RS50531B - Upotreba podloge za ćelijsku kulturu bez sadržaja seruma za produkciju il-18bp u ćelijama sisara - Google Patents

Abstract

Proces za kultivaciju/gajenje ćelija koje proizvode IL-18BP, koji obuhvata korak gajenja ćelija u u podlozi za kulturu ćelija koja je bez sadržaja komponenti dobijenih iz seruma životinja, naznačeno time da takva podloga za kulturu ćelija obuhvata: Asparagin u koncentraciji u rasponu od oko 800 do oko 900 mg/L; Natrijum hlorid u koncentraciji u rasponu od oko 3000 do oko 4500 mg/L; Selenit u koncentraciji u rasponu od oko 0.005 do oko 0.015 mg/L;Hidrolizat žita u koncentraciji u rasponu od oko 5000 do oko 15000 mg/L; i insulin u koncentraciji u rasponu od oko 2.5 do oko 6 mg/L. Prijava sadrži 1+20 patentnih zahteva.

Description

UPOTREBA PODLOGE ZA

ĆELIJSKU KULTURU BEZ SADRŽAJA <

SERUMA ZA PRODUKCIJU IL-18BP U

ĆELIJAMA SISARA

POLJE TEHNIKE

Ovaj pronalazak je na polju gajenja ćelija sisara u uslovima podloge za kulturu bez sadržaja seruma. Posebno, odnosi se na rast ćelija sisara kao što su ćelije jajnika kineskog hrčka (OHO). Ove ćelije proizvode rekombinantni protein koji se naziva interleukin-18 vezujući protein (IL-18BP).

STANJE TEHNIKE

Ovaj pronalazak se odnosi na proces koji koristi podlogu bez sadržaja seruma za rast i održavanje ćelija sisara u kulturi.

Ćelijska kultura se danas široko koristi za produkciju različitih biološki aktivnih proizvoda kao što su virusne vakcine, monoklonska antitela, ne-antitelo imunoregulatori, polipeptidni faktori rasta, hormoni, enzimi, tumor-specifični antigeni, itd. Ove proizvode produkuju i normalne ili transformisane i genetski manipulisane ćelije (inženjering).

Za gajenje ćelija u prošlosti je podloga za kulturu dopunjavana serumom, koji služi kao univerzalna hranljiva materija za rast i održavanje svih ćelijskih linija sisara koje proizvode biološki aktivne proizvode. Serum sadrži hormone, faktore rasta, noseće proteine, spojeve, i faktore širenja, hranljive materije, mikroelemente, itd. Podloge za kulturu obično sadrže do 10% životinjskog seruma, kao što je serum fetusa govečeta (FBS), koji se naziva i serum fetusa teleta

(FCS).

lako se široko koristi, serum ima mnoga ograničenja. On sadrži visoke nivoe brojnih proteina koji utiču na ograničene količine željenog proteina koji nas interesuje koji proizvode ove ćelije. Ovi protein izvedeni iz seruma moraju se odvojiti od proizvoda tokom nishodne obrade kao što je prečišćavanje proteina koji nas inrteresuje, što komplikuje proces i povećava cenu.

Pojava BSE (Bovine Spongiform Encephalopathv, t.j. goveđa spongiformna encefalopatija), zarazne neurodegenerativne bolesti goveda sa dugom latencom, odnosno periodom inkubacije, dovela je do zabrinutosti u vezi sa primenom propisa koji omogućavaju korišćenje seruma izvedenih iz životinja za proizvodnju biološki aktivnih proizvoda.

Prema tome, postoji velika potražnja za razvojem alternativnih podloga koje neće sadržati životinjske izvore koje će podržavati rast ćelija i održavati ćelije tokom produkcije biološki aktivnih proizvoda.

Po pravilu podloge za kulturu ćelija obuhvataju veliki broj komponenti različitih kategorija kao što su amino kiseline, vitamini, soli, masne kiseline, i druga jedinjenja: - Amino kiseline: Na primer, US 6.048,728 (Inlovv et al.) otkriva da sledeće amino kiseline mogu da se koriste kao podloga za kulturu ćelija: Alanin, Arginin, Aspartanska kiselina, Cistein, Glutaminska kiselina, Glutamin, Glicin, Histjdin, Izoleucin, Leucin, Lizin, Metionin, Fenialanin, Pralin, Serin, Triptofan, Tirozin, Treonin, i Valin. - Vitamini: US 2003/0096414 (Ciccarone et al.) ili US 5,811,299 (Renner et al.) na primer opisuju da sledeći vitamini mogu da se koriste podlozi za kulturu ćelija: Biotin, Pantotenat, Holin hlorid, Folna kiselina, Mio-lnozitol, Niacinamkl, Piridoksin, Riboflavin, Vitamin B12, Tiamin, Putrescin. - Soli: Na primer, US 6,399,381 (Blum et al.) otkriva podlogu koja sadrži CaCI2, KCI, MgCI2) NaCI, natrijum fosfat monobazni, natrijum fosfat dvobazni, natrijum selenit, CuS04, ZnCI2. Drugi primer za dokument koji otkriva neorganske soli koje mogu da se koriste u podlozi za kultuai je patent US 2003/0153042 (Arnold et al.), koji opisuje podlogu koja sadrži CaCI2, KCI, MgCI2, NaCI, natrijum fosfat monobazni, natrijum fosfat dvobazni, Cua2.2H20, ZnCI2. - Masne kiseline: Masne kiseline za koje se zna da se koriste u podlogama su sledeće: anahidonska kiselina, linoleinska kiselina, oleinska kiselina, laurinska kiselina, miristjčna kiselina, kao i metil-beta-ciklodekstrin, videti npr. US 5,045,468 (Darfler). Treba napomenuti da ciklodekstrin nije lipidperse,ali ima sposobnost da stvara komplekse sa lipidima i tako se koristi za solubilizaciju lipida u podlogama za kulturu ćelija. - Druge komponente, posebno one koje se korsite u okviru podloge za kulturu ćelija bez sadržaja seruma su jedinjenja kao što su glukoza, glutamin, Na-piruvat, insulin ili etanolamin (npr. EP 274 445), ili protektivni agens kao što je Pluronic F68. Plutonic® F68 (poznat i pod imenom Poloxamer 188) je jedan blok kopolimer etilen oksida (EO) i propilen oksida (PO).

Standardne "bazne podloge" su poznate ljudima koji su stručni za ovu oblast. Ove podloge već sadrže nekoliko komponenti podloga koje su pomenute gore. Primeri takvih podloga koje se široko primenjuju su:Dulbecco' s Modified Eagle' s Medium(DMEM),Rosweil Parić Memorial Institute Medium(RPMI), ili Hamova podloga.

Za razvoj i snabdevanje biološki aktivnim proizvodima kao što su terapijski proteini ili vakcine, moraju se proizvoditi velike količine. Kao odgovarajuće ćelije koje se široko koriste za produkciju polipeptjda pokazale su se ćelije jajnika kineskog hrčka (CHO).

Ćelije CHO je prvi put u kulturi odgajio Puck (J.Exp.Med. 108, 945, 1958) iz bioptata jajnika ženke kineskog hrčka. Od ovih prvobitnih ćelija, pripreman je veliki broj pod-linija sa različitim karakteristikama. Jedna od ovih ćelijskih linija CHO, CHO-K1, iziskuje prolin i ona je diploid za gen dihidrofolat reduktaze (DHFR). Još jedna linija izvedena je iz ćelijske linije i to je DHFR deftcijentna ćelijska linija CHO (CHO DUK B11) (PNAS 77, 1980, 4216-4220), koja se odlikuje gubitkom funkcije DHFR kao posledice mutacije u jednom genu DHFR i posledičnom gubitku drugog gena.

Dodatoe ćelije koje se Često koriste za produkciju proteina koji se prave sa namerom da se daju ljudima jesu humane ćelijske linije kao što su ćelijska linija humanog fibrosarkoma HT1080 ili ćelijska linije humanog embroonskog bubrega 293.

