gln<ai->GLP-1(7-37)0H su pogodniji.

Derivati molekula GLP-1 koji se prirodno Javljaju su oni peptidl koji

su dobljenl komadanjem sekvence koja se prirodno Javlja, 111 su sintetizovanl

na osnovu poznavanja sekvence amino kiseUnskog niza genetske materije

(DNK. ili RNK) koji niz so prirodno Javlja i slfruje ovu sekvencu. Termin

"derivati" takodje obuhvata hemijsku modifikaciju prirodnih ili neprirodnih

molekula GLP-1. Postupci za dobi Janje ovih derivata su dobro poznati

healčarlma koji se bave organskom hernijom i peptidlma (videti, na pr., VIO

91/11457, gore).

Molekuli GLP-1 iz ovog pronalaska takodje obuhvataju analoge GLP-1

(7-36)NHa i GLP-1 (7-37) u kojima se Jedna ili vise amino kiselina koje nisu

prisutne u prvobitnoj sekvencl dodaju ili izbacuju, i njihovi derivati.

Specifično, Hls i desaaino-histidln su poželjni za F^, sve dotle dok Je

ukupna lzoelektrična tačka molekula u opsegu od oko 6 do 9. Ala, Gly, i Val

su poželjni na poziciji "X", sve dotle dok Je ukupna lzoelektrična tačka

molekula u opsegu od oko 6 do 9. Slično, Glu, i Gln su poželjni na poziciji

"Y", sve dotle dok Je ukupna lzoelektrična tačka molekula u opsegu od oko 6

do 9. Takodje, Glu, i Gln su poželjni na poziciji "Z", sve dotle dok Je

ukupna lzoelektrična tačka molekula u opsegu od oko 6 do 9. Konačno,

Gly-OH Je poželjno za Ra> sve dotle dok Je ukupna lzoelektrična tačka

molekula u opsegu od oko 6 do 9.

Osla toga, ovaj pronalazak obuhvata oblik soli molekula GLP-1. GLP-1

iz ovog pronalaska može posedovatl dovoljno kisele, dovoljno bazne, ili obe

funkcionalne grupe, i prema tome reagovatl sa bilo kojom od neorgansklh baza,

i neorganskia i organskim kiselinama, radi obrazovanja soli. Kiseline koje

se obično koriste radi obrazovanja kiselinskih adicionih soli su neorganske

kiseline kao Sto je hlorovodonična kiselina, bromovodonlčna kiselina,

Jodovodonična kiselina, sumporna kiselina, fosforna kiselina, 1 slične, 1

organske kiseline kao Sto Je g-toluensulfoklsellna, metansulfokisellna,

oksalna kiselina, p-bromfenll-sulfokiselina, ugljena kiselina, ćillbarna

kiselina, limunova kiselina, benzojeva kiselina, slrčetna kiselina, 1

slične. Prlaeri takvih soli obuhvataju sulfate, pirosulfate, bisulfate,

sulfite, blsulflte, fosfate, monohldrogenfosfate, dihldrogenfosfate. meta-

fosfate, pirofosfate, hlorlde, bromlde, Jodlde, acetate, propionate,

dekanoate, kaprilate, akrllate, formate, lzobutirate, kaproate, heptanoate,

propiolate, oksalate, malonate, sukcInate, suberate, sebakate, fumarate,

maleate, butln-l,4-dioate, heksin-l,6-dioate, benzoate, hlorbenzoate,

metllbenzoat.-, dlnitrobenzoate, hidroksi benzoat e, metoksibenzoate, ftalate,

sulfonate, ksllensulfonate, fenllacetate, fenllproplonate, fenllbutlrate,

citrate, laktate, gama-hi droks i but i rate, gllkolate, tartarate, metansulfonate,

propanBulfonate, naftalen-l-sulfonate, naftalen-2-sulfonate, mandelate, i

slično. Pogodne kišeUnske adicione soli su one obrazovane sa mineralnim

kiselinama kao Sto Je hlorovodonlčna kiselina i bromovodonlćna kiselina, i,

naročito, hlorovodonlčna kiselina-

Bazne adicione soli obuhvataju one Izvedene lz neorgansklh baza, kao

Sto su amonljum Ili hidroksldi alkalnlh ili zemnoalkalnih metala, karbonati,

bikarbonati,1slično. Takve baze korisne kod dobijanja soli iz ovog

pronalaska obuhvataju natrijum hldroksid, kalljum hldroksld, amonijum

hidroksid, kalljum karbonat, 1 slično. Naročito su pogodni oblici soli.

