ES2089232T5 - 5-enolpiruvilsiquimato-3-fosfato sintasas tolerantes del glifosato. - Google Patents
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Abstract
SE PRESENTAN ENZIMAS DE LA CLASE II EPSPS QUE CODIFICAN GENES. LOS GENES SON UTILES EN LA PRODUCCION DE BACTERIAS Y PLANTAS TRANSFORMADAS QUE SON TOLERANTES A LOS HERBICIDAS DE GLICOSATO. LOS GENES DE LA CLASE II EPSPS COMPARTEN UNA PEQUEÑA HOMOLOGIA CON LOS GENES YA CONOCIDOS DE LA CLASE I EPSPS, Y NO SE HIBRIDIZAN CON SONDAS DE LA CLASE I EPSPS. LAS ENZIMAS DE LA CLASE II EPSPS SE CARACTERIZAN POR SER MAS CINETICAMENTE EFICIENTES QUE LA CLASE I EPSPS EN LA PRESENCIA DE GLIFOSATO. TAMBIEN SE PRESENTAN PLANTAS TRANSFORMADAS POR LA CLASE II EPSPS ASI COMO UN METODO PARA CONTROLAR DE FORMA SELECTIVA LAS MALAS HIERBAS EN COSECHAS AGRICOLAS.
Description
5-enolpiruvilsiquimato-3-fosfato
sintasas tolerantes del glifosato.
Esta invención se refiere en general a la
biología molecular de plantas y, más particularmente, a una nueva
clase de
5-enolpiruvilsiquimato-3-fosfato
sintasas tolerante del glifosato.
Recientes avances en ingeniería genética han
proporcionado las herramientas requeridas para transformar plantas
con el fin de que contengan genes extraños. Actualmente, es posible
producir plantas que poseen características únicas de importancia
agronómica. Por supuesto, una de dichas características ventajosas
es la de ofrecer un control de las malas hierbas más barato y más
compatible con el medio ambiente, debido a la tolerancia del
herbicida. Las plantas tolerantes de los herbicidas pueden reducir
la necesidad de trabajar el suelo para controlar las malas hierbas
reduciendo, de esta forma, de una manera eficaz la erosión del
suelo.
A este respecto, un herbicida que es el objeto
de mucha investigación es la N-fosfonometilglicina
usualmente denominada como glifosato. El glifosato inhibe la vía del
ácido siquímico, el cual, conduce a la biosíntesis de compuestos
aromáticos que incluyen aminoácidos, hormonas de plantas y
vitaminas. Específicamente, el glifosato frena la conversión del
ácido fosfoenolpirúvico (PEP) y del ácido
3-fosfosiquímico en ácido
5-enolpiruvil-3-fosfosiquímico
mediante la inhibición de la enzima
5-enolpiruvilsiquimato-3-fosfato
sintasa (denominada aquí más adelante como EPSP sintasa o
EPSPS).
Se ha mostrado ya que pueden producirse plantas
tolerantes del glifosato insertando en el genoma de la planta la
capacidad de producir un nivel más elevado de EPSP sintasa en el
cloroplasto de la célula (Shah y otros, 1986) cuya enzima es
preferiblemente tolerante del glifosato (Kishore y otros, 1988). Se
han aislado variantes de la enzima EPSPS del tipo salvaje, las
cuales, son tolerantes del glifosato como resultado de alteraciones
en la secuencia de codificación de los aminoácidos de la EPSPS
(Kishore y Shah, 1988; Schulz y otros, 1984; Sost y otros, 1984;
Kishore y otros, 1986). Típicamente, estas variantes tienen una
K_{i} más elevada para el glifosato que para la enzima EPSPS del
tipo salvaje, lo cual confiere el fenotipo tolerante del glifosato,
pero estas variantes se caracterizan, igualmente, por una K_{m}
elevada para el PEP, lo cual hace que la enzima sea cinéticamente
menos eficaz (Kishore y Skah, 1988; Sost y otros, 1984; Schulz y
otros, 1984; Kishore y otros, 1986; Sost y Amrhein, 1990). Por
ejemplo, la K_{m} aparente para el PEP y la K_{i} aparente para
el glifosato para la EPSPS nativa procedente del E. coli son
10 \muM y 0,5 \muM, en tanto que para un aislado tolerante del
glifosato que tiene una única sustitución de aminoácido de una
alanina por la glicina en la posición 96, estos valores son 220
\muM y 4,0 mM, respectivamente. Mediante mutagénesis, se han
construido un cierto número de plantas tolerantes del glifosato con
genes variantes de la EPSPS. Una vez más, la EPSPS tolerante del
glifosato fue inadecuada debido a un incremento en la K_{m} para
el PEP y una ligera reducción de la V_{max} de la enzima de la
planta nativa (Kishore y Shah, 1988), disminuyendo, de esta forma,
la eficacia catalítica (V_{max}/K_{m}) de la enzima. Puesto que
las constantes cinéticas de las enzimas variantes son inadecuadas
con respecto al PEP, se ha propuesto que se requerirían unos niveles
elevados de sobreproducción de la enzima variante,
40-80 veces, para mantener la actividad catalítica
normal en las plantas en presencia de glifosato (Kishore y otros,
1988).
Aunque dichas EPSP sintasas variantes han
probado ser útiles en la obtención de plantas transgénicas
tolerantes del glifosato, sería aún más beneficioso obtener una EPSP
sintasa que fuera altamente tolerante del glifosato, al mismo tiempo
que fuera aún eficaz cinéticamente, de forma que la proporción de
EPSPS tolerante del glifosato que sería necesario producir para
mantener la actividad catalítica normal en la planta se redujera, o
que pudiera obtenerse una tolerancia mejorada con el mismo nivel de
expresión.
Los estudios previos han mostrado que las
enzimas EPSPS procedentes de diferentes fuentes varían ampliamente
con respecto a su grado de sensibilidad a la inhibición por el
glifosato. Un estudio de la planta y de la actividad de la enzima
EPSPS bacteriana en función de la concentración de glifosato mostró
que existe una variación muy amplia en el grado de sensibilidad al
glifosato. El grado de sensibilidad no mostró correlación con ningún
género o especie ensayada (Schulz y otros, 1985). Igualmente, se ha
informado también de la insensibilidad a la inhibición del glifosato
de la actividad de la EPSS a partir de la Pseudomonas sp.
PG2982, pero no se aportan detalles de los estudios (Fitzgibbon,
1988). En general, aunque se ha informado de dicha tolerancia
natural, no existe ningún informe que sugiera la superioridad
cinética de las enzimas EPSPS tolerantes del glifosato de bacterias
que se producen de manera natural sobre las de las enzimas EPSPS
mutadas, ni se ha caracterizado ningún tipo de genes. De manera
similar, no existen informes sobre la expresión de las enzimas EPSPS
tolerantes del glifosato naturales en plantas con el fin de conferir
tolerancia al glifosato.
Se presenta una molécula de ADN que comprende el
ADN de codificación de una EPSP sintasa tolerante del glifosato,
eficaz cinéticamente. Las EPSP sintasas de la presente invención
reducen la proporción de sobreproducción de la enzima EPSPS en una
planta transgénica necesaria para la enzima con el fin de mantener
la actividad catalítica, al mismo tiempo que la confiere aún
tolerancia al glifosato. Esta y otras EPSP sintasas descritas en la
presente invención representan una nueva clase de enzimas EPSPS,
denominadas aquí más adelante como enzimas EPSPS de Clase II. Las
enzimas EPSPS de Clase II comparten poca homología con las enzimas
EPSPS de plantas o de bacterias conocidas y exhiben tolerancia al
glifosato, al mismo tiempo que mantienen intervalos de valores de
K_{m} (PEP) adecuados. Los intervalos de valores adecuados de
K_{m} (PEP) para EPSPS para las enzimas de la presente invención
están comprendidos entre 1-150 \muM, con un
intervalo de valores más preferidos comprendidos entre
1-35 \muM, y el intervalo de valores más preferido
comprendido entre 2-25 \muM. Estas constantes
cinéticas se determinaron bajo condiciones de ensayo especificadas
en la presente invención más adelante. La V_{max} de la enzima
suele ser, preferiblemente, al menos el 15% del de la enzima de la
planta no inhibida y, más preferiblemente, superior al 25%. Una
EPSPS de la presente invención tiene, preferiblemente, una K_{i},
para el intervalo de valores de glifosato, comprendida entre
25-10000 \muM. La relación K_{i}/K_{m} suele
estar comprendida entre 3-500, y más preferiblemente
entre 6-250. Preferiblemente, la V_{max} suele
estar comprendida dentro del intervalo de 2-100
unidades/mg (\mumoles/minuto x mg a 25ºC) y la K_{m} para el
siquimato-3-fosfato suele estar
comprendido, preferiblemente, dentro del intervalo de 0,1 a 50
\muM.
Los genes de codificación para las enzimas EPSPS
de Clase II se han aislado a partir de tres (3) bacterias
diferentes: Agrobacterium tumefaciens sp. cepa CP4,
Achromobacter sp cepa LBAA, y Pseudomonas sp. cepa
PG2982. Los genes de la EPSPS de Clase II de la LBAA y PG2982, se
han determinado que son idénticos y que las proteínas que contienen
los códigos de estos dos genes son muy similares a la proteína de la
CP4 y comparten aproximadamente una identidad del 84% de aminoácidos
con ella. Las enzimas EPSPS de Clase II pueden distinguirse
fácilmente de las EPSPS de Clase I por su incapacidad para
reaccionar con anticuerpos policlonales preparados a partir de
enzimas EPSPS de Clase I bajo condiciones en las cuales otras
enzimas EPSPS de Clase I reaccionarían fácilmente con los
anticuerpos de Clase I.
Usando una sonda de ácido nucléico procedente de
uno de los genes de la EPSPS de Clase II descritos en la presente
invención, pueden aislarse e identificarse fácilmente otras enzimas
EPSPS de Clase II usando técnicas de hibridación estándar. Dicha
sonda procedente de la cepa CP4 se ha preparado y usado para aislar
los genes de la EPSPS de Clase II procedentes de las cepas LBAA y
PG2982. Igualmente, estos genes pueden adaptarse para potenciar la
expresión en plantas mediante metodología conocida. Dicha sonda se
ha usado igualmente para identificar genes homólogos en bacterias
aisladas de novo procedentes de suelos.
Preferiblemente, las enzimas EPSPS de Clase II
están fusionadas a un péptido de tránsito de cloroplasto (CTP) con
el fin de identificar una proteína diana en los cloroplastos de la
planta, dentro de la cual puede introducirse. Los genes quiméricos
que contienen el código de esta proteína de fusión de
CTP-EPSPS de Clase II pueden prepararse con un
promotor apropiado y un sitio de 3'-poliadenilación
para la introducción dentro de una planta deseada mediante
procedimientos estándar.
De acuerdo con ello, en un aspecto, la presente
invención proporciona una nueva clase de EPSP sintasas que exhiben
una baja K_{m} para fosfoenolpiruvato (PEP), una alta relación
V_{max}/K_{m}, y una alta K_{i} para glifosato, de forma que,
cuando se introducen dentro de una planta, la planta se vuelve
tolerante del glifosato, de modo que la actividad catalítica de la
enzima y el metabolismo de la planta se mantiene en un estado
sustancialmente normal. Para los fines de esta exposición, una EPSPS
altamente eficaz se refiere a su eficacia en presencia de
glifosato.
En otro aspecto de la presente invención, se
describe una molécula de ADN de doble hélice que comprende el ADN
que contiene el código de una enzima EPSPS de Clase II. Se describe
una secuencia de ADN de enzima EPSPS de Clase II procedente de tres
fuentes: Agrobacterium sp. cepa CP4, Achromobacter sp.
cepa LBAA y Pseudomonas sp. cepa PG2982.
En un aspecto adicional de la presente
invención, se presenta una sonda de ácido nucléico procedente de un
gen de la EPSPS de Clase II que es adecuada para uso en el rastreo
de genes de la EPSPS de Clase II en otras fuentes, mediante el
ensayo de la capacidad de una secuencia de ADN procedente de la otra
fuente para hibridarse a la sonda.
En otro aspecto aún de la presente invención, se
describen plantas transgénicas y células de plantas transformadas
que se han vuelto tolerantes del glifosato mediante la introducción
de un gen de la EPSPS de Clase II en el genoma de la planta.
En otro aspecto aún adicional de la invención,
se describe una molécula de ADN de doble hélice, recombinante, que
comprende en orden sucesivo:
a) un promotor cuya función en las células de la
planta es causar la producción de una secuencia de ARN;
b) una secuencia de ADN estructural que causa la
producción de una secuencia de ARN que contiene el código de una
enzima de la EPSPS de Clase II; y
c) una región no traducida 3' cuya función en
las células de la planta es causar la adición de una extensión de
poliadenil nucleótidos en el extremo 3' de la secuencia de ARN,
en la que el promotor es heterólogo con respecto
a la secuencia de ADN estructural y adaptado para causar la
suficiente expresión del polipéptido de fusión como para potenciar
la tolerancia al glifosato de una célula de planta transformada con
dicha molécula de ADN.
En otro aspecto aún de la presente invención, se
presenta un procedimiento para controlar de manera selectiva las
malas hierbas en un campo de cultivo, mediante la plantación de
semillas de cultivo o de plantas de cultivo transformadas con un gen
de la EPSPS de Clase II, con el fin de conferirlas tolerancia al
glifosato a las plantas, lo cual, permite la aplicación de
herbicidas que contienen glifosato al cultivo con el fin de matar de
manera selectiva las malas hierbas sensibles al glifosato, pero no a
los cultivos.
Otros y adicionales aspectos, ventajas y objetos
de la invención resultarán evidentes a partir de las figuras de los
dibujos adjuntos y de la descripción de la invención.
La Figura 1 muestra la secuencia de ADN (SEQ ID
NO: 1) para el promotor de longitud total del virus del mosaico de
la celidonia menor (FMV35S).
La Figura 2 muestra el vector de clonación
cósmido pMON17020.
La Figura 3 muestra la secuencia de ADN
estructural (SEQ ID NO: 2) para el gen de la EPSPS de Clase II
procedente de aislado bacteriano de Agrobacterium sp. cepa
CP4 y la secuencia del aminoácido deducido (SEQ ID NO: 3).
La Figura 4 muestra la secuencia de ADN
estructural (SEQ ID NO: 4) para el gen de la EPSPS de Clase II
procedente del aislado bacteriano Achromobacter sp. cepa LBAA
y la secuencia del aminoácido deducido (SEQ ID NO: 5).
La Figura 5 muestra la secuencia del ADN
estructural (SEQ ID NO: 6) para el gen de la EPSPS de Clase II
procedente del aislado bacteriano Pseudomonas sp. cepa PG2982
y la secuencia del aminoácido deducido (SEQ ID NO: 7).
La Figura 6 muestra la comparación Bestfit de la
secuencia de aminoácidos de la EPSPS del E. coli (SEQ ID NO:
8) con la de la EPSPS de la CP4 (SEQ ID NO: 3).
La Figura 7 muestra la comparación Bestfit de la
secuencia de aminoácidos de la EPSPS de la CP4 (SEQ ID NO: 3) con la
de la EPSPS de la LBAA (SEQ ID NO: 5).
La Figura 8 muestra la secuencia del ADN
estructural (SEQ ID NO: 9) para el gen de la EPSPS de Clase II de la
CP4 sintético.
La Figura 9 muestra la secuencia del ADN (SEQ ID
NO: 10) del péptido de tránsito de cloroplasto (CTP) y la secuencia
que contiene el código del aminoácido (SEQ ID NO: 11) derivada a
partir del CTP de la EPSPS de la Arabidopsis thaliana y que
contiene el sitio de restricción SphI en el sitio de transformación
del cloroplasto, denominado aquí más adelante como CTP2.
La Figura 10 muestra la secuencia del ADN (SEQ
ID NO: 12) del péptido de tránsito de cloroplasto y la secuencia que
contiene el código del aminoácido (SEQ ID NO: 13) derivada a partir
del gen de la EPSPS de la Arabidopsis thaliana y que contiene
un sitio de restricción EcoR1 dentro de la región madura de la
EPSPS, denominado aquí más adelante como CTP3.
La Figura 11 muestra la secuencia del ADN (SEQ
ID NO: 14) del péptido de tránsito de cloroplasto y la secuencia que
contiene el código del aminoácido (SEQ ID NO: 15) derivada del CTP
de la EPSPS de la Petunia hybrida y que contiene un sitio de
restricción SphI en el sitio de transformación del cloroplasto y en
la cual se han cambiado los aminoácidos en el sitio de
transformación a -Cys-Met-, denominado aquí más
adelante como CTP4.
La Figura 12 muestra la secuencia del ADN (SEQ
ID NO: 16) del péptido de tránsito de cloroplasto y la secuencia que
contiene el código del aminoácido (SEQ ID NO: 17) derivada del gen
de la EPSPS de la Petunia Hydrida con el sitio EcoRI
producido de manera natural en la región madura del gen de la EPSPS,
denominado aquí más adelante como CTP5.
La Figura 13 muestra un mapa de plásmido del
vector de transformación/expresión CP4 en planta de la CP4, el
pMON17110.
La Figura 14 muestra un mapa de plásmido del
vector de transformación/expresión del gen de la EPSPS sintético de
la CP4 en planta, el pMON17131.
La Figura 15 muestra un mapa de plásmido del
vector de transformación/expresión del ADN libre de la EPSPS de la
CP4 en planta, el pMON13640.
La Figura 16 muestra un mapa de plásmido del
vector de transformación/selección directa de la CP4 en planta, el
pMON17227.
La Figura 17 muestra un mapa de plásmido del
vector de transformación/expresión de la CP4 en planta, el pMON
19653.
La expresión de un gen de una planta que existe
en forma de ADN de doble hebra implica la síntesis del ARN mensajero
(mARN) a partir de una hebra del ADN mediante enzima de ARN
polimerasa, y el posterior tratamiento del transcripto primario del
mARN dentro del núcleo. Este tratamiento implica una región 3' no
traducida que agrega poliadenilato nucleótidos en el extremo 3' del
ARN.
La transcripción del ADN en mARN está regulada
mediante una región de ADN normalmente denominada como
"promotora". La región promotora contiene una secuencia de
bases que indica la asociación de la ARN polimerasa con el ADN,
para iniciar la transcripción en el mARN usando una de las hebras
del ADN como un molde para obtener una hebra de ARN complementario
correspondiente.
En la bibliografía se han descrito un cierto
número de promotores que son activos en células de plantas. Estos
incluyen promotores de nopalina sintasa (NOS) y octopino sintasa
(OCS) (los cuales son portados sobre plásmidos que inducen a tumores
de Agrobacterium tumefaciens), los promotores del virus del
mosaico de la coliflor (CaMV) 19S y 35S, el promotor inducible por
luz procedente de la subunidad pequeña de la ribulosa
bis-fosfato carboxilasa (ssRUBISCO, un polipéptido
de planta muy abundante) y el promotor transcripto de longitud total
procedente del virus del mosaico de la celidonia menor (FMV35S).
Todos estos promotores han sido usados para crear diversos tipos de
constructos de ADN, los cuales han sido expresados en plantas.
Véase, p. ej., la Publicación de la PCT WO 84/02913 (Rogers y otros,
Monsanto).
Los promotores que son conocidos o que se ha
encontrado que causan la transcripción del ADN en células de plantas
pueden usarse en la presente invención. Dichos promotores pueden
obtenerse a partir de una diversidad de fuentes tales como plantas y
ADN de un virus de plantas, e incluyen, aunque no están limitados a
ellos, los promotores CaMV35S y FMV35S y los promotores aislados a
partir de genes de plantas tales como genes ssRUBISCO. Tal como se
describe más adelante, se prefiere que el promotor particular
seleccionado pueda ser capaz de causar la suficiente expresión como
para dar como resultado la producción de una cantidad eficaz de una
EPSPS de Clase II, con el fin de transformar a la planta en
sustancialmente tolerante a los herbicidas de glifosato. La cantidad
de EPSPS de Clase II necesaria para inducir la tolerancia deseada
pueden variar con la especie de planta. Se prefiere que los
promotores usados tengan una expresión relativamente alta en todos
los tejidos meristemáticos, además de en otros tejidos, puesto que
se sabe ahora que el glifosato se transloca y acumula en este tipo
de tejido de plantas. Como alternativa, puede usarse una combinación
de genes quiméricos para obtener resultados acumulativos en el nivel
de expresión general necesario de la enzima EPSPS de Clase II
seleccionada con el fin de producir un fenotipo tolerante del
glifosato.
