KR20170010863A - 이중특이성 이종이량체성 디아바디 및 이의 용도 - Google Patents

이중특이성 이종이량체성 디아바디 및 이의 용도 Download PDF

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아담 레이드 루트
윌리암 에이 브래디
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레어드 블룸
폴 에이 무어
레슬리 에스 존슨
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Abstract

이중특이성 이종이량체성 디아바디 분자 및 암의 치료에서의 이의 용도. 이중특이성 이종이량체성 디아바디 분자는 P-카데린 종양 세포 회합된 항원 및 CD3 T 세포 항원을 인식하는 2개의 에피토프 결합 자리를 형성하기 위해 회합하는 2개의 폴리펩티드 쇄를 포함한다.

Description

이중특이성 이종이량체성 디아바디 및 이의 용도{BISPECIFIC HETERODIMERIC DIABODIES AND USES THEREOF}
본원은 2014년 7월 1일자로 출원된 미국 가특허 출원 번호 제62/019,762호, 및 2015년 4월 17일자로 출원된 미국 가특허 출원 번호 제62/148,920호를 우선권 주장하고, 이들은 본원에 참고로 이들 전체가 인용된다.
서열 목록
본원은 전자적으로 EFS-웹을 통해 파일보관되고, 전자적으로 제출된 서열 목록을 .txt 형식으로 포함한다. .txt 파일은 2015년 6월 12일자로 생성되고 248 KB의 크기를 갖는 "PC72054A_Sequence_Listing.txt"라는 명칭의 서열 목록을 포함한다. 이러한 .txt 파일에 포함된 서열 목록은 본 명세서의 일부이고 본원에 참고로 이의 전체가 인용된다.
본 발명은 이중특이성 이종이량체성 디아바디 및 암의 치료에 있어서의 이들의 용도에 관한 것이다.
종양 세포 사멸을 중재하기 위해 T 세포 모집(recruitment)을 가능하게 하는 이중특이성 분자를 생산하기 위해 다양한 전략이 개발되어 왔다. 그러나, 이러한 분자를 생산하기 위한 대부분의 노력은 비효율적인 생산 및 불량한 안정성 특성으로 인해 제한되고 있다. 이러한 문제들을 해결하기 위해, 이중-친화도 재-표적화(dual-affinity retargeting)(DART: 등록상표) 단백질로서도 공지된, 공유 결합된 이중특이성 이종이량체성 디아바디 구조물에 기초한 Fv-유도된 전략이 개발되었다(미국 특허 출원 공개 제2007/0004909호, 제2009/0060910호, 및 제2010/0174053호).
이중특이성 항체의 생성과 연관된 도전을 극복하고, 표적 항원을 발현하는 종양 세포에 결합하고 CD3 활성화를 통해 T 세포를 모집하여 활성화시키는 매우 특이적이고 강력한 제제를 제공함으로써 혁신적이고 효과적인 암의 치료법을 생성하는 이중특이성 이종이량체성 디아바디에 대한 요구가 남아있다.
본 발명은 이중특이성 이종이량체성 디아바디를 제공하고, 여기서 이러한 이중특이성 이종이량체성 디아바디는 P-카데린(cadherin)의 에피토프 및 CD3의 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있다.
본 발명은 이중특이성 이종이량체성 디아바디를 제공하고, 여기서 이러한 이중특이성 이종이량체성 디아바디는 P-카데린의 에피토프 및 CD3의 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있으며, 이중특이성 이종이량체성 디아바디는 제1 폴리펩티드 쇄 및 제2 폴리펩티드 쇄를 포함하고, 이때, a. 제1 폴리펩티드는, N-말단에서 C-말단 방향으로, i. 서브-도메인 1A 및 서브-도메인 1B를 포함하는 도메인 1, 및 ii. 제1 이종이량체-촉진 도메인을 포함하고; b. 제2 폴리펩티드 쇄는, N-말단에서 C-말단 방향으로, i. 서브-도메인 2A 및 서브-도메인 2B를 포함하는 도메인 2, 및 ii. 제2 이종이량체-촉진 도메인을 포함하고, 여기서 서브-도메인 1A 및 서브-도메인 2A는 항-P-카데린 항체의 가변 중쇄(VH) 도메인(P-CAD VH) 및 항-P-카데린 항체의 가변 경쇄(VL) 도메인(P-CAD VL)을 포함하는 P-카데린 VLA/H 결합 도메인을 형성하고, 서브-도메인 1B 및 서브-도메인 2B는 항-CD3 항체의 VL 도메인(CD3 VL) 및 항-CD3 항체의 VH 결합 도메인(CD3 VH)을 포함하는 CD3 VL/VH 결합 도메인을 형성하거나; 또는 서브-도메인 1A 및 서브-도메인 2A는 CD3 VL 및 CD3 VH를 포함하는 CD3 VL/VH 결합 도메인을 형성하고, 서브-도메인 1B 및 서브-도메인 2B는 P-CAD VH 및 P-CAD VL을 포함하는 P-카데린 VL/VH 결합 도메인을 형성한다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 서브-도메인 1A는 P-CAD VL 또는 CD3 VL을 포함하고, 서브-도메인 1B는, 서브-도메인 1A가 CD3 VL을 포함할 경우 P-CAD VH를, 서브-도메인 1A가 P-CAD VL을 포함할 경우 CD3 VH를 포함하고; 여기서 서브-도메인 2B는 서브-도메인 1A에 대해 선택된 VL 도메인에 따라 P-CAD VL 또는 CD3 VL를 포함하고, 서브-도메인 2A는, 서브-도메인 2B가 CD3 VL을 포함할 경우 P-CAD VH를, 서브-도메인 2B가 P-CAD VL을 포함할 경우 CD3 VH를 포함한다.
본 발명의 특별한 양태에서, 서브-도메인 1A는 P-CAD VL을 포함하고 서브-도메인 1B는 CD3 VH를 포함하고, 서브-도메인 2B는 CD3 VL을 포함하고 서브-도메인 2A는 P-CAD VH를 포함하고; 여기서 서브-도메인 1A의 P-CAD VL 및 서브-도메인 2A의 P-CAD VH는 P-카데린의 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 VL/VH 결합 도메인을 형성하고, 서브-도메인 1B의 CD3 VH 및 서브-도메인 2B의 CD3 VL은 CD3의 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 VL/VH 결합 도메인을 형성한다.
특별한 양태에서, 서브-도메인 1A는 CD3 VL을 포함하고 서브-도메인 1B는 P-CAD VH를 포함하고, 서브-도메인 2B는 P-CAD VL을 포함하고 서브-도메인 2A는 CD3 VH를 포함하고; 여기서 서브-도메인 1A의 CD3 VL 및 서브-도메인 2A의 CD3 VH는 CD3의 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 VL/VH 결합 도메인을 형성하고, 서브-도메인 1B의 P-CAD VH 및 서브-도메인 2B의 P-CAD VL은 P-카데린의 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 VL/VH 결합 도메인을 형성한다.
또 다른 양태에서, 서브-도메인 1A는 항-P-카데린 항체(P-CAD VH) 또는 항-CD3 항체(CD3 VH)의 VH 결합 도메인을 포함하고, 서브-도메인 1B는 서브-도메인 1A가 CD3 VH를 포함할 경우 항-P-카데린 항체(P-CAD VL)의 VL 결합 도메인을, 또는 서브-도메인 1A가 P-CAD VH를 포함할 경우 항-CD3 항체(CD3 VL)를 포함하고; 여기서 서브-도메인 2B는 서브-도메인 1A에 대해 선택된 VH 도메인에 따라서 P-CAD VH 또는 CD3 VH를 포함하고, 서브-도메인 2A는 서브-도메인 2B가 CD3 VH를 포함할 경우 P-CAD VL을, 서브-도메인 2B가 P-CAD VH를 포함할 경우 CD3 VL을 포함한다.
특별한 양태에서, 서브-도메인 1A는 P-CAD VH를 포함하고 서브-도메인 1B는 CD3 VL을 포함하고, 서브-도메인 2B는 CD3 VH를 포함하고 서브-도메인 2A는 P-CAD VL을 포함하고; 여기서 서브-도메인 1A의 P-CAD VH 및 서브-도메인 2A의 P-CAD VL은 P-카데린의 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 VL/VH 결합 도메인을 형성하고, 서브-도메인 1B의 CD3 VL 및 서브-도메인 2B의 CD3 VH는 CD3의 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 VL/VH 결합 도메인을 형성한다.
특별한 양태에서, 서브-도메인 1A는 CD3 VH를 포함하고 서브-도메인 1B는 P-CAD VL을 포함하고, 서브-도메인 2B는 P-CAD VH를 포함하고 서브-도메인 2A는 CD3 VL을 포함하고; 여기서 서브-도메인 1A의 CD3 VH 및 서브-도메인 2A의 CD3 VL은 CD3의 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 VL/VH 결합 도메인을 형성하고, 서브-도메인 1B의 P-CAD VL 및 서브-도메인 2B의 P-CAD VH는 P-카데린의 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 VL/VH 결합 도메인을 형성한다.
본 발명은 추가로 이중특이성 이종이량체성 디아바디를 제공하고, 여기서 제1 이종이량체-촉진 도메인 및 제2 이종이량체-촉진 도메인은 CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 IgG Fc 영역을 포함하고, 이때 CH2 도메인 및/또는 CH3 도메인의 아미노산 서열은, 야생형 IgG Fc 영역과 비교하여, 적어도 하나의 아미노산 개질을 포함하여, 놉(knob) 또는 홀(hole)을 형성한다. 하나의 양태에서, 제1 이종이량체-촉진 도메인 및 제2 이종이량체-촉진 도메인은 둘다 놉이 아니거나 둘다 홀이 아니고/아니거나; 제1 이종이량체-촉진 도메인 및 제2 이종이량체-촉진 도메인은 IgG 면역글로불린 Fc 영역을 형성한다. 또 다른 양태에서, 놉을 형성하는 IgG Fc 영역은 서열번호 63의 서열을 포함하고, 홀을 형성하는 IgG Fc 영역은 서열번호 64의 서열을 포함한다.
본 발명은 추가로 이중특이성 이종이량체성 디아바디를 제공하고, 여기서 제1 이종이량체-촉진 도메인 및 제2 이종이량체-촉진 도메인은 글루탐산 및 음성으로 하전된 알파-나선형 코일을 포함하는 E-코일 영역 또는 라이신 및 양성으로 하전된 나선형 코일을 포함하는 K-코일 영역을 포함하고; 이때 제1 이종이량체-촉진 도메인 및 제2 이종이량체-촉진 도메인은 둘 다 E-코일 영역이 아니거나 둘 다 K-코일 영역이 아니다. 하나의 양태에서, E-코일 영역은 서열번호 61의 서열을 포함하고/하거나, K-코일 영역은 서열번호 62의 서열을 포함한다.
본 발명은 추가로 이중특이성 이종이량체성 디아바디를 제공하고, 여기서 서브-도메인 1A 및 서브-도메인 1B는 글리신-세린 연결기(연결기 1)에 의해 연결될 수 있고 VL/VH 에피토프 결합 도메인을 형성하기 위해 회합되지 않으며, 서브-도메인 2B 및 서브-도메인 2A는 글리신-세린 연결기(연결기 1)에 의해 연결될 수 있고 VL/VH 에피토프 결합 도메인을 형성하기 위해 회합되지 않는다. 본 발명의 하나의 양태에서, 글리신-세린 연결기(연결기 1)는 서열번호 68 또는 서열번호 69의 서열을 포함한다.
본 발명은 추가로 이중특이성 이종이량체성 디아바디를 제공하고, 여기서 제1 이종이량체-촉진 도메인은 시스테인 연결기(연결기 2)를 서브-도메인 1B 상에 포함하고/하거나 제2 이종이량체-촉진 도메인은 시스테인 연결기(연결기 2)를 서브-도메인 2A 상에 포함한다. 하나의 양태에서, 제1 이종이량체-촉진 도메인 및/또는 제2 이종이량체-촉진 도메인의 연결기 2는 추가로 적어도 하나의 글리신 잔기를 포함한다. 또 다른 양태에서, 제1 이종이량체-촉진 도메인 및/또는 제2 이종이량체-촉진 도메인의 연결기 2는 GFNRGEC(서열번호 70), GVEPKSC(서열번호 71), GGCGGG(서열번호 72), GCPPCP(서열번호 73), GGTGGCPPCP(서열번호 74), GEPKSSDKTHTCPPCP(서열번호 75) 또는 GGTGGGEPKSSDKTHTCPPCP(서열번호 76)의 서열을 포함한다. 또 다른 양태에서, 제1 이종이량체-촉진 도메인의 연결기 2는 GCPPCP(서열번호 73), GGTGGCPPCP(서열번호 74), GEPKSSDKTHTCPPCP(서열번호 75) 또는 GGTGGGEPKSSDKTHTCPPCP(서열번호 76)의 서열을 포함하고, 제2 이종이량체-촉진 도메인의 연결기 2는 GCPPCP(서열번호 73), GGTGGCPPCP(서열번호 74), GEPKSSDKTHTCPPCP(서열번호 75) 또는 GGTGGGEPKSSDKTHTCPPCP(서열번호 76)의 서열을 포함한다. 또 다른 양태에서, 제1 이종이량체-촉진 도메인의 연결기 2는 GGCGGG(서열번호 72)의 서열을 포함하고, 제2 이종이량체-촉진 도메인의 연결기 2는 GGCGGG(서열번호 72)의 서열을 포함한다. 또 다른 양태에서, 제1 이종이량체-촉진 도메인의 연결기 2는 GFNRGEC(서열번호 70)의 서열을 포함하고 제2 이종이량체-촉진 도메인의 연결기 2는 GVEPKSC(서열번호 71)의 서열을 포함하거나, 또는 제1 이종이량체-촉진 도메인의 연결기 2는 GVEPKSC(서열번호 71)의 서열을 포함하고 제2 이종이량체-촉진 도메인의 연결기 2는 GFNRGEC(서열번호 70)의 서열을 포함한다.
본 발명은 이중특이성 이종이량체성 디아바디를 제공하고, 여기서 이중특이성 이종이량체성 디아바디는 인간 P-카데린의 세포외 도메인 3(ECD3)에 특이적으로 결합한다. 본 발명은 추가로 이중특이성 이종이량체성 디아바디를 제공하고, 여기서 이중특이성 이종이량체성 디아바디는 P-카데린 상의 에피토프에 특이적으로 결합하지만, E-카데린 또는 VE-카데린 상의 에피토프에는 결합하지 않는다. 본 발명은 또한 이중특이성 이종이량체성 디아바디를 제공하고, 여기서 이중특이성 이종이량체성 디아바디는 인간 P-카데린 상의 에피토프에 특이적으로 결합하지만, 마우스 P-카데린 상의 에피토프에는 결합하지 않는다.
본 발명은 이중특이성 이종이량체성 디아바디를 제공하고, 여기서 이중특이성 이종이량체성 디아바디는 연장된 혈청 및 종양 반감기를 나타낸다. 약물동력학적 분석은 다양한 검정, 예컨대 ELISA에 의해 수행될 수 있다. 본 발명은 추가로 이중특이성 이종이량체성 디아바디를 제공하고, 여기서 이중특이성 이종이량체성 디아바디는 증가된 P-카데린 발현 수준 또는 증가된 수용체 밀도 수준의 존재하에 더 낮은 EC50을 나타낸다. EC50은 다양한 시험관내 및 생체내 세포독성 검정에 의해 결정될 수 있다.
본 발명은 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21 또는 23의 서열을 포함하는 P-CAD VL의 P-CAD VL CDR1, P-CAD VL CDR2, 및 P-CAD VL CDR3; 서열번호 45 또는 46의 서열을 포함하는 CD3 VH의 CD3 VH CDR1, CD3 VH CDR2, 및 CD3 VH CDR3; 서열번호 47의 서열을 포함하는 CD3 VL의 CD3 VL CDR1, CD3 VL CDR2, 및 CD3 VL CDR3; 및/또는 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 또는 24의 서열을 포함하는 P-CAD VH의 P-CAD VH CDR1, P-CAD VH CDR2, 및 P-CAD VH CDR3을 포함하는 이중특이성 이종이량체성 디아바디를 제공한다.
본 발명은 서열번호 35 또는 36의 서열을 포함하는 P-CAD VL CDR1, 서열번호 37 또는 38의 서열을 포함하는 P-CAD VL CDR2, 및 서열번호 39, 40, 41, 42, 43 또는 44의 서열을 포함하는 P-CAD VL CDR3을 포함하는 이중특이성 이종이량체성 디아바디를 제공하고; 여기서 CD3 VH CDR1은 서열번호 48의 서열을 포함하고, CD3 VH CDR2는 서열번호 49 또는 50의 서열을 포함하고, CD3 VH CDR3은 서열번호 51의 서열을 포함하고; CD3 VL CDR1은 서열번호 55의 서열을 포함하고, CD3 VL CDR2는 서열번호 56의 서열을 포함하고, CD3 VL CDR3은 서열번호 57의 서열을 포함하고/하거나; P-CAD VH CDR1은 서열번호 25 또는 33의 서열을 포함하고, P-CAD VH CDR2는 서열번호 26 또는 34의 서열을 포함하고, P-CAD VH CDR3은 서열번호 27, 28, 29, 30, 31 또는 32의 서열을 포함한다.
본 발명의 하나의 양태에서, P-CAD VL CDR1은 서열번호 35의 서열을 포함하고, P-CAD VL CDR2는 서열번호 37의 서열을 포함하고, P-CAD VL CDR3은 서열번호 41의 서열을 포함하고, P-CAD VH CDR1은 서열번호 25의 서열을 포함하고, P-CAD VH CDR2는 서열번호 26의 서열을 포함하고, P-CAD VH CDR3은 서열번호 28의 서열을 포함한다. 또 다른 양태에서, P-CAD VL CDR1은 서열번호 35의 서열을 포함하고, P-CAD VL CDR2는 서열번호 37의 서열을 포함하고, P-CAD VL CDR3은 서열번호 42의 서열을 포함하고, P-CAD VH CDR1은 서열번호 25의 서열을 포함하고, P-CAD VH CDR2는 서열번호 26의 서열을 포함하고, P-CAD VH CDR3은 서열번호 29의 서열을 포함한다. 또 다른 양태에서, P-CAD VL CDR1은 서열번호 35의 서열을 포함하고, P-CAD VL CDR2는 서열번호 37의 서열을 포함하고, P-CAD VL CDR3은 서열번호 43의 서열을 포함하고, P-CAD VH CDR1은 서열번호 25의 서열을 포함하고, P-CAD VH CDR2는 서열번호 26의 서열을 포함하고, P-CAD VH CDR3은 서열번호 30의 서열을 포함한다. 또 다른 양태에서, P-CAD VL CDR1은 서열번호 35의 서열을 포함하고, P-CAD VL CDR2는 서열번호 37의 서열을 포함하고, P-CAD VL CDR3은 서열번호 39의 서열을 포함하고, P-CAD VH CDR1은 서열번호 25의 서열을 포함하고, P-CAD VH CDR2는 서열번호 26의 서열을 포함하고, P-CAD VH CDR3은 서열번호 31의 서열을 포함한다.
본 발명은 추가로 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21 또는 23의 서열을 포함하는 P-CAD VL; 서열번호 45 또는 46의 서열을 포함하는 CD3 VH; 서열번호 47의 서열을 포함하는 CD3 VL; 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 또는 24의 서열을 포함하는 P-CAD VH를 포함하는 이중특이성 이종이량체성 디아바디를 제공한다. 하나의 양태에서, P-CAD VL은 서열번호 5의 서열을 포함하고 P-CAD VH는 서열번호 6의 서열을 포함한다. 또 다른 양태에서, P-CAD VL은 서열번호 7의 서열을 포함하고 P-CAD VH는 서열번호 8의 서열을 포함한다. 또 다른 양태에서, P-CAD VL은 서열번호 9의 서열을 포함하고 P-CAD VH는 서열번호 10의 서열을 포함한다. 또 다른 양태에서, P-CAD VL은 서열번호 15의 서열을 포함하고 P-CAD VH는 서열번호 16의 서열을 포함한다.
본 발명은 추가로 제1 폴리펩티드 쇄 및 제2 폴리펩티드 쇄를 포함하는, P-카데린의 에피토프 및 CD3의 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 이중특이성 이종이량체성 디아바디를 제공하고, 여기서 제1 폴리펩티드 쇄는 서열번호 90의 서열을 포함하고 제2 폴리펩티드 쇄는 서열번호 91의 서열을 포함한다. 본 발명은 추가로 제1 폴리펩티드 쇄 및 제2 폴리펩티드 쇄를 포함하는, P-카데린의 에피토프 및 CD3의 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 이중특이성 이종이량체성 디아바디를 제공하고, 여기서 제1 폴리펩티드 쇄는 서열번호 92의 서열을 포함하고 제2 폴리펩티드 쇄는 서열번호 93의 서열을 포함한다.
본 발명은 추가로 제1 폴리펩티드 쇄 및 제2 폴리펩티드 쇄를 포함하는, P-카데린의 에피토프 및 CD3의 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 이중특이성 이종이량체성 디아바디를 제공하고, 여기서 제1 폴리펩티드 쇄는 서열번호 88의 서열을 포함하고 제2 폴리펩티드 쇄는 서열번호 89의 서열을 포함한다.
본 발명은 추가로 제1 및 제2 폴리펩티드 쇄가 적어도 하나의 디설파이드 결합에 의해 서로 공유적으로 결합될 수 있는 이중특이성 이종이량체성 디아바디를 제공한다.
본 발명은 추가로 제1 폴리펩티드 쇄 및 제2 폴리펩티드 쇄를 포함하는, P-카데린의 에피토프 및 CD3의 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 이중특이성 이종이량체성 디아바디를 제공하고, 여기서 제1 폴리펩티드 쇄 및 제2 폴리펩티드 쇄는 도 30a, 30b, 31a, 31b, 32a 또는 32b에 제시된 바와 같은 서열을 포함한다. 본 발명의 또 다른 양태에서, 이중특이성 이종이량체성 디아바디는 표 5에 제시된 바와 같은 제1 폴리펩티드 쇄, 제2 폴리펩티드 쇄 및 제3 폴리펩티드 쇄를 포함한다.
본 발명은 이중특이성 이종이량체성 디아바디를 제공하고, 여기서 이중특이성 이종이량체성 디아바디는 제한되지 않지만 형광단 또는 방사성핵종을 비롯한 검출가능한 표지에 공액될 수 있다.
본 발명은 P-카데린에 결합하고 본원에 개시된 이중특이성 이종이량체성 디아바디에 결합하기 위해 경쟁하는 이중특이성 이종이량체성 디아바디를 제공한다.
본 발명은 추가로 치료학적 효과량의 본원에 개시된 이중특이성 이종이량체성 디아바디 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
본 발명은 추가로 본원에 개시된 이중특이성 이종이량체성 디아바디 또는 본원에 개시된 이중특이성 이종이량체성 디아바디를 포함하는 약학 조성물을 P-카데린 연관된 질환의 치료가 필요한 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 상기 환자에서 P-카데린 연관된 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 본 발명은 추가로 본원에 개시된 이중특이성 이종이량체성 디아바디 또는 본원에 개시된 이중특이성 이종이량체성 디아바디를 포함하는 약학 조성물을 P-카데린 연관된 질환의 치료가 필요한 환자에게 투여하는 단계를 포함하고, 이때 세포용해 T 세포 반응이 활성화되거나 유도되는, 상기 환자에서 P-카데린 연관된 질환을 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명은 추가로 치료법에 사용하기 위한 본원에 개시된 이중특이성 이종이량체성 디아바디를 제공한다. 본 발명은 추가로 치료법에 사용하기 위한 약제의 제조에 있어서의 본원에 개시된 이중특이성 이종이량체성 디아바디의 용도를 제공한다. 또 다른 양태에서, 치료법은 P-카데린 연관된 질환의 치료이다. 본 발명은 추가로 치료법에 사용하기 위한 본원에 개시된 이중특이성 이종이량체성 디아바디를 제공하고, 여기서 치료법은 세포용해 T 세포 반응을 활성화시키거나 유도한다.
하나의 양태에서, P-카데린 연관된 질환은 암이다. 또 다른 양태에서, 암은 P-카데린 발현 또는 P 카데린 양성 암이다. 암으로는, 제한되지 않지만, 유방암, 결장직장암, 난소암, 위암, 갑상선암, 전립선암, 자궁경부암, 췌장암, 폐암, 방광암, 간암, 자궁내막암, 두경부암(head and neck cancer), 고환암 및 교모세포종 암이 포함된다.
본 발명은 추가로 본원에 기재된 이중특이성 이종이량체성 디아바디를 재조합적으로 생산하는 단리된 숙주 세포, 본원에 개시된 이중특이성 이종이량체성 디아바디를 인코딩하는 누클레오티드 서열을 포함하는 단리된 폴리누클레오티드, 및 폴리누클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다.
본 발명은 추가로 이중특이성 이종이량체성 디아바디의 생산을 일으키는 조건하에 본원에 개시된 숙주 세포를 배양하는 단계, 및 이중특이성 이종이량체성 디아바디를 배양 상청액으로부터 정제하는 단계를 포함하는, 본원에 개시된 이중특이성 이종이량체성 디아바디의 제조 방법을 제공한다.
본 발명은 추가로 결정 구조가 서브-도메인 1B의 위치 239에서의 시스테인 잔기(Cys239) 및 서브-도메인 2A의 위치 246에서의 시스테인 잔기(Cys246)로 구성된 한 쌍의 시스테인 잔기 사이의 디설파이드 연결에 의해 안정화된 치밀한 구형 구조로 조립되고, 결정이 원자 좌표의 결정을 위한 X-선을 회절시켜 약 2.0 옹스트롬 보다 더 우수한 해상도를 제공하는, 본원에 개시된 이중특이성 이종이량체성 디아바디를 제공한다.
본 발명은 추가로 제1 폴리펩티드 쇄 및 제2 폴리펩티드 쇄를 포함하는, P-카데린의 에피토프 및 CD3의 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 이중특이성 이종이량체성 디아바디를 제공하고, 여기서 제1 폴리펩티드 쇄는, N-말단에서 C-말단 방향으로, 서열번호 47의 서열을 포함하는 항-CD3 항체의 VL 결합 도메인(CD3 VL)을 포함하는 서브-도메인 1A, 및 서열번호 6의 서열을 포함하는 항-P-카데린 항체의 VH 결합 도메인(P-CAD VH)을 포함하는 서브-도메인 1B를 포함하는 도메인 1을 포함하고(이때, 서브-도메인 1A 및 서브-도메인 1B는 글리신-세린 연결기(연결기 1)에 의해 공유적으로 연결될 수 있고 VL/VH 에피토프 결합 도메인을 형성하기 위해 회합되지 않음); 제2 폴리펩티드 쇄는, N-말단에서 C-말단 방향으로, 서열번호 5의 서열을 포함하는 P-CAD VL을 포함하는 서브-도메인 2B, 및 서열번호 45의 서열을 포함하는 CD3 VH를 포함하는 서브-도메인 2A를 포함하는 도메인 2를 포함하고(이때, 서브-도메인 2B 및 서브-도메인 2A는 글리신-세린 연결기(연결기 1)에 의해 공유적으로 연결될 수 있고 VL/VH 에피토프 결합 도메인을 형성하기 위해 회합되지 않음); 결정 구조는 서브-도메인 1B의 위치 239에서의 시스테인 잔기(Cys239) 및 서브-도메인 2A의 위치 246에서의 시스테인 잔기(Cys246)를 포함하는 한 쌍의 시스테인 잔기 사이의 디설파이드 연결에 의해 안정화된 치밀한 구형 구조로 조립되고, 결정은 원자 좌표의 결정을 위한 X-선을 회절시켜 약 2.0 옹스트롬 보다 더 우수한 해상도를 제공한다.
또 다른 양태에서, 본원에 기재된 이중특이성 이종이량체성 디아바디는 약 40 옹스트롬에 의해 서로 분리되는 2개의 항원 결합 자리를 함유하고, 결합 자리는 이중특이성 이종이량체성 디아바디의 직각으로 맞은편 상에 위치될 수 있다.
본 발명은 추가로 본원에 개시된 결정 구조물에 기초한 이중특이성 이종이량체성 디아바디내의 디설파이드 연결을 형성하기 위한 시스테인 잔기에 대한 추가적인 위치를 식별하는 방법을 제공하고, 여기서 결정 구조는 디설파이드 연결을 형성하는 한 쌍의 시스테인 잔기에 의한 치환을 위한 한 쌍의 아미노산 잔기 위치에 대해 분석된다. 본 발명의 특별한 양태에서, 디설파이드 연결을 형성하는 한 쌍의 시스테인 잔기에 의한 치환을 위한 한 쌍의 아미노산 잔기 위치는 아미노산 위치 Gln121(VH1B)Gly160(VL1A), Val129(VH1B)Gly244(VL1A), Val123(VH1B)Gly160(VL1A), Gly126(VH1B)Ser242(VL1A), 및 Ala127(VH1B)Ser242(VL1A)로 구성된 군에서 선택될 수 있다. 디설파이드 연결은 용매 접근성을 감소시키고 연결기의 길이를 감소시킬 수 있다.
본 발명은 추가로 더욱 안정한 도메인간 회합을 형성하기 위한 시도로 이중특이성 이종이량체성 디아바디 변이형를 조작하는 방법을 제공하고, 여기서 조작은 본원에 개시된 결정 구조물에 기초한 도메인간 계면에서의 아미노산 자리-유도된 돌연변이생성을 통해서이고, 이때 아미노산 자리-유도된 돌연변이생성은 거대한 내부 공극/홀을 충전시킨다. 본 발명의 특별한 양태에서, 자리-유도된 돌연변이생성은 작은 아미노산을 부피가 큰 방향족 측쇄를 갖는 아미노산으로 대체함으로써 아미노산 측쇄 부피를 증가시킬 수 있다. 본 발명의 또 다른 양태에서, 작은 아미노산은 위치 Ala44(VL1A), Val213(VH2A), Leu238(VH2A), 또는 Met231(VL2B)에서의 아미노산으로 구성된 군에서 선택될 수 있다. 본 발명의 또 다른 양태에서, 부피가 큰 방향족 측쇄를 갖는 아미노산은 페닐알라닌, 티로신, 또는 트립토판으로 구성된 군에서 선택될 수 있다.
본 발명은 추가로 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21 또는 23의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)의 CDR1, CDR2, 및 CDR3, 및/또는 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 또는 24의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH)의 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하는, P-카데린에 결합하는 항체를 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 본원에 개시된 항체는 서열번호 35 또는 36의 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열번호 37 또는 38의 서열을 포함하는 VL CDR2, 서열번호 39, 40, 41, 42, 43 또는 44의 서열을 포함하는 VL CDR3, 서열번호 25 또는 33의 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열번호 26 또는 34의 서열을 포함하는 VH CDR2, 및 서열번호 27, 28, 29, 30, 31 또는 32의 서열을 포함하는 VH CDR3을 포함한다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 본원에 개시된 항체는 서열번호 35 또는 36의 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열번호 37 또는 38의 서열을 포함하는 VL CDR2, 서열번호 39, 40, 41, 42, 43 또는 44의 서열을 포함하는 VL CDR3, 서열번호 25의 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열번호 26의 서열을 포함하는 VH CDR2, 및 서열번호 27, 28, 29, 30, 31 또는 32의 서열을 포함하는 VH CDR3을 포함한다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 본원에 개시된 항체는 서열번호 35의 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열번호 37의 서열을 포함하는 VL CDR2, 서열번호 42의 서열을 포함하는 VL CDR3, 서열번호 25의 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열번호 26의 서열을 포함하는 VH CDR2, 및 서열번호 29의 서열을 포함하는 VH CDR3을 포함한다.
본 발명은 추가로 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21 및 23의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및/또는 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 또는 24의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는, P-카데린에 결합하는 항체를 제공한다. 본 발명의 또 다른 양태에서, 본원에 개시된 항체는 서열번호 5의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 아미노산 및/또는 서열번호 6의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 본 발명의 또 다른 양태에서, 본원에 개시된 항체는 서열번호 7의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및/또는 서열번호 8의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 본 발명의 또 다른 양태에서, 본원에 개시된 항체는 서열번호 9의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및/또는 서열번호 10의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 본 발명의 또 다른 양태에서, 본원에 개시된 항체는 서열번호 15의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및/또는 서열번호 16의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
본 발명은 추가로 P-카데린에 결합하고 본원에 개시된 항체와 P-카데린으로의 결합에 대해 경쟁하는 항체를 제공한다.
본 발명은 추가로 치료학적 효과량의 본원에 개시된 항체 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
본 발명은 추가로 본원에 개시된 항체 또는 본원에 개시된 항체를 포함하는 약학 조성물을 P-카데린 연관된 질환의 치료가 필요한 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 상기 환자에서 P-카데린 연관된 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 본 발명은 추가로 치료법에 사용하기 위한 본원에 개시된 항체를 제공한다. 본 발명은 추가로 치료법에 사용하기 위한 약제의 제조에 있어서의 본원에 개시된 항체의 용도를 제공한다.
하나의 양태에서, P-카데린 연관된 질환은 암이다. 또 다른 양태에서, 암은 P-카데린 발현 또는 P 카데린 양성 암이다. 암으로는, 제한되지 않지만, 유방암, 결장직장암, 난소암, 위암, 갑상선암, 전립선암, 자궁경부암, 췌장암, 폐암, 방광암, 간암, 자궁내막암, 두경부암, 고환암 및 교모세포종 암이 포함된다.
본 발명은 추가로 본원에 개시된 항체를 인코딩하는 핵산을 제공한다. 본 발명의 또 다른 양태에서, 핵산은 서열번호 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114 및 116으로 구성된 군에서 선택된 서열을 포함할 수 있다. 본 발명의 추가의 양태에서, 핵산은 서열번호 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113 및 115로 구성된 군에서 선택된 서열을 포함할 수 있다. 본 발명은 추가로 본원에 개시된 핵산을 포함하는 벡터, 및 본원에 개시된 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다.
본 발명은 추가로 이중특이성 이종이량체성 디아바디 또는 본원에 개시된 항체를 제공하고, 여기서 P-CAD VL은 XL1.1-XL1.2-XL1.3-XL1.4-XL1.5-XL1.6-XL1.7-XL1.8-XL1.9-XL1.10-XL1.11-XL1.2-XL1.13을 포함하는 P-CAD VL CDR1 서열(이때, XL1.1 내지 XL1.13은 각각 독립적으로 표 57, 표 58, 또는 표 59의 칼럼 3에 따른 아미노산 잔기임); XL2.1-XL2.2-XL2.3-XL2.4-XL2.5-XL2.6-XL2.7을 포함하는 P-CAD VL CDR2 서열(이때, XL2.1 내지 XL2.7은 각각 독립적으로 표 60, 표 61, 또는 표 62의 칼럼 3에 따른 아미노산 잔기임); 및 XL3.1-XL3.2-XL3.3-XL3.4-XL3.5-XL3.6-XL3.7-XL3.8-XL3.9-XL3.10-XL3.11을 포함하는 P-CAD VL CDR3 서열(이때, XL3.1 내지 XL3.11은 각각 독립적으로 표 63, 표 64, 또는 표 65의 칼럼 3에 따른 아미노산 잔기임)을 포함하고; P-CAD VH는 XH1.1-XH1.2-XH1.3-XH1.4-XH1.5-XH1.6-XH1.7-XH1.8-XH1.9-XH1.10 또는 XH1.5-XH1.6-XH1.7-XH1.8-XH1.9-XH1.10을 포함하는 P-CAD VH CDR1 서열(이때, XH1.1 내지 XH1.10은 각각 독립적으로 표 48, 표 49, 또는 표 50의 칼럼 3에 따른 아미노산 잔기임); XH2.1-XH2.2-XH2.3-XH2.4-XH2.5-XH2.6-XH2.7-XH2.8-XH2.9-XH2.10-XH2.11-XH2.12-XH2.13-XH2.14-XH2.15-XH2.16-XH2.17 또는 XH2.1-XH2.2-XH2.3-XH2.4-XH2.5-XH2.6-XH2.7-XH2.8-XH2.9-XH2.10을 포함하는 P-CAD VH CDR2 서열(이때, XH2.1 내지 XH2.17은 각각 독립적으로 표 51, 표 52, 또는 표 53의 칼럼 3에 따른 아미노산 잔기임); 및 XH3.1-XH3.2-XH3.3-XH3.4-XH3.5-XH3.6-XH3.7-XH3.8-XH3.9를 포함하는 P-CAD VH CDR3 서열(이때, XH3.1 내지 XH3.9는 각각 독립적으로 표 54, 표 55, 또는 표 56의 칼럼 3에 따른 아미노산 잔기임)을 포함한다.
하나의 양태에서, XL1.1 내지 XL1.13은 각각 독립적으로 표 57의 칼럼 3에 따른 아미노산 잔기이다. 또 다른 양태에서, XL1.1 내지 XL1.13은 각각 독립적으로 표 58의 칼럼 3에 따른 아미노산 잔기이다. 또 다른 양태에서, XL1.1 내지 XL1.13은 각각 독립적으로 표 59의 칼럼 3에 따른 아미노산 잔기이다. 또 다른 양태에서, XL2.1 내지 XL2.7은 각각 독립적으로 표 60의 칼럼 3에 따른 아미노산 잔기이다. 또 다른 양태에서, XL2.1 내지 XL2.7은 각각 독립적으로 표 61의 칼럼 3에 따른 아미노산 잔기이다. 또 다른 양태에서, XL2.1 내지 XL2.7은 각각 독립적으로 표 62의 칼럼 3에 따른 아미노산 잔기이다. 또 다른 양태에서, XL3.1 내지 XL3.11은 각각 독립적으로 표 63의 칼럼 3에 따른 아미노산 잔기이다. 또 다른 양태에서, XL3.1 내지 XL3.11은 각각 독립적으로 표 64의 칼럼 3에 따른 아미노산 잔기이다. 또 다른 양태에서, XL3.1 내지 XL3.11은 각각 독립적으로 표 65의 칼럼 3에 따른 아미노산 잔기이다.
또 다른 양태에서, XH1.1 내지 XH1.10은 각각 독립적으로 표 48의 칼럼 3에 따른 아미노산 잔기이다. 또 다른 양태에서, XH1.1 내지 XH1.10은 각각 독립적으로 표 49의 칼럼 3에 따른 아미노산 잔기이다. 또 다른 양태에서, XH1.1 내지 XH1.10은 각각 독립적으로 표 50의 칼럼 3에 따른 아미노산 잔기이다. 또 다른 양태에서, XH2.1 내지 XH2.17은 각각 독립적으로 표 51의 칼럼 3에 따른 아미노산 잔기이다. 또 다른 양태에서, XH2.1 내지 XH2.17은 각각 독립적으로 표 52의 칼럼 3에 따른 아미노산 잔기이다. 또 다른 양태에서, XH2.1 내지 XH2.17은 각각 독립적으로 표 53의 칼럼 3에 따른 아미노산 잔기이다. 또 다른 양태에서, XH3.1 내지 XH3.9는 각각 독립적으로 표 54의 칼럼 3에 따른 아미노산 잔기이다. 또 다른 양태에서, XH3.1 내지 XH3.9는 각각 독립적으로 표 55의 칼럼 3에 따른 아미노산 잔기이다. 또 다른 양태에서, XH3.1 내지 XH3.9는 각각 독립적으로 표 56의 칼럼 3에 따른 아미노산 잔기이다.
