RS50510B - Formulacije koje sadrže ekteinascidin i disaharid - Google Patents

Abstract

Kompozicija naznačena time što sadrži ekteinascidin i disaharid.Prijava sadrži još 24 patentna zahteva.

Description

Predstavljeni pronalazak se odnosi na formulacije. Naročito se odnosi na kompozicije i formulacije ekteinascidina, kao što je ekteinascidin 743.

OSNOVA PRONALASKA

Ekteinascidini su identifikovani, strukturno okarakterisani i opisani su sintetički postupci za njihovo pripremanje. Videti na primer, R. Sakai, et al., 1992, Preo. Natl. Acad. Set USA 89, pages 11456-11460, "Additional antitumor ecteinascidins from Caribbean tunicate: Crvstal struetures and activities in vivo"; R. Menchaca, et al, 2003, J. Org. Chem. 68(23), pages 8859-8866, "Synthesis of natural ecteinascidins (ET-729, ET- 745, ET-759B, ET-736, ET-637, ET-594) from cyanosafracin B"; and I. Manzanares, et al, 2001, Curr. Med. • Chem. - Anti-Cancer Agents, 1, pages 257-276, "Advances in the Chemistrv and Pharmacology of Ecteinascidins, A Promising New Class of Anticancer Agents"; i reference koje se navode u ovim radovima. Ove reference opisuju ekteinascidine. Primeri ekteinascidina predstavljeni su sa ET-743, ET-729, ET-745, ET-759A, ET-759B, ET-759C, ET-770, ET-815, ET-731, ET-745B, ET-722, ET-736, ET-738, ET-808, ET-752, ET-594, ET-552, ET-637, ET-652, ET-583, ET-597, ET-596, ET-639, ET-641, i njihovim derivatima, kao što su acetilovani oblici, formilovani oblici, metilovani oblici, i oksidni oblici, kao što su N-oksidni oblici.

Strukturne karakterizacije takvih ekteinascidina ovde nisu ponovo eksplicirao date jer iz detaljnog opisa koji je dat u takvim radovima i citatima, svaka tehnički kvalifikovana osoba može dobiti takvu informaciju direktno iz izvora citiranih ovde i sličnih izvora.

Najmanje je jedno od ekteinascidin jedinjenja, ET-743, opsežno ispitivano, i ovde će

služiti za ilustraciju karakteristika pronalaska.

Ekteinascidin 743 (ET-743) je tetrahidroizohinolin alkaloid izolovan iz vrste morskih plaštašaEcteinascidia turbinatai ima sledeću strukturu:

Farmaceutska kompozicija koja sadrži ET-743 u kombinaciji sa farmaceutski prihvatljivim nosačem, razblaživačem ili inertnim puniocem navodi se u US 5,256,663.

Skoriji prikaz ET-743, njegove hernije, mehanizma delovanja i preklinički i klinički razvoj mogu se naći u van Kesteren, Ch. et at, 2003, Anti-Cancer Drugs, 14 (7), pages 487-502: "Yondelis (trabectedin, ET- 743): the development of an anticancer agent of marine origin", i referencama koje se u ovom radu navode.

ET-743 poseduje snažno antineoplastično dejstvo protiv niza različitih ksenograftova humanog tumora gajenih u atimusnim miševima, uključujući melanom i karcinom jajnika i dojke.

U kliničkoj fazi I ispitivanja ET-743, zabeleženi su obećavajući odgovori kod pacijenata sa sarkomom i karcinomom dojke i jajnika.

Prema tome, ovaj novi lek se trenutno intenzivno ispituje u nekoliko kliničkih ispitivanja faze II kod pacijenata sa kancerom sa nizom različitih neoplastičnih bolesti.

Kao što je objašnjeno u WO 0069441, i što je uključeno u celini na osnovu reference, ET-743 se nabavlja i čuva kao sterilni liofilizovani proizvod, a sadrži ET-743, manitol i fosfatni pufer. Poželjna formulacija je ona dobijena iz 0.9% natrijurnhlorida ili drugog pogodnog infuzionog nosača, 250 ug ET-743 sa 250 mg manitola, 34 mg monokalijum fosfata i fosforne kiseline za podešavanje pH vrednosti. Ova formulacija je zatim rekonstituisana i razblažena za intravenoznu injekciju.

ET-743 je kompleksan hemijski enitet, kao Što je otkriveno pre njegovih strukturnih karakteristika. Osim toga, ET-743 pokazuje ograničenu rastvorljivost u vodi, a njegovu stabilnost, naročito u biokompatibilnim oblicima i formulacijama, teško je predvideti i postići. Ove karakteristike zahtevaju uobičajene kvalifikacije i uobičajene metodologije u ovoj tehnologiji, naročito kada se radi o pripremi ET-743 formulacija koje će se koristiti u medicinske svrhe. Takve primene se poželjno oslanjaju na formulacije čije karakteristike obuhvataju jedno ili više od sledećeg: biokompatibilnost, stabilnost pod uslovima sredine ili pod uslovima koji su bliski uslovima sredine što je više moguće, sa što dužim rokom trajanja, i laka rekonstitutcija pri formiranju rekonstituisanih rastvora koji su stabilni pod uslovima sredine ili uslovima koji su bliski uslovima sredine što je duže moguće.

Međutim, uobičajene formulacije i metodologije za pripremu takvih formulacija ne obezbeđuju željene karakteristike i osobine kao što su one navedene u prethodnom tekstu. Na primer, u citiranom prikazu van Kesteren Ch, et al iz 2003 navode da „ET 743 ima ograničenu rastvorljivost u vodi. Međutim, podešavanjem pH vrednosti do 4, moguće je postići odgovarajuće koncentracije ET 743. Nestabilnost ET 743 u vodenom rastvoru zahteva liofilizaciju u cilju povećanja stabilnosti prilikom čuvanja farmaceutskog proizvoda. ET-743 je trenutno formulisan kao sterilni liofilizovani proizvod koji sadrži 250 ug aktivne supstance po jedinici doze, 250 mg manitola kao punioc i 0.05 M fosfatnog pufera na pH 4 u cilju rastvaranja ET-743. Ova formulacija je nestabilna pri dugotrajnom čuvanju u frižideru i na sobnoj temperaturi, i trebalo bi prema tome da se čuva između -15 i -25°C, zaštićena od svetlosti. Rekonstitucija se izvodi dodavanjem 5 ml vode za injekciju, uz naknadno razblaživanje u normalnom slanom rastvoru pre i.v. infuzije. Rekonstituisani rastvor je stabilan na temperaturi sredine do 24 časa".

U praksi se ovaj proizvod koji sadrži 250 ug ET-743 proizvodi sušenjem zamrzavanjem 5 ml rastvora koji sadrži ET-743, manitol, fosfatni pufer i vodu u ukalupljenim ampulama. Ukalupljene ampule koje sadrže 1 mg ET-743 takođe su proizvedene sušenjem zamrzavanjem 20 ml rastvora.

Sušenje zamrzavanjem obično obuhvata zamrzavanje rastvora, snižavanje pritiska u periodu primarnog sušenja kako bi se sublimacijom uklonila vodena para iz zamrznutog materijala i dobila polu-osušena masa, i povećanje temperature u periodu sekundarnog sušenja kako bi se uklonila preostala voda iz polu-osušene mase. Ampule se zatim zatvaraju.

Prethodno opisana uobičajena ET-743 formulacija ima nekoliko nedostataka. Jedna od njih je ta da se liofilizovana ET-743 formulacija mora čuvati na oko -20°C kako bi se sprečilo razlaganje ET-743 u cilju postizanja roka trajanja od najmanje 18 meseci.

Osim toga, ET-743 formulacije imaju problem formiranja relativno velikih količina ET-701 kao nečistoće. ET-701 je glavna nečistoća proizvedena u toku procesa liofilizacije i u toku čuvanja ET-743 formulacije. Ona nastaje iz hidrolize ET-743 i ima sledeću strukturu:

Formiranje nečistoća, međutim, smanjuje ili čak sprečava sposobnost da se formulacije standardizuju. Kao posledica toga, poželjno je obezbediti formulacije i postupke za pripremu istih koje obezbeđuju varijante čiji se sastav ne menja lako i neočekivano preko nekontrolisanog formiranja nečistoća.

Osim toga, sledeći nedostatak prethodno opisane uobičajene metodologije ET-743 formulacije je taj stoje za dobijanje liofilizovane formulacije neophodno sušiti zamrzavanjem relativno veliku količinu rastvora sa zapreminama punjenja od 5 do 20 ml. Nasuprot tome, bilo bi poželjno razviti metodologiju proizvodnje za formulacije sa jedinjenjima koja su kompleksna kao ET-743 koja dozvoljava pripremu formulacija sa višim koncentracijama aktivne supstance, tako da se zapremine koje su u opticaju smanjuju. Vreme i energija su potrebni u konvencionalnim metodama za korak sušenja zamrzavanjem, u pogledu relativno visokih zapremina punjenja od 5 ili 20 ml. Pored vremena i energije, takođe postoji rizik od razlaganja ET-743, naročito u sekundarnom sušenju.

U pogledu potencijala ET-743 formulacija kao antitumorskih sredstava, postoji potreba da se obezbedi formulacija koja može da reši probleme koje uobičajene formulacije i metodologije proizvodnje ne pokrivaju ili ne mogu u potpunosti da reše. Ovi problemi obuhvataju problem stabilnosti ET-743. Varijante ET-743 formulacija trebalo bi poželjno da pokažu povoljne osobine sušenja zamrzavanjem, trebalo bi poželjno da budu podložne lakoj rekonstituciji, i trebalo bi da poželjno pokažu osobine vezane za rastvaranje, kao što su usled razblaženja sa infuzionom tečnošću, uz istovremeno ispoljavanje što je više moguće poželjnih karakteristika formulacija za medicinsku upotrebu kao što je ovde razmatrano. Kao što je naznačeno u prethodnom tekstu, varijante ET-743 formulacija trebalo bi da budu stabilne u toku dugotrajnog čuvanja. Osim toga, formulacija i njena metodologija proizvodnje trebalo bi da zadovolje standarde biokompatibilnosti i trebalo bi tako da omoguće efikasnu primenu nosača formulacije koji nije toksičan, najmanje u koncentracijama korišćenim za infuziju.

