RS50372B - Infektivni klonovi - Google Patents

Infektivni klonovi

Info

Publication number
RS50372B
RS50372B YUP-375/02A YUP37502A RS50372B RS 50372 B RS50372 B RS 50372B YU P37502 A YUP37502 A YU P37502A RS 50372 B RS50372 B RS 50372B
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
virus
sequences
infectious
given
cdna
Prior art date
Application number
YUP-375/02A
Other languages
English (en)
Inventor
Luis ENJUANES SANCHEZ
Original Assignee
Consejo Superior De Investigaciones Cientificas,
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=8310818&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=RS50372(B) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Consejo Superior De Investigaciones Cientificas, filed Critical Consejo Superior De Investigaciones Cientificas,
Publication of YU37502A publication Critical patent/YU37502A/sh
Publication of RS50372B publication Critical patent/RS50372B/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/215—Coronaviridae, e.g. avian infectious bronchitis virus
    • A61K39/225—Porcine transmissible gastroenteritis virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5256—Virus expressing foreign proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
    • A61K2039/541—Mucosal route
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/20011—Coronaviridae
    • C12N2770/20034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/20011—Coronaviridae
    • C12N2770/20041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2770/20043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/20011—Coronaviridae
    • C12N2770/20061—Methods of inactivation or attenuation
    • C12N2770/20062—Methods of inactivation or attenuation by genetic engineering
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/20—Pseudochromosomes, minichrosomosomes
    • C12N2800/204—Pseudochromosomes, minichrosomosomes of bacterial origin, e.g. BAC
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/80—Vectors containing sites for inducing double-stranded breaks, e.g. meganuclease restriction sites

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

Postupak za dobijanje DNK koja sadrži sekvence izveciene od genomske RNK (gRNK) korona virusa gde date sekvence imaju najmanje 60% homologije sa prirodnim sekvencama virusa i koje kodiraju RNK polimerazu zavisnu od RNK i najmanje jedan strukturni ili nestrukturni protein, gde fragment date DNK može da se transkribuje u RNK i upakuje u virion, naznačen time, što obuhvata korake u kojima se interferentni defektni genom korona virusa klonira pod ekspresijom promotora u veštački bakterijski hromozom (BAC) i deletirane sekvence defektnog genoma se ponovo ubacuju u dati genom. Prijava sadrži još 4 nezavisna i 13 zavisnih patentnih zahteva.

