RS50083B

RS50083B - N-/2-hidroksi-3-(1-piperidinil) propoksi/piridin-1-oksid- 3-karbo ksimidoil hlorid i njegova upotreba u tretiranju insulinske rezistencije

Info

Publication number: RS50083B
Application number: YUP-603/01A
Authority: RS
Inventors: Laszlo Urogdi; Katalin Biro; Jeno Szilbereky; Ede Marvanyos; Laszlo Koranyi; Mihaly Barabas; Magdolna Torok; Zita Csakai; Zoltan Nagy; Maria Kurthy; Karoly Nagy; Tamas Mogyorosi; Andras Komaromi; Mihalyne Kardos; Melinda Nagy
Original assignee: Biorex Kutato Es Fejleszto Rt.,
Priority date: 1999-02-26
Filing date: 2000-02-24
Publication date: 2009-01-22
Also published as: EE200100447A; CA2360451C; JP2002537384A; DE60002187T2; US6649628B1; WO2000050403A1; CZ297386B6; BG105837A; NO20014103D0; IL144866A; EE04961B1; PL197692B1; RU2250901C2; CZ20013053A3; IL144866A0; HUP9900475D0; KR20010102410A; EP1163224A1; DK1163224T3; HRP20010584A2

Abstract

N-{2-hidroksi-3-(1-piperidinil)-propoksi}-piridin-1-oksid-3-karboksiimidoil hlorid, njegovi stereoizomeri, i adicione soli sa kiselinama. Prijava sadrži još 3 patentna zahteva.

Description

Halogenidni derivat 0-(3-piperidino-2^hidroksi'-1^-propil) hidroksainske kiseline, njegova primena u tretiranju insulinske rezistencije, i farmaceutski preparat koji sadrži oifeaj derivat kao efikasno sredstvo

Tehnička oblast pronalaska

Pronalazak se odnosi na halogenidni derivat 0-(3^-piperidin .^2^-hidroksi,<-l^propil) hidroksamske kiseline, njegovu farmaceutsku upotrebu i farmaceutske proizvode koji sadrže ovaj derivat kao aktivnu komponentu. Naime, pronalazak se odnosi na N*-/2«rhiđroksi~3*- Cl^piperidinil) - propoksi/piriđin-l^oksid^3<-karboksiimiđoil hlorid, njegove stereoizomere, kao i na njegove adicione soli sa kiselinama. Osim toga, pronalazak se takodje odnosi na upotrebu ovih. jedinjenja u tretiranju insulinske rezistencije i na farma'-ceutske proizvode koji sadrže ove derivate kao aktivnu komponentu.

Osnova pronalaska

Halogenidni derivati 0-(3-piperidino-2-hiđroksi-1-propil) hidroksamske kiseline su već poznati iz Evropske

Patentne Specifikacije No. 0 417 210 BI. Prema ovoj patentnoj specifikaciji, ova jedinjenja pokazuju selektivni beta blokirajući efekat i prema tome su pogodna za tretiranje dijabetlčne anglopatije, specifičnije đijabetične retinopatije i nefropatije.

Prema PCT Publikaciji W0 98/06400, halogenidni derivati 0-(3«piperidino-2-hidroksi-l'-propil) hidroksamske kiseline i druga jedinjenja slične strukture su efikasna u zaštiti i regeneraciji vaskularnih endotelijalnih delija,

i prema tome su pogodna aktivna sredstva za tretiranje bolesti izazvanih disfunkcijom enđotelijuma.

Efekat povećanja pratiočke ekspresije ("chaperon*-expression increasing effect") nekoliko hidroksilamin derivata, međju ovima halogeniđa O-C3»-piperidino-!-2?-hidroksi^l»'propil) hidroksamske kiseline, i upotreba ovih jedinjenja u tretiranju bolesti povezanih sa funkcionisanjem pratioč-kog ("chaperon") sistema su poznati iz WO 97/16439. U ovoj patentnoj prijavi, O*- C3^-piperidino~2*-hidroksi^lr-propil) -3^ piriđil hidroksamske kiseline hloriđni N^oksidni derivati (izmeđju ostalih) su đefinisani i zaštićeni kao nova jedinje«-nja, međjutim, postupak proizvodnje je opisan samo za piper±đ±n*-N-oksiđ i za jedinjenje koje sadrži N*-oksiđne grupe i u piperiđinskom i u piridinskom prstenu. Jedinjenje prema ovom pronalasku nije pomenuto u gornjoj prijavi.

Insulinska rezistentnost je patološko stanje koje blokira efekte insulina. Ono je uglavnom vezano sa dijabetesom, mada je njegovo obrazovanje takodje moguće i nezavis~ no. Usled insulinske rezistentnosti, telo ima potrebu za višim i sve višim koncentracijama insulina za metabolizam ugljenih hidrata, lipida i proteina, što dovodi do ekstremno visoke koncentracije insulina. Pokazano je da je dugotrajna visoka koncentracija insulina nezavisan kardio-cerebro-vaskularni rizični faktor.

Smanjenje insulinske rezistencije je bitno u oba

tipa dijabetesa: u slučaju dijabetesa tipa 2, ono je prisu-

tno kao glavni etiološki faktor, dok je u slučaju dijabetesa tipa 1, insulinska rezistncija izazvana toksičnošđu glukoze kao i prekomernim količinama insulina primenjenih eksogeno za terapeutske svrhe.

Nekoliko aktivnih sredstava je provereno za smanjenje insulinske rezistentnosti. Medju ovima, najznačajniji su insulinski senzibilizirajući proizvodi, najpoznatije sređst^

vo otuda je troglifcazon, član tiazoliđinT-dion grupe.

(A.R.Saltiel i sarađ., Diabetes 45/12/1996 str. 1661^-1669, i S. Kumar i sarađ.,Diabetologia 1996/39/6 str. 707-70.9.),

Glavni efekat ovog jedinjenja je smanjenje insulinske rezistencije smanjenjem perifernih insulinsklh. koncentracija i u osnovnom stanju i posle glukozne stimulacije. Kao rezultat, ono poboljša-va metabolizam ugljenih hidrata kao i koriguje niz patoloških devijacija. Koje se javljaju kao sekundarni efekat visokog insulinskog nivoa.fkao što je hiperlipidemija i patološka hemostazija. Njegov krajnji pozitivan efekat je smanjenje kardiovaskularnog rizika. Nepogodnost je, međjutim, što može da izazove ozbiljne, uglavnom hepatotoksične sporedne efekte i stoga je njegova primena ograničena i zahteva posebnu pa<g>nju.

