RS54928B1 - Poboljšano lečenje multiplog mijeloma - Google Patents

Abstract

Aplidin za primenu u metodi za lečenje multiplog mijeloma pomoću kombinovane terapije korišćenjem Aplidina u sinergističkoj kombinaciji sa deksametazonom.Prijava sadrži još 3 patentna zahteva.

Description

OBLAST PREDMETNOG PRONALASKA

Predmetni pronalazak odnosi se na sinergističku kombinaciju Aplidina sa deksametazonom za primenu u tečenju multipiog mijeloma.

STANJE TEHNIKE

Aplidin (Dehidrodidemnin B) je ciklični depsipeptid koji je izolovan iz mediteranskog morskogplaštaša, Aplidium albicans,i predmet je WO 9104985. Povezan je sa jedinjenjima poznatim kao didemnini, i ima sledeću strukturu:

Više informacija o Aplidinu, analozima Aplidina, njihovim primenama, formulacijama i sintezi može biti pronađeno u patentnim prijavama WO 99 42125, WO 01 35974, WO01 76616, WO 02 30441, WO 02 02596, WO 03 33013 i WO 2004 080477.

I u prekliničkim studijama na životinjama i u fazi I kliničkih studija na ljudima Aplidin je pokazan da ima citotoksični potencijal prema širokom spektru vrsta tumora uključujući leukemiju i limfom. Videti na primer: Faircloth, G. et al.: "Dehvdrodtdemnin B (DDB) a new marine derived antikancer agent with activitv against experimental tumour modcls", 9th NCI-EORTC Symp. New Drugs Kancer Ther. (March 12-15, Amsterdam) 1996, Abst111;

Faircloth, G. et al.: "Preclinical characterization of Aplidin, a new marine antikancer depsipeptide", Proc. Amer. Assoc. Kancer Res, 1997, 38: Abst 692;

Depenbrock H, Peter R, Faircloth GT. Manzanares I, Jimeno J, Hanauske AR.: "In vitro activitv of Aplidin, a new marine-derived antikancer compound, on freshlv explanted clonogenic human tumour ćelija and haematopoietic precursor ćelija" Br. J. Kancer, 1998; 78: 739-744;

Faircloth G, Grant W, Nam S, Jimeno J, Manzanares I, Rinehart K.: "Raspored-dependencv of Aplidin, a marine depsipeptide with antitumor activitv", Proc. Am. Assoc. Kancer Res. 1999; 40:394;

Broggini M, Marchini S, D'Incalci M, Tarabolerti G, Giavazzi R, Faircloth G, Jimeno J.: "Aplidin blocks VEGF secretion and VEGF/VEGF-R1 autocrine loop in a human leukemic ćelijska linija", Clin. Kancer Res. 2000; 6 (suppl): 4509;

Erba E, Bassano L, Di Liberti G, Muradore I, Chiorino G, Ubezio P, Vignati S, Codegoni A, Desiderio MA, Faircloth G, Jimeno J and D'Incalci M.: "Ccll cycle phase perturbations and apoptosis in tumour ćelija induced by Aplidin", Br. J. Kancer 2002; 86: 1510-1517;

Paz-Ares L, Anthony A, Pronk L, Twelves C, Alonso S, Cortes-Funes H, Cei I i N, Gomez C, Lopez-Lazaro L, Guzman C, Jimeno J, Kaye S.: "Phase I clinical and pharmacokinetic study of Aplidin, a nevv marine diđemnin, administered as 24-hour infusion weekly" Clin. Kancer Res. 2000; 6 (suppl): 4509;

Ravmond E, Ady-Vago N, Baudin E, Ribrag V, Faivre S, Lecot F, Wright T, Lopcz Lazaro L, Guzman C, Jimeno J, Ducreux M, Le Chevalier T, Armand JP.: "A phase I and pharmacokinetic study of Aplidin given as a 24-hour continuous infusion every other week in patients with solid tumor and limfom", Clin. Kancer Res. 2000; 6 (suppl): 4510; Maroun J, Belanger K, Seymour L, Soulieres D, Charpentier D, Goe] R, Stewart D, Tomiak E, Jimeno J, Matthews S. :"Phase I study of Aplidin in a 5 day bolus q 3 weeks in patients with solid tumors and limfoms", Clin. Kancer Res. 2000; 6 (suppl): 4509;

lzquterdo MA, Bowman A, Martinez M, Cicchella B, Jimeno J, Guzman C, Germa J, Smyth J.: "Phase 1 trial of Aplidin given as a 1 hour intravenous weekly infusion in patients vvith advanced solid tumors and limfom", Clin. Kancer Res. 2000; 6 (suppl): 4509.

MehanistiČke studije ukazuju da Aplidin može da blokira VEGF sekreciju iz ALL-MOLT4 ćelija i in vitro citotoksična aktivnost pri niskim koncentracijama (5nM) je primećena u AML i ALL uzorcima pedijatrijskih pacijenata sa de novo ili relapsiranom ALL i AML. Aplidin izgleda da indukuje i Gl i G2 zastoj u ćelijama leukemije koje su in vitro tretirane lekom. Nezavisno od negativne regulacije VEGF receptora, malo toga je poznato u vezi sa načinom (načinima) delovanja Aplidina.

U fazi I kliničkih studija sa Aplidinom, L-karnitin je dat kao 24-časovni pretretman ili koadministriran da se spreči mijelotoksićnost, videti na primer WO 02 30441. Koadministracija L-karnitina je pokazana da je u stanju da poboljša oporavak mišićne toksičnosti izazvane Jekovima i omogućila je povećanje doze Aplidina.

Ranije, in vitro i in vivo eseji sprovedeni sa Aplidinom u kombinaciji sa drugim antikancerskim agensima pokazali su da su testirane kombinacije lekova bile korisne u kombinovanoj terapiji za lecenje leukemije i limfoma. U WO 2004 080421, Aplidin je specifično evaluiran u kombinaciji sa metotreksatom. citozin arabinozidom, mitoksantronom, vinblastinom, metilprednizolonom i doksorubicinom za lečenje leukemije i limfoma.

WO 02/30441 opisuje fazu I kliničke studije Aplidina datog zajedno sa mišićno-skeletnim protektorom, kao stoje L-karnitin za lečenej kancera. WO 01/35974 takođe opisuje Fazu I kliničkih studija Aplidina, gde su obezbeđeni nekoliko doza i protokola za lečenje kancera.

WO 03/033013 opisuje daje nekolikoin vivotestova koji su spovedeni sa Aplidinom bilo korisno za lečenje kancera pankreasa.

WO 2004/080477 opisuje da je nekolikoin vitrotestova koji su spovedeni sa Aplidinom bilo korisno za lečenje multiplog mijeloma.

S obzirom daje kancer vodeći uzrok smrti kod životinja i ljudi, nekoliko pokušaja je preduzeto i još se preduzima u cilju dobijanja antitumorske terapije koja bi imala dejstva i bila bezbedna da se administrira pacijentima obolelim od kancera. Problem koji treba rešiti predmetnim pronalaskom je obezbediti antitumorske terapije koje su korisne u lečenju kancera.

REZIME PREDMETNOGPRONALASKA

Predmetni pronalazak je stavljen na uvid javnosti u priloženim patentnim zahtevima.

DETALJAN OPIS SLIKA

Slika 1.Primer analize linearne regresije koja je metoda za otkrivanje prisustva sinergije.

Slika2. Podaci o in vitro aktivnosti Aplidina (Aplidine®) u kombinaciji sa paklitakselom (Taxol<®>) na SKBR3 ćelijama.

Slika 3. Podaci o in vitro aktivnosti Aplidina (Aplidine®) u kombinaciji sa paklitakselom (Taxol<®>) na MOLT3 ćelijama.

Slika 4. Podaci o in vitro aktivnosti Aplidina (Aplidine®) u kombinaciji sa paklitakselom (TaxoI<®>) na PC3 ćelijama.

Slika5. Podaci o in vitro aktivnosti Aplidina (Aplidine®) u kombinaciji sa paklitakselom (Taxol<®>) na HL60 ćelijama.

Slika6. Podaci o in vitro aktivnosti Aplidina (Aplidine®) u kombinaciji sa paklitakselom (Taxol<®>) na MX1 ćelijama.

Slika7. Podaci o in vitro aktivnosti Aplidina (Aplidine®) u kombinaciji sa paklitakselom (Taxol<®>) na A549 ćelijama.

Slika 8. Podaci o in vitro aktivnosti Aplidina (Aplidine®) u kombinaciji sa doksorubicinom (DOX) na A549 ćelijama.

Slika9. Podaci o in vitro aktivnosti Aplidina (Aplidine®) u kombinaciji sa doksorubicinom (DOX) na HT29 ćelijama.

Slika 10.Podaci o in vitro aktivnosti Aplidina (Aplidine®) u kombinaciji sa doksorubicinom (DOX) na PC3 ćelijama.

Slika11.Podaci o in vitro aktivnosti Aplidina (Aplidine®) u kombinaciji sa doksorubicinom (DOX) na MOLT3 ćelijama.

Slika 12.Podaci o in vitro aktivnosti Aplidina (Aplidine®) u kombinaciji sa doksorubicinom (DOX) na MX1 ćelijama.

Slika 13.Podaci o in vitro aktivnosti Aplidina (Aplidine®) u kombinaciji sa doksorubicinom (DOX) na SKBR3 ćelijama.

Slika 14. Podaci o in vitro aktivnosti Aplidina (AP, Aplidine®) u kombinaciji sa cisplatinom (DDP)naMXl ćelijama.

Slika 15.Podaci o in vitro aktivnosti Aplidina (Aplidine®) u kombinaciji sa cisplatinom (cis-DDP) na HT29 ćelijama.

Slika 16.Podaci o in vitro aktivnosti Aplidina (APL, Aplidine®) u kombinaciji sa cisplatinom (cisDDP, DDP) na SKBR3 ćelijama.

Slika 17. Podaci o in vitro aktivnosti Aplidina (Aplidine®) u kombinaciji sa cisplatinom (cis-DDP, DDP) na MOLT3 ćelijama.

Slika 18.Podaci o in vitro aktivnosti Aplidina (Aplidine®) u kombinaciji sa cisplatinom (cis-DDP, DDP) na A549 ćelijama.

Slika19.Podaci o in vitro aktivnosti Aplidina (Aplidine®) u kombinaciji sa arsenik trioksidom (TRI) na A549 ćelijama.

Slika 20. Podaci o in vitro aktivnosti Aplidina (Aplidine®) u kombinaciji sa arsenik trioksidom (TRI) na HT29 ćelijama.

Slika 21.Podaci o in vitro aktivnosti Aplidina (Aplidine®) u kombinaciji sa arsenik trioksidom (TRI) na PC3 ćelijama.

Slika22. Podaci o in vitro aktivnosti Aplidina (Aplidine®) u kombinaciji sa arsenik trioksidom (TRI) na MOLT3 ćelijama.

Slika23. Podaci o in vitro aktivnosti Aplidina (Aplidine®) u kombinaciji sa 5-fluorouracilom (5FU) na HL60 ćelijama.

Slika 24. Podaci o in vitro aktivnosti Aplidina (Aplidine®) u kombinaciji sa 5-fluorouracilom (5FU) na SKBR3 ćelijama.

SHka25. Podaci o in vitro aktivnosti Aplidina (Aplidine®) u kombinaciji sa 5-fluorouracilom (5FU) na A549 ćelijama.

Slika26. Podaci o in vitro aktivnosti Aplidina (Aplidine®) u kombinaciji sa 5-fluorouracilom (5FU) na PC3 ćelijama.

Slika 27. Podaci o in vitro aktivnosti Aplidina (Aplidine®) u kombinaciji sa 5-fluorouracilom (5FU) na HT29 ćelijama.

Slika28. Podaci o in vitro aktivnosti Aplidina (Aplidine®) u kombinaciji sa citozin arabinozidom (AraC) na SK.BR3 ćelijama.

Slika29. Podaci o in vitro aktivnosti Aplidina (Aplidine®) u kombinaciji sa citozin arabinozidom (AraC) na A549 ćelijama.

Slika 30. Podaci o in vitro aktivnosti Aplidina (Aplidine®) u kombinaciji sa citozin arabinozidom (AraC) na PC3 ćelijama.

Slika 31.Podaci o in vitro aktivnosti Aplidina (Aplidine®) u kombinaciji sa citozin arabinozidom (AraC) na HL60 ćelijama.

Slika 32. Podaci o in vitro aktivnosti Aplidina (Aplidine®) u kombinaciji sa citozin arabinozidom (AraC) na HT29 ćelijama.

Slika33. Podaci o in vitro aktivnosti Aplidina (Aplidine®) u kombinaciji sa karboplatinom na PC3 ćelijama.

Slika 34.Podaci o in vitro aktivnosti Aplidina (Aplidine®) u kombinaciji sa karboplatinom na HT29 ćelijama.

Slika35. Podaci o in vitro aktivnosti Aplidina (Aplidine®) u kombinaciji sa karboplatinom na A549 ćelijama.

Slika36. Podaci o in vitro aktivnosti Aplidina (Aplidine®) u kombinaciji sa karboplatinom na MOLT3 ćelijama.

