RS50157B - Neutrališuća visoko afinitivna humana monoklonalna antitela specifična za rsv f-protein i postupci za njihovu proizvodnju - Google Patents

Abstract

Humano monoklonsko antitelo naznačeno time, što se specifično vezuje za F-protein respiratornog sincicijalnog virusa (RSV) i sadrži varijabilne regione lakog i teškog lanca koji imaju aminokiselinske sekvence izabrane iz grupe koju čine: aminokiselinske sekvence varijabilnih regiona lakog i teškog lanca antitela RF-1, koje su respektivno prikazane kao SEQ ID BR: 12 i SEQ ID BR: 13; i aminokiselinske sekvence varijabilnih regiona lakog i teškog lanca antitela RF-2, koje su respektivno prikazane kao SEQ ID BR: 14 i SEQ ID BR: 15. Prijava sadrži 8 nezavisnih i 40 zavisnih patentnih zaheva.

Description

Oblast tehnike

Pronalazak je iz oblasti bioinžinjeringa.

Tehnički problem

Objekt pronalaska je obezbeđjivanje poboljšanih postupaka za dobijanje antitela

visokih titara koja su specifična na željene antigene.

Specifičniji objekt pronalaska je obezbeđivanje novog postupka za proizvodnju visoko

titarskih humanih antitela koji obuhvata (i) primarno izlaganje prirodnih humanih splenocita antigenu in vitro, (ii) prenošenje in vitro primarno izlaganih prirodnih humanih splenocita ćelija na imunodeficijentnog donora, npr. SCID miša i (iii) podsticanje sa antigenom.

Drugi specifičan objekt pronalaska obezbeđuje poboljšane postupke za proizvodonju

humanih monoklonalnih antitela koja su specifična na respiratorni sincitialni virus (RSV) i naročito RSV fuzioni (F) protein.

Drugi objekt pronalaska je obezbeđjivanje poboljšanog postupka za proizvodnju EBV besmrtnih B-ćelija koje favorizuju građenje EBV besmrtnih B-celija koje uglavnom luče IgG.

Specifični objekt pronalaska je obezbeđjivanje poboljšanog postupka za proizvodnju EBV besmrtnih humanih B-ćelija koje uglavnom luče IgG koji obuhvata: (i) antigensko primarno izlaganje prirodnih humanih splenocita in vitro; (ii) prenošenje takvih in vitro antigenski primitizovanih splenocita u imunodeficijentnog donora, npr. SCID miš; (iii) podsticanje imunodeficijentnog donora sa antigenom; (iv) izolovanje B ćelija koje proizvode humana antitela iz antigenski podstaknutog imunodeficijentnog donora, npr. SCID miša; i

(v) EBV transformaciju B-ćelija koja proizvode humana antitela.

U drugom objektu pronalaska obezbeđuju se novi preparati koji sadrže EBV transformisane B-ćelije dobijene iz SCID miševa koje uglavnom luče humani IgG.

Specifični objekt pronalaska radi obezbeđivanja novih preparata koji sadrže EBV transformisane B-ćelije koje uglavnom luče humani IgG proizveden postupkom obuhvata: (i) primarno izlaganje prirodnih humanih splenocita antigenu in vitro; (ii) prenošenje dobijenih in vitro antigenskih primatozovanih prirodnih splenocita u imunodeficijentni animalni donor, npr. SCID miš; (iii) podsticanje imunodeficijentnog animalnog donora, npr. SCID miš sa antigenom; (iv) izolovanje B-ćelija koje proizvode humano antitelo iz antigenski podsticanog imunodeficijentnog donora, npr. SCID miša; i

(v) EBV transformisanje izolovanih B-ćelija koje proizvode humano antitelo.

Drugi specifični objekt pronalaska je proizvodnja RSV neutrališućih humanih monoklonalnih antitela koja imaju afinitet prema RSV F-proteinu < 2*10"<9>M.

Još dalji objekt pronalaska je obezbeđivanje besmrtnih ćelijskih linija koje luče RSV neutrališuća humana IgG monoklonalna antitela koja imaju afinitet na RSV F antigen < 2«IO<9>M.

Specifičniji objekt predmetnog pronalska je obezbeđivanje EBV besmrtnih ćelijskih linija RF-2 i RF-1, koje luče humana monoklonalna antitela označena respektivno, kao RF-2 i RF-1 koja neutrališu RSV in vivo i svaka poseduje afinitet za RSV F protein < 2*IO<*9>M.

Drugi objekt pronalaska je transfekcija eukariotskih ćelija sa DNA sekvencama koje kodiraju RF-1 ili RF-2 teških i lakih domena radi dobijanja transfektanata koji luče humana antitela koja sadrže varijabilni domen RF-1 ili RF-2 .

Specifičniji objekt pronalaska je obezbeđivanje transfektovanih CHO ćelija koje ekspresuju RF-1 ili RF-2 teških i lakih varijabilnih domena.

Drugi objekt pronalaska je tretiranje ili prevencija RSV infekcije kod ljudi davanjem terapeutski ili profilaktički aktivne količine RSV neutrališućih humanih monoklonalnih antitela koja su specifična na RSV protein i koja pokazuju Kd za RSV F-protein < 2« 10"9 M.

Specifičniji objekt pronalaska je tretiranje ili prevencija RSV infekcije kod ljudi davanjem terapeutski ili profilaktički efikasne količine RF-1 ili RF-2 humanog monoklonalnog antitela ekspresovanog u tarsfektovanoj eukariptičnoj ćeliji koja sadrži i ekspresuje varijabilne teške i lake domene RF-1 ili RF-2.

Drugi objekt pronalaska je obezbeđivanje vakcina za tretiranje ili prevnciju RSV infekcije koje obuhvataju terapeutski ili profilaktički efektivnu količinu humanih monoklionalnih antitela specifičnih na RSV F-protein koji ima Kd za RSV F-protein < 2«IO"<9>M, koja neutrališu RSV in vitro, u kombinaciji sa farmaceutski prihvatljivim nosačem ili ekscepijentom.

Dalji objekt pronalaska je obezbeđivanje vakcina za tretiranje ili prevenciju RSV infekcije koja obuhvata terapeutski ili profilaktički efikasnu količinu RF-1 ili RF-2 humanih monoklonalnih antitela izvedenih iz transfektovane eukariotske ćelije koja sadrži i ekspresuje DNA sekvence koje kodiraju varijabilne teške i lake domene RF-1 ili RF-2 u kombinaciji sa farmaceutski prihvatljivim nosačem ili eskcipientom.

Drugi objekt predmetnog pronalaska je obezbeđivanje postupka za dijagnozu RSV infekcije ispitivanjem prisustva RSV u analitu, npr. respiratornim fluidima koristeći humana monoklonalna antitela koja poseduju afinitet za RSV fuzioni (F) protein < 2» 10"9 M.

Još dalji objekt pronalaska je obezbeđivanje novih imunoproba i opreme za testiranje za detekciju RSV infekcije koja obuhvata humana monoklonalna antitela specifična na RSV F-protein koj poseduj afinitet za RSV F protein < 2*IO"<9>M., gde su antitela direktno ili indirektno vezana na podesan reporterski molekul, tj. enzim ili radionukleid. U poželjnoj realizaciji ova humana monoklonalna antitela će obuhvatati RF-1 ili RF-2 ili rekombinantna humana monoklonalna antitela dobijena u eukariotskim ćelijama, npr. CHO ćelijama koja su transfektovana sa varijabilnim teškim i lakim domenima RF-1 ili RF-2-a.

Stanje tehnike

Respiratorni sinicitialični virus (RSV) je Rarmixovirus Pneumovirus gen koji obično inficira gornji i donji respiratorni trakt. Poznato je da do dve godine starosti, veliki procenat dece je bio inficiran sa njim. Međutim, do četiri godine starosti, uglavnom svi humani organizmi imaju imunitet prema RSV.

Obično RSV infekcije su umerene, ostaju lokalizovane u gornjem respiratornom traktu i izazivaju simptome slične prehladi koji ne zahtevaju intezivni tretman. Međutim, u nekim subjektima, npr. imunosupresivnim individuama kao što su deca, starije osobe ili pacijenti podložni kardiopulmonalnim obolenjima, virus može prodreti u niži respiratorni trakt zahtevaju hospitilizaciju i podržano disanje. U nekim slučajevima, RSV infekcija može da izazove permanetno oštećenje pluća ili čak može biti životno opasna. U USA samo RSV dovodi do oko 90000 hospitaliziranih slučajeva svake godine i uzrokuje 4500 smrtnih slučajeva. RSV se javlja u dve glavne podgrupe A i B, primarno baziran, na serološkim razlikama vezanim sa spajanjem glikoproteina G. Glavni površinski glikoprotein, tj., 90kD G protein, može da se razlikuje za 50% aminokiselinskog nivoa između različitih izolata Johnson et al, Proc. Natl. Acad. Sci. (1987), 84, 5625-5629. Suprotno, potencijalna terapeutska meta 70kD fuzioni (F) protein, je veoma zaštićen kroz različite RSV vrste, oko npr. 89% na amino kiselinskom nivou Johnson et al. J. Gen. Virol. 61988) 69, 2623-2628, Johnson et al. J. Virol. (1987). 10, 3163-3166, P.L.Collins, Plenum Press, NY(1991), 103-162. Međutim, poznato je da antitela izvedena protiv F-proteina datog tipa su ukršteno reaktivna sa drugim tipom. F-protein je heterodimer, stvoren iz linearnog prekursora koji obuhvata disulfidno-povezane fragmente 48 i 23 kD respektivno, Walsh et al, J.Gen.Virol. (1985), 66, 401-415. Inhibicija formiranja sinicitija pomoću polikfonanalnih antitela je povezana sa značajnom reakcijom sa 23kD fragmentom.

Kao stoje istaknuto, mada je RSV infekcija obično umerena, kod nekih individua RSV infekcije mogu biti životno opasne. Trenutno, ozbiljna RSV infekcija se tretira davanjem antivirusnog reagensa Ribavarin-a. Međutim, mada Ribavarin pokazuje izvesnu efikasnost u kontrolisanju RSV infekcije, njegovo korišćenje je nepodesno iz više razloga. Na primer, veoma je skup i može se davati samo u bolnicama. Drugi poznati RSV tretmani samo tretiraju simpotome RSV infekcije i uključuju korišćenje aerosolidisanih bronhodilatora kod pacijenata sa bronhiolitisom i kortikosteroidnu terapiju kod pacijenata sa bronhiolitisom i RSV pneumonijom.

Do danas, RSV vakcine namenjene podsticanju antivirusnih protektivnih antitela su bile bezuspešne. Na primer, vakcina bazirana na formalin-inaktiviranom RSV koja je ispitivana pre oko 25 godina izazivala je antitela koja su bila neefikasna u inhibicionoj aktivnosti, Murphy et al, Clinical Microbiologv (1988), 26, 1595-1597 i ponekad je čak je pogoršavala bolest. Ovo može biti objašnjeno nemogućnošću formalinski inaktiviranog virusa da indukuje zaštitna antitela. Mada su kod primaoca vakcina mereni visoki antitelni titri, specifični zaštitni titri su bili niži nego kod kontrolne populacije. Ovo je možda zato što formalin inaktivira RSV koji ne pokazuju potrebne konformacione epitope potrebne za stvaranje zaštitnih antitela.

Mada nema poznate efiksane RSV vakcine ni danas, postoji klinička evidencija da antitelna terapija može da ponudi zaštitu protiv RSV infekcije kod suscepitibilnih individua i može čak da očisti postojeću RSV infekciju. Na primer, pokazano je da novorođena đeca pokazuju mali broj pojave ozbiljnih bronhiolitisa što je pripisano prisustvu zaštitnih antitela majke Oglivi et al, J. Med. Virol.

(1981), 7, 263-271. Takođe, deca koja su imuna na ponovnu infekciju pokazuju statistički više anti-F protein titre od one koja su ponovno inficirana. Međutim, intravenski imuni globulin (IVIG) dobijen iz RSV imunog donora visokog titra snižava RSV razlivanje i poboljšava oksigenaciju, Hemming et al, Anti. Viral Agents and Chematherapv (1987).31. 1882-1886. Takođe novije studije sugeriraju da virus može da se bori i oštećenje pluća se vrši davanjem RSV-obogaćenog imuno globulina (RSVIG), Groothuis et al, The new England J. Med. (199 3), 329, 1524-1530, K.MvIntosh, The New England, J. Med. (1993), 329, 1572-1573, J.R. Groothuis, Antiviral. Research. (1994), 23, 1-10, Siber et al,J.Infectious Diseases, (1994), 23,1-10. Siber et al. J. lnfectious Diseases (1994), 169, 1368-1373, Siber et al. J. Infectious Diseases (1992), 165,456-463.

Slično, neka animalna proučavanja sugeriraju da antitelna terapija sa virus neutrališućim antitelima može da ponudi zaštitu protiv RSV ili da očisti postojeću RSV infekciju. Na primer, in vitro neutrališuća mišja monoklonalna antitela je izneto da štite miševe od infekcije i takođe uklanjaju postojeće RSV infekcije, Tavlor et al. J.lmrnunologv (1984), 52,137-142, Stott et al., "Immune Responses, Virus Infections and Disease"l LR.L.Press London (1989), 85-104. Takođe, monoklonalna antitela prema F-proteinu iz RSV pokazuju visoku efikasnost in vitro i in vivo RSV modelima Tempest et al. Bio/Technology (1991), 9, 266-271, Crovve et al, Proc.Natl.Acad.Sci. (1994), 91,1386-1390, Walsh et al. Infection and Immunity (1984), 43,756-758, Barbas III et al. Proc . Natl . Acad. Sci. (1992), 89,10164-10168, Walsh et al. J.Gen.Virol. (1986), 67, 505-513. Niska koncentracija antitela 520-2000Hg/kg telesrte mase je data kao rezultat skorašnjeg otkrića u amimalnim proučavanjima Crowe et al, Proc. Natl . Acad. Sci. (1994), 91,1386-1390. Međutim, ova monoklonalna antitela su opisana kao da neutrališu A i B vrste uključujući laboratorijske vrste i vrste umerenog tipa. Ova antitela se daju bilo injekcijom Groothuis etal, The Nevv England J. Med. (1993).329, 1524-1530, Siber etal. J. lnfectious Diseases (1994), 16 9, 1368-1373 ili pomoću aerosola Crowe et al, Proc. Natl. Acad. Sci. (1994), 91, 1386-1390.

Dva različita tipa potencijalnih terapeutskih monoklonalnih antitela prema RSV F-proteinu su opisana u literaturi, humanizirana mišja antitela Tempest et al, Biol. Technologv (1991)9,266-271 ili stvarna humana antitela (Fab fragmenti) Barbas III et al, Proc. Natl. Acad. Sci. (1992). 89 10164-10168. Humanizirana mišja antitela nastala CDR kalemljenjem ukrštajuće vrste koja neutrališe mišje anti-F-proteinsko antitelo na generični humani Fc, kao strukturnu oblast varijabilnog dela. Humani Fab fragmenti su dobijeni tehnologijom kombinatorijske biblioteke koristeći humane ćelije kičmene moždine iz HIV pozitivnog donora (imunokompresibilnog). Terapeutski in vivo titri humaniziranih i humanih RSV antitela su bili mase 5 i 2 mg/kg telesne mase. Zapaženo je, međutim, da humanizirana antitela su testirana u sincitia inhibicionim ispitivanjima dok su humani anti-RSV fragmenti ispitivani radi određivanja njihove virusno neutrališuće aktivnosti. Stoga, rezultati dati sa humaniziranim i humanim anti-RSV antitelima nisu direktno uporedivi.

Fab fragment nastao tehnologijom kombinatorijske biblioteke opisano je daje efikasan u aerosolu. Ovo je verovatno zato što je molekul relativno male veličine. Ovi rezultati su veoma ohrabrujući postoje glavnina metne populacije za RCV vakcinu sastavljena od dece. Stoga, aerosol je naročito podesan način davanja.

Međutim, i pored prethodno objavljenih podataka o humaniziranim i Fab fragmentima specifičnim na RSV i dalje postoji znatna potreba za poboljšanjem anti-RSV antitela koja imaju poboljšan terapeutski potencijal, naročito anti-RSV antitela koja poseduju veliki afinitet i specifičnost za RSV F-protein koji efikasno neutrališe i sprečava RSV infekciju.

Antitelna terapija može biti podeljena na dve podgrupe principijelno različitih aktivnosti: (i) pozitivna imunoterapija koja koristi netaknuta neobeležena antitela ili obeležena antitela i (ii) aktivna imunoterapija koja koristi anti-idiotipove za ponovo uspostavljanje mrežne ravnoteže u autoimunitetu.

U pasivnoj imunoterapiji, gola antitela se daju radi neutralisanja antogena ili direktnih efektorskih funkcija na metne antigene vezane za membranu. Neutralizacija može biti limfokina, hormona ili anafilatoksina, tj. C5a. Efektorske funkcije uključuju komplementnu fiksaciju, makrofagnu aktivaciju i vrbovanje i antitelno zavisno ćelijski izazvanu citotoksičnost (ADCC) . Gola antitela su korišćena za tretiranje leukemije Ritz et al, S . F. Blood, (1981), 58, 141-152 i antitela na GD2 su korišćena u tretiranjima neuroblastoma Schulz et al, Cancer Res. (1984), 44:5914 i melanom Irie et al, Proc.Natl.Acad.Sci

Takođe, intravenska imuna gama globulinska antitela (IVIG) sa visokim titrima anti-RSV su nedavno korišćena u eksperimentalnim ispitivanjima tretiranja respiratornog oboljenja izazvanog RSV infekcijom Hemming et al» Anti Viral. Agents and Chemotherapv, (1987) Groothuis et al, The New England J. Med., (1993) ,329, 1524-1530, K. Mclntosh, The New England J. Med. (1993). 329, 1572-1573, J.R.Groothuis Antiviral Research. (1994), 23,1-10, Siber et al, J. lnfectious Diseases (1994), 169, 1368-1373.

Terapeutska efikasnost monoklonalnog antitela zavisi od više faktora uključujući, npr. količinu, reaktivnost, specifičnost i klasu antitela koje se vezuje na antigen. Takođe, in vitro poluživot antitela je značajan terapeutski faktor.

