RS51300B

RS51300B - Ciklopeptidni derivati sa anti-integrinskom aktivnošću

Info

Publication number: RS51300B
Application number: RSP-2010/0231A
Authority: RS
Inventors: Sergio Penco; Loredana Vesci; Claudio Pisano; Alma Dal Pozzo; Giuseppe Giannini; Maria Ornella Tinti; Hong Ni Ming
Original assignee: Sigma-Tau Industrie Farmaceutiche Riunite S.P.A.
Priority date: 2004-05-13
Filing date: 2005-05-04
Publication date: 2010-12-31
Also published as: ES2340862T3; AR048957A1; KR20070012524A; ATE460426T1; ITRM20040239A1; TW200606178A; DK1751176T3; BRPI0510985A; DE602005019876D1; PT1751176E; SI1751176T1; CA2562576A1; CN1953990A; HRP20100301T1; US20070178045A1; AU2005243418A1; JP2008500971A; WO2005111064A8; EP1751176A1; EP1751176B1

Abstract

Ciklični peptidi koji imaju sledeću Formulu I:c(R1-Arg-Gly-Asp-R2) (Formula I),naznačeni time, što:c znači ciklični;R1 je amino-kiselina opšte formule: -NX-CY(Z)-CO-; gdeX je odabrano iz grupe koja sadrži: H, linearni ili granati C1-C6 alkil, C6-C10 aril, benzil, (CH2)n-COR, (CH2)n-NHR, 4-COR-benzil, 4-(CH2-NHR')-benzil; gde je n ceo broj od 1 do 5;Y je odabrano iz grupe koja sadrži: H, CHmFm', gde je m + m' = 3, gde su m i m' celi brojevi od 0 do 3;Z je odabrano iz grupe koja sadrži: H, (CH2)n1-NHR', 4-NHR'-(CH2)n1-benzil, 4-COR-benzil, gde je n1 ceo broj od 0 do 5;R je odabrano iz grupe koja sadrži W, OW, N[CH2-CO-NH-CH2-O-(CH2CH2O)n2-CH2-COOW]2, NH-CH2-O-(CH2CH2O)n2-CH2-COOW, NW-(CH2-CH2NH)n2-CH2CH2NHW; gde je n2 ceo broj od 1 do 22; iW je odabrano iz grupe koja sadrži : H, C1-C3 alkil;R' je odabrano iz grupe koja sadrži H, CO-(CH2)n2-COOW, CO-CH2-O-(CH2CH2O)n2-CH2-NHW, CO-CH2-O-(CH2CH2O)n2-CH2-COOW; gde n2 ima značenje saopšteno gore; iR2 je odabrano iz grupe koja sadrži: D-Phe, D-4-tert-butil-Phe, D-4-CF3-Phe, D-4-acetilamin-Phe;njihove racemske smeše, njihove pojedinačne enantiomere, njihove pojedinačne dijastereoizomere i njihove farmaceutski prihvatljive soli.Prijava sadrži još 14 zavisnih patentnih zahteva.

Description

Oblast pronalaska

[0001]Objekti predmetnog pronalaska su jedinjenja upotrebljiva kao lekovi, postupci za njihovo pripremanje, farmaceutske kompozicije koje ih sadrže i njihova upotreba za pripremanje lekova korisnih za lečenje bolesti do kojih dolazi usled abnormalne angiogeneze.

Osnova pronalaska

[0002]Kod onkoloških pacijenata, hemoterapija je, u mnogim slučajevima, jedini metod izbora za lečenje rasejanog kancera. Jedan pristup za poboljšanje efikasnosti i smanjenje toksičnosti antikancerske hemoterapije je primena lekova čiji su ciljevi receptori uključeni u tumorsku angiogenezu.

[0003]Integrini su uključeni u adheziju između jedne i druge ćelije i između ćelija i vanćelijskog matriksa, i u procesu tumorske angiogeneze i u metastatičkim procesima. Posebno, avP3i avPsintegrinski receptori snažno se eksprimiraju u endotelskim ćelijama mikrovaskulature tumora kod ljudi, kao i u samim tumorskim ćelijama.

[0004]Vaskularizacija tumora se danas obično prepoznaje kao obećavajući cilj za antikancersku terapiju [H. Jin and J. Varner, Br. J. Cancer, 2004, 90(3): 561-5].

[0005]Poslednjih godina, brojne studije pokazale su da ciklopeptidni derivati koji sadrže sekvencu Arg-Gly-Asp pokazuju visok afinitet prema integrinskim receptorima.

[0006]Inhibicija progresije tumora i neoangiogeneze korišćenjem cikličnih RGD-peptida, izučavane su i neke studije su već dale obećavajuće rezultate.

[0007]Na primer, u hemijski indukovanom karcinomu kolona kod pacova, nedavno je pokazano da kasni početak lečenja integrin-blokirajućim peptidima dovodi do inhibicije rasta tumora i redukovanja veličine tumora koje je izgleda posredovano, bar delimično, inhibicijom neoangiogeneze (Haier J. et al. Clin. Exp. Metastasis, 2002: 19(8); 665-72). Prema tome, izgleda daje inhibicija av(33integrinskog receptora dobra terapijska strategija za kancer.

[0008]Pored toga, ovi ciklični RGD peptidi mogu imati interesantnu terapijsku primenu kod kardiovaskularnih oboljenja, osteoporoze i infekcija virusima kojih koriste ćelijske integrine da bi prodrli u ciljne ćelije (npr. HIV). Ovakva jedinjenja korisna su za usmeravanje hemoterapijskih lekova, posebno antikancerskih lekova, protiv onih ćelija koje eksprimiraju visoke nivoe integrinskih receptora. Na taj način, postiže se efikasan terapijski odgovor, uz redukovane sporedne efekte indukovane hemoterapijskim lekom.

