RS50229B - Analozi vitamina d3 - Google Patents

Abstract

Jedinjenje opšte formule u kojoj R1 označava vodonik ili C1-C4-alkil-grupu, R2 označava vodonik ili C1-C4-alkil-grupu ili R1, R2 i C20 zajedno označavaju ciklopropil, A označava R3 označava C1-C4-alkil, hidroksi-C1-C4-alkil ili fluor-C1-C4-alkil i R4 označava C1-C4-alkil, hidroksi-C1-C4-alkil ili fluor-C1-C4-alkil. Prijava sadrži još 6 patentnih zahteva.

Description

Ovaj pronalazak se odnosi na jedinjenje formule

u kojoj

Rioznačava vodonik ili alkil-grupu,

R2označava vodonik ili alkil-grupu, ili Ri, R2i C2o zajedno označavaju ciklopropil,

R3označava, alkil, hidroksi-alkil ili fluoralkil i R4 označava alkil, hidroksi—alkil ili fluoralkil.

Nađeno je da jedinjenja formule I indukuju inhibiciju proliferacije u ćelijskim nizovima raka (kancera) prostate, grudi (dojke) i mijeloidne leukemije. Otuda su jedinjenja formule I pogodna kao sredstva za lečenje raka prostate, raka grudi (dojke) i za lečenje leukemij e.

Takođe je nađeno da jedinjenja formule I imaju antiandrogensku aktivnost. Otuda su jedinjenja formule I pogodna za lečenje benignog rasta prostate, ćelavosti i raka prostate.

Takođe je nađeno da jedinjenja formule I imaju aktivnost koja ih čini prikladnim za lečenje bolesti lojnih žlezda kao što su akne ili seborejski dermatitis.

Takođe je nađeno da jedinjenja formule I imaju aktivnost koja ih čini prikladnim za lečenje osteoporoze.

Detalj an opis pronalaska

Kao što se ovde upotrebljava termin "alkil-grupa" označava pravolančanu ili račvastu alkil-grupu koja ima 1-4 C-atoma, na primer, metil, etil, propil, izopropil, butil, terc-butil i slično. Termin "hidroksi-alkil" označava alkil-grupu koja ima hidroksi-supstituent na bilo kojem od C-atoma ove alkil-grupe. Termin "fluor-alkil" označava alkil-grupu koja ima jedan, dva ili tri atoma fluora supstituisana na bilo kojem od C-atoma ove alkil-grupe.

U ovde datim formulama, različiti supstituenti su ilustrovani kao pridruženi nukleusu (jezgru) pomoću jedne od sledećih oznaka: klinasta puna linija ( ^) ukazuje na supstituent koji je iznad ravni molekula; klinasta isprekidana linija (.«««mrt) ukazuje na supstituent koji je ispod ravni molekula.

Pogodno Rioznačava vodonik a R2označava alkil, ili Rioznačava alkil a R2označava vodonik. Pogodnije, Rioznačava vodonik a R2označava metil ili Rioznačava metil a R2označava vodonik.

Pogodno, R3i R4nezavisno jedan od drugog, označavaju alkil, hidroksi-alkil ili trifluor-alkil. Pogodnije, R3i R4nezavisno jedan od drugog označavaju metil, hidroksi-metil ili trifluor-metil.

Pogodno A označava

Najpogodnije jedinjenje formule I je 1,25-dihidroksi-16-en-5,6-trans-holekalciferol.

Jedinjenja formule se dobivaju kao što je dole opisano, sa naročitom referencom na donju Shemu sa formulama.

R5označava vodonik ili trimetilsilil.

U gornjoj Shemi sa formulama, u kojoj Ph označava fenil, jedinjenje formule II, koje je jedinjenje [3S-(1E, 3|3, 5a) ]-2-{3, 5-bis-[[ (dimetiletil) dimetilsilil]oksi]-2-metilencikloheksiliđen]etil}-dif enilf osf in-oksid, pretvara se u jedinjenje formule IA reakcijom sa jedinjenjem formule III.

Reakcija se vrši pri -60°C do -90°C u polarnom aprotičnom organskom rastvaraču, kao što je anhidrovan etar ili pogodnije anhidrovan tetrahidrofuran, u prisustvu jake baze kao što je alkil-litijum kao butil-litijum.

Zaštitne grupe jedinjenja formule IA se uklanjaju reakcijom sa nekom fluoridnom soli, kao što je tetrabutilamonijum-fluorid u polarnom organskom rastvaraču, kao što je etar ili pogodnije tetrahidrofuran, dajući odgovarajuće jedinjenje formule

I.

Jedinjenje formule II se dobiva kao što je dole opisano u primerima 1-6 ili alternativno tome, kao što je opisano u primerima 7-8.

Jedinjenja formule III su poznata (na primer, u SAD patentu br. 5.087.619) ili se mogu dobiti prema poznatim postupcima.

Pogodna aktivnost jedinjenja formule I kao sredstava za lečenje kancera prostate, kancera dojke (grudi) i za lečenje leukemije može se pokazati pomoću sledećih postupaka za testove koji su poznati u ovoj oblasti nauke i tehnike.

Ovde se primenjuju sledeći odabrani materijali i sledeće procedure:Ćelijski. nizovi.Ćelijski niz kancera grudi (dojke)

(MCF-7), ćelijski niz kancera prostate (LNCaP) i ćelijski niz mijeloidne leukemije (HL-60) su održavani na sledeći način: MCF-7 ćelije su održavane u Dulbecco-vom modifikovanom orlovskom medij umu (DMEM) sa 10% seruma telećeg fetusa (FCS); LNCaP i HL-60 su gajeni u RPMI1640 sa 10% FCS. Sva tri ćelijska niza su održavana u inkubatoru temperature 37°C koji sadrži 5% C02.

Jedinjenja vitamina D3.Jedinjenja vitamina D3su rastvorena u apsolutnom etanolu pri koncentraciji od 10~<3>M kao skladišnom rastvoru koji je skladišten na -20°C i zaštićen od svetlosti. Za primenuin vi trojedinjenja su razblažena u medijumu DMEM ili RPMI. Za primenuin vivojedinjenja su razblažena sa fosfatnim puferovanim slanim rastvorom (PBS). Alikvotni deo je upotrebljen samo jedan put a LNCaP ćelije su tripsinizirane. Isprane suspenzije jedne vrste ćelija su numerisane i prevučene na pločice sa 2 4 udubljenja sa ravnim dnom sa ukupno 1 x 10~<3>ćelija/udubljenje u zapremini od 400 |i.l/udubl jenje . Hranljiv sloj je napravljen sa agarom koji je uravnotežen na 4 2°C. Pre ovog stupnja su jedinjenja pipetirana u udubljenja. Posle inkubacije su kolonije izbrojane.Svi eksperimenti su izvršeni najmanje tri puta uz primenu triplikatnih ploča za svaku eksperimentalnu tačku.