Description

OBLAST PRONALASKA
Ovaj pronalazak se odnosi na postupke pripremanja DNK ili RNK, nukleinskih kiselina koje se mogu dobiti ovim postupkom, kao i na njihovu upotrebu kao vakcina i za gensku terapiju.
OSNOVA PRONALASKA
Dostignuća u tehnologiji rekombinantne DNK vodila su ka napretku u razvoju transfera gena među organizmima. Trenutno se čine veliki napori da bi se proizveli hemijski, farmaceutski i biološki proizvodi od ekonomskog i komercijalnog značaja i to kroz upotrebu tehnika transfera gena.
Jedan od ključnih elemenata u genetskoj manipulaciji i prokariotskih i eukariotskih ćelija je razvoj vektora i vektor-domaćin sistema. Uopšteno, vektor je molekul nukleinske kiseline koji je sposoban da se replicira ili eksprimira u ćeliji domaćinu. Vektor-domaćin sistem se može definisati kao ćelija domaćina koja nosi vektor i dozvoljava da se genetička informacija koju nosi replicira i eksprimira.
Vektori su razvijeni od virusa koji imaju DNK, kao i od onih koji imaju RNK genome. Virusni vektori dobijeni od DNK virusa koja se replicira u jedru ćelije domaćina imaju nepoželjnu osobinu u vidu integrisanja u genom date ćelije, tako da u opštem slučaju nisu veoma bezbedni. Nasuprot tome, virusni vektori dobijeni od RNK virusa, koji se repliciraju u citoplazmi ćelije domaćina, sigurniji su od onih baziranih na DNK virusima, s obzirom da se replikacija odigrava preko RNK izvan jedra. Prema tome, malo je verovatno da se ovi vektori integrišu u genom ćelije domaćina.
cDNK klonovi su dobijeni od virusa sa jednostrukim lancem RNK sa pozitivnim polaritetom [ssRNK(+)], na primer, picomavirus (Racaniello & Baltimore, 1981); bromovirus (Ahlguist et al., 1984); alphavirus, rod koji obuhvata Sindbis virus; Semliki Forest virus (SFV) i virus Venecuelanskog ericefalitisa konja (VEE) (Rice et al., 1987; Liljestrom and Garoff, 1991; Frolov et al., 1996; Smerdou and Liljestrom, 1999); flavivirus i pestivirus (Rice and Strauss, 1981; Lai et al., 1991; Rice et al., 1989); i virusi familije Astroviridae (Geigen-muller et al., 1997). Slično tome, vektori za ekspresiju heterolognih gena su razvijeni od klonova DNK koja je komplementarna genomu ssRNK(+) virusa, na primer alphavirus, uključujući Sindbis virus, Semliki Forest virus (SFV) i virus Venecuelanskog encefalitisa konja (VEE) (Frolov et al., 1996; Liljestrom, 1994; Pushko et al., 1997). Međutim, sve postupke za pripremanje rekombinantnih virusa od RNK virusa čini dodatno komplikovanim činjenica da većina virusa sadrži sekvence koje su toksične za bakterije. Pripremanje cDNK viralne RNK i subkloniranje cDNK u bakterije stoga često vodi ka deleciji ili rearanžmanu DNK sekvenci kod bakterijskog domaćina. U ovu svrhu većina uobičajeno korišcenih subklonirajućih i ekspresionih vektora se ne može upotrebiti za pripremanje velikih DNK delova dobijenih od rekombinantnih RNK virusa. Međutim, dobijanje vektora, koji mogu da nose dugačke strane DNK sekvence neophodno je za više aspekata u razvoju farmaceutskih preparata, posebno vakcina.
Korona virus-i su ssRNK(+) virusi koji imaju najveći poznati genom za RNK virus, sa dužinom između oko 25 i 31 kilobaze (kb) (Siddell, 1995; Lai & Cavanagh, 1997; Enjuanes et al., 1998). Tokom infekcije korona virus-om, genomska RNK (gRNK) se replicira i sintetiše se grupa subgenomskih RNK (sgRNK) pozitivnog i negativnog polariteta (Sethna et al., 1989; Sawicki and Sawicki, 1990; van der Most & Spaan, 1995). Sinteza sgRNK je RNK-zavisan proces koji se javlja u citoplazmi inficirane ćelije, iako njegov tačan mehanizam nije još uvek sasvim poznat.
Opisana je konstrukcija cDNK koje kodiraju defektane interferentne (Dl) genome (delecioni mutanti koji zahtevaju prisustvo komplementirajućeg virusa za njihovu replikaciju i transkripciju) nekih korona virusa, kao što je virus hepatitisa miševa (MHV), infektivni virus bronhitisa (IBV), goveđi korona virus (BCV) (Chang et al., 1994) i virus gastroenteritisa svinja (TGEV) (Spanish Patent Application P9600620; Mendez et al., 1996; Izeta et al., 1999; Sanchez et al., 1999). Međutim, konstrukcija cDNK klona koji kodira kompletan genom korona virusa nije bila moguća usled velikih dimenzija i toksičnh sekvenci unutar genoma korona virusa.
Ukratko, iako je razvijen veliki broj virusnih vektora koji će se repliorfati i eksprimirati heterologne nukleinske kiseline u ćelijama domaćina većina poznatih vektora za ekspresiju heterolognih gena nisu podesni za subkTqniranje RNK virusa. Dodatno, tako dobijeni virusni vektori nisu poželjni usled nedostatka species specifičnosti i target organa ili ograničenosti na tkivo i zbog njihovog ograničenog kapaciteta za kloniranje, koje ograničava mogućnosti za upotrebu i u osnovnim i u primenjenim istraživanjima.
Stoga postoji potreba za postupcima za razvoj novih vektora za ekspresiju heterolognih gena koji mogu da prevaziđu goredate probleme. Posebno, bilo bi povoljno imati velike vektore za ekspresiju heterolognih gena sa visokim nivoom bezbednosti i kapacitetom za kloniranje, koji se mogu projektovati tako da se može kontrolisati njihova specifičnost za vrstu i tropizam.
OPIS PRONALASKA
Na osnovu datog pronalaska gorenavedeni problemi su rešeni pomoću postupka za pripremanje DNK, koji obuhvata sekvence izvedene od genomske RNK (gRNK) korona virusa; igde data sekvenca ima homologiju od najmanje 60% sa prirodnim sekvencama virusa i kodira RNK zavisnu RNK polimerazu i najmanje jedan strukturni ili ne-strukturni protein, pri čemu data DNK može da bude transkribovana u RNK i povezana u virion, a dati postupak obuhvata korake gde je interferentni defektni genom korona virusa kloniran pod eksprimiranjem promotora u veštački bakterijski hromozom (BAC) i izostavljene sekvence unutar defektivnog genoma su ponovo ubačene u dati genom.
Iznenađujuće, pronalazači koji podnose ovu prijavu pronašli su da se problemi koji su se javljali u ranijoj tehnici u pogledu postupaka za subkloniranje i eksprimiranje velikih DNK sekvenci dobijenih od viralne gRNK mogu prevazići korišćenjem BAC kao klonirajućeg vektora. Upotreba BAC ima posebnu prednost u tome da su ovi vektori prisutni kod bakterija sa jednom ili dve kopije po ćeliji, što značajno ograničava toksičnost i smanjuje verovatnoću interplazmidne rekombinacije.
Pronalazak dalje daje infektivni klon koi sadrži celu kopiju komplementarne DNK (cDNK) genomske RNK (gRNK) korona virusa, kloniranu pod transkripciono-regulatornom sekvencom.
U sledećem aspektu predmetni pronalazak je usmeren na rekombinantni virusni vektor koji sadrži infektivni klon koji obuhvata celu kopiju komplementarne DNK (cDNK) u genomsku RNK (gRNK) korona virusa. Klonirana pod transkripciono-regulatornom sekvencom, koja je modifikovana tako da sadrži heterologne nukleinske kiseline ubačene u dati infektivni klon pod uslovima koji dozvoljavaju satoj heterolgnoj nukleinskoj kiselini da bude eksprimirana.
Pronalazak obuhvata vakcine za zaštitu životinja od infekcije izazavane infektivnim agensom koja sadrži: (i) najmanje jedan rekombinantni virusni vektor kao što je prethodno definisano , pri čemu dati virusni vektor eksprimira ili, najmanje jedan antigen pogodan a indukciju imnog odgovora na dati infektivni agens, ili antitelo koje daje zaštitu od naznačenog infektivnog agensa, zajedno sa, po izboru,
(ii) farmaceutski prihvatljivim eksipijensom.
Ova vakcina može da bude mutivalentna vakcina za zaštitu od infekcije izazvane sa više infektivnih agenasa.
KRATAK OPIS SLIKA
Slika 1 prikazuje konstrukciju cDNK klona koji kodira infektivnu RNK TGEV. Slika 1A prikazuje genetičku strukturu TGEV, sa imenima gena označena slovima i brojevima (1a, 1b, S, 3a, 3b, E, M, N i 7). Slika 1B prikazuje strategiju kloniranja cDNK, koja se sastojala u kompletiranju Dl-C genoma. Naznačene su delecije A1, A2 i A3 koje su kompletirane da bi se ponovo dobila cela dužina cDNK. Brojevi ispod strukture Dl-C genoma označavaju nukleotide koji ograničavaju sa obe strane deleciju u datom Dl-C genomu. Slika 1C prikazuje četiri cDNK fragmenta konstruisana da upotpune deleciju A1 i poziciju glavnih restrikcionih mesta koja su upotrebljena tokom spajanja. Insercija fragmenta A1 je proizvela povećanje u toksičnosti cDNK.
Slika 2 prikazuje strukturu pBeloBAC plazmida (VVang et al., 1997) upotrebljenog u kloniranju infektivne cDNK TGEV. PBeloBAC plazmid je dat od strane H. Shizuva i M. Simon (California Institute of Technologv) i obuhvata 7,507 baznih parova (bp) koji sadrže origin replikacije (replikacioni početak) F faktoraE. coli(oriS), gene koji su neophodni da bi se sačuvala jedna kopija palzmida po ćeliji (parA, parB, parC i repE) i gen za otpornost na hloramfenikol (CM<r>). Naznačene su pozicije T7 i SP6 promotora i jedinstvenih restrikcionih mesta. CosN: mesto cosN lambde da bi se olakšala konstrukcija pBAC plazmida; lac Z: gen za p-galaktozidazu. Takođe je naznačena i sekvenca loxP upotrebljena tokom stvaranja plazmida.
Slika 3 prikazuje strukturu osnovnih plazmida koji su upotrebljeni u konstrukciji TGEV cDNK. pBAC-TcDNK<ACIaI>plazmid sadrži sve informacije za TGEV RNK osim za jedan Clal-Clal fragment od 5,198 bp. CDNK je klonirana preko brzog ranog promotora (IE) ekspresije citomegalovirusa (CMV) i ograničena je na 3' kraju sa poli(A) repom sa 24 ostatka A, ribozimom hepatitis delta virusa (HDV) i terminacionim i poliadenilacionim sekvencama goveđeg hormona rasta (BGH). PBAC-B+C+D5' plazmid sadrži Clal-Clal fragment neophodan za upotpunjavanje pBAC-TcDNK<AClal>sve dok cDNK ne dostigne punu dužinu. pBAC-TcDNK<FL>plazmid sadrži celu cDNK TGEV. SAP: alkalna fosfataza morskog raka.
Slika 4 prikazuje razlike u nukleotidnoj sekvenci S gena klonova TGEV PUR46-MAD (MAD) i C11. Brojevi označavaju pozicije supstituisanih nukleotida, smatrajući nukleotidom jedan svakog gena A inicijacionog kodona. Slova unutar šrafure označavaju odgovarajući nukleotid u naznačenoj poziciji. Slova postavljena ispod šrafure označavaju amino kiselinske (aa) supstitucije koje kodiraju nukleotidi koji se nalaze oko naznačene pozicije. A6 nt označava 6-nukleotidnu deleciju. Strelica označava poziciju terminacionog (stop) kodona S gena.
Slika 5 prikazuje strategiju za dobijanje infektivnog TGEV iz cele cDNK TGEV. pBAC-TcDNK<FL>plazmid je transficiran u ST ćelije (ćelije testisa svinje), a 48 časova posle transfekcije upotrebljen je supernatant za inficiranje novih ST ćelija. Virus je prenošen u naznačena vremena. Prilikom svakog prenosa, sakupljene su alikvote supernatanta i ćelijskog monosloja za titraciju virusa i izolaciju RNK za RT-PCR analizu, respektivno. VgRNK: virusna RNK cele dužine.
Slika 6 prikazuje citopatički efekat (CPE) proizveden od strane TGEV cDNK u transficiranim ST ćelijama. Prikazano je odsustvo CPE u ne-transficiranim (kontrolnim) ST ćelijama (Slika 6A) i CPE posmatran 14 i 20 časova posle transfekcije sa pBAC-TcDNK<FL>u ST ćelijama (Slike 6B i 6C, respektivno).
Slika 7 prikazuje razvoj viralnog titra u odnosu na sukcesivne prenose. Prikazan je grafik koji predstavlja virusni titar u supernatantu dve serije ćelijskih monoslojeva (1 i 2) kod različitih prenošenja posle transfekcije sa pBAC-TcDNK<FL>. Mock 1 i 2 se odnosi na ST ćelije transficirane sa pBAC-TcDNK<a>.
Slika 8 prikazuje rezultate analize sekvence virusa dobijenog posle transfekcije ST ćelija sa pBAC-TcDNK"-. Struktura TGEV genoma je naznačena na vrhu slike. Slično tome, naznačene su razlike u sekvenci nukleotida (genetički markeri) između virusa dobijenog od pBAC-TcDNK^ (TcDNK) plazmida i TGEV klonova C8 i C11. Pozicije razlika između nukleotida su naznačene brojevima postavljenim iznad šrafure. cDNK sekvence TcDNK virusa i klona C11 su određene sekvenciranjem fragmenata dobijenih pomoću RT-PCR
(reverzna transkripcija i lančana reakcija polimerizacije). Sekvenca klona C8 je poslata za objavljivanje (Penzes et al., 1999) i uključena je na kraju ovog patenta. Restrikcioni obrasci su prikazani sa Clal i Dralll fragmenata dobijenih sa RT-PCR koji obuhvataju nukleotide 18,997 i 20,990 TcDNK i C8 viruse. Restrikcioni obrasci prikazuju prisustvo ili odsustvo Clal i Dralll mesta u cDNK ovih virusa. Rezultat ovih analiza ukazuje da dobijeni TcDNK virus ima S-gensku sekvencu očekivanu za izolovani C11. MWM: markeri molekulske težine.
Slika 9 prikazuje rezultate RT-PCR analize dobijenog virusa. Virusna RNK je bila eksprimirana pod kontrolom CMV promotora koji je prepoznala ćelijska polimeraza pol II. U principu, ova RNK bi mogla podleći splajsovanju (isecanju introna) tokom njenog transporta u citoplazmu. Da bi se utvrdilo da li je to slučaj, mesta ove RNK sa visokom verovatnoćom splajsovanja su određena korišćenjem programa za predviđanje mesta za splajsovanje u sekvencama humane DNK (Verzija 2.1.5.94, Department of Cell Biologv, Baylor College of Medicine) (Solovyev et al., 1994). Potencijalno mesto splajsovanja sa maksimalnom verovatnoćom isecanja imalo je mesto donora na nt 7,243 i primaoca na nt 7,570 (Slika 9A). Da bi se utvrdilo da li je ovaj domen pretrpeo splajsing, RT-PCR fragment ograničen sa obe strane sa nt 7,078 i nt 7,802 (Slika 9B) pripremljen je od RNK iz prenosa 0 i 2 netransficiranih kultura (kontrola), ili od ST ćelija transficiranih sa TcDNK sa Clal fragmentom u suprotnom smeru (TcDNK<FL>("<ACIa>I)RS), ili u ispravnom smeru (TcDNK0-), a proizvodi dobijeni iz RT-PCR su analizirani na agaroznim gelovima. Dobijeni rezultati su prikazani na Slikama 9C (prenos 0) i 9D (prenos 2).
Slika 10 prikazuje rezultate imunofluorescentnih analiza virusa proizvedenih u kulturama ST ćelija transficiranih sa TcDNK. Bojenje za imunofluorescenciju je obavljeno sa antitelima specifičnim za TGEV PUR46-MAD izolat i za virus dobijen posle transfekcije sa pBAC-TcDNK^ plazmidom. Za ovo su upotrebljena TGEV-specifična monoklonalna antitela koja se vezuju za oba izolata ili samo za PUR46-MAD (Sanches et al., 1990). Rezultat je potvrdio da TcDNK virus ima očekivanu antigenost. Specifičan poliklonalni antiserum za TGEV se vezuje za oba virusa, ali ne i za neinficirane kulture, a samo očekivana monoklonalna antitla specifična za S (ID.B12 i 6A.C3), M (3B.B3) i N (3B.D8) proteine se vezuju za TcDNK virus (Sanches et al., 1999).
Slika 11 prikazuje ekspresiju GUS pod različitim transkripciono-regulatornim sekvencama (TRS) koje menjaju 5' region koji sa obe strane ograničava intergenske (IG) sekvence. Minigenom M39 je kloniran pod kontrolom CMV promotora. U ovaj minigenom je ubačena višestruko klonirajuća sekvenca (PL1, 5'-CCTAGGATTTAAATCCTAAGG-3'; SEQ ID NO: 2) i transkripciona jedinica formirana pomoću izabranih transkripciono-regulatomih sekvenci (TRS), druge višestruko klonirajuće sekvence (PL2, 5'-GCGGCCGCGCCGGCGAGGCCTGTCGAC-3'; SEQ ID NO: 3; ili PL3, 5-GTCGAC-3'; SEQ ID NO: 4), sekvence sa strukturom Kozak (Kz) domena, gen za p-glukuronidazu (GUS) i drugo višestruko klonirajuće mesto (PL4, 5-GCTAGCCCAGGCGCGCGGTACC-3'; SEQ ID NO: 5). Ove sekvence<1>su ograničene na 3'-kraju sa 3'-sekvencom minigenoma M39, HDV ribozimom i terminacionim i poliadenilacionim sekvencama BGH. TRS ima različit broj (0, -3, -8 i -88) nukleotida na 5' kraju IG sekvence (CUAAAC)<1>, a potekao je od N, S, ili M gena, kao što je naznačeno. ST ćelije su transficirane sa različitim plazmidima, inficirane sa komplementirajućim virusom (PUR46-MAD), a supernatanti su prenošeni 6 puta. GUS aktivnost kod inficiranih ćelija je određena pomoću protokola koji je opisao Izeta (Izeta et al., 1999). Rezultati koji su dobijeni stavljanjem u zavisnost GUS aktivnosti i broja prenošenja su sumirani na Slici 11B.
Slika 12 prikazuje ekspresiju GUS pod različitim TRS koji variraju u 3'-ograničavajućem regionu IG sekvence (pogledati Sliku 11 A). Korišćenjem ove transkripcione jedinice sa 5'-ograničavajućim regionom koji odgovara -88 nt N gena TGEV plus IG sekvenca (CUAAAC), 3'-ograničavajuće sekvence su modifikovane. Ove sekvence odgovaraju onima od različitih TGEV gena (S, 3a, 3b, E, M, N i 7), kao što je naznačeno na Slici 12A. U dva slučaja, 3'-sekvence su zamenjene drugim sekvencama koje sadrže restrikciono mesto (Sali) i optimizovanu Kozak sekvencu (Kz), ili sekvencom koja je identična sa onom koja je iza prve IG sekvence locirane posle lidera (predvodeće sekvence) viralnog genoma. Aktivnost GUS u inficiranim ćelijama je određena pomođu protokola opisanog u prethodnom tekstu (Izeta et al., 1999). CL12 označava sekvencu od 12 nukleotida koja je identična sa onom na 3'-kraju "lider" sekvence TGEV genoma (pogledati virusnu sekvencu naznačenu na kraju). Rezultati koji su dobijeni stavljanjem u zavisnost ekspresije GUS i broja prenošenja su sumirani na Slici 12B.<1>Potrebno je istaći da CTAAAC i CUAAC imaju isto značenje za svrhu ovog patenta. Prvi predstavlja sekvencu DNK, a drugi sekvencu odgovarajuće RNK.
