RS51134B - Grg23 i grg51 geni koji prenose rezistenciju na herbicid - Google Patents

Abstract

Izolovani molekul nukleinske kiseline, koji je izdvojen od:a) molekula nukleinske kiseline koji sadrži nukleotidnu sekvencu SEQ ID N0:1, 3 ili 5, ili njen komplement;b) molekula nukleinske kiseline koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja ima najmanje 80% identiteta sekvence sa nukleotidnom sekvencom SEQ ID N0:1, 3 ili 5, koja kodira EPSPS sa tolerancijom na glifosat, ili njen komplement;c) nukleotidne sekvence sa glifosat-tolerancijom iz DNK inserta plazmida deponovanog kao Accession No. NRRL B-30888 ili B-30949, ili njen komplement;d) molekula nukleinske kiseline koji kodira polipeptid koji sadrži amino kiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 2, 4 ili 6; ie) molekula nukleinske kiseline koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira polipeptid koji ima najmanje 80% identiteta amino kiselinske sekvence sa amino kiselinskom sekvencom SEQ ID N0:2, 4 ili 6, gde navedeni polipeptid ima aktivnost tolerancije na glifosat.Prijava sadrži još 13 patentnih zahteva.

Description

: GRG23 IGRG51 GENI KOJI

PRENOSE REZISTENCIJU NA

HERBICID

OBLAST TEHNIKE

Ovak pronalazak obezbeđuje nove gene koji kodiraju glifosatnu toleranciju koja je korisna u biologiji biljaka, uzgajanju useva i kulturi biljnih ćelija.

STANJE TEHNIKE

N-fosfonometilglicin, obično se naziva glifosat, je važna hemikalija u poljoprivredi. Glifosat inhibira enzim koji prevodi fosfoenolpiruvatnu kiselinu (PEP) i 3-fosfošikimi kiselinu u 5-enolpiruvil-3-fosfošikimi kiselinu. Inhibicija ovog enzima (5-enolpiruvilšikimat-3-fosfat sintaza; koja se ovde označava kao "EPSPS") ubija biljne ćelije obaranjem šikimatnog puta i, time inhibišući biosintezu aromatičnih kiselina.

S obzirom na to da herbicidi glifosatne klase inhibiraju biosintezu aromatičnih amino kiselina, oni ne samo da ubijaju biljne ćelije, već su, takođe, otrovni za bakterijske ćelije. Glifosat inhibira mnoge bakterijske EPSPS sintaze i, na taj način je otrovan za te bakterije. Ipak, EPSPS sintaze izvesnih bakterija imaju visok stepen tolerancije prema glifosatu.

Biljne ćelije koje su rezistentne na toksičnost glifosata se mogu proizvesti transformisanjem biljnih ćelija da ekspresuju bakterijske EPSPS sintaze koje su rezistentne na glifosat. Značajno, bakterijski gen izAgrobacterium tumefacienssoja CP4 je iskorišćen da prenese rezistenciju na herbicid na biljne ćelije po ekspresiji u biljkama. Mutirana EPSPS sintaza izSalmoneKa typhimuriumsoja CT7 prenosi rezistenciju na glifosat u bakterijske ćelije i, prenosi rezistenciju na glifosat u biljne ćelije (U.S. Patenti sa brojevima 4,535,060; 4,769,061; i 5,094,945). Ipak, postoji potreba i za genima za rezistenciju na druge herbicide.

Kinetička aktivnost EPSPS se može ispitati merenjem oslobađanja fosfata. Oslobađanje fosfata se detektuje upotrebom spojenog testa za fluorescentno otkrivanje fosfata na bazi stvaranja N-acetil-3,7-dihidroksifenoksacina (Amplex® Red), kao što je poznato u struci (Vazquez et al. (2003) Analvtica! Biochemistrv 320:292-298). Objavljeni uslovi testa mogu dovesti do zasićenja testa u ogledima gde se fosfat veoma brzo oslobađa. Potrebni su dodatni testovi za merenje kinetičke aktivnosti EPSPS.

IZLAGANJE SUŠTINE PRONALASKA

Obezbeđene su sastavi i postupci za prenošenje tolerancije na glifosat na bakterije, biljke, biljne ćelije, tkiva i seme. Sastavi uključuju molekule nukleinske kiseline koji kodiraju polipeptide sa tolerancijom na glifosat, vektore koji sadrže ove molekule nukieinskih kiselina i ćelije domaćina koji sadrže vektore. Sastavi, isto tako, uključuju antitela na polipeptide sa tolerancijom na glifosat. Kako je naznačeno, nukleotidne sekvence pronalaska se mogu koristiti u DNK konstrukcijama ili ekspresionim kasetama za transformaciju i ekspresiju u organizmima, uključujući mikroorganizme i biljke. Sastavi, isto tako, obuhvataju bakterije, biljke, biljne ćelije, tkiva i semena. Osim toga, obezbeđeni su postupci za proizvodnju polipeptida koje kodiraju sintetski nukleotidi pronalaska.

Obezbeđeni su izolovani molekuli nukleinske kiseline i njihove varijante koji kodiraju polipeptide sa tolerancijom na glifosat. Osim toga, obuhvaćene su i amino kiselinske sekvence i njihove varijante koje kodiraju polinukleotidi koji prenose toleranciju na glifosat. Ovaj pronalazak obezbeđuje izolovane molekule nukleinske kiseline koji sadrže nukleotidnu sekvencu iskazanu u SEQ ID NO:1, 3 ili 5, nukleotidnu sekvencu koja kodira amino kiselinsku sekvencu iskazanu u SEQ ID NO:2, 4 ili 6, nukleotidnu sekvencu tolerancije na glifosat deponovanu u bakterijskom domaćinu kao Accession Nbs. NRRL B-30888 ili NRRL B-30949, kao i njihove varijante i fragmente. Isto tako su obuhvaćene nukleotidne sekvence koje nisu komplementarne sa nukleotidnom sekvencom pronalaska, ili koje hibridizuju sa sekvencom pronalaska.

Postupci za merenje kinetičke aktivnosti enzima koji koriste fluorogene substrate su isto tako obezbeđeni.

Tako ovaj pronalazak obezbeđuje izolovani molekul nukleinske kiseline izolovani molekul nukleinske kiseline odabran od: a) molekula nukleinske kiseline koji sadrži nukleotidnu sekvencu SEQ ID NO:1, 3 ili 5, ili njen komplement; b) molekula nukleinske kiseline koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja ima najmanje 80% identiteta sekvence sa nukleotidnom sekvencom SEQ ID NO:1, 3 ili 5, koja kodira EPSPS sa tolerancijom na glifosat, ili njen komplement; c) nukleotidne sekvence sa glifosat-tolerancijom iz DNK inserta plazmida deponovanog kao Accession No. NRRL B-30888 ili B-30949, ili njen komplement; d) molekula nukleinske kiseline koji kodira polipeptid koji sadrži amino kiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 2, 4 ili 6; i e) molekula nukleinske kiseline koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira polipeptid koji ima najmanje 80% identiteta amino kiselinske sekvence sa amino

kiselinskom sekvencom SEQ ID N0.2, 4 ili 6, gde navedeni polipeptid ima aktivnost tolerancije na glifosat.

Ovaj pronalazak, isto tako, obezbeđuje:

- vektor koji obuhvata molekul nukleinske kiseline pronalaska, navedeni vektor opciono dalje sadrži molekul nukleinske kiseline koji kodira heterologe polipeptide. - ćeliju domaćina koja sadrži takav vektor;

- transgensku biljku koja sadrži ćeliju domaćina; ili

- transformisano seme takve biljke.

Pronalazak, sem toga, obezbeđuje izolovani polipeptid, odabran od:

a) polipeptida koji sadrži amino kiselinsku sekvencu SEQ ID NO:2, 4 ili 6; b) polipeptida kojeg kodira nukleotidna sekvenca SEQ ID NO:1, 3 ili 5; c) polipeptida koji sadrži amino kiselinsku sekvencu koja ima najmanje 80% identiteta sekvence sa amino kiselinskom sekvencom SEQ ID NO:2, 4 ili 6, gde

navedeni polipeptid ima aktivnost glifosatne tolerancije;

d) polipeptida kojeg kodira nukleotidna sekvenca koja je najmanje 80% identična sa nukleotidnom sekvencom SEQ ID NO:1, 3 ili 5, gde navedeni polipeptid ima

aktivnost glifosatne tolerancije; i

e) polipeptida kojeg kodira nukleotidna sekvenca sa glifosatnom tolerancijom iz DNK inserta plazmida deponovanog kao Accession No. NRRL B-30888 ili B-30949;

navedeni polipeptid opciono dalje sadrži heterologu amino kiselinsku sekvencu.

Pronalazak dalje obezbeđuje postupak za proizvodnju polipeptida sa aktivnošću glifosatne tolerancije, koji obuhvata uzgajanje ćelije domaćina pronalaska pod uslovima u kojima se ekspresuje molekul nukleinske kiseline koji kodira polipeptid, navedeni polipeptid je odabran iz grupe, koja se sastoji od: a) polipeptida koji sadrži amino kiselinsku sekvencu SEQ ID NO;2, 4 ili 6; b) polipeptida kojeg kodira nukleotidna sekvenca SEQ ID NO:1, 3 ili 5; c) polipeptida koji sadrži amino kiselinsku sekvencu koja ima najmanje 80% identiteta sekvence sa polipeptidom koji ima amino kiselinsku sekvencu SEQ ID NO:2, 4 ili 6, gde navedeni polipeptid ima aktivnost glifosatne tolerancije; d) polipeptida kojeg kodira molekul nukleinske kiseline koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja ima najmanje 80% identiteta sekvence sa sekvencom nukleinske kiseline SEQ ID N0.1, 3 ili 5, gde navedeni polipeptid ima aktivnost glifosatne tolerancije; i e) polipeptida kojeg kodira nukleotidna sekvenca sa glifosatnom tolerancijom iz DNK inserta plazmida deponovanog kao Accession No. NRRL B-30888 ili B-30949.

Pronalazak dalje obezbeđuje postupak za prenos glifosatne tolerancije u biljku, pomenuti postupak obuhvata transformisanje pomenute biljke sa DNK konstrukcijom, pomenuta konstrukcija sadrži promoter koji upravlja ekspresiju u biljnoj ćeliji, koji je operabilno povezan sa nukleotidnom sekvencom koja je najmanje 80% identična sa nukleotidnom sekvencom SEQ ID NO:1, 3 ili 5 koja kodira glifosatnu toleranciju EPSPS-a, i regeneraciju transformisane biljke.

Pronalazak dalje obezbeđuje biljku ili biljnu ćeliju koja ima u svom genomu stabilno inkorporiranu DNK konstrukciju, koja sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira protein koji ima aktivnost tolerancije na glifosat, gde je pomenuta nukleotidna sekvenca odabrana od: a) nukleotidne sekvence SEQ ID NO: 1, 3 ili 5; b) nukleotidne sekvence koja ima najmanje 80% identiteta nukleotidne sekvence SEQ ID NO:1, 3 ili 5, gde navedena nukleotidna sekvenca kodira polipeptid koji ima aktivnost tolerancije na glifosat; c) nukleotidne sekvence koja kodira polipeptid koji ima amino kiselinsku sekvencu SEQ IDNO:2, 4 ili 6; d) nukleotidne sekvence koja kodira polipeptid koji ima najmanje 80% identiteta amino kiselinske sekvence sa amino kiselinskom sekvencom SEQ ID NO:2, 4 ili

6, gde navedeni polipeptid ima aktivnost glifosatne tolerancije; i

e) nukleotidne sekvence sa glifosatnom tolerancijom iz DNK inserta plazmida deponovanog kao Accession No. NRRL B-30888 ili B-30949; pri čemu je pomenuta nukleotidna sekvenca operabilno povezana sa promoterom koji upravlja ekspresijom kodirajuće sekvence u biljnoj ćeliji.

Sem toga, pronalazak obezbeđuje izolovani molekul nukleinske kiseline koji kodira EPSPS enzim sa glifosatnom tolerancijom, gde pomenuti EPSPS enzim sa glifosatnom tolerancijom ima Km za fosfoenolpiruvat (PEP) između 1 i 150VM i Ki (glifosat) / Km (PEP) između 500 i 1000.

Pronalazak dalje obezbeđuje biljku koja ima u svom genomu stabilno inkorporiranu DNK konstrukciju, koja sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira nukleotidnu sekvencu koja kodira EPSPS polipeptid, pomenuti EPSPS polipeptid ima Km za PEP između otprilike 1 i otprilike 150^M i Ki (glifosat) / Km (PEP) između oko 500 i oko 1000, navedena biljka ispoljava toleranciju na glifosatni herbicid.

OPIS SLIKA

Slika 1 prikazuje poravnanje GRG23 ORF1 amino kiselinske sekvence (SEQ ID NO:2) i GRG51 (SEQ ID NO:6) saBacillus clausii(SEQ ID NO:7),Rubrobace rxylanophilus(SEQ ID NO:8),Escherichia coli(SEQ ID NO: 11),Agrobacterium sp.soj CP4 (SEQ ID NO: 10) iZea mays(SEQ ID NO:9).

Slika 2 prikazuje krivu rasipanja aktivnosti GRG23 enzima (y osa) kao funkciju koncentracije PEP (x osa) pri koncentracijama glifosata od 0, 3, 5 i 10 mM.

Slika 3 prikazuje krivu rasipanja Km (app) (y osa) kao funkciju koncentracije glifosata (x osa). Odsečak-X predstavlja Ki za glifosat.

DETALJAN OPIS

Ovaj pronalazak će sada ovde u nastavku biti podrobnije opisan s osvrtom na pridružene nacrte, u kojima su prikazana neka, ali ne i sva ostvarenja pronalaska. Zaista, ovi pronalasci se mogu ostvariti u brojnim različitim formama i ne treba da budu izgrađeni kao ograničenje ovde objašnjenim ostvarenjima; pre se ova ostvarenja obezbeđuju da bi ovo izlaganje zadovoljilo zakonske zahteve primenjivosti. Kao brojni što se odnose na slične elemente kroz izlaganje.

Stručnom licu će se razjasniti brojne modifikacije i druga ostvarenja ovde objašnjenih pronalazaka zahvaljujući kojima ovi pronalasci imaju korist od objašnjenja prezentovanih u prethodnim opisima i pridruženim crtežima. Zbog toga, treba shvatiti da pronalasci neće biti ograničeni na specifična ostvarenja koja su izložena i da modifikacije i druga ostvarenja treba da budu obuhvaćena okvirom priključenih patentnih zahteva. lako su ovde upotrebljeni specifični termini, oni su korišćeni samo u generičkom i opisnom smislu, a ne sa ciljem ograničavanja.

Ovaj pronalazak je usmeren na sastave i postupke za regulisanje rezistencije na herbicide u organizmima, naročito u biljkama ili biljnim ćelijama. Postupci obuhvataju transformisanje organizama sa nukleotidnim sekvencama koje kodiraju gen pronalaska sa glifosatnom tolerancijom. Nukleotidne sekvence pronalaska su korisne za pripremu biljaka koje pokazuju povećanu toleranciju na gifosatni herbicid. Tako su obezbeđene transformisane bakterije, biljke, biljne ćelije, biljna tkiva i semena. Sastavi uključuju nukleinske kiseline i proteine koji se odnose na toleranciju herbicida u mikroorganizmima i biljkama, kao i u transformisanim bakterijama, biljkama, biljnim tkivima i semenima. Izložene su nukleotidne sekvence gena za glifosatnu toleranciju( grg23igrg51)i amino kiselinske sekvence njima kodiranih proteina. Sekvence nalaze upotrebu u izgradnji ekspresionih vektora za neposrednu transformaciju u biljke od važnosti, kao probe za izolaciju drugih gena sa glifosatnom tolerancijom, kao izborni markeri i slično. Tako se pod "genom pronalaska sa glifosatnom tolerancijom podrazumeva nukleotidna sekvenca iskazana u SEQ ID NO:1 ili 3 i, njene varijante i fragmenti (SEQ ID NO:5, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30 i 32), koja kodira polipeptid glifosatne tolerancije. Slično, "glifosatni polipeptid pronalaska" je polipeptid koji ima amino kiselinsku sekvencu iskazanu u SEQ ID NO: 2 ili 4 i, njegove varijante i fragmenti (SEQ ID N0.6, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31 i 33), koji prenosi glifosatnu toleranciju u ćeliju domaćina.