El mARN producido por un constructo de ADN de la
presente invención contiene también una secuencia conductora 5' no
traducida. Esta secuencia puede derivarse a partir del promotor
seleccionado para expresar el gen, y puede modificarse
específicamente con el fin de incrementar la traducción del mARN.
Las regiones 5' no traducidas pueden obtenerse también a partir de
ARNs víricos, a partir de genes eucarióticos adecuados, o a partir
de una secuencia de gen sintético. La presente invención no está
limitada a los constructos, tal como se presenta en los ejemplos
siguientes, en los cuales la región no traducida deriva tanto de la
secuencia 5' no traducida que acompaña a la secuencia promotora
como de parte de la región 5' no traducida del gen de la proteína de
cubierta del virus. Más bien, la secuencia conductora no traducida
puede derivarse a partir de un promotor no relacionado o de una
secuencia de codificación tal como se expone más adelante. Un
promotor preferido para uso en la presente invención es el promotor
transcripto de longitud total (SEQ ID NO: 1) procedente del virus
del mosaico de la celidonia menor (FMV35S), el cual funciona como un
promotor fuerte y uniforme con expresión particularmente buena en el
tejido meristemático para genes quiméricos insertados en plantas,
particularmente dicotiledonias. La planta transgénica resultante
expresa, en general, la proteína que contiene el código del gen
insertado a un nivel más alto y más uniforme a través de los tejidos
y las células de la planta transformada que el mismo gen impulsado
por un promotor CaMV35S potenciado. Con referencia a la Figura 1, la
secuencia de ADN (SEQ ID NO: 1) del promotor FMV35S está localizada
entre los nucleótidos 6368 y 6930 del genoma del FMV.
Preferiblemente, con el promotor se encuentra acoplada una secuencia
conductora 5'no traducida. La secuencia conductora puede ser del
propio genoma del FMV35S o puede ser de una fuente diferente del
FMV35S.
La región 3' no traducida del gen de la planta
quimérica contiene una señal de poliadenilación que funciona en las
plantas para producir la adición de poliadenilato nucleótidos en el
extremo 3' del ARN vírico. Los ejemplos de regiones 3' adecuadas
son: (1) las regiones 3' no traducidas, transcritas, que contienen
la señal poliadenilada de los genes plásmidos inductores de tumor
(Ti) de Agrobacterium, tal como el gen nopalina sintasa
(NOS), y (2) genes de plantas del tipo de los genes de la proteína
de almacenamiento de la soja y la subunidad pequeña del gen de la
ribulosa-1,5-bisfosfato carboxilasa
(ssRUBISCO). Un ejemplo de una región 3' preferida es la procedente
del gen ssRUBISCO del guisante (E9), descrita con mayor detalle más
adelante.
Los constructos de ADN de la presente invención
contienen también una secuencia de codificación estructural en forma
de ADN de doble hebra que contiene el código de una enzima EPSPS de
Clase II altamente eficaz, tolerante del glifosato.
En un intento para identificar y aislar enzimas
EPSPS altamente eficaces, tolerantes del glifosato, se realizaron
análisis cinéticos de las enzimas EPSPS procedentes de un cierto
número de bacterias que exhibían tolerancia al glifosato o que
habían sido aisladas a partir de fuentes adecuadas. En algunos
casos, se descubrió que las enzimas EPSPS no mostraban tolerancia a
la inhibición por glifosato y se concluyó que el fenotipo de
tolerancia de la bacteria fue debido a una impermeabilidad al
glifosato o a otros factores. Sin embargo, en un cierto número de
casos, se identificaron microorganismos, cuya enzima EPSPS mostró un
grado mayor de tolerancia a la inhibición por glifosato y que
mostraron una baja K_{m} para el PEP cuando se compararon con las
previamente informadas para otras fuentes de plantas y de microbios.
Las enzimas EPSPS procedentes de estos microorganismos se
sometieron, a continuación, a un estudio y análisis posterior.
La Tabla I muestra los datos obtenidos para las
enzimas EPSPS identificadas y aisladas como resultado de los
análisis anteriormente descritos. La Tabla I incluye datos para las
tres enzimas EPSPS de Clase II identificadas que se observaron que
tenían una alta tolerancia de inhibición al glifosato y una baja
K_{m} para el PEP, así como los datos para la EPSPS de la Petunia
nativa y una variante tolerante del glifosato de la EPSPS de Petunia
denominada como GA101. La variante GA101 se denomina de esta forma
debido a que exhibe la sustitución de un resto de alanina por un
resto de glicina en la posición 101 (con respecto a la Petunia) en
la región invariante. Cuando el cambio introducido en la EPSPS de la
Petunia (GA101) se introdujo en un cierto número de otras enzimas
EPSPS, se observaron cambios similares en las cinéticas, una
elevación de la K_{i} para el glifosato y de la K_{m} para el
PEP.
| Fuente de | K_{m} del | K_{i} del glifosato | K_{i}/K_{m} |
| enzima | PEP (\muM) | (\muM) | |
| Petunia | 5 | 0,4 | 0,08 |
| Petunia GA101 | 200 | 2000 | 10 |
| PG2982 | 2,1-3,1^{1} | 25-82 | -8-40 |
| LBAA | -7,3-8^{2} | 60 (est) | -7,9 |
| CP4 | 12^{3} | 2720 | 227 |
| ^{1} Intervalo de PEP ensayado = 1-40 \muM | |||
| ^{2} Intervalo de PEP ensayado = 5-80 \muM | |||
| ^{3} Intervalo de PEP ensayado = 1,5-40 \muM |
La Agrobacterium sp. cepa CP4 se
identificó inicialmente por su capacidad para desarrollarse en
glifosato como una fuente de carbono (10 mM) en presencia de fosfato
1 mM. La cepa CP4 se identificó a partir de una colección obtenida a
partir de una columna inmovilizada de lecho fijo en la que se usaron
esférulas de tierra de diatomeas Mannville R-635. La
columna había estado trabajando durante tres meses con una
alimentación de agua residual procedente de una instalación de
producción de glifosato. La columna contenía 50 mg/ml de glifosato y
NH_{3} en forma de NH_{4}Cl. El carbono orgánico total fue de
300 mg/ml y las DOB (Demanda de Oxígeno Biológico = una medida de
la disponibilidad de carbono "blando") fueron menores de 30
mg/ml. (Esta columna de tratamiento ha sido descrita por Hietkamp y
otros, 1990). Se usó medio salino mínimo de
Dworkin-Foster que contenía glifosato 10 mM y con
fosfato 1 mM para la selección de microbios procedentes de un lavado
de esta columna que fueran capaces de desarrollarse sobre glifosato
como la única fuente de carbono. El medio mínimo de
Dworkin-Foster se obtuvo combinando en un litro de
H_{2}O (tratado
en autoclave), 1 ml de cada A, B y C y 10 ml de D (según se indica más adelante) y de clorhidrato de tiamina (5 mg).
en autoclave), 1 ml de cada A, B y C y 10 ml de D (según se indica más adelante) y de clorhidrato de tiamina (5 mg).
A. Sales D-F (1000 x solución
madre; por 100 ml; tratadas en autoclave):
| H_{3}BO_{3} | 1 mg |
| MnSO_{4}\cdot7H_{2}O | 1 mg |
| ZnSO_{4}\cdot7H_{2}O | 12,5 mg |
| CuSO_{4}\cdot5H_{2}O | 8 mg |
| NaMoO_{3}\cdot3H_{2}O | 1,7 mg |
B. FeSO_{4}\cdot7H_{2}O (1000X solución
madre; por 100 ml; tratado en autoclave)
\hskip3,9cm 0,1 g
C. MgSO_{4}\cdot7H_{2}O (1000X solución
madre; por 100 ml; tratado en autoclave)
\hskip3,9cm 20 g
D. (NH_{4})_{2}SO_{4} (100X
solución madre; por 100 ml; tratado en autoclave)
\hskip3,9cm 20 g
Se agregó extracto de levadura (YE; Difco) hasta
una concentración final de 0,01 ó 0,001%. La cepa CP4 se dejó
desarrollar también sobre medio compuesto de sales
D-F, reformadas tal como se ha indicado
anteriormente, que contenían glucosa, gluconato y citrato (cada uno
de ellos al 0,1%) como fuentes de carbono y con fosfato inorgánico
(0,2-1,0 mM) como la fuente de fósforo.
Se identificaron otros microorganismos que
contenían EPSPS de Clase II como Achromobacter sp. cepa LBAA,
la cual procedía de una colección de bacterias previamente descritas
(Halls y otros, 1988) y Pseudomonas sp. cepa PG2982, la cual
ha sido ya descrita en la literatura (Moore y otros, 1983;
Fitzgibbon, 1988). Previamente, se había informado ya, a partir de
mediciones de lisados brutos, que la enzima EPSPS procedente de la
cepa CP2982 era menos sensible a la inhibición del glifosato que la
del E. coli, pero no se habían informado sobre los detalles
de esta falta de sensibilidad y no se había informado de la K_{m}
para el PEP para esta enzima, ni de la secuencia de ADN para el gen
de esta enzima (Fitzgibbon, 1988; Fitzgibbon y Braymer, 1990).
Todas las proteínas de la EPSPS estudiadas hasta
la fecha han mostrado un grado importante de homología. Por ejemplo,
las EPSPS de plantas y bacterias son aproximadamente un 54%
idénticas y con una semejanza tan alta como del 80%. Dentro de las
propias EPSPS de las bacterias y de las EPSPS de plantas, el grado
de identidad y de semejanza es mucho mayor (véase Tabla II).
| Semejanza | Identidad | ||
| E. coli frente a S. typhimurium | 93,0 | 88,3 | |
| P. hybrida frente a E. coli | 71,9 | 54,5 | |
| P. hybrida frente a tomate | 92,8 | 88,2 | |
| ^{1} \begin{minipage}[t]{140mm} Las secuencias de EPSPS aquí comparadas se obtuvieron de las referencias siguientes: E. coli, Rogers y otros, 1983; S. typhimurium, Stalker, y otros, 1985; Petunia hybrida, Shah y otros, 1986; y Tomate, Gasser y otros, 1988. \end{minipage} |
Cuando se sondaron extractos brutos de bacterias
CP4 y LBAA (50 \mug de proteína) usando anticuerpo
anti-EPSPS de conejo (Padgette y otros, 1987) a la
proteína de la EPSPS de Petunia en un análisis Western, no pudo
detectarse ninguna señal positiva, incluso con tiempos de exposición
ampliados (sistema de revelado Proteína A-^{125}I)
y bajo condiciones en las cuales la EPSS de control (EPSPS de
Petunia, 20 mg; una EPSPS de Clase I) fue fácilmente detectada. La
presencia de actividad de la EPSPS en estos extractos se confirmó
mediante ensayo de enzima. Este resultado sorprendente, que indica
una falta de semejanza entre las EPSPS procedentes de estos aislados
bacterianos y los previamente estudiados, unido a la combinación de
una baja K_{m} para el PEP y una alta K_{i} para glifosato,
ilustra que estas nuevas enzimas de EPSPS son diferentes de las
enzimas de EPSPS conocidas (denominadas actualmente como EPSPS de
Clase I).
Por motivos de claridad y de brevedad de la
descripción, la descripción siguiente del aislamiento de los genes
que contienen el código de las enzimas EPSPS de Clase II está
dirigida al aislamiento de dicho gen a partir de un aislado
bacteriano. Los expertos en la técnica reconocerán que puede usarse
la misma o una estrategia similar para aislar dichos genes a partir
de otras fuentes de aislados microbianos, plantas u hongos.
Una vez establecida la existencia de una EPSPS
adecuada con Agrobacterium sp. cepa CP4, se emprendieron dos
vías paralelas para clonar el gen: la clonación basada en el
fenotipo esperado para una EPSPS tolerante del glifosato; y la
purificación de la enzima para proporcionar material con el fin de
generar anticuerpos y obtener secuencias de aminoácidos procedentes
de la proteína para facilitar la verificación de los clones. A menos
que se indique lo contrario, las técnicas genéticas y de clonación
son generalmente las descritas por Maniatis y otros, 1982 o por
Sambroox y otros, 1987. La estrategia de clonación fue la siguiente:
introducción de un banco cósmido de cepa de Agrobacterium sp.
cepa CP4 dentro de E. coli y selección del gen de la EPSPS
mediante selección del desarrollo sobre concentraciones inhibitorias
de glifosato.
El ADN cromosómico se preparó a partir de cepa
de Agrobacterium sp. cepa CP4 de la forma siguiente: el
sedimento celular procedente de 200 ml de Caldo L (Miller, 1972),
cultivo de fase logarítmica tardía de Agrobacterium sp. cepa
CP4, se resuspendió en 10 ml de Solución I (glucosa 50 mM, EDTA 10
mM, Tris-Cl 25 mM, pH 8,0) (Birnboim y Doly, 1979).
Se agregó SDS hasta una concentración final del 1% y la suspensión
se sometió a 3 ciclos de
congelación-descongelación, consistiendo cada uno de
ellos en la inmersión en hielo seco durante 15 minutos y en agua a
70ºC durante 10 minutos. A continuación, el lisato se extrajo cuatro
veces con volúmenes iguales de fenol:cloroformo (1:1; fenol saturado
con TE; TE = Tris 10 mM, pH 8,0; EDTA 1,0 mM) y las fases se
separaron mediante centrifugación (15.000 g; 10 minutos). Se hizo
sedimentar el material precipitable en etanol a partir del
sobrenadante mediante centrifugación breve (8.000 g; 5 minutos)
seguido de la adición de dos volúmenes de etanol. El sedimento se
resuspendió en 5 ml de TE y se dializó durante 16 horas a 4ºC frente
a dos litros de TE. Esta preparación proporcionó 5 ml de una
solución de ADN de 552 \mug/ml.
El ADN parcialmente restringido se preparó de la
forma siguiente. Se trataron tres muestras alícuotas de 100 \mug
del ADN de CP4 durante 1 hora a 37ºC con endonucleasa de restricción
HindIII a unas proporciones de 4, 2 y 1 unidades de enzima/\mug de
ADN, respectivamente. Las muestras de ADN se agruparon, se diluyeron
a 0,25 mM con EDTA y se extrajeron con un volúmen igual de
fenol:cloroformo. Después de la adición de acetato sódico y etanol,
el ADN se precipitó con dos volúmenes de etanol y se sedimentó
mediante centrifugación (12.000 g; 10 minutos). El sedimento de ADN
seco se resuspendió en 500 \mul de TE y se depositó en capas sobre
un gradiente de sacarosa al 10-40% (en incrementos
del 5% en 5,5 ml cada uno de ellos) en NaCl 0,5 M, Tris 50 mM, pH
8,0, y EDTA 5 mM. Después de centrifugación durante 20 horas a
26.000 rpm en un rotor SW28, los tubos se perforaron y se recogieron
fracciones de aproximadamente 1,5 ml. Se trataron muestras (20
\mul) de cada segunda fracción sobre gel de agarosa al 0,7% y el
tamaño del ADN se determinó mediante comparación con patrones de ADN
lambda linearizados y ADN lambda digeridos con HindIII. Las
fracciones que contenían ADN de fragmentos de 25-35
kb se agruparon, se desalaron sobre columnas AMICON 10 (7.000 rpm;
20ºC; 45 minutos) y se concentraron mediante precipitación. Este
procedimiento proporcionó 15 \mug de ADN de CP4 del tamaño
requerido. Se construyó un banco cósmido usando el vector pMON17020.
Este vector, del cual se presenta un mapa en la Figura 2, está
basado en el replicón pBR327 y contiene el gen de resistencia a la
espectinomicina/estreptomicina (Sp^{r}; spc) procedente del
Tn7 (Fling y otros, 1985), el gen de resistencia al cloranfenicol
(Cn^{r}; cat) procedente del Tn9 (Alton y otros, 1979), la
región promotora 10 del gen procedente del fago T7 (Dunn y otros,
1983), y el fragmento cos de BglII de 1,6 kb del fago lambda
procedente del pHC79 (Hohn y Collins, 1980). Se localizaron un
cierto número de sitios de clonación más abajo del gen cat.
Puesto que el bloque predominante de la expresión de genes
procedentes de otras fuentes microbianas en E. coli parece
tener un alto nivel de transcripción, el uso del promotor T7 y el
suministro de la T7 polimerasa in trans procedente del
plásmido PGP1-2 (Tabor y Richardson, 1985), hace
posible la expresión de grandes segmentos de ADN de ADN extraño,
incluso aquellos que contienen secuencias de terminación de
transcripción de ARN polimerasa. La expresión del gen spc
está perjudicada por la transcripción procedente del promotor T7 de
forma que, únicamente, puede seleccionarse el Cm^{r} en cepas que
contienen pGP1-2. Se prefiere el uso de resistencias
a antibióticos tal como resistencia al Cm, que no usan un componente
de membrana, debido a la observación de que el alto nivel de
expresión de los genes de resistencia que implican un componente de
membrana, es decir, resistencia a \beta-lactamasa
y Amp, da lugar a la generación de un fenotipo tolerante del
glifosato. Presumiblemente, esto es debido a la exclusión del
glifosato de la célula por la proteína de resistencia localizada en
la membrana. Igualmente, se prefiere que el marcador seleccionable
esté orientado en la misma dirección que el promotor T7.
A continuación, el vector se cortó con HindIII y
se trató con fosfatasa alcalina de ternera (CAP) para la preparación
de la clonación. Las secuencias vector y diana se ligaron mediante
la combinación siguiente:
| ADN vector (HindIII/CAP) | 3 \mug |
| Fragmentos HindIII de CP4 | |
| fraccionados en tamaño | 1,5 \mug |
| Tampón de ligamiento 10X | 2,2 \mul |
| ADN ligasa de T4 (New | |
| England Biolabs) (400 U/\mul) | 1,0 \mul |
y agregando H_{2}O hasta 22,0
\mul. Esta mezcla se incubó durante 18 horas a 16ºC. El tampón de
ligamiento 10X está formado por Tris-HCl 250 mM, pH
8,0, MgCl_{2} 100 mM, ditiotreitol 100 mM y espermidina 2 mM. El
ADN ligado
(5 \mul) se encapsidó en partículas de fago lambda (Stratagene; Gigapack Gold) usando el procedimiento del fabricante.
(5 \mul) se encapsidó en partículas de fago lambda (Stratagene; Gigapack Gold) usando el procedimiento del fabricante.
Una muestra 200 \mul de E. coli HB101
(Boyer y Rolland-Dussoix, 1973) que contenía el
plásmido de expresión de polimerasa T7 pGP1-2 (Tabor
y Richardson, 1985) y desarrollada durante una noche en Caldo L (con
maltosa al 0,2% y kanamicina con una concentración de 50 \mug/ml)
se infectó con 50 \mul del ADN encapsidado. Los transformantes se
seleccionaron a 30ºC sobre agar M9 (Miller, 1972) que contenía
kanamicina (50 \mug/ml), cloramfenicol (25 \mug/ml),
L-prolina (50 \mug/ml), L-leucina
(50 \mug/ml) y B1 (5 \mug/ml) y con glifosato 3,0 mM.