Kao opšti pregled interakcija inertnog punioca-leka u izvornim formulacijama dao je Akers, MJ, in Journal of Pharmaceutical Sciences, 91, 2002, 2283-2300. Ovaj rad daje, pored ostalog, deo punilaca u lioprotektivnih sredstava, uključujući ovaj predmet u kontekstu liofilizacije.

Predviđeno je da su metodologije i formulacije razvijene u kontekstu ovog pronalaska, pored ET-743, primenljive na druge ekteinascidine.

CILJEVI PRONALASKA

Cilj ovog pronalaska je obezbediti stabilne formulacije ekteinascidina, i postupke za pripremu takvih formulacija.

Poseban cilj ovog pronalaska je obezbediti novu stabilnu formulaciju ET-743. Naročito, potrebna je formulacija koja ima veću stabilnost prilikom čuvanja. Postoji posebna potreba da se izbegne forrniranje nečistoća. Naročito, poželjno je obezbediti varijante formulacija koje su značajno bez ET-701.

Osim toga, drugi ciljevi ovog pronalaska odnose se na razvoj metodologija proizvodnje koje omogućavaju pripremu ET-743 formulacija sa koncentracijama ET-743 koje su više od onih postignutih uobičajenim sredstvima. Dodatni ciljevi odnose se na razvoj postupaka za poboljšanje rastvorljivosti hemijskih entiteta kompleksnih kao ET-743, čime bi se eventualno postiglo- povećanje koncentracije ET-743 u rastvoru za liofilizaciju, i na taj način smanjenje zapremine punjenja u ampulama pre liofilizacije formulacije.

REZIME PRONALASKA

Prema predstavljenom pronalasku date su ET-743 kompozicije koje sadrže ET-743 i disaharid, kao i postupci za pripremu takvih kompozicija. Poželjne varijante takvih kompozicija su farmaceutske čistoće.

Druge varijante ovog pronalaska obezbeđene su kompozicijama koje sadrže ekteinascidin i disaharid.

Neke varijante takvih kompozicija date su kao liofilizovane formulacije koje sadrže ekteinascidin kao što je ET 743 i disaharid. Dati su postupci za pripremu takvih formulacija.

Pronalazak daje postupke za smanjenje, ili čak značajno elmiinisanje, formiranja nečistoća u ET-743 formulacijama. Neke varijante obuhvataju metodologiju za smanjenje, ili čak značajnu eliminaciju, formiranja ET-701 u ET-743 formulacijama.

Pronalazak takođe daje metodologiju za efikasniju manipulaciju formulacija ekteinascidina kao što je ET-743, uključujući. postupke za pripremu formulacija veće koncentracije i postupke za smanjenje zaprcmine punjenja ampule kod proizvodnje liofilizovane formulacije.

Predstavljeni pronalazak takođe daje postupke za povećanje rastvorljivosti složenih hemijskih entiteta, kao što su ekteinascidini, uključujući, ali ne ograničavajući se na, ET- 743. Takvi postupci omogućavaju proizvodnju koncentrovanijeg rastvora ET-743 u rastvoru za liofilizaciju, što vodi ka smanjenju zapremina punjenja.

DETALJAN OPIS PRONALASKA

Našli smo u kontekstu ovog pronalaska da disaharidi stabilizuju formulacije ekteinascidina. Ekteinascidini, uključujući ET-743, su složeni hemijski entiteti čije ponašanje u formulacijama nije predvidivo prema ponašanju drugih nesrodnih hemijskih supstanci. Takvo ponašanje je čak teže predvideti kada je najmanje jedan ekteinascidin uključen kao aktivna supstanca u formulaciju koja bi trebalo da zadovolji standarde biokompatibilnosti, uključujući medicinske standarde. Dalje smo našli u ovom smislu da upotreba disaharida kao punioca može drastično da smanji formiranje nečistoća u toku procesa liofilizacije i čuvanja ET-743 kompozicija.

Kada varijante ovog pronalaska treba da obezbede ET-743 formulacije koje su značajno oslobođene od drugih ekteinascidina kao što je ET-701, ili u najmanjem slučaju sa sadržajem ET-701 što je ruže moguće, tada se ET-701 smatra nečistoćom čije bi prisustvo u formulaciji trebalo u najmanjem slučaju da se smanji.

Osim toga, primena disaharida takođe poboljšava uslove čuvanja omogućavajući dugotrajno čuvanje liofilizovane formulacije u širokom opsegu temperatura, uključujući uslove hlađenja i sobnu temperaturu. Termin "stabilan" kao što je ovde korišćen, na primer, izraz "stabilna ET-743 formulacija", odnosi se na formulaciju koja zadovoljava karakteristike stabilnosti kao što je ovde prikazano i njene ekvivalente, koje ne poseduju uobičajene formulacije i koje se ne postižu kada je formulacija pripremljena uobičajenim metodologijama proizvodnje.

Primeri varijanti predstavljenog pronalaska obezbeđeni su novim farmaceutski prihvatljivim kompozicijama koje sadrže ekteinascidin kao što je ET-743 i disaharid.

Kao što je navedeno u uvodu, ekteinascidini su široko opisani. Oni mogu imati sledeću opštu formulu (I):

gde:

R5 je OH, alkoksi ili alkanoiloksi;

R6 je vodonik, alkil, alkenil, alkinil ili aril;

R12 je vodonik, alkil, alkenil, alkinil ili aril;

R16 je vodonik, alkil, alkenil, alkinil ili aril;

R17 je OH, alkoksi ili alkanoiloksi;

R18 je OH, alkoksi ili alkanoiloksi;

R<2!>jc H, OH, CN ili druga nukleofilna grupa; i

R<a>je vodonik i Rb je izborno supstituisani amino, ili

R<a>sa R<b>formira karbonil funkcionalnu grupu =0, ili

R<a>, R<b>i ugljenik za koji su vezani formiraju tetramaroizoMnolin grupu.

U ovim jedinjenjima supstiruenti mogu biti izabrani u skladu sa sledećim uputstvom: Alkil i alkoksi grupe poželjno imaju od 1 do 12 atoma ugljenika. Još jedna poželjnija klasa alkil i alkoksi grupa ima od 1 do oko 6 atoma ugljenika, a najpoželjnije 1, 2, 3 ili 4 atoma ugljenika. Metil, etil i propil uključujući izopropil su posebno poželjne alkil grupe u jedinjenjima predstavljenog pronalaska. Metoksi, etoksi i propoksi uključujući izopropoksi su posebno poželjne alkil grupe u jedinjenjima predstavljenog pronalaska. Sledeća poželjnija klasa alkil i alkoksi grupa ima od 4 do oko 12 atoma ugljenika, još poželjnije od 5 do oko 8 atoma ugljenika, a najpoželjnije 5, 6, 7 ili 8 atoma ugljenika. Kao što je ovde korišćen, termin alkil, osim ukoliko nije na drugi način modifikovan, označava kako ciklične tako i neciklične grupe, iako će ciklične grupe sadržati najmanje tri ugljenična člana prstena.

Poželjne alkenil i alkinil grupe u jedinjenjima predstavljenog pronalaska imaju jednu ili više nezasićenih veza i od 2 do oko 12 atoma ugljenika. Jedna poželjnija klasa alkenil ili alkinil grupa ima od 2 do oko 6 atoma ugljenika, a najpoželjnije 2, 3 ili 4 atoma ugljenika Sledeća poželjnija klasa alkenil ili alkinil grupa ima od 4 do oko 12 atoma ugljenika, još poželjnije od 5 do oko 8 atoma ugljenika, a najpoželjnije 5,6, 7 ili 8 atoma ugljenika. Termini alkenil i alkinil kao što su ovde korišćeni označavaju kako ciklične tako i neciklične grupe.

Pogodne aril grupe ujedinjenjima predstavljenog pronalaska obuhvataju jedinjenja sa jednim ili više prstenova, uključujući jedinjenja sa više prstena koja sadrže odvojene i/ili fuzionisane aril grupe. Tipične aril grupe sadrže od 1 do 3 odvojena ili fuzionisana prstena i od 6 do oko 18 ugljenikovih atoma u prstenu. Posebno poželjne aril grupe obuhvataju supstituisani ili nesupstituisani fenil, naftil, bifenil, fenantril i antracil.

Pogodne alkanoiloksi i alkanoil grupe imaju od 2 do oko 20 atoma ugljenika, poželjnije od 2 do oko 8 atoma ugljenika, još poželjnije od 2 do oko 6 atoma ugljenika, čak poželjnije 2 atoma ugljenika. Sledeća poželjna klasa alkanoiloksi grupa ima od 12 do oko 20 ugljenika, još poželjnije od 14 do oko 18 atoma ugljenika, a najpoželjnije 15, 16, 17 ili 18 atoma ugljenika.

