RS52509B2 - Anti-il-17 antitela - Google Patents

Description

Oblast pronalaska

[0001] Ovaj pronalazak je u oblasti medicine, naročito u oblasti monoklonskih antitela na IL-17 čoveka. Pronalazak se odnosi na neutralizaciju anti-IL-17 monoklonskih antitela koja se sa visokim afinitetom vezuju za IL-17 ne-linearne ili konformacione antigenske epitope sa amino kiselinama DGNVDYH (SEQ ID BR: 276). Antitela pronalaska mogu da budu himerna, humanizovana ili humana antitela, imunokonjugati antitela ili njihovi antigen-vezujući fragmenti i korisna su kao lekovi za lečenje autoimunskih, inflamatornih poremećaja, poremećaja ćelijske proliferacije i razvoja.

Stanje tehnike

[0002] Familija IL-17 citokina trenutno obuhvata IL-17A, IL-17B, IL-17C, IL-17D, IL-17E i IL-17F. Svi članovi familije IL-17 imaju visoko konzervirane ostatke cisteina koji su uključeni u formiranje disulfidnih veza unutar lanca i imaju dva ili više cisteinska ostatka koji se mogu uključiti u disulfidno vezivanje unutar lanca. Članovi IL-17 familije nemaju sekvencu sličnu bio kojim drugim citokinima. Međutim, viralni homolog IL-17A je nađen u otvorenom okviru čitanja 13 herpesvirus saimiri (Yao, Z. et al., Immunity, 3:811, 1995) i ima 72% amino kiselinskih ostataka indentičnih sa humanim IL-17A. Višestruke funkcije su prijavljene za članove familije IL-17 koji pretežno mogu da obuhvate regulaciju imunog odgovora.

[0003] Interleukin 17 (IL-17, takođe označen i kao IL-17A) je homodimerni glikoprotein od 20-30 kD dobijen pretežno aktivacijom CD4+ T ćeija i deluje kao proinflamatorni citokin. Kada je dati član familije IL-17 označem samo kao "IL-17," treba shvatiti da je član familije na koji se odnosi označen kao IL-17A. IL-17 sekretuju aktivirane T ćelije na mestima inflamacije, a ne u sistemskoj cirkulaciji . IL-17 se vezuje za tip I transmembranski receptor označen kao IL-17R koji je veliki sverisutan eksprimiran protein koji ne pokazuje značajnu sličnost se sekvencama drugih poznatih receptora citokina. IL-17 ima brojne biološke karakteristike, uključujući regulaciju naviše adehzije molekula i indukovanje proizvodnje višestrukih inflamatornih citokina i hemokina od različitih ćelijskih tipova uključujući sinoviocite, hondrocite, fibroblaste, endotelne ćelije, epihelne ćelije, keratinocite, i makrofage. Takođe, IL-17 indukuje angažovanje neutrofila na inflamatorno mesto preko indukcije oslobađanja hemokina, stimuliše proizvodnju prostaglandina i metaloproteinaza, i inhibira sintezu proteoglikana. Dalje, IL-17 igra važnu ulogu u matiraciji hematopoetičnih progenitor ćelija. Pokazano je da IL-17 ima signalizirajuću ulogu u različitim organima i tkivima uključujući pluća, artikularnu hrskavicu, kosti, mozak, hematopoetične ćelije, bubrege, kožu i creva. Za pregled bioaktivnosti IL-17 videti, npr., Kolls and Linden, Immunity 21:467-476, 2004, ili Fossiez, et al. Int. Rev. Immunol.16:541, 1998.

[0004] Povećani nivoi IL-17 (tj., IL-17A) su povezani sa nekolicinom stanja, bolesti ili poremećaja koji uključuju inflamaciju disajnih puteva, reumatoidni artritis ("RA"), osteoartritis, wroziju kostiju, intraperitonealne abscese i adhezije, upalnu bolest creva ("IBD"), odbacivanje alografta, psorijazu, određene tipove kancera, angiogenezu, aterosklerozu i multiplu sklerozu ("MS") (za pregled videti Witkowski, et al, Cell. Mol. Life Sci.61:567-579, 2004). I IL-17 i IL-17R su regulisani naviše u sinovijalnom tkivu kod RA pacijenata. Blokiranje bioaktivnosti IL-17 vezivanjem IL-17 specifičnog antitela ili rastvornog receptora za IL-17 smanjuje inflamaciju i eroziju kostiju u različitim modelima artritisa kod životinja. (videti, npr., Lubberts et al, Arthritis & Rheumatism, 50:650-659, 2004).Dalje, IL-17 ima IL-1β nezavisni efekat (dejstvo) na razlaganje matriksa kolegena i inflamaciju i oštećenje zglova, dok IL-17 u sinergiji sa TNF-α pojačava inflamaciju.

[0005] Tako, prema lokalizovanoj distribuciji na mestu inflamacije, čini se da je IL-17 novi cilj za lečenje RA i drugih inflamatornih ili autoimunskih bolesti sa potencijalno boljim profilom bezbednosti od lekova koji ciljaju sistemsku cirkulaciju pro-inflamatornih citokina kao što je TNF-α. Trenutno je FDA odobrila bioproizvode (ENBREL<®>, REMICADE<®>i HUMIRA<®>antitela) koja se vezuju za i neutrališu TNF-α a koja pokazuju efikasnost u smanjenju znakova i simptoma RA i u usporavanju napredovanja bolesti u podgrupi pacijenata sa RA. Međutim, svi pacijenti sa RA ne odgovaraju jednako na inhibiciju TNF-α bioaktivnosti ovim bioproizvodima. Dodatno, IL-17 mRNK je povećana kod multiple skelroze i u mononuklearnim ćelijama u krvi i cerebrospinalnoj tečnosti kod pacijenata sa MS -om, posebno tokom kliničkog pogoršanja. Shodno ovom, postoji potreba za kompozicijama koje antagonizuju ili neutrališu aktivnost IL-17 da bi se lečili poremećaji, bolesti ili stanja gde prisustvo bioaktivnosti IL-17 uzrokuje ili doprinosi neželjenim patološkim efektima ili gde smanjenje bioaktivnosti IL-17 doprinosi željenom terapeutskom efektu, uključujući inflamatorne poremećaje, poremećaje ćelijske proliferacije i poremećaje u razvoju i autoimune poremećaje kao što su RA i MS i IBD.

[0006] Giavedoni, L D, Journal of Immunological Methods, Vol.301, Nos.1-2, 89-101, June 2005, opisuje istovremenu detekciju multiplih citokina i hemokina u uzorcima primata koji nisu čovek, primenom lumineks tehnologije. Tri anti-IL-17 antitela su navedena u Tabeli 1.

[0007] Moseley, T a, et al, Cytokine and Growth Factor Reviews, Vol.14, No.2, 155-174, April 2003, opisuju familiju interleukina-17 i IL-17 receptora.

[0008] WO 2004/106377 opisuje metodu dobijanja antitela sa želljenom funkcijom. Anti-IL-17 antitela C9 i D12 opisna su u Tabeli 4.

[0009] Hofstetter et al, Gellular Immunology, Vol.237, No.2123-130, October 2005, opisuju terapeutsku efikasnost neutralizacije IL-17 kod mišijeg eksperimentalnog autoimunog encefalomijeltisa. Nađeno je da neutralizacija IL-17 sa monoklonskim antitelom poboljšava tok bolesti.

[0010] Postoji potreba za neutralizacijom anti-IL-17 antitela koje specifično vezuje IL-17 humanog porekla kao i IL-17 sisara koji nisu humanog porekla, omogućavajući tako da se antitelo upotrebi u predkliničkim i kliničkim in vivo ispitivanjima. Dalje, postoji potreba za antitelom specifičnim za IL-17 koje vezuje IL-17 sa visokim afinitetom i/ili sporo disosuje omogućavajući time da se efikasna terapeutska doza minimizuje, što omogućuje ređe doziranje tim antitelom nego antitelom koje vezuje IL-17 manjim afinitetom (tj. većom KD) i/ili ima bržu disocijaciju. Visoki afinitet IL-17-specifičnog antitela je takođe poželjan tako da može da omogući antitelu da bude administrirano pacijentu subkutano, pre nego intravenski. Takođe postoji potreba za IL-17-specifičnim antitelom sa niskom vrednosti za IC50u testu bioaktivnosti IL-17 da bi se dobilo terapeutsko anti-IL-17 antitelo sa minimalnom delotvornom terapeutskom dozom. Takođe je poželjno obezbediti antitelo specifično za IL-17 pri čemu je imunski odgovor, na antitelo koji je izazavan kod pacijenta koji prima antitelo, smanjen na minimum. Predmetni pronalazak zadovoljava ove potrebe i pruža naznačene prednosti.

OPIS PRONALASKA

[0011] Obim predmetnog pronalaska je definisan zahtevima i podatak koje se ne nalazi u zahtevima je dat samo kao informacija.

[0012] Antitela pronalaska su himerna, humanizovana ili potpuno humana anti-IL-17 monoklonska antitela, i njegovi antigen-vezujući delovi, koji vezuju ne-linearne epitope sa IL-17 amino kiselinama DGNVDYH (SEQ ID BR: 276) i antagonizuju ili neutrališi najmanje jedan in vitro ili in vivo biološku aktivnost povezanu sa IL-17 ili njenim delom.

[0013] U jednoj realizaciji, antitela pronalaska imaju IC50vrednosti manje od ili jednake 1 nM, 900 pM, 800 pM, 700 pM, 600pM, 560 pM ili 500 pM u in vitro IL-8 reporter analizi, kao što je opisano, na primer, u Primeru 6A ili manju od ili jednaku 560 pM u in vitro GROα Reporter analizi kao što je opisano, na primer, u Primeru 6B.

[0014] U sledećoj realizaciji, antitela pronalaska su okarakterisana velikim afinitetom vezivanja (KD) za humani IL-17, tj., manjim od 7 pM, 6.5 pM, 6.0 pM, 5.5 pM, 5.0 pM, 4.5 pM ili 4.0 pM. Alternativno, antitela pronalaska su okarakterisana sa KDza humani IL-17 ne većim od oko 7 pM, 6.5 pM, 6.0 pM, 5.5 pM, 5.0 pM, 4.5 pM li poželjno ne većim od oko 4.0 pM. Poželjno, antitela pronalaska su dalje okarakterisana brzinom koffza humani IL-17 ili ispod 2 x 10<-5>s<-1>.

[0015] U narednoj realizaciji, anti-IL-17 antitelo pronalaska je okarakterisano specifičnim vezivanjem humanog IL-17 kao IL-17 cinomolgus majmuna dok ne vezuje IL-17 miša ili pacova na nivou iznad osnovne linje (nivoa šuma). Dodatno, anti-IL-17 antitelo pronalaska vezuje humani IL-17 (npr., IL-17A) ali ne vezuje i humani IL-17B, C, D, E ili F.

[0016] U jednoj realizaciji, anti-IL-17 monoklonsko antitelo pronalaska obuhvata polipeptidni varijabilni region lakog lanca ("LCVR") koji sadrži 3 CDR sekvence koje su prisutne zajedno u Fab navedeno u Tabeli 3 u daljem tekstu i koje se nalaze u antitelu pronalaska na istom CDR položaju kao u Fab navedenoj Tabeli 3. Poželjno anti-IL-17 monoklonsko antitelo pronalaska sadrži LCVR polipeptid sa amino kiselinskom sekvencom odabranom iz grupe koju čine SEQ ID BRs: 178-243.

[0017] Prema prvom aspektu predmetnog pronalaska, dato je humanizovano anti-IL-17 monoklonsko antitelo, koje sadrži:

1. a) peptid sa SEQ ID BR: 131 na CDRL1,

2. b) peptid sa SEQ ID BR: 167 na CDRL2,

3. c) peptid sa SEQ ID BR: 168 na CDRL3,

4. d) peptid sa SEQ ID BR: 26 na CDRH1,

5. e) peptid sa SEQ ID BR: 30 na CDRH2, i

6. f) peptid sa SEQ ID BR: 52 na CDRH3.

[0018] Poželjno, humanizovano anti-IL-17 monoklonsko antitelo prema pronalasku sadrži LCVR sa SEQ ID BR: 241 i HCVR sa SEQ ID BR: 118.

[0019] Humanizovano antitelo prema pronalasku je antitelo cele dužine, u suštini intaktno antitelo, Fab fragment, F(ab')2fragment ili jednolančani Fv fragment.

[0020] Poželjno, antitelo prema pronalasku sadrži konstantni region teškog lanca odabran od IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM i IgD.

[0021] Prema drugom aspektu predmetnog pronalaska, data je kompozicija koja sadrži antitelo prema pronalasku gde data kompozicija dodatno sadrži i farmaceutki prihvatljiv nosač.

[0022] Prema trećem aspektu predmetnog pronalaska dato je antitelo prema pronalasku za upotrenu kao lek.

[0023] Poželjno, antitelo prema pronalasku je upotrebljeno za lečenje jednog ili više stanja koja su odabrana od reumatoidnog artritisa, inflamatorne bolesti creva, psorijaze i multiple skleroze.

[0024] U sledećoj realzaciji, anti-IL-17 monoklonsko antitelo pronalaska sadrži varijabilni region teškog lanca polipeptida ("HCVR") koji sadrži 3 CDRs koji su zajedno prisutni u Fab navedenim u Tabeli 2 u daljem tekstu i koji su prisutni u antitelu pronalaska na istom CDR položaju kao u Fab navedenim u Tabeli 2. Poželjno, anti-IL-17 monoklonsko antitelo pronalaska sadrži HCVR polipeptid sa amino kiselinskom sevencom odabranom iz grupe koju čine SEQ ID BRs: 56-121.

[0025] U sledećoj realizaciji, anti-IL-17 monoklonsko antitelo pronalaska sadrži LCVR polipeptid koji sadrži 3 CDRs koji su zajedno prisutni u Fab navedenim u Tabeli 3 i koji su poželjno prisutni u antitelu pronalaska na istom CDR položaju kao u Fab navedenom u Tabeli 3 i dalje sadrži HCVR polipeptide sa 3 CDRs koji su zajedno prisutni u Fab navedenim u Tabeli 2 i koji su prisutni u antitelu pronalaska na istom CDR položaju kao u Fab navedenom u Tabeli 2.

Poželjno, 6 CDRs antitela pronalaska ili njegov funkcionalni fragment postoje zajedno u Fab navedenim u Tabeli 1 u daljem tekstu i prisutni su u antitelu pronalaska na istom CDR položaju kao u Fab navedenom u Tabeli 1.

[0026] U poželjnoj realizaciji, anti-IL-17 monoklonsko antitelo pronalaska sadrži (i) LCVR polipeptid sa amino kiseinskom sekvencom odabranom iz grupe koju čine SEQ ID BRs: 178-243 i (ii) HCVR polipeptid sa amino kiselinskom sekvencom odabranom iz grupe koju čine SEQ ID BRs: 56-121. U poželjnijoj realizaciji, antitelo pronalaska sadrži LCVR polipeptid sa amino kiselinskom sekvencom odabranom iz grupe koju čine SEQ ID BRs: 178-243 a koji sadrži i HCVR polipeptid odabran iz grupe koju čine SEQ ID BRs: 56-121 prisutan u Fab navedenom u Tabeli 1 koji sadrži dati LCVR prsutan u antitelu.

[0027] U narednoj realizaciji, monoklonsko antitelo pronalaska je ono koje može da se takmiči za vezivanje za humani IL-17, ili deo humanog IL-17, sa konkurentnim antitelom pri čemu konkurentno antitelo sadrži dva polipeptida sa amino kiselinskim sekvencama SEQ ID BRs: 241 i 118.

[0028] U sledećoj realizaciji, LCVR anti-IL-17 monoklonskog antitela pronalaska sadrži 1, 2 ili 3 peptida, poželjno 3 peptida, odabrana iz grupe koju čine peptidi sa sekvencom kao što je dato u (a) SEQ ID BRs: 122-149; (b) SEQ ID BRs: 150-167, i (c) SEQ ID BRs:168-177 (tj., jedan peptid iz (a), jedan peptid iz (b) i jedan peptid iz (c) za antitelo koje sadrži 3 peptida). Peptid sa sekvencom datoj u SEQ ID BRs: 122-149, kada je prisutan u antitelu pronalaska, je na CDRL1. Peptid sa sekvencom datoj u SEQ ID BRs: 150-167, kada je prisutan u antitelo pronalaska, je na CDRL2. Peptid sa sekvencom datoj u SEQ ID BRs: 150-167, kada je prisutan u antitelu pronalaska, je na CDRL3.

[0029] U narednoj realizaciji, HCVR anti-IL-17 monoklonskog antitela pronalaska sarži 1, 2 ili 3 peptida, poželjno 3 peptida, odabrana iz grupe koju čine peptidi sa sekvencom datoj u (a) SEQ ID BRs: 11-28; (b) SEQ ID BRs: 29-32, i (c) SEQ ID BRs: 33-55 i 261 (i.e., jedan peptid iz (a), jedan peptid iz (b) i jedan peptid iz (c) za antitelo sadrži 3 ova peptida). Peptid sekvence date u SEQ ID BRs: 11-28, kada je prisutan u datom antitelu, je na CDRH1. Peptide sa sekvencom datoj u SEQ ID BRs: 29-32, kada je prisutan u naznačenom antitelu, je na CDRH2. Peptid sa sekvencom prikazanoj u SEQ ID BRs: 33-55 i 261, kada je prusutan u naznačenom antitelu, je na CDRH3.

[0030] Predmetni pronalazak dalje obezbeđuje anti-IL-17 monoklonsko antitelo koje sadrži šest peptida koji su odrabrani iz grupe koju čine peptidi sa sekvencama datim u (a) SEQ ID BRs: 122-149; (b) SEQ ID BRs: 150-167, (c) SEQ ID BRs:168-177, (d) SEQ ID BRs: 11-28; (e) SEQ ID BRs: 29-32, i (f) SEQ ID BRs: 33-55 i 261 tj., jedan peptid iz svake od (a-f)); poželjno šest peptida koegzistiraju u Fab u Tabeli 1 u daljem tekstu. Peptid sa sekvencom SEQ ID BRs: 122-149, kada je prisutan u antitelu pronalaska, je na CDRL1. Peptid sa sekvencom SEQ ID BRs: 150-167, kada je prisutan u antitelu pronalaska, je na CDRL2. A Peptid sa sekvencom SEQ ID BRs: 150-167, kada je prisutan u antitelu pronalaska, je na CDRL3. Peptid sa sekvencom SEQ ID BRs: 11-28, kada je prisutan u antitelu pronalaska, je na CDRH1. Peptid sa sekvencom SEQ ID BRs: 29-32, kada je prisutan u antitelu pronalaska, je na CDRH2 Peptid sa sekvencom SEQ ID BRs: 33-55 and 261, kada je prisutan u antitelu pronalaska, je na CDRH3.

[0031] Predmetni pronalazak dalje obezbeđuje anti-IL-17 monoklonsko antitelo koje sadrži šest peptida sekvence prikazane u SEQ ID BRs: 247, 248, 249, 244, 245 i 246. Peptid sa sekvencom SEQ ID BR: 247 je na CDRL1. Peptid sa sekvencom SEQ ID BR: 248 je na CDRL2. Peptid sa sekvencom SEQ ID BR: 249 je na CDRL3. Peptid sa sekvencom SEQ ID BR: 244 je na CDRH1. Peptid sa sekvencom SEQ ID BR: 245 je na CDRH2. Peptid sa sekvencom SEQ ID BR: 246 je na CDRH3.

[0032] Anti-IL-17 monoklonsko antitelo pronalaska može da sadrži ili da se sastoji od intaktnog antitela (tj., cele dužine), u suštini intaktnog antitela ili njegovog antigen-vezujućeg dela , npr., Fab fragment, F(ab')2fragment ili jednolančani Fv fragment. Dalje, antitelo pronalaska može da bude obeleženo oznakom koja se može detektovati, imobilizovano na čvrstoj fazi i/ili konjugovano sa heterolognim jedinjenjem, npr., enzimom, toksinom ili molekulom polietilen glikola.

[0033] U narednoj realizaciji, pronalazak obezbeđuje postupak za dobijanje anti-IL-17 monoklonskog antitela pronalaska koji obuhvata održavanje host ćelije pronalaska (tj., host ćelije koja je tranformisana, pretvorena ili inficirana vektorom (ili vektorima) pronalaska koja eksprimira antitelo pronalaska ) pod uslovima koji su odgovarajući za eksprimiranje monoklonskog antitela pronalaska, pri čemu je eksprimirano ovo antitelo. Postupak dalje obuvhata korak izolovanja monoklonskog antitela pronalaska iz ćelije ili poželjno iz hranljive podloge u kojoj je ćelija gajena.

[0034] Razmatrane su dijagnostičke upotrebe za monoklonska antitela pronalaska. U jednoj dijagnostičkoj primeni, pronalazak obezbeđuje postupak za određivanje nivoa IL-17 proteina u uzorku koji obuhvata izlaganje uzorka koji se testira anti-IL-17 antitelu pronalaska pod uslovima vezivanja i određivanje specifičnog vezivanja antitela za uzorak. Anti-IL-17 antitelo pronalaska može se upotrebiti za određivanje nivoa IL-17 u test uzorcima poređenjem vrednosti test uzorak sa standardnom krivom koja je dobijjena vezivanjem datog antitela za uzorke sa poznatim količinima IL-17. Pronalazak dalje obezbeđuje komplet koji sadrži antitelo pronalaska i poželjno, instrukcije za upotrebu antitela za detekciju IL-17 proteina u uzorku.

[0035] Pronalazak obezbeđuje kompoziciju, poželjno farmaceutsku kompoziciju, koja sadrži anti-IL-17 monoklonsko antitelo pronalaska. Farmaceutska kompozicija pronalaska može dalje da sadrži farmaceutski prihvatljiv nosač, eksipijens i/ili diluent. U datoj farmaceutskoj kompoziciji, anti-IL-17 monoklonsko antitelo pronalaska je jedini aktivni sastojak. Poželjno farmaceutska kompozicija sadrži homogenu ili u suštini homogenu populaciju anti-IL-17 monoklonskog antitela pronalaska. Kompozicija za terapeutsku upotrebu je fiziološki kompatibilna, sterilna i može da bude liofilizovana i po izboru sa odgovarajućim diluentom.

[0036] Ovde je opisan i postupak za inhibiciju najmanje jedne IL-17 bioaktivnosti kod životinja, poželjno sisara, još bolje čoveka, kojem je to potrebno, a obuhvata administriranje terapeutski delotvorne (efikasne) količine ili IL-17 neutrališuće količine, anti-IL-17 monoklonskog antitela pronalaska datoj životinji. Takođe je opisan i postupak za lečenje bolesti ili bolesti koja je pobolšana neutralizacijom ili antagonizacijom IL-17 bioaktivnosti, npr., inhibicijom transdukcije signala nastalog od vezivanja IL-17 za svoj receptor, a koji obuhvata administriranje pacijentu (npr., čoveku) kojem je ovakav tretman potreban ili za prevenciju, terapeutski delotovne količine IL-17 neutrališuće količine monoklonskog antitela pronalaska.

[0037] Pronalazak obuhvata anti-IL-17 monoklonsko antitelo pronalaska za upotrebu u proizvodnji leka za administraciju sisaru, poželjno čoveku, za lečenje npr., autoimunog poremećaja ili inflamacije ili poremećaja ćelijske proliferacije.

[0038] Pronalazak dalje obuhvata element proizvodnje koji obuhvata materijal za pakovanje i antitelo pronalaska koje se nalazi u datom materijalu za pakovanje, pri čemu materijal za pakovanje obuhvata uputstvo na kojem je naznačeno da antitelo specifično neutralizuje aktivnost IL-17 ili snižava nivo funkcioonalnog IL-17 prisutnog u sistemu.

[0039] Pronalazak dalje obezbeđuje izolovane molekule nukleinskih kiselina koji kodiraju antitelo pronalaska ili njihov laki ili teški lanac; vektor (ili vektore) koji sadrže ove nukleinske kiseline, po izboru vezane za kontrolne sekvence koje prepoznaje ćelija domaćina transformisana vektorom; ćeliju domaćina koja sadrži ovaj vektor; proces za dobijanje antitela pronalaska koji obuhvata gajenje ćelije domaćina tako da je eksprimirana nukleinska kiselina i po izboru, regeneraciju antitela iz hranljive podloge ćelije domaćina.