Slika 13 prikazuje efekat insercije na određenom mestu modula ekspresije u minigenom u odnosu na nivoe ekspresije GUS. GUS transkripciona jedinica, koja sadrži -88 nt N gena i ograničava 5'-kraj IG sekvence (CUAAAC) i Kz sekvence koje ograničavaju 3'-kraj (pogledati Sliku 12A) su ubačeni u četiri pojedinačna restrikciona mesta u minigenomu M39 (Slika 13A) da bi se odredilo da li su sva ova mesta jednako prijemčiva za ekspresiju heterolognog gena. ST ćelije su transficirane sa ovim plazmidima i inficirane sa komplementirajućim virusom (PUR46-MAD). GUS aktivnost u inficiranim ćelijama je određena na prenosu 0 (PO) sledeći protokol opisan u prethodnom tekstu (Izeta et al., 1999). Dobijeni rezultati su sumirani na Slici 13B.
DETALJAN OPIS PRONALASKA
Na osnovu date prijave "bakterijski veštački hromozom" je DNK sekvenca koja sadrži sekvencu F faktora. Plazmidi koji sadrže ove sekvence, takozvani F plazmidi, su sposobni da stabilno održavaju heterologne sekvence duže od 300 Kb u malom broju kopija (jedna ili dve kopije po ćeliji). Dotični BAC su poznati u tehnici (Shizuva et al., 1992).
Na osnovu datog pronalaska DNK klonirana u BAC ima homologiju od najmanje 60%, poželjno 75%, poželjnije 85 ili 95%, sa prirodnom sekvencom RNK virusa. Homologija sekvenci se poželjno određuje korišćenjem Clustal kompjuterskog programa koji je dostupan u European Bioinformatics Institute (EBI).
Na osnovu datog pronalaska termin "sekvenca dobijena (izvedena) od korona virusa" se odnosi na nuklinsko kiselinsku sekvencu koja ima homologiju od najmanje 60%, poželjno 75% i poželjnije 85 ili 95%, sa prirodnom sekvencom korona virusa. Homologija sekvenci se može odrediti korišćenjem Clustal kompjuterskog programa koji se može nabaviti iz European Bioinformatics Institute (EBI).
Termin "korona virus" je upotrebljen na osnovu datog pronalaska i odnosi se na grupu virusa koji imaju jedan molekul linearne, pozitivne, ssRNK od 25 do 33 Kb. Ovi virusi obično sadrže 7 do 10 strukturnih gena, tj. gena koji kodiraju proteine koji determinišu viralnu strukturu. Ovi geni su tipično organizovani u viralnom genomu u sledećem redosledu 5' replikaza-(hemaglutinin-esteraza)-bodlje(glikoproteinski nastavci omotača)-omotač-membrana-nukleoprotein-3'. Dodatno virusni genom može sadržati određen broj ne-strukturnih gena koji kodiraju ugneždjeni set iRNK sa uobičajenim 3' krajem i većinom su ne-esencijalne.
Termin "sposoban da se transkribuje u RNK koja se može sklopiti u virion" je upotrebljen da bi okarakterisao DNK sekvencu, koja će se - kada se jednom uvede u odgovarajuću ćeliju domaćina - transkribovati u RNK i stvarati virione. Virioni su poželjno infektivni virusi, ali takođe mogu biti inaktivirani, oslabljeni ili virusi sa defektnom replikacijom koji sadrže datu RNK. U poželjnom slučaju sve informacije neophodne za ekspresiju viriona kodira DNK sekvenca datog pronalska.
Nukleinske kiseline datog pronalaska mogu dodatno sadržati sekvencu koja kodira jedan ili više heterolognih gena od interesa. Na osnovu datog pronalaska gen je okarakterisan kao "heterologni gen" ako nije dobijen od korona virusa koji je upotrebljen kao izvor za gene koji kodiraju RNK zavisnu RNK polimerazu i strukturni ili ne-strukturni protein. "Heterologni gen" se prema tome takođe odnosi na gene dobijene od jednog tipa korona virusa i eksprimirane u vektoru koji sadrži sekvence dobijene od drugog tipa korona virusa. Bilo koji heterologni gen od interesa se može ubaciti u nukleinske kiseline datog pronalaska. Posebno je poželjno umetanje gena koji kodiraju peptide ili proteine koji se prepoznaju kao antigen iz infektivnog agensa od strane imunog sistema sisara. Heterologni gen može prema tome kodirati najmanje jedan antigen pogodan za indukovanje imunog odgovora protiv infektivnog agensa, najmanje jednan molekul koji utiče na repliklaciju infektivnog agensa ili antitelo koje obezbeđuje zaštitu protiv infektivnog agensa. Alternativno ili dodatno, heterologni gen može kodirati imunski modulator, citokin, imuopojačivač ili anti-inflamatorno jedinjenje.
Fragment DNK na osnovu datog pronalaska koji je transkribovan u RNK poželjno ima veličinu od najmanje 25 Kb. Fragmenti sa veličinom od najmanje 30 Kb su posebno poželjni.
Na osnovu poželjnog oblika datog pronalaska DNK dalje sadrži sekvence dobijene od korona virusa koje kodiraju nekoliko ili sve osim jednog strukturnog ili nestrukturnog proteina korona virusa. Alternativno, DNK datog pronalaska dalje sadrži sekvence koje kodiraju sve strukturne ili ne-struktume proteine korona virusa.
Na osnovu sledećeg oblika, nukleinske kiseline datog pronalaska sadrže sekvencu koja kontroliše transkripciju sekvence dobijene od gRNK korona virusa. Bilo koja sekvenca koja kontroliče transkripciju poznata u tehnici može se upotrebiti u ovu svrhu, uključujući sekvence koje izvode ekspresiju gena dobijenih iz DNK ili RNK genoma. Poželjna je upotreba brzog ranog (IE) promotora citomegalovirusa (CMV).
Nukleinska kiselina na osnovu datog pronalaska se takođe može ograničiti na 3' kraju sa poli(A) repom. Nukleinska kiselina može sadržati termincione i/ili poliadenilacione sekvence goveđeg hormona rasta (BGH). Dodatno ili alternativno, nukleinske kiseline mogu sadržati sekvence koje kodiraju ribozim, na primer ribozim virusa hepatitisa 8
(HDV).
Nukleinske kiseline datog pronalaska mogu da sadrže sekvence dobijene od korona virusa, na primer dobijene od izolata virusa svinjskog prenosivog gastroenteritisa (TGEV), mišjeg virusa hepatitisa (MHV), virusa infektivnog bronhitisa (IBV), goveđeg korona virusa (BoCV), psećeg korona virusa (CcoV), mačjeg korona virusa (FcoV) ili humanog korona virusa. Na osnovu poželjnog oblika nukleinska kiselina je dobijena od virusa prenosivog gastroenteritisa.
Na osnovu daljeg oblika datog pronalaska, DNK datog pronalaska su deo plazmida, poželjno deo bakterijskog veštačkog hromozoma (BAC).
Dati pronalazak dalje daje postupke za pripremanje DNK datog pronalaska koji sadrže korake, gde je interferentni defektni genom dobijen od korona virusa kloniran pod ekspresijom promotora u BAC vektor, a delecije unutar defektnog genoma su ponovo ubačene. Postupak može dalje obuhvatati korake, gde su toksične sekvence unutar viralnog genoma identifikovane pre ponovnog ubacivanja u preostalu genomsku DNK. Poželjno, toksične sekvence unutar viralnog genoma su poslednje sekvence koje bi trebalo ubaciti pre kompletiranja genoma. Na osnovu datog pronalaska ovaj postupak je pogodan za proizvodnju infektivnih klonova korona virusa koji su stabilni u bakteriji najmanje 80 generacija i prema tome predstavljaju veoma efikasan klonirajući vektor.
Dati pronalazak obezbeđuje razvoj infektivnih klonova cDNK dobijenih od korona virusa (Almazan et al., 2000), kao i vektora konstruisanih od datih infektivnih klonova koji takođe obuhvataju heterologne sekvence nukleinskih kiselina ubačene u date klonove. Infektivni klonovi i vektori dati u ovom pronalasku imaju brojne primene i u osnovnim i u primenjenim istraživanjima, kao i visok kapacitet za kloniranje i mogu se projektovati na takav način da se lako može kontrolisati njihova specifičnost za vrstu i tropizam.
Ovaj patent opisuje razvoj postupka koji omogućava dobijanje, po prvi put u istoriji korona virusa, infektivnog cDNK klona pune dužine koji kodira genom korona virusa (Almazan et al., 2000).
Razvijen je novi vektor ili sistem ekspresije heterolognih nukleinskih kiselina baziran na korona virus-u stvorenom od infektivnog cDNK klona koji kodira genomsku RNK (gRNK) coonavirusa. U jednoj posebnoj realizaciji ovog pronalaska, korona virus je virus svinjskog prenosivog gastroenteritisa (TGEV).
Novi sistem ekspresije se može upotrebiti u osnovim ili primenjenim istraživanjima, na primer, da bi se dobili proizvodi koji nas interesuju (proteini, enzimi, antitela, itd.), kao vektor vakcine, ili u genskoj terapiji i kod ljudi i kod životinja. Infektivnim korona virus-om dobijenim od infektivnog cDNK klona se može rukovati konvencionalnim tehnikama genetičkog inžinjeringa tako da se novi geni mogu ubaciti u genom korona virusa i tako da se ti geni mogu eksprimirati na tkivno-specifičan ili species-specifičan način da bi se izazvao imunski odgovor ili se mogu koristiti za gensku terapiju. Dodatno, ekspresija je optimizovana izborom novih sekvenci za regulisanje transkripcije (TRS) koje čine mogućim povećanje nivoa ekspresije od više od stotinu puta.
Vektori dobijeni od korona virusa, posebno TGEV, pokazuju nekoliko prednosti u pogledu indukcije imuniteta u mukuznim membranama u odnosu na druge sisteme ekspresije koji se ne repliciraju u njima: (i) TGEV inficira intestinalne i respiratorne mukuzne membrane (Enjuanes and Van der Zeijst, 1995), koje predstavljaju najbolja mesta za indukciju sekretornog imuniteta; (ii) njihov tropizam se može kontrolisati modifikacijom S (spike - glikoproteinska bodlja na omotaču) gena (Ballesteros et al., 1997); (iii) postoje nepatogeni sojevi za razvoj sistema ekspresije koji zavise od komplementirajućeg virusa (Sanchez et al., 1992); i (iv) korona virus-i su citoplazmatični RNK virusi koji se replikuju bez prolaženja kroz intermedijerni DNK stadijum (Lai and Cavanagh, 1997), čineći njihovo ugrađivanje u ćelijski hromozom praktično nemogućim.
Postupak koji je učinio mogućim dobijanje infektivnog korona virusa od cDNK koja kodira gRNK korona virusa obuhvata sledeće strategije: (i) ekspresiju RNK korona virusa pod kontrolom odgovarajućeg promotora; (ii) kloniranje genoma korona virusa u bakterijskim veštačkim hromozomima (BACs); (iii) identifikaciju sekvenci cDNK korona virusa koje su direktno ili indirektno toksične za bakteriju; (iv) identifikaciju tačnog redosleda spajanja komponenti cDNK koje kodiraju infektivnu RNK korona virusa (promotori, sekvence za terminaciju transkripcije, poliadenilacione sekvence, ribozimi, itd.);
i
(v) identifikaciju grupe tehnologija i postupaka (uslovi za rast BAC, modifikacije procesa prečišćavanja BAC DNK, transformacione tehnike, itd.) koji, zajedno, dozvoljavaju efikasno dobijanje infektivnog korona virusa od cDNK.
Promotor igra značajnu ulogu u povećanju ekspresije viralne RNK u jedru, gde se ona i sintetiše, da bi se kasnije tranportovala u citoplazmu.
Upotreba BAC čini jednu od ključnih tačaka postupka pronalaska. Kao što je poznato, kloniranje eukariotskih sekvenci u bakterijskim plazmidima je često nemoguće usled toksičnosti egzogenih sekvenci za bakteriju. U ovim slučajevima, bakterija obično eliminiše toksičnost modifikovanjem introdukovanih sekvenci. Međutim, u strategiji koja se sledi u ovom slučaju, da bi se izbegla toksičnost ovih virusnih sekvenci, izvedena su neophodna kloniranja da bi se dobila kompletna cDNK korona virusa u BAC. Ovi plazmidi se javljaju u samo jednoj kopiji ili maksimalno dve kopije po ćeliji, značajno ograničavajući njihovu toksičnost i smanjujući verovatnoću interpalzmidne rekombinacije.
Kroz identifikaciju bakteriotoksičnih cDNK sekvenci korona virusa, može se završiti konstrukcija cDNK koja kodira kompletan genom coronavrusa, sa izuzetkom toksičnih sekvenci, koje se dodaju u poslednjem koraku konstrukcije celokupnog genoma, odnosno, neposredno pre transfekcije u eukariotske ćelije, čime se izbegava njihova modifikaciju od strane bakterije.
Jedan predmet datog pronalaska se prema tome sastoji od infektivnog dvostrukog lanca cDNK klona koji kodira gRNK korona virusa, kao i od postupka za njegovo dobijanje.
Sledeći predmet ovog pronalaska se sastoji od grupe rekombinantnih virusnih vektora koji sadrže dati infektivni klon i sekvence heterolognih nukleinskih kiselina ubačene u dati infektivni klon.
Sledeći predmet ovog pronalaska se sastoji od postupka za proizvodnju rekombinantnog korona virusa koji obuhvata uvođenje datog infektivnog klona u ćeliju domaćina, kulturu transformisane ćelije u ustavima koji dozvoljavaju replikaciju infektivnog klona i proizvodnju rekombinantnog korona virusa i dobijanje rekombinantnog korona virusa iz kulture.
Sledeći predmet ovog pronalaska se sastoji od postupka za proizvodnju modifikovanog rekombinantnog korona virusa koji sadrži uvođenje rekombinantnog viralnog vektora u ćeliju domaćina, njeno kultivisanje u uslovima koji dozvoljavaju replikaciju viralnog vektora i proizvodnju modifikovanog rekombinantnog korona virusa, kao i dobijanje modifikovanog rekombinantnog korona virusa iz kulture.
Sledeći predmet ovog pronalaska se sastoji od postupka za stvaranje proizvoda od interesa koji se sastoji od kultivisanja ćelije domaćina koja sadrži dati rekombinantni virusni vektor u uslovima koji dozvoljavaju ekspresiju sekvence heterologne DNK.
Ćelije koje sadrže goredate infektivne klonove ili rekombinantne viralne vektore čine sledeći predmet datog pronalaska.
Sledeći predmet ovog pronalaska se sastoji od grupe vakcina koje štite životinje protiv infekcija izazavanih infektivnim agensima. Ove vakcine sadrže infektivne vektore koji eksprimiraju najmanje jedan antigen koji je podesan za indukovanje imunog odgovora protiv svakog infektivnog agensa, ili najmanje jedno antitelo koje obezbeđuje zaštitu protiv datog infektivnog agensa, zajedno sa farmaceutski prihvatljivim inertnim puniocem. Vakcine mogu biti mono- ili multivalentne, u zavisnosti od toga da li vektori eksprimiraju jedan ili više antigena sposobnih da indukuju imunski odgovor na jedan ili više infektivnih agenasa, ili, alternativno, jedno ili više antitela koja obezbeđuju zaštitu protiv jednog ili više infektivnih agenasa.
Sledeći predmet ovog pronalaska obuhvata postupak imunizacije životinja koji se sastoji u primeni date vakcine.
Pronalazak daje cDNK klon koji kodira infektivnu RNK korona virusa, nadalje infektivni klon infekcije, koji se sastoji od: (1) kopije komplementarne DNK (cDNK) infektivne genomske RNK (gRNK) korona virusa ili same viralne RNK; i (2) eksperioni modul za dodatni gen, koji obuhvata optimizovane sekvence za potpomaganje transkripcije.
U jednoj posebnoj realizaciji ovog pronalaska, korona virus je TGEV izolat, posebno, PUR46-MAD izolat (Sanchez et al., 1990), modrfikovan zamenom S gena ovog virusa sa S genom klona C11 TGEV izolata ili S genom psećeg ili humanog korona virusa.
Sekvenca za potpomaganje transkripcije, ili promotor, je RNK sekvenca locirana na 5'-terminalnom kraju svake informacione RNK (iRNK) korona virusa, za koju se vezuje viralna polimerazna RNK da bi se započela transkripcija informacione RNK (iRNK). U određenom i poželjnom obliku virusni genom je eksprimiran od cDNK korišćenjem IE promotora CMV, zahvaljujući visokom nivou ekspresije koji se dobija korišćenjem ovog promotora (Dubenskv et al., 1996) i zbog prethodnih rezultata dobijenih u našoj laboratoriji koji su ukazali da su veliki nepravilni genomi (9.7 kb i 15 kb) dobijeni od TGEV korona virusa eksprimirali RNK koje nisu podlegale splajsovanju tokom transporta iz jedra, gde se sintetišu, ka citoplazmi.
Infektivni klon pronalaska takođe sadrži terminacionu sekvencu transkripcije i poliadenilacioni signal kao što je onaj koji dolazi od BGH gena. Ove terminacione sekvence se moraju postaviti na 3'.kraj poli(A) repa. U jednoj određenoj realizaciji, infektivni klon pronalaska sadrži poli(A) rep od 24 ostatka A i terminacione i poliadenilacione sekvence BGH odvojene od poli(A) repa sekvencom HDV ribozima.
Plazmid u koji je ubačena infektivna cDNK virusa je molekul DNK koji poseduje origin replikacije (replikacioni početak) i prema tome je potencijalno sposoban da se replikuje u pogodnoj ćeliji. Upotrebljeni plazmid je replikon koji je odgovarajući u pogledu održavanja i amplifikacije infektivnog klona pronalaska u odgovarajućoj ćeliji domaćinu kao što je bakterija, na primer,Escherichia coli.Replikon u opštem slučaju nosi gen za otpornost na antibiotike koji dozvoljava selekciju ćelija koje ga nose (na primer,cat).
U Primeru 1 je opisana konstrukcija infektivnog klona TGEV pod kontrolom IE promotora CMV. 3' kraj cDNK je ograničen sa 24 nt poli(A) sekvencom, HDV ribozimom i terminacionom sekvencom transkripcije BGH.
Postupak za dobijanje infektivnog klona pronalaska sadrži konstruisanje cDNK pune dužine od gRNK korona virusa i pripajanje elemenata koji regulišu transkripciju.
