RS49692B - Imunostimulirajući i metastaza inhibirajući fermetnirani materijal iz pšenične prekrupe - Google Patents

Abstract

Imunostimulirajući i metastaza inhibirajući fermentirani suvi materijal, izveden iz fermentirane tečnosti dobijene fermentiranjem pšenične prekrupe sa Saccharomyces cerevisiae u vodenom medijumu. Prijava sadrži još 4 nezavisna i 7 zavisnih patentnih zahteva.

Description

Pronalazak se odnosi na fermentirani i osušen biljni materijal koji je imunostimulatoran i inhibira metastaze, njegove farmaceutske kompozicije, na postupak za dobijanje ovog materijala i na upotrebu osušenog biljnog materijala kao dijetetske dopune i na proizvodnju farmaceutskih kompozicija koje su imunostimulatorne i naročito inhibiraju metastaze.

Jedan od glavnih ciljeva tretiranja tumora je inhibiranje metastaza, pošto se primarni tumor izazvan malignim rastom ćelija širi preko metastaza na susedne ćelije i organe u kasnije sekundarne tumore, koji se ne mogu ukloniti hirurški i mogu takođe da postanu rezistent-

ni na hemoterapiju.

Istraživači se sve više i više koncentrišu na razvoj imunomodulatorskih materijala i intenzivno se proučavaju materijali prirodnog - uglavnom biljnog porekla.

Dobro je poznata činjenica da jedinjenja sa hinon-skom strukturom igraju važnu biološku ulogu. Nekoliko derivata hinona se nalaze u biljkama, kao što su ubihinoni,

plastohinoni, menahinoni, koji igr.au ulogu u fotosintezi,

ali takodje u ćelijskom respiratornom sistemu kičmenjaka, prema tome takodje i ljudi i u koagulaciji krvi itd. Nekoliko derivata benzohinona se isto tako upotrebljavaju za medicin-ske svrhe,. Ađriamicin, daunorubicin i mitomicin C, su deri-vati1 hinona sa citostatifikim efektom, dok drugi benzo- i hidrohinoni imaju antimikrobni efekat i i oni su aktivne komponente antibiotika pogodnih za tretiranja bakterijskih infekcija kao što su Tetran-B, Metaciklin i Goksiciklin.

U literaturi se navodi da 2,6-dimetoksi-p-benzohinon (2,6-DMBO) i 2-metoksi-p-benzohinon (.2<-MBO) imaju fungicidni i bakterJbstatičkiefekat, i oni su takodje citotoksični za maligne ćelije tumora. /Int. J. Quant. chem.: Ouant Biol.

Symp 7., 217-222 (1980), 9., 27-30 (1982) i 12., 257-261

(1985); Phytochemistry 27., 225 (1971) i J. Agric. Food Chem. 39., 266 (1991)/. Pokazano je da smeša 2,6-dimetoksi-p-benzohinona i askorbinske kiseline inhibira rast ćelijaEhrlich-ovog ascitiSnog tumora kod miševa /Proc.jjiatl Acađ.

Sci.USA 81., 2088-2091 (1984) i 82, 1439-1442 (1985).

2,6-dimetoksi-p-r-benzohinon i 2-metoksi-p-benzohinon su nadjeni i izolovani u nekoliko biljaka /Magy, Kem. Folyđirat

102/7., 320-325 (1996)/. Ova dva jedinjenja mogu se nađi u najvećim količinama u glukozidnom obliku u pšenici (Tricitum vulgaris) tačnije u pšeničnoj prekrupi. Jedinjenja su izolovana u pedesetim iz pšeničnih prekrupa-. sa kvascem i identifikovana za svrhu ispitivanja pogoršanja kvaliteta hleba u koji je dodata<p>šenična prekrupa /Helv. Him. Acta 33., 433 U95 0); J. Chem Soc. London 1952, 4821-4823/.

Prema listeraturi u pšeničnoj prekrupi količina 2-MBO je oko 0.05 težinskih %, a ona 2,6-DMBO je oko 0.01

težinskih % (kao glukozid) Prisustvo > hinona kao glukozida se objašnjava činjenicom da su hinoni, naročito metoksi supstituisani p benzohinoni reaktivni, dok su njihovi hidro-hinon glukozidi stabilniji i inertni.

Tokom naših eksperimenata koji se odnose na prouča-vanje fermentacije pšenične prekrupe, mi smo zaključili da suv ekstrakt izveden iz fermentirane tečnosti dobijene dok se fermentira pšenična prekrupa sa pekarskim kvascem (Saccharomices cerevisiae) ima iznenadjujući imunistimula-torni efekat i efekat inhibiranja metastaza, i da se može primeniti uspešno kao aktivni agens farmaceutskih kompozicija koje imaju imunostimulatorni efekat i efekat inhibira-^

nja metastaza.

Ovaj nalaz je iznenadjujuđi, pošto mada je u litera^

turi objavljeno /Proc. Natl. Acad, Sci. USA 80., 129 (1983)

da smeša 2,6-DMBO i askorbinske kiseline inhibira rast

delija Egrlich-ovog ascitičnog tumora - ove su eminentno pogodne za kvantitativnu analizu rasta tumora i za prouča-vanje njihovih bioloških funkcija - ekstrakt opisan u pronalasku, koji sadrži pored neidentifikovanih komponenti 2,6*-DMBOi 2-MBO - pokazao se da je neefikasan na ove primarne tumorne ćelije, čak i kombinovan sa askorbinskom kiselinom - uglavnom na sve primarne tumore i pokazao se samo veoma efikasnim u tretiranju metastaza. Aspekti tretiranja primarnih tumora i metastaza koje se razvijaju iz prethodnih su suštinski različiti, tako da nije samo po sebi evidentno za istraživača da biljni ekstrakt koji sadr-ži komponente za koje je poznato da su efikasne u tretiranju primarnih tumora i koje su do sada još uvek nepotpuno iden-tifikovane s obzirom na njihov hemijski sastav treba da imaju imunostimulatorni efekat i efekat inhibiranja metafeta-za. /Cancer, Principles of Oncologv, Vol 1. 4<4vrto izdanje,

J.B. Lippincott Companv, Philadelphia, 1993/.