[0040] Pronalazak dalje obezbeđuje izolovane molekule nukleinskih kiselina koji kodiraju IL-17 (SEQ ID BR: 253) cinomolgus majmuna ili IL-17 (SEQ ID BR: 251) zeca; IL-17 protein koridan nukelinskom kiselinom majmuna ili zeca (SEQ ID BRs: 10 ili 9 respektivno); vektore koji sadrže molekul dte nukleinske kiseline; ćeliju domaćina koja sadrži ovaj vektor; i proces za dobijanje IL-17 cinomolgus majmuna ili IL-17 zeca.

KRATAK OPIS SLIKA

[0041]

SL.1 pokazuje orijentaciju amino kiselinske sekvence članova humane IL-17 familije proteina (IL-17, IL-17B, IL-17C, IL-17D, IL-17E and IL-17F).

SL.2 pokazuje orijentaciju amino kiselinske sekvence IL-17 koji potiče od čoveka, zeca, pacova, cinomolgus majmuna i miša.

DETALJAN OPIS PRONALASKA

[0042] Obim predmetnog pronalaska je definisan zahtevima i bilo koja informacija koja nije obuhvaćena zahtevima, data je samo infromativno.

[0043] Pronalazak predstavlja himerna, humanizovana ili potpuno humana anti-IL-17 monoklonska antitela, ili njihove antigen-vezujuće proteine, koji mogu da neutralizuju ili antagonizuju bar jednu aktivnost IL-17 in vitro i/ili in vivo. Poželjno, ova antitela pronalaska su dalje okarakterisana time da imaju vrednosti za IC50manje od oko 600 ili 560 pM u npr., in vitro IL-8 reporter analizi očo GROα reporter analizi (videti, npr., Primer 6) i/ili poželjno ima veliki afintet vezivanja sa IL-17 ispod 4 pM. Antitela pronalaska su dalje okarakterisana time što specifično vezuju IL-17 (SEQ ID BRs: 1 i 10 ) humani i cinomolgus majmuna ali se vezuju IL-17 (SEQ ID BRs: 7 i 8 respektivno) miša ili pacova. Antigenski epitop za koji se vezuju monoklonska antitela pronalaska nije ne-linearni epitop ili humani (i majmuna) IL-17 i sadrži ostatke DGNVDYH (SEQ ID BR: 276) IL-17. Antitelo pronalaska je u kontaktu sa peptidom DGNVDYH (SEQ ID BR:276) kada je u sklpu celog IL-17.

Definicije

[0044] "Interleukin 17" takođe označen i kao "IL-17" ili "IL-17A" je 20-30 kD glikozilovani homodimerni protein. Humani IL-17 gen kodira protein od 155 amino kiselina, koji ima signalnu sekvencu od 19 amino kiselina i zreo segment od 136 amino kiselina Humani IL-17 pokazuje identičnost amino kiselinske sekvence od 62.5% i 58% sa mišijim ili pacovskim amino kiselinskim sekvencama IL-17, respektivno, kao što je prikazano na Slici 2. Humani IL-17 pokazuje indentičnost amino kiselinske sekvence od 97.4% sa IL-17cinomolgus majmuna.

[0045] Antitelo cele dužine kao što prirodno postoji je molekul imunoglobulina koji se sastoji od četiri peptidna lanca, dva teška (H) lanca (oko 50-70 kDa kada je cele dužine) i dva laka (L) lanca (oko 25 kDa kada je vele dužine) međusobno povezana disulfidnim vezama. Amino terminal deo svakog lanca obuhvata varijablni region od oko 100-110 ili više amino kiselina prvenstveno odgovornih za prepoznavanje antigena. Karboksi-terminalni deo svakog lanca definiše konstantan region prvenstveno odgovoran za efektorsku funkciju.

[0046] Laki lanci se klasifikuju kao kapa ili lambda i odlikuju se specifičnim konstantnim regionom. Svaki laki lanac sadrži varijabilni region N-terminalnog lakog lanca (ovde "LCVR") i konstantan region lakog lanca koji se sastoji od jednog domena, CL. Teški lanci su klasifikovani kao gama, mu, alfa, delta, ili epsilon, i definišu izotip antitela kao IgG, IgM, IgA, IgD, i IgE, respektivno i nekoliko od ovih može da bude dalje podeljeno na podklase (izotipi) npr., IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, i IgA2. Svaki tip teškog lanca je okarakterisan posebnim konstantnim regionom. Svaki teški lanac se sastoji od varijabilnog regiona N-terminalnog teškog lanca (u ovom tekstu "HCVR") i konstantnog regiona teškog lanca. Konstantni region teškog lanca sastoji se od tri domena (CH1, CH2, i CH3) za IgG, IgD, i IgA; i 4 domena (CH1, CH2, CH3, i CH4) za IgM i IgE.

[0047] Regioni HCVR i LCVR mogu se dalje podeliti u regione hipervarijabilnosti, koji se nazivaju regioni koji određuju komplementarnost (CDR, od engl. complementarity determining regions), između kojih su konzervativniji regioni, nazvani okvirni regioni (FR, od engl, framework regions). Svaki HCVR i LCVR se sastoji od tri CDRs i četiri FRs koji su poređani od aminotermina do karboksi-terminusa sledećim redosledom: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Za antitela pronalaska cele dužine, laki lanci poželjno sadrže , nizvodno od FR4, polipeptid sa sekvencom prikazanom u SEQ ID BR: 277. Za antitela pronalaska cele dužin, teški lanci poželjno sadrže, nizvodno od FR4, polipeptide sa sekvencom prikazanom u SEQ ID BR: 278. Ovde, 3 CDRs teškog lanca su označena kao "CDRH1, CDRH2, i CDRH3" i 3 CDRs lakog lanca su označeni kao "CDRL1, CDRL2 i CDRL3." CDRs sadrže većinu ostatatak koji formiraju specifične interakcije sa antigenom. Redosled i položaj amino kiselinskih ostataka CDR unutar HCVR i LCVR regiona je uskladu sa dobro poznatom numeracijom prema Kabat–u.

[0048] Izraz "antitelo," u odnosu na anti-IL-17 monoklonsko antitelo pronalaska (ili jednostavno "antitelo pronalaska"), kao što je ovde korišćen, odnosi sa na monoklonsko antitelo.

"Monoklonsko antitelo" kao što je ovde korišćen, odnosi se na antitelo glodara, miša, himerno antitelo, humanizovano antitelo ili potpuno humano antitelo, osim ako je drugačije naznačeno. Monoklonska antitela ovog pronalaska mogu se dobiti korišćenjem, npr. tehnika hibridoma dobro poznatih u struci, kao i rekombinantnih tehnologija, tehnologija eksponiranja faga, sintetičkim ili rekombinantnim tehnologijama ili kombinacijama ovih tehnologija koje su poznate u tehnici. Izraz "monoklonsko antitelo" kao što je ovde korišten, nije ograničen na antitela dobijena tehnologijom hibridoma. "Monoklonsko antitelo" se odnosi na antitelo koje je izvedeno iz jedne kopije ili klona, uključujući npr., eukariotksi, prokariotski klon ili klon faga , a ne motodom kojom je dobijeno. "Monoklonsko antitelo" može da bude intakto antitelo (koje sadrži kompletan Fc region ili Fc region cele dužine), suštinski intaktno antitelo, ili deo ili fragment antitela koji sadrži antigen-vezujući portion, npr., Fab fragment, Fab' fragment ili F(ab')2fragment antitela miša ili himernog, humanizovanog ili humanog antitela. "Fab" fragment sadrži varijabilne (promenljive) ik onstantne domene lakog lanca i varijablni domen i prvi kosntantan domen (CH1) teškog lanca. "F(ab')2" fragmenti antitela sadrže par Fab fragmenat koji su generalno kovalentno vezani u blizini karboksilnog kraja pregibnih cisteina smeštenih između njih. Ostala hemijska kuplovanja fragmenata antitela su takođe poznata u tehnici.

[0049] Varijabilni region svakog para lakog lanca formira antigen-vezujuće mesto na antitelu. Tako, intaktno IgG antitelo ima dva mesta vezivanja. Izuzev u bifunkcionalnim ili bispecifičnim antitelima, sva antigen-vezujuća mesta antitela su ista. Kao što je ovde upotrebljeno, "antigenvezujući deo " ili "antigen-vezujući region" ili "antigen-vezujući domen" odnosi se naizmenično na taj deo moelkula antitela koji sadrži amino kiselinske ostatke koji interaguju sa antigenom i daju antitelu njegovu specifičnost i afinitet za antigen. Ovaj deo antitela obuhvata "okvir" amino kiselinskih ostatatak koji je neophodan za održavanje odgovarajuće konformacije antigenvezujućih ostatala. Poželjno, CDRs antigen-vezujućeg regiona antitela pronalaska su u potpunosti ili u suštini mišijeg porekla, po izboru sa određenim izmenjenim amino kiselinskim ostacima, npr. supstituisan različitim amino kiselinskim ostacima, (videti npr., Tabele 2 i 3) za optimizaciju određene osobine antitela, npr., KD, koff, IC50. Poželjno okvir regiona antitela pronalaska su humanog porekla ili u suštini humanog porekla (najmanje 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% humanog porekla. Poželjni okviri regiona antitela pronalaska imaju sledeće sekvence: SEQ ID BRs: 262 (HCVR FR1), 263 (HCVR FR2), 264 (HCVR FR3), 265 (HCVR FR4), 266 (LCVR FR1), 267 (LCVR FR2), 268 (LCVR FR3), 269 (LCVR FR4) i prate numeraciju prema Kabat –u. U ostalim realizacijama, antigen-vezujući region IL-17 antitela pronalaska može se izvesti od drugih ne-humanih vrsta uključujući, ali ne i ograničavajući se na, zeca, pasova ili hrčka. Alternativno, antigen-vezujući region može se izvesti iz humane sekvence.

[0050] Dalje, "monoklonal antitelo" kao što je ovde upotrebljen može da bude jednolančani Fv fragment koji se može dobiti spajanjem DNK koja kodira LCVR i DNK koja kodira HCVR sa linker sekcencom. (videti, Pluckthun, The Pharmacology of Monoklonal Antitela, vol.113, Rosenburg and Moore cds., Springer-Verlag, New York, pp 269-315, 1994). Treba naglasiti da bez obzira na to da li su fragmenti naznačeni, Izraz "antitelo" kao što je ovde upotrebljen obuhvata ove fragmente kao i jednolančane oblike. Dokle god protein zadržava sposobnost da se specifično ili preferentno vezuje za svoj naznačeni cilj (tj., epitop ili antigen), obuhvaćen je izrazom "antitelo." Antitela mogu biti ili ne mogu da budu glikozilovana, ali su i dalje su obuhvaćena pronalaskom.

[0051] Populacija "monoklonskih antitela," se odnosi na homogenu ili u suštini populaciju antitela (tj., najmanje oko 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, a poželjno najmanje oko 97% ili 98% ili još bolje 99% antitela u populaciji će se takičiti u ELISA testu za isti antigen ili epitop ili bolje antitela su sa indetičnom amino kiselinskom sekvencom. Antitela mogu biti ili ne mogu da budu glikozilovana i još uvek su obuhvaćena obimom pronalaska. Monoklonska antitela mogu da budu homogena ukoliko imaju identične amino kiselinske sekvence iako mogu da se razlikuju u post-translacionoj modifikaciji, npr., šeme glikozilacije.

[0052] “Varijanta” antitela ovde se odnosi na molekul koji se razlikuje po aminokiselinskoj sekvenci od aminokiselinske sekvence “roditeljskog” (engl. parent) antitela pomoću dodavanja, delecije i/ili supstitucije jedne ili više amino kiselina u aminokiselinsku sekvencu ishodnog antitela " U poželjnoj realizaciji, variant antitelo sadrži najmanje jednu adiciju, deleciju ili supstituciju amino kiseline (npr., od jedan do deset, a poželjno 2, 3, 4, 5, 6, 7 i 8u CDR regionima roditeljskog antitela. Identičnost ili homologija u odnosu na promenljivu sekvencu antitela ovde se definiše kao procenat aminokiselinskih ostataka u promenljivoj sekvenci antitela koji su identični sa ostacima u ishodnim antitelima kada se porede sekvence i uvedu međuprostori, ako je potrebno, da bi se postigao maksimalan procenat identičnosti. Varjanto antitelo zadržava sposobnost da vezuje antigen, ili poželjno, epitop, za koje se vezuje roditeljsko antitelo i poželjno ima bar jednu karakteristiku ili bioaktivnost koja je superiorna u odnosu na roditeljsko antitelo. Na primer, poželjno je da varijanta antitela ima jači vezivni afinitet, sporiju brzinu disosovanja, manju IC50ili povećanu sposobnost da inhibira bioaktivnost antigena nego što to čini roditeljsko antitelo. Varijantno antitelo od posebnog interesa je ono koje ispoljava najmanje 2-struko, poželjno najmanje 5-struko, 10-struko ili 20-struko poboljšanje osobina ili bioaktivnosti u odnosu na roditeljsko antitelo.

[0053] “Roditeljsko" antitelo kao što je ovde dato je ono antitelo koje je kodirano aminokiselinskom sekvencom koja je upotrebljena za dobijanje variant antitela. Roditeljsko antitelo može da ima okvir sekvence mišijeg porekla, ali poželjno okvir sekvence je u potpunosti ili u suštini humanog porekla. Roditeljsko antitelo može da bude mišije, himerno, humanizovano ili humano antitelo.

[0054] Izraz "specifično vezuje" kao što je ovde korišćen odnosi se na situaciju u kojoj se jedan član specifičnog para vezivanja značajno ne vezuje za molekule osim za svoje specifine članove (partnere) vezivanja. Izraz se takođe može primeniti kada je npr., antigen-vezujući domen antitela pronalaska specifičan za određeni epitop koji nose brojni antigeni, u kom slučaju će specifično antitelo koje nosi antigen-vezujući domen biti u mogućnosti da se vezuje za različite antigene koji nose epitope. Shodno ovom, monoklonsko antitelo pronalaska specifično vezuje humani IL-17 (tj., IL-17A) kod ne vezuje specifično humani IL-17B, IL-17C, IL-17D, IL-17E, IL-17F. Dalje, monoklonsko antitelo pronalaska specifično vezuje humani IL-17 i cinomolgus majmuna IL-17 ali ne vezuje specifično IL-17 pacova ili IL-17 miša. Dalje, monoklonsko antitelo pronalaska specifično vezuje nelinearni ili konformacioni humani IL-17 epitop koji sadrži amino kiseline DGNVDYH (SEQ ID BR: 276), ali ne vezuje humani IL-17 epitop koji ne sadrži amino kiseline DGNVDYH (SEQ ID BR: 276).

[0055] Izraz "poželjno (preferentno) vezuje" kao što je ovde upotrebljen, odnosi se na situaciju u kojoj antitelo vezuje specifični antigen oko 20%, poželjno najmanje oko 50%, 2-struko, 20struko, 50-struk ili 100-struko jače nego što vezuje različit antigen što je merene tehnikom koja je raspoloživa u stanju tehnike, npr., kompetitivna ELISA ili merenje KDsa BIACORE ili KINEXA probom. Antitelo može poželjno da veže jedan epitop unutar antigena u odnosu na drugi epitopa u istom antigenu. Shodno ovo, antitelo pronalaska poželjno vezuje human IL-17 u odnosu na zečiji IL-17.

[0056] Termin “epitop” odnosi se na onaj deo molekula koji antitelo može da prepozna i da se veže za njega preko jednog ili više vezivnih regiona antitela za antigen. Epitopi se često sastoje od grupe molekula sa hemijski aktivnom površinom kao što su amino kiseline ili šećeri i imaju specifične trodimenzionalne strukturne karakteristike kao i specifično naelektrisanje. "inhibirajući epitop" i/ili "neutrališući epitop" je epitop, koji kada je u kontekstu intaktnog antigenskog molekula i kada je vezan antitelom specifičnim za epitop, dovodi do gubitka ili smanjenja biološke aktivnosti molekula in vivo ili in vitro ili u organizmu koji sadrži ovaj molekul.

[0057] Izraz "epitop," kao što je ovde upotrebljen, dodatno se odnosi na deo polipeptida sa antigenskim i/ili imunogenskim dejstvom kod životinja, poželjno sisara, npr., miša ili čoveka. Izraz "antigenski epitop," kao što je ovde upotrebljen, je definisan kao deo polipeptida za koji se specifično vezuje antitelo što je određeno bilo kojom metodom koja je poznata u tehnici, na primer, uobičajenim imunoesejima. Antigenski epitopi nisu nužno i imunogenski, ali mogu biti imunogenski. "Imunogenski epitop," kao što je ovde upotrebljen, je definisan kao deo polipeptida koji izaziva odogovor antitela kod životinja, što je određeno bilo kojom metodom koja je poznata u tehnici. "Nelinearni epitop" ili "konformacioni epitop" obuhvata nepovezane polipeptide (ili amino kiseline) u antigenskom proteinu za koji se vezuje antitelo specifično za epitop.

[0058] Fraze "biološka osobina " ili "biološka karakteristika," ili izrazi "aktivnost " ili "bioaktivnost," u odnosu na antitelo predmetnog pronalaska, su naizmenično upotrebljeni i obuhvataju, ali nisu ograničeni na, epitop/antigen afinitet i specifičnost, sposobnost da neutrališu ili antagonizuju aktivnost IL-17 in vivo ili in vitro, IC50, in vivo stabilnost antitela i imunogene osobine antitela. Druge biološke osobine ili karakteristike antitela priznate u struci uključuju, na primer, unakrsnu reaktivnost (tj. sa homologonima ciljnog peptida koji nisu humanog porekla, ili, uopšteno, sa drugim proteinima ili tkivima) , i sposobnost da očuvaju intenzivne nivoe ekspresije proteina u sisarskim ćelijama Prethodno naveden karakteristike ili osobine mogu se zapaziti, meriti ili procenti primenom poznatih tehnika koje obuhvataju, ali nisu ograničene na, ELISA, kompetitivni ELISA, BIACORE ili KINEXA analizu rezonancije površinskih plazmona (englsurface plasmon resonance analysis), proba in vitro ili in vivo neutralizacije bez ograničenja, vezivanje receptora, proizvodnja i/ili sekrecija citokina ili faktora rasta, signalna transdukcija i imunohistohemija uz odabri tkiva iz različitih izvora uključujući čoveka, primate, ili druge izvore.

[0059] Izraz "inhibira" ili "neutrališe" kao što je vode korišćen a odnosi se na aktivnost antitela pronalaska označava spospobnost sa suštinski antagonizuje, zabrani, spreči, ograničava, usporava, remeti, eliminiše, zaustavlja ili preusmerava npr., napredovanje ili jačine toga što je inhibirano, uključujući ali ne ograničavajući se na biološku aktivnost npr., aktivnost IL-17) ili osobinu, bolest ili stanje. Inhibicija ili neutralizacija aktivnosti IL-17 nastale od vezivanja antitela pronalaska sa IL-17 poželjno iznosi oko 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ili više.

[0060] Izraz "izolovan" kada se odnosi na nukelinsku kiselinu ili protein (npr., antitelo) označava molekul nukleinske kiseline ili proteina koji je identifikovan i odvojen od bar jedne nečistoće koje je obično prateća u njihovim prirodnim izvorima. Poželjno, "izolovano antitelo" je antitelo koje je u suštini bez drugih antitela koja imaju različite antigenske karakteristike (npr., farmaceutska kompozicija pronalaska sadrži izolovano antitelo koje specifično vezuje IL-17 i u suštini ne sadrži antitela koja specifično vezuju antigene osim IL-17).

[0061] Izrazi "Kabat numeracija" i "Kabat obeležavanje" su ovde naizmenicno korišćeni. Ovi izrazi, koji su priznati u tehnici, odnose se na system numeracije amino kiselinski ostataka koji su više varijabilne (promenljive) (tj., hipervarjiabilne) od ostalih amino kiselinskih ostataka u varijabilnim regionima antitela sa teškim i lakim lancem (Kabat, et al., Ann. NY Acad. Sci.

190:382-93 (1971); Kabat, et al., Sekvences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No.91-3242 (1991)).

[0062] Polinukleotid je “operativno povezan” sa drugim polinukleotidom kada se postavi u funkcionalan odnos sa drugim polinukleotidom. Na primer, promotor ili stimulator (engl. enhancer) su operativno vezani za kodirajuću sekvencu ako utiču na transkripciju te sekvence. Peptid je “operativno povezan” sa drugim polipeptidom kada su polinukleotidi koji ih kodiraju operativno povezani, naročito ako su u istom otvorenom okviru čitanja.

[0063] Izrazi "pojedinac," "subjekt," i "pacijent," koji su ovde naizmenično korišćeni, odnose se na sisara, uključujući ali ne i ograničavajući se na, miševe, majmune, ljude, domaće životinje sisare, sisare (životinje) za sport takođe, i sisare kućne ljubimce ; poželjno se izraz odnosi na ljude. U određenim realizacijama, subjekt koji je poželjno sisar, a poželjno čovek, je dalje okarakterisan bolešću ili stanjem koje će imati koristi od željene bioaktivnosti IL-17.

[0064] Izraz "vektor" obuhvata molekul nukleinske kiseline koja može da transportuje drugu nukleinsku kiselinu koja je vezana, uključujući, ali ne ograničavajući se na, plazmide i viralne vektotore. Određeni vektori su sposobni za autonomnu replikaciju u ćeliji domaćinu u koju su uvedeni dok ostali vektori mogu da budu integrisani u genom ćelije domaćina posle uvođenja u ćeliju domaćina, i shodno tome, su replicirani zajedno sa genomom domaćina. Dalje, određeni vektori su sposobni da usmeravaju ekspresiju gena za koji su operativno vezani. Ovi vektori su ovde označeni kao "rekombinantni ekspresioni vektori" (ili jednostavno "ekspresioni vektori") i primeri vektora su poznati u tehnici.

[0065] Kao što su ovde upotrebljeni, izrazi "ćelija," "ćelija domaćin," "ćelijska linija," i "ćelijska kultura" su naizmenično korišćeni i ouhvataju individualne ćelije ili ćelijsku kulturu koja je primalac bilo kog izolovanog polinukleotida pronalaska ili bilo kog rekombinantog vektora (rekombinantnih vektora), a sadrži sekvencu koja kodira HCVR, LCVR ili monoklonsko antitelo pronalaska. Ćelije domena sadrže progenitorske ćelije domaćina i progenitorska ćelije ne mora obavezno da bude i potpuno identična (po morfologiji ili komplement cele DNK) originalnoj roditeljskoj ćeliji zbog prirodnih, slučajnih, ili namernih mutacija i/ili promena. Ćelija domaćina obuhvata ćelije koje su transformisane, transdukovane ili inficirane rekombinantnim vektorom ili polinukleotidom koji eksprimira monoklonsko antitelo pronalaska ili njegov laki ili težak lanac. Ćelija domaćina koja sadrži rekombinanti vektor pronalaska, ili stablilno inkorporiran u hromozom domaćina ili ne, može se označiti kao "rekombinantna ćelija domaćin". Poželjne ćelije domaćini za upotrebu u pronalasku su CHO ćelije (npr., ATCC CRL-9096), NS0 ćelije, SP2/0 ćelije, COS ćelije (ATCC npr., CRL-1650, CRL-1651) i HeLa (ATCC CCL-2). Dodatne ćelije domaćini za upotrebu u pronalasku uključuju ćelije biljaka, ćelije kvasca, ostale sisarske ćelije i prokariotske ćelije.

Karakterizacija antitela

[0066] Predmetni pronalazak se odnosi na izolovana, monoklonska antitela koja specifično vezuju humani IL-17 (tj., IL-17A) sa visokim afinitetom. Antitela pronalaska su poželjno himerna, humanizovana ili humana antitela ili njihovi delovi koji vezuju antigen. Dalje, antitela pronalaska neutrališu ili antagonizuju bar jednu biološku aktivnost IL-17 in vivo i/ili in vitro. Specifično vezivanje anti-IL-17 monoklonskog antitela pronalaska, (uključujući njegove vezivne regione antitela za antigen) za IL-17 omogućava da dato antitelo može da bude upotrebljeno kao terapeutik /lek za bolesti ili poremećaje koji su povezani sa IL-17, tj., stanja, bolesti ili poremećaje koje će imati benefite od inhibicije biološke aktinosti IL-17.

