RS52690B

RS52690B - Humana anti-ifn-gama neutrališuća antitela kao selektivni inhibitori ifn-gama puta

Info

Publication number: RS52690B
Application number: YU20050298A
Authority: RS
Inventors: Haichun Huang; Andrew A. Welcher; Hilary T. Chute; Yue-Sheng Li
Original assignee: Medarex Inc.; Amgen Inc.
Priority date: 2002-10-16
Filing date: 2003-10-16
Publication date: 2013-08-30
Also published as: JP2006508689A; EP1578936A4; ES2370473T3; HK1084689A1; CY1111812T1; EP2298811B8; EP1578936A2; NO336802B1; CN1820026B; ATE520416T1; SG155054A1; ME00205B; US8202976B2; CA2501653C; WO2004035747A3; US8906371B2; RS20050298A; AU2003285874A1; PT1578936E; AU2003285874A8

Abstract

Izolovano potpuno humano antitelo koje sadržiCDRl teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je predstavljena kao Sekvenca čiji je ID broj: 34;CDR2 teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je predstavljena kao Sekvenca čiji je ID broj: 35;CDR3 teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je predstavljena kao Sekvenca čiji je ID broj: 36 ili Sekvenca čiji je ID broj: 37;CDR1 lakog lanca koji sadrži Sekvencu čiji je ID broj: 38 ili Sekvencu čiji je ID broj: 39;CDR2 lakog lanca koji sadrži Sekvencu čiji je ID broj: 41; iCDR3 lakog lanca koji sadrži Sekvencu čiji je ID broj: 43; gde se navedeno antitelo specifično vezuje za humani INF-γ.Prijava sadrži još 22 patentna zahteva.

Description

Opis pronalaska

Ova prijava traži prioritet od U.S. privremene prijave br. 60/419,057, podnete 16. oktobra 2002. i od U.S. privremene prijave br, 60/479,241, podnete 17. juna 2003. godine.

Oblast pronalaska

Predmetni pronalazak se odnosi na humana monoklonska antitela koja se vezuju za interferon gama (IFN-y). Takođe, opisani su preparati i postupci tečenja oboljenja koja su posredovana iFN-f-

Stanje tehnike

Interferoni (IFN) su originalno dobili ime po svojoj sposobnosti da interferiraju sa virusnom infekcijom u ćelijama - domaćinima (Isaacs & Lindedman, 1957, Proc. R. Soc. 147

: 28 - 267). Od vremena njihovog otkrića, identifikovani su brojni članovi interferonske porodice koji poseduju različite biološke uloge pored antivirusne odbrane, uključujući uloge u ćelijskom rastu i ćelijskom imunitetu. Interferoni IFN-a, EFB-<p>\ IFN-oo i IFN-t su interferoni tipa I i vezuju se za tip I IFN receptom, dok je LFN-y interferon tipa II i vezuje se za tip U IFN receptor (Pfefier et al.t 1998, Cancer Res. 58 : 2489 - 2499^

Signalizacija sa IFN-7zavisi od najmanje pet različitih proteina: EFNGRl i IFNGR2 (podjedinice IFN-y receptora), Jaki, Jak2 i transkripcionog faktora STATI (Schindler & Damell, 1995, Annu. Rev. Biochem. 64 : 621 - 651; Bach et al., 1997, Annu. Rev. Immunol.

15 : 563 - 591). IFN-? reeeptori se nalaze na većini ćelijskih tipova, izuzev na zrelim eritrocitima (farrar & Schreiber, 1993, Annu. Rev. Immunol. 11 : 571 - 611). Jaki, Jak2 i STATI proteini posreduju u signalizaciji sa IFN-v.

IFN-v reguliše brojne biološke funkcije, kao što su antivirusni odgovori, ćelijski rast, imunološki odgovori i supresija tumorskog rasta, a takođe lFN-y može da bude posrednik u različitim humanim bolestima.Stoga, postoji potreba u struci za sredstvima koja modulišu biološku aktivnost IFN-v.

Opis pronalaska

Predmetni pronalazak obezbeđuje monoklonska antitela koja se vezuju za interferon-v (IFN-v) i polinukleotiđe koji ih kodiraju. Antitela mogu da inhibiraju ili modulišu najmanje jedno od bioloških dejstava EFN-7i mogu biti od koristi za ublažavanje efekata oboljenja u kojima je IFN-v posrednik. Takođe, predmetni pronalazak obezbeđuje ćelije hbridoma koje proizvode i koje mogu da sekretuju u ćelijsku kulturu monoklonska antitela prema predmetnom pronalasku. Antitela prema predmetnom pronalasku mogu biti od koristi u tečenju oboljenja u kojima je IFN-v posrednik.

U određenim rešenjima, predmetni pronalazak obezbeđuje antitela, opciono monoklonska antitela i/ili humana antitela, koja mogu da sadrže teški lanac i laki lanac, pri čemu teški lanac sadrži arninokiselinskii sekvencu koja je označena kao sekvenca čiji je ID broj 2, ili obezbeđuje antigen - vezujući ili imunološki funkcionalni imunoglobulinski fragment ovog antitela.

U određenim rešenjima, predmetni pronalazak obezbeđuje antitela, opciono monoklonska antitela, koja mogu biti humana antitela, koja sadrže teški lanac i laki lanac, pri čemu teški lanac sadrži konstantni region teškog lanca IgGl, IgG2 ili IgG4. U nekim rešenjima, antitelo prema predmetnom pronalasku sadrži aminokiselinsku sekvencu konstantnog regiona teškog lanca IgGl koja je označena kao sekvenca čiji je ID broj 2 ili sadrži njen antigen - vezujući ili imunološki funkcionalni imunoglobulinski fragment.

U određenim rešenjima, antitela prema predmetnom pronalasku sadrže teški lanac i laki lanac, pri čćemu je varijabilni region teškog lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je označena kao sekvenca čiji je ID broj 6, ili sekvenca čiji je ID broj 10, ili sekvenca čiji je ID broj 14, ili sekvenca čiji je ID broj 30, ili sadrži njen antigen - vezujući ili imunološki funkcionalni imunoglobulinski fragment. U drugim rešenjima, varijabilni region lakog lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je označena kao sekvenca čiji je ID broj 8, ili sekvenca čiji je ID broj 12, ili sekvenca čiji je ID broj 16, ili sekvenca čiji je ID broj 31, ili sadrži njen antigen - vezujući ili imunološki funkcionalni imunoglobulinski fragment. U dodatnim rešenjima, teški lanac se sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je označena kao sekvenca čiji je ID broj 17, ili sekvenca čiji je ID broj 19, ili sekvenca čiji je ID broj 21, ili sekvenca čiji je ID broj 32, ili sadrži njen antigen - vezujući ili imunološki funkcionalni imunoglobulinski fragment. Dalje, u još nekim rešenjima, laki lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je označena kao sekvenca čiji je ID broj 18, ili sekvenca čiji je ID bro]20, ili sekvenca čiji je ID broj 22 ili sekvenca čiji je ID broj 33, ili sadrži njen antigen - vezujući ili imunološki funkcionalni imunoglobulinski fragment.

Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje antitela koja se specifično vezuju za IFN-v, pri Čemu teški lanac sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je označena kao sekvenca čiji je ID broj 6, ili sadrži njen antigen - vezujući ili imunološki funkcionalni imunoglobulinski fragment, a laki lanac sadrži varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je označena kao sekvenca čiji je ID broj 8, ili sadrži njen antigen - vezujući ili imunološki funkcionalni imunoglobulinski fragment

U određenim rešenjima, predmetni pronalazak takođe obezbeđuje antitela i njihove imunološki funkcionalne imunoglobulinske fragmente, koji mogu specifično da se vežu za i/ili da inhibiraju ili modulišu biološku aktivnost IFN-v, a koja sadrže taški lanac i laki lanac, pri čemu teški lanac sadrži varijabilni region teškog lanca, a varijabilni region teškog lanca sadrži sekvencu koja je najmanje 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili oko 99% identična sa aminokisetinskom sekvertcom koja je označena kao sekvenca čiji je ID broj 6, a gde laki lanac sadrži varijabilni region lakog lanca, pri čemu varijabilni region lakog lanca sadrži sekvencu koja je najmanje 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili oko 99% identična sa aminokiselmskom sekvencom koja je označena kao sekvenca čiji je ID broj 8, pri Čemu antitelo interaguje sa IFN-v.

Predmetni pronalazak dalje obezbeđuje antitela koja mogu da inhibiraju ili modulišu biološku aktivnost i/ili da se specifično vezuju za EFN-v, pri Čemu teški lanac sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je označena kao sekvenca čiji je ID broj 10, ili sadrži njen antigen - vezujući ili imunološki funkcionalni imunoglobulinski fragment, a laki lanac sadrži varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je označena kao sekvenca čiji je ID broj 12, ili sadrži njen antigen - vezujući ili imunološki funkcionalni imunoglobulinski fragment.

U određenim rešenjima, predmetni pronalazak obezbeđuje antitela koja mogu da inhibiraju ili modulišu biološku aktivnost i/ili da se specifično vežu za IFN-y, a koja sadrže taški lanac i laki lanac, pri čemu teški lanac sadrži varijabilni region teškog lanca, a varijabilni region teškog lanca sadrži sekvencu koja je najmanje 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili oko 99% identična sa aminokiselinskom sekvencom koja je označena kao sekvenca čiji je ID broj 10, a gde laki lanac sadrži varijabilni region lakog lanca, pri čemu varijabilni region lakog lanca sadrži sekvencu koja je najmanje 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili oko 99% identična sa aminokiselinskom sekvencom koja je označena kao sekvenca čiji je ID broj 12, pri Čemu antitelo interaguje sa IFN^v.

Predmetni pronalazak dalje obezbeđuje antitela koja mogu da inhibiraju ili modulišu biološku aktivnost i/ili da se specifično vezuju za IFN-v, pri Čemu teški lanac sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je označena kao sekvenca čiji je ID broj 30, ili sadrži njen antigen - vezujući ili imunološki funkcionalni imunoglobulinski fragment, a laki lanac sadrži varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je označena kao sekvenca čiji je ID broj 12, ili sadrži njen antigen - vezujući ili imunološki funkcionalni imunoglobulinski fragment.

U određenim rešenjima, predmetni pronalazak obezbeđuje antitela koja mogu da inhibiraju ili modulišu biološku aktivnost i/ili da se specifično vežu za IFN-y, a koja sadrže taški lanac i laki lanac, pri čemu teški lanac sadrži varijabilni region teškog lanca, a varijabilni region teškog lanca sadrži sekvencu koja je najmanje 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili oko 99% identična sa aminokiselinskom sekvencom koja je označena kao sekvenca čiji je ID broj 30, a gde laki lanac sadrži varijabilni region lakog lanca, pri čemu varijabilni region lakog lanca sadrži sekvencu koja je najmanje 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili oko 99% identična sa aminokiselinskom sekvencom koja je označena kao sekvenca čiji je ID broj 12, pri čemu antitelo interaguje sa IFN-v.

Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje antitela koja mogu da inhibiraju ili modulišu biološku aktivnost i/ili da se specifično vezuju za IFN-y, pri čemu teški lanac sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je označena kao sekvenca čiji je ID broj 14, ili sadrži njen antigen - vezujući ili imunološki funkcionalni imunoglobulinski fragment, a laki lanac sadrži varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je označena kao sekvenca čiji je ID broj 16, ili sadrži njen antigen - vezujući ili imunološki funkcionalni imunoglobulinski fragment.

U određenim rešenjima, predmetni pronalazak obezbeđuje antitela koja se specifično vezuju i/ili koja mogu da inhibiraju ili modulišu biološku aktivnost IFN-y, a koja sadrže taški lanac i laki lanac, pri čemu teški lanac sadrži varijabilni region teškog lanca, a varijabilni region teškog lanca sadrži sekvencu koja je najmanje 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili oko 99% identična sa animokiselinskom sekvencom koja je označena kao sekvenca čiji je ID broj 14, a gde laki lanac sadrži varijabilni region lakog lanca, pri čemu varijabilni region lakog lanca sadrži sekvencu koja je najmanje 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili oko 99% identična sa aminokiselinskom sekvencom koja je označena kao sekvenca čiji je ID broj 16, pri čemu antitelo interaguje sa EFN^f.

Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje antitela koja mogu da inhibiraju ili modulišu biološku aktivnost i/ili da se specifično vezuju za IFN-v, pri Čemu teški lanac sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je označena kao sekvenca čiji je ID broj 14, ili sadrži njen antigen - vezujući ili imunološki funkcionalni imunoglobulinski fragment, a laki lanac sadrži varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je označena kao sekvenca čiji je ID broj 31, ili sadrži njen antigen- vezujući ili imunološki funkcionalni imunoglobulinski fragment.

U određenim rešenjima, predmetni pronalazak obezbeđuje antitela koja mogu da inhibiraju ili modulišu biološku aktivnost i/ili da se specifično vežu za IFN-v, a koja sadrže taški lanac i laki lanac, pri čemu teški lanac sadrži varijabilni region teškog lanca, a varijabilni region teškog lanca sadrži sekvencu koja je najmanje 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili oko 99% identična sa aminokiselinskom sekvencom koja je označena kao sekvenca čiji je ID broj 14, a gde laki lanac sadrži varijabilni region lakog lanca, pri čemu varijabilni region lakog lanca sadrži sekvencu koja je najmanje 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili oko 99% identična sa aminokiselinskom sekvencom koja je označena kao sekvenca Čiji je ID broj 31, pri čemu antitelo interaguje sa EFN-y.

Predmetni pronalazak dalje obezbeđuje antitela koja mogu da inhibiraju ili modulišu biološku aktivnost i/ili da se specifično vezuju za IFN-y, pri čemu teški lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je označena kao sekvenca čiji je ID broj 17, ili sadrži njen antigen - vezujući ili imunološki funkcionalni imunoglobulinski fragment, a laki lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je označena kao sekvenca čiji je ID broj 18, ili sadrži njen antigen - vezujući ili imunološki funkcionalni imunoglobulinski fragment.

U određenim rešenjima, predmetni pronalazak obezbeđuje antitela koja mogu da inhibiraju ili modulišu biološku aktivnost i/ili da se specifično vežu za IFN-y, a koja sadrže taški lanac i laki lanac, pri Čemu teški lanac sadrži varijabilni region teškog lanca, a varijabilni region teškog lanca sadrži sekvencu koja je najmanje 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili oko 99% identična sa aminokiselinskom sekvencom koja je označena kao sekvenca čiji je ID broj 17, a gde laki lanac sadrži varijabilni region lakog lanca, pri čemu varijabilni region lakog lanca sadrži sekvencu koja je najmanje 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili oko 99% identična sa aminokiselinskom sekvencom koja je označena kao sekvenca čiji je ID broj 18, pri čemu antitelo interaguje sa IFN^.

Predmetni pronalazak dalje obezbeđuje antitela koja mogu da inhibiraju iH modulišu biološku aktivnost i/ili da se specifično vezuju za IFN-v, pri čemu teški lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je označena kao sekvenca čiji je ID broj 19, ili sadrži njen antigen - vezujući ili imunološki funkcionalni imunoglobulinski fragment, a laki lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je označena kao sekvenca Čiji je ID broj 20, ili sadrži njen antigen - vezujući ili imunološki funkcionalni imunoglobulinski fragment.

U određenim rešenjima, predmetni pronalazak obezbeđuje antitela koja mogu da inhibiraju ili modulišu biološku aktivnost i/ili da se specifično vežu za IFN-y, a koja sadrže taški lanac i laki lanac, pri čemu teški lanac sadrži varijabilni region teškog lanca, a varijabilni region teškog lanca sadrži sekvencu koja je najmanje 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili oko 99% identična sa aminokiselinskom sekvencom koja je označena kao sekvenca čiji je ID broj 19, a gde laki lanac sadrži varijabilni region lakog lanca, pri čemu varijabilni region lakog lanca sadrži sekvencu koja je najmanje 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili oko 99% identična sa aminokiselinskom sekvencom koja je označena kao sekvenca Čiji je ID broj 20, pri čemu antitelo interaguje sa IFN-^.

Predmetni pronalazak dalje obezbeđuje antitela koja mogu da inhibiraju ili modulišu biološku aktivnost tfili da se specifično vezuju za IFN-v, pri čemu teški lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je označena kao sekvenca čiji je ID broj 21, ili sadrži njen antigen - vezujući ili imunološki funkcionalni imunoglobulinski fragment, a laki lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je označena kao sekvenca čiji je ID broj 22, ili sadrži njen antigen - vezujući ili imunološki funkcionalni imunoglobulinski fragment.

U određenim rešenjima, predmetni pronalazak obezbeđuje antitela koja mogu da inhibiraju ili modulišu biološku aktivnost i/ili da se specifično vežu za IFN-v, a koja sadrže taški lanac i laki lanac, pri čemu teški lanac sadrži varijabilni region teškog lanca, a varijabilni region teškog lanca sadrži sekvencu koja je najmanje 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili oko 99% identična sa aminokiselinskom sekvencom koja je označena kao sekvenca čiji je ID broj 21, a gde laki lanac sadrži varijabilni region lakog lanca, pri čemu varijabilni region lakog lanca sadrži sekvencu koja je najmanje 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili oko 99% identična sa aminokiselinskom sekvencom koja je označena kao sekvenca čiji je ID broj 22, pri čemu antitelo interaguje sa IFN-7.

Predmetni pronalazak dalje obezbeđuje antitela koja mogu da inhibiraju ili modulišu biološku aktivnost i/ili da se specifično vezuju za IFN-v, pri čemu teški lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je označena kao sekvenca čiji je ID broj 32, ili sadrži njen antigen - vezujući ih* imunološki funkcionalni imunoglobulinski fragment, a laki lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je označena kao sekvenca čiji je ID broj 20, ili sadrži njen antigen - vezujući ili imunološki funkcionalni imunoglobulinski fragment.

U određenim rešenjima, predmetni pronalazak obezbeđuje antitela koja mogu da inhibiraju ili modulišu biološku aktivnost i/ili da se specifično vežu za IFN-v, a koja sadrže taški lanac i laki lanac, pri čemu teški lanac sadrži varijabilni region teškog lanca, a varijabilni region teškog lanca sadrži sekvencu koja je najmanje 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili oko 99% identična sa aminokiselinskom sekvencom koja je označena kao sekvenca Čiji je ID broj 32, a gde laki lanac sadrži varijabilni region lakog lanca, pri čemu varijabilni region lakog lanca sadrži sekvencu koja je najmanje 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili oko 99% identična sa aminokiselinskom sekvencom koja je označena kao sekvenca čiji je ID broj 20, pri čemu antitelo interaguje sa IFN-y.

Predmetni pronalazak dalje obezbeđuje antitela koja mogu da inhibiraju ili modulišu biološku aktivnost i/ili da se specifično vezuju za EFN-y, pri čemu teški lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je označena kao sekvenca čiji je ID broj 21, ili sadrži njen antigen - vezujući ili imunološki funkcionalni imunoglobulinski fragment, a laki lanac sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je označena kao sekvenca čiji je ID broj 33, ili sadrži njen antigen - vezujući ili imunološki funkcionalni imunoglobulinski fragment.

U određenim rešenjima, predmetni pronalazak obezbeđuje antitela koja mogu da inhibiraju ili modulišu biološku aktivnost i/ili da se specifično vežu za IFN-y, a koja sadrže taški lanac i laki lanac, pri čemu teški lanac sadrži varijabilni region teškog lanca, a varijabilni region teškog lanca sadrži sekvencu koja je najmanje 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili oko 99% identična sa aminokiselinskom sekvencom koja je označena kao sekvenca čiji je ID broj 21, a gde laki lanac sadrži varijabilni region lakog lanca, pri čemu varijabilni region lakog lanca sadrži sekvencu koja je najmanje 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili oko 99% identična sa aminokiselinskom sekvencom koja je označena kao sekvenca čiji je ID broj 33, pri čemu antitelo interaguje sa EFN-7.

Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje jednolančana antitela, jednolančana Fv antitela, F(ab) antitela, F(ab)' antitela i F(ab<*>)2antitela.

U određenim rešenjima, predmetni pronalazak obezbeđuje laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je označena kao sekvenca čiji je ID broj 8, sekvenca Čiji je ID broj 12, sekvenca čiji je ID broj 16, sekvenca čiji je ID broj 18, sekvenca čiji je ID broj 20, sekvenca čiji je ID broj 22, sekvenca Čiji je ID broj 31 ili sekvenca čiji je ID broj 33, ili sadrži njen antigen - vezujući ili imunološki funkcionalni imunoglobulinski fragment.

Dodatno, predmetni pronalazak obezbeđuje teški lanac kojiSadrži aminokiselinsku sekvencu koja je označena kao sekvenca čiji je ID broj 6, sekvenca čiji je ID broj 10, sekvenca čiji je ID brcjl4, sekvenca čiji je ID broj 17, sekvenca čiji je ID broj 19, sekvenca Čiji je ID broj 21, sekvenca čiji je ID broj 30 ili sekvenca čiji je ID broj32, ili sadrži njen antigen - vezujući ili imunološki funkcionalni imunoglobulinski fragment.

Predmetni pronalazak se takođe odnosi na izolovana humana antitela koja se specifično vezuju za IFN-y, pri čemu antitelo sadrži: (a) humane okvirne regione teškog lanca, humani CDR1 region teškog lanca, humani CDR2 region teškog lanca i humani CDR3 region teškog lanca; i *(b) humane okvirne regione lakog lanca, humani CDR1 region lakog lanca, humani CDR2 region lakog lanca i humani CDR3 region lakog lanca. U određenim rešenjima, humani CDR1 region teškog lanca može biti CĐR1 region teškog lanca monoklonskog antitela (mAt) 1119, 1118, 1118<*>ili 1121, kao što je prikazano na Slici 12 i sekvencom čiji je ID broj 34, a humani CDR1 region lakog lanca može biti humani CDR1 region lakog lanca mAt 1119, 1118, 1121<*>ili 1121, kao Što je prikazano na Slici 13 i sekvencom čiji je ID broj 38, sekvencom čiji je ID broj 40 ili sekvencom čiji je ID broj 40. U drugim rešenjima, humani CDR2 region teškog lanca može biti CDR2 region teškog lanca mAt 1119, 1118, 1118<*>ili 1121, kao što je prikazano na Slici 12 i sekvencom čiji je ID broj 35, a humani CDR2 region lakog lanca može biti humani CDR2 region lakog lanca mAt 1119, 1118, 1121* ili 1121, kao što je prikazano na Slici 13 i sekvencom čiji je ID broj 41 ili sekvencom čiji je ID broj 42. U drugim rešenjima, humani CDR3 region teškog lanca može biti CDR3 region teškog lanca mAt 1119, 1118, II18<*>ili 1121, kao što je prikazano na Slici 12 i sekvencom čiji je ID broj 36 ili sekvencom čiji je iD broj 37, a humani CDR3 region lakog tanca može biti humani CDR3 region lakog lanca mAt 1119,1118,1121 * ili 1121, kao što je prikazano na Slici 13 i sekvencom čiji je ID broj 43ili sekvencom čiji je ID broj 44.

Dodatno, predmetni pronalazak obezbeđuje postupak za lečenje oboljenja koje je udruženo sa povećanom proizvodnjom ili povećanom osetljivošću prema IFN-y i/ili oboljenja kod koga je IFN-y posrednik, a obuhvata korak primene farmaceutski efikasne količine jednog ili mnoštva monoklonskih antitela prema predmetnom pronalasku ili njihovih antigen - vezujućih ili imunološki funkcionalnih imunoglobulinskih fragmenata, kod osobe kojoj je ovakav tretman potreban.

Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje postupke za određivanje nivoa IFN-v u biološkom uzorku, uključujući korak mešanja uzorka sa monoklonskim antitelom prema predmetnom pronalasku ili sa njegovim antigen - vezujućim fragmentom.

Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje izolovano antitelo koje se specifično vezuje za i/ili inhibira ili moduliše biološku aktivnost IFN-v, a sadrži CDR3 region teškog lanca koji sadrži: (a) aminokiselinsku sekvencu koja se sastoji od najmanje 7 aminokiselina sekvence čiji je ID broj 36, u istom redosledu i prostornom rasporedu kao u sekvenci čiji je ID broj 36; ili (b) arrlinokiselinsku sekvencu koja sadrži sekvencu čiji je ID broj 37. Antitelo može dalje da sadrži CDR3 region lakog lanca koji sadrži: (a) aminokiselinsku sekvencu koja se sastoji od najmanje 8 aminokiselina sekvence Čiji je ID broj 43, u istom redosledu i prostornom rasporedu kao u sekvenci čiji je ID broj 43; ili (b) aminokiselinsku sekvencu koja sadrži barem 9 aminokiselina sekvence čiji je ID broj 44 u istom redosledu i prostornom rasporedu kao u sekvenci čiji je ID broj 44. Antitelo može dalje da sadrži jedan ili više CDR regiona koji su izabrani iz grupe koju čine: sekvenca Čiji je ID broj 34, sekvenca čiji je ID broj 35, sekvenca Čiji je ID broj 38, sekvenca čiji je ID broj 39, sekvenca čiji je ID broj 40, sekvenca čiji je ID broj 41 i sekvenca čiji je ID broj 42. CDR3 region teškog lanca može da sadrži najmanje aminokiseline sekvence čiji je ID broj 36, a CDR3 region lakog lanca može da sadrži najmanje aminokiseiine sekvence čiji je ID broj 36 ili najmanje od aminokiselina sekvenca čiji je ID broj 43.

Dodatno, predmetni pronalazak obezbeđuje izolovana antitela koja mogu specifično da se vežu za i/ili da inhibiraju ili modulišu biološku aktivnost IFN-y, a sadrže CDR3 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom koja sadrži: (a) aminokiselinsku sekvencu koja se sastoji od najmanje 8 aminokiselina sekvence čiji je ID broj 43, u istom redosledu i prostornom rasporedu kao u sekvenci čiji je ID broj 43; ili (b) aminokiselinsku sekvencu koja sadrži barem 9 aminokiselina sekvence čiji je ID broj 44 u istom redosledu i prostornom rasporedu kao u sekvenci čiji je ID broj 44. Antitelo može dalje da sadrži CDR čija je aminokisleinska sekvenca označena kao sekvenca Čiji je ID broj 35, sekvenca čiji je ID broj 38, sekvenca čiji je ID broj 39, sekvenca čiji je ID broj 40, sekvenca čiji je ID broj 41 ili sekvenca čiji je ID broj 42.

Izolovano antitelo prema predmetnom pronalasku, koje može da se specifično veže za i/ili da inhibira ili moduliše biološku aktivnost IFN-v, može da sadrži šest CDR regiona koji sadrže njamanje: (a) aminokiselinsku sekvencu čiji je ID broj 34; (b) aminokiselinsku sekvencu čiji je ID broj 35; (c) aminokiselinsku sekvencu čiji je ID broj 36 ili aminokiselinsku sekvencu čiji je ID broj 37; (d) aminokiselinsku sekvencu čiji je ID broj 38, sekvencu Čiji je ID broj 39 ili sekvencu čiji je ID broj 40; (e) aminokiselinsku sekvencu čiji je ID broj 41 ili sekvencu čiji je ID broj 42; i (f) aminokiselinsku sekvencu Čiji je ID broj 43 ili sekvencu čiji je ID broj 44.

