RS54972B1 - Kombinovana terapija za lečenje raka dojke - Google Patents

Description

REFERENCE NA SRODNE PRIJAVE

[0001 jOva prijava poziva se na prioritet Privremene prijave patenta br. 61/313.515 u SAD. zavedene 12. marta 2010. godine.

OBLAST PRONALASKA

[0002]Ovaj pronalazak odnosi se na kompozicije i metode za lecenje raka dojke. Konkretno, pronalazak se odnosi na primenu antagonista transformišućeg faktora rasta beta (TGFfi) u kombinaciji s jednim ili više hemioterapijskih agenasa radi lečenja raka dojke.

POZADINA PRONALASKA

[0003)Superfamiiija transformišućeg faktora rasta beta (TGF-beta ili TGFfi) sadrži mnoge proteine koji imaju zajedničke elemente sekvenci i strukturne motive. Za ove proteine zna se da pokreću širok spektar bioloških odgovora u raznim tipovima ćelija. Ćelijsko signaliziranje koje pokreću članovi superfamilije TGFB obuhvata kooperativno vezivanje Uganda i za TGFB tip II i za tip III komponente transmembranskih receptora. što indukuje izgradnju aktivnog receptorskog kompleksa serin/treonin kinaze sa receptorom TGFB tipa I. Ovaj receptorski kompleks pokreće put prenosa signala fosforilacijom citopiazmatskih Smad proteina, koji se zatim translociraju u jedro i deluju tako što suprimiraju ili aktiviraju transkripciju ciljnih gena.

[0004|Mnogi proteini TGFfi superfamilije imaju važne funkcije tokom embrionalnog razvoja u stvaranju obrazaca i specifikaciji tkiva. Signalizacija indukovana proteinima iz TGFB superfamilije reguliše različite procese diferencijacije, uključujući adipogenezu, miogenezu. hondrogenezu. bematopoezu i diferencijaciju epitelnih ćelija (za pregled videti Massague. 1987, Cell 49:437; Siegel et al, 2003. Nature Review Cancer. 8:807-20). U tkivima odraslih proteini TGFB superfamilije takođe su uključeni u procese poput rasta i metastaziranja tumora, zarastanja rana, reparacije kosti te remodelovanja kosti. Tumor-supresivni efekti

TGFB proteina prikazani su u ranijim studijama.Vide tiDervnck et al.. 2001. Nat Genet. 29:117-129.

|0005)Molekuli TGFB antagonista regulišu signalizaciju posredovanu TGFB proteinima. Primeri ovakvih antagonista obuhvataju monoklonalna i poliklonalna antitela usmerena protiv jedne ili više izoformi TGFfi (američki patentu.S. Pat. No. 5.571.714 i PCT patentna prijava WO 97/13844).

(0006|Za molekule antagonista TGFfi otkriveno je da inhibišu tumorogenosti ćelija raka dojke i da povećavaju aktivnost ćelija prirodnih ubica u slezini miševa.VideuArteaga et al.. 1993.J. Clin. Invest.. 92:6.

|0007|Postoji potreba za kombinovanim terapijskim modalitetima za iečenje raka.

KRATAK PREGLED PRONALASKA

[0008)Pronalazak obezbeđuje kombinovani terapijski metod za Iečenje raka dojke kod ispitanika. Metod uključuje korake primene terapijski efikasne količine antagonista transformišućeg faktora rasta beta (TGFB) kod ispitanika u kombinaciji s kapecitabinom. iksabepilonom ili oba. Primena (TGFB) antagonista u kombinaciji s kapecitabinom i iksabepilonom povećava efikasnost kombinacije kapecitabina i iksabepilona u lečenju raka dojke.

[0009|U jednom otelotvorenju, TGFB antagonist je molekul koji blokira vezivanje TGFfi proteina za njegov receptor. U drugom otelotvorenju. TGFB antagonist je molekul koji je sposoban da smanji aktivnost TGFB. U jednom konkretnom otelotvorenju. TGFB antagonist je anti-TGFB monoklonalno antitelo koje se vezuje za ili neutrališe jednu ili više izoformi TGFB (npr. pan-specilično anti-TGFB antitelo).

[0010]U nekim otelotvorenjima, TGFfi antagonist se primenjuje zajedno s kombinacijom kapecitabina i iksabepilona. U drugim otelotvorenjima. TGFB antagonist se primenjuje nezavisno od primene kombinacije kapecitabina i iksabepilona. [00111Kombinovana terapija pronalaska inhibiše rast primarnog tumora i dalje inhibiše metastaziranje primarnog tumora u pluća.

[00121Pronalazak takođe obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži terapijski efikasnu količinu TGFB antagonista, naznačenu time što je TGFB antagonist prisutan u količini delotvornoj da poveća efikasnost kombinacije kapecitabina i iksabepilona u lečenju raka dojke.

[0013|Pronalazak dalje obezbeđuje komplet koji sadrži terapijski efikasnu količinu TGFB antagonista, naznačenu time sto je TGFB antagonist prisutan u količini delotvornoj da poveća efikasnost kombinacije kapecitabina i iksabepilona u lečenju raka dojke.

[0014|Druge osobine i prednosti predmetnog pronalaska postaće jasne iz sledećih primera i slika s detaljnim opisima. Međutim, treba imati u vidu da su detaljni opis i specifični primeri, iako ukazuju na poželjna otelotvorenja pronalaska, dati samo kao ilustracija, budući da će različite izmene i modifikacije unutar ideje i okvira pronalaska iz ovog detaljnog opisa postati jasne onima upućenim u predmetnu oblast.

KRATAK OPIS CRTEŽA

[0015]Slika 1 prikazuje srednje vređnosti zapremine primarnih tumora. Inhibicija rasta tumora zabeležena je u kohortama s kapecitabinom. iksabepilonom i kapecitabinom+iksabepilonom. u poređenju s kohortom samo sa antitelom.

Slika 2 prikazuje da IDI 1 kao samostalni agens nije imao relativno nikakvog efekta na rast 411 tumora (A). 1 Dl 1 je povećavao efikasnost kapecitabina (B). ali nc i efikasnost iksabepilona (C).

Slika 3 prikazuje daje dodavanjem IDI 1 povećana efikasnost kombinovane terapije kapecitabin + iksabepilon u inhibiciji rasta 4T1 tumora (A). Kapecitabin je inhibirao rast4Tl tumora, ali nije bio podjednako efikasan kao iksabepilon. iako je IDI 1 povećavao efikasnost kapecitabina. što je rezultovalo inhibicijom rasta 411 tumora slično onoj kod primene samo iksabepilona (B). Nije bilo značajne prednosti kombinovane terapije kapeđtabin+iksabepilon nad primenom samo iksabepilona, osim ako u kombinovanu terapiju nije bio uključen i 1 Dl 1 (C). Slika 4 prikazuje pregled efekata antitela 1 Dl 1 kao samostalnog agensa, odnosno u kombinaciji s kapecitabinom i/ili iksabepilonom na rast 4T1 tumora. Najefikasnija terapija je trojna kombinacija IDI 1 +kapecitabin-Hksabepilon. Slika 5 prikazuje krivu preživljavanja kod životinja. Najduže preživljavanje (medijana) zabeleženo je kod životinja koje su lečene kombinacijom IDI 1 + kapecitabin + iksabepilon. Slika 6 prikazuje daje vreme potrebno da se dostigne krajnja tačka, zapremina primarnog tumora >2000 mm3, značajno različito (p<0,0001) između terapijskih grupa. IDI 1 je produžavao vreme do krajnje tačke kod terapije kapecitabinom. a najduže vreme do krajnje tačke postignuto je u grupi 1 Dl 1 +kapecitabin+iksabepilon. Slika 7 prikazuje ukupan broj metastaza u plućima u svim terapijskim grupama (A) i ukupan broj metastaza u plućima veličine >1 mm u svim terapijskim grupama (B). Najveći broj metastaza u plućima u svakoj kohorti bio je u terapijskoj grupi s najdužim vremenom do krajnje tačke; u svim slučajevima to je bila 1 Dl 1 terapijska grupa.

Slika 8 prikazuje broj metastaza u plućima u kohorti s jednim agensom (A), kohorti s kapecitabinom (B), kohorti sa iksabepilonom (C) i kohorti s

kapecitabinom+iksabepilonom (D). U svakoj kohorti, najveći broj metastaza u plućima zabeležen je u IDI 1 terapijskoj grupi, verovatno stoga što su ove terapijske grupe duže bile u studiji nego njihove odgovarajuće kontrole unutar svake kohorte. Slika 9 prikazuje da je postojala korelacija između broja metastaza u plućima i vremena provedenog u studiji, bez obzira na terapiju.

Slika 10 prikazuje srednje vrednosti zapremine primarnih tumora. Inhibicija rasta tumora zabeležena je u kohortama s kapecitabinom. iksabepilonom i kapecitabinom+iksabepilonom, u poređenju s kohortom samo sa antitelom.

Slika 11 prikazuje da je terapija antitelom 1D11 imala blag efekat kada je ono primenjeno kao samostalni agens, odnosno u kombinaciji ili s kapecitabinom ili sa iksabepilonom. A. Terapija antitelom ID11 kao samostalnim agensom rezultovala je značajnim smanjenjem veličine primarnog tumora. B. IDI 1. primenjen u kombinaciji s kapecitabinom. rezultovao je povećanom efikasnošću, većom od one kod primene samo kapecitabina. C. 1 Dl 1 nije povećavao efikasnost iksabepilona na statistički značajan način. (A:<*>= p<0,05, Takijev test višestrukih poređenja) (B:<*>= p<0.05.<**>= p<0,01. T-Test).

Slika 12 prikazuje da je terapija antitelom 1 Dl 1 značajno povećala efikasnost kombinacije iksabepilon/kapecitabin na zapreminu primarnog tumora. A. 1 Dl 1 je povećavao efikasnost iksabepilona i kapecitabina u poređenju sa 13C4 kombinovanim sa iksabepilonom i kapecitabinom. B. Iksabepilon je značajno povećavao efikasnost 1 Dl 1 i kapecitabina kada su se dozirali zajedno. C. Trojna kombinacija 1 Dl 1. kapecitabina i iksabepilona bila je efikasnija nego 1 Dl 1 + iksabepilon. (A:<*>= p<<>0.05. T-Test) (B: = pO.OOl. jednosmerna Anova) (C:<*>= p<0.05, T-Test) Slika 13 prikazuje pregled efekata 1 Dl 1 kao samostalnog agensa, odnosno u kombinaciji s kapecitabinom i/ili iksabepilonom na rast 4T1 tumora. Najefikasnija terapija je trojna kombinacija IDI 1+kapecitabin-iksabepilon.

Slika 14 prikazuje ukupne metastaze u plućima. IDI 1 nije smanjivao broj metastaza u plućima niti je povećavao efikasnost hemioterapeutika.

Slika 15 prikazuje shemu gejtinga CD11 b<+>ćelija izolovanih iz 4T1 primarnih tumora.

( A) FSC hi gejting zasnovan na veličini i rasipanju. (B)Live gate(tamne. 52%) vijabilnih ćelija kroz FSC hi gejt. (C) Gejting MDSC ćelija (Gr-1 PF svetle CD1 lb PerCP Cy5.5 svetle. 74.1%) i makrofaga (Gr-1 PE tamni i CD1 lb PerCP Cy5.5 svetli, 15,4%) u okviru gejta živih ćelija (D) Gejting Ml makrofaga (F4/80 svetli i CD206 Alexa 488 tamni, 83%) i M2 makrofaga (F4/80 svetli i CD206 Alexa 488 svetli. 15,7%) u okviru gejta za makrofage (E) Potvrda CD206 negativnog/niskog statusa MDC kroz gejt Gr-1+CD1 lb+.

Slika 16 prikazuje srednje vrednosti zapremine primarnih tumora. Inhibicija rasta tumora zabeležena je u kohortama s kapecitabinom, iksabepilonom i kapecitabinom+iksabepilonom. u poređenju s kohortom samo sa antitelom.

Slika 17 prikazuje da 1 Dl 1 kao samostalni agens nije imao nikakvog efekta na rast 411 tumora (A). IDI 1 takođe nije značajno povećavao efikasnost kapecitabina (B) niti iksabepilona (C).

Slika 18 prikazuje daje IDI 1 povećavao efikasnost kombinovane terapije kapecitabin + iksabepilon u inhibiciji rasta 4T1 tumora (A). Kapecitabin je blago inhibirao rast 4T1 tumora, ali je bio efikasniji u kombinaciji sa iksabepilonom (B). Po pitanju inhibicije rasta tumora, iksabepilon i kombinovana terapija kapecitabin+iksabepilon bili su slični, osim ako u kombinovanu terapiju nije bio uključen i 1 Dl 1 (C).

Slika 19 prikazuje pregled efekata IDI 1 kao samostalnog agensa, odnosno u kombinaciji s kapecitabinom i/ili iksabepilonom na rast 4T1 tumora. Najefikasnija terapija je trojna kombinacija 1 Dl 1+kapecitabin+iksabepilon.

Slika 20 prikazuje da su metastaze u plućima kod miševa sa SQ 4T1 tumorima bile smanjene kombinovanom terapijom kapecitabin + iksabepilon te da je efikasnost ove terapije značajno povećana dodavanjem 1 Dl 1.

Slika 21 prikazuje da je, na osnovu imunofenotipizacije ukupnih makrofaga (F4/80+). Ml makrofaga (F480TD206") i M2 makrofaga (F4/80<+>CD206') izolovanih iz 4TI primarnih tumora u studiji 09-4255. 1 Dl 1 imao neznatan efekat na broj makrofaga u primarnim tumorima. Crni stubac predstavlja nosač; crveni stubac predstavlja 13C4 (kontrolu); a plavi stubac predstavlja 1 Dl 1.

Slika 22 prikazuje da je arginaza iz CD11 b<+>ćelija izolovanih iz 4T1 primarnih tumora miševa lečenih antitelom 1 Dl 1 značajno snižena u poređenju s kontrolnim miševima.

(0016)Ovde opisan 1 Dl 1 predstavlja anti-TGFB monoklonsko antitelo.

DETALJAN OPIS PRONALASKA

|0017|Ovaj pronalazak odnosi se na kompozicije i metode za Iečenje raka dojke. Konkretno, pronalazak se odnosi na primenu TGFB antagonista u kombinaciji s jednim ili više hemioterapijskih agenasa radi lečenja raka dojke. Upotreba TGFB antagonista u kombinaciji s jednim ili više hemioterapijskih agenasa povećava efikasnost tog jednog ili više hemioterapijskih agenasa u lečenju raka dojke.

[0018]Hemioterapijski agensi iz ovog pronalaska obuhvalaju. ali nisu ograničeni na kapecitabin. iksabepilon ili njihovu kombinaciju.

[0019]U jednom otelotvorenju. ovde je predstavljena metoda za povećanje efikasnosti određene hemioterapije za Iečenje raka dojke kod ispitanika, a metoda obuhvata: primenu kod pomenutog ispitanika terapijski efikasne količine TGFB antagonista u kombinaciji s kapecitabinom i iksabepilonom, naznačeno time što primena pomenutog TGFB antagonista povećava efikasnost kapecitabina i iksabepilona u lečenju pomenutog raka dojke. [0020)U drugom otelotvorenju. ovde je predstavljena metoda za inhibiciju rasta tumora povezanog s rakom dojke kod ispitanika, a metoda obuhvata: primenu kod pomenutog ispitanika terapijski efikasne količine TGFB antagonista u kombinaciji s kapecitabinom i iksabepilonom. naznačeno time što primena pomenutog TGFB antagonista povećava efikasnost kapecitabina i iksabepilona u inhibiciji pomenutog rasta tumora povezanog s rakom dojke.