Koncentracije kalcijima u serumuiziviro.28 mužjaka miševa vrste Balb/c starosti 8-9 nedelja održavano je pod uslovima bez patogena i hranjeno sa standardnom laboratorijskom hranom. Uzeto je 4 miša po grupi i svaki drugi dan (osim subotom i nedeljom) injekcijom intraperitonalno im je ubrizgano jedinjenje vitamina D3ili razblaživać (100 ul/miš) u toku perioda od 3 nedelje. Doze1,25 (OH) 2-16-en-5, 6- trans- D3su bile: 0,1, 0,5, 1,0 i 2,0 ug. Doze l,25(OH)2D3su bile: 0,1 ng/miš. Kontrolnim miševima je ubrizgano 100\ igPBS. Vrednosti kalcijuma u serumu su merene svake nedelje primenom kvantitativne analize pomoću kolorimetrijske detekcije.

Eksperiment:! impuls neekspozicije.MCF-7 ćelije su inkubirane u tečnoj kulturi sa IO<-7>M l,25(OH)2D3ili 1, 25 (OH) 2~16-en-5, 6-trans-Ds u toku različitih perioda vremena. Posle inkubacije su ove ćelije dva puta pažljivo isprane sa PBS i izbrojane su žive ćelije i stavljene u pločice sa 24 udubljenja radi izvođenja probe (analize) sa kolonijom na mekom agaru, kao što je ranije opisano.

Analiza delijskog ciklusa pomoću protočne

citometrije.Analiza ćelijskog ciklusa je izvršena na MCF-7 ćelijama koje su inkubirane 4 dana sa l,25(OH)2D3ili 1,25 (OH) 2-16-en-5, 6-trans-D3 pri IO"<7>M. Ćelije su fiksirane u ohlađenom metanolu preko noći pre bojenja sa 50 (xg/ml propidijum-jodida, 1 mg/ml Rnaze (100 jedinica/ml) i 0,1% NP40. Analiza je izvršena odmah posle bojenja. Svi eksperimenti su izvršeni nezavisno jedan od drugog najmanje tri puta. Sve vrednosti su statistički analizirane pomoću Studentovog testa.

Vestern (zapadna) analiza sa mrljom (pegom) .Ćelije su dva puta isprane sa PBS, zatim suspendovane u Lysis puferu (50 mM Tris pH 8,0, 150 mM NaCl, 0,1% SDS, 0,5% natrijum-deoksiholata, 1% NP40, 100 ng/ml fenilmetil-sulfonil-fluorida, 2 (ig/ml aprotinina, 1 (xg/ml pepstatina i 10 jig/ml leupeptina) i držane na ledu u toku 30 minuta. Posle centrifugiranja pri 15.000 g u toku 20 minuta pri 4°C, sakupljen je gornji tečni sloj. Koncentracije proteina su kvantificirane. Potpuni lizati (15 ug) su razloženi pomoću 15%-nog natrijum-dodecil-sulfat-poliakrilamidnog gela, preneti na membranu nepokretnog poliviniliden-difurida i ispitivani sa anti-p27<kipl>zečjim poliklonalnim antitelom i anti—Actin mišjim monoklonalnim antitelom. Mrlje su razvijene.

Aktivnost telameraze.Da se detektuje relativna aktivnost telomeraze izvršene su analize sa telomernim ponavljajućim amplifikacionim (umnožavajućim) protokolom (TRAP). Za humanu telomeraznu reverznu transkriptazu (hTERT), totalne RNK su izolovane iz HL-ćelija koje su bile tretirane sa l,25(OH)2D3ili 1, 25 (OH) 2-16-en-5, 6-trans- Đ3(10~<9->10~<8>i 10~<7>M) u toku 4 dana sa monofaznim rastvorom fenola i gvanidin-izotiocijanata. RT-PCR je izvršen sa 1 ug ukupne RNK i slučajnim heksamernim osnovima. cDNK je amplificirana (umnožavana) uz primenu osnova specifičnih za hTERT gen ili GAPDH gen koji je upotrebijen kao kontrolna proba. Osnovi koji su upotrebijeni za hTERT su bili: 5'-CGGAAGAGTGTCTGGAGCAA-3'-(smer sinteze) (SEQ ID NO: 1) i 51 —GGATGAAGCGGAGTCTGGA-3' (antismer sinteze)(SEQ ID NO: 2). Termički ciklusi su bili 94°C u toku 90 sekundi, čemu je sledilo 33 ciklusa od 95°C u toku 20 sekundi, 68°C u toku 40 sekundi i 72°C u toku 30 sekundi. Osnovi za GAPDH gen su bili 5'-CCATGGAGAAGGCTGGGG—3'(smer sinteze)(SEQ ID NO: 3) i 5'-CAAAGTTGTCATGGATGACC—3' (antismer sinteze)(SEQ ID NO: 4). Uslovi za GAPDH amplifikacije (umnožavanja) su bili: 94°C za 2 minuta, 26 ciklusa od 94°C za 30 sekundi, 62°C za 40 sekundi, 72°C za 60 sekundi, čemu je sledilo 72°C za 4 minuta. PCR proizvodi su elektroforezirani na 1%-nom agaroznom gelu i obojeni sa etidijum-bromidom.

Efekat analoga vitamina D3na klonogensku probu.

Ćelije LNCaP, MCF-7 i HL-60 su klonirane u mekom agaru u prisustvu analoga vitamina D3pri IO"<11>do IO"<7>M. Nacrtane su krive odgovora dozi i određena je efektivna doza koja je inhibirala 50%-no formiranje kolonije (ED50) .1,25 (OH) 2-16-en-5,6- trans- D3je bio efikasan u inhibiciji klonalne proliferacije ova tri ćelijska niza na način zavisan od doze. ED50jedinjenja 1,25 (OH)2-16-en-5,6-trans- D3je bila 1,4 x IO"<9>M za LNCaP ćelije, 4,3 x IO"<9>M za MCF-7 ćelije i 3,0 x IO"<11>M za HL-60 ćelije što je oko 10-100 puta jače od l,25(OH)2D3.

