BRPI0609079A2 - peptìdeo, composição farmacêutica, método para o tratamento de cáncer, uso de um peptìdeo construto de ácido nucleico, vetor, hospedeiro, e, anticorpo - Google Patents

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Abstract

PEPTìDEO, COMPOSIçãO FARMACêUTICA, METODO PARA O TRATAMENTO DE CáNCER, USO DE UM PEPTìDEO CONSTRUTO DE áCIDO NUCLEICO, VETOR, HOSPEDEIRO, E, ANTICORPO. São fornecidas variantes de IL-2 1 nas quais os aminoácidos foram deletados e/ou substituidos na região consistindo de aminoácido No. 65-96.

Description

"PEPTÍDEO, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, MÉTODO PARA OTRATAMENTO DE CÂNCER, USO DE UM PEPTÍDEO CONSTRUTODE ÁCIDO NUCLEICO, VETOR, HOSPEDEIRO, E, ANTICORPO"
CAMPO DA INVENÇÃO
A presente invenção está interessada em novas variantes de IL-21, ditas variantes sendo úteis para terapia.
ARTE DE FUNDO DA INVENÇÃO
Peptídeos IL-21 foram descritos primeiro em WO 00/53761como SEQ ID No:2. O pró-peptídeo é um peptídeo de 161 resíduos deaminoácidos. Para conveniência, a seqüência é repetida no presente pedidocomo SEQ ID No: 1. Inicialmente se acreditou que o peptídeo maduro fosse opeptídeo consistindo de aminoácidos No. 33 a 162 de SEQ ID No: 1;entretanto mais recentemente (WO 2004/112703) foi sugerido que o peptídeomaduro seja, de fato, aminoácidos No. 30 a 162, que é descrito como SEQ IDNo: 11 com uma metionina N terminal adicional no presente pedido.
IL-21 é uma citocina. Citocinas geralmente estimulamproliferação, diferenciação e/ou ativação de células da linhagemhematopoiética ou participam nos mecanismos de resposta imune einflamatória no corpo. As interleucinas são uma família de citocinas quemediam respostas imunológicas produzindo várias citocinas, e elas afetamimunidade adaptativa para antígenos. Células T maduras podem ser ativadas,i.e., por um antígeno ou outro estímulo, para produzir, por exemplo, citocinas,moléculas de sinalização bioquímica, ou receptores que adicionalmenteinfluenciam a morte da população de células T.
Citocinas produzidas pela célula T foram classificadas comoTipo 1 e Tipo 2 (Kelso, A. Immun. Cell Biol. 76:300-317, 1998). Citocinas doTipo 1 incluem IL-2, IFN-γ, LT-α, e elas estão envolvidas em respostasinflamatórias, imunidade viral, imunidade para parasita intracelular e rejeiçãode aloenxerto. Citocinas do Tipo 2 incluem IL-4, IL-5, IL-6, IL-IO e IL-13, eelas estão envolvidas em respostas humorais, imunidade para helminto eresposta alérgica. Citocinas compartilhadas entre Tipo 1 e 2 incluem IL-3,GM-CSF e TNF-α. Existe alguma evidência para sugerir que populações decélula T produzindo Tipo 1 e Tipo 2 migram preferencialmente em diferentestipos de tecido inflamado.
Células T maduras podem ser ativadas, i.e., por um antígenoou outro estímulo, para produzir, por exemplo, citocinas, moléculas desinalização bioquímica, ou receptores que adicionalmente influenciam amorte da população de células T.
Células B podem ser ativadas através de receptores na suasuperfície celular incluindo receptor de célula B e outras moléculas acessóriaspara realizar funções celulares acessórias, tal como produção de citocinas eanticorpos.
Células exteraiinadoras naturais (NK) têm uma célulaprogenitora comum com células T e células B, e desempenham um papel emvigilância imune. Células NK, que compreendem até 15% de linfócitossangüíneos, não expressam receptores de antígenos, e portanto do não usamreconhecimento MHC como requerimento para linhagens a uma célula alvo.
Células NK estão envolvidas no reconhecimento e morte de certas célulastumorosas e células viralmente infectadas. In vivo, acredita-se que células NKrequeiram ativação, entretanto, in vitro, células NK mostraram matar apenasalguns tipos de células tumorosas através de ativação dependente de ligante KIR.
Apesar da eficácia mostrada por IL-21 no tratamento de váriasdoenças, permanece uma necessidade por variantes de IL-21 compropriedades melhoradas ou alternativas, tal como atividade, seletividade,estabilidade, e tempo de circulação ou meia-vida biológica, para satisfazernecessidades médicas.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
Os presentes requerentes surpreendentemente encontraram quea atividade de IL-21 é basicamente mantida ou mesmo melhorada quandoaminoácidos na região 66 a 98 são deletados e/ou substituídos. No presentecontexto, a numeração de aminoácido é com respeito ao peptídeo maduro de133 aminoácidos (aminoácido No. 30 a 162 do pró-peptídeo, SEQ ID No: 1).Esta seqüência é dada como SEQ ID No: 11 incluindo uma metionina Nterminal adicional gerando um peptídeo de 134 aminoácidos. SEQ ID No:2 éaminoácido No. 30 a 162 do pró-peptídeo, SEQ ID No: 1 sem uma metioninaN terminal adicional gerando um peptídeo de 133 aminoácidos. Porconseguinte, em uma forma de realização, a invenção se refere a um peptídeocompreendendo
a) uma primeira seqüência obtida deletando e/ou substituindoum ou mais aminoácidos na região consistindo de aminoácido No. 65 aaminoácido No. 96 de SEQID No:2; ou
b) uma seqüência obtida substituindo conservativamente até10 aminoácidos na dita primeira seqüência.
Em uma forma de realização, a invenção fornece o uso de umpeptídeo da presente invenção em terapia.
Em uma forma de realização, a invenção se refere a umacomposição farmacêutica compreendendo um peptídeo da presente invenção.
Em uma forma de realização, a invenção fornece um métodoterapêutico, o método compreendendo a administração de uma quantidadeterapeuticamente eficaz de um peptídeo da presente invenção a um pacientecom necessidade desta.
Em uma forma de realização, a invenção se refere ao uso depeptídeo da presente invenção na fabricação de um medicamento.
Em uma forma de realização, a invenção se refere a construtode ácido nucleico codificando um peptídeo da presente invenção; a vetorescompreendendo ditos construtos; e as células hospedeiras compreendendoditos vetores.Em uma forma de realização, a invenção se refere a anticorposespecíficos contra um peptídeo da presente invenção.
FIGURAS
Figura 1 Análise Baf3/hIL-21 R/Stat-Luc de variantes de IL-21
Sobrenadante de células HEK293-FS transfectadas com osconstrutos de IL-21 indicados foram analisadas no ensaio repórter BAf3-hIL-21 R/Stat-Luc. Teor protéico foi estimado por ELISA.IL-21 tipo selvagem; □—IL-21 mutante de deleção [A83 - R86] (SEQ IDNo: 3); e variante de IL-21 na qual a seqüência [K77 - T92] foi substituída(SEQ ID No: 7).
Figura 2 Curvas de dose-resposta para hIL-WT e ChimIL-21/4.
Proteínas purificadas foram analisadas em um ensaio derepórter usando as células Baf3/hIL-21 Ra. As curvas representam uma somade experimentos independentes (n = 4) todos realizados em triplicata.
Atividade é expressa como porcentagem de resposta máxima. Valores deEC50 ± S.E.M. obtidos são apresentados. Chinn-IL21 é a IL-21 sub[K77 - T92].
DEFINIÇÕES
No presente contexto "um" é pretendido para indicar um oumais.
No presente contexto, o termo "peptídeo" é pretendido paraindicar dois ou mais aminoácidos que são ligados por uma ligação peptídica.
Ditos aminoácidos podem ser codificáveis ou não codificáveis, e o termotambém inclui derivados de peptídeos, caracterizados pelo fato de que um oumais aminoácidos no peptídeo foram quimicamente substituídos, e.g. por PEGou um grupo lipofílico. Os termos "peptídeo" e "polipeptídeo" são usadospermutavelmente e são pretendidos para indicar o mesmo.
No presente contexto, o termo "sal farmaceuticamenteaceitável" é pretendido para indicar sais que não são prejudiciais ao paciente.Tais sais incluem sais de adição ácida farmaceuticamente aceitáveis, saismetálicos farmaceuticamente aceitáveis, sais de amônio e amônio alquilado.Sais de adição ácida incluem sais de ácidos inorgânicos assim como ácidosorgânicos. Exemplos representativos de ácidos inorgânicos adequadosincluem ácidos hidroclórico, hidrobrômico, hidroiodídrico, fosfórico,sulíurico, nítrico e os semelhantes. Exemplos representativos de ácidosorgânicos adequados incluem ácidos fórmico, acético, tricloroacético,trifluoroacético, propiônico, benzóico, cinâmico, cítrico, fiimárico, glicólico,láctico, maleico, málico, malônico, mandélico, oxálico, pícrico, pirúvico,salicílico, succínico, metanossulfônico, etanossulfônico, tartárico, ascórbico,pamóico, bismetileno salicílico, etanodisulfônico, glucônico, citracônico,aspártico, esteárico, palmítico, EDTA, glicólico, p-aminobenzóico, glutâmico,benzenossulfônico, p-toluenossulfônico e os semelhantes. Exemplosadicionais de sais de adição de ácido inorgânico ou orgânicofarmaceuticamente aceitáveis incluem os sais farmaceuticamenteaceitáveis listados em J. Pharm. Sei. 1977, 66, 2, que é incorporado nestelugar por referência. Exemplos de sais metálicos incluem sais de lítio,sódio, potássio, magnésio e os semelhantes. Exemplos de sais de amônio eamônio alquilado incluem sais de amônio, metilamônio, dimetilamônio,trimetilamônio, etilamônio, hidroxietilamônio, dietilamônio, butilamônio,tetrametilamônio e os semelhantes.
Uma "quantidade terapeuticamente eficaz" de um peptídeocomo usado neste lugar significa uma quantidade suficiente para curar, aliviarou interromper parcialmente as manifestações clínicas de uma dada doença esuas complicações. Uma quantidade adequada para realizar isto é definidacomo "quantidade terapeuticamente eficaz". Quantidades eficazes para cadapropósito irão depender do tipo e severidade da doença ou injúria assimcomo do peso e estado geral do sujeito. Será entendido que determinaruma dosagem apropriada pode ser atingido usando experimentação derotina, construindo uma matriz de valores e testando diferentes pontos namatriz, o que está tudo dentro dos versos habituais de um médico ouveterinário treinado.
O termo "tratamento" e "tratar" como usado neste lugarsignifica o manejo e cuidado de um paciente para o propósito de combateruma condição, tal como uma doença ou um distúrbio. O termo épretendido para incluir o espectro completo de tratamentos para uma dadacondição da qual o paciente está sofrendo, tal como administração docomposto ativo para aliviar os sintomas ou complicações, para atrasar aprogressão da doença, distúrbio ou condição, para aliviar ou reduzir ossintomas e complicações, e/ou para curar ou eliminar a doença, distúrbioou condição assim como para prevenir a condição, caracterizado pelo fatode que prevenção é para ser entendida como o manejo e cuidado de umpaciente para o propósito de combater a doença, condição, ou distúrbio einclui a administração dos peptídeos ativos para prevenir o início dossintomas ou complicações. O paciente a ser tratado é preferivelmente ummamífero, em particular um ser humano, mas ele também pode incluiranimais, tal como cachorros, gatos, vacas, ovelhas e porcos. E para serentendido, que regimes terapêuticos e profíláticos (preventivos)representam aspectos separados da presente invenção.
DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO
Em uma forma de realização, a invenção se refere a umpeptídeo compreendendo
a) uma primeira seqüência obtida deletando e/ou substituindoum ou mais aminoácidos na região consistindo de aminoácido No. 65 aaminoácido No. 96 de SEQ ID No:2; ou
b) uma seqüência obtida substituindo conservativamente até 10aminoácidos na dita primeira seqüência. Em particular pelo menos 2, tal comopelo menos 3, tal como pelo menos 4, tal como pelo menos 5, tal como pelomenos 6 aminoácidos foram deletados e/ou substituídos na dita primeiraseqüência.
A invenção também se refere a peptídeos obtidos porsubstituições conservativas nas formas de realização mais específicas dopeptídeo da presente invenção descrito abaixo.
Em particular, até 10, tal como 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10aminoácidos podem ser conservativamente substituídos. No presente contextouma substituição é conservativa quando um resíduo de aminoácido ésubstituído por outro resíduo de aminoácido do mesmo grupo, i.e. por outroresíduo de aminoácido com propriedades similares. Aminoácidos podem serconvenientemente divididos nos seguintes grupos baseado em suaspropriedades: Aminoácidos básicos (tal como arginina e lisina,), aminoácidosácidos (tal como ácido glutâmico e ácido aspártico), aminoácidos polares (talcomo glutamina, histidina, metionina e asparagina), aminoácidos alifáticos ouhidrofóbicos (tal como alanina, leucina, isoleucina, valina), aminoácidosaromáticos (tal como fenilalanina, triptofano, tirosina) e aminoácidospequenos (tal como glicina, alanina, serina, e treonina).
Em uma forma de realização, a invenção se refere a umpeptídeo compreendendo a seqüência obtida deletando e/ou substituindo umou mais aminoácidos na região consistindo de aminoácido No. 83 aaminoácido No. 86 de SEQ ID No:2.
Em uma forma de realização, a invenção se refere a umpeptídeo compreendendo a seqüência obtida deletando e/ou substituindo umou mais aminoácidos na região consistindo de aminoácido No. 83 aaminoácido No. 88 de SEQ ID No:2.
Em uma forma de realização, a invenção se refere a umpeptídeo compreendendo a seqüência obtida deletando e/ou substituindo umou mais aminoácidos na região consistindo de aminoácido No. 83 aaminoácido No. 90 de SEQ ID No:2.Em uma forma de realização, a invenção se refere a umpeptídeo compreendendo a seqüência obtida deletando e/ou substituindo umou mais aminoácidos na região consistindo de aminoácido No. 82 aaminoácido No. 88 de SEQ ID No:2.
Em uma forma de realização, a invenção se refere a umpeptídeo compreendendo a seqüência obtida deletando e/ou substituindo umou mais aminoácidos na região consistindo de aminoácido No. 77 aaminoácido No. 92 de SEQ ID No:2.
Em uma forma de realização, a invenção se refere a umpeptídeo compreendendo a seqüência obtida deletando e/ou substituindo umou mais aminoácidos na região consistindo de aminoácido No. 71 aaminoácido No. 92 de SEQ ID No:2.
Em uma forma de realização, a invenção se refere a umpeptídeo compreendendo a seqüência obtida deletando e/ou substituindo umou mais aminoácidos na região consistindo de aminoácido No. 65 aaminoácido No. 92 de SEQ ID No:2.
Em uma forma de realização, a invenção se refere a umpeptídeo compreendendo a seqüência obtida deletando e/ou substituindo umou mais aminoácidos na região consistindo de aminoácido No. 77 aaminoácido No. 96 de SEQ ID No:2.
Em uma forma de realização, a invenção se refere a umpeptídeo compreendendo a seqüência obtida deletando um ou maisaminoácidos na região consistindo de aminoácido No. 83 a aminoácido No.86 de SEQID No:2.
Em uma forma de realização, a invenção se refere a umpeptídeo compreendendo a seqüência obtida deletando um ou maisaminoácidos na região consistindo de aminoácido No. 83 a aminoácido No.88 de SEQ ID No:2.
Em uma forma de realização, a invenção se refere a umpeptídeo compreendendo a seqüência obtida deletando um ou maisaminoácidos na região consistindo de aminoácido No. 83 a aminoácido No.90 de SEQ ID No:2.
Em uma forma de realização, a invenção se refere a umpeptídeo compreendendo a seqüência obtida deletando um ou maisaminoácidos na região consistindo de aminoácido No. 82 a aminoácido No.88 de SEQ ID No:2.
Em uma forma de realização, a invenção se refere a umpeptídeo compreendendo a seqüência obtida substituindo e deletando dois oumais aminoácidos na região consistindo de aminoácido No. 77 a aminoácidoNo.92 de SEQID No:2.
Em uma forma de realização, a invenção se refere a umpeptídeo compreendendo a seqüência obtida substituindo e deletando dois oumais aminoácidos na região consistindo de aminoácido No. 71 a aminoácidoNo.92 de SEQID No:2.
Em uma forma de realização, a invenção se refere a umpeptídeo compreendendo a seqüência obtida substituindo e deletando dois oumais aminoácidos na região consistindo de aminoácido No. 65 a aminoácidoNo. 92 de SEQ ID No:2.
Em uma forma de realização, a invenção se refere a umpeptídeo compreendendo a seqüência obtida substituindo e deletando dois oumais aminoácidos na região consistindo de aminoácido No. 77 a aminoácidoNo. 96 de SEQ ID No:2.
