RS55470B1 - Hinazolinska jedinjenja - Google Patents

Description

OBLAST PRONALASKA

[0001]Ova prijava se odnosi na hinazolinska jedinjenja i farmaceutske kompozicije, koje sadrže prethodno pomenuto jedinjenje i njihovu upotrebu. Ova hinazolinska jedinjenja mogu efikasno inhibirati prekomernu pojavu i aktivnost receptora epidermalnog faktora rasta ( EGFR).

STANJE TEHNIKE

[0002]Vezivanje epidermalnog faktora rasta (EGF) za receptor epidermalnog faktora rasta (EGFR) može aktivirati tirozin kinazu i time pokrenuti reakcije, koje vode ćelijskoj proliferaciji. Prekomerna pojava i aktivnost EGFR može dovesti do nekontrolisane deobe ćelija, što može biti predispozicija za karcinom. Jedinjenja, koja mogu inhibirati prekomernu pojavu i aktivnost EGFR su stoga potencijalni kandidati za lečenje karcionoma. Takva jedinjenja su objavljena u CN 101619034 i W0 2010002845.

SUŠTINA PRONALASKA

[0003]Predstavljeno je jedinjenje 3aR,6aR)-N-(4-(3-etinilfenilamino)-7-metoksihinazolin-6-il)-1-metil-heksahidropirolo[3,4/b)pirol-5(1H)-karboksamid ili bar jedna farmaceutski prihvatljiva so prethodno navedenog jedinjenja.

[0004]Takođe predstavlja farmaceutsku kompoziciju obuhvatajući najmanje jedan farmaceutski prihvatljiv nosač i jedinjenje kako je definisano u patentnom zahtevu i/ili bar jednu farmaceutski prihvatljivu so prethodno opisanog jedinjenja.

[0005]Pronalazak se takođe odnosi na jedinjenje definisano u patentnom zahtevu i/ili bar jednu farmaceutski prihvatljivu so prethodno pomenutog jedinjenja za upotrebu kod lečenja karcinoma. Kao preferiran primer karcinoma izabrani su karcinom pluća, karcinom glave i vrata, karcinom debelog creva, karcinom farinksa, epidermoidni karcinom i karcinom pankreasa.

[0006]Predstavljen je metod in vivo inhibicije prekomerne pojave i aktivacije EGFR obuhvatajući kontakt EGFR sa delotvornom količinom jedinjenja, definisanog u patentnom zahtevu i/ili najmanje jedne farmaceutski prihvaćene soli prethodno opisanog jedinjenja.

DETALJAN OPIS PRONALASKA

[0007]Ukoliko nije drugačije naglašeno, sledeći termini, fraze i simboli, kako su ovde korišćeni treba da imaju značenja kako sledi u daljem tekstu.

[0008]Jedinjenja ovde opisana uključuju, ali nisu ograničena samo na to, njihove optičke izomere, racemate i ostale smeše navedenog jedinjenja. U tim situacijama, pojedini enantiomeri ili dijastereomeri to jest optički aktivne forme, mogu biti dobijeni asimetričnom sintezom ili razlaganjem racemskih modifikacija ili smešom dijastereomera. Razlaganje racemskih modifikacija ili smeša dijastereomera može biti izvršeno na primer konvencionalnim metodama kao što su kristalizacija u prisustvu razlagajućeg reagensa ili hromatografija, koristeći na primer tečnu hromatografiju pod visokim pritiskom (HPLC) kao oblik kolonske hromatografije.

[0009]Kada prethodno opisano jedinjenje postoji u različitim tautomerskim oblicima, pojam „jedinjenje" treba da obuhvati sve tautomerske oblike jedinjenja. Ta jedinjenja obuhvataju i kristalne oblike uključujući polimorfe i klatrate. Slično tome pojam ,,so" treba da obuhvati sve izomere, racemate, druge smeše, Z i E forme, tautomerske oblike i kristalne oblike soli jedinjenja.

[0010]„Farmaceutski prihvatljive soli" obuhvataju, ali nisu ograničene na soli sa neorganskim kiselinam kao što su hidrohtorati, fosfati, difosfati, hidrobromati, sulfati, sulfinati, nitrati i slične soli, nego i soli sa organiskim kiselinama kao što su malati, maleati, fumarati, tartarati, sukcinati, titrati, acetati, laktati, metansulfonati, P-toluensulfonati, 2-hidroksietilsulfonati, benzoati, salicilati, stearati i alkanoati, kao što su acetati, HOOC-(CH2)n-COOH gde je n 0-4, i slične soli. Slično, farmaceutski prihvatljivi katjoni obuhvataju, ali nisu ograničeni na natrijum, kalijum, kalcijum, aluminijum, titijum i amonijum.

[0011]Kao dodatak, ako ovde opisano jedinjenje je dobijeno kao kisela adiciona so, slobodna baza može biti dobijena alkalizacijom rastvora kisele soli. Obrnuto, ako je produkt slobodna baza, adiciona so, pogotovo farmaceutski prihvatljiva adiciona so, može se dobiti rastvaranjem slobodne baze u odgovarajućem organskom rastvaraču i tretiranjem rastvora kiselinom, u skladu sa konvencionalnom procedurom za pripremu kisele adicione soli iz baznog jedinjenja. Stručnjaci će prepoznati razne sintetičke metodologije, koje se mogu koristiti za pripremu netoksičnih farmaceutski prihvatljivih adicionih soli.

