RS50358B - Osteoprotegerin vezujući proteini i receptori - Google Patents

Osteoprotegerin vezujući proteini i receptori

Info

Publication number
RS50358B
RS50358B YUP-506/99A YU50699A RS50358B RS 50358 B RS50358 B RS 50358B YU 50699 A YU50699 A YU 50699A RS 50358 B RS50358 B RS 50358B
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
binding protein
seq
opg
protein
residues
Prior art date
Application number
YUP-506/99A
Other languages
English (en)
Inventor
William J. Boyle
Original Assignee
Amgen Inc.,
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=27126366&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=RS50358(B) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Priority claimed from US08/842,842 external-priority patent/US5843678A/en
Application filed by Amgen Inc., filed Critical Amgen Inc.,
Priority to MEP-328/08A priority Critical patent/MEP32808A/xx
Publication of YU50699A publication Critical patent/YU50699A/sh
Publication of RS50358B publication Critical patent/RS50358B/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70578—NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/02—Stomatological preparations, e.g. drugs for caries, aphtae, periodontitis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A61P19/10—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease for osteoporosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/12—Drugs for disorders of the metabolism for electrolyte homeostasis
    • A61P3/14—Drugs for disorders of the metabolism for electrolyte homeostasis for calcium homeostasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70575—NGF/TNF-superfamily, e.g. CD70, CD95L, CD153, CD154
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Diabetes (AREA)

Abstract

Izolovana nukelinska kiselina odabrana iz grupe koju čine: a) nukelinska kiselina koja kodira polipeptid na slici 1 (SEQ ID NO:2) ili slici 4 (SEQ ID NO:4); i b) nukleinska kiselina koja hibridizuje u komplementarnu nukleinsku kiselinu koja kodira protein na slici 1 (SEQ ID NO:2) ili slici 4 (SEQ ID NO:4) pod uslovima 5XSSPE, 50% formamid, 2X Denhardt'ov rastvor, 0.1% SDS i 100 μg/ml DNK sperme lososa u trajanju od 18-24 sati na 42°C i ostaje hibridizovana pod uslovima 2X SSC u trajanju od 10 min na sobnoj temperaturi, IX SSC u trajanju od 10 min na 50°C i 0.5X SSC u trajanju od 10 do 15 min., gde nukleinska kiselina kodira osteoprotegerin vezujući protein. Prijava sadrži još 12 nezavisnih i 22 zavisna patentna zahteva.

