RS55214B1

RS55214B1 - Marker vakcina za klasičnu svinjsku groznicu

Info

Publication number: RS55214B1
Application number: RS20160807A
Authority: RS
Inventors: Martin Beer; Sandra Blome; Immanuel Leifer
Original assignee: Idt Biologika Gmbh
Priority date: 2010-05-18
Filing date: 2011-05-18
Publication date: 2017-02-28
Also published as: PL2571519T3; EA031518B1; HRP20161225T1; US9315873B2; BR112012029145A2; KR101845571B1; CA2801897C; MX337048B; BR112012029145B1; CY1118060T1; CN102905725A; KR20130109008A; EA201270794A1; BR112012029145B8; PT2571519T; ES2593965T3; SI2571519T1; CN102905725B; PH12012502273A1; EP2571519B1

Description

[0001]Pronalazak se odnosi na marker vakcinu za profilaktički tretman klasične svinjske groznice koja sadrži modifikovani živi atenuirani virus klasične svinjske groznice. U jednom primeru izvođenja pronalaska marker vakcina je okarakterisana time što virusna nukleotidna sekvenca, koja kodira TAV-epitop i/ili aminokiselinsku sekvencu TAV-epitopa, sadrži različitu sekvencu od one kod virusa povezanog sa bolešću svinjske groznice, tako da subjekti koji ispoljavaju infekciju sa virusom povezanim za bolest svinjske groznice mogu biti diferencirani od subjekata vakcinisanih sa marker vakcinom prema predmetnom pronalasku pomoću seroloških i/ili genomskih analitičkih postupaka.

Osnova pronalaska

[0002] Klasična svinjska groznica (CSF) je epizootična bolest životinja koja se javlja širom sveta i ima značajnu političku i ekonomsku relevantnost (Vandeputte and Chappuis, 1999). Klasična svinjska groznica, takođe poznata kao svinjska kolera ili svinjska kuga, je jedna od bolesti koja mora biti beležena nacionalno, na EU-nivou kao i u Svetskoj organizaciji za zdravlje životinja (OIE) u Parizu po pojavi u bilo kojoj državi članici. Klasična svinjska groznica je uzrokovana malim RNK virusom sa omotačem rodaPestivirusu porodiciFlaviviridae.Prirodni domaćini virusa svinjske groznice su samo domestifikovane i divlje vrste svinja (npr. evropski divlji vepar).

[0003] Pokušaji su vršeni unutar Evropske Unije da se CSF izbriše preko rigoroznih mera bez profilaktičke vakcinacije, koja je zabranjena od 1990. Uprkos zabrani, vakcinacija predstavlja zakonski odobrenu opciju kao hitne vakcinacije u slučajevima kada se javlja svinjska groznica. U takvom slučaju vakcinacija bi trebalo da se odvija preko jednog od planova hitne vakcinacije, koji su ratifikovani od strane Evropske Unije (videti čl. 19 Direktive 2001/89/EC). Do sada, Rumunija je jedina država u kojoj se izvodi hitna vakcinacija. Razlozi za takvu ograničenu primenu leže u tehničkim ograničenjima marker vakcina dostupnih trenutno, kao što su ograničenja u efikasnosti vakcine, pored trgovinskih barijera vezanih za konvencionalno vakcinisane životinje (ograničenje na nacionalno tržište). Efikasnost licenciranih marker vakcina ne može se porediti sa modiflkovanim živim vakcinama, koje ispoljavaju značajne prednosti, i takve inaktivirane vakcine ili subjedinične vakcine ni u kom slučaju nisu pogodne za hitnu vakcinaciju zbog kasnije pojave imuniteta i potrebe za revakcinacijama.

[0004]Imajući u vidu širenje Evropske Unije ka državama istočne Evrope i stalno rastuću globalizaciju, razmatrane su nove strategije za potencijalnu hitnu vakcinaciju, koje imaju ulogu u prevenciji velikih razmera kod životinja i povezanih ekonomskih gubitaka (Leifer et al., 2009). Prema tome postoji značajna potreba za visoko efikasnom vakcinom koja omogućava serološku diferencijaciju između vakcinisanih i nevakcinisanih životinja i pored toga dalje ispoljava sve prednosti tradicionalnih modifikovanih živih vakcina.

[0005]Zbog toga što marker vakcine prve generacije, koje su zasnovane na E2 glikoproteinu CSF virusa imaju samo ograničenu dostupnost i teške nedostatke kao što su uslovi skladištenja, troškovi, efikasnost, postoji velika potreba za novim marker vakcinama. Različiti kandidati za takve vakcine su ispitivani, kao što su DNK vakcine, imunogeni peptidi, vektorske vakcine, delecioni mutanti i himerni virusi groznice (Beer et al, 2007; Dong and Chen, 2007). Većina od ovih kandidata marker vakcina ispoljavaju nedostatak da su proizvedene preko modernih postupaka genetičke modifikacije. Zbog značajnog straha potrošača od genetički modifikovanih proizvoda, pored komplikovanih procedura prijema, genetički modifikovane vakcine ispoljavaju značajne nedostatke.

[0006]Tradicionalne vakcine usmerene protiv CSFV obuhvataju modifikovane žive vakcine. Takve vakcine su visoko efikasne posle jedne primene, ali ne omogućavaju diferencijaciju između vakcinisanih i inficiranih životinja na osnovu serološkog profila. Mnoge od ovih vakcina su zasnovane na klasičnom virusnom soju "C" ili njegovom derivatu (takozvane "vakcine C soja"). Pored toga, postoje vakcine na bazi japanskog virusnog soja "guinea pig exultation-negative (GPE-)", "Thiverval" soja i "Mexican PAV" soja, od kojih su svi korišćeni kako u regionalnim tako i u međunarodnim uslovima (Blome et al, 2006; Greiser-Wilke & Moennig, 2004; van Oirschot, 2003). Postoje brojni podaci vezani za upotrebu vakcina na bazi C soja. Poznato je da se četiri dana posle primene vakcine, može demonstrirati potpuna zaštita životinja od infekcije virulentnim CSFV. Pored toga, sedam dana posle vakcinacije, potpuna zaštita je obezbeđena od vertikalnog prenošenja virusa kod nosećih životinja (de Smit et al, 2001).

[0007]Značajan nedostatak poznatih modifikovanih živih vakcina je apsolutna nesposobnost da se serološki napravi razlika između vakcinisanih i inficiranih životinja. U svetlu ovoga, jedan zadatak predmetnog pronalaska je obezbediti modifikovanu živu vakcinu koja omogućava razlikovanje između vakcinisanih i inficiranih životinja.

[0008]U oblasti marker vakcina, u stanju tehnike su poznate takozvane subjedinične vakcine, koje su zasnovane na rekombinantnom glikoproteinu E2 virusa CSFV. Test razlikovanja za takve vakcine je enzimski-vezana imunosorbent analiza (ELISA), u kojoj su antitela usmerena protiv E<ms>glikoproteina korišćena za indirektnu detekciju infekcija CSF virusom. Trenutno, samo jedna E2-subjedinična vakcina je dostupna na tržištu, međutim, licenca je suspendovana na nekoliko meseci (videti izveštaj EMA o E2 subjediničnim vakcinama).

[0009]Bez obzira na nemogućnost da se prodaju takvi proizvodi, takvi sistemi ispoljavaju ozbiljne biološke nedostatke. Jedan takav nedostatak je taj što su najmanje dve parenteralne imunizacije potrebne pre nego što je obezbeđena potpuna zaštita, koja čini takve vakcine potpuno nekompatibilnim sa "vakcinacijama preko mamca", gde su životinje hranjene u jednoj dozi sa vakcinom u vidu mamca. Pored toga, kampanje vezane za hitnu vakcinaciju su razumne samo kada se vrši zaštita protiv divljeg tipa CSFV. U različitim eksperimentima upotrebom E2 subjediničnih vakcina, potpuna zaštita od vertikalnog prenošenja nije postignuta. Dodatni nedostatak takvih sistema je taj što se antitela usmerena protiv glikoproteina E<ms>koriste za serološku diferencijaciju i što je osetljivost i specifičnost takvih test sistema bila samo umerena (Floegel-Niesmann, 2003).

[0010]Žive atenuirane CSF vakcine su poznate u tehnici, ali su do sada ometane različitim nedostacima. Većina vakcina opisanih u stanju tehnike sadrže stranu DNK i generisane su upotrebom postupaka genetičkog inženjeringa, koji su inače poznati kao tehnologija rekombinantne DNK, na taj način povezujući ozbiljne probleme procene rizika za životnu sredinu sa proizvodom. Poznate su druge varijante CSFV gde su aminokiseline supstituisane ili deletirane iz divljeg tipa TAV epitopa (WO 2010/074575 A2). Međutim, aminokiselinski ostaci i/ili nukleotidi koji su modifikovani u predmetnom pronalasku nisu opisani niti sugerisani u stanju tehnike.