Plazmidi koji sadrže nukleotidne sekvence pronalaska za glifosatnu toleranciju su deponovane u stalnoj zbirci u Agricultural Research Service Culture Collection, Northern Regional Research Laboratorv (NRRL), 18. novembra 2005. i označene su sa Accession No. NRRL B-30888( grg23)i 26. juna 2006. i označene su sa Accession No. NRRL B-30949( grg51).Ovo deponovanje će se za svrhe patentnog postupka održavati pod uslovima Budimpeštanskog ugovora sa Međunarodnog identifikovanja deponovanih mikroorganizama. Ovo deponovanje je ostvareno jedino kao pogodnost za stručna lica i nije pristup da se deponovanje zahteva pod 35 U.S.C. §112.

Pod "glifosatom" podrazumeva se svaki herbicidni oblik N-fosfonometilglicina (uključujući svaku njegovu so) i drugi oblici koji dovode do produkcije glifosatnog anjonain planta."Herbicidni rezistentni protein" iii protein koji nastaje ekspresijom "molekula nukleinske kiseline koji kodira herbicidnu rezistenciju" obuhvata proteine koji na ćeliju prenose sposobnost tolerancije prema većoj koncentraciji herbicida nego što imaju ćelije koje ne ekspresuju protein, ili da tolerišu izvesnu koncentraciju herbicida za duže vreme u odnosu na ćelije koje ne ekspresuju protein. "Protein glifosatne rezistencije obuhvata protein koji prenosi na ćeliju sposobnost da toleriše više koncentracije glifosata u odnosu na ćelije koje ne ekspresuju protein ili da tolerišu izvesne koncentracije glifosata za duži period vremena u odnosu na ćelije koje ne ekspresuju protein. Pod "toleriše" ili "tolerancija" podrazumeva se ili preživljavanje ili obavljanje esencijalnih ćelijskih funkcija, kao što je proteinska sinteza i respiracija na način koji se još uvek ne razlikuje od netretiranih ćelija.

Izolovani molekuli nukleinske kiseline, i njihove varijante i fragmenti

Jedan aspekat pronalaska se odnosi na izolovane molekule nukleinske kiseline, koji sadrže nukleotidne sekvence, koje kodiraju proteine i polipeptide tolerancije na glifosfat ili njihove biološke aktivne delove, kao i molekule nukleinske kiseline, koji su dovoljni za korišćenje u vidu hibridizacionih proba za identifikovanje nukleinskih kiselina, koje kodiraju toleranciju na glifosfat. Kao što je ovde korišćen, izraz "molekul nukleinske kiseline" je utvrđen kako bi uključio molekule DNK (npr., cDNK ili genomska DNK) i molekule RNK (npr., mRNK) i analoge DNK ili RNK, proizvedene korišćenjem analoga nukleotida. Molekul nukleinske kiseline može biti jedno-lančani ili dvo-lančani.

Nukleotidne sekvence, koje kodiraju proteine ovog pronalaska, uključuju sekvence, koje su navedene u SEQ ID NO.i, 3 i 5, nukleotidne sekvence tolerancije na glifosfat, koje su deponovane u bakterijskom domaćinu, kao Accession Nos. NRRL B-30888 i NRRL B-30949, njihove varijante, fragmente i komplemente. Pod "komplementom" se utvrđuje nukleotidna sekvenca, koja je u dovoljnoj meri komplementarna sa datom nukleotidnom sekvencom, tako da se može hibridizovati u datu nukleotidnu sekvencu, kako bi se, na taj način, obrazovao stabilni dupleks. Odgovarajuća aminokiseiinska sekvenca proteina tolerancije na glifosfat, koju kodiraju ove nukleotidne sekvence, navedena je u SEQ ID NO:2, 4 ili 6. Pronalazak, takođe, obuhvata molekule nukleinske kiseline, koji sadrže nukleotidne sekvence, koje kodiraju proteine tolerancije na glifosfat parcijalne dužine i njihove komplemente.

"Izolovani" ili "prečišćeni" molekul nukleinske kiseline ili protein, ili njihov biološki aktivan deo, je suštinski oslobođen drugog ćelijskog materijala ili medijuma kulture, kada se proizvodi postupcima rekombinovanja, ili je suštinski oslobođen prisustva hemijskih prekursora ili drugih hemikalija, kada se hemijski sintetizuje. Poželjno, "izolovana" nukleinska kiselina je oslobođena sekvenci (poželjno sekvenci,

koje kodiraju protein), koje prirodno zaposedaju nukleinsku kiselinu (t.j., sekvence, koje su locirane na 5' i 3' krajevima nukleinske kiseline) u genomskoj DNK organizma, iz koga je dobijena nukleinska kiselina. Za potrebe pronalaska, izraz "izolovan", kada se koristi da bi se odnosio na molekule nukleinske kiseline, isključuju izolovane hromozome. Na primer, u raznim ostvarenjima, izolovani molekul nukleinske kiseline, koji kodira toleranciju na glifosfat, može sadržavati manje od oko 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0.5 kb ili 0.1 kb nukleotidne sekvence, koja prirodno zaposeda molekul nukleinske kiseline u genomskoj DNK ćelije, iz koje je nukleinska kiselina dobijena. Protein tolerancije na herbicid, koji je suštinski bez ćelijskog materijala, uključuje preparate proteina, koji imaju manje od oko 30%, 20%, 10% ili 5% (prema suvoj težini) proteina bez tolerancije na herbicid (ovde, takođe, označen kao "kontaminirajući protein").

Molekuli nukleinske kiseline, koji su fragmenti ovih nukleotidnih sekvenci, koje kodiraju toleranciju na glifosfat, takođe su obuhvaćeni ovim pronalaskom. Pod "fragmentom" se utvrđuje deo nukleotidne sekvence, koji kodira protein tolerancije na glifosfat. Fragment nukleotidne sekvence može kodirati biološki aktivan deo proteina tolerancije na glifosfat, ili on može biti fragment, koji se, pri korišćenju, dole opisanih, postupaka, može upotrebiti kao hibridizaciona proba ili PCR prajmer. Molekuli nukleinske kiseline, koji su fragmenti nukleotidne sekvence sa tolerancijom na glifosfat sadrže najmanje oko: 15, 20, 50, 75, 100, 200, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1450, 1500, 1550, 1600, 1650, 1700, 1750, 1800, 1850, 1900, 1950 susednih nukleotida, ili sve do broja nukleotida, koji su prisutni u, ovde izloženoj, nukleotidnoj sekvenci pune dužine, sa tolerancijom na glifosfat (na primer, 1892 nukleotida SEQ ID NO:1, 1259 nukleotida SEQ ID NO:3 i 1242 nukleotida SEQ ID NO:5). Pod "susednim" nukleotidima se podrazumevaju nukleotidni ostaci, koji su u neposrednom susedstvu jedan sa drugim.

Fragmenti nukleotidnih sekvenci ovog pronalaska uopšteno će kodirati proteinske fragmente, koji zadržavaju biološku aktivnost proteina tolerancije na glifosfat pune dužine; t.j., aktivnost tolerancije na herbicid. Pod "zadržavanjem aktivnosti tolerancije na herbicid" podrazumeva se da će fragment imati najmanje oko 30%, najmanje oko 50%, najmanje oko 70% ili najmanje oko 80% aktivnosti tolerancije na herbicid, koju poseduju proteini pune dužine sa tolerancijom na glifosfat, koji su, ovde izloženi kao SEQ ID NO:2, 4 ili 6. Postupci za merenje aktivnosti rezistencije na herbicid, dobro su poznati u struci. Vidi, primera radi, U.S. Patent Nos. 4,535,060 i 5,188,642, od kojih je svaki ovde uključen posredstvom reference u svojoj celosti.

Fragment nukleotidne sekvence, koji kodira toleranciju na glifosfat, a koji kodira biološki aktivan deo proteina pronalaska, kodiraće najmanje oko 15, 25, 30, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400 susednih aminokiselina ili sve do ukupnog broja aminokiselina, prisutnih u proteinu pronalaska pune dužine, koji poseduje toleranciju na glifosfat (na primer, 436 aminokiselina za SEQ ID NO:2, 413 aminokiselina za SEQ ID NO:4 i 413 aminokiselina za SEQ ID NO:6).

Proteini ovog pronalaska, koji poseduju toleranciju na glifosfat, kodirani su od strane nukleotidne sekvence, koja je u dovoljnoj meri identična sa nukleotidnom sekvencom sa SEQ ID NO:1, 3 ili 5. Izraz "u dovoljnoj meri identičan" obuhvata aminokiselinsku ili nukleotidnu sekvencu, koja poseduje najmanje oko 60% ili 65% istovetnosti sekvence, oko 70% ili 75% istovetnosti sekvence, oko 80% ili 85% istovetnosti sekvence, oko 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% istovetnosti sekvence, u poređenju sa referentnom sekvencom, kada se koristi jedan od, ovde opisanih, programa slaganja, uz upotrebu standardnih parametara. Lice, stručno u ovoj oblasti, prepoznaće da ove vrednosti mogu biti primereno podešene, kako bi se utvrdila odgovarajuća istovetnost proteina, koje kodiraju dve nukleotidne sekvence, uzimajući u obzir degeneraciju kodona, sličnost aminokiselina, položaj okvira za čitanje, i sličnog.

Da bi se odredio procenat istovetnosti dve aminokiselinske sekvence ili dve nukleinske kiseline, sekvence se izravnavaju za potrebe optimalnog poređenja. Procenat istovetnosti između dve sekvence jeste funkcija broja identičnih položaja, koje dele sekvence (t.j., procenat istovetnosti = broj identičnih položaja/ukupan broj položaja (npr., položaja preklapanja) x 100). U jednom ostvarenju, dve sekvence su iste dužine. Procenat istovetnosti između dve sekvence može se utvrditi korišćenjem postupaka, koji su slični, dole opisanim, sa ili bez dozvoljenih šupljina u slaganju. U izračunavanju procenta istovetnosti, računaju se obično tačna podudaranja.

Određivanje procenta istovetnosti između dve sekvence može se izvesti korišćenjem matematičkog algoritma. Neograničavajući primer matematičkog algoritma, koji je korišćen za poređenje dveju sekvenci jeste algoritam Karlina i Altschula (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268, koji je modifikovan kao u Karlin i Altschul

(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877. Takav algoritam je uključen u BLASTN i BLASTX programe Altschula i saradnika (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410. BLAST pretraživanja nukleotida se mogu izvesti pomoću BLASTN programa, score = 100, vvordlength = 12, da bi se dobile nukleotidne sekvence, koje su homologne sa molekulima nukleinske kiseline pronalaska, sličnim GDC. BLAST pretraživanja proteina mogu se izvršiti BLASTX programom, score = 50, wordlength = 3, da bi se dobile aminokiselinske sekvence, homologne sa proteinskim molekulima pronalaska, sa rezistencijom na herbicid. Kako bi se, za potrebe poređenja, dobila slaganja sa pukotinama, može se koristiti Gapped BLAST, kao što je opisano u Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402. Alternativno, može se koristiti PSI-Blast, da bi se izvelo ponovljeno pretraživanje, koje otkriva udaljene veze među molekulima. Vidi Altschulet al.(1997)supra.Kada se koriste BLAST, Gapped BLAST i PSI-Blast programi, mogu biti upotrebljeni default parametri odgovarajućih programa (npr., BLASTX i BLASTN). Vidi www.ncbi.nim.nih.gov. Drugi ne-ograničavajući primer matematičkog algoritma, koji je korišćen za poređenje sekvenci jeste ClustalVV algoritam (Higgins et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22:4673-4680). ClustalVV upoređuje sekvence i izravnava celinu sekvence aminokiseline ili DNK, tako da se mogu dobiti podaci o očuvanosti sekvence celokupne aminokiselinske sekvence. ClustalVV algoritam se koristi u nekoliko komercijalno dostupnih softverskih paketa za analizu DNK/aminokiselina, kao što je ALIGNX modul Vector NTI Program Suite (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA). Nakon izravnavanja aminokiselinskih sekvenci sa ClustalVV, može se proceniti procenat aminokiselinske istovetnosti. Ne-ograničavajući primer sofverskog programa, koji je korišćen za analizu ClustalVV slaganja jeste GeneDoc™. Genedoc™ (Karl Nicholas) omogućuje procenu sličnosti i identiteta aminokiseline (ili DNK) između više proteina. Drugi ne-ograničavajući primer matematičkog algoritma, koji je korišćen za poređenje sekvenci, jeste algoritam Mversa i Millera (1988) CABIOS 4:11-17. Takav algoritam je ugrađen u ALIGN program (verzija 2.0), koji je deo softverskog paketa za GCG slaganje sekvence (raspoloživ posredstvom Accelrvs, Inc., San Diego, CA). Kod korišćenja ALIGN programa za upoređivanje aminokiselinskih sekvenci, može se upotrebiti PAM120 tabela težine ostatka, kazneni poen za dužinu šupljine od 12 i kazneni poen za šupljinu od 4.

Ukoliko nije drugačije navedeno, biće korišćena GAP verzija 10, koja koristi algoritam Needlemana i VVunscha (1970) J. Mol. Biol. 48(3):443-453, kako bi se utvrdila istovetnost ili sličnost sekvence, korišćenjem sledećih parametara: % istovetnosti i % sličnosti za nukleotidnu sekvencu, koristeći GAP težinu od 50 i težinu dužine od 3, i nwsgapdna.cmp scoring matrix; % istovetnosti i % sličnosti za aminokiselinsku sekvencu, koristeći GAP težinu od 8 i težinu dužine od 2 i BLOSUM62 scoring program. Takođe se mogu koristiti ekvivalentni programi. Pod "ekvivalentnim programom" se podrazumeva bilo koji program upoređivanja sekvenci, koji za bilo koje dve sekvence u ispitivanju, razvija slaganje, koje ima identična podudaranja nukleotidnog ostatka i identičan procenat istovetnosti sekvence, kada se uporedi sa odgovarajućim slaganjem, koje se razvija GAP-om verzije 10.

Pronalazak, takođe, obuhvata molekule varijanti nukleinske kiseline. "Varijante" nukleotidnih sekvenci, koje kodiraju toleranciju na glifosfat, uključuju one sekvence, koje kodiraju, ovde izloženi, protein tolerancije na glifosfat, ali se razlikuju u očuvanosti, zbog degeneracije genetskog koda, kao i one sekvence koje su u dovoljnoj meri identične, kao što je prethodno razmotreno (na primer, SEQ ID NO:5, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30 i 32 i varijante SEQ ID NO:1). Alelske varijante, koje postoje u prirodi, mogu se identifikovati korišćenjem dobro poznatih tehnika molekularne biologije, kao što su lančana polimeraza reakcija (PCR) i postupci hibridizacije, opisani ispod. Varijante nukleotidnih sekvenci, takođe, uključuju sintetski dobijene nukleotidne sekvence, koje su bile proizvedene, primera radi, korišćenjem mutageneze, usmerene ka položaju, ali koje još kodiraju proteine tolerancije na glifosfat, izložene u ovom pronalasku, kao što je razmotreno u nastavku. Proteini varijanti, obuhvaćeni ovim pronalaskom, su biološki aktivni, to jest oni zadržavaju željenu biološku aktivnost nativnog proteina, to jest, aktivnost tolerancije na herbicid. Pod "zadržavanjem aktivnosti tolerancije na glifosfat" podrazumeva se da će varijanta imati najmanje oko 30%, najmanje oko 50%, najmanje oko 70% ili najmanje oko 80% aktivnosti tolerancije na glifosfat nativnog proteina. Postupci merenja aktivnosti rezistencije na herbicid dobro su poznati u struci. Vidi, na primer, U.S. Patent Nos. 4,535,060 i 5,188,642, od kojih je svaki ovde uključen posredstvom reference u svojoj potpunosti.

Vešt stručnjak će, dalje, proceniti da se izmene mogu uvesti putem mutacije u nukleotidne sekvence pronalaska, dovodeći, na taj način, do promena u aminokiselinskoj sekvenci kodiranih proteina tolerancije na glifosfat, bez uticaja na biološku aktivnost proteina. Zbog toga se molekuli varijanti izolovane nukleinske kiseline mogu kreirati uvođenjem jedne ili više nukleotidnih supstitucija, adicija ili delecija u odgovarajuću nukleotidnu sekvencu, koja je ovde izložena, tako da se uvodi jedna ili više aminokiselinskih supstitucija, adicija ili delecija u kodirani protein. Mutacije se mogu uvesti standardnim postupcima, kao što su mutagenzea usmerena ka položaju i mutageneza posredovana PCR-om. Takve varijante nukleotidnih sekvenci isto tako su obuhvaćene ovim pronalaskom.