Prethodno pomenute grupe mogu biti supstituisane na jednom ili više dostupnih položaja jednom ili više pogodnih grupa kao što su OR, =0, SR , SOR, S02R, NO2, NHR, N(R)2=N-R', NHCOR', N(COR)2) NHS02R, CN, halogen, C(=0)R", C02R', OCf=0)R gde je svaka od R' grupa nezavisno izabrana iz grupe koju čine H, OH, N02, NH2, SH, CN, halogen, -O, C(0)H, Cf=0)CH3, C02H, supstituisani ili nesupstituisani C1-C12 alkil, supstituisani ili nesupstituisani C2-C12 alkenil, supstituisani ili nesupstituisani C2-Ci2alkinil i supstituisani ili nesupstituisani aril. Pogodni halogen supstituenti u jedinjenjima predstavljenog pronalaska obuhvataju F, Cl, Br i I.

Poželjna jedinjenja pronalaska su opšte formule (T) gde će se primeniti jedna ili više sledećih definicija: R<5>je alkanoiloksi;

R6 je metil;

R12 je metil;

R16 je metil;

R17 je metoksi;

R<18>jeOH;

R<21>jeH,OHiliCN;i

R" je vodonik i Rb je amido grupa, ili

Ra sa Rb formira -O, ili

R<a>, R<b>i ugljenik za koji su vezani formiraju grupu formule

(II):

Primeri jedinjenja za predstavljeni pronalazak obuhvataju prirodne ekteinascidine, kao što je ekteinascidin 743 i druga 1,4 premošćena fuzionisana jedinjenja ekteinascidina opisana na primer u US 5,089,273, US 5,478,932, US 5,654,426, US 5,721,362, US 6,124,293, US 5,149,804, US 09/546,877, US 5,985,876 i WO 01/77115.

Jedinjenja sledeće formule (III) posebno su poželjna:

gde je R<a>vodonik i Rb je amido formule -NHR<f->gde Rf je alkanoil, ili R<a>sa R<b>formira =Osili

R<a>, R<b>i ugljenik za koji su vezani formiraju grupu formule

OD:

Rd je alkanoil; i

R21jeH, OHiliCN.

Alkanoil grupe mogu biti acetil ili više, na primer do C20. Prema tome, poželjna jedinjenja ovog pronalaska obuhvataju:

i srodiia jedinjenja sa različitim acil grupama.

Ekteinascidin 743, takođe poznat kao ET743 ili ekteinascidin 743 posebno je poželjan.

Primeri pogodnih disaharida za kompozicije ovog pronalaska obuhvataju laktozu, trehalozu, saharozu i njihove kombinacije. Dodatni primeri disaharida koji se mogu koristiti u nekim varijantama ovog pronalaska obuhvataju najmanje jedan iz grupe sastavljene od maltoze, izomaltoze, celobioze, izosaharoze, izotrehaloze, sorboze, turanoze, melibioze, gentibioze i njihovih smeša. Trenutno je poželjna saharoza.

U drugim varijantama pronalaska, kompozicija sadrži ekteinascidin kao što je ET-743 i disaharid bez laktoze. U drugim varijantama pronalaska, kompozicija sadrži ekteinascidin kao što je ET-743 i disaharid bez trehaloze. U drugim varijantama pronalaska, kompozicija sadrži ekteinascidin kao što je ET-743 i disaharid bez saharoze. U drugim varijantama pronalaska, kompozicija sadrži ekteinascidin kao što je ET-743 i disahard bez maltoze. U drugim varijantama pronalaska, kompozicija sadrži ekteinascidin kao što je ET-743 i disaharid bez izomaltoze. U drugim varijantama pronalaska, kompozicija sadrži ekteinascidin kao što je ET-743 i disaharid bez celobioze. U drugim varijantama pronalaska, kompozicija sadrži ekteinascidin kao što je ET-743 i disaharid bez izosaharoze. U drugim varijantama pronalaska, kompozicija sadrži ekteinascidin kao stoje ET-743 i disaharid bez izotrehaloze. U drugim varijantama pronalaska, kompozicija sadrži ekteinascidin kao što je ET-743 i disaharid bez sorboze. U drugim varijantama pronalaska, kompozicija sadrži ekteinascidin kao što je ET-743 i disaharid bez turanoze. U drugim varijantama pronalaska, kompozicija sadrži ekteinascidin kao što je ET-743 i disaharid bez melibioze. U drugim varijantama pronalaska, kompozicija sadrži ekteinascidin kao što je ET-743 i disaharid bez gentibioze.

Prema tome, u nekim varijantama, kompozicija ovog pronalaska sadrži manje od 2% ili manje od 1% ili manje od 0.5% ili manje od 0.2% ili manje od 0.1% po masi najmanje jednog od, poželjno svakog od sledećeg, laktoze, trehaloze, saharoze, maltoze, izomaltoze, celobioze, izosaharoze, izotrehaloze, sorboze, turanoze, melibioze i gentibioze.

Termini „njihove smeše" i „njihove kombinacije" kao što su ovde korišćeni označavaju najmanje dva entiteta koji obezbeđuju prethodnu osnovu za termine „njihove smeše" ili „njihove kombinacije". Radi ilustracije, ali ne kao ograničenje, termini „proizvodi koji sadrže najmanje jedan od A, B, C i njihove smeše" označavaju varijante proizvoda za koji je bilo koje od sledećeg ispunjeno: A je u proizvodu; Bje u proizvodu; C je u proizvodu; A i B su u proizvodu; A i C su u proizvodu; B i C su u proizvodu; i A, B i C su u proizvodu.

Osim toga, podrazumeva se da se terrnini kao što su „reakcija", „formiranje", i srodni termini, odnose na hemijski entitet koji ovde označava bilo koji od: (a) hemijski entitet kao takav, i (b) hemijski entitet u obliku u kome je takav entitet prisutan u reakcionom medijumu. Analogno tome, imenovati hemijski entitet ili dati njegovu formulu u kontekstu funkcije ili koraka rekacije, ili imenovati ga ili dati njegovu formulu kao daje u medijumu, bilo čvrstom ili tečnom, uključujući proizvode, formulacije i kombinacije, ovde označava bilo koji od: (a) entitet kao takav, i (b) enzitet u obliku u kome je takav entitet prisutan u medijumu. Na primer, imenovanje kiselog hemijskog entiteta ovde označava bilo koji oblik ili oblike u kome je takav entitet prisutan u kontekstu u kome je on imenovan. Radi ilustracije, ali ne kao ograničenje, imenovanje hemijskog entiteta „natrijumhlorid" ili obezbeđivanje njegove hemijske formule ovde označava entitet NaCl kao takav dvoatomski molekul, ako je takav u obliku u kome je natrij umhlorid prisutan u odgovarajućem medijumu; on takođe označava skup nerazdvojenih i/ili razdvojenih hemijskih vrsta ako je natrijumhlorid u odgovarajućem medijumu potpuno ili delimično razdvojen, uključujući vrste u takvom medijumu koje su solvatirane, deo rešetke, vezane sa drugim vrstama, itd.

Svako jedinjenje koje se ovde navodi trebalo bi da predstavlja takvo specifično jedinjenje kao i određene varijacije ili oblike. Naročito, jedinjenja koja se ovde navode mogu imati asimetrične centre i prema tome postoje u različitim enantiomemim oblicima. Svi optički izomeri i stereoizomeri jedinjenja koja se ovde navode, kao i njihove smeše, razmatraju se u okviru obima formulacija i metodologije ovog pronalaska. Prema tome, svako dato jedinjenje koje se ovde navodi trebalo bi da predstavlja bilo koji od racemata, jednog ili više enantiomernih oblika, jedan ili više od diastereoizomernih oblika, jedan ili više od atropizomernih oblika i njihove smeše.

Osim toga, jedinjenja koja se ovde navode mogu da postoje kao geometrijski izomeri {tj., cis i trans izomeri), kao tautomeri ili kao atropizomeri. Pored toga, svako jedinjenje koje se ovde navodi trebalo bi da predstavlja hidrate, solvate i polimorfe, kao i njihove smeše kada takvi oblici postoje u medijumu. Pored toga, jedinjenja koja se ovde navode mogu da postoje u oblicima koji su obeleženi izotopom. Svi geometrijski izomeri, tautomeri, atropoizomeri, hidrati, solvati, polimorfi i oblici obeleženi izotopomjedinjenja koja se ovde navode, kao i njihove smeše, razmatraju u okviru obima formulacija i metodologije ovog pronalaska.

Da bi se obezbedio koncizniji opis, neki od kvantitativnih izraza koji su ovde dati nisu ograničeni terminom „oko". Razume se da, bilo da se termin „oko" koristi eksplicitno ili ne, svaka količina koja je ovde data označava stvarnu daru vrednost, i takođe bi trebalo da označava približnu vrednost takvoj datoj vrednosti koja bi bi se logično mogla izvesti na osnovu uobičajenih tehničkih kvalifikacija, uključujući ekvivalente i približne vrednosti kao posledice eksperimentalnih i/ili uslova merenja za takvu daru vrednost.

Aktivna supstanca ili supstance u kontekstu ovog pronalaska može biti prirodnog, polu-sintetičkog ili sintetičkog porekla, uključujući kombinacije porekla. U varijantama gde je aktivna supstanca ekteinascidin kao što je ET-743, ET-743 može biti prirodnog porekla, izolovan na primer iz tunikata rodaEcteinascidia,poželjno vrsteEcteinascidia turbinata.ET-743 može biti sintetičkog ili polu-sintetičkog porekla. Ovde se mogu navesti na primer WO 0069862 i WO 0187895, obe uključene u celini na osnovu reference.

