RS53104A - Hemijski modifikovani konjugati humanog hormona rasta - Google Patents

Hemijski modifikovani konjugati humanog hormona rasta

Info

Publication number
RS53104A
RS53104A YU53104A YUP53104A RS53104A RS 53104 A RS53104 A RS 53104A YU 53104 A YU53104 A YU 53104A YU P53104 A YUP53104 A YU P53104A RS 53104 A RS53104 A RS 53104A
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
conjugate according
hgh
group
poly
growth hormone
Prior art date
Application number
YU53104A
Other languages
English (en)
Inventor
Rory F. Finn
Wei Liao
Ned R. Siegel
Original Assignee
Pharmacia Corporation
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Pharmacia Corporation filed Critical Pharmacia Corporation
Publication of RS53104A publication Critical patent/RS53104A/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/61—Growth hormone [GH], i.e. somatotropin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/22—Hormones
    • A61K38/27—Growth hormone [GH], i.e. somatotropin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/06—Drugs for disorders of the endocrine system of the anterior pituitary hormones, e.g. TSH, ACTH, FSH, LH, PRL, GH

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

Ovaj pronalazak obezbeđuje hemijski modifikovane humane hormone rasta (hGH) dobijene vezivanjem polimera rastvornog u vodi za protein. Hemijski modifikovan protein prema ovom pronalasku može imati daleko duži hGH aktivnost nego nemodifikovani hGH., čime se otvara mogućnost za smanjenje doza i raspored.