Igualmente, se cultivaron muestras alícuotas sobre el mismo medio
que carecían de glifosato con el fin de valorar los cósmidos
encapsidados. Los transformantes cósmidos se aislaron sobre este
último medio en una relación de aproximadamente 5 x 10^{5} por
cada \mug de ADN de HindIII de CP4 después de 3 días a 30ºC. Las
colonias surgieron del agar de glifosato a partir del día 3 hasta el
día 15 con una relación final de aproximadamente 1 por cada 200
cósmidos. El ADN se preparó a partir de 14 clones tolerantes del
glifosato y, después de la verificación de su fenotipo, se
transformaron en E. coli GB100/pGP1-2 (E.
coli GB100 es un derivado aroA de MM294 [Talmadge y
Gilbert, 1980]) y se ensayaron para determinar la complementación
para desarrollarlos en ausencia de aminoácidos aromáticos y ácidos
aminobenzóicos agregados. Podrían usarse y serían igualmente
adecuados para este experimento otras cepas aroA tal como
SR481 (Bachman y otros, 1980; Padgette y otros, 1987). El uso de la
GB100 es puramente a modo de ejemplo y no debe considerarse en un
sentido limitativo. Usualmente, esta cepa aroA requiere que
el medio de desarrollo esté suplementado con
L-fenilalanina, L-tirosina y L-triptófano, cada uno de ellos con una concentración de 100 \mug/ml, y con ácido para-hidroxibenzóico, ácido 2,3-dihidroxibenzóico y ácido para-aminobenzóico, cada uno de ellos con una concentración de 5 \mug/ml, para desarrollo en medio mínimo. De los 14 cósmidos ensayados, únicamente uno mostró complementación del fenotipo aroA. Los transformantes de este cósmido, el pMON17076, mostraron un desarrollo débil pero uniforme sobre el medio mínimo no suplementado después de 10 días.
L-fenilalanina, L-tirosina y L-triptófano, cada uno de ellos con una concentración de 100 \mug/ml, y con ácido para-hidroxibenzóico, ácido 2,3-dihidroxibenzóico y ácido para-aminobenzóico, cada uno de ellos con una concentración de 5 \mug/ml, para desarrollo en medio mínimo. De los 14 cósmidos ensayados, únicamente uno mostró complementación del fenotipo aroA. Los transformantes de este cósmido, el pMON17076, mostraron un desarrollo débil pero uniforme sobre el medio mínimo no suplementado después de 10 días.
Las proteínas codificadas por los cósmidos se
determinaron in vivo usando un sistema de expresión T7 (Tabor
y Richardson, 1985). Los cultivos de E. coli que contenían
pGP1-2 (Tabor y Richardson, 1985) y los cósmidos de
ensayo y de control se desarrollaron a 30ºC en Caldo L (2 ml) con
cloramfenicol y kanamicina (25 y 50 \mug/ml, respectivamente)
hasta una lectura de Klett de aproximadamente 50. Se retiró una
parte alícuota y las células se recogieron mediante centrifugación,
se lavaron con sales M9 (Miller, 1972) y se resuspendieron en 1 ml
de medio M9 que contenía glucosa al 0,2% y tiamina con una
concentración de 20 \mug/ml y que contenía los 18 aminoácidos al
0,01% (menos cisteína y metionina). Después de incubación a 30ºC
durante 90 minutos, los cultivos se transfirieron a un baño de agua
a 42ºC y se mantuvieron en él durante 15 minutos. Se agregó
Rifampicina (Sigma) a una concentración de 200 \mug/ml y los
cultivos se mantuvieron a 42ºC durante 10 minutos adicionales y, a
continuación, se transfirieron a a un baño a 30ºC durante 20
minutos. Las muestras se trataron en un medio pulsante con 10
\muCi de ^{35}S-metionina durante 5 minutos a
30ºC. Las células se recogieron mediante centrifugación y se
resuspendieron en 60-120 \mul de tampón de
fraccionamiento (Tris-HCl 60 mM, pH 6,8, SDS al 1%,
2-mercaptoetanol al 1%, glicerol al 10% y azul de
bromofenol al 0,01%). Se trataron por electroforésis muestras
alícuotas sobre SDS-PAGE al 12,5% y después de
agitación durante 60 minutos en 10 volúmenes de ácido
acético:metanol:agua (10:30:60), el gel se agitó en
ENLIGHTNING^{TM} (DU PONT) siguiendo las instrucciones del
fabricante, se secó y se expuso a -70ºC a una película de rayos X.
Se detectaron proteínas de aproximadamente un tamaño de 45 kd,
marcadas con ^{35}S-metionina en un cierto número
de cósmidos, incluyendo el pMON17076.
Todos los procedimientos de purificación de
proteínas se realizaron a 3-5ºC. Los ensayos de
enzima EPSPS se realizaron usando o bien el procedimiento de
liberación de fosfato o bien el de HPLC radioactivo, tal como ha
sido previamente descrito por Padgette y otros, 1987, usando
concentraciones de sustrato de fosfoenol piruvato 1 mM (PEP,
Boehringer) y siquimato-3-fosfato
(S3P) 2 mM. Para los ensayos de HPLC radioactivos, se usó
^{14}C-PEP (Amersham). El S3P se sintetizó tal
como ha sido descrito previamente por Wibbenmeyer y otros, 1988. El
secuenciado de aminoácidos N-terminales se realizó
cargando las muestras en un filtro preciclado de Polybrene en
partes alícuotas, al mismo tiempo que se secaban. Se usó la química
de degradación de Edman automatizada para determinar la secuencia
N-terminal de la proteína, usando un secuenciador de
fase gaseosa Applied Biosystems Modelo 470A (Hunkapiller y otros,
1983) con un analizador PTH de Applied Biosystems 120A.
Se realizaron cinco fermentaciones de 10 litros
sobre un aislado "liso" espontáneo de cepa CP4 que mostró menor
agregación cuando se desarrolló en cultivo líquido. Esta menor
agregación y morfología lisa de la colonia puede ser debida a una
producción reducida de polisacáridos por este aislado. En la sección
siguiente referente a la purificación de la enzima EPSPS, la CP4 se
refiere al aislado "liso", el CP4-S1. Las
células procedentes de los tres lotes que mostraron actividades
específicas más elevadas se agruparon. La pasta de células de
Agrobacterium sp. CP4 (300 g) se lavó dos veces con 0,5 l de
solución salina al 0,9% y se recogió mediante centrifugación (30
minutos; 8.000 rpm en un rotor Sorval modelo GS3). El sedimento de
células se suspendió en 0,9 l de tampón de extracción
(Tris-Cl 100 mM, EDTA 1 mM, BAM (benzamidina) 1 mM,
DTT 5 mM y glicerol al 10%, pH 7,5) y se lisó mediante 2 pases a
través de una célula Manton Gaulin. La solución resultante se
centrifugó (30 minutos; 8.000 rpm) y el sobrenadante se trató con
0,21 l de sulfato de protamina al 1,5% (en Tris-Cl
100 mM, pH 7,5, 0,2% p/v de concentración final de sulfato de
protamina). Después de agitación durante 1 hora, la mezcla se
centrifugó (50 minutos; 8.000 rpm) y el sobrenadante resultante se
trató con sulfato amónico sólido hasta saturación al 40% y se agitó
durante 1 hora. Después de centrifugación (50 minutos; 8.000 rpm),
el sobrenadante resultante se trató con sulfato amónico sólido hasta
una saturación del 70%, se agitó durante 50 minutos y la proteína
insoluble se recogió por centrifugación (1 hora; 8.000 rpm). Esta
fracción de sulfato amónico al 40-70% se disolvió, a
continuación, en tampón de extracción para dar un volúmen final de
0,2 l y se dializó dos veces (tratamiento en tubos de diálisis de
P.M. 10.000 de corte, Spectrum) frente a 2 l de tampón de extracción
durante un total de 12 horas.
A la fracción de sulfato amónico al
40-70% dializada resultante (0,29 l) se agregó
sulfato amónico sólido para obtener una concentración final de 1 M.
Este material se cargó ( 2 ml/min) en una columna (5 cm x 15 cm; 259
ml) empaquetada con resina de fenil Sefarosa CL-4B
(Pharmacia) equilibrada con tampón de extracción que contenía
sulfato amónico 1 M y se lavó con el mismo tampón (1,5 l; 2 ml/min).
La EPSPS se eluyó con un gradiente lineal de tampón de extracción de
sulfato amónico que abarcaba desde 1 M hasta 0,00 M (volúmen total
de 1,5 l; 2 ml/min). Las fracciones se recogieron (20 ml) y se
ensayaron para determinar la actividad de la EPSPS mediante el
ensayo de liberación de fosfato. Las fracciones con la actividad de
la EPSPS más elevada (fracciones 36-50) se
agruparon y se dializaron frente a 3 x 2 l (18 horas) de
Tris-Cl 10 mM, KCl 25 mM, EDTA 1 mM, DTT 5 mM y
glicerol al 10%,
pH 7,8.
pH 7,8.
El extracto de la EPSPS dializado (350 ml) se
cargó (5 ml/min) en una columna (2,4 cm x 30 cm; 136 ml) empaquetada
con resina Q-Sefarosa de flujo rápido (Pharmacia)
equilibrada con Tris-Cl 10 mM, KCl 25 mM, DTT 5 mM y
glicerol al 10%, pH 7,8 (tampón Q-Sefarosa) y se
lavó con 1 l del mismo tampón. La EPSPS se eluyó con un gradiente
lineal de tampón Q-Sefarosa con KCl que abarcaba
desde 0,025 M hasta 0,40 M (volúmen total de 1,4 l; 5 ml/min). Las
fracciones se recogieron (15 ml) y se ensayaron para determinar la
actividad de la EPSPS mediante el ensayo de liberación de fosfato.
Las fracciones con la actividad de la EPSPS más elevada (fracciones
47-60) se agruparon y la proteína se precipitó
agregando sulfato amónico sólido hasta saturación al 80% y agitando
durante 1 hora. La proteína precipitada se recogió mediante
centrifugación (20 minutos; 12.000 rpm en un rotor Sorvall modelo
GSA), se disolvió en tampón Q-Sefarosa (volúmen
total de 14 ml) y se dializó frente al mismo tampón (2 x 1 l; 18
horas).
El extracto de la EPSPS purificado parcialmente
dializado resultante (19 ml) se cargó (1,7 ml/min) en una columna
Mono Q 10/10 (Pharmacia) equilibrada con tampón
Q-Sefarosa y se lavó con el mismo tampón (35 ml). La
EPSPS se eluyó con un gradiente lineal de KCl de 0,025 M hasta 0,35
M (volúmen total de 119 ml; 1,7 ml/min). Las fracciones se
recogieron (1,7 ml) y se ensayaron para determinar la actividad de
la EPSPS mediante el ensayo de liberación de fosfato. Las fracciones
con la actividad de la EPSPS más alta (fracciones
30-37) se agruparon (6 ml).
La agrupación con Mono Q se realizó en sulfato
amónico 1 M mediante la adición de sulfato amónico sólido y se
cromatografiaron partes alícuotas de 2 ml sobre una columna de Fenil
Superosa 5/5 (Pharmacia) equilibrada con Tris-Cl 100
mM, DTT 5 mM, sulfato amónico 1 M y glicerol al 10%, pH 7,5 (tampón
de Fenil Superosa). Las muestras se cargaron (1 ml/min), se lavaron
con tampón de Fenil Superosa (10 ml) y se eluyeron con un gradiente
lineal de tampón de Fenil Superosa con sulfato amónico que abarcaba
desde 1 M hasta 0,00 M (volúmen total de 60 ml; 1 ml/min). Las
fracciones se recogieron (1 ml) y se ensayaron para determinar la
actividad de la EPSPS mediante el ensayo de liberación de fosfato.
Las fracciones procedentes de cada ensayo con la actividad de la
EPSPS más elevada (fracciones aproximadamente 36-40)
se agruparon conjuntamente (10 ml; 2,5 mg de proteína). Para la
determinación de la secuencia de aminoácidos
N-terminales, se dializó una porción de una fracción
(#39 procedente del ensayo 1) frente a NaHCO_{3} 50 mM (2 x 1 l).
Se encontró que la muestra de EPSPS pura resultante (0,9 ml; 77
\mug de proteína) exhibía una secuencia de aminoácidos
N-terminales de:
| XH(G)ASSRPATARKSS(G)LX(G)(T)V(R)IPG(D)(K)(M) | (SEQ ID NO: 18). |
En esta y en todas las secuencias de aminoácidos
que figuran a continuación, se usó la nomenclatura de letra única
estándar. Todas las estructuras de péptidos representadas en la
descripción siguiente se muestran en el formato convencional, en el
cual, el grupo amino en el N-terminal aparece a la
izquierda y el grupo carboxilo en el C-terminal a la
derecha. Igualmente, la nomenclatura de aminoácidos para los
aminoácidos que se producen de manera natural encontrados en la
proteína es la siguiente: alanina (Ala; A), asparagina (Asn; N),
ácido aspártico (Asp; D), arginina (Arg; R), cisteína (Cys; C),
ácido glutámico (Glu; E), glutamina (Gln; Q), glicina (Gly; G),
histidina (His; H), isoleucina (Ile; I), leucina (Leu; L), lisina
(Lys; K), metionina (Met; M), fenilalanina (Phe; F), prolina (Pro;
P), serina (Ser; S), treonina (Thr; T), triptófano (Trp; W),
tirosina (Tyr; Y) y valina (Val; V). Se usó una "X" cuando el
resto de aminoácido es desconocido y los paréntesis designan que no
es posible una asignación inequívoca y la designación del aminoácido
comprendido entre los paréntesis es la estimación más probable en
base a la información
conocida.
conocida.
Las fracciones agrupadas de la EPSPS en Fenil
superosa restantes se dializaron frente a Tris-Cl 50
mM, DTT 2 mM, KCl 10 mM y glicerol al 10%, pH 7,5 (2 x 1 l). Se
cargó (1 ml/min) una parte alícuota (0,55 ml; 0,61 mg de proteína)
sobre una columna Mono Q 5/5 (Pharmacia) equilibrada con tampón Q
Sefarosa, se lavó con el mismo tampón (5 ml) y se eluyó con un
gradiente lineal de tampón Q Sefarosa con KCl que abarcaba desde
0-0,14 M en 10 minutos y, a continuación, se
mantuvieron en KCl 0,14 M (1 ml/min). Las fracciones se recogieron
(1 ml) y se ensayaron para determinar la actividad de la EPSPS
mediante el ensayo de liberación de fosfato y se sometieron a
SDS-PAGE (Phast System al 10-15%,
Pharmacia teñido con plata) para determinar la pureza de la
proteína. Las fracciones que exhibieron una banda única de proteína
mediante SDS-PAGE (22-25; 222
\mug) se agruparon y dializaron frente a bicarbonato amónico 100
mM, pH 8,1 (2 x 1 l; 9 horas).
A la EPSPS del Agrobacterium sp. cepa CP4
pura resultante (111 \mug) se agregaron 3 \mug de tripsina
(Calbiochem) y se dejó que se desarrollara la reacción de
tripsinolisis durante 16 horas a 37ºC. A continuación, el digesto
tríptico se cromatografió (1 ml/min) sobre una columna HPLC de fase
inversa C18 (Vydac) tal como ha sido previamente descrito por
Padgette y otros, 1988 para la EPSPS de E. coli. Para todas
estas purificaciones de péptidos, al ácido trifluoroacético al 0,1%
(TFA, Pierce) se le designó como tampón "RP-A"
y al TFA al 0,1% en acetonitrilo como tampón
"RP-B". El gradiente usado para la elución de
la EPSPS de Agrobacterium sp. CP4 tripsilizada fue:
0-8 minutos, RP-B al 0%;
8-28 minutos, RP-B al
0-15%; 28-40 minutos,
RP-B al 15-21%;
40-68 minutos, RP-B al
21-49%; 68-72 minutos,
RP-B al 49-75%;
72-74 minutos, RP-B al
75-100%. Se recogieron las fracciones (1 ml) y, en
base al perfil de elución a 210 nM, se produjeron al menos 70
péptidos distintos a partir de la EPSPS tripsilizada. Las
fracciones 40-70 se evaporaron hasta sequedad y se
redisolvieron en 150 \mul cada una de ellas de acetonitrilo al 10%
y ácido trifluoroacético al 0,1%.
La fracción de péptido 61 se purificó
adicionalmente sobre la columna C18 mediante el gradiente:
0-5 minutos, RP-B al 0%;
5-10 minutos, RP-B al
0-38%; 10-30 minutos,
RP-B al 38-45%. Las fracciones se
recogieron en base a la señal de UV a 210 nm. Un pico grande de
péptido en la fracción 24 eluyó con RP-B al 42%, se
secó, se resuspendió tal como se ha descrito anteriormente y se
recromatografió sobre columna C18 con el siguiente gradiente:
0-5 minutos, RP-B al 0%;
5-12 minutos, RP-B al
0-38%; 12-15 minutos,
RP-B al 38-39%;
15-18 minutos, RP-B al 39%;
18-20 minutos, RP-B al
39-41%; 20-24 minutos,
RP-B al 41%; 24-28 minutos,
RP-B al 42%. El péptido de la fracción 25, que eluyó
con RP-B al 41% y que se designó como péptido
61-24-25, se sometió a secuenciación
de aminoácido N-terminal, determinándose la
secuencia siguiente:
| APSM(I)(D)EYPILAV | (SEQ ID NO: 19) |
El péptido tríptico de la fracción 53 de la
EPSPS de la CP4 se purificó adicionalmente mediante HPLC en columna
C18 mediante el gradiente: B al 0% (5 minutos), B al
0-30% (5-17 minutos), B al
30-40% (17-37 minutos). El péptido
de la fracción 28, que eluyó con B al 34% y que se designó como
péptido 53-18, se sometió a secuenciación de
aminoácido N-terminal, determinándose la secuencia
siguiente:
| ITGLLEGEDVINTGK | (SEQ ID NO: 20). |
Con el fin de verificar el clon cósmido de la
EPSPS de la CP4, se designaron un cierto número de sondas de
oligonucleótidos en base a la secuencia de dos de las secuencias
trípticas procedentes de la enzima CP4 (Tabla III). La sonda
identificada como MID mostró una degeneración muy baja y se usó para
el rastreo inicial. Las sondas identificadas como
EDV-C y EDV-T estaban basadas en las
mismas secuencias de aminoácidos y diferían en una posición
(subrayada en la Tabla III más adelante) y se usaron como sondas
confirmatorias, esperándose únicamente un positivo de una de estas
dos sondas. En los oligonucleótidos que se muestran a continuación,
los nucleótidos alternativos aceptables para una posición particular
se designan mediante una "/" tal como A/C/T.
| PEPTIDO 61-24-25 APSM(I)(D)EYPILAV | (SEQ ID NO: 19) | |
| Sonda MID; 17-mero; sonda mezclada; 24 veces degenerado | ||
| ATGATA/C/TGAC/TGAG/ATAC/TCC | (SEQ ID NO: 21) | |
| PEPTIDO 53-28 ITGLLEGEDVINTGK | (SEQ ID NO: 20) | |
| Sonda EDV-C; 17-mero; sonda mezclada; 48 veces degenerado | ||
| GAA/GGAC/TGTA/C/G/TATA/C/TAACAC | (SEQ ID NO: 22) | |
| Sonda EDV-T; 17-mero;sonda mezclada; 48 veces degenerado | ||
| GAA/GGAC/TGTA/C/G/TATA/C/TAATAC | (SEQ ID NO: 23) |
Las sondas se marcaron usando
gamma-^{32}P-ATP y polinucleótido
quinasa. El ADN procedente de 14 de los cósmidos anteriormente
descritos se restringieron con EcoRI, se transfierieron a la
membrana y se sondaron con las sondas de oligonucleótidos. Las
condiciones usadas fueron las siguientes: la prehibridación se
realizó en 6 x de SSC y 10 x de Denhardt durante períodos de
2-18 horas a 60ºC, y la hibridación se realizó
durante 48-72 horas en 6 x SSC, 10 x de Denhardt y
100 \mug/ml de tARN a 10ºC por debajo de la T_{d} para la sonda.
La T_{d} de la sonda se obtuvo aproximadamente mediante la
fórmula: 2ºC x (A + T) + 4ºC x (G + C). A continuación, los filtros
se lavaron tres veces con 6 x de SSC durante diez minutos cada uno
de ellos a temperatura ambiente, se secaron y se autoradiografiaron.
