RS50928B

RS50928B - Gcsf konjugati

Info

Publication number: RS50928B
Application number: YUP-543/01A
Authority: RS
Inventors: Pascal Sebastian Bailon
Original assignee: Amgen Inc.
Priority date: 1999-01-29
Filing date: 2000-01-19
Publication date: 2010-08-31
Also published as: HUP0203652A3; NO331787B1; JP2002540065A; DE60004172D1; HUP0203652A2; US20070219356A1; SK10352001A3; YU54301A; NO20013700D0; NO20013700L; PT1157037E; EP1157037B1; CA2361766C; EA004685B1; AU2618500A; CZ20012654A3; ATE246202T1; US20030130193A1; HK1049673A1; MXPA01007609A

Abstract

Fiziološki aktivan konjugat, naznačen time što ima formulugde je G faktor stimulacije kolonije granulocita bez amino grupe ili njegovih grupa koje formiraju amidnu vezu sa polietilen glikol grupom u konjugatu; R je C1-C6 alkil; n je integral od 420 do 550; i m je integral 1-5.Prijava sadrži još 2 nezavisna i 17 zavisnih patentnih zahteva.

Description

STANJE TEHNIKE

Faktor stimulacije kolonije granulocita (GCSF) je farmaceutski aktivni protein koji reguliše proliferaciju, diferencijaciju i funkcionalnu aktivaciju neutrofilnih granulocita (Metcalf, Blood 67:257 (1986); Yan, i sar. Blood 84(3): 795-799 (1994); Bensinger, i sar. Blood 82(11): 3158-3163 (1993); Roberts, i sar., Đcpfl Hematology 22: 1156-1163 (1994); Neben, i sar., Blood 81(7): 1960-1967 (1993)). GCSF može mobilisati stem i prekursor ćelije iz koštane srži i upotrebljava se da se tretiraju pacijenti čiji su granulociti oslabljeni hemoterapijom, ili kao uvod u transplantante koštane srži.

U.S. patent br. 5,214,132 otkriva mutein humanog GCSF koji se razlikuje od prirodnog hGCSF na pozicijama 1, 3, 4, 5, i 17, gde umesto prirodnih GCSF amino kiselina mutein ima Ala, Thr, Tyr, Arg i Ser respektivno. (Vidi takođe, Kuga i sar., Biochem. Biophvs. Res. Commun. 159: 103-111 (1989)). M. Okabe i sar. (Blood 75(9): 1788-1793 (May 1, 1990)) objavili su derivat rhGCSF, u kojem su amino kiseline zamenjene na pet pozicija N-terminalnog regiona od rhGCSF, koji je pokazivao višu specifičnu aktivnost nego intaktni rhGCSF u progenitor ćelijama koštane srži miša i/ili ljudi u dva ogleda. U.S. patent br. 5,218,092 otkriva mutein humanog GCSF koji se razlikuje od nativnog hGCSF na pozicijama 1, 3, 4, 5, 17, 145 i 147 gde umesto nativnih GCSF amino kiselina mutein ima Ala, Thr, Tyr, Arg, Ser, Asn i Ser respektivno. Sadržaji U.S. patenata br. 5,214,132 i 5,218,092 inkorporirani su ovde putem referenci.

Biološka dostupnost proteinskih terapeutika kao što je GCSF je često ograničena kratkim poluživotom plazme i mogućnosti degradacije proteazama, sprečavajući maksimum kliničke sposobnosti. Izučavanja drugih terapeutskih proteina pokazala su da takve teškoće mogu biti prevaziđene konjugiranjem proteina na polimer kao što je polietilen glikol (PEG), obično preko vezivanja grupe kovalentnom vezom i za protein i za PEG.

Pokazano je da takvi PEG konjugovani biomolekuli imaju klinički korisne karakteristike (Inada i sar., J. Bioact. And Compatible Polvmers, 5:343 (1990); Delgado i sar., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Svstems, 9:249 (1992); i Katre, Advanced Drug Delivery Svstems, 10:91 (1993)). Među njima su bolja fizička i toplotna stabilnost, zaštita od podložnosti enzimskoj degradaciji, povećana rastvorljivost,in vivoduži polu-život cirkulacije i smanjeno oslobađanje, redukovana immunogenost i antigenost i redukovana toksičnost.

PEG-GCSF konjugati koji imaju različite strukture od konjugata ovog pronalaska su otkriveni u Evropskoj patentnoj publikaciji br. EP 0 335 423; Evropskoj patentnoj publikaciji br. EP 0 401 384; R.W. Niven i sar., J. Controlled Release 32: 177-189 (1994); i Satake-lshikawa i sar., Cell Structure and Function, 17:157-160 (1992)).

SAŽETAK PRONALASKA

U skladu sa tim, pronalazak je nova klasa derivata PEG od GCSF. Konjugati ovog pronalaska imaju amidni veznik kao što se to može videti niže.

U poređenju sa nemodifikovanim GCSF (tj. GCSF bez pričvršćenog PEG), konjugat ima povećani poluživot cirkulacije i vreme boravka u plazmi, smanjeno oslobađanje, i povećanu granulopoetičnu aktivnostin vivo.Sem toga, u poređenju sa PEG-GCSF konjugattma, konjugat ovog pronalaska ima superiorne granulopoetične karakteristike. Drugi PEG-GCSF konjugati su obelodanjeni u Evropskoj patentnoj publikaciji br. EP 0 335 423; Evropskoj patentnoj publikaciji br. EP 0 401 384; i Niven i sar.,Ibid.Međutim, konjugat ovog pronalaska ima različitu strukturu u odnosu na te konjugate i ima superiorne karakteristike, posebno u prikazivanju dugotrajne, visoke granulopoetične aktivnosti pri niskom doziranjuin

vivo.

Preferirani GCSF ovog pronalaska je GCSF mutein, koji ima karakteristike ekvivalentne ili superiorne u odnosu na nativni GCSF i ima istu upotrebu kao GCSF. Mutein ima istu sekvencu amino kiselina kao i GCSF sem na pozicijama 1, 3. 4. 5 i 17, gde umesto nativnih GCSF aminokiselina, mutein ima Ala, Thr, Tyr, Arg i Ser respektivno (GCSF Mutein) (vidi sliku 1.). Muteine je obelodanjen u U. S. patentu br. 5,214,132 koji je ovde inkorporiran referencom.

