RS55559B1 - Čvrste forme 3-(6-(1-(2,2-difluorobenzo[d][1,3]dioksol-5-il)ciklopropankarboksamido)-3-metilpiridin-2-il) benzoeve kiseline - Google Patents

Description

ČVRSTE FORME 3-(6-(l-(2,2-

DIFLUOROBENZO [D] [l,3]DIOKSOL-5-IL)CIKLOPROPANKARBOKSAMIDO)-3-METILPIRIDIN-2-IL) BENZOEVE

KISELINE

TEHNIČKA OBLAST PRONALASKA

[0001]Predmetni pronalazak se odnosi na kristalnu Formu 13-(6-(l-(2,2-difluorobenzo[d][l,3] dioksol-5-il) ciklopropancarboksamido)-3-metilpiridin-2-il)benzoeve kiseline, njihove farmaceutske kompozicije, i njihovu upotrebu.

POZADINA PRONALASKA

[0002]CFTR je cAMP/ATP-posredovan anjonski kanal koji se eksprimira u različitim vrstama ćelija, uključujući upijajuće i sekretorne epitelne ćelije, gde reguliše anjonski fluks kroz membranu, kao i aktivnosti drugih jonskih kanala i proteina. U epitelnim ćelijama, normalno funkcionisanje CFTR je od ključnog značaja za održavanje transporta elektrolita kroz telo, uključujući respiratorno i digestivno tkivo. CFTR se sastoji od približno 1480 amino kiselina koje kodiraju protein sastavljen od tandemskih ponavljanja transmembranskih domena, od kojih svaki sadrži šest transmembranskih heliksa i nukleotid vezujući domen. Ova dva transmembranska domena su povezana velikim, polarnim, regulatornim(R)-domenom sa višestrukim tačkama fosforilacije koje regulišu aktivnost kanala i ćelijski promet.

[0003]Gen koji kodira CFTR je identifikovan i sekvenciran (Videti Gregorv, R. J. et al. (1990) Nature 347:382-386; Rich, D. P. et al. (1990) Nature 347:358-362), (Riordan, J. R. et al. (1989) Science 245:1066-1073). Defekt u ovom genu izaziva mutacije u CFTR uzrokujući cistične fibroze ("CF"), što je najčešća fatalna genetska bolest kod ljudi. Cistična fibroza pogađa otprilike jedno na svakih 2.500 dece u Sjedinjenim Američkim Državama. U okviru opšte populacije SAD, do 10 miliona ljudi nosi jednu kopiju defektnog gena bez vidljivih znakova bolesti. Nasuprot tome, osobe sa dve kopije CF vezanog gena pate od iscrpljujućih i fatalnih posledica CF, uključujući i hronlčnu bolest pluća.

[0004]Kod pacijenata sa cističnom fibrozom, mutacije u CFTR koje su endogeno izražene u respiratornom epitelu i dovode do smanjene sekrecije apikalnih anjona što izaziva neuravnoteženo stanje u transportu jona i tečnosti. Izazvano smanjenje transporta anjona doprinosi povećanoj akumulaciji mukusa u plućima i pratećih mikrobioloških infekcija koje na kraju izazivaju smrt kod CF bolesnika. Pored respiratorne bolesti, CF pacijenti obično pate od gastrointestinalnih problema i insuficijencije pankreasa koji, ako se ne leče, dovode do smrti. Pored toga, većina muškaraca sa cističnom fibrozom su neplodni a plodnost se smanjuje i kod žena sa cističnom fibrozom. Za razliku od teških efekata dva primerka CF vezanog gena, pojedinci sa jednom kopijom CF vezanog gena pokazuju povećanu otpornost na koleru i dehidracije usled dijareje - što možda objašnjava relativno visoku učestalost gena CF unutar populacije.

[0005]Analiza sekvence CFTR gena CF hromozoma je otkrila niz mutacija koje izazivaju bolesti (Cutting, G. R. et al.

(1990) Nature 346:366-369; Dean, M. et al. (1990) Cell 61:863:870; and Kerem, B-S. et al. (1989) Science 245:1073-1080; Kerem, B-S et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:8447-8451). Do danas,> 1000 mutacija koje uzrokuju bolesti CF gena su identifikovane (http://www.genet.sickkids.on.ca/cftr/). Najrasprostranjenija mutacija je delecija fenilalanina na položaju 508 CFTR amino kiselinske sekvence, a obično se naziva AF508-CFTR. Ova mutacija se javlja kod oko 70% slučajeva cistične fibroze i povezana je sa ozbiljnom bolešću.

[0006]Brisanje ostatka 508 u AF508-CFTR sprečava tek nastali protein da se savija ispravno. Ovo dovodi do nemogućnosti proteina mutanata da izađe iz ER i da prodje do plazmine membrane. Kao rezultat toga, broj prisutnih kanala u membrani je daleko manji nego što je posmatrano u ćelijama koje eksprimiraju CFTR divljeg tipa. Pored oštećenog protoka, mutacija dovodi do neispravnog otvaranja i zatvaranja kanala. Zajedno, smanjen broj kanala u membrani i defektno otvaranje i zatvaranje dovode do smanjenja protoka anjona kroz epitel što dovodi do neispravnog transporta jona i tečnosti. (Quinton, P. M. (1990), FASEB J. 4: 2709-2727). Istraživanja su pokazala, međutim, da je smanjen broj AF508-CFTR u membrani funkcionalan, iako manje od CFTR divljeg tipa. (Dalemans et al. (1991), Nature Lond. 354: 526-528; Denning et al., supra; Pasyk and Foskett (1995), J. Cell. Biochem. 270: 12347-50). Pored AF508-CFTR, druge mutacije koje izazivaju bolesti u CFTR koje rezultiraju u defektnom protoku, sintezi, i/ili zatvaranju i otvaranju kanala mogu biti regulisane tako da menjaju sekreciju anjona i modifikuju napredovanje i/ili ozbiljnost bolesti.

[0007]Iako CFTR transportuje različite molekule pored anjona, jasno je da ova uloga (transport anjona) predstavlja jedan element u važnom mehanizmu transporta jona i vode kroz epitela. Ostali elementi uključuju epitelski Na+ kanal, ENaC, Na+/2CI-/K+ ko-transporter, Na+-K+-ATPase pumpu i K+ kanale bazolatelarne membrane, koji su odgovorni za uzimanje hlorida u ćeliju.

[0008]Ovi elementi rade zajedno na postizanju usmerenog transporta kroz epitel preko njihove selektivne ekspresije i lokalizacije unutar ćelije. Apsorpcija hlorida se odvija koordiniranom aktivnošću ENaC i CFTR prisutnih na apikalnoj membrani i Na+-K+-ATPase pumpe i Cl- kanala eksprimiranim na bazolateralnoj površini ćelije. Sekundarni aktivni transport hlorida sa luminalne strane dovodi do akumulacije intracelularnog hlorida, koji onda može da pasivno napusti ćeliju putem Cl- kanala, što dovodi do vektorialnog transporta. Raspored Na+/2CI-/K+ko-transportera, Na+-K+-ATPase pumpe i bazolateralne membrane K+ kanala na bazolateralnoj površini i CFTR na luminalnoj strani koordinira sekreciju hlorida putem CFTR na luminalnoj strani. Jer se voda verovatno nikada ne transportuje aktivno sama, njen tok preko epitela zavisi od sićušnih transepitelialnih osmotskih gradijenata koji su generisani obimom protoka natrijuma i hlorida.

[0009]Kako je gore navedeno, smatra se da delecija ostatka 508 u AF508-CFTR sprečava novonastali protein da se savija ispravno, što dovodi do nemogućnosti ovog mutiranog proteina da izađe iz ER, i da se transportuje na plazminu membranu. Kao rezultat, nedovoljne količine zrelog proteina su prisutne na plazminoj membrani i transport hlorida u okviru epitelnih tkiva je značajno smanjen. U stvari, pokazano je da je ovaj celuiarni fenomen defektne ER prerade ABC transportera od strane ER mehanizacije, glavna osnova ne samo za CF bolest, već za širok spektar drugih izolovanih i naslednih bolesti. Dva načina na koja ER mehanizacija može da dođe do kvara su ili gubitak spojnice za ER izvoz proteina koji vodi do degradacije ili ER akumulacija ovih neispravnih/pogrešno savijenih proteina [Aridor M, et al., Nature Med., 5(7), pp 745- 751 (1999); Shastry, B.S., et al., Neurochem. International, 43, pp 1-7 (2003); Rutishauser, J., et al., Swiss Med Wkly, 132, pp 211-222 (2002); Morello, IP et al., TIPS, 21, pp. 466- 469 (2000); Bross P., et al., Human Mut, 14, pp. 186-198 (1999)].

[0010]3-(6-(l-(2,2-difluorobenzo[d][l,3]dioksol-5-il) ciklopropankarboksamido)-3-metilpiridin-2-il) benzoeva kiselina u slanom obliku je opisana u International PCT Publication WO 2007056341 kao modulator CFTR aktivnosti i stoga je korisna u lečenju CFTR-posredovanih bolesti kao što je cistična fibroza. Međutim, postoji potreba za stabilnim čvrstim formama pomenutog jedinjenja koje se mogu lako koristiti u farmaceutskim kompozicijama pogodnim za upotrebu kao terapeutici.

REZIME PRONALASKA

[0011]Predmetni pronalazak se odnosi na kristalnu Formu I od 3-(6-(l-(2,2-difluorobenzo[d][l,3]dioksol-5-il) ciklopropankarboksamido)-3-metilpiridin-2-il)benzoeve kiseline (u daljem tekstu "Jedinjenje 1") koji ima strukturu kakva je prikazana ispod:

[0012]Jedinjenje 1 i njegove farmaceutski prihvatljive kompozicije su korisne za lečenje ili ublažavanje težine cistične fibroze. U jednom aspektu, Jedinjenje 1 je u suštiniski kristalnom i neslanom obliku koji se naziva Oblik I kao što je ovde opisano i naznačeno.

[0013]Procesi koji su ovde opisani se mogu koristiti za pripremanje kompozicija ovog pronalaska koje sadrže Oblik I. Količine i karakteristike komponenata koje se koriste u procesima bi bile onakve kako je ovde opisano.

KR ATAK OPIS SLIKA

[0014]

Slika1 je šablon rendgenske difrakcije koji je izračunat iz jedne kristalne strukture Jedinjenja 1 u Obliku I.

Slika2 je stvarni šablon rendgenske difrakcije praha Jedinjenja 1 u Obliku 1.

Slika3 je preklapanje šablona rendgenske difrakcije izračunato iz jednog kristala Jedinjenja 1 u Obliku I, i stvarnog šablona rendgenske difrakcije praha Jedinjenja 1 u Obliku I.

Slika4 je trag diferencijalne skenirajuće kalorimetrije (DSC) Jedinjenja 1 u Obliku I.

Slika5 je konformaciona slika Jedinjenja 1 u Obliku I zasnovana na analizi rendgena pojedinačnih kristala.

Slika 6je konformaciona slika Jedinjenja 1 u Obliku I zasnovana na analizi rendgena pojedinačnih kristala kao dimer koji je formiran kroz karboksilne kisele grupe.

Slika 7je konformaciona slika Jedinjenja 1 u Obliku I zasnovana na analizi rendgena pojedinačnih kristala koja pokazuje da su molekuli naslagani jedni na drugima.

Slika 8je konformaciona slika Jedinjenja 1 u Obliku I zasnovana na analizi rendgena pojedinačnih kristala koja pokazuje drugačiji pogled (dole a).

Slika 9je 1HNMR analiza Jedinjenja 1 u Obliku I u 50 mg/mL, 0.5 metil celulozni-polisorbat 80 suspenzija na T (0).

Slika 10je 1HNMR analiza Jedinjenja 1 u Obliku I u 50 mg/mL, 0.5 metil celulozni-polisorbat 80 suspenzija koja je čuvana na sobnoj temperaturi tokom 24 sata.

Slika 11je 1HNMR analiza Jedinjenja 1 • HCI standarda.

DETALJAN OPIS PRONALASKA

Definicije

[0015]Sledeće definicije će se primenjivati onako kako se ovde koriste ukoliko nije drugačije naznačeno.

