RS54963B1 - Polipeptidi stereptococcus suis-a i polinukleotidi koji ih kodiraju i njihova primena u vakcinama i dijagnostici - Google Patents

Description

OBLAST PRONALASKA

[0001] Ovaj pronalazak se odnosi na oblastStreptococcus- a.Specifičnije, ovaj pronalazak sc odnosi na identifikaciju polipeptida i polinukleotidnih sekvenci koje ih kodiraju, koji su uključeni u patogeni mehanizamS. suis.Ovaj pronalazak se takođe odnosi na upotrebu tih polipeptida u sastavima i metodima za sprečavanje, lečenje i dijagnozu oboljenja vezanih zaS. suisi infekcija izazvanih njim.

STANJE U STRUCI

100021Streptococcus suis jevažan svinjski patogen koji izaziva mnoga patološka stanja kao što su artritis, endokarditis, meningitis, upala pluća i septikemija (13, 14). On je i važan zoonotski agens za ljude u kontaktu sa kontaminiranim svinjama ili njihovim nuzproizvodima. koji izazivaju meningitis i endokarditis (1, 36). Trenutno se zna za trideset tri serotipa (tipovi od ! do 31, 33 i 1 2) zasnovana na kapsularnim antigenima (9-1 I. 15. 17. 31). Smatra se da je tip 2 najvirulentniji i da je prevalentan tip u obolelim svinjama. Mehanizmi koji su uključeni u patogenezu i virulencijuS..yh/,vse ne razumeju potpuno (13) i pokušaji da se kontroliše infekcija su sprečeni nedostatkom efektivnih vakeina.

100031 Nekoliko pristupa je napravljeno da bi se razvile vakcine zaS. suis.Međutim, postignut je slab uspeh jer je zaštita bila zavisna ili od serotipa ili od soja i rezultati su u većini slučajeva bili dvosmisleni (16, 30). Na primer, objavljena je neka zaštita sa ubijenim celim ćelijama i živom avirulentnom vakcinom, ali je to zahtevalo ponavljanje imunizacije i zaštita od heterolognih izazivača nije određena (18, 38). Izlaganje mladih prasića živim virulentnim sojevima je pokazalo pozitivan efekat u smanjenju kliničkih znaka karakterističnih za infekcijuS. suis- om,ali ne i u centralnom nervnom sistemu, ni u mortalitetu (35). Pošto kapsulaS. suisigra važnu ulogu u virulenciji. napravljeni su pokušaji da se razvije vakeina na osnovu kapsulamog materijala. Međutim, ova vakcinacija nije zadovoljavala, jer je kapsularni polisaharid slabo imunogen (7). Nedavno, interes je pomeren na proteinske antigeneS. suiskao na kandidate za vakcinu. Pokazano je da subjediniena vakeina koja koristi suilisin (20) ili MRP (protein koji oslobađa muramidazu) i EF (vanćelijski proteinski faktor) (39) štite svinje od homolognih i heterolognih sojeva serotipa 2, ali je njihova upotreba ometena činjenicom da znatan broj virulentnih sojeva u nekim geografskim regionima ne eksprimira ove proteine (S, 12, 29). Identifikovan je gen koji kodira protein od 38 kDaStreptococcus suis- a.Ovaj protein bi bio sposoban da izazove protektivni imuni odgovor u svinjama (45). Prema tome, identifikacija drugih antigenih faktora, naročito proteina sa površine, bi doprinela razvoju subjedinične vakcine.

|0004J Prema tome, postoji potreba za otkrićem i upotrebom novih meta za sprečavanje, lečenje i dijagnozu oboljenja vezanih zaS. suisi infekcija izazvanih njim.

SAŽETAK PRONALASKA

|0005| Cilj pronalaska je da se zadovolji gore pomenuta potreba. Konkretni je, cilj je postignut obezbeđivanjem izolovanog SPI, sposobnog da podigne imuni odgovor specifično naStreptococcus suis,koji se sastoji od aminokiselinske sekvence koja ima najmanje 95% identičnosti sa aminokiselinskom sekvencom navedenom u SEQ ID NO: 4 ili 17.

10006]Drugi cilj pronalaska se takođc odnosi na i/.olovan polinukleotid SPI koji kodira polipeptid kao Sto je gore definisan.

[0007] Ovaj pronalazak se dalje odnosi na antitelo koje se specifično vezuje za polipeptid SPI iz pronalaska, koje se sastoji od aminokiselinske sekvence navedene u SEQ 1D NO: 4 ili u SEQ 1D NO: 17.

|0008] Još jedan cilj pronalaska je da obezbedi vektor koji sadrži polinukleotid kao što je gore definisan.

[0009] Jedan drugi cilj pronalaska je da obezbedi sastav za sprečavanje ili lečenje oboljenja vezanih zaS. suisili infekcija izazvanih njim, koji sadrži prihvatljiv nosač i bar jedan od sledećih elemenata:

polipeptid kao što je gore definisan:

polinukleotid kao što je gore definisan:

vektor kao što je gore definisan.

[0010] Još jedan cilj pronalaska je da obezbedi sastav koji sadrži prihvatljiv nosač i bar jedno antitelo kao što je gore definisano.

[0011] Jedan drugi cilj pronalaska se odnosi na metod za dobijanje sastava kao što je gore definisan za sprečavanje oboljenja vezanih zaS. suisili infekcija izazvanih njim, koji sadrži korak mešanja bar jednog antitela kao što je gore definisano sa bar jednim prihvatljivim nosačem, gde je bar jedno antitelo rezultat vakcinisanja adjuvantom koji usmerava Th-1.

[0012] Jedan drugi cilj pronalaska se odnosi na metod za dobijanje sastava za upotrebu u sprečavanje oboljenja vezanih za5. suisili infekcija u životinji, koji sadrži korak mešanja bar jednog od sledećih:

polipeptid kao stoje gore definisan:

polinukleotid kao što je gore definisan:

vektor kao što je gore definisan;

sa bar jednim prihvatljivim nosačem i adjuvantom koji usmerava Th-1.

[0013] Dalji cilj pronalaska je polipeptid kao što je gore definisan i adjuvant koji usmerava Th-1; polinukleotid kao što je gore definisan i adjuvant koji usmerava Th-1; ekspresioni vektor kao što je gore definisan i adjuvant koji usmerava Th-1: ili sastav kao što je gore definisan i adjuvant koji usmerava Th-1: za upotrebu kao lek ili kao vakeina.

[0014] Jedan drugi cilj pronalaska se odnosi na polipeptid kao što je gore definisan i adjuvant koji usmerava Th-1; polinukleotid kao sto je gore definisan i adjuvant koji usmerava Th-1: ekspresioni vektor kao što je gore definisan i adjuvant koji usmerava Th-1; ili sastav kao što je gore definisan i adjuvant koji usmerava Th-1: za upotrebu u prevenciji oboljenja vezanih zaS, suisili infekcija u životinji.

[0015] Dalje, jedan cilj se odnosi na antitelo kao što je gore definisano ili sastav kao što je gore definisan za upotrebu kao lek. gde je bar jedno antitelo rezultat vakcinisanja adjuvantom koji usmerava Th-1. |0016| Jedan drugi cilj se odnosi na antitelo kao što je gore definisano ili sastav kao stoje gore definisan za upotrebu u prevenciji oboljenja vezanih zaStreptococcus suisili infekcije u leku za životinju, gde je bar jedno antitelo rezultat vakcinisanja adjuvantom koji usmerava Th-1.

[0017] Dalje, jedan cilj se odnosi na metod za detekcijuin vitroprisustva ili odsustva sojaStreptococcus suisu uzorku, koji obuhvata korake: a) dovođenja uzorka u dodir sa antitelom iz pronalaska dovoljno dugo i pod uslovima da se formira imuni kompleks i

b) detektovanja prisustva ili odsustva imunog kompleksa formiranog u a).

|0018| Jedan drugi cilj pronalaska se odnosi na metod za detekcijuin vitroprisustva ili

odsustva antitela podignutih protiv sojaStreptococcus suisu uzorku, koji obuhvata korake:

a) dovođenja uzorka u dodir sa polipcptidom iz pronalaska dovoljno dugo i pod uslovima da se formira imuni kompleks i

b) detektovanja prisustva ili odsustva imunog kompleksa formiranog u a).

|0019| Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje, u jednom drugom cilju, dijagnostički komplet za

detekciju prisustva ili odsustva antitela koja indikuju sojStreptococcus suis.koji sadrži: polipeptid prema pronalasku;

reagens za đelektovanje imunog kompleksa polipeptid-antitelo;

biološki referentni uzorak koji nema antitela koja se imunološki vezuju sa navedenim

polipeptidom i

uzorak za poređenje koji sadrži antitela koja mogu specifično da se vežu za navedeni polipeptid;

gde su navedeni polipeptid. reagens. biološki referentni uzorak i uzorak za poređenje prisutni u količini dovoljnoj da se izvede navedena detekcija.

(0020) Još jedan cilj je da se obezbedi dijagnostički komplet za detekciju prisustva ili odsustva polipeptida koji indikuju sojStreptococcus suis,koji sadrži: antitelo iz pronalaska;

reagens za detektovanje imunog kompleksa polipeptid-antitelo;

biološki referentni uzorak sa polipeptidima koja se imunološki vezuju za navedeno

antitelo i

uzorak za poređenje koji sadrži poiipeptide koji mogu specifično da se vežu za navedcni po 1 ipeptiđ: gde su navedeni polipeptid, reagens. biološki referentni uzorak i uzorak za poređenje prisutni u količini dovoljnoj da se izvede navedena detekcija.

|00211 Izolovan polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu suštinski identičnu sekvenci navedenoj uSEQII) NO 11 ili njen funkcionalni derivat i izolovan polinukleotid koji kodira navedeni polipeptid i njihova upotreba u sastavu i/ili metodu za lečenje i'ili sprečavanje oboljenja vezanih zaStreptococ cus suisili infekcija u životinji su takode ovde opisani.

KRATAK OPIS SLIKA

(0022| Ako nije specifično naznačeno suprotno, termini "SPI" i "Sao" se koriste u istom značenju.

Slika 1: Šematsko predstavljanje i parcijalna restrikciona mapa željenog polinukleotida iz pronalaska, naime, insert DNK rckombinantnog plazmida pSS735. Brojevi označavaju rastojanje (u baznim parovima) od 5" kraja.

Slika 2: Nukleotidna sekvenca (SEQ ID NO 18s) i izvedena aminokiselinska sekvenca (SEO 1D NO 17) gena koji kodira željeni polipeptid prvog oblika pronalaska, naime, proteina SPI (ili Sao)S. suis.Shine-Dalgarno sekvenca je u kurzivu (italik) i podvučena. Početni kodon. ATG, i stop kodon, TAA, su označeni masnim slovima (bold). Dva hidrofobna segmenta i na N- i na C-kraju SPI su podvučena. Vertikalna strelica pokazuje mesto cepanja potencijalnom signalnom peptidazom. Rl do RIO označavaju početak ponovljenih jedinica. Region potencijalno vezan za ćelijski zid je podvučen isprekidanom linijom. LPVTG motiv membranskog sidra je uokviren, i promenjen C-terminalni rep je obeležen.

Slika 3: Poravnavanje aminokiselinske sekvence regiona l.vs' do Val""<1>proteina SPI sa AvrXa7 avirulentnimfaktorom Kanlhomonas orvzctepv.orvzac.Vertikalne linije označavaju položaje sa identičnim ostacima. Dvotaćke predstavljaju konzervisane supstitucije, a obične tačke predstavljaju funkcionalne supstitucije.

Slika 4: Ekspresija fuzionog proteina MBP-SPI u/;. coliXLI-Blue i prečišćavanje rekombinantnog zrelog SP1. Gel obojen Coomassie-jem (A) i vvestern blot analiza (B) odgovarajućih uzoraka testiranih serumom iz svinja rekonvalescenata pokazuju lizat celih ćelijaE. coiipre (ležište 1) i posle (ležište 2) indukcije IPTG, ekstrakt citoplazme (ležište 3), fuzioni protein MBP-SPI prečišćen po afinitetu (ležište 4), SPI i MBP isečen faktorom X (ležište 5) i rekombinantni SPI bez. MBP korišćenjem jonoizmenjivačke hromatografije (ležište 6). Molekulske mase standardnih proteina su naznačene na levoj strani.

Slika 5: Imunoelektronska mikroskopijaS. suis(4500 x). Površinska lokacija SPI naS. suisje prikazana pomoću monospecifičnog antiseruma na SPI i sekundarnog antitela konjugovanog sa zlatom (B). Nije nađeno obeležavanje u kontrolnim ćelijama bakterija (A). Stubići, 200 nm.

Slika 6: Odgovori antitela posle vakcinisanja pomoću SPI u prasićima. (A) Ukupan SPI-speeifičan IgG u serumima je meren ELISA-om i pokazuje da je jedna jedina injekcija SPI podigla značajan IgG odgovor koji je očigledna pojačan busterom (pojačivačem). (B) ELISA za serumske IgG izotipove u prasićima imunizovanim pomoću SPI pokazuje da su nivoi IgG I dosleđno viši od nivoa lgG2. Rezultati su izraženi kao srednje vrednosti apsorbanci i standardne greške.

<*>: p < 0.05.

Slika 7: SP 1-specifični ukupni humoralni titri IgG u miševima imunizovanim Quil-om A i Quil-om A plus SPI.

Slika 8: IgG pođklase u serumima iz miševa imunizovanih rekombinantnim SPI.

Slika 10: Vakcmacija rekombinantnim SPI štiti miševe od smrtiizazvane S. suis- om.