Fiziološki aktivni PEG-GCSF konjugat ovog pronalaska ima formulu

Deo ovog pronalaska takođe su i jedinjenja obelodanjenih konjugata gde m i n mogu biti različiti integrali konjugata u jedinjenju.

Konjugat ovog pronalaska ima istu upotrebu kao i GCSF. Posebno je konjugat ovog pronalaska koristan za tretiranje pacijenata čiji granulociti su osiromašeni hemoterapijom ili kao uvod u transplantaciju koštane srži na isti način kao što se GCSF koristi za tretiranje tih stanja. Međutim, konjugat ovog pronalaska ima poboljšane karakteristike uključujući superiornu stabilnost, veću rastvorljivost, povećani poluživot cirkulacije i vreme opstanka u plazmi.

OPIS SLIKA

Slika 1: Primarna struktura GCSF Muteina

GCSF mutein je pokazao razlike od divljeg tipa humanog GCSF na pozicijama 1, 3, 4, 5 i 17, gde umesto nativnnih GCSF amino kiselina mutein ima Ala, Thr, Tyr, Arg i Ser respektivno.

Slika 2: Reagensi pegilacije

Slika 3: Razdvajanje 20kDa PEG-modifikovanog i nemodifikovanog GCSF Muteina.

Tipični profil rastvaranja za reakcionu smešu PEG-

Kolona: 1-2rnl Fractogel® EMD S03650S

Ekvilibracionl pufer: 10mM Amonijum acetata, pH 4.5

Puferi za rastvaranje: 1. 0.15M NaCI u ekvilibracionom puferu

2. 0.5M NaCI u ekvilibracionom puferu

Slika 4: PEG-GCSF aktivnost Muteina 5. dana nakon pojedinačne injekcije

Ženke C57BL/6J miševa injeka'rane su subkutano sa 25.2jig pegllranog GCSF konjugata Muteina: petog dana nakon davanja sakupljeni su uzorci venske krvi Iz retroorbitalnog sinusa Obavljene su Coulter-ova hematološka i diferencijalna analiza leukoclta; rezuttirajuća brojanja neutrofa su standardizovana u odnosu na kontrolni nosač za svaki eksperiment. Prikazani podaci predstavljaju srednju vrednost ±S.D. za 4 miša po grupi.

Slika 5: Porast u brojanjima PMN kao funkcija PEG mase (kDa) u GCSF mutein- PEG

konjugatima vezanim za amid I ureu. Za konjugate napravljene sa SPA reagensom PMN=0.277MT+3.95. Za konjugate napravljenim sa urea reagensom PMN=0.152MT+2.74.

Slika 6: PEG-GCSF aktivnost muteina 7. dana nakon pojedinačne injekcije

Ženke C57BL/6J miševa injekcirane su subkutano sa 25.2ug pegliranog GCSF konjugata muteina: sedmog dana nakon davanja sakupljeni su uzorci venske krvi Iz retroorbitalnog sinusa. Obavljene su Coulter-ova hematološka i diferencijalna analiza leukoclta; rezuttirajuća brojanja neutrofa su standardizovana u odnosu na kontrolni nosač za svaki eksperiment. Prikazani podaci predstavljaju srednju vrednost ±S.D. za 4 miša po grupi.

Slika 7: Ogled mišje PBSC mobilizacione kolonije

Slika 8: Ogled mišje PĐSC mobilizacione kolonije

Slika 9: Ogled mišje PBSC mobilizacione kolonije

Slika 10: Ogled mišje PBSC mobilizacione kolonije

Slika 11: Ogled mišje PBSC mobilizacione kolonije

DETALJAN OPIS PJjCflALASKA

Otkriveni pronalazak je fiziološki aktivan konjugat PEG-GCSF koji ima formulu

gde je G faktor stemuladje kolonije granulocita bez njegovih amino grupa koje učestvuju u amidnoj vez) sa grupom polietilen glikola kao što je pokazano u formuli I, R je C,-C, alkil, n je integral od 420 do 550 i m je Integral od 1 do 5.

Brojevi n i m su selekcionisani tako da rezultirajući konjugat formule I ima fiziološku aktivnost komparativnu sa neizmenjenim GCSF, aktivnost koja može predstavljati istu kao, više od, ili deo odgovarajuće aktivnosti nemodifikovanog GCSF. n predstavlja broj ostataka etilen oksida u PEG jedinicama. Jedinična PEG subjedinica od OCHjCHjima molekularnu težinu od oko 44 daltona. m predstavlja broj PEG subjedinica pričvršćenih na GCSF molekule. Konjugat ovog pronalaska može imati jednu, dve, tri, četiri, pet ili šest PEG jedinica po molekulu GCSF. Prema tome, molekularana težina konjugata (izuzimajući molekularnu težinu GCSF) zavisi od brojeva n i m.

n može imati vrednost od 420 do 550, produkujući konjugat u kojem jedinica PEG ima prosečnu molekularnu težinu od oko 18 kilodaltona do oko 25 kilodaltona po jedinici PEG. Preferentno, n ima vrednost od 450 do 490, produkujući konjugat u kojem svaka jedinica PEG ima prosečnu molekularnu težinu od oko 20 kilodaltona. m može imati vrednost 1, 2, 3, 4 ili 5. Poželjan m je 1-4, a posebno poželjan m je 2. Raspon molekularne težine PEG dela konjugata ovog pronalaska je od oko 18 kilodaltona (n=420, m=1) do oko 125 kilodaltona (n=550, m=5). Kada je n od 420 do 550 i m je integral od 1 do 4, raspon molekularne težine PEG dela konjugata ovog pronalaska je od oko 18 kilodaltona (n=420, m=1) do oko 97 kilodaltona (n=550, m=4). Molekularna težina od "oko" određenog broja znači da je u razumnom rasponu broja određenog konvencionalnim analitičkim tehnikama.

U poželjnom konjugatu n je 450 do 490 a m je 1-4, u kom slučaju raspon molekularne težine PEG dela konjugata ovog pronalaska je od oko 20 kilodaltona (n=450, m=1) do oko 86 kilodaltona (n=490, m=4). U drugom poželjnom konjugatu n je 420 do 550 i m je 2, u kom slučaju raspon molekularne težine PEG dela konjugata je od oko 37 kilodaltona (n=420) do oko 48 kilodaltona (n=550). U posebno poželjnom konjugatu n je 450 do 490 i m je 2, u kom slučju raspon molekularne težine PEG dela konjugata je od oko 40 kilodaitona (n=450) do oko 43 kilodaltona (n=490).