[0011]Višestruko pasažiranje je takođe korišćeno za generisanje virusnih varijanti, koje se mogu koristiti kao vakcine, iako pritisak antitelima nije prethodno primenjivan. Višestruko pasažiranje kultura inficiranih virusom u cilju generisanja varijanti kao što su opisane u stanju tehnike je prema tome ograničeno time što je potrebno da se izvede veliki broj pasažiranja kulture i takođe nedostatkom kontrole u odnosu na koju bi epitop trebalo daje modifikovan (Hulst et al).

[0012]Kortekaas et al opisuju genetički stabilnu, živu atenuiranu CSF vakcinu, koja omogućava serološku diferencijaciju inficiranih od vakcinisanih životinja. Mutirani C-soj je genetički modifikovan upotrebom ciljanog pristupa, gde je korišćena tehnologija rekombinantne DNK za uvođenje delecija u protein E2 virusa CSFV. Dodatne mutacije su zatim stečene na različitim lokacijama unutar genoma virusa preko višestrukih pasažiranja da bi se stvorili sojevi koji ispoljavaju povećanu proliferaciju. Sojevi opisani u Kortekaas et al su virusi dobijeni generičkim inženjeringom, što je značajna prednost u svetlu komplikovanih procesa za prihvatanje za oslođanje genetički modifikovanih proizvoda u životnu sredinu.

[0013]Holinka et al opisuju dvostruki antigeni marker živi atenuirani CSFV soj "FlagT 4vn" koji je dobijen kombinovanjem dve genetičke determinante atenuacije. FlagT4v ima pozitivni antigeni marker, sintetički Flag epitop, uveden preko 19-merne insercije u El glikoprotein; i negativni marker koji je rezultat mutacija vezujućeg mesta epitopa monoklonskog antitela WH303 (mAbWH303) u E2 glikoproteinu. Intranazalna ili intramuskularna primena svinje zaštićene sa FlagT4v protiv virulentnog CSFV Brescia soja rano (2 ili 3 dana), i kasno (28 dana) posle inokulacije. Odgovor antitela indukovan sa FlagT4v kod svinja reagovao je snažno na Flag epitop, ali nije uspeo da inhibira vezivanje mAbWH303 za sintetički peptid koji predstavlja WH303 epitop. Vakcina opisana u Holinka odnosi se na virus dobijen genetičkim inženjeringom koji ispoljava stranu DNK unutar svog genoma (Flag-Tag sekvenca pored povezane vektorske sekvence i markera). Ovo predstavlja značajan nedostatak u poređenju sa predmetnim pronalaskom, koji ne ispoljava stranu ili rekombinantnu DNK.

[0014]Dokument WO 2007/143442 A2 opisuje efekte mutacija unutar epitopa WH303 E2 virusa CSFV, koje menjaju aminokiselinsku sekvencu virulentnog Brescia CSFV progresivno ka homolognoj aminokiselinskoj sekvenci BVDV soja NADL. Životinje inficirane virusnim mutantima su zaštićene kada su izlagane virulentnom Brescia virusu 3 i 21 dan posle vakcinacije. Modifikacija na ovom mestu unutar WH303 epitopa takođe omogućava razvoj dijagnostičkog testa za diferencijaciju vakcinisanih od inficiranih životinja. Uprkos ovim efektima, mutacije su uvedene upotrebom genetičkog inženjeringa, prema tome uvođenjem stranog genetičkog materijala u virusnu vakcinu.

[0015]Gore navedeno stanje tehnike opisuje vakcine koje su dobijene inženjeringom preko rekombinantne genetičke tehnologije da bi se proizveli virusni sojevi. Kao što je opisano u prethodnom tekstu, vakcine dobijene genetičkim inženjeringom su povezane sa problemima bezbednosti za životnu sredinu i prema tome su ometene komplikovanim protokolima prihvatanja i straha u javnosti, na taj način predstavljajući značajan nedostatak za njihovu upotrebu.

Rezimepronalaska

[00161U svetlu stanja tehnike tehnički problem koji je u osnovi predmetnog pronalaska je obezbediti marker vakcinu za domestifikovane i divlje svinje koji omogućava zaštitu od virusa klasične svinjske groznice, koja omogućava diferencijaciju između vakcinisanih i inficiranih životinja, koja je poželjno proizvedena pomoću konvencionalnih tehnologija. U poželjnom primeru izvođenja marker vakcina nije proizvedena preko tehnologije rekombinantne genetičke modifikacije.

[0017]Ovaj problem je rešen karakteristikama nezavisnih patentnih zahteva. Poželjni primeri izvođenja predmetnog pronalaska su obezbeđeni zavisnim patentnim zahtevima.

[0018]Pronalazak se prema tome odnosi na marker vakcinu za profilaktički tretman klasične svinjske groznice koja sadrži modifikovani živi atenuirani virus klasične svinjske groznice.

[0019]U poželjnom primeru izvođenja pronalazak se dalje odnosi na marker vakcinu za profilaktički tretman klasične svinjske groznice koja sadrži modifikovani živi atenuirani virus klasične svinjske groznice, koja je naznačena time što virusna aminokiselinska sekvenca TAV-epitopa proteina E2 sadrži različitu sekvencu od one kod divljeg tipa virusa klasične svinjske groznice, pri čemu virusna aminokiselinska sekvenca ispoljava najmanje jednu od sledećih supstitucija:

- supstitucija aminokiseline 830 u valin,

- supstitucija aminokiseline 833 u serin,

- supstitucija aminokiseline 839 u glicin.

[0020]U poželjnom primeru izvođenja marker vakcina prema predmetnom pronalasku je okarakterisana time što modifikovani virus ne ispoljava rekombinantne nukleinsko kiselinske sekvence.

[0021]U poželjnom primeru izvođenja marker vakcina prema predmetnom pronalasku je okarakterisana time što virusna nukleotidna sekvenca ispoljava jednu ili više od sledećih supstitucija:

- supstitucija na nukleotidnom položaju 2862 u T,

- supstitucija na nukleotidnom položaju 2870 u T,

- supstitucija na nukleotidnom položaju 2889 u G.

[0022]U poželjnom primeru izvođenja marker vakcina prema predmetnom pronalasku je okarakterisana time što virusna aminokiselinska sekvenca ispoljava jednu ili više od sledećih supstitucija:

- supstitucija aminokiseline 426; u proteinu E<RNS>; u valin,

- supstitucija aminokiseline 576; u proteinu El; u histidin,

- supstitucija aminokiseline 583; u proteinu El; u glutaminsku kiselinu,

- supstitucija aminokiseline 951: u proteinu E2; u izoleucin.

[0023]U poželjnom primeru izvođenja marker vakcina prema predmetnom pronalasku je okarakterisana time što virusna nukleotidna sekvenca ispoljava jednu ili više od sledećih supstitucija:

- supstitucija na nukleotidnom položaju 1649 u G,

- supstitucija na nukleotidnom položaju 2099 u C,

- supstitucija na nukleotidnom položaju 2122 u G,

- supstitucija na nukleotidnom položaju 3225 u T.

[0024]U poželjnom primeru izvođenja marker vakcina prema predmetnom pronalasku je okarakterisana time što virusna aminokiselinska sekvenca TAV-epitopa sadrži sekvencu prema SEQ ID NO. 3 ili SEQ ID NO. 4.

[0025]U poželjnom primeru izvođenja marker vakcina prema predmetnom pronalasku je okarakterisana time što virusna nukleotidna sekvenca sadrži sekvencu prema SEQ ID NO. 1.

[0026]U sledećem primeru izvođenja marker vakcina prema predmetnom pronalasku je okarakterisana time što subjekti tretirani vakcinom kao što je ovde opisana mogu biti diferencirani od subjekata inficiranih virusom povezanim sa bolešću svinjske groznice preko analize bioloških uzoraka dobijenih od navedenih subjekata upotrebom seroloških i/ili genomskih analitičkih postupaka.

[0027]U sledećem primeru izvođenja marker vakcina prema predmetnom pronalasku je okarakterisana time što je genomski analitički postupak zasnovan na lančanoj reakciji polimeraze (PCR), poželjno PCR u realnom vremenu, gde se koriste prajmeri i/ili probe koji prepoznaju virusnu nukleotidnu sekvencu koja je modifikovana i/ili povezana sa bolešću.

