RS50342B - Postupak za radioobeležavanje proteina sa itrijumom-90 - Google Patents

Abstract

Postupak za radioobeležavanje helator-konjugovanog proteina ili peptida sa Y za dobijanje radioobeleženog proteina ili peptida koji se može davati direktno pacijentu bez daljeg prečišćavanja od neugrađenog radioaktivnog obeleživača, naznačen time što sadrži,: (i) mešanje helator-konjugovanog proteina ili peptida sa rastvorom koji sadrži 90Y ili njegovu so u prihvatljivom puferu; i (ii) inkubiranje mešavine manje od 8 minuta, na temperaturi između 25°C do 43°, na pH od 3 do 6 tako da se produkuje protein ili peptid obeležen sa 90Y koji ima radiohemijsku čistoću veću od 95%, specifičnu aktivnost najmanje 5 mCi/mg, specifičnost vezivanja od najmanje 50%, i može se davati direktno pacijentu bez daljeg prečišćavanja od neugrađenog radioaktivnog obeleživača. Prijava sadrži još 11 zavisnih patentnih zahteva.

Description

Područje pronalaska

Predmetni pronalazak odnosi se na kitove i metode za radioobeležavanje proteina i peptida sa terapeutskim radioizotopima tako da se ti rađioobeleženi proteini mogu davati direktno pacijentu bez potrebe za dodatnim prečišćavanjem. Takvi kitovi i metodi posebno su podesni za obeležavanje proteina i peptida sa itijumom-90 (<90>Y). Putem optimizovanja protokola za radioobeležavanje tako da nije potrebno dalje prečišćavanje, predmetni pronalazak zadovoljio je potrebu koja se dugo oseća u praksi, rešavajući problem kako da obezbedi itrijum-obeležene lekove u obliku prigodnom za korisnika tako da se ti lekovi mogu lako pripremiti i dati u bolnici ili okruženju bolesnika.

Stanje tehnike

Sve publikacije i patentne prijave ovde su inkorporirane referencom u istom obimu kao što je svaka pojedinačna publikacija ili patentna prijava posebno i pojedinačno naznačena da je inkorporirana referencom.

Rađioobeleženi proteini, posebno antitela, prolaze kroz procenu tokom mnogo godina kao potencijalni dijagnostički i terapeutski reagensi. Smatra se da su takvi reagensi posebno korisni kao terapeutici kod kancera, sada kada su istraživači počeli da identifikuju tumor-specifične antigene i srodne veznike ili antitela koja se vezuju na takve antigene. Davanjem radioobeleženog veznika ili antitela koje ima specifičnost vezivanja za tumor-specifični antigen, vezan za radioizotop koji ima kratak domet, visoku energiju i brojnu emisiju čestica, na raspolaganju je potencijal da se isporuče letalne doze zračenja direktno u tumorsku ćeliju.

U zavisnosti od dometa čestica određenog izotopa, obeleživači mogu biti izabrani na osnovu njihove pogodnosti za ciljanje određenog tipa ćelije. Na primer, gama emiteri generalno se upotrebljavaju za dijagnostičke svrhe, tj., omugućavaju da se tumori vide, ali generalno nisu efektivni kao agensi za ubijanje. Nasuprot tome, alfa i beta emiteri mogu biti upotrebljeni da izazovu ubijanje ćelije. Alfa emiteri mogu biti posebno korisni za bolesti krvnog porekla ili vaskularne tumore gde mogu dostići dobru penetraciju; i ako u nekim slučajevima emisija jednih čestica može biti dovoljna da izazove ubijanje ćelija, tipično alfa emiter mora biti lociran pravo na površinu ćelije. Suprotno tome, beta emiteri, tj.,<9>Y, posebno su pogodni za bulkier, više lokalizovanu bolest, zato što obično imaju duži domet emisije.

Itrijum-90-obeležena antitela i peptidi posebno su pokazali ohrabrujuće rezultate u protokolima kliničke terapije (Thomas i sar., 1995. Davanje gama interferona nakon terapije sa °Y radioobeleženim antitelom: preživljavanje i ispitivanje hemopoetične toksičnosti. Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. 31: 529-534; DeNardo i sar., 1995. Itrijum-90/indijum-lll DOTA peptid himerični L6: farmakokinetika, dozimetrija i početne terapeutske studije kod pacijenata sa kancerom dojke. J. Nucl. Med. 36: 97P). Takvi konjugati se obično prave vezivanjem bifunkcionalnog helatora za protein ili antitelo, zatim konjugovanjem radioobeleživača za proteinski konstrukt preko bifunkcionalnog helatora. Na primer, udružene prijave 08/475,813, 08/475,815 i 08/478,967, inkorporirane ovde referencom, opisuju radioobeležena terapeutska antitela za naciljavanje i destrukciju limfoma B ćelija i ćelija tumora. Posebno je otkriven konjugat Y2B8, koji sadrži anti-humano CD20 mišje monoklonalno antitelo, 2B8, pričvršćeno za ?Y preko bifunkcionalnog helatora, MX-DTPA.

U praksi su poznati patenti koji se odnose na helatore i konjugate helatora. Na primer, U.S. patent br. 4,831,175 Gansow-a je usmeren na polisupstituisane helatore i konjugate proteina dietillentriaminpentasirćetne kiseline koji sadrže iste i metode njihovog pripremanja. U.S. patenti br. 5,099,069, 5,246,692, 5,286,850 i 5,124,471 Gansow-a takođe se odnose na polisupstituisane DTPA helatore. Kao što su to opisali Kozak i sar., pokazano je da je nekoliko DTPA helatirajućih agensa, uključujući MX-DTPA, pogodno za radioimunoterapiju itrijum-monoklonalnim antitelom (1989. Priroda bifunkcionalnog helatirajućeg agensa upotrebljenog za radioimunoterapiju sa itrijum-90 monoklonalnim antitelima: kritični faktori u određivanju preživljavanjain vivoi toksičnosti za organe. Cancer Res. 49:2639-2644). Ove reference su ovde inkorporirane referencama u celini.

Itrijum-90 je posebno pogodan za radioimunoterapiju i terapiju radiopeptidima iz nekoliko razloga. 64. časovni polu-život<X>Yje dovoljno dugačak da omogući akumulaciju antitela od strane tumora i za razliku od, na primer,<131>1, on je čisti beta emiter visoke energije (E maks. 2.27 MeV) bez pratećeg gama zračenja u njegovom raspadanju. Emisija njegovih čestica prodire 100 do 1000 ćelijskih dijametara, što je dovoljno minimalna količina prodiranja zračenja da je davanje bolesniku moguće. Dalje, unošenje unutra radioobeleženih antitela nije neophodno za ubijanje ćelija i lokalna emisija jonizujućeg zračenja mora biti smrtonosna za susedne tumorske ćelije kojima može nedostajati ciljni antigen.

Međutim, uprkos prepoznatih upotreba itrijum-obeleženih antitela i ohrabrujućih kliničkih rezultata sa nekim terapeuticima obeleženim sa itrijumom, mnogi pacijenti su lišeni koristi koje ovi terapeutici mogu da pruže zbog prisutnih teškoća u sprovođenju i radioobeležavanja i davanja na istoj lokaciji. Ovaj značajan problem je evidentno, gotovo potpuno otsustvo kitova i produkata koji omogućuju obeležavanje reagenasa na licu mesta sa izotopima koji su alfa i beta emiteri, koji bi inače pokazali komercijalnu primenjivost takve tehnologije.

Problem sa obezbeđivanjem kitova za radioobeležavanje i davanje nakon toga obeleženih terapeutika sa destruktivnim izotopima izgleda da potiče od dugotrajnog verovanja u praksi da, pre nego što se mogu davati takvi terapeutici pacijentu, neophodan je ekstenzivan proces prečišćavnja da se uklone nevezani obeleživači tako da se pacijent ne izloži slobodnom radioizotopu koji se može akumulirati u kosturu ili drugim ne-ciljnim organima. Čak i oni kitovi koji su danas dostupni za obeležavanje antitela sa itrijumom zahtevaju komplikovane korake prečišćavanja pre nego što terapeutik postane spreman za davanje.

Na primer, trenutno Antisoma nudi kit za radioobeležavanje monoklonalnog antitela HMFGI (Theragvn®) sa ?°Y za uzastopno davanje pacijentima kod kojih je dijagnosticiran kancer ovarijuma. Prošireno istraživanje faza l-ll pokazalo je da taj tretman može biti posebno koristan za pacijente kao produžetak konvencionalne hirurgije i hemoterapije (Hird i sar. 1993. Pomoćna terapija kancera ovarijuma sa monoklonalnim antitelom. Br. J. Cancer 68: 403-406). Ipak Antisomini metodi obeležavanja zahtevaju uklanjanje nevezanog obeleživača putem Sephadex G50 gel filtriranja, što je značajno različito u odnosu na Theragvn® kit za obeležavanje koji je dostigao komercijalni uspeh, kao i prepreku za potvrđivanje da je ta terapija lako dostupna za sve pacijenate sa kancerom ovarijuma kojima može doneti korist.

Činjenica da danas takvi reagensi zahtevaju kolonsko prečišćavanje pre davanja je bila i produžiće i dalje da bude glavna smetnja u njihovoj dostupnosti svim pacijentima koji mogu imati koristi od takve tehnologije, sve dok se ne predstave pojednostavljeni metod koji omogućuje

lekaru da brzo, efektivno i pouzdano daje takve reagense. Na primer, doktor u okruženju pacijenta nema vremena niti opreme da prećišćava reagensa putem HPLC ili hromatografije sa gel filtracijom pre nego što da reagens svom pacijentu. To znači da na mestu mora biti dostupna dodatna operna za istovremenu produkciju reagensa i trenutnu isporuku doktoru, što drastično povećava cenu terapije i u nekim slučajevima može biti potrebno da pacijent putuje na znatna rastojanja da bi primio terapiju. Alternativno, lek može biti obeležen izvan okruženja, što bi zahtevalo prethodnu preparaciju i u najmanje kratkotrajno čuvanje terapeutika. To ne samo da deluje na efekt smanjenja snage radioizotopa kroz radioaktivno raspadanje tokom čuvanja, nego takođe vodi ka značajnoj šteti strukturnog integriteta proteina usled prekomernog izlaganja izotopu.