R može biti biio koji niži alkil, pod čime se podrazumeva alkil grupa koja ima od jedan do šest ugljenikovih atoma kao što su metil, etil, izopropil itd. Uključeni su i razgranati alkili. Preferirani alkil je metil.

Pod GCSF se podrazumeva prirodni rekombinantni protein, preferentno humani, kao onaj dobijen iz bilo kog konvencionalnog izvora kao što su tkiva, sinteza proteina, kultura ćelija sa prirodnim ili rekombinantnim ćelijama. Uključen je bilo koji protein koji ima aktivnost GCSF, kao što su muteini ili na drugi način modifikovani proteini. Dobijanje i izolovanje GCSF iz prirodnih ili rekombinantnih izvora je dobro poznato (vidi, na primer, U.S. patente br. 4,810,643 i 5,532,341, čiji sadržaj je ovde inkorporiran referencom). Preferirani GCSF konjugat je konjugat sa GCSF muteinom kao što je to opisano u U.S. patentu br. 5,214,132.

Fiziološki aktivni konjugat formule I ima GCSF aktivnost, pod kojom se podrazumeva bilo koja frakcija ili sadržitelj bilo koje poznate GCSF aktivnosti, kako je to određeno različitim ogledima poznatim u praksi. Posebno, konjugat ovog pronalaska ima GCSF aktivnost koja je pokazana sposobnošću da poveća brojanje PMN. To je poznata aktivnost GCSF. Takva aktivnost u konjugatu može biti određena ogledom dobro poznatim u praksi, na primer, ogledom opisanim dole (vidi takođe: Asano i sar., Jpn. Pharmacol. Ther. (1991) 19:2767-2773; Yamasaki i sar., J. Biochem. (1994) 115: 814-819; i Neben i sar. Blood (1993) 81:1960.

Konjugat formule I je produkovan kovalentnim povezivanjem GCSF sa sukcinimidil propionskom kiselinom (SPA) kao reagensom formule

Reagens formule II može se dobiti konvencionalnim postupcima, prema poznatim procedurama (vidi U.S. patent br. 5,672,662, čiji je sadržaj ovde inkorporiran sa referencom), n je isto kao i gore u formuli I, I selekcionisano je da produkuje konjugat željene molekulske težine. Takvi reagensi u kojim je n od 450 do 490 (MT=20 kDa) su pželjni. Druge molekulske težine mogu se dobiti variranjem n za PEG-alkohol startnih materijala za reagens formule II, konvencionalnim postupcima. SPA reagens formule II u molekularnim težinama 5, 10, 15 i 20 kDa mogu se dobiti od Shearvvater Polvmers, Inc. (Huntsville, Alabama).

Reagens formule II može biti konjugovan sa GCSF konvencionalnim postupcima. Vezivanje je preko amidne veze. Specifično, reagens formule II primamo reaguje sa jednom ili više amino grupa (na primer N-terminus i lizinski bočni lanci) GCSF da se formira amidna veza između GCSF i polimemom kičmom PEG-a. NH prikazana u formuli I je dobijena iz tih primarnih amino grupa (grupe) GCSF koji reaguje sa reagensom formule II da formira amidnu vezu. U manjem stepenu reagens formule II može takođe reagovati sa hidroksi grupom serina na poziciji 66 GCSF-a da formira estarsku vezu između GCSF i polimerne kičme PEG-a. Uslovi reakcije su konvencionalni za osobe sa iskustvom i dati su detaljno niže.

Pričvršćivanje reagensa za GCSF može biti ostvareno konvencionalnim postupcima. Mogu biti upotrebljeni PEG-ovi bilo koje izabrane MT ovog pronalaska (n). Na primer, reakcija se može izvesti u rastvoru na pH od 5 do 10, na temperaturi od 4°C do sobne temperature, za trideset minuta sve do 20 časova, koristeći molami odnos reagensa prema proteinu od 4:1 do 30:1. Uslovi reakcije mogu biti izabrani tako da usmere reakciju prema predominantnom produkovanju željenog stepana substitucije. Generalno, niža temperatura, niži pH (npr. pH 5), kratko vreme reakcije vode smanjenom broju pričvršćenih PEG-ova (niži m). Viša temperatura, neutralni ili visoki pH (npr. pH a 7), i duže vreme reakcije radi povećanja broja pričvršćenih PEG-ova (viši m). Na primer, u slučaju reagensa od 5kDa formule II, na pH 7.3 i molamog odnosa reagens protein od 30:1, temperaturi od 4°C i vremenu reakcije od 30 minuta produkuje se predominantno mono-PEG konjugat; temperatura od 4°C i vreme reakcije od 4 časa produkuje predominantno di-PEG konjugat; i temperatura sobne temperature i reakclono vreme od 4 časa produkuje predominantno tri-PEG konjugate. Rekacija se prekida zakiseljavanjem reakcione mešavine i zamrzavanjem na -20°C. Generalno su poželjni pH od 7 do 7.5, i molarni odnos reagensa i proteina od 4:1 do 6:1.

Postupci prečišćavanja kao što je hromatografija razmene katjona mogu se upotrebiti da se razdvoje konjugati na osnovu razlike u naelektrisanju, što efikasno razdvaja konjugate na njihove raznovrsne molekularne težine. Na primer, kolona za razmenu katjona može biti napunjena i zatim isprana sa =20mM natrljum acetata, pH»4 i zatim rastvorena sa linearnim NaCI (OM do 0.5M) gradijentom puferisanim na pH od 3 do 5.5, poželjno pH=4.5. Sadržaj frakcije dobijene hromatografijom katjonske razmene može biti identifikovan preko molekularne težine koristeći konvencionalne Postupci, na primer, masenu spektroskopiju, SDS-PAGE, ili druge poznati postupci za razdvajanje molekularnih entiteta putem molekularne težina. Zatim je na osnovu toga identifikovana frakcija koja sadrži konjugate formule I koji imaju željeni broj (m) pričvršćenih PEG-ova, slobodno prečišćena od nemodiflkovanih GCSF i od konjugata koji imaju drugi broj pričvršćenih PEG-ova.