Na primer, konzervativne aminokiselinske supstitucije se mogu izvesti na jednom ili više predviđenih aminokiselinskih ostataka, koji nisu esencijalni. "Neesencijalni" aminokiselinski ostatak je ostatak, koji se može izmeniti iz sekvence proteina tolerancije na glifosfat divljeg tipa, bez izmene biološke aktivnosti, budući da se za biološku aktivnost zahteva "esencijalni" aminokiselinski ostatak. "Konzervativna aminokiselinska supstitucija" je ona u kojoj se aminokiselinski ostatak zamenjuje aminokiselinskim ostatkom, koji ima sličan bočni lanac. Familije aminokiselinskih ostataka, koji imaju slične bočne lance, definisane su u struci. Ove familije uključuju aminokiseline sa baznim bočnim lancima (npr., lizin, arginin, histidin), kiselim bočnim lancima (npr., asparaginska kiselina, glutaminska kiselina), polarnim bočnim lancima bez naboja (npr., glicin, asparagin, glutamin, serin, treonin, tirozin, cistein), nepolarnim bočnim lancima (npr., alanin, valin, leucin, izoleucin, prolin, fenilalanin, metionin, triptofan), beta-razgranatim bočnim lancima (npr., treonin, valin, izoleucin) i aromatskim bočnim lancima (npr., tirozin, fenilalanin, triptofan, histidin). Supstitucije aminokiselina se mogu izvesti u nekonzervisanim regionima, koji zadržavaju funkciju. Uopšteno, takve supstitucije se ne bi vršile za konzervisane aminokiselinske ostatke, ili za aminokiselinske ostatke, koji se nalaze unutar konzervisanog motiva, pri čemu su takvi ostaci esencijalni za aktivnost proteina. Međutim, stručno lice u ovoj oblasti bi razumelo da funkcionalne varijante mogu posedovati manje konzervisane ili nekonzervisane izmene u konzervisanim ostacima.

Lys-22, Arg-124, Asp-313, Arg-344, Arg-386 i Lys-411 su konzervisani ostaci EPSP sintaze izE. coli(Schonbrunn et al. (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:1376-1380). Konzervisani ostaci, koji su važni za aktivnost EPSP sintaze uključuju, takođe, Arg-100, Asp-242 i Asp-384 (Selvapandiyan et al. (1995) FEBS Letters 374:253-256). Arg-27 se vezuje za S3P (Shuttlevvorth et al. (1999) Biochemistry 38:296-302).

Alternativno, varijante nukleotidnih sekvenci se mogu proizvesti uvođenjem mutacija nasumično duž cele ili parcijalne kodirajuće sekvence, kao na primer saturacionom mutagenezom, a nastalim mutantima se može ispitati sposobnost da daju aktivnost tolerancije na glifosfat, kako bi se identifikovali mutanti, koja zadržavaju aktivnost. Nakon mutageneze, kodirani protein se može ekspresovati rekombinantno, a aktivnost proteina se može odrediti korišćenjem standardnih postupaka testiranja.

Koristeći postupke, kao što su PCR, hibridizacija i slično, mogu se identifikovati odgovarajuće sekvence tolerancije na glifosfat, takve sekvence, koje poseduju suštinsku istovetnost sa sekvencom pronalaska. Vidi, primera radi, Sambrook i Russell (2001) Molecular Cloning: A Laboratorv Manual (Cold Spring Harbor Laboratorv Press, Cold Spring Harbor, NY) i Innis, et al. (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, St. Louis, MO).

U postupku hibridizacije, cela ili delimična nukleotidna sekvenca tolerancije na glifosfat može se koristiti za skriniranje biblioteka cDNK ili genomskih biblioteka. Postupci za konstruisanje takvih biblioteka cDNK i genomskih biblioteka uopšteno su poznati u struci i prikazani su u Sambrook i Russell (2001)supra.Takozvane hibridizacione probe mogu biti genomski DNK fragmenti, cDNK fragmenti, fragmenti RNK ili drugi oligonukleotidi, a mogu se obeležiti detektibilnom grupom, kao što je<32>P ili bilo kojim drugim detektibilnim markerom, kao što su drugi radioizotopi, fluorescentno jedinjenje, enzim ili enzimski ko-faktor. Probe za hibridizaciju mogu biti izrađene obeležavanjem sintetskih oligonukleotida, na bazi poznatih nukleotidnih sekvenci, izloženih ovde, koje kodiraju rezistenciju na glifosfat. Pored toga, mogu se koristiti degenerisani prajmeri, dizajnirani na bazi očuvanih nukleotida ili aminokiselinskih ostataka u nukleotidnoj sekvenci ili kodiranoj aminokiselinskoj sekvenci. Proba obično sadrži region nukleotidne sekvence, koji se hibridizuje pod strogim uslovima, u najmanje oko 12, najmanje oko 25, najmanje oko 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1200, 1400, 1600 ili 1800 uzastopnih nukleotida nukleotidne sekvence(a) pronalaska, koja kodira rezistenciju na glifosfat ili njihovog fragmenta ili varijante. Postupci za izradu proba za hibridizaciju uopšteno su poznati u struci i prikazani su u Sambrook i Russell (2001)suprai Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratorv Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratorv Press, Cold Spring Harbor, NY), od kojih su oba ovde uključena kao reference u svojoj celosti.

Na primer, celokupna, ovde izložena, sekvenca rezistencije na glifosfat ili jedan ili više njenih delova, mogu se upotrebiti kao proba, koja se može specifično hibridizovati u odgovarajuće sekvence rezistencije na herbicid i glasničke RNK. Da bi se postigla specifična hibridizacija pod raznim uslovima, takve probe uključuju sekvence, koje su jedinstvene, a imaju najmanje oko 10 nukleotida po dužini i najmanje oko 20 nukleotida po dužini. Takve probe se mogu koristiti za amplifikovanje odgovarajućih sekvenci tolerancije na glifosfat iz odabranog organizma, pomoću PCR-a. Ovaj postupak se može koristiti za izolovanje dodatnih kodirajućih sekvenci iz željenog organizma ili kao dijagnostički test za utvrđivanje prisustva kodirajućih sekvenci u organizmu. Hibridizacioni postupci uključuju hibridizacioni skrining postavljenih DNK biblioteka (plakovi ili kolonije; vidi, na primer, Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratorv Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratorv Press, Cold Spring Harbor,

NY).

Hibridizacija takvih sekvenci se može izvesti pod strogim uslovima. Pod "strogim uslovima" ili "strogim uslovima hibridizacije" podrazumevaju se uslovi pod kojima će se proba hibridizovati u svoju ciljnu sekvencu, u detektibilno većem stepenu nego u druge sekvence (npr., najmanje 2-puta iznad osnove). Strogi uslovi su zavisni od sekvence i biće različiti u različitim okolnostima. Kontrolisanjem strogosti ustova hibridizacije i/ili ispiranja, mogu se identifikovati ciljne sekvence, koje su 100% komplementarne sa probom (homologni probing). Alternativno, strogost uslova se može podesti, kako bi se dozvolilo izvesno nepodudaranje u sekvencama, tako da se otkrivaju niži stepeni sličnosti (heterologni probing). Uopšteno, proba ima manje od približno 1000 nukleotida po dužini, ili manje od oko 500 nukleotida po dužini.

Uobičajeno, strogi uslovi će biti oni, u kojima je koncentracija soli manja od približno 1.5 M jona Na, obično oko 0.01 do 1.0 M koncentracije Na jona (ili drugih soli), na pH 7.0 do 8.3, a temperatura je najmanje oko 30°C za kratke probe (npr., 10 do 50 nukleotida) i barem oko 60°C za dugačke probe (npr., veće od 50 nukleotida). Strogi uslovi se, isto tako, mogu postići dodavanjem agenasa za destabilizaciju, kao što je formamid. Primeri uslova slabe strogosti uključuju hibridizaciju sa puferskim rastvorom od 30 do 35% formamida, 1M NaCI, 1% SDS (natrijum dodecil sulfat), na 37°C, i ispiranje u 1X do 2X SSC (20X SSC = 3 0 M NaCI/0.3 M trinatrijum citrat), na 50 do 55°C. Primeri uslova umerene strogosti uključuju hibridizaciju u 40 do 45% formamidu, 1M NaCI, 1% SDS, na 37°C, i ispiranje u 0.5X do 1X SSC, na 55 do 60°C. Kao primer, uslovi visoke strogosti uključuju hibridizaciju u 50% formamidu, 1M NaCI, 1% SDS, na 37°C, i ispiranje u 0.1X SSC, na 60 do 65°C. Opciono, puferi za ispiranje mogu sadržavati oko 0.1% do oko 1% SDS. Trajanje hibridizacije je uopšteno kraće od oko 24 sata, uglavnom oko 4 do oko 12 sati.

Specifičnost je obično funkcija post-hibridazacionih ispiranja sa kritičnim faktorima, koji su jonska jačina i temperatura završnog rastvora za ispiranja. Za hibride DNK-DNK, Tmse može aproksimativno odrediti iz jednačine Meinkotha i Wahla (1984) Anal. Biochem. 138:267-284: Tm= 81.5 °C + 16.6 (log M) + 0.41 (%GC) - 0.61 (% form)

- 500/L; gde je M molaritet monovalentnih katjona, %GC je procenat gvanozinskih i

citozinskih nukleotida u DNK, % form je procenat formamida u hibridizacionom rastvoru, a L je dužina hibrida u parovima baza. Tmje temperatura (za definisanu jonsku jačinu i pH), pri kojoj se 50% komplementarne ciljne sekvence hibridizuje u savršeno podudarnu probu. Tmse snižava za oko 1°C za svaki 1% nepodudaranja; tako se mogu podesiti Tm, uslovi hibridizacije i/ili ispiranja, da bi se hibridizovali u sekvence željene istovetnosti. Na primer, ukoliko se traže sekvence sa £90% istovetnosti, Tmse može sniziti za 10°C. Uopšteno, strogi uslovi se biraju tako da budu oko 5°C niži od termičke tačke topljenja (Tm) za specifiču sekvencu i njen komplement, pri definisanoj jonskoj jačini i pH. Međutim, izrazito strogi uslovi mogu koristiti hibridizaciju i/ili ispiranje na 1, 2, 3 ili 4°C nižoj temperaturi od termalne tačke topljenja (Tm); umereno strogi uslovi mogu koristiti hibridizaciju i/ili ispiranje na 6, 7, 8, 9 ili 10°C nižoj temperaturi od termalne tačke topljenja (Tm); slabo strogi uslovi mogu koristiti hibridizaciju i/ili ispiranje na 11, 12, 13, 14, 15 ili 20°C nižoj temperaturi od termalne tačke topljenja (Tm). Koristeći jednačinu, sastave za hibridizaciju i ispiranje i željenu Tm, lica uobičajene stručnosti u ovoj oblasti će razumeti da su varijacije u strogosti hibridizacije i/ili rastvora za ispiranje, u biti opisane. Ukoliko željeni stepen nepodudaranja dovodi do Tm, koja je niža od 45°C (vodeni rastvor) ili 32°C (rastvor formamida), poželjno je da se poveća koncentracija SSC, tako da se može koristiti viša temperatura. Opsežan vodič za hibridizaciju nukleinskih kiselina nalazi se u Tijssen (1993) Laboratorv Techniques in Biochemistrv and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes, Part I, Chapter 2 (Elsevier, New York) i Ausubel et al., eds. (1995) Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 2 (Greene Publishing and Wiley-lnterscience, New York). Vidi, Sambrook et al.

(1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY).

Izolovani proteini i njihove varijante i fragmenti

Proteini tolerancije na glifosfat su, takođe, obuhvaćeni ovim pronalaskom. Pod proteinom tolerancije na glifosfat se utvrđuje protein, koji poseduje aminokiselinsku sekvencu, navedenu u SEQ ID NO:2, 4 ili 6. Takođe su dati njihovi fragmenti, biološki aktivni delovi i varijante, koji mogu biti korišćeni za praktično izvođenje postupaka ovog pronalaska.

"Fragmenti" ili "biološki aktivni delovi" uključuju polipeptidne fragmente, koji sadrže deo aminokiselinske sekvence, koji kodira protein tolerancije na glifosfat, kao što je navedeno u SEQ ID NO:2, 4 ili 6, i koji zadržava aktivnost tolerancije na glifosfat.

Biološki aktivan deo proteina tolerancije na glifosfat, može biti polipeptid, koji ima, primera radi, 10, 25, 50, 100 ili više aminokiselina po dužini. Takvi biološki aktivni delovi mogu biti pripremljeni rekombinantnim postupcima i može im se ispitati aktivnost tolerancije na glifosfat. Postupci merenja aktivnosti rezistencije na herbicid dobro su poznati u struci. Vidi, na primer, U.S. Patent Nos. 4,535,060 i 5,188,642, od kojih je svaki ovde uključen posredstvom reference u svojoj celosti. Fragment, kao što je ovde korišćen, sadrži najmanje 8 susednih aminokiselina SEQ ID NO:2, 4 ili 6. Pronalazak obuhvata druge fragmente, kao što je bilo koji fragment proteina, koji je, međutim, veći od oko 10, 20, 30, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350 ili 400 aminokiselina.

Pod "varijantama" se podrazumevaju proteini ili polipeptidi, koji poseduju aminokiselinsku sekvencu, koja je najmanje oko 60%, 65%, najmanje oko 70%, 75%, najmanje oko 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO:2, 4 ili 6 (na primer, SEQ ID NO:6, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31 i 33 su varijante SEQ ID NO:2). Varijante, takođe, uključuju polipeptide, koje kodira molekul nukleinske kiseline, koji se hibridizuju u molekul nukleinske kiseline SEQ ID NO;1, 3 ili 5, ili njihov komplement, pod strogim uslovima. Varijante uključuju polipeptide, koji se razlikuju u sekvenci aminokiseline, zbog mutageneze. Proteini varijanti, obuhvaćeni ovim pronalaskom, su biološki aktivni, to jest oni nastavljaju sa posedovanjem željene biološke aktivnosti nativnog proteina, to jest, sa zadržavanjem aktivnosti tolerancije na glifosfat. Postupci za merenje aktivnosti rezistencije na herbicid, dobro su poznati u struci. Vidi, primera radi, U.S. Patent Nos. 4,535,060 i 5,188,642, od kojih je svaki ovde uključen kao referenca u svojoj celosti.

Bakterijski geni, kao što jegrg23iligrg51gen ovog pronalaska, veoma često poseduju višestruke metioninske kodone inicijacije u blizini početka okvira otvorenog za čitanje. Često će inicijacija translacije na jednom ili više ovih start kodona, dovesti do proizvodnje funkcionalnog proteina. Ovi start kodoni mogu uključiti ATG kodone. Međutim, bakterije, kao što jeBacillussp., takođe prepoznaju GTG kodon, kao start kodon, a proteini, koji iniciraju translaciju na GTG kodonima sadrže metionin na prvoj aminokiselini. Dalje, često nijea prioriutvrđeno koji od ovih kodona se prirodno koristi u bakteriji. Zbog toga se podrazumeva da upotreba jednog od alternativnih metioninskih kodona može dovesti do proizvodnje varijantigr23iligrg51,koje daju toleranciju na glifosfat. Ovi proteini tolerancije na glifosfat uključeni su u ovaj pronalazak i mogu biti korišćeni u postupcima ovog pronalaska.

Antitela na polipeptide ovog pronalaska, ili na njihove varijante ili fragmenate, takođe su obuhvaćeni. Postupci za proizvodnju antitela dobro su poznati u struci (vidi, na primer, Harlovv i Lane (1988) Antibodies: A Laboratorv Manual (Cold Spring Harbor Laboratorv, Cold Spring Harbor, NY); U.S. Patent No. 4,196,265).