[0012] „Solvat", kao što je „hidrat" je dobijen interakcijom rastvarača i jedinjenja. Termin „jedinjenje" trebalo bi da obuhvati solvate, uključujući hidrate, jedinjenja. Slično „soli" uključuju solvate, kao što su hidrati, soli. Odgovarajući solvati su farmaceutski prihvatljivi solvati, kao što su hidrati, uključujući monohidrate i hemihidrate.

[0013] „Helati" se formiraju ostvarivanjem veza između jedinjenja i metalnog jona na 2 ili više tačaka. Termin „jedinjenje" bi trebalo da obuhvati helate jedinjenja. Slično tome „soli" uključuju helate soli.

[0014] „Nekovalentni kompleks" je formiran interakcijom jedinjenja i drugog molekula u čemu kovalentna veza nije formirana između jedinjenja i molekula. Na primer stvaranje kompleksa se može desiti pri van der Walls-ovoj interakciji, vezivanju vodonika, elektrostatičkoj interakciji ( takođe nazvano jonsko vezivanje). Takvi nekovalentni kompleksi su uključeni u termin „ jedinjenje".

[0015] Termin „ aktivan agens" se koristi da ukaže na hemijske supstance koje imaju biološku aktivnost. U nekim primenama pronalaska „aktivan agens" je hemijska supstanca, koja ima farmaceutsku korisnost.

[0016] „Lečiti" ili „lečenje" ili „ublažavanje" se odnosi na davanje jedinjenja definisanog u patentnom zahtevu i/ili najmanje jedne njegove farmacetuski prihvatljive soli, pacijentu, koji ima ovo oboljenje ili poremećaj ili ima simptom oboljenja ili poremećaja, ili ima predispoziciju prema oboljenju ili poremećaju, sa svrhom da se izleći, isceli, ublaži, olakša, izmeni, otkloni, poboljša, unapredi ili utiče na oboljenje ili poremećaj, simptome oboljenja ili poremećaja ili na predispoziciju prema oboljenju ili poremećaju. Ovo oboljenje ili poremećaj može biti karcinom.

[0017] Termin „ inhibicija" ukazuje na smanjenje, u osnovnim aktivnostima, biološke aktivnosti ili procesa. „Inhibicija prekomeme pojave i/ili aktivnosti receptora epidermalnog faktora rasta" se odnosi na smanjenje pojave i/ili aktivnosti EGFR kao direktan ili indirektan odgovor na prisustvo najmanje jednog jedinjenja i/ili najmanje jedne njegove farmaceutski prihvatljive soli, u odnosu na aktivnost EGFR, u odsustvu najmanje jednog jedinjenja i/ili jedne njegove farmaceutski prihvatljive soli. Smanjeje aktivnosti može biti usled direktne interakcije najmanje jednog jedinjenja i/ili najmanje jedne farmaceutski prihvatljive soli prethodno opisanog jedinjenja sa jednim ili više faktora što, zauzvrat, utiče na aktivnost EGFR. Na primer prisustvo najmanje jednog jedinjenja i/ili jedne njegove farmaceutski prihvatljive soli može smanjeiti aktivnost EGFR direktnim vezivanjem za EGFR, izazivajući ( direktno ili indirektno) drugi faktor za smenjenje aktivnosti EGFR ili ( direktno ili indirektno) smanjujući količinu EGFR prisutnog u ćeliji ili organizmu.

[0018] Termin „efikasna doza" se odnosi na dozu jedinjenja iz patentnog zahteva i/ili jedne farmaceutski prihvatljive soli prethodno opisanog, koja je efikasna za „lečenje" oboljenja ili poremećaja pacijenta. U slučaju karcinoma efikasna doza može izazvati bilo kakve promene, uočljive ili merljive, kod pacijenta, kao što je prethodno opisano u definiciji „lečenje", „ublažavanje". Na primer: efikasna doza može smanjiti broj karcionmskih ili tumorskih ćelija, smanjiti veličinu tumora, inhibirati ili zaustaviti infiltraciju tumorskih ćelija u periferne organe, ukjtučujući na primer širenje tumora u meko tkivo ili kost, inhibirati i zaustaviti metastaze tumora, inhibirati i zaustaviti rast tumora, osloboditi, u izvesnoj meri, jedan ili više simptoma povezanih sa karcionomom, smanjiti stopu obolevanja i smrtnosti, poboljšati kvalitet života, ili kombinaciju ovakvih efekata. Efikasna doza može biti doza dovoljna za smanjenje simptoma oboljenja kao odgovor na inhibiciju prekomerne pojave i/ili aktivnosti receptora epidermalnog faktora rasta. Za terapiju karcinoma efikasnost in vivo može npr. biti mereno procenom dužine preživljavanja, vremenom napredovanja oboljenja ( TTP), stepen odgovora ( RR), trajanje odgovora i/ili kvaliteta života.

[0019] Termin „efikasna doza" se takođe može odnositi na dozu jedinjenja iz patentnog zahteva i/ili najmanje jedne njegove farmaceutski prihvatljive soli, efikasne da inhibira prekomernu pojavu i/ili prekomernu aktivnost receptora epidermalnog faktora rasta.

[0020] Detalji jedne ili više primena pronalaska slede.

[0021] Predstavljeno je jedinjenje 3aR,6aR)-N-(4-(3-etinilfenilamino)-7-metoksihinazolin-6-il)-1-metil-heksahidropirolo[3,4/b]pirol-5(1H)-karboksamiđ ili najmaje jedna farmaceutski prihvatljiva so prethodno navedenog jedinjenja.