Slika11:Nukleotidna sekvenca funkcionalnog polinukleotidnog fragmenta, naime.SPI Afragment gena i izvedene aminokiselinske sekvence. SPI A je intenzivno reagovao sa serumom prasića rekonvalescenata u imunoblotovima i imunizacija rekombinantnim SPI A podiže značajne odgovore humoralnih antitela u prasićima i miševima, demonstrirajući da je SPI A jako imunogen. (Videti Primer 5)

Slika 12: Šematsko predstavljanje i parcijalna restrikciona mapa inserta rekombinantnog faga od 6,3 kb. Brojevi označavaju rastojanje (u baznim parovima) od 5' kraja.

Slika 13:Nukleotidna sekvenca i izvedena aminokiselinska sekvenca gena koji kodira SP2 proteinS. suis.Klaster pozitivnog naelektrisanja na N-terminalnom kraju SP2 je podvučen. Potencijalna N-terminalna signalna sekvenca je podvučena isprekidanom linijom. I.ysM donicn je uokviren, a strelice označavaju početak ponovljenih jedinica.

Slika 14: Distribucija SP2 gena u različitim serotipovima.V. suis. SP2geni su umnoženi PC Iv-om iz 31 od 33 serotipa referentnih sojevaS. suis.

Slika 15: Ekspresija fuzionog proteina Trx-His-SP2 u /:'.tolii prečišćavanje rekombinantnog zrelog SP2. Gel obojen Coomassie bojom pokazuje lizat celih ćelijaR. coliposle indukcije IPTG-om, fuzioni protein Trx-His-SP2 prečišćen po afinitetu, SP2 i Trx-His isečeni enterokinazom, izdvojen zreo SP2 i Trx-His marker jonoizmenjivaćkom hromatogratijom. Molekulske mase su naznačene na levoj strani.

Slika 16: Imunogena i lgG-vezujuća aktivnost rekombinantnog SP2. a) SP2-specifičan zečji serum reaguje sa ćelijskim preparatomS. suisS735. b) Rekombinantni SP2 reaguje sa serumom svinja rekonvalescenata. Rekombinantni SP2 vezuje humani (c) i praseći (d) IgG.

Slika 17: Odgovor antitela posle vakcinisanja rekombinantnim SP2 u miševima. SP2-specifićan IgG u serumima je meren ELISA-om.

Slika 18: Vakcinacija rekombinantnim SP2 ublažava kliničke znake miševa izazvanih virulentnim sojemS. suis.

Slika 19: Vakcinacija rekombinantnim SP2 štiti miševe od smrtiuzrokovane S. suis- om.

Slika 20: Telesna temperatura prasića vakcinisanih sastavom prema poželjnom obliku pronalaska, posle izazova.

Slika 21: Kliničko oboljenje prasića vakcinisanih sastavom prema poželjnom obliku pronalaska, posle izazova.

Slika 22: Preživljavanje prasića vakcinisanih sastavom prema poželjnom obliku pronalaska, posle izazova.

Slika 23: Ukupni serumski titri IgG prasića vakcinisanih sastavom prema poželjnom obliku pronalaska.

Slika24:Podklasc IgG indukovanih iz prasića vakcinisanih sastavom prema poželjnom obliku pronalaska.

Slika25: Poravnavanje aminokiselinskih sekvenci između dva polipeptida SPI. naime, SEQ 1D NO 1 i 2.

Slika26: Poravnavanje aminokiselinskih sekvenci između dva polipeptida SPI. naime, SEQ ID NO 1 i 3.

Slika27: Poravnavanje aminokiselinskih sekvenci između dva polipeptida SPI prema poželjnim oblicima pronalaska, naime. SEQ 1D NO 2 i 3.

Slika28: Poravnavanje aminokiselinskih sekvenci između tri polipeptida SPI. naime. SEQ ID NO 1, 2 i 3.

KRATAK PRIKAZ PRONALASKA

[0023J Pronalazači su nenadano našli dva nova polipeptida i polinukleotidaS. suiskoji kodiraju iste i koji su uključeni u patogeni mehanizamS. suis.U vezi toga, ovaj opis se specifično odnosi na njihovu identifikaciju i na upotrebu navedenih polipeptida ili polinukleotida u sastavima i metodima za sprečavanje, lečenje i dijagnostikovanje oboljenja vezanih zaStreptococcus suisili infekcija izazvanih njim.

[0024] Nepotpuna lista oboljenja vezanih zaStreptococcus suisza koje bi metodi iz pronalaska mogli da budu korisni, uključuje ona kao što su artritis, endokarditis, meningitis, upala pluća i septikemi ja.

Definicije

J00251 Termin "izolovan" je predviđen da opiše polinukleotid. polipeptid ili antitelo koje je u okolini različitoj od one u kojoj se polinukleotid. polipeptid. antitelo, ili ćelija domaćin prirodno javlja. Termin "životinja" se odnosi na bilo koju životinju podložnu infekciji sojemStreptococcus,kakav jeS. suis.Specifično, takva životinja može biti. ali nije ograničena na, miš, svinja, ovca, konj i Čovek. Konkretni je, životinja je svinja.

[0026|Termin "lečenje" se odnosi na proces po kom se simptomi infekcije ili oboljenja vezanog za sojStreptoccocusublažavaju ili se potpuno eliminišu. Kao što se ovde koristi, termin "sprečavanje" se odnosi na proces po kom se simptomi infekcije ili oboljenja vezanog za sojStreptococcussprečavaju ili odlažu.

[0027] Termin "zaštitni odgovor" označava sprečavanje početka oboljenja vezanog za sojStreptococcussuis ili infekcije izazvaneS. suis- om.ili smanjenje jačine takvog oboljenja koje postoji u životinji. Nivo "zaštitnog odgovora" može da se proceni. na primer. dodeljivanjem kliničkih ocena kao što su one đefinisane u Primeru 4.

[0028]Izraz "prihvatljiv nosač" označava nosač koji sadrži jedinjenja đobijena metodom iz pronalaska koja se mogu dati životinji domaćinu bez štetnih efekata. Pogodni nosači poznati u struci uključuju, ali nisu ograničeni na. čestice zlata, sterilnu vodu, slani rastvor, glukozu, dekstrozu, ili puferisane rastvore. Nosači mogu da uključe pomoćna sredstva uključujući, ali bez ograničenja, razblaživače. stabilizatore (tj.. šećere i aminokiseline). konzervanse, ovlaživače, emulzifikatore, pufere za održavanje pH. aditive koji povećavaju viskoznost. boje i slično.

[0029) Termin "fragment", kao što se ovde koristi, odnosi se na polinukleotidnu sekvencu (npr., cDNK) koja je izolovani deo nukleinske kiseline o kojoj se radi, konstruisan veŠtački (npr., hemijskom sintezom) ili cepanjem prirodnog proizvoda na mnogo đelova pomoću restrikeionih endonukleaza ili mehaničkim cepanjem, ili je deo nukleinske kiseline sintetisane pomoću PCR, DNK polmeraze ili bilo kojom drugom polimerizacionom tehnikom dobro poznatom u struci, ili eksprimiran u ćeliji domaćinu tehnologijom rekombinantne nukleinske kiseline dobro poznatom stručnjaku.

1 Polinuklcotidi i polipeptidi

[0030] Ova specifikacija opisuje izolovan polipeptid koji se sastoji od površinskog proteina, a konkretni je. od površinskog proteinaStreptococcus suisusidrenog C-krajem. koji se naziva SPI ili Sao. Kao sto je pokazano u ođeljku sa primerima. polipeptid SPI povoljno podiže zaštitni odgovor na izazov sojemStreptococcus suiskad se administrira životinji, kao što je prase.

[00311 Specifično, izolovan polipeptid obuhvata bar 15 ili čak poželjno bar 25 ili čak više, bar 35 susednih aminokiselina u N-terminalnom regionu aminokiselinske sekvence navedene u SEQ ID NO: 1. Kao što je poznato stručnjaku, termin "N-terminalni region" se, kad se odnosi na Sao protein, poželjno sastoji od regiona koji se proteže od aminokiselinskog ostatka 1 do 293 aminokiselinske sekvence navedene u SEQ ID NO: 1.

|0032| Izolovan polipeptid opisan ovde može dalje da sadrži bar jednu repetitivnu aminokiselinsku sekvencu kao što je pokazano na Slici 2. Konkretnije, repetitivna aminokiselinska sekvenca može da se sastoji od aminokiselinske sekvence pokazane u SEQ ID NO 9, gde

- Xau, je Val, Thr ili lio; Xaa-, je Lys ili Glu; Xaa4 je Lys ili Glu; Xaas je Ala ili Gln; Xaa7je Thr ili Pro; Xaa({ je Glv. Ser ili Val; Xaa., je Lys. Val, lle ili Asn; Xaan) jc Glu ili Val; Xaai i je Lys ili Asn; X aa 1 2 i e GI y, G1 u i I i Asp; Xaan je Asn ili Met; - Xaau je lle. Ala ili Val;

Xaai5 je Glu ili Val;

Xaai(, jc Pro ili Thr;

Xaais je Glu ili Gin;

Xaam je Lys ili Glu:

XaaiT je Thr ili Ala

Xaaif, je Lys ili Asn;

Xaa2?je Asp ili Glu;

Xiui:x je Asn ili Lys;

X;ui2<) je lle ili Val i

Xaa3o je Glu ili Val.

|0033|Podrazumevaće se da takav polipeptid SPI može da sadrži samo jednu od navedenih repetitivnih sekvenci, dok u nekim drugim slučajevima takav polipeptid SPI može da sadrži bar dve repetitivne sekvence ili čak i više od deset takvih repetitivnih sekvenci.

|0034|Na primer, izolovan polipeptid SPI sadrži bar 15 ili čak poželjno 25 ili čak poželjnije 35 u u C-terminalnom regionu aminokiselinske sekvence navedene u SEQ ID NO: I. Poželjno, C-tenninalni region sadrži motiv membranskog sidra, kao što je onaj koji se satoji od aminokiselinskih sekvenci kao što su navedene u SEQ ID NO 10, naime, Leu Pro Val Thr Gly.

[0035]Kao što je poznato stručnjaku, termin "C-tenninalni region", u kontekstu ove specifikacije, kad se odnosi na SPI protein, poželjno se satoji od regiona koji se proteže od aminokiselinskog ostatka 593 do 670 aminokiselinske sekvence navedene u SEQ ID NO: 1.

[0036]Na primer, polipeptid SPI sadrži aminokiselinsku sekvencu suštinski identičnu sekvenci odabranoj iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOS 1 do 3 ili njen funkcionalni derivat. Polipeptid SPI iz pronalaska može da se sastoji od aminokiselinske sekvence suštinski identične sekvenci pokazanoj u SEQ ID NO I, ih njenog funkcionalnog derivata.

[0037|"Funkcionalni derivat", kao što se uopšteno podrazumeva i koristi ovde, odnosi se na proteinsku/peptidnu sekvencu koja poseduje funkcionalnu biološku aktivnost koja je suštinski slična biološkoj aktivnosti cele proteinske/peptidne sekvence. Drugim rečima, poželjno se odnosi na polipeptid ili njegov(e) fragment(e) koji suštinski zadržavafju) kapacitet podizanja imunog odgovora, kao što je zaštitni odgovor na izazov sojemS. suiskad je navedeni funkcionalni derivat administriran životinji.

|0038|Ovaj pronalazak se odnosi na:

izolovan polipeptid SPI sposoban da podigne specifičan imuni odgovor naStreptococcus suis,koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima bar 95% identičnosti sa

aminokiselinskom sekvencom navedenom u SEQ ID NO: 4 ili 17;

izolovan polipeptid SPI, kao što je gore definisan, koji sadrži aminokiselinsku sekvencu

navedenu u SEQ ID NO: 10;

izolovan polipeptid SPI, kao što jc gore definisan, koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima bar 95% identičnosti sa aminokiselinskom sekvencom navedenom u SEQ ID

NO: 17;

- izolovan polipeptid SPI, kao što jc gore definisan, koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima bar 95% identičnosti sa aminokiselinskom sekvencom navedenom u SEQ ID

NO: 4;

izolovan polipeptid SPI iz zahteva I, koji sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu u

SEQ ID NO: 17;

izolovan polipeptid SPI, kao što je gore definisan, koji sadrži aminokiselinsku sekvencu

navedenu u SEQ ID NO: 4;

izolovan polipeptid SPI sposoban da podigne specifičan imuni odgovor naStreptococcus

suis.koji sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO: 2 ili 3;

izolovan polipeptid SPI, kao što jc gore definisan, koji se sastoji od aminokiselinske sekvence navedene u SEQ ID NO: 17;

izolovan polipeptid SPI. kao što je gore definisan. koji se sastoji od aminokiselinske

sekvence navedene u SEQ ID NO: 4:

izolovan polipeptid SPI, kao što je gore definisan. gde on podiže zaštitni odgovor na

izazov sojemStreptococcus suiskad sc administrira životinji.

100391 Jedan drugi izolovanS. suispolipeptid, naime, nazvan SP2. koji pogodno podiže zaštitni odgovor u životinji, je takode opisan.

100401Specifično, ovaj izolovan polipeptid SP2 sadrži aminokiselinsku sekvencu suštinski identičnu sekvenci kao što je navedena u SEQ ID NO: 1 I ili njen funkcionalni derivat.

f00411Pod "suštinski identična", kad se odnosi na aminokiselinsku sekvencu, podrazumevaće se da polipeptid poželjno ima aminokiselinsku sekvencu koja ima bar 75% homologije. ili čak poželjno 85% homologijc, ili čak još poželjnije 95% homologije sa delom ili ćelom sekvencom pokazanom u SEQ ID NO 11.