본 발명은 추가로 이중특이성 이종이량체성 디아바디 또는 본원에 개시된 항체를 제공하고, 여기서 P-CAD VL은 XL1.1-XL1.2-XL1.3-XL1.4-XL1.5-XL1.6-XL1.7-XL1.8-XL1.9-XL1.10-XL1.11-XL1.2-XL1.13을 포함하는 P-CAD VL CDR1 서열(이때, XL1.1 내지 XL1.13은 각각 독립적으로 표 69의 칼럼 3 또는 칼럼 4에 따른 아미노산 잔기임); XL2.1-XL2.2-XL2.3-XL2.4-XL2.5-XL2.6-XL2.7을 포함하는 P-CAD VL CDR2 서열(이때, XL2.1 내지 XL2.7은 각각 독립적으로 표 70의 칼럼 3 또는 칼럼 4에 따른 아미노산 잔기임); 및 XL3.1-XL3.2-XL3.3-XL3.4-XL3.5-XL3.6-XL3.7-XL3.8-XL3.9-XL3.10-XL3.11을 포함하는 P-CAD VL CDR3 서열(이때, XL3.1 내지 XL3.11은 각각 독립적으로 표 71의 칼럼 3 또는 칼럼 4에 따른 아미노산 잔기임)을 포함하고; P-CAD VH는 XH1.1-XH1.2-XH1.3-XH1.4-XH1.5-XH1.6-XH1.7-XH1.8-XH1.9-XH1.10 또는 XH1.5-XH1.6-XH1.7-XH1.8-XH1.9-XH1.10을 포함하는 P-CAD VH CDR1 서열(이때, XH1.1 내지 XH1.10은 각각 독립적으로 표 66의 칼럼 3 또는 칼럼 4에 따른 아미노산 잔기임); XH2.1-XH2.2-XH2.3-XH2.4-XH2.5-XH2.6-XH2.7-XH2.8-XH2.9-XH2.10-XH2.11-XH2.12-XH2.13-XH2.14-XH2.15-XH2.16-XH2.17 또는 XH2.1-XH2.2-XH2.3-XH2.4-XH2.5-XH2.6-XH2.7-XH2.8-XH2.9-XH2.10을 포함하는 P-CAD VH CDR2 서열(이때, XH2.1 내지 XH2.17은 각각 독립적으로 표 67의 칼럼 3 또는 칼럼 4에 따른 아미노산 잔기임), 및 XH3.1-XH3.2-XH3.3-XH3.4-XH3.5-XH3.6-XH3.7-XH3.8-XH3.9를 포함하는 P-CAD VH CDR3 서열(이때, XH3.1 내지 XH3.9은 각각 독립적으로 표 68의 칼럼 3 또는 칼럼 4에 따른 아미노산 잔기임)을 포함한다.
하나의 양태에서, XL1.1 내지 XL1.13은 각각 독립적으로 표 69의 칼럼 3에 따른 아미노산 잔기이다. 또 다른 양태에서, XL1.1 내지 XL1.13은 각각 독립적으로 표 69의 칼럼 4에 따른 아미노산 잔기이다. 또 다른 양태에서, XL2.1 내지 XL2.7은 각각 독립적으로 표 70의 칼럼 3에 따른 아미노산 잔기이다. 또 다른 양태에서, XL2.1 내지 XL2.7은 각각 독립적으로 표 70의 칼럼 4에 따른 아미노산 잔기이다. 또 다른 양태에서, XL3.1 내지 XL3.11은 각각 독립적으로 표 71의 칼럼 3에 따른 아미노산 잔기이다. 또 다른 양태에서, XL3.1 내지 XL3.11은 각각 독립적으로 표 71의 칼럼 4에 따른 아미노산 잔기이다. 또 다른 양태에서, XH1.1 내지 XH1.10은 각각 독립적으로 표 66의 칼럼 3에 따른 아미노산 잔기이다. 또 다른 양태에서, XH1.1 내지 XH1.10은 각각 독립적으로 표 66의 칼럼 4에 따른 아미노산 잔기이다. 또 다른 양태에서, XH2.1 내지 XH2.17은 각각 독립적으로 표 67의 칼럼 3에 따른 아미노산 잔기이다. 또 다른 양태에서, XH2.1 내지 XH2.17은 각각 독립적으로 표 67의 칼럼 4에 따른 아미노산 잔기이다. 또 다른 양태에서, XH3.1 내지 XH3.9는 각각 독립적으로 표 68의 칼럼 3에 따른 아미노산 잔기이다. 또 다른 양태에서, XH3.1 내지 XH3.9는 각각 독립적으로 표 68의 칼럼 4에 따른 아미노산 잔기이다.
추가로, 본 발명은 XH1.8이 G이고, XH2.5가 Y이고, XH3.1은 I이고, XH3.7 이 F이고, XL3.3이 W이고, XH2.6이 N이고, XH2.16이 Q이고, XH3.5가 N이고, XH3.9가 I이고, XL1.8이 G이고, XL2.2가 N이고, XL2.3이 N이고, XL3.2가 T이고/이거나, XL3.4가 D인 경우를 제공한다. 본 발명은 또한 본원에 기재된 양태의 임의의 조합을 제공한다.
도 1a 및 1b는 "놉-인-홀(knob-in-hole)" 회합을 통해 회합하도록 최적화된 Fc 영역을 포함하는 제1 이종이량체-촉진 도메인 및 제2 이종이량체-촉진 도메인을 갖는 LP-DART P-카데린/CD3 이중특이성 이종이량체성 디아바디의 4가지 대체 표시에 대한 개략도를 제공한다.
도 2는 제1 폴리펩티드 쇄(1)를 갖는, T 세포(CD3 항원을 통해) 및 종양 세포(P-카데린 항원을 통해)를 동시에 표적화하고 활성화시키는 VF-DART 이중특이성 이종이량체성 디아바디의 개략도를 제공하고, 여기서 제1 이종이량체-촉진 도메인은 제2 폴리펩티드 쇄(2)의 제2 이종이량체-촉진 도메인의 C-말단 펩티드와 함께 안정성을 위한 디설파이드 결합을 형성하는 C-말단 펩티드를 포함한다.
도 3은 제1 폴리펩티드 쇄(1) 및 제2 폴리펩티드 쇄(2)를 갖는 조립된 VF-DART 이중특이성 이종이량체성 디아바디의 개략도를 제공하고, 여기서 제1 이종이량체-촉진 도메인(예컨대 아래에 상세히 기재된, 서열번호 70 또는 서열번호 71) 및 제2 이종이량체-촉진 도메인(예컨대 제1 이종이량체 촉진 도메인의 선택에 의존하여, 서열번호 71 또는 서열번호 70)은 시스테인 잔기를 포함한다.
도 4는 제1 폴리펩티드 쇄(1)(여기서 제1 이종이량체-촉진 도메인은 음성으로 하전된 알파-나선형 코일(E-코일)을 형성하는 글루탐산-풍부 영역을 포함함), 및 제2 폴리펩티드 쇄(2)(여기서 제2 이종이량체-촉진 도메인은 양성으로 하전된 나선형 코일(K-코일)을 형성하는 라이신 풍부 영역을 포함함)를 갖는 조립된 EK-DART 이중특이성 이종이량체성 디아바디의 개략도를 제공한다.
도 5는 "놉-인-홀" 회합을 통해 회합하도록 최적화된 Fc 영역을 포함하는 제1 이종이량체-촉진 도메인 및 제2 이종이량체-촉진 도메인을 갖는 조립된 LP-DART 이중특이성 이종이량체성 디아바디의 개략도를 제공한다.
도 6은 MP3-DART로 지칭되는 Fc 도메인을 갖는 대안의 이중특이성 이종이량체성 디아바디의 구조를 제공한다. 이중특이성 이종이량체성 디아바디는 Fc 도메인의 N-말단 측부에 부착되고, 따라서 "N-말단 MP3-DART"로 지칭된다. N-말단 MP3-DART는 개략적으로 표시되는 제1, 제2 및 제3 폴리펩티드 쇄를 포함한다. N-말단 MP3-DART의 최종 구조가 표시된다.
도 7은 MP3-DART로 지칭되는 Fc 도메인을 갖는 대안의 이중특이성 이종이량체성 디아바디의 구조를 제공한다. 이중특이성 이종이량체성 디아바디는 Fc 도메인의 C-말단 측부에 부착되고, 이에 따라 "C-말단 MP3 DART"로 지칭된다. C-말단 MP3-DART는 개략적으로 표시되는 제1, 제2 및 제3 폴리펩티드 쇄를 포함한다. C-말단 MP3-DART의 최종 구조가 표시된다.
도 8은 세포 표면 P-카데린 발현에 대하여 세포독성 T 림프구(CTL) 활성을 비교하는 선형 회귀 분석을 제공한다.
도 9는 뮤린 HCT116 결장직장암 모델에서 종양 부피를 감소시키는 177 EK-DART의 생체내 능력을 입증한다.
도 10은 뮤린 HCT116 결장직장암 모델에서 종양 부피를 감소시키는 153 EK-DART의 생체내 능력을 입증한다.
도 11은 뮤린 HCT116 결장직장암 모델에서 종양 부피를 감소시키는 154 EK-DART의 생체내 능력을 입증한다.
도 12는 뮤린 HCT116 결장직장암 모델에서 종양 부피를 감소시키는 35 EK-DART의 생체내 능력을 입증한다.
도 13은 뮤린 HCT116 결장직장암 모델에서 종양 부피를 감소시키는 153 LP-DART의 생체내 능력을 입증한다.
도 14는 뮤린 HCT116 결장직장암 모델에서 종양 부피를 감소시키는 153 LP-DART의 생체내 능력을 입증한다.
도 15는 뮤린 Du145 전립선암 모델에서 종양 부피를 감소시키는 153 LP-DART의 생체내 능력을 입증한다.
도 16은 뮤린 H1650 폐암 모델에서 종양 부피를 감소시키는 153 LP-DART의 생체내 능력을 입증한다.
도 17a 내지 17d는 확립된 종양 + 이식된 인간 T 세포 모델에서 종양 부피를 감소시키는 153 LP-DART의 생체내 능력을 입증하고, 17e는 종양 부피의 원 웨이(one way) 아노바(ANOVA) 분석을 나타낸다.
도 18a 및 18b는 확립된 종양 인간 T 세포 양자 전달(adoptive transfer) 모델에서 종양 부피를 감소시키는 153 LP-DART의 생체내 능력을 입증한다.
도 19는 P-카데린 양성 환자 유래된 결장직장 종양 이종이식에서 종양 부피를 감소시키는 153 LP-DART의 생체내 능력을 입증한다.
도 20은 종양 침윤성 림프구(TIL)에서 153 LP-DART 중재된 투약량 의존성 증가를 보여준다.
도 21a 내지 21d는 형광단 표지화된 153 LP-DART 및 T 세포의 특성을 평가하기 위한 시험관내 검정을 제공한다.
도 22a 내지 22d는 종방향의 FMT 영상촬영을 사용하여 HCT116 이종이식 모델에서의 153 LP-DART의 생체내 분포 및 표적화를 제공한다.
도 23a 내지 23c는 FMT 영상촬영 연구로부터의 약물동력학적 데이터(ELISA)를 보여준다.
도 24a는 형광단 표지화된 T 세포 및 표지화되지 않은 T 세포의 T 세포 활성에 대한 평가를 보여주고, 24b는 FMT 영상촬영(생체내)을 사용하여 HCT116 종양 모델에서의 형광단 표지화된 T 세포의 세포 추적 동력학(cellular tracking kinetics)을 보여준다.
도 25는 P-CAD VH 도메인에 공유적으로 연결된 C-말단 His 태그("6XHIS"로 지정됨) 및 CD3 VH 도메인에 공유적으로 연결된 C-말단 FLAG("FLAG"로 지정됨)를 갖는, 결정학을 위해 지정된 DART 구축물의 개략도를 제공한다.
도 26은 결정학 35 DART 단백질의 결정 구조에 대한 상세한 묘사를 제공한다.
도 27은 항-CD3 CDR 영역 및 항-P-CAD CDR 영역에 대한 항원 결합 자리를 보여주는 결정학 35 DART 단백질의 상세한 묘사를 제공한다.
도 28은 다양한 아미노산에 의해 측쇄 부피가 증가됨으로써 충전될 수 있는 거대한 내부 공극/홀을 함유하는 도메인간 계면에서 자리-유도된 돌연변이생성을 통해 더욱 안정한 도메인간 회합을 갖는 결정학 35 DART 단백질 변이형의 개략도를 제공한다.
도 29는 디설파이드 결합의 용매 접근성을 감소시킬 뿐만 아니라 연결기의 길이를 감소시키기 위해 다양한 디설파이드 결합 위치(Cys-Cys 자리)를 갖는 결정학 35 DART 단백질의 결정 구조에 대한 상세한 묘사를 제공한다.
도 30a 및 30b는 본 발명의 VF-DART 이중특이성 이종이량체성 디아바디의 제1 및 제2 폴리펩티드 쇄를 위한 아미노산 서열을 제공한다.
도 31a 및 31b는 본 발명의 EK-DART 이중특이성 이종이량체성 디아바디의 제1 및 제2 폴리펩티드 쇄를 위한 아미노산 서열을 제공한다.
도 32a 및 32b는 본 발명의 LP-DART 이중특이성 이종이량체성 디아바디의 제1 및 제2 폴리펩티드 쇄를 위한 아미노산 서열을 제공한다.
도 33은 본 발명의 DART 이중특이성 이종이량체성 디아바디의 제1 및 제2 폴리펩티드 쇄를 위한 아미노산 서열을 제공한다.
도 34는 P-카데린 153 LP-DART의 에피토프 매핑(mapping)을 위한 P-카데린-세포외 도메인(ECD)-Fc 융합 단백질 구축물을 제공한다.
도 35는 전장 P-카데린 에피토프 서열[유니프롯(UniProt) P22223, CADH3, 인간 카데린-3]을 제공한다.
본 발명은 세포용해 T 세포의 모집 및 활성화를 위해 P-카데린에 특이적으로 결합하는 항원 결합 도메인 및 CD3에 특이적으로 결합하는 항원 결합 도메인을 포함하는 신규한 이중특이성 이종이량체성 디아바디를 기재한다. 이중특이성 이종이량체성 디아바디는 추가로 Fc 도메인을 포함할 수 있다. 더욱이, 이중특이성 이종이량체성 디아바디가 P-카데린을 발현하는 종양 세포에 T 세포 세포독성을 성공적으로 인도하거나 이를 활성화시키는 것으로 본원에서 입증된다. 추가로, 본 발명의 이중특이성 이종이량체성 디아바디는 생체내 반감기를 연장시키는 증진된 약물동력학적 특성을 증진시켰고, P-카데린 발현 종양의 존재하에 CD3 착체를 통해 다중클론성 T 세포 집단과 결체하여 이를 활성화시키도록 고안되었다.
본 발명은 인간 파아지 디스플레이 라이브러리로부터 유래된 P-카데린에 대항하는 전체 인간 단일-쇄 항체 결합 도메인의 단리 및 특징화를 기재한다. 본 발명은 추가로 앞서 기재된 DART 형식[무어(Moore) 등의 문헌 "Blood, 117(17): 4542-4551, 2011"]에서 항-CD3 항체의 항원 결합 도메인에 P-카데린 결합 도메인을 공유적으로 연결시켜 P-카데린 및 CD3에 동시에 결합할 수 있는 이중특이성 이종이량체성 디아바디를 생성한다. 추가로, 본 발명의 한 양태에서, 또한 이중특이성 이종이량체성 디아바디로서 공지된 항-P-카데린/항-CD3 DART 단백질은 P-카데린을 발현하는 세포의 T 세포 세포독성을 성공적으로 인도하고 이를 활성화시킨다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용되는 당분야의 모든 용어, 표기법 및 다른 과학적 용어 또는 전문용어는 본 발명이 속하는 분야의 숙련가에 의해 통상적으로 이해되는 의미를 갖고자 한다. 몇몇 경우에, 통상적으로 이해되는 의미를 갖는 용어는 명확성 및/또는 신속한 참조(ready reference)를 위해 본원에 정의되고, 본원에서 이러한 정의의 포함은 당분야에서 일반적으로 이해되는 것 이상의 실질적인 차이를 나타내는 것으로 반드시 해석되어야 하는 것은 아니다. 본 발명의 실행은, 달리 지시되지 않는 한, 당분야의 기술에 속하는 분자 생물학(재조합 기법 포함), 미생물학, 세포 생물학, 생화학, 핵산 화학, 및 면역학의 종래의 기법을 이용한다. 이러한 기법은 문헌, 예컨대 문헌[Current Protocols in Immunology (J. E. Coligan et al., eds., 1999, including supplements through 2001)]; [Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel et al., eds., 1987, including supplements through 2001)]; [Molecular Cloning: A Laboratory Manual, third edition (Sambrook and Russel, 2001)]에 전체적으로 설명되어 있다.
P-카데린(카데린-3, CDH3)은 발달 및 조직 항상성 동안 칼슘-의존성 세포-세포 접착을 조절하는 막관통 당단백질의 고전적인 카데린 상위계열(superfamily)에 속한다[굼비너(Gumbiner) 등의 문헌 "J. Cell Biol., 148: 399-403, (2000)"]. 카데린 세포내 도메인은 액틴(actin) 세포골격 망구조로 연결되는 세포질 카테닌(catenin)과 직접 상호작용하여, 안정한 세포 상호작용을 위한 분자 기초를 제공한다. 카데린/카테닌 착체, 뿐만 아니라 이러한 구조에 의해 제어되는 신호발송 경로는, 세포 성장, 분화, 운동성, 및 생존에 대한 이의 영향을 통해, 세포 운명 결정을 지도하는 주요 조절 기작을 나타낸다[카발라로(Cavallaro) 등, 2011]. 고전적인 카데린은 E-카데린(CDH1), N-카데린(CDH2) 및 P-카데린(CDH3)을 포함한다. 정상 조직에서의 P-카데린 발현은 낮고, 주로 근상피 세포 및 중층상피의 기저 층에 제한된다. P-카데린의 증가된 발현은 유방암, 위암, 자궁내막암, 췌장암 및 결장직장암을 비롯한 다양한 종양에서 보고되었고, 진행된 질병을 앓는 환자의 불량한 생존에 대한 우수한 예측자이다[하디(Hardy) 등, 2002; 이마이(Imai) 등, 2008; 파라데스(Parades) 등, 2005; 스테판슨(Stefansson) 등, 2004; 다니우치(Taniuchi) 등, 2005]. 유전자 발현 자료 수집 및 면역조직화학 분석으로부터 추가로 폐암(제한되지 않지만 비-소 세포 폐암 및 소 세포 폐암 포함), 난소암, 두경부암, 갑상선암 및 방광암이 제안되었다.
CD3(분화 클러스터 3)은 εδ, εγ 및 ζζ 이량체를 형성하는 4개의 별개의 쇄 ε, δ, γ 및 ζ를 포함하는 T 세포 공-수용체 단백질 착체이다.
이들 이량체는 T 세포 수용체(TCR)로서 공지된 분자와 회합하고 T 림프구에서 활성화 신호를 생성한다. TCR 및 CD3 분자는 함께 TCR 착체를 포함한다. 항-CD3 항체가 내생성 림포카인(lymphokine) 생산의 활성화를 통해 세포독성 T 세포의 생성을 이끌어 내고 종양 표적을 선택적으로 살해할 수 있는 것으로 잘 공지되어 있다[윤(Yun) 등의 문헌 "Cancer Research, 49: 4770-4774 (1989)"].
더욱 구체적으로, T 세포는 항원 특이적 면역 반응을 유도할 수 있는 TCR 착체를 발현한다[스미쓰-가빈(Smith-Garvin) 등, 2009]. 항원은 면역 반응을 자극할 수 있는 종양 세포 및 바이러스 감염된 세포에 의해 발현되는 펩티드이다. 세포내 발현된 항원은 주요 조직적합성 부류 I(MHC I: major histocompatibility class I) 분자에 결합하고, 이들이 T 세포에 노출될 경우 표면으로 수송된다. 항원과의 착체에서 TCR의 MHC 부류 I로의 결합 친화도가 충분하다면, 면역 시냅스(synapse)의 형성이 개시될 것이다. 면역 시냅스를 통한 신호발송은 εδ, εγ 및 ζζ 이량체를 형성하는 CD3 공-수용체를 통해 중재된다. 이들 이량체는 TCR과 회합하고 T 림프구에서 활성화 신호를 생성한다. 이러한 신호발송 캐스캐이드(cascade)는 항원을 발현하는 세포의 T 세포 중재된 살해를 인도한다. 세포독성은 그랜자임(granzyme) B 및 퍼포린(perforin)을 방출시키고 T 세포로부터 표적 세포로 이동시킴으로써 중재된다.
이론에 얽매려는 것은 아니지만, 본 발명의 이중특이성 이종이량체 디아바디는 T 세포가 항원과의 착체에서 TCR 및 MHC 부류 I의 상호작용에 대한 필요성을 피해가도록 할 수 있고, 그 대신 T 세포 상에서 발현된 CD3(예컨대 CD3 엡실론) 및 종양 상에서 발현된 P-카데린의 직접적인 공동-결체를 통해 T 세포를 표적 세포로 재인도하는 것으로 믿겨진다.
"효과자 작용"은 본원에 사용될 경우 이중특이성 이종이량체성 디아바디의 항-CD3 결합 도메인과 세포독성 T 세포의 상호작용으로부터 초래된 생화학적 반응을 지지하는 능력을 의미한다.
본원에 사용될 경우, 용어 "항체" 및 "항체들"은 단일클론성 항체, 다중특이성 항체, 인간 항체, 인간화된 항체, 합성 항체, 키메라성(chimeric) 항체, 다중클론성 항체, 카멜화된(camelized) 항체, 단일-쇄 Fv(scFv), 단일 쇄 항체, Fab 단편, F(ab') 단편, 디설파이드-연결된 이중특이성 Fv(sdFv), 세포내 항체(intrabody), 및 항-유전자형(항-Id) 항체(예를 들어 본 발명의 항체로의 항-Id 및 항-항-Id 항체 포함), 및 상기 임의의 항체의 에피토프-결합 단편 또는 결합 도메인을 지칭한다. 특히, 항체는 면역글로불린 분자 및 면역글로불린 분자의 면역학적으로 활성인 단편, 즉, 항원 결합 자리를 함유하는 분자를 포함한다. 면역글로불린 분자는 임의의 유형(예를 들어 IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 및 IgY), 부류(예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 또는 하위부류일 수 있다.
본원에 사용될 경우, 용어 "이중특이성 이종이량체성 디아바디"는 각각 적어도 하나의 항체 VL 및 하나의 항체 VH 도메인 또는 이의 단편을 포함하는 2개 이상의 폴리펩티드 쇄 또는 단백질의 착체를 지칭하고, 여기서 항체 결합 도메인은 둘 다 하나의 단일 폴리펩티드 쇄내에 포함되고, 각각의 폴리펩티드 쇄중 VL 및 VH 도메인은 상이한 항체로부터이다.
본원에 사용될 경우, 용어 "면역특이적으로 결합하는", "면역특이적으로 인식하는", "특이적으로 결합하는", "특이적으로 인식하는", 및 유사한 용어는 항원(예를 들어 에피토프 또는 면역 착체)에 특이적으로 결합하지만 또 다른 분자에 특이적으로 결합하지 않는 분자, 예를 들어 결합 도메인을 지칭한다. 항원에 특이적으로 결합하는 분자는 당분야에 공지된 검정, 예를 들어 면역검정, 비아코어(BIACORE: 등록상표), 또는 기타 검정에 의해 결정될 경우 더 낮은 친화도로 다른 펩티드 또는 폴리펩티드에 결합할 수 있다. 바람직하게는, 항원에 특이적으로 결합하는 분자는 다른 단백질과 교차-반응하지 않는다.
본원에 사용될 경우, 용어 "중쇄", "경쇄", "가변 영역" 또는 "가변 도메인", "골격구조 영역", "불변 도메인" 등은 면역학 분야에서 이들의 일상적인 의미를 갖고, 천연 발생 면역글로불린에서의 도메인 및 재조합 결합 단백질(예를 들어 인간화된 항체, 단일 쇄 항체, 키메라성 항체 등)의 상응하는 도메인을 지칭한다. 천연 발생 면역글로불린의 기본 구조 단위는 대체적으로 약 150,000 Da의 당단백질로서 발현되는 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄를 갖는 4량체이다. 각각의 쇄의 아미노-말단(N-말단) 부위는 약 100 내지 110의 가변 영역 또는 항원 인식에 주로 책임이 있는 더 많은 아미노산을 포함한다. 각각의 쇄의 카복시 말단(C-말단) 부위는 하나의 불변 영역을 정의한다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 도메인(VL) 및 경쇄 불변 도메인(CL)으로 구성된다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역(VH), 및 CH1, 힌지(hinge), CH2 및 CH3 도메인을 갖는 중쇄 불변 영역으로 구성된다. IgG 분자의 가변 영역은 상보성 결정 영역(CDR: complementarity determining region)으로 지칭되는 과가변의 영역을 포함하고, 이는 항원과 접촉된 잔기, 및 비-CDR 분절(골격구조 영역(FR)으로 지칭됨)을 함유하고, 이러한 분절은 (비록 특정 골격구조 잔기 또한 항원과 접촉할 수 있지만) 일반적으로 구조를 유지하고 CDR 루프(loop)의 위치선정을 결정한다. 각각의 VH 및 VL은 다음과 같은 구조로 아미노-말단으로부터 카복시-말단으로 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR을 포함한다: n-FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4-c. 면역글로불린 분자는 임의의 유형(예를 들어, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 및 IgY) 및 부류(예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 또는 하위부류일 수 있다.
"힌지 영역" 또는 "힌지 도메인"은 일반적으로 인간 IgG-1의 Glu216으로부터 Pro230으로의 연신부로서 정의된다. 다른 IgG 이소타입(isotype)의 힌지 영역은 중쇄 사이의 S-S 결합을 형성하는 첫번째 및 마지막 시스테인 잔기를 동일한 위치에 위치시킴으로써 IgG1 서열과 정렬될 수 있다.
본원에 사용될 경우, 용어 "Fc 영역", "Fc 도메인" 또는 유사한 용어는 IgG 중쇄의 C-말단 영역을 정의하기 위해 사용된다. IgG의 Fc 영역은 2개의 불변 도메인, CH2 및 CH3을 포함한다. 인간 IgG Fc 영역의 CH2 도메인은 대체적으로 아미노산 231로부터 아미노산 341까지 카밧(Kabat)의 번호매김 시스템에 따라 연장된다. 인간 IgG Fc 영역의 CH3 도메인은 대체적으로 아미노산 342로부터 447까지 카밧의 번호매김 시스템에 따라 연장된다. 인간 IgG Fc 영역의 CH2 도메인(또한 "Cy 2" 도메인으로서 지칭됨)은 또 다른 도메인과 가깝게 쌍을 이루지 않는다는 점에서 독특하다. 오히려, 2개의 N-연결된 분지된 탄수화물 쇄는 온전한 고유의 IgG의 2개의 CH2 도메인 사이에 놓인다.
결합 단백질, 결합 도메인, 또는 항체(본원에 넓게 정의되는 바와 같음)를 지칭할 때, 각각의 도메인으로의 아미노산의 할당은 카밧, 코티아(Chothia)의 정의, 카밧 및 코티아 둘 다의 누적, Abm 및/또는 입체배위적 정의 또는 당분야에 공지된 임의의 CDR 결정 방법을 따른다. 항체 CDR은 카밧 등에 의해 고유적으로 정의된 과가변 영역으로서 식별될 수 있다. 예를 들어, 카밧 등의 문헌[1992, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, NIH, Washington D.C.]을 참조한다. CDR의 위치는 또한 코티아 및 다른 사람에 의해 고유적으로 기재된 구조적 루프 구조로서 식별될 수 있다. 예를 들어, 코티아 등의 문헌[1989, Nature 342:877-883]을 참조한다. CDR 식별에 대한 다른 접근법으로는 카밧 및 코티아 사이의 절충안이고 옥스포드 몰레큘라(Oxford Molecular)의 AbM 항체 모델링 소프트웨어[악셀리스(Accelrys), 미국 캘리포니아주 샌 디에고 소재]를 사용하여 유도된 "AbM 정의", 또는 맥칼럼(MacCallum) 등의 문헌[1996, J. Mol. Biol., 262:732-745]에 제시된, 관찰된 항원 접촉부에 기초한 CDR의 "접촉부 정의"가 포함된다. CDR의 "입체배위적 정의"로서 본원에 지칭된 또 다른 접근법에서, CDR의 위치는 항원 결합에 엔탈피적(enthalpic) 기여를 하는 잔기로서 식별될 수 있다. 예를 들어, 마카베(Makabe) 등의 문헌[2008, Journal of Biological Chemistry, 283:1156-1166]을 참조한다. 여전히 다른 CDR 경계 정의는 상기 접근법중 하나를 엄격히 따르지 않을 수 있으나, 그럼에도 불구하고, 카밧 CDR의 적어도 일부와 중첩될 수 있지만, 이들은 특별한 잔기 또는 잔기의 그룹 또는 심지어 전체 CDR이 항원 결합에 그다지 영향을 주지 않는다는 예측 또는 실험적 발견의 견지에서 단축되거나 연장될 수 있다. 본원에 사용될 경우, CDR은 당분야에 공지된 임의의 접근법(접근법들의 조합 포함)에 의해 정의된 CDR을 지칭한다. 본원에 사용된 방법은 임의의 이들 접근법에 따라 정의된 CDR을 이용할 수 있다. 하나 보다 많은 CDR을 포함하는 임의의 제공된 양태를 위해, CDR은 카밧, 코티아, 연장부, AbM, 접촉부, 및/또는 입체배위 정의중 임의의 정의에 따라 정의될 수 있다.
인간화된 항체는 비-인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소한의 서열을 함유하는 키메라성 면역글로불린, 면역글로불린 쇄, 또는 이의 단편(예컨대 Fv, Fab, Fab', F(ab')2 또는 기타 항원-결합 결과물 또는 항체의 결합 도메인)인 비-인간(예를 들어 뮤린) 항체의 형태를 지칭한다. 바람직하게는, 인간화된 항체는 인간 면역글로불린(수여자 항체)이고, 여기서 수여자의 상보성 결정 영역(CDR)으로부터의 잔기는 원하는 특이성, 친화도 및 능력을 갖는 비-인간 종(공여자 항체), 예컨대 마우스, 래트 또는 토끼의 CDR로부터의 잔기로 대체된다.
용어 "단일클론성 항체"는 임의의 진핵, 원핵 또는 파아지 클론을 비롯한 단일 클론(이것이 생산되는 방법은 아님)으로부터 유래되는 항체를 지칭한다. 본 발명의 이중특이성 이종이량체성 디아바디의 도메인에 결합하는 단일클론성 항체는 하이브리도마(hybridoma), 재조합, 및 파아지 디스플레이 기술의 사용, 또는 이들의 조합을 비롯하여 당분야에 공지된 다양한 기법을 사용하여 제조될 수 있다 예를 들면, 단일클론성 항체는 당분야에 공지된 기법을 비롯하여 하이브리도마 기법에 의해 생산될 수 있다.
항체는 또한 당분야에 공지된 다양한 파아지 디스플레이 방법을 사용하여 생성될 수 있다. 파아지 디스플레이 방법에서, 작용성 항체 도메인은 이들을 인코딩하는 폴리누클레오티드 서열을 운반하는 파아지 입자의 표면 상에 디스플레이된다. 특별한 양태에서, 이러한 파아지는 레퍼토리(repertoire) 또는 조합적 항체 라이브러리(예를 들어 인간 또는 뮤린)로부터 발현되는, 항원 결합 도메인, 예컨대 Fab 및 Fv 또는 디설파이드-결합 안정화된 Fv를 디스플레이하기 위해 이용될 수 있다. 흥미로운 항원에 결합하는 항원 결합 도메인을 발현하는 파아지는 항원에 의해, 예를 들어 표지화된 항원 또는 고체 표면이나 비드(bead)에 결합되거나 포획된 항원에 의해 선택되거나 식별될 수 있다. 이들 방법에서 사용되는 파아지는 전형적으로 fd 및 M13을 비롯한 사상(filamentous) 파아지이다. 항원 결합 도메인은 파아지 유전자 III 또는 유전자 VIII 단백질에 재조합적으로 융합된 단백질로서 발현된다. 본 발명의 면역글로불린, 또는 이의 단편을 제조하기 위해 사용될 수 있는 파아지 디스플레이 방법의 예로는 브린크만(Brinkmann) 등의 문헌[(1995) "디설파이드-안정화된 Fv 단편의 파아지 디스플레이(Phage Display Of Disulfide-Stabilized Fv Fragments)" J. Immunol. Methods, 182:41-50]에 개시된 방법들이 포함된다.
다중 IgG 이소타입, 및 이의 도메인의 작용적 특징은 당분야에 잘 공지되어 있다. IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4의 아미노산 서열은 당분야에 공지되어 있다. 본 발명의 방법에 사용하기 위한 특이적인 IgG 이소타입으로부터의 2개 이상의 도메인의 선택 및/또는 조합은 FcγR에 대한 친화도를 비롯한 모 이소타입의 임의의 공지된 매개변수에 근거할 수 있다. 예를 들면, FcγRIIB, 예를 들어 IgG2 또는 IgG4로의 제한된 결합 또는 결합 부재를 나타내는 IgG 이소타입으로부터의 영역 또는 도메인의 사용은, 이중특이성 이종이량체성 디아바디가 활성화 수용체로의 결합을 최대화하고 저해성 수용체로의 결합을 최소화하도록 조작되는 것이 바람직한 경우에 특별한 용도를 발견할 수 있다. 유사하게, C1q 또는 FcγRIIIA에 우선적으로 결합하는 것으로 공지된 IgG 이소타입, 예를 들어 IgG3으로부터의 Fc 영역 또는 도메인의 사용은, 효과자 작용 활성, 예를 들어 보체 활성화 또는 ADCC가 최대화되도록 이중특이성 이종이량체성 디아바디 분자를 조작하기 위해, 항체-의존성 세포 중재된 세포독성(ADCC) 및/또는 보체 의존성 세포독성(CDC)을 증진시키는 것으로 당분야에 공지된 Fc 아미노산 변형과 조합될 수 있다. 유사한 양식으로, Fc 영역의 효과자 작용을 최소화시키거나 제거하는 돌연변이가 IgG 이소타입의 Fc 영역 또는 도메인에서 이루어질 수 있다.
용어 "에피토프"는 하나 이상의 항체의 항원-결합 영역에서 하나의 항체에 의해 인식되거나 결합될 수 있는 분자의 부분을 지칭한다. 에피토프는 종종 분자, 예컨대 아미노산 또는 당 측쇄의 화학적으로 활성인 표면 집단으로 구성되고, 특이적인 전하 특징 뿐만 아니라 특이적인 3차원 구조적 특징을 갖는다. "항원성 에피토프"는 본원에 사용될 경우, 당분야에 잘 공지된 임의의 방법에 의해, 예를 들면, 종래의 면역검정에 의해 결정될 경우 항체가 특이적으로 결합될 수 있는 폴리펩티드의 부분으로서 정의된다. "비선형 에피토프" 또는 "입체배위 에피토프"는 에피토프에 특이적인 항체가 결합하는 항원성 단백질내의 비인접한 폴리펩티드(또는 아미노산)를 포함한다. 일단 항원상의 원하는 에피토프가 결정되면, 예를 들어 본원에 기재된 기법을 사용하여 이러한 에피토프에 대한 항체를 생성하는 것이 가능하다. 발견 과정 동안, 항체의 생성 및 특징화는 원하는 에피토프에 대한 정보를 밝혀낼 수 있다. 이러한 정보로부터, 이어서 동일한 에피토프에 결합하는 항체를 경쟁적으로 선별할 수 있다. 이를 달성하기 위한 하나의 접근법은 서로 경쟁하거나 교차-경쟁하는 항체, 예를 들어 항원에 결합하기 위해 경쟁하는 항체를 발견하기 위해 경쟁 및 교차-경쟁 연구를 수행하는 것이다.
한가지 방법은 항체가 결합하는 에피토프를 식별하는 것, 또는 "에피토프 매핑"이다. 단백질 상의 에피토프의 위치를 매핑하고 특징화하기 위해 당분야에 공지된 많은 방법들이 존재하고, 예컨대 항체-항원 착체의 결정 구조의 해결, 경쟁 검정, 유전자 단편 발현 검정, 및 합성 펩티드에 기초한 검정이 포함되고, 예를 들면, 하로우(Harlow) 및 래인(Lane)의 문헌[Using Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1999]의 제11장에 기재된 바와 같다. 추가의 예에서, 에피토프 매핑은 항체가 결합하는 서열을 결정하기 위해 사용될 수 있다. 에피토프 매핑은 다양한 공급원, 예를 들면, 펩스칸 시스템스(Pepscan Systems)(네델란드 8219 PH 렐리스타드 에델헤르트웨크 15 소재)로부터 상업적으로 입수가능하다. 추가의 예에서, 항원 결합 도메인의 돌연변이생성, 도메인 스와핑(swapping) 실험 및 알라닌 스캐닝(scanning) 돌연변이생성은 에피토프 결합을 위해 요구되고/되거나, 충분하고/하거나 필수적인 잔기를 식별하기 위해 수행될 수 있다. 항원-결합 도메인 상호작용의 결합 친화도 및 해리-속도는 경쟁 결합 검정에 의해 결정될 수 있다. 경쟁 결합 검정의 일예는 표지화된 항원의 항온처리, 및 표지화된 항원에 결합된 분자의 검출을 포함하는 방사성면역검정이다. 항원에 대한 본 발명의 분자의 친화도 및 결합 해리-속도는 스카트차드(Scatchard) 분석에 의해 포화 데이터로부터 결정될 수 있다.
항원에 대한 본 발명의 분자의 친화도 및 결합 특성은 항원-결합 도메인에 대해 당분야에 공지된 시험관내 검정(생화학적 또는 면역학적 기초 검정), 예컨대 제한되지 않지만 효소-연결된 면역흡착 검정(ELISA: enzyme-linked immunosorbent assay), 표면 플라스몬 공명(SPR: surface plasmon resonance) 검정, 생물층 간섭측정(Bio-Layer Interferometry), 또는 면역침전 검정을 사용하여 초기에 결정될 수 있다. 본 발명의 분자는 시험관내 기초 검정과 유사한 결합 특성을 생체내 모델(예컨대 본원에 기재되고 개시된 바와 같음)에서 가질 수 있다. 그러나, 본 발명은 원하는 표현형을 시험관내 기초 검정에서 나타내지 않지만 원하는 표현형을 생체내에서 나타내는 본 발명의 분자를 배제하지 않는다.
용어 "결합 친화도(KD)"는, 본원에 사용될 경우, 특별한 항원-항체 상호작용의 해리 속도를 지칭하고자 한다. KD는 회합 속도 또는 "회합-속도(k회합)"에 대한 해리-속도(k해리)"로도 지칭되는 해리의 속도의 비율이다. 이와 같이, KD는 k해리/k회합과 동일하고 몰 농도(M)로서 표시된다. KD,가 더 작을수록, 결합 친화도는 더 강해진다. 따라서, 1 μΜ의 KD는 1 nM의 KD에 비해 약한 결합 친화도를 지시한다. 항체에 대한 KD 값은 당분야에 잘 확립된 방법을 사용하여 결정될 수 있다. 항체의 KD를 결정하기 위한 한가지 방법은 표면 플라스몬 공명(SPR), 전형적으로 바이오센서 시스템, 예컨대 비아코어(등록상표) 시스템을 사용하는 것이다. 비아코어 동력학적 분석은 고정화된 분자(예를 들어 에피토프 결합 도메인을 포함하는 분자)를 표면 상에 갖는 칩(chip)으로부터의 항원의 결합 및 해리를 분석함을 포함한다. 항체의 KD를 결정하기 위한 또 다른 방법은 생물층 간섭측정, 전형적으로 옥테트(OCTET: 등록상표) 기술[옥테트 큐케이e 시스템(Octet QKe system), 포르테바이오(ForteBio)]을 사용하는 것이다.
본원에 사용될 경우, 용어 "핵산" 및 "누클레오티드 서열"은 DNA 분자(예를 들어 cDNA 또는 게놈성 DNA), RNA 분자(예를 들어 mRNA), DNA 및 RNA 분자의 조합 또는 하이브리드 DNA/RNA 분자, 및 DNA 또는 RNA 분자의 유사체를 포함한다. 이러한 유사체는, 예를 들면, 누클레오티드 유사체를 사용하여 생성될 수 있고, 이로는 제한되지 않지만, 이노신(inosine) 또는 트리틸화된 염기가 포함된다. 이러한 유사체는 또한 분자, 예컨대, 예를 들면, 누클레아제(nuclease) 저항성 또는 세포막을 통과하는 증가된 능력에 유리하게 기여하는 개질된 주쇄를 포함하는 DNA 또는 RNA 분자를 포함한다. 핵산 또는 누클레오티드 서열은 단일-가닥, 이중-가닥일 수 있고, 단일-가닥 및 이중-가닥 부분 둘 다를 함유할 수 있으며, 삼중-가닥 부분을 함유할 수 있지만, 바람직하게는 이중-가닥 DNA이다.