[0028]U sledećem primeru izvođenja marker vakcina prema predmetnom pronalasku je okarakterisana time što je serološki analitički postupak zasnovan na enzimskoj imunološkoj analizi (EIA), poželjno enzimski-vezanoj imunosorbent analizi (ELISA), gde se koriste antitela koja se vezuju specifično za TAV-epitop koji je modifikovan i/ili povezan sa bolešću.

[00291 Sledeći aspekt pronalaska se odnosi na marker vakcinu, poželjno kao što je opisana ovde, koja se može dobiti generisanjem virusnih „escape" varijanti povezanih sa bolešću ili drugih poznatih sojeva virusa svinjske groznice primenom pritiska antitelima.

[0030] Sledeći aspekt pronalaska se odnosi na postupak za proizvodnju modifikovanog živog atenuiranog soja vakcine virusa klasične svinjske groznice, poželjno kao što je opisano ovde, koji sadrži generisanje „escape" varijanti koje su povezane sa bolešću ili drugih poznatih sojeva virusa svinjske groznice primenom pritiska antitelima.

[0031] U poželjnom primeru izvođenja postupak za proizvodnju kao što je ovde opisan je okarakterisan time što postupak sadrži: - višestruko pasažiranje ćelija, poželjno embrionalnih ćelija bubrega praseta, inficiranih sa virusom povezanim sa bolešću svinjske groznice u ćelijskoj kulturi, i - istovremenu primenu antitela usmerenih protiv TAV-epitopa proteina E2 virusa povezanog sa bolešću svinjske groznice i/ili poliklonskim serumom zeca imunizovanim sa CTAVSPTTLRTEVVK-peptidom.

[0032] Pronalazak se dalje odnosi na farmaceutsku kompoziciju koja sadrži marker vakcinu kao što je opisana ovde zajedno sa farmaceutski prihvatljivim nosačem.

[0033] Sledeći aspekt pronalaska se odnosi na marker vakcinu kao što je ovde opisana za upotrebu kao lek u profilaktičkom tretmanu (vakcinaciji), poželjno preko intramuskularne injekcije ili oralne primene, klasične svinjske groznice.

[0034] Sledeći aspekt pronalaska se odnosi na postupak za profilaktički tretman (vakcinaciju) klasične svinjske groznice koji sadrži primenu marker vakcine kao što je opisana ovde na subjekta, poželjno svinju, poželjno preko intramuskularne injekcije ili oralne primene.

[0035] Sledeća uobičajena situacija u kojoj klasična svinjska groznica zahteva vakcinaciju je kao odgovor na detekciju prirodne virusne infekcije u populacijama svinja. Kada se infekcija svinja javi, tako da je virus klasične svinjske groznice prisutan kod divljih ili domestifikovanih svinja, potrebna je hitna vakcinacija okolnih i/ili susednih populacija svinja. Vakcinacije su zatim izvođene do 1 do 2 godine svih svinja u okolnom regionu, bilo da su divlje ili domestifikovane, u cilju izbegavanja izbijanja infekcije virusom svinjske groznice velikih razmera. Marker vakcina prema predmetnom pronalasku je idealno podešena za hitnu vakcinaciju u slučaju detekcije ili izbijanja svinjske groznice. Marker vakcina, pored preko injekcije, olakšava brzu i efikasnu primenu preko oralnih puteva, i omogućava razlikovanje između životinja inficiranih prirodnim virusom (povezan sa groznicom) i vakcine.

Detaljan opis pronalaska

[0036]Razvoj vakcine prema predmetnom pronalasku nije zasnovan na postupcima genetičke modifikacije, već pre na principu da će se virus sam modifikovati na adaptivan način kada se postavi pod selektivni pritisak antitelima. Predmetni pronalazak se prema tome odnosi na negenetički modifikovanu živu vakcinu koja obezbeđuje zaštitu od virulentnog CSFV, koja ima sve potrebno za marker vakcinu (serološki i genetički posebna). Marker vakcina je dobijena inženjeringom primenom selektivnog pritiska antitelima na različite C-sojeve u ćelijskoj kulturi. Generisane varijante poseduju poželjno tri aminokiselinske izmene u E2 TAV epitopu i dve kompenzatorne izmene u El proteinu. Stabilnost ovih varijanti je dokazana pomoću više od deset pasaža ćelijske kulture u roler bubnjevima i npr. intramuskularna vakcinacija svinja je dovela do potpune zaštite od visoko virulentnog kontrolnog soja. Pored toga, direktna diferencijacija inficiranih i vakcinisanih životinja je omogućena pomoću seroloških i/ili genetičkih tehnika, na primer pomoću posebnih sistema imunofluorescentnog bojenja i lančane reakcije polimeraze-reverzne transkripcije u realnom vremenu (rRT-PCR). Takođe, indirektna diferencijacija inficiranih i vakcinisanih životinja bi se mogla postići optimizacijom komercijalnih E2-ELISAs (npr. promenom praga vrednosti) ili razvojem TAV-specifičnih peptid-ELISA sistema. Na taj način, predstavljena je negenetički modifikovana živa marker vakcina protiv CSFV.

[0037]Proizvodnja vakcine prema predmetnom pronalasku se odvija na sledeći način:

[0038]Prirodne „escape" varijante C-soja "Riems" su izabrane u sistemu ćelijske kulture (IFN-embrionalne ćelije bubrega praseta) preko pasažiranja C-soja virusa u toku primene E2-TAV specifičnih antitela i poliklonskog seruma zeca imunizovanog sa CTAVSPTTLRTEVVK-peptidom.

[0039]Primenjena antitela, pored antitela sadržanih u poliklonskom serumu zeca tretiranog peptidom, prepoznaju TAV-epitop u proteinu E2 virusa CSF specifično, i preko vezivanja za ovaj epitop neutralizuju CSF (C-soj) virus. CSFV ispoljava visoki stopu mutacija zbog prirode njihove RNK. Pod selekcionim pritiskom obezbeđivanja neutralizujućih antitela, izabrani su virusi, koji prolaze kroz mutacije u epitopu za koji se vezuju antitela (u ovom slučaju, TAV-epitop), pri čemu su nepromenjeni virusi divljeg tipa neutralizovani. Preko višestrukog pasažiranja pod različitim koncentracijama antitela i zečjeg seruma i smešama, mogu biti izabrani različiti izolati mutiranog virusa. [00401Virusi sa supstitucijom u TAV-epitopu su prvi izabrani. Preko dodatnog pasažiranja ovih virusa pod različitim vrstama pritiska antitelima izabran je izolat, koji sadrži dve susptitucije u TAV-epitopu i jednu kompenzatornu supstituciju u El proteinu (interakcija između El i E2 je važna za strukturu virusa). Ovi virusi su postavljeni pod dodatni pritisak antitelima, koja je dovela do izolacije virusa sa tri supstitucije u TAV-epitopu pored dve kompenzatorne supstitucije u El proteinu. Rezultirajući virusi (C-soj "Riems" Q7, C-soj "Riems" S10 i C-soj "Riems" 011) sadrže supstitucije u E2 proteinu na položajima 2862, 2870 i 2889, 3225, pored promena u El proteinu na položajima 2099 i 2122, pored supstitucije u E<RNS>proteinu na položaju 1649.

[0041]Promene u nukleotidnoj sekvenci omogućavaju RT-PCR sistem u realnom vremenu, koji može da pravi razliku između varijanti (Q7, S10, 011) i prirodnih izolata.

[0042]Promene u aminokiselinskoj sekvenci omogućavaju diferencijaciju između varijanti (Q7, S10, 011) i prirodnih izolata na osnovu vezivanja antitela, pri čemu antitela korišćena za neutralizaciju (A18 antitela) se više ne vezuju za varijante, već se vezuju za sve prirodne izolate zahvaljujući visoko konzervativnom TAV epitopu u CSFV. Antitela generisana protiv modifikovane TAV peptidne sekvence (sadrži mutacije prema predmetnom pronalasku) takođe se mogu koristiti za diferencijaciju između infektivnog virusa i vakcine, pri čemu će se antitela usmerena protiv varijanti vezivati za modifikovanu virusnu vakcinu prema predmetnom pronalasku i obezbediće pozitivnu identifikaciju vakcinisanih životinja, ali se neće vezati za prirodne izolate.

[0043]Predmetni pronalazak se odnosi na modifikovani virus svinjske groznice koji može da sadrži bilo koju ili sve moguće kombinacije mutacija i supstitucija koje su ovde opisane. Primeri i eksperimentalna podrška koji su ovde dati pokazuju da su generisani virusni sojevi koji ispoljavaju samo podgrupu svih supstitucija navedenih u Tabeli 1. Ovi virusni sojevi ispoljavaju zaštitni efekat pored toga što su sposobni da se koriste kao markeri, prema tome ispunjavajući cilj predmetnog pronalaska. Poželjni sojevi prema predmetnom pronalasku se odnose na sojeve koji sadrže podgrupe opisanih supstitucija, pored onih sojeva koji ispoljavaju sve navedene supstitucije.