Naravno, kada se Jedlnjenja ovog pronalaska upotrebljavaju za

farmakoterapeutske svrhe, ta Jedlnjenja mogu takodje biti u obliku soli,

ali so mora biti farmaceutski prihvatljiva.

Stoga, molekuli GLP-1 lz ovog pronalaska obuhvataju, izmedju ostalog,

one molekule GLP-1 koji funkcionalno pokazuju lnsulinotropsku aktivnost.

Termin "lnsulinotropska aktivnost" se odnosi na sposobnost supstance da

stimuliSe, ili izazove stimulaciju sinteze ili ekspresije hormonskog

lnsulina.

lnsulInotropska osobina Jedlnjenja se može utvrditi snabdevanjem

životinjskih ćelija tim Jedinjenjem, ili ubrizgavanjem tog Jedlnjenja

u životinje i kontrolisanjem osiobadJanja imunoreaktivnog Insulina (IRI)

u odredjenu sredinu 111 krvotok životinje, respektlvno. Prisustvo IRI Je

otkriveno pomoću radioimunoloSkog ispitivanja koje posebno može otkriti

lnsulin.

Mada se može koristiti bilo koje radioiaunoloSko ispitivanje koje može

da otkriva prisustvo IRI, poželjno Je da se upotrebljava modifikacija metode

ispitivanja Albano-a, J.D.M., et al., Acta Endocrinol., 70:487-509 (1972).

Kod ove modifikacije koristi se fosfat/albumin pufer sa pH od 7.4.

Inkubacija se priprema uzastopnim dodavanjem 500 ul fosfatnog pufera, 50 ul

uzorka perfuzata ili standardnog insulina pacova kod perfuzata, 100 ul

anti-insulinskog antlseruma (Vfellcome Laboratories; razblaženje u

odnosu 1:40,000), 1 100 ul [ ) Insulina, dajući ukupnu zapreainu od 750 pl

u staklenoj cevi od 10x75mm koja se izbacuje posle upotrebe. Posle Inkubacije

tokom 2-3 dana na 4°C, slobodni lnsulin se izdvaja lz insulina vezanog za

antltela metodom Izdvajanja drvenim ugljem. Osetljlvost analize Je 1-2 uUVmL.

U cilju merenja osiobadJanja IRI u sredini ćelljske kulture ćelija koje seuzgajaju u kulturi tkiva, jedna pogodno sjedinjuje radioaktivni marker u

prolnsullnu. Mada se može upotrebiti bilo koji radioaktivni marker koji Je u

stanju da markira polipeptid, poželjno Je upotrebljavati<3>H leucin u cilju

dobijanja markiranog proinsulina. Markiranje se može obaviti za bilo koji

vremenski period dovoljan da se omogući obrazovanje detektujućeg markiranog

pula molekula proinsulina; medjutlm, poželjno Je inkubirati ćelije u

prisustvu radioaktivnog markera za vremenski period od 60 minuta.

Mada se mnoge linije ćelija koje su u stanju da izvrše ekspresiju

Insulina mogu upotrebljavati radi utvrdjivanja da 11 Jedinjenje ima

lnsulinotropsko dejstvo, poželjno Je upotrebljavati ćelije lnsullnoma pacova,

a posebno RIN-38 ćelije lnsulinoma pacova. Takve ćelije se mogu uzgajati u

bilo kojoj pogodnoj sredini; medjutlm, poželjno Je upotrebljavati DME

sredinu koja sadrži 0.IX BSA 1 25 mM gllkoze.

lnsulinotropska osobina Jedlnjenja se takodje može utvrditi infuzijom

pankreasa. In situ odvojeno pripremanje pankreasa uz brizganje kod pacova

predstavlja modifikaciju metode Penhos-a, J.C., et al., Diabetes,

18:733-738 (1969). Mužjacima albino pacova vrste Charles Rlver koji su

ispošćlvani, težine 350-600 g, su anestezirani intraperltonealnoa Injekcijom

Amytal natrljuma (Eli Lilly and Co.: 160 ng/kg). Bubrežni, nadbubrežni,

želudačnl, 1 krvni sudovi spuštenog debelog creva su podvezani. Sva creva

su resecirana izuzev oko tem dvanaestopalaCnog creva 1 silaznog debelog

crevairektuma. Prema tome, samo Jedan mali deo creva Je prskan,

minimizirajućl moguće smetnje od strane enterićklh supstanci sa

imunoreaktivnoSću nalik na glukagon. Perfuzat Je modlflkovan Krebs-Ringer-ov

blkarbonatnl pufer sa 4% dekstrana T7010.2% govedjeg seruma albumina

(frakcija V), i penuSao Je sa 95X 0i5% CO . Nepulslrajući protok, 4-

kanaIna pumpa sa valjkastim ležajem (Buchler polystatic, Buchler Instruments

Division, Nuclear-Chicago Corp.) se upotrebljava,ipostiže se pomeranje

sa Jednog izvora perfuzata na drugi zamenom ventila koji ide u 3 pravca.