Drugi faktor koji može znatno da utiče na terapeutski potencijal antitela je vrsta njegovog porekla. Trenutno, monoklonalna antitela korišćena za imunoterapiju su skoro isključivo glodarskog porekla, Schulz et al. Cancer Res. (1984), 44:5914, Miller et al. Blood (198D.58. 78-86, Lanzavecchia et al, J.Edp.Med. (1988), 167, 345-352, Sikora et al, Br. Med. Buli. (1984), 40 :240, Tsujisaki et al, Cancer Research (1991), 51:2599, uglavnom za stvaranja glodarskih monoklonalnih antitela se koriste dobro okarakterisane i veoma efikasne tehnike Kohler et al, Nature (1975), 256:495, Galfre et al, Nature

(1977) 266:550. Međutim, mada glodarska monoklonalna antitela poseduju terapeutsku efikasnost, mogu posedovati i ograničenja i mane u odnosu na humana antitela. Na primer, često indukuju sub-optimalnu stimulaciju efektorskih funkcija domaćina (CDCC, ADCC itd.) . Takođe mišja antitela mogu da indukuju humane anti-mišje antitelne (HAMA) odgovore Schroff et al, Can . Res. (1985), 45:879-885, Shawler et al. J. Immunol. (1985), 135:1530-1535. Ovo može da dovede do smanjenja antitelnog poluživota Dillman et al, MocL (1986), 5, 73-84, Miller et al, Blood. (1983), 62:988-995 i u nekim slučajevima može da izazove toksične sporedne efekte, takve kao što je serumska bolest i anafilaksis.

U nekim subjektima, npr. teško imunosupresivnim subjektima (npr. pacijenti podvrgnuti teškoj hemijskoj ili radijacionoj terapiji kancera Irie et al, Prpe. Natl. Acad . Sci. (1986), 83:8694, Dillman et al, Mod. (1986), 5, 73-84, Koprovvski et al, Proc. Natl. Acad. Sci. (1984), 81:216-219. korišćenje mišjih monoklonalnih antitela izaziva ograničene negativne sporedne efekte. Surotno, kod pacijenata sa normalnim ili hiperaktivnim imunim sistemima, mišja antitela, baš kod nekih obolenja mogu da pokažu ograničenu aktivnost.

U cilju otklanjanja ograničenja mišjih monoklonalnih antitela, rekombinantne DNA tehnike su primenjene za proizvodnju himernih antitela, Morrison et al, Proc . Natl . Acad. Sci. (1984), 81:216-219, Boulianne et al, Nature (1984), 312, 644-646, humaniziranih antitela "CDR kalemljenjem", Riechmann et al, Nature (1984), 332, 323-327 i "furnirskih" antitela supstitucijom specifičnih površinskih ostataka sa drugim amino kiselinama radi izbegavanja ili eliminisanja antigeničnosti.

Međutim, mada su takva antitela korišćena klinički i uspešno, Gillis et al, J. Immunol. Meth.

(1989), 25:191, pokazano je da su glomazna za proizvodnju. Ovo je zato što razumevanje zahteva za optimalnu antigenska prepoznavanje i afinitet još nije sasvim postignuto. Takođe, humana mreža i mišji CDR regioni često reaguju sterno sa negativnim efektom na antitelnu aktivnost. Međutim, takva antitela će ponekad izazvati jake HAMA odgovore kod pacijenata.

Humana antitela uglavnom poseduju niz prednosti u odnosu na svoje mišje kopije; ona indukuju optimalne efektorske funkcije, ne indukuju HAMA odgovore i domaćin antigen-specifična antitela mogu da dovedu do identifikacije epitopa terapeutske vrednosti koja može da bude suviše fina da bi bila prepoznata pomoću ksenogenog imunog sistema, Lennox et al, "Monoclonal Antibodies in Clinical Medicine", London: Academic Press (1982) .

Iako su humana antitela veoma poželjna, njihova proizvodnja je iskomplikovana raznim faktorima uključujući etička razmatranja i činjenicu da uobičajeni postupci za proizvodnju humanih antitela su često neefikasni. Na primer, humani subjekt ne može da stvori adekvantnu imugenost sa većinom antigena zbog etičkih i bezbedonosnih razloga. Stoga, malo je izolovanja humanih monoklonalnih antitela sa korisnim afinitetima IO<8>M na specifične antigene, McCabe et al. Cancer Research, (1988), 48,434804353. Takođe, izolovanje antivirusnih humanih monoklonalnih antitela iz donorskih primarno izlaganih prirodnih humanih splenocita antigenu se pokazalo nezgrapno. Na primer, Gorny je izneo da samo 7 od 14 329 EBV transformisanih kultura perifernih krvnih monoklonalnih ćelija (PMBC) iz HIV pozitivnih donora daje specifična anti-HIV antitela koja daju ćelijske linije, Gorny et al, Proc . Nati. Acad. Sci. (1989), 86:1624-1628.

Do danas, većina humanih anti-tumornih antitela je nastala iz perifernih krvnih limfocita (PBLs) Me et al, J. Cancer (1981), ili tumomih limfocita limfnog čvora Schlom et al, Proc . Natl. Acad. Sci.

(1980), 77:6841-6845, Cote et al, Proc. Natl. Acad. Sci. (1983), 80:2026-2030 iz pacijenata sa kancerom. Međutim, takva antitela često reaguju sa intraćelijskim i tako terapeutski nekorisnim antigenima Ho et al, In. Hvbridoma Technologv , Amsterdam (1988), 35-37 ili su IgM klase McCabe et al, Cancer Research (1988), 48 4348-4353, klasa antitela sa nižom sposobnošću prodiranja u čvrste tumore od IgGs . Nekoliko ovih humanih antitela je bilo, izmenjeno u kliničkim testovima Drobvski et al, R . C . Transplatacion (1991), 51, 1190-1196 što je sugeriralo da oslobođjena antitela mogu da poseduju sub-optimalni kvalitete. Međutim, kako ovi prilazi koriste testirajuće donorske premazene B ćelije, jasno je da ove ćelije nisu optimalni izvor za oslobađanje korisnih monoklonalnih antitela. Nedavno, stvaranje humanih antitela iz primarno izlaganih donora je poboljšano stimulacijom sa CD40 što dovodi do ekspanzije humanih B ćelija, Banchereau et al, F. Science (1991), 251:70, Zhang et al, J. Immunol.(1990), 144,2955-2960, Thoma et al, J. Immunol. (1991), 146:2544-2552 ili pomoću ekstra in vitro stupnja pojačavanja primera prema besmrtnosti Chaudhuri et al, Cancer Supplement

(1994), 73,1098-1104. Ovaj princip je korišćen za stvaranje humanih antitela na Citomegalovirus, Epstein-Barr Virus (EBV) i Hemofilus influenza sa ćelijama iz primarno izlaganih donora (42-44) sa znatno višim prenosom od onog dobijenog sa drugim postupcima (32).

Međutim, u cilju ograničavanja primarnog izlaganja opisana je imunizacija i kultivacija eks vivo limfocita iz zdravih donora. Uspeh u stvaranju humanih monoklonalnih antitela koristeći eks homine pojačavanje PBL ćelija iz primarnih donora, Maeda et al, Hvbridoma (1986), 5:33-41, Kozbor et al, J. Immunol. (1984), 14:23, Duchosal et al, Nature, (1992), 355:258:262. Lakoća imuniziranja in vitro je prvo pokazana 1967. od strane Mishell i Duttona, Mishell et al, J. Exp. Med. (1967), 126:423-442 koristeći mišije limfocite.

U 1973. Hoffman je uspešno imunizirao humane limfocite, Hoffman et al, Nature (1993), 243:408-410. Takođe, uspeh primarne imunizacije je saopšten sa limfocitima iz periferne krvi, Luzzati et al, J. Exp. Med. (1975), 144:573:585, Misiti et al, J. Exp. Med.(1981). 154: 1069-1084, Komatsu et al, IntArchs. Allergv Appl. Immunol. (1986), Ohlin et al, C. A. K. Immunologv (1989), 68:325 (1989) krajnika Strike et al, J. Immunol. (1978), 132:1789-1803 i slezine, ova je dobijena iz povrede Ho et al, In Hvbridoma Technol<A>gv, Amsterdam (1988), 35-37, Boemer etal, J. Immunol. (1991), 147:86-95, Ho et al. J. Immunol. (1985), 135:3831-3838, Wasserman et al, J. Immunol. Meth. ( 1986). 93:275-283, Wasserman et al, J. Immunol. Meth. (1986), 93:275-283, Brams et al, Hum. Antibod. Hvbridomas (1993), 4,47-56, Brams et al. Hum. Antibod. Hvbridomas (1993), 4, 57-65 i pacijenata sa idiopatičnom trombocitopenija purpura (ITP) Boerner et al, J. Immunol. (1991), 147:86-95, Brams et al, Hum Antibod. Hvbridomas (1993) 4,47-56, Brams et al, Hum. Hvbridomas (1993). 4, 57-65, McRoberts et al, "In vitro Imunization in Hvbridimas Technologv", Elsevier, Amsterdam (1988), 267-275, Luetal. P.Hvbridoma

(1993), 12,381-389.

In vitro imunizacija nudi znatne prednosti, npr. lako reprodukovane imunizacije pružaju same lako manipulisanje antitelne klase pomoću odgovarajućih tehnika kultivisanja i manipulacije, Chaudhuri et al, Cancer Supplement (1994) 73, 1098-1104. Takođe ima evidencije da in vivo tolerancija prema samim antigenima nije preovlađavajuća tokom IVI Boerner et al, J. Immunol. (1991), 147-86-95, Brams et al, J. Immunol. Methods (1987), 98:11. Stoga, ova tehnika je potencijalno primenljiva za proizvodnju antitela prema samim antigenima, npr. tumorni markeri i receptori obuhvaćeni u autoimunitetu.

Više grupa je iznelo stvaranje odgovora na razne antigene izazvane samo in vitro, npr. sa tumorom povezani antigeni (TAAs) Boerner et al, J: i Immunol. (1991), 147:86-95, Borrebaeck et al, Proc . Na ti . Acad . Sci (1988), 85:3995. Međutim, na nesreću, dobijena antitela su obično IgM i ne IgG subklasa, McCabe et; al, Cancer Research (1988), 48,4348-4353, Koda et al, Hum. Antibod . Hvbridomas (1990), 1:15 i sekundarni (IgG) odgovori samo su dati sa protokolima koji koriste iimfocite iz imuniziranih donora. Stoga, jasno se vidi da ovi protokoli samo daju indukovanje primarnog imunog odgovora ali zahtevaju donorske imunizirane ćelije za stvaranje željenih odgovora.

Takođe izvršeno je istraživanje simetričnosti analize kultivisanja i imunizacionih promenljivih radi razvijanja opšteg protokola za efikasno indukovanje humanih monoklonalnih antitela in vitro, Boerner, J. Immunol« (1991) 147:86-95, Brams et al, Hum. Antibod. Hvbridomas (1993),4, 47-56, Lu et al, H vbridoma (1993), 12, 381-389. Ovo je dalo izolovanje humanih monoklonalnih antitela specifičnih za feritin, Boerner et al, J. Immunol. (1991). 147:86-95, indukovanim pimodu IVI prirodnih humanih ćelija slezine. Takođe, ovo istraživanje je dalo protokol prema kojem novi sekundarni (IgG) odgovori mogu biti sasvim indukovani in vitro, Brams et al, Hum Antibod. Hvbridomas (1993). 4, 57-65.

Međutim, uprkos velikih potencijalnih prednosti IVI, efikasnosti takvih postupaka su ozbiljno ograničene zbog činjenice što imune ćelije rastu u monoslojevima u posudama kulture. Suprotno, in vivo, germinalni centri koji poseduju trodimenzionu strukturu se nalaze u slezini tokom aktivnih faza imunog odgovora. Ove trodimenzione strukture obuhvataju aktivirane T- i B-ćelije okružene antigenskim ćelijama koje su kako se veruje glavnina imunologista radi upoređjivanj sa mestom antigenspecifične aktivacije B-ćelija.

Alternativno prirodnoj slezinskoj okolini je "stvaranje" ili imitiranje stanja slezine u imunodeficijentnom animalnom domaćinu, kao što je "Severe Combined Immune Deficient" (SCID) miš. Humani limfociti se lako adaptiraju pomodu SCID miša (hu-SCID) i proizvode visoke nivoe imunoglobulina, Mosier et al, Nature" (1988) 335:256, McCune et al, La Science (1988), 241,1632-1639. Međutim, ako je donor korišćen za rekonstruisanje izložen određenom antigenu, jak sekundarni odgovor na isti antigen se može razviti u takvim miševima. Na primer, Duchosal et al, Nature (19912) , 355: 158-262 ističu da humane periferne krvne B-ćelije iz donora vakcinisanog sa tetanus toksoidom 17 godina ranije mogu biti ponovo stimulisane u SCID okolini radi proizvodnje visokih serumskih nivoa, npr. oko IO<4>. Dalje su opisali kloniranje i ekspresiju gena dva humana anti-T antitela koristeći lambda i M13 faga kombinatorijski bibliotečki prilaz Huse et al, Science (1989), 246:1275 iz ekstrahovanih humanih ćelija. Dati antigenski afiniteti antitela su bili u oblasti IO<8>- IO9 /M. Međjutim, ovaj protokol zahteva donorske primarno izlagane ćelije i prinos je bio veoma mali; dobijena su samo dva klona iz biblioteke 370000 klonova.

Stoga, prethodni hu-SPL-SCID mišje samo korišćen za proizvodnju humanih monoklonalnih antitela na antigene gde donor je bio bilo efikasno primarno izlagana prirodno ili vakcinacijom Stahli et al, Methods in Enzvmolo<g>v (1983), 92,26-36, što u nejvećem broju slučajeva obuhvata izlaganje virusnim ili bakterijskim antigenima. Takođe je dat serum koristeći hu-SCID animalni model sa titarskim nivoima mnogo nižim od onih dobijenih imunizacijom normalnih miševa.

Dodatno opisana su dva protokola u kojima indukcija primarnih antitelnih odgovora može biti praćena indukcijom sekundarnih antitelnih odgovora u huSCID miševima koristeći prirodne humane limfocite. Međjutim, korišćenje oba ova ptotokola je znatno ograničen. U prvom protokolu, primarni odgovori su indukovani u huSCID miševima u koje su implantirani humanog zametka jetra, timus i limfni čvorovi. Međjutim, ovaj postupak je ozbiljno ograničen dostupnošću fetalnog tkiva kao i komplikovanom hiruškom metodologijom protokola McCune et al, L . Science (1988). 241, 1631-1639. U drugom protokolu, smrtno ozračeni normalni miševi su povraćeni sa T i B-ćelijom izdvojenom iz humane kičmene moždine i ćelijama SCID mišje kičmene moždine, Lubin et al, Science (1991) 25 2:427. Međjutim, metod je nepodesan jer zahteva 4 meseca inkubacionog perioda. Međjutim, oba protokola daju veoma male titre antitela tj, ispod IO4.

Takođe, Carlson et al, J. Immuno. l. (19912). 148:1065-1071 opisali su 1992. jedan prilaz koristeći PBMCs iz antigena (tetanus toksoid) primarno izlaganog donora. Ćelije su prvo oslobođena makrofaga i NK ćelija pre brze in vitro kultivacije i perioda primarnog izlaganja radi prenosa u SCId miša. Hu-SPL_SCID mišje tada stimulisan sa antigenom. Pokazano je da ovaj postupak daje prosečne TT specifične humane IgG titre od oko IO<4>u hu-SPL_SCID serumu do 5 10<s>.

Proizvodnja monoklonalnih antitela obično dalje zahteva proizvodnju besmrtnih B-ćelija u cilju dobijanja ćelija koje luče konstantno, idealno permanentnu zalihu željenih humanih monoklonalnih antitela. Imunizacija B-ćelija se obično izvodi na jedan od 4 načina: (i) transformacijom sa EBV, (ii) miš-humanom heterofuzijom, (iii) EBV transformacijom praćenom sa heterofuzijom i (iv) tehnikama kombinatorijske imunoglobulinske genske biblioteke.

EBV transformacija je uspešno korišćena u brojnim radovima, uglavnom za stvaranje antiHIV antitela Gorny et alf Proc. Natl. Acad. SCi. (1989), 86:1624-1628, Posner et al, J. Immunol. (1991), 146:4325-32. Glavna prednost je što skoro jedna od svakih 200 B-ćelija se transformiše. Međutim, EBV transformisane ćelije su obično nestabilne, proizvode male količine glavnog IgM antitela, kloniranje je siromašno i prestaje rađenje antitela posle nekoliko meseci kultivisanja. Heterofuzija "Carrol et al„ Jf Immunol. Meth . (1986) je obično favorizovana za proizvodnju hibridoma koji luče visoke nivoe IgG antitela. Hibridomi su takođe laki za kloniranje ograničenim razblaživanjem. Međutim, nedostatak je mali prinos tj. < 1 hibridoma na 20000 limfocita Boerner et al, J.Immunol. (1991),147:86-95, Ohlin et al, C.A.K. Immunologv (1989), 68:325, Xiu-mei et al, Hum. Antibod. Hvbridomas (1990), 1:42, Borrebaeck, C.A.K. Abstrakt "Second International Conference" on Human Antibodies and Hvbridomas", april 26-28, 1992, Cambridge, Engleska. Sjedinjavanje EBV tarnsformacije praćene heterofuzijom nudi dve prednosti: (i) humane B-ćelije se fuziraju lakše na fuzionog partnera posle EBV transformacije i (ii) dobijanje stabilnijih i većeg prinosa hibridoma Ohlin et al, Immunologv (1989), 68:325, Xiu-mei et al, Hum Antibod. Hvbridomas (1990). 1:42, Borrebaeck, C.A.K. apstrakt "Second International Conference" on "Human Antibodies and Hvbridoma", april 26-28, 1992, Cambridge, Engleska. Prednost poslednje tehnike tj. tehnike kombinatoriske imunoglobulinske genske biblioteke je činjenica da veoma velike biblioteke mogu biti ispitivane pomoću M13 Fab ekspresione tehnologije, Huse et al, Science (1989) 246:1275, Wiliam Huse Antibodv Engineering: Praktični vodič, Borrebaeck C.A.K, ed 5: 10 3-120 i što se geni mogu lako tarrisformisati za proizvodnju ćelijske linije. Međutim, prinos je obično veoma mali, reda 1 na 370000 klonova Duchosal et al, Nature (19912), 355:258-262.

Tako bazirano na gornjem, jasno je da su veoma poželjni efikasni postupci za proizvodnju humanih monoklonalnih antitela, naročito antitela specifičnih na RSV. Međutim, takođe je jasno da humana antitela specifična prema RSV F-proteinu koja imaju bolji afinitet vezivanja, specifičnost i

efektorske funkcije od onih trenutno raspoloživih su takođe veoma poželjna.

Opis rešenia tehničkog problema

Preditmetni pronalazak se u svojoj najširoj relaizaciji odnosi na nove postupke za dobijanje humanih antitela na željene antigene, poželjno antigene koji učestvuju u profilaksi, tretiranju ili detekciji stanja humanog obolenja. Ovi postupci obuhvataju anitegensko primarno izlaganje prirodnih humanih splenocita in vitro, prenošenje dobijenog in vitro antigena primarno izlaganih splenocitnih ćelija na imunodeficijentnog donora, npr. SCID miša i podsticanje pomenutog donora sa antigenom.