Na primer, mnogi izveštaji diskutovali su radiolitičku prirodu "V i sličnih radioizotopa (tj., Salko i sar,, 1998. Efekti radiolize na preparacije ttrijum-90-obeleženog Lym-1 antitela. J. Nucl. Med. 39: 667-670; Chakrabarti i sar., 1996. Prevencija radiolize monoklonalnog antitela tokom obeležavanja. J. Nucl. Med. 37: 1384-1388). Kao što je zabeleženo u Chakrabarti i sar., radionuklidi, kao što je ?Y isporučuju veliku količinu zračenja antitelu tokom procesa obeležavanja kao i tokom čuvanja. Zračenje je ponovljivo vodilo primerima znatne štete antitelu, koja može da eliminiše preferencijalno ciljanje ćelija tumora i izlaže ne-ciljna tkiva značajnim nivoima toksičnosti.

Mehanizam štete od zračenja bio je pripisan generisanju slobodnih radikala (Pizzarello, 1975. Direktno i indirektno delovanje. U: Pizzarello i VVitcofski, izd. Osnovna biologija zračenja, 2 izd. Phiiadelphia: Lea & Febger, pp. 20-29). Ali u Salko i sar., primećeno je da pri energiji od2.2MeV, beta čestice emitovane od<M>Y mogu lako raskinuti većinu hemijskih veza uključujući disulfidne mostove antitela, koji imaju snagu veze od samo 4.4 eV (Skoog. 1985. Principi instrumentalne analize, 3 izd. San Francisco: Saunders). Prema tome, što je kraće vreme u kojem je protein koji se obeležava izložen destruktivnim izotopima kao što je<S0>Y, to su bolje šanse da će protein zadržati strukturni integritet i specifičnost vezivanja koja mu je potrebna da interreaguje sa ciljnim antigenom sve do vremena kada će se davati i stići na ciljno mesto.

Radiolitička priroda<X>Ypoznata je u praksi godinama i mnogi su pokušali da reše problem prisustva ?Y u komercijalnoj primeni tih terapeutika. Na primer, i Salko i sar., i Chakrabarti i sar., procenjuju upotrebu radioprotektanata u preparacijama ^-obeleženog antitela kao način smanjenja štete antitelu. Salko i sar., posebno su izneli da je humani serum albumin omogućio održavanje imunoreaktivnosti preparacija ^V-obeleženog antitela sve do 72 časa. Međutim, specifična aktivnost pokazana Saiko-vim preparacijama bila je prilično niska (manje od 2 mCi/ml). Štaviše, ni Salko ni Chakrabati nisu pokušali da prevaziđu procese ekstenzivnog prečišćavanja, neophodne nakon obeležavanja antitela. Salko i sar. obeležavaju tokom perioda od 45 minuta do jedan čas, zatim prečišćavaju antitelo hromatografijom sa molekularnim sitima, dok Chakrabarti obeležava skoro tri sata i prečišćava hromatografijom sa filtracijom gela. Nijedan od tih metoda neće biti instrumentalan u davanju ^V-obeleženog terapeutika pacijentima u njihovom okruženju.

Chinol i Hnatovvich bili su u stanju da dostignu 90% radiohemijske čistoće za<X>Y-obeležene proteine sa specifičnim aktivitetima u rasponu od 1-3 mCi/mg bez prečišćavanja nakon obeležavanja, koristeći sopstveni generatorom-produkovan<90>Y (1987. Generator-produkovan itrijum-90 za radioimunoterapiju. J. Nucl. Med. 28(9): 1465-1470). Međutim, autori su br20 obeshrabrili davanje pacijentima preparacija koje imaju manje od 95% čiastoće i sugerisali da HPLC može biti važan i "verovatno bitan" korak.

Oni koji su shvatili da HPLC i drugi tipovi prečišćavanja moraju biti eliminisani kod bolesnika i bolničkih okruženja nisu uspeli u razvijanju protokola za dovljno davanje<X>Y tako da bude dostignut visok nivo inkorporacije obeleživača i prihvatljiv nivo stabilnosti antitela bude održan. Ako visok nivo radioinkorporacije nije konzistentno dostignut, pacijent može biti izložen neprihvatljivim nivoima radioinkorporacije slobodnog nevezanog radioobeleživača ako taj obeleživač nije prečišćen iz reagensa. Štaviše, ponovo, ako je strukturni integritet antitela oštećen tako da antitelo izgubi ciljnu specifičnost, takvi reagensi neće se vezati specifično za njihove srodne ligande.

Mather i kolege počeli su sa ciljem da obeleže tumor-specifična antitela sa "V na takav način da prečišćavanje nakon obeležavanja može biti izbegnuto (1989. Obeležavanje monoklonalnih antitela sa itrijumom-90. Eur. J. Nucl. Med. 15: 307-312). Međutim, Mather je našao da se visoka efikasnost obeležavanja (preko 95%) može dostići samo pri umerenim specifičnim aktivitetima (1 mCi/mg). Štaviše, Mather i sar., izveštavaju da su njihove preparacije antitela pokazale znakove raspadanja (zahvaljujući radiolizi) nakon samo nekoliko časova. To može biti zato što su Mather i sar., kao i mnogi drugi u oblasti, izvodili svoje reakcije obeležavanja tokom perioda od jednog časa.

Na primer, postoje metodi predloženi za obeležavanje proteinskih reagenasa sa manje destruktivnim obeleživačima kao što je<111>ln, koji prethodi dodatnim koracima prečišćavanja. Richardson i sar., predlažu takvu proceduru za obeležavanje antitela sa 111 In sa ciljem olakšavanja foimiranja kita za dijagnostičku upotrebu (Richardson i sar., 1987. Optimizacija i grupna produkcija DTPA-obeleženih kitova za rutinsku upotrebu u<111>ln imunoscintografiji. Nucl. Med. Comm 8: 347-356). Međutim, metod obeležavanja predložen u Richardson i sar., je vođen tokom perioda od jednog časa, što može biti izvodljivo sa<111>ln koji nije mnogo radiolitičan, ali nije pogodno za primene<M>Y kao što je dokazano teškoćama iznesenim kod Mather i sar.

To nas dovodi do iznenađujućih i neočekivanih prednosti predmetnog pronalaska, koji obezbeđuje dragocen uvid u procese radioobeležavanja proteina sa ?Y koji nisu do sada prepoznati od strane drugih u praksi. Iznenađujuće, predmetni pronalazači su pronašli da izvođenje HPLC ili drugih koraka prečišćavanja za koje su drugi dugo vremena mislili da su neophodni da se dostigne čisti reagens, i duga vremena inkubiranja koje su drugi prilagodili u pokušajma da povećaju specifičnu aktivnost njihovih reagenasa, su u stvari štetni za proces pripremanja<90>Y-obeleženog reagensa. Takvi procesi koji uključuju vreme služe samo da povećaju štetu na proteinima zbog radiolize, vodeći manjoj specifičnosti i povećanoj stopi degradacije proteina u vreme kada je rađioobeleženi protein spreman za injekciju. Na iznenađenje, predmetni pronalazači pronašli su da efektivno obeležavanje sa<90>Y (>95%) inkorporacije i najmanje 15 mCI/mg specifične aktivnosti) može biti obavljeno u samo dva do pet minuta, i u stvari takvo obeležavanje gubi svoju efikasnost kada su reakciona vremena povećana čak preko osam minuta.

Činjenica da obeležavanje sa<90>Y može sada biti dostignuto metodama predmetnog pronalaska u toliko malo kao što je dva minuta će kompletno ukloniti trenutni skepticizam u oblasti u pogledu upotrebljivosti itrijum radioobeleženih kitova u bolničkim i bolesničkim okruženjima. Kitovi predmetnog pronalaska će prema tome konačno zadovoljiti poterbu koja se dugo oseća koja je bila prepoznata od strane mnogih pacijenata sa kancerom i doktora u odnosu na komercijalnu primenjivost i dostupnost na proteinima baziranih radioobeležnih terapeutika kancera.

Sadržaj pronalaska

Predmetni pronalazak se odnosi na postupak za radioobeležavanje helator-konjugovanog proteina ili peptida sa 90Y za dobijanje radioobeleženog proteina ili peptida koji se može davati direktno pacijentu bez daljeg prečišćavanja od neugrađenog radioaktivnog obeleživača, Postupkak predmetnog pronalaska u osnovi sadrži (i) mešanje helator-konjugovanog proteina ili peptida sa rastvorom koji sadrži 90Y ili njegovu so u prihvatljivom puferu, i (ii) inkubiranje mešavine manje od 8 minuta, na temperaturi između 25oC do 43o, na pH od 3 do 6 tako da se produkuje protein ili peptid obeležen sa 90Y koji ima radiohemijsku čistoću veću od 95%, specifičnu aktivnost najmanje 5 mCi/mg, specifičnost vezivanja od najmanje 50%, i može se davati direktno pacijentu bez daljeg prečišćavanja od neugrađenog radioaktivnog obeleživača.