Takođe deo pronalaska je smeša konjugata gde su u specifičnim odnosima uključeni konjugati koji imaju različite vrednosti m. Poželjno Jedinjenje ovog pronalaska je mesavina konjugata gde je m=1, 2, 3 i 4. Procenat konjugata gde je m=1 je 18-25%, procenat konjugata gde je m=2 je 50-66%, procenat konjugata gde je m=3 je 12-16% i procenat konjugata gde je m=4 je sve do 5%. Takvo jedinjenje je produkovano reagovanjem pegilacionog reagensa sa GCSF u molarnom odnosu od 4 do 6:1 (višak reagensa). Omogućeno je da se reakcija produži na 4°C do 8°C za 20 časova na pH blizu 7.5. Na kraju reakcije dodana je sirćetna kiselina. Konjugat je zatim prečišćen Iz presotalog nemodifikovanog proteina, viška pegilacionog reagensa i drugih nečistoća i puferskih komponenti prisutnih tokom reakcije. Zajedno sa pegilacionim proteinom, kao sporedni produkti reakcije proizvedeni su N-hldroksisukcinlmid i polierJIen glikol-karboksilna kiselina.

Sledeći primeri su obezbeđeni da ilustruju ovde opisani pronalazak, ali ne i da ga ograniče na bilo koji način. U tim primerima je upotrebljen GCSF mutein. Druge vrste GCSF mogu takođe biti konjugovane sa PEG prikazanim postupcima.

Primer 1

Pogilacionl reagensi:

1. GABA amidnl linker (P-6GA-1, P-l2Ga-l)

Reagens GBA amid linker sadrži 2 PEG lanca od bilo 6 ili 12kDa. Vidi sliku 2-A zbog strukture.

2. Amidni Hnker (P-5am-1, P-10am-1)

Produkovanl su amidni linkeri od pet i 10kDa. Vidi sliku 2-B zbog strukture.

3. Amidni linker

Reagens je bila komercijalna sukclnimidil propionska kiselina (SPA), pripremljena sa 5, 10, 15 I 20kDa PEG molekula I njihova generalna struktura je ilustrovana na slici 2-C.

4. Urea linker

Ovaj reagent Je pripremljen sa 5, 10, i 25kDa PEG molekula i tipična struktura je ilustrovana na slici 2-D.

5. Uretanski linker

Produkovani su uretanski linkeri od 10 i 20kDa i struktura je prikazana na slici 2-E.

6. Uretanski linker

Kao struktura ovog komercijalno pripremljenog PEG reagenta od 36kDa, ilustrovanog na slici 2-G, jedan naznačeni kraj PEG reagensa je zatvoren sa t-butll grupom. Taj reagens je je bio PEG najveće MT upotrebljene u ovom primeru.

7. Tio-uret anski linker

Ova struktura pegilacionog reagensa može se videti na slici 2-F. MT PEG-a upotrebljenog u ovom reagensu bila je 20kDa.

Sledeći reagensi dobijeni su od Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Tokio, Japan: 1) G-CSF mutein označen kao GCSF Mutein, GCSF Mutein konjugovan na razgranati reagens metoksi polietilen glikol (m-PEG) sastavljen od dva m-PEG lanca od ili 6 ili 12 kDa (PEG-GABA-NHS, vidi sliku 2A) GCSF Mutein konjugovan na linearni 5 i 10kDa estar/arnid reagens m-PEG (vidi sliku 2B). m-PEG-sukcinimidil propionska kiselin-NHS (PEG-SPA) reagensi koji imaju molekulske težine od 5, 10, 15 i 20kDa nabavljeni su od Shearwater Polymers, (Huntsville, Alabama, vidi sliku 2C). Sledeći protein reagensi pegilacije pripremljeni su u Hoffmann-La Roche, Ine: 1) m-PEG-urea linker (5, 10 i 25kDa, vidi sliku 2D), 2) m-PEG-uretanski linker (10 i 20kDa, vidi sliku 2E) m-PEG-tiouretan linker (10 i 20kDa vidi sliku 2F) i reagens t-butil- m-PEG-uretanski linker sa prosečnom MT od 36kDa je dobijen od DDI Pharmaceuticals, Inc. (Mountainvievv, CA, vidi sliku 2G).

Reakcije pegilacije

Faktori koji deluju na reakcije pegilacije su 1) pH, 2) temperatura, 3) vreme reakcije, 4) molarni odnos protein PEG reagens, i 5) koncentracija proteina. Kontrolisanjem jednog ili vise tih faktora, reakcija se može usmeriti u pravcu predominantnog produkovanja mono-, di-, tri-, itd. PEG konjugata. Na primer, uslovi reakcije za Sheanvater Polymer's SPA-PEG 5000 (N-hidroksi sukcinimid) reagens bili su 1) pH 7.3, 2) temperatura 4°C, za mono- i di-PEG i sobna temperatura za tri-peg, 3) vreme reakcije za mono-PEG, 30 minuta; za di- i tri-PEG, 4 časa i 4) molarni odnos protein reagens od 1:30. Za sve reagense optimalni uslovi reakcije da se produkuje željena vrsta PEG određeni su pojedinačno. Oni su prikazani u tabeli 1. Reakcija je prekinuta zakišeljavanjem reakcione mešavine i zamrzavanjem na -20°C.

Razdvajanje modifikovanih i slobodnih GCSF muteina od reakcione smeše (Sulfopropil (SP) katjonska razmena)

Reakciona smeša, koja je sadržala približno 5mg proteina, razblažena je 10 do 20 puta sa vodom i pH je doteran do 4.5 sa glacijalnom sirćetnom kiselinom. Razblaženi uzorak je zatim stavljen na prethodno upakovanu kolonu 1-2ml Fractogel EMD S03- 650S (EM Separations, Gibbstovvn, New Jersev), koja je uravnotežena sa 10mM amonijum acetata, pH 4.5. Neapsorbovani reagens i sporedni produkti reakcije uklonjeni su ispiranjem. Mođifikovani GCSF Mutein je rastvoren sa postupnim gradientom pomoću 0.15M NaCI u uravnoteženom puferu. Nemodifikovani GCSF Mutein koji je ostao na koloni je postupno-rastvoren sa 05M NaCI u uravnoteženom puferu. Razdvojena mešavina GCSF Mutein-PEG konjugata sterilno je filtrirana sa 0.2ujn filterom i čuvana zamrznuta na -20°C.