[0044] Bilo je potpuno iznenađujuće da bi kombinacije jedne ili više od specifičnih genetičkih modifikacija (izvedenih preko prirodnih procesa kao rezultat pritiska antitelima) dovele do korisnih osobina marker vakcine kao što je ovde opisana. Stanje tehnike otkriva neke slične modifikacije, ali ništa poznato u tehnici ne bi sugerisalo da bi određeni ostaci modifikovani u predmetnom pronalasku obezbedili naročito efikasnu zaštitu od infekcije CSFV. Njihove jedinstvene kombinacije dovode do grupe osobina opisanih tako da omogućavaju da pronalazak deluje kao vakcina sposobna da pravi razliku između inficiranih i vakcinisanih životinja.

[0045] Bilo je nepoznato da bi takav selektivni pritisak kao što je primenjen u predmetnoj prijavi preko tretmana antitelom doveo do tačne modifikacije koja je ovde opisana. Kombinacije genetičkih modifikacija kao što su ovde opisane funkcionišu zajedno, obezbeđujući sinergistički efekat kompenzatornih mutacija koje održavaju proteinsku strukturu, dok omogućavaju TAV ostacima da mutiraju i na taj način obezbede marker karakteristike tražene u predmetnom pronalasku.

[0046]Termin gentički inženjering se odnosi na genetičku modifikaciju ili manipulaciju genoma organizma, na primer uvođenjem stranog nukleinsko kiselinskog materijala, kao što je DNK ili RNK, ili sintetičkih nukleinsko kiselinskih sekvenci u genom domaćina. Ova tehnologija je takođe poznata kao tehnologija rekombinantne DNK.

[0047]Termin atenuirani virus označava virus koji je modifikovan, na bilo koji način, tako da je virus manje štetan i/ili manje virulentan u poređenju sa virusom divljeg tipa (povezan sa bolešću). Na primer simptomi povezani sa svinjskom groznicom se javljaju kod subjekata inficiranih atenuiranim virusom u poređenju sa virusom divljeg tipa.

[0048]Termin pritisak antitelima ili selektivni pritisak antitelima prema predmetnom pronalasku označava primenu antitela u toku ćelijske kulture, poželjno tokom višestrukih pasaža, koja je usmerena na jedan ili više specifičnih epitopa virusa. Takva antitela mogu biti bilo koje vrste antitela poznate u tehnici, bilo mono ili poliklonska, ili mogu biti sadržana u serumu životinja tretiranih sa peptidom od interesa, na primer ciljnim epitopom. Takva antitela su često označena terminom neutralizujuća antitela. Pod selekcionim pritiskom obezbeđivanja neutralizujućih antitela, virusi, koji prolaze kroz mutaciju u epitopu za koji se vezuje antitelo (u ovom slučaju, TAV-epitop) su izabrani zahvaljujući njihovoj prednosti rasta, jer antitela se više ne vezuju za navedeni epitop i prema tome više ne obezbeđuju ograničavajući ili neutralizujući efekat, pri čemu su nepromenjeni virusi divljeg tipa neutralizovani antitelima zatim selektivno potisnuti u kulturi.

[0049]Ti virusi, koji prolaze kroz mutaciju u epitopu za koji se vezuju antitela (u ovom slučaju, TAV-epitop), su zajednički označeni kao „escape" varijante. Ove varijante su predmet predmetnog pronalaska, i genetički i serološki se razlikuju od virusa divljeg tipa.

[0050]Termin višestruki pasaži označava praksu pasažiranja ćelijske kulture (takođe poznata kao subkultura ili razdvajanje ćelija) određeni broj puta, pri čemu je mali broj ćelija prebačen u novu posudu, poželjno sa svežim medijumom, ili razblaženjem ćelijskih kultura u novom medijumu, određeni broj puta tako daje omogućeno da ćelijske kulture nastavljaju sa rastom bez povezanih efekata visoke gustine ćelija u kulturama.

[0051]U svetlu marker vakcine, pronalazak takođe može da se odnosi na ujedinjenu grupu pronalazaka koji su povezani jedinstvenom inventivnom idejom. Marker vakcina, sam virus i njihove farmaceutske kompozicije, njihova upotreba u lečenju životinja i postupci za proizvodnju virusa svi su unutar opšte inventivne ideje. Nova i inventivna marker vakcina koja je ovde opisana omogućava i ujedinjuje sve aspekte predmetnog pronalaska, tako da različiti primeri izvođenja koji su ovde opisani su unutar jednog objedinjujućeg pronalaska.

[0052] Tamo gde su obezbeđene nukleotidne sekvence u predmetnom pronalasku, popisi sekvenci su određeni tako da obuhvate odgovarajuće RNK i DNK sekvence. Iako su neke nukleotidne sekvence obezbeđene kao DNK sekvence, odgovarajuće RNK sekvence (na primer gde virusni genom ispoljava RNK molekul) su određene tako da budu obuhvaćene u predmetnom pronalasku. Nukleotidne sekvence prema predmetnom pronalasku takođe obuhvataju sekvence komplementarne sa onim navedenim, na primer komplementarne sekvence koje bi mogle preko Watson-Crick baznog sparivanja da se vežu za navedenu sekvencu. Odgovarajuće komplementarne, RNK i/ili DNK sekvence ne zahtevaju inventivni napor da se pretvore jedna u drugu i jednostavno su nadohvat ruke stručnjaka iz date oblasti tehnike.

[0053] Postupak primene za virusnu vakcinu prema predmetnom pronalasku, kompozicije prema pronalasku kao što su farmaceutske, imunološke, antigene kompozicije ili kompozicije vakcine ili terapeutske kompozicije, mogu biti primenjivane preko parenteralnih puteva, kao što su postupci intradermalne, intramuskularne ili subkutane primene. Takva primena omogućava sistemski imuni odgovor ili humoralne ili ćelijski posredovane imune odgovore. Vakcina prema predmetnom pronalasku takođe može biti primenjivana preko oralnih puteva, kao što je preko ugradnje u hranu za životinje, omogućavajući jednostavnu i efikasnu imunizaciju velikih populacija, npr. evropskog divljeg vepra.

[0054] Poželjni postupci primene se odnose na subkutanu primenu ili intramuskularnu primenu, poželjno pomoću injekcije i oralnu primenu.

[0055] Uopštenije, inventivne kompozicije virusne vakcine ili terapeutske kompozicije mogu biti pripremljene u skladu sa standardnim tehnikama koje su dobro poznate u farmaceutskoj i veterinarskoj tehnici.

[0056] Terapeutski efikasna količina takvih kompozicija može biti primenjena u dozama i pomoću tehnika koje su poznate stručnjacima iz oblasti medicinske ili veterinarske tehnike uzimajući u obzir takve faktore kao što su starost, pol, telesna težina, vrsta i stanje određenog subjekta i put primene. Kompozicije mogu biti primenjivane pojedinačno, ili mogu biti ko-primenjivane ili uzastopno primenjivane sa kompozicijama, npr., sa "drugim" imunološkim, antigenim kompozicijama ili kompozicijama vakcine ili terapeutskim kompozicijama na taj način obezbeđujući multivalentnu ili "koktel" ili kombinaciju kompozicija prema pronalasku i postupke koje ih koriste. Ponovo, sastojci i način (uzastopna ili ko-primena) primene, kao i doze mogu biti određeni uzimajući u obzir takve faktore kao što su starost, pol, telesna težina, vrsta i stanje određenog subjekta, i, put primene. [00571 Primeri kompozicija prema pronalasku obuhvataju tečne preparate za šupljine, npr., oralna, nazalna, analna, vaginalna, peroralna, intragastrična, itd., primena kao što su suspenzije, sirupi ili eliksiri; i, preparati za parenteralnu, subkutanu, intradermalnu, intramuskularnu ili intravensku primenu (npr., injektabilna primena) kao što su sterilne suspenzije ili emulzije.

[0058] U takvim kompozicijama CSFV varijante mogu biti pomešane sa farmaceutski prihvatljivim nosačem, razblaživačem ili ekscipijentom kao što su sterilna voda, fiziološki rastvor, glukoza ili slično. Kompozicije takođe mogu biti liofilizovane. Kompozicije mogu da sadrže pomoćne supstance kao što su sredstva za vlaženje ili emulgatori, pH puferujuća sredstva, adjuvanti, gelirajući aditivi ili aditivi za povećanje viskoznosti, konzervansi, sredstva za poboljšanje ukusa, boje i slično, u zavisnosti od puta primene i željenog preparata.