(0009] HaubnerR. et al., J. Am, Chem. Soc, 1996, 118, 7461 izučavali su uticaj konformacionih promena RGD-sadržavajućih cikličnih pentapeptida formule RGD-XX na inhibicioni profil ovog drugog na različite tipove integrinskih receptora. Menjanjem prirode poslednje dve amino-kiselinske rezidue (tj. XX), autori su zaključili da priroda poslednje rezidue nema nikakvog uticaja na inhibitorni profil čitavog cikličnog jedinjenja. Međutim, nema publikovanih podataka koji se tiču avpY

[0010]DE19725368 objavljuje derivate formule RGD-XX, međutim, kako u ovom patentu nema objavljenih bioloških podataka u vezi sa ovim derivatima, taj dokument ne pruža nikakav uvid o uticaju različitih rezidua na poziciji 4 i/ili 5 ciklične strukture.

Kratak sadržaj pronalaska

[0011]Predmetni pronalazak odnosi se na ciklopeptidne derivate sa anti-integrinskom aktivnošću, i posebno na ciklične peptide koji sadrže, pored sekvence od tri amino-kiseline koje su konstantne u svim ovde opisanim jedinjenjima, druge dve rezidue koje se sastoje od amino-kiselina koje se sreću u prirodi i koje se ne sreću u prirodi, koje mogu biti supstituisane na azotu ili na Ca reziduom koja se sastoji od funkcionalne grupe ili terminalnog lanca sa funkcionalnom grupom koja, neočekivano, pojačava njegovo vezivanje za integrine avp3iOvPs- Predmetni pronalazak se takođe odnosi na postupke za pripremanje pomenutih jedinjenja, njihovu upotrebu kao lekova, posebno kao inhibitora integrinskih receptora, sa dejstvom korisnim za lečenje bolesti kao što su retinopatija, akutna bubrežna insuficijencija, osteoporoza i metastaze i na farmaceutske kompozicije koje ih sadrže. Ova jedinjenja, kada su pogodno obeležena, korisna su i kao dijagnostička sredstva za detektovanje malih tumorskih masa i slučajeva okluzije arterija.

[0012]Lekovi nošeni ciklopeptidima prema predmetnom pronalasku pripadaju klasama citotoksičnih sredstava kao što su alkilirajuća sredstva (ciklofosfamidi, nitrozouree), antimetaboliti (metotreksat, 5-fluorouracil, citozin arabinozid), prirodni proizvodi (doksorubicin i strukturni analozi, aktinomicin D, bleomicin, alkaloidi vinke, epipodofilotoksini, i mitomicin C).

[0013]Za iscrpan opis stanja tehnike u vezi sa ctvfo i avpsintegrin-recetorskim jedinjenjima i njihovim primenama, čitalac se upućuje na WO 2004/011487, u ime Prijavioca, na koji se takođe eksplicitno upućuje u vezi sa naučnom osnovom.

[0014]Iznenađujuće, dobijeni molekuli predmetnog pronalaska pokazuju afinitet za integrine, koji je ponekad znatno veći nego onaj koji je zapažen za ciklopeptide koji pripadaju istoj klasi i opisani su u literaturi (H. Kessler, et al., J. Med. Chem., 1999, 42, 3033-40).

[0015]Prema tome, ovaj pronalazak obezbeđuje inhibitore integrina av(33i av(3stipa, koji su mnogo potentniji nego poznata jedinjenja.

[0016]Prema tome, glavni objekt predmetnog pronalaska su jedinjenja Formule 1, kao što sledi:

gde:

c znači ciklični;

Rije amino-kiselina opšte formule: -NX-CY(Z)-CO-; gde

X je odabrano iz grupe koja sadrži: H, linearni ili granati Ci-Cćalkil, Cć-Cioaril,

benzil, (CH2)n-COR, (CH2)n-NHR', 4-COR-benziI, 4-(CH2-NHR')-benzil; gde je n

ceo broj od 1 do 5;

Y je odabrano iz grupe koja sadrži: H, CHmFm'; gde je m+m-3, gde su m i m' celi

brojevi od 0 do 3;

Z je odabrano iz grupe koja sadrži: H, (CH2)n,-NHR\ 4-NHR'-(CH2)ni-benziI, 4-COR-benzil, gde je niceo broj od 0 do 5;

R je odabrano iz grupe koja sadrži W, OW, N[CH2-CO-NH-CH2-0-(CH2CH20)^-CH2-COOW]2, NH-CH2-0-(CH2CH20)n2-CH2-COOW, NW-(CH2CH2NH)n2-CH2-CH2NHW; gde je n2ceo broj od 1 do 22; i

W je odabrano iz grupe koja sadrži: H, C1-C3alkil;

R* je odabrano iz grupe koja sadrži H, CO-(CH2)n2-COOW, CO-CH2-0-(CH2CH20)n2-CH2-NHW, CO-CH2-0-(CH2CH20)n2-CH2-COOW; gde n2 ima

značenje saopšteno gore; i

R2je odabrano iz grupe koja sadrži: D-Phe, D-4-tert-butil-Phe, D-4-CF3-Phe, D-4-acetilamin-Phe;

njihove racemske smese, njihove pojedinačne enantiomere, njihove pojedinačne dijastereoizomere i njihove farmaceutski prihvatljive soli.