Usando la sonda MID, un fragmento de aproximadamente 9,9 kb en el
cósmido pMON17076 dió la única señal positiva. A continuación, este
ADN cósmido se sondó con las sondas EDV-C (SEQ ID
NO: 22) y EDV-T (SEQ ID NO: 23) separadamente y
nuevamente esta banda de aproximadamente 9,9 kb dió una señal y
únicamente con la sonda
EDV-T.
EDV-T.
Los datos combinados sobre el fenotipo tolerante
del glifosato, la complementación del fenotipo AroA de E.
coli, la expresión de una proteína de aproximadamente 45 kd, y
la hibridación de dos sondas derivadas de la secuencia de los
aminoácidos de la EPSPS de la CP4, sugieren fuertemente que el
cósmido pMON17076 contiene el gen de la EPSPS.
El gen de la EPSPS de la CP4 se localizó
posteriormente de la forma siguiente: se realizaron un cierto número
de análisis Southern adicionales sobre diferentes digestos de
restricción de pMON17076 usando las sondas MID (SEQ ID NO: 21) y
EDV-T (SEQ ID NO: 23), separadamente. En base a
estos análisis y a posteriores mapas de restricción elaborados
detalladamente de los subclones pBlueScript (Stratagene) del
fragmento de aproximadamente 9,9 kb procedente del pMON17076, se
identificó un fragmento EcoRI-SalI de 3,8 kb al cual
se hibridaron ambas sondas. Así mismo, este análisis mostró que las
sondas MID (SEQ ID NO: 21) y EDV-T (SEQ ID NO: 23)
se hibridaron a lados diferentes de los sitios BalHI, ClaI y SacII.
Este fragmento de 3,8 kb se clonó en ambas orientaciones en
pBlueScript para formar pMON17081 y pMON17082. A continuación, se
determinaron los fenotipos impartidos a E. coli por estos
clones. La tolerancia al glifosato se determinó mediante
transformación en E. coli MM294 que contenía
pGP1-2 (el pBlueScript contiene también un promotor
T7) sobre medio agar M9 que contenía glifosato 3 mM. Ambos pMON17081
y pMON17082 mostraron colonias tolerantes del glifosato a los tres
días a 30ºC con un tamaño aproximadamente la mitad de los controles
sobre el mismo medio que carecía de glifosato. Este resultado
sugiere que el fragmento de 3,8 kb contiene un gen intacto de la
EPSPS. La evidente falta de dependencia de la orientación de este
fenotipo puede explicarse por la presencia del promotor T7 en un
lado de los sitios de clonación y del promotor lac en el
otro. El fenotipo aroA se determinó en transformantes de
E. coli GB100 sobre medio agar M9 que carecía de suplementos
aromáticos. En este experimento, realizado con y sin el inductor
Plac IPTG, el pMON17082 mostró un desarrollo muy superior al
de pMON17081, lo que sugiere que el gen de la EPSPS se expresó desde
el sitio SalI hacia el sitio EcoRI.
La secuenciación de nucleótidos se inició a
partir de un cierto número de extremos de sitios de restricción,
incluyendo el sitio BamHI anteriormente expuesto. En el lado SalI de
este sitio BamHI se localizaron secuencias que contenían el código
de secuencias de proteínas que eran muy íntimamente compatibles con
la secuencia de la proteína N-terminal y con la del
fragmento tríptico 53-28 (SEQ ID NO: 20) (la base de
la sonda EDV-T) (SEQ ID NO: 23). Estos datos
proporcionaron la evidencia concluyente para la clonación del gen de
la EPSPS de la CP4 y para la dirección de la transcripción de este
gen. Estos datos emparejados con los datos de los mapas de
restricción elaborados indicaron, igualmente, que el gen completo
estaba localizado sobre un fragmento XhoI de aproximadamente 2,3 kb
y que este fragmento se subclonó dentro del pBlueScript. La
secuencia del nucleótido de al menos 2 kb de este fragmento se
determinó mediante una combinación de secuenciación a partir de los
fragmentos de restricción clonados y mediante el uso de cebadores
específicos para extender la secuencia. En la Figura 3 se muestra la
secuencia del nucleótido del gen de la EPSPS de la CP4 y las
regiones flanqueantes (SEQ ID NO: 2). Igualmente, se localizó la
secuencia que corresponde al péptido
61-24-25 (SEQ ID NO: 19). La
secuencia se determinó usando tanto el equipo Sequenase de IBI
(International Biotechnologies Inc.) como el epuipo Deaza de
secuenciación de T7 de Pharmacia.
Dicho gen clonado que contiene el código de la
actividad de la EPSPS purificada procedente del Agrobacterium
sp. cepa CP4, se verificó de la forma siguiente: mediante una serie
de mutagénesis dirigidas al sitio, los sitios BglII y NcoI se
situaron en el N-terminal con el fMet contenido
dentro de la secuencia de reconocimiento NcoI, se eliminó el primer
sitio NcoI interno (el segundo sitio NcoI interno se eliminó
posteriormente) y se situó un sitio SacI después de los codones de
parada. En una fase posterior, se eliminó igualmente el sitio NotI
interno mediante mutagénesis dirigida al sitio. La lista siguiente
incluye los cebadores para la mutagénesis dirigida al sitio
(adición o eliminación de sitios de restricción) del gen de la EPSPS
de la CP4. La mutagénesis se realizó mediante los procedimientos de
Kunkel y otros (1987), esencialmente tal como han sido descritos por
Sambrook y otros (1989).
CEBADOR BgNc (adición de los sitios BglII
y NcoI al N-terminal)
| CGTGGATAGATCTAGGAAGACAACCATGGCTCACGGTC | (SEQ ID NO: 24) |
\vskip1.000000\baselineskip
CEBADOR Sph2 (adición del sitio SphI al
N-terminal)
| GGATAGATTAAGGAAGACGCGCATGCTTCACGGTGCAAGCAGCC | (SEQ ID NO: 25) |
\vskip1.000000\baselineskip
CEBADOR S1 (adición del sitio SacI
inmediatamente después de los codones de parada)
| GGCTGCCTGATGAGCTCCACAATCGCCATCGATGG | (SEQ ID NO: 26) |
\vskip1.000000\baselineskip
CEBADOR N1 (eliminación del sitio de
reconocimiento interno NotI)
| CGTCGCTCGTCGTGCGTGGCCGCCCTGACGGC | (SEQ ID NO: 27) |
\vskip1.000000\baselineskip
CEBADOR Nco1 (eliminación del primer
sitio de reconocimiento interno NcoI)
| CGGGCAAGGCCATGCAGGCTATGGGCGCC | (SEQ ID NO: 28) |
\vskip1.000000\baselineskip
CEBADOR Nco2 (eliminación del segundo
sitio de reconocimiento interno NcoI)
| CGGGCTGCCGCCTGACTATGGGCCTCGTCGG | (SEQ ID NO: 29) |
\vskip1.000000\baselineskip
A continuación, este gen de la EPSPS de la CP4
se clonó como un fragmento N-terminal
NcoI-BamHI más un fragmento
C-terminal BamHI-SacI dentro de un
vector de expresión PrecA-gene 10L similar a los
descritos (Wong y otros, 1988; Olins y otros, 1988) para formar el
pMON17101. La K_{m} para el PEP y la K_{i} para el glifosato se
determinaron para la actividad de la EPSPS en lisatos brutos de
transformantes pMON17101/GB100 después de inducción con ácido
nalidíxico (Wong y otros, 1988) y se encontró que era la misma que
se había determinado para las preparaciones de enzima purificada y
bruta procedentes de Agrobacterium sp. cepa CP4.
Se construyó un banco de cósmidos del ADN de la
LBAA parcialmente restringido con HindIII en E. coli MM294
en el vector pHC79 (Hohn y Collins, 1980). Este banco se sondó con
una sonda del gen de la EPSPS de la CP4 de longitud total mediante
hibridación de colonias y los clones positivos se identificaron a
una relación de aproximadamente 1 por cada 400 cósmidos. El gen de
la EPSPS de la LBAA se localizó posteriormente en estos cósmidos
mediante análisis Southern. El gen se localizó sobre un fragmento
XhoI de aproximadamente 2,8 kb y, mediante una serie de etapas de
secuenciación, tanto a partir de extremos de fragmentos de
restricción como mediante el uso de los cebadores de
oligonucleótidos procedentes de la secuenciación del gen de la EPSPS
de la CP4, se completó la secuencia del nucleótido del gen de la
EPSPS de la LBAA, la cual se presenta en la Figura 4 (SEQ ID NO:
4).
Igualmente, se clonó el gen de la EPSPS
procedente de la PG2982. La proteína de la EPSPS se purificó,
esencialmente, tal como se describió para la enzima de la CP4, con
las siguientes diferencias: después de tratamiento en la columna de
Sefarosa CL-4B, las fracciones con la actividad de
la EPSPS más alta, se agruparon y la proteína se precipitó agregando
sulfato amónico sólido hasta saturación al 85% y agitación durante 1
hora. La proteína precipitada se recogió mediante centrifugación, se
resuspendió en tampón Q-Sefarosa y después de
diálisis frente al mismo tampón se cargó sobre la columna (al igual
que en el caso de la enzima de la CP4). Después de purificación
sobre la columna Q-Sefarosa, se cargaron
aproximadamente 40 mg de proteína en Tris 100 mM, pH 7,8, glicerol
al 10%, EDTA 1 mM, DTT 1 mM y sulfato amónico 1 M sobre una columna
de Fenil Superosa (Pharmacia). La columna se eluyó a 1,0 ml/minuto
con un gradiente de 40 ml de sulfato amónico desde 1,0 M hasta 0,00
M en el tampón anterior.
Aproximadamente, se cargaron 1,0 mg de proteína
procedente de las fracciones activas de la columna de Fenil Superosa
10/10 sobre una columna Mono P 5/10 Chromatofocusing de Pharmacia
con una velocidad de flujo de 0,75 ml/minuto. El tampón de partida
fue bis-Tris 25 mM, pH 6,3, y la columna se eluyó
con 39 ml de Polybuffer 74, pH 4,0. Aproximadamente, se dializaron
50 \mug de la fracción pico procedente de la columna
Chromatofocusing en bicarbonato amónico 25 mM. A continuación, esta
muestra se usó para determinar la secuencia de aminoácidos
N-terminales.
La secuencia N-terminal obtenida
fue la siguiente:
XHSASPKPATARRSE
(en la que X = un resto no
identificado) (SEQ ID NO: 30). Se designaron un cierto número de
sondas de oligonuclótidos degenerados en base a su secuencia y se
usaron para sondar una biblioteca de PG2982 de ADN de HindIII
parcial en el cósmido pHC79 (Hohn y Collins, 1980) mediante
hibridación de colonias bajo condiciones no restrictivas. Las
condiciones de lavado finales fueron 15 minutos con 1 x de SSC y SDS
al 0,1% a 55ºC. Una sonda con la secuencia GCGGTBGCSGGYTTSGG (en la
que B = C, G o T; S = C o G, y Y = C o T) (SEQ ID NO: 31)
identificó un grupo de clones de
cósmidos.
El grupo de cósmidos identificados de esta
manera estaba formada por cósmidos de diversos fragmentos HindIII.
Sin embargo, cuando este grupo se sondó con la sonda del gen de la
EPSPS de la CP4, se identificó un cósmido que contenía el gen de la
EPSPS de la PG2982 (designado originalmente como cósmido 9C1 y
posteriormente como pMON20107). Mediante una serie de mapas de
restricción y de análisis Southern, este gen se localizó en un
fragmento XhoI de aproximadamente 2,8 kb y se determinó la secuencia
de nucleótidos de este gen. Esta secuencia de ADN (SEQ ID NO: 6) se
muestra en la Figura 5. No existen diferencias de nucleótidos entre
las secuencias de genes de la EPSPS procedente de la LBAA (SEQ ID
NO: 4) y la PG2982 (SEQ ID NO: 6). Los parámetros cinéticos de las
dos enzimas entran dentro del margen del error experimental.
Un gen procedente de la PG2982 que imparte
tolerancia al glifosato en E. coli ha sido ya secuenciado
(Fitzgibbon, 1988; Fitzgibbon y Brayner, 1990). La secuencia del gen
de la EPSPS de Clase II de la PG2982 no muestra homología con la
secuencia previamente informada, lo que sugiere que el fenotipo
tolerante del glifosato del trabajo previo no está relacionado con
la EPSPS.
En la presente invención se han aislado y
descrito un cierto número de genes de Clase II. Resulta obvio que la
clonación del gen inicial, la del gen procedente de la CP4, fue
difícil debido al bajo grado de similitud entre las enzimas de Clase
I y de Clase II y los genes. Sin embargo, la identificación de otros
genes estuvo grandemente facilitada mediante el uso de este primer
gen como una sonda. En la clonación del gen de la EPSPS de la LBAA,
la sonda del gen de la CP4 permitió la rápida identificación de
clones de cósmidos y la localización del gen intacto a un pequeño
fragmento de restricción y parte de los cebadores de secuenciación
de la CP4 se usaron, igualmente, para secuenciar el gen(es)
de la EPSPS de la LBAA (y de la PG2982). Igualmente, la sonda del
gen de la CP4 se usó para confirmar el clon del gen de la PG2982. El
alto grado de similitud de los genes de la EPSPS de Clase II puede
usarse para identificar y clonar genes adicionales, en gran parte,
de la misma manera que se han usado las sondas de genes de la EPSPS
de Clase I para clonar otros genes de Clase I. Un ejemplo de esto
último fue la clonación del gen de la EPSPS de la A. thaliana
usando el gen de la P. hybrida como una sonda (Klee y otros,
1987).
Existen informes previos sobre la actividad de
la EPSPS tolerante del glifosato EPSP sintetasas procedente de un
cierto número de fuentes. Estas enzimas no han sido caracterizadas
de ninguna manera en la mayoría de los casos. El uso de sondas del
gen de la EPSPS de Clase I y de Clase II o de sondas de anticuerpos
proporciona un medio rápido para rastrear inicialmente la naturaleza
de la EPSPS y proporciona herramientas para la rápida clonación y
caracterización de los genes de dichas enzimas.
Dos de los tres genes descritos se aislaron a
partir de bacterias que se habían aislado a partir de una
instalación de tratamiento de glifosato (cepas CP4 y LBAA). El
tercero (PG2982) se aisló a partir de una bacteria que había sido
aislada a partir de una cepa de colección de cultivos. Este último
aislamiento sugiere que la exposición al glifosato puede no ser un
requisito previo para el aislamiento de enzimas de EPSPS altamente
tolerantes del glifosato y que el rastreo de colecciones de
bacterias puede proporcionar aislados adicionales. Es posible
enriquecer poblaciones microbianas resistentes al glifosato o
degradantes del glifosato (Quinn y otros, 1988; Talbot y otros,
1984) en los casos en los que se estima que dicho enriquecimiento en
dichos microorganismos pudiera potenciar la frecuencia de
aislamiento de microorganismos de la EPSPS de Clase II. Igualmente,
se identificaron bacterias adicionales que contenían el gen de la
EPSPS de Clase II. Una bacteria denominada C12, aislada a partir de
las mismas esférulas de la columna de tratamiento que la CP4 (véase
anteriormente) pero en un medio en el cual el glifosato se
suministró tanto como la fuente de carbono como la de fósforo, fue
mostrada mediante análisis Southern para hibridarse con una sonda
formada por la secuencia de codificación de la EPSPS de la CP4. Este
resultado, conjuntamente con el de la cepa LBAA, sugiere que este
procedimiento de enriquecimiento facilita la identificación de
aislados de la EPSPS de Clase II. Igualmente, se identificaron
nuevos aislados bacterianos que contenían genes de la EPSPS de Clase
II procedentes de medios ambientes diferentes de las instalaciones
de tratamiento de residuos de glifosato. Se preparó un inóculo
mediante la extracción de suelo (procedente de un campo de soja
recientemente cosechado en Jerseyville, Illinois) y se desarrolló
una población de bacterias seleccionadas a 28ºC en medio
Dworkin-Foster que contenía glifosato 10 mM como
fuente de carbono (y con cicloheximida a una concentración de 100
\mug/ml para evitar el desarrollo de hongos). Después de cultivo
sobre medio agar L, se identificaron cinco tipos de colonias. Se
preparó el ADN cromosómico a partir de 2 ml de cultivos de caldo L
de estos aislados y se exploró la presencia de un gen de la EPSPS de
Clase II usando una sonda de secuencia de codificación de la EPSPS
de la CP4 mediante análisis Southern bajo condiciones restrictivas
de hibridación y de lavado. Uno de los aislados de suelo, el S2, fue
positivo mediante este rastreo.
Las secuencias de aminoácidos deducidos de un
cierto número de enzimas de la EPSPS de Clase I y de Clase II se
compararon usando el programa de ordenador Bestfit suministrado en
el paquete UWGCG (Devereux y otros, 1984). Se redactó un informe
sobre el grado de semejanza y de identidad determinados usando este
programa. El grado de semejanza/identidad determinados en las
secuencias de la proteína de Clase I y de Clase II es notablemente
alto, por ejemplo, comparando E. coli con S.
typhimurium (semejanza/identidad = 93%/88%) e incluso comparando
E. coli con la EPSPS de una planta (Petunia hybrida;
72%/55%). Estos datos se muestran en la Tabla IV. Sin embargo, la
comparación de secuencias entre la Clase I y la Clase II muestra
únicamente un grado muy bajo de conexión entre las Clases
(semejanza/identidad =
50-53%/23-30%). La visualización del
análisis Bestfit para las secuencias de E. coli (SEQ ID NO:
8) y de CP4 (SEQ ID NO: 3) muestra las posiciones de los restos
conservados, las cuales se presentan en la Figura 6. Los análisis
previos de las secuencias de la EPSPS habían indicado el alto grado
de conservación de secuencias de las enzimas y la casi invarianza de
secuencias en dos regiones, las regiones
"20-35" y "95-107" (Gasser
y otros, 1988; numeración de acuerdo con la secuencia de la EPSPS de
la Petunia) y que estas regiones están menos conservadas en el caso
de la CP4 y la LBAA cuando se comparan con las secuencias de la
EPSPS de plantas y bacterianas de Clase I (véase Figura 6 para una
comparación de las secuencias de la EPSPS de la CP4 y de E.
coli con la secuencia de E. coli que aparece como la
secuencia superior en la Figura). Las secuencias correspondientes en
la EPSPS de Clase II de la CP4 son:
PGDKSISHRSFMFGGL \hskip0,3cm (SEQ ID NO: 32)
\hskip1,2cm y \hskip1,2cm LDFGNAATGCRLT \hskip0,3cm (SEQ ID
NO: 33).
Estas comparaciones muestran que la conexión
general de las proteínas de la EPSPS de Clase I y de Clase II es
baja y que las secuencias en las regiones conservadas relacionadas
divergen, igualmente, de manera considerable.
En la EPSPS de la CP4 está presente un resto
alanina en la posición "glicina 101". La sustitución de la
glicina conservada (procedente de la región
"95-107") por una alanina da como resultado una
K_{i} elevada para glifosato y una elevación en la K_{m} para el
PEP en la EPSPS de Clase I. En el caso de la EPSPS de la CP4, que
contiene una alanina en esta posición, la K_{m} para el PEP está
dentro del intervalo de valores bajos, lo que indica que las enzimas
de Clase II difieren en muchos aspectos de las enzimas de la EPSPS
hasta ahora caracterizadas.
Dentro de los aislados de Clase II, el grado de
semejanza/identidad es tan alto como el indicado para dentro de la
Clase I (Tabla IV). La Figura 7 muestra la alineación del programa
de ordenador Bestfit de las secuencias de aminoácidos deducidos de
la EPSPS de la CP4 (SEQ ID NO: 3) y la LBAA (SEQ ID NO: 5) con la
secuencia de la CP4 que aparece como la secuencia superior en la
Figura. Los símbolos usados en las Figuras 6 y 7 son los símbolos
estándar usados en el programa de ordenador Bestfit para designar
grados de semejanza y de identidad.