Slika37. Podaci o in vitro aktivnosti Aplidina (Aplidine®) u kombinaciji sa karboplatinom naMXl ćelijama.

Slika 38.Podaci o in vitro aktivnosti Aplidina (Aplidine®) u kombinaciji sa SN-38 na A549 ćelijama.

Slika 39.Podaci o in vitro aktivnosti Aplidina (Aplidine®) u kombinaciji sa SN-38 na SKBR3 ćelijama.

Slika 40.Podaci o in vitro aktivnosti Aplidina (Aplidine®) u kombinaciji sa SN-38 na HL60 ćelijama.

Slika 41.Podaci o in vitro aktivnosti Aplidina (Aplidine®) u kombinaciji sa SN-38 na PC3 ćelijama.

Slika. 42Ai42B.Podaci o in vitro aktivnosti Aplidina (A, Aplidine®) u kombinaciji sa VP16 (B) na HL-60 ćelijama.

Slika. 43Ai43B.Podaci o in vitro aktivnosti Aplidina (A, Aplidine®) u kombinaciji sa VP16 (B) na K562 ćelijama.

Slika. 44Ai44B.Podaci o in vitro aktivnosti Aplidina (A, Aplidine®) u kombinaciji sa VP16 (B) na MOLT-3 ćelijama.

Slika. 45Ai45B.Podaci o in vitro aktivnosti Aplidina (A, Aplidine®) u kombinaciji sa VP16(B) naMC 116 ćelijama.

Slika. 46A i46B.Podaci o in vitro aktivnosti Aplidina (A, Aplidine®) u kombinaciji sa VP16 (B) na RAMOS ćelijama.

Slika. 47Ai47B.Podaci o in vitro aktivnosti Aplidina (A, Aplidine®) u kombinaciji sa VP16(B) na U937 ćelijama.

Slika. 48Ai48B.Podaci o in vitro aktivnosti Aplidina (A, Aplidine®) u kombinaciji sa VP16 (B) na NCI-H929 ćelijama.

Slika.49A i49B.Podaci o in vitro aktivnosti Aplidina (A, Aplidine®) u kombinaciji sa VP16(B) naHUNS-1 ćelijama.

Slika. 50AiSOB.Podaci o in vitro aktivnosti Aplidina (A, Aplidine®) u kombinaciji sa VP16 (B) na U266 BI ćelijama.

Slika. 51Ai51B.Podaci o in vitro aktivnosti Aplidina (A, Aplidine®) u kombinaciji sa VP16 (B) na RPMI 8226 ćelijama.

Slika.52. Podaci o in vitro aktivnosti Aplidina (Aplidine®) u kombinaciji sa karboplatinom na LOX-I-MVI ćelijama.

Slika.53. Podaci o in vitro aktivnosti Aplidina (Aplidine®) u kombinaciji sa karboplatinom na UACC-257 ćelijama.

Slika. 54.Dozni odgovor na Aplidin nakon (48 h tretmana) na MM1S, MM1R, U266 i U266-LR7 ćelijskim linijama.

Slika. 55.Poređenje dozne efikasnosti Aplidina (Aplidine®) i drugih lekova na MM1S ćelijskoj liniji (48 h tretman).

Slika. 56.Kombinacija Aplidina (Aplidine®) i Deksametazona na 3 dana. A) Kriva odnosa doze i efekta. B) Fa-CI plot.

Slika.57. Kombinacija Aplidina (Aplidine®) i Deksametazona na 6 dana. A) Kriva odnosa doze i efekta. B) Fa-CI plot.

Slika.58. Kombinacija Aplidina (Aplidine®) i Mclfalana na 3 dana. A) Kriva odnosa doze i efekta. B) Fa-CI grafikon.

Slika.59, Kombinacija Aplidina (Aplidine®) i Melfalana na 6 dana. A) Kriva odnosa doze i efekta. B) Fa-CI grafikon.

Slika.60. Kombinacija Aplidina (Aplidine®) i Doksorubicina na 3 dana. A) Kriva odnosa doze i efekta. B) Fa-CI grafikon.

Slika. 61.Kombinacija Aplidina (Aplidine®) i Doksorubicina na 6 dana. A) Kriva odnosa doze i efekta. B) Fa-CI grafikon.

Slika.62. Kombinacija Aplidina (Aplidine®) i Lenalidomida (Revlimid®) na 3 dana. A) Kriva odnosa doze i efekta. B) Fa-CI grafikon.

Slika. 63. Kombinacija Aplidina (Aplidine®) i Lenalidomida (Revlimid®) na 6 dana. A) Kriva odnosa doze i efekta. B) Fa-CI grafikon.

Slika.64. Kombinacija Aplidin (Aplidine®) i Bortezomiba na 3 dana. A) Kriva odnosa doze i efekta. B) Fa-CI grafikon.

Slika.65. Kombinacija Aplidina (Aplidine®) i Bortezomiba na 6 dana. A) Kriva odnosa doze i efekta. B) Fa-CI grafikon.

Slika. 66. Kinetika neto volumena tumora nakon započinjanja tečenja sa Aplidinom (Aplidine®) kao pojedinačnim agensom ili u kombinaciji sa Dakarbazinom u tumorskim ksenograftima MRI-H-] 87 melanoma.

Slika.67. Kinetika neto volumena tumora nakon započinjanja lečenja sa Aplidinom (Aplidine®) kao pojedinačnim agensom ili u kombinaciji sa karboplatinom u tumorskim ksenograftima MRI-H-187 melanoma.

Slika.68. Kinetika neto volumena tumora nakon započinjanja lečenja sa Aplidinom (Aplidine®) kao pojedinačnim agensom ili u kombinaciji sa Interleukinom-2 (IL-2) u tumorskim ksenograftima MRI-H-187 melanoma.

Slika. 69. Kinetika neto volumena tumora nakon započinjanja lečenja sa Aplidinom (Aplidine®) kao pojedinačnim agensom ili u kombinaciji sa Interferonom-ct 2a (INF-a) u tumorskim ksenograftima MRI-H-187 melanoma.

Slika.70. Kinetika neto volumena tumora nakon započinjanja lečenja sa Aplidinom (APL) kao pojedinačnim agensom ili u kombinaciji sa Dakarbazinom (DTIC) u tumorskim ksenograftima LOX-IMVI melanoma.

Slika.71. Kinetika neto volumena tumora nakon započinjanja lečenja sa Aplidinom (APL) kao pojedinačnim agensom ili u kombinaciji sa karboplatinom u tumorskim ksenograftima LOX-IMVI melanoma.

Slika.72. Kinetika neto volumena tumora nakon započinjanja lečenja sa Aplidinom (APL, Aplidine®) kao pojedinačnim agensom ili u kombinaciji sa Interleukinom-2 (IL-2) u tumorskim ksenograftima LOX-IMVI melanoma.

Slika. 73. Kinetika neto volumena tumora nakon započinjanja lečenja sa Aplidinom (APL, Aplidine®) kao pojedinačnim agensom ili u kombinaciji sa Interferonom-a 2a (INF-a) u tumorskim ksenograftima LOX-IMVI melanoma.

Slika. 74. Kinetika neto volumena tumora nakon započinjanja lečenja sa Aplidinom (APL) kao pojedinačnim agensom ili u kombinaciji sa Bevacizumabom (Avastin®) u CaKi-l bubrežnim tumorskim ksenograftima.

Slika.75. Kinetika neto volumena tumora nakon započinjanja lečenja sa Aplidinom (APL) kao pojedinačnim agensom ili u kombinaciji sa lnterleukinom-2 (IL-2) u CaKi-1 bubrežnim tumorskim ksenograftima.

Slika.76. Kinetika neto volumena tumora nakon započinjanja lečenja sa Aplidinom (APL) kao pojedinačnim agensom ili u kombinaciji sa Interferonom-a 2a (INF-a 2a) u CaKi-I bubrežnim tumorskim ksenograftima.

Slika. 77. Kinetika neto volumena tumora nakon započinjanja lečenja sa Aplidinom (APL) kao pojedinačnim agensom ili u kombinaciji sa Bevacizumabom (Avastin®) u MRI-H12I bubrežnim tumorskim ksenograftima.

Slika. 78. Kinetika neto volumena tumora nakon započinjanja lečenja sa Aplidinom (APL) kao pojedinačnim agensom ili u kombinaciji sa lnterleukinom-2 (IL-2) u MRI-H121 bubrežnim tumorskim ksenograftima.

Slika. 79. Kinetika neto volumena tumora nakon započinjanja lečenja sa Aplidinom (APL) kao pojedinačnim agensom ili u kombinaciji sa Interferonom-a 2a (INF-a) u MR1-H121 bubrežnim tumorskim ksenograftima.

Slika. 80. Kombinacija Aplidin (A) + Lenalidomid (Revlimid<®>; R) + Deksametazon

(D) u MM1S nakon 72 h tretmana. Doze Aplidina su izražene u nM jedinicama, doze Lenalidomida su izražene u[iM jedinicama i doze Deksametazona su izražene u nM

jedinicama.

Slika. 81. Kombinacija Aplidin (A) + Bortezomib (B) + Deksametazon (D) u MM1S nakon 72h tretmana. Doze Aplidina su izražene u nM jedinicama, doze Bortezomiba su izražene u nM jedinicama i

Doze Deksametazon su izražene u nM jedinicama.

Slika. 82. Kombinacija Aplidin (A) + Bortezomib (B) + Lenalidomid (Revlimid<®>; R) u MM1S nakon 72h tretmana, doze Aplidina su izražene u nM jedinicama, doze Bortezomiba su izražene u nM jedinicama i doze Lenalidomida su izražene u nM jedinicama.

Slika. 83. Kombinacija Aplidin (A) + Talidomid (T) + Deksametazon (D) uMMIS nakon 72h tretmana. Doze Aplidina su izražene u nM jedinicama, doze Talidomida su izražene u uM jedinicama i doze Deksametazona su izražene u nM jedinicama.

Slika. 84. Kombinacija Aplidin (A) + Melfalan (M) + Deksametazon (D) u MM1S nakon 72h tretmana. Doze Aplidina su izražene u nM jedinicama, doze Melfalana su izražene u jiM jedinicama i doze Deksametazona su izražene u nM jedinicama.

Slika. 85. Kombinacija Aplidin (A) + Melfalan (M) + Bortezomib (B) u MMIS nakon 72h tretmana. Doze Aplidina su izražene u nM jedinicama, doze Melfalana su izražene u uM jedinicama i doze Bortezomiba su izražene u nM jedinicama.

DETALJAN OPIS PREDMETNOG PRONALASKA

Pod terminom "kancer" misli se da su uključeni tumori, neoplazme, i bilo koje drugo maligno tkivo ili ćelije. Predmetni pronalazak je usmeren na primenu Aplidina u kombinaciji za lečenje multiplog mijeloma.

Iako nije u skladu sa predmetnim pronalaskom, dodatno, opisujemo primenu Aplidinskog analoga u kombinaciji za lečenje kancera uopšte, ali poželjnije za lečenje kancera pluća, kancera dojke, kancera kolona, kancera prostate, kancera bubrega, melanoma, leukemija i limfoma.

U cilju izučavanja mogućeg pojačanja antikancerskih agenasa sa Aplidinom započeli smo sistematičnu studiju kombinacija lekova za moguću primenu u gore pomenulim vrstama tumora. Studije kombinacija lekova su izvedene na različitim tipovima ćelijskih linija. In vitro studije se izvedene korišćenjem tumorskih linija kao što su NSCL A549, karcinom dojke MX1, promijelocitna leukemija HL60, adenokarcinom kolona HT29, adenokarcinom prostate PC3, adenokarcinom dojke SKBR3 i acutna limfoblastična leukemija (MOLT3), koje imaju različitu senzitivnost na Aplidin (od niske do visoke). Dodatne studije su takođe spovede sa ćelijskim linijama leukemija, limfoma, multiplih mijeloma i melanoma. Dodatno, in vivo studije sa ksenograftima melanoma, bubrega, mijeloma, i limfoma su korišćene da se uspostavi efekat Aplidina u kombinaciji sa drugim standardnim agensima. Konačno, in vitro studije su sprovedene u ćelijskim linijama multiplog mijeloma korišćenjem trostrukih kombinacija, što je kombinovanje Aplidina sa dva dodatna standardna agensa (drugi i treći lek).

Iako nije u skladu sa predmetnim pronalaskom, opšti zaključak koji smo našli je daje citotoksičnost Aplidina u tumorskim ćelijama veoma povećana u kombinaciji sa mnogim od standardnih agenasa koji su korišćeni za ovu evaluaciju. Glavni sinergistički efekat je primećen sa kombinacijom Aplidina sa paklitakselom (Taxol<*>), doksorubicinom, cisplatinom, arsenik trioksidom, 5-fluorouracilom (5-FU), citozin arabinozidom (AraC), karboplatinom, 7-etil-10-hidroksikamptotecinom (SN38), etopozidom (VP16), melfalanom, deksametazonom, ciklofosfamidom, bortezomibom, erlotinibom, trastuzumabom, lenalidomidom (Revlimid®), interleukinom-2 (IL-2), interferonom-a 2 (INF- a), dakarbazinom (DTIC), bevacizumabom (Avastin®), idarubicinom, talidomidom, i rituksimabom. Dodatno, takođe je pronađeno daje pojačavanje citotoksičnosti dobijeno i sa trostrukom kombinacijom Aplidina sa gore pomenutim agensima.