Izolovano antitelo prema predmetnom pronalasku, koje može specifično da se veže za i/Hi da inhibira ili moduliše biološku aktivnost IFN-v, može da sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili oko 99% identična sa sekvencom koja je označena kao sekvenca čiji je ID broj 6, sekvenca čiji je ID broj 10, sekvenca čiji je ID broj 14 ili sekvenca čiji je ID broj 30, pri čemu se upoređivanje između te aminokiselinske sekvence i sekvence Čiji je ID broj 6, sekvence čiji je ID broj 10, sekvence čiji je ID broj 14 ili sekvence čiji je ID broj 30 proteže na rajmanje 50 aminokiselina, i/ili može da sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili oko 99% identična sa sekvencom koja je označena kao sekvenca čiji je ID broj 8, sekvenca čiji je ID broj 12, sekvenca čiji je ID broj 16 ili sekvenca čiji je ID broj 31, pri čemu se upoređivanje između te aminokiselinske sekvence i sekvence čiji je ID broj 8, sekvence čiji je ID broj 12, sekvence čiji je ID broj 16 ili sekvence čiji je ID broj 31 proteže na najmanje 50 aminokiselina.

U drugom rešenju, antitela prema predmetnom pronalasku, koja mogu specifično da se vežu za i/ili da inhibira ili moduliše biološku aktivnost IFN-v, mogu da sadrže aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili oko 99% identična sa sekvencom koja je označena kao sekvenca Čiji je ID broj 17, sekvenca čiji je ID broj 19, sekvenca čiji je ID broj 21 ili sekvenca čiji je ID broj 32, pri čemu se upoređivanje između te aminokiselinske sekvence i sekvence čiji je ID broj 17, sekvence čiji je ID broj 19, sekvence čiji je ID broj 21 ili sekvence čiji je ID broj 32 proteže na najmanje 50 aminokiselina, i/ili može da sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili oko 99% identična sa sekvencom koja je označena kao sekvenca čiji je ID broj 18, sekvenca čiji je ID broj 20, sekvenca čiji je ID broj 22 ili sekvenca čiji je ID broj 33, pri čemu se oporezivanje između te aminokiselinske sekvence i sekvence čiji je ID broj 18, sekvence Čiji je ID broj 20, sekvence čiji je ID broj 22 ili sekvence čiji je ID broj 33 proteže na najmanje 50 aminokiselina. Jedna aminokiselinska sekvenca ovih antitela može da sadrži najmanje 5 aminokiselina sekvence Čiji je ID broj 36 ili sekvence čiji je ID broj 37, u istom redosledu i prostornom rasporedu kao u sekvenci čiji je ID broj 36 ili sekvenci čiji je ID broj 37, i/ili jedna aminokiselinska sekvenca ovih antitela može da sadrži najmanje 6 aminokiselina sekvence čiji je ID broj 43 ili sekvence Čiji je ID broj 44, u istom redosledu i prostornom rasporedu kao u sekvenci čiji je ID broj 43 ili sekvenci Čiji je ID broj 44.

U jednom rešenju, predmetni pronalazak obezbeđuje antitelo, koje može biti izolovano, u potpunosti humano antitelo koje može da inhibira ili moduliše biološku aktivnost humanog IFN-v. U drugom rešenju, antitelo prema predmetnom pronalasku, koje može biti izolovano, u potpunosti humano antitelo, nemože da inhibira ili moduliše biološku aktivnost IFN-v Cvnomolgus majmuna ili miša. U još jednom rešenju, potpuno humano antitelo prema predmetnom pronalasku može da inbibir aili da moduliše biološku aktivnost IFN-v Čoveka ili šipmanze, ali nemože da inhibira ili moduliše biološku aktivnost IFN-v Cvnomolgus majmuna i/ili miša. U još jednom rešenju, supstitucija ostatka 19 humanog IFN-v sa asparaginskom kiselinom i/ili ostatka 20 sa prolinom, sprečava ili antagonizuje inhibiciju biološke aktivnosti humanog IFN-v pomoću antitela. Dalje, antitelo može da inhibira biološku aktivnost mutirane verzije IFN-^Cvnomolgus majmuna, koja je supstituisana na ostacima 19, 20 i 65 sa histidinom, serinom i serinom, respektivno.

U daljim rešenjima, izolovana antitela prema predmetnom pronalasku, koja mogu specifično da se vežu za i/ili da inhibiraju ili modulišu biološku aktivnost IFN-v, mogu da sadrže aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili oko 99% identična sa sekvencom koja je označena kao sekvenca čiji je ID broj 17, sekvenca Čiji je ID broj 19, sekvenca čiji je ID broj 21 ili sekvenca čiji je ID broj 32, pri čemu se upoređivanje između te aminokiselinske sekvence i sekvence čiji je ID broj 17, sekvence čiji je ID broj 19, sekvence čiji je ID broj 21 ili sekvence čiji je ID broj 32 proteže na najmanje 50 aminokiselina, i/ili može da sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili oko 99% identična sa sekvencom koja je označena kao sekvenca čiji je ID broj 18, sekvenca Čiji je ID broj 20, sekvenca čiji je ID broj 22 ili sekvenca čiji je ID broj 33, pri čemu se upoređivanje između te aminokiselinske sekvence i sekvence čiji je ID broj 18, sekvence čiji je ID broj 20, sekvence čiji je ID broj 22 ili sekvence Čiji je ID broj 33 proteže na najmanje 50 aminokiselina.

U drugom rešenju, predmetni pronalauak obezbeđuje izolovano antitelo, koje može da se specifično veže za IFN-v i koje sadrži: (a) aminokiselinsku sekvencu koja sadrži sekvencu čiji je ID broj 6, sekvencu čiji je ID broj 10, sekvencu čiji je ID broj 14 ili sekvencu čiji je ID broj 30, ili sadrži njen fragment; (b) aminokiselinsku sekvencu koja sadrži sekvencu čiji je ID broj 8, sekvencu čiji je ID broj 12, sekvencu čiji je ID broj 16 ili sekvencu čiji je ID broj 31, ili njen fragment. Antitelo može da sadrži teški lanac i laki lanac. Antitelo može da sadrži: (a) sekvencu čiji je ID broj 6, sekvencu čiji je ID broj 10, sekvencu čiji je ID broj 14 ili sekvencu čiji je ID broj 30, i (b) sekvencu čiji je ID broj 8, sekvencu čiji je ID broj 12, sekvencu čiji je ID broj 16 ili sekvencu čiji je ID broj 31.

Dalje, svako od antitela prema predmetnom pronalasku može biti hurnanizovano antitelo ili potpuno humano antitelo.

Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje polinukleotide, uključujući izolovane polinukleotide, koji kodiraju svako od antitela prema predmetnom pronalasku ili njihove deloe, kao što je ovde opisano, uključujući CDR regione, varijabilne regione teškog lanca, varijabilne regione lakog lanca, jednolančana antitela, jednolančana Fv antitela, F(ab) antitela, F(ab)' antitela i (Fab')2antitela. Predmetni pronalazak dalje obezbeđuje vektore koji sadrže takve polinukleotide i ćelije - domaćine, opciono sisarske ćelije - domaćine, koje sadrže takve polinukleotide i/ili vektore. Antitela prema predmetnom pronalasku mogu da se proizvode kultivacijom navedenih ćelija - domaćina.

Specifična poželjna rešenja prema predmetnom pronalasku će biti jasna na osnovu detaljnijeg opisa određenih poželjnih rešenja i patentnih zahteva koji slede.

Kratak opis crteža

Slike 1A - 1B prikazuju nukleotidnu sekvencu dela cDNK (Slika 1 A; sekvenca čiji je ID broj 1) koji kodira aminokiselinsku sekvencu (Slika 1B; sekvenca čiji je ID broj 2) konstantnog ergiona teškog lancaanti IFN-v antiitela 1118,1118*, 1119,1121 i 1121*.

Slike 2A - 2B prikazuju nukleotidnu sekvencu dela cDNK (Slika 2A; sekvenca čiji je ID broj 3) koji kodira aminokiselinsku sekvencu (Slika 2B; sekvenca čiji je ID broj 4) konstantnog regiona lakoglanca anti IFN-y antiitela 1118,1118<*>, 1119,1121 i 1121<*>.

Slike 3 A - 3Đ prikazuju nukleotidnu sekvencu dela cDNK (Slika 3 A; sekvenca čiji je ID broj 5) koji kodira aminokiselinsku sekvencu (Slika 3Đ; sekvenca čiji je ID broj 6) varijabilnog regiona teškog lanca anti IFN-v antiitela 1119.

Slike 4A - 4B prikazuju nukleotidnu sekvencu dela cDNK (Slika 4A; sekvenca čiji je ID broj 7) koji kodira aminokiselinsku sekvencu (Slika 4B; sekvenca čiji je ID broj 8) varijabilnog regiona lakog lanca anti IFN-v antiitela 1119.

Slike 5A - SB prikazuju nukleotidnu sekvencu dela cDNK (Slika 5A; sekvenca čiji je ID broj 9) koji kodira aminokiselinsku sekvencu (Slika SB; sekvenca čiji je ID broj 10) varijabilnog regiona teškog lanca anti IFN-v antiitela 1118. Slika 5G prikazuje aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca (sekvenca čiji je ID broj 30) anti-EFN-v antitela 1118<*.>Slika SD prikazuje nukleotidnu sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca (sekvenca Čiji je ID broj 56) anti- IFN-y antitela 1118<*>.

Slike 6A - 6B prikazuju nukleotidnu sekvencu dela cDNK. (Slika 6A; sekvenca čiji je ID broj 11) koji kodira aminokiselinsku sekvencu (Slika 6B; sekvenca čiji je ID broj 12) varijabilnog regiona lakog lanca anti IFN^v antiitela 1118 ili 1118<*>.

Slike 7A - 7B prikazuju nukleotidnu sekvencu dela cDNK (Slika 7A; sekvenca čiji je ID broj 13) koji kodira aminokiselinsku sekvencu (Slika 7B; sekvenca čiji je ID broj 14) varijabilnog regiona teškog lanca anti IFN-v antiitela 1121 ili 1121<*>.

Slike 8A - 88 prikazuju nukleotidnu sekvencu dela cDNK (Slika 8A; sekvenca čiji je ID broj 15) koji kodira aminokiselinsku sekvencu (Slika 8B; sekvenca čiji je ID broj 16) varijabilnog regiona lakog lanca anti IFN-y antiitela 1121. Slika 8C prikazuje aminokiselinsku sekvencu (sekvenca čiji je ID broj 31) varijabilnog regiona lakog lanca anti- IFN-y antitela 1121<*>. Slika 8D prikazuje nukleotidnu sekvencu (sekvenca čiji je ID broj 57) varijabilnog regiona lakog lanca anti- IFN-y antitela 1121<*>.

Slika 9 predstavlja grafikon koji prikazuje neutralizaciju ili inhibiciju biološke aktivnosti IFN-y u A549 biološkom testu korišćenjem 1119, 1118 i 1121 monoklonskih antitela.

Slika 10 predstavlja grafikon koji prikazuje neutralizaciju ili inhibiciju biološke aktivnosti IFN-v u THP-1/HLA DR biološkom testu korišćenjem 1119, 1118 i 1121 monoklonskih antitela.

Slika 11 predstavlja grafikon koji prikazuje neutralizaciju ili inhibiciju biološke aktivnosti IFN-v u biološkom testu pune krvi (dva donatora) korišćenjem 1119 monoklonskih antitela.

Slika 12 predstavlja upoređivanje aminoterrrunamih delova (uključujući varijabilni region) teških lanaca anti-IFN-y monoklonskih antitela označenih kao 118, 1118<*>, 1121 i 1119. Sekvence obuhvataju signalnu sekvencu kodiranu sa cDNK koja je izolovana u Primeru 3. Signalna sekvenca se proteže od položaja 1 do položaja 19. CDR-ovi su podvušeni. Kao što je prikazano na Slici, CDR1 se proteže od aminokiselina 50 - 54, CDR2 se proteže od aminokiselina 69 - 85, a CDR3 se proteže od aminokiselina 118 - 125. Sistem numeracije opisan od strane Kabata i saradnika (1991, Sequences od Proteins of Immunological Interest, Public Health Service N.I.H, Bethesda, MD) počinje od prve aminokiseline zrelog antitela i isključuje signalnu sekvencu. Stoga, položaj 20 na ovoj Slici odgovara položaju 1 po Kabat-u i saradnicima (navedeno iznad).

Slika 13 predstavlja upoređivanje aminoterminalnih delova (uključujući varijabilni region) lakih lanaca anti-IFN-Ymonoklonskih antitela označenih kao 118, 1118<*>, 1121 i 1119. Sekvence obuhvataju signalnu sekvencu kodiranu sa cDNK koja je izolovana u Primeru 3. Signalna sekvenca se proteže od položaja 1 do položaja 20. CDR-ovi su podvušeni. Kao što je prikazano na Slici, CDR1 se proteže od aminokiselina 44 - 55, CDR2 se proteže od aminokiselina 71 - 77, a CDR3 se proteže od aminokiselina 110 - 118. Sistem numeracije opisan od strane Kabata i saradnika (navedeno iznad) isključuje signalnu sekvencu, tako da položaj 21 na ovoj Slici odgovara položaju 1 po Kabatu i saradnicima.

Slika 14 prikazuje proizvodnju IP-10 u odgovoru na IFN-y pune krvi uzete od Šimpanze 2 ili 1 nedelju pre (redovi označeni sa<M->2" i M" na Slici 14) ili 2, 8, 15, 29 ili 36 dana nakon (redovi označeni sa "2", "8", "15", "29" ili "361' na Slici 14) početka tretmana od 3 injekcije anti-IFN-y antitela, koje se daju jednom nedeljno.

Slika 15 je slična Slici 14, s tim daje korišćena krv drugog šimpanze.

Detaljan opis pronalaska

Ovde naznačeno poglavlje služi isključivo za organizaciju teksta i ni na koji način ne ograničava opisanu subjektnu materiju. Sve reference koje su citirane u ovoj prijavi su ovde jasno inkorporirane po referenci u bilo koju svrhu da se koriste.

Definicije

Mogu se koristiti standardne tehnike za rekombinantnu DNK, sintezu oligonukleotida i kulturu tkiva i transformaciju ćelija (npr. elektroporacija, lipofekcija). Enzimske reakcije i tehnike prečišćavanja se mogu izvoditi prma uputstvima proizvođača ili na način koji je uobičajen u struci ili na način koji je ovde opisan. Tehnike i postupci koje će biti opisani mogu generalno da se izvedu korišćenjem konvencionalnih postupaka koji su dobro poznati u struci i koji su opisani u različitim opštim ili specifičnijim referencama koje su citirane i diskutovane u predmetnoj specifikaciji. Videti, npr., Sarnbrook et al., 2001, Molecular Cloning: A Laboratorv Manual, 3. izdanje, Cold Springs Harbor Laboratorv Press, Cold Spring Habor, N.Y., koja je ovde u potpunosti inkorporirana u bilo koju svrhu da se koristi. Osim ako nije drugačije naznačeno, ovde su opisane dobro poznate i u struci često korišćenje definicije, nomenklatura i laboratorijski postupci i tehnike analitičke hernije, sintetske organske hernije i medicinske i farmaceutske hernije. Za hemijske sinteze, hemijske analize, farmaceutske preparacije, formulacije i dopremanje i tretman pacijenata mogu da se koriste standardne tehnike.

Kao što se koriste u predmetnom pronalasku, sledeći pojmovi, osim ako nije drugačije naznačeno, imaju sledeće značenje.

Pojam "izolovami polinukteotid", kao što se ovde koristi, označava polinuklotid genomskog, cDNK ili sintetskog porekla ili neku kombinaciju navedenog, pri čemu izolovani polinukleotid po svom poreklu: (1) nije udružen sa celim ili sa delom polinukleotida u okviru koga se izolovani polinukleotid nalazi u prirodi, (2) jeste povezan sa polinukleotidom sa kojim nije povezan u prirodi, ili (3) ne javlja se u prirodi kao deo neke veće sekvence.

Pojam "izolovani protein" se ovde odnosi na subjektni protein koji je: (1) oslobođen barem od nekih drugih proteina sa kojima se tipično nalazi u prirodi, (2) praktično je oslobođen od drugih proteina poreklom iz istog izvora, npr. npr. proteina poreklom iz iste vrste organizma, (3) eksprimiran je u ćeliji iz različite vrste organizma, (4) izdvojen je iz barem 50% polinukeotida, lipida, ugljenih hidrata ili drugih materijala sa kojima je udružen u prirodi, (5) nije udružen (kovalentnim ili nekovalentnim interakcijama) sa delovima proteina sa kojima je "izolovani protein" udružen u prirodi, (6) operativno je povezan (kovalentnim ili nekovalentnim interakcijama) sa polipeptidom sa kojim nije udružen u prirodi, ili (7) ne postoji u prirodi. Takav izolovani protein može biti kodiran genomskom DNK, cDNK, iRNK ili drugom RNK, može biti sintetskog porekla ili može biti bilo kog kombinovanog porekla. Poželjno, izolovani protein je praktično oslobođen od proteina ili polipeptiđa ili drugih kontaminanata koji se prirodno nalaze u njegovom prirodnom okruženju i koji bi mogli da interrjeriraju u nekim vidovima njegove primene (terapijske, dijagnostičke, profilaktičke, istraživačke ili na neki drugi način).

Pojmovi "polipeptid" ili "protein" označavaju jedan ili vise lanaca amino kiselina, pri čemu svaki lanac sadrži aminokiseline koje su kovalentno povezane peptidnim vezama i pri čemu pomenuti polipeptid ili protein može da sadrži mnoštvo lanaca koji su međusobno povezani nekovalentno ili kovalentno peptidnim vezama, a koji poseduju sekvencu nativnih proteina, tj. proteina proizvedenih u ćelijama koje postoje u prirodi i specifično u nerekombinanmim ćelijama, ili koji su proizvedeni u genetskim inženjeringom dobijenim ili rekombinantnim ćelijama, pri čemu njihovi molekuli poseduju aminokiselinkse sekvence nativnih proteina ili njihovi molekuli imaju delecije, adicije i/ili supstitucije jedne ili više aminokiselina u odnosu na nativne proteine. Pojmovi "polipeptid" i "protein" specifično obuhvataju anti-IFN-v antitela, ili sekvence koje imaju delecije, adicije i/ili supstitucije jedne ili više aminokiselina u odnosu na anti-IFN-v antitela. Stoga, pojmovi "polipeptid" ili "protein" mogu da označe jedan ("monomerne") ili mnoštvo ("multimerne") aminokiselinske lance.

Pojam "polipeptidni fragment" označava polipeptid, koji može biti monomeran ili muitimeran, koji ima amino-terminalnu deleciju, karbolri-terminalnu deleciju i/ili neku internu deleciju ili supstituciju u odnosu na polipeptid koji postoji u prirodi ili na rekombinantni polipeptid. U određenim rešenjima, polipeptidni fragment može da podrazumeva aminokiselinski lanac od najmanje 5 do oko 500 aminokiselina. Treba shvatiti da u određenim rešenjima, fragmenti imaju najmanje 5,6, 8,10,14,20, 50,70,100,110,150, 200,250, 300,350,400 ili 450 aminokiselina. Posebno su korisni polipeptidni fragmenti koji obuhvataju funkcionalne domene, uključujući vezujuće domene. U slučaju anti-IFN-v antitela, korisni fragmenti obuhvataju, nez ograničenja, CDR region, posebno CDR3 region teškog ili lakog lanca; varijabilni domen teškog ili lakog lanca; deo lanca antitela ili samo varijabilni region koji sadrži dva CDR-a; i slično.

Pojam "imunološki funkcionalni imunoglobulinski fragment", kao što se ovde koristi, označava polipeptidni fragment koji sadrži makar CDR-ove imunoglobulinskih teških i lakih lanaca. Imunološki funkcionalni imunoglobulinski fragment prema predmetnom pronalasku je sposoban da se veže sa antigenom. U poželjnim rešenjima, antigen je ligand koji se specifično vezuje za receptor. U ovim rešenjima, vezivanje imunološki funkcionalnog imunoglobulinskog fragmenta prema predmetnom pronalasku sprečava ili inhibira vezivanje Uganda za odgovarajući receptor, pri čemu prekida biološki odgovor koji nastaje kao posledica vezivanja Uganda za određeni receptor. Poželjno, imunološki funkcionalni imuno<g>lobulinski fragment prema predmetnom pronalasku se specifično vezuje za IFN-7. Najpoželjnije, fragment se specifično vezuje i/ili inhibira ili moduliše biološku aktivnost humanog IFN-v.

Pojam "onaj koji postoji u prirodi", kao što se ovde koristi, označava objekat koji se može naći u prirodi Na primer, pojam označava polipeptiđnu ili polinukleotidnu sekvencu koja je prosutna u nekom organizmu (uključujući viruse) i koja se može izolovati iz prirodnog izvora i koja nije sa namerom modifikovana od strane čoveka.

Pojam "operativno povezan" označava da su komponente na koje se pojam odnosi u odnosu koji im omogućava da nose svoje inherentne funkcije u pogodnim uslovima. Na primer, transkripciona kontrolna sekvenca je "operativno povezana" procesom ligacije sa sekvencom koja kodira protein, tako da se postiže ekspresija sekvence koja kodira protein u uslovima koji su kompatibilni sa transkripcionom aktivnošću kontrolne sekvence.

Pojam "kontrolna sekvenca", kao što se ovde koristi, označava potinukleotidnu sekvencu koja može da utiče na ekspresiju, obradu ili intracelularau lokalizaciju proizvoda kodirajućih sekvenci sa kojima je ligirana. Priroda ovakvih kontrolnih sekvenci zavisi od organizma - domaćina. U određenim rešenjima, transkripcione kontrolne sekvence za prokariote mogu da sadrže promoter, mesto za vezivanje ribozoma i sekvencu za terrniriaciju transkripcije. U drugim određenim rešenjima, transkripcione kontrolne sekvence za eukariote mogu da sadrže promotere koji se sastoje od jednog ili od mnoštva mesta za prepoznavanje transkripcionih faktora, sekvence za pospešivanje transkripcije, skevnece za terrniriaciju transkripcije poliadenilacione sekvence. U određenim rešenjima, "kontrolne sekvence" mogu da sadrže lider sekvence i/ili fuzione partnerske sekvence.

Pojam "polinukleotid", kako se ovde koristi, označava jednolančane ili dvolančane polimere nukleinske kisleine dužine najmanje 10 baza. U određenim rešenjima, nukleotidi koji se nalaze u polinukleotidu mogu biti ribonukleotidi ili deoksiribonuleotidi ili modifikovani oblici bilo kog od ovih tipova nukleotida. Pomenute modifikacije uključuju modifikovane baze, kao što je brouridin, modifikovane riboze, kao što su arabinozid i 2',2'-dideoksiriboza, kao i modifikovane intemukleotidne veze, kao što su fosforotioatna, fošforoditioatna, fosforoselenoatna, fosforodiselenoatna, fosforoanilotioatna, fosforaniladatna i fosforoamidatna veza. Pojam "polinukleotid" specifično obuhvata jednolančane i dvolančane oblike DNK.

Pojam "aligonukleotiđ", kao Što se ovde koristi, označava prirodne i modifikovane nukleotide koji su zajedno povezani prirodnim ili veštačkim ohgonukleotiđnim vezama. Oligonukleotidi predstavljaju povrstu polinukieotida koja obuhvata članove koji su generalno jednolančani i koji poseduju dužinu od 200 ili manje baza. U određenim rešenjima, oligonukleotidi imaju dužinu od 10 do 60 baza. U određenim rešenjima, oligonukleotidi imaju dužinu od 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ili 20 ili 40 baza. Oligonukleotidi mogu biti jednolančani ili dvolančani, npr., kada se upotrebljavaju u konstrukciji genskog mutanta. Oligonukleotidi prema predmetnom pronalasku mogu biti isto usmereni ili komplementarni oligonukleotidi, u odnosu na kodirajuću sekvencu.

Osim ako nije drugačije navedeno, levi kraj jednolančanih polinukleotidnih sekvenci je 5' kraj; levostrani smer dvostrukih polinukleotidnih sekvenci se označava kao 5' smer. Smer dodavanja anscentnih RNK transkripta od 5' ka 3' se označava kao smer transkripcije; regioni sekvence na DNK lancu koji imaju istu sekvencu kao RNK i koji su transkripti RNK od 5' ka 5' kraju se označavaju kao "uzvodne sekvence"; regioni sekvence na DNK lancu koji imaju istu sekvencu kao RNK i koji su transkripti RNK od 3' ka 3' kraju se označavaju kao "nizvodne sekvence".

Pojam "nukleotidi koji se javljaju u prirodi" obuhvata deoksiribonukleotide i ribonukleotide. Pojam "mođifikovani nukleotidi" obuhvata nukleotide sa modifikovanim ili supstituisanim šećernim grupama i slične. Pojam "oligonukleotidne veze" obuhvata oligonukleotidne veze kao što su fosforotioatna, fosforoditioatna, fosforoselenoatna, fosforodiselenoatna, fosforoanilotioatna, fosforaniladatna i fosforoamidatna veza, kao i slične. Videti, npr., LaPlanche et al., 1986, Nucl. Acids Res., 14 : 9081; Stec et al., 1984, J. Am. Chem. Soc, 106:6077; Stein et al., 1988, Nucl. Acids Res., 16 : 3209; Zon et al., 1991, Anti-Cancer Drug Đesign, 6 : 539; Zon et aL, 1991, Oligonucleotides and analogues: A practical approach, str. 87 - 108 (F. Eckstein, urednik), Oxford University Press, Oxford, Engleska; Stec et al., U.S. patent br. 5,151,510; UhlmannA Peyman, 1990, Chemical Reviews, 90 : 543, čiji su opisi ovde inkorporirani po referenci u bilo koju svrhu da se koriste. Oligonukleotid može da obuhvati detektibilnu oznaku koja omogućava detekciju oligonukleotida ili njihovu hibridizaciju.

Pojam "vektor" se koristi da označi bilo koji molekul (npr., nukleinsku kiselinu, plazmid ili virus) koji se koristi za transfer kodne informacije u ćeliju - domaćina.

Pojam "vektor ekspresije" označava vektor koji je pogodan za transformaciju ćelije - domaćina i koji sadrži sekvence nukleinske kiseline koje usmeravaju i/ili kontrolišu ekspresiju ubačenih heterologih sekvenci nukleinske kiseline. Ekspresija obuhvata, bez ograničenja, procese kao Sto su transkripcija, translacija i isecanje RNK, ukoliko ova poseduje introne.

Pojam "ćelija - domaćin" se koristi da označi ceUju u koju se uvodi ili koja je sposobna da u nju bude uvedena sekvenca nukleinske kiseline i da dalje eksprimira ili koja se sposobna da eksprimira izabrani gen koji je od interesa. Pojam obuhvata potomstvo ćelije - roditelja, bez obzira na to da lije potomstvo identično po morfologiji ili po genetskom dizajnu sa originalnom roditeljskom ćelijom, sve dotle dok je izabrani gen prisutan u potomstvu.

Pojam "transđukcija" se koristi da označi transfer gena iz jedne bakterije u drugu, obično posredstvom raga. "Transđukcija" takođe označava prosvajanje i transfer eukariotskih ćelijskih sekvenci pomoću retrovirusa.

Pojam "transfekcija" se koristi da označi preuzimanje strane ili egzogene DNK odStrane ćelije, a ćelija je "transficirana" onda kada je egzogena DNK uvedena u prostor ograničen ćelijskom membranom. U struci su dobro poznate brojne tehnike transfekcije, koje su obuhvaćene u ovoj prijavi. Videti, npr., Granam et al„ 1973, Virology 52 : 456; Sambrook et al., 2001, Molecular Cloning, A Laboratorv Manual, Cold Spring Habor Laboratories; Daviš et al., 1986, Basic Methods in Molecular Biologv, Elsevier; i Chu et al., 1951, Gene 13:197. Opisane tehnike mogu da se koriste za uvođenje jedne ili više egzogenih DNK molekula u pogodne ćelije - domaćine.

