RS50926B

RS50926B - Upotreba il-18 inhibitora za lečenje i/ili prevenciju ateroskleroze

Info

Publication number: RS50926B
Application number: YUP-826/02A
Authority: RS
Inventors: Yolande CHVATCHO; Alain Tedgui; Ziad Mallat
Original assignee: Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm); Laboratoires Serono Sa.
Priority date: 2000-05-05
Filing date: 2001-04-30
Publication date: 2010-08-31
Also published as: HU229375B1; AU2001267390B2; ATE395075T1; NO20025307L; MEP64008A; PT1278540E; EP1278540A2; JP2003532685A; SI1278540T1; PL209371B1; PL365697A1; CZ20023644A3; CN1434722A; CN1841066A; IL152567A0; AR035640A1; EE200200620A; CA2407895C; CN1841066B; UA78492C2

Abstract

Upotreba inhibitora IL-18 za proizvodnju leka za lečenje i/ili prevenciju ateroskleroze što je naznačeno time, daje inhibitor IL-18 odabran iz grupe koja se sastoji od antitela na IL-18, antitela na bilo koje podjedinice receptora IL-18 i proteina koji vezuje IL-18 (IL-18BP), muteina IL-18BP koji sadrži konzervativne supstitucije amino kiselina, fuzionisanog proteina IL-18BP i regiona teškog lanca imunoglobulina ili PEGiliranog IL-18BP, gde mutein, fuzionisani protein ili PEGilovani IL-18BP zadržavaju biološku aktivnost vezivanja za IL-18.Prijava sadrži još 3 nezavisna i 31 zavisan patentni zahtev.

Description

POLJE PRONALASKA

Ovaj pronalazak se odnosi na polje vaskularnih bolesti. Još preciznije, ovaj pronalazak se odnosi na upotrebu 1L-18 inhibitora za lečenje i/ili prevenciju ateroskleroze.

STANJE TEHNIKE

Ateroskleroza je najčešća i najvažnija vaskularna bolest, ali postoje i mnogi drugi vaskularni poremećaji. Ateroskleroza najčešće pogađa velike i srednje arterije, a lezije uključuju masne trake, tibrolitične plakove i komplikovane lezije. Ateroskleroza je hronično zapaljensko oboljenje koje se odlikuje progresivnim nagomilavanje masti, kao stoje holesterol, ćelija kao što su makrofagi, T limfociti ili glatke mišićne ćelije, kao i ekstraćelijski matriks (1). Veće naslage nazivaju se ateromima ili plakovimna, i oni često sadrže kalcijum. Masno tkivo može da erodira zid arterije, smanji elastičnost arterije, i utiče na protok krvi. Na kraju, ugrušci mogu da se stvore oko deponovanih plakova, dodatno utičući na protok krvi, što može da dovede do potpune okluzije krvnog suda. Obično je ateroskleroza povezana s povećanim nivoima LDL-holesterola, Lp(a) fibrinogena i faktora VIIJ, kao i smanjenim nivoom HDL-holesterola. U faktore rizika spadaju starost, muški pol, pušenje, dijabetes, gojaznost, visoki nivo holesterola u krvi, ishrana bogata mastima, kao i lična i porodična istorija srčanih oboljenja. Ona je i glavni uzrok ishemije organa, na pr. infarkta miokarda.

Aterom je najuobičajenija lezija u arterijama, koja može dodatno da se

komplikuje trombo-embolijom. Ateromski plakovi često sužavaju lumen arterija dovodeći do ishemije i ponekad atrofije tkiva u hipoperfundovanoj teritoriji. U teške posledice spadaju simptomi angine pektoris zbog ishemije miokarda, srčana

insuficijencija zbog ishemije ili neishemičnih događaja, kao i hipertenzija zbog sužavanja bubrežne arterije i hipoperfuzija bubrega koja fiziološki reaguje povećanom sekrecijom renina.

Ponekad se ateroskleroza i arterioskleroza smatraju potpuno nezavisnim patološkim stanjima, i u tom slučaju, ateroskleroza se definiše kao stvrdnjavanje (skleroza) ili gubitak elastičnosti arterija specifično zbog ateroma, dok se arterioskleroza se defmiše kao stvrdnjavanje (skleroza) ili gubitak elastičnosti arterija iz bilo kog uzroka.

Komplikacije ili posledice ateroskleroze uključuju oboljenje koronarnih arterija (ateroskleroza koronarnih arterija), nedovoljno snabdevanje krvlju zbog opstrukcije (ishemija/angina pektoris), akutni EVI (infarkt miokarda, srlani napad), prolazni ishemični napad (TLA.) ili moždani udar, kao i oštećenje krvnih sudova, mišića ili telesnih organa.

Aneurizme, koje su trajne, abnormalne dilatacije krvnih sudova, predstavljaju takođe uobičajene posledice ateroskleroze. Aterosklerotične aneurizme abdominalne aorte se često razvijaju kod pacijenata starijeg životnog doba. One mogu da se raspuknu (ruptura) u retroperitonelani prostor. Kok aterosklerotskih aneurizmi, često postoji izraženi gubitak elastičnog tkiva i fibroze medije, uglavnom zbog ishemije mišića aortne medije, posle čega dolazi do oslobađanja enzima makrofaga koji izazivaju fragmentaciju elastičnih vlakana.

U lekove koji se preporučuju za lečenje ili prevenciju ateroskleroze spadaju oni za smanjenje masti/holesterola u krvi. Pre svega, široko se primenjuje terapija za smanjenje LDL-holesterola. U ovom trenutku se najšire koriste statini koji su specifični inhibitori HMG CoA reduktaze. U ostale agense za smanjenje masti spadaju holestiramin, kolestipol, nikotinska kiselina, gemfibrozil, probukol, lovastatin i drugi.

Drugi pristup je da se na najmanju meru svede rizik od formiranja tromba na oformljenoj ateromatoznoj leziji. Aspirin, koji je izgleda specifični inhibitor tromboksan A2 posredovane agregacije trombocita, ili antikoagulansi, mogu da se koriste da se smanji rizik od formiranja tromba.

Perkutana «balon angioplastika» koristi kateter koji na vrhu ima balon kojim se plak spljoŠti i poveća se protok krvi kroz okluziju. Ova tehnikaje slična onoj koja se koristi za otvaranje srčanih arterija, ali može da se primeni i na mnoge druge arterije u telu. Stenoza koronarnih arterija se premošćuje segmentima vene safene koja se uliva u proksimalnu aortu ili se disecira mamama arterija iz zida grudnog koša i pravi se anastamoza njenog distalnog kraja za arteriju na prednjoj površini srca.

Hirurško uklanjanje depozita (endarterektomija) može da se preporuči u nekim slučajevima (na primer: karotidna endarterektomija).

Međutim, ipak se najviše preporučuje da se leče ili kontrolišu faktori rizika, kao održavanje nivoa masti na niskom nivou, niskog holesterola, kao i ishrana siromašna solju i preporuke zdravstvenih radnika za lečenje ili kontrolu hipertenzije, dijabetesa i drugih bolesti, smanjenje telesne težine i prestanak pušenja, ako i redovno vežbanje da se popravi kondicija srca i cirkulacije.

Zapaljenski proces je uključen u sve stadijume ateroskleroze (1). Smatra se daje aktivacija endotela različitim faktorima uključujući niski tangencijalni napon, modifikovane lipoproteine i proinflamatorne citokine, prvi korak u aterosklerozi i daje pod kontrolom inflamacije (1). Mnoge novije studije su pokazale daje interakcija između vaskulamih i inflamatornih ćelija ključna za aterogenezu (1). Pre svega, inhibicija definisanih pro-inflamatornih puteva smanjuje razvoj ateroskleroze (1).

I zapaljenje igra važnu ulogu u pucanju aterosklerotskih plakova i trombozi (2-5), i na taj način utiče na pojavu sindroma akutne ishemije i prateći mortalitet (6). I stvarno, teže kliničke manifestacije ateroskleroze, uključujući infarkt srca, mozga i ma kog drugog organa koji je zahvaćen aterosklerozom, uglavnom su posledica okluzije lumena krvnih sudova trombom joji se stvara pri kontaktu sa pokidanim aterosklerotskim plakom (3,4). Patološke studije pokazale su da se vulnerabilni ili nestabilni plakovi, t.j. planovi skloni rupturi ili koji su već prsli, u mnogome u mnogome razlikuju u sastavu ćelija ili matriksa u poređenju sa stabilnim plakovima koji nisu skloni rupturi (7). Vulnerabilni plakovi su bogati inflamatornim ćelijama (makrofagima i T limfocitima), sadrže trombogenu masnu srž i odlikuju se tankom fibroznom kapicom s substancijalnim gubitkom ekstraćelijskog matriksa (7).

Smanjena sinteza kolagena, posredovana proinflamatornim citokinom LFNy i povećana aktivnost metaloproteinaza koje degradiraju matriksa dobijenih iz makrofaga odgovorni su za istanjenje fibrozne kapice i fragilnost (7). Ruptura fragilne fibrozne kapice izlaže visoko trombogenu lipidnu srž krvi u cirkulaciji i dovodi do formiranja okluzivnog tromba (1, 7). Prema tome, gustina zapaljenskih ćelija u datoj aterokslerotskoj leziji smatra se dobrim indikatorom nestabilnosti.

Klinička prognoza pacijenta s aterosklerozom zavisi samo delimično od veličine lezije (19, 20). Sada je široko prihvaćeno da kvalitet (sastav plaka), a ne veličina njegove lezije, može da bude još bolji prediktor pojave ishemičnih događaja. I stvarno, teške kliničke manifestacije ateroskleroze (infarkta mozga i srca) uglavnom su posledica okluzije krvnog suda trombom koji se formira pri kontaktu s erodiranim aterosklerotskim plakom (19). Patološke studije su pokazale da su vulnerabilni ili nestabilni plakovi koji su skloni rupturi ili koji su već erodirali, bogati zapaljenskim ćelijama i da pokazuju znatan gubitak glatkih mišićnih ćelija i kolagenskog sadržaja (20, 21). Štaviše, takvi plakovi pokazuju značajno povećanje apoptotične ćelijske smrti koja vodi do formiranja visoko trombogene lipidne srži (13, 22).

U zapaljenje su uključeni i proinflamatorni citokini. Citokinski interleukin 18 (LL-18) je inicijalno opisivan kao faktor koji indukuje interferon-y (LFNy) (8). To je rani signal razvoja odgovora ćelija pomagača tipa i (Thl) T limfocita. IL-18 deluje zajedno sa LL-12, LL-2, antigenima, mitogenima, i verovatno još nekim faktorima da se indukuje produkcija LFNy. LL-18 takođe pojačava produkciju GM-CSF i LL-1, pojačava proliferaciju T ćelija indukovanu anti-CD3, i pojačava ubijanje ćelija prirodnih ubica posredstvom Fas. Zreli LL-18 su proizvedeni iz svojih prekursora LL-ip konvertujućim enzimom (ICE, kaspaze-1). Receptor LL-18 sastoji se od najmanje dve komponente, koje sarađuju u vezivanju liganda. Mesta vezivanja LL-18 visokog i niskog afiniteta nađena su u mišjim T ćelijama koje su stimulisane LL-12 (19), što govori o receptorskom kompleksu multiplih lanaca. Do sada su identifikovane dve receptorske podjedinice, i obe pripadaju porodici LL-1 receptora (10). Transdukcija signala LL-18 uključuje aktivaciju NF-kB (11).

Nedavno je iz urina čoveka izolovan solubilni protein koji ima visoki afinitet za IL-18, pa su klonirani humana i mišja cDNK kao i taj humani gen (12; WO99/09063). Ovaj protein je nazvan LL-18 vezuućim proteinom (LL-18BP). LL-18BP nije vanćelijki domen jednog od poznatih LL-18 receprota, već protein koji se sekretuje i prirodno cirkuliše. On pripada novoj porodici sekretujućih proteina, koji još uključuju nekoliko proteina enkodiranih za Poxvirus (12). LL18BP se konstitutivno eksprimira u slezini (12). I urinarni i rekombinantni LL18BP specifično vezuju LL-18 visokim afinitetom i moduliraju biološki afinitet LL-18.

Gen ILI 8BP lokalizovan je na humanom hromozomu 11 q 113 i u genomskoj sekvenci 8,3mb nije nađen ekson koji kodira za transmembranski domen. Četiri nadovezane varijante izoforma LL18BP nađene su kod ljudi, i nazvan su LL18BP a, b, c i d, a sve dele isti N-terminus i razlikuju se u C-terminusu (12).