Naročito je poželjna kombinacija Aplidina sa paklitakselom u lečenju kancera, i preciznije u lečenju kancera odabranog od kancera dojke, leukemije i kancera prostate.

Naročito je poželjna kombinacija Aplidina sa doksorubicinom u lečenju kancera, i preciznije u lečenju kancera odabranog od kancera pluća, kancera kolona, kancera prostate, i multiplog mijeloma.

Naročito je poželjna kombinacija Aplidina sa cisplatinom u lečenju kancera, i preciznije u lečenju kancera odabranog od kancera dojke, i kancera kolona.

Naročito je poželjna kombinacija Aplidina sa arsenik trioksidom u lečenju kancera, i preciznije u lečenju kancera odabranog od kancera pluća, kancera kolona, i kancera prostate.

Naročito je poželjna kombinacija Aplidina sa 5-fluorou raci lom u lečenju kancera, i preciznije u lečenju kancera odabranog od leukemije, kancer pluća, kancer dojke, i kancera prostate.

Naročito je poželjna kombinacija Aplidina sa citozin arabinozidom u lečenju kancera, i preciznije u lečenju kancera odabranog od kancera pluća, kancera dojke, i kancera prostate.

Naročito je poželjna kombinacija Aplidina sa karboplatinom u lečenju kancera, i preciznije u lečenju kancera odabranog od kancera kolona, kancera prostate, i melanoma.

Naročito je poželjna kombinacija Aplidina sa SN38 u lečenju kancera, i preciznije u lečenju kancera pluća.

Naročito je poželjna kombinacija Aplidina sa etoposidom u lečenju kancera. i preciznije u lečenju kancera odabranog od limfoma, i multiplog mijeloma.

Naročito jc poželjna kombinacija Aplidina sa deksametazonom u lečenju kancera, i preciznije u lečenju multiplog mijeloma.

Naročito je poželjna kombinacija Aplidina sa lenalidomidom u lečenju kancera. i preciznije u lečenju multiplog mijeloma.

Naročito je poželjna kombinacija Aplidina sa bortezomibom u lečenju kancera, i preciznije u lečenju multiplog mijeloma.

Naročito je poželjna kombinacija Aplidina sa dakarbazinom u lečenju kancera, i preciznije u lečenju melanoma.

Naročito je poželjna kombinacija Aplidina sa bevacizumabom u lečenju kancera, i preciznije u lečenju kancera bubrega.

Naročito je poželjna kombinacija Aplidina sa interleukinom-2 u lečenju kancera, i preciznije u lečenju kancera bubrega.

Naročito je poželjna kombinacija Aplidina sa melfalanom u lečenju kancera, i preciznije u lečenju multiplog mijeloma.

Naročito je poželjna kombinacija Aplidina sa idarubicinom u lečenju kancera. i preciznije u lečenju leukemije.

Naročito je poželjna kombinacija Aplidina sa rituksimabom u lečenju kancera, i preciznije u lečenju limfoma.

Naročito je poželjna kombinacija Aplidina sa talidomiđom u lečenju kancera, i preciznije u lečenju multiplog mijeloma.

Naročito je poželjna trostruka kombinacija Aplidina sa lenalidomidom i deksametazonom u lečenju kancera, i preciznije u lečenju multiplog mijeloma.

Naročito je poželjna trostruka kombinacija Aplidina sa bortezomibom i deksametazonom u lečenju kancera, i preciznije u lečenju multiplog mijeloma.

Naročito je poželjna trostruka kombinacija Aplidina sa bortezomibom i lenalidomidom u lečenju kancera, i preciznije u lečenju multiplog mijeloma.

Naročito je poželjna trostruka kombinacija Aplidina sa bortezomibom i talidomiđom u lečenju kancera, i preciznije u lečenju multiplog mijeloma.

Naročito je poželjna trostruka kombinacija Aplidina sa deksametazonom i talidomiđom u lečenju kancera, i preciznije u lečenju multiplog mijeloma.

Naročito je poželjna trostruka kombinacija Aplidina sa deksametazonom i melfalanom u lečenju kancera, i preciznije u lečenju multiplog mijeloma.

Naročito je poželjna trostruka kombinacija Aplidina sa melfalanom i bortezomibom u lečenju kancera. i preciznije u lečenju multiplog mijeloma.

Kompozicija predmetnog pronalaska može da sadrži sve komponente (lekove) u pojedinačnoj farmaceutski prihvatljivoj formulaciji. Alternativno, komponente mogu biti formulisane odvojeno i administrirane u kombinaciji jedna sa drugom. Razne farmaceutski prihvatljive formulacije poznate poznavaocima oblasti mogu biti korišćene u predmetnom pronalasku. Odabir odgovarajuće formulacije za primenu u predmetom pronalsaku može btii izvedeno rutinski od strane poznavaoca oblasti na osnovu načina administracije i osobina rastvorljivosti komponentni kompozicije.

Primeri farmaceutskih kompozicija koje obuhvataju Aplidin ili analog Aplidina uključuju tečne kompozicije (rastvore, suspenzije ili emulzije) pogodne za intravenoznu administraciju, i mogu da obuhvate čisto jedinjenje ili u kombinaciji sa bilo kojim nosačem ili drugim farmakološki aktivnim jedinjenjima. Rastvoreni Aplidin pokazuje znatnu degradaciju pri testiranju u prisustvu toplote i uslovima blagog stresa, i liofilizirana dozna forma je razvijena, videti WO 99 42125.

Mada nije u skladu sa predmetnim pronalaskom, administracija Aplidina ili kompozicije predmetnog pronalaska su bazirane na Doznom protokolu poželjno intravenskom infuzijom. Preferiramo kada su korišćena vremena infuzije do 72 sata, poželjnije 1 do 24 sata, sa oko I, oko 3, ili oko 24 sata najpoželjnije. Kratka vremena infuzije koja mogu dozvoliti da lečenje bude izvedeno bez ostajanja u bolnici preko noći su naročito poželjna. Međutim, infuzija može biti oko 24 sata ili čak duža akoje tako zahtevano. Infuzija može biti sprovedena u pogodnim intervalima sa različitim obrascima (učestalošću davanja), ilustrativno jednom nedeljno, dva puta nedeljno, ili češće u toku nedelje, sa ponavljanjem svake nedelje po izboru sa pauzom od tipično jedne ili nekoliko nedelja.

Tačna doza jedinjenja kombinacije će varirati prema određenoj formulaciji, načinu aplikacije, i određenom mestu, domaćinu i tumoru koji sc tretiraju. Drugi faktori kao što su starost, telesna masa, pol, ishrana, vreme adminstracije, stopa ekskrecije stanje domaćina, kombinacije lekova, reakciona senzitivnost i ozbiljnost bolesti trebaju biti uzeti u obzir. Administracija može biti izvedena kontinuirano iii periodično unutar maksimalne tolerisane doze. Dalji vodič za administraciju Aplidina je dat u WO 01 35974.

U jednom apektu, predmetni pronalazak se odnosi na sinergističke kombinacije koje uključuju Aplidin i deksametazon i iako nije u skladu sa predmetnim pronalazaskom. druge kombinacije takođe mogu biti uključene. Kao indikacija sinergije može lako biti dobijena testiranjem kombinacija i analiziranjem rezultata, na primer linearnom regresionom analizom. Ovo je ilustrovano sa Slici 1. Alternativne metode kao što su analize izolobologramom su dostupne za otkrivanje sinergizma i mogu biti korišćene u trenutne svrhe.

PRIMERI

PRIMER 1. In vitro studije za određivanje efekta Aplidina u kombinaciji sa drugim standardnim agensom na tumorskim ćelijskim linijama.

Aplidin kao pojedinačni agens ili u kombinaciji sa odabranim standardnim hemoterapeutskim agensima je evaluiran na nekoliko tumorskih ćelijskih linija da bi se izmerile razlike u citotoksičnosti.

Sledeći standardni agensi su odabrani kao pojedinačni agensi i za kombinaciju sa Aplidinom: paklitaksel (Taxol<®>), doksorubicin, cisplatina, arsenik trioksid (Trisonex®). 5-fluorouracil (5-FU), citozin arabinozid (AraC), karboplatina i 7-etil-10-hidroksikamptotecin (SN38).

Pojedinačni agens Aplidin je citotoksična na nekoliko tipova kancera sa različitom potentnošću. Iz tog razloga reprezentativne tumorske ćelijske linije su odabrane da imaju nisku, srednju ili visoku osetljivost na Aplidin. Tumorske ćelijske linije koje su korišćene su prikazane u Tabeli 1.

Skrining je izveden iz dva dela:

a. U prvom setu testova, IC50vrednosti su određene za svako jedinjenje nakon 72 h od izlaganja leku u svakoj od tumorskih ćelijskih linija.

Sve ćelijske linije su održavane u odgovarajućem medijumu za rast na 37°C. 5% CO2i 98% vlažnosti. Sve formulacije medijuma nc sadrže antibiotike. Dan pre sađenja ćelija sve kulture su nahranjene sa svežim. kompletnim medijumom za rast. Na dan sakupljanja ćelija one su izbrojane pomoću metode bojenja Tripan plavom bojom (osnovna ćelijska kultura).

Ćelije su sakupljene i zasađenje u mikroploče sa 96 bunarića u broju od 10,000 ćelija po bunariću u 190 pL medijuma i inkubirane tokom 24 sata da se dozvoli ćelijama da uspostave veze pre dodavanja leka. Ćelije su tretirane sa lekovima i citotoksični efekat je

izmeren pomoću MTS eseja (Tetrazolium), koji je kolortmetrijska metoda za određivan je broja vijabilnih ćelija. Nakon 72 sata inkubacije sa lekom, 25 uL rastvora MTS+PMS je dodato u svaki miktotitatarski bunarić i inkubirano tokom 4 sata na 37°C. Ploče su zatim uklonjene iz inkubatora i postavljene na šejker ploča tokom 5 minuta (pokrivene sa aluminijumskom folijom da bi se zaštitile od svetla). Optičke gustine su očitane na 490 nm na spektrofotometarskom čitaču ploča. Podaci su analizirani korišćenjem SoftMax® v 3.12 programa.

IC50vrednost je izračunata, koja jc približan ekvivalent od IG50(koncentracija pri kojoj je 50% inhibicije rasta izmereno). Kriva regresije korišćenjem SoftMax® programa je generisana, i zatim je 50% inhibicione koncentracije manuelno interpolisano i konvertovana je koncentracija u molarnu (M) deljenjem molekulse mase jedinjenja. Pojedinačne IC50vrednosti (72 sata nakon izlaganja) su prikazane u tabeli 2. IC50vrednosti predstavljaju 100% koncentracije leka.

b. U drugom setu testova, svaka ćelijska linija je inkubirana sa Aplidinom u kombinaciji sa svakim od standardnih agenasa pomenutih iznad u sledećim kombinacijama jedinstvenih ICso koncentracija:

Mikrotitarske ploče su inkubirane tokom 72 h, na 5% CO2i 37°C. Citotoksični efekat je izmeren pomoću MTS eseja. Optičke gustine očitane su na 490 nm. Normalizovani podaci su grafički prikazani i predstavljeni kako je opisano. Podaci su analizirani kao što sledi: 1. Prism (Graphpad®) softvvare program je korišćen da se normalizuju podaci na kontrolne vrednosti (100% = ćelijski rast u odsustvu agensa (leka); 0% = blank kontrola). 2. Normalizovani podaci su prikazani kao tačkasti grafici. Linija je nacrtana tako da povezuje vrednosti od 100% IC50za svaki agens (lek). Vrednosti značajno iznad linije ukazuju na antagonizam, ispod ukazuju na sinergiju, a na liniji ukazuju na aditivnost.

Statistička obrada podataka pratila je Laska E. et al. Biometrics (1994) 50:834-841 and Greco et al. Pharmacol Rev. (1995) 47: 331-385. Kombinacije u testiranim doznim odnosima su procenjene kao sinergističke kada inhibicija ćelijske proliferacije prekorači maksimalne vrednosti inhibicije za svaki lek zasebno (pri 100% IC50). Nasuprot tome, antagonizam je zaključen kada je inhibicija niža od oba maksimuma. Aditivnost je konstatovana kada se efekti koncentracija ne razlikuju značajno od maksimuma za oba leka. Statistička značajnost je ocenjena izvođenjem Studentovog T-testa na inhibiciju svakog doznog odnosa prema inhibiciji maksimuma za svaki slani rastvor kontrola (sterilni slani rastvor). Opšta značajnost kombinacija lekova za svaku ćelijsku liniju je bila zavisna od pokazivanja statističke značajnosti za veće od 50% od doznog odnosa.

Kao vizuelna pomoć, vrednosti odgovora su grafički predstavljeni na tačkastim grafikonima sa doznim odnosima datim na x-osi i % vrednosti odgovora na y-osi. Horizontalna linija je ucrtana između krajnjih vrednosti odgovora (npr. Između vrednosti odgovora za 100% ICso Aplidina i 100% IC50standardnog hemoterapijskog agensa). U slučajevima gde vrednosti odgovora na dve krajnje tačke su približno ekvivalentne, tačke koje leže iznad ili ispod ove predviđene linije aditivnosti bi mogle biti interpretirane kao reprezentativna antagonistička ili sinergistička interakcija, redom.