Pojam "transformacija" se ovde koristi da označi promenu genetskih karakteristika ćelije, a ćelija je "transformirana" onda kada je modifikovana tako da sadrži novu DNK. Na primer, ćelija je transformirana onda kada je genetski modifikovana u odnosu na svoje nativno stanje. Nakon transfekcije ili transdukcije, transfbrmisana DNK može da se rekombinuje sa ćelijskom DNK tako što će se fizički integrisati u hrornozom ćelije ili može privremeno da se održava kao epizomski element bez replikacije, ili može da se nezavisno replikuje kao plazmid. Smatra se da je ćelija stabilno transfoimisana onda kada se DNK replikuje pri ćelijskoj deobi.

Pojam "onaj koji se javlja u prirodi" ili "nativni" se ovde koristi u vezi sa biološkim materijalima kao što su molekuli nukleinske kiseline, polipeptidi, ćelija - domaćin i sličnim, a označava da sa materijalima koji su nađeni u prirodi nije vršena manipulacija od strane čoveka. Slično tome, pojmovi "onaj koji se ne javlja u prirodi" ili "nenativni" se ovde koriste da označe materijal koji se ne nalazi u prirodi ili koji je strukturnalno modifikovan ili sintetisan od strane čoveka.

Pojam "antigen" označava molekul ili deo molekula koji je sposoban da se veže za selektivno sredstvo za vezivanje, kao što je antitelo i koje je dodatno sposobno za korišćenje kod životinje za proizvodnju antitela koja su sposobna da se vežu za neki epitop na tom antigenu. Antigen može imati jedan ili viže epitopa.

Pojam "epitop" obuhvata bilo koju determinantu, poželjno polipeptidnu determinantu, koja je sposobna da se specifično veže za imunoglobulinski ili T-ćelijski receptor. Epitop je region na antigenu koji se vezuje za antitelo. U određenim rešenjima, epitopske determinante obuhvataju hemijski aktivne površinske grupe molekula, kao što su aminokiseline, šećerni bočni lanci, fbsforil ili sulfonil grupe, a u određenim rešenjima, mogu posedovati specifične trodimenzionalne strukturne karakteristike i/ili specifično karakteristično naelektrisanje. U određenim rešenjima, za antitelo se kaže da se specifično vezuje za antigen onda kada specifično prepoznaje svoj ciljni antigen u kompleksnoj smeši proteina i/ili makromolekula. Za antitelo se kaže da se specifično vezuje za antugen onda kada je ravnotežna konstanta disocijacije < IO'<7>ili IO"<8>M. U nekim rešenjima, ravnotežna konstanta disocijacije može biti <10-<*>ili<10-,<0>M

Kao što se ovde koristi, kada se prva sekvenca sastoji od, na primer, 10 aminokiselina čija je sekvenca RASQSVSSSY (sekvenca čiji je ID broj 56), za drugu sekvencu se kaže da ima 7 aminokiselina u "istom redosledu i prostornom rasporedu" u odnosu na prvu sekvencu onda kada je 7 aminokiselina identično onim u prvoj sekvenci i kada imaju iste relative položaje kao u prvoj sekvenci. Na primer, sekvenca RAAAAVSSS Y (sekvenca čiji je ID broj 57) ima 7 aminokiselina u istom redosledu i prostornom rasporedu koji se javlja u sekvenci RASQSVSSSY (sekvenca Čiji je ID broj 56). Nasuprot tome, ovo nije slučaj sa sekvencom RASSVSSSY (sekvenca čiji je ID broj 58), jer ona sadrži internu deleciju u odnosu na RASQSVSSSY (sekvenca čiji je ID broj 56), sa 3 i 6 aminokiselina sa oba kraja delecije* Stoga, ova sekvenca poseduje najviše 6 aminokiselina u istom redosledu i prostornom rasporedu u odnosu na prvu sekvencu. Najkraća moguća sekvenca koja bi mogla da ima 7 aminokiselina u istom redosledu i prostornom rasporedu kao sekvenca RASQSVSSSY (sekvenca čiji je ID broj 56) bila bi duga 7 aminokiselina, na primer, bila ni to sekvenca SQSVSSS (sekvenca čiji je ID broj 59).

Pojam "identičan", kao što je poznato u struci, odnosi se na odnos između sekvenci dva ili više molekula polipeptida ili na dva ili više molekula nukleinskih kiselina, koji se određuje poređenjem njihovih sekvenci. U struci, pojam "identičan" takođe označava stepen povezanosti sekvenci između molekula nukleinskih kiselina ili polipeptida, kao što je to slučaj kada se određuje poklapanje između va ili više lanaca nukleotida ili đve ili više sekvenci aminokiselina. Pojam "identičan" predstavlja meru izraženu u procentima identičnih poklapanja između manje od dve ili više sekvenci sa upoređivanjem sa prazninama (ukoliko takve postoje) na koje ukazuje određeni matematički model ili kompjuterski program (tj. "algoritam").

Pojam "sličan" se u struci koristi u odnosu na povezani koncept, ali nasuprot pojmu "identičan", pojam "sličan" označava meru povezanosti, što obuhvata i identična poklapanja i poklapanja konzervativnih supstitucija. Ukoliko dve polipeptidne sekvence imaju, na primer, 10/20 identičnih aminokiselina, a ostatak su sve nekonzervativne supstitucije, tada su procenti identičnosti i sličnosti po 50%* U istom primeru, ako postoji još pet položaja sa konzervativnim supstitucijama, tada procenat identičnosti ostaje 50%, ali je procenat sličnosti 75% (15/20). Stoga, u slučajevima u kojim su prisutne konzervativne supstitucije, procenat sličnosti između dva polipeptida će biti veći od procenta identičnosti između dva polipeptida.

Identičnost i sličnost povezanih nukleinskih kiselina i polipeptida brzo može da se izračuna poznatim postupcima. Takvi postupci obuhvataju, bez ograničenja, postupke koji su opisani u publikacijama: Computational Molecular Biologv, (Lesk, A.M., urednik), 1988, Oxford Universitv Press, New York; Biocomputing: Informatics and genome projects (Smith, D.W., urednik), 1993, Academic Press, New York; Computer analvsis of sequence data, Deo 1 (Griftin, A.M. & Griffin, H.G., urednici), 1994, Humana Press, New Jersy; von Heinje, G., Sequence analvsis in molecular biologv, 1987, Academic Press; Sequence analvsis primer (Gribskov, M. & Devereux, J., urednici), 1991, M. Stockton Press, New York; Carillo et al., 1988, SIAM J. Applied Math., 48 : 1073; i Durbin et al., 1998, Biological sequence analvsis, Cambridge Universitv Press.

Poželjni postupci za određivanje identičnosti su dizajnirani tako da daju najveće poklapanje između ispitivanih sekvenci Postupci za određivanje identičnosti su opisani u javno dostupnim komjuterskim programima. Poželjni postupci koji koriste komjuterske programe za određivanje identičnosti između dve sekvence obuhvataju, bez ograničenja, GCG programski paket, uključujući GAP (Devereux et al., 1984, Nucl. Acid. Res., 12 : 387; Genetics Computer Group, Univeritv of Wisconsin, Madison, WI), BLASTP, BLASTN i FASTA (Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol., 215 : 403 - 410). BLASTX program je javno dostupan kod Nacionalnog centra za biotehnološke informacije (NCBI) i kad drugih izvora (BLAST Manual, Altschul et al., NCB/NLMZNIH Bethesda, MD 20894; Altschul et al., 1990, navedeno gore). Za određivanje identičnosti takođe može da bude dostupan dobro poznati Smith Waterman algoritam.

Određene šeme za upoređivanje dve aminokiselinske ili polinukleotidne sekvence mogu da rezultuju poklapanjem samo na kratkim regionima dve sekvence, a ovaj mali region poklapanja može da poseduje veoma visok štepen identičnosti, iako ne postoji značajan odnos između dve sekvence u punoj duzini. Shodno tome, u određenim rešenjima, izabrani postupak za upoređivanje (GAP program) može da rezultuje upoređivanjem koje se proteže na barem 50 aminokiselina željenog polipeptida koje se nalaze jedna iza druge. U nekim rešenjima, upoređivanje može da obuhvati 60, 70, 80, 90, 100, 110 ili 120 aminokiselina željenog polipeptida. Ukoliko se polipeptidi upoređuju korišćenjem GAP, upoređivanje može da se proteže na najmanje 100, 150 ili 200 nukleottda, koji se nalaze jedan iza drugog.

Na primer, korišćenjem kompjuterskog algoritma GAP (Genetics Computer Group, Univeritv of Wisconsin, Madison, WI), dva polipeptida, kod kojih procenat identičnosti sekvence treba da bude određen, upoređeni su na optimalno poklapanje njihovih odgovarajućih aminokiselina ("poklapajuće protezanje", koje je određeno algoritmom). U određenim rešenjima, zajedno sa algoritmom je korišćena zabrana za praznine na početku (koja se izračunava kao 3 x prosečna dijagonala; "prosečna dijagonala" je prosečna vrednost dijagonale matriksa za poređenje koji se koristi; "dijagonala" je vrednost ili broj koji je dodeijen svakom perfektnom poklapanju aminokiselina putem matriksa za poređenje) i zabrana za praznine pri produžavanju (koja je obično 1/10 * u odnosu na veličinu zabrane za praznine na početku), kao i matriks za poređenje, na primer, PAM 250 ili BLOSUM 62. U određenim rešenjima, u algoritmu se takođe koristi standardni matriks za poređenje (viđeti Davhoff et al., 1978, Atlas of Protein Sequence and Structure, 5 : 345 - 352 za PAM 250 matriks za poređenje; Henikoffet al., 1992, Proc. Natl. Acad, Sci USA, 89 : 10915 - 10919 za BLOSUM 62 matriks za poređenje).

U određenim rešenjima, parametri za poređenje polipeptidne sekvence obuhvataju sledeće:

Algoritam: Needleman et al., J. Mol. Biol., 48 :443 - 453 (1970):

Matriks za poređenje: BLOSUM 62, Henikoffet al., gore navedeno (1992);

Zabrana za praznine na početku: 12

Zabrana za dužinu praznine: 4

Prag sličnosti: 0

GAP program može biti od koristi uz upotrebu gore navedenih parametara. Za nukleotidne sekvence, parametri mogu da obuhvate zabranu za prazninu od 50 i zabranu za dužinu praznine od 3, tj. zabranu od 3 za svaki od simbola u ssvakoj grupi. U određenim rešenjima, prethodno navedeni parametri su standardni parametri za poređenje polipeptida (bez zabrane za prazninu na kraju) pri korišćenju GAP algoritma.

Kao što se ovde koriste, imena dvadeset konvencionalnih aminokiselina i njihove skraćenice koristeSe na konvencionalni način. Videti "Immunologv - A Svnthesis" (2. izdanje, E.S. Golub & D.R. Gren, urednici, Sinauer Associates, Sunderland, MA (1991)), koja je ovde inkorporirana po referenci u bilo koju svrhu da se koristi. Pogodne komponente za polipeptide prema predmetnom pronalasku mogu biti i stereoizomeri (npr. D-aminokiseline) dvadeset konvencionalnih aminokiselina; veštačke aminokiseline, kao što su a-disupstituisane aminokisetine, N-alkil aminokiseline, mtečna kiselina i druge nekonvencionalne aminokiseline. Primeri nekonvencionalnih aminokiselina obuhvataju: 4-hidroksiprofin, v-karboksiglutamat,£-N,N,N-trimetil lizin, e-N-acetil lizin, O-fosfoserin, N-acetilserin, N-formilmetionin, 3-metilhistidin, 5-hidroksilizin, o-N-metilarginin i druge slične amino i imino kiseline (npr. 4-hidroksiprolin). U nomenklaturi polipeptida koja se ovde koristi, L smer je smer amino terminala, a R smer je smer karboksi terminala, shodno standardnoj upotrebi i konvenciji.

Prirodni aminokiselinski ostaci se mogu podeliti u klase na osnovu zajedničkih osobina bočnih lanaca:

1) hidrofbbni: norleucin (Nor), Met, Ala, Val, Leu, Ile; 2) neutralni hidrofilni: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln; 3) kiseli: Asp, Glu; 4) bazni: His, Lys, Arg;

5) ostaci koji utiču na orijentaciju lanca: Gly, Pro; i

6) aromatični: Trp, Tyr, Phe.

Konzervativne aminokiselinske supstitucije mogu da obuhvate izmenu nekog člana jedne ođ navedenih klasa sa drugim članom iste klase. Konzervativne aminokiselinske supstitucije mogu da obuhvate veštačke aminokiselinske ostatke, koji su tipično inkorporirani hemijskom sintezom peptida, pre nego sintezom u biološkim sistemima. Ovde spadaju pepuđomimetski i drugi obrnuti ili invertovani oblici aminokiselinskih podjedinica.

Nekonzervativne supstitucije mogu da obuhvate izmenu člana jedne klase sa članom druge klase. Ovako supstituisani ostaci se mogu uvesti u regione humanog antitela koji su homologi sa ne-humanim antitelima, ili u nehomologe regione molekula.

Pri pravljenu ovakvih izmena, prema određenim rešenjima, u obzir se mora uzeti hidropatski indeks aminokiselina. Svakoj aminokiselini je priprisan hidropatski indeks na osnovu njene hidrofobičnosti i karakteristika naelektrisanja. Vrednosti ovih indeksa su: izoleucin (+4,5); valin (+4,2); leucin (+3,8); fenilalanin (+2,8); cistein/cistin (+2,5); metionin (+1,9); alanin (+1,8); glicin (-0*4); treonin (-0,7); serin (-0,8); triptofan (-0,9); tirozin (-1,3); prolin (-1,6); histidin (-3,2); glutamat (-3,5); glutamin (-3,5); aspartat (-3,5); asparagin (-3,5); lizin (-3,9) i arginin (-4,5).

Važnost mdropatskog indeksa aminokiselina u poređenju interaktivne biološke funkcije na proteinu je poznata u struci (Kyte et aL, J. Mol. Biol., 157 : 105 - 131 (1982)). Poznato je da određene aminokiseline mogu biti supstituisane drugim aminokiselinama koje poseduju sličan hidropatski indeks ili vrednost i koje još uvek zadržavaju sličnu biološku aktivnost. Prilikom pravljenja promena zasnovanih na hidropatskom indeksu, u određenim rešenjima, obuhvaćene su supstitucije aminokiselina čiji se hidropatski indeksi nalaze u intervalu od±2. U određenim rešenjima, takođe su obuhvaćene i supstitucije aminokiselina čiji se hidropatski indeksi nalaze u intervalu od ± 1, a u određenim rešenjima, obuhvaćene su i supstitucije aminokiselina čiji se hidropatski indeksi nalaze u intervalu od ± 0,5.

U struci je takođe poznato da se mogu efikasno napraviti supstitucije aminokiselina koje su slične po Indrofilnosti, posebno onda kada su biološki funkcionalni protein ili peptid koji su kreirani na taj način namenjeni upotrebi u imunološkim rešenjima, kao što je to slučaj u predmetnom pronalasku. U određenim rešenjima, najveća lokalna prosečna hidrofilnost proteina, koja je određena hidrofilnošću susednih aminokiselina, korelira sa imunogenoŠću i antigenošću, tj. sa biološkim svojstvima proteina.

Ammokiselinskim ostacima su pripisane sledeće vrednosti hidrofilnosti: arginin (+-3,0); aspartat (+3,0 ± 1); glutamat (+3,0 ± 1); serin (+0,3); asparagin (+0,2); glutamin (+0,2); glicin (0); treonin ('0,4); proHn (-0,5 ± 1); alanin (-0,5); cistein (-1,0); metionin(-l,3); valin (-1,5); leucin (-1,8); izoleuein (-1,8); tirozin (-2,3); fenilalanin (-2,5) i triptofan (-3,4). Prilikom pravljenja promena zasnovanih na sličnim vrednostirna hidrofilnosti, u određenim rešenjima su uključene supstitucije aminokiselina čije se vrednosti hidrofilnosti nalaze u opsegu od dk 2, u određenim rešenjima su uključene supstitucije aminokiselina čije se vrednosti hidrofilnosti nalaze u opsegu od ± 1, a u određenim rešenjima su uključene supstitucije aminokiselina čije se vrednosti hidrofilnosti nalaze u opsegu od ± 0,5. Takođe, na osnovu hidrofilnosti se mogu identifikovati epitopi od primarnih aminokiselinskih sekvenci. Ovakvi regioni se takođe označavaju i kao "osnovni epitopski regioni".

Primeri aminokiselinskih supstitucija su prikazani u Tabeli 1.

Stručnjak može da odredi odgovarajuće varijante polipeptida koji su ovde predstavljeni korišćenjem dobro poznatih tehnika. U određenim rešenjima, stručnjak može da ideatifikuje odgovarajuća područja molekula koja se mogu promeniti bez uništavanja aktivnosti ciljanjem regiona za koje se veruje da nisu važni za ispoljavanje aktivnosti. U određenim rešenjima, mogu se identifikovati ostaci i delovi molekula koji su konzervirani kod različitih polipeptida. U određenim rešenjima, čak se i područja koja mogu biti značajna za ispoljavanja biološke aktivnosti ili za strukturu mogu podvrgnuti konzervativnim supstitucijama aminokiselina bez narušavanja biološke aktivnosti ili negativnog uticaja na strukturu polipeptida.

Dodamo, stručnjak može da izvrši ispitivanja povezanosti strukture i funkcije identifikujući ostatke u sličnim polipeptidima koji su važni za ispoljavanje aktivnosti ili za strukturu. S obzirom na ovakvo poređenje, može se predviđen važnost aminokisleinskih ostataka u proteinu koji koreliraju sa aminokiselinskim ostacima važnim za ispoljavanje aktivnosti ili za strulcturu sličnih proteina. Stručnjak može izabrati hemijski slične aminokiselinske ostatke za supstitucije predviđenih važnih aminokiselinskih ostataka.

Stručnjak takođe može da analizira trodimenzionalnu strulcturu i aminokiselinsku sekvencu u odnosu na strukturu sličnih polipeptida. Na osnovu takvih informacija, stručnjak može da predvidi redosled aminokiselinskih ostataka antitela u odnosu na njegovu trodimenzionalnu strukturu. U određenim rešenjima, stručnjak može da izabere da ne pravi radikalne promene aminokiselinskih ostataka predviđenih da budu na površini proteina, jer takvi ostaci mogu biti uključeni u važne interakcije sa drugim molekulima. Štaviše, stručnjak može da napravi test varijante koje sadrže jednu aminokiselinsku supstituciju na svakom željenom aminokiselinskom ostatku. Tada varijante mogu da budu ispitane korišćenjem testova koji su poznati stručnjacima. Takve varijante mogu da posluže za prikupljanje informacija o pogodnim varijantama. Na primer, ukoliko se otkrije da promena određenog aminokiselinskog ostatka dovodi do gubitka, neželjenog smanjenja ili ispoljavanja nepoželjne aktivnosti, varijante sa takvom pramenom mogu da se izbegnu. Drugim recima, na osnovu informacija koje se prikupljaju tokom ovih rutinskih eksperimenata, stručnjak može lako da odredi aminokiseline kod kojih dalje supstitucije treba izbegavati, bilo same po sebi ili u kombinaciji sa drugim mutacijama.

Brojne naučne publikacije su posvećene predviđanju sekundarne strukture. Videti Moult J., Curr, Op. in Biotech., 7 (4) : 422 - 427 (1996), Chou et al, Biochemistrv, 13 (2): 222 - 245 (1974); Chou et al., Biochemistrv, 113 (2) : 211 - 222 (1974); Chou et al., Adv. Enzvmol. Relat. Areas Mol. Biol, 47 ; 45 - 148 (1978); Chou et al., Ann. Rev. Biochem., 47; 251 - 276 i Chou et aL, Biophys. J., 26 : 367 - 384 (1979). Štaviše, trenutno su dostupni kompjuterski programi koji su od pomoći u predviđanju sekundarne strukture. Jedan postupak za predviđanje sekundarne strukture se zasniva na modelovanju homologtjom. Na primer, dva polipeptida ili proteina čije sekvence poseduju identičnost veću od 30% ili sličnost veću od 40%, obično imaju slične strukturne topologije. Rast banke podataka proteinske strukture (Protein Structural Database - PĐD) omogućava poboljšano predviđanje sekundarne strukture, uključujući potencijalni broj pregiba unutar polipeptidne ili proteinske strukture. Videti Holm et al., Nucl. Acid. Res., 27 (1) : 244 - 247 (1999). Sugerisano je (Brenner et al., Curr. Op, Struct. Biol,, 7 (3): 369 - 376 (1997)) da postoji ograničen broj pregiba u datom polipeptidu ih' proteinu i da onda kada se razreši kritičan broj struktura, predviđanje strukture postaje dramatično preciznije.

Dodatni postupci predviđanja sekundarne strukture obuhvataju "razmenu" (Jones, D.,

Curr. OphL StrucL biol., 7 (3) : 377 - 87 (1997); Sippl et al., Structure, 4 (1): 15 - 19 (1996)), "analizu profila" (Bowie et al., Science, 253 : 164 - 170 (1991); Gribskov et al., Meth. Enyzm., 183 : 146 - 159 (1990); Gribskov et al., Proc. Nat. Acad. Sci., 84 (13) : 4355 - 4358

(1987)) i "evoluciono povezivanje" (videti Holm, navedeno ranije (1999) i Brenner, navedeno ranije (1997)).

Prema određenim rešenjima, aminokiselinske supstitucije su one koje: (1) smanjuju podložnost proteolizi, (2) smanjuju podložnost oksidaciji, (3) menjaju afinitet vezivanja za nastanak proteinskih kompleksa, (4) menjaju afinitete vezivanja i/ili (5) predstavljaju ili modifikuju druga fizičko-hemijska ili funkcionalna svojstva takvih polipeptida, Prema određenim rešenjima, pojedinačne ili višestruke aminokiselinske supstitucije (u određenim rešenjima, konzervativne aminokiselinske supstitucije) mogu da se naprave u prirodnoj sekvenci (u određenim rešenjima, u delu polipeptida van domena koji stvaraju intermolekulske kontakte), U poželjnim rešenjima, konzervativne aminokiselinske supstitucije tipično ne mogu značajno da menjaju strukturne karakteristike roditeljske sekvence (npr. zamena aminokiseline ne treba da narušava hetiks koji postoji u roditeljskoj sekvenci ili da narušava druge tipove sekundarne strukture koji su karakteristični za roditeljsku sekvencu). Primeri u struci priznatih polipeptidnih sekundarnih i tercijarnih struktura su opisani u publikaciji "Proteins, Structures and Molecular Principles", Creighton, urednik, W. H. Freeman & Companv, New York (1984); "Introduction to Protein Structure",

C Branden & J. Tooze, urednici, Garland PnbUshing, New York, N.Y. (1991); i Thornton et

al., Nature, 354 :105 (1991), koje su sve ovde inkorporirane po referencu

Peptiđni analozi se uobičajeno koriste u farmaceutsakoj industriji kao nepeptidni lekovi sa svojstvima koja su analogna onima koje poseduje peptid koji služi za uzor. Pomenuti tipovi ne-peptidnog jedmjenja se označavaju kao "peptiđni mimetici<1*>ili "peptidomimetici". Videti Fauchere, J. Adv. Drug Res. 15 : 29 (1986); Veber & Freidinger TINS str. 392 (1985); i Evans et al., J. Med. Chem. 30 : 1229 (1987), koja je ovde uključena

po referenci u bilo koju svrhu da se koristi. Ova jedinjenja se Često razvijaju uz pomoć kompjuteirzovanog molekulskog modelovanja. Peptiđni mimetici koji su strukturno slični terapeutski korisnim peptidima, mogu da se koriste za dobijanje sličnog terapijskog ili profilaktičkog dcjstva. Generalno, peptidomimetici su strukturno slični polipeptidu koji služi kao osnovni uzor (tj. polipeptidu koji poseduje biohemijsko svojstvo ili farmakološku aktivnost), kao što je humano antitelo, ali koji poseduje jednu ili više peptiđnih veza opciono

zamenjenih vezom izabranom iz grupe;-CH2NH-, -CH2S-, -CH2CH2-, -CH=CH- (cis i trans), - COCH2-, -CH(OH)CH2- i -CHiSO-, korišćenjem postupaka koji su dobro poznati u struci. Sistematska supstitucija jedne ili više amino kiselina konsenzus sekvence sa D-amino kiselinom istog tipa (D-lizin umesto L-lizina), može da se koristi u određenim rešenjima kako bi se dobili poželjniji peptidi. Dodamo, peptidi sa strogo određenom sekvencom, koji sadrže konsenzus sekvencu ili praktično identičnu varijaciju konsenzus sekvence, mogu da se dobiju postupcima koji su poznati u struci (Rizo i Geirasch Ann. Rev. Biochem* 61 : 387 (1992), koja je ovde uključen po referenci, u bilo koju svrhu da se koristi); na primer, dodavanjem unutrašnjih cisteinskih ostataka sposobnih za formiranje intramolekulskih disulfidnih mostova, koji dovode do ciklizacije peptida.

Pojmovi "antitelo" ili "peptidi antitela", koji se ovde koriste, se odnosi na monomerni ili multimemi proein koji se sastoji od jednog ili od više polipeptiđnth lanaca. Antitelo može specifično da se veže za antigen i može da inhibira ili moduliđe biološku aktivnost antigena. "Antitela" obuhvataju prirodna antitela, koja su opisana ispod. U određenim rešenjima, antitela se dobijaju rekombinantnim DNK tehnikama. U dodatnim rešenjima, antitela se dobijaju enzimskim ili hemijskim cepanjem prirodnih antitela. Antitela obuhvataju, bez ograničenja, Fab, F(ab'), F(ab')2, Fv i jednolančane Fv fragmente, kao i jednolančana, himerična, humanizovana, potpuno humana, poliklonska i monoklonska antitela. Po mmimalnim kriterijumima, antitelo, u ovde navedenom značenju, sadrži polipeptid koji specifično može da se veže za antigen i sadrži sve delove ili neki deo varijabilnog regiona lakog ili teškog lanca.

Varijabilni region sadrži barem tri regiona koji određuju komplementarnost (Complementarv Determining Region - CDR, koji su takođe poznati i kao bipervarijabilni regioni i koji su označeni kao CDR1, CDR2 i CDR3 u Kabat et al., 1991, Sequences of immunological interest, Public Health Service N.I.H., Bethesda, MD; videti takođe Chothia & Lesk, 1987, J. Mol. Biol. 196: 901 -17; Chothia et al, 1989, Nature 342 : 877 - 83) teškog ili lakog lanca, koji se nalaze u okviru regiona rama (označeni kao regioni rama 1 - 4, FR1, FR2, FR3 i FR4 u Kabat et al., navedeno gore; videti takođe Chothia & lesk, navedeno gore). CDR-ovi i segmenti rama su međusobno povezani na sledeći način, počevši od amino-terminala varijabilnog regiona: FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4.

Primarne sekvence regiona rama varijabilnih regiona antitela poseduju dosta reziđua koji muniven^o konzervi*^ Međutim, mnoge rezidue su veoma konzervirane između različitih rodova i/ili unutar vrste i/ili roda, a mnogi položaji unutar antitela su obično zauzeti jednom od poznatih grupa aminokiselina. Videt Kabat et al., navedeno gore. Alternativno, sekvenca može biti prepoznata kao antitelo po svojoj predviđenoj tercijarnoj strukturi. Tercijarna struktura varijabilnih regiona, koja sadrži 9 P lanaca koji formiraju strukturu koja je poznata kao 0 cilindar tipa grčkog ključa, ekstremno je konzervirana, a položaji CDR-ova u ovoj strukturi su takođe veoma konzervirani. Videti, npr., Bork et al., 1994, J. Mol. Biol. 242 : 309 - 20; Hunkapiller & Hood, 1989, Adv. Immunol. 44 : 1 - 63; Williams & Barclav, 1988, Ann. rev. Immunol. 6 : 381 - 405; Chothia & Lesk, navedno ranije; Kabat et al., navedeno ranije.