Description

Hemijski modifikovani konjugati humanog hormona rasta
Ova prijava zahteva pravo prvenstva u skladu sa Titile 35, United States Code §119 za provizionu prijavu Sjedinjenih Američkih Država, serijski broj 60/331,907, podneta 20 novembra 2001, koja je data kao referenca.
Oblast tehnike
Predmetni pronalazak se odnosi na hemijske modifikacije humanog hormona rasta (hGH) i njihove agonističke varijante kojima se mogu promeniti hemijske i/ili patološke osobine hGH. PEG-ilovan hGH može da ima produženo vreme koje provodi u plazmi, smanjenu brzinu izlučivanja, poboljšanu stabilnost, smanjenu antigenost ili njihovu kombinaciju. Predmetni pronalazak se takođe odnosi na postupk za modifikaciju hGH. Dodatno, predmetni pronalazak se odnosi na farmaceutske preparate koji asdrže modifikovan hGH. Sledeći pristup je primena modifikovanog hGH u lečenju poremećaja rasta i razvoja.
Stanje tehnike
Humani hormon rasta (hGH) je protein koji sadrži jedan lanac od 191 amino kiseline, unakrsno povezane sa dva disulfidna mosta i monomerni oblik ima molkulsku težinu od 22kDa. Humani GH luči hipofiza, a može se dobiti i rekombinantnim genetskim inžinjeringom. HGH izaziva rast u svim telesnim tkivima koja mogu da rastu.Rekombinantni hGH je komercijalno dostupan već nekoliko godina. Dve vrste terapeutski korisnih rekombinantnih hGH preparata su prisutni na tržištu: autentičan, npr. Genotropin™ ili Nutropin™ i analozi sa dodatim metionin ostatkom na N-terminalnom kraju, npr. Somatonorm™. hGH sc koristi za stimulaciju linearnom rata kod pacijenata sa hipofiznim patuljastim rastom, nazavanim još i nedostatak hormona rasta (GHD) ili Turner-ov sindrom ali i drugih indikacija uključujući dugotrajni tretman nerastenja kod dece uključujući i one koji su rođeni mali za gestaciono doba (SGA), za lečenje pacijenata sa Prader-Willi sindromom (PWS), hroničnom renalnom insufijencijom (CRI), AIDS iznurenost i starenje.
Glavni biološki efekat hormona rasta (GH) je da podstče rast kod mladih sisara i održavanje tkiva kod starijih sisara. Sistemi organa na koje utiče hormon rasta su skelet, vezivno tkivo, mišići i viscera kao što je jetra, creva i bubrezi. Hormon rasta deluje interakcijom sa specifičnim receptorima na membranama ciljnih ćelija. hGH pripada grupi homologih hormona koji obuhvataju placentalne laktogene, prolaktine i druge genetske varijante i varijante vrsta ili hormona rasta (Nicoll, C.S., et al. (1986)Endocrine Reviews 7:169). hGH se razlikuje od rugih po tome što pokazuje široku specifičnost za vrste i vezuje se ili za kloniran somatogeni (Leung, D.W., et al. [1987]Nature:330;537) ili prolaktin receptor (Boutin, J.M., et al. [1988]Cell;53: 69). Klonirani gen za hGH je eksprimovan u obiku sekreta kod Eschericia coli (Chang, C.N., et al. [1987]Gene55: 189) i objavljena je njegova DNK i amino kiselinska sekvenca (Goeddel, et al. [1979]Nature281: 544: Gray, et al. [1985]Gene39: 247).
Humani hormon rasta (hGH) učestvuje u većem delu regulacije normalnog rasta i razvoja čoveka. Predmetni hipofizni hormon pokazuje mnoštvo bioloških efekata uključujući linearni rast (somatogenezu), laktaciju, aktivaciju makrofaga, dijabetogenskih efekata i efekata sličnih insulinu (Chawla, R.K. (1983)Ann. Rev. Med.34, 519; Edvvards, C.K. et al. (1988)Science239, 769; Thomer. M.O., et al., (1988)J. Clin. Invest.81: 745). Nedostatak hormona rastva kod dece dovodi do patuljastog rasta, koji je uspešno tertiran više od deset godina, egzogenom administracijom hGH.
Humani hormon rasta (hGH) je jednolančani polipeptid koji se sastoji od 191 amino kiseline (molekulske težine 21,500). Disulfidne veze između položaja 53 i 165 i položaja 182 i 189. Niall, Nature , New Biologv, 230:90 (1971). hGH je snažan anabolni agens, posebno zbog retencije azota, fosfora, kalijuma i kalcijuma. Lečenjem pacova kojima je izvađena hipofiza sa GH, može da se regeneriše bar deo brzine rasta kod pacova. Moore et al.,Endocrinology122: 2920-2926 (1988). Jedan od najizraženijih efekata kod subjekata sa hipofunkcijom hipofize (nedostatak GH-hipopituarizam) je ubrzan linearan rast pločaste hrskavice kostiju , imajući za rezulat povećan stas. Kaplan,Growth Disorders in Children and Adolescents(Springfield, IL: Charles C. Thomas, 1964).
hGH je uzrok različitim fiziološkim i metaboličkim efektima kod različitih modela životinja, uključujući linearan rast kostiju, laktaciju, aktivaciju makrofaga, efekat sličan insulinu i dijabetogenski efeka i drugo (R.K. Chavvla et al.,Annu. Rev. Med.34: 519 (1983); O.G.P. Isaksson et al.,Annu. Rev. Physiol.47, 483 (1985); C.K. Edvvards et al.,Science,239, 769 (1988); M.O. Thomer and M.L. Vance,J. Clin. Invest.82:745 (1988); J.P. Hughes and H.G. Friesen,Ann. Rev. Physiol.Al: 469 (1985)). Izneto je da , posebno kod žena posle menopauze, se sekrecija GH smanjuje sa godinama. Millard et al.,Neurobiol. Aging,11: 229-235 (1990); Takahashi et al.,NeuroendocrinologyM, L6-137-142 (1987). Videti takođe Rudman etal., J. Clin. Invest.,67: 1361-1369 (1981) i Blacman,Endocrinology and Aging,16: 981 (1987). Dalje, postoji izveštaj da se neke manifstacije starenja, uključujući smanje
mase tela, ekspanzija mase adipoznog tkiva i stanjivanje kože, mogu ublažiti tretamon GH, tri puta nedeljno. Videti, npr. Rudman et al.,N. Eng. J. Med.,323: 1-6 (1990) i prateći članak u u istpom žurnalu autora Dr. Vance (pp. 51-54). Ovi biološki efekti potiču od interakcije između hGH i specifičnih ćelijskih receptora. Klonirana su dva različita humana receptora, hGH receptor jetre (D.W. Leung et al.,Nature330: 537 (1987)) i humani prolaktin receptor (J.M. Boutin. Et al.,Mol. Endocrinologv,3: 1455 (1989)). Međutim, postoje i drugi, uključujući humani placentalni laktogen receptor (M. Freemark, M. Comer, G. Comer, and S. Handwerger,Endocrinol.120: 1865 (1987)). Ovi homologi receptori sadrže glikosilovani ekstracelulerni hormon vezujući domen, jedan transmembranski domen i citoplazmični domen koji se značajno razlikuje u sekvenci i veličini. Smatra se da jedan ili više receptora igraju ulogu u određivanju fiziološke reakcije na hGH.
Primećeno je da fiziološki aktivni proteini administrirani u telo pokazuju svoju farmakološku aktivnost samo jedan kratak vremenski period kao posledica velike brzine eliminiacije u telu. Dalje, relativna hidrofobnost ovih proteina može ograničiti njihovu stabilost i/ili rastvorljivost.
Da bi se smanjila brzina eliminacije, poboljšanja stabilmosti ili uklonila antigenost terapuetskih proteina, predloženi su neki postupci, gde su proteini hemijski modifikovani polimerima rastvornim u vodi. Hemijska modifikacija ove vrste može efikasno blokirati proteolitički enzim od fizičkog kontakta sa samom osovinom proteina, na taj način sprečavajući degradaciju. Hemijsko vezivanje određenih polimera rastvornih u vosi može efikasno smanjiti renalnu eliminaciju usled povećane hidrodinamičke zapremine molekula. Dodatne prednosti su i, pod određenim uslovima, povećana stabilnost i vreme cirkulacije terapeutskog proteina, povećana rastvorljivost i smanjena imunogenost. Poli (akrilen oksid), poli (etilen glikol) (PEG), je jedna takva hemijska grupa koja je korišćena za dobijanje terapeutskih proteinskih proizvoda (izraz "pegilacija" označava pripajanje bar jedanog PEG molekula). Pripajanje poli (etil glikol) pokazuje zaštitu od proteolize, Sada et al,J. Fermentation Bioengineering,71: 137-139 (1991) i odstupni su postupci pripajanja odeređnih poli (etilen glikol) grupa. Videti S.A.D Pat. Br. 4,179,337, Daviš et al., "non-Immunogenic Polvpeptides", objaveljno 18 decembra 1979; i S.A.D. Pat. Br.4,002,531, Rover, "Modifaying enzvmes with Polyethylene Glycol and Products Produces Thereby", objavljena 11 januara 1977. Za pregled , videti Abuchowski et al., u Enzvmes as Dru<g>s. (J.S. Holcerberg and J. Roberts, eds.pp. 367-383 (1981)).
Korišćeni su i drugi polimeri rastvorni u vodi, kao na primer kopolimeri etilen glikol/propilen glikola, karboksimetilceluloza, drkstran, poli(vinil alkohol), poli(vinil pirolidon), poli(-l,3-dioksalan), poli(-l,3,6-trioksan), etilen/anhidrid maleinske kiseline kopolimer, poli-amino kiseline (ili homopolimeri ili slučajni kopolimeri).
Opisani su brojni primeri pegilovanih terapeutskih proteina. ADAGEN®, pegilovana formulacija denozindeaminaze, je odobren za lečenje teških oboljenja kombinovane imunodeficijencije. ONCASPAR® , pegilovana L-asparginaza je odobrena za lečenje hipersenzitivnosti kod pacijenata. Pegilovana superoksidaza dismutaza je ispitivana za lečenje povreda glave u kliničkim ispitivanjima.Pegilovan a-interferon (US. 5,738,846; 5,382,657) je odobren za lečenje hepatitisa; prijavljeno je da su pegilovana glukocerebrozidaza i pegilovan hemogolobin u prekliničkim ispitivanjima. Sledeći primer pegilovanog IL-6, EF 0 442 724, naslovljen, "Modified hIL-6", koji opisuje poIi(etilen glikol) moelkule dodate u IL-6.
Drugi specifični terapeutski protein, koji je hemijski modifikovan, je faktor koji stimuliše kolonije granulocita (G-CSF). G-CSF indukuje brzu proloferaciju i otpuštanje neutrofilnih granulocita u krv, i tako obezbeđuje terapeutski efekat za borbu protiv infekcije. Evropska patentna publikacija EP 0 401 384, objavljena 12 decembra 1990, pod nazivom "Chemically Modified Granulocite Colony Stimulating Factor" opisuje materijale i postupke za dobijanje G-CSF za koji su vezani molekuli poli(etilen-glikol)-a. Modifikovani G-CSF i njihovi analozi su takođe dati u EP 0 473 268, objavljeni 4 marta 1992, pod nazivom: " Continuous Release Pharmaceutical Copositiion Coprising a Polvpeptide Covalently Conjugated to A Water Soluble Polvmer", gde se navodi primena različitih G-CSF i derivata kovalentno kojugovanih sa česticama polimera rastvornog u vodi, kao stoje poli(etilen glikol). Modifikovani polipeptid koji pokazuje aktivnost faktora koji stimuliše kolonije granulocita je dat u EP 0 335 423 objavljen 4 oktobra 1989. u U.S. 5,824,784 su dati postupci za N-terminalne modifikujuće proteine ili njihove analoge i dobijene komopzicije, uključujući nove N-terminalne hemisjki modifikovane G-CSF preparate. U.S. 5,824,778 opisuje hemijski modifikovan G-CSF.
Sto se tiče poli(etilen glikol) su primenjeni različiti postupci za vezivanje molekula poli(etilen glikola) za protein. Generalno, poli (etilen glikol) molekuli su vezani za protein preko reaktivne grupe na proteinu.
Za ova vezivanja pogodne su amino grupe, kao što su one na ostacima lizina ili N-terminusa. Na primer, Rover (U.S. Pat. Br. 4,002,531) kaže daje korišćena reduktivna alkilacija za vezivanje moelkula poli(etilen glikola) za enzim. EP 0 539 167, objavljen 28 aprila 1993, Wright, " Peg Imidates and Proteine Derivatives Thereof' kaže da peptidi i organska jedinjenja sa slobodnom amino grupom (grupama) su modifikovane sa imidat derivatom PEG-a ili srodnim organskim polimerom rastvornim u vodi. US 5,298,643 i US 5,637,749 opisuju PEG aril imidate Chamow et al.,Bioconjugate Chem.5: 133-140 (1994) opisuje modifikaciju CD4 imunoadhezina sa monometoksipoli (etilen glikol) aldhidom , reduktivnom alkilacijom. Autro prijavljuje daje 50% CD4-Ig, MePEG-modifikovano, pod uslovima koji omogućavaju kontrolu izvan domašaja pegilacije.Id.Na strani 137. Autori takođe govore daje sposobnostin vitrovezivanja modifikovanog CD4-Ig (za protein gp 120) smanji brzinom koja je povezana sa stepenom MePEGliacijeIbid.U.S: Pat.Br. 4,904,584, Shaw, izdat 27 februara 1990, odnosi se na modifikaciju brojnih ostataka lizina u proteinima za vezivanje moelkula poli(etile glikol)-a preko amino grupe.
Mnog postupci pripajanja (vezivanja) polimera za protein podrazumevaju učešće grupe koja služi kao vezujuća (linker) grupa. Ove grupe mogu, međutim biti, antigenske. Postupak trezil hlorida ne uključuje vezujuću (linker) grupu, ali predmetni postupak je komplikovan za dobijanje terapeutskih proizvoda, pošto se korišćenjem trezil hlorida mogu dobiti toksični proizvodi. Videti Franciset al,u Stabilitv of protein phrmaceuticals: in vivo pathways of degradation and strategies for protein stabilization (Eds. Ahern, T and Manning, M.C.) plenum, New York, 1991). Takođe Delgadoetal,"Coupling of PEG to Protein By Activation With Tresyl Chloride, Application in Immunoaffinity Cell Preparation" u Separations Using Agueous Phase Svstems, Application In Cell Biologv and Biotechnologv, Fisheret al,izdavač Plenum Press, New York, N.Y., 1989 pp. 211-213.
Videti takođe,'Rose et al.,Bioconjugate Chemistry 2:154-159 (1991) koji govori o selektivnom vezivanju vezujuće (linker) grupe karbohidrazida za C- terminalnu karboksil grupu supstrata proteina (insulin).
WO 93/00109 se odnosi na postupak stimulacije tkiva koja reaguju na GH kod sisara ili ptica, a koji obuhvata održavanje kontinualne, efikasne koncentracije GH u plazmi u periodu od 3 ili više dana. Jedan način ostvarivanja ove koncentracije u plazmi je primena GH kuplovanog sa makromolekularnom supstancom kao što je PEG (polietilen glikol). Primećeno je da kuplovanje sa makromolekulsokom supstancom za rezultat ima produžen polu-život. PEGilovan humani hormon rastaje objavljen u WO 93/00109 primenom mPEG aldehid-5000 i mPEG N-hidroksisukcinimidil estar (mPEG-NHS-5000). Primena mPEG-NHS kao rezultat daje heterogenu smešu brojnih PEGilovanih oblika hGH. WO 93/00109 takođe opisuje primenu mPEG-maleimida na varijante PEGilovanog cistein hGH.