100421"Homologija" u ovom kontekstu označava identičnu ili sličnu referentnoj sekvenci. a direktne zamene/ modifikacije bilo koje od dalih aminokiselinu su takode uključene. Traženje homologije u ovom smislu se može izvesti pomoću BLAST-P (Basic Local Alignment Seareh Tool), programa dobro poznatog stručnjacima. Za odgovarajuću sekvencu nukleinske kiseline, homologija se traži pomoću programa BLASTX i BLASTN, poznatih u struci.

[0043] Izolovan polinukleotid koji kodira SPI ili SP2 polipeptid je takode opisan. Takav izolovan polinukleotid sadrži nukleotidnu sekvencu suštinski identičnu sekvenci navedenoj u SEQ ID NOS 18, 6 i 7 kad je reč o SPI i SEQ ID NO 12 kad je reč o SP2 i njihovi odgovarajući funkcionalni fragmenti.

(0044]Pod "suštinski identična", kad se govori o sekvenci nukleinske kiseline, podrazumevaće sc da polinukleotid iz pronalaska poželjno ima sekvencu nukleinske kiseline koja je bar 65% identična, konkretnije, 80% identična i još konkretnije 95% identična deki ili celoj sekvenci navedenoj u SEQ ID NOS 18. 6 i 7 i 12 ili njihovi funkcionalni fragmenti.

|0045| "Funkcionalni fragment", kao što se ovde uopšteno podrazumeva i koristi, odnosi sc na sekvencu nukleinske kiseline koja kodira funkcionalnu biološku aktivnost koja je suštinski slična biološkoj aktivnosti eele sekvence nukleinske kiseline. Drugim reč i ma. i u kontekstu ovog pronalaska, to se poželjno odnosi na nukleinsku kiselinu ili njen(e) fragment(e) koji that suštinski zadržava kapacitet kodiranja polipeptida/proteina koji podiže imuni odgovor, i poželjnije, zaštitni odgovor, na izazov sojemStreptococcus suiskad se administrira životinji. Na primer, takav fragment je polinukleotid naveden u SEQ ID NO 8. koji kodira SPI A polipeptid kao sto je gore definisan.

|0046] Izolovani polinukleotidi SPI prema ovom pronalasku su:

izolovan polinukleotid SPI koji kodira polipeptid kao što je gore definisan;

izolovan polinukleotid SPI kao stoje gore opisan, gde polinukleotidna sekvenca ima 95%

identičnosti sa sekvencom navedenom u SEQ ID NO: 18;

izolovan polinukleotid SPI kao sto je gore opisan, gde polinukleotidna sekvenca ima 95%

identičnosti sa sekvencom navedenom u SEQ ID NO: 8:

izolovan polinukleotid SPI kao što je gore opisan, koji sadrži sekvencu navedenu u SEQ

ID NO: 18;

izolovan polinukleotid SPI iz zahteva I I. koji sadrži polinukieotidnu sekvencu navedenu

uSEQ!DNO:8.

[00471 U jednom drugom obliku, pronalazak je dalje usmeren na vektor (npr. vektor za kloniranje ili ekspresioni vektor) koji sadrži izolovan polinukleotid SPI iz pronalaska kao što je gore definisan.

100481 Kao što se ovde koristi, termin "vektor" se odnosi na polinukleotidni konstrukt dizajniran za transdukciju/transf'ekciju jednog ili više tipova ćelija. Vektori mogu, na primer, biti "vektori za kloniranje" koji su dizajnirani za izolovanjc, propagaciju i replikaciju insertovanih nukleotida, "ekspresioni vektori" koji su dizajnirani za ekspresiju nukleotine sekvence u ćeliji domaćinu, ili "virusni vektor" koji je dizajniran da dovede do proizvodnje rekombinantnog virusa ili virusoidne čestice, ili "šatl vektori", koji imaju atribute više tipova vektora.

[0049] Niz vektora pogodnih za stabilnu transtekciju ćelija i bakterija je dostupan javnosti (npr., plazmiđi, adenovirusi. bakulovirusi, bakulovirusi kvasca, biljni virusi, adeno asociram virusi, retrovirusi. Herpes Simplex virusi, alfavirusi. lenti virusi), kao i metodi za konstrukciju takvih ćelijskih linija. Podrazumevaće sc da ovaj pronalazak obuhvata bilo koji tip vektora koji sadrži bilo koji polinukleotidni molekul iz pronalaska.

2.Antitela

[0050J U jednom drugom obliku, pronalazak predstavlja antitelo koje se specifično vezuje za polipeptid SPI koji se sastoji od aminokiselinske sekvence navedene u SEQ ID NO: 4 ili u SEQ ID NO: 17. Konkretnije, antitelo je prečišćeno poliklonsko ili monoklonsko antitelo koje se specifično vezuje za polipeptide SP I kao što je gore definisano.

100511Antitela iz pronalaska se mogu dobijati nizom metoda poznatih stručnjaku. Na primer. polipeptidi iz pronalaska se mogu administrirati životinji da bi se indukovala proizvodnja poliklonskih antitela. Alternativno i kao što jc gore pomonuto. antitela koja sc koriste kao što je ovde opisano mogu biti monoklonska antitela. koja se dobijaju pomoću poznatih hibridomskih tehnologija (videti, npr., Hammerling et al.. In Monoclonal Antibodies and T-Cell Hvbridomas, Elsevier, NY. 1981; Chailand. N.. M. ,)acques, S. lacouture and M. Gottschalk. 1997. Characterization and proteetive activitv of a monoclonal antibođv against a capsular epitope shared by Streptococcus suis serotvpes i. 2 and '/;. Microbiology 143 (Pt 11): 3607-14).

[0052]Vezano za antitela iz ovog pronalaska, termin "specifično se vezuje za" se odnosi na antitela koja se vezuju sa relativno visokim afinitetom za jedan ili više epitopa polipeptida SPI iz pronalaska, ali koja suštinski ne prepoznaju i ne vezuju druge molekule osim polipeptide SPI iz pronalaska. Kao što se ovde koristi, termin "relativno visok afinitet" označava afinitet vezivanja antitela i polipeptida SPI od bar\( tM ', a poželjno bar oko 10 M"<1>, a čak još poželjnije 10<*>M'' do IO1" M'<1.>Određivanje takvog afiniteta se poželjno vrši u standardnim uslovima za imunoesej sa kompetitivnim vezivanjem koji su opšte poznati stručnjaku.

3. Metodi lečenja i sastavi

100531Polipeptidi SPI. polinukleotidi koji kodiraju iste i antitela iz pronalaska mogu se koristiti na mnogo načina u tečenju i/ili sprečavanjuOboljenja vezanih za Streptococcus- suisili infekcija izazvanih S. suis-om.

[0054jNa primer, i prema jednom aspektu pronalaska, polipeptidi SPI iz pronalaska mogu sc koristiti kao imunogeni za proizvodnju specifičnih antitela za lečenje i i li sprečavanje infekcijaStreptococcus suis- om.Pogodna antitela se mogu određivati upotrebom odgovarajućih skrining metoda, na primer, merenjem sposobnosti određenog antitela da pasivno štiti od infekcijaStreptococcus suis- omu modelu za testiranje. Primeri životinjskih modela su mišji i svinjski model, opisani ovde u primerima.

[00551Prema jednom drugom aspektu, polinukleotidi koji kodiraju polipeptide iz pronalaska ili njihove derivate mogu se koristiti u metodu imunizacije pomoću DNK. Odnosno, oni se mogu ugraditi u vektor koji se posle injektiranja može replikovati i eksprimirati. proizvodeći na taj način antigenski polipeptidin vivo.Na primer. polinukleotidi se mogu ugraditi u plazmidni vektor pod kontrolom CMV promotora koji je funkcionalan u cukariotskim ćelijama. Poželjno je da se vektor injektira intramuskularno.

[0056|Upotreba polinukleotida iz pronalaska u genetičkoj imunizaciji ce poželjno koristiti pogodan metod ili sistem davanja kao stoje direktno injektiranje plazmidne DNK u mišiće [Wolf et al. H tM G (1992) I: 363, Turnes et al.. Vaccine (1999), 1? : 2089. Le et al., Vaccine

(2000) 18:1 893, Alves et al., Vaccine (2001)19 : 788], injektiranje plazmidne DNK sa ili bez adjuvanata [Ulmer et al., Vaccine (1999) 18: 18, Macfaughlin et al., J. Kontrol Release

(1998) 56: 259, Hartikka et al.. Gene Ther. (2000) 7: 1171-82, Benvenisty and Reshef, PNAS USA (1986) 83: 9551, Singh et al., PNAS USA (2000) 97: 811], ciljajući ćelije davanjem DNK kompleksa sa specifičnim nosačima [VVa et al., J Biol Chem (1989) 264; 16985, Chaplin et al., Infeet. Imtnun. (1999) 67:6434], injektiranje plazmiđa u kompleksu ili enkapsuliranih u različite forme lipozoma [Ishii et al., AIDS Research and Human Retroviruses (1997) 13: 142, Perrie et al.. Vaccine (2001) 19:3301], administriranje DNK raznim metodima bombardovanja [Tang et al., Nature (1992) 356: 152, Eisenbraun et al., DNA Cell Biol (1993) 12: 791. Chen et al.. Vaccine (2001) I9:2908| i administriranje DNK sa živim vektorima [Tubulekas et al.. Gene (1997) 190: 191. Pushko et al.. Virologv (1997) 239: 389. Spreng et al. FEMS (2000) 27: 299, Dictrich et al., Vaccine (2001) 19: 2506],

[0057|.loš jedan aspekt pronalaska je upotreba antitela usmerenih na polipeptide iz pronalaska za pasivnu imunizaciju. Mogla bi da se koriste antitela opisana u ovoj aplikaci ji.

[0058|U vezi sa ovim, jedan oblik ovog pronalaska se odnosi na sastav za sprečavanje ili lečenje takvih oboljenja ili infekcija.

[0059]Sastavi prema pronalasku su:

sastav ko ji sadrži prihvatljiv nosač i bar jedno od:

polipeptid kao što je gore definisan:

polinukleotid kao što je gore definisan; ili

vektor kao što je gore definisan;

sastav koji sadrži prihvatljiv nosač i bar jedno antitelo kao što je gore definisano.

100601U poželjnom obliku, sastav iz pronalaska još sadrži adjuvant. Kao što se ovde koristi, termin "adjuvant" označava supstancu dodat u sastavu iz pronalaska da bi se povećala

imunogenost sastava. Mehanizam kako adjuvant radi se ne zna u potpunosti. Veruje se tla neki adjuvanti pojačavaju imuni odgovor (humoralni i/ili eelijski odgovor) tako što polako oslobađaju antigen, dok su drugi adjuvanti jako imunogeni sami po sebi i veruje se da funkcionišu sincrgetski. Poznati adjuvanti uključuju, ali nisu ograničeni na. uljne i vodene emulzije (na primer, potpuni Freundov adjuvant i nepotpuni Freundov adjuvant), Corvtzebactei-ium parvuin, Ouil A. citokine kakav je ILI2, Emulsigen-Plus®, Bacillus Calmette Guerin, aluminijum hidroksid, glukan, đekstran sulfat, gvožđe oksid, natrijum alginat, Bacto adjuvant, određene sintetičke polimere kao što su poliaminokiseline i kopolimere aminokiselina, saponin, parafinsko ulje i muramil đipeptid. Adjuvanti obuhvataju i genetičke adjuvante kakvi su imunomođulatorski molekuli koji su kodirani u ko-inokuliranoj DNK. ili kao CpG oligonukleotidi. Ko-inoku!irana DNK može da bude u istom plazmiđnom konstruktu sa plazmidnim imunogenom ili u odvojenom DNK vektoru.

f00611 Ovaj pronalazak se dalje odnosi na:

Metod za dobijanje sastava kao što je gore definisan za sprečavanje oboljenja vezanih zaStreptococcus suisili infekcija izazvanih 5..s7/;.s-om. koji sadrži korak mešanja bar jednog antitela kao što jc gore definisano sa bar jednim prihvatljivim nosačem, gde je bar jedno

antitelo rezultat vakcinacije adjuvantom koji usmerava Th-1.

- Metod za dobijanje sastava za upotrebu u sprečavanju oboljenja vezanog zaStreptococcus suisili infekcije u životinji, gde metod sadrži korak mešanja bar jednog: polipeptida kao što je gore definisan;

polinukleotida kao što je gore definisan;

vektora kao što je gore definisan

sa bar jednim prihvatljivim nosačem i adjuvantom koji usmerava Th-1.

Polipeptid kao što je gore definisan i adjuvant koji usmerava Th-1; polinukleotid kao što je gore definisan i adjuvant koji usmerava Th-1; ekspresioni vektor kao što je gore definisan i adjuvant koji usmerava Th-1; ili sastav kao što je gore definisan i adjuvant

koji usmerava Th-1: za upotrebu kao lek ili kao vakeina.

Polipeptid kao što je gore definisan i adjuvant koji usmerava Th-1; polinukleotid kao što je gore definisan i adjuvant koji usmerava Th-1; ekspresioni vektor kao što je gore definisan i adjuvant koji usmerava Th-1: ili sastav kao što je gore definisan i adjuvant koji usmerava Th-1; za upotrebu u sprečavanju oboljenja vezanog zaStreptococcus suisili

infekcije u životinji.

Antitelo kao stoje gore definisano ili sastav kao što je gore definisan za upotrebu kao lek,

gde je bar jedno antitelo rezultat vakcinacije adjuvantom koji usmerava Th-1.