[0021]Pronalazači aktuelne aplikacije iznenađujuće i neočekivano su otkrili da neutralizacija TGFB u kombinaciji s jednim ili više hemioterapijskih agenasa povećava efikasnost jednog ili više hemioterapijskih agenasa u lečenju raka dojke. Na primer. primena TGFB antagonista u kombinaciji s kapecitabinom i iksabepilonom iznenađujuće i neočekivano povećava efikasnost kapecitabina i iksabepilona u lečenju raka dojke.

[0022)Kako se ovde koristi...TGFB"odnosi se na sve izoforme TGFB. Trenutno postoji 5 poznatih izoformi TGFB (1-5). od kojih su sve homologe (60-80% istovetnosti) i od kojih sve grade homodimere od oko 25 kD, a deluju na zajedničke TGFB ćelijske receptore (tipovi 1. 11 i III). Genetika i molekularna biologija TGFB dobro su poznate u struci (videti, na primer, Roberts. 1998. Miner. Electrolvte and Metab., 24(2-3):! 11-119: Wrana, 1998. Miner. Electrolvte and Metab., 24(2-3): 120-130.)

(0023]Kako se ovde koristi, „TGFB antagonist"je bilo koji molekul koji je sposoban da smanji količinu ili aktivnost TGFB. bilo u ćeliji ili u fiziološkom sistemu. Poželjno. TGFB antagonist deluje tako što smanjuje količinu ili aktivnost TGFB 1. 2 ili 3. Na primer. TGFfi antagonist može biti molekul koji inhibira ekspresiju TGFB na nivou transkripcije, translacije. obrade ili transporta; može uticati na stabilnost TGFB ili na konverziju prekursorskog molekula u aktivan, zreli oblik; može uticati na neutralizaciju TGFB ili na sposobnost TGFB da se vezuje za jedan ili više ćelijskih receptora (npr. tip I. II ili III); ili može uticati na signalizaciju putem TGFB.

[0024]Niz TGFfi antagonista i metoda za njihovu proizvodnju poznati su u struci, a mnogi drugi se trenutno razvijaju (videti. na primer, američki patent Dcnnis et al.. U.S. Pat. No. 5.821,227). Upotreba specifičnog TGFB antagonista nije ograničavajući faktor: bilo koji efikasan TGFB antagonist kako je ovde definisan može da se koristi u metodama i kompozicijama iz ovog pronalaska. U jednom otelotvorenju, TGFB antagonist je TGFB-1. TGFB-2 ili TGFB-3 antagonist. U jednom konkretnom otelotvorenju. TGFB antagonist je pan-specifično anti-TGFB antitelo koje se vezuje za iii neutrališe jednu ili više izoformi TGFfi.

|0025|Efekti TGFB posredovani su vezivanjem aktivnog TGFB za specifične receptore prisutne na ćelijama, što je praćeno prenosom signala na te ćelije. TGFB antagonisti definisani su kao agensi koji inhibiraju prenos signala putem TGFB. uključujući TGFB antagoniste koji su poznati u struci. Na primer. agensi koji vezuju TGFB i sprečavaju TGFB da se veže za TGFB receptor delovaće kao TGFfi antagonisti.

[0026]Drugi neograničavajući primeri uključuju blokirajuća (neutrališuća) antitela specifična za humani TGFB (NAbs) poput onih koje su opisali Dasch et al. (.1. Immunol. (1989) 142:1536) i Lucas et al. (J. Immunol. (1990) 145:1415). rastvorljive TGFfi receptore. TGFB receptore vezane za membranu, inhibitore proteaze koji inaktivišu proteazu odgovornu za aktivaciju prekursora TGFB u zreli TGFB. antitela specifična za TGFB receptore (tipove I. II ili III), a koja sprečavaju vezivanje TGFB za receptor, te njihove kombinacije.

|0027]Iskusni u struci poznaju različite načine na koje se antitelo dobijeno od jedne vrste, na primer miša, može obraditi tako da bude terapijski primenljivo na drugu vrstu, na primer čoveka. Neke od ovih tehnika ukratko su prikazane u radu Harris and Emerv, TIBTECH 11:42-44. 1993.

(0028]TGFB se generalno luči kao latentni prekursor koji se sastoji od TGFB neko valentno vezanog za protein koji se označava kao protein povezan s latencom (latencv-associated protein, LAP; pregled u radu Harpel et al. (1992) Prog. Grovvth Factor Res. 4: 321). DNK koja enkodira peptid od 278 aminokiselina koji odgovara pre-pro-TGFB. prekidajući proces tik pred zreli oblik TGFB. i koji sadrži supstituciju Cys33 u Ser33. eksprimirana je (Dervnck et al. (1985) Nature 316: 701). i utvrđeno je da vezuje TGFB i čini ga latentnim.

|0029)Rastvorljivi oblici TGFB receptora takođe će vezivati TGFB i sprečiti vezivanje za TGFfi receptore vezane za membranu. TGFB receptore opisali su Wang et al. (Cell (1991) 67: 797) i Lin et al. (Cell (1992) 68: 775). Rastvorljivi oblici TGFB receptora mogu se pripremiti metodama poznatim u struci. Na primer. mogu se pripremiti deletirani mutanti kojima

nedostaje transmembranski domen TGFB receptora. što će eksprimirati rastvorljiv TGF6-vezujući protein. Miyazono et al. {Adv. Immunol. (1994) 55: 181) dali su pregled TGFB receptora

|0030]Druge vrste TGFB antagonista takođe su poznate u struci. Na primer. Yamaguchi et al.

(Nature (1990) 346: 281) raspravljaju o dekorinu. malom hondroitin-dermatan sulfat proteoglikanu koji vezuje TGFB i modulira aktivnost ovog faktora rasta. Ohtsuki i Massague (Mol. Cell. Biol. 12:261-265. 1992) otkrivaju inhibitore protein-kinaze koji blokiraju određene biološke aktivnosti TGFB.T, cruziproizvodi cistein-proteazu (kruzain ili kruzipain; Eakin et al. (1992) J. Biol. Chem. 267: 7411) koja konvertuje neaktivni TGFfi prekursor u aktivni, zreli TGFB. Dizajn i upotreba inhibitora proteaze kao tekova dobro su poznati u struci (Design of Enzyme Inhibitors as Drugs; Sandier and Smith, eđs; 1989, Oxford University Press; Proteinase Inhibitors Medical and Biological Aspects; Katunuma. Umezavva and Holzer, eđs.. 1983. Springer-Verlag); stoga: inhibitori kruzaina mogu se pripremiti i biće korisni kao TGFfi antagonisti.

|0031] Idrugi TGFB antagonisti i metode za njihovu proizvodnju poznati su u struci, a mnogi drugi se trenutno razvijaju. Upotreba specifičnog TGFfi antagonista nije ograničavajući faktor, budući da bilo koji efikasan TGFB antagonist može da se koristi u metodama iz ovog pronalaska. Primeri ovakvih antagonista obuhvataju monoklonalna i poliklonalna antitela usmerena protiv jedne ili više izoformi TGFB (američki patent U.S. Pat. No. 5.571,714). TGFfi receptore. njihove fragmente, njihove derivate i antitela usmerena protiv TGFB receptora (američki patenti U.S. Pat. Nos. 5.693.607. 6.008.011. 6.001.969 i 6.010.872); peptid povezan s latencom (WO 91/08291). veliki latentni TGFB (WO 94/09812). fctuin (američki patent U.S. Pat. No. 5.821.227), dekorin i druge proteoglikane kao što su biglikan. fibromodulin, lumikan i endoglin (američki patenti U.S. Pat. Nos. 5,583,103, 5.654.270. 5.705.609, 5,726.149. 5.824,655, 5.830.847. i 6.015.693).

|0032|Dalji primeri ovakvih antagonista uključuju somatostatin (PCT patenta prijava WO 98/08529). manoza-6-fosfat ili manoza-1-fosfat (američki patent U.S. Pat. No. 5,520.926). prolaktin (PCT patentna prijava WO 97/40848). insulinu sličan faktor rasta II (PCT patentna prijava WO 98/17304), IP-10 (PCT patentna prijava WO97/00691). peptide koji sadrže arg-gly-asp (američki patent U.S. Pat. No. 5.958,411 i PCT patentna prijava \VO 93/10808).

ekstrakte biljaka, gljiva i bakterija (evropska patentna prijava 813875. japanska patentna prijava 8119984 i američki patent U.S. Pat. No. 5.693.610), antisens oligonukleotide (američki patenti U.S. Pat. Nos. 5.683.988. 5.772,995. 5.821.234 i 5.869.462 te PCT patentna prijava WO 94/25588). zatim mnoštvo drugih proteina uključenih u TGFB signalizaciju, uključujući SMAD i MAD (američki patenti U.S. Pat. Nos. 5.834.248. 5,807.708 i 5.948.639) te Ski i Sno (G. Vogel. Science. 286:665 (1999) i Stroschein et al., Science, 286:771-74

(1999)). kao i fragmente i derivate bilo kojih od gore navedenih molekula koji zadržavaju sposobnost da inhibišu aktivnost TGFfi.

[0033|TGFB receptori i TGFB-vezujući fragmenti TGFB receptora. naročito rastvorljivi fragmenti, korisni su TGFB antagonisti u metodama predmetnog pronalaska. TGFB receptori i nukleinske kiseline koje ih kodiraju dobro su poznate u struci. Sekvenca ljudske nukleinske kiseline koja kodira TGFB tip 1 receptor objavljena je. na primer, u GenBank. pristupni broj LI5436. i u američkom patentu U.S. Pat. No. 5,538.892 autora Donahoe et al. Sekvenca ljudske nukleinske kiseline za TGFB tip 2 receptor javno je dostupna, na primer. pod GenBank pristupnim brojevima AW236001: AI35790: AI279872: A1074706; i AA808255. Sekvenca ljudske nukleinske kiseline za TGFB tip 3 receptor takođe je javno dostupna, na primer. pod GenBank pristupnim brojevima NM 003243: AI887852: A1817295; i AI681599.

|0034jU poželjnom otelotvorenju, TGFB antagonist je antitelo koje blokira vezivanje TGFB za receptor. ili njegovi fragmenti poput Fab. Fab\ F(ab*)2fragmenata. Fv fragmenti, jednolancana antitela i drugi oblici ..antitela"koji zadržavaju sposobnost da se vezuju za TGFB. U jednom otelotvorenju. antitelo je pan-specifično anti-TGFB antitelo. U jednom primeru. pan-specilično anti-TGFB antitelo vezuje se za jednu ili više izoformi TGFB i neutrališe ih. U drugom primeru, pan-specifično anti-TGFB antitelo blokira ili inhibira vezivanje proteina za jednu ili više izoformi TGFfi.

(0035)U jednom otelotvorenju, antitelo je monoklonalno antitelo. U drugom otelotvorenju. antitelo je humano antitelo. U sledećem otelotvorenju. antitelo je humanizovano antitelo. U sledećem otelotvorenju. antitelo je himerično antitelo. U jednom konkretnom otelotvorenju. antitelo je humanizovan oblik mišjeg monoklonalnog antitela IDI 1, dcponovan pod ATCC brojem [ |. U drugom konkretnom otelotvorenju. antitelo je anti-TGFB antitelo opisano u američkoj patentnoj prijavili.S. 11/350,906, zavedenoj 8. februara 2006. (U.S.

2006/0251658). koja je ovde uključena referencom u celosti. U sledećem konkretnom otelotvorenju, antitelo obuhvata jedan ili više regiona sa IDI 1 koji određuju komplementarnost (CDR), opisanih u američkoj patentnoj prijavi U.S. 11/350,906.

[0036]Kako se ovde koristi, pojam ..antitelo" obuhvata intaktne molekule imunoglobulina koji sadrže 4 polipeptidna lanca, dva teška (H) lanca i dva laka (L) lanca, međusobno povezane disulfudnim vezama. Svaki teški ianac sastoji se od varijabilnog regiona teškog lanca (ovde skraćenog kao VH) i konstantnog regiona teškog lanca. Konstantni region teškog lanca sadrži tri domena. CH1. CH2 i CH3. Svaki laki lanac sastoji se od varijabilnog regiona lakog lanca (ovde skraćenog kao VL) i konstantnog regiona lakog lanca. Laki lanci antitela bilo koje vrste kičmenjaka mogu se svrstati ujedan od dva jasno odvojena tipa. zvana kapa (K) i lambda (X). zavisno od sekvenci aminokiselina u njihovim konstantnim domenima. Varijabilni regioni kapa lakih lanaca ovde su označeni kao VK. Izraz VL. kako se ovde koristi, služi da obuhvati i varijabilne regione lakih lanaca kapa tipa (VK) i lakih lanaca lambda tipa. Konstantni region lakih lanaca sastoji se od jednog domena. CL. VH i VI, regioni obuhvataju regione hipervarijabilnosti, zvane regioni koji određuju komplementarnost (CDR), izmešane s regionima koji su stalniji, zvanim okvirni regioni (FR). Svaki VH i VL građenje od tri CDR i četiri FR. poredanih od amino-kraja do karboksi-kraja sledećim redom: FR1-CDRI-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4...CDRH1" odnosi se na prvi CDR region u teškom lancu antitela, ..CDRH2" odnosi se na drugi CDR region u teškom lancu antitela. a „CDRH3" odnosi se na treći CDR region u teškom lancu antitela...CDRL1"odnosi se na prvi CDR region u lakom lancu antitela...CDRL2"odnosi se na drugi CDR region u lakom lancu antitela, a „CDRL3" odnosi se na treći CDR region u lakom lancu antitela.

|0037]Zavisno od sekvence aminokiselina u konstantnom domenu teških lanaca, antitela se mogu svrstati u različite klase. Postoji 5 velikih klasa intaktnih antitela: IgA. IgD. IgK, IgG. i IgM. Neke od njih mogu se dalje podeliti u potklase (izotipove).npr.IgGl. IgG2. lgG3. IgG4, IgA i lgA2. Konstantni domeni teških lanaca koji odgovaraju navedenim različitim klasama antitela nazivaju se. redom, alfa (a), delta (A), epsilon ( c). gama (y) i mi (u). Strukture subjedinica i trodimenzionalne konfiguracije različitih klasa imunoglobulina dobro su poznate. Predmetni pronalazak obuhvata antitela bilo koje od gorepomenutih klasa ili polklasa (izotipova).

|0038]Pojam ..antitelo", kako se ovde koristi, takođe je predviđen da obuhvati intaktna antitela, funkcionalne fragmente koji vezuju antigene, te njihove varijante koje vezuju antigene, uključujući mimetike antitela ili obuhvatajući delove antitela koji imitiraju strukturu i/ili funkciju antitela, odnosno njegovog definisanog fragmenta ili dela: sve navedeno sadrži bar po jedan CDR. Antitela iz pronalaska uključuju fragmente ili vari jante antitela koji sadrže jedan, dva. tri. četiri, pet, šest ili više CDR regiona.

|0039|Fragmenti antitela obuhvaćeni predmetnim pronalaskom uključuju Fab ( npr. digestijom papainom), Fab', F(ab')2, facb (npr. digestijom plazminom). pFc'( npr.digestijom pepsinom ili plazminom), Fd (npr. digestijom pepsinom. parcijalnom redukcijom i reagregacijom). sVds, i Fv ili scFv (npr. tehnikama molekularne biologije). Predviđeno je i da fragmenti antitela obuhvataju antitela sa izbrisanim domenom, antitela po tipudiabodiesitriubodies.linearna antitela, jednolančane molekule antitela (uključujući kamelizovana antitela) i multispecifična antitela stvorena od fragmenata antitela.

