RS54981B1 - Bakterini tretirani toplotom i vakcine tipa emulzije izrađene od ovakvih bakterina tretiranih toplotom - Google Patents

Abstract

Otkriveni su bakterini tretirani toplotom, postupak za dobij anje bakterina tretiranih toplotom i emulzione vakcine izrađene od ovih bakterina tretiranih toplotom.

Description

OBLAST PRONALASKA

Ovaj pronalazak se generalno odnosi na oblast vakcina i na postupke za stabilizaciju vakcina tipa emulzije. Posebno, ovaj pronalazak se odnosi na bakterine tretirane toplotom, na postupak dobijanja bakterina tretiranih toplotom i na vakcine tipa emulzije izrađene od ovakvih bakterina tretiranih toplotom.

STANJE TEHNIKE

Vakcinacija se sve više koristi za kontrolu infektivnih oboljenja kod životinja. U vakcinama se često koriste hemijski dodaci, jer su sposobni da povećaju humoralni i/ili celularni imuni odgovor na antigen. Vakcine se često formulišu kao emulzije zato što emulzija može da deluje kao hemijski dodatak i ima osobine zadržavanja antigena u obliku depoa na mestu injekcije. U emulzijama vakcina se često koriste emulgatori. Pored korišćenja emulgatora, stabilnost emulzije vakcina može takođe da se postigne redukcijom veličine čestica emulzije mehaničkim sredstvima.

U.S. patent broj 5,084,269 se odnosi na hemijski dodatak formulacije koja sadrži lecitin u kombinaciji sa mineralnim uljem, koji izaziva manju iritaciju kod životinje primaoca, a istovremeno dovodi do povećanja sistemskog imuniteta. Kompozicije u skladu sa US Patentom 5,084,269 su u komercijalnoj upotrebi pod trgovačkim nazivom AMPHIGEN® zaštićeno ime Pfizer, Inc.

Generalno, bakterijski antigeni su nestabilni kada se zagrevaju i čak kratko izlaganje povišenim temperaturama može da redukuje aktivnost antigena. Na primer, postojeće vakcine za antraks mogu potpuno da izgube biološku aktivnost u roku od 48 sati na 37° C (S. Sing, N. Ahuja, V. Chauhan, E. Rajasekaran, W. S. Mohsin, R. Bhat, and R. Bhatnagar; Bioche. Biophvs. Res. Commun. 2002 Sep. 6; 295(5): 1058-62).

KRATAK. OPIS PRONALASKA

Ovaj pronalazak se odnosi na bakterine tretirane toplotom, na postupak za izradu bakterina tretiranih toplotom i na vakcine tipa emulzije izrađene od takvih bakterina tretiranih toplotom. Postupak uključuje zagrevanje bakterina na temperaturi od približno 35 do približno 80 °C da se formira bakterin tretiran toplotom.

DETALJAN OPIS

DEFINICIJE

Prihvatljiva antigenska aktivnost - Naziv "prihvatljiva antigenska aktivnost" označava sposobnost da se indukuje zaštitni imuni odgovor kod vakcinisanih životinja nakon izazivanja ili propuštanjem kodiranog testa potencije sa homolozima živog organizma.

Bakterin - Naziv "bakterin" označava suspenziju ubijenih bakterija koja može da se koristi kao komponenta vakcine.

Emulgator- Naziv "emutgator" označava supstancu koja se koristi za stabilizaciju emulzije.

Emulzija - Naziv "emulzija" označava kompoziciju dve tečnosti koje se ne mešaju, u kojoj su male kapi jedne tečnosti suspendovane u kontinuiranoj fazi druge tečnosti.

Bakterin tretiran toplotom - Naziv "bakterin tretiran toplotom" označava bakterin koji je tretiran toplotom i koji ima aktivnost 50% ili manju od lipaza aktivnosti pre tretmana toplotom i koji ima prihvatljivu antigensku aktivnost.

Invertna emulzija - Naziv "invertna emulzija" označava emulziju voda u ulju.

Lipaza Naziv "lipaza" označava enzime, esteraze, lipaze i fosfolipaze, koji mogu da dovedu do razbijanja emulgtora u emulziji vakcine.

Normalna emulzija - Naziv "normalna emulzija" označava emulziju ulje u vodi.

Emulzija ulje u vodi - Naziv "emulzija ulje u vodi" označava emulziju u kojoj su male kapi ulja suspendovane u kontinuiranoj vodenoj fazi.

Sobna temperatura - Naziv "sobna temperatura" označava temperaturu od 18 do 25 "C.

Emulzija voda u ulju - Naziv "emulzija voda u ulju" označava emulziju u kojoj su kapljice vode suspendovane u kontinuiranoj uljanoj fazi.