Odnos aktivne supstance prema sredstvu za punjenje u varijantama ovog pronalaska određen je prema rastvorljivosti sredstva za punjenje i, kada je formulacija osušena zamrzavanjem, takođe na osnovu osobina sušenja zamrzavanjem sredstva za punjenje. Predviđa se da ovaj odnos (mas./mas.) može biti oko 1:1 u nekim varijantama, oko 1:5 u drugim varijantama, oko 1:10 u nekim varijantama, dok druge varijante ilustruju odnose u opsegu od oko 1:10 do oko 1:1. Predviđa se da druge vrijante imaju takve odnose u opsegu od oko 1:10 do oko 1:100, a još neke druge varijante imaju takve odnose u opsegu od oko 1:100 do oko 1:1500. Kada je aktivno jedinjenje ET-743, odnos (mas./mas.) ET-743 prema sredstvu za punjenje je obično od oko 1:100 do oko 1:1500, poželjno od oko 1:200 do oko 1:800, poželjnije od oko 1:250 do oko 1:600, a čak poželjnije oko 1:400.

Liofilizovani materijal je obično prisutan u ampuli koja sadrži naznačenu količinu ekteinascidina ili aktivnog jedinjenja. Kada je aktivno jedinjenje ET-743, aktivne količine su ilustrovane sa 250 ug i 1 mg.

Predstavljeni pronalazak nije ograničen određenim oblicima ili dizajnima pakovanja, sve dok je pakovanje prihvatljivo za njegovu nameravanu upotrebu i standarde. Varijante ovog pronalaska obezbeđene su sa formulacijom sadržanom u ampulama, poželjno presovanim ampulama.

Liofilizovane formulacije ovog pronalaska mogu biti rekonstituisane i razblažene tako da daju kompoziciju ovog pronalaska u obliku rastvora spremnog za intravenoznu injekciju. Stvarne količine rekonstituisane tečnosti nisu ograničavajuće karakteristike varijanti ovog pronalaska. Radi ilustracije, ali ne kao ograničenje, varijante liofilizovanih formulacija prema ovom pronalasku su rekonstituisane sa zapreminom vode. Većina takvih zapremina ne prelazi oko 20 ml, sa poželjnim zapreminama koje su u opsegu od oko 1 ml do oko 15 ml, poželjnije u opsegu od oko 1 ml do oko 10 ml, a čak poželjnije u opsegu od oko 1 ml do oko 4 ml. Kada je aktivna supstanca u obliku ET-743, rekonstituisani rastvor u takvim varijantama sadrži koncentraciju ET-743 do 500 ug/ml, sa poželjnim koncentracijama od oko 50 ug/ml, oko 100 ug/ml i oko 250 ug/ml.

Rekonstituisane varijante predstavljenog pronalaska mogu biti dodatno razblažene ako je to poželjno, sa ovim dodatnim razblaženjem koje ne predstavlja ograničenje predstavljenog pronalaska. Ovo dodatno razblaženje se poželjno izvodi sa vodenim sistemom koji je obično 0.9% natrijumhlorid ili 5% glukoza. Rekonstituisani rastvor će biti razblažen u zavisnosti od koncentracije u rekonstituisanom rastvoru i željene koncentracije u razblaženom rastvoru.

Varijante ET-743 formulacija prema ovom pronalasku mogu se koristiti u lečenju različitih kancera, uključujući lečenje bilo kog od sarkoma, leiomiosarkoma, liposarkoma, osteosarkoma, kancera jajnika, kancera dojke, melanoma, kolorektalnog kancera, mezotelioma, kancera bubrega, kancera endometrijuma i kancera pluća, i stanja sa većim brojem ovakvih oblika kancera. Razume se da se „lečenje" u ovom kontekstu odnosi na delovanje koje vodi poboljšanju stanja kancera. Varijante ET-743 formulacija prema ovom pronalasku mogu se takođe koristiti u lečenju teških stanja kancera koja nisu imala povoljan odgovor na druge tretmane. Pored toga, varijante formulacija prema ovom pronalasku mogu se koristiti u ispitivanjima sa laboratorijskim tkivima, uključujući, ali ne ograničavajući se na klinička ispitivanja, analitička ispitivanja i testove sa model-sistemima.

Varijante ovog pronalaska koje sadrže ekteinascidin kao što je ET-743 poželjno se primenjuju infuzijom. Korak infuzije se obično ponavlja na cikličnoj osnovi, koji se može ponavljati prikladno u toku, na primer, 1 do 20 ciklusa. Ciklus obuhvata fazu infuzije ET-743 formulacije, i obično takođe fazu u kojoj nema infuzije ET-743. Obično, ciklus se izvodi nedeljama, i tako da ciklus normalno sadrži jednu ili više nedelja faze infuzije ET-743, ijednu ili više nedelja za završetak ciklusa. Ciklus od 3 nedelje je poželjan, ali alternativno može biti od 1 do 6 nedelja. Faza infuzije može sama po sebi da bude jedna primena u svakom ciklusu od recimo 1 do 72 časa, uobičajenije od oko 1, 3 ili 24 Časa; ili infuzija na dnevnoj bazi u fazi infuzije ciklusa poželjno 1 do 5 časova, posebno 1 ili 3 časa; ili infuzija na nedeljnoj bazi u fazi infuzije ciklusa od poželjno 1 do 3 časa, naročito 2 ili 3 časa. Poželjna je jedna primena na početku svakog ciklusa. Poželjno, vreme infuzije je oko 1, 3 ili 24 časa.

Rekonstituisani i razblaženi rastvori predstavljaju primere varijanti ovog pronalaska. Formulacija koja je rekonstituisana i razblažena može se primeniti intravenozno primenom dostupnih protokola. Doza će biti izabrana na osnovu režima doziranja, imajući u vidu postojeće podatke o toksičnosti koja ograničava dozu, u vezi sa kojim videti na primer WO 0069441, WO 0236135 i WO 0339571, i van Kesteren, Ch. et al, 2003, Anti-Cancer Drugs, 14 (7), 487-502. Ove tri WO patentne specifikacije i ovaj rad van Kesteren-a uključeni su posebnim referencama.

Poželjni protokoli doziranja obuhvataju: a) oko 1.5 mg/m<2>površine tela, primenjeno kao intravenozna infuzija u toku 24 časa sa intervalom od tri nedelje između ciklusa; b) oko 1.3 mg/m<2>površine tela, primenjeno kao intravenozna infuzija u toku 3 časa sa intervalom od tri nedelje između ciklusa; c) oko 0.580 mg/m<2>površine tela, primenjeno nedeljno kao intravenozna infuzija u toku 3 časa u toku 3 nedelje i ostatak u toku jedne nedelje.

Ekteinascidin kao što je ET-743 može se koristiti u kombinaciji sa drugim lekom. Na primer, može se primenjivati sa drugim antitumorskim lekom. Čitaoca sada upućujemo na spisak u WO 0069441 i WO 0236135, čije se reference ovde navode. Primeri takvih drugih lekova obuhvataju doksorubicin, cisplatin, paklitaksel, karboplatin, pegilovani lipozomalni doksorubicin, docetaksel, kapecitabin i gemcitabin. Mogu se koristiti i lekovi sa drugim načinima delovanja, uključujući deksametazon. Primena drugog leka može biti pre, u toku ili posle primene ekteinascidina kao što je ET-743.

Varijante formulacija ovog pronalaska koje sadrže ekteinascidin kao što je ET-743 mogu se pripremiti sušenjem zamrzavanjem kompozicije ovog pronalaska u obliku rastvora za punjenje uključujući ekteinascidin i disaharid. Obično će rastvor za punjenje biti puferisan, na primer do pH vrednosti od oko 4. Pogodna sredstva za puferisanje obuhvataju fosfatni pufer i citratni pufer. Mogu se koristiti drugi mogući puferi, kao što su fosfatni / citratni pufer (smeša fosfatnog pufera i citratnog pufera), laktatni pufer, askorbatni pufer, tartarni / citratni pufer, bikarbonatni /hlorovodonična kiselina pufer, acetatni pufer, sukcinatni pufer i glicin / hlorovodonična kiselina pufer. Mogu se koristiti smeše pufera. Biokompatibilni puferi koji omogućavaju kontrolu pH vrednosti na željenoj vrednosti obezbeđuju dodatne varijante ovog pronalaska.

Druge komponente mogu biti uključene u rastvor za punjenje, na primer, površinski aktivna sredstva kao što je polioksietilen 20 sorbitan monooleat ili polioksil 40 stearat. Druga moguća površinski aktivna sredstva obuhvataju fosfolipide, kao što je lecitin; polioksietilen-polioksipropilen kopolimeri, kao što je Pluronic površinski aktivno sredstvo; polioksietilen estri 12-hidroksistearinske kiseline, kao što je Solutol površinski aktivno sredstvo; etoksilati holesterola, kao što su diacil glicerol, dialkil glicerol; soli žučne kiseline, kao što su natrijumholat natrijum deoksiholat; estri saharoze, kao Što je saharoza monolaurat, saharoza monooleat; polivinil pirolidon (PVP); ili polivinil alkohol (PVA).

Formulacija se normalno nabavlja kao ampula koja sadrži liofilizovani proizvod. Ovaj oblik u kome se nabavlja, međutim, nije ograničenje predstavljenog pronalaska. Da bi se obezbedila ampula koja sadrži liofilizovani proizvod, rastvor za punjenje se dodaje u ampulu i suši zamrzavanjem. Kao što je pomenuto ovde, sledeći cilj predstavljenog pronalaska je obezbediti postupak za poboljšanje rastvorljivosti ekteinascidina kao što je ET-743 u cilju povećanja koncentracije ekteinascidina u rastvoru i smanjenja zapremine punjenja u ampulama pre izvođenja procesa liofilizacije. Ova metodologija koja je razvijena u kontekstu predstavljenog pronalaska omogućava proizvodnju varijanti rastvora za punjenje sa koncentracijom aktivne supstance koja je veća od one dobijene prema uobičajenim metodologijama. Smanjene zapremine punjenja u poređenju sa uobičajenom formulacijom sa manitolom su prema tome dobijene ovde datom metodologijom. Ovo smanjenje zapremina punjenja omogućva uštedu vremena i energije u toku koraka sušenja zamrzavanjem. Pored toga, ovde takođe postoji smanjenje rizika od razlaganja ET-743, naročito u drugom sušenju.