Način na koji se Izvodi prskanje, kontrollSe, 1 analizira. Je u skladu sa

metodom Vfelr-a, G.C. et al., J. Clin. Inestigat. 54:1403-1412 (1974), koja

Je ovde obuhvaćena referencom.

Molekuli GLP-1 iz ovog pronalaska treba da poseduju histidinsku

funkcionalnost na amino završetku. Molekuli GLP-1 lz ovog pronalaska

mogu takodje posedovati modifikovanu histidinsku funkcionalnost umesto

tražene histidinske funkcionalnosti.

Termin "modifikovan hlstldln" se odnosi na histidinsku funkcionalnost

koja je hemijski 111 biološki izmenjena ili lzmenjona hlstidlnska

funkcionalnost koja Je sintetlzovana de novo, ali koja zadržava svoje

osobine vezivanja za metale.

Brojne takve modlfikovane histldinske funkcionalnosti i njihovo

dobiJanje su poznatiutehniciiobuhvataju, na prlmer, D-hlstidin(W091/11457), desamlno-hlstidin(UO92/18531), 2-amino-hlstidin

[Levine-Plnto, H. , et al., Blochem. Biophys. Res. Commun., 103(4): 1121-1130 (1981)), fl-hldroksi-L-hlstidin (Ova,T,et al., Chemlstry

Letters, pp. 1873-1874 (1988)], L-homohlstidln [Altman, J., et al.,

Svnthetic Commun.. 19C11&12) :2069-2076 (1989)], oc-fluormetil-histidin

(amer. patent br. 4,347,374), 1 a-met11hlstldln [O'Donnell, M.J., Synthetlc

Commun., 19(7&8) : 1157-1165 (1989)].

Potrebno Je da molekuli GLP-1 lz ovog pronalaska Jos imaju

lzoelektričnu tackuuopsegu od oko 6.0 do oko 9.0. Brojni molekuli GLP-1

koji Imaju lzoelektričnu tackuuovom opsegu, su prikazani 1 obuhvataju,

na prlmer:

Arg<2*>CLP-1(7-37),1 slični(videti, na pr.,W091/11457, gore). Pored toga, molekuliGLP-1 izovog pronalaska, kada poseduju svakuod

gore označenih modlfikovanih histidlnskih funkcionalnosti umesto

histldinske funkcionalnosti, imaju izoelektrlčne tačke koje spadajuu

napred defIni sani opseg. Metode za sraCunavanJe 111 eksperimentalno

utvrdjlvanje izoelektrične tačke drugih molekula GLP-1 su poznate prosecnom

stručnjaku.

Postupci za dobi Janje molekula GLP-1 lz ovog pronalaska su takodje

dobro poznati hemičaru koji se bavi peptldima.

U Jednom postupku, molekuli GLP-1 se dobiJaju dobro poznatim sintetičkim

shemama peptida u Čvrstoj fazi koje su opisali Merrlfield, J.M., Chera. Soc.,

85:2149 (1962), i Steuart 1 Young, Solid Phase Peptide Synthesis, pp. 24-66,

Freeman (San Francisco, 1969). Medjutlm, takodje Je moguće dobiti fragmente

po11peptida proglukagona Ili GLP-1 (1-37) cepanjem amino kiseUnske sekvence,

koja se prirodno Javlja, na fragmente, korisćenjem, na prlmer, proteolltički

enzim. Osim toga, moguće Je dobiti željene fragmente peptida proglukagona

ili GLP-1 (1-37) korisćenjem tehnologije rekomblnantne DNK kako su objavili

Manlatls, T. , et al., Molecular Biologv: A Laboratory Manual, CSH

(Cold Sprlng Harbor, 1982).