Izmeniene ili poboljšane varijante

Procenjeno je da DNK sekvencagrg23iligrg51može biti izmenjena raznim postupcima, i da te izmene mogu dovesti do sekvenci DNK, koje kodiraju proteine sa aminokiselinskim sekvencama, koje se razlikuju od onih, koje kodirajugrg23iligrg51.Ovaj protein može biti izmenjen na razne načine, koji uključuju aminokiselinske supstitucije, delecije, skraćivanja i umetanja. Postupci za takve manipulacije uopšteno su poznati u struci. Na primer, varijante aminokiselinske sekvence GRG23 ili GRG51 proteina mogu se pripremiti putem mutacija u DNK. Ovo se, takođe, može izvesti pomoću nekoliko oblika mutageneze i/ili usmerene evolucije. U nekim aspektima, izmene, koje su kodirane u aminokiselinskoj sekvenci, suštinski neće uticati na funkciju proteina. Takve varijante će posedovati željenu aktivnost tolerancije na glifosfat. Međutim, podrazumeva se da sposobnost GRG23 ili GRG51 da daje toleranciju na glifosfat može biti poboljšana, korišćenjem takvih postupaka, uz sastave ovog pronalaska. Na primer, GRG23 ili GRG51 se mogu ekspresovati u ćelijama domaćina, koje pokazuju visoke stepene pogrešne ugradnje baze tokom replikacije DNK, kao što je XL-1 Red (Stratagene, La Jolla, CA). Nakon razmnožavanja u ovim sojevima, DNKgrg23iligrg51se može izolovati (na primer izradom plazmidne DNK ili amplifikovanjem PCR-om i kloniranjem nastalog PCR fragmenta u vektoru) i kultivisati u ne-mutagenim sojevima. Klonovi, koji sadrže mutacije ugrg23iligrg51mogu se identifikovati merenjem poboljšane rezistencije na herbicid, kao što je glifosfat, na primer, uzgajanjem ćelija u rastućim koncentracijama glifosfata i ispitivanjem da li klonovi daju toleranciju na rastuće koncentracije glifosfata.

Alternativno, mogu se izvršiti izmene u proteinskoj sekvenci mnogih proteina na amino ili karboksi kraju, bez suštinskog uticaja na aktivnost. Ove promene mogu uključiti: umetanja, delecije ili izmene koje se uvode modernim molekularnim postupcima, kao što je PCR, uključujući PCR amplifikacije, koje menjaju ili produžuju kodirajuću sekvencu proteina, pomoću uključivanja sekvenci, koje kodiraju aminokiselinu u oligonukleotide, koji se koriste u PCR amplifikaciji. Alternativno, dodate proteinske sekvence mogu uključiti celokupne sekvence, koje kodiraju protein, kao što su one, koje se uobičajeno koriste u struci za proizvodnju fuzija proteina. Takve fuzije proteina su često korišćene za (1) povećanje ekspresije proteina od značaja; (2) uvođenje vezujućeg domena, enzimske aktivnosti ili epitopa, da bi se olakšalo prečišćavanje proteina, detekcija proteina ili druge eksperimentalne upotrebe, poznate u struci ili (3) ciljanu sekreciju ili translaciju proteina u subćelijsku organelu, kao što je periplazmatski prostor gram-negativnih bakterija ili endoplazmatski retikulum eukariotskih ćelija, pri čemu ovo poslednje često dovodi do glikozilacije proteina.

Varijante nukleotidnih i aminokiselinskih sekvenci ovog pronalaska, obuhvataju, takođe, sekvence, koje su dobijene iz mutagenih i rekombinantnih postupaka, kao što je mešanje DNK. U ovakvim procedurama, jedan ili više različitih kodirajućih regiona proteina tolerancije na glifosfat, mogu se upotrebiti za kreiranje novog proteina tolerancije na glifosfat, koji poseduje željene karakteristike. Na ovaj način se proizvode biblioteke rekombinantnih polinukleotida iz populacije polinukleotida srodnih sekvenci, koji sadrže regione sekvence, koji poseduju suštinski identitet sekvence i mogu se homologno rekombinovatiin vitroiliin vivo.Primera radi, korišćenjem ovog pristupa, motivi sekvence, koji kodiraju domen od značaja, mogu se izmešati između gena tolerancije na glifosfat iz pronalaska i drugih poznatih gena rezistencije na herbicid, kako bi se dobio novi gen, koji kodira protein sa poboljšanom karakteristikom od značaja, kao što je povećana aktivnost rezistencije na glifosfat. Strategije za takvo mešanje DNK poznate su u struci. Vidi, primera radi, Stemmer

(1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:10747-10751; Stemmer (1994) Nature 370:389-391; Crameri et al. (1997) Nature Biotech. 15:436-438; Moore et al. (1997) J. Mol. Biol. 272:336-347; Zhang et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:4504-4509; Crameri et al. (1998) Nature 391:288-291 i U.S. Patent Nos. 5,605,793 i 5,837,458.

Transformacija bakterijskih ili biljnih ćelija

Ovde su dati novi izolovani geni, koji daju toleranciju na glifosfat. Takođe su obezbeđene aminokiselinske sekvence GRG23 i GRG51 proteina. Protein, koji proističe iz translacije ovog gena, omogućuje ćelijama da funkcionišu u prisustvu koncentracija herbicida, koje se razlikuju od onih koje su toksične za ćelije, uključujući biljne ćelije i bakterijske ćelije. U jednom aspektu pronalaska,grg23iligrg51gen je koristan kao marker za procenu transformacije bakterijskih ili biljnih ćelija.

Izgradnjomgrg23iligrg51da bi (1) bili ekspresovani iz bakterijskog promotera, za koji se zna da stimuliše transkripciju u organizmu, koji se testira, (2) bili pravilno translatovani, kako bi se proizveo intaktni GRG23 ili GRG51 peptid i (3) postavili ćelije u koncentraciju herbicida, koja se razlikuje od one toksične, mogu se identifikovati ćelije, koje su transformisane sa DNK, uz pomoć njihove rezistencije na herbicid. Pod "promoterom" se podrazumeva sekvenca nukleinske kiseline, koja funkcioniše tako da usmerava transkripciju nishodne kodirajuće sekvence. Promoter, zajedno sa ostalim transkripcionim i translacionim regulatornim sekvencama nukleinske kiseline (takođe nazvanim "kontrolne sekvence") neophodan je za ekspresiju DNK sekvence od značaja.

Transformacija bakterijskih ćelija je izvršena uz pomoć jednog ili nekoliko postupaka, poznatih u struci, uključujući, ali bez ograničavanja na njih, elektroporaciju ili hemijsku transformaciju (Vidi, primera radi, Ausubel (ed.) (1994) Current Protocols in Molecular Biologv (John Wiley and Sons, Inc., Indianapolis, IN)). Markeri, koji daju rezistenciju na toksične supstance, korisni su u identifikovanju transformisanih ćelija (koje imaju prihvaćenu i ekspresovanu ispitivanu DNK) iz ne-transformisanih ćelija (onih koje ne sadrže ili ne ekspresuju ispitivanu DNK). U jednom aspektu pronalaska,grg23iligrg51gen je koristan kao marker za procenu transformacije bakterijskih ili biljnih ćelija.

Transformacija biljnih ćelija se može izvesti na sličan način. Pod "biljkom" se podrazumevaju cele biljke, biljni organi (npr., listovi, stabljike, korenje, itd.), semenje, biljne ćelije, organi za razmnožavanje, embrioni i potomstvo iste. Biljne ćelije mogu biti diferentovane ili nediferentovane (npr., kalus, ćelije suspenzione kulture, protoplasti, ćelije lista, ćelije korena, ćelije floema, polen). "Transgenske biljke" ili "transformisane biljke" ili "stabilno, transformisane" biljke, ćelije ili tkiva, odnose se na biljke, koje imaju ugrađene ili integrisane sekvence egzogene nukleinske kiseline ili DNK fragmente u biljnu ćeliju. Pod "stabilnom transformacijom" se podrazumeva da je nukleotidna konstrukcija, uvedena u biljku, integrisana u genom biljke i u stanju je da se nasleđivanjem prenosi na njihovo potomstvo.

grg23iligrg51gen pronalaska može biti modifikovan, da bi se postigla ili pojačala ekspresija u biljnim ćelijama. Sekvence pronalaska sa tolerancijom na glifosfat mogu biti obezbeđene u ekspresionim kasetama za ekspresiju u biljci od značaja. "Ekspresione kasete biljke" uključuju konstrukcije DNK, koje su u stanju da dovedu do ekspresije proteina iz okvira otvorenog za čitanje u biljnoj ćeliji. Kaseta će uključiti u 5'-3' smer transkripcije, region inicijacije transkripcije (t.j., promoter), koji je operativno povezan sa DNK sekvencom pronalaska i translacioni i transkripcioni terminacioni region (t.j., terminacioni region), koji je funkcionalan u biljkama. Kaseta može dodatno sadržavati najmanje jedan dodatni gen, koje bi bio kotransformisan u organizmu, kao što

je gen selektivnog markera. Alternativno, na višestrukim ekspresionim kasetama se mogu dobiti dodatni gen(i). Takva ekspresiona kaseta je obezbeđena sa mnoštvom restriktivnih položaja za umetanje sekvence tolerancije na glifosfat, koja bi bila pod transkripcionom regulacijom regulatornih regiona.

Promoter može biti nativan ili analogan, ili stran ili heterologan biljnom domaćinu i/ili DNK sekvenci pronalaska. Dodatno, promoter može biti prirodna sekvenca ili alternativno, sintetska sekvenca. Kada je promoter "nativan" ili "homologan" biljnom domaćinu, smatra se da se promoter nalazi u nativnoj biljci u koju je promoter uveden. Kada je promoter "stran" ili "heterologan" DNK sekvenci pronalaska, smatra se da promoter nije nativni ili u prirodi postojeći promoter za operativnu povezanu DNK sekvencu pronalaska. "Heterolognost" se uopšteno odnosi na sekvence nukleinske kiseline, koje nisu endogene ćeliji ili delu nativnog genoma, u kome su prisutne, nego su dodate ćeliji putem infekcije, transfekcije, mikroinjekcije, elektroporacije, mikroprojekcije i sličnog. Pod "operativnom povezanošću" se podrazumeva funkcionalna veza između promotera i druge sekvence, pri čemu sekvenca promotera pokreće i posreduje u transkripciji DNK sekvence, koja odgovara drugoj sekvenci. Uopšteno, operativna povezanost znači da su sekvence nukleinske kiseline, koje se povezuju, susedne, a, kada je neophodno da se spoje dva kodirajuća regiona proteina, susedne i u istom okviru za čitanje.

Često će takve konstrukcije, takođe, sadržavati 5' i 3' netranslatovane regione. Takve konstrukcije mogu sadržavati "signalnu sekvencu" ili "vodeću sekvencu" za olakšavanje ko-translacionog ili post-translacionog transporta peptida od značaja do određenih intracelularnih struktura, kao što je hloroplast (ili drugi plastid), endoplazmatski retikulum ili Goldžijev aparat, ili da budu sekretovani. Na primer, gen može biti izgrađen tako da sadrži signalni peptid za olakšavanje transfera peptida u endoplazmatski retikulum. Pod "signalnom sekvencom" se podrazumeva sekvenca, za koju se zna ili se pretpostavlja da dovodi do kotranslacionog ili post-translacionog transporta peptida kroz ćelijsku membranu. U eukariotima, ovaj transport obično uključuje sekreciju u Goldžijev aparat, sa nešto proizvedene glikozilacije. Pod "vodećom sekvencom" se podrazumeva bilo koja sekvenca, koja, kada se translatuje, proizvodi aminokiselinsku sekvencu, koja je dovoljna za pokretanje ko-translacionog transporta peptidnog lanca u sub-ćelijsku organelu. Stoga ovo uključuje vodeće sekvence, koje ciljano deluju na transport i/ili glikozilaciju, prolaskom u endoplazmatski retikulum, prolaskom u vakuole, plastide, koji uključuju hloropiaste, mitohondrije i slično. Biljne

ekspresione kasete, takođe mogu biti izgrađene tako da sadrže intron, tako da je mRNK procesuiranje introna neophodno za ekspresiju.

Pod "3' netranslatovanim regionom" se podrazumeva nukleotidna sekvenca, koja je locirana nishodno od kodirajuće sekvence. Poliadenilacione signalne sekvence i druge sekvence, koje kodiraju regulatorne signale, i koje su u stanju da utiču na dodavanje delova poliadenilne kiseline na 3' kraj prekursora mRNK, su 3' netranslatovani regioni. Pod "5' netranslatovanim regionom" se podrazumeva nukleotidna sekvenca, koja je locirana ushodno od kodirajuće sekvence.

Drugi ushodni ili nishodni netranslatovani elementi uključuju elemente za pojačavanje. Elementi za pojačavanje su nukleotidne sekvence, koje deluju tako da pojačavaju ekspresiju promoterskog regiona. Elementi za pojačavanje su dobro poznati u struci i uključuju, ali bez ograničavanja istima, SV40 region pojačivača i 35S element za pojačavanje.

Terminacioni region može biti prirođen transkripcionom regionu inicijacije, može biti prirođen sekvenci tolerancije na glifosfat ovog pronalaska ili može biti dobijen iz drugog izvora. Pogodni terminacioni regioni su dostupni iz Ti-plazmidaA. tumefaciens,kao što su terminacioni regioni oktopin sintaze i nopalin sintaze. Vidi, takođe, Guerineau et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 262:141-144; Proudfoot (1991) Cell 64:671-674; Sanfacon et al. (1991) Genes Dev. 5:141-149; Mogen et al. (1990) Plant Cell 2.1261-1272; Munroe et al. (1990) Gene 91:151-158; Ballas et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:7891-7903 i Joshi et al. (1987) Nucleic Acid Res. 15:9627-9639.

Kada je to pogodno, gen(i) može biti optimizovan za pojačanu ekspresiju u transformisanoj ćeliji domaćina. To jest, geni mogu biti sintetisani korišćenjem kodona za poboljšanu ekspresiju, koji su poželjni za ćeliju domaćina ili se mogu sintetisati upotrebom kodona sa frekvencijom korišćenja kodona, poželjnom za domaćina. Uopšteno, GC sadržaj gena će biti povećan. Vidi, primera radi, Campbell i Govvri (1990) Plant Phvsiol. 92:1-11 za razmatranje upotrebe kodona, poželjne za domaćina. Postupci su poznati u oblasti sintetisanja gena, poželjnih za domaćina. Vidi, na primer, U.S. Patent Nos. 6,320,100; 6,075,185; 5,380,831 i 5,436,391, U.S. Published Application Nos. 20040005600 i 20010003849 i Murrav et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:477-498, koji su ovde uključeni preko reference.

U jednom ostvarenju, nukleinske kiseline od značaja su ciljano usmerene na hloroplast za ekspresiju. Na ovaj način, kada nukleinska kiselina od značaja nije direktno umetnuta u hloroplast, ekspresiona kaseta će dodatno sadržavati nukleinsku kiselinu, koja kodira preiazni peptid, za usmerevanje genskog proizvoda od značaja u hloroplaste. Takvi preiazni peptidi su poznati u struci. Vidi, primera radi, Von Heijne et al.

(1991) Plant Mol. Biol. Rep. 9:104-126; Clark et al. (1989) J. Biol. Chem. 264:17544-17550; Della-Cioppa et al. (1987) Plant Phvsiol. 84:965-968; Romer et al. (1993) Biochem. Biophvs. Res Commun. 196:1414-1421 i Shah et al. (1986) Science 233:478-481.

Nukleinske kiseline od značaja, koje bi ciljano delovale na hloroplast, mogu biti optimizovane za ekspresiju u hloroplastu, što bi dovelo do razlika u upotrebi kodona između nukleusa biljke i ove organele. Na ovaj način, nukleinske kiseline od značaja mogu biti sintetisane korišćenjem kodona poželjnih za hloroplast. Vidi, primera radi, U.S.

Patent No. 5,380,831, koji je ovde uključen posredstvom reference.

Uobičajeno će "ekspresiona kaseta biljke" biti umetnuta u "transformacioni vektor biljke". Pod "transformacionim vektorom" se podrazumeva molekul DNK, koji je neophodan za efikasnu transformaciju ćelije. Takav molekul može biti sastavljen od jedne ili više ekspresionih kaseta, i može biti organizovan u više nego jednom "vektorskom" molekulu DNK. Na primer, binarni vektori su biljni transformacioni vektori, koji koriste dva DNK vektora, koja nisu susedna, kako bi kodirali sve neophodne cis- i trans-delujuće funkcije za transformaciju biljnih ćelija (Hellens i Mullineaux (2000) Trends in Plant Science 5:446-451). "Vektor" se odnosi na konstrukciju nukleinske kiseline, koja je dizajnirana za prenos između različitih ćelija domaćina. "Ekspresioni vektor" se odnosi na vektor, koji poseduje sposobnost da uključi, integriše i ekspresuje heterologne sekvence ili fragmente DNK u stranoj ćeliji.