Četiri humana i dva mišja izoforma LL-18BP dobijenih od nadovezivanja mRNK i koji su nađeni u raznim cDNK bibliotekama eksprimirani su, prečišćeni i procenjeni na vezivanje i neutralizaciju bioloških aktivnosti LL-18 (23). Humani LL18BP izoform a (ILI 8Bpa) ispoljava najveći afinitet za LL-18 s brzimon- rate,sporimoff- ratei

konstantom disocijacije (K(d)) od 399 pM. IL-18BPc deli Ig domen LL-18Bpa osima za 29 C-terminalne amino kiseline; K(d)) LL-18BPcje deset puta manja (2,94 nM). Ipak, IL-18BPa i LL-18BPc neutralizuju LL-18 >95% kada je molaritet više od dva. LL-18BPb i LL-18BPd izoformi nemaju potpuni Ig domen i nemaju sposobnost da vezuju ili neutralizuju LL-18. Mišji IL-18BPc i LL-18BPd izoformi imaju identičan Ig domen, i oni neutralizuju

>95% mišji LL-18 kada je molaritet više od dva. Međutim, mišji LL-18BPd, koji ima

zajednički C-terminalni motiv identifikuje jedno veliko mešano elektrostatsko i hidrofobno mesto vezivanja u Ig domenu LL-18BP, što može da objasni visoki afinitet vezivanja za ligand (23).

KRATAK PRIKAZ PRONALASKA

Ovaj pronalazak se zasniva nalazu da inhibitor LL-18 ima izrađeno korisno dejstvo na razvoj plaka, progresiju plaka i stabilnost plaka u mišjem modelu ateroskleroze. Inhibitor LL-18 ne samo sprečava nastajanje lezije u torakalnoj aorti, već indukuje i prelazak na stabilni fenotip plaka kod već oformljenih aterosklerotičnih plakova.

Prema tome, ovaj pronalazak se odnosi na upotrebu inhibitora IL-18 za proizvodnju leka za prevenciju i/ili lečenje ateroskleroze. Ovaj pronalazak se dalje odnosi na metode lečenja genskim terapijskim pristupom lečenja i /ili sprečavanja nastanka ateroskleroze.

KRAĆIOPISCRTEŽA

Slika 1 opisuje histogram koji opisuje procenat preživljavanja endotelijalnih ćelija iz humane umbilikalne vene po inkubaciji samim oksidisanim lipoproteinima ili inkubacije s kombinacijom oksidisanih lipoproteina i LL-18 antitela odnosno LL18BP.

Slika 2 pokazuje Western Blot test urađen na ekstraktima proteina iz aterosklerotičnih arterija u poređenju s kontrolnim aterijama. Kada se radio Western Blot, korišćena su antitela protiv LL-18BP (hLL18BP), LL-18 receptorska a podjedinica (hIL18Ra), LL-18 (hIL18) i Kaspase-1 (Kaspase-1 plO).

Slika 3 pokazuj etidijum bromidom obojeni agarozni gel koji pokazuje rezultate analize RT-PCR na IL-18 i LL-18BP mRNK u ćelijama aterosklerotičnih plakova.

Slika 4 Representativni rezultati RT-PCR za IL-18BP i IL-18 u aterosklerotičnim plakovima u poređenju sa ha-actin (kontrolnom) ekspresijom kod simptomatsdkih i asimptomatskih plakova.

S_Hk£L_5 pokazuje mapu vektora ekspresije koji se koristi za intramuskularni elektrotransfer kod miševa.

Slika 6 pokazuje histogram koji oslikava polje prebojene masnoće u aterosklerotičnim aterijama. Kvantitativna analize slike deponovane masnoće uz pomoć kompjutera. Ovi podaci predstavljaju srednje vrednosti s s.e.m. (n = 19 za prazni plasmid, n = 14 za LL-18BP plasmid). Četvorostruke zvezdice označavaju P < 0.0001.

SJjkaJZ pokazuje histogram koji oslikava polje lezije aortnog sinusa posle tretmana LL-18BP u poređenju s kontrolom (prazni plasmid). Kvantitativna analize slike ledirane površine uz pomoć kompjutera. Ovi podaci predstavljaju srednje vrednosti s s.e.m. (n = 19 za prazni plasmid, n = 14 za LL-18BP plasmid). Dvostruke zvezdice označavaju P < 0.01.

Slika 8 pokazuje dejstvo tretmana IL-18BP na lezije sa sadržajem zapaljenskih ćelija. Kvantitativna analize slike uz pomoć kompjutera je korišćena za određivanje procenta makrofag-pozitivnih površina (crvni stubići) i broja infiltriranih T limfocita na mm' (sivi stubići) u leziji aortnog sinusa kod kontrola (n = 12 za makrofagno bojenje, n = 15 za prebojavanje T limfocita) ili miševa tretiranih sa LL-18BP (n = 13 za makrofage, n = 12 za prebojavanje T limfocita) Podaci predstavljaju srednje vrednosti sa s.e.m. Trostruke zvezdice označavaju P < 0.005; a četvorostruke zvezdice označavaju P < 0.0001.

Slika 9 pokazuje dejstvo tretmana LL-18BP lezija na glatke mišićne ćelije i sadržaj kolagena. Kvantitativna analize slike uz pomoć kompjutera je korišćena za određivanje procenta površina pozitivnih na glatke mišićne ćelije (crni stubići) i akumulaciju kolagena (sivi stubići) u lezijama aortnog sinuda kontrola (n = 6 za glatke mišićne ćelije, n = 11 za kolagen) i miševe tretirane LL-18BP (n = 6 za glatke mišićne ćelije, n = 13 za kolagen). Podaci predstavljaju srednje vrednosti sa s.e.m. Pojedinačne zvezdice označavaju P < 0.05; a dvostruke zvezdice označavaju P < 0.01.

OPIS PRONALASKA

Ovaj pronalazak se zasniva na nalazu povećanih nivoa LL-18 u cirkulaciji pacijenata s akutnim koronarnim sindromom i povećanom produkcijom LL-18 kod nestabilnih aterosklerotičnih karotidnih plakova koji su odgovorni za moždani udar. Uz to, pokazano je dain vivoelektrotransfer ekpresije plazmida DNK koji kodiraju za LL-18BP sprečava razvoj masnih traka u torakalnoj aorti i usporava progresiju uznapredovalih aterosklerotskih plakova u aortnom sinusu u dobro utvrđenom mišjem modelu ateroskleroze. Još važnije, transfekcija sa plazmidom LL-18BP dovodi do dubokih promena u sastavu plaka (smanjenje makrofaga, T ćelija, ćelijske smrti i sadržaja lipida i povećanje glatkih mišićnih ćelija i sadržaja kolagena) što dovodi do stabilnog fenotipa plaka. Ovi rezultati po prvi put pokazuju važnu ulogu inhibitora LL-18 u smanjenju razvoja plaka ili njihove progresije i promocije stabilnosti plaka.

Prema tome, opvaj pronalazak se odnosi na korišćenje inhibitora LL-18 za proizvodnju medikamenta za lečenje i/ili prevenciju ateroskleroze.

Izraz "prevencija" u kontekstu ovog pronalaska odnosi se ne samo na kompletnu prevenciju nekih dejstava, već i na svaku delimičnu ili znatniju prevenciju, ublaženje, redukciju, smanjenje ili značajno umanjenje dejstva pre početka ili na samom početku bolesti.

Izraz "lečenje" u kontekstu ovog pronalaska odnosi se na svako blagotvorno dejstvo na progresiju bolesti, uključujući i ublaženje, redukciju, smanjenje ili značajno umanjenjivanje patološkog razvoja po započinjanju bolesti.

Izraz "inhibitor IL-18" u kontekstu ovog pronalaska odnosi se na svaki molekul koji modulira produkciju LL-18 i/ili delovanje na takav način da su produkcija i/ili dejstvo LL-18 ublaženi, smanjeni ili delimično ili substancijalno ili potpuno sprečeni ili blokirani.

Inhibitor produkcije može da bude svaki molekul koji negativno utiče na sintezu, procesiranje ili maturaciju EL-18. Inhibitori koji se uzimaju u obzir u skladu sa ovim pronalaskom mogu da budu, na primer, supresori genske ekspresije interleukina LL-18, antisense mRNK koja smanjuje ili sprečava transkripciju LL-18 mRNK ili dovodi do degradacije mRNK, proteina koji slabi ispravno savijanje ili delimično ili supstancijalno sprečavaju maturaciju ili sekreciju LL-18, proteaze koja degradira LL-18, kada se jednom sintetizuje, i slično. Jedan inhibitor produkcije može da bude inhibitor Kaspase-1 ili jedan ICE inhibitor, na primer, koji sprečava maturaciju LL-18.

Jedan inhibitor dejstva LL-18 može da bude, na primer antagonista LL-18. Antagonista može da veže ili sekvestrira sam molekul LL-18 s dovoljnim afinitetom i specifičnošću da delimično ili supostancijalno neutralizuje mesta vezivanja LL-18 ili IL-18 koja su odgovoRNK za vezivanje LL-18 za svoje ligande (kao na pr. za svoje receptore). Jedan antagonist može da inhibira i put signalizacije LL-18, akoji se aktivira u ćeliji po vezivanju IL-18 za receptor.

Inhibitori dejstva LL-18 mogu da budu i solubilni LL-18 receptori ili molekuli koji podražavaju receptore, ili agensi koji blokiraju LL-18 receptore, LL-18 antitela, kao monoklonska antitela, na primer, ili ma koji drugi agens ili molekul koji sprečava vezivanje LL-18 za svoje ciljeve, i na taj način smanjuje ili sprečava trigerovanje intra- ili ekstraćelijskih reakcija posredovanih preko LL-18.

Ateroskleroza se naziva i arterioskleroza ili stvrdnjavanje arterija. U kontekstu ovog pronalaska, izraz ateroskleroza obuhvata sve bolesti ili stanja bolesti arterija koja se obično nazivaju ateroskleroza, gde se masni materijal deponuje u zidovima krvnih sudova, što na kraju dovodi do sužavanja i slabljenja protoka krvi kao i rupture i/ili erozije sa stvaranjem ugruška.

U skladu sa ovim pronalaskom, izraz ateroskleroza obuhvata i sklerozu i gubitak elastičnosti arterija zbog ateroma (ateroskleroza) kao i iz ma kog drugog razloga (arterioskleroza). Patološko stanje ateroskleroza, kao i komplikacije ili posledice ateroskleroze, koje su ovde obuhvaćene izrazom "ateroskleroza" u smislu u kome se ovde koristi, detaljno su opisani u delu pod naslovom "Stanje tehnike", gore.

Progresija ateroskleroze uključuje formaciju aterosklerotskih plakova i njihov razvoj u sve nestabilniju formu. Prema tome ovaj pronalazak se odnosi i na upotrebu inhibitora LL-18 inhibitor za proizvodnju medikamenta za smanjenje ili prevenciju progresije ateroskleroze.

Okluzija krvnih sudova ugruškom (trombom) koji se stvara na aterosklerotskom plaku je kritični događaj u infarktu srca i mozga, koji spadaju u najteže posledice ateroskleroze. Prema tome, ovaj pronalazak se odnosi i na korišćenje inhibitora IL-18 za proizvodnju medikamenta za tretman i/ili preveciju tromboze aterosklerotskog plaka.

Stabilnost plaka utiče na razvoj aterosklerotskog plaka u štetni i vulnerabilni plak, koji ima tendenciju da izazove trombozu. Prema tome, ovaj pronalazak se dalje odnosi na korišćenje inhibitora LL-18 za proizvodnju medikamenta za tretman i/ili prevenciju for nestabilnosti aterosklerotskog plaka.

Nestabilni plak ima tendecniju da erodira, a erozija, t.j. disrupcija plaka može da dovede do tromboze. Prema tome, ovaj pronalazak se dalje odnosi na korišćenje inhibitora LL-18 za proizvodnju medikamenta za prevenciju erozije ili rupture aterosklerotskog plaka.

Nestabilnost plaka i tromboza mogu, na pr. Da budu posledica apoptotske ćelijske smrti koja novi visoku prokoagulantnu aktivnost i može da bude ključni element koji dovodi do tromboze ili rupture aterosklerotskog plaka, kao i embolijskog događaja (13, 14). Pokazano je da oksidizovani lipoproteini (oxLDL) indukuju makrofage i apoptozu endotelijalnih ćelija u kulturi (15). Kao što je prikazano u primeru dole, utvrđeno je daje jedan inhibitor LL-18 u stanju da u mnogome smanji smrt ćelija izazvanu oxLDL.