Karakterizacija konjugata GCSF Mutein PEG

Određivanje proteina

Koncentracija proteina prečišćenih GCSF Mutein PEG konjugata određena je pomoću Aja, vrednosti od 0.86, za 1 mg/ml rastvora.

Analiza SDS- PAGE

Ova analiza obavljena je pomoću poliakrilamidnih gelova od 12 i 15% ili 8-16% poliakrilamid gradijent gelova, u redukovanim uslovima, prema Laemmli, Nature 227:680-685, 1970.

Određivanja, procentnog sastava

Procentni sastav svake vrste (mono-, di-, tri- itd.) u različitim reakcionlm smešama Mutein-PEG konjugata određen Je iz densrtometrfjskih merenja SDS-PAGE gelova bojenih sa Coomassie blue (vidi tabelu 2).

Qdređjy.anle mase PEG u GCSF^uteiriJ^OJkojiji^atto

Ukupna masa PEG-a substisanog u različitim preparacijama određena je iz prosečne molekularne težine PEG, identifikovanjem pojedinačnih konjugata PEG (mono, di itd.), na osnovu elektroforetske mobilnosti, broja pričvršćenih molekula PEG i procentnog sastava baziranog na densitometrijskim merenjima SDS-PAGE bojenih sa Coomassie blue. Ukupna masa PEG određene preparacije je suma pojedinačnih masa PEG. Pojedinačna masa PEG izračunata je iz sledeče jednačine:

U određivanju ukupne mase PEG takođe je upotrebljena masena spektometrija (MALDI-TOF). U tom slučaju, maseni spektar omogućio je identifikovanje i određivanje molekularne težine pojedinačnih konjugata PEG. PEG MT pričvršćenog za svaki PEG konjugat je ukupna MT pojedinačnih PEG konjugata minus MT GCSF Muteina (18.9kDa). Te vrednostj pomnožene sa % sastavom dale su pojedinačne mase PEG; njihov zbir je ukupna masa PEG.

Oba postupka su bila upotrebljena za određivanje mase PEG različitih preparacija. Rezultati su sumarizovani u tabeli 2.

Određivanje nivoa endotoksina

Nivoi endotoksina su određeni koristeći LAL postupak, u skladu sa uputstvima proizvođača (Associates of Cape Cod, Inc., VVoods Hople, Massachusetts).

Btoaktivnosti

Obavljeni su bioogledin vltrona M-NFS-60 ćelijama iin vivoogled na ženkama C57BL/6J miševa na prethodno opisani način. (Vidi Asano i sar. Jpn. Pharmacol. Ther.

(1991) 19:2767-2773.)

Rezultati i diskusija

Reakcije pegilacije

Generalno, rezultati ukazuju da manje reaktivni reagensi, kao što je urea linker, zahtevaju viši pH, temperaturu i molarni odnos protein:reagens, kao i duže reakciono vreme, da se dobije željena količina konjugata (vidi tabele 1 i 2).

Razdvajanje modifikovanih i slobodnih GCSF muteina od reakcione smeše

Tipičan profil rastvaranja prikazan je na slici 4. U dodatku na hromatografiju katjonske razmene, mogu bffi potrebni dodatni koraci kao što je hromatografija zasićenog gela da bi se uklonili trag kontaminanata i endotoksin, i da se obavi zamena pufera konačnog produkta za čuvanje. Jaki postupak razdvajanja katjonskom razmenom skaliran je na 30mg skali za 20kDa SPA (amld) I 20kDa konjugata uretana. Ovom procedurom dobijena je gotovo kvantitativna nadoknada.

% sastav mase PEG

Procentni sastav i rezultati mase PEG sumarizovani su u tabeli 2. Po našem iskustvu, u slučaju visoke MT PEG konjugata (npr. 20kDa SPA diPEG i 12 kDa GABA), nije dovoljno pouzdano identffikovanje vrsta PEG bazirano na elektroforetskoj mobilnosti da se odredi % sastav reakcione smeše. Sa ciljem da se odredi masa PEG i identifikuju visoke MT i visoko sibstituisani PEG konjugati potrebne su, kombinacija SDS-PAGE, SP-HPLC i MALDI-TOF MS analize. Međutim, monopegilizovani i PEG konjugati dobijeni iz PEG reagensa male MT (npr., 5kDa) mogu se identifikovati vrlo pouzdano iz respektivnih SDS-PAGE profila.

Nivoi endotoksina

Koristeći LAL postupak, detektovano je < 1 EU/mg endotoksina u svim PEG konjugatima sem onom Izvedenom od uretanskog reagensa. U tom PEG konjugatu endotoksin je detektovan samo nakon rastvaranja. Potvrđeno je da to nije uzrokovano kontaminacijom tokom rastvaranja pa je, prema tome, neki nepoznat materijal mogao u tom uzorku uzrokovati inhibiciju u LAL ogledu, pri višim koncentracijama proteina. Nakon rastvaranja uzorka, i potpunog rastvaranja Inhibltomog materijala, dobijen je pozitivni rezultat na endotoksin.