OPIS

Ovaj pronalazak se odnosi na bakterine koji redukuju aktivnost lipaze, na vakcine izrađene od ovih bakterina i na postupak redukcije lipaza aktivnosti bakterina. Pored antigenskih komponenti, neki bakterini imaju lipaza aktivnost. Kada se bakterini sa lipaza aktivnošću inkorporiraju u emulziju, lipaza može da razori emulgator koji je korišćen za izradu emulzije. Vakcine tipa emulzije koje sadrže bakterine koji imaju visoku lipaza aktivnost imaju tendenciju da budu nestabilne emulzije, a one koje sadrže bakterine sa niskim nivoom lipaze, imaju tendenciju da budu stabilne. Primeri bakterija koje mogu, kada se ubiju, da produkuju bakterine sa lipaza aktivnošću,uključuju Aceinetobacter calcoaceticus. Acetobacter paseruianus.

Aeromonas hydrophila, Alicvclobacillus acidocaldarius, Arhaeglobus fulgidus, Bacillus purnihts,

Bacillus stearothermophillus, Bacillus subtilis, Bacillus thermocatemilatus, Burkholderia

cepacia, Burkholderia glumac, Campvlobacter coli, Campylobacter jejani, Campvlobacter

hyointestinalis, Chlamydia trachomatis, Chromohacterium viscosum, Erysipelothrix

rhusiopathieae, Listeria monocytogenes Eschehchia coli, Haemophilus influenzae, Lawsonia

intracellularis, Legionella pneumophilia, Moraxellsa sp., Mycoplasma hyopneumoniae,

Mvcoplasma mvcoides subsp. mvcoides LC, Clostridium perfringens, Photorhabdus

luminescens, Propionibacterium acnes, Proteus vulgahs, Pseudomnas wisconsinensis,

Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens C9, Pseudomonas lfuorescens SIKWI,

Pseudomonas fragi, Pseudomonas luteola, Pseudomonas oleovorans, Pseudomonas sp Bll- l,

Alcaliges eutrophus, Psvchrobacter immobilis, Rickettsia prowazekii, Salmonella typhimurium,

Serratia marcescens, Spirlina platensis, Staphlyoccocus aureus, Staphyloccoccus epidermidis,

Staphylococcus hyicus, Streptomyces albus, Streptomyces cinnamoneus, Streptomyces exfoliates,

Streptomyces scabies, Sulfolobus acidocaldarius, Syechocystis sp., Vibrio cholerae, Borrelia

burgdorferi, Treponema denticola, Treponema minutum, Treponema phagedenis, Treponema

refringens, Treponema vincentii, Treponema palladium.iLeptospiravrsta, kao što su poznati patogeniLeptospira canicola, Leptospira grippotyposa, Leptospira hardjo, Leptospira

icterohaemorrhagiae,iLeptospira pomona.

Lipaza, koja može da razori emulgatore koji se koriste u izradi emulzije, i na taj način da dovede do nestabilnosti i razaranja emulzije, može da obuhvati jedan ili više enzima koji razaraju emulziju, kao što su esteraze, lipaze i fosfolipaze. Ovi enzimi esteraze, lipaze i fosfolipaze se za zajednički označavaju kao lipaza. Lipaza aktivnost bakterina može da se meri pomoću sintetičkog substrata pod imenom O-pivaloiloksimetil umbeliferon (C-POM). Brzina hidrolize izazvane lipazom je mera aktivnosti lipaze. Brzina reakcije hidrolize izazvane lipazom u ovoj reakciji se prati povećanjem intenziteta fluorescencije produkta nastalog aktivnošću lipaze. Brzina reakcije zavisi od tačno izabranih uslova za test hidrolize, tako da upoređivanje nivoa aktivnosti lipaze, mereno brzinom hidrolize, može da se izvrši korišćenjem podataka dobijenih pod istim uslovima testa. U literaturi su postupci otkriveni u nekoliko članaka, uključujući Kurioka S., and Matsuda M.(1976)^««. Biochem.75: 281-289, De Silva NS, i Quinn PA.

(1987) J. Clin. Microbiol.25: 729-731, i Grau, A., and Ortiz, A. (1998)Chem. Phys. ofLipids.91: 109-118.

U vakcini tipa emulzije, razbijanje emulzije dovodi do razdvajanja faza komponenti. Ovo je nepoželjno, jer kada su faze razdvojene pojedinačne doze koje se uzmu iz kontejnera mogu da ne sadrže iste vrednosti komponenti vakcine. Dodatno, gubitak emulzije može da dovede do gubitka aktivnosti emulgatora kao hemijskog dodatk, a to dovodi do redukcije u antigenskom efektu vakcine.