Kitovi predmetnog pronalaska u osnovi sadrže (i) vijal koji sadrži helator-konjugovan protein ili peptid, (ii) vijal koji sadrži formulacioni pufer za stabilizovanje i davanje radioobeleženog antitela pacijentu, i (iii) instrukcije za obavljanje procedure radioobeležavanja, tako da kada se helator konjugovani protein ili polipeptid izloži radioizotopu ili njegovoj soli tokom dovoljnog trajanja vremena pod prihvatljivim uslovima kao što je preporučeno u pomenutim instrukcijama, rađioobeleženi protein ili peptid koji ima dovoljnu čistoću, specifičnu aktivnost i specifično vezivanje je dostignut tako da radioobeleženo antitelo može biti razblaženo do odgovarajuće koncentracije u pomenutom formulacionom puferu i dato direktno pacijentu bez daljeg prečišćavanja.

Kratak opis crteža

Slika 1. A) SB ćelije su isprane i resuspendovane do 90 X IO<6>ćelija/mL sa puferom za razblaživanje (IX PBS, pH 7.4 sa 1% (w/v) goveđeg serum albumina. Povećane koncentracije ćelija su bile inkubirane tokom 3 časa sa 2 ng/mL Y2B8 pripremljenim koristeći 2B8-MX-DTPA lot # 0165A. B). Dvostruko-inverzni plot koncentracije ćelija u odnosu na vezanu radioaktivnost/ukupna radioaktivnost (B/AT). Imunoreaktivnost je izračunata kao l/y-odsečak x 100. Imunoreaktivnosti i vrednosti koeficijenta korelacije (R) bile su 72.2% i 0.999, respektivno.

Detaljan opis pronalaska

Sem ako je definisano drugačije, svi tehnički i naučni termini koji se koriste ovde imaju isto značenje kao stoje to uobičajeno za prosečno iskusne u praksi kojoj pronalazak pripada. I ako u korišćenju ili ispitivanju predmetnog pronalaska mogu biti upotrebljeni bilo koji metodi i materijali slični ili ekvivalentni onima opisnim ovde, opisani su poželjni metodi i materijali.

Predmetni pronalazak uključuje metod za radioobeležavanje helator-konjugovanog proteina ili peptida sa terapeutskom radioizotopu, za davanje pacijentu, koji sadrži (i) mešanje helator-konjugovanog proteina ili peptida sa rastvorom koji sadrži radioizotop ili njegovu so, i (ii) inkubiranje mešavine tokom dovoljno vremena pod prihvatljivim uslovima tako daje dostignut rađioobeleženi protein ili peptid koji ima dovoljnu čistoću, tj. nivo radioinkorporacije, specifičnu aktivnost i specifičnost vezivanja tako da radioobeleženo antitelo može biti dato direktno pacijentu bez daljeg prečišćavanja. "Dalje prečišćavanje" uključuje HPLC. Gel filtriranje, druge tipove kolonske hromatografije i bilo koju drugu tehniku razdvajanja koja se upotrebljava sa ciljem da se ukloni slobodan ili vezan nekonjugovani radioobeleživač.

Metodi predmetnog pronalaska posebno su primenjivi za terapeutske radioizotope koji su tipično radiolitički i prema tome potencijalno opasni za strukturni integritet proteina. Takvi terapeutski radioizotopi su generalno selekcionisani iz grupe koja se sastoji od alfa i beta emitera. Poželjni terapeutski radionuklidi uključuju<203>Pb,<2l2>Pb,<2f2>Bi,<fo9>Pd,<M>Cu, 67Cu,90Y,7<7>Br,<21>'At,<97>Ru,<l05>Rh,<95>Au i<199>Ag ili<177>Lu. Drugi radionuklidi koji imaju terapeutsku primenu opisani su u U.S. patentu 5,541,287, inkorporiranog ovde referencom. Posebno poželjni radionuklidi su jaki emiteri beta zračenja koji mogu izazvati intramolekularno razlaganje, kao što su<90>Y,<67>Cu,<1>31l,1B<6>Rei<188>Re. Iakose "terapeutski" radioizotop generalno odnosi na radioizotope kao što su beta i gama emiteri koji imaju citotoksični efekt, u obimu u kojem takvi radioizotopi mogu biti takođe upotrebljeni u dijagnostičke svrhe, takve svrhe ne uklanjaju te izotope iz obima predmetnog pronalaska zato što je radiolitička priroda tih izotopa ono što ih prikazuje kao pogodne za obelodanjene metode i kitove.

Metodi predmetnog pronalaska mogu biti upotrebljeni da se obeleže proteini ili peptidi, posebno oni gde mora da se održi strukturni integritet zbog ciljne specifičnosti. Poželjni proteini su antitela ili delovi antitela, kao što su Fab, (Fab)2i Fv fragmenti, koje prepoznaju tumor specifični ili tumor-vezani antigeni. Poželjni peptidi uključuju somatostatin, vazointestinalni peptid (VIP), supstancu P i druge koji se vezuju za ćeiijske receptore. Takvi peptidi i helator-konjugovani derivati takvih peptida su obelodanjeni u U.S. patentu br. 5,830,431 inkorporiranom ovde referencom.

"Dovoljno inkubaciono vreme" kako je navedeno u metodama pronalaska je prihvatljiv raspon vremena tokom kojeg su dostignute dovoljna radioinkorporacija i radiohemijska čistoća tako da reagens može biti dat direktno pacijentu bez potrebe za daljim prečišćavanjem. Dovoljna radioinkorporacija i čistoća su generalno prepoznati u praksi da moraju biti najmanje 95%, ali može varirati u zavisnosti od nivoa toksičnosti obeleživača. Mora biti očigledno onima sa iskustvom u praksi da obim radioinkorporacije koji se smatra dovoljnim, je takođe funkcija željenog nivoa efikasnosti. Za* °Yi posebno ^V-obeležena antitela predmetnog pronalaska, takvo dovoljno vreme može generaino biti manje od osam minuta, ili još poželjnije između oko dva do oko pet minuta, pod pretpostavkom da je povoljan molami odnos helatora prema proteinu u helator-konjugovanom proteinu koji treba da se obeleži.

Onima sa iskustvom u praksi mora biti očigledno da optimalno vreme koje je potrebno za obeležavanje specifičnog proteina može varirati u zavisnosti od proteina, određenog radioobeleživača i određenog konjugata koji se upotrebljava. Istaknuti faktor u optimizaciji vremena određenog za radioobeležavanje je odnos helatora prema proteinu reagensa koji treba da se obeleži. Na primer, odnos helatora prema proteinu mora biti dovoljno visok da se dostigne terapeutski koristan nivo inkorporacije, tj., 95%, ali takođe ne srne biti toliko visok da se naruši strukturni integritet ili imunoreaktivnost proteina. To zahteva određeni proces balansiranja koji u nekim slučajevima može voditi ka nižem nivou konjugovanog helatora i dužem vremenu obeležavanja.

Na primer, predmetni pronalazači otkrili su da obeležavanje sa<X>Ydo željenog nivoa čistoće može biti obavljeno za manje od pet minuta koristeći MX-DTPA kao helator i samo oko 1 1/2 do 1 molarnog odnosa helatora prema antitelu. I ako odnos helatora prema antitelu može zaista biti povećan, to nije bilo neophodno zato što željeni nivo radioinkorporacije i specifične aktivnosti bio je dostignut nakon kratkog perioda obeležavanja. Uzevši u obzir ovo otkriće, parametri kao što je koncentracija helatora prema proteinu mogu se lako odrediti empirijskim načinima od strane onih sa iskustvom u praksi za druge proteine i peptide, u zavisnosti od izabranog terapeutskog obeleživača, izbora helatora, broja dostupnih mesta za pričvršćivanje helatora, osetljivosti proteina na radiolizu, željenog nivoa efikasnosti itd.

U metodu predmetnog pronalaska može biti upotrebljen bilo koji bifunkcionalni helator sve dok je sposoban za vezivanje i za protein i za radioizotop od interesa. Preferirani helatori mogu biti selekcionisani iz grupe koja se sastoji od MX-DTPA, fenil-DTPA, benzil-DTPA, CHX-DTPA, DOTA i njihovih derivata. Posebno poželjan helator je MX-DTPA.

"Pogodni uslovi" onako kako se koriste u predmetnim metodama uključuju prihvatljivu temperaturu, pH i uslove pufera. Onima sa iskustvom u praksi mora da bude očigledno da ne treba da budu odabrani uslovi reakcije koji su inhibitorni ili na neki drugi način ne vode ka reakciji obeležavanja. Lewis i sar. diskutuju uslove reakcije koji se moraju uzeti u obzir kada se radioobeležavaju imunokonjugati, i to je ovde inkorporirano referencom (1994. Lak, u vodi rastvorljiv metod za modifikovanje proteina sa DOTA. Upotreba povišene temperature i optimizacija pH da se dostigne visoka specifična aktivnost i visoka stabilnost helata u radioobeleženim imunokonjugatima. Bioconjugate Chem. 5: 565-576).

Prihvatljiva temperatura za reakciju može varirati u zavisnosti od proteina koji treba da se obeleži, ali je generalno u rasponu od oko 25°C do oko 43°C. Levvis i sar., pronašli su da je povećanje temperature radioobeležavanja od 25°C do 43°C povećalo i efikasnost inkorporacije radiometala i kinetičke stabilnosti ispitanih DOTA radiokonjugata.

Prihvatljivi pH može varirati značajno u zavisnosti od radioobeleživača koji se upotrebljava. Preporučeni pH za obeležavanje sa različitim radionuklidima generalno je poznat u praksi i može biti odabran u skladu sa radioizotopom. Na primer, za<90>Y, prihvatljivi pH može biti u rasponu od oko 3 do oko 6, ali je poželjnije oko 4.2.

