RS55578B1 - Polimerna jedinjenja polialkilena i njihova upotreba - Google Patents

Polimerna jedinjenja polialkilena i njihova upotreba

Info

Publication number
RS55578B1
RS55578B1 YU63504A YUP63504A RS55578B1 RS 55578 B1 RS55578 B1 RS 55578B1 YU 63504 A YU63504 A YU 63504A YU P63504 A YUP63504 A YU P63504A RS 55578 B1 RS55578 B1 RS 55578B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
ifn
group
interferon
beta
alkyl
Prior art date
Application number
YU63504A
Other languages
English (en)
Inventor
Kochung Lin
R Blake Pepinsky
Ling Ling Chen
Donna M Hess
Edward Y Lin
Russell C Petter
Darren P Baker
Original Assignee
Biogen Ma Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Biogen Ma Inc filed Critical Biogen Ma Inc
Publication of RS63504A publication Critical patent/RS63504A/sr
Publication of RS55578B1 publication Critical patent/RS55578B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
    • C08G65/00—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule
    • C08G65/02—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule from cyclic ethers by opening of the heterocyclic ring
    • C08G65/32—Polymers modified by chemical after-treatment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
    • C08G65/00—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule
    • C08G65/02—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule from cyclic ethers by opening of the heterocyclic ring
    • C08G65/32—Polymers modified by chemical after-treatment
    • C08G65/329—Polymers modified by chemical after-treatment with organic compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/22—Hormones
    • A61K38/31—Somatostatins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A61P31/22—Antivirals for DNA viruses for herpes viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
    • C08G65/00—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule
    • C08G65/34—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule from hydroxy compounds or their metallic derivatives
    • C08G65/48—Polymers modified by chemical after-treatment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08L—COMPOSITIONS OF MACROMOLECULAR COMPOUNDS
    • C08L71/00—Compositions of polyethers obtained by reactions forming an ether link in the main chain; Compositions of derivatives of such polymers
    • C08L71/02—Polyalkylene oxides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08L—COMPOSITIONS OF MACROMOLECULAR COMPOUNDS
    • C08L2203/00—Applications
    • C08L2203/02—Applications for biomedical use

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Polyethers (AREA)

Abstract

Ovaj pronalazak se odnosi na nova jedinjenja polialkilenglikola i na postupke za njihovu upotrebu. Naročito, jedinjenja koja sadrže nove konjugate polietilenglikola se koriste sama ili u kombinaciji sa antivirusnim agensima, za tretiranje virusnih infekcija, kao što je hronični hepatitis C.

Description

Ovaj pronalazak se odnosi na nova jedinjenja polialkilenglikola, konjugate ovih polimera i proteina, i na njihovu upotrebu.
Kovalentno vezivanje hidrofilnih polimera, kao što su polimeri polialkilenglikola, poznatih takođe i kao polialkilenoksidi, za biološki aktivne molekule i površine interesantno je u biotehnologiji i medicini.
Naročito mnogo istraživanja je usmereno na upotrebu konjugata poli(etilenglikol)-a (PEG), poznatih takođe i kao poli(etilenoksid)-i (PEO), za poboljšavanje rastvorljivosti i stabilnosti i za produžavanje poluvremena života molekula u krvotoku.
U njegovom najobičnijem obliku PEG je linearni polimer koji se sa oba kraja završava hidroksilnom grupom:
Gornji polimer, alfa-.omega-dihidroksipoli(etilenglikol), može se takođe predstaviti kao HO-PEG-OH, gde se podrazumeva da simbol -PEG- predstavlja sledeću strukturnu celinu:
gde se n tipično kreće od oko 4 do oko 10.000. PEG se obično koristi kao metoksi-PEG-OH, ili m-PEG, gde je na jednom kraju relativno inertna metoksi grupa, dok je na drugom kraju hidroksi grupa, koja je predmet jednostavnih hemijskih modifikacija. Pored toga, nasumični ili blok kopolimeri različitih alkilenoksida (npr. etilenoksid i propilenoksid) blisko su povezani sa PEG u pogledu njihove hernije i u mnogim primenama mogu zameniti PEG.
Da bi se kuplovao PEG na izabrani molekul, često je potrebno da se PEG aktivira pripremanjem derivata PEG koji ima reaktivnu funkcionalnu grupu, bar na jednom kraju. Funkcionalna grupa se bira na osnovu vrste reaktivne grupe sa kojom raspolaže molekul koji treba da se kupluje sa PEG.
PEG je polimer koji ima svojstvo rastvorljivosti u vodi i u mnogim organskim rastvaračima, netoksičan je i nema imunogenicitet. Jedna od upotreba PEG je kovalentno vezivanje za nerastvorne molekule, kako bi se kao rezultat dobio "konjugat" PEG-molekul koji je rastvoran.
Na primer, pokazano je da lek paclitaxel, koji je nerastvoran u vodi, kada se kupluje sa PEG postaje rastvoran u vodi. Greenvvald et al.,J. Org. Chem.1995, 60. 331-336.
Pristup preko proleka, gde se lekovi oslobađaju razgradnjom kompleksnijih molekula (prolekova) pod fiziološkim uslovima, predstavlja snažnu komponentu u oslobađanju lekova. Prolekovi mogu, na primer, da se formiraju vezivanjem PEG za lekove, preko veza koje se mogu razgraditi pod fiziološkim uslovima. Trajanje PEG prolekovain vivozavisi od vrste funkcionalne grupe (ili grupa) koja formira veze između PEG i leka. Obično, estarske veze, koje se formiraju reakcijom Peg-karboksilnih kiselina, ili aktiviranih PEG-karboksilnih kiselina, sa alkoholnim grupama na leku, hidrolizuju pod fiziološkim uslovima oslobađajući lek, dok su amidne i karbamidne veze, formirane sa aminskim grupama na leku, stabilne i ne hidrolizuju da bi se oslobodio lek. Pokazano je da hidrolitičko oslobađanje lekova iz PEG estara može povoljno da se do izvesne mere kontroliše preko kontrole broja vezujućih metilenskih grupa u distanceru, između krajnjeg kiseonika na PEG i karbonilne grupe pripojene karboksilne kiseline, ili derivata karboksilne kiseline. Na primer, Harris et al., u U.S. Patent-u No. 5,672,662, opisuju PEG-butanoinsku kiselinu i PEG-propanoinsku kiseinu i njihove aktivirane derivate, kao alternativu karboksimetjl-PEG jedinjenjima, gde je poželjna manja hidrolitička reaktivnost u odgovarajućim estarskim derivatima. Videti, uopšteno, publikaciju PCT WO 01/46291.
Faktor koji ograničava upotrebljivost potencijalnih supstanci za primenu u medicinskom tretmanu, kada se daju parenteralno, je što se u kratkom vremenu eliminišu iz tela. Ovo eliminisanje se može dogoditi kao rezultat razgradnje pomoću proteaza, ili izbacivanja, korišćenjem normalnih puteva eliminacije proteina, kao što je filtriranje kroz bubrege. Oralno ordiniranje ovih supstanci je još problematičnije, jer pored proteolize u stomaku, visoka kiselost u stomaku uništava ove supstance pre nego što stignu u namenjeno tkivo, kao metu. Problemi koji su povezani sa ovim putevima ordiniranja proteina su dobro poznati u farmaceutskoj industriji i koriste se razne strategije u pokušajima da se isti reše. Objavljeno je mnogo radova koji se bave stabilizovanjem proteina. Poznati su razni načini konjugovanja proteina sa polimernim materijalima, uključujući upotrebu dekstrana, polivinilpirolidona, glikopeptida, polietilenglikola i poliaminokiselina. Objavljeno je da kod parenteralnih aplikacija dobijeni konjugovani polipeptidi zadržavaju njihova biološka svojstva u pogledu rastvorljivosti u vodi.
Od posebnog interesa je povećavanje biološke aktivnosti interferona, uz smanjenje toksičnosti, koju prati upotreba ovih proteina pri tretmanu humanih pacijenata. Interferoni su familija malih proteina i glikoproteina koja se nalazi u prirodi, a stvara ih i izlučuje većina ćelija sa jezgrom, kao odgovor na virusnu infekciju, i druge antigenske stimulanse. Interferoni čine ćelije rezistentnim prema virusnoj infekciji, i pokazuju širok spektar dejstava na ćelije. Oni ispoljavaju njihove ćelijske aktivnosti vezivanjem za specifične membranske receptore na površini ćelije. Kada se jednom vežu za ćelijsku membranu, interferoni iniciraju složeni niz unutarćelijskih događanja. Ispitivanjain vitrosu pokazala da su to indukovanje nekih enzima, suzbijanje proliferacije ćelije, imunomodulatorne aktivnostu, kao što je pojačanje fagocitne aktivnosti makrofaga, pa porast specifične citotoksičnosti limfocita za ciljane ćelije, i inhibicija replikacije virusa u ćelijama zaraženim virusom.
Interferoni su ispitani u tretmanu niza kliničkih stanja bolesti. U tretmanu multiple skleroze uspostavljena je upotreba humanog interferona-beta. Nedavno su u Evropi i u SAD licencirana dva oblika rekombinantnog interferona-beta, za tretiranje ove bolesti: interferon-beta-1a (AVONEX<®>, Biogen, Inc., Cambridge, MA, i REBIF<®>, Serono, Ženeva, Švajcarska) i interferon-beta-1b (BETASEROB<®>, Berlex, Richmond, CA). lnterferon-beta-1a se stvara u ćelijama sisara, korišćenjem prirodne humane sekvencije gena, i glikozilovan je, dok se interferon-beta-tb stvara u bakterijamaE. coli,korišćenjem modifikovane humane sekvencije gena, koja sadrži genetskim inženjeringom podešenu supstituciju cisteina u serin, u položaju 17 aminokiselina, i nije glikozilovan.
Ne-humani interferoni, koji obuhvataju i alfa- i beta-interferon, poznato je da suzbijaju virus humane imunodeficijencije (HIV) i kod akutno- i kod hronično-inficiranih ćelija. Videti, Poli i Fauci,AIDS Research and Human Retroviruses,1992, 8(2), 191-197. Zahvaljujući njihovoj antivirusnoj aktivnosti, interferoni, a naročito alfa interferoni, stekli su značajnu pažnju kao terapeutski agensi u tretmanu bolesti srodnih sa virusom hepatitisa C (HCV). Videti Hoofnagle et al, "Viral Hepatitis 1981 International Svmposium", Filadefija, 1982, Franklin Institute Press; Hoofnagle et al.,New Engl. J. Med.1986, 315, 1575-1578; Thomson,Lancet,1987,1, 539-541; Kiyosawa et al., u "Viral Hepatitis and Liver Disease", urednik Zuckerman, Allen K. Liss, New York, str. 895-897; Hoofnagle et al.,Sem. Liv. D/s.1985, 9. 259-263.
Konjugati interferon-polimer su opisani, na primer u U.S. Patent No. 4,766,106, U.S. Patent No., 4,917,888, European Patent Application No., 0 236 987, European Patent Application No. 0 510 356 i u International Application Publication No. WO 95/13090.
VVO 00/23114 opisuje konjugate polimera interferona beta-1a i njihovu upotrebu.
Hronični hepatitis C je podmukla bolest koja sporo napreduje, a znatno utiče na kvalitet života. Pored poboljšanja u kvalitetu sakupljanja krvi dobrovoljnih davalaca i nedavnom obavljanju testiranja krvi dobrovoljnih davalaca na HCV, procenjena događanja akutne infekcije među osobama koje primaju transfuziju je između 5 i 10%. Videti Alter et al., u "Viral Hepatitis and Liver Disease", urednik Zuckerman, Allen K. Liss, New York, str. 537-542. Dakle, približno od 3 miliona osoba u SAD, koje tokom godine primaju transfuzije, akutni hepatitis C će se razviti kod oko 150,000. Mada će mnogi pacijenti, koji su dobili hepatitis C, imati subklinički, ili blag oblik bolesti, kod približno 50% to će uznapredovati do hroničnog stanja bolesti, koje karakteriše fluktuacija abnormalnosti serum transaminaze i inflamatorna oštećenja kod biopsije jetre. Procenjuje se da će se ciroza razviti kod i do 20% iz ove grupe. Videti Koretz et al.,Gastroenterology<1985, 88, 1251-1254.