[0067] Antigenski IL-17 epitop za koji se vezuju antitela pronalaska je ne-linearni epitop koji sadrži amino kiseline ADGNVDYHMN (SEQ ID BR: 275), a bolje amino kiseline DGNVDYH (SEQ ID BR: 276) humanog IL-17. Antitela koja vezuju ovaj epitop, specifično i preferentno vezuju humani IL-17 i IL-17 cinomolgus majmuna u odnosu na njihovo vezivanje mišijeg IL-17 ili IL-17 pacova. Monoklonska antitela pronalaska vezuju humani IL-17 bar 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, ili 100-puta više (npr., veći afinitet ili veća specifičnost) nego sa afinitetom kojim vezuju mišiji IL-17 ili IL-17 pacova; bolje bar 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550 ili 600-puta više nego što vezuje mišiji IL-17 ili IL-17 pacova, a još bolje ne vezuje mišiji IL-17 ili IL-17 pacova na nivoma iznad nivoa šuma kao što je određeno npr. ELISA testom, kompetitivnim ELISA testom ili KDvrednostima u u BIACORE ili KINEXA testu.

[0068] U poželjnoj realizaciji, pronalazak obezbeđuje anti-IL-17 monoklonsko antitelo koje poseduje snažan vezivni afinitet za humani IL-17, tj., vezuje humani IL-17, ili njegov deo koji sadrži DGNVDYH (SEQ ID BR: 276) [tj., antitelo stupa u vezu sa DGNVDYH (SEQ ID BR: 276) polipeptidom], sa afinitetom vezivanja (KD) za humani IL-17 manjim od 7 pM, 6.5 pM ili 6 pM, poželjno manjim od 5.5 pM, 5 pM ili 4.5 pM , a najbolje manjim od 4 pM. Alternativno, antitela pronalaska su okarakterisana sa KDza humani IL-17 ne većim od oko 7 pM, 6.5 pM ili 6 pM, poželjno ne većim od oko 5.5 pM, 5 pM ili 4.5 pM i još boljene većim od oko 4 pM. Afiniteti ntitela mogu se odrediti kao što je opisano u primerima u daljem tekstu ili drugim metodama koje su opisane u tehnici. Poželjno anti-IL-17 antitela pronalaska koja imaju veliki vezivni afinitet kao što je prethodno opisano, takođe vezuju ne-linearni humani IL-17 epitop koji sadrži amino kiseline ADGNVDYHMN (SEQ ID BR: 275), more poželjno amino kiseline DGNVDYH (SEQ ID BR: 276), gde antitelo se vezuje za polipeptid DGNVDYH (SEQ ID BR:276).

[0069] U jednoj realizaciji, antitela pronalaska imaju brzinu disocijacije (koff) za humani IL-17 manju od 5 x 10<-5>, 4 x 10<-5>, 3 x 10<-5>ili 2 x 10<-5>s<-1>. U poželjnoj realizaciji, antitela pronalaska okarakterisana time što imaju veliki vezivni afinitet za humani IL-17 kao što je prethodno opisano (KDmanje od oko 7 pM ili 6 pM, poželjno manje od oko 5 pM ili 4.5 pM i još bolje manje od 4 pM) takođe imaju brzinu disocijacije (koff) za IL-17 čoveka, manju od 5 x 10<-5>, 4 x 10<-5>, 3 x 10<-5>ili 2 x 10<-5>s<-1>i čak bolje vezuju ne-linearni IL-17 epitop čoveka koji sadrži amino kiseline ADGNVDYHMN (SEQ ID BR: 275), a bolje amino kiseline DGNVDYH (SEQ ID BR: 276) humanog IL-17.

[0070] U narednoj realizciji, antitela pronalaska imaju vrednost za IC50manju od InM, 900 pM, 800 pM, 700 pM, 650 pM, 600 pM, 560 pM, 550 pM ili 500 pM u npr., in vitro IL-8 reporter testu ili manju od oko 560 pM u GROα reporter probi (videti Primer 6). U poželjnoj realizaciji, antitela pronalaska su okarakterisana time što imaju veliki afinsitet vezivanja za humani IL-17 kao što je prethodno opisano (KDmnji od oko 7 pM ili 6 pM, poželjno manji od oko 5 pM ili 4.5 pM i najbolje manji od oko 4 pM) i takođe imaju vrednosti za IC50manje od InM, 900 pM, 800 pM, 700 pM, 650 pM, 600 pM, 560 pM, 550 pM ili 500 pM u npr., in vitro IL-8 reporter testu ili manje od 560 pM u GROα reporter testu i još bolje takođe imaju brzinu disocijacije (koff) za IL-17 čoveka manju od 5 x 10<-5>, 4 x 10<-5>, 3 x 10<-5>ili 2 x 10<-5>s<-1>i još bolje takođe vezuju ne-linearni IL-17 epitop čoveka koji sadrži amino kiseline DGNVDYH (SEQ ID BR: 276) IL-17 čoveka, pri čemu antitelo se vezuje za DGNVDYH (SEQ ID BR: 276) polipeptid.

[0071] Najpreferentnija realizacija pronalaska je anti-IL-17 antitelo sadrži amino kiselinsku sekvencu lakog lanca koja se sastoji od SEQ ID BR: 279 i amino kiselinsku sekvencu sa teškim lancem, koja se sastoji od SEQ ID BR: 280. Poželjno ovo antitelo obuhvata dva identična laka lanca i dva identična teška lanca. Poželjno laki lanac aminokiselinske sekvence kao što je prikazano u SEQ ID BR: 279 je kodiran nukelinskom kiselinom koja sadrži sekvencu kao što je prikazano u SEQ ID BR: 281 (uključujući signalnu sekvencu) ili SEQ ID BR: 283 (bez signalne sekvence). Poželjno težak lanac sa amino kiselinskom sekvencom kao što je prikazano u SEQ ID BR: 280 je kodiran nukelinskom kiselinom koja sadrži sekvencu prikazanu u SEQ ID BR: 282 (uključujući signalnu sekvencu) ili SEQ ID BR: 284 (bez signalne sekvence).

[0072] Monoklonska antitela ("mAbs") mogu se dobiti prema tehnologiji hibridoma koja je poznata u tehnici (videti npr., Kohler et al., Nature, 256:495, 1975) ili ili se može dobiti metodama rekombinantne DNK (npr., kao u U.S. Patentu Br 4,816,567). Generalno, hibridoma se može dobiti fuzijom odgovarajućih besmrtnih ćelijskih linija (npr., ćelijska linija mijeloma kao što je SP2/0) sa ćelijama imunskizovane životinje, koje proizvode antitelo. Ćelije koje proizvode antitelo, poželjno ćelije slezine ili limfnih čvorova, dobijene su od životinja koje su imunskizovane sa antigenom od interesa. Ćelije koje su fuzionisane (hibridomi) mogu se izolovati pod selektivnim uslovima gajenja i klonirati pod ograničenim razblaženjem. Podloge na kojima su gajene ćelije hibridoma su testirane na proizvodnju monoklonskih antitela usmerenih na antigen. Poželjno, specifičnost vezivanja mAbs koji su proizvele ćelije hibridoma određena je imunoprecipitacijom ili probom in vitro vezivanja, kao što je radioimunoesej ili ELISA. Ćelije koje proizvode antitela sa željenim osobinama vezivanja mogu se odabrati pogodnim testom.

Metode za ova izolovanja i skrininin su poznata u tehnici.

[0073] Mogu se primeniti i ostale pogodne metode za proizvodnju ili izolovanje antitela pronalaska, uključujući humana ili veštačka antitela, uključujući, na primer, metode koje odabiruz rekombinantno antitelo (npr., jednolančani Fv ili Fab) iz biblioteke, ili koje se oslanjaju na imunskizaciju transgenskih životinja (npr., miševa) koje mogu da proizvode repertar humanih antitela (videti npr., Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551-2555, 1993;

Jakobovits et al., Nature, 362:255-258, 1993; U.S. Patent Numbers 5,545,806 i 5,545,807).

[0074] Jednolancana antitela, i himerna, humanizovana ili primatizovana (CDR-graftovana) antitela, kao i himerna ili CDR-graftovana jednolančana antitela, i slična, sadrže delove izvedene od različitih vrsta, su pobuhvaćena predmetnim pronalaskom i izrazom "antitelo". Različiti delovi ovih antitela mogu se zajedno hemijski spojiti uobičajenim tehnikama, sintetički ili se mogu dobiti kao kontrinuirani protein primenom tehnike genetskog inženjeringa. Na primer, nukleinske kiseline koje kodiraju himerne ili humanizovane lance mogu se eksprimirati da proizvedu kontinuirani protein.Videti npr., U.S. Patent No.4,816,567; Evropski Patent br.

125,023 B1; U.S. Patent Br.4,816,397; Evropski Patent br.120,694 B1; WO 86/01533;

Evropski Patent br.194,276 B1; U.S. Patent br.5,225, 539; Evropski Patent br.239,400 B1 i U.S. Patente br.5,585,089 i 5,698,762.

[0075] Dodatno takođe se mogu dobiti i funkcionalni fragmenti antitela (tj., antigen-vezujući fragmenti), uključujući fragmente himernih, humanizovanih, primatizovanih li jednolančanih antitela, i obuhvaćeni su obimom pronalaska. Poželjni funkcionalni fragmenti zadržavaju antigen-vezujuću funkciju odgovarajućeg antitela cele dužine. Posebno poželjni funkcionalni fragmenti zadržavaju sposobnost da inhibiraju jednu ili više funkcija ili karakterističnih bioaktivnosti humanog zrelog IL-17, poželjno humanog IL-17, kao što je aktivnost vezivanja, aktivnost signalizacije, i/ili stimulacije ili inhibicije ćelijskog odgovora. Na primer, u jednoj realizaciji, funkcionalni fragment može da inhibira interakciju zrelog IL-17 sa svojim receptorom i/ili može da inhibira jednu ili više receptorom posrednovanih funkcija.

[0076] Delovi antitela koji mogu da se vezuju za humani IL-17 uključuju, ali nisu ograničeni na, Fv, Fab, Fab' i F(ab')2fragmenti i obuhvaćeni su pronalaskom. Ovi fragmenti mogu da se dobiju anzimskim cepanjem ili rekombinantnim tehnikama. Na primer, cepanje papainom ili pepsinom intaktnog antitela mogu se dobiti Fab ili F(ab')2fragmenti, respektivno. Digestija antitela papainom proizvodi dva identična antigen-vezujuća fragmenta, nazvana "Fab" fragmenti, svaki sa jednim mestom vezivanja antigena. Fab fragment takođe sadrži konstantni domen lakog lanca i prvi konstantni domen (CH1) teškog lanca. Tretmanom pepsinom dobija se F(abʹ)2fragment koji ima dva antigen-kombinujuća mesta i još uvek može da unakrsno veže antigen.

[0077] "Fv" je minimalni fragment antitela koji sadrži kompletno mesto indetifikacije (prepoznavanja) antigena i mesto vezivanja. Ovaj region se sastoji od dimera koji čine jedan teški lanac i jedan laki lanac varijabilanog domena u čvrstoj, nekovalentnoj asocijaciji. U ovoj konfiguraciji tri CDRs svakog od varijabnog domena interaguje tako da definiše antigenvezujuće mesto na površini VH-VLdimera. Zajedno,šest CDRs definišu antigen-vezujuću specifičnost antitelu. Za prevazilaženje tendencije nekovalentlno vezanih HCVR i LCVR domena u Fv da disosuju kada su ko-eksprimirani u ćeliji domaćinu, može se sastaviti jednolančani Fv fragment (scFv) u kojem fleksibilni polipepti odgovarajuće dužine vezuje ili C-terminus HCVR –a za N-terminus LCVR –a ili C-terminus LCVR-a za N-terminus HCVR-a. Linker koji se občno koristi je (Gly4Ser)3peptid sa 15-ostataka. Za pregled sFv-a, videti Pluckthun in The Pharmacology of Monoklonal Antitela, vol.113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp.269-315 (1994). Antitela se takođe mogu dobiti u različitim skraćenim oblicima koristeći gene antitela u koijma je jedan ili više stop kodona uvedeno uzvodno od prirodnog stop mesta. Na primer, himerni gen koji kodira deo teškog lanca F(ab')2može se označiti tako da obuvhati DNK sekvence koje kodiraju CH1domen i pregibni region teškog lanca.

[0078] Odabir fragmenata antitela iz biblioteke primenom tehnologija obogaćivanja kao što je tehnologija eksponiranja (displej) faga (Matthews DJ and Wells JA. Science.260:1113-7, 1993), eksponiranje ribozoma (Hanes, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 95:14130-5, 1998), bakterijski displej (Samuelson P., et al., Journal of Biotechnology.96:129-54, 2002) ili displej kvasca (Kieke M.C., et al., Protein Engineering, 10:1303-10, 1997) su se pokazali kao uspešne alternative klasičnoj tehnologiji hibridoma (Review: Little M. et al., Immunology Today, 21:364-70, 2000).

Varijante Antitela

[0079] Mišije monoklonsko antitelo ili humano antitelo (proizvedeno npr., u transgenskom mišu) podignuto protiv IL-17 može da bude roditeljsko antitelo. Roditeljsko antitelo može dalje da bude izmenjeno tako da se formira himerni ili humanizovani oblik antitela ili drugu varijantu antitela primenom metoda koji su dostupni u tehnici, npr., PCR mutagenezom. Ove himerne, humanizovane, ili ostale varijante antitela, mogu da posluže kao osnovna antitela za dalje varijacije ili mutagenezu. Osnovna antitela pronalaska mogu da budu mutagenizovana, npr., sa CDR domenom (domenima) (videti, npr., Tabele 2 i 3) za dobijanje varijante antitela koje može da bude analizirano na prisustvo karakteristike od interesa, npr., vezivni afinitet (niža KD), IC50, specifičnost, preferencijalno vezivanje, itd. Poželjno osobina od interesa u varijanti antiteli je poboljšanje osobina u odnosu na roditeljsko antitelo. Susptitucija amino kiselina u varijanti antitela je poželjna i najmanje je 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10 amino kiselinskih ostataka uklonjenih iz molekula roditeljskog antitela i na njihovo mesto su umetnuti različiti ostaci. Mesto od najvećeg interesa za supstitucionu mutagenzu je jedan ili više CDR regiona, ali takođe su razmatrane FR izmene (alteracije). Konzervativne supstitucije amino kiselina su poželjne , iako za temeljnije promene, ne-konzervativne promene amino kiselina mogu da budu uveden i nastala antitela su analizirana na osobine od interesa.

[0080] Uobičajeni način za dobijanje supstitucione varijante roditeljskog antitela je afinitet maturacije primenom dispeja faga. Ukratko, polinukleotidni molekul koji kodira roditeljsko antitelo je mutiran jednim ili više CDR regiona za dobijanje svih mogućih susptitucija amino kislina na kojima je je susptitucija tražena. Ovako dobijen varijante antitela su izložene na monovalentan način od filamentoznig čestiva fata kao fuzije sa genom III proizvoda M13 pakovanog unutar svake čestice. The varijante antitela sa izloženim fagama su zatim okarakterisane za svoju biološku aktivnost (npr., vezivni afinitet, specifičnost, IC50). Da bi se identifikovala data mesta CDR regiona za modifikaciju, mogu se izvesti alanin skenirajući mutageni da bi se identifikovao ostatakCDR regiona koji značajno doprinosti vezivanju antigena.

[0081] Alternativno, ili dodatno, može da bude pogodno analizirati kristalnu strukturu kompleksa antigen-antitelo da bi se identifikovale tačke kontakta između antitela i IL-17. Ovi kontakti ostataka i susednih ostataka su kandidati za supstituciju prema tehnikama koje su ovde opisane ili su poznate u tehnici. Alternativno, ili dodatno, nasumične mutageneze ili tačkaste mutageneze se mogu izvestina jednom ili više polinukleotidnih molekula koji kodiraju najmanje jedan CDR. Mutageneze mogu da budu izvedene, na jednom ili više položaja ili CDR je operativno vezan za okvir regiona unutar varijabnog regiona ili dok je CDR nezavistan od ostalih sekvenci varijabnog regiona i zatim je izmenjen CDR bvraćen na varijablni region primenom tehnologije rekombinantne DNK. Kada su formirane ove varijante antitela, panel varijanti je podvrgnut katakterizaciji na osobine ili aktivnost od interesa i antitela sa superiornim osobinama u jednom ili više testova mogu da budu odabrana za dalji razvoj.

[0082] Bilo koji cisteinski ostatak koji nije uključen u održavanje odgovaruće konformacije anti-IL-17 antitela pronalaska može da bude supstituisan, generalno serinom, za poboljšanje oksidativne stabilnosti molekula i sprečavanje nekontrolisanog umrežavanja. Obratno, cisteinske veze mogu da budu dodate u antitelo da poboljšale njegovu stabilnost (posebno kada je antitelo, fragment antitela kao što je Fv fragment).

[0083] Sledeći tip varijante amino kiselina u antitelu menja originalni način glikozilacije antitela. Pod menjanjem podrazumeva se delecija jednog ili više ostataka ugljenih hidrata u antitelu, i/ili dodavanje jednog ili više mesta glikozilacije koja nisu prisutna u osnovnom antitelu. Glikozilacija antitela je obično N-vezana ili O-vezana. N-vezana se odnosi na vezivanje ugljohidratnog ostatka za sporedni lanac asparaginskog ostatka. Tripeptidne sekvence asparagin-X-serin i asparagin-X-treonin, gde X je bilo koja amino kiselina izuzev prolina, koje su sekvence prepoznavanja za enzimsko vezivanje ugljohidratog ostatka za sporedni lanac asparagina. Tako prisustvo jedne od ovih tripeptidnih sekvenci u polipeptidu stvara potencijalna mesta glikozilacije. O-vezana glikozilacija se odnosi na vezivanje jednog od šećera N-aceilgalaktozamina, galaktoze, ili ksiloze za hidroksiamino kiselinu, najčešće serin ili treonin, mada se mogu koristiti i 5-hidroksiprolin ili 5-hidroksilzin.

[0084] Dodavanje mesta glikozilacije u antitelo se obično postiže menjanjem sekvence amino kiselina tako da sadrži jednu ili više prethodno opisanih tripeptidnih sekcenci (za N-vezana mesta glikozilacije). Moguće su i alteracije dodavanjem ili supstitucijom jednog ili više serinskih ili treoninskih ostatak u sesekvencu originalnog antitela (za O-vezana mesta glikozilacije).

Sekvenca

[0085] Poželjno monoklonsko antitelo pronalaska sadrži LCVR koji sadrži peptide sa sekvencom odabranom iz grupe koju čine SEQ ID BRs: 178-243 i/ili HCVR koji sadrži peptid sa sekvencom odabranom iz grupe koju čine SEQ ID BRs: 56-121. U preferentnoj realizaciji, antitelo pronalaska obuhvata LCVR koji sadrži peptide se sekvencom odabranom iz grupe koju čine SEQ ID BRs: 178-243 i dalje sadrži HCVR koji sadrži peptide sa sekvencom odabranom iz grupe koju čine SEQ ID BRs: 56-121, gde HCVR i LCVR prisutni u antitelu pronalaska postoje zajedno u Fab –u navedenom u Tabeli 1. Na primer, antitelo pronalaska sadrži LCVR polipeptid sa amino kiselinskom sekvecom SEQ ID BR: 178, poželjno dalje sadrži i HCVR polipeptid sa amino kiselinskom sekvencom odabranom iz grupe koju čine SEQ ID BRs: 56, 60, 68-93 i 95. Dalje, antitelo pronalaska sadrži LCVR polipeptid sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID BR: 241, poželjno dalje sadrži HCVR polipeptid koji sadrži amino kiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koju čine SEQ ID BRs: 118 i 106. Prosečan stručnjak će ceniti činjenicu da antitela pronalaska nisu ograničena na specifične sekvence HCVR LCVR kao što je navedeno u Tabeli 1, već obuhvataju i varijante ovih sekvencithat, kada su prisutna u anti-IL-17 antitelu pronalaska, zadržavaju ili poboljšavaju antigen vezujuću sposobnost i najmanje jednu drugu funkcionalnu osobinu roditeljskog antitela, npr., specifičnost epitopa, sposobnost da se takmiče sa roditeljskim antitelom za vezivanje za IL-17, IC50i/ili KDili koffvrednosti za vezivanje humanog IL-17.

[0086] Dalje, monoklonsko antitelo pronalaska je ono koje je kompetitivno inhibrano vezivanjem humanog IL-17 (ili njegovog dela koji sadrži DGNVDYH (SEQ ID BR: 276)) konkuretnod monoklonskog antitela gde konukrentno monoklonsko antitelo sadrži dva polipeptida sa amino kiselinskom sekvencom koja je prikazana u SEQ ID BRs: 241 (LCVR) i 118 (HCVR). Ova kompetitivna inhibicija između antitela može da se meri testiranjem poznatim u tehnici, npr., kompeticionim ELISA testom.

[0087] Poželjno, antitelo pronalaska koje se takmiči sa konkurentnim antitelom koje je prethodno definisano je dalje okarakterisano specifičnim vezivanjem humanom IL-17 ali ne i vezivanjem humanig IL-17B, IL-17C, IL-17D, IL-17E ili IL-17F. Dodato, antitelo je dalje oakrakterisano specifičnim vezivanjem humanog IL-17 i IL-17 cinomolgus majmuna ali ne i vezivanjem IL-17 pacova ili mišijeg IL-17 na niboima većim od roditeljskog šuma.

[0088] Bolje, antitelo pronalaska koje se takmiči za vezivanje za humani IL-17 sa konkurentnim antitelom, a sadrži amino kiselinske sekvence prikazane u SEQ ID BRs: 241 i 118 dalje je okarakterisano vezovanjem humanog IL-17 nelinearnog epitopa sa amino kiselinama DGNVDYH (SEQ ID BR: 276). Još bolje, antitelo pronalaska koje se takmiči za vezivanje za humani IL-17 sa konkurentnim antitelom sa amino kiselinskim sekvencema datim u SEQ ID BRs: 241 i 118 dodatno je okarakterisano sa a KDza humani IL-17 manjom od oko 7 pM, 6.5 pM ili 6 pM, poželjno manjom 5.5 pM, 5 pM ili 4.5 pM i najbilje, manjom od oko 4 pM i/ili okarakteirsano je sa IC50, poželjno u in vitro IL-8 reporter testu, koja je manja od 700 pM, 650 pM, 600 pM, 560 pM, 550 pM ili 500 pM, ili sa IC50u an in vitro GROα reporter testu manja od oko 560 pM, i/ili ima brzinu disocijacije (koff) za humani IL-17 manju od 5 x 10<-5>, 4 x 10<-5>, 3 x 10<-5>ili 2 x

10<-5>s<-1>.

[0089] U jednoj realizaciji, anti-IL-17 antitelo pronalaska ima varijablan region teškog lanca i varijabilni region lakog lanca, pri čemu teški lanac varijabilnog regiona sadrži CDR regione sa sledećim aminokiselinskim sekvencama: CDRH1 (SEQ ID BR: 244), CDRH2 (SEQ ID BR: 245), i CDRH3 (SEQ ID BR: 246); i/ili gde laki lanac varijablnog regiona sadrži CDR regione sa sledećim amino kiselinskim sekvencama: CDRL1 (SEQ ID BR: 247), CDRL2 (SEQ ID BR: 248) i CDRL3 (SEQ ID BR: 249). Poželjno, šest CDR antitela pronalaska postoje zajedno kao u Fab navedenom u Tabeli 1. Još bolje, teški lanci CDRS su u okviru sledećih okvira sekvenci: FR1 sa SEQ ID BR: 262, FR2 sa SEQ ID BR: 263, FR3 sa SEQ ID BR: 264 i FR4 sa SEQ ID BR: 265 i laki lanci CDR su u okviru sledećih okvira sekvenci: FR1 sa SEQ ID BR: 266, FR2 sa SEQ ID BR: 267, FR3 sa SEQ ID BR: 268 i FR4 sa SEQ ID BR: 269, pri čemu redosled od amino kraja je FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4.