Description

Oblast tehnike
Predmetni pronalazak se odnosi na polipeptide koji učestvuju u osteoklastnoj diferencijaciji. Tačnije, pronalazak se odnosi na osteoprotegerinske vezujuće proteine, nukleinske kiseline koje kodiraju proteine, ekspresione vektore i ćelije domaćina za proizvodnju proteina i ispitivanja vezivanja. Takođe su opisani preparati i postupci za tretiranje koštanih obolenja, takvih kao što su osteoporozis, koštani gubitak usled artritisa, Paget-ovo obolenje i hiperkalcemija.
Pronalazak se takođe odnosi na receptore za osteoprotegerinske vezujuće proteine i na postupke
i preparate za tretiranje koštanih obolenja uz korišćenje ovih receptora.
Stanje tehnike
Živo koštano tkivo pokazuje dinamičku ravnotežu između depozicije i resorpcije kostiju. Ovi procesi su uslovljeni primarno pomoću dva ćelijska tipa: osteoblasti koje luče molekuli koji obuhvataju organsku matricu kostiju; i osteoklasti koji promovišu rastvaranje koštane matrice i solubilizaciju koštanih soli. Kod mladih individua sa rastom kostiju, brzina koštane depozicije prevazilazi brzinu koštane resorpcije, dok kod starijih individua brzina resorpcije može da prevaziđe brzinu depozicije. U zadnjem slučaju, porast ovog poremećaja kod kostiju dovodi do smanjenja koštane mase i jačine, povećanog rizika od fraktura i sporog ili nepotpunog oporavka slomljenih kostiju.
Osteoklasti su velik fagocitične mutinukleidne ćelije koje su formirane od hematopoietičnih prekursorskih ćelija u koštanoj moždini. Kako rast i formiranje zrelih funkcionalnih osteoklasta nije sasvim razumljivo, smatra se da osteoklasti sazrevaju zajedno sa monocit/makrofaga ćelijskim vrstom ćelije kao odgovor na izlaganje raznim faktorima koji promovišu rast. Rani razvoj prekurosorskih ćelija koštane moždine u preosteoklastima veruje se da je ublažen sa solubilnim faktorima, takvim kao što je faktor-a tumorne nekroze (TNF-a), faktor-/3 tumorne nekroze (TNF-0), interleukin-1 (IL-1), interleukin-4 (IL-4), interleukin-6 (IL-6) i kukemijski inhibirajući faktor (LIF). U kulturi, preosteoklasti se grade u prisustvu dodatog stimulišićeg faktora makrofagne kolonije (M-CSF). Ovi faktori deluju primarno u ranim stupnjevima razvitka osteoklasta. Učešće polipeptidnih faktora u terminalnim stupnjevima formiranja osteoklasta nije široko opisivano. Opisano je međutim, da paratiroidni hormon stimuliše formiranje i aktiviranje osteoklasta i da kalcitonin ima suprotan efekat, mada u manjoj meri.
Nedavno je opisan nov polipeptidni faktor, nazvan osteoprotegerin (OPG) koji negativno reguliše formiranje osteoklasta in vitro i in vivo (vidi naše i pridružene U.S. prijave serijskih brojeva 08/577788 od 22. decembra 1995, 08/706945 od 3. septembra 1996 i 08/771777 od 20. decembra 1996 koje su uvde ubačene pomoću reference; i PCT prijavu br. W096/26271). OPG dramatično je povećao koštanu gustinu kod transgenskih miševa koji vrše ekspresiju OPG polipeptida i smanjio je stepen koštanog gubitka kada je bio primenjen kod ovariektomiranih pacova. Analiza OPG aktivnosti u in vitro formiranju osteoklasta je pokazala da OPG ne ometa rast i diferencijaciju monocit/makrofaga prekursora već što je verovatnije blokira diferencijaciju osteoklasta iz monocit/makrofaga prekursora. Tako OPG izgleda da ima specifičnost u regulisanju stepena formiranja osteoklasta.
OPG obuhvata dva polipeptidna domena koja imaju različite strukturne i funkcionalne osobine. Amino-terminalni domen koji ima raspon od oko 22-194 ostataka polipeptida pune dužine (N-terminalni metionin je označen kao ostatak 1) pokazuje homologiju u odnosu na druge članove familije receptora tumomog nekroznog faktora (TNFR), naročito TNFR-2, preko konzervacije cisteinom bogatih domena koji su karakteristični za članove TNFR familije. Karboksi terminalni domen koji ima raspon od 194-401 ostataka nema značajnu homologiju u odnosu na neku već poznatu sekvencu. Za razliku od brojnih drugih članova TNFR familije, OPG izgleda da je eksluzivno izlučivan protein i ne izgleda da može da bude sitetisan kao član sličnog oblika.
Zasnovano na njegovoj aktivnosti kao negativnog regulatora formiranja osteoklasta, predpostavljeno je da OPG može da bude vezan na polipeptidni faktor koji učestvuje u diferencijaciji osteoklasta i tako blokiranju jednog ili više terminalnih stupnjeva koji vode do formiranja zrelog osteoklasta.
Stoga objekt pronalaska je da identifikuje polipeptide koji interaguju sa OPG. Pomenuti polipeptidi mogu da igraju ulogu u sazrevanju osteoklasta i mogu da budu primenjivi u tretiranju koštanih obolenja.
Izvod pronalaska
Novi član familije faktora tumorne nekroze je bio identifikovan iz mišje cDNA biblioteke ekspresovane u COS ćelijima koje su testirane uz korišćenje rekombinantnog OPG-Fc fuzionog proteina kao afinitivne probe. Novi polipeptid je transmembranski OPG vezujući protein koji je predviđeno da bude dužine 316 amino kiselina, i da ima amino terminalni citoplazmatični domen, transmembranski domen i karboksi terminalni ekstraćelijski domen. OPG vezujući proteini pronalaska mogu da budu membransko-vezani ili mogu da budu u solubilnom obliku.
Pronalazak obezbeđuje nukleinske kiseline koje kodiraju OPG vezujući protein, vektore i ćelije domaćina koje vrše ekspresiju polipeptida i postupak za proizvodnju rekombinantnog OPG vezujućeg proteina. Antitela ili njihovi fragmenti koji specifično vezuju OPG vezujući protein takođe su obezbeđeni.
OPG vezujući proteini mogu da budu korišćeni u ispitivanju kvantitivnih OPG nivoa u biološkim uzorcima, u identifikaciji ćelija i tkiva koja pokazuju OPG vezujući protein i u identifikaciji novih članova familije OPG i OPG vezujućeg proteina. Takođe su obezbeđeni postupci za identifikovanje jedinjenja koja interaguju sa OPG vezujućim proteinom. Takva jedinjenja uključuju nukleinske kiseline, peptide, proteine, ugljene hidrate, lipide ili organske molekule male mase i mogu da deluju bilo kao agonisti bilo kao antagonisti aktivnosti OPG vezujućeg proteina.
OPG vezujući proteini učestvuju u diferencijaciji osteoklasta i u nivou osteoklastne aktivnosti i tako u modulaciji koštane resorpcije. OPG vezujući proteinski agonisti i antagonisti modulišu osteoklastno formiranje i koštanu resorpciju u mogu da budu korišćeni u tretiranju koštanih obolenja koja su okarakterisana sa promenama u koštanoj resorpciji, takvih kao što su osteoporozis, hiperkalcemija, koštani gubitak usled artritisnih metastaza, imobilizacija ili pmodontalno obolenje, Paget-ovo obolenje, osteopetrozis, protetično labavljanje i slično. Farmaceutski preparati koji obuhvataju OPG vezujuće proteine i agoniste i antagoniste OPG vezujućeg proteina su takođe obuhvaćeni sa pronalaskom.
Receptori za OPG vezujuće proteine su takođe identifikovani iz mišje cDNA biblioteke nagrađene od ćelija koštane moždine koje se vezuju na fluorescentno obeležen OPG vezujući protein. Receptori mogu da budu korišćeni radi identifikovanja agonistitičkih i antagonističkih interakcija OPG vezujućeg proteina sa njegovim receptorom koji može da bude korišćen za tretiranje koštanog obolenja.
Opis slika
Slika 1. Struktura i sekvenca 32D-F3 inserta koji kodira OPG vezujući protein. Predviđen transmembranski domen i mesta za asparagin-vezane ugljeno hidratne lance su podvučeni.
Slika 2. Ekspresija OPG vezujućeg proteina u COS-7 ćelije koje su transfektovane sa pcDNA/32D-F3. Ćelije su lipofektovane sa pcDNA/32D-F3 DNA, ispitane su za vezivanje bilo na kozji anti-humani IgGl alkalni fosfatazni konjugat (samo sekunadran), bilo na humani OPG[22-201]-Fc plus sekundarni (OPG-Fc) bilo na himerni ATAR ekstraćelijski domen-Fc fuzioni protein (sATAR-Fc). ATAR je novi član TNFR superfamilije a sATAR-Fc fuzioni protein služi kao kontrola za humani IgGl Fc vezujući domen i za generički TNFR sličan protein, koji se vezuju na površinske molekule 32D ćelije.
Slika 3. Ekspresija OPG vezujućeg proteina u humanim tkivima. AnalizaNorthernbojenja humanog tkiva mRNA (Clontech) uz korišćenje radio obeležene 32D-F3 izvedene hibridizacione probe. Relativna molekulska masa je data na levoj strani u kilobaznim parovima (kb). Strelica na desnoj strani naznačava migraciju oko 2,5 kb transkripta koji je detektovan u mRNA limfnog čvorića. Veoma slaba traka iste mase je takođe detektovana u jetri zametka.
Slika 4. Struktura i sekvenca pcDNA/hu OPGbp 1.1 inserta koji kodira humani OPG vezujući protein. Predviđen transmembranski domen i mesto za asparagin-vezane ugljeno hidratne lance su podvučeni.
Slika 5. Stimulacija razvoja osteoklasta in vitro iz makrofage koštane moždine i kokultura ST2 ćelija tretiranih sa rekombinantnim OPG vezujućim proteinom [158-316]. Kulture su tretirane sa promenljivim koncentracijama mišjeg OPG vezujućeg proteina koje idu od 1,6 do 500 ng/ml. Posle 8-10 dana, kulture su lizirane i TRAP aktivnost je merena pomoću'ispitivanja rastvora. Dodatno ovome, neke kulture su istovremeno tretirane sa 1, 10, 100, 500 i 100 ng/ml rekombinantnog mišjeg OPG [22-401ć-Fc proteina. Mišji OPG vezujući protein indukuje doza-zavisnu stimulaciju formiranja osteoklasta, dok OPG [22-401]-Fc inhibira formiranje osteoklasta.
Slika 6. Stimulacija razvijanja osteoklstnih prekursora iz koštane moždine in vitro u prisustvu M-CSF i mišjeg OPG vezujućeg proteina [158-316]. Prikupljena je mišja koštana moždina i kultivirana u prisustvu 250, 500, 1000 i 2000 U/ml M-CSF-a. Promenljive koncentracije OPG vezujućeg proteina [158-316], idući od 1,6 do 500 ng/ml, su dodate u ove iste kulture. Razvoj osteoklasta je meren pomoću TRAP ispitivanja rastvora.
Slika 7. Osteoklasti izvedeni iz ćelija koštane moždine u prisustvu M-CSF i OPG vezujućeg proteina [158-316] resorbuju kost in vitro. Ćelije koštane moždine tretirane bilo sa M-CSF, bilo sa OPG vezujućim proteinom bilo sa oba kombinovana faktora su nansene na koštane isečke u okcima kulture i ostavljene su da se razviju u zrele osteoklaste. Dobijene kulture su tada obojene sa Toluidin plavim (leva kolona) ili histohemijski radi detektovanja TRAP enzimske aktivnosti (desna kolona). U kulturama koje primaju oba faktora, zreli osteoklasti su formirani tako da su bili sposobni da erodiraju kost što se zaključuje na osnovu prisustva plavo obojenih neravnina na koštanoj površini. Ovo je kolerirano sa prisustvom mnoštvom velikih, multinukleovanih TRAP pozitivnih ćelija.
Slika 8. Grafik koji pokazuje ukupne nivoe u krvi jonizvanog kalcijuma (jCa) kod miševa koji su bili injektirani sa OPG vezujućim proteinom, 51 časa posle prve inekcije i kod miševa koji su takođe primili konkurentski OPG. OPG vezujući protein značajno i zavisno od doze povisio je nivoe za jCa. OPG (1 mg/kg/dan) potpuno je blokirao porast u jonizovanom kalcijumu pri dozi OPG vezujućeg proteina od 5 ug/dan, i naročito je blokirao porast pri dozi OPG vezujućeg proteina od 25 ug/dan. (<*>), razlika u odnosu na nosačem tretiranu kontrola (p < 0,05). (#), OPG tretiran jCa nivo značajno različit od nivoa kod miševa koji primaju samo dozu OPG vezujućeg proteina (p < 0,05). ;Slika 9. Radiografi levih femura i tibije kod miševa koji su tretirani sa 0, 5, 25 ili 100 /ig/dan OPG vezujućeg proteina tokom 3,5 dana. Postoji zavisno od doze opadanje koštane gustine koje je evidentno iz najviše prozračnosti u proksimalnom tibijalnom metafizisu ovih miševa, a što je pokazano pri dozi od 100^g/dan. ;Slika 10. Mišja ODAR cDNA sekvenca i proteinska sekvenca. Prikazana je nukeinska kiselinska sekvenca od oko 2,1 kb cDNA klona, i translacija 625 ostatka duž otvorenog čitajućeg rama naznačenog napred. Hidrofobni signalni peptid je podvučen a hidrofobna transmembranska sekvenca (ostaci 214-234) je data u boldu. Cisteinski ostaci koji obuhvataju cistein-bogate ponavljajuće motive u ekstraćelijskom domenu su dati u boldu. ;Slika 11. Imunofluorescentno bojenje ODAR-Fc vezivanje u OPG vezujućem proteinu transfektovane ćelije. COS-7 ćelije transfektovane sa ekspresujućim plazmidom OPG vezujućeg proteina su inkubirane sa humanim IgG Fc (gornji panel), ODAR-Fc (srednji panel) ili OPG-Fc (donji panel). FITC-obeleženo kozje anti humano IgG Fc antitelo je korišćeno kao sekundarno antitelo. Pozitivne vezujuće ćelije su ispitane pomoću konfokalne mikroskopije. ;Slika 12. Efekti ODAR-Fc na stvaranje osteoklasta iz mišje koštane moždine in vitro. Kulture mišje koštane moždine su dobijene kao u primeru 8 i izložene su OPG vezujućem proteinu (5 ng/ml) i CSF-l-u (30 ng/ml). Dodate su razne koncentracije ODAR-Fc-a koje idu od 1500 ng/ml do 65 ng/ml. Formiranje osteoklsta je ispitivano pomoću TRAP citohemije a TRAP ispitivanje rastvora je vršeno posle 5 dana u kulturi. ;Slika 13. Mineralna koštana gustina kod miševa posle tretiranja tokom četri dana sa ODAR-Fc-om pri različitim dozama. Miševi su primali ODAR-Fc pomoću dnevne podkožne injekcije u fosfatno puferisanom slanom nosaču. Mineralna gustina je određivana iz kostiju koje su fiksirane u 70% EtOI-I na proksimalnom tibijalnom metafizisu miševa pomoću periferne kvantitivno računate tomografije (pQCT) (XCT-960M, Norland Medical Svstems, Ft Atkinson, WI). Dva 0,5 mm poprečna preseka kosti, 1,5 mm i 2,0 mm od proksimalnog kraja tibije su analizirana (XMICE 5.2, Stratec Germanv) radi određivanja ukupne koštane mineralne gustine u metafizisu. Korišćenje separacioni prag mekog tkiva od 1500 radi definisanja granice metafizelne kosti. ODAR-Fc je proizveo značajan porast u koštanoj mineralnoj gustini u proksimalnom tibijalnom metafizisu na način zavistan od doze. Grupa n = 4. ;Detaljan opis pronalaska;Pronalazak obezbeđuje polipeptid označen kao OPG vezujući protein, koji specifično vezuje OPG i učestvuje u osteoklastnoj diferencijaciji. cDNA klona koji kodira mišji oblik polipeptida je identifikovan iz biblioteke koja je dobijena iz mišje mielomonocitne ćelijske linije 32-D i koji je transfektovan u COS ćelije. Transfektanti su ispitani na svoju sposobnost da se vezuju na OPG[22-201]-fc fuzioni polipeptid (Primer 1). Nukleinska kiselinska sekvenca je pokazala da OPG vezujući protein je novi član TNF familije i najsličniji je sa AGP-1, polipeptid koji je prethodno opisan u našoj i pri-druženoj U.S. prijavi serijski broj 08/660562 od 7. juna 1996. ;(Polipeptid identičan sa AGP-1 i označen kao TRA1L je opisanu Wiley et al. Immunitv 3, 673-682 (1995)). OPG vezujući protein je predskazano da bude tipa II transmembranski protein koji ima citoplazmatični domen na amino terminusu, transmembranski domen i karboksi terminalni ekstraćelijski domen (slika 1). Amino terminalni citoplazmatični domen ima raspon oko 1-48 ostataka, transmembranski domen ima raspon oko 46-69 ostataka i ekstraćelijski domen ima raspon oko 70-316 ostataka, kao stoje prikazano na slici 1 (SEQ ID NO:2). Membranski vezan protein specifično vezuje OPG (slika 2), Tako OPG vezujući protein i OPG dele mnoge karakteristike receptor-ligan para mada je moguće da postoje drugi prirodno zastupljeni reeeptori za OPG vezujući protein. ;DNA klona koja kodira humani OPG vezujući protein je izolovana iz limfnog čvorića cDNA ;biblioteke. Humana sekvenca (slika 4) je homologna sa mišjom sekvencom. Prečišćen solubilan mišji OPG vezujući protein je stimulisao formiranje osteoklasta in vitro i indukovao je ;hiperkalcemiju i koštanu resorpciju in vivo. ;OPG vezujući protein označava polipeptid koji ima amino kiselinsku sekevencu sisarskog OPG vezujućeg proteina ili njen fargment, analog ili derivat i koji ima najmanje aktivnost vezujućeg OPG. U poželjnim realizacijama, OPG vezujući protein je mišjeg ili humanog porekla. U drugoj realizaciji, OPG vezujući protein je solubilni protein koji ima, u jednom obliku, izolovan ekstraćelijski domen odvojen od citoplazmatičnog i tramnsmembranskog domena. OPG vezujući protein učestvuje u diferencijaciji osteoklasta i u brzini i stepenu koštane resorpcije i nađeno je da stimuliše osteoklastno formiranje i stimuliše koštanu resorpciju. ;Nukleinske kiseline ;Pronalazak obezbeđuje izolovane nukleinske kiseline koje kodiraju OPG vezujuće proteine. Kako je korišćeno ovde, termin nukleinska kiselina obuhvata cDNA, genomsku DNA, sasvim ili delimično sintetičku DNA i RNA. Nukleinske kiseline pronalaska se biraju iz grupe koju čine: a) nukleinske kiseline kao što je prikazano na slici 1 (SEQ ID NO:l) i slici 4 (SEQ ID NO:3); b) nukleinske kiseline koje hibridizuju u polipeptidne kodirajuće regione nukleinskih kiselina prikazanih na slici 1 (SEG ID NO: 1) i slici 4 (SEQ ID NO:3) i ostaju hibridizovane u ;nukleinskim kiselinama pod uslovima visoke obaveznosti; i ;c) nukleinske kiseline koje se degenerišu u nukleinske kiseline (1) ili (b). ;Hibridizacije nukleinskih kiselina obično obuhvataju multi-stupanjevit postupak koji obuhvata ;prvo hibridizacioni stupanj radi formiranja nukleinskih kiselinskih dupleksa iz pojediničnih struka koji je praćen sa drugim stupnjem hibridizacije koji se izvodi pod strožim uslovima obaveznosti radi selektivnog zadržavanja nukleinskih kiselinskih dupleksa koji imaju željenu homologiju. Uslovi za prvi stupanj hibridizacije nisu obično kritični, pod predpostavkom da nisu više obaveznosti od onih za drugi stupanj hibridizacije. Uopšteno, druga hibridizacija se izvodi pod uslovima više obaveznosti, gde "visoka obaveznost" označava stanja temperature i soli koji su oko 12-20°C ispod temperature topljenja (Tm) perfektnog hibridnog dela ili čitavih komplementarnih struka kojima odgovaraju slika 1 (SEQ. ID. NO:2) i slika 4 (SEQ ID NO:4). U jednoj realizaciji, uslovi "visoke obaveznosti" se odnose na oko 65°C i ne više od oko IM Na<+>. Podrazumeva se da koncentracija soli, temperatura i/ili dužina inkubacije mogu da variraju bilo u prvom ili drugom stupnju hibridizacije tako da se dobijaju hibridizacioni molekuli nukleinske kiseline prema pronalasku. Uslovi za hibridizaciju nukleinskih kiselina i izračunavanje Tm za hibride nukleinske kiseline su opisani u Sabrook et al. Molecular Cloning: A Laboratorv Manual Cold Spring Harbor Laboratorv Press, New York (1989). ;Nukleinske kiseline pronalaska mogu da hibridiziraju u deo ili čitav polipeptid koji kodira regione OPG vezujućeg proteina kao što je prikazano na slici 1 (SEQ ID NO:2) i slici 4 (SEQ ID NO:4); i stoga mogu da budu trankacije ili ekstenzije nukleinskih sekvenci prikazanih ovde. Tnkakativne ili eksptenzivne nukleinske kiseline su obuhvaćene pomoću pronalaska uz predpostavku da zadržavaju bar svojstvo vezujućeg OPG. U jednoj realizaciji, nukleinska kiselina će da kodira polipeptid od bar oko 10 amino kiselina. ;U drugoj realizaciji, nukleinska kiselina će da kodira polipeptid od bar oko 20 amino kiselina. U još drugoj realizaciji, nukleinska kiselina će da kodira polipeptid od bar oko 50 amino kiselina. Hibridizirajuće nukleinske kiseline mogu takođe da uključe nekodirajuće sekvence koje su locirane na 5' i/ili 3' u OPG' vezujućem proteinu koji kodira regione. Nekodirajuće sekvence uključuju regulatorske regione koji učestvuju u ekspresiji OPG vezujućeg proteina, takve kao što su promotori, pojačivači regiona, translatorna iniciaciona mesta, transkripciona terminaciona mesta i slično. ;U poželjnim realizacijama, nukleinske kiseline pronalaska kodiraju mišji ili humani OPG vezujući protein. Nukleinske kiseline mogu da kodiraju membranski vezani oblik OPG vezujućeg proteina ili solubilne oblika koji ne poseduju funkcionalni transmembranski region. Predviđen tfansmembranski region za mišji OPG vezujući protein uključuje amino kiselinske ostatke 49-69 inkluzivno kao stoje prikazano na slici 1 (SEQ. ID. NO:l). Predviđen transmembranski region za humani OPG vezujući protein uključuje ostatke 49-69 kao što je prikazano na slici 4 (SEQ ID NO:3). Supstitucije koje zamenjuju hidrofobne amino kiselinske ostatke u ovom regionu sa neutralnim ili hidrofilnim amino kiselinskim ostacima treba da se očekuje da raskidaju membransku asocijaciju i daju solubilni OPG vezujući protein. Dodatno ovome, brisanja dela ili čitavog transmembranskog regiona treba takođe očekivati da će da daju solubilne oblike OPG vezujućeg proteina. Nukleinske kiseline koje kodiraju amino kiselinske ostatke 70-316 kao što je prikazano na slici 1 (SEQ ID NO:l) ili njihove fragmente ili analoge, obuhvataju solubilne OPG vezujuće proteine. ;Nukleinske kiseline koje kodiraju trankatovane oblike solubilnih humanih OPG vezujućih proteina su takođe uključeni. Solubilni oblici uključuju ostatke 69-317 kao što je prikazano na slici 4 (SEQ ID NO:3) i njihove trankacije. U jednoj realizaciji, N-terminalne trankacije stvaraju polipeptide od ostataka, 70-317, 71-317, 72-317 i tako dalje. U drugoj realizaciji, nukleinske kiseline kodiraju solubilni OPGbp koji obuhvata ostatke 69-317 i njegove N-terminalne trankacije do OPGbp [158-317] ili alternativno do OPGbp [166-317]. ;Plazmid phuOPGbp 1,1 u E. coli vrsti DH10 koji kodira humani OPG vezujući protein je deponovan saAmerican Type Culture Collection,Rockville, MD 13. juna 1997. ;Nukleinske kiselinske sekvence pronalaska mogu da budu korišćene za detekciju sekvenci koje kodiraju OPG vezujući protein u biološkim uzorcima. Tačnije, mogu da budu korišćene sekvence za testiranje cDNA i genomskih biblioteka za slične OPG vezujuće proteinske sekvence, naročito one iz drugih vrsta. Nukleinske kiseline su takođe primenljive za moduliranje nivoa OPG vezujućeg proteina pomoću anti-senzibilne tehnologije ili in vivo genske ekspresije. Razvoj transgeneskih životinja koje ekspresuju OPG vezujući protein je primenljiv za proizvodnju polipeptida i za proučavanje in vivo biološke aktivnosti. ;Vektori i ćelije domaćina ;Nukleinske kiseline pronalaska će da budu vezane sa DNA sekvencama tako kao radi ekspresuje biološki aktivnog OPG vezujućeg proteina. Sekvence zahtevane za ekspresiju su poznate stručnjaku u ovoj oblasti i uključuju sekvence promotora i pojačivača za iniciranje RNA sinteze, transkripciona terminaciona mesta, robozomna vezujuća mesta za iniciranje proteinske sinteze i liderske sekvence za lučenje. Sekvence koje usmeravaju ekspresiju i lučenje OPG vezujućeg proteina mogu da budu homologne, na primer, sekvence su identične ili slične onim sekvencama u genomu koje učestvuju u eskpresiji i lučenju OPG vezujućeg proteina ili mogu da budu heterologne. Razni plazmidni vektori su raspoloživi za ekspresiju OPG vezujućeg proteina u ćelijama domaćina (vidi, na primer,Methods in Enzymologyv. 185, Goeddel D. V., ed., Academic Press (1990)). Za ekspresiju u sisarskim ćelijama domaćina, poželjna realizacija je plazmid pDSRa koji je opisan u PCT prijavi br. 90/14363. Za ekspresiju u bakterijskim ćelijama domaćina, poželjne realizacije uključuju plazmide koji daju lux promotor (vidi našu i pridruženu U.S. prijavu serijski br. 08/577778 od 22. decembra 1995). Dodatno ovome, dostupni su vektori za tkivo-specifičnu ekspresiju OPG vezujućeg proteina u transgenskim životinjama. Vektori genskog transfera retrovirusno i adenovirusno bazirani takođe mogu da budu korišćeni za ekspresiju OPG vezujućeg proteina u humanim ćelijama za in vivo terapiju (vidi PCT prijavu br. 86/00922). ;Prokariotske i eukariotske ćelije domaćina koje vrše ekspresiju OPG vezujućeg proteina su takođe obezbeđene pomoću pronalaska. Ćelije domaćina uključuju bakterijske, kvaščeve, biljne, insektske ili sisarske ćelije. OPG vezujući protein može takođe da bude proizveden u transgenskim životinjama, takvim kao što su miševi ili koze. Plazmidi i vektori koji sadrže nukleinske kiseline pronalaska su takođe uvedeni u odgovarajuće ćelije domaćina uz korišćenje tehnika transfekcije ili transformacije koje su poznate stručnjaku u ovoj oblasti. Ćelije domaćina mogu da sadrže DNA sekvence koje kodiraju OPG vezujući protein kao što je prikazano na slici 1 ili njegov deo, takav kao što je ekstraćelijski domen ili citoplazmični domen. Nukleinske kiseline koje kodiraju OPG vezujuće proteine mogu da budu modifikovane pomoću supstitucije kodona koji dozvoljavaju optimalnu ekspresiju u datom domaćinu. Bar neki od kodona mogu da budu tako zvani-poželjni kodoni koji ne menjaju amino kiselinsku sekvencu i često se nalaze u genima koji su visoko ekspresovani. Međutim, razumljivo je da promene kodona radi optimizacije ekspresije nisu ograničene na uvođenje poželjnog kodona. Primeri poželjnih sisarskih ćelija domaćina za ekspresiju OPG vezujućeg proteina uključuju, ali nisu ograničeni na ove, COS, CHOd-, 293 i 3T3 ćelije. Poželjna bakterijska ćelija domaćin je Escherichia coli. ;Polipeptidi ;Pronalazak takođe obezbeđuje OPG vezujući protein kao proizvod prokariotske ili eukariotske ekspresije eksogene DNA sekvence, na primer, OPG vezujući protein je rekombinantni OPG vezujući protein. Egzogene DNA sekvence uključuju cDNA, genomsku DNA i sintetičke DNA sekvence. OPG vezujući protein može da bude proizvod ekspresije bakterijske, kvaščeve, biljne, insektske ili sisarske ćelije ili iz translatacionih sistema bez ćelije. OPG vezujući protein koji je proizveden u bakterijskim ćelijama će da ima N-terminalni metionin ostatak. Pronalazak takođe obezbeđuje postupak za proizvodnju OPG vezujućeg proteina koji obuhvata rast prokariotskih ili eukariotskih ćelija domaćina koje su transformisane ili transfektovane sa nukleinskim kiselinama koje kodiraju OPG vezujući protein i izolovanje polipeptidnih eskresionih proizvoda nukleinskih kiselina. ;Polipeptidi koji su sisarski OPG vezujući proteini ili su njihovi fragmenti, analozi ili derivati su obuhvaćeni ovim pronalaskom. U poželjnoj realizaciji, OPG vezujući protein je humani OPG vezujući protein. Fragment OPG vezujućeg proteina se odnosi na polipeptid koji ima brisanje jedne ili više amino kiselina tako da dobijeni plipeptid ima bar svojstva vezujućeg OPG. Pomenuti fragmenti će da imaju brisanja koja potiču od amino terminalnog kraja, karboksi terminalnog kraja i internalnih regiona polipeptida. Fragmenti OPG vezujućeg proteina su bar oko deset amino kiselina, bar oko 20 amino kiselina ili bar oko 50 amino kiselina u dužini. U poželjnim realizacijama, OPG vezujući protein će da ima brisanje jedne ili više amino kiselina iz transmembranskog regiona (amino kiselinski ostaci 49-69 kao što je prikazano na slici 1), ili alternativno, jedne ili više amino kiselina iz amino-terminusa do i/ili uključujući transmembranski region (amino kiselinski ostaci 1-49 kao stoje prikazano na slici 1). U drugoj realizaciji, OPG vezujući protein je solubilni protein koji obuhvata, na primer, amino kiselinske ostatke 69-316 ili 70-316, ili njihove N-terminalne i C-terminalne trankatovaqne oblike, koji zadržavaju OPG vezujuću aktivnost. OPG vezujući protein je takođe humani solubilni protein kao stoje prikazano na slici 4 koji obuhvata ostatke 69-317 kao što je prikazano na slici 4 i njegove N-teminalne trankatovane oblike, na primer, 70-317, 71-317, 71-317, 72-317 i tako dalje. U poželjnoj realizaciji, solubilni humani OPG vezujući protein obuhvata ostatke 69-317 i njihovu N-terminalnu trankaciju OPGbp [158-317] ili alternativno OPG [166-317]. Pomenuti analozi će imati supstitucije ili adicije na nekom mestu duž polipeptida. Poželjni analozi uključuju one solubilnih OPG vezujućih