\newpage
Comparación de conexiones de
secuencias^{1} de proteínas de la
EPSPS
Comparación entre secuencias de
proteínas de la EPSPS de Clase I y Clase
II
| Semejanza | Identidad | |
| E. coli frente a CP4 | 52,8 | 26,3 |
| E. coli frente a LBAA | 52,1 | 26,7 |
| S. typhimurium frente a CP4 | 51,8 | 25,8 |
| B. pertussis frente a CP4 | 52,8 | 27,3 |
| S. cerevisiae frente a CP4 | 53,5 | 29,9 |
| P. hybrida frente a CP4 | 50,2 | 23,4 |
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Comparación entre secuencias de
proteínas de la EPSPS de Clase
I
| Semejanza | Identidad | |
| E. coli frente a S. typhimurium | 93,0 | 88,3 |
| P. hybrida frente a E. coli | 71,9 | 54,5 |
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Comparación entre secuencias de
proteínas de la EPSPS de Clase
II
| Semejanza | Identidad | |
| Agrobacterium sp. cepa CP4 | ||
| frente a Achromobacter sp. | ||
| cepa LBAA | 89,9 | 83,7 |
| \begin{minipage}[t]{140mm} ^{1} Las secuencias de la EPSPS aquí comparadas se obtuvieron de las siguientes referencias: E. coli, Rogers y otros, 1983; S. typhimurium, Stalker y otros, 1985; Petunia hybrida, Shah y otros, 1986; B. pertussis, Maskell y otros, 1988; y S. cerevisiae, Duncan y otros, 1987. \end{minipage} |
\vskip1.000000\baselineskip
Una diferencia que puede señalarse en las
secuencias de aminoácidos deducidos de las proteínas de la EPSPS de
la CP4 y de la LBAA es en la posición 100, en la cual, se encuentra
una Alanina en el caso de la enzima de la CP4 y una Glicina en el
caso de la enzima de la LBAA. En las enzimas EPSPS de Clase I
usualmente se encuentra una Glicina en la posición equivalente, es
decir, Glicina 96 en E. coli y K. penumoniae y Glicina
101 en Petunia. En el caso de estas tres enzimas se ha informado de
que la conversión de Glicina en una Alanina da como resultado una
elevación de la K_{i} aparente para el glifosato y una evolución
concomitante en la K_{m} aparente para el PEP (Kishore y otros,
1986; Kishore y Shah, 1988; Sost y Amrhein, 1990), lo cual, tal como
se expone más adelante, hace a la enzima menos eficaz, especialmente
bajo condiciones de bajas concentraciones de PEP. La Glicina 100 de
la EPSPS de la LBAA se convirtió en una Alanina y tanto la K_{m}
aparente para el PEP como la K_{i} aparente para el glifosato se
determinaron para la variante. El cambio Glicina100Alanina se
introdujo mediante mutagénesis usando el cebador
siguiente:
siguiente:
| CGGCAATGCCGCCACCGGCGCGCGCC | (SEQ ID NO: 34) |
y tanto el tipo salvaje como los
genes variantes se expresaron en E. coli en un vector de
expresión promotor RecA (pMON17201 y pMON17264, respectivamente) y
se determinaron las K_{m} y las K_{i} aparentes en los lisados
brutos. Los datos indican que la K_{i} aparente (Glifosato) para
la variante G100A se elevó aproximadamente 16 veces (Tabla V). Este
resultado está de acuerdo con la observación de la importancia de
este cambio G-A para la elevación de la K_{i}
aparente (appKi) (Glifosato) en las enzimas EPSPS de Clase I. Sin
embargo, en contraste con los resultados en las variantes
G-A de Clase I, la K_{m} aparente (appKm) (PEP) en
la variante G-A de Clase II (LBAA) se mantiene
inalterada. Esto proporciona aún otra distinción entre las enzimas
EPSPS de Clase II y de Clase
I.
| appKm(PEP) | appKi(glifosato) | |
| Lisato preparado a partir de: | ||
| E. coli / pMON17201 | ||
| (tipo salvaje) | 5,3 \muM^{@} | 28 \muM^{*} |
| E. coli / pMON17264 | 5,5 \muM^{@} | 459 \muM^{#} |
| (variante G100A) | ||
| ^{@} intervalo de valores de PEP 2-40 \muM | ||
| ^{*} intervalo de valores de glifosato 0-310 \muM | ||
| # intervalo de valores de glifosato 0-5000 \muM. |
\vskip1.000000\baselineskip
La variante G100A de la LBAA, en virtud de sus
propiedades cinéticas superiores, es capaz de impartir una
tolerancia al glifosato mejorada en plantas.
El gen de la EPSPS procedente del
Agrobacterium sp. cepa CP4 contiene secuencias que podrían
ser hostiles para un amplia expresión del gen en plantas. Estas
secuencias incluyen sitios de poliadenilación potenciales que son
frecuentes y ricos en A + T, un % de G + C superior al
frecuentemente encontrado en genes de plantas (63% frente a
aproximadamente 50%), extensiones concentradas de restos de G y C, y
codones que frecuentemente no son usados en los genes de plantas. El
alto % de G + C en el gen de la EPSPS de la CP4 tiene un cierto
número de consecuencias potenciales que incluyen las siguientes: un
mayor uso de G o de C que el encontrado en genes de plantas en la
tercera posición en codones, y el potencial para formar estructuras
fuertes de horquilla que pueden afectar la expresión o la
estabilidad del ARN. La reducción en el contenido de G + C del gen
de la EPSPS de la CP4, la interrupción de las extensiones de los G y
C, la eliminación de las secuencias de poliadenilación potenciales,
y las mejoras en el uso de los codones de forma que se usen los que
aparecen más frecuentemente en los genes de plantas, podría dar
como resultado una expresión superior del gen de la EPSPS de la CP4
en plantas.
Se diseñó un gen CP4 sintético para cambiar tan
completamente como fuera posible las secuencias hostiles
anteriormente expuestas. En resumen, la secuencia del gen se
rediseñó para eliminar tanto como fuera posible las secuencias o
características de secuencias siguientes (evitando, al mismo tiempo,
la introducción de sitios de restricción innecesarios): extensiones
de G y C de 5 o superiores; y regiones ricas en A + T
(predominantemente) que pudieran funcionar como sitios de
poliadenilación o región de desestabilización de ARN potencial. La
secuencia de este gen se muestra en Figura 8 (SEQ ID NO: 9). Esta
secuencia de codificación se expresó en E. coli procedente
del promotor RecA y se ensayó para determinar la actividad de la
EPSPS y se comparó con la procedente del gen de la EPSPS de la CP4
nativo. La K_{m} aparente para el PEP para los genes nativo y
sintético fue de 11,8 y 12,7, respectivamente, lo cual indica que la
enzima expresada a partir del gen sintético permaneció inalterada.
El N-terminal de la secuencia de codificación se
mutagenizó con el fin de colocar un sitio SphI en el ATG para
permitir la construcción de la fusión sintética
CTP2-CP4 a fin de importar al cloroplasto. Para
realizar esta mutagénesis se usó el cebador
siguiente:
siguiente:
| GGACGGCTGCTTGCACCGTGAAGCATGCTTAAGCTTGGCGTAATCATGG | (SEQ ID NO: 35). |
El glifosato diana en plantas, la enzima
5-enolpiruvil-siquimato-3-fosfato
sintasa (EPSPS), se localizó en el cloroplasto. Muchas proteínas
localizadas en el cloroplasto, incluyendo la EPSPS, se expresan a
partir de genes nucleares como precursores y se transportan al
cloroplasto mediante un péptido de tránsito al cloroplasto (CTP), el
cual se elimina durante las etapas de importación. Los ejemplos de
otras proteínas de cloroplasto incluyen la subunidad pequeña (SSU)
de la Ribulosa-1,5-bisfosfato
carboxilasa (RUBISCO), Ferredoxina, Ferredoxina oxidoreductasa, la
proteína I y la proteína II del complejo captador de la luz, y la
Tioredoxina F. Se ha demostrado in vivo e in vitro
que pueden usarse proteínas no pertenecientes al cloroplasto pueden
transportarse al cloroplasto, mediante el uso de fusiones de
proteína con un CTP y que una secuencia de CTP es suficiente para
transportar una proteína al
cloroplasto.
cloroplasto.
Se construyó una fusión de la EPSPS
CTP-CP4 entre las secuencias de codificación de la
EPSPS de la CP4 y el CTP de la EPSPS de la Arabidopsis
thaliana (Klee y otros, 1987). El CTP de la Aradidopsis
se construyó mediante mutagénesis dirigida al sitio con el fin de
colocar un sitio de restricción SphI en el sitio de transformación
del CTP. Esta mutagénesis reemplazó el Glu-Lys en
este lugar por Cys-Met. La secuencia de este CTP,
designado como CTP2 (SEQ ID NO: 10), se muestra en la Figura 9. El
N-terminal del gen de la EPSPS de la CP4 se modificó
para colocar un sitio SphI que abarcara al codón Met. Igualmente, el
segundo codón se convirtió en uno para la leucina en esta etapa.
Este cambio no tuvo efecto real sobre la actividad in vivo de
la EPSPS de la CP4 en E. coli a juzgar por la relación de
complementación del alelo aroA. A continuación, este
N-terminal modificado se combinó con el
C-terminal del SacI y se clonó más abajo de las
secuencias del CTP2. La fusión de la EPSPS CTP2-CP4
se clonó en pBlueScript KS (+). Este vector puede transcribirse
in vitro usando la T7 polimerasa y el ARN traducido con
^{35}S-Metionina para proporcionar material que
pueda ser evaluado para importar en cloroplastos aislados
procedentes de Lactuca sativa usando los procedimientos
descritos en la presente invención más adelante
(della-Cioppa y otros, 1986, 1987). Este molde se
transcribió in vitro usando T7 polimerasa, mostrándose que el
material de la EPSPS CTP2-CP4 marcado con
^{35}S-Metionina se importaba a los cloroplastos
con una eficacia comparable a la de la EPSPS de Petunia de control
(control = PreEPSPS marcada con ^{35}S [pMON6140;
della-Cioppa y otros, 1986]).
En otro ejemplo, el CTP de la EPSPS de la
Arabidopsis, designado como CTP3, se fusionó a la EPSPS de la
CP4 a través de un sitio EcoRI. En la Figura 10 se muestra la
secuencia de este CTP3 (SEQ ID NO: 12). Se introdujo un sitio EcoRI
en la región madura de la EPSPS de la Arabidopsis alrededor
del aminoácido 27, reemplazando la secuencia
-Arg-Ala-Leu-Leu-
por
-Arg-Ile-Leu-Leu-
durante el procedimiento. Se usó el cebador de la secuencia
siguiente para modificar el N-terminal del gen de la
EPSPS de la CP4 con el fin de agregar un sitio EcoRI para efectuar
la fusión al CTP3:
| CGAAGACGCCCAGAATTCACGGTGCAAGCAGCCGG | (SEQ ID NO: 36) |
(el sitio EcoRI está
subrayado).
Esta fusión de la EPSPS CTP3-CP4
se clonó, igualmente, en el vector pBlueScript y la fusión expresada
de T7 se encontró que se importaba también a los cloroplastos con
una eficacia comparable a la de la EPSPS de Petunia de control
(pMON6140).
Una serie relacionada de CYP, designada como
CTP4 (SphI) y CTP5 (EcoRI), basados en el gen y el CTP de la EPSPS
de Petunia se fusionaron, igualmente, a las secuencias del gen de la
EPSPS de la CP4 modificadas con SphI y EcoRI. El sitio SphI se
agregó mediante mutagénesis dirigida al sitio para colocar este
sitio de restricción (y para cambiar la secuencia de aminoácido a
-Cys-Met-) al sitio de transformación del
cloroplasto. Se mostró que todas las fusiones de la EPSPS
CTP-CP4 se importaban a los cloroplastos con
aproximadamente la misma eficacia. En las Figuras 11 y 12 se
muestran las secuencias CTP4 (SEQ ID NO: 14) y CTP5 (SEQ ID NO:
16).
Igualmente, se construyó una fusión de la EPSPS
CTP2-LBAA después de la modificación del
N-terminal del gen de la EPSPS de la LBAA mediante
la adición de un sitio SphI. Igualmente, se encontró que esta fusión
se había importado de manera eficaz a los cloroplastos.
Mediante vías similares, se ha mostrado también
que la fusión de la EPSPS CTP2-CP4 y la de la EPSPS
CTP4-CP4 se importaban de manera eficaz a los
cloroplastos preparados a partir de envolturas de hojas de maíz.
Estos resultados indican que estas fusiones CTP-CP4
podrían proporcionar igualmente genes útiles para impartir
tolerancia al glifosato en especies monocotiledóneas.
Los expertos en la técnica reconocerán que
pueden realizarse diversos constructos quiméricos que usen la
funcionalidad de un CTP particular para importar una enzima EPSPS de
Clase II al cloroplasto de una célula de planta. La incorporación de
la EPSPS de Clase II por parte del cloroplasto puede determinarse
usando el ensayo siguiente.
Se aislaron cloroplastos intactos procedentes de
lechuga (Latuca sativa, var. longifolia) mediante
centrifugación en gradientes de Percoll/Ficoll modificados por
Bartlett y otros, 1982. El sedimento final de cloroplastos intactos
se suspendió en 0,5 ml de sorbitol 330 mM estéril en
Hepes-KOH 50 mM, pH 7,7, se ensayó para determinar
su contenido en clorofila (Arnon, 1949) y se ajustó hasta la
concentración de clorofila final de 4 mg/ml (usando sorbitol/Hepes).
El rendimiento de cloroplastos intactos a partir de un solo cogollo
de lechuga es de 3-6 mg de clorofila.
Un experimento típico de fijación de 300 \mul
contiene ATP 5 mM, metionina 8,3 mM no marcada, sorbitol 322 mM,
Hepes-KOH 58,3 mM (pH 8,0), 50 \mul de productos
de traducción de lisato de reticulocito y cloroplastos intactos
procedentes de L. sativa (200 \mug de clorofila). La
muestra suspendida se agitó suavemente a temperatura ambiente (en
tubos de vidrio de 10 x 75 mm) directamente en frente de un conjunto
de iluminación de fibra óptica a la máxima intensidad luminosa
(bombilla de 150 watt). Se extrajeron muestras alícuotas de la
mezcla suspendida (aproximadamente 50 \mul) a diversos intervalos
de tiempo y se fraccionaron sobre 100 \mul de gradiente de aceite
de silicona (en tubos de polietileno de 150 \mul) mediante
centrifugación a 11.000 x g durante 30 segundos. En estas
condiciones, los cloroplastos intactos forman un sedimento bajo la
capa de aceite de silicona y el medio de incubación (que contiene el
lisato de reticulocito) flota sobre la superficie. Después de
centrifugación, los gradientes de aceite de silicona se congelaron
inmediatamente en hielo seco. A continuación, el sedimento de
cloroplasto se resuspendió en 50-100 \mul de
tampón de lisis (Hepes-KOH 10 mM, pH 7,5, PMSF 1 mM,
benzamidina 1 mM, ácido
e-amino-n-capróico 5
mM y 30 \mug/ml de apropinina) y se centrifugó a 15.000 x g
durante 20 minutos para sedimentar las membranas tilacoides. El
sobrenadante transparente (proteínas estromáticas) procedentes de
esta agitación, y una parte alícuota del medio de incubación de
lisato de reticulocito procedente de cada experimento de suspensión,
se mezclaron con un volúmen igual de 2 x de tampón de muestra de
SDS-PAGE para electroforésis (Laemmli,
1970).
1970).
La SDS-PAGE se realizó de
acuerdo con Laemmli (1970) en placas de gel de acrilamida al
3-17% (p/v) (60 mm x 1,5 mm) con geles superpuestos
de acrilamida al 3% (p/v) (5 mm x 1,5 mm). El gel se fijó durante
20-30 minutos en una solución con metanol al 40% y
ácido acético al 10%. A continuación, el gel se introdujo en
EN^{3}HANCE^{PM} (DuPont) durante 20-30 minutos,
seguido del secado del gel en un secador de geles. El gel se reveló
mediante autoradiografía, usando una pantalla de intensificación y
una exposición durante una noche con el fin de determinar si la
EPSPS de la CP4 se había importado dentro de los cloroplastos
aislados.
Las plantas que pueden hacerse tolerantes del
glifosato mediante la práctica de la presente invención incluyen,
pero sin estar limitadas a ellas, soja, algodón, maíz, canola,
colza, lino, remolacha azucarera, girasol, patata, tabaco, tomate,
trigo, arroz, alfalfa y lechuga así como diversas especies de
árboles, nueces y cepas.
Una molécula de ADN de doble hebra de la
presente invención (gen quimérico) puede insertarse dentro del
genoma de una planta mediante cualquier procedimiento adecuado. Los
vectores de transformación de plantas adecuados incluyen los
derivados a partir de un plásmido Ti de Agrobacterium
tumefaciens, así como los descritos, p. ej., por
Herrera-Estrella (1983), Bevan (1984), Klee (1985) y
la publicación EPO 120.516 (Schilperoort y otros). Además de los
vectores de transformación de plantas derivados a partir de
plásmidos Ti o inductores de raíces (Ri) de Agrobacterium,
pueden usarse procedimientos alternativos para insertar los
constructos de ADN de esta invención en células de plantas. Dichos
procedimientos pueden implicar, por ejemplo el uso de liposomas,
electroporación, compuestos químicos que incrementan la fijación de
ADN libre, el suministro de ADN a través de bombardeo de
microproyectiles y transformación usando virus o polen.
Pueden construirse secuencias de ADN de la EPSPS
de Clase II en vectores capaces de transformar plantas mediante el
uso de técnicas conocidas. La descripción siguiente se entiende que
es ilustrativa y no debe interpretarse en un sentido limitativo. Un
experto normal en la técnica comprendería que podrían usarse con
resultados adecuados otros plásmidos, vectores, marcadores,
promotores, etc. La fusión de la EPSPS CTP2-CP4 se
clonó como un fragmento BglII-EcoRI en el vector de
planta pMON979 (descrito más adelante) para formar el pMON17110, del
cual se presenta un mapa en la Figura 13. En este vector, se
expresó el gen CP4 a partir del promotor CaMV35S potenciado (E35S;
Kay y otros, 1987). Se completó un constructo promotor FMV35S
(pMON17116) de la forma siguiente: los fragmentos
SalI-NotI y NotI-BglII procedentes
de pMON979 que contenían el segmento de gen de la EPSPS
Spc/AAC(3)-III/oriV y el pBR322/Límite
Derecho/NOS 3'/CP4 procedente del pMON17110 se ligaron con el
fragmento promotor XhoI-BglII de FMV35S procedente
del pMON981. Estos vectores se introdujeron en tabaco, algodón
y
canola.
canola.
Igualmente, se completaron una serie de vectores
en el vector pMON977, en el cual se clonaron el gen de la EPSPS de
la CP4, la fusión de la EPSPS CTP2-CP4 y la fusión
CTP3-CP4 como fragmentos BglII-SacI
para formar el pMON17124, el pMON17119 y el pMON17120,
respectivamente. Estos plásmidos se introdujeron en tabaco. Así
mismo, se completó un derivado del pMON977 que contenía el gen de la
EPSPS CTP2-LBAA, el pMON17206, y se introdujo en
tabaco.
El vector de transformación/expresión de planta
pMON979 se derivó a partir del pMON886 (descrito más adelante)
reemplazando el gen neomicina fosfotransferasa tipo II (KAN) en el
pMON886 por el fragmento de 0,89 kb que contenía el gen bacteriano
gentamicina-3-N-acetiltransferasa
tipo III (AAC(3)-III) (Hayford y otros,
1988). El gen quimérico P35S/AA(3)-III/NOS 3'
contiene el código de resistencia a la gentamicina que permite la
selección de células de plantas transformadas. Igualmente, el
pMON979 contiene una caja de expresión de 0,95 kb formada por el
promotor CaMV35S potenciado (Kay y otros, 1987), diversos sitios de
restricción únicos, y el extremo NOS 3'
(P-En-CaMV35S/NOS 3'). El resto de
los segmentos del ADN del pMON979 son exactamente iguales que en
el
pMON886.
pMON886.