Razređeni živi virusi su često uključeni u vakcine zajedno sa bakterinima. Ove vakcine su korisne jer pojedinačna vakcina može da se koristi za stvaranje imuniteta na različite bolesti sa jednom vakcinom. Ukoliko je u bakterinu prisutna lipaza aktivnost, to će da dovede do odvajanja emulgatora od emulzije. Ovaj slobodni emulgator može da izazove poremećaj i da inaktivira žive viruse vakcine i na taj način da dovede do gubitka virusne infektivnosti.

Bakterini korisni u vakcinama mogu da se formiraju gajenjem potrebnih bakterija, a nakon toga se bakterije ubiju da se dobije bakterin koji sadrži različite komponente bakterija, uključujući komponente ćelijskog zida. Bakterija može da se ubije različitim postupcima, uključujući njihovo izlaganje jedinjenju kao što su mertiolat, formalin, formaidehid, dietilamin, binarni etilenamin (BEI), betapropiolakton (BPL) i glutaraldehid. Mogu da se koriste kombinacije ovih jedinjenja. Osim toga, bakterije mogu da se ubiju sterilizacijom radijacijom.

Nađeno je da lipaza aktivnost bakterina koji ima ovakvu lipaza aktivnost može da se redukuje tretmanom zagrevanjem. Posebno, lipaza aktivnost bakterina može da se redukuje zagrevanjem bakterina do temperature od približno 35 do približno 80 °C da se formira bakterin tretiran toplotom, koji takođe poseduje antigensku aktivnost. Tretman toplotom se izvodi u dovoljno dugom vremenskom periodu daje lipaza aktivnost bakterina tretiranog toplotom 50% ili manja od te aktivnosti bakterina pre tretmana toplotom. Za dobru stabilnost vakcine tipa emulzije nije neophodno da se lipaza aktivnost redukuje do nule. Mi smo otkrili da vakcine koje mogu dugo da se Čuvaju, mogu da se izrade od bakterina tretiranih toplotom koji imaju nivo lipaza aktivnosti 50% ili manji od nivoa lipaza aktivnosti pre tretmana toplotom.

Kada se kao mera lipaza aktivnosti bakterina koristi brzina hidrolize test substrata, tada se brzina hidrolize test substrata pre tretmana toplotom upoređuje sa brzinom hidrolize nakon tretmana toplotom. Tretman toplotom se izvodi tako da redukuje brzinu hidrolize do 50% ili manje od brzine hidrolize koja je dobijena za svež bakterin.

Egzaktan postupak merenja vrednosti lipaza aktivnosti nije presudan sve dok se isti postupak koristi za merenje aktivnosti pre tretmana toplotom i aktivnosti nakon tretmana toplotom. Na primer, ukoliko se brzina hidrolize test substrata meri korišćenjem jednog substrata, drugi substrat može da produkuje različitu brzinu. Međutim, ukoliko se isti substrat koristi za inicijalno određivanje aktivnosti i određivanje aktivnosti nakon tretmana, odnos brzina će da pokaže efekat tretmana toplotom.

Za bakterine koji uključuju jednu ili više od sledećih,Leptospira canicola, Leptospira

icterohaemorrhagiae. Leptospira grippotvphosa. Leptospira pontona,dati su kodirani testovi za antigensku aktivnost (9CFR §113.101, §113.102, §113.103, §113.104, i §113.105). Prihvatljiva antigenska aktivnost za ove vrste se definiše kao sposobnost da indukuju zaštitni imuni odgovor kod vakcinisanih hrčaka, tako da kada se hrčci nadraže sa homolozima žive bakterije, najmanje 75% vakcinisanih hrčaka preživi u modelu gde najmanje 80% ne-vakcinisanih hrčaka ne preživi. U slučaju antigena,Leptospira hardjo,prihvatljiva antigenska aktivnost se definiše kao sposobnost vakcine da indukuje serološku aglutinaciju prosečnog geometrijskog titra naLeptospira hardjood<>>40 kod teladi koji su vakcinisani sa vakcinom koja sadrži bakterijski antigen,Leptospira hardjo.Za druge bakterine, prihvatljiva antigenska aktivnost se definiše kao sposobnost da indukuju zaštitni imuni odgovor kod vakcinisanih životinja nakon izazivanja ili propuštanjem kodiranog testa potencije sa homolozima živog organizma.