Sllćno, stanje tehnike u molekularnoj biologiji obezbedjuje prosecnom

stručnjaku Jofi Jedno sredstvo kojim se mogu dobijati Jedlnjenja ovog

pronalaska. Mada se može debljati sintezom peptida u Čvrstoj fazi 111

rekombinantnim metodama, rekomblnantne metode mogu biti poželjne, Jer su

mogući veći prinosi. Osnovne faze kod rekoablnantnog dobijanja su:

a) izo1ovanJe prirodne DNK sekvence slfrovanjem molekula GLP-1 ili konstrulsanjem sintetičke 111 polu-sintetlCke DNK slfrlrajuće

sekvence za molekul GLP-1,

b) postavljanjem kodirajuce sekvence u ekspreBlonl vektor na način pogodan za ekspresiju proteina 111 samih ili kao fuzionl proteini, c) transformlsanje odgovarajuće eukarlotičke ili prokariotlčke ćelije domaćina sa ekspreslonim vektorom, d) kulturlsanje transformlsane ćelije domaćina pod uslovima koji će omogućiti ekspresiju molekula GLP-1, 1 e) rekuperovanje 1 prečišćavanje rekomblnantne dobijenog molekula GLP-1.

Kako Je ranije navedeno, kodirajuce sekvence mogu biti potpuno

sintetičke 111 rezultat modifikacija veće, natlvne glukagon-enkodlrajuće

DNK. DNK sekvenca koja slf ruje preproglukagon Je prikazana kod Lund-a,

et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 79:345-349 (1982) 1 može se koristiti kao polazna materija kod poluslntetlckog dobijanja Jedlnjenja iz ovog pronalaska lzmenom natlvne sekvence radi postizanja željenih rezultata.

Sintetički geni, ln vi tro 1)1 ln vivo transkripcija i translacija.

Sto rezultira dobijanjem molekula GLP-1, mogu biti napravljeni tehnikama koje su dobro poznate u tehnici. Zahvaljujući prirodnoj degeneraciji genetskog koda. stručnjak će priznati da se može konstruisatl odredjen broj DNK sekvenci koje se mogu klasificirati, a sve one Slfruju GLP-1 molekule.

Metodologija konstrukcije sintetičkog gena Je dobro poznata u tehnici. Videti Brown, et al. (1979) Methods ln Enzymology, Academic Press, N.Y., Vol. 68, pgs. 109-151. DNK sekvence koje Slfruju GLP-1 molekul mogu biti kreirane takoSto su bazirane na amino klsellnskim sekvencama koje su ovde opisane. Clm Je Jednom kreirana, sama sekvenca se može stvarati pomoću klasičnog DNK uredjaja za sintetlzovanjekaoSto su DNK slntetlzatorl Model 380A 111 380B (PE-Applied Blosvstems, Inc., 850 Lincoln Center Drlve, Foster City, CA 94404).

Da bi se izvršila ekspresija GLP-1molekula, umećese planirana sintetička DNK sekvenca u bilo koji od mnogih pogodnih rekomblnantnih

DNK ekspresionih vektora upotrebom odgovarajućih restrikclonih endonukleaza. Pogledati kod Maniatls et al. (1989) Molecular Clonlng; A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Laboratory Press, N.Y., Vol. 1-3. Restrlkclone pozicije cepanja endonukleaze su planirane tako da se nalaze ili u Jednom ili u drugom kraju DNK koja Slfruje GLP-1 molekul radi olakšavanja izdvajanja iz,

i integracije u poznate ampllfikacione 1 ekspresione vektore. Specifične koriSćene endonukleaze će biti diktirane od strane restrlkcionog modela cepanja endonukleaze, osnovnog ekspresionog vektora koji treba koristiti. Izbor restrikclonih pozicija Je tako Izabran da se kodirajuća sekvenca pravilno usmerava sa kontrolnim sekvencama radi postizanja odgovarajućeg očitavanja unutar okvira i ekspresije proteina koji Je od Interesa. Kodirajuća sekvenca mora biti postavljena tako da bude u odgovarajućem okviru za očitavanje sa mestom vezivanja promotora 1 ribozoma ekspresionog vektora, od kojih su oba funkcionalna u ćeliji domaćinu u kojoj protein treba da bude podvrgnut ekspresiji.

Da bi se postigla efikasna transkripcija sintetičkog gena, ona mora biti funkcionalno povezana sa zonom funkclonisanja promotora. Prema tome,zona funkcionisanja promotora sintetičkog gena je postavljena u isto

sledstveno usmcravanjeupogledu polaznog kodona ATC sintetičkog gena.