Bioaktivnost

Bioaktivnosti svih GCSF Mutein konjugataIn vitroiin vivopopisane su u tabeli 2. Generalno, zapažen je inverzni odnos izmeđuin vitroaktivnosti i stepena substitucije, kao i MT PEG-ova. Nasuprot tome, povećana aktivnostin vivozapažena je sa povećanjem MT substituisanog PEG-a. To su takođe zapazili i drugi (Satako-lshikawa i sar.,Cell Stmct. Funct.17(3):157-60, 1992). Predpostavljeno je da hemijsko pričvršćivanje molekula PEG-a za polipeptidnl kostur GCSF Muteina produkuje neki oblik konformacionih pramena koje nepopovoljno utiču na receptor/Iigand interakcije snižavajući tako afinitet vezivanja. U dodatku, relativno kratko vreme inkubiranja u ogleduin vitroje verovatno nedovoljno da se dostigne pik aktivnosti. S druge strane, ogledIn vivokod miševa je mnogo duži (dani) i prekida se nekoliko dana nakon injekcije leka. To duže vreme Inkubacije, kombinovano sa povećanim polužlvotom cirkulacije PEG-GCSF Muteina, kompenzuje svaki gubitak afiniteta za vezivanje zahvaljujući pegtlaclji. Krajnji rezultat je dostizanje maksimuma bioaktivnostiin vivo.Druga hipoteza je da PEG-GCSF Mutein deluje kao prolek kada se injicira miševima. U toj situaciji, grupa PEG-a PEG-GCSF Muteina biva nekako kontinuirano isečena što rezultira stalnim oslobađanjem minutnih količina slobodnog GCSF Muteina, koji Je razlog održavanja i povećavanja aktivnostiin vivo.Međutim, prolek hipoteza ne objašnjava opaženu polaznu liniju aktivnostiin vivo, 7dana nakon početnog doziranja. Mehanizam proleka nije verovatan zato što je amidna veza između proteina i PEG-a stabilna i ne kida se lako.

Među 15 izučavanih GCSF Mutein PEG konjugata,in vivoaktivnosti P-12GA-1, 20kDa SPA, 20kDa uretana i 36kDa uretana, bite su značajno više od ostalih preparacija (vidi sliku 4 I tabelu 2).

Ukupno, zapažena je direktna veza između MT molekula PEG i povećane aktivnostiin vivo.To je ilustrovano na slici 5, gde su povećana brojanja PMN iskazani kao funkcija ukupne mase PEG u amidu (SPA) i ureom vezanih PEG konjugata.

Selekcija i karakaterisuke GCSF Mutein PEG konjugata

Nakon pažljive procene hernije konjugata, bioloških karakteristika i razvoja uspešnosti leka, među 15 PEG konjugata tri izabrana za dalju procenu su: 1) P-12GA-1, 2) 20kDa SPA i 3) 20kDa uretan. 20kDa SPA-izveden mono, di i triPEG konjugati prisutni u SP-prećišćenoj mešavini su procenjeni u Head-to-head poređenju koje je pokazalo da sva tri zadržavaju visoku granulopoetičnu aktivnost kod ženki C57BL/6J miševa tokom 5 dana sa pojedinačnom dozom od 25jag (tabela 3 i slika 4). Nasuprot tome, bile su potrebne dnevne doze nemodifikovanog GCSF Muteina da se održe slične aktivnosti (podaci nisu prikazani). U svim sem u dva slučaja (20kDa SPA i P-12GA-1),in vivoaktivnost vratila se na normalnom nivoima 7 dana nakon inicijalnog dozitranja kod miševa (slika 6). I 20kDa SPA i P-12GA-1 konjugati pokazivali su povećanu aktivnost na nižim dozama od 8.4u,g i vratili su se na normalne nivoe 7. dana (vidi tabelu 3). Podaci o procentnom sastavu (tabela 3) ukazuju da i 20kDa SPA i P-12GA-1 preparacije sadrže približno 50% dimera i preostalih 50% je distribuirano između monomera i trimera. Reagens 20kDa uretan produkuje predominantno mono-PEG pod upotrebfjenim eksperimentalnim ustavima (vidi tabelu 3). Procenjenain vitroaktivnost svih PEG konjugata, ukjjučujći predominantno derivat monomernog uretana, sledi generalno inverzni odnos između stepena substitucije, kao i MT PEG-a. Procenjena biološka aktivnostin vivoPEG konjugata pokazala je direktnu vezu sa MT PEG-a u odnosu na procenjeni raspon molekularne težine (slika 5).

Zaključak

Među 15 ispitanih konjugata GCSF Mutein PEG-a, preparacije P-12GA-1, 20kDa SPA i 20kDa uretanski linker pokazale su dobre profile aktivnostiin vivo.20kDa PEG-GCSF Mutein pkazao je ukupno najbolje karakteristike, uključujući ekonomičnost produkovanja.

PrimarZ ; pripremanje20 kDa PEG- a konjugovanog na rhG-CSF_Mutein

Modifikacija G-CSF muteina sa 20 kDa metoksi-PEG sukcinimldil propionskom kiselinom (SPA) obavljena je onako kako dalje sledi. PEG reagens je rastvoren u destllovanoj vodi u koncentraciji od »200 mg/ml i dodan u rastvor G-CSF muteina («5mg/mr) u molarnom odnosu od 4:1 do 6:1 (reagens u višku). Pušteno je da se reakcija produži za 20 časova na 4°C do 8°C i pH«7.5. Na kraju reakcije dodana je glacijalna sirćetna kiselina da se zaustavi reakcija. Pegillrani GCSF Mutein (takođe označen I kao PEGG) je zatim prečišćen iz preostalog nemodifikovanog muteina, viška PEG reagensa i drugih nečistoća i puferskih komponenti prisutnih tokom modifikacije. Zajedno sa pegiliranim proteinom kao sporedni produkti reakcije produkovani su N-hldrokslsukcInimid i polietilen glikol-karboksilna kiselina.

PEGG je prečišćen pomoću hromatografije katjonske razmene praćene ultrafiltracijom. Kolona razmene katjona napunjena je i isprana sar 20 mM natrijum acetata, pH 4.0. Rastvaranje sa linearnim gradijentom natrijum hloridom razdvojilo je PEGG od ostalih komponenti u reakcionoj smeši. Nakon toga, uttrafiltracija/dijafiltracija upotrebljenl su da se PEGG koncentriše do »4.0 mg/ml i da se promeni pufer u 20 mM natrijum acetat, 50 mM natrijum hlorid, pH 6.0.

Pet tura pegilacija i prečišćavanja obavljenih u prethodno navedenim uslovima analizirano je putem hromatografije katjonske razmene i to je pokazalo ponovljivost pegilacione reakcije G-CSF muteina. Pokazano je da je pegitaciona reakcija ponovljiva u turama od sve do 2.5 g (konačni prinos PEGG) u sledećim optimalnim uslovima: odnos 20kDa-SPA-PEG:muteln od 4 do 6:1; pH«7.5, 4°C, 20 časova. Određeno je da je prosečni procentni sastav smeše PEGG-ova 21.7% mono-PEG (%RSD = 16.6), 60.3% di-PEGG (%RSD = 6.6), 15.1% tri-PEGG (%RSD=4.0) l 2.9% tetra-PEGG (%RSD = 26.1), kao što je prikazano na tabeli 4.