Em uma forma de realização, a invenção se refere a umpeptídeo obtido deletando e/ou substituindo um ou mais aminoácidos naregião consistindo de aminoácido No. 83 a aminoácido No. 86 de SEQ IDNo:2.
Em uma forma de realização, a invenção se refere a umpeptídeo obtido deletando e/ou substituindo um ou mais aminoácidos naregião consistindo de aminoácido No. 83 a aminoácido No. 88 de SEQ IDNO:2.
Em uma forma de realização, a invenção se refere a umpeptídeo obtido deletando e/ou substituindo um ou mais aminoácidos naregião consistindo de aminoácido No. 83 a aminoácido No. 90 de SEQ IDNo:2.
Em uma forma de realização, a invenção se refere a umpeptídeo obtido deletando e/ou substituindo um ou mais aminoácidos naregião consistindo de aminoácido No. 82 a aminoácido No. 88 de SEQ IDNo:2.
Em uma forma de realização, a invenção se refere a umpeptídeo obtido deletando e/ou substituindo um ou mais aminoácidos naregião consistindo de aminoácido No. 77 a aminoácido No. 92 de SEQ IDNo:2.
Em uma forma de realização, a invenção se refere a umpeptídeo obtido deletando e/ou substituindo um ou mais aminoácidos naregião consistindo de aminoácido No. 71 a aminoácido No. 92 de SEQ IDNo:2.
Em uma forma de realização, a invenção se refere a umpeptídeo obtido deletando e/ou substituindo um ou mais aminoácidos naregião consistindo de aminoácido No. 65 a aminoácido No. 92 de SEQ IDNo:2.
Em uma forma de realização, a invenção se refere a umpeptídeo obtido deletando e/ou substituindo um ou mais aminoácidos naregião consistindo de aminoácido No. 77 a aminoácido No. 96 de SEQ IDNo:2.
Em uma forma de realização, a invenção se refere a umpeptídeo obtido deletando um ou mais aminoácidos na região consistindo deaminoácido No. 83 a aminoácido No. 86 de SEQ ID No:2.Em uma forma de realização, a invenção se refere a umpeptídeo obtido deletando um ou mais aminoácidos na região consistindo deaminoácido No. 83 a aminoácido No. 88 de SEQ ID No:2.
Em uma forma de realização, a invenção se refere a umpeptídeo obtido deletando um ou mais aminoácidos na região consistindo deaminoácido No. 83 a aminoácido No. 90 de SEQ ID No:2.
Em uma forma de realização, a invenção se refere a umpeptídeo obtido deletando um ou mais aminoácidos na região consistindo deaminoácido No. 82 a aminoácido No. 88 de SEQ ID No:2.
Em uma forma de realização, a invenção se refere a umpeptídeo obtido substituindo e deletando dois ou mais aminoácidos na regiãoconsistindo de aminoácido No. 77 a aminoácido No. 92 de SEQ ID No:2.
Em uma forma de realização, a invenção se refere a umpeptídeo obtido substituindo e deletando dois ou mais aminoácidos na regiãoconsistindo de aminoácido No. 71 a aminoácido No. 92 de SEQID No:2.
Em uma forma de realização, a invenção se refere a umpeptídeo obtido substituindo e deletando dois ou mais aminoácidos na regiãoconsistindo de aminoácido No. 65 a aminoácido No. 92 de SEQID No:2.
Em uma forma de realização, a invenção se refere a umpeptídeo obtido substituindo e deletando dois ou mais aminoácidos na regiãoconsistindo de aminoácido No. 77 a aminoácido No. 96 de SEQID No:2.
Como discutido acima, IL-21 é expressa como um peptídeo de161 aminoácidos, mas é processada pós-traducionalmente removendoaminoácido No. 1 a 29 ou removendo aminoácido No. 1 a 31. A presenteinvenção é assim também pretendida para incluir peptídeos compreendendo aseqüência obtida removendo e/ou deletando um ou mais aminoácidos daregião consistindo de aminoácido No. 65 a aminoácido No. 96, caracterizadopelo fato de que o N terminal foi estendido pelos 29 aminoácidos N terminaisde SEQ ID No: 1 ou com os 31 aminoácidos N terminais de SEQ ID No: 1.Quando peptídeos são expressos em células de mamíferos, talcomo células CHO, um peptídeo sinal N terminal é freqüentemente removidopor uma assim chamada peptidase sinal levando ao peptídeo maduro. É bemconhecido na arte que para expressar os mesmos peptídeos heterólogos emcélulas procarióticas, tal como e.g. E. co/i, é freqüentemente necessário -através de tecnologia recombinante bem conhecida por aqueles versados naarte - introduzir uma metionina N terminal adicional na seqüência do peptídeomaduro. A presente invenção é assim também pretendida para incluir ospeptídeos mencionados acima com ou sem uma metionina N terminal.
Em uma forma de realização, a invenção se refere a peptídeosselecionados a partir de
A) SEQ ID No: 3 (deleção A83-R86), SEQ ID No: 4 (deleçãoA83-K88), SEQ ID No: 5 (deleção A83-R90), e SEQ ID No: 6 (deleção N82-K88); e
B) os peptídeos de A) com uma Met N terminal adicional
C) os peptídeos de A)-B), caracterizado pelo fato de que até 10aminoácidos foram conservativamente substituídos.
Em uma forma de realização, a invenção se refere a peptídeosselecionados a partir de
D) SEQ ID No: 7 (K77-T92 substituição), SEQ ID No: 8 (171-T92 substituição), SEQ ID No: 9 (R65-T92 substituição), e SEQ ID No: 10(K77-C96) substituição; e
E) os peptídeos de D) com uma Met N terminal adicional; e
F) os peptídeos de D-E) caracterizado pelo fato de que até 10aminoácidos foram conservativamente substituídos.
Em uma forma de realização, a invenção é relacionada a saisfarmaceuticamente aceitáveis dos peptídeos acima.
Os peptídeos da presente invenção podem ser derivadosadicionalmente pelo acoplamento de grupos que irão efetuar uma extensão dotempo de circulação em plasma e/ou meia-vida biológica, ou que irão reduzirqualquer imunogenicidade. E bem conhecido na arte que tais efeitos podemser obtidos pelo acoplamento de certos grupos, tal como polietilenoglicol(PEG); grupos lipofílicos, tal como ácidos graxos; proteínas de plasma, talcomo albumina; ou porções de ligação de albumina. Para exemplos da arte,veja e.g. WO 01/79271, Patente Norte-Americana 5.739.208, e WO 03/44056.
Como usado neste lugar o termo "construto de ácido nucleico"é pretendido para indicar qualquer molécula de ácido nucleico de origem decDNA, DNA genômico, DNA sintético ou RNA. O termo "construto" épretendido para indicar um segmento de ácido nucleico que pode ser de fitasimples ou dupla, e que pode ser baseado em uma seqüência de nucleotídeosnaturalmente ocorrente completa ou parcial codificando uma proteína deinteresse. O construto pode opcionalmente conter outros segmentos de ácidosnucleicos.
O construto de ácido nucleico da invenção codificando aproteína da invenção pode adequadamente ser de origem genômica ou decDNA, por exemplo obtido preparando uma biblioteca genômica ou de cDNAe triando por seqüências de DNA codificando para toda ou parte da proteínapor hibridização usando sondas sintéticas de oligonucleotídeos emconformidade com técnicas padrão (cf. Sambrook et al., supra). Para opresente propósito, a seqüência de DNA codificando a proteína épreferivelmente de origem humana, i.e. derivada de uma biblioteca de DNAgenômico ou cDNA humano. Em particular, a seqüência de DNA pode ser deorigem humana, e.g. cDNA de um órgão humano particular ou tipo celular ouum gene derivado de DNA genômico humano.
O construto de ácido nucleico da invenção codificando opeptídeo também pode ser preparado sinteticamente por métodos padrãoestabelecidos, e.g. o método de fosfoamidita descrito por Beaucage andCaruthers, Tetrahedron Letters 22 (1981), 1859 - 1869, ou o método descritopor Matthes et al., EMBO Journal 3 (1984), 801 - 805. De acordo com ométodo de fosfoamidita, oligonucleotídeos são sintetizados, e.g. em umsintetizador de DNA automático, purificados, anelados, ligados e clonados emvetores adequados.
Além disso, o construto de ácido nucleico pode ser de origemmisturada sintética e genômica, misturada sintética e cDNA ou misturadagenômica e cDNA preparado ligando fragmentos de origem sintética,genômica ou cDNA (como apropriado), os fragmentos correspondendo avárias partes do construto de ácido nucleico inteiro, em conformidade comtécnicas padrão.
O construto de ácido nucleico também pode ser preparado porreação em cadeia da polimerase usando iniciadores específicos, por exemplocomo descrito em Patente Norte-Americana 4.683.202 ou Saiki et al., Science239(1988), 487-491.
O construto de ácido nucleico é preferivelmente um construtode DNA cujo termo será usado exclusivamente no seguinte.
VETOR RECOMBINANTE
Em um aspecto adicional, a presente invenção se refere a umvetor recombinante compreendendo um construto de DNA da invenção. Ovetor recombinante no qual o construto de DNA da invenção é inserido podeser qualquer vetor que pode ser convenientemente sujeito a procedimentos deDNA recombinante, e a escolha de vetor irá freqüentemente depender dacélula hospedeira na qual ele está para ser introduzido. Assim, o vetor podeser um vetor autonomamente replicante, i.e. um vetor que existe como umaentidade extracromossômica, a replicação do qual é independente dereplicação cromossômica, e.g. um plasmídeo. Alternativamente, o vetor podeser um que, quando introduzido em uma célula hospedeira, é integrado nogenoma da célula hospedeira e replicado junto com o(s) cromossomo(s) noqual ele foi integrado.O vetor é preferivelmente um vetor de expressão no qual aseqüência de DNA codificando a proteína da invenção é operavelmente ligadaa segmentos adicionais requeridos para transcrição do DNA. Em geral, ovetor de expressão é derivado de plasmídeo ou DNA viral, ou pode conterelementos de ambos. O termo, "operavelmente ligados" indica que ossegmentos são arranjados de forma que eles funcionem em harmonia paraseus propósitos pretendidos, e.g. transcrição inicia em um promotor eprossegue através da seqüência de DNA codificando para a proteína.
O promotor pode ser qualquer seqüência de DNA que mostraatividade transcricional na célula hospedeira de escolha e pode ser derivadode genes codificando proteínas ou homólogas ou heterólogas para a célulahospedeira.
Exemplos de promotores adequados para direcionar atranscrição do DNA codificando a proteína da invenção em células demamíferos são o promotor SV40 (Subramani et al., Mol. Cell Biol. 1 (1981),854 -864), o promotor de MT-I (gene de metalotioneína) (Palmiter et al.,Science 222 (1983), 809 - 814) ou o promotor tardio principal de adenovírus 2.
Um exemplo de um promotor adequado para uso em células deinsetos é o promotor de poli-hedrina (Patente Norte-Americana 4.745.051;Vasuvedan et al., FEBS Lett. 311, (1992) 7 - 11), o promotor PlO (J.M. Vlaket al., J. Gen. Virology 69, 1988, pp. 765-776), o promotor de proteína básicade vírus da poli-hedrose de Autographa californica (Patente Européia 397485), o promotor de gene 1 precoce imediato de baculovírus (Patente Norte-Americana 5.155.037; Patente Norte-Americana 5.162.222), ou o promotor degene precoce retardado de baculovírus 39K (Patente Norte-Americana5.155.037; Patente Norte-Americana 5.162.222).
Exemplos de promotores adequados para uso em célulashospedeiras de levedura incluem promotores de genes glicolíticos de levedura(Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255 (1980), 12073 - 12080; Alber andKawasaki, J. Mol. Appl. Gen. 1 (1982), 419 - 434) ou genes de álcooldesidrogenase (Young et al., in Genetic Engineering of Microorganisms forChemicals (Hollaender et al, eds.), Plenum Press, Nova Iorque, 1982), ou ospromotores TPIl (Patente Norte-Americana 4.599.311) ou ADH2-4c (Russellet al., Nature 304 (1983), 652 - 654).
Exemplos de promotores adequados para uso em célulashospedeiras de fungo filamentoso são, por exemplo, o promotor ADH3(McKnight et al., The EMBO J. 4 (1985), 2093 - 2099) ou o promotor tpiA.
Exemplos de outros promotores úteis são aqueles derivados do genecodificando TAKA amilase de A. oryzae, aspártico proteinase de Rhizomucormiehei, α-amilase neutra de A. niger, α-amilase ácido estável de A. niger,glucoamilase (gluA) de A. niger ou A. awamori, lipase de Rhizomucor miehei,protease alcalina de A. oryzae, triose fosfato isomerase de A. oryzae ouacetamidase de A. nidulans. São preferidos os promotores de TAKA-amilasee gluA.
Exemplos de promotores adequados para uso em célulashospedeiras bacterianas incluem o promotor do gene de amilase maltogênicade Bacillus stearothermophilus, do gene de alfa-amilase de Bacilluslieheniformis, do gene de BAN amilase de Bacillus amyloliquefaeiens, dogene de protease alcalina de Bacillus subtilis, ou do gene de xilosidase deBacillus pumilus, ou pelo fago Lambda PR ou promotores Pl ou ospromotores lac, trp ou tac de E. coli.
A seqüência de DNA codificando a proteína da invençãotambém pode, se necessário, ser operavelmente conectada a um terminadoradequado, tal como o terminador de hormônio de crescimento humano(Palmiter et al., op. cit.) ou (para hospedeiros fungicos) os terminadores deTPIl (Alber and Kawasaki, op. cit.) ou ADH3 (McKnight et al., op. cit.). Ovetor pode compreender adicionalmente elementos tal como sinais depoliadenilação (e.g. de SV40 ou a região 5 EIb de adenovírus), seqüênciasestimuladoras transcricionais (e.g. o estimulador de SV40) e seqüênciasestimuladoras traducionais (e.g. aquelas codificando RNAs de adenovírus VA).
O vetor recombinante da invenção pode compreenderadicionalmente a seqüência de DNA possibilitando que o vetor se replique nacélula hospedeira em questão. Um exemplo de uma tal seqüência (quando acélula hospedeira é uma célula de mamífero) é a origem de replicação deSV40.
Quando a célula hospedeira é uma célula de levedura,seqüências adequadas possibilitando que o vetor se replique são os genes dereplicação REP 1-3 de 2 μ e origem de replicação de plasmídeo de levedura.
Quando a célula hospedeira é uma célula bacteriana,seqüências possibilitando que o vetor se replique são genes codificandocomplexo e origem de replicação de DNA polimerase III.
O vetor também pode compreender um marcador selecionável,e.g. um gene o produto do qual complementa um defeito na célula hospedeira,tal como o gene codificando para dihidrofolato redutase (DHFR) ou o geneTPI de Schizosaccharomyces pombe (descrito por P.R. Russell, Gene 40,1985, pp. 125-130), ou um que confere resistência a uma droga, e.g.ampicilina, canamicina, tetraciclina, cloranfenicol, neomicina, higromicina oumetotrexato. Para fungos filamentosos, marcadores selecionáveis incluemamdS, pyrG, argB, niaD e sC.
Para direcionar uma proteína da presente invenção na viasecretora das células hospedeiras, uma seqüência secretora sinal (tambémconhecida como uma seqüência líder, seqüência prepro ou seqüência pré)pode ser fornecida no vetor recombinante. A seqüência secretora sinal é unidaà seqüência de DNA codificando a proteína no quadro de leitura correto.
Seqüências secretoras sinal são comumente posicionadas 5' para a seqüênciade DNA codificando a proteína. A seqüência secretora sinal pode ser aquelanormalmente associada com a proteína ou pode ser de um gene codificandooutra proteína secretada.
Para secreção de células de levedura, a seqüência secretorasinal pode codificar qualquer peptídeo sinal que assegure direção eficiente daproteína expressa na via secretora da célula. O peptídeo sinal pode serpeptídeo sinal naturalmente ocorrente, ou uma parte funcional deste, ou elepode ser um peptídeo sintético. Peptídeos sinal adequados foram encontradossendo o peptídeo sinal de fator α (cf. US 4,870,008), o peptídeo sinal deamilase salivar de camundongo (cf. 0. Hagenbuchle et al., Nature 289, 1981,pp. 643-646), um peptídeo sinal de carboxipeptidase modificado (cf. L.A.Valls et al, Cell 48, 1987, pp. 887-897), o peptídeo sinal de BARl delevedura (cf. WO 87/02670), ou o peptídeo sinal de aspártico protease 3(YAP3) de levedura (cf. M. Egel-Mitani et al., Yeast 6, 1990, pp. 127-137).