Predmetni pronalazak se takođe odnosi na postupke za dobijanje Epstein-Barr Virus (EBV) besmrtnih B-ćelija koje koje favorizuju proizvodnju ćelija koje luče IgGs koji obuhvata: primarno izlaganje prirodnih humanih splenocita antigenu in vitro; prenošenje dobijenog in vitro antigenskih primarno izlaganih splenocita na imunodeficijentnog donora, tj. SCID miša; podsticanje donora sa antigenom; izolovanje B-ćelija koje luče humano antitelo, poželjno koje luči IgG, iz antigenski podstakntuog imunodeficijentnog donora, npr. SCID miša; i EBV transformisanje pomenutih ćelija koje luče humano antitelo.

Predmetni pronalazak se specifičnije odnosi na poboljšane postupke za dobijanje humanih antitela za RSV, tačnije RSV fuzioni (F) protein koja pokazuju veliki afinitet prema RSV F-proteinu i koja takođe neutrališu RSV infekciju kao i na humana monoklonalna antitela koje se dobijaju pomoću ovih postupaka. Ovo se poželjno vrši primarnim izlaganjem prirodnih humanih splenocita in vitro sa IL-2 i po izboru sa RSV F-proteinom; prenošenje dobijenih in vitro primarno izlaganih splenocitnih ćelija na imunodeficijentnog donora, npr. SCID miš i podsticanje sa RSV F-proteinom radi dobijanja B-ćelija koje luče neutrališuća anti-RSV F-protein humana antitela koja imaju visok afinitet prema RSV F-proteinu.tj<<>2»10"9M

Dobijene B-ćelije su poželjno besmrtne tako da obezbeđuju konstantno stabilnu zalihu humanih anti-RSV F-protein monoklonalnih antitela. U poželjnoj realizaciji B-ćelije se izoluju iz antigenski podstaknutog SCID miša i transformišu sa EBV virusom radi dobijanja EBV trasnformiranih humanih B-ćelija koje uglavnom luče humani IgGs. Ove ćelije se tada kloniraju radi selekcije EBV transformisanih ćelijskih linija koje luče humana monoklonalna antitela koja imaju visok afinitet prema RSV proteinu, tj. < IO"<7>M i poželjno < 2«10"<9>M.

Predmetni pronalazak se takođe odnosi na korišćenje takvih anti-RSV F-protein humanih antitela kao terapeustkih i/ili profilaktičkih, kao i dijagnostičkih agenasa. Kao što je istaknuto, predmetni postupci daju humana monoklonalna antitela koja pokazuju visok afinitet prema RSV F-proteinu, tj, koja poseduju Kd za RSV F-protein<<>2*10"<9>M, koja takođe neutrališu RSV in vitro. Stoga, ova antitela su idealno podesna kao profilatski i terapeutski agensi za sprečavanje ili tretiranje RSV infekcije usled činjenice što RSV protein je izvor proteina koji je veoma očuvan u različitim RSV izolatima.Takođe, dat visok afinitet i specifičnost predmetnih humanih monoklonalnih antitela prema RSV F-proteinu omogućuje njihovu primenu za dijagnoziranje RSV infekcije.

Specifičnije, predmetni pronalazk obezbeđuje dva određena humana monoklonalna antitela prema RSV F-proteinu, tj . RF-1 i RF-2 kao i rekombinantna humana antitela izvedena iz njih, koja se poželjno proizvode u CHO ćelijama koje su transfektovane sa DNA sekvencama koje kodiraju varijabilne teške i lake domene RF-1 ili RF-2-a. Ova antitela su naročito korisna kao profilatski i/ili terapeutski agensi za tretiranje ili prevenciju RSV infekcije. Međutim, ova antitela su korisna kao dijagnostički agensi pošto se vezuju za RSV F-protein sa velikim afinitetom, tj. svako poseduje afinitet za RSV F-protein < 2-10~<9>M. Naročito su podesna kao terapeustki agensi zbog svog velikog afiniteta i specifičnosti za RSV F-protein, i svoje sposobnosti efikasnog neutralisanja RSV infekcije in vitro.

Kratak opis slika

Slika 1 prikazuje imunobojenje F proteina sa anti-F proteinom hu-SPL SCID serumima: (A) u denaturisan (B) F protein su uvođeni u SDS-PAGE i preneti u nitrocelulozu pomoću Western-bojenja. Nitroceluložne trake su reagovale sa pozitivnim kontrolnim mišjim anti-F proteinom (linije 1A i 1B), negativnim kontrolnim hu-SPL-SCID serumom anti-TT (linije 2A i 2B) i hu-SPL-SCID anti-F protein serumima iz miševa ^ 6 (linije 3A i 3B), # 3 (linije 4A i 4B) if 4(linije 5A i 5B).

Slika 2 prikazuje imunoflurescenciju HEP-2 ćelija sa hu-SPL-SCID serumimskim anti-F proteinom. Neinficirane (Ievo) i RSV-inficirane HEp-2 ćelije su reagovale sa serumom iz hu-SPL-SCID miša ^ razblaženim 1:50 i uzetim 15 dana posle podsticanja. Vezivanje je otkrilo GAH IgG-FITC.

Slika 3 prikazuje reaktivnost prečišćenog RF-1 i RF-2 za plastično vezan afinitivno prečišćen RSV F-protein. Reaktivnost referentnog humanog anti-RSV seruma. LN je takođe zabeležena. ELISA ploča je prekrivena sa 50 ng RSV F-proteina.

Slika 4 prikazuje IEF RF-1 (linija 2) i RF-2 (linija 3) humani MAb prečišćen iz suprernatanata tumorne ćelije. IEF je izvedena na pH gradijentu 3-10. Linija 1 prikazuje pi standarde.

Slika 5 prikazuje idirektno imunofluorescensno protočno citometrijsko ispitivanje HEp-2 ćelija i HEp-2-ćelija inficiranih sa RSV, 1 IO<6>, inkubiranih sa raznim količinama RF-1 i zatim sa FITC-obeleženim GAH IgG. Zabeležen je relativni prosečni intezitet čitave populacije.

Slika 6 prikazuje NEOSPLA vektor korišćen za ekspresiju humanih antitela.

CMV=citomegalovirus promotor. BETA= mišji beta globin glavni promotor. BGH= poiiadenilacioni signal goveđeg hormona rasta. SVO=SV40 original replikacije. Nl = neomicin fosfotransferazni ekson 1, N2= neomicin fosfotransferazni ekson 2. LIGHT=humani imunoglobulinski kapa konstantan region. Heavy=Humani imunoglobulinski gama 1 ili gama 4 PE konstantan region. L=lider. SV=SV40 poiiadenilacioni region,

Slika 7a prikazuje amino kiselinsku i nukleinsku kiselinsku sekvencu varijabilnog lakog domena RF-1. (SEQ ID BR: 12)

Slika 7b prikazuje sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca antitela RF-1. (SEQ ID BR: 13)

Slika 8a prikazuje amino kiselinsku i nukleinsko kiselinsku sekvencu varijabilnog lakog domena RF-2. (SEQ ID BR: 14)

Slika 8b prikazuje sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca antitela RF-1. (SEQ ID BR: 15)

Slika 9a prikazuje amino kiselinsku i nukleinsko kiselinsku sekvencu RF-t lakog lanca, lidersku sekvencu i humanu kapa konstantnog domena sekvencu. (SEQ ID BR: 16)

Slika 9b prikazuje amino kiselinsku i nukleinsko kiselinsku sekvencu RF-1 teškog lanca, lidersku sekvencu i humanu/gama konstantnog domena sekvencu. (SEQ ID BR: 17, nukleotidi 1-750)

Slika 9c prikazuje humanu konstantnog domena sekvencu. (SEQ ID BR: 17, nukleotidi 751-1428)

Slika 10 prikazuje šematski NEOSPLA vektor.označen kaoNSKEl koji sadrži RF-1 nukleisnku kiselinsku sekvencu i humani gama/konstantan domen dat u si. 9a-9c.

Slika 1 la prikazuje amino kiselinsku i nukleinsku kiselinsku sekvencu RF-2 lakog lanca, lidersku sekvencu i humani kapa konstantan domen. (SEQ ID BR: 18)

Slika 1 lb prikazuje amino kiselinsku i nulleinsko kiselinsku sekvencu RF-2 teškog lanca, lidersku sekvencu i humani gama/konstantan domen. (SEQ ID BR: 19, nukleotidi 1-750)

Slika 11c opisuje amino kiselinsku i nukleinsku kiselinsku sekvencu humanog gama/konstantnog domena. (SEQ ID BR: 19, nukleotidi 751-1428)

Slika 12 prikazuje šematski NEOSPLA ekspresioni vektor označen kao NSKG1 koji sadrži RF-2 nukleinske kiseline sekvence i humanog gama/ konstantnog domena sekvence date na si. 1 la i 1 lc.

Detal jan opis pronalaska

Kao stoje diskutovano, predmetni pronalazak obezbeđuje novi veoma efikasan postupak za proizvodnju humanih monoklonalnih antitela na željene antigene, poželjno antigene koju učestvuju u humanim bolesnim stanjima. Antigeni koji učestvuju u humanim bolesnim stanjima su obično površinski antigeni koji obuhvataju podesne terapeutske mete za antitela. Na primer, uključuju površinske proteine virusa i antigena eskpresovanih na površini hunanih ćelija raka. U poželjnoj realizaciji, poželjni antigen će obuhvatiti fuzioni protein (F-protein) RSV-a.

Stanja humanih obolenja obuhvataju radi primera virusne infekcije, npr. RSV, papaloma Virus, hepatitis, AIDS, itd., kancer, bakterijske infekcije, gljivične infekcije, parazite infekcije, npr. malarija, itd. Ukratko stanja humanih obolenja obuhvataju stanje humanog obolenja potencijalno preventabilno tretibilno davanjem humanih monoklonalnih antitela specifičnih na određen antigen.

Predmetni postupak za dobijanje humanih monoklonalnih antitela uglavnom obuhvata kombinaciju in vitro primitizaciju prirodnih ćelija humane slezine, prenošenje ovih ćelija na imunopobećavajućeg donora, npr. SCID miša, zatim antigensko podsticanje SCID miševa kojima su date pomenute ćelije slezine. Iznenađujuće je nađeno da kombinovanje ova dva poznata postupka za proizvodnju humanih antitela daje sinergestičke rezultate. Specifično, daje veoma pojačane antigenski specifične odgovore na imunizirajući antigen kao i veoma velike titre humanih monoklonalnih antitela IgG izotipa. Specifičnije, nađeno je da ova kombinacija daje neočekivano visoke sekundarne odgovore: humani IgG odgovori u hu-SPL-SCID serumu su bili 10 puta viši od onih nastalih iz prenosa prirodnih ćelija u SCID a specifični antitelni odgovori su bili 1000 puta uvećani. Takođe, nađeno je da su antitela veoma afinitivna i specifično uporediva sa antitelima dobijenim u eksperimentalno hiperaktivnim životinjama. Takođe je nađeno da kada se koriste prirodne ćelije slezine, radi dobijanja takvih neočekivanih rezultata potrebno je izazvati sa antigenom in vitro i posle uvođenje u dobijenog hu-SPL-SCID miša. Takođe je poželjno ali nebitno uvođenje dodatnih svežih ćelija slezine koje nisu primarno izlagane u hu-SPL-SCID donora neposredno pre antigenskog podsticanja.Nađeno je da ovo dovodi do daljeg pojačavanja antitelnog odgovora.

Predmetni pronalazak je razvijen posle optimalnog in vitro primarnog izlaganja i podsticanja radi građenja sekundarnih odgovora iz prirodnih humanih ćelija slezine opisanog, u Brams et al, Hum.Antibod. Hvbridomas (1993), 4, 57-65. Ovaj protokol je nađeno da obezbeđuje za antigen specifične IgG odgovore oko 2-10 puta više od onih dobijenih iz kultura podvrgnutih antigenskoj stimulaciji. Ovaj in vitro imunizacioni (IV) protokol je razvijen i optimiziran koristeći veoma različite antigene, npr. konjski feritin (HoF), kalmodulin, prostatni specifični antigen (PSA), mišji IgG, transferin, Kevhole Limpet Hemocvanin (KLH) di-nitro fenil (DNP) vezan na T-ćelijski zavisne proteinske nosače

i RSV fuzioni (F) protein.

Ukratko, ovaj protokol obuhvata ponovnu stimulaciju kulture ćelije slezine na 1 dan posle početka kultivisanja sa antigenom zajedno sa autolognim ćelijama slezine u 1:1 odnosu. Pokazano je da IgG odgovori mereni koristeći ovaj protokol su bili rezultat ponovljenog antigenskog izlaganja i

ekvivalentni su sekundarnim odgovorima.

Ovi eksperimenti su dalje pokazali da nedirnute slezine su optimalni izvor limfocita uključujući trauma- i ITP slezinu. Suprotno, periferni krvni limfociti (PBLs) i ćelije iz krajnika i limfnih čvorića je pokazano da su inferiorniji za indukovanje antigen-specifičnih odgovora. Međutim, uklanjanje ili neutralizacija ćelijske komponente daje inferiornije odgovore, Boerner et al, J. Immunol. (1991), 147: 86-95. Tako, ovi eksperimenti su pokazali da za dati preparat ćelije slezine i antigen postoji jedinstvena optimalna antigenska koncentracija.

Stoga, dat je optimalni in vitro primarni i podsticani protokol za građenje sekundarnih odgovora iz prirodnih humanih ćelija slezine; pokazan je ovaj protokol u kombinaciji sa prethodnim in vivo postupcima za proizvodnju humanih monoklonalnih antitela, sa .SCID mišem. Ne zna se pre testiranja koji će efekat imati davanja antigenski primarno izlaganih ćelija slezine na proizvodnju humanih monoklonalnih antitela na dati antigen pomoću SCID miša ili na sposobnost održavanja humanih limfocita u mišu. Međutim, očekuje se da ovo obezbeđuje pojačano antigensko podsticanje i pojačanu ekspresiju in vitro antigenski primarno izlaganih prirodnih ćelija slezine.

Sa obzirom na ovo, prethodno je izneto da humani limfociti mogu sami biti uspostavljeni i da mogu ostati živi više meseci u SCIDs McCune et al, S cience (1988), 241,1632-1639, Lubin et al, Science (1991), 252:427. Međutim, kao stoje dato napred, prethodni postupci koji koriste SCIDs ili humana monoklonalna antitela prema antigenima koriste ćelije iz donora prethodno izloženih antigenu bilo prirodno ili vakcinacijom i obično ne daju visoke titre humanog antitela.

Sasvim iznenađujuće, nađeno je da kombinacija in vitro protokola primarnog izlaganja i podsticanja za građenje sekundarnih odgovora iz humanih prirodnih ćelija slezine Brams et al. Hum Antibod. Hvbridomas (1993), 4, 57-65 u hu-SCID modelu daje sinergističke rezultate izražene visokim značajnim antigenski specifičnim IgG odgovorima prema imunizirajućim antigenom.

Dalje, je takođe nađeno za kombinaciju ovih postupaka (koristeći konjski feritin (HoF) kao model antigena da: (i) uvođenje in vitro stupnja imunizacije pre prenosa u SCIDs je bitno za pouzdano indukovanje značajnih antigen-specifičnih odgovora; (ii) humane ćelije moraju biti prenesene u trbušnu maramicu radi postizanja opcionog održavanja humanih splenocita u SCID mišu; (iii) optimalna in vitro kultivacija je oko tri dana; (iv) korišćenje IL-2 i opciono IL-4 ili IL-6 in vitro daje najviše antitelne titre antigenski specifičnih odgovora u hu-SPL-SCID mišu; (v) hu-SPL-SCID u mišu se poželjno podstiče sa antigenom emulginovanim u adjuvantu, tj. Freunds Complete Adjuvant (FCA) i/ili Alum; (vi) ubijanje ili neutralisanje NK ćelija, mišjeg ili humanog porekla ne odgovara proizvodnji antitela. Međutim, nađeno daje korišćenje SCID-bež miša, NK

niske linije, kao domaćina za in vitro primarno izlagane ćelije, daje bolji odgovor kada se podsticanje vrši korišćenjem kombinacije adjuvanata, npr.

FCA i Alum.

(vii) slezine, ali ne i limfni čvorovi od oko 1/3 hu-SPL-SCID miševa su bile uvećane do 25 puta u poređenu sa nonnalirim SCIDs. Međutim, od ovih do 2/3 ćelija u takvim slezinama je testirano pozitivno za normalne humane limfocitne membranske markere.

Specifičnije, predmetni pronalazak obuhvata primarno izlaganje prirodnih humanih splenocita in vitro, za oko 1-10 dana, poželjno oko 3 dana sa antigenom, prenošenje primarno izlaganih ćelija u SCID miša i zatim podsticanje miša sa antigenom 3-14 dana kasnije, poželjno 7 dana kasnije. Pokazano je da ovo daje visoke antigenske specifične IgG odgovore u serumima dobijenih hu-SPL-SCID miševa od oko 24 dana. Obično, krajnji serumski titri su oko IO<6>(pola maksimalnih odgovora na oko 50 mg IgG/ml) pri korišćenju prirodnog antigena, konjskog feritina i IO<7>kada se pomenuti odgovor indukuje sa virusnim antigenom, tj. fuzionim proteinom RSV. Očekivano je na bazi ovih rezultata da se slični odgovori dobiju koristeći druge antigene.

Kao što je izneseno, optimalna indukcija željenog antitelnog odgovora zahteva antigensko podsticanje humanih ćelija in vitro i in vivo u hu_SPL-SCID mišu. Takođe je nađeno da IL-2 potreban tokom in vitro primarnog izlaganja i da IL-4 i IL-6 dati sa IL-2 dalje pojačavaju odgovore u hu-SPL-SCID mišu. Međutim, SCID rekonstituisanje je olakšano ali nije zavisno od istovremenog intraperitonelnog davanja ozračenih alogenih limfocita.

Dalje je nađeno da ima znatne varijacije u antitelnim odgovorima raznih slezina. Na primer neke slezine zahtevaju istovremeno unošenje antigena i svežih autolognih ćelija slezine 10 dana radi stvaranja antigenski specifičnih antitelnih odgovora. Takođe je nađeno da nivo antitelnih odgovora nešto varira u različitim hu-SPL-SCID-miševima. Međutim, bazirano na saznanjima u ovoj prijavi, stručnjaci lako mogu odabrati podesne uslove radi dobijanja optimalnog antigenski specifičnog antitelnog odgovora na dati antigen.

Na primer, testiranjem različitih preparata slezine na njihovu sposobnost da proizvode specifično antitelo u kulturi, tj. posle 10 dana in vitro imunizacije, može se identifikovati najveći odgovarač. Međutim, kako se veliki broj ćelija dobija i smrzava iz svake slezine, moguće je postaviti novu in vitro imunizaciju za tri dana iz odabrane slezine što je dalje praćeno prenosom u SCID miševe. Suprotno, drugi ćelijski materijali, npr. periferne krvne ćelije nisu podložni takvoj optimizaciji, daju sasvim ograničenu količinu PBL izdvojivu iz jednog donora u jednom prenosu.