In vitro kombinacije svakog leka sa Aplidinom imaju potencijal da budu sinergističke, aditivne, ili antagonističke. Sinergistička citotoksičnost na tumorskim ćelijama je optimalan efekat i implicira da kombinacija Aplidina sa drugim lekom je efektivnija nego sa bilo kojim samim lekom.

Prema ovom eseju pronađeno je da:

a. Kombinacija Aplidina sa paklitakselom pokazala je sinergizam kod ćelija adenokarcinoma dojke SKBR3 (Slika 2), ćelija akutne limfoblastne leukemije MOLT3 (Slika 3) i ćelija adenokarcinom a prostate PC3 (Slika 4). Trend ka aditivnosti je primećen kod ćelija promijelocitne leukemije HL60 (Slika 5), ćelija karcinoma dojke MX1 (Slika 6) i ćelija NSCL A549 (Slika 7). b. Kombinacija Aplidina sa doksorubicinom pokazala je sinergizam kod NSCL A549 ćelija (Slika 8), ćelija adenokarcinoma kolona HT29 (Slika 9) i ćelija adenokarcinoma prostate PC3 (Slika 10). Aditivnost je primećena kod ćelija akutne limfoblastne leukemije MOLT3 (Slika 11), ćelija karcinoma dojke MX1 (Slika 12) i ćelija adenokarcinom dojke SKBR3 (Slika 13). c. Kombinacija Aplidina sa cisplatinom pokazala je sinergizam kod ćelija karcinoma dojke MX1 (Slika 14) i ćelija adenokarcinoma kolona HT29 (Slika 15). Aditivnost je primećena kod ćelija adenokarcinoma dojke SKBR3 (Slika 16) i ćelija akutne limfoblastne leukemije MOLT3 (Slika 17), i kod NSCL A549 ćelija (Slika 18) trend ka sinergizmu je pronađen. d. Kombinacija Aplidina sa arsenik trioksidom pokazala je sinergizam kod NSCL A549 ćelija (Slika 19), ćelija adenokarcinoma kolona HT29 (Slika 20) i ćelija adenokarcinoma prostate PC3 (Slika 21). Aditivnost je primećena kod ćelija akutne limfoblastne leukemije MOLT3 (Slika 22).

e. Kombinacija Aplidina sa 5-fluorouracilom pokazala je sinergizam kod ćelija promijelocitne leukemije HL60 (Slika 23), ćelija adenokarcinoma dojke SKBR3 (Slika 24), NSCL A549 ćelija (Slika 25) i ćelija adenokarcinoma prostate PC3 (Slika 26). Aditivnost je primećena kod ćelija adenokarcinoma kolona HT29 (Slika 27).

f. Kombinacija Aplidina sa citozin arabinozidom pokazala je sinergizam kod ćelija adenokarcinoma dojke SKBR3 (Slika 28), NSCL dojke A549 ćelija (Slika 29) i ćelija adenokarcinoma prostate PC3 (Slika 30). Aditivnost je pronađena kod ćelija promijelocitne leukemije HL60 (Slika 31) i ćelija adenokarcinoma kolona HT29 (Slika 32).

g. Kombinacija Aplidina sa karboplatinom pokazala je sinergizam kod ćelija adenokarcinoma prostate PC3 (Slika 33) i ćelija adenokarcinoma kolona HT29 (Slika 34). Aditivnost je primećena kod NSCL A549 ćelija (Slika 35), ćelija akutne limfoblastne leukemije MOLT3 (Slika 36) i ćelija karcinoma dojke MX1 (Slika 37).

h. Kombinacija Aplidina sa SN38 pokazala je sinergizam kod NSCL A549 ćelija (Slika 38). Aditivnost je primećena kod ćelija adenokarcinoma dojke SKBR3 (Slika 39),

ćelija promijelocitne leukemije HL60 (Slika 40) i ćelija adenokarcinoma prostate PC3 (Slika 41).

Primer 2. In vitro studije za određivanje efekta Aplidina u kombinaciji sa drugim standardnim agensom na tumorkim ćelijskim linijama leukemije, limfoma, multiplog mijeloma i melanoma.

Praćenjem iste procedure kako je stavljeno na uvid u primeru I. Aplidin kao pojedinačni agnes ili u kombinaciji sa odabranim hemoterapijskim agensom, je evaluiran na nekoliko tumorskih ćelijskih linija da se izmere razlike u citotoksičnosti.

Sledeći standardni agenesi su odabrani kao pojedinačni agensi i za kombinaciju sa Aplidinom: etopozid (VP16) i karboplatina. Tumorske ćelijske linije koje su odabrane za ovaj test su prikazane u Tabeli 3.

Metodakultivacije ćelija

Sve ćelijske linije su održavane u odgovarajućem medijumu za rast na 37°C, 5% CO2i 98% vlažnosti. Sve formulacije medijuma nisu sadržale antibiotik. Dan pre postavljanja ćelija sve kulture su nahranjene sa svežim, kompletnim medijumom za rast. Na dan sakupljanja (postavljanja) ćelije su izbrojane pomoću metode isključenja bojenjem tripan plavom bojom.

Postavljanje ( sađenje) ćelija

Ćelija su sakupljene i zasađene u mikrotitarske ploče sa 96 bunarića u količini od 15,000 ćelija po bunariću u 190 ul medijuma i inkubirane su tokom 24 sata da se dozvoli ćelijama da se vežu pre dodavanja leka.

Tretman lekom

Štok rastvor Aplidina je pripremljen u 100% DMSO u koncentraciji 5 mg/ml. Štok rastvori hemoterapijskih agenasa VP16 i karboplatine su pripremljeni u 100% DMSO u koncentraciji 2 mg/ml za oba leka.

Ćelija su tretirane sa Aplidinom i drugim standardnim agensom u opsegu koji je prikazan ispod, i pojedinačne koncentracije leka su napravljene u triplikatima po ploči. Koncentracija testiranih agenasa koji su korišceni je izražena kao procenat ICso pojedinačnog agensa, koji je određen kao u Primeru l.

Pojedinačne IC50vrednosti za svaki agens za svaku ćelijsku liniju su prikazane u Tabeli 4.

Citotoksični efekat je izmeren pomoću MTS eseja (Tetrazolium), koji je kolorimetrijska metoda za određivanje broja vijabilnih ćelija.

Nakon 72 sata od inkubacije sa testiranim agensima 25 jjt MTS+PMS rastvora je dodato u svaki mikrotitarski bunarić i inkubirano tokom 4 sata na 37°C. Ploče su zatim uklonjene iz inkubatora i postavljene na šejker ploča tokom 5 minuta (pokrivene aluminijumskom folijom da bi se zaštitile od svetla). Optičke gustine su očitane na 490 nm na spektrofotomelrijskom čitaču ploča. Podaci su analizirani na sledeći način: 1. Prism (Graphpad®) softvvare program je korišćen da se normalizuju podaci na kontrolne vrednosti (100% = ćelijski rast u odsustvu agensa (leka); (0% = blank kontrola). 2. Normalizovani podaci su prikazani kao tačkasti grafici. Linija je nacrtana tako da povezuje vrednosti od 100% ICso za svaki agens (lek). Vrednosti značajno iznad linije ukazuju na antagonizam, ispod ukazuju na sinergiju, a na liniji ukazuju na aditivnost.

Statistička obrada podataka pratila je Laska E. et al. Biometrics (1994) 50:834-841 and Greco et al. Pharmacol Rev. (1995) 47: 331-385. Kombinacije u testiranim doznim odnosima su procenjene kao sinergističke kada inhibicija ćelijske proliferacije prekorači maksimalne vrednosti inhibicije za svaki lek zasebno (pri 100% ICso). Nasuprot tome, antagonizam je zaključen kada je inhibicija niža od oba maksimuma. Aditivnost je zaključena kada se efekti kombinacija ne razlikuju značajno od maksimuma za oba leka. Statistička značajnost je occnjena izvođenjem Studentovog T-testa na inhibiciju svakog doznog odnosa prema inhibiciji maksimuma za svaki lek. Opšta značajnost kombinacija lekova za svaku ćelijsku liniju je bila zavisna od pokazivanja statističke značajnosti za veće od 50% od doznog odnosa.

Kao vizuelna pomoć, vrednosti odgovora su grafički predstavljeni na tačkastim grafikonima sa doznim odnosima datim na x-osi i % vrednosti odgovora na y-osi. Horizontalna linija je ucrtana između krajnjih vrednosti odgovora (npr. između vrednosti odgovora za 100% ICso Aplidina i 100% ICso standardnog hemoterapijskog agensa). U slučajevima gde vrednosti odgovora na dve krajnje tačke su približno ekvivalentne, tačke koje leže iznad ili ispod ove predviđene linije aditivnosti bi mogle biti interpretirane kao reprezentativna antagonistička ili sinergistička interakcija, redom.

Na Slici 42A i 42B pokazani su podaci o in vitro aktivnosti Aplidina u kombinaciji sa VP16 na HL-60 ćelijama. Prema ovim podacima aditivni efekat je dobijen.

Na Slici 43A i 43B pokazani su podaci o in vitro aktivnosti Aplidina u kombinaciji sa VP16 na K562 ćelijama. Prema ovim podacima aditivnost je dobijena.

Na Slici 44A i 44B pokazani su podaci o in vitro aktivnosti Aplidina u kombinaciji sa VP16 na MOLT-3 ćelijama. Prema ovim podacima aditivnost je dobijena.

Na Slici 45A i 45B pokazani su podaci o in vitro aktivnosti Aplidina u kombinaciji sa VP16 na MCI 16 ćelijama. Prema ovim podacima aditivnost je dobijena na ovoj tumorskoj ćelijskoj liniji.

Na Slici 46A i 46B pokazani su podaci in vitro aktivnosti priinećeni sa Aplidinom u kombinaciji sa VP16 na RAMOS ćelijama. Prema ovim podacima sinergizam je dobijen na ovoj tumorskoj ćelijskoj liniji.

Na Slici 47A i 47B pokazani su podaci in vitro aktivnosti primećeni sa Aplidinom u kombinaciji sa VP16 na U937 ćelijama. Prema ovim podacima aditivnost je dobijena.

Na Slici 48A i 48B pokazani su podaci in vitro aktivnosti primećeni sa Aplidinom u kombinaciji sa VP16 na NCI-H929 ćeli jama. Prema ovim podacima sinergizam je dobijen.

Na Slici 49A i 49B pokazani su podaci in vitro aktivnosti primećeni sa Aplidinom u kombinaciji sa VP16 na HUNS-1 ćelijama. Prema ovim podacima aditivnost je dobijena na ovoj tumorskoj ćelijskoj liniji.

Na Slici 50A i 50B pokazani su podaci in vitro aktivnosti primećeni sa Aplidinom u kombinaciji sa VP16 na U266B-I ćelijama. Prema ovim podacima aditivnost je dobijena na ovoj tumorskoj ćelijskoj liniji.

Na Slici 51A i 51B pokazani su podaci in vitro aktivnosti primećeni sa Aplidinom u kombinaciji sa VP16 na RPMI 8226 ćelijama. Prema ovim podacima aditivnost je dobijena na ovoj tumorskoj ćelijskoj liniji.

Na Slici 52 pokazani su podaci in vitro aktivnosti primećeni sa Aplidinom u kombinaciji sa karboplatinom na LOX-I-MVI ćelijama. Prema ovim podacima aditivnost je dobijena na ovoj tumorskoj ćelijskoj liniji.

Na Slici 53 pokazani su podaci in vitro aktivnosti primećeni sa Aplidinom u kombinaciji sakarboplatinom against UACC-257 ćelija. Prema ovim podacima sinergizam je dobijen na ovoj tumorskoj ćelijskoj liniji.

Primer 3: In vitro studije da se odredi efekat Aplidina u kombinaciji sa drugim standardnim agensima na ćelijske linije multiplog mijeloma.

Multipli mijelom (MM) je maligna bolest plazma ćelija, generalno poreklom od klona plazma ćelija koje proliferišu i akumuliraju se u koštanoj srži. Kliničko-patološke osobine pacijenata sa mijciomom uključuju akumulaciju monoklonskih proteina u krvi ili urinu, litičke lezije kostiju, anemiju i renalnu disfunkciju (Sirohi B. et al. Lancet (2004) 363: 875-87).

Aktuelno lečenje mijeloma oslanja se na visoke doze terapije podržane transplantacijom stem ćelija. Uprkos naprecima u poslednjoj dekadi, danas MM ostaje neizlečiva bolest sa srednjim ukupnim preživljavanjem za pacijente od 2 do 5 godina (Sirohi B. et al. Lancet (2004) 363: 875-87). Novi pristupi lečenju su potrebni da se poboljša ishod pacijenata praćenjem tri glavne linije istraživanja a) poboljšanje efikasnosti hemoterapije kroz primenu visoke doze; b) poboljšanje imunog odgovora domaćina na ćelije mijeloma; i c) razvijanje novih lekova sa specifičnijim targetima koji mogu interferirati ne samo sa ćelijama mijeloma nego i sa mikrosredinom koštane srži (San Miguel JF et al. Curr. Treat. Options Oncol. (2003) 4: 247-58). Nadajmo se, kombinacija dva ili više terapijskih agenasa će voditi ka poboljšanoj anti-MM efikasnosti i dužim stopama preživljavanja.