Para secreção eficiente em levedura, uma seqüênciacodificando um peptídeo líder também pode ser inserida depois da seqüênciasinal e antes da seqüência de DNA codificando a proteína. A função dopeptídeo líder é permitir que a proteína expressa seja direcionada do retículoendoplasmático para o complexo de Golgi e depois para uma vesículasecretora para secreção no meio de cultura (i.e. exportação da proteína atravésda parede celular ou pelo menos através da membrana celular no espaçoperiplásmico da célula de levedura). O peptídeo líder pode ser o líder de fatorα de levedura (o uso do qual é descrito em e.g. Patente Norte-Americana4.546.082, Patente Européia 16 201, Patente Européia 123 294, PatenteEuropéia 123 544 e Patente Européia 163 529). Alternativamente, o peptídeolíder pode ser um peptídeo líder sintético, o que quer dizer um peptídeo lídernão encontrado na natureza. Peptídeos líderes sintéticos podem, por exemplo,ser construídos como descrito em WO 89/02463 ou WO 92/11378.
Para uso em fungos filamentosos, o peptídeo sinal podeconvenientemente ser derivado de um gene codificando uma amilase ouglucoamilase de Aspergillus sp., um gene codificando uma lipase ou proteasede Rhizomucor miehei ou uma lipase de Humicola lanuginosa. O peptídeosinal é preferivelmente derivado de um gene codificando TAKA amilase de A.oryzae, α-amilase neutra de A. niger, amilase ácido estável de A. niger, ouglucoamilase de A. niger.
Para uso em células de insetos, o peptídeo sinal podeconvenientemente ser derivado de um gene de inseto (cf. WO 90/05783), talcomo o peptídeo sinal de precursor de hormônio adipocinético de lepidópteroManduca sexta (cf. Patente Norte-Americana 5.023.328).
Os procedimentos usados para ligar as seqüências de DNAcodificando para a presente proteína, o promotor e opcionalmente oterminador e/ou seqüência secretora sinal, respectivamente, e para inserir elasem vetores adequados contendo a informação necessária para replicação, sãobem conhecidos por pessoas versadas na arte (cf., por exemplo, Sambrook etal., op.cit.).
CÉLULAS HOSPEDEIRAS
A célula hospedeira na qual o construto de DNA ou o vetorrecombinante da invenção é introduzido pode ser qualquer célula que sejacapaz de produzir a presente proteína e inclui células de bactérias, levedura,fungos e eucarióticas superiores.
Exemplos de células hospedeiras bacterianas que, em cultivo,são capazes de produzir a proteína da invenção são bactérias gram-positivastal como linhagens de Baeillus, tal como linhagens de B. subtilis, B.Ueheniformis, B. lentus, B. brevis, B. stearothermophilus, B. alkalophilus, B.amyloliquefaeiens, B. coagulans, B. circulans, B. lautus, B. megatherium ouB. thuringiensis, ou linhagens de Streptomyces, tal como S. Iividans ou S.murinus, ou bactérias gram-negativas tal como Echeriehia coli. Atransformação das bactérias pode ser efetuada por transformação deprotoplasto ou usando células competentes de uma maneira conhecida por si(cf. Sambrook et al., supra).
Ao expressar a proteína em bactérias tal como E. coli, aproteína pode ser retida no citoplasma, tipicamente como grânulos insolúveis(conhecidos como corpos de inclusão), ou pode ser direcionada para o espaçoperiplásmico por uma seqüência de secreção bacteriana. No primeiro caso, ascélulas são lisadas e os grânulos são recuperados e desnaturados depois doque a proteína é redobrada diluindo o agente desnaturante. No último caso, aproteína pode ser recuperada do espaço periplásmico rompendo as células,e.g. por sonicação ou choque osmótico, para liberar os conteúdos do espaçoperiplásmico e recuperar a proteína.
Exemplos de linhagens de células de mamíferos adequadas sãoas linhagens de células COS (ATCC CRL 1650), BHK (ATCC CRL 1632,ATCC CCL 10), CHL (ATCC CCL39) ou CHO (ATCC CCL 61). Métodosde transfectar células de mamíferos e expressar seqüências de DNAintroduzidas nas células são descritos em e.g. Kaufinan and Sharp, J. Mol.Biol. 159 (1982), 601 - 621; Southern and Berg, J. Mol. Appl. Genet. 1(1982), 327 - 341; Loyter et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 79 (1982), 422 -426; Wigler et al., Cell 14 (1978), 725; Corsaro and Pearson, Somatic CellGenetics 7 (1981), 603, Graham and van der Eb, Virology 52 (1973), 456; eNeumann et al., EMBO J. 1 (1982), 841 - 845.
Exemplos de células de leveduras adequadas incluem célulasde Saccharomyces spp. ou Schizosaccharomyces spp., em particularlinhagens de Saccharomyees eerevisiae ou Saccharomyees kluyveri.Métodos para transformar células de levedura com DNA heterólogo eproduzir proteínas heterólogas a partir deste são descritos, e.g. em PatenteNorte-Americana 4.599.311, Patente Norte-Americana 4.931.373, PatenteNorte-Americana 4.870.008, 5.037.743, e Patente Norte-Americana4.845.075, todas as quais são neste lugar incorporadas por referência.Células transformadas são selecionadas por um fenótipo determinado porum marcador selecionável, comumente resistência à droga ou a capacidadede crescer na ausência de um nutriente particular, e.g. leucina. Um vetorpreferido para uso em levedura é o vetor POTl descrito em Patente Norte-Americana 4.931.373. A seqüência de DNA codificando a proteína dainvenção pode ser precedida por uma seqüência sinal e opcionalmente umaseqüência líder, e.g. como descrito acima. Exemplos adicionais de célulasde levedura adequadas são linhagens de Kluyveromyces, tal como K. lactis,Hansenula, e.g. H. polymorpha, ou Pichia, e.g. P. pastoris (cf. Gleeson et al.,J. Gen. Microbiol. 132, 1986, pp. 3459-3465; Patente Norte-Americana4.882.279).
Exemplos de outras células fungicas são células de fungosfilamentosos, e.g. Aspergillus spp., Neurospora spp., Fusarium spp. ouTrichoderma spp., em particular linhagens de A. oryzae, A. nidulans ou A.niger. O uso de Aspergillus spp. para a expressão de proteínas é descrito em,e.g., Patente Européia 272 277 e Patente Européia 230 023. Atransformação de F. oxysporum pode, por exemplo, ser realizada comodescrito por Malardier et al., 1989, Gene 78: 147-156.
Quando um fungo filamentoso é usado como a célulahospedeira, ele pode ser transformado com o construto de DNA da invenção,convenientemente integrando o construto de DNA no cromossomo hospedeiropara obter uma célula hospedeira recombinante. Esta integração geralmente éconsiderada como sendo uma vantagem pois a seqüência de DNA é maispropensa a ser estavelmente mantida na célula. Integração dos construtosde DNA no cromossomo hospedeiro pode ser realizada de acordo commétodos convencionais, e.g. por recombinação homóloga ou heteróloga.
Transformação de células de insetos e produção de proteínasheterólogas nestas pode ser realizada como descrito em Patente Norte-Americana 4.745.051; Patente Norte-Americana 4.879.236; Patente Norte-Americana 5.155.037; 5.162.222; Patente Européia 397.485) todas as quaissão incorporadas neste lugar por referência. A linhagem celular de insetousada como o hospedeiro pode adequadamente ser uma linhagem celular deLepidoptera, tal como células de Spodoptera frugiperda ou células deTrichoplusia ni (cf. US 5.077.214). Condições de cultura podemadequadamente ser como descrito em, por exemplo, WO 89/01029 ou WO89/01028, ou qualquer das referências mencionadas acima.
A célula hospedeira transformada ou transfectada descritaacima é então cultivada em um meio nutritivo adequado em condiçõespermitindo a expressão da presente proteína, depois do que a proteínaresultante é recuperada da cultura.
O meio usado para cultivar as células pode ser qualquer meioconvencional adequado para crescer as células hospedeiras, tal como meiosmínimos ou complexos contendo suplementos apropriados. Meios adequadossão disponíveis a partir de fornecedores comerciais ou podem ser preparadosde acordo com receitas publicadas (e.g. em catálogos da American TypeCulture Collection). A proteína produzida pelas células pode então serrecuperada do meio de cultura por procedimentos convencionais incluindoseparar as células hospedeiras do meio por centrifugação ou filtração,precipitando os componentes proteináceos do sobrenadante ou filtrado pormeio de um sal, e.g. sulfato de amônio, purificação por uma variedade deprocedimentos cromatográficos, e.g. cromatografia por troca iônica,cromatografia por gelfiltração, cromatografia por afinidade, ou ossemelhantes, dependente do tipo de proteína em questão.
Peptídeos da presente invenção podem ser usados para criaranticorpos que se ligam especificamente aos peptídeos da presente invenção.No presente contexto, "anticorpos" incluem anticorpos monoclonais epoliclonais, e fragmentos de ligação a antígeno destes, tal comofragmentos F(ab')2 e Fab, incluindo anticorpos geneticamente modificadose anticorpos humanizados. Anticorpos são ditos serem específicos se elesse ligam a um peptídeo da presente invenção com um Ka maior do que ouigual a IO7 M"1. Métodos para preparar anticorpos são descritos em e.g.Hurrell J.G.R. (Ed.) Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques andApplications, CRC Press, Boca Raton, Florida, 1982 e Sambrok,Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour, NovaIorque, 1989.
IL-21 foi implicada no tratamento de doenças virais, tal comoVírus da Hepatite B, Vírus da Hepatite C, Vírus da ImunodeficiênciaHumana, Vírus Respiratório Sincial, Vírus Eppstein-Barr, Vírus da Influenza,Citomegalovírus, Vírus do Herpes e Síndrome Respiratória Aguda Severa;doenças alérgicas, tal como asma, rinite alérgica ou doenças alérgicas napele; doenças parasitárias, tal como infecção helmíntica, doençasautoimunes, tal como rejeição do aloenxerto e diabete; e câncer.
No presente contexto, "câncer" se refere a qualquer distúrbioneoplásica, incluindo tais distúrbios celulares tal como sarcoma, carcinoma,melanoma, leucemia, linfoma, cânceres na mama, cabeça e pescoço, ovários,bexiga, pulmão, faringe, laringe, esôfago, estômago, intestino delgado, fígado,pâncreas, cólon, trato reprodutivo feminino, trato reprodutivo masculino,próstata, rins e sistema nervoso central. Em particular, "câncer" é pretendidopara indicar distúrbios neoplásicos não metastáticos e metastáticos tal comomelanoma maligno, cânceres de pele não melanoma, carcinoma de célularenal, câncer da cabeça e pescoço, câncer do sistema endócrino, câncerovariano, câncer de pulmão de célula pequena, câncer de pulmão de célulanão pequena, câncer de mama, câncer esofágico, câncer gastrintestinalsuperior, câncer colo-retal, câncer de fígado e duto biliar, câncerpancreático, câncer de próstata, câncer de bexiga, câncer testicular, câncercervical, câncer endometrial, sarcomas de ossos e tecido mole, câncer dosistema nervoso central, linfoma, leucemia, e câncer de origem primáriadesconhecida.
Em aspectos mais específicos da invenção os termos"distúrbios neoplásicos", "câncer" ou "crescimento de tumor" são para serementendidos como se referindo a todas as formas de crescimento celularneoplásico, incluindo tanto tumores císticos como sólidos, tumores de osso etecido mole, incluindo tanto tumores benignos como malignos, incluindotumores em tecido anal, duto biliar, bexiga, células sangüíneas, osso, osso(secundário), intestino (cólon & reto), cérebro, cérebro (secundário), mama,mama (secundário), carcinóide, cérvice, cânceres infantis, olho, garganta(esôfago), cabeça & pescoço, sarcoma de kaposi, rim, laringe, leucemia(linfoblástica aguda), leucemia (mielóide aguda), leucemia (linfocíticacrônica), leucemia (mielóide crônica), leucemia (outra), fígado, fígado(secundário), pulmão, pulmão (secundário), linfonodos (secundário), linfoma(de hodgkin), linfoma (não hodgkin), melanoma, mesotelioma, mieloma,ovário, pâncreas, pênis, próstata, pele, sarcomas de tecido mole, estômago,testículos, tireóide, tumor primário desconhecido, vagina, vulva, ventre(útero).
Tumores de tecido mole incluem Monossomia deSchwannoma Benigno, tumor Desmóide, Lipoblastoma, Lipoma, leiomiomaUterino, sarcoma de célula clara, Dermatofibrosarcoma, sarcoma de Ewing,condrosarcoma mixóide extraesquelético, Liposarcoma mixóide,Liposarcoma, bem diferenciado, rabdomiosarcoma Alveolar, e sarcomaSinovial.
Tumores ósseos específicos incluem Fibroma não ossifícante,Cisto ósseo unicameral, Encondroma, Cisto ósseo aneurismal, Osteoblastoma,Condroblastoma, Condromixofibroma, Fibroma ossifícante e Adamantinoma,Tumor de célula gigante, Displasia fíbrosa, Sarcoma de Ewing, GranulomaEosinofílico, Osteosarcoma, Condroma, Condrosarcoma, HistiocitomaFibroso Maligno, e Carcinoma Metastático.Leucemias se referem a cânceres das células brancas dosangue que são produzidas pela medula óssea. Isto inclui mas não é limitadoaos quarto tipos principais de leucemia; linfoblástica aguda (ALL),mieloblástica aguda (AML), linfocítica crônica (CLL) e mielóide crônica(CML).
Em uma forma de realização, a invenção se refere a métodosde tratar infecções virais, doenças alérgicas, doenças autoimunes e câncercomo listado acima, o método compreendendo a administração de umaquantidade eficaz de um peptídeo da presente invenção a um paciente comnecessidade desta.
Em uma forma de realização, a presente invenção se refere aouso de um peptídeo da presente invenção para a fabricação de ummedicamento para o tratamento de infecções virais, doenças alérgicas,doenças autoimunes e câncer como listado acima.
É bem conhecido na arte que regimes de tratamento de câncerfreqüentemente incluem mais do que um medicamento ou modalidade detratamento. Em uma forma de realização, a presente invenção portantofornece um método para o tratamento de câncer, o método compreendendo aadministração de uma quantidade eficaz de um peptídeo da presente invençãoem combinação com uma quantidade eficaz de um ou mais dos seguintes I aVI. Na presente invenção, 'em combinação com' significa que um peptídeo dainvenção é administrado (i) antes de, (ii) no mesmo momento e/ou (iii) depoisde tratamento com um ou mais dos seguintes I a VI.
I. Agentes que induzem morte de célula tumorosa ou morte decélulas infectadas com vírus
a) quimioterapia convencional
b) terapia por radiação
c) anticorpos monoclonais
d) controle de ciclo celular/reguladores de apoptosee) moduladores de fator de crescimento e transdução de sinal
f) inibidores de vascularização de tumor (inibidores deangiogênese, drogas de angiogênese)
g) direcionamento viral (o uso de um vírus recombinante paradestruir células tumorosas)
h) agentes antivirais
i) agentes hormonais
II. Agentes que estimulam a resposta imune contra célulastumorosas ou células infectadas com vírus
j) ativadores de sistema imune
k) inibidores de sistema imune (e.g. agentes que inibem sinaisimunes diminuindo a resposta imune), incluindo agentes antianérgicos
l) vacinas terapêuticas
III. Agentes que interferem em crescimento de tumor,metástase ou espalhamento de células infectadas com vírus
m) integrinas, moduladores de moléculas de adesão celular
n) antimetastáticos
o) moduladores de célula endotelial
IV. Vacinação interna.
V. Antagonista de fator de tecido e outros fatoresinfluenciando a cascata de coagulação
p) anti Fator Xa, inibidores de anti Fator lia, agentesantifibrinogênicos
q) pentassacarídeos etc.
VI. Agentes imunossupressivos/imunomodulatores
r) agentes com influência em residência de linfócito-T e.g.FTY-720
s) Inibidores de calcineurina
t) Inibidores de TORUma descrição mais detalhada de algumas das possíveisdrogas de combinação é fornecida abaixo
Agentes que induzem morte de célula tumorosa ou morte decélulas infectadas com vírus
a) Agentes quimioterápicos convencionais
Em uma forma de realização da invenção, terapia decombinação é realizada administrando um peptídeo da presente invenção eagentes quimioterápicos convencionais.
Agentes quimioterápicos têm modos diferentes de ações talcomo influenciando ou
a) nível de DNA
b) nível de RNA
Exemplos não limitantes de agentes quimioterápicosconvencionais no nível de DNA ou no nível de RNA são antimetabólitos (talcomo Azatioprina, Citarabina, fosfato de Fludarabina, Fludarabina,Gemcitabina, citarabina, Cladribina, Capecitabina 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, metotrexato, 5-fluorouracil, e hidroxiuréia) agentes alquilantes (talcomo Melfalan, Busulfan, Cis-platina, Carboplatina, Ciclofosfamida,Ifosfamida, Dacarbazina, procarbazina, Clorambucil, Tiotepa, Lomustina,Temozolamida) agentes antimitóticos (tal como Vinorelbina, Vincristina,Vinblastina, Docetaxel, Paclitaxel) inibidores de topoisomerase (tal comoDoxorubicina, Amsacrina, Irinotecano, Daunorubicina, Epirubicina,Mitomicina, Mitoxantrona, Idarubicina, Teniposídeo, Etoposídeo,Topotecano) antibióticos (tal como actinomicina e bleomicina) asparaginase,ou as antraciclinas ou os taxanos.