Kratak opis slika

[0059]

Slika 1: Poređenja sekvenci

Slika 2: Indirektna imunofluorescentna analiza

Slika 3: VNT sa CSFV sojem Rosrath

Slika 4: Idexx E2-ELISA sa svinjskim serumom iz 06/10 studije na životinjama Detaljan opis slika

[0060] Slika 1: Poređenja sekvenci. A) Poređenje nukleotidne sekvence regiona TAV-epitopa između Q7, S10, 011 varijanti i prirodnog izolata C-soja. B) Poređenje aminokiselinske sekvence regiona TAV-epitopa između Q7, S10, 011 varijanti i prirodnog izolata C-soja.

[0061] Slika 2: Indirektna imunofluorescentna analiza. A) Analiza E2 „escape" mutanata, B5/2 pasaž 2 (prekursorni virus za Q7, S10 i 011, koji ispoljava samo 2 susptitucije u TAV-epitopu). B) analiza virusa C-soja.

[0062] Slika 3: Tri nedelje posle imunizacije sve životinje, sa izuzetkom jedne životinje u S10 grupi i jedne životinje u 011 grupi, pokazale su neutralizujuća antitela. 7 dana posle infekcije imunizovane životinje su pokazale VNT titar od 640 ili više. Najniži titar je bio 320, i pokazala ga je jedna životinja u grupi imunizovanoj TAV mutantom. Neimunizovane kontrolne životinje nisu pokazale titar u VNT protiv Rosrath.

[0063] Slika 4:Životinje imunizovane C-sojem pokazale su pozitivne rezultate u E2-ELISA 21 dan posle imunizacije. 7 dana posle infekcije sve imunizovane životinje su pokazale jasno pozitivne rezultate u ELISA. Neimunizovana kontrolna grupa nije pokazala detektabilna antitela posle infekcije.

PRI VI ERI

Dizajn eksperimenta i postupci

Imunizacija zečeva upotrebom TAV peptida

[0064]Dva zeca starosti 8-10 nedelja (ušni obeleživač 304 i 305) su imunizovana prema sledećoj šemi, upotrebom CTAVSPTTLRTEWK-peptida konjugovanog sa hemicijaninom prilepka (KLH) u cilju generisanja poliklonskog seruma neutralizujućeg C-soja. Izvedena je imunizacije i nakon nje je izvršeno 6 reimunizacija, svaka u približnim intervalima od mesec dana.

Izolacija „ escape " virusnih E2 varijanti C - soja " Riems "

[0065]U cilju stvaranja pritiska antitelima kojima se generišu mutacije virusa C-soja "Riems" u glikoproteinu E2, virus je tretiran sa različitim antitelima usmerenim protiv TAV-epitopa proteina E2, upotrebom različitih koncentracija. Inficirane ćelije su zatim inkubirane i pasažirane određeni broj puta. Antitela koja su primenjena u predstavljenim eksperimentima su monoklonska E2 specifična antitela, koja su komercijalno dostupna za E2 specifične ELISA analize CSFV viursa.

[0066]Antitela:

A18I (IDEXX)

A18B (Bommeli)

A18C (Ceditest)

HC34 (CRL, Hannover)

WH303 i WH 211 (Weybridge, Great Britain)

[00671Inkubacija virusnih kultura je izvedena prema sledećem. Različite koncentracije i smeše antitela su primenjene sa različitim količinama virusa. Inkubacija je trajala 2-6 časova na sobnoj temperaturi. Suspenzija virusa-antitela je dodata u ploče sa ćelijskom kulturom sa konfluentnim rastom ćelija i zatim inkubirana. U toku ovog vremena, virus je apsorbovan u ćelije (PK15-ćelije) u trajanju od 1-2 časa na 37°C. Konačno medijum ćelijske kulture je dodat i ploče su inkubirane 72 časa na 37°C i 5% COT.

[0068]Posle 72 časa supernatanti ćelijske kulture su pojedinačno odvojeni i čuvani. Ploče su zatim fiksirane i bojene upotrebom imunofluorescentnog bojenja i C16-antitela (specifično za NS3 protein iz CSFV). Slabo pozitivne komorice sa supernatantom ćelijske kulture su zatim pasažirane pod dodatnim pritiskom antitelima kao što je opisano u prethodnom tekstu. Supernatanti ćelijske kulture iz komorica sa pojedinačnim pozitivnim ćelijama ili pojedinačnim obojenim ćelijskim plakovima zatim su pasažirani pod veoma slabim ili bez pritiska antitelima da bi se povećao titar virusa za 1-2 pasaža. Različiti supernatanti ćelijske kulture su izabrani za sekvenciranje u El i E2 regionima.

[0069]Kontrola „escape" varijanti virusa izvedena je upotrebom imunofluorescentnog bojenja sa C16 antitelom ili A18 antitelom korišćenim za proizvodnju „escape" varijanti. Varijante virusa koje ispoljavaju promenu u TAV-epitopu više ne mogu biti bojene upotrebom A18 antitela.

Istorija pasaža

[0070]

Karakterizacija „ escape " varijantiB512 , 116 , 07 , S10 i Oll

[00711Izolovane „escape" varijante su sekvencirane u regionu El i E2 proteina. Različita imunofluorescentna bojenja su izvedena upotrebom antitela A18-idexx, A18-bommeli, A18-ceditest i C16 antitela. „Escape" varijante su pasažirane u bočicama sa kulturom tkiva (sve) i roler kulturama (Q7, S10, 011) i zatim su sekvencirane, diferencijalno bojene i titrirane.

07 specifična RT - PCR u realnom vremenu

[0072]U cilju testiranja genetičkih karakteristika virusa, i na taj način testiranja jedne od marker osobina vakcina, detekcija virusne RNK posle imunizacije sa „escape" varijantama je izvedena upotrebom prajmera i probe, koji su bili sposobni da razlikuju „escape" varijante iz originalnog C-soja "Riems" i CSFV prirodnih izolata.

Studija na životinjama 27109 - Testiranje imunog odgovora mutanata B5I2 - P6 i I16 - P2C - soja

Riems

[0073]U predstavljenim studijama na životinjama, tri praseta su imunizovana sa 2 ml suspenzije virusa (supernatant ćelijske kulture) preko intramuskularne primene. Grupisanje životinja je izvedeno na sledeći način: grupa A (B5/2), grupa B (116) i kontrolna grupa C-soja Riems (Riemser vakcina protiv svinjske groznice). Serološki test imunog odgovora je izveden za svaku grupu.

Studija na životinjama 06110 - Testiranje „ escape " varijantiQ7,S10 i Oll

[0074]Sledeće studije na životinjama su izvedene u cilju testiranja koje „escape" varijante su bile najbolje kod svinja primalaca u vezi sa odsustvom opasnih efekata i efikasnosti posle intramuskularne primene.

[0075]21 prase starosti 8-9 nedelja (približno 15-20 kg) je korišćeno u studiji. Svako prase je imunizovano sa 2 x IO5 0 KlDso/ml, i.m.

Testirano je 5 grupa:

[0076]Podaci vezani za telesnu temperaturu i kliničke simptome dobijani su jednom dnevno.

Studija na životinjama 24 / 10 — Testiranje „ escape " varijanti S10 i Oll; zaštita posle oralne

imunizacije

[0077] U cilju testiranja efikasnosti oralne primene, izvedena je sledeća studija na životinjama.

15 prasića je korišćeno kao test životinje, koje su bile 8-10 nedelja starosti (približno

15-20 kg).

[0078]Podaci vezani za telesnu temperaturu i kliničke simptome su dobijani jednom dnevno.

Eksperimentalni rezultati

Imunizacija zečeva sa TA V - peptidom

[0079]Oba zečja seruma (304 i 305) bila su pozitivna u komercijalno dobijenom E2-ELISA testu posle treće reimunizacije (približno 12 nedelja posle prve imunizacije). U testu neutralizacije virusa oba seruma su bila pozitivna približno tri nedelje posle treće reimunizacije. Titri u testu neutralizacije su bili niski i dodatno smanjeni posle četvrte do šeste reimunizacije.