Tercijarna struktura može da se predvidi različitim kompjuterskim programima, kao Sto su, na primer, Genefold<*>(Tripos, Inc., St. Louis, MO; Godzik & Skolnik, 1992, Proc. Natl. Acađ. Sci. USA 89 : 12098 - 12102; Godzik et al„ 1992, J. Mol. Biol. 227 ; 227 - 38; Godzik et al., 1993, Protein Bngng. 6 : 801 - 10), koji je program za procenu savijanja proteina i koji procenjuje verovatnoću određenog savijanja ispitivane proteinske sekvence u odnosu na strukturne predstavnike iz Banke podataka o proteinima (Protein Data Base - PDĐ)

(Berman et al., 2000, Nucleic Acids res. 28: 235 - 242; Jaroszevvski et aL, 1998, Proc. Sci. 7 : 1431 - 1440). Da bi se upotrebio Genefold<*>za klasifikaciju nove aminokiselinske sekvence, sekvenca se unosi u program, koji joj dodeljuje ocenu verovatnoće koja oslikava poklapanje sa savijanjem prethodno poznatih proteinskih struktura ("uzornih struktura") koje postoje u Genefold<*>bazi podataka. Pri ocenjivanju, Genefold<*>se oslanja na sličnost primarnih aminokiselinskih sekvenci, obrasce ponašanja rezidua, lokalne interakcije i upoređivanja sekundarnih struktura. Genefold<*>savija (ili uvrće) aminokiselinsku sekvencu oko svih uzornih struktura u prethodno postojećoj bazi podataka o savijanju proteina, koja obuhvata rešene strukture brojnih antitela. Rezultat rada Genefold* programa su tri liste proteina iz baze podataka, čija tercijarna struktura najvišeOdgovara unetoj aminokiselinskoj sekvenci. Tri liste sadrže tri različite ocene koje su izračunate na osnovu (i) same sekvence, (ii) sekvence i lokalnih konfbrrnacionih preferenci i obrazaca ponašanja ostataka, kao i na osnovu (ni) sekvence i i lokalnih konformacionih preferenci i obrazaca ponašanja ostataka i sekundarne strukture. U svakom od slučaja, program ■o r idređuje optimalno poklapanje, izračunava verovatnoću (P' vednost) koja predstavljastepen poklapanja koji se slučajno javlja i saopštava inverznu P - vrednost u vidu ocene, pri čemu je 999,9 (9,999 * 10<z>) najveća moguća ocena. Stoga, najviša vrednost ukazuje na najmanju verovatnoću da se poklapanje javlja slučajno. Tako, ove ocene predstavljaju stepen u kome se novi protein poklapa sa različitim referentnim strukturama i korisne su pri svrstavanju novog proteina u članstvo

poznatih porodica proteina. Na primer, za sekvencu koja ima strukturu varijabilnog regiona antitela se očekuje da se poklapa sa barem jednim poznatim varijabilnim regionom nekog poznatog antitela uz razumnu P- vrednost, kao što su vrednosti od oko 200, 300, 400, S00, 600,700,800 ili više.

Pojam "teški lanac" obuhvata svaki imunoglobulinski polipeptid koji ima sekvencu varijabilnog regiona koja je dovoljna za ispoljavanje specifičnog vezivanja za IFN-v. Pojam "laki lanac" obuhvata svaki imunoglobulinski polipeptid koji ima sekvencu varijabilnog regiona koja je dovoljna za ispoljavanje specifičnog vezivanja za IFN-v. Takav teški ili laki lanac može, a ne mora, da se vezuje za IFN-v u odsustvu lakog lanca (ako je to teški lanac), ili u odsustvu teškog lanca (ako je to laki lanac). Teški lanac pune dužine obuhvata domen varijabilnog regiona, Vm, i tri domena konstantnog regiona CH1, Gh2, Ch3. Vhdomen je na amino terminalu poUpeptida, a Ch3 domen je na korboksi terminalu. Pojam "teški lanac", kao što se ovde koristi, obuhvata teški lanac pune dužine i njegove fragmente. Laki lanac pune duzine obuhvata domen varijabilnog regiona, Vl, i domen konstantnog regiona Cl. Kao kod teškog lanca, domen varijabilnog regiona lakog lanca se nalazi na amino terminalu polipeptida. Pojam "laki lanac", kao što se ovde koristi, obuhvata laki lanac pune dužine i njegove fragmente. F(ab) fragment se sastoji od jednog lakog ranca i od CH1 i od varijabilnih regiona jednog teškog ranca. Teški lanac F(ab) molekula ne može da formira disulfidnu vezu sa drugim molekulom teškog lanca. F(ab<*>) fragment sadrži jedan laki lanac i jedan teški lanac koji ima više od konstantnog regiona, između domena ChI i Ch2, tako da se đisulfidna veza između lanaca može stvoriti između dva teška lanca, kako bi nastao molekul F(ab')2. Fv region sadrži varijabilne regione poreklom i od teškog i od lakog lanca, ali mu nedostaju konstantni regioni. Jednolančana antitela su Fv molekuli u kojima su varijabilni regioni teškog i lakog lanca povezani fleksibilnim veznikom, kako bi se dobio pojedinačni polipeptidni lanac, koji formira antigen-vezujući region. 0 jednolančanim antitelima se detaljno diskutuje u publikaciji međunarodne patentne prijave WO 88/01649 i u U.S. patentima br. 4,946,788 i 5,260,203.

Predmetni pronalazak takođe obuhvata potpuno humana, humanizovana i himerična antitela. Konkretno, potpuno humana antitela sadrže aminokiselinske sekvence koje su kodirane isključivo od strane polinukleotida koji su isključivo humanog porekla ili aminokiselinske sekvence koje su identične takvim sekvencama. Konkretno, antitela koja su kodirana sa DNK koja kodira humani imunoglobulin i koja je ubačena u mišiji genom nekog transgenog miša predstavljaju potpuno humana antitela, jer su kodirana od strane DNK kojaje isključivo humanog porekla. U ovoj situaciji, humana DNK koja kodira imunoglobulin može biti rearanžirana (tako da kodira antitelo) u organizmu miša, a takođe mogu da se jave i somatske mutacije. Antitela koja su kodirana od strane originalno humane DNK koja je podvrgnuta navedenim izmenama u organizmu miša takođe predstavljaju potpuno humana antitela, po ovde datoj definiciji. Korišćenje pomenutih transgenih miševa omogućava dobij anje humanog antitela specifičnog za određeni humani antigen. U prirodi, ovo nije moguće u većini slučajeva, jer se humani imuni odgovor protiv sopstvenog antigena normalno ne javlja. Stručnjak shvata da su potpuno humana antitela poželjnija za upotrebu kao lekovi, posebno za tečenje hroničnih bolesti, jer je malo verovatno da će izazvati imuni odgovor usmeren na sebe. Nasuprot tome, za mnoga ne-humana antitela se zna da izazivaju imuni odgovor protiv sebe kada se koriste kod ljudi, što čini hrontčnu upotrebu ovakvih antitela kod ljudi nepoželjnom. Stoga, potpuno humana antitela onemogućavaju nastanak dugotrajnih problema pri korišćenju antitela za lećenje hroničnih stanja, uključujući humane bolesti. Videti, npr., Billiau, 1988, Immunol. today 9:37 - 40; Horneff et al., 1991, Clin. Immunol. & Immunopathol. 59 : 89 - 103; Tjandra et al., 1990, ImmunoL & Cell Biol. 68 : 367 - 76. Stoga, potpuno humana anti-IFN-v antitela su posebno pogodna za tretman hroničnih humanih bolesti koje su posredovane sa IFN-v, kao što su to autoimune bolesti.

Kod humanizovanog antitela, čitavo antitelo, izuzev CDR-ova, je kodirano polinukleotiđom humanog porekla ili je identično sa takvim antitelom, izuzev u CDR-ovima. CDR-ovi, koji su kodirani nukleinskim kiselinama koje su poreklom iz ne-humanih organizama, presađeni su na okvir [3-nabora varijabilnog regiona humanog antitela u cilju kreiranja antitela, čija je specifičnost određena usađenim CDR-ovima. Dohtjanje ovakvih antitela je opisano, npr., u WO 92/11018; Jones et al., 1986, Nature 321 : 522 - 25; Verhoeven et al., 1988, Science 239 : 1534 - 36. Ovaj rad podvlači vodeću važnost CDR-ova u fbrnuranju mesta za vezivanje antigena. Himerično antitelo sadrži humani konstantni region (koji je kodiran polinukleotiđom humanog porekla ili je identičan takvom humanom

konstantnom regionu) i ne-humani varijabilni region. Dobijanje takvih antitela je opisano,

npr., u U.S. patentu br. 5,681,722.

Bivatentno antitelo koje se razlikuje od "muttispecifičnog" ili od "multtfunkdonalnog"

antitela, podrazumeva se da u određenim rešenjima sadrži identičnu specifičnost za antigene.

Prilikom procene vezivanja antitelainjegove specifičnosti prema predmetnom

pronalasku, antitelo se vezuje specifično i/ili značajno inhibira adheziju IFN-v za njegov

receptor onda kada višak antitela smanjuje količinu receptora vezanog za IFN-v, ili obrnuto,

za najmanje oko 20%, 40%, 60%, 80%, 85% ili više (merenoin vitrotestom kompetitivnog vezivanja). Kod antitela koje se specifično vezuje očekuje se da je vrednost ravnotežne konstante disocijacije vezivanja za IFN-v manja ili jednaka od 10" M, opciono manja ili jednaka od IO"9 M ili 10",0M

Za terapijsku primenu, važna karakteristika anti-IFN-v antitela je inhibicija ili modulacija biološke aktivnosti EFN-f. IFN-y poseduje mnoga različita biološka dejstva, koja mogu da se mere mnogim različitim testovima u različitim tipovima ćelija. Sposobnost anti-IFN-v antitela da inhibira ili moduliše biološku aktivnost IFN-v može da se meri korišćenjem A549 testa opisanog u Ptirneru 6 ispod, ili korišćenjem sličnog testa u kome se meri sposobnost antitela da poništi inhibiciju ćeiijske proliferacije primećene u prisustvu IFN-v. Da bi test dao rezultate koji se mogu tumačiti, proliferacija ćelija koje se koriste u testu mora biti trmibirana IFN<y koji se koristi u testu. Humani IFN-y može da inhibira proliferaciju nekih tipova ćelija, uključujući A549 ćelije (Primeri 6 i 7). Misiji IFNrv može da inhibira proliferaciju RAW 264.7 ćelija (Primer 7), ali ne i A549 ćelija. Posebno onda kada se ispituje sposobnost antitela da inhibira ili moduliše biološku aktivnost ne-humanog IFN-v, mogu da se koriste ćelijski tipovi koji se razlikuju od A549 ćelija, jer ne-humani IFN-v može, a ne mora da bude sposoban da inhibira proliferaciju A549 ćelija Ne može svako antitelo koje se specifično vezuje za antigen da blokira vezivanje antigena za njegov uobičajeni receptor i tako inhibira ili moduliše biološka dejstva koja nastaju vezivanjem antigena za receptor. Kao što je poznato u struci, takav efekat zavisi od dela antigena za koji se vezuje antitelo i od apsolutnih i od relativnih koncentracija antigena i antitela, u ovom slučaju, IFN-v i anti-IFN-v " antitela.Da bise smatralo sposobnim za inhibiciju ili modulaciju biološke aktivnosti IFN-v na način koji je ovde definisan, antitelo mora biti sposobno da spreči inhibiciju ćeiijske proliferacije koja se primećuje u prisustvu IFN-v, što se meri stepenom fluorescencije u A549 testu (Primer 6) ili nekom sličnom testu, za najmanje 20%, 40%, 60%, 80%, 85%, 100% ili više, kada su koncentracije IFN-v u opsegu, na primer, od oko ECsoili EC90, pri čemu dejstva sredstva koje inhibira njegovu biološku aktivnost mogu lako da se vide. Kao što je ovde deftnisana, ECgopredstavlja količinu IFN-y koja je potrebna da se ispolji 80% maksimalnog dejstva IFN<y>y. Ukoliko je koncentracija IFN-v značajno iznad ECgo, efekti sredstva za inhibiciju mogu biti manje vidljivi usled viška IFN-v. Koncentracija antitela koja je potrebna za inhibiciju ili modulaciju biološke aktivnosti IFN-v može značajno da varira i može da zavisi od jačine vezivanja antitela za IFN-v. Na primer, jedan molekul antitela ili manje po molekulu IFN-v može biti dovoljan da se inhibira ili moduliše biološka aktivnost u A549 testu, U nekim rešenjima, može biti potreban odnos IFN-o': antitelo od 2 : 1,1 : 1, 1 : 2,1 : 4, 1 : 6,1 : 8, 1 : 10,1 : 20, 1 : 40, 1 : 60, l : 100 ili l : 50000, da bi se inhibirala ili modulisala biološka aktivnost IFN-y, onda kada je koncentracija IFN-v u opsegu od oko EC50do oko EC90. Takođe je moguće da odnos IFN-f: antitelo bude između navedenih vrednosti.

U dodatnim rešenjima, varijante antitela mogu da obuhvate antitela koja sadrže modifikovani Fc fragment ili modifikovani konstantni region teškog lanca. Fc fragment, koji označava "fragment koji kristalizuje" ili konstantni region teškog lanca, može biti modifikovan mutacijom kako bi se dobila antitela izmenjenih karakteristika. Videti, na primer, Burton & Woof, 1992, Advances in Immunologv 51 : 1 - 84; Ravetch & Bolland, 2001, Annu. Rev. Immunol. 19 : 275 - 90; Shields et al., 2001, Journal of BioL Chem. 276 : 6591 - 6604; Telleman & Junghans, 2000, Immunologv 100 : 245 - 251; Medesan et al., 1998*Eur. J. Immunol. 28 : 2092 - 2100 (sve navedene publikacije su ivde inkorporirane po referenci). Pomenute mutacije mogu da obuhvate supstitucije, adicije, delecije, ili bilo koju njihovu kombinaciju, a tipično se izazivaju mutagenezom specifičnom za određeni lokus korišćenjem jednog ili više mutagenih oligonukleotida prema postupcima koji su ovde opisani, kao i prema drugim postupcima koji su poznati u struci (videti, na primer, Maniatis et al., Molecular Cloning: A laboratorv rnanual,Xizdanje, 2001, Cold Spring Harbor, N.Y. i Đerger & Kirnmel, Methods in enzimologv, Vol. 152, Guide to molecular cloning techniques, 1987, Academic Press, Ino, San Diego, CA, koji su ovde uključeni po referenci).

U određenim rešenjirna, varijante antitela obuhvataju glikozilirane varijante kod kojih je broj i/ili tip glikozilacionih mesta izmenjen u poređenju sa arnmokiselinskim sekvencama roditeljskog polipeptida. U određenim rešenjima, varijante proteina obuhvataju veći ili manji broj glikozilacionih mesta sa N-vezom u poređenju sa nativnim proteinom. Mesto za glikozilaciju povezano za azotom je okarakterisano sekvencom: Asn - X - Ser ili Asn - X - Thr, pri čemu aminokiselinski ostatak označen sa X može biti bilo koji ammokiselinski ostatak, izuzev prolina. Supstitucija aminokiselinskih ostataka u cilju stvaranja ove sekvence obezbeđuje potencijalno novo mesto za adiciju na N povezanog ugHenohidramog lanca. Alternativno, obezbeđene su supstitucije koje elirninišu ovu sekvencu uklanjaju postojeći ugljraohidratni lanac povezan za azotom. Takođe, obezbeđeno je preuređivanje za azot povezanih ugljenohidmmih lanaca kod kojih je jedno ili više za azot povezanih mesta za glikozilaciju (tipično ona koja se prirodno javljaju) eliminisano i kod kojih je jedno ili više novih za azot povezanih mesta stvoreno. Dodatne poželjne varijante antitela obuhvataju varijante sa cisternom kod kojih je jedan ili više cisteinskih ostataka delearano ili supstituisano drugim aminokiselinama (npr. serin) u odnosu na roditeljsku aminokiselinsku sekvencu. Cisteinske varijante mogu biti korisne onda kada se antitelo mora ponovo saviti u biološki aktivnu konformaciju, kao što je to slučaj nakon izolacije nerastvornih inkluzionih tela. Cisteinske varijante generalno imaju manje cisteinskih ostataka od nativnog proteina i tipično poseduju paran broj tih ostataka u cilju minimiziranja interakcija nastalih postojanjem neuparenih cisteina.

Pojam "sredstvo" kao što se ovde koristi, označava hemijsko jedinjenje, smešu hemijskih jedinjenja, biološki makromolekul ili ekstrakt dobijen iz bioloških materijala.

Pojmovi "oznaka" ili "obeležen", kaoStose ovde koriste, odnose se na uključivanje markera koji se mogu prepoznati, npr. na inkorporaciju radioaktivno obeležene amino kiseline ili na vezivanje polipeptida ili nukleinske kiseline nekog fluorescentnog markera, herniluminescenmog markera ili nekog enzima koji poseduje detektibilnu aktivnost, ili na vezivanje biotinskih podjedinica za polipeptid, koje se mogu detektovati obeleženim avidinom (npr. streptavidinom koji sadrži detektibilni marker, kao što je fluorescentni markef, hemiluminescentni marker ili enzimsku aktivnost koja se može detektovati, između ostalog, optičkim ili kolorimetrijskim postupcima). U određenim rešenjima, oznaka takođe može imati terapijsku vrednost Različiti postupci označavanja polipeptida i glikoproteina su poznati u struci i mogu se poželjno primeniti u ovde opisanim postupcima. Primeri oznaka za polipeptide obuhvataju, bez ograničenja, sledeće: radioižotope ilii radionuklide (npr.,<3>H,14C,<l5>N,<35>S, ™ Y, ""Te, 11V,<25>I, mI), fluoroscentne oznake (npr,, fluorescein izotiocijanat ili FITC, rodamin ilr lantanid fosfori), enzimske oznake (npr, peroksidaza rena, P-galaktozidaza, lucifćraza, alkama fosfataza), hemuurniniscentne oznake, haptenske oznake, kao što su biotinil grupe, kao i prethodno određene polipeptidne epitope koje prepoznaju sekundarni reporteri (npr. leucinska uklapajuća parna sekvenca, vezujuća mesta za sekundarna antitela, domeni za vezivanje metala, epitopske oznake). U određenim rešenjima, oznake su prikačenekracimaza razdvajanje (kao što su (€&)* pri Čemu je n<20) različitih dužina, u cilju smanjenja potencijalnih steričnih ometanja.

Pojam "biološki uzorak" kao što se ovde koristi, obuhvata, bez ograničenja, svaku količinu supstance poreklom iz živog bića ili bića koje je bilo živo. Pomenuta živa bića obuhvataju, bez ograničenja, ljude, miševe, majmune, pacove, zečeve i druge životinje. Pomenute supstance obuhvataju, bez ograničenja, krv, serum, urin, ćelije, organe, tkiva, kost, kostnu srž, limfne čvorove i kožu.

Pojam "farmaceutsko sredstvo ili lek", kao što se ovde koristi, odnosi se na hemijsko jedinjenje ili preparat koji je sposoban da indukuje pojavu željenog terapijskog dejstva pošto se na odgovarajući način primeni kod pacijenta.

Pojam "bolest koja je posredovana sa IFN-v" obuhvata, bez ograničenja, inflamatorne, infektivne i autoimune bolesti. Pojam "autoimuna bolest" se ovde koristi da označi Oboljenja i stanja kod kojih su imuni odgovori pacijenta usmereni ka sastavnim delovima samog pacijenta. Na primer, bolesti koje su posredovane sa IFN-v obuhvataju, bez ograničenja, sindrom stečene imunodeficijencije (SIDA), reumatoidni artritis, uključujući juvenilni reumatoidni artritis, inflamatornu bolest creva, uključujući ulcerativni kolitis i Hronovu bolest, multiplu sklerozu, Adisonovu bolest, dijabetes (tip I), epididimitis, glomerulonefritis, Grejvsovu bolest, Ouillan - Barre sindrom, Hašimotovu bolest, hemolitičku anemiju, sistemski lupaš eritematozus (SLE), lupusni nefritis, miasteniju gravis, pemfigus, psorijazu, psorijatični artritis, aterosklerozu, rezistenciju na eritropoetm, oboljenje presadak - protiv • domaćina, odbacivanje presatka, oštećenje jetre izazvano autoimunim hepatitisom, bilijamu cirozu, oštećenje jetre izazvano alkoholom, uključujući alkoholnu cirozu, reumatsku groznicu, sarkoidozu, sklerodermu, Sjegrenov sindrom, aponduoartrOpatije, uključujući ankilozdrajuči spondilitis, tireoiditis i vaskulitis. Pojam "bolest koja je posreedovana sa IFN-v" takođe obuhvata bilo koje medicinsko stanje koje je udruženo sa povišenim nivoima IFN-v Hl sa povećanom osetljivošću prema IFN-v.

Tretman oboljenja koje je posredovano sa IFN-v, uključujući autoimuno oboljenje, obuhvata ublažavanje makar jednog simptoma poremećaja, smanjenje ozbiljnosti oboljenja, ili odlaganje ili sprečavanje nastanka progresije do ozbiljnijeg oboljenja koje može da se javi nakon tretiranja oboljenja. Tretman ne podrazumeva da oboljenje bude u potpunosti izlečeno. Korisno terapijsko sredstvo treba samo da smanji ozbiljnost oboljenja, da smanji ozbiljnost simptoma koji su udruženi sa oboljenjem ili sa tretmanom oboljenja, ili da dovede do poboljšanja kvaliteta života pacijenta, ili da odloži pojavu ozbiljnijeg oboljenja koje može da se javi nakon tretiranjaoboljenja.Na primer, ukoliko je oboljenje reumatoidni artritis, terapijsko sredstvo može da smanji oticanje zglobova, da smanji broj zahvaćenih zglobova, ili da odloži ili inhibira gubitak koštanog tkiva. Pacijenti sa SLE mogu da imaju simptome kao što su, između ostalih, oštećenja kože, povišenu temperaturu, slabost, artritis, limfadenopatiju, pleuritis, perikarditis i/ili anemiju.Pomenuti simptomi mogu da se procene korišćenjem brojnih konvencionalnih tehnika, uključujući, na primer, inspekciju, fotografisanje, merenje temperature, merenje jačine stiska šake ili veličine zgloba i/ilimikroskopskim ispitivanjem krvi u cilju određivanja broja eritrocita. Predmetni pronalazak obezbeđuje postupak za tretiranje koji obuhvata primenu kod pacijenta sa oboljenjem posredovanim sa IFN-v antitela protiv IFN-v prema predmetnom pronalasku, u količini i tokom vremenskog perioda koji je dovoljan da indukuje trajnije poboljšanje u odnosu na osnovno stanje nekog indikatora koji pokazuje ozbiljnost određenog poremećaja ili ozbiljnost simptoma izazvanih poremećajem, ili da odloži ili spreči nastanak ozbiljnijeg oboljenja nakon tretiranja stanja u nekim ili u svim slučajevima. Predmetni pronalazak ne isključuje mogući tretman sa drugim terapijskim sredstvima pre, nakon i/ili tokom tretmana sa anti-IFN-v antitelom.

Kao što se ovde koristi, pojam "potpuno čist" ili "praktično potpuno prečišćen" označava da je jedinjenje ili vrsta jedinjenja dominantna vrsta jedinjenja prisutna u datom uzorku (tj. zastupljenija je od bilo koje druge pojedinačne vrste jedinjenja u preparatu na osnovu molarnosti), U određenim rešenjima, praktično čista frakcija je preparat u kome željena vrsta jedinjenja sadrži barem oko 50% (na osnovu molarnosti) svih rnakaomolekulsloh vrsta koje su prisutne u uzorku. U određenim rešenjima, praktično čist preparat sadrži više od oko 80%, 85%, 90%, 95%, 99% svih makromolekulskih vrsta koje su prisutne u preparatu. U određenim rešenjima, željena vrsta jedinjenja je prečišćena do stanja izražene homogenosti (konkomitantne vrste ne mogu biti. otkrivene u preparatu konvencionalnim postupcima detekcije), pri čemu se preparat sastoji praktično od jedne jedine molekulske vrste.

Pojam "pacijent" obuhvata humane ili animalne subjekte.

Osim ako drugačije nije naznačeno, pojmovi u jednim podrazumevaju i oblik množine istih pojmova. - *

Zbog toga što je IFN-v citokin sa višestrukim funkcijama, uključujući zaštitu tela od visrusne infekcije i zbog toga Što reguliše nekoliko aspekata imunog odgovora, povišena aktivnost IFN-v može da doprinese ispoljavanju odrešenog broja patoloških stanja. Prema određenim rešenjima prema predmetnom pronalasku, antitela protiv IFN-v mogu da se koriste za tretiranje oboljenja koje je posredovano IFN-v, uključujući, bez ograničenja, ona oboljenja koja su pomenuta ranije.

U jednom rešenju prema predmetnom pronalasku, obezbeđeno je potpuno humano monoklonsko antitelo koje je specifično usrnereno protiv i koje poseduje biološku i imunološku specifičnost za humani IFN-v. Predmetnim pronalaskom su obuhvaćeni varijabilni regioni koji su sadržani u takvim antitelima (sekvenca čiji je ID broj 6, sekvenca čiji je ID broj 8, sekvenca čiji je ID broj 10, sekvenca čiji je ID broj 12, sekvenca čiji je ID broj 14, sekvenca čiji je ID broj 16, sekvenca čiji je ID broj 30 i sekvenca čiji je ID broj 31),kompletniteški i laki lanci takvih antitela (sekvenca čiji je ID broj 17, sekvenca čiji je ID broj 18, sekvenca čiji je ID broj 19, sekvenca čiji je ID broj 20, sekvenca čiji je ID broj 21 i sekvenca čiji je ID broj 22), kao i antitela koja sadrže specifične CDR-ove (CDR1, CDR2 i/ili CDR3 teškog ili lakog lanca; od sekvence čiji je ID broj 34 do sekvence čiji je ID broj 44). Posebna rešenja ovog aspekta predmetnog pronalaska su sekvence koje odgovaraju CDR-ovima, specifično od CDR1 do CDR3 teškog i lakog lanca prema predmetnom pronalasku, dalje, predmetni pronalazak obezbeđuje antitela koja sadrže ovde priloženu sekvencu CDR3 (sekvenca čiji je ID broj 36, sekvenca čiji je ID broj 37, sekvenca čiji je ID broj 43 i/ili sekvenca čiji je ID broj 44), koja takođe može da sadrži sekvence koje su najmanje 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili oko 99%; identične sa bilo kojom ovde opisanom sekvencom varijabilnog regiona ili kompletnom sekvencom teškog ili lakog lanca, pri čemu antitelo može da inhibira ili 4a moduliše biološku aktivnost IFN-v.