Poznato je da interefoni utiču na mnoštvo ćelijskih funkcija, uključujući replikaciju DNK, sinetezu RNK i proteina, i to i u normalnim i abnormalnim ćelijama. Dakle, citotoksični efekti interferona se ne ograničavaju na tumor ili ćelije inficirane virusom, već se takođe manifestuju u normalnim, zdravim ćelijama. Kao rezultat toga, tokom terapije interferonom može doći do nepoželjnih sporednih efekata, naročito kada se zahtevaju visoke doze. Ordiniranje interferona može da dovede do mijelosupresije, što dovodi do smanjenog broja crvenih krvnih zrnaca i umanjenog sadržaja belih krvnih zrnaca i trombocita. Interferoni obično izazivaju simptome nalik gripu (npr. groznica, zamor, glavobolja i jeza), gastrointestinalne poremećaje (npr. anoreksija, mučnina i dijareja), vrtoglavicu i kašalj. Čest je slab uzdržani odgovor pacijenata sa HCV na tretman sa ne-PEG-ilovanim interferonom, pa taj tretman može da izazove ozbiljne sporedne efekte, uključujući, ali bez ograničavanja na iste, retinopatiju, tiroiditis, akutni pankreatitis i depresiju.
Nepoželjni sporedni efekti koji prate terapiju interferonom, često ograničavaju terapeutsku korist režima tretmana interferonom. Dakle, postoji potreba da se održe ili poboljšaju terapeutske koristi ove terapije, uz smanjenje ili eliminaciju nepoželjnih sporednih efekata.
Ovaj opis se odnosi na jedinjenja polialkilenglikola, na konjugate tih jedinjenja i na njihovu upotrebu.
Na osnovu opisa koji je ove dat, prikazani pronalazak se odnosi na konjugat koji ima strukturu prema formuli XXII a:
gde P je polialkilenglikolni polimer;
Xje O;
Z je prav ili razgranati lanac, zasićene ili nezasićene Cido C20alkil ili heteroalkil grupe, C3do Cg zasićeni ili nezasićeni ciklični alkil ili ciklični heteroalkil, supstituisana ili nesupstituisana aril ili heteroaril grupa, ili supstitiuisani ili nesupstituisani alkaril gde je alkil Cido C2ozasićena ili nezasićena alkil ili heteroalkaril grupa, gde su supstituenti izabrani iz grupe koju čine halogen, hidroksil, karbonil, karboksilat, estar, formil, acil, tiokarbonil, tioestar, tioacetat, tioformijat, alkoksil, fosforil, fosfonat, fosfinat, amino, amido, amidin, imin, cijano, nitro, azido, sulfhidril, sulfat, sulfonat, sulfamoil, sulfonamido, sulfonil, heterociklil, aralkil, aromatični ostatak, heteroaromatični ostatak, imino, silil, etar, i alkiltiol;
R<*>je ostatak za povezivanje obrazovan reakcijom ostatka izabranog iz grupe koju čine aldehid, aldehid hidrat, i acetal sa biološki aktivnim jedinjenjem;
B je biološki aktivno jedinjenje, gde je bilološki aktivno interferon-beta; i
n je 0 ili celi broj od 1 do 5
U još jednom aspektu, prikazani pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži konjugat prema prikaznom pronalasku i farmaceutski prihvatljiv nosač.
U još jednom aspektu, pronalazak obezbeđuje konjugat prema pronalasku za upotrebu u lečenju pacijenta sa virusnom infekcijom.
U još jednom aspektu, prikazani pronalazak obezbeđuje konjugat prema pronalasku za upotrebu u lečenju pacijenta sa autoimunom bolešću.
U još jednom aspektu, pronalazak obezbeđuje konjugat prema pronalasku za primenu u terapiji.
Prikazani pronalazak i njegova izvođenja su izneta u priloženim patentnim zahtevima.
Ukoliko se drugačije ne definiše, svi tehnički i naučni termini koji se ovde koriste imaju isto značenje koje obično shvata onaj ko je uobičajeno verziran u stanje tehnike na koje se ovaj pronalazak odnosi. Mada postupci i materijali, slični ili ekvivalentni ovima koji su ovde opisani, mogu da se koriste u praktikovanju ili testiranju ovog pronalaska, pogodni postupci i materijali su opisani niže. Pored toga, materijali, postupci i primeri služe i I us trovanju i nije im namera da budu ograničavajući.
Druge karakteristike i prednosti ovog pronalaska postaće jasni iz detaljnog opisa koji sledi, i iz patentnih zahteva.
KRATAK OPIS SLIKA NACRTA
Ovaj prikazani opis, uključujući prikazani pronalazak biće još shvatljiviji iz sledećeg opisa pozivajući se na slike gde su: Slika 1 je redukujući SDS-PAGE gel, koji pokazuje čistoću nemodifikovanog UFN-p-1a i 20 kDa mPEG-O-2-metilpropionaldehid-modifikovanog IFN-f>1a: Red A: markeri molarne mase (odozdo na gore; 100 kDa, 68 kDa, 45 kDa, 27 kDa i 18 kDa, respektivno); Red B: 4 ug nemodifikovanog IFN-p-1a; Red C: 4 ug 20 kDa mPEG-O-2-metilpropionaldehid-modifikovanog IFN-p-1a.
Slika 2 prikazuje tragove hromatografije sa isključivanjem po veličini kDa mPEG-O-2-metilpropionaldehid-modifikovanog IFN-p-1a: Slika 2A: standardi molarne mase; Slika 2B: 20 kDa mPEG-O-2-metilpropionaldehid-modifikovani IFN-(3-1a; Slika 2C: nemodifikovani IFN-p-1a.
Slika 3 grafik hromatografije sa isključivanjem po veličini 20 kDa mPEG-O-m-metilfenil-O-2-metilpropionaldehid-modifikovanog IFN-p-1a.
Slika 4 je redukujući SDS-PAGE gel koji pokazuje čistoću nemodifikovanog IFN-p-1a i 20 kDa mPEG-O-p-fenilacetaldehid-modifikovanog !FN-p-1a: Red A: 2,5 ug 20 kDa mPEG-O-pfenilacetladehid-midifikovani IFN-p-1a; Red B: 2,5 ug nemodifikovanog IFN-p-1a; Red C: markeri molarne mase (odozgo na dole, 100 kDa, 68 kDa, 45 kDa, 27 kDa i 18 kDa, respektivno).
Slika 5 pokazuje zapis hromatografije sa isključivanjem po veličini za 20 kDa mPEG-O-p-fenilacetaldehid-modifikovani IFN-p-1a; Slika 5A: standardi molarne mase; Slika 2B: 20 kDa mPEG-O-p-fenilacetaldehid-modifikovani IFN-p-1a.
Slika 6 je redukujući SDS-PAGE gel koji pokazuje stabilnosti 20 kD mPEG-p-fenilacetaldehid-modifikovani IFN-p-1a: Red A: markeri molarne mase (odozgo na dole: 100 kDa, 68 kDa, 45 kDa, 27 kDa, 18 kDa i 15 kDa, respektivno); Redovi B, C, D i E: 2 ug 20 mPEG-O-p-fenilacetaldehid-modifikovani IFN-p-1a, uzet iz test u dane: 0, 2, 5 i 7, respektivno.
Slike 7A-B pokazuju antivirusnu aktivnost raznih PEG-ilovanih uzoraka humanog IFN-p-1a, u funkciji koncentracije proteina: Slika 7A: nemodifikovani IFN-p-1a (o), 20 kDa mPEG-O-2-metilpropionaldehid-modifiovani IFN-p-1a; (<), 20 kDa mPEG-O-2-metilpripionaldehid-modifikovani iFN-p-1a (trougiovi) i 20 kDa mPEG-O-m-metilfenil-O-2-metilpropionaldehid-modifikovani IFN-p-1a (rombovi); Slika 7B: nemodifikovani IFN-p-1a (o), 20 kDa mPEG-O-p-fenilacetaldehid-modifikovani IFN-p-1a (trougiovi) i 20 kDa mPEG-O-m-fenilacetaldehid-modifikovani IFN-p-1a (rombovi).
Slike 8 A-B su grafici koji prikazuju farmakokinetiku nemodifikovanog i raznih PEG-ilovanih uzoraka humanog IFN-p-1a; Slika 8A: nemodifikovani !FN-p-1a (gornji dijagram) i IFN-p-1a modifikovan sa 20 kDa mPEG-O-2-metilpropionaldehidom (donji dijagram); Slika 8B: IFN-p-1a modifikovan sa 20 kDa mPEG-O-p-metilfenil-O-2-metilpropionaldehidom (gornji dijagram) i sa 20 kDa mPEG-O-p-fenilacetaldehidom (donji dijagram).
Slike 9 A-B su grafici koji prikazuju farmakokinetiku nemodifikovanog i raznih PEG-ilovanih uzoraka humanog IFN-p-1a; Slika 9A: nemodifikovani IFN-p-1a (gornji dijagram) i IFN-p-1a modifikovan sa 20 kDa mPEG-O-p-fenilpropionaldehidom (donji dijagram); Slika 9B: IFN-p-1a modifikovan sa 20 kDa mPEG-O-m-fenilacetaldehida (gornji dijagram) i 20 kDa mPEG-O-m-metilfenil-O-2-metilpropionaldehidom (donji dijagram).
Slika 10 je histogram gde se porede pojedinačna ordinranja 2' kDa mPEG-O-2-metilpropionaldehid-modifikovanim IFN-p-1a sa dnevnim ordiniranjem nemodifikovanog IFN-p-1a, pri smanjujućem broju radijalno orijentisanih novih krvnih sudova kod miševa sojanu/ nu,koji su nosili SK-MEL-1 ćelije humanog malignog melanoma: tretman sa tečnim nosačem kao kontrolom jedanput samo 1. dana (stubac A); tretman sa 1 MU (5 ug) nemodifikovanog IFN-p-1a svakodnevno u dane 1-9 zaključno (stubac B); tretman sa 1 MU (10 ug) 20 kDa mPEG-O-2-metilpropionaldhid-modifikovanim IFN-p-1a, jedanput dnevno samo 1. dana (stubac C); i tretman sa tečnim nosačem kao kontrolom u dane 1-9, zaključno (stubac D).
DETALJAN OPIS PRONALASKA
Ovaj opis je usmeren na jedinjenja i postupke koji su korisni pri tretiranju raznih bolesti i poremećaja. Kao što će biti detaljno objašnjeno u nastavku, te bolesti i poremećaji su, naročito, one koje su podložne tretmanu terapije sa interferonom, uključujući, ali bez ograničavanja, virusne infekcije, kao što su infekcije hepatitisa i autoimune bolesti, kao što je multipla skleroza.
Jedinjenja iz ovog opisa su nova jedinjenja aktiviranog polialkilenglikola, u skladu sa Formulom I:
gde P predstavlja polimer rastvoran u vodi, kao što je polimer polialkilenglikola. Lista takvih polimera, ali bez ograničavanja, sadrži druge homopolimere polialkilenoksida, kao što su polipropilenglikoli, polioksietilovani polioli, njihovi kopolimeri i blok kopolimeri. Drugi primeri pogodnih u vodi rastvomih i ne-peptidnih polimernih skeleta, su poli(oksietilovani poliol), poli(olefinski alkohol), poli(vinilpirolidon), poli(hidroksipropilmetakrilamid), poli(a-hidroksi kiselina), poli(vinil alkohol), polifosfazen, polioksazolin, poli(N-akriloilmorfolin) i njihovi kopolimeri, terpolimeri i smeše. U jednom slučaju, polimerni skelet je poli(etilenglikol) ili monometoksi polietilenglikol (mPEG), koji ima prosečnu molekulsku težinu od oko 200 Da do oko 400,000 Da. Treba znati da su za praktikovanje ovog opisa pogodni takođe i drugi srodni polimeri, i da u tom smislu upotreba naziva PEG ili poli(etilenglikol) namenu uključuje, a ne isključuje. Naziv PEG uključuje poli(etilenglikol) u bilo kome od njegovih oblika, uključujući alkoksi PEG, difunkcionalni PEG, više-grani PEG, viljuškasti PEG, račvasti PEG, viseći PEG ili PEG sa razgradivim vezama.
U klasi jedinjenja predstavljenih Formulom I, ima između nula i pet metilenskih grupa između Y i ugljenika sadržanog u 2 (npr. n je nula ili je ceo broj od jedan do pet), a m je nula ili jedan, dok je Y prisutan ili odsutan.
X i Y su nezavisno, O, S, CO, C02, COS, SO, S02, CONR', S02NR' ili NR'. U nekim slučajevima, X i Y predstavljaju kiseonik.