cDNK koja kodira infektivnu gRNK korona virusa je dobijena od Dl genoma dobijenog od korona virusa kloniranog kao cDNK pod kontrolom odgovarajućeg promotora u BAC, u svrhu povećanja stabilnosti cDNK. Zatim su identifikovane bakteriotoksične sekvence i, u svrhu eliminisanja te toksičnosti, date toksične sekvence su uklonjene i ubačene na kraj konstrukcije kompletnog genoma, neposredno pre transfekcije u eukariotske ćelije. Viralno potomstvo se može rekonstruisati transfekcijom BAC plazmida koji sadrži genom korona virusa u eukariotskim ćelijama koji podržava viralnu replikaciju.
Elementi koji regulišu transkripciju su pripojeni konvencionalnim tehnikama (Maniatis et al., 1989).
Infektivnim klonom pronalaska se može rukovati pomoću konvencionalnih tehnika genetičkog inžinjeringa da bi se ubacila najmanje jedna sekvenca heterologne nukleinske kiseline koja kodira određenu aktivnost, pod kontrolom promotora koji je prisutan u infektivnom klonu i pod kontrolom regulatornih sekvenci koje se nalaze u dobijenom ekspresionom vektoru.
Infektivni klon pronalaska ima brojne primene; na primer, može se koristiti i u osnovnim istraživanjima, na primer, za proučavanje mehanizma replikacije i transkripcije korona virusa i u primenjenim istraživanjima, na primer, u razvoju efikasnih sistema ekspresije proizvoda koji nas zanimaju (proteina, enzima, antitela, itd.).
Odgovarajuće ćelije se mogu transformisati od infektivnog cDNK klona pronalaska, a mogu se dobiti virioni koji sadrže kompletan genom korona virusa. Prema tome, pronalazak pored toga daje postupak za proizvodnju rekombinantnog korona virusa koji sadrži uvođenje infektivne cDNK pronalaska u ćeliju domaćina, kultivisanje date ćelije pod uslovima koji dozvoljavaju ekspresiju i replikaciju infektivnog klona i izolovanje viriona dobijenih od rekombinantnog korona virusa, koja sadrži infektivni genom korona virusa. Infektivni klon pronalaska se može ubaciti u ćeliju domaćina na različite načine, na primer transfekcijom ćelije domaćina sa RNK transkribovanom in vitro od infektivnog klona pronalaska, ili infekcijom ćelije domaćina sa infektivnim cDNK klonom pronalaska. Date ćelije domaćini koje sadrže infektivni klon pronalaska čini sledeći predmet datog pronalaska.
Pronalazak takođe daje grupu rekombinantnih virusnih vektora dobijenih od infektivnog klona pronalaska, nadalje označenih kao virusni vektori pronalaska. Virusni vektori pronalaska sadrže infektivan cDNK klon pronalaska modifikovan tako da sadrži heterolognu nukleinsku kiselinu ubačenu u dati infektivni klon pod uslovima koji dozvoljavaju da se heterologna nukleinska kiselina eksprimira.
Termin "nukleinska kiselina", kao što je upotrebljeno u opisu, obuhvata gene ili fragmente gena kao i, uopšteno, bilo koji molekul DNK ili RNK.
Termin "heterologna", u smislu u kome se koristi u ovom opisu, primenjen na nukleinsku kiselinu se odnosi na nukleinsko kiselinsku sekvencu koja normalno nije prisutna u vektoru upotrebljenom za uvođenje heterologne nukleinske kiseline u ćeliju domaćina. Heterologna nukleinska kiselina koja sadrži virusni vektor pronalaska može biti gen ili fragment koji kodira protein, peptid, epitop, ili bilo koji genski proizvod od interesa (kao što su antitela, enzimi, itd.)- Heterologna nukleinska kiselina se može ubaciti u infektivni klon pronalaska konvencionalnim tehnikama genetičkog inžinjeringa u bilo koji odgovarajući region cDNK, na primer, posle ORF 1b ili između gena N i 7, posle inicijacionog kodona (AUG) i u okviru čitanja sa tim genom; ili, alternativno, u zone koje odgovaraju ostalim ORF (otvorenim okvirima čitanja). U konstrukciji viralnog vektora pronalaska, osnovno je da umetanje heterologne nukleinske kiseline ne utiče na bilo koju od osnovnih virusnih funkcija.
Virusni vektor pronalaska može eksprimirati jednu ili više aktivnosti. U poslednjem slučaju, virusni vektor će obuhvatiti toliko sekvenci heterologne nukleinske kiseline koliko će se aktivnosti eksprimirati, pre tih sekvenci se nalazi jedan ili nekoliko promotora, ili promotor i različita mesta za prepoznavanje ribozoma (IRES, intemal ribosome entry sites -mesta ulaska u unutrašnjosti ribozoma), ili različiti promotori i jedno mesto za prepoznavanje ribozoma.
Prema tome, pronalazak daje postupak za proizvodnju produkta od interesa koji obuhvata kultivisanje ćelije domaćina koja sadrži virusni vektor pronalaska pod uslovima koji dozvoljavaju da se heterologna nukleinska kiselina eksprimira i da se izdvoji proizvod od interesa. Date ćelije domaćini koje sadrže virusni vektor pronalaska čine sledeći predmet datog pronalaska.
Virusni vektor pronalaska se može projektovati tako da se njegova species-specifičnost (specifičnost za vrstu) i tropizam mogu lako kontrolisati. Zahvaljujući ovim osobinama, veoma interesantna primena virusnih vektora pronalaska je njihova upotreba u genskoj terapiji kao vektora gena od interesa, ili kao vektora vakcine da bi se indukovali imunski odgovori protiv različitih patogena.
Pronalazak dalje daje vakcine, sposobne da štite životinju od infekcije izazvane infektivnim agensom, koje sadrže (i) najmanje jedan virusni vektor pronalaska koji eksprimira najmanje jedan antigen pogodan da izazove imunski odgovor protiv datog infektivnog agensa, ili antitelo koje obezbeđuje zaštitu od datog infektivnog agensa, zajedno sa, opciono, (ii) farmaceutski prihvatljivim inertnim puniocem.
"Indukovanje/izazivanje zaštite" u smislu koji je upotrebljen u ovom opisu bi trebalo shvatiti kao imunski odgovor organizma primaoca (životinja koja će se imunizovati)
indukovan virusnim vektorom pronalaska, kroz pogodne mehanizme kao što su oni indukovani supstancama koje potenciraju ćelijski odgovor (interleukini, interferoni, itd.), faktori ćelijske nekroze i slične supstance koje štite životinju od infekcija izazvanih infektivnim agensima.
Terminom "životinja" su obuhvaćene sve životinje bilo kojih vrsta, poželjno sisara, uključujući čoveka.
Termin "infektivni agens" u smislu koji je upotrebljen u ovom opisu obuhvata virusni, bakterijski, gljivični, parazitski ili neki drugi infektivni agens koji može inficirati životinju i izazvati patološke promene.
U jednoj određenoj realizaciji, vakcina data u ovam pronalasku sadrži najmanje jedan virusni vektor pronalaska koji eksprimira najmanje jedan antigen sposoban da indukuje sistemski imunski odgovor i/ili imunski odgovor u mukoznim membranama protiv različitih infektivnih agenasa koji se umnožavaju u respiratornim ili intestinalnim mukoznim membranama. Vektori pronalaska su sasvim pogodni da izazovu imunitet u mukoznim membranama kao i laktogeni imunitet, koji je od posebnog interesa u zaštiti novorođenčadi protiv infekcija intestinalnog trakta.
U sledećoj određenoj realizaciji, vakcina data u ovom pronalasku sadrži najmanje jedan virusni vektor pronalaska koji eksprimira najmanje jedan gen koji kodira lake i teške lance antitela bilo kog izotipa (na primer, \ gGi, IgA, itd.) koji štiti od infektivnog agensa.
Specifičnost za vrstu se može kontrolisati tako da virusni vektor može eksprimirati S protein omotača korona virusa koji inficira željene vrste (čoveka, psa, mačku, svinju, itd.), koji je pogodan za prepoznavanje od strane celijskih receptora odgovarajućih vrsta.
Vakcine koje su date u ovom pronalasku mogu biti monovalentne ili multivalentne, u zavisnosti od toga da li virusni vektori eksprimiraju jedan ili više antigena sposobnih da izazovu imunski odgovor na jedan ili više infektivnih agenasa, ili jedno ili više antitela koja obezbeđuju zaštitu protiv jednog ili više infektivnog agensa.
U određenoj realizaciji ovog pronalaska date su monovalentne vakcine koje su sposobne da zaštite čoveka, svinje, pse i mačke protiv različitih infektivnih humanih, svinjskih, psećih i mačjih agenasa, a tropizam je kontrolisan eksprimiranjem S glikoproteina korona virusa sa željenom specifičnošću za vrstu.
Monovalentne vakcine protiv svinjskih infektivnih agenasa mogu sadržati vektor koji eksprimira antigen izabran iz grupe koja se u suštini sastoji od antigena sledećih svinjskih patogena:Actinoacillus pleuropneumoniae, Actinobacillus suis, Haemophilus parasuis,svinjski parvovirus,Leptospira, Escherichia coli, Erysipelotrix rhusiopathiae, Pasteurella multocida, Bordetella bronchiseptica, Clostridiumsp.,Serpulina hydiosenteriae, Mycoplasma hyopneumoniae,virus svinjske epidemične dijareje (PEDV), svinjski respiratorni korona virus, rotavirus, ili protiv patogena koji izazivaju svinjski respiratorni i reproduktivni sindrom, Aujeszky-ova bolest (pseudorabies), svinjski grip, ili prenosivi gastroenteritis i etiološki agens atrofičkog rinitisa i proliferativnog ileitisa. Monovalentne vakcine protiv psećih infektivnih agenasa mogu sadržati ekspresioni vektor koji eksprimira antigen izabran iz grupe koja se suštinski sastoji od antigena sledećih psećih patogena: pseći herpes virusi, tip 1 i 2 pseći adenovirus, tip 1 i 2 pseći parvovirus, pseći reovirus, pseći rotavirus, pseći korona virus, pseći virus parainfluence, pseći virus influence, distemper virus, virus besnila, retrovirus i pseći calicivirus.
Monovalentne vakcine protiv mačjih infektivnih agenasa mogu sadržati ekspresioni vektor koji eksprimira antigen izabran iz grupe koja se suštinski sastoji od antigena sledećih mačjih patogena: mačji calicivirus, virus mačje imunodeficijencije, virus mačjeg herpesa, virus mačje panleukopenije, mačji reovirus, mačji rotavirus, mačji korona virus, virus mačjeg infektivnog peritonitisa, virus besnila, mačjaChlamydia psittacii virus mačje leukemije.
Vektori mogu eksprimirati antitelo koje obezbeđuje zaštitu od infektivnog agensa, na primer, svinjskog, psećeg ili mačjeg infektivnog agensa kao što su oni navedeni u prethodnom tekstu. U jednoj određenoj realizaciji, vektor eksprimira rekombinantno monoklonalno antitelo identifikovano kao 6A.C3, koje neutrališe TGEV, eksprimovano sa izotipovima \ gGi ili IgA, u kojoj je nepromenljivi deo imunoglobulina svinjskog porekla, ili neutralizujuća antitela za humane i svinjske rotaviruse.
Kao inertni punioc se može upotrebiti razblaživač kao što je fiziološki slani rastvor ili neki drugi slični slani ratsvori. Tome slično, ove vakcine mogu takođe sadržati adjuvant od onih koji se obično koriste u formulaciji obe vodene vakcine, kao što je aluminijumhidroksid, QuilA, suspenzije alumina gelova i tome slično, kao i uljane vakcine bazirane na mineralnim uljima, gliceridima, derivatima masnih kiselina i njihovim smešama.
Vakcine datog pronalaska mogu takođe sadržati supstance koje potenciraju ćelijski odgovor (CRP), to jest supstance koje potenciraju subpopulaciju pomoćnih T-ćelija { Th, i Th2) kao što su interieukin-1 (IL-1), IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-12, gama-IFN (gama-interferon), faktor ćelijske nekroze i slične supstance koje mogu teoretski da izazovu ćelijski imunitet kod vakcinisanih životinja. Ove CRP supstance se mogu upotrebiti u formulaciji vakcine sa vodenim ili uljanim adjuvantima. Može se koristiti drugi tip adjuvanata koji moduliraju i imunostimulišu ćelijski odgovor, kao što su MDP (muramil dipeptid), ISCOM (Imunostimulirajući kompleks) ili lipozomi.
Pronalazak obezbeđuje multivalentne vakcine sposobne za prevenciju i zaštitu životinja od infekcija izazvanih različitim infektivnim agensima. Ove multivalentne vakcine se mogu pripremiti od virusnih vektora pronalaska u koje su, u istom rekombinantnom vektoru, ubačene različite sekvence koje kodiraju odgovarajuće antigene, ili konstruisanjem nezavisnih rekombinantnih vektora koje bi se kasnije pomešali u cilju zajedničke inokulacije. Prema tome, ove multivalentne vakcine sadrže virusni vektor koji sadrži više od jedne sekvence heterolognih nukleinskih kiselina koje kodiraju više od jednog antigena ili, alternativno, različite viralne vektore, od kojih svaki eksprimira najmanje jedan različiti antigen.
Analogno tome, multivalentne vakcine koje sadrže multivalentne vektore se mogu pripremiti korišćenjem sekvenci koje kodiraju antitela koja štite od infektivnih agenasa, umesto sekvenci koje kodiraju antigene.
U jednoj određenoj realizaciji ovog pronalaska date su vakcine sposobne da imunski zuju ljude, svinje, pse i mačke protiv različitih svinjskih, psećih i mačjih infektivnih agenasa, respektivno. U ovu svrhu, virusni vektori sadržani u vakcini moraju eksprimirati različite antigene humanih, svinjskih, psećih ili mačjih patogena koji su dati u prethodnom tekstu ili neke druge.
Vakcine ovog pronalaska se mogu formulisati u tečnom ili liofilizovanom obliku i mogu se pripremiti suspendovanjem rekombinanntih sistema u inertnom puniocu. Ako su dati sistemi bili u liofilizovanom obliku, sam inertni punilac bi mogao biti rekonstituišuća supstanca.
Alternativno, vakcine date u ovom pronalasku se mogu upotrebiti zajedno sa ostalim konvencionalnim vakcinama, ili kao njihov deo ili kao razbalživač ili liofilizovana frakcija koju bi trebalo razblažiti sa ostalim konvencionalnim ili rekombinantnim vakcinama. Vakcine date ovim pronalaskom se mogu primeniti na životinju oralno, nazalno, subkutano, intradermalno, intraperitonealno, intramuskulamo ili aerosolom.
Pronalazak takođe daje postupak za imunizaciju životinja, posebno svinja, pasa i mačaka, na jedan ili različite infektivne agense istovremeno, koji obuhvata oralnu, nazalnu, subkutanu, intradermalnu, intraperitonealnu, intramuskulamu ili aerosol primenu (ili njihove kombinacije) vakcine koja sadrži imunološki efikasnu količinu rekobinantnog sistema datog u ovom pronalasku.
Dodatno, pronalazak takođe daje postupak za zaštitu novorođenih životinja protiv infektivnih agenasa koji inficiraju date životinje, koji se sastoji u oralnoj, nazalnoj, subkutanoj, intradermalnoj, intraperitonealnoj, intramuskulamoj, ili aerosol primeni (ili njihovoj kombinaciji) vakcine izabrane od istih datih u ovom pronalasku na majke pre ili tokom gestacijskog perioda, ili na njihove potomke.
Pronalazak je ilustrovan sledećim primerima, koji detaljno opisuju dobijanje infektivnih klonova i konstrukciju virusnih vektora pronalaska. Ove primere ne bi trebalo smatrati kao ograničavajuće za delokrug pronalaska, već kao ilustraciju. U datom primeru je izvedena transformacija i rast bakterije, DNK prečišćavanje, analiza sekvence i analiza za procenu stabilnosti plazmida, na osnovu metodologije opisane u daljem tekstu.
Transformacija bakterija
Svi plazmidi su podvrgnuti elektroporaciji uE. coliDH10B soj (Gibco BRL), uvođenjem malih modifikacija u prethodno opisanim protokolima (Shizuva et al., 1992). Za svaku transformaciju, pomešano je 2 uL ligacione i 50 uL kompetentne bakterije u 0.2-cm posudama (BioRad) i izvršena je elektroporacija na 200Cl,2.5 kV i 25 uF. Zatim je na svaku transformaciju dodato 1 mIL SOC medijuma (Maniatis et al., 1989), ćelije su inkubirane na 37°C 45 minuta i konačno, rekombinantne kolonije su otkrivene na pločama LB SOC medijuma (Maniatis et al., 1989) sa 12.5ug/mLhloramfenikolom.
Uslovi rasta bakterija
Bakterije koje sadrže originalne plazmide, u koje je kloniran nekompletan genom TGEV (Slika 3) su uzgajane na 37°C, pokazujući normalnu kinetiku rasta. Sa druge strane, BAC koji sadrži kompletnu cDNK je uzgajan na 30°C radi mininmizovanja nestabilnosti u najvećoj mogućoj meri. Čak i tada, veličina kolonija je redukovana i periodi inkubacije do 24 časa su bili neophodni da bi se dostigle normalne veličine kolonija.
Prečišćavanje DNK
Uz manje modifikacije, praćen je protokol opisan od stame Woo (Woo et al., 1994). Iz jedne kolonije, 4 L LB je inokulirano sa hloramfenikolom (12.5 u.g/ml). Posle inkubacionog perioda od 18 časova na 30°C, bakterije su sakupljene centrifugiranjem na 6,000 G i plazmid je prečišćen korišćenjem Ojagen Plasmid Maxipreparations kompleta na osnovu preporuka proizvođača. Ovim postupkom je primećeno da je dobijena plazmidna DNK kontaminirana sa bakterijskom DNK. Da bi se eliminisala kontaminirajuća bakterijska DNK, plazmidna DNK je prečišćavana centrifugiranjem na 55,000 rpm 16 časova na CsCI gradijentu. Dobijeni prinos je bio između 15 i 30 ng/L, u zavisnosti od veličine plazmida.
Analiza sekvence
DNK je sekvencirana u automatskom sekvenceru (373 DNA Sequencer, Applied Biosvstems) upotrebom didezoksinukleotida obeleženih sa fluorescentnim bojama i polimeraze otporne na temperaturu (Perkin Elmer). Reagensi su dobijeni u vidu kompleta (ABI PRISM Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit) iz kompanije Applied Biosystems. Thermocycler (aparat za automatsku cikličnu promenu temperature) koji je upotrebljen za izvođenje reakcija sekvenciranja je "GeneAmpPCR System 9600" (Perkin Elmer).