본 발명은 또한 항체의 결합 영역 및 폴리펩티드를 포함하는, 본 발명의 이중특이성 이종이량체성 디아바디를 인코딩하는 폴리누클레오티드를 포함한다. 본 발명의 분자를 인코딩하는 폴리누클레오티드는 당분야에 공지된 임의의 방법에 의해 수득될 수 있고, 폴리누클레오티드의 누클레오티드 서열은 당분야에 공지된 임의의 방법에 의해 결정될 수 있다.
본 발명의 이중특이성 이종이량체성 디아바디를 인코딩하는 폴리누클레오티드는 다음을 포함할 수 있다: 단지 변이형를 위한 코딩 서열, 변이형의 코딩 서열 및 추가의 코딩 서열, 예컨대 작용성 폴리펩티드, 또는 신호 또는 분비 서열 또는 전구(pro)-단백질 서열; 항체를 위한 코딩 서열 및 비-코딩 서열, 예컨대 인트론(intron) 또는 항체를 위한 코딩 서열의 비-코딩 서열 5' 및/또는 3'. 용어 "이중특이성 이종이량체성 디아바디를 인코딩하는 폴리누클레오티드"는 변이형를 위한 추가의 코딩 서열을 포함하는 폴리누클레오티드, 뿐만 아니라 추가의 코딩 및/또는 비-코딩 서열을 포함하는 폴리누클레오티드를 포괄한다. 특이적 숙주 세포/발현 시스템에 대해 최적화된 폴리누클레오티드 서열이 원하는 단백질의 아미노산 서열로부터 쉽게 수득될 수 있음은 당분야에 공지되어 있다[참조: 진아트(GENEART: 등록상표) 아게(AG), 독일 레겐스부르그 소재].
본원에 사용될 경우, 용어 "암"은 세포의 비정상적인 제어되지 않는 성장으로부터 야기된 신생물 또는 종양을 지칭한다. 몇몇 양태에서, 암은 국소화되어 남아있는 양성 종양을 지칭한다. 다른 양태에서, 암은 침습되고 파괴된 인근 신체 구조물을 갖고 멀리있는 부위로 전이된 악성 종양을 지칭한다. 몇몇 양태에서, 암은 특이적 암 항원과 회합된다.
본원에 사용될 경우, "치료학적 효과량"은 질병 또는 질환을 치료 또는 처치하기에 충분한 치료제의 양을 지칭한다. 치료학적 효과량은 질병의 개시를 지연 또는 최소화, 예를 들어 암의 전이를 지연 또는 최소화시키기에 충분한 치료제의 양을 지칭한다. 치료학적 효과량은 또한 질병의 치료 또는 처치에 치료학적 이점을 제공하는 치료제의 양을 지칭할 수 있다. 추가로, 본 발명의 치료제와 관련하여 치료학적 효과량은 질병의 치료 또는 처치에 치료학적 이점을 제공하는, 단독 또는 다른 치료제와 조합된 치료제의 양을 의미한다.
본원에 사용될 경우, 용어 "예방제" 및 "예방제들"은 질환의 예방, 또는 질환의 재발이나 전이의 예방에 사용될 수 있는 임의의 제제(들)를 지칭한다. 예방학적 효과량은 과증식 질환에 걸리기 쉬운 환자, 예를 들면 유전적으로 암에 걸리기 쉬운 환자, 또는 발암 물질에 이전에 노출된 환자를 비롯한 환자에서 과증식 질병, 특히 암의 재발이나 전이, 또는 이의 출현을 예방하기에 충분한 예방제의 양을 지칭할 수 있다. 예방학적 효과량은 또한 질병의 예방에 예방학적 이점을 제공하는 예방제의 양을 지칭할 수 있다. 추가로, 본 발명의 예방제와 관련한 예방학적 효과량은 질병의 예방에 예방학적 이점을 제공하는 단독으로의 또는 다른 제제와 조합된 예방제의 양을 의미한다.
본원에 사용될 경우, 용어 "예방하다", "예방하는" 및 "예방"은 예방제 또는 치료제의 투여 결과로서 피험체에서의 질환의 하나 이상의 증후의 재발이나 개시의 예방을 지칭한다.
본원에 사용될 경우, 용어 "조합된"은 하나 보다 많은 예방제 및/또는 치료제의 사용을 지칭한다. 용어 "조합된"의 사용은 예방제 및/또는 치료제가 질환을 앓는 환자에게 투여되는 순서를 제한하지 않는다. 달리 말하면, 조합 치료는 치료제들에 의해 별도로, 순차적으로, 또는 동시에 실행될 수 있다.
본 발명의 분자의 재조합 발현
일단 본 발명의 분자(즉, 결합 도메인)를 인코딩하는 핵산 서열이 수득되면, 분자를 생산하기 위한 벡터는 당분야에 잘 공지된 기법을 사용하여 재조합 DNA 기술에 의해 생산될 수 있다.
본 발명의 이중특이성 이종이량체성 디아바디 결합 도메인을 인코딩하는 폴리누클레오티드는 항체 코딩 서열에 작동적으로 연결된 발현 제어 폴리누클레오티드 서열을 포함할 수 있고, 예컨대 당분야에 공지된 천연적으로 회합되거나 이종성의 프로모터 영역이 포함된다. 발현 제어 서열은 진핵 숙주 세포를 형질전환시키거나 형질감염시킬 수 있는 벡터내의 진핵 프로모터 시스템일 수 있지만, 원핵 숙주를 위한 제어 서열이 사용될 수도 있다. 일단 벡터가 적절한 숙주 세포주에 혼입되면, 숙주 세포는, 원한다면, 항체의 수집 및 정제를 위해 누클레오티드 서열을 발현하기에 적합한 조건하에 증식된다. 진핵 세포주로는 CHO 세포주, 다양한 COS 세포주, HeLa 세포, 골수종 세포주, 형질전환된 B-세포, 또는 인간 배아 신장 세포주가 포함된다.
이중특이성 이종이량체성 디아바디
이전에 언급한 바와 같이, 이중특이성 이종이량체성 디아바디는 각각 적어도 하나의 항체 VL 및 하나의 항체 VH 도메인 또는 이의 단편을 포함하는 2개 이상의 폴리펩티드 쇄 또는 단백질의 착체를 지칭하고, 여기서 항체 결합 도메인은 둘 다 하나의 단일 폴리펩티드 쇄내에 포함되고, 각각의 폴리펩티드 쇄중 VL 및 VH 도메인은 상이한 항체로부터이다. 특정 양태에서, 이중특이성 이종이량체성 디아바디는 VL 및 VH 도메인 둘 다를 포함하는 폴리펩티드 쇄의 이량체 또는 사량체를 포함한다. 다량체성 단백질을 구성하는 개별적인 폴리펩티드 쇄는 쇄간 디설파이드 결합에 의해 다량체의 적어도 하나의 다른 펩티드에 공유적으로 연결될 수 있다.
본 발명의 이중특이성 이종이량체성 디아바디는 이중-친화도 재-표적화[DART(등록상표)] 플랫폼(platform) 기술(미국 특허 출원 공개 제2007/0004909호, 제2009/0060910호 및 제2010/0174053호)을 이용하여 항-CD3(CD3) 결합 도메인에 공유적으로 연결된 항-P-카데린(P-CAD) 결합 도메인으로 구성된다. DART 기술은 탁월한 안정성, 최적의 중쇄 및 경쇄 짝형성 및 항원 인식을 갖는 분자를 생성하는 공유적 연결을 제공한다. 게다가, 최소한의 연결기 크기 및 함량은 면역원성을 위한 잠재력을 감소시킬 수 있다. 본 발명의 DART 단백질은 T 세포(CD3) 및 종양 세포(P-CAD)를 동시에 표적화하고, P-카데린을 발현하는 종양 세포에 대해 T 세포 세포독성을 성공적으로 인도하고 활성화시킨다.
이중특이성 이종이량체성 디아바디의 각각의 폴리펩티드 쇄는 VL 도메인 및 VH 도메인을 포함하고, 이는 항체 결합 도메인이 자가-조립으로부터 구속되도록 공유적으로 연결될 수 있다(연결기 1). 또한, 각각의 폴리펩티드 쇄는 이종이량체화 도메인을 포함하고, 이는 다수의 폴리펩티드 쇄의 이종이량체화를 촉진시키고 상이한 폴리펩티드 쇄의 동종이량체화의 가능성을 감소시킨다. 이종이량체화 도메인은 폴리펩티드 쇄의 N-말단 또는 C-말단에 위치할 수 있다. 이종이량체화 도메인은 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개 또는 그 이상의 아미노산 잔기 길이인 시스테인 연결기(연결기 2)를 포함할 수 있다. 폴리펩티드 쇄들중 2개의 상호작용은 2개의 VL/VH 쌍을 생산하여, 2개의 에피토프 결합 도메인, 즉, 2가 분자를 형성할 수 있다. VH 또는 VL 도메인은 폴리펩티드 쇄내의 어떠한 위치에도 구속되지 않고, 즉 아미노 또는 카복시 말단에 제한되지 않고, 도메인은 이들의 서로에 대한 상대적 위치에도 제한되지 않으며, 즉 VL 도메인은 VH 도메인에 대한 N-말단일 수 있고 그 역일 수 있다. 유일한 제한은 상보성 폴리펩티드 쇄가 작용성 디아바디를 형성하기 위해 이용가능하다는 것이다. VL 및 VH 도메인이 상이한 항원에 특이적인 항체로부터 유래된 경우, 작용성 이중특이성 이종이량체성 디아바디의 형성은 2개의 상이한 폴리펩티드 쇄의 상호작용, 즉 이종이량체의 형성을 필요로 한다. 대조적으로, 2개의 상이한 폴리펩티드 쇄가 자유롭게 상호작용하는 경우, 예를 들어 재조합 발현 시스템에서, 하나는 VLA 및 VHB(A, 제1 에피토프임 및 B, 제2 에피토프임)이고 나머지는 VLB 및 VHA를 포함할 경우, 2개의 상이한 결합 자리는 다음을 형성할 수 있다: VLA-VHA 및 VLB-VHB. 모든 이중특이성 이종이량체성 디아바디 폴리펩티드 쇄 쌍의 경우, 두 쇄의 정렬오류 또는 결합오류가 가능하고, 예를 들어 VL-VL 또는 VH-VH 도메인의 상호작용이다. 그러나, 작용성 이중특이성 이종이량체성 디아바디의 정제는, 당분야에 공지되거나 본원에 예시된 임의의 친화도에 기초한 방법, 예를 들어 친화도 크로마토그래피를 사용하여 적절히 이량체화된 결합 자리의 면역특이성에 기초하여 쉽게 처리된다.
본 발명의 이중특이성 이종이량체성 디아바디는 2개의 분리된 별개의 에피토프에 동시에 결합할 수 있다. 특정 양태에서, 적어도 하나의 에피토프 결합 자리는 면역 효과자 세포 상에서 발현된, 예를 들어 T 림프구 상에서 발현된 CD3 결정인자에 대해 특이적이다. 하나의 양태에서, 이중특이성 이종이량체성 디아바디 분자는 효과자 세포 결정인자에 결합하고, 또한 효과자 세포를 활성화시킨다. 하나의 양태에서, 에피토프-결합 도메인은 유방암, 결장직장암, 난소암, 위암, 갑상선암, 전립선암, 자궁경부암, 췌장암, 폐암(제한되지 않지만 비-소 세포 폐암 및 소 세포 폐암 포함), 방광암, 간암, 자궁내막암, 두경부암, 고환암 및 교모세포종 암과 연관되는 P-카데린 종양-회합 항원에 결합할 수 있다.
본 발명의 이중특이성 이종이량체성 디아바디는 일반적으로 면역글로불린 또는 항체로부터 유래되는 항원 결합 도메인을 포함한다. 본 발명의 방법에 사용되는 결합 도메인이 유래되는 항체는 조류 및 포유동물(예를 들어 인간, 비-인간 영장류, 뮤린, 당나귀, 양, 토끼, 염소, 기니아 피그, 낙타, 말, 또는 닭)을 비롯한 임의의 동물 기원으로부터일 수 있다. 바람직하게는, 항체는 인간 또는 인간화된 단일클론성 항체이다. 본원에 사용될 경우, "인간" 항체로는 인간 면역글로불린의 아미노산 서열을 갖는 항체, 및 인간 면역글로불린 라이브러리 또는 합성 인간 면역글로불린 코딩 서열의 라이브러리로부터, 또는 인간 유전자로부터 항체를 발현하는 마우스로부터 단리된 항체가 포함된다.
본 발명의 이중특이성 이종이량체성 디아바디는 다양한 방식으로 특징화될 수 있다. 특히, 본 발명의 분자는 면역특이적으로 항원에 결합하는 능력에 대해 검정될 수 있다. 면역특이적으로 항원에 결합하는 것으로 식별된 분자는 이어서 이들의 항원에 대한 특이성 및 친화도에 대해 검정될 수 있다.
본 발명의 이중특이성 이종이량체성 디아바디는, 드 노보(de novo) 단백질 합성 및 결합 단백질을 인코딩하는 핵산의 재조합 발현을 비롯하여, 당분야에 잘 공지된 다양한 방법을 사용하여 생산될 수 있다. 원하는 핵산 서열은 재조합 방법(예를 들어 원하는 폴리누클레오티드의 더 일찍 제조된 변이형의 PCR 돌연변이생성) 또는 고체-상 DNA 합성에 의해 생산될 수 있다. 대체적으로 재조합 발현 방법이 사용된다. 하나의 양태에서, 본 발명은 항-CD3 VH 및/또는 VL을 인코딩하는 서열을 포함하는 폴리누클레오티드를 제공하고; 또 다른 양태에서, 본 발명은 항-P-카데린 VH 및/또는 VL을 인코딩하는 서열을 포함하는 폴리누클레오티드를 제공한다. 유전자 코드의 축중(degeneracy)으로 인해, 다양한 핵산 서열은 각각의 면역글로불린 아미노산 서열을 인코딩하고, 본 발명은 본원에 기재된 결합 단백질을 인코딩하는 모든 핵산을 포함한다.
연결기/펩티드
이중특이성 이종이량체성 디아바디의 폴리펩티드 쇄는 다양한 연결기 및 펩티드를 포함할 수 있다. 연결기 및 펩티드는 0개, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 그 이상의 아미노산일 수 있다. 특정 양태에서, 이중특이성 이종이량체성 디아바디의 폴리펩티드 쇄는 글리신-세린 연결기(연결기 1)를 포함할 수 있다. 또 다른 양태에서 연결기 1은, 제한되지 않지만, GGGSGGGG(서열번호 68) 및 GGGGSGGGG(서열번호 69)의 서열을 포함할 수 있다.
특정 양태에서, 이중특이성 이종이량체성 디아바디의 폴리펩티드 쇄는 시스테인 연결기(연결기 2)를 포함할 수 있다. 또 다른 양태에서, 연결기 2는 추가로 적어도 하나의 글리신 잔기를 포함할 수 있다. 하나의 양태에서, 연결기 2는, 제한되지 않지만, GFNRGEC(서열번호 70), GVEPKSC(서열번호 71), 및 GGCGGG(서열번호 72)로부터 선택된 서열을 포함할 수 있다. 특정 양태에서, 연결기 2는 서열 CPPCP(서열번호 60) 및 적어도 하나의 글리신 잔기를 갖는 절단된(truncated) IgG1 힌지 영역을 포함할 수 있다. 또 다른 양태에서, 연결기 2는 제한되지 않지만, GCPPCP(서열번호 73), GGTGGCPPCP(서열번호 74), GEPKSSDKTHTCPPCP(서열번호 75) 및 GGTGGGEPKSSDKTHTCPPCP(서열번호 76)의 서열을 포함할 수 있다.
특정 양태에서, 이중특이성 이종이량체성 디아바디의 폴리펩티드 쇄는 연결기 3을 포함할 수 있다. 하나의 양태에서, 연결기 3은, 제한되지 않지만, KAPSSSPME(서열번호 77)의 서열을 포함할 수 있다.
특정 양태에서, 이중특이성 이종이량체성 디아바디의 폴리펩티드 쇄는 펩티드 1을 포함할 수 있다. 특정 양태에서, 펩티드 1은 서열 CPPCP(서열번호 60)를 갖는 절단된 IgG1 힌지 영역을 포함할 수 있다. 하나의 양태에서, 펩티드 1은, 제한되지 않지만, DKTHTCPPCP(서열번호 96)의 서열을 포함할 수 있다.
VF-DART
본 발명의 한 양태에서, 도 2 및 3에 제시된 바와 같이, VF-DART로서 공지된 이중특이성 이종이량체성 디아바디는 제1 폴리펩티드 쇄(1) 및 제2 폴리펩티드 쇄(2)를 포함한다.
하나의 양태에서, 제1 폴리펩티드 쇄(1)는, (i) 항-P-카데린 항체(P-CAD VL) 또는 항-CD3 항체(CD3 VL)의 VL 결합 영역을 포함하는 서브-도메인 1A, (ii) 이러한 서브-도메인 1A가 CD3 VL을 포함할 경우 항-P-카데린 항체의 VH 결합 영역(P-CAD VH)을 포함하거나, 또는 서브-도메인 1A가 P-CAD VL을 포함할 경우 항-CD3 항체(CD3 VH)를 포함하는 서브-도메인 1B를 포함하는 도메인 1을 포함하고, 서브-도메인 1A 및 서브-도메인 1B는 서브-도메인 1B 및 서브-도메인 1A가 에피토프 결합 자리를 형성하기 위해 회합되지 않도록 글리신-세린 연결기(연결기 1)에 의해 공유적으로 연결될 수 있고; 서브-도메인 1B 상에 시스테인 연결기(연결기 2)를 포함하는 제1 이종이량체 촉진 도메인을 포함할 수 있다.
또 다른 양태에서, 제1 폴리펩티드 쇄(1)는, (i) P-CAD VH 또는 CD3 VH를 포함하는 서브-도메인 1A, (ii) 서브-도메인 1A가 CD3 VH를 포함할 경우 P-CAD VL을 포함하거나, 또는 서브-도메인 1A가 P-CAD VH를 포함할 경우 CD3 VL을 포함하는 서브-도메인 1B를 포함하는 도메인 1을 포함하고, 서브-도메인 1A 및 서브-도메인 1B는 서브-도메인 1B 및 서브-도메인 1A가 에피토프 결합 자리를 형성하기 위해 회합되지 않도록 글리신-세린 연결기(연결기 1)에 의해 공유적으로 연결될 수 있고; 서브-도메인 1B 상에 시스테인 연결기(연결기 2)를 포함하는 제1 이종이량체 촉진 도메인을 포함할 수 있다.
하나의 양태에서, 제1 폴리펩티드 쇄(1)는, (i) P-CAD VL을 포함하는 서브-도메인 1A 및 (ii) CD3 VH를 포함하는 서브-도메인 1B를 포함하는 도메인 1을 포함할 수 있다. 또 다른 양태에서, 제1 폴리펩티드 쇄(1)는, (i) CD3 VL을 포함하는 서브-도메인 1A 및 (ii) P-CAD VH를 포함하는 서브-도메인 1B를 포함하는 도메인 1을 포함할 수 있다. 추가의 양태에서, 제1 폴리펩티드 쇄(1)는, (i) P-CAD VH를 포함하는 서브-도메인 1A 및 (ii) CD3 VL을 포함하는 서브-도메인 1B를 포함하는 도메인 1을 포함할 수 있다. 또 다른 양태에서, 제1 폴리펩티드 쇄(1)는, (i) CD3 VH를 포함하는 서브-도메인 1A 및 (ii) P-CAD VL을 포함하는 서브-도메인 1B를 포함하는 도메인 1을 포함할 수 있다.
하나의 양태에서, 제2 폴리펩티드 쇄(2)는, (i) 서브-도메인 1A에 대해 선택된 VL 도메인에 따라서 항-P-카데린 항체(P-CAD VL) 또는 항-CD3 항체(CD3 VL)의 VL 결합 영역을 포함하는 서브-도메인 2B, (ii) 이러한 서브-도메인 2B가 CD3 VL을 포함할 경우 항-P-카데린 항체의 VH 결합 영역(P-CAD VH)을 포함하거나, 또는 서브-도메인 2B가 P-CAD VL을 포함할 경우 항-CD3 항체(CD3 VH)를 포함하는 서브-도메인 2A를 포함하는 도메인 2를 포함하고, 서브-도메인 2B 및 서브-도메인 2A는 서브-도메인 2B 및 서브-도메인 2A가 에피토프 결합 자리를 형성하기 위해 회합되지 않도록 글리신-세린 연결기(연결기 1)에 의해 공유적으로 연결될 수 있고; 서브-도메인 2A 상에 시스테인 연결기(연결기 2)를 포함하는 제2 이종이량체 촉진 도메인을 포함할 수 있다.
또 다른 양태에서, 제2 폴리펩티드 쇄(2)는, (i) P-CAD VH 또는 CD3 VH를 포함하는 서브-도메인 2B, (ii) 이러한 서브-도메인 2B가 CD3 VH를 포함할 경우 P-CAD VL을 포함하거나, 또는 이러한 서브-도메인 2B가 P-CAD VH를 포함할 경우 CD3 VL을 포함하는 서브-도메인 2A를 포함하는 도메인 2를 포함하고, 서브-도메인 2B 및 서브-도메인 2A는 서브-도메인 2B 및 서브-도메인 2A가 에피토프 결합 자리를 형성하기 위해 회합되지 않도록 글리신-세린 연결기(연결기 1)에 의해 공유적으로 연결될 수 있고; 서브-도메인 2A 상에 시스테인 연결기(연결기 2)를 포함하는 제2 이종이량체 촉진 도메인을 포함할 수 있다.
하나의 양태에서, 제2 폴리펩티드 쇄(2)는, (i) P-CAD VL을 포함하는 서브-도메인 2B 및 (ii) CD3 VH를 포함하는 서브-도메인 2A를 포함하는 도메인 2를 포함한다. 또 다른 양태에서, 제2 폴리펩티드 쇄(2)는, (i) CD3 VL을 포함하는 서브-도메인 2B 및 (ii) P-CAD VH를 포함하는 서브-도메인 2A를 포함하는 도메인 2를 포함한다. 추가의 양태에서, 제2 폴리펩티드 쇄(2)는, (i) P-CAD VH를 포함하는 서브-도메인 2B 및 (ii) CD3 VL을 포함하는 서브-도메인 2A를 포함하는 도메인 2를 포함한다. 또 다른 양태에서, 제2 폴리펩티드 쇄(2)는, (i) CD3 VH를 포함하는 서브-도메인 2B 및 (ii) P-CAD VL을 포함하는 서브-도메인 2A를 포함하는 도메인 2를 포함한다.
VF-DART의 또 다른 양태에서, 서브-도메인 1A 및 서브-도메인 2A는 회합되어, CD3 또는 P-카데린 상의 에피토프에 결합할 수 있는, VL/VH 결합 도메인을 갖는 제1 결합 자리를 형성할 수 있고, 서브-도메인 1B 및 서브-도메인 2B는 회합되어, P-카데린 또는 CD3 상의 에피토프에 결합하는, VL/VH 결합 도메인을 갖는 제2 결합 자리를 형성할 수 있다.
제1 폴리펩티드 쇄(1) 및 제2 폴리펩티드 쇄(2)는, 예를 들면 제1 및 제2 이종이량체 촉진 도메인 내에 위치된 시스테인 잔기에서 서로 공유적으로 결합될 수 있다. 하나의 양태에서, 제1 이종이량체 촉진 도메인의 연결기 2중의 시스테인 잔기 및 제2 이종이량체 촉진 도메인의 연결기 2중의 시스테인 잔기는 적어도 하나의 디설파이드 결합에 의해 연결될 수 있다.
본 발명의 한 양태에서, CD3 VL은 서열번호 48의 서열을 포함할 수 있고, CD3 VH는 서열번호 47 및 89로 구성된 군에서 선택된 서열일 수 있다. 또 다른 양태에서, P-CAD VL은 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 및 23로 구성된 군에서 선택된 서열일 수 있고, P-CAD VH는 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 및 24로 구성된 군에서 선택된 서열일 수 있다. 하나의 양태에서, 글리신-세린 연결기(연결기 1)는 GGGSGGGG(서열번호 68) 및 GGGGSGGGG(서열번호 69)로 구성된 군에서 선택된 서열을 포함할 수 있다. 본 발명의 한 양태에서, 제1 이종이량체 촉진 도메인의 시스테인 연결기(연결기 2)는 GFNRGEC(서열번호 70)의 서열을 포함하고 제2 이종이량체 촉진 도메인의 시스테인 연결기(연결기 2)는 GVEPKSC(서열번호 71)의 서열을 포함할 수 있다. 본 발명의 또 다른 양태에서, 제1 이종이량체 촉진 도메인의 시스테인 연결기(연결기 2)는 GVEPKSC(서열번호 71)의 서열을 포함하고 제2 이종이량체 촉진 도메인의 시스테인 연결기(연결기 2)는 GFNRGEC(서열번호 70)의 서열을 포함할 수 있다.
본원에 기재된 다양한 P-카데린 및 CD3 항체를 갖는 VF-DART 단백질의 제1 및 제2 폴리펩티드 쇄의 서열은 도 30a 및 30b에 제공된다.
E/K 코일 영역을 포함하는 EK-DART
이중특이성 이종이량체성 디아바디의 2개의 상이한 폴리펩티드 쇄의 이종이량체 형성은 또한 반대편 구성원에 대한 친화도 및 그 자체에 대한 반발을 갖는 도메인의 사용에 의해 촉진될 수 있다. 이러한 도메인의 일예는 코일링된(coiled)-코일 도메인이다. 예를 들면, 제1 폴리펩티드 쇄(1)는 음성으로 하전된 알파-나선형 코일(E-코일)을 형성하는 글루탐산-풍부 영역을 갖는 제1 이종이량체 촉진 도메인을 포함하고, 제2 폴리펩티드 쇄(2)는 양성으로 하전된 나선형 코일(K-코일)을 형성하는 라이신 풍부 영역을 갖는 제2 이종이량체 촉진 도메인을 포함하여, 이종이량체 형성을 촉진시키는 정전기적 상호작용을 허용할 수 있다. 동종이량체 형성은, E-코일이 또 다른 E-코일-함유 폴리펩티드에 대해 반발력을 갖고 K-코일의 경우도 이와 마찬가지이므로 감소될 수 있다.
본 발명의 한 양태에서, 도 4에 제시된 바와 같이, EK-DART로서 공지된 이중특이성 이종이량체성 디아바디는 제1 폴리펩티드 쇄(1) 및 제2 폴리펩티드 쇄(2)를 포함한다.
하나의 양태에서, 제1 폴리펩티드 쇄(1)는, (i) 항-P-카데린 항체(P-CAD VL) 또는 항-CD3 항체(CD3 VL)의 VL 결합 영역을 포함하는 서브-도메인 1A, (ii) 서브-도메인 1A가 CD3 VL을 포함할 경우 항-P-카데린 항체의 VH 결합 영역(P-CAD VH)을 포함하거나, 또는 서브-도메인 1A가 P-CAD VL을 포함할 경우 항-CD3 항체(CD3 VH)를 포함하는 서브-도메인 1B를 포함하는 도메인 1을 포함하고, 서브-도메인 1A 및 서브-도메인 1B는 서브-도메인 1A 및 서브-도메인 1B가 에피토프 결합 자리를 형성하기 위해 회합되지 않도록 글리신-세린 연결기(연결기 1)에 의해 공유적으로 연결될 수 있고; (i) 서브-도메인 1B 상의 시스테인 연결기(연결기 2), 및 (ii) 연결기 2에 공유적으로 연결된 E-코일 영역을 포함하는 제1 이종이량체 촉진 도메인을 포함할 수 있다.
또 다른 양태에서, 제1 폴리펩티드 쇄(1)는, (i) P-CAD VH 또는 CD3 VH를 포함하는 서브-도메인 1A, (ii) 서브-도메인 1A가 CD3 VH를 포함할 경우 P-CAD VL을 포함하거나, 또는 서브-도메인 1A가 P-CAD VH를 포함할 경우 CD3 VL을 포함하는 서브-도메인 1B를 포함하는 도메인 1을 포함하고, 서브-도메인 1A 및 서브-도메인 1B는 서브-도메인 1A 및 서브-도메인 1B가 에피토프 결합 자리를 형성하기 위해 회합되지 않도록 글리신-세린 연결기(연결기 1)에 의해 공유적으로 연결될 수 있고; (i) 서브-도메인 1B 상의 시스테인 연결기(연결기 2), 및 (ii) 연결기 2에 공유적으로 연결된 E-코일 영역을 포함하는 제1 이종이량체 촉진 도메인을 포함할 수 있다.
하나의 양태에서, 제1 폴리펩티드 쇄(1)는, (i) P-CAD VL을 포함하는 서브-도메인 1A 및 (ii) CD3 VH를 포함하는 서브-도메인 1B를 포함하는 도메인 1을 포함할 수 있다. 또 다른 양태에서, 제1 폴리펩티드 쇄(1)는, (i) CD3 VL을 포함하는 서브-도메인 1A 및 (ii) P-CAD VH를 포함하는 서브-도메인 1B를 포함하는 도메인 1을 포함할 수 있다. 추가의 양태에서, 제1 폴리펩티드 쇄(1)는, (i) P-CAD VH를 포함하는 서브-도메인 1A 및 (ii) CD3 VL을 포함하는 서브-도메인 1B를 포함하는 도메인 1을 포함할 수 있다. 또 다른 양태에서, 제1 폴리펩티드 쇄(1)는, (i) CD3 VH를 포함하는 서브-도메인 1A 및 (ii) P-CAD VL을 포함하는 서브-도메인 1B를 포함하는 도메인 1을 포함할 수 있다.
하나의 양태에서, 제2 폴리펩티드 쇄(2)는, (i) 서브-도메인 1A에 대해 선택된 VL 도메인에 따라 항-P-카데린 항체(P-CAD VL) 또는 항-CD3 항체(CD3 VL)의 VL 결합 영역을 포함하는 서브-도메인 2B, (ii) 서브-도메인 2B가 CD3 VL을 포함할 경우 항-P-카데린 항체의 VH 결합 영역(P-CAD VH)을 포함하거나, 또는 서브-도메인 2B가 P-CAD VL을 포함할 경우 항-CD3 항체(CD3 VH)를 포함하는 서브-도메인 2A를 포함하는 도메인 2를 포함하고, 서브-도메인 2B 및 서브-도메인 2A는 서브-도메인 2B 및 서브-도메인 2A가 에피토프 결합 자리를 형성하기 위해 회합되지 않도록 글리신-세린 연결기(연결기 1)에 의해 공유적으로 연결될 수 있고; (i) 서브-도메인 2A 상의 시스테인 연결기(연결기 2), 및 (ii) 연결기 2에 공유적으로 연결된 K-코일 영역을 포함하는 제2 이종이량체 촉진 도메인을 포함할 수 있다.
또 다른 양태에서, 제2 폴리펩티드 쇄(2)는, (i) P-CAD VH 또는 CD3 VH를 포함하는 서브-도메인 2B, (ii) 서브-도메인 2B가 CD3 VH를 포함할 경우 P-CAD VL을 포함하거나, 또는 서브-도메인 2B가 P-CAD VH를 포함할 경우 CD3 VL을 포함하는 서브-도메인 2A를 포함하는 도메인 2를 포함하고, 서브-도메인 2B 및 서브-도메인 2A는 서브-도메인 2B 및 서브-도메인 2A가 에피토프 결합 자리를 형성하기 위해 회합되지 않도록 글리신-세린 연결기(연결기 1)에 의해 공유적으로 연결될 수 있고; (i) 서브-도메인 2A 상의 시스테인 연결기(연결기 2), 및 (ii) 연결기 2에 공유적으로 연결된 K-코일 영역을 포함하는 제2 이종이량체 촉진 도메인을 포함할 수 있다.
하나의 양태에서, 제2 폴리펩티드 쇄(2)는, (i) P-CAD VL을 포함하는 서브-도메인 2B 및 (ii) CD3 VH를 포함하는 서브-도메인 2A를 포함하는 도메인 2를 포함한다. 또 다른 양태에서, 제2 폴리펩티드 쇄(2)는, (i) CD3 VL을 포함하는 서브-도메인 2B 및 (ii) P-CAD VH를 포함하는 서브-도메인 2A를 포함하는 도메인 2를 포함한다. 추가의 양태에서, 제2 폴리펩티드 쇄(2)는, (i) P-CAD VH를 포함하는 서브-도메인 2B 및 (ii) CD3 VL을 포함하는 서브-도메인 2A를 포함하는 도메인 2를 포함한다. 또 다른 양태에서, 제2 폴리펩티드 쇄(2)는, (i) CD3 VH를 포함하는 서브-도메인 2B 및 (ii) P-CAD VL을 포함하는 서브-도메인 2A를 포함하는 도메인 2를 포함한다.
EK-DART의 또 다른 양태에서, 서브-도메인 1A 및 서브-도메인 2A는 회합되어, CD3 또는 P-카데린 상의 에피토프에 결합할 수 있는, VL/VH 결합 도메인을 갖는 제1 결합 자리를 형성할 수 있고, 서브-도메인 1B 및 서브-도메인 2B는 회합되어, P-카데린 또는 CD3 상의 에피토프에 결합하는, VL/VH 결합 도메인을 갖는 제2 결합 자리를 형성할 수 있다.
제1 폴리펩티드 쇄(1) 및 제2 폴리펩티드 쇄(2)는, 예를 들면 제1 및 제2 이종이량체 촉진 도메인 내에 위치된 시스테인 잔기에서 서로 공유적으로 결합될 수 있다. 하나의 양태에서, 제1 이종이량체 촉진 도메인의 연결기 2중의 시스테인 잔기 및 제2 이종이량체 촉진 도메인의 연결기 2중의 시스테인 잔기는 적어도 하나의 디설파이드 결합에 의해 연결될 수 있다.
본 발명의 한 양태에서, CD3 VL은 서열번호 48의 서열을 포함하고 CD3 VH는 서열번호 47 및 89로 구성된 군에서 선택된 서열일 수 있다. 또 다른 양태에서, P-CAD VL은 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 및 23으로 구성된 군에서 선택된 서열일 수 있고, P-CAD VH는 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 및 24로 구성된 군에서 선택된 서열일 수 있다. 하나의 양태에서, 글리신-세린 연결기(연결기 1)는 GGGSGGGG(서열번호 68) 및 GGGGSGGGG(서열번호 69)로 구성된 군에서 선택된 서열을 포함할 수 있다. 본 발명의 한 양태에서, 제1 이종이량체 촉진 도메인 및 제2 이종이량체 도메인의 시스테인 연결기(연결기 2)는 GGCGGG(서열번호 72)의 서열을 포함할 수 있다. 하나의 양태에서, 제1 이종이량체 촉진 도메인은 추가로 EVAALEKEVAALEKEVAALEKEVAALEK(서열번호 61)의 서열을 포함하는 글루탐산-풍부 영역(E-코일)을 포함한다. 또 다른 양태에서, 제2 이종이량체 촉진 도메인은 추가로 KVAALKEKVAALKEKVAALKEKVAALKE(서열번호 62)의 서열을 포함하는 라이신-풍부 영역(K-코일)을 포함한다.
표 1, 및 도 31a 및 31b는 본원에 기재된 다양한 P-카데린 및 CD3 항체를 갖는 EK-DART 단백질의 제1 및 제2 폴리펩티드 쇄에 대한 서열을 제공한다.
[표 1]
EK-DART 단백질의 제1 및 제2 폴리펩티드 쇄의 서열
Figure pct00001
Fc 영역 또는 이의 일부를 포함하는 이중특이성 이종이량체성 디아바디
본 발명은 Fc 영역 또는 도메인, 또는 이의 일부를 포함하는 이중특이성 이종이량체성 디아바디를 포괄한다. 특정 양태에서, Fc 영역, 또는 이의 일부(들)는 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4의 하나 이상의 불변 도메인(들)을 포함한다(예를 들어 CH2 또는 CH3 도메인). 다른 양태에서, 본 발명은 Fc 영역 또는 이의 일부를 포함하는 분자를 포괄하고, 여기서 Fc 영역 또는 이의 일부는, 야생형 Fc 영역 또는 이의 일부와 비교하여, 적어도 하나의 아미노산 개질(예를 들어 치환)을 포함한다. 변이형 Fc 영역은 당분야에 잘 공지되어 있고, 당분야에 잘 공지되어 있는 임의의 결합 활성 또는 효과자 작용 검정, 예를 들어 ELISA, SPR 분석, 또는 ADCC로 검정될 경우 변이형 Fc 영역을 포함하는 항체의 표현형을 변경시키기 위해 주로 사용된다. 이러한 변이형 Fc 영역, 또는 이의 일부는, Fc 영역 또는 이의 일부를 포함하는 본 발명의 디아바디 분자에 의해 나타나는 혈장 반감기 및 안정성을 연장시킬 수 있다. 다른 양태에서, 본 발명은 당분야에 공지된 임의의 Fc 변이형의 사용을 포괄한다.
특정 양태에서, Fc 영역의 아미노산에 대한 하나 이상의 개질은 Fc 영역의 친화도 및 결합력을 감소시키고, 이에 따라 하나 이상의 FcγR 수용체를 위한 본 발명의 디아바디 분자를 생성한다. 구체적인 양태에서, 본 발명은 변이형 Fc 영역, 또는 이의 일부를 포함하는 디아바디를 포괄하고, 여기서 변이형 Fc 영역은 야생형 Fc 영역에 비해 적어도 하나의 아미노산 개질(이는 변이형 Fc 영역이 유일하게 하나의 FcγR에 결합하는 것임)을 포함하고, 여기서 FcγR는 FcγRIIIA이다. 또 따른 구체적인 양태에서, 본 발명은 변이형 Fc 영역, 또는 이의 일부를 포함하는 디아바디를 포괄하고, 여기서 변이형 Fc 영역은 야생형 Fc 영역에 비해 적어도 하나의 아미노산 개질(이는 변이형 Fc 영역이 유일하게 하나의 FcγR에 결합하는 것임)을 포함하고, 여기서 FcγR는 FcγRIIA이다. 또 다른 구체적인 양태에서, 본 발명은 변이형 Fc 영역 또는 이의 일부를 포함하는 디아바디를 포괄하고, 여기서 변이형 Fc 영역은 야생형 Fc 영역에 비해 적어도 하나의 아미노산 개질을 포함하고, 이러한 변이형 Fc 영역은 단지 하나의 FcγR에 결합하며, 여기서 FcγR는 FcγRIIB이다. 특정 양태에서, 본 발명은 변이형 Fc 영역을 포함하는 분자를 포괄하고, 여기서 변이형은, 당분야의 숙련가에게 공지되고 본원에 기재된 방법을 사용하여 측정될 경우, Fc 영역을 포함하지 않거나 야생형 Fc 영역을 포함하는 분자에 비해 감소된 ADCC 활성(또는 다른 효과자 작용) 및/또는 FcγRIIB(CD32B)로의 증가된 결합을 부여하거나 중재한다.