[0016]Termin "CFTR" kako je ovde korišćen znači regulator provodnosti transmembrane cistične fibroze ili njegova mutacija koja je sposobna da vrši aktivnosti regulatora, uključujući, ali ne ograničavajući se na, AF508 CFTR i G551D CFTR (videti, npr., http://www.genet.sickkids.on.ca/cftr/, za CFTR mutacije).

[0017]"Kristalni", kako se ovde upotrebljava, se odnosi na jedinjenja ili kompozicije gde su strukturne jedinice raspoređene u fiksnim geometrijskim šarama ili rešetkama, tako da kristalne čvrste supstance imaju kruti raspored daljeg rastojanja. Strukturalne jedinice koje sačinjavaju kristalnu strukturu mogu biti atomi, molekuli, ili joni. Kristalne čvrste supstance pokazuju određene tačke topljenja.

[0018]Termin "modulacija", kako se ovde upotrebljava, označava povećanje ili smanjenje, npr. aktivnosti, merljivim iznosom.

[0019]U jednom aspektu, pronalazak opisuje oblik 3-(6-(l-(2,2-difluorobenzo[d][l,3] dioksol-5-il) ciklopropankarboksamido)- 3-metilpiridin-2-il)benzoeve kiseline koji je okarakterisan kao Oblik I.

[0020]U drugom izvođenju, Oblik I je karakterisan sa jednim ili više maksimuma od 15,2 do 15,6 stepeni, 16,1 do 16,5 stepeni, i 14,3 do 14,7 stepeni u difrakciji rendgenskog praha dobijenoj pomoću Cu K alfa zračenja.

[0021]U još jednom izvođenju, Oblik I je karakterisan sa jednim ili više maksimuma od 15,4,16,3 i 14,5 stepeni.

[0022]U sledećem izvođenju, Oblik I je dalje karakterisan sa maksimumom od 14,6 do 15,0 stepeni.

[0023]U sledećem izvođenju, Oblik I je dalje karakterisan sa maksimumom od 14,8 stepeni.

[0024]U sledećem izvođenju, Oblik I je dalje karakterisan sa maksimumom od 17,6 do 18,0 stepeni.

[0025]U sledećem izvođenju, Oblik I je dalje karakterisan sa maksimumom od 17,8 stepeni.

[0026]U sledećem izvođenju, Oblik I je dalje karakterisan sa maksimumom od 16,4 do 16,8 stepeni.

[0027]U sledećem izvođenju, Oblik I je dalje karakterisan sa maksimumom od 16,4 do 16,8 stepeni.

[0028]U sledećem izvođenju, Oblik I je dalje karakterisan sa maksimumom od 16,6 stepeni.

[0029]U sledećem izvođenju, Oblik I je dalje karakterisan sa maksimumom od 7,6 do 8,0 stepeni.

[0030]U sledećem izvođenju, Oblik I je dalje karakterisan sa maksimumom od 7,8 stepeni.

[0031]U sledećem izvođenju, Oblik I je dalje karakterisan sa maksimumom od 25,8 do 26,2 stepeni.

[0032]U sledećem izvođenju, Oblik I je dalje karakterisan sa maksimumom od 26,0 stepeni.

[0033]U sledećem izvođenju, Oblik I je dalje karakterisan sa maksimumom od 21,4 do 21,8 stepeni.

[0034]U sledećem izvođenju, Oblik I je dalje karakterisan sa maksimumom od 21,6 stepeni.

[0035]U sledećem izvođenju, Oblik I je dalje karakterisan sa maksimumom od 23,1 do 23,5 stepeni.

[0036]U sledećem izvođenju, Oblik I je dalje karakterisan sa maksimumom od 23,3 stepeni.

[0037]U nekim izvođenjima, Oblik I je karakterisan difrakcionim šablonom koji je suštinski sličan onom sa Slike 1.

[0038]U nekim izvođenjima, Oblik I je karakterisan difrakcionim šablonom koji je suštinski sličan onom sa Slike 2.

[0039]U nekim izvođenjima, distribucija veličine čestica od D90 je oko 82 mm ili manje za Oblik I.

[0040]U nekim izvođenjima, distribucija veličine čestica od D50 je oko 30 mm ili manje za Oblik I.

[0041]U jednom aspektu, pronalazak prikazuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži Oblik I i farmaceutski prihvatljiv nosač.

[0042]U jednom izvođenju, predmetni pronalazak prikazuje Oblik I za upotrebu u lečenju bolesti koja je posredovana sa CFTR kod ljudi i koja obuhvata davanje efikasne količine Oblika I čoveku.

[0043]U nekim izvođenjima, upotreba se sastoji od davanja dodatnog terapeutskog agensa.

[0044]U nekim izvođenjima, bolest je odabrana iz cistične fibroze, hereditarnog emfizema, hereditarne hemokromatoze, deficijencija fibrinolize koagulacije, kao što je nedostatak proteina C, hereditarnog angioedema Tip 1, deficijencija prerade lipida, kao što je porodična hiperholesterolemija, kilomikronemije Tip 1, abetalipoproteinemije, bolesti skladištenja lizozoma, kao što je bolest I-ćelija/pseudo-Hurler, mukopolisaharidoza, Sandhof/Tay-Sachs, Crigler-Najjar tip II, poliendokrinopatije/hiperinsulemije, šećerne bolesti, Laron patuljasti rast, deficijencije mijeloperoksidaze, primarnog hipoparatiroidizma, melanoma, glikogenoze CDG tip 1, hereditarnog emfizema, kongenitalnog hipertiroidizma, osteogeneze imperfekta, hereditarne hipofibrinogenemije, deficijencije ACT, inspidnog dijabetesa (Dl), neurofizijalnog Dl, nefrogenskog Dl, Charcot-Marie Tooth sindroma, Perlizaeus-Merzbacher bolesti, neurodegenerativnih bolesti kao što je Alchajmerova bolest, Parkinsonova bolest, amiotrofična lateralna skleroza, progresivna supranuklearna palsi, Pick-ova bolest, nekoliko poliglutaminskih neuroloških poremećaja kao što su Huntington, spinocerebelarna ataksija Tip 1, spinalna i bulbarna mišićna atrofija, "dentatorubal pallidoluvsian" i miotonička distrofija, kao i spongiformna encefalopatija, kao što su hereditarna Creutzfeldt-Jakobova bolest, Fabri bolest, Straussler-Scheinker sindrom, COPD, bolest suvog-oka, i Sjogrenova bolest.

[0045]U jednom izvođenju, predmetni pronalazak obezbeđuje Oblik I za upotrebu u lečenju cistične fibroze kod čoveka, koji obuhvata administriranje pomenutom čoveku efektivne količine Oblika I.

[0046]U jednom aspektu, predmetni pronalazak karakteriše komplet koji sadrži Oblik I i uputstva za upotrebu istog.

[0047]U jednom aspektu, predmetni pronalazak predstavlja postupak pripremanja Oblika I koji sadrži disperziju ili rastvaranje HCI soli 3-(6-(l-(2,2-difluorobenzo[d][l,3]dioksol-5-il) ciklopropankarboksamido)-3-metilpiridin-2-il)benzoeve kiseline u odgovarajućem rastvaraču u delotvornoj količini vremena.

[0048]U jednom izvođenju, predmetni pronalazak predstavlja postupak pripremanja Oblika I koji sadrži disperziju HCI soli 3-(6-(l-(2,2-difluorobenzo[d][l,3]dioksol-5-il) ciklopropankarboksamido)-3-metilpiridin-2-il)benzoeve kiseline u odgovarajućem rastvaraču u delotvornoj količini vremena.

[0049]U nekim izvođenjima, odgovarajući rastvarač je voda ili smeša alkohol/voda.

[0050]U nekim izvođenjima, odgovarajući rastvarač je voda ili 50% metanol/voda smeša.

[0051]U nekim izvođenjima, odgovarajući rastvarač je voda.

[0052]U nekim izvođenjima, odgovarajući rastvarač je smeša koja se sastoji od 50% metanola i 50% vode.

[0053]U nekim izvođenjima, efikasna količina vremena je oko 2 do oko jedan dan. U nekim izvođenjima, efikasna količina vremena je oko 2 do oko 18 sati. U nekim izvođenjima, efikasna količina vremena je oko 2 do oko 12 sati. U nekim izvođenjima, efikasna količina vremena je oko 2 do oko 6 sati.

[0054]U jednom aspektu, pronalazak opisuje kristalni oblik 3-(6-(l-(2,2-difluorobenzo[d][l,3]dioksol-5-il) ciklopropankarboksamido)-3-metilpiridin-2-il)benzoeve kiseline koja ima monoklinički kristalni sistem, P21/n prostornu grupu, i sledeće dimenzije jedinica ćelija: a = 4,9626 (7) A, b = 12,2994 (18) A, c = 33,075 (4) A, a = 90 °, S = 93,938 (9) °, i Y = 90 °.

Metodi Pripreme Oblika I.

[0055]U jednom izvođenju, Oblik I se dobija rasipanjem ili rastvaranjem slanog oblika, kao što je HCL, 3-(6-(l-(2,2-difluorobenzo[d][l,3]dioksol-5-il) ciklopropankarboksamido)-3-metilpiridin-2-il)benzoeve kiseline u odgovarajućem rastvaraču u delotvornoj količini vremena. U još jednom izvođenju, Oblik I se dobija rasipanjem slanog oblika, kao što je HCL, 3-(6-(l-(2,2-difluorobenzo[d][l,3] dioksol-5-il)ciklopropankarboksamido)-3-metilpiridin-2-il) benzoeve kiseline u odgovarajućem rastvaraču u delotvornoj količini vremena. U još jednom izvođenju, Oblik I se formira direktno iz 3-(6-(l-(2,2-difluorobenzo[d][l,3 dioksol-5-il)ciklopropankarboksamido)-3-metilpiridin-2-il)-t-butilbenzoata i odgovarajuće kiseline, kao što je mravlja kiselina. U još jednom izvođenju, HCI slani oblik 3-(6-(l-(2,2-difiuorobenzo[d][l,3]dioksol-5-il)ciklopropankarboksamido)-3-metilpiridin-2-il) benzoeve kiseline je polazna tačka i u jednom izvođenju se može dobiti spajanjem kiselog hloridnog ostatka sa amino ostatkom prema Šemama 1-3.

[0056]Koristeći HCI, na primer, slani oblik 3-(6-(l-(2,2-difiuorobenzo[d3[l,3]dioksol-5-il) ciklopropankarboksamido)-3-metilpiridin-2-il)benzoeve kiseline kao polaznu tačku, Oblik I se može

formirati u visokim prinosima rasipanjem ili rastvaranjem HCI slanog oblika 3-(6-(l-(2,2-difluorobenzo[d] [l,3]dioksol-5-il)ciklopropankarboksamido)-3-metilpiridin-2-il) benzoeve kiseline u odgovarajućem rastvaraču u delotvornoj količini vremena. Drugi slani oblici 3-(6-(l-(2,2-difluorobenzo[d] [l,3]dioksol-5-il)ciklopropankarboksamido)-3-metilpiridin-2-il) benzoeve kiseline se mogu koristiti kao, na primer, drugi mineralni ili organski kiseli oblici. Ostali slani oblici nastaju kao rezultat hidrolize t-butil estra sa odgovarajućom kiselinom. Druge kiseline/slani oblici obuhvataju azotne, sumporne, fosforne, borne, sirćetne, benzoeve, malonske, i slično. Slani oblik 3-(6-(l-(2,2-difluorobenzo[d] [l,3]dioksol-5-il)ciklopropankarboksamido)-3-metilpiridin-2-il) benzoeve kiseline može ili ne mora biti rastvorljiv u zavisnosti od rastvarača koji se koristi, ali nedostatak rastvorljivosti ne sprečava formiranje Oblika I. Na primer, u jednom izvođenju, odgovarajući rastvarač može biti voda ili mešavina alkohol/voda kao što je smeša 50% metanol/voda, iako je HCI slani oblik 3-(6-(l-(2,2-difluorobenzo[d][l,3]dioksol-5-il) ciklopropankarboksamido)-3-metilpiridin-2-il)benzoeve kiseline samo slabo rastvorljiv u vodi. U jednom izvođenju, odgovarajući rastvarač je voda.