[0090] Dalje je razmatrano da anti-IL-17 antitelo pronalaska obuhvata HCVR sa CDRH1 sa sekvencom odabranom iz grupe koju čine SEQ ID BRs: 11-28, i/ili CDRH2 sa sekvencom odabranom iz grupe koju čine SEQ ID BRs: 29-32, i/ili CDRH3 sa sekvencom sekvence odabranom iz grupe koju čine SEQ ID BRs: 33-55 i 261. U sledećoj realizaciji, anti-IL-17 antitelo pronalaskaobuhvata LCVR koji sadrži CDRL1 sa sekvencom odabranom iz grupe koju čine SEQ ID BRs: 122-149, i/ili CDRL2 sa sekvencom odabranom iz grupe koju čine SEQ ID BRs: 150-167, i/ili a CDRL3 sa sekvencom sekvence odabranom iz grupe koju čine SEQ ID BRs: 168-177. U poželjnoj realizaciji, anti-IL-17 antitelo pronalaska obuvhata HCVR koji sadrži CDRH1 sa sekvencom odabranom iz grupe koju čine SEQ ID BRs: 11-28, i/ili CDRH2 sa sekvencom odabranom iz grupe koju čine SEQ ID BRs: 29-32, i/ili a CDRH3 sa sekvencom odabranom iz grupe koju čine SEQ ID BRs: 33-55 and 261, i dlaje obuvhata LCVR koji sadrži CDRL1 sa sekvencom selected from the group consisting of SEQ ID BRs: 122-149, i/ili CDRL2 sa sekvencom odabranom iz grupe koju čine SEQ ID BRs: 150-167, i/ili CDRL3 sa sekvencom odabranom iz grupe koju čine SEQ ID BRs: 168-177.

[0091] Kompozicija koja sadrži CDR pronalaska će generalno biti antitelo sa sekvencom teškog ili lakog lanca ili njegov suštinskih deo, gde je CDR lociran da delu koji je konzistentan sa Kabat numeracijom. Tri regiona CDR za svki lanac, težak i lak, su data u okviru regiona kao kontrinuirani susedna/granična sekvenca data formulom: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4. Težak lanac ili laki lanac FR1, FR2, FR3 i FR4 se kombinuju tako da obrazuju potpun okvir regiona antitela kada su poređani kao u kontrinuiranoj sekvenci sa CDR po navedenom redosledu. Poželjno okviri regiona antitela pronalaska su humanog porekla ili u suštini humanog porekla (tj., više od 80, 82, 85, 87, 90,92, 95, 97%).

[0092] U humanizovanom antitelu u terapeutskoj primeni na ljudima, okvir sekvence je poželjno u potpunosti ili u suštini humanog porekla. Poželjno okvir regiona lakog lanca humanizovanog, humanog ili himernog antitela pronalaska obuhvata FR1 sa SEQ ID BR: 266, FR2 sa SEQ ID BR: 267, FR3 sa SEQ ID BR: 268 i FR4 sa SEQ ID BR: 269. Poželjno okvir regiona teškog lanca humanizovanog, humanog ili himernog antitela pronalaska obuhvata FR1 sa SEQ ID BR: 262, FR2 sa SEQ ID BR: 263, FR3 sa SEQ ID BR: 264, i FR4 sa SEQ ID BR: 265. Na primer, poželjna realizacija LCVR antitela 126 pronalaska, kao što je opisano u Tabelama 1, 2 i 3 obuhvata (polipeptide u redosledu od N-kraja) FR1 sa SEQ ID BR: 266, CDR1 sa SEQ ID BR: 131, FR2 sa SEQ ID BR: 267, CDR2 sa SEQ ID BR: 167, FR3 sa SEQ ID BR: 268, CDR3 sa SEQ ID BR: 168 i FR4 sa SEQ ID BR: 269. Poptuna sekvenca LCVR, operativno vezana za humani kapa konstantni region je kao što je prikazano u SEQ ID BR: 274. Dalje, poželjna realizacija HCVR antitela 126 pronalaska obuhvata (u redosledu od N-krajaa) FR1 sa SEQ ID BR: 262, CDR1 sa SEQ ID BR: 26, FR2 sa SEQ ID BR: 262, CDR2 sa SEQ ID BR: 30, FR3 sa SEQ ID BR: 264, CDR3 sa SEQ ID BR: 52 i FR4 sa SEQ ID BR: 265. Celokupna sekvenca HCVR, operativno vezana za humani IgG4Fc region je kao što je prikazano u SEQ ID BR: 273.

[0093] U jednoj realizaciji, anti-IL-17 antitelo pronalaska, gde je ceo ili deo varijablnog regiona ograničen datom sekvencom kao što je prikazano u SEQ ID BR (videti , npr., Tabele 1-3) je dalje okarakterisano kao himerno, humanizovano, ili potpuno humano antitelo ili njegov antigenvezujući deo koji antagonizuje ili neutralizuje bar jednu aktivnost in vivo ili in vitro humanog IL-17. IL-17 antitelo pronalaska, gde je ceo all deo varijablnog regiona ograničen datom sekvensom kao što je prikazano sa SEQ ID BR, dalje je okarakterisan specifičnim vezivanjem humanog IL-17 ali ne i vezivanjem humanog IL-17B, IL-17C, IL-17D, IL-17E ili IL-17F. Dodatno, antitelo je dalje okarakterisano specifičnim vezivanjem humanog IL-17 i IL-17 cinomolgus majmuna, ali ne i vezivanjem IL-17 pacova ili mišijeg IL-17 na nivoima većim od praga osnovnog šuma.

[0094] Bolje, ovo antitelo je dalje okarakterisano vezivanje humanog IL-17 nonlinearnog epitopa koji sadrži amino kisleine DGNVDYH (SEQ ID BR: 276) pri čemu antitelo pravi kontakt sa polipeptidom sa SEQ ID BR: 276. Još bolje, ovo antitelo je dalje okarkaterisano sa KDza humani IL-17 manju od 7 pM, 6.5 pM ili 6 pM, poželjno manju od 5.5 pM, 5 pM ili 4.5 pM i još bolje manje od oko 4 pM i/ili je okarakterisano sa IC50, poželjno u in vitro IL-8 reporter testu, i iznosi manje od 700 pM, 650 pM, 600 pM, 560 pM, 550 pM ili 500 pM, ili sa IC50u in vitro GROα reporter testu i iznosi manje od oko 560 pM, i/ili ima brzinu disocijacije (koff) za humani IL-17 manju od 5 x 10<-5>, 4 x 10<-5>, 3 x 10<-5>ili 2 x 10<-5>s<-1>.

Eksprimiranje antitela

[0095] Predmetni pronalazak je takođe usmeren na ćelijske linije koje eksiprimiraju anti-IL-17 monoklonsko antitelo pronalaska ili njegov deo. Dobijanje i izolovanje ćelijskih linija koje proizvode monoklonsko antitelo pronalaska može se postići primenom standardnih tehnika koje su pozante u tehnici. Poželjne ćelijske linje su: COS, CHO, SP2/0, NS0 i kvasca (dostupne od opštih depoa kao što je ATCC, American Type Culture Collection, Manassas, VA).

[0096] Može se koristiti širok opseg sistema za eksprimiranje antitela predmetnog pronalaska uključujući prokariotske i enukariotske siteme za eksprimiranje (kao što je kvasac, bakulovirus, biljka, ćelije sisara ili ćelije drugih životinja, transgenske životinje, i hibridoma ćelije), kao i sistemi eksprimiranja dispeja faga. Kao primer odgovarajućeg vektora ekspresije bakterijaje pUC119 i pogodan eukariotski ekspresioni vektor je modifikovan pcDNA3.1 vektor sa oslabljenim sismtenom selekcije dhfr. Drugi sistemi eksprimiranja antitela su takođe poznati u tehnici i ovde su razmatrani.

[0097] Antitelo pronalaska se može dobiti rekombinantnom ekpresijom gena lakih i teških lanaca imunoglobulina u ćeliji domaćinu. Za rekombinantno eksprimiranje antitela, ćelija domaćin je transformisana, transdukovana, inficirana ili slično jednim ili više rekombinantnih vekotra ekspresije koji nose fragmente DNK koji kodiraju lake i/ili teške lance antitela imunoglobulina tako da su laki i/ili teški lanci eksprimirani u ćeliji domaćinu. Teški lanci i laki lanci mogu da budu eksprimirani nezavisno od različitih promotora za koji su oni operativno vezani u jedan vektor ili, alternativelno, težak lanac i laki lanac mogu da budu eksprimirani nezavisno od drugih promotora za koji su operativno vezani u dva vektora – jedan koji eksprimira težak lanac i drugi koji eksprimira laki lanac. Po izboru, težak lanac i laki lanac mogu da budu eksprimirani u različitim ćelijama domaćina. Poželjno, rekombinantna antitela su odabrana u medijumu u kojem su gajene ćelije domaćina, od kojih se antitela mogu regenerisati ili prečistiti. Standardne rekombinantne metodologije DNK su upotrebljene za dobijanje gena antitela sa lakim i teškim lancem, inkorporiranje ovih gena u rekombinantne ekspresione vektore, u uvođenje vektora u ćelije domaćina. Ove standardne rekombinante DNK tehnologije su opisane, na primer, u Sambrook, Fritsch, and Maniatis (Eds.), Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989; Ausubel, et al (Eds.) Curent Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates, 1989.

[0098] Izolovana DNK koja kodira HCVR region može se konvertovati u gen cele dužine sa teškim lancem operativnim vezivanjem HCVR-kodirajuće DNK za drugi molekul DNK koji kodira konstante regione sa teškim lancem (CH1, CH2, i CH3). Sekvence konstantnog regiona humannog gena sa teškim lancem su pozante u tehnici. Videti, npr., Kabat, et al., Sekvences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No.91-3242 (1991). Fragmenti DNK koji obuhvataju ove regione mogu se dobiti npr., standardnom amplifikacijom PCR. Konstantni region sa teškim lancem može biti bilo kojeg tipa , (npr., IgG, IgA, IgE, IgM ili IgD), klase (npr., IgG1, IgG2, IgG3i IgG4) ili podklase konstantnog regiona ili njihova alotpna varijanta kao što je opisano u Kabat (supra). Alternativno, deo koji vezuje antigen (antigen vezivni deo) može da bude Fab fragment, Fab' fragment, F(ab')2fragment, Fd, ili jednolančani Fv fragment (scFv). Za Fab fragment gena sa teškim lancem, HCVR-kodirajuća DNK može operativno da bude vezana za drugi molekul DNK koji kodira samo težak lanac CH1 konstantnog regiona.

[0099] Izolovana DNK koja kodira LCVR region može da bude konvertovana u gen cele dužne lakog lanaca (kao i u Fab gen lakog lanca) operativnim vezivanjem LCVR-kodirajuće DNK za drugi molekul DNK koji kodira konstantan region CL lakog lanca. Sekvence gena konstantnog regiona lakog lanca su poznate u tehnici. Videti, npr., Kabat, supra. DNK fragmente koji obuhvataju ove regione moguće je dobiti standardnom PCR amplifikacijom. Konstantan region lakog lanca može da bude kapa ili lambda konstantan region.

[0100] Za dobijanje scFv gena, HCVR- i LCVR-kodirajući DNK fragmenti su operativno vezani za drugi fragment koji kodira fleksiblni linker, npr., kodirajuća amino kiselinska sekvenca (Gly4-Ser)3, kao što su HCVR i LCVR sekvence mogu se eksprimirati kao kontrinuirani jednolančani protein, sa LCVR i HCVR regionima povezanim fleksiblnim linkerom. Videti, npr., Bird, et al., Science 242:423-6, 1988; Huston, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-83, 1988;

McCafferty, et al., Nature 348:552-4, 1990.

[0101] U jednoj realizaciji, pronalazak obezbeđuje vektor, poželjno (ali ne i ogainičen na) plazmid, rekombinantni vektor ekspresije, vektor ekspresije kvasca, ili retroviralni ekspresioni vektor koji sadrži polinukleotid koji kodira anti-IL-17 monoklonsko antitelo pronalaska.

Alternativno, vektor pronalaska obuhvata polinukleotid koji kodira LCVR i/ili polinukleotid koji kodira HCVR pronalaska. Kada su i LCVR i HCVR kodirajuće sekvence encoding prisutne u istom vektoru, mogu se nezavisno transkribovati, svaki od posebnog promotora za koji su operativno vezani. Ako su sekvence koje kodiraju LCVR i HCVR prisutne u istom vektoru i transkribovane od jednog promotra za koji su ove operativno vezane, LCVR može da bude 5' za HCVR ili LCVR moež da bude 3' zaHCVR,dalje, LCVR i HCVR kodirajući region u vektoru može da bude odvojen linker sekvencom bilo koje veličine ili sastava, poželjno ovaj linker, kada je prisutan je takav da kodira polinukleotid na mestu ulaska unutrašneg ribozoma.

[0102] Za eksprimiranje antitela pronalaska, DNK koja kodira laki i/ili težak lanac parcijalan ili cele dužine, dobijena kao što je prethodno opisano, je umetnuta u ekspresioni vektor tako da je gen operativno vezan za transkripcione i translacione kontrolne sekvence. Ekspresioni vektor i ekspresione kontrolne sekvence su odabrane tako da budu kompativilne sa upotrebljenim ekspresionim ćelijama domaćina. Gen antitela sa lakim lancem i antitela sa teškim lancem se mogu umetnuti u odvojene vektore ili , bolje, oba gena su umetnuta u isti ekspresioni vektor. Geni antitela su umetnuti u ekspresioni vektor standardnim metodama. Dodatno, rekombinantni vektor ekspresije može da kodira signalni peptid koji sprovodi sekreciju teškog i/ili lakog lanca anti-IL-17 monoklonskog antitela iz ćelije domaćina. Gen lakog i/ili teškog lanca anti-IL-17 monoklonskog antitela se može klonirati u vektor tako da je signalni peptid operativno u okviru vezan za amino terminus lanca gena antitela. Signalni peptid može da bude imunoglobulin signalni peptid ili heterologi signalni peptid.

[0103] Pored gena antitela sa teškim i/ili lakim lancem rekombinantni ekspresioni vektor pronalaska sadrži regulatornu sekvencu koja kontroliše ekspresiju lanca antitela gena u ćeliji domaćina. Izraz "regulatorna sekvenca " obuhvata promotore, stimulatore i druge elemente koji kontrolišu ekspresiju (npr., signali poliadenilacije), po potrebi, koji kontrolišu transkripciju ili translaciju lanaca antitela gena. Dizajn eksresionog vektora, uključujući selekciju regulatornih sekvenci mogu da zavise od faktora kao što je odabir ćelije domaćina koji se transformiše, nivo ekspresije željenog proteina. Poželjne regulatorne sekvence za eksprimiranje sisarskih ćelija domaćina obuvhataju viralne elemente koji usmeravaju na visoke nivoe ekspresije proteina u ćelijama sisara, kao što su promotori i/ili stimulatori dobijeni od citomegalovirusa (CMV), Simian Virusa 40 (SV40), adenovirusa, (npr., galavni kasni promotor adenovirusa (AdMLP)) i polioma virusa.

[0104] Pored teškog i/ili lakog lanca gena i regulatornih sekvenci, rekombinantni ekspresioni vektori pronalaska mogu da sadrži i dodatne sekvence, kao što su sekvence koje regulišu replikaciju vektora u ćeliji domaćina (npr., poreklo replikacije) i jedan ili više selektivnih marker gena. Selektivni marker geni sprovode selekciju ćelija domaćina u koje je uvede vektor. Na primer, obično selektivni marker geni doprinose otpornosti na lekove, kao što je G418, higromicin, ili metotreksat, na ćeliji domaćina u koji je uveden vektor. Poželjni seketvini marker geni uključuju dihidrofolat redukraza (dhfr) gen (za upotrebu u dhfr-minus ćeliji domaćinu sa selekcijom/amplifikacijom metotreksata), neo gen (za G418 selekciju), i glutamin sintetazu (GS) u GS-negativnoj ćelijskoj liniji (kao što je NS0) za selekciju/amplifikaciju.

[0105] Za ekspresiju lakih /ili teških lanaca, ekspresioni vektor(i) koji kodiraju teške i/ili lake lance su uvedeni u ćeliju domaćina prema standardnim tehnikama npr., elektroporacijom, taloženjem kalcijum fosfata, transfekcijom DEAE-dekstrana, transdukcijom, infekcijom i sličnim. Iako je teorijski moguće eksprimirati antitela pronalaska u ili prokariotskim ili eukariotskim ćelijama domaćina, eukariotske ćelije su preferentnije, i još bolje sisarske ćelije domaćina, zato što ove ćelije verovatnije sakupljaju i sekretuju kada su presavijene na odgovarajući način i imunološki aktivno antitelo. Poželjne sisarske ćelije domaćina za eksprimiranje rekombinantnog antitela pronalaska obuhvataju: ćelije jajnika kinskog hrčka (engl.Chinese Hamster Ovary (CHO ćelije)) [uključujućoi dhfr minus CHO ćelije, opisane u Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-20, 1980, upotrebljene sa DHFR selektivnim markerom, npr., kao što je opisano u Kaufman and Sharp, J. Mol. Biol.159:601-21, 1982] NS0 mijeloma ćelije, COS ćelije, iSP2/0 ćelije. Kada su rekombinantni ekspresioni vektori koji kodiraju gene antitela uvedeni u sisarske ćelije domaćina, antitela su dobijena gejenjem ćelija domaćina u vremenskom periodu koje je dovoljno da omogući eksprimiranje antitela u ćeliji domaćinu ili, bolje, sekreciju antitela u podlogu u kojoj su gajene ćelije domaćina pod odgovarajućim uslovima poznatim u tehnici. Antitela se mogu regenerisati iz ćelija domaćina i/ili podloge primenom standardni postupaka prečišćavanja.

[0106] Ćelije domaćina se takođe mogu koristiti za dobianje delova, ili fragmenata intaktnog antitela, npr., Fab fragmenata ili scFv molekula tehnikama koje su uobičajene. Treba naglasiti da će prosečan stručnjak shvatiti da su varijacije prethodno opisanih procedura obuhvaćene obimom predmetnog pronalaska. Na primer, može da bude poželjno transfektovati ćeliju domaćina sa DNK koja kodira ili laki lanac ili teški lanac antitela predmetnog pronalaska.

Rekombinantna DNK tehnologija se može koristiti za uklanjanje nekih ili svih DNK koje kodiraju laki lanac i/ili težak lanac koji nije i obavezno za vezivanje za IL-17. Molekuli eksprimirani iz ovih nepotpunih molekula DNK su takođe obuhvaćeni antitelom pronalaska.

[0107] Pronalazak obezbeđuje ćeliju domaćina koja sadrži molekul nukleinske kiseline predmetnog pronalaska. Poželjno ćelija domaćina predmetnog pronalaska sadrži jedan ili više vektora ili konstrukata koji sadrže molekul nukleinske kiseline predmetnog pronalaska. Ćelija domaćin predmetnog pronalaska je ćelija u koju je uveden vektor pronalaska, gde dati vektor sadrži polinukleotid kodira LCVR antitela pronalaska i/ili polinukleotid koji kodira HCVR pronalaska. Pronalazak takođe obezbeđuje ćelije domaćina u koji su uvedana dva vektora pronalaska; jedan koji sadrži polinukleotid koji kodira LCVR antitela pronalaska i jedan koji sadrži polinukleotid koji kodira HCVR prisutan u antitelu pronalaska pri čemu je svaki operativno vezan za promotor sekvencu.Ćelije domaćina obuhvataju sisarske, bakterijske, biljne ćelije i ćelije kvasca. Poželjno ćelija domaćin je CHO ćelija, COS ćelija, SP2/0 ćelija, NS0 ćelija, ćelija kvasca ili derivat ili naslednici bilo kojeg poželjnog tipa ćelija.

[0108] U poželjnom sistemu za rekombinantnu ekspresiju antitela pronalaska, rekombinantni ekspresioni vektor koji kodira težak lanac antitela i lak lanac antitela je uveden u into dhfr-minus CHO ćelije pomoću npr., transfekcije koja je posredovana kalcijum fosfatom. U rekombinantni ekspresioni vektor, svaki od gena anteitela sa teškim i lakim lancem je operativno vezan za pojačivač/promotor regulatorne elemente (npr., izvedene od SV40, CMV, adenovirusa i slične, kao što je CMV pojačivač/AdMLP promotor regulatorni element ili SV40 pojačivač/AdMLP promoter regulatorni element) za vođenje visokih nivoa transkripcije gena. Rekombinantni ekspresioni vektor takođe nosi dhfr gen, što omogućava odabir CHO ćelije koja je transfektovana sa vektorom selekcijom/amplifikacijom metotreksatom. Odabrne transformante ćelije domaćina su gajene tako da eksprimiraju antitelo sa lekim i teškim lancem i intaktno antitelo je regenerisano iz podloge za gajenje. Standardne tehnike molekularne biologije su primenjene za dobijanje rekombinantnog ekspresionog vektora, transfekciju ćelija domaćina, odabir transformanata, gajenje ćelija domaćina i regeneraciju antitelo iz podloge za gajenje. Antitela, ili njegovi antigen-vezujući delovi, pronalaska mogu se eksprimirati kod životinje (npr., miš) koja je transgenska za gene humanog imunoglobilna (videti, npr., Taylor, et al., Nucleic Acids Res.20:6287-95, 1992).

[0109] Eksprimirana, intaktna antitela, njihovi dimeri, individualni laki i teški lanci, ili drugi oblici imunoglobulina predmetnog pronalaska mogu se prečistiti prema standardnim procedurama u tehnici, uključujući taloženje amonijum sulfatom, jono-izmenjivačku , afinitetnu, reversno faznu hromatografiju na koloni, hromatografiju na koloni sa hiodrofobnim interakcijama, gel elektroforezu i slične. Poželjni su u suštni čisti imunoglobulini od najmanje 90%, 92%, 94% ili 96% homogenosti, a bolje od 98 do 99% ili više homogenosti, za farmaceutsku upotrebu.

Jednom prečišćeni, delimično ili do željene homogenosti, peptiti se zatim mogu upotrebiti terapeutski ili profilaktički, kao što je ovde dato.

Himerno antitelo

[0110] Kao što je ovde korišćen, izraz "himerno antitelo" obuhvata monovalentne, divalentne ili polivalentne imunoglobuline. Monovalentno himerno antitelo je dimer obrazovan od himernog teškog lanca koji je preko disulfidnih mostova vezan za himerni laki lanac. Divalentno himerno antitelo je tetramer obrazovan od dva dimera teškog lanca-lakog lanca koji su povezani preko disulfidnih mostova.

[0111] Himerni teški lanac antitela obuhvata antigen-vezujući region izveden od teškog lanca ne-humanog antitela specifičnog za IL-17, koje je operativno vezano za najmanje jedan deo humanog, ili suštinski humanog (ili vrste koje se razlikuju od onog od kojeg je potiče antigenvezujući region), konstantnog regiona teškog lanca kao što je CH1 ili CH2, ili poželjno za konstantan region teškog lanca cele dužine. Himerni laki lanac antitela za upotrebu kod ljudi obuhvata antigen-vezujući region izveden od potpuno ili suštinski od lakog laca ne-humanog antitela specifičnog za IL-17, koji operativno vezan za bar jedan deo humanog, ili suštinski humanog (ili vrste koje se razlikuju od onog od kojeg je potiče antigen-vezujući region), konstanog regiona lakog lanca (CL), ili poželjno za konstantan region teškog lanca cele dužine. Antitela, fragmenti ili derivati sa himernim teškim lancima ili lakim lancima iste ili različite specifičnosti vezivanja varijablnog regiona, takođe se mogu dobiti odgovarajućom asocijacijom individualnih polipeptidnih lanaca, prema pozantim fazama postupka.

[0112] Sa ovim pristupom, himerni teški lanci koji eksprimiraju ćelije domaćina su posebno gajeni od domaćina koje eksprimiraju himerni laki lanci, i imunoglobulin laci su posebno regenerisani i zatim povezani. Alternativno, domaćini mogu da budu zajedno gajeni i lanci mogu da se asosuju spontano u podlozi za gajenje, nakon čega sledi regeneracija sastavljenog imunoglobulina ili fragmenta. Metode za dobijanje himernih antitela su poznati u tehnici (videti, npr., U.S. Patent Br.: 6,284,471; 5,807,715; 4,816,567; i 4,816,397).

Humanizovana antitela

[0113] Poželjno antitelo pronalaska koje se koristi u terapeutske svrhe, imaće sekvencu okvira ili konstantnog regiona (u meri u kojo postoji u antitelu) koji je izveden od sisara u koje se može koristiti kao terapeutik, tako da umanji mogućnost da će sisar zabraniti imunski odgovor na terapeutsko antitelo. Humanizovana antitela su od posebnog interesa budući da se smatraju od posebne važnosti za terapeutsku primenu i izbegavanje humanog anti-mišiji antitelo odgovora koji su često primećeni kod antitela glodara. Dodatno, u humanizovanim antitelima , efektorni deo antitela je humanog porekla tako da mogu da interaguju bolje sa ostalim delovima humanog imunskog sistema (npr., razoriti ciljane ćelije efikasnije komplement-zavisnom citotoksičnošću ili antitelo-zavisnom ćelijskom citotoksičnošću). Takođe, injektirana humanizova antitela mogu da imaju polu život više kao kod humanih natitela koja se prirodno javljaju nego što imaju npr., antitela miša, omogućavajući na taj način smanje i češće doziranje. Izraz "humanizovano antitelo" kao što je vode korišćen odnosi se na antitelo koje sadrži delove antitela različitog porekla, pri čemu je najmanje jedan deo humanog porekla. Na primer, humanizovano antitelo može da sadrži delove izvedene od antitela nehumanog porekla sa traženom specifičnošću, kao što je mišije, i od antitela humanog porekla, koji su hemijski zajedno spojeni uobičajenim tehnikama (npr., sintetički) ili dobijeno kao kontrinuirani polipeptid primenom tehnika genetskog inženjeringa.