Pregled pronalaska

Tokom proučavanja u oblasti halogenida 0**O^piperidino*-2rtR±đroRsl^l<r.prop±l) hidroksamske kiseline, iizvušena su detaljna ispitivanja meleata hlorida O-(3-piperiđino-2-hiđroksi-1-propi1)-3-piridin hidroksamske kiseline, pozna-tog kao bimoklomol C'bimoclomol") i nadjeno je da je njegov najznačajniji efekat na patološkim konzekvencijama hronične neuropatije: Značajno poboljšava motornu i senzornu nervnu brzinu provodjenja deficijentnu kod dijabetesa, i takodje značajno utiđe na patološke devijacije koje se javljaju od autonomne neuropatije. Osim toge, i u eksperimentima na Životinjama i fazi II testova kod ljudi, smanjuje patološko dij.abetično urinarno albumin izlučiva-nje, i u testovima kod životinja smanjuje patološke histo-loške i elektrofiziološke promene koje se javljaju usled dijabetične retinopatije. Medjutim, u smanjenju insulinske rezistencije bimoklomol nije bio efikasan.

Za sada, nisu dostupni medicinski proizvodi koji mogu da smanje insulinsku rezistenciju i istovremeno da efikasno izleče devijacije koje se javljaju iz sve tri hro-nične dijabetične kompilacije.

0 traženju za pogodnom aktivnom materijalima, N~oksid derivati bimokloraola su testirani za biološku aktiv*-nost. U preliminarnom testu proučavana je efikasnost tri N-oksid derivata bimoklomola na motornu i senzornu neuro-pati ju kod STZ dijabetičnih Wistar pacova. Efikasnost tri bimoklomolna N-oksid. derivata u poboljšavanju periferne motorne i senzorne nervne brzine provodjenja deficijentne izazvane sterptozotocin^lndukovanim dijabetesom odredjena je postupkom detaljno opisanim u Eksperimentu 2. Rezultati su sumirani u sledeđoj tabeli,

Kao što proizilazi iz gornjih, rezultata, piridin N-oksid derivat bimoklomola je ekvivalentan sa bimoklomo-lom dok dva drugaN-oksid derivata imaju značajno slabi-ji efekat na motornu i senzornu neuropatiju. Na osnovu ovogiskustva fistraživanja su nastavljena sa piridin N-oksid derivatom, naime sa N-/2-hiđroksir--3-Cl-piperidinil) -JL-propoksi/piridin-l-oksid-karboksiimidoil hloridom.

Naša istraživanja su dala neočekivani rezultat da N-/ 2—hiđroksi-3-Cl-piperidinil)-propoksi/-piridin-l-oksiđ-3-Raboks±imido±l hloriđ smanjuje perifernu insulinsku režis-r tentnost pored toga što pokazuje efekat jednak sa, ili u nekim slučajevima veđi nego onaj bimoklomola u tretiranju gore pomenute tri glavne dijabetične komplikacije.

S obzirom na ovu karakteristiku, jedinjenje je pogodno za tretiranje hroničnih đijabetičnih komplikacija, naročito retinopatije, neuropatije i nefropatije, i za simultano smanjenje periferne insulinske rezistencije, ali je tako-

dje pogodno za tretiranje ne-đijabetične patološke insulinske rezistencije i bilo kojih patoloških stanja vezanih za ovo.

Povoljne biološke osobine N-/2-hiđroksi-3- (.1-piperidinil)-propoksi/-piriđin-l-oksid-3-karboksiimiđoil hlorida su potvrdjene pomoću sleđećih eksperimenata. Za ove testove upotrebljeni su maleatN-/2-hidroksi-3-Cl-pipe-ridinil) -propoksi/-piridin-l-oksid-3-karboksiimidoil hlorida ili maleat pogodnog optički aktivnog jedinjenja kao test jedinjenja. u opisu eksperimenata, maleat racemskog jedinjenja naveden je kao Jedinjenje A, dok je maleat optički aktivnog stereoizomera uvek specifično naznačen.

Eksperiment 1

Efekat tretiranja pomoću Jedinjenja A i Bimoklomola na metabolizam ugljenih hidrata kod gojaznih, insulin rezistentnih, hiper insulemičnih "Zucker fa/fa pacova" sa pogoršanom glukoznom tolerancijom, posle tretiranja u toku 2 meseca.

Materijali i postupci

U eksperimentima su upotrebljeni takozvani šećerni fa/fa pacovi ("Zucker fa/fa rats") (Charles River Laboratories Inc.). Kod monozigotičnih Životinja,gojaznost, insulinska rezistencija, visoki nivo insulina u krvi, pogoršana glukozna tolerancija i hipertrigliceridemia nastaju od hipotalamične leptinske receptor mutacije, S obzirom na gornje karakteristike, ovo je prihvaćeni model ranog tipe 2 dijabetesa.

životinje se stavljene u pojedinačne metaboličke kaveze u toku 24 sata na početku studije, i posle 1 ili 2

meseca tretiranja u toku 24 sata radi sakupljanja urina.

Životinjama šn davane ili test supstance ili fiziološki slani rastvor pcinudnim uvodjenjem u stomak pomođu cevi jednom na dan izmedju nedelja 14-2 2.

Biohe'mijski parametri krvi i urina su raereni pomo-ću Kodak Ectachem 700 automatskog analizatora. Nivo ukupnog proteina urina je odredjen spektrofotometrijski upotre-bom Bradford sredstva za bojenje (.Hitachi U-3200) na 595 nm. Koncentracija insulina u serumu je odredjena pomoći RIA postupka, upotrebljavajući ianti-insulin antitela pacova.

Sistolični, đijastolični krvni pritisak i rad srca se mere jednom nedeljno na repovima pacova (takozvani postupak manžetne na repu) pomoću Letica 200 automatskog analizatora. Posle dva meseca tretiranja, odred jen je nivo glukozne tolerancije pomoću testa intraperitonealne glukozne tolerancije (2 g/kg) ip.).