|0040jPojam „antitelo", kako se ovde koristi, takođe uključuje ..himerična"antitela u kojima je deo teškog i/ili lakog lanca identičan ili homolog odgovarajućim sekvencama u antitelima dobijenim od određene vrste ili koja pripadaju određenoj klasi ili potklasi antitela, dok je ostatak lan(a)ca identičan ili homolog odgovarajućim sekvencama u antitelima dobijenim od druge vrste (npr. miša ili pacova) ili koja pripadaju drugoj klasi ili potklasi antitela, kao i fragmente takvih antitela. sve dok ispoljavaju željenu biološku aktivnost. Stoga predmetni pronalazak obuhvata, na primer. himerična antitela koja sadrže himeričan težak lanac i/ili himeričan lak lanac. Himeričan težak lanac može da sadrži bilo koji od varijabilnih regiona teškog lanca (VH) opisanih ovde ili njihove mutante ili varijante spojene s konstantnim regionom teškog lanca nehumanog antitela. Himeričan lak lanac može da sadrži bilo koji od varijabilnih regiona lakog lanca (VL) opisanih ovde ili njihove mutante ili varijante spojene s konstantnim regionom lakog lanca nehumanog antitela.

|0041]Antitela iz pronalaska takođe obuhvataju ..humanizovana antitela". što su molekuli antitela sjednim ili više regiona koji određuju komplementarnost (CDR) iz nehumane vrste i okvirnim regionima iz humanog molekula imunoglobulina. Često se rezidue okvirnih regiona u humanim okvirnim regionima supstituišu odgovarajućom reziduom iz antitela donora CDR kako bi se izmenilo ili poboljšalo vezivanje antigena. Ove supstitucije okvirnih regiona

identifikuju se standardnim tehnikama poput modeliranja interakcija CDR i rezidua okvirnih regiona kako bi se identilikovale rezidue okvirnih regiona važne za vezivanje antigena i poređenja sekvenci kako bi se identifikovale neuobičajene rezidue okvirnih regiona na određenim pozicijama. Antitela se mogu humanizovati pomoću različitih tehnika, uključujući CDR-grafting,veneeringiliresurfacingte izmenu lanaca( chain shuffling).

|0042]Pojam ..humano antitelo". kako se ovde koristi, uključuje antitela koja imaju varijabilne i konstantne regione koji odgovaraju sekvencama humanih imunoglobulina germinativne linije. Humana antitela iz pronalaska mogu uključivati rezidue aminokiselina koje nisu kodirane sekvencama humanih imunoglobulina germinativne linije (npr. mutacije nastale nasumičnom ili mesto-specifičnom mutagenezomin vilroili somatskom mutacijomin rivo),na primer u CDR. Humano antitelo može imati bar jednu poziciju zamenjenu reziduom aminokiseline. npr. reziduom aminokiseline koja povećava aktivnost, a koja nije kodirana sekvencom humanog imunoglobulina germinativne linije. Međutim, pojam ..humano antitelo". kako se ovde koristi, nije predviđen da uključuje antitela u kojima su CDR sekvence đobijene od germinativnih linija drugih vrsta sisara, poput miša, graftovane na humane okvirne sekvence.

[0043]Fraza „rekombinantno humano antitelo"obuhv ata humana antitela koja su pripremljena, eksprimirana, kreirana ili izolovana rekombinantnim metodama, kao što su antitela eksprimirana pomoću rekombinantnog ekspresionog vektora transficiranog u ćeliju domaćina, antitela izolovana iz biblioteke rekombinantnih. kombinatomih humanih antitela. antitela izolovana iz životinje koja je transgena za gene humanih imunoglobulina, odnosno antitela pripremljena, eksprimirana, kreirana ili izolovana bilo kojom drugom metodom koja uključuje splajsovanje genskih sekvenci humanih imunoglobulina u druge DNK sekvence. Ovakva rekombinantna humana antitela imaju varijabilne i konstantne regione dobijene iz sekvenci humanih imunoglobulina germinativne linije.

[0044]Pojam „monoklonalno antitelo", kako se ovde koristi, odnosi se na antitelo dobijeno iz populacije uglavnom homogenih antitela.npr.pojedinačna antitela koja čine populaciju uglavnom su identična, s izuzetkom mogućih prirodno nastalih mutacija ili manjih posttranslacionih varijacija koje mogu biti prisutne. Monoklonalna antitela su visoko specifična, usmerena protiv jednog antigenog mesta (poznatog i kao determinanta ili epitop). Dalje, u suprotnosti s preparacijama konvencionalnih (poliklonalnih) antitela koje obično sadrže različita antitela usmerena protiv različitih determinanti, svako monoklonalno antitelo usmereno je protiv jedne jedine detenninante na antigenu. Modifikator ..monoklonalno"ukazuje na karakter antitela u smislu da je dobijeno iz uglavnom homogene populacije antitela i ne treba ga tumačiti kao da iziskuje proizvodnju antitela bilo kojom konkretnom metodom.

[0045| Antitela takođe obuhvataju polipeptide sa sekvencama aminokiselina uglavnom sličnim sekvencama aminokiselina varijabilnih ili hipervairjabilnih regiona teških i/ili lakih lanaca. Uglavnom ista sekvenca aminokiselina ovde je definisana kao sekvenca s bar 70%. 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ili 99% identičnosti s poređenom sekvencom aminokiselina. kako je određeno pretraživačkom metodom PAS TA u skladu s Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444-2448 (1988).

[0046| Antitela iz pronalaska uključuju ona koja su identična ovde opisanim, s izuzetkom jedne ili više konzervativnih supstitucija aminokiseline. Konzervativna supstitucija aminokiseline definiše se kao izmena u kompoziciji aminokiselina tako što su zamenjene jedna ili dve aminokiseline u peptidu, polipeptidu ili proteinu, odnosu u njihovom fragmentu. Supstitucija se vrši aminokiselinama sa suštinski sličnim osobinama (npr. kiselost, baznost, aromatičnost, veličina, pozitivno ili negativno naelektrisanje. polarnost. nepolamost) tako da supstitucija suštinski ne menja osobine (npr. naboj, izoelektrična tačka. afinitet, aviditet, konformacija, rastvorijivost) ili aktivnost peptida. polipeptida ili proteina. Tipične supstitucije koje sc mogu vršiti kod ovakvih konzervativnih supstitucija aminokiselina mogu biti među sledećim grupama aminokiselina: glicin (G). alanin (A), valin (V). leucin (L) i izoleucin (I): asparaginska kiselina (D) i glutaminska kiselina (E): alanin (A), serin (S) i treonin (T): histidin (H), lizin (K) i arginin (R); asparagin (N) i glutamin (Q); fenilalanin (F), tirozin (Y) i triptofan (W).

|0047] Konzervativne supstitucije aminokiselina mogu se vršiti u CDR ili okvirnim regionima,npr.regionima tik uz hipervarijabilne regione, koji su prvenstveno odgovorni za osobinu selektivnog i/ili specifičnog vezivanja molekula, kao i u drugim delovima molekula.npr.varijabilnoj kaseti teškog lanca.

|0048| Antitela iz predmetnog pronalaska obuhvataju i one čiji je afinitet povećan ili izmenjen direktnom mutacijom, maturaeijom afiniteta, ispoljavanjem na fagima( phugc display)ili izmenom lanaca. Afinitet i specifičnost mogu se menjati ili poboljšati mutiranjem CDR i/ili rezidua okvirnih regiona te skriningom za mesta vezivanja antigena koja imaju željene karakteristike. Jedan od načina jeste da se randomizuju pojedinačne rezidue ili kombinacije rezidua tako da se. u populaciji inače identičnih mesta vezivanja antigena, podsetovi od dve do dvadeset aminokiselina nađu na određenim pozicijama. Ili. mutacije se mogu indukovati na nizu rezidua greškom pomoću PCR metoda. U drugom primeru. vektoriza phage displuykoji sadrže varijabilne regione teških i lakih lanaca mogu se umnožavati u mutiranim sojevimaE. col i.

[0049)Antitela dobijena izmenom lanaca obuhvataju ona gde su teški ili laki lanci nasumično spareni s drugim ovde opisanim teškim ili lakim lancima. Stoga antitela iz pronalaska obuhvataju bilo koju kombinaciju teških i lakih lanaca (bilo celih. bilo njihovih delova).

[0050JAntitela iz predmetnog pronalaska specifična su za TGFB. Specifičnost antitela odnosi se na selektivno prepoznavanje određenog epitopa na antigenu od strane antitela. Antitela

mogu pokazivati selektivnost kako za vrstu tako i za molekul ili mogu biti selektivna samo za molekul i vezivati se za TGFB više od jedne vrste. Antitela iz pronalaska mogu se vezivati za humani, mišji, pacovski. pseći i/ili zečji TGFB. U jednom otelotvorenju. antitelo se vezuje za humani TGFB. Da li se neko antitelo specifično vezuje za neki TGFB može se odrediti npr. esejom vezivanja kao što je ELISA, koristeći panel antigena.

[0051]Specifičnost antitela može se odredili na osnovu afiniteta i/ili aviditeta. Afinitet, predstavljen ravnotežnom konstantom disocijacije antigena sa antitelom (K(/). meri jačinu vezivanja između antigenske determinante i vezujućeg mesta antitela. Aviditet je mera jačine vezivanja antitela sa svojim antigenom. Aviditet je povezan kako sa afinitetom između epitopa i njegovog antigen-vezujućeg mesta na antitelu. tako i sa valencom antitela. koja se odnosi na broj antigen-vezujućih mesta za određeni epitop. Antitela se tipično vezuju s konstantom disocijacije( Kj)od oko 10"'do oko 10"" l/mol( npr.Kn < 100 nM). Uopšte uzev, za svaku Kj manju od oko IO"4 l/mol smatra se da ukazuje na nespecifično vezivanje. Sto je vrednost K<<y>manja, to je jačina vezivanja između antigenske determinante i vezujućeg mesta antitela veća.

[0052]Antitela iz pronalaska vezuju se za TGFfi sa Kd poželjno oko 1 x 10"<8>M"<1>ili manje, poželjnije oko 1 x 10"<g>M"<1>ili manje, poželjnije oko 1 x 1()"<1>() M'<1>ili manje, a najpoželjnije oko 1x10"" M"<1>ili manje.

[0053JAntitela iz predmetnog pronalaska mogu biti monospecifična. bispecifična ili multispecitična. Monospecifična antitela vezuju se samo za jedan antigen. Bispecifična antitela (BsAbs) su antitela koja imaju dva različita antigen-vezujuća specificiteta ili mesta. Multispeciiična antitela imaju više od dva različita antigen-vezujuća specificiteta ili mesta. Kada antitelo ima više od jednog specificiteta. prepoznati epitopi mogu biti povezani s jednim antigenom ili s više antigena.

[0054|U drugom aspektu pronalaska, antitelo je konjugovano s drugim hemijskim

jedinjenjem, bilo direktno ili indirektno. Ova konjugacija može biti hemijska ili biosintetska. Druga jedinjenja koja mogu biti konjugovana sa antitelom obuhvataju toksine, antitumorske agense, detektabilne obeleživače, target jedinjenja i reporter jedinjenja. Pogodni toksini ovde su opisani.

[0055JU jednom otelotvorenju. jedan ili više hemioterapijskih agenasa iz pronalaska funkcionalno su povezani sa antitelom. Na primer, kapecitabin. iksabepilon ili oba mogu biti konjugovani sa anti-TGFB antitelom.

[0056] Antitela koja su konjugovana s detektabilnim obeleživačima mogu se, na primer. koristiti za dijagnozu bolesti, kao pomoć u prognozi i za lokalizaciju tumorskih ćelija,in vivoiliin vitro.Detektabilni obeleživač proizvodi merljiv signal koji je detektabilan eksternim metodama. Detektabilni obeleživači obuhvataju enzim, hromoforu. radioizotop ili supstancu kojaemituje svetlost fluorescencijom, fosforescencijom ili hemiluminiscencijom. Pogodni enzimi obuhvataju peroksidazu iz rena. alkalnu fosfatazu. B-galaktozidazu i acetilholinesterazu. Hromofore obuhvataju boje koje apsorbuju svetlost ultraljubičastog ili vidljivog spektra, a mogu biti supstrati ili degradacioni produkti enzimski katalizovanih reakcija. Pogodni fluorescentni materijali obuhvataju umbeliferon, fluorescein, fluorescein-izotiocijanat, rodamin. dihlorotriazinilamin-fluorescein, đanzil-hlorid ili fikoeritrin. Pogodni hemiluminiscentni materijali obuhvataju luminol. luciierazu. luciferin i ekvorin. Pogodni radioaktivni materijali obuhvataju 1251, 1311. 35S i 311.

|0057| Ciljna jedinjenja su prvi članovi vezujućih parova. Antitumorski agensi, na primer, mogu se konjugovati s drugim članovima ovakvih parova, pa su stoga usmereni ka mestu gde se vezuje antigen-vezujući protein. Čest primer ovakvog vezujućeg para su avidin i biotin. Biotin se može konjugovati sa antitelom iz pronalaska, postajući tako meta za antitumorski agens ili drugo jedinjenje konjugovano sa avidinom ili streptavidinom. Ili. biotin ili drugo slično jedinjenje se veže za antigen-vezujući protein iz pronalaska i koristi kao reporter, na primer, detektabilni obeleživač se konjuguje sa avidinom ili streptavidinom.

[0058)Predmetni pronalazak obuhvata i molekule nukleinskih kiselina koji kodiraju anti-TGFB antitelo ili njegov deo. Nukleinske kiseline mogu da kodiraju težak lanac antitela. koji sadrži bilo koji od VH regiona ili njegov deo, odnosno bilo koji od VH CDR. uključujući njihove bilo koje varijante, kako je ovde izloženo. Pronalazak obuhvata i nukleinske kiseline koje kodiraju lak lanac antitela, koji sadrži bilo koji od VL regiona ili njegov deo. odnosno bilo koji od VL CDR. uključujući njihove bilo kakve varijante, kako je ovde izloženo. U određenim otelotvorenjima, nukleinska kiselina enkodira i težak i lak lanac, odnosno njihove delove.

[0059] Pronalazak obuhvata i rekombinantne vektore koji sadrže bilo koji od ovde opisanih molekula nukleinskih kiselina. Vektor može da sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira samo jedan lanac antitela ili njegov deo{ npr.težak ili lak lanac), odnosno nukleinsku kiselinu koja kodira oba lanca antitela ili njihove đelove.

[0060| Primeri vektora obuhvataju plazmide, lagemide. kozmiđe, viruse i fagne nukleinske kiseline, odnosno druge molekule nukleinskih kiselina sposobne da se replikuju u prokariotskom ili eukariotskom domaćinu. Vektori tipično sadrže marker kako bi obezbedili fenotipsku osobinu radi selekcije transformisanih domaćina, poput prenosa rezistencije na antibiotike kao što su ampicilin ili neomicin.

[00611 Vektor može biti ekspresioni vektor, naznačen lime što je nukleinska kiselina koja kodira antitelo operabilno povezana sa sekvencom koja kontroliše ekspresiju. Tipični

ekspresioni vektori sadrže terminatore transkripcije i translacije. inicijalne sekvence i promotore korisne za regulaciju ekspresije molekula nukleinskih kiselina iz pronalaska. Vektori takođe mogu da sadrže genske ekspresione kasete koje sadrže nezavisnu terminator sekvencu, sekvence koje dozoljavaju replikaciju vektora i u eukariotama i u prokariotama,npr.šatl vektore i selekcione markere i za prokariotske i za eukariotske sisteme. Kada vektor sadrži nukleinske kiseline koje kodiraju i težak i lak lanac ili njihove Jelove, nukleinska kiselina koja kodira težak lanac može biti pod istim ili pod odvojenim promotorom. Odvojeni promotori mogu biti identični ili mogu biti različiti tipovi promotora.