U skladu sa ovim pronalaskom, s iznenađenjem je utvrđeno da su nivoi LL-18 signifikantno povišeni kod pacijenata sa srčanom insuficijencijom koji pate od rekurentnih napada, kao na pr. smrt, rekurentna ishemija, re-vaskularizacija, progresija ateroskleroze ili ponovna hospitalizacija zbog srčane insuficijencije u poređenju s pacijentima koji nisu ponovo hospitalizovani. Ovo povećanje nivoa LL-18 bilo je posebno naglašeno kod onih pacijenata koji su preminuli kasnije, u poređenju s onima koji su preživeli. Povišeni nivoi LL-18 u krvnoj cirkulaciji zapaženi su i u ihemičnih bolesnika kao i kod onih bez ishemije.

Prema tome, ovaj pronalazak se odnosi i na upotrebu inhibitora LL-18 za proizvodnju medikamenata za tretman i/ili prevenciju rekurentnih epizoda srčane insuficijencije. Ove rekurentne epizode mog biti svaki događaj posle srčane insuficijencije, kao što je smrt, rekurentna ishemija, re-vaskularizacija, progresija ateroskleroze ili ponovna hospitalizacija zbog srčane insuficijencije.

U prerefencijalnom obliku ovog pronalaska srčana insuficijencija je izazvana ishemijom, t.j. infarktom miokarda.

U drugom preporučenom obliku ovog pronalaska srčana insuficijencija nije izazvana ishemijom, odnosno ona je ne-ishemijska, izazvana na primer hiperetenzijom, oboljenjem srčanih zalistaka, ili plućnim oboljenjem koje dovodi do desne i o+nda kongestivne srčane insuficijencije.

U preporučenom obliku ovog pronalaska, inhibitor LL-18 se odabire iz grupe koja se sastoji od ICE-inhibitora, antitela protiv LL-18, antitela protiv LL-18 receptorskih podjedinica, inhibitora signalnih puteva LL-18 receptora, antagonista IL-18 koji se nadmeću sa LL-18 i blokiraju LL-18 receptor, i proteina koji vezuju LL-18, muteina, fuziranih proteina, funkcionalnih derivata, aktivnih frakcija ili njihovih cirkularno permutovanih derivata koji imaju istu aktivnost.

Kao što se ovde koristi, izraz "muteini" odnosi se na analoge jednog LL-18BP, ili analoge virusnog IL-18BP,gde jedan ili više amino kiselinskih ostataka prirodnog IL-18BP ili virusnog LL-18BP bivaju zamenjeni amino kiselinskim ostatkom, ili se brišu, ili se jedan ili više aminokiselinskih ostataka dodaje prirodnoj sekvenci LL-18BP, ili virusnom LL-18BP, ne menjajući značajnije aktivnost rezultujućeg proizvoda u poređenju s divljim tipom LL-18BP ili virusnim LL-18BP. Ovi muteini se pripremaju poznatom sintezom i/ili tehnikom mutageneze usmerenom na jedno mesto, ili ma kojom drugom poznatom pogodnom tehnikom.

Svaki takav mutein po mogućstvu sadrži jednu sekvencu amino kiselina dovoljno duplikativan za jedan LL-18BP, ili dovoljno duplikativan za jedan virusni LL-18BP, tako da ima aktivnost dovoljno sličnu aktivnosti LL-18BP. JeDNK od aktivnosti LL-18BP jeste sposobnost da vezuje LL-18. Sve dok taj mutein ima dovoljnu aktivnost vezivanja LL-18, može da se koristi za prečišćavanje LL-18, na primer pomoću afinitetne hromatografije, i tako može da se smatra da ima supstancijalno sličnu aktivnost kao i IL-18BP. Na taj način može da se odredi da li ma koji dati mutein ima supstancijalno istu aktivnost kao i LL-18BP uz pomoć rutinskih eksperimenata uključujući recimo mutein na primer prostom eseju sendvič kompeticije da se odredi da li se vezuje ili ne za odgovarajuće obeleženi LL-18 kao stoje radioimunoesej ili ELISA esej.

Muteini LL-18BP polipeptida ili muteini virusnih LL-18BP, koji mogu da se koriste u skladu sa ovim pronalaskom, ili nukelinske kiseline koje kodiraju za njih, uključuju konačni skup supstancijalno odgovarajućih sekvenci kao supstitucioni peptidi ili polinukleotidi koji ritinski mogu da se dobijaju na način poznat u ovoj oblasti, bez nepotrebnog eksperimentisanja na osnovu saznanja i smernica datih ovde.

Preporučene promene za muteine u skladu sa ovim pronalaskom poznate su kao "konzervativne" supstitucije. Konzervativne supstitucije amino kiselina IL-18BP polipeptida ili proteina ili virusnih LL-18BPs, mogu da uključe sinonimne amino kiseline u grupi koja ima dovoljno slična fizikohemijska svojstva da supstitucija između članova grupa očuva biološku funkciju molekula (16). Jasno je da se insercije i delecije amino kiselina mogu obaviti i u gore navedenim sekvencama ne menjajući njihovu funkciju, posebno ako ove insercije ili delecije uključuju samo manji broj amino kiselina, na pr. Manje od trideset, i po mogućstvu manje od deset, i ne uklanjaju se i ne pomeraju amino kiseline koje su kritične za funkcionalnu konformaciju, na primer cisteinski ostatak. Proteini i muteini koji se proizvedu takvim delecijama i/ili insercijama spadaju u okvire ovog pronalaska.

Po mogućstvu, sinonimske grupe amino kiselina su one koje su definisane na Tabeli I. Još je bolje ako su sinonimske grupe amino kiselina one koje su definisane na Tabeli II; a najbolje je ako su sinonimske grupe amino kiselina one koje su definisane na Tabeli LH.

Primeri produkcije supstitucija amino kiselina u proteinima koji mogu da se koriste za dobijanje muteina LL-18BP polipeptida ili proteina, ili muteina virusnog LL-18BPS, za upotrebu u ovom pronalasku uključuje sve metode i korake koji su prikazani u patentima SAD 4,959,314, 4,588,585 i 4,737,462, na Mark i sar; 5,116,943 naKoths i sar., 4,965,195 naNamen i sar; 4,879,111 na Chong i sar; i 5,017,691 na Lee i sar; lizinom supstituisane proteine prikazane u patentu SAD No. 4,904,584 (Shaw i sar).

Izraz "fuzirani protein" odnosi se na jedan polipeptid koji obuhvata LL-18BP, ili virusni IL-18BP, ili njihov mutein, koji je fuziran s drugim proteinom, koji na pr. ima produženo vreme boravka u telesnim tečnostima. LL-18BP ili jedan virusni LL-18BP, mogu na taj način da se spoje s drugim proteinom, polipeptidom ili slično, na pr. imunoglobulinim ili njegovim fragmentom.

"Funkcionalni derivati " u smislu u kome se ovde koriste uključuje derivate LL-18BPs ili virusni LL-18BP, i njihove muteine i fuzirane proteine, koji mogu da se pripremaju od funkcionalnih grupa koje nastaju kao bočni lanci na ostatcima ili na N- ili C-terminalnim grupama, na načine poznate u struci, i uključeni su u ovaj pronalazak sve dotle dok su farmaceutski prihvatljivi, t.j. ne uništavaju aktivnost LL-18BP, ili virusnog LL-18BPs, i ne daju toksična svojstva preparatima koji ih sadrže. Ovi derivati mogu, na primer, da uključe polietilenske glikolne bočne lance, koji mogu a maskiraju antigena mesta i produže boravak jednog LL-18BP ili virusnog LL-18BP u telesnim tečnostima. U druge derivate spadaju alifatični estri karboksilnih grupa, amidi karboksilnih grupa, reakcijom s amonijakom ili s primamim ili sekundarnim aminima, N-acil derivati slobodnih amino grupa amino kiselinskih ostataka koji se formiraju s acilnim sredinama( na pr.alkanoil ili karbociklične aroil grupe) ili O-acil derivati slobodnih hidroksilnih grupa (na primer seril ili treonil ostataka) koji se formiraju s acilnim sredinama.

Kao "aktivne frakcije" LL-18BP, ili virusnog LL-18BP, muteina i fuziranih proteina, ovaj pronalazak obuhvata svaki fragment ili prekursore polipeptidnih lanaca samog proteinskog molekula alone ilio zajedno s pratećim molekulima ili ostatcima povezanim za njega,na pr.,šećer ili fosfatni ostatci, ili agregati proteinskog molekula ili sami šećerni ostatci, pod uslovom da navedena frakcija ima aktivnost koja je supstancijalno slična aktivnosti L-18BP.

U dodatnom preporučenom obliku ovog pronalaska, inhibitor LL-18 je jedno LL-18 antitelo. Anti-LL-18 antitela mogu biti poliklonska ili monoklonska, himerska, humanizovana, ili čak potpuno humana. Rekombinantna antitela i njihovi fragmenti se odlikuju visokim afinitetom vezivanja za IL-18in vivoi niskom toksičnošću. Antitela koja mogu da se koriste u ovom pronalasku odlikuju se sposobnošću da tretiraju pacijente tokom perioda dovoljno dogog da se dobije dobra do odlična regresija ili ublaženje patogenog stanja ili svakog simptoma ili grupe simptoma koji su vezani za to patogeno stanje, i niskom toksičnošću.

Neutralizujuća antitela se lako dobiajju od životnja kao što je zec, koza ili miš imunizacijom sa LL-18. Imunizovani miševi su posebn o pogodni za obezbeđivanje izvora B ćelija za proizvodnju hibridoma, koji se za uzvrat gaje da proizvedu velike količine anti-LL-18 monoklonskih antitela.

Himerska antitela su imunoglobulinski molekuli koji se odlikuju sa dva ili više segmenata ili delova koji se dobijaju od različitih životinjskih vrsta. Generalno, variabilni region himerskog antitela dobija se od ne-humanog antitela sisara, kao što je mišje monoklonsko antitelo, a konstantni region imunoglobulina dobija se od jednog humanog imunoglobulinskog molekula. Po mogućstvu, oba regiona i kombinacija imaju nisku imunogenost što se rutinski određuje (24). Humanizovana antitela su imunoglobulinski molekuli stvoreni tehnikama genetskog inženjeringa gde se konstantni mišji regioni zamenjuju odgovarajućim humanim delovima dok istovremeno zadržavaju mišje regione vezivanja antigena. Dobijeno mišje-humano himersko antitelo ima po mogućstvu smanjenu imunogenost i poboljšanu farmakokinetiku kod ljudi (25).

Tako, u još jednom preporučenom obliku, LL-18 antitelo je humanizovano LL-18 antitelo. Preporučeni primeri humanizovanih anti-LL-18 antitela opisani su u European

Patent Application EP 0 974 600, na primer.

U još jednom preporučenom obliku LL-18 antitelo je potpuno humano. Tehnologija proizvodnje humanih antitela detaljno je opisana u na pr. WO00/76310, WO99/53049, US 6,162,963 ili AU 5336100. Potpuno humana antitela su po mogućstvu rekombinantna antitela, proizvedena u transgenim životinjama, na pr. ksenomišu, i obuhvataju sve delove funkcionalnih humanih Ig lokusa.

U visoko preporučenom obliku ovog pronalaska, inhibitor LL-18 je LL-18BP, ili izoform, mutein, fuzirani protein, funkcionalni derivat, aktivna frakcija ili cirkulamo permutivani derivat istih. Ovi izoformi, muteini, fuzirani proteini ili funkcionalni derivati zadržavaju biološku aktivnost LL-18BP, pre svega vezivanje za LL-18, i po mogućstvu imaju bar jednu aktivnost sličnu LL-18BP. Idealno, ovakvi proteini imaju biološku aktivnost koja je čak povećana u poređenju s nemodifikovanim LL-18BP. Preporučene aktivne frakcije imaju aktivnost koja je bolja od aktivnosti LL-18BP, ili koja ima druge prednosti, kao što je bolja stabilnost ili niža toksičnost ili imunogenost, ili ih je lakše proizvesti u većim količinama, ili ih je lakše prečistiti.

Sekvence LL-18BP i nadovezane variante/izoforme mogu da se preuzmu iz VVO99/09063 ili iz (12), kao i iz (23).

Funkcionalni derivati LL-18BP mogu da se konjuguju za polimere da bi se poboljšale osobine proteina, kao što su stabilnost, poluživot, biološka raspoloživost, tolerancija od strane ljudskog organizma ili imunogenost. Da bi se postigao ovaj cilj, LL18-BP može da se poveže na pr. za Polietilenglicol (PEG). PEGilacija može da se obavi poznatim metodama, opisanim u WO 92/13095, na primer.

Prema tome, u preporučenom obliku ovog pronalaska, LL-18BP je PEGiliran.