[0057]Efikasna količina vremena za formiranje Oblika I iz slanog oblika 3-(6-(l-(2,2-difluorobenzo[d][l,3]dioksol-5-il) ciklopropankarboksamido)-3-metilpiridin-2-il)benzoeve kiseline može biti bilo koje vreme između 2 do 24 časa ili duže. Generalno, više od 24 časa nije potrebno da bi se dobili visoki prinosi (~98%), ali neki rastvarači mogu zahtevati veće količine vremena. Takođe je poznato da je količina potrebnog vremena obrnuto proporcionalna temperaturi. To jest, što je viša temperatura to je manje vremena potrebno da bi se uticalo na odvajanje kiseline za formiranje Oblika I. Kada je rastvarač voda, mešanje disperzije približno 24 sata na sobnoj temperaturi daje Oblik I u prinosu od oko 98%. Ako je rastvor slanog oblika 3-(6-(l-(2,2-difluorobenzo[d][l,3]dioksol-5-il) ciklopropankarboksamido)-3-metilpiridin-2-iljbenzoeve kiseline poželjan za svrhe procesa, može se koristiti povišena temperatura. Nakon mešanja rastvora za efikasnu količinu vremena na povišenoj temperaturi, rekristalizacija nakon hlađenja prinosi značajno čiste oblike Oblika I. U jednom izvođenju, suštinski čist se odnosi na više od oko 90% čistoće. U još jednom izvođenju, suštinski čist se odnosi na više od oko 95% čistoće. U još jednom izvođenju, suštinski čist se odnosi na više od oko 98% čistoće. U još jednom izvođenju, suštinski čist se odnosi na više od oko 99% čistoće. Odabrana temperatura delimično zavisi od upotrebljenog rastvarača i neko ko je uobičajeno stručan u ovoj delatnosti je više nego sposoban da ovo odredi. U jednom izvođenju, temperatura je između sobne temperature i oko 80 °C. U drugom izvođenju, temperatura je između sobne temperature i oko 40 °C. U drugom izvođenju, temperatura je između oko 40 °C i oko 60 °C. U još jednom izvođenju, temperatura je između oko 60 °C i oko 80 °C.

[0058]U nekim izvođenjima, Oblik I može biti dalje prečišćen iz organskog rastvarača rekristalizacijom. Primeri organskih rastvarača uključuju, ali nisu ograničeni na, toluen, kumen, anizol, 1-butanol, izopropilacetat, butil acetat, izobutil acetat, metil t-butil etar, metil izobutil keton, ili 1-propanol/voda (u različitim razmerama). Temperatura se može koristiti kao što je opisano gore. Na primer, u jednom aspektu, Oblik I se rastvara u 1-butanolnu na 75°C sve dok se potpuno ne rastvori. Hlađenje rastvora na 10°C pri brzini od 0,2°C/min prinosi kristale Oblika I koji mogu biti izolovani filtracijom.

Upotrebe, formulacije i administriranie

Farmaceutski prihvatljive kompozicije

[0059]U drugom aspektu ovog pronalaska, farmaceutski prihvatljive kompozicije su obezbeđene, pri čemu ove kompozicije sadrže Oblik I kao što je ovde opisano, i opciono sadrže farmaceutski prihvatljiv nosač, adjuvant ili transportno sredstvo. U nekim izvođenjima, ove kompozicije izborno dalje sadrže jedan ili više dodatnih terapeutskih agensa.

[0060]Kao što je opisano gore, farmaceutski prihvatljive kompozicije predmetnog pronalaska dodatno sadrže farmaceutski prihvatljiv nosač, adjuvant ili transportno sredstvo, koji, kako se ovde koriste, obuhvataju bilo koji i sve rastvarače, razblaživače, ili druga tečna transportna sredstva, pomagala za disperziju ili suspenziju, površinski aktivne agense, izotonične agense, agense za zgušnjavanje ili emulgovanje, prezervative, čvrsta vezivna sredstva, lubrikante i slično, kako je pogodno za određeni željeni oblik doziranja. Remington's Pharmaceutical Sciences, Šesnaesto Izdanje, E. W. Martin (Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1980) otkriva različite nosače koji se koriste u formulisanju farmaceutski prihvatljivih kompozicija i poznate tehnike za njihovu pripremu. Osim ukoliko je bilo koji uobičajeni nosač posrednik nekompatibilan sa jedinjenjima pronalaska, kao što bi bilo da proizvodi bilo koji neželjeni biološki efekat ili da ima neki vid štetne interakcije sa bilo kojom drugom komponentom (komponentama) farmaceutski prihvatljive kompozicije, njegova primena se razmatra da bude u obimu ovog pronalaska. Neki primeri materijala koji mogu poslužiti kao farmaceutski prihvatljivi nosači obuhvataju, ali nisu ograničeni na, jonske izmenjivače, aluminijum, aluminijum stearat, lecitin, proteine seruma, kao što je ljudski serumski albumin, pufer supstance kao što su fosfati, glicin, sorbinska kiselina ili kalijum sorbat, parcijalne gliceridne smeše zasićenih masnih kiselina povrća, voda, soli ili elektroliti, kao što je protamin sulfat, dinatrijum hidrogen fosfat, kalijum hidrogen fosfat, natrijum hlorid, soli cinka, koloidni silicijum dioksid, magnezijum trisilikat, polivinil pirolidon, poliakrilati, voskovi, polietilen-polioksipropilen-blok polimeri, vunena mast, šećeri kao što je laktoza, glukoza i saharoza; škrobovi kao što je kukuruzni škrob i krompirov škrob; celuloza i njeni derivati kao što su natrijum karboksimetil celuloza, etil celuloza i celulozni acetat; tragakant u prahu; slad; žeiatin; talk; ekscipijenti kao što su kakao puter i voskovi supozitorije; ulja kao što je ulje kikirikija, ulje semena pamuka; ulje šafranike; susamovo ulje; maslinovo ulje; kukuruzno ulje i sojino ulje; glikoli; kao što je propilen glikol ili polietilen glikol; estri kao što je etil oleat i etil laurat; agar; agensi za puferovanje kao što su magnezijum hidroksid i aluminijum hidroksid; alginska kiselina; voda bez pirogena; izotonični slani rastvor; Ringerov rastvor; etil alkohol, i fosfatni pufer rastvori, kao i drugi netoksični kompatibilni lubrikanti kao što su natrijum lauril sulfat i magnezijum stearat, kao i agensi za bojenje, agensi za oslobađanje, agensi za oblaganje, agensi za zaslađivanje, agensi arome i mirisna, konzervansi i antioksidanti mogu ta kode biti prisutni u kompoziciji, prema proceni formulatora.

Upotreba jedinjenja i farmaceutski prihvatljivih kompozicija

[0061]U još jednom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje Oblik I za upotrebu u lečenju stanja, bolesti ili poremećaja koje CFTR podrazumeva. U nekim realizacijama, ovaj pronalazak obezbeđuje Oblik I za upotrebu u lečenju stanja, bolesti ili poremećaja koje nedostatak CFTR aktivnosti podrazumeva, koji obuhvata davanje kompozicije koja sadrži čvrsto stanje ovde opisanog Oblika I subjektu, poželjno sisaru, kojem je to potrebno.

[0062]"CFTR-posredovana bolest" kako se ovde upotrebljava je bolest izabrana iz cistične fibroze, Hereditarnog emfizema, Hereditarne hemohromatoze, nedostaka Fibrinolize koagulacije, poput nedostatka Proteina C, hereditarnog angioedema Tip 1, nedostka obrade lipida, kao što je porodična hiperholesterolemija, hilomikronemija Tip 1, Abetalipoproteinemia, bolesti skladištenja lizozoma, kao što je bolest I-ćelija/Pseudo-Hurler, Mukopolisaharidoza, Sandhof/Tai-Saks, Krigler-Najarov sindrom Tip II,

[0063]Poliendokrinopatija/Hiperinsulemia, dijabetes melitus, Laron patuljasti rast, nedostatak Mileoperoksidaze, primarni hiperparatireoidizam, Melanom, Glikanoza CDG tip 1, Hereditarni emfizem, Urođeni hipertiroidizam, Osteogeneza imperfekta, Hereditarna hipofibrinogenemia, nedostatak ACT, Inspidni dijabetes (Dl), Neurofizijski Dl, Neprogenski Dl, Charcot-Marie Tooth sindrom, Perlizeus-Merzbaher bolest, neurodegenerativne bolesti kao što je Alchajmerova bolest, Parkinsonova bolest, Amiotrofična lateralna skleroza, Progresivna supranuklearna Plaši, Pick-ova bolest, nekoliko poliglutaminskih neuroloških poremećaja kao što su Huntington, Spinocerebularna ataksija tip I, kičmena i bulbarna mišićna atrofija, Dentatorubalna palidoluzijska i Miotonična distrofija, kao Spongiformne encefalopatije, poput Hereditarne Creutzfeldt-Jakobove bolesti, Fabri bolesti, Straussler-Scheinker sindroma, COPD, oboljenja suvog-oka, i Sjogrenove bolesti.

[0064]U nekim izvođenjima, ovaj pronalazak obezbeđuje Oblik 1 za upotrebu u lečenju CFTR-posredovane bolesti kod čoveka i sadrži korak u kojem se pomenutom čoveku daje efektivna količina kompozicije koja sadrži Oblik I koji je ovde opisan.

[0065]Prema alternativnom poželjnom izvođenju, pronalazak obezbeđuje Oblik I za upotrebu u lečenju cistične fibroze kod čoveka i sadrži korak u kojem se pomenutom čoveku daje kompozicija koja sadrži Oblik I koji je ovde opisan.

[0066]Prema pronalasku "efikasna količina" Oblika I ili njegove farmaceutski prihvatljive kompozicije je ona količina koja je efikasna za lečenje ili ublažavanje težine bilo koje od bolesti koje su prethodno navedene.

[0067]Oblik I ili njegova farmaceutski prihvatljiva kompozicija se može primenjivati korišćenjim bilo koje količine i bilo kojeg načina primene koji su efektivni za lečenje ili ublažavanje težine jedne ili više gore pomenutih bolesti.

[0068]U nekim izvođenjima, Oblik I koji je ovde opisan ili njegova farmaceutski prihvatljiva kompozicija je korisna za lečenje ili ublažavanje težine cistične fibroze kod pacijenata koji ispoljavaju rezidualnu CFTR aktivnost u apikalnoj membrani respiratornog i ne-respiratornog epitela. Prisustvo rezidualne CFTR aktivnosti na epitelnoj površini se može lako detektovati korišćenjem postupaka poznatih u struci, npr. standardne elektrofiziološke, biohemijske ili histohemijske tehnike. Takvi postupci identifikuju CFTR aktivnost koristeći in vivo ili eks vivo elektrofiziološke tehnike, merenja znoja ili pljuvačne a- koncentracije, ili eks vivo biohemijske ili histohemijske tehnike za praćenje gustine površine ćelija. Korišćenjem takvih metoda, rezidualna CFTR aktivnost se može lako detektovati kod pacijenata koji su heterozigotni ili homozigotni za niz različitih mutacija, uključujući pacijente koji su homozigotni ili heterozigotni za najčešću mutaciju, AF508.

[0069]U jednom izvođenju, Oblik I koji je ovde opisan ili njegove farmaceutski prihvatljive kompozicije su korisni za lečenje ili ublažavanje težine cistične fibroze kod pacijenata koji su u okviru pojedinih genotipova koji pokazuju rezidualnu CFTR aktivnost, npr., mutacije Klase III (oslabljena regulacija ili otvaranje i zatvaranje), mutacije Klase IV (izmenjena provodljivost), ili mutacije Klase V (smanjena sinteza) (Lee R. Choo-Kang, Pamela L, Zeitlin, Type I, II, III, IV, and V cvstjc fibrosis Tansmembrane Conductance Regulator Defects and Opportunities of Therapv; Current Opinion in Pulmonary Medicine 6:521 - 529, 2000). Ostali genotipovi pacijenata koji pokazuju ostatak CFTR aktivnosti uključuju pacijente koji su homozigotni za jednu od ovih klasa ili heterozigotni sa bilo kojom drugom klasom mutacija, uključujući mutacije Klase I, mutacije Klase II ili mutaciju kojoj nedostaje klasifikacija.