Mnogo različitih ekspresionlh vektora korisnih za transformlsanje

prokariotsklh i eukariotsklh ćelija su dobro poznati u tehnici. Videti

ThePromega Biological Research Products Catalogue (1992) (Promega Corp.,

2800 Woods Hollou Road, Madison, WI, 53711-5399); i The Stratagene Clonlng

Systems Catalogue (1992) (Stratagene Corp., 11011 North Torrey Plnes Road,

La Jolla, CA, 92037). Takodje, američki patent br. 4,710,473 opisuje

transformacione vektore cirkularnlh plazmlda DNK korisnih za ekspresiju

egzogenih gena kodE. col ipri visokim nivoima. Ovi plazmidl su korisni kao

transformacionl vektori kod rekomblnantnih DNK postupakai

(a) prenose na plazmid sposobnost za autonomnu replikacljuućeliji

domaćinu;

(b) kontroliSu autonomnu replikaclju plazmlda u odnosu na temperaturu

na kojoj se održavaju kulture ćelija domaćina; (c) stabilizuju održavanje plazmlda u populacijama ćelija domaćina;(d)reguliSu sintezu proizvoda proteina koja pokazuje održavanje

plazmldaupopulaciji ćelije domaćina;

(e) obezbedjuju restrlkciona mesta raspoznavanja endonukleaze u

nizovima Jedinstvena za plazmid; 1

(f) okončavaju transkripciju mRNK.

Ovi clrkularni plazaldi DNK su korisni kao vektori kod rekomblnantnih DNK

postupaka radi obezbedjlvanja visokih nivoa ekspresije egzogenih gena.

PoSto Je konstruisan ekspresioni vektor za GLP-1 molekul, sledeča faza

Je postavljanje vektoraupogodnu ćeliju i time konstruiSe rekoablnantna

ćelija domaćin korisna za ekspresiju polipeptlda. Tehnike za transformlsanje

ćelija sa rekombinantnim DNK vektorima su dobro poznateutehnici1mogu se

pronaći u takvim opStim referencama kao kod Manlatis-a, et al. gore. Ćelije

domaćini se mogu konstrulsati ili lz eukariotsklhiliprokariotsklh ćelija.

Prokariotske ćelije domaćini obično proizvode protein pri većim

brzinama1lakSe ih Je kulturisati. Proteini koji su podvrgnuti ekspresiji

usistemima bakterijske ekspresije visokog nivoa karakteristično agregiraju

u granule 111 lnkluziona tela koja sadrže visoke nivoe proteina podvrgnutog

prekomernoj ekspresiji. Takvi proteinski agregati obično moraju biti

rastvoreni, denaturlzovani i ponovo presavijeni korisćenjem tehnika koje su

dobro poznateutehnici. Videti Kreuger, et al. (1990)uProtein Folding,

Glerasch and Klng, eds., pgs 136-142, American Assoclation for the

Advancement of Science, br. Publikacije 89-18S, VJashlngton, D.C.;1

američki patent br. 4,923,967.

Čim Je dobljen Željeni molekul GLP-1, njegovim obezbedjivanjem dobija

se izoelektrična tačka u opsegu od oko 6.0 do oko 9.0, a kompleksi iz ovog

pronalaska se dobi Jaju kompleksiranjem željenog GLP-1 molekula sa katjonom

dvovalentnog metala putem dobro poznatih metoda u tehnici. Takvi katjoni

<++><++><++><++>+<+><+>+

metala obuhvataju, na prlmer, Zn,Mn , Fe , Co , Cd , Ni ,1 slični.

Od katjona metala, Zn++ Je pogodan.

Obično se, željeni molekul GLP-1, sa potrebnom izoelektričnom tačkom,

sjedinjuje sa smeSom pogodnog pufera i odgovarajućim oblikom katjona metala.

Pogodni puferi su oni koji će održavati smesu u pH opsegu od oko 6.0

do oko 9.0, ali koji neće remetiti reakciju. Pogodni puferi obuhvataju

Goode-ove pufere, naročito HEPES, 1 Tris i Tris acetat.

Odgovarajući oblici katjona metala predstavljaju bilo koji oblik

katjona dvovalentnog metala koji Je dostupan radi obrazovanja kompleksa sa

molekulom GLP-1 iz ovog pronalaska. Pogodno, katJonska so dvovalentnog

metala kao sto Je cink hlorid Je obezbedjena u visku radi dobijanja molskog

odnosa do oko 50 molekula katjona dvovalentnog metala za svaki molekul GLP-1

supstrata.