Prema tome, ovaj pronalazak se odnosi na fermentirani i osušen biljni materijal koji je imuhostimulatoran i inhibira metastaze, koji se dobija fermentiranjem pšenične prekrupesa pekarskim kvascem u vodenom medijumu, filtri-ranjem fermentirane tečnosti bez ćelija i njenim sušenjem.

Ovaj pronalazak se takodje odnosi na farmaceutsku kompoziciju koja je imunostimulatorna i inhibira metastaze,

čiji aktivni agens sadrži fermentirani, osušeni biljni

materijal opisan u pronalasku.

Ovaj pronalazak se takodje odnosi na upotrebu gore pomenutog fermentiranog osušenog biljnog materijala u proizvodnji farmaceutskih kompozicija koje su imunostimulatorne i inhibiraju metastaze.

Ovaj pronalazak se takodje odnosi na potsupak za tretiranje sisara i stimulaciju imunog sistema i inhibiranje matastaza sa farmaceutskom kompozicijom opisanom u pronalasku.

Pronalazak se dalje odnosi na dijetetsku dopunu koja sadrži fermentirani, osušeni biljni materijal opisan u pronalasku i maltodekstrin.

Prema pronalasku fermentirani, osušeni biljni materijal je identifikovan i ispitan na bazi 2,6-DMBO sadržaja.

Želimo da napomenemo ovde da potpuna identifikacija hemijs-kog sastava ekstrakta nije bila moguća sa dostupnim postupa cima, tako da se svi podaci odnose na 2,6-DMBO sadržaj kao bazu.

Pokazalo se pogodnim da se za proizvodnju fermentiranog, osušenog bilnog materijela opisanog u ovom pronalasku upotrebi pšenična prekrupa - koja je nuz-proizvod mleve-nj a brašna i dostupna je u velikim količinama - samlevena na kvalitet brašna, ili u njenom originalnom obliku ili obazmašćena. Upotreba obezmašćene pšenične prekrupe nema specifične prednosti. Fermentacija se vrši sa pekarskim kvascem (.Saccharomvces cerevisiae). Ovaj tip kvasca je komercijalno dostupan. Period fermentacije je bio oko 10-24 sati, prvenstveno 15-20 sati ili oko 18 sati. Temperatura fermentacije je oko 25 - 35°C, prvenstveno oko 30°C.

Težinski odnos pšenične prekrupe i kvasca je 4:1 - 2:1,

prvenstveno oko 3:1, težinski odnos suvog materijala i vode je 1:6 - 1:12, prvenstveno oko 1:9.

Fermentacija-u laboratorijskom obimu - može da se postigne, na pr., dodavanjem u stakleni fermentor u sveže samlevenu pšeničnu prekrupu suspenzije kvasca u vodi, i meša-njem ili mućkanjem smeše. Fermentirana tečnost postaje penasta.

Posle fermentacije smeša se centrifugira 5-15 minuta na 2000 - 4500/min, prvenstveno oko 3000 / min. Gornji sloj tečnosti3e kuva; hladi i susi na noaodan način,naPr- ><li>ofil<iza->

cijom ili s šenjem raspršavanjem.

Proizvod, crvenkasto mrki prah je materijal prema pronalasku. Celishodno je da se materijal do dalje upotrebe drži ohladjen, i zbog njegovog higroskopnog karaktera u zatopljenim kontejnerima. Sadržaji 2,6-DMBO dobijenog suvog materijala je oko 0.4 mg/g,

U slučaju fermentacije u velikom obimu Cna pr., 4

kubnih metara), pogodno je da se upotrebi kontinualno

provetravanje, na pr., 0,5 1 vazduha/1 fermentirane tečnosti u minutu, i sporo mešanje. Period fermentacije je oko 18 sati. U cilju da se spreči penjenje mogu se upotrebiti uobi-čajeni aditivi- prvenstveno je da se upotrebi suncokretovo ulje. Na kraju fermentacionog procesa provetravanje i meša-nje se prekida i fermentirana tečnost se odvaja od pšenične prekrupe - suspenzije kvasca na uobičajeni način, na primer u pužastom dekantatoru, zatim u separatoru i filter presi. Ako je potrebno može se dodati pomodni materijal za filtri-ranje. Pogodno je da se upotrebi 5-10 kg perlita na kubni metar fermentirane tečnosti. Fermentirana tečnost se dobro (oštro) profiltrira , i kvalitet filtriranja se proverava pomoću mikroskopa. Filtrirana fermentirana tečnost praktično ne sadrži ćelije, što znači da nije nadjeno više od 1 ćelije kvasca na 10 posmatranja. Dobijena fermentirana tečnost, koja sadrži oko 1.5% težinski suvog materijala se uparava u vakuum kondenzatoru, prvenstveno na temperaturi od oko 40 - 50°C i posle prekidanja vakuuma, kuva se do ključanja na atmosferskom pritisku oko 15 minuta. Ovo dovodi do smanjenja štetnih enzimskih aktivnosti. Zatim se smeša suši pomoću raspršavanja, na pr., u rotacionoj aparaturi zaraspršavanje. Ako je upotrebljen gornji postupak fermentacije, sadržaj 2,6-DMBO dobijenog fermentiranog osušenog biljnog materijal je 0.12 <- 0.52ma/gsuvog materijala a 2 MBO sadržaj je 0.05 - 0.28 mg/g suvog materijala - u zavisnosti od sadržaja benzohinona pšenične prekrupe.