Rezultati:

Bimoklomol primenjen u dnevnim dozama od 20 mg/kg p, os značajno smanjuje nivo glukoze u krvi kod životinja lišenih hrane, medjutim ne utiće na koncentraciju insulina kod životinje lišene hrane.

U poređjenju sa prethodnim rezultatima, neočekivani rezultat je bio da Jedinjenje A primenjeno u dnevnim dozama od 20 mg/kg p.os značajno smanjuje i glukozu u krvi i koncentracije insulina, ove poslednje za približno 50%, Rezul^-tati su dati uTabeli 1 i Slici 1,

Tabela 1

Efekat Jedinjenja A i Bimoklomola na glukozu u krvi i koncentracije insulina kod životinja lišenih hrane

<**>p<0.001,<***>p<0.0001, uporedjeno sa kontrolom g«jaznih

U toku testa intraperitonealne glukozne tolerancije, niti bimoklomol, niti Jedinjenje A utiđu na površine ispod krive glukoze u krvi (AUC). Medjutim , u slučaju AUC insulina postoji razlika izmedju dva jedinjenja: bimoklomol nije imao nikakav efekat, dok ga je JedinjenjeAznačajno smanji-lo, do istog nivoa kao kod mršave kontrole. Rezultati su dati u Tabeli 2 i Slici 2.

Tabela sadrEi vrednosti površine ispod krive (AUC) izmedju 0-60 minuta.

Tabela 2

Efekat tretiranja pomoću Bimoklomola i Jedinjenja A na glukoznu toleranciju debelih, insulinski rezistentnih, hiper-lnsulemičnihZuckerfa/fa pacova sa pogoršanom glukoznom tolerancijom,rposle 2-meseca tretiranja

<***>p<0.0001, uporedjena sa kontrolom aojaznih

Rezime:

Jedinjenje A značajno smanjuje perifernu insulinsku rezistenciju, dok bimoklomol ne.

Eksperiment 2

Efekat tretiranja pomoću Jedinjenja A i Bimoklomola na patološke devijacije koje se javljaju od periferne neuropatije kod STZ dijabetičnih Wistar pacova, posle 1 meseca tretiranja.

Materijali i postupci:

U eksperimentima su upotrebljeni mužjaci Wistar pacova (Charles River Laboratories Inc.). Na početku eksperimenta, njihove težine su bile 340.-370 g. Dijabetes je izazvan pomoću intravenske primene jedne 45 mg/kg doze streprozotocica (STZ, Slgma, St. Louis, MO) rastvorenog u fiziološkom slanom rastvoru. Razvoj dijabetesa je proveren posle 1 dana pomoću testa glukoze u krvi, prihvatajući vrednost preko 15 mmol/1.

Test i referentne supstance se primenjuju p.os'na

životinje jednom dnevno.

Za odredjivanje brzine nervne provodijivosti ("nerve condustion velocity") CNCV) upotrebi jen je postupak

Stanley-a, modifikovan od strane De Konig-a i Gispen-a. Životinje su anestezirane pomoću simultane primene hiponorma ("Hvponorm) (1 mg/kg ip., Janssen, Tilburg, Danska) fluanisona CIO mg/ml), i fentanil citrata (0,2 mg/ml. Posle se, levi išijatikus i tibalni nervi stimu-lišu na standardnim tačkama. Supermaksimalni stimulus (kvadratni impuls, 0.03 ms) se upotrebljava sa platinskom elektrodom u obliku igle, preko Nihon-Kohđen (model SEN-1104, Japan) stimulatora. Elektromiogram (EMG) prenet sa mišića tabana i intenziviran pomoću miografa (Elma-Schflnander, Stokholm, Švedska) se dalje analizira pomoću Matlab za Windows CMathwork Inc. UK) program. Stepen

NCV oštećenja izazvanog dijabetesom je izražen u m/s. Efikasnost tretiranja je upotedjena sa ovim u oznakama procenta (%). Učinjena su statistička izračunavanja pomoću nesparenog. t-testa ili jednog-kriterijum ANOVA testa (zajedno sa Newraan-Keuls post hoc testom).

(Graphpad Instat, San Diego, CA)

Rezultati:

Bimoklomol primenjen jednom na dan u dozi od 20 mg/kg i Jedinjenje A primenjeno jednom na dan u dozi od 5 mg/kg značajno poboljšavaju motornu (MNGV) i senzornu (SNCV) brzinu nervne provodijivosti do istog značajnog stepena kod dijabetičnih životinja. Povećanje doze Jedinjenja A preko 10 mg/kg ne povećava efekat. Rezultati su dati uTabeli 3.

Tabela 3

Efekat tretiranja pomoću Jedinjenja A i Bimoklomola na brzinu nervne provodijivosti CNCV) deficijentncbh od STZ-đijabetičnih (STZ-DB) Wistar pacova

Eksperiment 3

Efekat tretiranja pomoću Jedinjenja A i Bimoklomola na patološke devijacije koji nastaju od dijabetične autonomne neuropatije kod STZ-dijabetičnih pacova, posle 1 meseca tretiranja

Materijali i postupci:

U eksperimentimas«lpotrebljeni mužjaci Wfcstar pacova (Charles Rlver Laboratories Inc.), na početku eksperimenta njihove težine su bile 340-370 g. Dijabetes je izazvan pomođu intravenske primene jedne doze od 45 mg/kg streptozotocina (STZ, Sigma, St. Louis, MO) rastvorenog u fiziološkom slanom rastvoru. Razvoj dijabetesa je proveren posle 1 dana pomođu testa glukoze u krvi, prihva-tajuđi vrednost preko 15 mmola/1.

Test i referentne supstance su primenjene p.os na životinje jednom na dan.

Eksperimenti su izvedeni pod anestezijom postignu-tom primenom 60 rog/kg ip. pentobarbital natrijuma(Nembutal, Sanofi, Phylaxia).Posle ovoga, intratarhealna tuba od poli-etilenske kanule je ubačena u fermoralnu arteriju i venu. Arterijski katetar je povezan sa transduktorom za pritisak za simultano merenje sistoličkog i điastoličkog krvnog pritiska (onlajn automatskog mernog i prosleđjujuđeg sistema, sa Haemosys kompjuter programom) Posle 20 minuta od perioda uravnotežavanja, sledeđe supstance se primenjuju intravenski: noradrenalin, 5 ug/kg iv. - izoproterenol 0.4 ug/kg iv.- N. vagus stimulacije (2 V,trajanje: 500/isec, kašnjenje 1 msec) . Efekti supstanci su beleženi u toku 10 minuta.