Antitelo kao što je gore definisano ili sastav kao što je gore definisan za upotrebu u sprečavanju oboljenja vezanog zaStreptococcus suisili infekcije u leku za životinju, gde je bar jedno antitelo rezultat vakcinacije adjuvantom koji usmerava Th-1.

[0062] Još jedan oblik ovog pronalaska je da obezbedi upotrebu pronalaska koja sadrži korak administriranja životinji sastava prema pronalasku.

100631 1 drugi agensi se mogu dodati u sastav iz pronalaska. Na primer, sastav iz pronalaska može da sadrži i agense kao što su lekovi. imunostimulansi (kao što je u-interteron, p-interferon, v-interferon, faktor stimulacije kolonije granulocitnih makrofaga (GM-C'SF), faktor stimulacije kolonije makrofaga (M-CSF). i interleukin 2 (IL2)). antioksiđanse, surfaktante, sredstva koja daju ukus. volatilna ulja, puferske agense, disperzante, propelante i

konzervanse. Za pripremanje takvih sastava mogu se koristiti metodi dobro poznati u struci. Poželjno je da količina komponenata ili elemenata sastava iz pronalaska bude terapijski efektivna količina. Terapijski efektivna količina predviđene komponente jc količina neophodna da dozvoli istoj da ispuni svoju imunološku ulogu bez suvišnog izazivanja negativnih efekata u domaćinu kome je sastav administrirali. Tačna količina komponenata koju treba upotrebiti i sastav koji treba administrirati će varirati u skladu sa faktorima kao što su tip stanja koje se tretira, tip i starost životinje koja se tretira, način administracije, kao i ostali sastojci u sastavu.

100641Sastav iz pronalaska se može dati životinji različitim putovima administracije. Na primer, sastav se može administrirati u vidu sterilnih injektabilnih preparata, kao što je sterilna injektabilna vodena ili uljna suspenzija. Ove suspenzije se mogu formulisati prema tehnikama poznatim u struci uz upotrebu pogodnih disperzionih agenasa ili agenasa za kvašenje i agenasa za suspendovanje. Sterilni injektabilni preparati mogu biti i sterilni injektabilni rastvori ili suspenzije u netoksičnim parenteralno prihvatljivim razblaživačima ili rastvaraćima. Oni se mogu davati parenteralno, na primer intravenozno, intramuskularno ili subkutano injekcijom, infuzijom ili oralno. Pogodne doze će varirati, u zavisnosti od faktora kao što su količina svake od komponenata u sastavu, željeni efekat (kratkoročan ili dugoročan), put administracije, starost i težina životinje koja se tretira. Bilo koji drugi metodi dobro poznati u struci mogu se koristiti za administraciju sastava iz pronalaska.

4. Metodi detekcijeili dijagnostički kompleti

(0065]SPI i/ili SP2 polipeptidi, polinukleotidi koji kodiraju iste i antitela iz pronalaska mogu se koristiti na razne načine i u detekciji i dijagnozi oboljenja vezanih zaStreptococcus suisili infekcija izazvanih S.suis- om.

|0066|U vezi s tim, i u još jednom obliku, ovaj pronalazak obezbeđuje metod za detektovanjeiu vitroprisustva ili odsustva sojaStreptococcus suisu uzorku, koji sadrži korake: a) dovođenja uzorka u dodir sa antitelom iz pronalaska kan što je gore definisano dovoljno dugo i pod uslovima da sc formira kompleks; i

b) detektovanja prisustva ili odsustva kompleksa formiranog u a).

]0067|Kao što se ovde koristi, termin "uzorak" se odnosi na mnoštvo tipova uzoraka

dobijenih iz životinje i mogu se koristiti u dijagnostičkom ili detekcionom eseju. Definicija obuhvata krv i ruge tečne uzorke biološkog porekla, uzorke Čvrstih tkiva kakav je uzorak biopsije ili kulturu tkiva ili ćelija izvedenu iz njega.

|0068] A u još jednom obliku, ovaj pronalazak obezbeđuje metod za detektovanjein vitroprisustva ili odsustva antitela podignutog na sojStreptococcus suisstrain u uzorku, koji sadrži korake: a) dovođenja uzorka u dodir sa polipeptidom iz pronalaska kao što je gore definisan dovoljno dugo i pod uslovima da se formira imuni kompleks; i

b) detektovanja prisustva ili odsustva imunog kompleksa formiranog u a).

|0069| Stručnjak će prepoznati da ovaj dijagnostički test može da ima nekoliko oblika,

uključujući imunološki test kao što je enzimski imunološki esej (ELISA) ili rađioimunoesej. u

suštini, da bi sc odredilo da li su antitela speci lična/.a protein (kao sto je SPI i ili SP2) prisutna u organizmu.

[0070j Ovaj pronalazak dalje obezbeđuje komplete za upotrebu unutar svih gore navedenih dijagnostičkih metoda. Takvi kompleti tipično sadrže dve ili više komponenti neophodne za izvođenje dijagnostičkog testa. Komponente mogu biti jedinjenja, reagensi. kontejneri i/ili oprema. Na primer, jedan kontejner u okviru kompleta kit ma može sadržati antitelo ili njegov fragment koji se specifično vezuje za polipeptid SPI ili SP2 iz pronalaska. Jedan ili više dodatnih kontejnera mogu da sadrže elemente, kao što su reagensi ili puferi, za korišćenje u testu.

]00711 S tim u vezi, ovaj pronalazak obezbeđuje i dijagnostički komplet za detektovanje prisustva ili odsustva antitela indikativnog na sojStreptococcus suis.koji sadrži:

izolovan polipeptid SP 1 prema pronalasku:

reagens za detektovanje imunog kompleksa polipeptid-antitelo:

biološki referentni uzorak koji nema antitela koja se imunološki vezuju za navedeni

peptid; i

uzorak za poređenje koji sadrži antitela koja mogu specifično da se vežu za navedeni

polipeptid;

gde su navedeni polipeptid, reagens, biološki referentni uzorak i uzorak za poređenje prisutni u količini dovoljnoj da se izvede navedena detekcija.

[0072] Jedan drugi dijagnostički komplet je poželjno osmišljen kao komplet za detektovanje prisustva ili odsustva polipeptida indikativnog na sojStreptococcus suis,koji sadrži;

antitelo prema pronalasku;

reagens za detektovanje imunog kompleksa polipeplid-antitelo;

biološki referentni uzorak polipeptida koji se imunološki vezuju za navedeno antitelo; i uzorak za poređenje koji sadrži polipeptide koji mogu specifično da se vežu za navedeni

polipeptid

gde su navedeno antitelo, reagens, biološki referentni uzorak i uzorak za poređenje prisutni u količini dovoljnoj da se izvede navedena detekcija.

PRIMERI

[0073[ Ovaj pronalazak će se lakše shvatiti kroz sledeće primerc. Ovi primeri su ilustrativni za širok opseg primenjivosti predstavljenog pronalaska i nisu namenjeni da ograniče njegov obim. Mogu se praviti njegove modifikacije i varijacije bez udaljavanja od duha i obima pronalaska, iako se u praksi za for testiranje ovog pronalaska mogu koristiti bilo koji metodi i materijali slični ili ekvivalentni onima opisanim ovde. poželjni metodi i materijali su opisani niže.

PRIMER 1

Identifikacija površinsko« proteinaStreptococcus suis- a iprocena njegovog Imunogenog i zaštitnog kapaciteta u prasićima100741 Iclentifikovanjc nov površinski proteinStreptococcus suis- akoji reaguje sa serumom prasića rekonvalescenata klinički inficiranihS. suis- omtipa 2. Uočen protein od 110 kDa označen kao SPI ispoljava tipične odlike površinskih proteina usidrenih u membrani Gram-pozitivnih bakterija, kao što jc signalna sekvenca i LPVTG motiv membranskog sidra. Štaviše, detektovan je konzervisan domen avirulencijc koji se često nalazi u biljnim patogenima. Elektronska mikroskopija uz upotrebu SP 1-specifičnog antiseruma je potvrdila površinsku lokaciju SPI proteina uS. suis.SPI-specifično antitelo reaguje sa ćelijskim lizatima većine serotipovaS. suisi izolatima tipa 2 u imunoblotovima. demonstrirajući svoju visoku konzervisanost u vrstiS. suis.Imunizacija prasića rekombinantnim SPI intramuskularnim putem podiže značajan ukupni odgovor imunoglobulinskog G (IgG) antitela. Međutim, odgovor antitela se ne odražava u zaštiti prasića koja su intratrahealno izazvana virulentnim sojem u našem konvencionalnom modelu vakcinacije.

Materijali i metodi

[0075| Bakterijski sojevi, fag, plazmidi i medijumi. Referentni soj S735S. suisserotipa 2 je korišćen za pravljenje genomske biblioteke. Referentni sojevi trideset tri serotipa (tipovi 1 do 31. 33 i 12). 26 prirodnih sojeva serotipa 2 različitog porekla, kao i pet drugih Gram-pozitivnih organizama su izlistani u Tabeli 1. Fag Lambda Zap II iEscherichia coliXLI-Blue MRF soj su dobijeni iz komercijalnog izvora (Stratagene, La Jolla.Calif.). S. suissu gajene u Todđ-Hewitt-ovoj supi (THB, Difco. Detroit. Mich.) ili na agarnim pločama (Quelab Laboratories, Montreal, Canada) na 37"C sa 5% CO2, dok su druge Gram-pozitivnc bakterije gajene kao što je preporučeno u ATCC" katalogu.E. coli jegajena bilo u samom Luria-Bertani (LB) medijumu, bilo u LB medijumu obogaćenom maltozom 2 g / L na 37°C. Kad je bilo prikladno,E. colije gajena u prisustvu 50 m.« ampicillimvml i 0,8 111M izopropil-p-D-tiogalaktopiranozidu (1PTG). pMal™-p vektor (New England BioLabs) je korišćen za generisanje MBP-SPI fuzionog proteina.

100761 Antiserumi. Serumi svinja rekonvalescenata su sakupljeni iz svinja klinički inficiranihS. suis- omtipa 2. soj S735. Monospecifičan anti-SPl serum je dobijen imunizovanjem novozelandskih bclih zečeva intravenozno pomoću 230[ig prečišćenog SPI cmulzitlkovanog pomoću 0,5 ml Freundovog nepotpunog adjuvanta. Zečevi su primili dve dodatne (booster) injekcije sa istom dozom SPI u dvonedeljnim intervalima, a zatim su iskrvavljeni 10 dana posle poslednje dodatne imunizacije. Serumi su čuvani na -20CC do upotrebe.

[0077| Identifikacija, kloniranje i sekvenciranjespigena. Hromozomska DNK izS. suisS735 soja je izolovana kao što je ranije opisano (33). Prečišćena hromozomska DNK je đelimično digestirana restrikcionim enzimomEcoIUi dohijeni fragmenti su clektroforezirani u 1%-nom agaroznom gelu. Fragmenti u opsegu veličine od 6 do 10 kh su ekstrahovani iz gela i ligi ran i naEcoRlkrake >.ZAP1I vektora i vektor je enkapsidiran pomoću Gigapack 1! ekstrakta za pakovanje (Stratagene). Rekombinantni fazi su korišćeni za inficiranjeE. coliXL1-Blue MRF", koja je zatim postavljena na LB agar. Dobijen naslage su skinute na nitroeelulozne membrane (Bio-Rad. Mississauga. Ontario, Canada). Membrane su blokirane puferom Tris-slani rastvor (TBS) sa 2% obranog mleka i redom inkubirane sa serumom svinja rekonvalescenata od infekcije S. suis-om serotipa 2, zečjim antiserumima sa anti-svinjskim imunoglobulinom G (IgG) konjugovanim sa peroksidazom (Jackson Immuno Research Laboratories, Inc.. West Grove. Pa.), i O-fenilendiaminom, Pozitivne naslage su prečišćene do homogenosti. Rekombinantni pBluescript plazmidi su ekscizirani ExAssist helper fagom (Stratagene) prema uputstvu proizvođača. Sekvenca inserta je određena pomoću T3 i T7 promotora kao prajmera u DNA Sctjucncing Facilitv. Univcrsitv of Maine (Orono. ME,

USA). Nukleotiđne i aminokiselinske sekvence izvedene iz otvorenih okvira čitanja (ORl-'s) su analizirane upotrebom programa dostupnih na internetu.

[0078J Sekvenca koja kodira zreo SPI je umnožena iz prečišćene hromozomske DNK soja S735 pomoću PCR prajmera Pl (5"-ATGGATCCATTGAAGGCCGCTCGGCACAAGAAGTAAAA-3<*>; SEQ ID NO 13) i P2

(5"-CCAAGTCGACTTATAATTTACGTTTACGTGTA-3"; SEQ ID NO 14), koji sadržeBamHliSalI restrikciona mesta, respektivno. PCR je izvođen 5 min na 94°C, za čim je sledilo 30 ciklusa od 1 min na 94°C, 30s na 56 °C i 1 min na 72°C. Dobijen PCR fragment je kloniran uBamHI iSalI mesta pMAL-p ekspresionog vektora. Rekombinantni plazmid koji sadrži spi gen je nazvan pORF3.

|fl()79| Ekspresija i prečišćavanje rekombinantnog SPI proteina. Prečišćen plazmid pORF3 jc korišćen za transformisanjeE. coliXL1-Blue soja đektroporaeijom u Genepulse 11 aparatu (Bio-Rad) sledeći preporuke proizvođača. Ovaj rekombinantni soj jc gajen u LB medijumu plus 2 g 'L glukoze i 50 pg ml ampicillina. Da bi se prekomerno eksprimirala. kultura je inokulirana iz prekonoenc kulture sa njenim početnim OD600 đolcranim do 0.1. Kultura je inkubirana uz mućkanje do OD600 od približno 0.8. a zatim je dodat IPTG tla bi sc indukovala proizvodnja MBP-SPI fuzionog proteina. Posle 2 sata od indukcije, fuzioni protein je nađen u bakterijskoj periplazmi, kao i u citoplazmi. Odlučeno je da sc koriste ekstrakti bakterijskih lizata za prečišćavanje SPI proteina.