Em uma forma de realização da invenção, terapia decombinação é realizada administrando um peptídeo da presente invenção edacarbazina (DTIC).
b) Terapia por radiação:Certos tumores podem ser tratados com radiação ouradiofármacos. A fonte de radiação pode ser ou externa ou interna ao pacientesendo tratado. Quando a fonte é externa ao paciente a terapia é conhecidacomo terapia de radiação de feixe externo (EBRT). Quando a fonte deradiação é interna ao paciente, o tratamento é chamado braquiterapia (BT).Átomos radioativos típicos que foram usados incluem rádio, Césio-13 7,Irídio-192, Amerício-241, Ouro-198, Cobalto-57, Cobre-67, Tecnécio-99,Iodo-123, Iodo-131 e índio-111.
Terapia por radiação é tratamento padrão para controlartumores irressecáveis ou inoperáveis e/ou metástase de tumor. Resultadosmelhorados foram vistos quando uma terapia por radiação foi combinada comoutras terapias.
Em uma forma de realização da invenção, um peptídeo dapresente invenção é administrado em combinação com terapia por radiação,
c) Anticorpos monoclonais (monoclonais; MAbs)
MAbs foram desenvolvidos para o tratamento de leucemia elinfoma assim como tumor sólido, e este princípio está ganhando crescenteinteresse. Estes anticorpos trabalham ou inibindo funções que são vitais parasobrevivência das células tumorosas, liberando uma virulência tóxica,interrompendo eventos de sinalização chave, ou por indução de citotoxicidademediada por célula dependente de anticorpo (ADCC) ou citotoxicidadecomplemento dirigida (CDC) contra as células tumorosas. Morte das célulastumorosas pode então levar à liberação de antígenos de tumor que "vacinam"o sistema imune e o estimulam a produzir uma resposta secundária que entãotem como objetivo a célula tumorosa (i.e. Vacinação interna' como descritoabaixo). Oncogenes superexpressos e antígenos de tumor-específicos sãoalvos chave para muitos mAbs em desenvolvimento.
Antígenos de tumor são descritos por exemplo em Stauss H,Kawakami Y and Parmiani G: Tumor antigens recognized by T cells andantibodies. Taylor and Francês (2003). A invenção cobre anticorpos criadoscontra estes alvos. A invenção também cobre anticorpos criados contraantígenos virais.
Em uma forma de realização da invenção um peptídeo dapresente invenção é combinado com os anticorpos tal como Rituximab,Alemtuzumab, Trastuzumab, Gemtuzumab, Gemtuzumab-ozogamicin(Myelotarg Wyeth) Cetuximab (Erbitux™), Bevacizumab, HuMax-CD20,HuMax-EGFr5 Zamil e Pertuzumab.
Em uma forma de realização da invenção um peptídeo dapresente invenção é combinado com Rituximab.
Em uma forma de realização da invenção um peptídeo dapresente invenção é combinado com Cetuximab.
Em uma forma de realização da invenção um peptídeo dapresente invenção é combinado com Bevacizumab.
Em uma forma de realização da invenção um peptídeo dapresente invenção é combinado com Bevacizumab e Cetuximab.
Em uma forma de realização da invenção um peptídeo dapresente invenção é combinado com Bevacizumab e Cetuximab.
Em uma forma de realização da invenção um peptídeo dapresente invenção é combinado com Panitumumab.
Em uma forma de realização da invenção um peptídeo dapresente invenção é combinado com Bevacizumab e Panitumumab.
Em uma forma de realização da invenção um peptídeo dapresente invenção é combinado com um anticorpo contra fator de tecido,receptores tipo Ig exterminadores (KIR), laminina-5, EGF-R, VEGF-R,PDGF-R, HER-2/neu, ou um anticorpo contra um antígeno de tumor tal comoPSA, PSCA5 CEA5 CA125, KSA, etc.
Em uma forma de realização da invenção, um peptídeo dapresente invenção é administrado junto com um anticorpo terapêutico, talcomo aqueles mencionados acima, e adicionalmente combinado comcompostos estimuladores de ADCC adicionais, ex. anticorpos antiKIR debloqueio, agonistas de NKG2D, antagonistas de NKG2A, IL-2, IL-12, IL-15,IL-18 ou IL-21.
Em outra forma de realização da invenção um peptídeo dapresente invenção é administrado como uma combinação com anticorposcontra antígenos virais.
d) Controle de ciclo celular/reguladores de apoptose
Diversos reguladores estão envolvidos na manutenção de ciclocelular normal.
Compostos, que direcionam reguladores tal como (i) cdc-25(com NSC 663284 como um exemplo não limitante (Pu et al (2003) J BiolChem 278, 46877)), (ii) quinases dependentes de ciclina que superestimulamo ciclo celular (com os seguintes exemplos não limitantes: flavopiridol(L868275, HMR1275; Aventis), 7-hidroxistaurosporina (UCN-01, KW-2401;Kyowa Hakko Kogyo) e roscovitina (R-roscovitina, CYC202; Cyclacel) -como revisto por Fischer & Gianella-Borradori (2003) Exp Op Invest Drugs12, 955-970), e (iii) telomerase, a enzima que ajuda as células cancerosas areconstruir seus telômeros estão dentro da presente invenção tal como osseguintes exemplos não limitantes BIBRl 532 (Damm et al (2001) EMBO J20, 6958-6968) e SOT-095 (Tauchi et al (2003) Oncogene 22, 5338-5347).Além disso, drogas que interferem em vias apoptóticas estão dentro dapresente invenção, tal como os seguintes exemplos não limitantes: liganteindutor de apoptose relacionado a TNF (TRAIL)/ligante 2 de apoptose (Apo-2L), anticorpos que ativam receptores de TRAIL, IFN-α e BcI-2antisentido.(veja Igney and Krammer (2002) Nature Rev. Câncer 2, 277-288;Makin and Dive (2003) Trends Mol Med 9, 2519; Smyth et al (2003)Immunity 18, 1-6; Panaretakis et al (2003) Oncogene 22, 4543-4556 ereferências nestes). Em uma forma de realização da invenção um peptídeo dapresente invenção, é combinado com um ou mais reguladores de ciclocelular e/ou agentes indutores de apoptose.
Em uma forma de realização da invenção acima os compostossão selecionados a partir do grupo compreendendo cdc-25, NSC 663284,flavopiridol, 7-hidroxistaurosporina, roscovitina, BIBRl532 SOT-095, liganteindutor de apoptose relacionado a TNF (TRAIL)/ligante 2 de apoptose (Apo-2L), anticorpos que ativam receptores de TRAIL, IFN-α e Bcl-2 antisentido.
e) Inibidores de fator de crescimento
Diversos mAbs contra fatores de crescimento e receptores defator de crescimento estão sendo desenvolvidos para o tratamento de câncer.Assim, como um exemplo não limitante, membros da família de receptor defator de crescimento epidérmico (EGF-R) são anormalmente ativados emmuitos tumores epiteliais, o que freqüentemente se correlaciona com cursoclínico mais agressivo. Anticorpos direcionados contra o domínio de ligaçãode ligante extracelular destes receptores e moléculas de baixo peso molecularque inibem seus domínios de tirosina quinase estão em desenvolvimentoclínico em estágio avançado ou aprovados para tratamento de câncer ou comoagentes únicos ou em combinação com outras drogas de câncer. Exemplosnão limitantes são Herceptina (anticorpo monoclonal), cetuximab (anticorpomonoclonal), Tarceva (inibidor de baixo peso molecular), e Iressa (inibidor debaixo peso molecular). Em adição, o ligante pode ser neutralizado antes dese ligar ao receptor.
Em uma forma de realização da invenção um peptídeo dapresente invenção é combinado com inibidores de fator de crescimento.
Em uma forma de realização da invenção os inibidores de fatorde crescimento são selecionados a partir do grupo compreendendo Herceptina(anticorpo monoclonal), cetuximab (anticorpo monoclonal), Tarceva (inibidorde baixo peso molecular), e Iressa (inibidor de baixo peso molecular).
Em uma forma de realização da invenção um peptídeo dapresente invenção é combinado com Herceptina.
f) Inibidores de vascularização de tumor (Drogasantiangiogênese e agentes antimetastático)
Crescimento de tumor é dependente de fornecimentosangüíneo suficiente e por conseguinte desenvolvimento de novos vasossangüíneos. Esta característica geral de tumores sólidos parece atrativa de umponto de vista terapêutico, i.e. crescimento reduzido de tumor e regressão detumor é esperado ao tratar pacientes com câncer com drogas antiangiogênese.Atualmente, mais do que 60 drogas antiangiogênese estão em testes clínicosincluindo a endostatina e angiostatina naturalmente ocorrentes (revisto emMarx (2003) Science 301, 452-454). Mas também drogas quimioterápicasmais antigas, outros remédios e terapia por radiação têm efeitosantiangiogênicos. Em um tipo de formas de realização da presente invenção éterapia de combinação com IL-21, análogos ou derivados desta e um ou maisagentes antiangiogênicos, tal como os seguintes exemplos não limitantes:endostatina, angiostatina, anticorpos que bloqueiam fatores que iniciamangiogênese (e.g. Avastina antiVEGF), compostos moleculares baixos queinibem angiogênese inibindo elementos chave em vias relevantes detransdução de sinal.
Atacar a vasculatura do tumor e da matriz extracelular atraiucrescente atenção. Os seguintes princípios foram desenvolvidos até agora:Bloqueio da célula endotelial, administração de angiostatina e endostatina,direcionamento de VEGF e matriz extracelular.
Em uma forma de realização da invenção um peptídeo dapresente invenção é combinado com uma droga antiangiogênese.
Em uma forma de realização da invenção a drogaantiangiogênese é selecionada a partir do grupo compreendendo: avastina,neovastat, talidomida, PTK787, ZK222584, ZD-6474, SU6668, PD547,632,VEGF-Trap, CEP-7055, NM-3, SUl 1248.g) Direcionamento viral
Direcionamento viral usa um vírus recombinante -normalmente incompetente para replicação - para destruir um tumordiretamente. Na prática, pelo menos um ciclo de replicação ocorre antes dovírus ser incapacitado. Por conseguinte, o tumor é lisado, o quefreqüentemente leva a imunização sistêmica com proteção resultante. Estaabordagem foi refinada usando adicionalmente modificação genética paraestimular a resposta imune. Por exemplo, a inserção genética de um gene deGM-CSF humano em um vetor de vírus do herpes simples tipo 2 foi usadapara melhorar a eficácia da vacina. Em uma forma de realização da invenção,terapia de combinação é realizada administrando IL-21, um análogo ou umderivado desta e direcionamento viral.
i) Agentes hormonais.
Agentes hormonais são primariamente conhecidos notratamento de cânceres dependentes de hormônio tal como câncer ovariano,câncer de mama e câncer de próstata tal como terapia antiandrógeno eantiestrógeno. Hormônios e anti-hormônios são compostos tal como fosfatode Estramustina, fosfato de Poliestradiol, Estradiol, Anastrozol, Exemestano,Letrozol, Tamoxifeno, acetato de Megestrol, acetato de Medroxiprogesterona,Octreotide, acetato de Ciproterona, Bicaltumida, Flutamida, Tritorelina,Leuprorelina, Buserelina ou Goserelina.
Em uma forma de realização da invenção um peptídeo dapresente invenção é combinado com terapia hormonal.
II: Agentes que estimulam a resposta imune contra célulastumorosas ou células infectadas com vírus
j) Ativadores de sistema imune
A lista seguinte de componentes ou agentes que podem serusados junto com um peptídeo da presente invenção em terapia decombinação de câncer e infecções virais estimulando a eficácia do sistemaimune não é pretendida para limitar de maneira alguma o escopo da invenção:
Adjuvantes:
Imunoterapia consiste de modalidades específicas e nãoespecíficas. Como exemplos de imunoterapia não específica são adjuvantesatuando primariamente como catalisadores para o início de uma respostaimune. Exemplos não limitantes de tais adjuvantes de vacinas são QS21, GM-CSF e oligodesoxinucleotídeos CpG5 lipopolissacarídeo e ácidopoliinosínico:policitidílico.
Em uma forma de realização da invenção um peptídeo dapresente invenção é combinado com um ou mais adjuvantes.
Em uma forma de realização da invenção os adjuvantes sãoselecionados a partir do grupo compreendendo: QS21, GM-CSF eoligodesoxinucleotídeos CpG5 lipopolissacarídeo e ácidopoliinosínico:policitidílico, a-Galctosilceramida ou análogos desta,dicloridrato de histamina, ou hidróxido de alumínio.
Citocinas:
Exemplos não limitantes de citocinas são IFN-a, IFN-β IFN-γ,IL-2, PEG-IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-12, IL-13, IL-15, IL-18, IL-21, IL-23,IL-27, IL-28a, IL-28b, IL-29, GM-CSF, ligante FIt3 ou fator de célula tronco.
Em uma forma de realização da invenção um peptídeo dapresente invenção é combinado com um ou mais citocinas.
Em uma forma de realização da invenção uma IL-21 écombinada com um ou mais dos compostos selecionados a partir do grupocompreendendo: IFN-a, IFN-β, IFN-γ, IL-2, PEG-IL-2, IL-4, EL-6, IL-7, IL-12, IL-13, IL-15, IL-18, IL-21, IL-23, IL-27, IL-28a, IL-28b, IL-29, GM-CSF, ligante Flt3 ou fator de célula tronco, ou um análogo ou derivado dequalquer destes.
Em uma forma de realização da invenção, os compostos sãoselecionados a partir do grupo compreendendo: IFN-a, IFN-β, IFN-γ, PEG-IL-2, IL-18, IL-23, IL-27, IL-28a, IL-28b, IL-29.
Em uma forma de realização da invenção um peptídeo dapresente invenção é combinado com um dos seguintes: IL-2, PEG-IL-2, IL-7,IL-12, IL-15, IL-18 e IFN-a.
Em uma forma de realização da invenção um peptídeo dapresente invenção é combinado com IL-12.Em uma forma de realização dainvenção um peptídeo da presente invenção é combinado com IFN-a.
Em uma forma de realização da invenção um peptídeo dapresente invenção é combinado com PEG-IL-2.
Em uma forma de realização da invenção um peptídeo dapresente invenção é combinado com mais do que um dos seguintes: IL-2,PEG-IL-2, IL-7, IL-12, IL-15, IL-18 e IFN-α. Em uma forma de realização dainvenção um peptídeo da presente invenção é combinado com pelo menos umdos seguintes: IL-2, PEG-IL-2, IL-7, IL-12, IL-15, IL-18 e IFN-α e umcomponente ativo adicional. Em uma forma de realização da invenção umpeptídeo da presente invenção é combinado com pelo menos um dosseguintes: IL-2, PEG-IL-2, IL-7, IL-12, IL-15, IL-18 e IFN-α e uma citocinaadicional da lista acima. Em uma forma de realização da invenção umpeptídeo da presente invenção é combinado com IFN-α e GM-CSF. Em umaforma de realização da invenção um peptídeo da presente invenção écombinado com IFN-α e timopentina.
Em uma forma de realização da invenção um peptídeo dapresente invenção é combinado com IFN-γ.
Em uma forma de realização da invenção um peptídeo dapresente invenção é combinado com TILs autólogos e IFN-a.
Em uma forma de realização da invenção um peptídeo dapresente invenção é combinado com IFN-α e IL-12.
Em uma forma de realização da invenção um peptídeo dapresente invenção é combinado com Cis-platina e IFN-a.Em uma forma de realização da invenção um peptídeo dapresente invenção é combinado com Cis-platina, tamoxifeno e IFN-a.
Em uma forma de realização da invenção um peptídeo dapresente invenção é combinado com Cis-platina, DTIC, tamoxifeno e IFN-a.
Em uma forma de realização da invenção um peptídeo dapresente invenção é combinado com Cis-platina, DTIC, tamoxifeno e GM-CSF.
Em uma forma de realização da invenção um peptídeo dapresente invenção é combinado com Cis-platina, Carmustina, DTIC e IFN-a.
Em uma forma de realização da invenção um peptídeo dapresente invenção é combinado com Cis-platina, Carmustina, DTIC,tamoxifeno e IFN-a.
Em uma forma de realização da invenção um peptídeo dapresente invenção é combinado com Cis-platina, Carmustina, DTIC,carboplatina, tamoxifeno e IFN-a.
Em uma forma de realização da invenção um peptídeo dapresente invenção é combinado com Cis-platina, DTIC, Vinblastina,tamoxifeno e IFN-a.
Em uma forma de realização da invenção um peptídeo dapresente invenção é combinado com Cis-platina, Vinblastina, temozolomida eIFN-a.
Em uma forma de realização da invenção um peptídeo dapresente invenção é combinado com Cis-platina, Carmustina, DTIC,Vindesina, tamoxifeno e IFN-a.
Em uma forma de realização da invenção um peptídeo dapresente invenção é combinado com Cis-platina, tamoxifeno e IFN-a.