Spajanje sekvenci i njihovo poređenje sa konsenzus sekvencom TGEV je izvedeno korišćenjem SeqMan II i Align (DNASTAR) programa, respektivno. Nisu otkrivene razlike u odnosu na odgovarajuću sekvencu.
Stabilnost plazmida
Iz originalnih glicerolata, uzgajane su bakterije koje sadrže rekombinantne pBeloBACU plazmide u 20 ml_ LB sa hloramfenikolom (12.5 (ig/mL) 16 sati na 30°C i 37°C. Ovaj materijal je uzet kao prenos 0. Bakterije su razblažene 10<6>puta i uzgajane na 30°C i 37°C 16 časova. Ostvareni su serijski prenosi tokom osam uzastopnih dana (svaki prenos predstavlja približno 20 generacija). Plazmidna DNK je prečišćena pomoću Miniprep na prenosima 0 i 8 (160 generacija) i analizirana je sa restrikcionim endonukleazama. Dva plazmida koji sadrže deo genoma TGEV su visoko stabilna, dok je plazmid koji sadrži kompletan genom TGEV pokazao izvesnu nestabilnost posle 40 generacija (u tom trenutku približno 80% DNK pokazuje ispravnu restrikcionu šemu).
Primer 1
KONSTRUKCIJA REKOMBINANTNOG VEKTORA ZASNOVANOG NA KLONU INFEKTIVNE cDNK DOBIJENE OD TGEV
1.1 Dobijanje infektivne cDNK TGEV
Radi dobijanja cDNK koja kodira kompletan TGEV genom, počeli smo sa cDNK koja kodira defektan Dl-C genom (Mendez et al., 1996). Ova cDNK, sa približnom dužinom od jedne trećine TGEV genoma, je klonirana u low-copy pACNR1180 plazmid (plazmid u kome se dobija mali broj kopija) (Ruggli et al., 1996) i njena sekvenca je određena. cDNK koja kodira defektan genom je efikasno izdvojena (replikovana i upakovana) uz pomoć komplementirajućeg virusa (Mendez et al., 1996; Izeta et al., 1999).
Dl-C genom predstavlja tri delecije (A1, A2 i A3) od približno 10, 1 i 8 kilobaza (kb), na ORF 1a, 1b i između gena S i 7, respektivno (pogledati Sliku 1).
Strategija koja je korišćena za kompletiranje sekvence cDNK koja će kodirati infektivan TGEV genom je bila inkorporisati, korak po korak, sekvence deletirane u Dl-C genomu, analiziranjem bakteriotoksičnosti novostvorenih konstrukcija. Ovaj aspekt je veoma važan, s obzirom da je opsežno dokumentovano u naučnoj literaturi da su rekombinantni plazmidi koji predstavljaju cDNK od RNK virusa u opštem slučaju slabo rasli i bili nestabilni (Boyer and Haenni, 1994; Rice et al., 1989; Mandl et al., 1997).
Prva delecija koju je trebalo kompletirati bila je delecija A2, od 1 kb, od ORF 1b, dajući stabilan rekombinantan plazmid. Sekvenca koja je nedostajala kod ORF 1a je uvedena kloniranjem cDNK fragmentata A, B, C i D (Slika 1) (Almazan et al., 2000) na takav način da je celokupna informacija neophodna za gen replikaze bila kompletna. Dobijeni rekombinantni plazmid je bio nestabilan u bakterijama, stvarajući nove plazmide koji su inkorporisali adicije i delecije u fragmentu B (Almazan et al., 2000). Interesantno, eliminacija 5,198 bp Clal-Clal restrikcionog fragmenta koji obuhvata region genoma koji se nalazi između nukleotida 4,417 i 9,615 (Penzes et al., 1999) je proizvela relativno stabilan plazmid uE. coliDH10B soju. Kasnije, sekvenca delecije A3 je dodata kloniranjem celokupne genetske informacije za strukturne i nestrukturne proteine 3'-kraja TGEV genoma (Slika 1).
Radi povećanja stabilnosti TGEV cDNK, odlučeno je da bi trebalo da se ista subklonira u BAC upotrebom pBeloBACU plazmida (Kim et al., 1992) (pogledati Sliku 2). PBeloBACU plazmid je velikodušan poklon od strane H. Shizuva i M. Simon (California Institute of Technologv). Plazmid, 7,507 bp veličine, obuhvata origin replikacije (replikacioni početak) F faktora iz parB, parC,E. coli(oriS) i gene neophodne da bi se zadržala jedna kopija plazmida po ćeliji (parA i repE). Plazmid takođe poseduje gen za otpornost na hloramfenikol (cat) kao selekcioni marker. cDNK je klonirana pod kontrolom IE promotora CMV, zahvaljujući visokom nivou ekspresije dobijenom korišćenjem ovog promotora (Dubenskv et al., 1996) i zbog prethodnih rezultata dobijenih u laboratoriji, koji ukazuju da su veliki (9.7 kb i 15 kb) defektni genomi dobijeni od TGEV eksprimovanih RNK koje nisu splajsovane tokom transporta iz jedra, gde su se sintetisali, ka citoplazmi (Izeta et al., 1999; Penzes et al., 1999; Almazan et al., 2000). Stvorena TGEV cDNK (pBAC-TcDNA-ACIal) koja sadrži informaciju za gene replikaze, sa izuzetkom deletiranog 5,198 bp Clal fragmenta, i celokupnu informaciju strukturnih i nestruktumih gena. 3'-kraj cDNK je ograničen sa 24 nt poliA sekvencom, HDV ribozomom i terminacionom sekvencom transkripcije BGH (Izeta et al., 1999). Sa druge strane, Clal fragment neophodan za stvaranje kompletnog genoma TGEV je kloniran u BAC, stvarajući plazmid pBAC-B+C+D5", koji sadrži region TGEV genoma između 4,310 i 9,758 (pogledati Sliku 3) . Oba plazmida su uzgajanau E. coliDH10B soju i sekvencirana u potpunosti. Dobijena sekvenca je bila identična sa odgovarajućom sekvencom PUR46-MAD izolata TGEV koja je data na kraju ovog dokumenta (SEQ ID NO: 1), sa izuzetkom dve zamene u nukleotidnim pozicijama 6,752 (A => G, tiha) i 18,997 (T => C, tiha) i promena u S genu PUR46-MAD koji je zamenjen D genom izolata C11 (ove promene su naznačene na Slici 4) .
Dalje, radi stvaranja cDNK koja bi kodirala virulentni TGEV, S gen PUR46-MAD izolata, koji se replicira na visokom nivou u respiratornom traktu (> 10<6>PFU/g tkiva) i na niskom nivou u intestinalnom traktu (< 10<3>PFU/mL), kompletno je zamenjen S genom TGEV klona 11, koji će se nadalje označavati kao C11, koji se replikuje sa povećanim titrima i u respiratornom traktu (< 10<6>PFU/mL) i u intestinalnom traktu (< 10<6>PFU/mL) (Sanchez et al., 1999). S gen C11 predstavlja 14 nukleotida koji se razlikuju od S gena PUR46-MAD izolata, plus 6 nt insercija na 5'-kraju S gena (pogledati sliku 4) (Sanchez et al., 1999). Prethodni rezultati u našoj laboratoriji (Sanchez et al., 1999) su pokazali da su mutanti stvoreni usmerenom rekombinacijom, u kojima je S gen PUR46-MAD izolata TGEV zamenjen S genom C11 intestinalnog izolata, postigli intestinalni tropizam i povećanu virulentnost, za razliku od prirodnog PUR46-MAD izolata TGEV koji se ili vrlo malo replikuje ili se uopšte ne replikuje u intestinalnom traktu inficiranih svinja.
cDNK je konstruisana od PUR46-MAD izolata TGEV sa S genom intestinalnog izolata C11, kloniranjem 5,198 bp Clal-Clal fragmenta, dobijenog od pBAC-B+C+D5' plazmida, u
pBAC-TcDNA"<AC>lalpla<z>mid, da bi se stvorio pBAC-TcDNA"- plazmid koji sadrži cDNK koja kodira za kompletan TGEV genom (Slika 3).
Stabilnost plazmida upotrebljenih u konstrukciji klona infektivne cDNK (pBAC-TcDNA"ACIa<l>i pBAC-Clal<F>) kao i plazmida koji sadrži kompletnu cDNK (pBAC-TcDNA111-) u bakterijama je analizirano nakon uzgajanja 160 njihovih generacija uE. coli.Stabilnost je analizirana digestijom prečišćenih DNK sa restrikcionim enzimima. Nisu otkrivene ni delecije ni insercije, iako se u slučaju pBAC-TcDNA"<ACIaI>plazmida i pBAC-B+C+D5' plazmida ne može potpuno isključiti prisustvo malih promena koje nisu otkrivene tehnikama korišćene analize. U slučaju pBAC-TcDNA plazmida, koji sadrži kompletan genom TGEV, izvesna nestabilnost je otkrivena posle 40 generacija (u ovom trenutku približno 80% DNK imalo je ispravanu restrikcionu šemu). Ova neznatna nestabilnost, međutim, ne predstavlja prepreku oslobađanju infektivnog virusa, s obzirom da je 20 generacija (4 L kulture) bakterijskog rasta dovoljno da bi se stvorila ona količina plazmidne DNK koja dozvoljava da se virus oslobodi.
1.2 Dobijanje infektivnog TGEV od cDNK koja kodira kompletan genom
ST ćelije su transficirane sa pBAC-TcDNA"- plazmidom. 48 časova posle transfekcije sakupljen je supematant kulture i prenošen je u ST ćelije šest puta (pogledati Sliku 5). Sa početkom na prenosu 2, 14 časova posle infekcije, postao je vidljiv citopatski efekat, proširujući se kasnije, 20 časova posle infekcije, na praktično sve ćelije koje su formirale monosloj (pogledati Sliku 6). Sa druge strane, titar oslobođenog virusa se brzo povećao sa prenosima, dostižući vrednosti reda veličine od 10<8>PFU/mL kao kod prenosa 3 (pogledati sliku 7). Eksperiment je ponavljan pet puta i u svim slučajevima oslobođen je infektivan virus sa sličnim titrima, budući da u slučaju netransficiranih ST ćelija ili ST ćelija transficiranih sa sličnim plazmidom, gde je Clal-Clal fragment pronađen u suprotnom smeru, virus nikada nije oslobođen.
U svrhu eliminisanja mogućnosti da je dobijeni virus proizvod kontaminacije, određena je sekvenca na pozicijama 6,752 i 18,997 sekvenciranjem cDNK fragmenata amplifikovanih pomoću RT-PCR upotrebom genomske RNK oslobođenog virusa kao kalupa. Analiza sekvence je odredila da su nukleotidi u pozicijama 6,752 i 18,997 oni koji su prisutni u cDNK. Dalje, oslobođeni virus je u cDNK sekvenci S gena pokazivao restrikciono mesto Dralll na poziciji 20,990, kao što se očekivalo za S gen C11 (Slika 8). Prisustvo tri genetička markera je potvrdilo da je izolovani virus poreklom iz cDNK.
U detaljnijoj karakterizaciji stvorenog virusa, izvedena je komparativna analiza imunofluorescencijom inficiranih ćelija sa oslobođenim virusom (TcDNK) posle transfekcije sa pBAC-TcDNA<FL>plazmidom ili ćelija inficiranih sa PUR46-MAD izolatom TGEV. Za ovo su upotrebljena posebna poliklonalna ili monoklonalna antitela koja prepoznaju i C11 izolat i PUR46-MAD izolat, ili samo poslednji (pogledati Sliku 10). Dobijeni rezultati su potvrdili očekivanu antigenost za novi TcDNA virus. Poliklonalno antitelo specifično za TGEV, očekivano specifično monoklonalno S proteina (ID.B12 i 6A.C3), kao i specifično monoklonalno M (3B.B3) i N (3B.D8) proteina prepoznaju i TcDNK i PUR46-MAD: Dobijeni podaci ukazuju da je stvoreni virus prikazivao M i N proteine PUR46-MAD izolata i S protein C11 izolata, kao što je projektovano u originalnoj cDNK.
1.3 In vivo infektivnost i virulentnost
U svrhu analiziranja in vivo infektivnosti TcDNA virusa, grupa novorođenih svinja je inokulirana virusom koji je kloniran iz prenosa 6 i analiziran je mortalitet. Pet inokuliranih svinja je umrlo 3 do 4 dana posle inokulacije, ukazujući na to da je TcDNA virus bio virulentan. Nasuprot tome, dve svinje inokulirane samo sa razblaživačem virusa i zadržane u istim uslovima nisu pretrpele promene.
1.4 Optimizacija nivoa ekspresije modifikacijom sekvenci koje regulišu transkripciju
Sinteza RNK u korona virus-u se odigrava pomoću RNK-zavisnog procesa, u kome se iRNK transkribuju od šablona sa negativnim polaritetom. U TGEV javlja se konzervativna konsenzus sekvenca, CUAAAC, koja je locirana neposredno ispred većine gena. Ove sekvence predstavljaju signale za transkripciju subgenomskih iRNK. U korona virus-u postoji između šest i osam tipova iRNK različitih veličina, u zavisnosti od tipa korona virusa i od domaćina. Najveće odgovaraju genomskoj RNK, koja zauzvrat služi kao iRNK za ORF 1a i 1b. Ostatak iRNK odgovara subgenomskim iRNK. Ove RNK su označene kao iRNK 1 do 7, u opadajućem redosledu. Sa druge strane, neke iRNK koje su otkrivene posle grupe originalno opisanih iRNK označene su imenom odgovarajuće iRNK, crticom, i brojem, npr., iRNK 2-1. iRNK pokazuju koterminalnu strukturu u odnosu na strukturu genomske RNK. Sa izuzetkom najmanje iRNK, ostale su strukturno policistronske, dok je, u opštem slučaju, samo ORF lociran najbliže 5' translatiran.
Efikasnost u ekspresiji marker gena (GUS) je proučavana korišćenjem različitih sekvenci koje ograničavaju 5'-kraj minimalno intergenske (IG) sekvence CUAAAC (Slika 11), različitih sekvenci koje ograničavaju 3'-kraj IG sekvence (Slika 12) i različitih mesta insercije (Slika 13). Dobijeni rezultati (Slike 11 do 13) ukazuju da je optimalna ekspresija postignuta sa TRS koji se sastoji od: (i) -88 nt koja ograničava odgovarajuću sekvencu za N gen TGEV; (ii) IG sekvence; i (iii) 3'-ograničavajuće sekvence IG sekvence S gena. Dalje, u skladu sa rezultatima koji su dobijeni u vezi sa položajem insercije heterolognog gena, najveći nivoi ekspresije su postignuti kada je heterologni gen lociran na 3'-kraju genoma. TRS kao onaj što je opisan dozvoljava da se GUS eksprimira na nivoima između 2 i 8 ug po 106 ćelija.
1.5 Tkivna specifičnost sistema ekspresije
Mnogi patogeni ulaze u domaćina kroz mukozne membrane. Da bi se sprečio ovaj tip infekcija, važno je razviti sisteme ekspresije koji dozvoljavaju indukciju visokih nivoa sekretornog imuniteta. Ovo se može postići fundamentalno kroz primenu antigena u limfnim čvorovima povezanih sa respiratornim i intestinalnim traktom. Da bi se postigao ovaj cilj i, uopšteno, da bi se usmerila ekspresija gena na tkivo koje nas zanima, proučavane su molekularne osnove tropizma TGEV. Ove studije su pokazale da se tkivna specifičnost TGEV može modifikovati konstrukcijom rekombinantnih virusa koji sadrže S gen korona virusa sa željenim tropizmom (Ballesteros et al., 1997; Sanchez et al., 1999). Ova informacija čini mogućim konstruisanje sistema ekspresije baziranih na cDNK genomima korona virusa sa respiratornim ili intestinalnim tropizmom.
1.6 Ekspresija viralnog antigena koju kodira ORF5 PRRSV upotrebom infektivne cDNK
U svrhu optimizovanja nivoa ekspresije hetrolognih gena stvarane su konstrukcije od vektora razmenljivih modula koji su ograničeni sa oba kraja klonirajućim sekvencama koje olakšavaju razmenu TRS i heterolognih gena unutar vektora. Konstrukcija, koja obuhvata ORF 5 PRRSV (virus svinjskog respiratornog i reproduktivnog sindroma) ograničena na 5'-kraju sa minimalnom IGS konsenzus sekvencom (CUAAAC) pre koje se nalazi -88nts koji ograničavaju gen viralnog nukleokapsida (N) i na 3'-kraju restrikcionim mestom Sali (GTCGAC) i sekvencu koja je analogna onom od Kozak (AC)GACC, proizvela je optimalnu ekspresiju (oko 10 u.g/106 ćelija). U principu, ovi nivoi ekpresije heterolognog gena su više nego dovoljni da indukuju imunski odgovor. Heterologni gen je ubačen u poziciju koju su prethodno zauzimali geni 3a i 3b virusa, koji nisu bitni.
1.7 Indukcija imunog odgovora kod svinje na antigen eksprimiran sa virusnim vektorom dobijenim od cDNK
Korišćenjem istog tipa virusnog vektora dobijenog od cDNK i TRS opisanih u prethodnom tekstu, gen koji kodira zeleni fluorescentni protein (GFP) je eksprimiran na visokim nivoima (20 p.g proteina po milion ćelija u tetsisu svinje, ST, ćelija). Nivoi ekspresije su bili stabilni više od 20 prenosa (razblaženja) u kulturi ćelija. Dalje, grupa svinja je imunizovana sa živim virusnim vektorom, koji je primenjen oralno, intranazalno i intragastično i detektovan je jak humoralni imunski odgovor protiv oba virusna vektora i GFP. Interesantno, nije primećen nikakav sekundarni efekat kod inokuliranih životinja posle primene tri doze virusnog vektora.
1.8 Konstrukcija bezbednog virusnog vektora koji eksprimira strani gen bez stvaranja infektivnog virusa.
Da bi se projektovao vektor za ljude, biobezbednost je prioritet. Da bi se postigao ovaj cilj, konstruisana su tri tipa bezbednosnih sistema u vektoru. Od njih su dva bazirana na deleciji dve virusne komponente, koja se nalaze na različitim pozicijama virunog genoma, esencijalne za replikaciju virusa. Ove komponente su date utransod strane ćelijske linije za pakovanje. Ova ćelija (bubreg mladunca hrčka, BHK) eksprimira TGEV gene koji nedostaju i koji kodiraju esencijalne strukturne proteine virusa (proteini omotača E i membranski M proteini). Treći bezbedonosni sitem je premeštanje signala za pakovanje virusnog genoma, na takav način da je stvaranje infektivnog virusa rekombinacijom sprečeno, što vodi stvaranju samoubilačkog vektora koji efikasno eksprimira heterologne gene, ali koji je nesposoban da se prenosi čak i do najbližih susednih ćelija.
Sa projektovanjem novog vektora za upotrebu kod ljudi, ne proizvodimo novi virus koji bi se mogao preneti u okviru ljudske vrste, s obzirom da se ovaj vektor ne može prenositi od ćelije do ćelije kod ljudi. Ovaj vektor je zasnovan na virusu sa defektnom replikacijom. Može se samo uzgajati u fabrici vakcina korišćenjem ćelija za pakovanje koje omogućavaju komplementaciju delecija kod virusa. Ovi bezbedonosni sistemi predstavljaju nove postupke u konstruisanju korona virusa. Rekombinantni virus sa novim tropizmom će biti replikaciono kompetentan bar u mačjim ćelijama, s obzirom da ove ćelije replikuju humane, svinjske, pseće i mačje korona virus-e.
Sladištenje mikroorganizama:
Bakterija dobijena odEscherichia coli,koja nosi plazmid sa infektivnim klonom pronalaska, identifikovana kao Escherichia coli pBAC-TcDNA<FL>, je uskladištena u Spanish Collection of Type Cultures (CECT) - španskoj kolekciji tipskih kultura, Burjassot (Valencia), 24. novembar 1999., pod registracionim brojem CECT 5265.

