RS51372B - Jedinjenja triazolopirazina korisna za tretman degenerativnih upalnih bolesti - Google Patents

Abstract

Jedinjenje u skladu sa formulom III:naznačeno time, daR1 je H ili supstituisani ili ne supstituisani alkil; a svaki od R8 i R9 je nezavisno izabran iz supstituisanog ili ne supstituisanog cikloalkila, supstituisanog ili ne supstituisanog heterocikloalkila, supstituisanog ili ne supstituisanog arila, supstituisanog ili ne supstituisanog heteroarila; ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, njegova rastvorena materija; i njegovi stereoizomeri, izotopične varijante i tautomere.Prijava sadrži još 36 zavisnih patentnih zahteva.

Description

Ovaj pronalazak se odnosi na klasu jedinjenja triazolopirazina koja su sposobna da se vežu na aktivno mesto serin/treonin kinaze, čija je ekspresija uključena u putu koji rezultuje degeneracijom ekstra-ćelijskog matriksa (ECM), degradacijom zglobova i bolestima koje uključuju takvu degradaciju i/ili zapaljenje.

Bolesti koje uključuju degradaciju ekstra-ćelijskog matriksa uključuju, ali time nisu ograničene, psorijazni artritis, mladenački artritis, rani artritis, reaktivni artritis, osteoartritis, ankilozni spondilitis, osteoporozu, muskulo-skeletne bolesti kao na primjer tendonitis i periodontalnu bolest, tumorske metastaze, bolesti dišnih putova (COPD, astma), renalnu i jetrinu fibrozu, kardio-vaskularne bolesti kao na primer ateroskleroza i greška srca i neurološke bolesti kao na primer neurozapaljenje i multipla skleroza. Bolesti koje uključuju primarnu degradaciju zglobova uključuju, ali time nisu ograničeni, psorijazni artritis, mladenački artritis, rani artritis, reaktivni artritis, osteoartritis i ankilozni spondilitis.

Reumatoidni artritis (RA) je hronična bolest degeneracije zglobova, koja se karakteriše zapaljenjem i destrukcijom strukture zgloba. Kada je bolest ostavljena samoj sebi, dovodi do značajne nesposobnosti i boli zbog gubljenja funkcionalnosti zgloba i čak preranu smrt. Cilj RA terapije nije da se bolest uspori već da se postigne remisija sa ciljem da se zaustavi destrukcija zgloba. Osim ozbiljnosti bolesti i visoka prevalencija RA (~0.8 % odraslih širom sveta je zahvaćeno) ima veliki socio-ekonomski impakt. (Za šire podatke o RA mi smo pogledali Smolen i Steiner (2003); Lee i Weinblatt (2001); Choy i Panavi (2001); O'Dell (2004) i Firestein (2003)).

Mada je opće prihvaćeno da je RA auto-imuna bolest, ne postoji konsenzus koji se odnosi na precizne mehanizme koje dovode do 'inicijalne faze' bolesti. Ono staje poznato je to da inicijalni izazivač(izazivači) stvarno posreduje, kod domaćina koji ima predispozicije, kaskadu događaja koji dovode do aktivisanja različitih tipova ćelija (B-ćelija, T-ćelija, makrofaga, fibroblasta, endotelijalnih ćelija, dendritičkih ćelija i drugih ćelija). Postepeno, u zglobovima i tkivima koja ih okružuju se pojavljuje povećana produkcija različitih citokina (na primjer, TNF-a, IL-6, IL-1, IL-15, IL-18 i drugih). Kada bolest napreduje, kaskada ćelijskih aktivisanja i produkcija citokina samu sebe održava. U ovoj ranoj fazi, destrukcija struktura zglobova je već veoma jasna. Trideset procenata pacijenata ima radiografski dokaz koštane erozije u vremenu dijagnoze, a ova proporcija raste na 60 procenata tokom dve naredne godine.

Histološka analiza zglobova pacijenata sa RA jasno pokazuje mehanizme koji su uključeni u degradacijskim procesima povezanima sa RA. Ova analiza pokazuje da je glavni efektor odgovoran za degradaciju zglobova povezan sa RA panus (resica tkiva), gde je sinuvijalni fibroblast, stvaranjem različitih proteolitičkih encima, primarni uzrok erozije hrskavice i kosti. Zglob klasično sadrži dve susedne kosti koje artikulišu na sloju hrskavice koji je okružen sa sinovijalnom membranom i kapsulom zgloba. Kod pacijenata sa naprednom RA, sinovijum zgloba povećava veličinu za da nastane panus zbog proliferacije sinovijalnih fibroblasta i infiltracije mononuklearnih ćelija poput T-ćelija, B-ćelija, monocita, makrofaga i neutrofila. Panus provodi degradaciju susedne hrskavice, šta dovodi do smanjenja prostora u zglobu i ima potencijal da napadne susednu hrskavicu i kost. Kako su koštano i hrskavično tkivo sastavljeni od uglavnom kolagena tipa I ili II, zbog toga destruktivne i invazione karakteristike se ostvaruju uz pomoć sekrecije kolagenolitičkih proteaza, u principu se radi o metalo proteinazama iz matriksa (MMP). Erozija kosti ispod i u susedstvu hrskavice je takođe deo procesa RA i u principu dovodi do pojave osteoklasta u interfejsu kosti i panusa. Osteoklasti su multinuklearne ćelije koje, nakon adhezije za koštano tkivo, formiraju zatvoreni deo u koji osteoklasti luče proteaze (Cathepsin K, MMP9) koje degradiraju koštano tkivo. Populacija osteoklasta u zglobu je abnormalno povećana zbog formiranja osteoblasta iz prekursorskih ćelija koje su indukovane sekrecijom receptorskog aktivatora NFkB liganda (RANKL) uz pomoć aktivisanih SF i T-ćelija.

Različiti tipovi kolagena imaju ključnu ulogu u definisanju stabilnosti ekstraćelijskog matriksa (ECM). Kolageni tipa I i kolageni tipa II, na primer, su glavne komponente kosti i hrskavice. Kolagenski proteini tipično se organizuju u multimerne strukture poznate kao kolegenska vlakna. Nativna kolagenska vlakna su veoma otporna na proteolitičko cepanje. Samo za nekoliko tipova proteina koji degradiraju ECM se zna da imaju kapacitet da degradiraju nativni kolagen: MMP i Katepsini. Među Katepsinima, katepsin K, koji je uglavnom aktivan u osteoklastima, je najbolje karakterizovan. Među MMP, MMP1, MMP2, MMP8 MMP 13 i MMP 14 je poznato da imaju kalogenolitičke karakteristike. Korelacija među povećane ekspresije MMP1 u sinovijalnim fibroblastima (SF) i progresije artritičkih bolesti je dobro utvrđena i može da se predvidi u procesima erozije zglobova (Cunnane et al., 2001). U kontekstu RA, MMP1 predstavlja visoko relevantni protein degradacije kolagena.In vitro,tretman kultivisanih SF sa citokinima relevantnim u patologiji RA (na primer TNF-a i ILI P) će da poveća ekspresiju MMP1 od strane pomenutih ćelija (Andreakos et al., 2003). Monitoring nivoa MMP1 koji je eksprimiran od strane SF je relevantan kao napredak u polju RA isto kao šta je indikativan za aktivisanje SF prema erozivnom fenotipu koji jein vivoodgovoran za degradaciju hrskavice. Inhibicija ekspresije MMP1 od strane SF predstavlja važan terapeutski pristup prema tretmanu RA.

Aktivnost belančevina koji degradiraju ECM takođe može da bude uzrokom ili može da korelira sa progresijom različitih bolesti koje su različite od RA, na primer drugih bolesti koje uključuju degradaciju zglobova. Ove bolesti uključuju, ali time nisu ograničene, psorijazni artritis, mladenački artritis, rani artritis, reaktivni artritis, osteoartritis i ankilozni spondilitis. Druge bolesti koje mogu da se tretiraju sa jedinjenjima koja su identifikovana u skladu sa ovim pronalaskom i koriste mete koje su uključene u ekspresiju MMP kao šta je opisano ovde su osteoporoza, mišićno skeletne bolesti poput tendonitisa i periodontalnih bolesti (Gapski et al., 2004), tumorskih metastaza (Coussens et al., 2002), bolesti dišnih putova (COPD, astma)

(Suzuki et al., 2004), pluća, renalna fibroza (Schanstra et al., 2002), jetrina fibroza koja je povezana sa hroničnim hepatitisom C (Reiff et al., 2005), kardio-vaskularne bolesti poput ateroskleroze i greške srca (Creemers et al., 2001) i neurološke bolesti poput neurozapaljenja i multipne skleroze (Rosenberg, 2002). Pacijenti koji pate od takvih bolesti mogu da imaju korist od stabilizovanja ECM (uz pomoć njegove zaštite od degradacije).

471-amino kiselinska serin/treonin kinaza identifikovana kao Mitogen-Aktivisana Protein Kinaza-Aktivisana Protein Kinaza 5 (MAPKAPK5 ili PRAK) se eksprimira u velikom broju tkiva. Protein sadrži svoju katalitičku domenu na N-terminalnom kraju i oba signala, za nuklearno lokalizovanje (NLS) i za nuklearni eksport (NES) na svojem C-terminalnom kraju. Endogena MAPKAPK5 je predominantno prisutna u citoplazmi, ali stres ili aktivisanje citokina iz stanice omogućava njenu translokaciju u jedro (New et al, 2003). Ovaj događaj je zavisan od fosforilacije same MAPKAPK5. Thrl82 je regulaciono fosforilacijsko mesto u MAPKAPK5. Mada je p38a kinaza sposobna da fosforilira MAPKAPK5 u stanju prekomerne ekspresije, eksperimenti sa endogenom MAPKAPK5 ne podupiru ovu hipotezu (Shi et al., 2003). Konstruisan je vijabilan i fertilan miš u kojem je nokautirana MAPKAPK5. Fenotip ovih miševa je veoma različit od onoga kod miševa koji su dificijentni za MAPKAPK2, šta je kinaza koja je slična sa MAPKAPK5, ali koja je regulisana od strane p38a (Shi et al., 2003). Ovo indicira daje

funkcija svakog od belančevina različita i da niti jedna od kinaza ne može da kompenzuje aktivnost druge. Sve zajedno, MAPKAPK5 i MAPKAPK2 predstavljaju različite mete sa ulogama koje se ne poklapaju. MAPK6 (takođe poznata i kao ERK3) nedavno je identifikovana kao fiziološki relevantan supstrat za MAPKAPK5, šta definiše novi put signalne transdukcije (Seternes et al., 2004).

POZADINA PRONALASKA

NSAIDS (Ne-steroidni anti-inflamatorni lekovi) se koriste da se smanji bol koji je povezan sa RA i da se poboljša kvalitet života pacijenata. Međutim, ovi lekovi neće da zaustave degradaciju zgloba koja je povezana sa RA.

Za kortikosteroide je pronađeno da smanjuju napredovanje RA kao šta je otkriveno radiografski pa se isti koriste u niskim dozama za tretman jednoga dela pacijenata sa RA (30 do 60%). Međutim, ozbiljne nus-pojave su povezane sa dugotrajnom upotrebom kortikosteroida (stanjivanje kože, osteoporoza, katarakte, visoki pritisak, povećanje masti).

Sintetički DMARD (lekovi protiv reume koji modifikuju bolest) (na primer metotreksat, leflunomid, sulfasalazin) uglavnom podižu komponentu RA za imuno-zapaljenje. Kao glavni nedostatak, ovi lekovi imaju ograničenu efikasnost (destrukcija zgloba je samo usporena, ali ne i blokirana od strane DMARD tako da progresija bolesti na duge staze se nastavlja). Nedostatak efikasnosti je indukovan od fakta da, u prošeku, samo 30 % pacijenata dostigne ACR40 uspeh nakon 24 meseca tretmana sa metotreksatom. Ovo znači da, u skladu sa Američkim koležom za reumatologiju, samo 30 % pacijenata postigne 50 % poboljšanje simptoma (O'Dell et al., 1996). Dodatno, precizan mehanizam delovanja DMARD često je nejasan.

Biološki DMARD (Infliksimab, Etanercept, Adalimumab, Rituksimab, CTLA4-Ig) su terapeutske belančevine koje inaktiviraju citokine (na primer TNF-a) ili ćelije (na primer T-ćelije ili B-ćelije) koje imaju važnu ulogu u RA patofiziologiji (Kremer et al., 2003; Edwards et al., 2004). Mada je kombinovana terapija sa TNF-a-blokatorima (Infliksimab, Etanercept, Adalimumab) i metotreksatom najefektivniji tretmani za RA koji je momentalno dostupan, iznenađujuće je to da ova terapija postiže samo 50 % poboljšanja (ACR40) šta se tiče simptoma bolesti u 50-60 % pacijenata nakon 12 mesečne terapije (St Clair et al., 2004). Postoje neki upozoravajuće štetni događaji delovanja anti-TNF-a lekova, koji bacaju svetio na nus-pojave koje su povezane sa ovim tipom lekova. Povećani rizik od infekcija (tuberkuloze), hematološki događaji i poremećaji demijelinizacije su već opisani u vezi sa TNP-a blokatorima (vidi takođe Gomez-Reino et al., 2003). Osim ovih serioznih nus-pojava, TNF-a blokatori takođe pokazuju opšte mane karakteristične za biološku klasu terapeutika, kao na primer neprijatan način administracije (česte injekcije praćene infuzijom pomoćnih reakcija) i visoki troškovi proizvodnje. Noviji agensi u kasnijoj fazi razvoja ciljaju ko-stimulacijske molekule T-ćelija i same B-ćelije. Za efikasnost ovih agenasa je očekivano da bude slična kao kod one za TNF-a blokatore. Fakat da brojne ciljne terapije imaju slične, ali ograničene efikasnosti, sugeriše da postoji mnoštvo patogenih faktora za RA. Ovo je takođe indikativno za manjak našeg razumevanja patogenih događaja koji su povezani sa RA.

Sadašnje terapije za RA nisu dovoljne zbog ograničene efikasnosti (ne postoji adekvatna terapija za 30 % pacijenata). Ovo traži dodatne strategije za postizanje remisije. Remisija je potrebna zbog toga šta rezidualna bolest nosi rizik progresivnog oštećivanja zgloba i na raj način i progresivne ne sposobnosti. Inhibiranje komponente imuno-zapaljenja bolesti RA, koja predstavlja glavni cilj lekova koji se momentalno koriste za tretman RA, ne rezultuje sa blokadom degradacije zgloba, glavne karakteristike bolesti.

US 2005/0009832 opisuje supstituisane imidazolo[l,2-a]pirazin-8-il-amine kao modulatore protein kinaza, uključujući MAPKAPK5. WO02/056888 opisuje inhibitore MAPKAPK5 kao TNF modulatore sposobne da regulišu ekspresiju nekih citokina. Niti jedno od ova dva prethodna stanja tehnike ne razotkriva bilo koje jedinjenje koje bi spadalo u okvir klase jedinjenja koja su opisana u ovom pronalasku.

KRATAK OPISPRONALASKA

Ovaj pronalazak se bazira na pronalasku da MAPKAPK5 deluje u putu koji rezultuje ekspresijom MMP1 i da inhibitori aktivnosti MAPKAPK5, kao na primer jedinjenja iz ovoga pronalaska, su korisni za tretman bolesti koje uključuju abnormalno visoku ekspresiju MMP.

Jedinjenja iz ovoga pronalaska mogu da se opšte uzeto opišu kao [l,2,4]triazol[l,5-a]pirazin-8-il-amini supstituisani na poziciji 5 sa arilnom i heteroarilnom grupom, a na poziciji 8 sa arilamino ili heteroarilamino grupom.

Detaljnije kazano, ovaj pronalazak se odnosi na jedinjenja koja imaju inhibitorne karakteristike prema metalo proteinazama iz matriksa ćelija sisara, u skladu sa formulom III:

gde

R 1 j* e H ili supstituisani ili ne supstituisani alkil; a svaki od R 8 i R 9je nezavisno selektiran iz supstituisanog ili ne supstituisanog cikloalkila, supstituisanog ili ne supstituisanog heterocikloalkila, supstituisanog ili ne supstituisanog arila, supstituisanog ili ne supstituisanog heteroarila; ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, rastvorena materija ili

prolek i njegovi stereoizomeri, izotopne varijante i tautomeri.

U jednoj izvedbi, sa obzirom na jedinjenja sa formulom III, R Q je selektiran iz supstituisanog ili ne supstituisanog ciklopentila, cikloheksila, supstituisanog ili ne supstituisanog fenila, supstituisanog ili ne supstituisanog piridila, supstituisanog ili ne supstituisanog pirimidina i supstituisanog ili ne supstituisanog pirazina, supstituisanog ili ne supstituisanog pirola, supstituisanog ili ne supstituisanog pirazola i supstituisanog ili ne supstituisanog imidazola. U jednoj izvedbi, sa obzirom na jedinjenja sa formulom III, R<1>je H, Me, Et, i-Pr ili CF3. U jednoj izvedbi, sa obzirom na jedinjenja sa formulom III, R<1>je H.

Drugi aspekt ovoga pronalaska se odnosi na jedinjenja u skladu sa formulom IVa, IVb, IVc ili IVd:

a gde L je veza, -CO-, -0(CH2)mi-, -CON(H)(CH2)mi- ili - NHCO-; oznaka ml je izabrana iz brojeva od 1-4; prsten P je supstituisani ili ne supstituisani heterocikloalkil;

oznaka n je izabrana iz brojeva 1-4; svaki R<8a>je nezavisno izabran među vodonika, supstituisanog ili ne supstituisanog alkila, alkoksi, cijano, karbamoila, CHO i halo; a R<9>

je nezavisno izabran među supstituisanog i ne supstituisanog arila i heteroarila; ili njihovih farmaceutski prihvatljivih soli, rastvorenih materija ili prolekova; i njihovih stereoizomera, izotopičkih varijanti i tautomera.

U jednoj izvedbi, sa obzirom na jedinjenja sa formulama III-IVd, R<9>je supstituisani ili ne supstituisani aril. U drugoj izvedbi, R9 je supstituisani ili ne supstituisani fenil.

U jednoj izvedbi, s obzirom na jedinjenja sa formulama III-IVd, R<9>je supstituisani ili ne supstituisani heteroaril. U drugoj izvedbi, R9 je supstituisani ili ne supstituisani piridil.

U jednoj izvedbi, s obzirom na jedinjenja sa formulama III-IVd, R<9>je izabran među supstituisanog ili ne supstituisanog fenila, indolila, izoinolila, pirolila, furanila, tienila, pirazolila, oksazolila i tiazolila.

U drugom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje farmaceutske kompozicije koje obuhvataju triazolopirazinska jedinjenja iz ovoga pronalaska i farmaceutskog kerijera, ekscipijenta ili razredivača. U ovom aspektu ovoga pronalaska, farmaceutske kompozicije mogu da obuhvate jednu ili više komponenti koje su ovde opisane. Takođe, jedinjenja iz ovoga pronalaska, koja su korisna u farmaceutskim kompozicijama i za metode tretmana, koji su ovde razotkrivene, su svi farmaceutski prihvatljivi onako kako su pripremljeni i kako se koriste.

Drugi aspekt ovoga pronalaska se odnosi na upotrebu ovoga jedinjenja u terapeutskom metodu, na upotrebu farmaceutske kompozicije i na proizvodnju takve kompozicije, koja je korisna za tretman bolesti koje obuhvataju zapaljenje, degradaciju kolagena, a posebno koje obuhvataju bolesti za koje je karakterističan abnormalna aktivnost metalo proteaza iz matriksa (MMPI) i/ili abnormalna aktivnost mitogenom-aktivisane protein-kinaze aktivisane protein kinazom 5 (MAPKAPK5), a od kojih je reumatoidni artritis (RA) posebno važna takva bolest. Ovaj pronalazak takođe se odnosi na procese za preparaciju pomenutih jedinjenja iz ovoga pronalaska.

Drugi ciljevi i prednosti će biti vidljive stručnjacima posle razmatranja detalja koji proizlaze iz detaljnog opisa, koji treba da se prouči uz pomoć sledećih ilustrovanih crteža.

KRATKI OPIS CRTEŽA

Slika 1.Ovaj dijagram prikazuje značajne histološke razlike među zdravog zgloba i zgloba pacijenta sa RA.

Slika 2.Ovaj grafikon prikazuje povećanu ekspresiju MMP1 u sinovijalnim fibroblastima, koji su potaknuti sa citokinima koji su uključeni u patologiji reumatoidnog artritisa.

Slika3. Ovaj grafikon prikazuje dozno-zavisnu inhibiciju ekspresije MMP1, indukovane uz pomoć "TNF-a-baziranog prekidača", preko SF i uz pomoć poznatog jedinjenja koje deluje protiv zapaljenja.

Slika 4.Ovaj gel prikazuje smanjenje, na proteinskom nivou, ekspresije MAPKAPK5 u SF uz pomoć infekcije ćelija sa Ad-siRNA virusom koji cilja MAPKAPK5.

Slika 5.Ovaj grafikon prikazuje smanjenje indukovanih nivoa ekspresije MMP1, uz pomoć

'kompleksa okidača', od strane SF i uz pomoć Ad-siRNA virusa koji cilja MAPKAPK5.

DETALJANOPISPRONALASKA

Definicije

Tokom opisivanja jedinjenja, farmaceutskih kompozicija koji sadrže takva jedinjenja i metoda za upotrebu takvih jedinjenja i kompozicija, sledeći termini imaju sledeća značenja osim ako nije drugačije navedeno.

"Alkoksi" označava alkil-O-. Primeri za alkoksi uključuju metoksi, etoksi, n-propoksi, i-propoksi, n-butoksi i heptoksi. Preferirane alkoksi grupe su one nižih alkoksi.

"Alkil" označava ravan ili razgranat alifatski ugljeno-vodonik koji ima od 1 do oko 20 atoma ugljena. Preferirano, alkil ima od 1 do oko 12 atoma ugljena. Još bolji je niži alkil. Razgranato označava da je jedna ili više nižih alkilnih grupa, poput metila, etila ili propila vezano na linearni alkilni lanac.

"Alkil amino" označava alkil-NH-. Preferirani alkil amino je (Ci-C6)-alkil amino. Primeri za alkil amino uključuju metilamino i etilamino.

"Amino niži alkanoil" označava NH2-R-CO-, gde R je niži alkilen. Preferirane grupe uključuju aminoetanoil i aminoacetil.

"Karbamoil niži alkil" označava radikal NFkCO-niži alkil-. Preferirane grupe uključuju karbamoiletil i karbamoilmetil.

"Karboksi niži alkil ester" označava nižeg alkil ester karboksi radikala, -COO-grupe.

"Jedinjenja iz ovoga pronalaska" i ekvivalentna ekspresija trebaju da obuhvate jedinjenja sa Formulom (III) kao šta je ovde već opisano, a čija ekspresija uključuje i prolekove, farmaceutski prihvatljive soli i rastvorene materije, na primer hidrate tamo gde kontekst dozvoljava. Slično, referenca na intermedijere, bez razlike dali se za iste traži patentna zaštita, treba da obuhvati i njihove soli i rastvorene materije tako gde kontekst dozvoljava.

"Ekspresija" označava endogenu ekspresiju.

"Halo" ili "halogen" označava fluoro, hloro, bromo ili jodo.

"Vodonik" se koristi u kontekstu supstituenta kada je -H prisutan na nekoj poziciji ujedinjenju i takođe uključuje i njegovog izotopa, deuterijuma.

"Niži alkanoil amino" označava neku amino grupu sa organskom funkcionalnom grupom R-CO-, gde R predstavlja nižu alkilnu grupu.

"Niži alkil" označava 1 do oko 6 atoma ugljena u linearnom alkilnom lancu koji može da bude prav ili razgranat.

"Niži alkoksi" označava 1 do oko 6 atoma ugljena u linearnom alkilnom lancu koji može da bude prav ili razgranat i koji je vezan na atom kiseonika.

"Niži alkil sulfonamid" se odnosi na niži alkil amid sulfonamida sa formulom -S02NR<*>R<*>, gde R<*>je vodonik ili niži alkil, a najmanje jedan R<*>je niži alkil.

"Profilaksa" znači mera koja je preduzeta za prevenciju bolesti.

"Rastvorena materija" označava fizičku asocijaciju jedinjenja korisnog u ovom pronalasku sa jednim ili više molekula rastvarača. Ova fizička asocijacija uključuje vodonikove veze. U nekim instancama, rastvorena materija može da se izoluje, na primer kada su jedan ili više molekula rastvarača inkorporisana u kristalnoj rešetki tvrde materije koja kristalizuje. "Rastvorena materija" obuhvata rastvorenu fazu i rastvorene materije koje mogu da se izoluju. Jedinjenja iz ovoga pronalaska mogu da se pripreme na primer u kristalnoj formi i mogu da se rastvore ili hidratizuju. Pogodne rastvorene materije uključuju farmaceutski prihvatljive rastvorene materije, kao na primer hidrate, i još uključuju stehiometrijske i ne stehiometrijske rastvorene materije. Konvencionalne rastvorene materije uključuju vodu, etanol, sirćetnu kiselinu i si., pa zbog toga reprezentativne rastvorene materije uključuju hidrate, etanolate i metanolate.

"Supstituisan" označava da jedan ili više atoma ili grupa atoma u molekulu je zamenjena sa drugim atomom ili grupom.

"Sulfonamid" se odnosi na grupu jedinjenja koja sadrže hemijsku grupu - SO2NH2.

"Terapeutski afektivna količina" označava da količina leka ili farmaceutskog agensa koji će da pokrene biološki ili medicinski odgovor subjekta koji se tretira od strane lekara ili nekog drugog radnika iz klinike. "Terapeutski efektivna količina" može da varira u zavisnosti o jedinjenju, bolesti i njenoj jačini, životnoj dobi, težini i si. subjekta koji se tretira. Posebno, u odnosu na tretiranje stanja bolesti koje se karakterizuje sa degradacijom ekstraćelijskog matriksa, termin "efektivna količina koja inhibira metalo-proteinaze matriksa" namenjen je da označava da efektivna količina nekog jedinjenja iz ovoga pronalaska koja će da uzrokuje biološki značajan porast u produkciji MMP-1 u tkivu subjekta koje je zahvaćeno bolešću tako da je degradacija ekstraćelijskog matriksa značajno smanjena. Jedinjenje koje ima karakteristike inhibiranja metalo-proteinaza iz matriksa ili "jedinjenje koje inhibira metalo-proteinaze iz matriksa" označava jedinjenje iz ovoga pronalaska koje kada se da ćeliji u efektivnoj količini u stanju je da uzrokuje biološki značajno smanjenje u produkciji MMP-1 u pomenutoj ćeliji.

"Aril" se odnosi na monovalentnu aromatsku ugljenovodoničnu grupu koja nastaje odstranjivanjem jednog vodonikovog atoma ili pojedinačnog atoma ugljena iz parentnog sistema aromatskog prstena. Tipične arilne grupe uključuju, ali time nisu ograničene, grupe izvedene iz aceantrilena, acenaftilena, acefenantrilena, antracena, azulena, benzena, hrisena, koronena, fluorantena, fluorena, heksacena, heksafena, heksalena, a<y->indacena, s-indacena, indana, indena,

naftalena, oktacena, oktafena, oktalena, ovalena, penta-2,4-diena, pentacena, pentalena, pentafena, perilena, fenalena, fenantrena, picena, pleiadena, pirena, pirantrena, rubicena, trifenilena, trinafthalena i si. Posebno, bilo koja arilna grupa koja obuhvata od 6 do 14 atoma ugljena.

"Supstituisani aril" uključuje one grupe koje su navedene u definiciji za "supstituisan", a posebno se odnosi na arilnu grupu koja ponekad može da bude supstituisana sa 1 ili više supstituenata, na primer od 1 do 5 supstituenata, posebno od 1 do 3 supstituenata, izabranih iz grupe koja obuhvata acil, acilamino, aciloksi, alkenil, supstituisani alkenil, alkoksi, supstituisani alkoksi, alkoksikarbonil, alkil, supstituisani alkil, alkinil, supstituisani alkinil, amino, supstituisani amino, aminokarbonil, aminokarbonilamino, aminokarboniloksi, aril, arilolksi, azido, karboksil, cijano, cikloalkil, supstituisani cikloalkil, halogen, hidroksil, nitro, tioalkoksi, supstituisani tioalkoksi, tioariloksi, tiol, alkil-S(O)-, aril-S(O)-, alkyl-S(0)2- i aril-S(0)2-.

"Bicikloaril" se odnosi na monovalentnu aromatsku ugljenovodoničnu grupu koja je izvedena uz pomoć odstranjivanja jednog vodoničnog atoma iz pojedinačnog atoma ugljena iz parentnog sistema bicikloaromatskog prstena. Tipične bicikloarilne grupe uključuju, ali time rusu ograničene, grupe izvedene iz indana, indena, naftalena, tetrahidronaftalena i si. Posebno, neka arilna grupa obuhvata od 8 do 11 atoma ugljena.

"Bicikloheteroaril" se odnosi na monovalentnu bicikloheteroaromatsku grupu koja je izvedena uz pomoć odstranjivanja jednog atoma vodonika iz pojedinačnog atoma ugljena iz parentnog sistema bicikloheteroaromatskog prstena. Tipične bicikloheteroarilne grupe uključuju, ali time nisu ograničene, grupe izvedene iz benzofurana, benzimidazola, benzindazola, benzdioksana, hromena, hromana, cinolina, ftalazina, indola, indolina, indolizina, izobenzofurana, izohromena, izoindola, izoindolina, izokinolina, benzotiazola, benzoksazola, naftiridina, benzoksadiazola, pteridina, purina, benzopirana, benzpirazina, piridopitimidina, kinazolina, kinolina, kinolizina, kinoksalina, benzomorfana, tetrahidroizokinolina, tetrahidrokinolina i si. Posebno, bicikloheteroarilna grupa obuhvata među 9-11-članih bicikloheteroarila, s time daje 5-10-člani heteroaril najpoželjniji. Posebne bicikloheteroarilne grupe su one koje su izvedene iz benzotiofena, benzofurana, benzotiazola, indola, kinolina, izokinolina, benzimidazola, benzoksazola i benzdioksana.

"Karbamoil" se odnosi na radikal -C(0)N(R<42>)2gde svaka R<42>grupa je nezavisno vodonik, alkil, cikloalkil ili aril, kao šta je ovde definisano, a koje mogu ponekad da budu supstituisane kao šta je ovde definisano. U specifičnoj izvedbi, termin "karbamoil" se odnosi na -C(0)-NH2.

"Cikloalkil" se odnosi na cikličke ugljenovodonične grupe koje imaju od 3 do oko 10 atoma ugljena i imaju pojedinačni ciklički prsten ili multipne kondenzovane prstene, uključujući fuzionisane sisteme i sisteme prstena sa mostom, koji ponekad mogu da budu supstituisani sa 1 do 3 alkilnih grupa. Takve cikloalkilne grupe uključuju, radi primera samo, jedno-prstenaste strukture poput ciklopropila, ciklobutila, ciklopentila, ciklooktila, 1-metilciklopropila, 2-metilciklopentila, 2-metilciklooktila i si. i strukture sa više prstena poput adamantanila i si.

"Supstituisani cikloalkil" uključuje one grupe koje su pomenute u definiciji za "supstituisan", a posebno se odnosi na cikloalkilne grupe koje imaju 1 ili više supstituenata, na primer od 1 do 5 supstituenata, a posebno od 1 do 3 supstituenata, izabranih među grupama koje obuhvataju acil, acilamino, aciloksi, alkoksi, supstituisani alkoksi, alkoksikarbonil, alkoksikarbonilamino, amino, supstituisani amino, aminokarbonil, aminokarbonilamino, aminokarboniloksi, aril, ariloksi, azido, karboksil, cijano, cikloalkil, supstituisani cikloalkil, halogen, hidroksil, keto, nitro, tioalkoksi, supstituisani tioalkoksi, tioariloki, tioketo, tiol, alkil-S(O)-, aril-S(O)-, alkil-S(0)2- i aril-S(0)2-.

"Supstituisani" se odnosi na grupu u kojoj jedan ili više atoma vodonika su svaki nezavisno zamenjeni sa istim ili različitim supstituentom(supstituentima). Tipični supstituenti uključuju, ali time nisu ograničeni, -X, -R<46>, -0\ =0, -OR46, -SR<46>, -S\ =S, -NR46R4<7>, =NR<46>, -CX3, -CF3, - CN, -OCN,-SCN, -NO, -N02, =N2, -N3, -S(0)20\ -S(0)2OH, -S(0)2R<46>, -OS(02)0\ - 0S(0)2R<46>, -P(0)(0<->)2, - P(0)(OR<46>)(0'), -OP(0)(OR<46>)(OR<47>), -C(0)R<46>, -C(S)R<46>, -C(0)0R<46>, -C(0)NR<46>R<47>, -C(0)0-, -C(S)OR<46>, -NR<48>C(0)NR<46>R<47>, -NR<48>C(S)NR<46>R<47>, - NR<49>C(NR<48>)NR<46>R<47>i -C(NR<48>)NR<46>R<47>, gde svaki X je nezavisno halogen; svaki R<4>6,R47,R48iR49 je nezavisno vodonik, alkil, supstituisani alkil, aril, supstituisani alkil, arilalkil, supstituisani alkil, cikloalkil, supstituisani alkil, cikloheteroalkil, supstituisani cikloheteroalkil, heteroalkil, supstituisani heteroalkil, heteroaril, supstituisani heteroaril, heteroarilalkil, supstituisani heteroarilalkil, -NR<50>R<51>, -C(0)R<50>ili -S(0)2R<5>° ili ponekad R<50>i R<51>zaje<d>no sa atomom na kojeg su oba vezana formiraju cikloheteroalkil ili supstituisani cikloheteroalkilni prsten; a R<50>i R<51>su nezavisno vodonik, alkil, supstituisani alkil, aril, supstituisani alkil, arilalkil, supstituisani alkil, cikloalkil, supstituisani alkil, cikloheteroalkil, supstituisani cikloheteroalkil, heteroalkil,

supstituisani heteroalkil, heteroaril, supstituisani heteroaril, heteroarilalkil ili supstituisani heteroarilalkil.

Primeri za reprezentativne supstituisane arile uključuju sledeće

U ovim formulama jedna od R i R može da bude vodonik i najmanje jedan od R i R svaki za sebe i nezavisno izabran među alkila, alkenila, alkinila, cikloheteroalkila, alkanoila, alkoksi, ariloksi, heteroariloksi, alkilamino, arilamino, heteroarilamino, NR54COR55, NR<S4>SOR<55>, NR<54>S02R<57>, COOalkil, COOaril, CONR54R<55>, CONR<54>OR<55>, NR<54>R<55>, S02<N>R<54>R<55>, S-alkil, S-alkil, SOalkil, S02alkil, Saril, SOaril, S02aril; iliR52i R<53>mogu da budu spojeni tako da formiraju ciklički prsten (zasićen ili ne zasićen) od 5 do 8 atoma, a koji ponekad sadrži jedan ili više heteroatoma izabranih iz grupe koja obuhvata N, O ili S. R<54>, R<55>i R<56>su nezavisno vodonik, alkil, alkenil, alkinil, perfluoroalkil, cikloalkil, cikloheteroalkil, aril, supstituisani aril, heteroaril, supstituisani ili hetero alkil ili si.

"Hetero", kada se koristi da opiše jedinjenje ili grupu koja je prisutna na jedinjenju označava da jedan ili više atoma ugljena u jedinjenju ili grupi su bili zamenjeni sa azotom, kiseonikom ili smfurnim heteroatomom. Hetero može da se primeni na bilo koju od hidrokarbilnih grupa opisanih ovde poput alkila, na primer heteroalkil, cikloalkil, na primer cikloheteroalkil, aril, na primer heteroaril, cikloalkenil, cikloheteroalkenil i si., a koje imaju od 1 do 5, a posebno od 1 do 3 heteroatoma.

"Heteroaril" se odnosi na monovalentnu heteroaromatičnu grupu koja je izvedena uz pomoć odstranjivanja jednog vodonika iz pojedinačnog atoma iz parentnog sistema heteroaromatskog prstena. Tipične heteroarilne grupe uključuju, ali time nisu ograničene, grupe koje su izvedene iz akridina, arsindola, karbazola, P-karbolina, hromana, hromena, cinolina, furana, imidazola, indazola, indola, indolina, indolizina, izbenzofurana izohromena, izoindola, izoindolina, izokinolina, izotiazola, izoksazola, naftiridina, oksadiazola, oksazola, perimidina, fenantridina, fenantrolina, fenazina, ftalazina, pteridina, purina, pirana, pirazina, pirazola, piridazina, piridina, pirimidina, pirola, pirolizina, kinazolina, kinolina, kinolizina, kinoksalina, tetrazola, tiadiazola, tiazola, tiofena, triazola, ksantena i si. Preferirano, heteroarilna grupa sadrži među 5-15-člani

heteroaril, s tim daje 5-10-člani heteroaril posebno poželjan. Posebne heteroarilne grupe su one koje su izvedene iz tiofena, pirola, benzotiofena, benzofurana, indola, piridina, kinolina, imidazola, oksazola i pirazina.

Primeri za reprezentativne heteroarile uključuju sledeće:

gde svaki Y je izabran među karbonila, N, NR<58>, 0 i S; a R<58>je nezavisno vodonik, alkil, cikloalkil, cikloheteroalkil, aril, heteroaril, heteroalkil ili si.

Na način na koji se ovde koristi, termin "cikloheteroalkil" se odnosi na pogodnog heterocikličkog ne aromatskog prstena i na fuzionisane prstene koji sadrže jedan ili više heteroatoma nezavisno izabranih među N, O i S. Fuzionisani heterociklički prstenski sistem može da uključi karbocikličke prstene i potrebno je da se uključi samo jedan heterociklički prsten. Primeri heterocikličkih prstena uključuju, ali time nisu ograničeni, piperazinil, homopiperazinil, piperidinil i morfolinil i isti su prikazani u sledećim ilustrovanim primerima: gđe svaki X je izabran među CR<58>2, NR<58>, O i S; a svaki Y je izabran među NR<58>, O i S; a R je nezavisno vodonik, alkil, cikloalkil, cikloheteroalkil, aril, heteroaril, heteroalkil ili si. Ovi cikloheteroalkilni prsteni mogu ponekad da se supstituiraju sa jednom ili više grupa izabranih iz grupe koja obuhvata acil, acilamino, aciloksi, alkoksi, supstituisani alkoksi, alkoksikarbonil, alkoksikarbonilamino, amino, supstituisani amino, aminokarbonil, aminokarbonilamino, aminokarboniloksi, aril, ariloksi, azido, karboksil, cijano, cikloalkil, supstituisani cikloalkil, halogen, hidroksil, keto, nitro, tioalkoksi, supstituisani tioalkoksi, tioariloksi, tioketo, tiol, alkil-S(O)-, aril-S(O)-, alkil-S(0)2- i aril-S(0)2-. Supstituisane grupe uključuju karbonil ili tiokarbonil koji obezbeđuje, na primer, laktam i derivate uree.

Primeri za reprezentativne cikloheteroalkenile uključuju sledeće:

gde svaki X je izabrana među CR<58>2, NR<58>, O i S; a svaki Y je izabran iz karbonila, N, NR<58>, O i S; a R58 je nezavisno vodonik, alkil, cikloalkil, cikloheteroalkil, aril, heteroaril, heteroalkil ili si.

Primeri za reprezentativne arile koji imaju hetero atome koji sadrže supstituciju uključuju sledeće:

gde svaki X je izabran među C-R<58>2, NR<58>, O i S; a svaki Y je izabran iz karbonila, NR<58>, 0 i S; a R<58>je nezavisno vodonik, alkil, cikloalkil, cikloheteroalkil, aril, heteroaril, heteroalkil ili si.

Stručnjak u polju organske sinteze moći će da prepozna da je maksimalni broj heteroatoma u stabilnom, hemijski izvedivom prstenu, bez razlike dali je aromatski ili ne aromatski, je određen preko veličine samoga prstena, stepenu ne zasićenosti i valenciji heteroatoma. Opšte uzeto, heterociklički prsten može da ima od jednog do četiri heteroatoma sve dok je heteroaromatski prsten hemijski izvediv i stabilan.

"Farmaceutski prihvatljiv" označava daje dozvoljen od strane regulatorne agencije Federacije ili vlade pojedine države ili da je naveden uU. S. Pharmacopoeiaili nekoj drugoj opšte priznatojpharmacopoeiaza upotrebu na životinjama, a posebno na ljudima.

"Farmaceutski prihvatljiva so" se odnosi na ne toksične, anorganske i organske kiselinske adicijske soli i na bazne adicijske soli jedinjenja koja su navedena u ovom pronalasku, a posebno na to da su farmaceutski prihvatljive i da poseduju željenu farmakološku aktivnost jedinjenja iz kojeg su izvedena. Ove soli mogu da se pripremein situtokom finalne izolacije i purifikacije jedinjenja koja su korisna u ovom pronalasku. Takve soli uključuju: (1) kiselinske adicijske soli, nastale sa anorganskim kiselinama poput hlorovodonične kiseline, bromovodonične kiseline, sumporne kiseline, azotne kiseline, fosforne kiseline i si.; ili nastale sa organskim kiselinama poput sirćetne kiseline, propionske kiseline, heksanoične kiseline, ciklopentanpropioničke kiseline, glikoličke kiseline, piruvičke kiseline, mlečne kiseline, malonske kiseline, sukcinske kiseline, malične kiseline, maleične kiseline, fumarne kiseline, tartarne kiseline, citrične kiseline, benzoičke kiseline, 3-(4-hidroksibenzoil) benzoičke kiseline, cinamičke kiseline, mandeličke kiseline, metansulfoničke kiseline, etansulfoničke kiseline, 1,2-etan-disulfoničke kiseline, 2-hidroksietansulfoničke kiseline, benzensulfoničke kiseline, 4-hlorobenzensulfoničke kiseline, 2-naftalensulfoničke kiseline, 4-toluensulfoničke kiseline, kamforsulfoničke kiseline, 4-metilbiciklo[2.2.2]-oct-2-en-l-karboksiličke kiseline, glukoheptonske kiseline, 3-fenilpropionske kiseline, trimetilsirćetne kiseline, tercijarno butil sirćetne kiseline, lauril sumporne kiseline, glukonske kiseline, glutamičke kiseline, hidroksinaftoičke kiseline, salicilne kiseline, stearinske kiseline, mukoničke kiseline i si.; ili (2) soli nastale kada jedan kiseli proton, koji je prisutan u početnom jedinjenju bude ili zamenjen sa metalnim jonom, na primer sa jonom alkalnog metala, jonom zemno alkalnog metala ili jonom aluminijuma; ili koordinira sa organskom bazom poput etanolamina, dietanolamina, trietanolamina, N-metilglukamina i si. Soli dodatno uključuju, primera radi, natrijum, kalijum, kalcijum, magnezijum, amonijum, tetraalkilamonijum i si.; i gde jedinjenje sadrži baznu funkcionalnost, soli ne toksičnih organskih i anorganskih kiselina, poput hlorovodonika, bromovodonika, tartarata, mesilata, acetata, maleata, oksalata i si. Termin

"farmaceutski prihvatljivi katjon" se odnosi na ne toksične, prihvatljive katjonske anti-jone sa kiselom funkcionalnom grupom. Takvi katjoni su na primer katjoni natrijuma, kalijuma, kalcijuma, magnezijuma, amonijuma, tetraalkilamonijma i si.

"Farmaceutski prihvatljiv prenosnik" se odnosi na razređivač, dodatak, ekscipijent ili nosač s kojim se jedinjenje iz ovoga pronalaska administrira.

"Sprečiti" ili "sprečavanje" se odnosi na redukciju rizika dobijanja bolesti ili poremećaja (na primer, koji uzrokuje najmanje jedan od kliničkih simptoma bolesti, koja se nije razvila kod subjekta koji možda nije bio izložen ili koji ima predispozicije za razvijanje bolesti, ali još uvek ne pokazuje ili trpi simptome bolesti).

"Prolekovi" se odnosi na jedinjenja, uključujući derivate jedinjenja iz ovoga pronalaska, koji imaju grupe koje mogu da se pocepaju i mogu da postanu jedinjenja iz ovoga pronalaska uz pomoć solvolize ili u fiziološkim uslovima, koja su aktivnain vivo.Takvi primeri uključuju, ali time nisu ograničeni, derivate holin estera i si., estere N-alkilmorfolina i si.

"Subjekt" uključuje ljude. Termini "čovjek" "pacijent" i "subjekt" ovde su sinonimi.

"Tretiranje" ili "tretman" bilo koje bolesti ili poremećaja se odnosi, u jednoj izvedbi, na ublažavanje bolesti ili poremećaja (na primer, zaustavljanje ili usporavanje razvoja bolesti ili najmanje jednoga od njenih kliničkih simptoma). U drugoj izvedbi, "tretiranje" ili "tretman" se odnosi na ublažavanje najmanje jednoga od fizioloških parametara, koji ne mora da bude primećen od strane subjeka. U drugoj izvedbi, "tretiranje" ili "tretman" se odnosi na moduliranje bolesti ili poremećaja, fizički (na primer, stabilizovanje neprimećenog simptoma), fiziološki (na primer, stabilizovanje fizičkog parametra) ili oba slučaja. U drugoj izvedbi, "tretiranje" ili "tretman" se odnosi na napad bolesti ili poremećaja.

Drugi derivati jedinjenja iz ovoga pronalaska imaju aktivnost u obe forme, kisele i bazne forme derivata, ali u osetljivoj kiseloj formi često pokazuju prednosti u smislu rastvorivosti, kompatibilnosti sa tkivom ili sa kasnim otpuštanjem u organizmu sisara (vidi, Bundgard, H., Design of Prodrugs, pp. 7-9, 21-24, Elsevier, Amsterdam 1985). Prolekovi uključuju derivate kiselina koji su dobro poznati stručnjacima u polju poput, na primer, estere koji su pripremljeni uz pomoć reakcije početne kiseline sa odgovarajućim alkoholom ili amide koji su pripremljeni uz pomoć reakcije početnog kiselinskog jedinjenja sa supstituisanim ili ne supstituisanim aminom ili kiselih anhidrida ili mešanih anhidrida. Preferirani su prolekovi alifatskih ili aromatskih estera, amida i anhidrida izvedeni iz kiselih grupa spojenih na jedinjenja iz ovoga pronalaska. U nekim slučajevima poželjno je da se pripreme prolekovi dvostrukog estera poput (aciloksi)alkil estera ili ((alkoksikarbonil)oksi)alkilestera.Preferirani su Cido Cg alkil, C2-C8alkenil, aril, C7-C12supstituisani aril i C7-Ci2arilalkil esteri jedinjenja iz ovoga pronalaska.

Na način na koji se ovde koristi, termin "izotopična varijanta" se odnosi na jedinjenje koje sadrži ne prirodne karakteristike izotopa, najmanje najednom ili više atoma koji prave takvo jedinjenje. Na primer, neka "izotopična varijanta" jedinjenja može da sadrži jedan ili više ne radioaktivnih izotopa, kao na primer, deuterijum (<2>H ili D), ugljen-13(13C), azot-15 (<15>N) ili si. Treba da se razume da, u jedinjenju gde je napravljena takva izotopna supstitucija, sledeći atomi, kada su prisutni, mogu da variraju pa tako, radi primera samo, bilo koji vodonik može da bude H/D, bilo koji ugljen može da bude<13>C ili bilo koji azot može da bude<15>N i da prisutnost i postavljanje takvih atoma može da se odredi u skladu sa stanjem tehnike. Slično, ovaj pronalazak može da uključi preparaciju izotopičnih varijanti sa radioizotopima, primera radi samo, gde nastala jedinjenja mogu da se koriste za lekove i/ili za studije u kojima se prati distribucija supstrata. Radioaktivni izotopi tricijum, odnosno<3>H i ugljen-14, odnosno<14>C su posebno korisni za ovu svrhu u smislu njihove upotrebe za inkorporisanje i u odnosu na način detektovanja. Dodatno, mogu da se pripreme takva jedinjenja koja su supstituisana sa izotopima koji emituju pozitrone, poput<n>C, 18F,<15>0 i<13>N, a mogu da budu korisna u studijamaPositron Emission Topography(PET) za ispitivanje popunjenosti supstrat-receptor.