WO 99/03887 opisuje cistein varijante hormona rasta koji je PEGilovan. Označen kao BT-005 za predmetni konjugat tvrdi se da je efikasniji za stimulaciju povećanja težine kod pacova sa nedostatkom hormona rasta i imaju duži polu-život nego hGH.
Pegilovan humani hormon rastaje takođe objavljen od strane Clark etal., korišćenjem sukcinimidil estra karboksimetilovanog PEG-a{ Journal of Biological Chemistry271: 21969-21977, 1996). Clark et a., opisuje derivate hGH veće veličine, korišćenjem mPEG-NHS-5000, koji je selektivno konjugovan sa primarnim aminima. Povišen nivo PEG modifikacija, smanjilo je afinitet za receptore i povećao EC5odo 1500 puta u ćelijskim esejima. Olson et al.,Polymer Preprints38: 568-569, 1997 opisuje primenu N-hidroksisukcinamid (NHS) PEG i sukcinimidil propionat (SPA)PEG kako bi se omogućilo razmnožavanje PEGilovanih hGH vrsta.
WO 94/20069 opisuje PEGilovan hGH kao deo formulacije za pulmonarno raznošenje.
US 4,179, 337 opisuje postupke PEGilovanih enzima i hormona za dobijanje fiziološki aktivnih ne-imunogenskih polipeptidnih konjugata nerastvornih u vodi. GH je pomenut kao jedan primer hormona koji je PEGilovan.
EP 458064 A2 opisuje PEGilaciju uvedenih ili prirodno prisutnih ostataka cisteina u somatotrofinu. EP 4580064A2 dalje pominje inkorporaciju dva ostatka cisteina na kraju petlje omega zavoja koji se nalazi na krajevima 102-112 u goveđem somatotrofinu , odnosno EP 458064 A2 posebno oopisuje supstituciju ostataka broj 102 i 112 goveđeg somatotrofina iz Ser u Cys i Tyr u Cys.
WO 95/11987'ukazuje na vezivanje PEG-a za tiol grupe ostataka cisteina kji su prisutni ili u roditeljskom molekulu ili uvedeni mutagenezom. WO 95/11987 opsuje Pegilaciju neksin-1 proteaze, međutim generalno je pomenuta i PEGilacija hGH-a i drugih proteina.
WO 99/03887 opisuje npr., homron rasta modifikovan uvođenjem dodanog cisteina na ostatke serina i vezivanje PEG-a za uvedene ostatke cisteina.
WO 00/42175 se odnosi na postupak dobijanja proteina koji sadrži slobodne ostatke cisteina za vezivanje PEG-a. WO 00/42175 opisuje sledeće mutirane proteinima hGH-a: T2C, S144C i T148C i njihovu PEGiliaciju cisteina.
WO 9711178 (kao i US 5849535, US 6004931 i US 6022711) odnose se na primenu varijanti GH kao agonista ili antagonista hGH. WO 9711178 takođe opisuje PEGilaciju hGH, uključujući PEGilaciju lizina i uvođenje ili zamenu lizina (npr. K168A i K172R). WO 9711178 takođe opisuje supstituciju G120K.
Prethodni izveštaji o PEGilovanom hGH podrumeva vezivanje brojih PEG-ova , što za rezultat ima neželjenu heterogenost proizvoda, da bi se postigla hidrodinamička zapremina veća od filtracije bubrega 70K molekulske težine, kao što je opisano (Knauf, M.J. et al.,J. Biol. Chem.263: 15064-15070, 1988).
GH molekul sa dužim poluživotom citkulacije bi smanjio broj neophodnih administracija i potencijalno obezbedio optimalniji terapeutski nivo hGH sa propratnim pojačanim terapeutskim efektom.
Predmetni pronalazak obezbeđuje hemijski modifikovane konjugate hGH smanjene heterogenosti, sa smanjenom brzinom eliminacije, produženim zadržavanjem u plazmi, poboljšanom rastvorljivosti, smanjenom antigenosti ili njihovom kombinacijom.
Opis pronalaska
Predmetni pronalazak se odnosi na hemijski modifikovan hGH i njegove agonističke varijante, koji imaju bar jednu poboljšanu hemijsku ili fiziološku osobinu odabranu od, ali ne i ograničenu na, brzinu eliminacije, produženim zadržavanjem u plazmi, povećanom stabilnosti i smanjenom antigenosti. Tako, kao što je kasnije detaljnije opisano, predmetni pronalazak ima brojne aspekte koji se odnose na hemijske modifikacije hGHnjegove agonističke varijantne kao i specifične modifikacije primenom poli(etilen glikol) grupa.
Predmetni pronalazak se takođe odnosi na postupke dobijanja hemijski modifikovanog hGH i njegovih agonističkih varijanti.
Predmetni pronalazak se takođe odnosi na komppozicije koji sadrže hemijski modifikovan hGH i njegove agnonističke varijante
Modifikovan hGH i njegove agonističke varijante predmetnog pronalaska mogu biti korine u lečenju , ali ni ograničene na, patuljast rast (GHD), GHD kod odraslih, Turners's sindrom, dugoročno lečenje problema rastenja kod dece koja su rođena mala za gestaciono doba (SGA), za lečenje pacijenata sa Prader-Willi sindromom (PWS), hroničnu renalnu insufijenciju (CRI), širenje AIDS-a, starenje, krajnji stadijum renalne insufijencije i cističnu fibrozu.
Kratak opis crteža
Slika 1 je reprodukcija redukujuće ili ne-redukujuće SDS-PAGE analize proizvoda reakcija hGH i 20K PEG-ALD i anion-izmenjivački prečišćenog 20K PEG-ALD hGH. Linija 1. MT standarda Proteina; Linija 2. redukovani hGH-10 ug; Linija 3. redukovan 20K linerani PEG-ALD hGH reakciona smeša-lOiag; Linija4. redukovan anion-izmenjivački prečiššćen 20K linearan PEG-ALD hGH- lOjag; Linija 5. Šlepa proba; Linija 6. ne-redukovan hGH-lOug; Linija 7. ne-redukovan 20K linearan PEG-ALD hGH reakciona smeša- lOiig; Linija 8. ne-redukovan anion-prečišćen 20K linearan PEG-ALD hGH - lOug; Linija 9. Šlepa proba; Linija 10. MT standarda proteina.
Slika 2 je reprodukcija ne-redukujuće SDS-PAGE analize različitih anion-izmenjivački prečišćenog PEGilovanih hGH molekula. Linija 1. MT standarda proteina; Linija 2. hGH - lOug; Linija 2. 4-6 x 5K PEG-SPA hGH - lOug; Linija 3. 20K linearan PEG-ALD hGH-lOug; Linija 4. 20K razgranat PEG-ALD hGH-10 iig. Linija 5. 40K razgranat PEG hGH - lOug.
Na Slici 3 je prikazana reprodukcija eluacionog profila RP-HPLC za mapiranje tripsinom hGH, 40 Br PEG-ALD hGH i 40K Br PEG-NHS hGH. PEG primarno kuplovan na N-kraju hGH (kao što je pokazano u 40K Br ALD hGH) za rezultat ima redukciju na N-terminalnom (TI) fragmentu maksimuma sa generacijom novh PEGilovanih TI maksimuma.
Na Slici 4 dato je poređenjein vivobioraspoloživosti nePEgilovanog hGH , doziranih dnevno (0.3mg/kg/dan) u Pegilovan hGH doziran subkutalno (SC) jednom svakih šest dana (1.8 mg/kg), prikazivanjem povećanja težine kod pacova kojima je uklonjena hipofiza u toku perioda od 11 dana.
Na Slici 5 je dato poređenjein vivobioaktivnosti ne-PEGilovanog hGH doziranog SC, dnevno (0.3 mg/kg/dan) do 4-6 x K PEG-SPA-hGH, mono-Pegilovanih 20K razgranatih PEG-ALD hGH i mono-PEGilovan 40K razgranat PEG-ALD hGH, svaki doziran SC jednom na šest dana (1.8 mg/kg), prikazivanjem povećanja težine kod pacova kojima je uklonjena hipofiza u toku perioda od 11 dana.
Na Slici 6 je dato poređenjein vivobioaktivnosti ne-PEGilovanog hGH doziranog SC, dnevno (0.3 mg/kg/dan) do 4-6 x K PEG-CMHBA-hGH, mono-PEGilovanih 20K ravnih ALD, mono-PEGilovan 30K ravnih ALD, mono-PEGilovan 20K razgranat PEG-ALD hGH i mono-PEGilovan 40K razgranat PEG-ALD hGH svaki doziran SC jednom na šest dana (1.8 mg/kg), prikazivanjem povećanja dužine tibialne kosti kod pacova kojima je uklonjena hipofiza u toku perioda od 11 dana.
Na Slici 7 je dato poređenjein vivobioaktivnosti jedne 1.8mg/kg SC doze ne-PEGilovanog hGH, mono-PEGilovanog 20K ravnog PEG ALD hGH, mono-PEGilovanog 20K ravnog PEG-ALD hGH, mono-PEGilovan 20K razgranatog PEG-ALD hGH, mono-PEGilovanog 20K ravnog PEG-hidrazida hGH, mono-PEGilovanog 30K ravnog PEG-ALD hGH, mono-PEGilovanog 40K razgranatog PEG-ALD hGH, 4-6 x 5K PEG SPA hGH, 4-6 x 5K PEG-CHMBA hGH, prikazivanjem povećanjem nivoa IGF-a u plazmi kod pacova kojima je uklonjena hipofiza u toku perioda od 9 dana.
Detaljan opis
hGH i njegove agonističke varijante pripadaju klasi rekombinantnih proteina, opisanih u US 4,658,021 i US 5,633,352, Njihovo rekombinatno dobijanje i postupci primene su opisani u US 4,342,832; 4,601,980; US 4,898,830; US 5,424,199; i US 5,795,745.
U predmetnom pronalasku mogu se koristiti prečišpćeni i izolovani hGH i njegove agonističke varijante, koje proizvodi ćelija domaćina kao stojeE. Colii životinjske ćelije transformisane ili trarrsfektovane primenom genetskih tehnika rekombinacije. Doadtne varijante hGH su opisane u US Sr. No. 07/715,300 podnetoj 14 juna 1991 i Sr. No. 07/743,614 podnetoj 9 avgusta 1991 i WO 92/09690 obajvljen 11 juna 1992. Među njima posebno je preferentan hGH ili njegova agonistička varijanta, koja je dobijena transformisanjemE. Coli.Ovaj hGH ili njegova agonistička varijanta može se dobiti u velikim količinima, visokog stepena čistoće i homogenosti. Na primer, ovah hGH ili njegova agnostička varijanta se može dobiti prema postupku opisanom u US 4,342,382; 4,601,980; US 4,898,830; US 5,424,199; i US 5,795,745. Izraz "u suštini ima aminokiselinsku sekvencu" znači da data aminokiselinska sekvenca može da obuhvati jednu ili više izmena amino kiselina (izostavljanje, dodavanje, umetanje ili zamenu) dokle god ove promene ne izazovu neku nepovoljnu ne-sličnost u funkciji hGH ili njegove agonističke varijante. Preferentnije je koristiti hGH ili njegovu gonističku varijantu u suštini sa aminokiselinskom sekvencom, i to bar jedan lizin, asparaginska kiselina, glutaminska kiselina, nesparen cisteinski ostatak, slobona N-terminalna a-amino grupa ili slbodna C-terminalna karboksilna grupa.
Prema ovom pronalasku, poli(etilen glikol) je kovalentno vezan preko aminokiselinskog ostatka hGH ili njegove agonističke varijante. Različiti poli(etilen glikoli) imaju brojne različite funkcionalne grupe, linkere, konfiguracije i molekulske težine poznate prosečnom stručnjaku u oblasti tehnike, koje se mogu upotrebiti za dobijanje PEG-hGH konjugata ili konjugata PEG-hGH agonističke varijante (videti Roberts M J. et al.Adv. Del Rev.54: 459-476, 2002), Ahrris .M. etal., Drug Delivery Systems 40:538-551, 2001). Aminokiselinski ostatak može biti bilo koji rekativan sa , recimo, slobodnom amino kiselinom, karboksil, sulfhidril (tiol), hidroksil, gvanidinil ili imidazolil grupe, za koje se može evzati terminalna reaktivna grupa aktiviranog poli(etilen glikola). Aminokiselinski ostaci sa slobodnim amino kiselinskim grupama mogu da imaju ostatke lizina i/ili N-terminalni aminokiselinski ostatak, oni sa slobodnim karboksilnim grupama mogu da imaju asparaginsku kiselina, glutaminsku kiselinu i/ili C-terminalne aminokiselinske ostatke, oni sa slobodnim sulfhidril (tiol) grupom, kao stoje cistein, oni sa slobodnom hidroksil grupom kao što je serin ili tirozin, oni sa slobodnom gvanidinil grupom, kao što je arginin i oni sa slobodnom imidazolil grupom, kao što je histidin.
U narednom pristupu, primenjena je hernija oksima (Lemieux & BertozziTih Tech16: 506-513, 1998) su korišćeni za napad na N-terminalne ostatke serina.
Poli(etilen glikol) koji je korišćen u ovom pronalasku nije ograničen nijednim naročitim oblikom ili molekulskom težinom. Molekulska težina poli(etilen glikola) može biti između 500 i 100,000'Normalno, koristi se onaj molekulske težine od 500-60,000, a još bolje od 1,000-40,000. Preferentnije je daje molekulska težina veća od 5,000 do oko 40,000.
U sledećem pristupu poli(etilen glikol) je razgranat PEG sa vezanom jednom ili više PEG grupa. Preferentni primeri razgranatih PEG su opisani u U.S. 5,932,462; U.S. 5,342,940; U.S. 5,643,575; U.S. 5,919,455 U.S. 6,113,906; U S. 5,183,660; WO 02/09766; Kodera Y.,Bioconjugate Cehmistry5: 283-288 (1994); i Yamasaki eta\., Afric. Biol. Chem.,52: 2125-2127, 1998. U preferentnom pristupu molekulska težina svakog poli(etilen glikola) razgranatog PEG-a iznosi 5,000-20,000.
Poli(alilen oksid)i, posebno poli(etilen glikol)i su vezani za tHGH ili njegove agonističke varijante preko terminalne reaktivne grupe, koja može ili ne može da ostavi vezujuću grupu (spejser) između PEG i proteina. Da bi se obrazovali hGH konjugati ili njihove agonističke varijante predmetnog pronalaska, konvertuju se polimeri kao što je poli 8alkilen oksid) u aktivirani oblik, termin poznat prosečnom stručnjaku. Reaktivna grupa, na primer, terminalna reaktivna grupa, koja je posrednik između hemijske grupe na proteinu, kao što su amino, karboksil ili tiol grupe, i poli(etilen glikol)a. Obično, jedan ili više terminalnih polimernih hidroksil grupa na kraju (npr., alfa ili omega terminalne hidroksil grupe) su konvertovane u reaktivne funkcionalne grupe, koje omogućavaju kovalentnu konjugaciju. Ovaj proces je često nazivan kao "aktivacija" i proizvod po!i(etilen glikoI)a sa reaktivnog grupom je označen u daljem tekstu kao "aktiviran poli(etilen glikol)" Polimeri sa i a i e vezujućim grupama su označene kao "bis-aktivirani poli(alkilen oksidi)" i označeni su kao "bifunkcionalni". Polimeri sa istim reaktivnim grupama na a i e terminalnim hidroksil grupama su ponekad označeni kao "homobifunkcionalni" ili "homobis-aktivirani". Polimeri sa različitim reaktivnim grupama na a i£terminalnim hidroksilima su ponekad označeni kao "heterobifunkcionalni" (vidi primer WO 01/26692) ili "heterobis-aktivirani". Polimeri sa jednom reaktivnom grupom su označeni kao "mono-aktivirani" polialkilen oksidi ili "mono-funkcionalni". Slično, drugi ne-antigenski polimeri su aktivirani" ili "funkcionalizirani".
Aktivirani polimeri su oni pogodni za obrazovanje posredne veze između hemijskih grupa na proteinu, kao što su a- ili e-amino, karboksil ili tiol grupe i poli(etilen glikol). Bis-aktivirani polimeri mogu dareaguju na ovaj način sa dva proteinska molekula ili jednim proteinskim molekulom i reaktivnim malim molekulom u sledećem prstupu, da bi efikasno obrazovali polimer proteina ili konjugate protein-mali molekul unakrsnim vezivanjem.