Jedan terapijski protein od interesa je lnterieukin-18 vezujući protein (IL-18BP). IL-18BP je rastvorljivi protein koji ima visoki afinitet za IL-18. Prvi put je izolovan iz urina čoveka, pa su klonirani humana i mišja cDNK kao i gen čoveka (Novick et al., 1999; WO 99/09063). Ovaj protein je nazvan IL-18 vezujući protein (IL-18BP). Međunarodno nezaštićeno ime ovog IL-18BPjetadekinigalfa. IL-18BP nije ekstraćelijski domen jednog od poznatih IL-18 receptora, već je to sekretovani protein koji je prirodno cirkulišući. On pripada novoj porodici sekretovanih proteina, koji još uključuju nekoliko proteina enkodiranih poksvirusom (Novick et al., 1999). Urinarni kao i rekombinantni IL-18BP specifično vezuje IL-18 visokim afinitetom i modulira biološki afinitet IL-18.

Gen IL-18BP je lokalizovan na ljudskom hromozomu 11q13, i nije utvrđeno nikakvo eksonsko kodiranje za transmembranski domen u genomskoj sekvenci 8.3kb. Do sada su kod ljudi pronađene četiri splajs varijante izoforma IL-18BP generisanih alternativnim splajsingom mRNK . One su nazvane IL-18BP a, b, c i d, i sve dele isti N-završetak, a razlikuju se po C-završetku (Novick etal, 1999).

Ovi izoformi se razlikuju po svojoj sposobnosti da vezuju IL-18. Za jedan od četiri, IL-18BP izoforma, a i c zna se da imaju neutralizujući kapacitet za IL-18. Humani IL-18BP izoform vezuje se za mišji IL-18. IL-18BP je predložen za terapijski protein u velikom broju boleti i poremećaja kao što su psorijaza, Kronova bolest, reumatoidni artritis, psorijatični artritis, oštećenje jetre, sepsis, ateroskleroza, ishemična bolest srcas, alergije, itd., npr. kako je to otkriveno u VVO9909063, VVO0107480, VVO0162285, VVO0185201. VVO02060479, WO02098456, WO03080104, VVO02092008, WO02101049, VVO03013577.

Zbog toga postoji potreba za efikasnim proizvodnim procesom za proizvodnju IL-18BP u ćelijskoj kulturi, a posebno procesom koji deluje u uslovima bez sadržaja seruma.

KRATAK PRIKAZ PRONALASKA

Ovaj pronalazak zasniva se na razvoju procesa za kutlivaciju ćelija u podlozi za kulturu koja ne sadrži komponente izvedene iz životinjskog seruma, a koja će istovremeno biti visoko efikasdna za rast i održavanje kulture ćelija sisara. Gajenje ćelija se obavlja za produkciju proteina u tim ćelijama.

U skladu sa ovim pronalaskom, ove ćelije proizvode IL-18BP ili su modifikovane da proizvode IL-18BP. Ovaj protein može da se izoluje i purifikuje iz podloge za kulturu ćelija (supematant) i formuliše u farmaceutskui sastav sa namerom da se koristi za davanje ljudima i životinjama.

Prema tome, u svom prvom aspektu, ovaj pronalazak se odnosi na proces za kultivaciju/gajenje ćelija koje proizvode IL-18BP, koji obuhvata korak gajenja ćelija u podlozi za kulturu ćelija bez sadržaja komponenti izvedenih iz seruma životinja, naznačeno time da ova podloga za kulturu ćelija obuhvata: Asparagin u koncentraciji u rasponu od oko 800 do oko 900 mg/L;

Natrijum hlorid u koncentraciji u rasponu od oko 3000 do oko 4500 mg/L;

Selenit u koncentraciji u rasponu od oko 0.005 do oko 0.015 mg/L;

Hidrolizatžita u koncentraciji u rasponu od oko 5000 do oko 15000 mg/L; i

Insulin u koncentraciji u rasponu od oko 2.5 do oko 6 mg/L.

U drugom aspektu, ovaj pronalazak se odnosi na proces za proizvodnju IL-18BP koji obuhvata korak gajenja ćelija koje eksprimiraju IL-18BP podlozi za kulturu ćelija bez sadržaja komponenti izvedenih iz seruma životinja, naznačeno time da podloga za kulturu ćelija obuhvata: Asparagin u koncentraciji u rasponu od oko 800 do oko 900 mg/L;

Natrijum hlorid u koncentraciji u rasponu od oko 3000 do oko 4500 mg/L;

Selenit u koncentraciji u rasponu od oko 0.005 do oko 0.015 mg/L;

Hidrolizat žita u koncentraciji u rasponu od oko 5000 do oko 15000 mg/L; and

Insulin u koncentraciji u rasponu od oko 2.5 do oko 6 mg/L.

Treći aspekt ovog pronalaska se odnosi na upotebu podloge u skladu sa pronalaskom za proizvodnju jednog proteina od interesa.

U četvrtom aspektu, ovaj pronalazak se odnosi na upotrebu podloge iz ovog pronalaska za gajenje ćelija u kulturi.

Peti aspekt ovog pronalaska se odnosi na upotrebu podloge u skladu sa pronalaskom za održavanje ćelija u kulturi tokom faze produkcije polipeptida od interesa.

KRATAK OPIS ILUSTRACIJA

Slika 1 Ćelije CHO koje eksprimiraju IL -18BP gajene su u suspenziji podloge bez sadržaja seruma u skladu sa pronalaskom uz ponavljanje dilucije svežom podlogom tokom 60 dana (n=10). Slika 1 pokazuje gustjnu vijabilnih ćelija ; Slika2 pokazuje nagomilane vijabilne ćelije; Slika 3 pokazuje vrme udvajanja; i Slika 4 pokazuje koncentracije glukoze i laktata u supernatantu.

DETALJNI OPIS PRONALASKA

Ovaj pronalazak se zasniva na razvoju procesa za rast i održavanje ćelija koje eksprimiraju IL-18BP i za proizvodnju IL-18BP, u podlozi za kulturu ćelija koja ne sadrži komponente izvedene iz seruma.

Prema tome, ovaj pronalazak se odnosi na proces za proizvodnju IL-18BP, koji obuhvata korak gajenja ćelija koje eksprimiraju IL-18BP u podlozi za kulturu ćelija bez sadržaja komponenti izvedenih iz seruma životinja, naznačeno time da ova podloga za kulturu ćelija obuhvata: Asparagin u koncentraciji u rasponu od oko 700 do oko 1000 mg/L, po mogućstvu od oko 800 do oko 900 mg/L;

Natrijum Hlorid u koncentraciji u rasponu od oko 2000 do oko 5000, po mogućstvu od oko 3000 do oko 4500 mg/L;

Selenit u koncentraciji u rasponu od oko 0.003 do oko 0.02 mg/L, po mogućstvu od oko 0.005 do oko 0.015 mg/L;

Hidrolizat žita u koncentraciji u rasponu od oko 3000 do oko 20000 mg/L, po mogućstvu od oko 5000 do oko 15000 mg/L; i

Insulin u koncentraciji u rasponu od oko 1 do oko 8 mg/L, po mogućstvu od oko 2.5 do oko 6 mg/L.

Ovaj pronalazak se dalje odnosi na proces gajenja ćelija koje eksprimiraju IL-18BP, koji obuhvata korak gajenja tih ćelija u podlozi za kulturu ćelija bez sadržaja komponenti izvedenih iz seruma životinja, naznačeno time da ta podloga za kulturu ćelija obuhvata: Asparagin u koncentraciji u rasponu od oko 700 do oko 1000 mg/L, po mogućstvu od oko 800 do oko 900 mg/L;

Natrijum Hlorid u koncentraciji u rasponu od oko 2000 do oko 5000, po mogućstvu od oko 3000 do oko 4500 mg/L;

Selenit u koncentraciji u rasponu od oko 0.003 do oko 0.02 mg/L, po mogućstvu od oko 0.005 do oko 0.015 mg/L;

Hidrolizat žita u koncentraciji u rasponu od oko 3000 do oko 20000 mg/L, po mogućstvu od oko 5000 do oko 15000 mg/L; and

Insulin u koncentraciji u rasponu od oko 1 do oko 8 mg/L, po mogućstvu od oko 2.5 do oko 6 mg/L.