proteina. Fragmenti ili analozi mogu da budu prirodno zastupljeni, takvi kao polipeptidni proizvod aleliske varijante ili mRNA upletena varijanta ili mogu da budu nagrađeni uz korišćenje tehnika koja su dostupne stručnjaku u ovoj oblasti za manipulisanje i sintetisanje nukleinskih kiselina. Polipeptidi mogu ili ne mogu da imaju amino terminalni metionin ostatak. ;U pronalazak su takođe uključeni derivati OPG vezujućeg proteina koji su polipeptidi koji su bili podvrgnuti post-translatacionim modifikacijama (na primer, adicija N-vezanih ili O-vezanih ugljeno hidratnih lanaca, obrada N-terminainih ili C-terminalnih krajeva), pripajanje hemijskih grupa na amino kiselinsku kičmu, hemijskim modifikacijama N-vezanih ili O-vezanih ugljeno hidratnih lanaca i adiciji N-terminalnog metionin ostatka kao rezultat eskpresije prokariotske ćelije domaćina. Tačnije, hemijski modifikovani derivati OPG vezujućeg proteina koji obezbeđuju podesne prednosti takve kao što je povećana stabilnost, duže cirkulaciono vreme ili smanjena imunogeničnost su obezbeđeni. Od naročite primene je modifikacija sa vodeno solubilnim polimerima, takvim kao što su polietilen glikol i njegovi derivati (vidi, na primer, U.S. patent br. 4179337). Hemijske grupe za derivatizaciju mogu da budu odabrane između vodeno solubilnih polimera takvih kao što su polietilen glikol, etilen glikol/propilen glikol kopolimeri, karboksimetilceluloza, dekstran, polivinil alkohol i slično. Polipeptidi mogu da budu modifikovani na neusmerenim pozicijama u molekulu ili na predhodno određenim pozicijama u molekulu i mogu da uključe jednu, dve, tri ili više pripojenih hemijskih grupa. Polipeptidi mogu takođe da budu modifikovani na predhodno određenim pozicijama u polipeptidu, takvim kao što je na amino terminusu ili na odabranom lizin ili arginin ostatku u polipeptidu. Druge hemijske modifikacije koje su obezbeđene uključuju detektabilni obeliživač, takav kao enzimatski, fluorescentni, izotopni ili afinitivni obeliživač radi obezbeđivanja detekcije i izolovanja proteina. ;Takođe su uključeni OPG vezujući proteinski himeri koji obuhvataju deo ili čitavu OPG vezujuću proteinsku amino kiselinsku sekvencu koja je fuzirana na heterolognu amino kiselinsku sekvencu. Heterologna sekvenca može da bude neka sekvenca koja dozvoljava da dobijeni fuzioni protein zadrži bar aktivnost vezujućeg OPG. U poželjnoj realizaciji, karboksi terminalni ekstraćelijski domen OPG vezujućeg proteina je fuziran na heterolognu sekvencu. Takve sekvence uključuju heterologne citoplazmitične domene koji dozvoljavaju alternativne intraćelijske signalne pojave, sekvence koje promovišu oligomerizaciju takvu kao Fc region IgG, enzimske sekvence koje obezbeđuju oznaku za polipeptid, i sekvence koje obezbeđuju afinitivne probe, takve kao antigen-antitelo prepoznalač. ;Polipeptidi pronalaska su izolovani i prečišćeni iz tkiva i ćelijskih linija koje vrše ekspresiju OPG vezujućeg proteina, bilo ekstrahovanog iz lizata ili iz sredine kondicioniranog rasta i iz traiisfoimisanih ćelija domaćina koje vrše ekspresiju OPG vezujućeg proteina. OPG vezujući protein može da bude dobijen iz mišje mielomonocitične ćelijske linije 32-D (ATCC pristupni broj CRL-11346). Humani OPG vezujući protein, ili nukleinske kiseline koje kodiraju isti, može da bude izolovan iz humanog limfnog čvorića ili iz tkiva jetre zametka. Izolovan OPG vezujući protein ne sadrži asocijaciju sa humanim proteinima i drugim sastojcima ćelija. ;Postupak za prečišćavanje OPG vezujućeg proteina iz prirodnih izvora (na primer, tkiva i ćelijske linije koje normalno vrše ekspresiju OPG vezujućeg proteina) i iz transfektovanih ćelija domaćina je takođe obuhvaćen pomoću pronalaska. Postupak prečišćavanja može da koristi jedan ili više stupnjeva prečišćavanja proteina u određenom poretku radi dobijanja prečišćenog proteina. Hromatografski stupnjevi mogu da uključe jonsku izmenu, gelno filtriranje, hidrofobnu interakciju, reversnu fazno, hromatofokusirajuću, afinitivnu hromatografiju koja koristi anti-OPG vezujući protein antitelo ili biottn-streptavidin afinitivni kompleks i slično. ;Antitela ;Antitela koja specifično vezuju polipeptide pronalaska su takođe obuhvaćena sa pronalskom. Antitela mogu da budu proizvedena pomoću imunizacije sa OPG vezujućim proteinom pune dužine, solubilnim oblicima OPG vezujućeg proteina ili njegovim fragmentom. Antitela pronalaska mogu da budu poliklonalna ili monoklonalna ili mogu da budu rekombinantna antitela, takva kao himerna antitela gde mišji konstantni regioni na lakim i teškim lancima su zamenjeni sa humanim sekvencama, ili CDR-kalemljena antitela gde samo komplementarno određujući regioni su mišjeg porekla. Antitela pronalaska mogu takođe da budu humana antitela koja su dobijena, na primer, pomoću imunizacije transgenskih životinja koje su sposobne da proizvedu humana antitela (vidi, na primer, PCT prijavu br. VV093/12227). Antitela su primenljiva za detektovanje OPG vezujućeg proteina u biološkim uzorcima, čime se dozvoljava identifikacija ćelija ili tkiva koji proizvode protein. Dodatno ovome, antitela koja se vezuju na OPG vezujući protein i blokiraju interakciju sa drugim vezujućim jedinjenjima mogu da imaju terapeutsku primenu u modulaciji difernecijacije osteoklasta i koštane resorpcije. ;Antitela na OPG vezujući protein mogu da bude primenljiva u tretiranju koštanih obolenja, takvih kao što su osteoporozis i Paget-ovo obolenje. Antitela mogu da budu testirana na OPG vezujući protein u odsustvu ili prisustvu OPG i mogu da hudu ispitana na njihovu sposobnost da inhibiraju ligandno (OPG vezujući protein) izazvan osteoklastogenzis i/ili koštanu resorpciju. Takođe je dato da sami peptidi mogu da deluju kao antagonisti ligand:receptor interakcije i inhibiraju ligand-izazvan osteoklasogenezis, i peptidi OPG vezujućeg proteina će da budu korišćeni takođe za ove svrhe. ;Preparati ;Pronalazak takođe obezbeđuje farmaceutske preparate koji obuhvataju terapeutski efikasnu količinu OPG vezujućeg proteina pronalaska zajedno sa farmaceutski prihvatljivim razblaživačem, nosačem, solubilizerom, emulziferom, konzervansom i/ili ađuvantom. Pronalazak takođe obezbeđuje farmaceutske preparate koji obuhvataju terapeutski efikasnu količinu agonsita ili antagonista OPG vezujućeg proteina. Termin "terapeutski efikasna količina" označava količinu koja obezbeđuje terapeutski efekat za specificirano stanje i način primene. Preparat može da bude u tečnom ili liofiliziranom obliku i obuhvata razblaživač (Tris, acetatni ili fosfatni puferi) koji imaju razne pH vrednosti i jonske jačine, solubilizer takav kao što je Tween ili Polisorbat, nosače takve kao humani serumski albumin ili želatin, konzervanse takve kao timerosal ili benzil alkohol i antioksidanse takve kao askorbinska kiselina ili matrijum metabisulfit. Selekcija određenog preparata će da zavisi od brojnih faktora uključujući stanja koje će da bude tretirano, načina primene i željenih farmakokinetičkih parametara. Još šire informacije o komponentama koje su podesne za farmaceutske preparate se nalaze u Remington' s Pharmaceutical Sciences. 18. ed. A. R. Gennaro, ed. Mack, Easton, PA (1980). ;U poželjnoj realizaciji, preparati koji obuhvataju solubilne OPG vezujuće proteine su takođe obezbeđeni. Takođe su obuhvaćeni preparati koji obuhvataju solubilni OPG vezujući protein modifikovan sa vodeno solubilnim polimerima radi povećanja solubilnosti, stabilnosti, plazma polu-života i biološke raspoloživosti. Preparati takođe mogu da obuhvate ugrađivanje solubilnog vezujućeg proteina u lipozome, mikroemulzije, micele ili mehure za kontrolisanu isporuku tokom produženog perioda vremena. Solubilni OPG vezujući protein može da bude formulisan u mikrokapsule podesne za pulmonarnu primenu. ;Preparati pronalaska mogu da budu primenjeni pomoću injekcije, i to podkožno, intravenski ili intramuskularno ili putem oralne, nazalne, pulmonarne ili rektalne primene. Način primene koji je eventualno odabran će da zavisi od brojnih faktora i može da bude odabran od strane stručnjaka u ovoj oblasti. ;Pronalazak takođe obezbeđuje farmaceutske preparate koji obuhvataju terapeutski efikasnu količinu nukleinskih kiselina pronalaska zajedno sa farmaceutski prihvatljivim ađuvantom. Preparati nukleinskih kiselina će da budu podesni za primenu dela ili čitavog kodirajućeg regiona OPG vezujućeg proteina i/ili flankirajućih regiona na ćelije i tkiva kao deo režima anti-senzibilne terapije. ;Postupci za primenu ;OPG vezujući proteini mogu da budu korišćeni u raznim ispitivanjima za detektovanje OPG i karakterizaciju interakcija sa OPG. Uopšteno, ispitivanje obuhvata inkubiranje OPG vezujućeg proteina sa biološkim uzorkom koji sadrži OPG pod uslovima koji dozvoljavaju vezivanje OPG na OPG vezujući protein, i merenje obima vezivanja. OPG može da bude prečišćen ili je prisutan u smešama, tako kao u telesnim fluidima ili sredini kulture. Mogu da budu razvijena ispitivanja koja su kvalitativna ili kvantitivna gde ova poslednja mogu da budu primenljiva za određivanje vezujućih parametara (afmitivne konstante i kinetike) OPG na OPG vezujući protein i za kvantitaciju nivoa biološke aktivnosti OPG u smešama. Ispitivanja mogu takođe da budu korišćena radi procene vezivanja OPG na fragmente, analoge i derivate OPG vezujućeg proteina i radi identifikacije novih članova familije OPG i OPG vezujućeg proteina. ;Vezivanje OPG na OPG vezujući protein može da bude izvedeno u više formata, koji uključuju ispitivanja ćelija-baziranog vezivanja, membransko vezivanja, rastvor-faza i imunoispitivanja. Uopšteno, nivoi u tragovima obeleženog OPG se inkubiraju sa uzorcima OPG vezujućeg proteina tokom specificiranog vremenskog perioda što je praćeno sa merenjem vezanog OPG pomoću filtriranja, elektrohemiluminiscencije (ECL, ORIGEN sistem pomoću IGEN), bazirano na ćeliji ili imunoispitivanjima. Tehnike homogenih ispitivanja za radioaktivnost (SPA; Amersham) i vreme ispitivanja fluorescencije (HTRF, Packard) takođe mogu da budu primenjene. Vezivanje se detektuje pomoću obeležavanja OPG ili anti-OPG antitela sa radioaktivnim izotopima (1251, 35S, 3H), fluorescentnim bojama (fluorescein), lantanidnim (Eu<3+>) helatima ili kriptatima, orbipiridil-rutenijum (Ru<2+>) kompleksima. Razumljivo je da izbor obeležavanja probe će da zavisi od sistema za detekciju koji se koristi. Alternativno, OPG može da bude modifikovan sa neobeleženom tag epitopom (na primer, biotin, peptidi, His6, myc) i može da bude vezan na proteine, takve kao što su streptavidin, anti-peptid ili anti-protein antitela koja imaju detektabilnu belegu kao što je opisano napred. ;U alternativnom postupku, OPG vezujući protein može da bude ispitan direktno uz korišćenje poliklonalnih ili monoklonalnih antitela na OPG vezujuće proteine u imunoispitivanju. Dodatni oblici OPG vezujućih proteina koji sadrže epitopne tag-ove kao što je opisano napred mogu da budu korišćeni u rastvoru i imunoispitivanjima. ;Postupci za identifikovanje jedinjenja koja interaguju sa OPG vezujućim proteinom su takođe obuhvaćeni sa pronalskom. Postupak obuhvata inkubiranje OPG vezujućeg proteina sa jedinjenjem pod uslovima koji dozvoljavaju vezivanje jedinjenja na OPG vezujući protein, i merenje obima vezivanja. Jedinjenje može da bude uglavnom prečišćeno ili prisutno u sirovoj smeši. Vezivajuća jedinjenja mogu da budu nukleinske kiseline, proteini, peptidi, ugljeni hidrati, lipidi ili organska jedinjenja male molekulske mase. Jedinjenja mogu da budu dalje okarakterisana pomoću njihove sposobnosti da povećaju ili snize aktivnost OPG vezujućeg proteina u cilju da se odredi da li oni deluju kao agonisti ili kao antagonisti. ;OPG vezujući proteini su takođe primenljivi za identifikaciju intraćelijskih proteina koji interaguju sa citoplazmatičnim domenom pomoću kvaščevog dvo-hibridnog postupka testiranja. Kao primer, hibridni konstrukti koji obuhvataju DNA koja kodira N-terminalnih 50 amino kiselina OPG vezujućeg proteina koji je fuziran na kvasac GAL4-DNA vezujući domen mogu da budu korišćeni kao dvo-hibridni plazmidi. Pozitivni klonovi koji se dobijaju iz testiranja mogu dalje da budu okarakterisani radi identifikacije interagujućih proteina. Ova informacija može da pomogne u rasvetljavanju intraćelijskog signalnog mehanizma koji je vezan sa OPG vezujućim proteinom i obezbeđuje intraćelijske mete za nove lekove koji modulišu koštanu resorpciju. OPG vezujući protein može da bude korišĆen za tretiranje stanja koja su okarakterisana sa suvišnim koštanom gustinom. Najčešće ovo stanje je osteopetrozis kod koga genetski defekt dovodi do porasta koštane mase i koje je obično fatalno u prvih nekolko godina života. Osteopetrozis se poželjno tretira pomoću primene solubilnog OPG vezujućeg proteina. ;Pronalazak takođe obuhvata modulatore (agoniste i antagoniste) OPG vezujućeg proteina i postupke za njihovo dobijanje. Modulator OPG vezujućeg proteina može bilo da poveća bilo da smanji bar jednu aktivnost koja je vezana sa OPG vezujućim proteinom, takvu kao što je sposobnost vezivanja na OPG ili neki drugi interagujući molekul ili da reguliše sazrevanje osteoklasta. Obično, agonist ili antagonist može da bude ko-faktor, takav kao protein, peptid, ugljeni hidrat, lipid ili molekul male molekulske mase, koji interaguje sa OPG vezujućim proteinom radi regulisanja njegove aktivnosti. Potencijalni polipeptidni antagonisti uključuju antitela koja reaguju sa oblicima OPG vezujućeg proteina koji su solubilni ili koji su vezani sa membranom i solubilne oblike OPG vezujućeg proteina koji obuhvataju deo ili čitav ekstraćelijski domen OPG vezujućeg proteina. Molekuli koji regulišu ekspresiju OPG vezujućeg proteina obično uključuju nukleinske kiseline koje su komplementarne nukleinskim kiselinama koje kodiraju OPG vezujući protein i koji deluju kao anti-senzibilni regulatori ekspresije. ;OPG vezujući protein učestvuje u kontroli formiranja zrelih osteoklasta, primarnog ćelijskog tipa koji učestvuju u koštanoj resorpciji. Porast u brzini koštane resorpcije (iznad one za formiranje kosti) može da dovede do raznih koštanih poremećaja kolektivno označenih kao osteopenije i koje uključuju osteoporozis, osteomielitis, hiperkalcemiju, osteopeniju stečenu pomoću hiruške interevncije ili primene steroida, Paget-ovo obolenje, osteonekrozis, koštani gubitak usled reumatoidnog artritisa, periodontalni koštani gubitak, imobilizaciju, protetičko labavljenje i osteolitički metastazis. Suprotno, smanjenje u brzini koštane resorpcije može da dovede do osteopetrozisa, stanja koje je okarkaterisano sa suvišnom koštanom gustinom. Agonisti i antagonisti OPG vezujućeg proteina modulišu formiranje osteoklasta i mogu da budu primenjeni kod pacijenata koji pate od koštanih poremećaja. Agonisti i antagonisti OPG vezujućeg proteina koji su korišćeni za tretiranje osteopeniazisa mogu da budu primenjeni sami ili u kombinaciji sa terapeutski efikasnom količinom agensa koji promoviše koštani rast koji uključuju koštane morfogenske faktore označene kao BMP-1 do BMP-12, faktor-j3 i TGF-/3 članove familije faktora regulisanja rasta, faktore FGF1 do FGF-10 kao faktore fibroblastnog rasta, interleukin-1 inhibitore, TNFa inhibitore, paratiroidni hormon, prostaglandine E serija, bisfosfonate i minerale za ojačavanje kostiju, takve kao što su fluorid i kalcijum. Antagonisti OPG vezujućih proteina mogu da budu naročito primenljivi u tretiranju osteopenije. ;Receptori za osteoprotegerinske vezujuće proteine ;Pronalazak takođe obezbeđuje receptore koji interaguju sa OPG vezujućim proteinima. Još određenije, pronalazak obezbeđuje osteoklastnu diferencijaciju i aktivaciju receptora (ODAR). ODAR je transmembranski polipeptid koji pokazuje najviši stepen homologije prema CD40, članu TNF familije receptora. Nukleinska kiselinska sekvenca za mišji ODAR i kodiran polipeptid je prikazana na slici 10. Humani homolog mišjeg ODAR-a može da bude lako izolovan pomoću hibridizacionog testiranja humane cDNA ili genomske biblioteke sa nukleinskom kiselinskom sekvencom sa slike 10. Postupci za kloniranje humanog ODAR-a su slični sa onima koji su opisane u primeru 5 za kloniranje humanih OPG vezujućih proteina. Humani homolog polipeptida koji je je prikazan na slici 10 je dat u Anderson et al. (Nature 390, 175-179 (1997)) i dat je ovde kao RANK. RANK je okarakterisan kao Tip I transmembranskog proteina koji ima homologiju prema članovima familije TNF receptora i učestvuje u dendritičnoj ćelijskoj funkciji. ;Evidencija za interakciju ODAR I OPG vezujućeg proteina je prikazana u primeru 13. Solubilni oblik ODAR-a (ODAR-Fc fuzioni protein) sprečava osteoklastno sazrevanje in vitro (slika 12) i povećava koštanu gustinu kod normalnih miševa posle podkožnog injektiranja (slika 13). Rezultati su saglasni sa OPG vezujućim proteinom koji interaguje sa i koji aktivira ODAR radi promovisanja osteoklastnog sazrevanja. ;Razvoj osteoklasta i brzina i obim koštane resorpcije su regulisani pomoću interakcije OPG vezujućeg proteina i ODAR-a. Jedinjenja koja snižavaju ili blokiraju interakciju OPG vezujućeg proteina i ODAR-a su potencijalni antagonisti aktivnosti OPG vezujućeg proteina i mogu da prekinu razvoj osteoklasta što dovodi do opadanja koštane resorpcije. Alternativno, jedinjenja koja povećavaju interakciju OPG vezujućeg proteina i ODAR-a su potencijalni agonisti koji promovišu osteoklastni razvoj i povećavaju koštanu resorpciju. ;Razna ispitivanja mogu da budu korišćena za merenje interakcije OPG vezujućeg proteina i ODAR-a in vitro uz korišćenje prečišćenih proteina. Ova ispitivanja mogu da budu korišćena za testiranje jedinjenja na njihovu sposobnost da povećaju ili smanje brzinu ili obim vezivanja na ODAR pomoću OPG vezujućeg proteina. U jednom tipu ispitivanja, ODAR protein može da bude imobilisan pomoću spajanja na dno okca mikrotitarske ploče. Radioobeležen OPG vezujući protein (na primer, jonizovan OPG vezujući protein) i jedinjenja koja se testiraju mogu tada da budu dodata pojedinačno u neko vreme (po nekom redosledu) ili istovremeno u okca. Posle inkubacije, okca mogu da budu isprana i ispitivanje se vrši uz korišćenje scintilacionog brojača za radioaktivnost radi određivanja obima vezivanja ODAR-a pomoću OPG vezujućeg proteina u prisustvu jedinjenja koje se testira. Obično, jedinjenje će da bude testirano u datoj oblasti koncentracija, a serije kontrolnih okaca koje ne sadrže jedan ili više elemenata testnih ispitivanja mogu da bude korišćene radi preciznosti u proceni rezultata. Alternativa ovom postupku obuhvata okretanje "pozicija" proteina, na primer, imobilizaciju OPG vezujućeg proteina u okca mikrotitarske ploče, inkubiranje sa jedinjenjem koje se testira i radiobeleženim ODAR-om i određivanje obima ODAR vezivanja (vidi, na primer, odeljak 18 uCurrent Protocols in Molecular Biology,Ausubel et al., ed. John Wiley & Sons, New York, NY (1995)). ;Kao alternativa radiobeležavanju, OPG vezujući protein ili ODAR može da bude konjugovan na biotin i prisustvo biotinilovanog proteina može tada da bude detektovano uz korišćenje streptavidina koji je vezan na enzim, takav kao što je hrenova peroksidaza [HRP] ili alkalna fosfataza [AP], što može da bude detektovano kolorimetrijski ili pomoću fluoresnetnog tagiranja streptavidina. Antitelo usmereno na OPG vezujući protein ili ODAR koji je konjugovan na biotin može takođe da bude detektovano posle inkubacije sa enzimski vezanim streptavidinom koji je vezan na AP ili HRP. ;OPG vezujući protein i ODAR mogu takođe da budu imobilizirani pomoću pripajanja na agarozne kuglice, akrilne kuglice i na druge tipove takvih inertnih supstrata. Supstrat-protein kompleks može da bude stavljen u rastvor koji sadrži komplementarni protein i jedinjenje koje se testira; posle inkubacije, kuglice mogu da budu staložene pomoću centrifugiranja i obim vezivanja između OPG vezujućeg proteina i ODAR-a može da bude određen uz korišćenje postupaka koji su opisani napred. Alternativno, supstrat-protein kompleks može da bude imobiliziran u koloni i molekul koji se testira i komplementarni protein se provode preko kolone. Formiranje kompleksa između OPG vezujućeg proteina i ODAR-a može da bude ispitano uz korišćenje neke od tehnika koje su date ovde napred, na primer, radioobeležavanje, antitelno vezivanje ili slično. ;Drugi tip in vitro ispitivanja koji je primenljiv za identifikaciju jedinjenja koje povećava ili smanjuje formiranje ODAR/OPG vezujući protein kompleksa je sistem površinskog plazmon rezonantnog detektora takav kao što jeBiacore assay system(Pharmacia, Piscataway, NJ). Ovaj sistem može da bude nagrađen uz korišćenje protokola proizvođača. Ovo ispitivanje uglavnom obuhvata kovalentno vezivanje bilo OPG vezujućeg proteina bilo ODAR-a na dekstranom prevučen senzorski čip koji je postavljen u detektora. Jedinjenje koje se testira i drugi komplementarni protein mogu tada da budu injektirani u prostor koji sadrži senzorski čip bilo istovremeno ili sekevnciono i količina komplementarnog proteina koji se vezuje može da bude određena bazirano na promeni u molekulskoj masi koja je fizički vezana sa stranom koja je prevučena dekstranom senzorskog čipa; promena molekuslke mase može da bude merena pomoću detektorskog sistema. ;U nekim slučajevima, može da bude poželjno ispitati dva ili više jedinjenja koja se ispituju zajedno za primenu za povećano ili smanjeno formiranje kompleksa ODAR/OPG vezujući protein. U ovim slučajevima, ispitivanja data napred mogu lako da budu modifikovana pomoću dodavanja takvog dodatnog jedinjenja za testiranje bilo istovremeno sa ili uzastopno, prvom jedinjenju koje se ispituje. Preostali stupnjevi ispitivanja su kao stoje dato ovde napred. ;In vitro ispitivanja, takva kao ona koja su opisana napred mogu podesno da budu korišćena radi brzog ispitivanja velikog broja jedinjenja koja utiču na formiranje kompleksa pomoću ODAR-a i OPG vezujućeg proteina. Ispitivanja mogu da budu automatizovana radi ispitivanja jedinjenja koja su nastala u fagnom prikazu, sintetičkog peptida i hemijski sintetisanih biblioteka. ;Jedinjenja koja povećavaju ili smanjuju formiranje kompleksa između OPG vezujućeg proteina i ODAR-a mogu takođe da budu testirana u kulturi ćelije uz korišćenje ćelija i ćelijskih linija koje nose ODGAR. Ćelije i ćelijske linije mogu da budu dobijene iz nekog sisara, ali poželjno će biti od čoveka ili nekog drugog primata ili iz pasjih i zečjih izvora. Ćelije koje sadrže ODAR, takve kao osteoklasti mogu da budu dobijene iz drugih ćelijskih tipova pomoću afinitivne hromatografije uz korišćenje javnosti dostupnih procedura. Pripajanje OPG vezujućeg proteina na ćelije koje nose ODAR je vršeno u prisustvu ili odsutvu jedinjenja koje se testira i obim vezivanja može da bude određen, na primer, pomoću protočne citometrije uz korišćenje bitinilovanog antitela prema OPG vezujućem proteinu. Alternativno, mišja ili humana osteoklastna kultura može da bude dobijena kao što je opisano u primeru 8 i jedinjenje koje se testira može da bude ispitano na svoju sposobnost da blokira sazrevanje osteoklasta koje je stimulisano sa dodavanjem CSF-1 i OPG vezujućeg proteina. Ispitivanja ćelijske kulture mogu podesno da budu korišćena za dalje ispitivanje jedinjenja koja su smatrana kao pozitivna u ispitivanjima proteinskog vezivanja koja su opisana napred. ;Jedinjenja koja povećavaju ili smanjuju interakciju OPG vezujućeg proteina sa ODAR-om mogu takođe da budu ispitana za in vivo aktivnost pomoću primene jedinjenja kod miševa što je dalje praćeno sa merenjima koštane gustine us korišćenje skanirajuće denzitometrije ili radiografije. Procedure za merenje koštane gustine su opisane u PCT publikaciji W097/23614 i u primeru 13. ;Pronalazak obezbeđuje jedinjenja koja snižavaju ili blokiraju interakciju između OPG vezujućeg proteina i ODAR-a i antagonisti su formiranja osteoklasta. Takva jedinjenja obično spadaju u dve grupe. Jedna grupa uključuje ona jedinjenja koja su izvedena iz OPG vezujućeg proteina ili koja interaguju sa OPG vezujućim proteinom. Ova su opisana ovde napred. Druga grupa uključuje ona jedinjenja koja su izvedena iz ODAR-a ili koja ineteraguju sa ODAR-om. Primeri jedinejnja koji su antagonisti ODAR-a uključuju nukleinske kiseline, proteine, peptide, ugljene hidrate, lipide ili organska jedinjenja male molekulske mase. ;Antagonisti ODAR-a mogu da budu jedinejnja koja se vezuju na ili blizu jednog ili više vezujućih mesta za OPG bp u ODAR ekstraćelijskom domenu i smanjuju ili potpuno blokiraju formiranje kompleksa. Oni regioni na ODAR-u koji učestvuju u formiranju kompleksa sa OPG vezujućim proteinom mogu da budu identifikovani pomoću analogije sa strukturom homolognog TNF/3/TNF-R55 kompleksa koji je opisan u Banner et al (Cell 73, 431-445 (1993)). Na primer, struktura TNF/3/TNF-R55 kompleksa može da bude korišćena za identifikovanje regiona OPG vezujućeg proteina i ODAR-a koji učestvuju u formiranju kompleksa. Tada mogu da budu označena jedinjenja koja se preferncijalno vezuje na regione koji učestvuju u formiranju kompleksa i deluju kao antagonisti. U jednom prlazu koji je dat u primeru 11, naznačeni su peptidni antigeni za korišćenje porasta broja antitela prema OPG vezujućem proteinu koji deluju kao antagonisti. Ova antitela očekuje se da se vezuju na OPG vezujući protein i blokiraju formiranje kompleksa sa ODAR-om. U sličnom prilazu, peptidni antitegni bazirani na ODAR strukturi mogu da budu korišćeni za porast broja anti-ODAR antitela koja deluju kao antagonisti. ;Antaogonisti ODAR-a mogu takođe da se vezuju na ODAR na lokacijama odvojenim od vezujućeg(ih) mesta za OPG bp i uvode konformacione promene u ODAR polipeptid što dovodi do manjeg ili ne-produktivnog formiranja kompleksa sa OPG vezujućim proteinima. ;U jednoj realizaciji, antagonist je solubilan oblik ODAR-a koji ne sadrži funkcionalni transmembranski domen. Solubilni oblici ODAR-a mogu da imaju brisanje jedne ili više amino kiselina u transmembranskom domenu (amino kiseline 214-234 kao što je prikazano na slici 10). Solubilni ODAR polipeptidi mogu da imaju deo ili čitav ekstraćelijski domen i sposobni su da vežu OPG vezujući protein. Po izboru, solubilni ODAR može da bude deo himernog proteina, gde deo ili čitav ekstraćelijski domen ODAR-a je fuziran na heterolognu amino kiselinsku sekvencu. U jednoj realizaciji, heterologna amino kiselinska sekvenca je Fc region iz humanog IgG. ;Modulatiori (agonosti i antagonisti) ODAR-a mogu da budu korišćeni radi prevencije ili tretiranja osteopenija koje uključuju osteoporozis, osteomielitis, hiperkalcemiju, osteopeniju stečenu pomoću hiruške interevncije ili primene steroida, Paget-ovo obolenje, osteonekrozis, koštani gubitak usled reumatoidnog artritisa, periodontalni koštani gubitak, imobilizaciju, protetičko labavljenje i osteolitički metastazis. Agonisti i antagonisti ODAR-a koji su korišćeni su tretiranje osteopeniaze mogu da budu primenjeni sami ili u kombinaciji sa terapeutski efektivnom količinom agensa koji promoviše koštani rast uključujući koštane morfogene faktore koji su označeni BMP-1 do BMP-12, članove