Ovde izveštavamo o nekoliko studija u vezi sa efektom Aplidina kao novog leka u lečenju multiplog mijeloma. Ove studije uključuju: 1) citotoksičnu efikasnost Aplidina (pojedinačno ili u kombinaciji) na nekoliko MM ćelijskih linija korišćenjem eseja ćelijske vijabilnosti (M'IT test) i apoptoze (bojenjeaneksinom V). 2) citotoksičnu efiaksnost kombinacija Aplidina i drugih klasičnih i nedavno razvijenih lekova u lečenju ove boelsti.

Materijal i metode

Ćelijske linije i reagensi za ćelijske kulture

Četiri ćelijske linije izvedene iz MM su korišćene u ovoj studiji: varijante deksametazon-senzitivne (MM.1S) i deksametazon-rezistentne (MM.1R) humane ćelijske multiplog mijeloma MM.i (Greenstein S. et al. Bxp. Hematol (2003) 3I:.271-82) koje su obezbeđene Ijubaznošću Dr. S Rudikoff, Bethesda MD; i U266 i njegov duplikat melfalan-rezistentne U266 LR7 ćelijske linije su dobijene od Dr. W. Dalton, Tampa, FL. Sve MM ćelijske linije su gajene u RPMI 1640 medijumu obogaćenom sa 10% fetalnog goveđeg seuma inaktivisanog toplotom, 100 U/ml penicilina, 100 ug/ml streptomicina i 2 mM L-giutamina. Svi medijumi za ćelijske kulture i reagensi su kupljeni od Invitrogen Corporation (Carlsbad, CA).

Eseji ćelijske vijabilnosti

Analiza MM ćelijske proliferacije je procenjena korišćenjem metiltiotetrazol (MTT; Sigma, St. Louis MO) kolorimetrijskog eseja. MM ćelijske linije su sađene u gustini od 50000 ćelija/200ul medijuma po bunariću u pločama sa 48 bunariča, i tretirane sa određenom dozom leka i tokom određenog vremena. Dva sata pre kraja tretmana, MTT rastvor (5 mg/ml u PBS; obično 10% od zapremine u svakom bunariću) je dodato i tetrazolijumska so je redukovana od strane metabolički aktivnih ćelija do obojenih formazanskih kristala. Nakon rastvaranja ovih kristala inkubacijom preko noći sa 10% SDS-HC1 rastvora, apsorbanca je izmerena na 570 nm sa korekcijom na 630 nm. Četiri bunariča su analizirana za svako stanje, i rezultati su prikazani kao srednja vrednost ± SD od kvadriplikata reprezentativnog eksperimenta koji je ponovljen najmanje tri puta.

Western blot

Ćelije su sakupljene i isprane sa PBS, i ukupni ćelijski lizati su dobijeni nakon inkubacije u ledeno hladnom puferu za lizu (140 mM NaCl, 10 mM EDTA, 10% glicerol, 1% Nonidet P-40, 20 mM Tris (pH 7.0), 1 u,M pcpstatin, 1 pg/ml aprotinin, 1 ug/ml leupeptin, 1 mM natrijum ortovanadat). Uzorci su zatim centrifugirani na 10,000g na 4°C tokom 10 min i jednake količine proteina u supernatantima su analizirane pomoću 6% - 12.5% SDS-PAGE. Proteini su zatim transferovani na nitrocelulozne ili PVDF membrane, blokirani inkubacijom u mleku u prahu sa 5% masti u PBST puferu (0.05% -Tween 20 u PBS) i zatim inkubirani sa specifičnim primarnim antCruz Technologies, ibody [anti-p-c-jun, anti-p-Erkl/2 i anti-Erk5 antitela su kupljena od Santa Cruz Biotechnologies (Santa Cruz, CA), pri čemu je anti-p-p38 dobijeno od Cell Signaling (Danvers, MA) i anti-PARP antitelo od Beclon Dickinson Biosciences (Bedford, MA)]. Nakon druge inkubacije sa odgovarajućim sekundarnim antitelom imunoblotovi su razvijeni pomoću povećane hemiluminescencije (ECL; Amersham, Arlington Heights, 1L). Identifikacija aktiviranih JNK i Erk5 zahtevala je prethodnu imunoprecipitaciju proteinskih lizata sa odgovarajućim antitclima i protein A sefarozom.

Analiza izobologramom

Interakcija između Aplidina i drugih anti-MM agenasa je analizirana korišćenjem Calcusyn softvvare programa (Biosoft, Ferguson, MO). Podaci dobijeni iz eseja ćelijske vijabilnosti (MTT) su izraženi kao frakcija ćelija koje su pod uticajem doze (Fa) u ćelijama koje su tretirane sa lekom u poređenju sa netretiranim ćelijama (kontrola). Ovaj program je baziran na Chou-Talalay metodi (Chou TC et al. Adv. Enzyme Regul. (1984) 22: 27-55) prema sledećoj jednačini CI = (D) 1 / (Dx) 1 + (D) 1 (D)2 / (Dx) 1 (Dx)2 gde (D) 1 i (D)2 su doze slani rastvor kontrola (sterilni slani rastvor)a 1 i 2 koji imaju isti x efekat kada su korišćeni sami. CI vrednosti manje od 1.0 ukazuju na sinergizam. Cl vrednosti = 1.0 ukazuju na aditivni efekat, a vrednosti veće od 1 odgovaraju antagonističkom efektu.

Rezultati

Dozni odgovor na Aplidin u ćelijskim linijama izvedenim iz MM

Prvo smo utvrdili da li Aplidin utiče na ćelijsku vijabilnost korišćenjem MTT eseja na ćelijskim linijama izvedenim iz MM i senzitivnoj i rezistentnoj lekove koji se koriste u konvencionalnoj terapiji. Kako se vidi na Slici 54, tretman Aplidinom tokom 48 h indukuje slično smanjenje ćelijske vijabilnosti na dozno-zavistan način u svim testiranim ćelijskim linijama. Smanjenje od 50% vijabilnih ćelija (IC50) nakom 48 h tretmana je bio unutar 1-10 nM opsega za Četiri testirane ćelijske linije.

Efikasnost Aplidina je takođe upoređena sa dugim klasičnim (Melfalan, Deksametazon) i novim lekovima (Bortezomib) u lečenju MM. Slika 55 pokazuje superiornu potentnost Aplidina u poređenju sa drugim lekovima kada su testirani u 0.1-1 nM dozama za 48 h na MM.1S ćelijskoj liniji; njegov efekat je sličan onom koji ima Bortexomib pri maksimalnim dozama (10-100 nM).

Evaluacija sinergizma u dvostrukim kombinacijama Aplidina

Pošto je trajna izloženost MM hemoterapiji u mnogim slučajevima povezana sa povećanom toksičnošću i razvojem rezistentnosti na novi lek, testirali smo da li kombinacije minimalno toksičnih koncentracija Aplidina i drugih lekova mogu uticati na ćelijsku vijabilnost ćelija MM. Specifično, Aplidin je kombinovan sa klasičnim lekovima u lečenju MM (kao stoje Deksametazon ili Melfalan), takođe sa nedavno razvijenim anti-mijelomskim agensima (Bortezomib), i sa drugim lekovima koji bi specifično imali za cilj mikrosredinu koštane srži (lenalidomid (Revlimid<®>)).

Eksperimenati vremenskog toka na dane 1, 2, 3 i 6 su takođe izvedeni za pomenute terapijske agense da se odrede odgovarajuće suboptimalne doze (10% do 30% inhibicije rasta) za eksperimente kombinovanja kao i da se istraži trajanje tretmana. Kombinacija eksperimenata Aplidina i ostalih lekova su izvedene nakon inkubacije od 3 dana ili 6 dana. Ćelijski rast MM. 1S ćelijske linije je izmeren pomoću MTT eseja kako je opisano iznad, i procenti inhibicije su analizirani pomoću CalcuSvn Programa. Kompjuterski izračunat kombinacioni indeks (CI) je korišćen da se procene ishodi kombinacija: CI>1, CI=1, i CI< 1 ukazujući na antagonizam, aditivne, i sinergističke efekte, redom. Uslađenost podataka sa principom srednjeg efekta može biti Iako ispoljen pomoću koeficijenta linearne korelacije (r) grafika srednjeg efekta: log (fa/fu) = m log (D)- m log (Dm), gde D je doza, Dm je doza potreba za 50% efekta, fa je frakcija pod uticajem doze, fu je nepromenjena frakcija (van uticaja), i m je koeficijent sigmoidnosti krive odnosa doze i efekta. Za svaku dvostruku kombinaciju nekonstantan odnos koncentracija je upotrebljen. Svaki eksperiment je ponovljen tri puta, i minimum od tri dobijena podatka za svaki pojedinačni slani rastvor kontrola (sterilni slani rastvor) i tri kombinacije su izvedene.

Kombinacija AplidinasaDeksametazonom

Na dan 3, sinergizam je primećen za kombinaciju 0.5 nM Apiidin/1 nM i 10 nM Deksametazona (Slika 56).

Kao što je ilustrovano na Slici 57, kombinaci ja je više sinergistička na 6 dana.

Kombinacija Aplidina sa Melfalanom

Sledeće kombinacije su pokazale skoro aditivne fekte na 3 i 6 dana (Slike 58 i 59 redom).

Kombinacija AplidinasaDoksorubicinom

Na 3 dana, samo jedna kombinacija je umereno sinergistička (Slika 60, kombinacija I) i dve kombinacije su aditivne (Slika 60, kombinacije 3 i 4).

Na 6 dana samo dve kombinacije su aditivne (Slika 61, kombinacija 7 i 8).

Kombinacija Aplidinasalenalidomidom( Revlimid®)

U pisutnoj studiji, kombinacija Aplidina i lenalidomida (Revlimid®) pokazala je veći stepen sinergizma nego sve druge kombinacije koje su izučene (Slika 62).

Značajno, sinergizam je značajniji na 6 dana (Slika 63).

Kombinacija Aplidina sa Bortezomibom

Ova kombinacija pokazala je antagonizam na 3 dana (Slika 64); na 6 dana sinergizam je pronađen kod dve kombinacije (Slika 65, kombinacija 4 i 6).

Primer 4: In vivo studije da se odredi efekat Aplidina u kombinaciji sa drugim stadardnim agensom u melanomskim i bubrežnim ksenograftima.

Svrha ove studije je da se evaluira antitumorska aktivnost Aplidina kada se administrira sa anitumorskim standardnim agensom, pri čemu su oba administrirana korišćenjem višestrukog doznog rasporeda u nekoliko tipova tumorskih ksenografta ženki miševa bez timusa.

Ženke golih ("nude") miševa bez timusa su dobijene od Harlan Sprague Dawley, Madison, Wisconsin starosti 4-5 nedelja. Miševi su navikavani na laboratoriju najmanje nedelju dana pre implantacije tumora. Životinje su smeštene u statičkim kavezima sa hranom i vodom koje mogu konzumirati kada žele. Eksperimentalne životinje su implantirane sa ili tumorskim fragmentima dobijenih od humanih tumora koji su uspostavljeni transplantacijom ili sa ćelijama dobijenim direktno izin vitrokulture. Tumori su implantirani subkutano na desni bok na Dan 0.

Merenja veličina tumora su zabeležena dva puta nedeljno počevši na dan 4 ili 5 korišćenjem nonijus Šestara. Formula za izračunavanje zaprem ine izduženog elipsoida je korišćena da se proceni zapremina tumora od 2-dimenzionalnih dimenzija tumora: tumorska zapremina (mm<3>) = (dužina x Širina<2>) ^ 2. Pretpostavljajući gustinu jedinica, zapremina je konvertovana u težinu (t.j., 1 mm<J>= I mg). Kada su tumori dostigli približni opseg zapremine od 100 ± 15 mg, miševi su nasumično raspoređeni u grupu koja je tretirana i kontrolnu grupu. Tretmani su inicirani i administrirani na osnovu pojedinačnih telesnih masa. Studije nalaženja doznog opsega su izvedene na svakom tumorskom modelu da se odredi odgovarajući dozni nivo za svako jedinjenje korišćeno u kombinacionim studijama.

Sledeći agensi prilagođeni invidualizovanoj terapiji za različite tipove kancera (indikacije) su kombinovani sa Aplidinom (APL) da se odredi da li će kombinovana terapija obezbediti bolju antitumorsku aktivnost kada se uporcdi sa kombinovanom aktivnošću dva agensa koji su administrirani kao monoterapije.

Tabele 5-10 prikazuju kinetiku neto volumena tumora (srednja vrednost ± S.E.M., mg) nakon početka tretmana sa Aplidinom ili pojedinačno ili u kombinaciji sa standardnim agensom za negu kod ksenografta melanoma i kancera bubrega.