Kao što je prethodno zapaženo, suprotno prethodnim radovima, nađeno je da za predmetni postupak, kada se koriste periferne krvne ćelije, neutralizacija humane NK aktivnosti nema efekta na slezine. Međutim, neutralizacija SCID NK ćelija sa komplementnim fiksirajućim anti-asialo GMI antitelima snižava antigen-specifične IgG odgovore. Suprotno, korišćenje SCID-bež miša, vrste sa redukovanim NK ćelijskim nivoima obezbeđuje znatno povećane-antigenski specifične IgG odgovore u odnosu na normalne SCID.

Dodatno, dva imunizaciona načina, intravenozno (IV) i intraperitonelno (IP) su upoređivana na svoju sposobnost obezbeđivanja rekonstitucije SCID miševa, npr. održavanje ćelija slezine i proizvodnje humanih antitela. Nađeno je daje trbušna maramica optimalno mesto prenosa ćelije i imunizacije. Međutim, danas, nije nađeno da prenos ćelija intravenozno učestvuje u repopulaciji kada je više od 0,01 ug/ml humanog IgG detektovano u mišjem serumu.

Takođe je nađeno da dobijene IgG koncentracije su direktno korelisane sa brojem prenetih humanih ćelija. Na primer, repopulacija SCIDs-a je bila 92% kada je 5T06 in vitro primarno izlaganih ćelija slezine injektirano intraperitonalno, i skoro 100% kada je 5T07 in vitro primarno izlaganih ćelija injektirano intraperitonalno. Stručnjak može bazirano na iznetom u ovoj prijavi, da odabere optimalan broj injektiranih in vitro primamo izlaganih ćelija slezine. Uopšteno, ovo će ići od oko 10<4>do oko IO<6>ćelija, poželjnije oko IO<6>do 10<8>ćelija i najpoželjnije bar oko 10<7>do IO<8>ćelija.

Takođe je nađeno da na antitelni odgovor deluje prisustvo određenog adjuvanta. Specifičnije, opaženo je da maksimalni humani antitelni odgovori se postižu kada su hu-SPL-SCID miševi podsticani sa antigenom emulgovanim u kompletnom Ferundovom adjuvantu (CFA) ili koristeći CFA i Alum zajedno. Testovi u hu-SPC-SCID podstaknutom sa feritinom su pokazali daje CFA bolji adjuvant od Alum-a dajući 33mg i 13 mg/ml humanog IgG respektivno. Kombinacija CFA i Alum-a ne poboljšava odgovor u SCID . Međutim, korišćenje ovih adjuvanata u SCID/bež-hu (koji obuhvataju mutaciju koja snižava aktivnost NK ćelije) daje 8-10 struko povećanje u IGG proizvodnji u odnosu na sam CFA. Međutim, očekuje se da drugi adjuvanti ili njihove kombinacije, mogu takođe da proizvedu ili čak poboljšaju rezultate. Najviši ukupan humani IgG koncentrat koristeći kompletan Freundov adjuvant i Alum zajedno je sadržavao 10 mg/ml i specifično najviša IgG koncentracija je bila oko 500 ug/ml monoklonalnog antitelnog ekvivalenta.

Korišćenje ovog postupka sa feritinom su proizvedeni antitelni odgovori uporedivi sa onima dobijenim u hiperimunim kozama, zečevima i svinjama sa obzirom na specifičnost, reaktivnost i korišćenje izotipova Ig lanca. Hu-SPL-SCID serumska antitela su uglavnom IgG, vezana samo na ćelije iz tkiva sa visokim feritinom i ne sa ćelijama iz tkiva sa niskim feritinom ili bez feritina i prepoznaju prirodni feritin kao i denaturisan feritin u Vestern bojenju. Ovi rezultati su veoma neočekivani kako u koncentraciji antitela tako i u antigenskoj specifičnosti dobijenih humanih antitela. Međutim, slični rezultati se dobijaju korišćenjem raznih antigena.

Poste injektiranja, nađeno je da humane ćelije teže da se akumuliraju na dva mesta, tj. trbušnoj maramici i mišjoj slezini. Mada više od 7% humanih ćelija nije nađeno u krvi, limfni čvorovi i jetra su imali humanog antigena između 25 i 33% ćelija je bilo humanog porekla u uvećanim slezinama i tumorima nekih životinja. Ove humane ćelije su bilo skoro isključivo B i T-ćelije, sa malom količinom CD14<+>ćelija, uglavnom monocita u uvećanim slezinama.

Ovi rezultati su dobijeni isptivanjem slezine, limfnih čvorova, jetre i trbušne maramice pomoću protočne citometrije. U slučajevima da humani splenociti repopulišu slezinu, nađjeno je da su slezene često uvećane do 25 puta u odnosu na prirodne SCID slezine. Humane ćelije činile su do oko 30% ukupnog broja ćelija u slezini izmerenih odmah posle ekstrakcije sa ostatkom nepoznatog porekla. Međutim, posle 3 dana u kulturi, većina preživelih ćelija je nađeno daje humanog porekla kao ćelija vezanih sa antitelima koje ne pokazuju ukrštenu reaktivnost sa mišjim limfocitima.

Dalje je opaženo da rekonstituciju miševi mogu biti podeljeni u dve grupe, oni sa normalnom veličinom slezine i oni sa uvećanim slezinama.

Hu-SPL-SCID miševi sa uvećanim slezinama, npr. sa 25 puta većim od normalnih su imali nivoe humanog IgG oko 150 puta više od onih sa normalnim slezinama i nivo antigenske specifičnosti; humanog IgG oko 10000 viši od onog sa normalnom veličinom slezine koji su tretirani slično. Takođe je nađeno da relativni afinitet antigenskog specifičnog odgovora raste kroz odgovor što pokazuje da veći procenat ukupnog imunoglobulinskog rezervoara je obuhvatao antitela koja imaju bolje osobine vezivanja. Ovi rezultati pokazuju da sistem je antigenski pokretan.

Ovi rezultati su veoma značajni i pokazuju daje obično moguće osloboditi humane ćelije iz hu-SOL-SCID i koristiti iste za stvaranje kombinatorijskih biblioteka humanih antitelnih gena koji daju humana monoklonalna antitela visokog afiniteta i specifičnosti koja mogu biti korišćena klinički i/ili dijagnostički.

Specifičnije, predmetni pronalazak obezbeđuje nova humana monoklonalna antitela za RSV F-protein koja pokazuju visok afinitet prema RSV F- proteinu, npr. <2*10"<9>M i koja su sposobna za neutralizaciju RSV in vitro. Predmetni pronalazak dalje obezbeđuje postupke za proizvodnju takvih humanih monoklonalnih antitela za RSV F-protein.

Uopšteno, takva humana antitela su dobijena in vitro imunizacijom prirodnih humanih splenocita sa RSV F-proteinom, prenosom tako ino vitro imuniziranih humanih splenocita u imunodeficijentnog animalnog donora, npr. SCID miš, podsticanje pomenute životinje sa RSV F-proteinom, i izolovanje iz životinje humanih B-ćelija koje luče humana monoklonalna antitela sa RSV F-proteinom, imunizaciju B ćelija radi odabiranja ćelija koje luče humana monoklonalna antitela koja imaju visok afinitet za RSV F-protein poželjno bar IO"<7>M i poželjnije < 2»10"<9>M.

Kao što je diskutovano nađeno je da kombinacija in vitro imunizacije naročito humanih splenocita, npr. koji su ili nisu prethodno izloženi RSV F-antigenu i prenesene u imunodeficijentni animalni donor, npr. SCID miš koji je tada podstican sa RSV F-proteinskim antigenom daje značajne prednosti u odnosu na uobičajene postupke za dobijanje humanih antitela u SCID miševima. Naime, obezbeđuje veoma visoke antitelne titre, tj. najviši anti-F proteinski titri su oko IO"<7>, visoke IgG koncentracije, npr. oko 3 mg/ml za najviše odgovarače. Međutim, ovaj postupak obezbeđuje proizvodnju humanih antitela koja imaju veoma visoke podesne kombinacije osobina, npr. koja pokazuju visok afinitet za RSV F-protein i koja pokazuju znatnu in vitro neutrališuću aktivnost.

Kao što je opisano detaljnije u primerima, predmetni pronalazači su izolovali dva humana monoklonalna antitela, RF-1 koja pokazuju afinitivnu konstantu Ka za F-protein, Ka=10<10>M

određenu pomoću plazmon rezonance i RF-2 koja pokazuju afinitivnu konstantu Ka=5,10<10>M određenu mikrokulometrijskom titracijom. Takođe, izračunato Kd za RF-2 je 2*IO"<9>M. Međutim,

oba ova antitela pokazuju in vitro virusne neutralizacione osobine pri koncentracijama između 8 i 120 ng/ml i pokazuju sposobnost inhibicije fuzije prethodno RSV inficiranih ćelija. Značajno, ova in vitro neutrališuća aktivnost je primenljiva protiv raznih divljih i laboratorijskih RSV vrsta A i B virusnih tipova.

Dodatno ovim rezultatima, tj. visok afinitet subjektnih antitela za RSV F-protein koji obuhvata površinski protein ekspresovan na površini RSV inficiranih ćelija, kao i sposobnost efikasnog neutralizovanja virusa i inhibicija fuzije viruski inficiranih ćelija, subjektna humana monoklonalna antitela treba da su podesna kao terapeutski i profilaktički agensi, npr. za tretiranje ili prevenciju RSV infekcije u popustljivim ili RSV inficiranim subjektima. Kao što je izneto, RSV infekcija uglavnom preovladava kod dece ili imunodeficijentni h osoba. Stoga, subjektna monoklonalna antitela su posebno poželjna za prevenciju ili tretiranje RSV infekcije u takvim subjektima.

Međutim, data subjektna monoklonalna antitela humanog porekla su naročito podesna za pasivnu imunoterapiju. Ovo je zato što neće biti lako subjekt potencijalnih ograničenja mišjih monoklonalnih antitela, na pr. HAMA odgovori i odsustvo normalnih afektorskih funkcija. Ustvari bazirano na karakterizaciji subjektnih monoklonalnih antitela (opisanih u primerima niže), jasno je da RF-1 i RF-2 pokazju znatno višu in vitro aktivnost i sposobnost inhibiranja fuzije prethodno inficiranih RSV ćelija od prethodno opisanih mišjih ili himernih anti-F protein antitela i humanih Fab fragmenata izvedenih iz rekombinantlih biblioteka. Takođe zbog njihovog humanog porekla očekuje se da takva neutralizaciona aktivnost bude održana posle in vivo unošenja.

Druga prednost subjektnih monoklonalnih antitela je njihovo znatno odsustvo reaktivnosti sa normalnim tkivima. Kao što je pokazano niže, subjektna humana monoklonalna antitela vezuju samo RSV inficirane ćelije, ne ćelijske linije koje predstavljaju limfoidno tkivo, jetru, prostatne ili laringelne epiderme. Stoga, ova antitela posle in vivo unošenja treba efikasno da vežu RSV inficirane ćelije i time obezbeđuju neutralizaciju RSV infekcije. Dalje, bazirano na opisanim osobinama, očekuje se da subjektna humana monoklonalna antitela prema RSV F-proteinu mogu biti korišćena za zaštitu popustljivog domaćina protiv RSV infekcije.

Specifičnije, subjektna humana monoklonalna antitela za RSV F-protein se dobijaju dobijenjem humanih splenocita iz traumatskih ili ITP izvora, koji se tada primarno izlažu in vitro. Ovo uglavnom obuhvata kultivisanje pomenutih prirodnih humanih splenocita in vitro u prisustvu dovoljne količine IL-2 i po izboru RSV-F proteina radi indukovanja imunizacije, takođe nazvano kao antigensko primarno izlaganje. Uopšteno, količina RSV F-proteina koji može biti korišćen u granicama je od oko 1 do 200 ng/ml RSV proteina, poželjnije 10 do 100 ng/ml i najpoželjnije oko 40 ng/ml RSV F-proteina.

In vitro sredina kulture će poželjno da sadrži limfokine tačnije IL-2 i po izboru IL-4 i IL-6. Njihova količina će biti ona koja obezbeđuje imunizaciju i željenu proizvodnju ćelija koje proizvode antitelo. Na primer, u slučaja IL-2, količina ide od oko 5 do 200 IU/ml, poželjnije od oko 10 do 50 IU/ml, najpoželjnije 25 IU/ml je podesna.

Ova sredina kulture će da sadrži takođe druge sastojke potrebne za održavanje vitalnosti humanih splenocita u kulturi, npr. amino kiseline i serum. U primerima je korišćena sredina kulture koja sadrži IMDM dopunjena sa 2mM glutamina, 2mM natrij um piruvata/ ne-bitne amino kiseline, 25 IU/ml IL-2 i 20% serum zametka govečeta, Međjutim, stručnjaci na bazi datog opisa mogu da promene sredinu kulture koristeći rutinsku optimizaciju.

In vitro imunizacioni stupanj će biti izveden za vreme dovoljno da izazove imunizaciju. Obično, delije će biti kultivisane u prisustvu RSV F-proteina od oko 1 do 10 dana i poželjno

za oko 3 dana. Međjutim, ovo će varirati zavisno od određenog uzorka slezine. Slično, stručnjak

će na bazi opisa i koristeći poznate tehnike moći da odredi podesno trajanje in vitro imunizacionog stupnja.

Antigen korišćen za in vitro imunizaciju će poželjno biti prečišćen RSV F-protein čime se osigurava da se splenociti imuniziraju protiv F-proteina i ne protiv drugih korišćenih (ne-površinskih) antigena. Postupci za dobijanje prečišćenih RSV proteina su poznati u tehnici. Predmetni pronalazači određenije koriste postupak VValsh et al, J. Gen. Virol., 70, 2953-2961, 1989. Međutim, dati postupak ne garantuje da dobijen RSV F-protein je dovoljne čistoće za dobijanje humanih monoklonalnih antitela koja imaju specifičnost prema RSV F-proteinu. Alternativno, RSV F-protein može biti proizveden rekombinantnim postupcima kao što je opisano u US patentu br. 5288630 od 22.02.1994.

Posle in vitro imunizacije, RSV F-protein imuniziran ili primarno izlagani prirodni humani splenociti se tada uvode u imunodeficijentnog donora, npr. SCID miša. Ovo se poželjno izvodi intraperitonalnim unošenjem RSV F-proteinski primarno izlaganih humanih splenocita u SCID miša. Broj takvih splenocita koji će biti dati varira obično od oko IO<4>do IO<8>ćelija slezine, sa oko 10<7>do 10<8>je poželjnih ćelija slezine. Broj takvih ćelija onaj koji daje željenu rekonstituciju npr. SCID miš koji proizvodi izdvojive koncentracije humanih antitela specifičnih na RSV F-protein. Poželjno, takve ćelije slezine će biti suspendovane u HBSS pri koncentraciji od oko 8 • 10<8>ćelija/ml pre unošenja.

Posle intraperitonalnog transfera splenocita, SCID miš se tada podstiče sa RSV F-proteinom. Ovo se vrši neposredno posle transfera splenocita tako da se odvija željena proizvodnja humanih anti-RSV F-proteinskih antitela. Obično, ovo može biti izvedeno 3 do 14 dana posle prenosa i optimalno 7 dana posle prenosa. Poželjno, unošenje datog antigena se vrši intraperitonalno. Količina datog RSV F-proteina će da ide od oko 1 do 50 ug i poželjno oko 1 do 10 ug. U primerima je unošeno 5 ug proteina. Međutim, količina i vreme imunizacije mogu da variraju zavisno od određenog miša, uzorka slezine i čistoće RSV F-proteina.

Poželjno, antigensko podsticanje će biti vršeno u prisustvu adjuvanta, npr. kompletan Freundov adjuvant, Alum, Saponin itd, sa kompletnim Freundovim adjuvantom i Alumom kao poželjnim. Međutim, očekuje se da drugi poznati adjuvanti mogu biti korišćeni radi dobijanja uglavnom ekvivalentnih ili boljih rezultata.

Posle antigenskog podsticanja, SCID mišu se uzme krv, npr. repna krv i serum se testira na koncentraciju humanog IgG i titre anti-F protein antitela. One životinje koje pokazuju najveće antitelne titre i koncentraciju se tada koriste za izdvajanje ćelija koje luče humani IgG.

Otkriveno je da SCID miš koji ima najviše anti-F protein antitelne titre ima razvijene velike abdonalne tumore koji predstavljaju dobar izvor ćelija koje luče humano antitelo. Poželjno, ovi tumori se izdvajaju isecanjem pod sterilnim uslovima, pripremaju se suspenzije singl ćelije i ćelije se ispiraju i kultivišu. U primerima, ćelije su ispirane sa IMDM koji sadrži 2% serum zametka govečeta i ćelije se kultivišu u suspenzije 10 ćelija/ml u T-25 bocama koje sadrže IMDM sa 10% FCS. Međutim, takvi uslovi kultivišanja mogu biti promenjeni od strane stručnjaka.

Ove ćelije se tad imortalizuju poželjno koristeći EBV. Usmrćene ćelije koje luče anti-F protein antitela se tada identifikuju poznatim postupcima, npr. ELISA. Kao što je izneto, ovaj postupak identifikuje dva različita humana monoklonalna antitela koja specifično vezuju RSV F-protein, npr. RF-1 i RF-2 . Međutim, bazirano na opisu datom u pronalasku, naročito primerima, druga monoklonalna antitela na RSV F-protein koja imaju slične osobine se mogu dobiti. Ova antitela se razlikuju usled činjenice da se većina dobijaju u dva različita eksperimenta koristeći različite SCID miševe. Ćelijske linije koje ekspresuju RF-1 i RF-2 su održavane u kulturi duže vreme, npr. 18 i 16 meseci respektivno; i se dele sa približnim vremenom dupliranja od oko 36-48 časova. Koncentracija specifičnog antitela je prosečno oko 0,8-1 ug/ml u kulturi zasejanoj na 0,5 IO<6>ćelija/ml rasloj 3 dana.

Kao što je diskutovano detaljnije niže, oba RF-1 i RF-2 su IgG (l,k) sa polumaksimalnim vezivanjem na F-protein u ELISA na 0,6 i 1 ng/ml, respektivno pokazuju izoelektrične tačke od oko 8,8 i 8,9 respektivno.

Međutim, ova antitela pokazuju veliki afinitet prema RSV F-proteinu. Specifično, za RF-1

kao što je određeno pomoću plazmon rezonance na IASYS mašini je oko 10"<10>M. Ka konstanta za RF-2 je slično visoka; kada se određuje mikrokulometrijskom titracijom prema Wiseman et al,

(1989) i Robert et al. (1989) je oko < 2»10"<9>M.