El plásmido pMON886 se formó a partir de los
segmentos siguientes de ADN. El primero es un fragmento AvaI a EcoRV
manipulado de 0,93 kb aislado a partir del transposón Tn7 que
contiene el código de resistencia a la
espectinomicina/estreptomicina bacteriana (Spc/Str), el cual es un
determinante para la selección en E. coli y Agrobacterium
tumefaciens. Este segmento se unió al segmento de 1,61 kb de ADN
que contiene el código de resistencia a la kanamicina quimérico que
permite la selección de células de plantas transformadas. El gen
quimérico (P-35S/KAN/NOS 3') está formado por el
promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV), el gen de
la neomicina fosfotransferasa tipo II (KAN) y la región 3' no
traducida del gen de la nopalina sintasa (NOS 3') (Fraley y otros,
1983). El siguiente segmento es el OriV de 0,75 kb que contiene el
origen de replicación del plásmido RK2. Este segmento se unió al
segmento SalI a PvuI de 3,1 kb del pBR322 (ori322), el cual
proporciona el origen de replicación para el mantenimiento en E.
coli y el sitio bom para la transferencia conjugacional dentro
de las células del Agrobacterium tumefaciens. El siguiente
segmento es el PvuI a BclI de 0,36 kb del pTiT37 que contiene el
límite derecho del ADN del tipo T de la nopalina (Fraley y otros,
1985).
El vector pMON977 es el mismo que el pMON981
excepto por la presencia del promotor
P-En-CaMV35S en lugar del promotor
FMV35S (véase más adelante).
El plásmido pMON981 contiene los segmentos de
ADN siguientes: el fragmento de 0,93 kb aislado a partir del
transposón Tn7 que contiene el código de resistencia a la
espectinomicina/estreptomicina bacteriana [Spc/Str; un determinante
para selección en E. coli y Agrobacterium tumefaciens
(Fling y otros, 1985)]; el gen de resistencia a la kanamicina
quimérico manipulado para expresión en plantas que permite la
selección del tejido transformado, formado por el promotor 35S del
virus del mosaico de la coliflor (P-35S) de 0,35 kb
(Odell y otros, 1985), el gen de la neomicina fosfotransferasa de
tipo II (KAN) de 0,83 kb, y la región 3' no traducida de 0,26 kb del
gen de la nopalina sintasa (NOS 3') (Fraley y otros, 1983); el
origen de replicación de 0,75 kb del plásmido RK2 (oriV) (Stalker y
otros, 1981); el segmento SalI a PvuI de 3,1 kb del pBR322, el cual
proporciona el origen de replicación para mantenimiento en E.
coli (ori-322) y el sitio bom para la
transferencia conjugacional dentro de las células del
Agrobacterium tumefaciens, y el fragmento PvuI a BclI de 0,36
kb del plásmido pTiT37 que contiene la región límite derecha del ADN
de tipo T de la nopalina (Fraley y otros, 1985). La caja de
expresión está formada por el promotor 35S de 0,6 kb procedente del
virus del mosaico de la celidonia menor (P-FMV35S)
(Gowda y otros, 1989) y la región 3' no traducida de 0,7 kb del gen
rbcS-E9 del guisante (E9 3') (Coruzzi y otros, 1984,
y Morelli y otros, 1985). El fragmento SspI de 0,6 kb que contenía
el promotor FMV35S (Figura 1) se manipuló para colocar sitios de
clonación adecuados más abajo del sitio de iniciación
transcripcional. La fusión del gen CTP2-CP4sin se
introdujo en los vectores de expresión de la planta (incluyendo el
pMON981, para formar el pMON17131; Figura 14) y se transformó en
tabaco, canola, patata, tomate, remolacha azucarera, algodón,
lechuga, pepino, colza, álamo y
Arabidopsis.
Arabidopsis.
El vector de planta que contiene el gen de la
EPSPS de Clase II puede movilizarse dentro de cualquier cepa de
Agrobacterium adecuada para la transformación de las especies
de plantas deseadas. El vector de planta puede movilizarse dentro de
una cepa de Agrobacterium ABI. Una cepa ABI adecuada es la
Agrobacterium tumefaciens A208 que contiene el plásmido Ti
desarmado pTiC58 (pMP90RK) (Koncz y Schell, 1986). El plásmido Ti no
contiene los genes de la citohormona del T-ADN y,
por ello, la cepa es incapaz de producir la enfermedad de la hernia
de la raíz. El apareamiento del vector planta con el ABI se realizó
mediante el sistema de conjugación triparental usando el plásmido
ayudante pRK2013 (Ditta y otros, 1980). Cuando el tejido de la
planta se incubó con el conjugado de ABI:vector planta, el vector se
transfirió a las células de la planta mediante las funciones
vir que contenían el código del plásmido desarmado pTiC58. El
vector se abre en la región límite derecha del T-ADN
y la secuencia completa del vector planta puede insertarse en el
cromosoma de la planta huésped. El plásmido Ti pTiC58 no se
transfiere a las células de la planta sino que permanece en el
Agrobacterium.
Los genes de la EPSPS de Clase II pueden
introducirse, igualmente, dentro de las plantas a través de
procedimientos de suministro directo. Se completaron un cierto
número de vectores de suministro directo para el gen de la EPSPS de
la CP4. A continuación, se describe el vector pMON13640, del cual se
presenta un mapa en la Figura 15. El vector plásmido se basa en un
plásmido pUC (Vieira y Messing, 1987) que contiene, en este caso, el
gen nptII (de resistencia a la kanamicina; KAN) procedente del Tn903
con el fin de proporcionar un marcador seleccionable en E.
coli. La fusión del gen CTP4-EPSPS se expresa a
partir del promotor P-FMV35S y contiene el
fragmento de secuencia de poliadenilación NOS 3' y a partir de una
segunda caja formada por el promotor E35S, la fusión del gen
CTP4-CP4 y las secuencias NOS 3'. El gen marcador
GUS marcable (Jefferson y otros, 1987) se expresa a partir del
promotor manoppina sintetasa (P-MAS; Velten y otros,
1984) y de las secuencias 3' del gen de la proteína de
almacenamiento 7S de la soja (Schuler y otros, 1982). Igualmente,
podrían obtenerse plásmidos similares en los cuales las fusiones de
la EPSPS CTP-CP4 estén expresadas a partir del
promotor CaMV35S potenciado o de otros promotores de plantas.
Podrían obtenerse otros vectores que fueran adecuados para
suministro de ADN libre dentro de plantas y como tales entran dentro
del conocimiento de la técnica y se contemplan como incluidos dentro
del alcance de esta
descripción.
descripción.
Cuando la expresión del gen de la EPSPS de Clase
II se realizó en células transformadas (o protoplastos), las células
(o protoplastos) se regeneraron dentro de plantas completas. La
elección de la metodología para la etapa de regeneración no es
crítica, encontrándose disponibles protocolos adecuados para
huéspedes de Leguminosas (alfalfa, soja, trebol. etc.), Umbelíferas
(zanahoria, apio, chirivía), Crucíferas (col, rábano, colza, etc.),
Cucurbitáceas (melones y pepino), Gramíneas (trigo, arroz, maíz,
etc.), Solanáceas (patata, tabaco, tomate, pimienta), diversos
cultivos florales, así como diversos árboles tales como álamo o
manzano, cultivos de nuez o plantas de cepa tales como uvas. Véase,
p. ej., Ammirato, 1984; Shimamoto, 1989; Fromm, 1990; Vasil,
1990.
Los ejemplos siguientes se proporcionan para una
mejor ilustración de la práctica de la presente invención y no deben
de interpretarse de ninguna forma como limitativos del alcance de la
presente invención. Los expertos en la técnica reconocerán que
pueden realizarse diversas modificaciones, alteraciones, etc., a los
procedimientos y genes aquí descritos sin apartarse del espíritu y
del alcance de la presente invención.
En los ejemplos que siguen, la actividad de la
EPSPS en plantas se ensayó mediante el procedimiento siguiente. Se
recogieron muestras de tejidos e inmediatamente se congelaron en
nitrógeno líquido. Se congeló un gramo de tejido de hoja joven en un
mortero con nitrógeno líquido y se trituró hasta un polvo fino con
una mano de mortero. A continuación, el polvo se transfirió a un
segundo mortero, se agregó tampón de extracción (1 ml/gramo) y la
muestra se trituró durante un período adicional de 45 segundos. El
tampón de extracción para Canola estaba formado por Tris 100 mM,
EDTA 1 mM, glicerol al 10%, DTT 5 mM, BAM 1 mM, ascorbato 5 mM y 1,0
mg/ml de BSA, pH 7,5 (4ºC). El tampón de extracción para tabaco
estaba formado por Tris 100 mM, EDTA 10 mM, KCl 35 mM, glicerol al
20%, DTT 5 mM, BAM 1 mM, ascorbato 5 mM y 1,0 mg/ml de BSA, pH 7,5
(4ºC). La mezcla se transfirió a un tubo de microcentrífuga y se
centrifugó durante 5 minutos. Los sobrenadantes resultantes se
desalaron en columnas G-50 (Pharmacia), previamente
equilibradas con tampón de extracción (sin BSA), en partes alícuotas
de 0,25 ml. Los extractos desalados se ensayaron para determinar la
actividad de la EPSP sintetasa mediante ensayo de HPLC radioactivo.
Las concentraciones de proteína en las muestras se determinaron
mediante el ensayo de microproteína BioRad con BSA como patrón.
Las concentraciones de proteína se determinaron
usando el procedimiento de microproteína BioRad. El BSA se usó para
generar una curva estándar con valores comprendidos desde
2-24 \mug. Se mezclaron o bien 800 \mul de
muestra estándar o bien de muestra diluida, con 200 \mul de
reactivo BioRad Bradford concentrado. Las muestras se agitaron y se
leyeron a A(595) después de aproximadamente 5 minutos y se
compararon con la curva patrón.
Los ensayos de la enzima EPSPS contenían HEPES
(50 mM), siquimato-3-fosfato (2 mM),
molibdato amónico (0,1 mM) y KF (5 mM), con o sin glifosato (0,5 ó
1,0 mM). La mezcla de ensayo (30 \mul) y el extracto de planta (10
\mul) se preincubaron durante 1 minuto a 25ºC y las reacciones se
iniciaron mediante la adición de ^{14}C-PEP (1
mM). Las reacciones se interrumpieron después de 3 minutos con 50
\mul de EtOH al 90%/HOAc 0,1 M, pH 4,5. Las muestras se agitaron a
6.000 rpm y los sobrenadantes resultantes se analizaron para
determinar la producción de ^{14}C-EPSP mediante
HPLC. El porcentaje de la EPSPS resistente se calculó a partir de
las actividades de la EPSPS con y sin glifosato.
El porcentaje de conversión del PEP marcado con
^{14}C a ^{14}C-EPSP se determinó mediante
radioensayo de HPLC usando una columna de guarda C18 (Brownlee) y
una columna de HPLC AX100 (0,4 x 25 cm, Synchropak) con eluyente de
fosfato potásico isocrático 0,28 M, pH 6,5 a 1 ml/min. Las
velocidades iniciales se calcularon multiplicando el cambio de
fracción por unidad de tiempo por la concentración inicial del
sustrato marcado (1 mM). El ensayo fue lineal con tiempos de hasta
aproximadamente 3 minutos y un 30% de cambio a EPSPS. Las muestras
se diluyeron con Tris 10 mM, glicerol al 10% y DTT 10 mM, pH 7,5
(4ºC), en los casos en que fue necesario, para obtener resultados
dentro del margen lineal.
En estos ensayos, el
DL-ditiotreitol (DTT), la benzamidina (BAM) y la
albúmina de suero bovino (BSA, esencialmente exenta de globulina) se
obtuvieron de Sigma. El fosfoenolpiruvato (PEP) procedía de
Boehringer Mannheim y el
fosfoenol-[1-^{14}C]piruvato (28 mCi/mmol)
procedía de Amersham.
Se generaron plantas de tabaco transformadas con
un cierto número de vectores del gen de la EPSPS de Clase II que
contenían la secuencia de ADN de la EPSPS de la CP4 tal como se
describió anteriormente, con la expresión adecuada de la EPSPS.
Estas plantas transformadas exhibían tolerancia al glifosato
impartida por la EPSPS de Clase II de la CP4.
Para la transformación del tabaco se usó el
protocolo de transformación de disco de hoja de tabaco, en el cual,
se usa tejido de hoja sano de aproximadamente un mes de antigüedad.
Después de 15-20 minutos de esterilización de la
superficie con Clorox al 10% más un tensoactivo, las hojas se
lavaron 3 veces en agua estéril. Usando un taladrador de papel
estéril, los discos de hoja se taladraron y se colocaron con la cara
superior hacia abajo sobre medio MS104 (4,3 g/l de sales MS, 30 g/l
de sacarosa, 2 ml/l de vitaminas B5 500X, 0,1 mg/l de NAA y 1,0 mg/l
de BA) para un precultivo de 1 día.
A continuación, los discos se inocularon con un
cultivo de una noche de una cepa ABI de Agrobacterium que
contenía el vector sujeto que había sido diluido 1/5 (es decir:
aproximadamente 0,6 OD). La inoculación se realizó colocando los
discos en tubos de centrífuga con el cultivo. Después de 30 a 60
segundos, se extrajo el líquido y los discos se secaron entre papel
de filtro estéril. A continuación, los discos se colocaron con la
cara superior hacia abajo sobre placas de alimentador MS104 con un
disco de filtro para co-cultivo.
Después de 2-3 días de
co-cultivo, los discos se transfirieron, con la cara
superior hacia abajo aún, a placas de selección con medio MS104.
Después de 2-3 semanas, se formó tejido de callo y
se separó una sola formación procedente de los discos de hojas.
Cuando los los brotes crecieron hasta que fue posible distinguirlos
de los tallos, aquellos se cortaron de una forma limpia de los
callos. Los brotes se colocaron sobre medio para enraizamiento
exento de hormona (MSO: 4,3 g/l de sales MS, 30 g/l de sacarosa y 2
ml/l de vitaminas B5 500X) seleccionados para resistencia al
antibiótico apropiado. La formación de raíz se produjo a las
1-2 semanas. Todos los ensayos de callo de hoja se
realizaron, preferiblemente, sobre brotes con raíces mientras aún
eran estériles. A continuación, los brotes con raíces se plantaron
en el suelo y se mantuvieron en un medio ambiente con un alto
contenido en humedad (es decir: contenedores o bolsas de plástico).
Los brotes se endurecieron exponiéndoles gradualmente a condiciones
de humedad ambiente.
\newpage
Se transformaron células de tabaco con un cierto
número de vectores de planta que contenían el gen de la EPSPS de la
CP4 nativo y usando diferentes promotores y/o CTPs. La evidencia
preliminar de la expresión del gen se obtuvo por la capacidad del
tejido de la hoja procedente de vástagos transformados seleccionados
para resistencia a antibióticos, para volver a formar callo en
presencia de glifosato. En algunos casos, el callo tolerante del
glifosato se seleccionó directamente después de la transformación.
El nivel de expresión de la EPSPS de la CP4 se determinó por el
nivel de actividad de la EPSPS tolerante del glifosato (ensayada en
presencia de glifosato 0,5 mM) o mediante análisis de transferencia
Western usando un anticuerpo de la anti-EPSPS CP4.
Las transferencias Western se cuantificaron mediante densitómetro de
trazado y comparación con una curva patrón establecida usando EPSPS
de la CP4 purificada. Estos datos se presentaron como % de proteína
de hoja soluble. Los datos procedentes de un cierto número de líneas
de plantas transformadas y de vectores de transformación se
presentan en la Tabla VI que figura a
continuación.
continuación.
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
^{**} \begin{minipage}[t]{120mm}la actividad de la EPSPS
tolerante del glifosato se demostró igualmente en extractos de hoja
para estas plantas.
\end{minipage} \cr}
La tolerancia al glifosato se demostró también a
nivel de planta entera en plantas de tabaco transformadas. En
tabaco, se pulverizaron transformantes R_{o} de la EPSPS
CTP2-CP4 a una concentración de 0,448 kg/hectárea,
una proporción suficiente como para matar las plantas de tabaco no
transformadas de control que correspondían a unos valores de 3, 1 y
0 a los 7, 14 y 28 días, respectivamente, y se analizaron
vegetativamente y reproductivamente (Tabla VII).
\vskip1.000000\baselineskip
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
^{*} \begin{minipage}[t]{140mm} Las plantas se evaluaron de
acuerdo con un sistema de puntuación numérico de
0-10, en el cual, una puntuación vegetativa de 10
representa sin daño con relación a controles no pulverizados y 0
representa una planta muerta. Las puntuaciones reproductivas
(Fértil) se determinaron a los 28 días después de pulverización y se
evaluaron en función de si la planta era o no
fértil.\end{minipage} \cr}
Se transformaron plantas de canola con los
vectores pMON17110, pMON17116 y pMON17131 y se obtuvieron un cierto
número de líneas de plantas de canola transformada que exhibieron
tolerancia al glifosato.
Se plantaron plántulas de Brassica napus
cv Westar en tiestos de aproximadamente 5 cm que contenían
Metro Mix 350. Se dejaron crecer en una cámara de crecimiento a
24ºC, con fotoperíodos de 16/8 horas con intensidad luminosa de 400
uEm^{-2} sec^{-1} (lámparas HID). Se fertilizaron con General
Purpose Special 20-10-20 de Peters.
Después de 2 1/2 semanas se transplantaron a tiestos de
aproximadamente 15 cm y se dejaron crecer en una cámara de
crecimiento a una temperatura de 15/10ºC día/noche, con un
fotoperíodo de 16/8 horas y una intensidad luminosa de 800
uEm^{-2} sec^{-1} (lámparas HID). Se fertilizaron con
Hi-Phos Special
15-30-15 de Peters.
Se extrajeron 4 internodos terminales
procedentes de plantas justamente antes de que se produzcan yemas o
en proceso de formación de yemas pero antes de la floración y se
esterilizaron superficialmente con etanol al 70%, v/v, durante 1
minuto y con hipoclorito sódico al 2%, p/v, durante 20 minutos y se
lavaron 3 veces con agua desionizada estéril. Los tallos con hojas
unidas pueden refrigerarse en bolsas de plástico húmedas durante
hasta 72 horas antes de la esterilización. Se cortaron de seis a
siete segmentos de tallo en discos de 5 mm con un Vegetable Slicer
200 de Redco manteniendo la orientación del extremo basal.
El Agrobacterium se desarrolló durante
una noche en un rotor a 24ºC en 2 ml de Caldo Luria que contenía 50
mg/l de kanamicina, 24 mg/l de cloramfenicol y 100 mg/l de
espectinomicina. Se realizó una dilución 1:10 en medio MS (Murashige
y Skoog) obteniéndose aproximadamente 9 x 10^{8} células por ml.
Esto se confirmó con lecturas de densidad óptica a 660 mu. Los
discos de tallo (explantados) se inocularon con 1,0 ml de
Agrobacterium y el exceso se aspiró de los explantados.
Los explantados se colocaron con la cara basal
hacia abajo en placas Petri que contenían sales MS estándar 1/10X,
vitaminas B5, sacarosa al 3%, agar al 0,8%, pH 5,7 y 1,0 mg/l de
6-benziladenina (BA). Las placas se extendieron en
capas con 1,5 ml de medio que contenía sales MS, vitaminas B5,
sacarosa al 3%, pH 5,7, 4,0 mg/l de ácido
p-clorofenoxiacético y 0,005 mg/l de cinetina y se
cubrieron con papel de filtro estéril.
Después de un co-cultivo de 2 a
3 días, los explantados se transfirieron a placas Petri profundas
que contenían sales MS, vitaminas B5, sacarosa al 3%, agar al 0,8%,
pH 5,7, 1 mg/l de BA, 500 mg/l de carbenicilina, 50 mg/l de
cefotaxima, 200 mg/l de kanamicina o 175 mg/l de gentamicina para la
selección. Sobre cada placa se colocaron siete explantas. Después de
3 semanas, se transfirieron 5 explantas por placa a medio reciente.
Los explantados se cultivaron en una habitación de crecimiento a
25ºC, bajo luz continua (luz blanca fría).