[0017] Poželjni primeri jedinjenja formule (I) su: c(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Amp);

c(Arg-Glv-Asp-D-Phe-Aad);

c(Arg-Glv-Asp-D-Phe-N-Me-Amp);

c[Arg-Gly-Asp-D-Phe-Amp-CO(CH2)2COOH];

c(Arg-Gly-Asp-D-Phe-N-Amb-Gly);

c[Arg-Gly-Asp-D-Phe-Amp-(CO-CH2-(0-CH2-CH2)2-0-CH2-COOH];

c[Arg-Gly-Asp-D-Phe-Amp-(CO-CH2-(OCH2CH2)8-OCH2-COOH]; i c[Arg-Gly-Asp-D-Phe-Amp(CO-CH2-(OCH2-CH2)3-OCH3)];

[0018] Pod farmaceutski prihvatljivom solju misli se na bilo koju so koja ne daje toksične ili sporedne efekte.

[0019] Takve soli su dobro poznate farmakolozima i stručnjacima u farmaceutskoj tehnologiji.

[0020] Jedinjenja Formule I mogu se pripremiti prema postupku koji je dole opisan i prikazan primerima za poželjna jedinjenja u skladu sa pronalaskom. Ovaj proces čini dalji objekt pronalaska.

[0021] Jedinjenja Formule I mogu se pripremiti, posle sintetisanja rezidua amino-kiselina koje se ne sreću u prirodi, prema opšte poznatim tehnikama sinteze peptida, kako je opisano u primerima u eksperimentalnom delu. Sinteza peptida može da se obavi u čvrstoj fazi ili u rastvoru. Kada se jednom pripremi pogodan zaštićeni linearni peptid, onda se on ciklizira.

[0022]Jedinjenja opisana u predmetnom pronalasku su inhibitori integrina i prema tome korisna su kao lekovi za lečenje kancera, kao dijagnostička prikazujuća sredstva, i kao vektori za usmerene lekove (G. C. Tucker 2003 Curr. Opin. Investig. Drugs 4, 722-31), posebno za lečenje tumora čije ćelije eksprimiraju integrine u višku, i prirodno i na indukovani način, na primer, kao rezultat radioterapije; u zapaljenskim oboljenjima (npr. reumatoidni artritis), u bolestima u čijoj osnovi je abnormalna angiogeneza, kao što su tumori, retinopatija, oboljenja oka, akutna bubrežna insuficijencija, osteoporoza i metastaza, kardiovaskularne bolesti (slog i oštećenje srca), i restenoza posle perkutane transluminalne koronarne angioplastike (J. S. Kerr et al., Drug News Perspect 2001, 14, 143 50). Ovde opisana jedinjenja korisna su takođe, kada su odgovarajuće obeležena, kao dijagnostička sredstva, posebno za detekciju malih tumorskih masa i slučajeva okluzije artrija. Različiti antagonisti obeležavani su sa (18)F, (lll)In, (99)Tc, (90)Y i mnogim izotopima joda, da bi se pratila tumorom indukovana angiogeneza, pošto su integrini uključeni u migraciju endotelskih ćelija pri formiranju novih krvnih sudova (R. H. Haubner et al., 2003 Q. J. Nucl. Med. 47 189-99). Radioaktivno obeleženi visokoafinitetni peptidi mogu da se koriste kao ciljevi za avp3integrine i sa ciljem pokazivanja područja vaskularnog oštećenja, budući da je ekspresija av(33povećana u aktiviranim endotelskim ćelijama i u glatkim mišićnim ćelijama krvnih sudova posle vaskularnog oštećenja. Ovaj pristup prevazilazi nedostatke metoda magnetne rezonance i kompjuterizovane aksijalne tomografije, kao što su odsustvo biološki relevantnih liganada i krvnih kontrastnih sredstava za prikazivanje (F. G. Blankenberg et al. 2002 Am. J. Cardiov. Drugs 2, 357-65).

[0023]Farmaceutske kompozicije sadrže kao aktivni sastojak bar jedno jedinjenje Formule I u količini koja je dovoljna da proizvede značajan terapijski efekat. Kompozicije prema predmetnom pronalasku su u celini opšte poznate i dobijaju se korišćenjem metoda koji su rutinski u farmaceutskoj industriji. U skladu sa odabranim načinom primene, kompozicije će biti u čvrstoj ili tečnoj formi, pogodne za oralnu, parenteralnu ili intravensku primenu. Kompozicije prema predmetnom pronalasku sadrže, pored aktivnog sastojka, bar jedan farmaceutski prihvatljivi nosač ili ekscipijens. Posebno korisni mogu biti adjuvansi formulacije kao što su, na primer, solubilizujuća sredstva, dispergujuća sredstva, suspenziona sredstva i emulzifikujuća sredstva. (0024]Jedinjenja Formule I takođe mogu da se koriste u kombinaciji sa drugim antikancerskim lekovima ili drugim lekovima koji imaju antiparazitsku ili antivirusnu aktivnost, u zasebnim formama ili jednoj doznoj formi. (0025]Lekovi koji su objekt predmetnog pronalaska koriste se takođe za lečenje parazitskih i adenovirusnih oboljenja. Ulazak patogena u ćelije odvija se putem direktnog prodiranja kroz plazminu membranu, endocitozom posredovanom klatrinom, kaveolusnom endocitozom, pinocitozom ili makropinocitozom. Makropinocitoza zahteva učešće integrina (O. Meier et al., 2003, J. Gene Med. 5, 451-62). U tom slučaju, antiparazitska aktivnost može da se ispolji inhibicijom adhezije posredovane integrinom i regrutovanjem leukocita vođenim receptorima za hemokine, npr. u kontroli zapaljenja indukovanogTrypanosoma cruzi.Uzgred, u akutnoj fazi Chagas-ove bolesti, indukcija zapaljenskog procesa ključna je za kontroluTrypanosoma cruziu ciljnom tkivu ekvilibrijuma domaćin/parazit (J. Lannes-Vieira, 2003, Mem. Inst. Osvvaldo Cruz, 98, 299-304).