Dodatno, ova antitela je pokazano da efikasno vezuju RSV inficirane ćelije mada ne vezuju normalne testirane humane ćelije, npr. obloga respiratornog trakta (HEp-2, Iarigel epidermoidni karcinom, CCL 23) jetra (HepG2, humana hepatoma ćelijska linija, HB 80686, limfoidno tkivo, SB, humana B limfoblastoidna ćelijska linija, kat.br. CCL 120 i HSB, T limfoblastoidna linija kat.br. CCL 120.1 i prostata (LNCaP, FGC, humana prostata adenokarcinomska linija, kat.br. CRL 1740).

Značajno, obe RF-1 i RF-2 je pokazano je da pokazuju znatnu in vitro RSV virusnu neutralizaciju. Ovo je pokazano u dva različita ispitivanja (opisana detaljnije niže) npr. ispitivanje neutralizacije infekcije je izvršeno pre-reagovanjem virusa sa prečišćenim monoklonalnim antitelom pre njegovog dodavanja ćelijama (pri čemu se meri sposobnost antitela da inhibira virusnu infektivnost) i ispitivanje inhibicije fuzije mereno merenjem sposobnosti monoklonalnog antitela da inhibira rast virusa i ekspanziju posle dolaska virusa u ćeliju.

Međutim, kao što je detaljnije diskutovano niže, oba RF-1 i RF-2 inhibiraju virusnu infekciju 12 različitih izolata pri koncentracijama koje idu respektivno od oko 30 ng/ml do 1000 ng/ml. Tako, RF-2 je jasno bolji od RF-1 dajući 50% virusnu inhibiciju (ED50) pri koncentracijama koje su oko 1,25 do 10 puta niže nego one za RF-1.

Suprotno, više koncentracije monoklonalnog antitela su zahtevane za inhibiciju fuzije i ekspresiju virusnog antigena u prethodno inficiranim ćelijama sa RF-1 koji je oko 5 do 10 puta moćniji od RF-2. Međutim, oba RF-1 i RF-2 su efikasni protiv tipa B RSV, Tipa B prototipa RS 6556 i Tipa A RSV, Tipa A prototipa RS dugog. Tako, in vitro pokazuju da subjektna humana monoklonalna antitela mogu biti korišćena za tretiranje ili prevenciju RSV infekcije izazvane pomrjću različitih RSV vrsta, oba Tipa A i Tipa B prototipa. Kao što je diskutovano napred, RSV F-protein je sasvim dobro očuvan u raznim RSV izolatima. Stoga, izgleda da subjektna monoklonalna antitela za RSV F-protein vezuju očuvan epitop RSV F-proteina.

Kao što je diskutovano, subjektna humana monoklonalna antitela ili rekombinantna humana antitela koja sadrže varijabilne teške i lake njihove sekvence (dobijanje diskutovano niže) će biti korišćena kao terapeutski i profilaktički agensi za tretiranje ili prevenciju RSV infekcije pasivnom antiteinom terapijom. Tačnije, DNA sekvenca koja kodira ove DNA varijabilne domene može biti ugrađena u IDEC-ov ekspresioni vektor koji je prikazan na sl.2. Ova je dato u US prijavi ser.br. 08/379072 od 25.01.1995. koja je ubačena ovde referncom. Ovaj vektor, na primer humani gama 1, humani gama4 ili njihov mutiran oblik označen kao gama 4 PE (vidi US ser. br. 0 8/379072). Uopšteno, ovo će da obuhvati davanje terapeutski ili profilaktički efikasne količine subjektnih humanih monoklonalnih antitela popustljivom subjektu ili onom koji pokazuje RSV infekciju. Doziranje efikasne količine će poželjno ići od oko 20 do 20000 ug/kg, poželjnije od oko 100 do 5000 ug/kg. Međutim, podesna doza će varirati zavisno od faktora, takvih kao što je stanje tretiranog domaćina, masa itd. Podesne efikasne doze mogu biti određjene od strane stručnjaka.

Subjektna humana monoklonalna antitela mogu biti unošena nekim podesnim načinom za unošenje antitela. Obično, subjektna antitela se injektiraju, npr. intravenozna, intramuskularna ili intraperitonalna injekcija ili poželjnije se unose pomoću aerosola. Kao što je prethodno dato, aerosolna primena je naročito podesna ako tretirani subjekti su novorođenčad.

Formulisanje antitela u farmaceutski prihvatljiv oblik se može izvesti poznatim postupcima, koristeći farmaceutske nosače i eskcipiente. Podesni nosači i ekscipijenti radi primera uključuju puferisani slani rastvor, goveđi serum, albumin, itd.

Međutim, subjektna antitela usled svoje visoke specifičnosti i afiniteta prema RSV

inficiranim ćelijama se mogu koristiti kao imunoprobe za dijagnoze RSV infekcije. Ovo će obično da obuhvati uzimanje uzorka, npr. respiratornog fluida osobe za koju se sumnja da ima RSV

infekciju i inkubiranje uzorka sa subjektnim humanim monoklonalnim antitelima radi detektovanja prisustva RSV inficiranih ćelija.

Ovo će da obuhvati direktno ili indirektno obeležavanje subjektnih humanih antitela sa reporterskim molekulom koji obezbeđuje detekciju naprimer humano monoklonalno antitelo-RSV imunih kompleksa. Primeri poznatih obeleživača uključuju radi primera enzime, npr. beta-

laktamaza, luciferaza, itd. i radiobeleživače.

Postupci za vršenje imunodetekcije antigena koristeći monoklonalna antitela su dobro poznati. Takođe, subjektna anti-RSV F-protein antitela u kombinaciji sa dijagnostički efikasnom količinom podesnog reporterskog molekula mogu biti formulisana kao testirajuća oprema za detekciju RSV infekcije.

Materijali i postupci

U primerima 1-6 su korišćeni sledeći materijali i postupci.

Dobijanje F proteina i njegovo prečišćavanje F protein je dobijen uglavnom prema postupku Walsh et al, J. Gen. Virol. 70,2953-2961 (1989). Ukratko, HEp-2 ćelije pri 70% konfluenci su inficirane sa Dugom vrstom RSV, laboratorijski adaptirana vrsta A tipa. Posle kultivisanja 48 časova u T-150 bocama za kultivisanje u IMDM-u dopunjenim sa 5% serumom zametka govečeta, 2mM glutamina i 2mM natrijum piruvata, ćelije su lizirane u lizirajućem puferu PBS koji sadrži 1% Triton X-100 i 1% deoksiloat. F protein je prečišćen iz sirovog ćelijskog lizata na afinitivnoj koloni Sephedex kuplovanoj sa mišjim monoklonalnim anti-F antitelom, B4 (vrsta poklonjena od Hirovki Tsutsumi) (Tsutsumi et al. 1987). Kolona je isprana dobro sa lizirajućim puferom i prečišćen F protein je eluiran u 0,1M glicin pH 2,5 koji sadrži 0,1% deoksiholata. Eluat je neutralisan odmah sa IM Tris, pH 8,5 i dializiran na suprot PBS. Pošto je deterdžent uklonjen na Extrakti-D gel koloni (Pierce, Rockford, IL, kat.br. 20346), koncentracija F proteina je određena pomoću EIA i rastvor je sterilisan pomoću gama zračenja.

Pobijanje limfoidne ćelije

Slezina je dobijena posle klinički utvrđene splenektomije idiopatičnog trombopeničnog purpura (ITP) pacijenta. Singl-ćelijska suspenzija je dobijena prosejavanjem kroz metalno sito i isprana u IMDM sredini dopunjenoj sa 2% serumom zametka govečeta. Crvene krvne ćelije su uklonjene tretiranjem sa amonijum hloridim lizirajućim puferom tokom 90 sekundi na 37 °C. Obogaćena suspenzija belih krvnih ćelija je tada isprana dva puta sa serumom koji sadrži sredinu, resuspendovana u ledeno ohlađenu sredinu (95% FCS sa 5% DMSO) pri 10 ćelija/ml i zamrznuta u tečnom azotu do korišćenja.

In vitro imunizaciia ( IVI)

Kultivisanje je vršeno u IMDM dopunjenom sa 2mM glutamina, 2mM natrijum piruvata, ne-bitnim amino kiselinama, 25 ug/ml IL-2 i 10% serumom zametka govečeta. Dodat je antibiotksi koktel koji sadrži 2,5 ug/ml amfoterieina, 100 ug/ml ampicilina, 100 ng/ml kanamicina, 5 ug/ml hlortetraciklina, 50 ug/ml neomicina i 50 ug/ml gentimicina. Ćelije su kultivisane u 6-okcnim klasterima pri 3 -106 ćelija/ml sa 40 ng/ml F proteina. Posle trrdana, ćelije su sakupljene, isprane i resuspnedovane u HBSS pri 8T0 ćelija/ml radi SCID rekonstituisanja.

Rekonsituisanje SCID miševa

Pet do osam sedmica stare ženke CB17/SCID miševa su rekonstituisane pomoću intraperitonalne injekcije 200 ul HBSS koji sadrži 4-IO<7>humanih ćelija slezine podvrgnutih imunizaciji (IVI); miševi su podsticani sedmicu kasnije sa 5 p.g F proteina u CFA i iz repa im je posle 15 dana uzimana krv. Njihov serum je testiran na koncentraciju humanog IgG i anti-F protein antitelni titer.

Izdvajanje humanih ćelija iz hu/ SCID miševa

Dva hu-SPL-SCId miša sa visokim anti-F humanim antitelnim titrima su imala razvijene velike abdominalne tumore. Tumori su izdvojeni isecanjem iz usmrćenih miševa pod sterilnim uslovima, pripremljana je singl ćelijska suspenzija, ćelije su isprane sa IMDM koji sadrži 2% seruma zametka govečeta i ku.ltivisane pri IO<6>ćelija/ml u T-25 bocama u IMDM sa 10% FCS.

Testiranje za humani IgG i anti- F protein antitela

Testiranje za humani IgG i anti-F antitela je izvršeno u ELISA. Za ovu svrhu, ploče su prekrivene preko noći sa GAH-Ig (0,05 ug/okcu) ili F proteinom (0,05 (ig/okcu) respektivno u 0,1M bikarbonatnom puferu, pH 9,5 i blokirane sa PBS koji sadrži 1% seruma zametka govečeta. Serije razblaženja mišjeg seruma, suprnatanata kulture ili prečišćenih antitela su reagovale na tacni. Vezani humani IgG je oslobođen uzastopnim dodavanjem GAH IgG-HDR i OPD substrata (Sigma). Odabrani visoko titarski humani serum je korišćen kao pozitivna kontrola u oba ispitivanja i prečišćen poliklonalni humani IgG ili (gama, kapa) mieloma protein je korišćen kao standard u proceni koncentracije humanih IgG i monoklonalnih antitela, respektivno.

Izotipiranie humanih antitela

Izotipiranje je izvršeno u ELISA na F proteinom prevučenim pločama kao što je opisano napred. Vezani humani IgG je oslobođen uzastopnim dodavanjem HRP konjugovanih mišjih monoklonalnih antitela specifičnih za humane gamal, gama2, gama3, gama4, mi, kapa i lambda lance. Pozitivne kontrole su išle sa mieloma proteinima (gamal, kapa), (gama2, kapa), (gama3, lambda), (gama4, lambda) ili (lambda, lambda) izotipom i lancima bez kapa i lambda.

Prečišćavanje A proteina

Antitela su prečišćena iz supernatanat kulture na protein A-Sepharose 4B koloni. Ukratko, supernatanti su prikupljeni, profiltrirani kroz 0,2mm filtere i dopunjeni sa 0,02% natrijum azidom. Kolone (gel zapremine oko 0,5 ml) su uravnotežene u PBS sa 0,02% natrijum azida, tada su šaržirane sa supernatantom malom brzinom. Posle dobrog ispiranja, vezan humani monoklonalni IgG je eluiran u 0,1M natrijum citratnom puferu, pH3,5, dijaliziran nasuprot PBS-azidu koristeći Centricon 10 filtere (Amicon) i sterilisan pomoću gama zračenja pre daljeg korišćenja. Kolone su regenerisane sa limunskom kiselinom pH 2,5 i ponovo uravnotežene sa PBS sa 0,02% natrijum azida za dalje korišćenje.

Izoelektrično fokusiranje

Izoelektrično fokusiranje (IEF) humanih antitela je izvršeno u poliakrilamidnom prelivenom gelu (Pharmacia, Uppsala, Sweden, kat. br. 80-1124-80),, pH 3-10. Ukratko, 20 ul uzoraka je šaržirano i stavljeno na 1500 volti 90 minuta. Standardi pi 5,8 do 10,25 su korišćeni zapi referencu. Gelovi su bojeni u Kumasi plavoj boji i odbojavani u puferu koji sadrži 25% metanola, 68% vode i 8% sirćetne kiseline.

Vestren blotiranje

Prečišćen F protein, prirodan i denaturisan kuvanjem, pusti se da migrira u 10% poliakrilamidni gel. Gel se nanese na nitrocelulozni list pri 30 volti tokom 2 časa i pri 60 volti preko noći. Posle prenosa, nitroceluloza se blokira 1 čas na sobnoj temperaturi sa 1% BSA i 0,1% Tween-20 u PBS. Različite trake se isperu u PBS i tokom jednog časa dodaju se primarno izlagana antitela, hu-SPL-SCID anti-F proteinski serumi ili hu-SPL-SCID anti-tetanus toksoidna negativna kontrola ili mišja anti-F protein pozitivna kontrola. Svi serumi se razblaže 1:5000. Posle dobrog ispiranja sa PBS, tokom 1 časa dodaju se sekundarna antitela, GAH IgG-HRP za uzorke i negativna kontrola ili GAM IgG za pozitivnu kontrolu. Oslobađanje se vrši sa 4-hIoro-l-naftolom.

Imunofluoroscencija

RSV inficirane HEp-2 ćelije (4-IO<4>) su fiksirane na staklo koristeći ledeno ohlađen aceton i tretirane sa 20 ul seruma razblaženog 1:10 ili prečišćenim MAb-om, 2 ug/ml, jedan čas na 37°C. Staklo je isprano i vezana antitela su oslobođena sa GAH IgG-FITC tokom 30 minuta na 37°C i ispitivana pod fiuorescencnim mikroskopom.

FACScan analiza

RSV-inficirane HEp-2 ćelije (10 ćelija/uzorku) se isperu sa puferom za ispiranje (PBS sa natrijum azidom 0,1%) . Ćelijska peleta se resuspnduje u 50 |il inkubacionog pufera (PBS sa natrijum azidom 0,1% dopunjenim sa BSA 0,1%) koji sadrži 2 ng/ml RF-1 ili RF-2. Posle 15 minuta inkubacije na ledu, ćelije su isprane i ponovo suspendovane u inkubacioni pufer koji sadrži GAH IgG-FITC za sledećih 15 minuta na ledu. Posle tri ispiranja, ćelije su fiksirane u 1 ml PBS sa 1% formaldehidom i analizirane u Becton-Dickinson FACScan aparaturi.

Određivanje afiniteta

Dva postupka su korišćena za određivanje afiniteta za humani MAbs prema solubilnom F proteinu: U plazmon rezonanci, koristedi IASYS mašinu, antitelo je vezano kovalentno na vlažnu stranu uređjaja iz koga je promena mase mogla da se odredi bazirano na promeni refrakcije svetlosti na suvoj strani uređaja. Dodavane su različite koncentracije F-proteina i zatim eluirane sa stabilnim protokom PBS. Promena mase kao rezultat oslobađana F-proteina iz anitela se meri i određuje se Koffiz kinetike. Ka se izračunava testiranjem off-rate vrednosti iz različitih nivoa početne saturacije.

Alternativno, afinitivna konstanta se određuje pomodu mikro-kalorimetrije prema Wiseman et al i Robert et al, kao što sledi: RF-2 i F protein se ko-inkubiraju pri poznatoj koncentraciji u termo-prostoriji na 42°C i meri se promena entalpije usled građenja imunog kompleksa u rastvoru. Reakcija se ponavlja na 50°C . Vezujuda asocijativna konstanta K se izračunava kao funkcija temperature i promene entalpije prema Robert et al, pomodu sledede jednačine:

K=Kobs e đHob^( 1rt- 1tr°bs).^^ obs^( lft- i™ °te).( Tff0iJS) đc/ R

gde Kobs je vezujuća ravnotežna konstanta a AHobs je promena entalpije određena eksperimentalno, na

datoj apsolutnoj temperaturi, Tobs; R je univerzalna gasna konstanta (1,987 kal.) i AC je eksperimentalno određena promena vezujućeg toplotnog kapaciteta.

Ispitivanje komplementno- poiačane virusne neutralizacije

Dve laboratorijske vrste (Duga tip A i 18537, tip B) i 10 divljih, tip RS virus izolati koji su izolovani iz hospitalizovane dece, su korišćene za ispitivanje neutralizacionog kapaciteta anti-F protein humanog MAbs. Serije razblaženja humanog MAb su inkubirane sa virusom (50-100 pfu) u prisustvu komplementa 30 minuta na sobnoj temperaturi u 100 \ i\ IMDM/okcu mikrotitracione ploče. HEp-2 ćelije ( 5T04 ćelije) su dodate u 100 ul i inkubirane tri dana na 37°C, 5% CO2

Ploče su isprane, fiksirane sa acetonom, vazđušno osušene i RSV antigen je detektovan pomoću ELISA koristeći mišji MAbs. Završna tačka neutralizacije je određivana arbitražno kao razblaženje koje smanjuje antigensku proizvodnju za 50% upoređenju sa kontrolnim okcima koja nisu sadržavala antitelo.

Ispitivanje inhibiciie fuzije virusa

Titri inhibicije su određivani pre-inkubiranjem 100 TCID50RSV dugog (prototip A virusa) ili RS 6556 (Tip B klinički izolat) sa VERO ćelijama (5T03 /okcu) u mikrotitracionim pločama 4 časa na 37 °C, 5% CO2. Razne koncentracije humanih monoklonalnih antitela ili kontrola su dodavane svakom okcu i učetvorostručene kulture su inkubirane 6 dana na 37°C, 5% CO2. Kontrolne kulture su sadržale virus ne inficiranih ćelija (negativne) ili inficiranih ćelija u odsustvu antitela (pozitivne). Rast virusa je detektovan u ELISA koristeći zečje poliklonalne anti-F protein antiserume i HRP-obeležen anti-zečji IgG. Reakcija je razvijena sa TMBlue supstratom (KPI, Gaithersburg, MD) Titri (ED50) su definisani kao koncentracija antitela koja inhibira rast virusa 50% bazirano na regresionoj analizi MAb doznog odgovora.

Primer 1

HU-SPL-SCID titri:

15 SCID miševa je primilo ćelije humane slezine iz jednog donora sa ITP stanjem. Ćelije su prethodno kultivisane 3 dana u prisustvu IL-2 i različitih koncentracija solubilnog F proteina. Sve životinje su uzastopno rekonstituisane i posle podsticanja sa F proteinom, ukupne koncentracije humanog IgG su varirane od 12 ng/ml do 10 mg/ml u serumu i anti-F protein titri su varirani od 3 IO<2>do 106. (Tabela I).