U drugom rešenju, predmetni pronalazak obezbeđuje izolovane nukleinske kiseline ili polinukleotide koji kodiraju antitela prema predmetnom pronalasku. Antitela prema predmetnom pronalasku mogu specifično da se vežu za i/fli da inhibiraju ili modulišu biološku aktivnost IFN-v. Specifično su obimom zaštite predmetnog pronalaska obuhvaćeni polinukleotidi koji sadrže nukleotidne sekvence koje kodiraju aminokiselinske sekvence: sekvencu Čiji je ID broj 17, sekvencu čiji je ID broj 18, sekvencu čiji je ID broj 19, sekvencu čiji je ID broj 20, sekvencu čiji je ID broj 21, sekvencu čiji je ID broj 22, sekvencu čiji je ID broj 32, sekvencu čiji je ID broj 33, sekvencu čiji je ID broj 5, sekvencu čiji je ID broj 7, sekvencu čiji je ID broj 9, sekvencu čiji je ID broj 11, sekvencu čiji je ID broj 13, sekvencu čiji je ID broj 15, sekvencu čiji je ID broj 30, sekvencu čiji je ID broj 31 i/ili sekvence koje su najmanje 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili oko 99% identične sa ovim sekvencama, pri čemu se poravnanje između sekvenci navedenih gore i ispitivane sekvence proteže na najmanje 50, 60, 70, 80, 90 ili 100 aminkiselina. Predmetni pronalazak dalje obezbeđuje polinukleotide koji sadrže sekvencu čiji je ID broj 45, sekvencu čiji je ID broj 46, sekvencu čiji je ID broj 47 i/ili sekvencu čiji je ID broj 48, koje kodiraju antitela koja specifično mogu da se vežu i/ili "da inhibiraju ili modulišu biološku aktivnost IFN-v. Dalje, predmetni pronalazak obuhvata polinukleotide koji su najmanje 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili oko 99% identični sa sekvencama: sekvencom čiji je ID broj 5, sekvencom čiji je ID broj 7, sekvencom Čiji je ID broj 9, sekvencom čiji je ID broj 11, sekvencom čiji je ID broj 13, sekvencom čiji je ID broj 15, sekvencom čiji je ID broj 30, sekvencom čiji je ID broj 31, sekvencom čiji je ID broj 17, sekvencom čiji je ID broj 18, sekvencom čiji je ID broj 19, sekvencom Čiji je ID broj 20, sekvencom čiji je ID broj 21, sekvencom čiji je ID broj 22, sekvencom čiji je ID broj 32 ili sekvencom čiji je ID broj 33, pri čemu antitelo koje je kodirano svakim od ovih polinukleotiđa može da inhibira ili moduliše biološku aktivnost i/ili da se specifično veže za IFN-v i pri čemu se poravnanje između nukleotidnih sekvenci navedenih gore i ispitivane sekvence proteže na najmanje 100, 150 ili 200 nukleotida.

Tabela 2 prikazuje kratki opis sekvenci u odnosu na njihov identifikacioni broj.

U još jednom rešenju, predmetni pronalazak obezbeđuje ćelije hibridoma i ćeiijske linije koje eksprimiraju imunoglobulinske molekule i antitela prema predmetnom, pronalasku, opciono monoklonska antitela. U daljem rešenju, ćelije hibridoma ili ćelije određene ćeiijske linije koja eksprimira i/ili sekretuje imunoglobulinski molekul ili antitelo prema predmetnom pronalasku mogu da se implantiraju u pacijenta, pri čemu je antitelo prema predmetnom pronalasku ili njegov imunološki funkcionalni imunoglobulinski fragment eksprimirano i/ili se sekretuje u organizmu pacijenta, pa tako inhibira ili moduliše aktivnost IFN-v.

Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje biološki i imunološki prečišćene preparate antitela, poželjno monoklonskih antitela koja poseduju biološku i imunološku specifičnost za vezivanje za humani IF<N>-v.

Postojanje tehnologije za kloniranje i rekonstruisanje humanih lokusa veličine

mnegabaze u veštačkim hromozomima gljivica (YAC-Yeast Artificial Chromosomes) i za

njihovo uvođenje u germinativne ćelije miša, omogućava razvoj naprednog pristupa za

deftnisanje funkcionalnih komponenti veoma velikih ili grubo mapiranih lokusa, kaoi

stvaranje korisnih modela humanih bolesti. Dalje, korišćenje takve tehnologije za supstituciju

miŠijih lokusa sa njihovim humanim ekvivalentima stvara mogućnost jedinstvenih uvida u

ekspresiju i regulaciju proizvoda humanih gena u toku razvoja, uvida u njihovu komunikaciju

sa drugim sistemima iunjihovu uključenost u indukciju i progresiju bolesti.

Važna praktična primena takve strategije jeste izmena rnišijeg humoralnog imunog

sistema uvođenjem humanih ununoglobulinskih (Ig) lokusa u organizam miša u komesu

andogeni Ig geni inaktivirani (Međunarodna prijava br. WQ 93/12227). Ovaj sistem nudi

mogućnost proučavanja mehanizama koji se nalaze u osnovi programirane ekspresijei

sklapanja antitela, kao i njihove uloge u razvoju B-ćelija. Dalje, takva strategija obezbeđuje

izvor za proizvodnju potpuno humanih monoklonskih antitela (Mat). Očekuje se da potpuno

humana MAt minimiziraju imunogeneialergijske odgovore specifične za organizam miša ili

za mišija MAt, pa stoga i da povećaju efikasnost i sigurnost prirnenjenih antitela. Potpuno

humana antitela mogu da se koriste u tretmanu hroničnih i relapsirajućih humanih bolesti, kao

što su osteoartritis, reumatoidni artritis i druga inflamatoma stanja, čiji tretman zahteva

ponavljanu primenu antitela. Stoga, jedna posebna prednost anti-IFN-Yantitela prema

predmetnom pronalasku jeste da su antitela potpuno humana i da mogu da se primenjuju kod

pacijenata na način koji nije akutan, uz niirumiziranje nepoželjnih đejstava koja su obično

udružena sa rrušijim anti-humanim antitelima ili sa drugim ranije opisanim antitelima koja

nisu potpuno humana, ili saoe-humanim antitelima poreklom iz ne-humanih vrsta.

Korišćenjem postupaka koji su ranije izneti, stručnjak može da genetskim

inženjeringom dobije sortu miševa koji su deficijentni za proizvodnju miŠijih antitelaisa

velikim fragmentima humanih Ig lokusa, tako da takvi miševi proizvode humana antitela, a ne

proizvode mišija antitela. Veliki humani Ig fragmenti mogu da sačuvaju veliku raznolikost

gena za varijabilni region, kaoiodgovarajuću regulaciju proizvodnjeiekspresije antitela.

iskorišćavanjem misije ćeiijske mašinerije za diverzifikaciju antitelainjihovu selekciju i

odsustvo imunološke tolerancije prema humanim„ proteinima, reprodukovani repertoar

humanih antitela u ovim mišijim sortama dovodi do proizvodnje antitela velikog afiniteta

protiv antigena od interesa, uključujući humane antigene. Korišćenjem tehnologije hibridoma,

mogu se proizvestiiselekcionirati antigen specifična humana MAt sa željenom specifičnošću.

U određenim rešenjima, iskusni stručnjak može da kod takvih miševa koristi konstantne regione iz vrsta koje nisu humane, zajedno sa humanim varijabilnim regionima, za proizvodnju himeričnih antitela.

Struktura antitela koje se javlja u prirodi

Većina prirodnih antitela tipično ima tetramernu strukturu. Svaki takav tetramer se

tipično sastoji od 2 identična para pohpeptiđnih lanaca, pri čemu svaki par ima jedan "laki1*

lanac kompletne dužine {koji tipično ima molekulsku masu od oko 25 kDa) i jedan "teški" lanac kompletne dužina (koji tipično ima molekulsku masu od oko 50-70 kDa). Aminoterminalni dep svakog lakog i teškog lanca tipično obuhvata varijabilni region od oko 100-110 ili više amino kiselina, koje su tipično odgovorne za prepoznavanje antigena. Na

karboksi terminalnom delu svakog lanca je tipično deflnisan konstantni region koji je

odgovoran za efektorsku funkciju. Humani laki lanci su tipično klasifikovani kao<iXlaki

tanci Teški lanci su tipično klasifikovani kao u, 5,y,a ili a i oni definišu izotip antitela IgM,

IgD, IgG, IgAiIgE, respektivno. IgG poseduje nekoliko podklasa, uključujući, bez

ograničenja, IgGl i IgG2, IgG3 i IgG4. IgM poseduje nekoliko podklasa, uključujući, bez ograničenja IgMl i IgM2. IgA je slično podeljena na podklase, uključujući, bez ograničenja, IgAl i IgA2. Tipično, u okviru lakih i teških lanaca pune dužine, varijabilni i konstantni regioni su povezani "J" regionom od oko 12 ili više amino kiselina, pri čemu teški lanac takođe sadrži "D" region od oko 10 ili više amino kiselina. Videti, na primer, Tundamental immunologv", poglavlje 7 (Paul, W„ urednik, 2 izdanje. Raven Press, N.Y. (1989)) (koja je ovde uključena u celosti u bilo koju svrhu da se koristi). Varijabilni regioni svakog od parova lakog i teškog lanca tipično formiraju antigen-vezujuće mesto.

Neka prirodna antitela, koja su nađena kod kamila i lama, su dimeri koji se sastoje od dva teška lanca i ne sadrže lake lance (Mulderrnans et al., 2001, J. Biotechnol. 74 : 277 - 302; Desmvter et al., 2001, J. Biol. chem. 276 : 26285 - 90). Predmetni pronalazak obezbeđuje dimerna antitela koja se sastoje od dva teška lanca koji se mogu vezati sa i/ili inMbirati biološku aktivnost IFN-v. Kristalografske studije antitela kamile su otkrile da CDR3 teškog lanca, koji je dugačak 19 aminokiselina, formira površinu koja interaguje sa antigenom i koja pokriva dva druga hipervarijabilna regiona (Desmvter et al., navedeno gore). Stoga, CDR3 je važan za vezivanje antitela kod dimernih kamiljih antitela, kao i u tipičnijim tetramernim antitelima.

Varijabilni regioni tipčno pokazuju istu opštu strukturu relativno konzerviranih okvirnih regiona (framework regions - FR) koji su povezani sa tri hipervarijabilna regiona, koji se takođe nazivaju regionima koji određuju komplementarnost ili CDR-ovi. CDR-ovi iz dva lanca svakog para su tipično sadržani unutar okvirnih regiona, koji mogu da omoguće vezivanje za specifičan epitop. Od N-terrninala do C-terrninala, varijabilni regioni i lakih i teških lanaca tipično sadrže domene FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Redosled amino kiselina u svakom domenu je tipično u suglasnosti sa definicijama Kabata i saradnika, što je detaljnije objašnjeno ispod (Kabat et al., Seauences od Proteins of hnmunological Interest, 1991, National Institutes of Health, Bethesda, MD; videti, takođe Chothia & Lesk, J. Mol. Biol. 196 : 901*917 (1987); Chothia et al., Nature 342 : 878 - 883 (1989). CDR-ovi

sačinjavaju glavne površinske kontaktne tačke za vezivanje antigena. Videti, npr., Chothia &

lesk, navedeno gore. Dalje, CDR3 lakog lanca i posebno CDR3 teškog lanca mogu da formiraju najvažnije determinante za vezivanje antigena unutar varijabilnih regiona lakog i teškog lanca. Videti, npr., Chothia & lesk, navedeno gore; Desiderio et aL (2001), J. Mol, Biol, 310 : 603 - 15; Xu & daviš (2000), Immunity 13 (1): 37 - 45; Desmvter et aL (2001), J. Biol Chem. 276 (28) : 26285 - 90; i Muyldermans (2001), J. Biotechnol. 74 (4) : 277 - 302. U nekim antitelima, CDR3 teškog lanca izgleda da formira glavnu površinu kontakta između antigena i antitela (Desmvter et at, navedeno gore). Da bi se izmenila vezujuća svojstva

antitela, mogu se koristitiin vitrošeme za selekciju u kojima se menja samo CDR3-

(Muviderrnans, navedeno gore; Desiderio, navedeno gore).

CDR-ovi mogu biti locirani u sekvenci varijabilnog regiona teškog lanca na sledeći način, CDR1 počinje otprilike od ostatka 31 zrelog antitela i obično je dugačak 5 - 7 aminokiselina, a skoro mu uvek prethodi sekvenca Cys - Xxx - Xxx - Xxx - Xxx - Xxx - Xxx

- Xxx - Xxx (sekvenca Čiji je ID broj 48) (pri čemu je "Xxx" bilo koja aminokiselina). Ostatak koji se nalazi nakon ODRI teškog lanca je skoro uvek triptofan, Često Tyr - val, Trp - Ile ili Trp - Ala. Četrnaest ammokiselina se skoro uvek nalazi između poslednjeg ostatka CDR1 i prvog ostatka CDR2, a CDR2 tipično sadrži 16-19 aminokiselina. Neposredno pre CDR2 može da se nalazi Leu - Glu - Trp - Ile - Gly (sekvenca čiji je ID broj 49), a neposredno nakon njega može da se nalazi Lys/Arg - Leu / Ile/Val / Phe/Thr / Ala - Thr/Ser / Ile/Ala. Druge aminokiseline mogu da se nalaze pre ili posle CDR2. Skoro uvek se između poslednjeg ostatka CDR2 i prvog ostatka CDR3 nalaze 32 aminokiseline, a CDR3 može biti dug od oko 3 do 25 ostataka. Sekvenca Cys - Xxx - Xxx se skoro uvek nalazi neposredno pre CDR3, a ostatak Trp - Gly - Xxx - Gly (sekvenca čiji je ID broj 50) se skoro uvek nalazi iza CDR3.

CDR-ovi lakog lanca mogu biti locirani u sekvenci lakog lanca na sledeći način. CDR1 počinje od otprilike ostatka 24 zrelog antitela i obično je dug oko 10 do 17 aminokiselina. Skoro uvek mu prethodi Cys. Skoro uvek se između poslednjeg ostatka CDR1 i prvog ostatka CDR2 nalazi 15 aminokiselina, a CDR2 je skoro uvek . dug 7 aminokiselina. Tipično, pre CDR2 se nalazi Ile - Tyr, Val - Tyr, Ile - Lys ili Ile - Phe. Skoro uvek se između CDR2 i CDK3 lakog lanca nalazi 32 ostataka, a CDR3 je obično dug oko 7 do 10 aminokiselina. Pre CDR3 se skoro uvek nalazi Cys, a obično se iza njega nalazi Phe - Gly - Xxx - Gly (sekvenca čiji je ID broj 51).

Stručnjak shvata da dužine okvirnih regiona koji okružuju CDR-ove mogu da sadrže insercije ili delecije koje njihovu dužinu čine različitom od tipične. Kao Sto se ovde podrazumeva, dužina okvirnih regiona teškog lanca se nalazi u sledećim opsezima: FR1,0 do 41 aminokiselina; FR2, 5 do 24 aminokiselina; FR3,13 do 42 aminokiselina; i FR4, 0 do 21 aminokiselina. dalje, predmetni pronalazak obuhvata dužine okvirnih regiona lakih lanaca u opsezima: FR1, 6 do 35 aminokiselina; FR2, 4 do 25 aminokiselina; FR3, 2 do 42 aminokiselina; i FR4,0 do 23 aminokiselina.

Antitela koja se javljaju u prirodi tipično obuhvataju signalnu sekvencu, koja usmerava antitelo ka ćelijskom putu sekrecije proteina i koja nije prisutna u zrelom antitelu. Polinukleotid koji kodira antitelo prema predmetnom pronalasku može da kodira signalnu sekvencu koja se normalno javlja ili heterologu signalnu sekvencu koja je opisana ispod.

Ili vitromaturacija antitela

Antitela mogu da maturirajuin vitro,kako bi se dobila antitela izmenjenih svojstava, npr., sa većim afinitetom za antigen ili sa nižom konstantom disocijacije, Varijacijama isključivo unutar CDR-ova, posebno unutar CDR3, mogu se dobiti izmenjena antitela koja se vezuju za isti antigen, ali sa većim afinitetom. Videti, npr., Schier et al., 1996, J. Mol. Biol. 263 : 551 - 67; Yang et al., 1995, J. Mol. Biol. 254 : 392 - 403. Predmetni pronalazak obuhvata antitela koja su dobijena raznimin vitroselekcionim šemama, kao što su afinitetna maturacija i/ili mešanjem komponenti lanca (kang et al., 1991, Proc.Nad. Acad. Sci. 88 : 11120 - 23) ili mešanjem komponenti DNK (Stemmer, 1994, Nature 370 : 389 - 391), kojima antitelammogubiti selekcionirana tako da poseduju poželjna svojstva. U mnogim šernama, poznato antitelo jeinvitro randomizirano na određenim položajima, često položajima u okviru CDR-ova i podvrgnuto je procesu selekcije, kojima mogu biti izolovana antitela sa željenim svojstvima, kao što je povećani afinitet za određeni antigen. Videti, npr., van den Beucken et al., 2001, J. Mol. Biol. 310 : 591 - 601; Desiderio et al., 2001, J. Mol. Biol. 310 : 603 - 15; Yang et al., 1995, J. Mol. Biol. 254 : 392 - 403; Schier et al., 1996, J. Mol. Biol. 263 : 551 - 67. tipično, tako mutirana antitela mogu da sadrže nekoliko izmenjenih ostataka u jednom ili u više CDR-ova, što zavisi od dizajna mutageneze i koraka selekcije. Videti, npr., van den Buecken et al., navedeno iznad.

Bispecifična ili bifunkcionalna antitela

Bispecifično ili bifunkcionalno antitelo tipično predstavlja veštačko hibridno antitelo, koje poseduje dva različita para teški/laki lanac i dva različita mesta vezivanja. Bispecifična antitela se mogu dobiti pomoću raznih postupaka, uključujući, bez ograničenja, fuziju hibridoma ili povezivanje F(ab') fragmenata. Videti, na primer, Songsivilai & Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79 : 315 - 321 (1990); Kostelny et al., J. Immunol. 148 : 1547 - 1553

(1992).

Dobijanje antitela

Predmetni pronalazak obezbeđuje antitela koja se specifično vezuju za humani IFN-v. Ova antitela mogu da se dobiju imunizacijom sa IFN-v pune dušine ili sa njegovim fragmentima. Antitela prema predmetnom pronalasku mogu biti poliklonska ili monoklonska i/ili mogu biti rekombinantna. U određenim rešenjima, potpuno humana antitela prema predmetnom pronalasku se dobijaju, na primer, imunizacijom transgenih životinja koje su sposobne za proizvodnju humanih antitela (videti, npr., Međunarđnu patentnu prijavu, publikacija WO 93/12227).

CDR-ovi varijabilnih regiona lakog i teškog lanca anti-IFN-Yantitela se mogu preneti u okvirne regione (FR) iste ili druge vrste. U oateđerrim rešenjima, CDR-ovi varijabilnih regiona lakog i teškog lanca anti-IFN-v antitela se mogu preneti na humane konsenzus FR-ove, da bi se dobilo humanizovano antitelo. takva humanizovana antitela su obuhvaćena obimom zaštite predmetnog pronalaska. Da bi se dobili humani konsenzus FR-ovi, aminokiselinske sekvence nekoliko humanih teških ili lakih lanaca su uporešene, kako bi se iđentifikovale konsenzus aminokiselinska sekvenca. FR-ovi teškog ili lakog lanca anti-IFN-7antitela mogu da se zamene sa FR-ovima različitih teških ili lakih lanaca. Retke aminokiseline u FR-ovima teških ili lakih lanaca anti-IFN-?antitela se ne zamenjuju, dok se ostale aminokiseline FR-ova mogu zameniti. Retke amino kiseline su specifične amino kiseline koje se nalaze na položajima na kojima se obično ne nalaze u FR-ovima. Umetnuti varijabilni regioni iz anti-IFN-Yantitela se mogu koristiti sa konstantnim regionom koji se razlikuje od originalnog konstantnog regiona anti-IFN-Yantitela. Alternativno, umetnuti varijabilni regioni su deo jednog lanca Fv antitela. Postupak umetanja CDR je opisan, na primer, u U.S. patentima br. 6,180370, 5,693,762, 5,693,761, 5,585,089 i 5,530,101, koji su ovde uključeni po referenci u bilo koju svrhu da se koriste.

Antitela prema predmetnom pronalasku mogu da se dobiju korišćenjem transgenih miševa koji poseduju značajni deo genoma za produkciju humanog antitela koji je umetnut u ćelije miša koje proizvode antitela, a koje su dalje tako dizajnirane da sudeficijentne za proizvodnju endogenih mišijih antitela. Takvi miševi su sposobni da proizvode humane imunoglobulinske molekule i antitela i ne proizvode ili proizvode izrazito smanjene količine mišijih imunoglobulinskih molekula i antitela. Tehnologije koje se koriste da bi se postigao ovakav rezultat su opisane u patentima, patentnim prijavama i referencama koje su ovde uključene po referenci. U određenim rešenjima, stručnjak može da koristi postupke koji su opisani u Međunarodnoj patentnoj prijavi, publikacija br. WO 98/24893, koja je ovde uključena po referenci u bilo koju svrhu da se koristi, Videti, takođe, Mendez et. al., Nature Genetics 15 : 146 * 156 (1997), koja je ovde uključena po referenci u bilo koju svrhu da se koristi.

Monoklonska antitela (MAt) prema predmetnom pronalasku mogu đa se dobiju korišćenjem brojnih tehnika, uključujući konvencionalne postupke za proizvodnju monoklonskih antitela, npr., standardnu tehniku hibridizacije somatskih ćelija po Kohler & Milstein (1975, nature 256 : 495). Iako su poželjni postupci hibridizacije somatskih ćelija, u principu, mogu da se koriste druge tehnike za proizvodnju monoklonskih antitela, npr., virusna ili onkogena transformacija B-lirafocita.

Jedan od mogućih životinjskih sistema za dobijanje hibridoma je mišiji sistem. Proizvodnja hibridoma u miševima je veoma dobro ustanocljena metoda, a u struci su dobro poznati protokoli imunizacije i tehnike za izolaciju imunizovanih splenocita za fuziju. Takođe su dobro poznati i fuzioni partneri (npr., mijelomske mišije ćelije) i postupci fuzije.

U nekim rešenjima, potpuno humana monoklonska antitela specifična za IFN-y, opciono humani IFN-v, mogu se dobiti biti korišćenjem transgenih miševa koji nose određene komponente humanog imunog sistema, pre nego mišijeg imunog sistema. Ovi transgeni miševi, koji su ovde označeni kao "HuMat" miševi,, poseduju minilokus humanog imunoglobulinskog gena koji kodira nearanžirane sekvence humanog teškog (p, i y) iklakog lanca imunoglobulina, zajedno sa ciljanim mutacijama koje inaktiviraju endogene lokuse\ iiklanca (Lonberg et al., 1994, Nature 368 : 856 - 859), Shodno tome, miševi pokazuju smanjenu ekspresiju mišijeg IgM ili k, a u odgovoru na imunizaetju, uvedeni humani transgeni teškog i lakog lanca podležu promeni klase i somatskoj mutaciji, kako bi se dobila visoko afinitetna humana IgGkmonoklonska antitela (Lonberg et al, navedeno gore; lonberg & Huszar, 1995, Intern. rev, Irnmunol. 13 : 65 - 93; Harding & Lonberg, 1995, Ann. N.Y. Acad. Sci. 764 : 536

- 546). Dobijanje HuMat miševa je detaljno opisano u Tavlor et al., 1992, Nucleic Acids res. 20 : 6287 - 6295; Chen et al., 1993, International Immunology 5 : 647 - 656; Tuaillon et al., 1994, J. Immunol. 152 : 2912 - 2920; Lonberg et al., 1994, Nature 368 : 856 - 859; Lonberg, 1994, Handbook of Exp. Pharmacology 113 : 49 - 101; Tavlor et al., 1994, International Imrnunology 6 : 579 - 591; lonberg & Huszar, 1995, Intern. rev. Immunol. 13 : 65 - 93; Harding & Lonberg, 1995, Ann. N.Y. Acad. Sci 764 : 536 - 546; Fishvvild et al., 1996, Nature Biotechnology 14 : 845 - 851; sadržaj navedenih referenci je ovde inkorporiran po referenci u potpunosti. Videti dalje, U.S. patente br. 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,789,650; 5,877,397; 5,661,016; 5*814,318; 5,874,299; i 5,770,429; svi podneti od Lonberg & Kay, kao i U.S. patente br. 5,545,807 podnet od Surani et al.; Međunarodne patentne prijave, publikacije br. WO 93/1227, objavljena 24.06.1993; WO 92/22646, objavljena 23.12.1992; i WO 92/03918, objavljena 19.03.1992, čiji su opisi ovde u potpunosti uključeni po referenci. Alternativno, za dobijanje humanih anti-IFN-y antitela mogu da se koriste sojevi HCo7 i HCol2 transgenih miševa, koje su opisane u Primerima dole,

U određenim rešenjima, antitela prema predmetnom pronalasku se specifično vezuju za IFN^sa ravnotežnom konstantom disocijacije (Kd) koja je manja od IO<*7>M, 10<**>M, 10<*9>M ili 10"<10>M. U određenim rešenjima, antitela se vezuju za IFN-y sa Kdčija je vrednost između IO<*8>i IO*<12>M.

U poželjnim rešenjima, antitela prema predmetnom pronalasku pripadaju IgGl, IgG2 ili IgG4 izotipu. Antitela mogu biti IgGl izotipa. U drugim rešenjima antitela prema predmetnom pronalasku su IgM, IgA, IgE ili IgD izotipa. U poželjnim rešenjima prema predmetnom pronalasku, antitela sadrže humaniklaki lanac i humani IgGl teški lanac. Ekspresija antitela prema predmetnom pronalasku koja sadrže konstantni region teškog lanca IgGl je opisana u Primerima dole. U određenim rešenjima, varijabilni regioni antitela su ligirani za konstantni region koji nije konstantni region IgGl izotipa. U određenim rešenjima, antitela prema predmetnom pronalasku su klonirana za ekspresiju u ćelijama sisara.

U određenim rešenjima, konzervativnim modifikacijama teških i lakih lanca anti-IFN-Yantitela (i odgovarajućim modifikacijama kodirajućih nukleotida) dobijaju se anti-IFN-?antitela, koja imaju funkcionalne i hemijske karakteristike slične onima koje imaju anti-IFN-y antitela. Nasuprot tome, značajne modifikacije funkcionalnih i/ili hemijskih karakteristika anti-IFN-v antitela se mogu postići izborom supstitucija u aminokiselinskoj sekvenci teških i lakih lanaca, koje se značajno razlikuju po svom dejstvu na održavanje (a) strukture molekulskog skeleta u području supstitucije, na primer kod konformacije ploče ili heliksa, (b) naboja ili hidrofobičnosti molekula na ciljnom mestu ili (c) glavnog dela bočnog lanca.

Na primer, "konzervativna supstitucija aminokiseline" može da obuhvati supstituciju nativnog amino kiselinskog ostatka sa ne-nativnim aminokiselinskim ostatkom, tako da je dejstvo na polarnost ili na naelektrisanje aminokiselinskog ostatka na tom položaju malo ili uopšte ne postoji. Dalje, svaki nativni ostatak u polipeptidu takođe može biti supstituisan alanlnom, kao što je ranije bilo opisano kod "skenirajuće alanin mutageneze".

Stručnjak može da odredi poželjene supstitucije amino kiselina (konzervativne ili nekonzervativne) onda kada su te supstitucije potrebne. U određenim rešenjima, aminokiselinske supstitucije se mogu koristiti za identifikaciju važnih ostataka anti-IFN-v antitela, ili za povećanje ili smanjenje afiniteta anti-IFN-v antitela, što je ovde opisano.