100621Pogodni promotori obuhvataju konstitutivne promotore i inducibilne promotore. Reprezentativne kontrolne sekvence/promotori ekspresije uključujulacsistem,npsistem,lacsistem,Ircsistem, glavne operator i promotor regione faga lambda. kontrolniregion fdproteina omotača, promotore glikolize u kvascu,npr.promotor za 3-fosfoglicerat kinazu, promotore kisele fosfataze kvasca,npr. Pho5.promotore alfa faktora parenja kvasca, promotore dobijene iz humanog citomegalovirusa, promotore metalotioneina. promotor virusa mišjeg tumora dojke, promotor Rous sarkoma virusa, promotor polihedrina i promotore dobijene od polioma, adenovirusa. retrovirusa i majmunskog virusa,npr.rane i kasne promotore SV40.

(0063|Pronalazak takođe obuhvata nehumane domaćine poput ćelija ili organizama koji sadrže molekul nukleinske kiseline ili vektor iz pronalaska. Pod pojmom ..domaćin"podrazumeva se nehumani jednoćelijski ili višećelijski organizam ili ..ćelija domaćin", što se odnosi na ćeliju ili populaciju ćelija u koju je unet molekul nukleinske kiseline ili vektor iz pronalaska...Populacija ćelija domaćina"odnosi se na grupu kultivisanih ćelija u koje se molekul nukleinske kiseline ili vektor iz predmetnog pronalaska može uneti i eksprimirati. Domaćin sadrži nukleinsku kiselinu ili vektor koji kodiraju samo jedan lanac ili njegov deo{ npr.težak ili lak lanac); ili može da sadrži nukleinsku kiselinu ili vektor koji kodiraju oba lanca ili njihove delove. bilo na istoj ili na odvojenim nukleinskim kiselinama i/ili vektorima.

|0064|Domaćin iz predmetnog pronalaska može biti prokariotski ili eukariotski. Pogodni prokariotski domaćini obuhvataju, na primer,E. coli.poputE. coliSG-936.£ coliI1B 101.E. adiW3110.E. adiXI776.E. adiX2282.E. adiDHI. iE. voliMRC1.Pscudomonas. Bacillus.kao što jeBacili us subfilis.iStreplomyces.Pogodne eukariotske ćelije obuhvataju

kvasce i druge gljive, ćelije insekata, ćelije biljaka, humane ćelije i životinjske ćelije, uključujući ćelije sisara, poput linija hibridoma. COS ćelija, NSO ćelija i CI 10 ćelija.

[0065|Pronalazak takođe sadrži metode za proizvodnju antitela iz predmetnog pronalaska, što podrazumeva kultivisanje ćelije domaćina koja eksprimira jednu ili više sekvenci nukleinskih kiselina koje enkodiraju antitelo iz predmetnog pronalaska, te dobijanje antitela iz medij uma kulture. U neki otelotvorenjima. antitelo se prečišćava odvajanjem od kulture medijuma. Antitela koja sadrže više od jednog lanca mogu se proizvoditi ekspresijom svih pojedinačnih lanaca zajedno u istom domaćinu; ili odvojenih lanaca, koji se sastavljaju pre ili posle dobijanja iz medijuma kulture.

|0066|Metode za proizvodnju drugih TGFB antagonista dobro su poznate u struci, kako je opisano gore.

[0067JKapecitabin je uopšte uzev izložen u američkom patentu U.S. Pat. No. 4.966.891 a posebno izložen u američkom patentu U.S. Pat. No. 5.472.949. U farmaceutskim kompozicijama na tržištu je pod zaštićenim imenom XELODA (proizvođač Roche Laboratories Inc.) (SAD). Različiti procesi sinteze kojima se dobija kapecitabin poznati su u dosadašnjem stanju tehnike, na primer, metode za dobijanje kapecitabina opisane su u objavi američke patentne prijave U.S. Patent Application Publication 20080300399. koja je ovde uključena referencom u celosti.

|0068jMetode za dobijanje iksabepilona takođe su dobro poznate u struci. Na primer. enterički obložena kapsula sa iksabepilonom te njena priprema i primena opisane su u objavi američke patentne prijave U.S. Patent Application Publication 20060153917. koja je ovde uključena referencom u celosti.

[0069|U drugom otelotvorenju, ovde je prikazana farmaceutska kompozicija za Iečenje raka dojke kod ispitanika koja sadrži: terapijski efikasnu količinu TGFB antagonista, kapecitabina i/ili iksabepilona, naznačenu time što je pomenuti TGFB antagonist prisutan u količini delotvornoj da poveća efikasnost kapecitabina i/ili iksabepilona u lečenju pomenutog raka dojke. U pojedinim otelotvorenjima, prva farmaceutska kompozicija sadrži TGFB antagonist, druga farmaceutska kompozicija sadrži kapecitabin. a treća farmaceutska kompozicija sadrži

iksabepilon. Ove pojedinačne i odvojene kompozicije mogu se primenjivati nezavisno ili zajedno.

|0070|Pronalazak takođe obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži antitelo. nukleinsku kiselinu, vektor, ćeliju domaćina ili hemioterapijske agense iz ovog pronalaska te jedan ili više farmaceutski prihvatljivih nosača...Farmaceutski prihvatljivi nosači" obuhvataju sve ekscipijente koji su netoksični za njima izloženu ćeliju ili sisara u primenjenim dozama i koncentracijama. Farmaceutske kompozicije mogu da sadrže jedan ili dodatne terapijske agense.

[00711Farmaceutski prihvatljivi nosači obuhvataju rastvarače, disperzione medijume. pufere. omotače, antibakterijske i antigljivične agense, ovlaživače. konzervanse. helirajuće agense, antioksidanse. izotoničke agense i agense koji odlažu apsorpciju.

[0072|Farmaceutski prihvatljivi nosači obuhvataju vodu; fiziološki rastvor; fiziološki rastvor s fosfatnim puferom; dekstrozu; glicerol; alkohole poput ctanola i izopropanola; fosfate, citrate i druge organske kiseline; askorbinsku kiselinu; poiipeptide male molekulske mase (manje od desetak rezidua); proteine, poput serumskih albumina, želatina ili imunoglobulina; hidrofilne polimere poput polivinilpirolidona; aminokiseline poput glicina. glutamina. asparagina, arginina ili lizina; monosaharide, disaharide i druge ugljene hidrate uključujući glukozu, manozu ili dekstrine; EDTA; kontrajone koji grade soli, poput natrijuma; i/ili nejonske surfaktante kao što su TWEEN. polietilen-glikol (PEG) i PLURON1CS: izotoničke agense poput šećera, polialkohola kao što su mankol i sorbitol. i natrijum-hlorida; kao i njihove kombinacije. Antibakterijski i antigljivični agensi uključuju parabene, hlorobutanol, fenol, askorbinsku kiselinu i timerosal.

[0073]Farmaceutske kompozicije iz pronalaska mogu biti formulisane na razne načine, uključujući na primer. tečne, polučvrste i čvrste oblike doziranja, poput tečnih rastvora( npr.injekcionih i infuzionih rastvora), disperzija ili suspenzija, tableta, pilula, praška, lipozoma i supozitorija. U pojedinim otelotvorenjima. kompozicije su u obliku injekcionih ili infuzionih rastvora. Kompozicija je u obliku pogodnom za oralnu, intravensku, intraarterijsku. intramuskularnu. supkutanu. parenteralnu. transmukoznu. transdermalnu ili topičku primenu. Kompozicija može biti formulisana kao kompozicija sa trenutnim, kontrolisanim. produženim ili odloženim oslobađanjem.

(0074)Preparacije za parenteralnu primenu obuhvataju sterilne vođene ili nevodene rastvore, suspenzije i emulzije. Primeri nevođenih rastvarača su propilen-glikol. polietilen-glikol. biljna ulja poput maslinovog, i injektabilni organski estri poput etil-oleata. Vođeni nosači obuhvataju vodu. vodeno-alkoholne rastvore, emulzije ili suspenzije, uključujući fiziološki rastvor i puferovane medijume. U predmetnom pronalasku, farmaceutski prihvatljivi nosači obuhvataju, ali nisu ograničeni na 0,01-01 M i poželjno 0.05M fosfatni pufer ili 0,8% fiziološki rastvor. Drugi uobičajeni parenteralni nosači obuhvataju rastvore natrij um-fosfata. Ringerovu dekstrozu, dekstrozu i natrijum-hlorid, Ringer-laktat ili fiksirana ulja. lntravenski nosači obuhvataju sredstva za nadoknadu tečnosti i hranijtvih materija, sredstva za nadoknadu elektrolita, poput onih zasnovanih na Ringerovoj dekstrozi. i slično. Konzervansi i drugi aditivi takođe mogu biti prisutni, na primer, antimikrobici. antioksidansi. helirajući agensi te inertni gasovi i slično.

|0075]Konkretnije, farmaceutske kompozicije pogodne za injekcionu primenu obuhvataju sterilne vodene rastvore (kada je supstanca rastvorljiva u vodi) ili disperzije i sterilne praškove za ekstemporalnu pripremu sterilnih injekcionih rastvora ili disperzija. U ovakvim slučajevima, kompozicija mora da bude sterilna i treba da bude tečna do te mere da se lako ubrizgava. Treba da bude stabilna u uslovima proizvodnje i skladištenja i po mogućstvu zaštićena od kontaminirajućeg dejstva mikroorganizama, poput bakterija i gljiva. Nosač može biti rastvarač ili disperzioni medij um koji sadrži, na primer. vodu, etanol, poliol( npr.glicerol. propilen-glikol, tečni polietilen-glikol i slično) i njihove pogodne smeše. Odgovarajuća tluidnost može se sačuvati, na primer. upotrebom omotača poput lecitina, očuvanjem potrebne veličine Čestica u slučaju disperzije i upotrebom surfaktanata. Pogodne formulacije za primenu u ovde izloženim terapijskim metodama opisane su u radu Remington's Pharmaceutical Sciences. Mack Publishing Co.. 16theđ. (1980).

|0076|U pojedinim otelotvorenjima. kompozicija sadrži izotoničke agense, na primer. šećere, polialkohole. poput manitola, sorbitola. ili natrijum-hlorid. Produžena apsorpcija injekcionih kompozicija može se postići dodavanjem agensa koji odlaže apsorpciju, na primer. aluminijum-monostearata i želatina, u kompoziciju.

|0077|Sterilni injekcioni rastvori mogu se pripremiti dodavanjem molekula, samog ili u kombinaciji s drugim aktivnim agensima, u potrebnu količinu odgovarajućeg rastvarača s jednim ili kombinacijom ovde nabrojanih sastojaka, po potrebi, praćenim sterilizacijom filtriranjem. Uopšte uzev. disperzije se pripremaju dodavanjem aktivnog jedinjenja u sterilan nosač, koji sadrži osnovni disperzioni medij um i potrebne druge sastojke u okviru gore pobrojanih. U slučaju sterilnih praškova za pripremu sterilnih injekcionih rastvora, jedna od metoda pripreme je sušenje u vakuumu i sušenje zamrzavanjem, čime se dobija prašak sa aktivnim sastojkom zajedno s bilo kojim dodatnim željenim sastojkom iz njihovog prethodno sterilno filtriranog rastvora. Preparacije za injekcije se obrade, sipaju u ambalaže poput ampula, vrećica, bočica, brizgalica ili liola te zapečate u aseptičnim uslovima u skladu s

metodama poznatim u struci. Dalje, preparacije mogu da se pakuju i prodaju u vidu kompleta, poput onih opisanih u objavi američke patentne prijave US App. Publ. No. 2002/0102208 Al. koja je ovde uključena referencom u celosti. Ovakvi proizvodi poželjno sadrže deklaraciju ili uputstvo koji navode da su sadržane kompozicije korisne za Iečenje ispitanika obolelog od

autoimunih ili neoplastičnih bolesti, odnosno pređi spo ni ranog za njih.

[0078| Efikasne doze kompozicija iz predmetnog pronalaska za Iečenje poremećaja ili bolesti kako je ovde opisano menjaju se zavisno od mnogih različitih faktora, uključujući načine primene. ciljno mesto. fiziološko stanje pacijenta, da li je pacijent čovek ili životinja, druge primenjene lekove te da li je primena prolilaktička ili terapi jska. Uobičajeno, pacijent je čovek. ali mogu se lečiti i nehumani sisari. uključujući transgene sisare. Doze za primenu mogu se titrirati rutinskim metodama poznatim onima upućenim u struku radi optimizacije bezbednosti i efikasnosti.

[0079] Farmaceutske kompozicije iz pronalaska mogu sadržati ..terapijski efikasnu količinu"". ..Terapijski efikasna količina"odnosi se na količinu efikasnu u neophodnim dozama i vremenskim periodima da bi se postigao željeni terapijski rezultat. Terapijski efikasna količina molekula može da se razlikuje zavisno od faktora poput stanja bolesti, uzrasta, pola i težine pojedinca, te sposobnosti molekula da izazove željeni odgovor kod pojedinca. Terapijski efikasna količina takođe je ona čiji terapijski povoljni efekti imaju prevagu nad bilo kojim toksičnim ili štetnim efektima molekula.(0080|Pronalazak dalje obezbeđuje komplet koji sadrži terapijski efikasnu količinu TGFB antagonista, kapecitabina, iksabepilona ili njihovu kombinaciju.

|0081|Pronalazak dalje obezbeđuje metode za Iečenje bolesti ili poremećaja koje obuhvataju primenu terapijski efikasne količine TGFB antagonista, kapecitabina. iksabepilona ili njihove kombinacije na sisaru kome je ona potrebna.

|0082]Kako se ovde koriste, pojmovi ..lečiti"i ..terapija"odnose se na terapijsko Iečenje. uključujući prolilaktičke ili preventivne mere. naznačene time sto je cilj sprečiti ili usporiti (oslabiti) neželjenu fiziološku promenu u vezi s bolešću ili poremećajem. Povoljni ili željeni klinički ishodi obuhvataju. ali nisu ograničeni na, ublažavanje simptoma, smanjene proširenosti bolesti ili poremećaja, stabilizaciju bolesti ili poremećaja (//. kada se bolest ili poremećaj ne pogoršavaju), odlaganje ili usporavanje progresije bolesti ili poremećaja, poboljšanje ili palijaciju bolesti ili poremećaja, te remisiju (bilo parcijalnu ili potpunu) bolesti ili poremećaja, bilo detektabilnu ili nedetektabilnu...Terapija"može da znači i produženje preživljavanja kada bi se uporedilo sa očekivanim preživljavanjem bez lečenja. Osobe kojima je Iečenje neophodno obuhvataju osobe koje već imaju bolest ili poremećaj, kao i osobe sklone dobijanju bolesti ili poremećaja, odnosno osobe kod kojih bolest ili poremećaj treba sprečiti.

[0083]Kanceri/tumori koji se mogu lečiti pronalaskom obuhvataju bilo koji kancer ili tumor. Primeri kancera/tumora koji se mogu lečiti obuhvataju. ali nisu ograničeni na rak dojke (uklj učujući HER2+ i metastatski). rak lečen kapecitabinom. iksabepilonom ili pomoću oba ieka, te rak povezan sa signalizacijom posredovanom preko TGFB.

[0084|Metode lečenja raka obuhvataju. ali nisu ograničene na. npr. inhibiciju angiogeneze u tumoru, inhibiciju rasta tumora, inhibiciju migracije tumora, inhibiciju proliferacije ili inhibiciju invazije tumorskih ćelija.

[0085|Kanceri koji eksprimiraju ili previše eksprimiraju TGFB ili su povezani sa ekspresijom ili prevelikom ekspresijom TGFB mogu se lečiti pronalaskom. Međutim, kancer koji se može lečiti ovom kombinovanom terapijom može biti bilo koji kancer. ne samo oni koji eksprimiraju ili previše eksprimiraju TGFB.

|0086)Kanceri koji se mogu lečiti obuhvataju primame tumore i sekundarne ili metastatske tumore (uključujući one koji su metastazirali iz pluća, dojke ili prostate), kao i rekurentne ili refraktorne tumore. Rekurentni tumori obuhvataju tumore koji su naizgled inhibisani

lečcnjem ovakvim agensima, ali se ponovo jave unutar pet godina, ponekad čak unutar deset ili više godina nakon obustave terapije. Refraklorni tumori su tumori koji nisu reagovali ili su otporni na Iečenje jednom ili pomoću više konvencionalnih terapija za taj konkretan tip tumora. Refraktomi tumori obuhvataju one koji su hormon-refraktorni (npr. androgen-nezavisni karcinom prostate; ili hormon-refraktorni karcinom dojke, poput karcinoma dojke refraktornog na tamoksifen); one koji su refraktorni na Iečenje jednim ili pomoću više hemioterapijskih agenasa; one koji su refraktorni na zračenje: i one koji su refraktorni na kombinacije hemioterapije i zračenja, hemioterapije i hormonske terapije, ili hormonske terapije i zračenja.