Claims (18)

1. Postupak za dobijanje DNK koja sadrži sekvence izvedene od genomske RNK (gRNK) korona virusa gde date sekvence imaju najmanje 60% homologije sa prirodnim sekvencama virusa i koje kodiraju RNK polimerazu zavisnu od RNK i najmanje jedan strukturni ili nestrukturni protein, gde fragment date DNK može da se transkribuje u RNK i upakuje u virion, naznačen time, što obuhvata korake u kojima se interferentni defektni genom korona virusa klonira pod ekspresijom promotora u veštački bakterijski hromozom (BAC) i deletirane sekvence defektnog genoma se ponovo ubacuju u dati genom.
2. Postupak za pripremanje DNK prema patetnom zahtevu 1, naznačen time, što su sekvence unutar viralnog genoma, koje su toksične za bakteriju u kojoj će on biti kloniran, identifikovane pre ponovnog ubacivanja u datu DNK.
3. Postupak za pripremanje DNK prema patentnom zahtevu 1 ili 2, naznačen time, što su toksične sekvence unutar viralnog genoma poslednje sekvence koje će se ponovo ubaciti kada se kompletira genom .
4. Postupak za pripremanje DNK prema patetnom zahtevu 1 do 3, naznačen time, što je dobijen infektivni klon koji sadrži kopiju pune dužine DNK komplementarne (cDNK) genomskoj RNK (gRNK) korona virusa, kloniranu sa sekvencom za regulaciju transkripcije pri čemu postupak obuhvata sastavljanje cDNK pune dužine od gRNK korona virusa i povezivanje elemenata koji regulišu transkripciju sa cDNK pune dužine.
5. Postupak za pripremanje DNK prema zahtevu 4, naznačen time, što stvaranje cDNK pune dužine od gRNK korona virusa obuhvata: (i) kloniranje interferentnog defektnog genoma dobijenog od datog korona virusa pod promotorom ekspresije u BAC; (ii) popunjavanje delecija datog interferentnog defektnog genoma obnavaljanjem deletiranih sekvenci u odnosu na infektivnu gRNK; (iii) identifikovanje toksičnih sekvenci za bakterije u koje će se one klonirati, uklanjanje toksičnih sekvenci i insercija datih toksičnih sekvenci neposredno pre transfekcije u eukariotskim ćelijama da bi se dobio cDNK klon, koji odgovara gRNK korona virusa.
6. Infektivni klon koji sadrži kopiju pune dužine DNK komplementarne (cDNK) genomskoj RNK (gRNK) korona virusa, kloniranu pod sekvencom za regulaciju transkripcije.
7. Infektivni klon prema zahtevu 6, naznačen time, što je dati korona virus izolat virusa svinjskog prenosivog gastroenteritisa (TGEV)
8. Infektivni klon prema zahtevu 6 ili 7, naznačen time, što je dati promotor, neposredno raniji (IE) promotor ekspresije citomegalovirusa (CMV).
9. Infektivni klon prema jednom od zahteva 6 do 8, naznačen time, što je cDNK pune dužine ograničena na 3'-kraju, poli(A) repom, ribozimom virusa hepatitisa delta (HDV) i terminacionim i poliadenilacionim sekvencama goveđeg hormona rasta (BGH).
10. Infektivni klon prema jednom od zahteva 6 do 9, naznačen time, što je data infektivna cDNK klonirana u bakterijskom veštačkom hromozomu (BAC).
11. Infektivni klon prema jednom od zahteva 6 do 10, naznačen time, što se data cDNK može dobiti od veštačkog bakterijskog hromozomaE. colideponovana kao CECT 5265 u Spanish Collection of Type Cultures
12.£. coli deponovanapod CECT 5265 u Spanish Collection of Type Cultures.
13. Rekombinantni virusni vektor koji sadrži infektivni klon prema zahtevu 6, naznačen time, što je modifikovan tako da sadrži heterolognu nukleinsku kiselinu ubačenu u dati infektivni klon pod uslovima koji dozvoljavaju datoj heterolognoj nukleinskoj kiselini da se eksprimira.
14. Vektor prema zahtevu 13, naznačen time, što je data heterologna nukleinska kiselina izabrana između gena i genskog fragmenta koji kodira željeni genski proizvod.
15. Vakcina za zaštitu životinju od bolesti izazvanih infektivnim agensom koja sadrži (i) najmanje jedan rekomibinantni virusni vektor prema zahtevu 13, pri čemu dati virusni vektor eksprimira najmanje jedan antigen pogodan za indukovanje imunog odgovora na infektivni agens, ili antitelo koje obezbeđuje zaštitu protiv datog infektivnog agensa, zajedno sa, po izboru, .. (ii) farmaceutski prihvatljivim e.ksipijensom.
16. Vakcina prema patentnom zahtevu 15, naznačena time, gde dati virusni vektor eksprimira najmanje jedan antigen koji je u stanju da indukuje sistemski imuni odgovor i/ili imunski odgovor u mukoznim membranama protiv različitih infektivnih agenasa koji se propagiraju u respiratornim ili intestinalnim mukoznim membranama
17. Vakcina prema zahtevu 15 li 16, naznačena time, što je to multivalentna vakcina za zaštitu od infekcija izazvanim sa više od jednog infektivnog agensa.
18. Multivalentna vakcina prema zahtevu 17, koja sadrži nezavisne rekombinante viralne vektore koje bi se pomešali i zajedno inokulirali, pri čemu svaki od rekombinantnih virusnih vektora eksprimira najmanje jedan različit antigen ili različito antitelo.
YUP-375/02A 1999-12-03 2000-11-30 Infektivni klonovi RS50372B (sr)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
ES009902673A ES2170622B1 (es) 1999-12-03 1999-12-03 Clones y vectores infectivos derivados de coronavirus y sus aplicaciones.