Sve izotopične varijante jedinjenja koja su ovde obezbeđena, radioaktivna ili ne, trebaju da budu deo okvira ovoga pronalaska.

Takođe, treba da se razume da jedinjenja koja imaju istu molekularnu formulu, ali se razlikuju u prirodi ili sekvenci vezanja njihovih atoma ili u aranžmanu njihovih atoma u prostoru su nazvana "izomerima". Izomeri koji se razlikuju u aranžmanu njihovih atoma u prostoru se nazivaju "stereoizomeri".

Stereoizomeri koji nisu ogledalne slike jedan drugome se nazivaju "dijastereomeri", a oni koji nisu superimpozibilne ogledalne slike jedan drugome se nazivaju "enantiomeri". Kada jedinjenje ima jedan asimetrični centar, na primer, isto je vezano za četiri različite grupe, moguć je par enantiomara. Jedan enantiomer može da bude karakterizovan apsolutnom konfiguracijom svojeg asimetričnog centra i je opisan sa R- i S-sekvensnim pravilima po Cahnu i Prelogu ili uz pomoć načina po kojem molekul rotira ravninu polarizovanog svetla pa je označeno kao desno-rotirajuće ili levo-rotirajuće (odnosno, kao (+) ili (-)-izomer). Hiralno jedinjenje može da postoji kao individualni enentiomer ili kao njihova mešavina. Mešavina koja sadrži jednake proporcije enetiomera se naziva "racemička mešavina".

"Tautomeri" se odnosi na jedinjenja koja su zamenjive forme nekog pojedinog jedinjenja sa nekom strukturom i iste variraju u rasporedu atoma vodonika i elektrona. Tako, dve strukture mogu da budu u ravnoteži preko kretanja n elektrona i nekog atoma (obično H). Na primer, enoli i ketoni su tautomeri zbog toga jer se isti rapidno međusobno izmenjuju uz pomoć tretmana sa kiselinom ili bazom. Drugi primer tautomerizma su aci- i nitro- forme fenilnitrometana, koji se takođe međusobno formiraju tretmanom sa kiselinom ili bazom.

Tautomeme forme mogu da budu relevantne za postizanje optimalnih hemijskih reaktivnosti i biološke aktivnosti jedinjenja od interesa.

Jedinjenja iz ovoga pronalaska mogu da poseduju jedan ili više asimetričnih centara; takva jedinjenja mogu da se proizvedu kao pojedinačni (R)- ili (S)- stereoizomeri ili kao njihove mešavine. Osim ako nije drugačije navedeno, opis ili imenovanje pojedinog jedinjenja u specifikaciji ili u zahtevima namenjeno je da uključuje oba individualna enantiomera i njihove mešavine, racemičke ili druge. Metodi za određivanje stereohemije i odvajanje stereoizomera su dobro poznati stručnjacima.

JEDINJENJA

Ovaj pronalazak se bazira na otkriću da MAPKAPK5 funkcioniše u putu koji rezultuje ekspresijom MMP1 i da inhibitori aktivnosti MAPKAPK5, poput jedinjenja iz ovoga pronalaska su korisna u tretmanu bolesti koje uključuju abnormalno visoku ekspresiju aktivnosti MMP.

Jedinjenja iz ovoga pronalaska mogu da se opišu opšte uzeto kao [l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-8-il-amini supstituisani u grupi na poziciji 5 i na poziciji 8.

Ovaj pronalazak se odnosi na jedinjenja u skladu sa formulom III:

gde R<1>je H ili supstituisani ili ne supstituisani alkil; a svaki od R<8>i R<9>je nezavisno izabran iz supstituisanog ili ne supstituisanog cikloalkila, supstituisanog ili ne supstituisanog heterocikloalkila, supstituisanog ili ne supstituisanog arila, supstituisanog ili ne supstituisanog heteroarila; ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, rastvorena materija ili prolek; i njegovi stereoizomeri, isotopične varijante i tautomeri.

U jednoj izvedbi, s obzirom na jedinjenja sa formulom III, R8 je izabran iz supstituisanog ili ne supstituisanog ciklopentila, cikloheksila, supstituisanog ili ne supstituisanog fenila, supstituisanog ili ne supstituisanog piridila, supstituisanog ili ne supstituisanog pirimidina i supstituisanog ili ne supstituisanog pirazina, supstituisanog ili ne supstituisanog pirola, supstituisanog ili ne supstituisanog pirazola i supstituisanog ili ne supstituisanog imidazola.

U jednoj izvedbi, s obzirom na jedinjenja sa formulom III, R<1>je H, Me, Et, i-Pr ili CF3.

U jednoj izvedbi, s obzirom na jedinjenja sa formulom III,R<1>je H.

U jednoj izvedbi, s obzirom na jedinjenja sa formulom III, R je izabran iz supstituisanog i ne supstituisanog cikloalkila.

U jednoj izvedbi, s obzirom na jedinjenja sa formulom III, R<8>je izabran iz supstituisanog i ne supstituisanog cikloheksila ili ciklopentila.

U jednoj izvedbi, s obzirom na jedinjenja sa formulom III, R<8>je izabran iz supstituisanog i ne supstituisanog heterocikloalkila.

U jednoj izvedbi, s obzirom na jedinjenja sa formulom III, R Q je izabran iz supstituisanog i ne supstituisanog piperidinila, morfolinila ili pirolidinila.

U jednoj izvedbi, s obzirom na jedinjenja sa formulom III, R<8>je izabran iz supstituisanog i ne supstituisanog fenila, piridila ili pirimidina.

U jednoj izvedbi, s obzirom na jedinjenja sa formulom III, R8 je izabran iz supstituisanog fenila, supstituisanog piridila i supstituisanog pirimidina; a supstitucija je

-L-R<8d>, a gde

L je izabran iz grupe koja obuhvata vezu, alkilen, heteroalkilen, -O-, -N(R<8e>)-. - CO-, -C02-, -SO-, -SO2-, -CON(R<8e>)-, -S02N(R<8e>)-, -N(R<8e>)CO-, -N(R<8e>)S02-, - N(R<8e>)CO N(R<8e>)-, N(R<8e>)S02N(R<8e>)-; a

R<8d>je izabran iz supstituisanog i ne supstituisanog alkila, supstituisanog i ne supstituisanog cikloalkila, supstituisanog i ne supstituisanog arila, supstituisanog i ne supstituisanog heterocikloalkila, supstituisanog i ne supstituisanog heteroarila, supstituisanog i ne supstituisanog amino, supstituisanog i ne supstituisanog aralkila, supstituisanog i ne supstituisanog heteroarilalkila i supstituisanog i ne supstituisanog aminoalkila; a

R<8e>je izabran iz H, supstituisanog i ne supstituisanog alkila i supstituisanog i ne supstituisanog cikloalkila.

U jednoj izvedbi, s obzirom na jedinjenja sa formulom III, R oje

gde L i R<8d>su kao šta je opisano u prethodnom paragrafu; oznaka nje izabrana iz brojeva od 1-4; a svaki R je nezavisno izabran iz vodonika, supstituisanog ili ne

supstituisanog alkila, alkoksi, cijano i halo.

U jednoj izvedbi, s obzirom na jedinjenja sa formulom III, R8 je kao staje opisano ranije, oznaka nje 1, a R8a je Me, Et, Pr, izo-Pr, CI, F, CN, Ome ili CF3. U drugoj izvedbi, R8a je na poziciji 2-(orto na -L). U drugoj izvedbi, R8a je 2-C1, 2-F, 2-Me ili 2-CF3.

U jednoj izvedbi, s obzirom na jedinjenja sa formulom III, R je opisan ranije, a

L je veza, -O-, -CO-, -CON(R<8e>)- ili -N(R<8e>)CO-;

R<8d>je izabran iz supstituisanog i ne supstituisanog alkila, supstituisanog i ne supstituisanog cikloalkila, supstituisanog i ne supstituisanog arila, supstituisanog i ne supstituisanog heterocikloalkila, supstituisanog i ne supstituisanog heteroarila, supstituisanog i ne supstituisanog aralkila, supstituisanog i ne supstituisanog heteroarilalkila i supstituisanog i ne supstituisanog aminoalkila; a

R8e je izabran iz H, supstituisanog i ne supstituisanog alkila.

U jednoj izvedbi, s obzirom na jedinjenja sa formulom III, R8 je kao šta je opisano ranije, a L je veza, -O-, -CO-, -CON(R<8e>)- ili -N(R<8e>)CO-; a

R RH je izabran iz H, alkilaminoetila, dialkilaminoetila, cikloalkila, heterocikloalkila,

arilalkila i heteroarilalkila.

U jednoj izvedbi, s obzirom na jedinjenja sa formulom III, R<8>je kao šta je opisano ranije, a L je veza, -O-, -CO-, -CON(R<8e>)- ili -N(R<8e>)CO-; a

R<8d>je izabran iz metilaminoetila, etilaminoetila, dimetilaminoetila, dietilaminoetila,

supstituisanog i ne supstituisanog pirolidinila, benzila i piridilmetila.

U jednoj izvedbi, s obzirom na jedinjenja sa formulom III, R8 je kao šta je opisano ranije, a L je veza, -CO-, S02, -(CH2)ml-, -0(CH2)ml-, -NH(CH2)ml-, -CON(H)(CH2)ml- ili - S02NH(CH2)mi-; oznaka ml je izabrana iz brojeva od 1-4; a R8d je

i gde prsten P je supstituisani ili ne supstituisani heterocikloalkil. U drugoj izvedbi, L je

veza, -CO-, -0(CH2)mi-, -CON(H)(CH2)mi- ili - NHCO-;

U jednoj izvedbi, s obzirom na jedinjenja sa formulom III, R8 je kao šta je opisano ranije; L je veza; a prsten P je supstituisani ili ne supstituisani heterocikloalkil.

U jednoj izvedbi, s obzirom na jedinjenja sa formulom III, R je kao šta je opisano ranije; L je veza; a prsten P je supstituisani ili ne supstituisani piperidin, supstituisani ili ne supstituisani piperazin i supstituisani ili ne supstituisani piperidin, morfolin.

U jednoj izvedbi, s obzirom na jedinjenja sa formulom III, R8 je kao šta je opisano ranije; L je CO; a prsten P je supstituisani ili ne supstituisani heterocikloalkil.

U jednoj izvedbi, s obzirom na jedinjenja sa formulom III, R o je kao šta je opisano ranije; L je CO; a prsten P je supstituisani ili ne supstituisani piperidin, supstituisani ili ne supstituisani piperazin i supstituisani ili ne supstituisani piperidin, morfolin.

U jednoj izvedbi, s obzirom na jedinjenja sa formulom III, R<8>je kao staje opisano ranije; L je -

(CH2)mi-, -0(CH2)mi- ili -NH(CH2)mi-; oznaka ml je izabrana iz brojeva od 1-4; a prsten P je supstituisani ili ne supstituisani heterocikloalkil.

U jednoj izvedbi, s obzirom na jedinjenja sa formulom III, R8 je kao šta je opisano ranije; L je -

(CH2)mi-, -0(CH2)mi- ili -NH(CH2)miS oznaka ml je 2 ili 3; a prsten P je supstituisani ili ne

supstituisani piperidin, supstituisani ili ne supstituisani piperazin i supstituisani ili ne supstituisani piperidin, morfolin.

U jednoj izvedbi, s obzirom na jedinjenja sa formulom III, R8 je kao šta je opisano ranije; L je - CON(H)(CH2)mi- ili -NHCO(GH2)mi-; oznaka ml je izabrana iz brojeva od 1-4; a prsten P je supstituisani ili ne supstituisani heterocikloalkil.

U jednoj izvedbi, s obzirom na jedinjenja sa formulom III, R8 je kao šta je opisano ranije; L je - CON(H)(CH2)mi- oznaka ml je 2 ili 3; a prsten P je supstituisani ili ne supstituisan piperidin, supstituisani ili ne supstituisan piperazin i supstituisan ili ne supstituisan piperidin, morfolin.

U jednoj izvedbi, s obzirom na jedinjenja sa formulom III, jedinjenje je u skladu sa formulama IVa, IVb, IVc ili IVd:

i gde L i prsten P su kao šta je opisano ranije; oznaka n je izabrana iz brojeva od 1-4;

svaki R<8a>je nezavisno izabran iz vodonika, supstituisanog ili ne supstituisanog alkila, alkoksi, cijano i halo; a R<9>je nezavisno izabran iz supstituisanog ili ne supstituisanog arila i heteroarila; ili njihove farmaceutski prihvatljive soli, rastvorene materije ili

prolekovi; i njihovi stereoizomeri, isotopičke varijante i tautomeri.

U jednoj izvedbi, s obzirom na jedinjenja sa formulama IVa-IVd, L je veza.

U jednoj izvedbi, s obzirom na jedinjenja sa formulama IVa-IVd, L je metilen, etilen, propilen i butilen.

U jednoj izvedbi, s obzirom na jedinjenja sa formulama IVa-IVd, L je -CO-.

Jedinjenje u skladu sa Zahtevom 9, gde L je -CO-.

Jedinjenje u skladu sa Zahtevom 9, gde L je -NHCO- ili -CONH-.

Jedinjenje u skladu sa Zahtevom 9, gde L je -CON(H)-CH2-CH2- ili -N(H)-CO-CH2-CH2-. Jedinjenje u skladu sa Zahtevom 9, gde L je -OCH2-CH2- ili -NHCH2-CH2-.

U jednoj izvedbi, s obzirom na jedinjenja sa formulama IVa-IVd, L je -SO2.

U jednoj izvedbi, s obzirom na jedinjenja sa formulama IVa-IVd, L je -CON(H)-CH2-CH2- ili - SO2NH-CH2-CH2-.

U jednoj izvedbi, s obzirom na jedinjenja sa formulama IVa-IVd, L je -OCH2-CH2- ili -NHCH2-CH2-.

U poželjnoj izvedbi L je veza.

U jednoj izvedbi, s obzirom na jedinjenja sa formulama IVa-IVd, prsten P je supstituisani ili ne supstituisani piperidin, morfolin ili piperazin.

U jednoj izvedbi, s obzirom na jedinjenja sa formulama IVa-IVd, L i prsten P su kao šta je ranije opisano; oznaka nje 4, a svaki R8a je H.

U jednoj izvedbi, s obzirom na jedinjenja sa formulama IVa-IVd, L i prsten P su kao šta je ranije opisano; oznaka nje 1, a R8a je Me, Et, Pr, izo-Pr, Cl, F, CN, Ome ili CF3. U drugoj izvedbi, R<8a>je na poziciji 2-(orto na -L). U drugoj izvedbi, R8a je 2-C1,2-F, 2-Me ili 2-CF3.

U jednoj izvedbi, s obzirom na jedinjenja sa formulom III, R8 je

a gde prsten P je supstituisani ili ne supstituisani heterocikloalkil; oznaka n je izabrana iz brojeva od 1-4, a svaki R<8a>je nezavisno izabran iz vodonika, supstituisanog ili

nesupstituisanog alkila, alkoksi, cijano i halo.

U jednoj izvedbi, s obzirom na jedinjenja sa formulom III, R je kao što je opisano ranije, a prsten P je supstituisani ili ne supstituisani piperidin, morfolin ili piperazin.

U jednoj izvedbi, s obzirom na jedinjenja sa formulom III, R<8>je kao što je opisano ranije, a oznaka nje 4, a svaki R je H.

U jednoj izvedbi, s obzirom na jedinjenja sa formulom III, R<8>je kao što je opisano ranije, a oznaka nje 1, a R8a je Me, Et, Pr, izo-Pr, Cl, F, CN, Ome ili CF3. U drugoj izvedbi, R<8a>jena poziciji 2-(orto naN-prstena P). U drugoj izvedbi, R<8a>je 2-C1, 2-F, 2-Me ili 2-CF3.

U jednoj izvedbi, s obzirom na jedinjenja sa formulom III, R8 je

a gde oznaka nje izabrana iz brojeva od 1-4; svaki R8a je nezavisno izabran iz vodonika, supstituisanog ili ne supstituisanog alkila, alkoksi, cijano i halo; R<8b>je vodonik, supstituisani ili ne supstituisani alkil ili supstituisani ili ne supstituisani cikloalkil; R<8c>je vodonik, supstituisani ili ne supstituisani alkil, a oznaka x je izabrana iz brojeva od 1-8. U jednoj izvedbi, s obzirom na jedinjenja sa formulom III, R Qje

a gde oznaka nje izabrana iz brojeva od 1-4; svaki R8a je nezavisno izabrana iz vodonika, supstituisanog ili ne supstituisanog alkila, alkoksi, cijano i halo; R<8b>je vodonik, supstituisani ili ne supstituisani alkil ili supstituisani ili ne supstituisani cikloalkil; R<8c>je

vodonik ili Mc.

U jednoj izvedbi, s obzirom na jedinjenja sa formulom III, R8 je

a gde oznaka nje izabrana iz brojeva od 1-4; svaki R8a je nezavisno izabran iz vodonika,

supstituisanog ili ne supstituisanog alkila, alkoksi, cijano i halo.

U jednoj izvedbi, s obzirom na jedinjenja sa formulom III, R8 je

a gde oznaka nje izabrana iz brojeva od 1-4; svaki R8a je nezavisno izabran iz vodonika, supstituisanog ili ne supstituisanog alkila, alkoksi, cijano i halo; a R<8b>je vodonik,

supstituisani ili ne supstituisani alkil ili supstituisani ili ne supstituisani cikloalkil. U jednoj izvedbi, s obzirom na jedinjenja sa formulom III, R rtje kao šta je ranije opisano, oznaka nje 4, a svaki R je H.

U jednoj izvedbi, s obzirom na jedinjenja sa formulom III, R je kao šta je ranije opisano, oznaka nje 1, a R8a je Me, Et, Pr, izo-Pr, Cl, F, CN, Ome ili CF3. U drugoj izvedbi, R8a je na poziciji 2-(orto naN-prstena P). U drugoj izvedbi, R8a je 2-C1,2-F, 2-Me ili 2-CF3.

U jednoj izvedbi, s obzirom na jedinjenja sa formulom III, R<8>je kao šta je ranije opisano, a R<8b>jeH.

U jednoj izvedbi, s obzirom na jedinjenja sa formulom III, R<8>je kao šta je ranije opisano, a R<8b>je supstituisani ili ne supstituisani alkil.

U jednoj izvedbi, s obzirom na jedinjenja sa formulom III, R<8>je kao šta je ranije opisano, a R<8b>je supstituisani ili ne supstituisani cikloalkil.

U jednoj izvedbi, s obzirom na jedinjenja sa formulom III, R<8>je kao šta je ranije opisano, a R<8b>je Me, Et, Pr, i-Pr, t-Bu, i-Bu, CH2CF3, CF3, CH2CONH2, ciklopropil ili ciklopropilmetil.

U posebnoj izvedbi, s obzirom na jedinjenja sa formulom III, R<8>je kao šta je ranije opisano, a R8bje i-Pr.

U dodatnoj izvedbi, s obzirom na jedinjenja sa formulama IVa-IVd, R<8a>je nezavisno izabran iz vodonika, supstituisanog ili ne supstituisanog alkila, alkoksi, cijano, karbamoila, CHO i halo. U jednoj izvedbi, R8a je H, Me, F ili Cl. U poželjnoj izvedbi R8a je H.

U jednoj izvedbi, s obzirom na jedinjenja sa formulama IVa-IVd, jedinjenje je u skladu sa formulama Va, Vb, Vc, Vd, Ve ili Vf:

a gde R<9>je kao šta je opisano za formulu III, a R<8b>je vodonik, supstituisani ili ne

supstituisani alkil ili supstituisani ili ne supstituisani cikloalkil.

U jednoj izvedbi, s obzirom na jedinjenja sa formulama Va-Vf, R OLje H.

U jednoj izvedbi, s obzirom na jedinjenja sa formulama Va-Vf, R RH je supstituisani ili ne supstituisani alkil.

U jednoj izvedbi, s obzirom na jedinjenja sa formulama Va-Vf, R je supstituisani ili ne supstituisani cikloalkil.

U jednoj izvedbi, s obzirom na jedinjenja sa formulama Va-Vf, R<8b>je Me, Et, Pr, i-Pr, t-Bu, i-Bu, CH2CF3, CF3, CH2CONH2, ciklopropil ili ciklopropilmetil.

U jednoj posebnoj izvedbi, s obzirom na jedinjenja sa formulama Va-Vf, R8b je i-Pr.

U jednoj izvedbi, s obzirom na jedinjenja sa formulama IH-Vf, R<9>je supstituisani ili ne supstituisani aril. U drugoj izvedbi, R<9>je supstituisani ili ne supstituisani fenil.

U jednoj izvedbi, s obzirom na jedinjenja sa formulama IH-Vf, R<9>je supstituisani ili ne supstituisani heteroaril. U drugoj izvedbi, R9 je supstituisani ili ne supstituisani piridil.

U jednoj izvedbi, s obzirom na jedinjenja sa formulama IH-Vf, R9 je izabran iz supstituisanog ili ne supstituisanog fenila, indolila, izoinolila, pirolila, furanila, tienila, pirazolila, oksazolila i tiazolila.

U jednoj izvedbi, s obzirom na jedinjenja sa formulama IH-Vf, R9 je

a svaki A<1>, A<2>i A<3>je nezavisno izabran iz S, O, N,NR9a i CR<9a>;svaki R9a je nezavisno H

ili supstituisani ili ne supstituisani alkil; a R9b je CONH2, CONHMe ili CN.

U dodatnoj izvedbi, s obzirom na jedinjenja sa formulama IH-Vf, R9 je

U dodatnoj izvedbi, s obzirom na jedinjenja sa formulama IH-Vf, R9 je

U dodatnoj izvedbi, s obzirom na jedinjenja sa formulama IH-Vf, R9 je a gde oznaka m je izabrana iz brojeva od 1-4, a svaki R<9d>je nezavisno H, supstituisani ili

ne supstituisani alkil ili halo.

U dodatnoj izvedbi, s obzirom na jedinjenja sa formulama IH-Vf, R9 je

a gde oznaka m je izabrana iz brojeva od 1-4, a svaki R9d je nezavisno H, supstituisani ili

ne supstituisani alkil ili halo.

U dodatnoj izvedbi, s obzirom na jedinjenja sa formulama IH-Vf, R9 je

a gde oznaka m je izabrana iz brojeva od 1-3, a svaki R9d je nezavisno H, supstituisani ili

ne supstituisani alkil ili halo.

U dodatnoj izvedbi, s obzirom na jedinjenja sa formulama IH-Vf, R9 je kao staje opisano ranije; a svaki R9d je H.

U dodatnoj izvedbi, s obzirom na jedinjenja sa formulama IH-Vf, R9 je kao šta je opisano ranije; a m je 1 ili 2, a svaki R9d je nezavisno Me, Cl ili F.

U jednoj izvedbi, s obzirom na jedinjenja sa formulom III, jedinjenje je u skladu sa formulama Via, VIb, Vic, Vid, Vle ili Vlf:

a R8b je vodonik, supstituisani ili ne supstituisani alkil ili supstituisani ili ne supstituisani

cikloalkil.

U dodatnoj izvedbi, s obzirom na jedinjenja sa formulama Vla-VIf, R je H.

U dodatnoj izvedbi, s obzirom na jedinjenja sa formulama Vla-VIf, R je cikloalkil.

U dodatnoj izvedbi, s obzirom na jedinjenja sa formulama Vla-VIf, R je ciklopropil.

U dodatnoj izvedbi, s obzirom na jedinjenja sa formulama Vla-VIf, R<8b>je supstituisani ili ne supstituisani alkil.

U dodatnoj izvedbi, s obzirom na jedinjenja sa formulama Vla-VIf, R8b je Me, Et, Pr, i-Pr, t-Bu, i-Bu, CF3, CH2CF3, CH2CONH2ili ciklopropilmetil.

U jednoj izvedbi, s obzirom na jedinjenja sa formulom III, jedinjenje je u skladu sa formulama Vila, Vllb, VIIc, VIIc, Vlld, Vile ili Vllf:

a R je vodonik, supstituisani ili ne supstituisani alkil ili supstituisani ili ne supstituisani

cikloalkil.

U dodatnoj izvedbi, s obzirom na jedinjenja sa formulama Vlla-VIId, R8b je H.

U dodatnoj izvedbi, s obzirom na jedinjenja sa formulama Vlla-VIIf, R je cikloalkil.

U dodatnoj izvedbi, s obzirom na jedinjenja sa formulama Vlla-VIIf, R8b je ciklopropil.

U dodatnoj izvedbi, s obzirom na jedinjenja sa formulama Vlla-VIIf, R<8b>je supstituisani ili ne supstituisani alkil.

U dodatnoj izvedbi, s obzirom na jedinjenja sa formulama Vlla-VIIf, R<8b>je Me, Et, Pr, i-Pr, t-Bu, i-Bu, CF3, CH2CF3, CH2CONH2ili ciklopropilmetil.

U jednoj izvedbi, s obzirom na jedinjenja sa formulom III, jedinjenje je u skladu sa formulama VHIa, VHIb, VIIIc, VUId, VHIe ili VHIf:

a R<8b>je vodonik, supstituisani ili ne supstituisani alkil ili supstituisani ili ne supstituisani

cikloalkil.

U dodatnoj izvedbi, s obzirom na jedinjenja sa formulama VHIa-VIIIf, R8b je H.

U dodatnoj izvedbi, s obzirom na jedinjenja sa formulama VHIa-VIIIf, R8b je cikloalkil.

U dodatnoj izvedbi, s obzirom na jedinjenja sa formulama VHIa-VIIIf, R8b je ciklopropil.

U dodatnoj izvedbi, s obzirom na jedinjenja sa formulama VHIa-VIIIf, R8b je supstituisani ili ne supstituisani alkil.

U dodatnoj izvedbi, s obzirom na jedinjenja sa formulama VHIa-VIIIf, R8b je Me, Et, Pr, i-Pr, t-Bu, i-Bu, CF3, CH2CF3, CH2CONH2ili ciklopropilmetil.

U jednoj izvedbi, s obzirom na jedinjenja sa formulom III, jedinjenje je u skladu sa formulama IXa, IXb, IXc, IXd, IXe ili fXf:

a R je vodonik, supstituisani ili ne supstituisani alkil ili supstituisani ili ne supstituisani

cikloalkil.

U dodatnoj izvedbi, s obzirom na jedinjenja sa formulama IXa-IXf, R8b je H.

U dodatnoj izvedbi, s obzirom na jedinjenja sa formulama IXa-IXf, R8b je cikloalkil.

U dodatnoj izvedbi, s obzirom na jedinjenja sa formulama IXa-IXf, R8b je ciklopropil.

U dodatnoj izvedbi, s obzirom na jedinjenja sa formulama IXa-IXf, R<8b>je supstituisani ili ne supstituisani alkil.

U dodatnoj izvedbi, s obzirom na jedinjenja sa formulama IXa-IXf, R8b je Me, Et, Pr, i-Pr, t-Bu, i-Bu, CF3, CH2CF3, CH2CONH2ili ciklopropilmetil.

U jednoj izvedbi, s obzirom na jedinjenja sa formulom III, jedinjenje je u skladu sa formulama Xa, Xb, Xc, Xd, Xe ili Xf:

a R je vodonik, supstituisani ili supstituisani alkil ili supstituisani ili ne supstituisani

cikloalkil.

U dodatnoj izvedbi, s obzirom na jedinjenja sa formulama Xa-Xf, R8b je H.

U dodatnoj izvedbi, s obzirom na jedinjenja sa formulama Xa-Xf, R8b je cikloalkil.

U dodatnoj izvedbi, s obzirom na jedinjenja sa formulama Xa-Xf, R8b je ciklopropil.

U dodatnoj izvedbi, s obzirom na jedinjenja sa formulama Xa-Xf, R<8b>je supstituisani ili ne supstituisani alkil.

U dodatnoj izvedbi, s obzirom na jedinjenja sa formulama Xa-Xf, R8b je Me, Et, Pr, i-Pr, t-Bu, i-Bu, CF3, CH2CF3, CH2CONH2ili ciklopropilmetil.

U jednoj izvedbi, s obzirom na jedinjenja sa formulom III, jedinjenje je u skladu sa formulama XIa, XIb, XIc, XId, XIe ili XIf:

a R8b je vodonik, supstituisani ili ne supstituisani alkil ili supstituisani ili ne supstituisani

cikloalkil; a R9e je vodonik, Me ili CN.

U jednoj izvedbi, s obzirom na jedinjenja sa formulama XIa-XIf, R9e je H.

U jednoj izvedbi, s obzirom na jedinjenja sa formulama XIa-XIf, R9e je Me.

U jednoj izvedbi, s obzirom na jedinjenja sa formulama XIa-XIf, R9e je C<N.>

U jednoj izvedbi, s obzirom na jedinjenja sa formulama XIa-XIf, R8b je H.

U dodatnoj izvedbi, s obzirom na jedinjenja sa formulama XIa-XIf, R8b je cikloalkil.

U dodatnoj izvedbi, s obzirom na jedinjenja sa formulama XIa-XIf, R8b je ciklopropil.

U dodatnoj izvedbi, s obzirom na jedinjenja sa formulama XIa-XIf, R<8b>je supstituisani ili ne supstituisani alkil.

U dodatnoj izvedbi, s obzirom na jedinjenja sa formulama XIa-XIf, R<8b>je Me, Et, Pr, i-Pr, t-Bu, i-Bu, CF3, CH2CF3, CH2CONH2ili ciklopropilmetil.

U jednoj izvedbi, s obzirom na jedinjenja sa formulom III, jedinjenje je u skladu sa formulama XIIa,XIIb, XIIc ili XIId:

<i>

U jednoj izvedbi, s obzirom na jedinjenja sa formulom III, jedinjenje je u skladu sa formulama XIIIa, XIIIb, XIIIc ili XIIId:

i

U jednoj izvedbi, s obzirom na jedinjenja sa formulom III, jedinjenje je u skladu sa formulama XIVa, XIVb, XIVc ili XIVd:

U jednoj izvedbi, s obzirom na jedinjenja sa formulom III, jedinjenje je u skladu sa formulama XVa, XVb ili XVc: a L je veza ili -O-CH2-CH2-; prsten P je

a R8b je H, Me, i-Pr, t-Bu, CH2CONH2ciklopropilmetil ili CH2CF3.

U posebnoj izvedbi, s obzirom na jedinjenja sa formulama XVa-XVc, L je veza. U drugoj posebnoj izvedbi, L je -O-CH2-CH2-.

U posebnoj izvedbi, s obzirom na jedinjenja sa formulama XVa-XVc, prsten P je

U posebnoj izvedbi, s obzirom na jedinjenja sa formulama XVa-XVc, prsten P je

U jednoj izvedbi, s obzirom na jedinjenja sa formulom III, jedinjenje je izabrano iz Tabele 1. U jednoj izvedbi, s obzirom na jedinjenja sa formulom III, jedinjenje je izabrano iz Tabele 2.

U nekim aspektima, ovaj pronalazak takođe razotkriva prolekove i derivate jedinjenja u skladu sa gornjim formulama. Prolekove i derivate jedinjenja iz ovoga pronalaska, koji imaju grupe koje mogu da se pocepaju metabolički ili da rastvaranjem ili pod fiziološkim uslovima mogu da postanu jedinjenja iz ovoga pronalaska, koja su farmaceutski aktivna u uslovimain vivo.Prolek može da bude inaktivan kada se administrira subjektu, ali se isti konvertujein vivou aktivno jedinjenje iz ovoga pronalaska. Termin "farmaceutski prihvatljivi lekovi", na način na koji se ovde koriste se odnosi na one prolekove jedinjenja koja su korisna u ovom pronalasku, koji su, u okvirima zdravog medicinskog suda, pogodna za upotrebu u kontaktu sa tkivima pacijenta bez da dovode do toksičnosti, iritacije, alergijskog odgovora u razmeru razumljive koristi/razumljivi rizik, i koji su efikasni u smislu namene jedinjenja iz ovoga pronalaska. Termin "prolek" označava jedinjenje koje se transformirain vivou efikasnu količinu jedinjenja koje je korisno za ovaj pronalazak ili u njegovu farmaceutski prihvatljivu so, hidrat ili rastvorenu materiju. Transformacija može da nastupi uz pomoć različitih mehanizama, kao na primer preko hidrolize u krvi. Jedinjenja koja sadrže grupe koje mogu da se pocepaju metabolički takođe nose prednost da mogu da pokažu poboljšanu biodostupnost kao rezultat pojačane stabilnosti i/ili pojačane rate apsorpcije upoređeno sa parentnim jedinjenjem baš zbog postojanja grupa koje mogu da se pocepaju metabolički, pa zbog toga, takva jedinjenja deluju kao prolekovi. Posebna diskusija o tome može da se vidi u Design of Prodrugs, H. Bundgaard, ed., Elsevier (1985); Methods in Enzymology; K. Widder et al, Ed., Academic Press, 42, 309-396 (1985); A Textbook of Drug Design and Development, Krogsgaard-Larsen and H. Bandaged, ed., Chapter 5; "Design and Applications of Prodrugs" 113-191 (1991); Advanced Drug Delivery Reviews, H. Bundgard, 8 , 1-38, (1992); J. Pharm. Sci., 77,285 (1988); Chem. Pharm. Buli., N. Nakeva et al, 32, 692

(1984); Pro-drugs as Novel Delivery Systems, T. Higuchi and V. Stella, 14 A.C.S. Svmposium Series, and Bioreversible Carriers in Drug Design, E.B. Roche, ed., American Pharmaceutical Association and Pergamon Press, 1987, koji su ovde uključeni referencom. Takvi primeri uključuju, ali time nisu ograničeni, derivate holin estera i si., estere N-alkilmorfolin i si. Drugi derivati jedinjenja iz ovoga pronalaska imaju aktivnost u obe forme, kao kiseline i kao derivati kiseline, ali forme osetljive na kiselinu često pokazuju prednost u smislu rastvorivosti, kompatibilnosti sa tkivom ili odloženim otpuštanjem u organizmu sisara (vidi, Bundgard, H., Design of Prodrugs, pp. 7-9, 21-24, Elsevier, Amsterdam 1985). Prolekovi uključuju derivate kiseline koji su dobro poznati stručnjacima, poput na primer, estere pripremljene uz pomoć reakcije parentne kiseline sa pogodnim alkoholom ili amide pripremljene uz pomoć reakcije parentne kiseline sa supstituisanim ili ne supstituisanim aminom ili kiselim anhidridima ili mešanim anhidridima. Jednostavni alifatski ili aromatski esteri, amidi i anhidridi izvedeni iz kiselih grupa koje su deo jedinjenja iz ovoga pronalaska su poželjni prolekovi. U nekim slučajevima, poželjno je da se pripreme prolekovi tipa dvostrukih estera poput estera (aciloksi)alkila ili estera ((alkoksikarbonil)oksi)alkila. Poželjni su Cido Csalkili, C2-C8alkenili, aril, C7-C12supstituisani aril i esteri C7-C12arilalkil jedinjenja iz ovoga pronalaska.

FARMACEUTSKE KOMPOZICIJE

Kada se koriste kao farmaceutici, jedinjenja iz ovoga pronalaska tipično se daju u formi farmaceutskih kompozicija. Takve kompozicije mogu da se pripreme na način koji je dobro poznat stanju tehnike i obuhvata najmanje jedno aktivno jedinjenje.

Opšte uzeto, jedinjenja iz ovoga pronalaska se daju u količini koja je farmaceutski aktivna. Količina jedinjenja koje se u stvari daje tipično treba da bude administrirana od strane lekara, u svetlu relevantnih okolnosti, uključujući i uslove koje treba da se tretiraju, izabranu rutu administracije, samoga jedinjenja koje se administrira, dobi, težini i odgovora pojedinog pacijenta, ozbiljnosti pacijentovih simptoma i si.

Farmaceutske kompozicije iz ovoga pronalaska mogu da se daju preko različitih ruta uključujući oralnu, rektalnu, transdermalnu, subkutanu, intravenoznu, intramuskularnu i intranazalnu. U zavisnosti od korišćene rute dostave, jedinjenja iz ovoga pronalaska su preferirano formulisana ili kao injektabilne kompozicije ili kao oralne kompozicije ili kao melemi, kao losioni ili kao masti za transdermalnu administraciju.

Kompozicije za oralnu administraciju mogu da zauzmu formu tečnih rastvora ili suspenzija ili pudera. Češće, međutim, kompozicije su predstavljene u pojedinačnim doznim formama sa ciljem povećanja tačnosti doziranja. Termin "pojedinačne dozne forme" se odnosi na fizički diskretne jedinice koje su pogodne za pojedinačnu upotrebu kod ljudskih subjekata i drugih sisara, e pri čemu svaka jedinica sadrži unapred određenu količinu aktivnog materijala za kojeg je izračunato da može dovesti do poželjnog terapeutskog efekta, zajedno sa pogodnim farmaceutskim ekscipijentom. Tipične pojedinačne dozne forme uključuju unapred popunjene, unapred izmerene ampule ili šprice sa tečnim kompozicijama ili u slučaju tvrdih kompozicija pilule, tablete, kapsule i si. U takvim kompozicijama, jedinjenje furasulfonske kiseline je obično manja komponenta (od oko 0.1 do oko 50% po težini ili poželjno od oko 1 do oko 40% po težini), a ostatak otpada na različite prenosnike ili kerijere i procesivne kiseline koje pomažu u formiranju željene dozne forme.

Tečne forme pogodne za oralnu administraciju mogu da uključe pogodnog vodenog ili ne vodenog prenosnika sa puferima, agensima za suspendovanje i za dispenzovanje, kolorantima, okusima i si. Tvrde forme mogu da uključe, na primer, bilo kojeg od sledećih sastojaka ili jedinjenja sa sličnom prirodom: veznika poput mikrokristalne celuloze, gumu tragakant ili želatin; neki ekscipijent poput škroba ili laktoze, agensa za raspadanje poput alginske kiseline, Primogelovi ili škroba iz kukuruza; lubrikanta poput magnezij stearata; glidanta poput koloidnog silikon dioksida; agensa za zasladivanje poput saharoze ili saharina; ili agensa za okus poput peperminta, metil salicilata ili okus pomorandže.

Kompozicije za injektiranje se tipično baziraju na injektiranje sterilnog slanog rastvora ili slanog rastvora koji je puferovan sa fosfatom ili na nekim drugim kerijerima koji mogu da se injektiraju, a koji su poznati stanju tehnike. Kao i pre, aktivno jedinjenje u takvim kompozicijama je tipično manjinska komponenta, često u količini od oko 0.05 do 10% po težini, a ostatak je kerijer koji može da se injektira i si.

Transdermalne kompozicije su tipično formulisane kao topikalne pomade ili kreme koje sadrže aktivne sastojke (ili aktivni sastojak), opšte uzeto u količini koja se kreće od oko 0.01 do oko 20 % po težini, preferirano od oko 0.1 do oko 20 % po težini, preferirano od oko 0.1 do oko 10 % po težini, a najbolje od oko 0.5 do oko 15 % po težini. Kada se formulišu kao pomada, aktivni sastojci će tipično da budu pomešani sa parafinskom bazom za pomade ili bazom za pomade koja može da se rastvori u vodi. Alternativno, aktivni sastojci mogu da se formulišu u kremu sa, na primer bazom za kreme ulje-u-vodi. Takve transdermalne formulacije su dobro poznate stanju tehnike, a opšte uzeto uključuju dodatne sastojke sa ciljem ubrzavanja dermalne penetracije i stabilnost aktivnog sastojaka ili formulacije. Sve takve poznate transdermalne formulacije i sastojci su uključeni u okvire ovoga pronalaska.

Jedinjenja iz ovoga pronalaska takođe mogu da se administriraju uz pomoć transdermalne naprave. Prema tome, transdermalna administracija može da se postigne uz pomoć upotrebe zavoja koji je povezan sa rezervoarom ili porozne membrane ili preko brojnih tvrdih matriksa. Gore opisane komponente za oralnu administraciju, za injektiranje ili kompozicije koje mogu da se administriraju topikalno su predstavljeni samo radi prezentacije. Drugi materijali, kao i procesivne tehnike i si., su navedeni u Delu 8 iz Remington' s Pharmaceutical Sciences. 17th edition, 1985, Mack Publishing Companv, Easton, Pennsvlvania, koji je ovde uključen referencom.

Jedinjenja iz ovoga pronalaska mogu da se administriraju i preko formi za odloženo otpuštanje ili preko sistema za odloženo otpuštanje i dostavljanje leka. Opis reprezentativnih materijala za odloženo otpuštanje može da se nađe u Remington' s Pharmaceutical Sciences.

Sledeći primeri za formulacije ilustruju reprezentativne farmaceutske kompozicije iz ovoga pronalaska. Ovaj pronalazak, međutim, nije ograničen samo na sledeće farmaceutske kompozicije.

Formulacija 1-Tablete

Jedinjenje iz ovoga pronalaska se mesa kao suvi puder sa suvim veznikom od želatina u težinskom omeru od otprilike 1:2. Manja količina magnezijum stearata se dodaje kao lubrikant. Mešavina je formira u tablete od 240-270 mg (80-90 mg aktivnog amidnog jedinjenja po tableti) u presi za tablete.

Formulacija 2-Kapsule

Jedinjenje iz ovoga pronalaska se meša kao suvi puder sa razređivačem od škroba u težinskom omeru od otprilike 1:1. Mešavina se puni u kapsule od 250 mg (125 mg aktivnog amidnog jedinjenja po kapsuli).

Formulacija3 -Tečnost

Jedinjenje iz ovoga pronalaska (125 mg), saharoza (1.75 g) i ksantanska guma (4 mg) se mešaju, propuštaju kroz sito američkog standarda No. 10, a tada se sve meša sa pre načinjenim rastvorom mikrokristalne celuloze i natrijum karboksimetil celuloze (11:89, 50 mg) u vodi. Natrijum benzoat (10 mg), okus i boja se razređuju sa vodom pa se dodaju uz pomoć mešanja. Tada se dodaje dovoljno vode sa ciljem stvaranja ukupnog volumena od 5 mL.

Formulacija 4-Tablete

Jedinjenje iz ovoga pronalaska se meša kao suvi puder sa suvim veznikom od želatina u težinskom omeru od otprilike 1:2. Manja količina magnezijum stearata se dodaje kao lubrikant. Mešavina se formulira u tablete od 450-900 mg (150-300 mg aktivnog amidnog jedinjenja) u presi za tablete.

Formulacija5 -Injekcija

Jedinjenje iz ovoga pronalaska se rastvara ili suspenduje u puferovani vodeni sterilni slani rastvor za injektiranje do koncentracije od otprilike 5 mg/ml.

Formulacija 6-Topikalno

Stearil alkohol (250 g) i beli petrolatum (250 g) se tope na oko 75° C, a tada se dodaje mešavina jedinjenja iz ovoga pronalaska (50 g), metilparaben (0.25 g), propilparaben (0.15 g), natrijum lauril sulfat (10 g) i propilen glikol (120 g) rastvoren u vodi (oko 370 g), a nastala mešavina se dalje meša sve dok se ne zgusne.

METODE TRETMANA

Ova jedinjenja se koriste kao terapeutski agensi za tretman stanja u sisara koja su uzročno povezana ili koja su posledica aberantne aktivnosti MMP1 i/ili MAPKAPK5. Prema tome, jedinjenja i farmaceutske kompozicije iz ovoga pronalaska imaju primenu kao terapeutici za sprečavanje i/ili tretman bolesti zapaljenja u sisara uključujući i ljude.

Ovaj pronalazak se takođe odnosi na upotrebu ovih jedinjenja u proizvodnji leka za tretman ili za profilaksu stanja koja mogu da se spreče, ublaže ili otklone uz pomoć administracije inhibitora aktivisane protein kinaze 5 koja je aktivisana mitogen-aktivisanom protein kinazom ili stanja koja su karakterizovana sa abnormalnom aktivnosti kolagenaze ili stanja koja su povezana sa degradacijom ECM ili stanja koja su izabrana iz bolesti koje uključuju zapaljenja, a najpoželjnije za tretman reumatoidnog artritisa.

Kao dodatni aspekt ovoga pronalaska, ova jedinjenja su obezbeđena za upotrebu kao farmaceutici, a posebno u tretmanu ili prevenciji sledećih stanja: - stanje povezano sa degradacijom ekstra-celularnog matriksa (ECM), posebno artritis, a još preciznije, reumatoidni artritis; - stanje povezano sa abnormalnim celularnom ekspresijom MMP 1; - stanje karakterizovano sa abnormalnom aktivnosti metalo proteinaza matriksa; - bolesti i poremećaji koji su uzrokovani uz pomoć zapaljenja poput, na primer reumatoidnog artritisa i osteoporoze, miokardialnim infarktom, različitim autoimunim bolestima i poremećajima, uveitisom i aterosklerozom; svrbežom/pruritusom poput, na primer psorijaze; i renalnim poremećajima; - stanjem karakterizovanim uz pomoć abnormalne aktivnosti kolagenaze ili stanjem povezanim sa degradacijom ECM ili stanje izabranim iz bolesti koje uključuju zapaljenje, naj preferiranije za tretman reumatoidnog artritisa.

Takođe je ovde obezbeđena upotreba ovih jedinjenja u proizvodnji leka za tretman ili prevenciju jednog od pre pomenutih stanja ili bolesti.

Opisan je metod koji obuhvata administraciju subjektu koji pati od bolesti čije se stanje karakterizuje uz pomoć zapaljenja, sa efektivnom količinom jedinjenja iz ovoga pronalaska koje inhibira metalo-proteinaze iz matriksa tokom perioda vremena koji je dovoljan da smanji abnormalne nivoe degradacije ekstracelularnog matriksa kod pacijenta ili poželjno da terminira proces koji je odgovoran za pomenutu degradaciju, a koji sam sebe ubrzava. Specijalna izvedba ovog metoda obuhvata administraciju efektivne količine jedinjenja koje inhibira metalo-proteinaze iz matriksa u subjekta koji pati od ili koji pokazuje sklonosti da razvije reumatoidni artritis tokom perioda vremena koje je dovoljno da smanji ili spreći degradaciju kolagena i kosti u zglobovima pomenutog pacijenta, a preferirano da terminira procese koji su odgovorni za pomenutu degradaciju, a koji same sebe ubrzavaju.

Doze za injekciju se kreću u rasponu od oko 0.1 mg/kg/h do najmanje 10 mg/kg/h, sve od oko 1 do oko 120 h, a posebno od 24 do 96 h. Pre napunjena forma sa velikom dozom od oko 0.1 mg/kg do oko 10 mg/kg ili više može takođe da se administrira sa ciljem postizanja adekvatnog stabilnog stanja. Maksimalna totalna doza nije očekivano da pređe oko 2 g/danu za ljudskog pacijenta od 40 do 80 kg.

Za prevenciju i/ili tretman kod dugotrajnih stanja, poput zapaljenja i autoimunih stanja, režim za tretman obično se proteže tokom više meseci ili godina, pa prema tome je preporučljivo oralno doziranje zbog pacijentovog poverenja i tolerancije. Sa oralnim doziranjem, jedna od pet, posebno dve do četiri, a tipično tri oralne doze po danu predstavljaju reprezentativan režim. Upotrebljavanjem ovih doznih rasporeda, svaka doza obezbeđuje od oko 0.01 do oko 20 mg/kg jedinjenja iz ovoga pronalaska, sa preferiranim dozama od kojih svaka obezbeđuje od oko 0.1 do oko 10 mg/kg, a posebno od oko 1 do oko 5 mg/kg.

Transdermalne doze su opšte uzeto izabrane sa ciljem da obezbede slične nivoe ili nivoe iz krvi koji su postignuti uz pomoć upotrebe doza za injekciju.

Kada se koriste sa ciljem da se spreči razvoj stanja zapaljenja, jedinjenja iz ovoga pronalaska mogu da se daju pacijentu sa rizikom da razvije pomenuto stanje, tipično uz preporuku i uz nadgledanje lekara, i to sa doznim nivoima koji su pre opisani. Pacijenti sa rizikom da razviju posebno stanje, opšte uzeto uključuju one koji imaju familijarnu istoriju pomenutog stanja ili one koji su identifikovani uz pomoć genetičkih testova ili pretraga da su posebno u opasnosti da razviju pomenuto stanje.