U drugom preporučenom obliku ovog pronalaska, inhibitor LL-18 je jedan fuzirani protein koji obuhvata celo ili delove LL-18 vezujućeg proteina, koji se vezuje za ceo ili za delove imunoglobulina. Stručnjak za ovu oblast će razumeti da rezultujući fuzioni protein zadržava biološku aktivnost LL-18BP, pre svega vezivanje za LL-18. Ova fuzija može da bude direktna, ili da se odvija preko kratkih linker peptida koji mogu biti kratki samo 1 do 3 amino kiselinska ostatka dužine ili mogu biti duži, na primer, 13 amino kiselinskih ostataka dužine. Ovaj linker može da bude tripeptid sekvence E-F-M (Glu-Phe-Met), na primer, ili linker sa 13-amino kiselinskih sekvenci i da obuhvata Glu-Phe-Gly-Ala-Gly-Leu-Val-Leu-Gly-Gly-Gln-Phe-Met koji se uvode između IL-18BP sekvence i imunoglobulinske sekvence. Rezultujući fuzioni protein ima poboljšana svojstva, kao što je produženo vreme boravka u telesnim tečnostima (polu-život), povećanu specifičnu aktivnost, povećani nivo ekspresije ili je olakšana purifikacija fuzionog proteina.

U jednom preporučenom obliku, LL-18BP je spoje za konstantni region jednog Ig molekula. Po mogućstvu, spaja se za region teških lanaca, kao CH2 i CH3 domeni humanog IgGl, na primer. Generisanje specifičnih fuzionih proteina koji uključuju IL-18BP i deo jednog imunoglobulina opisano je u primeru 11 iz WP99/09063, na primer. Drugi izoformi Ig molekula su takođe pogodni za generisanje fuzionih proteina u skladu sa ovim pronalaskom, kao što su izoformi IgG>ili IgG;, ili druge Ig klase, kao IgM ili IgA, na primer. Fuzioni proteini mogu biti monomerni ili multimerni, hetero- ili homomultimerni.

Interferoni su pre svega poznati po inhibitornom dejstvu na replikaciju virusa i ćelijsku proliferaciju. Interferon-y, na primer, igra važnu ulogu u promociji imuno i inflamatornih odgovora. Smatra se da Interferon p (EFN-p, interferon tip I), igra anti-inflamatornu ulogu.

Ovaj pronalazak se odnosi i na korišćenje kombinacije inhibitora LL-18 i jednog interferona za proizvodnju lekova za lečenje ateroskleroze.

Interferoni mogu da se konjuguju u polimere da bi se poboljšala stabilnost proteina. Konjugat Interferona P i poliol Polietilenglikol (PEG) opisan je na primer u W099/55377.

U drugom preporučenom obliku ovog pronalaska, interferon je Interferon-P (LFN-P), ili još bolje IFN-p la.

Inhibitor produkcije i/ili dejstva IL-18 se po mogućstvu koristi istovremeno, sekvencijalno ili odvojeno od interferona.

U još jednom obliku ovog pronalaska, inhibitor LL-18 se koristi u kombinaciji sa antagonistom TNF..Antagonisti TNF svoje dejstvo vrše na nekoliko načina. Prvo, antagonisti mogu da se vezuju ili da sekvestriraju sam TNF molekul s dovoljnim afinitetom i specifičnošću da delimično ili supstancijalno neutralizuju TNF epitop ili epitope odgovorne za vezivanje receptora TNF (u daljem tekstu nazivaće se "sekvestrirajući antagonisti"). Jedan sekvestrirajući antagonist može biti, na primer, i antitelo protiv TNF.

Alternativno, TNF antagonisti mogu da inhibiraju signalni put TNF koji se aktivira od strane receptora na površini ćelije po vezivanju TNF (u daljem tekstu "signalizirajući antagonisti"). Obe grupe antagonista su korisne, bilo same ili zajedno, u kombinaciji s IL-18 inhibitorom, za lečenje ateroskleroze.

TNF antagonisti se lako identifikuju i procenjuju rutinskim skriningom kandidata za njihovo dejstvo na aktivnost nativnog TNF na osetljive ćelijske linijein vitro,na primer humane B ćelije, u kojima TNF izaziva proliferaciju i sekreciju imunoglobulina. Ovaj esej sadrži TNF formulaciju u različitim razblaženjima kandidata antagonista, na pr od 0,1 do 100 puta molarne količine TNF koja se koristi u eseju, i kontrole bez TNF ili samo sa antagonistom (26).

Sekvestrirajući antagonisti su preporučeni TNF antagonisti koje treba koristiti u skladu sa ovim pronalaskom. Među sekvestrirajućim antagonistma, prednost se daje onim polipeptidima koji vezuju TNF visokim afinitetom a imaju nisku imunogenost. Solublni molekuli TNF receptora and neutralizujuća antitela na TNF se posebno preporučuju. Na primer, solubilni TNF-RI i TNF-RJI su korisni za ovaj pronalazak. Skraćene forme ovih receptora, koje obuhvataju ekstraćelijske domene receptora ili njihovih funkcionalnih delova, su posebno preporučeni antagonisti u skladu sa ovim pronalaskom. Skraćene solubilni TNF tip-I i tip-LT receptori opisani su u EP914431, na primer.

Skraćene forme TNF receptora su solubilne i detektovane su urinu i serumu kao 30 kDa i 40 kDa TNF inhibitorni vezujući proteini, koji se nazivaju TBPI odnosno

TBPII (27). U skladu sa ovim pronalaskom, prednost se daje simultanoj, sekvencijalnoj ili odvojenoj upotrebi inhibitora LL-18 sa TNF antagonistom i/ili Interferonom.

U skladu sa ovim pronalaskom, TBP I i TBPII su preporučeni TNF antagonisti koje treba koristiti u kombinaciji sa inhibitorom LL-18. Derivati, fragmenti, regioni i biološki aktivni delovi receptorskih molekula funkcionalni podsećaju na receptorske molekule koji takođe mogu da se koriste u ovom. Ovakav biološki aktivan ekvivalent ili derivat receptorskog molekula odnosi se da deo polipeptida, ili sekvence koja enkodira receptorski molekul, koji je dovoljno veliki i u stanju je da veže TNF takvim afinitetom da interakcija sa TNF receptorom vezanim za membranu biva inhibirana ili blokirana.

U još jednom preporučenom obliku, humani solubilni TNF-RI (TBPI) je TNF antagonist koji se koristi u skladu sa ovim pronalaskom. Prirodni i recombinantni solubilni TNF receptorski molekuli i metode njihove produkcije opisani su u evropskim patentima EP 308 378, EP 398 327 i EP 433 900.

Inhibitor LL-18 može da se koristi istovremeno, sekvencijalno ili odvojeno od inhibitora TNF. Bolje je kada se koristi kombinacija LL-18 antitelo ili antiserum i jedan solubilni receptor TNF, koji ima inhibitornu aktivnost TNF.

U još jednom preporučenom obliku ovog pronalaska, ovaj medikament još obuhvata i COX-inhibitor, po mogućstvu COX-2 inhibitor. COX inhibitori su poznati u struci. Specifični COX-2 inhibitori su otkriveni u WO 01/00229, na primer.

Inhibitori tromboksana, pre svega tromboksana A2, trenutno se široko koriste za lečenje ateroskleroze. Prema tome, u dodatnom preporučenom obliku ovog pronalaska ovaj medikament još obuhvata i inhibotor tromboksana pre svega inhibitor tromboksana A2, za simultanu, sekvencijalnu ili odvojenu upotrebu. Aspirin se posebno preporučuje za upotrebu sa inhibitorom LL-18, u skladu sa ovim pronalaskom.

Jedan od uzroka ateroskleroze je izgleda i visoka koncentracija lipida u krvi. Prema tome, u dodatnom obliku ovog pronalska, ovaj medicament dodatno obuhvata i agens za snižavanje koncentracije lipida za simultanu, sekvencijalnu ili odvojenu upotrebu. Svaki agens za snižavanje lipida poznat u struci može da se koristi za ovaj pronalazak, uključujući holestiramin, kolestipol, nikotinsku kiselinu, gemfibrozil, probukol, i druge. Prednost se daje posebno inhibtorima FLMG CoAReduktaze a posebno takozvanim statinima. Mnogi statini su poznati u struci, recimo Simvastatin ili lovastatin.

Da bi se još bolje sprečila i/ili lečila ateroskleroza preporučeni oblik ovog pronalaska odnosi se na korišćenje inhibitora IL-18 u kombinaciji sa ishranom siromašnom mastima i/ili holesterola i/ili soli.

U preporučenom obliku ovog ponalaska, inhibitor LL-18 se koristi u količini od oko 0.0001 do 10 mg/kg telesne težine, ili oko 0.01 do 5 mg/kg telesne težine ili oko 0.1 do 3 mg/kg telesne težine ili oko 1 do 2 mg/kg telesne težine. U još jednom preporučenom obliku, inhibitor LL-18 se koristi u količini od oko 0.1 do 1000 p.g/kg telesne težine ili 1 do 100 ug/kg telesne težine ili oko 10 do 50 u.g/kg telesne težine.

Ovaj pronalazak se dalje odnosi na korišćenje vektora ekspresije koji obuhvata sekvencu kodiranja inhibitora IL-18 za pripremu medikamenta za prevenciju i/ili lečenje ateroskleroze. Prema tome, za lečenje i/ili prevenciju bolesti koristi se genski terapijski pristup. Prednost se ogleda u tome sa će ekspresija inhibitora LL-18 tako bitiin situ,i na tak način efikasno blokirati LL-18 direktno u tkivima ili ćelijama zahvaćenim bolešću.

Kao što je u donjim primerima detaljno objašnjeno, pokazano je da efikasna ekspresija LL-18BP može da se pokaže na mišjem modelu po bolesti po elektrotransferu vektora ekspresije koji obuhvata sekvencu kodiranja LL-18BP.

Prema tome, u preporučeno m obliku, vektor ekspresije se daje elektrotransferom, po mogućstvu intramuskularno,

Korišćenje vektora ua indukciju i/ili pojačanje endogene produkcije inhibitora LL-18 u ćeliji koja je normalno nema za ekspresiju inhibitora LL-18, ili koja eksprimira nedovoljne količine inhibitora uzimaju se u obzir, takođe, po ovom pronalasku. Ovaj vektor može da obuhvata regulatorne sekvence koje su funkcionalne u ćeilijama koje želimo da ekprimiraju inhibitor LL-18. Opvakve regulatorne sekvences mogu da budu promoteri ili pojačivači, na primer. Ove regulatorne sekvence onda mogu da se uvedu u pravi lokus genoma homolognom rekombinacijom, i na taj način operativno povežu regulatorne sekvence sa genom, čiju ekspresiju treba indukovati ili pojačati. Ova tehnologija se obično naziva "endogenom genskom aktivacijom" (EGA), i opisana jena pr. u WO 91/09955.

Stručnjaci za ovu oblast će razumeti i da da se spreči ekspresija LL-18 korišćenjem iste tehnike, t.j. uvođenjem negativnog regulacionog elementa, kao na pr. elementa za utišavanje, u genski lokus IL-18, što tako dovodi do nishodne regulacije ili sprečavanja ekspresije LL-18. Stručnjaci za ovu oblast će razumeti i da takva nishodna regulacija ili utišavanje ekspresije LL-18 ima isto dejstvo kao i LL inhibitor -18 za sprečavanje i/ili lečenje bolesti.

Ovaj pronalazak se dodatno odnosi na korišćenje ćelije koja je genetski modifikovana da proizvede inhibitor LL-18 za proizvodnju medikamenta za lečenje i/ili prevenciju ateroskleroze.

Ovaj pronalazak se dalje odnosi na farmaceutski sastav koji je posebno koristan za lečenje i/ili prevenciju ateroskleroze, koji uključuje terapijski efikasne količine inhibitora LL-18 i terapijski efikasne količine interferona. Kao inhibitor LL-18, ova formulacija može da obuhvati inhibotore kaspaze-1, antitela protiv LL-18, antitela protiv ma koje LL-18 receptorske podjedinice, inhibitore LL-18 signalnog puta, antagoniste LL-18 koji se nadmeću sa LL-18 i blokiraju receptor LL-18, kao i IL-18 vezujuće proteine, izoforme, muteine, fuzirane proteine, funkcionalne derivate, aktivne frakcije ili njihove cirkulatomo permutovane derivate koji imaju istu aktivnost. LL-18BP i njegovi izoformi, muteini, fuzirani proteini, funkcionalni derivati, aktivne frakcije ili njihovi cirkulatomo permutovani kako su gore opisani predstavljaju preporučene aktivne sastojek farmaceutske formulacije.