본 발명은 또한 2개 이상의 IgG 이소타입으로부터의 도메인 또는 영역을 포함하는 Fc 영역의 용도를 포괄한다. 당분야에 공지된 바와 같이, Fc 영역의 아미노산 개질은 Fc-중재된 효과자 작용 및/또는 결합 활성에 크게 영향을 줄 수 있다. 그러나, 작용성 특징중의 이들 변형은 선택된 IgG 이소타입과 관련하여 실행될 경우 추가로 정련되고/되거나 조종될 수 있다. 유사하게, 이소타입 Fc의 고유의 특징은 하나 이상의 아미노산 개질에 의해 조종될 수 있다. 다수의 IgG 이소타입(즉, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4)은, 이들의 힌지 및/또는 Fc 영역의 아미노산 서열에서의 차이에 기인하여, 혈청 반감기, 보체 고정화, FcγR 결합 친화도 및 효과자 작용 활성(예를 들어 ADCC, CDC)을 비롯한 상이한 물리적 및 작용적 특성을 나타낸다. 특정 양태에서, 아미노산 개질 및 IgG Fc 영역은 원하는 특징을 갖도록 디아바디를 조작하기 위해, 이들의 개별적인 별도의 결합 및/또는 효과자 작용 활성에 기초하여 독립적으로 선택된다. 대부분의 양태에서, 아미노산 개질 및 IgG 힌지/Fc 영역은 IgG1과 관련하여 본원에 기재되거나 당분야에 공지된 결합 및/또는 효과자 작용 활성에 대해 별도로 검정되었다. 특정 양태에서, 아미노산 개질 및 IgG 힌지/Fc 영역은 디아바디 분자 또는 다른 Fc-함유 분자(예를 들어 및 면역글로불린)와 관련하여 유사한 작용성, 예를 들어 감소된 ADCC 활성(또는 다른 효과자 작용) 및/또는 FcγRIIB로의 증가된 결합을 나타낸다. 다른 양태에서, 본 발명은 당분야에 공지된 아미노산 개질의 조합을 포함하는 변이형 Fc 영역 및 신규한 특성(이러한 특성은 개질 및/또는 영역이 본원에 기재된 바와 같이 독립적으로 검정될 경우 검출가능하지 않았음)을 나타내는 선택된 IgG 영역을 포괄한다.
LP-DART
본 발명의 한 양태에서, LP-DART로 지칭되는, Fc 영역을 갖는 이중특이성 이종이량체성 디아바디는 도 1 및 5에 도시된다. LP-DART는 IgG의 Fc 도메인에 융합된, 표적 항원 및 CD3에 결합하는 2개의 scFv 도메인으로 구성된다. 본 발명의 하나의 양태에서, 이중특이성 이종이량체성 디아바디는 IgG1의 Fc 도메인에 융합된, P-카데린 및 CD3 엡실론에 결합하는 2개의 scFv 도메인으로 구성된다. 특히, 도 1a 및 1b는 항-P-카데린/항-인간 CD3 LP-DART의 4개의 대안의 대표물을 도시하고 도 5는 조립된 LP-DART의 일반적 개략도를 도시한다. LP-DART는, 제1 및 제2 이종이량체 촉진 도메인이 면역글로불린 Fc 영역의 CH2 및/또는 CH3 도메인을 갖는 면역글로불린 Fc 영역을 포함함을 제외하고, VF-DART 또는 EK-DART에 대해 상기 기재된 구조와 유사하고, 여기서 CH2 및/또는 CH3 도메인은 놉(돌출부) 또는 홀(강)을 포함하도록 변경되었다. LP-DART의 Fc 부분에 대한 개질은 아래에 기재되어 있다.
본 발명의 한 양태에서, 도 1a, 1b 및 5에 제시된 바와 같은 LP-DART 이중특이성 이종이량체성 디아바디는 제1 폴리펩티드 쇄(1) 및 제2 폴리펩티드 쇄(2)를 포함한다.
하나의 양태에서, 제1 폴리펩티드 쇄(1)는, (i) 항-P-카데린 항체(P-CAD VL) 또는 항-CD3 항체(CD3 VL)의 VL 결합 영역을 포함하는 서브-도메인 1A, (ii) 이러한 서브-도메인 1A가 CD3 VL을 포함할 경우 항-P-카데린 항체의 VH 결합 영역(P-CAD VH)을 포함하거나, 또는 이러한 서브-도메인 1A가 P-CAD VL을 포함할 경우 항-CD3 항체(CD3 VH)를 포함하는 서브-도메인 1B를 포함하는 도메인 1을 포함하고, 서브-도메인 1A 및 서브-도메인 1B는 서브-도메인 1A 및 서브-도메인 1B가 에피토프 결합 자리를 형성하기 위해 회합되지 않도록 글리신-세린 연결기(연결기 1)에 의해 공유적으로 연결될 수 있고; (i) 서브-도메인 1B 상의 시스테인 연결기(연결기 2) 및 (ii) 연결기 2에 공유적으로 연결된 놉 Fc 쇄(돌출부) 또는 홀 Fc 쇄(강)를 포함하도록 개질된 CH2 및/또는 CH3 도메인을 갖는 Fc 영역을 포함하는 제1 이종이량체 촉진 도메인을 포함할 수 있다.
또 다른 양태에서, 제1 폴리펩티드 쇄(1)는, (i) P-CAD VH 또는 CD3 VH를 포함하는 서브-도메인 1A, (ii) 이러한 서브-도메인 1A가 CD3 VH를 포함할 경우 P-CAD VL을 포함하거나, 또는 이러한 서브-도메인 1A가 P-CAD VH를 포함할 경우 CD3 VL을 포함하는 서브-도메인 1B를 포함하는 도메인 1을 포함하고, 서브-도메인 1A 및 서브-도메인 1B는 서브-도메인 1A 및 서브-도메인 1B가 에피토프 결합 자리를 형성하기 위해 회합되지 않도록 글리신-세린 연결기(연결기 1)에 의해 공유적으로 연결될 수 있고; (i) 서브-도메인 1B 상의 시스테인 연결기(연결기 2) 및 (ii) 연결기 2에 공유적으로 연결된 놉 Fc 쇄(돌출부) 또는 홀 Fc 쇄(강)를 포함하도록 개질된 CH2 및/또는 CH3 도메인을 갖는 Fc 영역을 포함하는 제1 이종이량체 촉진 도메인을 포함할 수 있다.
하나의 양태에서, 제1 폴리펩티드 쇄(1)는, (i) P-CAD VL을 포함하는 서브-도메인 1A 및 (ii) CD3 VH를 포함하는 서브-도메인 1B를 포함하는 도메인 1을 포함할 수 있다. 또 다른 양태에서, 제1 폴리펩티드 쇄(1)는, (i) CD3 VL을 포함하는 서브-도메인 1A 및 (ii) P-CAD VH를 포함하는 서브-도메인 1B를 포함하는 도메인 1을 포함할 수 있다. 추가의 양태에서, 제1 폴리펩티드 쇄(1)는, (i) P-CAD VH를 포함하는 서브-도메인 1A 및 (ii) CD3 VL을 포함하는 서브-도메인 1B를 포함하는 도메인 1을 포함할 수 있다. 또 다른 양태에서, 제1 폴리펩티드 쇄(1)는, (i) CD3 VH를 포함하는 서브-도메인 1A 및 (ii) P-CAD VL을 포함하는 서브-도메인 1B를 포함하는 도메인 1을 포함할 수 있다.
하나의 양태에서, 제2 폴리펩티드 쇄(2)는, (i) 서브-도메인 1A에 대해 선택된 VL 도메인에 따라서 항-P-카데린 항체(P-CAD VL) 또는 항-CD3 항체(CD3 VL)의 VL 결합 영역을 포함하는 서브-도메인 2B, (ii) 이러한 서브-도메인 2B가 CD3 VL을 포함할 경우 항-P-카데린 항체의 VH 결합 영역(P-CAD VH)을 포함하거나, 또는 이러한 서브-도메인 2B가 P-CAD VL을 포함할 경우 항-CD3 항체(CD3 VH)를 포함하는 서브-도메인 2A를 포함하는 도메인 2를 포함하고, 서브-도메인 2B 및 서브-도메인 2A는 서브-도메인 2B 및 서브-도메인 2A가 에피토프 결합 자리를 형성하기 위해 회합되지 않도록 글리신-세린 연결기(연결기 1)에 의해 공유적으로 연결될 수 있고; (i) 서브-도메인 2A 상의 시스테인 연결기(연결기 2) 및 (ii) 이러한 제1 이종이량체 영역이 홀 Fc 쇄(강)를 포함할 경우 놉 Fc 쇄(돌출부)를 포함하도록, 또는 이러한 제1 이종이량체 영역이 놉 Fc 쇄(돌출부)를 포함할 경우 홀 Fc 쇄(강)를 포함하도록 변경된, 연결기 2에 공유적으로 연결된 CH2 및/또는 CH3 도메인을 갖는 Fc 영역을 포함하는 제2 이종이량체 촉진 도메인을 포함할 수 있다.
또 다른 양태에서, 제2 폴리펩티드 쇄(2)는, (i) P-CAD VH 또는 CD3 VH를 포함하는 서브-도메인 2B, (ii) 이러한 서브-도메인 2B가 CD3 VH를 포함할 경우 P-CAD VL을 포함하거나, 또는 이러한 서브-도메인 2B가 P-CAD VH를 포함할 경우 CD3 VL을 포함하는 서브-도메인 2A를 포함하는 도메인 2를 포함하고, 서브-도메인 2B 및 서브-도메인 2A는 서브-도메인 2B 및 서브-도메인 2A가 에피토프 결합 자리를 형성하기 위해 회합되지 않도록 글리신-세린 연결기(연결기 1)에 의해 공유적으로 연결될 수 있고; (i) 서브-도메인 2A 상의 시스테인 연결기(연결기 2) 및 (ii) 이러한 제1 이종이량체 영역이 홀 Fc 쇄(강)를 포함할 경우 놉 Fc 쇄(돌출부)를 포함하도록, 또는 이러한 제1 이종이량체 영역이 놉 Fc 쇄(돌출부)를 포함할 경우 홀 Fc 쇄(강)를 포함하도록 변경된, 연결기 2에 공유적으로 연결된 CH2 및/또는 CH3 도메인을 갖는 Fc 영역을 포함하는 제2 이종이량체 촉진 도메인을 포함할 수 있다.
하나의 양태에서, 제2 폴리펩티드 쇄(2)는, (i) P-CAD VL을 포함하는 서브-도메인 2B 및 (ii) CD3 VH를 포함하는 서브-도메인 2A를 포함하는 도메인 2를 포함한다. 또 다른 양태에서, 제2 폴리펩티드 쇄(2)는, (i) CD3 VL을 포함하는 서브-도메인 2B 및 (ii) P-CAD VH를 포함하는 서브-도메인 2A를 포함하는 도메인 2를 포함한다. 추가의 양태에서, 제2 폴리펩티드 쇄(2)는, (i) P-CAD VH를 포함하는 서브-도메인 2B 및 (ii) CD3 VL을 포함하는 서브-도메인 2A를 포함하는 도메인 2를 포함한다. 또 다른 양태에서, 제2 폴리펩티드 쇄(2)는, (i) CD3 VH를 포함하는 서브-도메인 2B 및 (ii) P-CAD VL을 포함하는 서브-도메인 2A를 포함하는 도메인 2를 포함한다.
LP-DART의 또 다른 양태에서, 서브-도메인 1A 및 서브-도메인 2A는 회합되어, CD3 또는 P-카데린 상의 에피토프에 결합할 수 있는, VL/VH 결합 도메인을 갖는 제1 결합 자리를 형성할 수 있고, 서브-도메인 1B 및 서브-도메인 2B는 회합되어, P-카데린 또는 CD3 상의 에피토프에 결합하는, VL/VH 결합 도메인을 갖는 제2 결합 자리를 형성할 수 있다.
제1 폴리펩티드 쇄(1) 및 제2 폴리펩티드 쇄(2)는, 예를 들면 제1 및 제2 이종이량체 촉진 도메인 내에 위치된 시스테인 잔기에서 서로 공유적으로 결합될 수 있다. 하나의 양태에서, 제1 이종이량체 촉진 도메인의 연결기 2중의 시스테인 잔기 및 제2 이종이량체 촉진 도메인의 연결기 2중의 시스테인 잔기는 적어도 하나의 디설파이드 결합에 의해 연결될 수 있다.
본 발명의 한 양태에서, CD3 VL은 서열번호 48의 서열을 포함하고, CD3 VH는 서열번호 47 및 89로 구성된 군에서 선택된 서열일 수 있다. 또 다른 양태에서, P-CAD VL은 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 및 23으로 구성된 군에서 선택된 서열일 수 있고, P-CAD VH는 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 및 24로 구성된 군에서 선택된 서열일 수 있다. 하나의 양태에서, 글리신-세린 연결기(연결기 1)는 GGGSGGGG(서열번호 68) 및 GGGGSGGGG(서열번호 69)로 구성된 군에서 선택된 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 시스테인 연결기(연결기 2)는 서열 CPPCP(서열번호 60)를 갖는 절단된 IgG1 힌지 영역 및 힌지 영역에 선행하는 적어도 1개의 글리신 잔기를 포함할 수 있다. 하나의 양태에서, 연결기 2는 GCPPCP(서열번호 73), GGTGGCPPCP(서열번호 74), GEPKSSDKTHTCPPCP(서열번호 75) 및 GGTGGGEPKSSDKTHTCPPCP(서열번호 76)로 구성된 군에서 선택된 서열을 포함할 수 있다.
하나의 양태에서, 제1 이종이량체 촉진 도메인은 서열번호 63의 서열을 포함하는 놉 Fc 쇄(돌출부), 또는 서열번호 64의 서열을 포함하는 홀 Fc 쇄(강)를 포함하도록 변경된 CH2 및/또는 CH3 도메인을 갖는 Fc 영역을 포함할 수 있다. 또 다른 양태에서, 제2 이종이량체 촉진 도메인은 이러한 제1 이종이량체 영역이 홀 Fc 쇄(강)를 포함할 경우 서열번호 63의 서열을 포함하는 놉 Fc 쇄(돌출부)를 포함하도록, 또는 이러한 제1 이종이량체 영역이 놉 Fc 쇄(돌출부)를 포함할 경우 서열번호 64의 서열을 포함하는 홀 Fc 쇄(강)를 포함하도록 변경된 CH2 및/또는 CH3 도메인을 갖는 Fc 영역을 포함할 수 있다.
표 2 및 도 32a 및 32B는 본원에 기재된 다양한 P-카데린 및 CD3 항체를 갖는 LP-DART 단백질의 제1 및 제2 폴리펩티드 쇄에 대한 아미노산 서열을 제공한다. 서열번호 117-124는 괄호안에 참조된 상응하는 누클레오티드 서열을 제공한다.
[표 2]
LP-DART 단백질의 제1 및 제2 폴리펩티드 쇄의 서열
Figure pct00002
Figure pct00003
인간 IqG1 CH2-CH3에서의 효과자 삭제 돌연변이 및 C-말단 Lys의 제거
인간 IgG1의 Fc 영역은 종종 번역후 분할되는 C-말단 라이신 잔기를 제거할 뿐만 아니라, FcγRIII으로의 결합에 기인한 효과자 작용을 제거하기 위해 표준 프라이머-인도된 PCR 돌연변이생성을 사용하여 돌연변이 L234A, L235A 및 G237A를 도입하도록 개질되었다(효과자 삭제 표현형).
인간 IqG1 CH2 - CH3 에서의 놉-인-홀 돌연변이
"놉-인-홀"은 이종이량체화를 위해 항체 중쇄 동종이량체를 조작하기 위해 당분야에 공지된 효과적인 고안 전략이다. 이러한 접근법에서, "놉" 변이형은 IgG1의 Fc 영역의 하나의 쇄에서 작은 아미노산을 더 큰 아미노산으로 대체함으로써 수득되었고, 예를 들어 Y349C 및 T366W이다. "놉"은 큰 잔기를 더 작은 잔기로 대체(예를 들어 S354C, T366S, L368A 및 Y407V)함으로써 생성되는 Fc 영역의 상보성 쇄의 CH3 도메인중의 "홀"내로 삽입되도록 고안된다.
놉-인-홀 표시는 돌출부 및 강 표시와 유사하고 상호교환적으로 사용될 수 있다.
"돌출부" 또는 "놉"은 제1 폴리펩티드의 계면으로부터 돌출되고 이에 따라 인접한 계면(즉 제2 폴리펩티드의 계면)중의 상보성 강에 위치될 수 있어서, 이종이량체를 안정화시키고, 이로써 예를 들면 동종이량체 형성에 비해 이종이량체 형성에 우호적인 적어도 하나의 아미노산 측쇄를 지칭한다. 돌출부는 고유의 계면에 존재하거나, 합성적으로 도입될 수 있다(예를 들어 계면을 인코딩하는 핵산을 변경함으로써). 정상적으로, 제1 폴리펩티드의 계면을 인코딩하는 핵산은 돌출부를 인코딩하도록 변경된다. 이를 달성하기 위해, 제1 폴리펩티드의 계면에서 적어도 하나의 "고유의" 아미노산 잔기를 인코딩하는 핵산은 고유의 아미노산 잔기에 비해 더 큰 측쇄 부피를 갖는 적어도 하나의 "유입(import)" 아미노산 잔기를 인코딩하는 핵산으로 대체된다. 대체되는 고유의 잔기의 수에 대한 상한치는 제1 폴리펩티드의 계면중의 잔기의 총 수이다.
돌출부의 형성을 위한 특정 유입 잔기는 일반적으로 천연 발생 아미노산 잔기이고, 바람직하게는 아르기닌(R), 페닐알라닌(F), 티로신(Y) 및 트립토판(W)으로부터 선택된다.
"강" 또는 "홀"은 제2 폴리펩티드의 계면으로부터 움푹 들어가서 제1 폴리펩티드의 인접한 계면 상의 상응하는 돌출부를 수용하는 적어도 하나의 아미노산 측쇄를 지칭한다. 강은 고유의 계면에 존재할 수 있거나 합성적으로 도입될 수 있다(예를 들어 계면을 인코딩하는 핵산을 변경함으로써). 정상적으로, 제2 폴리펩티드의 계면을 인코딩하는 핵산은 강을 인코딩하도록 변경된다. 이를 달성하기 위해, 제2 폴리펩티드의 계면중의 적어도 하나의 "고유의" 아미노산 잔기를 인코딩하는 핵산은 고유의 아미노산 잔기에 비해 더 작은 측쇄 부피를 갖는 적어도 하나의 "유입" 아미노산 잔기를 인코딩하는 DNA로 대체된다. 대체되는 고유의 잔기의 수에 대한 상한치는 제2 폴리펩티드의 계면중의 잔기의 총 수이다.
강의 형성을 위한 특정 유입 잔기는 일반적으로 천연 발생 아미노산 잔기이고, 바람직하게는 알라닌(A), 세린(S), 트레오닌(T) 및 발린(V)으로부터 선택된다.
"고유의" 아미노산 잔기는 고유의 잔기에 비해 더 작거나 더 큰 측쇄 부피를 가질 수 있는 "유입" 잔기에 의해 대체되는 것이다. 유입 아미노산 잔기는 천연 발생 또는 비-천연 발생 아미노산 잔기일 수 있지만, 바람직하게는 전자이다. "천연 발생" 아미노산 잔기는 유전자 코드에 의해 인코딩되는 잔기이다. "비-천연 발생" 아미노산 잔기는 유전자 코드에 의해 인코딩되지 않지만, 폴리펩티드 쇄에서 인접한 아미노산 잔기(들)에 공유적으로 결합할 수 있는 잔기를 의미한다. 비-천연 발생 아미노산 잔기의 예는 노르로이신, 오르니틴, 노르발린, 호모세린 및 다른 아미노산 잔기 유사체, 예컨대 엘만(Ellman) 등의 문헌[Meth. Enzym. 202:301 -336 (1991)]에 기재된 것들이다. 본 발명의 방법은 적어도 하나의 고유의 아미노산 잔기를 대체함을 포함하지만, 하나 보다 많은 고유의 잔기가 대체될 수 있다. 정상적으로, 제1 또는 제2 폴리펩티드의 계면중의 전체 잔기만이 대체되는 고유의 아미노산 잔기를 포함할 수 있다.
돌출부 또는 놉은 강 또는 홀에 "위치될 수 있고", 이는 각각 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드의 계면 상의 돌출부 및 강의 공간적 위치, 및 돌출부 및 강의 크기가, 돌출부가 제1 및 제2 폴리펩티드의 정상적 회합을 계면에서 그다지 교란시키지 않으면서 강에 위치될 수 있도록 함을 의미한다. 돌출부, 예컨대 Tyr, Phe 및 Trp가 전형적으로 계면의 축으로부터 수직으로 연장되지 않으므로, 상응하는 강과의 돌출부의 정렬은, 예컨대 X-선 결정학 또는 핵 자기 공명(NMR)에 의해 수득된 3차원 구조에 기초한 돌출부/강 쌍을 모델링함에 근거한다. 이는 당분야에 널리 허용된 기법을 사용하여 달성될 수 있다.
따라서, 생성된 Fc 영역의 이종이량체화를 선호하기 위해, 상보성 돌연변이는, 표 3에 제공된 바와 같이, 각각의 Fc 쇄가 1 세트의 돌연변이, 즉 놉(또는 돌출부) Fc 쇄(서열번호 63)의 경우 Y349C 및 T366W, 또는 홀(또는 강) Fc 쇄(서열번호 64)에 대한 S354C, T366S, L368A 및 Y407V를 운반하도록 도입되었다. 적합한 포유동물 숙주내로 공동-형질감염될 경우, 서열번호 63 및 64의 아미노산 서열을 인코딩하는 DNA는 주로 하나의 홀(또는 강) Fc 쇄와 회합되는 하나의 놉(또는 돌출부) Fc 쇄 를 갖는 이중특이성 이종이량체성인 Fc 영역을 생산한다.
[표 3]
Fc 영역의 서열
Figure pct00004
중첩 프라이머 연장 PCR을 사용하여, 5' BspEI 제한 효소 인식 서열 TCCGGA(서열번호 67)는 놉(돌출부) 및 홀(강) Fc 쇄를 3' BspEI 자리가 함유된 각각의 DART 쇄에 서브클로닝하는데에 사용하기 위해 도입되었다. 이러한 제한 자리는 DART-Fc 연결부에서 아미노산 세린 및 글리신(ser-gly)의 골격구조내 삽입을 위해 코딩한다. 항-P-카데린/항-CD3 LP-DART 단백질은 실시예 6에 기재된 바와 같이 구축되었다.
본 발명의 항-P-카데린/항-CD3 LP-DART 단백질은 열 안정성 연구에서의 응집에 대해 안정하고, 인간 CD3 및 P-카데린 둘 다를 표적화하는 강력한 이중특이성 디아바디-Fc 융합물이다. 놉-인-홀 Fc 도메인은 CHO 세포에서의 개선된 발현 및 원하는 이종이량체의 높은 순도를 초래하는 개선된 정제를 허용한다. Fc 도메인내에 조작된 돌연변이는 FcγR 결합을 무효화시켜서, ADCC 중재된 T 세포 결핍을 강력히 방지한다. 추가로, Fc 도메인의 DART 단백질로의 혼입은 임상적으로 승인된 단일클론성 항체와 비교될 경우 시차 주사 열량측정법(DSC: differential scanning calorimetry) 및 강제 응집 검정(forced aggregation assay)에 의해 제시되는 바와 같이 분자의 안정성을 향상시킨다. 추가적으로, Fc 도메인은 약물동력학적 프로파일(profile)을 개선시킨다.
MP3 DART
도 6 및 7은 각각 N-말단 MP3-DART 및 C-말단 MP3-DART 이중특이성 이종이량체성 디아바디의 개략적 대표도이다. 이러한 MP3-DART 단백질은 다음의 3개의 폴리펩티드 쇄로 구성된다: 제1 폴리펩티드 쇄(1), 제2 폴리펩티드 쇄(2) 및 제3 폴리펩티드 쇄(3).
본 발명의 한 양태에서, 도 6에 제시된 바와 같이, N-말단 MP3-DART는, N-말단에서 C-말단 배향으로, (i) 항-P-카데린 항체(P-CAD VL) 또는 항-CD3 항체(CD3 VL)의 VL 결합 영역을 포함하는 서브-도메인 1A, (ii) 이러한 서브-도메인 1A가 CD3 VL을 포함할 경우 항-P-카데린 항체의 VH 결합 영역(P-CAD VH)을 포함하거나, 또는 이러한 서브-도메인 1A가 P-CAD VL을 포함할 경우 항-CD3 항체(CD3 VH)를 포함하는 서브-도메인 1B를 포함하는 도메인 1(여기서 서브-도메인 1A 및 서브-도메인 1B는 서브-도메인 1A 및 서브-도메인 1B가 에피토프 결합 자리를 형성하기 위해 회합되지 않도록 글리신-세린 연결기(연결기 1)에 의해 공유적으로 연결될 수 있음); (i) 서브-도메인 1B 상의 시스테인 연결기(연결기 2) 및 (ii) 연결기 2 상의 시스테인 펩티드 1 및 (iii) 펩티드 1에 공유적으로 연결된 IgG 도메인의 CH2 및/또는 CH3 도메인을 갖는 Fc 영역을 포함하는 제1 이종이량체 촉진 도메인을 포함하는 제1 폴리펩티드 쇄(1)를 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 도 7에 지시된 바와 같이, C-말단 MP3-DART는 N-말단에서 C-말단 배향으로, (i) 시스테인 펩티드 1, (ii) IgG Fc 도메인의 CH2 및/또는 CH3 도메인을 갖는 Fc 영역, 및 (iii) Fc 영역 상의 연결기 3을 포함하는 제1 이종이량체 촉진 도메인; 및 (i) 항-P-카데린 항체(P-CAD VL) 또는 항-CD3 항체(CD3 VL)의 VL 결합 영역을 포함하는 서브-도메인 1A, (ii) 이러한 서브-도메인 1A가 CD3 VL을 포함할 경우 항-P-카데린 항체의 VH 결합 영역(P-CAD VH)을 포함하거나, 또는 이러한 서브-도메인 1A가 P-CAD VL을 포함할 경우 항-CD3 항체(CD3 VH)를 포함하는 서브-도메인 1B를 포함하는 도메인 1(여기서 서브-도메인 1A 및 서브-도메인 1B는 서브-도메인 1A 및 서브-도메인 1B가 에피토프 결합 자리를 형성하기 위해 회합되지 않도록 글리신-세린 연결기(연결기 1)에 의해 공유적으로 연결될 수 있음); 및 (iv) 서브-도메인 1B 상의 시스테인 연결기(연결기 2)를 포함하는 제1 폴리펩티드 쇄(1)를 포함할 수 있다.
또 다른 양태에서, N-말단 MP3-DART 또는 C-말단 MP3-DART의 제1 폴리펩티드 쇄(1)는, (i) P-CAD VH 또는 CD3 VH를 포함하는 서브-도메인 1A, (ii) 이러한 서브-도메인 1A가 CD3 VH를 포함할 경우 P-CAD VL을 포함하거나, 또는 이러한 서브-도메인 1A가 P-CAD VH를 포함할 경우 CD3 VL을 포함하는 서브-도메인 1B를 포함하는 도메인 1을 포함한다.
하나의 양태에서, 제1 폴리펩티드 쇄(1)는, (i) P-CAD VL을 포함하는 서브-도메인 1A 및 (ii) CD3 VH를 갖는 서브-도메인 1B를 포함하는 도메인 1을 포함할 수 있다. 또 다른 양태에서, 제1 폴리펩티드 쇄(1)는, (i) CD3 VL을 포함하는 서브-도메인 1A 및 (ii) P-CAD VH를 포함하는 서브-도메인 1B를 포함하는 도메인 1을 포함할 수 있다. 추가의 양태에서, 제1 폴리펩티드 쇄(1)는, (i) P-CAD VH를 포함하는 서브-도메인 1A 및 (ii) CD3 VL을 포함하는 서브-도메인 1B를 포함하는 도메인 1을 포함할 수 있다. 또 다른 양태에서, 제1 폴리펩티드 쇄(1)는, (i) CD3 VH를 갖는 서브-도메인 1A 및 (ii) P-CAD VL을 포함하는 서브-도메인 1B를 포함하는 도메인 1을 포함할 수 있다.
하나의 양태에서, N-말단 MP3-DART 또는 C-말단 MP3-DART의 제2 폴리펩티드 쇄(2)는, (i) MP3-DART의 제1 폴리펩티드 쇄에 대해 선택된 VL 도메인에 따라서 항-P-카데린 항체(P-CAD VL) 또는 항-CD3 항체(CD3 VL)의 VL 결합 영역을 포함하는 서브-도메인 2B, (ii) 이러한 서브-도메인 2B가 CD3 VL을 포함할 경우 항-P-카데린 항체의 VH 결합 영역(P-CAD VH)을 포함하거나, 또는 이러한 서브-도메인 2B가 P-CAD VL을 포함할 경우 항-CD3 항체(CD3 VH)를 포함하는 서브-도메인 2A를 포함하는 도메인 2를 포함하고, 서브-도메인 2B 및 서브-도메인 2A는 서브-도메인 2B 및 서브-도메인 2A가 에피토프 결합 자리를 형성하기 위해 회합되지 않도록 글리신-세린 연결기(연결기 1)에 의해 공유적으로 연결될 수 있고; 서브-도메인 2A 상에 시스테인 연결기(연결기 2)를 포함하는 제2 이종이량체 촉진 도메인을 포함할 수 있다.
또 다른 양태에서, 제2 폴리펩티드 쇄(2)는, (i) P-CAD VH 또는 CD3 VH를 포함하는 서브-도메인 2B, (ii) 이러한 서브-도메인 2B가 CD3 VH를 포함할 경우 P-CAD VL을 포함하거나, 또는 이러한 서브-도메인 2B가 P-CAD VH를 포함할 경우 CD3 VL을 포함하는 서브-도메인 2A를 포함하는 도메인 2를 포함한다.
하나의 양태에서, 제2 폴리펩티드 쇄(2)는, (i) P-CAD VL을 포함하는 서브-도메인 2B 및 (ii) CD3 VH를 갖는 서브-도메인 2A를 포함하는 도메인 2를 포함한다. 또 다른 양태에서, 제2 폴리펩티드 쇄(2)는, (i) CD3 VL을 포함하는 서브-도메인 2B 및 (ii) P-CAD VH를 포함하는 서브-도메인 2A를 포함하는 도메인 2를 포함한다. 추가의 양태에서, 제2 폴리펩티드 쇄(2)는, (i) P-CAD VH를 포함하는 서브-도메인 2B 및 (ii) CD3 VL을 포함하는 서브-도메인 2A를 포함하는 도메인 2를 포함한다. 또 다른 양태에서, 제2 폴리펩티드 쇄(2)는, (i) CD3 VH를 포함하는 서브-도메인 2B 및 (ii) P-CAD VL을 포함하는 서브-도메인 2A를 포함하는 도메인 2를 포함한다.
하나의 양태에서, N-말단 MP3-DART 또는 C-말단 MP3-DART의 폴리펩티드 쇄(3)은, N-말단에서 C-말단으로의 배향에서, (i) 시스테인 펩티드 1 및 (ii) IgG Fc 도메인의 CH2 및/또는 CH3 도메인을 갖는 Fc 영역을 포함하는 제3 이종이량체 촉진 도메인을 포함할 수 있다.
본 발명의 하나의 양태에서, 서브-도메인 1A 및 서브-도메인 2A는 회합되어 CD3 또는 P-카데린 상의 에피토프에 결합하는, VL/VH 영역을 갖는 제1 결합 자리를 형성할 수 있고, 서브-도메인 1B 및 서브-도메인 2B는 회합되어 P-카데린 또는 CD3 상의 에피토프에 결합하는, VL/VH 영역을 갖는 제2 결합 자리를 형성할 수 있다.
제 1 폴리펩티드 쇄(1) 및 제2 폴리펩티드 쇄(2)는, 예를 들면 제1 및 제2 이종이량체 촉진 도메인 내에 위치된 시스테인 잔기에서 서로 공유적으로 결합될 수 있다. 하나의 양태에서, 제1 이종이량체 촉진 도메인의 연결기 2중의 시스테인 잔기 및 제2 이종이량체 촉진 영역 상의 연결기 2중의 시스테인 잔기는 적어도 하나의 디설파이드 결합에 의해 연결될 수 있다.
제1 폴리펩티드 쇄(1)의 제1 이종이량체 촉진 도메인 및 제3 폴리펩티드 쇄(3)의 제3 이종이량체 촉진 도메인은 면역글로불린 Fc 영역을 형성하기 위해 서로 회합될 수 있다. 제1 폴리펩티드 쇄(1) 및 제3 폴리펩티드 쇄(3)는, 예를 들면 제1 및 제3 이종이량체 촉진 도메인 내에 위치된 시스테인 잔기에서, 서로 공유적으로 결합될 수 있다. 또 다른 양태에서, 제1 이종이량체 촉진 도메인 상의 펩티드 1중의 시스테인 잔기 및 제3 이종이량체 촉진 도메인 상의 펩티드 1중의 시스테인 잔기는 적어도 하나의 디설파이드 결합에 의해 연결될 수 있다.
본 발명의 한 양태에서, CD3 VL은 서열번호 48의 서열을 포함하고, CD3 VH는 서열번호 47 및 89로 구성된 군에서 선택된 서열일 수 있다. 또 다른 양태에서, P-CAD VL은 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 및 23으로 구성된 군에서 선택된 서열일 수 있고, P-CAD VH는 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 및 24로 구성된 군에서 선택된 서열일 수 있다. 하나의 양태에서, 글리신-세린 연결기(연결기 1)는 GGGSGGGG(서열번호 68) 및 GGGGSGGGG(서열번호 69)로 구성된 군에서 선택된 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 한 양태에서, 시스테인 연결기(연결기 2)는 GFNRGEC(서열번호 70) 및 GVEPKSC(서열번호 71)로 구성된 군에서 선택된 서열을 포함할 수 있다. 또 다른 양태에서 제1 이종이량체 촉진 도메인의 시스테인 연결기(연결기 2)는 GFNRGEC(서열번호 70)의 서열을 포함하고, 제2 이종이량체 촉진 도메인의 시스테인 연결기(연결기 2)는 GVEPKSC(서열번호 71)의 서열을 포함할 수 있다.
특정 양태에서, 제3 이종이량체 촉진 영역의 연결기 3은 KAPSSSPME(서열번호 77)의 서열을 포함한다.
특정 양태에서, 제1 및 제3 이종이량체 촉진 영역 상의 펩티드 1은 서열 CPPCP(서열번호 60)을 갖는 절단된 IgG1 힌지 영역을 포함할 수 있다. 하나의 양태에서, 펩티드 1은, 제한되지 않지만, DKTHTCPPCP(서열번호 96)의 서열을 포함할 수 있다.
본원에 기재된 놉 및 홀 전략은 제1 및 제3 폴리펩티드 쇄의 적절한 짝형성을 보장하기 위해 MP3-DART 구축물에서 이용될 수 있다. 본원에 기재된 LP-DART와 유사하게, 인간 IgG1의 Fc 영역은 종종 번역후 분할되는 C-말단 라이신 잔기를 제거할 뿐만 아니라, FcγRIII으로의 결합에 기인한 효과자 작용을 제거하기 위해 돌연변이 L234A, L235A 및 G237A를 도입하도록 개질될 수 있다(효과자 삭제 표현형). 하나의 양태에서, 놉은 개질 T366W를 포함하도록 고유의 IgG Fc 영역을 개질시킴으로써 생성된다. 또 다른 양태에서 홀은 개질 T366S, L368A 및 Y407V를 함유하도록 고유의 IgG Fc 영역을 개질시킴으로써 생성된다. 바람직하게는 제1 폴리펩티드 쇄는 놉을 포함하고 제3 폴리펩티드 쇄는 홀을 포함한다. 제3 폴리펩티드 쇄의 임의의 동종이량체로부터 MP3-DART(상표명)를 정제하는 것을 돕기 위해, 제3 폴리펩티드 쇄의 CH2 및 CH3 도메인의 단백질 A 결합 자리는 바람직하게는 위치 435(H435R)에서 아미노산 치환에 의해 돌연변이된다. 이와 같이, 제3 폴리펩티드 쇄의 임의의 동종이량체는 단백질 A에 결합되지 않는 반면, MP3-DART(상표명)는 제1 폴리펩티드 쇄 상의 단백질 A 결합 자리를 경유하여 단백질 A에 결합하는 그의 능력을 보유한다. 따라서, 표 4에 제공된 바와 같이 놉(또는 돌출부) Fc 쇄는 서열번호 65의 서열을 가질 수 있고, 홀(또는 강) Fc 쇄는 서열번호 66의 서열을 가질 수 있다.
[표 4]
Fc 영역의 서열
Figure pct00005
표 5는 본원에 기재된 다양한 P-카데린 및 CD3-1 항체에 의해 구축된 예시적인 N-말단 MP3-DART 및 C-말단 MP3-DART 단백질의 제1(1), 제2(2) 및 제3(3) 폴리펩티드 쇄를 기재한다. 서열번호 125 내지 158은 표 5에 기재된 N-말단 및 C-말단 MP3-DART 이중특이성 이종이량체성 디아바디에 대한 폴리펩티드 쇄 1, 2 및 3을 위한 아미노산 및 누클레오티드 서열(괄호안에 참조됨)을 제공한다.
[표 5]
MP3-DART 단백질의 제1, 제2 및 제3 폴리펩티드 쇄
Figure pct00006
조작된 시스테인 잔기
특정 양태에서, 이중특이성 이종이량체성 디아바디의 각각의 폴리펩티드 쇄는, 쇄간 디설파이드 결합을 형성하기 위해 본 발명의 또 다른 폴리펩티드 쇄 상의 대응 시스테인 잔기와 상호작용할 수 있는 적어도 하나의 시스테인 잔기를 포함하도록 조작될 수 있다. 쇄간 디설파이드 결합은 디아바디 분자를 안정화시켜, 재조합 시스템에서의 발현 및 회수를 증진시킴으로써, 안정하고 일정한 제형을 생성할 뿐만 아니라, 단리되고/되거나 정제된 생성물의 생체내 안정성을 증진시킨다. 시스테인 잔기 또는 잔기들은 단일 아미노산으로서 또는 더 큰 아미노산 서열, 예를 들어 힌지 영역의 일부로서, 폴리펩티드 쇄의 임의의 부분에 도입될 수 있다. 구체적인 양태에서, 적어도 하나의 시스테인 잔기는 폴리펩티드 쇄의 C-말단에서 발생되도록 조작된다.
암 치료
본 발명은 치료학적 효과량의 본 발명에 따라 조작된 이중특이성 이종이량체성 디아바디를 피험체에게 투여하는 단계를 포함하는, 피험체에서 암을 치료, 예방 또는 처치하기 위한 방법 및 조성물을 포괄하고, 이러한 분자는 암 항원에 결합한다. 본 발명의 분자는 주요 종양의 성장 및 암 세포 전이의 예방, 저해, 감소 및/또는 퇴행에 특히 유용할 수 있다. 특별한 작용 기작으로 얽매려는 것은 아니지만, 본 발명의 분자는 종양 소거, 종양 감소 또는 이의 조합을 초래할 수 있는 효과자 작용을 중재할 수 있다.
따라서, 본 발명은 면역특이적으로 P-카데린 암 항원 및 T 세포 상의 CD3 항원을 인식하도록 이중특이성 이종이량체성 디아바디를 조작함으로써 P-카데린 암 항원을 특징으로 하는 암을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다. 본 발명에 따라 조작된 이중특이성 이종이량체성 디아바디는, 이들이 항-CD3 유도된 활성화된 킬러 T 세포에 의해 세포독성 활성을 가지므로, 암의 예방 또는 치료에 유용하다.
이에 따라, 본 발명의 양태는 P-카데린 양성 암의 치료가 필요한 환자에서 상기 암을 치료하는 방법을 제공하고, 여기서 암은 유방암, 결장직장암, 난소암, 위암, 갑상선암, 전립선암, 자궁경부암, 췌장암, 폐암(제한되지 않지만 비-소 세포 폐암 및 소 세포 폐암 포함), 방광암, 간암, 자궁내막암, 두경부암, 고환암 및 교모세포종 암으로 구성된 군에서 선택된다.
본 발명은 본원에 정의된 암을 치료하는 방법에 사용하기 위한 본 발명의 이중특이성 이종이량체성 디아바디를 제공한다. 또한, 본 발명은 본원에 정의된 바와 같은 암의 치료를 위한 약제의 제조에 있어서의 본 발명의 이중특이성 이종이량체성 디아바디의 용도를 제공한다.