Jedinjenja iz ovoga pronalaska mogu da se administriraju kao pojedinačni aktivni agens ili isti mogu da se administriraju u kombinaciji sa drugim agensima, uključujući druga jedinjenja koja demonstriraju istu ili sličnu terapeutsku aktivnost i za koja se zna da su bezbedna i efikasna za takvu spojenu administraciju.

OPŠTE PROCEDURE ZA SINTEZU

Triazolo[l,5-a]piridil jedinjenja iz ovoga pronalaska mogu da se prirede iz običnog i lako dostupnog početnog materijala uz pomoć opštih procedura i metoda. Treba da se razume da kada su navedeni tipični ili preferirani uslovi procesa (na primer, temperature reakcija, vremena, omeri molova reaktanata, rastvarači, pritisci i si.); drugi uslovi za proces mogu da se takođe upotrebe osim ako nije drugačije navedeno. Optimalni uslovi reakcije mogu da variraju sa pojedinim reaktantima ili rastvaračima koji se koriste, ali takvi uslovi mogu da se odrede od strane stručnjaka u polju uz pomoć rutinski optimalnih procedura.

Dodatno, kao šta će da bude vidljivo stručnjacima u polju, konvencionalne zaštitne grupe ponekad mogu da budu neophodne sa ciljem sprečavanja da neke fikcionalne grupe ne ostvare neželjene reakcije. Izbor pogodne zaštitne grupe za pojedinu funkcionalnu grupu, kao i pogodnih uslova za zaštitu i otklanjanje zaštite su dobro poznati stanju tehnike. Na primer, brojne zaštitne grupe i njihovo uvođenje i odstranjivanje su opisane u T. W. Greene i P. G. M. Wuts, Protecting Groups in Organic Svnthesis, Drugo izdanje, Wiley, New York, 1991 i u referencama koje su ovde citirane.

Sledeći metodi su predstavljeni u detalje s obzirom na preparaciju reprezentativnih bicikloheteroarila koji su pre bili navedeni. Jedinjenja iz ovoga pronalaska mogu da se pripreme iz poznatih ili komercijalno dostupnih početnih materijala i reagenata koji su poznati stručnjacima u organskoj sintezi.

Opšti sintetički put

Opšte

Svi reagenti su bili komercijalne čistoće i bili su korišćeni onako kako su nabavljeni, bez dodatne purifikacije, osim ako nije drugačije navedeno. Komercijalno dostupni bezvodni rastvarači su korišćeni za reakcione uslove u inertnoj atmosferi. Korišćeni su rastvarači koji su bili iste čistoće kao i reagenti u svim ostalim slučajevima, osim ako nije drugačije navedeno. Kolonska hromatografija se provodila na silika gelu 60 (35-70 pm). Tanko-slojna hromatografija je provedena uz pomoć pločica sa pre nanesenim silika gelom F-254 (debljina 0.25 mm). !H NMR spektari su bili snimljeni na spektrometru Bruker DPX 400 NMR (400 MHz). Hemijski pomaci (8) za<*>H NMR spektar su navedeni u delovima na milion (ppm) u odnosu na tetrametilsilan (8 0.00) ili u odnosu na pik odgovarajućeg rezidualnog rastvarača, na primer CHCI3(6 7.27), kao interna referenca. Multipliciteti su dani kao singlet (s), dublet (d), triplet (t), kvartet (q), multiplet (m) i široko (br). Konstante spajanja( J)su dane u Hz. MS spektar elektrospreja je dobiven na spektrometru Micromass platform LC/MS. Kolona koja je korišćena za sve LCMS analize: Waters Acquity UPLC BEH Cl8 1.7 um, 2.1 mm ID x 50 mm L (Deo No. 186002350)). Preparativni HPLC: Waters XBridge Prep Cl8 5 um ODB 19 mm ID x 100 mm L (Deo No. 186002978). Za sve metode je korišćen gradijent MeCN/H20. H20 sadrži ili 0.1 % TFA ili 0.1 %NH3.

Reprezentativna sinteza jedinjenja iz ovoga pronalaska

Jedinjenje 1: (4-Morfolin4-ilfenil)-[5-(lH-pirazol4-il)-[l,2,4]triazolo[l,5-alpirazin-8-il]amin

Korak 1: N'-( 3. 6- Dibromo- pirazin- 2- il)- N, N- dimetilformamidin

Mešavina 3,6-dibromo-pirazin-2-ilamina (15.37 g, 60.80 mmol) i JV-dimetilformamid dimetil acetatla (10.1 mL, 76.00 mmol) suspendovanog u etanolu (150 mL) je refluksovano tokom 2 časa. Reakciona mešavina je isparenain vacuošta dovodi do jedinjenja iz naslova (18.6 g).<1>H-NMR (400 MHz, CDC13) S(ppm) 3.20 (s, 3H), 3.21 (s, 3H), 7.93 (s, IH), 8.48 (s, IH). LCMS: Rt 3.81 min (99.1 %),mlz(APCI) 307 (M+H)<+.>

Korak 2: N-( 3. 6- Dibromo- pirazin- 2- il)- N'- hidroksiformamidin

U rastvor A<r->(3,6-dibromo-pirazin-2-il)-7/^V-dimetilformamidina (18.6 g, 60.80 mmol) u metanolu (200 mL) je dodan hidroksilamin hidrohlorid (5.91 g, 85.12 mmol) u jednom koraku. Reakcija je mešana na sobnoj temperaturi tokom 16 časova. Rastvarač je isparen, a tvrdi ostatak je tretiran sa hladnom (ohlađenom na ledu) vodom, a nakon toga je sve sakupljeno uz pomoć filtracije. Precipitat je opran dva puta sa vodom i petroleum eterom pa je sve osušenoin vacuošta dovodi do jedinjenja iz naslova (17.45 g) u formi bele tvrde materije. 'H-NMR (400 MHz, d6-DMSO) 8(ppm) 7.82 (IH, br s), 8.21 (IH, s), 8.34 (IH, m), 11.17 (IH, br s). LCMS: Rt 3.17 min (98.7 %),mlz(APCI) 295 (M+H)<+>.

Korak 3: 5, 8- Dibromo-[ l, 2. 4] triazolo[ l. 5- aJpirazin iV-(3,6-dibromo-pirazin-2-il)-iv'-hidroksiformamidin (17.4 mg, 58.80 mmol) je tretiran sa polifosfomom kiselinom (150 g) tokom jednog časa na 50° C, a tada tokom 1.75 časova na 70° C. Nakon hlađenja do sobne temperature, dodana je voda u reakcionu mešavinu. Nastaloj suspenziji je pH podešen na 8 uz pomoć dodavanja tvrdog NaHCChu malim porcijama. Precipitat koji nastaje je sakupljen uz pomoć filtracije, opran dva puta sa 1 N NaOH, tri pita sa vodom i sve je osušenoin vacuo.Ostatak je podeljen među etil acetata i 1 N NaOH, a organska faza je oprana još jednom sa 1 N NaOH ijednom sa slanim rastvorom. Organska faza je osušena preko MgS04, filtrirana i isparena sa ciljem nastajanja jedinjenja iz naslova (10.15 g) u formi bele tvrde materije.<*>H-NMR (400 MHz, de-DMSO) 8(ppm) 8.43 (s, IH), 8.92 (s, IH). LCMS: Rt 2.73 min (94.2 %),mlz(APCI) 277 (M+H)<+>.

Korak4: ( 5- Bromo-[ l, 2, 4] triazolo[ l, 5- a] pirazin- 8- il)-( 4- morfolin- 4- ilfenil) amin

Mešavina 5,8-dibromo-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazina (123 mg, 443 umol), 4-(4-morfolino)anilina (118 mg. 0.664 mmol) i iV-etildiizopropilamina (116 mL, 0.664 mmol) je grejana kod refluksa u 2-propanolu (3 mL) tokom 4.5 časova. Reakciona mešavina je isparena do suvoće, a ostatak je podeljen među dihlorometana i limunske kiseline (10 %). Organska faza je oprana jednom sa vodom i slanim rastvorom, osušena preko MgS04, filtrirana i isparena dok ne nastane jedinjenje iz naslova (156 mg, 94 %) u formi žute tvrde materije. 'H-NMR (400 MHz, c^-DMSO) 8(ppm) 3.11 (m, 4H), 3.78 (m, 4H), 6.97 (d, 2H), 7.82 (d, 2H), 7.87 (s, IH), 8.71 (s, IH), 9.93 (br s, IH). LCMS, Rt 3.32 min (96.8 %)mlz(APCI) 375 (M+H)<+.>

Korak 5: ( 4- Morfolin- 4- ilfenil)-[ 5-( lH- pirazol- 4- il)-[ l, 2, 4] triazolo[ l, 5- a] pirazin- 8- ilJamin

Suspenzija (5-bromo-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-8-il)-(4-morfolin-4-ilfenil)amina (220 mg, 0.586 mmol), 4-(4,4,5,5-tetratmetil-l,3,2-dioksaborolan-2-il)-lH-pirazola (171 mg, 0.879 mmol), Pd(PPh3)4(68 mg, 59 umol) i NaO'Bu (225 mg, 2.34 mmol) u 4 mL DMF/vode (3:1) je degazirana tokom 5 min u zatvorenom sudu. Reakciona mešavina je grejana u zatvorenom sudu na 90° C preko noći. Nakon isparavanje rastvarača, ostatak je sakupljen uz pomoć filtracije, opran sa vodom (3 x) i eterom (2 x) i osušenin vacuo.Grubi produkt je pročišćen uz pomoć kolonske hromatografije (silika gel, 96:4 DCM/MeOH) šta dovodi do jedinjenja iz naslova (76 mg, 36 %) u formi žute tvrde materije. 'H-NMR (400 MHz, d6-DMSO) 8(ppm) 3.11 (4H, m), 3.79 (4H, m), 6.98 (2H, d), 7.90 (2H, d), 8.17 (IH, s), 8.35 (IH, br s), 8.64 (IH, br s), 8.75 (IH, s), 9.73 (IH, br s). LCMS: Rt 2.68 min (97.7 %)mlz(APCI) 363 (M+H)<+>.

Jedinjenje 4: 4-(8-(4-(4-metilpiperazin-l-il)fenilamino)-[l,2,4]triazolo[l,5a]pirazin-5-

il)piridin-2(l H)-on

Korak 1: [ 5-( 2- Metoksi- piridin- 44l)-[ l, 2A] triazolo[ 1. 5- a] pirazin- 8- il]-[ 4-( 4- metil- piperaz^

il)- fenil]- amin

Ovo jedinjenje može da se priredi uz pomoć metoda kao šta je opisano za Jedinjenje 6, korak 4 uz upotrebu (5-bromo-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-8-il)-[4-(4-metil-piperazin-l-il)-fenil]-amina

(80 mg, 0.206 mmol), 2-metoksipiridin-4-boronične kiseline (63 mg, 0.412 mmol), Pd(PPh3)4(0.052 mmol) i 1.5 N Na2C03(1.1 mL, 1.65 mmol) u 2:1 DMF/dioksanu (2.2 mL). Grubi produkt je purifikovan uz pomoć silika gela na kolonskoj hromatografiji uz upotrebu 96:4 DCM:NH3(7 M u MeOH), a frakcije koje sadrže željeni produkt su spojene i isparene šta dovodi do jedinjenja iz naslova (40 mg, 47 %). HPLC (254 nm): Rt 2.26 min (65%).

Korak 2: 4-( 8-( 4-( 4- Metilpiperazin- l- il) fenilamino)-[ l, 2^] triazolo[ 1. 5a] pirazin- 5- il) piridin-2( lH)- on

Rastvor [5-(2-metoksi-piridin-4-il)-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-8-il]-[4-(4-metil-piperazin-l-il)-fenil]-amina (40 mg, 0.096 mmol) i piridin hidrohlorida (55 mg, 0.48 mmol) u vodi (1 mL) je mešan na sobnoj temperaturi tokom 1 časa. Rastvarač je odstranjenin vacuo,a ostatak je purifikovan na silika gelu tokom kolonske hromatografije uz eluciju sa 96:4 DCM:NH3(7 M u MeOH). Jedinjenje iz naslova je izolovano (23 mg, 60 %). 11 mg (0.0273 mmol) slobodne baze jedinjenja je rastvoreno u minimalnoj količini MeOH/DCM, (refluksovano sa ciljem rastvaranja), a nakon toga je dodano 0.1 M metansulfonske kiseline (0.273 mL) u MeOH. Nakon isparavanja rastvarača, ostatak je tretiran nekoliko puta sa mešavinom od 1:1 etil acetat-dietil etera i DCM-dietil etera, filtriranje i osušenin vacuosa ciljem dobijanja ciljnog jedinjenja u formi mesilatne soli (13 mg, 99 %). 'H-NMR (400 MHz, dg-DMSO) 8(ppm) 2.21 (3H, s), 2.91 (3H, s, MsOH). 3.00 (2H, t), 3.18-3.26 (2H, m), 3.58 (2H, d), 3.90 (2H, d), 6.83 (IH, s), 7.07 (2H, d), 7.25 (IH, s). 7.53 (IH, d), 7.93 (2H, d), 8.14 (IH, s), 8.76 (IH, s), 9.69 (IH, br s), 10.21 (IH, s), 13.3 (IH, br s). LCMS: Rt 1.71 min (97.5%),mlz(APCI) 403 (M+H)<+>.

Jedinjenje 6: Amid 4-{8-[4-(4-metil-piperazin-l-il)fenilamino]-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-5-iI}-tiofen-2-karboksilne kiseline

Korak 1: ( 5- Bromo[ l, 2, 4] triazolo[ l, 5- a] pirazin- 8- il)-[ 4-( 4- metil- piperazin- l- il)- fenil]- amin

Mešavina 5,8-dibromo-[l,2,4]tirazolo[l,5-a]pirazina (2 g, 7.20 mmol), 4-(4-metil-piperazin-l-il)-fenilamina (1.65 g, 8.64 mmol) i iV-etildiizopropil-amina (1.5 mL, 8.64 mmol) je grejana na 80° C u 2-propanolu (50 mL) tokom 8 časova. Reakciona mešavina je isparena do suvoće, a ostatak je podeljen među dihlorometana i vode. Vodena faza je ekstrahovana dva puta sa dihlorometanom. Organski slojevi su oprani sa slanim rastvorom, osušeni preko MgSO-j, filtrirani i ispareni sa ciljem dobijanja jedinjenja iz naslova (1.41 g) u formi sive tvrde materije. •H-NMR (400 MHz, d6-DMSO) 8(ppm) 2.27 (3H, s), 2.54 (4H, m), 3.14 (4H, m), 6.97 (2H, d), 7.80 (2H, d), 7.87 (IH, s), 8.72 (IH, s), 9.92 (IH, br s). LCMS: Rt 2.07 min (77.4 %),mlz(APCI) 388 (M+H)<+>.

Korak 2: Amid 4- bromo- tiofen- 2- karboksilne kiseline

Mešavina 4 bromo-tiofen-2-karboksilne kiseline (2.0 g, 9.66 mmol), l-etil-3-(3'-dimetilaminopropil)karbodiimid hidrohlorida (2.04 g, 10.63 mmol) i 1-hidroksibenzotriazol hidrata (1.44 g, 10.63 mmol) u DMF (20 mL) je mešana na sobnoj temperaturi tokom 2 časa. Reakciona mešavina je tada ohlađena do 0° C pa je dodan vodeni NH3(1 mL, 17.3 mmol). Mešavina je mešana na sobnoj temperaturi tokom dodatnih 5 časova, a tada je dodana voda u reakcionu mešavinu, a nastao precipitat je sakupljen uz pomoć filtracije i opran sa 1 M NaOH, H2O i petroleum eterom. Jedinjenje iz naslova je izolovano u formi bele tvrde materije (1.56 g, 78 %).

Korak 3: Amid 4-( 4, 4, 5, 5- tetrametil-[ l, 3, 2] dioksaborolan- 2- il)- tiofen- 2- karboksilne kiseline

Amid 4-bromo-tiofen-2-karboksilne kiseline (1.3 g, 6.34 mmol), bis(pinakolato)diboron (3.22 g, 12.7 mmol), PdCl2dppf (0.26 g, 0.318 mol) i KOAc (1.87 g, 19.10 mmol) su suspendovani u dioksanu (20 mL), pročišćeni sa azotom tokom 5 min, a tada je sve grejano na 90° C preko noći. Rastvarač je odstranjenin vacuo,a ostatak je podeljen među etil acetata i vode. Vodeni sloj je ekstrahovan tri puta sa etil acetatom, a spojene organske faze su oprane sa slanim rastvorom, filtrirane kroz MgSC»4 i isparene. Produkt iz naslova je kristalizovan iz EtOAc-petroleum etera (2.135 g, 77 % čistoća preko LCMS).

Korak 4: Amid 4-{ 8-[ 4-( 4- metil- piperazin- l- il)- fenilamino]-[ 1. 2. 4] triazolo[ 1. 5- a] pirazin- 5- il}-

tiofen- 2- karboksilne kiseline

Suspenzija 5-bromo-[l ,2,4]triazolo[ 1,5-a]pirazin-8-il)-[4-(4-metil-piperazin-1 -il)-fenil]-amina (100 mg, 258 mmol), amida 4-(4,4,5,5-tetrametil-[l,3,2]dioksa-borolan-2-il)-tiofen-2-karboksilne kiseline (130 mg, 516 mmol) i Pd(PPh3)4(74 mg, 64.5 mmol) u vodenom Na2C03(1.37 mL, 1.5 M, 2.06 mmol) i DMF/dioksanu 2/1 (2.75 mL) je degazirana tokom 5 min u reakcionoj tubi. Tuba je zapečaćena, a reakciona mešavina je grejana na 90° C tokom noći. Nakon hlađenja do sobne temperature, reakciona mešavina je podeljena među etil acetata i vode. Precipitat je sakupljen uz pomoć filtracije i opran sa vodom (1 x) i eterom (2 x) i osušenin vacuo.Grubi produkt je pročišćen uz pomoć kolonske hromatografije (silika gel, DCM/MeOH/NH396:4) šta dovodi do nastanka jedinjenja iz naslova (43 mg) u formi žute tvrde materije. 'H-NMR (400 MHz, de-DMSO) 5(ppm) 2.26 (3H, s), 2.50 (4H, m), 3.15 (4H, m,), 6.99

(2H, d), 7.60 (IH, br s), 7.88 (2H, d), 8.10 (2H, m), 8.48 (IH, s), 8.66 (IH, s), 8.79 (IH, s), 9.97 (IH, br s). LCMS: Rt 1.99 min (97.6 %),mlz(APCI) 435 (M+H)<+>.

Jedinjenje 9: Amid 5-{8-[4-(4-metil-piperazin-l-il)-fenilamino]-[l,2,4]triazolo[l,5-a] pirazin-5-il}-tiofen-2-karboksi!ne kiseline

Korak 1: Amid 5- bromo- tiofen- 2- karboksilne kiseline

Rastvor 5-bromo-tiofen-2-karboksilne kiseline (4.51 g, 21.78 mmol), 3-hidroksibenzotriazol hidrata (3.24 g, 23.96 mmol), l-etil-3-(3'-dimetilaminopropil)karbodiimida (4.6 g, 23.96 mmol) u DMF (70 mL) je mešan na sobnoj temperaturi tokom 2 časa. Reakciona mešavina je tada ohlađena do 0° C pa je dodan 35 % vodeni rastvor NH3(2.2 mL). Mešavina je mešana na sobnoj temperaturi tokom noći. Rastvarač je odstranjenin vacuo,a ostatak je rastvoren u EtOAc, opran sa 1 N NaHCC>3 i sa slanim rastvorom. Organski slojevi su spojeni, sušeni preko MgS04, filtrirani i koncentrisani sa ciljem da se dobije jedinjenje iz naslova (3.78 g, 84 %). HPLC (254 nm): Rt 2.46 min (96.5%).

Korak2: Amid5-( 4, 4, 5, 5- tetrametil-[ l, 3, 2] dioksaborolan- 2- il)- tiofen- 2- karboksilne kiseline

Amid 5-bromo-tiofen-2-karboksilne kiseline (0.5 g, 2.426 mmol), bis(pinakolato)diboron (678 mg, 2.669 mmol), PdCl2dppf (59 mg, 0.072 mmol) i KOAc (0.714 g, 7.28 mmol) su suspendovani u dioksanu (5mL), pročišćeni sa azotom tokom 5 min, a tada su grejani na 85° C preko noći. Rastvarač je odstranjenin vacuo,a ostatak je podeljen među etil acetata i vode. Vodeni sloj je ponovo ekstrahovan sa etil acetatom, a spojene organske faze su oprane sa slanim rastvorom, filtrirane kroz MgS04i isparenein vacuosa ciljem da se dobije jedinjenje iz naslova (417 mg, 68 %).

Korak 3: Amid 5-{ 8-[ 4-( 4- metil- piperazin- l- il)- fenilamino]-[ l, 2, 4] triazolo[ l, 5- a] pirazin- 5- il}-

tiofen- 2- kar boks Une kiseline

Ovo jedinjenje može da se priredi uz pomoć metoda koje su opisane za pripremu Jedinjenja 6, korak 4 uz upotrebu 5-bromo-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-8-il)-[4-(4-metil-piperazin-l-il)-fenil]-amina (100 mg, 0.258 mmol), amida 5-(4,4,5,5-tetrametil-[l,3,2]dioksa-borolan-2-il)-tiofen-2-karboksilne kiseline (130 mg, 0.516 mmol) i Pd(PPh3)4(74 mg, 0.0645 mmol) u vodenom 1.5 M rastvoru Na2C03(1.37 mL, 2.06 mmol) i dioksanu (2.75 mL). Nakon isparavanja rastvarača, ostatak se purifikuje uz pomoć silika gela preko kolonske hromatografije uz eluciju sa 96:6 DCM:NH3(7 M u MeOH) sa ciljem da se dobije jedinjenje iz naslova (23 mg, 21 %). LCMS: Rt 1.94 min (97.9 %). 'H-NMR (400 MHz, d6-DMSO) 8(ppm) 2.26 (3H, s), 2.49 (4H, m), 3.14 (4H, m), 6.98 (2H, d), 7.51 (IH, br s), 7.85-7.89 (2H, m), 8.03 (2H, d), 8.10 (IH, br s), 8.38 (IH, s), 8.82 (IH, s), 10.10 (IH, s). LCMS: Rt 1.94 min, (97.9%),mlz(APCI) 435 (M+H)<+>.

Jedinjenje12:5-(5-Metil-lH-pirazol-4-il)-N-(4-morfolinofenil)-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-8-amin

Ovo jedinjenje može da se pripremi uz pomoć metoda koje su opisane za pripremu Jedinjenja 6, korak 4 uz upotrebu (5-bromo-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-8-il)-(4-morfolin-4-il-fenil)-amina (0.2 g, 0.53 mmol), 5-metil-4-(4,4,5,5-tetrametil-[l,3,2]dioksaborolan-2-il)-lH-pirazola (222 mg, 1.06 mmol) i Pd(PPh3)4(0.154 mg, 0.134 mmol) u 1.5 M Na2C03(vodeni rastvor) (2.84 mL, 4.26 mmol) i dioksanu (8.5 mL). Reakciona mešavina se purifikuje preko silika gela na kolonskoj hromatografiji uz upotrebu 98:2 i 97:3 DCM:NH3(7 M u MeOH) sa ciljem da se dobije jedinjenje iz naslova (15 mg, 7.5 %). Koncentrisanje soli mesilata uz upotrebu 0.1 M metansulfonične kiseline u MeOH (0.398 mL) dovodi do nastanka jedinjenja (15 mg) u formi zelene tvrde materije.<!>H-NMR (400 MHz, d6-DMSO) 8(ppm) 2.41 (3H, s, MsOH), 2.46 (3H, s), 3.20 (4H, m), 3.71 (4H, m), 7.11 (2H, d), 7.74 (IH, s), 7.97 (2H, d), 8.15 (IH, s), 8.69 (IH, s), 9.88 (IH, s). LCMS: Rt 2.41 min (98.3%),mlz(APCI) 377 (M+H)<+>.

Jedinjenje 15: Amid 4-[8-(4-morfoIin-4-il-fenilamino)-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-5-il]-tiofen-2-karboksilne kiseline

Ovo jedinjenje može da bude pripremljeno uz pomoć metoda koje su opisane za pripremu Jedinjenja 6, korak 4 uz upotrebu (5-bromo-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-8-il)-(4-morfolin-4-ilfenil)-amina (0.2 g, 0.53 mmol), amida 4-(4,4,5,5-tetrametil-[l,3,2]dioksaborolan-2-il)-tiofen-2-karboksilne kiseline (0.27 mg, 1.06 mmol) i Pd(PPh3)4(0.15 mg, 0.133 mmol) u 1.5 M Na2C03(vodeni rastvor) (2.84 mL, 4.26 mmol) i dioksanu (10 mL). Reakciona mešavina je podeljena među vode i etil acetata. Nastaje precipitat, koji se sakuplja uz pomoć silika gela na kolonskoj hromatografiji uz eluciju sa 95:5 DCM.MeOH sa ciljem nastajanja jedinjenja iz naslova (84.1 mg, 37.4 %). 'H-NMR (400 MHz, d6-DMSO) 8(ppm) 3.13 (4H, m), 3.79 (4H, m), 7.01 (2H, d), 7.60 (IH, br s), 7.91 (2H, d), 8.10 (2H, s), 8.48 (IH, s), 8.66 (IH, s), 8.79 (IH, s), 9.96 (IH, s). LCMS: Rt 2.61 min (97.1%),mlz(APCI) 422 (M+H)<+>.

Jedinjenje 16: 5-(5-Metil-lH-pirazol-4-iI)-N-(4-(4-metilpiperazin-l-il)fenil)-[ 1,2,4]triazolo

[l,5-a]pirazin-8-amin

Korak 1: 5- Metil- 4-( 4, 4, 5, 5- tetrametil-[ l, 3, 2] dioksaborolan- 2- il)- lH- pirazol

Ovo jedinjenje može da se priredi uz pomoć metoda koje su opisane kod priređivanja Jedinjenja 86, korak 2 uz upotrebu 4-bromo-5-metil-lH-pirazola (3 g, 18.6 mmol), bis(pinakolato)diborona (8.52 g, 33.5 mmol), PdCl2dppf (913 mg, 1.118 mmol) i KOAc (5.49 mg, 55.9 mmol) u dimetilsulfoksidu (30 mL). Reakciona mešavina je purifikovana na silika gelu uz pomoć kolonske hromatografije uz eluciju sa 7:3, a nakon toga sa 1:1 petroleum etenetil acetatom sa ciljem da se dobije 5-metil-4-(4,4,5,5-tetrametil-[l,3,2]dioksaborolan-2-il)-lH-pirazol (3.87 g, 100 %).

Korak 2: 5-( 5- Metil- lH- pirazol- 4- il)- N-( 4-( 4- metilpiperazin- l- il) fenil)-[ l^

aJpirazin- 8- amin

Ovo jedinjenje može da se dobije uz pomoć metoda koje su prikazane kod dobijanja Jedinjenja 6, korak 4 uz upotrebu (5-bromo-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-8-il)-[4-(4-metil-piperazin-l-il)-fenil]-amina (132 mg, 0.340 mmol), 5-metil-4-(4,4,5,5-tetrametil-[l,3,2]dioksaborolan-2-il)-lH-pirazola (141 mg, 0.68 mmol), Pd(PPh3)4(98 mg, 0.085 mmol) i 1.5 N Na2C03(1.81 mL, 2.72 mmol) u dioksanu (5.4 mL). Grubi produkt je purifikovan sa silika gelom na kolonskoj hromatografiji uz eluciju sa 95:5 DCM:NH3(7 M u MeOH), a nakon toga je smrvljen u dietil eteru i petroleum eteru sa ciljem da se dobije jedinjenje iz naslova (9 mg, 7 %) u formi bledo zelene tvrde materije. 'H-NMR (400 MHz, de-DMSO) 5(ppm) 2.27 (3H, s), 2.38-2.49 (7H, m), 3.14 (4H, m), 6.97 (2H, d), 7.70 (IH, s), 7.88 (2H, d), 7.99 i 8.43 (IH, br s), 8.68 (IH, s), 9.71 (IH, s), 12.92 i 12.98 (IH, brs).

Konzervisanje u mesilatnu su uz upotrebu 0.1 M metan sulfonske kiseline (0.231 mL) dovodi do ciljnog jedinjenja (11 mg). LCMS: Rt 1.78 min (86%),mlz(APCI) 390 (M+H)<+>.

Jedinjenje 17: -(3-FIuoro-4-morfolinofenil)-5-(lH-pirazol-4-il)-[l,2,4]triazolo[l,5-alpirazin-8-amin

Korak 1: ( 5- Bromo-[ 1, 2, 4Jtriazolof1, 5- a] pirazin- 8- il)-( 3- fluoro- 4- morfolin- 4- il- fenil)- amin

Ovo jedinjenje može da se dobije uz pomoć metoda koje su prikazane kod dobijanja Jedinjenja 6, korak 1 uz upotrebu 5,8-dibromo-[l,2,4]tirazolo[l,5-a]pirazina (0.5 g, 1.799 mmol), 3-fiuoro-4-morfolin-4-il-fenilamina (0.53 g, 2.70 mmol) i DIPEA (0.470 mL, 2.70 mmol) u 2-propanolu (6 mL). Reakciona mešavina je podeljena među 10 % vodenog rastvora limunske kiseline i DCM. Organska faza je odvojena i oprana sa vodom i slanim rastvorom, osušena preko MgS04, filtrirana i koncentrisana pod vakumom sa ciljem da se dobije jedinjenje iz naslova (697 mg, 98 %) koje se koristi u sledećem koraku bez dodatne purifikacije. LCMS: Rt 3.52 min (98.2%).

Korak 2: N-( 3- Fl uoro- 4- morfolinofenil)- 5-( 1 H- pirazol- 4- il)-[ 1, 2, 4Jtriazolof1, 5- aJpirazin- 8-amin

Ovo jedinjenje može da se dobije uz pomoć metoda koje su prikazane kod dobijanja Jedinjenja 6, korak 4, uz upotrebu (5-bromo-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-8-il)-(3-fluoro-4-morfolin-4-ilfenil)-amina (100 mg, 0.254 mmol), 4-(4,4,5,5-tetrametil-[l,3,2]dioksaborolan-2-il)-lH-pirazola (99 mg, 0.51 mmol) i Pd(PPh3)4(73 mg, 0.063 mmol) u 1.5 M Na2C03(1.36 mL, 2.03 mmol) i dioksanu (4 mL). Grubi materijal je purifikovan na silika gelu uz pomoć kolonske hromatografije uz eluciju sa 98:2 DCM:NH3(7 M u MeOH) i uz pomoć mrvljenja sa dietil eterom i petroleum eterom sa ciljem da se dobije jedinjenje iz naslova (43 mg, 44 %). 'H-NMR (400 MHz, d6-DMSO) 8(ppm) 3.01 (4H, m), 3.79 (4H, m), 7.08 (IH, t), 7.79 (IH, d), 8.06 (IH, d), 8.26 (IH, s), 8.38 (IH, s), 8.67 (IH, s), 8.79 (IH, s), 10.03 (IH, s), 13.3 (IH, br s). LCMS: Rt 2.83 min (99%),mlz(APCI) 381 (M+H)<+.>

Jedinjenje 19: 5-(5-(lH-Pirazol-4-il)-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-8-ilamino)-2-

morfolinobenzamid

Korak 1: 5-( 5- Bromo-[ l, 2, 4] triazolo[ l, 5- a] pirazin- 8- ilamino)- l- morfolin- 4- il- benzamid

Ovo jedinjenje može da se dobije uz pomoć metoda koje su prikazane kod dobijanja Jedinjenja 6, korak 1 uz upotrebu 5,8-dibromo-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazina (250 mg, 0.90 mmol) 5-amino-2-morfolin-4-il benzamida (299 mg, 1.35 mmol) i A^^/V-diizopropiletilamina (0.24 mL, 1.35 mmol) u 2-propanolu (7 mL). Trituracija sa 'PrOH i Et20 dovodi do jedinjenja iz naslova (273 mg, 73 %).

Korak 2: 5-( 5-( lH- Pirazol- 4- il)-[ l, 2, 4] triazolo[ l, 5- a] pirazin- 8- ilamino)- l- morfolinobenzamid

Ovo jedinjenje može da se dobije uz pomoć metoda koje su prikazane kod dobijanja Jedinjenja 6, korak 4 uz upotrebu 5-(5-bromo-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-8-ilamino)-2-morfolin-4-il-benzamida (140 mg, 0.33 mmol), 4-(4,4,5,5-tetrametil-[l,3,2]dioksaborolan-2-il)-lH-pirazola (130 mg, 0.67 mmol) i Pd(PPh3)4, (96 mg, 0.083 mmol) u 1.5 M K2C03(vodeni rastvor) (1.93 mL) i dioksanu (3.44 mL). Grubi materijal je purifikovan na silika gelu uz pomoć kolonske hromatografije uz eluciju sa DCM, a nakon toga sa 99:1, pa sa 97:3, pa sa 95:5 DCM:NH3(7 M u MeOH) sa ciljem da se dobije jedinjenje iz naslova u formi bele tvrde materije (40.5 mg, 30 %). 'H-NMR (400 MHz, d6-DMSO) 8(ppm) 2.96 (4H, m), 3.79 (4H, m), 7.28 (2H, d), 7.45 (IH, m), 7.54 (IH, br s), 8.01-8.09 (IH, dd), 8.25 (IH, s), 8.50 (IH, d), 8.69 (IH, br s), 8.78 (IH, s), 9.98 (IH, s), 13.3 (111, br s). LCMS: Rt 2.23 min (96.9%),mlz(APCI) 406 (M+H)<+>.

Jedinjenje 21: 4-(8-(4-(2-Morfolinoetoksi)fenilamino)-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-5-

il)tiofen-2-karboksamid

Ovo jedinjenje može da se dobije uz pomoć metoda koje su prikazane kod dobijanja Jedinjenja 6, korak 4, uz upotrebu (5-bromo-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-8-il)-[4-(2-morfolin-4-il-etoksi)-fenil]-amina (113 mg, 0.27 mmol), 4-(4,4,5,5-tetrametil-[l,3,2]dioksaborolan-2-il)-tiofen-2-karboksamida (136 mg, 0.537 mmol) i Pd(PPh3)4(78 mg, 0.067 mmol) u 1.5 M Na2C03(1.44 mL, 2.16 mmol) i dioksanu (4.3 mL). Reakciona mešavina je purifikovana preko silika gela uz pomoć kolonske hromatografije uz eluciju sa 97:3 DCM:NH3(7 M u MeOH) sa ciljem da se dobije jedinjenje iz naslova (65 mg, 52 %). LCMS: Rt 1.98 min (98.9%). Konzervisanje u mesilatnu so uz upotrebu 0.1 M metansulfonske kiseline u MeOH (1.1385 mL) dovodi do jedinjenja iz nalova (50 mg, 95 %).<!>H-NMR (400 MHz, oVDMSO) 5(ppm) 2.37 (3H, s, MsOH), 3.21-3.64 (6H, m), 3.76 (2H, t), 4.05 (2H, d), 4.40 (2H, m), 7.09 (2H, d), 7.61 (IH, br s), 8.02 (2H, d), 8.11 (2H, s), 8.48 (IH, s), 8.67 (IH, s), 8.82 (IH, s), 9.91 (IH, br s), 10.09 (IH, s). LCMS: Rt 1.98 min (97.7%),mlz(APCI) 466 (M+H)<+>.

Jedinj enje 22: 5-(8-(4-(2-Morfolinoetoksi)fenilamino)-[ 1,2,4] triazolo [ 1,5-a] pirazin-5-

il)tiofen-2-karboksamid

Ovo jedinjenje može da se dobije uz pomoć metoda koje su prikazane kod dobijanja Jedinjenja 6, korak 4, uz upotrebu (5-bromo-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-8-il)-[4-(2-morfolin-4-il-etoksi)-fenil]-amina (118 mg, 0.28 mmol), 5-(4,4,5,5-tetrametil-[l,3,2]dioksaborolan-2-il)-tiofen-2-karboksamida (142 mg, 0.56 mmol) i Pd(PPh3)4(81 mg, 0.07 mmol) u 1.5 M Na2C03(1.5 mL, 2.24 mmol) i dioksanu (4.5 mL). Reakciona mešavina je purifikovana preko silika gela uz pomoć kolonske hromatografije uz eluciju sa 97:3 DCM:NH3(7 M u MeOH) sa ciljem da se dobije jedinjenje iz naslova (33 mg, 25 %). LCMS: Rt 2.66 min (99%). Konzervisanje u mesilatnu so uz upotrebu 0.1 M metansulfonske kiseline u MeOH (0.569 mL) dovodi do jedinjenja iz naslova (24 mg, 86 %).<*>H-NMR (400 MHz, oVDMSO) 5(ppm) 2.37 (3H, s, MsOH), 3.25 (2H, m), 3.50-3.64 (4H, m), 3.76 (2H, t), 4.05 (2H, d), 4.40 (2H, m), 7.09 (2H, d), 7.51 (IH, br s), 7.87 (IH, d), 7.99-8.05 (3H, m), 8.11 (IH, br s), 8.37 (IH, s), 8.84 (IH, s), 9.92 (IH, br s), 10.21 (IH, s). LCMS: Rt 1.95 min (98.8%),mlz(APCI) 466 (M+H)<+>.

Jedinjenje 23: (4-MorfoIin-4-il-fenii)-[5-(2H-pirazol-3-iI)-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-8-il]-amin

Korak 1: l-( Tetrahidro- piran- 2- il)- lH- pirazol

ifl-Pirazol (14.3 g, 0.21 mol) je rastvoren u 3,4-dihidro-2H-piranu (26.74 g, 0.32 mol) u prisutnosti katalitičke količine TFA (0.1 mL, 1.3 mmol). Reakciona mešavina je mešana na 95° C tokom 5 časova, ohlađena i tada je ugašena sa NaH (0.2 g, 5 mmol). Rastvarač je odstranjen sa ciljem da nastane jedinjenje iz naslova u formi kafenog ulja (33.3 g, 99 %), koje se koristi u sledećem koraku bez dodatne purifikacije.

Korak 2: lH- Pirazol- 2- boronična kiselina

U hladni rastvor (-78° C) l-(tetrahidro-piran-2-il)-lH-pirazola (7.6 g, 52 mmol) u THF (50 mL), dodani su «BuLi (33 mL, 2.5 M u heksanu, 82.5 mmol) i triizopropil boran (12.7 mL, 55 mmol) kap po kap uz održavanje temperature na -70° C. Reakciona mešavina je mešana na -70° C tokom jednog časa, a tada je ostavljena da dostigne temperaturu sobe tokom 4 časa. Nakon gašenja reakcije sa 2 M HC1, rastvarač je odstranjenin vacuo,a pH je podešen do 6 uz upotrebu 1 M NaOH. Nastaje precipitat, koji se sakuplja uz pomoć filtracije i pere sa toluenom i petroleum eterom. Trituracija sa etil acetatom dovodi do ciljnog jedinjenja u formi bele tvrde materije (2.7 g, 48 %), koje se koristi u sledećem koraku bez dodatne purifikacije.

Korak 3: ( 4- Morfolin- 4- il- fenil)-[ 5-( 2H- pirazol- 3- il)-[ l, 2, 4Jtriazolofl, 5- a] pirazin- 8- il]- amin

Ovo jedinjenje može da se dobije uz pomoć metoda koje su prikazane kod dobijanja Jedinjenja 6, korak 4, uz upotrebu 5-bromo-[l,2,4]tirazolo[l,5-a]pirazin-8-il)-[4-(morfolin-4-il)-fenil]-amina (100 mg, 0.267 mmol), lH-pirazol-2-boronične kiseline (60 mg, 0.535 mmol), Pd(PPh3)4(93 mg, 0.08 mmol) i Na2C03(88 mg, 0.80 mmol) u DMF (2 mL). Reakciona mešavina je ostavljena u parnoj tubi i mešana na 100° C tokom 18 časova. Nakon hlađenja, mešavina je razređena sa rastvorom NaHC03i ekstrahovana sa EtOAc (4x). Organski sloj je opran sa vodom, osušen preko MgS04, filtriran i isparen sa ciljem da se dobije grubi produkt koji se purifikuje na silika gelu uz pomoć kolonske hromatografije uz eluciju sa DCM, a nakon toga sa 96:4 DCM:NH3(7 M u MeOH). Jedinjenje iz naslova je izolovano nakon trituracije sa dietil eterom (12.4 mg, 13 %). Konzervisanje u mesilatnu so uz pomoć 0.1 M metansulfonske kiseline (0.342 mL, 0.0342 mmol) daje ciljno jedinjenje (10 mg, 81 %).<*>H-NMR (400 MHz, oVDMSO) 8(ppm) 2.34 (3H, s, MsOH), 3.14 (4H, m), 3.81 (4H, m), 7.04 (2H, d), 7.27 (IH, m), 7.92 (3H, m), 8.24 (IH, s), 8.76 (IH, s), 9.92 (IH, s). LCMS: Rt 2.45 min (97.6%),mlz(APCI) 363 (M+H)<+>.

Jedinjenje 28: 4-(8-(4-(4-Izopropilpiperazin-l-il)fenilamino)-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-5-

il)tiofen-2-karboksamid

Ovo jedinjenje može da se dobije uz pomoć metoda koje su prikazane kod dobijanja Jedinjenja 6, korak 4, uz upotrebu 5-bromo-7V-(6-(4-izopropilpiperazin-l-il)piridin-3-il)-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-8-amina (100 mg, 0.24 mmol), 4-(4,4,5,5-tetrametil-[l,3,2]dioksaborolan-2-il)-tiofen-2-karboksamida (121 mg, 0.48 mmol) i Pd(PPh3)4(69 mg, 0.059 mmol) u 1.5 M Na2C03(1.28 mL, 1.92 mmol) i dioksanu (3.84 mL). Grubi produkt je purifikovan na silika gelu uz pomoć kolonske hromatografije uz eluciju sa DCM i 97:3 DCM:NH3(7 M u MeOH) sa ciljem da se dobije jedinjenje iz naslova (68 mg, 61 %) u formi bledo zelene tvrde materije. Konzervisanje u mesilatnu so uz upotrebu 0.1 M metansulfonske kiseline u MeOH (1.47 mL, 0.147 mmol), a nakon toga uz pomoć tirturacije sa DCM i dietil eterom dovodi do jedinjenja iz naslova (67 mg, 98.5 %).<l>H-NMR (400 MHz, d6-DMSO) 8(ppm) 1.35 (6H, d), 2.34 (3H, s, MsOH), 3.00 (2H, t), 3.22-3.25 (2H, m), 3.56-3.61 (3H, m), 3.89 (2H, d), 7.09 (2H, d), 7.60 (IH, br s), 7.97 (2H, d), 8.10 (2H, s), 8.48 (IH, s), 8.67 (IH, s), 8.81 (IH, s), 9.23 (IH, br s), 10.03 (IH, s). LCMS: Rt 2.13 min (98.4%),mlz(APCI) 463 (M+H)<+>.

Jedinjenje 29:5-( 8-( 4- Morfolinofenilamino)-[ l, 2, 4Jtriazolo[ l, S- a] pirazin- S4l) furan- 3-

karboksamid

Korak 1: Tert- butil ester [ 5-( 4- karbamoil- furan- l- il)-[ l, 2, 4] triazolo[ l, 5- a] pirazin- 8- il]-( 4-

morfolin- 4- il- fenil)- karbamične kiseline

Ovo jedinjenje može da se dobije uz pomoć metoda koje su prikazane kod dobijanja Jedinjenja 35, korak 3 uz upotrebu terr-butil estera (4-morfolin-4-il-fenil)-(5-tributilstannanil-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-8-il)-karbamične kiseline (137 mg, 0.199 mmol), 5-bromo-furan-3-karboksamida (76 mg, 0.4 mmol) i Pd(PPh3)4(23 mg, 0.020 mmol) u DMF (1 mL). Purifikacija reakcione mešavine uz eluciju sa 98:2 DCM:MeOH i sa 96:4 DCM:NH3(7 M u MeOH) dovodi do jedinjenja iz naslova (33 mg, 33 %).

Korak 2: 5-( 8-( 4- Morfolinofenilamino)-[ 1, 2, 4] triazolo[ 1, 5- a] pirazin- 5- il) furan- 3- karboksamid

Rastvorterr-butilestera [5-(4-karbamoil-ruran-2-il)-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-8-il]-(4-morfolin-4-il-fenil)-karbamoične kiseline (33 mg, 0.065 mmol) u mešavini 1:1 DCM:TFA (2 mL) (2 kapi vode) je mešan na sobnoj temperaturi tokom 2 časa. Nakon dodavanja zasićenog rastvora Na2CC>3 nastaje precipitat koji je sakupljen uz pomoć filtracije i opran sa vodom, dietil eterom i petroleum eterom. Nakon sušenja pod vakumom, izolovano je jedinjenje iz naslova (20 mg, 76 %). Konzervisanje u mesilatnu so uz upotrebu 0.1 M metansulfonske kiseline u MeOH (0.444 mL) dovodi do jedinjenja iz naslova (19 mg, 100 %). 'H-NMR (400 MHz, oVDMSO) 5(ppm) 2.36 (3H, s, MsOH), 3.22 (4H, m), 3.82-3.89 (4H, m), 7.13 (2H, d), 7.36 (IH, br s), 7.86 (IH, s), 7.95 (3H, m), 8.17 (IH, s), 8.40 (IH, s), 8.84 (IH, s), 10.17 (IH, s). LCMS: Rt 2.60 min (96.9%),mlz(APCI) 406 (M+H)<+>.

Jedinjenje 33: 5-(8-(4-MorfoIinofenilamino)-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-5-il)izoindolin-l-on

Ovo jedinjenje može da se dobije uz pomoć metoda koje su prikazane kod dobijanja Jedinjenja 6, korak 4 uz upotrebu (5-bromo-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-8-il)-(4-morfolin-4-il-fenil)-amina (1.0 g, 2.67 mmol), 5-(4,4,5,5-tetrametil-[l,3,2]dioksaborolan-2-il)-2,3-dihidro-izoindol-l-on (vidi opis za Jedinjenje 79) (1.03 g, 4.01 mmol) i Pd(PPh3)4(0.77 g, 0.67 mmol) u 1.5 M Na2C03

(14.3 mL) i dioksanu (40 mL). Purifikacija na silika gelu uz pomoć kolonske hromatografije uz eluciju sa DCM, a nakon toga sa 96:4 DCM:NH3(7 M u MeOH) dovodi do jedinjenja iz naslova (0.895 g, 79 %). 'H-NMR (400 MHz, d6-DMSO) 8(ppm) 3.12 (4H, m), 3.79 (4H, m), 4.51 (2H, s), 7.01 (2H, d), 7.84 (IH, d), 7.92 (2H, d), 8.01 (IH, s), 8.09 (IH, d), 8.23 (IH, s), 8.72 (IH, s), 8.73 (IH, s), 10.02 (IH, s). LCMS: Rt 2.51 min (97.8%),mlz(APCI) 428 (M+H)<+.>

Jedinjenje 34: 4-(8-(4-Morfolinofenilamino)-[l^,4]triazolo[l,5-a]pirazin-5-iI)furan-2-

karboksamid

Ovo jedinjenje može da se dobije uz pomoć metoda koje su prikazane kod dobijanja Jedinjenja 6, korak 4, uz upotrebu (5-bromo-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-8-il)-(4-morfolin-4-il-fenil)-amina (78 mg, 0.16 mmol), amida 4-(4,4,5,5-tetrametil-[l,3,2]dioksaborolan-2-il)-furan-2-karboksilne kiseline (100 mg, 0.34 mmol) i Pd(PPh3)4(60 mg, 0.052 mmol) u 1.5 M Na2C03(vodeni rastvor)

(1.1 mL, 1.68 mmol) i dioksanu (3 mL). Reakciona mešavina je podeljena među vode i etil acetata, a jedinjenje iz naslova precipituje pa je sakupljeno uz pomoć filtracije. Purifikacija tvrde materije na silika gelu uz pomoć kolonske hromatografije uz eluciju sa DCM i 95:5 DCM:NH3(7 M u MeOH) dovodi do jedinjenja iz naslova (42 mg, 65 %). Konzervisanje u mesilatnu so uz upotrebu 0.1 M metansulfonske kiseline (0.82 mL) daje tvrdu materiju koja je smrvljena sa dietil eterom sa ciljem da se dobije jedinjenje iz naslova (30.5 mg).<J>H-NMR (400 MHz, d6-DMSO) 6(ppm) 2.19 (3H, s, MsOH), 3.03-3.07 (4H, m), 3.67 (4H, m), 6.99 (2H, br s), 7.43 (IH, d), 7.74-7.82 (4H, m), 8.06 (IH, br s), 8.59 (IH, br s), 8.64 (IH, s), 9.91 (IH, br s). LCMS: Rt 2.64 min (98.1%),mlz(APCI) 406 (M+H)<+.>

Jedinjenje 35: 6-(8-(4-Morfolinofenilamino)-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-5-iI)-3,4-

dihidroizokinolin-l (2H)-on

Korak 1: Tert- butil ester ( 5- bromo- fl, 2JJtriazolo[ l, 5- aJpirazin- 8- il)-( 4- morfolin- 4- il- fe^

karbamične kiseline

Rastvor 5-bromo-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-8-il)-[4-(morfolin-4-il)-fenil]-amina (300 mg, 0.800 mmol), dimetilaminopiridina (10 mg, 0.08 mmol) idi- tertbutil dikarbonata (523 mg, 2.4 mmol) u dihlorometanu (5 ml) se meša na 50° C tokom noći. Reakciona mešavina je podeljena među DCM i vode, a organski sloj je opran sa 1 N NaOH i slanim rastvorom. Organski sloj je osušen preko MgS04, filtriran i koncentrisanin vacuosa ciljem da se dobije grubo jedinjenje koje se purifikuje na silika gelu uz pomoć kolonske hromatografije. Elucija sa 98:2 DCM:MeOH dovodi do jedinjenje iz naslova (352 mg, 93 %). LCMS: Rt 3.45 min (97.8%).