Izolacija „ escape " varijanti E2 C - soja Riems virusa

[00801Inkubacija C-soja Riems sa E2 specifičnim antitelima dovela je, posle samo nekoliko pasaža, do izolacije „escape" varijanti koje su ispoljile jednu supstituciju u E2 regionu na položaju 2870. Bilo je važno za izolaciju dodatnih varijanti da se takođe javila kompenzatorna promena u El proteinu na položaju 2122, na primer kao izolat 16P1. Ako su se obe promene javile istovremeno, tada je potrebno samo nekoliko pasaža pod pritiskom antitelima i serumom u cilju izolacije dodatnih varijanti koje dodatno ispoljavaju supstituciju na položaju 2889 u E2 proteinu. Neke od ovih „escape" varijanti pokazale su dodatno promenu na položaju 3225 u E2 proteinu. Primer takve „escape" varijante je izolat B5/2.

[0081]Šematski prikaz TAV-epitopa varijante B5/2:

[0082]Dodatno pasažiranje B5/2 izolata pod pritiskom antitelima dovodi do izolacije CB32 izolata. Ovaj izolat je dodatno ispoljio dodatnu susptituciju u E2 proteinu (nukleotid 2862), pored kompenzatorne supstitucije u El proteinu na položaju 2899. Izolat CB32 je nastao kao rezultat smeše varijanti B5/2 i nove varijante sa dodatnom supstitucijom. U cilju izolacije novih varijanti koje su ispoljile dodatne supstitucije, izolat CB32 je pasažiran kroz višestruke pasaže pod pritiskom antitelima. Iz kasnijeg i spojenog pasaža Hl5 izolovani su izolati Q7, S10 i Oll.

[0083]Videti Sliku 1 za poređenje sekvence TAV-epitopa S10, Oll i Q7 mutanta. Videti Tabelu 1 za prikaz nukleotidnih i aminokiselinskih supstitucija u izolovanim „escape" varijantama.

Karakterizacija „ escape " varijantiB512 , 116 , Q7 , S10 i Oll

[0084]Testiranje „escape" varijanti u vezi sa vezivanjem različitih E2 specifičnih antitela izvedeno je upotrebom imunofluorescencije.

[0085]U većini slučajeva, jedna aminokiselinska supstitucija u TAV-epitopu je bila dovoljna da obezbedi negativni signal kada se koristi imunofluorescencija sa A18Bommeli antitelom. „Escape" varijante sa dve TAV mutacije (kao što je B5/2) takođe su pokazale negativne rezultate sa A18Bommeli i A18C antitelima (Slika 2).

[0086]Svi testirani izolati su pokazali negativne signale za izabrane pasaže za A18 bojenja. Međutim, na osmom pasažu S10 izolata, mala kolonija je mogla da se boji upotrebom antitela WH303. Ovo podržava visoku stabilnost supstitucija u TAV-epitopu. Dodatni testovi stabilnosti izvedeni su za Q7, S10 i Oll izolate, upotrebom roler kultura tokom 10 dodatnih pasaža.

[0087]Na desetom pasažu, nije bilo virusnih varijanti koje pokazuju reverziju, tako daje bojenje bilo moguće samo sa C16. Varijanta Q7 je bila negativna za sva bojenja do četrnaestog pasaža, pri čemu šesnaesti pasaž takođe nije mogao da se detektuje sa C16 antitelom. Ovi nalazi su potvrđeni upotrebom RT-PCR pored sekvencirajućih PCR protokola. Prema tome bilo je jasno da virus nije prisutan na šesnaestom pasažu, tako da greška u pasažiranju takođe može biti isključena. Neke ćelije bi međutim mogle biti bojene u četrnaestom i šesnaestom pasažu S10 izolata upotrebom A18 (idexx) antitela. Za mutant Oll, 16 pasaža je izvedeno pre nego što su neke pojedinačne ćelije mogle biti obojene upotrebom A18 (bommeli) i WH303 antitela. Ovi rezultati pokazuju visoku stabilnost seroloških karakteristika virusnih vakcina kao što su ovde opisane.

Karakterizacija ., escape " varijanti preko sekvenciran ja El i E2

[0088]

[0089]Supstitucija na položaju 2870 je održavana u svim izolatima posle 10 pasaža, koja izgleda daje veoma stabilna. Ovo podržava zaključak da ova određena supstitucija nema veliki efekat na strukturu proteina, tako da reverzija sekvence divljeg tipa ne obezbeđuje korist.

[0090]Promene u sekvenci u izolatima Oll, S10 i Q7 bile su stabilne za sve testirane pasaže (14-17).

[0091]Svi sekvencirani pasaži virusa tri varijante sadržale su susptitucije u El i E2 proteinima koji su indukovani pomoću imunog pritiska. Šesnaesti pasaž Q7 ne bi mogao da bude sekvenciran, verovatno zato što u supernatantu ćelijske kulture nije bilo preostalog virusa (videti u prethodnom tekstu). U slučaju da se revertantni virusi ne javljaju, što se na osnovu različitog bojenja na Slici 2 ne može isključiti, oni su detektabilni samo sekvenciranjem od određenog procenta. Velika većina virusa međutim nije revertirana i ostaje supstituisana. Pojedinačni revertirani virusi ne bi mogli biti detektovani sekvenciranjem.

07 specifična RT - PCR u realnom vremenu

[0092] U cilju diferencijacije između vakcinisanih i inficiranih žvitoinja, primenjen je RT-PCR sistem. Zbog toga što je TAV-epitop visoko konzervativan kod svih CSF virusa, supstitucije u TAV-epitopu su korišćene kao osnova za prajmere i probe u PCR analizi u realnom vremenu.

[0093]Koncentracija virusa je određena upotrebom RT-PCR u realnom vremenu. Sistem CSF-mešavine 1 prepoznao je sve CSFV sojeve i nije pravio razliku između C-soja divljeg tipa i novih „escape" varijanti. Q7-TAV sistem je prepoznao sve tri „escape" varijante specifično. C-soj-TAV sistem je samo prepoznao C-soj divljeg tipa (nijednu od „escape" varijanti), sa ct vrednošću od približno 14.

[0094]Veoma malo smanjenje u razlici u Ct vrednostima između Q7-TAV RT-PCR sistema i C-soj-TAV sistema sa rastućim brojem pasaža obezbedilo je snažan dokaz za veoma malu količinu revertanata posle visokog broja pasaža. Uopšteno, razlika između dva sistema 14 Ct vrednosti predstavlja odnos mutanata prema revertantima od približno 1:8000, pri čemu Ct vrednost od 10 predstavlja od 1:1000.

Studija na životinjama 27 / 09 — Ispitivanje imunog odgovora mutanata B5I2 - P6 i 116 -

P2C - soja Riems virusa

[0095]Intramuskularna imunizacija je izvedena sa 3 praseta, pri čemu je svako prase primilo 2 ml suspenzije virusa (supernatant ćelijske kulture). Grupa A je tretirana sa B5/2, grupa B je tretirana sa 116 i kontrolna grupa je tretirana sa Riemser vakcinom protiv svinjske groznice. Ove studije su obezbedile analizu imunog odgovora posle imunizacije, test marker karakteristika vakcinacije posle modifikovanog imunog odgovora (ELISA) i test karakteristika virusa kod vakcinisanih životinja (genetička stabilnost i karakteristike replikacije).

[0096]Povratna titracija primenjenih virusa obezbedila je sledeće rezultate:

Tolerancija životinja na vakcinu

[0097]Tretirane svinje nisu pokazale očigledne simptome posle imunizacije (nije bilo groznice ili simptoma bolesti). Broj leukocita nije povećan iznad normale prvih 7 dana posle imunizacije.

[0098]Virus ne bi mogao da bude izolovan iz krvi. RNK izolovana iz uzoraka krvi 4 dana i 7 posle imunizacije je korišćena za RT-PCR analizu. PCR proizvod je međutim bio nestabilan za kasnije sekvenciranje. Ovo pokazuje veoma nisku stopu replikacije virusa u životinjama.

Studija na životinjama 06110 — Testiranje „ escape " varijanti 07 , S10 i Oll

[0099] Povratna titracija je otkrila sledeće koncentracije virusa, koje su korišćene u eksperimentima:

[0100]Posle imunizacije, nije bilo promena u telesnoj temperaturi niti u simptomima bolesti tipičnim za svinjsku groznicu.

Klinička analiza posle test infekcije

[0101] Groznica je definisana kao rektalna telesna temperatura od >40°C najmanje dva uzastopna dana.

[0102]U grupi 1 sporadično su se povećala merenja temperature između trećeg i trinaestog dana posle test infekcije, koja međutim nisu bila povezana za bilo koje drugo vidljivo pogoršanje zdravlja životinjskim subjekata. Samo životinja br. 4 je pokazala groznicu tokom 4 dana.

[0103]Grupa 2 je pokazala sporadična povećanja u temperaturi kod 3 tretirane životinje, pri čemu je životinja br. 9 pokazala značajno visoke temperature.