Em uma forma de realização da invenção um peptídeo dapresente invenção é combinado com Cis-platina, Vinblastina, DTIC e IFN-a.
Em uma forma de realização da invenção um peptídeo dapresente invenção é combinado com DTIC e IFN-a.
Em uma forma de realização da invenção um peptídeo dapresente invenção é combinado com DTIC, GM-CSF e EFN-a.
Em uma forma de realização da invenção um peptídeo dapresente invenção é combinado com DTIC, timosina-α e IFN-a.
Em uma forma de realização da invenção um peptídeo dapresente invenção é combinado com Vinblastina e IFN-a.
Em uma forma de realização da invenção um peptídeo dapresente invenção é combinado com 5-fluorouracil e IFN-a.
Em uma forma de realização da invenção um peptídeo dapresente invenção é combinado com Fotemustina e IFN-a.
Em uma forma de realização da invenção um peptídeo dapresente invenção é combinado com Oxaliplatina e IFN-a.
Em uma forma de realização da invenção um peptídeo dapresente invenção é combinado com Oxaliplatina, tamoxifeno e IFN-a.
Em uma forma de realização da invenção um peptídeo dapresente invenção é combinado com Oxaliplatina, DTIC, tamoxifeno e IFN-a.
Em uma forma de realização da invenção um peptídeo dapresente invenção é combinado com Oxaliplatina, DTIC, tamoxifeno e GM-CSF.
Em uma forma de realização da invenção um peptídeo dapresente invenção é combinado com Oxaliplatina, Carmustina, DTIC e IFN-a.
Em uma forma de realização da invenção um peptídeo dapresente invenção é combinado com Oxaliplatina, Carmustina, DTIC,tamoxifeno e IFN-a.
Em uma forma de realização da invenção um peptídeo dapresente invenção é combinado com Oxaliplatina, Carmustina, DTIC,carboplatina, tamoxifeno e IFN-a.
Em uma forma de realização da invenção um peptídeo dapresente invenção é combinado com Oxaliplatina, DTIC, Vinblastina,tamoxifeno e IFN-a.
Em uma forma de realização da invenção um peptídeo dapresente invenção é combinado com Oxaliplatina, Vinblastina, temozolomidae IFN-a.
Em uma forma de realização da invenção um peptídeo dapresente invenção é combinado com Oxaliplatina, Carmustina, DTIC,Vindesina, tamoxifeno e IFN-a.
Em uma forma de realização da invenção um peptídeo dapresente invenção é combinado com Oxaliplatina, tamoxifeno e IFN-a.
Em uma forma de realização da invenção um peptídeo dapresente invenção é combinado com Oxaliplatina, Vinblastina, DTIC e IFN-a.
Em uma forma de realização da invenção um peptídeo dapresente invenção é combinado com 5-fluorouracil ou um análogo oralmenteativo deste.
Em uma forma de realização da invenção um peptídeo dapresente invenção é combinado com oxaliplatina e 5-fluorouracil ou umanálogo oralmente ativo destes.
Em uma forma de realização da invenção um peptídeo dapresente invenção é combinado com oxaliplatina, leucovorina, e 5-fluorouracil ou um análogo oralmente ativo destes.
Em uma forma de realização da invenção um peptídeo dapresente invenção é combinado com Irinotecano.
Em uma forma de realização da invenção um peptídeo dapresente invenção é combinado com Irinotecano e oxaliplatina.
Em uma forma de realização da invenção um peptídeo dapresente invenção é combinado com Irinotecano e Cetuximab.
Em uma forma de realização da invenção um peptídeo dapresente invenção é combinado com Irinotecano e bevacizumab.Em uma forma de realização da invenção um peptídeo dapresente invenção é combinado com Irinotecano e Cetuximab e bevacizumab.
Em uma forma de realização da invenção um peptídeo dapresente invenção é combinado com DTIC e células LAK autólogas.
Em uma forma de realização da invenção um peptídeo dapresente invenção é combinado com Gemcitabina e IFN-a.
Qualquer das combinações acima pode ser adicionalmentecombinada com IL-2.
Imunoterapia celular
Exemplos de imunoterapia celular (ou imunoterapia adotiva)incluem re-infiisão de células T infiltrando tumor expandido ex-vivo oucélulas T geneticamente modificadas.
Em uma forma de realização da invenção, terapia decombinação é combinar administração de um peptídeo da presente invenção eimunoterapia celular.
Imunoterapia celular pode incluir isolamento de células quepodem estimular ou exercer uma resposta anticâncer de pacientes, expandindoestas em números maiores, e reintroduzindo elas no mesmo ou outro paciente.Em um aspecto isto pode ser células T CD4+ ou CD8+ reconhecendoantígenos específicos de tumor ou antígenos associados a tumor. Em outroaspecto isto pode ser células B expressando anticorpos específicos paraantígenos específicos de tumor ou antígenos associados a tumor. Em outroaspecto isto pode ser células NK que são capazes de matar as célulastumorosas. Em um aspecto preferido isto pode ser células dendríticas (DC)que são cultivadas ex vivo com um agente de expansão de DC (e.g. GM-CSFou Flt3-L), carregadas com antígenos específicos de tumor ou antígenosassociados a tumor e re-infundidas em um paciente com necessidade deste.Em uma forma de realização da invenção, terapia de combinação é combinaradministração de um peptídeo da presente invenção, e imunoterapia celular outerapia adotiva.
Em uma forma de realização da invenção a terapia adotivacelular compreende células T CD4+ ou CD8+ reconhecendo antígenosespecíficos de tumor ou antígenos associados a tumor.
Em uma forma de realização da invenção a terapia adotivacelular compreende célula B expressando anticorpos específicos paraantígenos específicos de tumor ou antígenos associados a tumor.
Em uma forma de realização da invenção terapia adotivacelular compreende células NiC que são capazes de matar as célulastumorosas.
Em uma forma de realização da invenção terapia adotivacelular compreende células dendríticas (DC).
Em uma forma de realização das acima as células dendríticassão cultivadas in vivo com um agente de expansão de DC (e.g. GM-CSF ouFlt3-L), carregado com antígenos específicos de tumor ou antígenosassociados a tumor e reintroduzidas in vivo.
k) Agentes que bloqueiam sinalização inibidora no sistemaimune.
Respostas imunes, incluindo respostas antitumor e antiviral,são reguladas por um equilíbrio de sinalização através de receptoresestimuladores e inibidores em células do sistema imune. Uma mudança parasinalização abundante através de receptores ativadores pode levar a respostasimunes mais eficazes, ao passo que sinalização estimulada através dereceptores inibidores pode levar a respostas menos produtivas, ou podemainda prejudicar imunidade. A fim de estimular respostas antitumores ouantivirais, é útil bloquear terapeuticamente sinalização através de receptoresinibidores, a fim de mudar o equilíbrio para ativação. Portanto, agentes quebloqueiam receptores inibidores, ou vias inibidoras de sinalização, sãoagentes preferidos para temperatura de combinação, em conjunção com opeptídeo da presente invenção. Exemplos não limitantes de tais agentes quebloqueiam receptores inibidores são mAbs específicos para CTLA-4(antiCTLA-4), mAbs específicos para KIR (antiKIR), mAbs específicos paraLIR (antiLIR), mAbs específicos para CD94 (antiCD94), ou mAbsespecíficos para NKG2A (antiNKG2A).
Agentes antialérgicos são compostos pequenos, proteínas,glicoproteínas ou anticorpos que podem quebrar tolerância a antígenos detumor e câncer.
Embora a presença de linfócitos tumor infiltrantes (TILs) secorrelacione com resultado clínico melhorado em diversas formas diferentesde câncer, existe claramente uma necessidade de melhorar a atividade destesTILs devido a anergia ou tolerância a antígenos de tumor. A condiçãoanérgica pode, em um número substancial de casos, ser cancelada poranticorpos monoclonais que previnem anergia ou tolerância induzida porCTLA-4. Bloqueio de CTLA-4 mostrou em modelos animais, e em pacienteshumanos com câncer, melhorar a eficácia de terapia de câncer sugerindo quebloqueio de CTLA-4 pode ser usado para quebrar a tolerância a câncer eantígenos de tumor. Um exemplo não limitante de um anticorpo monoclonalque pode ser usado para indução da atividade de TILs é MDX-010 (Phan etal. (2003) Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 100: 8372). Em uma forma derealização da invenção, terapia de combinação é realizada administrando umpeptídeo da presente invenção e um ou mais agentes que quebram a tolerânciaa câncer, tumor ou antígenos virais. Em uma forma de realização da invençãoum peptídeo da presente invenção é combinado com MDX-010.
Em uma forma de realização da invenção um peptídeo dapresente invenção é combinado com anticorpos contra CTLA-4.
Em uma forma de realização da invenção um peptídeo dapresente invenção é combinado com anticorpos contra KIR.
Em uma forma de realização da invenção um peptídeo dapresente invenção é combinado com anticorpos contra CD94.
Em uma forma de realização da invenção um peptídeo dapresente invenção é combinado com anticorpos contra NKG2A.
Em uma forma de realização da invenção um peptídeo dapresente invenção é combinado com anticorpos contra um receptor inibidorexpresso em uma célula NK5 uma célula T ou uma célula NKT.
Em uma forma de realização da invenção um peptídeo dapresente invenção é combinado com um antagonista de um receptor inibidor.
Em uma forma de realização da invenção um peptídeo dapresente invenção é combinado com um antagonista de uma proteína desinalização envolvida em transmissão de sinais inibidores.
I) Vacinas terapêuticas
O desenvolvimento de praticamente todos os câncereshumanos envolve alterações genéticas, e isto pode levar a expressão demoléculas alteradas em células tumorosas e superexpressão de moléculasnormais, respectivamente. Em princípio, estas mudanças devem levar a umaresposta imune do hospedeiro (vigilância imune). Obviamente, esta ativaçãoteórica do sistema imune leva apenas a regressão espontânea do tumor emmuitos poucos casos excepcionais. Isto pode, entre outros fatores, se devido àausência de "sinais de perigo", um fenômeno que atraiu crescente interesse.
Antígenos específicos de tumor foram identificados, evacinação com tais antígenos pode estimular o sistema imune a erradicar otumor. Antígenos específicos de tumor (TSAs) são um grupo relativamentepequeno de antígenos exemplificado pelos antígenos de câncer de testículos.Estes genes são silenciosos em tecido normal mas são expressos por célulascancerosas. Eles são marcadores altamente específicos de doença e incluemMAGE (gene de antígeno de melanoma) encontrado em melanoma.
Antígenos associados a tumor (TAAs) normalmente sãoantígenos de diferenciação expressos por células normais mas massivamentesuperexpressos em tecido canceroso. Alvos pensados inicialmente paraserem específicos para um câncer particular atualmente são bastantecomuns em muitos tumores, tal como os gangliosídeos e antígenos demucina. Antígenos de diferenciação clássicos incluem MART-I (antígenode melanoma reconhecido por células T) e gp 100, ambos de melanoma,tirosinase, antígeno carcinoembriônico (CEA) e gp75.
Antígenos mutacionais: Mutações pontuais são comuns emmuitos cânceres, e freqüentemente ocorrem em uma localização similar, talcomo a mutação comum dos oncogenes P53 ou ras. Indução in vitro derespostas de linfócito-T citotóxico (CTL) humano contra peptídeos de p53mutante e tipo selvagem foi relatada. Em um modelo de camundongo, célulasdendríticas pulsadas com p53 mutante foram capazes de induzir CTLespecífico de p53 e inibir o crescimento de tumores estabelecidos.
Antígenos virais: Certos vírus são oncogênicos e produtos degenes codificados por estes vírus podem provocar respostas imunes e assimservir como antígenos de câncer. Um exemplo são as proteínas E6 e E7 devírus de papiloma humano tipo 16, que mostrou induzir respostas de linfócito-T citotóxico in vitro.
Antígenos específicos de tumor, antígenos associados a tumore/ou antígenos mutacionais e antígenos virais podem ser usados ou comopeptídeos, antígenos purificados recombinantes de agente único,combinações de antígenos purificados recombinantes e/ou purificados oucombinações de antígenos isolados de células cancerosas ou célulastumorosas como uma vacina para provocar uma resposta imune antitumor.Similarmente, peptídeos, antígenos purificados recombinantes de agenteúnico, combinações de antígenos recombinantes e/ou purificados oucombinações de antígenos isolados de células infectadas com vírus podemser usadas em uma vacina para provocar uma resposta contra célulasinfectadas com vírus. Vacinas terapêuticas também podem estar na formade lisados ou extratos celulares de tumor autólogo, ou lisados ou extratosde linhagens celulares de tumor alogênico. Vacinas terapêuticas tambémpodem estar na forma de uma vacina de DNA para provocar respostaimune contra células cancerosas e infectadas com vírus. Dita vacina deDNA pode consistir de um vetor de expressão codificando o antígenoapenas ou codificando o antígeno junto com uma citocina (eg. GM-CSF,IL-2, IL-12 ou IL-21) que pode estimular a resposta imune contra célulascancerosas e infectadas com vírus. Dita vacina de DNA também podeconsistir de um vírus modificado (eg. vírus da varicela, vírus Vaccinia ouAdenovírus) que contém uma seqüência de DNA codificando o antígenoapenas ou codificando o antígeno junto com uma citocina. Vacinasterapêuticas também podem estar na forma de anticorpos antiidiotipo paraprovocar resposta imune contra células cancerosas e infectadas com vírus.Vacinas terapêuticas também podem estar na forma de células dendríticasautólogas carregadas com ditos antígenos ou peptídeos derivados destesjunto com um agente modificador de DC, tal como citocinas, agonistas dereceptor tipo portagem (TLR), oligodesoxinucleotídeos de CpG, GMCSF,ou proteínas de choque térmico.
Dita provocação mediada por vacina de uma respostaantitumor ou uma resposta contra células infectadas com vírus pode serestimulada administrando adjuvantes, citocinas, agonistas de receptor tipoportagem (TLR), oligodesoxinucleotídeos de CpG, células dendríticas,GM-CSF, ou proteínas de choque térmico. Em uma forma de realização dainvenção, terapia de combinação é realizada administrando Um peptídeoda presente invenção com um ou mais vacinas terapêuticas com ou semadjuvantes, citocinas, agonistas de receptor tipo portagem (TLR),oligodesoxinucleotídeos de CpG, células dendríticas, GM-CSF, ouproteínas de choque térmico.
n) AntimetastáticosCélulas cancerosas metastáticas penetram a matriz extracelular(ECM) e a membrana basal dos vasos sangüíneos para metastasiar para umórgão alvo (sítio ectópico). EMC consiste de proteínas embebidas em umcomplexo de carboidrato (peptidoglicanos de heparam sulfato), e proteases aoredor do tumor são ativas nesta degradação do tecido hospedeiro. Agentesantimetastáticos antagonizam o efeito de tais proteases (e.g. inibidores demetaloproteinase) (Coussens et ai. Science 2002;295:2387-2392). Em umaforma de realização da presente invenção é terapia de combinação com umpeptídeo da presente invenção e um ou mais agentes antimetastáticos, talcomo inibidores de metaloproteinase.
IV: Vacinação interna
"Vacinação interna" e "terapia de vacinação interna" sereferem à morte de células tumorosas induzida por droga ou radiação que levaà provocação de uma resposta imune direcionada para (i) ditas célulastumorosas como um todo ou (ii) partes de ditas células tumorosas incluindo(a) proteínas secretadas, glicoproteínas ou outros produtos, (b) proteínasassociadas à membrana ou glicoproteínas ou outros componentes associadoscom ou inseridos em membranas e (c) proteínas intracelulares ou outroscomponentes intracelulares. A resposta imune pode ser humoral (i.e.mediada por complemento de anticorpo) ou mediada por célula incluindomas não limitada a desenvolvimento de linfócitos-T citotóxicos quereconheceram ditas células tumorosas ou partes destas. Vacinação internasustenta muitas similaridades com outros procedimentos de vacinação eenvolve muitos ou todos os mesmos componentes celulares do sistemahematopoiético e imune com a vantagem de que os imunogenes oucomponentes antigênicos são endógenos e assim representativos para orepertório antigênico de ditas células tumorosas. Vacinação interna podeassim ser considerada vacinação personalizada, que é provocada por usode procedimentos gerais para tratamento de câncer levando a morte decélula tumorosa. Em adição a terapia por radiação, exemplos nãolimitantes de drogas e agentes que podem ser usados para induzir dita mortede célula tumorosa e vacinação interna são agentes quimioterápicosconvencionais, inibidores de ciclo celular, drogas antiangiogênese, anticorposmonoclonais, agentes indutores de apoptose e inibidores de transdução desinal.
"Terapia de combinação de peptídeo da presente invenção evacinação interna" se refere à terapia de combinação onde um peptídeo dapresente invenção é administrado a pacientes com câncer que são tratadoscom vacinação interna. Um peptídeo da presente invenção pode seradministrado antes de, concomitante com ou depois de realizar vacinaçãointerna.