Interferon koji je uključen u ovu farmaceutsku foprmulaciju je po mogućstvu IFN-p

U još jednom preporučenom obliku, farmaceutska formulacija obuhvata terapisjki aktivne količine inhibitora LL-18, po želji interferon, i jedan TNF. Ovi antagonisti TNF mogu biti antitela koja neutralizuju aktivnost TNF ili solubilni antagonist skraćeni TNF receptorski fragmenti, koji se nazivaju i TBPI i TPBLI. Farmaceutska formulacija u skladu sa ovim pronalaskom može da uključi još i inhibitore COX, po mogućstvu inhibitore COX-2. Farmaceutska formulacija u skladu sa ovim pronalaskom može da uključi još i inhibitore tromboksana, kao što je aspirin, i/ili agens za snižavanje lipida kao stoje statin.

Definicija "farmaceutski prihvatljivog" ima za cilj da obuhvati nosač, koji ne utiče na efikasnost biološke aktivnosti aktivnog sastojka i koji nije toksičan za domaćina kome se daje. Na primer, za parenteralnu primenu, aktivni protein(i) mogu da se formulišu u jedinici doziranja za injekcije sa nosačima kao što su fiziološki rastvor, rastvor dekstroze, serumski albumin i Ringerov rastvor.

Aktivni sastojci farmaeutske formulacije u skladu sa ovim pronalaskom mogu da se daju pojedincima na različite načine. U načine davanje spadaju intradermalni, transdermalni (na pr. za formulacije sa sporim oslobađanjem), intramuskularni, intrapentonealni, intravenski, supkutani, oralni, epiduralni, površinski, i intranazalni način. Može se koristiti i svaki drugi terapijski efikasan način davanja, na primer apsorpcija kroz epitelijalno ili endotelijalno tkivo, ili genskom terapijom gde molekul DNK koji enkodira aktivni agens biva dat pacijentu (na pr. preko vektora) što dovodi do ekspresije ili sekrecije aktivnog agensa in vivo. Uz to, protein(i) u skladu sa ovim pronalaskom mogu da se daju zajedno s drugim komponentama biološki aktivnih agenasa kao što su farmaceutski prihvatljivi surfaktanti, ekscipienti, nosači, razblaživači i slično.

Za parenteralnu (na pr. intravensku, supkutanu, intramuskularnu) primenu, aktivni protein(i) mogu da se formulišu kao rastvori, suspenzije, emulzije ili liofilizovani prah u kombinaciji s farmaceutski prihvatljivim (na pr. voda,, fiziološki rastvor, rastvor dekstroze) i dodaci koji održavaju izotoničnost (na pr. manitol) ili hemijsku stabilnost (na pr. konzervansi i puferi). Formulacija se sterilizuje uobičajenim tehnikama.

Biološka raspoloživost aktivnih protein(a) u skladu sa ovim pronalaskom može da se poboljša i korišćenjem procedure konjugacije koja pojačava polu-život ovog molekula u telu čoveka, na primer povezivanjem ovog molekula za polietilenglicol, kao što je opisano u zahtevu za patent PCT WO 92/13095.

Terapijski efikasne količine aktivnih protein(a) biće u funkciji mnogih promenljivih, uključujući tip antagoniste, afinitet tog antagoniste za IL-18, svu preostalu citotoksičnu aktivnost koju manifestuju antagonisti, način davanja, kliničko stanje pacijenta (uključujući i poželjnost da se održi ne-toksični nivo aktivnosti LL-18 ).

"Terapijski efikasna količina" je takva da kada se daje, inhibitor LL-18 dovodi do inhibicije biološke aktivnosti LL-18. Primenjena doza, u vidu pojedinačne ili multiplih doza, svakom pojedinom pacijentu zavisiće od brojnih činilaca, uključujući i farmakokinetička svojstva inhibitora LL-18, način davanja, osobine pacijenta i njegovo stanje (pol, godine starosti, telesna težina, veličina), težinu simptoma, prateću terapiju, učestalost lečenja i željeno dejstvo. Podešavanje i manipulacije utvrđenog režima doziranja znatno se razlikuju zavisno od sposobnosti stručnjaka kao i zavisno odin vi troiin vivometoda određivanja inhibicije LL-18 kod svakog pojedinca.

U skladu sa ovim pronalaskom, inhibitor LL-18 se koristi u količini od oko 0.0001 do 10 mg/kg ili oko 0.01 do 5 mg/kg telesne težine, ili oko 0.01 do 5 mg/kg telesne težine, ili oko 0.1 do 3 mg/kg telesne težine, ili oko 1 do 2 mg/kg telesne težine. Druge preporučene količine inhibitora LL-18 su količine od oko 0.1 do 1000 u.g/kg telesne težine, ili oko 1 to 100 u.g/kg telesne težine, ili oko 10 to 50 M-g/kg telesne težine.

U skladu sa ovim pronalaskom, što se tiče načina davanja, prednost se daje supkutanoj administraciji. U skladu sa ovim pronalaskom preporučuje se i intramuskularna administracija.

U drugim preporučenim oblicima, inhibitor LL-18 se daje svaki dan ili svaki drugi dan.

Dnevne doze se obično daju u podeljenim dozama ili u oblicima sa kontrolisanim oslobađanjem da bi se dobilo željeno dejstvo. Drugo ili naredno davanje može da se obavi u dozi koja je ista, manja ili veća od inicijalne ili prethodne doze koja se da individualnom pacijentu. Drugo ili naredno davanje može da se obavi tokom bolesti ili pre početka bolesti.

U skladu sa ovim pronalaskom, inhibitor IL-18 može da se daje profilaktički ili terapijski, istovremeno, sekvencijalno sa drugim terapijskim režimima ili agensima (na pr. režimi sa više lekova) u terapijski efikasnoj količini. Aktivni agensi koji se daju istovremeno s drugim terapijskim agensima mogu da se daju u istim ili drugačijim sastavima.

Ovaj pronalazak se dalje odnosi na metodu lečenja i/ili prevencije ateroskleroze kojom se podrazumeva davanje efikasne inhibirajuće doze inhibitora LL-18 domaćinu kome je to potrebno.

Ovaj pronalazak se dalje odnosi na metodu lečenja i/ili prevencije ateroskleroze uključuje davanje ekspresivnog vektora koji uključuje sekvencu inhibitora LL-18 domaćinu kome je to potrebno.

U preporučenom obliku ovog pronalaska, vektor ekspresije se daje sistemski, i po mogućstvu u vidu intramuskularne injekcije.

Ovaj proizvod se dalje odnosi na korišćenje LL-18 kao dijagnostičkog markera za lošu kliničku prognozu kod srčane insuficijencije. Loša klinička prognoza obuhvata svako pogoršanje stanja pacijenta, kao rekurentni napad, ili čak smrt, po prvom infarktu miokarda

Preporučuje se da se LL-18 koristi kao dijagnostički marker rekurentih napada po prvoj srčanoj insuficijenciji. U rekurentne događaje spadaju sledeći: smrt, rekurentna ishemija, re-vaskularizacija, progresija ateroskleroze ili ponovna hospitalizacija zbog srčane insuficijencije, i drugi.

Pošto smo opisali pronalazak, lakše ćemo ga razumeti pozivom na sledeće primere koji su dati u cilju ilustracije, a ne ograničavanja ovog pronalaska.

PRLMERI

Materijal i metode

Uzorci

Prikupljeno je četrdeset jedan humanih aterosklerotskih plakova dobijenih od 36 bolesnika podvrgnutih karotidnoj endarterektomiji. Kao kontrola služile su 2 karotidne i 3 interne mamarne arterije bez ateroskleroze (2 sa minimalnim fibromuskularnim zadebljanjem) koje su dobijene ili autopsijski ili tokom operacije koronarnog bajpasa. One su odmah uronjene u tečni azot i čuvane na -80°C. Plakovi koji su korišćeni za ekstrakciju proteina i DNK odmah su oprani, uronjeni u tečni azot i čuvani na -80°C. Za imunohistohemijska ispitivanja, plakovi su 2 sata čuvani u svežem 4% para-formaldehidu, a zatim preneti u 30% rastvor saharoze-PBS pre brzog zamrzavanja na optimalnu temperaturu za sekciju tkiva u medijumu za obradu (O.C.T. Compound, Miles Ine, Diagnostics Division) s tečnim azotom i čiuvani na -80°C for za kriostatske preseke. Za svaki uzorak dobij eno je po nekoliko preseka debljine 8- to 10-um za histološku analizu i imunohistohemijska ispitivanja.

Klasifikacija pacijenata

Da bi se ispitao potencijalni odnos između ekspresije IL-18/LL-18BP i znakova nestabilnosti plaka, prospektivno i slepo smo prikupljali kliničke podatke od 23 uzastopna pacijenta (od 36) koji su podvrgnuti endarterektomiju u periodu između maja i avgusta 2000. Prisustvo ili odsustvo ulkusa na plaku na makroskopskom pregledu sistematski je beležio hirurg koji je obavljao samu endarterektomiju. Ovo nam je omogućilo da plakove klasifikujemo kao ulcerisane i ne-ulcerisane. Uz to, pacijenti su klasifikovani u dve posbne grupoe po svojim simptomima. Oni koji su e pojavili sa kliničkim simptomima cerebralnoj ishemijskog napada vezanog za karotidnu stenozu klasifikovani su kao simptomatski. Endarterektomija je urađena 2-66 dana (17.6 ± 5.3 dana) po prvoj pojavi kliničkih simptoma kod tih bolesnika. Pacijenti koji nikada nisu imali simptome cerebralne ishemije na teritoriji karotidne arterije klasifikovani su kao asimptomatski. Asimptomatska karotidna stenoza je otkrivena na bazi sistematskog kliničkog pregleda pacijenata s koronarnom ili perifernom bolešću, a težina je određena korišćenjem ponovljene Doppler ehografije od strane iskusnog pouzdanog ehografiste. Iako asimptomatski bolesnici nikada nisu imali ishemičnu epizodu na teritoriji karotine stenoze, karotidna endarterektomija se pokazala korisnom kod ovih bolesnika što je pokazala studija asimptomatske karotidne ateroskleroze (ACAS) (28).

Analiza JVestern Blot

Proteini su ekstrahovani iz 12 aterosklerotskih plakova i 5 kontrolnih normalnih arterija. Zamrznuti uzorci su pulverizovani u tečnom azotu. Prah je ponovo suspendovan u ledenom puferu za liziranje [20 mmol/L Tris-HCl, pH 7.5, 5 mmol/L EGTA, 150 mmol/L NaCl, 20 mmol/L glicerofosfate, 10 mmol/L NaF, 1 mmol/L natrijum ortovanadat, 1% Triton X-100, 0.1% Tween 20,1 ug/mL aprotinin, 1 mmol/L PMSF, 0.5 mmol/L N-tosil-L-fenilalanin hlorometil keton (TPCK), 0.5 mmol/L N(a)-p-tosil-L-lizin hlorometil keton (TLCK)] u odnosu od 0.3 mL/10 mg mokre težine. Ekstrakti su inkubirani na ledu 15 minuta a onda su centrifugirani (12 000 g, 15 minuta, 4°C). Frakcije supernatanta rastvorljive u deterdžentu su zadržane, a koncentracije proteina u uzorcima su ujednačene korišćenjem Bio-Rad protein eseja.

Da bi se uradili Western blot analize na LL-18 i LL-18R, ekstrakti proteina su kuvani 5 minuta u stavljani na 7.5% ili 15% SDS-poliakrilamid gel. Za IL-18BP, rhLL-18 prečišćen iz E.Coli (Serono Pharmaceutical Research Institute, Geneva) kupliran je sa Affligel 15 (Biorad) nalmg/ml smole u skladu sa protokolom proizvođača. Ekstrakt proteina (60 ug) inkubiran je preko noći na 4°C na roleru sa 20 ul smole podešeno na 500 ul PBS 0.05% Tween. Da bi se uklonilo svako nespecifično vezivanje, smola je centrifugirana i oprana salO mM Tris pH 8, 140 mM NaCl, 0.5% Tnton-X-100 (Fluka), 0.5% deoksiholata, a zatim sa 50 mM Tris pH 8, 200 mM NaCl, 0.05% TX100, 0.05% nonidet P40 (Fluka), 2 mM CHAPS (Boehringer, Mannheim) i potom je poslednji put prana sa 50 mM Tris pH 8. Smola je potom centrifugirana, ponovo suspendovana u puferu uzorka u redukovanim uslovima, kuvana 5 minuta i konačno postavljana na 10% SDS-poliakrilamid NuPAGE gel (Invitrogen).