Q je zasićeni ili nezacićeni C3-C8ciklični alkil ili ciklični heteroalkil (uključujući pripojene biciklične i premošćene biciklične prstenaste strukture), supstituisana ili nesupstituisana aril ili heteroaril grupa, ili supstituisani ili nesupstituisani alkaril, gde je alkil zasićena ili nezasićena C1-C20alkil ili heteroalkaril grupa. Supstituenti mogu biti halogen, hidroksil, karbonil, karboksilat, estar, formil, acil, tiokarbonil, tioestar, tioacetat, tioformijat, alkoksil, fosforil, fosfonat, fosfinat, amino, amido, amidin, imin, cijano, nitro, azido, suifhidril, sulfat, sulfonamido, sulfonil, heterociklil, aralkil, aromatični ostatak, heteroaromatični ostatak, imino, sulfamoil, sulfonat, siiil, etarili alkiltio.
Z supstituent je vodonik, zasićena ili nezasićena C1-C20alkil ili heteroalkil grupa ravnog ili račvastog lanca, zasićeni ili nezasićeni C3-C8ciklični alkil ili ciklični heteroalkil, supstituisana ili nesupstituisana aril ili heteroaril grupa, ili supstituisani ili nesupstituisani alkaril, gde je alkil zasićena ili nezasićena C1-C20alkil ili heteroalkaril grupa. Supstituenti mogu biti halogen, hidroksil, karbonil, karboksilat, estar, formil, acil, tiokarbonil, tioestar, tioacetat, tioformijat, alkoksil, fosforil, fosfonat, fosfinat, amino, amido, amidin, imin, cijano, nitro, azido, sulfhidril, sulfat, sulfonamido, sulfonil, heterociklil, aralkil, aromatični ostatak, heteroaromatični ostatak, imino, sulfamoil, sulfonat, silil, etar ili alkiltio.
Kada X ili Y predstavlja NR', R' može biti vodonik, zasićena ili nezasićena C1-C20alkil ili heteroalkil grupa ravnog ili račvastog lanca, zasićeni ili nezasićeni C3-C8ciklični alkil ili ciklični heteroalkil, supstituisana ili nesupstituisana aril ili heteroaril grupa, ili supstituisani ili nesupstituisani alkaril, gde je alkil zasićena ili nezasićena C1-C20alkil ili heteroalkaril grupa. Supstituenti mogu biti halogen, hidroksil, karbonil, karboksilat, estar, formil, acil, tiokarbonil, tioestar, tioacetat, tioformijat, alkoksil, fosforil, fosfonat, fosfinat, amino, amido, amidin, imin, cijano, nitro, azido, sulfhidril, sulfat, sulfonamido, sulfonil, heterociklil, aralkil, aromatični ostatak, heteroaromatični ostatak, imino, sulfamoil, sulfonat, silil, etar ili alkiltio
R je reaktivna funkcionalna grupa, tj. aktivirajući ostatak koji je u stanju da reaguje formirajući spoj ili vezu između jedinjenja Formule I i biološki aktivnog jedinjenja ili njegovog prekursora. Dakle, R predstavlja "aktivirajuću grupu" aktiviranih polialkilenglikolnih jedinjenja (PGC), predstavljenih Formulom I. R može biti, na primer, karboksilna kiselina, estar, aldehid, aldehid hidrat, acetal, hidroksi, zaštićeni hidroksi, karbonat, alkenil, akrilat, metakriiat, akrilamid, supstituisani ili nesupstituisani tiol, halogen, supstituisani ili nesupstituisani amin, zaštićeni amin, hidrazid, zaštićeni hidrazid, sukcinimidil, izocijanat, izotiocijanat, ditiopiridin, vinilpiridin, jodoacetamid, epoksid, hidroksisukcinimiidil, azol. maleimid, sulfon, alil, vinilsulfon, trezil, sulfo-N-sukcinimidil, dion, mezil, tozil ili glioksal. U posebnim slučajevima R je aldehid hidrat.
Specifični primeri R u literaturi su N-sukcinimidilkarbonat (videti, npr. U.S. Patent No. 5,281,698 i 5,468,478), amin (videti npr. Buckmann etal.,Makromol. Chem.1981, 182, 1379; Zaplinsky et al.Eur. Polym. J,1983, 19, 1177), hidrazid (videti npr. Andresz et al.Makromol. Chem.1978, 179, 301), sukcinimidilpropionat i sukcinimidilbutanoat (videti npr. Olson et al., u "Poly(ethylene glvcol) Chemistry & Biological Applications", urednici Harris i Zaplinsky, ACS, VVashington, DC, 1977 str. 170-181; videti takođe U.S. Patent No. 5,672,662), sukcinimidilsukcinat (videti npr., Abuchowski et al.Cancer Biochem. Biophys.1984, 7, 175; i Joppich et al.Macrolot. Chem.1979, 180, 1381), sukcinimidilestar (videti npr. U.S. Patent No. 4,670,417), benzotriazolkarbonat (videti npr. U.S. Patent No. 5,650,234), glicidiletar (videti npr. Pitha et al,Eur. J. Biochem.1979, 94, 11; Elling et al.,Biotech. Appl. Biochem.1991, 13, 354), oksikarbonilimidazol (videti npr. Beauchamp et al.,Anal. Biochem.1983, 131, 25 i Tondelli et al.,J. Controlled Release1985, 1, 251), p-nitrofenilkarbonat (videti npr. Veronese et al.Appl. Biochem. Biotech.1985, H, 141 i Sartore et al.,Appl. Biochem. Biotech.1991, 27, 4510), aldehid (videti npr. Harris et al.,J. Polym. Sci. Chem. Ed.1984, 22, 341, U.S. Patent No. 5,824,784 i U.S. Patent No. 5,252,714), maleimid (videti npr. Goodson et al.,Bio/ Technology1990, 8, 343, Romani et al,Chemistry of Peptides and Proteins,1984, 2, 29, i Kogan,Synthetic Comm.1992, 22, 2417), orto-piridildisulfid (videti npr. vVoghiren et al.,Bioconj. Chem.1993, 4, 314), akrilol (videti npr. Sawhney et al.,Macromolecules,1993, 26, 581), vinilsulfon (videti npr. U.S. Patent No. 5,900,461). Pored toga, mogu i dva molekula iz ovog opisa da budu povezana sa aminokiselinom lizin, formirajući disupstituisani lizin, koji se zatim može još aktivirati sa N-hidroksisukcinimidom, formirajući N-sukcinimidil ostatak (videti npr. U.S. Patent No. 5,932,462).
Nazivi "funkcionalna grupa", "aktivan ostatak", "aktivna grupa", "aktivirajuća grupa", "aktivirajući ostatak", "reaktivno mesto", "hemijski reaktivna grupa" i "hemijski reaktivan ostatak", koriste se u stanju tehnike i ovde da označe određene, definisane delove ili jedinke molekula. Ovi termini su donekle sinonimi u stanju tehnike u herniji, a ovde se koriste da označe delove molekula koji imaju karakterističnu hemijsku aktivnost i koji su tipično reaktivni sa drugim molekulima. Naziv "aktivan", kada se koristi zajedno sa funkcionalnim grupama, namera je da obuhvati one funkcionalne grupe koje lako reaguju sa elektrofilnim ili nukleofilnim grupama na drugim molekulima, nasuprot onim grupama koje zahtevaju jake katalizatore ili krajnje nepraktične reakcione uslove da bi reagovale. Na primer, kao što je poznato u stanju tehnike, naziv "aktivan estar" obuhvata one estre koji lako reaguju sa nukleofilnim grupama, kao što su amini. Tipično, aktivan estar će reagovati sa aminom u vodenoj sredini unutar nekoliko minuta, dok neki estri, kao što su metil- ili etilestri, zahtevaju jak katalizator da bi reagovali sa nukleofilnom grupom.
U jedinjenjima iz ovog opisa definisanim gore, funkcionalna grupa R postaje mesto za povezivanje R<*>, nakon što je reagovala sa biološki aktivnim molekulom formirajući spoj ili vezu između jedinjenja aktiviranog polialkilenglikola (PGC) i biološki aktivnog jedinjenja. Dakle, B je biološki aktivno jedinjenje posle konjugovanja sa PGC, a R<*>je ostatak formiran reakcijom R sa aktiviranim PGC sa jednom ili više reaktivnih funkcionalnih grupa na biološki aktivnom jedinjenju B, tako da rezultat predstavlja jedinstvena kovalentna veza između PGC i biološki aktivnog jedinjenja. U poželjnom slučaju R<*>je ostatak koji se formira reaktijom R na aktiviranom PGC sa jednom reaktivnom funkcionalnom grupom na biološki aktivnom jedinjenju, tako da dolazi do kovalentnog spajanja između aktiviranog jedinjenja polialkilenglikola (PGC) i biološki aktivnog jedinjenja.
Poželjno je da biološki aktivno jedinjenje ili njegov prekursor (B) ne utiče štetno njegovim prisustvom na PGC. Pored toga, B ili prirodno poseduje funkcionalnu grupu koja je u stanju da reaguje i formira vezu sa aktiviranim PGC, ili se modifikuje da bi sadržalo takvu reaktivnu grupu.
Kako se ovde koristi, naziv prekursor Bje neaktivan ili manje aktivan oblik B, koji se menja u aktivan ili aktivniji oblik, respektivno, nakon dolaska u dodir sa fiziološkim uslovima, npr. ordiniranjem nekom subjektu. Te promene mogu biti konformacione ili strukturne promene, uključujući, ali bez ograničavanja, promenu iz zaštićenog u nezaštićeni oblik B. Kako se ovde koriste, te promene ne obuhvataju oslobađanje konjugovanog PGC iz ovog opisa.
Kao što se podrazumeva u stanju tehnike, naziv "zaštićen" odnosi se na prisustvo zaštitne grupe ili ostatak koji sprečava reagovanje hemijski reaktivne funkcionalne grupe pod određenim uslovima reakcije. Zaštitna grupa će varirati, zavisno od vrste hemijski reaktivne grupe koja se štiti. Na primer, ukoliko je hemijski reaktivna grupa amin ili hidrazid, zaštitna grupa se može odabrati iz grupe terc-butoksikarbonil (i-Boc) i 9-fluorenilmetoksikarbonil (Fmoc). Ukoliko je hemijski reaktivna grupa tiol, zaštitna grupa može biti orto-piridilsulfid. Ukoliko je hemijski reaktivna grupa karboksilna kiselina, kao što je butanoinska ili propionska kiselina, ili hidroksi grupa, zaštitna grupa može biti benzil ili alkil grupa, kao što su metil ili etil. U ovom opisu se mogu koristiti i druge zaštitne grupe, koje su poznate u stanju tehnike.
Nazivi "ostatak za povezivanje", "spoj" ili "linker" ovde se koriste da označe ostatke ili veze formirane kao rezultat hemijske reakcije i to su tipično kovalentni spojevi. Dakle, spoj predstavljen vezom R<*->B u gronjim formulama, potiče iz reakcije između aktiviranog ostatka R na PGC i biološki aktivnog jedinjenja, tj. B'. R<*>je ostatak za povezivanje formiran iz R posle reakcije sa B', a B je biološki aktivno jedinjenje konjugovano sa PGC, reakcijom funkcionalne grupe na B' sa
R.
Kako se ovde koristi, naziv "biološki aktivno jedinjenje" se odnosi na ona jedinjenja koja pokazuju jedan ili više bioloških odgovora ili aktivnosti, kada se ordiniraju subjektu, i sadrže reaktivne grupe koje imaju reaktivne ostatke koji su u stanju da reaguju sa ili da se konjuguju sa najmanje jednim aktiviranim PGC iz ovog opisa. Naziv "biološki aktivan molekul*', "biološki aktivan ostatak" ili "biološki aktivan agens", kada se ovde koriste, označavaju bilo koju supstancu koja može da utiče na fizička ili biohemijska svojstva bilo kog subjekta, uključujući, ali bez ograničavanja, viruse, bakterije, gljivice, biljke, životinje i humana bića. Naročito, biološki aktivni molekuli koji se ovde koriste, su bilo koja supstanca koja je namenjena dijagnozi, lečenju, ublažavanju, tretmanu, prevenciji bolesnih humanih bića ili drugih životinja, ili bilo kome drugačijem poboljšavanju fizičkog ili mentalnog stanja humanih ili animalnih bića.
Primeri biološki aktivnih molekula su, ali bez ograničavanja, peptidi, analozi peptida, proteini, enzimi, mali molekuli, boje, lipidi, nukleozidi, oligonukleotidi, analozi oltgonukleotida, šećeri, oligosaharidi, ćelije, virusi, liozomi, mikročestice, površine i micele.