[0022] Hinazolinsko jedinjenje iz patentnog zahteva i/ili njegova farmaceutski prihvatljiva so mogu biti sintetisane iz komercijalno dostupnih početnih materijala, metodama dobro poznatih u tehnici. Detaljan proces je prikazan u odeljku Primeri ovog zahetva.

[0023] Sintetička hemijska transformacija korisna za sintetizovanje poželjnih hinazolinskih jedinjenja je takođe opisana na primer u R. Larock, Comprehensive Organic Transformations, VCH Publishers (1989); T.W. Greene and P.G.M. Wuts, Protective Groups in Organic Svnthesis, 3rd Ed., John Wiley and Sons (1999); L. Fieser and M. Fieser, Fieser and Fieser's Reagents for Organic Svnthesis, John Wiley and Sons (1994); and L. Paquette, ed., Encvđopedia of Reagents for Organic Svnthesis, John Wiley and Sons (1995) i njihova naredna izdanja.

[0024] Jedinjenje iz zahteva pronalaska i/ili najmanje jedna njegova farmaceutski prihvatljiva so može biti prečišćena kolonskom hromatografijom, tečnom hromatografijom visokih performanski, kristalizacijom ili drugom odgovarajućim metodama.

[0025] Hinazolinska jedinjenja iz zahteva pronalaska i/ili najmanje jedna njegova farmaceutski prihvatljiva so mogu reagovati sa EGFR kinazom i/ili inhibirati aktivnost EGFR.

[0026]Takođe je opisana kompozicija, koja sadrži najmanje jedan farmaceutski prihvatljiv nosač i jedinjenje iz zahteva pronalaska i/ili najmanje jednu njegovu farmaceutski prihvatljivu so.

[0027]Kompozicija, koja sadrži jedinjenje iz zahteva pronalaska i/ili najmanje jednu farmaceutski prihvatljivu so prthodno opisanog može biti data na različite, već poznate načine, kao što je oralno, parenteralno, putem inhalacionog spreja ili preko ugrađenog rezervoara. Termin „parenteralan" ovde korišćen obuhvata subkutanu, intrakutanu, intravensku, intramuskularnu, intraartikularnu, intraarterijalnu, intrasinovijalnu, intrakranijalnu, injekcionu ili infuzionu tehniku.

[0028]Oralna kompozicija može biti u bilo kom pogodnom obliku za oralnu upotrebu uključujući, ali ne ograničavajući se na tablete, kapsule, emulzione i vodene suspenzije, disprezije i rastvore. Nosači, koji su uobičajeni za tablete, uključuju laktozu i kukuruzni škrob. Lubrikanti, kao što su magnezijumov stearat, su takođe uobičajeno dodati tabletama. Za oralnu upotrebu u obliku kapsule, korisni diluenti uključuju laktozu i suvi kukuruzni škrob. Kada se oralno koriste vodene ili emulzione suspenzije, aktivni sastojak može biti rastvoren ili suspendovan u ulju kombinovano sa emulzionim agensima ili agensima za suspendovanje. Po želji mogu biti dodati određeni ukusi, zasladivači ili boje.

[0029]Sterilna injekciona kompozicija ( vodena ili uljana suspenzija) može biti formulisana prema poznatoj tehnici koristeći pogodna sredstva za dispergovanje ili vtaženje ( npr. Tvveen 80) i suspendovanje. Sterilni injekcioni preparat može biti i sterilan injekcioni rastvor ili suspenzija u netoksičnom parenteralno prihvatljivom diluentu ili rastvaraču, kao što je rastvor u 1,3 butandiolu. Među farmaceutski prihvatljivim nosačima i rastvaračima, koji se mogu koristiti, su manitol, voda, Ringerov rastvor i izotonični rastvor NaCl. Pored toga, sterilna fiksirana ulja mogu konvencionalno biti upotrebljena kao rastvarač ili medijum za suspendovanje ( sintetički mono ili digliceridi). Masne kiseline, kao što je oleinska, i njeni gliceridni derivati su korisni za pripremu injekcija, kao i prirodna farmaceutski prihvatljiva ulja, kao što su maslinovo i ricinusovo, kao što je u njihovoj polioksietilovanoj verziji. Ovi uljani rastvarači ili suspenzije mogu takođe sadržati alkoholni diluent sa dugačkim lancima ili raspršivač ili karboksimetil celulozu ili sličan agens za disperziju.

[0030]Kompozicija za inhalaciju može biti napravljena prema poznatoj tehnici farmaceutske formulacije, kao rastvor u fiziološkom rastvoru, može se koristiti benzil alkohol ili drugi pogodni konzervans, apsorpcioni agensi za poboljšanje biorasploživosti, fluorougljenici i/ili drugi agensi za rastvaranje ili disperziju.

[0031]Kompozicije za topikalnu primenu mogu biti u formi ulja, kreme, losiona, masti i slično. Pogodni nosači za kompoziciju uključuju biljna ili mineralna ulja, vazelin, životinjske masti i alkohole velike molekulske mase. U pojedinim slučajevima farmaceutski prihvatljiv nosač je onaj u kom je aktivni sastojak rastvorljiv. Emulgatori, stabilizatori, antioksidansi i sredstva za održavanje vlažnosti mogu takođe biti uključeni kao i boje i mirisi. Dodatno, poboljšivači transdermalnog prodiranja mogu biti korišćeni u ovim topikalnim formama. Primeri za ove poboljšivače mogu biti nađeni u SAD patentima pod brojevima 3989816 i 4444762.