Funkcionalnim rupama koje mogu da reaguju ili sa amino terminalnom a-amino grupom ili e-amino grupom lizina nađenim u hGH ili njegovoj agonističkoj varijanti su: N-hidroksisukcinimdil estri, karbonati kao što su p-nitrofenil ili sukcinimidil (US 5,808,096, 5,612,460, US 5,324,844, US 5,5,122,614), karbonil imidazol; azlaktoni (US 5,321,095; US 5,567,422); ciklični imid tioketoni (US 5,405,877, 5,349,001); izocijanati ili izotiocijanati (Greenvvald R.B.,J. Org. Chem.,60: 331-336, 1995); trezil hlorid (EP 714 402, EP 439 508); halogen formiati (WO 96/40791) i aldehidi.
Funkcionalne grupe koje mogu da reaguju sa grupama karboksilne kiseline, reaktivne karbonil grupe i oksidovane ugljovodonične grupe na hGH ili njegovimagonističkim varijantama obuhvataju primarne amine i hidrazin i hidrazid funkiconane grupe kao što su acil hidrazidi, karbazati, semikarbamati, tiokarbamati itd. (WO 01/70685).
Merkapto grupe, ukoliko su dostupne na hGH ili njegovoj agonističkoj varijanti, takođe se može koristiti kao mesto vezivanja za aktivirane polimere sa reaktivnim grupama kao što su tioli, malemidi, sulfoni i fenil glioksali; videti na primer U.S. Pat. Br. 5,093,531 čije je otrkiće ovde dato referencom. Drugi nukleofili koji mogu da reaguju sa elektrofilnim centrima su, ali nisu i ograničeni na, recimo , hidroksil, amino, karboksil, tiol, aktivni metilen i slično.
Takođe su obuhvaćeni polimeri salipofilnim i hidrofilnim grupama opisanim u US 5,359,030 i US 5,681,811; US 5,438,040; i US 5,359,030.
Dalje, halogenizovani PEG su opisani u WO 98/32466 koji mogu dareaguju sa amino, tiol grupama i armoatičnim hidroksi grupama, koje su direktno kovanentno vezuju PEG za protein.
U preferentnom pristupu pronalaska, povezivanje sekundarnog amina ili admida je izvedeno između N-terminalnih cc-amino grupa ili e-amino grupa lizina hGH ili njegove agonistične varijante i aktiviranog PEG-a.
U sledećem preferentnom aspektu pronalaska povezivanje sekundarnog amina se odvija između N-terminalne primarne a- iliE-amino grupe hGH ili njeggove agonističke varijante i jednostrukog razgranatog lanca PEG aldehida, redukcijom odgovarajućim redukcionim sredstvom kao stoje NaCNBH3, NaBH3, piriđin boran itd. kao što je i opisano u Chamo\v et al.,Bioconjugate Chem.5: 133-140 (1994) i US pat. Br. 5,824,784.
U preferentnom pristupu barem 70%, poželjno barem 80%, poželjno barem 81%, poželjno barem 82%, poželjno barem 83%, poželjno barem 84%, poželjno barem 85%, poželjno barem 86%, poželjno barem 87%, poželjno barem 888%, poželjno barem 89%, poželjno barem 90%, poželjno barem 91%, poželjno barem 92%, poželjno barem 93%, poželjno barem 94%, poželjno barem 95%, poželjno barem 96%, poželjno barem 97%, a najbolje barem 98% poli(etilen glikolja je na amino terminalnoj a-amino grupi.
U narednom preferentnom pristupu pronalaska, polimeri aktivirani linkerima za obrazovanje amida kao što su sukcinimidil estri, ciklični imid tioketoni, ili slični, korišćenji su uspostavljanje veze između hGH ili njegove agonističke varijante i polimera, videti na primer, U.S. Pat. Br. 5,349,001; U.S. Pat. Br. 5,405,877; i Greenvvald, et al.,Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst.17: 101-161, 2000 koji su ovde dati referencom. Jedan preferentan poli(etilen glikol) koji se može vezati za tri amino grupe hGH ili njegove agonističke varijante sajednim ili razgranatim lanacem N-hidroksisukcinilimid poli(etilen glikola) se može pripremiti aktiviranjem poli(etilen glikol)estara ćilibarne kiseline saN-hidroksisukcinilimidom.
Drugi preferentni pristupi pronalaska obuhvataju aktiviranje polimera za obrazovanje kovalentne veze polimera sa hGH ili njegovom agonističkom varijantom preko e-amino ili drugih grupa. Na primer, izocijanat ili izotiocijanatni oblici terminalno aktiviranih polimera se mogu koristiti za obrazovanje urea- i tiourea veza sa amino grupama lizina (Greenwald R.B.,J. Org. Chem.,60: 331-336, 1995).
U narednom preferentnom aspektu pronalaska karbamitne (uretan) veze su obrazovane sa amino grupama proteina opisanim u U.S. Pat. Br. 5,122,614; 5,324,844; i 5,612,640 koji su ovde inkorporirani referencom. Primeri obuhvataju N-sukcinimidil karbonat, para-nitrofenil karbonat i aktivirani polimeri karbonil imidazola. U narednom preferentnom pristupu ovog pronalaska, derivati benzotriazol karbonata PEG-a je vezan za amino grupe hGH ili njegove agonističke varijante.
Sledeći aspekt pronalaska predstavlja prolek i oblik sa trajnim destvom hGH-a ili njegove agonističke varijante, obuhvata polimer rastvoran u vodi kao stoje poli(etilen glikol), vezan za molekul hGH ili njegove agonističke varijante funkcionalnim linkerom čije se očekivano razlaganje enzimskom hidrolizom ili hidrolizom pH oslobađanje hGH ili derivata njegove agonističke varijante. Prolek može takođe biti i "dvostruki prolek" (Bundgaard inAdvanced Delivery Reviews3: 39-65, 1989) uključujući primenu kaskadne farmakološke modifikacije aktivne komponente (latencija). U ovakvim sistemima, hidrolitičke reakcije obuhvataju početnu fazu koju diktira enzim ili pH, a koja određuje brzinu reakcije i drugu fazu koja obuhvata brzu ne-enzimatsku hidrolizu koja se odvija tek posle prve. Ovakav plimer koji se može oslobađati daje konjugate proteina, koji su prolazni i mogu da se ponašaju kao rezervoari, koji kontinualno oslobađaju hGH ili njegovu agonističku varijantu. Ov funkcionalni linkeri su opisani u US 5,614,549; US 5,840,900; US 5,880,131 US 5,965,119; US 5,965,565; US 6,011,042; US 6,153,655; US 6,180,095 BI; US 6,413,507; Greemvald R.B. et al.,J. Med. Chem.42; 3657-3667, 1999; Lee, S. Et al.,Bioconjugate chem12: 163-169, 2001; garman A.J. et al., FEBS Lett. 223: 361-365, 1987; Woghiren C. Et al.,Bioconjugate Chem.4:314-318,1993;Roberts M.J. et al., J. Pharm. Sci.87, 1440-1445, 1998; Zhao X., uNinth Int. Symp. Recent Adv. Drug Delivery Syst.1999; Greemvald R.B. et al.,J. Med. Chem. 43:475-487, 2000; i Greenwald R.B. Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst.17: 101-161,2000. Zalipskv et al., 28<th>Int Symp. On controlled Release of Bioactive Materilas 1; 73-74, 2001.
Reakcije konjugacijc, označene kao reakcije pegilacije, koja se istorijski izvodi u rastvoru sa u molarnom višku polimera i bez obzira gde će se polimer vezati za protein. Ove opšte tehnike, međutim, su se već pokazale neadekvatnim za konjugacijubioaktvnih proteina za ne-antigenske polimere uz zadržavanje dovoljne bioaktvinosti. Jedan način za održavanje bioaktivnosti hGH-a i njegove agonističke varijante je da se u osnovi izbegne konjugacija onih reaktivnih grupa hGH i njeogvih agonističkih varijanti opvezanih sa mestima vezivanja receptora u procesu polimernog kuplovanja. Sledeći aspekt ovog pronalaska je da se obezbedi postupak konjugacije poli(etilen glikola) za hGH ili njegovu agonističku varijantu uz odražavanje visokog nivoa zadržane aktivnosti.
Hemijske modifikacije kroz kovalentno vezivanje mogu se izvesti pod odgovarajućim uslovima, generralno prihvaćenim za reakcije biološki aktivnih supstanci sa aktiviranim polifetilen glikolom). Reakcija konjugacije je izvedena pod relativno blagim uslovima radi izbegavanja inaktivaciju hGH ili njegovih agonističkih varijanti. Blagi uslovi podrazumevaju održavanje pH reakcionog rastvora u opsegu od 3 do 10 i reakcione temperature u opsegu od oko 0° - 37°C. U slučajevima kada su reaktivni aminokiselinski ostaci u hGH ili njegovim agonističkim varijantama imaju slobodne amino grupe, ova modifikacija se preferentno izvodi u odgovarajućim puferima (pH 3 do 10) uključujći i, ali ne-ograničavajući se na, fosfatne, MES, citratne, acetatne, sukcinatne ili HEPES, u trajanju os 1 do 48 sati na 4°-37°C. U ciljnim N-terminalnim amino grupama sa reagensima kao što su PEG aldehidi preferentno je održavanje pH 4-8. Aktiviran poli(etilen glikol) se može koristiti oko 0.05-100 puta, bolje oko 0.01-2.5 puta, molarne količine broja slobodnih amino grupa hGH ili njegovih agonističkih varijanti. Sa druge strane, kada reaktivni aminokiselinski ostaci u hGH ili njegovim agonističkim varijanta imaju slobodne amino karboksilne grupe, poželjno je da se ova modifikacija odvija u pH od oko 3.5 do oko 5.5, na primer, modifikacijom sa poli(oksietilendiaminom) se izvodi u prisustvu karbodiimida (pH 3.5-5) u trajanju od 1-24 sata na 4°-37°C. Aktiviran poli(etilen glikol) se može koristiti 0.05-300 puta molarne količine broja slobodnih karboksilnih grupa hGH ili njegovih agonističkih varijanti.
U posebnim pristupima, gornja granica za količinu polimera obuhvaćena reakcijom konjugacije prelazi oko 1:1 do te mere tako daje moguće da reaguje aktivirani polimer i hGH ili njegova agonistička varijanta bez obrazovanja znatne količine vrste velike molekulske težine, npr., više od oko 20% konjugata koji sadrže više od jednog lanca polimera po molekulu hGH ili njegove agonističke varijante. Na primer, u ovom aspektu pronalaska razmatrano je da se odnosi od oko 6:1 mogu primeniti za formiranje značajnih količina željenih konjugata koji se dalje mogu izolovati iz bilo koje vrste velike molekulske težine.
U sledećem aspektu ovog pronalaska, bifunkcionalno aktivirani derivati PEG-a se mogu koristiti za dobijanje poliernih PEG molekula hGH ili njegove agonističke varijante, u kojima su višestruki molekuli hGH ili njegove agonističke varijante unakrsno povezani preko PEG-a. Mada je su reakcioni uslovi koji su ovde opisani , mogu rezultovati u znatnim količinama nemodifikovanog hGH ili njegovih agonističkih varijnati, nemodifikovan hGH ili njegove agonisstičke varijante mogu se lako reciklizovati sledeće serije za dodatne reakcije konjugovanja. Postupakom ovog pronalaska dobija se neočekivano malo, tj. manje od oko 30%, a bolje manje od oko 10% vrste molekula velike molekulske težine i vrste koje sadrže više od jednog lanca polimera po hGH-u ili njegovoj agonističkoj varijnanti. Reakcioni uslovi se razlikuju od onih za polimerne reakcije konjugacije gde je aktivirani polimer prisutan u molarnom višku od nekoliko puta u odnosu na cilj. U sledećim aspektima pronalaska, polimer je prisutan u količini od oko 0.1/amino grupi do oko 50 ekvivalenata po ekvivalentu hGH ili njegovoj agonističkoj varijanti. U narednom aspektu pronalaska, polimer je prisutan u količini od oko 1 do oko 10 ekvivalenata po ekvivalentu hGH ili njegove gonističke varijante.
Reakcije konjugacije ovog pronalaska prvo daje reakcionu smešu ili kombinovanu smešu koji se sastoji od mono- i di-PEG-hGH konjugata, neizreagovanog hGH, neizreagovanog polimera i obično manje od oko 20% vrste velike molekulske težine. Vrste velike molekulske težine obuhvataju konjugate koji sadrže jedan polimerni lanac i/ili polimerizovan PEG-hGH ili njegovu agonističku varijantu. Posle uklanjanja neizreagovane vrste i vrste velike molekulske težine, komozicija koja sadrži primarno mono- i di-polimerni hGH ili konjugate njegove agonističke varijante je regenerisana. Budući da konjugati najvećim delom sadrže lanac polimera, konjugati su u suštini, homogeni. Ovi modifikovani hGh ili njegove agonističke varijante imaju najmanje oko 0.1%in vitrobiološku aktivnost povezanu sa nativnim ili nemodifikovanim hGH ili njegovom agonističkom varijantom merenom pomoću standardne analize proliferacije FDC-P1 ćelija. (Clark et al.,Journal of Biological Chemistrj271: 21969-21977, 1996), analize vezivanja receptora (US 5,057,417) ili rast pacova kojima je uklonjena hipofiza (Clark et al.,Journal of Biological Chemistry271: 21969-21977, 1996). U preferentnom aspektu pronalaska, međutim, modifikovani hGH ili njegova agonistička varijanta ima oko 25%in vitrobiološke aktivnosti, odnosno modifikovani hGH ili njegova agonistička varijanta imaju oko 50%in vitrobiološku aktivnost, bolje, modifikovani hGH ili njegova agonistička varijanta ima oko 75%in vitrobiološku aktivnost, a najbolje modifikovan hGH ili njegova agonistička varijanta ima ekvivalentnu ili poboljšanjuin vitroibiološku aktvnost.
Postupci ovog.pronalaska preferentno obuhvataju pre ograničene odnose polimera i hGH ili njegove agonističke varijante. Tako je nađeno da su konjugati hGH ili njegove agonističke varijante , pretežno ograničeni na vste koje sadrže samo jedan lanac polimera. Dalje, vezivanje polimera za reaktivne grupe hGH ili njegove agonističke varijante, je u suštini manje slučajano nego u slčaju kada se koristi molarni višak polimera linkera. Nemodifikovan hGH ili njegova agonistička varijanta koja se nalazi u kombinovanoj reakcionoj smeši, nakon što je prekinuta reakcija konjugacije, može se reciklizovati za sledeće reakcije pomoću iono-izmenjivača ili ekskluzione hromatografije ili sličnim tehnikama razdvajanja.
Poli(etilen glikol)-modifikovan hGH ili njegova agonistička varijanta, tj. hemijski modifikovani proteini prema ovom pronalasku, mogu se prečistiti iz reakcione smeše konvencionalnim postupcima koji se koriste za perčišćavanje proetina, kao stoje dijaliza, isoljavanje, ultrafiltracija, iono-izmenjivačka hromatografija, hromatografija hidrofobnim interakcijama (HIC), gel hromatografija ili elektroforeza. Iono-izmenj ivačka hromatografija je posebno efikasna za uklanjanje neizreagovanog poli(etilen glikola) i hGH ili njegove agonističke varijante. U narednom aspektu pronalaska, mono- i di-polimer-hGH ili vrste njegove agonističke varijante su izolovani iz reakcione smeše za uklanjanje vrste velike molekulske težine i nemodifikovanog hGH ili njegove agonističke varijante. Razdvajanje je izvedeno stavljanjem oko 0.5-10 mg/ml hGH ili njihove agonističke varijante - polimer konjugata. Odgovarajući rastvori imaju pH od oko 4 do oko 8. Poželjno je da rastvori sadrže jednu ili više pufervskih soli, odabranih od KC1, NaCl, K2HP04, KH2P04, Na2HP04, NaH2P04, NaHC03, NaB04, CH3C02H i NaOH.