Klase biološki aktivnih agenasa koji su pogodni za upotrebu u ovom opisu su, ali bez ograničavanja, hemokini, limgokini, antitela, rastvorljivi receptori, anti-tumorni agensi, agensi protiv anksioznosti, hromoni, faktori rasta, antibiotici, fungicidi, fungistatički agensi, antivirusni agensi, steroidni agensi, antimikrobni agensi, germicidni agensi, antipiretički agensi, antidijabetički agensi, bronhodilatatori, agensi protiv dijareje, agensi za koronarnu dilataciju, glikozidi, spazmolitici, antihipertenzivni agensi, antidepresanti, agensi protiv anksioznosti, drugi psihoterapeutski agensi, kortikosteroidi, analgetici, kontraceptivi, nesteroidni anti-inflamatorni lekovi, agensi za snižavanje glukoze u krvi, agensi za snižavanje holesterola, antikonvulzanti, drugi antiepileptički agensi, imunomodulatori, antiholinergici, simpatolitici, simpatomimetici, vazodilatatorni agensi, antikoagulanti, antiaritmici, prostaglandini koji imaju razna farmakološka dejstva, diuretici, pomoćna sredstva za spavanje, antihistaminički agensi, antineoplastični agensi, onkolitički agensi, antiandrogeni, agensi protiv malarije, agensi protiv lepre i razne druge vrste lekova. Videti Goodman i Gilman "The Basis of Therapeutics" (Deveto izdanje, Pergamon Press Inc., USA, 1966) i The Merck lndex (Trinaestro izdanje, Merck & Co., Inc. USA, 2001).
Biološki aktivna jedinjenja su bilo koje jedinjenje koja ispoljava biološki odgovor u njegovom postojećem obliku, ili bilo koje jedinjenje koje ispoljava biološki odgovor kao rezultat hemijske konverzije njegove strukture iz njegovog postojećeg oblika. Na primer, biološki aktivna jedinjenja su bilo koje jedinjenje koje sadrži zaštitnu grupu, koja, kada se otcepi, daje jedinjenje koje ispoljava biološki odgovor. Ovo otcepljivanje može biti rezultat, na primer, reakcijein vivotog jedinjenja sa endogenim enzimima, ili reakcijom pre ordiniranja tog jedinjenja, uključujući reakciju sa aktiviranim PGC iz ovog opisa. Kao sledeći primer, biološki aktivna jedinjenja će takođe obuhvatiti bilo koje jedinjenje koje podleže stereotransformaciji,in vivoili exvivo,uz formiranje jedinjenja koje pokazuje biološki odgovor ili dejstvo.
Biološki aktivna jedinjena tipično sadrže nekoliko reaktivnih mesta na kojima je moguće kovalentno spajanje aktiviranog PGC. Na primer, aminske grupe mogu da podlegnu acilovanjima, sulfhidril grupe mogu podleći reakcijama adicije i alkilovanja, karboni Ine i karboksilne grupe mogu podleći acilovanjima, a aldehidne i hidroksilne grupe mogu podleći aminovanju i redukcionom aminovanju. Jedna ili više od ovih reakcija može da se koristi prilikom dobijanja biološki aktivnih jedinjenja modifikovanih poliakilenglikolom, iz ovog opisa. Pored toga, biološki aktivna jedinjenja se mogu modifikovati tako da formiraju reaktivne ostatke na tim jedinjenjima, koji olakšavaju te reakcije i dovode do konjugovanja sa aktiviranim PGC.
Oni koji su uobičajeno verzirani u stanje tehnike shvataju da su na raspolaganju brojni reakcioni mehanizmi za olakšavanje konjugovanja aktiviranog PGC sa biološki aktivnim jedinjenjem. Na primer, ako je aktivirajući ostatak R hidrazidna grupa, ona se može kovalentno kuplovati na sulfhidrilni, šećerni ili karbonilni ostatak na biološki aktivnim jedinjenjima {nakon što se ti ostaci podvrgnu oksidaciji, dajući aldehide). Reakcija hidrazidnih aktivirajućih ostataka (R) sa aldehidima na biološki aktivnim jedinjenja (B') stvara hidrazonski spoj (R<*->B). Kada R predstavlja maleimidnu grupu, ona može da reaguje sa sulfhidril grupom formirajući stabilan tioetarski spoj. Ukoliko sulfhidrili nisu prisutni na biološki aktivnom jedinjenju, oni se mogu stvoriti preko redukcije disulfida ili tiolovanjem sa 2-iminotiolanom ili sa SATA. Kada R predstavlja imidoestar, on će reagovati sa primarnim aminima na B' formirajući imidoamidni spoj. Imidoestarsko konjugovanje se obično obavlja između pH 8,5-9,0. Kada se povezuje aktivirani PGC za biološki aktivne proteine, imidoestri pružaju prednost u odnosu na druge grupe R, zato što ne utiču na ukupno naelektrisanje proteina. Oni nose pozitivno naelekstrisanje pri fiziološkom pH, kao i primarni amini koje zamenjuju. Reakcije imidoestra se obavljaju između 0°C i sobne temperature (npr. na 4°C), ili na povišenim temperaturama, u anhidrovanim uslovima. Kada R predstavlja NHS-estar, njegov glavni cilj su primarni amini. Pristupačne a-aminske grupe, na primer one koje su prisutne na N-krajevima peptida i proteina, reaguju sa NHS estrima, formirajući kovalentnu amidnu vezu.
U nekim slučajevima, R<*->B predstavlja hidrolitički stabilan spoj. Hidrolitički stabilan spoj znači da je taj spoj suštinski stabilan u vodi i da ne reaguje sa vodom u korisnoj oblasti pH, npr. taj spoj je stabilan pod fiziološkim uslovima u dužem periodu vremena, možda čak i neograničeno. U drugim slučajevima, R<*->B je hidrolitički nestabilan ili razgradiv spoj. Hidrolitički nestabilan spoj znači da je taj spoj razgradiv u vodi iii u vodenim rastvorima, uključujući naprimer, krv. Enzimatski nestabilni ili razgradivi spojevi označavaju takođe da se taj spoj može razgraditi sa jednim ili više enzima.
U stanju tehnike se podrazumeva da polialkilen i srodni polimeri mogu posedovati razgradive spojeve u polimernom skeletu, ili u iinkerskoj grupi između polimernog skeleta i jedne ili više krajnjih funkcionalnih grupa molekula PGC. Na primer, estarski spojevi, formirani reakcijom, npr. PGC karboksinih kiselina iii aktivianih PGC karboksilnih kiselina, sa alkoholnim grupama na biološki aktivnom jedinjenju, obično hidrolizuju pod fiziološkim uslovima oslobađajući taj agens. Druge hidrolitički degradabilne spojeve obuhvataju karbonatni spojevi, iminski spojevi, koji potiču iz reakcije amina i aldehida (videti npr. Ouchi et al.,Polymer Preprints,1997, 38(1), 582-3); fosfatni estarski spojevi se formiraju reagovanjem alkohola sa fosfatnom grupom; acetalni spojevi, koji su proizvodi reakcije aldehida i alkohola; ortoestarski spojevi koji su proizvod reakcije formijata i alkohola; peptidni spojevi formirani pomoću aminske grupe, npr. na kraju PGC, i karboksilne grupe peptida; i oligonukleotidni spojevi formirani pomoću fosforamiditne grupe, npr. sa kraja polimera, i 5'-hidroksi grupe na oligonukleotidu.
Polialkilenglikol, P, može biti polietilenglikol koji ima strukturnu Formulu II:
gde je a ceo broj od 4 do 10.000, a E je vodonik ili ravna ili račvasta CrC2oalkilgrupa, obeležje koje se može detektovati, ili ostatak podesan za formiranje veze između jedinjenja Formule I i biološki aktivnog jedinjenja ili njegovog prekursora.
Dakle, kada E predstavlja ostatak koji je pogodan za formiranje veze između jedinjenja Formule I i biološki aktivnog jedinjenja ili njegovog prekursora, E može biti karboksilna kiselina, estar, aldehid, aldehid hidrat, acetal, hidroksi, zaštićeni hidroksi, karbonat, alkenil, akrilat, metakrilat, akrilamid, supstituisani ili nesupstituisani tiol, halogen, supstituisani ili nesupstituisani amin, zaštićeni amin, hidrazid, zaštićeni hidrazid, sukcinimidil, izocijanat, izotiocijanat, ditiopiridin, vinilpiridin, jodoacetamid, epoksid, hidroksisukcinimidil, azol, maleimid, sulfon, alil, vinilsulfon, trezil, sulfo-N-sukcinimidil, dion, mezil, tozil ili glioksal. Podrazumeva se da E treba da bude kompatibilno sa R, tako da se reakcija između E i R ne odigrava.
Pod "obeležje koje se može detektovati" podrazumeva se obeležje za koje je moguća detekcija. Primeri bez ograničavanja su izotopi, fluorescentni ostaci, fosforescentni ostaci, hemiluminiscentni ostaci i kvantne tačke. Ostala obeležja koja se mogu detektovati su biotin, cistein, histidin, hemaglutinin, myc ili flg privesci.
U nekim slučajevima, E ima strukturu u skladu sa Formulom III ili Formulom IV:
Svaki od Q, X, Y, Z, m i n je definisan gore, a svaki W je, nezavisno, vodonik ili C1-C7 alkil.
U ovoj klasi jedinjenja ostatak R" je pogodan za formiranje veze između jedinjenja Formule lili biološki aktivnog jedinjenja ili njegovog prekursora; a R'" je ostatak pogodan za formiranje veze između jedinjenja Formule IV i biološki aktivnog jedinjenja ili njegovog prekursora.
R" i R'" mogu da budu karboksilna kiselina, estar, aldehid, aldehid hidrat, acetai, hidroksi.zaštićeni hidroksi, karbonat, alkenil, akrilat, metakrilat, akrilamid, supstituisani ili nesupstituisani tiol, halogen, supstituisani ili nesupstituisani amin, zaštićeni amin, hidrazid, zaštićeni hidrazid, sukcinimidil, izocijanat, izotiocijanat, ditiopiridin, vinilpiridin, jodoacetamid, epoksid, hidroksisukcinimidil, azol, maleimid, sulfon, alil, vinilsulfon, trezil, sulfo-N-sukcinimidil, dion, mezil, tozil ili glioksal. Podrazumeva se da R" i R'" treba da su kompatibilni sa R, tako da se ne odigrava reakcija sa R.
Kako se ovde koristi, R" i R'°, posle konjugovanja sa biološki aktivnim jedinjenjem ili njegovim prekursorom, formiraju ostatke za povezivanje, kako su definisani gore. Dakle, R<**>je ostatak za povezivanje formiran reakcijom R" ili R'" grupe na aktiviranom PGC sa reaktivnom funkcionalnom grupom na biološki aktivnom jedinjenju, tako da dođe do kovalentnog spajanja između PGC i biološki aktivnog jedinjenja. R i R" ili R'" mogu biti isti ostatak ili različiti ostaci, a biološki aktivno jedinjenje vezano za svaki može biti isto ili različito.
Kako se ovde koristi, naziv "alkil" se odnosi na radikal zasićenih alifatičnih grupa, uključujući alkil grupe ravnog lanca, račvaste alkii grupe, cikloalkil (aliciklične) grupe, cikloalkil grupe supstituisane sa alkil i alkil grupe supstituisane sa cikloalkil. U poželjnim slučajevima alkil ravnog lanca ili račvastog lanca ima 30 ili manje atoma ugljenika u njegovom skeletu (npr. C1-C30za ravan lanac, C3-C30za račvasti lanac), a poželjnije 20 ili manje. Slično, poželjni cikloalkili imaju od 3-10 atoma ugljenika u strukturi njihovog prstena, poželjnije 5, 6 ili 7 atoma ugljenika u strukturi prstena.