(0080J Fuzioni protein je prečišćen afinitetnom hromatografijom upotrebom amilozne smole (New England BioLabs) sledeći uputstvo proizvođača. Celijski peletE. colije suspendovan u puferu za vezivanje za afinitetnu kolonu (20 mM Tris-HCI, 50 mM NaCl, pH 7,4) i ćelije su lizirane pomoću French Pressure Cell Press (SLM Instruments, Inc.). Posle fdtracije na membrani od 0,45 |.im, supernatant je nanesen na amiloznu smolu. MBP-SPI fuzioni protein je eluiran 1%-nom maltozom u puferu za vezivanje i frakcije koje sadrže protein su određene elektroforezom na natrijum dotlecil sulfat-poliakrilamidnom gelu (SDS-PAGE). Prečišćen fuzioni protein je isečen proteazom Factor Xa (New England BioLabs) u koncentraciji od 20 ug/ing proteina i nanesen na kolonu mono-Q (Amersham Pharmacia Bioteeh. Baie đTJrfee. Canada). Rekombinantni SPI očišćen od MBP nosača je eluiran sa kolone pomoću linearnog gradijenta NaCl (0 do 0,4 M NaCl u 20 mM Tris-HCI, pH 7.4). Frakcije koje sadrže SPI su kombinovane i dijalizovane prema PBS puferu. Čistoća rekombinantnog SPI je procenjena pomoću SDS-PAGE. a koncentracija proteina je određena Brađforđovim testom proteina (Bio-Rad) prema uputstvu proizvođača.

(00811 SDS-PAGE i vvestern imunoblot. SDS-PAGE je sproveden kao što jc opisao Lacmmli (21). ukupan celijski ekstrakt ili prečišćen protein je odvojen na 10 %-noni akrilamidnom gelu i gel je zatim obojen bojom Coomassie brilliant blue R250 (Sigma. St. Louis, Mo). Prethodno obojeni markeri male molekulske mase (Bio-Rad) su korišćeni za određivanje prividnih molekulskih težina proteina. Alternativno, vvestern blot proteina prebačenih na nitrocelulozne membrane je izvedeno suštinski kao sto je opisao Burnette (5).

|0082] Imunoelektronska mikroskopija. Soj.S'. suisS735 je gajen u 5 ml THB preko noći, centrifugiran i ponovo suspendovan u 500 ul PBS (pH 8.0). 20 pl bakterijske suspenzije je stavljeno na nikl-formvar rešetku (INRS. Institut Armantl Frappier. Laval. Canada) i ostavljeno da se đelimično osuši na vazduhu. Posle 30 minuta blokiranja 10%-nim normalnim magarećim serumom u puferu za razblaživanjc (PBS-1 % goveđi albumin-l % Tvveen 20. pH

8.0), rešetke su potopljene u 50 }.d SPI-specifičnog zečjeg seruma ili kontrolnog zečjeg anti-MBP seruma (Ncw England BioLabs) razblaženog I'25 u puferu za razblaživanje 2 h na sobnoj temperaturi. Rešetke su oprane tri puta u PBS-1% T\veen20, a zatim prebačene u 50 u. i 12 nm koloidnog rastvora magarećih anti-zečjih IgG sa zlatom-AffiniPure (Jackson ImmunoRescarch Laboratories) razblaženog 1/30 u puferu za razblaživanje i inkubirane 1 h na sobnoj temperaturi. Posle tri pranja puferom PBS-1% Tvveen 20 i jednog pranja destilovanom vodom, bakterije su obojene 1 %-nom fosfovolframnom kiselinom i ispitane pod elektronskim mikroskopom (Philips 201) pri ubrzavajućem naponu od 60 kV.

[0083| Studija imunizacije i zaštite. Prasići su korišćeni tla se izvede test imunizacije i zaštite u VIDO-u (Saskatoon, Canada) u skladu sa principima istaknutim u Vodiču za brigu i upotrebu eksperimentalnih životinja Kanadske skupštine za brigu o životinjama korišćenjem protokola koji je odobrio Univerzitetski komitet za brigu o životinjama (37). Tri nedelje stari prasići prosečne težine 8,23 kg, iz krda koje nemaS. suisserotip 2, su nasumično podcijeni u dve grupe od po osam. Prasićima je intramuskulamo injektiran dva puta u intervalu od 3 nedelje 1 ml bilo 100 ug prečišćenog SPI pomešanog sa 30%-nim Emulsigen-Plus (MVP Laboratories, Ralston, Nebr.) adjuvantom, bilo 30%-ni Emulsigen-Plus u fiziološkom slanom rastvoru kao kontrola. Jedanaest dana posle druge injekcije, imunizovanc i kontrolne životinje su izazvane aerosolom od 1 ml (4,6 x 10" CFU) log-faze kultureS.. suisvirulentnog soja 166. za koji je potvrđeno da je jako virulentan (3). Uzorci krvi su sakupljeni pre svake injekcije, izazova i kraja eksperimenta da bi se odredili odgovori antitela. Prasićima su svakodnevno praćeni klinički znaci, telesna temperatura i mortalitet deset dana posle izazova. Svi prasići su ispitani postmortem na vidljivu patologiju i krv je kultivisana da bi sc detektovalo prisustvo

bakteremije S. suis.

[0084] ELISA. Serumski SPI-specifični ukupni IgG i IgG izotipovi (IgGl i lgG2) imunizovanih prasića su određeni enzimskim imunološkim esejem (ELISA). Polysorb ploče (Nunc-Immunoplates, Rochester, New York, USA) su prevučene sa 100 uđ po ležištu prečišćenog rekombinantnog SPI u koncentraciji od 0.3 u g/ml u karbonatnom puferu preko noći na 4°C. Posle tri pranja PBS-om koji sadrži 0.05% Tvveen20 (PBST), ploče su blokirane 5%-nim obranim mlekom u PBST 1 h na 37°C. Za određivanje ukupnog IgG, svinjski serumi iz kontrolne i vakcinisane grupe su razblaženi 1 5000 u PBS T i dodati u odgovarajuća ležišta u duplikatu, 100 ul po ležištu. Posle 1 h inkubacije na 37"C i pranja tri puta. vezana antitela su detektovana jednosatnom inkubacijom na 37°C sa kozjim antiserumima sa anti-svinjskim IgG(H+L) konjugovanim sa peroksidazom (Jackson Immuno Research Laboratories). Za detekciju IgGl i IgG2, 1/500 razblaženi svinjski serumi iz vakcinisane grupe su dodati. 100 ul po ležištu. Mišji anti-praseći IgGl ili lgG2 (Serotec. Kidlington. Oxford, UK) je korišćen kao primarno antitelo. a kozji anti-mišji IgG (H+L) konjugovan sa peroksidazom (Serotec) je korišćen kao sekundarno antitelo. Ploče su razvijene sa TMB supstratom (Zvmed, S. San Francisco, USA). Apsorbanca je merena na 450 nm u ELISA čitaču (Povver Wavc 340, Bio-Tek Instruments, Inc.). Rezultati su izraženi kao srednje vređnosti ± S.D. Statistička značajnost je određena studentovim!testom.

10085j Pristupni broj nukleotiđne sekvence. Sekvenca gena koji kodira protein SPIS. suis-a je pokazana na Slici 2 i đođeljen joj je GenBank pristupni broj AY86433I.

Rezultati

f0086jIdentifikacija .spi gena. Hromozomska bibliotekaS. suisje konstruisana iz.S'. suissoja S735 uXZAPII i pretražena uz upotrebu seruma svinja rekonvalescenata iz životinja inficiranihS. suis- omscrotip 2. Jedan klon. koji je eksprimirao protein sa prividnom molekulskom težinom (MW) od 110 kDa koji je bio jako reaktivan na serum svinja rekonvalescenata, je odabran za dalju karakterizaciju. Rekombinantni pBluescript plazmid. označen sa pSS735. je isečen iz kraka bakteriofaga i njegova šematska organizacija je prikazana na SI. 1. Analiza DNK sekvenci 6057- bp inserta pSS735 je otkrila četiri ORFs. Ovaj klaster gena je nađen u delimično sekvenciranimn genomimaS. suis.kanadskog soja 89/1591 (NZAAFAOOOOOOOO) i evropskog soja Pl/7 (NC 004549) sa istom organizacijom. Izvedene aminokiselinske sekvence i iz ORF1 i iz ORF2 su pokazale identičnosti u opsegu od 50 - 80% sa glikozil transferazom, a ORF4 su pokazale identičnosti u opsegu od 50 - 75% sa proteinom A koji kontroliše katabolite iz mnogih bakterijskih vrsta, od kojih većina pripada roduStreptococcus.ORF3 kodira protein od 670 aminokiselina. označen sa SPI. sa predviđenim pi od 6.0 i izračunatom molekulskom masom od 74.8 kDa. Poređenje aminokiselinske sekvence SPI sa onima iz dostupnih baza podataka nije otkrilo značajnu homologiju sa drugim proteinima. Analiza subklonova SPI sekvence u pMal-p vektoru je otkrila da je SPI jako reagovao sa serumom svinja rekonvalescenata, demonstrirajući da je SPI imunogeni protein.

[0087j SPI je nov površinski proteinS. suis- ausidren C-krajem. Sekvenca spi gena od 2010 bp počinje ATG kodonom kome prethodi moguć Shine-Dalgamo-ov niz (GAAAGGA) 10 bp uzvodno od start kodona i završava se TAA kodonom (SI. 2). Analiza predviđene aminokiselinske sekvence SPI je otkrila hidrofobno jezgro od 15 aminokiselina na N-kraju i moguće mesto seČenja signal-peptidazom između Ala29 i Gln30. Deset ponovaka od 27 aminokiselinskih sekvenci sa jakim konsenzusnim obrascem, odvojeno marginama od po 3 aminokiselinska ostatka, je detektovano unutar karboksilne polovine proteina. Odmah uz region sa ponovcima, prema C-kraju, je region vezan za celijski zid, koji obuhvata 49 aminokiselinskih ostataka i karakteriše se visokim procentom treoninskih ostataka (20,4%). Odmah iza ovog regiona bogatog treoninom sledi LPVTG konsenzusu i motiv, tipičan za površinske proteine usidrene u membrani mnogih Gram-pozitivnih bakterija. Posle četiri aminokiseline od membranskog motiva sidra, prema C-kraju, identifikovan je drugi hidrofobni segment od 16 aminokiselina, iza koga slede četiri pozitivno naelektrisana aminokiselinska ostatka na C-kraju proteina (SI. 2).

|0088| Analiza aminokiselinskog sastava je otkrila region bez aromatičnih ostataka između Glu"'" i Thr<Ml>. koji obuhvata sve ponovljene sekvence. Štaviše. traženje konzervisanih domena korišćenjem BLAST-a identifikovalo je đomen avirulencije u regionu Lys">n do Val''"1, koji ispoljava sličnost sa AvrXa7 faktorom avirulencije iz biljnog patogenaKunthomonas orvzaepv.orvzae(41) sa 20% identičnosti (SI. 3). Ako se uzmu u obzir konzervativne supstitucije aminokiselina, sličnost je 48%.

10089] Proizvodnja rekombinantnog SPI. Sekvenca koja kodira zreo SPI protein umnožena je PCR-om i ligi rana u IPTG-inducibilan pMAL-p vektor. Dobijen rekombinantni plazmid je eksprimiran u sojuE. coliXL1- Blue. Kao što je pokazano na SI. 4A, indukcija rekombinanataE. coli,u kojima se nalazimalE- splfuzioni gen. je dovela do ekspresije MBP-SPI fuzionog proteina od približno 150 kDa (ležište 2). koji nije bio prisutan u neindukovanim ćelijamaE. coli(ležište 1). Fuzioni protein je nađen najviše u citoplazmi ćelija /;'.coli(ležište 3). Interesantno da je skraćeni MBP-SPI fuzioni protein, u kome je deletiran region sa ponovcima okarakterisan odsustvom aromatičnih supstitucija, u eelini

transportovan u periplazmatski prostor (podaci nisu pokazani), sugerišući da je ovaj region nekako interfcrisao sa lokalizacijom MBP.

[00901 Fuzioni protein je prečišćen na atinitctnoj koloni sa ami lozom na matriksu eluiranjcm maltozom, i pojavila se jedna jedina ležište proteina od približno 150 kDa na SDS-PAGE (ležište 4). Prečišćen fuzioni protein je proteci i tičk i isečen Factor-om Xa. dajući prividnih 1 10 kDa zrelog SPI i očekivanih 45 kDa MBP markera (ležište 5). Zreo SPI očišćen od MBP je dobijen sledećim prečišćavanjem jonoizmenjivačkom hroma tografijom, čistoće >95%. procenjene pomoću SDS-PAGE (ležište 6). ! MBP-SPI fuzioni protein i prečišćen rekombinantni SPI su ispoljili specifičnu reaktivnost u vvestern blotu na serum svinja rekonvalescenata koji je korišćen za inicijalni skriniiig genomske biblioteke (SI. 4B). Identičnost prečišćenog SPI je potvrđena sekvenciranjem N-kraja proteina. Koncentracija proteina je merena Bradfordovim testom proteina i podešena na 1 mg/ml.