Pošto je finalni proizvod higroskopan u cilju da se poveća efikasnost sušenja raspršavanjem i upotreba finalnog proizvoda jedan od upobičajenih aditiva, na pr,, malto** dekstrin, guma akacije, guar guma, ksantan, brašno zrna rogača itd., mogu se upotrebiti tokom sušenja raspršava-njem. Prvenstveno je da se primeni maltodekstrin, Pogodan postupak je da se odredi sadržaj suvog materijala smeše uparene u vakuum kondenzatoru i kuvane do ključanja i da se doda toliko maltodekstrina da sadržej suvog materijala smeše koja treba da se osuši iznosi oko 30% težinski. Pogodno je da se rastvori maltodekstrin u toploj vodi i doda ohladjen u kondenzovanu smešu. Posle sušenja finalni proizvod - prar». šak-sadrži oko 60% težinski fermentiranog, osušenog biljnog materijala i oko 40% težinski maltodekstrina.

Stabilnost dobijenog materijala može da se proveri beleženjem promena koncentracije 2,6 DMBO. Kvantitativna analiza može da se izvrši pomoću HPLC. Prašak dobijen prema gore opisanom postupku ostajeStabilan oko 3 godine na sobnoj temperaturi.

Fermentirani, osušeni biljni materijal prema ovom pronalasku može da se upotrebi kao aktivni agans farmaceutskih kompozicija koje su imunostimulatorne i inhibiraju metasteze. Farmaceutske kompozicije mogu takodje da sadrže askorbinsku kiselinu ili druge citostatičke materijale pored navedenog aktivnog agensa.

Fermentirani, osušen biljni materijal može da se preradi u uobičajenje čvrste ili tečne farmaceutske kompozicije za peroralnu ili parenteralnu primenu. Tokom proiz-vodnje farmaceutskih kompozicija higroskopni karakter<f>ermentiranog, osušenog biljnog materijala mora da se uzme u obzir. Pogodan oblik je kapsula koja štiti aktivni agens od vlažnosti u vazđuhu.

U proizvodnji farmaceutskih kompozicija, pomoćni materijali koji se obično primenjuju u farmaceutskoj praksi mogu da se upotrebe. Kao materijali i njijove moguće upotrebe su opisane detaljno u farmaceutskoj literaturi, selekci-ja i dobijanje pogodnog oblika je rutinski zadatak. Doza za jednokratu upotrebu aktivnog agensa može da varira izmedju širokih granica u zavisnosti od stanja pacijenta, i selek-cija pogodne efikasne doze mora uvek da bude odgovornost lekara. Uglavnom, pogodni rezultati mogu da se dobiju ako je doza 0.001 - 100 g, prvenstveno 0.01 - 50 g, još pogodnije 0.1 - 40 g po kg telesne težine, na pr., u dozama od 0.1 - 10, 1 - 25 ili 10 - 30 g.

Fermentirani, osušeni biljni materijal prema pronalasku može da se meša sa askorbinskom kiselinom (Vi<t>amin C). Prema našim eksperimentima askorbinska kise-lina može da poveća inhibirajući efekat za metast<aze,>materijala prema pronalasku. Težinski odnos fermentiranog osušenog biljnog materijala i askorbinske kiseline može da bude na pr., 10:1 - 1:1, prvenstveno 6':1 - 2:1, još pogodnije 3:1, 4:1 ili 5:1.

Pronalazak se takodje odnosi na imunostimulatorni i/ili inhibirajući za metastaze tretman sa fermentiranim osušenim biljnim materijalom prema pronalasku. Cilj tret-^mana je da se pacijentu da efikasna doza fermantiranog, osušenog biljnog materijala.

Fermentirani, osušeni biljni materijal može takodje da se upotrebi kao dijetetska dopuna za sisare. U ovom slučaju prvenstveno je da se primeni smeša koja sadrži maltodekstrin i uobičajene pomoćne materijale koji se primenjuju u industriji hrane, na pr., aromatične materijale, zasladjivače, sredstva za bojenje itd. Dijetetska dopuna može, na pr., da se proizvede granulisanjem smeše koja sadrži 60% težinski osušenog materijala i 40% težinski maltodekstrina plus aromatične materijale i zasladjivače u tečnom sloju, i pakovanjem instant granulata u na'pr., vreće.

Pridodate slike su opisane niže:

Slika 1. Kalibracioni dijagram HPLC merenja 2,6-DMBO

Slika 2. HPLC hromatocrram hloroforrcskog ekstrakta materijala Slika 3. HPLC hromatogram etanolnog ekstrakta materijala Slika 4. Vezivanje B16 tumornih ćelija u prisustvu liofilizata različitih koncentracija u 60r-tim1 90-tim minutima posle postavljanja. CSvaka vrednost predstavlja prosečnu vrednost od 8 paralelnih merenja - SD, procena pomoću spektrofotometrijskog merenja)

Slika 5.Efekat različitih doza liofilizata na prolifera-ciju B16 ćelija<p>osle 24 i 48 sati posle početka tretmana. (Svaka vređsnost predstavlja prosečnu vrednost od 8 paralelnih merenja - SD, procena

pomoću spektrofotometrijskog merenja),

Slika 6, Razvoj A2058 humanog melanoma u prisustvu razli-čitih doza liofilizata 24 sati posle početka tretmana. Procena kultura se izvodi na bazi proteinske (SRB) i dehidrogenaza aktivnosti (MTT) pomoću paralelnih spektrofotometrijskih merenja (Svaka vrednost predstavlja prosečnu vrednost od

8 paralelnih merenja - SD)

Slika 7, Odnos apoptotičnih ćelija (FACS analiza) u A2058

humanom melanomu in vitro kulturama posle tretmana sa različitim dozama liofilizata.