Nije opažena korelacija između in vitro F protein izlaganja i anti-F protein titra in vivo.

Prethodno je opaženo sa subjektnim postupkom, u konjskom feritin antigen sistemu, daje antigensko izlaganje potrebno tokom in vitro kultivisanja ćelija slezine radi obezbeđjivanja zatim specifičnog antitelnog titra. Neslaganje između ova dva sistema može biti pripisano razlici u zahvaćenim genima: kako ljudi prirodno nisu izloženi konjskom feritinu, stupanj IVI obuhvata antigensko primamo izlaganje ćelija slezine i indukuje primarni odgovor in vitro; sa druge strane, skoro svi ljudi su imuni na RSV prirodnu infekciju u najranijem dobu svog života, što dovodi do stalne memorije na F-protein, stoga, stimulacija sa IL-2 samim in vitro pradena podsticanjem in vivo je dovoljna da izazove sekundarne odgovore.

Antiserumi su bili poliklonalni kao što je pokazano iz načina izoelektričnog fokusiranja (podaci nisu prikazani). Testirani su na reaktivnost prema F proteinu u Vestern blotiranjskoj tehnici. Naši rezultati su pokazali da poliklonalni humani Abs prepoznaju solubilni prirodni F protein kao u svom dimernom obliku (140 KD) tako i svom monomernom obliku (70 KD); takođe su jako reagovali sa denaturisanim F proteinom vezujući se specifično na 2 subjedinice 48KD i 23KD (reprezentativni podaci na si. 1). Ovo sugerira da bar frakcija humoralnog odgovora na F protein je usmerena protiv, linearnih, nekonformacionih epitopa molekula. Imunofluorescencna proučavanja su dalje pokazala specifičnost hu-SPL-SCID seruma, dakle imunih seruma, ali neprirodnih SCID mišjih seruma, jakog reagovanja sa RSV-inficiranim HEp-2 ćelijama (slika 2). Nije opažena reaktivnost prema neificiranim HEp-2 ćelijama korišćenim kao negativna kontrola. Stoga se zaključuje da solubilni F protein je adekvantni antigen za stvaranje antitela specifičnih na membranski virusni antigen ekspresovan na prirodno inficiranim ćelijama.

Primer 2

Identifikacija antitela u kulturama ćelija tumora

Svi miševi sa visokim anti-F proteinskim titrima su usmrćeni i humane ćelije su prikupljene iz peritonalnog ispiranja i slezina. Dva miša (hu-SPL-SOD#> i hu-SPL-SCID#15) spontano su razvili čvrste abdominalne tumore koji su izdvojene i uneti u singl ćelijsku suspenziju. Ćelije tumora koje luče anti-F protein antitela su određjene u ELISA.

Ovi tumori i antitela su označeni kao RF-1 (RSV F-protein) i RF-2. RF-1 i RF-2 su stvoreni u dva razlčita eksperimenta razdvojena međusobno za oko dva meseca i izdvojeni su iz individualnih hu-SPL-SCID miševa kao različita antitela; odgajana su zatim 18 i 16 meseci respektivno, deleći se sa približnim vremenom dupliranja od 36-48 časova. Koncentracija specifičnog antitela je obično 0,5 - 1Ug/ml u kulturi zasejanoj pri 0,5 TO6 ćelija/ml i posle rasta tokom 3 dana.

Za dalju karakterizaciju, oba humana MAbs su prečišćena iz supernatanata kulture, koristeći protein A sepharose kolone. Oba RF-1 i RF-2 su IgG (l,k) sa polu maksimalnim vezivanjem na F-protein u ELISA na 0,6 i 1 ng/ml,respektivno (slika 3). Iz načina migracije u IEF, RF-1 RF-2 određene izoelektrične tačke su 8,8 i 8,9 respektivno (slika 4). RF-1 i RF-2 specifično su prepoznavali RSV inficirane HEp-2 ćelije u protočnoj citometriji (slika 5). Disocijaciona konstanta Kd, za RF-1 je određena pomoćuplazmon rezonance na IASYS mašini kao IO"<10>M. Kd konstanta RF-2 je određena pomoću mikro kalorimetrijske titracije, prema Wiseman et al (1989) i Robert et al. (1989) kao 2»I0"<9>M.

Primer 3

Tkivna specifičnost anti- F- proteina

Prečišćena antitela sulfta reaktivnost prema serijama humanih ćelijskih linija raspoloživih na ATCC pomoću indirektnih imunofluoroscentnih ispitivanja merenjem pomoću protočne citometrije (Tabela II): Rezultati su pokazali da antitela ne vezuju ćelijske linije koje predstavljaju obloge respiratornog trakta (HEp-2, laringel epidermoidni karcinom, kat. br. CCL 23), jetre (HepG2, humana heptoma ćelijska linija, kat. br. HB 8065), limfoidnog tkiva (SB, humana B limfoblastoidna ćelijska linija kat.br. CCL 120 i HSB, T limfoblastoidna linija kat.br. CC1 120.1 i prostate (LNCaP.FGC, humana prostatna adenokarcinoma linija kat. br. CRL 1740).

Primer 4

In vitro funkcionalna aktivnost

Radi određivanja da li antitela imaju virus neutrališući efekat in vitro antitela su podvrgavana dvama tipova funkcionalnih ispitivanja: Infekciona neutrališuća ispitivanja su vršena pre-reagovanjem virusa sa prečišćenim MAb pre njegovog dodavanja ćelijama i stoga pokazuje sposobnost MAb-a da inhibira virusnu infektivnost; inhibicija fuzije pokazuje sposobnost Ab da inhibira rast virusa i ekspanziju posle ulaska virusa u ćeliju. Rezultat oba ispitivanja je meren kao količina virusa oslobođena u kulturi posle datog inkubacionog vremena, kao što je određeno pomoću virusne antigenske titracije u E1A.

Oba Abs su bila sposobna da inhibiraju virusnu infekciju 12 testiranih izolata pri koncentracijama koje idu od 30 do 1000 ng/ml i od 8 do 165 ng/ml za RF-1 i RF-2 respektivne RF-2 se pokazao boljim od RF-1 dajući 50% virusne inhibicije (ED50) pri koncentracijama 1,25 do 10 puta nižim od RF-1. Odgovarajući podaci su dati u Tabeli III.

Kao što je očekivano, više koncentracije MAb-a su zahtevane za inhibiranje fuzije i

virusne antigenske ekspresije u prethodno inficiranim ćelijama. U ovom ispitivanju, RF-1 je bio 5-10 puta moćniji od RF-2. Oba MAb su bili efikasniji u Tipu B prototpu RS 6556 nego u Tipu A prototip RS dugačak (Tabela III)

Tabela I: splenociti iz jednog donora su kultivisani u prisustvu IL-2, 3 dana sa ili bez F proteina. SCID miševi su rekustituisani ga 4 IO<7>ćelijama i podstaknute sa 10 ug F proteina ip u CFA. U miševe br. 1,2,3,4 i 5, sveže analogne ćelije (20 IO<5>) su injektirane sa podstrekačem. Koncentracija humanog IgG je određena upoređjivanjem sa standardnom krivom poliklonalnog IgG i anti-F protein titar je određen pomoću krajnje tačke razblaženja u EIA.

Tabela II: Reaktivnost RF-2 sa raznim ćelijskim linijama. Razne ćelijske linije su podvrgnute indirektnom imunofluoroscentnorn obeležavanju sa RF-2,200 ng/10<6>ćelija. Fab guščji anti-humani IgG-FITC je korišćen kao drugi stupanj. (-) pokazuje da prisustvo RF-2 ne daje pramenu prolaza za prosečnu fluorescenciju; (+) pokazuje porast prosečnog obeležavanja za log 0,5.

Tabela III: ED50 je definisano kao koncentracija antitela koja inhibira rast virusa za 50% bazirano na regresionoj analizi monoklonalnom antidelnom doznom odgovoru.

Primer 5 ( Uporedni)

Indukcija IgG opozivnih odgovora na F-protein in vitro:

Više od 95% populacija iznad dve godine starosti je bilo izloženo i odgovorilo uspešno na HSV Henderson et al, J. Med. (1979), 300f 530-534.Podsticanje ćelije slezine in vitro sa RSV F-proteinom treba, stoga da dovede do opozivajudih odgovora, i zaista,uglavnom IgG odgovori su indukovani in vitro sa ćelijama slezine (vidi sl.5). Optimalna koncentracija antigena, 40 ng/ml je bila bar za red veličine niža od one koja je opažena za antigenski indukovane primarne odgovore, npr. feritin, Ilig/ml, Boerner et al, J.Immunol., 1991, 147, 86-95; Brams et al, Hum. Antibod. Hvbridomas. 1993, 4, 47-56. Stoga, može se smatrati da in vitro primarno izlaganje sa F-proteinom indukuje sekundarne slične odgovore. Nije izvedeno mnogo pokušaja indukpvanja znatnih in vitro odgovora na RSV F-protein sa PBMCs i tonzil izvedenim ćelijama.

Ograničeni napori u stvaranju monoklonalnih antitela iz in vitro primarno izlaganih ćelija slezine dali su više monoklonalnih IgG antitela prema RSV F-proteinu. Većina ovih, međutim, ukršteno reaguje sa jednim od više kontrolnih antigena u ELISA (rezultati nisu prikazani).

Primer 6

Kloniranje gena koji kodira RF- 2

Ni Rf-1 ni RF-2 klon ne proizvodi znatne količine antitela. Takođe, obe ove ćelijske linije rastu najbolje u sredini sa 20% FCS, koja je nepodesna jer dovodi do kontaminacije prečišćenog antitela sa goveđim IgG. Stoga, u cilju sposobnosti proizvodnje i prečišćavanja količine antitela potrbenog za vršenje potpunog animalnog modelnog testiranja, koje obično zahteva do 1 gram odabranog antitela, podesno je preneti gene koji kodiraju RF-1 i RF-2 u proizvodni vektor i ćelijsku liniju. Predmetni zastupnik, IDEC Pharmaceuticals, Ine, je razvio veoma efikasan eukariotski proizvodni sistem koji daje proizvodnju humanih monoklonalnih antitela u CHO ćelijama. Ovaj vektorski sistem je opisan u US prijavi ser.br. 08/379 072 od 25. januara 1995. i ser. br. 08/149,099 od 3.11.1993. koje su ovde ubačene referencom. Rutinski koristeći ovaj sistem antitelnog gena, transfektovane CHO ćelije proizvode oko 200 mg antitela po litri sredine bez seruma u spiralnim kulturama i iznad 500 mg/litru u fermentorima posle pojačavanja u metotreksatu.

Klonirana ćelija kulture (vidi niže) RF-2 ćelije, oko 5 IO6, je podvrgnuta RNA ekstrakciji korišdenjem mRNA izolacione opreme, Fast Trakt (InVitroGen, San Diego, Kalifornija) i jednostruka cDNA je dobijena koristeći aligo-dT primer i reversnu transkriptazu. Alikvot cDNA je korišćen kao polazni materijal za reakciju polimeraznog lanca (PCR) radi pojačavanja gena varijabilnog regiona. PCR se izvodi korišćenjem dva seta primera (vidi Tabelu IV).

Prvi set primera je nagrađen radi pojačavanja teškog lanca promenljivih regiona. Sastoji se od 3 primera koji se vezuju u J region i 5 familija-specifičnih 5'primera koji se vezuju u zadnji liderski i mrežni 1 region. Drugi set primera je nagrađen radi pojačavanja kapa promenljivog regiona. PCR reakcije su izvedene elektroforezom na agaroza gelima i tačno dimenzionirane trake 350 baznog para su isečene. DNA je elektroeluirana, isečena sa odgovarajućim restrikcionim enzimima i klonirana u IDEC's NEOSPLA ekspresioni vektor (vidi sliku 6). NEOSPLA vektor korišćen za ekspresiju humanih antitela sadrži sledeće: CMV=citomegalovirus promotor, BETA mišji beta globin glavni promotor, BGH=poliadenilacioni signal goveđeg hormona rasta, SVO=SV40 original replikacije. Nl=Neomicin fosfoamsferaza ekson 1, N2= Neomicin fosfotransferaza ekson 2. LIGHT= Humani imunoglobulin kapa konstantnog regiona. Heavy= Humani imunoglobulin gama 1 ili gama 4 PE konstantan region. L= lider,

SV=SV40 poiiadenilacioni region.

IDEC-ovi NESPLA ekspresioni vektori su nagrađeni za veću proizvodnju imunoglobulin gena (vidi, Reffet al, Blood (1994), 83,435-445, što je ovde ubačeno referncom). Mišja/humana himerična, primatna/humana himerična i humana antitela su uspešno ekspresovana pri visokim nivoima koristeći ove vektore. NEOSPLA sadrži neomicin fosfotransferazni gen za selekciju CHO ćelija koje imaju stabilno integrisan plazmidni vektor DNA. Dodatno, NEOSPLA sadrži dihidrofolat reduktazni gen za pojačavanje u metotreksatu, humani konstatan laki lanac (kapa ili lambda) i human težak lanac konstantnog regiona (gamal ili gama 4(PE)). Gama 4 (PE) je humani gama 4 konstantan region sa 2 mutacije glutaminsku kiselinu i CH2 regionu koja je uvedena radi eliminisanja rezidualnog FcR vezivanja i prolinsku supstituciju u hinge regionu namenjenu poboljšanju stabilnosti interakcije disulfidne veze teškog lanca, Algre et al, J. Immunol.. 148,3461-3468(1992); Angal et al, Mol Imunonol., 105-108 (1993) što je ovde ubačeno referencom. Jedinstvena restrikciona mesta su ugrađena u vektor u cilju olakšavanja ubacivanja željenih i lakih promenljivi regiona. Reff et al, Blood (1994),83,435-445.

Laki lanac FR-2 je kloniran u NESPLA u duplikatu i sekvenciran pomoću postupka Sanger et al, Proc. NatlAcad. Sci. (1977), 74, 5463-5467. Kapa lanac je član kapa 2 podgrupe. Slično, varijabilni region humanog teškog lanca RF-2 je izolovan i kloniran ispred humanog gamal konstantnog domena.

Laki lanac koji kodira gene RF-1 i RF-2 je lako dobiti dok CDNA za gene koji kodiraju teške lance se ne možei nagraditi koristeći opštu Tac reversnu transkripciju. Međutim, problem je rešen korišćenjem visoko temperaturske reversne transkripcije, 70°C . Tako se mogu nagraditi nedirnuti PCR proizvodi sa primerima primarno izvedenim iz Vh2 familije gena.

Amino kiselinska sekvenca i nukleinsko kiselinska sekvenca za RF-1 lake i teške varijabilne domene se može naći na sl.7a i 7b, respektivno. Amino kiselinska i nukleinsko kiselinske sekvence za lake i teške varijabilne domene za RF-2 se mogu naći na si. 8a i 8b, respektivno. Slike 9a i 9b prikazuju nukleinsko kiselinsku i amino kiselinsku sekvencu RF-1 kao što su izražene u subjektnom NEOSPLA vektoru. Slike 9a i 9b prikazuju lidersku, varijabilnu laku i tešku i humanu konstatnih domena sekvence, npr. humani kapa domen i humani gama/konstantan domen. Slika 9c prikazuje amino kiselinsku i nukleinsko kiselinske sekvence humanog gama/konstantnog domena Slika 10 prikazuje šematski ekspresioni vektor koji vrši ekspresiju sekvenci datih na si. 9a-9c i rekombinantnog RF-1 u CHO ćelije.

Slike 1 la-1 lc slično prikazuju amino kiselinsku i nukelinsko kiselinske sekvence liderske sekvence, RF-1 varijabilnog lakog, humanog kapa konstantnog regiona, RF-2 varijabilnog teškog i humanog gama/ konstantnog domena. Slika 12 prikazuje šemtaski ekspresioni vektor za ekspresiju rekombinantnog RF-2 u CHO ćelije.

Primer 7

Razvijanje protokola za kloniranje EBV transformisanžh ćelija

Proizvodnja antitela iz EBV transformisanih ćelija neprekidno opada i konačno iščezava. Kozbor et al, J.Immunol. (1981),127,1275-1280. Radi obesmtrnjenja proizvodnje antitela, bitno je ekstrahovati imunoglobulin kodirajude gene iz ćelija pre ovog događaja i preneti ih u odgovarajući ekspresioni sistem. U cilju izolovanja gena koji kodiraju za antigen koji vezuje varijabilne domene antitela proizvedenih pomoću EBV transformisanih ćelija, bitno je osigurati da ćelijski materijal je monoklonalan. EBV transformisane ćelije su, međutim, veoma teške za kloniranje ograničavajućim razblaživanjem ili u polučvrstom agaru. Izoelektrična fokusirajuća gel elektroforeza proteina A prečišćenih preparata naša dva anti F-proteinska antitela, RF-1 i RF-2 je pokazala da bar dve populacije antitela u RF-2 preparatu i moguću oligoklonivost u RF-1 preparatu.

Korišćenjem mišje tioma linije EL-4 B5 Zhang et al, J. Immunol. (1990),144, 2955-2960 kao hranljivog sloja, ćelije će se prostirati iz singl ćelije kroz granično razblaženje. Humana tioma ćelijska linija EL-4 B5 ekspresuje gp39 u receptor: membrane i tako indukuje 4 rast B ćelija 5-10<4>El-4 B5 ćelija/okcu je izvučeno na mikrolitarsku ploču i ćelije iz kulture su nanesene na EL-4 B5

sloj raznih koncentracija, od 0,38 ćelija/okcu i više. Broj okaca sa rastom za svaku nanesenu koncentraciju je izborajn posle odgovarajućeg vremena.

Supernatant je testiran na prisustvo humanog IgG i na antigen-specifičnog IgG. Na ovaj način izolovali smo i klonirali ćelije koje proizvode RF-1 (vidi Tabelu V) i RF-2 (vidi Tabelu VI), respektivno iz originalnih oligoklonalnih preparata. Ne-specifična antitela nađena u kloniranju su analizirana samo na izotip, i nađeno je daje isti kao za specifična antitela IgGlk. Bazirano na prinosu F-proteinskih specifičnih klonova iz zamrzavanja izvedenog u različitim momentima tokom kultivisanja RF-1 kao i količine IgG koja je proizvedena, procenjeno je da specifična antitela čine oko 1/20 ukupne količine antitela kratko posle početka kultivisanja i nestaju posle oko 8 meseci u kulturi. RF-2 čini mnogo veći deo ukupnog IgG, ne manje od 10% u datom vremenu. Antitelo iz oligoklonalnih preparata je korišćeno za građenje in vitro neutralizacionih podataka koji daju prekomernu stimulaciju ED50 titara. Naša afinitivna proučavanja sa plazmon rezonancom, međutim, nisu zavisna od korišćenja čistih antitela. Afinitivna proučavanja koristeći titracionu mikro kalorimetriju su izvršena na kloniranom materijalu. EL4-B5 ćelije su nanesene pri 5-IO<4>ćelija/okcu n ploču sa 96 okaca ravnog dna. Oko 24 časa kasnije, RF-1 ćelije u eksponencijalnom rastu su nanesene na hrarnljivi sloj pri opisanim koncentracijama. Posle 2-3 sedmice, okca su ispitivana na rast i prisustvo anti-F aktivnosti.