Rezultati:

Autonomna neuropatija je jedan od vodeđih sluča*-jeva iznenadne srčane smrti i u slučaju dijabetesa i u drugim bolestima Ina pr. bolesti jetre) Stoga su, svi proizvodi koji efikasno mogu da smanje patološke devijacije nastale od autonomne neufcopatije veoma važni.

U eksperimentima, dnevna jedna doza od 20 mg/kg bilo bimoklomola ili Jedinjenja A značajno smanjuje nekoliko patoloških devijacija nastalih od autonomne neu o-patije.

Rezime i upoređjenje naših rezultata je prik zano u Tabeli 4.

Dvostruka strelica u Tabeli pokazuje da je test supstanca statistički efikasnija od one druge.

Eksperiment 4

Efekat tretiranja pomođu Jedinjenja A i Bimoklomola na patološke histološke promene izazvane nanom đijabetičnom retinopatijom kod STZ-dijabetičnih Wistar pacova, posle tretiranja 1 mesec

Materijali i postupci:

U eksperimentima su upotrebljeni mužjaci Wistar pacova (Charles River Laboratories Inc.), na početku eksperimen-

ta njihove težine su bile 340-370 g. Dijabetes je izazvan pomođu intravenske primene jedne doze od 45 mg/kg streptozotocina (STZ, Sigma, St. Louis, M6) rastvorenog u fizio-loškom slanom rastvoru. Razvoj dijabetesa je proveren pos-

le 1 dana pomođu testa glukoze u krvi, prihvatajuđi vrednost preko 15 mmola/1.

Test i referentne supstance su primenjene p.os na životinje jednom na dan.

Posle anestezije (G_alypsovet, 125 mg/kg lp., Richter Rt., Madjarska) oči su izvadjene i fiksirane u 4% formalde-hidu rastvorenom u fosfatnom puferu CpH 7.4).

Docnije su one usadjene u parafin (Medim DDM, P800., centar usađjivanja: Lignifer L-120-92-014,, sredstvo za bojenje: Shandon Elicttt, Microtome: Leica SM 20uOO R, mikroskop: Jenaval Karl Zeiss Jena) Nekoliko sekcija očiju od 6. mikrona je pripremljeno, i upotrebljeno je hematoksilin/eozinCFluka)

iPAS (periodična kiselina-Schiff, Fluka) bojenje. Izvršeno je9vetlosno mikroskopske odredjivanje na poveđanju od 40.x i 100.x, Fotografije i slajd pozitivi su dobijeni sa reprezenta-r tivnim uzorcima.

Histološko odredjivanje je izvršeno na kodiranim uzorcima, podela grupe je bila nepoznata istraživaču. Pato-loške devijacije retine su klasifikovane na skali od 0-20.,

dok su one sočiva na skali od 0-3.

Statistička izračunavanja su izvršena sa Statistica 4.5 (SatSoft, USA) programom. Data vrednost za negativne slučajeve je bila 0.1. Takodje je pripremljen Box i Whisker plot grafikon.

Za svaku grupu u eksperimentu, srednje + SE (stan-dardna greška) vrednosti su izračunate, 1 izvršeno je upo-redjivanje pomođu ne-parametrijskim Mann-Whitney U-testom (Graphpad Instat, San Diego, CA).

Rezultati:

Svakodnevna jedna doza od 5 mg/kđ Jedinjenja A i svakodnevna jedna doza od 20 mg kg bimoklomola značajno poboljšava điabetičnu retinopatiju izazvanu patološkim histološkim promenama. Jedinjenje A je bilo statistički efikasnije u poredjenju sa dijabetičnim, ne-tretiranim životinjama. Rezultati su dati u Tabeli 5.

Tabela 5

Efekat tretiranja pomođu Jedinjenja A i Bimoklomol3 na patološke histološke promene izazvane ranom STZ-dijabetičnom retinopatijom

Eksperiment 5

Efekat tretiranja pomođu Jedinjenja A i Bimoklomola

na patološki gubitak urinarnog proteina izazvanog đijabetičnom nefropatijom kod STZ-đijabetičnih Wistar pacova posle tretiranja 1 mesec

Materijali i postupci:

U eksperimentima su upotrebljeni mužjaci Wistar pacova (Charles River Laboratories Inc.), na početku eksperimenta njihove težine su bile 340-370 g. Dijabetes je izazvan pomođu intravenske primene jedne doze od 45 mg/kg streptozotocina (STZ, Sigma, St Louis, MO) rastvorenog u fizio-loškom slanom rastvoru. Razvoj dijabetesa je proveren pos-

Test i referentne supstance su primenjene p.os na životinje jednom na dan.

Radi sakupljanja urina u periodu od 24 sati, životinje su stavljene u pojedinačne metabolične kaveze. Tokom ovog .perioda davana im je voda et libltum (po želji) ali nije davana nikakva hrana. Ova poslednja mera je bila potrebna da bi se sprečila moguća kontaminacija sadržajem proteina u hrani. Urin je sakupljan u kalibrisanim staklenim posudama, u koje je stav-ljen timol kristal (Reanal 3135-1-08-38) da bi se sprečila bakterijska kontaminacija.

Pre merenja, uzorci urina su centrifugirani (2500

opm) i filtrirani kroz papirni filter (Khatman 1). Ako je potrebno, oni se lageruju na -20°C do merenja.

Sadržaj ukupnog proteina urina je odredjen pomođu Bradford postupka bojenja (Sigma B-6916, St, Louis, MO),

i intenzitet boje je odredjen pomođu spektrofotometrije (Hitachi-U-3200),

Rezultati:

Bimoklomol, primenjen u jednoj dnevnoj dozi od 20 mg/kg, značajno smanjenjeSTZ-dijabetesom izazvan mrinarni gubitak proteina. Jedinjenje A primenjeno u jednoj dnevnoj dozi od 10 mg/kg ne smanjuje značajno gubitak proteina. Medjutim, (+) enantiomer Jedinjenja A, primenjen u jednoj dnevnoj dozi od 5 mg/kg značajo smanjuje đi-jabetični gubitak proteina. Rezultati su dati u Tabeli 6.