Em uma forma de realização da invenção um peptídeo dapresente invenção está incluído em uma terapia de vacinação interna.
Terapia gênica inclui transferência de material genético parauma célula para alterar transientemente ou permanentemente o fenótipocelular. Diferentes métodos são investigados para liberação de citocinas,antígenos de tumor e moléculas estimuladoras adicionais. No contexto destainvenção, um peptídeo da presente invenção pode ser ou o agente liberado ouco-administrado. Em uma forma de realização desta invenção, um peptídeo dapresente invenção pode ser administrado como a polinucleotídeo. Opolinucleotídeo é descrito em WO 00/53761.
VI: Agentes imunossupressivos/imunomoduladores
r) agentes com influência em residência de linfócito-T e.g.FTY-720
s) Inibidores de calcineurina
Inibidores de calcineurina tal como valspodar, PSC 833, sãoativos para prevenir desenvolvimento de resistência a agentes citotóxicosdevidos aos efeitos inibidores em MDR-1 e p-glicoproteína.t) Inibidores de TOR
Inibidores de TOR atuam bloqueando o TOR de mamífero deserina-treonina quinase (mTOR). Compostos tais como sirolimo, everolimo erapamicinas são agentes antiproliferativos. Eles estão envolvidos nas cascatasde sinalização subjacente e portanto são relevantes no tratamento de todos ostipos de tumor (eg propriedades antiangiogênicas).
Em uma forma de realização, as modalidades de tratamento decâncer mencionadas acima são combinadas com SEQ ID No:2 da mesmamaneira que exemplificado para um peptídeo da presente invenção. Em umaforma de realização, a presente invenção fornece composições farmacêuticascomo discutido abaixo compreendendo um peptídeo com SEQ ID No :2 e umaou mais das modalidades de tratamento de câncer como descrito acima.
COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS
Outro objetivo da presente invenção é fornecer umaformulação farmacêutica compreendendo um peptídeo da presente invençãoque está presente em uma concentração de 10-15 mg/ml a 200 mg/ml, talcomo IO"10 mg/ml - 5 mg/ml, e caracterizada pelo fato de que dita formulaçãotem um pH de 2,0 a 10,0. Opcionalmente, dita formulação pode compreenderum ou mais agentes de câncer adicionais como descrito acima. A formulaçãopode compreender adicionalmente um sistema tampão, conservante(s),agente(s) de tonicidade, agente(s) quelante(s), estabilizantes e tensoativos. Emuma forma de realização da invenção a formulação farmacêutica é umaformulação aquosa, i.e. formulação compreendendo água. Tal formulação étipicamente uma solução ou uma suspensão. Em uma forma de realizaçãoadicional da invenção a formulação farmacêutica é uma solução aquosa. Otermo "formulação aquosa" é definido como uma formulação compreendendopelo menos 50% p/p de água. Da mesma maneira, o termo "solução aquosa" édefinido como uma solução compreendendo pelo menos 50% p/p de água, e otermo "suspensão aquosa" é definido como uma suspensão compreendendopelo menos 50% p/p de água.
Em outra forma de realização a formulação farmacêutica éuma formulação liofilizada, à qual o médico ou o paciente adiciona solventese/ou diluentes antes de uso.
Em outra forma de realização a formulação farmacêutica éuma formulação seca (e.g. Iiofilizada ou pulverizada em atmosfera aquecida)pronta para uso sem qualquer dissolução anterior.
Em um aspecto adicional a invenção se refere a umaformulação farmacêutica compreendendo uma solução aquosa de um peptídeoda presente invenção, e um tampão, caracterizada pelo fato de que ditaproteína OGP está presente em uma concentração de 0,1-100 mg/ml, ecaracterizada pelo fato de que dita formulação tem um pH de cerca de 2,0 acerca de 10,0.
Em uma outra forma de realização da invenção o pH daformulação é selecionado a partir da lista consistindo de 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4,2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3,0, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4,0, 4,1, 4,2,4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0,6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8,7,9, 8,0, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9,0, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6,9,7, 9,8, 9,9, e 10,0.
Em uma forma de realização adicional da invenção o tampão éselecionado a partir do grupo consistindo de acetato de sódio, carbonato desódio, citrato, glicilglicina, histidina, glicina, lisina, arginina, diidrogêniofosfato de sódio, hidrogênio fosfato de dissódico, fosfato de sódio, etris(hidroximetil)-aminometano, bicina, tricina, ácido málico, succinato, ácidomaleico, ácido fumárico, ácido tartárico, ácido aspártico ou misturas destes.Cada um destes tampões específicos constitui uma forma de realizaçãoalternativa da invenção.
Em uma forma de realização adicional da invenção aformulação compreende adicionalmente um conservante farmaceuticamenteaceitável. Em uma forma de realização adicional da invenção o conservante éselecionado a partir do grupo consistindo de fenol, o-cresol, m-cresol, p-cresol, metil p-hidroxibenzoato, propil p-hidroxibenzoato, 2-fenoxietanol,butil phidroxibenzoato, 2-feniletanol, benzil álcool, clorobutanol, etiomerosal, bronopol, ácido benzóico, imiduréia, clorohexidina,dehidroacetato de sódio, clorocresol, etil phidroxibenzoato, cloreto debenzetônio, clorfenesina (3p-clorfenoxipropano-l,2-diol) ou misturasdestes. Em uma forma de realização adicional da invenção o conservanteestá presente em uma concentração de 0,1 mg/ml a 20 mg/ml. Em umaforma de realização adicional da invenção o conservante está presente emuma concentração de 0,1 mg/ml a 5 mg/ml. Em uma forma de realizaçãoadicional da invenção o conservante está presente em uma concentração de5 mg/ml a 10 mg/ml. Em uma forma de realização adicional da invenção oconservante está presente em uma concentração de 10 mg/ml a 20 mg/ml.Cada um destes conservantes específicos constitui uma forma derealização alternativa da invenção. O uso de um conservante emcomposições farmacêuticas é bem conhecido pela pessoa versada. Paraconveniência é feita referência a Remington: The Science and Practice ofPharmacy, 20a edição, 2000.
Em uma forma de realização adicional da invenção aformulação compreende adicionalmente um agente isotônico. Em uma formade realização adicional da invenção o agente isotônico é selecionado a partirdo grupo consistindo de um sal (e.g. cloreto de sódio), um açúcar ou álcool deaçúcar, um aminoácido (e.g. L-glicina, L-histidina, arginina, lisina, isoleucina,ácido aspártico, triptofano, treonina), um alditol (e.g. glicerol (glicerina), 1,2-propanodiol (propilenoglicol), 1,3-propanodiol, 1,3- butanodiol)polietilenoglicol (e.g. PEG400), ou misturas destes. Qualquer açúcar tal comomono, di, ou polissacarídeos, ou glucanas solúveis em água, incluindo porexemplo frutose, glicose, manose, sorbose, xilose, maltose, lactose,sucrose, trealose, dextrana, pululana, dextrina, ciclodextrina, amidosolúvel, hidroxietil amido e carboximetilcelulose-Na podem ser usados.
Em uma forma de realização o aditivo de açúcar é sucrose. Álcool deaçúcar é definido como um hidrocarbono de C4-C8 tendo pelo menos umgrupo -OH e inclui, por exemplo, manitol, sorbitol, inositol, galactitol,dulcitol, xilitol, e arabitol. Em uma forma de realização o aditivo de álcoolde açúcar é manitol. Os açúcares ou álcoois de açúcar mencionados acimapodem ser usados individualmente ou em combinação. Não existe limitefixo para a quantidade usada, contanto que o açúcar ou álcool de açúcarseja solúvel na preparação líquida e não afete adversamente os efeitosestabilizantes atingidos usando os métodos da invenção. Em uma forma derealização, a concentração de açúcar ou álcool de açúcar é entre cerca de 1mg/ml e cerca de 150 mg/ml. Em uma forma de realização adicional dainvenção o agente isotônico está presente em uma concentração de 1 mg/ml a50 mg/ml. Em uma forma de realização adicional da invenção o agenteisotônico está presente em uma concentração de 1 mg/ml a 7 mg/ml. Em umaforma de realização adicional da invenção o agente isotônico está presente emuma concentração de 8 mg/ml a 24 mg/ml. Em uma forma de realizaçãoadicional da invenção o agente isotônico está presente em uma concentraçãode 25 mg/ml a 50 mg/ml. Cada um destes agentes isotônicos específicosconstitui uma forma de realização alternativa da invenção. O uso de umagente isotônico em composições farmacêuticas é bem conhecido pelapessoa versada. Para conveniência é feita referência a Remington: TheScience and Practice of Pharmacy, 20a edição, 2000.
Em uma forma de realização adicional da invenção aformulação compreende adicionalmente um agente quelante. Em uma formade realização adicional da invenção o agente quelante é selecionado apartir de sais de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA), ácido cítrico, eácido aspártico, e misturas destes. Em uma forma de realização adicionalda invenção o agente quelante está presente em uma concentração de0,lmg/ml a 5mg/ml. Em uma forma de realização adicional da invenção oagente quelante está presente em uma concentração de 0,lmg/ml a2mg/ml. Em uma forma de realização adicional da invenção o agentequelante está presente em uma concentração de 2mg/ml a 5mg/ml. Cadaum destes agentes quelantes específicos constitui uma forma de realizaçãoalternativa da invenção. O uso de um agente quelante em composiçõesfarmacêuticas é bem conhecido pela pessoa versada. Para conveniência éfeita referência a Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20aedição, 2000.
Em uma forma de realização adicional da invenção aformulação compreende adicionalmente um estabilizante. O uso de umestabilizante em composições farmacêuticas é bem conhecido pela pessoaversada. Para conveniência é feita referência a Remington: The Science andPractice of Pharmacy, 20a edição, 2000.
Mais particularmente, composições da invenção sãocomposições farmacêuticas líquidas estabilizadas cujos componentesterapeuticamente ativos incluem um polipeptídeo que possivelmente exibeformação agregada durante armazenamento em formulações farmacêuticaslíquidas. Por "formação agregada" é pretendida uma interação física entreas moléculas de polipeptídeos que resulta em formação de oligômeros, quepodem permanecer solúveis, ou grandes agregados visíveis que precipitamda solução. Por "durante armazenamento" é pretendida uma composiçãoou formulação farmacêutica líquida ou que uma vez preparada, não éimediatamente administrada a um sujeito. Preferivelmente, seguindopreparação, ela é embalada para armazenamento, ou em uma formalíquida, em um estado congelado, ou em uma forma seca para posteriorreconstituição em uma forma líquida ou outra forma adequada paraadministração a um sujeito. Por "forma seca" é pretendida umacomposição ou formulação farmacêutica líquida que é seca ou porsecagem por congelamento (i.e., liofilização; veja, por exemplo, Williamsand Polli (1984) J. Parenteral Sei. Technol. 38:48-59), secagem porpulverizador (veja Masters (1991) in Spray-Drying Handbook (5th ed;Longman Scientific and Technical, Essez, U.K.), pp. 491676; Broadhead etal. (1992) Drug Devei. Ind. Pharm. 18:1169-1206; and Mumenthaler et al.(1994) Pharm. Res. 11:12-20), ou secagem ao ar (Carpenter and Crowe(1988) Cryobiology 25:459-470; and Roser (1991) Biopharm. 4:47-53).Formação agregada por um polipeptídeo durante armazenamento de umacomposição farmacêutica líquida pode afetar adversamente atividadebiológica daquele polipeptídeo, resultando em perda de eficáciaterapêutica da composição farmacêutica. Além disso, formação agregadapode causar outros problemas tal como bloqueio de sonda, membranas, oubombas quando a composição farmacêutica contendo polipeptídeo éadministrada usando um sistema de infusão.
As composições farmacêuticas da invenção podemcompreender adicionalmente uma quantidade de uma base de aminoácidosuficiente para diminuir formação agregada pelo polipeptídeo durantearmazenamento da composição. Por "base de aminoácido" é pretendido umaminoácido ou uma combinação de aminoácidos, onde qualquer dadoaminoácido está presente ou em sua forma de base livre ou em sua forma desal. Onde uma combinação de aminoácidos é usada, todos os aminoácidospodem estar presentes em suas formas de base livre, todos podem estarpresentes em suas formas de sal, ou alguns podem estar presentes em suasformas de base livre enquanto outros estão presentes em suas formas de sal.
Em uma forma de realização, aminoácidos para uso em preparação dascomposições da invenção são aqueles portanto uma cadeia lateral carregada,tal como arginina, lisina, ácido aspártico, e ácido glutâmico. Qualquerestereoisômero (i.e., L, D, ou misturas destes) de um aminoácido particular(e.g. glicina, metionina, histidina, imidazol, arginina, lisina, isoleucina, ácidoaspártico, triptofano, treonina e misturas destes) ou combinações destesestereoisômeros, podem estar presentes nas composições farmacêuticas dainvenção contanto que o aminoácido particular esteja presente ou em suaforma de base livre ou sua forma de sal. Em uma forma de realização o L-estereoisômero é usado. Composições da invenção também podem serformuladas com análogos destes aminoácidos. Por "análogo de aminoácido" épretendido um derivado do aminoácido naturalmente ocorrente que causa oefeito desejado de diminuir formação agregada pelo polipeptídeo durantearmazenamento das composições farmacêuticas líquidas da invenção.Análogos de arginina adequados incluem, por exemplo, aminoguanidina,ornitina e N-monoetil L-arginina, análogos de metionina adequados incluemetionina e butionina e análogos de cisteína adequados S-metil-L cisteína.
Como com os outros aminoácidos, os análogos de aminoácidos sãoincorporados nas composições ou em sua forma de base livre ou sua forma desal. Em uma forma de realização adicional da invenção os aminoácidos ouanálogos de aminoácidos são usados em uma concentração, que é suficientepara prevenir ou atrasar agregação da proteína.
Em uma forma de realização adicional da invenção metionina(ou outros aminoácidos sulfuricos ou análogos de aminoácidos) pode seradicionada para inibir oxidação de resíduos de metionina para sulfóxido demetionina quando o polipeptídeo atuando como o agente terapêutico é umpolipeptídeo compreendendo pelo menos um resíduo de metionina susceptívela tal oxidação. Por "inibir" é pretendido acumulação mínima de espéciesoxidadas de metionina com o tempo. Inibir oxidação de metionina resulta e,mmaior retenção do polipeptídeo em sua forma molecular própria. Qualquerestereoisômero de metionina (L, D, ou misturas destes) ou combinaçõesdestes podem ser usadas. A quantidade a ser adicionada deve ser umaquantidade suficiente para inibir oxidação dos resíduos de metionina deforma que a quantidade de sulfóxido de metionina seja aceitável paraagências reguladoras. Tipicamente, isto significa que a composiçãocontém não mais do que cerca de 10% a cerca de 30% de sulfóxido demetionina. Geralmente, isto pode ser atingido adicionando metionina deforma que a proporção de metionina adicionada a resíduos de metioninavarie de cerca de 1:1 acerca de 1000:1, tal como 10:1 acerca de 100:1.
Em uma forma de realização adicional da invenção aformulação compreende adicionalmente um estabilizante selecionado a partirdo grupo de polímeros de alto peso molecular ou compostos de baixo pesomolecular. Em uma forma de realização adicional da invenção o estabilizanteé selecionado a partir de polietilenoglicol (e.g. PEG 3350), polivinil álcool(PVA), polivinilpirrolidona, carboxi/hidroxicelulose ou derivados desta(e.g. HPC, HPC-SL, HPC-L e HPMC), ciclodextrinas, substânciascontendo enxofre como monotioglicerol, ácido tioglicólico e 2-metiltioetanol, e diferentes sais (e.g. cloreto de sódio). Cada um destesestabilizantes específicos constitui uma forma de realização alternativa dainvenção.
As composições farmacêuticas também podem compreenderagentes estabilizantes adicionais,que estimulam adicionalmente estabilidadede um polipeptídeo terapeuticamente ativo nestas. Agentes estabilizantes deinteresse particular para a presente invenção incluem, mas não são limitadosa, metionina e EDTA, que protegem o polipeptídeo contra oxidação demetionina, e um tensoativo não iônico, que protege o polipeptídeo contraagregação associada com congelamento-degelo ou cisalhamento mecânico.