Pored toga, naziv "alkil" (ili "niži alkil") namera je da obuhavti i "nesupstituisane alkile" i "supstituisane alkile", a ovi poslednji se odnose na alkil ostatke koji imaju supstituente koji zamenjuju vodonik na jednom ili više ugljenika ugljovodoničnog skeleta. Ti supstituenti su, na primer, halogen, hidroksil, karbonil (kao što je karboksi), alkoksikarboni! (formil ili acil), tiokarbonil (kao što je tioestar, tioacetat ili tioformijat), alkoksi, fosforil, fosfonat, fosfinat, amino, amido, amidin, imin, cijano, nitro, azido, sulfhidril, alkiltio, sulfat, sulfonat, sulfamoil, sulfonamido, sulfonil, heterociklil, aralkil ili aromatični ili heteroaromatični ostatak. Oni koji su verzirani u stanje tehnike znaju da ostaci koji su supstituisani na ugljovodoničnom lancu i sami mogu biti supstiuisani, ukoliko je to potrebno. Na primer, supstituenti na supstituisanom alkilu mogu obuhvatiti supstituisane i nesupstituisane oblike amino, azido, imino, amido, fosforil (uključujući fosfonat i fosfinat), sulfonil (uključujući sulfat, sulfonamido, sulfamoil i sulfonat), i silil grupe, kao i etre, alkiltio, karbonile (uključujući ketone, aldehide, karboksilate i estre), -CF3, -CN. Cikloalkili mogu još biti supstituisani sa alkil-ima, alkenil-ima, alkoksi-ma, alkiltio-ima, aminoalkil-ima, alkil-ima supstituisanim sa karbonil, -CF3, -CN.
Naziv "aralkil", kao se ovde koristi, odnosi se na alkil grupu supstituisanu sa aril grupom (npr. aromatičnom ili heteroaromatićnom grupom). Primeri aralkil grupa su, ali bez ograničavanja, benzil i uobičajenije (CH2)n-Ph, gde je Ph fenil ili supstituisani fenil, a nje 1, 2 ili 3.
Nazivi "alkenil" i "alkinil" se odnose na nezasićene alifatične grupe, analogne po dužini i mogućim supstitucijama sa alkilima, opisanim gore, ali koji sadrže najmanje jednu dvogubu ili trogubu vezu, respektivno.
Ukoliko je broj atoma ugljenika specificiran, "niži alkil" se ovde koristi da označi alkil grupu, definisanu gore, koja ima od jedan do deset ugljenika, poželjnije od jedan do šest atoma ugljenika u strukturi njenog skeleta. Slično, "niži alkenil" i "niži alkinil" imaju slične dužine lanaca. Poželjne alkil grupe su niži alkili. U poželjnim realizacijama, supstituent koji se ovde označava kao alkil, je niži alkil.
Naziv "aril", kako se ovde koristi, obuhvata 5-, 6- i 7-Člane aromatične grupe sa jednim prstenom, koje mogu da sadrže od nula do četiri heteroatoma, na primer, benzen, pirol, furan, tiofen, imidazol, oksazol, tiazol, triazol, pirazol, pirdin, pirazin, piridazin i pirimidin. One aril grupe koje imaju heteroatome u prstenastoj strukturi, mogu se takođe nazivati "aril heterocikli" ili "heteroaromatici". Aromatični prsten može biti supstituisan u jednom ili više položaja prstena, sa supstituentima opisanim gore, kao što su na primer, halogen, azid, alkil, aralkil, alkenil, alkinil, cikloalkil, hidroksil, alkoksil, amino, nitro, sulfhidril, imino, amido, fosfonat, fosfinat, karbonil, karboksil, silil, etar, alkiltio, sulfonii, sulfonamido, keton, aldehid, estar, heterociklil, aromatični ili heteroaromatični ostaci, -CF3, -N, ili slično. Naziv "aril" obuhvata takođe policiklične prstenaste sisteme, koji imaju dva ili više prstenova, u kojima su dva ili više ugljenika zajednički za dva spojena prstena (ovi prsteni se zovu "pripojeni prstenovi"), gde je najmanje jedan od tih prstenova aromatičan, npr. drugi ciklični prstenovi mogu biti cikloalkili, cikloalkeni, cikloalkini, arili i/ili heterociklili.
Naziviorto, metaiparakoriste se za 1,2-, 1,3- i 1,4-disupstituisane benzene, respektivno. Na primer, 1,2-dimetilbenzen i orto-dimetilbenzen su sinonimi.
Nazivi "heterociklil" ili "heterociklična grupa" se odnose na 3- do 10-članu prstenastu strukturu, poželjnije 3- do 7-člane prstenove, u čijoj prstenastoj strukturi su jedan do četiri heteroatoma. Heterocikli mogu takođe biti policiklični. Heterociklične grupe su, na primer, tiofen, tiantren, furan, piran, izobenzofuran, hromen, ksanten, fenoksantiin, pirol, imidazol, pirazol, izotiazol, izoksazol, piridin, pirazin, pirimidin, piridazin, indolizin, izoindol, indol, indazol, purin, hinolizin, izohinolin, hinolin, ftalazin, nafthiridin, hinoksalin, hinazolin, cinolin, pteridin, karbazol, karbolin, fenanthridin, akridin, pirimidin, fenantrolin, fenazin, fenarsazin, fenotiazin, furazan, fenoksazin, pirolidin, oksolan, tiolan, oksazol, piperidin, piperazin, morfolin, laktoni, laktami, kao što su azetidinoni i pirolidinoni, sultami, sultoni. Heterociklični prsten može biti supstituisan u jednom ili više položaja, sa supstituentima koji su opisani gore, kao što su na primer, halogen, azid, alkil, aralkil, alkenil, alkinil, cikloalkil, hidroksil, alkoksil, amino, nitro, sulfhidril, imino, amido, fosfonat, fosfinat, karbonil, karboksil, silil, etar, alkiltio, sulfonil, sulfonamido, keton, aldehid, estar, heterociklil, aromatični ili heteroaromatični ostaci, -CF3, -CN.
Naziv "karbocikl", kako se ovde koristi, odnosi se na aromatični ili ne-aromatični prsten u kome je svaki atom u prstenu ugljenik.
Heterocikli i karbocikli obuhvataju i pripojene biciklične i premošćene biciklične prstenaste strukture.
Kako se ovde koristi, naziv "nitro" označava -NO2, naziv "halogen" označava -F, -Cl, -Br ili -I, naziv "sulfhidril" označava -SH, naziv "hidroksil" označava -OH, i naziv "sulfonil" označava -S02.
Nazivi "amin" i "amino" su poznati u stanju tehnike i odnose se i na nesupstituisane i na supstituisane amine, npr. ostatak koji se može predstaviti opštom formulom:
gde R9, R10i R'10, svaki nezavisno, predstavljaju vodonik, alkil, alkenil, -(CH2)m-Rsili R9i R10, uzeti zajedno sa atomom N sa kojim su spojeni, čine heterocikl, koji ima 4 do 8 atoma u prstenastoj strukturi; R8predstavlja aril, cikloalkil, cikloalkenil, heterocikl ili policik!, i m je nula ili ceo broj od 1 do 8.
Naziv "alkilamin" ovde se koristi da označi amino grupu, kako je definisana gore, koja ima pripojen supstituisan ili nesupstituisan alkil, tj. najmanje jedan od R9i R10 je alkil grupa.
Naziv "acilamino" je poznat u stanju tehnike i odnosi se na ostatak koji se može predstaviti opštom formulom:
gde je Rg definisano gore, a R'npredstavlja vodonik, alkil, alkenil ili -{CH2)m-Re, gde je R8definisano gore.
Naziv "amido" je poznat u stanju tehnike kao karbonili supstituisan sa amino i obuhvata ostatak koji se može predstaviti opštom formulom:
gde su R9lR10definisani gore. Poželjne realizacije amida ne obuhvataju imide, koji mogu biti nestabilni.
Naziv "amidin" je poznat u stanju tehnike kao grupa koja se može predstaviti opštom formulom:
gde su Rg, R10definisani gore.
Naziv "gvanidin" je poznat u stanju tehnike kao grupa koja se može predstaviti opštom formulom:
gde su Rg, R10definisani gore.
Naziv "alkiltio" se odnosi na alkil grupu, kako je definisana gore, koja ima prikačen za nju sumporni radikal. U poželjnim realizacijama "alkiltio" ostatak se predstavlja jednim od: -S-alkil, -S-alkenil, -S-alkinil i -S-(CH2)m-R8,9de je R8definisano gore. Reprezentativne alkiltio grupe su metiltio, etiltio i slično.
Naziv "karbonil" je poznat u stanju tehnike i obuhvata ostatke koji se mogu predstaviti opštom formulom:
gde je X veza, ili predstavlja kiseonik ili sumpor, a Rnpredstavlja vodonik, alkil, alkenil, -(CH2)m-R8, ili farmaceutski prihvatljivu so, R'npredstavlja vodonik, alkil, alkenil ili -(CH2)m-R8, gde je R8definisano gore. Ukoliko X predstavlja kiseonik, a Rnili R'nnije vodonik, ova formula predstavlja "estar". Ukoliko X predstavlja kiseonik, a Rnje kao što je definisano gore, ovaj ostatak se ovde odnosi na karboksilnu grupu, a posebno, ako je Rnvodonik, ova formula predstavlja "karboksilnu kiselinu". Ukoliko X predstavlja kiseonik, a R'nje vodonik, ova formula predstavlja "formijat". Obično, ukoliko se atom kiseonika u gornjoj formuli zameni sumporom, tada formula predstavlja "tiolkarbonil" grupu. Ukoliko X predstavlja sumpor, a Rni R'nnisu vodonik, formula predstavlja "tioestar". Ukoliko X predstavlja sumpor, a Rnje vodonik, formula predstavlja "tiokarboksilnu kiselinu". Ukoliko X predstavlja sumpor, a R'nje vodonik, formula predstavlja "tioformijat". S druge strane, ukoliko X predstavlja vezu, a Rnnije vodonik, gornja formula predstavlja "ketonsku" grupu. Ukoliko X predstavlja vezu, a Rnje vodonik, gornja formula predstavlja "aldehidnu" grupu.
Nazivi "alkoksil" ili "alkoksi", kako se ovde koriste, odnose se na alkil grupu, kako je ovde definisana, koja ima pripojen kiseonični radikal. Reprezentativne alkoksil grupe su metoksi, etoksi, propiloksi, terc-butoksi i slično. "Etar" predstavlja dva ugljovodonika kovalentno povezana preko kiseonika. U skladu sa tiim, supstituent alkila, koji čini taj alkil etrom je, ili podseća na alkohol, kao što to predstavlja jedan između sledećih: -O-alkil, -O-alkenil, -O-alkinil, -0-(CH2)m-R8, gde su m i R8opisani gore.
Naziv "sulfonat" je poznat u stanju tehnike i obuhvata ostatak koji se može predstaviti opštom formulom:
gde je R41elektronski par, vodonik, alkil, cikloalkil ili aril.
Naziv "sulfat" je poznat u stanju tehnike, a obuhvata ostatak koji se može predstaviti opštom formulom:
gde je R41definisano gore.
Naziv "sulfonamido" je poznat u stanju tehnike, a obuhvata ostatak koji se može predstaviti opštom formulom:
gde su R9i R'n, definisani gore.
Naziv "sulfamoil" je poznat u stanju tehnike, a obuhvata ostatak koji se može predstaviti opštom formulom:
gde su R9i R10definisani gore.
Naziv "sulfonil" je poznat u stanju tehnike, a obuhvata ostatak koji se može predstaviti opštom formulom:
gde se R44bira iz grupe koju čine vodonik, alkil, alkenil, alkinil, cikloalkil, heterociklil, aril ili heteroaril.
Naziv "sulfoksido", kakose ovde koristi, osdnosi se na ostatak koji se može predstaviti opštom formulom:
gde se R44bira iz grupe koju čine vodonik, alkil, alkenil, alkinil, cikloalkil, heterociklil, aralkil ili aril.
Podrazumeva se da "supstitucija" ili "supstituisan sa" obuhvata implicitan uslov da je ta supstitucija u skladu sa dozvoljenom valencom supstituisanog atoma i supstituenta, i da supstitucija dovodi do stabilnog jedinjenja, npr. koje spontano ne podleže transformaciji, kao što su premeštanje, ciklizacija, eliminisanje itd.
Kako se ovde koristi, naziv "supstituisan" podrazumeva se da obuhvata sve dozvoljene supstituente organskih jedinjenja. U širokom aspektu, dozvoljeni supstituenti su aciklični i ciklični, račvasti i ne-račvasti, karbociklični i heterocikl i čn i, aromatični i ne-aromatični supstituenti organskih jedinjenja. Ilustrativni supstituenti su na primer, oni koji su opisani gore. Dozvoljeni supstituenti mogu biti jedan ili više istih ili različitih za odgovarajuća organska jedinjenja. Za potrebe ovog pronalaska, heteroatomi, kao što je azot, mogu da imaju vodonične supstituente i/ili bilo koje dozvoljene supstituente organskih jedinjenja koji su ovde opisani, a zadovoljavaju valence tih heteroatoma. Ovaj pronalazak nema nameru da na bilo koji način bude ograničen dozvoljenim supstituentima organskih jedinjenja.