Ovaj biljni transformacioni vektor može biti sastavljen od jednog ili više DNK vektora, koji su potrebni da bi se izvršila transformacija biljke. Na primer, uobičajena je praksa u struci da se koriste biljni transformacioni vektori, koji su sastavljeni od više nego jednog susednog segmenta DNK. Ovi vektori se u struci često označavaju kao "binarni vektori". Binarni vektori, kao i vektori sa pomoćnim plazmidima, najčešće se koriste za transformaciju posredovanuAgrobacteriumom,kada je veličina i kompleksnost DNK segmenata, potrebnih za izvođenje efikasne transformacije, veoma velika, a pogodno je da se razdvoje funkcije na zasebnim molekulima DNK. Binarni vektori obično sadrže plazmid vektor, koji sadrži cis-delujuće sekvence, neophodne za T-DNK prenos (kao što je leva granica i desna granica), selektivni marker, koji je izgrađen kako bi se mogao ekspresovati u biljnoj ćeliji, i "gen od značaja" (gen, koji je izgrađen kako bi se mogao ekspresovati u biljnoj ćeliji, za šta je poželjna proizvodnja transgenskih biljaka). Takođe su na ovom plazmid vektoru prisutne sekvence, koje su potrebne za bakterijsku replikaciju. Cis-delujuće sekvence su raspoređene na način, koji omogućuje efikasan prenos u biljne ćelije i ekspresiju u njima. Primera radi, gen selektivnog markera i gen od značaja locirani su između levih i desnih granica. Često drugi plazmid vektor sadrži trans-delujuće faktore, koji posreduju u T-DNK transferu izAgrobacteriumau biljne ćelije. Ovaj plazmid često sadrži funkcije virulentnosti (Vir geni), koji omogućuju infekciju biljnih ćelijaAgrobacteriumom,i prenos DNK otcepljivanjem na graničnim sekvencama i vir-posredovani prenos DNK, kao što se u struci podrazumeva (Hellen i Mullineaux (2000) Trends in Plant Science, 5:446-451). Nekoliko vrsta sojevaAgrobacteriuma(npr. LBA4404, GV3101, EHA101, EHA105, itd.) mogu se upotrebiti za transformaciju biljke. Drugi plazmid vektor nije neophodan za transformisanje biljaka ostalim postupcima, kao što su: mikroprojekcija, mikroinjekcija, elektroporacija, polietilen glikol, itd.

Transformacija biljke

Postupci pronalaska obuhvataju uvođenje nukleotidne konstrukcije u biljku. Pod "uvođenjem" se utvrđuje prisustvo nukleotidne konstrukcije u biljci, na takav način da konstrukcija dobija pristup u unutrašnjost ćelije biljke. Postupci pronalaska ne zahtevaju da se koristi poseban postupak za uvođenje nukleotidne konstrukcije u biljku, jedino da nukleotidna konstrukcija dobije pristup u unutrašnjost najmanje jedne ćelije biljke. Postupci za uvođenje nukleotidnih konstrukcija u biljke su poznati u struci, a uključuju, ali bez ograničavanja na njih, postupke stabilne transformacije, postupke privremene transformacije i postupke posredovane virusom.

Uopšteno, postupci transformacije biljke uključuju prenošenje heterologne DNK u ciljne biljne ćelije (npr., nezreli ili zreli embrioni, suspenzione kulture, nediferentovani kalus, protoplasti, itd.), a zatim primenu maksimalnog nivoa praga pogodne selekcije (u zavisnosti od gena selektivnog markera, a u ovom slučaju "glifosfata"), da bi se ćelije transformisane biljke povratile iz grupe netransformisane ćelijske mase. Eksbiljke se obično prenose na svežu zalihu istog medijuma i kultivišu se rutinski. Nakon toga, transformisane ćelije se diferenciraju u mlade izdanke, posle postavljanja na regenerativni medijum, koji je nadopunjen maksimalnim nivoom praga selektivnog agensa (npr. "glifosfat"). Mladice se zatim prenose u selektivni medijum za ukorenjivanje, za obnavljanje ukorenjene mladice ili mlade biljke. Transgenska biljčica je, potom, izrasla u zrele biljke i proizvela fertilno semenje (npr. Hiei et al. (1994) The Plant Journal 6:271-282; Ishida et al. (1996) Nature Biotechnologv 14:745-750). Eksbiljke se obično prenose na svežu zalihu istog medtjuma i kultivišu se rutinski. Opšti opis procedura i postupaka za proizvodnju transgenskih biljaka nalazi se u Ayres i Park

(1994) Critical Reviews in Plant Science 13:219-239 i Bommineni i Jauhar (1997) Mavdica 42:107-120. Budući da transformisani materijal sadrži mnogo ćelija; obe i transformisane i ne-transformisane ćelije su prisutne u bilo kom delu izloženog ciljnog kalusa ili tkiva ili grupe ćelija. Sposobnost uništavanja ne-transformisanih ćelija i omogućavanje transformisanim ćelijama da proliferišu, dovodi do kultura transformisane biljke. Često je sposobnost da se uklone ne-transformisane ćelije ograničenje brzom obnavljanju transformisanih biljnih ćelija i uspešnoj proizvodnji transgenskih biljaka. Mogu se koristiti molekularni i biohemijski postupci za potvrdu prisustva integrisanog heterolognog gena od značaja u genomu transgenske biljke.

Proizvodnja transgenskih biljaka se može izvesti pomoću jednog ili nekoliko postupaka, koji uključuju, ali se istima ne ograničavaju, uvođenje heterologne DNK uz pomoćAgrobacteriumau biljne ćelije (transformacija posredovana Agrobacteriumom), bombardovanje biljnih ćelija heterolognom stranom DNK, koja je adherirana na čestice, i raznim drugim direktno-posredovanim postupcima bez čestica (npr. Hiei et al. (1994) The Plant Journal 6:271-282; Ishida et al. (1996) Nature Biotechnology 14:745-750; Ayres i Park (1994) Critical Revievvs in Plant Science 13:219-239; Bommineni i Jauhar

(1997) Mavdica 42:107-120), da bi se prenela DNK.

Postupci za transformisanje hloroplasta poznati su u struci. Vidi, na primer, Svab et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:8526-8530; Svab i Maliga (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:913-917; Svab i Maliga (1993) EMBO J. 12:601-606. Postupak se oslanja na oslobađanje DNK čestičnim pištoljem, uz prisustvo selektivnog markera i ciljano usmeravanje DNK na genom plastida posredstvom homologne rekombinacije. Dodatno, transformacija plastida se može izvesti transaktivacijom tihog transgena, koji je nosio plazmid, uz pomoć tkivno-poželjne ekspresije nuklearno-kodirane i plastidno-usmerene RNK polimeraze. Takav sistem je izložen u McBride et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:7301-7305.

Ćelije, koje su bile transformisane, mogle su se razviti u biljke u skladu sa konvencionalnim načinima. Vidi, primera radi, McCormick et al. (1986) Plant Cell Reports 5:81-84. Ove biljke su zatim mogle biti uzgojene i oprašene ili istim transformisanim sojem ili različitim sojevima, i identifikovan je proistekli hibrid, koji je posedovao konstitutivnu ekspresiju željenih fenotipskih karakteristika. Mogle su se

uzgajati dve ili više generacija, da bi se obezbedilo da se ekspresija željenih fenotipskih karakteristika stabilno održava i nasleđuje, a zatim je prikupljeno semenje, kako bi se osiguralo da je izvršena ekspresija željenih fenotipskih karakteristika. Na ovaj način, tekući pronalazak obezbeđuje transformisano seme (takođe označeno kao "transgensko seme"), koje poseduje nukleotidnu konstrukciju pronalaska, na primer, ekspresionu kasetu pronalaska, stabilno ugrađenu u njihov genom.

Merenje EPSPS aktivnosti

U jednom ostvarenju pronalaska, EPSPS enzim tolerancije na glifosfat ima Kmza fosfoenolpiruvat (PEP) između oko 1 i oko 150uM, uključujući oko 2 uM, oko 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130 ili oko 140 uM, i K, (glifosfat)/Km(PEP) između otprilike 500 i oko 1000, oko 550, oko 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950 ili sve do približno 1000. Kmi K, kao što su ovde korišćene, merene su pod uslovima, u kojim enzim prati Michaelis-Menten kinetiku, oko pH 7. Jedan neograničavajući postupak merenja koristi enzim u prečišćenom obliku u kalijum hloridu i HEPES puferu na pH 7, na sobnoj temperaturi i koristi koncentracije glifosfata od 0 do 10 mM.

Kinetička aktivnost EPSPS se može ispitati, primera radi, merenjem oslobađanja fosfata, koje se dešava tokom katalize supstrata EPSPS (na primer, PEP i S3P) u njegov naredni reakcioni proizvod (na primer, 5-enolpiruvil-3-fosfošikimi kiselinu), koristeći fluorescentni test, koji su opisali Vazquez et al. (2003). Anal. Biochem. 320(2):292-298. Ovaj test je baziran na oksidaciji ne-fluorescentnog jedinjenja A/-acetil-3,7-dihidroksifenoksacina (Amplex<®>Red, Invitrogen, Carlsbad, CA) u fluorescentno jedinjenje resorufin, sa vodonik peroksidom (Zhou i Panchuk-Voloshina (1997) Anal. Biochem. 253:169-174). Reakcija se oslanja na korišćenje fosfata od strane purin nukleozid fosforilaze (PNP), ksantin oksidaze (XOD) i peroksidaze rena (HRP). Oslobađanje fosfata je povezano sa nivoom fluorescencije, koja proizlazi iz konverzije Amplex<®>Red-a u resorufin. Fluorescencija se može izmeriti korišćenjem, primera radi, filter fluorometra, čitača ploča, spektrofluorometra, spektrofotometra ili slično, koristeći postupke, koji su u struci dobro poznati. Fluorescencija, proizvedena reakcijom, može se detektovati koristeći podešavanje fluorometra na ekscitaciju u rasponu od oko 530 do oko 560 nm i emisiju od oko 590 nm. Apsorbancija se može meriti (primera radi, koristeći spektrofotometar ili čitač ploča) na oko 565 nm.

U jednom ostvarenju, ovaj pronalazak obuhvata izmene, prethodno izloženih, uslova testa, da bi se proširio dinamički raspon testa, za prilagođivanje šireg raspona koncentracija supstrata. Izmena uključuje koncentraciju XOD od najmanje 1 IJ/ml, oko 1 do oko 1.25 IJ/ml, oko 1.25 do oko 1.5 I J/ml, oko 1.5 do oko 2 IJ/ml ili veću od 2 IJ/ml; koncentraciju PNP veću od 0.1 IJ/ml, oko 0.1 do oko 0.5 IJ/ml, oko 0.5 do oko 1 IJ/ml, oko 1 do oko 1.5 IJ/ml, oko 1.5 do oko 2 IJ/ml ili veću od 2 IJ/ml i koncentraciju Amplex<®>Red-a veću od 100 uM, oko 100 do oko 200 uM, oko 200 do oko 300 uM, oko 300 do oko 400 uM, oko 400 do oko 500 uM, oko 500 do oko 600 uM, oko 700 do oko 800 uM, oko 800 do oko 900 uM, oko 900 do oko 1000 uM ili veću od oko 1000 uM. Ova modifikacija se može primeniti na testove merenja kinetičke aktivnosti bilo kog enzima, u kome se oslobađa fosfat, tokom reakcije, katalizirane od strane enzima.

Biljke

Ovaj pronalazak se može koristiti za transformisanje bilo kog biljnog speciesa, uključujući, ali bez ograničavanja na njih, monokotiledone i dikotiledone. Primeri biljaka od značaja uključuju, ali se njima ne ograničavanja, kukuruz, sirak, pšenicu, suncokret, paradajz, krstašice, papričice, krompir, pamuk, pirinač, soju, šećernu repu, šećernu trsku, duvan, ječam i uljanu repicu,Brassicasp., lucerku, raž, proso, šafraniku, kikiriki, slatki krompir, kasavu, kafu, kokos, ananas, stabla limuna, kakao, čaj, bananu, avokado, smokvu, guavu, mango, maslinu, papaju, indijski oraščić, makadamiju, badem, zob, povrće, ukrasno bilje i četinare.

Povrće uključuje, ali se njima ne ograničava, paradajz, salatu, zeleni pasulj, lima pasulj, grašak i članove rodaCurcumis,kao što je krastavac, krastava dinja i lubenica. Ukrasno bilje uključuje, ali bez ograničavanja, azaleju, hortenziju, hibiskus, ruže, lale, narcise, petunije, karanfil, mlečiku i hrizantemu. Poželjno, biljke ovog pronalaska su biljke useva (na primer, kukuruz, sirak, pšenica, suncokret, paradajz, krstašice, papričice, krompir, pamuk, pirinač, soja, šećerna repa, šećerna trska, duvan, ječam, uljana repica, itd.).

Ovaj pronalazak je posebno pogodan za bilo kog člana biljne familije monokotiledona, koji uključuju, ali se istima ne ograničavaju, kukuruz, rižu, ječam, zob, pšenicu, sirak, raž, šećernu trsku, ananas, konoplju, luk, bananu, kokos i datule.

Procena transformacije biljke

Nakon uvođenja heterologne strane DNK u biljne ćelije, transformacija ili integrisanje heterolognog gena u genom biljke potvrđeno je raznim postupcima, kao što su analize nukleinskih kiselina, proteina i metabolita, povezanih sa integrisanim genom.

PCR analiza je brzi postupak za ispitivanje prisustva inkorporiranog gena u transformisanim ćelijama, tkivu ili mladicama u ranijem stadijumu pre presađivanja u zemljište (Sambrook i Russell (2001) Molecular Cloning: A Laboratorv Manual (Cold Spring Harbor Laboratorv Press, Cold Spring Harbor, NY)). PCR je izveden uz korišćenje oligonukleotidnih prajmera, koji su specifični za gen od značaja ili pozadinskog vektoraAgrobacteriuma.

Transformacija biljke se može potvrditi Southern blot analizom genomske DNK (Sambrook i Russell (2001)supra).Uopšteno, ukupna DNK se ekstrahuje iz transformisane ćelije, svari se pogodnim restriktivnim enzimima, frakcioniše na agaroza gelu i prenosi na nitroceluloznu ili najlonsku membranu. Membrana ili "blot" mogu, zatim, biti ispitani sa, primera radi, radioobeleženim<32>P ciljanim fragmentom DNK, kako bi se potvrdila integrisanost uvedenog gena u genom biljke, u skladu sa standardnim postupcima (Sambrook i Russell, 2001,supra).

U Northern analizi, RNK se izoluje iz specifičnih tkiva transformisanih organizama, frakcioniše se u formaldehidnom agaroza gelu i nanosi u vidu mrlje na najlonski filter, u skladu sa standardnim postupcima, koji se rutinski koriste u struci (Sambrook i Russell (2001)supra).Zatim se ispituje ekspresija RNK, kodirane od stranegrg23iligrg51,pomoću hibridizacije filtera sa radioaktivnom probom, dobijenom iz GDC, postupcima, poznatim u struci (Sambrook i Russell (2001)supra).

VVestern blot, biohemijske analize i slično, mogu se izvesti na transgenskim biljkama, kako bi se utvrdilo prisustvo proteina, kodiranog od strane gena rezistencije na herbicid, pomoću standardnih postupaka (Sambrook i Russell (2001)supra),uz korišćenje antitela, koja se vezuju za jedan ili više epitopa, koji su prisutni na proteinu rezistencije na herbicid.

Sledeći primeri su dati kao ilustracija, a ne kao ograničenje.

OGLEDNI DEO

Primer 1: Izolacija ATX21308

ATX21308 je izolovan postavljanjem zemljanih uzoraka na Enriched Minimal Media 3 (EMM3) koji sadrži fosfate i 50 mM glifosata. Kako EMM3 ne sadrži aromatične amino kiseline, soj mora biti rezistentan na glifosat kako bi rastao na ovom medijumu.

Otprilike jedan gram zemlje se suspenduje u otprilike 10ml vode i promeša se na vorteks mikseru tokom 5 sekundi. 100^1 ove suspenzije se doda u 1ml EMM3 sa fosfatom, ali bez glifosata. EMM3 sadrži (po litri, pH 7.0): 10g saharoze, 1g NH4CI, 0,2g MgS047H20, 0,01g FeS04 7H20, 0,007g MnS04H20 i 10ml rastvora fosfata koji sadrži (po litru, pH 7.0) 21 Og Na2HP04i 90g NaH2P04. Kultura se mućka na roler-valjku za kulture tkiva, na 21°C preko noći i onda se postavlja na EMM3 agar koji sadrži 50 mM glifosata. Posle tri dana, izolat se postavlja na Luria Bertani (LB) agar da bi se potvrdila pojedinačna morfologija. Nakon šest dana, pojedinačna kolonija se zaseje na EMM3 agar koji sadrži 50 mM glifosata. Izolat preko noći raste na 50 mM glifosatnim pločama. Jedan naročiti soj, označen kao ATX21308, izdvojen je zahvaljujući svojoj sposobnosti da raste u prisustvu visokih koncentracija glifosata. Ovaj soj je testiran na svoju sposobnost da raste u prisustvu glifosata u tečnoj kulturi i može da raste do otprilike 300 mM glifosata u uslovima testa.