U zavisnosti od rekaiconog pufera, rastvor polimera konjugata hGH ili njegove agoniostičke varijante mogu se prvo podvrgnuti izmeni pufera/ultraciltaciji kako bi se uklonio neizreagovan polimer. Na primer, rastvor konjugata PEG-hGH ili njegove agonističke varijantemože se prvo podvrgnuti utrafiltraciji kroz membranu za odstranjivanje malih molekulskih težina (10,000 do 30,000 Daltona) za uklanjanje neželjenih materijala kao što je neizreagovani polimer, površinski aktivne sredstvo, ukoliko su prisutni, ili slično.
Frakcionisanje konjugata u kombinovanoj smeši sa željenim vrstama preferentno je izveden na medijumu iono-izmenjivačke hromatografije. Ovaj medijum može da slektivno veže konjugate PEG-hGH ili njegove agonističke varijante preko razlika u naelektrisanju, koja može varirati na donekle predvidljiv način. Na primer, površinsko naelektrianje hGH ili njegove agonističke varijante je određena brojem raspoloživih naeletkrisanih grupa na površini proteina. Ove naelektrisane grupe obično služe kao tačka potencijalnog vezivanja polimera poli(alkilen oksida). Tako, konjugati hGH ili njegove agonističke varijante imaće različita naelektrisanja od ostalih vrsta da bi omogućili selektivno izolovanje.
Jako polarne anion ili kation izmenjivačke smole kao što je kvaternerni amin ili sulfopropilna smola, se koriste u postupku ovog pronalaska. Iono-izmenj ivačke smole su preferentne. Listi sa komercijalno dostupnim kation-imenjivačkim smolama pogodnim za primenu u ovom pronalasku, a koja ne ograničava pronalazak pripadaju SP®-hitrap, SP-Sepharose HP® i brzo-protočna SP Sepharose®. Ostale pogodne kation-izmenj ivačke smole koje se mogu korisiti su npr., S i CM smole. Listi sa komercijalno dostupnim anion-imenjivačkim smolama pogodnim za primenu u ovom pronalasku, a koja ne ograničava pronalazak pripadaju Q-hitrap®, Q Sepharose HP® i brzo-protočna Q sepharose ®. Druge podogne anion-izmenjivačke smole koje se mogu upotrebiti su, npr. DEAE smole.
Na primer, poželjno je da se anion- ili kation-izmenj ivačke smole pakuju u koloni i ekvilibrišu na uobičajen način. Korišćen je pufer sa istim vrednostima za pH i osmolalnost kao što ima i rastvor polimera kojugovanog hGH ili njegove agonističke varijante. Preferentno je da pufer za eluiranje sadrži jednu ioli više soli odabranih od KC1, NaCI, K2HPO4, KH2P04, Na2HP04, NaH2P04, NaHC03, NaB04, i (NH4)2C03rastvor sa konjugatom je zatim adsorbovan na koloni pri čemu neizreagovani polimer i neke vrste velike molekulske težine se ne zadržavaju. Po završenom nanošenju, ispira se eluacionim puferom sa koncentracionim gradijentom soli, kako bi se eluirale željene frakcije polialkilen oksi-konjugovani hGH ili njegova agonističke varijante. Poželjno je da se sakupljene eluirane frakcije ograniče na konjugate polimera posle faze razdvajanje kation- ili anion- izmenjivačkog razdvajanja bilo koja vrsta konjugovanog hGH ili njegove agonističke varijante se zatim može isprati sa kolone konvencionalnim tehnikama. Po želji, vrste mono- i višestruko PEGilovanih hGH ili njegove agonističke varijante mogu se dalje razdvoiti jedan od drugog dodatnom iono-izmenjivačkom hromatografijom ili ekskluzionom hromatografijom.
Mogu se takođe primeniti i tehnike primene višestrukih izokratskih faza povećanjem koncentracija soli ili pH. Kao rezultat višestrukih faza izokratskog eluiranja di-, a zatim konjugata polimera mono-hGH ili njegove agonističke varijante.
Temperaturski opseg za eluiranje se kreće od oko 4°C do oko 25°C. Preferentno, eluiranje je izvedeno na temperaturi od oko 4°C do oko 22°C. Na primer, eluiranje frakcije PEG-hGH ili njegove agonističke varijante je je detektovano UV absorbancom na 280 nm. Prikupljanje frakcija se može izvesti jednostavnim vremenskim podešavanjem eluacionih profila.
Površinski aktivna sredstva se mogu korisitti u procesima konjugovanja poli(etilen glikol) poliemra sa grupama hGH ili njegove agonističke varijante. Odgovarajuće površinski aktivna sredstva obuhvataju agense ionskoge vrste kao što je natrijum dodecil sulfat (SDS). Mogu se koristiti i druga površinski aktivna sredstva ovog tipa su litijum dodecil sulfat, kvaternerna amonijum jedinjenja, tauroholična kiselina, kaprilna kiselina, dekan sulfonska kiselina itd. Mogu se koristiti na primer i materijali kao što je poli(oksietilen) sorbitani (Tweens), poli(oksietilen) etri (Tritons). Videti takođe Neugebauer, A guide to the Properties and Uses of Detergents in Biologv and Biochemistrv (1992) Calbiochem Corp. Jedina ograničenja za površinski aktivna sredstva korišćena u ovom pronalasku su ta da se koriste pod uslvoima i u koncentraaciji koja ne izaziva suštinsku ireverzibilnu denaturaciju hGH ili njegove agonističke varijante i ne inhibira u potpunosti konjugaciju polimera. Površinski aktivna sredstva su prisutna u reakcionim smešama u količini od oko 0.01-0.5% poželjno od oko 0.05-0.5%), a najbolje od oko 0.075-0.25%. Smeše površinski aktivnih sredstava su takođe obuhvaćene.
Smatralo se da površinski aktivna sredstva daju privremeni, ireverzibilni zaštitini sistem u toku procesa konjugacije polimera. Površinski aktivna sredstva su se pokazala efikasnim selektivnom onemogućavanju agregata polimera omogućavajući tako nastavak lizinsku ili amino-terminalu konjugaciju.
Prisutan poli(etilen glikol) modifikovanm hGH ili njegova agonistička varijanta ima trajniji farmakološki efekat, koji verovatno doprinosi njegovom dužemin vivopolu-životu.
Dalje, ovaj poli(etilen glikol)-modifikovan hGH ili njegova agonistička varijanta može se koristiti za lečenje hipopituariznog patuljastog rasta (GHD), nedostatka hormona rasta kod odraslih, Turner-ov sindrom, prestana rasta kod dece koja su rođena niska za gestacioni uzrast
(SGA), Prader-Willi sindroma (PWS), hronične renalne insufijencije (CRI), AIDS iznurenosti i starenja.
Poli(etilen glikol) -modifikovan hGH ili njegova agonistička varijanta mogu se formulisati u preparate koji takođe sadrže farmaceutski prihvatljiv razblaživač, agens za pripremanje izotoničnog rastvora i slično , za administraciju pacijentu.
Ovi pomenuti preparati se mogu administrirati subkutalno, intramuskularno, intravenozno, pulmonalno, intradermalno ili oralno u zavisnosti od vrste lečenja. Doza se takođe može bazirati na vrsti i stanju poremećaja pacijenta koji se leči, i kreće se obično od 0.1 mg do 5 mg injekcijom i od 0.1 mg do 5mg za oralno administriranje odraslom pacinetu.
Preferentno ej da su obuhvaćene polimerne supstance rastvorne u vodi na sobnoj temperaturi. Ne-ograničavajuća lista ovakvih polimera obuhvata poli(alkilen ksid) homopolimere kao stoje poli(etilen glikol) ili poli(propilen glikol), poli(oksietitisane poliole), njihove kopolimere i njihove blok polimere, pod uslovom daje zadržana rastvorljivost u vodi blok polimera.
Takođe se mogu koristiti i alternativni polimeri sa PEG -om osnovi, efikasni ne-antigenski materijali kao što je dekstran, poli(vinil pirolidoni), poli(akrilamidi), poli(vinil alkoholi), polimeri koji su u osnovi imaju uglovodonike i slični. Svakako, aktivacija a- i co-terminalnih grupa ovih polimernih supstanci mogu se sprovesti na način sličan onom koji se koristi za konverziju poli(alki!en oksida) što će i biti očigledno prosečnom stručnjaku. Prosečan stručnjak će uvideti da prethodno data lista, ilustrativna i da su razmatrani svi polimerni materijali u ovde datim količinama. Izraz "efikasni ne-antigenski" odnosi se na materijale koji se u tehnici smatraju ne-toksičnim i koji ne izmamljuju merljive imunogenske reakcije kod sisara.
Definicije
Sledi lista skraćenica i odgovarajućih značenja kao što su ovde korišćena:
Kompletan sadržaj svih publikacija, patenata i patentnih prijava navedenih u ovom otkriću su inkorporirani referencom kao daje svaka publikacija, patent ilipatentna prijava ponaosob specifično i individualno označena daje inkoporirana referencom.
I pored toga što su prethodni pronalasci i opisani do detalja, ilustracijama i primerima radi jasnoće i razumevanja, prosečnom stručnjaku će biti jasno po pitanju ovogo pronalaska da su izmene i modifikacije učinjene bez udaljavanja od obima i duha ove prijave. Sldeći primeri su dati samo za ilustraciju i ni na koji način ne ograičavaju obim pronalaska koji je prethodno detaljno opisan.
U sledećim primerima, hGH ima sekvencu SEQ ID NO: 1. Treba napomenuti da ostali članovi familije polipeptida hGH ili njegovih agonističkih varijanti takođe mogu biti PEGilovani na način sličan onom opisanom u primerima.
Sve ovde date reference, patentni i patentne prijave su inkorporirane referencom u poptinosti.
Ovaj pronalazak će dalje biti ilustovan upućivanjem na sledeće primer, koji međutim, ni na koji način ne ograničavaju obim ovog pronalaska.
PRIMER 1
Ravan lanac 20,000 MW PEG-ALD hGH
Ovaj primer se odnosi na postupak dobijanja u suštini homoegnog preparata N-terminalnog monopegilovanog hGH redukctivnom alkilacijom. Metoksi-lineranan PEG-propionaldehidni reagens od oko 20,000 MW (Shearvvater Corp.) je selektivno kuplovana reduktivnom animacijom N-terminusa hGH, na račun razlike u relativnim pKa vrednostima primarnih amina na N-terminusu u odnosu na pKa vrednosti primarnih amina naE-amino položaju ostataka lizina. hGH protein rastvoren pri koncentraciji od 10 mg/ml u 25mM MES (Sigma Chemical, St. Louis, MO), pH 6.0, 25 mM Hepes (Sigma Chemical, St. Louis, MO) pH 7.0 ili u 10 mM Natrijum acetatu (Sigma Chemical, St. Louis, MO) pH 4.5, je reagovao sa metoksi-Peg-propionaldehidom, M-PEG-ALD (Shearvvater Corp., Huntsville, AL) dodatkom M-PEG-ALD , za dobijanje PEG : hGH i relativnom molarnom odnosu od 0.1:0.7 po aminu
(po potrebi se može dodati 8% acetonitril). Reakcije su katalizovane dodatkom osnovnog IM rastvora NaCNBH.4 (Sigma Chemical, St. Louis, MO), rastvorenog u H2O, do krajnje koncentracije od 10-50mM. Reakcije su izvedene u tami na 4°C do RT u trajanju os 18-24 sata. Reakcije su prekinute dodatkom IM Tris (Sigma Chemical, St. Louis, MO)~pH 7.6 do finalne koncentracije Tris od 50 mM ili razlažen u odogovarajućem puferu za neposredno prečišćavanje.
PRIMER 2
Ravan lanac 30,000 MW PEG-ALD hGH
Metoksi linearan 30,000 MW Peg-propionaldehidni reagens (Shearvvater Corp.) je kuplovan sa N-terminusom hGH prema postupku opisanom za Primer 1.
PRIMER 3
Ravan lanac 5,000 MW PEG-ALD Hgh
Metoksi linearan 5,000 MW Peg-propionaldehidni reagens (Shearvvater Corp.) je kuplovan sa N-terminusom hGH prema postupku opisanom za Primer 1.
PRIMER 4
Razgranat lanac 40,000 MW PEG-ALD hGH
Metoksi razgranat 40,000 MW Peg-aldehidni (PEG2-ALD) reagens (Shearwater Corp.) je kuplovan sa N-terminusom hGH prema postupku opisanom za Primer 1.
PRIMER 5
Razgranat lanac 20,000 MW PEG-ALD Hgh
Metoksi razgranat 20,000 MW Peg-aldehidni (PEG2-ALD) reagens (Shearvvater Corp.) je kuplovan sa N-terminusom hGH prema postupku opisanom za Primer 1, uzmajući molarni odnos PEG : hGH 0.1-0.5 po aminu.
PRIMER 6
Ravan lanac 30,000 MW SPA-ALD hGH
Ovaj primer pokazuej postupak za dobijanje u sutini homogenog preparata mono-pegilovanog hGH korišćenjem N-hidroksisukcinimidil (NHS) aktivnih estara. Osnovni rastvor hGH proteina je rastvoren u koncentraciji od 10 mg/ml u 0.25M HEPES pufera, pH 7.2 ( po potrebi može se dodati i acetonitril). Rastvor je zatim reagovao sa Metoksi-PEG-sukcinimidil propionatom (SPA-PEG) dodatko SPA-Peg za dobijanje PEG : hGH u relativnom odnosu od 0.1-0.65 po aminu. Reakcije su izvedene na 4°C do RT, u trajanju od 5 minuta do 1 sata. Reakcije su prekinute.snižavanjem pH na 4.0 dodatko 0.1N sirćetne kiseline ili dodatkom Tris HCL u 5X polarnom višku.
PRIMER 7
Ravan lanac 20,000 MW SPA-PEG hGH
Ravan lanac 20,000 MW SPA-PEG reagens (Shearwater Corp.) je kuplovan sa N-terminusom hGH prema postupku opisanom za Primer 6.
PRIMER 8
Ravan lanac 10,000 MW Biotin-SPA-PEG hGH
10,000 MW razgranat PEG2-NHS (Shearvvater Corp.) je kuplovan sa hGH prema postupku opisanom za Primer 6.
PRIMER 10
Razgranat 20,000 MW NHS-PEG hGH
20,000 MW razgranat PEG2-NHS (Shearvvater Corp.) je kuplovan sa hGH prema postupku opisanom za Primer 6.
PRIMER 11
Razgranat 40,000 MW NHS-PEG hGH
Razgranat 40,000 MW SPA-PEG reagens (Shearvvater Corp.) je kuplovan sa hGH prema postupku opisanom za Primer 6.
PRIMER 12
Razgranat 20,000 MW PEG-BTC hGH
20,000 MW PEG-BTC (Shearvvater Corp.) je kuplovan sa hGH prema postupku opisanom za Primer 6. Ovaj primer opisuje postupak dobijanja homogenog preparata pegilovanog hGH primernom derivata benzotriazol karboanta PEG-a.
PRIMER 13
Ravan lanac 5,000 MW PEG-SS- hGH
5,000 MW sukcinimidil sukcinat-PEG (SS-PEG) (Shearvvater Corp.) je kuplovan sa hGH prema postupku opisanom za Primer 6. Ovaj primer prikazuje postupak dobijanja homogenih preparata peglisanog hGH primenom veze koja se može hidrolizovati.
PRIMER 14
Ravan lanac 20,000 MW PEG-CM-HBA- hGH
Ravan lanac 20,000 MW PEG-BCT (Shearvvater Corp.) je kuplovan sa hGH prema postupku opisanom za Primer 6. Ovaj primer prikazuje postupak dobijanja homogenih preparata peglisanog hGH polazeći od veze koja se može hidrolizovati.
PRIMER 15
Ravan lanac 2-4Xx 5,000 MW PEG-CM-HBA- hGH
5,000 MW Peg-CM-HBA (Shearvvater Corp.) je kuplovan sa hGH prema psotupku opisanom za primer 13.
PRIMER 16 -
Ravan lanac 20,000 MW HZ-PEG hGH
Ovaj primer odnosi se na postupak dobijanja homogenog prearata pegilovanog hGH