Koncentracije (nivoi)kalcijuma u serumuIn vivo.Pošto je hiperkalcijemija glavna toksičnost jedinjenja vitamina D3kalcemijski efekti l,25(OH>2D3su poređeni sa 1, 25 (OH) 2-16-en-5, 6-trans-D3. Svi miševi su preživeli 3 nedelje proučavanja. Svi miševi koji su primili 0,1 jxg l,25(OH)2D3bili su hiperkalcemijski sa koncentracijama kalcijuma u serumu od približno 12 mg/dl (normalno 8,5-10,5 mg/dl). Nasuprot tome, miševi koji su primili1,25(OH)2-16-en-5,6- trans- D3(0,1-2,0 ug/miš) imali su skoro istu koncentraciju kalcijuma (8-10 mg/dl) kao kontrolni miševi (8-9 mg/dl).

Eksperimenti impulsne ekspozicije. Da se ispita da li je inhibicija klonogenske proliferacije pomoću analoga vitamina D3bila reverzibilna, izvršeni su eksperimenti impulsne ekspozicije. MCF-7 ćelije su izložene l,25(OH)2-16-en-5, 6- trans- D3 ilil,25(OH)2D3u toku različitih vremenskih perioda, zatim su pažljivo isprane, prevučene u mekom agaru i brojevi kolonija su numerisani na dan 14 gajenja. Približno 40% i 30% klonogenskih ćelija je bilo inhibirano nakon 4 dana ekspozicije (izlaganja) l,25(OH)2-16-en-5, 6- trans- D3odnosno 1,25 (OH) 2D3.

Analiza ćelijskog ciklusa.Određen je efekat1,25 (OH)2-16-en-5, 6-trans-D3 il,25(OH)2D3(IO<-7>, 4 dana) na ćelijski ciklus MCF-7 ćelija. Dogodilo se značajno povećanje(P <,0,05) u broju ćelija u fazi G0-Gićelijskog ciklusa sa pratećim istovremenim smanjenjem u proporciji ćelija u S fazi.

Vestern (zapadna) analiza sa mrljom (pegom) .

Inhibitori kinaze koji zavise od ciklina i koji su poznati kao p21<wa£1>i p27<kipl>mogu da inhibiraju aktivnost ciklinske kinaze i tako uspore progresiju ćelija preko ćelijskog ciklusa. Kontrolne MCF-7 ćelije su bitno imale umeren nivo ekspresije p21<Ma£1>i p27<k>i<p>lkao<š>to je to određeno pomoću Vfestern (zapadne) analize sa mrljom (pegom). Izlaganje u toku jednog dana prema 1,25 (OH)2-16-en-5,6-trans-D3(IO<-7>M) povećalo je ekspresiju p21Maflip27<kipi>za oko 3,2-3,5 puta dok je kultura sa l,25(OH)2D3(IO<-7>) povećala ekspresiju p21<wafl>i p27kiploko 1,6-1,8 puta. Izlaganje MCF-7 ćelija prema 1,25(OH)2-16-en-5,6-trans- D3(IO-<7>M) u toku 3 dana rezultovalo je u povećanju u ekspresiji p21<wafl>odnosno p27<kipl>za oko 2,8 odnosno 3,4 puta. l,25(OH)2D3(10~<7>, 3 dana) je povećao ekspresiju p21<wafl>odnosno p27<kipl>za oko 4,8 odnosno 3,3 puta.

Ispitivan je doza zavisan efekat jedinjenja vitamina D3na ekspresiju p27<kipl>HL-60 ćelija. Oba jedinjenja, l,25(OH)2D3i1, 25(OH)2-16-en-5, 6- trans- Đ3 sudoterali ekspresiju<p>27<kipl>i ovi nivoi (koncentracije) su primetno porasli posle inkubacije sa 1,25 (OH) 2-16-en-5,6-trans-D3 (4 dana, IO"<9>M) . Nivoi (koncentracije) p27<kipl>su značajno porasli kada su HL-60 ćelije gajene sa 10 8 - 10"7 M l,25(OH)2D3.

Aktivnost telomeraze.Efekat 1,25 (OH) 2-16-en-5,6-trans-D3i l,25(OH)2D3(IO-9-IO"<7>M, 4 dana) na aktivnost telomeraze je izračunat uz primenu TRAP analize. Aktivnost telomeraze se primetno smanjila u HL-60 ćelijama koje su gajene sa1, 25 (OH) 2-16-en-5, 6- trans- D3IO' 9 M ili IO"<7>M l,25(OH)2D3.

Efekti analoga vitamina D3na ekspresiju hTERT u HL-60 ćelijama su procenjeni uz primenu RT-PCR. Oba jedinjenja, 1,25(OH) 2-16-en-5,6-trans-D3 i l,25(OH)2D3su inhibirala ekspresiju hTERT mRNK na način zavisan od doze sa skoro potpunom inhibicijom ekspresije koja se vrši pri IO"<8>M 1,25 (OH)2-16-en-5,6-trans-D3 i pri IO"<7>M 1,25(OH)2D3.

Pogodna aktivnost jedinjenja formule I kao sredstava za lečenje benignog rasta prostate može se pokazati pomoću sledećih postupaka za test koji su poznati u ovoj oblasti nauke i tehnike.

1, 25 (OH) 2—16—en—5, 6-tra/is—D3 jeprocenjen na antiandrogensku aktivnost u kastriranim, testosteronom stimulisanim muškim sirijskim hrčcima. Proučavanja su pokazala da je 1,25 (OH) 2-16-en-5,6-trans-D3 bitno suzbio androgenom indukovanu hipertrofiju semenih kesica i trbušne prostatine žlezde u ovim životinjama, dok je l,25(OH)2D3bio inaktivan pri netoksičnim dozama (1 ug) .

Kastriranim muškim sirijskim hrčcima injekcijom s.c. je dnevno ubrizgavano 20 ug testosteron-propionata i 1 ug 1, 25 (OH) 2-16-en-5, 6-trans-D3 u toku 14 uzastopnih dana. Oba jedinjenja su davana u prenosniku od po 0,2 ml sezamovog ulja. Nekropsija (pregled mrtvih životinja) je izvršena na dan 15. Uklonjeni su prostata i semene kesice, zatim su osušeni i izmereni. Dobivene vrednosti su analizirane radi dobivanja statističkog značenja uz primenu Studentovog t-testa i izražene kao procentna inhibicija stimulisanog odgovora.