[0087] Terapija može biti ..prvog izbora", (/. kao inicijalna terapija kod pacijenata koji nisu ranije imali nikakvu antikancersku terapiju, bilo samostalna, bilo u kombinaciji s drugim terapijama; ili ..drugog izbora", kao terapija kod pacijenata koji su imali jedan prethodni antikancerski terapijski režim, bilo samostalna, bilo u kombinaciji s drugim terapijama: odnosno ..trećeg izbora", „četvrtog izbora"itd, bilo samostalna ili u kombinaciji s drugi terapijama.

[0088] Terapija se može davati i pacijentima koji su imali prethodne terapije koje su bile delimično uspešne. ali su intolerantni na konkretnu terapiju. Terapija se može davati i kao adjuvantna terapija, //. za prevenciju ponovnog javljanja kancera kod pacijenata koji u tom trenutku nemaju detektabilnu bolest ili nakon hirurškog uklanjanja tumora.

[0089] Kanceri koji se mogu lečiti obuhvataju tumore koji nisu vaskularizovani. ili još nisu značajno vaskularizovani. kao i vaskularizovane tumore. Kanceri mogu obuhvatati nesolidne tumore (poput leukemija i limfoma) ili solidne tumore. Tipovi kancera koji se mogu lečiti antitelima iz pronalaska obuhvataju. ali nisu ograničeni na karcinome, blastome i sarkome, te određene leukemije ili limfoidne malignitete. benigne i maligne tumore, te malignitete.npr.sarkome, karcinome i melanome. Obuhvaćeni su adultni tumori/kanceri i pedijatrijski tumori/kanceri.

[0090]Može se primenjivati više od jednog TGFB antagonista, bilo u sastavu iste kompozicije ili u odvojenim kompozicijama.

[00911 TGFB antagonist može se davati samostalno ili u kombinaciji s jednim ili više terapijski efikasnih agenasa (npr. kapecitabinom, iksabepilonom ili oba) ili terapija. Drugi terapijski efikasan agens može se konjugovati sa TGFB antagonistom, ugraditi u istu kompoziciju kao i TGFB antagonist ili se može primeniti kao zasebna kompozicija. Drugi terapijski agens ili terapija može se primeniti pre, tokom i/ili posle primene TGFB antagonista.

[0092) U jednom otelotvorenju, TGFB antagonist se primenjuje zajedno s kapecitabinom. iksabepilonom ili njihovom kombinacijom. U drugom otelotvorenju. TGFB antagonist se primenjuje nezavisno od primene kapecitabina. iksabepilona ili njihove kombinacije. U jednom otelotvorenju, TGFB antagonist se primenjuje prvi. a zatim se primenjuju kapecitabin. iksabepilon ili njihova kombinacija. U drugom otelotvorenju. kapecitabin. iksabepilon ili njihova kombinacija se primenjuju prvi. a zatim se primenjuje TGFB antagonist.

[0093| Drugi terapijski efikasni agensi/terapije obuhvataju hirurgiju. antineoplastike (uključujući hemioterapijske agense i zračenje), antiangiogene agense, antitela na druge ciljne antigene, male molekule, fotodinamsku terapiju, imunoterapiju, citotoksične agense, citokine. hemokine. agense koji inhibišu rast. antihormonske agense, inhibitore kinaze. kardioprotektivne agense, imunostimulatorne agense, imunosupresivne agense, agense koji podstiču proliferaciju hematopoeznih ćelija i inhibitore protein-tirozin-kinaze (PTK).

[0094| Hemioterapijski agens može se primeniti kao prolek. Pojam ..prolek'* odnosi se na prekursor ili derivat farmaceutski aktivne supstance koji je manje citotoksičan za tumorske ćelije u poređenju s iekom roditeljem i koji je sposoban da se enzimski aktivira ili konvertuje u aktivniji roditeljski oblik. Prolekovi koji se mogu upotrebiti u ovde prikazanim kompozicijama i metodama obuhvataju, ali nisu ograničeni na prolekove koji sadrže fosfate, prolekove koji sadrže tiofosfate, prolekove koji sadrže sulfate, prolekove koji sadrže peptide.

D-aminokiselinski modifikovane prolekove. giikozilirane prolekove. prolekove koji sadrže beta-laktam. opcionalno supstituisane prolekove koji sadrže fenoksiacetamiđ ili opcionaino supstituisane prolekove koji sadrže fenilacetamid. 5-fluorocitozin i druge 5-fluorouridinske prolekove koji se mogu konvertovati u aktivniji citotoksični slobodan lek. Primeri citotoksičnih tekova od kojih se derivacijom može dobiti prolek za upotrebu sa antitelima i Fc fuzijama iz kompozicije i metoda kako su ovde navedene obuhvataju. ali nisu ograničeni na bilo koji od gorenavedenih hemioterapijskih agenasa.

[0095J Primena TGFB antagonista s drugim agensima (npr. kapecitabinom. iksabepilonom ili oba) i/ili terapijama može biti simultana ili odvojena, istim ili različitim putem, u isto ili različito vreme. Režimi doziranja mogu se prilagoditi kako bi se postigao optimalan željeni odgovor( npr.terapijski ili profilaktički odgovor).

|0096] U jednom primeru, može se dati jedan jedini bolus. LI drugom primeru. tokom vremena može da se da više podcijenili doza. U sledećem primeru, doza može proporcionalno da se smanji ili poveća zavisno od potreba terapijske situaci je. Oblik jedinice doziranja, kako se ovde koristi, odnosi se na fizički diskretne jedinice pogodne za pojedinačne doze za Iečenje ispitanika sisara. Svaka jedinica može sadržati prethodno određenu količinu aktivnog jedinjenja izračunatu tako da postigne željeni terapijski efekat. U nekim otelotvorenjima, oblici jedinice doziranja iz pronalaska određeni su i direktno zavisni od jedinstvenih karakteristika aktivnog jedinjenja i konkretnog terapijskog ili profilaktičkog efekta koji treba postići.

[0097)Kompozicija iz pronalaska može se primeniti samo jednom ili se može primenjivati više puta. Kod multiplih doza, kompozicija se, na primer. može davati triput dnevno, dvaput dnevno, jednom dnevno, svakog drugog dana, dvaput nedeljno. jednom nedeljno, jednom u dve nedelje ili jednom mesečno.

[0098J Treba imati na umu da se veličina doze može menjati zavisno od vrste i težine poremećaja koji treba ublažiti. Dalje treba razumeti da za svakog pojedinačnog ispitanika specifične režime doziranja treba prilagođavati tokom vremena zavisno ođ individualnih potreba i profesionalne ocene osobe koja daje kompozicije ili nadgleda njihovo davanje, te da su ovde nadalje navedeni opsezi doza dati samo kao primer i ne treba da ograniče obuhvat i delovanje kompozicija iz prijave.

[0099|..Primena"na ispitaniku nije ograničena ni na jedan određen put davanja leka i može obuhvatati, bez ograničenja, parenteralni (uključujući supkutanu. intravensku. intramedularnu. intraartikularnu. intramuskularnu ili intraperitoneainu injekciju), rektalni. topički. transdermaini ili oralni (na primer, u kapsulama, suspenzijama ili tabletama). Primena na domaćinu može biti u pojedinačnoj dozi ili ponavljana, u bilo kom od brojnih fiziološki prihvatljivih oblika soli, i/ili s prihvatljivim farmakološkim nosačem i/ili aditivom kao deo farmaceutske kompozicije (opisano ranije). Još jednom, fiziološki prihvatljivi oblici soli i standardne tehnike farmaceutskih formulacija dobro su poznati osobama iskusnim u struci (videti. na primer«Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co.).

[0100]Kompozicija iz pronalaska (npr. TGFB antagonist) može se davati parenleralno (npr. intravenski, supkutano, intraperitonealno, intramuskulamo). Dalje, kompozicija iz pronalaska može se davati putem intravenske infuzije ili injekcije. Kompozicija iz pronalaska može se davati putem intramuskularne ili supkutane injekcije. U pojedinim otelotvorenjima, kompozicija iz pronalaska (npr. kapecitabin i/ili iksabepilon) može se davati oralno. Kako se ovde koristi, „kom<p>ozicija" se odnosi na bilo koju kompoziciju koja sadrži farmaceutski efikasnu količinu jednog ili više aktivnih sastojaka (npr. TGFB antagonist, kapecitabin. iksabepilon ili njihovu kombinaciju).

[0101]Ovde opisane metode lečenja mogu se koristiti za Iečenje bilo kog pogodnog sisara. uključujući primate, poput majmuna i čoveka. konje, krave, mačke. pse. zečeve i glodare. poput pacova i miševa. U jednom otelotvorenju. sisar koji se leći je čovek.

(0102]Svi patenti i reference iz literature navedene u predmetnoj specifikaciji uključene su referencom u celosti.

PRIMERI

PRIMER 1

Studija1: Efekti IDU, iksabepilona, kapecitabina i kombinacija ovih terapeutikana

rast primarnog tumora i metastaze u singenom modelu tripl- negativnog karcinoma

dojke ( 4T1)

[0103 jKlinički, za kombinaciju hemioterapeutika iksabepilona i kapecitabina dokazano je da je efikasna u lečenju metastatskog iii lokalno uznapredovalog tripl-negativnog karcinoma

dojke (TNBC) rezistentnog na taksane. Pretklinička studija sprovedena je da bi se: (1) odredili efekti IDI 1, iksabepilona i kapecitabina kao pojedinačnih agenasa na rast supkutanih 4T1 tumora i posledične metastaze u pluća, (2) odredilo da li kombinovane terapije ovim agensima imaju aditivne ili sinergističke efekte na efikasnost pojedinačnih agenasa i (3) stekao uvid u potencijalne probleme s bezbednošću/toksićnošću ovih kombinovanih terapija.

Eksperimentalne metode:

[0104|

[01051Na dan 0. svaka od 150 ženki BALB/c miševa starih 12 nedelja dobila je supkutane injekcije 50 000 4T1 ćelija u matrigelu u desni bok. Miševi nosači tumora rutinski su posmatrani, a redovna merenja tumora 2-3X/nedeljno započeta su 6. dana. Zapremina tumora određivana je sledećom formulom:

Zapremina tumora = Dužina x Širina<2>x 0.52

(0106)Šest dana nakon injekcije tumorskih ćelija, kada je prosečna zapremina tumora dostigla 80 mm<3>, životinje su mečovane po veličini i podcijene u dvanaest terapijskih grupa od po deset miševa. Trideset miševa s primarnim tumorima koji su bili ili značajno veći od prošeka ili nepalpabilni (0 mm<3>) isključeno je iz studije. Od tog trenutka istraživači nisu imali uvid u to koja je koja terapijska grupa i započeta je terapijska primena. Svi miševi dobili su 10 mg/kg ili IDI 1 ili 13C4 ili nosača antitela. u dozama od po 100 uT i.p. triput nedeljno (tabela 1). Specifične kohorte miševa dobijale su dodatne terapije iksabepilonom (6 mg/kg u 200 ul i.v. triput u intervalima od četiri dana), kapecitabinom (360 mg/kg u 100 u! oralno, jednom dnevno tokom 14 dana) ili obe.

[0107]Miševi su žrtvovani kad bi primarni tumor dostigao zapreminu 2000 mm<J>ili veću ili ako bi se više od 20% površine tumora ulcerisalo ili ako bi životinje ispoljavale samrtnička stanja (izostanak čišćenja, teško disanje, kaheksija. anoreksija ili letargija). Po žrtvovanju, izvršene su makroskopske nekropsije i prikupljeni tumori, pluća i druga tkiva s metastazama. Deo primarnog tumora je zamrznut u OCT za imunohistohemiju na imunomarkere. a preostali tumor i druga tkiva s metastazama fiksirani su u cink-formalinu za uklapanje u parafin.

Rezultati:

[0108|Studijski miševi iz studije 09-3493 dobijali su kao terapiju nosač antitela. 13C4 ili IDI 1 triput nedeljno tokom sedam uzastopnih nedelja. Nije bilo poteškoća u doziranju iksabepilona, kapecitabina niti terapeutika sa antitelom; verovatno zbog korišćenja BALB/c miševa proizvođača Charles River u ovoj studiji.

[01091 Nekoliko miševa u ovoj studiji u kohorti kapecitabin+iksabepilon ili je pronađeno mrtvo ili Je moralo biti žrtvovano zbog ispoljavanja samrtničkog stanja. Ove toksičnosti u vezi s terapijom opisane su u tabeli 1. Miševi kojima je bila neophodna eutanazija bil i su izrazito mršavi, zapušteni, pogrbljeni i teško su disali. Neki miševi u grupama koje su dobijale iksabepilon pokazivali su znake periferne neuropatije; imali su teškoće u korišćenju zadnjih ekstremiteta. Međutim, kao sto je primećeno u prethodnim studijama kojima se ispitivao iksabepilon na ovom modelu, neuropatija se povukla nakon poslednje doze hemioterapeutika. Dodatak IDI 1 hemioterapeuticima nije povećao niti smanjio učestalost ovih toksičnosti.

|0110]Efekti na rast tumora bili su različiti zavisno od primenjene terapije (si. 1). Kao samostalni agens, IDI 1 nije imao značajan efekat na rast SQ 4T1 tumora (si. 2A). Kao

monoterapija, iksabepilon je bio najefikasniji u inhibiciji rasta 4T1 tumora u poređenju bilo s terapijom antitelom ili s kapecitabinom, premda je kapecitabin takođe inhibisao rast tumora. Dodatak antitela IDI 1 terapiji kapecitabinom rezultirao je povećanom efikasnošću u odnosu na kapecitabin davan sam ili sa 13C4 (si. 2B). međutim IDI 1 nije povećavao efikasnost samostalno davanog iksabepilona (si. 2C).

[01111Najjača inhibicija rasta tumora zabeležena je kod miševa koji su primali kombinovanu terapiju IDI 1+kapecitabin+iksabepilon. koja je pokazivala povećanu efikasnost u odnosu na kapecitabin+iksabepilon. same ili sa 13C4 (si. 3A). Kombinacija kapecitabina i iksabepilona bila je efikasnija nego sam kapecitabin (si. 3B), međutim ova kombinacija nije bila efikasnija od terapije iksabepilonom (si. 3C). Što se tiče terapija sa IDI 1.

I DI 1+kapecitabin+iksabepilon je bila efikasnija nego 1 Dl 1+iksabepilon, koja je bila efikasnija nego 1 Dl 1 +kapecitabin. koja je bila efikasnija nego 1 Dl 1 kao samostalni agens (si. 4).

|0112JRazličiti terapijski režimi imali su različite efekte na preživljavanje. Miševi lečeni antitelom ili samo kapecitabinom imali su slične krive preživljavanja (si. 5). Miševi lečeni samo iksabepilonom ili u kombinaciji s kapecitabinom imali su slično preživljavanje, koje je bilo veće nego u kohorti sa antitelom i kohorti s kapecitabinom. IDI 1 kao samostalni agens nije povećavao preživljavanje, ali je terapija IDI 1+kapecitabin imala povećano preživljavanje u odnosu na samostalni kapecitabin. Antitelo IDI 1 nije povećavalo ni preživljavanje kod samostalnog iksabepilona, ali je najveća medijana preživljavanja zabeležena u terapijskoj grupi 1 Dl 1+kapecitabin+iksabepilon. Na krive preživljavanja uticala je i toksičnost hemioterapijskih režima kako je gore opisano.