primenom 20,000 MW metoksi-PEG hidrazida, HZ-PEG (Shearvvater Corp.). osnovni rastvor hGH protein je dalje rastvoren u koncentraciji od 10 mg/ml u lOmM MES-u, pH 4.0. Rastvor je zatim reagovao sa HZ-PEG za dobijanje PEG : hGH u relativnom molskom odnosu od 0.1-5.0 po karbonil grupi. Reakcija je katalizovana karbodiimidom (EDC, EOAC, EDCEC) pri finalnoj koncentraciji od 2mM do 4mM. Reakcija je izvedena na 4°C u trajanju od 2 sata do preko noći. Reakcioje su zaustavljene prečišćavanjem na kation izmenjivaču.
PRIMER 17
Multi-pegilovane vrste
Modifikovani hGH sa jednom ili više PEG (multi - pegilovan) su takođe dobijeni iz Primera 1 i 4 i razdvojeni su od mono-pegilovanih vrsta iono izmenjivačkom hromatografijom. Modifikovani hGH sa dva ili više PEG (multi-pegilovani) su takođe razdvojeni od mono PEGilovanih vrsta kation-izmenjivačkom hromatografijom. Modifikovani hGH sa jednom ili više PEG (multi - pegilovan) su takođe dobijeni iz Primera 2, 3, 5-13 prečišćeni su na način sličan onom opisanom za primere 1 i 4.
PRIMER 18
Prečišćavanje PEGilovaniog hGH
Pegilovane hGH vrste su prečišćene iz reakcione smeše do >95% (SEC analiza) korišćenjem faze mono-iono izmenjivačke hromatografije.
Anion ionoizmenj' ivačka hromatografija
PEG hGH vrste su prečišćene iz reakcione smeše do >95% (SEC analiza) primenom faze mono-ionoizmenjivačke hromatorgafije.Mono-pegilovan hGH je prečišćen iz nemodifikovanog hGH i multi-pegilovane hGH vrste, pomoću anion-izmenj ivačke hromatografije. Tipčna 20K aldehidna hGH rekaciona smeša (5-100mg proteina) kao što je gore opisano, je prečišćena na Q-Sepharose Hitrap koloni (1 ili 5ml) (Amersham Pharmacia Bioetch, Piscataway, NJ) ili Q-Sepharose brzo protočna kolona (26/20, zapremine 70ml)
(Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) ekvilibrisana u 25mM HEPES, pH 7.3 (Pufer A). Reakciona smeša je razblažena 5-10X puferom A i naneta na kolonu pri brzini ptoroka od 2.5 ml/min. Kolona je isprana puferom A , 8 zapremina kolone. Nakon toga, različite hGH vrste su elirane sa kolone puefrom A, 80-100 zapremina kolone i lineranim NaCl gradijentom od 0-lOOmM. Eluenti su praćeni apsorbancom na 280nm (A280) i prikupljene su frakcije od 5ml. Frakcije su skupljene kao nastavak peliovanja npr. mono, di, tri itd. (kaoš što je razmatrano u primeru 15). Prikupljene frakcije su koncentrovane do 0.5-5 mg/ml u Centriprep YM10 koncentratom (Amicon, Technology Corporation, Northborough, MA). Koncentracija proteina u frakcijama je određena na A2so, uzimajući vrednost za ekstincioni koeficijent od 0.78. Ukupan prinos prečišćenog mono 20K PEG-aldehid hGH iz ovog procesa iznosio je 25-30%.
Kation izmenjivačka hromatografija
Kation izmenjivačka hromatografija je izvedena na SP Sepharose koloni (Pharmacia XK 26/20, zapremine 70ml), ekvilibrisana lOmM natrijum acetatom pH 4.0 (pufer B). Reakciona smeša je razblažena 10X puferom B i naneta na kolonu pri brzini protoka od 5ml/min. Zatim je kolona isprana sa 5 zapremina kolona pufera B, nakon toga sa 5 zapremina kolone 12% pufera C (lOmM acetat pH 4.5, IM NaCl). Nakon toga, PEG-hGH vrste su elirane sa kolone lineranim gradijentom od 12 do 27% pufera C u 20 zapremina kolona. Eluiranje je praćeno na A280nm i prikupljene su frakcije od 10 ml. Frakcije su prikupljene kao nastavak pegilovanja (mono, di, tri itd), dodat je lOmM acetatni pufer pH 4.5 i koncentrovani do l-5mg/ml umešanoj ćeliji sa Amicon YM10 membranom. Koncentracija proteina u frakcijama je određena na A280, uzimajući vrednost za ekstincioni koeficijent od 0.78. Ukupan prinos monopegilovanog hGH iz ovog procesa iznosio je 10-50%).
PRIMER 19
Biohemijska karakterizacija
Prečišćene kolecije pegilovanih hGH su okarakterisane redukovanjem i ne-redukovanjem SDS-PAGE, ne-denaturisanjem i denaturisannjem ekskluzionom hromatografijom, N-terminalnim sekvencionisanjem, hromatografijom hidrofobnim interakcijama i reverezno faznom HPLC.
Ekskluziona hromatografija pod visokim pritiskom ( SEC- HPLC)
Ne- denaturisanje SEC- HPLC
Reakcija različitih grupa, veličine , linkera i geometrije metoksi PEG-a sa hGH anion izmenjivačkim prečišćavanjem prikupljenih frakcija i finalnog prečišćenog proizvoda je određeno pomoću SEC-HPLC ne-dentarusanjem. Analitička SEC-HPLC ne-denaturisanjem je izvedena na Tosohaas G4000PWXL koloni, 7.8mm X 30 cm, (Tosohaas Amersham Bioscience, Piscataway, NJ) ili Supredex 200 (Amersham Bioscience, Piscataway, NJ) u 20mM fosfatnom puferu pH 7.2, 150mM NaCl pri brzini protoka od 0.5ml/minut. Pegilovanje u mnogome povećava hidrodinamičku zapreminu proteina što za poseldicu ima pomeranje ka ranijim retencionim vremenima. Nove vrste su uočene u PEG aldehid reakiconim smešama zajedno sa nemodifikovanim hGH. Ove PEGilovane i ne-pegilovane vrste su razdvojene hromatografijom na Q-Sepharose-i i dobijene prečišćene mono-PEG-Aldegid hGH vrste su zatim elurane kao jedan pik na SEC ne-denaturisanjem (>95% čistoće). Faza hromatografisanja na Q-Sepharose-i efikasno uklanja PEG, hGH i multi PEGilovane hGH vrste od mono-Pegilovanih hGH. SEC-HPLC ne-denaturisanjem je pokazala da efikasna veličina PEGilovanih-hGH je daleko veća nego njihova teorijska molekulska težina (Tablica 1)
SEC- HPLC denaturisanjem
Reakcija različitih metoksi PEG sa hGH, anion izmenjivačko prečišćavanje i krajnji prečišćeni proizvodi su određeni SEC-HPLC denaturisanjem. Analitičko SEC-HPLC denaturisanjem je izvedeno na Tosohaas 3000SWXL koloni 7.8mm x 30cm (Tosohaas Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) u lOOmM fosfatu pH 6.8, 0.1% SDS pri protoku od 0.8ml/minuti. PEGilovanje značajno povećava hidrodinamičku zapreminu proteina što za poseldicu ima pomeranje ka ranijim retencionim vremenima. Nove vrste su primećenne u 20k PEG aldehid hGH reakcionoj smeši zajendo sa nemodifikovanim hGH. Ove PEGilovane i ne-PEGilovane vrste su razdvojene hromatografijom na Q-Sepharose i dobijeni prečišćen mono 20K PEG-aldehid hGH je eluiran kao jedan pik na SEC denaturisanjem (>95% čistoće). Faza hromatografije na Q-Sepharose-i efikasno uklanja slobodni PEG, hGH i multi PEGilovane hGH vrste od mono PEGilovanog hGH.
SDS PAGE/ PVDF transfer
SDS-PAGe se koristi za izvođenje reakcije različitih PEG reagenasa sa hGH i perčišćenim finalnim proizvodima. Primeri ovih tehnika su date sa mono 20K lineranim ili razgranatim 20k i 40k PEG aldehidom i 4x6 5K SPA PEG (Slike 1 i 2).SDS - PAGE je izveden na 10-20% tris glicin gelu debljine od 1 mm (Invitrogen, Carlsbad, CA) pod redukcionim i ne-redukcionim uslovima a izazvano je korišćenjem (Invitrogen, Carlsbad, CA). Prečišćene mono-PEG-aldehid hGH vrste migriraju kao jedna velika traka na SDS-PAGE. Trake su nanete na PVDF membranu za identifikaciju N-terminalnih sekvenci.
Analitička anion- izmenjivačka HPLC
Analitička anio-izmenjivačka HPLC je primenjena za određivanje reakcije različitih mPEG sa hGH, anion -izmenjivačkog prečišćavanja frakcija i krajnjeg prečišćavanja proizvoda. Analitička anion-izmenj ivačka HPLC je izvedeno na Tosohaas Q5PW ili DEAE-PW anion izmenjivačkoj koloni, 7.5mm x 75mm (Tosohaas Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) u 50mM Tris pH 8.6 pri brzini protoka od 1 ml/min. Uzorci su elirani lineranim gradijentom od 5-200mM NaCl.
Reverezno fazna HPLC ( RP- HPLC)
PEG-GH reakcione smeše i prečišćeni PEGilovani proizvodi su analizirani RP HPLC-om za tumačenje hGH vrsta, mono i višestruko Pegilovanih hGH vrsta i praćenje oksidovanih hGH oblika, kao i, PEG hGH izooblika sa jednim PEG-om vezanim na različitim mestima (npr. N-terminalni vs. lizin e-amino grupe). RP-HPLC je izvedena na Zorbax SB-CN 150 ili 250 mm x4.6mm( 3.5mmili 5mm) reverezno faznoj HPLC koloni.Eksperimenti su izvedeni na sobnoj temperaturi, uobičajenim nanošenjem lOmg proteina po uzorku. Pufer A je 0.1 % trifluorsirćetna kiselina; pufer B je0.1% trifluorsirčćtna kiselina u acetonitrilu. Gradijent, koji daje 1/2 % porast B u minutu, je sledeći:
Mapiranje N- terminalne sekvence ipeptida
Automatizovana Edman-ova degradaciona hernija je korišćena za određivanje sekvence NH2-teminalnog proteina. Za degradaciju je korišćen Applied Biosvstem Model 494 Procise sekvcencer (Perkin Elmer, Wellesley, MA).Odgovarajući PTH-AA derivati s identifikovani RP-HPLC analizom pomoću Applied Biosystems Model 140C PTH analizatoroa opremljenim sa PerkinElmer/Brownlee 2.1 mm u.p. PTH-C18 kolonom. Sekvencirane su trake 20K linearnog i 20 i 40K razgranatog PEG-ALD hGH proteina prebačene su na PVDF membrane ili rastvori prečišćenog 20K lineranog i razgranatog 20 i 40K PEG-ALD hGH . Prečišćen 20K linearan PEG-hGH daje glavni signal (oko 88% ) za koji je primećeno da ima očekivanu sekvencu za hGH osim što nema N-terminalnu amino kiselinu. Ovo je i očekivano za protein koji je N-terminalno PEGilovan , hernijom aldehida. Ostatak prvog ciklusa je nemoguće regenerisati zbog vezane PEG grupe. Manji signal (oko 12%) ima tačnu N-terminalnu aminokiselinsku sekvencu. Uzimajući u obzir daje maksimum prikupljen od RP-HPLC, 100%o PEGilovan, ovi podaci ukazuju na to da oko 88%PEG modifikacija je na N-terminusu dok je ostatak očigledno vezan za nekoliko moućih ostataka lizina.
Mapiranje proteina tripsinom je izvedeno pri koncentraciji od 1 mg/ml i občno se uzima 50u.g materijala po analizi. Tripsin je dodat u količini tako daje odnos PEG-hGH odnos 1:30 (t/t). Tris pufer je prisutan u koncentraciji od 30mM, pH 7.5. Uzorci su inkubirani na sobnoj temepraturi u trajanju od 16±0.5 sat. Reakcije su prekinute dodatkom 50ul IN HC1 po ml rastvora za mapiranje. Uzorci su razblaženi pre postavljanja uzoraka u autosampler do krajnje koncentracije od 0.25mg/ml u 6. 25% acetonitrila. Prvo je dodat acetonitril (19.8% acetonitril) smeša pažljivo pomešana, pa je dodata voda do krajnje koncenteracije (četiri puta veća od polazne zapremine). Višak rastvora se može ukloniti u čuvati najduže nedelju dana na -20°C.
Za analizu je korišćen Waters Alliance 2695 HPLC sistem, ali i drugi sistemi bi terbalo da daju slične rezultate. Korišćena je kolona Astec C-4 polimerna 25cm x 4.6mm kolona sa česticama od 5 um. Eksperimenti su izvedeni na sobnoj temperaturi i to sa 50u.g proteina po uzorku. Ufer A je 0.1% trifluorsirćetna kiselina u vodi; pufer B je 0.085% trifluorsirćetna kiselina u acetonitrilu. Gradijent je sledeći:
Kolona je zagrevana na 40°C pomoću grejača. Pikovi su detektovani Waters 996PDA detektorom prikupljanjem podataka od 210 do 300nm. Ekstrahovani hromatogrami na 214nm su korišćeni za analizu uzorka za određivanje stepena -terminalnog PEGilovanja (gubitak T-l fragmenta) kao što je dato u Tablici 2.
PRIMER 20
Farmakodinamička ispitivanja
Efikasnost ispitivanja kod ženki Spraque Dawley pacova kojima je uklonjena hipofiza u Harlan Labs, koje su 7-10 dana bile na ispitivanju brzine rasta. Tako dasu isptivanja rasta trajala 11 dana. Pacovi su podeljeni u grupe od šest do osam. Grupu 1 čine pacovi kojima je dnevno ili dana 0 ili dana 6 subkutalno davana doza (doze) nosača. Grupi 2 su dnevno subkutalno davane doze GH (0.3mg/kg/dozi). Grupi 3 su subkutalno davane doze GH dana 0 i dana 6 (1.8mg/kg/doze). Grupi 4 su subkutalno davane doze PEG-GH dana 0, 6 (1.8mg/kg/doze). Pacovi kojima je uklonjena hipofiza su kontrolisani na povećanje težine, merenjem barem jednom dnevno u toku ispitivanja. Povećanje težine (prosečna vrednost +/-SEM) za 20K PEG-ALD hGH, 20K i 40K razgranatog PEG-ALD hGH i 4-6xPEG-SPA hGH doziranih jednom nedeljno, slično je onima koji su dnevno primali doze hGH (Slike 3 & 4). U Tablici 3 sumirano je ukupno povećanje težine (prosečna vrednost +/- SEM) 11 -og dana, jedenom nedeljno doziranjem različitih PEGilovanih hGH molekula u odnosu na dnevnu dozu hGH.
Po završenom isptitvanju rasta, životinje su žrtvovane i analizirana je dužina kosti (tibia). Na Slici 6 date su promene u dužini tibialne kosti (prosečna vrednost +/- SEM) 11-og dana kao rezulutat različitih PEG-GH konjugata doziranih dana 0 i dana 6 ili hGH doziran dnevno.
IIGF- 1 nivoi kod pacova kojima je uklonjena hipofiza
Eksperimenti su izvedeni kao što je prethodno dato za ispitivanje povećanja težine, sa tom razlikom što su uzorci uzeti na dan 0, 1, 2, 3, 4, 5 i posle žrtvovanja životinja dana 9. Novi IGF-1 su određeni pomoću ELISA. Na Slici 7 dato je poređenje nivoa IGF-1 u serumu (prosečna vrednost +/- SEM) kod pacova kojima je uklonjena hipofiza nakon čega je sedilo dnevno doziranje hGH ili jedinične doze hGh ili doziranje PEGilovanog hGH dana 0, dana 6.
Farmakokinetička ispitivanja
Farmakokinetička ispitivanja su sprovedena na normalnim mužjacima Sprague-Dawley pacova, miševima i cvnomolgus majmunima. Injekcije su pripremljene ili kao jedinični subkutalni bolus od 1.8mg/kg ili kao jedinična iv doza od l.Omg/kg GH ili PEG-GH kod pacova i miševa, i to na šest pacova i do 60 miševa po grupi. Kod Cvnomolgus majmuna primenjena je doza od 0.18 mg/kg GH ili PEG-GH za oba jedinična subkutalna bolusa i IV, na 2-4 majmuna po grupi. Uzorci krvi su uzeti u periodu od jednog do pet dana kako je već pogodno za određivanje relevantnih PK parametara (Tablica 4) (ti/2) = Terminalni polu život (Cl) = eliminacija, (Tmax) = vreme maksimuma koncentracije, Vss = raspodela zapremine u stabilno stanju i (Cmax) = nivoi maksimalne koncentracije GH i PEG-GH u krvi su na svakom uzorku praćeni imunoesejem.
hGH imunoesej
Određeni su nivoi koncentracija hGH i pegilovanih hGH proteina u plazmi pacova, miševa i Cvnomolgus majmuna pomoću hGH AutoDELFIA kompletom fluorescentnog imunoeseja (PerkinElmer Life Sciences), korišćenjem odgovarajućeg PEG hGH za dobijanje stadnardne krive.