[ 00911 Ekspresija SPI na površini ćelije uS. suis.Da bi sc potvrdila lokacija SPI na površini ćelijaS. suis.urađena je inumoelektronska mikroskopija uz korišćenje monospecifičnog poliklonskog anli-SPI antitela. R44. Nađeno je da su imunozlatne čestice ravnomerno raspoređene na površini S..v///'.v soja S735. To indikuje daje SPI protein homogeno eksprimiran na eelijskoj površini. Zečji anti-MBP serum je korišćen kao kontrola i nije pokazao nikakvo obeležavanje {SI. 5).

(00921 Raspodela SPI meduS. suis.Da bi sc procenila konzervisanost SPI medu referentnim sojevima različitih serotipovaS. suisi serotip 2 prirodna sojeva, preparati cei ih ćelija bakterija su naneseni na vvestern blot i detektovani SP-specifičnim antitelom R44. Kao što je pokazano u Tabeli 1, osim sojeva serotipova 13, 16. 20, 22 i 24, R44 je reagovao sa ostalih 28S. suisserotipova, dok je 25 od 26 testiranih izolata tipa 2 iz različitih geografskih izvora reagovalo sa antitelom R44. Pet sojeva iz drugih vrsta Streptococci je korišćeno da bi se potvrdila specifičnost SPI i SPI protein nije detektovan.

[0093] Inuinogenost SPI i zaštita prasića od izazovaS. suis- om.Grupe od po 8 prasića su imunizovane dvaput intramuskularno. bilo pomoću 100 ug prečišćenog rekombinantnog SPI emulzifikovanog adjuvantom. bilo samo adjuvantom. Imunizaeija prasića pomoću SPI je uključila antigen-specifican odgovor (SI. 6A). Analiza odgovarajućih seruma dobijenih iz kontrolnih životinja i životinja pre imunizaci je je jasno naznačila da ni je bilo SP I-specifičnog antitela, jer su zabeležene samo pozadinske vređnosti u EI.ISA-i. Samo dve nedelje posle prve injekcije, SPI je podigao značajan IgG odgovor koji jc očigledno bio pojačan dodatnom imunizacijom. Procena IgG izotipova jc pokazala da su serumi iz imunizovanih prasića sadržali i IgGl i IgG2 antitela (SI. 6B). Međutim. IgGl odgovor jc dominirao nad IgG2, sugerišući daje vakcinacija SPI uglavnom indukovala imuni odgovor tipa Th2. Acrosolni izazov prasićaS. suissojem 166 je doveo do stabilnih povećanja kliničke ocene počev od drugog dana posle izazova i nije bilo značajnog efekta vakcinacije. Kao što jc sumirano u Tabeli 2, iako je manje prasića patilo od artritisa u vakcinisanoj grupi nego u kontrolnoj grupi, obe grupe su ispoljile slične simptome posle izazova, Po tri praseta iz svake grupe je uginulo ili jc eutanazirano zbog visokih kliničkih ocena pre kraja eksperimenta.S. suisbakteremija je nađena u svim mrtvim prasićima. a nije bila đetektovana u preživelim prasićima.

Diskusija

[0094] Prva imunizaeija prasića je podigla brz SPI-specifičan humoralni odgovor antitela koji se može značajno pojačati sledećom injekcijom. Međutim, antitelo na SPI nije dalo imunitet na heterologan izazovS. suissojem 166. Ovaj raskorak između odgovora antitela i zaštite je prijavljen u nekim drugim površinskim antigenima Gram-pozitivnih bakterija, kao što je streptokokni protein koji vezuje fibronektin (Sfbl) (26). pneumokokni površinski protein A (PspA) (27), polisaharid grupe B (25) i M-sliean protein (ScM)Streptocococcus equi- a (34).Nije jasno zašto antitela na SPI ne štite od izazovaS. suis- om166. U studiji ubijanja fagocitima, prisustvo spojenih seruma iz SP 1 -imuni/.ovanih prasića nije podstaklo ubijanjeS. suisprascćim neutrofilima, sugerišući da antitelima nedostaje opsonofagocitna funkcija. Zaštita domaćina od infekcija izazvanih S. suis-om, izrazito enkapsuliranim mikroorganizmom, je posredovana prvenstveno fagocitozom (32). Prema tome, ukupni nivoi IgG generisani u modelu autora ove prijave konvencionalne vakcinacije možda ne odražavaju adekvatno prisustvo zaštitnih antitela koja su sposobna da pokrenu efektorske funkcije leukocita. Za dalju ilustraciju tipova imunih odgovora pokrenutih pomoću SPI. procenjeni su IgG izotipovi u imunizovanim serumima. Nivoi IgG I su bili konzistentno viši nego nivoi IgG2 sugerišući indukciju odgovora tipa Th2. lako koncept ravnoteže "Thl Th2" još nije dobro dokumentovan u prasićima kao u nekim drugim vrstama, nedavni dokazi pokazuju da praseći lgG2 ima veću sposobnost za aktivaciju komplementa nego IgGl (6).

[0095| Emulsigen-Plus je korišćen kao adjuvant u ovoj studiji, jer sc verovalo da je on u stanju da napravi depo antigena na mestu inokulaeijc. iz kog se antigen polako otpušta i tako obezbeđuje produženu stimulaciju imunog sistema (23, 37). Međutim, nedavni dokazi pokazuju da vakeina formulisana sa samim Emulsigenom uključuje pretežno IgGl odgovor, a vrlo slab imuni odgovor tipa Thl (19, 28). Dokaz iz vakcinacije korišćenjem površinskih antigena drugih Gram-pozitivnih bakterija je demonstriralo da efikasnost opsonofagocitoze može dramatično da se poveća korišćenjem adjuvanta koji usmerava Th-ls, kao što je CpG i interleukin-12 (IL-12) (4, 22, 24). Ovi adjuvanti pođstiču imuni odgovor tipa Thl, koji sc odlikuje povećanom proizvodnjom opsonizujućih antitela, naročito IgG2 izotipa. Staviše, pojačana opsonizacija u kojo posreduje antitelo je jasno odražena u zaštiti (2, 40).

100961Da zaključimo. SPI je nov površinski proteinS. suisusidren na C-kraju, kao što je demonstrirano analizom molekulskih osobina i elektronskom mikroskopijom. Vakcinacija rekombinantnim SPI je podigla značajan humoralni odgovor antitela u prasićima. zajedno sa činjenicom da serumi svinja rekonvalescenata pokazuju visoke titre antitela na ovaj protein, sugerišući da jc SPI eksponiran antigenS. suis- i\.Kad se uzme u obzir i njegova široka raspodela u različitim serotipovima5. suis,ovi nalazi čine SPI kandidatom za razmatranje u razvoju subjedinične vakcine. Potencijal SPI kao kandidata za vakeinu će biti demonstriran u sledećim primerima.

PRIMER 2

Rekombinantni SPI štiti miševe od infekcije izazvane5. suis

100971Cilj ove studije je da se proceni da li SPI rekombinantni protein štiti kao kandidat za subjediničnu vakeinu u mišjem modelu sa mođifikovanim načinom imunizacije i adjuvantom.

[0098| EKSPERIMENTALNA PROCEDURA:Miševi (CD1) su nasumićno podcijeni u dve grupe od po deset i imunizovani subkutano dvaput u đvonedeljnom intervalu, bilo pomoću 20 pg prečišćenog SPI pomešanog sa 20 ug Quil-a A kao adjuvanta. bilo pomoću 20 pg samo Quil-a A kao kontrola (Tabela I). Deset dana posle druge vakcinacije. životinje su izazvane i.p. pomoću I x l()<x>CFUS. suisvirulentnog soja (31533). Miševima su dvaput

dnevno praćeni klinički znaci i mortalitet do 14-og dana posle infekcije. Uzorci krvi .su sakupljeni pre svake vakcinacije i izazova da bi se odredili odgovori antitela.

100991 REZULTATI: Vakcinacija pomoću SPI je podigla značajne humoralne odgovore IgG u miševima posle primarne imunizacije (srednja vrednost titra 3 x IO4), a dodatna injekcija je značajno povećala titar antitela (1.8 x 10*'). Nasuprot tome, SPI - specifičan IgG u serumima kontrolne grupe je bio na nedetektabilnom nivou (SI. 1). Štaviše. sve četiri pođklase IgG su bile indukovane u SPI-imunizovanim miševima, sa najvišim titram lgG2a (1,75 x IO<6>) , iza kog su sledili IgGl (1,2 x IO<6>). lgG2b (7,25 x IO<5>) i IgG3 (3.7 x IO<4>) (SI. 2). Specifičnost antitela indukovanib pomoću SPI je demonstrirana vvestern blotom. u kom spojeni serumi, sakupljeni iz SPI-imunizovanih miševa, mogu da prepoznaju prečišćen SPI i SPI protein u ćelijskim preparatima S.suisS735 i 31533.

f0100] Šesnaest sati posle administriranja infekcije-izazivača, svi miševi u kontrolnoj grupi su počeli da ispoljavaju kliničke znake (septikerniju), kao što je razbarušenost (koja sugeriše groznicu) i spor odgovor na stimuluse. Počev od 4. dana posle izazova, 8 od 10 miševa u ovoj grupi su sukcesivno razvili teške simptome centralnog nervnog sistema (meningitis), kao što je trčanje u krugovima i opistotonos (ukočenost vrata). Svih 8 bolesnih miševa je uginulo, ili su morali da budu eutanazirani zbog ozbiljnosti stanja. Nasuprot njima, osim 6 od 10 miševa u SPl-vakcinisanoj grupi koji su imali prolazne kliničke znake kao što je malo kostrešenje dlake i nerado su se kretali tokom 16 - 40 sati posle izazova, svi miševi u ovoj grupi su ostali zdravi tokom perioda posmatranja (SI. 3 i 4).

|01011 DISKUSIJA I ZAKLJUČAK: Razlika u zaštiti uočena između mišjeg i prasećeg modela se objašnjava dobro balansiranim nivoima podklasa IgG izazvanim u modelu mišje vakcinacije, naročito ekstremno visokim titrom lgG2a. Medu mišjim izotipovima antitela, pokazano je daje IgG2a najefektivniji u aktiviranju opsonofagocitne funkcije leukocita (2, 42, 43)). Štaviše, S.suis,enkapsulirana bakterija, se najefektivnije eliminiše opsonofagocitozom. Prema tome. izgleda da pređominantna proizvodnja IgG2 najviše doprinosi viđenoj zaštiti. Ipak, ovi podaci ukazuju na to da imunizaeija miševa pomoću SPI korišćenjem adjuvant koji indukujc Thl, kakav je Quil A, može da indukuje efikasan antigen-specitičan odgovor i đa zaštiti miševe od izazivanja infekcije letalnom dozom virulentnogS. suissoja i da dovede do potpune zaštite od smrtiS. suis- om(SI. 4).

PRIMER 3

Identifikacija novog gena koji kodira proteinStreptococcus suis- asa aktivnošću vezivanja IgG i zaštitnim kapacitetom

[0102] U trajnom naporu autora ove prijave da razume patogeni mehanizam ofS. suisi traganju za njegovim proteinima koji mogu da budu korisni u razvoju pouzdanog dijagnostičkog reagensa ili vakcine. identi ti kovan je nov protein iz virulentnog soja5. suisserotipa 2, koji ispoljava aktivnost vezivanja IgG. Ovaj protein od prividnih 58 kDa, označen sa SP2. sadrži N-tenninalnu signalnu sekvencu od 23 aminokiseline koja se može šeći i lizinski M motiv blizu N-kraja i šest identičnih ponovaka od 13 aminokiselina. svi unutar C-terminalnog dela. SP2 je visoko konzervisan u različitimS. suisscrotipovima kao što je demonstrirano umnožavanjemSP2gena pomoću PCR. Rekombinantni SP2 je jako reagovao sa serumom svinja rekonvalescenata akupljenim iz prasića klinički inficiranihS. suis- omlip 2. Imunizaeija miševa prečišćenim rekombinantnim SP2 je podigla značajan odgovor antitela koji je preneo delimičnu zaštitu od izazivanja infekcije virulentnim sojemS. suis. [ 01031Ovi rezultati pokazuju daje SP2 potencijalan dijagnostički agens i kandidat za vakeinu protivinfekcije S.suis- om.

Eksperimentalne procedure i rezultati

Identifikacija SP2 gena

[0104| Pozitivni fag koji jc reagovao ne-imunim mehanizmom sa različitim klasama i vrstama Ig (svinjski IgG, humani IgG i IgA) je identifikovan pretraživanjem konstruisane genomske biblioteke S.suisserotipa 2. Sekvenca DNK inserta je otkrila insert od 6.3 kb koji sadrži tri ORF-a koji kodiraju dehidrogenaze, SP2 i dekstran glikozidaze (44) (SI. 12). Ovaj klaster gena jc nađen u đclimično sekvenciranim genomimaS. suiskanadskog soja HV 1591 (NZAAFAOO0O0OO0) i evropskog soja PI/7 (NC_004549) sa istom organizacijom. Aminokiselinska sekvenca SP2 je pokazala sličnosti sa nekim streptokoknim proteinima koji obično ispoljavaju aktivnost vezivanja lg. Identičnost od 45% je viđena između niza od 395 aminokiselina i konzervisanog hipotetičkog proteinaSirepiocuccus pucuinoniac- a(AAL00677). Druge homologije su nađene sa moguićim proteinomSircpiococcus pvogenes- a od42 kDa (45%-na identičnost niza od 388 aminokiselina) (AAK33481) i sa grupom B streptokoknog površinskog imunogenog proteina (40%-na identičnost niza od 434 aminokiselina) (60)(AAG 18474).