[0104]U grupi 3 samo životinja br. 14 je pokazala povećanu telesnu temperaturu sa groznicom četvrtog i petog dana posle test infekcije.

[0105]Životinje iz grupe 4 nisu pokazale groznicu, pri čemu sporadično povećanje temperature je mereno kod 2 tretirane životinje.

[0106]Sve životinje iz grupe 5 pokazale su groznicu između drugog i sedmog dana posle infekcije. Kao posledica značajnih simptoma svinjske groznice sve životinje iz grupe 5 su žrtovane 7 dana posle infekcije. Najčešći simptomi su bili efekti na centralni nervni sistem (pareza i ataksija zadnje noge, dijareja, konjuktivitis i pospanost). Jedna životinja je pokazala hematom kože.

[0107]Virus nije mogao da bude izolovan iz imunizovanih životinja iz brisa nosa, pri čemu nevakcinisane kontrolne životinje su testirane pozitivne kao pozitivne 7 dana posle infekcije.

RT - PCR rezultati sa uzorcima seruma

[0108]RT-PCR rezultati su pokazali da bi se posle 14 dana posle infekcije samo veoma slabi signali mogli biti dobijeni iz imunizovanih životinja kada su testirane za prisustvo virulentnog virusa povezanog sa bolešću. Međutim, nevakcinisane kontrolne životinje su pokazale snažne pozitivne signale sa pozitivnim Ct vrednostima od 30 ili manje 3 dana posle infekcije. Ct vrednosti od nevakcinisanih životinja su pale do 17 posle 7 dana.

RT - PCR rezultati iz brisa nosa

[01091RT-PCR rezultati od imunizovanih životinja su bili samo negativni. Nevakcinisane kontrolne životinje su međutim pokazale snažan pozitivan signal sa Ct vrednostima između 25 i 28, 7 dana posle infekcije.

Test neutralizacije virusa sa CSFV Alfort

[0110]Test neutralizacije virusa se odnosi na određivanje da li životinje (bilo vakcinisane ili nevakcinisane) ispoljavaju antitela koja su sposobna za neutralizaciju virulentnog virusa. Sve imunizovane grupe su pokazale neutralizujuća antitela 21 dan posle imunizacije. 7 dana posle infekcije test titar neutralizacije virusa protiv Alfort bio je 640 NDso ili više, u svim imunizovanim grupama. Jedna životinja u Ol 1 imunizovanoj grupi i jedna životinja u kontrolnoj grupi C-soja pokazala je titar od 480. Neimunizovane kontrolne životinje nisu pokazale titar virusa protiv Alfort u VNT.

Test neutralizacije virusa ( VNT ) sa CSFV Rosrath

[0111]Videti Sliku 3 za VNT sa CSFV sojem Rosrath.

[0112]Tri nedelje posle imunizacije sve životinje, sa izuzetkom jedne životinje u S10 grupi i jedne životinje u Oll grupi, su pokazale neutralizujuća antitela. 7 dana posle infekcije imunizovane životinje su pokazale generalno titar VNT od 640 ili veći. Najniži titar je bio 320, koji je pokazala jedna životinja u grupi imunizovanoj TAV mutantom. Neimunizovane kontrolne životinje nisu pokazale titar u VNT protiv Rosrath.

E2 - ELISA ( idexx )

[0113]E2-ELISA je komercijalno dostupan ELISA-komplet za testiranje za prisustvo klasične svinjske groznice. U prošeku, životinje imunizovane C-sojem pokazale su pozitivne rezultate u E2-ELISA 21 dan posle imunizacije. Životinje koje su imunizovane sa TAV mutantima takođe su pokazale pozitivne rezultate posle 7 dana u idexx E2-ELISA. Neimunizovana kontrolna grupa nije pokazala detektabilna antitela posle infekcije.

[0114]Videti Sliku 4 za Idexx E2-ELISA sa serumom svinje.

[0115]U E2-ELISA, rezultati za TAV mutante pre infekcije bili su pozitivni, ali ne snažni, pri čemu posle infekcije rezultati postaju snažno pozitivni, što sugeriše snažan imunizacioni efekat. Kontrolne životinje imunizovane C-soj em su bile snažno pozitivne u E2-ELISA pre infekcije.

[0116]Rezultati životinja imunizovanih sa TAV mutantima su uporedivi sa životinjama imunizovanim sa kontrolnom grupom C-soja. Izolacija virusa posle infekcije je bila negativna i RT-PCR rezultati su bili sumnjivi ili slabo pozitivni, što je takođe pokazano u kontrolnoj grupi C-soja. Sve životinje su pokazale visoke titre u testu neutralizacije virusa protiv Alfort pored Rosrath. Sve imunizovane životinje su pokazale potpunu zaštitu protiv infektivnog virusnog soja Koslov četiri nedelje posle intramuskularne imunizacije.

Studija na životinjama 24110 - Testiranje „ escape " varijanti S10 i Oll; zaštita posle

oralne imunizacije

[0117]U cilju testiranja efikasnosti oralne primene, izvedena je sledeća studija na životinjama. 15 prasića je korišćeno kao test životinje, koje su bile 8-10 nedelja starosti (približno 15-20 kg).

Doza vakcine i eksperimentalni dizajn:

Grupa 1 (6 svinja): mutanti A varijante S10 (IO<5>KIDso/ml) C-soja

Grupa 2 (6 svinja): mutanti B varijante Oll (10<4>KIDso/ml) C-soja

Grupa 3 (3 svinje): Infektivna kontrola (nevakcinisane)

[0118]Grupa 1: sve životinje ove grupe su bile potpuno zaštićene pre test infekcije. Nisu detektovani simptomi povezani sa infekcijom. Sve životinje su pokazale neutralizujuća antitela, koja su bila detektabilna pomoću VNT i ELISA testova.

[0119]Grupa 2: Životinje u grupi 2 pokazale su mešavinu zaštite i infekcije. 2 životinje su pokazale simptome bolesti, kao što su visoka temperatura i drugi tipični simptomi svinjske groznice. Pogođene životinje su eutanizirane. Zaštićene životinje su pokazale neutralizujuća antitela, koja su bila detektabilna pomoću VNT i ELISA testa.

[0120]Grupa 3: Sve životinje su inficirane i pokazle su simtome bolesti. Pogođene životinje su eutanizirane.

[0121]Studija oralne imunizacije pokazala je da oralna imunizacija, naročito upotrebom S10 mutanta, dovodi do efikasne zaštite od infekcije. Oll izolat je takođe pokazao korisne rezultate, s obzirom da je doza vakcinacije bila smanjena u poređenju sa varijantom virusa S10.

Literatura:

[0122]Council Directive 2001/89/EC of 23 October 2001 on Communitv measures for the control of classical swine fever (2001): Official Journal of the European Communities L 316, 5-35.

Diagnostic Techniques and Vaccines for Foot-and-Mouth Disease, Classical Swine Fever, Avian Influenza and some other important OlE List A Diseases (2003a): Report of the Scientific Committee on Animal Health and Animal Welfare Adopted 24-25th April 2003 , 1-150.

Report on the evaluation of a new classical swine fever discriminatorv test(2003/265/EC)

(2003b).

Commission Decision of 23 November 2006 approving the plans for the eradication of classical swine fever in feral pigs and the emergencv vaccination of those pigs and of pigs in holdings against that disease in Romania (2006/802/EC) (2006): Official Journal of the European Union L329, 34-37.

Beer, M, Reimann, I, Hoffmann, B, Depner, K (2007): Novel marker vaccines against classical swine fever. Vaccine 25 (30): 5665-5670.

Blome, S, Meindl-Bohmer, A, Loeffen, W, Thuer, B, Moennig, V (2006): Assessment of classical swine fever diagnostics and vaccine performance. Rev Sci Tech 25 (3): 1025-1038.

de Smit, AJ, Bouma, A, Van Gennip, HG, de Kluijver, EP, Moormann, RJ (2001): Chimeric (marker) C-strain viruses induce clinical protection against virulent classical swine fever virus (CSFV) and reduce transmission of CSFV between vaccinated pigs. Vaccine 19(11-12): 1467-1476.

Dong, XN, Chen, YH (2007): Marker vaccine strategies and candidate CSFV marker vaccines. Vaccine 25 (2): 205-230.

Floegel-Niesmann, G (2003): Marker vaccines and companion diagnostic tests for classical swine fever. Dev Biol (Basel) 114, 185-191.

Greiser-Wilke, I, Moennig, V (2004): Vaccination against classical swine fever virus: limitations and new strategies. Anim Health Res Rev 5 (2): 223-226.