U alternativnim rešenjima, antitela prema predmetnom pronalasku mogu biti eksprimirana u ćelijskim linijama koje se razlikuju od ćelijskih linija hibridoma. U određenim rešenjima, sekvence koje kodiraju određena antitela mogu da se upotrebe za transformaciju pogodne ćelije - domaćina sisara. Prema tim rešenjima, transformacija se može izvesti korišćenjem bilo kog poznatog postupka u struci za uvođenje polinukleotida u ćeliju - domaćina, uključujući, na primer, pakovanje polinukleotida u virus (ili u virusni vektor) i transdukciju ćelije - domaćina virusom (ili vektorom) ili korišćenjem postupaka transfekcije koji su poznati u struci, kao što su oni navedeni u U.S. patentima br. 4,399,216, 4,912,040, 4,740,461 i 4,959,455 (koji su ovde uključeni po referenci u bilo koju svrhu da se koriste). Generalno, postupci transformacije koji se koriste mogu da zavise od domaćina koji treba da bude transfonnisan. Postupci za uvođenje heterologih polinukleotida u ćelije sisara su dobro poznati u struci i obuhvataju, bez ograničenja, transfekciju posredovanu dekstranom, precipitaciju kalcijum fosfatom, transfekciju posredovanu polibrenom, fuziju protoplasta, elektroporaciju, enkapsulaciju polinukleotida u lipozomima i direktno mikroinjektiranje DNK ujedra.

Obimom zaštite prema predmetnom pronalasku su obuhvaćeni molekuli nukleinske kiseline (ili polinukleotidi) koji kodiraju aminokiselinsku sekvencu konstantnog egiona teškog lanca, varijabilni region teškog lanca, konstantni region lakog lanca ili varijabilni region lakog lanca anti-IFN-y antitela. Pomenuti polinukleotidi mogu da se umetnu u odgovarajući ekspresioni vektor korišćenjem standardnih tehnika ligacije, U poželjnom rešenju, polinukleotid koji kodira konstantni region teškog ili lakog lanca anti-IFN^ antitela se dodaje na razvodni kraj polinukleotida koji kodira odgovarajući varijabilni region i ligiran je u okviru ekspresionog vektora. Vektor se tipično bira tako da bude funkcionalan u određenoj ćeliji - domaćinu koja se koristi (tj. vektor je kompatibilan sa mašinerijom ćelije - domaćina, tako da može da se javi amlifikacija gena i/ili njegova ekspresija). Radi revijskog pregleda vektora, videti Meth. Enz. 185 (Ooeddel, urednik), 1990, Academic Press.

Tipično, ekspresioni vektori koji se koriste u bilo kojoj ćeliji - domaćinu sadrže sekvence za održavanje plazmida i za kloniranje i ekspresiju egzogenih nukleotidnih sekvenci. pomenute sekvence, koje se kolektivno označavaju kao "bočne sekvence" u određenim rešenjima tipično obuhvataju jednu ili više sledećih nukleotidnih sekvenci: promotersku sekvencu, jednu ili više pojačavaćkih sekvenci, sekvencu početka replikacije, sekvencu za terrniriaciju transkripcije, kompletnu intronsku sekvencu koja sadrži mesto cepanja donora i akceptora, sekvencu koja kodira lider sekvencu za sekreciju peptida, sekvencu mesta za vezivanje ribozoma, poliadenilacionu sekvencu, poiiveznik region za inserciju nukleinske kiseline koja kodira polipeptid koji treba da bude eksprimiran, kao i sekvencu elementa selefctibilnog markera. Svaka od pomenutih sekvenci je diskutovana u tekstu koji sledi

Opciono, vektor može da sadrži sekvencu za kodiranje "oznake", tj. oligonukleotidni molekul koji je lociran na 5' ili 3<*>kraju sekvence koja kodira polipeptid anti-DFN-Yantitela; oligonukteotidnu sekvencu koja kodira poliHIS (kao što je heksaHis), ili neku drugu "oznaku", kao što su FLAG, HA (hemaglutinin influenca virusa) ilimyc,za koje postoje komercijalno dostupna antitela. Pomenuta oznaka se tipično fuzioniše sa polipeptidom nakon ekspresije polipeptida i može da posluži za afinitetno prečišćavanje ili za detekciju anti-IFN-yantitela u ćeliji-domaćinu, Aflnitetno prečišćavanje može da se postigne, na primer,

hromatografijom na koloni korišćenjem antitela specifičnih za oznaku kao afinitetni matriks.

opciono, oznaka može nakon toga da se razdvoji od pećišćenog polipeptida anti-IFN-v antitela

na različite načine korišćenjem određenih peptidaza.

Bočne sekvence mogu biti homologe (tj. poreklom od iste vrste i/ili soja ćelija-

domaćina), heterologe (tj., iz vrste koja se razlikuje od vrste ili soja ćelije - domaćina),

hibridna (tj., kombinacija bočnih sekvenci iz više od jednog izvora), sintetska ili nativna. kao

takav, izvor bočne sekvence može biti prokariotski ili eukariotski organizam, bilo koji

kičmenjak ili beskičmenjak, ili bilo koja biljka, s tim da je bočna sekvenca funkcionalna u

mašineriji ćelije-domaćina ili da se u njoj može aktivirati.

Bočne sekvence koje su korisne u vektorima prema predmetnom pronalasku mogu da

se dobiju nekim od brojnih načina koji su dobro poznatiustruci. Tipično, bočne sekvence

koje su ovde korisne prethodno su identifikovane mapiranjem i/ili digestijom restrikcionim

endonukleazama, pa tako mogu biti izolovane iz odgovarajućeg tkiva korišćenjem pogodnih

restrikcionih endonukleaza. U nekim slučajevima, mogu biti poznate čitave nukleotidne

sekvence bočne sekvence. U rečenjima prema predmetnom pronalasku, bočne sekvence mogu

da se sitetišu korišćenjem postupaka koji su ovde opisani za sintezu ili kloniranje nukleinske

kiseline.

Bez obzira da li je poznata čitava bočna sekvenca ili samo njen deo, ona se može

dobiti korišćenjem lančane reakcije polimeraze (PCR) i/ili pretragom genomske biblioteke sa

odgovarajućim probama, kao što su fragmenti oligonukleotida i/ili bočne sekvence iz iste ili

druge vrste. Kada su bočne sekvence poznate, fragment DNK koji sadrži bočnu skvencu može

biti izolovan iz većeg molekula DNK, koji može da sadrži, na primer, kodirajuču sekvencu ili

čak drugi gen ili gene. Izolacija može da se izvede digestijom restrikcionim endonukleazama,

čime se dobtja odgovarajući DNK fragment, a posle toga sledi izolacija korišćenjem postupka

prečišćavanja sa agaroza gelom, Cuagen<®>hromatografije na koloni (Chatsv/orth, CA) ili

drugih postupaka koji su poznati iskusnom stručnjaku. Selekcija odgovarajućih enzima

kojima se postiže navedeno jasna je prosečnom stručnjaku.

Mesto početka replikacije je tipično deo onih prokariotskih ekspresionih vektora koji se dobavljaju komercijalno i ono pomaže u amplifikaciji vektora u ćeliji - domaćinu. Ukoliko vektor po izboru ne sadrži mesto početka replikacije, ono se može hemijski sintetisati na osnovu poznate sekvence, nakon čega se ligira za vektor. Na primer, mesto početka replikacije za plazmid pBR322 (New England Biolabs, Beverlv, MA) je pogodno za većinu Gram-negativnih bakterija, a različita virusna mesta početka replikacije (npr., mesta početka replikacije SV40, polioma, adenovirusa, virusa vezikularnog stomatitisa (VSV) ili papiloma virusa, kao što su HPV ili BPV) su korisni kao vektori za kloniranje u ćelijama sisara. Generalno, mesto početka replikacije kao komponenta nije potrebno za ekspresione vektore za ćelije sisara (na primer, mesto početka replikacije SV40 se često koristi samo zato što takođe sadrži rani virusni promoter).

Sekvenca za terminaciju transkripcije je tipično locirana na 3' kraju regiona koji kodira polipeptid i služi za terminaciju transkripcije. Obično, sekvenca za terminaciju transkripcije u prokariotskim ćelijama je fragment bogat G-C parovima, nakon koga štedi poli-T sekvenca. Dok še sekvenca lako klonira iz biblioteke ili se čak komercijalno poručuje kao deo nekog vektora, ona se takođe može lako sintetisati korišćenjem postupaka za sintezu nukleinske kiseline, kao Što su oni koji su ovde opisani.

Selektibilni marker gen kodira protein koji je neophodan za preživljavanje i rast ćelije - domaćina koja se uzgaja na selektivnoj podlozi. Tipični selektibilni marker geni kodiraju proteine koji (a) ispoljavaju otpornost na antibiotike ili druge toksine, npr., ampicilin, tetraciklin ili kanamicin za prokariotske ćelije; (b) nadoknađuju auksotrofne deficijencije ćelije; ili (c) obezbeđuju kritične hranljive materije koji nisu dostupni iz složenih ili definisanih podloga. Poželjni selektibilni markeri su gen za rezistenciju prema kanamicinu, gen za rezistenciju prema ampicilinu, kao i gen za rezistenciju protiv tetraciklina. Poželjno, takođe, za selekciju i kod prokariotskih i kod eukariotskih ćelija može biti koriščen gen za rezistenciju prema neomicinu.

Drugi selektibilni geni mogu da se upotrebe za amplifikaciju gena koji treba da bude eksprimiran. Ampiiftkacija je proces u kome se geni koji su potrebni za proizvodnju proteina koji je kritičan za rast ili preživljavanje ćelije reiterisani u tandemu sa hromozomima sukcesivnih generacija rekombinantnih ćelija. Primeri odgovarajućih selektibilnih markera obuhvataju gene za dihidrofolat reduktazu (DHPR) i za timidin kinazu bez promotera. Transformanti sisarskih ćelija se postavljaju u uslove selekcionog protoska u kojima su isključivo transformanti adaptirani tako da prežive usled postojanja selektibilnog gena u vektoru. Selekcioni pritisak se ostvaruje kultivacijom transformiranih ćelija u uslovima u kojima se koncentracija sredstva za selekciju u podlozi sukcesivno povećava, što vodi amplifikaciji selektibilnog gena i DNK u okviru drugog gena, npr., gena za antitelo koje se vezuje za IFN-v. Kao rezultat ovoga, iz amltfikovane DNK se sintetišu povećane količine polipeptida, kao što je anti-IFN-y antitelo.

? Mesto za vezivanje ribozoma je obično neophodno za inicijaciju translacije iRNK i karakteristično je po Shine -Dalgarno sekvenci (prokarioti) ili po Kozak sekvenci (eukarioti). Ovaj element je tipično lokaiizovan na 3' kraju u odnosu na promoter i na 5' kraju u odnosu na kodirajuću sekvencu za polipeptid koji treba da se eksprimira.

U nekim slučajevima, kao u slučajevima kada je potrebna glikozilacija u ekspresionom sistemu eukariotske ćelije - domaćina, moguće je manipulisati različitim pre- ili pro-sekvencama, kako bi se poboljšala glikozilacija ili prinos proizvoda. Na primer, moguće je menjati mesto cepanja peptiđazom na određenom signalnom peptiđu, ili dodati pro-sekvence, koje takođe mogu da utiču na glikozilaciju. Krajnji proteinski proizvod može imati na -1 položaju (u odnosu na prvu aminokisetinu zrelog proteina) jednu ili više dodatnih, aminokiselina, koje ne moraju da budu potpuno uklonjene pre ekspresije. Na primer, krajnji proteinski proizvod može imati jedan ui dva aminokiselinska ostatka koji se nalaze na mestu cepanja peptiđazom i koja su prikačena na amino-terminalu. Alternativno, korišćenjem mesta cepanja određenim enzimima može da se dobije malo okrnjena forma željenog polipeptida, ukoliko enzim vrši cepanje u takvom području u okviru zrelog polipeptida.

Vektori za ekspresiju i kloniranje prema predmetnom pronalasku tipično sadrže promoter koji je prepoznat od strane organizma domaćina i koji je operativno povezan sa molekulom koji kodira anti-IFN-v antitelo. Promoteri su sekvence koje se ne tranškribuju i koje su locirane uzvodno (tj., na 5<r>kraju) u odnosu na start kodon strakturnog gena (generalno, u okviru 100 do 1000 bp) i koje kontrotišu transkripciju strukturnog gena. Promoteri su konvencionalno grupisani u jednu od dve klase: inducibilni i konstitutivni promoteri. Inducibilni promoteri iniciraju povećanje nivoa transkripcije sa DNK koja je pod njihovom kontrolom u odgovoru na neke promene u uslovima u kulturi ćelija, npr., u odgovoru na prisustvo ili odsustvo određenog hranljivog sastojka ili na prornenu temperature. Sa druge strane, konstitutivni promoteri dovode do uniformne transkricije sa gena za koji su opserativno povezani, tj., ispoljavaju malo ili ne ispoljavaju kontrolu nad ekspresijom gena U struci je poznat veliki broj promotera, koji mogu biti prepoznati od brojnih potencijalnih ćelija - domaćina. Odgovarajući promoter je operativno povezan sa DNK koja kodira teški lanac ili laki lanac koji sačinjavaju anti-IFN-y antitelo prema predmetnom pronalasku, tako što je promoter iz originalne DNK uklonjen dejstvom digestijom restrikcionim enzimima, nakon čega je umetnuta željena promoterska sekvenca u dati vektor.

U struci su takođe poznati odgovarajući promoteri koji se upotrebljavaju kod gljivica - domaćina. Sa promoterima gljivica se poželjno koriste gljivični pojačivači. U struci su dobro poznati odgovarajući promoteri koji se upotrebljavaju kod sisarskih ćelija - domaćina i ovde spadaju, bez ograničenja, oni koji su dobijeni iz genoma virusa, kao što su polioma virus, kokošiji poks virus, adenovirus (kao Sto je Adenovirus 2), goveđi papiloma virus, ptičiji sarkoma virus, citomegalovirus, retrovirusi, hepatitis-B virus, a najpoželjnije Simijan virus 40 (SV40). Drugi pogodni sisarski promoteri uključuju heterologe sisarske promotere, na primer, promotere proteina toplotnog udara i aktinski promoter.

Dodatni promoteri koji mogu biti od interesauljučuju, bez ograničenja: rani promoter SV40 (Benoist & Chambon, 1981, Nature 290 : 304 - 10); CMV promoter (Thomsen et al„ 1984, Proc. Natl. Acad. USA 81 : 659 - 663); promoter koji se nalazi u 3' dugom terminalu repetitivne sekvence Rous sarkoma virusa (Yamamoto et al., 1980, Gell 22 : 787 - 97); promoter herpes timidin kinaze (Wagneret al., 1981, Proc. natl. Acad. Sci. USA 78 : 1444 - 45); promoter i regulatorne sekvence iz gena za metalotionin (Brinster et al., 1982, Nature 296: 39 - 42); i prokariotske promotere, kao što su promoter pMaktamaze (Villa - Kamaroff et al., 1978, Proc, natl. Acad. Sci. USA 75 ; 3727 - 31); ili promoter tac (DeBoer et al,, 1983, Proc. Natl. Acad. Sci, USA 80 : 21 - 25). takođe, od interesa su sledeći animalni kontrolni regioni transkripcije, koji pokazuju tkivnu specifičnost i koji se koriste kod transgenih životinja: kontrolni region gena zaeiastazu I koji je aktivan u ćelijama pankreasnih acinusa (Svvift et al., 1984, Gell 38 : 639 - 46; Omitzet al., 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50 : 399 - 409 (1986); MacDonalđ, 1987, Hepatologv 7 : 425 - 515); kontrolni region msulinskog gena koji je aktivan u pankreasnim p ćelijama (Hanahan, 1985, Nature 315: 115-22); kontrolni region imunoglobulinskbg gena koji je aktivan u timfoidnim ćelijama (Grosseheld et aL, 1984, Cell 38 : 647 - 58; Adames et al., 1985, Nature 318 : 533 - 38; Alexander et al., 1987, Mol. Cell. Biol. 7 : 1436 - 44); kontrolni region virusa mišijeg tumora dojke koji je aktivan u testikularnim ćelijama, ćelijama dojke, limfoidnirn i mast ćelijama (Leder et al., 1986, Cell 45 : 485 - 95); kontrolni region albuminskog gena koji je aktivan u jetri (Pinkert et al., 1987, Genes and devel. 1 : 268 - 76); kontrolni region a-feto proteina koji je aktivan u jetri (Knimlauf et al., 1985, Mol. Cell. Biol. 5 :1639 - 48; Hammer et al., 1987, science 235 : 53 - 58); kontrolni region a-l-antitripsin gena koji je aktivan u jetri (Kelsev et al., 1987, genes and devel. 1 : 161 - 71); kontrolni region P globina koji je aktivan u mijeloidnim ćelijama (Mogram et al, 1985, Nature 315 : 338 - 40; Kollias et al., 1986, Cell46: 89 - 94); kontrolni region gena baznog proteina mijelina koji je aktivan u oligodendrocitnim ćelijama mozga (readhead et at., 1987, cell 48 : 703 - 12); kontrolni region gena za miozinski laki lanac 2 koji je aktivan u skeletnom mišiću (Sani, 1985, nature 314 : 283 - 86); i kontrolni region gena za oslobađajući hormon za gonadotropne hormone koji je aktivan u hipotalamusu (Mason et al., 1986, Science 234:1372 - 78).

Pojačavačka sekvenca može biti ubačena u vektor kako bi se povećala transkripcija sa DNK koja kodira laki ili teški lanac unutar anti-IFN-v antitela prema predmetnom pronalasku kod viših eukariota. Pojačavači su cu-delujući elementi DNK, obično oko 10 - 300 bp dugi, koji deluju na promoter kako bi povećali ekspresiju. Pojaćivači su relativno nezavisni od orijentacije i položaja i nalaze se i na 5' i na 3<*>položajima u odnosu na transkripcionu jedinicu. Poznato je nekoliko pojačavačkh sekvenci poreklom iz gena sisara (npr., gena za globin, elastazu, alburnin, a-fetoproteiri i insulin). Tipično, međutim, koristi se pojačavač iz virusa. Primeri pojačavačkihelemenata za aktivaciju eukariotskih promotera koji su poznati u struci su pojačavač SV40, pojačavač ranog promotera cfcomegalovirusa, pojačavač polioma i pojacavačadenovirusa. Iako pojačavač može da se nalazi u vektoru i na položaju 5' i na položaju 3' u odnosu na kodirajuću sekvencu, tipično je lociran na 5<*>položaju u odnosu na promoter.

Sekvenca koja kodira odgovarajuću nativnu ili heterologu signalnu sekvencu (lider sekvenca ili signalni peptid) može biti inkorporirana u ekspresioni vektor, kako bi se pospešila ekstracelularna sekrecija antitela. Izbor signalnog peptida ili lider sekvence zavisi od tipa ćelije - domaćina u kojoj antitelo treba da bude proizvedeno, a heterologa signalna sekvenca može da zameni nativnu signalnu sekvencu. Primeri signalnih peptida koji su funkcionalni u ćeliji - domaćinu sisara uključuju sledeće: signalnu sekvencu interleukina 7 (IL-7) koja je opisana u U.S. patentu br. 4,965,195; signalna sekvenca receptora za IL-2 koja je opisana u Cosman et al., 1984, Nature 312 : 768; signalni peptid za receptor IL-4 koji je opisan u EP patentu br. 0 367 566; signalni peptid receptora tipa I IL-1 koji je opisan u U.S. patentu br. 4,968,607; signalni peptid receptora tipa U IL-1 koji je opisan u EP patentu br. 0 460 846; signalna sekvenca humanog IgK (sekvenca METDTLLLWVLLLWVPGSTG; sekvenca čiji je ID br. 52); signalna sekvenca humanog hormona rasta (sekvenca MATGSRTSLLLAFGLLCLPWLQEGSA; sekvenca čiji je ID br. 53); i humane signarae sekvence MGSTAILALLLAVLQGVCA (sekvenca čiji je ID br. 54) i METPAQLLFLLLLWLPDTTG (sekvenca čiji je ID br. 55), koje su kodirane sa cDNK koja kodira teški i laki lanac izolovan u Primeru 3.

Ekspresioni vektori prema predmetnom pronalaskumogu da se konstruišu iz početnog vektora, kao što je neki komercijalno dostupni vektor. Takvi vektori mogu, mada ne moraju, da sadrže sve željene bočne sekvence. Onda kada jedna ili vise bočnih sekvenci koje su ovde opisane nije prisutno u vektoru, one se mogu individualno nabaviti i ligirati u vektor. Postupci koji se ovde koriste za dobijanje svake od bočnih sekvenci su dobro poznati stručnjacima.

Pošto je vektor konstruisan i kada su na odgovarajuće mesto u vektoru ubačeni molekuli nukleinske kiseline koji kodiraju laki lanac, teški lanac ili laki i teški lanac koji se nalaze u anu-IFN-v antitelu, kompletni vektor može biti ubačen u odgovarajuću ćeliju - domaćina radi amplifikacije i/ili ekspresije polipeptida. Transformacija ekspresionog vektora za anti-IFN-Y antitelo u odabranoj ćeliji - domaćinu može da se postigne dobro poznatim postupcima uključujući transfekciju, infekciju, ko-precipitaciju sa kalcijum fosfatom, elektroporaciju, mikroinjekciju, lipofekciju, transfekciju posredovanu DEAE-dekstranom, ili drugim poznatim tehnikama. Izabrani postupak je delimično zavistan od tipa ćelije - domaćina koja treba da se koristi. Ovi postupci i drugi odgovarajući postupci su dobro poznati iskusnom stručnjaku i opisani su, na primer, u Sambrook et al., navedeno iznad.

Ćelija - domaćin, kada je kuttivisana pod odgovarajućim uslovima, sintetiše anti-IFN-Yantitela koja nakon toga mogu da se prikupe iz podloge kulture (ukoliko ih ćelija - domaćin sekretuje u podlogu) ili direktno iz ćelije - domaćina koja ih proizvodi (ukoliko ih ne sekretuje). Izbor odgovarajuće ćelije - domaćina zavisi od različitih činilaca, kao što su željeni nivoi ekspresije, polipeptidne modifikacije koje su poželjne ili neophodne za aktivnost (kao što su glikozilacija ili fosforilacija) i lakoća sklapanja u biološki aktivni molekul.

Sisarske ćeiijske linije koje su dostupne kao domaćini za ekspresiju, dobro šu poznate u struci i obuhvataju, bez ograničenja, imortaiizovane ćeiijske linije koje su dostupne u Američkoj kolekciji tipskih kultura (ATCC), uključujući, bez ograničenja,. ćelije jajnika kineskog hrčka (ĆHO ćelije), HeLa ćelije, ćelije bubrega mladunčeta hrčka (ĐHK ćelije), ćelije bubrega majmuna (COS ćelije), ćelije humanog hepatocelularnog karcinoma (npr., Hep G2) i brojne druge ćeiijske linije. U određenim rešenjima, ćeiijske linije mogu da se izaberu putem određivanja ćeiijske linije sa visokim nivoima ekspresije koja konstitutivno proizvodi antitela sa svojstvima vezivanja IFN7. U drugim rešenjima, takođe može biti izabrana ćelijska linija iz B ćeiijske loze koja ne proizvodi svoja antitela, ali koja poseduje kapacitet za proizvodnju i sekreciju heterologih antitela. '

Antitela prema predmetnom pronalasku su korisna za detektovanje IFN-Yu biološkim uzorcima i za identifikaciju ćelija ili tkiva koja proizvode IFN-y protein. Antitela prema predmetnom pronalasku koja se specifično vezuju za IFN-y mogu biti od koristi u lečenju oboljenja koja su posredovana sa IFN-y. pomenuta antitela mogu da se koriste u testovima vezivanja za detekciju EFN-y i za inhibiciju stvaranja kompleksa IFN-y sa IFN-?receptorirna. Pomenuta antitela koja se vezuju za IFN-v i koja blokiraju interakciju sa drugim jedinjenjima sa kojima je moguće vezivanje mogu da se upotrebe u terapijske svrhe da bi se modulisala oboljenja posredovana sa IFN-v. u poželjnim rešenjima, anti-IFN-y antitela mogu da blokiraju IFN-v a se veže za svoj receptor, što može da dovede do prekidanja sa IFN-v indukovane kaskade prevođenja signala.

U određenim rešenjima, predmetni pronalazak obezbeđuje farmaceutske preparate koji sadrže terapijski efikasnu količinu jednog ili mnoštva antitela prema predmetnom pronalasku zajedno sa farmaceutski prihvatljivim diluentom, nosiocem, solubilizerorn, emulzifikatorom, konzervansom i/ili adjuvansom. Poželjno, prihvatljivi materijali za formulacije nisu toksični za recipijente u dozama i koncentracijama koje se koriste. U poželjnim rešenjima, obezbeđeni su farmaceutski pereparati koji sadrže trapijski efikasnu količinu anti-IFN-v antitela.

U određenim rešenjima, prihvatljivi materijali za formulacije su poželjno netoksični za recipijente u dozama i koncentracijama koje se koriste.

U određenim rešenjima, farmaceutski preparat može da sadrži formulacione materijale za modifikaciju, održavanje ili čuvanje, na primer, pH vrednosti, osmolarnosd, viskoznosti, bistrine, boje, tzotoničnosti, mirisa, sterilnosti, stabilnosti, brzine rastvaranja ili otpuštanja, adsorpcije ili penetracije preparata. U takvim rešenjima, odgovarajući formulacioni materijali obuhvataju, bez ograničenja, aminokiseline (kao što su glicin, glutamin, asparagin, arginin ili lizin); antimikrobna sredstva; antioksidantna sredstva (kao što su askorbinska kiselina, natrijum sulfit Ui natrijum hidrogen-sutfit); pufere (kao što su boratni, bikarbonatni, Tris - HC1, citratni, fosfatni ili puferi drugih organskih kiselina); sredstva za bubrenje (kao što su manitol ili glicin); helirajuća sredstva (kao što su etuendiarnin tetrasirćetna kiselina (EDTA)); sredstva za stvaranje komleksnih jedinjenja (kao što su kafein, potivinilpirolidon, p-ćiklođekstrin Uihidroksi<p>ro<p>il-P-ciklodekslrin); punioce; monošahariđe; disaharide; i druge ugljene hidrate (kao što su glukoza, manoza ili dekstrini); proteine (kao što su serumski albumin, gelatin ili imunoglobuline); veštačke boje, arome i sredstva za razblaživanje; sredstva za emulgovanje; hidrofilne polimere (kao što je polivmilpirolidon); polipeptide male molekulske mase; katjone za formiranje soli (kao što je natrijum); konzervanse (kao što je benzalkonijum hloriđ, benzojeva kiselina, salicilna kiselina, timerosal, fenetil alkohol, metilparaben, propilparaben, hlorbeksidin, sorbinska kiselina ili vodonik peroksid); rastvarače (kao što su glicerin, propilen glikol ili polietilen glikol); šećerne alkohole (kao što su manitol ili sorbitol); sredstva za suspenđovanje; surfaktante ili sredstva za ovlaživanje (kao što su pluronici, PEG, sorbitan estri, polisorbati, kao što su polisorbat 20, polisorbat 80, tritort, trometamin, lecitin, holesterol, tiloksapai); srestva za pospešivanje stabilnosti (kao što su sukroza ili sorbitol); sredstva za uspostavljanje toniciteta (kao Što su metalni halidi, poželjno natrijum ili kalijum hlorid, manitol, sorbito,); vehikulume za dopremanje; diluente; ekscipijente i/ili farmaceutske ađjvante. Videt Remington's Pharmaceutical Sciences, 1S. izdanje (urednik A.R. Gennaro), 1990, Mack Publishing Companv.