[0114] Poželjno, "humanizovano antitelo" ima CDRs koji potiče (ili suštinski potiče) od nehumanog antitela (poželjno mišijeg monoklonskog antitela) dok okvir i konstantni region, u meri u kojo je prisutan, (ili njegov značajni ili suštinski deo, tj., najmanje oko 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99%) u kodirani informacijom sekvence nunukelinskih kiselina koja se odvija u regionu imunoglobulina humanih klicinih ćelijskih linija (germinativnih ćelija) (videti, npr., International ImMunoGeneTics Database) ili u njihovim rekombinovanim ili mutiranim oblicima bilo da su data antitela proizvodena u humanim ćelijama ili ne.

[0115] CDR humanizovanog antitela mogu da budu izmenjeno ili optimizovani od CDRa nehumanog roditeljskog antitela od kojeg potiču tako da se dobijaju željene osobine, npr., specifičnost, afinitet i/ili preferencijalno vezivanje. Izmenjeni ili optimizovani CDR mogu da poseduju supstitucije, adicije i/ili delecije amino kiselina u odnosu na osnovne CDRe, poželjno oko 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10 ukupno unutar šest CDR domena. Na primer, položaji amino kiselina u CDRs koje su podvučene i napisana polu -crnim slovima u Tabelama 2 i 3 su položaji koji su izmenjeni u odnosu na CDRs kao što je dato u Fab 1 u Tabelaa 2 i 3. Alternativno mišije antitelo 2321 može da bude roditeljsko antitelo za poređenje CDRs antitela pronalaska.

[0116] Humanizovani oblici ne-humanpg (npr., mišijeg ) antitela obuhvataju intaktno antitelo, suštinski intaktni antiteloseo antitela koje sadrži mesto vezivanja antigena (antigen-vezujuće mesto), ili deo antitela koji sadrži Fab fragment, Fab' fragment, F(ab')2, ili jednolančani Fv fragment. Humanizovana antitela poželjno sadrže minimalnu sekvencu nastalu od ne-humanog imunoglobulina. Humanizovana antitela takođe mogu da sadrže ostatke koji su nisu nađeni ni kod recipijenata antitela niti u uvezenim sekvencama CDR ili okvirnim. Generalno, humanizovano antitelo će obuhvatiti u suštini sve od najmanje jednog, i obično dva, varijablna domena, u kojima sve ili u suštini sve amino kseline u CDR regionim odgovaraju onim nehumanog imunoglobulina i sve ili u suštini amino kiseline u FR regionima su one koje pripadaju humanim imunoglobulin konsenzus sekvence. Humanizovano antitelo optimalno sadrži najmanje deo konstantnog regiona (Fc) imunoglobulina obično humanog imunoglobulina.

[Jones et al., Nature, 321:522-525, 1986; Riechmann et al., Nature, 332:323-329, 1988; and Presta, Cur. Op. Struct. Biol., 2:593-596, 1992.]

[0117] Humanizovana antitela mogu se podvrgnuti in vitro mutagenezi primeno uobičajenih metoda (ili, kada se koriste životinjska transgenska antitela za humane Ig sekvence, in vivo somatskoj mutagenezo) i shodno tome okvir regiona amino kiselinskih sekvenci HCVR i LCVR regiona humanizovanih rekombinantnih antitela su sekvence koje, iako dobijene od onih koje su povezane sa HCVR i LCVR sekvencama humanih germinativnih ćelija , ne moraju da prirodno postoje u repertoaru germinativnih humanih antitela in vivo. Razmatrano je da ove amino kiselinske sekvence okvira HCVR i LCVR regiona humanizovanog rekombinantnog antitela su bar 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 98% ili najbolje 99% identične humanoj germinativnoj sekvenci. Poželjno, ovi okviri ostatka roditeljskog antitela (npr., mišije antitelo ili generalno antitelo iz kojeg je izvedeno humanizovano antitelo) koje održava ili utiče na struktre kombinovag mesta, će biti sačuvani . Ovi ostaci mogu da budu identifikovani npr., rengdenskom kristalografijom roditeljskog antitela ili Fab fragmenta, određujući tako trodiumenszionalnu strukuturu antigenvezujućeg mesta. Jedna taktika za humanizaciju antitela je odabrati germinativnu humanu sekvencu koja ima najveću homologiju sa okvirom roditeljskog antitela budući da okvir prima donor CDRs. Ovaj pristup je baziran na istoj logici kao taktika najboljeg fitovanja (engl.best-fit strategy), Sali su u bazi podataka pretražene samo germinativne sekvence.

[0118] Humanizovano antitelo predmetnog pronalwska može da sadrži ili da bude izvedeno od okvira humanog germinativnog lakog lanca . U posebnoj realizaciji, sekvenca germinativnog lakog lanca je odabrana od humanih VK seknveci uključujući, but ali ne i ograničvajući se na, A1, A10, A11, A14, A17, A18, A19, A2, A20, A23, A26, A27, A3, A30, A5, A7, B2, B3, L1, L10, L11, L12, L14, L15, L16, L18, L19, L2, L20, L22, L23, L24, L25, L4/18a, L5, L6, L8, L9, O1, O11, O12, O14, O18, O2, O4, i 08. In U određenim realizacijama, ovaj laki lanac okvira humanih germinativnih linija je odabran od V1-11, V1-13, V1-16, V1-17, V1-18, V1-19, V1-2, V1-20, V1-22, V1-3, V1-4, V1-5, V1-7, V1-9, V2-1, V2-11, V2-13, V2-14, V2-15, V2-17, V2-19, V2-6, V2-7, V2-8, V3-2, V3-3, V3-4, V4-1, V4-2, V4-3, V4-4, V4-6, V5-1, V5-2, V5-4, i V5-6.

[0119] U ostalim realizacijama, humanizovano antitelo predmetnog pronalska može da sadrži ili da bude izvedeno od okvira germinativnog humanog teškog lanca. U posebnim realizacijama, ovaj okvir germinativnog humanog teškog lanca je odabran od VH1-18, VH1-2, VH1-24, VH1-3, VH1-45, VH1-46, VH1-58, VH1-69, VH1-8, VH2-26, VH2-5, VH2-70, VH3-11, VH3-13, VH3-15, VH3-16, VH3-20, VH3-21, VH3-23, VH3-30, VH3-33, VH3-35, VH3-38, VH3-43, VH3-48, VH3-49, VH3-53, VH3-64, VH3-66, VH3-7, VH3-72, VH3-73, VH3-74, VH3-9, VH4-28, VH4-31, VH4-34, VH4-39, VH4-4, VH4-59, VH4-61, VH5-51, VH6-1, i VH7-81. Videti PCT WO 2005/005604 za opis različitih germinativnih sekvenci.

[0120] U posebnim realizacijama, lakil lanac varijabilnog regiona i/ili težak lanac varijabilnog regiona obuhvata(ju) okvir regiona ili bar deo okvira region (npr., sadrži 2 ili 3 subregiona, kao što je FR2 i FR3). U određenim realizacijama, bar FRL1, FRL2, FRL3, ili FRL4 je potpuno human. U ostalim realizacijama, bar FRH1, FRH2, FRH3, ili FRH4 je potpuno human. U nekim realizacijama, bar FRL1, FRL2, FRL3, ili FRL4 je sekvenca germlinativna sekvenca (npr., humana germinativna ćelijska linija) ili sadrži humane konsenzus sekvence za dati okvir. U ostalim realizacijama, bar FRH1, FRH2, FRH3, ili FRH4 je germinativna sekvenca (npr., humana germinativna ćelijska linija) ili sadrži humane konsenzus sekvence za dati okvir. U poželjnim realizacijama, svaki region okvira je okvir humanog regiona.

[0121] Generalno, humanizovana antitela mogu se proizvesti tako što se dobiju sekvence nukelinskih kiselina koje kodiraju HCVR i LCVR antitela, npr., a mišijeg antitela ili antitela dobijenog pomoću hibridoma, koji vezuje IL-17 epitop pronalaska, identifikući tako CDR u datim HCVR i LCVR (nehumani), i graftovanje ovih CDR-kodirajućih sekvenci nukleinskih kiselina u odabrane humane okvir –kodirajuće sekvence nukleinskih kiselina. Po izboru, CDR region može da bude optimizovan nasumičnom mutagenizom ili na određenim mestima da bi se susptituisala jedna ili više amino kiselina u CDR sa različitim amino kiselinima pre graftovanja CDR regiona o okvir regiona. Alternativno, CDR region može da bude optimizovan posle umetanja (insercije) u okvir humanog regiona pomoću metoda koje su dotupne prosečnom stručnjaku. Poželjno, sekvence amino kiselina humanog okvira su odabrane tako da je rezultujuće antitelo pogodno za in vivo administraciju kod ljudi. Ovo se može odrediti, npr., na osnovu prethodne primene antitela koa sadrže ovakav okcir humane sekvence. Poželjno, okvir humane sekvence neće biti sâm značajno imunogen.

[0122] Alternativno, sekvence amino kiselina okvira antitela da postane humanizovano mogu se porediti sa poznatim sekvencama humanih okvira koje se koriste za CDR-grafting i koje su odabrane na osnovu njihovih sekvenci koje su veoma slične sekvencama roditeljskog antitela, npr., mišije antitelo koje vezuje IL-17 (npr., antitelo koje sadrži HCVR sa SEQ ID BR: 270 i dodatno sadrži LCVR sa SEQ ID BR: 271). Brojne skevence humanih okvira su izolovane i njihoe sekvence objavljene u tehnici. Ovo povećava verovatnoću da rezultatno CDR-graftovano humanizovano antitelo, koje sadrži CDRs roditelja (npr., miša) ili optimizovane CDRs roditeljskog antitela graftovano u odabrane humane okvire čitanja (i moguće takođe humani konstantni region) će suštinski zadržati antigen vezujuću strukturu i na taj način zadržati vezivni afinitet roditeljskog antitela. Da bi se u značajnoj meri zadržao antigen vezujući afinitet, odabrani regioni humanih okvira će poželjno biti oni za koje se očekuje da budu pogodni za in vivo administraciju, tj., ne imunogeni.

[0123] U jednoj od metoda, dobijena je DNK sekvenca koja kodira HCVR i LCVR regione poželjno mišijeg anti-IL-17 antitela. Metode za kloniranje nukleinskih kiselina koje kodiraju imunoglobuline su poznati u stanju tehnike. Ove metode mogu, na primer, da obuhvate amplifikaciju imunoglobulin-kodirajućih sekvenci za klonirnaje primenom odgovarajućih prajmera polimeraznom lančanom reakcijom (PCR). Prajemri koji su pogodni za amplifikaciju sekvenci nukleinskih kiselina imunoglobulina, a posebno mišijih HCVR i LCVR sekvencei su objavljeni u literaturi. Posle kloniranja ovih imunoglobulin-kodirajućih sekvenci, to su sekvence sekvence prema metodama koje su pozante u tehnici.

[0124] Nakon što su CDR-kodirajuće sekvence graftovane u odabrane human okvir-kodirajuće sekvence, rezultantne DNK sekvence koje kodiraju "humanizovane" varijabilne sekvence teškog i lakog lanca su zatim eksprimirane tako da se stvara humanizovan Fv ili humanizovano antitelo koje vezuje IL-17. Humanizovani HCVR i LCVR mogu da budu eksprimirani kao deo celog molekula anti-IL-17 antitela, tj., kao fuzioni protein sa sekvencama konstantnog humanog domena čine kodirajuće DNK sekvence su dobijene iz komercijano dostupnih biblioteka ili koje su dobijene primenom, npr., jedne od prethodno opisanih metoda za dobijanje DNK sekvenci, ili koje su poznate u tehnici. Međutim, HCVR i LCVR sekvence se takođe mogu eksprimirati u odsustvu konstantnih sekvenci pri čemu se dobijaju humanizovana anti-IL-17 Fv. Ipak, fuzija konstatnih humanih sekvenci na varjiablni region je potencijalno poželjna zbog toga što rezultantna humanizovana anti-IL-17antitela mogu da imaju humane efektorske funkcije.

[0125] Metode za sintezu DNK kodirajućeg proteina poznate sekvence su dobro poznate u tehnici. Primenom ovih metoa, DNK sekvence koje kodiraju date humanizovane HCVR and LCVR sekvence (sa ili bez konstantnih regiona) su sintetisane, i zatim eksprimirane u sistemu vektora pogodnim za eksprimiranje rekombinantnih antitela. Ovo se može izvesti u bilo kom sistemu vektora koji obezbeđuje da se date humanizovane HCVR i LCVR sekvence eksprimiraju kao fuzioni protein sa humanim konstatnim domen sekvencama i povezuju tako da se dobijaju funkcionalna (antigen vezujuća) antitela ili fragmenti antitela.

[0126] Skevence konstanog humanog domena su poznate u tehnici i objaveljene su u literaturi. Poželjne konstantne sekvence lakog lanca obuhvataju kapa i lambda konstantne sekvence lakog lanca. Poželjne konstantne sekvence teškog lanca obuhvataju humani IgG1, humani IgG2, humani IgG3, humani IgG4(videti, npr., SEQ ID brs: 257-260 respektivno) i njihove mutirane varijante koje obezbeđuju izmenjenu efektorsku funkciju, npr., veći in vivo polu-život, smanjeno Fc receptorsko vezivanje, izmenjenprofil deamidacije i slično.

[0127] Ukoliko su prisutni, regioni humanog okvira su poželjno dobijeni od varijabilnog reiona humanog antitela koji ima sekvencu sličnu onoj koja čini analogni ili ekvivalentni region antigen vezujućeg region donora (tj., roditeljsko antitelo). Ostali izvori okviri regioni za delove humanog porekla humanizovanog antitela uključuju humane varijablne konsenzus sekvenci (videti npr., Kettleborough, C.A. et al. Protein Engineering 4:773-783 (1991); Carter et al., WO 94/04679. Na primer, sekvence antitela ili varijablnih regiona koje su upotrebljene za dobijanje nehumanog dela mogu se porediti sa humanim sekvencama kao što je opisano u Kabat et al. Sekvences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH, U.S. Government Printing Office (1991). U posebno poželjnoj realizaciji, lanci okvira regiona humanizovanih antitela su izvedeni od humanih varijablnih regiona sa oko 60% indentičnim sekvencama, poželjno najmanje oko 70%, 80%, ili 90% indentičnim sekvencama i još bolje najmanje oko 85% indentičnim sekvencama, varijabilnog regiona nehumanog donora. Humani deo takođe može da bude izveden od humanog antitela sa najmanje oko 65% indentičnim sekvencama, a poželjno najmanje oko 70% indentičnim sekvencama, unutar datog dela (npr., FR) koji je upotrebljen, u odnosu na ekvivalentan deo (npr., FR) ne-humanog donora.

[0128] Reference dalje opisuju metode obuhvaćene humanizacijom mišijeg antitela koje mogu biti primenjen, kao npr., Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:2869, 1991; U.S. Pat. No.

5,693,761; U.S. Pat. No.4,816,397; U.S. Pat. No.5,225,539; computer programs ABMOD and ENCAD as described in Levitt, M.,J. Mol. Biol.168:595-620, 1983; humanization can be essentially performed following the method of Winter and coworkers (Jones et al., Nature, 321:522-525, 1986; Riechmann et al., Nature, 332:323-327, 1988; Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536, 1988).

Humana Antitela

[0129] Kao alternativa humanizaciji, humana antitela se mogu dobiti. Human antitela se mogu proizvesti primenom različitih tehnika koje su pozante u tehnici, uključujući biblioteku displeja faga (Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227:381, 1991; Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581, 1991). Tehnike koje su primenili Cole et al. and Boerner et al. su takođe dostupne za dobijanje humanih monoklonalih antitela (Cole et al., Monoklonal Antitela and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p.77 (1985) and Boerner et al., J. Immunol., 147:86-95, 1991). Slično, humana antitela se mogu dobiti uvođenjem humanih lokusa imunoglobulina u transgenskim životinjama, npr., miševima čiji su endogeni imunoglobulinski geni delimično ili u celosti inaktivirani. Posle imunskizacije, npr., sa antigenom koji sadrži imunogeni epitop pronalaska, dobijen je pun repertoar proizvodnje humanih antitela, koji liči na ona viđen kod ljudi u svakom smislu, uključujući preuređivanje gena, skapanje i repertoar antitela. Ovaj pristup je opisan, na primer, u U.S. Pat. Nos.5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,589,369; 5,591,669; 5,625,126; 5,633,425; 5,661,016, i u sledećim naučnim publikacijama: Marks et al., BioTechnology 10:779-783, 1992; Lonberg et al., Nature 368: 856-859, 1994; Morison, Nature 368: 812-13, 1994; Fishwild et al., Nature Biotechnology 14:845-51, 1996; Neuberger, Nature Biotechnology 14: 826 (1996);

Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol.13: 65-93 (1995) and Jobkobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551, 1993.

[0130] Humani imunoglobulinski geni koji su uvedeni u miša, stvarajući tako transgenske miševe koji mogu da odgovaraju na antigene antitelima sa humanim sekvencama su takođe opisani u Bruggemann et al. (Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 86:6709-6713, 1989). Postoji nekoliko strategija koje stvaranje sisara koji mogu da proizvedu humana antitela. Posebno, postoji i pristup "minilokus" u kojem je egzogeni Ig lokus opona[an kroz inkluziju delova (npr., individual genes) from the Ig locus (videti, npr., U.S. Pat. NOs.5,545,807, 5,545,806, 5,625,825, 5,625,126, 5,633,425, 5,661,016, 5,770,429, 5,789,650, and 5,814,318, 5,612,205, 5,721,367, 5,789,215), YAC uvodi velike i suštinski fragmente klicinih ćelijskih linija lokusa Ig (Videti Mendez et al. Nature Genetics 15:146-156, 1997; Green and Jakobovits J. Exp. Med.188:483-495, 1998), i uvodi cele ili suštinski cele lokuse preko primene fuzije mikroćelija (videti evropsku patentnu prijavu br. EP 0843961 A1).

[0131] Bilo koji transgenski miš koji može da odgovori na imunskizaciju sa antitelima sa humanim sekvencama mogu se upotrebiti za dobijanje anti-IL-17 antitela pronalaska kad se koriste metode dostupne u tehnici, npr., kada je miš imunskizovan sa polipeptidom koji sadrži imunogenski epitop pronalaska.

Upotrebe

[0132] Antitela predmetnog pronalaska su korsina u terapeutske, profilaktičke, dijagnostičke i istraživačke svrhe kao što je ovde opisano. Antitelo pronalaska se može upotrebiti za dijagnozu poremećaja ili bolesti povezanih sa eksprimiranjem humanog IL-17. Na sličan način, antitelo pronalaska se može upotrebiti u analazi praćenja nivoa IL-17 kod subjekta koji je testiran na stanje povezano sa IL-17. Primena u istraživanjima obuhvata metode koje koriste antitelo pronalaska i oznaku za detekciju IL-17 u uzorku, npr., u tečnostima tela čoveka ili u ekstraktima ćelija ili tkivima. Antitela pronalaska se mogu upotrebiti sa ili bez modifikacije, i obeležena su kovalentnom ili nekovalentnom vezom grupe koja se može detektovati. Grupa koja se može detektovati može biti bilo koja koaj može da proizvede, bilo direktno ili indirektno, detektujući signal. Na primer, grupa koja se može detektovati može da bude radioizotop kao što je, npr.,<3>H,<14>C,<32>P,<35>S, ili<125>I, a fluorescent ili chemiluminescent compound, such as fluorescein izotiocijanat, rodamin, ili luciferin; ili enzim, kao što je alkalna fosfataza, beta-galaktozidaza, ili peroskidaza iz rena. Može se primeniti bilo koja metoda u tehnici za odvojenu konjugaciju antitela za grupu koja se može detektovati, uključujući i one koje su opisali Hunter, et al., Nature 144:945, 1962; David, et al., Biochemistry 13: 1014, 1974; Pain, et al., J. Immunol. Meth.40: 219, 1981; and Nygren, J. Histochem. and Cytochem.30: 407, 1982.

[0133] Različiti uobičajeni protokoli za merenje IL-17, uključujući npr., ELISAs, RIAs, i FACS, su poznati u tehnici i obezbeđuju osnovu za dijagnozu izmenjenih ili abnormalnih nivoa eksprimiranja IL-17. Normalne ili standardne vrednosti eksprimiranja su utvrđene primenom tehnika koje su poznate u tehnici, npr., kombinovanjem uzorka koji sadrži IL-17 polipeptid sa, npr., antitelom pod uslovima koji su pogodni za formiranje kompleksa antigen:antitelo. Antitelo je direktno ili indirektno ozbleženo supstancom koja se može detektovati da bi se omogućila detekcija vezanog ili nevezanog antitela. Pogodne supstance koje se mogu detektovati obuhvataju različite enzime, prostetičke grupe, fluorescentne materijale, luminescentne materijale i radioaktivne materijale. Primeri pogodnih anzima obuhvataju peroksidazu iz rena, alkalnu fosfatazu, β-galaktozidazu, ili acetilholinesterazu; primeri odgovarajućih kompleksa prostetičkih grupa uključuju streptavidin/biotin i avidin/biotin; primeri odgovarajućih fluorescentnih materijala uključuju umbelliferon, fluorescein, fluorescein izotiocijanat, rodamin, dihlortriazinilamin fluorescein, dansil hlorid ili fikoeritrin; primer luminescentnog materijala uključuje luminol; i primeri radioaktivnih materijala uključuju<125>I,<131>I,<35>S, ili<3>H. (Videti, npr., Zola, Monoklonal Antitela: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc. (1987)).Količina obrazovanog standardnog kompleksa je kvantifikovan različitim metodama, kao što je, npr., fotometrijska metoda. Količine IL-17 polipeptida eksprimirane u uzorcima su zatim poređene sa standardni vrednostima.

[0134] Iz praktičnih razloga, antitelo predmetnog pronalaska može da bude u kompletu, upakovana kombinacija reagenasa u prethodno odmerenim količinama sa instrukcijama za izvođenje dijagnostičkog testa. Kada je antitelo obeleženo enzimom, komplet će da sadrži supstrate i kofaktore potrebne za enzim (npr., odgovarjaući prekursor substrata koji obezbeđuje hromofore ili fluorofore koje se mogu detektovati). Dodatno, mogu da budu dodati i ostali aditivi kao što su stabilizatori, puferi (npr., puferi za blokiranje ili puferi za lizu) i slično. Relativne količine različitih reagenasa mogu veoma da variraju da b se obezbedile odgovarajuće koncentracije reagenasa u rastvoru koji su suštini optimizuju osetljivost testa. Posebno, reagensi mogu da budu u obliku suvih prahova, obično liofizirani, uključujući eksipijense nakon čijeg rastvaranja se dobija rastvor odgovarajuće koncentracije.

Terapeutske primene antitela

[0135] IL-17 je pro-inflamatorni citokin koji sekretuju aktivirane T ćelije na mestima inflamacije, a ne u sistemskoj cirkulaciji; nije ga jednostavno detektovati u serumu ili tkivima zdrave osobe. IL-17 reguliše naviše (uzvodno) adheziju molekula, obuhvata proizvodnju višestrukih inflamatornih citokina i hemokina od različitih tipova ćelija uključujći sinoviocite, hondrocite, fibroblaste, endotelne ćelije, epitelne ćelije, indukujući tako angažovanje neutrofila na mestu inflamacije, stimuliše proizvodnju prostaglandina i metaloproteinaza, i inhibira sintezu proteoglikana synthesis. Dalje, IL-17 igra važnu ulogu u maturaciji hematopoeznih progenitornih ćelija. IL-17 ima signalnu ulogu u različitim organima i tkivima uključujući pluća, artikularnu hrskavicu, kosti, mozak, hematopoezne ćelije, bubrege, kožu i creva. IL-17 deli homologiju od 15-27% amino kiselina sa IL-17 B, C i E i homologiju od 44-50% amino kiselina sa IL-17 D i F. IL-17 se vezuje za receptor IL-17 sa malim afinitetom (oko 1 nM), dok se ostali članovi IL-17 familje ne vezuju za receptor IL-17.