Prihvatljivi puferi će takođe varirati u zavisnosti od određenog radioobeleživača. Na primer, Levvis i sar., i drugi našli su da prisustvo citrata inhibira reakcije obeležavanja sa<90>Y. Prema tome, citratni pufer ne bi bio odgovarajući ako je<90>Y odabrani radioobeleživač. Kada se obeležava sa 90Y, poželjni pufer je acetatni pufer, a još preciznije natrijum acetatni pufer u koncentraciji od oko 10 i oko 1000 mM.

Ako ne inhibira ili na drugi način štetno delije na reakciju obeležavanja, u reakcioni pufer može takođe biti uključen dobroćudni (ne-štetn) radioprotektant. Prema Chakrabati, askorbinska kiselina je jedan takav radioprotektant koji ne interferira sa procesom obeležavanja. Međutim, kada se upotrebi humani serum albumin u reakciji obeležavanja zbog prisustva metala koji bi interferirali sa procesom obeležavanja, mora se obratiti pažnja.

Zato što se predmetni pronalazak odnosi na radioobeležavanje proteina sa posebnim radiolitičkim izotopima, može postojati određeni balans između specifičnosti vezivanja i specifične aktivnosti sa kojom se iskusni praktičar može sresti kada praktikuje metode predmetnog pronalaska. Na primer, kada je specifična aktivnost vrlo visoka (tj., pogodno preko 5 mCi/mg, poželjno preko lOmCi/mg i još poželjnije preko 15 mCi/mg), proteinski konstrukt koji ima željenu specifičnost vezivanja imaće značajan kapacitet ubijanja u regionu tumora. Međutim, deo proteina u populaciji kao celini koja zadržava svoju imunoreaktivnost može biti niži nego u populaciji imajući nižu specifičnu aktivnost zahvaljujući radiolizi radioobeleživača. U zavisnosti od željenog nivoa specifične aktivnosti, iskusan praktičar može odabrati da usaglasi određeni nivo imunoreaktivnosti.

Na primer, predmetni pronalazači našli su da, sa<90>Y, kada je antitelo obeleženo specifičnom aktivnošću od oko 15 mCi/mg, specifičnost vezivanja ili imunorektivnost proteina je generalno najmanje oko 70%. To naravno može varirati u zavisnosti od osetljivosti antitela i radiolitičke prirode upotrebljenog radioizotopa, i može biti menjano od strane iskusnog praktičara ako je potreban visok nivo imunoreaktivnosti ili specifične aktivnosti. Predmetni pronalazači dostigli su specifične aktivnosti sa<90>Y od sve do oko 20 mCi/mg. Specifičnosti vezivanja od najmanje 50% poželjne su za terapeutske primene.

Zajedničke prijave 09/259,337 i 09/259,347, zajedničko vlasništvo i podnete istovremeno s tim, obelodanjuju oglede vezivanja, koji mogu biti upotrebljeni da se odredi procenat afiniteta vezivanja i imunorektivnost konjugata nakon obeležavanje ako je potrebno. Mora se naglasiti da, i ako nije potrebno dalje prečišćavanje nakon metoda obeležavanja predmetnog pronalaska, TLC-baziran ogled da se verifikuje nivo radioinkorporacije mora biti uvek obavljen tako da se ne izloži opasnosti zdravlje pacijenta. Jedan takav ogled može se obaviti za oko 3-4 minuta i ne bi trebalo da značajno deluje na stabilnost ili efikasnost radioerapeutika.

Predmetni pronalazak takođe uključuje kitove za radioobeležavanje helator-konjugovanog proteina ili peptida sa terapeutskim radioizotopom za davanje pacijentu, koji sadrže (i) vijal koji sadrži helator-konjugovani protein ili peptid, (ii) vijal koji sadrži formulacioni pufer za stabilizaciju i davanje radioobeleženog antitela pacijentu, i (iii) instrukcije za izvođenje procedure radioobeležavanja, tako da kada helator-konjugovani protein ili peptid je izložen radioizotopu ili njegovoj soli tokom dovoljnog vremena pod povoljnim uslovima kako je preporučeno u pomenutim instrukcijama i opisano dalje gore, rađioobeleženi protein ili peptid koji ima dovoljnu čistoću, specifičnu aktivnost i specifična aktivnost je dostignuta tako da radioobeleženo antitelo može biti razblaženo do odgovarajuće koncentracije u pomenutom formulacionom puferu i dato direktno pacijentu bez daljeg prečišćavanja. Pomenuti helator-konjugovani protein ili peptid može biti isporučen u liofiiiziranom obliku.

Mora se shvatiti da su kitovi predmetnog pronalaska dizajnirani da izvedu metode opisane ovde i mogu, prema tome, biti upotrebljeni za tu svrhu. Shodno tome, mora biti očigledno onima na koje se odnosi pripremanje pronalaska da će instrukcije kita biti bazirane na metodima opisanim ovde, i da gore upućena razmatranja imaju isu važnost i značenje kada se razmatraju u odnosu na oblik kita. Sem toga, mora biti jasno nakon čitanja prijave u celini da su alternativni oblici kita uključeni u predmetni pronalazak koji može sadržati komponente kao što je acetatni pufer za doterivanje pH radioobeleživača kao što je gore opisano.

Posebno korisna komponenta kita je formulacioni pufer za stabilizovanje protiv efekta radiolize i davanja radioobeleženog konjugata antitela pacijentu. Formulacioni pufer je farmaceutski prihvatljiv nosač koji služi i kao rastvarač za obeleženo antitelo i kao pufer za davanje. I ako farmaceutski prihvatljivi rastvarač može biti upotrebljen za davanje terapeutskih ili dijagnostičkih antitela pacijentu, formulacioni pufer predmetnog pronalaska je posebno podesan za davanje radioobeleženih antitela.

Na primer, formulacioni pufer predmetnog pronalaska sadrži radioprotektant kao što je humani serum albumin (HSA) ili askorbat, koji minimizuje radiolizu zahvaljujući itrijumu i drugim jakim radionuklidima. U praksi su poznati drugi radiprotektanti i koji mogu biti takođe upotrebljeni u formulacionom puferu predmetnog pronalaska, tj., slobodni radikali čistači (fenol, sulfiti, glutation, cistein, gentisična kiselina, nikotinska kiselina, askorbil palmitat, HOP(:0)H2, glicerol, natrijumformaldehid sulfoksilat, Na2S205, Na2S203i S02, itd.

Formulacioni pufer predmetnog pronalaska takođe sadrži višak nekonjugovanog helatora. Svrha uključivanja nekonjugovanog helatora je da helator služi kao čistač bilo kojih ne-protein vezanih radioobeleživača kod pacijenta, i uzrokuje ekskreciju radioobeleživača redukujući tako uzimanje "kost-zahtevnog" izotopa, tj.,90Y,od strane kostiju pacijenta. Na primer, kada je antitelo kita konjugovano sa DTPA helatorom, višak DTPA ili bilo kog drugog helatora može biti uključen u formulacioni pufer. Formulacioni pufer je takođe preferentno isporučen u takvoj količini da su kompletni sadržaji preneseni u reakcioni vijal. Kako je to diskutovano gore, ovoj rezultira povećanom lakoćom upotrebe i ponovljivosti zato što tačne zapremine ne moraju biti merene i prenošene.

Poželjna formulacija pufera sadrži pufrizovane fosfate ili fiziološki rastvor, humani serum albumin i DTPA. Humani serum albumin poželjno je u koncentraciji od oko 5 do 25% (w/v) i još poželjnije u koncentraciji od oko 7.5% (w/v). Koncentracija DTPA poželjno je oko 1 mM. Askorbat može biti upotrebljen kao alternativa humanom serum albuminu i tipično upotrebljen u koncentraciji od oko 1 do 100 mg/ml. I ako može biti upotrebljen širi raspon koncentracija bez ugrožavanja sigurnosti pacijenta.

Kit može biti isporučen u drugim alternativnim oblicima u zavisnosti od prioriteta kupca. Na primer, kit može dalje sadržati sterilni reakcioni vijal u kojem mogu biti izvedene i reakcija obeležavanja i razblaživanja u formulacionom puferu. Zamišljeni su dalji oblici u kojima pufer za doterivanje pH radioobeleživača je isporučen u aktualnom reakcionom vijalu da se smanji otpad. Takođe su zamišljkeni kitovi koji dalje sadrže vijal radioizotopa, i ako može biti podesnije da se ranije naruči kit za obeležavanje i odvojeno naruči radioizotop neposredno pre davanja. Takođe su zamišljeni kitovi koji sadrže vijal sekundarnog proteina ili peptida da služe ili kao kontrola u utvrđivanju afiniteta vezivanja radioobeleženog produkta, ili u nekim slučajevima da se upotrebe u kombinovanom terapeutskom režimu sa radioobeleženim proteinom ili peptidom.

Detaljan opis poželnih oblika

^V-obeleženo mišje monoklonalno anti-CD20 antitelo (Y2B8) se trenutno procenjuje u kliničkim trijalima za tretman ponovljenih limfoma B-ćelija. 2B8 antitelo je mišje antitelo koje prepoznaje humani CD20. Himerična verzija ovog antitela (Rituxan®) nedavno je dobila FDA odobrenje za tretman u ne-Hodgkin-ovog limfoma. U.S. patentna prijava br. 08/475,813, inkorporirana ovde referencom, obelodanjuje dosledno davanje Rituxana® sa itriium-obeleženim mišjim monklonalnim antitelom u kombinovanom terapeutskom režimu, gde je davanje itrijum-obeleženog anti-CD20 antitela nakon davanja Rituxana® dovoljno da (a) očisti bilo koje preostale B ćelije iz krvi koje nisu očišćene sa himeričnim anti-CD20 antitelom; (b) započne iscrpljivanje B ćelija iz limfnih čvorova; ili (c) započne iscrpljivanje B ćelija iz drugih tkiva.