[0070]U jednom izvođenju, Oblik I koji je ovde opisan ili njegova farmaceutski prihvatljiva kompozicija su korisni za

lečenje ili ublažavanje težine cistične fibroze kod pacijenata unutar određenih kliničkih fenotipova, npr., klinički fenotip koji može biti od umerenog do blagog i koji se obično povezuje sa količinom preostale CFTR aktivnosti u apikalnoj membrani epitela. Takvi fenotipovi uključuju pacijente koji su imali insuficijenciju pankreasa ili pacijenate sa dijagnozom idiopatskog pankreatitisa i sa kongenitalnim bilateralnim odsustvom VAS deferensa, ili blagom bolešću pluća.

[0071]Tačna količina koja je potrebna će varirati od subjekta do subjekta, u zavisnosti od vrste, starosti i opšteg stanja subjekta, težine infekcije, određenog agensa, njegovog načina primene, i slično. Jedinjenja iz pronalaska su poželjno formulisana u obliku jedinične doze, radi lakšeg davanja i uniformnosti doziranja. Izraz "dozni jedinični oblik" kako se ovde koristi se odnosi na fizički odvojenu jedinicu primerenog agensa za pacijenta koji se tretira. Podrazumeva se, međutim, da ukupnu dnevnu upotrebu jedinjenja i kompozicija iz ovog pronalaska odlučuje lekar u okviru medicinske procene. Specifičan efikasan nivo doze za svakog posebnog pacijenta ili organizam zavisiće od različitih faktora uključujući poremećaj koji se leči i ozbiljnost poremećaja; aktivnost specifičnog jedinjenja koje se koristi; specifični sastav koji se koristi; starosti, telesne težine, opšteg zdravlja, pola i načina ishrane pacijenta; vremena primene, načina primene, i stope izlučivanja specifičnog jedinjenja koje se koristi; trajanje tretmana; lekova koji se koriste u kombinaciji ili zajedno sa specifičnim jedinjenjem koje se koristi, i sličnih faktora koji su dobro poznati u medicinskoj tehnici. Termin "pacijent", kako je ovde korišten, označava životinju, poželjno sisara, a najpoželjnije čoveka.

[0072]Farmaceutski prihvatljive kompozicije iz ovog pronalaska se mogu primenjivati na ljude i druge životinje oralno, rektalno, parenteralno, intracisternalno, intravaginalno, intraperitonealno, topikalno (kao praškovi, masti ili kapi), bukalno, kao oralni ili nazalni sprej, ili slično, u zavisnosti od težine infekcije koja se leči. U nekim izvođenjima, jedinjenja iz ovog pronalaska se mogu primenjivati oralno ili parenteralno u nivoima doze od oko 0.01 mg/kg do oko 50 mg/kg i poželjno od oko 1 mg/kg do oko 25 mg/kg, telesne težine subjekta po danu, jednom ili više puta dnevno, da se dobije željeni terapeutski efekat.

[0073]U izvesnim izvođenjima, količina doze Oblika I u obliku jedinične doze je od 100 mg do 1.000 mg. U drugom izvođenju, količina doze Oblika I je od 200 mg do 900 mg. U drugom izvođenju, količina doze Oblika I je od 300 mg do 800 mg. U sledećem izvođenju, količina doze Oblika I je od 400 mg do 700 mg. U još jednom izvođenju, količina doze Oblika I je od 500 mg do 600 mg.

[0074]Injektabilni preparati, na primer, sterilne injekcione vodene ili uljane suspenzije mogu biti formulisane prema onome što je poznato u struci korišćenjem pogodnih agensa za rasipanje ili vlaženje i agensa za suspendovanje. Sterilni preparat za injekcije može takođe biti sterilni injektabilni rastvor, suspenzija ili emulzija u netoksičnom parenteralno prihvatljivom razblaživaču ili rastvaraču, na primer, kao rastvor u 1,3-butandiolu. Među prihvatljivim tečnim nosačima i rastvaračima koji se mogu koristiti su voda, Ringerov rastvor, U.S.P. i izotonični rastvor natrijum hlorida. Pored toga, sterilna, fiksirana ulja se konvencionalno koriste kao rastvarač ili posrednik za suspendovanje. Za ovu svrhu se bilo koje blago fiksirano ulje može koristiti uključujući sintetičke mono- ili digliceride. Pored toga, masne kiseline kao što je oleinska kiselina se koriste u pripremanju injekcija.

[0075]Injektabiine formulacije mogu biti sterilisane, na primer, filtracijom kroz filter koji zadržava bakterije, ili ugradnjom sterilišućih agensa u obliku sterilnih čvrstih kompozicija koje pre upotrebe mogu biti rastvorene ili rasprštene u sterilnoj vodi ili drugom sterilnom injektabilnom posredniku.

[0076]Kompozicije za rektalnu ili vaginalnu primenu su poželjno supozitorije koje mogu biti pripremljene mešanjem jedinjenja ovog pronalaska sa pogodnim neiritirajućim ekscipijentima ili nosačima, kao što su kakao puter, polietilen glikol iii supozitor vosak koji su čvrsti na sobnoj temperaturi ali tečni na telesnoj temperaturi i stoga se tope u rektumu ili vaginalnoj šupljini i oslobađaju aktivno jedinjenje.

[0077]Čvrsti dozni oblici za oralnu administraciju uključuju kapsule, tablete, pilule, praškove i granule. U takvim čvrstim doznim oblicima, aktivno jedinjenje se meša sa najmanje jednim inertnim, farmaceutski prihvatljivim ekscipijentom ili nosačem kao što je natrijum citrat ili dikalcijum fosfat i/ili a) punioci ili proširivači kao što su škrobovi, laktoza, saharoza, glukoza, manitol i silicijumska kiselina, b) vezivna sredstva kao što su, na primer, karboksimetiiceluloza, alginati, želatin, polivinilpirolidinon, saharoza i akacija, c) ovlaživači kao što je glicerol, d) sredstva za razlaganje kao što su agar, kalcijum karbonat, krompirov ili tapioka škrob, alginska kiselina, određeni silikati i natrijum karbonat, e) agensi koji usporavaju rastvore kao što je parafin, f) ubrzivači apsorpcije kao što su kvartarna amonijak jedinjenja, g) sredstva za vlaženje kao što su, na primer, cetil alkohol i glicerol monostearat, h) apsorbenti kao što su kaolin i bentonit glina, i i) lubrikanti kao što su talk, kalcijum stearat, magnezijum stearat, čvrsti polietilen glikoli, natrijum lauril sulfat, i njihove smeše. U slučaju kapsula, tableta i pilula, dozni oblik može takođe sadržati agense za puferovanje.

[0078]Čvrste kompozicije sličnog tipa se takođe mogu koristiti kao punioci u meko i čvrsto punjenim želatinskim kapsulama primenom takvih ekscipijenata kao što su laktoza ili mlečni šećer kao i polietilen glikoli velike molekulske težine i slično. Čvrsti oblici doze tableta, dražeja, kapsula, pilula i granula se mogu pripremiti sa omotačima i ljuskama kao što su gastrorezistentni omotači i drugi omotači dobro poznati u struci farmaceutske formulacije. Oni mogu izborno da sadrže neprozirne agense i mogu takođe biti takvog sastava da aktivni sastojak (sastojke) oslobađaju samo, ili prvenstveno, u određenom delu intestinalnog trakta, opciono, na usporen način. Primeri umetnutih kompozicija koje se mogu koristiti obuhvataju polimerne supstance i voskove. Čvrste kompozicije sličnog tipa se takođe mogu koristiti kao punioci u meko i čvrsto punjenim želatinskim kapsulama primenom takvih ekscipijenata kao što su laktoza ili mlečni šećer kao i poletilen glikoli sa velikom molekularnom težinom i slično.

[0079]Aktivna jedinjenja takođe mogu biti u obliku mikrokapsule sa jednim ili više ekscipijenata kao što je gore navedeno. Čvrsti oblici doze tableta, dražeja, kapsula, pilula i granula se mogu pripremiti sa omotačima i ljuskama kao što su gastrorezistentni omotači, omotači sa kontrolom oslobađanja i drugi omotači dobro poznati u struci farmaceutske formulacije. U takvim čvrstim doznim oblicima aktivno jedinjenje može biti pomešano sa najmanje jednim inertnim razblaživačem kao što je saharoza, laktoza ili škrob. Takvi dozni oblici mogu takođe sadržati, kao što je uobičajeno, dodatne supstance osim inertnih razblaživača, npr., tabletni lubrikanti i druga tabletna pomagala što su magnezijum stearat i mikrokristalna celuloza. U slučaju kapsula, tableta i pilula, dozni oblici mogu takođe sadržati agense za puferovanje. Oni mogu opciono da sadrže neprozirne agense i mogu takođe biti takvog sastava da oslobađaju aktivni sastojak (sastojke) samo, ili prvenstveno, u određenom delu intestinalnog trakta, opciono, na usporen način. Primeri umetnutih kompozicija koje se mogu koristiti obuhvataju polimerne supstance i voskove.

[0080]Takođe treba uzeti u obzir da se Oblik I koji je ovde opisan ili njegova farmaceutski prihvatljiva kompozicija mogu koristit' u kombinovanim terapijama, to jest, Oblik I se može primenjivati istovremeno sa, pre ili posle, jednim ili više drugih željenih terapeub'ka ili medicinskih procedura. Za posebnu kombinaciju terapija (terapeutika ili procedura) koja se koristi u kombinovanom režimu treba uzeti u obzir kompatibilnost željenih letova i/ili procedure i željeni terapeutski efekat koji treba da se postigne. Takođe je jasno da terapije koje se koriste mogu postići željeni efekat za isti poremećaj (na primer, smišljeno jedinjenje se može davati simultano sa drugim agensom koje se koristi za lečenje istog poremećaja), ili mogu postići različite efekte (npr.,kontrola bilo kakvih neželjenih efekata). Kako se ovde koristi, dodatni terapeutski agensi koji se normalno primenjuju za lečenje ili prevenciju određene bolesti, ili stanja, su poznati kao "odgovarajući za bolest, ili stanje, koje se leči".

[0081]U jednom izvođenju, dodatni agens se bira iz mukolitičkog agensa, bronhodijalatora, anti-biotičkog, anti-infektivnog agensa, anti-inflamatornog agensa, CFTR modulatora osim jedinjenja iz predmetnog pronalaska, ili nutritivnog agensa.

[0082]U drugom izvođenju, dodatni agens je jedinjenje izabrano iz gentamicina, kurkumina, ciklofosfamida, 4-fenilbutirata, miglustata, felodipina, nimodipina, Filoksina B, genisteina, Apigenina, cAMP/cGMP modulatora kao što su rolipram, sildenafil, milrinon, tadalafil, amrinon, izoproterenol, albuterol, i almeterol, deoksispergualina, HSP 90 inhibitora, HSP 70 inhibitora, inhibitora proteozoma poput epoksomicina, laktacistina itd.

[0083]U sledećem izvođenju, dodatni agens je jedinjenje koje je otkriveno u WO 2004028480, WO 2004110352, WO 2005094374, WO 2005120497, ili WO 2006101740.

[0084]U drugom izvođenju, dodatni agens je benzo(c) hinolizidinski derivat koji ispoljava aktivnost CFTR modulacije ili benzopiranski derivat koji ispoljava aktivnost CFTR modulacije.

[0085]U sledećem izvođenju, dodatni agens je jedinjenje koje je otkriveno u US7202262, US6992096, US20060148864, US20060148863, US20060035943, US20050164973, VVO2006110483, VVO2006044456, VVO2006044682, WO2006044505, WO2006044503, VVO2006044502, ili VVO2004091502.

[0086]U još jednom izvođenju, dodatni agens je jedinjenje koje je otkriveno u VVO20O4080972, WO2004111014, WO2005035514, VVO2005049018, WO2006002421, VVO2006099256, WO2006127588, ili VVO2007044560.

[0087]U još jednom izvođenju, dodatni agens odabran iz jedinjenja opisanih u U.S. Patent Application Serial No. 11/165,818, izdat kao U.S. Published Patent Application No. 2006/0074075, predat 24og Juna 2005. U sledećem izvođenju, dodatni agens je N-(5-hidroksi-2,4-ditert-butil-fenil)-4-okso-lH-hinolin-3-karboksamid. Ove kombinacije su korisne za lečenje bolesti koje su ovde opisane, uključujući cističnu fibrozu. Ove kombinacije su takođe korisne u kompletima koji su ovde opisani.