Karakterizacija SP2 proteina

101051 SP2 gen I 158 bp kodira 386-aa SP2 protein, sa teorijskim pl od 4,40 i molekulske mase 42,5 kDa. Ovaj protein je bogat val inom (15%), glutaminskom kiselinom (10%), i alaninom (9%). Analiza raspodele naelektrisanja SP2 je otkrila jedan klaster pozitivnog naelektrisanja (K<2>- K<2h>) at the N-terminus i jedan klaster negativnog naelektrisanja (Du>ft - E" ") u sredini proteina (SI. 13). Iza klastera pozitivnog naelektrisanja je sledila moguća signalna sekvenca od 23 aminokiseline. Aminokiselinska sekvenca SP2 sadrži LysM (lizin) motiv na položajima 71 do 109. Ovaj LysM domen je nađen u mnoštvu enzima uključenih u degradaciju bakterijskog ćelijskog zida i ima opštu funkciju vezivanja pepliđoglikana. što sugeriše da SP2 može biti a površinski proteinof S. suis.Prema tome. sastav N-kraja SP2 je otvorio mogućnost da je klaster pozitivnog naelektrisanja ostao u funkcijama citoplazme za privremeno zaustavljanje i pomaže u formiranju zrelog SP2 sečenjem signalne sekvence i u lociranju SP2 na bakterijskoj površini preko vezivanja LysM domena za peptidoglikan. Pored toga, identitikovano je šest identičnih ponovljenih sekvenci od 13 aminokiselina u srednjem delu SP2 (SI. 13).

Raspodela SP2 gena u različitim serotipovima S.suis

[0106| Da bi sc procenio nivo konzervacije SP2, rađen je PCR uz upotrebu prajmera koji pokrivaju cei u dužinu SP2 gena. PCR je rađen sa početnim denaturisanjem na 94° C 5 minuta, iza čega je sledilo 30 ciklusa od 1 min na 94° C. I min na 52° C i 2 min na 72" C. i završni period elongacije od 10 min na 72° C.

101071 Prajmer za kodirajući lanac i reverzni prajiner korišćeni za distribuciju SP2 u različitim serotipovima su bili, respektivno:

[01081, SP2 gen je umnožen iz 31 od 33 serotipa referentnih sojeva sa nekim varijacijama u veličini (SI. 14). Analiza sekvenci odabranih fragmenata varijanti sugeriše da je broj ponovaka u SP2 genu odgovoran za varijacije u veličini.

Proizvodnja i prečišćavanje rekombinantnog SP2

[0109] Gen koji kodira zreo SP2 jc generisan PCR-om iz hromozomaS. suisS735 i subkloniran u pET32+ vektor (Ne\v England BioLabs). Konstrukt je korišćen za transformisanjeE. coliDE3 soja elektroporacijom pomoću Genepulse 11 aparata (Bio-Rad) sledeći preporuke proizvođača. Za hipereksprcsiju. kultura je inokulirana iz prekonoć ne kulture sa početnim OD600 podešenim na 0.1. Kultura jc inkubirana uz mućkanje do ODWHi od približno 0,8, a zatim je dodat 1PTG (0.5 mM) da bi se indukovala proizvodnja fuzionog proteina Tr.x-His-SP2. Posle 2 sata od indukcije, bakterijska citoplazma je pripremljena i kori Scena za prečišćavanje SP2 proteina.

101101 Trx-His-SP2 fuzioni protein je prečišćen iz citoplazme afinitetnom hromatogratijom uz upotrebu Ni+ kolone (Amersham Pharmacia Biotech, Baie d'Urfee, Canada). Citoplazma je profiltrirana na membrani od 0.45 mm i nanesena na kolonu. Fuzioni protein je eluiran 500 mM-nim imidazolom u puferu za vezivanje i frakcije koje sadrže protein su određene pomoću SDS-PAGE. Prečišćen fuzioni protein je isečen 0.001%-nom (w/w) enterokinazom (New England BioLabs), dajući SP2 od prividnih 58 kDa i Trx-His marker od očekivanih 20 kDa (SI. 15), a zatim nanesen na mono-Q kolonu (Amersham Pharmacia Biotech, Baie d'Urfee, Canada). Rekombinantni SP2 očišćen od Trx-His markera je dobijen eluiranjem kolone pomoću linearnog NaCl gradijenta, procenjene čistoće veće od 95%, kao što je vizuelizirano pomoću SDS-PAGE (SI. 15). Koncentracija proteina je određena pomoću Bio-Rad kompleta za testiranje proteina (Bio-Rad). prema upulstvu proizvođača. Identičnost prečišćenog SP2 je potvrđena sekvenciranjem N-kraja proteina.

SP2 je imunogeni proteinS. suis- ai ispoljavaaktivnost vezivan ja IgG

101111SP2-specifično antitelo je generisano imunizovanjem novozelandskih belih zečeva intramuskularno pomoću 100 ug rekombinantnog SP2 proteina emulzifikovanog sa 0,5 ml Freund-ovog nepotpunog adjuvanta. Zečevi su primili dve dodatne injekcije sa istom dozom SP2 u intervalima od 2 nedelje, a zatim su iskrvavljeni 10 dana posle poslednje dodatne imunizacije. Povratno. SP2-speeilično antitelo je prepoznalo SP2 u ćelijskom preparatuS. suisu vvestern blotu (SI. 16a). Pored toga. rekombinantni SP2 je reagovao sa serumom svinja rekonvalescenata (Si. 16b), demonstrirajući da anti-SP2 antitelo postoji u serumu prasića klinički inficiranihS. suis- om.

|0112| Aktivnosti vezivanja rekombinantnog SP2 za humani i praseći IgG su demonstrirane na SI. 16c i I6d.

Rekombinantni SP2 delimično štiti miševe od infekcije izazvane S. suis-om

[0113] Miševi (CD1) su nasumieno podcijeni u dve grupe od po jedanaest (vakcinisana grupa) i deset (kontrola) i imunizovani subkiitano dvaput u đvonedeljnom intervalu, bilo pomoću 50 ug prečišćenog SPI pomešanog sa 20 ug Quil-a A kao adjuvanta koji indukuje Thl, bilo pomoću 20 ug samo Quil-a A kao kontrola. Deset dana posle druge vakcinacije, životinje su izazvane i.p. pomoću I x I0<X>CFU virulentnog sojaS. suis(31533). Miševima su dvaput dnevno praćeni klinički znaci i mortalitet do 14-og dana posle infekcije. Uzorci krvi su sakupljeni pre svake vakcinacije i izazova da bi se odredili odgovori antitela.

(0114]Vakcinacija pomoću SP2 jc podigla značajne humoralne odgovore IgG u miševima. Nasuprot tome, SP2-specifičan IgG u serumima kontrolne grupe je bio na nedetektabilnom nivou (SI. 17). Obe grupe su pokazale kliničke znake septikemije i meningitisa, međutim, kliničke ocene u SP2-vakcinisanoj grupi su manje nego u kontrolnoj grupi (SI. 18). 4 od 1 I miševa u SP2-vakcinisanoj grupi je uginulo ili je moralo da bude eutanazirano zbog težine stanja (stepen preživljavanja = 64%). Nasuprot tome, 8 od 10 miševa u kontrolnoj grupi je uginulo (stepen preživljavanja = 20%) (SI. 10). Ovi rezultati pokazuju da SP2 štiti miševe od infekcije izazvane S. suis-om.

Zaključak

[01151SP2 je nov opisan imunogeni proteinS. suiskoji deli malu identičnost sa ostalim poznatim sekvencama. Serumi svinja rekonvalescenata imaju antitelo na ovaj protein, demonstrirajući da je SP2 potentan antigen koji sc eksprimira tokom infekcije S. suis-om. Ovi nalazi, zajedno sa njegovom širokom raspodclotn u različitim serotipovimaS. suis.čine SP2 kandidatom za razmatranje u razvoju dijagnostičkog reagensa. Pošto je vakcinacija miševa rekombinantnim SP2 dovela do zaštite, jasno je. prema tome. da je SP2 potencijalan kandidat za vakeinu protiv infekcije S. suis-om.

PRIMER 4

Efekat imunizacije prasića eksperimentalnom vakcinoinprotivStreptococcus suis

[01161Ova studija procenjuje zaštitni efekat rekombinantnog Sao proteina na izazivanje infekcijeS. suis- omserotipa 2 u prasićima.

MATERIJALI I METODI

Životinje, dodeljivanje tretmana i kiiterijumi isključivanja:

[0117|Korišćeno je ukupno 24 ukrštena praseta iz krda koje nema oboljenje izazvano S. suis-om (H & M Fast Farms Inc.), bez ikakve prethodne vakcinacije protivS. suis.Prasići su čuvani u komercijalnim uslovima u krdu porekla od rođenja dok nisu odvojeni pri prosećnoj težini od 7,70 kg, sa 23,5 dana starosti. Prasići su čuvani na kontrolisanoj temperaturi (27 do 30°C) i ventilaciji, na metalnom podu prekrivenom vinilom, obezbedena im je voda preko kontejnera sa sisaljkom i imali su slobodan pristup komercijalno pripremljenoj, nutriciono balansiranoj hrani bez antibiotika. Veterinar je pregledao prasiće pre početka studije. Ali vvere healthv. Prilikom odvajanja, prasići su nasumićno podcijeni u dve grupe, balansirane po telesnoj težini.

Grupa I: 200 ug Sao i 400 pg Quil A u I mL slanog rastvora

Grupa 2: 400 ug Quil A u I mL slanog rastvora (kontrola)

[0118JSvaka životinja koja dobije nepredviđen tretman ili podlegne nevezanoj bolesti će biti isključena iz analize.

Vakcinacija i izazov:

[0119]Svi prasići su vakcinisani IM jednim mililitrom dva puta u intervalu od 2 nedelje. Uzorci krvi su sakupljeni pre svake injekcije i svakog izazova. Nije bilo nikakvih štetnih posledica ovih tretmana.

[0120]Dve nedelje posle druge vakcinacije, prasići su anestezirani halotanom i izazvani aerosolom od 1 ml suspenzijeS. suis166. Bakterije su bile iz log-faze kulture gajene u Todd-Hewitt-ovoj kvasnoj supi, sterilisanoj na filtru, do OD(12ood 0,8 i razblažene 1:100 u slanom rastvoru (0,85 % NaCl). Koncentracija bakterija administrirana prasićima je kasnije merena i bila je 6,8 x 10<f>,CFU/ml.

Kliničke opservacije:

|0121|Veterinar ili tehničar obučen za brigu o životinjama je klinički proeenjivao prasiće jedanput dnevno i mcrio im telesnu temperaturu tokom dodeljivanja kliničkih oeena svako jutro deset dana posle izazivanja. Dnevna klinička ocena (od 0 do 4) je izvedena kao zbir držanja i ocene lokomocije za svaku životinju na osnovu znaka ncrvnih. mišićnoskeletnih ili respiratornih oboljenja na sledeći način:

Držanje:

(0122)

0 = normalno držanje i odgovor na stimuluse

1 = neaktivan i spor da odgovori; okulo-nazalne sekrecije

2 = responzivan samo na ponovljene stimuluse, apatiean

3 = ležeći, neresponzivan. nesvcsan okruženja

4 = mrtav

Lokomocija:

[0123[

0 = normalno kretanje i postura

1 = labav u koordinaciji, hromost i/ili oticanje zglobova, ali ustaje bez asistencije

2 = vidno nekoordinisan ili hrom, ali stoji bez asistencije

3 = izrazita hromost, izrazita ataksija, nemože da stoji

4 = mrtav

[0124| Prasići koji imaju kliničku ocenu veću od 2 na bilo kojoj od skala su eutanazirani letalnom injekcijom. Prasići sa rektalnom temperaturom jednakom ili većom od -10.6 (' j kliničkom ocenom većom od 0, kao i oni prasići koji su bili mrtvi, su zabeleženi kao bolesni tog dana. Prasići koji su uginuli ili su eutanazirani pre kraja eksperimenta, devetog dana su zabeleženi kao mrtvi za evaluaciju efekta tretmana na stepen mortaliteta. Sve osobe koje su davale sud o životinjama, koje su procenjivale znake bolesti, ili koje su izvele laboratorijske eseje, nisu znale za identičnost tretmana.

Hem atološki ušlo vi:

|0125| Uzorak krvi tretiran heparinom je dobijen venipunkturom za detekciju bakteremije S. suis-om (u kulturi ()-tog i 3-ćeg dana posle izazivanja i po.stmortem).

Titar antitela:

|0126|Titri Sao-specifičnih ukupnih IgG i IgG podklasa (IgGl i IgG?) u serumima su određeni pomoću ELISA-e. Razblaženje seruma koje je dovelo do OD450 od 0,1 posle oduzimanja pozadine je smatrano titrom ovog seruma.

Nekropsija:

[0127| Svi prasići su ispitani postmortem i slcđcća tkiva su gajena u kulturi za bakterije: bris iz malog mozga, traheo-bronhijalni limfni čvor, bris iz zgloba (pogođen zglob ako su prisutna lezije; ako ne, onda koleno) i krv. BrojS. suisbakterija koje su sakupljene je zabeležen na skali sa rednim brojevima od 0 do 4 (približan broj kolonija, kao log 10). Pored toga. stepen (procenat) uključenosti pluća je procenjen vizuelnim ispitivanjem.

Statistička analiza

101281 Značajnost razlika među grupama u nominalnim podacima (mortalitet, prisustvo ili odsustvoS. suisu tkivima, broj dana koliko je bolestan ili zdrav) je određena analizom tabele kontigencije i Fišerovim testom racia verodostojnosti. Značajnost razlika među grupama u ordinalnim podacima (klinička ocena) je transformisana rangiranjem i određena t-testom. Značajnost razlika medu grupama u krivama preživljavanja je određena analizom preživljavanja korišćenjem log-rang testa (ekvivalent Mantel-Haenszel-ovog testa). Značajnost razlika medu grupama u kontinuiranim podacima (dužina preživljavanja posle izazivanja, telesna temperatura, log2 CFU/ml krvi) je određena pomoću t-testa (posle odgovarajuće transformacije u normalnost po potrebi).