Prema tome, uzevši u obzir dokazanu efikasnost anri-CD20 antitela u tretmanu ne-Hodgkin-ovog limfoma i poznatu osetljivost limfocita na radioaktivnost, bilo bi vrlo probitačno za takva terapeutska antitela da postanu komercijalno dostupna u obliku kita dok istovremeno mogu biti lako modifikovana sa radioobeleživačem i data direktno pacijentu u kliničkom okruženju.

Kit za radioobeležavanje za 2B8 antitelo je preferentno sastavljen od četiri komponente:1.) 2B8-MX-DTPA u rastvoru sa niskim sadržajem metala na 2 mg/mL, 2.) 50 mM natrijum acetata upotrebljenog da se dotera rastvor radioizotopa do odgovarajućeg pH obeležavanja, 3.) formulacioni pufer (1X PBS, pH 7.4 koji sadrži 7.5% humanog serum albumina i 1mM DTPA) i prema potrebi, 4.) prazni stakleni vijal od 10 mL (reakcioni vijal)("10 mL" reakcioni vijal u stvari lako prima 10mL i tehnički je nešto veći od "10mL"). Sve komponente su testirane na sterilnost i odsustvo pirogena.

Ovaj odeljak sumarizuje proveru vrednosti ovog kita za radioobeležavanje, koji je jednostavan i lak za upotrebu i koji daje radioobeležena antitela sa >95% radioinkorporacije i prihvatljivo zadržavanje vezivanja antigen-pozitivnih ćelija. Takođe je obavljena procena vrednosti eksperimentalnih parametara koji utiču na vezivanje i radioinkorporaciju.

Primer 1. Kit za radioobeležavanje i metodi za obeležavanje 2B8 sa<90>Y

A. Reagensi i kit za radioobeležavanje

1. 2B8-MX-DTPA, IDEC; lot# 082395RM2

2. 50 mM natrijum acetat, niži sadržaj metala, IDEC; lot# 082395RM3

3. Formulacioni pufer (1X PBS, pH 7.4, koji sadrži 7.5% (w/v) humanog serum albumina i 1 mM

DTPA), IDEC. Lo1# 082395RM1

4. Reakcioni vijal, 10 mL, IDEC

B. Materijali i oprema

1. Biodex Tec-Kit za kontrolu radioinkorporacije, kat.#151-770

2. Rukavice: bez-talka

3. Sterilne polistirenske siringe

4. Sterilne igle za siringe

5. Male tube sa poklopcem; 1.5 ml

C. Metodi

1. Pripremanje Y2B8 pomoću kita za radioobeležavanje

Reagensi kita pripremljeni su i napunjeni u staklene vijale sa pregradom. Borosilikatni vijali tipa I (2 ili 10 mL) su isprani sa sterilnom vodom za injekcije (WFI) i autoklavirani pre punjenja. Pregrade od butil gume su isprane sa sterilnim WFI i autoklavirane pre upotrebe. Reagensi su ručno napunjeni i uvijeni stavljeni u Class 100 sobu i testirani na pirogenost i sterilnost putem USP metoda.

Dodatni reagensi:

1. ltrijum-[90]: hloridna so, bez nosača, u HCI.

Upozorenja:

1. Svi koraci moraju se obaviti koristeći aseptične tehnike.

2. Komponente kita za radioobeležavanje moraju biti ostavljene da dostignu sobnu temperaturu pre upotrebe.

Protokol za radioobeležavanje

1. Zapremina ^VCIg koja treba da se doda u reakcioni vijal izračunata je na sledeći način:

a. Koncentracija radioaktivnosti u vremenu radioobeležavanja:

C0 = Koncentracija radioaktivnosti u vreme kalibracije (vidi sertifikat analize proizvođača). At = Promena u vremenu (pozitivni broj je post kalibracija, negativni broj je pre-kalibracija). b. Zapremina ^ VC^ koja treba da se doda u reakcioni vijal: 2. Zapremina 50 mM natrijum acetata koja treba da se doda reakcionom vijalu izračunata je na sledeći način:

a. Za<90>Y<C>I3u 0.040 M HCI (Amersham):

Zapremina<90>YCI3(korak 1b) x (0.8) = zapremina natrijum acetata koja treba da se doda

b. Za<90>YCI3u 0.050 M HCI (Nordian):

Zapremina ^VCLj(korak 1b) x (1.0) = zapremina natrijum acetata koja treba da se doda 3. Pregrada reakciohog vijala i vijal natrijum acetata su izbrisani sa alkoholom. Koristeći siringu od 1 cc, izračunata zapremina (korak 1a ili 1b) od 50 mM natrijum acetata (korak 2) je prenesena u reakcioni vijal. Vijal je pomešan obrtanjem nekoliko puta. 4. Pregrada ""VC^ izvornog vijala je izbrisana sa alkoholom. Vijal sa iglom snabdeven je filterom od 0.2/m Koristeći sterilnu siringu od 1 cc kao otvor prenesena je potrebna zapremina (korak 1b) '"VCIg u reakcioni vijal. Vijal je pomešan obrtanjem nekoliko puta. 5. Pregrada 2B8-MX-DTPA vijala je izbrisana sa alkoholom. Vijal sa iglom snabdeven je filterom od 0.2/m Koristeći sterilnu siringu od 3 cc, 1.5 mL 2B8-MX-DTPA prenesen je u reakcioni vijal. Vijal je pomešan obrtanjem nekoliko puta. 6. Ukupna zapremina reakcione mešavine izračunata je dodavanjem količine dodanog Y-90 hlorida (korak 4), plus količina od 50 mM dodanog natrijum acetata (korak 3), plus količina dodanog 2B8-MX-DTPA (korak 5). 7. Zapremina formulacinog pufera koja treba da se doda reakcionom vijalu da se dobije konačna zapremina od 10 mL izračunata je oduzimanjem ukupne reakcione zapremine izračunate u u koracima 6 do 10. 8. Vilaj formulacionog pufera izbrisan je alkoholom i vijal je zapečaćen. Zahvaljujući viskoznosti formulacionog pufera vijalj je snabdeven sa 0.20//M filterom za siringu. Koristeći 10cc sterilnu siringu snabdevenu sa odgovarajućom iglom, zapremina formulacionog pufera izračunata u koraku 7 prenesena je u reakcioni vijal. Ventilaciona igla je uklonjena iz reakcionog vijala i vijal je promešan obrtanjem nekoliko puta (konačni produkt). Vijal je inkubiran najmanje 5 minuta pre obavljanja "ogleda radioinkorporacije". Boja rastvora bila je žuta i reakcioni vijal bio je pun potvrđujući tako da je dodan formulacioni pufer. 9. Ukupna radioaktivnost vijala konačnog produkta merena je koristeći odgovarajuću opremu setovanu za merenje<90>Y.

10. Konačni produkt je odmah čuvan na 2° - 8°C dok nije bio potreban za davanje pacijentu.

2. Ogled radioinkorporacije

Procenat radioinkorporacije je određen instant tankoslojnom hromatografijom (ITLC) koristeći Biodex-Tec-Control Radiochromatographic Kit prema sledećem protokolu:

Dodatni materijal i oprema:

1. ^-rađioobeleženi 2B8-MX-DTPA

2. Tube za brojanje radioaktivnih TLC traka

3. Makazice

4. Sterilne siringe, 1cc

5. Sterilne igle, 26G

6. Gama brojač ili scintilacioni brojač

7. Pipetor

Procedura:

1. Prvo se mora u celini pročitati Biodex-ovo uputstvo za rukovanje.

2. Svaki rađioobeleženi uzorak testiran je u triplikatu prema instrukcijama za kit: razvijena je jedna traka po vijalu. 3. Da se nanese radioaktivni uzorak na hromatografsku traku, upotrebljen je pipetor da se nanese 1//) na početnu liniju. Alternativno, može biti nanesena jedna mala tačka iz 26g igle pričvršćene na strilnu 1cc siringu. Antitelo ostaje na početku i ne inkorporirani "V-DTPA pomera se sa frontom rastvarača. 4. Svaka sekcija je prebrajana za aktivnost koristeći odgovarajući brojač, tj., scintilacioni brojač za<ao>W,doteran u odnosu na pozadinu.

5. Praćene su instrukcije za izračunavanje procenta radioobeležavanja Biodex-a.

3. Ogled vezivanja

Dodatni reagensi

1.<90>Y2B8-MX-DTPA

2. liofilizirane ćelije -

Humane ćelijske linije SB (CD20-pozitivne) i HSB (CD20-negativne) dobijene su od American Type Culture Collection u T-flašama koristeći RPMI-1640 koji je sadržao 10% fetalnog goveđeg seruma sa 2% glutamina. Kulture su održavane na 37°C i 5% COž. Ćelije se tipično dele 1:2 svakog drugog dana i prikupljaju na 0.5-2.5 x 10<6>ćelija/mL i vijabilitetu >80%. Koncentracije ćelija određene su koristeći hemacitometar a vijabilitet je određen pomoću isključivanja tripan plavog.

Ćelije su prikupljene na temperaturi ambijenta i pri gustini ćelija od 0.5-2.5 x 10<6>ćelija/mL centrifugiranjem (1300 rpm u Sorvall centrifugi) i dva puta isprane sa 1X HBSS. Oborene ćelije su resuspendovane do 50 x 10<6>ćelija/mL u 1X HBSS koji sadrži 1% (w/v) goveđeg serum albumina (BSA) i 10% (w/v) manitola (pufer za liofiliziranje), 0.5 mL podeljeno u 1.5 mL polipropilenskih tuba za mikrofuge sa o-prstenom i čuvane na -70°C i liofilizirane preko noći na 30 - 60 militora. Tube liofiliziranih ćelija čuvane su isušene na 2 - 8 °C i rekonstituisane u sterilnoj vodi za oglede; tube ćelija liofiliziranih u tubama za mikrofuge čuvane su sa isušivačem.