[0088]Količina dodatnog terapeutskog sredstva prisutnog u kompozicijama iz ovog pronalaska neće biti veća od količine koja bi se normalno primenjivala u kompoziciji koja sadrži taj terapeutski agens kao jedini aktivni agens. Poželjno je da je količina dodatnog terapeutskog agensa u ovim opisanim kompozicijama u opsegu od oko 50% do 100% od količine koja je normalno prisutna u kompoziciji koja sadrži taj agens kao jedini terapeutski aktivni agens.

[0089]Oblik I koji je ovde opisan ili njegova farmaceutski prihvatljiva kompozicija se može takođe uključiti u kompozicije za oblaganje implantabilnih medicinskih uređaja, kao što su proteze, veštački zalisci, vaskularni graftovi, stentovi i kateteri. Prema tome, ovaj pronalazak, u sledećem aspektu, obuhvata kompoziciju za oblaganje implantabilnog uređaja koji sadrži Oblik I koji je ovde opisan ili njegovu farmaceutski prihvatljivu kompoziciju, i u klasama i podklasama koje se ovde koriste, i nosač koji je pogodan za oblaganje navedenog implantabilnog uređaja. U još jednom aspektu, predmetni pronalazak obuhvata impiantabilni uređaj koji je obložen kompozicijom koja sadrži Oblik I koji je ovde opisan ili njegovu farmaceutski prihvatljivu kompoziciju, i nosač pogodan za oblaganje navedenog implantabilnog uređaja. Pogodni omotači i opšta priprema obloženih implantabilnih uređaja su opisani u US Patentima 6,099,562; 5,886,026; i 5,304,121. Omotači su tipično biokompatibilni polimerni materijali kao što su hidrogel polimer, polimetildisiloksan, polikaprolakton, polietilen glikol, polimlečna kiselina, etilen vinil acetat i njihove smeše. Omotači mogu opciono biti dalje pokriveni pogodnim površinskim slojem od fluorosilikona, polisaharida, polietilen glikola, fosfolipida ili njihovih kombinacija da bi davali kontrolisane karakteristike oslobađanja u kompoziciji.

[0090]Da bi se ovde opisani pronalazak potpunije razumeo, sledeći primeri su navedeni. Treba razumeti da su ovi primeri samo za ilustrativne svrhe i da ih ne treba tumačiti kao da ograničavaju ovaj pronalazak ni na koji način.

PRIMERI

Metodi I Materijali

Diferencijalna skeniraiućakalorlmetrija ( DSC)

[0091]Podaci diferencijalne skenirajuće kalorimetrije (DSC) Oblika I su prikupljeni pomoću DSC Q100 V9.6 Build 290 (TA Instruments, New Castle, DE). Temperatura je kalibrisana sa indijumom i toplotni kapacitet je kalibrisan sa safirom. Uzorci 3-6 mg su odmereni u aluminljumske posude koje su savijene korišćenjem poklopaca sa 1 rupicom. Uzorci su skenirani od 25°C do 350°C pri brzini zagrevanja od l,0°C/min i sa produvavanjem gasovitog azota od 50ml/min. Podaci su sakupljeni softverom Thermal Advantage Q SeriesTM verzija 2.2.0.248 i analizirani softverom Univerzalne Analize verzija 4.1D (TA Instruments, New Castle, DE). Objavljeni brojevi predstavljaju pojedinačne analize.

XRPD ( Ultrazvučna Difrakcija Praha)

[0092]Podaci ultrazvučne difrakcije praha (XRPD) Oblika 1 su sakupljeni na Bruker D8 DISCOVER difraktometaru praha sa HI-STAR 2-dimenzionalnim detektorom i ravnim grafitnim monohromatorom. Cu zapečaćena cev sa Ka zračenjem je korišćena na 40 kV, 35mA. Uzorci su postavljeni na silikonskim pločicama nulte-pozadine na 25°C. Za svaki uzorak, dva okvira podataka su sakupljena, svaki na 120 sekundi na ukupno 2 različita 62 ugla: 8° i 26°. Podaci su integrisani sa GADDS softverom i spojeni sa DIFFRACTplusEVA softverom. Neizvesnosti za maksimalne prijavljene položaje su 6 0.2 stepeni.

[0093]Vitride® (natrijum bis(2-metoksietoksi) aluminijum hidrid [ili NaAIH2(OCH2CH20CH3)2], 65 wtg% rastvor u toluenu) je kupljen od Aldrich Chemicals.

[0094]2,2-Difluoro-l,3-benzodioksol-5-karboksilne kiseline je kupljen od Saltigo (partner Lankess korporacije).

[0095]Bilo gde u ovom pronalasku gde naziv jedinjenja ne može pravilno opisati strukturu jedinjenja, struktura zamenjuje ime i upravlja.

Sinteza 3-( 6-( l-( 2r2- dffluorobenzo[ dl[ lr3] dioksol- 5- ll) ciklopropankarboksamido)-3-metllplrldin-2-il)

benzoeve kiseline > HCI.

Acil Hlorldni Ostatak

Sinteza (2,2-difluoro-l,3-benzodloksol-5-il)-metanola

[0096]

[0097]Komercijalno dostupna 2,2-difluoro-l,3-benzodioksol-5-karboksilna kiselina (1.0 eq) se suspenduje u toluenu (10 vol), vltride® (2 eq) se dodaje kroz levak za dodavanje takvom brzinom da održava temperaturu na 15-25°C. Na

kraju dodavanja temperatura se povećava do 40°C tokom 2 h i zatim 10% (w/w) aq. NaOH (4.0 eq) se pažljivo dodaje kroz levak za dodavanje uz održavanje temperature na 40-50°C. Posle mešanja dodatnih 30 minuta, slojevi mogu da se razdvoje na 40°C. Organska faza se ohladi na 20°C zatim pere vodom (2 x 1.5 vol), suši (Na2S04), filtrira i koncentruje da bi se dobio sirovi (2,2-difluoro-l,3-benzodioksol-5-il)-metanol koji se direktno koristi u sledećem koraku.

Sinteza 5-hlormetil-2,2-difluoro-l,3-benzodioksola

[0098]

[0099](2,2-dinuoro-l,3-benzodioksol-5-il)-metanol(1.0 eq) se rastvara u MTBE (5 vol). Katalltlčka količina DMAP(1 mol %) se dodaje i SOCI2 (1.2 eq) se dodaje kroz levak za dodavanje. SOCI2 se dodaje takvom brzinom da se temperatura u reaktoru održava na 15-25°C. Temperatura se povećava do 30°C tokom 1 sata i zatim ohladi do 20°C i zatim se dodaje voda (4 vol) kroz levak za održavanje temperature na manje od 30°C. Posle mešanja dodatnih 30 minuta, dozvoljeno je da se slojevi razdvoje. Organski sloj se meša i 10% (w/v) aq. NaOH (4.4 vol) se dodaje. Posle mešanja 15 do 20 minuta, slojevi mogu da se razdvoje. Organska faza se zatim suši (Na2S04), filtrira i koncentruje da bi se dobio sirovi 5-hlorometil-2,2-difluoro-l,3-benzodioksol koji se direktno koristi u sledećem koraku.

Sinteza (2,2-difluoro-l,3-benzodioksol-5-il) acetonitrila.

[0100]

[0101]Rastvor 5-hlorometil-2,2-difiuoro-l,3-benzodioksol (1 eq) u DMSO (1.25 vol) se dodaje u gustu smešu NaCN (1.4 eq) u DMSO (3 vol) uz održavanje temperature između 30-40°C. Smeša se meša 1 sat, a zatim se dodaje voda (6 vol) I posle toga MTBE (4 vol). Posle mešanja od 30 min, slojevi se razdvajaju. Vodeni sloj je ekstrahovan sa MTBE (1.8 vol). Kombinovani organski slojevi se ispraju vodom (1.8 zapremina), suše (Na2S04), filtriraju i koncentruju da bi se dobio sirovi (2,2-difluoro-l,3-benzodioksol-5-il) acetonitril (95%) koji se koristi direktno u sledećem koraku.

Sinteza (2,2-difluoro-l,3-benzodioksol-5-II)-ciklopropankarbonltrila.

[0102]

[0103]Smeša (2,2-difluoro-l,3-benzodioksol-5-il) acetonitrila (1.0 eq), 50 wt% vodenog rastvora KOH (5.0 eq) 1-bromo 2-hloroetan (1.5 eq), i 0ct4NBr (0.02 eq) se zagreva na 70°C tokom 1 h. Reakciona smeša se hladi zatim obrađuje sa MTBE i vodom. Organska faza se ispira vodom i slanim rastvorom a zatim se rastvarač ukloni da bi se dobio (2,2-difluoro-l,3-benzodioksol-5-il)-ciklopropankarbonitril.

Sinteza l-(2,2-difluoro-l,3-benzodioksol-5-il)-clklopropankarbonske kiseline.

[0104]

[0105](2,2-difluoro-l,3-benzodioksol-5-il)-ciklopropankarbonitril se hidrolizuje primenom 6 M NaOH (8 equiv) u etanolu (5 vol) na 80°C preko noći. Smeša se hladi do sobne temperature i etanol ispari pod vakumom. Ostatak se prenese u vodu i MTBE, 1 M HCI se dodaje i slojevi se odvajaju. MTBE sloj se zatim tretira sa dicikloheksilaminom (0.97 equiv). Smeša je ohlađena na 0°C, filtrirana i oprana sa heptanom da bi dala odgovarajuću DCHA so. So se stavlja u MTBE 110% limunske kiseline i meša se sve dok se čvrste supstance ne rastvore. Slojevi se razdvajaju i MTBE sloj se ispira vodom i slanim rastvorom. Zamena rastvarača u heptan praćena filtriranjem daje l-(2,2-difluoro-l,3-benzodioksol-5-il)-ciklopropankarbonske kiseline nakon sušenja u vakumskoj peći na 50°C preko noći.

Sinteza l-(2,2-difluoro-l,3-benzodioksol-5-il)-ciklopropankarbonil hlorida.

[0106]

[0107]1- (2,2-difluoro-l,3-benzodioksol-5-il)-ciklopropankarbonske kiseline (1,2 eq) je razmućen u toluenu (2,5 vol) i smeša se zagreva do 60°C. S0CI2 (1.4 eq) se dodaje kroz levak za dodavanje. Toluen i SOCI2 su destilovani iz reakcione smeše nakon 30 minuta. Dodatni toluen (2.5 vol) se dodaje i ponovo destiluje.

Amino Ostatak

Sinteza terc-butil-3-(3-metilpiridin-2-il) benzoata.

[0108]

[0109]2-bromo-3-metilpiridin (i,o eq) se rastvara u toluenu (12 vol). K2C03 (4.8 eq) se dodaje a zatim i voda (3.5 vol) i smeša se zagreva do 65°C pod mlazom N2 u toku 1 sata. 3-(t-butoksikarbonil) fenilboronska kiselina (1.05eq) i Pd(dppf)CI2-CH2CI2 (0.015 eq) se zatim dodaju i smeša se zagreva na 80°C. Nakon 2 sata, toplota se Isključuje, voda se dodaje (3.5 vol) i slojevi mogu da se razdvoje. Organska faza se zatim ispira vodom (3.5 vol) i ekstrahuje sa 10% vodene metansulfonske kiseline (2 eq MsOH, 7.7 vol). Vodena faza postaje bazna sa 50% vodenog NaOH (2 eq) i ekstrahuje se sa EtOAc (8 vol). Organski sloj se koncentriše da bi se dobio sirovi terc-butil-3-(3-metilpiridin-2-il)benzoat (82%) koji se koristi direktno u sledećem koraku.

Sinteza 2-(3-(terc-butoksikarbonil)fenil)-3-metilpiridin-l-oksida.

[0110]

[0111]terc-Butil-3-(3-metilpiridin-2-il) benzoat (1.0 eq) se rastvara u EtOAc (6 vol). Voda (0. 3 vol) se dodaje a zatim i urea-hidrogen peroksid (3 eq). Ftalni anhidrid (3 eq) se dodaje u porcijama kao čvrsta supstanca za održavanje temperature u reaktoru ispod 45°C. Nakon završetka dodavanja ftalne kiseline, smeša se zagreva na 45°C. Posle mešanja dodatnih 4 sata, toplota se isključuje. 10% w/ tež vodeni Na2S03 (1,5 eq) se dodaje kroz levak za dodavanje. Nakon završetka Na2S03 dodavanja, smeša se meša dodatnih 30 minuta i slojevi se odvajaju. Organski sloj se meša i 10% w/w vodenog Na2C03 (2 eq) se dodaje. Posle mešanja tokom 30 minuta, slojevi mogu da se razdvoje. Organska faza se ispira 13% w/w vodenim NaCI. Organska faza se zatim filtrira i koncentruje da bi se dobio sirovi 2-(3-(terc-butoksikarbonil) fenil)-3-metilpiridin-l-oksid (95%) koji se koristi direktno u sledećem koraku.