Publications (2)

Publication Number Publication Date
YU37502A YU37502A (sh) 2005-11-28
RS50372B true RS50372B (sr) 2009-11-10

Family

ID=8310818

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
YUP-375/02A RS50372B (sr) 1999-12-03 2000-11-30 Infektivni klonovi

Country Status (27)

Country Link
US (4) US7445928B2 (sr)
EP (2) EP1437400A3 (sr)
JP (1) JP4637432B2 (sr)
KR (1) KR100755814B1 (sr)
CN (3) CN100402643C (sr)
AR (1) AR027893A1 (sr)
AT (1) ATE267246T1 (sr)
AU (2) AU785081B2 (sr)
BR (1) BR0016145A (sr)
CA (1) CA2393325A1 (sr)
CZ (1) CZ302785B6 (sr)
DE (1) DE60010921T3 (sr)
DK (1) DK1234024T4 (sr)
ES (2) ES2170622B1 (sr)
HU (1) HU228205B1 (sr)
IL (2) IL149859A0 (sr)
MX (1) MXPA02005525A (sr)
NO (1) NO331812B1 (sr)
NZ (1) NZ518990A (sr)
PL (1) PL206816B1 (sr)
PT (1) PT1234024E (sr)
RS (1) RS50372B (sr)
SI (1) SI1234024T2 (sr)
SK (1) SK7612002A3 (sr)
TR (1) TR200401186T4 (sr)
WO (1) WO2001039797A2 (sr)
ZA (1) ZA200203560B (sr)

Families Citing this family (29)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2170622B1 (es) 1999-12-03 2004-05-16 Consejo Superior De Investigaciones Cientificas Clones y vectores infectivos derivados de coronavirus y sus aplicaciones.
EP1470218B1 (en) * 2001-05-17 2010-07-07 Universiteit Utrecht Corona-virus-like particles comprising functionally deleted genomes
US7556957B2 (en) 2001-05-17 2009-07-07 Stichting Voor De Technische Wetenschappen Coronavirus-like particles comprising functionally deleted genomes
US7906311B2 (en) 2002-03-20 2011-03-15 Merial Limited Cotton rat lung cells for virus culture
US7371837B2 (en) * 2004-07-21 2008-05-13 The University Of Hong Kong Human virus causing respiratory tract infection and uses thereof
EP1619246A1 (en) * 2004-07-23 2006-01-25 Université de la Méditerranée, Aix-Marseille II RNA dependent RNA polymerases from coronavirus and their use in molecular biology and drug screening
EP1632247A1 (en) * 2004-09-03 2006-03-08 Consejo Superior De Investigaciones Cientificas Nucleic acid sequences encoding FMDV proteins capable of associating into a virus-like particle
BRPI0514911A (pt) 2004-09-03 2008-06-24 Consejo Superior Investigacion seqüências de ácido nucléico codificando proteìnas que têm a capacidade de associar em uma partìcula similar a vìrus
CA2958259C (en) 2004-10-22 2020-06-30 Revivicor, Inc. Ungulates with genetically modified immune systems
EP1792996A1 (en) 2005-12-01 2007-06-06 Consejo Superior de Investigaciones Cientificas Nucleic acid sequences encoding vaccines against Porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV)
JP2007312649A (ja) * 2006-05-24 2007-12-06 Japan Health Science Foundation 再構築された感染性レトロウイルスゲノムクローンｄｎａ及びそれを含む微生物ならびにそれらの製造方法
ES2548377T3 (es) 2008-10-27 2015-10-16 Revivicor, Inc. Ungulados inmunodeprimidos
FR2947839A1 (fr) * 2009-07-09 2011-01-14 Centre Nat Rech Scient Nouveaux agents antibacteriens
EP2681232A1 (en) 2011-03-02 2014-01-08 Intervet International B.V. Infectious bronchitis virus (ibv) spike protein as subunit vaccine
GB201307528D0 (en) 2013-04-26 2013-06-12 Univ Leuven Kath Bacterial artificial chromosomes
JP2017515509A (ja) * 2014-05-16 2017-06-15 イエール ユニバーシティ ワクチン用途のための高力価ウイルス様ベシクルの進化の方法
CN106459998A (zh) * 2014-05-16 2017-02-22 耶鲁大学 预防或治疗慢性乙型肝炎病毒(hbv)感染的基于病毒样囊泡(vlv)的疫苗
BR112017005744B1 (pt) 2014-09-22 2023-11-28 Regents Of The University Of Minnesota "vírus pichinde geneticamente manipulado, método de fabricação e uso do mesmo, partícula viral infecciosa, composição, coleção de vetores, sistema de genética reversa e método de uso do mesmo"
GB201603374D0 (en) 2016-02-26 2016-04-13 Ucl Business Plc Packaging cell
CN107190022B (zh) * 2017-06-28 2020-10-30 浙江大学 一种快速构建禽传染性支气管炎病毒反向遗传株的方法
WO2019204654A1 (en) * 2018-04-18 2019-10-24 Utah State University Compositions and methods for zika virus characterization and vaccine development
KR102119875B1 (ko) * 2019-03-19 2020-06-05 한국화학연구원 한국형 중동호흡기증후군 코로나바이러스 감염성 변이 유전자 및 이의 용도
CN110468113A (zh) * 2019-08-07 2019-11-19 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所（中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心） 重组修饰的猪传染性胃肠炎病毒强毒株及其应用
CN110656120A (zh) * 2019-10-16 2020-01-07 中国医学科学院医学生物学研究所 一种乙脑病毒sa14-14-2的克隆方法及应用
CN111662885A (zh) * 2020-06-22 2020-09-15 扬州大学 两株基因组高度同源猪繁殖与呼吸综合征病毒强弱毒株感染性克隆构建、拯救与应用
US20230285544A1 (en) * 2020-08-03 2023-09-14 The Penn State Research Foundation Synthetic defective interfering coronaviruses
US11796111B2 (en) 2020-09-08 2023-10-24 Sunflower Therapeutics, Pbc Fluid transport and distribution manifold
CN112852873B (zh) * 2021-02-04 2023-03-24 华中农业大学 一种猪δ冠状病毒感染性克隆质粒的构建方法
CN115094142B (zh) * 2022-07-19 2024-05-28 中国医学科学院肿瘤医院 用于诊断肺肠型腺癌的甲基化标志物