Primer 3

Mobitizacija stem ćefija penfeme krvi

Razvijene su tehnike da se mobilizuju i primitivne stem ćelije i obavezni prekursori Iz koštane srži, i da se rašire cirkulišuće progenltorske ćelije u perifernoj krvi. Te stemulisane ćelije mogu biti sposobne da posreduju rane i ustaljene kaleme nakon letalnog označivanja koštane srži ili transplantanta stem ćelija. Neben, S., Marcus, K. I Mauch, P: Mobilizacija hematopoetičnih stem I progenitor subpopulacija ćelija iz srži u krv miševa nakon ciklofosfamid i/ili granulocitna kolonija- stemulacionog faktora. Blood 81: 1960 (1993). Regnitovanje stem ćelija periferne krvi (PBSC) može pomoći da se skrati hemopoetićni oporavak kod pacijenata hipoplazijom koštane srži izazvane hemoterapijom ili kod onih koji su podvrgnutih drugim mieloblastivnih tretmanima. Roberts, AW i Metcalf, D: Faktor stemulacije kolonija granulocita indukuje selektivne projekcije progenitor ćelija u perifernu krv miševa Bcpeiimental Hematologv 22: 1156 (1994). I faktori rasta i hemoterapeutski lekovi upotrebljavani su da se stemuliše mobilizacija. Bodine, D: Mobilizacija "stem" ćelija periferne krvi: gde ima dima ima i vatre? Experimental Hematologv 23: 293 (1995). Nakon stemulacije PBSC, mobllisane ćelije su prikupljene leukaferezom i krlo-sačuvane do vremena kada su bile potrebne. Današnji klinički protokoli zahtevaju ponovljeno sakupljanje PBSC koncentrata putem leukafereze praćene standardnom visoko-doznom hemoterapijom (CHT) i ponovljenim dnevnim doziranjem ili kontinuiranim infuzijama sa faktorima rasta, koje ponekad traju dve nedelje ili više. Brugger, W, Bross, K, Frish, J, Dern, P,-Weber, B, Mertelsmann, R i Kanz, L: Mobilizacija progenitor ćelija periferne kn/i uzastopnim davanjem lnterleukina-3 i stemulacionog faktora kolonija granulocite-makrofage praćene polihemoterapijom sa etopsidom, ifosfamidom i cisplatinom. Blood Z9: 1193 (1992). Ispitivanja opisana dole obavljena su sa dva modela mobilizacije PBSC na miševima, prvi kod normalnih miševa i drugi u hemoterapijskom modelu. Eksperimenti pokazuju povećanu efikasnost pegiliranih G-CSF Muteina u skladu sa ovim pronalaskom (PEGG), u poređenju sa NEUPOGEN (G-CSF), da deluje na mobilizaciju stem ćelija. Superiornost pegiliranog muteina u značajno redukovanom i mnogo efikasnijem režimu doziranja je takođe dobro utvrđena.

Te studije procenile su ekspanzioni kapacitet mobilizovanog nezrelog mišijeg PBSC-a, stemulisanogin vitrovišestrukim faktorima rasta, u ogledu sedmodnevne kolonije na agaru. U dodatku na sposobnost formiranja kolonije, obavljen je kompletan hematološki profil plus procena apsolutnih neutrofilnih brojanja (ANC) u krvi svih miševa. Takođe, su određeni nivoi serum G-CSF. Nakon optimizacije ogleda, obavljeno je nekoliko eksperimenata u različitim vremenima I ispitane su i visoke i niske doze G-CSF. Eksperimentalni model uključio je G-CSF i ciklofosfamidom (Cytoxan) indukovanu mobilizaciju, kao i kombinovani tretman koristeći i CHT i citokin.

Materijal I postupaU eksperimentima su korišćene 6- do 10 nedelja stare ženke C57BL/6J miševa, dobijene od Jackson Laboratorv. Miševi su injekciranl IP 1. dana sa 200 mg/kg Cytoxan-a ili nosačem, rastvorom fosfatnog pufera (PBS). Nultog dana životinje su injekcirane SC sa 0.1 ml NEUPOGEN (GCSF), PEGG (20 kD SPA-vezanog pegiliranog muteina, Lot # P20VV3), Ili PBS nosač koji je sadržao 1% normalnog mišijeg seruma. Miševima koji su dobijali Neupogen davane su dnevno injekcije iste doze, dok su drugi miševi dobili nosač. Na dan žrtvovanja, sakupljena je periferna krv Iz retroorbitalnog sinusa anesteziranih miševa u epruvete sa EDTA. Za svaku grupu mala količina sabrane cele krvi je dodana trostrukim posudama za kulturu od 35 mm<2>koje su sadržale 1000 U/ml rekombinantnog mišijeg (rm) lnterleukina-3, 100 ng/ml faktora stem ćelija i 1000 U/ml rm lnterleukina-6, toal-u od 1 ml RPMI 1640 medijumu dopunjenog sa 15% fetalnog kravljeg seruma i 0.35% Difco agara. Čvrste kulture na agaru inkubirane su jednu nedelju na 37°C u vlažnoj vazdušnoj atmosferi sa 5% C02. Kolonije su pobrojane pomoću stereoskopskog disekcionog mikroskopa sa tamnim poljem.

Rezultati:U prvom prikazanom izučavanju, normalni miševi su primili dnevne injekcije 25ug/mišu NEUPOGEN-a od nultog do petog dana, ili pojedinačnu Injekciju 25ug/mišu PEGG-a nuitog dana. Miševi su žrtvovani 3-7 dana. Kao što se vidi na slici 7 mobilfzacija, kako je to pokazano formiranjem kolonija, je bila značajno povećana kod NEUPOGEN-om injekciranih miševa 3 i 4 dana, ali postepeno počinje da se vraća na nivoe polazne linije 5. dana (uprkos injekciji NEUPOGEN-a u 5. danu). S druge strane, miševi injekcirani sa PEGG-om pokazali su mnogo više procenjene brojeve kolonija, koji su ostali na nivou platoa tokom 7. dana.