Después de 3 semanas se cortaron brotes de los
explantados. Se iniciaron ensayos de recallecimiento de la hoja para
confirmar la modificación de los brotes R_{o}. Se colocaron tres
piezas delgadas de tejido de hoja sobre medio de recallecimiento que
contenía sales MS, vitaminas B5, sacarosa al 3%, agar al 0,8%, pH
5,7, 5,0 mg/l de BA, 0,5 mg/l de ácido naftalenoacético (NAA), 500
mg/l de carbenicilina, 50 mg/l de cefotaxima y 200 mg/l de
kanamicina o gentamicina o glifosato 0,5 mM. Las hojas de ensayo se
incubaron en una habitación de crecimiento bajo las mismas
condiciones que el cultivo de la explanta. Después de tres semanas,
los ensayos de recallecimiento de hoja se puntuaron para determinar
la tolerancia al herbicida (callo o tejido de hoja verde) o la
sensibilidad (blanqueamiento).
En el mismo momento del corte, los tallos de los
brotes se sumergieron en Rootone^{R} y se introdujeron en tiestos
de aproximadamente 5 cm que contenían Metro-Mix 350
y se colocaron en un ambiente húmedo cerrado. Se colocaron en una
cámara de crecimiento a 24ºC, con un fotoperíodo de 16/8 horas, una
intensidad luminosa de 400 uEm^{-1} sec^{-2} (lámparas HID)
durante un período de endurecimiento de aproximadamente 3
semanas.
La semilla recolectada a partir de las plantas
Rº es semilla R_{1}, la cual produce las plantas R_{1}. Para
evaluar la tolerancia al glifosato de una planta R_{o}, se evaluó
su progenie. Puesto que se supone que una planta Rº es hemizigoto en
cada lugar de inserción, la autofecundación da como resultado la
segregación genotípica máxima en el R_{1}. Dado que cada inserto
actúa como un alelo dominante, en ausencia de ligamiento y
suponiendo que únicamente se requiere un inserto hemizigótico para
la expresión de tolerancia, un inserto segregaría 3:1, dos insertos
15:1, tres insertos 63:1, etc. De acuerdo con ello, se necesitan
desarrollar relativamente pocas plantas R^{1} para encontrar al
menos un fenotipo resistente.
La semilla procedente de una planta R_{0} se
recolectó, se trilló y se secó antes de plantarla en un ensayo de
pulverización de glifosato. Se han usado diversas técnicas para
desarrollar las plantas para las evaluaciones de pulverización de
R_{1}. Los ensayos se realizaron tanto en invernaderos como en
cámaras de crecimiento. Se usaron dos sistemas de plantación;
tiestos de aproximadamente 10 cm o bandejas de plantas que contenían
32 ó 36 células. El suelo usado para la plantación fue o bien Metro
350 más tres tipos de fertilizantes de liberación lenta, o bien
Metro 350. La irrigación fue o bien mediante riego por aspersión en
invernaderos, o bien mediante sub-irrigación en
cámaras de crecimiento. El fertilizante se aplicó en los casos
requeridos en el agua de irrigación. Se mantuvieron los regímenes
de temperatura apropiados para canola. Se mantuvo un fotoperíodo de
dieciseis horas. A la aparición de la floración, las plantas se
transplantaron a tiestos de aproximadamente 15 cm para la producción
de semillas.
En la misma fecha, se pulverizó un "lote"
de pulverización formado por diversos grupos de progenies R_{1}.
Algunos lotes pueden incluir también evaluaciones de otras plantas
distintas de las R_{1}. Igualmente, cada lote incluye genotipos
no-transgénicos pulverizados y no pulverizados que
representan los genotipos del lote particular en que fueron
putativamente transformados. Igualmente, se incluyó en un lote uno o
más genotipos transformados no segregantes que previamente se habían
identificado como poseedores de alguna resistencia.
Dos a seis plantas procedentes de cada progenie
R_{0} individual no se pulverizaron y sirvieron como controles
para comparar y medir la tolerancia al glifosato, así como para
comprobar cualquier variabilidad no inducida por el glifosato.
Cuando las otras plantas alcanzaron el estado de hoja
2-4, normalmente de 10 a 20 días después de la
plantación, se aplicó glifosato con unas concentraciones que
variaron desde 0,28 hasta 1,12 kg/ha, dependiendo de los objetivos
del estudio. Se adoptaron tecnologías de baja concentración que usan
bajos volúmenes. Se calibró un pulverizador de laboratorio con el
fin de suministrar una concentración equivalente a las condiciones
de
campo.
campo.
Se usó una escala de 0 a 10 para puntuar las
plantas pulverizadas con respecto a la resistencia vegetativa. La
escala es relativa con respecto a las plantas no pulverizadas
procedentes de la misma planta R_{0}. Un 0 representa muerte, en
tanto que un 10 representa una diferencia no visible con respecto a
la planta no pulverizada. Un número más alto entre 0 y 10 representa
progresivamente menos daño en comparación con la planta no
pulverizada. Las plantas se puntuaron a los 7, 14 y 28 días después
del tratamiento (DAT), o hasta que se produjeron yemas,
representándose, mediante una línea, la puntuación promedio de las
plantas pulverizadas dentro de una familia de plantas R_{0}.
Se usaron 6 números enteros para describir
cualitativamente el grado de daño reproductivo debido al
glifosato:
0: sin desarrollo de yemas florales
2: yemas florales presentes, pero abortadas
antes de abrirse
4: flores abiertas, pero sin anteras, o las
anteras no sobresalen por encima de los pétalos
6: anteras estériles
8: anteras parcialmente estériles
10: flores completamente fértiles.
Las plantas se puntuaron usando esta escala al
inicio o poco después de la iniciación de la floración, dependiendo
de la velocidad de desarrollo de la estructura floral.
Después de un período de 3 semanas, las plantas
de canola transformadas se ensayaron para determinar la presencia de
actividad de la EPSPS tolerante del glifosato (ensayada en presencia
de glifosato 0,5 mM). Los resultados se muestran en la Tabla
VIII.
\hskip0,4cm^{*} Ensayada en presencia de
glifosato 1,0 mM.
\vskip1.000000\baselineskip
A continuación, los transformantes R_{1} de
canola se desarrollaron en una cámara de crecimiento y se
pulverizaron con glifosato a una concentración de 0,56 kg/ha y se
valoraron vegetativamente. Estos resultados se muestran en la Tabla
IXA - IXC. Debe tenerse en cuenta que se prefiere observar en todos
los tejidos la expresión de la EPSPS resistente al glifosato que el
fenotipo de tolerancia al glifosato óptimo en estas plantas
transgénicas. En las Tablas que figuran a continuación, únicamente
se describen los resultados de expresión obtenidos con tejidos
de
hojas.
hojas.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
^{*} % de actividad de la EPSPS resistente en
presencia de glifosato 0,5 mM.\cr ^{**} Una población
vegetativa de 10 indica ausencia de daño, una puntuación de 0 indica
la muerte de la
planta.\cr}
\vskip1.000000\baselineskip
Los datos obtenidos para los transformantes de
la EPSPS de Clase II pueden compararse con los transformantes de la
EPSPS de Clase I tolerantes del glifosato, en los cuales se usó el
mismo promotor para expresar los genes de la EPSPS y en los cuales
el nivel de actividad de la EPSPS tolerante del glifosato fue
comparable para los dos tipos de transformantes. Una comparación de
los datos del pMON17110 (en la Tabla IXA) y del pMON17131 (en la
Tabla IXB) con los del pMON899 [en la Tabla IXC; el gen de Clase I
en el pMON899 es el de la A. thaliana (Klee y otros, 1987),
en el cual, la glicina de la posición 101 se ha cambiado por una
alanina] ilustra que la EPSPS de Clase II es al menos tan buena
como la de la EPSPS de Clase I. Resulta clara una mejora en la
tolerancia vegetativa de la EPSPS de Clase II cuando se tiene en
cuenta que las plantas de Clase II se pulverizaron al doble de
concentración y que se ensayaron como plantas R_{1}.
Se transformaron plantas de soja con el vector
pMON13640 (Figura 15) y se obtuvieron un cierto número de líneas de
plantas de soja transformadas que exhibían tolerancia al
glifosato.
Las plantas de soja se transformaron con el
pMON13640 mediante el procedimiento de inyección de microproyectiles
usando la tecnología de pistola de partículas descrita por Christou
y otros, (1988). La semilla recolectada a partir de las plantas
R_{0} es semilla R_{1}, la cual produce las plantas R_{1}.
Para evaluar la tolerancia al glifosato de una planta R_{0}, se
evaluó su progenie. Puesto que se supone que una planta R_{0} es
hemizigoto en cada lugar de inserción, la autofecundación da como
resultado la segregación genotípica máxima en el R_{1}. Dado que
cada inserto actúa como un alelo dominante, en ausencia de
ligamiento y suponiendo que únicamente se requiere un inserto
hemizigótico para la expresión de tolerancia, un inserto segregaría
3:1, dos insertos 15:1, tres insertos 63:1, etc. De acuerdo con
ello, se necesitan desarrollar relativamente pocas plantas R_{1}
para encontrar al menos un fenotipo resistente.
La semilla procedente de una planta de soja
R_{0} se recolectó, se trilló y se secó antes de plantarla en un
ensayo de pulverización de glifosato. Las semillas se plantaron en
tiestos cuadrados de aproximadamente 5 cm que contenían Metro 350.
Para el ensayo se consideraron adecuadas veinte plántulas
procedentes de cada planta R_{0}. Las plantas se mantuvieron y
desarrollaron en ambiente de invernadero. Se reguló un fotoperíodo
de 12,5-14 horas y temperaturas de 30ºC por el día y
de 24ºC por la noche. De acuerdo con la necesidad, se aplicó
fertilizante Peters Pete Lite soluble en agua.
En la misma fecha, se pulverizó un "lote"
de pulverización formado por diversos grupos de progenies R_{1}.
Algunos lotes pueden incluir también evaluaciones de otras plantas
distintas de las R_{1}. Igualmente, cada lote incluye genotipos
no-transgénicos pulverizados y no pulverizados que
representan los genotipos del lote particular en que fueron
putativamente transformados. Igualmente, se incluyó en un lote uno o
más genotipos transformados no segregantes que previamente se habían
identificado como poseedores de alguna resistencia.
Una a dos plantas procedentes de cada progenie
R_{0} individual no se pulverizaron y sirvieron como controles
para comparar y medir la tolerancia al glifosato, así como para
comprobar cualquier variabilidad no inducida por el glifosato.
Cuando las otras plantas alcanzaron el primer estado de hoja
trifoliada, normalmente de 2-3 semanas después de la
plantación, se aplicó glifosato con una concentración equivalente a
8,895 kg/ha de Roundup^{R}. Se calibró un pulverizador de
laboratorio con el fin de suministrar una concentración equivalente
a dichas condiciones.
Se usó una puntuación vegetativa de 0 a 10. La
puntuación es relativa con respecto a las progenies no pulverizadas
procedentes de la misma planta R_{0}. Un 0 representa muerte, en
tanto que un 10 representa una diferencia no visible con respecto a
la planta no pulverizada. Un número más alto entre 0 y 10 representa
progresivamente menos daño en comparación con la planta no
pulverizada. Las plantas se puntuaron a los 7, 14 y 28 días después
del tratamiento (DAT). Los datos procedentes del análisis de un
grupo de plantas de soja transformadas y de control se describen en
la Tabla X y muestran que el gen de la EPSPS de la CP4 imparte
también tolerancia al glifosato en la soja.
El gen de la EPSPS de la CP4 puede usarse para
seleccionar material de planta transformado directamente sobre medio
que contiene glifosato. La capacidad para seleccionar e identificar
material de planta transformado depende, en la mayoría de los casos,
del uso de un gen marcador seleccionable dominante para facilitar el
desarrollo preferencial y continuado de los tejidos transformados en
presencia de una sustancia normalmente inhibidora. Los genes de
resistencia a antibióticos y de tolerancia a herbicidas se han usado
casi exclusivamente como dichos genes marcadores seleccionables
dominantes en presencia del antibiótico o herbicida correspondiente.
El esquema de selección nptII/kanamicia es, probablemente, el más
frecuentemente usado. Se ha demostrado que la EPSPS de la CP4 es,
igualmente, un esquema de marcador seleccionable/selección útil y,
posiblemente superior, para la producción e identificación de
plantas transformadas.
Un vector de transformación de planta que puede
usarse en este esquema es el pMON17227 (Figura 16). Este plásmido se
parece mucho a otros plásmidos descritos anteriormente y está
compuesto esencialmente del sistema replicón bacteriano
anteriormente descrito que permite a este plásmido el replicarse en
E. coli e introducirse dentro y replicarse en
Agrobacterium, el gen marcador seleccionable bacteriano
(Spc/Str), y localizarse entre el límite derecho y el límite
izquierdo del T-ADN, es el gen sintético
CTP2-CP4 en la caja 3' de E9 del promotor FMV35S.
Igualmente, este plásmido tiene sitios únicos para un cierto número
de enzimas de restricción, localizados entre los límites y el
exterior de la caja de expresión. Esto le hace posible agregar
fácilmente otros genes y elementos genéticos al vector para su
introducción en plantas.
El protocolo para la selección directa de
plantas transformadas para glifosato es el señalado para el tabaco.
Los explantados se prepararon para precultivo como en el
procedimiento estándar descrito en el Ejemplo 1: esterilización
superficial de hojas procedentes de plantas de tabaco de un mes de
antigüedad (15 minutos en Clorox al 10% + tensoactivo; 3 x lavados
en H_{2}O); cortado de los explantados en cuadrados de 0,5 x 0,5
cm, eliminación de los bordes de las hojas, la vena central, la
punta, y el extremo del peciolo para obtener un tipo de tejido
uniforme; colocación de los explantados en una capa única, con la
cara superior hacia abajo, sobre placas con MS104 + 2 ml de medio
4COO5K para humedecer la superficie; el período de precultivo fue de
1-2 días. Los explantados se inocularon usando
cultivo de una noche de Agrobacterium que contenía el
plásmido de transformación de la planta que se había ajustado hasta
un valor de 1,2 x 10^{9} bacterias/ml con medio 4COO5K. Los
explantados se colocaron en un tubo de centrífuga, se agregó la
suspensión de Agrobacterium y la mezcla de bacterias y
explantas se batió ajustándose el tiempo a un máximo de 25 segundos
con el fin de asegurar una penetración por igual de las bacterias.
Las bacterias se eliminaron por vertido y los explantados se secaron
entre capas de papel de filtro estéril seco para eliminar el exceso
de bacterias. Los explantados secadas se colocaron con la cara
superior hacia abajo sobre placas de MS104 + 2 ml de medio 4COO5K +
disco de filtro. El período de co-cultivo fue de
2-3 días. Los explantados se transfirieron a MS104 +
1000 mg/ml de Carbenicilina + 100 mg/l de cefotaxima durante 3 días
(fase retardada). A continuación, los explantados se transfirieron a
MS104 + glifosato 0,05 mM + 1000 mg/l de Carbenicilina + 100 mg/l de
cefotaxima para la fase de selección. A las 4-6
semanas se cortaron brotes procedentes de callos y se colocaron
sobre medio de enraizamiento MSO + 500 mg/l de Carbenicilina. Se
formaron raíces a los 3-5 días, al cabo de cuyo
tiempo, pueden extraerse piezas de hojas procedentes de placas con
raíces para confirmar la tolerancia al glifosato y que el material
se ha transformado. La presencia de la proteína de la EPSPS de
la CP4 en estos tejidos transformados se confirmó mediante análisis
de inmunotransferencia de discos de hoja. A continuación, se
presentan los datos procedentes de un experimento con pMON17227: 139
brotes formados sobre glifosato procedentes de 400 explantas
inoculadas con Agrobacterium ABI/pMON17227; 97 de estos
fueron positivos con referencia al recallecimiento sobre glifosato.
Estos datos indican una relación de transformación de 24 por cada
100 explantas, lo cual hace que este sea un procedimiento de
transformación que economiza tiempo y altamente eficaz para plantas.
Se han obtenido frecuencias de transformación similares con
pMON17131 e igualmente se ha mostrado la selección directa de
transformantes sobre glifosato con los genes de la EPSPS de la CP4
en otras especies de plantas, que incluyen Arabidopsis,
patata, tomate, algodón, lechuga y remolacha azucarera.
El plásmido pMON17227 contiene sitios de
escisión de reconocimiento de enzima de restricción únicos (NotI,
XhoI y BstXI) entre la región de selección de glifosato de la CP4 y
el límite izquierdo del vector para la clonación de genes
adicionales y para facilitar la introducción de estos genes dentro
de plantas.
El gen de la EPSPS de la CP4 se introdujo
también dentro de células de maíz Black Mexican Sweet (BMS) con la
expresión de la proteína y la resistencia al glifosato detectada en
el callo.
La estructura fundamental de este plásmido era
un derivado del plásmido de muchas copias pUC119 (Viera y Messing,
1987). El fragmento de pUC119 de 1,3 kb FspI-DraI
que contenía el origen de replicación se fusionó al fragmento
cargado SmaI-HindIII de 1,3 kb procedente del pKC7
(Rao y Rogers, 1979), el cual contiene el gen tipo II de la
neomicina fosfotransferasa para conferir resistencia a la kanamicina
bacteriana. Este plásmido se usó para construir un vector caja de
expresión de monocotiledónea que contenía el promotor del ARN 35S
del virus del mosaico de la coliflor (CaMv) de 0,6 kb con una
duplicación de la región -90 a -300 (Kay y otros, 1987), un
fragmento de 0,8 kb que contenía un intrón procedente de un gen de
maíz en la región conductora no traducida 5', seguido de un
poliligador y la secuencias de terminación 3' procedentes del gen de
la nopalina sintasa (NOS) (Fraley y otros, 1983). Un fragmento de
1,7 kb que contenía el péptido de tránsito de cloroplasto de 300 bp
procedente de la EPSP sintasa de la Arabidopsis fusionado en
el marco a la secuencia de codificación de 1,4 kb para la EPSP
sintasa de la CP4 bacteriana, se insertó dentro de la caja de
expresión monocotiledónea en el poliligador entre el intrón y la
secuencia de terminación NOS para formar el plásmido pMON19653
(Figura 17).
El ADN del pMON19653 se introdujo en las células
del Black Mexican Sweet (BMS) mediante co-bombardeo
con EC9, un plásmido que contenía una forma resistente a la
sulfonilurea del gen acetolactato sintasa del maíz. Se recubrieron
2,5 mg de cada plásmido con partículas de tungsteno y se
introdujeron en células BMS de fase logarítmica usando una pistola
de partículas PDS-1000 esencialmente tal como ha
sido descrita por Klein y otros, 1989. Los transformantes se
seleccionaron sobre medio MS que contenía 20 ppb de clorsulfurón.
Después de selección inicial sobre clorsulfurón, los callos
pudieron ensayarse directamente mediante transferencia Western. La
tolerancia al glifosato pudo comprobarse mediante transferencia de
los callos a medio que contenía glifosato 5 mM. Tal como se muestra
en la Tabla XI, la EPSPS de la CP4 confiere tolerancia al glifosato
a los callos de maíz.
| Expresión de la CP4 | ||
| Línea | (% de proteína extraída) | |
| 284 | 0,006% | |
| 287 | 0,036 \hskip0,2cm | |
| 290 | 0,061 \hskip0,2cm | |
| 295 | 0,073 \hskip0,2cm | |
| 299 | 0,113 \hskip0,2cm | |
| 309 | 0,042 \hskip0,2cm | |
| 313 | 0,003 \hskip0,2cm |
Para medir la expresión de la EPSPS de la CP4 en
el callo de maíz, se usó el procedimiento siguiente: se secó callo
de BMS (3 g de peso seco) sobre papel de filtro (Whatman #1) en
vacío, se volvió a pesar y se agregó tampón de extracción (500
\mul/g de peso seco; Tris 100 mM, EDTA 1 mM y glicerol al 10%). El
tejido se homogeneizó con un agitador de tipo aéreo Wheaton durante
30 segundos graduado a una potencia de 2,8. Después de
centrifugación (3 minutos, microcentrífuga Eppendorf), se eliminó el
sobrenadante y la proteína se cuantificó (Ensayo de Proteína
BioRad). Se cargaron muestras (50 \mug/cavidad) sobre un gel de
SDS-PAGE (Jule, 3-17%) conjuntamente
con EPSPS de la CP4 estándar (10 ng), se electroforetizaron y se
transfirieron a nitrocelulosa de manera similar a un procedimiento
descrito anteriormente por Padgette, 1987. La mancha de
nitrocelulosa se sondó con IgG de anti-EPSPS de CP4
de cabra y se reveló con Proteína G marcada con ^{125}I. La mancha
radioactiva se visualizó mediante autoradiografía. Los resultados se
cuantificaron mediante densitometría en un densitómetro de láser
UltraScan XL de LKB y se tabularon tal como se indica a continuación
en la Tabla XII.