Family Cites Families (57)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5833975A (en) * 1989-03-08 1998-11-10 Virogenetics Corporation Canarypox virus expressing cytokine and/or tumor-associated antigen DNA sequence
US5288641A (en) * 1984-06-04 1994-02-22 Arch Development Corporation Herpes Simplex virus as a vector
US4946787A (en) * 1985-01-07 1990-08-07 Syntex (U.S.A.) Inc. N-(ω,(ω-1)-dialkyloxy)- and N-(ω,(ω-1)-dialkenyloxy)-alk-1-yl-N,N,N-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor
US5545412A (en) * 1985-01-07 1996-08-13 Syntex (U.S.A.) Inc. N-[1, (1-1)-dialkyloxy]-and N-[1, (1-1)-dialkenyloxy]-alk-1-yl-n,n,n-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor
US5106733A (en) * 1987-06-25 1992-04-21 Immunex Corporation Bovine granulocyte-macrophage colony stimulating factor
CA2045129A1 (en) * 1989-02-01 1990-08-02 Alfred I. Geller Herpes simplex virus type i expression vector
US5811103A (en) * 1989-03-19 1998-09-22 Akzo Nobel N.V. Hog cholera virus vaccine and diagnostic
US5703055A (en) * 1989-03-21 1997-12-30 Wisconsin Alumni Research Foundation Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery
CA2039921A1 (en) 1990-04-16 1991-10-17 Xandra O. Breakefield Transfer and expression of gene sequences into central nervous system cells using herpes simplex virus mutants with deletions in genes for viral replication
US5264618A (en) * 1990-04-19 1993-11-23 Vical, Inc. Cationic lipids for intracellular delivery of biologically active molecules
JP3602530B2 (ja) * 1991-03-07 2004-12-15 ヴァイロジェネティクス コーポレイション 遺伝子操作したワクチン菌株
ES2026827A6 (es) * 1991-03-26 1992-05-01 Ercros Sa Procedimiento para la produccion de una vacuna subunidad contra el parvovirus porcino.
US5382425A (en) * 1992-01-13 1995-01-17 Syntro Corporation Recombinant swinepox virus
US6033904A (en) * 1992-01-13 2000-03-07 Syntro Corporation Recombinant swinepox virus
US5658724A (en) * 1992-07-31 1997-08-19 University Of Pittsburgh Of The Commonwealth System Of Higher Education Herpes simplex virus strains deficient for the essential immediate early genes ICP4 and ICP27 and methods for their production, growth and use
ES2152304T3 (es) * 1993-02-08 2001-02-01 Bayer Ag Procedimiento para el crecimiento del virus del sindrome reproductivo y respiratorio porcino y su uso en vacunas.
DE69434447T2 (de) * 1993-06-07 2006-05-18 Vical, Inc., San Diego Für die gentherapie verwendbare plasmide
US20020146392A1 (en) 1993-06-24 2002-10-10 Frank L. Graham Helper dependent adenovirus vectors based on site-specific recombinases
WO1995003400A1 (en) * 1993-07-23 1995-02-02 Johns Hopkins University School Of Medicine Recombinationally targeted cloning in yeast artificial chromosomes
US6015686A (en) * 1993-09-15 2000-01-18 Chiron Viagene, Inc. Eukaryotic layered vector initiation systems
EP0804249A2 (en) * 1994-03-15 1997-11-05 Brown University Research Foundation Polymeric gene delivery system
ATE298370T1 (de) * 1994-04-29 2005-07-15 Baxter Healthcare Sa Rekombinante poxviren mit fremdenpolynukleotiden in wichtigen regionen
GB2289279B (en) * 1994-05-13 1998-09-16 Iberica Cyanamid Diagnostic kits and vaccines containing recombinant PRRSV proteins
US5585096A (en) * 1994-06-23 1996-12-17 Georgetown University Replication-competent herpes simplex virus mediates destruction of neoplastic cells
GB9415319D0 (en) 1994-07-29 1994-09-21 Medical Res Council HSV viral vector
WO1996015779A1 (en) 1994-11-21 1996-05-30 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Unique associated kaposi's sarcoma virus sequences and uses thereof
US5719131A (en) * 1994-12-09 1998-02-17 Genzyme Corporation Cationic amphiphiles containing dialkylamine lipophilic groups for intracellular delivery of therapeutic molecules
EP1683858A3 (en) 1995-02-21 2006-08-02 Cantab Pharmaceuticals Research Limited Viral preparations, vectors, immunogens, and vaccines
US6043232A (en) * 1997-07-23 2000-03-28 Nitromed, Inc. Nitroso esters of beta-oxo-amides and aryl propionic acid derivatives of non-steroidal antiinflammatory drugs
US6019980A (en) * 1995-06-07 2000-02-01 Connaught Laboratories Limited Nucleic acid respiratory syncytial virus vaccines
US5820869A (en) * 1995-06-07 1998-10-13 American Home Products Corporation Recombinant raccoon pox viruses and their use as an effective vaccine against feline immunodeficiency virus infection
US5705385A (en) * 1995-06-07 1998-01-06 Inex Pharmaceuticals Corporation Lipid-nucleic acid particles prepared via a hydrophobic lipid-nucleic acid complex intermediate and use for gene transfer
US5851826A (en) 1995-07-26 1998-12-22 Children's Medical Center Corporation Helper virus-free herpesvirus vector packaging system
US5795872A (en) * 1995-09-19 1998-08-18 Pharmadigm, Inc. DNA construct for immunization
US6133243A (en) 1996-02-22 2000-10-17 Onyx Pharmaceuticals, Inc. Liposomal-viral DNA complexes for treating disease
ES2109189B1 (es) 1996-03-14 1998-05-16 Iberica Cyanamid Vectores basados en genomas virales defectivos recombinantes y su empleo en la formulacion de vacunas.
FR2751224B1 (fr) * 1996-07-19 1998-11-20 Rhone Merieux Formule de vaccin polynucleotidique contre les pathologies respiratoires et de reproduction des porcs
US5990091A (en) * 1997-03-12 1999-11-23 Virogenetics Corporation Vectors having enhanced expression, and methods of making and uses thereof
US6004777A (en) * 1997-03-12 1999-12-21 Virogenetics Corporation Vectors having enhanced expression, and methods of making and uses thereof
DE19733364A1 (de) * 1997-08-01 1999-02-04 Koszinowski Ulrich H Prof Verfahren zur Klonierung eines großen Virusgenoms
US6517843B1 (en) * 1999-08-31 2003-02-11 Merial Reduction of porcine circovirus-2 viral load with inactivated PCV-2
UA78180C2 (uk) * 1997-10-03 2007-03-15 Меріаль Кільцевий вірус свині типу ii, вакцини та діагностичні реагенти
US6391314B1 (en) * 1997-10-03 2002-05-21 Merial Porcine circoviruses vaccines diagnostic reagents
US7211379B2 (en) * 1997-10-03 2007-05-01 Merial Sas Prevention of myocarditis, abortion and intrauterine infection associated with porcine circovirus-2
FR2781159B1 (fr) * 1998-07-06 2000-10-06 Merial Sas Vaccin circovirus et parvovirus porcin
US6165493A (en) * 1997-10-22 2000-12-26 New York Blood Center, Inc. "Methods and compositions for decreasing the frequency of HIV, herpesvirus and sexually transmitted bacterial infections"
FR2772047B1 (fr) * 1997-12-05 2004-04-09 Ct Nat D Etudes Veterinaires E Sequence genomique et polypeptides de circovirus associe a la maladie de l'amaigrissement du porcelet (map), applications au diagnostic et a la prevention et/ou au traitement de l'infection
US20040062775A1 (en) * 1997-12-05 2004-04-01 Agence Francaise De Securite Sanitaire Des Aliments Circovirus sequences associated with piglet weight loss disease (PWD)
NZ505008A (en) * 1997-12-11 2003-07-25 Univ Saskatchewan Porcine circovirus (PCV) isolates from pigs displaying postweaning multisystemic wasting syndrome virus
US6277621B1 (en) * 1998-02-26 2001-08-21 Medigene, Inc. Artificial chromosome constructs containing foreign nucleic acid sequences
AU770002B2 (en) * 1998-03-13 2004-02-12 University Of Georgia Research Foundation, Inc., The Vaccines against circovirus infections
US6497883B1 (en) * 1999-06-10 2002-12-24 Merial Porcine circovirus recombinant poxvirus vaccine
ES2170622B1 (es) 1999-12-03 2004-05-16 Consejo Superior De Investigaciones Cientificas Clones y vectores infectivos derivados de coronavirus y sus aplicaciones.
EP1238092B1 (en) 1999-12-14 2007-01-24 Novartis AG Bovine immunodeficiency virus (biv) based vectors
US6593111B2 (en) * 2000-05-21 2003-07-15 University Of North Carolina At Chapel Hill Directional assembly of large viral genomes and chromosomes
DE10044648A1 (de) * 2000-09-08 2002-03-21 Aventis Behring Gmbh Verfahren zur Vermehrung oder zur Entfernung von Cirocoviren aus biologischem Material
KR100876629B1 (ko) * 2001-03-27 2009-01-07 유니버시티 오브 사스카췌완 써코바이러스의 배양 방법

Also Published As

Publication number Publication date
ATE267246T1 (de) 2004-06-15
WO2001039797A3 (en) 2002-01-24
NO20022419D0 (no) 2002-05-22
SI1234024T2 (sl) 2010-10-29
DK1234024T4 (da) 2010-10-11
DE60010921T2 (de) 2006-05-11
JP2003515335A (ja) 2003-05-07
MXPA02005525A (es) 2004-09-10
CZ20021882A3 (cs) 2002-11-13
KR100755814B1 (ko) 2007-09-07
PL206816B1 (pl) 2010-09-30
DE60010921D1 (de) 2004-06-24
WO2001039797A2 (en) 2001-06-07
DK1234024T3 (da) 2004-09-13
NO331812B1 (no) 2012-04-10
YU37502A (sh) 2005-11-28
AU2006203327A1 (en) 2006-08-31
ES2218276T3 (es) 2004-11-16
CN100402643C (zh) 2008-07-16
US7368557B2 (en) 2008-05-06
PT1234024E (pt) 2004-08-31
BR0016145A (pt) 2002-08-13
CN1616670A (zh) 2005-05-18
EP1234024B1 (en) 2004-05-19
ES2170622A1 (es) 2002-08-01
KR20020060251A (ko) 2002-07-16
NO20022419L (no) 2002-07-30
EP1437400A2 (en) 2004-07-14
NZ518990A (en) 2004-03-26
US7445928B2 (en) 2008-11-04
SK7612002A3 (en) 2002-11-06
EP1437400A3 (en) 2004-10-20
AU785081B2 (en) 2006-09-14
PL356390A1 (en) 2004-06-28
US20030148325A1 (en) 2003-08-07
HUP0203305A2 (hu) 2003-01-28
US20100167352A1 (en) 2010-07-01
ZA200203560B (en) 2003-03-26
US20110142879A1 (en) 2011-06-16
IL149859A (en) 2009-07-20
HUP0203305A3 (en) 2004-07-28
AU3005101A (en) 2001-06-12
CZ302785B6 (cs) 2011-11-09
JP4637432B2 (ja) 2011-02-23
TR200401186T4 (tr) 2004-07-21
CA2393325A1 (en) 2001-06-07
AU2006203327B2 (en) 2009-09-10
US20040086846A1 (en) 2004-05-06
DE60010921T3 (de) 2011-01-05
IL149859A0 (en) 2002-11-10
CN1402780A (zh) 2003-03-12
SI1234024T1 (en) 2004-08-31
EP1234024B2 (en) 2010-06-16
AR027893A1 (es) 2003-04-16
ES2170622B1 (es) 2004-05-16
ES2218276T5 (es) 2010-10-07
HU228205B1 (en) 2013-01-28
EP1234024A2 (en) 2002-08-28
CN1872994A (zh) 2006-12-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RS50372B (sr) Infektivni klonovi
KR100360327B1 (ko) 재조합결함성바이러스게놈계벡터및이들벡터를백신의제형화에사용하는방법
US7279327B2 (en) Methods for producing recombinant coronavirus
HK1064409A (en) Artificial chromosome constructs containing nucleic acid sequences capable of directing the formation of a recombinant rna-virus
MXPA04007178A (es) SECUENCIA DE áCIDO NUCLEICO QUE COMPRENDE LA SENAL DE ENCAPSIDACION DEL RNA DE UN CORONAVIRUS DEL GRUPO 1 Y SUS APLICACIONES.
HK1028067A (en) Vectors based on recombinant defective viral genomes, and their use in the formulation of vaccines