Pogodna aktivnost jedinjenja formule I kao sredstava za lečenje osteoporoze može se pokazati pomoću sledećih postupaka za test koji su poznati u ovoj oblasti nauke i tehnike.

Materijali i metode

Životinjeitretman:

Upotrebijene su ženke odraslih pacova stare tri meseca. Posle nedelju dana klimatizacije životinje su raspoređene u grupe po težini i tretirane oralnim kljukanjem pri 1 ml/kg/dan sa nekoliko koncentracija1,25(OH)-16-en-5, 6- trans- D3.Na dan 7 posle doziranja životinjama je ispuštena krv i određene su koncentracije (nivoi) kalcijuma u serumu.

Priprema jedinjenja:

Jedinjenje je rastvoreno u 200 ml proverenog etanola tako da se proizvede koncentracija od 100 ng/ml. Prenosnik od sezamovog ulja i etanolski rastvor jedinjenja su pripremljeni za najveću koncentraciju doziranja, zatim je .smeša uparena na 37°C na rotacionom vakuum uparivaču da se ukloni etanol. Zapremina doze je izračunata uz primenu srednje telesne težine grupe za doziranje. Da se postignu odgovarajuće koncentracije doziranja izvršena su serijska razblaživanja jedinjenja rastvorenog u prenosniku.

Sakupljanje seruma i određivanje:

Krv (1,5 ml) je sakupljena iz svake životinje primenom orbitalne punkture pod etarskom anestezijom na dan 7 posle doziranja. Krv je sakupljena u epruvete (kivete) separatora seruma, centrifugirana pri 2.000 obrta/min u toku 15 minuta a zatim su uzete alikvotne količine seruma za određivanje kalcijuma. Kalcijum iz seruma je određen kolorimetrijskom analizom.

Rezultati

Koncentracije (nivoi) kalcijuma u serumu:

Koncentracije kalcijuma u serumu su bile unutar normalnog opsega za grupe doziranja do 2 ug/kg/dan tretmana sa 1,25(OH)-16-en-5,6-trans-D3.

Materijaliimetode

Životinje i tretman:

Odrasle ženke pacova stare tri meseca su podvrgnute bilateralnoj ovariektomiji ili operaciji slepog creva. Posle nedelju dana klimatizacije životinje su raspoređene u grupe po težini i tretirane oralnim kljukanjem pri specificiranoj koncentraciji od 1 mg/kg. Zapremina doze je nedeljno izračunata uz primenu grupne srednje telesne težine. Doziranje je započelo 17 dana posle operacije i nastavljeno je u toku 19 dana. Na dan 20 životinje su eutanizirane uz primenu inhalacije ugljen-dioksida i isečene su leve butnjače.

Ukupni kalcijum butne kosti:

Pri nekropsiji (pregledu mrtvih životinja) su isečene leve butnjače iz svih grupa i potom je uklonjeno meko tkivo. Kosti su izmerene i presečene na pola na srednjoj dijafizi (osi kosti); zatim je posle uklanjanja epifize longitudinalno isečen na pola distalni deo. Isprana je koštana moždina i kalcijum je ekstrahovan uranjanjem u 5%-ni TCA. Sadržaj kalcijuma u TCA ekstraktima je određen uz primenu kvantitativnog kolorimetrijskog određivanja kalcijuma. Dobivene vrednosti su izražene kao srednja vrednost ukupnog kalcijuma iz kosti u mg/distalna polubutnjača (DHF) + serum.

Sakupljanje seruma i određivanje:

Krv (1,5 ml) je sakupljena iz svake životinje primenom orbitalne punkture pod etarskom anestezijom na dan 7 i na dan 18 posle doziranja. Krv je sakupljena u epruvete (kivete) separatora seruma, centrifugirana pri 2.000 obrta/min u toku 15 minuta a zatim su uzete alikvotne količine seruma za određivanja kalcijuma. Kalcijum iz seruma je određen kolorimetrijskom analizom.

Statistika:

Za verifikaciju efekta ovariektomije na kalcijum u kostima, grupe sa operisanim slepim crevom i izvršenom ovariektomijom su rastvorene u prenosniku i poređene uz primenu Studentovog t-testa. Ovx grupe su poređene primenom jednostruke analize različitosti (ANOVA), čemu je sledila Fišerova LSD radi poređenja svake tretirane grupe u odnosu na prenosnik kada je ukupni efekat bio statistički značajan.

Prvo smo identifikovali prikladnu aktivnost jedinjenja formule I kao sredstava za lečenje bolesti lojnih žlezda, kao što je pokazano sledećim procedurama za test koje su poznate u ovoj oblasti nauke i tehnike.

200 (il1, 25 <OH) 2_16-en-5, 6-trans-n3 jerastvoreno u propilen-glikolu i dnevno (5 dana u nedelji) davano kljukanjem zlatnim sirijskim hrčcima. Životinje su žrtvovane posle 4 nedelje i uši su pripremljene za histološko određivanje. Površina lojnih žlezda je merena na histološki pripremljenim poprečnim presecima uha primenom analize slike.

Takođe je ispitana ukupna lipidna frakcija iz jednog od ušiju (ekstrakcijom organskim rastvaračem čemu je sledilo merenje težine preostalog lipidnog materijala).

Jedinjenja formule I mogu se davati oralno za lečenje raka (kancera) grudi (dojke), raka prostate ili lukemije, ljudima koji trebaju takvo lečenje. Specifičnije rečeno, jedinjenja formule I mogu se davati oralno odraslim ljudima u doziranjima koja su u opsegu od oko 1 do 20 ug na dan za takvo lečenje.

Jedinjenja formule I mogu se davati oralno za lečenje benignog rasta prostate i ćelavosti ljudima koji trebaju takvo lečenje. Specifičnije rečeno, jedinjenja formule I mogu se davati oralno odraslim ljudima u doziranjima koja su u opsegu od oko 1 do 20 ug na dan za takvo lečenje.

Jedinjenja formule I mogu se davati oralno za lečenje osteoporoze u ljudima pri doziranju od oko 1 do 2 0 ug na dan.