Korak 2: Tert- butil ester ( 4- morfolin- 4- il- fenil)-( 5- tributilstannanil-[ l, 2, 4] triazolo[ l, 5-a] pirazin- 8- il)- karbamične kiseline

U ohlađeni (-78° C) rastvortert-butilestera (5-bromo-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-8-il)-(4-morfolin-4-il-fenil)-karbamične kiseline (370 mg, 0.78 mmol) u THF (12 mL) dodan je 2 M izopropilmagnezijum hlorid u THF (0.78 mL, 1.56 mmol), a nakon 5 min mešanja, tributiltin hlorid (0.42, 1.56 mmol). Reakciona mešavina je mešana na -78° C tokom 15 min pa na sobnoj temperaturi tokom dodatnih 15 min. Nakon odstranjivanja rastvarača, ostatak je purifikovan na silika gelu uz pomoć kolonske hromatografije uz eluciju sa 5:1 petroleum etenetil acetatom, a nakon toga sa 1:1 petroleum etenetil acetatom. Jedinjenje iz naslova je izolovano (105 mg, 20<%>)<.>

Korak 3: Tert- butil ester ( 4- morfolin- 4- il- fenil)-[ 5-( l- okso- l, 2, 3, 4- tetrahidro- izokinolin- 6- il)-[ 1, 2, 4] triazolo[ l. 5- a] pirazin- 8- il]- karbamične kiseline

U degazirani rastvortert-butilestera (4-morfolin-4-il-fenil)-(5-tributilstannanil-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-8-il)-karbamične kiseline (100 mg, 0.15 mmol) i 6-bromo-3,4-dihidro-2H-izokinolin-l-on u DMF (1 mL) je dodan tetrakis(trifenilfosfin)paladijum(0) (17 mg, 0.015 mmol), a reakciona mešavina je mešana na 90° C tokom noći. Nakon odstranjivanja rastvaračain vacuo,ostatak je purifikovan na silika gelu uz pomoć kolonske hromatografije. Elucija sa 1:1 petroleum etenetil acetatom i etil acetatom dovodi do ciljnog jedinjenja u formi žute tvrde materije (30 mg, 37 %).

Korak 4: 6-[ 8-( 4- Morfolin- 4- il- fenilamino)-[ 1, 2, 4] triazolo[ l, 5- a] pirazin- 5- il]- 3, 4- dihidro- 2H-izokinolin- l- on

Rastvor tert-butil estera (4-morfolin-4-il-fenil)-[5-(l-okso-l,2,3,4-tetrahidro-izokinolin-6-il)-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-8-il]-karbamične kiseline (30 mg, 0.055 mmol) u mešavini 1:1 TFA:DCM (1 kap H2O) je mešan na sobnoj temperaturi tokom 2 časa. Rastvarač je odstranjenin vacuo,a ostatak je podeljen među etil acetatom i zasićenim NaHCC>3 (vodeni rastvor). Vodeni sloj je ekstrahiran sa etil acetatom (2 x). Organski slojevi su spojeni i ispareni sa ciljem nastajanja ostatka koji je purifikovan na silika gelu uz pomoć kolonske hromatografije uz eluciju sa etil acetatom. Jedinjenje iz naslova je izolovano (18 mg, 75 %) i konvertovano u mesilatnu so (16.6 mg, 97 %) uz upotrebu 0.1 M metansulfonske kiseline (0.317 mL) u MeOH.

'H-NMR (400 MHz, d6-DMSO) 5(ppm) 2.36 (3H, s MsOH), 3.04 (2H, t), 3.21 (4H, m), 3.47 (2H, t), 3.83 (4H, m), 7.11 (2H, d), 7.95-8.02 (6H, m), 8.05 (IH, s), 8.74 (IH, s), 10.09 (IH, br s). LCMS: Rt 2.81 min (97.9%),mlz(APCI) 442 (M+H)<+>.

Jedinjenje 36: 5-(8-(4-(4-IzopropiIpiperazin-l-il)fenilamino)-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-5-

iI)izoindolin-1 -on

Ovo jedinjenje može da se dobije uz pomoć metoda koje su prikazane kod dobijanja Jedinjenja 6, korak 4 uz upotrebu 5-bromo-A'-(6-(4-izopropilpiperazin-l-il)piridin-3-il)-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-8-amina (0.6 g, 1.44 mmol), 5-(4,4,5,5-tetrametil-[l,3,2]dioksaborolan-2-il)-2,3-dihidro-izoindol-l-on (0.56 g, 2.16 mmol) i Pd(PPh3)4(0.416 g, 0.36 mmol) u 1.5 M Na2C03(7.7 mL) i dioksanu (23 mL). Purifikacija na silika gelu uz pomoć kolonske hromatografije uz eluciju sa DCM, a nakon toga sa 98:2 DCM:NH3(7 M u MeOH) dovodi do jedinjenja iz naslova (0.36 g, 53 %) koje je konvertovano u mesilatnu so uz pomoć 1 M metansulfonske kiseline u MeOH (0.77 mL). Nakon trituracije sa dietil eterom i DCM izolovano je jedinjenje iz naslova u formi tvrde materije (0.410 g). 'H-NMR (400 MHz, d6-DMSO) 6(ppm) 1.35 (6H, d), 2.35 (3H, s, MsOH), 3.04 (2H, t), 3.20-3.27 (2H, m), 3.56-3.63 (3H, m), 3.89 (2H, d), 4.52 (2H, s), 7.09 (2H, d), 7.85 (IH, d), 7.95-8.01 (3H, m), 8.10 (IH, d), 8.24 (IH, s), 8.72 (IH, s), 8.74 (IH, s), 9.27 (IH, br s), 10.07 (IH, s). LCMS: Rt 2.93 min (97.9%),mlz(ES<+>) 469 (M+H)<+>.

Jedinjenje37:{5-[5-(lH-Pirazol-4-il)-[l,2,4]triakolo[l,5-a]pirazin-8-ilamino]-2-

morfolinofenil}metanol

Korak 1: ( 2- Morfolin- 4- il- 5- nitro- fenil)- metanol

U ohlađeni (0° C) rastvor 2-morfolin-4-il-5-nitro-benzaldehida (0.8 g, 3.39 mmol) u MeOH (5 mL) je dodan NaBIL; (0.125 g, 3.39 mmol), a reakciona mešavina je mešana na sobnoj temperatuti tokom 3 časa. Nakon gašenja reakcije sa vodom, rastvarač je odstranjenin vacuo,a ostatak je rastvoren u etil acetatu i opran sa slanim rastvorom. Organski sloj je osušen preko MgSO/j, filtriran i koncentrisan sa ciljem da se dobije jedinjenje iz naslova (870 mg), koje se koristi u sledećem koraku bez dodatne purifikacije.

Korak 2: ( 5- Amino- 2- morfolin- 4- il- fenil)- metanol

U rastvor (2-morfolin-4-il-5-nitro-fenil)-metanola (870 mg) u etanolu (40 mL) dodan je paladijum hidroksid (87 mg), a mešavina je mešana u Parr-aparatu u atmosferi vodonika pod pritiskom (10 bara) tokom 4 časa. Reakciona mešavina je filtrirana preko Celita 521, oprana sa etanolom i koncentrisanain vacuosa ciljem da nastane jedinjenje iz naslova (640 mg, 83 %).

Korak 3: 3-( tert- Butil- dimetil- silaniloksimetil)- 4- morfolin- 4- il- fenilam

Rastvor (5-amino-2-morfolin-4-il-fenil)-metanola (640 mg, 3.07 mmol), rert-butildimetilsilil hlorida (509 mg, 3.38 mmol) i imidazola (250 mg, 3.68 mmol) u dimetilformamidu (20 mL) je mešan na sobnoj temperaturi tokom noći. Rastvarač je odstranjenin vacuo,a ostatak je podeljen među vode i etil acetata. Organski sloj je opran sa slanim rastvorom, osušen preko MgS04, filtriran i koncentrisan sa ciljem da se dobije grubi produkt. Purifikacija uz upotrebu silika gela na kolonskoj hromatografiji uz eluciju sa DCM, a nakon toga sa mešavinom 95:5 DCM:MeOH dovodi do jedinjenja iz naslova u formi ljubičaste tvrde materije (390 mg, 27 %).

Korak 4: ( 5- Bromo-[ 1, 2, 4] triazolo[ l, 5- a] pirazin- 8- il)-[ 3-( tert- butil- dimetil- silanilksimetil)- 4-

morfolin- 4- il- fenil]- amin

Mešavina 5,8-dibromo-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazina (0.391 g, 1.41 mmol), 3-(/er/-butil-dimetil-silanilksimetil)-4-morfolin-4-il-fenilamina (0.5 g, 1.55 mmol) i iV-etildiizopropil-amina (0.27 mL, 1.55 mmol) je grejana na 90° C u 2-propanolu (10 mL) tokom 8 časova. Reakciona mešavina je isparena do suvoće, a ostatak je podeljen među dihlorometana i vode. Vodena faza je ekstrahovana dva puta sa dihlorometanom. Organski slojevi su kombinovani, oprani sa slanim rastvorom, osušeni preko MgS04, filtrirani i koncentrisaniin vacuosa ciljem da se dobije jedinjenje iz naslova (335 mg, 46 %).

Korak 5: [ 5-( 5- Bromo-[ 1. 2A] triazolo[ l, 5- a] pirazin- 8- ilamino)- 2- morfolin- 4- il- fenil]

Rastvor 5-bromo-[l ,2,4]triazolo[l ,5-a]pirazin-8-il)-[3-(/er/-butil-dimetil-silanilksimetil)-4-morfolin-4-il-fenil]-amina (285 mg, 0.549 mmol) u 1 M rastvoru tetrabutilamonijum fluorida u THF (0.63 mL) je mešan na sobnoj temperaturi tokom 1 časa. Reakciona mešavina je podeljena među etil acetata i vode. Organski sloj je opran sa 10 % rastvorom limunske kiseline i sa slanim rastvorom, osušen preko MgS04, filtriran i koncentrisan sa ciljem da se dobije jedinjenje iz naslova u formi kremove tvrde materije (100 mg, 45 %).

Korak 6: { 5-[ 5-( lH- Pirazol- 4- il)-[ 1, 2, 4] triazolo[ 1, 5- a] pirazin- 8- ilamino7-2-

morfolinofeniljmetanol

Ovo jedinjenje može da se dobije uz pomoć metoda koje su prikazane kod dobijanja Jedinjenja 6, korak 4 uz upotrebu [5-(5-bromo-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-8-ilamino)-2-morfolin-4-ilfenil]-metanola (85 mg, 0.21 mmol), 4-(4,4,5,5-tetrametil-[l,3,2]dioksa-borolan-2-il)-lH-pirazola (81 mg, 0.42 mmol) i Pd(PPh3)4(60 mg, 0.052 mmol) u 1.5 M Na2C03(1.12 mL) i dioksanu (2.0 mL). Reakciona mešavina je purifikovana na silika gelu uz upotrebu kolonske hromatografije uz eluciju sa 95:3 DCM:NH3(7 M u MeOH), a nakon toga je purifikovana uz pomoć preparativne HPLC preko reversne faze. Jedinjenje iz naslova je dobiveno u formi bledo kafene tvrde materije (10 mg, 12 %). 'H-NMR (400 MHz, d6-DMSO) 8(ppm) 2.87 (4H, m), 3.77 (4H, m), 4.63 (2H, d), 5.12 (IH, t), 7.11 (IH, d), 7.84 (IH, d), 8.12 (IH, s), 8.21 (IH, s), 8.39 (IH, s), 8.69 (IH, s), 8.77 (IH, s), 9.78 (IH, s), 13.29 (IH, br s). LCMS: Rt 2.45 min (96.3%),mlz(APCI) 393 (M+H)<+>.

Jedinjenje 41: (6-[Morfolin-4-il]piridin-3-il)-[5-(lH-pirazol-4-il)-[l,2,4]triazolo[l,5-a] pirazin-8-il] amin

Ovo jedinjenje može da se dobije uz pomoć metoda koje su prikazane kod dobijanja Jedinjenja 120, uz upotrebu (5-bromo-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-8-il)-(6-morfolin-4-il-piridin-3-il)amina u Koraku 4. LCMS: Rt = 0.80 min (95 %),mlz(ESI) 364 (M+H)<+>.

Jedinjenje 42: [6-(4-[Ciklopropilmetil]piperazin-l-il)piridin-3-il]-[5-(lH-pirazol-4-il)-[1,2,4] triazolo [ 1,5-a] pirazin-8-il] amin

Ovo jedinjenje može da se dobije uz pomoć metoda koje su prikazane kod dobijanja Jedinjenja 120, uz upotrebu (5-bromo-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-8-il)-[6-(4-[ciklopropilmetil]piperazin-l-il)piridin-3-il]amina u koraku 4. LCMS: Rt = 0.80 min (95 %),mlz(ESI) 417 (M+H)<+>.

Jedinjenje 43: [6-(4-Izopropilpiperazin-l-il)piridin-3-il]-[5-(lH-pirazol-4-il)-[1,2,4] triazolo [ 1,5-a] pirazin-8-il] amin

Ovo jedinjenje može da se dobije uz pomoć metoda koje su prikazane kod dobijanja Jedinjenja 120, uz upotrebu (5-bromo-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-8-il)-[6-(4-izopropilpiperazin-l-il)piridin-3-il]amina u Koraku 4. LCMS: Rt = 0.77 min (95 %),mlz(ESI) 405 (M+H)<+>.

Jedinjenje 44: [5-(lH-Pirazol-4-il)-[l,2,4]triazoIo[l,5-a]pirazin-8-il]-{6-[4-(2^,2-trifluoroetil) piperazin-l-iI]piridin-3-il}amin

Ovo jedinjenje može da se dobije uz pomoć metoda koje su prikazane kod dobijanja Jedinjenja 120, uz upotrebu (5-bromo-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-8-il)-{6-[4-(2,2,2-trilfuoroetil)piperazin-l-il]-piridin-3-il}amina u koraku 4. LCMS: Rt - 0.95 min (95 %),mlz(ESI) 445 (M+H)<+>.

Jedinjenje 46: {4-[4-(Ciklopropilmetil)piperazin-l-il]fenil}-[5-(lH-pirazol-4-il)-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-8-il]amin

Ovo jedinjenje može da se dobije uz pomoć metoda koje su prikazane kod dobijanja Jedinjenja 120, Korak 4, uz upotrebu (5-bromo-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-8-il)-{4-[4-ciklopropilmetil)piperazin-l-il]fenil} amina. LCMS: Rt = 1.02 (95 %),mlz(ESI) = 444 (M+H)<+>.

Jedinjenje 47: Amid 4-[8-(6-[morfolin-4-il]piridin-3-ilamino)-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-5-il]tiofen-2-karboksilne kiseline

Ovo jedinjenje može da se dobije uz pomoć metoda koje su prikazane kod dobijanja Jedinjenja 167, uz upotrebu (5-bromo-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-8-il)-(6-morfolin-4-il-piridin-3-il)amina u Koraku 4. LCMS: Rt = 0.85 min (95 %),mlz(ESI) 423 (M+H)<+>.

Jedinjenje 48: (5-Benzo[b]tiofen-3-il-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-8-il)-(4-morfolin-4-

ilfenil)amin

Ovo jedinjenje može da se dobije uz pomoć metoda koje su prikazane kod dobijanja Jedinjenja 120, uz upotrebu (5-bromo-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-8-il)-(4-morfolin-4-ilfenil)amina i 4,4,5,5-tetrametil-2-benzo[b]tiofen-3-il-[l,3,2]dioksaborolana u koraku 4. LCMS: Rt 0.84 min (95 %),mlz(ESI) 402 (M+H)<+>.

Jedinjenje 50: (4-Morfolin-4-ilfenil)-(5-tiofen-3-il-[l,2,4]triazoIo[l,5-a]pirazin-8-il)amin

Ovo jedinjenje može da se dobije uz pomoć metoda koje su prikazane kod dobijanja Jedinjenja 120, uz upotrebu (5-bromo-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-8-il)-(4-morfolin-4-ilfenil)amina i 4,4,5,5-tetrametil-2-tiofen-3-il-[l,3,2]dioksaborolana u koraku 4. LCMS: Rt 1.19 min (95 %),mlz(ESI) 379 (M+H)<+.>

Jedinjenje 51: [4-(4-Izopropilpiperazin-l-il)fenil]-(5-tiofen-3-il-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-8-il)amin

Ovo jedinjenje može da se dobije uz pomoć metoda koje su prikazane kod dobijanja Jedinjenja 50, uz upotrebu (5-bromo[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-8-il)-[4-(4-izopropilpiperazin-l-il)-fenil]amina u finalnom koraku. LCMS: rt = 1.11 min (95 %), m/z (ESI) 420 (M+H)<+>.

Jedinjenje 52: 5-(5-Etil-1 H-pirazol-4-il)-N-(4-morfolinofenil)-[1,2,4] triazolo [ 1,5-a]pirazin-8-amin

Korak 1: 3- Etil- lH- pirazol

U mešani rastvor l-trimetilsilanil-pent-l-in-3-on (0.5 g, 3.25 mmol) i sulfatne soli hidrazina (0.56 g, 4.33 mmol) u etanolu (15 mL) je dodan zasićeni rastvor Na2C03(0.52 g, 4.87 mmol), a mešavina je refluksovana na 90° C tokom 5 časova. Reakciona mešavina je razređena sa vodom i slanim rastvorom i ekstrahovana uz upotrebu dietil etera (3 x). Organski slojevi su spojeni, osušeni preko MgSOzj, filtrirani i koncentrisani sa ciljem da se dobije grubi produkt, koji se purifikuje na silika gelu preko kolonske hromatografije. Elucija sa 90:10 petroleum eter:etil acetatom dovodi od jedinjenja iz naslova (0.1196 g, 36 %).

Korak 2: 4- Bromo- 5- etil- lH- pirazol

U mešani rastvor 3-etil-lH-pirazola (0.114 g, 1.186 mmol) u sirćetnoj kiselini (2 mL), dodan je bromin (0.061 mL, 1.186 mmol), a mešavina je mešana na sobnoj temperaturi tokom 2 časa. Reakciona mešavina je prevedena iz kiselog stanja u bazno uz pomoć dodavanja zasićenog rastvora NaHC03i sve je ekstrahovano uz upotrebu etil acetata (3 x). Organski slojevi su spojeni, osušeni preko MgS04, filtrirani i koncentrisani sa ciljem da se dobije jedinjenje iz naslova (0.180 g, 87 %). Jedinjenje se koristi u sledećem koraku bez dodatne purifikacije.

Korak 3: 4- Bromo- 5- etil- l-( tetrahidro- piran- 2- il)- lH- pirazoli4- Bromo- 3- etil- l-( tetrahidro-

piran- 2- il)- l H- pirazol

4-Bromo-5-etil-lH-pirazol (0.179 g, 1.032 mmol) je rastvoren u 3,4-dihidro-2H-piranu (0.28 mL, 3.098 mmol) u prisustvu katalitičke količine TFA (0.001 mL, 0.00103 mmol). Reakciona mešavina je mešana na 90° C tokom 3 časa, ohlađena, a tada je ugašena uz upotrebu NaH (1.5 mg, 0.0061 mmol). Nakon odstranjivanja rastvarača, ostatak je purifikovan na silika gelu uz upotrebu kolonske hromatografije uz eluciju sa mešavinom 90:10 petroleum eter-etil acetata. Frakcije koje sadrže željena jedinjenja su sakupljene i koncentrisanein vacuosa ciljem dobijanja jedinjenja iz naslova (175 mg, 66 %).

Korak 4: 5- Etil- l-( tetrahidro- piran- 2- il)- 4-( 4, 4, 5, 5- tetrametil-[ l, 3, 2] dioksaborolan- 2- il)- lH-

pirazoli3- Etil- l-( tetrahidro- piran- 2- il)- 4-( 4, 4, 5, 5- tetrametil- f1, 3, 2] dioksaborolan- 2- il)- lH-

pirazol

Ovo jedinjenje može da se dobije uz pomoć metoda koje su prikazane kod dobijanja Jedinjenja 86, korak 2 uz upotrebu 4-bromo-5-etil-l-(tetrahidro-piran-2-il)-lH-pirazola i 4-bromo-3-etil-l-(tetrahidropiran-2-il)-lH-pirazola (168 mg, 0.65 mmol), bis(pinakolato)diborona (331 mg, 1.3 mmol), PdCbdppf (53 mg, 65 umol) i KOAc (190 mg, 1.95 mmol) u dimetilsulfoksidu (2 mL). Reakciona mešavina je purifikovana na silika gelu uz upotrebu kolonske hromatografije i uz eluciju sa 90:10 petroleum etenetil acetatom sa ciljem da se dobiju jedinjenja iz naslova (61.1 mg, 31%).

Korak 5: { 5-[ 5- Etil- l-( tetrahidro- piran- 2- il)- lH- pirazol- 4- il]-[ l, 2, 4] triazolo[ l, 5- a] pirazin- 8-

il}-( 4- morfolin- 4- il- fenil)- amini{ 5-[ 3- Etil- l-( tetrahidro- piran- 2- il)- lH- pirazol- 4- il]-[ l, 2, 4] triazolo[ l, 5- a] pirazin- 8- il}-( 4- morfolin- 4- il- fenil)- amin

Ovo jedinjenje može da se dobije uz pomoć metoda koje su prikazane kod dobijanja Jedinjenja 6, korak 4 uz upotrebu (5-bromo-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-8-il)-(4-morfolin-4-il-fenil)-amina

(0.032 g, 0.085 mmol), 5-etil-l-(tetrahidro-piran-2-il)-4-(4,4,5,5-tetrametil-[l,3,2]dioksaborolan^2-il)-lH-pirazola i 3-etil-l-(tetrahidro-piran-2-il)-4-(4,4,5,5-tetrametil-[l,3,2]dioksaborolan-2-il)-lH-pirazola (0.52 mg, 0.17 mmol) i Pd(PPh3)4(0.025 mg, 0.021 mmol) u 1.5 M Na2C03(vodeni rastvor) (0.45 mL, 0.6 mmol) i dioksanu (2 mL). Reakciona mešavina je purifikovana na silika gelu uz pomoć kolonske hromatografije i uz eluciju sa 1:1 petroleum etenetil acetatom, a nakon toga sa 1:4 petroleum etenetil acetatom sa ciljem da se dobije jedinjenje iz naslova (45 mg).

Korak 6: 5-( 5- Etil- lH- pirazol- 4- il)- N-( 4- morfolinofenil)-[ l, 2, 4] triazolo[ l, 5- a] pirazin- 8- amm

Rastvor { 5-[5-etil-1 -(tetrahidro-piran-2-il)-1 H-pirazol-4-i 1 ]-[ 1,2,4]triazolo [ 1,5-a]pirazin-8-il} -

(4-morfolin-4-il-fenil)-amina i {5- [3 -etil-1 -(tetrahidropiran-2-il)-1 H-pirazol-4-il] -

[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-8-il}-(4-morfolin-4-il-fenil)-amina (40 mg, 0.077 mmol) i koncentrisane HC1 (0.3 mL) u MeOH (10 mL) je mešan na sobnoj temperaturi tokom 5 časova. Nakon odstranjivanja rastvarača, tvrdi ostatak je podeljen među etil acetata i zasićenog NaHC03. Ne rastvorena tvrda materije je sakupljena uz pomoć filtracije, oprana sa vodom, dietil eterom i petroleum eterom i osušena sa ciljem da se dobije jedinjenje iz naslova (5 mg, 17 %). Konzervisanje u mesilatnu so uz pomoć 0.1 M metansulfonske kiseline (0.128 mL) dovodi do jedinjenja iz naslova (5.6 mg, 89 %) u formi tvrde materije. 'H-NMR (400 MHz, đVDMSO) 8(ppm) 1.13 (3H, m), 2.29 (3H, s, MsOH), 2.74 (2H, m), 3.29 (4H, m), 3.77 (4H, m), 7.06 (2H, m), 7.62 (IH, s), 7.89 (2H, d), 8.00 (IH, s), 8.61 (IH, s), 9.83 (IH, s). LCMS: Rt 2.69 min (98.4%),mlz(APCI) 391 (M+H)<+.>

Jedinjenje 53: 6-[8-(4-Morfolin-4-iI-fenilamino)-[1^2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-5-il]-l,l-diokso-l,2-dihidro-lX,<6->benzo[d]izotiazol-3-on

Korak 1: 1, l- Diokso- 6-( 4, 4, 5, 5- tetrametil-[ l, 3, 2] dioksaborolan- 2- il)- l, 2- dihidro- l'^-

benzo[ d] izotiazol- 3- on

Ovo jedinjenje može da se dobije uz pomoć metoda koje su prikazane kod dobijanja Jedinjenja 86, korak 2 uz upotrebu 6-bromo-l,l-diokso-l,2-dihidro-l X<6->benzo[d]izotiazol-3-on (0.5, 1.9 mmol), bis(pinakolato)diborona (0.53 g; 2.1 mmol), PdCl2dppf (0.047 g, 0.058 mmol) i KOAc (0.56 g, 5.7 mmol) u dioksanu (10 mL). Rastvarač je odstranjenin vacuo,a ostatak je podeljen među DCM i vode. Organski sloj je opran sa zasićenim rastvorom NaHC03i 2 M HCI, osušen preko MgS04, filtriran i isparen sa ciljem da se dobije jedinjenje iz naslova (990 mg, 169 %) koje se koristi u sledećem koraku bez dodatne purifikacije.

Korak 2: Tert- butil ester ( 4- morfolin- 4- il- fenil)-[ 5-( l, l, 3- triokso- 2, 3- dihidro- lH- l X<6->

benzo[ d] izotiazol- 6- il)-[ l, 2, 4] triazolo[ l, 5- a] pirazin- 8- il]- karbamične kiseline

Ovo jedinjenje može da se dobije uz pomoć metoda koje su prikazane kod dobijanja Jedinjenja 6, korak 4 uz upotrebuterr-butilestera (5-bromo-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-8-il)-(4-morfolin-4-il-fenil)-karbamične kiseline (170 mg, 0.36 mmol), l,l-diokso-6-(4,4,5,5-tetrametil-[l,3,2]dioksaborolan-2-il)-l,2-dihidro-l X<6->benzo[d]izotiazol-3-on (374 mg, 0.72 mmol) i Pd(PPh3)4(100 mg, 0.082 mmol) u 1.5 M Na2C03(2 mL, 3 mmol) i dioksanu (6 mL). Purifikacija reakcione mešavine na silika gelu preko kolonske hromatografije uz upotrebu 1:1 petroleum etenetil acetata dovodi do pojave jedinjenja koje je još uvek nedovoljno čisto. Druga kolonska hromatografija na silika gelu uz eluciju sa 10:1 DCM:MeOH dovodi do jedinjenja iz naslova (91 mg, 44 %).

Korak 3: 6-[ 8-( 4- Morfolin- 4- il- fenilamino)-[ l, 2, 4] triazolo[ 1, 5- a] pirazin- 5- il]- l, 1- diokso- l, 2-

dihidro- 1 \ 6- benzo[ d] izotiazol- 3- on

Suspenzijater/-butilestera (4-morfolin-4-il-fenil)-[5-(l,l,3-triokso-2,3-dihidro-lH-lX<6->benzo[d]izotiazol-6-il)-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-8-il]-karbamične kiseline (100 mg, 0.173 mmol) u 4 M HC1 (2.5 mL) u dioksanu je mešana na sobnoj temperaturi tokom 2 časa. Rastvarač je odstranjen pod vakumom, a ostatak je smrvljen sa DCM, dietil eterom i petroleum eterom sa ciljem da se dobije jedinjenje iz naslova (84 mg, 100 %).<!>H-NMR (400 MHz, aVDMSO) 6(ppm) 3.25 (4H, m), 3.85 (4H, m), 7.20 (2H, d), 7.88 (2H, d), 8.16 (IH, d), 8.24 (IH, s), 8.58 (IH, d), 8.82 (2H, s), 8.96 (IH, s), 10.31 (IH, s). LCMS: Rt 2.31 min (95.7%),mlz(APCI) 478

(M+H)<+>.

Jedinjenje 54: Amid 4-{8-[6-(4-[ciklopropilmetil]piperazin-l-il)-piridin-3-ilamino]-[l,2,4]triazolo [l,5-a]pirazin-5-il}tiofen-2-karboksi!ne kiseline

Ovo jedinjenje može da se dobije uz pomoć metoda koje su prikazane kod dobijanja Jedinjenja 120, uz upotrebu (5-bromo-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-8-il)-[6-(4-[ciklopropilmetil]piperazin-l-il)piridin-3-il]amina u koraku 4. LCMS: Rt = 0.85 min (95 %),mlz(ESI) 476 (M+H)<+>.

Jedinjenje 55: Amid 4-{8-[6-(4-izopropilpiperazin-l-il)piridin-3-iIamino]-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-5-iI}tiofen-2-karboksline kiseline

Ovo jedinjenje može da se dobije uz pomoć metoda koje su prikazane kod dobijanja Jedinjenja 167, uz upotrebu (5-bromo-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-8-il)-[6-(4-izopropilpiperazin-l-il)piridin-3-il]amina u Koraku 4. LCMS: Rt = 0.82 min (95 %),mlz(ESI) 464 (M+H)<+>.

Jedinjenje 56: Amid 4-(8-{6-[4-(2,2,2-trifluoroetil)piperazin-l-il]-piridin-3-ilamino}-[l,2,4]triazolo [l,5-a]pirazin-5-il)tiofen-2-karboksilne kiseline

Ovo jedinjenje može da se dobije uz pomoć metoda koje su prikazane kod dobijanja Jedinjenja 167, uz upotrebu (5-bromo-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-8-il)-{6-[4-(2,2,2-trifIuoroetil)piperazin-l-il]-piridin-3-il}amina u koraku 4. LCMS: Rt = 0.99 min (95 %),mlz(ESI) 504 (M+H)<+>.Jedinjenje57:Amid4-(8-{4-[4-(2,2,2-trifluoroetil)piperazin-l-il]-fenilamino}-[l,2,4]triazoIo[l,5-a]pirazin-5-il)tiofen-2-karboksilne kiseline

Ovo jedinjenje može da se dobije uz pomoć metoda koje su prikazane kod dobijanja Jedinjenja 58, uz upotrebu (5-bromo-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-8-il)-{4-[4-(2,2,2-trifluoroetil)piperazin-l-il]fenil}amina. LCMS: Rt = 1.07 min (95 %),mlz(ESI) 503 (M+H)<+.>

Jedinjenje 58: Amid 4-{8-[4-(4-(ciklopropilmetil)piperazin-l-il)-fenilamino]-(l,2,4]triazo!o(l,5-a]pirazin-5-il}tiofen-2-karboksilne kiseline

Ovo jedinjenje može da se dobije uz pomoć metoda koje su prikazane kod dobijanja Jedinjenja 46, uz upotrebu 2-(aminokarbonil)tiofen-4-boronične kiseline. LCMS: Rt = 0.93 (95 %),mlz(ESI) 475 (M+H)<+>.

Jedinjenje 59: [4-(4-Ciklopropilpiperazin-l-il)fenil]-[5-(lH-pirazol-4-il)-[l,2,4]triazolo[l,5-a] pirazin-8-il] amin

Ovo jedinjenje može da se dobije uz pomoć metoda koje su prikazane kod dobijanja Jedinjenja 46, uz upotrebu (5-bromo-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-8-il)-[4-(4-ciklopropilpiperazin-l-il)-feniljamina. LCMS: Rt = 0.84 (95 %),mlz(ESI) 402 (M+H)<+>.

Jedinjenje 60: [6-(4-Ciklopropilpiperazin-l-il)piridin-3-il]-[5-(lH-pirazol-4-il)-[l,2,4]triazoIo [l,5-a]pirazin-8-il]amin

Ovo jedinjenje može da se dobije uz pomoć metoda koje su prikazane kod dobijanja Jedinjenja 120, uz upotrebu (5-bromo-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-8-il)-[6-(4-ciklopropilpiperazin-l-il)piridin-3-il]amina u koraku 4. LCMS: Rt = 0.76 min (95 %),mlz(ESI) 403 (M+H)<+>.

Jedinjenje 61: Amid 4-[8-(4-morfoIin-4-iIfeniIamino)-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-5-

il]tiazol-2-karboksilne kiseline

Ovo jedinjenje može da se dobije uz pomoć metoda koje su prikazane kod dobijanja Jedinjenja 73, uz upotrebu amonijaka (7 M u MeOH) koji se koristi u koraku 3. LCMS: Rt = 1.00 min (95 %),mlz(ESI) 423 (M+H)<+>.

Jedinjenje 62: Amid 4-{8-[4-(4-izopropilpiperazin-l-il)fenilamino]-[l^,4]triazolo[l,5-a]pirazin-5-il}tiazol-2-karboksilne kiseline

Ovo jedinjenje može da se dobije uz pomoć metoda koje su prikazane kod dobijanja Jedinjenja 61, uz upotrebu (5-bromo[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-8-il)-[4-(4-izopropilpiperazin-l-il)-feruTJamina u finalnom koraku. LCMS: rt = 0.96 min (95 %), m/z (ESI) 464 (M+H)<+>. Jedinjenje 63: Amid 4-(8-{4-[l-(2,2,2-trifluoroetil)piperidin-4-il]fenilamino}-[ 1,2,4]triazolo [1,5-a] pirazin-5-il)tiofen-2-karboksiIne kiseline

Korak 1: l- Trijluoroacetil- 4-( 4- nitrofenil) piperidin

Trietilamin (1.0 mL, 7.3 mmol) i 4-(4-nitrofenil)piperidin (1.0 g, 4.8 mmol) su mešani u DCM (25 mL) na 0° C u uslovima N2pa je dodan i trifluorosirćetni anhidrid (0.81 mL, 5.8 mmol). Mešavina je mešana tokom tri dana, a potom je ostavljena da se temperatura digne do sobne. Rastvor je tada razređen sa DCM (50 mL) i opran sa vodom (2 x 15 mL), NaHC03(50 % zasićeni vodeni rastvor, 2 x 15 mL) i sa slanim rastvorom (15 mL). Rastvarač je osušen preko MgS04i isparen sa ciljem da se dobije željeno jedinjenje (1.46 g, 4.66 mmol).

Korak 2: l-( 2, 2, 2- Trifluoroetil)- 4-( 4- nitrofenil) piperidin

Rastvor l-trifluoroacetil-4-(4-mtrofenil)piperidina (1.42 g, 4.7 mmol) u THF (15 mL) je mešan u 25 mL 2-vratnom bocom na kojoj se nalazi kondenzor i dodatni levak za ekvilibraciju pritiska. Sistem je opran sa N2, pa je dodan NaBFLj (210 mg, 5.6 mmol), a boca je ohlađena do 0° C. Dodan je rastvor joda (600 mg, 2.3 mmol) u THF (5 mL) kao po kap tokom 20 min, a nakon toga je dodatni levak odstranjen, a mešavina je grejana kod refluksa tokom noći. Nastala bledo žuta suspenzija je ohlađena do sobne temperature pa je veoma pažljivo dodan MeOH (1.5 mL), šta dovodi do nagle pojave gasa. Isparavanje rastvarača dovodi do jedinjenja iz naslova, koje se koristi bez da se dodatno purifikuje.

Korak3: 4-[ l-( 2, 2, 2- Trifluoroetil) piperidin- 4- il] fenilamin

Amonijum format (1.38 g, 22 mmol) i 10 % Pd/C (230 mg, 0.2 mmol) su dodani u rastvor 1-(2,2,2-trifluoroetil)-4-(4-nitrofenil)piperidina (1.26 g, 4.4 mmol) u EtOH (10 mL) i EtOAc (10 mL). Suspenzija je grejana kod refluksa tokom 24 časa, uz dodavanje dodatnih porcija amonijum formata (2 g) nakon 4 i 8 časova. Mešavina je filtrirana kroz celit pa je isparena sa ciljem da se dobije tvrda materija boje pomorandže. Ona je podeljena među DCM (40 mL) i vode (20 mL), a slojevi su odvojeni. Vodena faza je ekstrahovana sa DCM (2 x 20 mL), a spojeni organski slojevi su osušeni preko MgS04 i ispareni pod redukovanim pritiskom sa ciljem da se dobije iV-{4-[l-(2,2,2-trilfuoroetil)piperidin-4-il]fenil} formamid u formi tvrde materije boje svetle pomorandže (980 mg).

Rastvor formamida u MeOH (20 mL) je mešan na sobnoj temperaturi pa je dodana HC1 (koncentrisana, 1 mL). Tamno ljubičasti rastvor je grejan kod refluksa tokom 1 časa, ohlađen je pa je MeOH isparen. Ostatak je mešan sa vodom (20 mL) pa je dodan NaHCOa(zasićeni vodeni rastvor) sve dok se ne pojave mehurići. Mešavina je ekstrahovana sa DCM (20 mL, 2x10 mL), a spojeni ekstrakti su osušeni preko MgS04i ispareni pod redukovanim pritiskom sa ciljem da se dobije jedinjenje iz naslova u formi tvrde materije boje pomorandže (870 mg).

Ovaj materija je korišćen kod pripreme amida 4-(8-{4-[l-(2,2,2-trifluoroetil)piperidin-4-il]fenilamino}-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-5-il)tiofen-2-karboksilne kiseline uz upotrebu metoda koji su analogni onima koji su korišćeni za pripremu Jedinjenja 89.

LCMS: Rt = 2.11 min (100%), m/z (ESI) 502 (M+H)<+>.

Jedinjenje 65: 5-(8-(4-(2-Morfolinoetoksi)fenilamino)-[l^,4]triazolo[l,5-a]pirazin-5-

il)izoindolin-l-on

Korak 1: ( 5- Bromo-[ l, 2, 4] triazolo[ 1, 5- a] pirazin- 8- il)-[ 4-( 2- morfolin- 4- il- etoksi)- fenU^

U skladu sa procedurom koja je opisana za Jedinjenje 6, korak 1, 5,8-dibromo-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin (0.5 g, 1.799 mmol), 4-(2-morfolin-4-il-etoksi)-fenilamin (0.6 g, 4.5 mmol) i MAf-diizopropiletilamin (0.47 mL, 2.7 mmol) u 2-propanolu (6 mL) su mešani na 95° C tokom noći. Nakon isparavanja rastvarača, ostatak je rastvoren u DCM i opran sa vodom (2 x) i slanim rastvorom. Organski sloj je osušen preko MgS04, filtriran i koncentrisanin vacuosa ciljem da se dobije ulje koje se purifikuje na silika gelu preko kolonske hromatografije. Elucija sa mešavinom 97:3 DCM:MeOH daje jedinjenje iz naslova (650 mg 86 %) u formi svetio žute tvrde materije. LCMS: Rt 2.06 min (97.7%).

Korak 2: 5-( 8-( 4-( 2- Morfolinoetoksi) fenilamino)-[ l, 2A] triazolo[ l, 5- a] pirazin- 5Al) izoind^

on

Ovo jedinjenje može da se dobije uz pomoć metoda koje su prikazane kod dobijanja Jedinjenja 6, korak 4, uz upotrebu (5-bromo-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-8-il)-[4-(2-morfolin-4-il-etoksi)-fenil]-amina (80 mg, 0.19 mmol), 5-(4,4,5,5-tetrametil-[l,3,2]dioksaborolan-2-il)-2,3-dihidro-izoindol-l-on (74 mg, 0.29 mmol) i Pd(PPh3)4(55 mg, 0.047 mmol) u 1.5 M Na2C03(1.02 mL, 1.53 mmol) i dioksanu (3 mL). Reakciona mešavina je purifikovana na silika gelu preko kolonske hromatografije uz eluciju sa DCM i sa mešavinom 97:3 DCM:NH3(7 M u MeOH). Nakon mrvljenja uz upotrebu dietil etera, izolovano je jedinjenje iz naslova u formi tvrde materije (61.9 mg, 69 %). Konzervisanje materijala u mesilatnu so uz upotrebu 1 M metansulfonske kiseline (0.134 mL) u MeOH dovodi do jedinjenja iz naslova (57.1 mg). 'H-NMR (400 MHz, oVDMSO) 8(ppm) 2.40 (3H, s, MsOH), 3.25-3.38 (2H, m), 3.60-3.78 (4H, m), 3.84 (2H, t), 4.09 (2H, d), 4.45 (2H, m), 4.56 (2H, s), 7.14 (2H, d), 7.90 (IH, d), 8.05-8.19 (4H, m), 8.28 (IH, s), 8.76 (IH, br s), 8.79 (IH, s), 10.00 (IH, br s), 10.16 (IH, s). LCMS: Rt 1.98 min (99.1%),mlz(APCI) 472 (M+H)<+>.

Jedinjenje 67: N-(2-Fluoro-4-morfolinofenil)-5-(lH-pirazoI-4-iI)-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-8-amin

Korak 1: ( 5- Bromo-[ l, 2, 4] Mazolo[ l, 5- a] pirazin- 8- il)-( 2- fluoro- 4- morfolin- 44l- fenil)- amin

Ovo jedinjenje može da se dobije uz pomoć metoda koje su prikazane kod dobijanja Jedinjenja 6, korak 1, uz upotrebu 5,8-dibromo-[l,2,4]triazoIo[l,5-a]pirazina (0.105 g, 0.89 mmol), 2-fluoro-4-morfolin-4-il-fenilamina (93 mg, 0.474 mmol), DIPEA (0.123 mL, 0.706 mmol) i 1,4-diazabiciklo[2.2.2]oktana (53 mg, 0.472 mmol) u 2-propanolu (2 mL). Reakciona mešavina je podeljena među DCM i 10 % limunske kiseline (vodeni rastvor), organski sloj je odvojen i opran sa 10 % rastvorom limunske kiseline, vodom i slanim rastvorom, osušen preko MgS04, filtriran i koncentrisanin vacuo.Jedinjenje iz naslova je izolovano u formi bledo crvene tvrde materije (77 mg, 42 %) pa je korišćeno u sledećem koraku bez dodatne purifikacije. LCMS: Rt 3.48 min (89%).

Korak 2: N-( 2- Fluoro- 4- morfolinofenil)- 5-( lH- pirazol- 4- il)-[ 1, 2, 4] triazolo[ 1, 5- a] pirazin- 8-amin

Ovo jedinjenje može da se dobije uz pomoć metoda koje su prikazane kod dobijanja Jedinjenja 6, korak 4, uz upotrebu (5-bromo-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-8-il)-(2-fluoro-4-morfo]in-4-ilfenil)-amina (80 mg, 0.203 mmol), 4-(4,4,5,5-tetrametil-[l,3,2]dioksaborolan-2-il)-lH-pirazola (79 mg, 0.406 mmol) i Pd(PPh3)4(59 mg, 0.051 mmol) u 1.5 N Na2C03(1.09 mL, 1.62 mmol) i dioksanu (3.25 mL). Reakciona mešavina je purifikovana na silika gelu preko kolonske hromatografije uz eluciju sa 97:3 DCM:NH3(7 M u MeOH). Frakcije koje sadrže produkt su spojene i isparenein vacuosa ciljem da se dobije tvrda materija koja je smrvljena sa dietil eterom i petroleum eterom sa ciljem da se dobije jedinjenje iz naslova (29 mg, 38 %). LCMS: Rt 2.90 min (96%).

Konzervisanje u mesilatnu so uz upotrebu 0.1 M rastvora metansulfonske kiseline u MeOH (0.762 mL, 0.076 mmol) dovodi do nastanka jedinjenja iz naslova (35 mg). ^-NMR (400 MHz, d6-DMSO) 8(ppm) 2.36 (3H, s, MsOH), 3.19 (4H, m), 3.79 (4H, m), 6.84-6.94 (2H, m), 7.54 (IH, t), 8.08 (IH, s), 8.48 (2H, s), 8.76 (IH, s), 9.31 (IH, s). LCMS: Rt 2.91 min (95.4%),mlz(APCI) 381 (M+H)<+>.

Jedinjenje 70: (4-(8-(4-Morfolinofenilamino)-[l,2,4]tirazolo[l,5-a]pirazin-5-il)-lH-pirazol-5-il)metanol

Korak 1:4- Bromo- 5-( tert- butil- dimetil- silaniloksimetil)- lH- pirazol

Rastvor (4-bromo-2H-pirazol-3-il)-metanola (0.64 mg, 3.63 mmol), rerr-butildimetilsilil hlorida (0.82 g, 5.45 mmol) i imidazola (0.42 g, 6.18 mmol) u /^N-dimetilformamidu (20 mL) je mešan na sobnoj temperaturi tokom noći. Reakciona mešavina je razređena sa mešavinom 50:50 dietil etenetil acetata i oprana sa vodom (3 x). Organski slojevi su osušeni preko MgS04, filtrirani i koncentrisani. Ostatak je purifikovan na silika gelu preko kolonske hromatografije uz eluciju sa 80:20 petroleum eter:etil acetatom sa ciljem da se dobije jedinjenje iz naslova (1.035 g, 98 %).

Korak 2: 4- Bromo- 3-( tert- butil- dimetil- silaniloksimetil)- l-( tetrahidro- piran- 2- il)-i4-Bromo- 5-( tert- butil- dimetil- silanilohimetil)- l-( tetrahidro- piran- 2- il)^

4-Bromo-5-(tetr-butil-dimetil-silaniloksimetil)-lH-pirazol (1 g, 3.45 mmol) je rastvoren u 3,4-dihidro-2H-piranu (0.944 mL, 10.34 mmol) u prisustvu katalitičke količine TFA (0.0026 mL, 0.035 mmol). Reakciona mešavina je mešana na 90° C tokom 18 časova, ohlađena i tada je ugašena sa NaH (4.69 mg, 0.206 mmol). Nakon odstranjivanja rastvarača, ostatak je purifikovan na silika gelu preko kolonske hromatografije uz eluciju sa mešavinom 95:5 petroleum eter-etil acetata, a nakon toga sa 90:10 petroleum eter-etil acetatom. Frakcije koje sadrže željena jedinjenja su sakupljene i koncentrisanein vacuosa ciljem da se dobiju 4-bromo-3-(etrt-butil-dimetil-silaniloksimetil)-l-(tetrahidro-piran-2-il)-l H-pirazol i 4-bromo-5-(tert-butil-dimetil-silaniloksimetil)-l-(tetrahidro-piran-2-il)-l H-pirazol (724 mg, 56 %).