[0113)Antitelo IDI 1 kao samostalan agens nije produžavalo vreme potrebno da se dostigne krajnja tačka veličine od 2000 mm<3>niti je produžavalo vreme do krajnje tačke kod životinja lečenih iksabepilonom (si. 6). Međutim, antitelo IDI 1 je produžavalo vreme do krajnje tačke u kohorti s kapecitabinom, a najduže vreme do krajnje tačke u studiji zabeleženo je u grupi 1D11 +kapecitabin+iksabepilon.

|0114|Terapija antitelom IDI 1 dovela je do povećanja broja metastaza u plućima u svim kohortama (si. 7). U grupi sa IDI 1 kao samostalnim agensom značajno je povećan broj metastaza u plućima u poređenju s grupom lećenom nosačem ili lekom 13C4. a slična povećanja usled terapije antitelom IDI 1 zabeležena su u kohortama s kapecitabinom. iksabepilonom i kapecitabinom+iksabepilonom (si. 8). Broj metastaza u plućima rastao je u funkciji vremena koje je životinja provela u studiji i taj efekat bio je nezavisan od terapijske grupe (si. 9).

[0115]U klinici, objavljeno je daje kombinovana terapija iksabepilonom i kapecitabinom efikasnija od samostalnog kapecitabina kod taksan-rezistentnog tripl-negativnog karcinoma dojke (TNBC). Mišji 4T1 model karcinoma dojke rutinski se koristi kao dobar surogat za humani TNBC i za prctklinička ispitivanja terapijskih agenasa protiv TNBC. Svrha studije bila je da se odredi da li bi IDI 1 povećao efikasnost kapecitabina. iksabepilona ili kombinacije ova dva hemioterapeutika protiv rasta primarnog tumora i/ili sledstvenih metastaza u singenom 4T1 modelu TNBC.

[0116]Kako je zabeleženo u prethodnim studijama sa ovim modelom. 1 Dl 1 kao samostalni agens nije značajno inhibisao rast primarnih, SQ 4T1 tumora. Međutim, 1 Dl 1 jeste povećavao efikasnost kapecitabina i kombinovane terapije kapecitabin+iksabepilon protiv primamili tumora. Zapravo, trojna kombinacija IDI 1+kapecitabin+iksabepilon bila je najefikasnija u inhibiciji rasta 4T1 primarnih tumora, a takođe je pokazala najveći povoljan efekat na preživljavanje i omogućila najduže vreme do krajnje tačke. Zajedno gledano, ovi podaci sugerišu da kombinovanje strategije neutralizacije TGFB s terapijom kapecitabin+iksabepilon može imati povoljniji terapijski učinak u odnosu na terapiju samo kapecitabinom+iksabepilonom.

[0117]Ovi podaci predstavljaju prvo povećanje etikasnosti nekog hemioterapeutika na modelu SQ 4T1 tumora. Prethodno je na ovom modelu 1 Dl 1 kombinovan s paklitakselom. cisplatinom ili karboplatinom i ni u jednoj od ovih studija 1 Dl 1 nije povećavao efikasnost ispitivanih hemioterapeutika.

[0118]U ovoj studiji, kombinovanjem antitela 1 Dl 1 s kapecitabinom povećana je efikasnost zabeležena kod samostalnog kapecitabina. što sugeriše da povećana efikasnost u grupi 1 Dl 1 + kapecitabin + iksabepilon u odnosu na grupu kapecitabin+iksabepilon može bili usled pojačanja efekta kapecitabina na rast tumora. Kapecitabin je oralni prolek koji se konvertuje u 5-fluorouracil, koji blokira sintezu DNK tako što imitira pirimidin. Antitumorski mehanizam sličan je onom kod gemcitabina. Interesantno je da IDI 1 nije povećavao efikasnost gemcitabina na modelima karcinoma pankreasa, što sugeriše da povećanje zabeleženo u ovoj studiji zavisi od specifičnog leka. tumorskog modela ili oba.

[0119]Iznenađujuće, terapija antitelom IDI 1 rezultirala je povećanim brojem metastaza u svim kohortama, a ne pojačanim efektom svakog hemioterapeutika.

[0120]U ovoj studiji, toksičnosti u vezi s terapijom, poput gubitka u težini, zapuštenog, pogrbljenog izgleda i otežanog disanja, zabeležene su kod miševa koji su primali hemio-kombo terapije. Miševi koji su primali iksabepilon imali su perifernu neuropatiju u vidu nepokretnosti zadnjih ekstremiteta, koja je prošla po završetku terapije. 1 Dl 1 nije imao efekta na učestalost niti na težinu ovih toksičnosti.

PRIMER2

Studija 2: Efekti IDU, iksabepilona, kapecitabina i kombinacija ovih teraneutikana

rast primarnog tumora i metastaze u singenom modelu tripl- negativnog karcinoma

dojke ( 4T1).

Eksperimentalne metode:

[0121]Terapijske grupe, vremenske tačke i tkiva bili su slični kao u gore opisanoj studiji. Na dan 0, svaka od 150 ženki BALB/c miševa starih 12 nedelja dobila je supkutane injekcije 50 000 4T1 ćelija u matrigelu u desni bok. Miševi nosači tumora rutinski su posmatrani, a redovna merenja tumora vršena su 2-3X/nedeljno počev od 6. dana. Zapremina tumora određivana je sledećom formulom:

Zapremina tumora = dužina x širina<3>x 0.52

|0122|Šest dana nakon injekcije tumorskih ćelija, kada je prosečna zapremina tumora iznosila 70 mra<J>, životinje su mečovane po veličini i pođeljene u dvanaest terapijskih grupa od po deset miševa. Trideset miševa s primarnim tumorima koji su bili ili značajno veći od prošeka ili nepalpabilni (0 mm<3>) isključeno je iz studije. Ođ tog trenutka istraživači nisu imali uvid u to koja je koja terapijska grupa i započeta je terapijska primena. Svi miševi dobili su 10 mg/kg ili IDI 1 ili 13C4 ili nosača antitela. u dozama od po 100 ul i.p. triput nedeljno (si. 10). Specifične kohorte miševa dobijale su dodatne terapije iksabepilonom (3 mg/kg u 200 ul i.v. triput u intervalima od četiri dana), kapecitabinom (360 mg/kg u 100 ul oralno, jednom dnevno tokom 14 dana) ili obe.

[0123]Miševi su praćeni na pojavu izraženih ulceracija ili samrtničkih stanja (izostanak čišćenja, teško disanje, kaheksija, anoreksija ili letargija). Radi ispravne analize metastaza, svi miševi su žrtvovani 23. studijskog dana. Po žrtvovanju, izvršene su makroskopske nekropsije i prikupljeni tumori, pluća i druga tkiva s metastazama. Primarni tumor je podeljen napola, jedna polovina je zamrznuta u OCT. a druga sačuvana u reagensu RNAlater radi qPCR analize. Pluća su fiksirana u cink-puferovanom fonnalinu radi prebrojavanja plućnih metastaza i dalje imunohistohemijske analize.

Rezultati;

[0124JDo 23. studijskog dana. miševi su primili osam terapija nosača antitela. 13C4 ili 1 Dl 1. U ovoj studiji nisu zabeleženi problemi s toksičnošću ni tokom doziranja iksabepilona, ni kapecitabina, ni terapeutika sa antitelom. Sve životinje su žrtvovane 23. studijskog dana izuzev jednog miša koji je žrtvovan pre završetka studije jer je tumor ulcerisao.

[0125JTumori u ovoj studiji rasli su nešto sporije nego u prethodnim studijama, pa su posledično bili relativno manji kada je studija završena 23. studijskog dana.

|0126JUprkos smanjenoj veličini tumora u ovoj studiji, zabeležene su jasne razlike između srednjih zapremina tumora među terapijskim grupama (si. 10 i 11). Treba istaći značajno smanjenje zapremine tumora registrovano 20. i 22. studijskog dana poređenjem životinja lečenih antitelom IDI 1 kao samostalnim agensom sa onima koje su dobijaie samo 13C4. iako je terapija antitelom 1D11 rezultirala statistički neznačajnim trendom inhibicije rasta antitelom 1D11 u poređenju sa životinjama lečenim nosačem (si. 11 A). Terapija kapecitabinom rezultirala je trendom ka inhibiciji rasta primarnih tumora, a nakon terapije iksabepilonom zabeleženo je značajno smanjenje zapremine tumora. Dodatak antitela IDI 1 terapiji kapecitabinom rezultirao je statistički neznačajnim trendom ka povećanoj efikasnosti u odnosu na samostalan kapecitabin (si. 11B). Kombinovanje 1D11 sa iksabepilonom rezultiralo je povećanom efikasnošću u poređenju sa samostalnim iksabepilonom. ali u poređenju sa 13C4+iksabepilonom (si. 11C).

[0127|Dodatna korist od kombinovanja iksabepilona i kapecitabina nad bilo kojim hemioterapeutikom pojedinačno, zabeležena u studiji 09-3493, potvrđena je u ovoj studiji (si. 12A). Kombinovana terapija kapecitabinom i iksabepilonom bila je značajno efikasnija u

inhibiciji rasta SQ 4T1 tumora nego kapecitabin (si. 12B). a zabeležena je i blaga korist u odnosu na samostalan iksabepilon (si. 12C). Najjača inhibicija rasta tumora zabeležena je kod miševa koji su primali kombinovanu terapiju IDI 1+kapecitabin+iksabepilon. koja je pokazivala povećanu efikasnost u odnosu na kapecitabin+iksabepilon. same ili sa 13C4 (si. 12A). što je potvrdilo podatke iz studije 09-3493. Što se tiče terapija sa IDI 1. IDI 1+kapecitabin+iksabepilon je bila efikasnija nego IDI 1+iksabepilon. koja je bila efikasnija nego IDI 1 +kapecitabin. koja je bila efikasnija nego IDI 1 kao samostalni agens (si. 13).

|0128JTerapija antitelom IDI 1 nije inhibirala broj plućnih metastaza kao samostalni agens (si. 14). Metastaze su značajno smanjene u kohorti koja je dobijala kombinovane terapije, a prosečan broj metastaza u svakoj od ovih kohorti bio je manji od 10. I 1 Dl 1 +iksabepilon i 13C4+iksabepilon smanjivali su broj metastaza u poređenju s kapecitabinom. ali nije bilo razlika između terapijskih grupa u kohortama s kapecitabinom ili

kapecitabinom+iksabepilonom.

[0129]Ova studija je druga po redu koja određuje efekat dodavanja IDI 1 u kombinaciju hemioterapeutika iksabepilona i kapecitabina na inhibiciju rasta primarnog tumora i prevenciju metastaza u plućima. Slično kao u prvoj studiji. 09-3493, antitelo IDI 1 nije imalo bitan efekat na rast primarnog tumora kao samostalni agens. Postojao je trend ka inhibiciji u grupi sa 1 Dl 1 u poređenju s grupom lečenom lekom 13C4. ali ovaj značaj je nestao kada je poređen s grupom lečenom nosačem. Takođe su postojali trendovi koji pokazuju da je I DI 1 pojačavao efikasnost kapecitabina i iksabepilona. iako je u drugom slučaju povećanje efikasnosti iksabepilona bilo slično onom kod 13C4. Međutim, u ovoj studiji, kao i u 09-3493, najznačajnija inhibicija rasta 411 tumora zabeležena je kod miševa lečenih kombinacijom I DI 1+kapecitabin+iksabepilon. Povećanje efikasnosti bilo je očigledno iako su životinje žrtvovane u vremenskoj tački kada je razdvajanje među terapijskim grupama tek počelo da se odvija. Zajedno gledano, podaci iz ove dve studije jasno pokazuju da kombinovanje strategije neutralizacije TGFB s terapijom kapecitabin+iksabepilon može imati povoljniji terapijski učinak u odnosu na terapiju samo kapecitabinom+iksabepilonom.

[01301Zajedno gledano, podaci iz ove dve studije predstavljaju prvo povećanje efikasnosti nekog hemioterapeutika na modelu SQ 4T1 tumora. Prethodno je na ovom modelu 1 Dl 1

kombinovan s paklitakselom, cisplatinom ili karboplatinom i ni u jednoj od ovih studija 1 Dl 1 nije povećavao efikasnost ispitivanih hemioterapeutika.

(01311U studiji 09-3493, povećanje efikasnosti kapecitabina+iksabepilona moglo je biti pripisano povećanju efikasnosti kapecitabina. budući da je 1 Dl 1 povećavao efikasnost samostalnog kapecitabina, ali ne i iksabepilona. U ovoj studiji postojao je trend ka povećanju efikasnosti antitelom IDI 1 u kohorti s kapecitabinom. ali nije bio statistički značajan. Izgledalo je da IDI 1 povećava efikasnost iksabepilona. ali je sličan rezultat zabeležen kada je iksabepilon kombinovan sa 13C4. Verovatno je da bi razdvajanje između terapijskih grupa u svakoj kohorti bilo bolje daje studija trajala duže. lime bi se trebalo pozabaviti u narednim studijama kako bi se odredilo da li je povećanje efikasnosti kapecitabina+iksabepilona antitelom 1 Dl 1 bilo zbog povećanja aktivnosti kapecitabina. iksabepilona ili je samo slučaj kada se 1 Dl 1 kombinuje sa oba terapeutika.

[0132|U studiji 09-3493. životinje koje su dobijale 6 mg/kg iksabepilona tipično su ispoljavale perifernu neuropatiju, a mnoge u kohorti sa iksabepilonom + kapecitabinom bile su na samrti zbog terapije i morale su biti žrtvovane. U ovoj studiji, doza iksabepilona smanjena je sa 6 mg/kg na 3 mg/kg; to je doza koja je bila efikasna protiv rasta 4T1 tumora u MTD studiji koju je sproveo Pharm/Tox. Sa ovako smanjenom dozom iksabepilona. nijedna životinja u studiji nije pokazivala znake intoksiciranosti ni u jednoj tački tokom studije. Pored toga, dokazano je da je doza od 3 mg/kg bila efikasna protiv rasta primarnog tumora i/ili učestalosti metastaza u ovoj studiji. Kao takva, primena ove manje doze verovatno bi imala prednost u budućim studijama zbog smanjene toksičnosti.

[0133]Osim sto je mogla da registruje efekte na rast primarnog tumora, ova studija bila je dizajnirana na takav način daje mogla da prepozna i efekte antitela 1 Dl 1 kao samostalnog agensa ili u kombinaciji s hemioterapeuticima na metastaze SQ 4T1 primarnog tumora u pluća. Sve životinje su žrtvovane 23. dana. a ne kada bi svaki pojedinačni tumor dostigao 2000 mm<J>(kao u studiji 09-3493). kako bi se eliminisala mogućnost da više vremena za rast tumora dovede do više metastaza. Iznenađujuće. IDI 1 nije inhibisao metastaze u ovoj studiji kao što je bilo zabeleženo na drugim tumorskim modelima, uključujući 4T1 intrakardijalni model eksperimentalnih metastaza. Međutim, treba napomenuti da je broj plućnih metastaza u kohorti sa antitelom kao samostalnim agensom bio nizak u svim terapijskim grupama, a naročito nizak u hemio-kombo kohortama, što ukazuje na to da su ove životinje možda žrtvovane ranije nego stoje trebalo. Prosečna veličina tumora u vreme završetka studije bila je 1000 mm<3>u kohorti sa antitelom. 700 mm<3>u kohorti s kapecitabinom. a 500 mm<3>ili manja u kohortama sa iksabepilonom i iksabepilonom+kapecitabinom. Velika većina zabeleženih metastaza bila je manja od 1 mm među svim kohortama. U prethodnim studijama, pouzdan broj metastaza (50-100 po plućima) nije bio prisutan sve dok primarni tumori nisu dostigli 1500 mn<r>\

PRIMER3

Studija3:Efekti IDU, iksabepilona, kapecitabina i kombinacija ovih teraneutika na

rast primarnog tumora i metastaze u singenom modelu tripl- negativnog karcinoma

dojke ( 4T1).