구체적인 양태에서, 본 발명의 이중특이성 이종이량체성 디아바디는, 본 발명의 이중특이성 이종이량체성 디아바디의 부재하의 암 세포의 성장과 비교하여, 적어도 99%, 적어도 95%, 적어도 90%, 적어도 85%, 적어도 80%, 적어도 75%, 적어도 70%, 적어도 60%, 적어도 50%, 적어도 45%, 적어도 40%, 적어도 35%, 적어도 30%, 적어도 25%, 적어도 20%, 또는 적어도 10%로 암 세포의 성장을 저해하거나 감소시킨다.
구체적인 양태에서, 본 발명의 이중특이성 이종이량체성 디아바디는, 본 발명의 이중특이성 이종이량체성 디아바디의 부재하에서에 비해, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 100% 더 우수하게 세포를 살해하거나 암 세포의 성장을 저해하거나 감소시킨다.
본 발명은 추가로 본 발명의 분자를 암의 치료 또는 예방을 위한 당분야의 숙련가에게 공지된 다른 치료법과 조합하여 투여함을 포괄하고, 이러한 치료법은 제한되지 않지만, 현행의 표준 및 실험 화학치료법, 생물 치료법, 면역요법, 방사선 치료법, 또는 수술이 포함된다. 몇몇 양태에서, 본 발명의 분자는 치료학적 또는 예방학적 효과량의 하나 이상의 제제, 치료학적 항체 또는 암의 치료 및/또는 예방을 위해 당분야의 숙련가에게 공지된 기타 제제와 조합하여 투여될 수 있다.
따라서, 암을 치료하는 방법은 치료가 필요한 환자에게 효과량의 본 발명의 이중특이성 이종이량체성 디아바디를 화학치료제와 조합하여 투여함을 포함한다. 이러한 조합 치료제는 별도로, 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있다. 적합한 화학치료제로는, 제한되지 않지만, 5-플루오로우라실, 아스파라기나아제(asparaginase), BCNU, 블레오마이신(bleomycin), 칼리케아미신(calicheamicin), 캄프토테신(camptothecin), 카보플라틴(carboplatin), 시스플라틴(cisplatin), 사이클로포스파미드, 사이타라빈(cytarabine), 사이톡산(cytoxan), 다카바진(dacarbazine), 닥티노마이신(dactinomycin), 다우노루비신(daunorubicin), 도세탁셀(docetaxel), 독소루비신(doxorubicin), 에토포시드(etoposide), 하이드록시우레아(hydroxyurea), 이다루비신(idarubicin), 이포스파미드(ifosfamide), 이리노테칸(irinotecan), L-아스파라기나아제, 머캅토퓨린(mercaptopurine), 메토트렉세이트(methotrexate), 미토마이신(mitomycin), 미토잔트론(mitoxantrone), 질소 머스타드(nitrogen mustard), 니트로소우레아(nitrosourea), 파클리탁셀(paclitaxel), 필카마이신(plicamycin), 프로카비진(procarbizine), 탁솔(taxol), 티오구아닌, 토포테칸(topotecan), 빈블라스틴(vinblastine), 빈크리스틴(vincristine), 및 비노렐빈(vinorelbine)이 포함된다.
본원에 제공된 투여의 투여량 및 빈도는 "치료학적으로 효과적인" 및 "예방학적으로 효과적인"이라는 용어에 의해 포괄된다. 투여량 및 빈도는 추가로 투여되는 특정 치료제 또는 예방제, 암의 위중성 및 유형, 투여 경로, 뿐만 아니라 환자의 연령, 체중, 반응, 및 과거의 의학적 병력에 의존하여 각각의 환자에 대해 특이적인 인자들에 따라서 다양할 수 있다. 적합한 섭생은 이러한 인자를 고려하고, 예를 들면, 문헌에 보고되고 문헌[Physician"s Desk Reference (56th ed., 2002)]에 권고된 투여량을 따름으로써 당분야의 숙련가에 의해 선택될 수 있다.
본 발명의 이중특이성 이종이량체성 디아바디는 선택된 투여 방식, 및 약학적으로 허용가능한 희석제 또는 부형제, 예컨대 완충제, 계면활성제, 보존제, 가용화제, 등장성 제제, 안정화제, 담체 등에 대해 적절하게 제형화된 투여용 약학 조성물의 형태로 존재할 수 있다. 레밍턴(Remington)의 문헌[Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton Pa., 18th ed., 1995]은 의사에게 일반적으로 공지된 바와 같은 제형화 기법의 개요서를 제공한다.
이들 약학 조성물은 암을 치료하기 위해 일반적으로 의도되는 목적을 달성하는 당분야에 공지된 임의의 수단에 의해 투여될 수 있다. 투여 경로는 비경구적이고, 제한되지 않지만 정맥내, 근육내, 복강내, 피하 및 동맥내 주사 및 주입을 비롯한 투여 방식을 지칭하는 것으로 본원에 정의된다. 투여된 투여량은 수여자의 연령, 건강, 및 체중, 존재한다면 함께 진행되는 치료의 종류, 및 원하는 효과의 성질에 좌우될 수 있다.
본 발명의 범주내의 조성물은 이중특이성 이종이량체성 디아바디가 암을 치료하기 위해 원하는 의학적 효과를 달성하는데에 효과적인 양으로 존재하는 모든 조성물을 포함한다. 개별적 요구는 환자들 사이에서 다양할 수 있으므로, 모든 성분들의 효과량의 최적 범위에 대한 결정은 숙련된 임상학자의 능력에 있다.
본 발명은 상기 방법에서 사용될 수 있는 키트를 제공한다. 하나의 양태에서, 키트는 본 발명의 이중특이성 이종이량체성 디아바디를 포함한다. 또 다른 양태에서, 키트는 추가로 암의 치료에 유용한 하나 이상의 다른 예방제 또는 치료제를 하나 이상의 용기에 포함한다. 특정 양태에서, 기타 예방제 또는 치료제는 화학치료제이다. 다른 양태에서, 예방제 또는 치료제는 생물학적 치료제 또는 호르몬 치료제이다.
본 발명의 약학 조성물, 예방제 또는 치료제에 대한 몇몇 양태는 바람직하게는 시험관내에서, 세포 배양 시스템에서, 및 동물 모델 유기체, 예컨대 설치류 동물 모델 시스템에서, 인간에게 사용하기 전에 원하는 치료 활성을 위해 시험된다.
본 발명의 예방학적 및/또는 치료학적 프로토콜의 독성 및 효능은 세포 배양액 또는 실험 동물에서 표준 약학 절차에 의해, 예를 들어 LD50(모집단의 50%에 치명적인 용량) 및 ED50(모집단의 50%에서 치료 효과적인 용량)을 결정하기 위해 결정될 수 있다. 독성 및 치료 효과 사이의 용량 비는 치료학적 지수이고, 이는 LD50/ED50의 비로서 표현될 수 있다. 큰 치료학적 지수를 나타내는 예방제 및/또는 치료제가 바람직하다.
추가로, 당분야의 숙련가에게 공지된 임의의 검정은 암의 치료 또는 예방을 위해 본원에 개시된 치료법 또는 조합 치료법의 예방학적 및/또는 치료학적 이용성을 평가하기 위해 사용될 수 있다.
생물 기탁
본 발명의 대표적인 물질은 2013년 12월 20일자로 미국 균주 은행(ATCC: American Type Culture Collection)(미국 버지니아주 20110-2209 마나사스 유니버서티 불러바드 10801 소재)에 기탁되었다. ATCC 수납 번호 PTA-120809를 갖는 벡터 153 LP-DART A는 P-카데린 LP-DART(Fc-융합 디아바디) 쇄 A를 인코딩하는 재조합 인간 DNA 삽입물을 포함하고, ATCC 수납 번호 PTA-120810을 갖는 벡터 153 LP-DART B는 P-카데린 LP-DART(Fc-융합 디아바디) 쇄 B를 인코딩하는 재조합 인간 DNA 삽입물을 포함한다. 기탁은 특허 절차상의 미생물 기탁의 국제적 승인에 관한 부다페스트 조약(Budapest Treaty on International Recognition of the Deposit of Microorganisms for the Purpose of Patent Procedure)의 조항 및 그 하에서의 규제(부다페스트 조약)하에 이루어졌다. 이는 기탁일로부터 30년 동안 기탁물의 생존가능한 배양물의 유지를 보장한다. 기탁물은 부다페스트 조약에 관하여 ATCC에 의해, 화이자 인코포레이티드(Pfizer Inc) 및 ATCC 간의 동의에 따라 입수가능할 것이고, 이는 적절한 미국 특허의 허여시 또는 임의의 미국 또는 외국 특허 출원의 대중에 대한 공개시(어느 것이 먼저든 상관없이) 기탁 배양물의 자손체의 영구적이고 제한되지 않는 대중에 대한 이용가능성을 보장하고, 35 U.S.C. 섹션 122에 따라 권한을 받은 특허 및 상표 위원장 및 이에 따른 위원장의 규칙(886 OG 638을 특히 참조하여 37 C.F.R. 섹션 1.14를 포함함)에 의해 결정된 자에게 자손체의 이용가능성을 보장한다.
본 출원의 양수인은, 기탁시 물질의 배양액이 적합한 조건하에 배양될 경우 죽거나 소실되거나 파괴되어야 한다면, 그 물질은 통지시 또 다른 동일물로 신속히 대체될 것임을 동의하였다. 기탁된 물질에 대한 이용가능성은 특허법에 따라 임의의 정부 권한하에 수여되는 권리를 위반하여 본 발명을 실행하는 자격증으로서 해석되지 않는다.
본 발명을 실행하기 위한 특정 양태에 대한 하기 실시예는 단지 예시적인 목적을 위해 제공되고, 본 발명의 범주를 어떠한 방식으로도 제한하려는 것이 아니다.
실시예 1
P-카데린 항체 및 이중특이성 이종이량체성 디아바디의 생성
각각의 재조합 생산, 정제 및 결합 특징을 평가하기 위해 이중특이성 이종이량체성 디아바디를 구축하였다. 친화도 정제된 이중특이성 이종이량체성 디아바디를 본원에 기재된 재조합 발현 시스템에 의해 생산하였다. ELISA 및 SPR 분석은 추가로 공유적 이중특이성 이종이량체성 디아바디가 표적 항원, P-카데린 및 CD-3 둘 다에 대하여 친화도를 나타내고 항원 둘 다에 동시에 결합할 수 있음을 보여주었다.
A. 파아지 디스플레이
P-카데린의 세포외 도메인(ECD)에 결합하는 단일 쇄 단편 가변(scFv) 작용부분(moiety)을 당분야에 공지된 기법을 이용하여 비-인간화된 인간 공여자로부터 유래된 scFv로 구성된 파아지 디스플레이 라이브러리에 의해 식별하였다. 파아지의 표면 상에서 발현된 scFv의 결합을 P-카데린 단백질 구축물 및 P-카데린-발현 세포 상에서 표준 ELISA 기법에 의해 측정하였다.
B. 서열 분석
ScFv 단편을, 정제되지 않은 박테리아 글리세롤 스톡(stock)으로서 또는 정제된 플라스미드로서 프라이머 5' GGAGATTTTCAACGTGAA 3'(서열번호 58) 및 5' CTCTTCTGAGATGAGTTTTTG 3'(서열번호 59)에 의해 종래의 방법을 사용하여 서열분석하였다.
C. DART로의 전환
강한 재조합 P-카데린 또는 세포 표면 결합(> 3x 배경 또는 음성 세포 결합)을 나타내는 ScFv 단편을 DART 단백질내로의 서브-클로닝을 위해 선택하였다. DART 고안 및 클로닝 방법은 이전에 기재되었다[존슨(Johnson) 등의 문헌 "J Mol Biol, 399:436-449, 2010"; 무어(Moore) 등의 문헌 "Blood, 117(17):4542-51, 201 1"]. 파아지 디스플레이 라이브러리로부터 신규한 항-P-카데린 scFv를 채택하는 방법은 다음과 같다: VH를 위한 BamHI/BspEI 및 VL을 위한 BssHII/BamHI가 혼입된 프라이머로 표준 폴리머라아제 쇄 반응(PCR)에 의해 단편을 증폭시켰다. 단편을 제조업체[뉴 잉글랜드 바이이오랩(New England Biolabs)]의 설명서에 따라 상응하는 제한 효소로 절단하였다.
DART 발현 벡터를 생성하기 위해, 항-P-카데린 VH(P-CAD VH) 또는 VL(P-CAD VL) scFv를 겔 정제하고[퀴아겐(QIAGEN: 등록상표) 겔 정제 키트], 항-CD3 VL(CD3 VL) 또는 VH(CD3 VH) scFv가 함유된 포유동물 발현 벡터내로 별도로 결찰시켰다.
VF-DART의 생성을 위해, 도 2 및 3에 제시된 바와 같이, DART 발현 벡터는 추가로 각각 시스테인 연결기(연결기 2)를, 예컨대 GFNRGEC(서열번호 70) 또는 GVEPKSC(서열번호 77)를 갖는 제1 및 제2 이종이량체 촉진 도메인을 포함하였다.
EK-DART를 생성하기 위해, 도 4에 제시된 바와 같이, DART 발현 벡터는 추가로 각각 시스테인 연결기(연결기 2), 예컨대 GGCGGG(서열번호 72), 및 E-코일 도메인(서열번호 61) 또는 K-코일 도메인(서열번호 62)을 갖는 제1 및 제2 이종이량체 촉진 도메인을 포함한다.
LP-DART를 생성하기 위해, 도 1 및 5에 제시된 바와 같이, DART 발현 벡터는 추가로 각각 시스테인 연결기(연결기 2), 예컨대 GCPPCP(서열번호 73), GGTGGCPPCP(서열번호 74), GEPKSSDKTHTCPPCP(서열번호 75), 또는 GGTGGGEPKSSDKTHTCPPCP(서열번호 76), 및 "놉" Fc 쇄(서열번호 63) 또는 "홀" Fc 쇄(서열번호 64)를 갖는 제1 및 제2 이종이량체 촉진 도메인을 포함한다.
파아지 디스플레이 라이브러리로부터의 신규한 항-P-카데린 scFv에 더하여, 항-P-카데린 임상적 mAb PF-03732010으로부터의 VH 및 VL 도메인[장(Zhang) 등의 문헌 "Clin Cancer Res. 16(21), 5177-5188, 2010"]을 또한 양성 대조군으로서 작용하는 상기 기재된 다양한 DART 발현 벡터내로 서브-클로닝하였다.
이어서 발현 벡터를 HEK 293 세포내로 공동-형질감염시킴으로써 DART 단백질을 일시적으로 포유동물 세포에서 발현시켰다. P-카데린 친화도를 보유하는 DART 단백질을 CNBr-활성화된 세파로즈 4B[지이 헬쓰케어(GE Healthcare), 미국 뉴저지주 피스카타웨이 소재]에 커플링된 항-코일링된-코일 mAb 15F1에 의해 친화도 정제하였다. 정제된 DART 단백질의 생물학적 특성은 SDS-PAGE 및 SEC에 의해 평가하였다.
표 6은 본원에 기재된 기법에 의해 생성된 항-P-카데린 scFv 클론에 대한 VL 및 VH 아미노산 서열을 제공한다. 클론 20 및 30에 대한 CDR은 카밧에 따라 밑줄그어져 있다. 서열번호 97 내지 116은 괄호안에 참조된 상응하는 누클레오티드 서열을 제공한다.
[표 6]
P-CAD VL 및 VH 서열.
Figure pct00007
Figure pct00008
표 7a 및 7b는, 각각 카밧 및 AbM 번호매김 표시를 사용하여, 생성된 항-P-카데린 VH scFv 클론에 대한 CDR 서열을 제공한다.
[표 7a]
카밧 번호매김을 사용하는 P-CAD VH CDR 서열
Figure pct00009
[표 7b]
AbM 번호매김을 사용하는 P-CAD VH CDR 서열
Figure pct00010
표 7c는 생성된 항-P-카데린 VL scFv 클론에 대한 CDR 서열을 제공한다.
[표 7c]
카밧/ABM 번호매김을 사용하는 P-CAD VL CDR 서열
Figure pct00011
표 8은 친화도-돌연변이된 P-카데린 클론에서 발견되는 아미노산 돌연변이를 제시한다. 데이터는 해결된 결정 구조에 기초하여 VL/VH 폴딩(folding) 및 리간드 상호작용에 미치는 잠재적 효과를 제안한다. CDR 결합 포켓(pocket)내에서의 돌연변이는 증진된 리간드 상호작용에 대한 잠재성을 보여주었다. CDR 결합 포켓 바깥쪽에서 발견되는 돌연변이는 증진된 VL/VH 폴딩에 대한 역할을 제안하였다.
[표 8]
친화도-돌연변이된 P-카데린 클론의 아미노산 돌연변이
Figure pct00012
표 9는 본원에 기재된 기법에 의해 생성된 항-CD3 scFv 클론에 대한 VL 및 VH 아미노산 서열을 제공한다.
[표 9]
CD3 VL 및 VH 아미노산 서열.
Figure pct00013
표 10a 및 10b는, 각각 카밧 및 AbM 번호매김 표시를 사용하여, 생성된 항-CD3 VH scFv 클론에 대한 CDR 서열을 제공한다.
[표 10a]
카밧 번호매김을 사용한 CD3 VH CDR 서열
Figure pct00014
[표 10b]
AbM 번호매김을 사용한 CD3 VH CDR 서열
Figure pct00015
표 10c는 생성된 항-CD3 VL scFv 클론에 대한 CDR 서열을 제공한다.
[표 10c]
카밧/AbM 번호매김을 사용한 CD3-1 및 CD3-2 VL CDR 서열
Figure pct00016
실시예 2
항-P-카데린/항-인간 CD3 LP-DART의 구축
항-P-카데린/항-인간 CD3 DART 단백질을, 각각의 DART 단백질이 포유동물 발현 벡터내로 클로닝하기 위해 각각의 단부에서 제한 효소 클로닝 자리를 함유하도록 PCR에 의해 증폭시켰고, 표 11 및 도 33a 및 33b를 참조한다.
[표 11]
항-P-카데린/항-인간 CD3 DART 단백질
Figure pct00017
이후, DART 단백질 서열을 인코딩하는 핵산을 개질된 Fc 구축물을 인코딩하는 각각의 핵산, 예를 들어 "놉" Fc 쇄(서열번호 63) 및 "홀" Fc 쇄(서열번호 64)에 융합시키고, 각각은 시스테인 연결기, 예컨대 GCPPCP(서열번호 73), GGTGGCPPCP(서열번호 74), GEPKSSDKTHTCPPCP(서열번호 75) 및 GGTGGGEPKSSDKTHTCPPCP(서열번호 76)의 C-말단에 연결된다.
PCR 증폭 이후, DART 및 Fc 쇄 핵산을 둘 다 BspEI 및 HindIII(5' DART 클로닝 자리) 또는 EcoRI(3' Fc 클로닝 자리)에 의해 소화시켰다. 소화된 DNA를 아가로스 겔로부터의 배제에 의해 단리하고 후속적으로 정제한 후 30 분 동안 실온에서 HindIII-EcoRI 소화된 발현 벡터내로 결찰시켰다. 이어서 결찰물을 컴피턴트(competent) 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) DH5α로 형질전환시키고 37℃에서 하룻밤 100 ㎍/mL의 카베니실린(carbenicillin)이 함유된 아가로스 플레이트 상에서 성장시켰다. 콜로니를 계수하고, 따내고, 하룻밤 YT-브로쓰(broth) + 100 ㎍/mL 카베니실린에서 성장시키고 표준 방법에 의해 DNA를 단리하였다. 이어서 모든 DNA 구축물을 포유동물 세포 발현 이전에 양쪽 가닥에 대해 서열분석하였다. 이어서 상보성 구축물 쌍을 1백만개 세포/mL HEK 293 세포가 함유된 1 L 로그(log) 상 배양액으로 공동-형질감염시켰다. 24 시간 감염시킨 후, 트립토판을 0.75%의 최종 농도로 첨가하고, 세포를 수확 전 추가의 5일 동안 성장시켰다. 이어서 소비된 배양액을 수집하고, 원심분리시켜 세포 찌꺼기를 제거한 다음 20 ㎛ 필터를 통해 통과시켰다. 이어서 당분야에 공지된 기법을 이용하여 단백질 정제를 수행하였다. 항-P-카데린/항-인간 CD3 LP-DART의 개략적인 예는 도 1a 및 1b에 제시된다.
실시예 3
P-카데린 scFv-Fc 및 DART 단백질의 결합 특성
P-카데린 scFv-Fc 구축물(인간 IgG Fc 영역에 융합된 P-카데린 VH 및 VL) 및 DART 단백질의 P-카데린 단백질 구축물 및 P-카데린 발현 세포로의 결합 특성을 표준 ELISA 기법에 의해 분석하였다. 표 12에서의 데이터는 파아지 유래된 P-카데린 scFv-Fc 구축물이 재조합 인간 P-카데린에 대해 강한 결합을 갖고 뮤린 P-카데린으로는 검출가능한 결합을 갖지 않음을 입증한다.
[표 12]
P-카데린 scFv-Fc의 P-카데린 단백질 구축물로의 결합 특성
Figure pct00018
세포-기초한 ELISA에서 P-카데린 scFv-Fc의 다양한 P-카데린 발현 세포 유형으로의 결합 특성은 표 13에 제시된다. 파아지 유래된 P-카데린 scFv-Fc 구축물은 H1650 세포 및 SW480-huPcad와 CHO-huPcad 세포 유형으로의 강한 결합을 입증하였다
[표 13]
P-카데린 scFv-Fc의 다양한 P-카데린 발현 세포 유형으로의 결합 특성
Figure pct00019
표 14에 제시된 바와 같이, 본 발명의 항-P-카데린 EK-DART 단백질은 ELISA 형식에서 H1650 세포 상의 세포 표면 발현된 P-카데린에 대해 및 재조합 인간 P-카데린-Fc에 대해 강한 결합을 나타내지만, 다른 카데린 계열 구성원, E-카데린 및 VE-카데린에 결합되지 않았다. EK-DART는 E/K 코일 도메인 구축물이다. PF EK-DART는, 실시예 1에 기재된 바와 같이, 항-P-카데린 임상적 mAb PF-03732010으로부터의 VH 및 VL을 이용하는 양성 대조군이다. 표 14중의 모든 EK-DART 단백질은 CD3-2를 포함한다.
[표 14]
P-카데린 EK-DART 단백질의 결합 특성
Figure pct00020
실시예 4
DART 단백질의 표면 플라스몬 공명(SPR) 분석
EK-DART 단백질의 P-카데린 및 CD3으로의 결합 친화도를, SPR에 의해 비아코어(등록상표) 3000 바이오센서(지이 헬쓰케어)를 사용하여 분석하였다. 항원 huCD3εδ 및 인간 P-카데린-Fc 또는 인간/사이노몰구스 원숭이/뮤린 P-카데린-ECD를 제조업체에 의해 권고된 바와 같이 CM-5 센서 칩에 아민 커플링 키트에 의해 고정화하였다. 표 15는 사이노몰구스 원숭이("사이노") P-카데린 ECD에 대한 파아지 유래된 EK-DART 단백질의 결합 친화도를 제시하고, 표 16은 인간 가용성 CD3 단백질에 대한 파아지 유래된 EK-DART 단백질의 결합 친화도를 제시한다. 표 15 및 16중의 모든 EK-DART 단백질은 CD3-2를 포함한다.
[표 15]
사이노 P-카데린 ECD에 대한 EK-DART 단백질의 결합 친화도
Figure pct00021
[표 16]
인간 가용성 CD3에 대한 EK-DART 단백질의 결합 친화도
Figure pct00022
표 17에서, 비아코어 데이터는, CD3-2를 갖는 모 35 EK-DART와 비교된, CD3-2를 갖는 최적화된 EK-DART 단백질의 사이노 P-카데린 ECD에 대한 결합 친화도를 나타낸다. 표 17중의 모든 EK-DART 단백질은 CD3-2를 포함한다.
[표 17]
사이노 P-카데린 ECD에 대한 EK-DART 단백질의 결합 친화도
Figure pct00023
표 18에서, 비아코어 데이터는 모 35 EK-DART 및 최적화된 EK-DART 단백질의 가용성 CD3δε에 대한 결합 친화도를 나타낸다. 표 18중의 모든 EK-DART 단백질은 CD3-2를 포함한다.
[표 18]
인간 가용성 CD3에 대한 EK-DART 단백질의 결합 친화도
Figure pct00024
다양한 DART 형식의 pH 7.4에서의 사이노 P-카데린에 대한 결합 친화도는 표 19에 제시된다. P-카데린 클론 153 VH 및 VL 결합 도메인을 갖는 VF, EK, LP, MP3-C-말단 및 MP3-N-말단 형식의 DART 단백질을 비교하였다. 153 VF-DART는 가장 높은 결합 친화도 및 가장 빠른 회합 속도를 나타내었다. KD는 153 EK-DART 및 153 LP-DART 단백질과 유사하였다. 153 MP3-DART 단백질은 더 느린 회합 속도로 지시되는 바와 같이 약간 더 낮은 사이노 P-카데린에 대한 결합 친화도를 가졌다. 모든 153 DART 단백질의 경우 활성%(R최대값)은 낮았고 유사하였다. 표 19중의 모든 DART 단백질은 CD3-1을 포함하였지만, 단 153 EK-DART는 CD3-2를 포함하였다.
[표 19]
사이노 P-카데린 ECD에 대한 다양한 DART 형식의 결합 친화도
Figure pct00025
다양한 DART 형식의 pH 7.4에서의 shCD3(가용성 인간 CD3)에 대한 결합 친화도는 표 20에 제시된다. P-카데린 클론 #153 VH 및 VL 결합 도메인을 갖는 VF, EK, LP, MP3-C-말단 및 MP3-N-말단 형식의 DART 단백질을 비교하였다. 153 VF-DART는 shCD3에 대한 가장 빠른 회합 속도 및 가장 높은 결합 친화도를 나타내었다. 153 EK, LP 및 MP3 DART 단백질은 shCD3에 대해 유사한 친화도를 가졌다. shCD3에 대한 활성%(R최대값)은 사이노 P-카데린에 대해 관찰된 것에 비해 더 우수하였다. 표 20중의 모든 DART 단백질은 CD3-1을 포함하였지만, 단 153 EK-DART는 CD3-2를 포함하였다.
[표 20]
인간 가용성 CD3에 대한 다양한 DART 형식의 결합 친화도
Figure pct00026
실시예 5
P-카데린 DART 단백질의 특징화
시차 주사 열량측정법(DSC) 분석을 사용하여 파아지 유래된 EK-DART 단백질의 열 안정성을 특징규명하였다. 표 21은 P-카데린 EK-DART 단백질이 65℃ 이상의 Tm1 전이를 갖는 유리한 열적 프로파일을 가짐을 보여준다. 강제 응집 분석은 40℃에서 P-카데린 EK-DART 단백질의 열적 스트레스에 대한 저항성을 입증한다. 표 21중의 모든 EK-DART 단백질은 CD3-2를 포함한다.
[표 21]
P-카데린 EK-DART 단백질에 대한 DSC 분석
Figure pct00027
친화도-돌연변이된 P-카데린 EK-DART 단백질의 추가적인 생리학적 특성은 표 22a에 제시된다. 이들 분자의 이론적 PI는 대략 8.5이다. 표 22a중의 EK-DART 단백질은 CD3-2를 포함한다.
[표 22a]
P-카데린 EK-DART 단백질의 생리학적 특성
Figure pct00028
표 22b는 친화도-돌연변이된 P-카데린 VF-DART 단백질의 작용 특징을 제시한다. 2가지 유형의 세포독성 T 림프구(CTL) 검정에 의한 데이터는 E-K 코일이 없는 이중특이성 이종이량체성 디아바디의 보유된 세포독성을 보여주었다. 리간드에 대한 더 높은 친화도는, EK-DART에서 볼 수 있듯이, CTL에서의 더 높은 효능에 상응한다. 표 22b중의 모든 VF-DART 단백질은 CD3-1을 포함한다.
[표 22b]
P-카데린 VF-DART 단백질의 작용 특징
Figure pct00029
표 22c는 친화도-돌연변이된 P-카데린 VF-DART 단백질의 생리학적 특징 데이터를 포함한다. VF-DART 단백질의 분석은, 65℃까지는 응집물의 상당한 증가가 검출되지 않았음을 나타낸다. 데이터로부터 VF-DART 형식이 낮은 온도에서 강제 응집 프로파일을 증진시킨 반면 Tm1에 영향을 주지 않음을 알 수 있다. LC/MS 데이터는 발현 및 정제 이후 적절한 이종이량체가 형성됨을 나타낸다. 표 22c중의 모든 VF-DART 단백질은 CD3-1을 포함한다.
[표 22c]
P-카데린 VF-DART 단백질의 생리학적 특징 데이터
Figure pct00030
실시예 6
P-카데린 LP-DART 단백질의 특징화
표 23은 모 클론 P-CAD 35 및 CD3-2에 의해 생성된 8개의 상이한 P-카데린 LP-DART 구축물(#1 내지 #8)에 대한 다양한 작용적 및 생리학적 데이터를 요약한다.
예를 들면, LP-DART #1의 제1 폴리펩티드 쇄(1)는 다음과 같이 지정된다: CD3 VL x P-CAD 35 VH-놉, 여기서 CD3 VL은 서열번호 47의 항-CD3-2 항체 VL 결합 영역을 지칭하고, P-CAD 35 VH는 서열번호 6의 항-P-카데린 항체 클론 35 VH 결합 영역을 지칭하며, "놉"은 서열번호 63의 Fc 놉 쇄를 지칭한다. LP-DART #1의 제2 폴리펩티드 쇄(2)는 다음과 같이 지정된다: P-CAD 35VL x CD3VH-홀, 여기서 P-CAD 35VL은 서열번호 5의 항-P-카데린 항체 클론 35 VL 결합 영역을 지칭하고, CD3 VH는 서열번호 46의 항-CD3-2 항체 VH 결합 영역을 지칭하며, "홀"은 서열번호 64의 Fc 홀 쇄를 지칭한다. 서열 CPPCP(서열번호 60)를 갖는 절단된 IgG1 힌지 및 적어도 하나의 글리신 잔기를 갖는 다양한 시스테인 연결기(연결기 2)를 합성하였다. LP-DART 구축물 #1 내지 #8을 모 35 EK-DART와 비교하였다.
데이터는 DART 부분 및 Fc 도메인 사이의 더 짧은 연결기(연결기 2)가 각각의 리간드에 대한 더 높은 친화도 및 CTL 검정에서의 더 높은 효능과 상관됨을 입증하였다. 이는 Fc 도메인이 DART 부분 상의 리간드 결합 자리를 간섭하는 것을 더 짧은 연결기(연결기 2)가 방지함을 제시하였다. 이러한 데이터는 또한 CD3 VL x P-CAD 35 VH-홀 및 P-CAD 35 VL x CD3 VH-놉 배향이, LP-DART #5 내지 LP-DART #8에서 제시된 바와 같이, LP-DART 생성을 위해 최적임을 제시하였다.
[표 23]
P-카데린 LP-DART 단백질의 작용적 및 생리학적 데이터
Figure pct00031
표 24는 높은 친화도의 P-카데린 VH 및 VL 결합 도메인 뿐만 아니라 높은 친화도의 항-CD3 VH 및 VL 결합 도메인을 혼입한 몇몇 P-카데린 LP-DART 단백질의 시험관내 작용적 특징을 보여준다. 데이터는 증가된 친화도가 증가된 CTL 효능과 상관되고; P-카데린 VF-DART 및 EK-DART 형식의 경우에 관찰된 상관관계와 유사함을 입증한다. 표 24중의 모든 LP-DART 단백질은 CD3-1을 포함한다. 33, 34 및 35 모 클론의 경우와 마찬가지로, 153 LP-DART는 뮤린 P-카데린에 결합하지 않았다.
[표 24]
P-카데린 LP-DART 단백질의 작용적 특징
Figure pct00032
표 25는 몇몇 P-카데린 LP-DART 단백질의 생리학적 특징을 보여준다. P-카데린 LP-DART 단백질의 DSC는 P-카데린 EK-DART 및 VF-DART 단백질에 의해 수득된 것과 유사한 Tm1 값을 보여주었다. 강제 응집 분석 결과, P-카데린 EK-DART 형식에 비해 더 낮은 온도에서의 증진된 안정성 및 임상적 mAb와 유사한 전체 프로파일이 제시되었다. LC/MS 데이터는 발현 및 정제 이후 적절한 이종이량체가 형성됨을 지시하였다. 표 25중의 모든 LP-DART 단백질은 CD3-1을 포함한다.
[표 25]
P-카데린 LP-DART 단백질의 생리학적 특징
Figure pct00033
표 26은 사이노 P-카데린 ECD 및 가용성 CD3δε로의 P-카데린 LP-DART 단백질, 153 LP-DART 및 154 LP-DART 결합에 대한 비아코어 SPR 데이터를 제공한다. 데이터는 상응하는 EK-DART의 친화도와 비교하여 각각의 리간드에 대한 친화도가 아주 약간 감소하였음을 보여준다. 표 26중의 모든 LP-DART 단백질은 CD3-1을 포함한다.
[표 26]
P-카데린 LP-DART 단백질의 사이노 P-카데린 및 가용성 CD3로의 결합 특성
Figure pct00034
실시예 7
P-카데린 발현의 정량화
A. 시험관내 연구용 루시퍼라아제를 발현하도록 조작된 암 세포주 상에서의 P-카데린 발현의 정량화
유세포분석 실험을 수행함으로써 항-P-카데린 mAb(PF-03732010) 결합을 평가하여 10개 암 세포주 패널에 대한 내생성 세포 표면 P-카데린 발현의 상대 수준을 결정하였다. 시험관내 시험을 위해 모든 종양 세포주를 조작하여 루시퍼라아제를 발현시켰다. 일정 범위의 P-카데린 수용체 발현을 나타내는 종양 세포주를 포화 FACS 결합에 대해 기재된 바와 같이 수집하였다. 샘플당 2.5 x 105개 세포를 96-웰 환저 폴리프로필렌 플레이트에 전달하였다. 세포를 1:1의 mAb 대 PE[이바이오사이언스(eBioscience)]의 비율로 공액된 5 ㎍/mL 및 10 ㎍/mL의 파이코에리트린(PE: phycoerythrin) 표지화된 항-인간 P-카데린 mAb(PF-03732010)에 의해, 또는 대조용 마우스 IgG1 mAb[바이오레겐드(Biolegend)]에 공액된 PE에 의해 30 분 동안 실온에서 염색시켰다. 세포를 세척하고 FACS 완충액 + 10 ng/mL 요오드화 프로피듐에 의해 재현탁시킨 후 FACS 디바(Diva) 소프트웨어가 구비된 LSRII를 사용하여 획득하였다. 0.5 mL의 FACS 완충액을 사용하여 퀀티브리테(QuantiBRITE) PE 비드[비디 파르민겐(BD Pharmingen]를 재구성하고 종양 세포 샘플과 동일한 전압 설정으로 LSRII를 사용하여 획득하였다. 비드 및 종양 세포 둘 다의 PE 기하 평균 형광 강도를 사용하여 퀀티브리테 PE 비드 키트에 대한 제조업체 규정 프로토콜에 따라 세포 당 결합된 PE 표지화된 항체(ABC)의 수를 계산하였다. 각각의 종양 세포주에 대하여 5 ㎍/mL 및 10 ㎍/mL의 PE 표지화된 항-P-카데린 mAb에서 퀀티브리테 검정에 의해 결정된 평균 수용체 밀도의 Log10 값을, 동일한 표적 종양 세포주에 대한 평균 시험관내 세포독성 EC50의 Log10 값에 대하여 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism) 5.0 소프트웨어를 사용하여 도표화함으로써 수용체 밀도 및 세포독성 EC50 사이의 선형 회귀 곡선 정합을 결정하였다.
광범위한 세포 표면 P-카데린 발현을, 표 27에 제시된 바와 같이, 다양한 암 유형, 예컨대 유방암, 폐암 및 결장직장암으로부터 유래된 세포주에 결합된 항-P-카데린 mAb 및 패널에 대해 관찰하였다. 대조적으로, 대조 mAb는 주목할만한 결합을 나타내지 않았다. MFI = 평균 형광 강도; ABC = 세포 당 결합된 항체.
[표 27]
루시퍼라아제 발현 암 세포주 상에서의 내생성 세포 표면 P-카데린 발현 수준
Figure pct00035
B.생체내 연구용 암 세포주 상에서의 P-카데린 발현에 대한 정량화
유세포분석 실험을 수행함으로써 항-P-카데린 mAb(화이자 PF-03732010) 결합을 평가하여 생체내 연구용 암 세포주의 패널에 대한 내생성 세포 표면 P-카데린 발현의 상대적 수준을 결정하였다. 일정 범위의 P-카데린 수용체 발현을 나타내는 종양 세포주를 포화 FACS 결합에 대해 기재된 바와 같이 수집하였다. 샘플당 2.5 x 105개 세포를 96-웰 환저 폴리프로필렌 플레이트에 전달하였다. 세포를 1:1의 mAb 대 PE(이바이오사이언스)의 비율로 공액된 5 ㎍/mL 및 10 ㎍/mL의 파이코에리트린(PE) 표지화된 항-인간 P-카데린 mAb에 의해, 또는 대조용 마우스 IgG1 mAb(바이오레겐드)에 공액된 7.5 ㎍/mL의 PE에 의해 30 분 동안 실온에서 염색시켰다. 세포를 세척하고 FACS 완충액 + 10 ng/mL 요오드화 프로피듐에 의해 재현탁시킨 후 FACS 디바 소프트웨어가 구비된 LSRII를 사용하여 획득하였다. 0.5 mL의 FACS 완충액을 사용하여 퀀티브리테 PE 비드(비디 파르민겐)를 재구성하고 종양 세포 샘플과 동일한 전압 설정으로 LSRII를 사용하여 획득하였다. 비드 및 종양 세포 둘 다의 PE 기하 평균 형광 강도를 사용하여 퀀티브리테 PE 비드 키트에 대한 제조업체 규정 프로토콜에 따라 세포 당 결합된 PE 표지화된 항체(ABC)의 수를 계산하였다.
광범위한 세포 표면 P-카데린 발현을 결장직장암 및 유방암으로부터 유래된 세포주 상에서 관찰하였고, 따라서 표 28에 제시된 바와 같이 다음과 같은 순위가 매겨졌다; HCT116 > SUM149 > SW480 > Ls174T > SW620. 대조적으로, 이소타입 대조 mAb는 어떠한 세포주에도 주목할만한 결합을 나타내지 않았다.
[표 28]
암 세포주 상에서의 내생성 세포 표면 P-카데린 발현 수준
Figure pct00036
실시예 8
시험관내 세포독성 검정
A. EK-DART 세포독성 T-림프구(CTL) 검정
강한 재조합 P-카데린/CD3 단백질 결합 뿐만 아니라 강한 세포 결합 신호(>3x 배경 또는 EC50
Figure pct00037
PF03732010-DART)를 나타내는 EK-DART 단백질을 이전에 기재된 바와 같이 T 세포 인도된 세포 살해 검정에서 선별하였다[무어(Moore) 등의 문헌 "Blood, 1 17(17): 4542-4551, 2011"]. 표 29는 본 발명의 P-카데린 EK-DART 단백질에 대한 효과적인 T 세포 인도된 세포독성을 입증한다. 30:1의 E:T 비율에서의 인간 PBMC의 존재하에, 인간 P-카데린을 과발현하도록 조작된 CHO 세포 및 P-카데린의 높은 수준을 내생적으로 발현하는 암 세포주(H1650)는 둘 다 LDH 방출 검정을 사용하여 측정될 경우 EK-DART 단백질에 의해 24 시간 항온처리한 후 효과적으로 용해되었다. 40 시간으로의 연장된 항온처리 시간은 추가로 P-카데린 EK-DART 분자에 의한 재인도된 T 세포 살해의 작용 기작에 의해 기대되는 바와 같이 세포 살해의 효능을 증가시켰다. 대조적으로, P-카데린 발현의 결핍에 기초하여 기대되는 바와 같이 모 CHO 세포주 상에서는 세포 살해가 관찰되지 않았다. 표 29중의 모든 EK-DART 단백질은 CD3-2를 포함한다.