Uzorci su elektroforetski preneseni sa poliakrilamid gela na nitrocelulozu. Nitrocelulozne membrane su saturisane 2 sata na sobnoj temperaturi TBST [50 mmol/L Tris-HCl (pH 7.5), 250 mmol/L NaCl, i 0.1% Tween slani rastvor] sa sadržajem 5% obranog suvog mleka. Membrane su onda inkubirane kozjim anti-humanim LL-18 i IL-18R (a-lanac) poliklonskim antitelima (1 ug/ml) (R & D Svstems), mišjim anti-humanim LL-18 BP monoklonskim antitelom (Mab 657.27 na 5 pg/ml) (Corbaz i sar., 2000, rukopis podnet), zečjim anti-humanim kaspaze-1 poliklonskim antitelom (1 ug/ml) (A-19, Santa Cruz). Specifičnost Mab 657.27 analizirana je na trakama membrana kompeticijom korišćenjem 200 x molami višak rhLL-18BP-6his (prečišćen iz ćelija jajnika kineskog hrčka, Serono Pharmaceutical Research Institute) koji se inkubira zajedno sa Mab 657.27 na 5 u.g/ml tokom 1 h. Po inkubaciji sa HRP konjugovanim odgovarajućim antitelima, substrati hemiluminescencije (ECL, Western blotting; Amersham Corp) su korišćeni da se otkriju pozitivne trake u skladu sa uputstvima proizvođača, a trake su vizualizovane po izlaganju Hvperfilm ECL (Amersham Corp).

Imunohistohemija

Zamrznute sekcije 6 aterosklerotskih plakova inkubirane su sa 1:10 normalnim konjskim serumom ili 1:10 normalnim kozjim serumom 30 minuta na sobnoj temperaturi, oprane jednom u PBS, onda inkubirani bilo primarnim mišjim monoklonskim antitelom protiv CD68 za identifikaciju makrofaga (DAKO-CD68, KP1), ili primarnim mišjim monoklonskim antitelom protiv a-aktina humanog glatkog mišića (1A4, DAKO) za identifikaciju ćelija glatkih mišića. Za identifikaciju receptora LL-18 i LL-18 u aterosklerotskim plakovima, specifična kozja poliklonska antitela (R & D Svstems) su korišćena u razblaženju od 5 ug/mL. LL-18 BP su detektovana korišćenjem specifičnih monoklonskih antitela protiv rekombinantnog humanog LL-18BP izoforma a (H20) (Corbaz i sar., 2000 rukopis podnet). Po pranju u PBS, pločice su inkubirane sledećim sekundarnim biotiniliranim antitelima: biotinilirani konjski anti-miš IgG (Vector Laboratories, Ine) u razblaženju od 1:200 za detekciju mrlja sa antitelima protiv CD68, a-actina glatkih mišića i LL-18 BP, kao i biotinilirani konjski anti-kozji IgG (Vector) u razblaženju od 1:200 za detekciju anti-LL-18 i anti-LL-18 receptorskih antitela. Imuno-mrlje su vizualizovane korišćenjem avidin-biotin HRP sistema vizualizacije (Vectastain ABC kit PK-6100 Vector). Za negativne kontrole, okolne sekcije su prebojavane izotip-usklađenim irelevantnim antitelima umesto primarnim antitelima.

Priprema RNK

Ukupna RNK je ekstrahovana iz 29 aterosklerotskih plakova u kiselom guanidium tiocijanat rastvoru i ekstrahovana fenolom i hloroformom korišćenjem metode Chomczvnski i Sacchi (29). Prečišćena RNK je rastvorena u vodi, a koncentracija je merena apsorbancom na 260 nm. Integritet RNK procenjen je elektroforezom na 1% agarosa gelu. cDNK je sintetizovana iz lug ukupne RNK korišćenjem Promega sistema reverzne transkripcije u skladu sa protokolom proizvođača.

Pohkvantitativna i Real- time PCR humanog IL- 18 i IL- 18BP u humanim

aterosklerotskim plakovima.

Polukvantitativne reakcije PCR obavljane su u ukupnoj zapremini od 50 ul prisustvu 1U AmpliTaq DNK Polimerase (Perkin Elmer, Roche, U.S.A), 2.5 mM dNTPs (Amersham, U.S.A), i 50 pmoles ushodnih i reverznih PCR prajmera. Reakcije su inkubirane u PTC-200 Peltier Effect Thermal Cvcler (MJ Research, U.S.A) u sledećim uslovima: denaturacija 1 min na 94°C, kaljenje 1 min na 55°C i ekstenzija 1 min na 72°C. Da bi se obezbedilo poređenje količine PCR proizvoda tokom linearne faze PCR reakcije, LL-18BP, LL-18 i P-aktin su analizovani posle 25, 28 i 31 ciklusa. Određivanje optimalni broj ciklusa za LL-18BP, LL-18 i p-aktin pre saturacije traka (31, 28 i 25, u istom redosledu). PCR prajmeri su određeni na bazi objavljenih sekvenci (AF110799, D49950, X00351) na sledeći način: LL-18, revervni 5'-GCGTCACTACACTCAGCTAA-3'; ushodm 5 '-GCCTAGAGGTATGGCTGTAA-3'; LL18BP, ushodm 5'-ACCTGTCTACCTGGAGTGAA-3'; reverzni 5'-GCACGAAGATAGGAAGTCTG-3'; P-aktin, reverzni 5' -GGAGGAGC AATGATCTTGATCTTC-3'; ushodni 5'-GCTCACCATGGATGATGATATCGC-3'. Da se isključi amplifikacija potencijalno genomske DNK koja bi kontaminirala uzorke, PCR reakcije su rađene uz odsustvu cDNK templata. PCR proizvodi (lOul) su analizirani na 1% agarosa gelu i podvrgnuti elektroforei u lx TAE puferu. Veličina PCR proizvoda verifikovana je poređenjem sa markerima od 1 kb ladder (Gibco) po prebojavanju gelova. Relativna kvantifikacija traka prebojenih etidijum-bromidom rađena je pod UV svetlom Kodak Digital Sciences analitičkog softvera, i beležena je kao koeficijent ciljnog gena (hLL-18BP, hLL-18) ihousekeepinggena (gena koji je svuda prisutan) (hp-actin).

SYBR Green Real Time PCR prajemri za IL-18, IL-18BP i GAPDH( housekeepingkontrola) određeni su korišćenjem the Primer Express softvera koji proizvodi PE Biosvstems u skladu sa objavljenim sekvencama (AF110799, D49950, NM 002046) na sledeći način: LL-18, revervni 5,-CAGCCCTCTTTAGCACTCCA-3,; ushodm 5'-CAAGGAATTGTCTCCCAGTGC-3'; LL18BP, reverzni 5'-AACCAGGCTTGAGCGTTCC-3'; forvvard 5 '-TCCC ATGTCTCTGCTCATTTAGTC-3'; GAPDH, reverzni 5 '-GATGGGATTTCC ATTGATGAC A-3'; fonvard 5'-CCACCCATGGCAAATTCC-3'; intron-GAPDH, reverzni 5'-CCTAGTCCCAGGGCTTTGATT-3'; ushodni 5'-CTGTGCTCCCACTCCTGATTTC-3'. Testirani su specifičnost i optimalna koncentracija prajmera. Potencijalna genomska DNK kontaminacija isključena je obavljanjem PCR reakcija sa specifičnim intron-GAPDH prajmerima. Odsustvo ne -specifične amplifikacije potvrđeno je analizom PCR proizvoda elektroforezom na 3.5% agarosa gelu. SYBR Green Real-Time PCR je rađen sa 5 ul / udubljenju RT-proizvoda (0.5 ng ukupne RNK), 25 ul / udubljenju SYBR Green PCR master mix (PE Biosvstem, CA, USA) sa AmpErase Uracil N-Glycosylase (UNG)

(0.5 Jedinica / udubljenju) i 20 u.1 prajmera (300 nM). PCR je rađen na 50°C tokom 2 min (za inkubaciju AmpErase UNG ukloniti sav uracil inkorporisan u cDNK), 95°C tokom 10 min (za aktivaciju AmpliTaq Gold) z zatim raditi 40 ciklusa na 95°C tokom 15 sec, 60°C tokom 1 min na ABI PRISM 7700 Detection System. Uzorci reverzne-transkribovane cDNK su tako amplifikovani a određene su vrednosti njihovih Ct (pragovi ciklusa). Sve vrednosti Ct su normalizovane zahousekeepinggen GAPDH. Pojedinačna specifična traka DNK za LL-18, LL-18BP i GAPDH je posmatrana korišćenjem gel elektroforeze.

The principle detekcije u realnom vremenu korišćenjem "SYBR Green PCR master mix" zasniva se na direktnoj detekciji PCR proizvoda merenjem povećanja fluorescencije izazvane vezivanjem SYBR zelene boje za DNK sa dvostrukim lancem.

Statistička analiza

Podaci su izraženi kao srednja vrednost ± SEM. Nivoi LL-18 upoređeni su između grupa korišćenjem Mann-Whitney testa. Vrednost p 0.05 smatrala se statistički signifikantnom.

Primer 1: Zaštita inhibitora IL-18 od smrti endotelijalnih ćelija izazvane oksidizovanim lipoproteinima (oxLDL)

Endotelijalne ćelije humane umbilikalne vene u kulturi (HTJVECs) izlagane su tokom 16 sati oxLDL u prisustvu ili odsustvu IL-18 vezujućeg proteina ili anti-LL-18 antitela. Kako je prikazano na SI. 1, 83% HUVECs sušenim posle izlaganja oxLDL. Ko-inkubacija sa LL-18BP ili anti-LL-18 antitelom skoro potpuno spašava ćelije od smrti. Kada je korišćen LL-18BP nije bilo ćelijske smrti. 89% ćelija preživelo je korišćenjem anti-LL-18 antitela.

Ovaj eksperiment pokazuje protektivno dejstvo dva različita inhibitora LL-18 protiv ćelijske smrti zbog apoptoze u aterosklerotskom plaku.

Primer 2: Ekspresija proteina LL-18 i njegovog endogenog inhibitora LL-18 BP u aterosklerotskim plakovima

Analize Western blot rađene su na proteinskim ekstraktima 12 karotidnih aterosklerotskih arterija i 5 normalnih kontrola. Protein LL-18, uključujući i aktivnu formu, bio je visoko eksprimiran u svim aterosklerotskim plakovima dopk je malo ili nimalo ekspresije detektovano u normalnim arterijama (SI. 2). Linije 1 do 4 sadrže uzorke aterosklerotskih plakova, linije 5 do 7 sadrže uzorke normalnih arterija. Interesantno je da je detekcija aktivne forme LL-18 u korelaciji s aktivnom formom kaspaze-1, koja je uključena u procesovanje IL-18 (SI. 2 četvrti red). Signifikantna ekspresija IL-18 receptorskog proteina (a lanac) otkrivena je u aterosklerotskim plakovima u poređenju sa veoma niskim nivoima ekspresije u normalnim arterijama (SI. 2 drugi red). Uz to, većina aterosklerotskih plakova eksprimira LL-18BP iako su nivoi ove ekspresije heterogeni (SI. 2 prvi red).

Primer 3: Ćelijska lokalizacija proteina LL-18 i njegovog endogenog inhibitora LL-18BP u aterosklerotskim plakovima

Da bi se odredila ćelijska lokalizacija IL-18 i LL-18BP, imunohistohemijska ispitivanja urađena su na 6 karotidnih aterosklerotskih plakova. Kao što je ilustrovano na Slici 2, LL-18 je uglavnom eksprimiran u makrofagima, a te ćelije su verovatno glavni izvor IL-18 u plaku (nije prikazano). Ova polja su bogata i CD3-pozitivnim limfocitima. međutim, T limfociti izgleda nisu direktno uključeni u produkciju LL-18. LL-18 je takođe eksprimiran i u nekim ćelijama intime glatkih mišića i ponekoj endotehjalnoj ćeliji. Za razliku od toga, značajna ekspresija LL-18BP otkrivena je u endotelijalnim ćelijama plakova mikro krvnih sudova i u onima na luminalnoj površini, iako ekspresija nije nađena u svim krvnim sudovima. Relativno niska i heterogenija ekspresija LL-18 BP otkrivena je, uglavnom ekstracelularno u oblastima bogatim makrofagima.

Primer 4: Ekspresija LL-18 i LL-18BP mRNK transkripta u aterosklerotskim plakovima i odnos sa nestabilnošću plaka

Da bi se utvrdilo da li se humani LL-18 i LL-18BP mRNK eksprimiraju u humanim karotidnim aterosklerotskim plakovima, urađen je polu-kvantitativni RT-PCR na šest aterosklerotskih plakova (SI. 3). LL-18 i IL-18BP mRNK su detektovani u svim aterosklerotskim plakovima iako je količina mRNK za LL-18 i LL-18BP bila heterogena. Prema tome, da bismo tačno kvantifikovali nivoe ekspresije LL-18 i IL-18BP mRNK, 23 aterosklerotskih plakova je analizovano dodatno uz pomoć metode SYBR Green Real-Time PCR (SI. 4). Ovi plakovi su karakterisani kliničkim i patološkim pregledom kao simptomatski (nestabilni) ili asimptomatski (stabilni) plakovi sa sadržajem makroskopskog ulkusa ili bez njega. Kliničke karakteristike ovih pacijenata prikazane su na Tabeli 4. Procenat smanjenja prečnika karotide (60%-95%) i faktori rizika uključujući godine starosti, dijabetes, hiperholesterolemiju, hipertenziju, i pušenje cigareta nije se razlikovalo između ovih grupa.