[0136] Povećani nivoi IL-17 (i.e., IL-17A) su povezani sa određenim stanjima uključujući inflamaciju disajnih puteva, RA, osteoartritis, eroziju kostiju, intraperitonealne abscese i adhezije, IBD, odbacivanje alografta, psorijazu, određene tipove kancera, angiogenezu, aterosklerozu i MS. IL-17 i IL-17R su uzvodno regulisani u sinovialnim tkivima pacijenata sa RA. IL-17 ispoljava svoju ulogu u patogenezi RA korz IL-1-β i TNF-α zavisne ili nezavisne puteve. IL-17 stimuliše sekreciju ostalih citokina i hemokina, npr., TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-8 i Gro-α. IL-17 direktno doprinosi napredovanju bolesti u RA. Injektiranjem IL-17 u koleno miša proizvodi destrukciju zgloba nezavisno od aktivnosti IL-1β (Ann. Rheum. Dis.59:529-32, 2000). Anti-IL-1β antitelo nema efekat na inflamaciju indukovanu sa IL-17 i oštećenje zgloba (J. Immunol.

167:1004-1013, 2001). U mišijem modelu SCW-indukovanog artritisa, IL-17 indukovana infiltracija inflamatornih ćelija i gubitak (deplecija) proteoglikana u divljem tipu i IL-1β knock out i TNF-α knock out miša. Il-17 knock out miša su fenotipno normalni u odsustvu antigenskog izazova, ali su primetno umanjili artritis posle imunskizacije tip II kolagenom (J. Immunol.

171:6173-6177,2003).

[0137] Multipla skleroza ("MS") je autoimuna bolest okarakterisana inflamacijom centralnog nervnog sistema ("CNS") sa oštećenjem mijelinskih omotača kojim su obavijeni aksoni.

Obeležje MS je to da T ćelije infiltriraju u CNS. MS pogađa više od 350,000 osoba u U.S. i 2.5 milliona širom sveta. Postoji u više oblika i najčešće je to relaps/remitirajuća bolest (engl relapsing/remitting disease , RMS) nakon čega sledi sekundarni progresivni stadijum. Trenutnu terapiju čine Interferon-β (AVONEX, BETASERON i REBIF) koji smanjuje povratal/pogoršanje brzine za 31%-34%, ali imože da izazove simptome karakteristične za grupu i/ili sintezu neutralizujućih antitela (npr., oko 15% pacijenata koji primaju AVONEX proizvodi neutrališuća antitela za 18 meseci. TYSABRI, koji je FDA odobrila za RMS je naknadno uklonjen sa tržišta zbog problema imunosupresije CNS. I dalje postoji medicinska potreba za tretmanom MS. mRNK IL-17 je povećana u MS lezijama i u mononuklearnim ćelijama (MNC) u krvi i cerebrospinalnoj tečnosti kod pacijenata sa MS. Povišen broj IL-17 mRNK-eskprimirajućih MNC u krvi je detektovan tokom MS kliničkog pogoršanja u odnosu na remisiju (Multiple Sclerosis, 5:101-104, 1999). Dalje, eksperimentalni autoimunski encefalomijelitis ("EAE"), preklinički životinjsi model za MS je značajno potisnu kod IL-17 knockout miševa.

[0138] Shodno ovom, farmaceutska kompozicija koja sadrži anti-IL-17 monoklonsko antitelo pronalaska može da bude korisna za lečenje ili prevenciju stanja u kojima prisustvo IL-17 uzrokuje ili doprinosi neželjenom patološkim efektima ili smanjenje aktivnosti IL-17 ima terapeutski benefit kod sisara, poželjno ljudi, uključujući, ali ne i ograničavajući se na, inflamaciju disajnih puteva, astmu, RA, osteoartritis, eroziju kostiju, intraperitonealne abscese i adhezije, IBD, odbacivanje alografta, psorijazu, određen tipove kancera, angiogenezu, aterosklerozu i MS, kao i druge inflamatorme poremećaje, stanja, bolesti ili oboljenja uključujući bez ograničenja: eritematozu, odgovor na izlaganje alergenu, Helicobacter pylori povezan sa gastritisom, bronhijalnu astmu, i odbacivanje alografta (npr., renalno), sisptemski eritematozni lupus i lupus nefritis. Ovde je razmatrana upotreba anti-IL-17 monoklonskog antitela predmetnog pronalaska za lečenje ili prevenciju bar jedne od prethodno navedenih poremećaja u kojima je aktivnost IL-17 štetna ili koja doprinosi smanjenju nivoa bioaktivnog IL-17. Dodatno, razmatarana je upotreba anti-IL-17 monoklonskog antitela predmetnog pronalaska za uptorebu u proizvodnji leka za lečenje najmanje jednog od prethodno navedenih poremećaja.

[0139] Kao što su ovde korišćeni, izrazi "tretman", "tretiranje/ lečenje", i slični, odnose se na postizanje željenog farmakološkog i/ili fiziološkog efekta. Efekat može da bude profilaktički u smislu potpune ili delimične prevenciije bolesti ili njenih simporma i/ili može da bude terapeutski u smislu delimičnog ili potpunog izlečenja od bolesti i/ili štetnih efekata koji doprinose bolesti. "Tretman", kao što je ovde upotrebljen, obuvhata administraciju jedinjenja predmetnog pronalaska za lečenje od bolesti ili stanja kod sisara, naročito kod ljudi, i obuhvata: (a) prevenciju bolesti koje se javljju kod subjekta koji može biti sklon bolesti ali još nije diagnostikovana bolest; (b) inhibiranje bolesti, tj., zaustavljanje razvoja; i (c) ublažavanja bolesti, tj., izazivanje regresije bolesti ili poremećaja ili ublažavanje simptoma ili njihovih komplikacija. Dozni režim se može podesiti tako da obezbedi optimalnu željenu dozu (npr., terapeutski ili profilaktički odgovor). Na primer, može da bude administriran individualni bolus, nekoliko podeljenih doza može da bude administrirano tokom vremena ili doza može da bude proprcionalno smanjena ili povećana što je indikovano potrebama terapeutske situacije.

Farmaceutska kompozicija

[0140] Antitelo pronalaska se može inkroporirati u farmaceutske kompozicije pogodne za administraciju subjektu (videti, npr., Primer 14). Jedinjena pronalaska mogu se administrirati sâma ili u kombinaciji sa farmaceutski prihvatljivim nosačem, diluentom, i/ili eksipijensom, u jednoj ili više podeljenih doza. Farmaceutske kompozicije za administraciju su dizajnirane tako da su pogodne za odabrani način administracije, i farmaceutski prihvatljiv diluent, nosač , i/ili eksipijensa kao što su: dispergujući agensi, puferi, površinski aktivna sredstva (surfaktanti), konzervansi, agensi za rastvaranje, izotonični agensi, stabilizatori i slično su upotrebljeni po potrebi (videti, npr., Primer 14 u ovom tekstu). Date kompozicije su dizajnirane u skladu sa uobičajenim tehnikama kao u npr., Remington The Science and Practice of Pharmacy, 19th Edition, Gennaro, Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA 1995 koji daje pregled tehnika formulacija koje su opšte poznate prosečnom stručnjaku.

[0141] Farmaceutska kompozicija sadrži anti-IL-17 monoklonsko antitelo predmetnog pronalaska može se administrirati subjektu koji je pod rizikom od ili pokazuje patologije kao što je ovde opisano primenom standardnih tehnika administracije uključujući oralnu, intravensku, intraperitonealnu, subkutanu, pulmonarnu, transdermalnu, intramuskularnu, intranazalnu, bukalnu, sublingvalnu ili supozitornu administraciju.

[0142] A Farmaceutska kompozicija pronalaska poželjno je "terapeutski efikasna (delotvorna) količina " ili "profilaktički efikasna količina " antitela pronalaska. "Terapeutski efikasna količina " se odnosi na količinu koja je efikasna, u dozama i tokom potrebnog vremenskog perioda, za postizanje željenih terapeutskih rezultatta. Terapeutski efikasna količina antitela može da varira prema faktorima kao što je stanje bolesti, starost, pol, i težina pojedinca, i spospobnosti antitela ili dela antitala da izazove željeni odgovor kod pojedinca. Terapeutski efikasna količina je takođe ona u kojoj bilo koji toksični ili štetni efekti antitela, su nadmašeni terapeutski povoljnim efektima. "Profilaktički efikasna (delotvorna) količina " se odnosi na količinu koja je efikasna, u dozama i u toku potrebnog vremenskog periosa, za postizanje željenih profilaktičkih rezultata. Tipično, budući da je profilaktička doza upotrebljena na subjektu pre oboljevanja ili u ranom stadijumu bolesti, profilaktički delotvorna količina će biti manja od terapeutski delotvorne količine.

[0143] Terapeutski delotvorna ili profilaktički delotvorna količina je bar minimalna doza, ali manja od toskične doze, aktivnog agensa koji dorpinosi terapeutskom benefitu subjekta. Drugim rečima, terapeutski delotvorna količina antitela pronalaska je količina koja kod sisara, poželjno ljudi, smanjuje bioaktivnost IL-17, npr., vezivanje za IL17R, pri čemu prisustvo IL-17 izaziva ili odprinosi neželjenim patološkim efektima ili smanjenje nivao IL-17 dovodi do povoljnog terapeutskog efekta kod sisara, poželjno čoveka.

[0144] Način administracije antitela predmtnog pronalaska može da bude oralan, parenteralan, inhalacijom, ili topikalan. Poželjno, antitela pronalaska se mogu inkorporirati u farmaceutsku kompoziciju koja je pogodna za parenteralnu administraciju. Izraz parenteralan kao što je ovde upotrebljen obuvhata intravensku, intramuskularnu, subkutanu, rektalnu, vaginalnu, ili intraperitonealnu administraciju. Periferna sistema distribucija intravenskom ili intraperitonealnom ili subkutanom injekcijom je poželjna. Odgovarajući nosači za ove injekcije su poznati iz stanja tehnike.

[0145] Farmaceutksa kompozicija mora biti sterilna i stabilna pod uslovima proizvodnje i čuvanja u datim posudama za čuvanje, uključujući npr., zatvorenu ampulu ili špric. Prema tome, farmaceutske kompozicije mogu da budu sterilne filtracijom posle dobijanja formualcije, ili na drugi način mikrobiološki prihvatljive. Tipična kompozicija za intravensku infuziju može da ima zapreminu od 250-1000 ml tečnosti, kao što je sterilan Ringer-ov rastvor, fiziološki rastvor, rastvor dekstroze i Hank-ov rastvor i antitelo u terapeutski efikasnoj dozi (npr., 1 do 100 mg/ml, ili veća). Doza može da varira u zavisnosti od tipa i ozbiljnosti bolesti. Kao što je poznato u stanju tehnike, doze mogu za bilo kog subjekta zavise od brojnih faktora, uključujući veličinu pacijenta, površinu tela pacijenta, starost, posebno jedinjenje koje se administrira, pol, vreme i način administracije, opšte zdravlje, i od ostalih lekova koji se istovremeno administriraju.

Tipična doza može da bude, na primer, u opsegu od 0.001 do 1000 µg; međutim, doze date kao primer u daljem tekstu ili prethodno, se mogu predvideti, posebno uzimajući u obzir ranije iznete faktore. Dnevni parenteralni dozni režim može da bude oko 0.1 µg/kg do oko 100 mg/kg ukupne težine tela, poželjno od oko 0.3 µg/kg do oko 10 mg/kg i još bolje od oko 1 µg/kg do 1 mg/kg, još bolje od oko 0.5 do 10 mg/kg telesne tećine na dan. Progres se može pratiti periodičnom procenom. Za ponovljene administracije tokom nekoliko dana ili duže, u zavisnosti od stanja, tretman je ponavaljan sve do pojave željene suppresije simptoma bolest. Međutim, ostali dozni režimi mogu da budu korisni i nisu izuzeti. Željeni dozni oblik se može distribuirati individualnom bolus administracijom, višestrukim bolus administracijama, ili kontinualnom infuzijom antitela, u zavisnosti od načina farmakokinetičkog razlaganja koje lekar želi da postigne.

[0146] Ove predložene količine antitela u velikoj meri su predmet terapeutskog nahođenja. Ključni faktor u odabiru odgovarajuće doze i rasporeda je postignuti rezultat. Faktori za razmatranje u ovom smislu obuhvataju određenu bolest koja se tretira, sisara koji se tretira, kliničko stanje pojedinačnog pacijenta, uzrok bolesti, mesto distribucije antitela, poseban tipa antitela, način administracije, raspored administracije, i ostalih faktora koji su poznati lekarima.

[0147] Terapeutski agensi pronalaska mogu da budu smrznuti ili liofilizirani za skladištenje (čuvanje) i rekonstituisani u odgovarajućem sterilnom nosaču pre upotrebe. Liofilizacija i rekonstitucija može da dovede različtih stepena gubitka aktivnosti antitela. Doze moraju da budu podešene da bi se ovo nadoknadila. Generalno, pH između 6 i 8 je poželjno.

Proizvod

[0148] U sledećoj realizaciji pronalaska, opisan je proizvod koji sadrži materijale koji su korisni u lečenju ili prevenciji prethodno opisanih poremećaja ili stanja. Proizvod dobijen postupkom sadrži posudu i nalepnicu (oznaku). Odgovarajuće posude su, na primer, bočice, ampule, špricevi, i test -peruvete. Posude se mogu dobiti od različčitih materijala kao što je staklo ili plastika. Posuda sadržu kompoziciju antitela pronalaska koja je efikasna (delotvorna) za prevenciju ili lečenje poremećaja ili stanja i može imati sterilni priključak (na primer posuda može da bude vreća sa intravenskim rastvorom ili ampula koja ima poklopac koji se može probušiti hipodermičko iglom za injekcije). Aktivni agens u kompoziciji je anti-IL-17 antitelo pronalaska. Nalepnica nalepnjena na posudu ili stavljena zajedno sa posudom ukazuje na to da se kompozicija koristi za lečenje stanja po izboru. Proizvod dobijen postupkom proizvodnje može dalje da sadrži i drugu posudu koja sadrži farmaceutski prihvatljiv pufer, kao što je rastvor soli sa fosfatnim puferom, Ringer-ov rastvor i rastvor dekstroze. Može da lje da sadrži druge materijalekoji su poželjni sa komercijalne i korisničke tačke glediša, uključujući ostale pufere, diluente, filtere, igle, špriceve, i umetke u pakovanju sa instrukcijama za upotrebu.

[0149] Sledeći primeri su dati u isključivo ilustrativne svrhe, i nisu namenjeni da ni na koji načine ograniče obim pronalaska.

TABELA 1: BROJEVI SEQ ID

Fab # LCVR Laki CDR1 Laki CDR2 Laki CDR3 HCVR H-CDR1 H-CDR2 H-CDR3

Tabela 2 Prikaz teških lanaca CDR

Konsenzus:

Tabela 3: Prikaz lakih lanaca CDR

Konsenzus:

PRIMERI

Primer 1 ELISA I: Vezivanje antitela za IL-17 različitih vrsta

[0150] Primer ELISA testa za merenje vezivanje antitela za IL-17 koristi zatvorene Costar 3366 mikrotitar ploče koje su obložene preko noći na 4°C sa 50 µl 1.0 µg/ml humanog IL-17 po ležištu (R&D Systems, #317-IL/CF) u karbonatnom puferu za oblaganje (50 mM natrijum karbonat, pH 9.0). Alternativno, korišćen je IL-17 miša, pacova, zeca, ili cinomolgus majmuna. Humani IL-22 (R&D Systems) je korišćen kao kontrolni antigen. IL-17 zeca i cinomolgus majmuna nisu komercijalno dostupni i shodno tome zahtevaju kloniranje i eskpresiju, ili veštačku sintezu, prema metodama koje su pozante u tehnici koristeći amino kiselinske sekvence za IL-17 različitih vrsta datih na Slici 2 (SEQ ID brs: 9 i 10). Primeri nukleotidne sekvence koja kodira IL-17 različite vrste prikazane su u SEQ ID BRs: 250-254.

[0151] Ploča je zatim bliokirana dodatkom 100 µl pufera za blokiranje (Pierce #37515). Tploče su inkubirane 1 h na 37°C zatim isprane pti puta u puferu za ispiranje (PBS pH 7.4 i 0.05% Tween). Zatim, po 50 µl svakog uzorka antitela ili kontrolnog antitela (u različitim koncentracijama razblažen sa PBS pH 7.4, npr., 2, 0.4, 0.08, 0.016, 0.0032 i 0 µg/ml) je dodato u svako ležite i ploča je dalje inkubirana 1 h na 37°C. Ploča je zatim isprana tri puta sa puferom za ispiranje pre nego što je dodato 50 µl po ležištu konjugata anti-humane kapa-alkalne fosfataze razblaženog na 1:1000 u PBS –u , sa pH 7.4. Test uzorci su inkubirani 1 h na 37°C. Zatim, sveže je pripremljena p-nitrofenil fosfat dinatrijumova so (PNPP, Pierce #37620) rastvaranjem u puferu dietanolamin supstrata prema instrukcijama proizvođača i 50 µl j dodato u svako ležište. Period od oko 10 minuta na sobnoj tempeturi je ostavljen za razvoj boje pa je zatim bojeni signal meren na apsrobanci od 405 nm korišćenjem odgovarajućeg čitača ploča ELISA. Stepen vezivanja je proporcionalna proizvodnji bojenog signala.

[0152] Antitela pronalaska vezuju humani IL-17 u ELISA testu kao što je ovde opisano, ali ne vezuju IL-17 pacova ili miša. Predviđeno je, uzimajući u obzir Biacore podatake iz Primera 4 koja pokazuju da antitela pronalaska vezuju IL-17 čoveka i majmuna, da će antitela pronalaska takođe pokazati vezivanje za IL-17 majmuna u ELISA testu, kao što je ovde opisano.

Primer 2 ELISA II: Vezivanje antitela za proteine iz familije IL-17

[0153] ELISA je upotrebljen za merenje da li antitela pronalaska selektivno i/ili prefencijalno vezuju naročito humane članove IL-17 (npr., IL-17A, IL-17B, IL-17C, IL-17D, IL-17E ili IL-17F) ili humani IL-22 (negativna kontrola).

[0154] Ovo je test dat kao primer, ležišta u ELISA ploči (Nunc Immuno Maxisorp) su obložene sa 100 µl (0.5 µg/ml u 1X puferu za oblaganje (BioFx)) proteina člana IL-17 familije (R&D Systems), zatvorena i inkubirana preko noći na 4°C. Rastvor u ležištu je uklonjen lakim tresenjem i dodat je pufer za blokiranje (200 µl 1.5% BSA u PBS-u). Ploče su inkubirane na rotirajućoj mućkalici 30 minuta na sobnoj temperaturi. Zatim, u svako ležište je dodato 100 µl antitela, za testiranje, po ležištu u različitim koncentracijama (npr., 2, 0.4, 0.08, 0.016, 0.0032 i 0 µg/ml). Ploče su ponovo inkubirane preko noći (4°C) pa su zatim zagrejane na rotirajućoj mućkalici (60 min sobna temp.). Svako ležište na ploči je zatim isprano pet puta puferom (1X Ish puferom, BioFX). Posle ispiranja, dodato je odgovarajuće komercijalno dostupno HRP-konjugovano sekundarno antitelo (1:2000 u PBS-u sa 1.5% BSA) (100 µl/ležištu). Ploče su ponovo inkubirane na rotirajućoj mućkalici (60 min. sobna temp.) nakon čega su isprane puferom (5X) kao što je opisano. Kolorimetrijski signal je razvijen dodatkom TMB (100 µl/ležištu) do zasićenja (oko 3-5 min.) zatim je dalje razvijanje zaustavljeno dodatkom stop rastvora (100 µl/ležištu, BioFXBOjeni signal je meren na 450 nm apsorbance koristeći odgovarajući čitač ploča za ELISA. Stepen vezivanje je proporcionalan proizvedenom bojenom singalu. Antitela pronalaska (npr., Fabs 103, 104, 118, 121, 126 i 131 kao što je opisano u Tabeli 1) specifično vezuju humani IL-17 (tj., IL-17A), ali pod sličnim uslovima ne vezuju na nivou većem od roditeljskog za humani IL-17B, humani IL-17C, humani IL-17D, humani IL-17E, humani IL-17F, mišiji IL-17 ili humani IL-22.

Primer 3 Izolovanje i aktivacija ćelije za kloniranje IL-17

A. Splenociti pacova

[0155] Korišćenjem sterilnih forcepa i makaza, ukloniti slezinu pacova koji je eutanaziran inhalacijom sa CO2i ostaviti slezinu u speruvetu koja sadrži 5 ml RPMI 1640 medijuma 10% fetalnog goveđeg seruma i penicilin/streptomicin (rastvor medjuma). Sipati sadržaj epruvete u Petri sud od 10 cm i ukloniti mast od slezine. Homogenizovati slezinu pažljivo koristeći par potpuno zamrznutih prethodno sterilisanih mikroskopskih ploča. Isprati ćelije sa ploča pomoću rastvora medijuma, pipetirati nekoliko puta i profilerirati ćelije kroz ćelijski filter (Fisher Scientific). Isprati ćelije jednom sa rastvorom medijuma, izbrojati ćelije i resuspendovati ih u konačnoj koncentraciji od 2 x 10<7>ćelije/ml u 80 ml. Dodati ćelijski rastvor u balon T150, dodati Concanavalin A do krajnje koncentracije od 3 µg/ml i inkubirati na 37°C u trajanju od 15 h. Sakupiti ćelije, isprati sa PBS-om, zamrznuti ćelijske pelete u suvom ledu i odmah nastaviti sa standardnim procedurama izolovanja RNK.

B. Mononuklearne ćelije iz periferne krvi zeca (PBMC) (engl.rabbit peripheral blood mononuclear cells) i Cinomolgus majmuna

[0156] Naneti oko 7 ml krvi cinomolgus majmuna ili 10 ml krvi New Zealand belog zeca na BD Vacutainer™ CPT™ System za razdvajanje mononuklearnih ćelija od krvi. Centrifugirati CPT epruvetu, 20 min na 1500 x g u horizontalnom rotoru sa rotiraućim bocama. Sakupiti limfocite i monocite na međusloju, dva puta isprati rastvorom medijuma , izborjati i resuspendovati u rastvoru medijuma do kranje koncetracije od 10<6>ćelija/ml. Dodati Concanavalin A do krajnje koncentracije od 3 µg/ml i inkubirati na 37°C u trajanju od 15 h. Sakupiti ćelije, isprati sa PBS-om, zamrznuti ćelijske pelete u suvom ledu i odmah nastaviti sa standardnim procedurama izolovanja RNK.

Primer 4 Merenje kinteičkih konstantni vezivanja

[0157] A BIACORE<®>2000 instrument je upotrebljen za merenje kintike i afiniteta vezivanja antigen-antitelo. Instrument koristi optičke osobine rezonancije površinskih plazmona za detekciju alteracija u koncentraciji proteina interagujućih molekula unutar biosenzornog matriksa od dekstrana. Osim kada je naznačeno, svi reagensi i materijali su kupljeni od BIACORE<®>AB. Sva merenja su izvedena na 25°C. Uzorci su resuspendovani u HBS-EP puferu do krajnje koncentracije od 2 µg/ml (150 mM natrijum hlorida, 3 mM EDTA, 0.005% (t/z) površinski aktivno sredstvo (sufraktant) P-20, i 10 mM HEPES, pH 7.4). Protein A je imobilisan na protočnim ćelijama 1 do 4 u CM4 senzor čipu na nivou od 500 jednica odgovora koristeći komplet za kuplovanje amina.

[0158] Vezivanje je određeno primenom multiplih analitičkih ciklusa. Svaki ciklus je izveden pri protoku od 50 µl/minuti i sastoji se od sledećih koraka: injekcije oko 20 µl kompozicije antitela u koncentraciji od 2 µg/ml ciljajući na sakupljanje 100-200 jedinica odgovora, injekcija od 250 µl humanog IL-17, IL-17Cinomalgus majmuna, IL-17New Zealand belog zeca, IL-17 pacova ili mišijeg IL-17 (polazeći od 10 nM i koristeći dovstruka serijska razblaženjaza svaki ciklus) nakon čega sledi 20 minuta za disocijaciju i regeneraciju koristeći 30 µl , 10 mM glicin hidrohlorida, pH 1.5. Brzine asocijacije i disocijacije za svaki ciklus određene su pomoću modela vezivanja "1:1 sa transferom masa " u BIAevaluation software.