Eksperimentalne metode:

[0134|Na dan 0, svaka od 150 ženki BALB/c miševa starih 12 nedel ja dobila je supkutane injekcije 50 000 4T3 ćelija u matrigeiu u desni bok. Miševi nosači tumora rutinski su posmatrani. a redovna merenja tumora 2-3X/nedeljno započeta su 6. dana. Zapremina tumora određivana je sledećom formulom:

Zapremina tumora = dužina x širina<2>x 0,52

[0135]Šest dana nakon injekcije tumorskih ćelija životinje su mečovane po veličini i

podeljene u dvanaest terapijskih grupa od po deset miševa. Preostalih 30 životinja uključeno je u prateći eksperiment pri ovoj studiji, radi traženja efekata antitela 1011 na regrutovanje i aktivnost makrofaga ( videti dole). Od tog trenutka istraživači nisu imali uvid u to koja je koja terapijska grupa i započeta je terapijska primena. Sve grupe miševa dobile su kao terapiju ili nosač antitela ili 1 Dl I ili 13C4, primenjene u dozama od po 100 ul i.p. triput nedeljno. Specifične kohorte miševa dobijale su dodatne terapije kapecitabinom (360 mg/kg u 100 ul oralno, jednom dnevno tokom 14 uzastopnih dana), iksabepilonom (3 mg/kg u 200 ul i.v. triput u intervalima od četiri dana) ili obe.

[0136|Čitava kohorta miševa žrtvovana je kada je prosečna zapremina tumora u jednoj grupi unutar te kohorte dostigla 1500 mm<3>ili više. Pojedinačni miševi žrtvovani su pre ove krajnje tačke u veličini ako su tumori ulcerisali ili ako bi životinje ispoljavale samrtnička stanja

(izostanak čišćenja, teško disanje, kaheksija. anoreksija ili letargija). Po žrtvovanju, izvršene su makroskopske nekropsije i prikupljeni tumori, pluća i druga tkiva s metastazama. Deo primarnog tumora je zamrznut u OCT za imunohistohemiju na imunomarkere. a preostali tumor i druga tkiva s metastazama fiksirani su u cink-formalinu za uklapanje u parafin.

[0137]Trideset miševa koji nisu uključeni u hemio-kombo deo ove studije mečovano je po veličini i podeljeno u tri dodatne grupe lečene nosačem antitela, lekom I3C4 ili antitelom IDI 1 kako bi se evaluiralo prisustvo M2 makrofaga na mestu primarnog tumora (tabela 3). Primarni tumori prikupljeni su sa ovih miševa 21. studijskog dana. Tumori su enzimski svareni u 5 ml Hankovog balansiranog rastvora soli (HBSS) koji sadrži 50 u g/m I kolagenaze 1. 50 pg/ml kolagenaze IV, 25 pg/ml hijaluronidaze. 10 u.g/ml DNaze I i 0.2 U/ml inhibitora tripsina. Tkiva su dvaput inkubirana u rastvoru enzima 20 minuta na 37°C uz konstantno mućkanje, a suspenzija ćelija napravljena je pomoću disocijatora tkiva gentleMACS. Razdvojene ćelije i preostalo tkivo propušteni su kroz cediljku od 100 um. a zatim kroz cediljku od 40 um u epruvete za centrifugu od 50 ml. Ćelije su dvaput oprane u HBSS. pa su izbrojane žive ćelije. Radi obogaćenja CD 1 lb<r>ćelijama, žive ćelije su podešene na 1.0xl0<7>ćelija po 90 ul degasiranog PBS koji sadrži 0,5% BSA bez endotoksina i 2 mM FDTA, pa su inkubirane sa anti-CDl lb magnetnim mikrosferama. CD1 lb+ ćelije su pozitivno selektovanc pomoću AutoMacs Pro Separalora. Porcije pojedinačnih CD1 lb" ćelijskih suspenzija obojene su na CD1 lb, F4/80. CD206 i Gr-1. Preostale CD11 h+ ćelije su lizirane da bi se ekstrahovala arginaza.

[0138]Za esej ćelijske arginaze. obogaćene ćelije oprane su u PBS, pa je 1.0x10'' ćelija iz svakog tkiva dodato u odvojene epruvete za mikrocentrifugu od 0,5 ml. Ćelije su oprane u PBS na 1000 g na 4°C, pa su peletirane ćelije lizirane 10 minuta u 10 mM Tris-IlCl (pll 7,4) koja sadrži 0.4% Triton X-100 i inhibitor proteaze. Lizati su centri fugi rani na 14 000 g, pa su supernatanti skladišteni na -80°C do dana eseja. Nivoi arginaze. određeni merenjem konverzije arginina u omitin i ureu prema standardnoj krivoj za ureu. kvantifikovani su pomoću kompleta Quantichrome Arginase Kit (BioAssav Svstem).

[0139]Za imunofenotipizaciju ćelija. 1,0x 106 ćelija iz svakog tkiva blokirano je sa 10 u g/m I Fc Block (anti-CDl6/32) 30 minuta pre bojenja antitelima na ćelije mijeloidnog porekla (CD1 lb), makrofage (F4/80), M2 makrofage (CD206) i MDSC ćelije (Gr-1). Vijabilnost ćelija određena je pomoću boje Live/Dead Fixable Dead Cell Stain (Invitrogen). Ćelije su fiksirane 15 minuta u 1% paraformaldehidu. a rezultati su dobijeni na protočnom citometru BD LSR II. Analiza podataka izvršena je pomoću softvera Flovv Jo (si. 15).

Rezultati:

[0140]Efekti na rast tumora bili su različiti zavisno od dođeljene terapije, tako da je najbrži rast tumora zabeležen kod miševa lečenih samo antitelima, a najsporiji rast kod miševa lečenih antitelom + kapecitabinom + iksabepilonom (si. 16). U ovoj studiji, cela kohorta životinja žrtvovana je na dan kada je prosečna zapremina tumora u toj kohorti dostigla krajnju tačku veličine od 1500 mm<3>. Miševi u kohorti samo sa antitelom dostigli su srednju zapreminu tumora od 1500mm<3>23. studijskog dana. Kohorte s kapecitabinom i sa iksabepilonom pokazivale su usporen rast tumora, sa dostizanjem krajnje tačke 27. dana. odnosno 29. dana, tim redom, dok je kombinacija kapecitabina i iksabepilona imala najsporiji rast, budući da je ova kohorta dostigla krajnju tačku 30. dana. (01411Kao samostalni agens, IDI 1 nije imao značajan efekat na rast SQ 4T1 tumora (si. 17A). Terapija kapecitabinom rezultirala je vrlo skromnom inhibicijom rasta tumora, a iksabepilon je bio najefikasniji u inhibiciji rasta 4T1 tumora kao monoterapija. Dodavanjem 1 Dl 1 nije povećana efikasnost ni kapecitabina (si. 17B) ni iksabepilona (si. 17C).

|0142]Najjača inhibicija rasta tumora zabeležena je kod miševa koji su primali kombinovanu terapiju IDI 1+kapecitabin+iksabepilon. koja je pokazivala povećanu efikasnost u odnosu na kapecitabin+iksabepilon, same ili sa 13C4 (si. 18A). Vrlo je upečatljivo da je kombinacija 1 Dl 1, kapecitabina i iksabepilona rezultirala najmanjom srednjom zapreminom tumora, 1174.50 mm<3>u vreme žrtvovanja u poređenju s grupama s kombinovanom terapijom s nosačem (1689,06 mm<3>) i s lekom 13C4 (1651,24 mm<3>) u toj kohorti. Kombinacija kapecitabina i iksabepilona bila je efikasnija nego sam kapecitabin (si. 18B), međutim ova kombinacija je bila tek malo efikasnija od terapije iksabepilonom (si. 18C). Što se tiče terapija sa 1 Dl 1, IDI 1+kapecitabin+iksabepilon je bila efikasnija nego 1 Dl 1 +iksabepilon. koja je bila efikasnija nego IDI 1+kapecitabin. koja je bila efikasnija nego 1 Dl 1 kao samostalni agens (si. 19).

[0143|Antitelo IDI 1 nije imalo efekta na broj metastaza koje su se razvile u plućima miševa sa SQ primarnim 4T1 tumorima. Terapija kapecitabinom + iksabepilonom inhibirala je metastaze, a efikasnost ove kombinovane terapije značajno je povećana antitelom 1 Dl 1 (si.

20).

|0144) Imunofcnotipizacijaukupnih makrofaga (CD1 1 b .J '4 80 ) Ml makrofaga (CD1 lb+.F4/80+,CD206), M2 makrofaga (CD1 lb+.F4/80*CD206+) i MDSC ćelija (CD11 b'.(ir-l') otkrila je da su većina CD1 lb" izolovanih iz primarnih 4T1 tumora MDSC ćelije (tabela 1). Izgleda da postoji blago povećanje broja TAM makrofaga i smanjenje broja

MDSC ćelija u primarnim tumorima lečenim antitelom I DI 1 u poređenju s kontrolama. Kvantitativno merenje ukupnih makrofaga. Ml makrofaga i M2 makrofaga izvršeno je računanjem unazad do ukupnog broja ćelija izolovanih iz primarnih tumora prikupljenih od svakog pojedinačnog miša (si. 21). Prema ovoj analizi, nije bilo značajne razlike u broju makrofaga između terapijskih grupa. Međutim, postoji trend porasta CD206- Ml makrofaga iz primarnih tumora (si. 21) miševa lečenih antitelom IDU.

[0145]Iako terapija antitelom 1 Dl 1 nije smanjila broj M2 makrofaga povezanih s tumorima, izgleda da IDI 1 ima inhibitorni efekat na proizvodnju arginaze od strane TAM ćelija. Nivoi arginaze bili su značajno smanjeni iz iizata CD1 lb<*>ćelija miševa lečenih antitelom I Dl 1 u poređenju s kontrolama (si. 22, p <0.001 jednosmernom ANOVA analizom i Takijevim testom višestrukih poređenja)

[0146] Uklinici, objavljeno je da je kombinovana terapija iksabepilonom i kapecitabinom efikasnija od samostalnog kapecitabina kod taksan-rezistentnog tripl-negativnog karcinoma dojke (TNBC). Mišji 4T1 model karcinoma dojke rutinski sc koristi kao dobar surogat za humani TNBC i za pretklinička ispitivanja terapijskih agenasa protiv TNBC. Svrha ranije studije bila je da se odredi da li bi 1 Dl 1 povećao efikasnost kapecitabina. iksabepilona ili kombinacije ova dva hemioterapeutika protiv rasta primarnog tumora i/ili sledstvenih metastaza u singenom 4T1 modelu TNBC.

|0147)Ova studija je dizajnirana da odredi da li bi 1 Dl 1 mogao da poveća efekat hemioterapeutika kapecitabina i iksabepilona na inhibiciju rasta primarnih 411 tumora i metastaze primarnog tumora u pluća. Najjača inhibicija rasta tumora zabeležena je u terapijskoj grupi IDI 1 plus kapecitabin i iksabepilon. Kombinacija kapecitabina i iksabepilona takođe je inhibirala metastaze u pluća, a ovaj efekat dodatno je povećan kada je IDI 1 dodat kombinovanoj terapiji. Kako je zabeleženo u prethodnim studijama sa ovim modelom, 1 Dl l kao samostalni agens nije imao efekta na rast primarnog tumora, nije inhibirao metastaze i nije značajno povećavao efikasnost ni kapecitabina ni iksabepilona kada su se primenjivati kao monoterapije.

[0148]Rezultati studije 09-4255 potvrđuju rezultate prethodne dve studije. 09-3493 i 09-3494. da 1 Dl 1 može značajno da poveća efikasnost kombinovane terapije kapecitabinom i iksabepilonom protiv rasta 4T1 primarnih tumora, a ova studija bila je prva koja je pokazala da IDI 1 može i da poveća inhibiciju metastaza od strane kapecitabina + iksabepilona. Ovi podaci predstavljaju prvo povećanje efikasnosti nekog hemioterapeutika na modelu SQ 4T1 tumora. Prethodno je na ovom modelu IDI 1 kombinovan s paklitakselom, cisplatinom ili karboplatinom i ni u jednoj od ovih studija IDI 1 nije povećavao efikasnost ispitivanih hemioterapeutika.

[0149)Budući da IDI 1 kao samostalni agens nema efekta ni na rast primarnog tumora ni na metastaze, dodatak antitela IDI 1 u kapecitabin+ iksabepiion rezultira sinergističkim efektom. Razlog za ovu sinergiju još nije poznat. Antitelo 1 Dl 1 jedino povećava efikasnost kombinacije kapecitabina i iksabepilona. odnosno IDI 1 nije konzistentno povećavao efikasnost ni kapecitabina ni iksabepilona kada su se ovi hemioterapeutici primenjivali pojedinačno. Antitumorska aktivnost kapecitabina. proleka koji se konvertuje u 5-fluorouracil, posledica je njegove sposobnosti da funkcioniše kao antagonist pirimidina. a iksabepilon je stabilizator mikrotubula. U klinici, kombinacija kapecitabina i iksabepilona bila je efikasnija od oba pojedinačna agensa protiv tripl-negativnog karcinoma dojke. Na modelu 4T1 tumora, efikasnost kombinovane terapije bila je jača nego kod samostalnog kapecitabina, odnosno samo neznatno bolja od one zabeležene kod samostalnog iksabepilona. Pretpostavlja se da targetiranje TGFB antitelom IDI 1 povećava antitumorsku imunost neutralisanjem imunosupresivnih efekata TGFB poreklom iz tumora i strome. Moguće je da bi ovi potencijalno suptilni efekti na modelu ovako agresivnog tumora mogli jedino da povećaju efikasnost hemioterapeutika kada bi se tumori napadali multiplim terapeuticima koji ciljano deluju na multiple puteve.

[0150]U studiji 09-3493, zabeležena je značajna toksičnost kod životinja nosača tumora lečenih kombinacijom kapecitabina i iksabepilona. Doze ova dva terapeutika bile su 360 mg/kg i 6 mg/kg. tim redom. Doza iksabepilona koja može da uzrokuje neuropatiju smanjena je na 3 mg/kg u drugoj studiji u ovoj seriji. 09-3494. To je rezultiralo značajnim smanjenjem toksičnosti i neuropatije, pa je stoga ova doza korišćena u aktuelnoj studiji, lako je kod miševa koji su primali terapiju antitelo/hemioterapeutik zabeležen gubitak u težini, postojalo je značajno smanjenje teških neželjenih dejstava poput paralize zadnjih udova i smrti, koja su zabeležena u studiji 09-3493. Gubitak u težini bio je najčešće neželjeno dejstvo kombinovane terapije, međutim, dodatak antitela IDI 1 nije ni povećao ni smanjio učestalost ove toksičnosti.

[0151]Zajedno gledano, ovi podaci pokazuju da će kombinovanje strategije neutralizacije TGFfi s terapijom kapecitabin+iksabepilon imati povoljniji terapijski učinak u odnosu na terapiju samo kapecitabinom+iksabepilonom u klinici.

[0152]S obzirom na efikasnost koju IDI 1 ima protiv metastaza na drugim tumorskim modelima i povećanje dejstva kapecitabina + iksabepilona u ovoj seriji studija, sprovedeno je nekoliko studija za ispitivanje mehanizma dejstva antitela 1 Dl 1. Utvrđeno je da su citotoksični T limfociti (CTL) ključni za sposobnost antitela IDI I da inhibiše metastaze na modelu spontanih metastaza tumora jastučića na šapama B16-F10. U studiji 09-4255. sproveden je prateći eksperiment pri glavnoj studiji efikasnosti kako bi se odredilo da li neutralizacija faktora TGFB antitelom IDI 1 utiče na regrutovanje. fenotip i/ili aktivnost TAM makrofaga.