3. Sterilna voda za navodnjavanje ili sterilna voda za injekcije

4. Pufer za razblaživanje (1X PBS, pH 7.2 - 7.4 sa 1% goveđeg serum albumina (BSA) i 0. 02. natrijum azida)

Procedura:

Priprema uzorka radioobeleženog antitela

1. Dobijeno je radioobeleženo antitelo i čuvano na 2 - 8 °C.

2. Zapremina od 10//I je povučena sa P20 i dodana u tube za mikrofuge od 1.5 mL koje su sadržale 990 / A. pufera za razblaživanje (razblaženje 1:100). Nastavak je je ispran i tube su lagano izmućkane. 3. Dobijena je sterilna polipropilenska tuba od 50 mL sa poklopcem i 10mL i u tubu je dodano 10 mL pufera za razblaživanje koristeći serološke pipete od 10 mL. 4. Zapremina od 35/A. je odstranjena sa P200 iz tube za razblaživanje od 1:100 i dodana koničnoj tubi koja je sadržala 10 mL pufera za razblaživanje. Pomešaj energično.

Preparacija liofiliziranih ćelija

1. Dobijene su tri tube liofiliziranih SB ćelija.

2. Svakoj tubi je dodana zapremina od 0.5 mL SWFI i tube su promućkane sve dok nije dobijena suspenzija pojedinačnih ćelija. 3. Dobijene su tri prazne tube za mikrofuge od 1.5 mL; 0.5 mL pufera za razblaživanje dodano je u tri tube, što je predstavljalo kontrolu bez ćelija.

Protokol ogleda

1. Zapremina od 0.5 mL razblaženog<90>Y2B8-MX-DTPA je dodana u svaku tubu.

2. Tube su stavljene na i preko miksera tokom 45 minuta, nakon što smo se uverili da se poklopci pouzdano zatvoreni. 3. Nakon 45 minuta inkubacije na temperaturi ambijenta ćelije su oborene mikrocentrifugiranjem tokom 5 minuta.

4. Zapremina od 0.8 mL supernatanta je prenesena u scintilacione vijale.

5. U svaki vijal dodan je scintilacioni koktel.

6. Količina radioaktivnosti u svakom vijalu određena je koristeći scintilacioni brojač, doteran u odnosu na pozadinu.

D. Rezultati

Ponovljivost i preciznost protokola za radioobeležavanje za Y2B8 je procenjena izvođenjem nekoliko krugova potvrde valjanosti koristeći različite lotove svakog radioizotopa. Šest lotova za procenu valjanosti, svaki od Y2B8, pripremljeni su od strane pet operatora. Ti lotovi su određeni kako sledi i ispitani sledećom opremom:

#1: IDEC Pharmaceuticals

#2: IDEC Pharmaceuticals

#3: IDEC Pharmaceuticals

#4 MD Anderson Healt Center

#5 Mayo Clinic

#6 City of Hope

Rezultati ispitivanja za svaki lot za procenu valjanosti sumarizovani su u tabeli 1.

Srednja vrednost = 98.8 Srednja vrednost = 82.3 Standardna devijacija = 1.24 Standardna devijacija = 3.4 % CV = 1.25% CV = 4,2%

Za šest procena valjanosti pripremljenih lotova, dobijeni procenat vezivanja bio je u rasponu od 78.6% do 87.0% sa srednjom vrednosti od 82.3%. Vrednosti radioinkorporacije za Y2B8 bile su u prošeku 98.8% (raspon od 96.3% do 99.5%). Zajedno, ti rezultati potvrđuju ponovljivost i preciznost metoda kita za radioobeležavanje za pripremanje Y2B8 i zajedno ukazuju da je Y2B8 koji je pripremljen koristeći taj kit za radioobeležavanje pogodan za upotrebu u kliničkom okruženju.

Primer 2. Početna procena parametara reakcije -pHi vremena reakcije

Kinetičke studije su inicijalno izvedene da se proceni radioinkorporacija i vezivanje<90>Y-obeleženog antitela (Y2B8) praćenog reakcijama obeležavanja izvedenim pod promenjivim uslovima pH i vremena reakcije. Za reakcije radioobeležavanja u rasponu pH od 3.9 do 4.7 i vremenu inkubacije od 5 min, radioinkorporacija je bila >96% sa >80% zadržavanja vezivanja za CD20-pozitivne ćelije (tabela 2). Slični rezultati dobijeni su za inkubaciona vremena od 3, 5 i 10 min. za raspon pH 2.9-4.6 (tabela 3).

<1>Rezultati reakcije obeležavanja i studija procene parametra iznesenih u tabelama 2 i 3 su obavljeni sa

2B8izvedenim iz ekspresionog sistema CHO ćelije; MX-DTPA konjugat je pripremljen pomoću protokola sličnog onom upotrebljenom za prethodno okarakterisane 2B8-49. Reakcije su izvedene koristeći približno 3 mg antitela i molarni odnos 4:1 helatora prema antitelu kao što je opisano u pridruženoj aplikaciji serijski br. 09/ , istovremeno popunjenoj i inkorporiranoj ovde reterencom.

Imunoreaktivnosti za Y2B8 preparacije određene su metodom Lindmo i sar. Povećane količine sveže prikupljenih CD20-pozitivnih SB ćelija su inkubirane sa fiksiranom količinom Y2B8 u uslovima viška antigena. Recipročna plot analiza podataka vezivanja pokazala je imunoreaktivnost od 72.2% za Y2B8 nakon preparacije jednog trijala (slika 1).

Primer 3. Procena dodatnih reakcionih parametara

I. Uvod

Eksperimenti opisani u ovom odeljku ispituju uticaj devijacija protokola na vezivanje Y2B8 pripremljenog pomoću kita za radioobeležavanje Y2B8. Vezivanje radioobeleženog antitela može biti pod uticajem nekoliko parametara tokom procesa radioobeležavanja (tabela 4).

Sledeća odstupanja od protokola radioobeležavanja su prepoznata kao ona koja izgleda imaju najveći negativan uticaj na vezivanje, i uključuju: 1.) dodavanje manje zapremine natrijum acetata 2.) dodavanje viška zapremine rastvora<90>Y hlorida 3.) dodavanje manje zapremine 2B8-MX-DTPA i 4.) povećavanje maksimalnog inkubacionog vremena reakcije. Uticaj ovih odstupanja je procenjen odvojeno i istovremeno.

Kad je procenjivano odvojeno, 20% odstupanja zapremine u stavkama 1-3 gore rezultovala su u IDEC-Y2B8 prolaznom specifikacijom oslobađanja utvrđenom za vezivanje u kliničkom trijalu, čak kada su inkubirani tokom 8 min. U studiji kada su sva tri odstupanja zapremine napravljena istovremeno (1 - 3 gore), jedino doze pripremljene koristeći ponedeljak protokol obeležavanja (potencijalno najviše radiolitičan) i inkubirane tokom 8 min. (60% duže nego normalno) su marginalno ispod (< 3%) kliničkih specifikacija oslobađanja. Nasuprot tome, doze pripremljene korišćenjem petak protokola obeležavanja održavale su prihvatljive rezultate vezivanja, uprkos kumulativnim efektima odstupanja u sva četiri parametra (1-4 gore). Za sva odstupanja, odvojeno ili kolektivno, radioinkorporacija je bila iznad kliničkih specifikacija oslobađanja od 95%.

II.Izbor parametara

Presudili smo da 20% odstupanja od zahtevane zapremine reagenasa, ili dopuštanje da se vreme reakcije produži 30% u odnosu na maksimum od 6 min. koji se upotrebljava normalno, predstavlja potencijalno ekstremne devijacije od protokola upotrebljenog u radiofarmaciji. U ovoj studiji procenili smo uticaj tih devijacija na vezivanje IDEC-Y2B8. Stimulisali smo "ponedeljak" i "petak" obeležavanja da se osigura da uslovi koji su procenjeni predstavljaju ekstreme doze preparacije za celu nedelju. Takođe smo procenili kombinovane efekte na vezivanje kada se sve devijacije dešavaju u preparaciji pojedinačne doze, i uticaj tih devijacija na radioinkorporaciju 9°Y.

"Ponedeljak" i "petak" obeležavanja su odraz koncepta da, pošto rastvor* °Yhlorida ima kratak polu-život (64 časa), zapremina upotrebljenog radioizotopa zavisi od dana u nedelji kada je doza pripremljena. Iz tog razloga reakciona zapremina doze pripremljene u ponedeljak je manja, rezultirajući višim koncentracijama<90>Y, što može rezultirati većom radiolizom. Prema tome, mi smo stimulisali procedure obeležavanja ponedeljak i petak da obezbedimo da procenjeni uslovi predstavljaju ekstreme doze preparacije za celu nedelju.