Korak 3: Tert- butil ester { 5-[ 5-( tert- butil- dimetil- silaniloksimetil)- l-( tetrahidro- piran- 2- il)- lH-

pirazol- 4- il]-[ l, 2, 4] triazolo[ l, 5- a] pirazin- 8- il}-( 4- morfolin- 4- il- fenil)- kari kiselineitert-butil ester { 5-[ 3-( tert- butil- dimetil- silaniloksimetil)- l-( tetrahidro- piran- 2- il)- lH^

[ lJ, 4Jtriazolo[ l, 5- a] pirazin- 8- il}-( 4- morfolin- 4- il- fenil)- karbamične kiseline

Ovo jedinjenje može da se dobije uz pomoć metoda koje su prikazane kod dobijanja Jedinjenja 35, korak 3 uz upotrebutert-butilestera (4-morfolin-4-il-fenil)-(5-tributilstananil-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-8-il)-karbamične kiseline (210 mg, 0.30 mmol), 4-bromo-3-(tert-butil-dimetil-silaniloksimetil)-1 -(tetrahidro-piran-2-il)-1 H-pirazola i 4-bromo-5-(etrt-butil-dimetil-silaniloksimetil)-l-(tetrahidro-piran-2-il)-lH-pirazola (170 mg, 0.45 mmol) i tetrakis(trifenilfosfin)paladijuma(0) (35 mg, 0.030 mmol) u DMF (4mL). Grubi produkt je purifikovan na silika gelu uz upotrebu kolonske hromatografije i uz eluciju sa 7:3, a tada sa 3:7 petroleum etenetil acetatom sa ciljem da se dobiju jedinjenja iz naslova (62.5 mg).

Korak 4: ( 4-( 8-( 4- Morfolinofenilamino)-[ l, 2, 4] triazolo[ l, 5- a] pirazin- 5- il)- lH- pirazol- 5-

iljmetanol

Rastvor {5-[3-(te^butil-dimetil-silaniloksi^

[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-8-il}-(4-morfolin-4-il-ferul)-amina i {5-[5-(terf-butil-dimetil-silaniloksimetil)-1 -(tetrahidro-piran-3-il)-1 H-pirazol-4-il]-[ 1,2,4]triazolo[ 1,5-a]pirazin-8-il} -(4-morfolin-4-il-fenil)-amina (53.6 mg, 0.077 mmol) i koncentrisane HC1 (0.27 mL) u MeOH (5 mL) je mešan na sobnoj temperaturi tokom 2 časa. Nakon odstranjivanja rastvarača, ostatak je podeljen među etil acetata i vode. Vodeni sloj je opran sa etil acetatom (3 x), a spojeni organski slojevi su osušeni preko MgS04, filtrirani i koncentrisani. Ostatak je rastvoren u 4 M HC1 u dioksanu, koncentrisanin vacuo,a tada je podeljen među etil acetata i zasićenog NaHC03. Organski sloj je osušen preko MgS04, filtriran i koncentrisanin vacuosa ciljem da se dobije grubi produkt koji je purifikovan sa silika gelu preko kolonske hromatografije. Jedinjenje iz naslova je izolovano uz eluciju sa EtOAc i sa mešavinom 95:5 DCM:MeOH (5.4 mg, 18 %).

'H-NMR (400 MHz, d6-DMSO) 8(ppm) 3.11 (4H, m), 3.79 (4H, m), 4.65 (2H, d), 5.25 i 5.53 (IH, br s), 6.99 (2H, m), 7.84 i 8.51 (IH, br s), 7.92 (2H, d), 8.12 (IH, d), 8.70 (IH, s), 9.74 (IH, s), 13.12 i 13.23 (IH, br s). LCMS: Rt 2.26 min (96.2%),mlz(APCI) 393 (M+H)<+>.

Jedinjenje 73: Metilamid 4-[8-(4-morfolin-4-il-feniIamino)-[1^2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-5-

il]-tiazol-2-karboksilne kiseline

Korak 1: 2. 4- Dibromotiazol

Tiazolidinon (3.43 g, 29.32 mmol) i POBr3(25 g, 87.96 mmol, 3 ekvivalenata) su pomešani kao tvrde materije u atmosferi azota. Reakciona mešavina je tada grejana do 110° C uz mešanje tokom 3 časa šta dovodi do nastanka crnog sirupa. Reakciona mešavina je tada ostavljena da se ohladi do sobne temperature pa je veoma oprezno dodana mešavina vode/leda (200 mL). Rezultujuća siva suspenzija je ekstrahovana sa dietil eterom (3 x 50 mL), organski slojevi su pomešani, filtrirani na silika gelu i ispareni sa ciljem da se dobije jedinjenje iz naslova u formi ulja boje pomorandže (4 g, 57%) koje se koristi u sledećem koraku bez dodatne purifikacije.

Korak 2: Etil ester 4- bromotiazol- 2- karboksilne kiseline

U rastvor dibromotiazola (1 g, 4.15 mmol) u THF (15 mL) na 0° C kap po kap je dodan rastvor iPrMgCl u THF (2 M, 2.3 mL, 4.57 mmol, 1.10 ekvivalenata). Reakcija je mešana na 0° C tokom 0.25 časova. Rezultujućem rastvoru boje pomorandže preko cevčice je dodan dietil karbonat (3 mL) u THF (5 ml). Rezultujući zeleni rastvor je dodatno mešan na sobnoj temperaturi tokom 0.5 časova, kada je reakcija ugašena dodavanjem zasićenog rastvora NH4CI. Jedinjenje iz naslova je purifikovano uz pomoć LC uz eluciju sa 6/4 cikloheksan/DCM sa ciljem da se dobije 514.2 mg (52 %) jedinjenja iz naslova u formi bledo žute praškaste materije.

Korak 3: Metilamid 4- bromotiazol- 2- karboksilne kiseline

Etil ester 4-bromotiazol-2-karboksilne kiseline (500 mg, 2.13 mmol) je rastvoren u metanolu (1 mL) pa je dodan metil amin u metanolu (10 mL). Mešavina je mešana tokom noći na sobnoj temperaturi. Isparavanje rastvarača u uslovima redukovanog pritiska dovodi do jedinjenja iz naslova u formi žute tvrde materije. LCMS: Rt 0.92 min (100%) m/z (ESI) 219/221 (M+H)<+>.

Korak 4: Metilamid 4-[ 8-( 4- morfolin- 4- il- fenilamino)-[ l, 2, 4] triazolo[ l, 5- a] pirazin- 5- il]- tiazol-2- karboksilne kiseline

Metilamid 4-bromotiazol-2-karboksilne kiseline je konvertovan u boronat na način koji je analogan onom koji je opisan kod dobijanja Jedinjenja 6, Korak 3. Jedinjenje iz naslova je tada pripremljeno uz pomoć metoda koje su opisane kod dobijanja Jedinjenja 120, korak 4. LCMS: Rt = 1.06 min (95 %),mlz(ESI) 437 (M+H)<+>.

Jedinjenj e 79: 5-(8-(6-(4-Izopropilpiperazin-1 -il)piridin-3-ilamino)- [ 1,2,4] triazolo [1,5-a] pirazin-5-il)izoindolin-1 -on

Korak 1: Metil ester 4- bromo- 2- bromometil- benzoične kiseline

4-Bromo-2-metil-benzoična kiselina (4.6 g, 21.39 mmol) je rastvorena u 2 M HC1 u MeOH pa je refluksovana tokom 3 časa. Rastvarač je isparen sa ciljem da se dobije metil ester 4-bromo-2-metil-benzoične kiseline (4.24 g, 86 %). Intermedijer (18.51 mmol) je rastvoren u ugljen tetrahloridu (100 mL) pa je dodan N-bromosukcinimid (NBS) (5.57 g, 24.06 mmol). Tada je dodan AIBN (122 mg, 740 umol), a mešavina je pročišćena sa azotom tokom 5 min. Reakciona mešavina je tada refluksovana tokom 4 časa. Nakon hlađenja do sobne temperature, reakciona mešavina je filtrirana, a filtrat je isparen. Ostatak je purifikovan uz pomoć protočne hromatografije (silika gel, 2:1 petroleum eter/etil acetat) sa ciljem da se dobije jedinjenje iz naslova (3.42 g, 60 %).

Korak2: 5- Bromo- 2, 3- dihidro- izoindol- l- on

Metil ester 4-bromo-2-bromometil-benzoične kiseline (0.5 g, 16.2 mmol) je tretiran sa metanolnim amonijakom (10 mL, 7 N NH3u MeOH) tokom 5 min na 90° C. Nakon hlađenja do sobne temperature, pojavljuje se precipitat koji je sakupljen i opran sa malom količinom metanola sa ciljem da se dobije jedinjenje iz naslova u formi bezbojne tvrde materije (224 mg, 65 %). 'H-NMR (400 MHz, d6-DMSO) 8(ppm) 4.41 (2H, s), 7.64 (IH, d), 7.70 (IH, d), 7.87 (IH, s), 8.67 (IH, br s). LCMS: Rt 2.49 min, (99.6%),mlz(APCI) 212 (M+H)<+>.

Korak3: 5-( 4, 4, 5, 5- Tetrametil-[ l, 3, 2] dioksaborolan- 2- il)- 2, 3- dihidro- izoindol- l- on

5-Bromo-2,3-dihidro-izoindol-l-on (230 mg, 1.08 mmol), bis(pinakolato)diboron (300 mg, 1.18 mmol), PdCbdppf (25 mg, 31 (irnol) i KOAc (320 mg, 3.26 mmol) su suspendovani u dioksanu (4 mL), pročišćeni sa azotom tokom 5 min, a tada grejani na 85° C tokom noći. Rastvarač je odstranjenin vacuo,a ostatak je podeljen među etil acetata i vode. Vodeni sloj je ekstrahovan sa etil acetatom (3 x), a spojene organske faze su oprane još jednom sa slanim rastvorom, filtrirane kroz MgS04i isparene. Tvrdi ostatak je smrvljen sa heksanom i osušenin vacuosa ciljem da se dobije jedinjenje iz naslova (185 mg, 66 %) u formi sive tvrde materije. ^-NMR (400 MHz, CDCI3) 8(ppm) 1.37 (12H, s), 4.45 (2H, s), 6.38 (IH, br s), 7.87 (IH, d), 7.93 (2H, m).Korak 4: l- Izopropil- 4-( 5- nitro- piridin- 2- il)- piperazin

U rastvor 2-hloro-5-nitropiridina (2.5 g, 15.7 mmol) u THF (25 mL) dodani su 1-izopropilpiperazin (2.01 g, 15.7 mmol) i K2C03(3.25 g, 23.6 mmol). Reakciona mešavina je mešana na 50° C tokom 4 časa, a tada na 70° C tokom noći. Rastvarač je odstranjenin vacuo,a rezultujuća tvrda materija boje pomorandže je smrvljena uz upotrebu 10:1 petroleum eter-dietil etera. Izolovano jedinjenje (3.7 g, 94 %) je korišćeno u sledećem koraku bez dodatne purifikacije.

Korak 5: 6-( 4- lzopropil- piperazin- l- il)- piridin- 3- il- amin

l-Izopropil-4-(5-nitro-piridin-2-il)-piperazin (0.9 g, 3.6 mmol) je rastvoren u MeOH (20 mL) pa je dodan tin (II) dihlorid dihidrat (4 g, 18 mmol). Mešavina je ohlađena uz upotrebu vodene banje pa je dodana koncentrisana HC1 (4 mL). Reakcija je mešana na sobnoj temperaturi tokom noći. Nakon odstranjivanja metanola, rezultujući žuti rastvor je preveden od kiselog stanja u bazno uz upotrebu koncentrisane NaOH (pH 11) nakon čega nastaje beo precipitat. Tvrda materija je sakupljena uz pomoć filtracije, a voda je ekstrahovana uz pomoć dietil etera (5 x). Organski slojevi su sakupljeni, osušeni preko MgS04, filtrirani, koncentrisani pod vakumom sa ciljem da se dobije ulje boje pomorandže koje kristalizuje ako stoji, a sve sa ciljem da se dobije tvrda materija boje pomorandže (0.68 g, 86 %).Korak 6: 5- Bromo- 8-( 6-( 4- izopropilpiperazin- l- il) piridin- 3- il)-[ l, 2, 4] triazolo[ l, 5- a] pirazin- 8-amin

Ovo jedinjenje može da se dobije uz pomoć metoda koje su prikazane kod dobijanja Jedinjenja 6, korak 1, uz upotrebu 5,8-dibromo-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazina (0.188 g, 0.68 mmol), 6-(4-izopropil-piperazin-l-il)-piridin-3-ilamina (0.180 g, 0.816 mmol) i iV-etildiizopropil-amina (0.20 mL, 1.02 mmol) u 2-propanolu (2 mL). Purifikacija grubog materijala na silika gelu uz pomoć kolonske hromatografije i uz eluciju sa DCM, a nakon toga sa 95:5 DCM:MeOH dovodi do jedinjenja iz naslova u formi bledo kafene tvrde materije (260 mg, 92 %).

Korak 5: 5-( 8-( 6-( 4- Izopropilpiperazin- l- il) piridin- 3Mamino)-[ l, 2A] triazolo[ l, 5- a] pirazin- 5-

il) izoindolin- l- on

Ovo jedinjenje može da se dobije uz pomoć metoda koje su prikazane kod dobijanja Jedinjenja 6, korak 4, uz upotrebu 5-bromo-A<r->(6-(4-izopropilpiperazin-l-il)piridin-3-il)-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-8-amina (50 mg, 0.12 mmol), 5-(4,4,5,5-tetrametil-[l,3,2]dioksaborolan-2-il)-2,3-dihidro-izoindol-l-on (56 mg, 0.216 mmol) i Pd(PPh3)4(35 mg, 0.03 mmol) u 1.5 M Na2C03(0.64 mL) i dioksanu (2 mL). Grubi produkt je purifikovan na silika gelu preko kolonske hromatografije uz eluciju sa 95:5 DCM:MeOH, a nakon toga sa 90:10 DCM:MeOH. Jedinjenje iz naslova je dobiveno nakon trituracije sa mešavinom 10:1 «-hekasan:DCM (19 mg, 34 %). Konverzija u mesilatnu so uz pomoć 0.1 M metansulfonske kiseline (0.35 mL) daje jedinjenje iz naslova u formi žute tvrde materije (20 mg, 69 %). ^-NMR (400 MHz, d6-DMSO) 8(ppm) 1.34 (6H, d), 2.36 (6H, s, 2xMsOH), 3.16-3.21 (5H, m), 3.57 (2H, m), 4.45 (2H, d), 4.52 (2H, s), 7.11 (IH, d), 7.86 (IH, d), 8.01 (IH, s), 8.10 (IH, d), 8.24-8.29 (2H, m), 8.72 (IH, s), 8.76 (IH, s), 8.82 (IH, d), 9.39 (IH, br s), 10.21 (IH, s). LCMS: Rt 1.92 min (98.5%),mlz(APCI) 470

(M+H)<+>.

Jedinjenje 80: Amid 3-[8-(4-morfolin-4-ilfenilamino)-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-5-il]-benzo[b] tiofen-7-karboksilne kiseline

Korak 1: l- Bromo- 2-( 2- etoksivinilsulfanil) benzen

U rastvor 2-bromotiofenola (10.50 g, 55.87 mmol) u suvom DMF (50 mL) u uslovima atmosfere azota pažljivo je dodan kalijum karbonat (9.2 mL, 61.46 mmol, 1.10 ekvivalenata). Jednom kada otpočne stvaranje mehurića, dodaje se 2-bromo-l,l-dietoksietan (8.46 g, 61.46 mmol, 1.10 ekvivalenata), a mešavina je mešana tokom 2 časa na sobnoj temperaturi. Rezultujuća suspenzija je izlivena preko 200 mL ledene vode pa je ekstrahovana sa dietil eterom (3 x 50 mL). Organski slojevi su oprani sa slanim rastvorom, osušeni preko MgS04sa ciljem da se nakon odstranjivanja rastvarača dobije jedinjenje iz naslova u formi viskoznog ulja boje pomorandže, koje je korišćeno bez dodatne purifikacije.

Korak 2: 7- bromobenzo[ b] tiofen

l-Bromo-2-(2-etoksivinilsulfanil)benzen je rastvoren u hlorobenzenu (50 mL), a rastvor je grejan do 70° C. Tada je pažljivo dodan PPA (10.5 mL), a bifazna mešavina je grejana na 150° C tokom noći. Rezultujući tamni sirup je ostavljen da se ohladi, a rastvarač iz supernatanta je odstranjen uz pomoć pipete. Dodan je hlorobenzen (15 mL) u ostatak i sve je grejano na 150° C tokom 30 min. Rastvarač je ponovo odstranjen, a ostatak je opran sa malim količinama dihlorometana sve dok pranja nisu postala prozirna. Organske frakcije su spojene i filtrirane kroz celit sa ciljem da se dobije prozirni žuti rastvor. Koncentrisanje pod vakumom, a nakon toga procedura LC uz korišćenje cikloheksana kao eluenta dovodi do jedinjenja iz naslova u formi viskoznog bezbojnog ulja (1.21 g, 35%).

Korak 3: Etil ester benzo[ b] tiofen- 7- karboksilne kiseline

7-bromobenzo[b]tiofen (500 mg, 2.36 mmol) je rastvoren u suvom THF (5.0 mL) u atmosferi azota. Dodan je magnezijum u nekoliko rundi (530 mg, 2.83 mmol, 1.20 ekvivalenata), a nastala mešavina je grejana pod refluksom do potpunog rastvaranja magnezij uma. Rezultujući gusti žuti rastvor je ostavljen da se ohladi do sobne temperature pa je dodan dietil karbonat (2 mL, u suvišku), a sa mešanjem je nastavljeno tokom još jednog časa, nakon čega je dodan amonijum hlorid (10 % vodeni rastvor). Rezultujuća mešavina je podeljena među DCM i vode, a vodeni sloj je ekstrahovan sa DCM. Organske frakcije su spojene, oprane sa slanim rastvorom, osušene preko Na2S04i apsorbovane na silika. Purifikacija sa LC uz upotrebu 8/2

cikloheksan/dihlorometana kao eluenta dovodi do jedinjenja iz naslova u formi ulja boje svetle pomorandže (346.2 mg, 71%).

Korak 4: Benzo[ b] tiofen- 7- karboksilna kiselina

U rastvor etil estera benzo[b]tiofen-7-karboksilne kiseline (1.0 g, 48 mmol) u metanolu (10 mL) i vodi (10 mL) je dodan natrijum hidroksid (5 g, u suvišku). Rastvor je mešan na sobnoj temperaturi tokom 30 min, kada je sav ester već istrošen. Reakciona mešavina je podešena do pH 1 uz dodavanje 6 M rastvora HC1 i sve je ekstrahovano sa DCM. Spojeni organski slojevi su filtrirani kroz silika zapušač sa ciljem da se dobije jedinjenje iz naslova u formi žute tvrde materije (505.2 mg, 59 %).

Korak 5: Amid benzo[ b] tiofen- 7- karboksilne kiseline

Rastvor benzo[b]tiofen-7-karboksilne kiseline (505 mg, 2.84 mmol) u dihlorometanu (10 mL) je mešan na sobnoj temperaturi pa je dodan tionil hlorid (669 mg, 5.68 mmol, 2.0 ekvivalenta), a nakon toga DMF (0.06 mL) šta uzrokuje oslobađanje gasa. Rezultujući rastvor je mešan na sobnoj temperaturi tokom 1 časa. Tada je pažljivo dodan vodeni amonijak (10 mL) u mešavinu šta uzrokuje naglo oslobađanje gasa. Rezultujuća mešavina je tada razređena sa vodom (50 mL), a pH je doveden do neutralnog uz pomoć dodavanja zasićenog NaHCC>3 (vodeni rastvor). Vodeni sloj je ekstrahovan sa DCM, a organski slojevi su spojeni i osušeni preko Na2SC»4. Isparavanje rastvarača u uslovima smanjenog pritiska dovodi do jedinjenja iz naslova (81 % čistoće) u formi žute tvrde materije (500 mg, 98 %) koje je korišćeno bez dodatne purifikacije.

Korak 6: Amid 3- bromobenzo[ b] tiofen- 7- karboksilne kiseline

Rastvor amida benzo[b]tiofen-7-karboksilne kiseline (500 mg, 2.82 mmol) u dihlorometanu (5 mL) je mešan na sobnoj temperaturi pa je dodana sirćetna kiselina (5 mL), a nakon toga NBS (750 mg, 4.23 mmol, 1.5 ekvivalenta). Reakcija je mešana na sobnoj temperaturi tokom 1 časa kod koje tačke analiza uz pomoć LC-MS pokazuje potpunu konverziju startnog materijala u željeno jedinjenje (79 %) i dibrominovani materijal (21 %). Reakcija je razređena sa vodom (50 mL), neutralizovana sa vodenim rastvorom kalijum disulfita, a nakon toga sa natrijum bikarbonata. Vodeni sloj je tada ekstrahovan sa dihlorometanom, a nastali organski slojevi su spojeni, oprani sa slanim rastvorom, osušeni preko NajSCMi ispareni. Grubi materijal je purifikovan uz pomoć LC koristeći DCM kao eluent sa ciljem da se dobije jedinjenje iz naslova u formi bele tvrde materije (300 mg, 41%).

Korak 7: Amid 3-( 4, 4, 5, 5- tetrametil[ l, 3, 2] dioksaborolan- 2- il) benzo[ b] tiofen- 7- karboksilne

kiseline

Rastvor amida 3-bromobenzo[b]tiofen-7-karboksilne kiseline (300 mg, 1.18 mmol) u dioksanu (5 mL) je mešan u uslovima azota. Dodani su Pd(dppf)Cl2(29 mg, 3 mol%), kalijum acetat (230 mg, 2.35 mmol, 2.0 ekvivalenta) i bispinakolatodiboron (450 mg, 1.77 mmol, 1.5 ekvivalenta), a reakcija je grejana do 80° C i mešana tokom noći. Rezultujuća suspenzija boje pomorandže je razređena sa DCM, filtrirana kroz celit i koncentrisana pod vakumom sa ciljem da se dobije ulje koje se koristi u sledećem koraku bez dodatne purifikacije.

Korak 8: Amid 3-[ 8-( 4- morfolin- 4- il- fenilamino)-[ l, 2, 4] triazolo[ l, 5- a] pirazin- 5- il]-benzofbJtiofen- 7- karboksilne kiseline

Ovo jedinjenje može da se dobije uz pomoć metoda koje su prikazane kod dobijanja Jedinjenja 120, Korak 4. !H-NMR (400 MHz, d^-DMSO) 5(ppm) 3.19 (4H, br s), 3.76 (4H, br s), 5.70 (IH,

d), 7.12 (2H, m), 7.43 (IH, t), 7.63 (IH, br s), 7.76-7.80 (2H, m), 7.92 (IH, d), 8.03 (IH, d), 8.21 (IH, s), 8.28 (IH, s), 8.6 (IH, s), 10.09 (IH, s). LCMS: Rt = 1.01 min (95%),mlz(ESI) 472

(M+H)<+>.

Jedinjenje 81: Amid 3-{8-[4-(4-izopropilpiperazin-l-il)fenilamino]-[l,2,4]triazolo[l,5-a] pirazin-5-iI} benzo[b]tiofen-7-karboksiIne kiseline

Ovo jedinjenje može da se dobije uz pomoć metoda koje su prikazane kod dobijanja Jedinjenja 80, uz upotrebu (5-bromo[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-8-il)-[4-(4-izopropilpiperazin-l-il)-fenil]amina u finalnom koraku. LCMS: rt = 0.94 min (95 %), m/z (ESI) 513 (M+H)<+>.

Jedinjenje 83: (4-{8-[4-(4-Izopropilpiperazin-l-il)-fenilamino]-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-5-il}piridin-2-il)metanol

Korak 1: 4- Bromo- 2- metilpiridin- l- oksid

Rastvor 4-bromo-2-metilpiridina (5 g, 29 mmol) u DCM (20 mL) je ohlađen do 0° C pa je dodana tm-CPBA (7.55 g, 43.87 mmol, 1.5 ekvivalenta) deo po deo tokom 30 min. Tada je ledena banja odstranjena, a mešavina je ostavljena da se meša na sobnoj temperaturi tokom 3 časa. Rezultujući rastvor je razređen sa natrijum bikarbonatom (zasićeni vodeni rastvor) i ekstrahovan sa DCM. Organski slojevi su spojeni, oprani sa natrijum bikarbonatom (zasićeni vodeni rastvor), osušeni preko Na2S04, a sve je koncentrisano pod vakumom sa ciljem da se dobije jedinjenje iz naslova u formi ulja boje svetle pomorandže koje je korišćeno bez dodatne purifikacije.

Korak 2: 4- Bromopiridin- 2- ilmetil ester sirćetne kiseline

U rastvor 4-bromo-2-metilpiridin-l-oksida (4.00 g, 21.40 mmol) u DCM (20 mL) je dodan sirćetni anhidrid (6 mL). Mešavina je mešana na sobnoj temperaturi tokom 1 časa, a tada je grejana kod refluksa tokom noći. Rastvarač je odstranjen pod vakumom, a grubi produkt je filtriran kroz zapušač od celita uz eluciju sa DCM sa ciljem da se dobije jedinjenje iz naslova u formi ulja boje pomorandže (815 mg).

Korak 3: 4-( 4, 4, 5, 5- Tetrametil-[ l, 3, 2Jdioksaborolan- 2- il) piridin- 2- ilmetil ester sirćetne kiseline

Rastvor 4-bromopiridin-2-ilmetil estera sirćetne kiseline (800 mg, 3.49 mmol) u dioksanu (5 mL) je mešan u uslovima azota. Dodani su Pd(dpp£)Cl2(85 mg, 3 mol%), kalijum acetat (1.03 g, 10.5 mmol, 3.0 ekvivalenta) i bispinakolatodiboron (1.33 g, 5.24 mmol, 1.5 ekvivalenta), a reakcija je grejana na 80° C tokom noći. Rezultujuća suspenzija boje pomorandže je razređena sa DCM, filtrirana kroz celit i koncentrisana pod vakumom sa ciljem da se dobije ulje koje se koristi u sledećem koraku bez dodatne purifikacije.

Korak 4: 4-{ 8-[ 4-( 4- Izopropil- piperazin- 14l)- fenilamino]-[ l, 2, 4] triazolo[ l, 5- a] piazin- 5- U^

piridin- 2- ilmetil ester sirćetne kiseline

Suspenzija (5-bromo-[l ,2,4]triazolo[ 1,5-a]pirazin-8-il)-[4-(4-izopropil-piperazin-1 -il)fenil]amina (300 mg, 0.723 mmol) i Pd(dppf)Cl2(59 mg, 10 mol%) u 4/1 dioksan/vodi (5 mL) je mešan na sobnoj temperaturi pa je dodan kalijum karbonat (200 mg, 1.45 mmol, 2.0 ekvivalenta) i 4-(4,4,5,5-tetrametil-[l,3,2]dioksaborolan-2-il)piridin-2-ilmetil ester sirćetne kiseline (300 mg, 1.08 mmol, 1.5 ekvivalenta). Rezultujuća mešavina je grejana na 85° C tokom noći. Rezultujući rastvor je podeljen među dihlorometana i vode, a organski sloj je koncentrisan na silika gelu i purifikovan uz pomoć kolonske hromatografije (98/2 DCM/MeOH) sa ciljem da se dobije jedinjenje iz naslova u formi žute tvrde materije. LCMS: Rt = 0.78 min (100%),mlz445

(M+H)<+>.

Korak 5: ( 4-{ 8-[ 4-( 4- Izopropilpiperazin- l- il) fenilamino]-[ l, 2, 4] triazolo[ l, 5- a] pirazin- 5-

il} piridin- 2- il) metanol

4-{8-[4-(4-Izopropilpiperazin-1-il)fem ester sirćetne kiseline je mešan na sobnoj temperaturi tokom noći u 10 mL 1.5 M rastvora kalijum karbonata u metanolu. pH je tada doveden do neutralnog uz pomoć dodavanja 10 % vodenog rastvora limunske kiseline, a mešavina je ekstrahovana sa DCM. Purifikacija uz pomoć LC i uz korišćenje 98/2 DCM/2 M NH3u MeOH kao eluenta dovodi do jedinjenja iz naslova u

formi žutog pudera (40.3 mg, 12.5 % tokom 2 koraka). 'H-NMR (400 MHz, oVDMSO) 6(ppm) 1.02 (6H, m), 2.33 (IH, m), 2.60 (4H, br m), 3.10 (4H, br m), 4.65 (2H, d), 5.51 (IH, t), 6.96 (2H, d), 7.84-7.89 (3H, m), 8.11 (IH, s), 8.17 (IH, m), 8.61 (IH, d), 8.73 (IH, m), 10.08 (IH, s). LCMS: Rt = 0.78 min (100%),mlz(ESI) 445 (M+H)<+>.

Jedinjenje 84: [4-(l-Izopropilpiperidin-4-il)fenil]-[5-(lH-pirazol-4-il)-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-8-il]amin

Ovo jedinjenje može da se dobije uz pomoć metoda koje su prikazane kod dobijanja Jedinjenja 92, uz upotrebu pirazol-4-boronične kiseline u koraku 4. LCMS: Rt 0.89 min (100 %)mlz(ESI) 403 (M+H)<+>.

Jedinjenje 86: 4-(8-(6-(4-Izopropilpiperazin-l-iI)piridin-3-ilamino)-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-5-il)furan-2-karboksamid

Korak 1: Amid 4- bromo- furan- 2- karboksilne kiseline

U rastvor 4,5-dibromo-furan-2-karboksilne kiseline (7.79 g, 28.85 mmol) u NH4OH (100 mL) je dodana cinkova prašina (2.29 g, 34.62 mmol) u malim porcijama. Reakciona mešavina je mešana na sobnoj temperaturi tokom 7 min, a tada je filtrirana preko celita i oprana sa vodom i 2 M HC1. Filtrat je doveden do kiselog stanja od pH 1 uz upotrebu koncentrisane HC1 i ekstrahovan sa etil acetatom (3 x). Organska faza je oprana sa slanim rastvorom, osušena preko MgS04, filtrirana i koncentrisanain vacuosa ciljem da se dobije ulje (4.96 g) koje postaje tvrdo ako stoji, a sa ciljem da se dobije bela tvrda materija, koja se koristi bez dodatne purifikacije.

Tvrda materija (4.93 g, 25.81 mmol) je rastvorena u tionil hloridu (44.2 mL) i refluksovana tokom 1 časa. Nakon odstranjivanja rastvaračain vacuo,ostatak je rastvoren u dihlorometanu (75 mL), pa je dodan 0.5 M rastvor NH3u dioksanu (52 mL). Reakciona mešavina je mešana na sobnoj temperaturi tokom 1 časa, a tada je dodan 33 % vodeni rastvor NH3(5 mL), a reakciona mešavina je mešana dodatna 2 časa. Rastvarač je odstranjenin vacuo,a ostatak je rastvoren u zasićenom rastvoru NaHC03. Osnovni rastvor je ekstrahovan uz pomoć etil acetata (3 x), spojeni organski slojevi su osušeni preko MgS04i koncentrisaniin vacuo.Purifikacija na silika gelu uz pomoć kolonske hromatografije i uz eluciju sa mešavinom (50:49:1) etil acetat:petroleum eter: sirćetnom kiselinom dovodi do jedinjenja iz naslova (1.2 g, 22 %).

Korak 2: Amid 4-( 4, 4, 5, 5- tetrametil-[ l, 3, 2] dioksaborolan- 2- il) furan- 2- karboksilne kiseline

Amid 4-bromo-furan-2-karboksilne kiseline (1.2 g, 6.32 mmol), bis(pinakolato)diboron (1.76 g, 6.94 mmol), PdCl2dppf (0.154 g, 189 mol) i KOAc (1.85 g, 18.94 mmol) su suspendovani u dioksanu (20 mL), pročišćeni su sa azotom tokom 5 min, a tada su grejani na 90° C tokom noći. Rastvarač je odstranjenin vacuo,a ostatak je podeljen među etil acetata i vode. Vodeni slojevi su ekstrahovani tri puta sa etil acetatom, a spojene organske faze su oprane sa slanim rastvorom, filtrirane kroz MgS04i isparene. Tvrdi ostatak je smrvljen sa heksanom i osušenin vacuosa ciljem da se dobije jedinjenje iz naslova u formi tvrde materije (0.984 g, 66 %).

Korak 3: 4-( 8-( 6-( 4- Izopropilpiperazin- 14l) piridin- 3- ilamino)-[ l, 2, 4] triazolo[ l, 5- a] pirazin- 5-

il) furan- 2- karboksamid

Ovo jedinjenje može da se dobije uz pomoć metoda koje su prikazane kod dobijanja Jedinjenja 6, korak 4 uz upotrebu 5-bromo-8-(6-(4-izopropilpiperazin-l-il)piridin-3-il)-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-8-amina (60 mg, 0.144 mmol), amida 4-(4,4,5,5-tetrametil-[l,3,2]dioksaborolan-2-il)-furan-2-karboksilne kiseline (59 mg, 0.26 mmol) i Pd(PPh3)4(42 mg, 0.036 mmol) u 1.5 M Na2C03(0.8 mL, 1.15 mmol) i dioksanu (2 mL). Nakon isparavanja rastvarača, grubi materijal je purifikovan na silika gelu uz pomoć kolonske hromatografije i uz upotrebu DCM, a nakon toga 97.5:2.5 i 95:5 DCM:NH3(7 M u MeOH). Jedinjenje iz naslova je dobiveno u formi žute tvrde materije (30 mg, 47 %).<!>H-NMR (400 MHz, d6-DMSO) 8(ppm) 1.05 (6H, d), 2.54-2.59 (4H, m), 2.70-2.74 (IH, m), 3.47 (4H, m), 6.90 (IH, d), 7.60 (IH, br s), 7.91 (IH, s), 7.99 (IH, br s), 8.12 (IH, dd), 8.19 (IH, s), 8.68 (IH, s), 8.75 (IH, s), 8.81 (IH, s), 10.03 (IH, s). LCMS: Rt 2.64 min (98.1%),mlz(APCI) 406 (M+H)<+>. LCMS: Rt 2.74 min (93%),mlz(ES<+>) 448 (M+H)<+>.

Jedinjenje 88: 4-(8-(4-(4-Izopropilpiperazin-l-il)fenilamino)-[ 1,2,4]triazolo [1,5-a] pirazin-5-

il)furan-2-karboksamid

Korak 1: l- Izopropil- 4-( 4- nitro- fenil)- piperazin

U rastvor 4-fluoronitrobenzena (5 g, 35.4 mmol) u THF (50 mL), dodani su 1-izopropilpiperazin (4.54 g, 35.4 mmol) i K2C03(7.35 g, 53.2 mmol). Reakciona mešavina je mešana na sobnoj temperaturi tokom noći. Rastvarač je odstranjenin vacuo,a ostatak je podeljen među EtOAc i vode. Organski sloj je opran sa slanim rastvorom, osušen preko MgS04, filtriran i koncentrisan. Grubi produkt je purifikovan na silika gelu uz pomoć kolonske hromatografije i uz upotrebu 99:1 i 98:2 DCM:NH3(7 M u MeOH) sa ciljem da se dobije jedinjenje iz naslova (8.2 g, 94 %).

Korak 2: 4-( 4- Izopropil- piperazin- l- il)- fenilamin

l-Izopropil-4-(4-nitro-fenil)-piperazin (8.3 g, 33.2 mmol) je rastvoren u MeOH (120 mL) pa je dodan tin (II) dihlorid dihidrat (37.4 g, 0.165 mol). Mešavina je ohlađena uz pomoć vodene banje pa je dodana koncentrisana HC1 (36 mL). Reakcija je mešana na sobnoj temperaturi tokom noći. Nakon odstranjivanja metanola, rezultujući rastvor je doveden u bazno stanje uz pomoć koncentrisanog NaOH (pH 11). Vodena faza je ekstrahovana sa dietil eterom (3 x), a organski slojevi su spojeni, osušeni preko MgS04, filtrirani, koncentrisaniin vacuosa ciljem da se dobije jedinjenje iz naslova (6.4 g, 88 %).Korak 3 ( 5- Bromo- f1, 2, 4] triazolo[ l, 5- a] pirazin- 8- il)-[ 4-( 4- izopropil- piperazin- l- il)- fenil]- amin

Ovo jedinjenje može da se dobije uz pomoć metoda koje su prikazane kod dobijanja Jedinjenja 6, korak 1, uz upotrebu 5,8-dibromo-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazina (2 g, 7.20 mmol), 4-(4-izopropil-piperazin-l-il)-fenilamina (1.89 g, 8.62 mmol) i iV^iV-diizopropiletilamina (1.88 mL, 10.8 mmol) u 2-propanolu (30 mL) koji su mešani na 95° C tokom noći. Jedinjenje iz naslova je izolovano nakon trituracije sa dietil eterom i petroleum eterom u formi sive tvrde materije (2.59 g, 87%).

Korak 4: 4-( 8-( 4-( 4- Izopropilpiperazin- l- il) fenilamino)-[ l, 2, 4] triazolo[ l, 5- a] pirazin- 54l) fur^

2- karboksamid

Ovo jedinjenje može da se dobije uz pomoć metoda koje su prikazane kod dobijanja Jedinjenja 6, korak 4, uz upotrebu 5-bromo-A^-(6-(4-izopropilpiperazin-l-il)piridin-3-il)-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-8-amina (80 mg, 0.21 mmol), amida 4-(,4,4,5,5-tetrametil-[l,3,2]dioksaborolan-2-il)-furan-2-karboksilne kiseline (101 mg, 0.42 mmol) i Pd(PPh3)4(62 mg, 0.053 mmol) u 1.5 M Na2C03(vodeni rastvor) (1.143 mL, 1.71 mmol) i dioksanu (4 mL). Grubi materijal je purifikovan na silika gelu uz pomoć kolonske hromatografije i uz eluciju sa DCM i 97:3 DCM:NH3(7 M u MeOH). Jedinjenje iz naslova je izolovano nakon trituracije sa dietil eterom (35.4 mg, 42 %). Konzervisanje u mesilatnu so uz upotrebu 1 M metansulfonske kiseline u MeOH (0.0793 mL) dovodi do jedinjenje iz naslova u formi tvrde materije (35 mg). H-NMR (400 MHz, oVDMSO) 8(ppm) 1.35 (6H, d), 2.35 (3H, s, MsOH), 3.01 (2H, t), 3.22-3.35 (2H, m), 3.58 (3H, m), 3.88 (2H, d), 7.09 (2H, d), 7.61 (IH, br s), 7.94 (2H, m), 8.00 (IH, br s), 8.22 (IH, s), 8.76 (IH, s), 8.82 (IH, s), 9.27 (IH, br s), 10.02 (IH, s). LCMS: Rt 2.02 min (98.9%),mlz(APCI) 447 (M+H)<+>.

Jedinjenje 89: Amid 4-{8-[4-(l-izopropilpiperidin-4-iI)fenilamino]-[l,2,4]triazolo[l,5-a] pirazin-5-il}-tiofen-2-karboksilne kiseline

Ovo jedinjenje može da se dobije uz pomoć metoda koje su prikazane kod dobijanja Jedinjenja 92, uz upotrebu 2-(aminokarbonil)tiofen-4-boronične kiseline u koraku 4. LCMS: Rt 0.94 min (100 %)mlz(ESI) 462 (M+H)<+>.

Jedinj enj e 90: (4-{8- [6-(4-Izopropilpiperazin-1 -il)pi ridin-3-ilamino] - [ 1,2,4] triazolo [ 1,5-a]pirazin-5-il}piridin-2-il)metanol

Ovo jedinjenje može da se dobije uz pomoć metoda koje su prikazane kod dobijanja Jedinjenja 83, uz upotrebu (5-bromo-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-8-il)-[6-(4-izopropilpiperazin-l-il)piridin-3-il]amina u Koraku 4. LCMS: Rt = 0.71 min (95 %),mlz(ESI) 446 (M+H)<+>.

Jedinjenje 92: 5-{8-[4-(I-lzopropilpiperidin-4-il)fenilamino]-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-5-

il}-2,3-dihidroizoindol-l-on

Korak 1: l- Izopropil- 4-( 4- nitrofenil) piperidin

4-(4-Nitrofenil)piperidin (250 mg, 1.21 mmol), K2C03(170 mg, 1.21 mmol) i 2-jodopropan (240 uL, 2.4 mmol) su mešani u acetonitrilu (3 mL) u zatvorenom sudu na 120° C tokom 45 min. Mešavina je ohlađena, a rastvarač je odstranjen pod redukovanim protoskom. Ostatak je podeljen među DCM (20 mL) i vode (5 mL), slojevi su odvojeni, a DCM je opran sa vodom (5 mL) i slanim rastvorom (5 mL) i osušen preko MgS04. Isparavanje rastvarača dovodi do jedinjenja iz naslova (300 mg) koje se koristi bez dodatne purifikacije.

Korak 2: 4-( l- Izopropilpiperidin— 4- il) fenilamin

Hidrazin (35 % težinskih u vodi, 0.67 mL, 7.2 mmol) i 10 % Pd/C (38 mg, 0.03 mmol) su dodani u rastvor l-izopropil-4-(4-nitrofenil)piperidina (180 mg, 0.72 mmol) u EtOH (10 mL), a mešavina je grejana kod refluksa tokom 3 časa. Nakon hlađenja, mešavina je filtrirana kroz celit, a rastvarač je isparen. Ostatak je ponovo rastvoren u DCM (25 mL), osušen preko MgS04, a ostatak je isparen sa ciljem da se dobije željeno jedinjenje u formi bledo žute tvrde materije (113 mg, 0.52 mmol) koje je korišćeno bez dodatnog pročišćavanja.

Korak 3: ( 5- Bromo-[ 1, 2, 4Jtriazolof1, 5] pirazin- 8- il)-[ 4- izopropilpiperidin- 4- ilJamin iV^V-Diizopropiletilamin (200 uL, 1.2 mmol) je dodan u mešavinu 4-(l-izopropilpiperidin-4-il)fenilamina (220 mg, 1.0 mmol) i 5,8-dibromo-[l,2,4]tirazolo[l,5-a]pirazina (280 mg, 1.0 mmol) u 'PrOH (5 mL) pa je sve grejano kod refluksa tokom 48 časa. Mešavina je ohlađena, a rastvarač je isparen pod smanjenim pritiskom sa ciljem da se dobije tvrda materija boje tamne pomorandže. Ona je podeljena među DCM (50 mL) i vode (20 mL), a slojevi su odvojeni. Organska faza je oprana sa limunskom kiselinom (10 % vodeni rastvor, 3 x 25 mL). Spojena ispiranja su ekstrahovana sa DCM (25 mL) i prevedena u bazno stanje uz pomoć dodavanja NaHC03(zasićeni rastvor). Mešavina je ekstrahovana sa DCM (3 x 25 mL), a spojeni ekstrakti su osušeni preko MgS04i ispareni. Grubi materijal je purifikovan uz pomoć hromatogtafije na silika gelu uz eluciju sa 5 % - 10 % MeOH u DCM sa ciljem sa se dobije željeno jedinjenje, koje je kontaminirano sa startnim anilinom. Jedinjenje je ponovo kristalizovano iz MeOH sa ciljem da se dobije čisto jedinjenje iz naslova (110 mg).

Jedinjenje može da se koristi za preparaciju 5-{8-[4-(l-izopropilpiperidin-4-il)fenilamino]-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-5-il}-2,3-dihidroizoindol-l-on na način koji je analogan načinu iz koraka 4 kao šta je opisano za Jedinjenje 79.

LCMS: Rt 0.91 min (100 %)mlz(ESI) 468 (M+H)<+>.

Jedinjenje 100: l-(4-(5-(lH-Pirazol-4-il)-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-8-

ilamino)feniI)piperazin-2-on

Korak 1: Tert- butil ester 4-( 4- amino- fenil)- 3- okso- piperazin- l- karboksilne kiseline

Suspenzija p-jodo-anilina (918 mg, 4.8 mmol),tert-butilestera 3-okso-piperazin-l-karboksilne kiseline (960 mg, 4.2 mmol) (7i?,2/?)-cikloheksan-l,2-diamina (0.05 mL, 0.42 mmol), bakar (I) jodida (14.9 mg,0.0042 mmol) i K2CO3(1.19 g, 2.04 mmol) u dioksanu (4 mL) je pročišćena sa azotom tokom 5 min u reakcionoj tubi. Tuba je zatvorena, a reakciona mešavina je grejana na 119° C tokom 15 časova. Nakon hlađenja do sobne temperature, reakciona mešavina je filtrirana kroz punjenje silike uz ispiranje sa etil acetatom (40 mL). Filtrat je koncentrisanin vacuosa ciljem da se dobije jedinjenje iz naslova u formi kafene tečnosti (1.06 g, 87 %). LCMS: Rt 0.88 min (91 %).

Korak 2:1 -[ 4-( 5- Bromo-[ 1. 2, 4] triazolo[ 1, 5- a] pirazin- 8- ilamino)- fenilJ- piperazin- 2- on

Ovo jedinjenje može da se dobije uz pomoć metoda koji su prikazani kod dobijanja Jedinjenja 6, korak 1, uz upotrebu 5,8-dibromo-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazina (0.283 g, 1.00 mmol),tert-butilestera 4-(4-amino-fenil)-3-okso-piperazin-l-karboksilne kiseline (0.300 g, 1.00 mmol) iN-etildiizopropil-amina (0.20 mL, 1.02 mmol) u 2-propanolu (1 mL). Purifikacija grubog materijala na silika gelu uz pomoć kolonske hromatografije i uz eluciju sa DCM, a nakon toga sa 98:2 DCM:MeOH dovodi dotert-butilestera 4-[4-(5-bromo-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-8-ilamino)-fenil]-3-okso-piperazin-l-karboksilne kiseline u formi bele tvrde materije (0.252 g, 51<%>)<.>

Rastvortert-butilestera 4-[4-(5-bromo-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-8-ilamino)-fenil]-3-okso-piperazin-l-karboksilne kiseline (0.252 mg, 0.6 mmol) u 2:1 DCM:TFA (4.8 mL) je mešan tokom 1 časa na sobnoj temperaturi. Mešavina je tada razređena sa DCM i dovedena u bazno stanje uz pomoć zasićenog NaHCOs. Vodeni sloj je ekstrahovan sa DCM (3 x), a organski slojevi su spojeni, osušeni preko MgS04, filtrirani i koncentrisani sa ciljem da se dobije jedinjenje iz naslova u formi tvrde materije (180 mg, 78 %).

Korak 3: l-( 4-( 5-( lH- Pirazol- 4- il)-[ 1, 2, 4Jtriazolof1, 5- a] pirazin- 8- ilamino) fenil) piperazin- 2- on

Ovo jedinjenje može da se dobije uz pomoć metoda koji su prikazani kod dobijanja Jedinjenja 1, korak 5 uz upotrebu l-[4-(5-bromo41,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-8-ilamino)-fenil]-piperazin-2-on (70 mg, 0.18 mmol), 4-(4,4,5,5-tetrametil-l,3,2-dioksaborolan-2-il)-lH-pirazola (64 mg, 0.33 mmol), Pd(PPh3)4(21 mg, 18 umol) i NaO'Bu (70 mg, 0.72 mmol) u 2 mL 3:1 rastvor DMF/vode. Reakciona mešavina je koncentrisana pod vakumom, a ostatak je purifikovan na silika gelu uz pomoć kolonske hromatografije i uz eluciju sa gradijentom od 99:1 do 90:10 DCM:NH3(7 M u MeOH). Jedinjenje iz naslova je izolovano u formi bledo zelene tvrde materije (13 mg, 19 %). 'H-NMR (400 MHz, d6-DMSO) 5(ppm) 3.05 (2H, m), 3.42 (2H, s), 3.62 (2H, m), 7.32 (2H, d), 8.07 (2H, d), 8.26 (IH, s), 8.39 (IH, br s), 8.67 (IH, br s), 8.81 (IH, s), 10.05 (IH, s), 13.32 (IH, br s). LCMS: Rt 6.98 min (92.4%),mlz(APCI) 376 (M+H)<+>.