Sledeđi primeri služe da ilustruju fermentirani, osušeni biljni materijal prema pronalasku, njegovu proizvodnju i farmakološke efekte.

PRIMER 1

Fermantacija pšenične prekrupe u laboratorijskom obimu

Suspenzija od 33.3 g kvasca (Saccharomvces cerevišiae) i 1000 ml pijaće vode dodaje se u 100 g sveže pšenične prekrupe (prema Madjarskom standardu- mSZt081361-80) samlevene do kvaliteta brašna. Smeša se mučka u muđkallci u toku 18 sati na 30°c. Tokom ovog perioda fermentirana tečn<ost>postaje penasta i dostiže oko tri puta svoju originalnu zapreminu. Posle fermantacije smeša se centrifugira 15 minuta na 30.0.0/ min. Posle kuvanja do ključanja u hladjenja gornji sloj tečnosti se suši liofilizacijom, i đobijeni liofilizirana materija se čuva do dalje upotrebe u frizu (-10°c)

Sadržaj 2,6-DMBO dobijenog liofilizata je bio 0.4 mg/g

suvog materijaala (0.04% težinski)

PRIMER 2

Fermantacija pšenične prekrup u velikom obimu

300 kg pšenične prekrupe samlevene do kvaliteta brašna (.prema Madjarskom standardu) i 100 kg kvasca se stav-lja u fermentor od 5 kubnih metara, i dodaje se pijađa vode sve dok zapremina na postane 4000 1. Period fermentacije je bio 18 sati, tokom koga se upotrebljava kontinualno provetravanje (0.5 1 vazduha /l fermentirane tečnosti/minut i sporo mešanje (30 rev/min). U cilju da se spreči<p>enjenje u srcešu se dodaje 1 1/kubni m suncokretovog ulja . Posle fermentaci<j>e prekida se provetravanje i mešanje, i fermentirana tečnost se odvaja prvo u pužastom dekantatoru, zatim u separatoru i na kraju u filter presi sa tekstilnim filtrom. Kao pomodni materijal dodaje se 10 kg perlita za filtriranje/kubni ra. Fermentirana tečnost se oštro filtrira i oštrina se proverava pomoću mikroskopa. Profiltrirana fermentiranja tečnost praktično nije sadržala ćelije, što znači da je maksimalno 1 ćelija kvasca nadjenja na 10 posmatranja. Dobijena fermentirana tečnost koja je sadržavala oko 1.5% težinskih suvog materijala se uparava u vakuum kondenzatoru, na temperaturi od 40 - 50°C i posle prekidanja vakuuma kuva se do klju-čanja na atmosferskom pritisku oko 15 minuta. Posle ovoga sadržaj suve materije u rastvoru se odredjuje i dodaje se toliko maltodekstrina - prvo rastvorenog u toploj vodi i zatim ohladjenog - tako da sadržaj suve materije u rastvoru postane oko 30 masenih %. Posle toga se rastvor suši ras-pršavanjem u rotacionom sušaću sa raspršavanjem sa smicajućom mlaznicom u kome je temperatura izlazećeg vazduha bila 90°C,

Dobijenifinalni proizvod - prašak - sadržavao je?G©% težinskih fermentiranog biljnog materijala prema pronalasku i 40 % težinski maltodekstrina. Sadržaj 2,6-DMBO

je bio -odredjen pomoću HPLC prema postupku opisanom u sledećem primeru - 0.4 mg/g suvog materijala.

PRIMER 3

Karakteristike materijala prema pronalasku

Materijal prema pronalasku može da se karakteriše na dva načina, ili odredjivanjem njegovog 2,6v DMBO sadržaja ili tako-zvanog h<p>omatograma otisaka prstiju. U oba slučaja koristi se HPLC hromatografija.

Analiza se izvodi i na materijalu proizvedenom kao što je opisano u Primeru 1 i na onom dobijenom kao što je opisano u Primeru 2, i rezulati su oba slučaja identični.

A. Kvantitativna i kvalitativna analiza benzohinon derivata Dobijanje uzorka

Pre analize postalo je neophodno da se poveća kon^centracija benzohinona u liofilizatu, U cilju da se postigne ovo, liofilizat se razblažuje do originalne koncentracije sa destilovanom vodom (. 1 težinski procenat sadržaja suvog materijala)-- (0.5 g liofilizata, 50 ml destilovane vode) Rastvor se ekstrahuje sa 3 x 25 ml hloroforma u tri stupnja. Eventualna vlažnost koja ostaje u hloroformskoj fazi se uklanja sa bezvodnomNa sulfatom. Posle filtriranja hloro^formska faza se uparava, u ostatak se dodaje hloroform do ukupne zapremine od 5 ml. Ovaj uzorak se injektora tokom HPLC analize.

Kvalitativna i kvantitativna analiza benzohinon derivata

se izvodi pomoću HPLC postupka.

Opis HPLC postupka

Primenjena HPLC oprema sastoji se od Beckman-ovog modela 114 M pumpe, LaborMim UV, odnosno Merck-Hitachi-DAD mod. rednoq detektora sa 4500 dioda, i Waters 740 tipa integratorske jedinice. Za merenja je upotrebijena Chromosil C18 (250 x 4 mm) 10pkolona. UV detekcija se izvodi na frekvenciji od 290 mm, brzina protoka je bila 2 ml/min.