[0026]Sledeći primeri dalje ilustruju pronalazak.

[0027]Skraćenice koje su korišćene su: Aad (aminoadipinska kiselina);

Amb (aminometilbenzil);

Amp (aminometilfenilalanin);

Boe (ter-_butoksikarbonil);

CSA (camfosulfonska kiselina);

CTH (hidrogenizacija katalitičkim transferom);

DBU (1,8-diazabiciklo[5.4.0]undec-7-en);

DCC (dicikloheksilkarbodiimid);

DCM (dihlorometan);

DEAD (dietil acetilendikarboksilat)

DIEA (diizopropiletilamin);

DMF (dimetilformamid);

EMEM (Eagle-ov minimalni esencijalni medijum sa Earle-ovom solju);

Fm (fluorenilmetil);

Fmoc (9-fluorenilmetil-oksikarbonil);

HOBT (hidroksibenzotriazol);

NMP (N-metil-pirolidon);

oNBS (2-nitrobenzensulfonat);

PBS (slani fosfatni pufer);

Pht (ftaloil);

Pmc (pentametilhroman-6-_sulfoniI);

SDS (natrijum dodecilsulfat);

TBTU (tetrafluoroborat-O-benzotriazol-1 -i 1 -tetrametiluronijum);

TEA (trietilamin);

Teg (trietilenglikol monometiletar); i

TFA (trifluorosirćetna kiselina).

Primeri

Primer 1

Sinteza c( Arg- Glv- Asp- D- Phe- Amp) - ST2581

[0028]1.587 mmol Fmoc-Gly-Res (Res = Sasrin Resin®, Bachem) suspenduje se uz mešanje u 75 ml DMF, 30 min, posle čega se doda 18 ml piperidina, uz nastavak mešanja još 30 min. Smola, filtrirana i isprana pomoću DMF, suspenduje se u 50 ml NMP (N-metil-pirolidon), 15 min, posle čega se dodaju Fmoc-Arg(Pmc)-OH, HOBT, TBTU i DIEA (3.174 mmol svakog); posle 2 sata mešanja, suspenzija se filtrira i ispere sa DMF. Posle deprotektovanja piperidinom, ponovi se kondenzacija sa drugim aminokiselinama sukcesivno, postupajući svaki put kako je gore opisano, naime: Fmoc-Amp(Cbz)-OH, Fmoc-D-Phe-OH, i Fmoc-Asp(OtBu)-OH. Posle poslednjeg deprotektovanja Fmoc-N-završetka, linearni pentapeptid se oslobodi iz smole pomoću 45 ml 1% TFA u DCM. Ovo se rastvori u približno 11 CH3CN, i 4.761 mmol HOBT i TBTU, i 10 ml DIEA se dodaju; rastvor se ostavi 30 min da se meša, rastvarač ispari do male zapremine i precipitacija proizvoda se završi sa vodom.

[0029]Filtrirani sirovi proizvod rastvori se u tioanisolu (50 eq) i TFA (270 eq) i ostavi se da se meša preko noći na sobnoj temperaturi.

[0030]Reakciona smeša se dovede do suvog i rezidua preuzme pomoću minimalne količine TFA i reprecipitira sa viškom etil-etra. Konačno, sirovi proizvod se prečisti pomoću RP-HPLC [Kolona: Alltima C-18, Alltech; mobilna faza: 17% CH3CN u vodi + 0.1% TFA].

[0031]Analitička HPLC: kolona: Purosphere STAR, Merck; mobilna faza: 15% CH3CN u vodi + 0.1% TFA): Rt =12.15 min.

Molekulska masa = 652

Primer 2

Sinteza cf Arg- Glv- Asp- D- Phe- Aad) - ST2650

[0032]0.69 mmol Fmoc-Gly-R.es tretira se tačno kako je opisano u primeru 1, s tom razlikom što se u ovom slučaju treća i četvrta amino-kiselina dodaju u vidu dipeptida Fmoc-D-Phe-Aad(OBzl)-OH. Posle deprotektovanja benzil estra pomoću CTH i prečišćavanja sirovog proizvoda preparativnom RP-HPLC (mobilna faza: CH3CN 55% u vodi + TFA 0.1%; Rt = 17.29 min), dobija se 187 mg čistog deprotektovanog peptida. Ovo se rastvori u TFA i, posle 1 sata na sobnoj temperaturi, rastvor se dovede do suvog. Rezidua se ponovo rastvori u minimalnoj količini TFA i presipitira sa etil etrom u višku. Postupak se ponavlja dok se ne dobije čist finalni proizvod.

[0033]Analitička RP-HPLC (17% CH3CN u vodi +0.1% TFA), Rt = 12.52 min.