REZULTATI

Isključene životinje:

|0129| Jedno prase je ubijeno humano 5. dana posle izazivanja zbog upornog pogoršavajućeg prolapsa rektuma. Ovo prase će biti isključeno iz analize.

Kliničke opservacije:

|0I30| /. Odgovor na innmizaciju:Nije bilo neobičnih reakcija koje bi se pripisalc vakcinaciji.2. Telesna temperatura:podaci o telesnoj temperaturi, kao što su analizirane t-testom.

nisu pokazali značajne razlike između dve grupe (p > 0.05). Uopšteno. vakcinisani prasići su naginjali ka nižim temperaturama (SI. 20)

3. Klinička bolest:"klinička ocena" je mera količine bolesti i uključuje i mortalitet i morbiditet. Dve grupe su uporedene korišćenjem Mann-Whitney analize efekta vakcine na kliničku oeenu i klinička bolest u vakeinisanoj grupi je bila značajno manja nego ona u kontroli (p=(),024) (SI. 21).

4. Preživljavanje prasića posle izazivanja S. suis- om:Stopa preživljavanja je bila 82%

u vakeinisanoj grupi i 42% u kontrolnoj grupi. Poređenje krivih preživljavanja uz upotrebu dva skupa podataka, pokazuje da je vreme preživljavanja vakcinisanih prasića bilo značajno duže nego ono kontrole (p = 0,048) (SI. 22).

Bakteriologija

I0131J

/. Baktcrcmija: Bakterije u krvi prasića nisu đetektovane (ND) pre izazivanja. Bakteremija prasića posle izazivanja i poslmonerm nije bila značajno različita između dve grupe. Međutim, vakeinisani prasići su imali manju bakteremiju (tabela 3).2. Injekciju postmortem:Urađena je mikrobiološka kultura uzoraka iz mozga,

traheobronhijalnih limfnih čvorova i zglobova svih prasića koji su bili izazvani da bi se pratio nivo infekcije. Sakupljena su tkiva sa bakterijama koje imaju morfologiju kolonija tipičnu za soj-izazivač što je prikazano u Tabeli 4. Wilcoxon-ov test ranga sa znakom za efekat vakcinisane grupe na medijanu bakteriološke ocene (medijana sume ocena za sva tkiva svakog praseta) pokazuje daje ova razlika značajna (p = 0,007).

Patologija ( post- m ortem)

(0132] Patološke lezije artritisa ili pneumonije su đetektovane u samo 6 prasića (2 u vakeinisanoj grupi i 4 u kontroli). Ostali mrtvi ili eutanazirani prasići nisu imali nikakve krupne patološke znake. Jedna od karakteristika infekcije S. suis-om je da akutna infekcija može biti fatalna bez merljivih krupnih znakova patologije. Traheobronhi jalni limfni čvor je bio uvećan. Bio je trag tibrina na mezenterijumu, koji inđikuje blagi peritonitis. Bilo je dokaza o artritisu u oba kolena, u kojima je bila mala količina purulentnog materijala, i u levom ramenu, gde je bio trag purulentnog eksudat.

Odgovor antitela

[0133] Imunizaeija prasića pomoću Sao u kombinaciji sa Quil-om A je podigla značajne humoralne odgovore IgG posle primarne imunizacije i dodatna injekcija je značajno povećala titar antitela (SI. 23). Štaviše, iako su obe podklase IgGl i lgG2 bile indukovane. titar lgG2 je dominirao nad IgGl, kao što je izmereno u serumima 2 nedelje posle druge vakcinacije (SI. 24).

SAŽETAK i DISKUSIJA

|0134| Pokazano je da je vakeina bezbedna. jer prasići koji su bili vakeinisani dvaput nisu imali nikakve neželjene reakcije. Imunizaeija prasića pomoću Sao u kombinaciji sa Quil-om A je podigla značajne titre IgG sa dominantnom proizvodnjom lgG2, sugerišući da jc preovladujući imuni odgovor tipa Thl. Aerosolno izazivanje prasića je dovelo do bolesti sa ukunom stopom smrtnosti od oko 58% u kontrolama. Preživljavanje vakcinisanih prasića posle izazivanja je bilo značajno veće nego kontrola (p < 0,05). Neki prasići u svakoj grupi su se razboleli posle izazivanja i bilo je značajno manje bolesti (niža klinička ocena) kod

vakcinisanih prasića. Vakcinacija nije imala značajan efekat na pojavu krupne patologije postmortem; međutim, akutna streptokokna septikemija može biti fatalna i bez merljivih krupnih znaka patologije. Manje bakterijaS. suisje bilo sakupljeno iz vakcinisanih prasića nego iz kontrolnih prasića post mortem (p < 0,01).

PRIMER 5

Imunizaeija miševaiprasića fragmentom SPI A

Im u n i za čija m iše va

[0135] Tri grupe ođ po 10 miševa su imunizovane dva puta (1. dana i 17. dana) i.p. pomoću 40 pg prečišćenog SP1A-MBP (MBP=protein koji vezuje maltozu) fuzionog proteina, 20 ug MBP ili samo PBS, uz upotrebu Freund-ovog nekompletnog rastvora kao adjuvanta. Serumi su dobijeni pre svake imunizacije ili 10 dana posle druge injekcije i razblaženi su 1:5000 za ELISA test. (Viđeti Tabelu 5)

Imunizaeija prasića

|0I36|Tri grupe od po 3 praseta su imunizovane dva puta (1. dana i 17. dana) i.m. pomoću 200 pg prečišćenog SPI A-MBP fuzionog proteina, 100 ug MBP ili samo PBS, uz upotrebu Emulsigena kao adjuvanta. Serumi su dobijeni pre svake imunizacije ili 10 dana posle druge injekcije i razblaženi su 1:5000 za ELISA test. (Viđeti Tabelu 6)

Claims (29)

1. Izolovan polipeptid SPI sposoban da podigne imuni odgovor specifičan naStreptococcus suis,koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 95% identičnosti sa aminokiselinskom sekvencom navedenom u SEQ ID NO: 4 ili 17.

2. Izolovan polipeptid SPI iz zahteva 1, koji sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQIDNO:10.

3. Izolovan polipeptid SPI iz zahteva 1 ili 2. koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 95% identičnosti sa aminokiselinskom sekvencom navedenom u SEQ ID NO: 17.

4. Izolovan polipeptid SPI iz zahteva 1 do 2. koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 95% identičnosti sa aminokiselinskom sekvencom navedenom u SEQ ID NO: 4.

5. Izolovan polipeptid SPI iz zahteva 1. koji sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO: 17.

6. Izolovan polipeptid SPI iz zahteva 1. koji sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO: 4.

7. Izolovan polipeptid SPI sposoban da podigne imuni odgovor specifičan naStreptococcus suis,koji sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO: 2 ili 3.

8. Izolovan polipeptid SPI iz zahteva I, koji se sastoji od aminokiselinske sekvence navedene uSEQIDNO:17.

9. Izolovan polipeptid SPI iz zahteva 1, koji se sastoji od aminokiselinske sekvence navedene u SEO ID NO: 4.

10. Izolovan polipeptid SPI iz. bilo kog od zahteva i do 9. u kom on podiže zaštitan odgovor na izazivanje sojemStreptococcus suis kadse administrira životinji.

11.Izolovan polinukleotid SPI koji kodira polipeptid kao što je definisan u bilo kom od zahteva 1 do 10.

12. Izolovan polinukleotid SPI iz zahteva II, gde polinukleotidna sekvenca ima 95% identičnosti sa sekvencom navedenom u SEQ ID NO: I 8.

13. Izolovan polinukleotid SPI iz zahteva II, gde polinukleotidna sekvenca ima 95% identičnosti sa sekvencom navedenom u SEQ ID NO: 8.

14. Izolovan polinukleotid SPI iz zahteva I 1. koji sadrži sekvencu navedenu u SEQ ID NO: 18.

15. Izolovan polinukleotid SPI iz zahteva I 1. koji sadrži polinukleotidni! sekvencu navedenu u SEQ ID NO: 8.

16. Antitelo koje se specifično vezuje za polipeptid SPI koji se sastoji od aminokiselinske sekvence navedene u SEQ ID NO: 4 ili u SEQ ID NO: 17.'

17. Vektor koji sadrži polinukleotid kao što jc definisan u bilo kom od zahteva I 1 do I 5.

18. Sastav koji sadrži prihvatljiv nosač i najmanje jedan od sledećih: - polipeptid kao što je definisan u bilo kom od zahteva 1 do 10; - polinukleotid kao što je definisan u bilo kom od zahteva 11 do 15 ili - vektor kao što je definisan u zahtevu I 7.

19. Sastav koji sadrži prihvatljiv nosač i najmanje jedno antitelo kao što jc definisano u zahtevu 16.

20. Metod za dobijanje sastava kao što je definisan u zahtevu 19 za sprečavanje oboljenja vezanih zaStreptococcus suisili infekcija izazvanih pomoću S. suis, koji sadrži korak mešanja bar jednog antitela kao što je definisano u zahtevu 16 sa bar jednim prihvatljivim nosačem, gde je bar jedno antitelo rezultat vakcinacije adjuvantom koji usmerava liv 1.

21. Metod za dobijanje sastava za upotrebu u sprečavanju oboljen ja vezanog zaStreptococcus suisili infekcije u životinji, metod koji sadrži korak mešanja bar jednog od sledećih: - polipeptid kao što je definisan u bilo kom od zahteva 1 do 10; - polinukleotid kao što je definisan u bilo kom od zahteva 11 do 15; - vektor kao što je definisan u zahtevu 1 7. sa bar jednim prihvatljivim nosačem i adjuvantom koji usmerava Th-1.

22. Sastav koji se sastoji od polipeptida kao što je definisan u bilo kom od zahteva 1 do 10 i adjuvanta koji usmerava Th-1; polinukleotida kao što je definisan u bilo kom od zahteva 11 do 15 i adjuvanta koji usmerava Th-1: ekspresionog vektora kao stoje definisan u zahtevu 17 i adjuvanta koji usmerava Th-1; ili sastava kao što je definisan u zahtevu 18 i adjuvanta koji usmerava Th-1; za upotrebu kao lek ili kao vakeina.

23. Sastav koji se sastoji ud polipeptida kao sto je definisan u bilo kom od zahteva I do 10 i adjuvanta koji usmerava Th-1; polinukleotida kao što je definisan u bilo kom od zahteva 1 I do 15 i adjuvanta koji usmerava Th-1; ekspresionog vektora kao što je definisan u zahtevu 1 7 i adjuvanta koji usmerava Th-1; ili sastava kao sto je definisan u zahtevu 18 i adjuvanta koji usmerava Th-1; za upotrebu u sprečavanju oboljenja vezanog zaStreptococcus suisili infekcije u životinji.

24. Antitelo kao što je definisano u zahtevu 16 ili sastav kao što je definisan u zahtevu 19 za upotrebu kao lek u kom je bar jedno antitelo rezultat vakcinacije adjuvantom koji usmerava Th-1.

25. Antitelo kao što je definisano u zahtevu 16 ili sastav kao što je definisan u zahtevu 19 za upotrebu u sprečavanju oboljenja vezanog zaStreptococcus suisili infekcije u leku za životinju u kemije bar jedno antitelo rezultat vakcinacije adjuvantom koji usmerava Th-1.

26. Metod za detekcijuin vitroprisustva ili odsustva sojaStreptococcus suisu uzorku, koji sadrži korake: a) dovođenja uzorka u dodir sa antitelom kao Sto je definisano u zahtevu 16 dovoljno dugo i pod uslovima da se formira imuni kompleks i b) detektovanja prisustva ili odsustva imunog kompleksa formiranog u a).

27. Metod za detekcijuin vitroprisustva ili odsustva antitela podignutih protiv sojaStreptococcus suisu uzorku, koji sadrži korake: a) dovođenja uzorka u dodir sa polipeptiđom kao što je definisan u bilo kom od zahteva 1 do 10 dovoljno dugo i pod uslovima da se formira imuni kompleks i b) detektovanja prisustva ili odsustva imunog kompleksa formiranog u a).

28. Dijagnostički komplet za detekciju prisustva ili odsustva antitela koja ukazuju na sojStreptococcus suis,koji sadrži: - polipeptid prema bilo kom od zahteva 1 do 10: reagens za detektovanje imunog kompleksa polipeptid-antitelo: biološki referentni uzorak koji nema antitela koja se imunološki vezuju sa navedenim polipeptiđom i uzorak za poređenje koji sadrži antitela koja mogu specifično da se vežu za navedeni polipeptid: gde su navedeni polipeptid, reagens, biološki referentni uzorak i uzorak za poređenje prisutni u količini dovoljnoj da se izvede navedena detekcija.

29. Dijagnostički komplet za detekciju prisustva ili odsustva polipeptida koja ukazuju na sojStreptococcus suis,koji sadrži: - antitelo prema zahtevu 16; reagens za detektovanje imunog kompleksa polipeptid-antitelo; biološki referentni uzorak sa polipeptiđima koja se imunološki vezuju za navedeno antitelo i uzorak za poređenje koji sadrži polipeptide koji mogu specifično da se vežu za navedeni polipeptid; gde su navedeni polipeptid, reagens, biološki referentni uzorak i uzorak za poređenje prisutni u količini dovoljnoj da se izvede navedena detekcija.