Sastav primenjenog eluenta je bio sleđeći:

Na2HP0425 mmola, Na<H>2P0425mmola, N<a>2EDTA 25 mmola,NH20H.HC1, 20 mmola, 10 žapreminskih % metanola, pH = 6.5.

Tri različita benzo- i hiđrohinorta je analizirano pomodu postupka opisanog gore.Postoji ali mala razlika izmedju retencionih vremena jedinjenja. Smanjivanjem jačine eluenta - organske faze do 10% - selektivnost se povećava do velike mere. Analiza retencionih podataka pokazuje da p-benzohinoni pokazuju veću retenciju nego hidrohinoni i retencija raste sa brojem metoksi grupa. Koncentracija sva tri standarda je bila O.lmg/ml. Tabela 2 pokazuje podatke za retenciona vremena (tR) standarda i faktor kapaciteta (k'). Cilj merenja je bila detekcija i kvantitativna defi-nicija 2,6-dimetoksi-p-benzohinona, tako će u sledećem delu merenje biti detaljno prodiskutovano.Ispitano je da li je razradjen postupak pogodan za kvantitativnu analizu 2,6-dimetoksi-p-benzohinona. Upotrebljeni kalibracioni dijagram je prikazan u Slici 1. Sa korelacionim koeficijen-tom od 0.99 rezultat je prava linija. Takodje je provereno da li se merenja mogu reprodukovati, na svakom uzorku su izvršena tri paralalna merenja i izračunato je rasipanje rezultata. Tabela 1 prikazuje paralelne rezultate merenja izvršenog na uzorcima u toku perioda od šest meseci i njihovo rasipanje. Naši rezultati pokazuju da je postupak merenja pogodan za egzaktno i reproduktivno merenje 2,6-dimetoksi-p-benzohinona .

Tabela1

Paralelne vrednost! kvantitativne analize 2,6^DMRO £ rasipanje rezultata

Tabela 2

Vrednostt retencionog vremena (tR) i faktora kapaciteta CkM

ispitanih materijala

Slika 2. Prikazuje HPLC hromatogram hloroformskog uzorka dobijenog kao što je opisano gore. Hromatogram pokazuje samo jedan pik karakterističan za 2,6 DMBO. 2.6-DMBO sadržaj uzorka je odredjen na bazi ovog poslednjeg.

B. Hromatogram otiska prstiju

Dobijanje uzorka

50 ml 96% zapreminski etanola se dodaje u 5 g raspršavanjem osušenog materijala (dobijenog kao što je opisano u Primeru 2.). Smeša se mučka 30 minuta na temperaturi od 50°C i 200/min.<D>osle ovoga sraeša se filtrira, uparava do suva i preostali materijal se rastvara u 10 ml metanola. Profiltrirani rastvor se injektira na kolonu,

HPLC postupak

HPLC instrumenti, kolona i uslovi opisani gore i upotrebljavaju se i ovde, ali je sastav eluenta bio sledeđi: Na2HP04, 1.25 mmola,NaH2P041.25 mmola, N<a>2EDTA 1.25 mmola,NH2OH.HCl 2.50 mmola, 5 zapreminskih % metanola,

Slika 3, prikazuje dobijeni HPLC hromatogram. Pokazano je da se pod ovim uslovima javljaju dva karakteristična pika, jedan na oko 4.7 minuta (5) i jedan na 5.8 minuta (.6). Na retencionom vremenu od 7.3, odnosno 7.7 minuta dva pika (.7, 8) koji slede jedan za drugim veoma brzo, koji se ne mogu potpuno odvojiti. Pik manjeg intenziteta se javlja na 9.8 minuta (9), praćen karakterističnim intenzivnim pikom (11) na oko 13.1 minuta. Na oko 15 minuta javlja se manji pik (12) i jedan drugi intenzivni pik (14) na 18 minuta. Ma 21.8 minuta hromatogram pokazuje manji pik (15) na oko 31 minuta ravniji pik, koji sadrži nekoliko materijala.

C. Testovi stabilnosti

Razlaganje materijala prema pronalasku je provereno preko promena u koncentraciji 2,6-dimetoksi-p-benzohinona. Mi smo izvršili eksperimente lagerovanja na tri različite temperature (sobnoj temperaturi 20°C, 40°C i 60°C,) Liofilizat - oko 1 a - je lagerovan i test-epruvetama koje su bile zatopljene i nepropustljive za vazduh. Trajanje eksperimenta je bilo 8 nedelja, svake hedelje su izvedena tri paralelna merenja na uzorzima uzetim iz sve tri serije držane na različitim temperaturama. Kvantitativna analiza banzohinin derivata je izvršena pomoću HPLC.

Testovi su pokazali da je osušeni materijal prema pronalasku ostao stabilan čak i tri godine na sobnoj temperaturi, to jest, 2,6 DMBO sadržaj je ostao praktično ne-promenjen.

U isto vreme materijal nije stabilan na 40°c -

2,6 DMBO se razlaže za nekoloko nedelja i na 60°C 2,6 DMBO sadržaji naglo opadaju za nekoliko dana.

Razlaganje 2-metoksi-p-benzohinona je takodje proučavano u obe serije meranja. Ovo jedinjenje je nestabil-nije od 2,6-dimetoksi-p-benzohinona, i kao posledica, njego-vo prisustvo se nije pokazalo posle jedne nedelja lagerovanja u uzorcima držanim na 40 ili 60°C. Na sobnoj temperaturi koncentracija ovog jedinjenja je takodje ostala nepro^menjena.