[0159] mAbs 103, 104, 118, 121, 126 i 131 cele dužine (videti Tabelu 1) sa IgG4Fc regionom koji ispoljava visok vezivni afinitet za humani IL-17 i za IL-17 majmuna, sa KDmanjom od 5 pM, Koffsporijom od 2 x 10<-5>s<-1>i Konod najmanje 5 x 10<6>M<-1>s<-1>. KDi koffsu poboljšane (tj., niža KD, sporija koff) u ovim varijantama mAbs overu odnosu na Fab 2321 mAb(roditeljski Fab od npr., Fab 103 i 104) sadrži mišiji varijablni region [SEQ ID brs: 261 (VH of 2321), 262 (VL 2321)], teški lanac konstatnog regiona humanog IgG4(SEQ ID BR: 260) i kapa laki lanac konstantnih regiona (SEQ ID BR: 272). Antitela pronalaska ispoljavaju vezivanje ne veće od roditeljskog nivoa za mišiji IL-17 ili IL-17 pacova; nije detektovano vezivanje do 200 nM mišijeg IL-17 i nije detektovano vezivanje do 1 µM IL-17 pacova. Kada su testirani mAbs 103, 104, 121 i 126 cele dužine, pod istim uslovima kao što je prethodno opisano, za veziovanje za IL-17 cinomolgus majmuna i IL-17 zeca; vezivanje za IL-17 majmuna je slabije i bifazno dok je vezivanje za IL-17 majmuna slično vezivanju za humani. Specifične vrednosti za određena monoklonska antitela (vrednosti su date kao srednja vrednosti ± standardna greška) pronalaska kada su testirani u ovoj probi, date su u Tabeli 4 u daljem tekstu. Smatrano je da Fc regioni osim onih od IgG4značajno ne utiču na KDi koff.

Tabela 4

Primer 5 Ispitivanja kompeticije vezivanja IL-17 receptor/Anti-IL-17 Antitela

[0160] Ovaj primer pokazuje da se antitela pronalaska takmiče za vezivanje za IL-17 sa receptorom IL-17.

[0161] Ispitivanja vezivanja BIACORE su izvedena pomoću IL-17 receptor Fc-fuzioniog proteina (R&D #177-IR). DA bi se prikazalo da IL-17 receptor Fc-fuzioni protein vezuje humani IL-17, izveden je BIACORE test u puferu vezivanja BIACORE (HBS-EP) 1 mg/ml BSA na 25°C na BIACORE 2000 instrumentu. CM4 čip je uptorebljen sa oko 600 jedinica odgovora Proteina A koji je imobilizovan an poročnoj ćeliji 1, 2 i 3 na čipu. Oko 100 jedinica odgovora receptora IL-17 Fc-fuzionog proteina je sakupljeno na protočnoj ćeliji 2 na čipu. Humani IL-17 je zatim izložen protčnoj ćeliji 1 i 2 u koncentracijama u opsegu od 600 nM do 9.4 nM. Posle svake injekcije od 250 µl humanog IL-17, kompleks je ostavljen da disosuje oko 12 minuta, tako što pufer teče preko čipa. Na kraju disocijacije, 20 µl injekcije 100 mM glicina sa pH 1.5 je uptorebljeno za regeneraciju čipa pre početka sledećeg ciklusa vezivanja. Protočna ćelija 1 je uptorebljena kao referentna protočna ćelija. Podaci su fitovani pomoću "Bivalent analyte" modela u BIAevaluation Version 3.2 softveru. Rezultati ukazuju na to da ova interakcija brzinu od 1.06 x 10<5>M<-1>s<-1>, i brzinu disocijacije od 20.3 s<-1>kao i sporu disocijaciju od 1.63 x 10<-4>s<-1>. Prema tome, ova interakcija ima KDili vezivni afinitet od 1.5 nM i 0.19 mM koji je mnogo slabiji nego vezivni afinitet antitela pronalaska za humani IL-17.

[0162] Ekperiment kompetitivnog vezivanje je takođe meren u HBS-EP 1 mg/ml BSA na 25°C na BIACORE 2000 instrumentu sa CM4 čipom. Približno 1000 jedinica odgovora antitela pronalaska je imobilizovan na protočnim 2, 3 i 4 ćelijama sa čipom; dok je protočna ćelija 1 oistavljena kao slepa proba (engl. blank). Protokom od 50 µl/ml, injektirano je 25 µl od 500 nM humanog IL-17 kroz sve protočne ćelije, pri čemu se formira kompleks antitelo:antigen na površini čipa. Posle završenom injektiranju i formiranju kompleksa, injektirano je 250 µl od 500 nM humanog IL-17 receptor Fc fuzionog proteina kroz sve četiri protočne ćelije. Na kraju ove injekcije , injekcija od 25 µl 100 mM glicina sa pH 1.5 je upotrebljena za regeneraciju čipa: Isti eksperiment vezivanja je zatim ponovljen sa injekcijom 250 µl pufera pre nego IL-17 receptor Fc fuzionog proteina.

[0163] Profili vezivanja za: injekcije receptora u odnosu na kompleks antitelo:antigen i za injekciju puferske kontrole u odnosu na kompleks antitelo:antigen su identični. Ovo ukazuje na to da nema raspoloživih mesta za vezivanje da se dimerni IL-17 veže za svoj receptor onda kada je vezan za antitelo pronalaska. Ovaj rezultat takođe ukazuje na to da receptor ne može da "povuče " IL-17 od bilo kog od antitela od onog momenta kada je kompleks formiran. Ova antitela takođe inhibiraju humani IL-17 od vezivanja za receptore, shodno tome neutrališuća biološka aktivnost humanog IL-17.

Primer 6A In vitro testiranje reportera IL-8

[0164] Za testiranje sposobnosti antitela pronalaska da neutrališe ili antagonizuje bioaktivnost IL-17, stručnjak može da primeni IL-8 reporter test kao što je ovde opisano. Ovaj pristup se takođe može upotrebiti za određivanje jačine Fabs ili mAbs pronalaska u ćelijski-baziranom testu. Human HS27 ćelijska linija (ATCC #CRL-1634) sekretuje IL-8 u odgovoru na IL-17. IL-17-indukuje sekreciju IL-8 neutralizacijom anti-IL-17 antitela (videti, npr., J. Imm.155:5483-5486, 1995 ili Cytokine 9:794-800, 1997). Shodno ovom, IL-17-indukovana sekrecija IL-8 treba da nastavi bez ograničenja ukoliko je dodato dovoljno IL-17 u HS27 ćelije u odsustvu neutralizujućeg anti-IL-17 antitela.

[0165] HS27 ćelije u ovom testu su održavane maintained u medijumu: DMEM sa visokim sadržajem glukoze bez fenol crvenog (Invitrogen #31053-028) sa 10% fetalni goveđim serumom, 4 mM L-glutaminom, 1 mM natrijum piruvatom, penicilinom G (100 U/500 ml) i streptomicinom (100 µg/500 ml). Ćelije su gajene u balonima T 150 dok nisu oko 80-90% konfluentne na dan testiranja. Humani IL-17 (R&D Systems, #317-IL-050) je rekonstituisan u sterilnom PBS –u bez Ca<2+>i Mg<2+>, čuvan smrznut, sveže jeodmrznut za upotrebu i razblažen do 200 ng/ml u medijumu za testriranje. Alikvot od 50 µl razblaženog IL-17 je dodat u svako ležište na ploči za gajenje, sa 96-ležišta sa ravnim dnom (Falcon #35-3072) pri čemu su spoljašnja ležišta ostavljena prazna. Ležišta u duplikatu su upotrebljena samo za medijum, kao kontrole (100 µl/ležištu) i samo IL-17 kao kontrola (100 µl/ležištu). Testiranje je izvedeno u duplikatu ili triplikatu. Sterilni mAb proteini cele dužine su razblaženi do maksimalne koncentracije od 24 µg/ml u medijumu za testiranje. Serijska razblaženja (obično 1:5) su napravljena na posebnoj ploči i 50 µl uzoraka Fab u različitim razblaženjima je dodato u ležišta koja sadrže IL-17, pa su zatim inkubirani na 37°C u trajanju od 1 h. Sâm medijum za testiranje je upotrebljen kao negativna kontrola.

[0166] HS27 ćelije (tipično oko 20,000 ćelija u 100 µl medijuma za testiranje) su dodate u svako ležište ploče koja sadrži Fab IL-17 (ili kontrole) i inkubirane su oko 48 h na 37°C. Supernatanti su zatim sakupljeni posle centrifugiranja plože sa 96 ležišta u trajanju od 5 minuta na 500 x g i razblaženi 1:15 ili 1:10 u medijumu. Nivo neutralizacije IL-17 je meren određivanjem količina IL-8 u supernatantu primenom komercijalnog ELISA kompleta prema instrukcijama proizvođača izuzev što je medijum zamenjen standardnim diluentom i zapremine substrata iznosi 100 µl/ležištu (R&D Systems, ELISA D-8000C ili R&D DuoSet ELISA #DY208hIL-8). ELISA merenja (450 nm) su izvedena na čitaču mikroploča. Kalibracione krive su dobijene primenom 4-paramaterske logističke regresije sa IL-8 vrednostima (pg/ml) koje su određene iz kalibracionih krivih primenom standardnih statističkih tehnika. IC50vrednosti su dobijene primenom standardnih statističkih tehnika.

[0167] Monoklonska antitela pronalaska 103, 104, 121 i 126 cele dužine (sa IgG4Fc regionom), kada su testirana u opisanom testu (2-4 ponavljanja), imaju prosečnu vrednost IC50(na osnovu procenjene molekulske težine od 150 kD za svaki mAb) između 450 i 500 pM sa opsegom svih merenih vrednosti između 365 i 618 pM.

Primer 6B In vitro testiranje reportera GROα

[0168] Za testiranje sposobnosti antitela pronalaska da neutrališe ili antagonizuje bioaktivnost IL-17 , stručnjak može da primeni sledeći ćelijski-baziran test. IL-17 može da stimuliše epitelialne ćelije i ostale ćelije da sekretuju GROα. U ovoj probi testirana je sposobnost antitela pronalaska da neutrališe IL-17- indukovanu GROα sekreciju iz humanih kolorektalnih adenokarcinoma epitelialnih ćelijskih linija HT-29.

[0169] Za testiranje da li humani IL-17 zavisno od doze indukuje sekreciju GROα iz ćelija HT-29, rekombinantni IL-17 (R&D Systems #317-IL-050/CF; rekonstituisan u sterilnom Dulbecco's PBS bez Ca<2+>i Mg<2+>(D-PBS)) je razblažen (do 4.5 µg/ml; 3X najveće testirane koncentracije) u medijumu za testiranje/gajenje (McCoy's 5A (Invitrogen); 10% FBS (Invitrogen); penicilin G (100 U/500 ml); i streptomicin (100 µg/500 ml. IL-17 je dalje serijski razblažen (1:5) u medijumu. Različite koncentracije IL-17 (0.096 ng/ml - 1,500 ng/ml; 3.0 pM - 46,875 pM) su dodate (po 50µl) u unutrašnja ležišta ploče sa 96 ležišta koja su tretirana podlogom za gajenje. Medijum za testiranje (50 µl) je dodat u 3 ležipta za tretiranje " sâmo medijumom". Testiranje je izvedeno u triplikatu (3 ležišta po tretmanu). Pločasa IL-17 iu medijumu je inkubirano približno 60-90 minuta na 37°C, 5% CO2, pre nego što su dodate HT-29 ćelije.

[0170] Za evaluaciju antitela pronalaska, npr., mAb 126 sa IgG4Fc regionom, primenjena je koncentracija IL-17 koja je dala oko 70% maksimalne GROα sekrecije iz HT-29 ćelija (60 ng/ml). Rekombinantni humani IL-17 (R&D Systems) je rablažen (do 240 ng/ml; 4X radna koncentracija) u medijumu za testiranje/gajenje. Razblažen IL-17 je dodat (50 µl) u 60 posebnih unutrašnjih ležipta na pločama sa 96 ležišta koje su tretrirane podlogom za gajenje (Becton Dickinson Falcon #35-3072). Medijum (50 µl) je dodat u 3 ležišta za tretman "sâmim medijumom".

[0171] Opseg doza antitela pronalaska za testiranje obično iznosi od 2.56 - 40,000 pM. U posebnoj ploči za razblaženja, antitelo pronalaska i kontrolno antitelo (sterilno, u 1X PBS, pH 7.4) razblaženo je do 160,000 pM u medijumu za testiranje. Antitelo pronalaska i kontrolno antitelo su dalje razblažena serijski (1:5) u medijumu za testiranje. Svaka od koncentracija antitela pronalaska za testiranje je zatim dodata (50 µl) u ležišta koja sadrže IL-17. Testiranje se obično izvodi u triplikatu. Sâm medijum za testiranje (50 µl) je upotrebljen kao kontrola "sâmo medijum " i kontrola " sâmo IL-17 ". Ploče koje sadrže smeše IL-17 i antitela pronalaska su inkubirane 60-90 minuta na 37°C, 5% CO2, pre nego što su dodate HT-29 ćelije.

[0172] HT-29 ćelije (humane epitelialne ćelije kolorektalnog adenocarcinoma, ATCC #HTB-38), su održavane u medijumu za gajenje/testiranje u balonu koji je tretiran podlogom za gajenje primenom standardnih tehnika. HT-29 ćelije su gajene u sudu sa podlogom dok nisu 50-80% konfluentne na dan testiranja. Na dan testiranja, ćelije su isprane sa HBSS –om (Cambrex #CC-5024) i odvojene od posuda sa podlogom sa tripsinom EDTA. Tripsin je inaktiviran sa kompletnim medijumom za testiranje. HT-29 ćelije su zatim centrifugiran na 500Xg tokom 5 min. na RT. Ćelijske pelete su zatim resuspendovane u medijumu za testiranje i dodato je 20,000 HT-29 ćelija (u 100 µl) u svako ležište na ploči sa 96-ležišta. Jednake zapremine D-PBS su dodate u svako od neupotrebljenih ležišta duž stranica ploča (bez ćelija) da bi se smanjio tzv. efekat ivice koji nastaje kao posledica isparavanja. Ploče sa 96-ležišta su postavljene u inkubator za podloge (37°C, 5% CO2) u trajanju od oko 48 h.

[0173] Na kraju testiranja, ploče su centrifugirane (500Xg u trajanju od 5 min. na RT), i ćelijski medijum je prebačen na poliproplenske ploče sa 96-ležišta. Nivoi GROα su mereni pomoću GROα sendvič ELISA (R+D Systems DuoSet #DY275), prema instrukcijama proizvođača, izuzev: korišćen je test medijum kao standardni diluent, korišćen je 1X ELISA pufer za ispiraje od BioFX Labs, korišćena je zapremina uzorak i standarda od 50 µl po ležištu, korišćen je substrat od BioFX Labs (HRP substrate, #TMBW-1000-01), i korišćen je stop rastvor od BioFX Labs (#LSTP-1000-01) (100 µl po ležištu). Na kraju ELISA reakcije, polče su očitane na 450 nm na člitaču mikroploča. Kalibracione krive za GROα su dobijene izvođenjem 4- paramaterske logističke regresije. Vrednosti za GROα (koncentracija u pg/ml) za uzorke dobijene su iz kalibracionih kriva. Epitelialna ćelijska linija HT-29 humanog kolorektalnog adenokarcinoma koej sekretuje GROα su zaitm stimulisane sa IL-17, na način koji zavisi od doze (Tabela 5). Kontrolni humani IgG4 nije izazvao smanjenje u IL-17 – indukovanoj sekreciji GROα. Ovi rezultati (Tabela 6) pokazuju da mAb 126 može potpuno da neutrališe sekreciju GROα indukovanu humanim IL-17 iz HT-29 ćelija in vitro pod navedenim uslovima. Vrednosti IC50za mAb 126 u ovom testiranju iznose oko 560 pM.

Tabela5

Tabela6

Primer 7 In vivo Neutralizacija hIL-17

[0174] Humani IL-17 može da veže i stimuliše mišiji IL-17 receptor, što dovodi do povećanja i zatimi sekrecije mišijeg KC (CXCL1) hemokina. Vreme i doze u eksperimentima su podvrgnuti identifikaciji optimalne doze humanog IL-17 i optimalnog vremena za indukciju mišijeg KC. Ovi eksperimenti ukazuju na to da doza od 150 µg/kg humanog IL-17 i vremem od 2 h post IL-17 administracije daju maksimalne nivoe KC u mišijem serumu. Antitela cele dužine predmetnog pronalaska (npr., Fab 126 ili Fab 121 sa HCVR operativno vezan za humani IgG4Fc, SEQ ID BR:260 [ili SEQ ID BR: 278] i LCVR operativno vezan za humani konstantni region kapa, SEQ ID BR: 263 [ili SEQ ID BR: 277]) su intravenski administrirani mišu kao 1, 10, 100 i 1000 µg/kg, jedan sat pre subkutane injekcije humanog IL-17. Dva sata posle administracije humanog IL-17, miševi su eutanaziani i nivoi KC su određeni pomoću ELISA korišćenjem komercijalno dostupnog kompleta prema instrukcijama proizvođača (KC Quantikine, R&D). Antitela odgovarajućeg izotipa su upotrebljena kao negativne kontrole. Antitela blokiraju sposobnost humanog IL-17 da stimulište mišiji IL-17 receptor, što dovodi do inhibicije povećanja mišijeg KC, na način koji zavisi od doze. Mab126 (antitelo cele dužine koji sadrži Fab 126), u dozi od 20µg/miša pod opisanim uslovima, smanjuje srednju vrednost nivoa KC oko četiri puta u odnosu na kontrolno antitelo koje nema efekta. Mab 121, u dozi od 20 µg/mišu pod opisanim uslovima, smanjuje srednju vrednost nivoa KC oko tri puta u odnosu na kontrolno antitelo.

Primer 8 Mapiranje epitopa

[0175] Dva anti-IL-17 antitela (Fab 126 iFab 104) su upotrebljena za određivanje da humanizacija i optimizacija roditeljskog Fab miša (2321, SEQ ID BRs: 261 i 262) ne menjaju epitop-vezivnu sposobnost Fabs nastalu kao rezultat humanizacije i optimizacije roditeljskog Fab-a . Humanizovani, optimizovani Fab koji se vezuju za isti epitop kao i roditeljski Fab miša kao što je utvrđeno standardnom kompetitivnom ELISA ili sa H-D izmenom i masenim spektrom za mapiranje epitopa (Videti, npr., Hoofnagle, A., et al., Methods Mol. Biol.250:283-298, 2004; Hoofnagle, A., et al., Ann. Rev. Biophys. Biomol. Struct., 32:1-25, 2003; Baerga-Ortiz, A., et al., Protein Sci.11:1300-8,2002) prema tome, očekuje se da Fabs 1-132 pronalaska dobijen od istog roditelkjskog Fab, vezuje isti epitop.

[0176] Koristeći H-D izmenu i maseni spektar (H/DXMS) za mapiranje epitopa, određeno je da amino kiseline između položaja 80 i 89 [ADGNVDYHMN (SEQ ID BR: 275)] humanog IL-17 (SEQ ID BR: 1) su obuhvaćene diskontinualnim epitopom za koja se vezuju antitela pronalaska. DGNVDYH (SEQ ID BR: 276) je glavna sekvenca koja je obuhvaćena diskontinualnim epitopom za koji se antitela pronalaska vezuju na osnovu poređenja varijacije sekvence IL-17 između različitih vrsta i kapaciteta vezivanja. Menjanje amino kiselinske sekvence SEQ ID BR: 267 u sklopu cele sekvence IL-17, dovodi do vezivanja antitela pronalaska za izmenjen IL-17 koje se ne može detektovati. Antitela pronalaska se ne vezuju za IL-17 pacova ili miša na nivoim većim od kontrolnog antitela.

[0177] H/DXMS test je upotrebljen za identifikaciju regiona IL-17 za koja se vezuju antitela pronalaska. Brzina izmene vodonika amida zavisi od strukture i pristupa solventa vodoniku amida. Kompleks slobodan IL-17 ili IL-17: antitelo u vodi je pomešan sa deuterizovanom vodom (D2O) da bi se omogućila izmena protona amida, deuterijumom. Ove osnovne amido grupe koje učestvuju u vezivanju proteina su zaštićene od izmena i ostaju protonovane. Ovi regioni su zatim identifikovani peptičnom proteolizom, spregnutom (kuplovanom) sa LC i elektrosprej jonizacionom masenom spektrometrijom. Humani IL-17 koji sadrži C-terminalni His i Flag tag (IL-17-Flis) je eksprimiran i prečišćen iz GS-CHO ćelije na IMAC koloni. Dva alikvota od 10 µg (7.7 µl) rastvora IL-17-Flis je prebačeno u 2 Microcon, i 100 µg mAb 104 ili mAb 126 (molarni odnos IL-17/Mab = 1/2) je dodato u Microcon. Dvadeset µg rastvora IL-17-Flis je prebačeno u drugi Microcon i nije dodato antitelo. Zatim je 1x PBS pufer dodat u svaki od Microcon –a do krajnje zapremine od ~180 µl i centrifugirano na 14,000g u trajanju od 14 min. Zatim je 150 ml 1x PBS pufera dodato u svaki od Microcon –a i centrifugirano na 14,000g tokom 14 min. Ovi koraci su neophodni da bi se obezbedilo da su slobodni antigen i antigen:antitelo kompleksi pod identičnim puferskim uslovima.

[0178] Deo proteina je skupljen i krajnja zapremina je podešena na 50 µl (kompleks) ili 80 µl (samo IL-17-Flis) dodatkom 1xPBS-a. Šest mikrolitara IL-17-Flis ili kompleksa IL-17-Flis i mAb kompleksa je transfektovano u plastične mikro ampule, i dodato je 14 µl 100% D2O, što daje 70% D2O u uzorku . Rastvor je inkubiran na sobnoj temperature, 10 min. Izmena je odmah zaustavjena, digestirana dodatkom 20 µl 1% rastvora mravlje kiseline i 2 µl 2 mg/ml rastvora pepsina, i inkubirano na sobnoj temperaturi, 30 sec ili na 0°C u trajanju od 10 min. Digestirani proizvod je odmah ručno injektiran na kolonu. Waters 2795 HPLC i Micromass LTC Premier su upotrebljeni za sve analize. HPLC tok od HPLC pumpe je povezan sa metalnom cevi (oko 1 ml), za maneulni injektor, za Zorbax C18 kolonu (2.1×50mm) , pri čemu je pod ovim uslovima izvršena analiza (Temperatura kolone:0°C; Mobilna Faza C: 0.15% mravlja kiselina u H2O, D: 0.12% mravlja kiselina u ACN; vreme analize :23 min). Kolona je ekvilibrisana sa 98% A (0.15% vodeni rastvor mrvlje kiseline) i 2% B (0.12% rastvor mravlje kiseline u acetonitrilu) pri protoku od 0.2 ml/min. Eluiranje gradijentom je izvedeno od 2% do 10% B tokom 0.5 min, zatim do 40% B tokom 14.5 min, zatim do 90% B tokom 1 min sa 2 min rampe, i onda je vraćeno na 2%B za 1 min.). Uzorak iz HPLC je analiran masenim spektrometrom koji radi pod sledećim podešavanjima (Jonski mod: Pozitivan; opseg skeniranja: 300-2000; napon cevi uzorka: 80; protok desolvatacionog gasa (L/Hr):700; temperatura desolvatacije : 300°C). Metalna cev, petlja injektora i kolona su potopljeni u ledenu vodu tokom analize. Maseni spektar svakog od peptičnih peptida IL-17 je dobije nakon izmene H/D sa ili bez testiranog anti-IL-17 mAb. Za male peptide, srednja masa svakog peptida je izračunata na osnovu izotopskih jona i intenziteta. Za veće peptide, srednje mase su dobijene dekonvulacijom masenih spektara posle unutrašnje kalibracije.