[0032]Kreme mogu biti formulisane iz mešavine mineralnih ulja samo emulgovanog pčelinjeg voska i vode, u koju se pomeša mešavina aktivnih sastojaka, rastvorenih u maloj količini ulja, kao što je bademovo ulje. Primer za to je krema koja uključuje 40 delova vode, oko 20 delova pčelinjeg voska, oko 40 delova mineralnog ulja i jedan deo bademovog ulja. Masti mogu biti formulisane mešanjem rastvora aktivnih sastojaka u biljnom ulju kao što je bademovo sa toplim, mekim parafinom. Potom smešu ostaviti da se ohladi. Primer za takvu mast je ona koja uključuje oko 30% težinski, bademovog utja i oko 70% težinski, toplog, belog parafina.

[0033]Farmaceutski prihvatljiv nosač se odnosi na nosač, koji je kompatibiln sa aktivnim sastojcima kompozicije ( a u nekim slučajevima je sposoban da stabilizuje aktivne sastojke) i nije štetan za pacijenta koji se tretira. Na primer agensi za rastvaranje kao što su ciklodekstrini ( koji čine specifičan više rastvorljiv kompleks sa bar jednim jedinjenjem i/ili bar jednom farmaceutski prihvatljivom soli prethodno opisanog) mogu biti korišćeni kao farmaceutski nosači za isporuku aktivnih sastojaka. Primeri ostalih nosača uključuju koloidni silicijum dioksid, magnezijum stearat, celulozu, natrijumov lauril sulfat i DSC žuta broj 10. Hidrofilni nosači kao što su sintetski i prirodni polimeri ( na primer albumin i derivati istog) su takođe primeri farmaceutski prihvatljivih nosača.

[0034]Jedinjenje iz patentne prijave i/ili najmanje jedna njegova farmaceutski prihvatljiva so može biti in vitro testirana u inhibiciji aktivnosti EGFR, da bi se naknadno moglo testirati in vivo. Na primer jedinjenje prethodno opisano i/ili najmanje jedna farmaceutski prihvatljiva so istog može biti data životinji tipa mišu, koja ima karcinom i Čijim se terapeutskim rezultatima može pristupiti i raspolagati. Na osnovu rezultata može se odrediti odgovarajuća doza, opseg kao i put unosa, kako za životinje tako i za ljude.

[0035]Jedinjenje iz patentne prijave i/ili najmane jedna farmaceutski prihvatljiva so prethodno opisanog, može biti korišćena za postizanje blagotvornih terapeutskih ili profilaktičnih rezultata na primer kod pacijenata sa karcinomom. Termin „karcinom", koji je ovde korišćen se odnosi na ćelijski poremećaj okarakaterisan kao nekontrolisana i neregulisana ćelijska proliferacija, smanjena ćelijska diferencijacija, sposobnost za invaziju okolnog tkiva i/ili sposobnost za novi rast na ektopičnom mestu. Termin „karcinom" uključuje, ali nije ograničavajući, solidne tumore i tumore krvi. Termin „karcinom" obuhvata oboljenje kože, tkiva, organa, kostiju, hrskavice, krvi i sudova, kao i primarne karcinome i metastaze karcinoma.

[0036]Neograničavajući primeri solidnh tumora uključuju karcinom pankreasa, karcinom bešike, karcinom debelog creva, karcinom dojke, uključujući i metastatski karcinom dojke, karcinom prostate uključujući androgen-zavisne i androgen- nezavisne karcinome, karcinom bubrega uključujući i naprimer metastatski karcinom bubrega, hepatocelularni karcinom i karcinom pluća uključujući i nemikrocelularni karcinom pluća ( NSCLC), bronhioalveolarni karcinom ( BAC) i adenokarcinom pluća, karcinom jajnika, uključujući i progresivni epitelni ili primarni peritonealni karcinom, karcinom grlića materice, karcinom želuca, karcinom jednjaka, karcinom glave i vrata uključujući na primer planocelularni karcinom glave i vrata, karcinom kože, uključujući maligni melanom, neuroendokrini karcinom uključujući metastatski neuroendokrini karcinom, tumore mozga, uključujući gliom, anaplastični oligodendrogliom, primarni multifurmni glioblastom, anaplastični astrocitom, karcinom kostijju, sarkom mekog tkiva i karcinom štitne žlezde.

[0037]Neograničavajući primeri hematoloških maligniteta obuhvataju akutnu mijeloidnu leukemiju (AMLJ, hroničnu mijaloidnu leukemiju ( CML) uključujući ubrzanu i blastnu fazu ( CML-BP), akutnu limfoblastnu leukemiju ( ALL), hroničnu limfocitnu leukemiju { CLL), Hočkinovu bolest ( HD), non Hočkinov limfom ( NHL) uključujući folikularni limfom i Mantle ćelijski limfom, multipli mijelom ( MM), Walden Stromovu makroglobulinemiju, mijelodisplastični sindrom ( MDS) uključujući refraktornu anemiju ( RA), refraktornu anemiju sa prstenastim sideroblastima ( RARS), refraktornu anemiju sa viškom blasta ( RAEB) i RAEB u transformaciji ( RAEB-T) i mijeloproliferativni sindrom.