PRIMER 4

Testovi efikasnosti

I liofilizat dobijen kao što je opisano u Primeru 1, i raspršavanjem osušeni materijal dobijen kao što je opisano u Primeru 2 su testirani na efikasnost. Standardizo-vani osušeni materijal je upotrebljen sa 2,6 DMBO sadrža-jem od 0.4 mg/g suvog materijala i HPLC kriva kao što je ona prikazana na Slici 2. Oba materijala daju iste rezultate - tako da đe se materijal prema pronalasku dalje nazi-vati jednostavno liofilizat. Niže đe biti prodiskutovani rezultati bioloških i toksikoloških testova koji se odnose na ovaj liofilizat, sa specijalnim naglaskom na imunu rekonstituciju i efekte rasta tumora i inhibiranja metastaza.

I. Efekti na rast tumora i inhibiranje metastaza Cin vivo testovi)

Za testiranje su upotrebljeni sleđeći tipovi tumora koji se mogu injektirati kod miševa i pacova: varijanta koja veoma mnogo obrazuje metastaze (3LL-HH) Lewis-ovog karcinoma pluća ( (misiji plućni rak), B16 misiji melanom i HCR-25 humani rak debelog creva ksenograft.

3LL-HH (LLT-HH) i B16 tumori se održavaju u C57B1/6 prirodnim miševima. HCR-25 ksenograf se injektira u CBC/CA miševe prethodno imunosupresovane pomoću timektomije ±?. ozračene celim telom. U slučaju 3LL-HH i HCR-25 tumora, ćelije tumora su transplantirane u slezinu, u slučaju B16 melanoma u mišiće levog nižeg ekstremiteta. Tretirana i kontrolna grupa životinja injektiranih sa HCR25 tumorom su takodje splenektomizirane 21 dana posle transplantacije tumora.

Tretiranje sa liofilizatom opisanim u pronalasku je započeto 24 sati posle injektiranja tumora. Dnevne doze od 3 g/telesne težine kg su primenjene per os,sa stomačnom probom u obliku 0.6 g/ml vodene suspenzije.

Testovi se prekidaju 14 dana posle transplantaci<-je u slučaju 3LL-HH tumora, 21 dana posle transplantacije u slučaju B16 tumora i 51 dana pošle u slučaju HCR^25 5 tumora puštajući krv životinja do smrti ili pod narkozom.

Tabele 3., 4., i 5., ukratko izlažu r.ezultate testova

svaka test grupa sadržala je 10 životinja

Tabela 3

Efekat tretiranja sa liofilizatom prema pronalasku na broj metastaza jetre u slučaju 3LL-HH mišijeg raka pluđa

injektizanog u slezinu

<*>Splenektomija je i,zvršena 21 dan posto je tumor injektiran u slezinu,

Svaka test grupa ja sadržala 12 životinja.

Tabela 4

Efekat tretiranja sa liofilizatom prema pronalasku na jedan broj metastaza jetre 51 dana pošto je HCR-25 hflmani karcinom debelog creva injektiran u slezinu imunosupreso-vanih CBC/CA miševa

svaka test grupa je sadržala 1Q životinja

Tabela 5

Efekat tretiranja sa liofilizatom prema pronalasku na težinu ekstremiteta injektiranog sa tumorom na broj metastaza pluća u slučaju B16 melanoma injektiranog u mišiće ekstremiteta

21 dana pošto je tumor injektiran

Gornji rezultati pokazuju da tretiranje sa liofilizatom opisano u pronalasku značajo smanjuje - za 71% - broj metastaza pluća kada je 3LL-HH tumor injektiran u slezinu (.Tabela 3.).

U slučaju HCR-25 humanog raka debelog creva tretman od 50. dana smanjuje i težinu slezine sa tumorom i broj metastaza jetre. Broj metastaza u poredjenju sa kontrolnom grupom je oko 50% i u u splenektomj_ziranoj i u ne-splenek-tomiziranim grupama CTabela 4.).

U slučaju B16 melanoma injektiranog u mišić težina tumora koji raste u mišiću nije se menjala kao efekat tretiranja, ali se broj metastaza pluća smanjio veoma značajno, za 85% u poredjenju sa kontrolnom grupom CTabela5.):

II. In vitro testovi

Kao što su gornji testovi nedvosmisleno pokazali

da liofilizat opisan u pronalasku može značajno da smanji metastaze malignih tumora, efekti proizvoda na različite faze obrazovanja metastaza su takodje ispitani. Obrazova-nje metastaza se sastoji od nekoliko faza, u kojima pored proliferacije i apoptotične aktivnosti delija primarnog tumora, adhezioni potencijal delija tumora i zaštitni mehanizmi organizma protiv tumornih delija igraju ulogu.

U in vitro testovima efekat liofilizata na đelijsku proli-feraciju i apoptozu i adheziju je proučavan.

Pošto je veliki deo in vivo testova izvršen na B16 mišijim melanoma ćelijama, u prvom stupnju je upotrebljen ovaj tumor da bi se testirao liofilizat

1. Adhezioni test

Adhezija tumornih ćelija je testirana na mikro-ploči sa 96 udubljanja. Doze liofilizata su bije 300, 3000

i 30000 pg/ml. Upotrebljen je RPMI medijum kulture, i u odsustvu seruma i u prisustvu 10% FCS. Adhezija je testirana 10, 30, 60, 90 i 120 minuta posle inkubacije pod uobičaje-nim uslovima. Procena je izvršena pomoću kolorimetrijskog postupka na bazi SRB analize. (Mossmann, T,: J. Immunol,Neth.65 f55-63 /19.83/) .Test se bazira na sulforhodamin B - bojenju ukupnog sadržaja proteina kulture, absorpcija se očitava na 570 nm sa spektofotometrom. Slika 4 pokazuje samo dva momenta vremena, što medjutim adekvatno predstavlja efekat liofilizata. Pokazano je da ako je doza liofilizata bila 3000 ug/ml ili deset puta veća, smanjila je dramatično adheziju tumornih ćelija, i u prisustvu i u odsustvu seruma. Ako je doza 300 ug/ml, nije uočen takav efekat

2. Proliferacioni test

U ovom testu tumorne delije su stavljene 24 sati pre tretiranja na mikroploču sa 96 udubijenja. Posle tretiranja sa pogodnim dozama liofilizata proliferaciona aktivnost delija je takodje testirana pomoću SRB analize, 24,

48 i 72 sati posle tretiranja. Rezultati ponovljenih testova su pokazali da kao efekat tretiranja u 900— 15 ooo )ig/xnl oblasti tumornih ćelija izlaze na površinu monosloja i - kao što je pokazano pomoću ekskluzionog postupka sa triptan plavom bojom - umiru (Kaltenbach, J.P. i sarad.: Exp. Cell Res. 15,112-117 /1985/). (Slika 5.)