Temperatura korlSćena u ovoj fazi Je ona koja Je dovoljna da se ostvari

završetak reakcije. Obično se reakcija Izvodi na temperaturi okoline.

Proizvod ove reakcije, kristalna 111 amorfna suspenzija, se izdvaja 1

prečiSćava pomoću standardnih tehnika.

Ovaj pronalazak takodje obezbedjuje farmaceutske smese koje obuhvataju

Jedinjenje ovog pronalaska u kombinaciji sa farmaceutski prihvatljivim

nosačem, razblažlvačem, ili ekscipljentom. Takve farmaceutske smese se

dobiJaju na način dobro poznat u farmaceutskoj tehnici,idaju se

pojedinačno 111 u kombinaciji sa drugim terapeutsklm sredstvima, pogodno

parenteralnim načinima. Naročito pogodni načini obuhvataju lntramuskularnu 1

supkutanu prImenu.

Parenteralne dnevne doze, pogodno Jedna dnevna doza, su u opsegu od oko

iPg'kg d°oko 1,000 ug/kg telesne težine, mada se mogu davati manje 111

veće doze. Potrebna doza će zavisiti od ozbiljnosti stanja pacijenta i od

takvih kriterijima kao Sto su pacijentova visina, težina, pol, uzrast, 1

istorlja bolesti.

Kod dobijanja smesa iz ovog pronalaska, aktivni sastojak, koji obuhvata

najmanje Jedno Jedinjenje iz ovog pronalaska, se obično meSa sa

eksclpiJentom Ili razblažuje eksclpiJentom. Kada se ekscipljent upotrebljava

kao razblažlvač, on može biti čvrsta, polu-čvrsta, ili tečna materija koja

se ponaša kao prenosnlk, nosač, ili sredina za aktivni sastojak.

Kod dobijanja formulacije, može biti potrebno da se aktivno Jedinjenje

samelje radi obezbedjlvanja odgovarajuće veličine čestica pre sjedinjavanja sa

drugim sastojcima. Ako Je aktivno jedinjenje u osnovi nerastvorljivo, obično

se melje do veličine čestica od manje od oko 200 mesa. Ako Je aktivno

Jedinjenje u osnovi rastvoriJlvo u vodi, veličina čestica se obično podešava

mlevenjem radi obezbedjlvanja u osnovi uniformne distribucije u formulaciji,

na pr., oko 40 mesa.

Neki prlmerl pogodnih eksclpiJenata obuhvataju laktozu, dekstrozu,

saharozu, trehalozu, sorbitol, 1 manito1. Smese ovog pronalaska se mogu

formulisatl tako da obezbede brzo, neprekidno 111 usporeno oslobadjanje

aktivnog sastojka nakon davanja pacijentu korisćenjem postupaka dobro

poznatih u tehnici.

Smese se pogodno formulisu u obliku Jedinične doze sa svakom dozom koja

obično sadrži od oko 50 ug do oko 100 mg, češće od oko lmg do oko lOmg

aktivnog sastojka. Izraz "oblik Jedinične doze" se odnosi na fizički

izolovane Jedinice pogodne kao Jedinične doze za ljude i druge sisare, a

svaka- Jedinica sadrži prethodno odredjenu količinu aktivne materije

sračunate da proizvede željeno terapeutsko dejstvo zajedno sa pogodnim

farmaceutskim ekscipiJentom.

U svrhu parenteralne primene, smese koje sadrže Jedinjenje iz ovog

pronalaska se pogodno sjedinjuju sa destilovanoa vodom, a pH se podešava do

oko 6.0 do oko 9.0.

Mogu se koristiti dodatne farmaceutske metode radi kontrollsanja

trajanja delovanja. Preparati sa kontrolisanim oslobadjaajem se mogu

dobi Jat i upotrebom pollaera radi koaplekslranja 111 apsorbovanja Jedlnjenja

iz ovog pronalaska. Kontrollsano otpuštanje se može vršiti selekcijom

odgovarajućih makromolekula (na prlmer, poliestri, pollamino kiseline,

pol ivinilpirolldon, etilenvlnll acetat, metilceluloza,

karboksimetilceluloza, i protamin sulfat) 1 koncentracija makromolekula, kao

i postupci inkorporlsanja u cilju kontrollsanja oslobadjanja.

Drugi moguć postupak za kontroliranje trajanja delovanja preparatima sa

kontrolisanim oslobadjanjem Je da se Jedinjenje ovog pronalaska inkorporlse

u čestice pollmerske materije kao sto su poliestri. poliaalno kiseline,

hldrogell, poli (mlečna kiselina) ili kopollmerl etilen vlnilacetata.