Po mogućstvu, ovaj proces dodatno obuhvata korak ubiranja podloge koja uključuje I protein od interesa.

U svom dodatnom preporučenom obliku, ovaj proces dalje obuhvata izolovanje proteina od interesa.

U svom dodatnom preporučenom obliku, ovaj proces dalje obuhvata formulisanje izolovanog proteina sa farmaceutki prihvatljivim nosačem da se dobije farmaceutski sastav.

U trećem aspektu, ovaj pronalazak se odnosi na ovu upotrebu podloga za kulturu ćelija koje obuhvataju

Asparagin u koncentraciji u rasponu od oko 700 do oko 1000 mg/L, po mogućstvu od oko 800 do oko 900 mg/L;

Natrijum Hlorid u koncentraciji u rasponu od oko 2000 do oko 5000, po mogućstvu od oko 3000 do oko 4500 mg/L;

Selenite u koncentraciji u rasponu od oko 0.003 do oko 0.02 mg/L, po mogućstvu od oko 0.005 do oko 0.015 mg/L;

Hidrolizat žita u koncentraciji u rasponu od oko 3000 do oko 20000 mg/L, po mogućstvu od oko 5000 do oko 15000 mg/L; and

Insulin u koncentraciji u rasponu od oko 1 do oko 8 mg/L, po mogućstvu od oko 2.5 do oko 6 mg/L za proizvodnju polipeptida od interesa.

U četvrtom aspektu, ovaj pronalazak se odnosi na upotrebu podloga za kulturu ćelija koje obuhvataju Asparagine u koncentraciji u rasponu od oko 700 do oko 1000 mg/L, po mogućstvu od oko 800 do oko 900 mg/L;

Natrijum Hlorid u koncentraciji u rasponu od oko 2000 do oko 5000, po mogućstvu od oko 3000 do oko 4500 mg/L;

Selenit u koncentraciji u rasponu od oko 0.003 do oko 0.02 mg/L, po mogućstvu od oko 0.005 do oko 0.015 mg/L;

Hidrolizat žita u koncentraciji u rasponu od oko 3000 do oko 20000 mg/L, po mogućstvu od oko 5000 do oko 15000 mg/L; i

Insulin u koncentraciji u rasponu od oko 1 do oko 8 mg/L, po mogućstvu od oko 2.5 do oko 6 mg/L za gajenje ćelija koje eksprimiraju IL-18BP u kulturi.

U petom aspektu, ovaj pronalazak se odnosi na upotebu podloge za kulturu ćelija koje obuhvataju: Asparagin u koncentraciji u rasponu od oko 700 do oko 1000 mg/L, po mogućstvu od oko 800 do oko 900 mg/L;

Natrijum Hlorid u koncentraciji u rasponu od oko 2000 do oko 5000, po mogućstvu od oko 3000 do oko 4500 mg/L;

Selenit u koncentraciji u rasponu od oko 0.003 do oko 0.02 mg/L, po mogućstvu od oko 0.005 do oko 0.015 mg/L;

Hidrolizat žita u koncentraciji u rasponu od oko 3000 do oko 20000 mg/L, po mogućstvu od oko 5000 do oko 15000 mg/L; i

Insulin u koncentraciji u rasponu od oko 1 do oko 8 mg/L, po mogućstvu od oko 2.5 do oko 6 mg/L za održavanje ćelija koje eksprimiraju IL-18BP u kulturi, npr. tokom faze produkcije pollpeptida od interesa.

U skladu sa ovim procesima i upotrebama za ovaj pronalazak, takva podloga za kulturu ćelija obuhvata: Asparagin u koncentraciji u rasponu od oko 700 do oko 1000 mg/L, po mogućstvu od oko 800 do oko 900 mg/L;

Natrijum Hlorid u koncentraciji u rasponu od oko 2000 do oko 5000, po mogućstvu od oko 3000 do oko 4500 mg/L;

Selenit u koncentraciji u rasponu od oko 0.003 do oko 0.02 mg/L, po mogućstvu od oko 0.005 do oko 0.015 mg/L;

Hidrolizat žita u koncentraciji u rasponu od oko 3000 do oko 20000 mg/L, po mogućstvu od oko 5000 do oko 15000 mg/L; i

Insulin u koncentraciji u rasponu od oko 1 do oko 8 mg/L, po mogućstvu od oko 2.5 do oko 6 mg/L.

U okviru ovog pronalaska, Asparagin može da se koristi u svakoj koncentraciji u rasponu od oko 700 do 1000 mg/L, npr. u koncentraciji od 705, 710, 715, 720, 725, 730, 735. 740, 745, 750, 755. 760, 765, 770. 775, 780, 785, 790, 795, 800, 805, 810. 815, 820, 825, 830, 835, 840, 845, 850, 855, 860, 865, 870, 875, 880, 885, 890, 895, 900, 905, 910, 915, 920, 925, 930, 935, 940, 945, 950, 955, 960. 965, 970, 675, 980, 985, 990, 995 mg/L.

U okviru ovog pronalaska, natrijum hlorid može da se koristi u svakoj koncentraciji u rasponu od oko 2000 do oko 5000 mg/L, npr. u koncentraciji od 2100, 2200, 2300, 2400, 2500, 2600, 2700, 2800, 2900, 3000, 3100, 3200, 3300, 3400, 3500, 3600, 3700, 3800, 3900,4000,4100,4200, 4300,4400, 4500,4600, 4700, 4800,4900 mg/L.

U okviru ovog pronalaska, selenit može da se koristi u svakoj koncentraciji u rasponu od oko 0.003 do oko 0.02 mg/L, npr. u koncentraciji od 0.0035, 0.004. 0.0045, 0.005, 0.0055, 0.006, 0.0065, 0.007, 0.0075, 0.008, 0.0085, 0.009, 0.0095, 0.01, 0.011, 0.012, 0.013, 0.014, 0.015, 0.016, 0.017, 0.018, 0.019, 0.02 mg/L.

U okviru ovog pronalaska, hidrolizat žita može da se koristi u svakoj koncentraciji u rasponu od oko 3000 do oko 20000 mg/L, npr. u koncentraciji od 3500,4000, 4500, 5000, 5500, 6000, 6500. 7000, 7500; 8000, 8500, 9000, 9500, 9600, 9700, 9800, 9900, 10000, 10100, 10200, 10300, 10400, 10500, 10600, 10700, 10800, 10900, 11000, 11500, 12000, 12500, 13000, 13500, 14000, 14500, 15000, 15500, 16000, 16500, 17000, 18000, 18500, 19000, 19500 mg/L.

U okviru ovog pronalaska, insulin može da se koristi u svakoj koncentraciji u rasponu od oko 1 do oko 8 mg/L, npr. u koncentraciji od 1.25,1.5,1.75, 2, 2.25,2.5, 2.75, 3, 3.25, 3.5, 3.75, 4, 4.25, 4.5, 4.75, 5, 5.25, 5.5, 5.75. 6, 6.25, 6.5, 6.75, 7, 7.25, 7.5, 7.75, 8, 8.25, 8.5, 8.75 mg/L.

Kao što je pokazano na primerima dole, u procesu prikazanom ovim pronalaskom gde se koriste podloge koje obuhvataju ove komponente u navedenim rasponima, podržava se izvanredan ćelijski rast i održavanje tokom produženih vremenskih perioda.

Faza gajenja kutlure u procesu ovog pronalaska može da se sprovede u svakom primerenom okruženju, kao što su Petrijeve šolje, T-bočice ili okrugle bočice, ali po mogućstvu u posudama koje imaju veće zapremine, ka što je npr. bioreaktor. T-bočice i okrugle bočice su posebno pogodne za gajenje ćelija, a za produkciju proteina ćelije se po mogućstvu održavaju u bioreaktoru.