Claims (79)

1. Konjugat koji sadrži barem jedan molekul polimera rastvoran u vodi, kovalentno vezan za najmanje jedan aminokiselinski ostatak biološki aktivnog polipeptida humanog hormona rasta (hGH) ili njegove agonističke varjante.
2. Konjugat prema zahtevu 1, naznačen time, što polipeptid hGH sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:l.
3. Konjugat prema zahtevu lili 2, naznačen time, što je polimer, molekul poli(etilen oksida).
4. Konjugat prema zahtevu 3, naznačen time, stoje molekul poli(etilen oksida), molekul poli(etilen glikola).
5. Konjugat prema zahtevu 4, naznačen time, što je poli(etilen glikol) vezan za aminokiselinski ostatak sa slobodnom amino grupom (grupama), karboksilnom grupom (grupama) ili sulfhidril grupom (grupama).
6. Konjugat prema zahtevu 5, naznačen time, što je dobijen od aktiviranog poli(etilen glikola).
7. Konjugat prema zahtevu 6, naznačen time, što pomenuti aktivirani poli(etilen glikol) sadrži funkcionalnu grupu.
8. Konjugat prema zahtevu 7, naznačen time, što je grupa koja je vezana, amino kiselina sa slobodnom amino grupom.
9. Konjugat prema zahtevu 8, naznačen time, što su pomenute funkcionalne grupe odabrane iz grupe koju čine; karbonati, karbonil imidazoli, aktivni estri karboksilnih kiselina, azlaktoni, cikličnih imid tioketoni, izocijanati ili izotiocijanati, imidati i aldehidi.
10. Konjugat prema zahtevu 9, naznačen time, što funkcionalna grupa, karbonat ili karbonil imidazol.
11. Konjugat prema zahtevu 10, naznačen time, što je aktivirani poli(etilen glikol) odabran iz grupe koja se sastoji od:
12. Konjugat prema zahtevu 11, sledeće strukture gde je R, polipeptid humanog hormona rasta.
13. Konjugat prema zahtevu 12, naznačen time, što pomenuti polipepti humanog hormona rasta sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO.T.
14. Konjugat prema zahtevu 9, naznačen time, što je funkcionalan grupa ciklični amid tioketon.
15. Konjugat prema zahtevu 14, naznačen time, što je je aktivirani polifetilen glikol)odabran iz grupe koju čine: gde je L, odabrano iz grupe koja se sastoji od -O-, -NFfe-, OCH2-, -NH-CO(CH2)n, -NH-CO(CH2)nO-, -CO-NH(CH2)n-, -S-, -CO-NH(CH2)nO-,. -0(CH2)N0-, -0(CH2)n-, -SCH2CH2- i -NH(CH2)n-.
16. Konjugat prema zahtevu 9, naznačen time, što je funkcionalna grupa, azalakton.
17. Konjugat prema zahtevu 16, naznačen time, što je aktiviran poli(etilen glikol) odabran iz grupe koja se sastoji od: gdeje: R1 odabrano iz grupe u čiji sasva ulaze vodonik, alkil, cikloalkil, karboksilni i heteroaromatični prstenovi, a, p-nezasićen alkil i R<1>i<R3>su nezavisno odabrani d vodonika, alkila, arila i alkilarila.
18. Konjugat prema zahtevu 9, naznačen time, što je funkcionalna grupa izocijanat ili izotiocijanat.
19. Konjugat prema zahtevu 18, naznačen time, što je aktivirani poli(etilen glikol) odabran iz grupe koja se sastoji od: mPEG-N=C=0 i mPEG-N=C=S.
20. Konjugat prema zahtevu 9, naznačen time, što je funkcionalna grupa aldehid ili aldehidhidrat.
21. Konjugat prema zahtevu 20, naznačen time, što je aktiviran poli(etilen glikol) odabran iz grupe koja se sastoji od:
22. Konjugat prema zahtevu 9, naznačen time, stoje funkcionalna grupa, aktivan estar karboksilne kiseline.
23. Konjugat prema zahtevu 22, naznačen time. stoje aktiviran poli(etilen glikol) odabran iz grupe koja se sastoji od:
24. Konjugat prema zahtevu 23, naznačen time, što ima strukturu odabranu iz grupe koja se sastoji od: gde je R polipeptid humanog hormona rasta.
25. Konjugat prema zahtevu 24, naznačen time, što polipepid humanog hormona rasta ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:l.
26. Konjugat prema zahtevu 9, naznačen time, stoje aktiviran poli(etilen glikol) odabran iz grupe koju čine: mPEG-0-S02-CH2CF2,<1>
27. Konjugat prema zahtevu 26, naznačen time, što ima strukturu odabranu iz grupe koja se sastoji od: gde je R polipeptid humanog hormona rasta.
28. Konjugat prema zahtevu 27, naznačen time, što polipeptid humanog hormona rasta ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:l.
29. Konjugat prema zahtevu 28, naznačen time, što je funkcionalna grupa, imidat.
30. Konjugat prema zahtevu 9, naznačen time, što je aktivirani poli(etilen glikol) odabran iz grupe koja se sastoji od:
31. Konjugat prema zahtevu 9, naznačen time, što je slobodna amino grupa, amino terminalna a-amino grupa.
32. Konjugat prema zahtevu 31, naznačen time, što je amino terminalna a-amino grupa, fenilalanin.
33. Konjugat prema zahtevu 8, naznačen time, stoje grupa koja je vezana, amino kiselina sa slobodnom karobkilnom grupom.
34. Konjugat prema zahtevu 33, naznačen time, što je funkcionalna grupa odabrana iz grupe u čiji sastav ulaze: primarni amini, hidrazin i hidrazid funikcionalne grupe.
35. Konjugat prema zahtevu 34, naznačen time, stoje funkcionalna grupa odabrana iz grupe koja se sastoji od:
36. Konjugat prema zahtevu 8, naznačen time, stoje grupa koja je vezana, amino kiselina sa slobodnom sulfhidril grupom.
37. Konjugat prema zahtevu 36, naznačen time, što je funkcionalna grupa odabrna iz grupe koja se sastoji od tiola, meleimida, vinil sulfona i fenil glioksala.
38. Konjugat prema zahtevu 37, naznačen time, što je funkcionalna grupa odabrana iz grupe u čiji sastav ulaze:
39. Konjugat prema zahtevu 38, naznačen time, što ima strukturu odabran iz grupe koja se sastoji od: gde je R polipeptid humanog hormona rasta.
40. Konjugat prema zahtevu 39, naznačen time, što polipeptid humanog hormona rasta ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 1.
41. Konjugat prema zahtevu 8, naznačen time, što poli(etilen glikol) ima molekulsku težinu između 0.5kDa i oko lOOkDa.
38. Konjugat prema zahtevu 37, naznačen time, što je funkcionalna grupa odabrana iz grupe u čiji sastav ulaze:
39. Konjugat prema zahtevu 38, naznačen time, što ima strukturu odabran iz grupe koja se sastoji od: gde je R polipeptid humanog hormona rasta.
40. Konjugat prema zahtevu 39, naznačen time, što polipeptid humanog hormona rasta ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 1.
41. Konjugat prema zahtevu 8, naznačen time, što poli(etilen glikol) ima molekulsku težinu između 0.5kDa i oko lOOkDa.
42. Konjugat prema zahtevu 41, naznačen time, što poli(etilen glikol) ima molekulsku težinu između 5kDa i oko 40 kDa.
43. Konjugat prema zahtevu 8, naznačen time, što je poli(etilen glikol), razgranat polimer.
44. Konjugat prema zahtevu 43, naznačen time, što je razgranati polimer odabran iz grupe koja se sastoji od:
45. Konjugat humanog hormona rasta-PEG, naznačen time, što ima strukturu: gde je R polipeptid humanog hormona rasta.
46. Konjugat prema zahtevu 45, naznačen time, što polipeptid humanog hormona rasta ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:l.
47. Konjugat prema zahtevu 46, naznačen time, što je najmanje 80% polietilen glikola konjugovano za amino-ternimani fenilalanin.
48. Konjugat prema zahtevu 46, naznačen time, što je najmanje 90% polietilen glikola konjugovano za aminoterminalni fenilalanin.
49. Konjugat prema zahtevu 47 ili 48 naznačen time, što svaki mPEG ima molekulsku težinu od oko 20kDa.
50. Konjugat humanog hormona rasta-PEG , naznačen time, što ima strukturu:
51. Konjugat prema zahtevu 50, naznačen time, što polipeptid humanog hormona rasta ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 1.
52. Konjugat prema zahtevu 51, naznačen time, što je najmanje 80% polietilen glikola konjugovano za amino-ternimani fenilalanin.
53. Konjugat prema zahtevu 51, naznačen time, što je najmanje 90% polietilen glikola konjugovano za amino-ternimani fenilalanin.
54. Konjugat prema zahtevu 52 ili 53, naznačen time, što mPEG ima molekulsku težinu od oko 20kDa.
55. Konjugat humanog hormona rasta-PEG, naznačen time, što ima strukturu: mPEG-OCH2CH2CH2NH-R
56. Konjugat prema zahtevu 55, naznačen time, što polipeptid humanog hormona rasta ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:l.
57. Konjugat prema zahtevu 56, naznačen time, što je najmanje 80% polietilen glikola konjugovano za amino-ternimani fenilalanin.
58. Konjugat prema zahtevu 56, naznačen time, što je najmanje 90% polietilen glikola konjugovano za amino-ternimani fenilalanin.
59. Konjugat prema zahtevu 57 ili 58, naznačen time, što svaki mPEG ima molekulsku težinu od oko 20kDa.
60. Konjugat prema zahtevu 8, naznačen time, što je poli(etilen glikol), bifunkcionalni polimer.
61. Konjugat prema zahtevu 8, naznačen time, što je poli(etilen glikol), prolek.
62. Preparat naznačen time što sadrži hGH iz zahteva 1 i barem jedan farmaceutski prihvatljiv nosač.
63. Postupak lečenja pacijenata sa poremećajem rasta ili razvoja , koji obuhvata administriranje obolelom pacijentu terapeutski efikasnu količinu hGH konjugata iz zahteva 1.
64. Postupak prema zahtevu 63, naznačen time, što je poremećaj rasta ili razvoja, nedostatak hormona rasta (GHD).
65. Postupak prema zahtevu 63, naznačen time, stoje poremećaj rasta ili razvoja, Turner-ov sindrom.
66. Postupak prema zahtevu 63, naznačen time, što je poremećaj rasta ili razvoja, hronična renalna insufijencija.
67. Postupak prema zahtevu 63, naznačen time, što je poremećaj rasta ili razvoja, malo gestaciono doba (SGA).
68. Preparat naznačen time, što sadrži hGH iz zahteva 48 i barem jedan farmaceutski prihvatljiv nosač.
69. Postupak lečenja pacijenata sa poremećajem rasta ili razvoja, koji obuhvata administriranje obolelom pacijentu terapeutski efikasnu količinu hGH konjugata iz zahteva 48.
70. Postupak prema zahtevu 69, naznačen time, što je poremećaj rasta ili razvoja, nedostatak hormona rasta(GHD).
71. Postupak prema zahtevu 69, naznačen time, što je poremećaj rasta ili razvoja, Turner-ov sindrom.
72. Postupak prema zahtevu 69, naznačen time, stoje poremećaj rasta ili razvoja, hronična renalna insufijencija..
73. Postupak prema zahtevu 69, naznačen time, stoje poremećaj rasta ili razvoja malo gestaciono doba (SGA).
74. Preparat naznačen time, što sadrži hGH iz zahteva 50 ili 55 i barem jedan farmaceutski prihvatljiv nosač.
75. Postupak lečenja pacijenta sa poremećajem rasta ili razvoja koji obuhvata administriranje obolelom pacijentu terapeutski efikanu količinu hGH konjugata iz zahteva 1.
76. Postupak prema zahtevu 75, pri čemu je poremećaj rasta ili razvoja, nedostatak hormona rasta (GHD)..
77. Postupak prema zahtevu 75, pri čemu je poremećaj rasta ili razvoja, Turner-ov sindom.
78. Postupak perma zahtevu 75, pri čemu je poremećaj rasta ili razvoja, hronična renalna insufijencija.
79. Postupak perma zahtevu 75, pri čemu je poremećaj rasta ili razvoja, malo gestaciono doba (SGA).
YU53104A 2001-11-20 2002-11-20 Hemijski modifikovani konjugati humanog hormona rasta RS53104A (sr)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US33190701P 2001-11-20 2001-11-20
PCT/US2002/037270 WO2003044056A2 (en) 2001-11-20 2002-11-20 Chemically-modified human growth hormone conjugates