Em uma forma de realização adicional da invenção aformulação compreende adicionalmente um tensoativo. Em uma forma derealização adicional da invenção o tensoativo é selecionado a partir de umdetergente, óleo de ricínio etoxilado, glicerídeos poliglicolisados,monoglicerídeos acetilados, ésteres de ácido graxo de sorbitano, polímeros debloqueio de polioxipropileno-polioxietileno (eg. Poloxâmeros tal comoPluronic® F68, poloxâmero 188 e 407, Triton X-100), ésteres de ácidograxo de polioxietileno sorbitano, derivados de polioxietileno e polietilenotal como derivados alquilados e alcoxilados (tweens, e.g. Tween-20,Tween-40, Tween-80 e Brij-35), monoglicerídeos ou derivados etoxiladosdestes, diglicerídeos ou derivados de polioxietileno destes, álcoois,glicerol, lectinas e fosfolipídios (eg. fosfatidil serina, fosfatidil colina,fosfatidil etanolamina, fosfatidil inositol, difosfatidil glicerol eesfmgomielina), derivados de fosfolipídeos (eg. dipalmitoil ácido fosfatídico)e lisofosfolipídeos (eg. palmitoil lisofosfatidil-L-serina e l-acil-sn-glicero-3-fosfato ésteres de etanolamina, colina, serina ou treonina) e alquil, alcoxil(alquil éster), alcoxi (alquil éter)- derivados de lisofosfatidil efosfatidilcolinas, e.g. derivados de lauroil e miristoil de lisofosfatidilcolina,dipalmitoilfosfatidilcolina, e modificações do grupo de cabeça polar, isto écolinas, etanolaminas, ácido fosfatídico, serinas, treoninas, glicerol,inositol, e o DODAC positivamente carregado, DOTMA, DCP, BISHOP,lisofosfatidilserina e lisofosfatidiltreonina, e glicerofosfolipídeos (eg.cefalinas), gliceroglicolipídeos (eg. galactopiranosídeo),esfingoglicolipídeos (eg. ceramidas, gangliosídeos), dodecilfosfocolina,lisolecitina de ovo de galinha, derivados de ácido fusídico (e.g. tauro-dihidrofusidato de sódio etc.), ácidos graxos de cadeia longa e sais destesC6-C12 (eg. ácido oléico e ácido caprílico), acilcarnitinas e derivados,derivados Na-acilados de lisina, arginina ou histidina, ou derivadosacilados de cadeia lateral de lisina ou arginina, derivados Na-acilados dedipeptídeos compreendendo qualquer combinação de lisina, arginina ouhistidina e um aminoácido neutro ou ácido, derivado Na-acilado de umtripeptídeo compreendendo qualquer combinação de um aminoácidoneutro e dois aminoácidos carregados, DSS (docusato de sódio, registroCAS no [577-11-7]), docusato de cálcio, registro CAS no [128-494]),docusato de potássio, registro CAS no [7491-09-0]), SDS (dodecil sulfatode sódio ou lauril sulfato de sódio), caprilato de sódio, ácido cólico ouderivados deste, ácidos biliares e sais destes e conjugados de glicina outaurina, ácido ursodesoxicólico, colato de sódio, desoxicolato de sódio,taurocolato de sódio, glicocolato de sódio, N-Hexadecil-N,Ndimetil-3-amônio-1-propanossulfonato, tensoativos monovalentes aniônicos (alquil-aril-sulfonatos), tensoativos zwitteriônicos (e.g. N-alquil-N,N-dimetilamônio-1 -propanossulfonatos, 3 -colamido-1 -propildimetilamônio-1-propanossulfonato, tensoativos catiônicos (bases de amônio quaternário)(e.g. brometo de cetil-trimetilamônio, cloreto de cetilpiridínio),tensoativos não iônicos (eg. Dodecil β-D-glucopiranosídeo), poloxaminas(eg. Tetronic's), que são copolímeros de bloqueio tetrafuncionaisderivados de adição seqüencial de óxido de propileno e óxido de etilenopara etilenediamina, ou o tensoativo pode ser selecionado a partir do grupode derivados de imidazolina, ou misturas destes. Cada um destestensoativos específicos constitui uma forma de realização alternativa dainvenção.
O uso de um tensoativo em composições farmacêuticas é bemconhecido pela pessoa versada. Para conveniência é feita referência aRemington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th edição, 2000.
E possível que outros ingredientes possam estar presentes naformulação farmacêutica de peptídeo da presente invenção. Tais ingredientesadicionais podem incluir agentes umectantes, emulsificantes, antioxidantes,agentes de diluição, modificadores de tonicidade, agentes quelantes, íonsmetálicos, veículos oleaginosos, proteínas (e.g., albumina no soro humano,gelatina ou proteínas) e um zwitteríon (e.g., um aminoácido tal como betaína,taurina, arginina, glicina, lisina e histidina). Tais ingredientes adicionais, comcerteza, não devem afetar adversamente a estabilidade geral da formulaçãofarmacêutica da presente invenção.
Composições farmacêuticas contendo um peptídeo da presenteinvenção podem ser administradas e um paciente com necessidade de taltratamento em diversos sítios, por exemplo, em sítios tópicos, por exemplo,sítios de pele e mucosa, em sítios que burlam absorção, por exemplo,administração em uma artéria, em uma veia, no coração, e em sítios queenvolvem absorção, por exemplo, administração na pele, sob a pele, em ummúsculo ou no abdômen.
Administração de composições farmacêuticas de acordo com ainvenção pode ser através de diversas vias de administração, por exemplo,lingual, sublingual, bucal, na boca, oral, no estômago e intestino, nasal,pulmonar, por exemplo, através dos bronquíolos e alvéolos ou umacombinação destes, epidérmica, dérmica, transdérmica, vaginal, retal, ocular,por exemplos através da conjuntiva, uretral, e parenteral a pacientes comnecessidade de um tal tratamento.
Composições da presente invenção podem ser administradasem diversas formas de dosagem, por exemplo, como soluções, suspensões,emulsões, microemulsões, emulsão múltipla, espumas, ungüentos, pastas,emplastros, pomadas, comprimidos, comprimidos revestidos, enxágües,cápsulas, por exemplo, cápsulas duras de gelatina e cápsulas macias degelatina, supositórios, cápsulas retais, gotas, géis, líquidos pulverizáveis, pó,aerossóis, inalantes, gotas oculares, pomadas oftálmicas, enxágües oftálmicos,pessários vaginais, anéis vaginais, pomadas vaginais, solução de injeção,soluções de transformação in situ, por exemplo geleificação in situ,configuração in situ, precipitação in situ, cristalização in situ, solução deinfusão, e implantes.
Composições da invenção podem ser adicionalmentecompostas em, ou acopladas a, por exemplo através de interações covalentes,hidrofóbicas e eletrostáticas, um carreador de droga, sistema de liberação dedroga e sistema avançado de liberação de droga a fim de estimularadicionalmente estabilidade do peptídeo da presente invenção, aumentarbiodisponibilidade, aumentar solubilidade, diminuir efeitos adversos, atingircronoterapia bem conhecida por aqueles versados na arte, e aumentaraquiescência de paciente ou qualquer combinação destes. Exemplos decarreadores, sistemas de liberação de droga e sistemas avançados de liberaçãode droga incluem, mas não são limitados a, polímeros, por exemplo celulose ederivados, polissacarídeos, por exemplo dextrana e derivados, amido ederivados, poli(vinil álcool), polímeros de acrilato e metacrilato, ácidopoliláctico e poliglicólico e co-polímeros de bloqueio destes,polietilenoglicóis, proteínas carreadoras, por exemplo albumina, géis, porexemplo, sistemas termogeleificantes, por exemplo sistemas co-poliméricosde bloqueio bem conhecidos por aqueles versados na arte, micelas,lipossomos, microsferas, nanoparticulados, cristais líquidos e dispersõesdestes, fase L2 e dispersões desta, bem conhecidas por aqueles versados naarte de comportamento de fases em sistemas de lipídio e água, micelaspoliméricas, emulsões múltiplas, auto-emulsificante, auto-microemulsificante,ciclodextrinas e derivados destas, e dendrímeros.
Composições da presente invenção são úteis na formulação desólidos, semisólidos, pó e soluções para administração pulmonar de umpeptídeo da presente invenção, usando, por exemplo um inalador com dosemedida, inalador de pó seco e um nebulizador, todos sendo dispositivos bemconhecidos por aqueles versados na arte.
Composições da presente invenção são especificamente úteisna formulação de sistemas de liberação de droga controlada, sustentada,prolongada, retardada, e de liberação lenta. Mais especificamente, mas nãolimitado a, composições são úteis em formulação de sistemas parenterais deliberação controlada e liberação sustentada (ambos sistemas levando a umaredução de muitas vezes em número de administrações), bem conhecidos poraqueles versados na arte. Ainda mais preferivelmente, são sistemas deliberação controlada e liberação sustentada administrados subcutaneamente.Sem limitar o escopo da invenção, exemplos de sistema de liberaçãocontrolada e composições úteis são hidrogéis, géis oleaginosos, cristaislíquidos, micelas poliméricas, microsferas, nanopartículas.
Métodos para produzir sistemas de liberação controlada úteispara composições da presente invenção incluem, mas não são limitados a,cristalização, condensação, co-cristalização, precipitação, co-precipitação,emulsificação, dispersão, homogeneização em pressão alta, encapsulação,secagem por pulverizador, microencapsulação, coacervação, separação defases, evaporação de solvente para produzir microsferas, extrusão eprocessos de fluidos supercríticos. Referência geral é feita a Handbook ofPharmaceutical Controlled Release (Wise, D.L., ed. Mareei Dekker, NovaIorque, 2000) e Drug and the Pharmaceutical Sciences vol. 99: ProteinFormulation and Delivery (MacNally, E.J., ed. Mareei Dekker, Novalorque, 2000).
Administração parenteral pode ser realizada por injeçãosubeutânea, intramuscular, intraperitoneal ou intravenosa por meio de umaseringa, opcionalmente uma seringa tipo caneta. Alternativamente,administração parenteral pode ser realizada por meio de uma bomba deinfusão. Uma opção adicional é uma composição que pode ser umasolução ou suspensão para a administração do peptídeo da presenteinvenção na forma de um líquido pulverizável nasal ou pulmonar. Comouma opção ainda adicional, as composições farmacêuticas contendo opeptídeo da presente invenção podem ser também adaptadas paraadministração transdérmica, e.g. por uma injeção livre de agulha ou apartir de um esparadrapo, opcionalmente um esparadrapo iontoforético, outransmucosal, e.g. administração bucal.
O termo "formulação estabilizada" se refere a uma formulaçãocom estabilidade física aumentada, estabilidade química aumentada ouestabilidade física e química aumentada.
O termo "estabilidade física" da formulação protéica comousado neste lugar se refere à tendência da proteína para formar agregadosbiologicamente inativos e/ou insolúveis da proteína como um resultado deexposição da proteína a estresses termo-mecânicos e/ou interação cominterfaces e superfícies que são desestabilizantes, tal como superfícies einterfaces hidrofóbicas. Estabilidade física das formulações protéicasaquosas é avaliada por meio de inspeção visual e/ou medidas de turbidezdepois de expor a formulação carregada em recipientes adequados (e.g.cartuchos ou frascos) a estresse mecânico/físico (e.g. agitação) emdiferentes temperaturas por vários períodos de tempo. Inspeção visual dasformulações é realizada em uma luz de foco definido com um fundoescuro. A turbidez da formulação é caracterizada por um escore visualclassificando o grau de turbidez por exemplo em uma escala de 0 a 3 (umaformulação mostrando nenhuma turbidez corresponde a um escore visual0, e uma formulação mostrando turbidez visual na luz do dia corresponde aescore visual 3). Uma formulação é classificada instável fisicamente comrespeito à agregação protéica, quando ela mostra turbidez visual na luz dodia. Alternativamente, a turbidez da formulação pode ser avaliada pormedidas simples de turbidez bem conhecidas pela pessoa versada.
Estabilidade física das formulações protéicas aquosas também pode seravaliada usando um agente espectroscópico ou sonda do estadoconformacional da proteína. A sonda é preferivelmente uma moléculapequena que se liga preferencialmente a um confôrmero não nativo daproteína. Um exemplo de uma sonda espectroscópica molecular pequenade estrutura protéica é Tioflavina T. Tioflavina T é um corantefluorescente que foi amplamente usado para a detecção de fibrilasamilóides. Na presença de fibrilas, e talvez outras configurações protéicastambém, Tioflavina T gera um novo máximo de excitação à cerca de 450nm e emissão estimulada a cerca de 482 nm quando ligada a uma formaprotéica de fibrila. Tioflavina T é essencialmente não fluorescente noscomprimentos de onda.
Outras moléculas pequenas podem ser usadas como sondas dasmudanças em estrutura protéica de estados nativos para não nativos. Porexemplo as sondas de "trecho hidrofóbico" que se ligam preferencialmente atrechos hidrofóbicos expostos de uma proteína. Os trechos hidrofóbicosgeralmente estão enterrados dentro da estrutura terciária de uma proteína emseu estado nativo, mas se tornam expostos na medida em que uma proteínacomeça a se desdobrar ou desnaturar. Exemplos destas sondasespectroscópicas moleculares pequenas são corantes aromáticoshidrofóbicos, tal como antraceno, acridina, fenantrolina ou os semelhantes.
Outras sondas espectroscópicas são complexos de metal e aminoácido, talcomo complexos de metal cobalto de aminoácidos hidrofóbicos, tal comofenilalanina, leucina, isoleucina, metionina, e valina, ou os semelhantes.
O termo "estabilidade química" da formilação protéica comousado neste lugar se refere a mudanças químicas covalentes na estruturaprotéica levando a formação de produtos de degradação química com menospotência biológica potencial e/ou propriedades imunogênicas potenciaisaumentadas comparado com a estrutura protéica nativa. Vários produtos dedegradação química podem ser formados dependendo do tipo e natureza daproteína nativa e do ambiente ao qual a proteína é exposta. Eliminação dedegradação química mais provavelmente não pode ser completamenteevitada e quantidades crescentes de produtos de degradação químicafreqüentemente são vistas durante armazenamento e uso da formulaçãoprotéica como bem sabido pela pessoa versada na arte. A maioria dasproteínas é propensa a desamidação, um processo no qual o grupo amidada cadeia lateral em resíduos de glutaminil ou asparaginil é hidrolisadopara formar um ácido carboxílico livre. Outras vias de degradaçãoenvolvem formação de produtos de transformação de alto peso molecularonde duas ou mais moléculas de proteínas são covalentemente ligadas umaa outra através de transamidação e/ou interações dissulfeto levando àformação de produtos de degradação de dímero, oligômero e polímerocovalentemente ligados (Stability of Protein Pharmaceuticals, Ahern. T.J.& Manning M.C., Plenum Press, Nova Iorque 1992). Oxidação (de porexemplo resíduos de metionina) pode ser mencionada como outra variantede degradação química. A estabilidade química da formilação protéicapode ser avaliada medindo a quantidade dos produtos de degradaçãoquímica em vários momentos de tempo depois de exposição a diferentescondições ambientais (a formação de produtos de degradaçãofreqüentemente pode ser acelerada por exemplo aumentando temperatura).
A quantidade de cada produto de degradação individual freqüentemente é15 determinada por separação dos produtos de degradação dependendo detamanho e/ou carga de molécula usando várias técnicas de cromatografia(e.g. SEC-HPLC e/ou RP-HPLC).
Por conseguinte, como descrito acima, uma "formulaçãoestabilizada" se refere a uma formulação com estabilidade física aumentada,estabilidade química aumentada ou estabilidade física e química aumentada.
Em geral, uma formulação deve ser estável durante uso e armazenamento (emconformidade com uso recomendado e condições de armazenamento) até adata de validade ser atingida.
Em uma forma de realização da invenção a formulaçãofarmacêutica compreendendo o peptídeo da presente invenção é estável pormais do que 6 semanas de uso e por mais do que 3 anos de armazenamento.
Em outra forma de realização da invenção a formulaçãofarmacêutica compreendendo o peptídeo da presente invenção é estável pormais do que 4 semanas de uso e por mais do que 3 anos de armazenamento.Em uma forma de realização adicional da invenção aformulação farmacêutica compreendendo o peptídeo da presente invenção éestável por mais do que 4 semanas de uso e por mais do que dois anos dearmazenamento.
Em uma forma de realização ainda adicional da invenção aformulação farmacêutica
compreendendo o peptídeo da presente invenção é estável pormais do que 2 semanas de uso e por mais do que dois anos dearmazenamento.
EXEMPLOS
Teste de atividade de variantes de IL-21
hIL-21 tipo selvagem e proteínas mutantes foram analisadasusando em ensaio de atividade celular usando um sistema repórter deluciferase regulado imediatamente.
O ensaio emprega a linhagem murina de célula Baf3, que foiestavelmente transfectada para expressar o IL-21 R humano e um construtorepórter de luciferase ligado imediatamente. As células Baf3 expressamendogenamente a 'cadeia comum' gama C que constitui um componenteessencial do complexo de sinalização do receptor de IL-21. A linhagem decélula repórter Baf3/hIL-21 R foi subalimentada em meio livre de IL-3 por 6horas antes de estimulação. Uma análise de dose e resposta foisubseqüentemente realizada usando estimulação das células por 24 horas.
Figura 1 representa uma análise de proteínas expressastransientemente em células HEK293 FS (Stengaard-Pedersen et al.N.Engl.J.Med. (2003) 349: 554; Invitrogen). As proteínas foram analisadas naforma de sobrenadantes brutos coletados 48 horas após transfecção.
Figura 2 representa uma análise de proteínas hIL-21 tiposelvagem e mutantes analisadas como proteínas purificadas. Chim-IL21 é aIL-21 sub[K77 - T92] (SEQ ID No.7). Aqui construtos foram preparados paraexpressão em E.coli e purificados através de redobramento de proteínaspresentes em corpos de inclusão.