familije faktora koji transformišu rast, faktor-/? i TGF-/3, faktore fibroblastnog rasta FGF-1 do FGF-10, interleukin-1 inhibitore, paratiroidni hormon, prostaglandine E serija, bisfosfonate, estrogene, SERMs i koštano-ojačivačke minerale takve kao što je fluorid i kalcijum. Antagonisti ODAR-a su naročito primenljivi u tretiranju osteopenije. ;Sledeći primeripružaju potpuniju ilustraciju pronalaska, ali nisu dati radi ograničavanja njegovog obima. ;Primer 1 ;Identifikacija izvora ćelijske linije za OPG vezujući protein;Osteoprotegerin (OPG) negativno reguliše osteoklastogenezis in vitro i in vivo. Pošto OPG je TNFR-sličan protein, može da se očekuje da interaguje sa članom TNF-slične familije uz posredovanje njegovih efekata. Sa jednim izuzetkom svi poznati članovi TNF superfamilije su tipa I transmembranski proteini koji su ekspresovani na ćelijskoj površini. Radi identifikovanja izvora OPG vezujućeg proteina, rekombinantni OPG-Fc fuzioni proteini su korišćeni kao imunoprobe radi testiranja na OPG vezujuće protine koji su locirani na površini raznih ćelijskih linija i primarno hematopoitskih ćelija. ;Ćelijske linije koje su rasle kao pripojene kulture in vitro su tretirane uz korišćenje sledećih postupaka. Ćelije su nanesene u okca ploča sa 24 okca za tkivnu kulturu (Falcon), tada su ostavljene da rastu do oko 80% konfluence. Sredina za rast se tada ukloni i pripojene kulture se isperu sa fosfatno puferisanirn slanim rastvorom (PBS) (Gibco) koji sadrži 1% seruma goveđeg zametka (FCS). Rekombinantni mišji OPG [22-194]-Fc i humani OPG [22-201]-Fc fuzioni proteini (vidi U.S. prijavu serijski broj 08/706945 od 3. septembra 1996) su individualno razblaženi do 5/xg/ml u PBS-u koji sadrži 1 % FCS-a, tada su dodati u kulture i ostavljeni su radi inkubacije tokom 45 minuta na 0°C. Odbačen je rastvor OPG-Fc fuzionog proteina i ćelije su isprane u PBS-FCS rastvoru kao što je opisano napred. Kulture su tada izložene fikoiritrin-konjugovanom kozjem F(ab') anti-humanom IgG sekundarnom antitelu (Southeren Biotechnologv Associates Cat. # 2043-09) razblaženom u PBS-FCS. Posle 30-45 minuta inkubacije na 0°C, rastvor je odbačen i kulture su isprane kao što je opisano napred. Ćelije su tada analizirane pomoću imunofluorescentne mikroskopije radi detektovanja ćelijskih linija koje vrše ekspresiju OPG vezujućeg proteina ćelijske površine. ;Suspenzije ćelijskih kultura su analizirane na sličan način sa sledećim modifikacijama: Razblaživač i ispirajući pufer se sastoje od pufersianog slanog rastvora koji ne sadrži kalcijum i magnezuijum i koji sadrži 1% FCS. Ćelije su prikupljene iz eksponencijalno replikujućih kultura u sredini za rast, peletirane su pomoću centrifugiranja, tada su ponovo suspendovane pri 1 IO<7>ćelija/ml u okca mikrotitarske ploče za tkivnu kulturu sa 96 okaca (Falcon). Ćelije su sekvenciono izlagane rekombinatriim OPG-Fc fuzionim proteinima, tada sekundarnom antitelu kao što je opisano napred i ćelije su ispirane pomoću centrifugiranja između svaka dva stupnja. Ćelije su tada analizirane pomoću sortiranja fluorescentno aktiviranih ćelija (FACS) uz korišćenjeBecton Dickinson FACskenera. ;Uz korišćenje ovog pristupa, mišja mielomonocitna ćelijska linija 32D (ATCC pristupni br. CRL-11346) je nađena radi ekspresije površinskog molekula koji može da bude detektovan sa mišjim OPG{22-194]-Fc i humanim OPG[22-201]-Fc fuzionim proteinima. Sekundarno antitelo samo se ne vezuje na površinu 32D ćelija niti na prečišćen IgGl Fc što pokazuje da vezivanje OPG-Fc fuzionih proteina je izazavano OPG delom. Ovo vezivanje može da bude okarakterisano kao doza zavisno pomoću dodavanja rekombinantnog mišjeg ili humanog OPG[22-401] proteina. Tako OPG koji je zahtevan za njegovu biološku aktivnost je spsooban za specifično vezivanje na 32D-izveden molekul površine. ;Primer 2 ;Ekspresiono kloniranje mišjeg OPG vezujućeg proteina;CDNA biblioteka je dobijena iz 32D mRNA i ligirana je u sisarski ekspresioni vektor pcDNA3.1(+) (Invitrogen, San Diego, CA). Eksponencijalno rastuće 32D ćelije su održavane u prisustvu rekombinantnog interleukina-3 i prikupljene su a ukupna ćelijska RNA je prečišćena pomoću gunaidinium tiocijanat-fenol-hloroform ekstrakcije (Chomczvnski i Sacchi. Anal. Biochem. 162, 156-159(1987)). Poli (A+) mRNA frakcija je dobijena iz ukupne RNA pomoću absorpcije i eluiranja, Dvnabeads Oligo (dT) 25 (Dynal Corp) uz korišćenje procedura preporučenih od strane proizvođača. Usmerena oligo-dT cDNA biblioteka primara je dobijena uz korišćenjeSuperscript Plazmid System(Gibco BRL, Gaithersburg, Md) uz korišćenje procedura preporučenih od strane proizvođača. Dobijena cDNA je digestirana do kraja sa Sal I i Not I restrikcionim endonukleazama, tada je frakcionisana pomoću ekskluzivne gelne hromatografije. Odabrane su frakcije najviše molekulske mase, i tada su ligirane u polilinkemi region plazmidnog vektora pcDNA3.1(+) (Invitrogen, San Diego, CA). Ovaj vektor sadrži CMV promotor iznad višestrukog klonirajućeg mesta i usmerava ekspresiju visokog nivoa u eukariotske ćelije. Biblioteka je tada elektrougrađena u odgovarajuću E. col i (ElectroMAX DH10B, Gibco, NY), i preneta na LB agar koji sadrži 100 ug/ml ampilicina. Biblioteka je tada raspoređena u segregacione rezervoare koji sadrže oko 1000 klonova/rezervoaru, i 1,0 ml kulture svakog rezervoara je rastao tokom 16-20 časova na 37°C. Plazmid DNA iz svake kulture je dobijen uz korišćenjeQiagen Qiawell 96 Ultra Plasmid Kitopreme (katalog # 16191) uz praćenje procedura preporučenih od strane proizvođača. ;Rezervoari sa raspoređenom 32D cDNA ekspresionom bibliotekom su individualno lipofektovani u COS-7 kulture, tada su ispitani na sticanje ćelijske površine OPG vezujućeg proteina. Za vršenje ovoga, COS-7 ćelije su nanesene pri gustini od 1 IO<6>ćelija po ml u okca ploče za tkivnu kulturu sa šest okaca (Costar), tada su kultivirane preko noći u DMEM (Gibco) koji sadrži 10% FCS. Približno 2figplazmida DNA iz svakog rezervoara je razblaženo u 0,5 ml DMEM-a bez seruma, tada je sterilisano pomoću centrifugiranja kroz 0,2fxm Spin- Xkolone (Costar). Istovremeno, 10 ^1 lipofektamina (Life Technologies Cat # 18324-012) je dodato u posebnu epruvetu koja sadrži 0,5 ml DMEM-a bez seruma. DNA i lipofektaminski rastvori su izmešani i ostavljeni radi inkubiranja tokom 30 minuta na sobnoj temperaturi. COS^7 ćelijske kulture su tada oprane sa DMEM-om bez seruma i DNA-lipofektaminski kompleksi su izloženi kulturama tokom 2-5 časova na 37°C. Posle ovog perioda, sredina je uklonjena i zamenjena sa DMEM-om koji sadrži 10% FCS-a. Ćelije su tada kultivirane tokom 48 časova na 37°C. ;Radi detektovanja kultura koje vrše ekspresiju OPG vezujućeg proteina, sredina za rast je uklonjena i ćelije su isprane sa PBS-FCS rastvorom. U svako okce je dodata zapremina od 1,0 ml PBS-FCS koji sadrži 5/xg/ml humanog OPG [22-201]-Fc fuzionog proteina i tokom 1 časa vršeno je inkubiranje na sobnoj temperaturi. Ćelije su isprane tri puta sa PBS FCS rastvorom i tada su fiksirane u PBS koji sadrži 2% paraformaldehid i 0,2% glutaraldehid u PBS na sobnoj temperaturi tokom pet minuta. Kulture su isprane odjednom sa PBS-FCS, tada su inkubirane tokom jednog časa na 65°C uronjene u PBS-FCS rastvor. Kulture su ostavljene da se ohlade, i PBS-FCS rastvor je usisan. Kulture su tada inkubirane sa alkalin-fosfataza konjugovanim kozjim anti-humanim IgG (Fc specifičnim) antitelom (SIGMA Proizvod # A-9544) na sobnoj temperaturi tokom 30 minta, tada su isprane tri puta sa 20 mM Tris-Cl (pH 7,6) i 137 mM NaCl. Imuni kompleksi koji su nagrađeni tokom ovih stupnjeva su detektovani pomoću ispitivanja na alkalnu fosfataznu aktivnost uz korišćenjeFast Red TR/ AS- MX Substrate Kitopreme (Pierce, Cat. # 34034) prateći procedure koje su preporučene od strane proizvođača. ;Uz korišćenje ovog prilaza, ukupno od oko 300000 nezavisnih 32D cDNA klonova je ispitano, prisutnih u 300 trasnefektovanih rezervoara svaki od po 1000 klonova. Jedno okce je identifikovano da sadrži ćelije koje su stekle sposobnost da budu specifično dekorisane pomoću OPG-Fc fuzionog proteina. Ovaj rezervoar je podeljen pomoću sekvencionih prečaga radi selekcije dajući tako jedan plazmidni klon 32D-F3 (slika 1). 32D-F3 plazmidna DNA je tada trasfektovana u COS-7 ćelije, koje su imunoobojene bilo samo sa FITC-konjugovanim kozjim anti-humanim IgG sekundarnim antitelom, bilo sa OPG [22-211]-Fc fuzionim proteinom plus sekundarni bilo sa ATAR-Fc fuzionim proteinom (ATAR takođe poznat kao HVEM; Montgomerv et al. Cell 87, 427-436 (1996)) (slika 2). Samo sekundarno antitelo se ne vezuje na COS-7/32D-F3 ćelije niti na ATAR-Fc fuzioni protein. Samo OPC Fc fuzioni protein se vezao u COS-7/32D-F3 ćelije što pokazuje da 32D-F3 je kodirao OPG vezujući protein prikazan na površini ekspresionih ćelija. ;Primer 3 ;Sekvenca OPG vezujućeg proteina;32D-F3 klon izolovan napred sadržao je insert od oko 2,3 kb cDNA (slika 1), koji je bio sekvenciran u oba smera naApplied Biosystems 373Aautomatizovanom DNA sekvenceru uz korišćenje primer-Taq boja-terminator reakcija( Applied Biosystems)uz praćenje procedura preporučenih od strane proizvođača. Dobijena nukleotidna sekvenca je upoređena sa DNA sekvencom iz baze podataka uz korišćenje FASTA programa (GCG, Univeristv of Wisconsin) i analizirana je na prisustvo dugih otvorenih čitajućih ramova (LORF's) uz korišćenje primene ;" Six- way open reading frame"(Frames) (GCG, Univeristv of Wisconsin). LOPvF od 316 amino kiselinskih (aa) ostataka koji počinju na metioninu je detektovan u odgovarajućoj orijentaciji a predhodio im je 5' netranslovan region od oko 150 bp. 5' netranslovan region sadržao je u ramu stop-ni kodon iznad predviđenog start-nog kodona. Ovo pokazuje da struktura 32D-F3 plazmida je saglasna sa njegovom sposobnošću korišćenja CMV promotorskog regiona radi direktne ekspresije 316 aa genskog proizvoda u ćelijama sisara. ;Predviđena sekvenca OPG vezujućeg proteina je tada upoređena sa postojećom bazom podataka poznatih proteinskih sekvenci uz korišćenje modifikovane verzije FASTA programa (Pearson, Meth. Enzvmol. 183, 63-98 (1990)). ;Amino kiselinska sekvenca je takođe analizirana na prisustvo specifičnih motifa sačuvanih u svim poznatim članovima superfamilije faktora tumorne nekroze (TNF) uz korišćenje metoda sekvencionog profila (Gribskov et al. Proc. Natl. Sci. USA 83, 4355-4359 (1987)), kako su ga modifikovali Luethv et al. Protein Sci. 3, 139-146 (1994)). Izgelda da postoji značajna homologija preko OPG vezujućeg proteina više članova TNF superfamilije. Mišji OPG vezujući protein izgleda da je najsličniji sa mišjim i humanim homolozima sa TRAIL i sa CD40 ligandom. Dalje analize sekvence OPG vezujućeg proteina su pokazale jako sparivanje TNF suprefamilije sa veoma značajnim Z skorom od 19.46. ;Amino kiselinska sekvenca OPG vezujućeg proteina sadrži verovatan hidrofobni transmembranski domen koji počinje na M49 i ide do L69. Bazirano na ovoj konfiguraciji u odnosu na metionin start-ni kodon, predloženo je da OPG vezujući protein bude tipa II transmembrasnki protein, sa kratkim N-terminalnim intraćelijskirn domenom i dužim C-terminalnim ekstraćelijskim domenom (slika 4). Ovo treba da bude slično sa svim poznatim članovima TNF familije sa izuzetkom a limfotoksina (Nagata i Golstein, Science 267, 1449-1456 (1995)). ;Primer 4 ;Ekspresija humanog OPG vezujućeg proteina mRNA;VišestrukoNorthernmrljanje humanog tkiva (Clontech, Palo Alto, CA) je ispitivano sa 32P-dCTP obeleženim 32D-F3 restrikcionim fragmentom radi detektovanja veličine humanog transkripta i radi određivanja načina ekspresije.Northernmrlje su predhodno hibridizirane u 5X SSPE, 50% formamidu, 5X Denhardt-ovom rastvoru, 0,5% SDS i 100/ug/ml denaturisanoj DNA sperme lososa tokom 2-4 časa na 42°C. Mrlje su tada hibridizirane u 5X SSPE, 50% formamidu, 2X Denhardt-ovom rastvoru, 0,1% SDS i 100/ig/ml denaturisanoj DNA sperme lososa i 5 ng/ml obeleženoj probi tokom 18-24 časa na 42°C. Mrlje su tada ispirane u 2X SSC tokom 10 minuta na sobnoj temperaturi, IX SSC tokom 10 minuta na 50°C, tada u 0,5X SSC tokom 10-15 minuta. ;Uz korišćenje probe koja je izvedena iz mišje cDNA i hibridizacije pod obaveznim uslovima, detektovane su predominantne mRNA vrste sa relativnom molekulskom masom od oko 2,5 kb u limfnim čvorićima (slika 3). Slab signal je takođe detektovan na istoj relativnoj molekulskoj masi u mRNA fetalne jetre. Transkripti OPG vezujućeg proteina nisu detektovani u drugim ispitivanim tkivima. Ovi podaci sugeriraju da ekspresija OPG vezujećeg proteina mRNA je krajnje ograničena u humanim tkivima. Podaci takođe pokazuju da izolovana cDNA klona je veoma bliska po veličini sa prirodnim transkriptom što sugerira da 32D-F3 je klon pune dužine. ;Primer 5 ;Molekularno kloniranje humanog OPG vezujućeg proteina;Humani homolog OPG vezujuđeg proteina je ekspresovan kao mRNA od približno 2,5 kb u humanim perifernim limfnim čvorićima i detektovana je pomoću hibridizacije sa mišjom cDNA probom pod obaveznim hibridizacionim uslovima. DNA koja kodira humani OPG vezujući protein je dobijena pomoću testiranja cDNA biblioteke humanih limfnih čvorića bilo pomoću rekombinantne bakterifagne plake bilo pomoću transformisane bakterijske kolonije, hibridizacioni postupci (Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratorv Manual Cold Spring Harbor Press, New York (1989)). Radi ovoga faga ili plazmidna cDNA biblioteka su ispitivane uz korišćenje radioaktivno-obeleženih proba koje su izvedene iz mišjeg OPG vezu jućeg proteina klona 32D-F3. Probe su korišćene radi ispitivanja nitroceluloznog filtera podignutog sa nanesene na ploču biblioteke. Ovi filteri su predhodno hibridizirani i tada su hibridizirani uz korišćenje uslova koji su specificirani u primeru 4, konačno dajući porast u prečišćenim klonovima humanog OPG vezujućeg proteina cDNA. Inserti koji su dobijeni iz nekog humanog OPG vezujućeg proteina klonova treba da budu sekvencirani i analizirani kao što je opisano u primeru 3. ;Humana limfnog čvorića poli A+ RNA (Clontech Inc., Palo Alto, CA) je bila analizirana na prisustvo OPG-bp transkripata kao predhodno u U.S. prijavi serijski broj 08/577 788 od 22. decembra1995. Northernmrljanje ovog RNA uzorka ispitano pod obaveznim uslovima sa 32P-obeleženom mišjom OPG-bp brobom je pokazalo prisustvo humanih OPG-bp transkripata. Oligo dT-primara cDNA biblioteka je tada sintetisana iz limfnih čvorića mRNA uz korišćenjeSuperScripoprem (GIBCO life Technologies, Gaithersberg, MD) kao što je opisano u primeru 2. Dobijena cDNA je selektirana po veličini i frakcija visoke molekulske mase je ligirana na plazmidni vektor pcDNA 3.1(+) (Invitrogen, SanDiego, CA). Elektrokompetentna E. coli DH10 (GIBCO life Technologies, Gaithersberg, MD) je transformisana i 1 IO<6>ampicilin rezistentni transformanti su ispitani pomoću hibridizacije kolonije uz korišćenje 32P-obeležene probe mišjeg OPG vezujućeg proteina . ;Plazmidni klonpredpostavljene cDNA humanog OPG vezujućeg proteina je izolovan, phuOPGbp-1.1 i sadržavao je insert od 2,3 kb. Dobijena nukleotidna sekvenca phuOPGbp-1.1 inserta je imala 80-85% homologije u odnosu na sekvencu cDNA OPG vezujućeg proteina. Translacija inserta DNA sekvence pokazala je prisustvo dugog otvorenog čitajućeg rama za koji je predpostavljeno da kodira 317 aa polipetid (slika 4). Upoređivanje mišjih i humanih OPG-bp polipeptida pokazuje da su oni približno 87% identični što pokazuje da ovaj protein je veoma očuvan tokom evolucije. ;DNA humanog OPG vezujućeg proteina i proteinske sekvence nisu prisutne u Genskoj banci i nema homolognih EST sekvenci. Kao sa mišjim homologom, humani OPG vezujući protein pokazuje jaku sekvencionu sličnost sa svim članovima TNFa superfamilije citokina. ;Primer 6 ;Kloniranje i bakterijska ekspresija OPG vezujućeg proteina;PCR amplifikacija koja koristi primarne parove i template koji su opisani niže je korišćena za stvaranje raznih oblika mišjih OPG vezujućih proteina. Jedan primar svakog para uvodi TAA stop-ni kodon i jedinstveno XhoI ili SacII mesto koje je praćeno sa karboksi terminusom gena. Drugi primar svakog para uvodi jedinstveno Ndel mesto, N-terminalni metionin i optimizirane kodone za amino terminalni deo gena. PCR i termocikliranje se vrši uz korišćenje standardne rekombinantne DNA metologije. PCR proizvodi su prečišćeni, restrikciono digestirani i ubačeni su u jedinstvena Ndel i XhoI ili SacII mesta vektora pAMG21 (ATCC pristupni br. 98113) i transformirani su prototrofnu E. coli 393 ili 2596. Drugi obično korišćeni E. coli ekspresioni vektori i ćelije domaćina su takođe podesni za ekspresiju. Posle transformacije, klonovi su selektirani, plazmidna DNA je izolovana i sekvenca inserta OPG vezujućeg proteina je potvrđena. ;pAMG21- mišji OPG vezujući protein f75- 3161 ;Ovaj konstrukt je nagrađen tako da ima 242 amino kiselina u dužini i ima sledeće N-terminalne i C-terminalne ostatke, NH2-Met(75)-Asp-Pro-Asn-Arg Gln-Asp-Ile-Asp(316)-COOH. Templat koji je korišćen za PCR je bio pcDNA/32D-F3 i oligonukleotidi #1581-72 i #1581-76 su bili primarni par koji je korišćen za PCR i kloniranje ovog genskog konstrukta. ;1581-72: ; 1581-76 ;pAMG21- mišji OPG vezujući protein T95- 3161 ;Ovaj konstrukt je nagrađen tako da bude 223 amino kiselina u dužini i ima sledeće N-terminalne i C-terminalne ostatke, NH2-Met-His(95)-Glu-Asn-Ala-Gly Gln-Asp-Ile-Asp(316)-COOH. Templat koji je korišćen za PCR je bio pcDNA/32D-F3 a oligonukleotidi #1591-90 i #1591-95 su primarni par koji je korišćen za PCR i kloniranje ovog genskog konstrukta. ;1591-90: ; 1591 95 ;pAMG21- mišii OPG vezujući protein 1107- 3161 ;Ovaj konstrukt je nagrađen tako da bude 211 amino kiselina u dužini i ima sledeće N-terminalne i C-terminalne ostatke, NH2-Met-Ser(107)-Glu-Asp-Thr-Leu Gln-Asp-Ile-Asp(316)-COOH. Templat koji je korišćen za PCR je bio pcDNA/32D-F3 a oligonukleotidi #1591-93 i #1591-95 su primarni par koji je korišćen za PCR i kloniranje ovog genskog konstrukta. ;1591-93: ; 1591-95: ;pAMG21- mišii OPG vezujući protein f! 18- 3161 ;Ovaj konstrukt je nagrađen tako da bude 199 amino kiselina u dužini i ima sledeće N-terminalne i C-terminalne ostatke, NH2-Met(118)-Lys-Gln-Ala-Phe-Gln Gln-Asp-Ile-Asp(316)-COOH. Templat koji je korišćen za PCR je bio pcDNA/32D-F3 a oligonukleotidi #1591-94 i #1591-95 su primarni par koji je korišćen za PCR i kloniranje ovog genskog konstrukta. ;1591-94: ; 1591-95 ;pAMG21- mišii OPG vezujući protein IT28- 3161 ;Ovaj konstrukt je nagrađen tako da bude 190 amino kiselina u dužini i ima sledeće N-terminalne i C-terminalne ostatke, NH2-Met-Lys(128)-Glu-Leu-Gln-His Gln-Asp-Ile-Asp(316)-COOH. Templat koji je korišćen za PCR je bio pcDNA/32D-F3 a oligonukleotidi #1591-91 i #1591-95 su primarni par koji je korišćen za PCR i kloniranje ovog genskog konstrukta. ;1591-91: ; 1591-95 ;pAMG21- mišii OPG vezujući protein f 137- 3161 ;Ovaj konstrukt je nagrađen tako da bude 181 amino kiselina u dužini i ima sledeće N-terminalne i C-terminalne ostatke, NH2-Met-Gln(137)-Arg-Phe-Ser-Gly Gln-Asp-Ile-Asp(316)-COOH. Templat koji je korišćen za PCR je bio pcDNA/32D-F3 a oligonukleotidi #1591-92 i #1591-95 su primarni par koji je korišćen za PCR i kloniranje ovog genskog konstrukta. ;1591-92: ; 1591-95 ;pAMG21- mišii OPG vezujući protein [ 146- 316] ;Ovaj konstrukt je nagrađen tako da bude 171 amino kiselina u dužini i ima sledeće N-terminalne i C-terminalne ostatke, NH2-Met(146)-Glu-Gly-Ser-Trp Gln-Asp-Ile-Asp(316)-COOH. Templat koji je korišćen za PCR je bio pAMG21 mišji OPG vezujući protein [75-316] koji je opisan napred a oligonukleotidi #1600-98 i #1581-76 su primarni par koji je korišćen za PCR i kloniranje ovog genskog konstrukta. ;1600-98: ; 1581-76 ;pAMG21- mišii OPG vezujući protein [ 156- 3161 ;Ovaj konstrukt je nagrađen tako da bude 162 amino kiselina u dužini i ima sledeće N-terminalne i C-terminalne ostatke, NH2-Met-Arg(156)-Gly-Lys-Pro Gln-Asp-Ile-Asp(316)-COOH. Templat koji je korišćen za PCR je bio pAMG21 mišji OPG vezujući protein [158-316] dat niže a oligonukleotidi #1619-86 i #1581-76 su primarni par koji je korišćen za PCR i kloniranje ovog genskog konstrukta. ;1619-98: ; 1581-76 ;pAMG21- mišii OPG vezujući protein [ 158- 3161 ;Ovaj konstrukt je nagrađen tako da bude 160 amino kiselina u dužini i ima sledeće N-terminalne i C-terminalne ostatke, NH2-Met-Lys(158)-Pro-Glu-Ala Gln-Asp-ile-Asp(316)-COOH. Templat koji je korišćen za PCR je bio pcDNA/32D-F3 a oligonukleotidi #1581-73 i #1581-76 su primarni par koji je korišćen za PCR i kloniranje ovog genskog konstrukta. ;1581-73: ; 1581-76 ;pAMG21- mišji OPG vezujući protein \ 166- 3161 ;Ovaj konstrukt je nagrađen tako da bude 152 amino kiselina u dužini i ima sledeće N-terminalne i C-terminalne ostatke, NH2-Met-His(166)-Leu-Thr-Ile Gln-Asp-Ile-Asp(316)-COOH. Templat koji je korišćen za PCR je bio pcDNA/32D-F3 a oligonukleotidi #1581-75 i #1581-76 su primarni par koji je korišćen za PCR i kloniranje ovog genskog konstrukta. 1581-76 ;pAMG21- mišji OPG vezujući protein f 168- 3161 ;Ovaj konstrukt je nagrađen tako da bude 150 amino kiselina u dužini i ima sledeće N-terminalne i C-terminalne ostatke, NH2-Met-Thr(168)-Ile-Asn-Ala Gln-Asp-Ile-Asp(316)-COOH. Templat koji je korišćen za PCR je bio pcDNA/32D-F3 a oligonukleotidi #1581-74 i #1581-76 su primarni par koji je korišćen za PCR i kloniranje ovog genskog konstrukta. ;1581-74: ; 1581-76 ;Treba razumeti da gornji konstrukti su primeri i stručnjak u ovoj oblasti može lako da dobije druge oblike OPG vezujućeg proteina uz korišćenje opšte metodologije koja je ovde data. ;Rekombinantni bakterijski konstrukti pAMG21 mišji OPG vezujući protein [75-316], [95-316], [107-316], [118-316], [128-316], [137-316] i [158-316] su klonirani, potvrđena je DNA sekvenca i ispitani su nivoi rekombinantnog genskog proizvoda koji prati ekspresionu indukciju. Svi konstrukti proizveli su nivoe rekombinantnog genskog proizvoda koji su bili lako vidljivi posle SDS poliakrilamidne gelne elektroforeze i kumasajnog bojenja sirovih lizata. Rast transformisane E. coli 393 ili 2596, indukcija eskpresije OPG vezujućeg proteina i izolovanja inkluzionih tela koja sadrže OPG vezujući protein su izvedeni prema procedurama koje su opisane u PCT W097/23614. ;Prečišćavanje OPG vezujućih proteina iz inkluzionih tela zahteva solubilizaciju i denaturisanje OPG vezujućeg proteina uz korišćenje procedura koje su dostupne stručnjaku u ovoj oblasti. Rekombinantni mišji OPG vezujući protein [158-316] je nađeno da se proizvodi uglavnom kao nesolubilan, ali je nađeno i oko 40% solubilne frakcije. Rekombinantni protein je prečišćen iz solubilne frakcije kao što je opisano niže i ispitana je njegova bioaktivnost. ;Primer 7 ;Prečišćavanje rekombinantnog mišjeg OPG vezujućeg proteina [ 158- 316];Smrznute bakterijske ćelije koje proizvode ekspresovan mišji OPG vezujući protein (158-316) su odmrznute i ponovo suspendovane u 20 mM tris-HCl pH 7,0, 10 mM EDTA. Ćelijska suspenzija (20 mas. %) je tada homogenizovana pomoću tri provođenja kroz mtkrofluidizer. Lizirana ćelijska suspenzija je centriugirana u JA14 rotoru pri 10000 obrta u minuti tokom 45 minuta. SDS-PAGE analiza je pokazala traku od oko 18 kd molekulske mase koja je prisutna kako u inkluzionim telima tako i u supernatantu. Solubilna frakcija je tada primenjena naPharmacia SP Sepharose 4FFkolonu koja je uravnotežena sa 10 mM MES-a pH 6,0. OPG vezujući protein je eluiran sa 20 gradijentnih zapremina kolone od 0-0,4M NaCl u MES-u pH 6,0. Frakcije koje sadrže OPG vezujući protein su tada primenjene naABX Bakerbondkolonu koja je uravnotežena sa 20 mM MES-a pH 6,0. OPG vezujući protein je eluiran sa 15CV gradijentom 0-0,5M NaCl u MES-u pH 6,0. Konačni proizvod je bio više od 95% homogen prema SDS-PAGE. N-terminalno sekvenciranje dalo je sledeću sekvencu: Met-Lys-Pro-Glu-Ala-Gln-Pro-Phe-Ala-His koja je identifikovana kao ona predpostavljena za polipeptid koja polazi na ostatku 158 (sa metioninom kao inicijatorom). Relativna molekulska masa proteina tokom SDS-PAGE nije se menjala posle redukcije. ;Primer 8 ;In vitrobioaktivnost rekombinantnog solubilnog OPG vezujućeg proteina;Rekombinantni OPG protein predhodno je pokazano da blokira D3-zavistno formiranje osteoklasta iz prekursora iz koštane moždine i slezine u ispitivanju formiranja osteoklasta kao što je opisano u U.S prijavi serijski br. 08/577788. Pošto OPG vezujući protein vezuje OPG i nov je član TNF familije liganada, to je i potencijalna meta OPG bioaktivnosti. Rekombinantni solubilni OPG vezujući protein (158-316) koji predstavlja minimalno jezgro TNFa-sličnog domena bio je testiran na svoju sposobnost da vrši modulaciju osteoklastne diferencijacije iz osteoklastnih prekursora. Ćelije koštane moždine su izolovane iz femura odraslog miša, i tretirane su sa M-CGF. Ne-prijanjajuća frakcija je bila ko-kultivirana sa ST2 ćelijama u prisustvu i odsustvu vitamina D3 i deksametasona. Kao što je predhodno pokazano, osteoklasti se razvijaju samo iz ko-kultura koje sadrže stromalne (ST2) ćelije, vitamin D3 i deksametason. Rekombinantan solubilan OPG vezujući protein je dodavan pri raznim koncentracijama koje idu od 0,16 do 500 ng/ml i sazrevanje osteoklasta je određivano pomoću ispitivanja TRAP rastvora i pomoću vizuelnog posmatranja. OPG vezujući protein jako stimuliše diferencijaciju osteoklasta i sazrevanje na način zavistan od doze, sa polu maksimalnim efektima u oblasti 1-2 ng/ml, što sugerira da ovaj deluje kao moćan inducer osteoklastogenezisa in vitro (sklika 5). Efekat OPG vezujućeg proteina je blokiran pomoću rekombinantnog OPG (primer 6). ;Radi testiranja da li OPG vezujući protein može da zameni strome i dodate steroide, formirane su kulture uz korišćenje M-CSF pri promenljivim koncentracijama radi promovisanja rasta osteoklastnih prekursora i dodate su razne količine OPG vezujućeg proteina. Kao što je pokazano na slici 6, OPG vezujući protein zavisno od doze stimulisao je TRAP aktivnost, a jačina stimulacije je bila zavisna od nivoa dodatog M-CSF-a što sugerira da ova dva faktora zajedno su stožer za osteoklastni razvoj. Radi potvrde biološkog značaja ovog zadnjeg opažanja, kulture su formirane na goveđim kortikalnim koštanim isečcima i testirani su efekti za M-CSF i OPG vezujući protein bilo posebno bilo zajedno. Kao što je prikazano na slici 7, OPG vezujući protein u prisustvu M-CSF je stimulisao formiranje velikih TRAP pozitivnih osteoklasta koji su erodirali površinu kosti uz građenje neravnina. Tako, OPG vezujući protein deluje kao stimulišući faktor osteoklastegenezisa (diferncijacije). Ovo sugerira da OPG blokira osteoklastni razvoj pomoću sekvestirajućeg OPG vezujućeg proteina. ;Primer 9 ;In vivoaktivnost rekombinantnog solubilnog OPG vezujućeg proteina;Bazirano na in vitro proučvanjima, rekombinantni mišji OPG vezujući protein [158-316] koji je proizveden u E. coli je moćan inducer osteoklastnog razvoja iz mieloidnih prekursora. Radi određivanja njegovih efekata in vivo, mužjaci BDF1 miševa starosti 4-5 sedmica (Charles River Laboratories) su primali podkožne injekcije OPG vezujućeg proteina [158-316] dva puta dnevno tokom tri dana i ujutro četvrtog dana (dani 0, 1, 2 i 3). Pet grupa miševa je primalo (n = 4) samo noiiačl, 5, 25 ili 100/ig OPG vezujućeg proteina [158-316] na dan. Dodatnih pet grupa miševa (n = 4) su primale gornje doze nosača ili OPG vezujućeg proteina [158-316] i dodatno su primale humani Fc-OPG [22-194] i to lmg/kg/dan (približno 20^g/dan) pomoću jedne dnevne podkožne injekcije. Čitav krvni jonizovani kalcijum je određivan pre tretiranja na dan 0 i 3-4 časova posle prve dnevne injekcije OPG vezujućeg proteina [158-316] na dane 1, 2 i 3. Četiri časa posle poslednje injekcije na dan 3 miševi su ubijeni i načinjeni su radiografi. Rekombinantni OPG vezujući protein [158-316] je proizveo značajan porast u krvnom jonizovanom kalcijumu dva dana posle tretmana pri dozi od 5/ig/dan i višim (slika 8). Ozbiljnost hiperkalcemije ukazuje na jaku indukciju osteoklastne aktivnosti koja dovodi do povećane koštane resorpcije. Istovremena OPG primena ograničila je hiperkalcemiju pri dozama OPG vezujućeg proteina [158-316] od 5 i 25jug/dan ali ne i pri dozi od 100^g/dan. Ove iste životinje su analizirane pomoću radiografije radi određivanja da li ima nekih efekata na koštanu mineralnu gustinu vidljivu pomoću X-zraka (slika 9). Rekombinantni OPG vezujući protein [158-316] injektiran tokom tri dana snizio je koštanu gustinu u proksimalnoj tibiji miševa na način koji zavisi od doze. Smanjenje u koštanoj gustini je bilo naročito evidentno kod miševa koji su primali 100Mg/dan što potvrđuje da duboka hiperkalcemija kod ovih životinja je nastala iz povećane koštane resorpcije koja dovodi do oslobađanja kalcijuma iz skeleta. Ovi podaci jasno pokazuju da OPG vezujući protein [158-316Ć deluje in vivo tako da promoviše koštanu resorpciju, što dovodi do sistemske hiperkalcemije a rekombinantni OPG umanjuje ove efekte. ;Primer 10 ;Kloniranje i ekspresija solubilnog OPG vezujućeg proteina u ćelijama sisara;Klon pune dužine mišjeg i humanog OPG vezujućeg proteina može da bude ekspresovan u ćelijama sisara kao što je predhodno opisano u primeru 2. Alternativno, cDNA klonovi mogu da budu modifikovani radi kodiranja izlučenih oblika proteina kada su ekspresovani u ćelijama sisara. Zbog ovoga, prirodni 5'kraj cDNA koji kodira inicijaciju kodona i koji se prostire približno kroz prvih 69 amino kiselinskih proteina, uključujući transmembranski spanirajući region, može da bude zamenjen sa signalnom peptidnom liderskom sekvencom. Na primer, DNA sekvence koje kodiraju iniciacioni kodon i signalni peptid poznatog gena mogu da budu upletene u cDNA sekvencu OPG vezujućeg proteina počevši bilo gde posle regiona koji kodira amino kiselinski ostatak 68. Dobijeni rekombinantni klonovi predpostavljeno je da proizvode lučene oblike OPB vezujućeg proteina u ćelijama sisara i mogu da podlegnu translacionim modifikacijama koje se normalno javljaju u C-terminalnom ekstraćelijskom domenu OPG vezujućeg proteina, takvoj kao što je glikolizacija. Uz korišćenje ove strategeije, izlučen oblik OPG je konstruisan tako da ima na svom 5' kraju zreo OPG signalni peptid a na svom 3' kraju ima humani IgGl Fc domen. Plazmidni vector pCEP4/muOPG[22-401]-Fc kao što je opisano u U.S. prijavi serijski broj 08/577788 od 22. decembra 1995 je digestiran sa Noti radi raskidanja između 3' kraja OPG i Fc gena. Linearizovana DNA je tada delimično digestirana sa Xmnl radi rasskidanja samo između ostataka 23 i 24 OPG odlazećeg zarubljenog kraja. Restrikcioni digesti su tada defosforilovani sa CIP i vektorski deo ovog digesta (uključujući ostatke 1-23 OPG-a i Fc) je gelno prečišćen. ;Mišji cDNA region OPG vezujućeg proteina koji kodira amino kiselinske ostatke 69-316 je PCR amplificiran uz korišćenjePfu Polymerase(Stratagene, San Diego, CA) iz plazmidnog templata uz korišćenje primara sledećih oligonukleotida: ;1602-61 oligonukleotid amplificira 5' kraj gena i sadrži umetnuto StuI mesto. 