Eksperiment 6

Efekat Jedinjenja A i njegovih (+) i (-) enantiomera na patološke promene periferne neuropatije kod STZ-dijabetič-nih Wistar pacova posle 1 meseca tretiranja

Materijali i postupci: eksperimentalne životinje i svi postupci koji su primenjeni su isti kao što je opisano u Eksperimentu 2

Rezultati:

Jedinjenje A u jednoj dnevnoj dozi od 10 mg/kg i Jedinjenje A(>) u jednoj dnevnoj dozi od 5 mg/kg su ekviaktivni i zna-čajno poboljšavaju i defektivnu motornu CMNCV) i senzornu (SNCV)brzinu nervne provodijivosti đeficijentnu kod dija-betičnih životinja. Nasuprot ovome, Jedinjenje A(-) nije imalo značajan poboljšavajuđi efekat na bilo koji parametar. Rezultati su prikazani u Tabeli 7.

Tabela 7

Efekat Jedinjenja A i njegovog A(+) i At-) enentiomera na brzinu nervne provodijivosti (NCV) đeficijentne kod STZ-di jabetičnih Wistar pacova

Eksperiment 7

Efekat Jedinjenja A i njegovih AO) i AC-) enantioiuera na patološke histološke promene rane đljebetične retlnopatije kod STZ dijabetičnih padova posle 2 meseca tretiranja Materijali i postupci: eksperimentalne životinje i svi primenjeni postupci su isti kao što je opisano uEksperimentu 4 Rezultati: At+) enantiomer u jednoj dnevnoj dozi od 5 mg/kg značajno poboljšava i lentikularne i retinalne patološke histološke promene izazvane dijabetičnom retinopatijom posle 2 meseca tretiranja,' dok efekat Jedinjenja A u jednoj dnevnoj dozi od 10 mg/kg nije bio značajan i A(-) enantiomer u jednoj dnevnoj dozi od 5 mg/kg nije bio efikasan. S obzirom samo na retinalne histološke promene, i Jedinjenje A i njegov. A(+) enantiomer su bili efikasni, dok efekat A(-) enantiomera nije bio značajan. Rezultati su prikazani u Tabeli 8

Eksperiment 8

Efekti AC+) i A'(-) enentiomera na in vivo insulinski zavisno preuzimanje glukoze kod dijetom izazvanog insulinski rezistentnog životinjskog modela

Materijali i postupci:

U eksperimentima su korišđeni mužjaci Wistar pacova (Charles River Laboratories Inc.) sa početnom telesnom težinom od 30Q-35Q g.

Insulinska rezistencija je izazvana dijetetskom manipula-cijom: životinjama je davana visoko masna (high fat) (HF) dijeta u toku 3 nedelje. U HF dijeti odnos zasićenih masti je bio dominantan i davao je 70 % od ukupnog dnevnog dabi-janja kalorija. A(+) i A(-) enantimeri su davani jednom dnevno u preventivnoj primeni u dozi od 20 mg/kg/dan.

Na kraju od 3 nedelje tretiranja ispitivani su sleđeđi parametri: 1. ugljenohidratni i lipiđni parametri iz seruma i 2. in vivo insulinom izazvano preuzimanje glukoze pomođu euglikemnog postupka učvršđivanja glukoze koji je trenutno najtačniji postupak za kvantitativno odredjivanje preuzi-manja glukoze (DeFronzo i sarad., American Journal od Physiology, 19.79/237/E214-223 strane) .

Ukratko: koncentracija glukoze u krvi kod životinja lišava-nih hrane u različitim životinjskimgrupama mora da bude identična. Eksperimenti se izvode kod svesnih pacova koji se slobodno kredu, hronično kanuliranim pacovima: prvo je započeta infuzija insulina (6.4 mU/kg/min), prađena pomođu paralelnog toka kontinualne infuzije glukoze da bi se održale koncentracije glukoze u krvi u euglikemonoj oblasti. Posle stabilizacije, meri se količina infuzovane glukoze u toku periaga od 90 minuta (brzina infuzije glukoze(glucose infusion rate) = SIR, mg/kg/min) koja je kvantitativni parametar osetljivosti.

Rezultati s

A(+) i A(-) enantiomeri u dnevnoj dozi od 20 mg/kg/min nisu uticali na telesnu težinu i potrošnju hrane i nivoe glukoze u krvi kod pacova lišenih hrane.

Nasuprot ovome, oba jedinjenja normalizuju HF dijetom izazvano lišavanje insulina i koncentracija trigliceriđa i takodje značajno smanjuju povećani sadržaj trigliceriđa u mišićima. Test učvršđivanja euglikemne glukoze potvrdio je da HF

dijeta značajno potiskuje in vivo insulinom izazvano preuzimanje glukoze: kontrola: 26.7 + 0.68 mg/kg/min, HF dijeta: 15.0 + 0,39 mg/kg/min.Potisnuto preuzimanje glukoze izazvano insulinom se povećava pomođu oba enantiomera: HF+ A(+): 20,5 + 0,8a rog/kg/min i HF+ At-): 19.7 + 1,38 mg/kg/min (značajno poveđanje u oba slučaja na nivou od p^.0.01). Prema ovim rezultatima oba enantiomera poveđavaju insulinom izazvano preuzimanje glukoze što se pokazuje iz nove pers-pektive smanjujućeg dejstva insulinske rezistencije jedinjenja prema pronalsku.

Eksperiment 9

Antidijabetična aktivnost A(+) enantiomera u Zucker đijabetič'-n±m gojaznim pacovima posle hronične primene

Materijali i postupci:

Odabran je genetički, đijabetični životinjski model i u eksperimentu su upotrebljeni Zucker dijahetični gojazni (ZĐF) (.Zucker Dlabetic Fatty) pacovi. Ovaj model je đijabe-tična varijanta insulinske rezistencije, gojaznih. ali ne-dijabettčnih Zucker fa/fa životinjs-kog modela (vldeti Eksperiment li. Kod ZDF pacova dijabetes se razvio na kraju 6-8 neđelja kojima prethodi faza insulinske rezistencije.

Efekat (A+) enantiomera je ispitivan u tretiranjima sa

dozom od 2 x 20.mg/kg/dan polazeći u ne-dijabetičnoj fazi, pri starosti od 7 nedelja i trajanju 6 nedelja.