Utvrđeno je da je količina LL-18 ushodno regulisana kod simptomatskih u poređenju sa asimptomatskim aterosklerotskim plakovima (2.03 ±0.5 prema 0.67 ± 0.17)

(SI. 4A). Statistička analiza je pokazala daje ovo povećanje produkcije LL-18 koje je zabeleženo kod simptomatskih plakova visoko signifikantno (p < 0.0074), dok povećana količina LL-18BP koja je zabeležena kod simptomatskih u poređenju sa asimptomatskim plakovima nije (4.64 ± 0.98 prema 2.5 ± 0.92) (SI. 4B). Drugim rečima, iako su i simptomatska i asimptomatska grupa pokazale pozitivnu korelaciju između IL-18 i IL-18BP mRNK, ovi nagibi su se signifikantno razlikovali između ove dve grupe 2 (simptomatska grupa: nagib 1.16 [0.19-2.14], r<2>= 0.36 prema asimptomatskoj grupi: nagib 4.79 [2.39-7.20], r<2>= 0.76; p < 0.05). Prema tome, izgleda da povećana ekspresija LL-18BP u simptomatskoj grupi nije dovoljna da kompenzuje ekspresije LL-18. Štaviše, kako je prisustvo ulceracije smatrano osobinom nestabilnosti plaka, statistička analiza je urađena dodatno na plakovima bez ulkusa ili sa ulkusima unutar plakova i pokazana j e signifikantna ushodna regulacija LL-18 u plakovima koji su imali ulkus (p < 0.018) (SI. 4C).

Ovi podaci pokazuju da je povećanje ekspresije IL-18 koje se vidi u aterosklerotskim plakovima u korelaciji sa nestabilnošću plaka.

Primer 5: LL-18BP modulira razvoj aterosklerotskih lezija i stabilnost na in vivo modelu bolesti

Metode

Osobine pacijenata

Uzorci plazme dobijeni su od pacijenata s akutnim ishemičnim koronarnim sindromima (nestabilna angina pektoris i infarkt miokarda), manje od 7 dana po pojavi simptoma. Nestabilna angina definisana je kao povezanost tipičnog bola u grudima sa bilo ishemičnim promenama na elektrokardiogramu ili prisustvo koronarne arterijske bolesti. Infarkt miokarda dijagnostikovan je na osnovu tipičnih ishemijskih promena na elektrokardiogramu koje su praćene značajnim povećanjem miokardijalnih enzima (kreatin fosphokinaza i troponin I) u krvi u cirkulaciji. Neishemični bolesnici regrutovani su na istom odeljenju za kardiologiju i bili su potpuno bez simptoma ishemije. Nivoi humanog LL-18 u plazmi određivani su korišćenjem komercijalnih kitova (MBL, Japan).

In vivo intranniskularni elektrotransfer mišjeg IL- 18BP ekspresivnog plazmida

Četrnaest mužjaka miševa C57BL/6 apoE KO, starosti 14-nedelja, primili su u intervalima od 3 nedelje, 3 injekcije sa LL-18BP ekspresionim plasmidom, pcDNK3-LL18BP. Kontrolnim miševima (n = 19) ubrizgan je kontrolni prazni plazmid. Mišji LL-18BP izoform d cDNK izolovan kako je opisano (broj # Q9ZOM9) (23) subkloniran je u EcoRl/Notl mesta sisarskog ćelijskog ekspresionog vektora pcDNK3 koji je pod kontrolom promotora citomegalovirusa (Invitrogen). Ovaj konstrukt, nazvan 334.yh, prikazanje na SI. 5. Kontrolni plazmid bio je slični konstrukt bez terapijske cDNK. LL-18BP ili kontrolni ekspresioni plazmid (60 pg) ubrizgavani su u oba tibijalna kranijalna mišića anestetiziranih miševa, kako je prethodno opisano (13). Ukratko, transkutani električni pulsevi (8 kvadratnih talasa električnih pulseva od 200 V/cm, 20 msec trajanja na 2 Hz) davani su preko PS-15 elektropulsatora (Genetronics, France) korišćenjem dve pločaste elektrode od nerđajućeg čelika koje su postavljane sa razmakom 4.2 do 5.3 mm, na svaku stranu noge.

Elisa mIL- 18BP

Ove ploče su preko noći oblagane prečišćenim zečjim poliklonskim antitelom r-mLL-koja imaju afinitet za 18BPd(5 p.g/udubljenju). Rastvorljive mLL-18BP je otkriven korišćenjem biotiniliranim zečjeg poliklonskog antitela (0.3 u,g/ml) koje je dobijeno protiv E. coli r-mIL-18BP (Peprotec) a potom se koristila ekstravidin peroksidaza (1/1000) (Sigma). Ovako dobijeno zečje poliklonsko antitelo testirano je VVestern Blot metodom da se potvrdi specifičnost mLL-18BP. Rekombinantno mLL-18BPd proizvedeno od strane HEK 293 ćelija korišćeno je kao standard. Osetljivost ELISA testa iznosila je 5 ng/ml.

Analiza miševa

Kriostatski preseci (8 pm) dobijeni su iz aortnog sinusa i korišćeni su za detekciju depozita lipida korišćenjem Uljano crvenog, za detekciju kolagena korišćenjem Sirius crvenog i za imunohistohemijsku analizu kako je prethodno opisano (13). Ovi preseci su bojeni specifičnim primarnim antitelima: anti-miš makrofag, klon MOMA2 (BioSource), fosfataze alkalno-konjugovani anti-ct-aktin za ćelije glatkih mišića i anti-CD3 za T limfocite (Dako) kako je prethodno opisano (13). Detekcija ćelijske smrti obavljana je korišćenjem tehnike TUNEL (13). CD3 pozitivne su mikroskopski bojene na slepi način. Aterosklerotski plakovi u aortnom sinusu i oblastima koje su bojene pozitivno na makrofage, ćelijama glatkih mišića, kolagenu ili TUNEL mereni su kvantifikacijom slike uz pomoć kompjutera (NS15000, Microvision) kako je prethodno opisano (13). Bojenje ne-imuno izotip-usklađenim imunoglobulinima procenilo je specifičnost imunološkog prebojavanja. Specifičnost TUNEL procenjena je uz pomoć deoksinukleotidil transferaze. Torakalne aorte, koje se šire od leve subklavijalne arterije do bubrežnih arterija, fiksirane su u 10% puferovanom formalinu i bojene Uljano crvenim da se otkriju lipidni depoziti. Otvoreni su longitudinalno a procenat lipidnih naslaga izračunat je (NS 15000, Microvision).

Rezultati

U ovoj studiji je testirana hipoteza da regulacija LL-18/LL-l 8BP igra ključnu ulogu u aterogenezi i stabilnosti plaka. Mereni su nivoi LL-18 u plazmi pacijenata s akutnim koronarnim sindromima (30 muškaraca, 18 žena, srednja starost 66.2 ± 1.8 godina, od kojih je 14 imalo nestabilnu anginu pektoris, a 34 infarkt miokarda) i neishemičnih kontrolnih pacijenata (10 muškaraca, 3 žena, srednja starost 60.0 ± 5.2 godina). Nivoi LL-18 u plazmi pacijenata a akutnom koronarnom bolešću bili su značajno veći nego kod kontrolnih (146.9 ±17.1 prema 73.0 + 12.2 pg/ml, p < 0.05) za razliku od nivoa LL-18BP u cirkulaciji koji su bili blago povišeni (20.1 + 2.7 prema 7.5 ± 2.5 ng/ml, p = 0.06). Uz to, nivoi LL-18 bili su u korelaciji sa težinom bolesti jer su najviši nivoi zabeleženi kod pacijenata sa težom ishemičnom srčanom disfunkcijom i kliničkim znacima plućnog edema (224.03 + 39.1 pg/ml, p < 0.001 u poređenju s kontrolom). Ovi rezultati dobijeni od pacijenata s akutnom koronarnom bolešću zajedno s prethodnim opažanjima da je nivo LL-18 povišen u aterosklerotskim plakovima kod pacijenata sa moždanim udarom [Mallat, 2001], govori o potencijalno važnoj ulozi regulacije LL-18/LL-18BP u procesu ateroskleroze.

Prema tome, ovu hipotezu smo proveravali korišćenjem apoE nokaut (KO) miševa koji su spontano razvili aterosklerotske lezije slične humanim. Četrnaest mužjaka miša starih 14 nedelja primilo je suplement LL-18BPin vivointramuskularnim elektrotransferom ekspresionog plazmida DNK koji nekodira za mišji LL-18BPd, dok je 19 kontrola iste starosti primilo prazni plazmid. Elektrotransfer plazmida ponavljanje svake 3 nedelje, a miševi su žrtvovani u uzrastu od 23 nedelje po 9 nedelja tretmana. Nivoi mišjeg LL-18BP u plazmi bili su ispod granica detekcije (5 ng/ml) kod apoE KO miševa kojima je ubrizgavan prazan plazmid. Međutim, pojedinačna injekcija BL-18BP plazmida rezultirala je u visokim nivoima LL-18BP u krvi gde je maksimum dostizan 2 dana po injekciji (323.5 ± 100.9 ng/ml) i 127.4 ± 35.4 ng/ml je izmereno posle 2 nedelje. Posle devet nedelja tretmana bilo LL-18BP bilo praznom plazmidom, ukupni holesterol (489.4 ± 34.6 prema 480.8 ± 36.3 mg/dl) i nivoi lipoproteina visoke gustine u serumu (52.3 ± 9.4 prema 48.8 ± 5.1 mg/dl) nisu se razlikovali između ove dve grupe. Umereni, ali značajan porast težine životinja zabeležen je kod grupe tretirane LL-18BP u poređenju s kontrolnom (31.8 ± 0.9 prema 28.6 ± 0.8 g, p < 0.05).

Ishod dodavanja LL-18BP na aterosklerozu ispitivanje na dve različite lokacije: u descendentoj torakalnoj aorti i u aortnom sinusu. Torakalna aorta je odabrana za određivanje uloge LL-18BP u razvoju masnih traka (aterogeneza) jer torakalne aterosklerotske lezije skoro ne postoje na uzrastu od 14 nedelja (podaci nisu prikazani) gde je počela transfekcija LL-18BP. Aortni sinus, gde su aterosklerotske lezije već prisutne na uzrastu od 14 nedelja (podaci nisu prikazani), ispitivani su na uznapredovalu progresiju plaka i njegov sastav, stoje važna odrednica stabilnosti plaka. Tretman miševa apoE KO sa LL-18BP značajno je uticao na razvoj aterosklerotskih lezija i njihovu progresiju. Ispitivanje torakalne aorte pokazalo je značajno smanjenje depozita masti kod miševa tretiranih IL-18BP plazmidom u poređenju s praznim plazmidom (SI. 6). Kvantitativna analiza slike uz pomoć kompjutera pokazala je 69% smanjenja obima aterosklerotskih lezija (p < 0.0001) (SI. 6), čime se ukazuje na kritičnu permisivnu ulogu LL-18 u aterogenezi. Uz to, tretman plazmidom LL-18BP tokom samo 9 nedelja značajno umanjuje progresiju uznapredovalih aterosklerotskih plakova u aortnom sinusu (24% smanjenje veličine plaka, p = 0.01) u poređenju s tretmanom praznim plazmidom (SI. 7).

Sto je još važnije, sastav uznapredovalih lezija, što je glavna odrednica nestabilnosti plaka, značajno je pogođena tretmanom LL-18BP. Aterosklerotske lezije miševa tretiranih plazmidom LL-18BP pokazale su veoma značajno smanjenje infiltracije makrofaga od 50% (p < 0.0001) (SI. 8), gde je sadržaj T limfocita bio manji za 67% (p < 0.005) (SI. 8), a pokazano je dvostruko povećanje akumulacije u glatkim mišićnim ćelijama (p < 0.05) (SI. 9). Uz to, ove važne promene u ćelijskom sastavu lezija bile su praćene značajnim povećanjem sadržaja kolagena od 85% (p < 0.0005) što je određeno bojenjem Siri us crvenim, kao i smanjenjem ukupnog sadržaja masti.