1602-59 primar amplificira 3' kraj gena i sadrži umetnuto NotU mesto. Dobijen PCR proizvod je digestiran sa Noti i StuI i tada je gelno prečišćen. Prečišćen PCR proizvod je ligiran sa vektorom, tada je korišćen radi transformacije elektrokompetentnih E. coli DH10B ćelija. Dobijeni klon je sekvenciran radi potvrde integriteta amplificirane sekvence i pripajanja restrikcionog mesta. Ovaj plazmid je tada korišćen za transfekciju humanih 293 fibroblasta i OPG vezujući protein-Fc fuzioni proten je prikupljen iz sredine kulture kao što je predhodno opisano u U.S prijavi serijski broj 08/577 788 od 22. decembra 1995. ;Uz korišćenje slične strategije nagrađen je ekspresioni vektor koji je sposoban da vrši ekspresiju N-terminalne trankacije fuzirane na humani IgGl Fc domen. Ovaj konstrukt sastoji se od mišjeg OPG signalnog peptida (aa ostatak 1-21), fuziranog u ram ostataka 158-316 mišjeg OPG vezujućeg proteina što je praćeno sa u-ramu fuzijom u humani IgGl Fc domen. Radi ovoga, plazmidni vektor pCEP4/mišji OPG [22-401] (U.S. prijava serijski broj 08/577 788 od 22. decembra 1995), je digestiran sa Hindlll i Noti radi uklanjanja čitavog OPG čitajućeg rama. Mišji OPG vezujući protein, ostaci 158-316 su PCR amplificrani uz korišćenje plazmidnog templata pCDNA/32D-F3 uz korišćenje sledećih primara: ;1616-44 amplificira OPG vezujući protein koji počinje na ostatku 158 i koji takođe sadrži ostatke 16-21 muOPG signalnog peptida sa umetnutim XhoI mesoma. 1602-59 amplificira 3' kraj gena i dodaje u ram Noti mesto. PCR proizvod je bio digestiran sa Noti i XhoI i tada je gelno prečišćen. ;Sledeći komplementarni primari su anilirani radi formiranja adaptera koji kodira mišji OPG signalni peptid i Kozak sekvencu koja okružuje translatorsko inicijaciono mesto: ;Ovi primari su anilirani tako da grade 5' preveske kompatibilne sa Hindlll na 5' kraju i XhoI na 3' kraju. Digestiran vektor dobijen napred, anilirani oligo i digestirani PCR fragment su ligirani zajedno i elektro-uneti u DH10B ćelije. Dobijeni klon je sekvenciran radi potvrde autentične rekonstrukcije spajanja između signalnog peptida, fragmenta OPG vezujućeg proteina koji kodira ostatke 158-316 i IgGl Fc domena. Rekombinantni plazmid je prečišćen, transfektovan u humane 293 fibroblaste i ekspresovan kao proizvod kondicionirane sredine kao što je opisano napred. ;Pune dužine mišje i humane cDNAs su klonirane u pCEP4 ekspresion vektor (Invitrogen, San Dieg, CA), tada su transfektovani u kulture humanih 293 fibroblasta kao što je opisano u primeru 1. Ćelijske kulture su prikupljene i izvršena je selekcija sa higromicinom kao što je opisano napred i dobijena je kondicionirana sredina bez seruma. Ova sredina je izložena koloni imobiliziranog rekombinantnog OPG i skunuti oblici mišjeg i humanog rekombinantnog OPG bp su afmitivno prečišćeni. N-terminalna sekvenciona analiza prečišćenih solubilnih OPG vezujućih proteina pokazuje da mišji protein je prefercijalno raskinut pre fenilalanina 139 a humani protein je prefercijalno raskinut pre homolognog ostatka, izoleucin 140. Dodatno humani protein je takođe prefercijalno raskunut pre glicina 145. Ovo sugerira da prirodno zastupljene forme humanog OPG vezujućeg proteina imaju amino terminalne ostatke bilo izoleucin na poziciji 140 bilo glicin na poziciji 145. ;Primer 11 ;Peptidi OPG vezujućeg proteina i dobijanje poliklonalnih i monoklonalnih antitela prema proteinu;Antitela prema specifičnim regionima OPG vezujućeg proteina mogu da budu dobijena pomoću imunizacije sa peptidima iz OPG vezujućeg proteina. Ovi peptidi mogu da budu korišćeni sami ili mogu da budu korišćeni konjugovani oblici peptida za imunizaciju. ;Kristalna struktura zrelog TNFa je bila opisana [E.Y. Jones, D.I. Stuart i N.P.C. Walker (1990) J. Cell Csi. Suppl. 13, 11-18] i monomeri grade antiparalelne /5-nabrane ravni sendvičirane sa gelirolnom topologijom. Deset antiparalelnih /3-struka je opaženo u ovoj kristalnoj strukturi i grade/3 sendvič sa/3 ravni koja se sastoji od struka B'BIDG i drugih struka C'CHEF [E.. Jones et al., isto). Dve petlje zrelog TNFa su upletene iz mutaganeznih proučavanja radi uspostavljanja kontakata sa receptorom, ovo su bile petlje nagrađene između/3 struke B&B' i petlja između jS struka E & F [C. R. Goh, C-S. Loh, i A. G. Porter (1991) Protein Engineering 4, 785-791]. Kristalna struktura kompleksa nagrađenog između TNFa i ekstraćelijskog domena 55kd TNF receptora (TNF-R55) je bila razrešena i receptor-ligand kontakti su bili opisani [D.W. Banner, A. D'Arcv, W. Janes, R. Gentz, H-J. Schoenfeld, C. Broger, H. Loetscher i W. Lesslauer ;(1993) Cell 73, 431-445]. Saglasno sa mutageneznim proučavanjima opisanim napred [C.R. Goh et al., isto] odgovarajuće petlje BB' i EF Uganda TNF/3 je nađeno da čine glavninu kontakata sa receptorom u razrešenoj kristalnoj strukturi TNFb:TNF-R55 kompleksa. Amino kiselinska sekvenca mišjeg OPG vezujućeg proteina je upoređena sa amino kiselinskim sekvencama TNFa i TNF/3. Regioni mišjeg OPG vezujućeg proteina koji odgovaraju BB' i EF petljama su predviđajuće bazirani na ovom upoređivanju i peptidi su označeni i opisan i niže. A. Antigen( i): Rekombinantni mišji OPG vezujući protein [158-316] je korišćen kao antigen (ag) za imunizaciju životinja kako je opisano niže, i serum će da bude ispitan uz korišćenje prilaza koji su opisani niže. Peptidi u navodnim BB' i EF petljama mišjeg OPG vezujućeg proteina su bili sintetisani i biće korišćeni za imunizaciju; tri peptida su: ;Peptidi sa karboksi-terminalnim cisteinskim ostatkom su bili korišćeni za konjugacju uz korišćenje prilaza koji su opisani odeljku B niže, i korišćeni su za imunizaciju. ;B. Keihol limpet hemocijanin ili goveđi serum ;Albuminska konju<g>acija: Odabrani peptidi ili proteinski fragmenti mogu da budu konjugovani u keihol limpet hemocijanin (KLH) u cilju povećanja njihove imunogeničnosti kod životinja. Takođe, goveđi serumski albuminski (BSA) konjugovani peptidi ili proteinski fragmenti mogu da budu korišćeni u EIA protokolu. Imdžekt maleimidno aktiviran KLH ili BSA (Pierce Chemical Companv, Rockford, IL) je rekonstituisan u dH20 do konačne koncentracije od 10 mg/ml. Peptidni ili proteinski fragmenti su rastvoreni u fosfatnom puferu i tada izmešani sa ekvivalentnom masom (g/g) KLH ili BSA. Konjugacija je ostavljena da reaguje tokom dva časa na sobnoj temperaturi (rt) uz blago mešanje. Rastvor je tada proveden preko desolirane kolone ili je dijaliziran na suprot PBS preko noći. Peptidni konjugat je odložen na 20°C do korišćenja u imunizacijama ili u EIAs. ;C. Imunizacija: Balb/c miševi (Charles River Laboratories, VVilmington, MA), Lou pacovi ili beli zečevi sa Novog zelanda će da budu podkožno injektirani (SQI) sa ag (50/xg, 150^gi 100ng,po istom redosledu) koji je emulziran u kompoletnom Freund-ovom ađuvantu (CFA, 50% zapr/zapr; Difco Laboratories, Detroit, MI). Zečevi su tada pobuđivani dva ili tri puta na intervale od dve sedmice sa antigenom koji je pripremljen na sličan način u ne-kompoletnom Freund-ovom ađuvantu (ICFA, Difco Laboratories, Detroit, MI). Miševi i pacovi su pobuđivani približno Četiri sedmice. Sedam dana posle drugog pobuđivanja, vršeno je testno krvarenje i serumski antitelni titri su određeni. Kada je titar razvijan kod zečeva, sedmično krvarenje od 50 ml je vršeno tokom šest uzastopnih sedmica. Odabrani su miševi i pacovi za proizvodnju hibridoma bazirano na serumskim titarskim nivoima; životinje sa polu-maksimalnim titrima većim od 5000 su korišćene. Podešavanja u ovom protokolu mogu da budu primenjena od strane stručnjaka u ovoj oblasti; na primer, razni tipovi imunomodulatora su sada dostupni i mogu da budu ugrađena u ovaj protokol; ;D. Enzimski- vezano imunosorbentno ispitivanje ( EIA) : ;EIAs ispitivanje će da bude izveden radi određivanja serumskih (ab) antitelnih titara individualnih životinja, i zatim za ispitivanje potencijalnih hibridoma. Ravnog dna, visoko vezujuće mikrotiracione ploče EIA/RIA sa 96 okaca (Costar Corporation, Cambridge, MA) će biti prevučene sa prečišćenim rekombinantnim proteinom ili proteinskim fragmentom (antigen, ag) pri 5pg/ mlu karbonat-bikarbonat puferu, pH 9,2 (0,015 M Na2C03, 0,035 M NaHC03). Proteinski fragmenti mogu da budu konjugovani u goveđem serumskom albuminu (BSA) ako je potrebno. Petnaestfđag će da bude dodato u svako okce. Ploče će tada da budu prekrivene sa acetatnim filmom (ICN Biochemicals, INC., Costa Mesa, CA) i inkubirane na sobnoj temperaturi (rt) na ljuljajućoj platformi tokom dva časa ili preko noći na 4°C. Ploče će da budu blokirane tokom 30 minuta na sobnoj temperaturi sa 250filpo okcu 5% BSA rastvora koji je dobijen pomoću mešanja jednog dela BSA razblaživač/blokirajući koncentrovan rastvor (Kirkegaarđ i Perry Laboratories, Inc., Gaithersburg, MD) sa jednim delom dejonizovane vode (dH20). Blokirajući rastvor je odbačen, 50 ( il seruma 2-puta razblaženog (1:100 do 1:12800) ili supernatanti hibridoma tkivne kulture će da budu dodati u svako okce. Serumski razblaživač je 1% BSA (10% BSA razblaživač/koncentrovani blokirajući rastvor razblažen 1:10 u Dulbecco-ovom fosfatno puferisanom slanom rastvoru, D-PBS; Gibco BRL, Grand Island, NY)) dok su supernatanti hibridoma testirani bez razblaživanja. U slučaju ispitivanja hibridoma, jedno okce je održavano kao konjugatna kontrola, a drugo okce kao pozitivna ab kontrola. Ploče su ponovo inkubirane na sobnoj temperaturi, uz mućkanje tokom jednog časa, tada su isprane 4 puta uz korišćenje 1 deo rastvora za ispiranje 20 delova koncentrata (Kirkegaarđ i Perry Laboratories Inc., Gaithersburg. MD) u dH20. Hrenova peroksidazaje konjugovana sekundarno ab (Boeringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis, IN) razblažena je u 1% BSA i tada je inkubirana u svakom okcu tokom 30 minuta. Ploče su isprane kao ranije, suvo mrljane, i ABTS peroksidazni jedno komponentni supstrat (Kirkegaarđ i Perry Laboratories, Inc., Gaithersburg, MD) je dodat. Absorbancija je očitavana na 405 nm za svako okce uz korišćenjeMicroplate EL30čitača (Bio-tek Instruments Inc., Winooski, VT). Polu-maksimalni titar serumskih antitela je izračunat crtanjem log serumskog razblaženja prema optičkoj gustini na 405, tada ekstrapolacijom na tački 50% maksimalne optičke gustine dobijene pomoću tog seruma. Hibridome su odabrane kao pozitivne ako je skor optičke gustine 5-to struko veći od gornje baze. Podešavanja u ovom protokolu mogu da budu primenjeni; na primer, konjugovano sekundarno antitelo može da bude odabrano za specifičnost ili ne-ukršenu reaktivnost. ;E. Ćelijska fuzija: Životinja koja je odabrana za proizvodnju hibridoma se intravenski injetira sa 50 do 100 fig ag u PBS. Četiri dana kasnije, životinja je ubijena pomoću ugljen dioksida i pod sterilnim uslovima uzeta joj je slezina u 35 mlDulbeccos' Modified Eagle' ssredine koja sadrži 200 U/ml penicilina G, 200 jig/ml streptomicin sulfata i 4 mM glutamina (2x P/S/G DMEM). Ovo se zatim prenese u sterilnuStomacherkesu (Tekmar, Cincinnati, OH) koja sadrži 10 ml 2x P/S/G DMEM i raskida se u jedno ćelijsku suspenziju saStomacher Lab Blender 80mešalicom (Seward Laboratorv UAC House; London, England). Kada se ćelije oslobode iz slezinske kapsule u sredinu uklone se iz kese i prenesu u sterilnu konusnu centrifugnu epruvetu ;(Becton Dickinson i Companv, Lincoln Prk, NJ). Sveža sredina se doda u kesu i postupak se nastavlja dok čitav ćelijski sadržaj slezine se ne oslobodi. Ovi splenociti se isperu tri puta pomoću centrifugiranja pri 225 x g tokom 10 minuta. ;Istovremeno, log faze kulture mielomnih ćelija, Sp2/0-Agl4 ili Y3-Agl.2.3 za miša ili pacova splenocitnih fuzija, po istom redosledu (American Type Culture Collection; Rockville, MD) raslih u kompletnoj sredini (DMEM, 10% neaktivirani fetalni goveđi serum, 2mM glutamin, 0,1 mM ne-esnecijalnih amino kiselina, 1 mM natrijum piruvata i 10 mM hepes pufera; Gibco Laboratories, Grand Island, NY) su isprani na sličan način. Splenociti su sjedinjeni sa mieloma ćelijama i peletirani su jednom ponovo. Sredina je isisana iz ćelijske pelete i 2ml polietilen glikola 1500 (PEG 1500; Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis, IN) se lagano umeša u ćelija tokom perioda od jednog minuta. Posle ovoga, ista zapremina 2x P/S/G DMEM-a je lagano dodata. ? Ćelije su ostavljene da se fuziraju na 37°C tokom dva minuta, tada se doda dodatnih 6 ml 2x P/S/G DMEM-a. Ćelije su ponovo stavljene na 37°C tokom tri minuta. Konačno, 35 ml 2x P/S/G DMEM-a je dodato u ćelijsku suspenziju, i ćelije su peletirane pomoću centrifugiranja. Sredina je isisana iz pelete i ćelije su lagano resuspendovane u kompletnu sredinu. Ćelije su raspoređene na ploče za kulture sa 96 okaca ravnog dna (Becton Dickinson Labware; Lincoln Park, NJ) pomoću pojedinačnih kapi iz pipete od 5 ml. Ploče su inkubirane preko noći u humidiziranim uslovima na 37°C i 5% C02. Sledećeg dana, ista zapremina selekcione sredine je dodata u svako okce. Selekcija se sastoji od 0,1 mM hipoksantana, 4 x IO"<4>mM aminopterina, i 1,6 x IO 2 mM timidina u kompletnoj sredini. Fuzione ploče su inkubirane tokom sedam dana što je praćeno sa dve promene sredine tokom sledeća tri dana; HAT selekciona sredina je korišćena posle svake promene sredine. Supernatanti tkivne kulture su uzimani 3 do 4 dana posle zadnje promene fluida iz svakog okca koji sadrži hibrid i testirani su pomoću EIA na specifičnu aktivnu reaktivnost. Ovaj protokol je modifikovan pomoćuHudson i Hay, " Practical Immunology,drugo izdanje" Blakwell Scientific Publications. ;Primer 12 ;Kloniranje receptora OPG vezujućeg proteina ekspresovanog u;hematopoietskim prekursorskim ćelijama;Biološki aktivni rekombinantni mišji OPG vezujući protein [158-316] je konjugovan u fluorescein-izotiocijanat (FITC) radi stvaranja fluorescentne probe. Fluorescentno obeležavanje je vršeno pomoću inkubacije rekombinatnog mišjeg OPG vezujećeg proteina [158-316] sa 6-fluorescein-5- (i 6) karboksiamido heksanoinske kiseline sukcinamidil estrom (Molecular Probes, Eugene, OR) pri 1:6 molarnom odnosu tokom 12 časova na 4°C. FITC-obeležen OPG vezujući protein [158-316] je dalje prečišćen pomoću gel filtracione hromatografije. Ćelije mišje koštane moždine su izolovane i inkubirane u kulturi u prisustvu CSF-1 i OPG vezujući protein [158-316] kao što je opisano u primeru 10. Ćelije mišje koštane moždine su kultivirane preko noći u CSF-1 (30 ng.ml) i OPG vezujućem proteinu [158-316] 20 ng/ml). Ne-prijanjajuće ćelije su uklonjene prvo i odložene su na led a preostale prijanjajuće ćelije su uklonjene pomoću inkubiranja sa puferom za disocijaciju ćelija (Sigma Chemicals, St. Luis, MO), sjedinjene su sa ne-prijanjajućom populacijom i tada su obojene sa FITC-OPG vezujućim proteinom kao što je opisano napred. Posle ispiranja i resuspendovanja u PBS sa 0,5% BSA, ćelije su izložene FTIC-OPG vezujućem proteinu, isprane su i su tada sortirane pomoću FACS. Populacija ćelija koje su bile pozitivne za bojenje sa FITC-OPG vezujućim proteinom je prikupljena i mRNA je izolovana kao što je opisano u primeru 2. Ovaj mRNA preparat je korišćen za dobijanje cDNA biblioteke uz praćenje procedura koje su opisane u primeru 2. ;cDNA biblioteka proizvedena iz ovog izvora je korišćena za neusmerenu EST sekvencionu analizu kao što je predhodno opisano u PCT publikaciji br. W097/23614 i u Simonet et al. (Cell 89, 309-319 (1997)). Uz korišćenje ovog postupka, 2,1 kb cDNAje detektovana koja kodira novi TNFR-sličan protein. Dug otvoren čitajući ram mišje ODAR cDNA kodira protein 625 amino kiselinskih ostataka i sadrži karakteristične odlike TNFR-sličnog proteina: hidrofobni signalni peptid je njegov N-terminus, četiri tandemske cistein-bogate ponavljajuće sekvence, hidrofobni transmembranski domen i citoplazmatični signalni domen. Homologija ovog proteina sa drugim članovima familije TNF receptora i njegova ekspresija u ćelijama koštane moždine koje vezuju FITC-obeleženi OPG vezujući protein sugerira da je to potencijalni receptor za TNF-sličan OPG vezujući protein. Ovaj protein je označan kao ODAR ili osteoklastne diferencijacije aktivacioni receptor. Nukleinska kiselinska sekvenca i predviđena amino kiselinska sekvenca za mišji ODAR je prikazana na slici 10. ;Nedavna analiza sekvenci u publici dostupnoj bazi podataka pokazuje da ovaj protein je mišji homolog humanog TNFR-sličnog proteina poznatog kao RANK (Anderson et al., Natura 390. 175-179 (1997)). ;Primer 13 ;Proizvodnja rekombinantnog ODAR proteina u ćelijama sisara;Solubilni ODAR ekstraćelijski domen fuziran na Fc region humanog IgG je proizveden uz korišćenje procedura za konstrukciju i ekspresiju Fc fuzionih proteina kao što je predhodno opisano u W097/23614 i u Simonet et al., supra. Radi nastajanja solubilnog ODAR proteina u ćelijama sisara, cDNA koja kodira ekstraćelijski domen mišjeg ODAR-a (amino kiseline 27-211) je amplificirana sa sledećim setom oligonukleotidnih primara: ;PCR reakcije su izvedene u zapremini od 50/zl sa jednom jedinicom otvorne DNA polimeraze (New England Biolabs) u 20 mM Tris-HCl pH 8,8, 10 mM KC1, 10 mM (NH4)2S04, 0,1% Triton-X100, 10fiMsvakog dNTP, 1/ jMsvakog primara i 10 ng ODAR cDNA templata. Reakcije su vršene na 94°C tokom 30 sekundi, na 55°C tokom 30 sekundi i na 72°C tokom jednog minuta, tokom ukupno 16 ciklusa. PCR fragment je izolovan pomoću elektroforeze. PCR fragment stvara Hind III restrikciono mesto na 5' kraju i Not I restrikciono mesto na 3' kraju. Hind III-Not I koji digestira PCR fragment je tada subkloniran u ramu u modifikovan pCEP4-Fc vektor u prednjoj IgG-71 sekvenci teškog lanca kao što je opisano predhodno u W097/23614 i u Simonet et al. supra). Uveden je linker koji kodira dve irelevantne amino kiseline koje obuhvataju spoj između ODAR ekstraćelijskog domena i IgG Fc regiona. ;Konstrukt je tada digestiran sa Nhe I i Hind III i zatim anilirani oligonukleotidni par koji kodira OPG signalni peptid (amino kiselina 1-21) je ubačen u ram: ;Linker koji kodira dve irelevantne amino kiseline je uveden između OPG signalnog peptida i ODAR sekvenci. Konačno nagrađen (ODAR-Fc/pCEP4) kodira fuzioni protein koji sadrži od amino terminusa do karboksi terminusa: OPG siganlni peptid (amino kiseline l-21)-linker (LvsLeu)-ODAR (amino kisleine 27-21 l)-linker (AlaAla)-humani IgG Fc. ;Konstrukt je transfektovan u 293-EBNA-l ćelije pomoću postupka kalcijum fosfata kao što je opisano (Ausubel et al., Curr. Prot. Mol. Biol. 1, 9.1.1-9.1.3 (1994). Transfektovane ćelije su tada selektirane u 200fig/ mlhigromicina (GibcoBRL) i nastale lek-rezistentn mase kultura su prikuljene radi sjedinjavanja. Ćelije su isprane u PBS jednom i tada su kultivirane u sredini bez seruma tokom 72 časova. Kondicionira sredina je prikupljena. ODAR-Fc fuzioni protein u sredini je detektovan pomoću analizewesternbojenja sa anti-humanim IgG Fc antitelom. ;Fc fuzioni protein je prečišćen pomoću Protein-A hromatografije na koloni (Pierce) uz korišćenje procedura preporučenih od strane proizvđača. Pedeset pmolova prečišćenog proteina je tada podvrgnuto analizi N-terminalne sekvence pomoću automatizovane Edmon degradacije kao što je uglavnom opisao Matsudaira et al (J. Biol. Chem. 262, 10-35 (1987)). Sledeća amino kiselinska sekvenca je očitana posle 10 ciklusa: ;Akativnost vezivanja za ODAR-Fc sa OPG vezujućim proteinom je ispitina pomoću imunofluoroscentnog bojenja transfekovatih COS-7 ćelijskih kultura kao što je opisano u primeru 2. COS-7 ćelije su lipofektovane sa 1/*g ekspresionog vektora koji sadrži DNA koja kodira mušji OPG vezujući protein. Posle 48 časova inkubacije, ćelije su tada inkubirane u PBS-FBS rastvoru koji sadrži 10 mg//il humanog IgG Fc, ODAR-Fc ili OPG-Fc protein na 4°C tokom jednog časa. Ćelije su tada isprane sa PBS dva puta i tada su inkubirane u PBS-FBS rastvoru koji sadrži 20/xg/ml FITC-obeleženog kozjeg anti-humanog IgG (Southern Biotech Associates) tokom sledećeg časa. Posle ispiranja sa PBS, ćelije su ispitane pomoću konfoklane mikroskopije (ACAS, Ultima, Insight Biomedical Imaging, Inc., Okemos, MI). ODAR-Fc i OPG-Fc se vezuju na OPGL
tarnsfektovane COS-7 ćelije (slika 11).
Primer 14
In vitrobiološka aktivnost rekombinantnog solubilnog ODAR- a
Sposobnost ODAR-a da inhibira stimulaciju osteoklastnog formiranja pomoću OPG vezujućeg proteina je ispitana u kulturi mišje koštine moždine u prisustvu CSF-1 (30 ng/ml) i OPG vezujućeg proteina (5 ng/ml). Procedure za korišćenje kultura mišje koštane moždine u proučavanju osteoklastnog sazrevanja su opisane u W097/23614 i u primeru 8. ODAR-Fc fuzioni protein koji je proizveden kao što je opisano u primeru 12 je dodat u koncentracijama od 65 do 1500 ng/ml. Formiranje osteoklasta je ispitano pomoću tartarat rezistentne alkalne fosfotazne (TRAP) citohemije i ispitivanja TRAP rastvora posle pet dana u kulturi.
Dozno zavisna inhibicija osteoklastnog formiranja pomoću ODAR-Fc fuzije je opažena kako pomoću citohemije tako i pomoću TRAP aktivnosti (slika 12). ODAR-Fc fuzioni protein je inhibirao osteoklastno formiranje sa ED50od oko 10-50 ng/ml.
Primer 15
In vivobiološka aktivnost rekombinantnog solubilnog ODAR- a
Mladi mužjaci BDF1 miševa koji brzo rastu starosti 3-4 cedmice su primali razne doze ODAR-Fc fuzionog proteina pomoću jednostruke dnevne injekcije u nosaču (PBS/0,1 % BSA) tokom Četiri dana. Miševi su ispitivani pomoću ozračivanja sa X-zracima na dan 5. Doze ODAR-Fc fuzionog proteina koje su korišćene su bile 0,5, 1,5 i 5 mg/kg/dan. Za svaki tretman, svi miševi u toj grupi i u kontrolnoj grupi koji su primili PBS/0,1 % BSA su ozračeni X zracima na jednom filmu. Proksimalni tibijalni metafizelni region je upoređivan između parova kontrolnih i tretiranih tibija i skoriran kao " +" ako tretirana tibija je gušća na osnovu vizuelnog ispitivanja u odnosu na kontrolnu koja daje skor 8 prikazan ovde niže. Arbitrarni skor od 5/8 je zahtevan za "pozitivan" rezultat. (Doza je u mg/kg/dan). (n=4).
Posle usmrćenja, desna tibija je uklonjena iz svake životinje i koštana gustina u proksimalnom tibijalnom metafizisu je merena pomoću periferne kvantitivne kompjuterizovane tomografije (pQCT) (Stratec, Germanv). Dva 0,5 mm poprečna preseka kosti, 1,5 mm i 2,0 mm od proksimalnog kraja tibije su analizirane (XMICE 5.2, Stratec, Germanv) radi određivanja ukupne mineralne gustine u metafizisu. Prag separacije mekog tkiva od 1500 je korišćen radi definisanja granice metafizalne kosti.
ODAR-Fc primena kod mladih miševa koji rastu inhibirala je koštanu resorpciju na rast proksimalne tibije što dovodi do porasta koštane gustine koja je vizuelno evidentna na radiografima. Radiografne promene su jasne pri dozi od 1,5 mg/kg/dan i višim u dva eksperimenta (tabela 1). Merenje koštane gustine pomoću pQCT u uzorcima iz drugog eksperimenta u sličnom regionu tibije je potvrdilo doza zavisno povećanje u koštanoj gustini kod ovih miševa (slika 13).
Mada je predemtni pronalazak opisan sa obzirom na poželjne realizacije jasno je da varijacije i modifikacije će biti činjene od strane stručnjaka u ovoj oblasti. Stoga, namera je bila da pridruženi zahtevi pokriju sve takve ekvivalentne varijacije koje ulaze u obim zahteva kako je dato u zahtevima.