U određenim rešenjima, optimalni farmaceutski preparat se određuje od strane stručnjaka na osnovu, na primer, željenog načina primene, oblika za dopremanje i željene doze. Videti, na primer, "Remingtnon's Pharmaceutical Sciences", navedeno iznad. U određenim rešenjima, takvi preparati mogu da utiču na fizičko stanje, stabilnost, brzinu otpuštanjain vivoi brzinuin vivoklirensa antitela prema predmetnom pronalasku.

U određenim rešenjima, primarni vehikulum ili nosilac u farmaceutskom preparatu po prirodi može biti voda ili supstanca koja še razlikuje od vode. Na primer, odgovarajući vehikulum ili nosilac može biti voda za injekcije, fiziološki rastvor ih veštačka cerebrospinalna tečnost, moguće sa dodacima drugih materijala koji su uobičajeni za pareneteralnu primenu. Neutralni puferovani fiziološki rastvor ili fiziološki rastvor pomešan sa serumskim albuminom, može predstavljati dalje rešenje venikuluma. U poželjnim rešenjima, farmaceutski preparati sadrže Tris pufer čija je pH vrednost oko 7,0 - 8,5, ili acetatni pufer čija je pH vrednost 4,0 - 5,5, koji dalje mogu da sadrže sorbitol ili za njega odgovarajuću zamenu. U određenim rešenjima, preparat koji sadrži anti-IFN-v antitela može da se pripremi za skladištenje mešanjem izabranog preparata koji poseduje željeni stepen čistoće sa opcionim sredstvima za pripremanje formulacije ("Remingtnon's Pharmaceutical Sciences", navedeno iznad) u obliku liofilizovane smeše ili vodenog rastvora. Dalje, u određenim rešenjima, preparat koji sadrži anti-IFN-y antitela mogu da budu formulisana kao liofilizat korišćenjem odgovarajućeg ekscipijenta, kao što je sukroza.

Farmaceutski preparati prema predmetnom pronalasku mogu biti namenjeni za parenteralnu primenu leka. Alternativno, preparati mogu biti namenjeni za inhalaciju ili za primenu preko digestivnog trakta, npr., za oralnu upotrebu. Preparati, takvih farmaceutski prihvatljivih preparat poznati su stručnjacima.

Poželjno, komponente formulacije su prisutne u koncentracijama koje su prihvatljive za određeno mesto primene. U određenim rešenjima, puferi se koriste za održavanje fiziološke pH vrednosti preparata ili nešto niže pH vrednosti, tipično u opsegu pH vrednosti od oko 5 do oko 8.

Kada se plasira parenteralna primena, terapeutski preparat za upotebu prema predmetnom pronalasku može biti obezbeđen u obliku u kome nema pirogena i koji je u obliku vodenog rastvora prihvatljivog za parenteralnu primenu, koji sadrži željena anti-IFN-y antitela u farmaceutski prihvatljivom vehikulumu. Posebno pogodan vehikulum za parenteralnu injekciju je sterilna destilovana voda u kojoj se nalaze anti-IFN-v anfitela,pri čemu je preparat formulisan kao sterilni, izotonični rastvor, koji se čuva na odgovarajući način. U određenim rešenjima, preparat može da obuhvati formulaciju željenog molekula sa sredstvima kao što su injcktibilne mikrosfere, biorazložive čestice, poUmerna jedinjenja (kao Što su poliaktinska kiselina ili poliglikolna kiselina), perlice ili lipozomi, koji mogu da obezbede kontrolisanO i dugotrajno otpuštanje proizvoda koji može zatim biti dopremljen posredstvom depo injekcije. U određenim rešenjima, takođe može da se koristi hijaluronska kiselina, koja može da pospeši dugotrajno otpuštanje leka u cirkulaciju, U određenim rešenjima, za primenu željenog molekula antitela mogu da se koriste implantabilni uređaji za dopremanje leka.

Farmaceutski preparat prema predmetnom pronalasku može biti formulisan za inhalaciju. U ovim rešenjima, anti-IFN-v antitela su poželjno formulisana u vidu suvog praha za inhalaciju. U poželjnim rešenjima, inhatacioni rastvor koji sadrži anti-IFN-v antitela može takođe biti formulisan sa propelantom za dopremanje u obliku aerosola. U određenim rešenjima, rastvori mogu biti nebulizovani. Primena preko parenhima pluća je dalje opisana u PCT prijavi br. PCT/US94/001875, koja je ovde uključena po referenci i koja opisuje dopremanje hemijski rnodifikovanih proteina do pluća.

Takođe, obimom zaštite predmetnog pronalaska je obuhvaćena oralna primena formulacija Anti-IFN-v antitela koja se primenjuju na ovaj način mogu biti formulisana sa ili bez nosioca koji se uobičajeno koriste u formulisanju čvrstih doznih oblika, kao Što su tablete i kaspule. U određenim rešenjima, kapsula može biti tako dizajnirana da otpušta aktivni deo formulacije u deo gastrointestinalnog trakta u kome je biološka raspoloživost najveća, a presistemska razgradnja najmanja. Dodatna sredstva mogu biti uključena u formulaciju, kako bi se pospešila apsorpcija anti-IFN-v antitela. Takođe, mogu se koristiti diluenti, veštačke arome, voskovi niske tačke topljenja, biljna ulja, lubrikanti, sredstva za suspendovanje, sredstva za dezintegraciju tableta i veznici.

Farmaceutski preparat prema predmetnom pronalasku je poželjno obezbeđen tako da sadrži efikasnu količinu jednog ili mnoštva anti-IFN-v antitela, u smeši sa netoksičnim ekscipijentima koji su pogodni za proizvodnju tableta Rastvaranjem tableta u sterilnoj vođi ili nekom drugom pogodnom vehikulumu, mogu se pripremiti rastvori u obliku jediničnih doza. Pogodni ekscipijenti obuhvataju, bez ograničenja, inertne diluente, kao što su kalcijum karbonat, natrijum karbonat ili bikarbonat, laktozu ili kalcijum fosfat; ili vezujuća sredstva, kao Što su škrob, gelatin ili akacija; ili lubrikante, kao što su magnezij um stearat, stearinska kiselina ili talk.

Dodatni farmaceutski preparati će biti jasni stručnjacima, uključujući formulacije koje obuhvataju anti-IFN-v antitela u obliku formulacija sa odloženim ili kontrolisanim otpuštanjem leka. Stručnjacima su takođe poznate brojne druge tehnike za formulisanje preparata sa produženim ili kontrolisanim otpuštanjem, kao što su formulacije sa lipozomima kao nosiocima, biorazgradivim rnikroćesticama ili poroznim prelicama i depo injekcijama. Videti, na primer, Međunarodnu patentnu prijavu br. PCT/US93/00829, koja je ovde inkorporirana po referenci i koja opisuje kontrolisano otpuštanje farmaceutskog preparata korištenjem poroznih polimernih mikročestica. Preparati sa produženim otpuštanjem mogu da obuhvate polupropusne polimerne matrikse koji su različito oblikovani, npr. kao filmovi ili mikrokapsule. Matriksi za produženo otpuštanje mogu da sadrže poliestre, hidrogelove, poliaktide (U.S. patent br. 3,773,919 i Evropska patentna prijava br. EP 058481), kopolimere L-glutaminske kiseline i v-etil-L-glutamat (Sidman et al., Biopolvmers, 22 : 547 - 556

(1983)), poli (2-hiđroksieitl-metakrilat) (Langer et al., J. Biomed. Mater. Res., 15 : 167 - 277

(1981) i Langer, Chem. Tech., 12 : 98 - 105 (1982)), etilen vini! acetat (Langer et al., gore navedeno) ili poli-D-(-)-3-hidroksibuternu kiselinu (Evropska patentna prijava br. EP 133,988). Preparati sa produženim otpuštanjem mogu takođe da obuhvate lipozome, koji se mogu dobiti na bilo koji način koji je poznat u struci. Videti, na primer, Eppstein et aL, Proc. Natl. Acađ. Sci. USA, 82 : 3688 - 3692 (1985); Evropske patentne prijave br. EP 036,676, EP 088,046 i EP 143,949, koje su sve inkorporirane po referenci

Farmaceutski preparati koji se koriste zain vivoprimenu su tipično sterilani. Sterilnost preparata se može postići filtracijom kroz sterilne filtracione membrane. Kada je preparat liofilizovan, strilizacija koja koristi ovaj postupak se može izvesti ili pre ili nakon liofilizacije i rekonštitucije. Preparati za parenteralnu upotrebu se mogu uskladiŠtiti u liofilizovanom obliku ili u obliku rastvora. Preparati za parenteralnu upotrebu se generalno postavljaju u kontejner koji poseduje sterilni pristupni deo, kao što su, na primer, vreća za intravenski rastvor ili bočica koja poseduje zaštitnik koji se može probiti iglom za hipodermalne injekcije.

Onda kada je farmaceutski preparat formulisan, može se uskladištiti u sterilnim bočicama kao rastvor, suspenzija, gel, emulzija, čvrsta supstanca ili kao dehidriram ili liofiUzovani prašak. Takve formulacije se mogu uskladištiti ili u obliku za neposrednuUpotrebu ili u obliku (npr. Hofiliziranom) koji se rekonstituiše neposredno pre upotrebe.

Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje komplete za proizvodnju pojedinačne doze za primenu. Kompleti prema predmetnom pronalasku mogu da sadrže prvi kontejner koji sadrži suvi protein i drugi kontejner koji poseduje vodenu formulaciju. U određenim rešenjima prema predmetnom pronalasku, kompleti sadrže prethodno napunjene špriceve sa jednom ili sa više komora (npr. špricevi sa tečnošću i lio-špricevi).

Terapijski efikasna količina farmaceutskog preparata koji sadrži anli-IFN-v antitela namenjena terpijskoj primeni, zavisi, na primer, od terapijskog konteksa i postavljenih ciljeva. Stručnjak shvata da odgovarajući nivoi doza za lečenje delimično zavise od molekula koji se prtmenjuje, indikacije za koju se koriste anti-IFN-v antitela, puta primene, kao i veličine (telesne mase, površine tela i veličine organa) i/ili od stanja (starosne dobi i opšteg zdravstvenog stanja) pacijenta. U određenim rešenjima, lekar može da podešava dozu i modifikuje put primene, kako bi se dobio optimalni terapijski efekat. Tipične doze mogu da se nalaze u opsegu od oko 0,1 ug/kg, do oko 30 mg/kg, u zavisnosti od činilaca koji su prethodno pomenuti. U poželjnim rešenjima, doze se nalaze u opsegu od oko 0,1 ug/kg, do oko 30 mg/kg ili od oko 10 ug/kg do oko 5 mg/kg.

Učestalost doze zavisi od fannakokinetskih parametara određenog anti-IFN-v antitela koje se koristi u formulaciji. Tipično, lekar primenjuje preparat sve dok se ne postigne doza koja ispoljava željeni efekat. Peparat se može primeniti u obliku pojedinačne doze, dve ili više doza (koje mogu, a ne moraju, da sadrže istu količinu željenog molekula)tokom određenog vremena, ili u obliku kontinuirane infuzije putem uređaja za primenu koji se implantira ili katetera. Dalja podešavanja odgovarajućih doza mtinski vrše stručnjaci i to spada u okvir njihovih rutinskih zadataka. Odgovarajuće doze mogu biti procenjene na osnovu odgovarajućih podataka a odnosu doze i odgovora na dozu. U određenim rešenjima, antitela prema predmetnom pronalasku mogu da se primenjuju kod pacijenata tokom dužeg vremenskog perioda. Hronična primena antitela prema predmetnom pronalasku minimizuje neželjene imune ili alergijske odgovore, koji su uobičajeno udruženi sa primenom antitela koja su specifična za humani antigen u nekoj životinji, na primer, onda kada se koriste ne potpuno humana antitela ili ne-humana antitela proizvedena u nekoj životinji.

Put primene farmaceutskog preparata je u skladu sa poznatim putevima primene, npr. to je oralni, intravenski, intraperitonealni, intracerebralni (intraparenhimski), mtracerebroventrikularni, intramuskdarni, intraokularni, intraarterijski, intraportalni ili intralezionalm put primene, zatim to je primena putem sistema za produženo otpuštanje i puteni implantabilnih uređaja. U određenim rešenjima, preparati se mogu primeniti injekcijom u bolusu ili kontinuirano infuzijom ili pomoću implantabilnog uređaja.

Preparat se takođe može primeniti lokalno, implantacijom membrane, sunđera ili drugog pogodnog materijala na koji je željeni molekul apsorbovan ili u kome je enkapsuliran. U određenim rešenjima, kada se koristi implatnabilni uređaj, on se može implantirati u bilo koje odgovarajuće tkivo ili organ, a primena željenog molekula se može postići putem m'fuzije, bolusa koji se otpušta u određeno vreme ili putem kontinuirane primene.

Takođe, može biti poželjno da se farmaceutski peparati koji sadrže anti-IFN-v antitela upotrebe a*vivo.U takvim slučajevima, ćelije, tkiva i/ili organi koji treba da se uklone iz pacijenta, izlažu se farmaceutskom preparatu koji sadrži farmaceutski preparat sa anuVJFN-v antitelima, nakon čega se te ćelije, tkiva i/ili organi ponovo implantiraju u pacijenta.

Posebno, anti-IFN-Yantitela mogu da se primene implantacijom određenih ćelija koje su dobijene genetskim inženjeringom, korišćenjem postupaka kao što su oni koji su opisani ovde, u cilju eksprirniranja i sekrecije određenog polipepetida. U određenim rešenjima, te ćelije mogu biti životinjske ili ljudske i mogu biti autologe, heterologe ili ksenogene. U određenim rešenjima, ćelije mogu biti imortalizovane. U drugim rešenjima, u cilju smanjivanja verovatnoće pojave imunološkog odgovora, ćelije mogu biti inkapsulirane, kako bi se izbegla infiltracija okolnih tkiva. U daljim rešenjima, materijali za enkapsulaciju su tipično biokompatibilni, polupropusni polimerni omotači ili membrane koje omogućavaju otpuštanje proteinskih proizvoda, ali sprečavaju razaranje ćelija od strane pacijentovog imunog sistema ili od strane drugih oštećujućih činilaca iz okolnog tkiva.

Primeri

Sledeći primeri, uključujući izvedene eksperimente i postignute rezultate, obezbeđeni su isključivo kao ilustracija i ni na koji način ne ograničavaju obim zaštite predmetnog pronalaska.

Primer1:Dobijanje humanog IFN-v proteina iz CHO ćelija

cDNK humananog IFN-v pune dužine je amplifikovana pomoću PCR (pod standardnim uslovima) korišćenjem humane Marathon - Ready cDNK slezine (Clonetech) kao uzorne sekvence. Sekvenca je subklonirana u pDSR<x2 plazmid. DH10B (Escherichia coli) ćelije su transfonnirane sa pDSRa2 plazmidom. DNK je dobijena korišćenjem standardnih tehnika, a CHO ćehje su transficirane postupkom sa kalcijum fosfatom (Speciatity Media, Inc.). Za dobijanje kondicioniranih podloga bez seruma korišćena je ćelijska linija klona sa visokim stepenom ekspresije. Kondicionirana podloga za CHO ćelije koje sadrže humani IFN-v (tat-IFN-y) je koncentrovana, podvrgnuta dijalizi i prečišćena u nekoliko koraka hromatografijom. Prvi korak je Q-HP (Pharmacia) hrc^tografija koja koristi stauKlarđni NaCl gradijent za razdvajanje veoma glikoziliranih od neglikozuiranih oblika hu-IFN^y. Frakcija koja je dobijena u ovom koraku je dalje prečišćena pomoću hromatografije sa aglutiriinom pšeničnih klica (EY Laoboratories). Prečišćeni materijal je razdvojen elektroforezom na SDS poliakrilamidnom gelu (SDS-PAGE) i ispitan je bojenjem sa Cootnassie plavim i srebrom. Prečišćeni materijal poseduje stepen čistoće veći od 95%, što je određeno korišćenjem SDS-PAGE i bojenjem sa Coomassie plavim i srebrom. Pomenuti materijal je takođe ispitan korišćenjem postupka gel-ugrušak (lizat Limulus amebocita), koji je pokazao nizak nivo endotoksina. Identitet hu-lFN-v je potvrđen Westem blot analizom, korišćenjem anti-AF-285 NA antitela, koje je dobijeno od kompanije R&D Svstems. Krajnja koncentracija proteina je određena na osnovu apsorbancije (Ajgo) korišćenjem postupka sa koeficijentom ekstinkcije, pri čemu se vrednost koncentracije (g/l) dobija iz odnosa vrednost apsorbancije / koeficijent ekstinkcije (koeficijent ekstinkcije = 0,66).

Primer 2: Proizvodnja humanih monoklonskih antitela specifičnih za IFN-y

Transgeni HuMat miševi

Potpuno humana monoklonska anti-IFN-v antitela su dobijena korišćenjem HCo7, HCol2 i HCo7 + HCol2 sojeva transgenih miševa, pri čemu svaki od sojeva eksprimira gene za humana antitela. Kod svakog od ovih sojeva, gen za endogeni mišijiklaki lanac je homozigotno oštećen, kao što je opisano u Chen et al., (1993, EMBO J. 12 : 811 - 820), a endogeni gen za teški lanac je homozigotno oštećen na način koji je opisan u Primeru 1 objavljene Međunarodne patentne prijave br. WO 01/09187 (koja je ovde inkorporirana po referenci). Svaki od sojeva je nosilac transgena za humani k laki lanac, KCoS, kao što je opisano u: Fishwild et al. (1996, Nature Biotechnologv 14 : 845 - 851). HCo7 sojevi su nosioci HCo7 transgena za humani teški lanac, kao što je opisano u U.S. patentima br. 5,545,806, 5,625,825 i 5,545,807 (koji su ovde inkorporirani po referenci). HCol2 soj je nosilac transgena za humani HCol2 teški lanac, kao što je opisano u Primeru 2 objavljene Međunarodne patentne prijave: br. WO 01/09187 (koja je ovde inkorporirana po referenci). HCo7 + HCol2 soj je nosilac transgena zaHCo7 i HCol2 teškog lanca i homozigotan je za svaki transgen. Svi ovi sojevi su ovde označena kao HuMAt miševi.

imunizacije HuMAt miševa

Da bi se dobila potpuno humana monoklonska antitela specifična za IFN-v, HuMAt miševi su imunizovani prečišćenim rekombinantnim IFN-v kao antigenom, koji je dobijen iz £. Coli ili iz CHO ćelija. Opšte šerne imunizacije za HuMAt miševe su opisane u Londberg et al. (1994, Nature 368 : 856 - 859; Fishvvild et al., navedeno ranije, iMeđunarođna patentna prijava br. WO 98/24884, koje su ovde inkorporirane po referenci). Miševi su bili starosne dobi od 6 - 16 nedelja u vreme davanja prve infuzije antigena. Za inrrapeirtonealnu (i.p.) ili subkutanu (s.c.) imunizaciju HuMAt miševa je korišćen prečišćeni rekombinantni preparat (25 - 100 ug) IFN-v antigena (npr., koji je prečišćen iz transficiramh E. coli ili CHO ćelija koje eksprimiraju IFN-v).

Imunizacija HuMAt transgenih miševa je izvedena korišćenjem antigena u kompletnom Freundovom adjuvansu, inicijalno davanjem dve injekcije, a nakon toga se imunizacija nastavlja tokom 2 - 4 nedelje i.p. imunizacije (sve do ukupno 9 imunizacija) sa antigenom u kompletnom Freundovom adjuvansu. Nekoliko desetina miševa je imunizovano svakim od antigena (humani IFNvy proizveden u E. coli ili CHO ćelijama). Ukupno 91 miševa HCo7, HCol2 i HCo7 + HCol2 sojeva je imunizovano sa JFN-v. Imuni odgovori su posmatrani posmatranjem retroorbitalnog krvarenja.

Da bi se izabrali HuMAt miševi koji proizvode antitela koja vezuju IFN-f, serumi imunizovanih miševa se ispituju korišćenjem ELSIA , kao što je opisano u Fishwild et al., navedeno ranije. Ukratko, ploče za mikrotitraciju su obložene prečišćenim rekombinantnim IFN-v iz CHO ćelija ili iz E. coli u koncentraciji od 1 - 2 ul/ml u PBS, pa je po 50 ul/polju inkubirano na 4 °C tokom noći, a zatim je blokirano sa 200 ul/polju 5% kokošijeg seruma u PBS/Tvveen (0,005%). U svako od polja su dodati razblaženja plazme iz miševa imunizovanih sa IFN-v, pa su ploče inkubirane tokom 1-2 časa na sobnoj temperaturi. Ploče suIsprane sa PBS/Tvveen, a potom su inkubirane sa kozijim anti-humanim IgG poliklonskim reagensom specifičnim za Fc koji je konjugovan saperoksidazom rena (HRP) tokom 1 časa na sobnoj temp. Ploče su isprane sa PBS/Tvveen i inkubirane su sa kozijim anti-humanim IgG poliklonskim reagensom specifičnim za Fc koji je konjugovan saperoksidazom rena (HRP) tokom 1 časa na sobnoj temp. nakon ispiranja, ploče su razvijene sa ABTS supstratom (Sigma Chemical Ca, St, Louis, MO, kataloški br. A-1888, 0,22 mg/ml i ispitane su spektcofotometrijski radi određivanja optičke gustine (OD

na talasnim dužinama od 415 - 495 nm. Miševi sa dovoljnim tttrom anti-IFN-v antitela su korišćeni za proizvodnju monoklonskih antitelajcao Što je ranije opisano.

Dobijanjehibridoma kojiproizvode humana monoklonskaanti-IFN-vantitela

Miševi šu pripremljeni za proizvodnju monoklnskog antitela izlaganjem antigenu intravenski 2 dana pre žrtvovanja, a nakon toga su im uklonjene slezine. Šplenociti miša su izolovani iz HuMAt miševa i fuzionisani su sa PEG za mišiju mijelomsku ćelijsku liniju korišćenjem standardnog protokola. Tipično, izvedeno je 10-20 fuzija za svaki od antigena.

Ukratko, suspenzije pojedinačnih ćelija limfocita slezine iz imunizovanih miševa su fuzionisane sa jednom četvrtinom od broja P3X63-AgS.653 nesekretujućih mišijih mijelomskih ćelija (ATCC pristupni br. CRL 1580 sa 50% PEG (Sigma). Ćelije su postavljene na ploče za mikrotitraciju sa ravnim dnom u koncentraciji od 1 * IO<3>ćelija/polju, a nakon toga štede dve nedelje inkubacije u selektivnoj podlozi koja sadrži 10% fetalni goveđi serum, 10% podlogu koja je kondiciomrana sa P388D1 (ATCC pristupni br. CRL TIB-63), 3 - 5% Origen<®>faktor za kloniranje hibridoma (IGEN), parcijano prečišćen dodatak za podlogu za rast hibridoma koji je dobijen iz podloge koja se koristi za kultivaciju ćeiijske linije mišijih makrofagima sličnih ćelija, u DMEM (Mediatech, kataloški br. CRL 10013, sa visokim nivoom glukoze, L-glutamina i natrijum piruvata), uz dodatak 5 mM HEPES, 0,055 mM 2-merkaptoetanola, 50 mg/ml gentamicina i 1 x HAT (Sigma, kataloški br. CRL P-7185). Nakon 1 - 2 nedelje, ćelije su kultivisane u podlozi u kojoj je HAT zamenjen sa HT.

Kod đobijenih hibridoma je ispitivana proizvodnja antigen - specifičnih antitela. Pojedinama polja su ispitivana korišćenjem ELISA (opisano iznad) na prisustvo humanih monoklonskih anti-IFN-v antitela IgG klase. Onda kada se javi izraziti rast hibridoma, podloga se prati, obično nakon 10 -14 dana. Hibridomi koji sekretuju antitela se prenesu na nove ploče, ponovo se ispitaju i, ukoliko su pozitivni na prisustvo humanih IgG, anti-IFN-v monoklonska antitela se subkloniraju najmanje dva puta pomoću limitiranog razblaženja Stabilni subklonovi se potom kultivišuin vitro,kako bi se dobile male količine antitela u podlozi za kulturu tkiva radi prečišćavanja i karakterizacije.

Selekcija humanih monoklonskih antitelakojasevezuju za IFN-v

Gore opisani ELISA se koristi za ispitivanje hibridoma koji su pokazali pozitivnu reaktivnost sa IFN-v irnuno<g>enom. Hibridomi koji sekretuju monoklonska antitela koja se sa visokim afinitetom vezuju za IFN-v se subkloniraju i dalje ispituju. Po jedan klon iz svakog hibridoma, koji je zadržao reaktivnost roditeljske ćelije (što se određuje korišćenjem ELISA) je izabran za formiranje ćeiijske banke od 5 - 10 bočica u tečnom azotu.

Izvodi se izotip - specifična ELISA za određivanje izotipa monoklonskog antitela proizvedenog na ovde opisani način. U ovim eksperimentima, ploče za mikrotitraciju su obložene sa po 50 ul/polju rastvora 1 ug/ml mišijeg anti-humanog k lakog lanca u PBS i inkubirane su na 4 "C tokom noći. Nakon blokiranja sa 5% kokošijim serumom, ploče su izložene reakciji sa supernatantom koji sadrži svako ispitivano monoklonsko antitelo i prečišćena izotipsku kontrolu. Ploče su inkubirane na sobnoj temp. tokom 1 - 2 časa Polja su potom izložena reakciji ili sa kozijim antihumanim poliklonskim antiserumima konjugovanim sa peroksidazom rena koji su specifični ili za humana IgGl ili humana IgG3 antitela, nakon čega su ploče razvijene i ispitane na gore opisani način.

Monoklonska antitela koja su prečišćena iz supematanta hibridoma koja su pokazala značajni nivo vezivanja za IFN-^(što je detektovano sa ELISA) su dalje ispitivana na biološku aktivnost, korišćenjem brojnih bioloških testova, koji su opisani u tekstu ispod. Antitela koja su izabrana označena su kao 1119,1121,1118<*>. 1121* i 1118.

Primer 3:Kloniranjeteških i lakihlanacaanti-IFN-vantitela

Hibridomi koji eksprimiraju anti-IFN-v monoklonska antitela 1119, 1121, 1118<*>,1121<*>i 1118 iđentifikovana u Primeru 2 iznad, korišćeni su kao izvor za izolaciju ukupne RNK, uz upotrebu TRIzol<*>reagensa (Invitrogen), monofaznog rastvora fenola i guanidin izotiocijanata, koji je pogodan za izolaciju ukupne RNK, DNK i proteina. Prvi lanac cDNK je sintetisan korištenjem nasumično izabranog prajmera sa adapterom ekstenzije (5' - GGC CGG ATA GGC CTC CAN NNN NNT - 3') (sekvenca Čiji je ID br. 23), pa je 5' RACE (RACE - rapid anuification of cDNA ends - brza amplifikacija krajeva cDNK) preparativni test izveden korišćenjem Generacer™ kompleta (Invitrogen), koji služi za brzu amplifikaciju krajeva cDNK uz poboljšanu efikasnost, prateći uputstva proizvođača. Za dobijanje cDNK koja kodira kompletni laki lanac, prajmer za napredovanje se nalazi u okviru Generacer™ prajmera, a reverzni prajmer je 5' - GGG GTC AGG CTG GAA CTG AGG - 3<*>(sekvenca čiji je ID br. 24). reverzni prajmer je dizajniran tako da prepozna konzervirani region sekvence cDNK koji se nalazi na 3' regionu humanihktanacakoji se netransliraju. Za dobijanje cDNK koja kodira varijabilni region teških lanaca, napredni prajmer se nalazi u okviru Generacer™ prajmera, a reverzni prajmer je 5' - TGA GGA CGC TGA CCA CAC G - 3<r>(sekvenca čiji je ID br. 25), koji je tako dizajniran da prepozna konzervirani region u kodirajućoj sekvenci Fc regiona humanih IgG lanaca. Proizvodi RACE su kloniram u pCR4-TOPO (Invitrogen), pa su im određene sekvence. Za dizajniranje prjamera za PCR amplifikaciju lanca antitela pune dužine su korišćene konsenzus sekvence.