Kao što je zabeleženo u prethodnom tekstu, ET 743 ima ograničenu rastvorljivost u vodi, videti na primer van Kesteren, Ch., et at, 2003, Anti-Cancer Drugs, 14 (7), pages 487-502. Uobičajene metodologije obezbeđuju podešavanje pH vrednosti međijuma do 4 primenom pufera, kako bi se povećala rastvorljivost ET 743. Ova kontrola pH vrednosti je uobičajeno postignuta sa 0.05 M fosfatnim puferom na pH 4. Nađeno je da je u kontekstu ovog pronalaska rastvorljivost ET-743 poboljšana u rastvoru za punjenje formiranjem predrastvora ET-743 u kiselini. Sa ovim predrastvaranjem koncentracja ET-743 u rastvoru za punjenje i ampuli može biti povećana i zapremina punjenja u ampuli može biti smanjena. U ovim varijantama predstavljenog pronalaska, zapremina punjenja je obično smanjena za oko 80% u odnosu na istu kod uobičajene zapremine punjenja. Radi ilustracije, ali ne kao ograničenje, varijante ovog pronalaska obezbeđuju zapreminu punjenja od 1 ml za ampulu koja sadrži 0.25 mg ET-743, i 4 ml za ampulu koja sadrži 1 mg ET-743. Zapremina punjenja može biti izborno dodatno smanjena u drugim varijantama ovog pronalaska povećanjem koncentracije ET-743.

Uobičajena metodologija sadržala je rastvaranje ET-743, manitola i 0.05 M fosfatnog pufera na pH vrednosti 4 zajedno sa vodom za injekciju; rastvorljivost rastvora za punjenje bila je ograničena kao posledica niske rastvorljivosti ET-743 u ovom medijumu. Nađeno je u kontekstu ovog pronalaska da predtretman ET-743 u kiselom rastvoru poboljšava rastvorljivost ET-743 i omogućava dobijanje rastvora za punjenje sa višim koncentracijama ET-743. Prema tome, predstavljeni pronalazak daje postupke korisne za poboljšanje rastvorljivosti ET-743 u rastvoru za punjenje koji obuhvataju rastvaranje ET-743 u kiselom medijumu, mešanje medijuma sa ET-743 sa drugim komponentama rastvora za punjenje, i izborno, podešavanje pH vrednosti. U nekim ilustrativnim, ali neograničavajućim, varijantama ovog pronalaska, podešavanje pH vrednosti se postiže sa fosfatnim puferom. Kiseli medijum pogodno ne sadrži ili ne sadrži značajne količine puferskih komponenti, i obično se sastoji od vodenog rastvora kiseline.

Ilustrativne varijante rastvora za punjenje za sušenje zamrzavanjem prema predstavljenom pronalasku date su kao rastvor ET-743 puferisan na pH 4 sa primamim kiselim kalijumfosfatom i fosfornom kiselinom sa saharozom kao sredstvom za punjenje.

Ilustrativna varijanta metodologije prema ovom pronalasku obezbeđuje sledeće: ET-743 je rastvoren u 0.1N fosfornoj kiselini. Zatim su pomešani voda za injekciju ("WF1"), primami kiseli kalijumfosfat, saharoza i ET-743 (prethodno rastvoren u 0.1N fosfornoj kiselini). Rastvaranje je vizuelno provereno pre nastavka, i rastvaranje je uzeto kao završeno kada je to vizuelno tako procenjeno. pH vrednost rastvora proverena je i podešena do vrednosti u opsegu od oko 1 do oko 5, poželjnije u opsegu od oko 2 do oko 4.5, čak poželjnije u opsegu od oko 3 do oko 4.5, a najpoželjnije do pH vrednosti od oko 4.0 laganim dodavanjem pogodne kiseline. Poželjna varijanta takve kiseline je fosforna kiselina, u kom slučaju je poželjna koncentracija oko 0.1 N. Pogodna baza je izborno dodata radi kontrole pH vrednosti. Poželjna varijanta takve baze je kalijumhidroksid, poželjno u rastvoru, u kom slučaju je poželjna koncentracija oko 0.1 N. Zapremina je konačno podešena dodavanjem pogodne, biokompatibilne tečnosti, poželjno WF1. Rastvor za punjenje je zatim punjen u ampule prema željenoj dozi.

Sušenje zamrzavanjem je izvedeno u nekim varijantama ovog pronalaska primenom skraćenih vremena sekundarnog sušenja. Poželjni protokol obuhvata hlađenje do temperature od oko -40°C, primarno sušenje na 40 do 80 ubar u trajanju od 10 do 50 časova, i sekindamo sušenje na nižem pritisku i iznad 0°C u trajanju od 10 do 50 časova. U drugim protokolima u kontekstu ovog pronalaska poželjno je hlađenje do temperatura ispod -40°C.

Varijante ovog pronalaska sadrže liofilizaciju hlađenjem proizvoda ispod -40°C. Primamo sušenje je izvedeno na temperaturi od oko -20°C do oko -26°C i pritisku od oko 60 jibar približno 15 do 40 časova. Sekundarno sušenje je izvedeno na temperaturi od oko 20°C do oko 30°C i pritisku od oko 100 ubar približno 20 do 40 časova.

Varijante liofilizovanih formulacija ovog pronalaska su pogodne za čuvanje na temperaturama značajno višim od temperatura koje su uobičajene za čuvanje formulacija. Primeri temperatura čuvanja za formulacije prema ovom pronalasku su oko +5°C. Ove temperature se lako obezbeđuju u običnim frižiderima.

CRTEŽI PRONALASKA

Slika 1. Uporedno ispitivanje stabilnosti. Procena čistoće ET-743 posle 6 meseci čuvanja na 5°C.

Slika 2. Uporedno ispitivanje stabilnosti. Procena Čistoće ET-743 posle 12 meseci na 5°C.

Slika 3. Proizvodnja nečistoće ET-701 u različitim formulacijama čuvanim u toku 9 meseci na 5°C.

Slika 4. Komparativni razvoj ET-743 % čistoće novih formulacija i 3 doze referentnih formulacija, čuvanih u toku 3 meseca na 5°C.

Slika 5. Proizvodnja ET-701 nečistoće u različitim formulacijama čuvanim u trajanju od 3 meseca na 5°C.

Slika 6. Komparativni razvoj ET-743 % čistoće novih formulacija i 3 doze referentnih formulacija, čuvanih u trajanju od 3 meseca na25°C/65% relativne vlažnosti.

Slika 7. Proizvodnja ET-701 nečistoće u različitim formulacijama, čuvanim u trajanju od 3 meseca na 25°C/ 65% relativne vlažnosti.

Slika 8. Komparativni razvoj ET-743 % čistoće novih formulacija Čuvanih na 40°C/ 70% relativne vlažnosti u trajanju od 3 meseca.

Slika 9. Komparativni razvoj ET-743 % čistoće novih formulacija čuvanih na 40°C/70% relativne vlažnosti u trajanju od 3 meseca.

PRIMERI

Primer 1

Ovaj primer opisuje uporednu studiju stabilnosti 8 novih formulacija sa uobičajenom ET-743 formulacijom (sa manitolom). Laktoza i saharoza su korišćeni za ilustraciju predstavljenog pronalaska. Referentna formulacija je izvedena upotrebom manitola. Druga poznata sredstva za punjenje kao što su dekstran (Dextran 40) i povidon (Kolliđon 12, PVP) uzeta su radi poređenja. Površinski aktivna sredstva polioksil 40 stearat (Myrj 45) ili polioksietilen 20 sorbitan monooleat (Polvsorbate 80) korišćena su u nekim formulacijama, i pufer nije korišćen u nekim formulacijama.

Rastvori za punjenje su pripremljeni i sušeni zamrzavanjem standardizovanim postupkom. Svaka formulacija je pripremljena u zapremini od 150 ml: Količina kalijumfosfata za krajnji rastvor (1.02 g) je odrnerena i rastvorena u 90% krajnje zapremine (135 ml) vode. Zatim, pH vrednost je podešena do pH vrednosti od 4.0 sa 0.1 N fosfornom kiselinom.

7.85 mg ET-743 dodato je u staklenu posudu za mešanje i rastvoreno magnetnim mešanjem u 2/3 zapreniini (90 ml) rastvora kalijumfosfata približno 1 čas (rastvaranje je proveravano vizuelno). Količina sredstva za punjenje i površinski aktivnog sredstva dodati su i rastvoreni u 1/3 zapremini rastvora kalijumfosfata. Zatim, rastvor je dodat u rastvor ET-743 i mešanje je održavano još 1 čas.

Rastvor je doveden do krajnje težine primenom vode (gustina od 1.019 g/cc izabrana je za sve formulacije).

Rastvor je filtriran kroz 0.22 \ xm celulozni filter. Rastvor je napunjen u 25 ml staklene ampule u količini od 5 ml/ampulii održavana na - 20°C do procesa liofilizacije.

Liofilizacija je izvedena prema sledećoj tabeli I:

Posle sušenja zamrzavanjem, ampule su zatvorene. Amuple su prebačene u rashlađeni prostor (-20°C).

Sastav za svaku ampulu bio je sledeći (Tabela II), uz napomenu da voda isparava tokom procedure sušenja zamrzavanjem.

Testiranje stabilnosti izvedeno je na temperaturi od 5 ± 3°C.