Ćelije koje se koriste u okviru različitih aspekata ovog pronalaska su po mogućstvu ćelije sisara. One mogu biti humanog ili životinjskog porekla. U primere ćelija sisara koje se mogu gajiti u ovom procesu u skladu sa ovim pronalaskom spadaju, npr., 3T3 ćelije, COS ćelije, ćelije humanog osteosarkoma, MRC-5 ćelije, BHK ćelije, VERO ćelije, CHO ćelije, rCHO-tPA ćelije, rCHO - ćelije Hep B površinskog antigena, HEK 293 ćelije, rHEK 293 ćelije, rC127 - ćelije Hep B površinskog antigena, normalne humane fibroblastne ćelije, stromalne ćelije, hepatocitne ćelije, PER.C6 ćelije i humane trajne amniocttne ćelije. U primere hibridoma koji se mogu kultivisati u procesu u skladu sa ovim pronalaskom spadaju , npr., DA4.4 ćelije, 123A ćelije, 127A ćelije, GAMMA ćelije i 67-9-B ćelije.

Izuzetno se preporučuje da se ćelije jajnika kineskog hrčka (CHO ćelije) gaje u skladu sa ovim pronalaskom.

Ćelije gajene u skladu sa ovim pronalaskom mogu da se gaje u suspenziji, ili za ćellije koje zavise od tačke oslonca, spojene za čvrstu podlogu ćelije.

Mikronosači i Fibra -Cei® diskovi mogu da se koriste kulturi ćelija sisara za rast ćelija koje zavise od tačke oslonca i spadaju u utvrđene tehnološke platforme za industrijsku produkciju proteina (videti, npr,Bohakefa/.1987; Pettjet ah1994).

U okviru procesa i upotreba za ovaj pronalazak, asparagin je vrlo zgodno fbrmulisan kao asparagin.H20 (TLC 99%, gde TLC označava tankoslojnu hromatografiju).

Selenit može, npr. da u podlozi bude u obliku natrijum selenita.

Hidrolizat žita je komponenta izvedena iz biljke, što je deo podloge iz ovog pronalaska koji se zasniva na činjenici da ćelije mogu da koriste i amino kiseline koje su u obliku peptida. Peptidi u veličini mogu da se kreću u rasponu od dve amino kiseline do mnogo amino kiselina. Peptidi koji su izvedeni hidrolizom proteina daju dodatni (nedefinisani) izvor amino kiselina u obliku koji podržava superiorni rast brojnih ćelijskih linija/tipova.

Insulin koji će se koristiti u okviru podloge u ovom pronalasku može da se izvede iz bilo kog izvora ili vrste, sve dotle dok podržava rast i održavanje određene ćelijske linije ili ćelijskog tipa za koji se ta podloga koristi. Po mogućstvu, insulin može da bude rekombinantni. Dalje se preporučuje da insulin bude izveden (da e dobija) iz vrste koja odgovara vrsti iz koje se izvodi i ćelijska linija ili ćelijski tip, ili da to bude humani insulin.

Preporučeni rasponi koncentracija jedinjenja iz podloge koja će se korisitti u procesu ovog pronalaska su sledeće:

- Asparagin u koncentraciji u rasponu od oko 810 do oko 850 mg/L, najbolje oko 830.

- Natrijum hlorid u koncentraciji u rasponu od oko 3400 do oko 3600 mg/L, najbolje oko 3500 mg/L.

- Selenit u koncentraciji u rasponu od oko 0.01 do oko 0.012 mg/L, najbolje oko 0.0110 mg/L

- Hidrolizat žita u koncentraciji u rasponu od oko 8000 do oko 12000 mg/L, najbolje oko 10000 mg/L.

- Insulin u koncentraciji u rasponu od oko 3 do oko 5 mg/L, najbolje oko 4 mg/L.

U preporučenom obliku, ova podloga dodatno obuhvata glukoza u koncentraciji u rasponu od oko 500 do oko 5500 mg/L, preferencijalno oko 1000 mg/L ili oko 4500 ili oko 5000 mg/L

U svom dodatnom preporučenom obliku, ova podloga obuhvata jednu ili više amino kiselina. Ove amino kiseline su odabrane iz sledećih: alanin, arginin, aspartanska kiselina, cistein, glutaminska kiselina, glicin, histidin, izoleucin, leucin, lizin, metionin, fenialanin, prolin, serin, triptofan, tirozin, treonin, i valine, ali ne glutamine.

U jednom alternativnom obliku, glutamin se dodaje u poglogu. Glutamin može preferencijalno da se dodaje u podlogu tokom gajenja (kulture) ćelija (npr. rast, održavanje, tok same produkcije).

Po mogućstvu, ova podloga dalje u skladu sa pronalaskom obuhvata i vitamine, vitamini koji se preporučuju za podlogu iz ovog odabiraju se iz sledećih: biotin, pantotenat, holin hlorid, folna kiselina, mio-lnositol, niacinamid, piridoksin, riboflavin, vitamin b12, tiamine, i putrescin.

Ova podloga u skladu sa pronalaskom preferencijalno dalje obuhvata neorganske soli i mikroelemente. Ovi joni su po mogućstvu Ca<z+>, K<+>, MG<2+>, Na<+>. CT, Fosfat, Cu<2+>, Zn<2+>. Ove soli i mikroelementi se preferencijalno odabiraju iz sledećih: CaCI2anhidrovani, KCI, MgCI2anhidrovani, NaCI, natrijum fosfat monobazni, natrijum fosfat dvobazni, CuCI2.2H20, i ZnCI2.

Po mogućstvu, podloga iz ovog pronalaska dodatno obuhvata neki pufer. Mnogi puferi mogu da se koriste u okviru podloge iz ovog pronalaska, kao što je natrijum bikarbonatni pufer, Tris, BES (N,N-Bis(2-hidroksietil)-2-arninoetansulfonična kiselina), Glicinski pufer, ili slično. Cviterionski pufer je posebno pogodan kao podloga iz ovog pronalaska. Preferencijalni cviterionski jonski pufer koji može da se koriste je HEPES (N-(2-Hidroksietil)piperazin-N'-2-etansurfonična kiselina) u obliku kiseline.

U još jednom preporučenom obliku, ova podloga dodatno obuhvata masne kiseline. Takve masne kiseline se prefernecijalno odabiraju iz grupe sledećih: arahidonska kiselina, linoleinska kiselina, oleinska kiselina, lauriinska kiselina, miristična kiselina, ciklodekstrin, što nije lipid per se već prosto služi za solubilizaciju lipida u podlozi. Ciklodekstrin je preferencijalno metil-beta-dklodekstrin.

Dalje, hidrolizati mogu da se koriste u okviru ovog pronalaska, sve dok se ne izvode iz životinjskih izvora. Po mogućstvu, podloga iz ovog pronalaska može dodatno da uključi i hidrolizat soje.

Takođe se preporučuje da podloga iz ovog pronalaska dodatno obuhvata steroide kao što su npr. kortizon ili hidro kortjzon, i/ili dodatne izvore energeije kao što su npr. piruvat, npr. Na-piruvat, i/ili protektivni agens kao što je Pluronic F68.

U okviru procesa i upotreba za ovaj pronalazak, svaka poznata pogodna bazna pogloga bez sadržaja seruma može da se koristi, sve dok su prisutna i sledeca jedinjenja

Asparagin u koncentraciji u rasponu od oko 700 do oko 1000 mg/L, po mogućstvu od oko 800 do oko 900 mg/L;

Natrijum hlorid u koncentraciji u rasponu od oko 2000 do oko 5000, po mogućstvu od oko 3000 do oko 4500 mg/L;

Selenit u koncentraciji u rasponu od oko 0.003 do oko 0.02 mg/L, po mogućstvu od oko 0.005 do oko 0.015 mg/L;

Hidrolizat žita u koncentraciji u rasponu od oko 3000 do oko 20000 mg/L, po mogućstvu od oko 5000 do oko 15000 mg/L; i

Insulin u koncentraciji u rasponu od oko 1 do oko 8 mg/L, preferablv from about 2.5 do oko 6 mg/L.