Teste de atividade alternativo de variantes de IL-21
Os cDNAs codificando as variantes de IL-21 são analisadospor expressão transiente seguida por análise de atividade em um sistemarepórter regulado imediatamente.
Os cDNAs são transfectados em células HEK293 FreeStyle(Stengaard-Pedersen et al. N.Engl.J.Med. (2003) 349: 554; Invitrogen).Sobrenadantes são coletados de meio livre de soro em 48 horas apóstransfecção e analisados em um bioensaio celular. O ensaio emprega alinhagem murina de célula BaB5 estavelmente transfectada para expressar oIL-21 R humano e um construto repórter de luciferase ligado imediatamente.
As células Baf3 expressam endogenamente o componente yc do complexoativo de receptor de IL-21. A linhagem de célula repórter BaB/hIL-21 R ésubalimentada em meio livre de IL-3 por 18 horas antes de estimulação. Umaanálise de dose e resposta é realizada usando sobrenadante bruto dostransfectantes HEK293-FS. Duração da estimulação é de quatro horas.
MÉTODOS FARMACOLÓGICOS
O método in vitro seguinte é usado para investigar estimulaçãode ADCC.
Células alvo expressando o antígeno alvo são incubadas com oanticorpo contra o antígeno alvo e células mononucleares de sangueperiférico, células NK5 neutrófilos, macrófagos, monócitos ou DC comocélulas efetoras. Células efetoras podem ser pré-incubadas por 1 a 10 diascom IL-21, ou IL-21 pode ser adicionada à cultura contendo tanto célulasefetoras como alvo. Outros compostos que podem estimular ADCC podemser incluídos na cultura ou cultura de pré-incubação. Eficiência de ADCC serámedida como liberação específica de 51Cr das células alvo ou como atividadede LDH como previamente descrito (Golay et al., Haematologica88:10021012, 2003 ou Liu et al., Câncer Immun 2:13, 2002 ou Watanabe etal., Breast CancerRes Treat 53:199-207, 1999).
Determinação de ADCC usando um ensaio baseado emcitometria de fluxo como previamente descrito (Flieger et. al., JImmunother23:480-486, 2000 ou Flieger et al., JImmunol Methods 180:113,1995 ou Flieger et al., Hybridoma 18:63-68, 1999).
Determinação de ADCP através de ensaio de fluorescência deduas cores como descrito em Watanabe et al., Breast Câncer Res Treat53:199-207, 1999 ou Akewanlop et al., CancerRes 61:4061-4065, 2001.
Um método in vivo para determinar a estimulação de ADCC édescrito abaixo:
Células de leucemia ou células transformadas são injetadasi.v., i.p. ou s.c. em animais singênicos seguido por tratamento com oanticorpo terapêutico reconhecendo um antígeno expresso pelas células deleucemia ou células transformadas, com ou sem terapia de IL-21. Pontosfinais são carga e sobrevivência de tumor. O envolvimento de ADCC pode serconfirmado pelo uso de anticorpos bloqueando FcyRI ou pelo uso decamundongos deficientes em FcyRL
Um método in vivo para investigar estimulação de ADCC paracélulas alvo de origem humana é previamente descrito em Zhang et al., Blood102:284-288, 2003 ou Flavell et al. Câncer Res 58:5787-5794, 1998. Deacordo com estes modelos células de leucemia humana ou célulastransformadas são injetadas i.v., i.p. ou s.c. em camundongos SCID seguidopor tratamento com o anticorpo terapêutico reconhecendo um antígenoexpresso pelas células de leucemia ou células transformadas, com ou semterapia de IL-21.
Linhagens de células tumorosas, e.g. células de CarcinomaPulmonar de Lewis (LLC) ou células de melanoma B16-F10 ou células decarcinoma de célula renal ou células de carcinoma de mama 4T1 sãoimplantadas s.c. em camundongos singênicos. Quando os tumores se tornampalpáveis, os camundongos são tratados com IL-21 em combinação comoutros agentes anticâncer como descrito neste pedido. A metodologia édescrita em Palumbo et al., Câncer Res. 62:6966-6972 (2002); Bove et al.,Biochem Biophys Res Commun 291:1001-1005 (2002); Wigginton et al., JImmunol 169:4467-4474 (2002).
Linhagens de células tumorosas, e.g. células de CarcinomaPulmonar de Lewis (LLC) ou células de melanoma B16-F10 são implantadass.c. em camundongos singênicos. O tumor primário é removido depois de 1-4semanas, e os camundongos são tratados com IL-21 em combinação comoutros agentes anticâncer como descrito neste pedido. A metodologia édescrita em Palumbo et al., Câncer Res. 62:6966-6972 (2002).
Linhagens de células tumorosas, e.g. células de CarcinomaPulmonar de Lewis (LLC) ou células de melanoma B16-F10 ou células decarcinoma de célula renal são injetadas i.v. em camundongos singênicos e oscamundongos são tratados com IL-21 em combinação com outros agentesanticâncer como descrito neste pedido. A metodologia é descrita emAmirkhosravi et al., Thromb.Haemost. 87:930936 (2002);Hosaka et al.,Câncer Lett 161:231-240 (2000); Maini et al., In vivo 17:119-123 (2003).
Células de carcinoma de célula renal são injetadas intra-renalmente em um rim em camundongos singênicos. O tumor primário éremovido depois de 1-4 semanas, e os camundongos são tratados com IL-21em combinação com outros agentes anticâncer como descrito neste pedido. Ametodologia é descrita em Murphy et al., Jlmmunol 170:2727-2733 (2003).

Claims (44)

1. Peptídeo, caracterizado pelo fato de compreender:a) uma primeira seqüência obtida deletando e/ou substituindoum ou mais aminoácidos na região consistindo de aminoácido No. 65 aaminoácido No. 96 de SEQ ID No:2; oub) uma seqüência obtida substituindo conservativamente até 10aminoácidos na dita primeira seqüência.
2. Peptídeo de acordo com reivindicação 1, caracterizado pelofato de compreender a seqüência obtida deletando e/ou substituindo um oumais aminoácidos na região consistindo de aminoácido No. 83 a aminoácidoNo. 86 de SEQ ID No:2.
3. Peptídeo de acordo com reivindicação 1, caracterizado pelofato de compreender a seqüência obtida deletando e/ou substituindo um oumais aminoácidos na região consistindo de aminoácido No. 83 a aminoácidoNo. 88 de SEQIDNo:2.
4. Peptídeo de acordo com reivindicação 1, caracterizado pelofato de compreender a seqüência obtida deletando e/ou substituindo um oumais aminoácidos na região consistindo de aminoácido No. 83 a aminoácidoNo. 90 de SEQID No:2.
5. Peptídeo de acordo com reivindicação 1, caracterizado pelofato de compreender a seqüência obtida deletando e/ou substituindo um oumais aminoácidos na região consistindo de aminoácido No. 82 a aminoácidoNo. 88 de SEQIDNo:2.
6. Peptídeo de acordo com reivindicação 1, caracterizado pelofato de compreender a seqüência obtida deletando e/ou substituindo um oumais aminoácidos na região consistindo de aminoácido No. 77 a aminoácidoNo. 92 de SEQ ID No:2.
7. Peptídeo de acordo com reivindicação 1, caracterizado pelofato de compreender a seqüência obtida deletando e/ou substituindo um oumais aminoácidos na região consistindo de aminoácido No. 71 a aminoácidoNo. 92 de SEQ ID No:2.
8. Peptídeo de acordo com reivindicação 1, caracterizado pelofato de compreender a seqüência obtida deletando e/ou substituindo um oumais aminoácidos na região consistindo de aminoácido No. 65 a aminoácidoNo. 92 de SEQ ID No:2.
9. Peptídeo de acordo com reivindicação 1, caracterizado pelofato de compreender a seqüência obtida deletando e/ou substituindo um oumais aminoácidos na região consistindo de aminoácido No. 77 a aminoácidoNo. 96 de SEQ ID No:2.
10. Peptídeo de acordo com reivindicação 2, caracterizado porobtido deletando e/ou substituindo um ou mais aminoácidos na regiãoconsistindo de aminoácido No. 83 a aminoácido No. 86 de SEQID No:2.
11. Peptídeo de acordo com reivindicação 3, caracterizado porobtido deletando e/ou substituindo um ou mais aminoácidos na regiãoconsistindo de aminoácido No. 83 a aminoácido No. 88 de SEQID No:2.
12. Peptídeo de acordo com reivindicação 4, caracterizado porobtido deletando e/ou substituindo um ou mais aminoácidos na regiãoconsistindo de aminoácido No. 83 a aminoácido No. 90 de SEQID No:2.
13. Peptídeo de acordo com reivindicação 5, caracterizado porobtido deletando e/ou substituindo um ou mais aminoácidos na regiãoconsistindo de aminoácido No. 82 a aminoácido No. 88 de SEQID No:2.
14. Peptídeo de acordo com reivindicação 6, caracterizado porobtido deletando e/ou substituindo um ou mais aminoácidos na regiãoconsistindo de aminoácido No. 77 a aminoácido No. 92 de SEQID No:2.
15. Peptídeo de acordo com reivindicação 7, caracterizado porobtido deletando e/ou substituindo um ou mais aminoácidos na regiãoconsistindo de aminoácido No. 71a aminoácido No. 92 de SEQID No:2.
16. Peptídeo de acordo com reivindicação 8, caracterizado porobtido deletando e/ou substituindo um ou mais aminoácidos na regiãoconsistindo de aminoácido No. 65 a aminoácido No. 92 de SEQ ID No:2.
17. Peptídeo de acordo com reivindicação 9, caracterizado porobtido deletando e/ou substituindo um ou mais aminoácidos na regiãoconsistindo de aminoácido No. 77 a aminoácido No. 96 de SEQID No:2.
18. Peptídeo de acordo com reivindicação 1, caracterizadopelo fato de ser selecionado a partir de:A) SEQ ID No: 3, SEQ ID No: 4, SEQ ID No: 5, e SEQ IDNo: 6; eB) os peptídeos de A) com uma Met N terminal adicional; eC) os peptídeos de A)-B), em que até 10 aminoácidos foramconservativamente substituídos.
19. Peptídeo de acordo com reivindicação 1, caracterizadopelo fato de ser selecionado a partir de:D) SEQ ID No: 7, SEQ ID No: 8, SEQ ID No: 9, e SEQ IDNo: 10; eE) os peptídeos de D) com uma Met N terminal adicional; eF) os peptídeos de D-E), em que até 10 aminoácidos foramconservativamente substituídos.
20. Peptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1a 19, caracterizado pelo fato de que a potência do peptídeo é pelo menos 80%da potência de IL-21 tipo selvagem em um ou mais dos ensaios como descritonos Exemplos.
21. Peptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1a 19, caracterizado pelo fato de que a potência do peptídeo é pelo menossubstancialmente similar à potência de IL-21 tipo selvagem em um ou maisdos ensaios como descrito nos Exemplos.
22. Peptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1a 19, caracterizado pelo fato de que a potência do peptídeo é substancialmentemaior do que a potência de IL-21 tipo selvagem em um ou mais dos ensaioscomo descrito nos Exemplos.
23. Peptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1a 19, caracterizado pelo fato de que a potência do peptídeo é pelo menos 2vezes maior do que a potência de IL-21 tipo selvagem em um ou mais dosensaios como descrito nos Exemplos.
24. Peptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1a 19, caracterizado pelo fato de que a potência do peptídeo is pelo menos 5vezes maior do que a potência de IL-21 tipo selvagem em um ou mais dosensaios como descrito nos Exemplos.
25. Peptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1a 19, caracterizado pelo fato de que a potência do peptídeo é cerca de 10vezes maior do que a potência de IL-21 tipo selvagem em um ou mais dosensaios como descrito nos Exemplos.
26. Peptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1a 22, caracterizado por ser para uso em terapia.
27. Peptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1a 22, caracterizado por ser para uso no tratamento de câncer.
28. Peptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1a 22, caracterizado por ser para o tratamento de câncer.
29. Peptídeo de acordo com reivindicação 25 ou reivindicação-26, caracterizado pelo fato de que o câncer é selecionado a partir de distúrbiosneoplásicos não metastáticos e metastáticos tal como melanoma maligno,cânceres de pele não melanoma, carcinoma de célula renal, câncer da cabeça epescoço, câncer do sistema endócrino, câncer ovariano, câncer de pulmão decélula pequena, câncer de pulmão de célula não pequena, câncer de mama,câncer esofágico, câncer gastrintestinal superior, câncer colo-retal, câncer defígado e duto biliar, câncer pancreático, câncer de próstata, câncer de bexiga,câncer testicular, câncer cervical, câncer endometrial, sarcomas de ossos etecido mole, câncer do sistema nervoso central, linfoma, leucemia, e câncerde origem primária desconhecida.28. Peptídeo de acordo com reivindicação 27, caracterizadopelo fato de que o câncer é melanoma maligno.29. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato decompreender um peptídeo como definido em qualquer uma das reivindicações-1 a 22.
30. Composição de acordo com reivindicação 29, caracterizadapelo fato de que dita composição compreende adicionalmente um agente decâncer.
31. Método para o tratamento de câncer, caracterizado pelofato de compreender a administração de uma quantidade eficaz de umpeptídeo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 22,opcionalmente em combinação com um agente de câncer, a um paciente comnecessidade desta.
32. Método de acordo com reivindicação 31, caracterizadopelo fato de que o câncer é selecionado a partir de distúrbios neoplásicos nãometastáticos e metastáticos tal como melanoma maligno, cânceres de pele nãomelanoma, carcinoma de célula renal, câncer da cabeça e pescoço, câncer dosistema endócrino, câncer ovariano, câncer de pulmão de célula pequena,câncer de pulmão de célula não pequena, câncer de mama, câncer esofágico,câncer gastrintestinal superior, câncer colo-retal, câncer de fígado e dutobiliar, câncer pancreático, câncer de próstata, câncer de bexiga, câncertesticular, câncer cervical, câncer endometrial, sarcomas de ossos e tecidomole, câncer do sistema nervoso central, linfoma, leucemia, e câncer deorigem primária desconhecida.
33. Método de acordo com reivindicação 32, caracterizadopelo fato de que o câncer é melanoma maligno.
34. Uso de um peptídeo como definido em qualquer uma dasreivindicações 1 a 22, caracterizado por ser na fabricação de um medicamentopara o tratamento de câncer.
35. Uso de acordo com reivindicação 34, caracterizado pelofato de que o câncer é selecionado a partir de distúrbios neoplásicos nãometastáticos e metastáticos tal como melanoma maligno, cânceres de pele nãomelanoma, carcinoma de célula renal, câncer da cabeça e pescoço, câncer dosistema endócrino, câncer ovariano, câncer de pulmão de célula pequena,câncer de pulmão de célula não pequena, câncer de mama, câncer esofágico,câncer gastrintestinal superior, câncer colo-retal, câncer de fígado e dutobiliar, câncer pancreático, câncer de próstata, câncer de bexiga, câncertesticular, câncer cervical, câncer endometrial, sarcomas de ossos e tecidomole, câncer do sistema nervoso central, linfoma, leucemia, e câncer deorigem primária desconhecida.
36. Uso de acordo com reivindicação 35, caracterizado pelofato de que o câncer é melanoma maligno.
37. Uso de acordo com reivindicação 34, caracterizado pelofato de que o câncer é selecionado a partir de distúrbios neoplásicos nãometastáticos e metastáticos tal como melanoma maligno, cânceres de pele nãomelanoma, carcinoma de célula renal, câncer da cabeça e pescoço, câncer dosistema endócrino, câncer ovariano, câncer de pulmão de célula pequena,câncer de pulmão de célula não pequena, câncer de mama, câncer esofágico,câncer gastrintestinal superior, câncer colo-retal, câncer de fígado e dutobiliar, câncer pancreático, câncer de próstata, câncer de bexiga, câncertesticular, câncer cervical, câncer endometrial, sarcomas de ossos e tecidomole, câncer do sistema nervoso central, linfoma, leucemia, e câncer deorigem primária desconhecida.
38. Uso de acordo com reivindicação 34, caracterizado pelofato de que o câncer é melanoma maligno.
39. Construto de ácido nucleico, caracterizado pelo fato decodificar um peptídeo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 22.
40. Vetor, caracterizado pelo fato de compreender o construtode ácido nucleico como definido na reivindicação 39.
41. Hospedeiro, caracterizado pelo fato de compreender oconstruto de ácido nucleico como definido na reivindicação 39, ou o vetorcomo definido na reivindicação 40.
42. Anticorpo, caracterizado pelo fato de ser contra umpeptídeo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 22.
43. Anticorpo, caracterizado pelo fato de se ligarespecificamente a um peptídeo como definido em qualquer uma dasreivindicações 1 a 22.
44. Anticorpo de acordo com reivindicação 42, caracterizadopelo fato de não se ligar a IL-21 tipo selvagem.
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