Procena čistoće devet formulacija na 5°C u toku 3 meseca prikazana je u tabeli III i na slici 1. U slučaju formulacija koje pokazuju veću stabilnost (kontrola, saharoza, laktoza i ET-poly80sacc), testiranje stabilnosti produženo je do 9 meseci, i u slučaju formulacija laktoze i saharoze testiranje stabilnosti bilo je čak produženo do 12 meseci zahvaljujući njihovoj visokoj stabilnosti. Podaci u tabeli III i na slici 2 pokazuju da formulacije koje sadrže saharozu i laktozu pokazuju poboljšanu stabilnost sa smanjenjem čistoće od samo 2%. Ovo smanjenje je značajno niže od smanjenja zabeleženog u drugim testiranim formulacijama.

Kao što je prikazano u tabeli IV i na slici 3, glavni proizvod razlaganja kontrolne formulacije, ET-701, bio je prilično snižen kada je ET-743 formulisan u prisustvu saharoze ili laktoze.

U kontekstu ovog pronalaska je nađeno da disaharidi poboljšavaju stabilnost ET-743 u poređenju sa manitolom. Varijante takvih disaharida obuhvataju laktozu, saharozu i njihove smeše. Stabilnost formulacija koje sadrže disaharide je takođe poboljšana u poređenju sa drugim formulacijama koje sadrže druga uobičajena sredstva za punjenje kao što su dekstran i poviđon. Varijante disaharidnih formulacija prema ovom pronalasku određene su kao stabilne za najmanje 12 meseci na 5°C. Varijante formulacija prema ovom pronalasku imaju sadržaj nečistoća koji je značajno smanjen u odnosu na taj sadržaj kod uobičajenih formulacija. Prisustvo ET-701 je prema tome smanjeno. Varijante ovog pronalaska sadrže najmanje jedno površinski aktivno sredstvo, kao što je polisorbat 80. Ove varijante su pokazale povoljne osobine rastvaranja ET-743 i stabilizacione karakteristike. Prisustvo najmanje jednog površinski aktivnog sredstva, međutim, nije ograničavajuća karakteristika ovog pronalaska, i druge varijante ne sadrže takvo sredstvo (sredstva).

Primer 2

Svrha ove studije bila je poređenje stabilnosti standardne formulacije ET-743 sa pet novih formulacija. U ovoj studiji vršena je procena stabilnosti formulacija na +5°C.

Sastav testiranih formulacija bio je sledeći (Tabela V), uz napomenu da voda isparava tokom procedure sušenja zamrzavanjem:

Rastvori za punjenje su pripremljeni i sušeni zamrzavanjem primenom sledećih protokola:

Formulacije ETtreal. ETP80treal i kontrola

Težina od 100 g svake formulacije pripremljena je na sledeći način:

Količina kalijumfosfata za krajnji rastvor je odmerena i rastvorena u 90% krajnje zapremine (90 ml) vode. Zatim, pH vrednost je podešena do pH 4.0 sa 0.1N fosfornom kiselinom.

Količina ET-743 (5.0 mg) je dodata u staklenu posudu za mešanje i rastvorena magnetnim mešanjem u 2/3 zapremini (60 ml) rastvora kalijumfosfata približno 1 čas (rastvaranje je proveravano vizuelno). Količina sredstva za punjenje i površinski aktivnog sredstva su dodati i rastvoreni u 1/3 zapremini rastvora kalijumfosfata. Zatim, rastvor je dodat u rastvor ET-743 i mešanje je održavano još 1 čas.

Rastvor je doveden do krajnje težine sa vodom.

Rastvor je filtriran kroz 0.22 nm celulozni filter, uzimajući alikvotu pre filtracije za

IPC.

Rastvor je napunjen u 25 ml ampule u količini od 5 ml/ampuli i održavan na -20°C do procesa liofilizacije.

Formulacije ETP80sacc250.ETP80treal250.ETP80trealglv250

Težina od 30 g svake formulacije pripremljena je na sledeći način:

Količina kalijumfosfata ili glicina za krajnji rastvor je odmerena i rastvorena u 90% krajnje zapremine (27 ml) vode. Zatim, pH vrednost je podešena do pH vrednosti 4.0 sa 0.1 N fosfornom kiselinom ili 0.1 N HC1. Količina polisorbata 80 je odmerena i dodata u 1/3 zapreminu puferskog rastvora.

Količina ET-743 (7.5 mg) je dodata u staklenu posudu za mešanje i rastvorena magnetnim mešanjem u 2/3 zapremini (60 ml) rastvora kalijumfosfata približnio 1 čas (rastvaranje je proveravano vizuelno). Količina sredstva za punjenje je dodata i rastvorena u 2/3 zapremini puferskog rastvora. Zatim, rastvor je dodat u rastvor ET-743 i mešanje je održavano 10 min. Rastvor je doveden do krajnje težine sa vodom. Rastvor je filtriran kroz 0.22 um celulozni filter. Rastvor je napunjen u 10 ml ampule u količini od 1 ml/ampuli i održavan na -20°C do procesa liofilizacije.

Proces liofilizacije u svih šest formulacija izveden je prema sledećoj tabeli VI:

Posle sušenja zamrzavanjem, ampule su zatvorene. Ampule su prebačene u ohlađeni prostor (-20°C).

Testiranje stabilnosti izvedeno je n a temperaturi od 5 ± 3°C.

Sve formulacije su bile stabilnije na 5°C od kontrolne formulacije. Između novih formulacija nisu zapažene veće razlike. Tabela VII prikazuje ET-743 hromatografsku čistoću ispitivanih formulacija:

Primer 3

Šest formulacija ET-NF A, ET-NF B, ET-NF C, ET-NF D, ET-NF E i ET-NF F su proizvedene i upotrebljene za dodatno ispitivanje stabilnosti na različitim temperaturama.

Saharoza i laktoza su izabrani kao sredstvo za punjenje. Korišćena su dva različita pufera: natrijumcitratni pufer 0.1M pH 4 i kalijumfosfatni 0.05M pufer pH 4. Testirane su dve različite koncentracije ET-743 u rastvoru za punjenje: 0.250 mg/ml i 0.100 mg/ml. Korišćena su dva različita ciklusa sušenja zamrzavanjem u zavisnosti od zapremine punjenja (4 ml naspram 10 ml). Grupa od najmanje 125 bočica proizvedena je za svaku formulaciju.

Za svaku ampulu sastav rastvora za punjenje bio je sledeći (Tabela VIII), uz napomenu da voda isparava tokom procedure sušenja zamrzavanjem.:

Rastvori za punjenje pripremljeni su i sušeni zamrzavanjem primenom sledećih protokola:

Formulacije ET- NF A. ET- NF B i ET- NF F

Priprema 2L limunske kiseline približno 0.2M: 76.96 g limunske kiseline rastvoreno je u volumetrijskoj boci od 2L i rastvor je doveden do krajnje zapremine sa injekcijom vode. Krajnji molaritet rastvora limunske kiseline bio je 0.183 M.

Priprema 2L natrijum citrata približno 0.2M; 117.64 g natrijumcitrata rastvoreno je u volumetrijskoj boci od 2L i rastvor je doveden do krajnje zapremine sa vodom za injekciju. Krajnji molaritet rastvora natrijumcitrata bio je 0.175 M.

Priprema 4 L citratnog pufera pH 4 približno 0.1M: 1125 mL rastvora limunske kiseline 0.2M pomešano je sa 875 mL rastvora natrijumcitrata 0.2M u volumetrijskoj posudi od 4L. Rastvor je doveden do krajnje zapremine sa vodom za injekciju. pH vrednost rastvora je proveravana i podešena do pH 4. Krajnji molaritet rastvora citratnog pufera bio je 0.089 M.

143.83 mg ET-743 dodato je u staklenu posudu za mešanje i rastvoreno magnetnim mešanjem u približno 80% potrebne krajnje zapremine citratnog pufera 0.1M za približno 1 čas (rastvaranje je proveravano vizuelno).

Zatim, količina saharoze ili laktoze (55 g saharozne formulacije A i B, i 27.5 g laktozne formulacije F) je dodata i smeša je mešana za dodatni period od pruibližno 1 čas do rastvaranj a.

Posle provere pH vrednosti, rastvor je doveden do krajnje zapremine dodavanjem citratnog pufera 0.1 M pH 4. Ponovno podešavanje do pH 4 sa limunskom kiselinom bilo je potrebno za formulaciju A. Gustina krajnjeg rastvora: 1.04 g/I. Krajnja težina 572 mg.

Rastvor je filtriran kroz 0.22 um PVDF filter.

Rastvor je napunjen u 25 ml ampule primenom automatske pumpe i presovane cevi obrađene silicijumom i platinom 3.2 mm. Standardna zapremina punjenja bila je 4 ml.

Zapremina punjenja je proveravana u pravilnim intervalima (svaki 15 ampula), i zapremina punjenja je podešavana prema potrebi.

Nakon punjenja postavljeni su čepovi za liofilizaciju i ampule postavljene u liofilizator na 5°C.

Proces liofilizacije je izveden prema sledećoj tabeli IX:

Ampule su zatvorene. Izvršeno je završno taloženje. Ampule su prebačene u ohlađeni prostor (-20°C).

Formulacije ET- NF C i ET- NF D

Priprema 1L limunske kiseline približno 0.2M: 38.48 g limunske kiseline rastvoreno je u volumetrijskoj boci od 1L i rastvor je doveden do krajnje zapremine sa vodom za injekciju. Krajnji molaritet rastvora limunske kiseline bio je 0.183 M.

Priprema 1L natrijumcitrata približno 0.2M: 58.82 g natrijumcitrata rastvoreno je u volumetrijskoj posudi od 1L i rastvor je doveden do krajnje zapremine sa vodom za injekciju. Krajnji molaritet rastvora natrijumcitrata bio je 0.175 M.