Primeri poznatih baznih podloga bez sadržaja seruma navedeni su dole:

Procesi i upotrebe ovog pronalaska preferencijalno služe da se produkuje polipeptid od interesa.

Ovakav polipeptid od interesa može da bude, npr., prirodno sekretovani protein, normalno citoplazmični protein, normalno transmembranski protein, ili humano ili humanizovano antitelo. Kada je ovakav protein od interesa normalno citoplazmični ili normalno transmembranski protein, ovaj protein je preferencijalno manipulisan (podvrgnut inženjeringu) da bi postao rastvorljiv.

Ovakav polipeptid od interesa može da bude bilo kog porekla. Preferencijalni polipeptidi od interesa su humanog porekla, a još bolje, po mogućstvu, ovi proteini od interesa su terapijski proteini.

Ovakav protein od interesa može da bude neki hormon, citokin-vezujući protein, interferon, solubiini receptor, ili neko antitelo.

Terapijski proteini koji mogu da budu produkovani u skladu sa metodom predstavljenom za ovaj pronalazak uključuju, npr., horionski gonadotropin, folikulo-stimulirajući hormon, lutropin-horiogonadotropni hormon, hormon za stimulaciju tiroideje, humani hormon raste, interferone (npr., interferon beta-1a, interferon beta-1b), interferonske receptore (npr., interferon gama receptor), TNF receptore p55 and p75, TACI-Fc fuzione proteine, interleukine (npr., interieukin-2, interieukin-11), interleukin vezujuće proteine (npr., interieukin-18 vezujući protein), anti-CD11a antitela, eritropoietin, faktor stimulacije granulocitnih kolonija, faktor stimulacije granulocitnih/makrofagnih kolonija, peptidni hormoni hipofize, menopauzalni gonadotropin, faktori rasta slični insulinu (npr., somatomedin-C), keratinocitni faktor rasta, neurotrofični factor izveden iz linije glijalnih ćelija, trombomodulin, bazni fibroblastni faktor rasta, insulin, Fakctor VIII, somatropin, koštani morfogenetski protein-2, faktor rasta izveden iz trombocita, hirudin, epoietin, rekombinantni LFA-3/lgG1 fuzioni protein, glukocerebrosidaza, i muteini, fragmenti, solubilne forme, funkcionalni derivati, njihovi fuzioni proteini.

Ovakav polipeptid može posebno da se odabere iz horioniskog gonadotropina (CG), folikulo-stimulirajućeg hormona (FSH), lutropin-horiogonadotropnog hormone(LH), hormona za stimulisanje tiroideje (TSH), humanog hormona rasta (hGH), interferona (npr., interferon beta-1a, interferon beta-1b), interferonskih receptora (npr., interferon gama receptor), TNF receptora p55 'i p75, interleukina (npr., interleukin-2, interleukin-11), interleukin vezujućih proteina (npr., interleukin-18 vezujući protein), anti-CD 11a antitela, i muteina, fragmenata, solubilnih formi, funkcionalnih derivata, njihovih fuzionih proteina.

Dodatni polipeptjdi od interesa uključuju, npr., eritropoietin, faktor stimulacije granulocitnih kolonija, faktor stimulacije granulocitnih/makrofagnih kolonija, peptidni hormoni hipofize, menopauzalni gonadotropin, faktore rasta slični insulinu (npr,, somatomedin-C), keratinocitni faktor rasta, neurotrofični factor izveden iz linije glijalnih ćelija, trombomodulin, bazni fibroblastni faktor rasta, insulin, Faktor VIII, somatropin, koštani morfogenetski protein-2, faktor rasta izveden iz trombocita, hirudin, epoietin, rekombinantni LFA-3/lgG1 fuzioni protein, glukocerebrosidaza, i muteine, fragmente, solubilne forme, funkcionalne derivate, njihove fuzione proteini. - Ako je protein od interesa formulisan sa farmaceutski prihvatljivim nosačem, rezultat ovakvog procesa je farmaceutski sastav.

Definicija "farmaceutski prihvatljivi" ima za cilj da obuhvati sve nosače koji ne utiču na efikasnost biološke aktivnosti aktivnog sastojka, kao i one koji nisu toksični za domaćina kome se daju. Na primer, za parenteralnu administraciju, aktivni proteini mogu da budu formulisani u jedinici doziranja u obliku za injekcije/ubrizgavanje u nosačima kao što su rastvor dekstroze, serumski albumin i Ringerov rastvor.

Farmaceutski sastav koji je formulisan u skladu sa ovim pronalaskom može onda da se daje pojedincima na različite načine. U ove načine davanja spadaju intradermalni, transdermalni (npr. U formulacijama sa usporenim oslobađanjem), intramuskulami, intraperitonealni, intravenski, supkutani, oralni, intrakranijalni, epiduralni, površinski, rektalni, i intranazalni put. Mogu se koristiti i svi drugi terapijski efikasni načini davanja, na primer apsorpcija kroz epitelijalno ili endotelijalno tkivo, ili genskom terapijom naznačeno time da neki jedan DNK molekul koji enkodira aktivni agens daje pacijentu (npr. preko vektora), što dovodi do toga da se aktivni agens eksprimira in vivo. Uz to, mogu se davati i proteini u skladu sa ovim pronalaskom, zajedno sa drugim komponentama biološki aktivnih agenasa kao što su farmaceustki prihvatljvii surfaktanti, ekscipijenti, nosači, razblaživači/diluenti i vehikulumi.

Za parenteralno (npr. intravensko, supkutano, intramuskularno) davanje, aktivni protein(i) se mogu formulisati kao rastvor, suspenzija, emulzija ili liofilizovani prah u kombinaciji sa farmaceutski prihvatljivim parenteralnim nosačem (npr. voda, fiziološki rastvor, rastvor dekstroze) i aditivima koji održavaju izotoničnost (npr. manitol) ili hemijsku stabilnost (npr. konzervansi i pufers). Ova formulacija se sterilizuje uobičajeno korišćenom tehnikom.

Procesi i upotrebe ovog pronalaska imaju za cilj produkciju interleukin-18 vezujućeg proteina (IL-18BP). IL-18BP može da bude nativni, t.j. prirodno nastajući IL-18BP. Po mogućstvu, IL-18BP koji treba da se proizvede je humanog porekla. Budući da je IL-18BP solubilni, sekretovani protein, on se oslobađa u supernatant ćelijske kulture, bilo pomoću svog prirodnog signalnog peptida, ili pomoću heterolognog signalnog peptida, t j. signalnog peptida koji je izveden iz drugog sekretovakog proteina koji može da bude efikasniji u posebnom sistemu ekspresije koji se koristi.

Izraz "IL-18 vezujući protein" se ovde koristi kao sinonim izrazu "IL-18BP". Ovaj izraz se odnosi na IL-18 vezujuće proteine kao što su oni definisani u WO 99/09063 ili u Novick et al., 1999. Izraz IL-18BP uključuje splajs varijantu i/ili izoform IL-18 vezujućih proteina, kao što su oni koje je definisao Kim et al., 2000, posebno humani izoformi a i c IL-18BP. Izraz "IL-18PB", u smislu u kome se ovde koristi, dodatno uključuje muteine, funkcionalne derivate, aktivne frakcije, fuzirane proteine, cirkularno permutovane proteine i pojedine delove IL-18BP kao što je to definisano u WO 99/09063. IL-18BP koji se proizvede korišćenjem podloge koju opisuje ovaj pronalazak preferencijalno je glikozilirana.