Alternativno, umesto inkorporlsanja Jedlnjenja u ove čestice polimera,

moguće Je zatvoriti Jedinjenje ovog pronalaska u mikrokapsule dobljene,

na primer, tehnikamastapanjailimedjupovrslnskom polimerizacljom,na

prlmer, hldrokslmetl1 celuloza 111 2elatinske aikrokapsule, respektlvno.

Iliu sistemima davanja koloidnog laka, na primer, lipozoma, mlkrosfera

albumlna, mlkroemulzlJa, nanočestlca,inanokapsula, ili u makroemulziJama.

Takvestudijesuopisane u Remlngton's Pharmaceutical Sciences (1980).

Jedlnjenja ovog pronalaska Imaju lnsulInotropsku aktivnost. Stoga,

drugi aspekt ovog pronalaska obezbedjuje postupak za pojačavanje ekspresije

insulina koji obuhvata obezbedjlvanje slsarskoj ćeliji pankreasa B-tipa nalik

na ostrvce efikasne količine Jedlnjenja ovog pronalaska.

Slićno, ovaj pronalazak obezbedjuje postupak za lećenje šećerne bolesti

kod sisara na početku sazrevanja, poželjno čoveka, kome Je potrebno takvo

lečenje, koji postupak obuhvata davanje efikasne količine Jedlnjenjaili

smese iz ovog pronalaska takvom sisaru.

'Sledećl primer isuobezbedjenl radi dalje ilustracije ovog pronalaska-.

Nije nameravano da ovaj pronalazak bude ograničen po obimu iz razloga bilo

kog od sledećih prlmera.

Primer_l

Pojedinačni alikvoti od S različitih GLP-1 molekula su dobljenl dobro

poznatom sintezom peptida u čvrstoj fazi i lloflliziranl u malim ampulama.

Delovi od 0. IM HEPES (N-[2-hidroksietll]piperazin-N"-[2-etansulfokiselina])

pufera pri pH 7.4 koji sadrže različite nivoe cink hlorida su dodavani

alikvotima radi dobijanja koncentracije proteina od oko 0.lmg/ml. Uzorci su

pomesani 1 uskladišteni na temperaturi okoline (22°C) oko 18 časova. Smese

su zatim centrifugirane (Flsher Model 23SC mlkro-centrifuga) tokom S minuta.

Bistri površinski slojevi su pipetom vadjeni iz cevi. Sadržaj proteina iz

površinskih slojeva Je procenjen merenjem njihove apsorpcije pri 280 nmu

spektrofotometru (Gilford 260). Teoretska vrednost apsorpcije za rastvor od

0.1 mg/ml GLP-1 molekula pri ovoj talasnoj dužiniukuvetama odlemJe0.207.Rezultati ovog eksperimentasuprikazaniuTabeli1.

Ovaj prlmer pokazuje da Je potrebna samo mala količina cinka radi

komplekslranja sa i taloženja značajnog dela GLP-1 molekula iz ovih

razblaženlh rastvora.

Primer_2

5mgGLP-1(7-3B)NH2Je potpuno rastvoren u 2.Sml pH 7.4, 0. IMHEPES

pufera oslobodjenog cinka. Zatim Je brzo dodato Jos 2.5al pH 7.4, 0. IM

HEPES pufera koji sadrži 0.6 mMcinkhlorlda. Približan molski odnos cinka premaGLP-1(7-361NH2u ovom uzorku Je 1 prema 1. Rastvor Je odmah postaonalikna oblakiubrzo Je obrazovan talog. Smesa Je uskladištena na temperaturiokoline (22°C)tokom 18 časova.

TalogJepostao čvrsto vezan za dno staklene ampule. Površinskisloj Je potpunodekantovan pipetom. Talog Je zatim potpuno rastvorenu5.Omi0.01N hlorovodonlčnekiseline. Apsorpcija pri 280 nm Je utvrdjenaiza površinskisloj i za ponovorastvorene rastvore taloga.Nivoicinkauovim rastvorima

sukvantlfikovani spektrofotometrijom atomske apsorpcije. Rezultati ovog

eksperimenta suprikazaniuTabeli2.