[표 29]
P-카데린 EK-DART 단백질에 대한 T 세포 인도된 세포독성
Figure pct00038
인간 P-카데린을 발현하는 종양 세포 및 구성적으로-발현된 루시퍼라아제 리포터(reporter) 구축물에 대한 최적화된 P-카데린 EK-DART 단백질의 T 세포 인도된 세포독성이 표 30에 제시된다. 표 30중의 모든 EK-DART 단백질은 CD3-2를 포함한다.
[표 30]
P-카데린 EK-DART 단백질에 대한 T 세포 인도된 세포독성
Figure pct00039
B. LP-DART 세포독성 T-림프구(CTL) 검정
153 LP-DART의 중재된 세포 살해를 세포독성 T-림프구(CTL) 검정에 의해 평가하였다. 10:1의 효과자(T 세포) 대 표적(CHO 세포) 비율의 CHO 모 세포 및 CHO P-카데린 세포를 153 LP-DART의 증가된 농도의 존재하에 CD3+ T 세포와 함게 항온처리하였다. 세포 생존력을 48 시간 이후 측정하였고, 절반의 최대 효과 농도(EC50)는 0.41 pM인 것으로 계산되었다. 결과는 153 LP-DART가 CHO P-카데린 세포에 대한 강력한 살해를 나타내었지만, CHO 모 세포 상에서 음성 대조군 이상의 검출가능한 활성을 나타내지 않았음을 보여준다. 따라서, CTL 활성은 P-카데린 발현에 의존적이었다.
153 LP-DART의 중재된 종양 살해를 세포독성 T-림프구(CTL) 검정에 의해 평가하였다. 인간 P-카데린을 발현하는 종양 세포 및 구성적으로-발현된 루시퍼라아제 리포터 구축물에 대한 최적화된 153 LP-DART 단백질의 T 세포 인도된 세포독성을 분석하였다. CD3+ T 세포를 3:1의 효과자(T 세포) 대 표적(암 세포) 비율의 암 세포주 패널과 함께 153 LP-DART의 증가된 농도의 존재하에 항온처리하였다. 세포 생존력을 72 시간 이후 측정하고, 각각의 암 세포주에 대한 절반의 최대 효과 농도(EC50)를 표 31에 제시된 바와 같이 계산하였다. 결과는 153 LP-DART가 암 모델에서 강력한 항-종양 활성을 중재함을 입증하였다. EC50 = 절반의 최대 효과 농도; S.D. = 표준 편차; pM = 피코몰; NA = 비활성.
[표 31]
루시퍼라아제 발현 암 세포주에서의 153 LP-DART의 세포독성 T-림프구 활성
Figure pct00040
C. 세포 표면 P-카데린 발현 수준에 대한 CTL 활성의 비교
일정 범위의 P-카데린 수용체 발현을 나타내는 섹션 A로부터의 종양 세포주를 수집하고, 샘플 당 2.5 x 105개 세포를 96-웰 환저 폴리프로필렌 플레이트에 전달하였다. 세포를 1:1의 mAb 대 PE(이바이오사이언스)의 비율로 공액된 5 ㎍/mL 및 10 ㎍/mL의 파이코에리트린(PE) 표지화된 항-인간 P-카데린 mAb(화이자 PF-03732010)에 의해, 또는 대조용 마우스 IgG1 mAb(바이오레겐드)에 공액된 PE에 의해 30 분 동안 실온에서 염색시켰다. 세포를 세척하고 FACS 완충액 + 10 ng/mL 요오드화 프로피듐에 의해 재현탁시킨 후 FACS 디바 소프트웨어가 구비된 LSRII를 사용하여 획득하였다. 0.5 mL의 FACS 완충액을 사용하여 퀀티브리테 PE 비드(비디 파르민겐)를 재구성하고 종양 세포 샘플과 동일한 전압 설정으로 LSRII를 사용하여 획득하였다. 비드 및 종양 세포 둘 다의 PE 기하 평균 형광 강도를 사용하여 퀀티브리테 PE 비드 키트에 대한 제조업체 규정 프로토콜에 따라 세포 당 결합된 PE 표지화된 항체(ABC)의 수를 계산하였다.
각각의 종양 세포주에 대하여 5 ㎍/mL 및 10 ㎍/mL의 PE 표지화된 항-P-카데린 mAb에서 퀀티브리테 검정에 의해 결정된 평균 수용체 밀도의 Log10 값을, 동일한 표적 종양 세포주에 대한 평균 시험관내 세포독성 EC50의 Log10 값에 대하여 그래프패드 프리즘 5.0 소프트웨어를 사용하여 도표화함으로써 수용체 밀도 및 세포독성 EC50 사이의 선형 회귀 곡선 정합을 결정하였다. 도 8에 제시된 바와 같이, 더 낮은 EC50 및 항-P-카데린 mAb의 세포 표면으로의 증가된 결합 사이에 유의적인 관계가 존재하였다, P 값=0.0127. 이는 CTL 활성이 P-카데린 발현 수준과 상관되었음을 나타낸다.
실시예 9
인간 PBMC 재구성 이종이식 연구
강력한 T 세포 인도된 세포독성(<10 ng/mL의 EC50)을 나타내는 다양한 DART 단백질을 하기 기재된 바와 같이 이종이식 재구성 실험에서 생체내 시험하였다.
A. 인간 전혈로부터의 PBMC 및 T 세포의 단리
피콜(Ficoll) 구배 원심분리를 사용함으로써 건강한 인간 공여자로부터의 PBMC를 전혈로부터 단리하였다. 간단히, 전혈을 멸균 PBS에 의해 1:1로 희석시켰다. 35 mL의 희석된 혈액을 50 mL의 튜브중 15 mL의 피콜-파크(FICOLL-PAQUE: 상표명) 플러스(Plus) 상으로 층상화시키고, 튜브를 1400 rpm에서 20 분 동안 제동기 없이 원심분리하였다. 2개의 상 사이의 버피 코트(buffy coat) 층을 50 mL 튜브내로 수집하고, 튜브를 600 x g(1620 rpm)에서 5 분 동안 원심분리함으로서 45 mL의 PBS로 세척하였다. 상청액을 따라버리고, 세포 펠릿(pellet)을 PBS로 1회 세척하고, 생존가능한 세포 계수를 트립판 블루(Trypan Blue) 염료 배제 시험에 의해 결정하였다. PBMC를 완전 배지(RPMI 1640, 10% FBS, 2 mM 글루타민, 10 mM HEPES, 100 μ/100 μ/mL 페니실린(penicillin)/스트렙토마이신(Streptomycin)(P/S))중에서 2.5 x 106개 세포/mL의 최종 농도로 재현탁시켰다.
B. T 세포 단리 및 활성화
인간 T 세포를 로세타셉(RosettaSep) T 세포 단리 키트에 제공된 제조업체의 프로토콜에 따라서 헤파린화된 전혈로부터 단리시켰다. 정제된 T 세포를 항-CD3(OKT-3; 1 ㎍/mL) 및 항-CD28(66 ㎍/mL) 항체에 48 시간 동안 노출시킴으로써 이러한 세포를 후속적으로 활성화시켰다. 자극 이후, 세포를 10% FBS 및 1% 페니실린/스트렙토마이세스가 함유된 RPMI 1640 배지에서 IL-2(7.6 ng/mL)의 존재하에 3 주 이하 동안 성장시켰다.
C. 종양 모델
인간 T 세포 및 종양 세포(HCT116, Du145 또는 H1650)를 1:5의 비율(각각 1 x 106 및 5 x 106)로 조합하고, 200 ㎕의 멸균 염수에 현탁시키고 연구일 0(SDO)에 피하로(SC) 주사하였다. 다양한 P-카데린 EK-DART(CD3-2), LP-DART(CD3-1) 또는 대조군 DART(CD3-2) 단백질을 대조군과 함께 정맥내로(IV) 꼬리 정맥 주사를 통해 100 ㎕로 SDO, 1, 2, 및 3일째 투여하였다. 각각의 치료군은 8 마리의 동물을 포함하였다.
HCT116 종양 모델에서의 P-CAD 177 EK-DART: P-CAD 177 EK-DART를 0.5, 0.2, 0.1 또는 0.05 mg/kg의 투약량으로 4개의 치료군에 투여하고, 비히클 대조군(이식된 HCT116 세포 단독 또는 + T 세포)을 하나의 치료군에 투여하였다(0 mg/kg).
HCT116 종양 모델에서의 P-CAD 153 EK-DART: P-CAD 153 EK-DART를 0.5, 0.2, 0.1 또는 0.05 mg/kg의 투약량으로 4개의 치료군에 투여하고, 비히클 대조군(이식된 HCT116 세포 단독 또는 + T 세포)을 하나의 치료군에 투여하였다(0 mg/kg).
HCT116 종양 모델에서의 P-CAD 154 EK-DART: P-CAD 154 EK-DART를 0.5, 0.2, 0.1 또는 0.05 mg/kg의 투약량으로 4개의 치료군에 투여하고, 비히클 대조군(이식된 HCT116 세포 단독 또는 + T 세포)을 하나의 치료군에 투여하였다(0 mg/kg).
HCT116 종양 모델에서의 P-CAD 35 EK-DART: P-CAD 35 EK-DART를 0.5, 0.2, 0.1 또는 0.05 mg/kg의 투약량으로 4개의 치료군에 투여하고, 비히클 대조군(이식된 HCT116 세포 단독 또는 + T 세포)을 하나의 치료군에 투여하였다(0 mg/kg).
HCT116 종양 모델에서의 P-CAD 153 LP-DART: 치료군에게 P-CAD 153 LP-DART를 0.5, 0.2, 0.1 또는 0.05 mg/kg의 투약량으로, 또는 비히클 대조군(이식된 HCT116 세포 단독 또는 + T 세포)을 투여하였다.
HCT116 종양 모델에서의 P-CAD 153 LP-DART: 치료군에게 P-CAD 153 LP-DART를 100, 10, 1, 0.1, 또는 0.01 ㎍/kg의 투약량으로, 또는 비히클 대조군(이식된 HCT116 세포 단독), 비히클 대조군(이식된 HCT116 세포 + T 세포) 또는 4420-hXR32 LP-DART(100 ㎍/kg) 대조군을 투여하였다.
Du145 종양 모델에서의 P-CAD 153 LP-DART: 치료군에게 P-CAD 153 LP-DART를 100, 10, 1, 0.1, 또는 0.01 ㎍/kg의 투약량으로 또는 비히클 대조군(이식된 Du145 세포 단독), 비히클 대조군(이식된 HCT116 세포 + T 세포) 또는 4420-hXR32 LP-DART(100 ㎍/kg) 대조군을 투여하였다.
H1650 종양 모델에서의 P-CAD 153 LP-DART: 치료군에게 P-CAD 153 LP-DART를 100, 10, 1, 0.1, 또는 0.01 ㎍/kg의 투약량으로, 또는 비히클 대조군(이식된 H1650 세포 단독), 비히클 대조군(이식된 H1650 세포 + T 세포) 또는 4420-hXR32 LP-DART(100 ㎍/kg) 대조군을 투여하였다.
C. 데이터 수집 및 통계학적 분석
동물 체중: 종양 세포 주사의 시간에 시작하여 연구가 종료될 때까지 개별 동물 체중을 주 2회 기록하였다.
빈사 상태/사망률: 일반적인 빈사 상태 및 1일 사망률에 대해 동물을 주 2회 관찰하였다. 동물의 사망은 전체적 관찰 및 체중 감소를 비롯한 인자에 기초하여 약물-관련되거나 기술적인 것으로서 평가되었고; 동물 사망을 매일 기록하였다.
종양 부피: 종양 이식의 1 주 이내에 시작하여 연구가 종료될 때까지 연속적으로 개별적인 종양 부피를 주 2회 기록하였다.
종양 부피(㎣) = [길이(mm) x 폭2] /2
기술적 또는 약물-관련된 사망을 겪은 동물을 데이터 계산에서 검열삭제하였다.
종양 성장 저해: 하기 수학식을 사용하여 종양 성장 저해(TGI) 값을 치료된 동물이 포함된 각각의 군에 대해 계산하였다:
1 - {[평균 최종 종양 부피(치료됨) - 평균 초기 종양 부피(치료됨)]/[평균 최종 종양 부피(대조군) - 평균 초기 종양 부피(대조군)]} x 100
부분적 반응 또는 완전 반응을 겪은 동물, 또는 기술적 또는 약물-관련된 사망을 겪은 동물을 TGI 계산에서 검열삭제하였다. 화합물 활성에 대한 미국 국립 암 연구소(National Cancer Institute) 기준은 TGI > 58%이다[코르베트(Corbett) 등의 문헌 "(2004) Anticancer Drug Development Guide; Totowa, NJ: Humana 99-123'].
부분적/완전한 종양 반응: 1 일째 1 ㎣ 미만으로 측정된 종양을 갖는 개개의 마우스를 부분적 반응(PR)을 갖는 것으로 분류하고 종양 퇴행%(%TR) 값을 하기 수학식을 사용하여 결정하였다:
1 - [최종 종양 부피(㎣)/초기 종양 부피(㎣)] x 100%
감지가능한 종양이 없는 개개의 마우스를 완전 반응(CR)을 겪은 것으로 분류하였다.
종양 부피 통계학: 종양 부피를 비교하는 통계학적 분석을 치료군 및 대조군 사이에서 실행하였다. 이러한 분석을 위해, 본페로니 포스트-테스트(Bonferroni post-test)가 수반되는 편차에 대한 투-웨이(two-way) 분석을 이용하였다. 모든 분석을 그래프패드 프리즘(등록상표) 소프트웨어(버전 5.02)에 의해 수행하였다. 기술적 또는 약물-관련된 사망을 겪은 개개의 동물로부터의 체중 및 종양 데이터를 분석으로부터 검열삭제하였다. 그러나, 부분적 또는 완전 반응을 보고하는 동물로부터의 종양 데이터는 이들 계산에 포함시켰다.
D. HCT116 종양 모델 결과
세포주 HCT116을 활성화된 T 세포와 예비-혼합하고, 상기 기재된 바와 같이 연구 0 일(SDO)째 NOD/SCID 감마 넉아웃(knockout) 마우스(N = 8 마리/군)에 피하(SC) 이식하였다. 종양 세포/T 세포 혼합물을 이식한 동일한 날짜에 다양한 P-카데린 EK-DART, LP-DART 또는 대조 DART 단백질에 의한 치료를 개시하고[(SDO)], 총 4일 동안의 매일의 주사를 위해 추가의 3일 동안 매일 주사를 후속적으로 진행하였다. 동물들을 P-카데린 EK-DART, LP-DART 또는 대조 DART 단백질에 의해 4가지 투약량 수준(0.5, 0.2, 0.1, 및 0.05 mg/kg)으로 치료하였다. 결과는 도 9 내지 14에 제시된다.
비히클 치료된 군(HCT116 세포 단독 또는 + T 세포)에서의 HCT116 종양은 생체내에서 비교적 공격적인 성장 프로파일을 나타내었다. 연구 20 일(SD20)째, 비히클-치료된 군에서의 종양의 평균 부피는 대략 125 ㎣이었고, 연구 35 일(SD35)째, 종양은 대략 450 ㎣의 평균 부피에 도달하였다. 연구 45 일(SD45)째 실험의 종료시, 종양은 대략 750 ㎣의 평균 부피에 도달하였다. HCT116 종양의 성장은 시험된 대부분의 P-카데린 DART 단백질의 경우 모든 투약량 수준에서 유의적으로 저해되었다. SD45에서 실험의 종료시, 종양의 평균 부피는 모든 치료의 경우 대략 100 내지 0 ㎣의 범위였지만, 단 177 EK-DART는 대략 500 내지 100 ㎣의 범위였다.
E. Du145 결과
세포주 Du145를 활성화된 T 세포와 예비-혼합하고, 상기 상세화된 바와 같이SDO에서 NOD/SCID 감마 넉아웃 마우스(N = 8 마리/군)에 SC 이식하였다. 종양 세포/T 세포 혼합물을 이식한 동일한 날짜에 153 LP-DART에 의한 치료를 개시하고[(SDO)], 총 4일 동안의 매일의 주사를 위해 추가의 3일 동안 매일 주사를 후속적으로 진행하였다. 동물들을 153 LP-DART에 의해 5가지 투약량 수준(100, 10, 1, 0.1, 및 0.01 ㎍/kg)으로 치료하였다. 결과는 도 15에 제시된다.
비히클 치료된 군(Du145 세포 단독 또는 + T 세포)에서의 Du145 종양은 생체내에서 비교적 공격적인 성장 프로파일을 나타내었다. Du145 종양의 성장은 153 LP-DART의 100, 10 및 1 ㎍/kg의 투약량 수준에서 유의적으로 저해되었고, 실험 종료시(SD74) 종양의 평균 부피는 0 ㎣이었다. 153 LP-DART의 0.1 ㎍/kg 투약량 수준에서, Du145 종양의 성장은 유의적으로 저해되었고, 실험 종료시(SD74) 종양의 평균 부피는 대략 500 ㎣이었다.
F. H1650 결과
세포주 H1650을 활성화된 T 세포와 예비-혼합하고, 상기 기재된 바와 같이SDO에서 NOD/SCID 감마 넉아웃 마우스(N = 8 마리/군)에 SC 이식하였다. 종양 세포/T 세포 혼합물을 이식한 동일한 날짜에 153 LP-DART에 의한 치료를 개시하고[(SDO)], 총 4일 동안의 매일의 주사를 위해 추가의 3일 동안 매일 주사를 후속적으로 진행하였다. 동물들을 153 LP-DART에 의해 5가지 투약량 수준(100, 10, 1, 0.1, 및 0.01 ㎍/kg)으로 치료하였다. 결과는 도 16에 제시된다.
비히클 치료된 군(H1650 종양 세포 단독 또는 + T 세포)에서의 H1650 종양은 생체내에서 비교적 공격적인 성장 프로파일을 나타내었다. H1650 종양의 성장은 153 LP-DART의 100, 10 및 1 ㎍/kg의 투약량 수준에서 유의적으로 저해되었고, 실험 종료시(SD49) 종양의 평균 부피는 50 ㎣이었다. 153 LP-DART의 0.1 ㎍/kg 투약량 수준에서, H1650 종양의 성장은 유의적으로 저해되었고, 실험 종료시(SD49) 종양의 평균 부피는 대략 400 ㎣이었다.
다양한 EK-DART, LP-DART 및 대조 DART 단백질은, 투약이 이식일에 개시되어 3일 또는 그 이상의 연속일 동안 지속된 경우 윈(Winn) 모델과 관련하여, NOD/SCID 마우스에 SC 이식된 HCT116, Du145 및 H1650 종양의 성장을 효과적으로 저해하였다. 미국 국립 암 연구소에 의해 확립된 기준에 근거하여, 0.1 mg/kg 이상의 투약량 수준(TGI >58)에서의 다양한 DART 단백질은 3가지 모델에서 활성인 것으로 고려된다.
실시예 10
확립된 종양 인간 PBMC 이식된 모델
정량적 유세포 분석에 기초하여 높은(HCT116), 중간의(SW480), 낮은(Ls174T) 및 음성의(SW620) P-카데린 발현으로 분류된 인간 결장직장암의 4가지 별도의 이종이식 종양 모델을 확립하였다. HCT116은 세포 표면 P-카데린 발현의 가장 높은 상대 수준을 나타내고(43,801 ABC, 표 28), SW480은 세포 표면 P-카데린 발현의 비교적 중간 수준을 나타내며(12,665 ABC, 표 28), Ls174T는 세포 표면 P-카데린 발현의 비교적 낮은 수준을 나타낸다(4,160 ABC, 표 28).
NOD scid 감마(NSG) 동물에게 오른쪽 측복부내로 피하적으로 5 x 106개의HCT116, 5 x 106개의 SW480, 2 x 106개의 Ls174T 또는 5 x 106개의 SW620 종양 세포를 0 일째 이식하였다. 기대되는 종양 성장에 기초하여 무작위화하기 전 7 일째(5 일), 동물에게 5 x 106개의 신선하게 단리된 인간 혈액 말초 단핵 세포(PBMC)를 PBS중 0.2 mL의 세포 현탁액의 복강내 주사를 통해 접종하였다. PBMC 이식 후 1 주일(12 일)째 종양 부피를 모든 연구 동물에 대해 측정하였고, 혈액 샘플을 유세포분석을 위해 수집하였다. 각각의 샘플로부터의 적혈구 세포를 BD 파름라이세(Pharmlyse) 용액(비디 파르민겐)으로 용해시키고 생성된 세포 펠릿을 인간 CD3, 인간 CD4, 및 인간 CD8에 대해 염색시키고, FACS 디바 소프트웨어가 구비된 비디 파르민겐 LSRII를 사용하여 유세포분석에 의해 분석하였다. 정방향 산란 대 측부 산란 게이팅(gating)에 의해 결정된 총 림프구의 퍼센트로서 인간 CD3+ 세포를 각각의 동물에 대해 확립하였다. 디지털 베르니에르 캘리퍼(Vernier caliper)[미투토요 아메리카(Mitutoyo America), 미국 일리노이주 오로라 소재]를 사용하여 종양 측정값을 수집하고, 변형된 타원체 식 ½(폭2 x 길이)를 사용하여 부피를 계산하였다.
2개의 매개변수 무작위화를 사용하여 종양 부피 및 인간 CD3+ 세포 이식값 사이에 동일한 가중치를 제공하는 군당 n=10 마리 동물의 치료군을 확립하였다. 동물에게 정맥내로 0.05 mg/kg 또는 0.5 mg/kg의 153 LP-DART(CD3-1), 0.5 mg/kg의 음성 대조 이중특이성(FITC 및 CD3 엡실론에 대한 이종이량체성 디아바디 Fc 융합 단백질) 또는 비히클로서의 DPBS를 각각의 동물의 측부 꼬리 정맥내에 투약하였다. 격주로 종양 측정값을 수집하여, 이식물 대 숙주 질병의 징후(예를 들어 감소된 체중, 탈모, 등을 구부린 자세)를 연속적으로 모니터링하면서, 대조군에 대한 종양 성장 저해를 평가하였다.
시간에 대해 도표화된 종양 부피(㎣)를 나타내는 종양 성장 도표가 도 17a 내지 17d에 제시되고, 상응하는 데이터 표는 아래의 표 32 내지 35에 제시된다. 이러한 데이터는 HCT116(높음), SW480(중간) 종양 모델의 경우 가장 높은 투약량(0.5 mg/kg)에서 종양 퇴행을, Ls174T(낮음) 종양 모델의 경우 가장 높은 투약량(0.5 mg/kg)에서 중간 정도의 효능을 초래하였음을 입증한다. 음성 대조 이중특이성 물질은 비히클 치료된 마우스와 비교하여 종양 저해에 어떠한 증가도 나타내지 않았다. HCT116 종양 모델에서, 도 17a는 153 LP-DART의 0.05 및 0.5 mg/kg 투약량에서 각각 61.9% 및 105.1%의 종양 성장 저해(TGI)를 보여준다. 도 17a 내지 17d는 추가로 확립된 이종이식 종양의 종양 성장 저해가 P-카데린 수준 발현에 의존적이었음을 입증한다.
[표 32]
HCT116 종양 모델에서의 종양 성장 저해
Figure pct00041
[표 33]
SW480 종양 모델에서의 종양 성장 저해
Figure pct00042
[표 34]
Ls174T 종양 모델에서의 종양 성장 저해
Figure pct00043
[표 35]
SW620의 이식된 인간 T 세포에 의한 종양 성장 저해
Figure pct00044
도 17e는 비히클 대조군에 대한 던네트(Dunnet)의 다중 비교 시험에 의한 HCT116 종양 모델의 이식 후 25 일째 수집된 종양 부피(㎣)에 대한 원 웨이(one way) 아노바 분석을 제시한다. 데이터는 0.05 mg/kg 및 0.5 mg/kg의 153 LP-DART가 투약된 군 둘 다에서 유의적인 종양 성장 저해(*p < 0.05)를 입증한다.
P-카데린 153 LP-DART 치료된 HCT116 종양을 갖는 NSG 동물에 대한 약물동력학적 분석 결과는 표 36에 제시된다. 동물에게 0.05 또는 0.5 mg/kg의 153 LP-DART의 단일 IV 투약량을 투여하고, 투약후 지시된 시점에 n=3 마리 군에서 안락사시켜 혈청 및 종양을 수집하였다. LP-DART에 대한 검정을 표준 곡선에 대해 샌드위치형 ELISA에 의해 수행하였다. 153 LP-DART는 연장된 혈청 및 종양 반감기를 나타내었다.
[표 36]
153 LP-DART 치료된 동물에 대한 약물동력학적 분석
Figure pct00045
실시예 11
확립된 종양 인간 T 세포 양자 전달 모델
HCT116(결장) 및 SUM149(유방)의 인간 T 세포의 양자 전달에 의한 종양 성장 저해를 분석하였다. HCT116은 세포 표면 P-카데린 발현의 가장 높은 상대 수준을 나타내고(43,801 ABC, 표 28) SUM149는 세포 표면 P-카데린 발현의 비교적 중간 수준을 나타낸다(15,426 ABC, 표 28). T 세포를 2X 글루타맥스(GlutaMax)-1, 1% 펜스트렙(PenStrep), 및 20 ng/mL의 재조합 인간 IL-2[라이프 테크놀로지스(Life Technologies), 미국 캘리포니아주 칼스바드 소재]가 보충된 옵트마이저(OpTmizer) CTS T 세포 팽창 무혈청 배지(Cell Expansion Serum-Free Media)에 의해 0.5 x 106개 세포/mL로 재현탁시켰다. 이어서 다이나비즈(Dynabeads) 인간 T-익스팬더(Expander) CD3/CD28 자성 비드(라이프 테크놀로지스)를 T 세포에 1 x 10e6개 비드/mL(2개 비드/세포)로 첨가하고, 세포를 제조업체의 프로토콜에 따라 1 주일 동안 배양하였다. 수확시, 비드를 자석으로 제거하고, 생체내 접종을 위해 세포를 DPBS에 1 x 107개 세포/mL로 재현탁시켰다.
이종이식 연구를 위해, NSG 마우스에 5 x 106개 HCT116 세포를 측복부에, 또는 5 x 106개 SUM149 세포를 유방 지방체에 총 0.2 mL의 주사 부피로 접종하였다. HCT116 세포를 DPBS에 현탁시킨 반면, SUM149 세포를 성장 배지에 현탁시키고 1:1로 마트리겔 베이스먼트 멤브레인 매트릭스(Matrigel Basement Membrane Matrix)(비디 바이오사이언시즈, 미국 캘리포니아주 산 호세 소재)와 혼합하였다.
디지털 베르니에르 캘리퍼(미투토요 아메리카, 미국 일리노이주 오로라 소재)를 사용하여 종양 측정값을 수집하고, 변형된 타원체 식 ½(폭2 x 길이)를 사용하여 부피를 계산하였다. 일단 종양이 성장 상에 도달되면 마우스를 무작위화하여 초기 투약량을 제공하고, 2 x 106개의 배양된 T 세포/마우스를 다음 날 접종하였다. 마우스에게 0.2 mL의 일시정맥 주사를 매주 5회 이하로 투약하였고, 모든 화합물 및 T 세포 투여는 각각의 동물의 측방향 꼬리 정맥을 통한 정맥내 투여하였다. 이식물 대 숙주 질병의 징후(예를 들어 감소된 체중, 탈모, 등을 구부린 자세)를 연속적으로 모니터링하면서, 격주로 종양 측정값을 수집하였다.
HCT116(결장)의 인간 T 세포의 양자 전달에 의한 종양 성장 저해는 도 18a(표 37)에 제시되고 SUM149(유방)은 도 18b(표 38)에 제시된다. 153 LP-DART(CD3-1)를 매주 투여한 결과 가장 높은 투약량(0.5 mg/kg)에서는 종양 퇴행을, 가장 낮은 투약량(0.05 mg/kg)에서는 궁극적으로 재발되는 종양 정체를 갖는 투약량 반응을 초래하였다. 음성적 대조 LP-DART의 투여는 비히클 처리된 마우스와 비교하여 종양 저해에 있어서 어떠한 증가도 나타내지 않았다. 실시예 10의 상기 이식된 T 세포 모델과 비교하여, 양자 T 세포 전달 모델은 마우스가 GVHD에 걸리기 전에 연장된 153 LP-DART 투약을 허용한다(각각 2 주 및 ≥ 6 주).
[표 37]
HCT116의 인간 T 세포의 양자 전달에 의한 종양 성장 저해
Figure pct00046
[표 38]
SUM149의 인간 T 세포의 양자 전달에 의한 종양 성장 저해
Figure pct00047
실시예 12
P-카데린 양성 환자 유래된 이종이식(PDX)
P-카데린 양성 PDX의 생체내 종양 성장 저해를 분석하였다. P-카데린 양성 환자 유래된 결장직장 종양 이종이식, PDX-CRX-11260을 FFPE 종양 샘플을 항-P-카데린 항체로 양성으로 염색함으로써 식별하였다. PDX-CRX-11260 종양 조직을 NSG 동물에게 이식하고, 대략 100 ㎣로 성장시켰다. 동물을 n=7 마리의 투약 군으로 무작위화하고, 비히클, 0.05 mg/kg의 153 LP-DART(CD3-1), 또는 0.5 mg/kg의 153 LP-DART(CD3-1)를 매주 투약하였다. 초기 투약 후 1 일에 모든 동물에게 2 x 106개의 시험관내 팽창된 인간 T 세포를 공급하였다.
PDX-CRX-11260의 종양 성장 저해를 도 19(표 39)에 제시한다. 0.05 mg/kg의 153 LP-DART 투약 군의 경우 7 마리 동물 중 3 마리가 완전 반응을 나타내었고, 0.5 mg/kg의 153 LP-DART 투약 군의 경우 7 마리의 동물중 7마리가 완전 반응을 나타내었다. 데이터는 153 LP-DART가 P-카데린 양성 결장 종양 PDX의 강력한 종양 성장 저해를 나타냄을 입증한다.
[표 39]
P-카데린 양성 PDX-CRX-11260의 종양 성장 저해
Figure pct00048
실시예 13
종양 침윤성 림프구(TIL)의 투약량 의존성 축적
인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)가 이식되고 상이한 수준의 153 LP-DART(CD3-1)가 투약된, HCT116 종양을 갖는 마우스(n=3)를 투약 후 6 일째 안락사시켜 종양 침윤성 인간 CD3+ 림프구를 평가하였다. 종양 샘플을 인간 종양 세포 해리 완충액이 함유된 젠틀(gentle)MACS C 튜브[밀테니 바이오텍(Miltenyi Biotech)]내로 수집하고, 젠틀MACS 조직 해리기(밀테니 바이오텍)에 의해 연한 인간 종양을 위하여 제조업체 제안된 프로토콜에 따라 단일 세포 현탁액으로 가공하였다. 이어서 세포 현탁액을 2 mM EDTA가 함유된 DPBS로 세척하고 생존가능한 세포 계수를 트립판 블루 배제 시험 및 혈구계산판에 의해 결정하였다. 각각의 샘플로부터 1 x 106개의 살아있는 세포를 2% FBS 및 0.02% 아지드화 나트륨이 함유된 PBS내로 수집하고, CD3 FITC(비디 파르민겐)에 의해 30 분 동안 얼음 상에서 염색시켰다. 세척 후, 요오드화 프로피듐을 각각의 샘플에 첨가한 직후 FACS 디바 소프트웨어가 구비된 LSRII(비디 파르민겐)에 의해 분석하였다.
데이터를 플로우조(FlowJo) 소프트웨어[트리스타(Treestar)]에 의해 분석하고, 총 살아있는 세포중 CD3+ 세포 퍼센트를, 그래프패드 프리즘 5.0 소프트웨어에 의해 처리되지 않은 대조 샘플에 대한 던네트의 다중 비교 시험에 의해 원 웨이 아노바를 통해 결정된 유의성을 갖고, 분류된 도표로 도표화하였다. 도 20 및 표 40에 제시된 결과는 종양 침윤성 림프구(TIL)에서의 투약량 의존성 증가를 입증한다. 추가로, 종양 조직의 인간 CD3의 면역조직화학(IHC) 염색(제시되지 않음)은, P-카데린 양성 종양 및 인간 T 세포를 갖는 동물의 153 LP-DART 치료가 CD3+ 림프구의 종양내 축적을 초래하였음을 입증하였다.
[표 40]
종양 침윤성 림프구(TIL)의 투약량 의존성 축적
Figure pct00049
실시예 14
FMT 영상촬영에 의한 P-카데린 LP-DART의 생체내 분포 및 종양 표적화
피하 HCT116 이종이식이 확립된 NSG 또는 무흉선 누드 마우스(athymic nude mice)를 사용하였다. T 세포의 이식을 포함한 연구는 건강한 인간 지원자로부터 단리된 T 세포를 공급받았다. 종양이 300 내지 500 ㎣에 도달되었을 때 생체내 분포 연구를 개시하였다. P-카데린 153 LP-DART(CD3-1) 또는 음성 대조-DART(비-표적화된 도메인 x CD3 결합 도메인)를 근적외선 형광단 비보태그(VivoTag)680XL(VT680)과 1 내지 2.75의 이중특이성 표지에 대한 형광단의 비율로 공액시켜, P-카데린 153 LP-DART-비보태그680XL 및 대조-LP-DART-비보태그680XL를 생성하였다.
표지화 효능을 분광광도계로 결정하였다. 수송(trafficking) 연구에서 사용되는 T 세포를 셀뷰(CellVue)815(CV815)에 의해 표지화하였다. 세포 표면 P-카데린 발현 및 P-카데린 153 LP-DART 결합을 유세포분석에 의해 결정하였다. T 세포 활성을 세포독성 T-림프구(CTL) 검정으로 측정하였다. FMT 영상촬영을 표지화된 이중특이성 물질의 주사 후 종방향으로 수행하였다. 데이터를 트루퀀트(TrueQuant) 소프트웨어에 의해 분석하였다. 혈장 및 조직을, ELISA에 의해 PK 분석을 위해 다양한 시점에서 수집하였다.
A. 표지화된 생물 분자의 시험관내 특징화
VT680 표지화가 분자 특성에 영향을 미치는지의 여부를 결정하기 위해, 품질 제어 연구를 수행하였다: FACS 분석에 의한 세포로의 시험관내 결합 및 분자 활성에 대한 세포독성 검정. 특성을 VT680 표지화되고 표지화되지 않은 대조 LP-DART 및 P-카데린 153 LP-DART에 대해 비교하였다. CV815로 표지화된 T 세포의 경우, T 세포 팽창 및 또한 효과자 세포에 대한 세포독성을 평가하였다. 표 41은 생체내 분포 연구를 위해 사용된 분자를 제시한다. DOL: 표지화 정도.
[표 41]
비보태그680XL 표지화된 분자
Figure pct00050
결합 능력을 평가하기 위한 직접적 가용성 P-카데린 ELISA: 도 21a는 P-카데린 153 LP-DART로의 VT680 표지화가 P-카데린 결합에 최소한의 영향을 주었음을 입증한다. 최소한의 감소는 DOL 의존성이었다. 대조-LP-DART(표지화되거나 표지화되지 않음)는 P-카데린에 결합하지 않았다.
결합 능력을 평가하기 위한 직접적 가용성 CD3 ELISA: 도 21b는 P-카데린 153 LP-DART로의 VT680 표지화가 CD3 엡실론/델타 단백질로의 결합을 유의적으로 감소시켰음을 입증한다. 결합의 감소는 DOL 의존성이었다. 대조 LP-DART는 P-카데린 153 LP-DART에 비해 더 낮은 결합을 가졌다. VT680 표지화는 CD3 엡실론/델타로의 결합을 유의적으로 감소시켰다.
루시퍼라아제를 발현하는 HCT116 세포를, 24 시간 검정시 10:1의 효과자 대 표적 비에서 P-카데린 153 LP-DART의 적정에 대하여 정제된 인간 T 림프구 "효과자" 세포에 의한 시험관내 세포독성을 위한 "표적" 세포로서 이용하였다. 도 21c에 제시된 세포독성 도표는 P-카데린 153 LP-DART가 VT680에 의해 2.0 DOL에서 표지화될 경우 세포독성이 감소하였음을 보여준다.
세포 표지화 염료에 의한 표지화 이후의 세포 생존력 및 T 세포의 팽창에 대한 비교: 공여자로부터 단리된 인간 T 세포를 형광 세포 추적 염료 - 비보트랙(VivoTrack)680 및 셀뷰815(CV815)로 표지화하였다. 도 21d는 비보트랙680 또는 CV815중 어느 것도 T 세포의 세포 생존력 또는 팽창에 영향을 미치지 않음을 입증한다.
B. 생체내 FMT 영상촬영 및 PK 분석 데이터
HCT116 이종이식 모델에서의 P-카데린 153 LP-DART의 생체내 분포 및 표적화를 종방향의 FMT 영상촬영에 의해 분석하였다. 50% 마트리겔(matrigel)중 1백만개의 HCT116 세포를 암컷 nu/nu 마우스(8 주령)의 SQ 측복부내로 주사하였다. 종양을 약 300 내지 500 ㎣의 크기로 성장시켰다. 동물에게 1 나노몰의 VT680에 해당하는 탐침자(VT680 표지화된 생물 분자)를 주사하였다(표 41). 생체내 FMT 영상촬영(전신)을 주사 후 5 분, 24 시간, 48 시간, 96 시간 및 240 시간째 종방향으로 수행하였다. 혈액(혈장) 샘플을 각각의 시점에 수집하였다. 간헐적 시점 및 연구의 종료시, 동물을 안락사시키고 PBS/염수로 관류시켜 혈액을 혈관 구획으로부터 제거하였다. 조직(종양, 간, 비장, 신장, 폐 및 뇌)을 생체외에서 영상촬영하였다. FMT 데이터를 트루퀀트 소프트웨어에 의해 분석하였다. 생체외 영상촬영 이후, 조직을 후속적인 PK 분석을 위해 순간 동결시켰다. 혈장 및 조직 샘플의 PK 분석을 ELISA에 의해 수행하였다. T 세포 이식을 생체내 분포 연구에서는 수행하지 않았다.
FMT 영상촬영은, P-카데린 153 LP-DART가 HCT116 종양을 특이적으로 표적화함을 보여주었다. 비-침습성 생체내 FMT 영상촬영은, 대조 LP-DART에 비해 종양에서 높은 수준의 P-카데린 153 LP-DART 축적을 일으킴을 밝혀내었다(영상은 제시되지 않음). 생체내 동력학은, 도 22a에 제시된 바와 같이, 종양중의 피크 축적이 주사 후 약 96 시간임을 밝혀내었다. 다양한 조직, 종양 및 혈관 구획으로부터의 축적 및 소거의 조합을 나타내는 전신 분포 및 소거 데이터는, 도 22b에 제시된 바와 같이, P-카데린 153 LP-DART 및 대조-LP-DART 사이에 전체적으로 유의적인 차이가 없음을 보여주었다.
도 22c 및 22d에 제시된 바와 같이, 48, 96 및 240 시간에서의 종양 및 선택된 조직의 생체외 분석은 P-카데린 153 LP-DART가 조직내로 침투하였음을 입증하였다. 종양은 모든 시점에서 대조-LP-DART와 비교하여 20 내지 30배 더 높은 P-카데린 153 LP-DART의 축적을 나타내었다. 주사후 240 시간째, 여전히 측정가능한 P-카데린 153 LP-DART가 종양에서 검출되었다. 다양한 기관에서의 축적의 생체외 비교[간(도 22d), 신장, 비장, 폐 및 뇌(데이터는 제시되지 않음)]는 P-카데린 153 LP-DART 또는 음성 대조 DART 사이에 차이가 없음을 보여주었다.