U smislu u kome se odve koristi izraz "muteini" odnosi se na analoge IL-18BP, ili analoge virusnog IIL-18BP, u kome jedna ili više amino kiselinskih reziduuma prirodne ili virusne IL-18BP biva zamenjeno različitim amino kiselinskim reziduumima, ili se briše, ili jedan ili više amino kiselinskih reziduuma biva dodato u prirodnu sekvencu IL-18BP, ili u virusni IL-18BP, ne menjajući znatnije aktivnost rezultujuih proizvoda u poređenju sa divljim tipom IL-18BP ili virusnim IL-18BP. Ovi muteini se pripremaju poznatom sintezom i/ili tehnikama mutageneze usmerenim na jedno mesto, ili ma kojom drugom tehnikom pogodnom za ove namene.

Muteini u skladu sa ovim pronalaskom uključuju proteine enkodirane nekom nukle/nskom kiselinom, kao što je DNK ili RNK, koje hibridizuju u DNKili RNK, koje enkodira IL-18BP ili enkodira virusni IL-18BP (WO 99/09063) pod strogim uslovima.

Izraz "strogi ustavi" odnosio se na hibridizaciju i uslove pranja posle toga, za koje ljudi koji su stručni za ovu oblast smatraju da su „strogi" u konvencionalnim značenju te reći. Videtj Ausubel et al.,Current Prvtocols in Molecular Biology(Tekući protokoli u molekularnoj biologiji) , supra, Interscience, N.Y„ §§6.3 i 6.4 (1987, 1992). Bez ograničavanja, primeri strogih uslova uključuju uslove pranja, 12-20"C ispod izračunatog Trn za ispitivani hibrid u, npr., 2 x SSC i 0.5% SDS tokom 5 minutea, 2 x SSC i 0.1% SDS tokom 15 minuta; 0.1 x SSC i 0.5% SDS na 37°C tokom 30-60 minuta i potom, 0.1 x SSC i 0.5% SDS na 68<*>C tokom 30-60 minuta. Oni koji su stručnjaci za ovu oblast razumeju da strogost uslova zavisi i od dužine sekvence DNK, oligonukleotidnih proba (kao što su 10-40 baze) ili mešanih oligonukleotidnih proba. Ako se koriste mešane probe preporučuje se da se koristi tetrametil amonijum hlorid (TMAC) umesto SSC. Videti Ausubel, gore. ;Identičnost oslikava odnos između dve ili više polipeptidnih sekvenci ili dve ili više polinukleotidne sekvence, što se određuje poređenjem tih sekvenci. Po pravilu, identičnost se odnosi na tačni nukleotid prema nukleotidu ili amino kiselinu prema amino kiselini, njihovu korespodenciju za kada se radi o dve polinukleotidne, odnosno dve polipeptjdne sekvence na dužini sekvenci koje se porede. ;Za sekvence gde nema tačne korespodencije, može se utvrditi"% identičnosti". Po pravilu, dve sekvence koje će se porediti stavljaju se jedna pored druge da se dobije maksimalna korelacija između sekvenci. To može da uključi i inserciju „praznih prostora" u jednu ili pak u obe sekvence, da bi se povećao stepen sličnosti. Procenat (%) identičnosti može da se utvrdi za celu dužinu sekvenci koje se porede (takozvano globalno poređenje - alignment), koje je posebno pogodno za sekvence iste ili veoma slične dužine, ili za kraće, definisane dužine (takozvano lokalno poređenje - alignment), koje je pogodnije za sekvence različitih dužina. ;Metode poređenja identičnosti i homologije dve ili više sekvenci dobro je poznato stručnjacima za ovu oblast. Tako, na primer, programi koji postoje u softverskom paketu VVisconsin Sequence Analvsis Package, verzija 9.1 (Devereux J et al., 1984), na primer programi BESTFIT i GAP, mogu da se koriste da se odredi procenat, % identičnosti i procenat % homologije između dve polipeptidne sekvence. BESTFIT koristi algoritam "lokalne homologije" autora Smith i Vvaterman (1981) i nalazi najbolji pojedinačni region sličnost između dve sekvence. Drugi programi za utvrđivanje identičnosti i/ili sličnosti između sekvenci poznati su u ovom polju stručnosti, kao, na primer BLAST porodica programa (Altschul S F et al, 1990, Altschul S F et al, 1997, kojima se može prići preko sajta NCBI na adresi www.ncbi.nlm.nih.gov) i FASTA (Pearson WR, 1990). ;Svaki takav mutein preferencijalno ima sekvence amino kiselina dovoljno duplikativne za IL-18BP, ili dovoljno duplikativne za virusni viral IL-18BP, teko da ima supstancijalno sličnu aktivnost kao i IL-18BP. Jedna aktivnost IL-18BP jeste sposobnost vezivanja IL-18. Sve dok taj mutein ima supstancijalnu mogućnost vezivanja za IL-18, može se smatrati da on ima supstancijalno istu aktivnost kao i IL-18BP. Prema tome, može se odrediti da li da li bilo koji dati mutein ima supstancijalno sličnu aktivnost kao i IL-18BP uz pomoć rutinskih eksperimenatta koji obuhvata podvrgavanje takvog muteina, npr., testu jednostavne sendvič kompeticije da se utvrdi da li se on vezuje ili se ne vezuje za odgovarajuće obeleženi IL-18, kakav je radioimunoesej ili ELISA esej. ;U preporučenom obliku, svaki takav mutein ima najmanje 40% identičnosti ili homologije sa sekvencom bilo IL-18BP ili virusno enkodiranog IL-18BP homologa, kao što je to definisano u WO 99/09063. Još bolje, ima najmanje, 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80% ili preferencijalno, najmanje 90% ili 95% identičnosti ili homologije s njim. ;Preporučene promene za muteine skladu sa ovim pronalaskom predstavljaju ono što je poznato kao „konzervativne" supostitucije. Konzervativne supstitucije amino kiselina IL-18BP polipeptida ili proteina ili virusnih IL-18BPs, mogu da uključuju sinonimne amino kiseline u okviru grupe koja ima dovoljno slične fizikohemjjske osobine da će zamena između članova grupe da očuva biološku funkciju molekula (Grantham, 1974). Jasno je da insercije i delecije amino kiseline takođe mogu da se prave na gore definisanim sekvencama ne menjajući njihovu funkciju, posebno ako te insercije ili delecije uključuju samo nekoliko amino kiselina, npr., manje od trideset, i po mogućstvu manje od deset, a ne uklanjaju ili ne menjaju mesto amino kiselina koje su kritične za funkcionalne konformacije, npr., cisteinski reziduum. Proteini i muteini koji se proizvode takvim delecijama i/ili inserđjama spadaju u okvire ovog pronalaska. ;Izraz "fuzirani protein" odnosi se na polipeptid koji obuhvata IL-18BP, ili virusni IL-18BP, ili mutein ili njegov fragment, fuziran za drugi protein, koji, npr., ima produženo vreme boravka u telesnim tečnostima. Jedan IL-18BP iili virusni IL-18BP, može tako da se fuzira za drugi protein, polipeptid ili slično, npr., neki imunoglobulin ili njegov fragment. ;Kao "aktivne frakcije" IL-18BP, ili virusnog IL-18BP, muteina i fuziranih proteina, ovaj pronalazak obuhvata svaki fragment ili prekursore polipeptidnog lanca samog proteinskog molekula ili pak zajedno sa povezanim molekulima ili za njih vezanim reziduumima (ostatke), npr., šećerni ili fosfatni reziduumi, ili agregati proteinskog molekula ili sami šećerni ostaci, pod uslovom da pomenuta frakcija ima supstancijalno sličnu aktivnost kao i IL-18BP. ;Sekvence IL-18BP i njegove splajs varijante/izoformi mogu da se uzmu iz VVO99/09063 ili iz Novick et al., 1999, kao od Kim et al., 2000. ;Ako se IL-18BP iz ovog pronalaska koristi kao farmaceutski sastav, takav farmaceutski sastav se može koristiti za lečenje i/ili prevenciju većeg broja bolesti ili poremećaja. Takve bolesti ili poremećaji su preferencijalno oni koji su posredovani preko IL-18. Pre svega, purifikovani IL-18BP mogu da se koriste za terapiju i/ili prevenciju psorijaze, psorijatičnog artritisa, Kronove bolesti, reumatoidnog artritisa, oštećenja jetre kao što je alkoholna ciroza jetre, sepsa, ateroskleroza, ishemična bolest srca, alergije, posebno preosetljhivost odloženog tipa, kao i zatvorene povrede glave, kao što je to otkriveno u WO9909063, VVO0107480, VVO0162285, VVO0185201, VVO02060479, VVO02096456, VVO03080104, VVO02092008, VVO02101049, VVO03013577. ;Pošto smo sada u celini opisali ovaj pronalazak, oni koji su stručni za ovu oblast lako će shvatiti da se ovo lako može uraditi u okviru širokog spektra ekvivalentnih parametara, koncentracija i uslova ne odvajajući se od duha i obima ovog pronalaska i bez nepotrebnog eksperimentisanja. ;lako je ovaj pronalazuak opisan u vezi sa njegovim posebnim oblicima, jasno je da se na njega mogu primeniti različite modifikacije. Ova primena ima za cilj da obuhvati sve varijacije, upotrebe i adaptacije ovog pronalaska, prateći, u opštim crtama, sve principe samog pronalaska i uključujući sva odstupanja od ovog otkrivanja koja spadaju u poznatu i uobičajenu praksu u okviru struke kojoj ovaj pronalazak pripada, i može se primeniti na osnovne osobine navedene gore, i one koje će biti navedene u zahtevima koji slede dole. ;Sva literatura, t.j. reference koji su ovde citirani, uključujući i članke ili apstrakte, objavljene ili neobjavljene u SAD, ili inostrane zahteve za patente, izdate u SAD ili inostrane patente ili sve druge reference smatraju se u celini uključenim samim citiranjem, uključujući sve podatke, tabele, slike i tekst prikazan u citiranim referencama. Uz to, celokupni sadržaj citiranih referenci takođe se samim pominjanjem uključuje u ovaj tekst.. ;Pozivanje na poznate korake metoda, konvencinalne korake metoda, poznate metode ili konvencionalne metode ne predstavlja ni na koji način priznavanje daje u bilo kom aspektu, opisu ili obliku ovaj pronalazak već otkriven, podučavan ili predstavljan u relevantnoj stručnoj literaturi. ;Gore pomenuti opis konkrentnih oblika toliko potpuno otkriva opštu prirodu ovog pronalaska da drugi, primenjujući znanja poznata u struci (uključujući i sadržaj citiranih referenci) mogu lako da modifikuju, i/ili prilagode različite primene konkrentih ovih oblika, bez nepotrebnog eksperimentisanja, i ne udaljavajući se od opšteg koncepta predstavljenog pronalaska. Prema tome, takve adaptacije i modifikacije imaju narneru da ostanu u smislu raspona ekvivalenata otkrivenih oblika, na osnovu podučavanja i usmeravanja koji su ovde predstavljeni. Treba razumeti da su frazeologija i terminologija ovde korišćeni za svrhe opisa, a ne ograničavanja, tako da tu terminologiju ili frazeologiju ove konkretne specifikacije treba da tumači neko ko je stručan za ovu oblast u svetlu znanja i usmeravanja koji su ovde prikazani u kombinaciji sa znanjem koje inače poseduje stručnjak za ovu oblast. ;PRIMER 1: Rast CHO ćelije koja eksprimira IL-18BP u podlozi koja ne sadrži serum ;1. 1. Priprema podloge bez sadržaja seruma ( SFM) nazvane " SM- 005*