Claims (35)

1. Izolovana nukelinska kiselina odabrana iz grupe koju čine: a) nukelinska kiselina koja kodira polipeptid na slici 1 (SEQ ID NO:2) ili slici 4 (SEQ ID NO:4); i b) nukleinska kiselina koja hibridizuje u komplementarnu nukleinsku kiselinu koja kodira protein na slici 1 (SEQ ID NO:2) ili slici 4 (SEQ ID NO:4) pod uslovima 5XSSPE, 50% formamid, 2X Denhardt'ov rastvor, 0.1% SDS i 100 ug/ml DNK sperme lososa u trajanju od 18-24 sati na 42°C i ostaje hibridizovana pod uslovima 2X SSC u trajanju od 10 min na sobnoj temperaturi, IX SSC u trajanju od 10 min na 50°C i 0.5X SSC u trajanju od 10 do 15 min., gde nukleinska kiselina kodira osteoprotegerin vezujući protein.
2. Nukelinska kiselina prema zahtevu 1, naznačena time, što je cDNK, genomska DNK, sintetička DNK ili RNK.
3. Nukleinska kiselina prema zahtevu 1, naznačena time, što sadrži jedan ili više kodona preferentnih za eksprimovanje Escherichia coli.
4. Nukelinska kiselina prema zahtevu 1, naznačena time, što je za nju vezana oznaka koja se može detektovati.
5. Nukleinska kiselina prema zahtevu 1, naznačena time, što kodira rastvorni osteoprotegerin vezujući protein.
6. Nukelinska kiselina prema zahtevu 5, naznačena time, što kodira polipeptid koji sadrži ostatke 70-316 kao na slici 1 (SEQ ID NO:2) ili ostatke 69-317 prikazane na slici 4 (SEQ ID NO:4).
7. Ekspresioni vektor, naznačen time, što sadrži nukleinsku kiselinu iz zahteva 1 ili 5.
8. Ćelija domaćin transformirana ili transfektovana sa ekspresionim vektorom iz zahteva 7.
9. Ćelija domaćin iz zahteva 8, naznačena time, što je to eukariotska ili prokariotska ćelija.
10 Ćelija domaćin iz zahteva 9, naznačena time, što je to Escherichia coli.
11. Postupak za proizvodnju osteoprotegerin vezujućeg proteina koji je kodiran nuklinskim kiselinama iz zahteva 1 ili 5, naznačen time, što obuhvata: pod stabilnim uslovima hranjenja, gajenje ćelija domaćina koje su transformisane ili transfektovane sa nukleinskim kiselinama iz zahteva 1 ili 5; i izolovanje polipeptidnog proizvoda ekspresije nukleinske kiseline
12. Izolovan osteoprotegerin vezujući protein čija je aminokiselinska sekvenca kao na slici 1 (SEQ ID NO:2) ili na slici 4 (SEQ ID NO:4).
13. Protein iz zahteva 12, naznačen time, što je to rastvoran osteoprotegerin vezujući protein.
14. Protein iz zahteva 13, naznačen time, što je kovalentno modifikovan polimerom rastvornim u vodi.
15. Proten iz zahteva 13, naznačen time, što je polimer, polietilen glikol.
16. Protein iz zahteva 13, naznačen time, što obuhvata aminokiselinsku sekvencu od ostataka 70-316, ili ostataka 75-316, ili ostataka 95-316, ili ostataka 107-316, ili ostataka 118-316, ili ostataka 128-316, ili ostataka 137-316, ili ostataka 146-316, ili ostataka 156-316, ili ostataka 158-316, ili ostataka 166-316, ili ostataka 168-316, kao što je dato na slici 1 (SEQ ID NO:2).
17. Protein iz zahteva 13 , naznačen time, što obuhvata aminokiselinsku sekvencu od ostataka 69-317, ili ostataka 140-317, ili ostataka 145-317, ili ostataka 158-317, ili ostataka 166-317 kao što je dato na slici 4 (SEQ ID NO:4).
18. Antitelo ili njegov fragment, naznačen time, što se specifično veže za osteoprotegerin vezujući protein SEQ ID NO:2 ili SEQ ID NO:4 ili njegov rastvorni oblik.
19. Antitelo iz zahteva 18, naznačeno time, stoje to monoklonalno antitelo.
20. Antitelo iz zahteva 18, naznačeno time, što je antitelo antagonist osteoprotegerin vezujućeg proteina koje smanjuje stvaranje osteoklasta.
21. Antitelo iz zahteva 18, naznačeno time, što sc antitelo vezuje za ekstracelularni domen osteoprotegerin vezujućeg proteina u SEQ ID NO.2 ili SEQ ID NO:4 ili za fragment ekstracelularnog domena osteprotegerin vezujućeg proteina u SEQ ID NO.2 ili SEQ ID NO:4.
22. Postupak za detektovanje prisustva osteoprotegerin vezujućeg proteina SEQ ID NO:2 ili SEQ ID NO:4 ili njegovog rastvornog oblika u biološkom uzorku, naznačen time, što obuhvata: inkubiranje uzorka sa antitelom iz zahteva 18 pod uslovima koju dozvoljavaju vezivanje antitela za osteoprotegerin vezujući protein; i detektovanje vezanog antitela.
23. Postupak za detektovanje prisustva osteoprotegerina u biološkom uzorku, naznačen time, što obuhvata: inkubiranje uzorka sa osteoprotegerin vezujućim proteinom SEQ ID NO:2 ili SEQ ID NO:4 ili njegovim rastvornim oblikom pod uslovima koji dozvoljavaju vezivanje proteina za osteoprotegerin; i merenje vezanog osteoprotegerin vezujućeg proteina.
24. Postupak za ispitivanje sposobnosti ispitivanog jedinjenja da veže osteoprotegerin vezujući protein SEQ ID NO:2 ili SEQ ID NO:4, naznačen time, što obuhvata: inkubiranje osteoprotegerin vezujućeg proteina sa ispitivanim jedinjenjem pod uslovima koji dozvoljavaju vezivanje; i merenje vezanog jedinjenja.
25 Postupak prema zahtevu 24, naznačen time, što obuhvata i merenje povećanja ili smanjenja aktivnosti osteoprotegerin vezujućeg proteina.
26 Postupak prema zahtevu 25, naznačen time, što je aktivnost merena stvaranjem ili maturacijom osteoklasta.
27. Postupak prema zahtevu 24, naznačen time, što je jedinjenje, agonist ili antagonist osteoprotegerin vezujućeg proteina.
28. Upotreba nukelinske kiseline komplementarne nukleinskim kiselinama kao što je dato na slici 1 (SEQ ID NO:l) ili slici 4 (SEQ ID NO:3) za dobijanje leka za regulaciju ekspresije osteoprotegerin vezujućeg proteina kod životinja.
29. Upotreba rastvornog oblika humanog receptora diferencijacije i aktivacije osteoklasta (ODAR) a dobijanje leka za prevenciju ili lečenje bolesti kostiju kod sisara.
30. Postupak za ispitivanje sposobnosti ispitivanog jedinjenja da poveća ili smanji vezivanje osteoprotegerin vezujućeg proteina SEQ ID NO:2 ili SEQ ID NO:4 ili njegovog rastvornog oblika za ODAR sa slike 10 (SEQ ID NO:43) ili humani ODAR ili njegov rastvorni oblik, naznačen time, što obuhvata: inkubiranje osteoprotegerin vezujućeg proteina, ODAR-a i po potrebi ispitivanog jedinjenja pod uslovima koji omogućavaju vezivanje osteoprotegerin vezujućeg proteina za ODAR; i merenje vezivanja osteoprotegerin vezujućeg proteina za ODAR u prisustvu ili odsustvu ispitivanog j edinj enj a.
31. Upotreba antitela ili njegovog fragmenta koji se vezuje za osteoprotegerin vezujući protein SEQ ID NO:4 za dobijanje leka za inhibiranje osteoklastogeneze ili resorpcije kostiju kod sisara.
32. Upotreba prema zahtevu 31, naznačena time, što se antitelo ili njegov fragment vezuje za ekstracelularni domen ili za fragment ekstracelularnog domena osteoprotegerin vezujućeg proteina.
33. Upotreba prema zahtevu 31, naznačena time, što je osteoklastogeneza ili resorpcija kostiju povezana sa oboljenjem kostiju odabranim od osteoporoze, osteomijelitisa, mperkalcemije, osteopenije nastale kao posledica operacije ili admisnitracijom steroida, Paget'ove bolesti, osteonekroze, gubitka koštane mase kao posledica reumatoidnog artritisa, periodontalnog gubitka koštane mase, osteopenije kao posledice imobilizacije, olabavljenja proteze i osteolitičke metastaze.
34. Upotreba prema zahtevu 31, naznačena time, što se antitelo ili njegov fragment vezuje za oblik osteoprotegerin vezujućeg proteina povezanog sa membranom.
35. Upotreba prema zahtevu 31, naznačena time, što se antitelo ili njegov fragment vezuje za rastvoran osteoprotegerin vezujući protein.
YUP-506/99A 1997-04-16 1998-04-15 Osteoprotegerin vezujući proteini i receptori RS50358B (sr)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
MEP-328/08A MEP32808A (en) 1997-04-16 1998-04-15 Osteoprotegerin binding proteins and receptors