Primer 2. Proizvodnja i skrining kozmidnih biblioteka

Ukupna DNK je izolovana iz kulture ATX21308 korišćenjem postupaka koji su uobičajeni i poznati u struci. DNK je bila podvrgnuta delimičnoj digestiji sa restrikcionim enzimomSau3A1i vezana sa SuperCos (Stratagene) fragmentom vektora prema uputstvima proizvođača. Proizvodi povezivanja su spakovani u fagne čestice upotrebom GigaPack III XL ekstrakta za pakovanje (Stratagene), transfektovani u ćelijeE. colii, postavljeni na LB Agar koji sadrži 50 (.ig/ml kanamicina da bi se izdvojile kolonije koje sadrže kozrnide.

Pojedinačne kolonije su sakupljene u ploče sa 384 reakciona mesta, koje sadrže LB čorbu i 50 ng/ml kanamicina i, uzgojene su do zasićenja. Ćelije iz ovih kultura su razblažene 1:10, zatim su pinovane na ploče sa M63 agarom, koje sadrže 50^g/ml kanamicina i, bilo 0 mM, 10 mM, 20 mM ili 50 mM glifosata. [M63 agarni medijum 100 mM KH2P04, 15 mM (NH4)2S04, 50^iM CaCI2, 1\ xMFeS04, 50 uM MgCI2, 55 mM glukoze, 25 mg/litru L-proilna, 10 mg/litru tiamin HCI, dovoljno NaOH da bi se podesio pH na 7.0 i 15 g/litar agara]. Transformanti, koji mnogo brže rastu pri višim koncentracijama glifosata su izolovani i podvrgnuti digestiji sa restrikcionim enzimomEcoRI da bi se identifikovali kozmidi sa podeljenim restrikcionim profilima. Identifikovana je nekolicina klonova, koja raste u prisustvu glifosata i deli sličniEcoRI restrikcioni profil. Jedan od ovih kozmidnih klonova, pAX1924 je izdvojen za dalje eksperimente.

Primer 3. Identifikacijagrp23u kozmidnom pAX1924

Da bi se identifikovao gen(i) odgovoran za glifosatnu rezistenciju koju pokazuje kozmid pAX1924, DNK iz ovog klona je mutagenizovana sa promenjivim elementima. U ovom postupku su identifikovani klonovi koji su pretrpeli premeštanje umetanja i izgubili mogućnost prenošenja glifosatne rezistencije. Lokacija premeštenih umetanja utvrđuje okvir otvorenog čitanja, koji je odgovoran za fenotip glifosatne rezistencije.

Kozmid pAX1924 je podvrgnutin vitromutagenezi premeštanja korišćenjem EZ::TN reagens kompleta za umetanje (Epicentre, Madison, Wl) u skladu sa protokolom proizvođača. Ovaj postupak nasumično umeće premeštajne fragmente u kozmid DNK i na taj način nasumično prekida funkciju gena u kozmidu. Ovaj naročiti premeštaj sadrži gen koji kodira rezistenciju na trimetoprim, pa tako klonovi sa premeštajnim umetanjem mogu biti odabrani putem sposobnosti da rastu u prisustvu antibiotika. Lokacije premeštajnih umetanja se mogu odrediti mapiranjem restrikcionih fragmenata ili sekvencioniranjem sa prajmerima koji očvršćavaju pri premeštanju. Klonovi pAX1924 koji su sa premeštajnim umetanjem postavljaju se na M63 medijum koji sadrži glifosat. Prepoznaju se klonovi koji sadrže višestruko premeštanje, koji su izgubili sposobnost da rastu u prisustvu glifosata, što ukazuje na to da je premeštanje prekinulo gen, koji je odgovoran za rezistenciju.

Određuje se DNK sekvenca za region pAX1924 koji sadrži premeštajna umetanja, upotrebom sekvencionih postupaka, koji su dobro poznati u struci. Upotrebom ove sekvencione informacije, sintetišu se DNK prajmeri i koriste za određivanje DNK sekvence u pAX1924, u regionu koji obuhvata premeštajna umetanja. Analiza nastale DNK sekvence pokazuje da ovaj region sadrži jedan gen. Ovaj gen je označen ovde kaogrg23.Analizagrg23pokazuje da on može dati dva moguća proteina u bakterijskim ćelijama zahvaljujući prisustvu moćnih izmenjenih translacionih startnih položaja. Prvi ORF (ORF1) započinje sa GTG startnim kodonom na položajima 109-111 u SEQ ID N0:1 i završava sa TAG stop kodonom pri nukleotidima 1417-1419 u SEQ ID NO:1. Drugi ORF (ORF2) započinje sa ATG startnim kodonom sa nukleotidima 178-180 u SEQ ID NO:1 i završava sa TAG stop kodonom pri nukleotidima 1417-1419 u SEQ ID NO:1. Translacija ORF1 daje amino kiselinsku sekvencu iskazanu u SEQ ID NO:2. Translacija ORF2 daje amino kiselinsku sekvencu iskazanu u SEQ ID NO:4.

Analiza DNK regiona koji okružujegrg23sugeriše da ORF2 prethodi vezujuće mesto ribozoma, dok nema očiglednog vezujućeg mesta ribozoma koje prethodi ORF1 transacionom startu. Sem toga, preklapanje oba okvira otvorenog čitanja sa reprezentativnim EPSPS enzimima pokazuje da nekolicina EPSPS enzima sadrži ovu N-terminalnu ekstenziju koja se kodira u okviru ORF1. Zbog toga, funkcionalna ORF koju kodiragrg23u bakteriji jeste ORF2. Zato, kako je ovde korišćen, GRG23 se odnosi na one koje kodira ORF2 (nukleotidi 178-1419 u SEQ ID NO:1). Pored toga, dobro je poznato u struci da su EPSPS enzimi prilično tolerantni na dodatne amino kiseline u svom N-terminusu. Zbog toga, ekspresija ORF1 (nukleotidi 109-1419 u SEQ ID NO:1) bi takođe trebalo da da EPSPS koje prenose glifosatnu rezistenciju.

Da bi se ispitala mogućnost ORF2 da funkcioniše kao EPSPS i prenosi rezistenciju na glifosat u ćelije, ovaj okvir otvorenog čitanja se može subklonirati i ekspresovati uE. coli.

Primer 4. Subkloniranjeqrg23u vektore za ekspresiju uE . coli .

Gen koji kodira GRG23 ORF2 (koji počinje sa ATG (položaji 178-180 u SEQ ID NO:1), ekspresujući protein sa 413 amino kiselina) je subkloniran u pUC 18 i pRSFIb korišćenjem iste strategije kloniranja, koja gore navedena. PCR prajmer [5' CAGGGATCCGGCATGGAAACTGATCGACTAGTG 3'] je sintetisan da dodajeBamtflmesto koje sledi GGC (5-GGATCCGGC-3') neposredno 5' startnog položaja. Drugi prajmer je sintetisan [5' ATTGGCGCGCCCTAGCCGGGGAGCGTAAG 3'] koji dodajeAsc\mesto neposredno 3' u stop sekvenci (5'-GGCGCGCC-3').grg23kodirajući region se amplifikuje PCR-om upotrebom PFUULTRA™ DNK polimeraze (Stratagene). Nakon PCR amplifikacijegrg23korišćenjem ovih prajmera i restrikcione digestije saBamH \/ Asc\,PCR proizvod se povezuje u pUC 19 (podvrgnut digestiji saBamHI iAsc\)i pRSFIb (podvrgnut digestiji saBamHI iAsc\)i, dobijaju se kolonije koje sadrže umetanja.pUC1 8- grg23klon (ovde označen kao pAX1927) je potvrđen restrikcionom digestijom i DNK sekvencioniranjem.

Slično, ekspresioni vektor pAX1909 je podvrgnut digestiji saBamHI iAsc\i vektor koji je sadržavao fragment, podvrgnut je gel-prečišćavanju dobro poznatim postupcima u struci. pAX1909 je derivat PRSF-1b (Novagen, San Diego, CA), modifikovan da sadržiBamH\mesto direktno 3' u regionu koji kodira histidinom bogat "His-Tag". Zato su proteini, koji su klonirani u pAX1909 fuzije u-okviru, koje sadrže dodatne amino kiseline MAHHHHHHGSG. Vektori, kao pAX1909 se obično razvijaju za proteinsku ekspresiju i prečišćavanje i, ovi su postupci dobro poznati u struci.

PCR proizvodi podvrgnuti digestiji koji su prethodno nastali se spajaju u pAX1909 vektor podvrgnut digestiji i dobijaju se kolonije koje sadrže umetanja.pAX1 909- grg23klon(ovde označen kao pAX1926) je potvrđen restrikcionom digestijom i DNK sekvencioniranjem. Način izgradnje pAX1926 je takav da predviđeni GRG23 proizvod translacije sadrži amino-terminalnu ekstenziju sadržanu Ova N-terminalna ekstenzija sadrži 'histidinski tag' ili 'šesto histidinski tag' koji je koristan za olakšavanje prečišćavanja GRG23 proteina, kao što je dobro poznato u struci.

Plazmid pAX1926 koji sadržigrg23ORF2 je deponovan 18. novembra 2005. u Poljoprivrednom istraživačkom servisu zbirki kultura (NRRL) i označen je kao Accession No. NRRL B-30888.

Primer5. Qrq23prenosi rezistenciju prema visokim nivoima glifosata

pUC18-Grg23 konstrukcija (pAX1927) je transformisana uE. coli sojDH5a i postavljena na ploče sa LB agarom koje su obogaćene sa karbenicilinom (0.1 mg/mL). Izdvojene su dve kolonije, resuspendovane u sterilnoj vodi i išarane po M63 pločama koje sadrže ili 0 mM, 25 mM, 50 mM ili 100 mM glifosata. Na ploče je, takođe dodat i izopropil-B-D-tiogalaktopiranozid (IPTG; 0.1 mM). Kao kontrola, ćelije koje sadrže sam pUC 18 vektor su transformisane i išarane po pločama sa glifosatom. Slede 2 dana rasta, a zatim, ove se ploče ispituju na rast (Tabela 1).

Ovaj rezultat potvrđuje da ekspresijagrg23u smislu proizvodnje GRG23-ORF2 prenosi glifosatnu rezistenciju uE. colido najmanje 100 mM. Sem toga, rast £.colikoja sadrži pAX1927 je jači u prisustvu glifosata nego u njegovom odsustvu.

Primer 6. Homologiia GRG23 sa drugim proteinima

Izvedena amino kiselinska sekvenca GRG23 ima homologiju sa EPSPS enzimima, ukazujući dagrg23kodira EPSPS.

Ispitivanja izvedene amino kiselinske sekvence GRG-ORF2 (SEQ ID NO.4) otkrivaju da ona ne sadrži četiri domena tipična za Klasu II EPSPS enzima. Zato je to novi, EPSPS sa rezistencijom na glifosat, koji ne pripada Klasi II.

Pretražujući javno dostupnu proteinsku bazu podataka, kao što je SVVISSPROT, otkriva se da GRG23 ima amino kiselinsku sličnost sa širokom grupom EPSPS enzima. Ipak, ni jedan protein ni u jednoj bazi podataka nije više od 50% identičan sa GRG23 amino kiselinskom sekvencom. Na Slici 1 je prikazano reprezentativno preklapanje GRG23 sa ostalim EPSPS enzimima.

Primer 7. Prečišćavanje GRG23

KonstrukcijapRSF1b-gn?23(pAX1926) je ekspresovana uE. colišto sledi indukcija sa IPTG i prečišćavanje u jednom koraku upotrebom kobaltne hromatografske kolone, kako je u struci poznato. Nakon eluacije kolone, prečišćeni GRG23 je dijalizovan prema 50 mM HEPES/100 mM KCI, pH 7.0. Protein je više od 95% bio čist ispitivanjem sa PAGE. Količina GRG23 je izmerena upotrebom Bradford postupka, koji je isto dobro poznat u struci (Bradford (1976) Anal. Biochem. 72:248-254).

Primer 8. Kinetički testovi GRG23 aktivnosti.

Uzorci prečišćenih proteina su testirani na EPSPS aktivnost upotrebom kinetičkog testa koji uključuje inkubaciju PEP (Sigma, St. Louis, MO) i S3P u puferu koji sadrži kalijum hlorid i HEPES na pH 7.0. Oslobađanje fosfata je detektovano korišćenjem spojenog testa za fluorescentnu detekciju fosfata na bazi stvaranja Amplex crvenog, kako je poznato u struci (Vazquez et al. (2003) Anal. Biochem. 320:292-298).

Publikovani uslovi testa mogu dovesti do zasićenja testa u ogledima gde se fosfat oslobađa veoma brzo. Ovo zasićenje nekako ograničava dinamički opseg testa i zahteva definisanje opsega enzimske koncentracije. Određeno je da je kinetičko ograničenje fluorescentnog fosfatnog testa prividno zbog kombinacije faktora, uključiv ograničenje inozina i PNP. U ovom pronalasku, uslovi testa su razvijeni da pruže suštinski unapređen dinamički opseg i omoguće upotrebu šireg opsega koncentracija enzima i supstrata. Uslovi testa koji su značajnije izmenjeni uključuju koncentracije purin nukleozidne fosforilaze (PNP), ksantin oksidaze (XOD), AMPLEX®Red i inozina, kojima je svima bila povećana koncentracija u testu da bi se prilagodile velikim brzinama fosfatnog turnovera. Ovaj test je adaptiran za korišćenje u merenju EPSPS aktivnosti u formatu 96 reakcionih mesta sa sledećim poboljšanjima:

Enzimatski testovi su izvedeni u pločama sa 96 reakcionih mesta, u ukupnoj zapremini od 50 ?). Reakcije su izvedene na sobnoj temperaturi, na pH 7.0. Sve komponente testa, sem PEP, EPSPS i S3P su sjedinjene u Master Mix-u i alikvoti preneseni u ploče sa 96 reakcionih mesta upotrebom multi kanalne pipete. Zatim su dodate odgovarajuće koncentracije PEP u svako reakciono mesto. Pripremljena su sveža razblaženja EPSPS i dodata su u odgovarajuća reakciona mesta. Svaki test je indikovan dodavanjem S3P.

Formirana je kriva od podataka o brzini i određeni su kinetički parametri Kmi Kcatkorišćenjem primenjene Michaelis-Mentenove jednačine, upotrebom fit programa sa ne-lineamom krivom (KALEIDAGRAPH®, Synergy Sofware). Podaci o Ki su određeni merenjem Km(app) pri višestrukim koncentracijama glifosata i postavljanjem Km(app) na krivu kao funkcije inhibitorne koncentracije.

Postavljanjem Km(app) na krivu kao funkcije koncentracije glifosata, može se dobiti linearno predstavljena rezistencija GRG23 na glifosat. Odsečak X dobijene krive predstavlja -Ki. Postavljanje ove krive sa podacima prikazanim u Tabeli 3 daje sledeće podatke:

GRG23 je visoko rezistentan na glifosat, sa Ki od preko 9mM i, Ki/Km odnosom preko 800.

Primer 9. Izolacija ATX21313

Za soj ATX21313, otprilike je suspendovan gram zemlje u 10 ml vode i, 100\ i\je upotrebljeno za inkubaciju 1 ml kulture medijuma A sa mineralnim solima (MSMA) i bez glifosata. MSMA sadrži (po 1 litru, pH 7.0) 1 g NH4CI, 10 g saharoze, 0.2 g MgS04•7H20, 0.01 g FeS04 7H20, 0.007 g MnSCyH20 i obogaćen je fosfatima. Posle inkubacije preko noći, kultura je postavljena na čvrsti medijum koji sadrži MSMA i 50 mM glifosata, inkubirana nekoliko dana i inokulisana u Luria Bertani agarne ploče da bi se potvrdio jedini tip kolonije. Rast u prisustvu 50 mM glifosata je ponovo potvrđen ponovnim rastom na MSMA, 50 mM agarnim pločama. Ovaj postupak izolacije je proizveo soj ATX21313, koji je mogao da dobro raste raste pod ovim uslovima.