Sinteza terc-butil-3-(6-amino-3-metilpiridin-2-il) benzoata.

[0112]

[0113]Rastvor 2-(3-(terc-butoksikarbonil) fenil)-3-metilpiridin-l-oksida (1 eq) i piridina (4 eq) u MeCN (8vol) se zagreva do 70°C. Rastvor metansulfonskog anhidrida (1,5 eq) u MeCN (2 vol) se dodaje tokom 50 min kroz levak za dodavanje uz održavanje temperature na manje od 75°C. Smeša je meša dodatnih 0.5 sati nakon završetka dodavanja. Smeša se zatim ostavlja da se ohladi do sobne temperature. Etanolamin (10 eq) se dodaje kroz levak za dodavanje. Nakon mešanja tokom 2 sata, dodaje se voda (6 vol) i smeša se ohladi na 10°C. Posle mešanja NLT 3_sata, čvrsta supstanca se sakuplja filtracijom i ispira vodom (3 vol), 2:1 MeCN/voda (3 vol), i MeCN (2 x 1.5 vol). Čvrsti ostatak se suši do konstantne težine (<1% razlika) u vakumskoj peći na 50°C uz blago N2 curenje da bi se dobio terc-butil-3-(6-amino-3-metilpiridin-2-il) benzoat kao crveno-žuta čvrsta supstanca (53% prinos).

Sinteza 3-(6-(l-(2,2-difluorobenzo[d][l,3] dioksol-5-il) ciklopropankarboksamido)-3-metilpiridin-2-il)-tbutilbenzoata.

[0114]

[0115]Sirovi acil hlorid se rastvara u toluenu (2,5 vol na bazi acil hloridu) i dodaje se kroz levak za dodavanje u smešu terc-butil-3-(6-amino-3-metilpiridin-2-il)benzoata (1 eq), dimetilaminopiridina (DMAP, 0,02 eq), i trietilamina (3.0 eq) u toluenu (4 vol na bazi terc-butil-3-(6-amino-3-metilpiridin-2-il) benzoata). Nakon 2 sata, dodataje se voda (4 vol na bazi terc-butil-3-(6-amino-3-metilpiridin-2-il) benzoata) u reakcionu smešu. Posle mešanja tokom 30 minuta, slojevi se razdvajaju. Organska faza se zatim filtrira i koncentruje da bi se dobilo gusto ulje 3-(6-(l-(2,2-difluorobenzo [dj[l,3] dioksol-5-il) ciklopropankarboksamido)-3-metilpiridin-2 il)-t-butilbenzoata (kvantitativni sirovi prinos). MeCN (3 vol na bazi sirovog proizvoda) se dodaje i destiluje do pojave kristalizacije. Voda (2 vol na bazi sirovog proizvoda) se dodaje i smeša se meša 2 h. Čvrsti ostatak se sakuplja filtracijom, ispira sa 1:1 (odnos zapremina) MeCN/voda (2x1 vol na bazi sirovog proizvoda), i delimično se suši na filteru pod vakumom. Čvrsti ostatak se suši do konstantne težine (<1% razlika) u vakumskoj sušnici na 60°C uz blago N2 curenje da bi se dobio 3-(6-(l-(2,2-difluorobenzo[d][l,3]dioksol-5-il) ciklopropankarboksamido)-3-metilpiridin-2-il)-t-butilbenzoat kao braon čvrsta supstanca.

Sinteza 3-(6-(l-(2,2-difluorobenzo[d][l,3]dioksol-5-il) ciklopropankarboksamido)-3-metilpiridln-2-il)

benzoeve kiseline • HCI soli.

[0116]

[0117]Gustoj smeši od 3-(6-(l-(2,2-difluorobenzo[d][l,3]dioksol-5-il) ciklopropankarboksamido)-3-metilpiridin-2-il)-tbutilbenzoata (1-0 eq) u MeCN (3.0 vol) se dodaje voda (0.83 vol), a zatim i koncentrovani vodeni HCI (0.83 vol). Smeša se zagreva do 45 6 5 °C. Nakon mešanja od 24 do 48 sati, reakcija je završena i smeša je može da se ohladi do sobne temperature. Voda (1.33 vol) se dodaje 1 smeša se meša. Čvrsti ostatak se sakuplja filtracijom, ispra se vodom (2 x 0.3 vol), i delimično suši na filteru pod vakumom. Čvrsti ostatak se suši do konstantne težine (<1% razlika) u vakumskoj sušnici na 60°C uz blago N2 curenje da bi se dobila 3-(6-(l-(2,2-difluorobenzo[d][l,3]dioksol-5-il)ciklopropankarboksamido)-3-metilpiridin-2-il) benzoeva kiselina • HCI kao beličasta čvrsta supstanca.

Sinteza 3-(6-(l-(2,2-difluorobenzo[d][l,3]dioksol-5-il) ciklopropankarboksamido)-3-metilpiridin-2-il)

benzoeve kiseline (Oblik I).

[0118]

[0119]Gusta smeša 3-(6-(l-(2,2-difluorobenzo[đ3[l,3]dioksol-5-il) ciklopropankarboksamido)-3-metilpiridin-2-il) benzoeve kiseline • HCI (1 eq) u vodi (10 vol) se meša na sobnoj temperaturi. Uzorak se uzima nakon mešanja tokom 24 časa. Uzorak se filtrira i čvrsta supstanca se ispra vodom (2 x). Čvrsti uzorak se dostavlja za DSC analizu. Kada DSC analiza pokuzuje potpunu konverziju u Oblik I, čvrsta supstanca se sakuplja filtriranjem, ispira se vodom (2 x 1,0 vol), i delimično suši na filteru pod vakumom. Čvrsti ostatak se suši do konstantne težine (<1% razlika) u vakumskoj sušnici na 60°C uz blago N2 curenje da bi se dobio Oblik I kao beličasta čvrsta supstanca (prinos 98%). IH NMR (400 MHz, DMSO-d6)9.14 (s, IH), 7.99-7.93 (m, 3H), 7.80-7.78 (m, IH), 7.74-7.72 (m, IH), 7.60-7.55 (m, 2H), 7.41-7.33 (m, 2H), 2.24 (s,3H), 1.53-1.51 (m, 2H), 1.19-1.17 (m, 2H).

Sinteza 3-(6-(l-(2,2-difluorobenzo[d][l,3]dIoksol-5-il) ciklopropankarboksamido)-3-metilpiridin-2-il)

benzoeve kiseline (Oblik I) koristešcenjem vode i baza.

[0120]

[0121]Gustoj smeši od 3-(6-(l-(2,2-difluorobenzo[d][l,3]dioksol-5-il) ciklopropankarboksamido)-3-metilpiridin-2-il) benzoeve kiseline • HCI (1 eq) u vodi (10 vol) koja se meša na sobnoj temperaturi dodat je 50% w/w aq. NaOH (2.5 eq). Smeša se meša NLT 15 minuta ili dok se ne dobije homogeni rastvor. Koncentrovani HCI (4 eq) se dodaje da bi se kristalizovao Oblika I. Smeša se zagreva na 60°C ili 90°C, ako je potrebno da se smanji nivo t-butilbenzoat estra. Smeša se zagreva dok HPLC analiza ne pokaže NMT 0,8% (AUC) t-butilbenzoat estar. Smeša se zatim hiadi do sobne temperature i čvrsti ostatak se sakuplja filtracijom, ispra vodom (3 x 3.4 vol), i delimično suši na filteru pod vakumom. Čvrsti ostatak se suši do konstantne težine (<1% razlika) u vakumskoj sušnici na 60°C uz blago N2 curenje da bi se dobio Oblik I kao beličasta čvrsta supstanca (prinos 97%).

Sinteza 3-(6-(l-(2,2-difluorobenzo[d][l,3]dioksol-5-il) ciklopropankarboksamido)-3-metilpiridin-2-il)

benzoeve kiseline (Oblik I) direktno iz benzoata.

[0122]

[0123]Rastvor 3-(6-(l-(2,2-difluorobenzo[d][l,3]dioksol-5-il) ciklopropankarboksamido)-3-metilpiridin-2-il> tbutilbenzoata (1.0 eq) u mravljoj kiselini (3.0 vol) se zagreva na 70 6 10 °C. Reakcija se nastavlja dok se reakcija ne završi (NMT 1,0% AUC 3-(6-(l-(2,2-difluorobenzo[d][l,3]dioksol-5-il) cikIopropankarboksamido)-3-metilpiridin-2-il)-tbutilbenzoat) ili grejanje za NMT 8 h. Smeša se ostavlja da se ohladi do sobne temperature. Rastvor se doda u vodu (6 vol) zagreva se na 50 °C i smeša se meša. Smeša se zatim zagreva do 70 6 10 °C dok nivo 3-(6-(l-(2,2-difiuorobenzo[d]

[l,3]dioksoi-5-il) ciklopropankarboksamido)-3-methilpiridin- 2-il)-t-butilbenzoata nije NMT 0,8% (AUC). Čvrsti ostatak se sakuplja filtracijom, ispira vodom (2x3 vol), i delimično suši na filteru pod vakumom. Čvrsti ostatak se suši do konstantne težine (<1% razlika) u vakumskoj sušnici na 60°C uz blago N2 curenje da bi se dobilo Jedinjenje 1. u Obliku I kao beličasta čvrsta supstanca.

[0124]Šablon rendgenske difrakcije koji se izračunava iz jedne kristalne strukture Jedinjenja l u Obliku I prikazan je na: Slika 1. Tabela 1 prikazuje izračunate maksimume za Sliku 1.

[0125]Stvarni šablon rendgenske difrakcije praha iz Jedinjenja 1 u Obliku 1 je prikazan na Slici 2. Tabela 2 prikazuje stvarne maksimume za Sliku 2.

[0126]Preklapanje rendgenske difrakcije izračunate iz jedne kristalne strukture Jedinjenja 1 u Obliku I, i stvarni šablon rendgenske difrakcije praha Jedinjenja 1 u Obliku I je prikazan na Slici 3. Preklapanje pokazuje dobro slaganje između obračunatih i stvarnih položaja maksimuma, razlika je samo oko 0.15 stepeni.

[0127]DSC trag Jedinjenja 1 u Obliku I je prikazan na Slici 4. Topljenje za Jedinjenje 1 u Obliku I se javlja na oko 204

°C.

[0128]Konformacione slike Jedinjenja 1 u Obliku I koje je bazirano na jednostrukoj kristalnoj rendgenskoj analizi su prikazane na Slikama 5-8. Figures 6-8 prikazuju vodonične veze između grupa karboksilne kiseline dimera i dobijenog slaganja koji se javlja u kristalu. Kristalna struktura otkriva gustu pakovanje molekula. Jedinjenje 1 u Obliku I je monokiiničko, P21/n, sa sledećim dimenzijama jedinica ćelija: a = 4.9626(7) A, b = 12.299(2) A, c = 33.075 (4) A, 6 = 93.938(9)°, V = 2014.0 A3, Z = 4. Gustina Jedinjenja 1 u Obliku 1 koja je izračunata iz strukturalnih podataka je 1.492 g/cm3 na 100K.

[0129]1HNMR spektri Jedinjenja 1 su prikazani na Slikama 9-11 (Slike 9 i 10 prikazuju Jedinjenje 1 u Obliku I u 50 mg/mL, 0,5 metil celuloza-polisorbat 80 suspenziji, i Slika 11 prikazuje Jedinjenje 1 kao HCI so).

[0130]Tabela 3 u nastavku pokazuje dodatne analitički podatke za Jedinjenje 1.