III. Materijal i metodi

A. Reagensi

1.<X>YC\^u 0.05 M HCI; Pacific Northvvest National Laboratorv, kvalitet reagensa; P.O.#08016, 08118

2. Ultrex HCI; J.T. Baker, produkt# 6900, lot# J22539

3. Sterilna voda za navodnjavanje; Baxter, deo#2F7114, lot#G924092

4. Pufer za razblaživanje; sadrži 10 mM rastvora fosfatnog pufera, pH 7.4, 1% BSA; Sigma, deo# P-3683, lot# 076H8913 5. IDEC isporučeni kit za radioobeležavanje; IDEC deo#130018, lot# 0129, koji sadrži sledeće:

a) 2B8-MX-DTPA; IDEC deo# 129017, lot# 0165

b) 50 mM natrijum acetat; IDEC deo# 121017, lot# 0209A

c) formulacioni pufer; IDEC deo# 120015, lot# 0202

d) reakcioni vijal; IDEC deo# 122015, iot#0218

6. Liofilizirane SB ćelije, IDEC deo# 127, lot# 127-001F

B. Materijali i oprema

1. Pipetori (20, 200 i 1000 gL)

2. Vortekser

3. Nastavci za pipete bez metala (Biorad; bez metala)

4. Gama brojač (Isodata, model# 20-10)

5. Staklene tube (12 X 75 mm)

6. Polipropilenske tube (Costar; 15 mL i 50 mL konične, sterilne)

7. Tec-Control radiohromatografski kit (Biodex; cat# 151-770)

8. Mikrocentrifuga (Savant)

9. Polipropilenske tube za mikrofuge, bez metala (Bniorad; cat# 223-9480

C. Metodi

1. Preparacija Y2B8

Generalno, ^V-obeleženi 2B8-MX-DTPA je pripremljen koristeći malu verziju protokola za radioobeležavanje opisanog gore modifikovanog izmenama opisanim dole. Radioobeležavanje je izvedeno koristeći štok<M>Y hlorida koncentracije od 84 mCi/mL ili 29.8 mCi/mL da se stimuliše, respektivno. Ponedeljak ili petak preparacije doza (zasnovane na kalibraciji srede od 50 mCi/mL). Koncentrisani rastvor<X>Yhlorida je razblažen koristeći 50 mM HCI (Ultrex, visoke čistoće) u plastičnim tubama za mikrofuge "bez metala". Ultrex (visoka čistoća) HCI je razblažen do 50 mM sa sterilnom vodom za navodnjavanje (SWFI). Reakcije radioobeležavanja izvedene su u plastičnim tubama za mikrofuge "bez metala', koničnim tubama od 15 mL, ili staklenim reakcionim vijalom od 10 mL sa pregradom, obezbeđenim u kitu za radioobeležavanje Y2B8.

a. Obeležavanje u manjem obimu da se predvide preparacije doze potpunog obima

Reakcije radioobeležavanja od 1, 3, 10 i 40 mCi izvedene su koristeći uslove reakcije koji su simulirali preparaciju doza ponedeljka. Zapremine reagensa u mL za svaku reakciju sumarizovane su na tabeli 5.

Nakon 5 min. inkubacije, uzorci od 20 uL su uklonjeni i razblaženi sa formulacionim puferom do konačne Koncentracije od 0.21 mg/mL i čuvani na 2-8°C do ogleda. Vrednosti vezivanja su normalizovane u 1 mCi reakciji zato što su 1 mCi reakcije upotrebljene kao kontrole u naknadnim eksperimentima opisnim u ovom izveštaju. Iznesene vrednosti su normalizovane u 1 mCi kontrolnom uzorku deljenjem vrednosti vezivanja za svaku reakciju sa vrednosti vezivanja za kontrolu, i izražene u procentima.

b. Uticaj dodane zapremine natrijum acetata

Za ponedeljak obeležavanje, pomešano je 10 mCi<M>Y hlorida (0.119 mL) sa 0.114 mL od 50 mM natrijum acetata. Ova zapremina od 50 mM natrijum acetata predstavlja 20% smanjenje u količini pufera koji se normalno koristi da se pripreme kliničke doze IDEC-Y2B8. Dodano je konjugovano antitelo (2B8-MX-DTPA) (0.333 mL), uzorak je pomešan i zatim inkubiran na temperaturi ambijenta. Specifična aktivnost rastvora za radioobeležavanje bila je 18.9 mCi/mg antitela. U drugom minutu, 0.020 mL je uklonjeno, formulisano sa 0.24 mg/mL sa formulacionim puferom, i čuvano na 2-8°C. Formulisan je ostatak rastvora za radioobeležavanje nakon 8 min., do 24 mg/mL i čuvan na 2-8°C. Protokol je ponovljen da se simulira petak obeležavanje, koristeći 0.335 mL ?'Y hlorida, 0.323 mL natrijum acetata i 0.333 mL 2B8-MX-DTPA. Za obe studije, izvedena je 1mCi kontrolna reakcija koristeći "standard" uslove opisane gore (reakcija 5 min ).

c. Uticaj dodavanja viška zapremine<90>Y hlorida

Za ponedeljak obeležavanje, pomešano je 12 mCi<90>Y hlorida (0.143 mL) sa 0.143 mL od 50 mM natrijum acetata. Ova zapremina od 50 mM natrijum acetata predstavlja 20% povećanje u količini ^ potrebnoj za pripremanje tipične doze Y2B8. Dodano je konjugovano antitelo i rastvor uzorka je pomešan i zatim inkubiran na temperaturi ambijenta. Konačna specifična aktivnost bila je 22.5 mCi/mg antitela. U drugom minutu, 0.020 mL je uklonjeno, formulisano sa 0.24 mg/mL sa formulacionim puferom, i čuvano na 2-8°C. Formulisan je ostatak rastvora za radioobeležavanje nakon 8 min., do 24 mg/mL i čuvan na 2-8°C. Protokol petak obeležavanja izveden je na sličan način, koristeći 0.403 mL XY hlorida, 0.403 mL od 50 mM natrijum acetata i 0.333 mL 2B8-MX-DTPA (specifična aktivnost 22.5 mCi/mg antitela). Za obe studije, izvedena je 1mCi kontrolna reakcija koristeći "standard" uslove opisane gore (reakcija 5 min.).

d. Uticaj dodavanja manje zapremine konjugata antitela

Za ponedeljak obeležavanje, pomešano je 10 mCi * °Y hlorida (0.119 mL) sa 0.143 mL od 50 mM natrijum acetata.. Dodano je konjugovano antitelo (0.267 mL) što je predstavljalo 20% manje antitela od onog što se normalno upotrebljava, i rastvor je pomešan i zatim inkubiran na temperaturi ambijenta. U drugom minutu, 0.020 mL je uklonjeno, formulisano sa 0.24 mg/mL sa formulacionim puferom do konačne koncentracije antitela od 0.21 mg/mL, i čuvano na 2-8°C do ogleda. Protokol petak obeležavanja izveden je na sličan način, koristeći 0.336 mL<X>Yhlorida, 0.403 mL od 50 mM natrijum acetata i 0.27 mL konjugata. Za obe studije, izvedena je 1mCi kontrolna reakcija koristeći "standard" usiove opisane gore (reakcija 5 min.).

e. Uticaj devijacija kombinovanog reagensa

Uticaj 20% otstu panja u zapremini natrijum acetata, ?Y hlorida i konjugata je procenjen istovremeno za ponedeljak ili petak protokol obeležavanja. Za ponedeljak obeležavanje, pomešano je 12 mCi<90>Y hlorida sa 0.114 mL od 50 mM natrijum acetata, što predstavlja 20% povećanje u količini<X>Y hlorida i 20% smanjenja u količini natrijum acetata koji se normalno koristi. 2B0-MX-DTPA (0.267 mL), koji predstavlja 20% manje antitela nego što se normalno koristi, dodano je u reakcionu mešavinu inkubiranu na temperaturi ambijenta. U 2, 4, 6 i 8 minuta, uklonjeno je 0.020 mL iz reakcione mešavine, formulisane sa formulacionim puferom do konačne koncentracije antitela od 0.21 mg/mL, i čuvano na 2-8°C do ogleda. Petak obeležavanje izvedeno je slično koristeći 0.403 mL<X>Yhlorida, 0.387 mL natrijum acetata i 0.267 mL konjugata; uzorci od 40/vL su uklonjeni u naznačenim vremenima i formulisani sa formulacionim puferom. Za obe studije, izvedena je 1mCi kontrolna reakcija koristeći "standard" uslove opisane gore (reakcija 5 min.).

2. Određivanje radioinkorporacije

Količina radioaktivnosti vezana sa konjugatima određena je prema gore opisanom ogledu, koristeći komercijalno dostupan kit proizveden od strane Biodex (Tec-Control Radiochromatographic Kit). Generalno, uzorci od 0.5 - 1//L naneseni su na dvostruke trake koristeći mikropipetor i razvijeni prema dodatnim instrukcijama Biodex-a. Polovine traka su prebrajane na radioaktivnost u staklenim tubama koristeći Isodata gama brojač sa prozorima od100 - 1000 KeV. Inkorporacija radioobeležavanja je izračunata deljenjem količine radioaktivnosti na gornjoj polovini trake sa ukupnom radioaktivnosti nađenoj i na gornjoj i na donjoj polovini. Ta vrednost je izražena kao određeni procenat i određena je srednja vrednost.

3. Određivanje vezivanja

Uzorci su analizirani kao procenat vezivanja CD20 pozitivnih ćelija prateći protokol opisan gore. Međutim, uzorci HSB ćelija negativne kontrole nisu uključeni u ove eksperimente i SB ćelije su liofilizirane u vijalima od 5 mL umesto u tubama za mikrofuge.

Uosnovi, svi konačno formulisani uzorci Y2B8 su razblaženi 1:100 sa puferom za razblaživanje (10.0jA.antitela + 990[ Apufera). Antitelo je nakon toga ponovo razblaženo u odgovarajuću koncentraciju u rasponu od 8 ng/mL dodavanjem 35/ A.1:100 razblaženja do 10 mL pufera za razblaživanje u 50 mL polipropilenske tube.