Jedinjenja formule I mogu se davati lokalno za lečenje ćelavosti ljudima koji trebaju takvo lečenje. Specifičnije rečeno, jedinjenja formule I mogu se davati lokalno u doziranjima koja su u opsegu od oko 5 do 50 ug na gram lokalne formulacije na dan za takvo lečenje.

Jedinjenja formule I mogu se davati oralno za lečenje bolesti lojnih žlezda u ljudima u doziranju od oko 1 do 20 ug na dan.

Oblici oralnog doziranja koji obuhvataju jedinjenja formule I prema ovom pronalasku mogu biti inkorporirani u kapsule, tablete i slično sa farmaceutski prihvatljivim nosećim materijalima (nosačima).

Primeri (ilustracija) farmaceutski prihvatljivih nosećih materijala (nosača) koji mogu biti inkorporirani u kapsule i slično su sledeći: vezivo kao što je guma tragant, akacija, kukuruzni škrob ili želatin; ekscipijent kao što je dikalcijum-fosfat; sredstvo za dezintegraciju kao što je kukuruzni škrob, škrob od krompira, algenska kiselina i slično; mazivo kao što je magnezijum-stearat, sredstvo za zaslađivanje kao što je saharoza, laktoza ili saharin; sredstvo za aromu kao što je pepermint, ulje od zimzelena ili trešnja. Pri tome mogu biti prisutni različiti materijali kao sredstva za prevlačenje ili da drugačije modifikuju fizički oblik jedinice za doziranje. Na primer, tablete mogu biti prevučene šelakom, šećerom ili sa obe ove supstance. Sirup ili eliksir može sadržati aktivno jedinjenje, saharozu kao zasladivač, metil- i propil-parabene kao prezervative (sredstva za čuvanje), boju i sredstvo za aromu kao što je aroma trešnje ili pomorandže.

Lokalni oblici doziranja koji obuhvataju jedinjenja formule I data ovim pronalaskom uključuju: masti i kreme koje obuhvataju formulacije koje imaju uljaste (zejtinjave), u vodi rastvorljive i emulzifikujuće baze (osnove) kao što su vazelinsko ulje, lanolin, polietilen-glikoli i slično.

Losioni su tečni preparati i variraju od prostih rastvora do vodenih ili vodeno-alkoholnih preparata koji sadrže fino raspodeljene supstance. Losioni mogu sadržati sredstva za suspendovanje ili dispergovanje, na primer,

derivate celuloze kao što su etilceluloza, metilceluloza i slično; želatin ili kaučuke (gume), koji inkorporiraju aktivni sastojak u prenosniku načinjenom od vode, alkohola, glicerina i sličnog.

Gelovi su polučvrsti preparati načinjeni geliranjem rastvora ili suspenzije aktivnog sastojka u nosećem prenosniku. Ovi prenosnici, koji mogu biti vodeni ili anhidrovan!, su gelirani uz primenu sredstva za geliranje, kao što je karboksipolimetilen, i neutralisani do odgovarajuće gelne konzistencije uz primenu alkalija, kao što su natrijum-hidroksid i amini, kao polietilen-kokosamin.

Kao što se ovde upotrebljava, termin "lokalni" označava primenu aktivnog sastojka, koji je inkorporiran u pogodnom farmaceutskom nosaču i apliciran (nanešen) na mestu zapaljenja radi ispoljavanja lokalnog dejstva. Otuda lokalne smeše uključuju one farmaceutske oblike u kojima se ovo jedinjenje aplicira (nanosi) spolja primenom direktnog kontakta sa kožom. Lokalni oblici doziranja obuhvataju gelove, kreme, losione, masti, praškove, aerosolove i druge uobičajene oblike za apliciranje (nanošenje) leka na kožu koji se dobivaju mešanjem jedinjenja formule I sa poznatim farmaceutskim lokalnim nosećim materijalima.

Sledeći primeri su dati da dalje opišu ovaj pronalazak i nisu namenjeni da ga ograniče na bilo koji način.

Primer 1

(2R, 3S , 5S, 7S) -2-{5, 7-Bis[ (1,1-dimetiletil) dimetilsilil]-oksi}-4-metilen-l-oksaspiro[2,5]oktan-2 -metanol-acetat

U magnetom mešan rastvor od 18,5 g (0,0523 mol)

(2R, 3S, 5S, 7S) -5-hidroksi-4-metilen-7-[ (1, 1-dimetiletil) - dimetilsililoksi]-l-oksaspiro[2, 5]oktan-2-metanol-acetata [Y. Kiegel, P. M. Wovkulich and M. R. Uskokovic,Tetrahedron Letters32(1991) 6057-6060] i 6,8 g (0,099 mol) imidazola u 50 ml dimetilformamida pod atmosferom argona je dodato 9,8 g (0,65 mol) terc-butildimetilsilil-hlorida. Reakciona smša je mešana 5 sati, razorena sa 5 ml vode, mešana 30 minuta i sipana u 4 00 ml vode. Smeša je ekstrahovana heksanom (2 x 500 ml) i etrom (2 x 500 ml). Organski slojevi su spojeni, ispirani vodom (300 ml), osušeni iznad natrijum-sulfata i upareni. Hromatografija na koloni silikagela je dala 22,31 g (92%) naslovnog jedinjenja u obliku bezbojnog ulja.

Primer 2

[3S- (1E, 3(J, 5a) ]-2-{3,5-Bis[[ (1,1-dimetiletil) dimetilsilil]-oksi]-2-metilencikloheksiliden}etanol-acetat U trogrli balon od 3 litra koji je snabdeven uvodnikom za argon, mehaničkom mešalicom i termometrom, sipano je 500 ml tetrahidrofurana i ovaj je ohlađen na -60°C u kupatilu sa suvim ledom/acetonom. Dodavanje anhidrovanog tungsten-heksahlorida (43,23 g, 0,108 mol) je izvršeno u porcijama uz održavanje temperature pri -60°C. Zatim je izvršeno brzo ukapavanje 200 ml 1,6M rastvora n-butil-litijuma u heksanu uz održavanje

temperature ispod -45°C (u toku oko 5 minuta) . Kupatilo sa suvim ledom/acetonom je zamenjeno kupatilom sa ledenom vodom što je omogućilo da temperatura dostigne 5°C. Boja se promenila od plave do kaki boje zatim do crvenkasto-crne. Posle 30 minuta držanja na 5°C brzim ukapavanjem u toku 3 minuta dodat je rastvor (2R,3S,5S,7S)-2-{5, 7-bis[ (1,1-dimetiletil) dimetilsilil]oksi}-4-metilen-1-oksaspiro[2,5]oktan-2-metanol-acetata (22,31 g, 0, 04884 mol) u 50 ml heksana. Posle 4 sata je reakciona smeša razblažena sa 2 litra heksana, filtrirana kroz kolač od silikagela koji je zatim ispiran smešom heksan/etilacetat (9:1, 3 x 500 ml). Reakciona smeša je zatim uparena. Dobiveni ostatak je hromatografisan na koloni od 75 g silikagela dajući 22,56 g sirovog proizvoda. Hromatografija pod srednjim pritiskom na koloni silikagela uz eluiranje smešom dihlormetan/etilacetat (100/1) dala je 17,42 g (80,1%) naslovnog jedinjenja i malu količinu odgovarajućeg IZ epimera.