Tretman toplotom može da se izvede u velikom rasponu temperatura, i u toku promenljive dužine trajanja. Generalno, zagrevanje može da se vrši na temperaturi od približno 35 do približno 80 °C, u toku približno 20 minuta do približno 24 sata. Kada se bakterin zagreva na višoj temperaturi, kao stoje približno 75 do približno 80 °C, vreme zagrevanjaje kraće. Kada se zagrevanje vrši na nižoj temperaturi, zagrevanje se vrši u toku dužeg vremenskog perioda. Jedna od kombinacija temperature i vremena je zagrevanje na temperaturi od približno 60 do približno 70 °C, u toku približno 9 do približno 10 sati. Naredna kombinacija temperature i vremena je zagrevanje na temperaturi od približno 65 do približno 70 °C, u toku približno 5 do približno 8 sati. Naredna kombinacija temperature i vremena je zagrevanje na temperaturi od približno 65 do približno 70 °C, u stoku približno jedan sat. Naredna kombinacija temperature i vremena je zagrevanje na temperaturi od približno 55 do približno 65 °C, u toku približno 5 do približno 8 sati.

Bakterini, nakon tretmana toplotom, imaju manju lipaza aktivnost nego sveže izrađeni bakterini, ali s druge strane mogu da se formulišu na isti način kao sveže izrađeni bakterini. U skladu sa tim, bakterini tretimi toplotom mogu da se inkorporiraju u vakcine uobičajenim postupcima za izradu vakcina. Postupci su dobro poznati u tehnici.

Vakcine tipa emulzije mogu da se formiraju kombinacijom željenog bakterina sa uljanom fazom i emulgatorom, ili emulgatorima. Kombinacija se nakon toga podvrgne intenzivnom mešanju da se formira emulzija. Odgovarajući postupci mešanja obuhvataju homogenizaciju, a nakon toga mikrofluidizaciju. Pre emulzifikacije, u kombinaciju mogu da se dodaju konzervansi i ekscipijenti.

Vakcine mogu da uključe i bakterine i virusne antigene. U izradi vakcine koja uključuje bakterine i virusne antigene, bakterini, bakterins, neki virusni antigeni koji treba da se inkorporiraju, emulgator, ili emulgatori, i opciono konzervansi i ekscipijenti se kombinuju sa uljanom fazom i emulguju. Nakon formiranja emulzije, pH formulacija može da se podesi na odgovarajući pH koristeći ili rastvor NaOH ili HC1. Za upotrebu vakcine, generalno je poželjnije da pH bude bliže neutralnom kako bi se izbegla iritacija na mestu injektiranja. Uobičajen je pH od približno 7.0 do približno 7.3.

Pogodne uljane faze za izradu vakcine tipa emulzije uključuju ulja koja se ne metabolišu i ulja koja se metabolišu. U ulja koja se ne metabolišu spadaju mineralna ulja, kao što je belo mineralno ulje i Iako mineralno ulje. Ulja koja se metabolišu uključuju biljna ulja, riblja ulja i sintetičke gliceride masne kiseline.

Primeri emulgatora koji mogu da se koriste u izradi vakcina tipa emulzije iz ovog pronalaska su fosfolipidi, estri sorbitana, estri polietoksiliranog sorbitana i derivati manitola, koji su uobičajeni emulgatori u vakcinama. U fosfolipidne emulgatore spadaju lecitin, fosfatidiletanolamin, fosfatidilinizitol, fosfatidilserin i lecitin (na primer, kao što je AMPHIGEN<®>). Emulgatori estra sorbitana uključuju sorbitan monolaurat, (na primer Spari® 20 i Arlacel® 20), sorbitan monooleat (na primer Špan* 80 i Arlacel<*>80), sorbitan monopalmitat (na primer Span 40 i Arlacel 40) i sorbitan monostearat (na primer Span 60 i Arlacel 60). Estri polietoksiliranog sorbitana uključuju polietoksi sorbitan monolaurat (na primer Tween 20 i Tweeri8 21), polietoksi sorbitan monooleat (na primer Tween® 80), polietoksi sorbitan monopalmitat (na primer Tvveeri<*>40) i polietoksi sorbitan monostearat (na primer Tween<B>' 60). U emulgatore derivate manitola spadaju manitoloktadekanoatni etri. Span<*>, Arlacel* i Tween<*>su zaštićena imena ICI America. AMPHIGEN® je zaštićeno ime Pfizer-a, Inc. Generalno, vakcine se formulišu kao normalne emulzije tipa ulje u vodi, mada je moguće da se izrade invertne emulzije tipa voda u ulju.