TESTOVI

Testovi za detekciju i merenje DF508- CFTR Correction Svojstva jedinjenja

Membranslci po tencijal Optičke metode za ispitivanje DF508- CFTR modulacije osobina jedinjenja

[0131]Test potencijala optičke membrane koristi FRET senzore osetljive na napon koje je opisao Gonzalez i Tsien (videti, Gonzalez, J. E. and R. Y. Tsien (1995) "Voltage sensing by fluorescence resonance energv transfer in single (continued) cells" Biophys J 69(4): 1272-80, and Gonzalez, J. E. and R. Y. Tsien (1997) "Improved indicators of cell membrane potential that use fluorescence resonance energv transfer" Chem Biol 4(4): 269-77) u kombinaciji sa instrumentima za merenje pramena fluorescencije kao što je Napon/Jon Čitač Sonde (V1PR) (Videti, Gonzalez, J. E., K. Oades, et al. (1999) "Cell-based assays and instrumentation for screening ion-channel targets" Drug Discov Today 4(9): 43M39).

[0132]Ovi napon osetljivi testovi su bazirani na promeni prenosa fluorescentne rezonantne energije (FRET) između boje koja je membranski rastvorljiva i osetljiva na napon, DiSBAC2(3), i fluorescentnog fosfolipida, CC2-DMPE, koji je vezan za spoljni list plazmine membrane i deluje kao FRET donator. Promene u membranskom potencijalu (Vm) izazvaju negativno napunjeni DiSBAC2(3) da se preraspodeli kroz membranu plazme i iznos transfera energije iz CC2-DMPE se menja u skladu sa tim. Promene u emisiji fluorescencije su praćene korišćenjem VIPR™ II, koji je sastavni tečni handler i fluorescentni detektor dizajniran da sprovede ćelijske ekrane na mikrotiter ploču sa 96- ili 384-otvora.

l.Identifikacija Korekcionih Jedinjenja

[0133]Da bi se identifikovali mali molekuli koje ispravljaju defekt prenosa koji je u vezi sa AF508-CFTR; HTS test format sa jednom adicijom je napravljen. Ćelije su inkubirane u sredstvu bez seruma tokom 16 sati na 37°C u prisustvu ili odsustvu (negativna kontrola) testiranog jedinjenja. Kao pozitivna kontrola, ćelije postavljene u ploče sa 384-udubljenja su inkubirane tokom 16 sati na 27°C do AF508-CFTR" ispravne temperature". Ćelije su potom isprane 3X sa Krebs Ringer rastvorom i napunjene naponski osetljivim bojama. Da bi se aktivirao AF508-CFTR, 10 mM forskolina i CFTR potenciator, genistein (20 mM), su dodati zajedno sa sredstvom bez Cl u svako udubljenje. Dodavanje sredstva bez CI je pomoglo izazivanju Cl- isticanja kao odgovor na AF508-CFTR aktivaciju i dobijena membranska depolarizacija je optički praćena pomoću FRET boja sa naponskim senzorom.

2. Identifikacija Potenciator Jedinjenja

[0134]Da bi se identifikovali potencijatori AF508-CFTR, format HTS testa dvostruke adicije je napravljen. Tokom prve adicije, sredstvo bez Cl sa ili bez test jedinjenja je dodato u svako udubljenje. Nakon 22 sekunde, druga adicija sredstva bez CI ssadrži 2-10 mM forskolina je dodata da bi se aktivirao AF508-CFTR. Vanćelijska Cl koncentracija posle obe adicije je bila 28 mM, što je pomoglo stvaranju Cl- isticanja kao odgovor na AF508-CFTR aktivaciju i depolarizacija membrane koja je nastala kao rezultat je optički pratćena pomoću FRET boja sa naponskim senzorom.

3. Rastvori

[0135]

Tečni Rastvor #l:(u mM) NaCI 160, KC14.5, CaCI2 2, MgCI2 1, HEPES 10, pH 7.4 sa NaOH.

Tečni rastvor bez hlorida; Hlorid soli u Tečnom Rastvoru # 1 su supstituisane sa solima glukonatima.

CC2-DMPE: Pripremljen je kao visoko koncentrovani rastvor od 10 mM u DMSO i čuva se na -20 °C. DiSBAC2(3): Pripremljen je kao visoko koncentrovani rastvor od 10 mM u DMSO i čuva se na -20 °C.

4. Ćel ijs ka Kultura

[0136]NIH3T3 fibroblasti miševa koji stabilno eksprimiraju AF508-CFTR se koriste za optička merenja membranskog potencijala. Ćelije održavane na 37 °C u 5% C02 i 90% vlažnosti u modifikovanom Dulbecco Eagle sredstvu sa suplementom od 2 mM glutamina, 10% fetalnog goveđeg seruma, 1 X NEAA, B-ME, 1 X pen/strep, i 25 mM HEPES, u bocama za kulturu od 175 cm2. Za sve optičke testove, ćelije su posejane na 30.000/odubljenja u matrigel-obložene ploče sa 384-udubljenja i kultivisane tokom 2 sata na 37 °C pre gajenja na 27 °C tokom 24 časa za potenciatorski test. Za korekcione testove, ćelije su kultivisane na 27 °C ili 37 °C, sa i bez jedinjenja tokom 16 - 24 sata.

Elektrofiziološki Testovi za testiranje AF508- CFTR svojstava modulacije jedinjenja

1. Upotreba tzv " Komora Test"- a

[0137]Komora testovi su vršeni na polarizovanim epitelnim ćelijama koje eksprimiraju AF508-CFTR da bi dalje karakterisale AF508-CFTR modulatore koji su identifikovani u optičkim testovima. FRTAF508-CFTR epitelne ćelije koje se uzgajaju na Costar Snapvvell umetcima za kulturu ćelija su postavljene u komora testovima (Physiologic Instruments, Inc., San Diego, CA), a na monoslojevima je stalno pravljen kratak spoj koristeći Voltage-clamp Sistem (Department of Bioengineering, Universitv of Iowa, IA, and, Phvsiologic Instruments, Inc., San Diego, CA). Transepitelialna rezistencija je merena primenom 2-mV pulsa. Pod ovim uslovima, FRT epitel je pokazao otpornost na 4 K£l/cm2 ili više. Rastvori su održavani na 27 °C i u njima su pravljeni vazdušni mehurići. Potencijal protivteže elektrode i otpor tečnosti su ispravljeni korišćenjem bezćelijskog umetka. Pod ovim uslovima, struja odražava protok Cl- kroz AF508-CFTR koji je eksprimiran u apikalnoj membrani. ISC je dobijen digitalno korišćenjem MP100A-CE interfejsa i AcqKnowledge softvera (v3.2.6; BIOPAC Svstems, Santa Barbara, CA).

2. Identifikacija Korekcionih Jedinjenja

[0138]Tipični protokol je podrazumevao korišćenje gradijenta Cl-koncentracije bazolatelarne membrane do apikalne membrane. Da bi se podesio ovaj gradijent, normalni tzv."ringer" je korišćen na bazolateralnoj membrani, dok je apikalni NaCI zamenjen ekvimolarnim natrijum glukonatom (titrirano do pH 7.4 sa NaOH) dajući veliki gradijent Cl- koncentracije preko epitela. Svi eksperimenti su izvedeni sa netaknutim monoslojevima. Da bi se u potpunosti aktivirao AF508-CFTR, forskolin (10 mM) i PDE inhibitor, IBMX (100 mM), su primenjeni što je praćeno dodavanjem CFTR potenciatora, genisteina (50 mM).

[0139]Kao što je primećeno u drugim tipovima ćelija, inkubacija FRT ćelija koje stabilno eksprimiraju AF508-CFTR, pri niskim temperaturama, povećava funkcionalnu gustinu CFTR u plazminoj membrani. Za određivanje aktivnosti korekcionih jedinjenja, ćelije su inkubirane sa 10 mM test jedinjenja na 24 sata na 37 °C a potom su isprane 3X pre snimanja. cAMP and genistein posredovan ISC u ćelijama koje su tretirane jedinjenjem je normalizovan na 27 °C i 37 °C kontrolama i izražen kao procenat aktivnosti. Preinkubacija ćelija sa korekcionim jedinjenjem je značajno povećala cAMP i genistein posredovan ISC u odnosu na 37 °C kontrole.

3. Identifikacija Potenciator Jedinjenja

[0140]Tipičan protokol je podrazumevao korišćenje Cl- koncentracionog gradijenta bazolatelarne membrane do apikalne membrane. Da bi se podesio ovaj gradijent, normalni tzv."ringers" je korišćen na bazolateralnoj membrani i permeabilizovan je sa nistatinom (360 mg/ml), dok je apikalni NaCI zamenjen ekvimolarnom natrijum glukonatom (titrirano do pH 7.4 sa NaOH) dajući veliki Cl- koncentracioni gradijent preko epitela. Svi eksperimenti su izvedeni 30 min posle Nistatin permeabilizacije. Forskolin (lOmM) i sva test jedinjenja su dodata u obe strane umetaka ćelijske kulture. Efikasnost pretpostavljenih AF508-CFTR potencijatora je poređena sa poznatim potenđatorom, genisteinom.

4. Rastvori

[0141]

Bazolateralni rastvor (u mM): NaCI (135), CaCI2 (1.2), MgCI2 (1.2), K2HP04 (2.4), KHP04 (0.6), N-2-hidroksietilpiperazin-N'-2-etansulfonska kiselina (HEPES) (10), i dekstroza (10). Rastvor je titriran do pH 7.4 sa NaOH.

Apikalni rastvor (u mM): Isto kao bazolateralni rastvor gde je NaCI zamenjen sa Na glukonatom (135).

5. Ćeiijska Kultura

[0142]Fisher ćelije epitela pacova (FRT) koje eksprimiraju AF508-CFTR (FRTAF508-CFTR) su korišćene za eksperimente tzv,"Ussing" komore za predpostavljene AF508-CFTR modulatore koji su identifikovani iz naših optičkih testova. Ćelije su kultivisane na Costar Snapwell umetcima ćelijske kulture i kultivisane pet dana na 37 °C i 5% C02 u

"Coon's" modifikovanom "Ham's" F-12 posredniku koji je dopunjen sa 5% fetalnog goveđeg seruma, 100 U/ml penicilina i 100 mg/ml streptomicina. Pre korišćenja za karakterizađju potenciatorske aktivnosti jedinjenja, ćelije su inkubirane na 27 °C tokom 16 - 48 sati da bi se izvršila korekcija za AF508-CFTR. Za određivanje aktivnosti korekcionih jedinjenja, ćelije su inkubirane na 27 °C ili 37 °C sa i bez jedinjenja tokom 24 sata.

6. Snimanja celih ćeliia

[0143]Makroskopska AF508-CFTR struja (IAF508) u temperaturno i test jedinjenja korigovanim NIH3T3 ćelijama koje stabilno eksprimiraju AF508-CFTR je praćena pomoću snimanja perforiranog tzv."patch-a", celih ćelija. Ukratko, tzv.'Voltage-clamp" snimci IAF508 su napravljeni na sobnoj temperaturi upotrebom Axopatch 200B tzv."patch-clamp" pojačala (Akon Instruments Inc., Foster Citi, CA). Svi snimci su dobijeni na frekvenciji uzorkovanja od 10 kHz i niskopropusno filtrirani na 1kHz. Pipete su imale otpor od 5 - 6 MQ kad se popune intracelularnim rastvorom. Pod ovim uslovima snimanja, obračunati reverzibilni potencijal za Cl- (ECI) na sobnoj temperaturi je bio -28 mV. Svi snimci su imali rezistencioni pečat > 20 GQ i otpor serije <15 Mfl. Puls generacija, prikupljanje podataka i analiza su izvršeni korišćenjem računara opremljenim sa Digidata 1320 A/D interfejsom u vezi sa Clampex 8 (Axon Instruments Inc.). Tečni rastvor je sadržao <250 ml fiziološkog rastvora i kontinuirano zalivan pri brzini od 2 ml/min korišćenjem sistema perfuzije sa gravitacionim pogonom.