Primer 10. Kloniranje glifosat- rezistentnih EPSP sintaza

Genomska DNK je ekstrahovana iz soja ATX21313 i dobijena DNK je podvrgnuta delimičnoj digestiji sa restrikcionim enzimomSau3A1 da bi se dobili DNK fragmenti veličine otprilike 5 kilobaza. Ovi DNK molekuli su izdvojeni prema veličini na agaroznom gelu, prečišćeni i povezani u LAMBDA ZAP® vektorske krake koji su prethodno podvrgnuti digestiji saBamH\.Spojeni kraci su onda upakovani u fagne čestice, a titar faga je određen kako je poznato u struci. Nastale biblioteke su amplifikovane poznatim postupcima kako bi se stvorio titar biblioteke između 3x10<7>i 3x10<8>PFU/mL. Za svaku nezavisnu biblioteku,E. coli(XL1 Blue MRF') je onda ko-transfektovana sa fagom iz amplifikovane biblioteke kao i u M13 helper fag da bi se omogućilo maseno isecanje biblioteke u obliku infektujuće, cirkularne ssDNK, kako je poznato u struci (Short et al. (1988) Nucleic Acids Research 16:7583-7600). Nakon centrifugiranja ko-infektovanih ćelija, supernatant koji sadrži fag je grejan na 65-70°C tokom 15-20 minuta kako bi se onesposobila svaka zaostala lambda fagna čestica. Razblaženja nastalih ssDNK plazmidnih biblioteka su transfektovana u svežu kulturu kompetentnihE. coliXL1 Blue MRF' ćelija i, takođe, XL-Blue MRF'( AaroA)ćelija (XL1 Blue MRF'). Dobijene transfektovane ćelije su postavljene na M63 ploče koje sadrže kanamicin, 0.1 mM IPTG i bilo 0 mM, 20 mM ili 50 mM glifosata. Ovaj skrining postupak omogućava identifikaciju klonova koji sadrže glifosat-tolerantne EPSP sintaze, kao i klonova koji nose toleranciju na glifosat. Kolonije rastu na 20mM ili 50mM glifosata uAaro^soju ili XL-Blue MRF' gde su sakupljene i njihovi plazmidi analizirani restrikcionom digestijom za identifikovanje plazmida sa podeljenim restrikcionim profilima. Pojedinačni plazmidi su sekvencionirani postupcima poznatim u struci, a prednost je data plazmidima koji prenose rezistenciju do 50 mM glifosata.

Korišćenjem ovog pristupa, kako se nekad modifikuje za svaku biblioteku, kako je poznato i razjašnjeno u struci, identifikovane su bibliotečke kolonije koje sadrže gene EPSP sintaze.

Sekvence regiona dobijenih klonova su određene u regionu EPSP sintaze.

Primer 11. DNK i proteinske sekvence EPSP sintaze

DNK sekvenca glifosat rezistentne EPSP sintaze je određena za pAX1967 postupcima, koji su dobro poznati u struci. DNK sekvencagrg51je ovde obezbeđena kao SEQ ID NO:5. Predviđeni translacioni proizvodgrg51(GRG51) je ovde obezbeđen kao SEQ ID NO:6. GRG51 pokazuje 97% amino kiselinskog identiteta sa GRG23 (SEQ ID NO:2).

Plazmid pAX1967, koji sadržigrg51je deponovan u Poljoprivrednom istraživačkom servisu zbirki kultura (NRRL) 26. juna 2006. i, označen je sa Accession No. NRRL B-30949.

Tabela 5 zbirno prikazuje homologiju GRG23 i GRG51 sa drugim EPSP sintaza enzimima.

Primer 12. Kloniranje nove EPSP sintaze rezistentne na glifosat u ekspresioni vektor E.

coli

grg51gen koji je sadržan u pAX1967 je sub-kloniran u ekspresioni vektor pRSFIbE. coli(Invitrogen). Nastali klonovi su potvrđeni DNK sekvencioniranjem i upotrebljeni za indukovanje ekspresijegrg51uE. coli.Ekspresovani His-obeleženi protein je zatim prečišćen na način poznat u struci.

Primer 13. Glifosatna rezistenci ja EPSP sintaza

Ćelije koje sadrže pAX1967 su postavljene na M63+ ploče koje sadrže antibiotik i bilo 0 mM ili 20 mM glifosata. Rast je sumiran nakon dva dana rastenja na 37°C. Zapaženo je da GRG51 prenosi rezistenciju do 20 mM glifosata u ćelijeE. coli(Tabela 6).

Primer 14.syngrg23 dizajni ekspresija

Nova genska sekvenca koja kodira GRG23 protein (SEQ ID NO:2; U.S. patentna prijava br. 60/741,166, prijavljena 1. decembra 2005.) je dizajnirana i sintetisana. Sekvenca je obezbeđena kao SEQ ID NO: 12. Ovaj okvir otvorenog čitanja, ovde označen" syngrg23",kloniran je u ekspresioni vektor pRSFIb (Invitrogen), poznatim postupcima iz struke.

Gensyngrg23koji kodira GRG23 je kloniran u pUC19 vektor da bi se kreirao pAX748. PCR prajmeri koji napadajusyngrg23u ovom vektoru se korise za amplifikacijusyngrg23iz pAX748 upotrebom MUTAZYME® II sistema (Stratagene) da bi se uvele nasumične mutacije u syngrg23kodirajući region. Templat je razblažen 1:50 u PCR reakciji kose-greške i, amplifikacija je izvedena u 30 ciklusa. Dobijeni PCR proizvod je podvrgnut digestiji sa restrikcionim enzimimaBamHI iSgsI, prečišćen je na gelu i, povezan u vektor pRSF1 b da bi se kreirala mutagenizovanasyngrg23biblioteka.

Mutagenizovanesyngrg23biblioteke su transformisane uE. colisoj BL21<*>DE3 star (Invitrogen). Posle transformacije, pojedinačne kolonije su postavljene na 1xM63 medijum, koji sadrži 150 mM glifosata da bi se izdvojili klonovi koji su zadržali enzimsku aktivnost i toleranciju na rast.

Primer 15. Skrining na glifosatnu rezistenciju na pločama

Bibliotečke ligacije su transformisane u BL21<*>DE3 kompetentneE. colićelije (Invitrogen). Transformacije su izvedene u skladu sa uputstvima proizvođača sa sledećim modifikacijama. Posle inkubacije od 1 sata, na 37°C u SOC medijumu, ćelije su sedimentirane centrifugiranjem (5 minuta, 1000xg, 4°C). Ćelije su isprane sa 1 ml M63+, ponovo centrifugirane i dekantovan je supernatant. Drugi put su ćelije isprane sa 1 ml M63+ i resuspendovane u 200 \ i\ M63+.

Za izdvajanje mutantnih GRG23 enzima koji prenose glifosatnu rezistenciju u £.coli,ćelije su postavljene na ploče sa M63+ agarnim medijumom koji sadrži 150 mM glifosata, 0.05 mM IPTG (izopropil-beta-D-tiogalaktopiranozid) i 50 ng/ml kanamicina. M63+ medijum sadrži : 100 mM KH2P04, 15 mM (NH4)2S04, 50 uM CaCI2, 1\ xMFeS04, 50 i^M MgCI2, 55 mM glukoze, 25 mg/litru L-prolina, 10 mg/litru tiamin HCI, dovoljno NaOH da bi se podesio pH na 7.0 i, 15 g/litru agara. Ploče su inkubirane tokom 36 sati na 37°C.

Pojedinačne kolonije se pokupe i rasporede u ploče sa 384 reakciona mesta. Na ovaj način kreiraju se dve ploče sa 384 reakciona mesta. Treća ploča sa 384 klona je uzeta sa kolonija koje su uzgajane na pločama kojima nedostaje glifosat.

Primer 16. Izolacija i analiza GRG23 varijanti sa glifosatnom rezistencijom

BL21<*>DE3 ćelije koje su transformisane sa mutagenizovanimsyngrg23i/iligrg23varijantama se otkrivaju rastom na glifosatnim pločama. Ekstrakti mutagenizovanihsyngrg23i/iligrg23varijanti se pripremaju i testiraju kako bi se poboljšala enzimska aktivnost. Kolonije koje su identifikovane na glifosatnim pločama se ubadaju u blokove sa 96 mesta koji sadrže LB medijum i rastu do O.D. od otprilike 0.6. Zatim se doda IPTG (0.5 mM) i blokovi se inkubiraju preko noći na 25°C da bi se indukovala ekspresija proteina. Proteinski ekstrakti se pripremaju od kuglica ćelija upotrebom POP reagensa za kulture (Novagen) i Lvsonase (Novagen) i, meri se enzimska aktivnost u sirovim lizatima nakon grejanja ekstrakata tokom 30 minuta na 37°C. Ekstrakti koji imaju veću aktivnost od dve standardne devijacije od srednje vrednosti za set ekstrakata koji sadrže odgovarajući kontrolni protein (na primer, GRG23), izdvojeni su za dalju analizu.

Klonovi koji pokazuju povećanu aktivnost nakon inkubacije kao sirovi ekstrakti, uzgajani su u 250 ml_ LB kulturama, a ekspresija proteina je indukovana sa IPTG. Po indukciji, mutantni GRG23 protein je prečišćen iz svake kulture pomoću afinitetne hromatografije, upotrebom kobaltne smole (Novagen). Prečišćeni proteini su onda testirani na enzimatsku aktivnost posle grejanja tokom 0, 2, 4 i, otprilike 16 sati na 37°C.

Primer 17. Unapređene GRG23 varijante.

Iz DNK biblioteke mutagenizovanog syngrg23 identifikovano je nekoliko klonova sa unapređenom aktivnošću. Određena je DNK sekvence klonova koji odgovaraju ovim ekstraktima. Tabela 7 prikazuje amino kiselinske promene određene u šest varijanti GRG23 koje zadržavaju glifosatnu rezistenciju:grg23( L3P1 . B20)(SEQ ID NO:26) koja kodira amino kiselinsku sekvencu GRG23(L3P1.B20) (SEQ ID NO:27);grg23( L3P1. B3)(SEQ ID NO:28) koja kodira amino kiselinsku sekvencu GRG23(L3P1.B3) (SEQ ID NO:29);grg23( L3P1. F18)(SEQ ID NO.30) koja kodira amino kiselinsku sekvencu GRG23(L3P1.F18) (SEQ ID NO:31); igrg23( L3P1. 023)(SEQ ID NO:31) koja kodira amino kiselinsku sekvencu GRG23(L3P1.023) (SEQ ID NO:32).

Klonovi su uzgajani u 250 mL LB kulturama, a ekspresija proteina je indukovana i izolovana, kao što je prethodno objašnjeno. Prečišćeni proteini su onda testirani na enzimatsku aktivnost posle grejanja od 0, 2 i 4 i, otprilike 16 sati na 37°C. Potvrđeno je da jedan od klonova, nazvan "M5", zadržava povećan odnos svoje enzimske aktivnosti posle produžene inkubacije na 37°C (Tabela 8). Određena je sekvenca ovog klona i gen je ovde označen kaogrg23( ace1)(SEQ ID NO: 14). Protein koji se ekspresuje izgrg23( acel)je označen kao GRG23(ACE1) (SEQ ID NO: 15).

GRG23(ACE1) sadrži 2 amino kiselinske supstitucije u odnosu na divlji tip GRG23 proteina:A49—>TiS276—>T.pRSFIb vektor, koji sadrži ovaj gen, označen je kao pAX3801. Slika 1 prikazuje relativnu stabilnost GRG23(ACE1) u odnosu na GRG23 na povišenim temperaturama.

Primer 18. Određivanje EPSPS aktivnosti GRG23 varijanti

Ekstrakti koji sadrže GRG23 varijantu proteina su testirani na aktivnost EPSP sintaze kako je opisano u U.S. patentnoj prijavi br. 60/741,166, podnetoj 1. decembra 2005., a koja je ovde u celosti obuhvaćena kao referenca. Testovi su izvedeni prema uputstvima proizvođača, a u konačnoj zapremini od 50^l, sadržavajući 0.5 mM šikimat-3-fosfata, 200\ iMfosfoenolpiruvata (PEP), 1 IJ/ml ksantin oksidaze, 2 IJ/ml nukleozid fosforilaze, 2.25 mM inozina, 1 IJ/ml peroksidaze rena, 0-2 mM glifosata, 50 mM HEPES/KOH pH 7.0, 100 mM KCI i, AMPLEX®Red (Invitrogen). Ekstrakti su inkubirani sa svim sastojcima testa, osim sa šikimat-3-fosfatom, u toku 5 minuta na sobnoj temperaturi i, testovi otpočinju dodavanjem šikimat-3-fosfata. Aktivnost EPSP sintaze je izmerena upotrebom Spectramax Gemini XPS fluorescentnog spektrometra (Molecular Dvnamics, ekscitacija: 555 nm; emisija: 590 nm).

Posle kompletnog određivanja kinetičkih parametara izvedeno je na prečišćenom proteinu kako je prethodno opisano (U.S. patentna prijava broj 60/741,166, prijavljena 1. decembra 2005.), podešavanje za količinu proteina određenu Bradford testom, kao što je u struci poznato. Za ma koju koncentraciju glifosata, EPSP aktivnost sintaze je izmerena kao funkcija širokog opsega PEP koncentracija. Podaci su uređeni prema Michaelis-Mentenovoj jednačini korišćenjem KALEIDAGRAPH®softvera (Synergy Software) i upotrebljeni za određivanje Km (Km prividna) EPSP sintaze za tu koncentraciju glifosata. Prividne Km vrednosti su određene na ne više od 4 glifosatne koncentracije i Ki EPSPS za glifosat je izračunat iz krive : prividna Km vs koncentracija glifosata, upotrebom jednačine (m1<*>x/(m2+x); m1=1; m2=1), kao što je poznato u struci.

Primer 19. Identifikacija qrq23 ( ace2).

GRG23(ACE1) sadrži dve amino kiselinske izmene u odnosu na GRG23. Da bi se odredilo da li dodatne supstitucije na ovim položajima mogu dalje poboljšati aktivnost, napravljena je DNK biblioteka koja proizvodi klonove koji ekspresuju proteine koji su suštinski bili mutirani na oba položaja 49 i 276 u GRG23. Klonovi koji prenose glifosatnu rezistenciju su izdvojeni rastom na glifosatnim pločama i, uzgajani su i testirani na kinetička svojstva kako je opisano.

Iznenađujuće, otkriveno je da jedan klon, ovde označen kaogrg23( ace2)

(SEQ ID NO:16), koji kodira GRG23(ACE2) protein (SEQ ID NO:17), ima unapređenu termostabilnost. DNK sekvencagrg23( ace2)pokazuje da GRG23(ACE2) sadrži jednu amino kiselinsku izmenu (ostatak 276 u GRG23 za arginin).

Primer 20. Poređenje GRG23 i GRG51 i mutageneza ostataka koji se razlikuju.

Dve biblioteke su generisane kako bi se postigle permutacije amino kiselinskih sekvenci koje su moguće iz poređenja amino kiselinskih sekvenci u GRG23 i GRG51. Prva biblioteka uvodi varijaciju iz GRG51 amino kiselinske sekvence ugrg23( ace2)kodirajući region. Druga biblioteka uvodi varijaciju iz GRG23(ACE2) amino kiselinske sekvence ugrg51kodirajući region.

Klonovi nastalih biblioteka su procenjeni na (1) sposobnost prenošenja glifosatne rezistencije na ćeliju i, (2) aktivnost posle produžene inkubacije na 37°C. Svi od deset klonova su sekvencionirani i analizirani detaljnije. Jedan poseban klon, ovde označen kaogrg51. 4(SEQ ID NO: 18), koji kodira protein GRG51.4 (SEQ ID NO:19), sadrži nekoliko amino kiselinskih izmena u odnosu na oba GRG23(ACE2) i GRG51. Amino kiselinske izmene prisutne u GRG51.4 u odnosu na GRG23(ACE2) su suštinski uvedene ugrg23( ace2)gen, kako bi se dobiogrg23( ace3)(SEQ ID NO.20), koji kodira GRG23(ACE3) protein (SEQ ID NO:21). GRG23(ACE3) ispoljava superiornu aktivnost i termostabilnost u odnosu na GRG23 i GRG23(ACE2).