약물동력학적 방법에 의한 FMT 데이터의 비교를 수행하여 FMT 영상촬영의 프로파일을 확인하였다. FMT 연구로부터의 샘플을 일상적인 약물동력학적 방법, ELISA에 의해 평가하였다. 종양 및 간으로부터의 PK 데이터는 상기 기재된 FMT 영상촬영 데이터와 유사한 경향을 나타내었다. 도 23a에 제시된 바와 같이, 혈장 프로파일은 대조-LP-DART와 비교하여 P-Cad-LP-DART의 약 2 내지 3배 더 긴 혈장 노출을 보여주었다. 도 23b에 제시된 바와 같이, 생체외 종양 샘플의 평가는 P-Cad-LP-DART의 축적에서 약 7배 증가를 보여주었다. 도 23c에 제시된 바와 같이, 생체외 간 샘플의 평가는 48 시간에서의 증가된 축적을 보여주었지만, 96 및 240 시간에서는 유의적인 차이가 없었다.
C. 이식된 T 세포의 세포 추적
FMT 영상촬영을 사용하여 HCT116 모델에서 이식된 T 세포의 세포 추적을 수행하였다. 50% 마트리겔중 1백만개의 HCT116 세포를 암컷 NSG 마우스(8 주령)의 SQ 측복부내로 주사하였다. 종양이 약 300 내지 500 ㎣의 크기로 성장되었을 때, P-카데린 153 LP-DART(VT680에 의해 표지화되거나 표지화되지 않음)를 SQ 경로를 통해 주사하였다. 약물을 주사한지 24 시간 후, CV815로 표지화된 5백만개의 T 세포를 IV 경로를 통해 주사하였다. 세포 이식후 FMT 영상촬영을 종방향으로 수행하였다. 153 LP-DART-VT680 및 T 세포-CV815 군에 대해 순차적인 영상촬영을 680 nm 및 800 nm 레이저를 사용하여 수행하였다.
셀뷰 표지화된 T 세포에 의한 세포 추적 연구는 종양에서 T 세포 및 P-카데린 153 LP-DART의 공동-편재화를 보여주었다. 도 24a에 제시된 바와 같이, CV815 표지화되고 표지화되지 않은 T 세포의 T 세포 활성에 대한 평가는, 형광단에 의한 T 세포의 표지화가 T 세포의 세포독성 능력에 영향을 미치지 않았음을 입증한다(시험관내). 도 24b에 제시된 바와 같이, 종양에서 형광단 표지화된 T 세포의 FMT 영상촬영에 의한 생체내 추적 동력학은 P-카데린 153 LP-DART 주사된 군에서 T 세포 추적이 유의적으로 증가하였고 세포 이식후 7 일째 축적됨을 입증한다.
FMT 영상(제시되지 않음)은 세포 이식 후 5 일 및 7 일째의 비보태그680 표지화된 P-카데린 153 LP-DART의 표적화 및 종양에 대한 CV815 표지화된 T 세포의 추적을 보여주었다. 이러한 군에게 CV815 표지화된 T 세포 + 비보태그680으로 표지화된 P-카데린 153 LP-DART를 제공하였다. 1.0의 DOL을 갖는 P-카데린 153 LP-DART-VT680을 사용하였다. 1.0의 DOL은 P-카데린 및 CD3 단백질에 대한 결합에 최소한으로 영향을 주는 것으로 보였다.
실시예 15
결정화 및 구조 결정
결정화 시험을 위해, 도 25에 제시된 정제된 DART 단백질을 이용하였다. 특히, DART 단백질(클론 35 P-CAD VL/VH 결합 도메인 및 클론 CD3 결합 도메인 포함)을, 결정학을 위해 이종이량체 촉진 도메인이 없고 P-CAD 35 VH 도메인에 공유적으로 연결된 "6XHIS"로 지정된 C-말단 His 태그 HHHHHH(서열번호 78) 및 CD3 VH 도메인에 공유적으로 연결된 "FLAG"로 지정된 C-말단 FLAG 서열 GGCGGDYKDDDDK(서열번호 79)를 갖도록 고안하였다(이후 본원에서 "결정학 35 DART"로 지정됨).
정제된 결정학 35 DART를 TBS가 함유된 단백질 용액에 9.6 mg/mL로 농축시켰다. 결정을 15% PEG 8K 및 0.5 M 황산 리튬이 포함된 조건으로부터 현적 증기-확산(hanging-drop vapor-diffusion) 방법에 의해 수득하였다. 6각형 판-유사 결정은 세포 매개변수 a=b=142.81 Å; c=62.69 Å을 갖는 삼각형 이격기 P321과 일치하는 대칭을 갖고 결정학적 비대칭 단위중 하나의 결정학 35 DART 분자를 가졌다. 25% 에틸렌 글리콜이 함유된 저장소 용액을 사용하여 결정을 동결-보호시키고, 액체 질소에서 순간 동결시켰다. 2.0 Å 해상도로 설정된 데이터를 아르고네 내셔널 래보레이토리(APS: Argonne National Laboratory)에서 IMCA 빔라인(beamline) 17-ID에서 단일 동결된 결정으로부터 수집하였다. 데이터를 오토PROC 및 SCALA에 의해 가공하고 조정하였다. 최종 데이터 집합은, 9.9의 평균 중복성 및 14.2%의 R대칭을 가지면서 96.8% 완료되었다.
브룩해븐(Brookhaven) PDB 참여 코드, 1 moe로부터 제조된 단일 쇄 Fv 단편 모델로 출발하여 PHASER에 의한 분자 대체에 의해 구조를 결정하였다. 결정학 35 DART 분자의 4개 서브유닛 각각에 대해 별도로 조사함으로써 해결책을 수득하였다. 오토BUSTER에 의한 결정학적 정련 및 COOT를 사용한 모델 리빌딩 및 수동 조정의 수 회의 반복적 라운드(iterative round)는 17.6%의 결정학적 Rwork 및 20.5%의 Rfree를 갖는 최종 결정학 35 DART 모델을 수득하였고, 여기서 Rwork = ||F관찰값| - |F계산값|| / |F관찰값|이고, Rfree는 Rwork에 해당하지만, 정련 공정으로부터 생략된 반사중 무작위적으로 선택된 5%에 대해 계산된다.
최종 결정학 35 DART 모델은 2개의 쇄인 중쇄(H) 및 경쇄(L)를 포함하고, 쇄 H의 잔기 1-110, 117-239 및 쇄 L의 잔기 2-110, 116-246을 가졌다. 모델에 존재하는 비-단백질 원자는 574개의 물 분자 및 5개의 설페이트 이온을 포함하였다. 연결기 영역에서의 아미노산 소실(11개 잔기)은 구조내로 모델링되지 않았는데, 이는 아마도 무질서로 인하여 전자가 결핍되기 때문이다.
도 26은 결정학 35 DART 단백질의 결정 구조를 상세히 묘사한다. 결정에서, 결정학 35 DART는 이전에 공개된 디아바디 구조로부터 상당히 상이한 매우 압축된 구형 구조로 조립되었다(도 27)[카르미카엘(Carmichael) 등의 문헌 "J. Mol. Biol. 326: 341-351 (2003)"; 페리시크(Perisic) 등의 문헌 "Structure, 2(12): 1217-1226, (1994)" 참조]. 이는 예상치못하게 서브유닛 사이의 연장된 계면, 및 2개의 폴리펩티드 쇄 사이의 디설파이드 연결기, Cys239(VH1B) - Cys246(VL2A)에 의한 구조의 안정화에 대한 명백한 증거를 갖는다. 4개 서브유닛, VL1A, VH1B, VL2B 및 VH2A 모두는 결합 계면에 기여하고, 대부분의 기여는 양쪽 쇄의 골격구조 아미노산 잔기로부터이다. 후자의 관찰은 다른 CDR 서열에 의해 구축되고 다양한 종양-회합된 항원에 결합하는 기타 DART 단백질이 결정학 35 DART과 유사한 구조 및 유사한 도메인 계면을 공유할 수 있음을 제안하였다.
비교적 치밀한 패킹에도 불구하고, 결정학 35 DART 계면은 중쇄 및 경쇄 도메인 사이의 높은 쇄간 회합을 특징으로 하는, Fab 분자에서의 천연 발생 계면처럼 고도로 강화되고 상보적으로 형상화되지 않았다. 결정학 35 DART에서, 하나의 쇄 또는 도메인중의 돌출부와 상보성이 아닌 다른 쇄 또는 도메인중의 소수의 함몰부는 작은 내부 패킹 결함 및 큰 공극을 생성하였고, 이는 결정 구조중의 결합수에 의해 충전된다(도 28).
결정학 35 DART 상의 2개의 항원 결합 자리는 서로 약 40 Å으로 분리되었고 분자의 직각 대향면 상에 위치되었다. 이와 관련하여, "직각 대향면"은 결정학 35 DART 상의 2개의 결합 자리가 약 90°각으로 서로 대향함을 의미한다.
항-CD3 CDR 영역은 서브유닛 계면으로부터 고립되어 위치된 반면, 항-P-CAD CDR 영역은 더욱 인접한 영역내에 존재하였다(도 27 참조).
또한, 2개의 쇄 디아바디 짝형성오류의 문제를 해결하는 신규한 단일 쇄 DART(scDART) 변형체를 생성하였다(다양한 VH 및 VL 쇄 인도성은 결정 구조에 기초하여 사용될 수 있다). scDART 단백질내의 공유 연결을 유도하기 위해 추가적인 시스테인 잔기를 조작하여 단일 쇄 디아바디의 안정성을 추가로 개선시켰다. 이 방법은 각각의 자리의 품질을 평가하는 추가의 분석을 이용하는 다니엘(Dani) 등의 문헌[Prot. Eng. 16(3): 187-193 (2003)]의 변형법이다. 다양한 디설파이드 결합 위치를 또한 이러한 방법에 의해 조작하여 디설파이드 결합의 용매 접근성을 감소시킬 뿐만 아니라 연결기의 길이를 감소시켰다. 예를 들면, 입체화학적으로 최적인 디설파이드의 도입을 위한 모델링 위치는 시스테인 돌연변이생성을 위한 하기 아미노산 잔기-쌍을 제안하였다(도 29 참조): Gln121(VH1B)Gly160(VL1A), Val129(VH1B)Gly244(VL1A), Val123(VH1B)Gly160(VL1A), Gly126(VH1B)Ser242(VL1A), 및 Ala127(VH1B)Ser242(VL1A).
추가로, 디스커버리 스튜디오(Discovery Studio)[악셀리스 소프트웨어 인크(Accelrys Software Inc)] 안정성 예측 프로토콜 및 로제타(Rosetta) v2.3 안정성 프로토콜을 사용하여, 도메인 사이의 회합의 안정성을 추가로 개선시키려는 시도로서 큰 내부 공극/홀(도 26)을 충전시키기 위해 도메인 사이의 계면에서의 자리-유도된 돌연변이생성을 통해 DART 변형체(scDART 변형체 포함)를 조작하였다. 예를 들면, 비교적 작은 아미노산을 페닐알라닌, 티로신, 또는 트립토판과 같은 부피가 큰 방향족 측쇄로 대체함으로써 위치 Ala44(VL1A), Val213(VH2A), Leu238(VH2A), 또는 Met231(VL2B)에서 측쇄 부피가 증가된다. 자리 특이적 생물-공액 접근법을 위한 결정 구조에 기초하여 다양한 위치를 탐침하는 단일 표면 시스테인 돌연변이체를 추가로 조작하였다.
실시예 16
P-카데린 153 LP-DART의 에피토프 매핑
P-카데린 153 LP-DART의 결합 에피토프를 식별하기 위해, 가용성 P-카데린-세포외 도메인(ECD)-Fc 융합 단백질 구축물을 생성하였다. 각각의 P-카데린-Fc 구축물은, 도 34에 제시된 바와 같이, 분할가능한 연결기를 통해 인간 IgG1의 CH2 및 CH3 도메인 및 힌지에 유전적으로 융합된 P-카데린 ECD 서브도메인 영역(ECD1, ECD1-2, ECD1-3, ECD1-4, 또는 ECD1-5), 단일 펩티드 및 프로-펩티드로 구성된다. ECD-Fc 구축물을 생성하기 위해 사용된 ECD1, ECD2, ECD3, ECD4, 및 ECD5 P-카데린 서브도메인 단편은, 도 35에 제시되고 추가로 표 42에서 특징지워진 전장 p-카데린 에피토프[유니프롯(UniProt) P22223, CADH3, 인간 카데린-3]에서 식별된 서열과 상응한다.
[표 42]
생성된 P-카데린 도메인 및 서브도메인
Figure pct00051
모든 구축물을 DNA 서열분석으로 확인하고 프리스타일(Freestyle: 상표명) 293 HEK 세포(라이프 테크놀로지스, 미국 뉴욕주 그랜드 아일랜드 소재)내로 제조업체의 방법에 따라 일시적으로 형질감염시키고 5 내지 7 일에 걸쳐 발현시켰다. 프로펩티드의 증진된 가공을 위해, PACE 분할 효소가 함유된 발현 벡터를 P-카데린-함유 벡터와 함께 공동-형질감염시켰다. 흥미로운 가용성 단백질을 표준 단백질 A 크로마토그래피 기법(단백질 A FF, 지이 헬쓰케어, 미국 뉴저지주 피스카타웨이 소재), 이후 겔 여과 크기 배제 크로마토그래피[수퍼덱스(Superdex)200, 지이 헬쓰케어, 미국 뉴저지주 피스카타웨이 소재]에 의해 정제하였다. 결합 ELISA에 의해 상업적으로 입수가능한 항-인간 P-카데린 단일클론성 및 다중클론성 항체를 사용하여 정제된 단백질을 순도 및 활성에 대해 특징지웠다. 정제된 P-카데린 ECD-Fc 구축물을 단백질 ELISA에서 사용하여, 153 LP-DART가 P-카데린의 어떤 ECD 서브도메인(들)에 결합하는지를 결정하였다.
표 43은 153 LP-DART, 및 다양한 다른 항-P-카데린 DART 분자의 생성된 P-카데린 ECD-Fc 구축물로의 결합 결과를, ECD-Fc 구축물의 적절한 발현 및 폴딩을 확인하기 위해 사용되는 다중클론성 Ab[알앤디 시스템스(R&D Systems), 미국 미네소타주 미네아폴리스 소재]와 함께 제시한다. 결과는 153 LP-DART가 ECD1-Fc 또는 ECD1-2-Fc에 결합하지 않지만, ECD3을 함유하는 모든 구축물(ECD1-3-FC, ECD1-4-Fc 및 ECD1-5-Fc)에 결합함을 보여준다. 이러한 데이터는 153 LP-DART가 ECD3내에서 인간 P-카데린에 결합함을 입증한다.
[표 43]
P-카데린 DART의 P-카데린 ECD-Fc 구축물로의 결합
Figure pct00052
표 24(상기)에 제시된 바와 같이, 153 LP-DART가 뮤린 P-카데린에 결합하지 않고, 따라서 153 LP-DART가 인간 P-카데린(서열번호 164)의 ECD3 상의 에피토프를 인식하며, 여기서 이는 뮤린 P-카데린 ECD3으로부터의 서열(서열번호 172)에 있어서 상이하다. 표 44는 인간 및 뮤린 P-카데린 ECD-3의 정렬을 제시하고, 이는 이들 오솔로그(ortholog) 사이에 차이를 나타낸다. (;)는 유사함을 표시하고, (.)는 상이함을 표시하며, (-)는 매우 상이한 잔기를 표시한다.
[표 44]
인간 및 마우스 P-카데린 세포외 도메인3(ECD3)의 정렬
Figure pct00053
결합 에피토프 및 결합 친화도가 T-세포 재표적화 세포독성 검정에서의 효능에 영향을 미치는지의 여부를 결정하기 위해, 다양한 항-P-카데린 EK-DART에 대한 세포독성 T-림프구(CTL) 검정의 결과를 분석하였다. 세포독성 값(표 29 참조)을 비아코어 및 ELISA에 의해 가용성 및 세포 표면-발현된 P-카데린으로의 결합 친화도와 비교하였다(표 14 내지 16, 및 24 참조). PF-DART는 한 자리 수 nM의 결합 친화도로 ECD2중의 P-카데린에 결합하고, 서브-nM의 CTL 세포독성 활성을 갖는다. 35 EK-DART(153 EK-DART의 모 클론)는, PF-DART 경우의 거의 35배 미만인 대략 35 nM의 결합 친화도로 ECD3중의 P-카데린에 결합하지만, 여전히 유사한 효능(서브-nM)으로 살해한다. 이러한 데이터는 세포 막에 더 가까운 ECD3에서의 결합이 더 높은 CTL 효능을 생성함을 제시한다. 153 LP-DART는 또한 35 EK-DART(0.5nM)에 비해 훨씬 더 강한 결합 친화도로 ECD3중의 P-카데린에 결합하고, 가장 높은 CTL 활성(서브-pM)을 나타낸다.
실시예 17
항-P-카데린 CDR의 파라토프(Paratope) 매핑
상보성 결정 영역(CDR)에서 어떤 아미노산(AA) 잔기가 인간 P-카데린으로의 scFv 153 결합에 관여하는지를 추가로 이해하기 위해, 모든 비-알라닌 CDR AA를 개별적으로 평행 자리-유도된 돌연변이생성에 의해 알라닌으로 돌연변이시켰다.
자리-유도된 돌연변이생성
63개의 올리고(33 내지 45개 염기 길이)를 고안하였다(표 45). 올리고 길이를 각각의 올리고에 대해 필적할만한 예측된 용융 온도(Tm) 값을 갖도록 조정하였다. 각각의 올리고를, 클론 153 scFv의 센스(sense) 가닥의 역 보체(reverse complement)이고, "AGC"(알라닌 코돈의 역 보체, GCT)의 측부 상에 15 내지 21개 염기가 플랭크되도록 고안하였다.
[표 45]
고안된 올리고
Figure pct00054
Figure pct00055
단일-가닥 DNA를 공개된 프로토콜에 의해 생산하였다[토니키안(Tonikian R) 등의 문헌 "Nat. Protoc. 2007; 2(6): 1368-86"]. 간단히, 파아지 발현 벡터는 제조업체 프로토콜[루시겐(Lucigen), 미국 위스콘신주 미들톤 소재]에 따라 CJ236 전기-컴피턴트(electro-competent) 세포내로 형질전환시키고 0.05%의 세포를 LB/Amp 플레이트 상에 도말하였다. 하룻밤 성장시킨 후, 100 ㎍/mL의 앰피실린(ampicillin), 10 ㎍/mL의 클로람페니콜(chloramphenicol), 및 1e+10의 M13K07 헬퍼(helper) 파아지 입자가 보충된 2 x TY/2% 글루코스에서 성장시킨 6개의 1 mL 배양액을 독립적 콜로니에 의해 접종하고 37℃에서 2 시간 동안 성장시킨 후 카나마이신(kanamycin)을 25 ㎍/mL로 첨가하였다. 37℃에서 4 시간 이상 진탕시킨 후, 혼탁도를 나타내는 배양액을 모으고, 2 L 들이 배플 플라스크(baffled flask)중의 120 mL의 배양액(100 ㎍/mL의 앰피실린, 25 ㎍/mL의 카나마이신, 0.25 ㎍/mL의 우리딘(uridine)이 보충된 2 x TY/2% 글루코스)내로 팽창시켰다. 하룻밤 성장시킨 후, 배양 상청액을 원심분리(6000 rpm, 10 분)를 통해 구하고, 20 mL의 PEG/NaCl을 100 mL의 상청액에 첨가하고 파아지를 PEG-침전에 의해 정제하였다. 정제된 파아지(1 mL PBS에 재현탁됨)를 용해시키고 단일-가닥 우라실 DNA를 제조업체의 프로토콜에 따라 정제하였다[퀴아프렙 스핀(Qiaprep spin) M13 키트, 카탈로그 번호 27704]. DNA를 나노드롭(Nanodrop)[써모(Thermo)]으로 정제하였다.
올리고를 트리스-EDTA 완충액(200 ㎕중 50 μΜ)에서 정규화된 형태로 정리하였다. 그런 다음, 200 피코몰의 각각의 올리고(4 ㎕)를 96-웰 포맷(format)에서 37℃하에 90 분 동안 인산화시키고 65℃에서 20 분 동안 열 불활성화시켰다. 반응 혼합물은 다음을 포함하였다: 4 ㎕의 올리고, 2 ㎕의 10 x PNK 완충액, 2 ㎕의 10 mM ATP, 1 ㎕의 100 mM DTT, 11 ㎕의 물, 2 ㎕의 T4 PNK(T4 폴리누클레오티드 키나아제). 자리-유도된 돌연변이생성 반응물을 96-웰 포맷에서 다음과 같이 설정하였다: 2.2 ㎕의 단일-가닥 우라실 주형 DNA(200 ng), 2 ㎕의 Pfu 터보(Turbo) Cx 완충액, 2 ㎕의 100 mM DTT, 0.4 ㎕의 NAD+, 0.16 ㎕의 dNTP, 10 ㎕의 물, 0.2 ㎕(0.5 유닛)의 Pfu 터보 Cx, 1 ㎕의 Taq DNA 리가아제(Ligase), 2 ㎕의 20-배 희석된 인산화 반응물(0.9 피코몰). 반응물을 다음과 같이 항온처리하였다: 95℃에서 3 분 동안, 55℃에서 90 초 동안, 68℃에서 15 분 동안, 45℃에서 15 분 동안. 그런 다음, 1 ㎕(1 피코몰)의 5' 인산화된 OmpA 올리고를 첨가하고 반응물을 추가로 다음과 같이 항온처리하였다: 95℃에서 30 초 동안, 55℃에서 45 초 동안, 68℃에서 10 분 동안, 45℃에서 15 분 동안. 이들 항온처리 이후, 2 ㎕ 또는 2 유닛의 UDG[우라실 DNA 글리코실라아제(glycosylase)] 및 5 유닛의 엑소누클레아제(Exonuclease)III 효소 믹스(mix)를 첨가하여 주형을 우선 37℃에서 60 분 동안, 이어서 65℃에서 20 분 동안 소화시켰다. 최종적으로, 각각의 반응물(63개의 총 반응물)로부터 2 ㎕를 모으고, 서열분석을 위해 ER2738 전기-컴피턴트 세포내로 0.3 ㎕를 전기천공시켰다.
ELISA에서 사용하기 위한 파아지 발현 scFv의 제조
ScFv는 파아지 입자의 표면 상에 발현될 수 있다. 이들 표면 상에서 scFv를 발현하는 파아지를 제조하기 위해, 2% 글루코스/100 ㎍/mL의 앰피실린을 갖는 1 mL의 2X TY 매질이 함유된 96-딥 웰(deep well) 플레이트를 해동된 글리세롤 스톡으로부터 0.5 내지 1 ㎕(웰 당 하나의 클론)에 의해 큐픽스(QPix: 상표명)2 콜리니 피커(Colony picker)[몰레큘라 디바이시즈(Molecular Devices), 미국 캘리포니아주 서니베일 소재]를 사용하여 접종시켰고, 37℃(900 rpm)에서 약 4 시간 동안 성장시켰다. 그런 다음, 헬퍼 파아지(8.3 x 1013 pfu)의 1:29 희석물 5 ㎕를 플레이트에 첨가하고, 추가로 30 분 동안 37℃에서 진탕없이 항온처리하고, 이어서 300 rpm에서 1 시간 동안 수행하였다. 플레이트를 원심분리하고, 배지를 카나마이신/글루코스 미함유 배지(50 ㎍/mL의 카나마이신 및 100 ㎍/mL의 앰피실린을 갖는 2X TY)로 대체하였다. 플레이트에서 25℃(900 rpm)하에 하룻밤 성장시키고, 파아지를 원심분리 후 상청액에서 수확하였다.
scFv 단백질의 인간 P-카데린-Fc로의 결합을 측정하기 위한 ELISA
P-카데린-ECD1-3-Fc 단백질 또는 음성 대조군 단백질을 하룻밤 4℃에서 96-웰 눈크 맥시소프(Nunc Maxisorp: 등록상표) 플레이트[써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific), 미국 커넥티컷주 매디슨 소재] 상에서 PBS + Ca2 + 및 Mg2 +중 2 ㎍/mL의 농도로 코팅하였다. PBS + Ca2 + 및 Mg2 +를 사용하여 플레이트를 3회 세척하고, 3% 밀크/PBS + Ca2+ 및 Mg2+에서 실온에서 1 시간 동안 차단시켰다. 상기 기재된 바와 같이 제조된 파아지 샘플을 차단된 플레이트에 1 시간 동안 실온에서 첨가하였다. 플레이트를 PBS + Ca2 + 및 Mg2 +에 의해 3회 세척한 후, 2차 항체(항 M13-HRP 1:2000, 지이 헬쓰케어, 미국 뉴저지주 피스카타웨이 소재)를 첨가하였다. 플레이트를 추가의 1 시간 동안 실온에서 항온처리하고 PBS + Ca2 + 및 Mg2 +에 의해 6회 세척하였다. 신호를 TMB[서모딕스(SurModics), 미국 미네소타주 에덴 프레이리어 소재]에 의해 발전시키고, 반응을 H2S04로 종결시키고, 흡광도를 450 nm에서 인비전(EnVision: 등록상표) 플레이트 판독기[퍼킨 엘머(Perkin Elmer), 미국 매사추세츠주 왈탐 소재] 상에서 판독하였다.
인간 P-카데린으로의 결합에 대한 평가
항-P-카데린 scFv 153 알라닌-돌연변이체의 파아지 제조물의 인간 P-카데린-Fc 단백질로의 결합을 ELISA에 의해 시험하였다. 데이터를 총 결합 신호(OD450)로서 및 모 클론 153에 비교된 결합 퍼센트로서 도표화하였다. 이어서 Z-스코어를 클론 153의 결합 퍼센트의 표준 편차에 기초하여 계산하였다. 이러한 검정을 위한 데이터를 표 46 및 표 47에 제시하였다.
결과는 파아지 상에서의 scFv의 양호한 발현을 지시하고, 클론 153의 예상된 결합 활성을 입증한다. 특정 CDR 잔기는, Ala로의 돌연변이가 인간 P-카데린 결합에 부정적인 영향을 주고 -1 미만의 Z-스코어를 갖기 때문에 중요하게 여겨진다. 특정 CDR 잔기는, Ala로의 돌연변이가 -0.2 내지 -1.0의 Z-스코어를 생성하므로 중간 정도로 중요하게 여겨진다. 이들 결과는 H1.8, H2.5, H3.1, H3.7 및 L3.3이 인간 P-카데린 결합을 위해 중요한 AA인 반면, H2.16, H2.16, H3.5, H3.9, L1.8, L2.2, L2.3, L3.2 및 L3.2가 결합에 중간 정도로 중요함을 제시한다.
[표 46]
항-P-카데린 클론 153 알라닌-돌연변이체의 결합
Figure pct00056
[표 47]
항-P-카데린 클론 153 알라닌-돌연변이체의 결합
Figure pct00057
본원에 제공된 알라닌 스캔 데이터 및 구조적 정보(실시예 15)는 항-P-카데린 scFv 153에서 상당한 수의 CDR 잔기가 항원 결합에 그다지 영향을 주지 않으면서 치환될 수 있었음을 제시한다. 이와 같이, 추가의 분석을 수행하여 어떠한 CDR 잔기가 P-카데린 결합에 그다지 영향을 주지 않으면서 치환될 수 있는지를 결정하였다. 표 48 내지 65는 디스커버리 스튜디오(Discovery Studio) 4.0 안전성 예측 알고리즘을 사용하여 각각의 위치에 대한 예측된 델타 델타 G(DDG: Delta Delta G) 안정성을 보여준다. 안정성 스코어(DDG)는 단백질 안정성에 미치는 돌연변이의 예측된 영향을 지시한다.
[표 48]
대체 VH CDR1 잔기(DDG <=1.0 kcal/몰)
Figure pct00058
[표 49]
대체 VH CDR1 잔기(DDG <= 0.5 kcal/몰)
Figure pct00059
[표 50]
대체 VH CDR1 잔기(DDG <= 0 kcal/몰)
Figure pct00060
[표 51]
대체 VH CDR2 잔기(DDG <= 1.0 kcal/몰)
Figure pct00061
[표 52]
대체 VH CDR2 잔기(DDG <= 0.5 kcal/몰)
Figure pct00062
[표 53]
대체 VH CDR2 잔기(DDG <= 0 kcal/몰)
Figure pct00063
[표 54]
대체 VH CDR3 잔기(DDG <= 1.0 kcal/몰)
Figure pct00064
[표 55]
대체 VH CDR3 잔기(DDG <= 0.5 kcal/몰)
Figure pct00065
[표 56]
대체 VH CDR3 잔기(DDG <= 0 kcal/몰)
Figure pct00066
[표 57]
대체 VL CDR1 잔기(DDG <= 1.0 kcal/몰)
Figure pct00067
[표 58]
대체 VL CDR1 잔기(DDG <= 0.5 kcal/몰)
Figure pct00068
[표 59]
대안의 VL CDR1 잔기(DDG <= 0 kcal/몰)
Figure pct00069
[표 60]
대체 VL CDR2 잔기(DDG <= 1.0 kcal/몰)
Figure pct00070
[표 61]
대체 VL CDR2 잔기(DDG <= 0.5 kcal/몰)
Figure pct00071
[표 62]
대체 VL CDR2 잔기(DDG <= 0 kcal/몰)
Figure pct00072
[표 63]
대체 VL CDR3 잔기(DDG <= 1.0 kcal/몰)
Figure pct00073
[표 64]
대체 VL CDR3 잔기(DDG <= 0.5 kcal/몰)
Figure pct00074
[표 65]
대체 VL CDR3 잔기(DDG <= 0 kcal/몰)
Figure pct00075
표 66 내지 71은 각각의 CDR 위치에서 인간 서열에 대한 아비시스(Abysis) 분석의 결과를 보여준다. 항-P-카데린 153으로부터의 각각의 CDR을 데이터베이스로부터의 인간 항체 서열로부터 상응하는 CDR과 비교하였다. 이러한 데이터데이스는 다음의 몇몇 데이터베이스로부터의 모든 인간 서열을 조합하였다: PDB, 카밧 데이터베이스, IMGT 데이터베이스, VBASE, 및 화이저의 내부 데이터베이스. 이러한 데이터베이스에서 인간 항체 서열을 아비시스에 의해 카밧 번호매김하고, 항-P-카데린 클론 153에서 발견되는 CDR과 동일한 길이를 갖는 CDR만을 사용하여 CDR 잔기의 빈도를 계산하였다. 표 66 내지 71은 각각의 위치에서의 대체 아미노산을 보여주고, 여기서 열거된 잔기는 인간 서열의 적어도 5% 또는 10%에 존재한다. 고유의 P-카데린 153 잔기는 또한 칼럼 3 및 칼럼 4에 포함되지만, 이들은 5% 또는 10% 이상의 카테고리에 속하지 않는다.
[표 66]
대체 VH CDR1 잔기(아비시스)
Figure pct00076
[표 67]
대체 VH CDR2 잔기(아비시스)
Figure pct00077
[표 68]
대체 VH CDR3 잔기(아비시스)
Figure pct00078
[표 69]
대체 VL CDR1 잔기(아비시스)
Figure pct00079
[표 70]
대체 VL CDR2 잔기(아비시스)
Figure pct00080
[표 71]
대체 VL CDR3 잔기(아비시스)
Figure pct00081
본원에 인용된 모든 특허, 특허 출원, 및 공보의 개시내용은 본원에 참고로 그의 전체가 인용된다.
본 발명이 구체적인 실시태양을 참조하여 개시되었지만, 본 발명의 취지 및 범주를 벗어나지 않고 당분야의 다른 숙련가에 의해 본 발명의 다양한 실시태양 및 변형이 고안될 수 있음이 분명하다. 첨부된 특허청구범위는 모든 이러한 실시태양 및 동등한 변형을 포함한다.