Naši testovi na humanim amelanotičnim metanola CA20.58 tumornim ćelijama - Todaro, G.J. i sarad.: Proc.Natl. Acad. Sci USA 77, 5258-5262 /1980/) pokazuju slične rezultate sa onima mišijeg melanotičnog melanoma CSlika 6.) U slučaju ovog tumora paralelno sa SRB analizom izvršena

je MTT analiza koja predstavlja metaboličku aktivnost ćeliia (Cole, S.P. C;: Cancer Chemother, Pharmacol, 17,' 259-263 /l9.86./) . Test se bazira na fenomenu da metabolički aktivna ćelija transformiše tetrazolijum so u obojeni formazan proizvodi, primarno preko njegove dehidrogenaza aktivnosti. Bojena reakcija, koja je proporcionalna sa aktivnošću može da se očita pomoću spektrofotometra na 570 nm, MTT analiza jejasno pokazala da funkcionalna aktivnost tumornih ćelija opada čak i ako je doza bila 300 ug/ml (Slika 4.).Kao u slučaju ćelija dolazak na površinu što izaziva apoptozu je nepoznat, apopotična aktivnost celokupne đelijske popula-cije je testiran pomoću protočne citometričke CFACS) analize CSlika 7.). Kao što Slika 7 prikazuje tumorne ćelije su bile u apaptozi r- u zavisnosti od doze - do neuobičajeno velikog obima.

III Test efekata na imunu reakciju

Ispitan je efekat liofilizata opisanog u pronalasku u dva razlilita modela. U jednoj seriji testova proučavana je mogućnost uništavajuđe transformacije mononuklearnih ćelija dobijenih iz slezine životinja tretiranih sa liofilizatom, dok je u drugoj, proučavan alograf modela transplantacije kože za totalno vezivanje kože transplantirane na zadnjem regionu miševa.

1. Test uništavajuće transformacije T-limfočita

Tretiranje sa liofilizatom opisanim u pronalasku značajno povećava uništavajuđu transformaciju T-limfočita koji igraju značajnu ulogu u imunoj reakciji. Ovo je pokazano sledeđim eksperimentom,

Ccj-^Bljk miševi su tretirani šest nedelja pet puta nedeljno per os. sa stomačnom probom liofilizata opisanog u pronalasku u 3 g/kg dozi (0.6 g/ml vodene suspenzije). Posle završetka tretmana limfociti dobijeni perfuzijom iz slezine životinja se prebacuju u ćelijsku kulturu, tretiraju sa 1 ug/ml Con A. Posle 48 sati ćelije koje vrše DNS sintezu se markiraju pomoću 0,4 uCi H timidina. Stepen markiranjasedefiniše sa tečnim scintilacionim brojačem (.Beckraan). Kao što Tabela 6 pokazuje tretiranje sa Con A značajno povećava - u poredjenju sa kontrolom - inkorporaciju H-TdR, to jest uništavajuđu transformaciju

Tabela 6

Inkorporacija H-timiđina u limfocite slezine kontrolnih i liofilizatom tretiranih miševa

2. Test imunostimulatornog efekta u alograft model, transplantiranja kože

Najbolji način da se ilustruje restitucija defici-jentne imune reakcije je test alograft transplantacije kože kod miševa učinjenih delimično imuno deficijentnim pomoću timektomije (operaciono uklanjanje timusa), C57B<1>io ^<B>10<LP>zalihe miševa se razlikuju samo u H-3 mestu, tako da se koža transplantirana iz članova jedne zalihe u drugu ne odbacuje u toku 7 dana, već jedino posle oko 3 nedelje.

Ako je primalac bio timektomiziran, odbacivanje se javlja posle prosečno od 50 dana. Svi materijali koji ' unapre-djuju zrenje i diferencijaciju limfocita u moždini, kao što su hormoni timusa, smanjuju vreme potrebno za odbacivanje transplantirane kože CJ. Immunpharmacologv 7, 67-78 /1985/). Isti efekat se može posmatrati u našim testovima kada se primeni tretman sa liofilizatom opisanim u pronalasku.

<C>57B11Qmiševi su upotrebljeni kao primaoc, a

B^gLP miševi kao donor. Miševi primaoci su timektomizirani i koža je transplantirana posle 7 nedelja. per os. - 5 puta na nedelju, 30 mg/kg - tretiranja sa liofilizatom su započe-ta jedne nedelje pre timektomije. Tretman je završen 70

dana posle transplantacije kože. Eventualno odbacivanje kože je i posmatranai svakodnevno.

Tabela 7 prikazuje da je vreme odbacivanja kod n'e-timektomiziranih miševa bilo 21 dana (mužjaci) odn. 28.7 dana (ženke). Kod timektomiziranih miševa vreme odbacivanja je produženo na 52.4 odn. 41.6 dana. Tretiranje sa liofilizatom prema pronalasku skraćuje značajno kod timektiziranih i tretiranih miševa preživljavanje kožnih transplantanata (kalema). Ovo pokazuje da se imuno deficijencija izazvana timektomijom smanjuje značajno kao rezultat tretiranja, što znači da liofilizat ima imuno simulantni efekat.