Za dobijanje cDNK koja kodira k laki lanac anti-IFN-v antitela, korišćen je 5' PCR prajmer koji kodira amino-terminal signalne sekvence, zatimXba\mesto restrikcionog enzima i optimizovanu Kozak sekvencu (5<*>- ACA ACA AG CTT CTA GAC CAC CAT GGA AAC CCC AGC TCA GCT TCT CTT - 3'; sekvenca čiji je ID br. 26)- 3' prajmer kodira karboksi-terminal i kodofl za terminaciju, kao iSa/I restrikcionomesto (5' - CTT GTC GAC TCA ACA CTC TCC CCT GTT GAA GCT - 3'; sekvenca čiji je ID br. 27). Fragment koji je dobijen kao proizvod PCR je prečišćen, digestiransa XbaliSati,a potom je izolovan sa gelom i ligiran u ekspresioni vektor za sisare pDSRal9 (videti Međunarodnu patentnu prijavu br. W0 90/14363, koja je ovde uključena po referenci u bilo koju svrhu da se koristi).

Za dobijanje cDNK koja kodira teški lanac anti-IFN-v antitela, korišćen je 5' PCR prajmer koji kodira amino-terminal signalne sekvence, zatimXba\mesto restrikcionog enzima i optimizovanu Kozak sekvencu (5' - CAG CAG AAG CTT CTA GAC CAC CAT GGG GTC AAC CGC CAT CCT CG - 3'; sekvenca čiji je ID br. 28), 3' prajmer kodira karboksi-terminal varijabilnog regiona, uključujući prirodni sens lanacBsmBlmesto (5' - CTT GGT GGA GGC ACT AGA GAC GGT GAC CAG GGT GCC ACG GCC- 3'; sekvenca čiji je ID br. 29). Dobijem proizvod je prečišćen, digestiran saXbaliBsmBl,a potom je izolovan sa gelom i ligiran u vektor pDSRal9 koji sadrži cDNK konstantnog regiona humanog IgGl.

Primer 4: Ekspresija anti-IFN-v antitela u ćelijama jajnikakineskoghrčka (CHOćelije)

Stabilna ekspresija 1119 anti-IFN-v monoklonskog antitela je postignuta kotransfekcijom plazmida 1119-teški lanac/pDSRal9 i 1119- k lanac/pDSRal9 u ćelije jajnika kineskog hrčka (CHO ćelije) koje su deficijentne za đehidrofolat reduktazu (DHFR"), koje su adaptirane za život bez seruma, pri čemu je korišćen postupak sa kalcijum fosfatom. Selekcija transficiranih ćelija je izvedena u podlozi koja sadrži dijalizirani serum, ali ne sadrži hipoksantin - timidin, kako bi se osigurao rast ćelija koje eksprimiraju DHFR enzim. Transficirani kloni su ispitani korišćenjem testova kao što su ELISA, kako bi se detektovala ekspresija 1119 anti-IFN-v monoklonskog antitela u kondicioniranoj podlozi. Ćeiijske linije koje eksprimiraju 1119 At su podvrgnute amplifikaciji sa metotrekSatom. Klenovi sa najvećim stepenom ekspresije su nakon amplifikacije izabrani za kloniranje pojedinačne ćelije i za stvaranje banke ćelija.

Sva rekombinantna anti-IFN-y antitela prema predmetnom pronalasku mogu da se dobiju u ćelijama jajnika kineskog hrčka deficijentnim za DHFR korišćenjem istog protokola koji je opisan gore za 1119 MAt. DNK sekvence koje kodiraju kompletan teški ili laki lanac svakog anti-IFN-v antitela prema predmetnom pronalasku su klonirane u ekspresione vektore. CHO ćelije koje su deficijentne za DHFR su kotransficirane sa ekspresionim vektorom koji je sposoban za ekspresiju kompletnog teškog lanca i sa ekspresionim vektorom koji je sposoban za ekspresiju kompletnog lakog lanca odgovarajućeg anti-IFN-v antitela. Na primer, da bi se dobilo 1118 At, ćelije su kotransficirane sa vektorom koji je sposoban za ekspresiju kompletnog teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu označenu kao sekvenca čiji je ID br. 19, i kotransficirane su sa vektorom koji je sposoban za ekspesiju kompletnog lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu označena kao sekvenca čiji je ID br. 20. Da bi se dobilo 1121 At, ćelije su kotransficirane sa vektorom koji je sposoban za ekspresiju kompletnog teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu označenu kao sekvenca čiji je ID br. 21, i kotransficirane su sa vektorom koji je sposoban za ekspesiju kompletnog lakog lanca koji ima aininokiselinsku sekvencu označenu kao sekvenca čiji je ID br. 22. Da bi se dobilo 1118<*>At, ćelije su kotransficirane sa vektorom koji je sposoban za ekspresiju kompletnog teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu označenu kao sekvenca čiji je ID br. 32, i kotransficirane su sa vektorom koji je sposoban za ekspesiju kompletnog lakog lanca koji ima aniinokiselinsku sekvencu označenu kao sekvenca čiji je ID br. 20. Da bi se dobilo 1121<*>At, ćelije su kotransficirane sa vektorom koji je sposoban za ekspresiju kompletnog teškog lancakoji ima aminokiselinsku sekvencu označenu kao sekvenca čiji je ID br. 21, i kotransficirane

su sa vektorom koji je sposoban za ekspesiju kompletnog lakog lanca koji ima

aminokiselinsku sekvencu označenu kao sekvenca čiji je ID br. 33. Tabela 3 sažeto prikazuje

kompletne teSke i kompletne lake lance različitih anti-IFN-v antitela.

Primer 5: Proizvodnja anti-IFN- antitela

1119 At je dobijeno ekspresijom klonske linije CHO ćelija koja ga eksprimira. Za odvijanje proizvodnje, ćelije iz jedne bočice su otopljene u podlozi za kultivaciju bez seruma. Inicijalno, ćelije su uzgajane u flaši za mešanje od 250 ml, zatim u većoj flaši za mešanje, a konačno u reaktorima od nerđajućeg čelika koji su se povećavali do bioreaktora od 2000 1. Proizvodnja se odvijala u bioreaktoru u kome se nalazi kultura serije, kojoj se konstantno

dodaju hranijivi sastojci koji sadrže koncentrovane komponente podloge, kako bi se održao ćelijski rast i vijabilnost kulture. Proizvodnja traje oko 2 nedelje, a tokom tog perioda se 1119 At konstitutivno proizvodi od strane ćelije i sekretuje se u podlogu ćeiijske kulture.

reaktor za proizvodnju se kontroliše tako da se održava prethodno određeni pH, temperatura i nivo rastvorenog kiseonika. Vrednost pH se kontroliše dodavanjem ugljen - dioksida i natrijum karbonata. Nivo rastvorenog kiseonika se kontroliše protokom vazduha, azota i kiseonika.

Na kraju procesa proizvodnje, ćelijska kaša se prenosi u centrifugu, gde se supernatant kulture razdvaja od ćelija. Koncentrat se dalje prečišćava prevođenjem kroz duboke filtere, a onda kroz filter vel. 0,2 um. IsČišćena kondicionirana podloga se zatim koncentruje ultrafiltracijom sa tangencijalnim protokom. Kondicionirana podloga se koncentruje 15 do 30

*. Dobijena kofleerttrovana kondicionirana podloga se zatim prerađuje kako bi se prečistilo antitelo koje sadrži, ali može biti i zamrznuta i prečišćena kasnije. Svako od ovde opisanih antitela može da se proizvede na sličan način.

Primer 6: Karakterizacija aktivnosti anti-IFN-v antitela

S obzirom da IFN-v poseduje brojna biološka dejstva, korišćeno je nekoliko različitih bioloških testova da bi se uporedila snaga različitih anti-IFN-v antitela. A549 test koji je doleOpisan je korišćen za primarno ispitivanje, pri čemu su njime izabrane supstance dalje ispitivane. Izabrane supstance obuhvataju 1119, 1118 i 1121 antitela.

A549 Biološki test

Jedno od utvrđenih svojstava IFN-v jeste antiproliferativni efekat na brojne ćeiijske popilacije. Videti, npr., Aune & Pogue, 1989, J. Ctin. Invest. 84 : 863 - 75. Humana plućna ćelijska linija A549 se često koristi u publikacijama da opiše biološku aktivnost IFN-v. Videti, npr., Aune & Pogue, navedeno gore; Hill et al., 1993, Immunologv 79 : 236 - 40. Generalno, aktivnost inhibitora se ispituje pri koncentraciji stimulišuće supstance koja se nalazi na delukrive doza - odgovor na kome mala promena doze dovodi do promene u odgovoru. Stručnjak zna da ako se stimulišuća supstanca primeni u višku, potrebne su veoma velike doze inhibitora da bi se primetila promena u odgovoru. Koncentracije koje se uobičajeno koriste za stimuliSuću supstancu jesu ECgo i EC90(koncentracije pri kojima se postiže 80% ili 90% (respektivno) maksimalnog odgovora).

Generisana je kriva doza - odgovor za IFN-v, kako bi se odredila EC90za ćelijsku liniju karcinoma epitela pluća AS49 (približno 30 pM). U narednim eksperimentima, različite koncentracije prečišćenih antitela su mešane sa fiksnom dozom IFN-y (30 pM), pa je određivana sposobnost antitela da inhibira biološku aktivnost anti-proliferativnog dejstva IFN-v. Test je izvođen tokom 5 dana, a proliferacija je merena na osnovu fluorescencije nastale redukcijom Alamarblue™ (AccuMed International, Inc., Chicago, IL), boje koja se koristi za ukazivanje na ćelijski rast metabolički aktivnih, tj., proliferišućih ćelija. Videti, npr., de Fries & Mitsuhashi, 1995, J. Clin. Lab. Analvsis 9 <2): 89 - 95; Ahmed et al., 1994, J. Immunol. Methods 170 (2): 211 - 24.

Kao Sto je prikazano na Slici 9, 1119 antitelo je najpotentnije antitelo sa IC50(koncentracija pri kojoj se postiže inhibicija dejstva IFN-v od 50%) od 14 pM, a nakon toga slede At 1121 (46 pM) i At 1118 (97 pM).

HLA DR biološki test

Druga ustanovljena karakteristika IFN-y jeste njegova sposobnost da pospeŠi ekspresiju gena za MHC klase I i klase II u različitim tipovima ćelija. Ova aktivnost može biti posebno značajna kod lupusnog nefritisa (Yokoyama et al., 1992, kidnev Int. 42 : 755 - 63). U publikacijama se često koristi THP-1 ćelijska linija humanih monocita za opisivanje ove biološke aktivnosti IFN-v. generiše se kriva doza - odgovor za IFN-v da bi se odredila EC402a određenu THP-1 ćelijsku liniju koja se koristi u eksperimentu (oko 21 pM). U narednim eksperimentima, različite koncentracije prečišćenih antitela se mešaju sa fiksnom dozom IFN-Y(21 pM), pa se određuje sposobnost antitela da neutrališu ili inhibiraju povećanje ekspresije HLA DR na površini ćelije koje je indukovano sa IFN-v. Tst se izvodi tokom 24 časova, pa se meri srednji intenzitet fluorescencije upotrebom FACS analize, kojom se detektuje vezivanje sa FITC obeleženog anti-HLA DR antitela za ćelije.

Kao što je prikazano na Slici 10, 1119 At je najpotentnije, sa IC50vrednošću od 14 pM, a potom slede At 1121 (60 pM) i At 1118 (86 pM).

Biološko ispitivanje pune krvi

Na osnovu opservacija da IFN-v povećava proizvodnju hemokina IP-10 u nekoliko različitih ćeiijskih linija, razvijeno je biološko ispitivanje pune krvi. Ova aktivnost može biti posebno važna kod lupusnog nefritisa (narumi et al., 2000, Cvtokine 12 : 1561 - 1565). Puna krv od brojnih normalnih humanih donora je ispitivana da bi se utvrdila sposobnost IFN-v da poveća proizvodnju IP-10. generisana je kriva doza - odgovor za IFN-v da bi se utvrdila EC50kod pojedinačnih donora. Kao što je i očekivano, prunećene su neke varijacije između donora. Generalno, korišćeni su donori koji su mogli da u ponovljenim ispitivanjima pokažu EC50od 50 - 100 pM. Puna krv je pomešana sa fiksnom koncentracijom IFN-v i različitim koncentracijama antitela, a smeše su inkubirane tokom 18,5 časova, a onda je pomoću ELISA određen nivo IP-10. Reprezentativni rezultati testa pune krvi kod dva različita donora su prikazani na SLici 11. IC50kod ova dva donora su 17 i. 14 pM. Do danas, identifikovan je samo jedan đonor sa spontano povećanim nivoma IP-10 na osnovu testa pune krvi, kod koga nije bilo potrebno dodavanje egzogenog IFN-v. Anti-IFN-v antitela su sposobna da blokiraju ovu spontanu proizvodnju IP-10, najvcrovatnije blokiranjem endogeno proizvedenog IFN-v.

Biokemijski testovi

Kinetika vezivanja za nekoliko anti-IFN-v antitela je određvana B AIcore analizom. Inicijalni rezultati sugerišu da antitela imaju parametre koji se približavaju 1 imitacijama za pouzdano merenje na BIACORE™ mašini (Pharmacia Biosensor AB Corp., Uppsala, švedska), aparatu koji koristi površinsku rezonanciju za merenje vezivanja između molekula. Shodno tome, razvijen je i korišćen test ravnotežnog vezivanja. Fiksna količina antitela je inkubirana sa različitim koncentracijama IFN-v tokom duže od 5 časova, kako bi se postigla ravnoteža, a potom je šmeša izložena perlicama na koje je povezan IFN-v tokom kratkog vremena, pa je količina slobodnog antitela koje se vezalo za perlice merena u Kinexa™ mašini (Sapidvne Instruments Inc., Boise, ID), instrumentu kod koga se merenje zasniva na fluorescentnom imunološkom testu. Sa At 1119 je dobijena najniža ravnotežna konstanta disocijacije od oko 24 pM.

Primer 7: Ukrštena reaktivnoat između različitih vrsta

ispitivana je sposobnost gore opisanih antitela da neutrališu ili inhibiraju

rekombinantne IFN-v proteine iz nekoliko različitih vrsta. Mišiji IFN-v je nabavljen

komercijalno, dok su IFN-v čoveka, Cvnomolgus majmuna i šimpanze klonirani i

eksprirnirani u konvencionalnim ekspresionim sistemima sisara, kao što je ćelijska linija

humanih 293 ćelija. IFN-v čoveka, Cvnomolgus majmuna i šimpanze su aktivniuprethodno

opisanom A549 testu koji je opisan ranije, dok mišiji IFN-v nije bio aktivan u ovom testu. Mišiji protein je bio aktivan u biološkom testu koji koristi RAW 264.7 ćelijsku liniju, koji je

praktično identičana sa AS49 testom opisanim ranije, s tim da se koristi mišija ćetijka linija.

RAW 264.7 je ćelijska linija mišijih monocita rnakrofaga i može da se nabavi, na primer, iz

Američke kolekcije tipskih kultura. Kao što je prikazano u tabeli 4, sva. tri antitela su

sposobna da neutrališu IFN-y čoveka i šimpanze, dok ni jedno nije sposobno da neutrališe ili

inhibira biološku aktivnost IFN-v Cvnomolgus majmuna ili miša.

Primer8: Identifikacija epitopa anti-IFN-v antitela

Upoređivanje aminokiselinskih sekvenci zrelog humanog i Cvnomolgus IFN-v ukazuje na postoji 9 različitih aminokiselina na položajima 19,20, 31,34, 65, 77, 103,110 i126, navedeno prema sekvenci humanog IFN-v. Sekvence humanog i šimpanzinog IFN-v su opisane u Thakur & Landolfi. (1999), Molecular Immunologv 36 : 1107 - 15. Sekvenca IFN-v Cvnomolgus majmuna je opisana u Tatsumi & Sata (1997), Int. Areh. Allergz immunol. 114 (3): 229 - 36; a sekvenca mišijeg IFN-v je opisana, npr., u Nacionalnom centru za biotehnološke informacije (NCBI) pod pristupnim brojem NP_032363. Za mesto specifična mutageneza uz upotrebu komercijalno dostupnih kompleta je korišćena za individualnu supstituciju svake aminokiseline iz humanog IFN-v koja se razlikuje u poređenju sa odgovarajućom aminokiselinom u IFN-v Cvnomolgus majmuna. Svaki supstituisani IFN-v je označen kao "huIFNy" i simbolom aminokiseline kojom je zamenjena aminokiselina prisutna u sekvenci humanog IFNv, kao i položajem na kome je u sekvenci zrelog humanog IFNy doSlo do supstitucije. Na primer, " huIFNYD19" označava verziju IFN-v koja je identična humanom IFN-v, s tim da je na položaju 19 asparaginska kiselina zamenila histidin, koji normalno zauzima ovaj položaj. Slični eksperimenti su izvedeni, s thn da je IFN-v Cvnomolgus majmuna menjan supstitucijama svake različite aminokiseline u odnosu na humanu sekvencu, sa aminokiselinom koja je prisutna na istom položaju u humanom IFN-v. Na primer, "cynoIFNYL103" označava verziju IFN-v koja je identična IFN-v Cvnomolgus majmuna, s tim da na položaju 103 leucin zamenjuje serin koji je normalno prisutan na ovom položaju. Videti Tabele 5 16. Ovi mutantni proteini su eksprimirani u konvencionalnom ekspresionom sistemu sisara, kao što je to ćelijska linija humanih 293 ćelija. Svi mutantni IFN-v proteini su zadržali aktivnost, što je proeenjeno A549 testom, ispitivana je sposobnost 1119 antitela da neutrališe ili inhibira biološku aktivnost različitih mutantnih IFN-y proteina, korišćenjem A549 biološkog testa. Sposobnost 1119 antitela da neutrališe ili inhibira anti - proliferativnu aktivnost humanog IFN-v je određena merenjem fluorescencije na gore opisani način, pri čemu $u rezultati korišćeni kao osnova za upoređivanje sposobnosti 1119 At da neutrališe aktivnost svake od ostalih varijanti IFN-v.<p>očevši od humanog IFN-v, inhibicija aktivnosti IFN-v ie izražavana u procentima, pri čemu je dogovoreno da maksimalni nivo fluorescencije koji se primećuje u prisustvu humanog IFN-v 1 Hl? At (usled redukcije Alamarblue™ od strane proliferišućih ćelija) bude prihvaćen kao 100%, a onda da se maksimalni nivoi fluorescencije koji se mere u prisustvu svakog od izmenjenih oblika IFN-v i 1119 At upoređuju sa tom vređnošcu. Alternativno, moguće je kao standard uzeti parametre kada je prisustan IFN-v Cvnomolgus majmuna, a inhibiciju ocenjivati kvalitativno u odnosu na ovu vrednost.

Kao što je sažeto prikazano u Tabeli 5, At 1119 je sposobno da neutrališe ili inhibira biološku aktivnost humanog IFN-v i svih supstitucionih mutanata IFN-v, izuzev huIFNvD19 i huIFNvP20. Kao i u prethodnom primeru, IFN-v Cvnomolgus majmuna takođe nije inhibiran 1119 antitelom. Ova analiza ukazuje da su ostaci 19 i 20 posebno važni za interakciju At 1119 i IFN-v i da mogu biti mesta kontakta između antitela 1119 i humanog IFN-v.

Tabela 6 prikazuje da izmenjene verzije IFN-v Cvnomolgus majmuna usled supstitucija koje omogućavaju da sekvenca IFN-v Cvnomolgus majmuna bude identična sa humanom sekvencom na položajima 19 i 20, ne mogu biti neutralizovane sa 1119 antitelom. Međutim, verzije IFN-v Cvnomolgus majmuna koje poseduju supstitucije koje odgovaraju humanoj sekvenci na pložajima 19, 20 i 65 ili 19, 20 i 104, mnogu da se neutrališu sa 1119 antitelom, kao i verzije koje poseduju dodatne mutacije pored ovih koje su navedene.

Primer9: Biološka aktivnost anti-IFN-v antitela nakon njegove primene kod šimpanzi

At 1119 je primenjeno kod dve šimpanze u dozi od 20 mg/kgsvakenedelje tokom3

nedelje. Krv je bila uzeta od šimpanzi ili 2 (-2) ili jednu nedelju (-1) pre primene antitela, a

dalje je krv uzimana nakon 2, 8, 15,29 i 36 dana od primene prve doze antitela. Ispitivanje

pune krvi šimpanze je izvedeno na uzetim uzorcima praktično na isti način koji je korišćen u

testu pune krvi koji je opisanuPrimeru 6, s ključnom razlikom da antitelo nije dodatoupunu

krv egzogeno, već je prethodnoInvivo primenjeno kod šimpanzi. IFN-v je dodavan u krv u

raznim koncentracijama (0,01 ng/ml, 3,9 ng/irn ili 1 ug/ml), a zatim je krv inkubirana na 37

°C tokom 20-24 časa, pa je proizvodnja IP-10 merena korišćenjem ELISA sa perlicama.

Kao što može da se primeti na Slikama 14 i 15, krv koja je od životinja uzeta pre

davanja doze antitela je reagovala na IFN-v povećanjem proizvodnje IP-10 na đozno zavistan

način. Nasuprot tome, krv koja je od životinja uzeta nakon primene antitela nije reagovala ni

na jednu koncentraciju IFN-v porastom proizvodnje BP-10. Ovi podaci ukazuju da antitelo

zadržava sposobnost da neutrališe IFN-v, čak i nakon njegove primenein vivo.Dalje, količina

IFN-v koji je dodat U ove kulture značajno premašuje endogene nivoe lFN-y kod šimpanzi, što

sugeriše daje primenjeno antitelo sposobno da neutrališe endogeni IFN-7in vivo.

Treba razumeti. da prethodno izneti opis ističe određena specifična rešenja prema

predmetnom pronalasku i da se sve modifikacije ili alternative koje su mu ekvivalentne nalaze

u okviru duha i obima zaštite predmetnog pronalaska, koji je definisan u priđodatim

patentnim zahtevima. Sve publikacije koje su ovde citirane su u potpunosti inkorporirane po

referenci.

Claims

1. Izolovano potpuno humano antitelo koje sadrži CDR1 teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je predstavljena kao Sekvenca čiji je ID broj: 34; CDR2 teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je predstavljena kao Sekvenca čiji je ID broj: 35; CDR3 teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je predstavljena kaoSekvenca čiji je ID broj: 36 ili Sekvenca čiji je ID broj: 37; CĐR1 lakog lanca koji sadrži Sekvencu čiji je ID broj: 38 ili Sekvencu Čiji je ID broj: 39; CDR2 lakog lanca koji sadrži Sekvencu čiji je ID broj: 41; i CĐR3 lakog lanca koji sadrži Sekvencučijije ID broj: 43; gde se navedeno antitelo specifično vezuje za humani INF-7.

2. Antitelo prema patentnom zahtevu 1,naznačeno timešto sadrži varijabilni region teškog lanca najmanje 90% identičan Sekvencičijije ID broj: 10, Sekvenci čiji je ID broj: 6 i(li) Sekvenci čiji je ID broj: 14; i varijabilni region lakog lanca najmanje 90% identičan Sekvenci čiji je ID broj: 8, Sekvenci čiji je ID broj: 12 i(li) Sekvenci čiji je ID broj: 16.

3. Antitelo prema patentnom zahtevu 2,naznačeno timeŠto je varijabilni region teškog lanca najmanje 95% identičan Sekvenci čiji je ID broj:10, Sekvenci čiji je ID broj: 6 i(li) Sekvenci čiji je ID broj: 14; i Sto je varijabilni region lakog lanca najmanje 95% identičan Sekvenci čiji je ID broj: 8>Sekvenci čiji je ID broj: 12 i(li) Sekvenci čiji je ID broj: 16.

4. Antitelo prema patentnom zahtevu 1,naznačeno timešto sadrži aminokiselinske sekvence predstavljene Sekvencom čiji je ID broj: 10 i Sekvencom Čiji je ID broj: 12.

5. Antitelo prema patentnom zahtevu 1,naznačeno timešto sadrži aminokiselinske sekvence predstavljene Sekvencom čiji je ID broj: 6 i Sekvence čiji je ID broj: 8.

6. Antitelo prema patentnom zahtevu 1,naznačeno timeSto sadrži aminokiselinske sekvence predstavljene Sekvencom čiji je ID broj: 14 i Sekvencom čiji je ID broj: 16.

7. Antitelo prema patentnom zahtevu 1,naznačeno timešto sadrži aminokiselinske sekvence predstavljene Sekvencom čiji je ID broj: 19 i Sekvencom čiji je ID broj: 20.

8. Antitelo prema patentnom zahtevu 1,naznačeno timešto sadrži aminokiselinske sekvence predstavljene Sekvencom čiji je ID broj: 17 i Sekvencom čiji je ID broj: 18.

9. Antitelo prema patentnom zahtevu 1,naznačeno timešto sadrži aminokiselinske sekvence predstavljene Sekvencom čiji je ID broj: 21 i Sekvencom čiji je ID broj: 22.

10. Antitelo prema patentnom zahtevu 1,naznačeno timešto CDR3 teškog lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je predstavljena kao Sekvenca čiji je ID broj: 37; i CDR1 lakog lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je predstavljena kao Sekvenca čiji je ID broj: 39.

11. Antitelo prema patentnom zahtevu 1,naznačeno timešto CDR3 teškog lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je predstavljena kaoSekvenca čiji je ID broj: 36; i CDR1 lakog lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je predstavljena kao Sekvenca čiji je ID broj: 38.

12.Antitelo prema patentaom zahtevu 1, naznačeno time Sto CDR3 teškog lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je predstavljena kao Sekvenca čiji je ID broj: 37; i CDR1 lakog lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je predstavljena kao Sekvenca čiji je ID broj: 38.

13. Antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 12,naznačeno timešto navedeno antitelo sadrži teški lanac i laki lanac, gde navedeni teški lanac sadrži VHregion,ChI region, Ch2 region i Ch3 region i gde laki lanac sadrži VLregion i Clregion.

14. Antitelo prema patentnom zahtevu 13,naznačeno timeŠto je navedeno antitelo IgGl, IgG2 ili IgG4 antitelo.

15. Antitelo prema patentnom zahtevu 14,naznačeno timešto je navedeno antitelo IgGl antitelo.

16. Antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 12,namučeno timešto je navedeno antitelo jednolančano antitelo.

17. Izolovani polinukleotidnaznačen timešto kodira antitelo iz bilo kog od patentnih zahteva 1 do 16.

18.Vektor naznačen timešto sadrži polinukleotid iz patentnog zahteva 17.

19. Ćelija domaćinnaznačena timešto sadrži polinukleotid iz patentnog zahteva 17.

20. Ćelija domaćin prema patentnom zahtevu 19,naznačena timeSto je navedena ćelija domaćin ćelija sisara.

21. Ćelija domaćin prema patentnom zahtevu 20,naznačena timeSto je navedena ćelija domaćin CHO ćelija.

22. Postupak za dobijanje antitelanaznačen timešto podrazumeva gajenje u kumiri ćelije domaćina iz bilo kog ođ patentnih zahteva 19 do 21.

23. Farmaceutski preparatnaznačen timešto sadrži antitelo iz bilo kog od patentnih zahteva 1 do 16.