GRG23(ace1) je mutagenizovan i testirani su klonovi da bi se identifikovali klonovi koji ekspresuju varijante sa poboljšanom termostabilnošću i/ili aktivnošću. Jedan klon,grg23( L5P2. J2)(SEQ ID NO:22), koji kodira GRG23(LSP2.J2) (SEQ ID NO:23), identifikovan je na temelju svojih unapređenih kinetičkih svojstava. GRG23(L5P2.J2) sadrži tri amino kiselinske izmene u odnosu na GRG23(ACE1), kako je prikazano u sledećoj Tabeli 10.

Oligonukleotidna mutageneza je upotrebljena da bi se kreirali klonovi koji sadrže svaku amino kiselinsku izmenu koja je otkrivena u GRG23(L5P2.J2) ugrg23( ace3)kodirajućem regionu. Klon je identifikovan kako kodira protein koji ima poboljšana kinetička svojstva nad GRG23(ACE3) i označen je kaogrg23( ace4)(SEQ ID NO:24). Protein kojeg kodiragrg23( ace4)je označen kao GRG23(ACE4) (SEQ ID NO:25) i sadrži jednu amino kiselinsku izmenu u odnosu na GRG23(ACE3) (valin 101 za fenilalanin). Na osnovu ovog rezultata, izvedene su odvojene oligonukleotidne mutageneze da bi se ispitale kinetike svake moguće amino kiselinske supstitucije na položaju 101. Nijedna od amino kiselinskih izmena nije dovela do daljeg poboljšanja u kinetičkim svojstvima u poređenju sa GRG23(ACE4).

Primer 21. Konstruisanjegrg23iligrg51za biljnu transformaciju

grg23iligrg51okvir otvorenog čitanja (ORF) se amlifikuje pomoću PCR-a iz cDNK templata u punoj dužini.HindIII restrikcioni položaji se dodaju na svaki kraj ORF-a tokom PCR-a. Sem toga, nukleotidna sekvenca ACC se dodaje neposredno 5' startnom kodonu gena da bi se povećala efikasnost translacije (Kozak (1987) Nucleic Acids Research 15:8125-8148; Joshi (1987) Nucleic Acids Research 15:6643-6653). PCR proizvod se klonira i sekvencionira upotrebom dobro poznatih tehnika iz struke da bi se osiguralo da se ne uvedu nikakve mutacije u toku PCR-a.

Plazmid koji sadržigrg23iligrg51PCR produkte se podvrgava digestiji saHindIII i izoluju se fragmenti koji sadrže intaktne ORF. Ovakav fragment se klonira u Hind III položaj plazmida pAX200, biljni ekspresioni vektor koji sadrži aktinski promoter iz pirinča (McEIrov et al. (1991) Molec. Gen. Genet. 231:150-160) i Pinll terminator (An et al. (1989) The Plant cell 1:115-122). Promoter-gen-terminator fragment iz ovog intermedijernog plazmida se subklonira u plazmid pSB11 (Japan Tobacco, Ine) da bi se formirao konačni plazmid, na primer, pSB11GRG23. pSB11GRG23 je organizovan tako da se može izrezati 3.91 kb DNK fragment, koji sadrži promoter-grg23-terminator konstrukciju, putem dvostruke digestije saKpnI iPmeI i upotrebiti za transformaciju u biljke aerosolnom zračnom injekcijom. Struktura pSB11GRG23 se potvrđuje restrikcionom digestijom i elektroforezom na gelu, kao i sekvencioniranjem duž raznih klonirajućih spojnica.

Plazmid se mobiliše uAgrobacterium tumefacienssoj LBA4404 koji, isto tako, zaokružuje i plazmid pSB1 (Japan Tobacco, Inc.), korišćenjem postupaka triparentalnog prepokrivanja koji su dobro poznati u struci i, postavlja se na medijum koji sadrži spektinomicin. Plazmid pSB11GRG23 nosi rezistenciju na spektinomicin ali je to plazmid sa uskim opsegom domaćina i ne može se reprodukovati uAgrobacteriuma.Kolonije rezistentne na spektinomicin niču kada se pSB11GRG23 integriše u plazmid pSB1 širokog opsega domaćina, kroz homologne rekombinacije. Ko-sastavni proizvod pSB1 i pSB11GRG23 je potvrđen Southern hibridizacijom.Agrobacteriumsoj, koji zaokružuje ko-sastav, koristi se da transformiše kukuruz putem Purelntro postupka (Japan Tobacco).

Primer 22. Transformacijaor<g>23 ili grg51u biljnim ćelijama

Klipovi kukuruza se sakupe 8-12 dana po oprašivanju. Iz svakog klipa su izolovani embrioni i za transformaciju su upotrebljeni oni embrioni koji su bili veličine 0.8-1.5 mm. Embrioni su postavljeni skutelumom nagore na pogodne medijume za inkubaciju, kao što je DN62A5S medijum (3.98 g/L N6 soli; 1 mL/L (1000xmatičnog) N6 vitamini; 800 mg/L L-asparagin; 100 mg/L mioinozitol; 1.4 g/L L-prolin; 100 mg/L Casamino kiseline; 50 g/L saharoza; 1 mL/L (1 mg/mL matičnog) 2,4-D). Ipak, u struci su poznati i drugi pogodni medijumi i soli. Embrioni se inkubiraju preko noći na 25°C, u mraku.

Dobijeni eksplanti se prenose na sitasti kvadrat (30-40 po ploči), prenose se na osmotski medijum tokom 30-45 minuta, a zatim se prenose na ploču koja zrači (vidi, na primer, PCT Publication No. VVO/0138514 i U.S. Patent No. 5,240,842).

DNK konstrukcije, koje su osmišljene da ekspresuju GRG23 u biljnim ćelijama, ubrzavaju se u biljnom tkivu upotrebom aerosolnog zračnog akceleratora, korišćenjem uslova suštinski opisanih u PCT Pubikaciji br. WG7138514. Nakon zračenja, embrioni se inkubiraju 30 minuta na osmotskom medijumu, a onda stavljaju na inkubacioni medijum preko noći na 25°C, u mraku. Da bi se izbeglo nesumnjivo oštećenje ozračenih eksplanata, inkubiraju se najmanje 24 sata pre prenosa na medijum za obnavljanje. Embrioni se onda rašire po medijumu za period obnavljanja u toku 5 dana na 25°C, u mraku, zatim, prenesu u selekcioni medijum. Eksplanti se inkubiraju u selekcionom medijumu do osam nedelja, zavisno od prirode i osobina naročito korišćene selekcije. Nakon perioda selekcije, nastali kalus se prenosi u embrion medijuma za sazrevanje, sve dok se ne primeti formiranje zrelih somatskih embriona. Dobijeni zreli somatski embrioni se onda smeštaju pod slabo svetio, a proces regeneracije se otpočinje u struci poznatim načinom. Dobijenim izdancima se omogući puštanje korenova na medijumu za okorenjivanje, a nastale biljke se prenose u rasadne posude i rasađuju kao transgene biljke.

Podesi se pH rastvora na pH 5.8 sa 1N KOH/1N KCI, doda Gelrite (Sigma) do 3 g/L i, autoklavira. Posle hlađenja na 50°C, doda se 2 ml/L 5 mg/ml matičnog rastvora srebro nitrata (Phytotechnology Labs). Prepisani prinos otprilike 20 ploča.

Primer 23. Transformacijaarq23iliQrq51u kukuruznim biljnim ćelijama putem

■ 4q/ t>bacfemjm- posredovane transformacije

Klipovi su sakupljeni 8-12 dana po oprašivanju. Iz svakog klipa su izolovani embrioni i za transformaciju su upotrebljeni oni embrioni koji su bili veličine 0.8-1.5 mm. Embrioni su postavljeni skutelumom nagore na pogodne medijume za inkubaciju i, inkubirani su preko noći na 25°C, u mraku. Ipak, nije neophodnoper seinkubirati embrione preko noći. Embrioni se stavljaju, u toku 5-10 min, u dodir saAgrobacteriumsojem koji sadrži odgovarajuće vektore za transfer posredovan Ti plazmidom i, zatim se postavljaju na medijum za ko-kultivaciju tokom 3 dana (25°C, u mraku). Nakon ko-kultivacije, eksplanti se prenose u medijum za period obnavljanja tokom pet dana (na 25°C, u mraku). Eksplanti se inkubiraju u selekcionom medijumu do osam nedelja, zavisno od prirode i osobina naročito korišćene selekcije. Nakon perioda selekcije, nastali kalus se prenosi u embrion medijuma za sazrevanje, sve dok se ne primeti formiranje zrelih somatskih embriona. Dobijeni zreli somatski embrioni se onda smeštaju pod slabo svetio, a proces regeneracije se otpočinje u struci poznatim načinom. Dobijenim izdancima se omogući puštanje korenova na medijumu za okorenjivanje, a nastale biljke se prenose u rasadne posude i rasađuju kao transgene biljke.

Sve publikacije i patentne prijave pomenute u ovom opisu patenta su indikativne u nivou veštine stručnih lica na koje se ovaj pronalazak i odnosi. Sve publikacije i patentne prijave su ovde obuhvaćene kao referenca do iste mere kao i što je svaka pojedina publikacija ili patentna prijava specifično i pojedinačno obuhvaćena kao referenca.

lako je gornji pronalazak opisan u nekim detaljima u vidu ilustracija i primera zbog pojašnjavanja i razumevanja, očigledno je da se izvesne izmene i modifikacije mogu izvesti u okviru priključenih patentnih zahteva.

Claims (14)

1. Izolovani molekul nukleinske kiseline, koji je izdvojen od: a) molekula nukleinske kiseline koji sadrži nukleotidnu sekvencu SEQ ID NO:1, 3 ili 5, ili njen komplement; b) molekula nukleinske kiseline koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja ima najmanje 80% identiteta sekvence sa nukleotidnom sekvencom SEQ ID NO:1, 3 ili 5, koja kodira EPSPS sa tolerancijom na glifosat, ili njen komplement; c) nukleotidne sekvence sa glifosat-tolerancijom iz DNK inserta plazmida deponovanog kao Accession No. NRRL B-30888 ili B-30949, ili njen komplement; d) molekula nukleinske kiseline koji kodira polipeptid koji sadrži amino kiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 2, 4 ili 6; i e) molekula nukleinske kiseline koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira polipeptid koji ima najmanje 80% identiteta amino kiselinske sekvence sa amino kiselinskom sekvencom SEQ ID NO:2, 4 ili 6, gde navedeni polipeptid ima aktivnost tolerancije na glifosat.

2. Izolovani molekul nukleinske kiseline, kao u patentnom zahtevu 1, gde je navedena nukleotidna sekvenca dizajnirana za ekspresiju u biljci.

3. Vektor, koji sadrži molekul nukleinske kiseline, kao u patentnom zahtevu 1; navedeni vektor opciono dalje sadrži molekul nukleinske kiseline koji kodira heterologi polipeptid.

4. Ćelija domaćin koja sadrži vektor, kao u patentnom zahtevu 3.

5. Ćelija domaćin, kao u patentnom zahtevu 4, koja je bakterijska ćelija domaćina ili biljna ćelija.

6. Transgenska biljka sadrži biljnu ćeliju domaćina, kao u patentnom zahtevu 5; ili transformisano seme pomenute biljke.

7. Izolovani polipeptid, koji je izdvojen od: a) polipeptida koji sadrži amino kiselinsku sekvencu SEQ ID NO.2, 4 ili 6; b) polipeptida kojeg kodira nukleotidna sekvenca SEQ ID NO.1, 3 ili 5; c) polipeptida koji sadrži amino kiselinsku sekvencu koja ima najmanje 80% identiteta sekvence sa amino kiselinskom sekvencom SEQ ID NO:2, 4 ili 6, gde navedeni polipeptid ima aktivnost glifosatne tolerancije; d) polipeptida kojeg kodira nukleotidna sekvenca koja je najmanje 80% identična sa nukleotidnom sekvencom SEQ ID NO.1, 3 ili 5, gde navedeni polipeptid ima aktivnost glifosatne tolerancije; i e) polipeptida kojeg kodira nukleotidna sekvenca sa glifosatnom tolerancijom iz DNK inserta plazmida deponovanog kao Accession No. NRRL B-30888 ili B-30949; navedeni polipeptid opciono dalje sadrži heterologu amino kiselinsku sekvencu.

8. Postupak za proizvodnju polipeptida sa aktivnošću glifosatne tolerancije, koji obuhvata uzgajanje ćelije domaćina, kao u patentnom zahtevu 4, pod uslovima u kojima se molekul nukleinske kiseline koji kodira polipeptid ekspresuje; navedeni polipeptid je izdvojen iz grupe, koja se sastoji od: a) polipeptida koji sadrži amino kiselinsku sekvencu SEQ ID NO:2, 4 ili 6; b) polipeptida kojeg kodira nukleotidna sekvenca SEQ ID NO:1, 3 ili 5; c) polipeptida koji sadrži amino kiselinsku sekvencu koja ima najmanje 80% identiteta sekvence sa polipeptidom koji ima amino kiselinsku sekvencu SEQ ID NO:2, 4 ili 6, gde navedeni polipeptid ima aktivnost glifosatne tolerancije; d) polipeptida kojeg kodira molekul nukleinske kiseline koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja ima najmanje 80% identiteta sekvence sa sekvencom nukleinske kiseline SEQ ID NO:1, 3 ili 5, gde navedeni polipeptid ima aktivnost glifosatne tolerancije; i e) polipeptida kojeg kodira nukleotidna sekvenca sa glifosatnom tolerancijom iz DNK inserta plazmida deponovanog kao Accession No. NRRL B-30888 ili B-30949.

9. Postupak za prenošenje tolerancije na glifosat u biljci, navedeni postupak obuhvata transformisanje navedene biljke sa DNK konstrukcijom, navedena konstrukcija sadrži promoter koji vodi ekspresiju u biljnoj ćeliji operabilno povezan sa nukleotidnom sekvencom koja je najmanje 80% identična sa nukleotidnom sekvencom iskazanom u SEQ ID NO:1, 3 ili 5 koja kodira EPSPS sa glifosatnom rezistencijom i, regenerisanje transformisane biljke.

10. Biljka ili biljna ćelijja koja ima u svom genomu stabilno inkorporiranu DNK konstrukciju koja sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira protein koji ispoljava aktivnost rezistencije na glifosat, gde je navedena nukleotidna sekvenca izdvojena od: a) nukleotidne sekvence SEQ ID NO:1, 3 ili 5; b) nukleotidne sekvence koja ima najmanje 80% identiteta nukleotidne sekvence SEQ ID NO:1, 3 ili 5, gde navedena nukleotidna sekvenca kodira polipeptid koji ima aktivnost tolerancije na glifosat; c) nukleotidne sekvence koja kodira polipeptid koji ima amino kiselinsku sekvencu SEQ ID NO:2, 4 ili 6; d) nukleotidne sekvence koja kodira polipeptid koji ima najmanje 80% identiteta amino kiselinske sekvence sa amino kiselinskom sekvencom SEQ ID NO:2, 4 ili 6, gde navedeni polipeptid ima aktivnost glifosatne tolerancije; i e) nukleotidne sekvence sa glifosatnom tolerancijom iz DNK inserta plazmida deponovanog kao Accession No. NRRL B-30888 ili B-30949; pri čemu je pomenuta nukleotidna sekvenca operabilno povezana sa promoterom koji upravlja ekspresijom kodirajuće sekvence u biljnoj ćeliji.

11. Izolovani molekul nukleinske kiseline koji kodira EPSPS enzim sa glifosatnom tolerancijom, gde navedeni EPSPS enzim sa glifosatnom tolerancijom ima Km za fosfoenolpiruvat (PEP) između otprilike 1 i otprilike 150 ?M i Ki (glifosat) / Km (PEP) između oko 500 i otprilike 1000.

12. Biljka koja ima u svom genomu stabilno inkorporiranu DNK konstrukciju koja sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira EPSPS polipeptid, navedeni EPSPS polipeptid ima Km za PEP između 1 i 150 |xM i Ki (glifosat) / Km (PEP) između 500 i 1000, navedena biljka ispoljava toleranciju na glifosatni herbicid.

13. Biljka, kao u patentnom zahtevu 12, gde je navedena biljka soja ili kukuruzna biljka.

14. Biljka, kao u patentnom zahtevu 6 ili 11, gde je navedena biljka : kukuruz, sirak, žito, suncokret, paradajz, krstašica, biber, krompir, pamuk, pirinač, soja, šećerna repa, šećerna trska, duvan, ječam ili uljana repica.