Šira lista skraćenica koje koriste uobičajeno verzirani organski hemičari nalazi se u prvoj svesci svakog godišta časopisaJournal of Organic Chemistry;ova lista je tipično predstavljena u tabeli pod naslovom "Standard List of Abbreviations"..
U nekim slučajevima jedinjenja iz ovog opisa imaju strukturu u skladu sa Formulom V:
gde su X, Y, m, n, Z i R' definisani gore, a R je aktivirajući ostatak, definisan gore, koji je pogodan za formiranje veze između jedinjenja Formule V i biološki aktivnog jedinjenja ili njegovog prekursora. U posebnim slučajevima, R je aldehid hidrat.
P je deifnisano gore, a može se predstaviti Formulom II:
gde je E opisano gore, a u nekim slučajevima može biti predstavljeno Formulom III ili IV.
Tii T2su, nezavisno, odsutni ili zasićena ili nezasićena C1-C20alkil ili heteroalkil grupa ravnog ili račvastog lanca, zasićeni ili nezasićeniC3-C8ciklični alkil ili ciklični heteroalkil, supstituisana ili nesupstituisana ril ili heteroaril grupa, ili supstituisani ili nesupstituisani alkaril, gde alkil predstavlja zasićena ili nezasićena Ci-C2oalkil ili heteroalkaril grupa. Supstituenti mogu da budu halogen, hidroksil, karbonil, karboksilat, estar, formil, acil, tiokarbonil, tioestar, tioacetat, tioformijat, alkosil, fosforil, fosfonat, fosfinat, amino, amido, amidin, imin, cijano, nitro, azido, sulfhidril, sulfat, sulfonat, sulfamoil, sulfonamido, sulfonil, heterociklil, aralkil, aromatični ostatak, heteroaromatični ostatak, imino, silil, etar ili alkiltio.
Ukoliko je d jednko nuli, nema dodatnih supstituenata (L) na aromatičnom prstenu. Ukoliko d predstavlja ceo broj od 1 do 4, ovi supstituenti (L) mogu biti zasićena ili nezasićena C1-C2oalkil ili heteroalkil grupa ravnog ili račvastog lanca, zasićeni ili nezasićeniC3-C8ciklični alkil ili ciklični heteroalkil, supstituisana ili nesupstituisana ril ili heteroaril grupa, ili supstituisani ili nesupstituisani alkaril, gde alkil predstavlja zasićena ili nezasićena C1-C20alkil ili heteroalkaril grupa. Supstituenti mogu da budu halogen, hidroksil, karbonil, karboksilat, estar, formil, acil, tiokarbonil, tioestar, tioacetat, tioformijat, alkosil, fosforil, fosfonat, fosfinat, amino, amido, amidin, imin, cijano, nitro, azido, sulfhidril, sulfat, sulfonat, sulfamoil, sulfonamido, sulfonil, heterociklil, aralkil, aromatični ostatak, heteroaromatični ostatak, imino, silil, etar ili alkiltio.
Ako je R aldehid, jedinjenja spadaju među ona koja predstavlja Formula VI:
gde su sve varijable definisane gore.
Na primer, ukoliko X i Y predstavljaju kiseonik, a R je aldehid, jedinjenja iz ovog opisa predstavlja jedinjenje J.
gde supstituenti Tii T2mogu biti u orto, meta ili para položaju.
Ukoliko supstituenti Tii T2predstavljaju alkil grupe ravnog lanca, a d je nula, ova jedinjenja predstavlja Formula IX:
gde je svaki u, nezavisno, nula ili ceo broj od jedan do pet, a sve druge varijable su definisane gore. U posebnom slučaju, Z je vodonik ili metil.
Posebna klasa jedinjenja koja pripadaju Formuli IX, može se predstaviti Formulama VII i VIII:
Neki reprezentativna jedinjenja aktiviranih polialkilenglikola su kao što sledi, gde je polimer polialkilenglikola PEG ili mPEG:
U nekim slučajevima, jedinjenja ovog opisa predstavlja Formula X:
gde su, kao i gore, n je nula ili ceo broj od jedan do pet, a X je O, S, CO, C02, COS, SO, S02, CONR', SONR' ili NR'.
Ukoliko X predstavlja NR', tada R' može biti vodonik, zasićena ili nezasićena C1-C20alkil ili heteroalkil grupa ravnog ili račvastog lanca, zasićeni ili nezasićen i C3-C8 ciklični alkil ili ciklični heteroalkil, supstituisana ili nesupstituisana aril ili heteroaril grupa, ili supstituisani ili nesupstituisani alkaril, gde alkil predstavlja zasićena ili nezasićena CrC2o alkil ili heteroalkaril grupa, a supstituenti se biraju iz grupe koju čine halogen, hidroksil, karbonil, karboksilat, estar, formil, acil, tiokarbonil, tioestar, tioacetat, tioformijat, alkosil, fosforil, fosfonat, fosfinat, amino, amido, amidin, imin, cijano, nitro, azido, sulfhidril, sulfat, sulfonat, sulfamoil, sulfonamido, sulfonil, heterociklil, aralkil, aromatični ostatak, heteroaromatični ostatak, imino, silil, etar ili alkiltio.
Z može biti zasićena ili nezasićena C1-C20alkil ili heteroalkil grupa ravnog ili račvastog lanca, zasićeni ili nezasićeniC3-Ceciklični alkil ili ciklični heteroalkil, supstituisana ili nesupstituisana ril ili heteroaril grupa, ili supstituisani ili nesupstituisani alkaril, gde alkil predstavlja zasićena ili nezasićena Ci-C20alkil ili heteroalkaril grupa. Ukoliko su prisutni, supstituenti mogu da budu halogen, hidroksil, karbonil, karboksilat, estar, formil, acil, tiokarbonil, tioestar, tioacetat, tioformijat, alkosil, fosforil, fosfonat, fosfinat, amino, amido, amidin, imin, cijano, nitro, azido, sulfhidril, sulfat, sulfonat, sulfamoil, sulfonamido, sulfonil, heterociklil, aralkil, aromatični ostatak, heteroaromatični ostatak, imino, silil, etar ili alkiltio.
Kao što je gore definisano, R je aktivirajući ostatak pogodan za formiranje veze između jedinjenja Formule X i biološki aktivnog jedinjenja ili njegovog prekursora. U nekim slučajevima R je aldehid hidrat.
P je polimer polialkilenglikola, definisan gore, a može se predstaviti Formulom II:
gde su E i a definisani gore, a u nekim slučajevima mogu se predstaviti Formulama III ili IV. U nekim slučajevima E je metil, pa stoga P predstavlja mPEG.
Kada R predstavlja aldehid, a X kiseonik, ova jedinjenja spadaju unutar strukture u skladu sa Formulom XI:
gde su P, Z i n definisani za Formulu X.
Ukoliko P predstavlja mPEG, jedinjenja opisuje Formula XII: a kada je n jednako jedan, i Zje metil, jedinjenja predstavlja Formula XIII:
gde a predstavlja ceo broj od 4 do 10.000.
Primeri puteva sinteze za dobijanje jedinjenja u skladu sa ovim opisom izneti su u Primerima u nastavku.
Ovaj opis obuhvata takođe sastave aktiviranih jedinjenja polialkilenglikola (PGC) iz ovog opisa sa jednim ili više biološki aktivnih jedinjenja. Kao što je gore opisano, biološki aktivna jedinjenja su ona jedinjenja koja pokazuju biološki odgovor ili dejstvo kada se ordiniraju nekom subjektu. Nekonjugovana biološki aktivna jedinjenja mogu se ordinirati subjektu pored jedinjenja iz ovog opisa. Pored toga, biološki aktivna jedinjenja mogu da sadrže reaktivne grupe koje su u stanju da reaguju sa i da se konjuguju sa najmanje jednim aktiviranim PGC iz ovog opisa.
Ovaj opis obuhvata takođe konjugate novih PGC sa biološki aktivnim jedinjenjima. U jednom slučaju, ovi konjugati se formiraju iz jedinjenja Formule I i biološki aktivnog jedinjenja (B), kao što opisuje Formula XIV:
Kao i gore,
m je nula ili jedan, tako da je Y odsutno ili prisutno;
n je nula ili ceo broj od jedan do pet;
X i Y, nezavisno, su O, S, CO, C02, COS, SO, S02, CONR', S02NR' ili NR';
Q je zasićeni ili nezasićeniC3-C8ciklični alkil ili ciklični heteroalkil (uključujući pripojene biciklične i premošćene biciklične prstenaste strukture), supstituisana ili nesupstituisana ril ili heteroaril grupa, ili supstituisani ili nesupstituisani alkaril, gde alkil predstavlja zasićena ili nezasićena C1-C20alkil ili heteroalkaril grupa. Ukoliko su prisutni, supstituenti mogu da budu halogen, hidroksil, karbonil, karboksilat, estar, formil, acil, tiokarbonil, tioestar, tioacetat, tioformijat, alkosil, fosforil, fosfonat, fosfinat, amino, amido, amidin, imin, cijano, nitro, azido, sulfhidril, sulfat, sulfonat, sulfamoil, sulfonamido, sulfonil, heterociklil, aralkil, aromatični ostatak, heteroaromatični ostatak, imino, silil, etar ili alkiltio;
R' i Z, svaki nezavisno, su vodonik, zasićena ili nezasićena C1-C20alkil ili heteroalkil grupa ravnog ili račvastog lanca, zasićeni ili nezasićeniC3-C8ciklični alkil ili ciklični heteroalkil, supstituisana ili nesupstituisana ril ili heteroaril grupa, ili supstituisani ili nesupstituisani alkaril, gde alkil predstavlja zasićena ili nezasićena C1-C20alkil ili heteroalkaril grupa, gde se supstituenti biraju iz grupe koju čine halogen, hidroksil, karbonil, karboksilat, estar, formil, acil, tiokarbonil, tioestar, tioacetat, tioformijat, alkosil, fosforil, fosfonat, fosfinat, amino, amido, amidin, imin, cijano, nitro, azido, sulfhidril, sulfat, sulfonat, sulfamoil, sulfonamido, sulfonil, heterociklil, aralkil, aromatični ostatak, heteroaromatični ostatak, imino, silil, etar ili alkiltio;
R<*>je ostatak za povezivanje koji se formira reakcijom R sa odgovarajućom funkcionalnom grupom na biološki aktivnom jedinjenju B, kao što je opisano gore. Na primer, R<*>se formira reakcijom ostatka kao što je karboksilna kiselina, estar, aldehid, aldehid hidrat, acetal, hidroksi, zaštićeni hidroksi, karbonat, alkenil, akrilat, metakrilat, akrilamid, supstituisani ili nesupstituisani tiol, halogen, supstituisani ili nesupstituisani amin, zaštićeni amin, hidrazid, zaštićeni hidrazid, sukcinimidil, izocijanat, izotiocijanat, ditiopiridin, vinilpiridin, jodoacetamid, epoksid, hidroksisukcinimidil, azol, maleimid, sulfon, alil, vinilsulfon, trezil, sulfo-N-sukcinimidil, dion, mezil, tozil ili glioksalna funkcija, sa biološki aktivnim jedinjenjem ili njegovim prekursorom;
P je polimer polialkilenglikola definisan gore, a može se prikazati Formulom
II:
gde je E vodonik, C-1-C20alkil grupa ravnog ili račvastog lanca (npr. metil), obeležje koje se može detektovati ili ostatak koji je u stanju da formira vezu između jedinjenja Formule XIV i biološki aktivnog jedinjenja ili njegovog prekursora. Kao i gore, a je ceo broj od 4 do 10.000.
Ukoliko E predstavlja obeležje koje se može detektovati, to obeležje može biti radioaktivan izotop, fluorescentni ostatak, fosforescentni ostatak, hemiluminiscentni ostatak ili kvantna tačka.
Ukoliko je E ostatak koji je u stanju sa formira vezu između jedinjenja Forule XIV i biološki aktivnog jedinjenja ili njegovog prekursora, E može formirati vezu sa drugim molekulom biološki aktivnog jedinjenja (B), tako da je aktivirano jedinjenje polialkilenglikola vezano za bilo koji kraj molekula iste vrste biološki aktivnog jedinjenja, dajući dimerni molekul.
U nekim slučajevima E formira vezu sa biološki aktivnim jedinjenjem različitim od B, stvarajući heterodimer biološki aktivnih jedinjenja ili njihovih pekursora.