Jedinjenje 102: 5-{8-I4-(4-tert-Butil-piperazin-l-il)-fenilamino]-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-5-il}-2,3-dihidro-izoindoI-l-on

Korak 1: l- tert- Butil- 4-( 4- nitro- fenil)- piperazin

U rastvor l-fluoro-4-nitro-benzena (314 mg, 2.23 mmol) i 4-terr-butilpiperazina (1 g, 3.34 mmol) u dioksanu (15 mL) je dodan K2CO3(1.65 mg, 11.9 mmol), a reakcija je mešana na 130° C tokom noći. Rastvarač je isparen pod vakumom, a ostatak je podeljen među etil acetata i vode. Organski sloj je opran sa slanim rastvorom, osušen preko MgS04, filtriran i koncentrisan sa ciljem da se dobije grubo jedinjenje. Purifikacija na silika gelu uz pomoć kolonske hromatografije i uz eluciju sa DCM, a nakon toga sa 99:1 DCM:NH3(7 M u MeOH) dovodi do jedinjenje iz naslova (348 mg, 55.4 %). LCMS: Rt 3.87 min (99%).

Korak 2: 4-( 4- tert- Buil- piperazin- l- il)- fenilamin

l-ter/-Butil-4-(4-nitro-fenil)-piperazin (348 mg, 1.32 mmol) je rastvoren u MeOH (10 mL) pa je dodan tin (II) dihlorid dihidrat (1.08 g, 4.79 mmol). Mešavina je ohlađena uz pomoć vodene banje pa je dodana koncentrisana HC1 (3 mL). Reakcija je mešana na 40° C tokom noći. Nakon odstranjivanja metanola, rezultujući rastvor je doveden u bazno stanje uz pomoć koncentrisanog NaOH (pH 11). Vodena faza je ekstrahovana sa dietil eterom (3 x), a organski slojevi su spojeni, osušeni preko MgS04, filtrirani i koncentrisaniin vacuosa ciljem da se dobije jedinjenje iz naslova (308 mg, 99 %) koje se koristi u sledećem koraku bez dodatne purifikacije. LCMS: Rt 2.16 min (87%).Korak 3: ( 5- Bromo- fl, 2, 4] triazolo[ l, 5- a] pinazin- 8- il)-[ 4-( 4- tert- butil- piperazin- l- il)- fenil]-amin

Ovo jedinjenje može da se dobije uz pomoć metoda koji su prikazani kod dobijanja Jedinjenja 6, korak 1, uz upotrebu 5,8-dibromo-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazina (0.308 g, 1.107 mmol),4-( 4- tert-butil-piperazin-l-il)-fenilamina (0.310 g, 1.33 mmol) i jV-etildiizopropil-amina (0.289 mL, 1.66 mmol) u 2-propanolu (5 mL). Reakciona mešavina je podeljena među DCM i 1 N NaOH, organski sloj je odvojen i opran sa vodom i slanim rastvorom, osušen preko MgS04, filtriran i koncentrisan pod vakumom. Trituracija ostatka sa dietil eterom i petroleum eterom dovodi do jedinjenja iz naslova (440 mg, 92 %) u formi kremove tvrde materije. LCMS: Rt 2.25 min (96%).

Korak 4: 5-( 8- f4-( 4- tert- Butil- piperazin- 1 - U)- fenilamino]-[ l, 2, 4Jtriazolof1, 5- a] pirazin- 5- il} 2, 3-

dihidro- izoindol- l- on

Ovo jedinjenje može da se dobije uz pomoć metoda koje su prikazane kod dobijanja Jedinjenja 6, korak 4, (5-bromo-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-8-il)-[4-(4-et^butil-piperazin-l-il)-fenil]-amin (100 mg, 0.232 mmol), 5-(4,4,5,5-tetrametil-[l,3,2]dioksaborolan-2-il)-2,3-dihidro-izoindol-l-on (90 mg, 0.32 mmol) i Pd(PPh3)4(67 mg, 0.058 mmol) u 1.5 M Na2C03(vodeni rastvor) (1.24 mL) i dioksanu (3.7 mL). Reakciona mešavina je podeljena među etil acetata i slanog rastvora, organski sloj je ekstrahovan, osušen preko MgS04filtriran i isparenin vacuo.Ostatak je purifikovan na silika gelu uz pomoć kolonske hromatografije i uz eluciju sa 98:2 DCM:NH3(7 M u MeOH), a nakon toga sa 95:5 DCM:NH3(7 M u MeOH) sa ciljem da se dobije tvrda materija koja je smrvljena sa dietil eterom i petroleum eterom sa ciljem da se dobije jedinjenje iz naslova (71 mg, 63 %). 'H-NMR (400 MHz, de-DMSO) 6(ppm) 1.43 (9H, s), 2.36 (3H, s, MsOH), 3.02 (2H, m), 3.19-3.26 (2H, m), 3.67 (2H, d), 3.90 (2H, d), 4.52 (2H, s), 7.10 (2H, d), 7.86 (IH, d), 7.96-8.01 (3H, m), 8.10 (IH, d), 8.24 (IH, s), 8.72 (IH, s), 8.75 (IH, s), 9.09 (IH, br s), 10.09 (IH, s). LCMS: Rt 2.07 min (99%),mlz(APCI) 483 (M+H)<+>.

Jedinjenje 105: 5-{8-[4-(2-Okso-piperazin-l-il)fenilamino]-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-5-

il}-2,3-dihidro-izoindol-l-on

Korak 1: Tert- butil ester 3- okso- 4-{ 4-[ 5-( l- okso- 2, 3- dihidro- lH- izoindol- 5- il)-[ 1, 2, 4Jtriazolof1, 5- aJpirazin- 8- ilaminoJ- fenil} - piperazin- 1- karboksilne kiseline

Ovo jedinjenje može da se priredi uz pomoć metoda koji su opisani kod pripreme Jedinjenja 6, korak 4, uz upotrebutert-butilestera 4-[4-(5-bromo-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-8-ilamino)-fenil]-3-okso-piperazin-l-karboksline kiseline (115 mg, 0.24 mmol), 5-(4,4,5,5-tetrametil-[l,3,2]dioksaborolan-2-il)-2,3-dihidro-izoindol-l-on (92 mg, 0.35 mmol) i Pd(PPh3)4(83 mg, 0.072 mmol) u 1.5 M Na2C03(vodeni rastvor) (1.3 mL, 1.92 mmol) i dioksana (2.5 mL). Reakciona mešavina je razređena sa slanim rastvorom, a tada je dodan toluen nakon čega nastaje precipitat koji je sakupljen uz pomoć filtracije. Rezultujuća tvrda materija je rastvorena u DCM i filtrirana kroz punjenje sa silikom sa ciljem da se dobije jedinjenje iz naslova u formi žute tvrde materije (60 mg, 47 %).

Korak 2: 5-{ 8-[ 4-( 2- Okso- piperazin- l- il)- fenilamino]-[ 1, 2, 4] triazolo[ 1, 5- aJpirazin- 5- il}- 2, 3-

dihidro- izoindol- 1 - on

Rastvortert-butilestera 3-okso-4-{4-[5-(l-okso-2,3-dihidro-lH-izoindol-5-il)-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-8-ilamino]-fenil}-piperazin-l-karboksilne kiseline (59 mg, 0.1 mmol) u 3:1 DCM:TFA (1.2 mL) je mešan na sobnoj temperaturi tokom 1 časa. Reakciona mešavina je razređena sa DCM i dovedena u bazno stanje uz pomoć zasićenog rastvora NaHC03. Vodeni sloj je ekstrahovan sa DCM (3 x), a organski slojevi su spojeni, osušeni preko MgS04, filtrirani i koncentrisani pod vakumom sa ciljem da se dobije jedinjenje iz naslova u formi žute tvrde materije (38 mg, 86 %). 'H-NMR (400 MHz, de-DMSO) 8(ppm) 3.07 (2H, m), 3.44 (2H, s), 3.64 (2H, m), 4.50 (2H, s), 7.32 (2H, d), 7.83 (IH, d), 8.04-8.10 (4H, m), 8.22 (IH, s), 8.70 (IH, br s), 8.74 (IH, s), 10.25 (IH, s). LCMS: Rt 7.17 min (93.7%),mlz(APCI) 441

(M+H)<+>.

Jedinjenje 108: 7-Fluoro-5-{8-[4-(4-izopropiIpiperazin-l-il)-feniIamino]-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-5-il}-23-dihidroizoindol-l-on

Korak 1: Metil ester 4- bromo- 2, 6- dilfuorobenzoične kiseline

U suspenziju 4-Bromo-2,6-dilfuoro-benzoične kiseline (5 g, 21 mmol) u DCM (10 mL) je dodan tionil hlorid (15 mL) i DMF (0.5 mL). Mešavina je mešana na sobnoj temperaturi tokom 2.5 časa. Tada je ohlađena do 0° C pa je pažljivo dodan MeOH (20 mL) šta dovodi do burne pojave HC1. Nakon mešanja tokom dodatnih 0.5 časa, bistri rastvor je podeljen među DCM (50 mL) i vode (50 mL). Organski sloj je opran sa zasićenim rastvorom NaHC03, slanim rastvorom, osušen preko MgS04, a rastvarač je odstranjen pod vakumom sa ciljem da se dobije jedinjenje iz naslova u formi bledo žutog ulja koje se koristi bez dodatne purifikacije.

Korak 2: Metil ester 4- bromo- 2- lfuoro- 6-( nitrometil) benzoične kiseline

Nitrometan (10 mL, 169 mmol, 8 ekvivalenata) je dodan pažljivo u suspenziju natrijum hidrida (4.05 g, 169 mmol, 8 ekvivalenata) i MgS04(40 g) u DMSO (100 mL) na sobnoj temperaturi, a rezultujući gusti rastvor je mešan tokom 0.25 časova. U nastao žuti gusti rastvor je dodan metil ester 4-bromo-2,6-difluorobenzoične kiseline (5.3 g, 21 mmol), a mešavina je mešana na sobnoj temperaturi tokom 3 dana kada je sav startni materijal istrošen. Dodani su voda (200 mL) i 6 M HC1 (50 mL), a nakon toga i DCM (200 mL). Dodano je još vode (500 mL) sa ciljem da se dobije bistri bifazni sistem. Vodeni sloj je ekstrahovan sa DCM (3 x 100 mL), a DCM slojevi su tada spojeni, oprani sa zasićenim rastvorom NaHC03i sa slanim rastvorom i sve je osušeno preko MgS04. Isparavanje rastvarača dovodi do tvrde materije boje pomorandže koja sadrži 64 % željenog jedinjenja, koje se koristi bez dodatne purifikacije. LCMS; Rt = 1.27 min (64%).

Korak 3: 5- Bromo- 7- fluoro- 2, 3- dihidro- izoiudol- l- on

Grubi metil ester 4-bromo-2-fluoro-6-(nitrometil)benzoične kiseline iz prethodnog koraka je rastvoren u MeOH (100 mL). U ovaj bistri rastvor je dodana cinkova prašina (3.35 g, 51.3 mmol, 3 ekvivalenta), a nakon toga amonijum format (3.23 g, 51.3 mmol, 3 ekvivalenta) šta dovodi do egzotermne reakcije. Nakon 0.3 časa, dodan je 7 M NH3u MeOH (50 mL), a mešavina je mešana tokom noći na sobnoj temperaturi. Rezultujuća mešavina je filtrirana kroz celit, a žuti filtrat je apsorbovan na siliku i grubo pročišćen uz pomoć LC uz korišćenje 94/6 DCM/ MeOH 7 M NH3. Odstranjivanje rastvarača dovodi do tvrde materije koja je ponovo rastvorena u DCM, oprana sa 10 % NaOH i koncentrisana pod redukovanim pritiskom sa ciljem da se dobije bela tvrda materija, koja je dodatno smrvljena sa malom količinom DCM sa ciljem da se dobije jedinjenje iz naslova. LCMS: Rt 0.96 min (100%)mlz230/232 (M+H)<+>.

Korak 4: 7- Fluoro- 5-( 4, 4, 5, 5- tetrametil- f1, 3, 2] dioksabrolan- 2- il)- 2, 3- dihidroizoindol- l- on

Rastvor 5-bromo-7-fluoro-2,3-dihidroizoindol-l-on (531 mg, 2.31 mmol) u dioksanu (5 mL) je mešan u atmosferi azota. Dodani su Pd(dppf)Cl2(94 mg, 5 mol %), kalijum acetat (453 mg, 4.62 mmol. 2.0 ekvivalenta) i bispinakolatodiboron (1.17 g, 4.62 mmol, 2 ekvivalenta), a reakcija je grejana na 80° C tokom 3 časa. Rezultujuća suspenzija boje pomorandže je razređena sa DCM, filtrirana kroz celit i koncentrisana pod vakumom sa ciljem da se dobije ulje koje je ponovo rastvoreno u minimumu DCM. Polako je dodavan dietil eter sa ciljem da se dobije jedinjenje iz naslova u formi žućkastosmeđe tvrde materije. LCMS: Rt 1.18 min (100%) m/z 277/279

(M+H)<+>.

Korak 5: 7- Fluoro- 5-{ 8-[ 4-( 4- izopropilpiperazin- l- il)- fenilamino]-[ 1, 2, 4] triazolo[ 1, 5- aJpirazin-5- U} - 2, 3- dihidroizoindol- l- on

Ovo jedinjenje može da se priredi uz pomoć metoda koji su opisani kod pripreme Jedinjenja 91 uz upotrebu već pomenutog boronata. LCMS: Rt = 0.90 min (95 %),mlz487 (M+H)<+>.

Jedinjenje 112: 5-(8-(4-(4-Izopropil-2-oksopiperazin-l -iI)fenilamino)- [1,2,4] triazolo [1,5-a] pirazin-5-il)izoindolin-1 -on

Korak 1: l-[ 4-( 5- Bromo-[ l, 2, 4] triazolo[ l, 5- a] pirazin- 8- ilamino)- fenil]- 4- izopropil- piperazin- 2-

on

U rastvor l-[4-(5-bromo-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-8-ilamino)-fenil]-piperazin-2-on (primer 31, korak 2) (180 mg, 0.47 mmol) u MeOH (4 mL) su dodani sirćetna kiselina (0.03 mL, 0.47 mmol), NaOAc (38 mg, 0.47 mmol) i aceton (0.2 mL, 1.18 mmol). Reakciona mešavina je mešana na sobnoj temperaturi tokom 1 časa, a tada je dodan NaCNBH3(60 mg, 0.94 mmol), a mešavina je mešana na 40° C tokom noći. Nakon hlađenja do sobne temperature, reakciona mešavina je dovedena u kiselo stanje uz pomoć koncentrisane HC1 (pH 1) i sve je koncentrisanoin vacuo.Ostatak je podeljen među 6 N NaOH i DCM. Vodeni sloj je ekstrahovan sa DCM (3 x), a spojeni organski slojevi su osušeni preko MgS04i koncentrisaniin vacuosa ciljem da se dobije grubo jedinjenje koje je purifikovano na silika gelu uz pomoć kolonske hromatografije. Elucija sa DCM i 98:2 DCM:MeOH dovodi do jedinjenja iz naslova u formi žute tvrde materije (45 mg, 25 %).

Korak 2: 5-( 8-( 4-( 4- Izopropil- 2- oksopiperazin- l- il) fenilamino)- flJ

il) izoindolin- l - on

Ovo jedinjenje može da se priredi uz pomoć metoda koji su opisani kod pripreme Jedinjenja 6, korak 4, uz upotrebu l-[4-(5-bromo-[l>2,4]trazolo[l,5-a]pirazin-8-ilamino)-fenil]-4-izopropil-piperazin-2-on (40 mg, 0.09 mmol), 5-(4,4,5,5-tetrametil-[l,3,2]dioksaborolan-2-il)-2,3-dihidro-izoindol-l-on (37 mg, 0.14 mmol) i Pd(PPh3)4(31 mg, 0.027 mmol) u 1.5 M Na2C03(vodeni rastvor) (0.5 mL, 0.75 mmol) i dioksanu (1.2 mL). Reakciona mešavina je razređena sa slanim rastvorom, a tada je dodan toluen nakon čega nastaje precipitat koji je sakupljen uz pomoć filtracije. Filtrat je opran sa dietil eterom, petroleum eterom i MeOH, a tada je purifikovan na silika gelu uz pomoć kolonske hromatografije. Elucija sa 99:1 DCM:NH3(7 M u MeOH), a nakon toga sa 98:2 i 95:5 DCM:NH3(7 M u MeOH) dovodi do jedinjenja iz naslova u formi žute tvrde materije (24 mg, 55 %). 'H-NMR (400 MHz, d6-DMSO) 5(ppm) 1.08 (6H, d), 2.73-2.87 (3H; m), 3.27 (2H, s), 3.62-3.68 (2H, m), 4.52 (2H, s), 7.36 (2H, d), 7.84 (IH, d), 8.07-8.10 (4H, m), 8.25 (IH, s), 8.70 (IH, br s), 8.77 (IH, s), 10.28 (IH, s). LCMS: Rt 1.94 min (95.2%),mlz(APCI) 483 (M+H)<+>.

Jedinjenje 114: 5-{8-[4-(4-Izopropilpiperazin-l-il)-fenilamino]-[l,2,4]triazoIo[l,5-a]pirazin-5-il}-33-dimetil-2,3-dihidroizoindol-l-on

Korak 1: 5- Bromo- 2-( 4- metoksibenzil)- 3, 3- dimetil- 2, 3- dihidroizoindol- l- on

Suspenzija natrijum hidrida (130 mg, 60 % disperzija u mineralnom ulju, 3.2 mmol) i tetra-"butilamonijum jodida (243 mg, 0.68 mmol) u THF (20 mL) je mešana na sobnoj temperaturi pa je dodan rastvor of 5-bromo-2,3-dihidroizoindol-l-on (675 mg, 3.2 mmol) u THF (20 mL) i DMF (4 mL). Nakon 75 min dodan je 4-metoksibenzil bromid (460 uL, 3.2 mmol), a mešanje je nastavljeno tokom 4 časa. Tada je dodan natrijum hidrid (635 mg, 60 % disperzija u mineralnom ulju, 15.9 mmol), a mešanje je nastavljeno tokom 30 min pre no je dodan jodometan (1.19 mL, 19 mmol), a mešavina je grejana na 70° C tokom 30 min. Nakon hlađenja, dodan je NH4CI (zasićeni vodeni rastvor), a mešavina je razređena sa etil acetatom (120 mL). Slojevi su odvojeni, organska faza je osušena preko MgS04, a rastvarači su odstranjeni pod redukovanim pritiskom. Ostatak je purifikovan uz pomoć hromatografije na silici i uz eluciju sa 5 % do 10 % etil acetatom u petroleum eteru sa ciljem da se dobije jedinjenje iz naslova u formi žutog ulja (640 mg, 1.78 mmol).

Korak 2: 5- Bromo- 3, 3- dimetil- 2, 3- dihidroizoindol- l- on

Rastvor 5-bromo-2-(4-metoksibenzil)-3,3-dimetil-2,3-dihidroizoindol-l-on (640 mg, 1.78 mmol) i cerični amonijum nitrat (2.91 g, 5.33 mmol) u acetonitrilu (11 mL) i vodi (5 mL) je mešan na 0° C tokom 45 min. Rastvor je razređen sa etil acetatom (100 mL) i opran sa slanim rastvorom (40 mL). Organski razređivaći su osušeni preko MgS04i ispareni pod redukovanim pritiskom. Ostatak je purifikovan na uz pomoć hromatografije na silici i uz eluciju sa 10 % do 50 % etil acetatom u petroleum eteru sa ciljem da se dobije jedinjenje iz naslova (367 mg, 1.53 mmol).

Korak 3: 5-{ 8-[ 4-( 4- Izopropilpiperazin- l- il)- fenilamino]-[ l, 2, 4] triazolo[ l, 5- a] pirazin- 5- il}- 3. 3-

dimetil- 2, 3- dihidroizoindol- l- on

5-Bromo-3,3-dimetil-2,3-dihidroizoindol-l-on je konvertovan u odgovarajući boronat na način koji je analogan načinu pomenutom kod dobijanja Jedinjenja 6, Korak 3. Ovo je tada korišćeno da se pripremi jedinjenje iz naslova iz jedinjenja (5-bromo[l,2,4]trazolo[l,5-a]pirazin-8-il)-[4-(4-izopropilpiperazin-l-il)-fenil]amina uz pomoć metoda koji su opisani kod dobijanja Jedinjenja 120, Korak 4. LCMS: Rt = 0.92 (100%), m/z = 497 (M+H)<+>.

Jedinjenje 118: 4-(5-(lH-Pirazol-4-iI)-[l^,4]triazoIo[l,5-ajpirazin-8-iIamino)-N-(piridin-3-

ilmetil)benzamid

Korak 1: Metil ester 4-( 5- bromo-[ l, 2, 4] triazolo[ l, 5- a] pirazin- 8- ilamino)- benzoične kiseline

Ovo jedinjenje može da se priredi uz pomoć metoda koji su opisani kod pripreme Jedinjenja 6, korak 1 uz upotrebu 5,8-dibromo-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazina (250 mg, 0.90 mmol), metil estera 4-aminobenzoične kiseline (163 mg, 1.08 mmol) i iV-etildiizopropil-amina (0.19 mL, 1.08 mmol) u 2-propanolu (2.5 mL). Jedinjenje iz naslova je dobiveno nakon trituracije sa 2-propanolom u formi kafene tvrde materije (148 mg, 47 %).

Korak 2: 4-( 5- Bromo-[ l, 2, 4] triazolo[ l, 5- a] pirazin- 8- ilamino)- benzoična kiselina

Metil ester 4-(5-bromo-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-8-ilamino)-benzoične kiseline (460 mg, 1.32 mmol) je suspendovan u THF (11 mL) pa je dodan rastvor litijum hidroksid monohidrata (554 mg, 13.2 mmol) u vodi (11 mL). Reakciona mešavina je mešana na sobnoj temperaturi tokom 4 časa, a tada je dodan metanol (11 mL), a mešavina je mešana na 50° C tokom 24 časa. Mešavina je podeljena među vode i DCM, vodena faza je dovedena u kiselo stanje sa 2 M HC1 (pH 2) nakon čega nastaje žuti precipitat. Precipitat je sakupljen uz pomoć filtracije, opran sa vodom i dietil eterom i osušen sa ciljem da se dobije jedinjenje iz naslova (215 mg, 49 %).

Korak 3: 4-( 5- Bromo-[ l, 2, 4] triazolo[ l, 5- a] pirazin- 8- ilamino)- N- piridin- 34lmetil- benza

Rastvor 4-(5-bromo-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-8-ilarnino)-benzoične kiseline (0.230 g, 0.69 mmol), 3-hidroksibenzotriazola (0.103 g, 0.76 mmol), l-etil-3-(3'-dimetilaminopropil)karbodiimid hidrata (0.146 g, 0.76 mmol) u DMF (5 mL) i 3-pikolilamina (0.077 mL, 0.76 mmol) je mešan na sobnoj temperaturi tokom 21 časa. Rastvarač je odstranjenin vacuo,a ostatak je smrvljen sa dietil eterom, etil acetatom i dihlorometanom. Dobivena je bledo žuta tvrda materija, koja je oprana sa vodom i osušena sa ciljem da se dobije jedinjenje iz naslova (241 mg, 82 %).

Korak 4: 4-( 5-( lH- Pirazol- 4- il)-[ 1, 2, 4] triazolo[ l, 5- a] pirazin- 8- ilamino)- N-( piridin- 3-

ilmetil) benzamid

Ovo jedinjenje može da se priredi uz pomoć metoda koji su opisani kod pripreme Jedinjenja 6, korak 4 uz upotrebu 4-(5-bromo-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-8-ilamino)-3-piridin-3-ilmetil-benzamida (100 mg, 0.24 mmol), 4-(4,4,5,5-tetrametil-[l,3,2]dioksaborolan-2-il)-lH-pirazola (93 mg, 0.48 mmol) i Pd(PPh3)4(70 mg, 0.06 mmol) u 1.5 M K2C03(vodeni rastvor) (1.4 mL) i dioksana (2.5 mL). Grubi materijal je purifikovan na silika gelu uz pomoć kolonske hromatografije i uz eluciju sa DCM, a nakon toga sa 98:2 pa sa 96:4 pa sa 90:10 DCM:NH3(7 M u MeOH) sa ciljem da se dobije jedinjenje iz naslova u formi bele tvrde materije (19.6 mg, 20<%>)<.>

'H-NMR (400 MHz, oVDMSO) 5(ppm) 4.52 (2H, d), 7.40 (IH, m), 7.78 (IH, d), 7.93 (2H, d), 8.18 (2H, d), 8.32 (IH, s), 8.48-8.62 (4H, m), 8.82 (IH, s), 9.01 (IH, t), 10.21 (IH, br s), 13.3 (IH, br s). LCMS: Rt 1.86 min (93%),mlz(ES<+>) 412 (M+H)<+>.

Jedinjenje 119: 4-(5-(2-Okso-l,2-dihidropiridin-4-il)-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-8-

ilamino)-N-(piridin-3-iImetil)benzamid

Korak 1: 4-[ 5-( 2- Metoksi- piridin- 4- il)-[ 1, 2, 4] triazolo[ l, 5- a] pirazin- 8- ilamino]- N- piridin- 3-

ilmetil- benzamid

Ovo jedinjenje može da se priredi uz pomoć metoda koji su opisani kod pripreme Jedinjenja 6, korak 4 uz upotrebu 4-(5-bromo-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-8-ilamino)-A<r->piridin-3-ilmetil-benzamida (120 mg, 0.28 mmol), 2-metoksipiridin-4-boronične kiseline (87 mg, 0.57 mmol) i Pd(PPh3)4(81 mg, 0.07 mmol) u 1.5 M K2C03(vodeni rastvor) (1.6 mL) i dioksana (2.9 mL). Grubi materijal je purifikovan na silika gelu uz pomoć kolonske hromatografije i uz eluciju sa DCM, a nakon toga sa 99:1 pa sa 97:3 pa sa 95:5 DCM:NH3(7 M u MeOH) sa ciljem da se dobije jedinjenje iz naslova u formi bele tvrde materije (92.6 mg, 73 %).

Korak 2: 4-( 5-( 2- Okso- l , 2- dihidropiridin- 4- il)-[ l , 2, 4] triazolo[ l, 5- a] pirazin- 8- ilamino)- N-( piridin- 3- ilmetil) benzamid

Mešavina 4-[5-(2-metoksi-piridin-4-il)-[l ,2,4]triazolo[l ,5-a]pirazin-8-ilamino]-A^-piridin-3-ilmetil-benzamida (71.5 mg, 0.16 mmol) i piridinijum hidrohlorida (91 mg, 0.79 mmol) u vodi (0.5 mL) je zatvorena u tubi i grejana na 150° C tokom 25 min. Nakon ovoga vremena, rastvarač je odstranjenin vacuo.Ostatak je purifikovan hromatografijom na silika gelu u eluciju sa DCM, a nakon toga sa 98:2 i sa 90:10 DCM:NH3(7 M u MeOH), a frakcije koje su sadržavale željeni produkt su spojene i isparene. Jedinjenje iz naslova je izolovano u formi žute tvrde materije (34.5 mg, 49 %).

'H-NMR (400 MHz, ds-DMSO) 5(ppm) 4.52 (2H, d), 6.82 (IH, m), 7.22 (IH, s), 7.38 (IH, m), 7.51 (IH, d), 7.78 (2H, d), 8.18-8.23 (3H, m), 8.51 (IH, d), 8.62 (IH, s), 8.82 (IH, s), 9.01 (IH, t), 10.58 (IH, br s), 11.8 (IH, br s). LCMS: Rt 1.72 min (97%),mlz(ES<+>) 439 (M+H)<+>.

Jedinjenje 120: 2-Metoksi-7V-(6-metiIpiridin-3-il)metil-4-[5-(lH-pirazol-4-iI)-[l,2,4]triazolo

[1,5-a] pirazin-8-ilamino] -benzamid

Korak 1:2- Metoksi- N-( 6- metilpiridin- 3- il) metil- 4- nitrobenzamid

2-Metoksi-4-nitrobenzoična kiselina (293 mg, 1.49 mmol) je rastvorena u DMF (2 mL) pa su dodani 4-metilmorfolin (220 uL, 3.0 mmol) i TBTU (1.79 g, 1.7 mmol). Mešavina je mešana na sobnoj temperaturi tokom 30 min pa je dodan C-(6-metilpiridin-3-il)metilamin (400 mg, 3.27 mmol). Mešanje je nastavljeno na sobnoj temperaturi tokom 12 časa. Dodan je DCM (10 mL), a organske faze su oprane sa Na2CC>3 (5 % vodeni rastvor), HC1 (3 % vodeni rastvor) i sa vodom, a nakon toga su osušene preko Na2SC>4. Nakon isparavanja rastvarača, ostatak je smrvljen sa eter-heksanom sa ciljem da se dobije jedinjenje iz naslova u formi bele tvrde materije.Korak 2: 4- Amino- 2- metoksi-' N-[( 6- metilpiridin- 3- il) metil] benzamid

Rastvor 2-metoksi-7V-(6-metilpiridin-3-il)metil-4-nitrobenzamida (448 mg, 1.49 mmol) u EtOH i EtOAc (8 mL each) je mešan pa su dodani amonijum format (375 mg, 6 mmol) i 10 % Pd/C (100 mg). Mešavina je grejana kod refluksa tokom 20 min, ohlađena, filtrirana kroz celit, tvrda materija je oprana sa EtOH, a spojeni rastvarači su ispareni sa ciljem da se dobije jedinjenje iz naslova.

Korak 3: 4-( 5- Bromo-[ 1, 2, 4] triazolo[ l, 5- a] pirazin- 8- ilamino)- 2- hidroksi- N-[( 6- metil- piridin- 3-

iljmetilJ benzamid

5,8-Dibromo-[l,2,4]tirazolo[l,5-a]pirazin (285 mg, 1.03 mmol) i 4-amino-2-metoksi-A'-[(6-metilpiridin-3-il)metil]benzamid (280 mg, 1.03 mmol) je mešan u 'PrOH (5 mL) pa je dodan HBr (48 % vodeni rastvor, 380 pX). Mešavina je grejana kod refluksa tokom 24 časa. Ohlađena suspenzija je dodana u NaHC03(zasićeni vodeni rastvor, 25 mL) i vode (25 mL) i ekstrahovana sa CHCI3(4 x 30 mL). Ekstrakti su osušeni preko MgS04i ispareni. Ostatak je purifikovan uz pomoć kolonske hromatografije, eluiran sa 10 % CH2Cl2/MeOH. Frakcije koje sadrže produkt su isparene, a ostatak je smrvljen sa MeOH sa ciljem da se dobije jedinjenje iz naslova u formi kafene tvrde materije.

Korak 4: 2- Metoksi- N-( 6- metilpiridin- 3- il) metil- 4-[ 5-( lH- pirazol- 4- il)-[ l, 2, 4] triazolo[ l, 5-

aJpirazin- 8- ilamino]- benzamid

Pirazol-4-boronična kiselina (19 mg, 0.17 mmol), 4-(5-bromo-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-8-ilamino)-2-hidroksi-A<r->[(6-metil-piridin-3-il)metil]benzamid (40 mg, 0.085 mmol), K2C03(24 mg, 0.17 mmol) i Pd(dppf)Cl2CH2Cl2(4 mg, 0.005 mmol) su stavljeni u tubu koja može da se zatvori. Tuba je oprana sa azotom pa je dodan dioksan-voda (4:1, 4 mL). Tuba je zatvorena, stavljena u ultrasoničnu banju sa protokom gasnog azota tokom 30 sekunda, a tada je stavljena u uljnu banju na 85° C. Reakcija je mešana tokom 28 časova uz dodavanje dodatnih porcija boronične kiseline (10 mg) i katalizatora (2 mg) nakon 2 časa i nakon 18 časova. Grubi materijal je apsorbovan na Si02i pročišćen uz pomoć kolonske hromatografije i uz eluciju sa 1 % - 10 % MeOH/DCM. Dobiveni produkt je ponovo rastvoren u MeOH/DCM (4:1, 10 mL) pa je dodan 0.1 M MsOH/MeOH (2 ekvivalenta), rastvarači su ispareni, a ostatak je rastvoren u vodi i liofilizovan sa ciljem da se dobije jedinjenje iz naslova kao bis-mesilatna so (38 mg). LCMS: Rt 0.92 min (93.9 %)mlz(ESI) 455 (M+H)<+>.

Jedinjenje 122: A^-Benzil-2-metoksi-4-[5-(lH-pirazol-4-il)-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-8-

ilamino]-benzamid

Ovo jedinjenje može da se priredi uz pomoć metoda koji su opisani kod pripreme Jedinjenja 120, uz upotrebu benzilamina u koraku 1. LCMS: Rt 1.62 min (100 %)mlz(ESI) 440 (M+H)<+>.

Jedinjenje 124:7V-Piridin-2-ilmetiI3-[5-(lH-pirazol-4-iI)-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-8-

ilamino] benzamid

Ovo jedinjenje može da se priredi uz pomoć metoda koji su opisani kod pripreme Jedinjenja 129 uz upotrebu 2-piridilmetilamina u koraku 5. LCMS: Rt = 0.84 min (100 %),mlz(ESI) 412

(M+H)<+>.

Jedinjenje127:(4-IzopropiIpiperazin-l-iI)-{3-[5-(lH-pirazol-4-il)-[l,2,4]triazolo[l,5-a] pirazin-8-ilamino] fenil} metanon

Ovo jedinjenje može da se priredi uz pomoć metoda koji su opisani kod pripreme Jedinjenja 129, uz upotrebu 4-izopropilpiperazina u koraku 5. LCMS: Rt = 0.84 min (100 %),mlz(ESI) 432

(M+H)<+>.

Jedinjenje 129: A^-Etil 3-[5-(lH-pirazol-4-il)-[l^,4]triazolo[l,5-alpirazin-8-

ilamino] benzamid

Korak 1: Etil ester 3-( 5- bromo-[ l, 2, 4] triazolo[ l, 5- a] pirazin- 8- ilamino) benzoične kiseline

5,8-Dibromo-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin (1.39 g, 5.00 mmol) i etil 3-aminobenzoat (0.93 g, 5.60 mmol) su mešani u 'PrOH (10 mL) pa je dodan HBr (48 % vodeni rastvor, 1.14 mL, 10 mmol). Mešavina je grejana na 85° C tokom 4 časa, a tada je ohlađena do sobne temperature i ugašena sa NaHC03(zasićeni vodeni rastvor, 25 mL). Rezultujuća suspenzija je ohlađena do 0° C, a bela tvrda materija je sakupljena uz pomoć filtracije sa usisavanjem i oprana sa vodom (10 mL). Grubi produkt je rastvoren u EtOH, a rastvarač je isparen sa ciljem da se dobije jedinjenje iz naslova u formi prljavo bele tvrde materije (1.79 g, 4.9 mmol) koje je korišćeno bez dodatne purifikacije.

Korak 2: Etil ester 3- f( 5- bromo- fl, 2, 4Jtriazolofl, 5- aJpirazin- 8- il)- tert- butoksikarbonil-

aminojbenzoične kiseline

Rastvor etil estera 3-(5-bromo-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-8-ilamino)benzoične kiseline (1.79 g, 4.93 mmol) u DCM (20 mL) je mešan u uslovima N2na sobnoj temperaturi pa su dodani BOC20 (1.34 g, 6.16 mmol) i DMAP (0.30 g, 2.46 mmol). Mešanje je nastavljeno tokom 2 časa, kada LCMS pokazuje daje startni materijal kompletno konvertovan. Mešavina je filtrirana, a filtrat je opran sa razređenom limunskom kiselinom (pH 6, 5 mL) i slanim rastvorom (5 mL), a sve je osušeno preko Na2S04. Isparavanje rastvarača dovodi do jedinjenja iz naslova u formi žutog ulja (1.87 g, 4.0 mmol) koje se koristi bez dodatne purifikacije.

Korak 3: Etil ester 3-{ ter\ rbutoksikarbonil-[ 5-( lH- piraz

il]- amino} benzoične kiseline

Azot je proveden u formi mehuriča kroz mešavinu etil estera 3-[(5-bromo-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-8-il)-ter/-butoksikarbonil-amino]benzoične kiseline (0.58 g, 1.25 mmol), 4-(4,4,5,5-tetrametil-[l,3,2]dioksaborolan-2-il)-lH-pirazola (0.49 g, 2.50 mmol), K2C03(0.35 g, 2.50 mmol) i Pd(dppf)Cl2DCM (102 mg, 0.125 mmol) u dioksanu (37.5 mL) i vodi (9.6 mL). Kondenzator je namešten na bocu, sistem je evakuisan i pročišćen sa N2(gas), a tada je grejan na 115° C tokom 25 min. Banja za grejanje je odstranjena pa je dodan C02(rastvor) sa ciljem da ohladi i puferuje sistem. Rastvarač je odstranjen pod redukovanim pritiskom, a ostatak je purifikovan hromatografijom na silici uz eluciju sa 10 % do 50 % etil acetatom u DCM, a sa ciljem da se dobije jedinjenje iz naslova u formi ulja boje pomorandže (0.61 g, > 100%) koje se koristi bez dodatne purifikacije.

Korak 4: 3-{ l& X- Butoksikarbonil-[ 5-( lH- pirazol- 4- il)-[ l, 2, 4] triazolo[ 1, 5- aJpirazin- 8- ilJ-

aminojbenzoična kiselina

Nečisti etil ester 3-{ter^butoksikarbonil-[5-(lH-pirazol-4-il)-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-8-il]-amino}benzoične kiseline (0.61 g, 1.25 mmol) je rastvoren u THF (2.5 mL) pa je dodan KOH (2 M vodeni rastvor, 2.5 mL, 5 mmol), a mešavina je grejana na 60° C tokom noći. Rastvor je ohlađen i filtriran kroz celit uz ispiranje sa vodom. Filtrat je dodan u limunsku kiselinu (2 M vodeni rastvor, 2.5 mL) i mešan na 0° C. Rezultujuća tvrda materija je sakupljena uz pomoć filtracije sa usisavanjem, oprana sa vodom osušena uz pomoć suspendovanja u EtOH i isparena pod redukovanim pritiskom sa ciljem da se dobije kafena guma (280 mg).

Dodatna količina produkta je dobivena uz pomoć ekstrahovanja filtrata sa DCM, a kada se sve spoji dobija se total od 352 mg jedinjenja iz naslova. Jedinjenje je korišćeno bez dodatne purifikacije.

Korak 5: N- Etil 3-[ 5-( lH- pirazol- 4- il)-[ 1, 2, 4] triazolo[ l, 5- a] pirazin- 8- ilaminoJbenzamid

3-{/err-ButoksikarboniH5-(lH-pra kiselina (42 mg, 0.10 mmol), etilamin (12 M vodeni rastvor, 42 uL, 0.50 mmol) i trietilamin (28 uL, 0.20 mmol) su mešani u DMF (0.30 mL) pa je dodan PyBOP (57 mg, 0.11 mmol). Mešanje je nastavljeno tokom noći. Reakciona mešavina je podeljena među EtOAc (7 mL) i NaHC03(zasićeni vodeni rastvor, 7 mL), a slojevi su odvojeni. Spojeni organski slojevi su oprani sa slanim rastvorom (2x5 mL) i osušeni preko Na2S04. Isparavanje rastvarača dovodi do ulja koje je rastvoreno u MeOH (0.3 mL), koji sadrži HC1 (12 M vodeni rastvor, 0.15 mL), a sve je mešano preko noći. Dodani su trietilamin (0.25 mL) i EtOH (2 mL), a rastvarači su odstranjeni pod redukovanim pritiskom. Ostatak je purifikovan uz pomoć preparativne HPLC sa ciljem da se dobije jedinjenje iz naslova u formi bele tvrde materije (7 mg). 'H NMR (DMSO-d6, 400 MHz): 8 = 13.29 ppm (s, 0.8 H); 10.01 (s, 0.9 H); 8.77 (s, 1.0 H); 8.65 (s, 1.0 H); 8.52 (s, 1.1 H); 8.41-8.37 (m, 2.1 H); 8.25 (s, 1.0 H); 8.08 (d, 1.0 H); 7.47 (d, 1.0 H); 7.41 (t, 1.1 H); 7.04-7.03 (m, 0.5 H); 3.32 (s, 29.2 H (voda)); 1.14 (t, 3.5 H). LCMS: Rt = 0.95 min (100 %),m/ z(ESI) 349

(M+H)<+>.

Jedinjenje 131: A^-(4-Hidroksibenzil) 3-[5-(lH-pirazol-4-il)-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-8-

ilamino] benzamid

Ovo jedinjenje može da se priredi uz pomoć metoda koji su opisani kod pripreme Jedinjenja 129 uz upotrebu 4-hidroksibenzilamina u koraku 5. LCMS: Rt = 0.98 min (100 %),mlz(ESI) 427

(M+H)<+>.

Jedinjenje 134: iV-Benzil-iV-metil 3-[5-(lH-pirazol-4-il)-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-8-ilamino] benzamid

Ovo jedinjenje može da se priredi uz pomoć metoda koji su opisani kod pripreme Jedinjenja 129 uz upotrebu jV-metilbenzilamina u koraku 5. LCMS: Rt = 1.15 min (100 %),mlz(ESI) 425

(M+H)<+>.

Jedinjenje 167: Amid 4-[8-(6-fenilacetilamino-piridin-3-ilamino)-[l,2,4]triazoIo[l,5-a]pirazin-5-il]-tiofen-2-karboksilne kiseline

Korak 1: ~ N-( 5- Nitropiridin- 2- il)- 2- fenilacetamid

Rastvor 2-amino-5-nitropiridina (4.17 g, 30 mmol) u piridinu (30 mL) je mešan na sobnoj temperaturi pa je kap po kap dodan rastvor fenilacetil hlorida (4.64 g, 30 mmol) u THF (30 mL). Mešavina je mešana tokom 24 časa, a tada je dodana u ledenu vodu (250 mL) sa ciljem da se dobije kafena tvrda materija, koja je korišćena bez dodatne purifikacije.

Ovaj materijal je korišćen za preparaciju iV-[5-(5-bromo-[l,2,4]triazolo[l,5-a ]pirazin-8-ilamino)-piridin-2-il]-2-fenilacetamida na način koji je analogan načinu iz koraka 2 i 3 iz metoda koji su opisani za pripremu Jedinjenja 120.

Korak 4: Amid 4-[ 8-( 6- fenilacetilamino- piridin- 3- ilamino)-[ l, 2, 4] triazolo[ l, 5- a] pirazin- 5- il]-tiofen- 2- karboksline kiseline

Ovo jedinjenje može da se priredi uz pomoć metoda koji su opisani kod pripreme Jedinjenja 120, korak 4 uz upotrebu iV-[5-(5-bromo-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-8-ilamino)-piridin-2-il]-2-fenilacetamida i 2-(aminokarbonil)tiofen-4-boronične kiseline. LCMS: Rt 1.06 min (100 %)mlz(ESI) 471 (M+H)<+>.

Jedinjenje 169: 2-(4-{4-[5-(lH-Pirazol-4-iI)-[l,2,4]tirazolo[l,5-a]pirazin-8-iIamino]fenil}-

piperidin-l-il)acetamid

Ovo jedinjenje može da se priredi uz pomoć metoda koji su opisani kod pripreme Jedinjenja 84 uz upotrebu 2-bromoacetamida u koraku 1. LCMS: Rt = 0.81 min (100%), m/z (ESI) 418

(M+H)<+.>

Jedinj enj e 170: 5- {8- [4-(4-Izopropilpiperazin-l -il)-3-trifluorometilfenilamino] -

[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-5-il}-2,3-dihidroizoindoI-l-on

Ovo jedinjenje može da se priredi uz pomoć metoda koji su opisani kod pripreme JedinjenjaGB15uz upotrebu 5-(4,4,5,5-tetrametil-[l,3,2]dioksaborolan-2-il)-2,3-dihidroizoindol-l-on. LCMS: Rt = 0.99 min (95 %),mlz(ESI) 537 (M+H)<+>.

Jedinjenje 171: [4-(4-Izopropilpiperazin-l-iI)-3-trilfuorometilfeniI]-[5-(lH-pirazol-4-il)-[1,2,4] triazolo [ 1,5-a] pirazin-8-il] amin

Ovo jedinjenje može da se priredi uz pomoć metoda koji su opisani kod pripreme Jedinjenja 46 uz upotrebu (5-bromo-[l ,2,4]triazolo[ 1,5-a]pirazin-8-il)-[4-(4-izopropilpiperazin-1 -il)-3-trifluorometilfenil]amina. LCMS: Rt = 0.99 (95 %),mlz(ESI) 472 (M+H)<+>.

Drugi primeri jedinjenja iz ovoga pronalaska, pripremljenih uz pomoć pomenutih procedura su opisani dalje.

Uslovi purifikacije i karakterizovanje

Rutinski, nakon sinteze, sva jedinjenja mogu da se purifikuju uz pomoć HPLC reverzne faze koristeći Gilson preparativni HPLC sistem (322 pumpe, 155 UV/VIS detektor, 215 tečnih držača). Gilson 215 deluje i kao auto-sempler i kao kolektor frakcija. Jedinjenja mogu takođe da budu purifikovana uz pomoć hromatografije sa ispiranjem na silika gelu.

Jedinjenja su karakterizovana uz pomoć masene spektrometrije uz upotrebu instrumenta sa jednim kvadripolom sa izvorom elektrospreja.

Biološki testovi koji demonstriraju korisnost jedinjenja

Primer 1: MAPKAP- K5 test

MAPKAP-K5 reakcije se provode u FlashPlate formatu uz upotrebu 0.1 ili 0.2 uCi 33P-ATP; 0.6 uM ATP; 1 mU MAPKAP-K5; 3 uM MAPKAP-K5 peptidni supstrat uz inkubaciju na sobnoj temperaturi tokom 30 min.

Test na Flashplate pločici:

Reakcija sa MAPKAP-K5 kinazom se provodi u polipropilenskoj pločici sa 384 rupica (Matrix Technologies), a tada se prenosi u flashplate pločicom omotanom sa streptavidinom i sa 384 rupica (Perkin-Elmer).

U rupice koje su sadržavale 2 uL testiranog jedinjenja ili standardnog inhibitora, dodano je 13 uL encimske mešavine ili razređivač uz korišćenje Hydra (Robbins Scientific).

Reakcije su započete uz dodavanje 10 uL of [2.5 x] supstratnog koktela uz upotrebu Multidrop (Thermo-Labsystems) sa ciljem da se dobije finalna koncentracija testa od:

1 mU MAPKAP-K5

3 uM MAPKAP-K5 peptidni supstrat

0.6 uM ATP

0.004 uCi [33P]-y-ATP/uL

1 x reakcioni pufer

Pločice su inkubirane na sobnoj temperaturi tokom 30 min.

Reakcije su završene uz dodavanje 25 uL EDTA (50 mM) u svaku rupicu uz pomoć Micro-fill (Biotek).

Reakcije su prenesene u flashplate pločice prekrivene sa streptavidinom uz pomoć Zymark robotskog sistema. Pločice su inkubirane tokom 60 min na sobnoj temperaturi.

Sve rupice su oprane 3 puta sa 100 ul slanim rastvorom koji je bio puferovan sa fosfatnim puferom uz upotrebu Tečan ispirača za pločice.

Radioaktivnost je određena uz pomoć brojanja scincilacije flashplate pločice (prazne rupice) na aparatu Packard TopCount.

Encimska mešavina:

Encim

50 mM Tris HC1 (pH 7.5)

0.1 mMEGTA

2 mM DTT

1 mg/mL BSA

Reakcioni pufer:

50 mM Tris HC1 (pH 7.5)

0.1 mMEGTA

10 mM Magnezijum acetat

2mM DTT

Sledeća jedinjenja su bila ili mogu da se pripreme u skladu sa sintetičkim metodima koji su ovde opisani. Za potrebe Tabele 1 i Tabele 2 ispod, aktivnost svakog jedinjenja, koja može da bude određena uz pomoć MAPKAPK5 testnog metoda opisanog u Primeru 1, je navedena kako sledi:

++++ jedinjenje pokazuje MAPKAPK5 IC501-100 nM

-H-+ jedinjenje pokazuje MAPKAPK5 IC50101-500 nM

++ jedinjenje pokazuje MAPKAPK5 IC50501-1000 nM

+ jedinjenje pokazuje MAPKAPK5 IC50>1000 nM

Primer 2. Razvijanje testazaidentifikovanje regulatora ekspresije MMP1 uz pomoć

aktivisanih primarnih sinovijalnih fibroblasta.