U vakcinama mogu da se koriste različiti hemijski dodaci, kao što su Quil A, holesterol, aluminijum fosfat i aluminijum hidroksid, i konzervansi kao što je mertiolat. Quil A je prečišćena mešavina kvilaja saponina ekstrahovanih iz kore južno američkog drveta Quillaja Saponaria Molina. Quil A deluje direktno na imuni sistem akvirajući opšte stanje osetljivosti. Delujući tako, indukuje i humoralne odgo vore i odgovore u kojima je posrednik ćelija. Lipofilni lanac dozvoljava da se interakcija antigena i hemijskog dodatka odvoji u citozol za učestvovanje u endogenim putevima. Quil A se često koristi sa holesterolom zato što holesterol, kada se doda u odgovarajućem odnosi, eliminiše manje poželjne sporedne efekte. Holesterol gradi nerastvorljive komplekse sa Quil A, i na taj način formira strukture slične heliksu tako što se holesterol vezuje sa Quil A, čime se oslobađaju delovi šećera u molekuli, što pomaže stimulaciju imunog odgovora.

Uobičajeno je da se u vakcine koje sadrže bakterine dodaju virusni antigeni. Jedna od prednosti ovakvog pristupa je što jedna vakcina može da se koristi za stvaranje imuniteta za nekoliko bolesti, umesto da se zahteva doziranje više različitih vakcina kako bi se postigao isti rezultat. U vakcinama mogu da se koriste i ubijeni virusi i razblaženi živi virusi. Između virusa koji mogu da se koriste su ptičiji herpesvirus, goveđi herpesvirusi, pseći herpesvirusi, konjski herpesvirusi, mačji viralni rinotraheitis virus, virus Marek-ove bolesti, ovčiji herpesvirusi, svinjski herpesvirusi, pseudorabijes virus, ptičiji paramiksovirusi, goveđi respiratorni sincitijalni virus, pseći distemper virus, pseći virus parainfluence, goveđa parainfluenca 3, ovčija parainfluenca 3, Rinderpest virus, virus Border-ove bolesti, goveđi virus viralne dijareje (BVD), klasičan virus svinjske groznice, ptičiji Leukosis virus, goveđi imunodeficijentni virus, goveđi virus leukemije, konjski virus infektivne anemije, mačji imunodeficijentni virus, mačji virus leukemije, ovčiji virus progresivne pneumonije, ovčiji virus adenokarcinoma pluća, pseći koronavirus, goveđi koronavirus, mačji enterični koronavirus, mačji virus infektivnog peritonitisa, svinjski virus epidemične dijareje, svinjski virus hemaglutinativnog encefalomijelitisa, svinjski parvovirus, virus prenosivog gastroenteritisa, ćureći koronavirus, goveđi virus efemeralne groznice, besnilo, virus vezikulamog stomatitisa, ptičija groznica, virus konjske groznice, virus svinjske groznice, virus pseće groznice, virus istočno psećeg encefalitisa (EEE), virus venecuelanskog psećeg encefalitisa i virus zapadno psećeg encefalitisa.

Ukoliko je lipaza aktivnost prisutna u bakterinu, može da izazove odvajanje emulgatora iz emulzije. Slobodan emulgator može da poremeti omotač živog virusa i inaktivira žive viruse vakcine i na taj način dovede do gubitka virusne infektivnosti. U skladu sa tim, tretman bakterina toplotom omogućava stabilizaciju emulzije i čuva efekte njenih hemijskih dodataka kao što čuva i viralnu infektivnost virusa

Naredni primeri su dati u svrhu dalje ilustracije i nemaju za cilj da ograniče okvir pronalaska za koji se traži zaštita.

PROCEDURE

Procedura 1 Određivanje zamućenosti

Zamućenost se određuje u Nefelometrijskim jedinicama (NU) postupkom razlaganja svetlosti. Intenzitet razložene svetlosti od strane uzorka pod definisanim uslovima se poredi sa intenzitetom razlaganja svetlosti standardnom referentnom suspenzijom. Veći intenzitet razložene svetlosti, veća zamućenost uzorka. Izvor svetlosti se usmeri na uzorak, a razlaganje svetlosti se meri na 90° od pravca izvora svetlosti. Instrumenti su podešeni merenjem razlaganja svetlosti suspenzije formazina.

Kalibracija instrumenta Nefeiometra

Ultra-filtrirana voda se dobija filtriranjem destilovane vode kroz membranski filter koji ima veličinu pora od 0.2 pm. Prvi rastvor se izrađuje rastvaranjem 1.00 g hidrazin sulfata, (NHi) H2SO4, u ultra-filtriranoj vodi i razblaživanjem sa ultra-filtriranom vodom do 100 ml, u odmernoj tikvici. Drugi rastvor se izrađuje rastvaranjem 10.00 g. heksametilentetramina u ultra-filtriranoj vodi i razblaživanjem sa ultra-filtriranom vodom do 100 ml, u odmernoj tikvici. Suspenzija formazina se izrađuje mešanjem 5.0 ml prvog rastvora sa 5.0 ml drugog rastvora. MeŠavina se ostavi da stoji u toku 24 sata, na približno 24 °C. MeŠavina se razblaži do lOOml sa ultra-filtriranom vodom da se formira suspenzija osnovne zamućenosti koja ima zamućenost od 400 NU. Suspenzija formazina koja ima zamućenost od 40 NU se izrađuje razblaživanjem 10.00 ml suspenzije osnovne zamućenosti do 100 ml sa ultra-filtriranom vodom. Dalji rastvori za kalibraciju se izrađuju razblaživanjem osnovnog rastvora.