Tabela 7

Efekat tretiranja sa liofilizatom prema pronalaku na odbacivanje kalemova kože (primalac C^Bl-^miš, davalac BlQLPmiš)

In vivo i in vitro testovi sa liofilizatom prema pronalaku pokazuju da ovaj proizvod ima značajan anti-metastatični efekat u nekoliko životinjskih test modela.

Ovaj efekat je verovatno povezan sa imunostimulatornim

efektom posmatranim i u in vivo i u in vitro testovima,

ali je isto tako moguće da na smanjenje broja metastaza takodje utiću antiproliferativni, apoptozu izazivajući efekti, efekat materijala na adheziju i efekat koji izaziva stvaranje slobodnih radikala.

IV. Test aktivnosti vezivanja radikala

Pošto benzohinoni imaju dobro poznat efekat da obrazuju slobodne rađikale, aktivnost vezivanja radikala liofilizatom opisanim u pronalasku je takodje testirana. Vezivanje i peroksidnog (SSA) i hidroksilnog radikala (OH-SA) je merene postupkom elektronske spin rezonance. Liofilizat ima značajan SSA, čistu aktivnost vezivanja radikala od 1 mg, što odgovara aktivnosti od 5.6 4 ^ug peroksidne dismutaze (SOD).Liofilizat nema OH-SA aktivnosti, ali prekida vodonik-peroksid/Fe hidroksilni radikal obrazujući sistem, tako se može pretpostaviti nema tako zvane ne-helatorske aktivnosti.

V.Toksikološki testovi (subakutno)

77 dnevni toksikološki testovi su izvršeni prema preporukama Registrv of Industrial Toxicology Animal-data (RITA), (Ekp. T<3xic. Pathol. 47, 247-266 /i995/) naT344 pacovima i C^Bl-^ miševima. Životinje su tretirana svakodnevno sa dozom od 3 g/kg (0.6 g/ml vodene suspenzije). Tokom tretiranja posmatrane su promene težine životinja, eventualne patološke fizičke promene, spontano stradanje (uginuđe) životinja. Zaključujući test merena je -.teži-

na srca, pluća, timusa, slezine, jetre, bubrega i'testisa i 34 organa propisanih od strane RITA je patološki ispitano. Nije bilo spontanog stradanja (uginuća) životinja, a težina životinja se menjala kao u kontrolnoj grupi. Zaključujući test težina različitih organa nije pokazivaGpromene u poredjenju sa kontrolnom grupom. Tokom patološkog procesi-ranja tretiranih životinja nisu uoćene nikakve promene, koje su mogle biti izazvane liofilizatom.

Gornji rezultati pokazuju da fermentirani biljni materijal prema pronalasku nije toksičan, i zbog njegovog imunostimulatornog efekta on je indiciran u svim stanjima u kojima je oštećen imuni sistem, Zbog njegovih gore opisanih bioloških karakteristika on moze da ima komplementarne upotrebe u medicinskom tretiranju malignih tumora, uglavnom u inhibiranju metastaza.

Claims (12)

1. Imunostimulirajući i metastaza inhibirajući fermentirani suvi materijal, izveden iz fermentirane tečnosti dobijene fermentiranjem pšenične prekrupe sa Saccharomvces cerevisiae u vodenom medijumu.

2. Materijal prema zahtevu 1, koji ima HPLC hromatogram koji suštinski odgovara onom/prikazanom na Slici 3.

3. Materijal prema zahtevu 1, čiji je 2,6-dimetoksi-p-benzohinon sadržaj 0.12 - 0.52 mg/g suvog materijala i 2-metoksi-p-benzohinon sadržaj 0.05 - 0.28 mg/g suvog materijala, određeno pomoću HPCL.

4. Materijal prema zahtevu 3, čiji je 2,6-dimetoksi-p-benzohinon sadržaj 0.4 mg/g suvog materijala.

5. Postupak za dobijanje imunostimulirajućeg i metastaza inhibirajućeg fermentiranog suvog materijala,naznačen time,što se samlevena pšenična prekrupa fermentira u vodenom medijumu u prisustvu Saccharomvces cerevisiae i fermentirana tečnost se odvaja, oštro filtrira, uparava, kuva do ključanja i suši kao takva ili u prisustvu pomoćnih materijala za sušenje.

6. Postupak prema zahtevu 5,naznačen time,što se fermentacija izvodi na temperaturi od oko 30°C, u toku oko 18 sati pod uslovima provetravanja i mešanja.

7. Postupak prema zahtevu 5 ili 6,naznačen time,što se sušenje izvodi u prisustvu maltodekstrina.

8. Imunostimulirajući i metastaza inhibirajući farmaceutski proizvod koji kao aktivni agens sadrži suvi materijal kao što je definisan o zahtevima 1-4.

9. Dijetetska dopuna za sisare, koja sadrži suvi materijala kao što je definisan u zahtevima 1-4.

10. Dijetetska dopuna prema zahtevu 9 koja sadrži suvi materijal dobijen postupkom iz bilo kog zahteva 5-7, koji se sastoji od 60% težinski fermentiranog materijala i 40% težinski maltodekstrina.

11. Upotreba suvog materijala prema bilo kom od zahteva 1 - 4 za proizvodnju farmaceutske kompozicije koja je imunostimulirajuća i inhibira metastaze.

12. Upotreba suvog materijala prema bilo kom od zahteva 1 - 4 za proizvodnju dijetetske dopune za sisare.