U cilju potvrde kliničke primenjivosti dva humana monoklonalna antitela sa in vitro virusnom neutrališućom aktivnošću, su dalje okarakterisana sa obzirom na njihovu efikasnost u čišćenju RSV infekcije u dva različita animalna modela. Ova preklinička ispitivanja su izvršena sa materijalom proizvedenim pomodu CHO ćelija transfektovanih sa kloniranim genima koji kodiraju antitela ubačena u odgovarajući vektor (vidi sliku 6). Dva antitelna modela, jedan sa nedirnutim komplementom i Fc receptorskim vezujućim domenima, gamal, i drugi bez ovih domena gama4(PE mutant), Alegre et al, J. Immunol. (1992), 148. 3461-3468; Angal et al., Molecular Immunolo<g>v (1993).30,105-108 će biti testirana. Rezon za testiranje gama4 verzije je baziran na dve činjenice: (i) Anti-F protein Fabs je pokazao značajan virusni neutrališući efekat in vitro, Barbas et al, Proc. Natl. Acad. Sci. (1992), 89, 10164-10168 kao i in vivo, Crowe et al. Proc. Natl. Acad. Sci. (19941.9U386-1390, čak i kada se direktno unese u pluća, (ii) potencijalno izbegava oštećenje pluća izazvano efektorskom funkcijom aktivacije u osetljivom tkivu već napadnutom virusnom infekcijom. Set nespecifični kontrolnih antitela, jedno su gamal a drugo gama4(PE) nastaće iz nespecifičnog hibridoma antitela.

Prvi animalni model je mišji model, Taylor et al, J. Immunologv (198A, 52,137-142; Walsh E.E., J. lnfectious Diseases (1994), 170, 345-350. Ovaj model je korišćen za određivanje efikasne doze, defmisane kao najmanja doza koja dovodi 2 log smanjenja virusa šaržiranog u plućno tkivo posle jedno sedmične inkubacije. Ovaj model je takođe korišćen za određivanje koji od predloženih antitelnih modela se odvija. Drugi animalni model je model primarnog izlaganja korišcenjem Afričkog zelenog majmuna, Kakuk et al, J Infectious Diseases (1993), 167, 553-561. RSV izaziva oštećenje pluća kod Afričkih zelenih majmuna i glavna svrha ovog modela je procena osobina prevencije oštećenja za data antitela. Broj testova sa ovim modelom će biti ograničen na testiranje jednog antitela u 5 različitih doza. Antitelo, doza i infuzioni podaci prema infekcionim podacima će biti određeni na bazi rezultata sa mišjim modelom. Pluća se ispituju na virusno šaržiranje ispitivanjem plaka i mikroskopski za detektovanje povreda izazvanih sa RSV.

Pratiće se da li ima promena u amino kiselinskoj sekvenci tokom stimulisanja i širenja ćelija koje proizvode dva antitela. Ovo se vrši testiranjem sa PCR primerima baziranim na CDR3 regionima teških lanaca RF-1 i RF-2 na sekvence gena koji kodiraju RF-1 i RF-2 u originalnom smrznutom ćelijskom materijalu iz koga su stvorene dve ćelijske linije. Pozitivna kontrola RF-1 i RF-2 pričvršćene ćelije izvora. Analiza prati principe koje je dao Levy et al, 1989, Levy et al, J. Exp. Med. (1989), 169:2007 i Alegre et al, J. Immunol. (1992), 148, 3461-3468; Angel et al., Molecular Immunolo<g>v (1993),30,105-108; Foote et al., Nature (1991), 352, 530-532; Rada et al, Proc. Natl. Acad. Sci. (1991) 88, 5508-5512; Kocks et al., Rev. Immunol. (1989). 7, 537-559; Wysocki et al, Proc. Natl. Acad. Sci. (1986),83, 1847-1851: Kipps et al. J. Exp. Med. (1990).171.189-196: Ueki et al. Exp. Med. (1990). 171, 19-34.

Primer 8

Stvaranje CHO ćelijskih linija koje proizvode velike količine ( iznad lOOmg/ litru) RF- 1 i RF- 2

a. Transfektivna ekspresija plazmida i širenje G418 rezistentnih CHO klonova koji ekspresuju najviše nivoe RF-1 i RF-2

RF-1 i RF-2 geni varijabilnog regiona su klonirani u NEOSPLA, Jajne ćelije kineskog hrčka (CHO) (DG44), Urlaub et al, J. Somat. Cei 1 . MobGenet.. (1986.),16,555 su transformisane sa

plazmidom DNA. CHO ćelije su rasle u SSFM H minus hipoksantinu i timidinu (GIBCO).

4-IO<6>ćelija, elektroporatovano sa 25 u-g plazmida DNA koristeći BTX 600 elektroporacioni uređaj (BTX, San Diego, Ka) u 4ml kivete koje se posle upotrebe odbacuju. Pre elektroporacije, plazmid DNA de biti restrikovan sa Pac I koji razdvaja gene ekspresovane u sisarskim ćelijama iz dela plazmida korišćenog za rast u bakterijama. Uslovi za elektroporaciju su 230 volti, 400 mikro faradeja, 13 oma. Svaka elektroporacija se nanosi u činiju sa 96 okaca (oko 40000 ćelija/okcu). Činije su snabdevane sa sredinom koja sadrži G418 (Geneticin, GIBCO) pri 400 ug/ml 3 dana posle elektroporacije i zatim periodično do nastanka kolonija. Supernatant iz kolonija je ispitivan u ELISA na prisustvo humanog IgG i anti-F proteinske aktivnosti.

b. Pojačavanje ekspresije antitela u metotreksatu

G418 rezistantne kolonije koje proizvode najvišu količinu imunoglobulina su prenesena u

veće posude radi širenja. Ekspresija klona koji najviše luči G418 je uvedana genskim umnožavanjem selekcijom u 5 nM metotreksatu (MIX) u činijama sa 96 okaca. 5nM kolonije koje proizvode najvišu količinu antitela su tada širene i tada ekspresiono pojačane ponovo pomoću selekcije u 50nM MTX u činijama sa 96 okaca. Pratedi ovaj protokol, prethodno smo bili u mogućnosti da ravijemo CHO ćelije koje luče više od 200 mg/litru tokom 7 dana u spinernu kulturu (više od 0,5g/litru u fermentorima za 6 dana). Humano antitelo je tada prečišćeno iz superantanta koristeći protein A afinativnu hromatografiju.

c. Proizvodnja i prečišćavanje antitela

Stvoreno je po lOOmg svakog antitela. Odabrana antitela su proizvedena u količinama određenim iz proučavanja mišjih modela. Spinerne boce sa odabranim CHO transfektomama u sredini CHO-S SFM II bez seruma (GIBCO kat .br. 91-0456DK) sa 50 nM metoteraksata su korišćene za proizvodnju antitela u zahtevanim količinama. Suparnatant je prikupljen i profiltriran kroz set filtera radi uklanjanja čestičnog materijala, sa završetkom na 0,2 nm filteru. Supernatant je propuštan kroz protein A kolonu sa prethodno određenom veličinom bazirano na ukupnoj količini antitela. Posle ispiranja, antitelo se eluira iz kolone sa 0,1 M Glicin/HCl, pH=2,8 u neutralizacioni pufer, IM Tris/HCI, pH=7,4. Eluaciono/neutralizacioni pufer je široko izmenjen >I000 puta sa sterilnim PBS ultrafiltracijom kroz Amicon Centriprep ili Centricon 30 (kat.br. 4306 i 4209). Koncentracija antitela je podešena na 2mg/ml i sterilisana pomoću filtracije kroz 0,2 nm filter. Antitelo je prečišćeno i magacionirano na ledu u 2ml kriocevima do korišćena u životinjama.

Primer 9

Karakterizacija RF- 1 i RF- 2 sa obzirom na ponašanje u RSV animalnim modelima

Performansa RF-1 i RF-2 je određena koristeći odgovarajuće animalne modele. Procenaje podeljena u dva stupnja, prvo (a) Balb/c model, Tavlor et al, J. ImmunoU 19841.52.137-142; Crowe et al, Proc. Natl. Acad.Sci. (1994),91,1396-1390) Conors et al, J. Virology(1992),66, 7444-7451, određivanje sposobnosti antitela kao i određivanje tipa efektorskih funkcija je bitno za antitela radi čišćenja virusnog šaržiranja. Iz podataka dobijenih na mišjem modelu, odabran je kandidat za dalje proučavanje na modelu primata. Model primata je model Afričkog zelenog majmuna, Kakuk et al, J. lnfectious Diseas f 1993), 167,553-561. Model primata je naročito podesan za potvrdu da subjektna antitela mogu biti korišćena za prevenciju virusnog oštećenja pluća.

a. Testiranje perfomsnse na mišjem modelu

Model glodara koji smo odabrali bio je balb/c miš. Ovaj model je dobro okarkterisan, Crowe et al. Proc»Natl. Acad. Sci. (1994), 91, 1386-1390; Connors et al, J. Virologv (1992)66, 7444-7451, za proučavanje pasivne terapije. Balb/c miševi su veoma podesni za rast RSV u nižim i višim vazdužnim putevima u svim dobima života.Tavlor et al. J. Immunol. (1984)52,137-142. Životinje su grupisane u grupe koje su sadržavale po 5 životinja, hranjenje standardnom mišjom hranom i pojene ad libitum i negovane prema "Rochester General Hospital vivarium Gudelines". Ovi vodiči su saglasni sa onim New York State Health Depertment, The Federal Animal Welfare Act and DHHS pravilima. Sve procedure, uključujući injekcije, virusno inficiranje, orbitalno krvarenje i žrtvovanje cervikalnom dislokacijom su vršene pod pentranskom anestezijom.

i. Određivanje efikasne doze antitela i upoređivanje performanse ga2sar<*>I i gama 4

(PE verziji) RF-1 i RF-2

Grupe od po 5 miševa su inficirane intranazalnom instilacijom 106 duge (podgrupa A) ili 105 185 37 (podgrupa B) plakom koja gradi jedinice (PFU) RSV-a u 100 uJL zapremini prvog dana. Četvrtog dana na maksimumu virusnog titra, životinje su injektirane intraperitonalno sa svakim od 4 F-protien specifičnih monoklonalnih antitela iii kontrolnim antitelom.Testirane doze su na početku odabirane oko onih referentnih doza izračunatih za obezbeđivanje serumskog neutralizacionog titra od oko 1:300 ili više iz in vivo proučavanja. Ovaj titar je povezan sa zaštitnim nivoima protiv podsticanja sa RSV u malim životinjama. Dozni odgovor je procenjivan tretiranjem sa 25, 5, 1, 1/5 i 1/25 referentnim dozama. Eksperimenti sa višim ili nižim dozama su izvršeni radi predostrožnosti. Kontrolni misi su injektirani sa ekvivalentnom dozom izotopski mačovanih monoklonalnih antitela, kao što je opisano napred. 24 časa kasnije, 5 dan vrh gubitka virusa, miševi su žrtvovani. Serum je dobijen intrakardijalnom puinkturom, a nazalni turbina i pluća se uklone, odmere i homogenizuju u 1 i 2ml NMM, respektivno. Homogenati su titrirani za firus na HEp-2 ćelije, i virusni titri su izraženi kao TCID50/gmtkiva. Prosečni titri između grupa su upoređeni sa onima za kontrolnu grupu pomoću studentskog t-testa. Serum je dobijen u vreme infekcije i usmrćenja radi humane monoklonalne antitelne kvantifikacije pomoću imuno i neutralizacionih ispitivanja. Opaženo je da najveća smanjenja virusnog titra su u rastu virusa u plućima kako IgG izotipovi nisu aktivno lučeni (na suprot za IgA) u gornjoj respiratornoj grani. Terapija na 4. dan od infekcija pokazala se neefikasnom u smanjenju virusnog titra pluća, terapija na 2. i 3. dan će biti ispitana.

Titar svakog monoklonalnog antitela u rastvorima za magacioniranje i u serumu iz injektiranih životinja je određen koristeći ELISA kao što je opisano. RSV fuzioni protein prečišćen pomoću afinitivne hromatografije koristeći postupke (82) je korišćen u čvrstoj fazi. Posebno ispitivanje za RSV G protein biće takođe izveden radi ispitivanja mišjih IgG odgovora na eksperimentalnu RSV infekciju. Zečje antitelo specifično za humani IgG i mišji IgG (dostupni od Virion Svstems, Inc. Bethesda, MD) su korišćeni za detektovanje humanog monoklonalnog antitela ili mišjeg antitela u ELISA.

Efekat doznog odgovora monoklonalnih antitela je određen za antitela kao najniži antitelni titar koji snižava titar virusa za više od logio2 ili iznad 99% smanjenja titra virusa. Stepen zaštite je koreliran sa serumskim nivoem antitela postignutim na dan usmrćenja. Dodatno, potencijalni sinergistički efekat različitih kombinacija humanih monoklonalnih antitela je određen. Rezultati Početni in vitro proučavanja izneseni napred biće korišćeni u izvođenju in vivo eksperimenata. Na primer, ako RF-1 i RF-2 imaju različita antigenska vezujuća mesta na RSV F proteinu, kombinacije istog izotipa (gamal ili gama4) mogu da obezbede sinergističku zaštitu.

ii. Histološko ispitivanje plućnog tkiva

Efekat pasivne terapije na zapaljenje pluća je ispitivan standardnim histopatološkim i imunohistohemijskim tehnikama. Oba peribronhiolarni infiltrati i alveolarni infiltrati su opisani u mišjoj primarnoj ili sekundarnoj infekciji, Conners et al, J. Virologv: (1992),66,7444-7451. Eksperimentalne životinje su tretirane sa monoklonalnim antitelom kao što je opisano napred. Neinficirani netretirani kontrolni miševi služe kao referentni za ispitivanje histoloških efekata. Na 5. i 8. dan posle infekcije, pluća su uklonjena i ispunjena sa formalinom pod konstantnim pritiskom punjenja (30 cm H2O) tokom 30 minuta. Posle seciranja i bojenja sa hematoksilin-eozinom, stepen inflamatornog infiltrata (PMN i limfocit posebno) u peribronhiolarnim i alveolarnim područjima se određuje koristeći standardni zbirajući sistem. Kako je zapaženo da se gamal i gama4 monoklonalna antitela mogu fiksirati i aktivirati potpuno različito, sekcije pluća su obojene za mišju C3 depoziciju u oblasti inflamacije koristeći komercijalno dostupno zečje anti-mišje C3 antitelo (Viron Svstems, Inc. Methesda, MD) i peroksidaza konjugovane kozji i zečji IgG.

Dodatno radi procene histoloških promena viđenih u fiksiranim pulmonarnim tkivima, pulmonama tnflamacijaje ispitivana ocenom alveolarne citologije. Grupe miševa, tretirane kao što je opisano napred su usmrćene bronhoalveolarno ispiranje (BAL) jer izvršeno ponovljenom infuzijom 3ml PBS u niži vazdušni put. Izvršeno je brojanje ćelija u Bal-u i ćelijski tip je identifikovan bojenjem cito-centrifugnih preparata.

iii. Efekat antitelne terapije na prirodni imuni odgovor na infekciju

U modelima pacova i majmuna, pasivna terapija RSV infekcije sa poli-klonalnim IgG

preparatima smanjuje uzastpni antitelni odgovor na virus, mada su životinje potupno zaštićene posle re-podsticanja, Hemming et al, J.lnfectious Diseases (1985), 152, 1083-1086; Prince et al, Virus Research

(1985),3,193-206. Suprotno, Graham je našao da tretirani misi imaju oba otvorena antitelna odgovora i popustljiva su prema virusnom re-podsticanju, Graham et al, Ped. Research (1993),34, 167-172. Radi ispitivanja ove mogućnosti koristeći humana monoklonalna antitela, miševi su inficirani sa dugom vrstom RSV i tretirani sa zaštitnom dozom antitela na 4. dan, kao što je dato napred. Kontrole će uključiti inficirane netretirane životinje i neinficirane tretirane životinje. Miševima je puštana krv radi određivanja antitela svake druge sedmice tokom 8 sedmica i tada svakih 4 sedmica još daljih 8 sedmica. Humano monoklonalno antitelo i mišje antitelo prema RSV F i G proteinima su određivana pomoću ELISA. Dodatno, neutralizacioni titar seruma je određivan u svakoj tački vremena. Doprinosi neutra-lizaciji rezidualnih monoklonalnih antitela i stvarno proizvedenih mišjih tela su određeni iz ELISA rezultata i rezultata neutralizacije aktivnosti neinficiranog antitela tretiranih kontrola. Kada se humano monoklonalno antitelno ne đetektuje pomoću ELISA, životinje su repodsticane sa istom vrstom RSV. Posle 4 dana, životinje su usmrćene i plućno i nazalna tkiva su titrirana za virus i upoređena sa kontrolnim grupama.

U cilju ispitivanja udara monoklonalne antiteine terapije na indukciju citotoksičnih ćelija (CTL), izvršeni su slični eksperimenti, ali 6 sedmica posle infekcije, miševi su usmrćeni i kulture ćelija slezine su stimulisane sa živom RSV 5 dana, Walsh,E.E. J. Infectious Diseases (1994). 170.345-350 . CTL aktivnost je ispitivana standardnim Chromium 51 ispitivanjem oslobađanja koristeći persistentno inficiranu Balb/c fibroblastnu ćelijsku linije (BCH4 ćelije) koji su upoređeni sa neinficiranom Balb/c fibroblastnom linijom.

Bazirano primarno na proučavanju efektivne doze pasivne terapije je uspostavljene RSV infekcije, određeno koje antitelo, RF-1 ili Rf-2 je najefiksanije u prevenciji ili tretiranju RSV infekcije. Izbor između gamal ili gama4(PE) verzije uzima u obzir proučavanja histologije pluća, tačnije da li se kandidat komplementa pojavljuje znatno pojačan sa Clq vezujućim antitelom. Masivna aktivacija komplementa može potencijalno imati i negativne efekte, mada pojačana vaskularizacija koja teče može da poveća virus-antitelo sukob.

c. Testiranje perfomance u majmunskom modelu

Odlučujući test za odabrana antitela je u modelu primata. Odabrali smo Afričkog zelenog majmuna (Cercopithecus ethiotips) zbog njegove visoke popustljivosti za RSV, a infekcija dovodi do pojačane patologije pluća i detektabilnih oštećenja, Kakuk et al, J. lnfectious Diseases (1993), 167,553-561. Afrički zeleni majmuni su lako dostupni i nisu ugroženi. Masa ovih majmuna je između 5 i 10 kg. Najviša očekivana maksimalna doza antitela je 20 mg/kg. Tri životinje svaka od lOkg sa 20 mg/kg daju 600 mg antitela. Neki divlji Afrički zeleni majmuni su prirodno imuni na RSV i zahtev za korišćenje majmuna u našem proučavanju je da su serumski negativni na RSV.