Leifer, I, Lange, E, Reimann, I, Blome, S, Juanola, S, Duran, JP, Beer, M (2009): Modified live marker vaccine candidate CP7_E2alf provides early onset of protection against lethal challenge infection with classical swine fever virus after both intramuscular and oral immunization. Vaccine.

Van Oirschot, JT (2003): Vaccinologv of classical swine fever: from lab to field. Vet Microbiol 96 (4): 367-384.

Vandeputte, J, Chappuis, G (1999): Classical swine fever: the European experience and a guide for infected areas. Rev Sci Tech 18 (3): 638-647.

Diagnostic Techniques and Vaccines for Foot-and-Mouth Disease, Classical Swine Fever, Avian Influenza and some other important OIE List A Diseases.: European

Commission, Directorate-General for Health and Consumer Protection, Brussels; 2003 p. 1-150.

Koenig P, Lange E, Reimann I, Beer M. CP7_E2alf: a safe and efficient marker vaccine strain for oral immunisation of wild boar against Classical swine fever virus (CSFV). Vaccine 2007 Apr 30;25(17):3391-9.

Floegel-Niesmann G. Classical swine fever (CSF) marker vaccine. Trial III. Evaluation of discriminatorv ELISAs. Vet Microbiol 2001 Nov 8;83(2): 121-36. D. Luetticken, C. Drexler, N. Visser and V. Kaden, The relevance of CSF marker vaccines for field use, Proceedings of OIE svmposium on classical swine fever (Hog Cholera) Birmingham, U.K., July 9-10 (1998).

J.T. van Oirschot, Diva vaccines that reduce virus transmission, J Biotechnol 73 (2- 3)

(1999), pp. 195-205.

A. Uttenthal, M.F. Le Potier, L. Romero, G.M. DeMia and G. Floegel-Niesmann, Classical swine fever (CSF) marker vaccine Trial I. Challenge study in weaner pigs, Vet Microbiol 83 (2) (2001), pp. 85-106.

K.R. Depner, A. Bouma, F. Koenen, D. Klinkenberg, E. Lange and H. de Smit et al., Classical swine fever (CSF) marker vaccine Trial II: Challenge study in pregnant sows, Vet Microbiol 83 (2) (2001), pp. 107-120.

AJ. de Smit, H.G. van Gennip, G.K. Miedema, P.A. van Rijn, C. Terpstra and RJ. Moormann, Recombinant classical swine fever (CSF) viruses derived from the Chinese vaccine strain (C-strain) of CSF virus retain their avirulent and immunogenic characteristics, Vaccine 18 (22) (2000), pp. 2351-2358.

Yan Li et al, A multiplex nested RT-PCR for the detection and differentiation of wildtype viruses from C-strain vaccine of classical swine fever virus.

Y. Qi, et al, Characterization of antibodv responses against a neutralizing epitope on the glycoprotein E2 of classical swine fever virus.

Jian-Jun Zhao et al, Evaluation of a multiplex real-time RT-PCR for quantitative and differential detection of wildtype viruses and C-strain vaccine of Classical swine fever virus.

Susana Mendozaa et al, Antigenic differentiation of classical swine fever vaccinal strain PAV250 from other strains, including field strains from Mexico.

J. Kortekaas et al, Rational design of a classical swine fever C-strain vaccine virus that enables the differentiation between infected and vaccinated animals, 2009. L.G. Holinka et al: Development of live attenuated antigenic marker classical swine fever vaccine, Virology, 2009.

Hulst et al, Passage of Classical Swine Fever Virus in Cultured Swine Kidney Cells Selects Virus Variants That Bind to Heparan Sulfate due to a Single Amino Acid Change in Envelope Protein Erns, Journal of Virology, Oct. 2000, p. 9553-9561 Vol. 74, No. 20.

LISTING SEKVENCI

[0123]

Claims

1. Marker vakcina za profilaktički tretman klasične svinjske groznice koja sadrži modifikovani živi atenuirani virus klasične svinjske groznice, naznačena time što virusna aminokielinska sekvenca TAV-epitopa proteina E2 sadrži različitu sekvencu od one divljeg tipa virusa klasične svinjske groznice, pri čemu virusna aminokiselinska sekvenca pokazuje najmanje jednu od sledećih supstitucija u odnosu na C-soj "Riems" virusa: - supstitucija aminokiseline 830 u valin, - supstitucija aminokiseline 833 u serin, - supstitucija aminokiseline 839 u glicin.

2. Marker vakcina prema prethodnom patentnom zahtevu, naznačena time što modifikovani virus ne ispoljava rekombinantne nukleinsko kiselinske sekvence.

3. Marker vakcina prema prema bilo kom od patentnih zahteva, naznačena time što virusna nukleotidna sekvenca ispoljava jednu ili više sledećih supstitucija u odnosu na C-soj "Riems" virusa: - supstitucija na nukleotidnom položaju 2862 u T, - supstitucija na nukleotidnom položaju 2870 u T, - supstitucija na nukleotidnom položaju 2889 u G.

4. Marker vakcina prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, naznačena time što virusna aminokiselinska sekvenca ispoljava jednu ili više supstitucija u odnosu na C-soj "Riems" virusa: - supstitucija aminokiseline 426; u proteinu E<1>^; u valin, - supstitucija aminokiseline 576; u proteinu El; u histidin, - supstitucija aminokiseline 583; u proteinu El; u glutaminsku kiselinu, - supstitucija aminokiseline 951: u proteinu E2; u izoleucin.

5. Marker vakcina prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, naznačena time što virusna nukleotidna sekvenca pokazuje jednu ili više sledećih supstitucija u odnosu na C-soj "Riems" virusa: - supstitucija na nukleotidnom položaju 1649 u G, - supstitucija na nukleotidnom položaju 2099 u C, - supstitucija na nukleotidnom položaju 2122 u G, - supstitucija na nukleotidnom položaju 3225 u T.

6. Marker vakcina prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, naznačena time što virusna aminokiselinska sekvenca TAV-epitopa sadrži sekvencu prema SEQ ID NO. 3 ili SEQ ID NO. 4.

7. Marker vakcina prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, naznačena time što virusna nukleotidna sekvenca sadrži sekvencu prema SEQ ID NO. 1.

8. Marker vakcina prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, naznačena time što subjekti tretirani vakcinom mogu biti diferencirani od subjekata inficiranih sa virusom povezanim sa bolešću klasične svinjske groznice preko analize bioloških uzoraka dobijenih od navedenih subjekata upotrebom seroloških i/ili genomskih analitičkih postupaka.

9. Marker vakcina prema prethodom patentnom zahtevu, naznačena time što je genomski analitički postupak zasnovan na lančanoj reakciji polimeraze (PCR), poželjno PCR-u u realnom vremenu, pri čemu su korišćeni prajmeri i/ili probe koji prepoznaju virusnu nukleotidnu sekvencu koja je modifikovana i/ili povezana sa bolešću.

10. Marker vakcina prema patentnom zahtevu 8, naznačena time što je serološki analitički postupak zasnovan na enzimskoj imunološkoj analizi (EIA), poželjno enzimski-vezanoj imunosorbent analizi (ELISA), pri čemu su korišćena antitela koja se specifično vezuju za modifikovani i/ili sa bolešću povezani TAV-epitop.

11. Marker vakcina prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, koja se može dobiti generisanjem virusnih „escape" varijanti povezanih sa bolešću ili drugih poznatih sojeva virusa svinjske groznice primenom pritiska antitelima.

12. Postupak za proizvodnju soja vakcine modifikovanog živog atenuiranog virusa klasične svinjske groznice, poželjno prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 11, koji sadrži generisanje „escape" varijanti povezanih sa bolešću ili drugih poznatih virusnih sojeva klasične svinjske groznice primenom pritiska antitelima.

13. Postupak prema patentnom zahtevu 12, naznačen time što postupak sadrži: - višestruko pasažiranje ćelija, poželjno embrionalnih bubrežnih ćelija praseta, inficiranih virusom povezanim sa bolešću klasične svinjske groznice u ćelijskoj kulturi, i - istovremenu primenu antitela usmerenih protiv TAV-epitopa proteina E2 virusa povezanog sa bolešću klasične svinjske groznice i/ili poliklonskog zečjeg seruma imunizovanog sa CTAVSPTTLRTEVVK-peptidom.

14. Farmaceutska kompozicija koja sadrži marker vakcinu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 11 sa farmaceutski prihvatljivim nosačem.

15. Marker vakcina prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 11 za upotrebu kao lek u profil akti čkom tretmanu (vakcinaciji), poželjno preko intramuskularne injekcije ili oralne primene, klasične svinjske groznice.