Así mismo, podrían lograrse mejoras en la
expresión de la EPSPS de Clase I mediante la expresión del gen
usando promotores de planta más fuerte, usando secuencias de señal
de poliadenilación 3' mejores, optimizando las secuencias alrededor
del codón de iniciación para la carga del ribosoma y la iniciación
de traducción, o mediante la combinación de estas o de otras
secuencias o factores reguladores o de expresión. Igualmente, sería
beneficioso transformar la planta deseada con un gen de la EPSPS de
Clase I conjuntamente con otro gen de la EPSPS tolerante del
glifosato o con un gen capaz de degradar el glifosato con el fin de
potenciar la tolerancia al glifosato de la planta transformada.
A partir de lo anterior, se observará que esta
invención está bien adaptada para lograr todos los fines y objetos
anteriormente establecidos, junto con ventajas que son obvias e
inherentes a la invención.
Debe de entenderse que ciertas características y
subcombinaciones son de utilidad y que pueden usarse sin referencia
a las otras características y subcombinaciones. Esto se contempla y
está incluido dentro del alcance de las reivindicaciones.
Puesto que pueden realizarse muchas
realizaciones posibles de la invención sin apartarse del alcance de
la misma, debe de entenderse que todo objeto aquí establecido o
mostrado en los dibujos adjuntos debe interpretarse como ilustrativo
y no en un sentido limitante.
El gen de la EPSPS de Clase II de la LBAA se ha
introducido en plantas e imparte también tolerancia al glifosato. En
la Tabla XIII se presentan datos sobre tabaco transformado con
pMON17206 (véase a continuación).
| Línea | Valoración al día 7 |
| 33358 | 9 |
| 34586 | 9 |
| 33328 | 9 |
| 34606 | 9 |
| 33377 | 9 |
| 34611 | 10 |
| 34607 | 10 |
| 34601 | 9 |
| 34689 | 9 |
| Samsum (control) | 4 |
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(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE: Barry, Gerard F.
\hskip3,9cm Kishore, Ganesh M.
\hskip3,9cm Padgette, Stephen R.
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: 5-enolpiruvilsiquimato-3-fosfato sintasas tolerantes del glifosato.
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 36.
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DIRECCIÓN DE LA CORRESPONDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESTINATARIO: Dennis, R. Hoerner, Jr., Monsanto Co. BB4F.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 700 Chesterfield Village, Parkway.
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD. St. Louis.
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: Missouri.
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: USA.
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO: 63198.
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- FORMA DE LECTURA EN ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: Disco flexible.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: IBM PC compatible.
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS.
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOTFWARE: PatentIn Release #1.0, Versión #1.25.
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DATOS DE LA PRESENTE SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: US 07/576537.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 31-Agosto-1990.
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (viii)
- INFORMACIÓN DEL APODERADO/AGENTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE. Hoerner, Jr., Dennis, R.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- NÚMERO DE REGISTRO: 30.914.
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: 38-21 (10535).
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- INFORMACIÓN PARA TELECOMUNICACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TELÉFONO: (314) 537-6099.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TELEFAX: (314) 537-6047.
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 597 pares de bases.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucléico.
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE LA HEBRA: doble.
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- TOPOLOGÍA: lineal.
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico).
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA :SEQ ID NO: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 2.
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1982 pares de bases.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucléico.
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE LA HEBRA: doble.
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TIPOLOGÍA: lineal.
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (Genómico).
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 62..1426.
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2.
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD. 455 aminoácidos.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácidos.
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: lineal.
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLÉCULAR: proteína.
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1673 pares de bases.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleíco.
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE LA HEBRA: doble.
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal.
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico).
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 86..1432.
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4:
\hskip1cm20
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 449 aminoácidos.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido.
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TOPOLOGÍA: lineal.
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína.
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1500 pares de bases.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucléico.
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE LA HEBRA: doble.
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal.
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 34..1380
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 449 aminoácidos.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido.
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TOPOLOGÍA: lineal.
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína.
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 423 aminoácidos.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido.
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE LA HEBRA: simple.
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal.
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína.
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 8:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 9:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1377 pares de bases.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucléico.
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE LA HEBRA: doble.
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal.
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico).
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 10:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 318 pares de bases.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleíco.
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE LA HEBRA: doble.
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal.
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 87..317
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 10:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 11:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 77 aminoácidos.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido.
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TOPOLOGÍA: lineal.
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína.
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 11:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 12:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 402 pares de bases.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucléico.
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE LA HEBRA: doble.
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal.
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE:CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 82..401
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 12:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 13:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 105 aminoácidos.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido.
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TOPOLOGÍA: lineal.
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína.
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 13:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 14:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 233 pares de bases.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucléico.
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE LA HEBRA: doble.
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal.
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico).
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 14..232
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 14:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 15:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 73 aminoácidos.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido.
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TOPOLOGÍA: lineal.
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína.
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 15:
\hskip1cm42
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 16:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 352 pares de bases.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucléico.
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE LA HEBRA: doble.
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal.
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico).
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 49..351
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 16:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 17:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 101 aminoácidos.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido.
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TOPOLOGÍA: lineal.
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína.
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 17:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 18:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 28 aminoácidos.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido.
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE LA HEBRA: simple.
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal.
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido.
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 18:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Xaa His Gly Ala Ser Ser Arg Pro Ala Thr Ala
Arg Lys Ser Ser Gly}
\sac{Leu Xaa Gly Thr val Arg Ile Pro Gly Asp
Lys Met}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 19:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 13 aminoácidos.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido.
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE LA HEBRA: simple.
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal.
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido.
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SLA ECUENCIA: SEQ ID NO: 19:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ala Pro Ser Met Ile Asp Glu Tyr Pro Ile Leu
Ala Val}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 20:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 15 aminoácidos.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido.
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE LA HEBRA: simple.
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal.
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido.
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 20:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ile Thr Gly Leu Leu Glu Gly Glu Asp Val Ile
Asn Thr Gly Lys}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 21:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 17 pares de bases.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucléico.
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE LA HEBRA: simple.
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal.
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico).
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 21:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipATGATHGAYG ARTAYCC
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 22:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 17 pares de bases.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucléico.
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE LA HEBRA: simple.
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal.
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico).
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 22:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGARGAYGTNA THAACAC
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 23:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 17 pares de bases.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucléico.
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE LA HEBRA: simple.
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal.
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico).
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 23:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGARGAYGTNA THAATAC
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 24:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 38 pares de bases.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucléico.
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE LA HEBRA: simple.
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal.
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico).
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 24:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCGTGGATAGA TCTAGGAAGA CAACCATGGC TCACGGTC
\hfill38
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 25:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 44 pares de bases.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucléico.
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE LA HEBRA: simple.
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal.
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico).
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 25:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGATAGATTA AGGAAGACGC GCATGCTTCA CGGTGCAAGC AGCC
\hfill44
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 26:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 35 pares de bases.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucléico.
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE LA HEBRA: simple.
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal.
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico).
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 26:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGCCTGCCTGA TGAGCTCCAC AATCGCCATC GATGG
\hfill35
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 27:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 32 pares de bases.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucléico.
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE LA HEBRA: simple.
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal.
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico).
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 27:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCGTCGCTCGT CGTGCGTGGC CGCCCTGACG GC
\hfill32
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 28:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 29 pares de bases.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucléico.
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE LA HEBRA: simple.
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal.
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico).
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 28:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCGGGCAAGGC CATGCAGGCT ATGGGCGCC
\hfill29
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 29:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 31 pares de bases.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucléico.
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE LA HEBRA: simple.
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal.
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico).
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 29:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCGGGCTGCCG CCTGACTATG GGCCTCGTCG G
\hfill31
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 30:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 15 aminoácidos.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido.
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE LA HEBRA: simple.
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal.
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína.
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 30:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Xaa His Ser Ala Ser Pro Lys Pro Ala Thr Ala
Arg Arg Arg Ser Glu}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 31:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 17 pares de bases.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucléico.
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE LA HEBRA: simple.
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal.
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico).
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 31:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGCGGTBGCSG GYTTSGG
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 32:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 16 aminoácidos.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido.
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE LA HEBRA: simple.
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal.
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido.
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 32:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Pro Gly asp Lys Ser Ile Ser His Arg Ser Phe
Met Phe Gly Gly Leu}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 33:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 13 aminoácidos.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido.
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE LA HEBRA: simple.
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal.
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido.
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 33:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Leu Asp Phe Gly Asn Ala Ala Thr Gly Cys Arg
Leu Thr}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 34:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 26 pares de bases.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucléico.
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE LA HEBRA: simple.
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal.
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico).
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 34:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCGGCAATGCC GCCACCGGCG CGCGCC
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 35:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 49 pares de bases.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucléico.
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE LA HEBRA: simple.
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal.
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico).
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 35:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGACGGCTGC TTGCACCGTG AAGCATGCTT AAGCTTGGCG TAATCATGG
\hfill49
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 36:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 35 pares de bases.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucléico.
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE LA HEBRA: simple.
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal.
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico).
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 36:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGAAGACGCC CAGAATTCAC GGTGCAAGCA GCCGG
\hfill35
Claims (33)
1. Una secuencia de ADN aislada que contiene la
codificación de una enzima EPSPS de Clase II, siendo dicha enzima
una enzima EPSPS que tiene una K_{m} para fosfoenolpiruvato (PEP)
comprendida entre 1-150 \muM y una relación
K_{i} (glifosato)/K_{m} (PEP) comprendida entre
3-500, cuya enzima es capaz de reaccionar con
anticuerpos generados contra una enzima EPSPS de Clase II
seleccionada entre el grupo formado por las enzimas de la SEQ ID NO:
3 y de la SEQ ID NO: 5.
2. Una secuencia de ADN de la Reivindicación 1,
en la que dicha K_{m} para fosfoenolpiruvato está comprendida
entre 2-25 \muM.
3. Una secuencia de ADN de la Reivindicación 1,
en la que dicha relación K_{i}/K_{m} está comprendida entre
6-250.
4. Una secuencia de ADN aislada que contiene la
codificación de una proteína que muestra actividad de EPSPS, en la
que dicha proteína es capaz de reaccionar con anticuerpos generados
contra una enzima EPSPS de Clase II seleccionada entre el grupo
formado por las enzimas de la SEQ ID NO: 3 y de la SEQ ID NO: 5.
5. La secuencia de ADN de la Reivindicación 4,
en la que dichos anticuerpos se han generado contra una enzima EPSPS
de Clase II de la SEQ ID NO: 3.
6. Una secuencia de ADN que contiene la
codificación de una enzima EPSPS de Clase II seleccionada entre el
grupo formado por la SEQ ID NO: 3 y la SEQ ID NO: 5.
7. Una molécula de ADN de doble hélice,
recombinante, que comprende en orden sucesivo:
a) un promotor cuya función en las células de la
planta es causar la producción de una secuencia de ARN;
b) una secuencia de ADN estructural que causa la
producción de una secuencia de ARN que contiene el código de una
enzima EPSPS de Clase II capaz de reaccionar con anticuerpos
generados contra una enzima EPSPS de Clase II seleccionada entre el
grupo formado por las enzimas de la SEQ ID NO: 3 y de la SEQ ID NO:
5; y
c) una región no traducida 3' cuya función en
las células de la planta es causar la adición de una extensión de
poliadenil nucleótidos en el extremo 3' de la secuencia de ARN, en
la que el promotor es heterólogo con respecto a la secuencia de ADN
estructural y adaptado para causar la suficiente expresión del
polipéptido de fusión como para potenciar la tolerancia al glifosato
de una célula de planta transformada con dicha molécula de ADN.
8. La molécula de ADN de la Reivindicación 7, en
la que dicha secuencia de ADN estructural contiene el código de un
polipéptido de fusión que comprende un péptido de tránsito de
cloroplasto amino-terminal y una enzima EPSPS de
Clase II.
9. La molécula de ADN de la Reivindicación 8, en
la que dicha secuencia de ADN estructural que contiene la
codificación de una enzima EPSPS de Clase II está seleccionada entre
el grupo formado por la SEQ ID NO: 2, la SEQ ID NO: 4 y la SEQ ID
NO: 6.
10. La molécula de ADN de la Reivindicación 9,
en la que dicha secuencia procede de la SEQ ID NO: 2.
11. Una molécula de ADN de la Reivindicación 8,
en la que el promotor es un promotor de virus de ADN de planta.
12. Una molécula de ADN de la Reivindicación 11,
en la que el promotor está seleccionado entre el grupo formado por
los promotores CaMV35S y FMV35S.
13. Una molécula de ADN de la Reivindicación 7,
en la que dicho ADN estructural contiene el código de una enzima
EPSPS de Clase II seleccionada entre el grupo formado por la SEQ ID
NO: 3 y la SEQ ID NO: 5.
14. Un procedimiento de producción de plantas
transformadas genéticamente que son tolerantes frente a herbicidas
de glifosato, que comprende las etapas de:
a) la inserción dentro del genoma de una célula
de planta de una molécula de ADN de doble hebra, recombinante, que
comprende:
- i)
- un promotor cuya función en las células de plantas es causar la producción de una secuencia de ARN,
- ii)
- una secuencia de ADN estructural que causa la producción de una secuencia de ARN que contiene el código de un polipéptido de fusión que comprende un péptido de tránsito de cloroplasto amino-terminal y una enzima EPSPS de Clase II capaz de reaccionar con anticuerpos generados contra una enzima EPSPS de Clase II seleccionada entre el grupo formado por las enzimas de la SEQ ID NO: 3 y la SEQ ID NO: 5,
- iii)
- una secuencia de ADN no traducida 3' cuya función en las células de plantas es causar la adición de una extensión de poliadenil nucleótidos en el extremo 3' de la secuencia de ARN,
- en la que el promotor es heterólogo con respecto a la secuencia de ADN estructural y adaptado para causar la suficiente expresión del polipéptido de fusión como para potenciar la tolerancia al glifosato de una célula de planta transformada con dicho gen;
b) la obtención de una célula de planta
transformada; y
c) la regeneración a partir de la célula de
planta transformada de una planta transformada genéticamente que
tiene tolerancia incrementada al herbicida de glifosato.
15. El procedimiento de la Reivindicación 14, en
el que dicha secuencia de ADN estructural que contiene la
codificación de una enzima EPSPS de Clase II está seleccionada entre
el grupo formado por la SEQ ID NO: 2, la SEQ ID NO: 4 y la SEQ ID
NO: 6.
16. La molécula de ADN de la Reivindicación 15,
en la que dicha secuencia es tal como se establece en la SEQ ID NO:
2.
17. Un procedimiento de la Reivindicación 14, en
el que el promotor procede del ADN de un virus de planta.
18. Un procedimiento de la Reivindicación 17, en
el que el promotor está seleccionado entre el grupo formado por los
promotores CaMV35S y FMV35S.
19. Un procedimiento de la Reivindicación 14, en
el que dicho ADN estructural contiene el código de una enzima EPSPS
de Clase II seleccionada entre el grupo formado por la SEQ ID NO: 3
y la SEQ ID NO: 5.
20. Una célula de planta tolerante del glifosato
que comprende una molécula de ADN de las Reivindicaciones 8, 9, 12
ó 13.
21. Una célula de planta tolerante del glifosato
de la Reivindicación 20, en la que el promotor es un promotor de
virus de ADN de planta.
22. Una célula de planta tolerante del glifosato
de la Reivindicación 21, en la que el promotor está seleccionado
entre el grupo formado por los promotores CaMV35S y FMV35S.
23. Una célula de planta tolerante del glifosato
de la Reivindicación 20, seleccionada entre el grupo formado por
maíz, trigo, arroz, soja, algodón, remolacha azucarera, colza,
canola, lino, girasol, patata, tabaco, tomate, alfalfa, álamo,
pino, manzana y uva.
24. Una planta tolerante del glifosato que
comprende células de planta de la Reivindicación 20.
25. Una planta tolerante del glifosato de la
Reivindicación 24, en la que el promotor procede de un promotor del
ADN de un virus de planta.
26. Una planta tolerante del glifosato de la
Reivindicación 25, en la que el promotor está seleccionado entre el
grupo formado por los promotores CaMV35S y FMV35S.
27. Una planta tolerante del glifosato de la
Reivindicación 26, seleccionada entre el grupo formado por maíz,
trigo, arroz, soja, algodón, remolacha azucarera, colza, canola,
lino, girasol, patata, tabaco, tomate, alfalfa, álamo, pino, manzana
y uva.
28. Un procedimiento para controlar
selectivamente las malas hierbas en un campo que contiene un cultivo
con semillas o plantas de cultivo plantadas, que comprende las
etapas de:
a) la plantación de dichas semillas o plantas de
cultivo que son tolerantes del glifosato como resultado de haberse
insertado una molécula de ADN de doble hebra, recombinante, dentro
de dicha semilla o planta de cultivo, conteniendo dicha molécula de
ADN:
- i)
- un promotor cuya función en las células de plantas es causar la producción de una secuencia de ARN,
- ii)
- una secuencia de ADN estructural que causa la producción de una secuencia de ARN que contiene el código de un polipéptido que comprende un péptido de tránsito de cloroplasto amino-terminal y una enzima EPSPS de Clase II capaz de reaccionar con anticuerpos generados contra una enzima EPSPS de Clase II seleccionada entre el grupo formado por las enzimas de la SEQ ID NO: 3 y la SEQ ID NO: 5,
- iii)
- una secuencia de ADN no traducida 3' cuya función en las células de plantas es causar la adición de una extensión de poliadenil nucleótidos en el extremo 3' de la secuencia de ARN,
- en la que el promotor es heterólogo con respecto a la secuencia de ADN estructural y adaptado para causar la suficiente expresión del polipéptido de fusión como para potenciar la tolerancia al glifosato de una célula de planta transformada con dicho gen; y
b) la aplicación a dicho cultivo y malas hierbas
en dicho campo de una proporción suficiente de herbicida de
glifosato como para controlar dichas malas hierbas sin afectar de
manera significativa a dicho cultivo.
29. El procedimiento de la Reivindicación 28, en
el que dicha secuencia de ADN estructural que contiene la
codificación de una enzima EPSPS de Clase II está seleccionada entre
las secuencias tal como se establece en las SEQ ID NO: 2, SEQ ID
NO: 4 o SEQ ID NO: 6.
30. Un procedimiento de la Reivindicación 29, en
el que dicha molécula de ADN contiene una secuencia de ADN
estructural procedente de la SEQ ID NO: 2.
31. Un procedimiento de la Reivindicación 30, en
el que dicha molécula de ADN comprende además un promotor
seleccionado entre el grupo formado por los promotores CaMV35SS y
FMV35S.
32. Un procedimiento de la Reivindicación 31, en
el que la planta de cultivo está seleccionada entre el grupo
formado por maíz, trigo, arroz, soja, algodón, remolacha azucarera,
colza, canola, lino, girasol, patata, tabaco, tomate, alfalfa,
álamo, pino, manzana y uva.
33. El procedimiento de la Reivindicación 28, en
el que dicha secuencia de ADN estructural contiene el código de una
enzima EPSPS de Clase II seleccionada entre el grupo formado por la
SEQ ID NO: 3 y la SEQ ID NO: 5.
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