Merenje zamućenosti

Uzorak koji se meri se razblaži sa ultra-filtriranom vodom tako daje zamućenost u opsegu kalibriranog raspona nefeiometra. Meri se zamućenost, a početna zamućenost se izračunava po sledećoj jednačini:

gde: M je zamućenost razblaženog uzorka u NU

D je zapremina vode za razblaživanje, u mL

O je zapremina početnog uzorka, u mL

Procedura 2 Analiza lipaze

Aktivnost lipaze se određuje pomoću O-pivaloksimetilumbeliferona kao fluorogenskog substrata. Hidrolizom ovog ne-fluorescentnog substrata, koju katalizira lipaza dobija se

hidroksimetiletar, koji je nestabilan u vodenoj sredini. Razlaganje nestabilnog hidroksimetiletra dovodi do stvaranja fonnaldehida i fluorescentnog produkta umbeliferona. Praćenjem intenziteta fluorescencije dobijenog umbeliferona, u funkciji vremena, dobija se mera kinetičke osetljivosti enzimatičke aktivnosti lipaze.

Rastvori O-pivaloksimetilumbeliferona (Molecular Probes produkt broj P35901) se izrađuju u čistom DMSO, u osnovnoj koncentraciji od 5 mM; nekorišćeni rastvor se čuva na -20 °C, zaštićen od svetlosti. Rastvor 5 mM O-pivaloksimetilumbeliferona se razblaži do 750 uM koristeći 58 mM TRIS-HC1 pufera (pH 8.0), a dobijeni rastvor se zagreje na 37 °C. UzorakLeptospiraili kontrolni rastvor pufer/medijum se centrifugira 10 minuta na sobnoj temperaturi pri 6500 X obrtaja da se formiraju peleta i supernatant. Reakcije se izvode kombinacijom 15 uL 100 mM TRIS-HC1 pufera (pH 8.0) sa 15 uL supematanta, na sobnoj temperaturi iz uzorkaLeptospiraili iz kontrolnog uzorka pufer/medijum, u kivetama za ispitivanje na pločama sa 96 otvora male zapremine (Corning 3393, crna nevezujuća površina polistirena, pola oblasti); prvo inkubira 10 minuta na 37 °C; a nakon toga se reakcija započinje dodavanjem 20 uL uzorkaO-pivaloksimetilumbeliferona koncentracije 750 uM ili kontrolnog uzorka pufer/medijum. Dobijene reaktivne mešavine sadrže 53 mM TRIS-HC1 pufera (pH 8.0) i 0 ili 300 uMO-pivaloksimetilumbeliferona. Intenzitet fluorescencije se meri u intervalima od 30-45 sekundi u periodu od jedn sat (Spectramax Gemini XS, 37 °C, >*ex= 360 nm,Aem=460 nm, PMT osetljivost podešena na 'srednju', 6 očitavanja po kiveti). Brzina reakcije se određuje iz nagiba rezultujuće progresivne krive.

PRIMERI

Primer 1 Redukcija lipaza aktivnosti tretmanom toplotom

Izradi se grupa leptospira ubijenih mertiolatom koja sadrži sledećevrste Leptospira

canicola, Leptospira icterohaemorrhagiae, Leptospira grippotvphosa, Leptospira hardjoi

Leptospira pomonada se formira bakterin. Šest uzoraka bakterina se ostavi u toku noći (aproksimativno 12 sati) na 4 °C, 37 °C, 45 °C, 56 °C, 65 °C i 80 °C. Uzorak ostavljen na 4 °C

služi kao ne-tretirani kontrolni uzorak. Uzorci ostavljeni 12 sati na 37 °C, 45 °C, 56 °C, 65 °C i 80 °C su uzorci tretirani toplotom. Nakon stajanja, meri se brzina kojom test substrat hidrolizira u prisustvu svakog bakterina, u skladu sa postupkom iz Procedure 2. Brzina hidrolize za uzorak podeljeno sa brzinom hidrolize uzorka čuvanog na 4 °C se pomnoži sa 100 i to predstavlja procenat osnovne lipaza aktivnosti svakog bakterina koja ostaje nakon čuvanja. Naredna tabela pokazuje temperaturu čuvanja i procenat osnovne lipaza aktivnosti koja je preostala nakon čuvanja.