Ova podloga za kulturu ćelija koja je upotrebljena u eksperimentima opisanim pod 1.2. bila je podloga koja je prilagođena tako da sadrži sledeće komponente u sledećim koncentracijama: - Asparagin u koncentraciji od 830 mg/L; - Natrijum hlorid u koncentraciji od 3500 mg/L; - Selenit u koncentraciji od 0.0110 mg/L;

- Hidrolizat žita u koncentraciji od 10000 mg/L; i

- Insulin u koncentraciji od 4 mg/L.

Ova podloga sadrži i 4.5 g/l glukoze. Ako se ova podloga koristi u načinu rada za proizvodnju, koncentracija glukoza može da bude smanjena do 1 g/l. Dalje, ova podloga sadrži sve amino kiseline izuzev glutamina. Vitamini, soli, masne kiseline, HEPES kao pufer, Pluronic F68, hidrokortizon, Na piruvate i hidrolizat soje takođe su bili prisutni u ovoj podlozi. Dole navedena podloga poznata je pod imenom SM-005.

1. 2. Rast ćelije u suspenziji

T-bočice ili kružne bočice inokulirane su ćelijama iz CHO klona koje eksprimiraju i sekretuju IL-18BP, koje su dobijene ranije. Ove ćelije rastu u suspenziji i prvo su ekspandirane. Tokom procesa ekspanzije ćelija, ćelije su gajene u suspenziji i sistematski raszblaživane definisanim zapreminama sveže podloge SM-005 u utvrđenim danima. Za svrhe praćenja, gustina ćelija, koncentracije glukoze i laktata praćene su i merene u svakoj fazi dilucije {videti slike).

Dana označenog kao nulti, istopljen je sadržaj bočice iz prethodno oformljene Glavne banke ćelija. Ćelije iz te bočice zatim su inokulirane u bočicu sa kulturu ćelija veličine 75 cm<2>(TCF 75 cm<2>) u ukupnoj zaprmini od 30 mL sveže podloge SM-005. Dobijena koncentracija ćelija u TCF dostigla je približno 0.20 miliona ćelija/mL Na kraju, TCF je inkubiran mućkanjem na temperaturi od 37 "C.

Dana 4, ova kultura je preneta u posudu TCF175 cm<2>i razblažena do 120 mL dodavanjem sveže i prethodno zagrejane podloge SM-005.

Dana 8, ova kultura je preneta u posudu RB850 cm2 i razblažena do 400 mL dodavanjem sveže i prethodno zagrejane podloge SM-005.

Dana 12, ova kultura je razblažena do 1200 mL (koeficijent dilucije od 1/3) dodavanjem sveže i prethodno zagrejane podloge SM-005, a potom podeljena u tri kružne bočice RB650 cm<2>, svaka sa sadržajem po 400 mL.

Dana 16, ova kultura je razblažena do 4800 mL (koeficijent dilucije od 1/4) dodavanjem sveže i prethodno zagrejane podloge SM-005, a potom podeljena u 6 kružnih bočica RB1750 cm<2>, svaka sa sadržajem po 800 mL.

Od dana 20 (D20, D23, D26, ... sve do D62), RB1750 cm<2>su razblaživane repetitivno na svaka tri dana, uvek u koeficijentu dilucije od 1/4. Svakog dana kada je rađena dilucija, generisan je potrebni broj RB1750cm<2>(najmanje 4 RB1750 cm<2>). Prema tome, svaki RB1750cm<2>jerazblaživan sa 800 mL do 3200 mL dodavanjem sveže i prethodno zagrejane podloge a potom podeljen u četiri kružne bočice RB1750 cm<2>, svaka sa sadržajem po 800 mL.

Da bi se inokulirali biorektori, potrebni broj kružnih bočica ubiran je na dan razblaživanja (između D20 i D60), objedinjen u jednu sterilnu staklenu staklenu bočicu , pa potom premešten u bioreaktore.

Slike 1 do 4 pokazuju podatke izmerene tokom procesa pripreme inokuluma (n=lO). Slika 1 pokazuje gustinu vijabilnih ćelija, Slika 2 akumulirane vijabilne ćelije, Slika 3 vreme udvostrućavanja broja, a Slika 4 koncentraicju glukoze i laktata u supematantu. - Posle 20.dnevne faze adaptacije, rast ovih ćelija je vrlo dosledan i reproduciblan u podlozi bez sadržaja seruma. Stabilni uslovi rasta omogućavaju supkulturu ćelija veoma lako, ponavljanim razblaživanjima u odnosu od 1:4 tokom produženih vremenskih perioda (testirano do Dana 62, kao što je pokazano na Slikama 1,2,3,4).