U drugim slučajevima E formira dodatnu vezu sa biološki aktivnim jedinjenjem B, tako da su i E i R vezani preko različitih funkcionalnih grupa istog molekula biološki aktivnog jedinjenja ili njegovog prekursora.
Ukoliko je E u stanju da formira vezu sa biološki aktivnim jedinjenjem ili njegovim prekursorom, E može biti isto ili različito od R, i da se bira iz grupe koju čine karboksilna kiselina, estar, aldehid, aldehid hidrat, acetal, hidroksi, zaštićeni hidroksi, karbonat, alkenil, akrilat, metakrilat, akrilamid, supstituisani ili nesupstituisani tiol, halogen, supstituisani ili nesupstituisani amin, zaštićeni amin, hidrazid, zaštićeni hidrazid, sukcinimidil, izocijanat, izotiocijanat, ditiopiridin, vinilpiridin, jodoacetamid, epoksid, hidroksisukcinimidil, azol, maleimid, sulfon, alil, vinilsulfon, trezil, sulfo-N-sukcinimidil, dion, mezil, tozil ili glioksalni ostatak.
Ukoliko je E u stanju da formira vezu sa biološki aktivnim molekulom ili njegovim prekursorom, E može da ima strukturu u skladu sa Formulom III ili Formulom IV:
gde su
Q, X, Y, Z, m i n, nezavisno, kao što su definisani gore;
VV, svaki nezavisno, je vodonik ili C1-C7alkil;
R" je ostatak pogodan za formiranje veze između jedinjenja Formule III i biološki aktivnog jedinjenja ili njegovog prekursora; i
R'" je ostatak koji je pogodan za formiranje veze između jedinjenja Formule IV i biološki aktivnog jedinjenja ili nejgovog prekursora.
R" i R'" se nezavisno, biraju iz grupe koju čine karboksilna kiselina, estar, aldehid, aldehid hidrat, acetal, hidroksi, zaštićeni hidroksi, karbonat, alkenil, akrilat, metakrilat, akrilamid, supstituisani ili nesupstituisani tiol, halogen, supstituisani ili nesupstituisani amin, zaštićeni amin, hidrazid, zaštićeni hidrazid, sukcinimidil, izocijanat, izotiocijanat, ditiopiridin, vinilpiridin, jodoacetamid, epoksid, hidroksisukcinimidil, azol, maleimid, sulfon, alil, vinilsulfon, trezil, sulfo-N-sukcinimidil, dion, mezil, tozil ili glioksalni ostatak.
Ukoliko je Q u Formuli XIV supstituisani ili nesupstituisani alkaril, konjugat se formira između aktiviranog polialkilenglikola Formule V i biološki aktivnog molekula (B), a opisan je u skladu sa Formulom XV:
gde su
Tii T2, nezavisno, odsutni ili su zasićena ili nezasićena CrC2oalkil ili heteroalkil grupa ravnog ili račvastog lanca, zasićeni ili nezasićeniC3-Caciklični alkil ili ciklični heteroalkil, supstituisana ili nesupstituisana arii ili heteroaril grupa, ili supstituisani ili nesupstituisani alkaril, gde alkil predstavlja zasićena ili nezasićena C1-C20alkil ili heteroalkaril grupa. Ukoliko su prisutni, supstituenti mogu da budu halogen, hidroksil, karbonil, karboksilat, estar, formil, acil, tiokarbonil, tioestar, tioacetat, tioformijat, alkosil, fosforil, fosfonat, fosfinat, amino, amido, amidin, imin, cijano, nitro, azido, sulfhidril, sulfat, sulfonat, sulfamoil, sulfonamido, sulfonil, heterociklil, aralkil, aromatični ostatak, heteroaromatični ostatak, imino, silil, etar ili alkiltio. U nekim slučajevima Tii T2, ukoliko su prisutni, su zasićena ili nezasićena C-i-C2oalkil ili heteroalkil grupa ravnog ili račvastog lanca.
d je nula (npr. nema L supstituenata na aromatičnom prstenu) ili je ceo broj od 1 do 4;
L ukoliko je prisutan, svaki predstavlja zasićena ili nezasićena CrC20 alkil ili heteroalkil grupa ravnog ili račvastog lanca, zasićeni ili nezasićeniC3-C8ciklični alkil ili ciklični heteroalkil, supstituisana ili nesupstituisana ril ili heteroaril grupa, ili supstituisani ili nesupstituisani alkaril, gde alkil predstavlja zasićena ili nezasićena C1-C20alkil ili heteroalkaril grupa. Supstituenti mogu da budu halogen, hidroksil, karbonil, karboksilat, estar, formil, acil, tiokarbonil, tioestar, tioacetat, tioformijat, alkosil, fosforil, fosfonat, fosfinat, amino, amido, amidin, imin, cijano, nitro, azido, sulfhidril, sulfat, sulfonat, sulfamoil, sulfonamido, sulfonil, heterociklil, aralkil, aromatični ostatak, heteroaromatični ostatak, imino, silil, etar ili alkiltio.
Sve druge varijable su kao što je opisano gore, uključujući P, koji je polimer polialkilenglikola, a može se predstaviti Formulom II:
gde je E vodonik, C1-C20alkil grupa ravnog ili račvastog lanca (npr. metil), obeležje koje se može detektovati, ili ostatak koji je pogodan za formiranje veze između jedinjenja Formule XV i biološki aktivnog jedinjenja ili njegovog prekursora. Kao i gore, a je ceo broj od 4 do 10.000.
Ukoliko E predstavlja obeležje koje se može detektovati, ovo obeležje može biti na primer, radioaktivan izotop, fluorescentni ostatak, fosforescentni ostatak, hemiluminiscentni ostatak ili kvatna tačka.
Ako je E ostatak pogodan za formiranje veze između jedinjenja Formule XV i biološki aktivnog jedinjenja B, E može da formira vezu i sa drugim molekulom biološki aktivnog jedinjenja (B), tako da je aktivirano jedinjenje polialkilenglikola vezano za bilo koji od krajeva molekula iste vrste biološki aktivnog jedinjenja, stvarajući dimerni molekul.
U nekim slučajevima E formira vezu sa biološki aktivnim jedinjenjem različitim od B, stvarajući heterodimer biološki aktivnih jedinjenja ili njihovih prekursora.
U drugim slučajevima E formira dodatnu vezu sa biološki aktivnim jedinjenjem B, tako da su i E i R vezani preko različitih funkcionalnih grupa istog molekula za biološki aktivno jedinjenje ili njegov prekursor.
Ako je E u stanju da formira vezu sa biološki aktivnim molekulom ili njegovim prekursorom, E može biti isto ili različito od R, a bira se iz grupe koju čine karboksilna kiselina, estar, aldehid, aldehid hidrat, acetal, hidroksi, zaštićeni hidroksi, karbonat, alkenil, akrilat, metakrilat, akrilamid, supstituisani ili nesupstituisani tiol, halogen, supstituisani ili nesupstituisani amin, zaštićeni amin, hidrazid, zaštićeni hidrazid, sukcinimidil, izocijanat, izotiocijanat, ditiopiridin, vinilpiridin, jodoacetamid, epoksid, hidroksisukcinimidil, azol, maleimid, sulfon, alil, vinilsulfon, trezil, sulfo-N-sukcinimidil, dion, mezil, tozil ili glioksalni ostatak.
Ako E može da formira vezu sa biološki aktivnim jedinjenjem ili njegovim prekursorom, u nekim slučajevima E može biti Formula III ili Formula IV:
gde su
Q, X, Y, Z, m i n, nezavisno, kao što su definisani gore;
W svaki nezavisno, je vodonik ili C1-C7alkil;
R" je ostatak pogodan za formiranje veze između jedinjenja Formule III i biološki aktivnog jedinjenja ili njegovog prekursora; i
R'" je ostatak pogodan za formiranje veze između jedinjenja Formule IV i biološki aktivnog jedinjenja ili njegovog prekursora.
R" i R'" se nezavisno, biraju iz grupe koju čine karboksilna kiselina, estar, aldehid, aldehid hidrat, acetal, hidroksi, zaštićeni hidroksi, karbonat, alkenil, akrilat, metakrilat, akrilamid, supstituisani ili nesupstituisani tiol, halogen, supstituisani ili nesupstituisani amin, zaštićeni amin, hidrazid, zaštićeni hidrazid, sukcinimidil, izocijanat, izotiocijanat, ditiopiridin, vinilpiridin, jodoacetamid, epoksid, hidroksisukcinimidil, azol, maleimid, sulfon, alil, vinilsulfon, trezil, sulfo-N-sukcinimidil, dion, mezil, tozil ili glioksalni ostatak
Ako su vezani sa oba kraja biološki aktivnog jedinjenja ili njegovog prekursora, ovi bifunkcionalni molekuli se mogu predstaviti u skladu sa Formulom XX ili Formulom XXI:
gde je svaki od
X i Y, Tii T2|R' i Z, L, Q, m, n, a i n opisan gore;
W svaki nezavisno, je vodonik, ili C1-C7alkil;
R* i R<**>su, nezavisno, ostaci za povezivanje, koji se formiraju reakcijom R i R" sa biološki aktivnim jedinjenjem ili njegovim prekursorom; i B i B' svaki je biološki aktivno jedinjenje ili njegov prekursor, posle konjugovanja sa R i R", respektivno.
U nekim slučajevima B i B' su ista vrsta biološki aktivnog jedinjenja. U drugim slučajevima B i B' su različita biološki aktivna jedinjenja. U još nekim slučajevima, B i B' su isti biološki aktivan molekul. U dodatnim slučajevima R<*>i R<**>su isti. U drugim slučajevima R<*>i R<**>su različiti. Na primer, u nekim slučajevima E može da formira vezu sa drugim molekulom biološki aktivnog jedinjenja (B=B'), tako da je aktivirani PGC vezan sa bilo kog kraja sa molekulom iste vrste biološki aktivnog jedinjenja, dajući dimerni molekul. U nekim slučajevima, E formira vezu sa biološki aktivnim jedinjenjem koje se razlikuje od B (B nije B'), stvarajući heterodimer biološki aktivnih jedinjenja ili njihovih prekursora. U drugim slučajevima E formira dodatnu vezu sa biološki aktivnim jedinjenjem B, tako da su i E {preko R" ili R'") i R vezani preko različtih funkcionalnih grupa za isti molekul biološki aktivnog jedinjenja ili njegovog prekursora.
U nekim slučajevima R<*>ili R<**>je metilenska grupa, a B i B' je biološki aktivan molekul koji sadrži amino grupu, pri čemu metilenska grupa formira vezu sa amino grupom na B. Na primer, amin može da bude amino kraj peptida, amin aminokiseline u bočnom lancu peptida, ili amin supstituenta za glikozilovanje glikozilovanog peptida. U nekim slučajevima, peptid je interferon, kao što je interferon-beta, npr. interferon-beta-1a. U nekim slučajevima ova vrsta veze se formira reakcijom redukcionog alkilovanja.
Ukoliko su Tii T2supstituenti Formule XV alkil grupe ravnog lanca, X i Y predstavljaju kiseonik, a d je nula, pa konjugate predstavlja Formula XIX:
gde je u, svaki nezavisno, nula ili ceo broj od jedan do pet, a sve druge varijable su definsiane gore. U posebnim slučajevima, Z je vodonik ili metil.
Posebne klase jedinjenja koja pripadaju Formuli XV, mogu se prikazati Formulama XVII i XVIII, koja se formiraju reakcijom Formula VII i VIII, respektivno, sa biološki aktivnim jedinjenjem ili njegovim prekursorom:
gde su:
n je nula ili ceo broj od jedan do pet;
P je polimer polialkilenglikola, kao što je opisan gore;
Z je vodonik, zasićena ili nezasićena Ci-C20alkil ili heteroalkil grupa ravnog ili račvastog lanca;
R<*>je ostatak za povezivanje, kao što je opisan gore;
B je biološki aktivan molekul.
Ova jedinjenja mogu biti bifunkcionalna ili monofunkcionalna, zavisno od identiteta E, kao što je opisano gore.
U nekim slučajevima R<*>je metilenska grupa, a B je biološki aktivan molekul koji sadrži amino grupu, pri čemu metilenska grupa formira vezu sa amino grupom na B. Na primer, amin može biti amino kraj peptida, amin aminokiseline u bočnom lancu peptida, ili amin supstituenta za glikozilovanje glikozilovanog peptida. U nekim slučajevima peptid je interferon, kao što je intereron-beta, npr. interferon-beta-1a. U nekim slučajevima, ova vrsta veze se formira reakcijom redukcionog alkilovanja.