Primer 2 Izrada eksperimentalnih formulacija vakcine

Zaseju se kultureLeptospira canicola, Leptospira icterohaemorrhagiae, Leptospira grippotvphosa, Leptospira hardj,iLeptospira pomona.Zamućenost svake kulture se meri u nefelometričnim jedinicama (NU). Bakterije se ubiju sa mertiolatom da se formiraju bakterini. Svaki bakterin se tretira toplotom na 65 °C u toku 8 sati da se redukuje lipaza aktivnost. Bakterini se kombinuju, a nakon toga mešaju sa AMPHIGEN<®->om, hemijskim dodacima, konzervansima i puferom za razblaživanje tako da svakih 5 ml doze vakcine sadrži komponente koje su navedene u niže datoj tabeli.

Koncentracija antigena

Formulacija se homogenizuje koristeći Silverson homogenizator i mikronizira koristeći mikronizer proizvođača Microfluidics. Nakon homogenizacije i mikroniziranja, pH formulacije se podesi na pH 7.0 do 7.3.

Primer 3 Testiranje potencije na hrčkovima i kravama

Vakcina iz Primera 2 se primenjuje na hrčkovima i kravama za testiranje potencije koristeći standardne modele labolatorijskih i domaćih životinja. Hrčkovi koji se ispituju se zaraze sa dozomLeptospira canicola, Leptospira icterohaemorrhagiae, Leptospira grippotvphosa, Hi Leptospira pomonada se testira potencija vakcina. Broj preživelih je mera koja pokazuje efikasnost. Mikroskopski titri aglutinacije kod govečeta se mere na delovanjeLeptospira hardjoda se pokaže potencija ove frakcije vakcine na kravama. Niže data tabela pokazuje da su vakcine izrađene od Leptospira bakterina tretiranih toplotom sposobne da produkuju antigenski odgovor koji zadovoljava kriterijum efikasnosti.

Primer 4 Fizikohemijsko ispitivanje vakcina

Vakcina se izrađuje od Leptospira bakterina tretiranih toplotom u skladu sa postupkom iz Primera 2. Slična vakcina se izradi i od Leptospira bakterina ne-tretiranih toplotom, u skladu sa postupkom iz Primera 2. Obe formulacije vakcine se čuvaju 60 dana na 4 °C. Analiza veličine čestica se izvrši za svaku vakcinu kada je sveže izrađena, na dan 0 i ponovo na dan 60, pomoću laserskog difraktometra.

Niže dati dijagrami pokazuju distribuciju veličine Čestica za svaku vakcinu na dan 0, pre i nakon čuvanja u toku 60 dana.

Analiza veličine čestica vakcine koja sadrži Leptospira bakterine tretirane toplotom na dan 60

Vakcina izrađena od Leptospira bakterina tretiranih toplotom pokazuje zadržavanje veličine čestica, što ukazuje na stabilnost emulzije. Vakcina izrađena od Leptospira bakterina ne-tretiranih toplotom pokazuje povećanje veličine čestica, što ukazuje daje emulzija razorena.

Primer 5 Ispitivanje viricidala

Po postupku iz Primera 2, izrade se vakcine od Leptospira bakterina ne-tretiranih toplotom i od Leptospira bakterina tretiranih toplotom. Nakon 5 do 6 meseci stajanja, vakcine se testiraju na viricidalnu aktivnost za BHV-1 virus, PB virus i BRSV virus. Test viricidalne aktivnosti se izvodi kontrolnim ispitivanjima rehidratacije mo no valentnih viricida (VAC), sa razblaženjem hemijskog dodatka koji se testira. Dva kontrolna ispitivanja monovalentnih viricida se rehidratišu za svaku određenu zapreminu. Dva rehidrirana monovalentna VACs se grupišu i inkubiraju dva sata na 20-25 °C pre titracije i inokuliranja na ćelije kako bi se, pomoću TCID50(50% zaražene određene kulture tkiva), odredio titar živih virusa. Gubitak titra virusa veći od 0.7 TCID5o/nil nije zadovoljavajući.

Rezultati ispitivanja viricida koji pokazuju smanjenje titra virusa su navedeni u niže datoj tabeli:

Vakcine izrađene od Leptospira bakterina ne-tretiranih toplotom pokazuju visoke vrednosti viricidnog delovanja. Vakcina izrađena sa Leptospira bakterinima tretiranih toplotom nije viricidalna.