Primer 3

[3S- (1B,3P, 5a)]-2-{3 ,5-Bis[[ (1,1-dimetiletil) dimetilsilil]-oksi]-2-metilenaikloheksiliden}etanol-acetat (E-dien)

i

[3S- (IZ, 3p, 5a) ]-2-{3,5-bis[[ (1,1-dimetiletil) dimetilsilil]-oksi]-2-metilenoiklohekslliden}etanol-acetat (Z-dien)

U 465 ml anhidrovanog THF na -78°C, uz mešanje, dodato je 64,3 g (160 mmol) WCl6(plav rastvor) čemu je sledilo dodavanje 337,5 ml 1,43M rastvora n-butil-litijuma u heksanu (takvom brzinom da unutrašnja temperatura nije porasla iznad -20°C) . Reakciona smeša je ostavljena da se zagreje na sobnu temperaturu. Ukapavanjem je dodat rastvor od 24,5 (53,6 mmol) (2S,3R,5S,7S)-2-{5, 7-bis[(l, 1-dimetiletil) dimetilsilil]oksi}-4-metilen-l-oksaspiro[2,5]oktan-2-metanol-acetata u 65 ml THF i smeša je mešana 4 sata. Reakciona smeša je razblažena sa 600 ml pentana i filtrirana kroz sloj od 4 cm silikagela, zatim je ispirana smešom heksan/EtOAc (19:1) dajući, posle isparavanja isparijivih supstanci pod sniženim pritiskom, 27 g sirove smeše diena. Dalje prečišćavanje uz primenu hromatografije uz eluiranje smešom heksan/EtOAc (25:1) dalo je 21,6 g (91%) smeše 2:3 Z/E diena (naslovnih jedinjenja) koja se mogu razdvojiti hromatografijom na silikagelu (eluens: heksan(EtOAc 40:1).

Z-dien<X>H—NMR (5 u ppm): 0,052 (s, 6H), 0,06 (s, 6H), 0,87 (s, 9H) , 0,89 (s, 9H) , 1,74-1, 90 (m, 2H) , 2,04 (s, 3H), 2,20 (dd, J = 6,0 i 12,8 Hz, IH), 2,41 (d, J = 11,1 Hz, IH), 4,19 (m, IH), 4,42 (m, IH), 4,61 (dd, J= 7,3 i 12,1Hz, IH), 4,68 (dd, J = 7,3 i 12,1 Hz, IH), 4,80 (s, IH), 5,20 (s, IH), 5,47 (t, J = 7,2 Hz, IH) . [<x]D<25>- +1,2°

(c = 0,4, EtOH) . Analiza: izračunato za C23H4404Si2: C 62,27, H 10,01; nađeno: C 62,55, H 10,33.