ATCC PTA-120809 20131220 ATCC PTA-120810 20131220
<110> Pfizer Inc. <120> BISPECIFIC HETERODIMERIC DIABODIES AND USES THEREOF <130> PC72054A <140> PCT/IB2015/054829 <141> 2015-06-26 <150> US 62/019,762 <151> 2014-07-01 <150> US 62/148,920 <151> 2015-04-17 <160> 239 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide sequence <400> 1 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn 20 25 30 Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Thr Leu Gly Ile Thr Gly Leu Gln 65 70 75 80 Thr Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Ser Ser Leu 85 90 95 Ser Ala Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu 100 105 110 <210> 2 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide sequence <400> 2 Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val 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107 cagtctgtct tgacgcagcc gccctcagtg tctgcggccc caggacagaa ggtcaccatc 60 tcctgctctg gaagcagctc caacattggg aataattatg tatcctggta ccagcagctc 120 ccaggaacag cccccaaact cctcatttat gacaataata agcgaccctc agggattcct 180 gaccgattct ctggctccaa gtctggcacg tcagccaccc tgggcatcac cggactccag 240 actggggacg aggccgatta ttactgcgga acatgggata gcagcctgag tgcttatgtc 300 ttcggaactg ggaccaaggt caccgtccta 330 <210> 108 <211> 354 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide sequence <400> 108 gaggtccagc tggtgcagtc tggagctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60 tcctgcaagg cttctggtta cacctttacc agctacggta tcagctgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag ggcttgagtg gatgggatgg atcagcgctt acaatggtaa cacaaactat 180 gcacagaagc tccagggcag agtcaccatg accacagaca catccacgag cacagcctac 240 atggagctga ggagcctgag atctgacgac acggccgtgt attactgtgc gactatcgat 300 acagctaatg cttttgatat ctggggccaa gggacaatgg tcaccgtctc gagc 354 <210> 109 <211> 330 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide sequence <400> 109 cagtctgtgt tgacgcagcc gccctcagtg tctgcggccc caggacagaa ggtcaccatc 60 tcctgctctg gaagcagctc caacattggg aataattatg tatcctggta ccagcagctc 120 ccaggaacag cccccaaact cctcatttat gacaataata agcgaccctc agggattcct 180 gaccgattct ctggctccaa gtctggcacg tcagccaccc tgggcatcac cggactccag 240 actggggacg aggccgatta ttactgcgga acatgggata gcagcctgag tgctgtggta 300 ttcggcggag ggaccaagct gaccgtccta 330 <210> 110 <211> 354 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide sequence <400> 110 gaggtccagc tggtgcagtc tggagctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60 tcctgcaagg cttctggtta cacctttacc agctacggta tcagctgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag ggcttgagtg gatgggatgg atcagcgctt acaatggtaa cacaaactat 180 gcacagaagc tccagggcag agtcaccatg accacagaca catccacgag cacagcctac 240 atggagctga ggagcctgag atctgacgac acggccgtgt attactgtgc gactatcgat 300 acagctaatg cttttgatat ctggggccaa gggacaatgg tcaccgtctc gagc 354 <210> 111 <211> 330 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide sequence <400> 111 cagtctgtcc tgacgcagcc gccctcagtg tctgcggccc caggacagaa ggtcaccatc 60 tcctgctctg gaagcaggtc caacattgga aataattatg tatcctggta ccagcaactc 120 ccaggaacag cccccaaact cctcatttat gacagtaata agcgaccctc agggattcct 180 gaccgattct ctggctccaa gtctggcacg tcagccaccc tgggcatcac cggactccag 240 actggggacg aggccgatta ttactgcgga acatgggata gcagcctgag ttcttgggtg 300 ttcggcggag ggaccaagct gaccgtccta 330 <210> 112 <211> 354 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide sequence <400> 112 gaggtccagc tggtgcagtc tggagctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60 tcctgcaagg cttctggtta cacctttacc agctacggta tcagctgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag ggcttgagtg gatgggatgg atcagcgctt acaatggtaa cacaaactat 180 gcacagaagc tccagggcag agtcaccatg accacagaca catccacgag cacagcctac 240 atggagctga ggagcctgag atctgacgac acggccgtgt attactgtgc gactatcgat 300 acagctaatg cttttgatat ctggggccaa gggacaatgg tcaccgtctc gagc 354 <210> 113 <211> 330 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide sequence <400> 113 cagtctgtgg tgacgcagcc gccctcagtg tctgcggccc caggacagaa ggtcaccatc 60 tcctgctctg gaagcagctc caacattggg aataattatg tatcctggta ccagcagctc 120 ccaggaacag cccccaaact cctcatttat gacaataata agcgaccctc agggattcct 180 gaccgattct ctggctccaa gtctggcacg tcagccaccc tgggcatcac cggactccag 240 actggggacg aggccgatta ttactgcgga acatgggata gcagcctgag tgcttatgtc 300 ttcggaactg ggaccaaggt caccgtccta 330 <210> 114 <211> 354 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide sequence <400> 114 gaggtccagc tggtgcagtc tggagctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60 tcctgcaagg cttctggtta cacctttacc agctacggta tcagctgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag ggcttgagtg gatgggatgg atcagcgctt acaatggtaa cacaaactat 180 gcacagaagc tccagggcag agtcaccatg accacagaca catccacgag cacagcctac 240 atggagctga ggagcctgag atctgacgac acggccgtgt attactgtgc gactatcgat 300 acagctaatg cttttgatat ctggggccaa gggacaatgg tcaccgtctc gagc 354 <210> 115 <211> 330 <212> DNA 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780 ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc atgatctccc ggacccctga ggtcacatgc 840 gtggtggtgg acgtgagcca cgaagaccct gaggtcaagt tcaactggta cgtggacggc 900 gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg cgggaggagc agtacaacag cacgtaccgt 960 gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag gactggctga atggcaagga gtacaagtgc 1020 aaggtctcca acaaagccct cccagccccc atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg 1080 cagccccgag aaccacaggt gtgcaccctg cccccatccc gggaggagat gaccaagaac 1140 caggtcagcc tgtggtgcct ggtcaaaggc ttctatccca gcgacatcgc cgtggagtgg 1200 gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac 1260 ggctccttct tcctctatag caagctcacc gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac 1320 gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc 1380 tccctgtccc cgggt 1395 <210> 118 <211> 1374 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide sequence <400> 118 caggctgtgg tgactcagga gccttcactg accgtgtccc caggcggaac tgtgaccctg 60 acatgcagat ccagcacagg cgcagtgacc acatctaact acgccaattg ggtgcagcag 120 aagccaggac 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tggcaaggag tacaagtgca aggtctccaa caaagccctc 1020 ccagccccca tcgagaaaac catctccaaa gccaaagggc agccccgaga accacaggtg 1080 tacaccctgc ccccatgccg ggaggagatg accaagaacc aggtcagcct gtcctgcgcg 1140 gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag 1200 aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg gactccgacg gctccttctt cctcgttagc 1260 aagctcaccg tggacaagag caggtggcag caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg 1320 catgaggctc tgcacaacca ctacacgcag aagagcctct ccctgtcccc gggt 1374 <210> 119 <211> 1395 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide sequence <400> 119 cagtctgtgc tgacgcagcc gccctcagtg tctgcggccc caggacagaa ggtcaccatc 60 tcctgctctg gaagcagctc caacattggg aataattatg tatcctggta ccagcagctc 120 ccaggaacag cccccaaact cctcatttat gacaataata agcgaccctc agggattcct 180 gaccgattct ctggctccaa gtctggcacg tcagccaccc tgggcatcac cggactccag 240 actggggacg aggccgatta ttactgcgga acatgggata gcagcctgag tggtgtggta 300 ttcggcggag ggaccaagct gaccgtccta ggtggcggat ccggcggcgg aggcgaggtg 360 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gatgaccaag 420 aaccaggtca gcctgtggtg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 480 tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 540 gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 600 aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 660 ctctccctgt ctccgggtaa agccccttcc agctccccta tggaacagtc cgtcctgact 720 cagcctccct ccgtgtccgc agctcctggg cagaaggtca caatcagttg ctctgggtca 780 tcctcaaaca ttggcaacaa ttacgtgtct tggtatcagc agctgcccgg gacagcccct 840 aagctgctga tctacgacaa caacaagcgg ccaagtggca ttcccgatcg gttcagcggc 900 agcaagtctg gcaccagcgc cacactgggc atcactgggc tgcagaccgg ggacgaggct 960 gattactatt gcggaacctg ggactcttca ctgtctgccg tcgtcttcgg agggggaacc 1020 aaactgaccg tgctgggtgg aggcggatcc ggcggcggag gcgaggtgca gctggtggag 1080 tctgggggag gcttggtcca gcctggaggg tccctgagac tctcctgtgc agcctctgga 1140 ttcaccttca gcacatacgc tatgaattgg gtccgccagg ctccagggaa ggggctggag 1200 tgggttggaa ggatcaggtc caagtacaac aattatgcaa cctactatgc cgactctgtg 1260 aagggtagat tcaccatctc aagagatgat tcaaagaact cactgtatct gcaaatgaac 1320 agcctgaaaa ccgaggacac ggccgtgtat tactgtgtga gacacggtaa cttcggcaat 1380 tcttacgtgt cttggtttgc ttattgggga caggggacac tggtgactgt gtcttccgga 1440 gttgagccca aatcttgt 1458 <210> 129 <211> 243 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide sequence <400> 129 Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly 1 5 10 15 Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser 20 25 30 Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly 35 40 45 Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Trp Thr Pro Ala Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala 65 70 75 80 Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn 85 90 95 Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly Gly 100 105 110 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu 115 120 125 Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly 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tggagaagtc 360 cagctggtgc agagtggggc agaagtcaag aaacccggcg catcagtgaa agtctcatgt 420 aaagcatcag gctatacctt tacatcatac ggaatcagct gggtgaggca ggctccagga 480 cagggactgg agtggatggg atggatttct gcatacaacg gcaatacaaa ctatgcccag 540 aagctgcagg gccgggtgac tatgaccaca gacactagca cctccacagc ctatatggaa 600 ctgcggtctc tgagaagtga cgatactgcc gtctactatt gcgctaccat tgataccgct 660 tcagccttcg acatttgggg gcaggggact atggtgacag tgagctccgg attcaacagg 720 ggagagtgt 729 <210> 131 <211> 486 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide sequence <400> 131 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly 1 5 10 15 Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 20 25 30 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 35 40 45 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 50 55 60 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 65 70 75 80 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 85 90 95 Lys 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atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 540 gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 600 aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 660 ctctccctgt ctccgggtaa agccccttcc agctccccta tggaacagtc cgtcctgact 720 cagcctccct ccgtgtccgc agctcctggg cagaaggtca caatcagttg ctctgggtca 780 tcctcaaaca ttggcaacaa ttacgtgtct tggtatcagc agctgcccgg gacagcccct 840 aagctgctga tctacgacaa caacaagcgg ccaagtggca ttcccgatcg gttcagcggc 900 agcaagtctg gcaccagcgc cacactgggc atcactgggc tgcagaccgg ggacgaggct 960 gattactatt gcggaacctg ggactcttca ctgtcttcct acgtcttcgg aacgggaacc 1020 aaagtgaccg tgctgggtgg aggcggatcc ggcggcggag gcgaggtgca gctggtggag 1080 tctgggggag gcttggtcca gcctggaggg tccctgagac tctcctgtgc agcctctgga 1140 ttcaccttca gcacatacgc tatgaattgg gtccgccagg ctccagggaa ggggctggag 1200 tgggttggaa ggatcaggtc caagtacaac aattatgcaa cctactatgc cgactctgtg 1260 aagggtagat tcaccatctc aagagatgat tcaaagaact cactgtatct gcaaatgaac 1320 agcctgaaaa ccgaggacac ggccgtgtat tactgtgtga gacacggtaa cttcggcaat 1380 tcttacgtgt cttggtttgc ttattgggga caggggacac tggtgactgt gtcttccgga 1440 gttgagccca aatcttgt 1458 <210> 137 <211> 243 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide sequence <400> 137 Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly 1 5 10 15 Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser 20 25 30 Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly 35 40 45 Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Trp Thr Pro Ala Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala 65 70 75 80 Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn 85 90 95 Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly Gly 100 105 110 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu 115 120 125 Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly 130 135 140 Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly 145 150 155 160 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atgattcaaa gaactcactg 600 tatctgcaaa tgaacagcct gaaaaccgag gacacggccg tgtattactg tgtgagacac 660 ggtaacttcg gcaattctta cgtgtcttgg tttgcttatt ggggacaggg gacactggtg 720 actgtgtctt ccggagttga gcccaaatct tgtgacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc 780 ccagcacctg aagccgcggg ggcaccgtca gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac 840 accctcatga tctcccggac ccctgaggtc acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa 900 gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca 960 aagccgcggg aggagcagta caacagcacg taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg 1020 caccaggact ggctgaatgg caaggagtac aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca 1080 gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac 1140 accctgcccc catcccggga ggagatgacc aagaaccagg tcagcctgtg gtgcctggtc 1200 aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac 1260 aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag 1320 ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat 1380 gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag agcctctccc tgtctccggg 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Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide sequence <400> 187 tgcatagttt gtgttaccag cgtaagcgct gatccatcc 39 <210> 188 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide sequence <400> 188 ctgtgcatag tttgtgttag cattgtaagc gctgatcca 39 <210> 189 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide sequence <400> 189 gagcttctgt gcatagtttg tagcaccatt gtaagcgctg atcca 45 <210> 190 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide sequence <400> 190 gagcttctgt gcatagttag cgttaccatt gtaagcgct 39 <210> 191 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide sequence <400> 191 ctggagcttc tgtgcataag ctgtgttacc attgtaagc 39 <210> 192 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide sequence <400> 192 gccctggagc ttctgtgcag cgtttgtgtt accattgta 39 <210> 193 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide sequence <400> 193 gactctgccc tggagcttag ctgcatagtt tgtgttacc 39 <210> 194 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide sequence <400> 194 ggtgactctg ccctggagag cctgtgcata gtttgtgtt 39 <210> 195 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide sequence <400> 195 catggtgact ctgccctgag ccttctgtgc atagtttgt 39 <210> 196 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide sequence <400> 196 ggtcatggtg actctgccag cgagcttctg tgcatagtt 39 <210> 197 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide sequence <400> 197 ggtcatggtg actctagcct ggagcttctg tgc 33 <210> 198 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide sequence <400> 198 accaaaagca ttagctgtat cagcagtcgc acagtaatac acggc 45 <210> 199 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide sequence <400> 199 aaaagcatta gctgtagcga tagtcgcaca gta 33 <210> 200 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide sequence <400> 200 gataccaaaa gcattagcag catcgatagt cgcacagta 39 <210> 201 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide sequence <400> 201 gccccagata ccaaaagcag cagctgtatc gatagtcgc 39 <210> 202 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide sequence <400> 202 ttggccccag ataccagcag cattagctgt atc 33 <210> 203 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide sequence <400> 203 cccttggccc cagatagcaa aagcattagc tgt 33 <210> 204 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide sequence <400> 204 cattgtccct tggccccaag caccaaaagc attagctgt 39 <210> 205 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide sequence <400> 205 gttggagctg cttccagcgc aggagatggt gac 33 <210> 206 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide sequence <400> 206 aatgttggag ctgctagcag agcaggagat ggt 33 <210> 207 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide sequence <400> 207 attcccaatg ttggagctag ctccagagca ggagatggt 39 <210> 208 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide sequence <400> 208 attattccca atgttggaag cgcttccaga gcaggagat 39 <210> 209 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide sequence <400> 209 ataattattc ccaatgttag cgctgcttcc agagcagga 39 <210> 210 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide sequence <400> 210 ggatacataa ttattcccaa tagcggagct gcttccagag cagga 45 <210> 211 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide sequence <400> 211 ggatacataa ttattcccag cgttggagct gcttccaga 39 <210> 212 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide sequence <400> 212 ccaggataca taattattag caatgttgga gctgcttcc 39 <210> 213 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide sequence <400> 213 gtaccaggat acataattag ccccaatgtt ggagctgct 39 <210> 214 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide sequence <400> 214 ctggtaccag gatacataag cattcccaat gttggagct 39 <210> 215 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide sequence <400> 215 ctgctggtac caggatacag cattattccc aatgttgga 39 <210> 216 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide sequence <400> 216 gagctgctgg taccaggaag cataattatt cccaatgtt 39 <210> 217 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide sequence <400> 217 tgggagctgc tggtaccaag ctacataatt attcccaat 39 <210> 218 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide sequence <400> 218 tgagggtcgc ttattattag cataaatgag gagtttggg 39 <210> 219 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide sequence <400> 219 ccctgagggt cgcttattag cgtcataaat gaggagttt 39 <210> 220 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide sequence <400> 220 aatccctgag ggtcgcttag cattgtcata aatgaggag 39 <210> 221 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide sequence <400> 221 gtcaggaatc cctgagggtc gagcattatt gtcataaatg aggag 45 <210> 222 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide sequence <400> 222 tcggtcagga atccctgagg gagccttatt attgtcataa atgag 45 <210> 223 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide sequence <400> 223 tcggtcagga atccctgaag ctcgcttatt attgtcata 39 <210> 224 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide sequence <400> 224 tcggtcagga atcccagcgg gtcgcttatt att 33 <210> 225 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide sequence <400> 225 gctgctatcc catgtagcgc agtaataatc ggc 33 <210> 226 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide sequence <400> 226 caggctgcta tcccaagctc cgcagtaata atc 33 <210> 227 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide sequence <400> 227 accactcagg ctgctatcag ctgttccgca gtaataatc 39 <210> 228 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide sequence <400> 228 accactcagg ctgctagccc atgttccgca gta 33 <210> 229 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide sequence <400> 229 cacaccactc aggctagcat cccatgttcc gca 33 <210> 230 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide sequence <400> 230 gaataccaca ccactcagag cgctatccca tgttccgca 39 <210> 231 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide sequence <400> 231 gccgaatacc acaccactag cgctgctatc ccatgttcc 39 <210> 232 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide sequence <400> 232 gccgaatacc acaccagcca ggctgctatc cca 33 <210> 233 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide sequence <400> 233 tccgccgaat accacagcac tcaggctgct atc 33 <210> 234 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide sequence <400> 234 ccctccgccg aatacagcac cactcaggct gct 33 <210> 235 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide sequence <400> 235 ggtccctccg ccgaaagcca caccactcag gct 33 <210> 236 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide sequence <400> 236 Ala Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Lys Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Ile Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Thr Ala Ser Thr Leu Gln Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Val Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Phe Asn Thr Pro Arg 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 237 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide sequence <400> 237 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Arg Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Gly Ser Gly Ser Gly Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Met Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 238 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide sequence <400> 238 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser 20 25 30 Asp Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Asp Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Gly 85 90 95 Thr His Trp Pro Pro Leu Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 239 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide sequence <400> 239 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Ser Ser Ser Asp Arg Thr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115

Claims (76)

  1. 제1 폴리펩티드 쇄 및 제2 폴리펩티드 쇄를 포함하는 P-카데린의 에피토프 및 CD3의 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 이중특이성 이종이량체성 디아바디로서,
    a. 상기 제1 폴리펩티드가 N-말단에서 C-말단 방향으로,
    i. 서브-도메인 1A 및 서브-도메인 1B를 포함하는 도메인 1, 및 ii. 제1 이종이량체-촉진 도메인을 포함하고;
    b. 상기 제2 폴리펩티드 쇄가 N-말단에서 C-말단 방향으로,
    i. 서브-도메인 2A 및 서브-도메인 2B를 포함하는 도메인 2, 및 ii. 제2 이종이량체-촉진 도메인을 포함하고, 이때
    서브-도메인 1A 및 서브-도메인 2A가 항-P-카데린 항체의 가변 중쇄(VH) 도메인(P-CAD VH) 및 항-P-카데린 항체의 가변 경쇄(VL) 도메인(P-CAD VL)을 포함하는 P-카데린 VL/VH 결합 도메인을 형성하고, 서브-도메인 1B 및 서브-도메인 2B가 항-CD3 항체의 VL 도메인(CD3 VL) 및 항-CD3 항체의 VH 결합 도메인(CD3 VH)을 포함하는 CD3 VL/VH 결합 도메인을 형성하거나; 또는
    서브-도메인 1A 및 서브-도메인 2A가 CD3 VL 및 CD3 VH를 포함하는 CD3 VL/VH 결합 도메인을 형성하고, 서브-도메인 1B 및 서브-도메인 2B가 P-CAD VH 및 P-CAD VL을 포함하는 P-카데린 VL/VH 결합 도메인을 형성하는, 이중특이성 이종이량체성 디아바디.
  2. 제1항에 있어서,
    서브-도메인 1A가 P-CAD VL 또는 CD3 VL을 포함하고, 서브-도메인 1A가 CD3 VL을 포함할 경우 서브-도메인 1B가 P-CAD VH를 포함하거나, 또는 서브-도메인 1A가 P-CAD VL을 포함할 경우 서브-도메인 1B가 CD3 VH를 포함하고; 서브-도메인 2B가 서브-도메인 1A에 대해 선택된 VL 도메인에 따라서 P-CAD VL 또는 CD3 VL을 포함하고, 서브-도메인 2B가 CD3 VL을 포함할 경우 서브-도메인 2A가 P-CAD VH를 포함하거나, 또는 서브-도메인 2B가 P-CAD VL을 포함할 경우 서브-도메인 2A가 CD3 VH를 포함하는, 이중특이성 이종이량체성 디아바디.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    서브-도메인 1A가 P-CAD VL을 포함하고 서브-도메인 1B가 CD3 VH를 포함하고, 서브-도메인 2B가 CD3 VL을 포함하고 서브-도메인 2A가 P-CAD VH를 포함하는, 이중특이성 이종이량체성 디아바디.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    서브-도메인 1A가 CD3 VL을 포함하고 서브-도메인 1B가 P-CAD VH를 포함하고, 서브-도메인 2B가 P-CAD VL을 포함하고 서브-도메인 2A가 CD3 VH를 포함하는, 이중특이성 이종이량체성 디아바디.
  5. 제1항에 있어서,
    서브-도메인 1A가 P-CAD VH 또는 CD3 VH를 포함하고, 서브-도메인 1A가 CD3 VH를 포함할 경우 서브-도메인 1B가 P-CAD VL을 포함하거나, 또는 서브-도메인 1A가 P-CAD VH를 포함할 경우 서브-도메인 1B가 CD3 VL을 포함하고; 서브-도메인 2B가 서브-도메인 1A에 대해 선택된 VH 도메인에 따라 P-CAD VH 또는 CD3 VH를 포함하고, 서브-도메인 2B가 CD3 VH를 포함할 경우 서브-도메인 2A가 P-CAD VL을 포함하거나, 또는 서브-도메인 2B가 P-CAD VH를 포함할 경우 서브-도메인 2A가 CD3 VL을 포함하는, 이중특이성 이종이량체성 디아바디.
  6. 제1항 또는 제5항에 있어서,
    서브-도메인 1A가 P-CAD VH를 포함하고 서브-도메인 1B가 CD3 VL을 포함하고, 서브-도메인 2B가 CD3 VH를 포함하고 서브-도메인 2A가 P-CAD VL을 포함하는, 이중특이성 이종이량체성 디아바디.
  7. 제1항 또는 제5항에 있어서,
    서브-도메인 1A가 CD3 VH를 포함하고 서브-도메인 1B가 P-CAD VL을 포함하고, 서브-도메인 2B가 P-CAD VH를 포함하고 서브-도메인 2A가 CD3 VL을 포함하는, 이중특이성 이종이량체성 디아바디.
  8. 제1항 내지 제7항중 어느 한 항에 있어서,
    제1 이종이량체-촉진 도메인 및 제2 이종이량체-촉진 도메인이 CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 IgG Fc 영역을 포함하고, 여기서 CH2 도메인 및/또는 CH3 도메인의 아미노산 서열이, 야생형 IgG Fc 영역과 비교하여, 하나 이상의 아미노산 개질을 포함하여 놉(knob) 또는 홀(hole)을 형성하는, 이중특이성 이종이량체성 디아바디.
  9. 제8항에 있어서,
    제1 이종이량체-촉진 도메인 및 제2 이종이량체-촉진 도메인이 둘 다 놉이 아니거나 둘 다 홀이 아니고/아니거나; 제1 이종이량체-촉진 도메인 및 제2 이종이량체-촉진 도메인이 IgG 면역글로불린 Fc 영역을 형성하는, 이중특이성 이종이량체성 디아바디.
  10. 제8항 또는 제9항에 있어서,
    놉을 형성하는 IgG Fc 영역이 서열번호 63의 서열을 포함하고, 홀을 형성하는 IgG Fc 영역이 서열번호 64의 서열을 포함하는, 이중특이성 이종이량체성 디아바디.
  11. 제1항 내지 제7항중 어느 한 항에 있어서,
    제1 이종이량체-촉진 도메인 및 제2 이종이량체-촉진 도메인이 글루탐산 및 음성으로 하전된 알파-나선형 코일을 포함하는 E-코일 영역 또는 라이신 및 양성으로 하전된 나선형 코일을 포함하는 K-코일 영역을 포함하고; 제1 이종이량체-촉진 도메인 및 제2 이종이량체-촉진 도메인이 둘 다 E-코일 영역이 아니거나 둘 다 K-코일 영역이 아닌, 이중특이성 이종이량체성 디아바디.
  12. 제11항에 있어서,
    E-코일 영역이 서열번호 61의 서열을 포함하고, K-코일 영역이 서열번호 62의 서열을 포함하는, 이중특이성 이종이량체성 디아바디.
  13. 제1항 내지 제12항중 어느 한 항에 있어서,
    서브-도메인 1A 및 서브-도메인 1B가 글리신-세린 연결기(연결기 1)에 의해 연결되고, 서브-도메인 2B 및 서브-도메인 2A가 글리신-세린 연결기(연결기 1)에 의해 연결되는, 이중특이성 이종이량체성 디아바디.
  14. 제13항에 있어서,
    글리신-세린 연결기(연결기 1)가 서열번호 68 또는 서열번호 69의 서열을 포함하는, 이중특이성 이종이량체성 디아바디.
  15. 제1항 내지 제14항중 어느 한 항에 있어서,
    서브-도메인 1A 및 서브-도메인 1B가 VL/VH 에피토프 결합 도메인을 형성하기 위해 회합되지 않고, 서브-도메인 2B 및 서브-도메인 2A가 VL/VH 에피토프 결합 도메인을 형성하기 위해 회합되지 않는, 이중특이성 이종이량체성 디아바디.
  16. 제1항 내지 제15항중 어느 한 항에 있어서,
    제1 이종이량체-촉진 도메인이 서브-도메인 1B 상에 시스테인 연결기(연결기 2)를 포함하고/하거나 제2 이종이량체-촉진 도메인이 서브-도메인 2A 상에 시스테인 연결기(연결기 2)를 포함하는 이중특이성 이종이량체성 디아바디.
  17. 제16항에 있어서,
    제1 이종이량체-촉진 도메인 및/또는 제2 이종이량체-촉진 도메인의 연결기 2가 추가로 하나 이상의 글리신 잔기를 포함하는 이중특이성 이종이량체성 디아바디.
  18. 제17항에 있어서,
    제1 이종이량체-촉진 도메인 및/또는 제2 이종이량체-촉진 도메인의 연결기 2가 GFNRGEC(서열번호 70), GVEPKSC(서열번호 71), GGCGGG(서열번호 72), GCPPCP(서열번호 73), GGTGGCPPCP(서열번호 74), GEPKSSDKTHTCPPCP(서열번호 75) 또는 GGTGGGEPKSSDKTHTCPPCP(서열번호 76)의 서열을 포함하는 이중특이성 이종이량체성 디아바디.
  19. 제18항에 있어서,
    제1 이종이량체-촉진 도메인의 연결기 2가 GCPPCP(서열번호 73), GGTGGCPPCP(서열번호 74), GEPKSSDKTHTCPPCP(서열번호 75) 또는 GGTGGGEPKSSDKTHTCPPCP(서열번호 76)의 서열을 포함하고, 제2 이종이량체-촉진 도메인의 연결기 2가 GCPPCP(서열번호 73), GGTGGCPPCP(서열번호 74), GEPKSSDKTHTCPPCP(서열번호 75) 또는 GGTGGGEPKSSDKTHTCPPCP(서열번호 76)의 서열을 포함하는 이중특이성 이종이량체성 디아바디.
  20. 제18항에 있어서,
    제1 이종이량체-촉진 도메인의 연결기 2가 GGCGGG(서열번호 72)의 서열을 포함하고, 제2 이종이량체-촉진 도메인의 연결기 2가 GGCGGG(서열번호 72)의 서열을 포함하는, 이중특이성 이종이량체성 디아바디.
  21. 제18항에 있어서,
    제1 이종이량체-촉진 도메인의 연결기 2가 GFNRGEC(서열번호 70)의 서열을 포함하고 제2 이종이량체-촉진 도메인의 연결기 2가 GVEPKSC(서열번호 71)의 서열을 포함하거나, 또는 제1 이종이량체-촉진 도메인의 연결기 2가 GVEPKSC(서열번호 71)의 서열을 포함하고 제2 이종이량체-촉진 도메인의 연결기 2가 GFNRGEC(서열번호 70)의 서열을 포함하는, 이중특이성 이종이량체성 디아바디.
  22. 제1항 내지 제21항중 어느 한 항에 있어서,
    a. 인간 P-카데린의 세포외 도메인 3(ECD3)에 결합하거나,
    b. P-카데린 상의 에피토프에 결합하지만 E-카데린 또는 VE-카데린 상의 에피토프에 결합하지 않거나,
    c. 인간 P-카데린 상의 에피토프에 결합하지만 마우스 P-카데린 상의 에피토프에 결합하지 않거나,
    d. 연장된 혈청 및 종양 반감기를 나타내거나, 또는
    e. 증가된 P-카데린 발현 수준 또는 증가된 수용체 밀도 수준의 존재하에 더 낮은 EC50을 나타내는, 이중특이성 이종이량체성 디아바디.
  23. 제1항 내지 제22항중 어느 한 항에 있어서,
    a. XL1.1-XL1.2-XL1.3-XL1.4-XL1.5-XL1.6-XL1.7-XL1.8-XL1.9-XL1.10-XL1.11-XL1.2-XL1.13을 포함하는 P-CAD VL CDR1 서열,
    b. XL2.1-XL2.2-XL2.3-XL2.4-XL2.5-XL2.6-XL2.7을 포함하는 P-CAD VL CDR2 서열,
    c. XL3.1-XL3.2-XL3.3-XL3.4-XL3.5-XL3.6-XL3.7-XL3.8-XL3.9-XL3.10-XL3.11을 포함하는 P-CAD VL CDR3 서열,
    d. XH1.1-XH1.2-XH1.3-XH1.4-XH1.5-XH1.6-XH1.7-XH1.8-XH1.9-XH1.10 또는 XH1.5-XH1.6-XH1.7-XH1.8-XH1.9-XH1.10을 포함하는 P-CAD VH CDR1 서열,
    e. XH2.1-XH2.2-XH2.3-XH2.4-XH2.5-XH2.6-XH2.7-XH2.8-XH2.9-XH2.10 또는 XH2.1-XH2.2-XH2.3-XH2.4-XH2.5-XH2.6-XH2.7-XH2.8-XH2.9-XH2.10-XH2.11-XH2.12-XH2.13-XH2.14-XH2.15-XH2.16-XH2.17을 포함하는 P-CAD VH CDR2 서열, 및
    f. XH3.1-XH3.2-XH3.3-XH3.4-XH3.5-XH3.6-XH3.7-XH3.8-XH3.9를 포함하는 P-CAD VH CDR3 서열을 포함하되,
    XL3 .3이 W이고, XH1 .8이 G이고, XH2 .5가 Y이고, XH3 .1이 I이고, XH3 .7이 F인, 이중특이성 이종이량체성 디아바디.
  24. 제23항에 있어서,
    XL1 .8이 G이고, XL2 .2가 N이고, XL2 .3이 N이고, XL3 .2가 T이고, XH2 .6이 N이고, XH2.16이 Q이고, XH3 .5가 N이고, XH3 .9가 I인, 이중특이성 이종이량체성 디아바디.
  25. 제1항 내지 제24항중 어느 한 항에 있어서,
    a. 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21 또는 23의 서열을 포함하는 P-CAD VL의 P-CAD VL CDR1, P-CAD VL CDR2, 및 P-CAD VL CDR3;
    b. 서열번호 45 또는 46의 서열을 포함하는 CD3 VH의 CD3 VH CDR1, CD3 VH CDR2, 및 CD3 VH CDR3;
    c. 서열번호 47의 서열을 포함하는 CD3 VL의 CD3 VL CDR1, CD3 VL CDR2, 및 CD3 VL CDR3; 및/또는
    d. 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 또는 24의 서열을 포함하는 P-CAD VH의 P-CAD VH CDR1, P-CAD VH CDR2, 및 P-CAD VH CDR3
    을 포함하는, 이중특이성 이종이량체성 디아바디.
  26. 제25항에 있어서,
    a. P-CAD VL CDR1이 서열번호 35 또는 36의 서열을 포함하고, P-CAD VL CDR2가 서열번호 37 또는 38의 서열을 포함하고, P-CAD VL CDR3이 서열번호 39, 40, 41, 42, 43 또는 44의 서열을 포함하고/하거나;
    b. CD3 VH CDR1이 서열번호 48의 서열을 포함하고, CD3 VH CDR2가 서열번호 49 또는 50의 서열을 포함하고, CD3 VH CDR3이 서열번호 51의 서열을 포함하고/하거나;
    c. CD3 VL CDR1이 서열번호 55의 서열을 포함하고, CD3 VL CDR2가 서열번호 56의 서열을 포함하고, CD3 VL CDR3이 서열번호 57의 서열을 포함하고/하거나;
    d. P-CAD VH CDR1이 서열번호 25 또는 33의 서열을 포함하고, P-CAD VH CDR2가 서열번호 26 또는 34의 서열을 포함하고, P-CAD VH CDR3이 서열번호 27, 28, 29, 30, 31 또는 32의 서열을 포함하는, 이중특이성 이종이량체성 디아바디.
  27. 제25항 또는 제26항에 있어서,
    P-CAD VL CDR1이 서열번호 35의 서열을 포함하고, P-CAD VL CDR2가 서열번호 37의 서열을 포함하고, P-CAD VL CDR3이 서열번호 41의 서열을 포함하고, P-CAD VH CDR1이 서열번호 25의 서열을 포함하고, P-CAD VH CDR2가 서열번호 26의 서열을 포함하고, P-CAD VH CDR3이 서열번호 28의 서열을 포함하는, 이중특이성 이종이량체성 디아바디.
  28. 제25항 또는 제26항에 있어서,
    P-CAD VL CDR1이 서열번호 35의 서열을 포함하고, P-CAD VL CDR2가 서열번호 37의 서열을 포함하고, P-CAD VL CDR3이 서열번호 42의 서열을 포함하고, P-CAD VH CDR1이 서열번호 25의 서열을 포함하고, P-CAD VH CDR2가 서열번호 26의 서열을 포함하고, P-CAD VH CDR3이 서열번호 29의 서열을 포함하는, 이중특이성 이종이량체성 디아바디.
  29. 제25항 또는 제26항에 있어서,
    P-CAD VL CDR1이 서열번호 35의 서열을 포함하고, P-CAD VL CDR2가 서열번호 37의 서열을 포함하고, P-CAD VL CDR3이 서열번호 43의 서열을 포함하고, P-CAD VH CDR1이 서열번호 25의 서열을 포함하고, P-CAD VH CDR2가 서열번호 26의 서열을 포함하고, P-CAD VH CDR3이 서열번호 30의 서열을 포함하는, 이중특이성 이종이량체성 디아바디.
  30. 제25항 또는 제26항에 있어서,
    P-CAD VL CDR1이 서열번호 35의 서열을 포함하고, P-CAD VL CDR2가 서열번호 37의 서열을 포함하고, P-CAD VL CDR3이 서열번호 39의 서열을 포함하고, P-CAD VH CDR1이 서열번호 25의 서열을 포함하고, P-CAD VH CDR2가 서열번호 26의 서열을 포함하고, P-CAD VH CDR3이 서열번호 31의 서열을 포함하는, 이중특이성 이종이량체성 디아바디.
  31. 제1항 내지 제30항중 어느 한 항에 있어서,
    a. P-CAD VL이 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21 또는 23의 서열을 포함하고;
    b. CD3 VH가 서열번호 45 또는 46의 서열을 포함하고;
    c. CD3 VL이 서열번호 47의 서열을 포함하고;
    d. P-CAD VH가 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 또는 24의 서열을 포함하는, 이중특이성 이종이량체성 디아바디.
  32. 제31항에 있어서,
    P-CAD VL이 서열번호 5의 서열을 포함하고, P-CAD VH가 서열번호 6의 서열을 포함하는, 이중특이성 이종이량체성 디아바디.
  33. 제31항에 있어서,
    P-CAD VL이 서열번호 7의 서열을 포함하고, P-CAD VH가 서열번호 8의 서열을 포함하는, 이중특이성 이종이량체성 디아바디.
  34. 제31항에 있어서,
    P-CAD VL이 서열번호 9의 서열을 포함하고, P-CAD VH가 서열번호 10의 서열을 포함하는, 이중특이성 이종이량체성 디아바디.
  35. 제31항에 있어서,
    P-CAD VL이 서열번호 15의 서열을 포함하고, P-CAD VH가 서열번호 16의 서열을 포함하는, 이중특이성 이종이량체성 디아바디.
  36. 서열번호 90의 서열을 포함하는 제1 폴리펩티드 쇄 및 서열번호 91의 서열을 포함하는 제2 폴리펩티드 쇄를 포함하는, P-카데린의 에피토프 및 CD3의 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 이중특이성 이종이량체성 디아바디.
  37. 서열번호 92의 서열을 포함하는 제1 폴리펩티드 쇄 및 서열번호 93의 서열을 포함하는 제2 폴리펩티드 쇄를 포함하는, P-카데린의 에피토프 및 CD3의 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 이중특이성 이종이량체성 디아바디.
  38. 서열번호 88의 서열을 포함하는 제1 폴리펩티드 쇄 및 서열번호 89의 서열을 포함하는 제2 폴리펩티드 쇄를 포함하는, P-카데린의 에피토프 및 CD3의 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 이중특이성 이종이량체성 디아바디.
  39. 도 30a, 30b, 31a, 31b, 32a 또는 32b에 제시된 서열을 포함하는 제1 폴리펩티드 쇄 및 제2 폴리펩티드 쇄를 포함하는, P-카데린의 에피토프 및 CD3의 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 이중특이성 이종이량체성 디아바디.
  40. 제1항 내지 제39항중 어느 한 항에 있어서,
    제1 및 제2 폴리펩티드 쇄가 하나 이상의 디설파이드 결합에 의해 서로 공유적으로 결합되는 이중특이성 이종이량체성 디아바디.
  41. P-카데린에 결합하고, 제1항 내지 제40항중 어느 한 항의 이중특이성 이종이량체성 디아바디로의 결합에 대해 경쟁하는 이중특이성 이종이량체성 디아바디.
  42. 치료학적 효과량의 제1항 내지 제41항중 어느 한 항의 이중특이성 이종이량체성 디아바디 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물.
  43. P-카데린 연관된 질환의 치료가 필요한 환자에게 제1항 내지 제41항중 어느 한 항의 이중특이성 이종이량체성 디아바디 또는 제42항의 약학 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 상기 환자에서 P-카데린 연관된 질환의 치료 방법.
  44. 제43항에 있어서,
    P-카데린 연관된 질환이 암인 방법.
  45. 제44항에 있어서,
    암이 유방암, 결장직장암, 난소암, 위암, 갑상선암, 전립선암, 자궁경부암, 췌장암, 폐암, 방광암, 간암, 자궁내막암, 두경부암(head and neck cancer), 고환암 및 교모세포종 암으로 구성된 군에서 선택되는 방법.
  46. P-카데린 연관된 질환의 치료가 필요한 환자에게 제1항 내지 제41항중 어느 한 항의 이중특이성 이종이량체성 디아바디 또는 제42항의 약학 조성물을 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 세포용해 T 세포 반응이 활성화되는, 상기 환자에서 P-카데린 연관된 질환의 치료 방법.
  47. 제1항 내지 제41항중 어느 한 항에 있어서,
    치료법에 사용하기 위한 이중특이성 이종이량체성 디아바디.
  48. 치료법에 사용하기 위한 약제의 제조에 있어서의 제1항 내지 제41항중 어느 한 항의 이중특이성 이종이량체성 디아바디의 용도.
  49. 제47항 또는 제48항에 있어서,
    치료법이 P-카데린 연관된 질환의 치료인 용도를 위한 이중특이성 이종이량체성 디아바디.
  50. 제49항에 있어서,
    P-카데린 연관된 질환이 암인 용도를 위한 이중특이성 이종이량체성 디아바디.
  51. 제50항에 있어서,
    암이 유방암, 결장직장암, 난소암, 위암, 갑상선암, 전립선암, 자궁경부암, 췌장암, 폐암, 방광암, 간암, 자궁내막암, 두경부암, 고환암 및 교모세포종 암으로 구성된 군에서 선택되는 용도를 위한 이중특이성 이종이량체성 디아바디.
  52. 제47항 또는 제48항에 있어서,
    치료법이 세포용해 T 세포 반응을 활성화시키는 용도를 위한 이중특이성 이종이량체성 디아바디.
  53. 제1항 내지 제41항중 어느 한 항의 이중특이성 이종이량체성 디아바디를 재조합적으로 생산하는 단리된 숙주 세포.
  54. 제1항 내지 제41항중 어느 한 항의 이중특이성 이종이량체성 디아바디를 인코딩하는 누클레오티드 서열을 포함하는 단리된 폴리누클레오티드.
  55. 제54항의 폴리누클레오티드를 포함하는 벡터.
  56. 이중특이성 이종이량체성 디아바디의 생산을 일으키는 조건하에 제53항의 숙주 세포를 배양하는 단계, 및 이중특이성 이종이량체성 디아바디를 배양 상청액으로부터 정제하는 단계를 포함하는, 이중특이성 이종이량체성 디아바디의 제조 방법.
  57. 제1항 내지 제41항중 어느 한 항에 있어서,
    결정 구조가 서브-도메인 1B의 위치 239에서의 시스테인 잔기(Cys239) 및 서브-도메인 2A의 위치 246에서의 시스테인 잔기(Cys246)를 포함하는 한 쌍의 시스테인 잔기 사이의 디설파이드 연결에 의해 안정화된 치밀한 구형 구조로 조립되고; 결정이 원자 좌표의 결정을 위한 X-선을 회절시켜 약 2.0 옹스트롬 보다 더 우수한 해상도를 제공하는, 이중특이성 이종이량체성 디아바디.
  58. a. XL1 .1-XL1 .2-XL1 .3-XL1 .4-XL1 .5-XL1 .6-XL1 .7-XL1 .8-XL1 .9-XL1 .10-XL1 .11-XL1 .2-XL1 .13을 포함하는 P-CAD VL CDR1 서열,
    b. XL2.1-XL2.2-XL2.3-XL2.4-XL2.5-XL2.6-XL2.7을 포함하는 P-CAD VL CDR2 서열,
    c. XL3.1-XL3.2-XL3.3-XL3.4-XL3.5-XL3.6-XL3.7-XL3.8-XL3.9-XL3.10-XL3.11을 포함하는 P-CAD VL CDR3 서열,
    d. XH1.1-XH1.2-XH1.3-XH1.4-XH1.5-XH1.6-XH1.7-XH1.8-XH1.9-XH1.10 또는 XH1.5-XH1.6-XH1.7-XH1.8-XH1.9-XH1.10을 포함하는 P-CAD VH CDR1 서열,
    e. XH2.1-XH2.2-XH2.3-XH2.4-XH2.5-XH2.6-XH2.7-XH2.8-XH2.9-XH2.10 또는 XH2.1-XH2.2-XH2.3-XH2.4-XH2.5-XH2.6-XH2.7-XH2.8-XH2.9-XH2.10-XH2.11-XH2.12-XH2.13-XH2.14-XH2.15-XH2.16-XH2.17을 포함하는 P-CAD VH CDR2 서열, 및
    f. XH3.1-XH3.2-XH3.3-XH3.4-XH3.5-XH3.6-XH3.7-XH3.8-XH3.9를 포함하는 P-CAD VH CDR3 서열을 포함하되,
    XL3.3이 W이고, XH1.8이 G이고, XH2.5가 Y이고, XH3.1이 I이고, XH3.7이 F인,
    P-카데린에 결합하는 항체.
  59. 제58항에 있어서,
    XL1.8이 G이고, XL2.2가 N이고, XL2.3이 N이고, XL3.2가 T이고, XH2.6이 N이고, XH2.16이 Q이고, XH3 .5가 N이고, XH3 .9가 I인, 항체.
  60. 제58항 또는 제59항에 있어서,
    서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21 또는 23의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역의 P-CAD VL CDR1, P-CAD VL CDR2, 및 P-CAD VL CDR3 및/또는 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 또는 24의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역의 P-CAD VH CDR1, P-CAD VH CDR2, 및 P-CAD VH CDR3을 포함하는 항체.
  61. 제58항 내지 제60항중 어느 한 항에 있어서,
    a. 서열번호 35 또는 36의 서열을 포함하는 P-CAD VL CDR1,
    b. 서열번호 37 또는 38의 서열을 포함하는 P-CAD VL CDR2,
    c. 서열번호 39, 40, 41, 42, 43 또는 44의 서열을 포함하는 P-CAD VL CDR3,
    d. 서열번호 25 또는 33의 서열을 포함하는 P-CAD VH CDR1,
    e. 서열번호 26 또는 34의 서열을 포함하는 P-CAD VH CDR2, 및
    f. 서열번호 27, 28, 29, 30, 31 또는 32의 서열을 포함하는 P-CAD VH CDR3
    을 포함하는 항체.
  62. 제58항 내지 제61항중 어느 한 항에 있어서,
    a. 서열번호 35 또는 36의 서열을 포함하는 P-CAD VL CDR1,
    b. 서열번호 37 또는 38의 서열을 포함하는 P-CAD VL CDR2,
    c. 서열번호 39, 40, 41, 42, 43 또는 44의 서열을 포함하는 P-CAD VL CDR3,
    d. 서열번호 25의 서열을 포함하는 P-CAD VH CDR1,
    e. 서열번호 26의 서열을 포함하는 P-CAD VH CDR2, 및
    f. 서열번호 27, 28, 29, 30, 31 또는 32의 서열을 포함하는 P-CAD VH CDR3
    을 포함하는 항체.
  63. 제58항 내지 제62항중 어느 한 항에 있어서,
    a. 서열번호 35의 서열을 포함하는 P-CAD VL CDR1,
    b. 서열번호 37의 서열을 포함하는 P-CAD VL CDR2,
    c. 서열번호 42의 서열을 포함하는 P-CAD VL CDR3,
    d. 서열번호 25의 서열을 포함하는 P-CAD VH CDR1,
    e. 서열번호 26의 서열을 포함하는 P-CAD VH CDR2, 및
    f. 서열번호 29의 서열을 포함하는 P-CAD VH CDR3
    을 포함하는 항체.
  64. 제58항 내지 제63항중 어느 한 항에 있어서,
    서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21 및 23의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및/또는 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 또는 24의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항체.
  65. 제64항에 있어서,
    서열번호 5의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및/또는 서열번호 6의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항체.
  66. 제64항에 있어서,
    서열번호 7의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및/또는 서열번호 8의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항체.
  67. 제64항에 있어서,
    서열번호 9의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및/또는 서열번호 10의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항체.
  68. 제64항에 있어서,
    서열번호 15의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및/또는 서열번호 16의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항체.
  69. P-카데린에 결합하고, 제58항 내지 제68항중 어느 한 항의 항체와 P-카데린으로의 결합을 위해 경쟁하는 항체.
  70. 치료학적 효과량의 제58항 내지 제69항중 어느 한 항의 항체 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물.
  71. 제58항 내지 제69항중 어느 한 항의 항체 또는 제70항의 약학 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, P-카데린 양성 암의 치료가 필요한 환자에서 P-카데린 양성 암의 치료 방법.
  72. 제58항 내지 제69항중 어느 한 항에 있어서,
    치료법에 사용하기 위한 항체.
  73. 치료법에서 사용하기 위한 약제의 제조에 있어서의 제58항 내지 제69항중 어느 한 항의 항체의 용도.
  74. 제58항 내지 제69항중 어느 한 항에 따른 항체를 인코딩하는 핵산.
  75. 제74항의 핵산을 포함하는 벡터.
  76. 제75항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
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X601 Decision of rejection after re-examination