LITERATURA

1. Altschul S F et al, J Mol Biol, 215,403-410,1990.

2. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biologv, supra, Interscience, N.Y., §§6.3 and 6.4(1987,1992).

3. Altschul S F etal, Nucleic aCIDS Res., 25:389-3402,1997.

4. Bohaket at.1987 Bohak Z, Kadouri A ofal.(1987) "Novel anchorage matrices for suspension curture of mammalian cells "Biopolimers. 26 Supp!:S205-213.

5. Devereux J et al, Nucleic Acids Res, 12,387-395,1984.

6. Grantham et al., Science, Vol. 185, pp. 862-864 (1974).

6. Kim SH, Eisenstein M, Reznikov L, Fantuzzi G, Novick D, Rubinstein M, Dinarello

CA. Structural requirements of six naturally occurring isoforms of the IL-18 binding protein to

inhibit IL-18. Proc Natl Acad Sci U S A 2000;97:1190-1195.

7. Novick, D, Kim, S-H. Fantuzzi, G, Reznikov, L, Dinarello, C, and Rubinstein, M (1999).

Immunitv 10,127-136.

8. Pearson, Methods Enzvmol. 1990; 183:63-98.

9. Petti SA, Lages ACef al.(1994) 'Three-dimensional mammalian cell growth on nonvvoven poliesterfabricdisks" Biotechnol Prog. 10(5):548-550.

10. Pucketa)., J.Exp.Med. 108, 945,1956

Claims (21)

1. Proces za kultivaciju/gajenje ćelija koje proizvode IL-18BP, koji obuhvata korak gajenja ćelija u u podlozi za kulturu ćelija koja je bez sadržaja komponenti dobijenih iz seruma životinja, naznačeno time da takva podloga za kulturu ćelija obuhvata: Asparagin u koncentraciji u rasponu od oko 800 do oko 900 mg/L; Natrijum hlorid u koncentraciji u rasponu od oko 3000 do oko 4500 mg/L, Selenit u koncentraciji u rasponu od oko 0.005 do oko 0.015 mg/L; Hidrolizat žita u koncentraciji u rasponu od oko 5000 do oko 15000 mg/L; i Insulin u koncentraciji u rasponu od oko 2.5 do oko 6 mg/L

2. Proces za proizvodnju IL-18BP, koji obuhvata korak kultivacije ćelija koje eksprimiraju IL-18BP u podlozi za kulturu ćelija koja je bez sadržaja komponenti dobijenih iz seruma životinja, naznačeno time da ta podloga za kulturu ćelija obuhvata: Asparagin u koncentraciji u rasponu od oko 800 do oko 900 mg/L; Natrijum hlorid u koncentraciji u rasponu od oko 3000 do oko 4500 mg/L; Selenit u koncentraciji u rasponu od oko 0.005 do oko 0.015 mg/L; Hidrolizat žita u koncentraciji u rasponu od oko 5000 do oko 15000 mg/L; i Insulin u koncentraciji u rasponu od oko 2.5 do oko 6 mg/L.

3. Proces u skladu sa zahtevom 1 ili 2, koji dalje obuhvata korak prikupljanja podloge koja obuhvata protein od interesa

4. Proces u skladu sa ma kojim od prethodnih zahteva, koji dalje obuhvata izolovanje proteina od interesa

5. Proces u skladu sa ma kojim od prethodnih zahteva, koji dalje obuhvata formulisanje izotovanog proteina sa farmaceutski prihvatljivim nosačem da se dobije jedan farmaceutski sastav.

6. Proces u skladu sa ma kojim od prethodnih zahteva, naznačeno time da ove ćelije budu ćelije jajnika kineskog hrčka (CHO).

7 Proces u skladu sa ma kojim od prethodnih zajteva; naznačeno time da ova podloga dodatno obuhvata i obuhvata glukozu u koncentraciji u rasponu od oko 500 do oko 5500 mg/L.

8. Proces u skladu sa ma kojim od prethodnih zahteva, naznačeno time da ova podloga dodatno obuhvata amino kiseline odabrane iz sledećih: Alanin, arginin, aspartanska kiselina, cistein, glutaminska kiselina, glicin, histidin, izoleucine, leucin, lizin, metionin, fenialanin, prolin, serin, triptofan, tirozin, treonin, i valin, ali ne i glutamin.

9. Proces u skladu sa zahtevom 8, naznačeno time da ova podloga dodatno uključuje i glutamin.

10. Proces u skladu sa ma kojim od prethodnih zahteva, naznačeno time da ova podloga dodatno obuhvata vitamine odabrane iz sledećih: biotin, pantotenat, holine hlorid, folna kiselina, mio-Inositol, niacinamid, piridoksin, riboflavin, vitamin B12, tiamin, i putrescin.

11. Proces u skladu sa ma kojim od prethodnih zahteva, naznačeno time da ova podloga dodatno obuhvata soli odabrane iz sledećih: CaCI2, KCI, Mg C!2, natrijum fosfat, CuCI2ti ZnCI2.

12. Proces u skladu sa ma kojim od prethodnih zahteva, naznačeno time da ova podloga dodatno obuhvata i jedan pufer.

13. Proces u skladu sa ma kojim od prethodnih zahteva, koji dalje obuhvata masne kiseline odabrane iz sledećih: arahidonska kiselina, linoleinska kiselina, oleinska kiselina, laurinska kiselina, miristična kiselina.

14. Proces u skladu sa ma kojim od prethodnih zahteva, naznačeno time da ova podloga dodatno obuhvata ciklodekstrin.

15. Proces u skladu sa ma kojim od prethodnih zahteva, naznačeno time da ova podloga dodatno obuhvata hidrolizat soje.

16. Proces u skladu sa ma kojim od prethodnih zahteva, naznačeno time da ova podloga dodatno obuhvata hidnokortizon.

17. Proces u skladu sa ma kojim od prethodnih zahteva, naznačeno time da ova podloga dodatno obuhvata zaštitni agens, a posebno Pluronic F68.

18. Proces u skladu sa ma kojim od prethodnih zahteva, naznačeno time da ova podloga dodatno obuhvata piruvat.

19. Upotreba podloge za kulturu ćelija koja uključuje Asparagin u koncentraciji u rasponu od oko 800 do oko 900 mg/L; Natrijum hlorid u koncentraciji u rasponu od oko 3000 do oko 4500 mg/L; Selenite u koncentraciji u rasponu od oko 0.005 do oko 0.015 mg/L; Hidrolizat žita u koncentraciji u rasponu od oko 5000 do oko 15000 mg/L; i Insulin u koncentraciji u rasponu od oko 2.5 do oko 6 mg/L za rast ćelija koje eksprimiraju IL-18BP u kulturi.

20. Upotreba podloge za kulturu ćelija koja uključuje Asparagin u koncentraciji u rasponu od oko 800 do oko 900 mg/L; Natrijum hlorid u koncentraciji u rasponu od oko 3000 do oko 4500 mg/L; Selenit u koncentraciji u rasponu od oko 0.005 do oko 0.015 mg/L; Hidrolizat žita u koncentraciji u rasponu od oko 5000 do oko 15000 mg/L; i Insulin u koncentraciji u rasponu od oko 2.5 do oko 6 mg/L za proizvodnju ćelija koje eksprimiraju IL-18BP u kulturi.

21. Upotreba podloge za kulturu ćelija koja uključuje Asparagin u koncentraciji u rasponu od oko 800 do oko 900 mg/L; Natrijum hlorid u koncentraciji u rasponu od oko 3000 do oko 4500 mg/L; Selenit u koncentraciji u rasponu od oko 0.005 do oko 0.015 mg/L; Hidrolizat žita u koncentraciji u rasponu od oko 5000 do oko 15000 mg/L; i Insulin u koncentraciji u rasponu od oko 2.5 do oko 6 mg/L za održavanje ćelija koje eksprimiraju IL-18BP u kulturi.