Claims (15)

1. Kompozicija, naznačena time, što sadrži: a) emulziju, koja se sastoji od nekog ulja i jednog ili više emulgatora; i b) neki bakterin tretiran toplotom, koga čini suspenzija mrtvih bakterijaLeptospira,pri čemu ove mrtve bakterijeLeptospirapredstavljaju jednu od pet vrstaLeptospira,koje se biraju iz grupe koju čineLeptospira canicola, Leptospira grippotyposa, Leptospira hardjo, Leptospira icterohaemorragiaeiLeptospira pomona,a pri tome pomenuti bakterin ima aktivnost lipaze koja iznosi 50% ili manje od aktivnosti lipaze bakterina pre tretiranja toplotom; osim toga, pomenuti bakterin ima prihvatljivu antigensku aktivnost; a momenuta kompozicija je stabilna, i: i) pomenuti bakterin je zagrevan 5 do 8 h na temperaturi od 55 do 65°C, ili je ii) pomenuti bakterin zagrevan 5 do 8 h na temperaturi od 65 do 70°C, ili je iii) pomenuti bakterin zagrevan 1 h na temperaturi od 65 do 70°C, ili je iv) pomenuti bakterin zagrevan 9 do 10 h na temperaturi od 60 do 70°C.

2. Kompozicija prema Zahtevu 1, naznačena time, što je bakterin zagrevan 5 do 8 h na temperaturi 55 do 65°C.

3. Kompozicija prema Zahtevu 1, naznačena time, što je bakterin zagrevan 5 do 8 h na temperaturi 65 do 70°C.

4. Kompozicija prema Zahtevu 1, naznačena time, što je bakterin zagrevan 1 h na temperaturi 65 do 70°C.

5. Kompozicija prema Zahtevu 1, naznačena time, što je bakterin zagrevan 9 do 10 h na temperaturi 60 do 70°C.

6. Kompozicija prema Zahtevu 1, naznačena time, što mrtve bakterijeLeptospirapredstavljaju jednu od pet vrstaLeptospira,koje se biraju iz grupe koju čineLeptospira canicola, Leptospira grippotyposa, Leptospira hardjo, Leptospira icterohaemorragiaeiLeptospira pomona.

7. Kompozicija prema Zahtevu 1, naznačena time, što se jedan ili više pomenutih emulgatora biraju iz grupe koju čine lecitin, sorbitan monooleat i polietoksi sorbitan monooleat.

8. Kompozicija prema Zahtevu 1, naznačena time, što se toplotno tretirani bakterin dobija po postupku koji se sastoji od zagrevanja bakterina: 5 do 8 h na temperaturi od 55 do 65°C, ili 5 do 8 h na temperaturi od 65 do 70°C, ili 1 h na temperaturi od 65 do 70°C, ili 9 do 10 h na temperaturi od 60 do 70°C.

9. Kompozicija prema Zahtevu 1, naznačena time, što se toplotno tretirani bakterin dobija po postupku koji se sastoji od sledećih koraka: a) merenja aktivnosti lipaze bakterina; b) 5 do 8 h zagrevanja bakterina na temperaturi od 55 do 65°C, ili 5 do 8 h zagrevanja na temperaturi od 65 do 70°C, ili 1 h zagrevanja na temperaturi od 65 do 70°C, ili 9 do 10 h zagrevanja na temperaturi od 60 do 70°C; c) merenje aktivnosti lipaze bakterina posle tretiranje toplotom; d) poredjenje aktivnosti lipaze bakterina pre zagrevanja, sa aktivnošću lipaze posle zagrevanja; i e) biranje bakterina tretiranog toplotom tako da aktivnost lipaze iznosi 50% ili manje od aktivnosti lipaze istog bakterina pre tretiranje toplotom.

10. Kompozicija prema Zahtevu 1, naznačena time, što mrtve bakterijeLeptospirapredstavljaju jednu od pet vrstaLeptospira,koje se biraju iz grupe koju čineLeptospira canicola, Leptospira grippotyposa, Leptospira hardjo, Leptospira icterohaemorragiae i Leptospira pomona.

11. Kompozicija prema Zahtevu 1, naznačena time, što se bakterin zagreva 8 h na temperaturi 65°C.

12. Kompozicija prema Zahtevu 1, naznačena time, što bakterin tretiran toplotom nije viricidalan.

13. Kompozicija prema Zahtevu 1, naznačena time, što sadrži još Quil A i holesterol.

14. Kompozicija prema Zahtevu 13, naznačena time, što sadrži još i virusne antigene.

15. Kompozicija prema Zahtevu 14, naznačena time, što se virusni antigeni biraju iz grupe koju čine BRSV, BHV-1 i P13.