Molekulska masa = 619

Primer 3

Svnthesis of c( Arg- Glv- Asp- D- Phe- N- Me- Amp) - ST2700

[0034]U suspenziju Fmoc-Phe(4-Pht-N-CH2)-COOH u anhidrovanom toluenu dovedenu do refluksa, dodaju se 2 eq CSA i 20 eq paraformaldehida, podeljeno u 4 porcije, u intervalima od po 15 minuta. Mešavina se ostavi da se ohladi, razblaži se sa 120 ml toluena i ispere sa 5% NaHC03i vodom. Posle evaporacije rastvarača, rezidua se rastvori u 15 ml CHCI3+ 15 ml TFA + 700 u.1 Et3SiH; smeša se ostavi u mraku da se meša 42 sata. Posle evaporacije rastvarača, rezidua se prečisti filtracijom na silika gelu. Ukupni prinos: 90%.

(0035]Sintetiše se linearni peptid u čvrtstoj fazi, kako je opisano u Primeru 1, insertovanjem Fmoc-N-Me-Phe-(4-Pht-N-CH2)-COOH kao treće aminokiseline, pripremljene kako je opisano gore. U ovom slučaju, deprotektovanja N-Fmoc-kraja na

smoli obavljana su sa 30% diizopropilaminom (300 eq) u rastvoru DMF (usled prisustva ftalimida). Posle ciklizacije, 500 mg peptida se rastvori zagrevanjem u 10 ml apsolutnog EtOH, u koji je dodato 0.9 ml rastvora NH2-NH9H2O, IM u etanolu. Posle zagrevanja na refluksu tokom 2 sata, rastvarao evaporiše i rezidua se preuzme pomoću 10 ml DCM + 10 ml Na2C03rastvora, uz snažno mućkanje. Posle evaporacije organske faze, sirova rezidua se prečisti preparativnom RP-HPLC (mobilna faza: 17% CH3CN u vodi + 0.1% TFA).

[0036]Analitička RP-HPLC (16% CH3CN u vodi + 0.1% TFA), Rt = 11.7 min Molekulska masa = 665

Primer 4

Sinteza cfArg- Glv- Asp- D- Phe- Amp- fC^b COOHI - ST2649

[0037] 120 mg ciklopeptida c[Arg(Pmc)-Gly-Asp(OtBu)-D-Phe-Amp]-TFA (pripremljeno kako je opisano u primeru 1) rastvori se u 3.6 ml smeše DCM-DMF 2:1, zajedno sa stehiometrijskom količinom TEA anhidrida sukcinata. Posle 1 sata, reakciona smeša se razblaži sa 30 ml DCM i ispere sa vodom. Organska faza, osušena i koncentrovana, daje reziduu 100 mg hemisukcinata. Ovaj proizvod se potpuno deprotektuje sa TFA i zatim podvrgne prvom prečišćavanju, kako je već opisano u primerima gore. Zatim se dalje prečišćava preparativnom RP-HPLC: (20% CH3CN u vodi + 0.1% TFA), Rt = 14.66 min.

Molekulska masa = 751.

Primer 5

Sinteza c( Arg- Glv- Asp- D- Phe- N- Amb- Glv) - ST2701

[0038]U rastvor 1.22 mmol Boc-monoprotektovanog p-ksililendiamina u 6 ml THF, doda se 1.83 mmol TEA i, u kapima, rastvor 1.22 mmol benzil bromoacetata u 2 ml THF. Smeša se ostavi da se meša preko noći, posle čega rastvarač ispari i rezidua se prečisti na koloni za fleš-hromatografiju (CHCI3-EtOAc, 9:1). Dobijenoje 0.69 mmol of N-(4-Boc-NH-CH2-benzil)-glicin benzilestra.

[0039]250 mg Fmoc-D-Phe-OH rastvori se u 27 ml DCM i doda se 40 ul difosgena i 230 u.1 simkolidina; posle 15 min doda se 190 mg prethodno pripremljenog estra, rastvorenog u 3 ml DCM. Posle 3 sata, u reakcionu smešu se doda 80 u.1 N-Me-piperazina i meša se 10 min, posle čega se smeša razblaži sa 10 ml DCM i obavi se ekstrakcija sa vodom, HC1 0.5 N, vodom, 5% NaHC03i vodom. Posle evaporacije rastvarača, rezidua se prečisti fleš hromatografijom na silika gelu (DCMEtOAc, 9:1). Prinos 80%.

[0040]U 100 mg tako dobijenog proizvoda rastvorenog u 6 ml MeOH, doda se 76 ul AcOH i 42 mg HCOONH4i smeša se ohladi na 0°C i doda se 50 mg 10% Pd/C. Posle 30 min, reakciona smeša se filtrira na celitu. Filtrat se dovede do suvog i prečisti na koloni za fleš hromatografiju (CHCl3-MeOH 9:1). Prinos 90%.

[0041]190 mg tako dobijenog proizvoda rastvori se u 1.2 ml TFA i dovede do suvog (deprotekcija od Boe); rezidua se ponovo rastvori u 9 ml 10% Na2C03+ 6 ml dioksana, ohladi na 0°C i doda se u kapima rastvor od 120 p.1 benziloksikarbonil hlorida razblaženog sa 3 ml dioksana. Posle 1 sata mešanja na sobnoj temperaturi, obavi se evaporacija u vakuumu do male zapremine, posle čega se smeša razblaži vodom, pH se snizi na 1 pomoću HC1 i obavi se ekstrakcija sa EtOAc. Posle evaporacije rastvarača, rezidua se prečisti filtracijom na silika gelu, ispere sa CHCl3-MeOH 8:2). Prinos čistog dipeptida 82%.