Bazirano na baznoj liniji postavljenoj u mišjem modelu, korišćena su efikasne doze/kg i infekciono vreme pre terapije, izvršene su ograničene serije testova u cilju uspostavljanja efikasne doze za smanjenje virusa kao i potvrde da li ovo korelira sa prevencijom plućne patologije, tačnije paremcimal inflamatornog zahvatanje. Samo jedan virus duge vrste (subtip A) je testiran. Početno, testirano grupe je 25,5,1 i 1/25 referentne doze. Dve kontrolne grupe su analizirane; jedna koja je primila virus ali ne i antitelo i druga koja je primila virus i maksimalnu dozu izotip mačovano kontrolno antitelo. Ukartko, eskeprimenti su izvedeni kao što je opisano napred. Majmuni u grupama od po 3 su takođe inficirani intranazalnom instilacijom sa 10<6>PFU virusa. 6-7 dana posle infekcije sa virusom, majmuni su usmrćeni i uzeti su uzorci pluća i farinksa radi ispitivanja virusa kao što je opisano napred kao i za histologiju.

Histologija je izvedena uglavnom kao što je opisano napred. Ukratko, pluća su perfuzirana sa 10% neutralnim puferisanim formalinom pod konstantnim pritiskom punjenja. Pluća ostaju u formalinu bar jednu sedmicu. Posle sekcioniranja i bojenja sa hematoksilin-eozinom, ploče su ispitivane histološki prema Kakuk et al, J. lnfectious Diseases (1993) ,167,553-561. Serumski uzorci su takođe uzeti u cilju određivanja titra humanog antitela prema RSV u ELISA i u ispitivanjima neutralizacije infekcije.

Primer 10

1. Potvrda tkivne specifičnosti in vitro testom na sekcijama humanog tkiva

Antitelo je tada dalje testirano na potencijalnu ukrštenu reaktivnost prema normalnom tkivu pomoću imunohistoioških proučavanja na raznim smrznutim normalnim tkivnim sekcijama iz dve različite individue. Ukratko, kriostatski mikrotomski isečci zamrznutog tkiva su podvrgnuti ispitivanju u 3 testa: Fiksaciona analiza, Nitraciona analiza i specifičnost/distribucija analiza. Prečišćeno biotinski obeleženo anti-RSV F-protein antitelo u PBS sa dodatkom 1% ESA je na.pločici inkubirano 30 min u vlažnoj prostoriji na 200C. Ploča je tada isprana a PBS sa 1% BSA. Ploča je tada inkubirana sa Avidin-HRP u PBS sa 1% BSA 30 minuta. HRP je ostavljen da reaguje sa 3,3 diaminobenzidin-tetrahidrohloridom, koji gradi nesolubilni obojen talog oksidacijom sa HRP. Ovo će identifikovati moguće ukrštene reakcije subjektnog humanog monoklonalnog antitela. Ovaj test će biti izveden pomoću Ompath Laboratories, N.Y. i potvrđen pomoću FDA za l.N.D. submisije za proizvode namenjen humanoj terapiji. Ovaj histološki prilaz koristi pre-postojeće tkivo i jeftinije je od alternativnih proučavanja sa metama za RSV inficirane majmune sa radiobeleženim antitelom.

Claims (49)

1. Humano monoklonsko antitelo naznačeno time što se specifično vezuje za F-protein respiratornog sincicijalnog virusa (RSV) i sadrži varijabilne regione lakog i teškog lanca koji imaju aminokiselinske sekvence izabrane iz grupe koju čine: aminokiselinske sekvence varijabilnih regiona lakog i teškog lanca antitela RF-1, koje su respektivno prikazane kao SEQ ID BR:12 i SEQ ID BR:13; i aminokiselinske sekvence varijabilnih regiona lakog i teškog lanca antitela RF-2, koje su respektivno prikazane kao SEQ ID BR:14 i SEQ ID BR:15.

2. Monoklonsko antitelo prema zahtevu 1, naznačeno time što navedeno antitelo sadrži laki lanac antitela RF-1 koji ima aminokiselinsku sekvencu prikazanu kao SEQ ID BR:16; i teški lanac antitela RF-1 koji ima aminokiselinsku sekvencu prikazanu kao SEQ ID BR:17.

3. Monoklonsko antitelo prema zahtevu 1, naznačeno time što navedeno antitelo sadrži laki lanac antitela RF-2 koji ima aminokiselinsku sekvencu prikazanu kao SEQ ID BR: 18; i teški lanac antitela RF-2 koji ima aminokiselinsku sekvencu prikazanu kao SEQ ID BR:19.

4. Monoklonsko antitelo prema zahtevu 1, naznačeno time što je navedeno antitelo rekombinantno antitelo koje sadrži konstantni region humanog kapa ili lambda lakog lanca, kao i konstantni region teškog lanca koji je izabran iz grupe koju čine konstantni regioni humanog gama 1, humanog gama 4 i humanog gama 4(PE) konstantnog regiona.

5. Monoklonsko antitelo prema bilo kom od zahteva 1 do 4, naznačeno time što neutrališe RSVin vitro.

6. DNK nukleotidna sekvenca naznačena time što kodira polipeptidnu aminokiselinsku sekvencu koja je izabrana iz grupe koju čine: varijabilni domen lakog lanca antitela RF-1 koji je prikazan kao SEQ ID BR:12; varijabilni domen teškog lanca antitela RF-1 koji je prikazan kao SEQ ID BR:13; varijabilni domen lakog lanca antitela RF-2 koji je prikazan kao SEQ ID BR:14; varijabilni domen teškog lanca antitela RF-2 koji je prikazan kao SEQ ID BR:15; laki lanac antitela RF-1 koji je prikazan kao SEQ ID BR:16; teški lanac antitela RF-1 koji je prikazan kao SEQ ID BR:17; laki lanac antitela RF-2 koji je prikazan kao SEQ ID BR:18; i teški lanac antitela RF-2 koji je prikazan kao SEQ ID BR:19.

7. Ekspresioni vektor naznačen time što sadrži DNK nukleotidnu sekvencu iz zahteva 6.

8. Eukariotske ćelije naznačene time što proizvode humana monoklonska antitela koja se vezuju za RSV-F protein, gde su te ćelije transficirane ekspresionim vektorom koji sadrži nukleotidne sekvence koje kodiraju polipeptide lakog i teškog lanca humanog monoklonskog antitela koji sadrže: (a) varijabilne regione odabrane iz grupe koja se sastoji od: varijabilnih regiona lakog i teškog lanca antitela RF-1 prikazanih respektivno kao SEQ ID BR:12 i SEQIDBR:13; i varijabilnih regiona lakog i teškog lanca antitela RF-2 prikazanih respektivno kao SEQ ID BR:14 i SEQ ID BR:15; i (b) konstantni region humanog kapa ili lambda lakog lanca, kao i konstantni region teškog lanca odabran iz grupe koja se sastoji od konstantnih regiona humanog gama 1, humanog gama 4 i humanog gama 4(PE) konstantnog regiona.

9. Eukariotske ćelije prema zahtevu 8, naznačene time što dato antitelo sadrži lake i teške lance antitela RF-1 koji imaju aminokiselinske sekvence prikazane respektivno kao SEQ ID BR:16 i SEQ ID BR:17.

10. Eukariotske ćelije prema zahtevu 8, naznačene time što dato antitelo sadrži lake i teške lance antitela RF-2 koji imaju aminokiselinske sekvence prikazane respektivno kao SEQ ID BR:18 i SEQ ID BR:19.

11. Eukariotske ćelije prema bilo kom od zahteva 8 do 10, naznačene time što je ekspresioni vektor NEOSPLA vektor.

12. Eukariotske ćelije prema bilo kom od zahteva 8 do 10, naznačene time što su navedene eukariotske ćelije CHO ćelije.

13. Farmaceutski preparat naznačen time što je pogodan za sprečavanje nastanka ili tretiranje infekcije RSV-om kod podložnih osoba ili osoba koje su inficirane RSV-om i koji sadrži profilaktički ili terapijski efikasnu količinu monoklonskog antitela iz bilo kog od zahteva 1 do 4, kao i farmaceutski prihvatljivi nosač.

14. Farmaceutski preparat prema zahtevu 13, naznačen time što je pogodan za primenu putem injekcije ili aerosolom, koji je opciono formulisan sa adjuvansom, poželjno sa kompletnim Freund-ovim adjuvansom (CFA), sa aluminijumom ili sa njihovom kombinacijom.

15. Farmaceutski preparat prema zahtevu 13, naznačen time što su navedena monoklonska antitela rekombinantna humana monoklonska antitela.

16. Upotreba humanih monoklonskih antitela za proizvodnju medikamenta za sprečavanje nastanka ili tretiranje RSV infekcije kod osoba koje su podložne ili inficirane RSV-om, pri Čemu se humana monoklonska antitela specifično vezuju za F-protein RSV i sadrže varijabilne regione lakog i teškog lanca koji imaju aminokiselinske sekvence koje su izabrane iz grupe koju čine: aminokiselinske sekvence varijabilnih regiona lakog i teškog lanca antitela RF-1, koje su respektivno prikazane kao SEQ ID BR:12 i SEQ ID BR:13; i aminokiselinske sekvence varijabilnih regiona lakog i teškog lanca antitela RF-2, koje su respektivno prikazane kao SEQ ID BR:14 i SEQ ID BR:15.

17. Upotreba prema zahtevu 16, naznačena time što navedena humana monoklonska antitela sadrže laki lanac antitela RF-1 koji ima aminokiselinsku sekvencu prikazanu kao SEQ ID BR:16; i teški lanac antitela RF-1 koji ima aminokiselinsku sekvencu prikazanu kao SEQ ID BR:17.

18. Upotreba prema zahtevu 16, naznačena time što navedena humana monoklonska antitela sadrže laki lanac antitela RF-2 koji ima aminokiselinsku sekvencu prikazanu kao SEQ ID BR.T8; i teški lanac antitela RF-2 koji ima aminokiselinsku sekvencu prikazanu kao SEQ ID BR:19.

19. Upotreba prema bilo kom od zahteva 16 do 18, naznačena time što su navedena humana monoklonska antitela rekombinantna antitela koja sadrže konstantni region humanog kapa ili lambda lakog lanca, kao i konstantni region teškog lanca koji je izabran iz grupe koju čine humani gama 1, humani gama 4 i humani gama 4 (PE) konstantnog regiona.

20. Upotreba prema bilo kom od zahteva 16 do 19, naznačena time što su navedena antitela prisutna u farmaceutskoj formulaciji koja je pogodna za primenu putem injekcije ili aerosola.

21. Postupak proizvodnje humanih antitela u organizmu miša sa fenotipom ozbiljne kombinovane imunodeficijencije (SCID miš) koja se specifično vezuju za F-protein RSV, naznačen time što obuhvata korake: (i) primarnog izlaganja humanih splenocita antigenuin vitrokultivacijom navedenih humanih splenocita u prisustvu F-proteina RSV i IL-2; (ii) prebacivanja navedenih humanih splenocita u organizam SCID miša u cilju dobijanja miša sa rekonstituisanim fenotipom; (iii) pospešivanja funkcije humanih splenocita koji suin vitroprimarno izloženi antigenu putemin vivoimunizacije navedenog miša sa rekonstituisanim fenotipom F-proteinom RSV; i (iv) izolovanja B ćelija iz navedenog miša sa rekonstituisanim fenotipom koje proizvode humana antitela koja se specifično vezuju za F-protein RSV.

22. Postupak prema zahtevu 21, naznačen time što se korakin vitroprimarnog izlaganja antigenu izvodi u prisustvu najmanje još jednog dodatnog citokina uz IL-2, gde je navedeni dodatni citokin IL-4 ili IL-6, ili njihova kombinacija.

23. Postupak prema zahtevu 215naznačen time što korakin vitroprimarnog izlaganja antigenu obuhvata izlaganje humanih splenocita tokom jednog do deset dana F-proteinu RSV u koncentraciji koja je dovoljna da indukuje odgovor u vidu proizvodnje antitela koje je specifično za F-protein RSV.

24. Postupak prema zahtevu 21, naznačen time što korak prebacivanja obuhvata intraperitonealno injektiranje humanih splenocita koji su primarno izloženi antigenu u organizam SCID ili SCID/Beige miša.

25. Postupak prema zahtevu 24, naznačen time što korak prebacivanja obuhvata intraperitonealno injektiranje oko IO<4>do IO<8>humanih splenocita koji su primarno izloženi antigenu u organizam SCID ili SCID/Beige miša.

26. Postupak prema zahtevu 21 naznačen time Što se korak pospešivanja funkcije splenocita primenjuje od tri do četrnaest dana nakon koraka prebacivanja.

27. Postupak prema zahtevu 26 naznačen time što se korak pospešivanja funkcije splenocita primenjuje oko sedam dana nakon koraka prebacivanja.

28. Postupak prema zahtevu 21, naznačen time što korak pospešivanja funkcije splenocita dalje obuhvata primenu F-proteina RSV zajedno sa barem još jednim adjuvansom.

29. Postupak prema zahtevu 21, naznačen time što dalje obuhvata korak izolacije humanih ćelija koje proizvode antitela iz organizma navedenog miša sa rekonstituisanim fenotipom.

30. Postupak prema zahtevu 29, naznačen time što se navedene humane ćelije koje proizvode antitela dobijaju iz peritoneuma ili slezine miša sa rekonstituisanim fenotipom.

31. Postupak prema zahtevu 29, naznačen time što dalje obuhvata korak imortalizacije navedenih humanih ćelijain vitro.

32. Postupak prema zahtevu 31, naznačen time što korak imortalizacije obuhvata inficiranje izolovanih humanih ćelija Epštajn - Barovim virusom (EBV).

33. Postupak prema zahtevu 31, naznačen time što korak imortalizacije obuhvata fuzionisanje izolovanih humanih ćelija sa ćelijom koja je fuzioni partner.

34. Postupak prema zahtevu 29, naznačen time što se izolovane humane ćelije koriste za stvaranje kombinatorne genske biblioteke humanih antitela koja proizvodi humana monoklonska antitela protiv F-proteina RSV.

35. Postupak prema bilo kom od zahteva 31 do 34, naznačen time što dalje obuhvata korak prečišćavanja navedenih humanih antitela proizvedenih u navedenim imortalizovanim ćelijama.

36. Postupak prema zahtevu 21, naznačen time što dalje obuhvata korak detekcije nastanka tumora u organizmu miša sa rekonstituisanim fenotipom i izolaciju ćelija koje proizvode humana antitela iz navedenog tumora.

37. Postupak prema zahtevu 21, naznačen time što dalje obuhvata korak uvođenja svežih humanih ćelija slezine koje nisu prethodno primarno izložene antigenu u organizam miša sa rekonstituisanim fenotipom pre koraka pospešivanja funkcije splenocita.

38. Postupak prema zahtevu 21, naznačen time što humani splenociti prethodno nisu bili u kontaktu sa antigenom.

39. Postupak detekcije prisustva RSV u materijalu koji se analizira, naznačen time što obuhvata inkubaciju navedenog materijala u uslovima koji omogućavaju formiranje imunih kompleksa između F-proteina RSV i antitela, zajedno sa humanim monoklonskim antitelima koja se vezuju za F-protein RSV i koja sadrže: (a) varijabilne regione izabrane iz grupe koja se sastoji od: varijabilnih regiona lakog i teškog lanca antitela RF-1 koji imaju aminokiselinske sekvence koje su respektivno prikazane kao SEQ ID BR:12 i SEQ ID BR:13; i varijabilnih regiona lakog i teškog lanca antitela RF-2 koji imaju aminokiselinske sekvence koje su respektivno prikazane kao SEQ ID BR:14 i SEQ ID BR:15; i (b) konstantni region humanog kapa ili lambda lakog lanca i konstantni region teškog lanca odabran iz grupe koja se sastoji od konstantnih regiona humanog gama 1, humanog gama 4 i humanog gama 4(PE) konstantnog regiona; i detekciju prisustva navedenih imunih kompleksa između F-proteina RSV i antitela u cilju određivanja da li je RSV prisutan u materijalu.

40. Postupak prema zahtevu 39, naznačen time što su navedena antitela rekombinantna humana monoklonska antitela.

41. Postupak prema zahtevu 39, naznačen time što su navedena antitela direktno ili indirektno vezana za reporterski molekul.

42. Postupak prema zahtevu 41, naznačen time što je navedeni reporterski molekul detektibilni enzim ili radionuklid.

43. Postupak prema zahtevu 39, naznačen time što materijal koji se analizira sadrži tečnost dobijenu iz respiratornog tkiva.

44. Postupak prema zahtevu 39, naznačen time što navedena antitela sadrže polipeptide lakog i teškog lanca antitela RF-1 koji imaju aminokiselinske sekvence koje su prikazane kao SEQ ID BR:16 i sekvenca ID br 17, respektivno.

45. Postupak prema zahtevu 39, naznačen time što navedena antitela sadrže polipeptide lakog i teškog lanca antitela RF-2 koji imaju aminokiselinske sekvence koje su prikazane kao SEQ ID BR:18 i sekvenca ID br 19, respektivno.

46. Test komplet za ispitivanje prisustva RSV u materijalu koji se analizira, naznačen time što sadrži: humana monoklonska antitela koja se vezuju za F-protin RSV, pri čemu svako od njih sadrži: (a) varijabilne regione lakog i teškog lanca izabrane iz grupe koju čine: varijabilnih regiona lakih i teških lanaca antitela RF-1, koji imaju aminokiselinske sekvence respektivno prikazane kao SEQ ID BR:12 i SEQ ID BR:13; i varijabilnih regiona lakih i teških lanaca antitela RF-2, koji imaju aminokiselinske sekvence koje su respektivno prikazane kao SEQ ID BR:14 i SEQ ID BR:15; i (b) konstantni region humanog kapa ili lambda lakog lanca i konstantni region teškog lanca izabran iz grupe koja se sastoji od konstantnih regiona humanog gama 1, humanog gama 4 i humanog gama 4(PE) konstantnog regiona; i (c) reporterski molekul koji je direktno ili indirektno vezan za navedeno humano monoklonsko antitelo.

47. Test komplet prema zahtevu 46, naznačen time što su navedena antitela rekombinantna humana monoklonska antitela.

48. Test komplet prema zahtevu 46, naznačen time što navedena antitela sadrže polipeptide lakog i teškog lanca antitela RF-1 koji imaju aminokiselinske sekvence prikazane kao SEQ ID BR:16 i SEQ ID BR: 17, respektivno.

49. Test komplet prema zahtevu 46, naznačen time što navedena antitela sadrže polipeptide lakog i teškog lanca antitela RF-2 koji imaju aminokiselinske sekvence prikazane kao SEQ ID BR:18 i SEQ ID BR: 19, respektivno.