E-dien<*>H-NMR (8 u ppm): 0,046 (s, 3H), 0,057 (s, 3H), 0,065 (s, 6H), 0,88 (s, 9H), 0,89 (s, 9H), 1,77 ;(ddd, J = 3,1, 9,4 i 11,9 Hz, IH), 1,89 (m, IH), 2,09 (s, 3H), 2,31 (dd, J = 2,0 i 15,2 Hz, IH), 2,39 (dd, J = 6,3 ;i 15,2 Hz, IH), 4,21 (širok s, IH), 4,50 (m, IH), 4,58 ;(dd, J = 7,2 i 12,9 Hz, IH), 4,65 (dd, J = 7,2 i 12,9 Hz, IH), 4,95 (s, IH), 4,99 (s, IH), 5,69 (t, J= 7,2 Hz, IH). [oc]D<25>= +8,0° (c «= 0,5, EtOH) . Analiza: izračunato za C23H4404Si2: C 62,67, H 10,06; nađeno: C 62,42, H 10,01. ;Primer 4; ;[3S- (1E, 3p, 5a) ]-2-{3,5-Bis[[ (1,1-dimetiletil) dimetilsilil]-oksi]-2-metilencikloheksiliden} etanol;U magnetom mešan rastvor od 10,84 g (24,6 mmol) [3S-(1E, 3P, 5a)]-2-{3, 5-bis[[(l, 1-dimetiletil)dimetilsililjoksi]-2-metilencikloheksiliden}etanol-acetata u 100 ml metanola pod atmosferom argona je dodato 3,5 g tableta natrijum-hidroksida i reakciona smeša je mešana 3 sata pod atmosferom argona. Reakciona smeša je zatim uparena pod sniženim pritiskom na zapreminu od 50 ml, zatim je razblažena vodom (500 ml), ekstrahovana smešom heksan/etar (1:1, 2 x 500 ml). Organski sloj je ispiran vodom, osušen iznad natrijum-sulfata i uparen. Dobiveno je 9,80 g (100%) naslovnog jedinjenja u obliku bele čvrste materije. ;Primer 5 ;[1R- (lot, 3p, 5E) ]-{[ (2-Hloretiliden) -4-metilen-l, 3-ciklo;heksandiil]bis (oksi) }bis (1,1-dimetiletil) dimetilsilan;U mešan rastvor od 6,67 g (50 mmol) N-hlor-sukcinimida u 150 ml dihlormetana koji je pod atmosferom argona ohlađen na 2°C u kupatilu sa ledom/acetonom ukapavanjem u toku 2 minuta je dodato 4 ml (55 mmol) dimetilsulfida. Formiran je beli talog. Posle 30 minuta na 0°C, kupatilo je zamenjeno kupatilom sa suvim ledom-acetonom i temperatura reakcione smeše je podešena na ;-20°C. Dodat je rastvor od 9,8 g (24,6 mmol) [3S- ;(1E, 3P, 5a) ]-2-{3, 5-bis[[ (1,1-dimetiletil) dimetilsilil]oksi]-2-metilencikloheksiliden}etanola u 60 ml dihlormetana. Posle 15 minuta je uklonjeno kupatilo za hlađenje i reakciona smeša je mešana 50 minuta a zatim je preneta u levak za odvajanje koji sadrži 500 ml vode. Reakciona smeša je ekstrahovana heksanom (2 x 350 ml). Organski sloj je ispiran sa 500 ml vode, osušen iznad natrijum-sulfata i uparen dajući 10,49 g sirovog proizvoda u obliku žute tečnosti. Prečišćevanje fleš hromatografijom je dalo čisto naslovno jedinjenje u obliku bezbojnog ulja.<H>l-NMR (CDC13, 8 u ppm) : 0,03 (s, 3H) , 0,05 (s, 3H) , 0,07 (s, 6H), 0,87 (s, 9H), 0,89 (s, 9H) , 1,70-1, 94 (m, 2H) , 2,34 (m, 2H)", 4,13 (m, 2H) , 4,28 (m, IH) , 4,53 (m, IH), 5,00 (m, IH), 5,03 (m, IH), 5,78 (tm, J = 8 Hz, IH). ;Primer 6; ;[3S- (1E, 3p,5a) ]-2-{3,5-Bis[[ (1,1-dimetiletil) dimetilsilil]-oksi]-2-metilencikloheksiliden]etil}difenilfos£in-oksid;U trogrli balon od 1 litar koji je snabdeven uvodnikom za argon, termometrom i mehaničkom mešalicom, sipan je rastvor od 10,26 g (24,6 mmol) [1R-(la,3p,5E) ]-{[ (2-hloretiliden)-4-metilen-l,3-cikloheksandiil]-bis(oksi)}bis(1,1-dimetiletil)dimetilsilana u 100 ml sveže predestilovanog anhidrovanog tetrahidrofurana i ohlađen u kupatilu sa suvim ledom-acetonom na -65°C. Dodavan je 0,5M rastvor kalijum-difenilfosfida u tetrahidrofuranu u toku 30 minuta do nestanka crvene boje (što je zahtevalo dodavanje 60 ml rastvora). Posle mešan ja u toku 1 sat na -65°C, dodato je 10 ml vode i uklonjeno je kupatilo za hlađenje. Reakciona smeša se obezbojila. Zatim je brzo dodato 200 ml dihlormetana a zatim 200 ml vodenog rastvora koji sadrži 10 ml 30%-nog vodonik-peroksida. Posle 1 sat, sukcesivno je dodato 13,5 g natrijum-sulfita, 100 ml zasićenog vodenog rastvora natrijum-hlorida i 200 ml dihlormetana. Posle pažljivog mućkanja, faze su raszdvojene i vodena faza je ispirana sa 200 ml dihlormetana. Organska faza je ispirana sa 200 ml zasićenog vodenog rastvora natrijum-hlorida. Spojeni organski slojevi su osušeni iznad natrijum-sulfata, filtrirani i upareni dajući 16,33 g sirovog proizvoda. Ovaj sirov proizvod je prečišćen hromatografijom pod srednjim pritiskom na silikagelu G-60 dajući 12,54 g (87%) naslovnog jedinjenja u obliku belih kristala.<1>H-NMR (CDCI3, 8 u ppm): 0,02 (s, 3H) , 0,07 (s, 6H) , 0,08 (s, 3H), 0,84 (s, 18H), 1,76 (m, 2H), 2,98-3,15 (m, 2H), 4,06 (m, IH), 4,37 (m, IH), 4,53 (m, IH), 4,72 (m, IH), 4,79 (m, IH), 7,45 (m, 6H), 7,72 (m, 4H). ;Primer 7; ;Metil-estar [E- <3S ,5R) ]-[3,5-bis- (fcero-butil-dimetil-;silaniloksi) -2—metilenaikloheksiliđen]-sirć:etne kiseline;(Ro 65-8821);Rastvor od 4,45 g (10,43 mmol) metil-estra [Z-(3S, 5R)]-[3, 5-bis- (terc-butil-dimetil-silaniloksi) -2-metilencikloheksiliden]-sirćetne kiseline (X) (A. Mowrino et al.,Tetrahedron Letters38(1997) 4713-4716) u 100 ml heksana ozračivan je UV lampom u toku 3 sata. Uparavanje je dalo 4,25 g (95,5%) naslovnog jedinjenja u obliku bezbojnog ulja. ^-NMR (CDC13, 8 u ppm): 0,06 (s, 3H) , 0,07 (s, 9H), 0,85 (s, 9H), 0,89 (s, 9H), 1,76 (m, IH), 1,84 (m, IH), 2,70 (m, IH), 3,36 (m, IH), 3,70 (s, 3H) , 4,26 (m, IH), 4,58 (m, IH), 5,07 (m, 2H), 5,91 (širok s, ;IH) . ;Primer 8; ;[3S- (1E,30,5a)]-2-{3,5-Bis[[ (1,1-dimetiletil) dimetilsilil]-oksi]-2-metilenaikloheks±liden}etanol;U rastvor od 4,25 g (9,96 mmol) metil-estra [E-(3S, 5R) ]-[3, 5-bis- (terc-butil-dimetil-silaniloksi) -2-metilencikloheksiliden]-sirćetne kiseline u 100 ml toluena na -78°C ukapavanjem je dodato 25 ml (30 mmol) 1,2M rastvora diizobutilaluarinijum-hidrida i reakciona smeša je mešana 1 sat. Posle dodavanja 5 ml metanola, reakciona smeša je ostavljena da se zagreje na sobnu temperaturu. Reakciona smeša je zatim razblažena sa 150 ml 2M vodenog rastvora kalijum-natrijum-tartarata i snažno mešana. Organska faza je odvojena, osušena iznad natrijum-sulfata i uparena do suva. Sirov proizvod je prečišćen fleš hromatografijom (eluens: heksan/etilacetat (8:2, zapr.)) dajući 2,8 g (70%) naslovnog jedinjenja u obliku bezbojne voskaste čvrste materije. ^-NMR (CDCI3, S u ppm): 0,05 (s, 3H), 0,07 (s, 9H), 0,88 (s, 9H), 0,91 (s, 9H), 1,74 (m, IH), 2,06 (m, IH), 2,26 (dm, J = 13,6 Hz, IH), 2,40 (dd, J = 13,6, 5,2 Hz, IH), 4,30-4,11 (m, 3H), 4,53 (m, IH), 4,98 (m, IH), 5,00 (m, IH), 5,80 (trn, J = 7 Hz, IH). ;Primer 9;1,25-Dihidroksi-16-en-5,6-fcrans-holekalciferol;Mešan rastvor od 796 mg (1,37 mmol) [3S-(1E, 3P, 5a) ]-2-{3, 5-bis[£ (1,1-dimetiletil) dimetilsilil]oksi]-2-metilen-cikloheksiliden]etil}difenilfosfin-oksida u 10 ml anhidrovanog tetrahidrofurana, ukapavanjem pod argonom na -78°C, tretiran je sa 0,83 ml (1,33 mmol) 1,6M rastvoran-butil-litijuma u heksanu. U tako dobiven crveni rastvor ukapavanjem pod argonom u toku 10 minuta dodat je rastvor od 280 mg (0,803 mmol) [3aR-[l (R*) , 3aa, 7ap]-l-{l, 5-dimetil-5-[ (trimetilsilil) oksi]heksil}-3, 3a, 5,6,7, 7a-heksahidro-7a-metil-4H-inden-4-ona u 5 ml tetrahidrofurana. Reakciona smeša je mešana 90 minuta na -78°C, zatim je razorena dodavanjem 40 ml smeše (1:1) 2N vodenog rastvora Rochelle-ove soli i 2N vodenog rastvora kalijum-bikarbonata (KHCO3) i ostavljena da se zagreje na sobnu temperaturu. Reakciona smeša je ekstrahovana etilacetatom (3 x 100 ml). Organski slojevi su spojeni, ispirani 3 puta smešom voda/zasićen vodeni rastvor natrijum-hlorida, osušeni iznad natrijum-sulfata i upareni do suva. Sirov proizvod je prečišćen fleš hromatografijom na koloni (dimenzija 40 mm x 6") silikagela (eluens: heksan/ etilacetat (40/1, zapr.)) dajući 278 mg trisililovanog naslovnog jedinjenja i 140 mg polaznog ketona.