[0038]U nekim primenama pronalaska primeri karcinoma koji se tretiraju obuhvataju, ali ne ograničavaju, karcinom pluća, karcinom glave i vrata, karcinom debelog creva, karcinom pankreasa, karcinom dojke, karcinom jajnika, karcinom prostate, karcinom želuca, karcinom bubrega, karcinom jetre, karcinom mozga, karcinom kostiju i leukemiju. U nekim primenama pronalaska primer karcinom koji će biti tretiran je izabran između karcinoma pluća, karcinoma glave i vrata, kolorektalnog karcinoma, karcinoma farinksa, epidermoidnog karcinoma i karcinoma pankreasa.

[0039]U nekim primenama pronalaska jedinjenje iz patentnog zahteva i/ili najmanje jedna njegova farmaceutski prihvatljiva so je dato u konjunkciji sa efikasnom dozom drugog terapijskog agensa, koji se razlikuje od jedinjenja ovde opisanog i/ili najmanje jedne njegove farmaceutski prihvatljive soli. U nekim primenama pronalaska drugi terapijski agens je antikancerogen. U nekim primenama pronalaska drugi terapijski agens je onaj, koji se i inače daje pacijentima, kojim se leči neko oboljenje ili stanje. Jedinjenje iz patentnog zahtev i/ili najmanje jedna njegova farmaceutski prihvatljiva so, može biti dato zajedno kao jedna doza sa drugim terapijskim agensom ili odvojeno. Ukoliko se daju odvojeno drugi terapijski agens može biti dat pre, istovremeno ili posle jedinjenja iz patentnog zahteva i/ili najmanje jedne njegove farmaceutski prihvtaljive soli.

[0040]U nekim primenama pronalaska jedinjene iz patentnog zahteva i/ili najmanje jedna njegova farmaceutski prihvatljiva so može biti dato sa antikancerogenim sredstvom. Kako je ovde korišćeno, termin „antikancerogeno sredstvo" se odnosi na bilo koje sredstvo koje se daje pacijentu sa karcinom u svrhu tečenja istog. Neograničavajući primeri natikancerogenog sredstva uključuju: radioterapiju, imunoterapiju, hemoterapisjka sredstva koja oštećuju ONK i hemoterapijska sredstva koja ometaju ćelijsku replikaciju.

[0041]Neograničavajući primeri hemoterapsijkih sredstava koja oštećuju DNK uključuju inhibitore topoizomeraze I ( irinotekan, topotekan, kamptotecin i analoge njihovih metabolita i doksorubicin); inhibitori topoizomeraze II ( npr. etoposid, teniposid i daunorubicin); agense za alkilovanje ( npr. melfalan, hlorambucil, busulfan, tio TEPA, ifosfamid, karmustin, lomustin, semustin, streptozocin, đekarbazin, metotreksat, mitomicin C i cikolofosfamid ); DNK interkalatore ( cisplatin, oksaliplatin i karboplatin); DNK interkalatore i generatore slobodnih radikala kao što je bleomicin i nukleozidne mimetike (npr. 5-fluorouracil, kapecitabin, gemcitabin, fludarabin, citarabin, merkaptopurin, tioguanin, pentostatin i hidroksinurea).

[0042]Hemoterapijska sredstva koja ometaju ćelijsku replikaciju uključuju paklitaksel, docetaksel i srodne analoge, vinkristin, vinblastin i srodne analoge, talidomid i srodne analoge ( npr. CC-5013 i CC-4047), inhibitore proteina tirozin kinaze ( imatinib, mezilat i gefitinib), inhibitore proteazoma ( bortezomib); inhibitore NF-kappa B uključujući inhibitore I kappa B kinaze, antitela koja vezuju proteine prekomerno izražene u karcinomu i time snižavaju ćelijsku replikaciju ( trastuzumab, rituksimab, cetuksimab i bevacizumab) i ostale inhibitore proteina ili enzima koji su povećani, prekomerno izraženi i aktivirani kod karcinoma, a čijom se inhibicijom smanjuje ćelisjka replikacija.

[0043]Opisan je metod in vitro inhibicije prekomerne pojave i aktivnosti receptora epidermalnog faktora rasta kontaktom receptora epidermalnog faktora rasta sa efikasnom dozom jedinjenja iz patentnog zahteva i/ili najmanje jedne farmaceutski prihvatljive soli prethodno opisanog.

PRIMERI

[0044]Stedeći primeri imaju nameru da ilustruju otkriće bez ikakvog ograničavanja obima istog.

[0045]U sledećim primerima korišćene su sledeće skraćenice:

CMC-Natrijum karboksimetil celuloza

DELFIA Dissociation-Enhanced Lanthanide Fluorescent Immunoassav

DMEM Dulbekov niskoglukozni modifikovani medij um

DMF N,N-Dimetilformamid

DMSO Dimetil sulfoksid

DTT Ditiotreitol

EDTA etilendiamintetra sirćetna kiselina

EtOAc etil acetat

FBS fetalni serum govečeta

h sati

ml mililitar

min minut

PBS natrijum fosfatni pufer

PMSF fenilmetansulfonilfluoriđ

Py piridin

THF tetrahidrofuran

Tris-Cl hidroksimetilaminometan hidroflorid

Primer 1:

[0046]3aR,6aR)-N-(4-(3-etinilfenilamino)-7-metoksihinazolin-6-il)-1-metil-heksahidropirolo [3,4-b]pirol-5 (IH)-karboksamid