Tabela 5 i Slika 66 i 67 pokazuju kinetiku neto volumena tumora nakon početka tretmana sa Aplidinom (Aplidine®) kao pojedinačnim agensom ili u kombinaciji sa DTIC i karboplatinom u MRI-H187 melanoma tumorski ksenograftima. Aplidin je administriran svaki dan tokom 9 uzastopnih dana pomoću intraperitonealne (i.p.) injekcije, kontrolni slani rastvor (sterilni slani rastvor) svaki dan tokom 9 uzastopnih dana pomoću i.p. injekcije, DTIC svaki dan tokom 5 uzastopnih dana pomoću i.p. injekcije i Karboplatina jedna doza 4 dana do ukupno 4 tretmana pomoću i.p. injekcije.

Na osnovu ove ksenograftske studije zaključeno je da u melanomskim MRI-H187 ćelijama kombinacija Aplidina sa DTIC i Aplidina sa karboplatinom pokazuje jasnu statistički značajnu potencijaciju antitumorske aktivnosti, koja je još značajnija u slučaju kombinacije sa karboplatinom.

Tabela 6 i Slika 68 i 69 pokazuju kinetiku neto volumena tumora nakon početka tretmana sa Aplidinom (Aplidine®) kao pojedinačnim agensom ili u kombinaciju sa Interleukinom-2 (IL-2) i Interferonom-a 2a (INF-a) u tumorskim ksenograftima MRI-H-187 melanoma. Aplidin je administriran svaki dan tokom 9 uzastopnih dana pomoću i.p. injekcije, slani rastvor kontrola (sterilni slani rastvor) svaki dan tokom 9 uzastopnih dana pomoću i.p. injekcije, IL-2 svaki dan tokom 5 radnih dana (ponedeljak-petak) tokom 3 nedelje pomoću i.p. injekcije i INF-a svaki dan tokom 5 radnih dana (ponedeljak-petak) tokom 3 nedelje pomoću subkutane (s.c.) injekcije.

Na osnovu ove ksenograftske studije zaključeno je daje u melanomskim MRI-H187 ćelijama kombinacija Aplidina sa IL-2 i Aplidina sa INF-a pokazala aditivnost.

Tabela 7 i Slika 70 i 71 pokazuju kinetiku neto volumena tumora nakon početka tretmana sa Aplidinom (APL) kao pojedinačnim agensom u kombinaciji sa DTIC i karboplatinom u tumorskim ksenograftima LOX-IMVI melanoma. Aplidin je administriran svaki dan tokom 9 uzastopnih dana pomoću i.p. injekcije, slani rastvor kontrola (sterilni slani rastvor) svaki dan tokom 9 uzastopnih dana pomoću i.p. injekcije, DTIC svaki dan tokom 5 uzastopnih dana pomoću i.p. injekcije i Karboplatina jedna doza svaka 4 dana do ukupnog broja od 4 tretmana pomoću i.p. injekcije.

S.E.M.=Standardna greška srednje vrednosti

Na osnovu ove ksenograftske studije zaključeno je da u melanomskim LOX-IMVI ćelijama kombinacija Aplidina sa DTIC pokazuje aditivni obrazac i kombinacija Aplidina sa karboplatinom pokazuje trend ka sinergizmu.

Tabela 8 i Slika 72 i 73 pokazuju kinetiku neto volumena tumora nakon početka tretmana sa Aplidinom (APL) kao pojedinačnim agensom ili u kombinaciji sa Interieukinom-2 (IL-2) i Interferonom-a 2a (INF-a) u tumorskim ksenograftima LOX-IMVl melanoma. Aplidin je administriran svaki dan tokom 9 uzastopnih dana pomoću i.p. injekcije, slani rastvor kontrola (sterilni slani rastvor) svaki dan tokom 9 uzastopnih dana pomoću i.p. injekcije, IL-2 svaki dan tokom 5 radnih dana (ponedeljak-petak) tokom 3 nedelje pomoću i.p. injekcije i INF-a svaki dan tokom 5 radnih dana (ponedeljak-petak) tokom 3 nedelje pomoću s.c. injekcije.

S.E.M.=Standardna greška srednje vrednosti

Na osnovu ove ksenograftske studije zaključeno je da u melanomskim LOX-IMVI ćelijama kombinacija Aplidina sa IL-2 i Aplidina sa INF-a pokazuje aditivnost.

Tabela 9 i Slika 74, 75 i 76 pokazuju kinetiku neto volumena tumora nakon početka tretmana sa Aplidinom (APL) kao pojedinačnim agensom ili u kombinaciji sa Bevacizumabom (Avastin<®>), lnterieukinom-2 (IL-2) i Interferonom-a 2a (INF-a) u CaKi-1 bubrežnim tumorskim ksenograftima. Aplidin je administriran svaki dan tokom 9 uzastopnih dana pomoću i.p. injekcije, slani rastvor kontrola (sterilni slani rastvor) svaki dan tokom 9 uzastopnih dana pomoću i.p. injekcije, Bevacizumab (Avastin<®>) svaka 3 dana do ukupno 4 tretmana pomoću i.p. injekcije, IL-2 svaki dan tokom 5 radnih dana (ponedeljak-petak) tokom 3 nedelje pomoću i.p. injekcije and INF-a svaki dan tokom 5 radnih dana (ponedeljak-petak) tokom 3 nedelje pomoću s.c. injekcije.

Na osnovu ove ksenograftske studije zaključeno je da u bubrežnim CaKi-1 ćelijama kombinacija Aplidina sa Avastin<®>i Aplidina sa IL-2 pokazuje sinergizam, još značajnije u slučaju kombinacije sa IL-2. Sa druge strane, kombinacija Aplidina sa INF-a pokazuje aditivni obrazac.

Tabela 10 i Slika 77, 78 i 79 pokazuju kinetiku neto volumena tumora nakon početka tretmana sa Aplidinom (APL) kao pojedinačnim agensom ili u kombinaciji sa Bevacizumabom (Avastin<®>), Interleukinom-2 (IL-2) i Interferonom-a 2a (INF-a) u MRI-HI21 bubrežnim tumorskim ksenograftima. Aplidin je administriran svaki dan tokom 9 uzastopnih dana pomoću i.p. injekcije, slani rastvor kontrola (sterilni slani rastvor) svaki dan tokom 9 uzastopnih dana pomoću i.p. injekcije, Bevacizumab (Avastin®) svaka 3 dana do ukupno 4 tretmana pomoću i.p. injekcije, IL-2 svaki dan tokom 5 radnih dana (ponedeljak-petak) tokom 3 nedelje pomoću i.p. injekcije i INF-a svaki dan tokom 5 radnih dana (ponedeljak-petak) tokom 3 nedelje pomoću s.c. injekcije.

Na osnovu ove ksenograftske studije zaključeno je da u bubrežnim MR1-H121 ćelijama tri kombinacije pokazuju aditivni obrazac.

Primer 5. Dodatni in-vitro testovi na ćelijskim linijama multiplog mijeloma (RPMI-8226 i U266B1) su sprovedeni da se odredi efekat Aplidina u kombinaciji sa dva agensa korišćenau individualizovanoj hemoterapiji (Bortezomib i Melfalan).

Aplidin kao pojedinačni agens ili u kombinaciji sa ili Bortezomibom ili Melfalanom su evaluirani na ćelijskim linijama multiplog mijeloma, specifično RPMI-8226 i U266B1 ćelijskim linijama.

Ove ćelijske linije su gajene u RPMI1640 medijumu sa 10% FBS i 1% L-Glutaminom. Svaka ćelijska linija je postavljena u ploče sa 96 bunariča u broju 20,000 ćelija po bunariću.

Prvo Aplidin, Bortezomib i Melfalan su testirani sami da se odredi IC50vrednost za svaki od njih pojedinačno. Da se odredi IC50vrednost svaki lek je proveren na različitim opsezima koncentracija leka, prateći proceduru koja je stavljena na uvid u Primeru 1. Tabela 11 prikazuje pojedinačne IC50dobijene za svaki od tri leka na dve ćelijske linije multiplog mijeloma.

U sledećem koraku ili Bortezomib ili Melfalan su kombinovani sa Aplidinom. U ovim ekperimentima, koncentracije Aplidina su korišćene u serijskom razblaženju 1:10. Svako serijsko razblaženje je upareno sa 4 različite koncentracije Bortezomiba ili Melfalana.

Ploče su inkubirane tokom 3 dana na 37°C i 5% CO2. Ploče su očitane korišćenjem Promega MTS esej sistema sa MTS koji je metabolisan od strane živih ćelija pretvarajući se u formazan koji je fluorescentan na talasnoj dužini od 490nm. Ovo je indirektna mera ćelijske vijabilnosti. One su analizirane korišćenjem Softmax Pro® programa koji određuje ćelijsku vijabilnost na osnovu procenta kontrolnih bunarića. Ovi IC50podaci su zatim prenešeni u program CalcuSvn za analizu kombinacionog indeksa. CalcuSvn poredi IC50vrednosti samih lekova sa onim za lekove u kombinaciji koristeći algoritam da se odredi kombinacioni indeks. Važno je napomenuti da kombinacioni indeks (CI) reflektuje kombinacioni efekat dva leka: CI = 1 ukazuje na aditivni efekat; Cl <1 ukazuje na sinergistički efekat; iCI>l ukazuje na antagonistički efekat.

Tabela 12 sumira one doze gde je primećen sinergistički efekat u kombinaciji Aplidina sa Bortezomibom na RMPI 8226 ćelijskoj liniji:

Tabela 15 sumira one doze gde je primećen sinergistički efekat u kombinaciji Aplidina sa Melfalanom na U266B1 ćelijskoj liniji:

Primer 6. Dodatni in-vitro eseji na ćelijskim linijama leukemije (MOLT4 and K-562) su sprovedene da se utvrdi efekat Aplidina u kombinaciji sa agensom korišćenim u individualizovanoj hemoterapiji kao što je Idarubicin.

Aplidin kao pojedinačni agens ili u kombinaciji Idarubicinom su evaluirani na ćelijskim linijama leukemije, specifično MOLT4 i K.562 ćelijskim linijama.

Ove ćelijske linije su gajene u RPM11640 medijumu sa 10% FBS i 2mM L-Glutaminom. Svaka ćelijska linija je postavljena u ploče sa 96 bunarića u količini od 20,000 ćelija po bunariću.

Prvo su Aplidin i Idarubicin bili testirani sami da se odredi IC50vrednost za svaki od njih pojedinačno. Da se odredi IC50vrednost svaki lek je proveren u različitom opsegu koncentracija, prateći proceduru kako je prikazan u Primeru 1. Tabela 16 prikazuje pojedinačne IC50dobijene za svaki od dva leka na ćelijskim linijama leukemije.

U sledećem koraku Idarubicin je kombinovan sa Aplidinom. U eksperimentu u vezi sa MOLT4 ćelijskom linijom, koncentracije Aplidina su korišćene u serijskom razblaženju 1:10. Svako serijsko razblaženje je upareno sa 4 različite koncentracije Jdarubicina. U eksperimentu u vezi sa K562 ćelijskom linijom, koncentracije Aplidina su korišćene u serijskom razblaženju 1:5, i koncentracija Idarubicina je dodata u svaki set kombinacija na osnovu odnosa. Tako, kombinacija A je 1:1, kombinacija B je 0.008:1, kombinacija C je 6.4E-05:! i kombinacija Dje 5.12E-07:!.

Ploče su inkubirane tokom 3 dana na 37°C i 5% CO2. Ploče su očitane korišćenjem Promega MTS esej sistema sa MTS koji je metabolisan od strane živih ćelija pretvarajući se u formazan koji je fluorescentan na talasnoj dužini od 490nm. Ovo je indirektna mera ćelijske vijabilnosti. One su analizirane korišćenjem Softmax Pro® programa koji određuje ćelijsku vijabilnost na osnovu procenta kontrolnih bunarića. Ovi ICsopodaci su zatim preneseni u program CalcuSvn za analizu kombinacionog indeksa. CalcuSvn poredi ICsovrednosti samih lekova sa onim za iekove u kombinaciji koristeći algoritam da se odredi kombinacioni indeks. Važno je napomenuti da kombinacioni indeks (Cl) reflektuje kombinacioni efekat dva leka: Cl = 1 ukazuje na aditivni efekat; Cl <1 ukazuje na sinergistički efekat; iCI>l ukazuje na antagonistički efekat.

Tabela 17 sumira one doze gde je primećen sinergistički efekat u kombinaciji Aplidina sa Idarubicinom na MOLT4 ćelijskoj liniji:

Tabela 18 sumira one doze gde je primećen sinergistički efekat u kombinaciji Aplidina sa Idarubicinom na K562 ćelijskoj liniji:

Primer 7: In vivo studije da se odredi efekat Aplidina u kombinaciji sa drugim standardnim agensom u melanomskim ksenograftima.

Svrha ove studije je da se evaluira antitumorska efikasnost Aplidina kada je administriran u kombinaciji sa karboplatinom na subkutano-implantiranim UACC-257 humanim melanomskim ćelijama kod ženkiNCr-m//«wmiševa bez timusa.

Životinje su bile smešete u mikro-izolovanim kavezima, do pet po kavezu u ciklusu 12-sati svetio/mrak. Ženke stare šest nedclja,NCr-/Wrtwmiševa bez timusa su se aklimatizovale u laboratoriji tokom jedne nedelje pre eksperimenta.