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS53104A true RS53104A (sr) 2006-10-27

Family

ID=23295870

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
YU53104A RS53104A (sr) 2001-11-20 2002-11-20 Hemijski modifikovani konjugati humanog hormona rasta

Country Status (25)

Country Link
EP (1) EP1453859A2 (sr)
JP (2) JP2005525302A (sr)
KR (2) KR20050044858A (sr)
CN (1) CN1608079A (sr)
AP (1) AP2004003050A0 (sr)
AU (1) AU2002356990A1 (sr)
BR (1) BR0214451A (sr)
CA (1) CA2467731A1 (sr)
CO (1) CO5580794A2 (sr)
EA (2) EA008505B1 (sr)
EC (1) ECSP045114A (sr)
GE (1) GEP20063860B (sr)
HR (1) HRP20040448A2 (sr)
HU (1) HUP0500997A2 (sr)
IL (1) IL162031A0 (sr)
IS (1) IS7268A (sr)
MA (1) MA27544A1 (sr)
MX (1) MXPA04004809A (sr)
NO (1) NO20042182L (sr)
OA (1) OA13063A (sr)
PL (1) PL374354A1 (sr)
RS (1) RS53104A (sr)
TN (1) TNSN04090A1 (sr)
WO (1) WO2003044056A2 (sr)
ZA (1) ZA200403907B (sr)

Families Citing this family (49)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030171285A1 (en) * 2001-11-20 2003-09-11 Finn Rory F. Chemically-modified human growth hormone conjugates
US7041855B2 (en) 2001-12-11 2006-05-09 Sun Bio, Inc. Monofunctional polyethylene glycol aldehydes
WO2003049699A2 (en) * 2001-12-11 2003-06-19 Sun Bio, Inc. Novel monofunctional polyethylene glycol aldehydes
US6956135B2 (en) 2001-12-11 2005-10-18 Sun Bio, Inc. Monofunctional polyethylene glycol aldehydes
US6916962B2 (en) 2001-12-11 2005-07-12 Sun Bio, Inc. Monofunctional polyethylene glycol aldehydes
DK1476181T3 (en) * 2002-01-18 2016-05-23 Biogen Ma Inc POLYALKYLENE POLYMER COMPOUNDS AND USE THEREOF
MXPA05002620A (es) 2002-09-09 2005-05-05 Nektar Therapeutics Al Corp Alcanales polimericos solubles en agua.
EP1591467A1 (en) * 2002-09-09 2005-11-02 Nektar Therapeutics Al, Corporation Conjugate between a polyethylene glycol having a terminal alkanal group and a human growth hormone
US20040142870A1 (en) * 2002-11-20 2004-07-22 Finn Rory F. N-terminally monopegylated human growth hormone conjugates, process for their preparation, and methods of use thereof
US20050281778A1 (en) * 2003-03-28 2005-12-22 Myung-Ok Park Human growth hormone conjugated with biocompatible polymer
EP1673464A2 (en) * 2003-10-10 2006-06-28 Novo Nordisk A/S Conjugation of peptides
US7524813B2 (en) 2003-10-10 2009-04-28 Novo Nordisk Health Care Ag Selectively conjugated peptides and methods of making the same
EP2368579A1 (en) * 2004-01-21 2011-09-28 Novo Nordisk Health Care AG Transglutaminase mediated conjugation of peptides
JP2008511610A (ja) * 2004-08-31 2008-04-17 ファルマシア・アンド・アップジョン・カンパニー・エルエルシー グリセロール分岐のポリエチレングリコール−ヒト成長ホルモン結合体、それらの製造方法及び使用方法
MX2007007590A (es) 2004-12-22 2007-12-10 Ambrx Inc Composiciones que contienen, metodos que involucran y usos de aminoacidos no naturales y polipeptidos.
US8080391B2 (en) * 2004-12-22 2011-12-20 Ambrx, Inc. Process of producing non-naturally encoded amino acid containing high conjugated to a water soluble polymer
EP2284191A3 (en) * 2004-12-22 2011-07-20 Ambrx, Inc. Process for the preparation of hGH
JP2008531482A (ja) 2005-02-10 2008-08-14 ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ Ｃ末端がｐｅｇ化された成長ホルモン
BRPI0609079A2 (pt) 2005-04-18 2010-11-16 Novo Nordisk As peptìdeo, composição farmacêutica, método para o tratamento de cáncer, uso de um peptìdeo construto de ácido nucleico, vetor, hospedeiro, e, anticorpo
WO2007025988A2 (en) 2005-08-30 2007-03-08 Novo Nordisk Health Care Ag Liquid formulations of pegylated growth hormone
HRP20110404T1 (hr) * 2005-11-08 2011-08-31 Ambrx Ubrzivači za modifikaciju ne-prirodnih aminokiselina i polipeptida ne-prirodnih aminokiselina
ES2529065T3 (es) * 2005-12-14 2015-02-16 Ambrx, Inc. Composiciones que contienen, procedimientos que implican y usos de aminoácidos no naturales y polipéptidos
US9175061B2 (en) * 2006-07-07 2015-11-03 Novo Nordisk Health Care Ag Protein conjugates and methods for their preparation
CN101108895B (zh) * 2006-07-19 2011-10-26 北京键凯科技有限公司 聚乙二醇乙醛衍生物及其与药物的结合物
CN101553501A (zh) 2006-10-26 2009-10-07 诺沃-诺迪斯克有限公司 Il-21变种
CL2008002399A1 (es) * 2007-08-16 2009-01-02 Pharmaessentia Corp Conjugado sustancialmente puro que posee una porcion polimerica, una porcion proteica (interferon alfa 2b) y un ligante alifatico de 1 a 10 atomos de carbono, util en el tratamiento de las hepatitis b o c.
BRPI0822530B1 (pt) * 2008-04-03 2022-03-22 Biosteed Gene Expression Tech. Co., Ltd Método de preparação de um hormônio de crescimento humano glicolado por polietileno (modificado por peg), hormônio do crescimento humano modificado por peg de menor peso molecular aparente e seu uso, preparação de hormônio do crescimento humano modificado por peg de menor peso molecular aparente e seu método de preparação e composição
DK2279007T3 (en) 2008-04-29 2016-08-22 Ascendis Pharma Growth Disorders Div As Pegylated recombinant relations of human growth hormone
KR101104574B1 (ko) * 2008-05-14 2012-01-11 성균관대학교산학협력단 폴리에틸렌글리콜로 화학적으로 수식된 인간 성장 호르몬, 이의 제조방법 및 용도
CN102131844B (zh) * 2008-07-31 2016-03-02 药华医药股份有限公司 肽-聚合物缀合物
MX2011000847A (es) 2008-08-06 2011-02-25 Novo Nordisk Healthcare Ag Proteinas conjugadas con eficacia prolongada in vivo.
RU2409669C9 (ru) * 2008-08-18 2012-05-27 ООО "Саентифик Фьючер Менеджмент" ("Scientific Future Management", "SFM") Способ иммобилизации биологически активного вещества (бав) на носитель (варианты) и конъюгат бав-носитель, полученный данными способами
EP2331139B1 (en) * 2008-09-11 2019-04-17 Nektar Therapeutics Polymeric alpha-hydroxy aldehyde and ketone reagents and conjugation method
MX2011007736A (es) 2009-01-22 2011-09-06 Novo Nordisk Healthcare Ag Compuestos de hormona del crecimiento estables.
WO2011015649A1 (en) 2009-08-06 2011-02-10 Novo Nordisk Health Care Ag Growth hormones with prolonged in-vivo efficacy
DK2512450T3 (en) 2009-12-15 2018-04-23 Ascendis Pharma Endocrinology Div A/S Dry growth hormone composition transiently bound to a polymer carrier
CN118767117A (zh) 2010-01-22 2024-10-15 诺沃—诺迪斯克保健股份有限公司 体内功效延长的生长激素
BR112012018162A2 (pt) 2010-01-22 2017-10-03 Novo Nordisk Healthcare Ag Compostos de hormônio do crescimento estáveis
CA2798518A1 (en) * 2010-05-17 2011-11-24 Cebix, Inc. Pegylated c-peptide
EP2446898A1 (en) 2010-09-30 2012-05-02 Laboratorios Del. Dr. Esteve, S.A. Use of growth hormone to enhance the immune response in immunosuppressed patients
EA019967B1 (ru) * 2011-12-21 2014-07-30 Общество С Ограниченной Ответственностью "Форт" (Ооо "Форт") Ковалентный конъюгат полиэтиленгликоля с гормоном роста человека
CN105120887A (zh) 2013-04-05 2015-12-02 诺和诺德保健股份有限公司 生长激素化合物制剂
US11559567B2 (en) 2014-11-06 2023-01-24 Pharmaessentia Corporation Dosage regimen for pegylated interferon
US10799563B2 (en) 2014-11-18 2020-10-13 Ascendis Pharma Endocrinology Division Polymeric hGH prodrugs
PL3220892T3 (pl) 2014-11-21 2022-01-31 Ascendis Pharma Endocrinology Division A/S Postacie dawkowane długo działającego hormonu wzrostu
KR20170125839A (ko) * 2015-03-11 2017-11-15 넥타르 테라퓨틱스 Ｉｌ-7 부분 및 중합체의 접합체
KR102152437B1 (ko) * 2015-09-18 2020-09-07 고쿠리츠 다이가쿠 호징 미야자키 다이가쿠 장시간 작용형 아드레노메둘린 유도체
SG11202108735QA (en) 2019-03-04 2021-09-29 Ascendis Pharma Endocrinology Div A/S Long-acting growth hormone dosage forms with superior efficacy to daily somatropin
CN114539384B (zh) * 2020-11-19 2024-09-06 江苏众红生物工程创药研究院有限公司 聚乙二醇化长效生长激素及其制备方法和医药应用

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4179337A (en) * 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
US4904584A (en) * 1987-12-23 1990-02-27 Genetics Institute, Inc. Site-specific homogeneous modification of polypeptides
ES2113354T3 (es) * 1990-05-04 1998-05-01 American Cyanamid Co Estabilizacion de somatotropinas y otras proteinas por modificacion de residuos de cisteina.
JPH06506217A (ja) * 1991-03-18 1994-07-14 エンゾン，インコーポレーテッド ポリペプチドまたはグリコポリペプチドとポリマーとのヒドラジン含有結合体
AU2147192A (en) * 1991-06-28 1993-01-25 Genentech Inc. Method of stimulating immune response using growth hormone
NZ250375A (en) * 1992-12-09 1995-07-26 Ortho Pharma Corp Peg hydrazone and peg oxime linkage forming reagents and protein derivatives
US5824784A (en) * 1994-10-12 1998-10-20 Amgen Inc. N-terminally chemically modified protein compositions and methods
JP3628333B2 (ja) * 1995-09-21 2005-03-09 ジェネンテック インコーポレーテッド ヒト成長ホルモン変異体
IL133974A0 (en) * 1997-07-14 2001-04-30 Bolder Biotechnology Inc Derivatives of growth hormone and related proteins
ATE526401T1 (de) * 1999-01-14 2011-10-15 Bolder Biotechnology Inc Verfahren zur herstellung von proteinen mit freien cysteinresten
IL144361A0 (en) * 1999-01-29 2002-05-23 Hoffmann La Roche Gcsf conjugates
WO2001076639A2 (en) * 2000-04-06 2001-10-18 Pharmacia Corporation Chemically-modified myelopoietin conjugates
WO2002055532A2 (en) * 2001-01-11 2002-07-18 Maxygen Aps Variant growth hormone molecules conjugated with macromolecular compounds

Also Published As

Publication number Publication date
MA27544A1 (fr) 2005-10-03
HRP20040448A2 (en) 2006-02-28
JP2005525302A (ja) 2005-08-25
NO20042182L (no) 2004-08-11
KR20070072924A (ko) 2007-07-06
GEP20063860B (en) 2006-06-26
EP1453859A2 (en) 2004-09-08
WO2003044056A2 (en) 2003-05-30
TNSN04090A1 (fr) 2006-06-01
ECSP045114A (es) 2004-07-23
PL374354A1 (en) 2005-10-17
KR20050044858A (ko) 2005-05-13
EA200700431A1 (ru) 2008-02-28
ZA200403907B (en) 2007-12-27
CA2467731A1 (en) 2003-05-30
IL162031A0 (en) 2005-11-20
MXPA04004809A (es) 2004-08-11
EA200400565A1 (ru) 2005-06-30
CN1608079A (zh) 2005-04-20
WO2003044056A3 (en) 2003-08-21
JP2006321808A (ja) 2006-11-30
HUP0500997A2 (en) 2007-11-28
CO5580794A2 (es) 2005-11-30
AP2004003050A0 (en) 2004-06-30
BR0214451A (pt) 2006-05-30
EA008505B1 (ru) 2007-06-29
IS7268A (is) 2004-05-17
AU2002356990A1 (en) 2003-06-10
OA13063A (en) 2006-11-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RS53104A (sr) Hemijski modifikovani konjugati humanog hormona rasta
US20030171285A1 (en) Chemically-modified human growth hormone conjugates
EP1715887B1 (en) N-terminally monopegylated human growth hormone conjugates, process for their preparation, and use thereof
CA2577999A1 (en) Glycerol branched polyethylene glycol human growth hormone conjugates, process for their preparation, and methods of use thereof
TWI281864B (en) N-terminally monopegylated human growth hormone conjugates and process for their preparation
US20040038892A1 (en) Chemically-modified human growth hormone conjugates
EP1861125A2 (en) Conjugates of an hgh moiety and peg derivatives
CA2553899A1 (en) Chemically-modified human growth hormone receptor antagonist conjugates
HK1104913A (en) Glycerol branched polyethylene glycol human growth hormone conjugates, process for their preparation, and methods of use thereof
MXPA06008888A (en) N-terminally monopegylated human growth hormone conjugates, process for their preparation, and methods of use thereof