[0047]Rastvoru jedinjenja 3-a (40g, 0.138 mol pripremljenog prema proceduri objavljenoj u WO20100O2845) piridin (40mL, 0.495 mol ) i DMF ( anhidriran 22mL) u anhidriranu THF ( 500mL) je dodano fenilkarbonohloridat 3-b (22mL, 0.175mol) kap po kap na -10°C. Smeša je ostavljena da se mesa na sobnoj temperaturi tokom 12 sati. Talog je filtriran i posle suspendovan u zasićenom rastvoru NaHC03 ( 500mLj. Čvrsti ostatak je filtriran, ispran sa H20 i EtOAc i osušen in vacuo da bi se dobilo jedinjenje 3-c (46g). Smeša jedinjenja 3-c ( 1g, 2.44mmol) i jedinjenje 3-d (369mg, 2.92mmol) u dioksanu ( 30mL) mešan je na 70* C tokom 5 sati, a onda ohlađena na sobnu temperaturu. Talog je isfiltriran ispran sa EtOAc i osušen in vacuo da bi se dobilo jedinjenje 3 { 0.8g). MS(m/e):443.4 (M+1)+.

Farmakološki testovi

Test aktivacije i inhibicije EGFR

[0048]Zasejavanje i izgladnjivanje ćelija: A431 ( humani epidermoidni karcinom) ćelije razređene u 10% fetalnom serumu govečeta, koji sadrži DMEM su zasejane 1.3x10" ćelija po bunariću na mikrotitarskoj ploči sa 96 bunarića i inkubirane preko noći. Potom su medijumi sa ćetijskim kulturama zamenjenji sa serum free DMEM medijumom 90 ul po bunariću. Pločice su inkubirane preko noći zbog izgladnjivanja.

[0049]Razblaženje jedinjenja i tretman: Jedinjenje je testirano u seriji trostrukih razblaženja u medijumu bez fetalnog seruma govečeta, koji sadrži 5% DMSO. 10ul po bunariću razblaženog jedinjenja je dodato u ćelije, 10ul po bunariću, 5% DMSO bez testiranog jedinjenja je dodato u kontrolne bunariće. Za svaku tačku testa je izvedena duplikat studija. Potom ploče su inkubirane na 37<*>C tokom 60 minuta u5%C02 inkubatoru. 10uI po bunariću 200ng/mL EGF ( Biosource, PHG0064) je dodato i ploče su inkubirane na 37°C tokom 45 minuta u 5% inkubatoru.

[0050] Priprema lizata: medijum je uklonjen i 100 pL po bunariću 50 mM Tris-CI, pH 8.0 pufer ćelijske lize (koja sadrži 0.5 M NaCl, 0.2 mM EOTA, 0.1% Triton X-100, 1 ug/mL aprotinin, 0.75 ug/mL leupeptin, 1 ug/mL pepstatin, 1 mM DTF, 500 uM natrijum vanadat i 1 mM PMSF) je dodat u svaki bunarić da lizira ćelije. Inhibitor proteaze je dodat neposredno pre upotrebe. Lizat ćelija je zaleđen na -80" C preko noći.

[0051] Premaz blokiranje ploče: 100pLpo bunariću, 0,5 pg/mL antiEGFR antitela ( Perkin Elmer, AFZ31) razblaženog u PBS je dodato u mikrotitarsku DELFIA ploču sa 96 polja ( Pelkin Elmer, AAAND - 0001) i inkubirano na 25'C preko noći sa laganim mućkanjem. Rastvor je odstranjen. Ploča je isprana 3 puta sa 200pL po bunariću DELFIA puferom za ispiranje (PBS pufer sadrži 0,05% Tween-20). 200uL po bunariću blokirajućeg pufera ( PBS sadrži 0,137M NaCL, 0.0027M KCl, 0,01 M Na2P04x12H20, 0,0015M KH2PO„, pH 7,4 i U BSA) je dodato u svaki bunarić i ploča inkubirna na 25"C tokom 2 sata sa laganim mućkanjem.

[0052] Povezivanje: Blokirajući pufer je odstranjen i ploča je isprana sa 2Q0uL po bunariću DELFIA pufera za ispiranje 3 puta. 80 pL po bunariću uzorka diluenta (20 mM Tris-CI/pH7.3, 150 mM NaCl, 0.1% BSA i 0.05% Tween-20) i 20 pL/po bunariću ćelijskog lizata su dodati u svaki bunarić. Ploča se inkubirna na 25<*>C dodatnih sat vremena sa laganim mućkanjem.

[0053] Otkrivanje: Ploča je ponovo isprana sa 200uL po bunariću DELFIA puferom za ispiranje 3 puta. 100uL po bunariću, 0,5ug/mL Eu-PT66 antitela { Perkin Elmer, AD0040) razblaženog u DELFIA test puferu (Perkin Elmer, 1244-106) je dodato i ploča je inkubirana na 25° C sat vremena sa laganim mućkanjem. Nakon ispiranja sa 200uL po bunariću DELFIA pufera za ispiranje 3 puta, 100 pL po bunariću DELFIA pufera za poboljšavanje ( koga je dostavio Perkin Elmer, 4001-0010) je dodato. Ploča se inkubirna na 25°C tokom 30 minuta sa laganim mućkanjem.

[0054] Očitavanje: Fluorescentni signal je meren na 340 nm eksitacije i 620nm emisije na Victor<3>( Perkin Elmer)

[0055] Stopa inhibicije računata je na sledeći način:

Gde je

[Fluorescentno očitavanje]Tretirano očitavanje bunarića tretiranog sa testiranim jedinjenjem nakon EGF stimulacije [Fluorescentno oči tavanje]Netreti rano očitavanje bunarića bez jedinjenja za terapiju i bez EGF stimulacije [Fluorescentno očitavanje]EGFočitavanje bunarića sa EGF stimulacijom, ali bez jedinjenja za terapiju, koja je korišćenakao maksimalni signal.