[0042]0.69 mmol Fmoc-Gly-R.es tretira se kako je opisano u primeru 1. Posle Arg doda se prethodno pripremljeni dipeptid Fmoc-D-Phe-N(4-Cbz-NH-CH2-benzil)-Gly. Sirovi proizvod se rastvori u tioanisolu i TFA i ostavi da se meša na sobnoj temperaturi 4.5 sata. Prvo prečišćavanje obavi se kako je opisano u drugim primerima, dok se konačno prečišćavanje obavlja preparativnom HPLC (mobilna faza: 16% CH3CN u vodi + 0.1%

TFA).

[0043]Analitička RP-HPLC (15% CH3CN u vodi + 0.1% TFA), Rt = 7.67 min. Molekulska masa = 652.

Primer 6

Sinteza crArg- Glv- Asp- D- Phe- Amp^ CO- C^- fO- C^- CH^ VO- CH.- COOHI - ST2661.

[0044]U rastvor 200 mg c(Arg(Pmc)-Gly-Asp(OtBu)-D-Phe-Amp)-TFA (dobijenog kako je opisano u primeru 1) u 4 ml smeše 3:1 DCM-DMF, doda se u znatnom višku glikol diacid. U isti rastvor dodaju se DIEA (3 eq) i DCC (2 eq). Smeša se ostavi da se meša preko noći, posle čega se razblaži sa DCM i ispere sa vodom. Sirovi proizvod se dobije evaporacijom organske faze i prečisti se fleš hromatografijom (mobilna faza: CHCI3-MeOH 7:3 + 1% AcOH); prikupe se frakcije koje sadrže proizvod, isperu vodom, dehidratišu i dovedu do suvog, i dobije se rezidua od 157 mg čistog proizvoda. Ovo se tretira sa TFA 1.5 sat i prečisti kako je opisano u drugim primerima, posle čega se obavi finalno pečišćavanje preparativnom HPLC (mobilna faza: 22% CH3CN u vodi + 0.1% TFA).

[0045]Analitička RP-HPLC: (23% CH3CN u vodi + 0.1 % TFA);

Rt= 10 min.

Molekulska masa =855

Primer 7

Sinteza crArg- Glv- Asp- D- Phe- Amp( CO- CH?-( OCH2CHz) rOCHrCOOH1 - ST2874

[0046]150 mg peptida opisanog u primeru 1 i 10 mg PEG 600-COOFm (1 eq) + HOAT (1.5 eq) + DIEA (2 eq) rastvore se u 6 ml smeše DCM-DMF (2:1), i rastvor se ohladi na 0°C; doda se 1.5 eq DCC i smeša se ostavi da se meša preko noći. Posle evaporacije rastvarača, rezidua se prečisti na koloni za fleš hromatografiju (korak 1: CHCl3-MeOH, 96:4; korak II: CHCl3-MeOH, 90:10). Za deprotektovanje fluorenilmetilestra, 36 mg estra rastvori se u 1.8 ml CHC13, doda se 41 ul (20 eq) peridina i ostavi se preko noći na sobnoj temperaturi. Posle evaporacije rastvarača, sirova rezidua se prečisti preparativnom HPLC (46% CH3CN u vodi + 0.1% TFA). Sirovi proizvod dobijen na taj način rastvori se u TFA i ostavi 2 sata na sobnoj temperaturi. Posle smanjenja na malu zapreminu, potpuno deprotektovani proizvod se precipitira sa etil etrom u višku.

[0047]Analitčka RP-HPLC (26% CH3CN u vodi + 0.1% TFA); Rt = 7.89-15.83 min. Molekulska masa: 1119.

Primer 8

Sinteza c[ Arg- Glv- Asp- D- Phe- Amp( CO- CH2-( OCH2 CH2) rOCH3) l- ST2597

[0048]Ovaj peptid se sintetiše u čvrstoj fazi kako je opisano u Primeru 1, insertovanjem Fmoc-Amp(COCH2-Teg)-OH kao treće amino-kiseline, koja se priprema na sledeći način: 570 mg CH30(CH2CH20)3-CH2-COOH, 473 mg of 2,3,4,5-pentafluorofenola (Pfp) i 207 ul piridina se rastvori u 11.4 ml of DCM. U rastvor, ohlađen na 0°C, doda se 637 mg DCC i reakciona smeša se ostavi da se meša 1.5 h. Posle filtracije i ispiranja filtrata vodom, 1 N HC1, vodom, 5% NaHC03i vodom, organski rastvor se dovede do suvog, dajući 984 mg sirovog estra.

[0049]U suspenziju od 500 mg Fmoc-aminometilfenilalanina. TFA so u 15 ml DCM, 260 u.1 of TEA se doda, praćeno sa 800 mg aktiviranog estra i smeša se ostavi da se meša 3 h. Sirovi proizvod se prečisti fleš hromatografijom, dajući čisti gradivni blok.

[0050]Finalni ciklični peptid prečisti se kako je uobičajeno i izoluje sa preparativne HPLC (27% CH3CN u vodi + 1%TFA), Rt= 12.7 min.

Molekulska masa = 855.

Primer 9

Biološki rezultati

Vezivanje za integrinskeajfii L receptore

[0051]Prečišćeni Ovfc receptori (Chemicon, cat. CC1020) razblaže se u puferu (20 mM Tris, pH 7.4, 150 mMNaCl, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 1 mM MnCl2) do koncentracije od 0.5 p.g/ml. Alikvot od 100 ul nanese se na ploče sa 96 jamica i inkubira preko noći na +4°C. Ploče se jedanput isperu puferom (50 mM Tris, pH 7.4, 100 mM NaCl, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 1 mM MnCl2, 1% goveđi serum albumin) i zatim se inkubiraju još 2 sata na sobnoj temperaturi. Ploče se dva puta isperu istim puferom i inkubiraju 3 sata na sobnoj temperaturi sa radioaktivnim Ugandom [125I]ehistatinom (Amersham Pharmacia Biotech) 0.05 nM u prisustvu kompetitivnih liganada. Na kraju inkubacije, jamice se isperu i radioaktivnost se određuje korišćenjem gama-brojača (Packard). Nespecifično vezivanje liganda određuje se u prisustvu hladnog ehistatina u višku (1 uM).