[0153]Klasično aktivirani TAM makrofagi, poznati i kao Ml makrofagi. delom su tumoricidni zahvaljujući inducibilnoj NO sintazi. (iNOS). Obrnuto, alternativno aktivirani

TAM makrofagi, ili M2 makrofagi. povezivani su s progresijom tumora putem pospešivanja tumorske invazije, metastaza i angiogeneze. Zabeleženo je u literaturi da M2 makrofagi luče arginazu i da su sposobni da pospešuju proliferaciju tumorskih ćelija preko arginaznog puta. Drugi ćelijski tip, MDSC ćelije, regrutuju se na mesto primarnog tumora, gde imaju imunosupresivnu ulogu. MDSC ćelije i makrofagi su i veliki proizvođači TGFB. koji pomaže u pospešivanju progresije tumora.

[0154]Immunofluorescencija CD68/CD206 kolokalizacijom pokazala je đa su M2 makrofagi prisutni u primarnim 4T1 tumorima nelečenih miševa nosača tumora. U ovoj studiji, zabeležen je trend ka povećanom broju tumoricidnih Ml makrofaga i u primarnim tumorima i u plućima miševa lečenih antitelom 1D11. Terapija antitelom 1 Dl 1 nije dovela do značajnog smanjenja broja dva ćelijska tipa. M2 makrofaga i MDSC ćelija, povezanih s primarnim tumorima. Premda terapija antitelom 1 Dl 1 nije dovela do smanjenja broja tumor-pospešujućih M2 makrofaga niti MDSC ćelija, postoji značajno smanjenje intraćelijske arginaze porekla CD1 lb" ćelija izolovanih iz oba 411 primarna tumora. Ovo demonstrira farmakodinamsku aktivnost IDI l na modelu jer je pokazano da TGFB vrši ushodnu regulaciju sinteze arginaze, koju proizvode pro-tumorigeni M2 makrofagi. i nishodnu regulaciju sinteze enzima iNOS. koju luče anti-tumorigeni Ml makrofagi. Pokazano je da arginaza pospešuje proliferaciju tumorskih ćelija, tako da bi inhibicija proizvodnje arginaze neutralizacijom TGFB mogla imati štetan efekat na proliferaciju i rast tumora.

PRIMER 4

Neutralizacija TGFB pan- neutrališućim TGFB antitelom, 1D11, selektivno povećava

efikasnost hemioterapeutika na pretkliniČkom tumorskom modelu

|0155| Kombinacija TGF-B neutralizacije upotrebom mišjeg monoklonskog antitela 1 Dl 1 i odabranih hemioterapeutika testirana je na mišjem modelu raka dojke, raka pankreasa, melanoma i karcinoma bubrežnih ćelija. Od testiranih kombinacija, jedino je dodatak antitela IDI 1 kombinovanoj terapiji kapecitabin + iksabepilon konzistentno rezultirao povećanom

efikasnošću nad režimom samo sa hemioterapeutikom. Antitelo IDI 1 rutinski je povećavalo efikasnost kapecitabina+iksabepilona protiv rasta primarnog tumora i inhibisalo metastaze u singenom 4T1 supkutanom (SQ) tumorskom modelu i prva je demonstracija aditivnog efekta kada se IDI 1 kombinuje s hemioterapeuticima u nekoliko studija raka.

[0156| Antitelo IDI 1 kombinovano je s paklitakselom i na ksenograft (MDA-MB-231) modelu raka dojke i na singenom 4T1 modelu raka dojke. U ovim studijama, 1 Dl 1 nije povećavao inhibiciju primarnih tumora paklitakselom, a u 4T1 studijama 1 Dl 1 takođe nije povećavao sposobnost paklitaksela da inhibiše spontane metastaze primarnih tumora u pluća. Kombinacija antitela 1 Dl 1 i ciklofosfamida takođe je testirana na ksenograft MDA-MB-231 modelu i ni u ovom slučaju IDI 1 nije povećavao efikasnost ciklofosfamida protiv rasta primarnog tumora. MDA-MB-231 i 411 modeli takođe su korišćeni za testiranje kombinovanih terapija antitelom 1D11 i jedinjenjima platine cisplatinom ili karboplatinom. Na 4T1 SQ modelima, IDI 1 nije povećavao efikasnost karboplatina protiv rasta primarnog tumora. Na 4T1 modelu eksperimentalnih metastaza, gde su tumorske ćelije ubrizgavane u levu srčanu komoru što je rezultiralo metastatskim rasejanjem u kosti, nadbubrežne žlezde. bubrege i pluća, i IDI 1 i cisplatin bili su sposobni đa inhibišu metastaze, naročito u kosti, ali nije zabeležena povećana efikasnost kada su sc ova dva terapeutika kombinovala.

[0157]Nije zabeleženo povećanje efikasnosti kada je 1 Dl 1 kombinovan sa standardnim hemioterapeuticima na modelima raka pankreasa ili melanoma. Gemcitabin je hemioterapeutik prve linije za rak pankreasa, a kombinacija antitela IDI 1 i gemcitabina testirana je na SQ ksenograft modelu ( Panc-1). SQ singenom modelu (Pan02) i na genetski - inženjeriranom mišjem modelu (GEMM) AVt/.v/mutantni p53-indukovanog duktalnog adenokarcinoma pankreasa (PDAC). U Panc-1 studijama. 1 Dl 1 nije imao efekta na efikasnost gemcitabina protiv SQ primarnih tumora, a sličan efekat zabeležen je i u PDAC GEMM. Međutim, na Pan02 modelu, kombi no vanje IDI 1 sa gemcitabinom zapravo je smanjilo efikasnost gemcitabina protiv rasta primarnih tumora, što je rezultovalo ubrzanim rastom tumora u poređenju s kontrolama.

|0158|Mišji B16-FT0 model melanoma korišćen je da se procene efekti kombinovanja antitela IDI 1 sa dakarbazinom, hemioterapeutikom koji se koristi kao prva linija terapije melanoma. Na SQ B16-F10 modelu. IDI 1 nije povećavao efikasnost dakarbazina protiv rasta primarnog tumora. Hemio-kombo terapija antitelom 1 Dl 1 i dakarbazinom takođe je testirana na modelu spontanih metastaza B16-F10 mišjeg melanoma. Na ovom modelu, tumorske

ćelije ubrizgavane su supkutano u plantarni region miševa, gde se razvio primarni tumor koji je spontano metastazirao u regionalni poplitealni limfni čvor. Kao i na SQ modelu. I Dl 1 nije povećavao efikasnost dakarbazina protiv primarnih tumora, a nije ni povećavao efikasnost dakarbazina protiv metastaza u drenirajući limfni čvor

[0159)Na kraju, ID11 je testiran na Caki-1 ksenograft modelu karcinoma bubrežnih ćelija u kombinaciji sa ciklofosfamidom i paklitakselom i u toj studiji izgledalo je da l Dl I smanjuje efikasnost oba ova hemioterapeutika.

[0160JUkratko, podaci jasno pokazuju da neutralizacija TGFB antitelom 1 Dl 1 jedino povećava efikasnost određenih hemioterapeutika. IDI 1 je povećavao efikasnost kombinacije kapecitabina i iksabepilona na pretkliničkom modelu raka dojke, ali nije povećavao efikasnost paklitaksela, ciklofosfamida. cisplatina, karboplatina, gemcitabina niti dakarbazina na relevantnim tumorskim modelima.

[01611 Iskusniu struci prepoznaće da se otelotvorenja opisana gore mogu menjati, a da se ne odstupi od njihovog šireg pronalazačkog koncepta. Stoga je razumljivo da ovaj pronalazak

nije ograničen na konkretna izložena otelotvorenja. već je namenjen da obuhvati modifikacije koje su u opsegu pronalaska, kako je definisano priloženim patentnim zahtevima.

[0162] Specifične karakteristike pronalaska, definisane u originalnim patentnim zahtevima matične prijave, izložene su u narednim pasusima:

1. Metoda za Iečenje raka dojke kod ispitanika, pri čemu metoda obuhvata:

primenu kod pomenutog ispitanika terapijski efikasne količine antagonista transformišućeg faktora rasta (TGFB) u kombinaciji s kapecitabinom i iksabepilonom. naznačeno time što primena pomenutog TGFB antagonista povećava efikasnost kapecitabina i iksabepilona u lečenju pomenutog raka dojke.

2. Metoda iz prethodnog pasusa 1. naznačena time što je pomenuli antagonist TGFB

agens koji blokira vezivanje TGFB proteina za odgovarajući receptor.

3. Metoda iz prethodnog pasusa 2. naznačena time što je pomenuti agens protein.

4. Metoda iz prethodnog pasusa 3. naznačena time što je pomenuti agens anti-TGFB

antitelo.

5. Metoda iz prethodnog pasusa 4. naznačena time što je pomenuto antitelo pan-neutrališuće anti-TGFB antitelo. 6. Metoda iz prethodnog pasusa 4. naznačena time što je pomenuto antitelo anti-TGFB

monoklonsko antitelo.

7. Metoda iz prethodnog pasusa 6. naznačena time što je pomenuto antitelo

humanizovano antitelo koje sadrži jedan ili više CDR regiona antitela 1 Dl 1.

8. Metoda iz prethodnog pasusa 2. naznačena time što je pomenuti TGFB protein TGFB-1.

-2, -3 ili njihova kombinacija.

9. Metoda iz prethodnog pasusa 1. naznačena time sto je pomenuti TGFB antagonist

molekul koji je sposoban da smanji aktivnost TGFB.

10. Metoda iz prethodnog pasusa 1, pomenuti TGFB antagonist se primenjuje zajedno s

kapecitabinom i iksabepilonom.

11. Metoda iz prethodnog pasusa 1, pomenuti TGFB antagonist se primenjuje nezavisno

od primene kapecitabina i iksabepilona.

12. Metoda iz prethodnog pasusa 1. naznačena time Što primena pomenutog TGFB

antagonista u kombinaciji s kapecitabinom i iksabepilonom inhibiše rast primarnog tumora.

13. Metoda iz prethodnog pasusa 1, naznačena time što primena pomenutog TGFB antagonista u kombinaciji s kapecitabinom i iksabepilonom inhibiše metastaze. 14. Metoda iz patentnog zahteva 1. naznačena time što primena pomenutog TGFB antagonista u kombinaciji s kapecitabinom i iksabepilonom inhibiše metastaze primarnog tumora u pluća. 15. Metoda za inhibiciju rasta tumora povezanog s rakom dojke kod ispitanika, pri čemu metoda obuhvata: primenu kod pomenutog ispitanika terapijski efikasne količine antagonista transformišućeg faktora rasta beta (TGFB) u kombinaciji s kapecitabinom i iksabepilonom. naznačeno time što primena pomenutog TGFB antagonista povećava efikasnost kapecitabina i iksabepilona u inhibiciji pomenutog rasta tumora povezanog s rakom dojke. 16. Metoda iz prethodnog pasusa 15, naznačena time Sto je pomenuti TGFB antagonist agens koji blokira vezivanje TGFB proteina za odgovarajući receptor.

17. Metoda iz prethodnog pasusa 16. naznačena time sto je pomenuti agens protein.

18. Metoda iz prethodnog pasusa 17. naznačena time što je pomenuti agens anti-TGFB antitelo. 19. Metoda iz prethodnog pasusa 18, naznačena time što je pomenuto antitelo pan-neutrališuće anti-TGFB antitelo. 20. Metoda iz prethodnog pasusa 18. naznačena time što je pomenuto antitelo anti-TGFB monoklonsko antitelo. 21. Metoda iz prethodnog pasusa 20. naznačena time što je pomenuto antitelo humanizovano antitelo koje sadrži jedan ili više CDR regiona antitela 1 Dl 1. 22. Metoda iz prethodnog pasusa 16, naznačena time što je pomenuti TGFfi protein TGFB-1, -2, -3 ili njihova kombinacija. 23. Metoda iz prethodnog pasusa 15. naznačena time sto je pomenuti TGFfi antagonist molekul koji je sposoban da smanji aktivnost TGFfi. 24. Metoda iz prethodnog pasusa 15, pomenuti TGFB antagonist se primenjuje zajedno s kapecitabinom i iksabepilonom. 25. Metoda iz prethodnog pasusa 15. pomenuti TGFB antagonist se primenjuje nezavisno od primene kapecitabina i iksabepilona. 26. Metoda iz prethodnog pasusa 15, naznačena time što primena pomenutog TGFB antagonista u kombinaciji s kapecitabinom i iksabepilonom inhibiše rast primarnog tumora. 27. Metoda iz prethodnog pasusa 15, naznačena time što primena pomenutog TGFB antagonista u kombinaciji s kapecitabinom i iksabepilonom inhibiše metastaze. 28. Metoda iz prethodnog pasusa 15, naznačena time što primena pomenutog TGFB antagonista u kombinaciji s kapecitabinom i iksabepilonom inhibiše metastaze primarnog tumora u pluća.

Claims (16)

1. Farmaceutska kompozicija za Iečenje raka dojke kod ispitanika koja sadrži: terapijski efikasnu količinu antagonista transformišućeg faktora rasta beta (TGFB), kapecitabina i iksabepilona, naznačena time što je pomenuti TGFB antagonist prisutan u količini delotvornoj da poveća efikasnost kapecitabina i iksabepilona u lečenju pomenutog raka dojke.

2. Kompozicija prema zahtevu 1. naznačena time što je pomenuti TGFB antagonist agens koji blokira vezivanje TGFB proteina za odgovarajući receptor.

3. Kompozicija prema zahtevu 2. naznačena time što je pomenuti agens protein.

4.Kompozicija prema zahtevu 3. naznačena time što je pomenuti agens anti-TGFB antitelo.

5. Kompozicija prema zahtevu 4, naznačena time što je pomenuto antitelo pan-neutrališuće anti-TGFB antitelo.

6. Kompozicija prema zahtevu 4. naznačena time što je pomenuto antitelo anti-TGFB monoklonsko antitelo.

7. Kompozicija prema zahtevu 6. naznačena time što je pomenuto antitelo humanizovano antitelo koje sadrži jedan ili više CDR regiona antitela IDI 1.

8. Kompozicija prema zahtevu 2. naznačena time što je pomenuti TGFB protein TGFB-1, -2. - 3 ili njihova kombinacija.

9. Komplet za Iečenje raka dojke kod ispitanika koji sadrži: terapijski efikasnu količinu antagonista transformišućeg faktora rasta beta (TGFB). kapecitabina i iksabepilona. naznačen time što je pomenuti TGFB antagonist prisutan u količini delotvornoj da poveća efikasnost kapecitabina i iksabepilona u lečenju pomenutog raka dojke.

10. Komplet prema zahtevu 9. naznačen time što je pomenuti antagonist TGFB agens koji blokira vezivanje TGFB proteina za odgovarajući receptor.

11. Komplet prema zahtevu 10, naznačen time što je pomenuti agens protein.

12. Komplet prema zahtevu 11, naznačen time što je pomenuti agens anti-TGFB antitelo.

13. Komplet prema zahtevu 12. naznačen time što je pomenuto antitelo pan-neutrališuće anti-TGFB antitelo.

14. Komplet prema zahtevu 13. naznačen time stoje pomenuto antitelo anti-TGFB monoklonsko antitelo.

15. Komplet prema zahtevu 14. naznačen time što je pomenuto antitelo humanizovano antitelo koje sadrži jedan ili više CDR regiona antitela 1 D1 1.

16. Komplet prema zahtevu 10, naznačen time što je pomenuti TGFB protein TGFB-1. -2, -3 ili njihova kombinacija.