[0056]ICsoje izračunata koristeći XL-Fit 2.0 softver.

[0057]Vrednost IC5o jedinjenja 3 iznosi 0,006 uM.

Anti- tumor testovi in vivo na humanom „ kseno^ raft" modelu

1. Materijali i metode:

[0058]Linije humanih tumorskih ćelija: FaDu ( humani karcinom glave i vrata, karcinom farinksa, HTB-43), HCC827 ( humani nemikro celularni karcinom pluća, NSCLC; CRL-2868), A431 ( humani epidermoidni karcinom, CRL-2592) ćelijske linije su nabavljene od ATCC; FaDu, HCC827 i A431 ćelije su gajene u EMEM, RPMI 1640 i DMEM medijumu odnosno 10% fetalnom serumu govečeta. Ove ćelije su inkubirane u vlažnom inkubatoru na 37"C i ispod 5% CO;.

[0059]Životinje: Atimični miševi ( 6 do 8 sedmica) su nabavljeni iz Shanghai SLAC laboratorv animal CO. LTD. Životinje su smeštene u uslovima izolacije od specifičnih patogena, četiri životinje po kavezu, po standardnim uslovima ( 12: 12 odnos dana i noći,40- 50% relatvina vlažnost i na 20 -25"C) i imale su slobodan pristup hrani sterilisanoj zračenjem Kobaltom 60 i sterilnoj vodi.

[0060]Agensi: testirano jedinjenje je formulisano u sterilnom 0, 25% CMC-Na u različitim koncentracijama ( 0,05 - 1mg/mL) i uskladišteno na 4'C.

[0061]Subkutana implantacija tumorskih ćelija i studija antitumorske efikasnosti: Tiumorske ćelije su bil inkubirane na 37'C u 5% C02inkubatoru, dok nisu dostigle stapanje do oko 80%. Ćelije su bile odvojene 0,05% tripsin-EDTA, centrifugovane na 800 rpm i suspendovane u medijumu bez seruma. Koncentracija je bila prilagođena implantaciji golih miševa. Goli miševi su bili u karantinu nekoliko dana pre implantacije i 3x FaOu ili A431 ćelije u 0,1 mL medijuma ili 5xHCC827 ćelija u 0,2 mL medijuma su bile subkutano ubrizgane u predeo slabine golih miševa.

[0062] 1-3 sedmice nakon inokulacije, kad prosečna veličina tumora dostigne 100-300 mm<1>, životinje su podeljenje,slučajnim izborom, na grupe tretirane jedinjenjom ili rastvorom. Miševima je oralno administrovan ili rastvor 0,5% CMC-Na ili testirano jedinjenje sa različitim dozama 1 dnevno. Obim doziranja je bio 10mL/kg telesne težine (režim doziranja je prikazan u tabeli 1 i tabeli 2). Veličina tumora je merena 2-3 puta sedmično, šestarom za dužinu i širinu i onda računato koristeći formulu : Veličina tumora( TV,mm<J>)=širina<I>x dužina/2. Težina životinjskog tela i ponašanje je praćeno tokom eksperimenta. Inhibicija rasta tumora je računata na sledeći način: TGI {%) =100-(T-T0)/(C-Co)x100% gde T predstavlja srednju zapreminu tumora tretirane grupe na određeni dan tokom eksperimenta. T0predstavlja srednju zapreminu tumor iste tretirane grupe prvog dana terapije. C predstavlja srednju zapreminu tumora kontrolne grupe na određeni dan tokom eksperimenta i C0 predstavlja sredju zapreminu tumora iste kontrolne grupe prvog dana terapije.

2. Statistička analiza:

[0063]Podaci o veličini tumora su bili izraženi kao prošek ± standardno odstupanje. Jednostruka analiza varijanse ANOVA je korišćena za poređenje većeg broja uzoraka i studentov T test je korišćen za poređenje sa kontrolnim rastvorom. Razlike su smatrane statistički značajnim na p"0,05.

3. Rezultati

[0064]Testirano jedinjenje je pokazalo značajnu inhibiciju rasta tumora na 3 modela tumora na dozno zavisan način. Dodatno, ni jedan od miševa koji je tretiran sa testiranim jedinjenjem nije bio izložen značajnom gubitku telesne težine tokom eksperimenta.

[0065]TGIs (%) koju je izazvalo reprezentativno testirano jedinjenje u primeru 1. je prikazano u tabeli koja sledi:

hERG test

1. Kultura ćelije

[0066] Ćelije ovarijuma kineskog hrčka ( CHO) stabilno transficirane sa hERG kDNK i izraženi hERG kanali su korišćeni za ovu studiju. Ćelije su kultivisane u medijumu koji sadrži:

• Dulbekov niskoglukozni modifikovani medijum (DMEM/F12)

• 10% (v/v) toplotno inaktivisani fetalni serum govečeta

• 1% (v/v) penicilin/streptomicin

• 500pg/ml Geneticin ® reagens (G418)

[0067] Pre testiranja ćelije su uzete korišćenjem Accumax ( Innovative Cell Technologies).