Za identifikovanje jedinjenja koja smanjuju ECM-degradacijsku aktivnost ćelija, ECM-degradacijska aktivnost ćelija može da bude indukovana sa ciljem da se ostvari odgovarajuće detektovanje ove aktivnosti i sa ciljem da se postigne jasnije očitavanje. U kontekstu RA, izabrana ćelije su sinovijalni vibroblasti sisara, a pokretači koji mogu da se koriste za indukovanje ECM-degradacijske aktivnosti su citokini koji su relevantni u polju artritisa: na primer TNF-a, ILip, IL6, OSM, IL17 i MIFl-a. Ova lista nije sveobuhvatna zbog velikog broja citokina koji su potencijalno uključeni u RA patogenezi (Smolen i Steiner, 2003). Da se uspostaviin vitrotest koji je sličan kompleksnosti patologije, primenjeni pokretač treba da bude mešavina faktora generisanih uz pomoć spajanja ćelija koje proizvode citokine relevantne za artritis, kao na primer monocita, makrofaga, T-ćelija i B-ćelija sa pokretačem. Ćelije koje proizvode citokine će da odgovore na taj kontakt tako da produkuju kompleksnu i nepristranu mešavinu faktora. Ukoliko ćelija koja proizvodi citokine je takođe nađena i u panusu, a citokin koji nastaje na delovanje pokretača se nalazi u sinovijalnoj tečnosti pacijenata sa reumatoidnim artritisom, mešavina faktora koja je finalno proizvedena će da sadrži deo faktora koji su prisutni i u zglobovima pacijenata sa artritisom.

Princip ' MMP testa'

Metalo proteaze iz matriksa (MMP) poseduju različite fiziološke uloge, kao na primer sazrevanje drugih proteaza, faktora rasta i degradaciju ekstra-celularnih komponenti matriksa. MMP1 je jedan od članova MMP porodice koji je sposoban da degradira nativni kolagen, glavnu komponentu kostiju i hrskavice. Povećana ekspresija MMP1 u sinovijalnim fibroblastima (SF) je dijagnosticirana tokom progresije artritičkih bolesti, a može da se predvidi i za procese erozije zglobova (Cunnane et al., 2001). Ekspresija MMP1 u SF može da se poveća uz pomoć aktivisanja SF sa pokretačima relevantnima za reumatoidni artritis, kao citokini poput TNF-a ili ILip (Andreakos et al., 2003). Uzeti zajedno, merenja nivoa MMP1 proizvedene od strane aktivisanim SF su nalazi koji su veoma relevantni u kontekstu RA jer ovaj događaj reflektuje nivo aktivisanja SF prema erozivnom fenotipu kao šta je viđen u panusu. Ukoliko redukovana ekspresija u ciljnom testnom leku kandidatu u aktivisanim SF dovede do redukcije MMP1 ekspresije od strane ovih ćelija, ciljni lek je tada dokazan daje uključen u regulisanju MMP1 ekspresije šta se smatra relevantnim za razvijanje terapeutskih strategija za tretman RA.

U sledećim primerima, razvijanje testa, u daljnjem tekstu nazvanim 'MMP test', razmatra MMP1 produkciju od strane sinovijalnih fibroblasta (SF) kao odgovor na brojne pokretače aktivisanja (Primer 2.1). Upotreba ovoga testa je tada opisana za validaciju genskih produkata koji se smatraju ciljnim lekovima za razvijanje RA terapija (Primer 2.2). Validacija ciljnih lekova se provodi uz upotrebu rekombinantnih adenovirusa, u daljnjem tekstu nazvanima nokdaun virusi ili Ad-siRNA, koji provode ekspresiju u ćelijama shRNA šta smanjuje ekspresiju ciljnih gena uz pomoć mehanizma baziranog na RNAi (RNA interferencije) (vidi WO 03/020931). Identifikovanje jedinjenja koja menjaju aktivnost validnih ciljnih lekova je tada opisano u Tabeli 3. Upotreba 'MMP testa' za testiranje jedinjenja koja menjaju aktivnost identifikovanih ciljnih lekova je opisano u donjem tekstu.

Primeri testa

Korišćeni kontrolni virusi:

Kontrolni virusi korišćeni u ovim studijama su navedeni ispod. dEl/dE2A adenovirusi su generisani iz sledećih adapter plazmida uz pomoć ko-transfekcije plazmida helpera pWEAd5AflIJ.-rITR. dE2A u PER. E2A ćelijama za pakovanie. kao šta je opisano u

W099/ 64582.

Virusi negativne kontrole:

Ad5-eGFP_KD: Ciljna sekvencija: GCTGACCCTGAAGTTCATC (SEQ ID NO: 1). Klonirana uz pomoć Sapl-mesta u vektoru, a virus je generisan kao šta je opisano u WO03/020931.

Ad5-Luc_vl3_KD: Ciljna sekvencija GGTTACCTAAGGGTGTGGC (SEQ ID NO: 2). Klonirana uz pomoć Sapl-mesta u vektoru, a virus je generisan kao šta je opisano u WO03/020931.

Ad5-M6PR_vl_KD: Ciljna sekvencija CTCTGAGTGCAGTGAAATC (SEQ ID NO: 3). Klonirana uz pomoć Sapl-mesta u vektoru, a virus je generisan kao šta je opisano u

WO03/020931.

Virusi pozitivne kontrole:

Ad5-MMPl_vlO_KD: Ciljna sekvencija ACAAGAGCAAGATGTGGAC (SEQ ID NO: 4). Klonirana uz pomoć Sapl-mesta u vektoru, a virus je generisan kao staje opisano u

WO03/020931.

Virusi korišćeni za validaciju cilja:

Ad5-MAPKAPK5_vl3_KD: Ciljna sekvencija CGGCACTTTACAGAGAAGC (SEQ ID NO: 5). Klonirana uz pomoć Sapl-mesta u vektoru, a virus je generisan kao šta je opisano u WO03/020931.

Ad5-MAPKAPK5_vl2_KD: Ciljna sekvencija ATGATGTGTGCC AC AC ACC (SEQ ID NO: 6). Klonirana uz pomoć Sapl-mesta u vektoru, a virus je generisan kao šta je opisano u WO03/020931.

Primer 2. 1: Razvoj MMP testa

Razvijen je ELISA format sa 384 rupica za merenje MMP1. Brojna primarna antitela su testirana, kao i brojni ELISA protokoli. Sledeći protokol je razvijen i validovan za merenje MMP1 nivoa u SF supernatantu u pločicama sa 384 rupica: bele Lumitrac 600 pločice sa 384 rupica (Grcincr) su omotane sa 2 ug/mL anti-MMPl antitelom MAB1346 (Chemicon). Antitelo je razređeno u puferu 40 (1.21 g Tris basa (Sigma), 0.58 g NaCl (Calbiochem) i 5 ml 10 % NaN3(Sigma) u 1 L milliQ vodi, a pH je podešen do 8.5). Nakon preko noćne inkubacije na 4° C, pločice su oprane sa PBS (80 g NaCl, 2 g KC1 (Sigma), 11.5 g Na2HP04.7H20 i 2 g KH2PQ4u 10 L milliQ: pH 7.4) i blokirane sa 100 uL/po rupici kazeinskim puferom (2 % kazein (VWR International) u PBS). Sledeći dan, kazeinski pufer je odstranjen iz ELISA pločica i zamenjen sa 50 uL/po rupici EC puferom (4 g kazein, 2.13 g Na2HP04(Sigma), 2 g goveđi albumin (Sigma), 0.69 g NaH2P04.H20 (Sigma), 0.5 g CHAPS (Roche), 23.3 g NaCl, 4 ml 0,5 M EDTA pH 8 (Invitrogen), 5 ml 10 % NaN3u 1 L milliQ, a pH je podešen do 7.0). Dodano je 0.25 mM DTT (Sigma) u pločice za uzorke koje menjaju od smrznutog u tečno stanje na gradualan način. Nakon odstranjivanja EC pufera, 20 uL uzorka je premešten na ELISA pločice. Nakon preko noćne inkubacije na 4° C pločice su oprane dva puta sa PBS i jednom sa PBST (PBS sa 0.05 % Tween-20 (Sigma)) i inkubirane sa 35 uL/po rupici biotinilovanim rastvorom anti-MMPl antitela (R&D). Ovo sekundarno antitelo je razređeno u puferu C (0.82 g NaH2P04.H20, 4.82 g Na2HP04, 46.6 g NaCl, 20 g goveđi albumin i 4 mL 0.5 M EDTA pH 8 u 2 L milliQ, a pH je podešen do 7.0) kod koncentracije od 5 p-g/mL. Nakon 2 časa inkubacije na sobnoj temperaturi, pločice su oprane kao šta je ranije opisano i inkubirane sa 50 uL/po rupici streptavidin-HRP konjugatom (Biosource). Streptavidin-HRP kojugat je razređen u puferu C kod koncentracije od 0.25 ng/mL. Nakon 45 min, pločice su oprane kao šta je opisano ranije i inkubirane tokom 5 min sa 50 uL/po rupici BM Chem ELISA supstratom (Roche). Iščitavanje je provedeno na aparatu Luminoscan Ascent Luminometer (Labsvstems) sa integracionim vremenom od 200 ms ili sa aparatom Envision reader (Perkin Elmer).

Povećanje MMP1 ekspresije u SF nakon tretmana sa citokinima relevantnim u polju RA (TNF-a, ILlp i OSM) ili njihovim kombinacijama je prikazano na Slici 2 u formi belih histograma. Za ovaj eksperiment, SF su posejane u pločice sa 96 rupica, 3,000 ćelija/rupica. 24 časa kasnije, medijum je zamenjen sa M199 medijumom koji je obogaćen sa 1 % FBS. Jedan dan nakon promene medijuma, citokini ili njihove kombinacije su dodani u kulture, pri čemu je svaki citokin dodan u finalnoj koncentraciji od 25 ng/mL. 72 časa nakon dodavanja citokina, supematant je sakupljen i procesovan u MMP1 ELISA kao šta je opisano u protokolu koji je dan iznad. Paralelno sa ovim eksperimentom, SF su poticane, koristeći se sa istim protokolom, sa supernatantom iz THP1 ćelija (2-puta razređenje u M199 + 1 % FBS) tretiranim sa istim citokinima ili njihovim kombinacijama tokom 48 časova u M199 medijumu + 1 % FBS. MMP1 nivoi za ove primerke su prikazani na Slici 2 kao sivi histogrami. Indukcija MMP1 ekspresije sa SF poticanim sa supernatantima iz TNF-a-tretiranih THP1 ćelija je jača (> 4.5 puta indukcije) ako se uporedi sa SF poticanih samo sa rekombinantnim TNF-a (3-puta indukcije) i gotovo jednaka sa 5-puta indukcijom koja je dobivena uz pomoć mešavine 3 purifikovanih citokina (TNF-a, ILipb, OSM). Ovaj rezultat indicira da supematant TNF-a-indukovanih THP1 ćelija sadrži, pored TNF-a, dodatne faktore koje pokreću zapaljenje koji akti višu SF prema MMP1 ekspresiji. Kako je uloga TNF-a u RA patogenezi validovana (TNF-a-blokeri poput Infliximab i Etanercept pokazuju neku efikasnost u tretmanu RA pacijenata), a THP-1 ćelije su predstavnici monocita/makrofaga koji su prisutni u zglobovima RA pacijenata, TNF-a-bazirana mešavina za poticanje koja je pripremljena uz pomoć kontaktiranja THP-1 ćelija sa TNF-a će sa sadrže faktore koji su prisutni u zglobovima RA pacijenata i koji su posledično relevantni za RA. Ovaj kompleksni pokretač baziran na TNF-a, koji se u daljnjem tekstu naziva 'kompleksni pokretač', dalje će biti korišćen kao baza za 'MMP test'.

Inhibicija aktivisanja SF od strane 'kompleksnog pokretača' je prikazana preko deksametazona, jaki agens protiv zapaljenja koji takođe silno redukuje artritis koji je indukovan kolagenom u glodara (Yang et al., 2004) (Slika 3). Deksametazon je prikazan u đozno-zavisnim količinama koje redukuju MMP1 proizveden u SF aktivisanima preko kompleksnog pokretača. SF su posejane u gustoći od 3000 ćelija/rupici u pločicama sa 96 rupica. 24 časa nakon sejanja, ćelijama je dodan deksametazon u koncentracijama koje se povećavaju. Nakon preko noćne inkubacije, medijum iz svake rupice je obnovljen sa dodatkom supernatanta THP-1 ćelija tretiranih sa TNF-a (50 % razređenje u Ml99 + 0.5 % FBS) pa je dodan deksametazon u istim koncentracijama kao i dan ranije. 48 časova nakon tretmana, supematant je sakupljen i podvrgnut MMP1 ELISA testu koji je opisan pre. Dodavanje deksametazona jasno redukuje MMP1 ekspresiju ćelija SF sa vrednostima IC50od oko 1 nM (vidi Sliku 3). Ovi podaci pokazuju ta MMP1 ekspresija u aktivisanim ćelijama SF može da se redukuje uz pomoć dodavanja fiziološki relevantnog inhibitora i predstavljaju dokaz principa za 'MMP testa'.

Primer 2. 2: MAPKAPK5 menja MMP1 ekspresiju u ćelijama SF indukovanima preko

' kompleksnog pokretača'

(A) Ad- siRNA virus funkcioniše tako da nokdaunira MAPKAPK5 ekspresiju.

Rekombinantni adenovirusi koji provode ekspresiju siRNA koje ciljaju MAPKAPK5 i eGFP su

generisani u skladu sa procedurom koja je opisana u WO03/020931. Ciljna sekvencija koja se koristi u rekombinantnom adenovirusu je: CGGCACTTTACAGAGAAGC (SEQ ID NO: 5) kao i ATGATGTGTGCCACACACC (SEQ ID NO: 6). Ciljna sekvencija bez eGFP mRNA koja je korišćena u rekombinantnom adenovirusu je: GCTGACCCTGAAGTTCATC (SEQ ID NO: 1). Ove sekvencije su klonirane u plazmid adapter uz pomoć mesta Sapi. dEl/dE2A adenovirusi su

konstruisani iz ovih plazmida adaptera uz pomoć ko-transfekcije plazmida helpera pWEAd5AflII-rITR.dE2A u PER.E2A ćelijama za pakovanje, kao šta je opisano u W099/64582.

Funkcionalnost adenovirusa koji cilja MAPKAPK5 je testirana na sledeći način. Ovi adenovirusi se koriste za infekciju primarnih humanih SF koji rastu u petrijevim pločama na sledeći način. Prvoga dana je posejano 1, 500.000 SF ćelija po petrijevoj ploči. Jedan dan kasnije, ćelije su inficirane sa Ad5-MAPKAPK5-vl3_KD (1.6E9 VP/mL) ili Ad5-eGFP-v5_KD (1.3E10 VP/mL) kod MOI od 4000 (na osnovu titara (broj virusnih čestica po mL) definisan za viruse preko Q-rt-PCR). Sedmog dana, ćelije su odvojene od petrijevih ploča u skladu sa standardnom procedurom uz upotrebu rastvora tripsina i EDTA. Tripsin je tada neutralizovan uz dodavanje DMEM medijuma koji je pojačan sa 10 % FBS. Ćelije su tada sakupljene uz pomoć centrifugovanja (1000 rpm, 5 min). Pelet je liziran u 100 uL svežeg RIPA pufera (50 mM Tris pH 7.5, 150 mM NaCl, 1 % deoksiholat, 1 % Triton X100, 0.1 % SDS). Primerci su tada sonifikovani tokom 10 sekunda. Koncentracija belančevina u uzorcima je tada određena uz pomoć BCA kita (Pierce, Kat. N° 23227) kao šta je opisano od strane proizvođača uz upotrebu BSA kao standarda. U 30Hg ćelijskog lizata razređenog do 19.5 ul u RIPA puferu, dodano je 3.5 uL agensa za redukovanje (NuPage agens za redukovanje N° 10, Invitrogen NP0004) i 7.5 uL pufera za uzorke (NuPage LDS pufer za uzorke, Invitrogen NP0007). Primerci od 30 uL su tada grejani tokom 5 min i stavljeni na 10 % poliakrilamidni gel (Invitrogen NP0301). Sa ciljem određivanja nivoa belančevina koji je nokdauniran, na gel je takođe dodano 15 ug, 7.5\ igi 3.75 ng lizata Ad5-eGFP-v5_KD inficiranih ćelija. Gel je vožen tokom 2 časa na 100 V u 1 x MOPS/SDS NuPage puferu za elektroforezu (Invitrogen NP001). 10 ul Seablue Plus Prestained standard (Invitrogen LC5925) je korišćen za određivanje veličina belančevina na gelu. Belančevine na gelu su tada transferisane na PVDF membrane (Invitrogen LC2002) uz pomoć procedure vlažnog blota koristeći se sa puferom za trensfer koji je pripremljen uz pomoć mešanja 100 ml Nupage pufera za transfer 20<*>(NP0006-1), 400 mL metanola i 1500 mL Milli Q vode. Pre transfera, membrana je prvo zamočena u metanolu i u puferu za transfer. Transfer je proveden kod 100 V tokom 90 min. Membrana je tada blokirana tokom 30 min uz pomoć namakanja u pufera za blokiranje (2 % pudera za blokiranje (Amersham, RPN 2109) pripremljen u PBST (PBS je obogaćen sa 0,1 % Tween 20 (Sigma, P1379)). Nakon blokiranja, provedena je imunodetekcija uz pomoć mišjeg monoklonalnog antitela protiv MAPKAPK5 (BD Biosciences, Kat. N°612080) razređenog 250 puta u puferu za blokiranje. Nakon preko-noćne inkubacije sa ovim primamim antitelom, membrana je oprana 3 puta sa PBST i inkubirana 1 čas sa sekundarnim antitelom ((Poliklonalno kozje antitelo protiv primarnog antitela iz miša Ig, HRP konjugovano (DAKO P0447) razređenim 50000 puta u puferu za blokiranje. Blot je tada opran 3 puta u PBST, a detekcija je provedena sa ECL advance (RPN2109, Amersham) na aparatu Kodakimager u skladu sa instrukcijama proizvođača. Western bloting je otkrio niske nivoe ekspresije MAPKAPK5 u Ad5-MAPKAPK5-vl3_KD inficiranim ćelijama upoređeno sa ćelijama koje su bile inficirane sa Ad5-eGFP-v5_KD virusima negativne kontrole. Uporedba sa razređenim Ad5-eGFP-v5_KD inficiranim uzorcima je utvrdila redukciju ekspresije od 2 puta. Podjednako punjenje 30 pg uzoraka je demonstrirano uz pomoć imunodetekcije p-aktina nakon odstranjivanja MAPKAPK5 antitela uz pomoć 'procedure skidanja' (5 min grajanja membrane u PBST). Imunodetekcija P-aktina je provedena u skladu sa metodom koji je opisan za detekciju MAPKAPK5, ali uz upotrebu kozjeg poliklonalnog antitela protiv P-aktina (Santa Cruz, Kat. N° SC-1615) kod razređenja od 1000 puta za primarno antitelo i zečjeg antitela protiv kozjeg antitela kod razređenja od 50000 puta kao sekundarno antitelo. Rezultati ovoga eksperimenta su prikazani na Slici 4. Sve zajedno, ovaj eksperiment pokazuje funkcionalnost Ad-siRNA virusa koji je proizveden sa ciljem da redukuje nivoe MAPKAPK5 ekspresije u primarnim humanim

SF.

(B) MAPKAPK5 nokdaun Ad- siRNA redukuje SF- indukovanu MMP1 ekspresiju

Efikasnost Ad5-MAPKAPK5-vl3_KD virusa u 'MMP testu' je testirana na sledeći način. Prvog

dana, SF (pasaž 9 do 10) su posejane u pločice sa 96 rupica kod razređenja od 3000 ćelija po rupici u kompletnom medijumu za sinovijalni rast (Cell Applications). Jedan dan kasnije, ćelije su inficirane sa povećavaj ućim količinama (3, 6, 9, 12 ili 15 ul) sledećih virusa: Ad5-eGFP-v5_KD, Ad5-MAPKAPK5-vl2_KD, Ad5-MAPKAPK5-vl3_KD, Ad5-MMPl-vl0_KD. Količina virusa je korigovana uz pomoć dodavanja neutralnog virusa Ad5-Luc-vl3_KD sa ciljem da finalni volumen dodanih ćelija bude 15 uL u svakoj rupici. Ova korekcija garantuje da efekti koji su primećeni nisu rezultat virusnog volumena koji je dodan ćelijama. Ćelije su tada inkubirane tokom 5 dana pre koraka aktivisanja. Ovaj korak uključuje zamenu, u svakoj rupici, medijuma za rast sa 75 uL Ml 99 medijuma koji je pojačan sa 25 uL 'kompleksnog pokretača'.

48 časova nakon koraka aktivisanja, supematant je sakupljen i podvrgnut MMP1 ELISA kao šta je opisano u Primeru 1. Rezultati ovoga eksperimenta su prikazani na Slici 5. Kvalitet eksperimenta je pokazan uz pomoć efikasnosti Ad-siRNA virusnog ciljanja MMP1. Virus pozitivne kontrole silno redukuje MMP1 ekspresiju u ćelijama SF, dok virus negativne kontrole, koji je dizajniran da cilja ekspresiju luciferaze, ne utiče na nivoe MMP1 ekspresije. Dva virusa koja su korišćena za validaciju MAPKAPK5 cilja (Ad5-MAPKAPK5-vl2_KD i Ad5-MAPKAPK5-vl3) takođe dovode do jasnog redukovanja MMP1 ekspresije indukovane uz pomoć kompleksnim pokretačem u primarnim humanim ćelijama SF. Može da se zaključi, iz ovoga eksperimenta, da MAPKAPK5 predstavlja vredan cilj za lek za kojeg je pokazano da modulira MMP1 ekspresiju u ćelijama SF. Slično, inhibicija MAPKAPK5 encimske aktivnosti uz pomoć jedinjenja sa malim molekulom je očekivano da smanjuje MMP1 ekspresiju indukovanu 'kompleksnim citokinom' u 'MMP testu'. Inhibicija MAPKAPK5 encimske aktivnosti uz pomoć jedinjenja sa malim molekulom je takođe predviđena da smanjuje degradaciju zglobova koja je povezana sa RA.

(C)In vitro ' MMPtest' koji testira jedinjenja koja inhibiraiu MAPKAPK5

Jedinjenja koja inhibiraju MAPKAPK5 aktivnost u biohemijskom testu (na primer, testu bez

ćelija, uz pomoć purifikovanog encima), su testirana uz pomoć 'MMP testa' u skladu sa sledećim protokolom.

Glavni stokovi jedinjenja (svi kod 10 mM koncentracije u 100 % DMSO) su razređeni 10 puta u vodi (Destilovana voda, GIBCO, bez DNAze i RNAze) sa ciljem da se dobije 1 mM intermedijarni radni stok u 10 % DMSO. Ovaj intermedijarni radni stok je dodatno razređen ili 3 puta (ili 10 puta) u 10 % DMSO sa ciljem da se dobije intermedijarni radni stok 333 uM (ili 100 uM) koncentracije u 10 % DMSO. 1 mM kao i 333 pM (ili 100 uM) intermedijarni radni stokovi su tada dodatno razređeni 10 puta u 1.1 % DMSO sa ciljem da se dobije 10 x radni stok kod 100 uM i 33.3 uM (ili 10 pM) koncentracije u 2 % DMSO. Ovaj 10 x radni stok je tada dodatno razređen 10 puta u M199 medijumu koji je obogaćen sa 1 % FBS sa ciljem da se dobije konačna 'preparacija od 1 x jedinjenja' koja sadrži jedinjenja od 10 uM i 3.33 uM (ili 1 uM) koncentracije kao i 0.2 % DMSO. Ovo su finalni uslovi kod koji su jedinjenja testirana u ćelijama. Paralelno, 10 x radni stok je razređen 10 puta u 'kompleksnom pokretaču' (na primer, supematant TNF-a tretiranih THP1 ćelija je proizveden kao šta je opisano u Primeru 1) koji je razređen 2 puta u Ml99 obogaćenim sa 1 % FBS sa ciljem da se proizvede 'preparacija 1 x jedinjenje u 50 % kompleksnom pokretaču'.

Prvog dana, RASF su posejane u pločice sa 96 rupica (Ravno dno, tretirane kulture tkiva, Greiner) kod gustoće od 3000 ćelija/po rupici u kompletnim medij umom za sinovijalni rast (Cell Applications). Petog dana, jedinjenja su dodana u kultivisane ćelije na sledeći način. Medijum je kompletno odstranjen od ćelija pa je zamenjen sa 75 uL 'preparacija 1 x jedinjenje' koje sadrže jedinjenja kod koncentracije ili 10 pM ili 3.33 uM (ili 1 pM) u M199 medijumu koji je obogaćen sa 1 % FBS i 0.2 % DMSO. Nakon inkubacije od 2 časa, koja dozvoljava jedinjenjima da se ekvilibrišu u uđu u stanice, u rupice preko 'preparacije 1 x jedinjenje' je dodano po 25 pL 'preparacije 1 x jedinjenje u 50 % kompleksnom pokretaču', u rupicama koje sadrže odgovarajuća jedinjenja kod odgovarajućih koncentracija. Na ovaj način, 8 puta razređeni kompleksni pokretač je konačno primenjen na ćelijama. Inkubacija od 48 časova je tada provedena, a 20 pl ćelijskog supernatanta je tada procesirano u MMP1 ELISA kao šta je opisano ranije, šta dovodi do grubih podataka (RLU: relativne jedinice luminuscencije). Sledeće kontrole su uključene u eksperimente. Kontrola maksimalnog signala, u kojoj su ćelije aktivisane uz pomoć kompleksnog pokretača, a dodan je samo prenosnik od 0.2 % DMSO (bez jedinjenja). Ova kontrola indicira maksimalni nivo MMP1 koji može da se postigne u testu. Kontrola minimalnog signala je takođe bila uključena u eksperimentima. Tu, ćelije nisu bile poticane. Medijum ćelija je tada zamenjen sa 100 pl M199 medijuma koji je bio obogaćen sa 1 % FBS tokom petog dana. Ova kontrola vraća bazalne nivoe MMP1 koje su proizvedene uz pomoć RASF. Procenat inhibicije MMP1 ekspresije koji je postignut uz pomoć jedinjenja je tada izračunat na osnovu RLU povratnih podataka koji su dobiveni uz pomoć ELISA, a preko sledeće formule: [[(maksimalni MMP1 nivoi - minimalni MMP1 nivoi) - (MMP1 nivo za jedinjenje X kod koncentracije Y - minimalni MMP1 nivoi)]/(maksimalni MMP1 nivoi - minimalni MMP1 nivoi)] x 100.

Toksičnost jedinjenja je procenjena na sledeći način. Prvog dana, SF su posejane u bele pločice sa 96 rupica tretirane sa kulturom tkiva kod gustoće od 3000 ćelija po rupici u 100 pL kompletnom medijumu za sinovijalni rast. Rukovanje sa jedinjenjima, dodavanje jedinjenja, kao i aktivisanje ćelija je dalje provedeno kao šta je opisano ranije u primeru za determinaciju MMP1 nivoa. Nakon 48 časovnog perioda inkubacije, medijum je odstranjen iz rupica, zamenjen je sa 50 pL svežeg Ml 99 medijuma koji je obogaćen sa 1 % FBS. 50 pL supstrata (Promega Celltiter Glow kit za vijabnilnost ćelija) je tada dodano u rupice. Nakon inkubacije tokom perioda od 10 min, izmeren je signal luminiscencije. Redukcija u signalu luminiscencije za više od 50 % upoređeno sa rupicama sa kontrolom maksimalnog signala se smatra da predstavlja signifikantnu toksičnost. Toksičnost nije bila primećena za jedinjenja koja su bila testirana uz pomoć 'MMP testa'.

Treba da se razume da faktori poput diferencijalnog kapaciteta penetracije u ćelije različitih jedinjenja mogu da doprinesu za razlike među aktivnostima jedinjenja uin vitrobiohemijskim i ćelijskim MMP testovima.

Za potrebe Tabele 3 i Tabele 4 ispod, MMP1 EC5oza svako jedinjenje, koji može da se odredi uz pomoć metoda testiranja koji su opisani ranije, je izražen na sledeći način:

Primer 3: Test za procenu efekta jedinjenja na oslobađanje citokina od strane humanih

PBMC

Humane mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC) su izolovane iz ne koagulisane krvi nakon centrifugovanja krvi zdravih volontera, a izolovane su specijalno u skladu sa metodom po Boyumu (1984). Ukratko, ne koagulisana krv nakon centrifugovanja je razređena 1:1 sa 1 x PBS (Gibco) pa je pažljivo na vrh tuba od 20 mL Lvmphoprep™ (Lucron Bioproducts) i na vrh tuba od 50 mL Falcon dodano po 30 mL. Nakon centrifugovanja (35 min, 400 g, 18° C) mononuklearne ćelije su sakupljene iz belih interfaza i oprane 3 puta sa 1 x PBS uz pomoć resuspendovanja i centrifugovanja (10 min, 200 g). Izolovani PBMC su finalno resuspendovani u RPM1 1640 (Kat.No. 21875, Gibco) koji je bio obogaćen sa 10 % FBS (Hvclone) inaktivisanim grejanjem.

Za potrebe testa, PBMC su posejane kod koncentracije od 2.5 E6 ćelija/mL u 160 pL na pločice sa 96 rupica (Nunc). Serijska razređenja testiranih jedinjenja su napravljena prvo u DMSO (Sigma), a tada su razređena 50 puta u M199 medijumu (Gibco) koji je sadržavao 1 % FBS inaktivisanog grejanjem. Jedinjenja su dodatno razređena 1/10 u testnim pločicama sa ciljem da se dobije finalna DMSO koncentracija od 0.2 %. Ćelije su preinkubirane sa jedinjenjima tokom 1 časa na 37° C, 5 % CO2. Tada, ćelije su stimulisane sa LPS( Eschelichia coliserotip 026:B6, Kat.No. L2654, Sigma) koji je dodan u volumenu od 20 pL do finalne koncentracije od 1 pg/mL,a ćelije su dodatno kultivisane tokom 24 časa. Pločice su centrifugovane, a supematant je sakupljen i spremljen na -80° C do momenta analize odgovarajućih razređenja uz pomoć ELISA.

Sledeći hemiluminescentni ELISA protokol na 384 rupice je razvijen sa ciljem da se meri nivo TNFa u supernatantu: Bele Lumitrac 600 pločice sa 384 rupica (Greiner) su omotane sa (40 pL/rupici) anti-TNFa antitelo lovac (Kat.No. 551220, BD Pharmingen) koje je razređeno do 1 pg/mL u 1 x PBS (Gibco). Nakon preko noćne inkubacije na 4° C, pločice su oprane sa 1 x PBS

(80 g NaCl, 2 g KC1 (Sigma), 11.5 g Na2HP04.7H20 i 2 g KH2P04u 10 L milliQ; pH 7.4) i blokirane sa 100 pL/rupici puferom B (1 x PBS koji sadrži 1 % BSA (Sigma), 5 % saharoze (Sigma) i 0.05 % NaN^(Sigma)). Nakon 4 časa inkubacije na sobnoj temperaturi, reagent za blokiranje je odstranjen, a pločice su oprane jedno sa PBST (1 x PBS sa 0.05 % Tween-20 (Sigma)). Tada, 40 pL uzoraka je preneseno u ELISA pločice koje su inkubirane na 4° C. Sledeći dan, pločice su oprane 3 puta (dva puta sa PBST i jedan puta sa PBS) pa je dodano 35 pL/rupici biotinilovanog anti-TNFa antitela (Kat.No. 554511, BD Pharmingen) razređeno prvo do koncentracije od 250 ng/ml u puferu D (1 x PBS sa 1 % BSA). Nakon 2 časa inkubacije na sobnoj temperaturi, pločice su oprane kako je opisano ranije pa je dodano 35 pL/rupici 1/2000 razređenja konjugata streptavidin-HRP (Kat.No. SNN2004, Biosource) u puferu D. Nakon 45 min, pločice su oprane kako je opisano ranije i inkubirane tokom 5 min sa 50 pL/rupici BM Chemiluminescence ELISA supstratom POD (Roche). Očitanje je provedeno na aparatu Luminoscan Ascent Luminometer (Labsvstems) sa integracionim vremenom od 100 ms šta daje grube podatke (RLU: relativne jedinice luminescencije). Sledeće kontrole su uključene u eksperimentima, kontrola maksimalnog signala, u kojoj ćelije su aktivisane uz pomoć LPS, ali je dodao samo 0.2 % DMSO prenosnika (bez jedinjenja). Ova kontrola pokazuje maksimalni nivo TNFa koji može da se postigne u testu. Kontrola minimalnog signala je takođe uključena u ovim eksperimentima. Ovde, ćelije nisu poticane. Ova kontrola vraća bazalni nivo TNFa proizveden od strane PBMC. Procenat inhibicije (PIN) oslobađanja TNFa, postignut uz pomoć jedinjenja je tada izračunat na osnovu RLU povratnih podataka uz pomoć ELISA preko sledeće formule: 100 - [((TNFa nivo jedinjenja X kod koncentracije Y- minimalni TNFa nivoi)/(maksimalni TNFa nivoi - minimalni TNFa nivoi)) x 100]. Kada su jedinjenja testirana kod 8 koncentracije (1/3 serijska razređenja), EC50-vrednosti mogu da se izračunaju uz pomoć krive koja podešava srednje vrednosti PIN podataka koje su dobivene za jedinjenje kod svake testne koncentracije.

Sa ciljem testiranja efekata jedinjenja na oslobađanje ILI i IL6 od strane PBMC kultura stimulisanih sa LPS, odgovarajuća razređenja supernatanta mogu da se mere uz pomoć istog ELISA protokola kao šta je opisano ranije. Par antitela za ILI i IL6 ELISA (sva od R&D Svstems) mogu da se koriste na sledeći način: anti-ILl antitelo lovac (Kat.No. MAB601) kod koncetracije 0.5 pg/mL, biotinilovano anti-ILl antitelo za detekciju (Kat.No. BAF201) kod koncentracije 50 ng/mL; anti-IL6 antitelo lovac (Kat.No. MAB206) kod koncentracije 1 pg/mL; biotinilovano anti-IL6 antitelo za detekciju (Kat.No. BAF206) kod koncentracije 50 ng/mL.

Za potrebe Tabele 5 ispod, PBMC EC50svakog jedinjenja, koji može da se odredi uz pomoć testa koji je opisan ranije, je predstavljen na sledeći način:

Ova aplikacija opisuje metod za tretman ili prevenciju od bolesti zapaljenja, koji obuhvata davanje subjektu u potrebi, terapeutski efektivni inhibitor Mitogenom-Aktivisane Protein Kinaze-Aktivisane Protein Kinaze 5, inhibirajuću količinu jedinjenja u skladu sa Formulom 1.

Drugi aspekt ove aplikacije se odnosi na metod za tretman ili profilaksu stanja koje je karakterizovano sa abnormalnom aktivnosti metalo proteinaza iz matriksa, koji obuhvata davanje terapeutski efektivne količine jedinjenja u skladu sa Formulom 1 koje inhibira metalo proteinazu iz matriksa.

Dodatni aspekt ove aplikacije je metod za tretman ili profilaksu stanja koje je izabrano iz bolesti koje uključuju degradaciju ekstra-celularnog matriksa, koji obuhvata davanje terapeutski efektivne količine jedinjenja u skladu sa Formulom 1 koje inhibira metalo proteinazu iz matriksa.

Dodatni aspekt ove aplikacije je metod za tretman ili profilaksu stanja izabranog iz bolesti koje uključuju abnormalnu celularnu ekspresiju MMP1, koji obuhvata davanje terapeutski efektivne količine jedinjenja u skladu sa Formulom 1 koje inhibira metalo proteinazu iz matriksa.

Specijalna izvedba aplikacije je metod za tretman ili prevenciju reumatoidnog artritisa, koji obuhvata davanje subjektu u potrebi, terapeutski efektivnu količinu jedinjenja u skladu sa Formulom 1.

Ovaj pronalazak se takođe odnosi na upotrebu pomenutih jedinjenja u proizvodnji leka za tretman ili profilaksu stanja koje je sprečeno, ublaženo ili eliminisano uz pomoć davanja inhibitora Mitogenom-Aktivisane Protein Kinaze-Aktivisane Protein Kinaze 5 ili stanja karakterizovanog sa abnormalnom aktivnosti kolagenaze ili stanja koje je izabrano iz bolesti koje uključuju zapaljenje, a naj preferiranije za tretman reumatoidnog artritisa.

Davanje jedinjenja iz ovoga pronalaska subjektu (pacijentu) uključuje samo-administraciju i administraciju uz pomoć druge osobe. Pacijent može da bude u potrebi za tretmanom postojeće bolesti ili medicinskog stanja ili može da želi primenu profilaktičkog tretmana sa ciljem da spreči ili smanji rizik od dobijanja bolesti i medicinskog stanja koje je uzrokovano poremećajem metabolizma kostiju. Jedinjenje iz ovoga pronalaska može da se dostavi subjektu (pacijentu) oralno, transdermalno, uz pomoć inhaliranja, injekcije, nazalno, rektalno ili preko formulacija sa odloženim otpuštanjem.

Preferirani režim ovoga metoda obuhvata administraciju subjektu koji pati od bolesnog stanja karakterizovano zapaljenjem, sa efektivnom količinom jedinjenja iz ovoga pronalaska koje može da inhibira metalo proteinazu iz matriksa tokom perioda vremena koji je dovoljan da smanji abnormalne nivoe degradacije ekstracelularnog matriksa kod pacijenta, a poželjno da terminira proces koji sam sebe ubrzava i koji je odgovoran za pomenutu degradaciju. Specijalna izvedba metoda obuhvata administraciju efektivne količine jedinjenja iz ovoga pronalaska koje može da inhibira metalo proteinaze iz matriksa subjektu koji pati od ili koji ima predispozicije za razvijanje reumatoidnog artritisa, tokom perioda vremena koji je dovoljan da smanji ili spreči degradaciju kolagena i kosti u zglobovima pomenutog pacijenta, a najpoželjnije da terminira proces koji sam sebe ubrzava i koji je odgovoran za pomenutu degradaciju.

Toksičnost i terapeutska efikasnost pomenutih jedinjenja može da se odredi uz pomoć standardnih farmaceutskih procedura u kulturi ćelija ili uz upotrebu eksperimentalnih životinja,na primerza određivanje LD50 (doze koja je letalna za 50 % populacije) i ED50 (doza koja je terapeutski efektivna na 50 % populacije). Omer doza među toksičnih i terapeutskih efekata je terapeutski indeks i može da se izrazi kao omer LD50/ED50. Jedinjenja koja pokazuju velike terapeutske indikacije su poželjna. Mada jedinjenja koja pokazuju toksične nus-pojave mogu da budu korišćena, treba da se preduzme pažnja da se razvije sistem za dostavu koji cilja pomenuta jedinjenja na samo mesto pogođenih tkiva sa ciljem da se smanji potencijalna šteta na ne zahvaćenim ćelijama i, na taj način, da se smanje nus-pojave.

Podaci koji su dobiveni iz testova sa kulturama tkiva i studijama na životinjama mogu da se koriste u formulisanju raspona doziranja za upotrebu kod ljudi. Doziranje pomenutih jedinjenja leži preferirano u rasponu koncentracija koje cirkulišu i uključuju ED50 sa malom ili bez toksičnosti. Doziranja mogu da variraju u ovom rasponu u zavisnosti od dozne forme koja je primenjena i od rute administracije koja je korišćena. Za bilo koje jedinjenje koje se kristi u metodu iz ovoga pronalaska, terapeutski efektivna doza može da se utvrdi inicijalno iz testova sa kulturama tkiva. Doza može da se formulira na animalnim modelima sa ciljem da se postigne koncentracija koja cirkuliše u plazmi u rasponu koji uključuje IC50 (na primer, koncentracija testiranog jedinjenja koja postiže pola od maksimalne inhibicije simptoma) kao šta je determinisano iz kulture ćelija. Takve informacije mogu da se koriste za još tačnije određivanje korisnih doza za ljude. Nivoi u plazmi mogu da se mere, na primer, uz pomoć visoko-efikasne tečne hromatografije.

Preferirana terapeutski efektivna količina jedinjenja iz ovoga pronalaska koja može da se administrira subjektu (pacijentu) je oko 0.1 mg/kg do oko 10 mg/kg administrirana od jednog pa do tri puta na dan. Na primer, efektivan režim ovoga metoda može da administrira oko 5 mg pa do oko 1000 mg pomenutog jedinjenja iz ovoga pronalaska od jednog pa do tri puta na dan. Treba da se razume, međutim, da specifičan dozni nivo za bilo koji pojedini subjekt (pacijent) će da zavisi od brojnim faktorima uključujući starost, telesnu težinu, opšte zdravlje, pol, prehranu, vreme administracije, rutu administracije, ratu ekskrecije, kombinaciju leka i ozbiljnosti pojedinog stanja zapaljenja. Uzimanje u obzir ovih faktora spada u razmatranje običnog radnika u klinici sa ciljem da se determiniše terapeutski efektivna ili profilaktički efektivna dozna količina koja je potrebna za sprečavanje, okretanje ili zaustavljanje progresa pomenutog stanja.

Jedinjenja iz ovoga pronalaska mogu da se inkorporiraju u farmaceutske kompozicije pogodne za administraciju. Takve kompozicije tipično obuhvataju najmanje jedno jedinjenje iz ovoga pronalaska i najmanje jedan farmaceutski prihvatljiv kerijer. Na način na koji se ovde koristi, termin "farmaceutski prihvatljiv kerijer" ima za cilj da uključi tvrde kerijere poput laktoze, magnezijum stearata, tera alba, saharoze, talka, stearinske kiseline, želatina, agara, pektina, akaciu i si.; i tečne poput biljnih ulja, ulja od kikirikija i sterilne vode i si., bilo kojeg i svih rastvarača, medijuma za disperziju, materija za zamotanje, antibakterijskih i antifungalnih agenasa, izotoničnih agenasa i agenasa koji usporavaju apsorpciju i si., a koji su kompatibilni za farmaceutsku primenu. Ova lista farmaceutski prihvatljivih kerijera ne treba da se smatra kao ograničavajuća. Upotreba takvih medijuma i agenata kao farmaceutski aktivne supstancije je dobro poznato stanju tehnike. Ako bilo koji od konvencionalnih medijuma ili agenata nije kompatibilan sa aktivnim jedinjenjem, njegova upotreba treba da se preispita. Dodatna aktivna jedinjenja mogu takođe da budu uključena u pomenute kompozicije.

Farmaceutska kompozicija iz ovoga pronalaska je formulirana da bude kompatibilna sa rutom koja je namenjena za njenu administraciju. Primeri za rute adniinistracije uključuju parenteralnu, na primer, intravenoznu, intradermalnu, subkutanu, oralnu (poput inhalacije), transdermalnu (topikalno), transmukozalnu i rektalnu administraciju. Rastvori ili suspenzije koje se koriste za parenteralnu, intradermalnu ili subkutanu aplikaciju mogu da uključe sledeće komponente: sterilni razređivač poput vode za injekciju, slanog rastvora, fiksiranih ulja, polietilen glikola, glicerina, propilen glikola ili drugih sintetskih rastvarača; antibakterijske agense poput benzil alkohola ili metil parabene; antioksidante poput askorbinske kiseline ili natrijum bisulfita; helatne agense poput etilendiamintetrasirćetne kiseline; pufere poput acetate, citrate ili fosfate i agense za podešavanje toničnosti poput natrijum hlorida ili dekstroze. pH može da se podesi sa kiselinama ili bazama, poput hlorovodonične kiseline ili natrijum hidroksida. Parenteralne preparacije mogu da budu zamotane u ampulama, špricevima za jednu upotrebu ili u formi višedoznih bočica za lekove napravljene od stakla ili plastike.

Farmaceutske kompozicije koje su prikladne za injektiranje uključuju sterilne vodene rastvore (gde je voda solubilna) ili disperzije i sterilne pudere za ekstemporanlnu preparaciju sterilnih rastvora za injektiranje ili disperzija. Za intravenoznu administraciju, prikladni kerijeri uključuju fiziološki rastvor, bakteriostatičku vodu, Cremophor ELTM (BASF, Parsippanv, NJ) ili slani rastvor koji je puferovan sa fosfatom (PBS). U svim slučajevima, kompozicija mora da bude sterilna i treba da bude tečna do onog stepena da omogući lako injektiranje. Mora da bude stabilna u uslovima proizvodnje i skladištenja i mora da bude zaštićena od kontaminacije sa mikroorganizmima poput bakterija i gljiva. Kerijer može da bude rastvarač ili disperzija, medijum koji sadrži, na primer, vodu, etanol, poliol (na primer, glicerol, propilen glikol i tečni polietilen glikol i si.) i prikladne njihove mešavine. Odgovarajuća fluidnost može da se održava, na primer, uz pomoć upotrebe zamotanja poput lecitina, uz pomoć održavanja željene veličine čestica u slučaju disperzije i uz pomoć upotrebe surfaktanata. Prevencija od delovanja mikroorganizama može da se postigne uz pomoć brojnih antibakterijskih i antifunglanih agenasa, na primer, parabena, 'hlorobutanola, fenola, askorbinske kiseline, timerosala i si. U mnogim slučajevima, može da bude poželjno da se uključe i izotonični agensi, na primer, šećeri, polialkoholi poput manitola, sorbitola, natrijum hlorida u pomenutu kompoziciju. Kompozicije sa prolongiranom apsorpcijom koje mogu da se injektiraju mogu da se postignu uz pomoć uključivanja u kompoziciju nekog agensa koji usporava apsorpciju, na primer, aluminijum mono stearata i želatina.

Sterilni rastvori za injektiranje mogu da se pripreme uz pomoć uključivanja aktivnog jedinjenja (na primer, jedinjenja u skladu sa nekom od izvedbi ovoga pronalaska) u željenoj količini u odgovarajućem rastvaraču sa jednim ili sa kombinacijom sastojaka koji su nabrojani ranije, i kao šta je potrebno uz sterilizovanje preko filtracije. Opšte uzeto, disperzije se pripremaju uz pomoć ugradnje aktivnog jedinjenja u sterilni prenosnik koji sadrži bazni disperzioni medijum i ostale željene sastojke od onih koji su pre bili nabrojani. U slučaju sterilnih pudera za preparaciju sterilnih rastvora za injektiranje, poželjan metoda preparacije je vakum sušenje i sušenje uz pomoć smrzavanja šta dovodi do pudera aktivnog sastojaka plus ostalih dodatnih željenih sastojaka iz njegovog prethodnog rastvora koji je bio sterilizovan uz pomoć filtracije.

Oralne kompozicije opšte uzeto uključuju neki inertan rastvarač ili neki jestivi kerijer. Isti mogu da budu pakovani u želatinske kapsule ili mogu da budu nabijene u tablete. Za potrebe oralne terapeutske administracije, aktivno jedinjenje može da bude inkorporisano s ekscipijentima i može da se koristi u formi tableta, lozunga ili kapsula. Oralne kompozicije mogu takođe da se pripreme uz pomoć upotrebe tečnog kerijera koji se koristi za pranje usta, dok jedinjenje u tečnom kerijeru može da se aplicira oralno uz pomoć šmrkanja ili može da se proguta. Farmaceutski kompatibilni vezni agensi i/ili dodatni materijali mogu da budu uključeni kao deo kompozicije. Tablete, pilule, kapsule, lozung i si. mogu da sadrže bilo koji od sledećih sastojaka ili jedinjenja slične prirode: veznik poput mikrokristalne celuloze, gumu tragakant ili želatin; ekscipijent poput škroba ili laktoze, agens za raspadanje poput alginske kiseline, Primogela ili škroba od kukuruza; lubrikant poput magnezijum stearata ili Sterotes; glidant poput koloidnog silikon dioksida; agensa za zaslađivanje poput saharoze ili saharina; ili agensa za okus poput peperminta, metil salicilata ili okusa pomorandže.