Klinički hemijski parametri su mereni standerdnim postup-cima.

Koncentracije insulina u serumu su merene pomoću u skorije vreme razvijenom postupku (ELISA postupak, DRG International, Inc., U.S.A.).

Rezultati;

U ovom eksperimentu je otkriveno kao novi rezultat, da A(+) enantiomer ima jaku antidijabetičnu aktivnost kod dijabetič-nih životinja.

Rezultati dobijeni posle 3 15 nedelja tretiranja prikazani su u Tabeli 9.

Iako tretiranje sa A(+) enantiomerom nije normalizovalo koncentracije glukoze u krvi, kombinovani efekti jake antidijabetične aktivnosti i prethodno identifikovana značajna efikasnost izlečenja kod hroničnih dijabetičnih komplikacija daju jedinjenju jedinstveni karakter. Terapeutska indicirana oblast A(+) enantiomera može znač-ajno da se proširi na bazi ove nove kombinovane efikasnosti.

Dalji eksperimenti su doveli do zaključka da jedinjenja prema ovom pronalasku, pored njihove efikasnosti kod pato-loških komplikacija dijabetesa su korisna u tretiranju drugih oštećenja perifernih nerava izazvanih dijabetesom. Ovaj zaključak je podržan rezultatima sledeđeg neuro-regeneracionog eksperimenta.

Eksperiment 10

Terapeutski efekat Jedinjenja A i AC+) enantiomera na neuro-regeneraciju kod STZ-dijabetičnih Wistar pacova.

Materijali i postupci:

Eksperimenti su izvršeni na Wistar pacovima sa telesnom težinom od 320-350 g. Dijabetes je izazvan 1 proveren kao što je opisano u Eksperimentu 2. Kod test životinja koje su bile dijabetične 3 nedelje levi nerv išijatikusa je povredjen zamrzavanjem a desna strana je korišđena kao ne-povredjena kontrola. Regeneracija je posmatrana beleženjem signala fleksor refleksa provociranih pomođu ozračivanja tabana koji su površine ispod krive CAUC) (areas under curve) elektromiograma prenetog sa prednjeg tibijalnog mišiđa.

Za stimulaciju i detekciju upotrebijen je sistem opisan u Eksperimentu 2.

Pojedinačne dnevne doze od 10 mg/kg Jedinjenja A i 5 mg/kg A(+) enantiomera su primenjivane 5 nedelja posle povredji*-vanja zamrzavanjem.

Rezultati:

Na kraju perioda od 3 nedelje dijabetesa, pre povređjiva-nja zamrzavanjem razvila se senzor neuropatija i izazvala 23-25% smanjenje u AUC na obe noge. Nije uočena nikakva reakcija tokom 2 nedelje posle povredjivanja zamrzavanjem. Stepen neuroregeneracije je bio 63 % na 5 nedelja. Regeneracija je poveđana do 73 % pomođu Jedinjenja A, AC+) enantiomer je bio efikasan do stepena 93%. Neuroregene-racija od 83 % i samo 44 % ne-zamrznutih nerava je uočena kao rezultat tretiranja sa A(+) enantiomerom i odnosno Jedinjenjem A.Prema tome A(+) enantiomer ima jak neuro-regenerativni efekat.

N-/2-hidroksi-3-(1-piperidinil)-propoksi/-piriđin-l-oksid-3-karboksiimidoilhlorid može da se dobije sledeđim postupkom, koji nije poznat od ranije.

Prema oksidacionom postupku opisanom u W0 97/16349, derivat se oksidiše na azotovom atomu oba prstena, ili sa manje reagensa derivat oksidisan na alicikličnom prstenu može da se dobije iz hlorida O- (3-piperiđino-2-hiđroksi*rl-propil)-3-piridin hidroksamske kiseline, pošto je alicikli-čni azotov atom prvenstven u oksidacionoj reakciji. Regio-nalna selektivnost oksidacije je usmerena prema piridinskom prstenu radi dobijanja jedinjenja prema pronalasku, stoga je postupak modifikovan. Osnovna tačka modifikacije je ta, da se u cilju da se olakša selektivna oksidacija piridin-Skog prstena, perkiselinska oksidacija izvodi u prisustvu jake kiseline, prvenstveno metan sulfo kiseline, koja protonizira aliciklični azot i tako sprečava njegovu oksi-daciju?stoga oksidacija piridina postaje primarna. Kao oksidans, može da se upotrebi bilo koji tip perkiseline, prvenstveno persirđetna kiselina.

Optički antivni enantiomeri jedinjenja prema pronalasku se dpbijaju upotrebljavajući pogodneenantiomer optički aktivan kiselinski hlorid 0-(3-piperidino-2-hidroksi-l-propil)-3-piriđin hidroksamske kiseline kao polazni materijal, koji može da se dobije na primer premaEP 0 417 210 BI razdvajanjem racemskog jedinjenja. U toku reakcije, hiralnost molekula nije oštećena, i dobijeni proizvod ima istu optičku čistoću kao polazna supstanca.

Ako je poželjno, N-/2-hidroksi-3-(1-piperidinil)-propoksi/piridin-l-oksid-3-karboksiimidoil hlorid koji je dobijen ili jedan od njegovih optički aktivnih enantio-

mera može da se transformiše u kiselinsku adicionu so sa mineralnom ili organskom kiselinom, pomoću poznatih postu-paka.

N-/2-hidroksi-3-(1-piperidinil)-propoksi/-piridin-l-oksid-3-karbokslimidoil hlorid, njegov optički aktivan

(+) ili (-)enantiomer, smeša enantiomera u bilo kom odnosu, racemsko jedinjenje, osim toga, adicione soli sa kiselinama obrazovane iz bilo kojih gornjih jedinjenja sa mineralnim ili organskim kiselinama predstavljaju predmete ovog pronalaska. Svi mogući geometrijski oblici N-/2-hidroksi-3-Cl-piperidinil) -propoksi/-piridin-l-oksid-3-karboksiimidoil hlorida spadaju u obim pronalaska. Izraz "stereoizomeri N-/2-hidroksi-3-(1-piperidinil)-propoksi/-piridin-l-oksid-3-karboksiimidoil klorida" odnosi se na sve moguće optičke i geometrijske izomere jedinjenja.