Priprema 2L citratnog pufera pH 4 približno 0.1M: 850 ml rastvora limunske kiseline 0.2M pomešano je sa 650 ml rastvora natrijumcitrata 0.2M u volumetrijskoj boci od 2L. Rastvor je doveden do krajnje zapremine sa vodom za injekciju. pH rastvora je proveravana i podešena do pH 4. Krajnji molaritet rastvora citratnog pufera bio je 0.089 M.

141.21 mg ET-743 dodato je u staklenu posudu za mešanje i rastvoreno magnetnim mešanjem u približno 80% ukupne zapremine citratnog pufera 0.1M približno 1 čas (rastvaranje je proveravano vizuelno).

Količina saharoze ili laktoze (135 g) je dodata i smeša je mešana dodatni vremenski period približno 1 čas do rastvaranja.

Posle provere pH vrednosti, rastvor je doveden do krajnje zapremine dodavanjem citratnog pufera 0.1 M pH 4. nije bilo potrebno ponovno podešavanje pH vrednosti.

Gustina krajnjeg rastvora: 1.04 g/l. Krajnja težina 1404 mg.

Rastvor je filtriran kroz 0.45 um PVDF filter.

Rastvor je punjen u ampule od 25 ml primenom automatske pumpe i presovane cevi obrađene silicijumom i platinom 3.2 mm. Standardna zapremina punjenja bila je 10 ml.

Zapremina punjenja je proveravana u pravilnim intervalima (svakih 15 ampula), i zapremina punjenja je prema potrebi podešavana.

Posle punjenja, postavljeni su liofilizacioni čepovi i boce su postavljene u liofilizator na 5°C.

Proces liofilizacije je izveden kao u prethodnom slučaju za formulacije ET-NF A, ET-NF B i ET-NF F (Tabela IX).

Kao posledica velike zapremine u bocama, predloženi ciklus nije uspeo da da odgovarajuću liofilizaciju i stvoren je talog. Da bi se izbegla nova proizvodnja, sve ampule su rekonstituisane sa 10 ml prečišćene vode, proveravan je profil čistoće nekih rekonstituisanih rastvora, čepovi su zamenjeni za dva čepa za popunjavanje rupa i upotrebijen je sledeći novi ciklus (Tabela X);

Posle sušenja zamrzavanjem, ampule su zatvorene. Izvršeno je završno taloženje. Ampule su prebačene u rashlađeni prostor (-20°C).

Formulacija ET- NF E

141.21 mg ET-743 dodalo je u staklenu bocu za mešanje i rastvoreno magnetnim mešanjem u 1080 ml wfi + 3,240 mL fosforne kiseline 1 N približno 1 čas (rastvaranje je proveravano vizuelno).

Količina saharoze (135 g) i kalijumfosfata (9.18 g) je dodata i smeša je mešana dodatni vremenski period približno 1 čas do potpunog rastvaranja molekula.

Posle provere pH vrednosti i ponovnog podešavanja do pH 4 sa fosfornom kiselinom 1 N, rastvor je doveden do krajnje zapremine dodavanjem vode za injekciju. Gustina krajnjeg rastvora: 1.04 g/ L Krajnja težina 1404 mg.

Rastvor je filuiran kroz 0.45p.m PVDF filter.

Rastvor je napunjen u ampule od 25 ml primenom automatske pumpe i presovane cevi obrađene silicijumom i platinom 3.2 mm. Standardna zapremina punjenja je bila 10 ml.

Zapremina punjenja je proveravana u pravilnim intervalima (svakih 15 ampula), i zapremina punjenja je podešavana prema potrebi.

Nakon to su postavljeni liofilizacioni čepovi ampule su postavljene u liofilizator na 5°C.

Proces liofilizacije je izveden kao u prethodnom slučaju za formulacije ET-NF A, ET-NF B i ET-NF F (Tabela IX).

Kao posledica velike zapremine u ampulama, predloženi ciklus nije dao adekvatnu liofilizaciju i stvoren je talog. Da bi se izbegla nova proizvodnja, sve amupule su rekonstituisane sa 10 ml prečišćene vode, profil čistoće nekih rekonstituisanih rastvora je proveravan, čepovi su zamenjeni za dva čepa za popunjavanje rupa i novi ciklus je upotrebljen kao u slučaju formulacija ET-NF C i ET-NF D (Tabela X).

Posle sušenja zamrzavanjem, ampule su zatvorene. Izvršeno je završno taloženje. Boce su prebačene u rashlađeni prostor (-20°C).

Željena koncentracija ET-743 je postignuta u svim slučajevima i profil nečistoće je bio sličan između formulacija. U toku proizvodnje nisu zabeležene razlike u koncentraciji ET-743 i profilima nečistoće (pre i posle filtracije, ili posle punjenja). Boja rastvora za punjenje bila je bledo žućkasta u onim formulacijama koje sadrže laktozu.

Formulacije sa punjenjem od 4 ml ili punjenjem od 10 ml su na početku sušene zamrzavanjem uz praćenje naznačenog protokola. Dok su formulacije sa punjenjem od 4 ml pravilno liofilizovane, formulacije sa punjenjem od 10 ml su istaložene. Promena pritiska u drugom sušenju ukativala je na stvaranje taloga i ključanje presovanog taloga sušenog zamrzavanjem. Ampule sa formulacijama ET-NF C, ET-NF D i ET-NF E su rekonstituisane sa 10 ml prečišćene vode. Proveravan je profil čistoće formulacija. Kako u profilu čistoće nisu zabeležene promene u poređenju sa rastvorima za punjenje, odlučeno je da se amuplc ponovo liofilizuju primenom naznačenog prepravljenog ciklusa sušenja zamrzavanjem. Punjenja su liofilizovana kako je opisano, što je dalo dobar rezultat bez taloga ah sa izvesnim sakupljanjem pri dnu.

Sadržaj ET-743 u ampulama bio je u okviru specifikacija (95%-105%). Profili nečistoća pokazali su sličnost među formulacijama i ti profili su uporedivi sa nečistoćama rastvora za punjenje. Sadržaj preostale vode bio je niži ili jednak 2% sa najvećim vrednostima kod formulacija sa punjenjem od 10 ml.

pH vrednost rekonstituisanog rastvora bila je između pH 4 i pH 4.2 u svim slučajevima. Rastvori su bili bistri i bezbojni bez vidiljive strane materije ili taloga. Vreme rekonstitucije bilo je slično za sve formulacije i kraće od 30 s.

Primer 4

Svrha stuudije bila je ispitivanje stabilnosti ET-743 u različitim formulacijama ET-NF A, ET-NF B, ET-NF C, ET-NF D, ET-NF E i ET-NF F u 1 mg/amupli pod različitim temperaturnim uslovima.

Grupa od 130 ampula svake od formulacija ET-NF A, ET-NF B, ET-NF C, ET-NF D, ET-NF E i ET-NF F, 1 mg ET-743/amupli, proizvedena je prema primeru 3.

Testiranje stabilnosti izvedeno je na temperaturi od 5°C, 25°C/65% relativne vlažnosti i 40°C /70% relativne vlažnosti.

Slika 4 i tabela XI pokazuju razvoj ET-743 čistoće novih formulacija u toku čuvanja na 5°C, u poređenju sa tri konvencionalne formulacije (koje sadrže ET-743, manitol i fosfatni pufer).

Slika 6 i tabela XII prikazuju razvoj ET-743 čistoće novih formulacija u toku čuvanja na 25°C/65% relativne vlažnosti, u poređenju sa tri konvencionalne formulacije (koje sadrže ET-743, manitol i fosfatni pufer).

Slika 8 i tabela XIII prikazuju razvoj ET-743 čistoće novih formulacija u toku čuvanja na 40°C/70% realtivne vlažnosti, u poređenju sa konvencionalnom formulacijom {koja sadrži ET-743, manitol i fosfatni pufer).

Pored toga, slika 5 i tabela XIV prikazuju proizvodnju ET-701 nečistoće novih formulacija u toku čuvanja na 5°C, u poređenju sa tri konvencionalne formulacije (koje sadrže ET-743, manitol i fosfatni pufer).

Slika 7 i tabela XV prikazuju proizvodnju nečistoće ET-701 novih formulacija u toku čuvanja na 25°C/65% relativne vlažnosti, u poređenju sa tri konvencionalne formulacije (koje sadrže ET-743, manitol i fosfatni pufer).

Kao što je prikazano na ovim slikama, stabilnost novih formulacija bila je veća od stabilnosti konvencionalnih formulacija. Pored toga, glavni proizvod razlaganja konvencionalnih formulacija, ET-701, bio je drastično snižen u novim formulacijama.

Primer 5

Tri nove formulacije na bazi saharoze kao sredstva za punjenje korišćene su za dalje studije stabilnosti. Ove nove formulacije se razlikuju u molarnosti fosfatnog pufera (0.05M naspram 0.1M) i zapremini punjenja ili, drugim rečima, u koncentraciji ET-743 u rastvoru za punjenje (10 ml prema 4 ml).

Opisana je proizvodnja grupe od najmanje 50 ampula svake od ovih formulacija. Rezime opisa formule po ampuli je sledeći (Tabela XVI), uz napomenu da voda isparava tokom procedure sušenja zamrzavanjem:

Pripremljena je zapremina od 240 ml za formulacije ET-NF-G i ET-NF-I: 62.76 mg ET-743 dodato je u staklenu bocu za mešanje i rastvoreno magnetnim mešanjem u rastvoru 192 ml wfi + 1 N fosforne kiseline (576 ul za NF G, 816 ul for NF I) za približno 1 čas (rastvaranje proveravano vizuelno).

Količine saharoze (24 g) i kalijumfosfata {1.63 g zaNF G; 3.26 g za NF I) su dodate i smešaje mešana dodatni vremenski period od približno 1 čas do rastvaranja.