7. Identifikacija Ko rekcionih Jedinjenja

[0144]Da bi se odredila aktivnost korekcionih jedinjenja za povećanje gustine funkcionalnog AF508-CFTR u plazminoj membrani, koristili smo gore opisane tehnike perforiranog "patch" snimanja za merenje gustine struje koje prate 24-satni tretman sa korekcionim jedinjenjima. Da bi se u potpunosti aktivirao AF508-CFTR, 10 mM forskolina i 20 mM genisteina su dodati ćelijama. Pod našim uslovima snimanja, gustina struje koja je pratila 24-satnu inkubaciju na 27 °C je bila viša od one posmatrane nakon 24-satne inkubacije na 37 °C. Ovi rezultati su u skladu sa poznatim efektima niskotemperaturne inkubacije gustine AF508-CFTR u plazminoj membrani. Da bi se odredili efekti korekcionih jedinjenja na CFTR gustini struje, ćelije su inkubirane sa 10 mM test jedinjenja tokom 24 časa na 37 °C i gustina struje je poređena sa 27 °C i 37 °C kontrolama (% aktivnosti). Pre snimanja, ćelije su isprane 3X sa posrednikom ekstracelularnog snimanja da bi se otklonila bilo koja preostala test jedinjenja. Predinkubacija sa 10 mM korekcionih jedinjenja je značajno povećala cAMP- i genistein-zavisnu struju u odnosu na 37 °C kontrole.

8. Identifikacija Potenciator Jedinjenja

[0145]Sposobnost AF508-CFTR potencijatora da povećaju makroskopsku AF508-CFTR Cl- struju (IAF508) u NIH3T3 ćelijama koje stabilno izražavaju AF508-CFTR je takođe ispitivana korišćenjem tehnika perforiranog tzv."patch" snimanja. Potencijatori koji su identifikovani iz optičkih testova su evocirali porast dozno-zavisnog IAF508 sa sličnom snagom i efikasnošću kakva je zabeležena u optičkim testovima. U svim ispitanim ćelijama, reverzibilni potencijal pre i tokom primene potenciatora je bio oko -30 mV, što je izračunati ECI (-28 mV).

9. Rastv ori

[0146]

Intracelularni rastvor (u mM): Cs-aspartat (90), CsCI (50), MgCI2 (1), HEPES (10), i 240 mg/ml

amfotericin-B (pH podešen na 7,35 s CsOH).

Ekstracelularni rastvor (u mM): N-metil-D-glukamin (NMDG)-CI (150), MgCI2 (2), CaCI2 (2), HEPES (10)

(pH podešen na 7,35 sa HCI).

1 0. Ćelijska Kultura

[0147] NIH3T3 fibrobiasti miševa koji stabilno eksprimiraju AF508-CFTR se koriste za snimanja celih ćelija. Ćelije su održavane na 37 °C u 5% C02 i 90% vlažnosti u Dulbecco modifikovanom Eagle posredniku sa dodatkom od 2 mM glutamina, 10% fetalnog goveđeg seruma, 1X NEAA,B-ME, 1X pen/strep, i 25 mM HEPES, u bocama za kulturu od 175 cm2. Za snimanja celih ćelija, 2.500 - 5.000 ćelija je zasejano na staklenim poklopcima obloženim poli-L-lizinom i kultivisane tokom 24 - 48 sati na 27 °C pre upotrebe da bi se testirala aktivnost potencijatora; i inkubirane sa ili bez korekcionog jedinjenja na 37 °C da bi se izmerila aktivnosti korektora.

11. Snimanja Pojedinačnih Kanala

[0148] Aktivnosti pojedinačnih kanala AF508-CFTR sa korigovanom temperaturom koji su stabilno eksprimirani u NIH3T3 ćelijama i aktivnosti potenciator jedinjenja su posmatrana korišćenjem tzv."patch" isečene izvrnute membrane. Ukratko, tzv."voltage-clamp" snimci aktivnosti pojedinačnih kanala su izvedeni na sobnoj temperaturi sa Axopatch 200B "patch-clamp" pojačalom (Axon Instruments Inc.). Svi snimci su dobijeni na frekvenciji uzorkovanja od 10 kHz i niskopropusno filtrirane na 400Hz. Tzv."Patch" pipete su izrađene od Corning Kovar Sealing #7052 stakla (World Precision Instruments, Inc., Sarasota,FL) i imale se otpor 5 - 8 MQ kad se popune ekstracelularnim rastvorom. AF508-CFTR je aktiviran nakon isecanja, dodavanjem 1 mM Mg-ATP, i 75 nM cAMP-zavisne protein kinaze, katalitička podjedinica (PKA; Promega Corp. Madison, WI). Nakon što se aktivnost kanala stabilizovala, tzv."patch" je perfuzovan pomoću mikroperfuzionog sistema na gravitacioni pogon. Priliv je postavljen pored tzv."patch-a", što je dovelo do potpune zamene rastvora tokom 1 - 2 sek. Da bi se održala AF508-CFTR aktivnost tokom brze perfuzije, nespecifični inhibitor F- (10 mM NaF) fosfataze je dodat u tečni rastvor. Pod ovim uslovima snimanja, kanalska aktivnost je ostala konstantna tokom celog trajanja tzv.<M>patch" snimanja (do 60 minuta). Struje proizvedene pozitivnim naelektrisanjem kretanja od intra do ekstraćelijskih rastvora (anjoni se kreću u suprotnom smeru) su prikazane kao pozitivne struje. Pipeta potencijal (Vp) je održavan na 80 mV.

[0149]Kanalska aktivnost je analizirana iz membranskih tzv."patch-eva" koji sadrže < 2 aktivnih kanala. Maksimalan broj istovremenih otvaranja je odredio broj aktivnih kanala tokom eksperimenta. Da bi se utvrdila amplituda struje pojedinačnog kanala, podaci koji su zabeleženi iz 120 sekundi AF508-CFTR aktivnosti se filtriraju tzv."off-line" na 100 Hz, a zatim koriste za izgradnju tzv."all-point" histograma amplituda koje su podešene sa multigausovskim funkcijama pomoću Bio-Patch Analvsis softvera (Bio-Logic Comp. France). Ukupna mikroskopska struja i otvorena verovatnoća (Po) su određene iz 120 sekundi kanalskih aktivnosti. Po je određen korišćenjem Bio-Patch softvera ili iz odnosa Po = I/i(N), gde 1= srednja struja, i = strujna amplituda pojedinačnih kanala, i N = broj aktivnih kanala u "patch-u".

12. Rastvori

[0150]

Ekstracelularni rastvor (u mM): NMDG (150), asparaginska kiselina (150), CaCI2 (5), MgCI2 (2), i

HEPES (10) (pH podešen na 7,35 sa Tris bazom).

Intracelularni rastvor (u mM): NMDG-CI (150), MgCI2 (2), EGTA (5), TES (10), i Tris baza (14)

(pH podešen na 7,35 sa HCI).

13, Ćeliiska Kultura

[0151]NIH3T3 fibroblasti miševa koji stabilno eksprimiraju AF508-CFTR se koriste za tzv."patch-clamp" snimke isečene-membrane. Ćelije su održavane na 37 °C u 5% C02 i 90% vlažnosti, u modlfikovanom Dulbecco modifikovanom Eagle posredniku sa dodatkom od 2 mM glutamina, 10% fetalnog goveđeg seruma, 1 X NEAA, 8 -ME, 1X pen/strep, i 25 mM HEPES, u bocama za kulturu od 175 cm2. Za snimanja pojedinačnih kanala, 2.500 - 5.000 ćelija je zasejano na staklenim poklopcima obloženim poli-L-lizinom i kultivisano tokom 24 - 48 sati na 27 °C pre upotrebe.

[0152]Koristeći gore navedene postupke, aktivnost, tj. EC50s, Jedinjenja 1 je izmerena i prikazana u tabeli 4.

Claims (31)

1. 3-(6-(l-(2,2-Difluorobenzo[d][l,3] dioksol-5-il) ciklopropankarboksamido)-3-metilpiridin-2-il) benzoeva kiselina naznačena kao Oblik I, gde je Oblik I naznačen sa jednim ili više maksimuma na 15,2 do 15,6 stepeni, 16,1 do 16,5 stepeni, i 14,3 do 14,7 stepeni u rendgenskoj difrakđji praha dobijenoj upotrebom Cu K alfa zračenja na 40 kV, 35 mA.

2. Oblik I iz zahteva 1, gde je Oblik I naznačen sa jednim ili više maksimuma na 15,4, 16,3 i 14,5 stepeni.

3. Oblik I iz zahteva 1, gde je Oblik 1 dalje naznačen sa maksimumom na 14,6 do 15,0 stepeni.

4. Oblik I iz zahteva 3, gde je Oblik I dalje naznačen sa maksimumom na 14,8 stepeni.

5. Oblik I iz zahteva 3, gde je Oblik I dalje naznačen sa maksimumom na 17,6 do 18,0 stepeni.

6. Oblik I iz zahteva 5, gde je Oblik I dalje naznačen sa maksimumom na 17,8 stepeni.

7. Oblik I iz zahteva 5, gde je Oblik I dalje naznačen sa maksimumom na 16,4 do 16,8 stepeni.

8. Oblik I iz zahteva 7, gde je Oblik I dalje naznačen sa maksimumom na 16,4 do 16,8 stepeni.

9. Oblik I iz zahteva 8, gde je Oblik I dalje naznačen sa maksimumom na 16,6 stepeni.

10. Oblik I iz zahteva 8, gde je Oblik I dalje naznačen sa maksimumom na 7,6 do 8,0 stepeni.

11. Oblik I iz zahteva 10, gde je Oblik I dalje naznačen sa maksimumom na 7,8 stepeni.

12. Oblik I iz zahteva 10, gde je Oblik I dalje naznačen sa maksimumom na 25,8 do 26,2 stepena.

13. Oblik I iz zahteva 12, gde je Oblik I dalje naznačen sa maksimumom na 26,0 stepeni.

14. Oblik I iz zahteva 12, gde je Oblik I dalje naznačen sa maksimumom na 21.4 do 21,8 stepeni.

15. Oblik I iz zahteva 14, gde je Oblik I dalje naznačen sa maksimumom na 21,6 stepeni.

16. Oblik I iz zahteva 14, gde je Oblik I dalje naznačen sa maksimumom na 23,1 do 23,5 stepeni.

17. Oblik I iz zahteva 16, gde je Oblik I dalje naznačen sa maksimumom na 23,3 stepena.

18. Oblik I iz zahteva 1, gde je Oblik I naznačen sa difrakcionim šablonom koji je suštinski sličan onom iz Slike 1.

19. Oblik I iz zahteva 1, gde je Oblik I naznačen sa difrakcionim šablonom koji je suštinski sličan onom iz Slike 2.

20. Oblik I iz zahteva 1, gde je distribucija veličine čestica od D90 oko 82 pm ili manje.

21. Oblik I iz zahteva 1, gde je distribucija veličine čestica od D50 oko 30 pm ili manje.

22. Farmaceutska kompozicija koja sadrži Oblik I iz zahteva 1, i farmaceutski prihvatljiv nosač.

23. Oblik I iz zahteva 1 za upotrebu u lečenju cistične fibroze kod sisara obuhvatajući davanje sisaru efektivne količine navedenog Oblika I.

24. Oblik I za upotrebu kao što je definisano zahtevom 23, gde upotreba obuhvata davanje dodatnog terapeutskog agensa.

25. Komplet koji sadrži Oblik I iz zahteva 1 i uputstva za upotrebu istog.

26. Postupak za pripremu Oblika I iz zahteva 1 obuhvatajući suspendovanje ili rastvaranje HCI soli 3-(6-(l-(2,2-Difluorobenzo[d][l,3] dioksol-5-il) ciklopropankarboksamido)-3-metilpiridin-2-il) benzoeve kiseline u odgovarajućem rastvaraču tokom efektivne količine vremena.

27. Postupak iz zahteva 26, gde je odgovarajući rastvarač voda ili 50% smeše metanol/voda.

28. Postupak iz zahteva 26, gde je odgovarajući rastvarač voda.

29. Postupak iz zahteva 26, gde je efektivna količina vremena 2 do 24 sata.

30. Postupak iz zahteva 26, gde je efektivna količina vremena 2 do 6 sati.

31. Kristalni oblik 3-(6-(l-(2,2-Difluorobenzo[d][l,3] dioksol-5-il) ciklopropankarboksamido)-3-metilpiridin-2-il) benzoeve kiseline prema zahtevu 1 imajući monoklinički kristalni sistem, P2i/n prostornu grupu, i sledeće dimenzije jediničnih ćelija: a = 4.9626 (7) A a = 90° b = 12.2994 (18) A p= 93.938 (9)° c = 33.075 (4) Ar=90°.