Ovaj prlmer pokazuje da se najveći deo GLP-1 (7-36)NILj, istalozio iz

rastvora kada Je dodat rastvor HEPES koji sadrži cink. Vrednost apsorpcije

280 nm 1.932 pokazuje da je GLP-1 (7-36 JNHg koncentracija ponovo

rastvorenog taloga 0.933mg/ml, 111 283 uH. Koncentracija cinka iz ovog istog

rastvora, 13.3 dela po mi 1 ionu. Je ekvivalentna koncentraciji cinka od 203

uM. Prema tome, molski odnos cinka prema GLP-1 (7-36)NH2 u talogu je bio

0.717 prema 1.

Claims (14)

1.Polipeptid formule Ri-X<Hu<)ly-Trir-Phe-T^ AjA-AJa-Lvs-Z-rtie-ne-Ala-Trp^Leu-Val-L aauiacen time, Koje:Riizabrano odL-histidina, D-histidina, desanuno-histidina, 2-amiro-hiatidina, B-hidroksi-histidina,homo-histidina, alfa-fluonnetil4ustidina,ial&-raetil-histidina;X jeizabrano od Val, Ue, i alfa-metil-Ala;Y jeizabranood Glu, Gln,Ala, Thr, Ser, iGly; Z jeizabrano odGlu, Gln,Ala,Thr,Ser,i Gly,Raje izabrano od NH2, i Gly-OH; pod uslovomdapolipeptidimaizoelektriCnutačkuuopsegu od 6.0do9.0.

2.Polipeptidprema zahtevu1,naznacca time, Stoje Rtizabrano od L-histidina i desamino-histidina.

3.Polipeptidprema zahtevu1 ilizahtevu 2, aaanaften time, Sto je X Val.

4. PolipeptMpreinAbifokomodza^ adGlu i Gln.

5.Polipeptidpremabilokom od zahteva1do 4, aantaff time,StojeZizabranood Glu i Gln.

6.Polipeptid formule:Ri-X<Jlu<}yt-Thr4^Tr^P1ie-ne-AJa-Trp-Leu-Val-Lvs-Gly-Arg-R^ nazaačea time, Stoje:RiL4iistidine;X je Val;Y je Glu;ZjeGlu.iRa jeGly-OH.

7. Polipeptid formule:RrX<51u<}ry-Tlir-r1ie-^ P1ie-Ue-Ala-Trp-Leu-Val-L<y>8^1y-Aj^-R2i naznačen time, Stoje:R, L-histidine;X je Val;Y je Gln;ZjcGlu.iRa jeGIy-OH.

8. Kompleks GLP-1 molekula koji se sastoji od dvovalentnog metalnog katjona povezanog sa polipeptidom iz bilo kog od zahteva od1do7, isposoban da sekotaložisa pomenutim polipeptidom.

9. Kompleksizzahteva 8, naznačen time, Stoje pomenutJ dvovalentni metalni kanjon cink.

10. Farmaceutska formulacija, naznačena time, Sto sadrži kao aktivni sastojak kompleks,ilinjegove farmaceutski prihvatljive soli, kaoSto se zahteva u zahtevu 8ili9, povezanih sa jednimiliviše fannaceutski prihvatljivih nosača, razblaživača ili ekscipijenata.

11. Delotvoma količina kompleksa GLP-1 molekula, ili njegove faimaceutski prihvatljive soli, kako se zahteva u zahtevu 8ili9 za upotrebu u tečenju dijabetes melitusa upočetnojfazi sazrevanja.

12. Upotreba delotvorne količine kompleksa GLP-1 molekula, ili njegove framaceutski prihvatljive soli, kako se zahteva u zahtevu 8ilizahtevu 9 uproizvodnjileka za tečenje dijabetes melitusa kod sisan, u početnoj fazi sazrevanja.

13. Upotreba delotvorne količine kompleksa GLP-1 molekula, ili njegove farmaceutske soli, kako se zahteva u zahtevu 8ilizahtevu 9uproizvodnji fannaceutske kompozicije namenjene povećanju ekspresije insulina iz sisarskih ćelija pankreasa B-tipa nalik na ostrvca,

14. Postupak zapripremukompleksa GLP-1 molekula kako se zahteva u zahtevu 8ilizahtevu 9, naznačen time, Sto se sastoji od meSanja pomenutog GLP-1 polipeptida sa dvovalentnim metalnim katjonom. ISJFannaceutska formulacija, ■azaačeaa time. Sto sadrži kao aktivni sastojak polipeptid,ili njegova faimaceutski prihvatljiva so, kako se zahteva u zahtevima od1do 7 povezanih sa jednim ili više fannaceutsld prihvatljivih nosača, razblaživača ili ekscipijenata.