Prema tome, tretman LL-18BP značajno smanjuje zapaljenski proces u aterosklerotskim lezijama i indukuje proces zalečenja koji odlikuje stabilne aterosklerotske plakove. Štaviše, značajno smanjenje inflamatorne komponente lezija kod miševa tretiranih LL-18BP praćeno je značajnim smanjenjem pojave ćelijske smrti u plakovima (2.9 ± 0.9% kod miševa tretiranih LL-18BP prema 10.5 ± 3.6% kod kontrolnih, p < 0.05), i na taj način se ograničava ekspanzija i trombogenost acelularne lipidne srži [Mallat, 1 999],

Zaključci:

Korišćenjem dobro validiranog mišjeg modela ateroskleroze slične humanoj, dobijeni su rezultati koji jasno utvrđuju nesumnjivu i ključnu ulogu LL-18 i LL-18BP regulacije u razvoju aterosklerotskih plakova, njihovoj progresiji i stabilnosti. Dok se sprečava rano formiranje lezija u torakalnoj aorti, inhibicija aktivnosti IL-18 uz pomoć dodavanja IL-18BP takođe značajno utiče na sastav uznapredovalih lezija u aortnom sinusu, i na taj način indukuje prelazak ka stabilnom fenotipu plaka.

Klinička prognoza pacijenata s aterosklerozom zavisi samo delimično od veličine lezije. Sada je široko prepoznato da kvalitet (sastav plaka), a ne veličina lezije može da bude još bolji prediktor pojave ishemičnog događaja. I stvarno, teške kliničke manifestacije ateroskleroze (infarkti srca i mozga) uglavnom su posledica okluzije krvnih sudova zbog tromba koji se stvorio zbog rupture aterosklerotskog plaka (19). Patološke studije su pokazale da vulnerabilni ili nestabilni plakovi, koji su skloni rupturi ili su već erodirali, sadrže puno zapaljenskih ćelija i ispoljavaju značajan gubitak glatkih mišićnih ćelija (20, 21). Staviše, ovakvi plakovi manifestuju značajni porast apoptotične smrti ćelija koja dovodi do formiranja visoko trombogenoe lipidne srži (13, 22). Vredi pomenuti i da su svi ovi znaci povećane nestabilnosti plaka značajno oslabljeni kod miševa tretiranih LL-18BP što govori da LL-18 signalizacija predstavlja glavnu odrednicu nestabilnosti plaka.

Relevantnost rezultata dobijenih kod miševa apoE KO za bolest ljudi ojačana je i našim nalazima povišenih nivoa LL-18 u cirkulaciji pacijenata s akutnim koronarnim sindromima, kao i povećanom produkcijom IL-18 u nestabilnim karotidnim aterosklerotskim plakovima odgovornim za šlog. Ovi nalazi skupa identifikuju inhibitor aktivnosti LL-18 kao novo terapeutsko sredstvo za sprečavanje i lečenje aterosklerotskih plakova, njihovog razvoja i ograničavanje komplikacija.

Primer 6: Povišeni nivoi LL-18 su u korelaciji sa rekurentnim zbivanjima u pacijenata sa srčanom insuficijencijom

Nivoi LL-18 mereni su ELISA tehnikom u krvnom serumu pacijenata uz pomoć LL-18 specifičnog antitela.

Ukupno je testirano 56 ishemičnih i neishemičnih bolesnika sa srčanom insuficijencijom ili bez nje.

Kod pacijenata koji su potom umrli, nivoi IL-18 su bili 216.0 + 41.5 pg/ml u poređenju sa 112.2 + 12.2 pg/ml kod pacijenata bez smrtnog ishoda (p = 0.0018).

Kod pacijenata sa ma kojim rekurentim događajem, kao što je smrtni ishod, rekurentna ishemija, re-vaskularizacija ili progresija ateroskleroze ili ponovna hospitalizacija izmereni su sledeći nivoi: 165.8 ± 23.8 prema 107.7 + 14.6 kod pacijenata bez rekurentnih događaja (p=0.03).

Ovi rezultati pokazuju da su nivoi LL-18 značajno povišeni kod pacijenata koji imaju lošu kliničku prognozu, kao što je rekurentni događaj ili čak smrtni ishod.

Uzeti su uzorci krvi 16 neishemičnih pacijenata sa srčanom insuficijencijom ili bez nje, da bi se izmerili njihovi nivoi LL-18. Kod pacijenata koji su potom preminuli, nivoi su bili 199.0 ±_34.8 pg/ml u poređenju sa 95.3 ± 20.4 pg/ml kod pacijenata koji su preživeli (p=0.09).

Pacijenti sa ma kojim rekurentnim događajem: 146.6 + 34.4 pg/ml LL-18 prema 95.4 + 23.9 pg/ml kod pacijenata bez rekurentnih događaja (p=0.03). Iako razlika u nivoima LL-18 nije dostigla nivo statističke značajnosti, zbog malog broja obrađenih bolesnika, može se uočiti jasan trend ka povišenim nivoima LL-18.

Kod ishemičnih bolesnika, nivoi LL-18 su bili 214.2 + 45.9 pg/ml kod onih koji su umrli, prema 118.4 + 12.8 pg/ml kod onih koji su preživeli (p=0.007).

162.8 + 24.7 pg/ml LL-18 izmereno je kod pacijenata koji su imali ma kakav rekurentni događaj u poređenju sa 116.2 + 16.0 kod onih bez takvih događaja.

Claims

1. Upotreba inhibitora IL-18 za proizvodnju leka za lečenje i/ili prevenciju ateroskleroze stoje naznačeno time, daje inhibitor IL-18 odabran iz grupe koja se sastoji od antitela na IL-18, antitela na bilo koje podjedinice receptora IL-18 i proteina koji vezuje IL-18 (IL-18BP), muteina IL-18BP koji sadrži konzervativne supstitucije amino kiselina, fuzionisanog proteina IL-18BP i regiona teškog lanca imunoglobulina ili PEGiliranog IL-18BP, gde mutein, fuzionisani protein ili PEGilovani IL-18BP zadržavaju biološku aktivnost vezivanja j&IL- 4&.

2.Upotreba prema zahtevu 1, što je naznačeno time da je to lek za lečenje i/ili prevenciju tromboze aterosklerotičnog plaka.

3. Upotreba prema zahtevima 1 ili 2, što je naznačeno time daje ovaj lek za lečenje i/ili prevenciju ulceracije aterosklerotičnog plaka.

4. Upotreba prema bilo kom od predhodnih zahteva, što je naznačeno time daje lek za lečenje i/ili prevenciju destabilizacije aterosklerotičnog plaka.

5. Upotreba prema bilo kom od predhodnih zahteva, što je naznačeno time daje lek za lečenje i/ili prevenciju ishemičnih sindroma koji su posledica destabilizacije plaka.

6. Upotreba prema bilo kom od predhodnih zahteva, što je naznačeno time daje lek za lečenje i/ili prevenciju disrupcije aterosklerotičnog plaka.

7. Upotreba prema bilo kom od predhodnih zahteva, što je naznačeno time da je inhibitor IL-18 antitelo usmereno protiv IL-18.

8. Upotreba prema bilo kom od predhodnih zahteva, što je naznačeno time daje to antitelo humanizovano antitelo.

9. Upotreba prema bilo kom od predhodnih zahteva, što je naznačeno time daje to antitelo humano antitelo.

10. Upotreba prema zahtevima od 1-6, što je naznačeno time da je inhibitor IL-18 zapravo IL-18BP, mutein IL-18BP koji sadrži konzervativne supstitucije amino kiselina, fuzionisani protein IL-18BP i regiona teškog lanca imunoglobulina, ili PEGilirani IL-18BP, gde taj mutein, fuzionisani protein ili PEGilovani IL-18BP zadržavaju biološku aktivnostV«*wa,ttjs,tx45.

11. Upotreba prema zahtevu 10, što je naznačeno time da je imunoglobulin u fuzionisanom proteinu IgGl ili IgG2 izotipa.

12. Upotreba prema bilo kom od predhodnih zahteva, što je naznačeno time da taj lek dalje sadrži interferon za simultanu, sekvencionalnu ili zasebnu upotrebu.

13. Upotreba prema zahtevu 12, što je naznačeno time da je taj interferon zapravo interferon-p.

14. Upotreba prema bilo kom od predhodnih zahteva, što je naznačeno time da taj lek dalje sadrži antagonist Faktora tumorske nekroze (TNF) za simultanu, sekvencionalnu ili zasebnu upotrebu.

15. Upotreba prema zahtevu 14, što je naznačeno time daje antagonist TNF zapravo TBPI i/ili TBPII.

16. Upotreba prema bilo kom od predhodnih zahteva, što je naznačeno time da ovaj lek dalje obuhvata inhibitor COX za simultanu, sekvencionalnu ili zasebnu upotrebu.

17. Upotreba prema zahtevu 16, što je naznačeno time daje COX inihibitor zapravo COX-2 inhibitor.

18. Upotreba prema bilo kom od predhodnih zahteva, što je naznačeno time da ovaj lek dalje obuhvata inhibitor tromboksana za simultanu, sekvencionalnu ili zasebnu upotrebu.

19. Upotreba prema zahtevu 18, što je naznačeno time daje inihibitor tromboksana zapravo aspirin.

20. Upotreba prema bilo kom od predhodnih zahteva, što je naznačeno time da ovaj lek dalje obuhvata agens za snižavanje lipida za simultanu, sekvencionalnu ili zasebnu upotrebu.

21. Upotreba prema zahtevu 20, što je naznačeno time daje taj agens za snižavanje lipida zapravo inhibitor HMG CoA.

22. Upotreba prema zahtevu 21, što je naznačeno time da je HMG CoA inhibitor zapravo statin.

23. Upotreba prema bilo kom od predhodnih zahteva, što je naznačeno time da se ovaj lek koristi u kombinaciji sa ishranom sa niskim sadržajem masti i/ili niskim sadržajem holesterola i/ili niskim sadržajem soli.

24. Upotreba prema bilo kom od predhodnih zahteva, što je naznačeno time da inhibitor IL-18 treba koristiti u količini od oko 0.0001 do 10 mg/kg telesne težine ili od oko 0.01 do 5 mg/kg telesne težine ili od oko 0.1 do 3 mg/kg telesne težine ili od oko 1 do 2 mg/kg telesne težine.

25. Upotreba prema bilo kom od predhodnih zahteva, što je naznačeno time da inhibitor IL-18 treba koristiti u količini od oko 0.1 do 1000 ug/kg telesne težine ili 1 do 100 ug/kg telesne težine ili oko 10 do 50 ug/kg telesne težine.

26. Upotreba prema bilo kom od predhodnih zahteva, što je naznačeno time da inhibitor IL-18 treba davati subkutano.

27. Upotreba prema bilo kom od predhodnih zahteva, što je naznačeno time da inhibitor IL-18 treba davati intramuskularno.

28. Upotreba prema bilo kom od predhodnih zahteva, što je naznačeno time da inhibitor IL-18 treba davati jednom na dan.

29. Upotreba prema bilo kom od predhodnih zahteva, što je naznačeno time da inhibitor IL-18 treba davati svakog drugog dana.

30. Upotreba vektora ekspresije koji obuhvata kodirajuću sekvencu za inhibitor IL-18 u proizvodnji leka za lečenje i/ili prevenciju ateroskleroze, što je naznačeno time daje inhibitor IL-18 odabran iz grupe koja se sastoji od antitela protiv IL-18, antitela protiv bilo koje podjedinice receptora IL-18 i IL-18BP, muteina IL-18BP koji sadrži supstitucije konzervativnih amino kiselina, fuzionisanog proteina IL-18BP i regiona teških lanaca imunoglobulina ili PEGilirani IL-18BP, gde mutein, fuzionisani protein ili PEG-ilovani IL-18BP zadržavaju biološku aktivnost vezivanja za IL-18.

31. Upotreba prema zahtevu 30, što je naznačeno time da se vektor ekspresije daje putem elektrotransfera.

32. Upotreba prema zahtevu 30 ili 31, što je naznačeno time da se vektor ekspresije daje sistemski.

33. Upotreba prema bilo kom od prethodnih zahteva, što je naznačeno time da se vektor ekspresije daje intramuskularno.

34. Upotreba ćelije koja je genetski modifikovana kako bi se proizveo inhibitor IL-18 za proizvodnju leka za lečenje i/ili prevenciju ateroskleroze, što je naznačeno time daje IL-inhibitor odabran iz grupe koja se sastoji od antitela na IL-18, antitela na bilo koju podjedinicu receptora IL-18 i IL-18BP, muteina IL-18BP koji sadrži supstitucije konzervativnih amino kiselina, fuzionisanog proteina IL-18BP i regiona teških lanaca imunoglobulina ili PEGiliranog IL-18BP, gde mutein, fuzionisani protein ili PEG-ilovani IL-18BP zadržavaju biološku aktivnost vezivanja za IL-18.

35. Upotreba IL-18 kao dijagnostičkog markera progresije ateroskleroze.