[0179] Kada antitelo obrazuje kompleks sa IL-17, region vezivanja (epitop) u IL-17 je zaštišen od solventa. Ovo dovodi do sporije brzine izmene vodonika amida when u odnosu na one u sâmom IL-17. Poređenjem masa peptida slobodnih i kompleksa posle izmene deuterijuma, peptidi koji su zaštićeni stvaranjem kompleksa treba da budu različiti od odgovarajućeg peptida u slobodnom IL-17. Tabela 7 pokazuj listu razlika u masi koje su dobijene sa H/DXMS za peptične peptide IL-17. Ovi peptični peptidi pokrivaju celu sekvencu IL-17-Flis. Kao što podaci u tabeli pokazuju , razlika u masi IL-17-Flis peptida između kompleksa i sâmog peptida je slična za oba testirana antitela, tj. vezuju isti epitop. Glavna razlika u masama je nađena sa peptični peptid 24-87+117-133 (tj amino kiseline 24 do 87 i 117 do 133 u IL-17) (ova dva peptida su povezane preko disulfidnih veza) i 66-87+117-134, što ukazuje na to da su ostaci ova dva regiona uključeni u vezivanje. Budući da su ovi peptični peptidi prilično veliki, neophodne su digestije anzimima da bi se suzio izbor specifičnih amino kiselinskih ostataka koji su uključeni u vezivanje. Pored ovih podatatka, antitela pronalaska se ne vezuju za druge članove familije IL-17 (IL-17 B,C,D,E, i F) i takođe se ne vezuju za mišiji ili pacovski IL-17. Ovi podaci zajedno sa poređenjem sekvenci i ispitivanjem IL-17 homolgije strukturnog modela stukazuje na to da ostaci 80-89 su obuhvaćeni nelinearnim epitopom IL-17 za koji se vezuju antitela pronalaska.

Tabela 7

Primer 9 Eksprimiranje IL-17 u tkivima kancera

[0180] Različiti lizati humanih ne-kanceroznih i kanceroznih ćeliija su testirani na prisustvo proteina IL-17. Tkiva (oko 50-100 mg uzorka) su trenutno smrznut a(engl. snap-frozen) u suvom ledu, otopljena na ledu i lizirana u 350 µl TPER bufera (Pierce #78510) koji sadrži inhibitore proteaze (Pierce #78410) i inhibitore fosfataze u epruveticama koje sadrže keramičke kuglice za liziranje (Qbiogene #6913-050; 1.4 mm keramičke kuglice u eprivetici od 2.0 ml). epruvetice su ostavljene u ledu 5-10 min pa zatim centrifugirane na 13,000 x g u tajanju od 10 min na 4°C i materijal je prebačen u nove eprivete da bi se uklonili ostaci. Ostatak je ponovo je centrifugirano kao što je opisano i prebačen u novu epruvetu. Koncentracija proteina je određena primenom standardne BSA metode. Uzorci su analizirani na IL-17 koristeći komercijalni komplet IL-17 ELISA prema instrukcijama proizvođača (R&D #DY317 koristeći pufer za ispiranje, rastvor substrata i stop rastvor od BioFX Labs). Nivoi IL-17 su normalizvani na ukupnu koncentraciju proteina. Nivoi IL-17 su povećani između dva- i tri –puta u kanceroznim tkivima debelog creva (testirano 60 uzoraka) u odnosu na normalno tkivo debelog creva (testirano 63 uzroka). Nivoi IL-17 su povećani u proseku tri- do četiri - puta u kanceroznom tkivu bubrega (testiran 21 uzorak) u odnosu na normalno tkivo bubrega (testiran 21 uzorak). Nivoi IL-17 u kanceroznom tkivu prostate (testirano 44 uzorka) su povećani u odnosu na normalno tkivo prostate (testirano 7 uzoraka). Nivoi IL-17 nisu povećani u ostalim testiranim tipovima tkiva tumora uključujući tkiva tumora dojke, vrata, pluća, jednjaka, tiroide, jezika, jajnika i mozga.

Primer 10 IL-17 aktivacija mikroglialnih ćelija

[0181] IL-17 indukuje mikroglinu ćelijsku liniju (BV-2) mišijeg mozga da skeretuje IFN i IL-12p70. BV-2 mišija mikroglialne ćelijske linije [dobijena od Scios, sa dozvolom od Elisabeta Blasi (Microbiology University of Perugia, Italy) koji su ih originalno izolovali (E. Blasi et al., J. Immunology 1990, 27:229-237)] gejene su u sudovim za gajenje koji su oboloženi poli-D-lizinom, do ne više od 60% konfulentnosti u DMEM sa visokim sadržaje glukoze (Invitrogen #31053-028) sa 2 mM L-glutaminom (Invitrogen/GIBCO #25030-081), 10% FBS (inaktiviran toplotom; Invitrogen/GIBCO #10082-147), 1 mM natrijum piruvat (Invitrogen/GIBCO #11360-070), 100 µg/ml Normocin (InvivoGen) na 37°C, 5% CO2.

[0182] Dana 0 testiranja, BV-2 ćelije su isprane (Dulbecco's PBSbez Ca2+ i Mg2+; Invitrogen), odvojene (0.25% tripsin EDTA) zatim su inaktivirane tripsinom, potom centrifugirane (500Xg 5 min. na RT). Dobijena peleta ćelija je ponovo suspendovana do gustine ćelija od ~7,000 ćelija/100 µl medijumu.100 µl ćelijske suspenzije je dodato u 60 posebni unutrašnjih ležita ploča sa 96-ležišta koje su obložene poli-D-lizinom. Ploče su inkubirane kao što je opisano, oko 48 hr pre tretmana sa IL-17.

[0183] Dana 2 testiranja, rekombinantni mišiji IL-17 (mIL-17) (bez nosača; R&D Systems); je rekonstituisan u sterilom Dulbecco PBS bez Ca<2+>i Mg<2+>je razblažen na polipropilnskoj ploči do 1.5 µg/ml (najviša testirana koncetracija) na podlozi. Mišiji IL-17 je dalje serijski razblažen na polipropilenskoj ploči. A pozitivna kontrola LPS je razblažena u medijumu do 1 µg/ml (najviša testirana koncentracija). Mdijum za testiranje je upotrebljen kao negativna kontrola. Medijum je pažljivo aspiracijom odvojen od ćelija, pre nego što su dodati reagensi za tretiranje (150 µl/ležištu). Testiranje je uvedeno u triplikatu (3 ležišta po tretiranju). Razdvojene kopije ploča su inkubirane ili 24 h ili 48 h na 37°C, 5% CO2.

[0184] Dana 3 i ndana 4 testiranja, ploče su centrifugirane (500Xg u trajanju od 5 min. RT), zatim je medijum za gajenje prebačen na polipropilenske ploče sa 96-ležišta, koje su zatvorene poklopcem i zamrznute (-80°C). Uzorci su odmrznuti i testirani na nivoe citokina i hemokina pomoću mišijeg 22-strukog multipleks komplekta (Linco), prema instrukcijama prozvođača (izuzev: polikarbonatna filter ploče (Millipore) sa crnim zidovima menja filter ploču koja se nalazi u komplet). Fluorescencija je očitana na Luminex® instrumentu (50 kuglica po grupi kuglica, malo povećane RP1). Podaci su dati u Tabeli 8 u dlajem tekstu.

[0185] Standardne krive su dobijene primenom četiri- ili peto-parametarske logističke regresije. IFNγ i IL-12p70 vrednosti (pg/ml) su određene iz standardnih kriva primenom standardnih statističkih tehnika.

primaju 5% DSS 30-40 Kd) u pijaćoj vodi tokom 7 dana. Indeks akdivnosti bolesti (engl. Disease Activity Index (DAI)) uključujući pozitivan test na okultno krvarenje (hemokult test) ili rektalno krvarenje, meku stolicu i gubitak telesne težine (5-8%) je zapaženo oko dana 8. Telesna težina miševa je praćena svaki dan u periodu od 2 nedelje. Miševi su eutanazirani od dana 12 do dana 15. Protein IL-17 protein je značajno povećan kod debelog creva tretiranog sa DSS-om, u odnosu na nromalno debelo crevo. Tretman sa IL-17 antitelom može da smanji indeks aktivnosti bolesti.

Primer 12 EAE Model za multiplu sklerozu

[0187] EAE je CD4+ T ćelijski posreddovana bolest demijelinacije centralnog nervnog sistema (CNS) koji služi kao model za MS kod ljudi. Patogeni mehanizmi razvoja EAE obuhvataju aktivaciju antigen-specifičnih T ćelija i diferencijaciju Th1 pa zatim infiltraciju u CNS preko T ćelija i makrofaga. IL-17 doprinosi patologiji multiple skleroze (MS). Biočip analiya MS lezija kod čoveka je pokazala povećanje IL-17 (Lock, et al. Nat. Med.8:500-508, 2002). IL-17 mononuklearne ćelije (MNC) koje eksprimiraju mRNK u krvi i cerebrospinalnoj tečnosti su značajno povećani kod većine MS pacijenata i veći broj IL-17 mononuklearnih ćelija (MNC) koje eksprimiraju mRNK u krvi je detektovano tokom kliničkog pogoršanja MS u odnosu na fazu remisije (Matusevicius, et al. Multiple Sclerosis.5:1-1-104, 1999). EAE je značajno potisnuto u IL-17 nokaut miševa (Nakae et al., J. Immun.171:6173-6177).

[0188] Ovde opisan primer pokazuje da je nivo IL-17 proteina povećan u kičmenoj moždini kod EAE miševa i da tretman sa anti-mišijim IL-17 antitelom smanjuje vrednost EAE u aktivnom moedelu EAE. Za indukovanje bolest, ženke C57BL/6 miševa starosti 8-9 nedelja su subkutano imunskizovane na dan 0 sa ili (i) 200 µl 5 mg/ml pertuziskim toksinom (PT) i komplentiim Freund-ovim adjuvantom (CFA) ili (ii) PT, CFA i 300 µg/200 µl MOG35-55 (mijelinski oligodendrocitni glikoprotein emulgovan u CFA koji sadrži 5 mg/ml toplotno inaktivirane sa Mycobacterium tuberculosis). Dana 2, miševi su tretirani ponovo sa PT. Miševi su označeni tokom ispitivanja prema stepenu paralize. Bolest je očekivana u grupu koja prima MOG.

Pacovsko anti-mišije IL-17 monoklonsko IgG1antitelo ili izotip kontrolno antitelo je administrirano mišu u dane 1, 7 i 15 (BD Biosciences za pasvosko anti-mišije IL-17 antitelo). Mševi koji primaju MOG su eutanazirani kada klinički rezultat dostigne između 1-3 (na skali od 0-4); ovo je između dana 14-31 za ispitivanje 1 u Tabeli 9 u daljem tkesttu i između dana 14-16 za ispitivanje 2 u Tabeli 10 u dlajem tekstu. Klinički znaci bolesti se razvijaju priblićno na dan 10. Pojedinačne životinje su naknadno ocenjene sa najmanje 2 ocene nezavisno i sa skrivenim oznakama, svrstane u tretirane grupe prema kliničkoj ozbiljnost CNS bolesti. Vrednost 0 je oznaka normalnu životinju; Vrednost 1 kao potpuno mlitav rep, Vrednost 2 unilateralna delimična slabost zadnjih udova; Vrednost 3 je potpuna parliza zadnjih udova; i Stepen 4 je znak da je životinja na samrti. (videti J. Exp. Med.194: 873-881, 2001). Kontrolni miš je žrtvovan istog dana kada i miš tretiran MOG-om. Kičmene moždine su izvađene u vreme žrtvovanja i brzo zamrznute da bi se koristile za analizu IL-17 proteina sa ELISA. Grupa tretirana IL-17 antitelom ima primetno manji stepen bolesti u odnosu na izotip kontrolnu grupu.

[0189] Lizati svake od kičmenih moždina u celosti su pripremljeni u 1 ml (ispitivanje 1 u Tabeli 9 u daljem tekstu) ili 0.4 ml (ispitivanje 2 u Tabeli 7 u daljem tekstu) reagensu za ekstrakciju proteina TPER (Pierce #78510) sa kompletnim inhibitorima proteaze (Roche Applied Science #11697498), u epruvetama od 2 ml koje sadrže keramičke kuglica (lysing matrix D, QBiogene #6913050), i FastPrep instrument (Bio101) tokom 30 sekundi na skali od 5.5. Posle lize, uzorci su centrifugirani (5 min. na 14,000 rpm u mikrofugi) da bi seukloili ostaci. Supernatantis su prebačeni u nove epruvete za mirkofugu. Ukupna koncetracija proteina u svkom lizatu je određena BCA kompletom za testiranja protiena (Pierce #23225), na mikroploči prema protokolu proizvođača. Lizati su smrznuti i skladišteni na -80°C.

[0190] Posle odmrzavanja lizata na ledu i posle bistrenja centrifugiranjem, nivoi IL-17 miša su merene u nerazblaženim izorcima pomoću ELISA (R&D Quantikine #M1700) prema instrukcijama proizvođača. Standardne krive su dobijene primenom četvoro-parametarske regresione krive. Vrednosti za IL-17 su određene iz standardnih kriva primenom standardnih statističkih tehnika. Nivoi IL-17 su normalizovani na koncetraciju proteina u svakom uzorku i izraženi kao pg IL-17/ml ukupnog proteina u svakom lizatu u Tabelama 9 i 10 u daljem tekstu. Kao što je dato podacima u tabelama, povećani nivoi IL-17 su detektovani kod EAE miševa.

Tabela 9

Tabela 10

Primer 13 Model artritisa indukovanog kolagenom

[0191] Artritis indukovan kolagenom (engl. Collagen-induced arthritis (CIA)) je široko korišćen model na glodarima za reumatoidni artritis ("RA") i ima histopatološke karakteristike zajednične sa RA čoveka. Eksperimentalni artritis, indulovan kod DBA/1 miševa imunskizacijom i pojačan emulzijama kolagena tipa II, je poliartritična bolest okarakteriana inflamacijom malih zglobova i progresivnom erozijom hrskavice i kostiju (Trentham, D, et al, J. Exp. Med.146:857-858, 1977). Nedavno, Lubberts, et al, (Arthritis & Rheumatism, 50:650-659, 2004; ovde inkorporirano) su pokazali da polklonsko zečije anti-mišije IL-17 antitelo, administrirano ili na početku ili u kasnije stadijumu CIA miša, poboljšava kliničke znake artritisa.

[0192] U modelu CIA, miševi kojima je davana jedna injekcija anti-mišijeg IL-17 IgG2a mAb pacova intraperitonealno (8mg/kg R&D, MAB421 klon 50104.11) pokazuju značajno manje kliničke vrednosti od miševa kojima je injektivano 16 mg/kg kontrolnog IgG2a pacova. Reaktant akutna faze, C-reaktivni protein (CRP), je prihvaćen indeks aktivnosti bolesti kod pacijenata sa RA. Slično CRP-u, serum amiloidni protein (SAP) miša služi kao indikator bolesti u modelu CIA miša (Bliven, M., et al, Arthritis & Rheumatism, 29:1131-1138, 1986). Kod životinja koje su tretirane sa 8 mg/kg anti-mišijeg IL-17, nivoi SAP su značajno niži neko kod od onih tretiranih sa kontrolnim antitelom. Dalje, sniženje kliničkih rezultata i vrednosti SAP može se porediti sa grupom anti-mišijeg IL-1β (8 mg/kg) koji je korišćen kao pozitivna kontrola. Konačno, značajno smenjenje sinovijalne inflamacije pri koncentraciji antitela od 8mg/kg i reposrpcije kostiju u koncentraciji antitela od 16 mg/kg je prisutna u odnosu na iste kod miševa koji su tretirani kontrolnim antitelom. Ispitivanje doza- odgovor je izvedeno u modelu CIA sa anti-mišijim IL-17 antitelom (npr., pri 0.1, 1 i 8 mg/kg). Klinički rezultati za anti-mišiji IL-17 pacova pokazuju trent za odgovor na dozu. Sličan test se može izvesti na cinomolgus majmunima kao model za RA koristeći antitelo pronalaska.

Primer 14 prečišćavanje Anti-IL-17 mAb

[0193] Vektor koji eksprimira mAb pronalaska je stablno inkorporiran u odgovarajuću ćeliju domaćina, (npr., CHO DG44 (dhfr-) ćelije (Chasin) ili NSO ćelije) prema standardnim procedurama i prečišćen na Protein A afinitetnoj koloni. Ukratko, bistar uravnotežen medijum je nanet na kolonu 5 ml HiTrap rProtein A Sepharose FF (Amersham Biosciences) koja je ekvilibrisana sa PBS –om (pH 7.4). Kolona je isprana sa 5 zapremina kolona pufera za ekvilibrciju pri protoku od 110 cm/hr da bi se isprale nespecifične komponente vezivanja.

Vezano antitelo je eluirano linearnim pH gradijentom (0.1 M natrijum fosfatni pufer pH 6.8 do 0.1 M natrijum citratni pufer pH 2.5). Sakupljen je glavni prik proteina prilikom eluiranja je i njegovo pH je podešeno na neutralno dodatkom 1 M Tris pufera (pH 8.5). Proteinski pul je koncentrovan do 1-2 mg/ml pomoću 10K Vivaspin membrane (Vivasciences) i sterilno profiltriran (0.45 µm) pre skladištenja na 4°C.

[0194] Za dobianja na veliko preparata mAb pronalaska, koncentrat slobodnih ćelija je prečišćen kroz tri sekvencijalno hromatografske kolone (Protein A, Anion Exchange, i Hydrophobic Interaction chromatography). Čistoća mAb posle ovih hromatografskih koraka je iznad 99% što je određeno analitičkom ekskluzionom hromatografijom. mAb je izmenjen u puferu kao što je dato u daljem tekstu, zavisno od koncentracije antitela. Rezultati hemijske stabilnost i ukazuju na to da poželjno pH iznosi između 6.i 7.0 (uključujući); iako za preprate od 20mg/ml, pH može da iznosi između 5.5 i 7.0 (uključujući, npr., 5.5., 5.6, 5.7., 5.8, 5.9, 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6., ili 7.0). Za liofilizovan proizvod, poželjan je nivo natrijum hlorida od 90- 30mM (90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35 ili 30 mM ili bilo koja vrednost između 30 i 90mM), dok za tečne formulacije (npr., za administraciju subkutano) poželjan je nivo natrijum hlorida od 100 - 150 mM (100, 110, 120, 130, 140, ili 150 mM ili bilo koja vrednost od 100 i 150 mM). Proizvod je zatim koncentrovan do krajnje koncentracije od oko 10, 20 ili 25 mg/ml (alternativno više, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150 mg/ml ili higher) i sterilno profiltriran. Profiltriran proizvod može da b ude trenutno zamrznut na -70°C ili može da bude liofiliziran. Minimalni odnos težina od 1:2 antitelo u odnosu na lioprotektant, (npr., sukroza ili trehaloza) je potreban za staiblno liofiliziranu formulaciju ali nije potreban za tečnu formulaciju. Dodatno, 0.02% surfaktant (t/z), tj., polisorbat-80, je dodat i u rastvor formulacije i rastvore za liofilizaciju. Liofilizovani materijal je ponovo suspendovan u sterilnoj vodi za injekciju ili sterilnom 0.9% natrijum hloridu pre administracije.

Table 11

Primer 15 In vivo poluživot antitela

[0195] Farmakokinetike antitela pronalaska (npr., mAb 126 and 121 [IgG4 Fc region sa Fab 126 ili 121 respectively]) u serumu određene su posle intravenske ili subkutane administracije mužjacima cinomolgus majmuna. Koncentracije antitela u serumu su određene primenom standardne ELISA probe za hvatanje (engl-capture) antigena, u kojoj su ploče obložene sa IL-17 čoveka i vezano serum antitelo je detektovano pomoću anti-IgG4sekundarnog antitela. Posle intravenske administracije 1 mg/kg, mAb 126 je elminisan sa srednjim polu-životom od 6.5 dana i mAb 121 je eliminisan sa srednjim polu-životom od oko 11 dana. Posle subkutane administracije 1 mg/kg, mAb 126 ima srednji polu-život eliminacije od 10.3 dana i mAb 121 ima srednji polu-život eliminacije od 13 dana.

Primer 16 Model Ksenografta Tumora

[0196] Da bi se utvrdili modeli ksenografta tumorakojim bi se testirala antitumorska aktivnost anti-IL-17 antitela pronalaska, 5 miliona ćelija HCT116 kolorektalnog karcinoma je pomešano sa Matrigel –om i subkutano injektirano u levi bok aritmičnih ženki starosti 56-nedelja (nu/nu) (Charles River laboratories, Wilmington. MA). Miševi su tretirani subkutanom injekcijom svakih 7 dana sa kontrolnim antitelim (npr., IgG4 čoveka i IgG1 miša), 4 mg/kg anti-humani-IL-17, 8 mg/kg anti-mišiji IL-17, ili kombinacija 4 mg/kg anti-humanog -IL-17 i 8 mg/kg anti-mišijeg -IL-17 tokom 4 nedelje. Prva administracija antitela počela je dan pre implantiranja ćelija. Tumori su mereni dva puta nedeljno pomoću nonijusa (šublera) i praćena je težina tela dva puta nedeljno. Plazma je sakupljena od svakog miša 34-og dana i nivoi KC su mereni pomoću KC ELISA kompleta prema instrukcijama proizvođača (R&D System). U odnosu na kontrolne miševe kojima je injektiran IgG, miševi tretirani kombinacijom anti-humanog IL-17 antitela i anti-mouse-IL-17 antitela imaju značajno smanjenu zapreminu tumor. Dalje, miševi tretirani i anti-humanim IL17 antitelom i anti-mišijim IL17 antitelom imaju značajno snižene vrednosti KC u plazmi. Miševi tretirani ili sa 4 mg/kg anti-humanog IL17 antitela ili sa 8 mg/kg anti-mišijeg IL17 antitela ne pokazuju značajno smanjenje zapremine tumora i nivoa KC u plazmi. Podaci su dati u Tabelama 12 i 13 u daljem tekstu.

[0197] Za merenje nivoa IL17 u tumorima, tumori iz modela mišijeg skenografta su pripremljeni kao što je opisano u Primeru 9. Za merenje proteina, lizati tumora su razblaženi 1:10 u TPER 1X Halt na polipropilenskoj ploči sa 96-ležišta. Koncentracija proteina jeodređena korišćenjem protokola za mikroploče od Coomassie Plus Protein Assay (Pierce #23236). BSA standard je razblažen u TPER Halt. Nivoi IL-17 proteina su određeni korišćenjem humanog i mišijeg IL-17 ELISA kompleta od R&D System prema instrukcijama proizvođača (human IL-17 DuoSet ELISA, R+D Systems, Cat. #DY317; mouse IL-17 ELISA, R+D System, Cat. # 421). IL-17 čoveka i miša su povećani u tumorima kod ksenograft modela HCT116 i HT29 tumora debelog creva u odnosu na ksenograft model H460 tumora pluća.

Tabela12 Zapremina tumora

Tabela 13 Nivo KC hemokina u plazmi, 35 dana posle implantacije

Claims (7)

1. PATENTNI ZAHTEVI 1. Humanizovano anti-IL-17 monoklonsko antitelo, naznačeno time što navedeno antitelo sadrži: a) peptid sa SEQ ID BR: 131 na CDRL1, b) peptid sa SEQ ID BR: 167 na CDRL2, c) peptid sa SEQ ID BR: 168 na CDRL3, d) peptid sa SEQ ID BR: 26 na CDRH1, e) peptid sa SEQ ID BR: 30 na CDRH2, i f) peptid sa SEQ ID BR: 52 na CDRH3.
2. 2. Humanizovano anti-IL-17 monoklonsko antitelo prema zahtevu 1, naznačeno time što navedeno antitelo sadrži aminokiselinsku sekvencu lakog lanca (LC) koja se sastoji od SEQ ID BR: 279 i aminokiselinsku sekvencu teškog lanca (HC) koja se sastoji od SEQ ID BR: 280, pri čemu, SEQ ID BR: 279 (LC) je: i pri čemu SEQ ID BR: 280 (HC) je:
3. 3. Humanizovao antitelo prema zahtevu 1, naznačeno time, što antitelo je antitelo cele dužine, suštinski intaktno antitelo, fragment Fab, fragment F(ab')2ili jednolančani fragment.Fv.
4. 4. Antitelo prema zahtevu 1 ili 3, naznačeno time što antitelo dodatno sadrži konstantan region teškog lanca odabran od IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM i IgD.
5. 5. Kompozicija koja sadrži antitelo prema bilo kom od zahteva 1 do 4 i pri čemu navedena kompozicija dodatno sadrži farmaceutski prihvatljiv nosač.
6. 6. Antitelo prema bilo kom od zahteva 1 do 4, za upotrebu kao lek.
7. 7. Antitelo prema bilo kom od zahteva 1 do 4 za upotrebu u lečenju jednog ili više stanja odabranih od reumatoidnog artritisa, inflamatorne bolesti creva, psorijaze i multiple skleroze.