2. Rastvori

[0068]Za elektrofiziološko snimanje korišćeni su sledeći rastvori:

3. Sistemi za snimanje

[0069] Snimanje celih ćelija je izvedeno koristeći EPC10USB (HEKA). Ćelije su bile pod nametnutom voltažom na održavanom potencijalu od -80mV. hERG struja je bila aktivirana depolarizacijom na +20mVtokom 2 sekunde posle čega je struja vraćena na -50mV tokom 2 sekunde da bi se otklonilo inaktiviranje i posmatralo deaktiviranje odložene struje (tail current) . Prvi korak na -50mV je korišten kao osnova za merenje vrha amplitude odložene struje.

4. Predaja i razblaživanje jedinjenja

[0070]Jedinjenje je pripremljeno kao 10ml DMSO rastvor u staklenoj bočici. Rastvor je energično mešan tokom10 minuta na sobnoj temperaturi. Za testiranje, jedinjenje je bilo razblaženo u staklenoj bočici koristeći rastvor. RazbLaživanje je urađeno ne duže od 30 minuta pre upotrebe. Podjednake količine ĐMSO { 0,1%) su bile prisutne u konačnom rastvoru

5. Elektrofiziološke procedure

[0071]Nakon postizanja konfiguracije celih ćelija, ćelije su praćene tokom 90 sekundi dok ne postignu stabilnost i isprane eksternim ratvorom tokom 66 sekundi. Voltažni protokol, opisan prethodno, je bio primenjivan svakih 20 sekundi na ćelije tokom čitave procedure. Jedino su stabilne ćelije sa očitanim parametrima iznad praga ( treshold), bile podvrgnute proceduri dodavanja leka.

[0072]Eksterni rastvor koji sadrži 0,1% 0MS0 je bio primenjen na ćelije da bi se utvrdila osnova. Nakon puštanja da se struja stabilizuje tokom 3 minute, jedinjenje je primenjeno. Rastvor jedinjenja je dodavan u 4 koraka i ćelije su držane u testianom jedinjenu, dok efekat jedinjenja ne dostigne stabilno stanje maksimum 6 minuta. Zatim je dodata pozitivna kontrola ( 100nM Cisaprid). Ispiranje eksternim jedinjenjem je izvođeno dok oporavak od struje nije dosegao stabilno stanje.

6. Analiza podataka

[0073]Podaci su analizirani koristeći Puslefit i Origin 7 ( Originlab Corporation)

7. Rezultati

[0074]Jedinjenje 3 je inhibisalo hERG odloženu struju sa nekim IC509.3±1,2pM ( 5 koncentracija, 5x2) koristeći takozvani „patch clamp" test celih ćelija.

Claims (10)

1. Jedinjenje (3aR,6aR)-N-(4-(3-etinilfenilamino)-7-metoksihinazolin-ć-il)-1-metil-heksah 5(lH)-karboksamid; ili najmanje jedna njegova farmaceutski prihvatljiva so.

2. Farmaceutska formulacija, koja sadrži najmanje jedan farmaceutski prihvatljiv nosač i jedinjenje (3aR,6aR)-N-(4-(3-etinilfenilamino)-7-metoksiWnazolin-6-il)-1-metil-heksahidropirolo[3,4-b]pirol-5(1H)-karboksamid; i/ili najmanje jedna njegova farmaceutski prihvatljiva so.

3. Jedinjenje (3aR,6aR)-N-(4-(3-etinilfem'lamino)-7-metoksihinazolin-6-il)-1-metil-heksahidropirolo[3,4/b]pirol-5(1 H)-karboksamid; i/ili najmanje jedna njegova farmaceutski prihvatljiva so za upotrebu u lečenju karcinoma.

4. Jedinjenje i/ili najmanje jedna njegova farmaceutski prihvatljiva so za upotrebu prema patentnom zahtevu 3, naznačeno time, što je karcinom izabran od karcinoma pluća, karcinoma glave i vrata, kolorektalnog karcinoma, karcinoma farinksa, epidermoidnog karcinoma i karcinoma pankreasa.

5. Jedinjenje i/ili najmanje jedna njegova farmaceutski prihvatljiva so za upotrebu prema patentnom zahtevu 4, naznačeno time što je karcinom nemikrocelularni karcinom pluća.

6. Jedinjenje i/ili najmanje jedna njegova farmaceutski prihvatljiva so za upotrebu prema patentnom zahtevu 3, u kombinaciji sa antikancerogenim agensom, koji se razlikuje od (3aR,6aR)-N-(4-(3-etinilfenilamino)-7-metoksihinazolin-6-il)-1-metil-heksahidropirolo[3,4-b]pirol-5(1H)-karboksamida, i/ili najmanje jedne njegove farmaceutski prihvatljive soli.

7. Metod zain vitroinhibiciju prekomerne espresije i/ili prekomerne aktivnosti receptora epidermalnog faktora rasta kontaktom jedinjenjenja i/ili najmanje jedne njegove farmaceutski prihvatljive soli za upotrebu prema patentnom zahtevu 1, sa receptorom epidermalnog faktora rasta.

8. Upotreba jedinjenja i/ili najmanje jedne njegove farmaceutski prihvatljive soli prema patentnom zahtevu 1 za proizvodnju leka za lečenje karcinoma.

9. Upotreba prema patentnom zahtevu 8, naznačeno time, što je karcinom izabran od karcinoma pluća, karcinoma glave i vrata, kolorektalnog karcinoma, karcinoma farinksa, epidermoidnog karcinoma i karcinoma pankreasa.

10. Upotreba prema patentnom zahetvu 9, naznačena time, što je karcinom nemikrocelularni karcinom pluća.