Rastvor od 278 mg (0,389 mmol) ovog trisililovanog intermedijera u 8 ml anhidrovanog tetrahidrofurana tretiran je pod argonom u toku 17 sati sa 1,9 ml (1,9 mmol) IM rastvora tetrabutilamonijum-fluorida u tetrahidrofuranu. Reakciona smeša je razorena vodom (6 ml) i potom mešana 30 minuta. Posle isparavanja tetrahidrofurana u vakuumu preostali rastvor je ekstrahovan etilacetatom (3 x 100 ml). Organski slojevi su ispirani smešom voda/zasićen vodeni rastvor natrijum-hlorida (4 x 100 ml), osušeni iznad natrijum-sulfata i upareni do suva. Sirov proizvod (192 mg) je prečišćen fleš hromatografijom na koloni silikagela koja je prethodno ispirana 1%-nim rastvorom trietilamina u etilacetatu (300 ml). Eluiranje je izvršeno etilacetatom. To je dalo 152 mg kristalnog naslovnog jedinjenja. Uzorak za analizu koji je je prekristalisan iz smeše tetrahidrofuran/metil-formijat (0,3/7) imao je t.t. 95-100°C. [a]D25 = +160, 5° (EtOH, c = 0,20). ^ 272/3nm (s 20.600).

Primer 10

Kapsula sa mekim želatinom

Formulacija I

Postupak proizvodnje

1. Suspendovati BHT i BHA u migliolu 812. Zagrejati do oko 50°C i mešati do rastvaranja sastojaka. 2. Rastvoriti1,25 (OH)2-16-en-5, 6- trans- D3u rastvoru iz stupnja 1 pri 50°C. 3. Ohladiti rastvor iz stupnja 2 na sobnu temperaturu.4.Puniti rastvor iz stupnja 3 u kapsule sa mekim

želatinom.

PzrimBdba:Sve stupnjeve ovog postupka proizvodnje vršiti pod atmosferom azota i uz zaštitu od svetlosti.

Primer 11

Kapsula sa mekim želatinom

Formulacija XX

Postupak proizvodnje

1. Suspendovati di-a-tokoferol u migliolu 812. Zagrejati do oko 50°C i mešati do rastvaranja sastojaka. 2. Rastvoriti 1,25 (OH) 2~16-en-5,6-trans-D3 u rastvoru iz

stupnja 1 pri 50°C.

3- Ohladiti rastvor iz stupnja 2 na sobnu temperaturu.

4. Puniti rastvor iz stupnja 3 u kapsule sa mekim

želatinom.

Prlmedba:Sve stupnjeve ovog postupka proizvodnje vršiti pod atmosferom azota i uz zaštitu od svetlosti.

Claims (7)

1. Jedinjenje opšte formule u kojoj Rioznačava vodonik ili Ci-Cj-alkil-grupu, R2označava vodonik ili Ci-C4-alkil-grupu ili Ri, R2 i C20zajedno označavaju ciklopropil, A označava R3označava Ci-C4-alkil, hidroksi-Ci-C4-alkil ili fluor-Ci-C4-alkil i R4označava Ci-C4-alkil, hidroksi-Ci-C4-alkil ili fluor-Ci-C4-alkil.

2. Jedinjenje prema zahtevu 1 u kojem Rioznačava vodonik, a R2označava Ci-C4-alkil ili Rioznačava Ci-C4-alkil, a R2 označava vodonik.

3. Jedinjenje prema zahtevu 2 u kojem Rioznačava vodonik a R2označava metil ili Rioznačava metil a R2označava vodonik.

4. Jedinjenje prema zahtevu 3 u kojem R3i R4nezavisno jedan od drugog označavaju Ci-C4-alkil, hidroksi-Ci-C4-alkil ili trifluor-Ci-C4-alkil.

5. Jedinjenje prema zahtevu 4 u kojem R3i R4nezavisno jedan od drugog označavaju metil, hidroksi-metil ili trifluor-metil.

6. Jedinjenje prema zahtevu 5 u kojem A označava

7. Jedinjenje prema zahtevu 6 koje je 1,25-dihidroksi-16-en-5,6-trans-holekalciferol.