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US08/842,842 US5843678A (en) 1997-04-16 1997-04-16 Osteoprotegerin binding proteins
US88085597A 1997-06-23 1997-06-23
US09/052,521 US6316408B1 (en) 1997-04-16 1998-03-30 Methods of use for osetoprotegerin binding protein receptors

Publications (2)

Publication Number Publication Date
YU50699A YU50699A (sh) 2000-10-30
RS50358B true RS50358B (sr) 2009-11-10

Family

ID=27126366

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
YUP-506/99A RS50358B (sr) 1997-04-16 1998-04-15 Osteoprotegerin vezujući proteini i receptori

Country Status (15)

Country Link
US (4) US6316408B1 (sr)
EP (1) EP2311955A3 (sr)
JP (2) JP2009001566A (sr)
KR (2) KR101328809B1 (sr)
CN (1) CN103990122B (sr)
CA (1) CA2706609A1 (sr)
CY (1) CY1108998T1 (sr)
GE (1) GEP20033002B (sr)
IL (1) IL132304A (sr)
LT (1) LTC0975754I2 (sr)
ME (2) ME00184B (sr)
NO (1) NO2010022I2 (sr)
PT (1) PT975754E (sr)
RO (1) RO122495B1 (sr)
RS (1) RS50358B (sr)