Paradigma za model hemoterapije bila je slična. Miševi u CHT grupama primili su injekciju Cytoxan-a prvog dana. Zatim su neki od miševa u sledećim danima primili samo nosač, dok su drugi primili kombinovani tretman koji se sastojao ili od dnevnih injekcija NEUPOGEN-a u danima 0-5, ili od pojedinačne injekcije PEGG-a nultog dana. Slika 8 pokazuje pik kod miševa tretiranih Cytoxan-om 4. dana, sa postupnim povratkom u sledećim danima na nivoe polazne osnove. Obe grupe, i NEUPOGEN i PEGG, imale su pik petog dana, pokazujući visok rast broja kolonija. Međutim, Cytoxan + PEGG vrednosti ostale su značajno povišene posle onih za Cytoxan + NEUPGEN grupu u šestom i sedmom danu. Slika 9 pokazuje sinergetski efekat kombinovane terapije u odnosu na sam Cytoxan ili G-CSF.

Drugo ispitivanje pokazanao je na slikama 10 i 11. Normalni miševi koji su primili dnevne injekcije niže doze NEUPOGEN-a od 3ug/mišu tokom 10 uzastopniha dana pokazali su relativno nizak nivo «multifazne» mobilizacije tokom trajanja ispitivanja. Životinje injicirane sa pojedinačnom dozom PEGG-a od 3ng7mišu pokazale su približno pet puta veći broj mobilisanih progenitora u perifernoj cirkulaciji sa četvrtim danom, i ako je efekat bio pojedinačna eksplozija koja je bila u osnovi gotova u okviru 6 dana.

Kod miševa injekciranih Cytoxan-om pojedinačna doza PEGG-a od 3jig/mtšu indukovala je približno ekvivalentnu količinu PBSC mobilizacije kao i 30u,g/mišu NEUPOGEN-a injekciranih u 10 dnevnih doza od po 3ng/mišu (slika 11). Obe grupe imale su pikove u mobilizaciji progenitora petog dana i intenzitet pikova bio je isti. Pokazalo se da je jedina razlika u neznatno dužem efektu zadržavanja NEUPOGEN-a. Brojevi kolonija u CHT modelu bili su 4 - 10 puta viši nego oni u normalnom mišjem modelu.

Ti eksperimenti pokazuju dve različite potencijalne prednosti pegiliranog muteina u odnosu na NEUPOGEN. Prvo, veća efikasnost PEGG-a u poređenju sa NEUPOGEN-om u sposobnosti da indukuje mobilizaciju PBSC je evidentna, i kod normalnih i hemoterapijom-tretiranih miševa. Drugo, pokazano je da je pegilirani mutein mnogo efektivniji nego NEUPOGEN kod miševa, koristeći redukovani i više efikasan režim doziranja nego onaj što je trenutno u upotrebi sa kliničkim produktima.

Claims

1. Fiziološki aktivan konjugat, naznačen time što ima formulu gde je G faktor stimulacije kolonije granulocita bez amino grupe ili njegovih grupa koje formiraju amidnu vezu sa polietilen glikol grupom u konjugatu; R je C,-C8alkil; n je integral od 420 do 550; i m je integral od 1 - 5.

2. Konjugat iz zahteva 1, naznačen time što je R metil.

3. Konjugat iz zahteva 2, naznačen time što je n od 450 do 490.

4. Konjugat iz zahteva 2, naznačen time što je m integral od 1 do 4.

5. Konjugat iz zahteva 4, naznačen time što je m 2.

6. Konjugat iz zahteva 1, naznačen time što je faktor stimulacije kolonije granulocita GCSF Mutein koji ima sekvencu prikazanu na slici 1.

7. Konjugat iz zahteva 1, naznačen time što je n od 450 do 490.

8. Konjugat iz zahteva 1, naznačen time što je m integral od 1 do 4.

9. Konjugat iz zahteva 8, naznačen time što je m 2.

10. Konjugat iz zahteva 1, naznačen time što ima duži polu-život u cirkulaciji i veću granulopoetičnu aktivnostin vivonego odgovarajući nekonjugovani faktor stimulacije kolonije granulocita.

11. Konjugat iz zahteva 10, naznačen time što je faktor stimulacije kolonije granulocita GCSF Mutein koji ima sekvencu prikazanu na slici 1.

12. Konjugat prema zahtevu 1, naznačen time što je R metil; n je integral od 450 do 490; m je 2; G je GCSF Mutein koji ima sekvencu pokazanu na slici 1 bez njegovih amino grupa koje formiraju amidnu vezu sa polietilen glikol grupom u konjugatu.

13. Kompozicija koja sadrži fiziološki aktivne konjugate, naznačena time što ima formulu gde je G u svakom od konjugata faktor stimulacije kolonije granulocita bez amino grupa ili njegovih grupa koje formiraju amidnu vezu sa polietilen glikol grupom u konjugatima; R je u svakom od konjugata nezavisno niži alkil; n je u svakom od konjugata nezavisno integral od 420 do 550; i u svakom od konjugata nezavisno m je integral od 1 do 4; procenat konjugata gde je m 1 je od osamnaest do dvadeset pet posto; procenat konjugata gde je m 2 je od pedeset do šezdeset šest posto; procenat konjugata gde je m 3 je od dvanaest do šesnaeset posto i procenat konjugata gde je m 4 je sve do pet posto.

14. Kompozicija iz zahteva 13, naznačena time što je R metil u svakom od konjugata.

15. Kompozicija iz zahteva 13, naznačena time Što su n i R isti u svakom od konjugata.

16. Kompozicija iz zahteva 13, naznačena time što je n od 450 do 490.

17. Kompozicija iz zahteva 13, naznačena time što je u svakom od konjugata faktor stimulacije kolonije granulocita GCSF Mutein koji ima sekvencu prikazanu na slici 1.

18. Kompozicija prema zahtevu 17, naznačena time što R je metil, n je u svakom od konjugata isto i predstavlja integral od 450 do 490.

19. Postupak za produkovanje PEG-GCSF konjugata koji ima duži polu-život u cirkulaciji i veću granulopoetičnu aktivnostin vivonego odgovarajući nekonjugovani GCSF, naznačen time što se sastoji od kovalentnog vezivanja reagensa formule za GCSF da se produkuje pomenuti konjugat.

20. Postupak iz zahteva 19, naznačen time što GCSF je GCSF Mutein koji ima sekvencu prikazanu na slici 1.