Za administraciju uz pomoć inhaliranja, jedinjenja su dostavljena u formi aerolosnog spreja iz kontejnera koji je pod pritiskom ili dispensera koji sadrži odgovarajući propelant, kao na primer gasa poput ugljen dioksida ili zamagljivača.

Sistematska administracije može takođe da bude transmukozna ili transdermalna. Za transmukoznu ili transdermalnu administraciju, u formulaciji se koriste penetranti koji su pogodni za barijeru koja treba da se penetrira. Takvi penetranti su generalno poznati stanju tehnike i uključuju, na primer, za transmukoznu administraciju, deterdžente, gorke soli i derivate fusidične kiseline. Transmukozalna administracija može da se postigne kroz upotrebu nazalnih sprejova ili čepića. Za transdermalnu administraciju, aktivne komponente se formulišu u masti, meleme, gelove ili kreme kao šta je opšte poznato stanju tehnike.

Jedinjenje može takođe da bude pripremljeno u formi čepića (na primer, sa konvencionalnom bazom za čepiće poput putera od kokosa i drugih glicerida) ili u formi klistira za zadržavanje za rektalnu dostavu.

U jednoj izvedbi, aktivne komponente su pripremljene sa kerijerima koji će da štite jedinjenje od rapidnog eliminisanja iz tela, poput formulacije za kontrolisano otpuštanje, uključujući implante i mikroenkapsulovane sisteme za otpuštanje. Mogu da se koriste bioraspadivi, biokompatibilni polimeri, poput etilen vinil acetata, polianidrida, poliglikolne kiseline, kolagena, poliortoestere i polilactične kiseline. Metodi za preparaciju takvih formulacija trebaju da budu poznati stručnjacima. Materijal takođe može da bude nabavljen komercijalno iz Alza Corporation i Nova Pharmaceuticals, Inc. Liposomalne suspenzije (uključujući liposome koji ciljaju inficirane ćelije uz pomoć monoklonskih antitela na viralne antigene) takođe mogu da se koriste kao farmaceutski prihvatljivi kerijeri. Ovi mogu da se pripreme u skladu sa metodima koji su poznati stručnjacima.

Posebno je velika prednost da se formulišu oralne ili parenteralne kompozicije u doznim jediničnim formama za laku administraciju i uniformnosti doziranja. Dozne jedinične forme na način na koji se ovde koriste se odnose na fizički diskretne jedinice koje su pogodne za unitarno doziranje subjekta koji se tretira; svaka jedinica sadrži pre određeni kvantitet aktivnog jedinjenja koji je izračunat sa ciljem da se postigne željeni terapeutski efekat u asocijaciji sa potrebnim farmaceutskim kerijerom. Specifikacija za dozne jedinične forme iz ovoga pronalaska su diktirane i su direktno zavisne od jedinstvenih karakteristika aktivnog jedinjenja i posebnog terapeutskog efekta koji treba da se postigne, ali i od ograničenja koja karakterišu stanje tehnike u vezi sa rukovanjem sa aktivnim jedinjenjem za tretman pojedinaca.

Farmaceutske kompozicije mogu da budu stavljeni u kontejner, pakovanje ili dispenzer zajedno sa instrukcijama za administraciju.

Jedinjenje u skladu sa nekom izvedbom iz ovoga pronalaska može da se formira kao so, preferirano kao farmaceutski prihvatljiva so jedinjenja sa formulom III. Primeri farmaceutski prihvatljivih soli ovih jedinjenja uključuju one soli koje su derivirane iz organskih kiselina poput sirćetne kiseline, malične kiseline, tartarne kiseline, limunske kiseline, mlečne kiseline, oksalne kiseline, suckinske kiseline, fumarne kiseline, maleične kiseline, benzoične kiseline, salicilne kiseline, fenilsirćetne kiseline, mandelične kiseline, metansulfonske kiseline, benzensulfonske kiseline i/7-toluensulfonske kiseline, mineralnih kiselina poput hlorovodonične kiseline i sumporne kiseline i si. kiselina, šta daje metansulfonate, benzensulfonate,/?-toluensulfonate, hlorovodonike i sulfate i si. ili onih soli koje su derivirane od baza poput organskih ili anorganskih baza. Primeri prikladnih anorganskih baza za formiranje soli jedinjenja iz ovoga pronalaska uključuju hidrokside, karbonate i bikarbonate amonijaka, litijuma, natrijuma, kalcijuma, kalijuma, aluminijuma, gvožđa, magnezijuma, cinka i si. Soli takođe mogu da budu formirane sa odgovarajućim organskim bazama. Takve baze prikladne za formiranje farmaceutski prihvatljivih baznih adicionih soli sa jedinjenjima iz ovoga pronalaska uključuju organske baze koje nisu toksične i koje su dovoljno jake da formiraju so. Takve organske baze su već dobro poznate stanju tehnike i mogu da uključe amino kiseline poput arginina i lizina, mono-, di- ili trihidroksialkilamina poput mono-, di- i trietanolamina, holina, mono-, di- i trialkilamina, poput metilamina, dimetilamina i trimetilamina, gvanidina; N-metilglukozamina;N-metilpiperazina; morfolina; etilendiamina; iV-benzilfenetilamina; tris(hidroksimetil) aminometana i si.

Soli jedinjenja u skladu sa nekom izvedbom ovoga pronalaska mogu da se pripreme na konvencionalan način iz pomoć metoda koji su dobro poznati stanju tehnike. Kisele adicione soli pomenutih baznih jedinjenja mogu da se pripreme uz pomoć rastvaranja slobodnog baznog jedinjenja u skladu sa prvim ili drugim aspektom iz ovoga pronalaska u vodenom ili vodeno-alkoholnom rastvoru ili u nekim drugim prikladnim rastvaračima koje sadrže željenu kiselinu. Tamo gde jedinjenje iz ovoga pronalaska sadrži kiselu formulaciju, može da se pripremi bazna so pomenutog jedinjenja uz pomoć reakcije pomenutog jedinjenja sa odgovarajućom bazom. Kisela ili bazna so može da se odvoji direktno ili može da se dobije uz pomoć koncentrisanja rastvora na primer preko isparavanja. Jedinjenja iz ovoga pronalaska mogu takođe da postoje u solvatizovanim ili hidratizovanim formama.

Stručnjaci u polju treba da razumeju da su ovaj opis i navedeni primeri samo ilustrativni i da im je namera da ilustruju pronalazak i njegove preferirane izvedbe. Kroz rutinsko eksperimentiranje, stručnjak će biti u stanju da prepozna odgovarajuće modifikacije i varijacije koje mogu da se naprave bez da se izađe iz okvira ovoga pronalaska. Tako, ovaj pronalazak ima za nameru da se definiše ne preko ovog opisa, već preko navedenih zahteva.

REFERENCE

Choy EH, Panavi GS. (2001). N Engl J Med. 344: 907-16.

Firestein GS. (2003). Nature. 423:356-61.

Smolen JS, Steiner G. (2003). Nat Rev Drug Discov. 2: 473-88.

Lee DM, Weinblatt ME (2001). Lancet. 358: 903-11.

Kremer J. M., Westhovens R., Leon M., Di Giorgio E., Alten R., Steinfeld S., Russell A., Dougados M., Emery P., Nuamah I. F., Williams G. R., Becker J.-C, Hagerty D. T., Moreland L. W. (2003) N Engl J Med. 349:1907-1915.

Edwards J. C.W., Szczepanski L., Szechinski J., Filipowicz-Sosnowska A., Emery P., Close D. R., Stevens R. M., Shaw T. (2004) N Engl J Med. 350:2572-2581.

O'Dell JR, Leff R, Paulsen G, Haire C, Mallek J, Eckhoff PJ, Fernandez A, Blakely K, Wees S, Stoner J, Hadley S, Felt J, Palmer W, Waytz P, Churchill M, Klassen L, Moore G. (2002) Arthritis Rheum. 46:1164-70.

St Clair EW, van der Heijde DM, Smolen JS, Maini RN, Bathon JM, Emery P, Keystone E, Schiff M, Kalden JR, Wang B, Dewoody K, Weiss R, Baker D; (2004) Combination of infliximab and methotrexate therapy for early rheumatoid arthritis: a randomized, controlled trial. Arthritis Rheum. 50 :3432-43.

Gomez-Reino JJ, et al. (2003). Arthritis Rheum. 48: 2122-7.

O'Dell JR. (2004) Therapeutic strategies for rheumatoid arthritis. N Engl J Med. 350(25):2591-602.

New L, Jiang Y, Han J. (2003) Regulation of PRAK subcellular location by p38 MAP kinases. Mol Biol Cell. 14(6):2603-16.

Shi Y, Kotlyarov A, Laabeta K, Gruber AD, Butt E, Marcus K, Meyer HE, Friedrich A, Volk HD, Gaestel M. (2003) Elimination of protein kinase MK5/PRAK activity by targeted homologous recombination. Mol Cell Biol. 23:7732-41.

Seternes OM, Mikalsen T, Johansen B, Michaelsen E, Armstrong CG, Morrice NA, Turgeon B, Meloche S, Moens U, Keyse SM. (2004) Activation of MK5/PRAK by the atypical MAP kinase ERK3 defines a novel signal transduction pathway.

EMBO J. 23:4780-91.

Andreakos E, et al. (2003). Arthritis Rheum. 48: 1901-12.

Cunnane G, et al. (2001). Arthritis Rheum 44: 2263-74.

Coussens LM, et al. (2002). Science 295: 2387-92.

Creemers EE, et al. (2001). Circ Res. 2001 89:201-10

Gapski R, et al. (2004). J Periodontol. 75:441-52.

Reif S, Somech R, Brazovski E, Reich R, Belson A, Konikoff FM, Kessler A. (2005) Digestion. 71:124-130.

Rosenberg GA. (2002). Glia. 39:279-91.

Schanstra JP, et al. (2002). J Clin Invest. 110:371-9.

Suzuki R, et al. (2004). Treat Respir Med. 3:17-27.

Iz navedenog opisa, brojne modifikacije i promene u kompozicijama i metodima ovoga pronalaska mogu da se ostvare radom stručnjaka. Sve takve modifikacije koje spadaju u okvire patentnih zahteva ovoga pronalaska trebaju da budu uključeni u ovaj pronalazak.

Treba da se razume da faktori poput diferencijalne penetracije u ćelije brojnih jedinjenja mogu da doprinesu za pojavu razlika među aktivnostima jedinjenja testiranih uin vitrobiohemijskim i ćelijskih testovima.

Hemijska imena jedinjenja iz ovoga pronalaska koja su navedena u ovoj aplikaciji su generisana uz pomoć softvera MDL's ISIS Draw Autonom Softvvare tool i nisu verifikovana. Preferirano, ukoliko se pojavi slučaj nekonzistencije, struktura koja je navedena na slici treba da bude ona iz koje će da se izvede ime.

Claims (37)

1. Jedinjenje u skladu sa formulom III: naznačeno time,da R<1>je H ili supstituisani ili ne supstituisani alkil; a svaki od R<8>i R9 je nezavisno izabran iz supstituisanog ili ne supstituisanog cikloalkila, supstituisanog ili ne supstituisanog heterocikloalkila, supstituisanog ili ne supstituisanog arila, supstituisanog ili ne supstituisanog heteroarila; ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, njegova rastvorena materija; i njegovi stereoizomeri, izotopične varijante i tautomere.

2. Jedinjenje u skladu sa zahtevom 1,naznačeno time,da R<8>je izabran iz supstituisanog ili ne supstituisanog ciklopentila, cikloheksila, supstituisanog ili ne supstituisanog fenila, supstituisanog ili ne supstituisanog piridila, supstituisanog ili ne supstituisanog pirimidina i supstituisanog ili ne supstituisanog pirazina, supstituisanog ili ne supstituisanog pirola, supstituisanog ili ne supstituisanog pirazola i supstituisanog ili ne supstituisanog imidazola.

3. Jedinjenje u skladu sa zahtevom 1,naznačeno time,da R je izabran iz supstituisanog fenila, supstituisanog piridila i supstituisanog pirimidina; a supstitucija je -L-R<8d>; gde L je izabran iz veze, alkilena, heteroalkilena, -O-, -N(R<8e>)-, -CO-, -C02-, -SO-, -S02-, -CON(R<8e>)-, -S02N(R<8e>)-, -N(R<8e>)CO-, -N(R<8e>)S02-, -N(R<8e>)CON(R<8e>)-, - N(R<8e>)S02N(R<8e>)-; a R<8d>je izabran iz supstituisanog ili ne supstituisanog alkila, supstituisanog ili ne supstituisanog cikloalkila, supstituisanog ili ne supstituisanog arila, supstituisanog ili ne supstituisanog heterocikloalkila, supstituisanog ili ne supstituisanog heteroarila, supstituisanog ili ne supstituisanog amino, supstituisanog ili ne supstituisanog aralkila, supstituisanog ili ne supstituisanog heteroarilalkila i supstituisanog ili ne supstituisanog aminoalkila; a R je izabran iz H, supstituisanog ili ne supstituisanog alkila supstituisanog ili ne supstituisanog cikloalkila.

4. Jedinjenje u skladu sa zahtevom 1,naznačeno time,da R je gde L i R<8d>su kao šta se zahteva u zahtevu 3; oznaka nje izabrana iz brojeva od 1-4; a svaki R<8a>je nezavisno izabran iz vodonika, supstituisanog ili ne supstituisanog alkila, alkoksi, cijano i halo.

5. Jedinjenje u skladu sa zahtevom 4,naznačeno time,da L je veza, -O-, -CO-, -CON(R<8e>)-ili - N(R<8e>)CO-; R je izabran iz supstituisanog ili ne supstituisanog alkila, supstituisanog ili ne supstituisanog cikloalkila, supstituisanog ili ne supstituisanog arila, supstituisanog ili ne supstituisanog heterocikloalkila, supstituisanog ili ne supstituisanog heteroarila, supstituisanog ili ne supstituisanog aralkila, supstituisanog ili ne supstituisanog heteroarilalkila i supstituisanog ili ne supstituisanog aminoalkila; a R8e je izabran iz H, supstituisanog ili ne supstituisanog alkila.

6. Jedinjenje u skladu sa zahtevom 4,naznačeno time,da L je veza, -CO-, -0(CH2)mi-, - CON(H)(CH2)mi- ili - NHCO-; oznaka ml je izabrana iz brojeva od 1-4; a R8d je a gde prsten P je supstituisani ili ne supstituisani heterocikloalkil.

7. Jedinjenje u skladu sa zahtevom 1,naznačeno time,da pomenuto jedinjenje je u skladu sa formulom IVa, IVb, IVc ili IVd: a gde L i prsten P su kao šta je zahtevano u zahtevu 6; oznaka nje izabrana iz brojeva od 1-4; svaki R<8a>je nezavisno izabran iz vodonika, supstituisanog ili ne supstituisanog alkila, alkoksi, cijano i halo; a R<9>je nezavisno izabran iz supstituisanog ili ne supstituisanog arila i heteroarila; ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, njegova rastvorena materija; i njegovi stereoizomeri, izotopične varijante i tautomeri.

8. Jedinjenje u skladu sa zahtevom 7,naznačeno time,da L je veza.

9. Jedinjenje u skladu sa zahtevom 7,naznačeno time,da L je -NHCO- ili -CONH-.

10. Jedinjenje u skladu sa zahtevom 7,naznačeno time,da L je -OCH2-CH2- ili -NHCH2-CH2-.

11. Jedinjenje u skladu sa bilo kojim od zahteva od 6-10,naznačeno time,da prsten P je supstituisani ili ne supstituisani piperidin, morfolin ili piperazin.

12. Jedinjenje u skladu sa zahtevom 1,naznačeno time,da pomenuto jedinjenje je u skladu sa formulom Va, Vb, Vc, Vd, Ve ili Vf: a gde R Q je kao šta se zahteva u Zahtevu 1 i R Rh je vodonik, supstituisani ili ne supstituisani alkil ili supstituisani ili ne supstituisani cikloalkil.

13. Jedinjenje u skladu sa zahtevom 1,naznačeno time,da R9 je izabran iz supstituisanog ili ne supstituisanog arila.

14. Jedinjenje u skladu sa zahtevom 1,naznačeno time,da R9 je izabran iz supstituisanog ili ne supstituisanog heteroarila.

15. Jedinjenje u skladu sa zahtevom 1,naznačeno time,da R<9>je izabran iz supstituisanog ili ne supstituisanog fenila, piridila, indolila, izoindolila, pirolila, furanila, tienila, pirazolila, oksazolila i tiazolila.

16. Jedinjenje u skladu sa bilo kojim od zahteva od 1-15,naznačeno time,da R9 je a svaki od A<1>, A<2>i A<3>je nezavisno izabran iz S, O, N, NR<9a>i C<R9a>; i svaki od R9a je nezavisno H ili supstituisani ili ne supstituisani alkil; a R<9b>je CONH2, CONHMe ili CN.

17. Jedinjenje u skladu sa bilo kojim od zahteva od 1-15,naznačeno time,da R9 je

18. Jedinjenje u skladu sa bilo kojim od zahteva od 1-15,naznačeno time,da R9 je

19. Jedinjenje u skladu sa bilo kojim od zahteva od 1-15,naznačeno time,da R9 je a gde oznaka m je izabrana iz brojeva od 1-4, a svaki R<9d>je nezavisno H, supstituisani ili ne supstituisani alkil ili halo.

20. Jedinjenje u skladu sa bilo kojim od zahteva od 1-15,naznačeno time,da R9 je a gde oznaka m je izabrana iz brojeva od 1-4 i svaki R9d je nezavisno H, supstituisani ili ne supstituisani alkil ili halo.

21. Jedinjenje u skladu sa zahtevom 1,naznačeno time,da pomenuto jedinjenje je u skladu sa formulom VHIa, VHIb, VIIIc, VUId, VHIe ili VHIf: a R<8b>je vodonik, supstituisani ili ne supstituisani alkil ili supstituisani ili ne supstituisani cikloalkil.

22. Jedinjenje u skladu sa zahtevom 1,naznačeno time,da pomenuto jedinjenje je u skladu sa formulom IXa, IXb, IXc, IXd, IXe ili IXf: a R<8b>je vodonik, supstituisani ili ne supstituisani alkil ili supstituisani ili ne supstituisani cikloalkil.

23. Jedinjenje u skladu sa zahtevom 1,naznačeno time,da pomenuto jedinjenje je u skladu sa formulom Xa, Xb, Xc, Xd, Xe ili Xf: a R<8b>je vodonik, supstituisani ili ne supstituisani alkil ili supstituisani ili ne supstituisani cikloalkil.

24. Jedinjenje u skladu sa zahtevom 12 ili sa bilo kojim od zahteva od 21-23,naznačeno time,daR<8b>jeH.

25. Jedinjenje u skladu sa zahtevom 12 ili sa bilo kojim od zahteva od 21-23,naznačeno time,da R8b je cikloalkil.

26. Jedinjenje u skladu sa zahtevom 12 ili sa bilo kojim od zahteva od 21-23,naznačeno time,da R<8b>je ciklopropil.

27. Jedinjenje u skladu sa zahtevom 12 ili sa bilo kojim od zahteva od 21-23,naznačeno time,da R8b je supstituisani ili ne supstituisani alkil.

28. Jedinjenje u skladu sa zahtevom 12 ili sa bilo kojim od zahteva od 21-23,naznačeno time,da R<8b>je Me, Et, Pr, i-Pr, t-Bu, i-Bu, CF3, CH2CF3, CH2CONH2ili ciklopropilmetil.

29. Jedinjenje u skladu sa zahtevom 1,naznačeno time,da pomenuto jedinjenje je u skladu sa formulom XIIa, XIIb, XIIc ili XIId:

30. Jedinjenje u skladu sa zahtevom 1,naznačeno time,da pomenuto jedinjenje je u skladu sa formulom XVa, XVb ili XVc: a L je veza, -CO- ili -0-CH2-CH2-; dok prsten P je a R8b je H, Me, i-Pr, t-Bu, CH2CONH2ciklopropilmetil ili CH2CF3.

31. Jedinjenje u skladu sa zahtevom 30,naznačeno time,da L je veza, a prsten P je

32. Jedinjenje u skladu sa zahtevom 1, naznačeno time, da pomenuto jedinjenje je izabrano iz sledećih jedinjenja (4-Morfolin-4-il-fenil)-[5-( l/f-pirazol-4-il)-[ 1,2,4]triazolo[ 1,5-a]pirazin-8-il]-amin; [4-(4-Metil-piperazin-l-il)-fenil]-[5-(li/-pirazol-4-il)-[l,2,4]triazolo[l,5-a]p amin; 4-{8-[4-(4-Metil-piperazin-l-il)-fenilamino]-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-5-il}-benzamid; 4- {8-[4-(4-Metil-piperazin-1 -il)-fenilamino]-[ 1,2,4]triazolo[1,5-a]pirazin-5-il} -1 H-piridin-2-on; 4-[8-(4-Morfolin-4-il-fenilamino)-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-5-il]-benzamid;ž Amid4- {8- [4-(4-metil-piperazin-1 -il)-fenilamino] -[ 1,2,4]triazolo [ 1, 5- a] pirazin-5 -il} -tiofen-2-karboksilne kiseline; 2- Fluoro-4- {8-[4-(4-metil-piperazin-1 -il)-fenilamino]-[ 1,2,4]triazolo[ 1,5-or]pirazin-5-il}-benzamid; 3- Fluoro-4- {8-[4-(4-metil-piperazin-1 -il)-fenilamino]-[ 1,2,4]triazolo[ 1,5-a]pirazin-5-il} - benzamid; Amid 5-{8-[4-(4-metil-piperazin-l-il)-fenilamino]-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-5-il}-tiofen-2-karboksilne kiseline; 3-Fluoro-4-[8-(4-morfolin-4-il-fenilamino)-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-5-il]-benzamid^2-Fluoro-4-[8-(4-morfolin-4-il-fenilamino)-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-5-il]-benzamid; [5-(5-Metil-l //-pirazol-4-il)-[ 1,2,4]triazolo[ 1,5-a]pirazin-8-il]-(4-morfolin-4-il-fenil)-amin; Amid 5-[8-(4-Morfolin-4-il-fenilamino)-[l ,2,4]triazolo[l ,5-a]pirazin-5-il]-tiofen-2-karboksilne kiseline; 2,6-Difluoro-4-[8-(4-morfolin-4-il-fenilamino)-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-5-il]-benzamid; Amid 4-[8-(4-morfolin-4-il-fenilamino)-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-5-il]-tiofen-2-karboksilne kiseline; [4-(4-Metil-piperazin-l-il)-fenil]-[5-(5-metil-l^-pirazol-4-il)-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-8-il]-amin; (3-Fluoro-4-morfolin-4-il-fenil)-[5^ amin; (3-Hloro-4-morfolin-4-il-fenil)-[5^ amin; [4-(2-Morfolin-4-il-etoksi)-fenil]-[5-( 1 //-pirazol-4-il)-[ 1,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-8-il]-amin; Amid 4- {8-[4-(2-morfolin-4-il-etoksi)-ferulamino]-[ 1,2,4]triazolo [ 1,5-a]pirazin-5-il} - tiofen-2-karboksilne kiseline; Amid 5-{8-[4-(2-morfolin-4-il-etoksi)-fenilamino]-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-5-il}-tiofen-2-karboksilne kiseline; (4-Morfolin-4-il-fenil)-[5-(2i/-pw^ Amid 4-{8-[4-((2R,6S)-2,6-dimetil-morfolin-4-il)-fenilamino]-[l ,2,4]triazolo[l ,5-a]pirazin-5-il}-tiofen-2-karboksilne kiseline; (4-Morfolin-4-il-3 -trifluorometil-fenil)-[5-( 1 //-pirazol-4-il)-[ 1,2,4]triazolo[l,5-ft]pirazin-8-il]-amin; 2,6-Difluoro-4-{8-[4-(4-izopropil-piperazin^ 5-il}-benzamid; Amid 4-[8-(4-piperazin-1 -il-fenilamino)-[l ,2,4]triazolo[ 1]pirazin-5-il]-tiofen-2-karboksilne kiseline; Amid 4- { 8- [4-(4-izopropil-piperazin-1 -il)-fenilamino]-[ 1,2,4]triazolo [ 1,5 -a ]pirazin-5-il} - tiofen-2-karboksilne kiseline; Amid 5-[8-(4-morfolin-4-il-fenilamino)-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-5-il]-furan-3-karboksilne kiseline; Amid 5-{8-[4-(4-izopropil-piperazin-l-il)-fenilamino]-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-5-il}-furan-3-karboksilne kiseline;[5-(l//-Pirazol-4-il)-[l,2,4]triazolo[l>^l-il)-fenil]-amin; Amid 4-{8-[4-((2S,5R)-2,4,5-trimetil-piperazin-1 -il)-fenilamino]-[l ,2,4]triazolo[l ,5-a]pirazin-5-il} -tiofen-2-karboksilne kiseline; 5- [8-(4-Morfolin-4-il-fenilamino)-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-5-il]-2,3-dihidro-izoind 1-on; Amid 4-[8-(4-morfolin-4-il-fenilamino)-[l,2^ karboksilne kiseline; 6- [8-(4-Moifolin-4-il-fenilamino)-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-5-il]-3,4-dihidro-2^-izokinolin-l-on; 5-{8-[4-(4-izopropil-piperazin-l-il)-fenilamino]-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-5-il}-2,3-dihidro-izoindol-1 -on; {2-Morfolin-4-il-5-[5-(l//-pii^^ metanol; [4-(4-Izopropil-piperazin-1 -il)-fenil]-[5-( 1 H-pirazol-4-il)-[ 1,2,4]triazolo[ 1,5-a]pirazin-8-il]-amin; 6-[8-(4-Morfolin-4-il-fenilamin^^ kinolin-2-on; (4-Piperazin-1 -il-fenil)-[5-(l //-pirazol-4-il)-[ 1,2,4]triazolo[ 1,5-a]pirazin-8-iI]-amin; (6-Morfolin-4-il-piridiii-3-il)-[5-( l//-pirazol-4-il)-[ 1,2,4]triazolo[l ,5-a]pirazin-8-il]-amin; [6-(4-Ciklopropilmetil-piperazm^^ a]pirazin-8-il]-amin; [6-(4-Izopropil-piperazin-l-il)-piri^^ a]pirazin-8-il]-amin; [5-( 1 #-Pirazol-4-il)-[ 1,2,4]triazolo[ 1,5 -a ]pirazin-8-il] - { 6-[4-(2,2,2-trifluoro-etil)-piperazin-1 -il] -piridin-3 -il} -amin; [5-(l//-Pirazol-4-il)-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-8-il]-{4-[4-(2,2,2-trifluoro-etil)-piperazin-1 -il] -fenil} -amin; [4-(4-Ciklopropilmetil-piperazin-l-il)-fenil]-[5-(l//-pirazol-4-il)-[l,2,4]triazolo[l,5-fl]pirazin-8-il]-amin; Amid 4-[8-(6-morfolin-4-il-piridin-3-ilamino)-[l,2,4]triazolo[l,5-đ]pirazin-5-il]-tiofen-2-karboksilne kiseline; (5-Benzo[b]tiofen-3-il-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-8-il)-(4-morfolin-4-il-fenil)-amin; (5-Benzo[b]tiofen-3-il-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-8-il)-[4-(4-izopropil-piperazin-l-il)-fenil]-amin; (4-Morfolin-4-il-fenil)-(5-tiofen-3-il-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-8-il)-amin; [4-(4-Izopropil-piperazin-1 -il)-fenil] -(5-tiofen-3 -il- [ 1,2,4]triazolo [ 1,5-a]pirazin-8-il)-amin; [5-(5-Etil-l//-pirazol-4-il)-[l,2,4]tri^ 6-[8-(4-Morfolin-4-il-fenilamino)-[l ,2,4]tirazolo[l ,5-a]pirazin-5-il]-l, 1 -diokso-1,2-dihidro-1 X6-benzo[d]izotiazol-3-on; Amid 4-{8-[6-(4-ciklopropilmetil-piperazin-l-il)-piridin-3-ilamino]-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-5-il} -tiofen-2-karboksilne kiseline; Amid 4-{8-[6-(4-izopropil-piperazin-1 -il)-piridin-3-ilamino]-[ 1,2,4]tirazolo[ 1,5-a]pirazin-5 -il} -tiofen-2-karboksilne kiseline; Amid 4-(8- {6-[4-(2,2,2-trifluoro-etil)-piperazin-1 -il]-piridin-3-ilamino} - [l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-5-il)-tiofen-2-karboksilne kiseline; Amid 4-(8- {4-[4-(2,2,2-trifiuoro-etil)-piperazin-1 -il]-fenilamino} -[1,2,4]tirazolo[ 1,5-a]pirazin-5-il)-tiofen-2-karboksilne kiseline; Amid 4-{8-[4-(4-ciWopropilmetil-piperazin-M^^ 5 -il} -tiofen-2-karboksilne kiseline; [4-(4-Cildopropil-piperazin-l-il)-fe^ il]-amin; [6-(4-Ciklopropil-piperazin-l-il)-piridin-3-il]-[5-(l/^pirazol-4-il)-[l,2,4]tirazolo[l,5-a]pirazin-8-il]-amin; Amid 4-[8-(4-morfolin-4-il-fenilamino)-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-5-il]-tiazole-2-karboksilne kiseline; Amid 4-{8-[4-(4-izopropil-piperazin-l-il)-fenilamino]-[l,2,4]txiazolo[l,5-a]pirazin-5-il}-tiazole-2-karboksilne kiseline; Amid 4-(8-{4-[l-(2,2,2-tirfluoro-etil)-pipe^^ a]pirazin-5-il)-tiofen-2-karboksilne kiseline; [5-(l//-Pirazol-4-il)-[l,2,4]triazolo[l,5^^ 4- il]-fenil}-amin; 5- {8-[4-(2-Morfolin-4-il-etoksi)-fenilamino]-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-5-il}-2,3-dihidro-izoindol-1 -on; (5-Benzotiazol-6-il-[ 1,2,4]triazolo[ 1,5-a]pirazin-8-il)-(4-morfolin-4-il-fenil)-amin; (2-Fluoro-4-morfolin-4-il-fenil)-[5-(l^-pirazol-4-il)-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-8-il]-amin; (2-Hloro-4-morfolin-4-il-fenil)-[5-(li^ amin; l-{5-[8-(4-Morfolin-4-il-fenilamm^ {4-[8-(4-Morfolin-4-il-fenilamino)-[ 1,2,4]tirazolo[ 1,5-a]pirazin-5-il]-2//-pirazol-3-il}-metanol; 6- {4-[8-(4-Morfolin-4-il-fenilamino)-[l,2,4]tirazolo[l,5-a]pirazin-5-il]-fenil}-4,5-dihidro-2/f-piridazin-3 -on; (5-Benzo[l,2,5]oksadiazol-5-il-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-8-il)-(4-morfolin-4-il-fenil)-amin; Metil amid 4-[8-(4-morfolm-4-il-fenilamino)-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-5-il]-tiazole-2-karboksilne kiseline; Metil amid 4-{8-[4-(4-izopropil-piperazin-l-il)-fenilamino]-[l,2,4]triazolo[ 1,5-a]pirazin-5-il}-tiazol-2-karboksilne kiseline; 5-[8-(2-Fluoro-4-mofrolin-4-il-fenilam izoindol-l-on; 5-[8-(2-Hloro-4-morfolin-4-il-fenU^ izoindol-l-on; 5-{8-[2-Hloro-4-(4-izopropil-piperazin-l-^ il} -2,3 -dihidro-izoindol-1 -on; [5-(2-Amino-pirimidin-5-il)-[l,2,4]tri^ amin; 5-{8-[6-(4-Izopropil-piperazin-l-il)-piridin-3-ilamino]-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-5-il}-2,3-dihidro-izoindol-l-on; Amid 3-[8-(4-morfolin-4-il-fenilamino)-[l,2,4]1riazolo[l,5-a]pirazin-5-il]-benzo[b]tiofen-7-karboksilne kiseline; Amid 3 - { 8- [4-(4-izopropil-piperazin-1 -il)-fenilamino] - [ 1,2,4] triazolo [ 1,5 -a]pirazin-5 -il} - benzo[b]tiofen-7-karboksilne kiseline; {4-[8-(4-Morfolin-4-il-fenilamino)-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-5-il]-piridin-2-il}-metanol; (4- {8-[4-(4-Izopropil-piperazin-1 -il)-fenilamino]- [ 1,2,4]triazolo[ 1,5-a]pirazin-5-il} - piridin-2-il)-metanol; [4-(l-Izopropil-piperidin-4-il)-fenil]-[5-(l//-piazol-4-il)-[l,2,4]tirazolo[l,5-a]piazin-8-U^ amin; {5-[4-(2-Amino-tiazol-4-il)-fenil]-[l,2,4]tirazolo[l,5-a]pirazin-8-il}-(4-morfolin-4-ilfenil)-amin; Amid 4- { 8- [6-(4-izopropil-piperazin-1 -il)-piridin-3-ilamino]-[1,2,4]triazolo [ 1,5 -a]pirazin-5-il}-furan-2-karboksilne kiseline; 5-[8-(6-Morfolin-4-il-piridin-3-ilamino)-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-5-il]-2,3-dihidro-izoindol-l-on; Amid 4-{8-[4-(4-izopropil-piperazin-l-il)-fenilamino]-[l,2,4]triazolo[l,5-af]pirazin-5-il}-furan-2-karboksilne kiseline; Amid 4-{8-[4-(l-izopropil-piperidin-4-il)-fenilamino]-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-5-il}-tiofen-2-karboksilne kiseline; (4-{ 8-[6-(4-Izopropil-piperazin-1 -il)-piridin-3-ilamino]-[ 1,2,4]triazolo[l ,5-a]pirazin-5-il} - piridin-2-il)-metanol; [5-(2-Fluorometil-piridin-4-il)-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-8-il]-[4-(4-izopropil-piperazin-l-il)-fenil]-amin; 5 - { 8-[4-( 1 -Izopropil-piperidin-4-il)-fenilamino] - [ 1,2,4]triazolo [ 1,5-a]pirazin-5-il}-2,3-dihidro-izoindol-1 -on; [5-(l//-Indazol-6-il)-[l,2,4]Mazolo[l,5-«]pirazin-8-il]-(4-morfolin-4-il-fenil^Amid 4-[8-(6-morfolin-4-il-piridin-3-ilamino)-[l ,2,4]triazolo[l ,5-a]pirazin-5-il]-furan-2-karboksilne kiseline; Amid 4-{8-[4-(4-izopropil-piperazin-l-il)-fenilamino]-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-5-il}-5-metil-tiofen-2-karboksilne kiseline; Amid 4-{8-[6-(4-izopropil-piperazin-l-il)-piridin-3-ilamino]-[l,2,4]tirazolo[l,5-a]pirazin-5 -il} -5 -metil-tiofen-2-karboksilne kiseline; 4-{8-[4-(4-Izopropil-piperazin-l-il)-fenilamino]-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-5-il}-2,3-dihidro-izoindol-1 -on; 4- {8-[6-(4-Izopropil-piperazin-l-il)-piridin-3-ilamino]-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-5-n 2,3 -dihidro-izoindol-l-on; 5- [8-(2-Moifolin-4-il-pirimidin-5-ilamm^ izoindol-l-on; l-{4-[5-(l/f-Pirazol-4-il)-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-8-ilamino]-fenil}-piperazin-2-on; 5-{8-[2-(4-Izopropil-piperazin-1 -il)-pirimidin-5-ilamino] - [ 1,2,4]triazolo[ 1,5-a]pirazin-5-il} -2,3 -dihidro-izoindol-1 -on; 5 - {8-[4-(4-tert-Butil-piperazin-1 -il)-fenilamino] - [ 1,2,4] triazolo [ 1,5 -a]pirazin-5 -il} -2,3 - dihidro-izoindol-1 -on; [4-(4-tert-Butil-piperazin-l-il)-fenil]-[5-(l//-pirazol-4-il)-[l,2,4]tirazolo[l,5-o]pirazin-8-irj-amin; [5-(l/f-Indazol-5-il)-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-8-il]-(4-morfolin-4-il-fenil)-amin; 5- {8-[4-(2-Okso-piperazin-1 -il)-fenilamino] -[ 1,2,4]triazolo[ 1,5-a]pirazin-5-il} -2,3 -dihidro-izoindol-l-on; [5-( 1 i/-Indazol-6-il)- [ 1,2,4]triazolo [1,5 -a]pirazin-8-il] - [4-(4-izopropil-piperazin-1 -il)-fenil]-amin; [6-(4-Izopropil-piperazin-l-il)-piirdin-3-il]-(5-{(E)-l-[4-metilen-2,4-dihidro-pirazol-(3E)-ilidenmetil]-propenil} -[ 1,2,4]triazolo[ 1,5-a]pirazin-8-il)-amin; 7-Fluoro-5-{8-[4-(4-izopropil-piperazin-l-il)-fenilamino]-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-5-il} -2,3 -dihidro-izoindol-1 -on; 6- {8-[4-(4-Izopropil-piperazin-l-il)-fenilamino]-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-5-il}-2,3-dihidro-izoindol-1 -on; (3-Metilaminometil-4-m^ a]pirazin-8-il] -amin; 2-[8-(4-Morfolin-4-il-fenilaminoM c]pirol-4-on; 5- {8- [4-(4-Izopropil-2-okso-piperazin-1 -il)-fenilamino] -[ 1,2,4]triazolo [ 1,5-a]pirazin-5-il} - 2,3-dihidro-izoindol-l-on; 2-[8-(4-Morfolin-4-il-fenilamino)-[ 1,2,4]triazolo[l ,5-a]pirazin-5-il]-4,5-dihidro-tieno[2,3-c]pirol-6-on; 5-{8-[4-(4-Izopropil-piperazin-l-il)-fenilamino]-[l,2,4]Mazolo[l,5-a]pirazin-5-il}-3,3-dimetil-2,3-dihidro-izoindol-1 -on; 5-(8-Cikloheksilamino-[l ,2,4]triazolo[ 1,5-a]pirazin-5-il)-2,3-dihidro-izoindol-1 -on; 5-[8-(Tetrahidro-piran-4-ilam 1- on; [4-(4-te^Butil-<pi>perazin-l-il)-fenil]-[5-(l//-pirazol-4-il)-[l,2,4]tirazolo[l,5-a]pirazin-8-il]-amin; 2- [8-(4-Mofrblin-4-il-fenilamino)- [ 1,2,4]triazolo [ 1,5-a]pirazin- 5-il]-4,5-dihidro-tieno[2,3-c]pirol-6-on; i 5-[8-(4-Fluoro-fenilamino)-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-5-il]-2,3-dihidro-izoindol-l-on.

33. Jedinjenje u skladu sa zahtevom 1, naznačeno time, da pomenuto jedinjenje je izabrano iz sledećih jedinjenja: 4-[5-(l//-Pirazol-4-il)-[l,2,4]tirazolo[l,5-a]pirazin-8-ilamino]-A<f->piridin-3-ilmetil-benzamid; 4-[5-(2-Okso-l ,2-dihidro-piridin-4-il)-[l ,2,4]triazolo[l ,5-a]pirazin-8-ilamino]-A^-piridin-3 -ilmetil-benzamid; 2-Metoksi-Ar-(6-metil-piridin-3-ilmetil)-4-[5-(l/f-pirazol-4-il)-[l,2,4]triazolo[ a]pirazin-8-ilamino]-benzamid; Amid 4-(8-{3-metoksi-4-[(6-metil-piridin-3-ilmetil)-karbamoil]-fenilamino}-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-5-il)-tiofen-2-karboksilne kiseline; iV-Benzil-2-metoksi-4-[5-(l//-pirazol-4-il)-[l ,2,4]triazolo[l ,5-a]pirazin-8-ilaminoj-benzamid; A<r->Benzil-3-[5-(l>Y-pirazol-4-il)-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-8-ilamino]-benzamid; 3 - [5-(1 //-Pirazol-4-il)-[ 1,2,4] triazolo [ 1,5 -a]pirazin- 8-ilamino]-N-piridin-2-ilmetil-benzamid;i\^A^-Dietil-3-[5-(l/f-pirazol-4-il)-[l,2,4]tirazolo[l,5-a]pirazin-8-ilam^benzamid; {3-[5-( 1 i/-Pirazol-4-il)- [ 1,2,4]triazolo[ 1,5-a]pirazin-8-ilamino]-fenil} -pirolidin-1 - ilmetanon; (4-Izopropil-piperazin-1 -il)- { 3 - [5 -(1 /f-pirazol-4-il)- [ 1,2,4] triazolo [ 1,5 -a ]pirazin-8-ilamino] -fenil} -metanon; 3- [5-(l//-Pirazol-4-il)-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-8-ilamino]-benzamid; A^-Etil-3-[5-(l/^-pirazol-4-il)-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-8-ilamino]-benzamid; A<r->Cikloheksilmetil-3-[5-(l//-pirazol-4-il)-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-8-ilamino]-benzamid; AT-(4-Hidroksi-benzil)-3-[5-(l/^pirazol-4-il)-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-8-ilamino]-benzamid; Amid 4-[8-(4-benzilkarbamoil-3-metoksi-fenilamino)-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-5-il]-tiofen-2-karboksilne kiseline; Amid 4-[8-(6-benzoilamino-piridin-3-ilamino)-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-5-il]-tiofen-2-karboksilne kiseline; A^-Benzil-A^metil-3-[5-(l/f-pirazol-4-il)-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-8-ilaniino]-benzamid; A^-{5-[5-(l//-Pirazol-4-il)-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-8-ilamino]-piridin-2-il}-benzamid; Metil amid l-{4-[5-(l//-pirazol-4-il)-[l ,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-8-ilamino]-benzoil} -piperidin-4-karboksilne kiseline; 4- [5-(l^-Pirazol-4-il)-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-8-ilamino]-A^-(2-piirdin-4-il-etil)-benzamid; (4-Etil-piperazin-1 -il)- {4- [5-( 1 i/-pirazol-4-il)- [ 1,2,4]triazolo[ 1,5-a]pirazin-8-ilamino]-fenil}-metanon; A^l-Etil-pirolidin^-ilmeti^ 8-ilamino] -benzamid; (2,5-Dihidro-pirol-1 -il)- {4-[5-( li/-pirazol-4-il)-[ 1,2,4]triazolo[1,5-a]pirazin-8-ilamino] -fenil} -metanon; [4-(2-Etoksi-etil)-piperazin-l-il]-{4-[5-(li/-pirazol-4-il)-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-8-ilamino] -fenil} -metanon; AM3iklopropilmetil-4-[5-( 1 ^ ilamino] -benzamid; A<r->Metil-AT-(l-{4-[5-(l/f-pirazol-4-il)-[l,2,4]tirazolo[l,5-a]pirazin-8-ilami^^benzoil} -pirolidin-3 -il)-acetamid; [4-(4-Fluoro-benzil)-piperazin-1 -il] - {4-[5 -(1 #-pirazol-4-il)- [ 1,2,4]triazolo [1,5-a]pirazin-8-ilamino]-fenil}-metanon; (4-Fenil-piperazin-1 -il)- {4-[5-(l//-pirazol-4-il)-[l ,2,4]triazolo[l ,5-a]pirazin-8-ilamino] -fenil} -metanon; ((S)-2-Metoksimetil-pirolidm-l-il)-{4-[5-(l//-pirazol-4-il)-[l,2,4]triazolo[l,5-a ]pirazin-8-ilamino]-fenil} -metanon; A<r->((R)-l-Benzil-pirolidin-3-il)-4-[5-(l/f-pirazol-4-il)-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-8-ilamino] -benzamid; {4-[5-(l//-Pirazol-4-il)-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-8-ilamino]-fenil}-(4-piridin-2-il-piperazin-1 -il)-metanon;N-( 1 -Metoksimetil-propil)-4- [5-( 1 #-pirazol-4-il)- [ 1,2,4]triazolo[ 1,5-a]pirazin-8-ilamino] -benzamid; [4-(2-Metoksi-etil)-piperazin-l-il]-{4-[5-(l//-pirazol-4-il)-[l,2,4]tirazolo[l,5-a]pirazin-8-ilamino]-fenil} -metanon; Aq2-(4-Hidroksi-fenil)-eti^ ilamino]-benzamid; (4-sec-Butil-piperazin-l-il)-{4-[5-(l//-pirazol-4-il)-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-8-ilamino] -fenil} -metanon; tf-[4-(4-Metil-piperazin-1 -il)-fenil]-4-[5-(l H-pirazol-4-il)-[l ,2,4]tirazolo[ 1,5-a]pirazin-8-ilamino] -benzamid; Etil ester (benzil-{4-[5-(l/f-pirazol-4-il)-[ 1,2,4]triazolo[ 1,5-a]pirazin-8-ilamino]-benzoil}-amino)-sirćetne kiseline; N-Izopropil-2-(4- {4-[5 -(1 //-pirazol-4-il)- [ 1,2,4]triazolo [1,5 -a ]pirazin-8-ilamino] - benzoil} -piperazin-1 -il)-acetamid; A^-(2-Metoksi-etil)-^-metil-4-[5-(l//-pirazol-4-il)-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-8-ilamino]-benzamid; iV-Etil-^-(2-metoksi-etil)-4-[5-(l/f-pirazol-4-il)-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-8-ilamino] -benzamid;4- [5-( 1 /Y-Pirazol-4-il)- [ 1,2,4]triazolo [ 1 , 5- a] pirazm- S- i\ mimo]- N-( tetraidćxo-furan-2-ilmetil)-benzamid; (3,6-Dihidro-2/f-piridin-1 -il)- {4-[5-( l//-pirazol-4-il)-[ 1,2,4]triazolo[ 1,5-a]pirazin-8-ilamino] -fenil} -metanon; AK2-Metilsulfaml-etil)-4-[5-(^^ ilaniino]-benzamid; A<r->(2,2-Dimetil-[l,3]dioksolan-4-ilmetil)-4-[5-(l//-pirazol-4-il)-[1,2,4]triazolo[l ,5-a]pirazin-8-ilamino]-benzamid; iV-(2-Diizopropilamino-etil)-4-[5 -(1 i/-pirazol-4-il)-[ 1,2,4]triazolo [ 1,5 -a ]pirazin-8-ilamino]-benzamid; 7V-((S)- l-Etil-pirolidin-2-ilmetil)-4- [5-( 1 #-pirazol-4-il)- [ 1,2,4]triazolo [1,5-a]pirazin-8-ilamino] -benzamid; iV-Izobutil-4-[5-( 1 //-pirazol-4-il)-[ 1,2,4]triazolo [ 1,5 -a]pirazin-8-ilamino] - benzamid; [l,4]Bipiperidinil-l'-il-{4-[5-(l/f-pirazol-4-il)-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-8-ilamino] -fenil} -metanon; A^-(2-Hidroksi-etil)-4-[5-(l//-pirazol-4-il)-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-8-ilamino]-benzamid; i Amid 4-[8-(6-fenilacetilamino-piridin-3-ilamino)-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-5-il]-tiofen-2-karboksilne kiseline.

34. Farmaceutska kompozicija,naznačena time,da obuhvata farmaceutski prihvatljiv kerijer i farmaceutski efektivnu količinu jedinjenja u skladu sa bilo koji od zahteva od 1 do 33.

35. Upotreba jedinjenja u skladu sa bilo kojim od zahteva od 1 do 33,naznačena time,da se pomenuto jedinjenje koristi u proizvodnji leka za tretman ili profilaksu stanja koje je karakterizovano sa degradacijom ECM.

36. Upotreba jedinjenja u skladu sa bilo kojim od zahteva od 1 do 33,naznačenatime, da se pomenuto jedinjenje koristi u proizvodnji leka za tretman ili profilaksu stanja koje je izabrano iz bolesti koje uključuju zapaljenje.

37. Upotreba jedinjenja u skladu sa zahtevom 36,naznačena time,da je pomenuta bolest reumatoidni artritis.