Families Citing this family (83)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IL117175A (en) * 1995-02-20 2005-11-20 Sankyo Co Osteoclastogenesis inhibitory factor protein
PT1114864E (pt) * 1996-12-13 2008-10-08 Schering Corp Antigénios de superfície de células de mamífero, reagentes relacionados
DE69740107D1 (de) 1996-12-23 2011-03-10 Immunex Corp Rezeptor aktivator von nf-kappa b, rezeptor is mitglied der tnf rezeptor superfamilie
ES2263204T5 (es) * 1997-04-15 2013-10-14 Daiichi Sankyo Company, Limited Nueva proteína y proceso para producir la misma
ES2284203T5 (es) 1997-04-16 2016-03-11 Amgen Inc. Proteínas de unión a osteoprotegerina y sus receptores
US6316408B1 (en) * 1997-04-16 2001-11-13 Amgen Inc. Methods of use for osetoprotegerin binding protein receptors
AU762574B2 (en) * 1998-05-14 2003-06-26 Immunex Corporation Method of inhibiting osteoclast activity
US6540722B1 (en) 1999-12-30 2003-04-01 Advanced Cardiovascular Systems, Inc. Embolic protection devices
US20030103978A1 (en) * 2000-02-23 2003-06-05 Amgen Inc. Selective binding agents of osteoprotegerin binding protein
WO2002024896A2 (en) * 2000-09-22 2002-03-28 Immunex Corporation Screening assays for agonists or antagonists of receptor activat or of nf-kb
EP1365769B1 (en) * 2001-02-06 2011-01-26 The Sydney Children's Hospitals Network (Randwick and Westmead) (incorporating The Royal Alexandra Hospital for Children) A drug for the treatment of osteonecrosis and for the management of patients at risk of developing osteonecrosis
WO2002064782A2 (en) * 2001-02-09 2002-08-22 Maxygen Holdings Ltd. Rank ligand-binding polypeptides
US20040132971A1 (en) * 2001-02-09 2004-07-08 Haaning Jesper Mortensen Rank ligand-binding polypeptides
MXPA03011270A (es) * 2001-06-06 2004-03-18 Immunex Corp Uso de antagonistas rank para tratar cancer.
EP2295081B1 (en) * 2001-06-26 2018-10-31 Amgen Inc. Antibodies to OPGL
US6638294B1 (en) 2001-08-30 2003-10-28 Advanced Cardiovascular Systems, Inc. Self furling umbrella frame for carotid filter
US6592606B2 (en) 2001-08-31 2003-07-15 Advanced Cardiovascular Systems, Inc. Hinged short cage for an embolic protection device
US8262689B2 (en) 2001-09-28 2012-09-11 Advanced Cardiovascular Systems, Inc. Embolic filtering devices
US20030109444A1 (en) * 2001-10-12 2003-06-12 Jonathan Lam Bone anti-resorptive compounds
US7241304B2 (en) 2001-12-21 2007-07-10 Advanced Cardiovascular Systems, Inc. Flexible and conformable embolic filtering devices
US7381792B2 (en) * 2002-01-04 2008-06-03 Xencor, Inc. Variants of RANKL protein
US20030166559A1 (en) * 2002-01-04 2003-09-04 Desjarlais John R. Dominant negative proteins and methods thereof
US20040170602A1 (en) * 2002-01-04 2004-09-02 Desjarlais John R. Dominant negative proteins and methods thereof
US7718776B2 (en) 2002-04-05 2010-05-18 Amgen Inc. Human anti-OPGL neutralizing antibodies as selective OPGL pathway inhibitors
US7172614B2 (en) 2002-06-27 2007-02-06 Advanced Cardiovascular Systems, Inc. Support structures for embolic filtering devices
US7259143B2 (en) * 2002-09-05 2007-08-21 Wisconsin Alumni Research Foundation Method of extending the dose range of vitamin D compounds
US20080249068A1 (en) * 2002-09-05 2008-10-09 Deluca Hector F Method of Extending the Dose Range of Vitamin D Compounds
US7331973B2 (en) 2002-09-30 2008-02-19 Avdanced Cardiovascular Systems, Inc. Guide wire with embolic filtering attachment
JP2006521084A (ja) * 2002-12-10 2006-09-21 シェーリング−プラウ・リミテッド イヌｒａｎｋｌならびにイヌｒａｎｋｌを調製および使用するための方法
US7344716B2 (en) * 2003-05-13 2008-03-18 Depuy Spine, Inc. Transdiscal administration of specific inhibitors of pro-inflammatory cytokines
US8361467B2 (en) * 2003-07-30 2013-01-29 Depuy Spine, Inc. Trans-capsular administration of high specificity cytokine inhibitors into orthopedic joints
US8895540B2 (en) 2003-11-26 2014-11-25 DePuy Synthes Products, LLC Local intraosseous administration of bone forming agents and anti-resorptive agents, and devices therefor
BRPI0519008A2 (pt) 2004-12-13 2008-12-23 Evogenix Ltd proteÍnas variantes de osteoprotegerina
TW200736277A (en) * 2005-11-14 2007-10-01 Amgen Inc RANKL antibody-PTH/PTHrP chimeric molecules
US20080107597A1 (en) * 2006-01-12 2008-05-08 Anaptys Biosciences, Inc. Isolation of antibodies that cross-react and neutralize rankl originating from multiple species
US8101564B2 (en) * 2006-05-03 2012-01-24 Trustees Of The University Of Pennsylvania Methods for regulating osteoclast differentiation and bone resorption using LRRc17
WO2008088594A2 (en) * 2007-01-12 2008-07-24 Anaptysbio, Inc. Isolation of antibodies that cross-react and neutralize rankl orginating from multiple species
US8216209B2 (en) 2007-05-31 2012-07-10 Abbott Cardiovascular Systems Inc. Method and apparatus for delivering an agent to a kidney
US20100260680A1 (en) * 2007-06-05 2010-10-14 Oriental Yeast Co., Ltd. Novel bone mass increasing agent
US20090162351A1 (en) * 2007-12-21 2009-06-25 Depuy Spine, Inc. Transdiscal administration of inhibitors of p38 MAP kinase
US8986696B2 (en) * 2007-12-21 2015-03-24 Depuy Mitek, Inc. Trans-capsular administration of p38 map kinase inhibitors into orthopedic joints
EP3517630B1 (en) 2010-10-06 2022-01-19 Institució Catalana de Recerca i Estudis Avançats Method for the diagnosis, prognosis and treatment of breast cancer metastasis
US20140127192A1 (en) * 2011-04-19 2014-05-08 Amgen Inc Method for treating osteoporosis
GB201118840D0 (en) 2011-11-01 2011-12-14 Univ Sheffield Pulmonary hypertension II
EP2650682A1 (en) 2012-04-09 2013-10-16 Fundació Privada Institut de Recerca Biomèdica Method for the prognosis and treatment of cancer metastasis
EP3467124A1 (en) 2012-06-06 2019-04-10 Fundació Institut de Recerca Biomèdica IRB (Barcelona) Method for the diagnosis, prognosis and treatment of lung cancer metastasis
KR101872965B1 (ko) 2012-10-12 2018-06-29 인바이오모션 에스.엘. Ｃ―ｍａｆ를 이용하는 전립선암 전이의 진단, 예후 및 치료 방법
US10119171B2 (en) 2012-10-12 2018-11-06 Inbiomotion S.L. Method for the diagnosis, prognosis and treatment of prostate cancer metastasis
UY35148A (es) 2012-11-21 2014-05-30 Amgen Inc Immunoglobulinas heterodiméricas
WO2014184679A2 (en) 2013-03-15 2014-11-20 Inbiomotion S.L. Method for the prognosis and treatment of renal cell carcinoma metastasis
JP6577873B2 (ja) 2013-03-15 2019-09-18 フンダシオ、インスティトゥト、デ、レセルカ、ビオメディカ（イエレベ、バルセロナ）Ｆｕｎｄａｃｉｏ Ｉｎｓｔｉｔｕｔ Ｄｅ Ｒｅｃｅｒｃａ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａ （Ｉｒｂ Ｂａｒｃｅｌｏｎａ） がんの転移の予後診断および処置のための方法
US9708375B2 (en) 2013-03-15 2017-07-18 Amgen Inc. Inhibitory polypeptides specific to WNT inhibitors
EP3041863A4 (en) 2013-09-05 2017-08-16 Amgen Inc. Fc-containing molecules exhibiting predictable, consistent, and reproducible glycoform profiles
TR201907389T4 (tr) 2013-10-09 2019-06-21 Fundacio Inst De Recerca Biomedica Irb Barcelona Meme kanserinden kaynaklanan metastazlı kemik kanserinin prognozu ve tedavisine yönelik yöntem.
US10373702B2 (en) * 2014-03-27 2019-08-06 Massachusetts Institute Of Technology Water-soluble trans-membrane proteins and methods for the preparation and use thereof
ES3055185T3 (en) 2014-03-28 2026-02-10 Univ Duke Treatment of an estrogen receptor positive breast cancer using a selective estrogen receptor modulator
US10156562B2 (en) 2014-05-16 2018-12-18 Amgen Inc. Assay for detecting Th1 and Th2 cell populations
US9616114B1 (en) 2014-09-18 2017-04-11 David Gordon Bermudes Modified bacteria having improved pharmacokinetics and tumor colonization enhancing antitumor activity
KR20170093182A (ko) 2014-12-11 2017-08-14 인바이오모션 에스.엘. 인간 c-maf에 대한 결합 구성원
KR20250152679A (ko) 2015-04-29 2025-10-23 래디어스 파마슈티컬스, 인코포레이티드 암을 치료하는 방법
US10676723B2 (en) 2015-05-11 2020-06-09 David Gordon Bermudes Chimeric protein toxins for expression by therapeutic bacteria
AU2017271385B2 (en) 2016-05-25 2023-10-05 Inbiomotion S.L. Therapeutic treatment of breast cancer based on c-MAF status
MX389702B (es) 2016-06-22 2025-03-20 Ellipses Pharma Ltd Compuestos para usarse en el tratamiento de cancer de mama que expresa el receptor de androgenos (ar+).
US11180535B1 (en) 2016-12-07 2021-11-23 David Gordon Bermudes Saccharide binding, tumor penetration, and cytotoxic antitumor chimeric peptides from therapeutic bacteria
US11129906B1 (en) 2016-12-07 2021-09-28 David Gordon Bermudes Chimeric protein toxins for expression by therapeutic bacteria
JP7481115B2 (ja) 2017-01-05 2024-05-10 ラジウス ファーマシューティカルズ，インコーポレイテッド Ｒａｄ１９０１－２ｈｃｌの多形性形態
US11680101B2 (en) 2017-01-27 2023-06-20 Kymab Limited Anti-OPG antibodies
CA3056011A1 (en) 2017-03-14 2018-09-20 Amgen Inc. Control of total afucosylated glycoforms of antibodies produced in cell culture
MX2020005182A (es) 2017-11-22 2020-08-17 Inbiomotion Sl Tratamiento terapeutico del cancer de mama basado en el estado del c-maf.
US12325737B2 (en) 2018-03-26 2025-06-10 Amgen Inc. Total afucosylated glycoforms of antibodies produced in cell culture
MX2020013713A (es) 2018-07-04 2021-03-02 Radius Pharmaceuticals Inc Formas polimorficas de rad1901-2hcl.
TWI679439B (zh) * 2018-10-01 2019-12-11 緯穎科技服務股份有限公司 電源管理系統及電源管理方法
EP3924328A1 (en) 2019-02-12 2021-12-22 Radius Pharmaceuticals, Inc. Processes and compounds
BR112022005583A2 (pt) 2019-09-26 2022-09-20 Amgen Inc Métodos para a produção de composições de anticorpos
EP4110371A1 (en) 2020-01-24 2023-01-04 Radius Health, Inc. Methods of stimulating bone growth with abalopartide and denosumab
US20230273126A1 (en) 2020-06-04 2023-08-31 Amgen Inc. Assessment of cleaning procedures of a biotherapeutic manufacturing process
KR20230087539A (ko) 2020-10-15 2023-06-16 암젠 인크 항체 생산 방법에서의 상대적인 비결합 글리칸
EP4352094A1 (en) 2021-06-07 2024-04-17 Amgen Inc. Using fucosidase to control afucosylation level of glycosylated proteins
US20250076309A1 (en) 2021-10-05 2025-03-06 Amgen Inc. Fc-gamma receptor ii binding and glycan content
WO2023215725A1 (en) 2022-05-02 2023-11-09 Fred Hutchinson Cancer Center Compositions and methods for cellular immunotherapy
AU2024256160A1 (en) 2023-04-20 2025-10-02 Amgen Inc. Methods of determining relative unpaired glycan content
WO2025038600A1 (en) 2023-08-14 2025-02-20 Amgen Inc. Methods for reducing yellow color
WO2025101820A1 (en) 2023-11-08 2025-05-15 Fred Hutchinson Cancer Center Compositions and methods for cellular immunotherapy

Family Cites Families (80)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US595524A (en) * 1897-12-14 William clough
US4179337A (en) 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
US4816567A (en) * 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4710457A (en) * 1983-06-29 1987-12-01 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Monoclonal antibody for human hematopoietic glycoproteins and method
US4710473A (en) * 1983-08-10 1987-12-01 Amgen, Inc. DNA plasmids
EP0192658A4 (en) 1984-07-30 1987-07-13 Salk Inst For Biological Studi RETROVIRAL GENE TRANSFER VECTORS.
US4959314A (en) * 1984-11-09 1990-09-25 Cetus Corporation Cysteine-depleted muteins of biologically active proteins
US6410516B1 (en) * 1986-01-09 2002-06-25 President & Fellows Of Harvard College Nuclear factors associated with transcriptional regulation
US5846534A (en) * 1988-02-12 1998-12-08 British Technology Group Limited Antibodies to the antigen campath-1
JP2877509B2 (ja) 1989-05-19 1999-03-31 アムジエン・インコーポレーテツド メタロプロテイナーゼ阻害剤
WO1993012227A1 (en) 1991-12-17 1993-06-24 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
WO1992009697A1 (en) * 1990-11-30 1992-06-11 Celtrix Laboratories, Inc. USE OF A BONE MORPHOGENETIC PROTEIN IN SYNERGISTIC COMBINATION WITH TGF-β FOR BONE REPAIR
US5118667A (en) * 1991-05-03 1992-06-02 Celtrix Pharmaceuticals, Inc. Bone growth factors and inhibitors of bone resorption for promoting bone formation
CA2068389A1 (en) 1991-05-13 1992-11-14 Masahiko Sato Method for inhibiting bone resorption
MX9204303A (es) * 1991-07-23 1993-11-01 Rhone Poulenc Rorer Int Factor regulador del crecimiento de osteoclasto.
IL99120A0 (en) 1991-08-07 1992-07-15 Yeda Res & Dev Multimers of the soluble forms of tnf receptors,their preparation and pharmaceutical compositions containing them
US5961974A (en) * 1991-10-25 1999-10-05 Immunex Corporation Monoclonal antibodies to CD40 ligand, pharmaceutical composition comprising the same and hybridomas producing the same
US5447851B1 (en) * 1992-04-02 1999-07-06 Univ Texas System Board Of Dna encoding a chimeric polypeptide comprising the extracellular domain of tnf receptor fused to igg vectors and host cells
ATE188610T1 (de) 1992-04-30 2000-01-15 Amgen Inc Methoden zur behandlung von interleukin- 1 und - tumor - nekrose - faktor - verursachten krankheiten
US5585479A (en) * 1992-07-24 1996-12-17 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Antisense oligonucleotides directed against human ELAM-I RNA
US5578569A (en) * 1993-03-12 1996-11-26 Tam; Cherk S. Method of increasing bone growth
US5457035A (en) * 1993-07-23 1995-10-10 Immunex Corporation Cytokine which is a ligand for OX40
ATE202571T1 (de) * 1993-09-14 2001-07-15 Merck & Co Inc Humane protein-tyrosinphosphatase decodierende cdna
US6268212B1 (en) 1993-10-18 2001-07-31 Amgen Inc. Tissue specific transgene expression
US5641747A (en) * 1994-07-25 1997-06-24 Temple University-Of The Commonwealth System Of Higher Education Treatment of osteopetrotic diseases
JP4046349B2 (ja) 1994-11-07 2008-02-13 ヒューマン ジノーム サイエンシーズ， インコーポレイテッド 腫瘍壊死因子−γ
AU4440496A (en) 1995-02-10 1996-08-22 Smithkline Beecham Corporation Use of src SH2 specific compounds to treat a bone resorption disease
IL117175A (en) 1995-02-20 2005-11-20 Sankyo Co Osteoclastogenesis inhibitory factor protein
US6001349A (en) 1995-02-22 1999-12-14 Therion Biologics Corporation Generation of human cytotoxic T-cells specific for carcinoma self-associated antigens and uses thereof
WO1996028546A1 (en) 1995-03-15 1996-09-19 Human Genome Sciences, Inc. Human tumor necrosis factor receptor
US20030166097A1 (en) * 1995-03-15 2003-09-04 Human Genome Sciences, Inc. Human tumor necrosis factor receptor
US7094564B1 (en) * 1995-03-15 2006-08-22 Human Genome Sciences, Inc. Human tumor necrosis factor receptor
JPH11507205A (ja) 1995-04-27 1999-06-29 ヒューマン・ジェノム・サイエンシズ・インコーポレイテッド ヒト腫瘍壊死因子受容体
US5843901A (en) * 1995-06-07 1998-12-01 Advanced Research & Technology Institute LHRH antagonist peptides
AU5985996A (en) 1995-06-07 1997-01-15 Osteosa Inc. Osteoclast growth regulatory factor
AU6090896A (en) 1995-06-07 1997-01-15 Osteosa Inc. Osteoclast growth regulatory factor
DK1666591T3 (da) 1995-06-29 2011-05-23 Immunex Corp Cytokin der inducerer apoptose
US6369027B1 (en) 1995-12-22 2002-04-09 Amgen Inc. Osteoprotegerin
US6613544B1 (en) * 1995-12-22 2003-09-02 Amgen Inc. Osteoprotegerin
US6046048A (en) * 1996-01-09 2000-04-04 Genetech, Inc. Apo-2 ligand
US5981220A (en) * 1996-03-27 1999-11-09 Human Genome Sciences, Inc. Epidermal differentiation factor
TW555765B (en) 1996-07-09 2003-10-01 Amgen Inc Low molecular weight soluble tumor necrosis factor type-I and type-II proteins
JPH1057071A (ja) 1996-08-19 1998-03-03 Snow Brand Milk Prod Co Ltd 新規ｄｎａ及びそれを用いた蛋白質の製造方法
PT1114864E (pt) 1996-12-13 2008-10-08 Schering Corp Antigénios de superfície de células de mamífero, reagentes relacionados
FR2757507B1 (fr) 1996-12-20 1999-01-29 Inst Francais Du Petrole Procede de separation de paraxylene comprenant une adsorption avec injection d'eau et une cristallisation
WO1998028423A2 (en) 1996-12-20 1998-07-02 Board Of Regents, The University Of Texas System Compositions and methods of use for osteoclast inhibitory factors
US6271349B1 (en) * 1996-12-23 2001-08-07 Immunex Corporation Receptor activator of NF-κB
DE69740107D1 (de) 1996-12-23 2011-03-10 Immunex Corp Rezeptor aktivator von nf-kappa b, rezeptor is mitglied der tnf rezeptor superfamilie
ES2263204T5 (es) * 1997-04-15 2013-10-14 Daiichi Sankyo Company, Limited Nueva proteína y proceso para producir la misma
US6316408B1 (en) * 1997-04-16 2001-11-13 Amgen Inc. Methods of use for osetoprotegerin binding protein receptors
ES2284203T5 (es) 1997-04-16 2016-03-11 Amgen Inc. Proteínas de unión a osteoprotegerina y sus receptores
US5843678A (en) * 1997-04-16 1998-12-01 Amgen Inc. Osteoprotegerin binding proteins
CA2229449A1 (en) * 1997-04-25 1998-10-25 Takeda Chemical Industries, Ltd. Novel receptor protein and its use
CA2288351A1 (en) 1997-05-01 1998-11-05 Amgen Inc. Chimeric opg polypeptides
AU7705098A (en) * 1997-05-29 1998-12-30 Human Genome Sciences, Inc. Human tumor necrosis factor receptor-like protein 8
JPH119269A (ja) 1997-06-19 1999-01-19 Kaken Pharmaceut Co Ltd 破骨細胞系細胞
US6087555A (en) 1997-10-15 2000-07-11 Amgen Inc. Mice lacking expression of osteoprotegerin
US7063960B2 (en) * 1997-12-12 2006-06-20 The Rockefeller University Protein belonging to the TNF superfamily involved in signal transduction, nucleic acids encoding same, and methods of use thereof
WO1999029865A2 (en) 1997-12-12 1999-06-17 The Rockefeller University A protein belonging to the tnf superfamily, nucleic acids encoding same, and methods of use thereof
US6790823B1 (en) 1998-04-23 2004-09-14 Amgen Inc. Compositions and methods for the prevention and treatment of cardiovascular diseases
AU762574B2 (en) 1998-05-14 2003-06-26 Immunex Corporation Method of inhibiting osteoclast activity
HUP0102782A3 (en) 1998-06-19 2002-12-28 Smithkline Beecham Corp Salycilanilide as inhibitors of transcription factor nf-kb
HUP0102492A2 (hu) 1998-06-19 2001-11-28 Smithkline Beecham Corp. Amino-indanon származékok alkalmazása NF-kB transzkripciós faktor inhibitor hatású gyógyszerkészítmények előállítására
HUP0103578A3 (en) * 1998-09-15 2005-11-28 Pharmexa As Method for down-regulating osteoprotegerin ligand activity
AU6078500A (en) 1999-07-09 2001-01-30 Amgen, Inc. Combination therapy for conditions leading to bone loss
US20030144187A1 (en) 1999-09-03 2003-07-31 Colin R. Dunstan Opg fusion protein compositions and methods
IL142900A0 (en) 1999-09-03 2002-04-21 Amgen Inc Compositions and methods for the prevention or treatment of cancer and bone loss associated with cancer
AUPQ314799A0 (en) 1999-09-29 1999-10-21 University Of Western Australia, The Bone cell factor
SI1257648T2 (sl) 2000-02-23 2016-11-30 Amgen Inc. Antagonistični selektivni vezavni agensi za osteoprotegerin vezavni protein
US20030103978A1 (en) * 2000-02-23 2003-06-05 Amgen Inc. Selective binding agents of osteoprotegerin binding protein
WO2002016551A2 (en) 2000-08-18 2002-02-28 University Of Massachusetts Medical Center Trance regulation of chondrocyte differentiation
AU2001288342A1 (en) 2000-08-21 2002-03-04 Smith Kline Beecham Corporation Anti-rank ligand monoclonal antibodies useful in treatment of rank ligand mediated disorders
WO2002024896A2 (en) * 2000-09-22 2002-03-28 Immunex Corporation Screening assays for agonists or antagonists of receptor activat or of nf-kb
CA2447518A1 (en) * 2001-05-17 2002-11-21 Immunex Corporation Therapeutic use of rank antagonists
MXPA03011270A (es) * 2001-06-06 2004-03-18 Immunex Corp Uso de antagonistas rank para tratar cancer.
EP2295081B1 (en) * 2001-06-26 2018-10-31 Amgen Inc. Antibodies to OPGL
US7084257B2 (en) * 2001-10-05 2006-08-01 Amgen Inc. Fully human antibody Fab fragments with human interferon-gamma neutralizing activity
US7183069B2 (en) 2002-03-07 2007-02-27 Toyama University Reagent, method and apparatus for measuring amylase activity
US7718776B2 (en) * 2002-04-05 2010-05-18 Amgen Inc. Human anti-OPGL neutralizing antibodies as selective OPGL pathway inhibitors
US7504586B2 (en) 2002-11-27 2009-03-17 Yazaki Corporation Cable and cable identificating method

Also Published As

Publication number Publication date
US20030100488A1 (en) 2003-05-29
GEP20033002B (en) 2003-06-25
YU50699A (sh) 2000-10-30
US20050003400A1 (en) 2005-01-06
IL132304A (en) 2015-07-30
JP2009001566A (ja) 2009-01-08
PT975754E (pt) 2007-08-20
ME00184B (me) 2010-10-10
US7807795B2 (en) 2010-10-05
LTPA2010013I1 (lt) 2021-05-25
CA2706609A1 (en) 1998-10-22
EP2311955A2 (en) 2011-04-20
CN103990122A (zh) 2014-08-20
EP2311955A3 (en) 2012-12-12
KR20120108046A (ko) 2012-10-04
LTC0975754I2 (lt) 2022-03-25
KR101314478B1 (ko) 2014-01-17
KR20010006405A (ko) 2001-01-26
KR101328809B1 (ko) 2014-01-17
US6316408B1 (en) 2001-11-13
NO2010022I1 (no) 2011-01-10
MEP32808A (en) 2010-10-10
CY1108998T1 (el) 2014-07-02
NO2010022I2 (no) 2015-03-30
RO122495B1 (ro) 2009-07-30
US7097834B1 (en) 2006-08-29
CN103990122B (zh) 2017-01-04
JP2013028622A (ja) 2013-02-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RS50358B (sr) Osteoprotegerin vezujući proteini i receptori
AU779461B2 (en) Osteoprotegerin binding proteins and receptors
AU2011202547B2 (en) Osteoprotegerin binding proteins and receptors
HK1022330B (en) Osteoprotegerin binding proteins and receptors
MXPA99009387A (en) Osteoprotegerin binding proteins and receptors