Svaki miš je inokulisan subkutano blizu desnog boka sa UACC-257 humanim melanomskim ćelijama poreklom od in vitro ćelijske kulture korišćenjem igle od 23-gauge. Svaki miš je dobio 2 x IO7 ćelija resuspendovanih u 0.2 mL matrigela Matrigel<®.>Vajlica sa UACC-257 humanim melanomskim zamrznutim ćelijama je otopljena i ćelije stavljene u medijum RPMI 1640 koji ima nizak sadržaj glukoze (2,000 mg/L), natrijum bikarbonata (1,500 mg/mL), 2 mM L-glutamina, i 10% fetalnog goveđeg seruma (kompletni medijum), i gajene na +37°C u inkubatoru u vlažnoj atmosferi sa 5% COi dok neophodni broj ćelija za inokulaciju nije dobijen. Ćelije su sakupljene nakon Četiri pasaža u kulturi. Ćelije su uklonjene iz falkona, postavljene u epruvete za centrifugiranje od 50 mL i centrtfugirane na 1,000 rpm tokom 10 minuta u centrifugi u frižideru. Ćelijski taloži su resuspendovani u svežem kompletnom medijumu. Ćelijski broj i vijabilnost su određeni sa Beckman Coulter VI CELL XR ćelijskim brojačem i analizatorom vijabilnosti. Ćelijska suspenzija je centrifugirana, i ćelijski talog je resuspendovan u matrigelu Matrigel<®>u gustini ćelija od 1.0 x 10<8>ćelija/mL i postavljen na vlažan led. Finalna koncentracija matrigela Matrigel<®>u ćelijskoj suspenziji je bila 56.9%. Na dan kada su se ćelije sakupljale ćelijska vijabilnost je bila 98.9%.

Dan inokulacije tumorskih ćelija je označen kao Dan 0. Pojedinačni tumori su rasli do 150-245 mg u težini (150-245 mm<3>u veličini) na dan početka lečenja, Dan 13 nakon inokulacije tumorskih ćelija. Četrdeset životinja sa tumorima u odgovarajućem opsegu veličina je dodeljeno u četiri grupe za tretman tako daje su srednje tumorske težine na prvi dan tretmana bile što je moguće bliže jedna drugoj.

Eksperiment se sastojao od kontrolne grupe tretirane nosačem od 10 miševa i tri grupe tretirane lekom od 40 miševa za ukupno 40 miševa na prvi dan lečenja, dan 13 nakon inokulacije tumorskih ćelija. Životinje u grupi 1 su tretirane i.p. svaki dan tokom 9 uzastopnih dana (Dani 13-21) sa nosačem Aplidina razblaženog sa slanim rastvorom. Aplidin je administriran i.p. svaki dan tokom 9 dana (Dani 13-21) u dozi od 60 u-g/kg/dozi pojedinačno (Grupa 2) ili u kombinaciji sa karboplatinom (Grupa 4). Karboplatina je administrirana i.v. svaka 4 dana do ukupno tri tretmana (Dani 13, 17, i 2 1) u dozi od 50 mg/kg/dozi samoj (Grupa 3) ili u kombinaciji sa Aplidinom (Grupa 4). Na dane kada su oba jedinjenja administrirana Grupi 4, Aplidin je injektiran prvo svakoj od 10 životinja u grupi, praćeno odmah sa administracijom Karboplatine (Grupa 4).

Grupa 1 je tretirana i.p. sa 0.18% kremofor EL/0.18% etanol/0.84% WFl/98.8% slani rastvor (zapremina injekcije: 0.1 mL/10 g telesne mase). Aplidin je rekonstituisan pomoću nosača koji se sastoji od 15% kremofor EL/15%, etanola 70% WF1 i razblažen sa slanim rastvorom (zapremina injekcije: 0.1 mL/10 g telesne mase). Karboplatina je pripremljena u WFI (zapremina injekcije: 0.1 mL/10 g telesne mase).

Životinje su posmatrane svakodnevno i klinički znaci su zabeleženi. S.c. tumori su izmereni i životinje su inerene dva puta nedeljno počevši od prvog dana lečenja, Dan 13. Volumen tumora je određen pomoću merenja šestarom (kaliperom) (mm) i korišćenjem formule za elipsoidnu sferu:

LxW<2>/2=mm3,

Gde seLiWodnose na veće i manje perpendikularne dimenzije sakupljene pri svakom merenju. Ova formula je takođe korišćena da se izračuna masa tumora, pretpostavljajući jedinicu gustine(l mm - 1 mg).

Poređenje srednje vrednosti mase tumora u Grupi koja se tretira (T) sa srednjom vrednošću mase tumora u kontrolnoj grupi (T/C x 100%) na Dan 23 (dva dana nakon kraja tretmana) i Dan 70 (dan završetka studije) su korisćeni za evaluaciju antitumorske efikasnosti. %T/ C za svaki tretman je pokazano u Tabeli 19.

Raspored nosača: q 1 d x 9 dan 13

Raspored Aplidina: qld x 9 dan 13

Raspored Karboplatine: q4d x 3 dan 13

Raspored Aplidin/Karboplatina: qld x 9 dan 13/ q4d x 3 dan 13

Kombinovani tretman Aplidin plus Karboplatina je tolerisan bez smrtnosti. Kombinovani tretman je rezultovao u T/C vrednostima od 95% i 53% na Dane 23 i 70, redom.

Primer 8: In vivo studije da se odredi efekat Aplidina u kombinaciji sa drugim standardnim agensom kod mijelomskih ksenografta.

Svrha ove studije je da se evaluira antitumorska aktivnost Aplidina kada se administrira u kombinaciji sa bortezomibom na subkutano-implantiranim RPMI 8226 humanim mijelomskim ćelijama kod mužjaka SCID miševa.

Životinje su bile smešete u mikro-izolovanim kavezima, do pet po kavezu u ciklusu 12-sati svetio/mrak. Mužjaci stare šest nedelja, SCID miševa su sc aklimatizovali u laboratoriji tokom jedne nedelje pre eksperimenta.

Svaki mišje inokulisan s.c. blizu desnog boka sa RPMI 8226 humanim mijelomskim ćelija poreklom od in vitro ćelijske kulture korišćenjem igle od 23-gauge. Svaki miš je dobio 2 x IO<7>ćelija resuspendovanih u 0.2 mL matrigela Matrigel<®>. RPMI 8226 humane mijelomske ćelijame su originalno kupljene od ATCC (ATCC broj: CCL-155). Vajlica sa zamrznutim ćelijama je otopljena i ćelije stavljene u medijum RPMI 1640 koji ima visok sadržaj glukoze (4,500 mg/L), natrijum bikarbonat (1,500 mg/mL), 2 mM L-glutamin, 10 mM Hepes, 1 mM natrijum piruvat, i 10% fetalnog goveđeg seruma (kompletni medijum), i gajene na +37°C u inkubatoru u vlažnoj atmosferi sa 5% CO2dok neophodni broj ćelija za inokulaciju nije dobijen. Ćelije su sakupljene nakon četiri pasaža u kulturi. Ćelije su uklonjene iz falkona, postavljene u epruvete za centrifugiranje od 50 mL i centrifugirane na 1,000 rpm tokom 10 minuta u centrifugi u frižideru. Ćelijski taloži su resuspendovani u svežem kompletnom medijumu. Ćelijski broj i vijabilnost su određeni sa Beckman Coulter VI CELL XR ćelijskim brojačem i analizatorom vijabilnosti. Ćelijska suspenzija je centri fugi rana, i ćelijski talog je resuspendovan u matrigelu Matrigcl<*>u gustini ćelija od 1.0 x 10<s>ćelija/mL i postavljen na vlažan led. Finalna koncentracija matrigela Matrigel<®>u ćelijskoj suspenziji je bila 78.3%. Na dan kada su se ćelije sakupljale ćelijska vijabilnost je bila 89.3%.

Dan inokulacije tumorskih ćelija je označen kao Dan 0. Pojedinačni tumori su rasli do 75-188 mg u težini (75-188 mm<3>u veličini) na dan početka lečenja. Dan 18 nakon inokulacije tumorskih ćelija. One životinje odabrane sa tumorima u odgovarajućem opsegu veličina su dodeljene u četiri grupe za tretman tako da su srednje tumorske težine na prvi dan tretmana bile stoje moguće bliže jedna drugoj.

Eksperiment se sastojao od kontrolne grupe tretirane nosačem od 10 miševa i tri grupe tretirane lekom od 10 miševa za ukupno 40 miševa na prvi dan lečenja, dan 18 nakon inokulacije tumorskih ćelija. Životinje u grupi I su tretirane i.p. u dva kruga tokom 9 uzastopnih dana (Dani 18-26 i Dani 38-46) sa nosačem Aplidina razblaženog sa slanim rastvorom. Aplidin je administriran i.p. tokom dva kruga tokom 9 uzastopnih dana (Dani 13-21) u dozi od 60 (ig/kg/dozi pojedinačno (Grupa 2) ili u kombinaciji sa bortezomibom (Grupa 4). Bortezomib je administriran i.v. u dozi od 0.35 mg/kg/doza tokom četiri nedelje svaka 3 dana do ukupno 2 tretmana počevši na Dan 18 praćeno sa još jednom i.v. injekcijom administriranom na Dan 46 pojedinačno (Grupa 3) ili u kombinaciji sa Aplidinom (Grupa 4). Na dane kada su oba jedinjenja administrirana Grupi 4, Aplidin je injektiran prvo svakoj od 10 životinja u grupi, praćeno odmah sa adminsitracijom bortezomiba (Grupa 4).

Grupa 1 je tretirana i.p. sa 0.18% kremofor EL/0.18% etanol/0.84% WFI/98.8% slani rastvor (zapremina injekcije: 0.1 mL/10 g telesne mase). Aplidin je rekonstituisan pomoću nosača koji se sastoji od 15% kremofor EL/15%, etanola 70% WFI i razblažen sa slanim rastvorom (zapremina injekcije: 0.1 mL/10 g telesne mase). Velcade<®>(Bortezomib) je pripremljen u slanom rastvoru (zapremina injekcije: 0.1 mL/10 g telesne mase).

Životinje su posmatrane svakodnevno i klinički znaci su zabeleženi. S.c. tumori su izmereni i životinje su merene dva puta nedeljno počevši od prvog dana lečenja, Dan 18. nakon inokulacije tumorskih ćelija. Volumen tumora je određen pomoću mcrenja šestarom (kaliperom) (mm) i korišćenjem formule za elipsoidnu sferu, kako je opisano u Primeru 7.

Poređenje srednje vrednosti mase tumora u Grupi koja se tretira (T) sa srednjom vrednošću mase tumora u kontrolnoj grupi (T/C x 100%) na Dan 27 (jedan dan nakon kraja prvog kruga tretmana Aplidinom) i Dan 48 (dva dana nakon kraja tretmana sa Aplidinom i Bortezomibom) su korišćeni za evaluaciju antitumorske efikasnosti. %T/ C za svaki tretman je pokazano u Tabeli 20.

Bortezomib mg/kg/dozaIV

Raspored Nosača: qld x 9 dan 18, 38

Raspored Aplidina: qld x 9 dan 18, 38

Raspored Bortezomiba: q3d x 2 dan 18, 25, 32, 39; qld x 1 day 46

Raspored Aplidin/Bortezomib: qld x 9 dan 18, 38/ q3d x 2 dan 18, 25, 32, 39; qld x 1 dan 46

Kombinovani tretman Aplidin plus Bortezomib je tolerisan bez smrtnosti. Kombinovani tretman je bio efikasan u inhibiciji rasta RPMI 8226 mijelomskih ćelija, rezultujući u T/C vrednostima od 49% i 31% na dane 27 i 48, redom. Antitumorska aktivnost kombinovanog tretmana je bila veća nego aditivna u poređenju sa antitumorskom aktivnošću proizvedenom administracijom svakog jedi njenja pojedinačno.

Primer 9: In vivo studije da se odredi efekat Aplidina u kombinaciji sa drugim standardnim agensom kod ksenografta limfoma.

Svrha ove studije je da se evaluira antitumorska aktivnost Aplidina kada se administrira u kombinaciji sa rituksimabom na subkutano-implantiranim RL humanim ćelijama limfoma kod ženki SCID miševa.

Životinje su bile smešete u mikro-izolovanim kavezima, do pet po kavezu u ciklusu 12-sati svetio/mrak. Mužjak star šest nedelja, SCID miševa su se aklimatizovali u laboratoriji tokom jedne nedelje pre eksperimenta.