Vezivanje za integrinske ayp\ receptore

[0052]Prečišćeni avp5receptor (Chemicon, cat. DCC 1020) rastvori se u puferu (20 mM Tris, pH 7.4, 150 mM NaCl, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 1 mM MnCl2) do koncentracije od 1 u.g/ml. Alikvot od 100 ui nanese se na ploče sa 96 jamica i inkubira preko noći na +4°C. Pčoče se jednom isperu puferom (50 mM Tris, pH 7.4, 100 mM NaCl, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 1 mM MnCI2, 1% goveđi serum albumin) i zatim inkubiraju još 2 sata na sobnoj temperaturi. Ploče se dva puta isperu istim puferom i inkubiraju 3 sata na sobnoj temperaturi sa radioaktivnim ligandom [125I]ehistatinom (Amersham Pharmacia Biotech) 0.15 nM u prisusutvu kompetitivnih liganada. Na kraju inkubacije, jamice se isperu i radioaktivnost određuje korišćenjem gama-brojača (Packard). Nespecifično vezivanje liganda određuje se u prisustvu hladnog ehistatina u višku (1 uM).

Evaluacija ICsn parametara

[0053]Afinitet proizvoda za vitronektinske reeptore izražava se kao IC50vrednost ± SD, tj. kao koncentracija sposobna da inhibira 50% specifičnog vezivanja radioligand-receptor. IC50parametar se određuje korišćenjem "ALLFIT" softvera.

Rezultati

[0054]Svi ispitivani RGD peptidi pokazali su značajan afinitet za avp3i avp5integrinske receptore, sa IC50vrednošću reda nanomola. Posebno, najaktivniji u inhibiciji vezivanja ehistatina za0^3integrine bio je ST2581 (IC50= 1.7 nM), praćeno proizvodima ST2661 i ST2700 (IC50= 4 i 7 nM), dok je najaktivniji za avPsintegrinske receptore bio proizvod ST2650 (IC50= 0.17 nM), praćen molekulima ST2661 i ST2700 (IC50= 0.35 i 0.99 nM, respektivno).

[0055]Iako je glavna funkcija integrina da posreduje u adheziji ćelija za proteine VĆM u međućelijskom prostoru i bazalnoj membrani, oni takođe vrše transdukciju unutarćelijskih signala koji pokreću migraciju i preživljavanje ćelija. Integrini nemaju sopstvenu enzimsku aktivnost ali aktiviraju signalne puteve tako što stvaraju koklastere sa kinazama i adaptorskim proteinima u fokalnim adhezivnim kompleksima posle njihove asocijacije sa polivalentnim proteinima vanćelijskog matriksa (VĆM). Na primer, ligacija integrina suprimira apoptozu aktiviranjem supresora apoptoze i inhibiranjem aktivacije kaspaza. Integrin takođe stimuliše migraciju ćelija aktiviranjem Rho i Rac GTPaza (guanozin trifosfataze) i ukotvljavanjem aktinskih filamenata za membranu. Ovi adhezivni proteini pokreću ulazak u ćelijski ciklus stimulacijom ekspresije ciklina. Ligacija integrina, prema tome, podržava kaskade prenosa signala koje promovišu proliferaciju ćelija, preživljavanje i migraciju. Nasuprot tome, inhibicija interakcije ćelijski integrin-ligand inhibira migraciju i proliferaciju ćelija i indukuje apoptozu (Jin H. and Varner J. 2004 Br. J. Cancer 90, 561-565).

Test adheziie tumorskih ćelija na vitronektin

[0056]Ćelije A2780 humanog karcinoma ovarijuma i ćelije PC3 karcinoma prostate rasle su na RPMI 1640 sa 10% fetalnim goveđim serumom i sa 50 u.g/ml gentamicin sulfata. Ćelije humanog bubrežnog karcinoma A498 rasle su na EMEM sa 10% fetalnim goveđim serumom i sa 50 ug/ml gentamicin sulfata. Sve ćelije su držane na 37°C u inkubatoru sa zasićenom vlažnošću i u atmosferi od 95% vazduha i 5% CO?.

[0057]Ćelijska linija A2780 cell line eksprimira visoke nivoe av(35integrina, A498 visoke nivoe avp3integrina, and PC3 niske nivoe oba integrina.

[0058]Da bi se ispitao efekat lekova na adheziju, pogodna gustina ćelija (40000-50000 ćel./jamici) za svaku tumorsku ćelijsku liniju inkubirana je sa različitim koncentracijama jedinjenja na pločama za kulturu tkiva sa 96 jamica obloženih vitronektinom (5 ug/ml) i omogućeno je prikačinjanje tokom 3 sata. Posle tog vremena ćelije su isprane jednom sa PBS koji sadrži Ca<2+>e Mg<2+>. Tumorske ćelije su fiksirane sa 4% paraformaldehidom, 10 min na sobnoj temperaturi i bojene 1% toluidinskim plavim, 10 min na sobnoj temperaturi. Tumorske ćelije su isprane redestilovanom vodom, osušene i solubilizovane sa 1% SDS. Broj adheriranih ćelija određen je na čitaču mikroploča (Victor2, EG&G Wallac) na 600 nm.