Prema pronalasku, ova jedinjenja se primenjuju za tretiranje patološke insulinske rezistencije i za tretiranje i prevenciju patoloških stanja vezanih za ovo.

Specijalna realizacija pronalaska je da se ova jedinjenja upotrebljavaju ža simultano tretiranje ili prevenciju hroničnih dijabetesom-izazvanih komplikacija, naročito retinopatije, neuropatije i nefropatije, i patološke insulinske rezistencije i patološk h stanja povezanih sa ovim.

Prema jednoj drugoj specijalnoj realizaciji pronalaska, N-/2-hidroksi-3- (1-piperidinil)-propoksi/-piridin-l-oksid-3-karboksiimidoil hlorid ili njegovi stereoizomeri ili njegove adicione soli sa kiselinama upotrebljavaju se u tretiranju patološke insulisks rezistencije i patoloških stanja vezanih sa ovim i za stimultano povećanje dijabetesom Izazvanog patološki smanjene periferne neuroregeneracije.

Jedinjenja prema pronalaku mogu da se primene i u humanoj u i veterinarskoj terapiji.

Prema tome, predmet pronalaska takodje uključuje postupak za tretiranje patološke insulinske rezistencije i tretiranje i prevenciju patoloških stanja vezanih sa time,

i načina na koji se primenjuje na pacijente N-/2-hidroksi-3- (1-piperidinil) -propoksi/piridin-l-oksid-3-karboksiimidoil hlorid ili jedan od njegovih stereoizomera u obliku baze ili adicione soli sa kiselinom. Prvenstvena realizacija postupka prema pronalasku je kada se N-/2-hidroksi-3-Cl-piperidinil) -propoksi/-piridin-l-oksi-3-karboksiimiđoil hlorid ili jedan od njegovih stereoizomera, ili njegova adiciona so sa kiselinom primenjuje na pacijenta koji pati od dijabetične retinopatije, neuropatije ili nefropatije.

Prema jednoj drugoj specijalnoj realizaciji pronalaska N-/2-hiđroksi-3-Cl-piperidinil) -propoksi/-piridin-l-oksiđ-3-karboksiimidoil hlorid ili jedan od njegovih stereoizomera ili njegova adiciona so sa kiselinomse primenjuje na pacijenta u slučaju patološkog smanjenja nero-regeneracije izazvanog dijabetesom.

Doza jedinjenja zavisi od stanja i bolesti pacijent ta, i dnevna doza je 0.1-40.0 mg/kg, prvenstveno 0., 1*0. GCL mg/kg. U humanoj terapiji, oralna doza je prvenstveno 10--30-0. mg, u slučaju rektalne primene 1t-15 mg, dok u slučaju parenteralne primene 1-15 mg za odraslog pacijenta. Ove doze se prvenstveno primenjuju u oblicima jediničnih, doza, koje mogu da se podele u 2-3 manje doze na dan u izvesnim slučajevima, naročito u oralnom tretiranju.

Prvenstveno se upotrebljava stereoizomer racemskog jedinjenja, najpogodnije (+) enantiomer. u ovom slučaju, manja količina aktivne komponente unutar gornjih granica je dovoljna za tretiranje.

Farmaceutski preparati pogodni za tretiranje su takodje predmet pronalaska. Ove farmaceutske kompozicije sadrže, pored uobičajenih pomodnih supstanci i nosača, N-/2-hidroksi-3-(1-piperidinil)-propoksi/-piridin-l-oksiđ-3-karboksiimiđoil hlorid ili jedan od njegovih stereoizomera, ili adicionu so jednog od gornjih, kao aktivne komponente .

Farmaceutske kompozicije prema pronalasku mogu da se dobiju u obliku čvrstog ili tečnog preparata uglavnom upotrebijenog u humanoj ili veterinarskoj terapiji. Jednostavne ili obložene tablete, dražeje, granule, kapsule, rastvori ili sirupi mogu da se dobiju za oralnu primenu, supozitorije za rektalnu primenu, i liofilizirane ili ne-liofilizirane injekcije ili infuzioni rastvori za parente-ralnu primenu. Oni mogu da se dobiju uobičajenim postupci-ma. Proizvod za oralnu upotrebu može da sadrži materijale za punjenje (punioce) kao što su mikrokristalna celuloza, škrob ili laktoza, maziva kao što su stearinska kiselina ili magnezijum stearat, materijale za oblaganje kao§tosušeđer, materijale koji obrazuju film, kao što je hidroksi metil celuloza, arome ili zaslađjivađe kao što su njetil-paraben ili saharin, ili supstance za bojenje, Supozitorije mogu da sadrže kakao buter ili polietilen glikol kao što su pomodna sredstva, Parenteralni proizvodi mogu da sadrže pored efikasne supstance, alani rastvor, ili u izvesnim slučajevima supstance za dispergovanje i kvašenje kao što je propilen glikol

Pronalazak je dalje ilustrovan pomođu sledeđih priraera:

Primer 1

Dobijanje N-/2-hidroksi-3-(1-piperidinil)-propoksi/- piriđin-l-oksiđ-3-karboksiimiđoil hlorid (Z)-2-butendioat

(1:1)

40,4 g (.0.136 mola)N-/2-hiđroksi-3-(1-piperidi-nil) -propoksi/-3-piridin-karboksiimidoil hlorida se rastvori

u smeši od 238 ml glacijalne sirđetne kiseline i 13.0 g 1.0.136 mola) metan sulfo kiseline. 61.5 ml (0.591 mola) 30 % rastvora vodonik peroksida se dodaje na 60°C. Rekciona smeša se meša na 60°C 3.5-4 sata. Rastvor se ohladi do 1Q°C, i zatim se u ovo dodaje ftl ml 0.5 M rastvora Na2S205 . Iz ovog rastvora se predestiliše 315 ml smeše vode-sirđetne kiseline, u ostatak se dodaje 250 ml 4 N NaOH rastvora CpH= 10.55) i muđka sa hloroformom. Hloroformska faza se pere sa vodom, suši, tretira sa drvenim ugljem, i zatim uparava. U ostatak se dodaje voda, i ekstrahuje se sa izopropil etrom i zatim sa hloroformom, Hloroformska faza se suši, tretira sa drvenim ugljem, filtrira i uparava, Ostatak se rastvara u acetonu i transformiše u so sa maleinskom kiselinom. Talog se profiltrira, pere se sa acetonom i suši, Proizvod se kristališe iz kljucalog etanola.