Svaki miš je inokulisan s.c. blizu desnog boka sa RL humanim ćelijama limfoma ćelija porcklom od in vitro ćelijske kulture korišćenjem igle od 23-gauge. Svaki mišje dobio 2 x 10<7>ćelija resuspendovanih u 0.2 mL matrigela Matrigel<®>. Vajlica sa zamrznutim ćelijama je otopljena i ćelije stavljene u medijum RPMI 1640 koji ima visok sadržaj glukoze (4,500 mg/L), natrijum bikarbonat (1,500 mg/mL), 2 mM L-glutamin, 10 mM Hepes, 1 mM natrijum piruvat, i 10% goveđi fetalni serum (kompletni medijum), i gajene u inkubatoru na +37°C u vlažnoj atmosferi sa 5% CO2dok neophodni broj ćelija za inokulaciju miševa nije dobijen. Ćelije su sakupljene nakon šest pasaža u kulturi. Ćelije su uklonjene iz falkona, postavljene u epruvete za centrifugiranje od 50 mL i centrifugirane na 1,000 rpm tokom 10 minuta u centrifugi u frižideru. Ćelijski taloži su resuspendovani u svežein kompletnom medijumu. Broj ćelija je određen korišćenjem ćelijskog brojača Coulter Model Zl i vijabilnost je izmerena praćenjem bojenja sa propidijum jodidom i analizirana na protočnom citometru Beckman Coulter EPICS XL. Ćelijska suspenzija je centrifugirana, i ćelijski talog je resuspendovan u matrigelu Matrigel* u gustini ćelija od 5.0 x IO<7>ćeiija/mL i postavljen navlažan led. Finalna koncentracija matrigela Matrigel<®>u ćelijskoj suspenziji je bila 73.0%. Na dan kada su se ćelije sakupljale ćelijska vijabilnost je bila 98.9%.

Dan inokulacije tumorskih ćelija je označen kao Dan 0. Pojedinačni tumori su rasli do 100-196 mg u težini (100-196 mm<3>u veličini) na dan početka lečenja, Dan 15 nakon inokulacije tumorskih ćelija. Četrdeset životinja sa tumorima u odgovarajućem opsegu veličina su dodeljene u Četiri grupe za tretman tako da su srednje tumorske mase na prvi dan tretmana bile stoje moguće bliže jedna drugoj.

Eksperiment se sastojao od kontrolne grupe tretirane nosačem od 10 miševa i tri grupe tretirane lekom od 10 miševa po grupi do ukupno 40 miševa na prvi dan lečenja, dan 15 nakon inokulacije tumorskih ćelija. Životinje u grupi 1 su tretirane i.p. u dva kruga svaki dan tokom 9 uzastopnih dana (Dani 15-23 i Dani 28-36) sa nosačem Aplidina razblaženog sa slanim rastvorom. Aplidin je administriran i.p. tokom dva kruga svaki dan tokom 9 uzastopnih dana (Dani 15-23 i Dani 28-36) u dozi od 60 ug/kg/dozi pojedinačno (Grupa 2) ili u kombinaciji sa Rituksimabom (Grupa 4). Rituksimab je administriran i.p. u dozi od 20 mg/kg/doza tokom četiri nedeljna kruga tretmana svaka 3 dana do ukupno 2 tretmana (q3d x 2 raspored) počevši na dan 15 pojedinačno (Grupa 3) ili u kombinaciji sa Aplidinom (Grupa 4). Na dane kada su oba jedinjenja administrirana Grupi 4, Aplidin je injektiran prvo svakoj od 10 životinja u grupi, praćeno odmah sa administracijom Rituksimaba (Grupa 4).

Grupa I je tretirana i.p. sa 0.18% kremofor EL/0.18% etanol/0.84% WFI/98.8% slani rastvor (zapremina injekcije: 0.1 mL/10 g telesne mase). Aplidin je rekonstituisan pomoću nosača koji se sastoji od 15% kremofor EL/15%, etanola 70% WFI i razblažen sa slanim rastvorom (zapremina injekcije: 0.1 mL/10 g telesne mase). Rituxan® (Rituksimab) je pripremljen u slanom rastvora (zapremina injekcije: 0.1 mL/10 g telesne mase).

Životinje su posmatrane svakodnevno i klinički znaci su zabeleženi. S.c. tumori su izmereni i životinje su merene dva puta nedeljno počevši od prvog dana lečenja. Dan 15. Volumen tumora je određen pomoću merenja šestarom (kaliperom) (mm) i korišćenjem formule za elipsoidnu sferu, kako je opisano u Primeru 7.

Poređenje srednje vrednosti mase tumora u Grupi koja se tretira (T) sa srednjom vrednošću mase tumora u kontrolnoj grupi (T/C x 100%) na Dan 24 (jedan dan nakon kraja 9-dnevnog kruga tretmana Aplidinom) i Dan 38 (dva dana nakon kraja drugog 9-dnevnog kruga tretmana sa Aplidinom) su korišćeni za evaluaciju antitumorske efikasnosti.%T7C za svaki tretman je pokazano u Tabeli 21.

Raspored Nosača: q 1 d x 9 dan 15, 28

Raspored Aplidina: qld x 9 dan 15, 28

Raspored Rituksimaba: q3d x 2 dan 15, 22, 29, 36

Raspored Aplidin/Rituksimaba: q ld x 9 dan 15, 28/ q3d x 2 dan 15, 22, 29, 36

Kombinovani tretman Aplidin plus Rituksimab je tolcrisan bez smrtnosti. Kombinovani tretman je bio efikasan u inhibiciji rasta RL ćelija limfoma, rezultujući u T/C vrednostima od 69% i 74% na dane 27 i 38, redom. Dakle, kada je Aplidin kombinovan sa Rituksimabom primećeno je pojačanje antitumorske aktivnosti.

Primer 10: In vivo studije da se odredi efekat Aplidina u kombinaciji sa drugim standardnim agensima (trostruke kombinacije) na tumorskim ćelijskim linijama multiplog mijeloma.

U ovoj studiji trostruke kombinacije antitumorskih agenasa su analizirane. Sve kombinacije su testurane korišćenjem eseja ćelijske vijabilnosti (MMT) na MM.1S ćelijskoj liniji, veoma senzitivnoj MM ćelijskoj liniji. Rezultati su analizirani korišćenjem Calcusyn softvvare.

Ćelijske linije i reagensi za ćelijske kulture

Deksametazon-senzitivna MM ćelijska linija MM.1S je dobijena Ijubaznošću Dr. S Rudikoff, Bethesda MD). Ćelijska linija je gajena u RPMI 1640 medijumu obogaćenoj sa 10% fetalnog goveđeg seruma koji je inaktivisan toplotom, 100 U/ml penicilina, 100 (ig/ml streptomicina i 2 mM L-glutamina. Sve ćelijske kulture i medijumi su kupljeni od Invitrogen Corporation (Carlsbad, CA).

Eseji ćelijske vijabilnosti

Analiza MM ćelijske proliferacije je procenjena korišćenjem metiltiotetrazol (MTT; Sigma, St. Louis MO) kolorimetrijskog eseja. MM ćelijske linije su sađene u gustini od 50000 ćelija/200ul medijuma po bunariću u pločama sa 48 bunarića, i tretirane sa određenim dozama i vremenskim intervalima. Dva sata pre kraja tretmana, MTT rastvor (5 mg/ml u PBS; obično 10% zaprem ine u svakom bunariću) je dodato i tetrazoliumska soje redukovana od strane metabolički aktivnih ćelija do obojenih formazanskih kristala. Nakon rastvaranja ovih kristala inkubacijom preko noći sa 10% SDS-HCI rastvorom, izmerena je apsorbanca na 570nm sa korekcijom na 630nm, Četiri bunarića su analizirana za svako stanje, i rezultati su prikazani kao srednja vrednost ± SD od kvadriplikata reprezentativnog eksperimenta koji je ponovljen najmanje tri puta.

Analiza izobologramom

Interakcija između Aplidina i drugih anti-MM agenasa je analizirana korišćenjem programa Calcusvn softvvare (Biosoft, Ferguson, MO). Podaci eseja ćelijske vijabilnosti (MTT) su izraženi kao frakcija ćelija pod uticajem doze (Fa) u ćelijama tretiranim lekom u poređenju sa netretiranim ćelijama (kontrola). Ovaj program je baziran na Chou-Talalay metodi prema sledećoj jednačini CI = (D)l/(Dx)l + (D)l (D)2/(Dx)I (Dx)2 gde (D)l i (D)2 su doze leka 1 i 2 koje imaju isti x efekat kada su korišćene same.

Kompjuterski izračunat kombinacioni indeks (CI) je korišćen da se procene ishodi kombinacija: CI>1, CI=1, i CI<1 ukazujući na antagonizam, aditivne, i sinergističke efekte, redom. Usklađenost podataka sa principom srednjeg-efekta može biti jasno pokazan pomoću koeficijenta linearne regresije (r) grafikona srednjeg-efekta: log (fa/fu) = m log (D)- m log (Dm), gde D je doza, Dm je doza potrebna za 50% efekta, fa je frakcija pod uticajem doze, fu je frakcija bez uticaja, i m je koeficijent sigmoidnosti krive odnosa doze i efekta. Za svaku kombinaciju nekonstantan odnos kombinacija je upotrebljen.

Rezultati

Kombinacija Aplidin+Lenalidomid ( Revlimid81)+Deksametazon

Dodavanje Deksametazona kombinaciji Aplidin + Lenalidomid pokazala je značajnu sinergiju u svim testiranim kombinacijama na senzitivnoj ćelijskoj liniji (MM1S) (Slika 80). Na Slici 80 doze Aplidina su izražene u nM jedinicama, doze Lenalidomida su izražene u uM jedinicama i Deksametazon doze su izražene u nM jedinicama.

Kombinacija Aplidin+Bortezomib+Deksametazon

Dodavanje Deksametazona kombinaciji Aplidina sa Bortezomibom rezultovala je u nekoliko doza sa jasnim trendom ka sinergiji (Slika 81). Na Slici 81 doze Aplidina su izražene u nM jedinicama, doze Bortezomiba su izražene u nM jedinicama i Deksametazon doze su izražene u nM jedinicama.

Kombinacija Aplidin+Bortezomib+Lenalidomide ( Revlimid®)

Dodavanje Deksametazona kombinaciji Aplidina sa imunomodulatornim agensom kao što je Lenalidomid jasno je povećala njegov antitumorski efekat sa CI u opsegu sinergizma na MM1S (Slika 82). Na slici 82 doze Aplidina su izražene u nM jedinicama, doze Bortezomiba su izražene u nM jedinicama i doze Lenalidomida su izražene u uM jedinicama.

Kombinacija Aplidin+Talidomid+Deksametazon

Ova kombinacija je pokazala jasnu sinergiju u trostrukim kombinacijama kako se vidi na Slici 83. Na Slici 83 doze Aplidina su izražene u nM jedinicama, Talidomid doze su izražene u fiM jedinicama i Deksametazon doze su izražene u nM jedinicama.

Kombinacija Aplidin+Melfalan+Deksametazon

Ova kombinacija je pokazala takođe jasan opseg sinergizma, uglavnom sa visokim dozama lekova (Slika 84). Na Slici 84 doze Aplidina su izražene u nM jedinicama, Melfalan doze su izražene u uM jedinicama i Deksametazon doze su izražene u nM jedinicama.

Kombinacija Aplidin+Melfalan+Bortezomib

Ova kombinacija je rezultovala sa CI u opsegu sinergizma pri korišćenju visokih doza (Slika 85). Na Slici 85 doze Aplidina su izražene u nM jedinicama, Melfalan doze su izražene u (iM jedinicama i doze Bortezomiba su izražene u nM jedinicama.

Ovi zaključci u vezi sa Aplidinom mogu biti prošireni na analoge Aplidina, derivate i srodna jedinjenja. Na primer, takođe opisujemo kombinaciju jedinjenja kao stoje ono iz WO 02 02596 sa antikancerskim lekom, poželjno paklitaksel (TaxoI<*>), doksorubicin, cisplatina. arsenik trioksid, 5-fluorouracil (5-FU), citozin arabinozid (AraC), karboplatina, 7-etil-10-hidroksikamptotecin (SN38), etopozid (VP16), melfalan, deksametazon, ciklofosfamid, bortezomib, erlotinib, trastuzumab, lenalidomid (Revlimid®), interleukin-2 (IL-2), interferon-a 2 (INF- a), dakarbazin (DTIC), bevacizumab (Avastin®), idarubicin, talidomid, i rituksimab.

Primeri analoga Aplidina koji mogu biti korišćeni umesto samog Aplidina uključuju poželjna jedinjenja prikazana u WO 02 02596. Poželjnije, analozi su strukturno bliski Aplidinu, i obično se razlikuju od Aplidina u odnosu na amino kiselinu ili terminalni bočni lanac. Različita amino kiselina može biti u cikličnom delu molekula ili u bočnom lancu. Mnogi primeri ovakvih jedinjenja su dati u WO 02 02596.

Claims (4)

1. Aplidin za primenu u metodi za lečenje multiplog mijeloma pomoću kombinovane terapije korišćenjem Aplidina u sinergističkoj kombinaciji sa deksametazonom.

2. Aplidin za primenu prema patentnom zahtevu 1, gde Apiidin i deksametazon formiraju deo iste kompozicije.

3. Aplidin za primenu prema patentnom zahtevu 1. gde su Aplidin i deksametazon obezbeđeni kao zasebne kompozicije gde je deksametazon administriran pre, za vreme, ili nakon administriranja Aplidina.

4. Aplidin za primenu prema patentnom zahtevu 3, gde su Aplidin i deksametazon obezbeđeni kao zasebne kompozicije u kojima je deksametazon administriran pre, ili nakon administriranja Aplidina.