[0059]IC50vrednost kao parametar za merenje inhibirajućeg efekta molekula na adheziju tumorskih ćelija za vitronektin procenjivana je korišćenjem "ALLFIT" kompjuterskog programa. Rezultati dobijeni sa testnim jedinjenjima prema pronalasku prikazani su u Tabeli 2.

Claims

1. Ciklični peptidi koji imaju sledeću Formulu I: c(Ri-Arg-Gly-Asp-R2) (Formula I), naznačeni time,što: c znači ciklični; Rije amino-kiselina opšte formule: -NX-CY(Z)-CO-; gde X je odabrano iz grupe koja sadrži: H, linearni ili granati Ci-Cealkil, C6-C10aril, benzil, (CH2)n-COR, (CH2)n-NHR', 4-COR-benzil, 4-(CH2-NHR')-benzil; gde je n ceo broj od 1 do 5; Y je odabrano iz grupe koja sadrži: H, CHmFm', gde je m + m' = 3, gde su m i m' celi brojevi od 0 do 3; Z je odabrano iz grupe koja sadrži: H, (CH2)n,-NHR', 4-NHR'-(CH2)n,-benzil, 4-COR-benzil, gde je niceo broj od 0 do 5; Rje odabrano iz grupe koja sadrži W, OW, N[CH2-CO-NH-CH2-0-(CH2CH20)n2-CH2-COOW]2, NH-CH2-0-(CH2CH20)n2-CH2-COOW, NW-(CH2-CH2NH)n2-CH2CH2NHW; gde je n2ceo broj od 1 do 22; i W je odabrano iz grupe koja sadrži : H, C1-C3alkil; R'je odabrano iz grupe koja sadrži H, CO-(CH2)n2-COOW, CO-CH2-0-(CH2CH20)n2-CH2-NHW, CO-CH2-0-(CH2CH20)n2-CH2-COOW; gde n2ima značenje saopšteno gore; i R2je odabrano iz grupe koja sadrži: D-Phe, D-4-tert-butil-Phe, D-4-CF3-Phe, D-4-acetilamin-Phe; njihove racemske smeše, njihove pojedinačne enantiomere, njihove pojedinačne dijastereoizomere i njihove farmaceutski prihvatljive soli.

2. Jedinjenje prema zahtevu 1, naznačeno time, što je odabrano iz grupe koja se sastoji od: c(Arg-Glv-Asp-D-Phe-Amp); c(Arg-Gly-Asp-D-Phe-N-Me-Amp); c[Arg-Gly-Asp-D-Phe-Amp-CO(CH2)2COOH]; c(Arg-Gly-Asp-D-Phe-N-Amb-Gly); c[Arg-Gly-Asp-D-Phe-Amp-(CO-CH2-(0-CH2-CH2)2-0-CH2-COOH]; c[Arg-Gly-Asp-D-Phe-Amp-(CO-CH2-(OCH2CH2)8-OCH2-COOH]; i

3. Jedinjenja, naznačena time, što imaju formulu: c[Arg-Gly-Asp-D-Phe-Amp(CO-CH2-(OCH2-CH2)3-OCH3)]; c(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Aad);

4. Postupak za pripremanje peptida prema zahtevima 1-3, naznačen time, što obuhvata sintezu linearnog peptida i njegovu ciklizaciju posle toga.

5. Postupak prema zahtevu 4, naznačen time, što se sinteza peptida obavlja u čvrstoj fazi ili u rastvoru.

6. Upotreba jedinjenja prema zahtevima 1-3, naznačena time, što se upotrebljavaju kao lekovi.

7. Farmaceutske kompozicije, naznačene time, što sadrže bar jedno jedinjenje prema zahtevu 1 ili 2 ili 3 u smeši sa farmaceutski prihvatljivim ekscipijentom ili nosačem.

8. Kompozicije prema zahtevu 7,naznačene time,što dodatno sadrže lek odabran iz grupe koja se sastoji od antikancerskih, antiparazitskih ili antivirusnih sredstava, u odvojenim formama ili u jednoj doznoj formi.

9. Upotreba jedinjenja prema zahtevima 1-3,nazančena time,što se koriste za pripremanje lekova koji pokazuju inhibitornu akivnost prema integrinskim receptorima.

10. Upotreba jedinjenja prema zahtevu 9,naznačena time,što se pomenuti lek koristi za lečenje bolesti nastalih zbog abnormalne angiogeneze.

11. Upotreba prema zahtevu 10,naznačena time,što je pomenuta bolest odabrana iz grupe koja se sastoji od tumora koji u višku eksprimiraju integrine, prirodno i na indukovani način, zapaljenskih formi (npr. reumatoidni artritis), bolesti oka, retinopatije, akutne bubrežne insuficijencije, osteoporoze i matastaza, kardiovaskularne bolesti (šlog i oštećenje srca).

12. Upotreba jedinjenja prema zahtevima 1-3,naznačena time,što se koriste za pripremu leka sa antiparazitskom aktivnošću preko inhibicije integrina.

13. Kompozicija,naznačena time,što sadrži radioaktivno obeležene derivate jedinjenja prema zahtevima 1 ili 2 ili 3.

14. Upotreba radioaktivno obeleženih derivata jedinjenja prema zahtevima 1 ili 2 ili 3,naznačena time,što se koriste za pripremanje dijagnostičkih sredstava.

15. Upotreba prema zahtevu 14,naznačenatime, što se pomenuto dijagnostičko sredstvo koristi za detekciju malih tumorskih masa ili slučajeva okluzija arterija.