Prinos: 20 g (35%)

T.t.: 150.5-154.5°C

^H-NHR Crastvarač: DMSOfreferenca: DM80j> V = 30Q MHz) /ppm/: 8.55 (s, IH, 2-piriđin); 8.35 lđ, IH,Ć^piriđin) - f7.68 td, IH,4-piridin) ;7.55 (m, IH 5-piridin); 6.0.0. Cs, 2H, CH=CH) y 4,23-4.48 (m, 3H, CE-OH i N0CH2)f2,9-5^3.50.

(m, 6H, 3 x NCH2)y 1.20-1.90. (m, 6H, piridin: 3 x CH2) .

<13>C-NMR (rastvarač: DMSO-, referenca: DMSO;; v =<30.0.MHz) /ppm/,: 167.6 (2C, 2COOH) y141.0 C2~piriđin) ? 136.8 C6-piridin); 136.4 (2C, CH=CH-, 133.4 (CC1) j 131,9 C3-piridin) %-127.2 (4-piridin) j 123,6 J(5-piridin) } 77.9 (N0CH2)?

63.6 (ĆH2N); 58.3 (CHOH); 52.0-55.0 (2C, piperidin; 2 x NCH2); 22.6, i 21.7 (3C, piperidin: 3 x CH2).

Primer 2

Dobijanje (+)-/R/-N-/2-hiđroksi-3-(ipiperidinil)-propoksi/-piridin-l-oksid-3-karboksiimiđoil hlorid (Z)-2-butenđioat U:1)

Postupak opisan u Primeru 1 je ponovljen sa tom razlikom što se umesto racemskog N-/2-hiđroksi-3-(1-piperidinil)-propoksi/-3-piriđin-karboksiimidoil hlorida upotrebljeva njegov R enantiomer. čist oblik jedinjenja se izoluje iz sirove baze kristalizacijom sa heksanom.

Prinos: 31 %

T.t.: 91- 93°C

IR (KBr, cm"<1>): 3167 (širok); 284G; 2710; 1575; 1480.; 1443 (širok) 1293 (s); 1279 (s); 1093; 1053; 1043; 1023 (s) ;

834 (s); 810., 688

Ako se želi, maleatna so može takodje da se dobije iz sirove haze. u rastvoru acetona kao što je opisano u Primeru. 1.

<p>rinos1?33%

Ttt,| «2tQ-133.a°c

Odnos enantiomera: 9B/2 CBPLC merenje na hiralnc^. AGP 100 x 4 mm koloni)

1 13

E-NMR i<C>t>NMR: isti kao spektri racemskog jedinjenja.

Primer 3

Dobivanje C<*) ^/S/?N^/2-hldroksi-3-.a-piperidinll)* propok«iy~pxr£đ±n-.l-*oksiđ-3- karoksiimidoil hlorid (Z)-2-butendioata Cl:1)

Postupak opisan u Primeru 1 se ponavlja sa tom razlikom še se mesto racemskog N-/2-hidroksi-3- (1-piperidinil)-propoksi/-3-piriđin-karboksiimiđoil hlorida upotrebljava* S-enantiomer.

Prinos: 34 %

T.t.: 132.0.-133. 0°C.

Odnos enantiomera: 98/2 (HPLC merenje na hiralnoj AGP 100 x

4 mm koloni).

<1>ENMR i 13ONMR: isti kao spektri racemskog jedinjenja.

Primer 4

Fino samlevena aktivna komponenta se pomeša sa pomodnim materijalima, smeša se homogenizuje i granuliše. Granulat se zatim komprimuje u tablete,

Primer 5

Kapsule

(+)-N-/2-hidroksi-3- Cl-piperidinil)propoksi/-

piridin-l-oksid-3-karboksiimidoil hlorid

Aktivna komponenta se pomeša sa pomodnim materijalima, smeša se homogenizuje i puni u želatinske kapsule.

Primer 6

Aktivna komponenta i polivinil pirolidon se rastva-raju u etanolu. Smeša laktoze i škroba krompira se pokvase ravnomerno sa rastvorom za granulisanjeaktivne komponente. Posle filtriranja, granule se suše na 50°C i prosejavaju. Dodaje se magnezijum stearat i presuje se u oblik tableta, koje se zatim prekrivaju oblogom od šeđera i poliraju pomođu pčelinjeg voska,

Primer 7

Kakao buter i supozitorijska masa se zagrevaju do 40.°C, i aktivna komponenta se disperguje u stopljenoj masi, zatim se masa puni u supozitorijske kalupe.

Priffl<p>r ft

Primer 9-.

Rastvor se puni u ampule od 2 ml i zatim zatapa.

Pr imer 10

Infuzioni rastvor

500 ml infuzionog rastvora se dobija sa sledeđom kompozicijom:

Claims

1. N-{2-hidroksi-3-(1-piperidinil)-propoksi}-piridin-l-oksid-3-karboksiimidoil hlorid, njegovi stereoizomeri, i adicione soli sa kiselinama

2. Upotreba N-{2-hiđroksi-3-(1-piperidinil)-propoksi}-piridin-l-oksid-3-karboksiimidoil hlorida, njegovih stereoizomera, i adicionih soli sa kiselinama otuda, u proizvodnji leka za tretiranje patološke insulinske rezistencije, i za tretiranje patoloških stanja povezanih sa ovime.

3. Upotreba N-{2-hidroksi-3-(1-piperidinil)-propoksi}-piridin-l-oksiđ-3-karboksiimidoil hlorida, njegovih stereoizomera, i adicionih soli sa kiselinama otuda, u proizvodnji leka za tretiranje i prevenciju dijabetesom izazvanih hroničnih komplikacija, naročito retinopatije, neuropatije i nefropatije, i/ili patološkog opadanja periferne neuroregeneracije izazvane dijabetesom.

4. Farmaceutska kompozicija koja sadrži N-{2-hidroksi-3-(1-piperidinil)-propoksi}-piridin-1-oksid-3-karboksiimidoil hlorid ili jedan od njegovih stereoizomera ili adicionu so sa kiselinom otuda kao aktivnu komponentu u smeši sa najmanje jednim farmaceutski prihvatljivim pomoćnim materijalom i nosačem koji se obično upotrebljavaju.