Šest do sedam vijala liofiliziranih ćelija je rekonstituisano sa SWFI i pulirano u koničnim tubama od 50 mL. Rekonstituisane ćelije (0.5 mL) su zatim alikvotovane u triplikatu u tri tube za mikrofuge od 1.5 mL, a tri tube po uzorku su testirane. Pufer za razblaživanje (0.5 mL) je dodan u tri prazne tube za mikrofuge. Razblaženo antitelo (0.5 mL) dodano je u svaku tubu, čvrsto poklopljeno i inkubirano na temperaturi ambijenta tokom 45 minuta sa mešanjem kraj-preko kraja. Nakon inkubiranja, ćelije su oborene centrifugiranjem tokom 5 minuta na "6" (4000 X g) koristeći Savant mikrocentrifugu. Supernatanti iz uzoraka (0.75/A)su preneseni u staklene tube od 12 X 75 mm radi brojanja radioaktivnosti putem Isodata gama brojača sa energetskim prozorima postavljenim na 100 - 1000 KeV.

Vezivanje radioaktivnosti (B) za ćelije izračunato je oduzimanjem nevezane radioaktivnosti (supernatant) od ukupne dodate radioaktivnosti. Ukupna radioaktivnost je određena iz prebrojane radioaktivnosti u tubama bez ćelija. Procenat vezivanja je izračunat izražavanjem vezane radioaktivnosti kao procenta od ukupnog.

Da se minimizuje efekat varijabilnosti lota-prema-lotu liofiliziranih ćelija upotrebljenih da se proceni vezivanje, vrednosti vezivanja su normalizovane do 1mCi Y2B8 kontrola pripremljenih koristeći "standard" uslove obeležavanja. Kontrolni uzorci bili su pripremljeni kao što je ranije navedeno u ovom odeljku, za svaki set eksperimenata.

D. Rezultati

1. Obeležavanje u maloj razmeri da se predvide doze preparacija pune razmere

Da se obezbedi da su reakcije radioobeležavanja u maloj razmeri bile predviđanje pune razmere preparacija doze (40 mCi), doze od 1, 3, 10, i 40 mCi Y2B8 pripremljene su koristeći protokole za radioobeležavanje opisane gore. Ti rezultati su prikazani u tabeli 6 i pokazuju da povećavanje opsega reakcione mešavine od 1 mCi na 40 mCi doze ne deiuje štetno na vezivanje i radioinkorporaciju.

2. Uticaj dodavanja manje zapremine natrijum acetata

Kada je pripremljen Y2B8 koristeći 20% manju zapreminu 50 mL natrijum acetata, i produžavanje vremena inkubacije za 60%, naknadno vezivanje je zadržano, u poređenju sa radioobeleženim antitelom pripremljenim sledeći "standard" uslove obeležavanja (tabela 7 niže). Čak i kada je reakcija obeležavanja izvedena koristeći ponedeljak uslove obeležavanja, zadržano je >89% kontrolnog vezivanja. Slični rezultati dobijeni su za petak preparacije doza. Te devijacije nisu delovale na radioinkorporaciju, bez obzira na dan kada su doze pripremljene.

3. Uticaj dodavanja zapremine<90>ltrijum hlorida u višku

Kada je pripremljen Y2B8 koristeći 20% viška zapremine<90>Y hlorida, u kombinaciji savremenom inkubacije za 60% većim od normalnog, naknadno vezivanje je zadržano, u poređenju sa kontrolom pripremljenom sledeći "standard" uslove obeležavanja (tabela 7 niže). Kada je reakcija obeležavanja povećana na 8 minuta, vezivanje je još uvek ostalo >90% relativno u odnosu na kontrolu i za ponedeljak ili za petak preparacije doza. Dodavanje 20% više zapremine

* °Yhlorida nije uticalo na radioinkorporaciju bez obzira na dan kada su doze pripremljene.

4. Uticaj dodavanja manje zapremine konjugata antitela

Kada je pripremljen Y2B8 koristeći 20% manje zapremine konjugata (2B8-MX-DTPA), i produžavanjem vremena inkubacije za 60%, vezivanje nije bilo značajno pogođeno u poređenju sa Y2B8 pripremljnom prema "standard" uslovima obeležavanja (tabela 7 niže). Dodavanje 20% više zapremine 90Y hlorida nije uticalo na radioinkorporaciju bez obzira na dan kada su doze pripremljene.

5. Uticaj devijacija kombinovanog reagensa

Kada je Y2B8 pripremljen koristeći protokol u kojem su sve četiri devijacije napravljene istovremeno, vezivanje je još uvek naknadno održavano u poređenju sa radioobeleženim antitelom pripremljenim koristeći "standard" uslove obežavanja (tabela 8 ispod). Vezivanje je još uvek bilo >83%, čak i kada je ponedeljak preparacija inkubirana za 30% duže od maksimuma od 6 minuta koji se normalno koristi. Radioinkorporacija nije značajno narušena tim kumulativnim devijacijama, čaki i nakon 8 minuta vremena inkubacije, bez obzira na dan kada je doza pripremljena.

V.Diskusija

Da se redukuje izlaganje zračenju operatora, procenjene su manje reakcije obeležavanja umesto potpunih preparacija doza. Prema tome mi smo verifikovali da su obeležavanja od 1 mCi i 10 mCi, procenjena u ovoj studiji, bila dovoljna za predviđanje potpunih preparacija od 40 mCi. Rezultati su pokazali da nema značajnih razlika u vezivanju i radioinkorporaciji u rasponu od 1 mCi do 40 mCi.

Došli smo do rešenja da 20% grešaka zapremine za natrijum acetat,<90>Y hlorid i konjugovano antitelo predstavlja potencijalno ekstremne devijacije u protokolu radioobeležavanja. Dodatno inkubiranje od 8 minuta (3 min. duže od normalnog) viđeno je kao značajno odstupanje od protokola. Generalno, zahvaljujući kraćem poluvremenu<90>Y hlorida, zapremina izotopa će se razlikovati u zavisnosti od dana preparacije doze. Prema tome, eksperimenti opisani u ovom izveštaju su izvedeni koristeći<90>Y hlorid u koncentracijama reprezentativnim i za ponedeljak i za petak da bi predstavljale pun raspon preparacije moguće doze.

Y2B8 doze pripremnjene koristeći 20% manje zapremine natrijum acetata i inkubirane 8 minuta zadržale su značajno vezivanje (>89%) relativno u odnosu na standard uslova obeležavanja. Slični rezultati su dobijeni za doze pripremljene ponedeljkom i petkom. Ta devijacija u zapremini natrijum acetata nije delovala na radioinkorporaciju.

Dodavanjem 20% više zapremine<90>Y hlorida i inkubiranjem sve do 8 minuta, redukovalo je vezivanje, realtivno u odnosu na standardne uslove preparacije doze i za ponedeljak i petak. Međutim, vezivanje je bilo još uvek >90%, što je više od normalizovane specifikacije oslobađanja. Vezivanje je bilo marginalno bolje za petak doze obeležavanja. Radioinkorporacija nije bila značajno narušena povećanom zapreminom 90Y hlorida.

Da se proceni uticaj istovremenog pravljenja svih devijacija zapremina, ponedeljak i petak doze su pripremljene poredeći vremena inkubacije od 2, 4, 6 i 8 minuta. Samo kada je Y2B8 pripremljen u ponedeljak koristeći inkubaciju od 8 min., tada vezivanje marginalno nije uspelo da dostigne normalizovanu specifikaciju (83.2% u poređenju sa normalizovanom specifikacijom oslobađanja od 86.3%).

Claims (12)

1. Postupak za radioobeležavanje helator-konjugovanog proteina ili peptida sa ?Y za dobijanje radioobeleženog proteina ili peptida koji se može davati direktno pacijentu bez daljeg prečišćavanja od neugrađenog radioaktivnog obeleživača, naznačen time što sadrži: (i) mešanje helator-konjugovanog proteina ili peptida sa rastvorom koji sadrži<90>Y ili njegovu so u prihvatljivom puferu; i (ii) inkubiranje mešavine manje od 8 minuta, na temperaturi između 25°C do 43°, na pH od 3 do 6 tako da se produkuje protein ili peptid obeležen sa<X>Ykoji ima radiohemijsku čistoću veću od 95%, specifičnu aktivnost najmanje 5 mCi/mg, specifičnost vezivanja od najmanje 50%, i može se davati direktno pacijentu bez daljeg prečišćavanja od neugrađenog radioaktivnog obeleživača.

2. Postupak prema zahtevu 1, naznačen time što je pomenuti protein antitelo ili fragment antitela.

3. Postupak prema zahtevu 1, naznačen time što je pomenuto dovoljno inkubaciono vreme između dva do pet minuta.

4. Postupak prema zahtevu 1, naznačen time što pomenuti helator je bifunkcionalni helator selekcionisan iz grupe koja se sastoji od MX-DTPA, fenil-DTPA, benzil-DTPA, CHX-DTPA, DOTA i njihovih derivata.

5. Postupak prema zahtevu 4, naznačen time što je pomenuti helator MX-DTPA.

6. Postupak prema zahtevu 1, naznačen time što je pomenuti prihvatljivi pufer acetatni pufer.

7. Postupak prema zahtevu 6, naznačen time što je pomenuti pufer natrijum acetat u koncentarciji između od 10 i 1000mM.

8. Postupak prema zahtevu 1, naznačen time što pomenuti prihvatljivi pufer uključuje dobroćudni radioprotektant.

9. Postupak prema zahtevu 8, naznačen time što je pomenuti dobroćudni radioprotektant askorbat.

10. Postupak prema zahtevu 1, naznačen time što je pomenuta specifičnost vezivanja najmanje 70%.

11. Postupak prema zahtevu 1, naznačen time što je protein ili peptid antitelo koje specifično vezuje CD20.

12. Postupak prema zahtevu 1, naznačen time što je odnos helatora i peptida ili proteina u rasponu od 11/2do 1.