Posle provere pH vrednosti i ponovnog podešavanja do pH 4.00 prema potrebi sa 1 N fosfornom kiselinom, rastvor je doveden do krajnje zapremine dodavanjem vode za injekciju. Gustina krajnjeg rastvora: 1.04 g/l. Krajnja težina 249.6 g.Rastvor je filtriran kroz 0.45 um PVDF filter. Rastvor je punjen u ampule od 25 ml primenom automatske pumpe i cevi obrađene silicijumom i platinom 3.2 mm. Standardna zapremina punjenja bila je 4 ml. Zapremina punjenja proveravana je u pravilnim intervalima (svakih 15 ampula), i prema potrebi podešavana.

Posle punjenja stavljeni su liofilizacioni čepovi i boce su postavljene u liofilizator na 5°C.

Proces liofilizacija je izvedena prema sledećim parametrima (Tabela XVII):

Posle sušenja zamrzavanjem, ampule su zatvorene. Izvršeno je završno taloženje. Ampule su prebačene u rashlađeni prostor (-20°C).

Zapremina od 600 ml formulacije ET-NF-H pripremljena je na sledeći način: 62.76 mg ET-743 dodato je u staklenu posudu za mešanje i rastvoreno magnetnim mešanjem u rastvoru od 480 ml wfi + 1.44 ml IN fosforne kiseline za približno 1 čas (ratstvaranje je proveravano vizuelno). Količine saharoze (60 g) i kalijumfosfata (8.16 g) su dodate i smeša je mešana dodatni vremenski period približno 1 čas do rastvaranja.

Posle provere pH vrednosti i ponovnog podešavanja do pH 4.00 prema potrebi sa 1 N fosfornom kiselinom, rastvor je doveden do krajnje zapremine dodavanjem vode za injekciju. Gustina krajnjeg rastvora: 1.04 g/l. Krajnja težina 624 g.

Rastvor je filtriran kroz 0.45 um PVDF filter.

Rastvor je punjen u ampule od 25 ml primenom automatske pumpe i cevi obrađene silicijumom i platinom 3.2 mm. Standardna zapremina punjenja bila je 10 ml.

Zapremina punjenja je proveravana u pravilnim intervalima (svaki 15 ampula), i prema potrebi podešavana

Posle punjenja stavljeni su liofilizacioni čepovi i ampule su postavljene u liofilizator na 5°C.

Proces liofilizacije je izvedena prema sledećim paramterima (Tabela XVIII):

Posle sušenja zamrzavanjem, ampule su zatvorene. Izvršeno je završno taloženje. Ampule su prebačene u rashlađeni prostor (-20°C).

Sadržaj ET-743 je bio unutar specifikacija (95%-105%). Profili nečistoća su pokazali sličnost za sve formulacije i slični su sa nečistoćama rastvora za punjenje. Sadržaj preostale vode bio je niži od 2%, a najveća vrednost je bila za formulaciju sa punjenje od 10 ml.

pH vrednost rekonstituisanog rastvora bila je između pH 4 i pH 4.28 u svim slučajevima. Rastvori su bili bistri i bezbojni bez vidljive strane materije ili taloga Vreme rekonstitucije bilo je slično za sve formulacije i kraće od 30 s.

Testiranje stabilnosti izvedeno je u trajanju od 3 meseca na temperaturi čuvanja od 40°C/70% relativne vlažnosti.

Slika 9 i tabela XIX prikazuju razvoj ET-743 čistoće novih formulacija u toku čuvanja na 40°C /70% relativne vlažnosti.

Pored toga, na slici 8 podaci vezani za stabilnost su prikazani u poređenju sa konvencionalnom formulacijom (koja sadrži ET-743, manitol i fosftani pufer).

Rezultati dobijeni u Primerima 4 i 5 ukazuju na to da su sve formulacije koje sadrže disaharid kao sredstvo za punjenje stabilnije od konvencionalnih formulacija koje sadrže manitol kao sredstvo za punjenje. Formulacija ET-NF-G je poželjna formulacija.

Varijante formulacija prema ovom pronalasku testirane su posle čuvanja pod većim brojem različitih uslova čuvanja (uključujući temperature od -20°C, 4°C i 25°C/60% relativne vlažnosti) za različita vremena čuvanja (uključujući vremena čuvanja od 3 meseca, 6 meseci i 9 meseci). Rezultati testa pokazali su daje najmanje 99.5% ET-743 preostalo posle 9 meseci čuvanja na -20°C, najmanje 99% ET-743 je preostalo posle 9 meseci čuvanja na 4°C i najmanje 97% ET-743 je preostalo posle 9 meseci čuvanja na 25°C/60% relativne vlažnosti. Ukupne nečistoće, uključujući ET-701, ET-745 i druge nečistoće nisu prešle 1.66% posle 9 meseci čuvanja na 25°C/60% relativne vlažnosti. Pored toga, nivo ET-701 nečistoće nije prešao 0.21% posle 9 meseci navedenih uslova čuvanja.

Za svu literaturu koja je ovde citirana, ovde su navedene reference. Karakteristike i prednosti ovog pronalaska su očigledne u svetlu ovde datog opisa. Na osnovu ovog opisa, moguće su modifikacije i adaptacije različitih uslova i primena, čime se stvaraju varijante koje su u okviru obima ovog pronalaska.

Claims (25)

1. Kompozicija naznačena time što sadrži ekteinascidin i disaharid.

2. Kompozicija prema patentnom zahtevu 1, naznačena time što ekteinascidin sadrži ET-743.

3. Kompozicija prema patentnom zahtevu 1 ili 2, naznačena time što je navedeni disaharid izabran iz grupe koju čine laktoza, trehaloza, saharoza i njihove smeše.

4. Kompozicija prema patentnom zahtevu 3, naznačena time što je navedeni disaharid saharoza.

5. Kompozicija prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, naznačena time što je odnos (mas./mas.) ET-743 prema disaharidu od oko 1:100 do oko 1:1500.

6. Kompozicija prema patentnom zahtevu 5, naznačena time što je odnos (mas./mas.) ET-743 prema disaharidu od oko 1:250 do oko 1:600.

7. Kompozicija prema patentnom zahtevu 6, naznačena time što je odnos (mas./mas.) ET-743 prema disaharidu oko 1:400.

8. Kompozicija prema bio kom od prethodnih patentnih zahteva, naznačena time što dodatno sadrži sredstvo za puferovanje.

9. Kompozicija prema patentnom zahtevu 8, naznačena time što je navedeno sredstvo za puferovanje izabrano od fosfatnog pufera, citratnog pufera, glicin/hlorovodonična kiselina pufera i njihovih smeša.

10. Kompozicija prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, naznačena time Što dodatno sadrži površinski aktivno sredstvo.

11. Kompozicija prema patentnom zahtevu 10, naznačena time što je površinski aktivno sredstvo izabrano od polioksietilen 20 sorbitan monooleata, polioksil 40 stearata i njihovih smeša.

12. Kompozicija prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, naznačena time što je kompozicija u obliku liofilizovane formulacije.

13. Liofilizovana formulacija prema patentnom zahtevu 12, naznačena time što je liofilizovana formulacija u ampuli i sadrži određenu količinu ET-743.

14. Liofilizovana formulacija prema patentnom zahtevu 13, naznačena time što je navedena količina ET-743 oko 250 p.g.

15. Liofilizovana formulacija prema patentnom zahtevu 14, naznačena time što navedena ampula sadrži formulaciju koja sadrži: oko 0.25 mg ET-743, oko 100 mg saharoze i oko 6.8 mg fosfata, pri čemu se navedenih 6.8 mg fosfata računa kao kalijum dihidrogen fosfat.

16. Liofilizovana formulacija prema patentnom zahtevu 13, naznačena time što je navedena količina ET-743 oko 1 mg.

17. Liofilizovana formulacija prema patentnom zahtevu 16, naznačena time što navedena ampula sadrži formulaciju koja sadrži: oko 1.0 mg ET-743, oko 400 mg saharoze i oko 27.2 mg fosfata, pri čemu se navedenih 27.2 mg fosfata računa kao kalijum dihidrogen fosfat.

18. Postupak za pripremu ampule koja sadrži liofilizovanu formulaciju ekteinascidina, naznačen time što sadrži sušenje zamrzavanjem rastvora za punjenje koji sadrži ekteinascidin i disaharid.

19. Postupak prema patentnom zahtevu 18, naznačen time stoje ekteinascidin ET-743.

20. Postupak za smanjenje formiranja ET-701 u formulaciji ET-743, naznačen time što sadrži sušenje zamrzavanjem rastvora za punjenje koji sadrži ET-743 i disaharid.

21. Postupak za pripremu rastvora za punjenje za liofilizaciju, naznačen time što sadrži rastvaranje ekteinascidina u kiselom medijumu, mešanje prethodno rastvorenog ekteinascidina sa drugim komponentama rastvora za punjenje i, izborno, podešavanje pH vrednosti krajnjeg rastvora.

22. Postupak prema patentnom zahtevu 21, naznačen time što je ekteinascidin ET-743.

23. Postupak za pripremu rastvora za intravenoznu infuziju, naznačen time što sadrži: obezbeđivanje ampule koja sadrži liofilizovani ekteinascidin i disaharid, dodavanje vode kako bi se formirao rekonstituisani rastvor i razblaživanje navedenog rekonstituisanog rastvora sa vodenim sistemom.

24. Postupak prema patentnom zahtevu 23, naznačen time što je ekteinascidin ET-743.

25. Postupak za lečenje kancera, naznačen time što sadrži intravenoznu infuziju rastvora pripremljenog pomoću postupka prema patentnom zahtevu 23.