Konjugati iz ovog opisa se mogu takođe formirati reakcijom jedinjenja u skladu sa Formulom X sa biološki aktivnim jedinjenjem ili njegovim prekursorom, formirajući konjugat u skladu sa Formulom XXII:
gde su
B je biološki aktivan molekul, kao što je opisano gore;
n je nula ili ceo broj od jedan do pet;
X je 0, S, CO, C02, COS, SO, S02, CONR', S02NR' ili NR',
R' je vodonik, zasićena ili nezasićena CrC20alkil ili heteroalkil grupa ravnog ili račvastog lanca, zasićeni ili nezasićeniC3-C8ciklični alkil ili ciklični heteroalkil, supstituisana ili nesupstituisana ril ili heteroaril grupa, ili supstituisani ili nesupstituisani alkaril, gde alkil predstavlja zasićena ili nezasićena CrC2oalkil ili heteroalkaril grupa. Ukoliko su prisutni, supstituenti mogu da budu halogen, hidroksil, karbonil, karboksilat, estar, formil, acil, tiokarbonil, tioestar, tioacetat, tioformijat, alkosil, fosforil, fosfonat, fosfinat, amino, amido, amidin, imin, cijano, nitro, azido, sulfhidril, sulfat, sulfonat, sulfamoil, sulfonamido, sulfonil, heterociklil, aralkil, aromatični ostatak, heteroaromatični ostatak, imino, silil, etar ili alkiltio;
Z je zasićena ili nezasićena Ci-C20alkil ili heteroalkil grupa ravnog ili račvastog lanca, zasićeni ili nezasićeniC3-Ceciklični alkil ili ciklični heteroalkil, supstituisana ili nesupstituisana ril ili heteroaril grupa, ili supstituisani ili nesupstituisani alkaril, gde alkil predstavlja zasićena ili nezasićena CrC2o alkil ili heteroalkaril grupa. Supstituenti mogu biti halogen, hidroksil, karbonil, karboksilat, estar, formil, acil, tiokarbonil, tioestar, tioacetat, tioformijat, alkosil, fosforil, fosfonat, fosfinat, amino, amido, amidin, imin, cijano, nitro, azido, sulfhidril, sulfat, sulfonat, sulfamoil, sulfonamido, sulfonil, heterociklil, aralkil, aromatični ostatak, heteroaromatični ostatak, imino, silil, etar ili alkiltio;
R<*>je ostatak za povezivanje koji se formira reakcijom R sa odgovarajućom funkcionalnom grupom na biološki aktivnom jedinjenju B, kao što je opisano gore. Na primer, R<*>se formira reakcijom ostatka kao što je karboksilna kiselina, estar, aldehid, aldehid hidrat, acetal, hidroksi, zaštićeni hidroksi, karbonat, alkenil, akrilat, metakrilat, akrilamid, supstituisani ili nesupstituisani tiol, halogen, supstituisani ili nesupstituisani amin, zaštićeni amin, hidrazid, zaštićeni hidrazid, sukcinimidil, izocijanat, izotiocijanat, ditiopiridin, vinilpiridin, jodoacetamid, epoksid, hidroksisukcinimidil, azol, maleimid, sulfon, alil, vinilsulfon, trezil, sulfo-N-sukcinimidil, dion, mezil, tozil ili glioksalna funkcija, sa biološki aktivnim jedinjenjem ili njegovim prekursorom.
U nekim slučajevima Z je metil, a n je jedan.
P je polimer polialkilenglikola definisan gore, a može se prikazati Formulom II:
gde je E vodonik, C1-C20alkil grupa ravnog ili račvastog lanca (npr. metil), obeležje koje se može detektovati ili ostatak koji je u stanju da formira vezu između jedinjenja Formule XXII i biološki aktivnog jedinjenja ili njegovog prekursora. Kao i gore, a je ceo broj od 4 do 10.000.
Ukoliko E predstavlja obeležje koje se može detektovati, to obeležje može biti radioaktivan izotop, fluorescentni ostatak, fosforescentni ostatak, hemiluminiscentni ostatak ili kvantna tačka.
Ukoliko je E ostatak koji je u stanju sa formira vezu sa biološki aktivnim molekulom, kao rezultat se dobije bifunkcionalni molekul. E može formirati vezu sa drugim molekulom biološki aktivnog jedinjenja (B), tako da je aktivirano jedinjenje polialkilenglikola vezano sa bilo kog kraja za molekul iste vrste biološki aktivnog jedinjenja, dajući dimerni molekul.
U nekim slučajevima E formira vezu sa biološki aktivnim jedinjenjem različitim od B, stvarajući heterodimer biološki aktivnih jedinjenja ili njihovih pekursora.
U drugim slučajevima E formira dodatnu vezu sa biološki aktivnim jedinjenjem B, tako da su i E i R vezani preko različitih funkcionalnih grupa istog molekula biološki aktivnog jedinjenja ili njegovog prekursora.
Ako je E u stanju da formira vezu sa biološki aktivnim jedinjenjem ili njegovim prekursorom, E može biti isto ili različito od R, i da se bira iz grupe koju čine karboksilna kiselina, estar, aldehid, aldehid hidrat, acetal, hidroksi, zaštićeni hidroksi, karbonat, alkenil, akrilat, metakrilat, akrilamid, supstituisani ili nesupstituisani tiol, halogen, supstituisani ili nesupstituisani amin, zaštićeni amin, hidrazid, zaštićeni hidrazid, sukcinimidil, izocijanat, izotiocijanat, ditiopiridin, vinilpiridin, jodoacetamid, epoksid, hidroksisukcinimidil, azol, maleimid, sulfon, alil, vinilsulfon, trezil, sulfo-N-sukcinimidil, dion, mezil, tozil ili glioksalni ostatak.
U nekim slučajevima E može imati strukturu u skladu sa Formulom III ili Formulom IV:
gde su
Q, X, Y, Z, m i n, nezavisno, definisani gore;
VV svaki nezavisno, je vodonik ili CrC?alkil;
R" je ostatak koji se poogodan za formiranje veze između jedinjenja Formule lili biološki aktivnog jedinjenja ili njegovog prekursora; i
R'" je ostatak koji je pogodan za formiranje veze između jedinjenja Formule IV i biološki aktivnog jedinjenja ili nejgovog prekursora.
R" i R'" se nezavisno, biraju iz grupe koju čine karboksilna kiselina, estar, aldehid, aldehid hidrat, acetal, hidroksi, zaštićeni hidroksi, karbonat, alkenil, akrilat, metakrilat, akrilamid, supstituisani ili nesupstituisani tiol, halogen, supstituisani ili nesupstituisani amin, zaštićeni amin, hidrazid, zaštićeni hidrazid, sukcinimidil, izocijanat, izotiocijanat, ditiopiridin, vinilpiridin, jodoacetamid, epoksid, hidroksisukcinimidil, azol, maleimid, sulfon, alil, vinilsulfon, trezil, sulfo-N-sukcinimidil, dion, mezil, tozil ili glioksalni ostatak, a mogu biti isti ili različiti od
R.
Ukoliko su vezani za oba kraja biološki aktivnog jedinjenja ili njegovog prekursora, ovi bifunkcionalni molekuli se mogu predstaviti u skladu sa Formulom XXIV ili Formulom XXV:
gde su
X i Y svaki nezavisno, 0, S, CO, C02, COS, SO, S02, CONR', S02NR' ili NR', R' i Z svaki nezavisno, je vodonik, zasićenia ili nezasićena Ci-C20alkil ili heteroalkil grupa ravnog ili račvastog lanca;
Q je zasićeni ili nezasićeniCs-Csciklični alkil ili ciklični heteroalkil (uključujući pripojene biciklične i premošćene biciklične prstenaste strukture), supstituisana ili nesupstituisana ril ili heteroaril grupa, ili supstituisani ili nesupstituisani alkaril, gde alkil predstavlja zasićena ili nezasićena C-i-C20 alkil ili heteroalkaril grupa. Ukoliko su prisutni, supstituenti mogu da budu halogen, hidroksil, karbonil, karboksilat, estar, formil, acil, tiokarbonil, tioestar, tioacetat, tioformijat, alkosil, fosforil, fosfonat, fosfinat, amino, amido, amidin, imin, cijano, nitro, azido, sulfhidril, sulfat, sulfonat, sulfamoil, sulfonamido, sulfonil, heterociklil, aralkil, aromatični ostatak, heteroaromatični ostatak, imino, silil, etar ili alkiltio;
W svaki nezavisno, je vodonik ili C1-C7alkil;
m je nula ili jedan;
a je ceo broj od 4 do 10.000;
n svaki nezavisno, je 0 ili ceo broj od 1 do 5;
R<*>i R<**>nezavisno, su ostaci za povezivanje, kao što su opisani gore; i
B i B', nezavisno, su biološki aktivan molekuli, a mogu biti isti ili različiti.
U nekim slučajevima E (preko R" ili R'") može da formira vezu sa biološki aktivnim jedinjenjem (B) tako da je aktiviranojedinjenje polialkilenglikola vezano preko bilo koga kraja za molekul iste vrste biološki aktivnog jedinjenja, stvarajući dimerni molekul.
U nekim slučajevima E (preko R" ili R'") može da formira vezu sa biološki aktivnim jedinjenjem različitim od B, stvarajući heterodimer biološki aktivnih jedinjenja ili njihovih prekursora.
U drugim realizacijama E (preko R" ili R'") formira dodatnu vezu sa biološki aktivnim jedinjenjem B, tako da su i E i R vezani preko različitih funkcionalnih grupa za isti molekul biološki aktivnog jedinjenja ili njegovog prekursora.
R" i R'" mogu biti isti kao i različiti od R, a biraju se iz grupe koju čine karboksilna kiselina, estar, aldehid, aldehid hidrat, acetal, hidroksi, zaštićeni hidroksi, karbonat, alkenil, akrilat, metakrilat, akrilamid, supstituisani ili nesupstituisani tiol, halogen, supstituisani ili nesupstituisani amin, zaštićeni amin, hidrazid, zaštićeni hidrazid, sukcinimidil, izocijanat, izotiocijanat, ditiopiridin, vinilpiridin, jodoacetamid, epoksid, hidroksisukcinimidil, azol, maleimid, sulfon, alil, vinilsulfon, trezil, sulfo-N-sukcinimidil, dion, mezil, tozil ili glioksalni ostatak.
U nekim slučajevima, R<*>ili R<**>je metilenska grupa, a B ili B' je biološki aktivan molekul koji sadrži amino grupu, pri čemu metilenska grupa formira vezu sa amino grupom u B. Na primer, amin može biti amino kraj peptida, amin aminokiseline bočnog lanca peptida, ili amin ostatka za glikozilovanje glikozilovanog peptida. U nekim slučajevima ovaj peptid je inteferon, kao što je interferon-beta, npr. interferon-beta-1-a. U nekim slučajevima ova vrsta veze se formira reakcijom redukcionog alkilovanja.
Konjugati iz ovog opisa mogu se dobiti kuplovanjem biološki aktivnog jedinjenja na jedinjenje polialkilenglikola, kao što je opisano u Primerima. U nekim slučajevima ovo kuplovanje se postiže reakcijom redukcionog alkilovanja.
Interesantna biološki aktivna jedinjenja predstavljaju bilo koju supstancu namenjenu dijanozi, olakšavanju lečenjem, tretmanu ili prevenciji bolesti kod humanih ili drugih animalnih bića, ili da na drugi način poboljša fizičko ili mentalno stanje humanih ili animalnih bića. Primeri biološki aktivnih jedinjenja su, ali bez ograničavanja, peptidi, analozi peptida, proteini, enzimi, mali molekuli, boje, lipidi, nukleozidi, oligonukleotidi, analozi oligonukleotida, šećeri, oligosaharidi, ćelije, virusi, lipozomi, mikročestice, površine i micele. Ova klasa jedinjenja obuhvata takođe i prekursore tih vrsta molekula. Klase biološki aktivnih agenasa, pogodne za upotrebu u ovom opisu su, ali bez ograničavanja, citokini, hemokini, limfokini, rastvorni receptori, antitela, antibiotici, fungicidi, antivursni agensi, anti-inflamatorni agensi, anti-tumorni agensi, kardiovaskularni agensi, anti-anksiozni agensi, hormoni, faktori rasta, steroidni agensi.
Biološki aktivno jedinjenje može biti peptid, kao što je interferon, uključujući interferon-beta (npr. interferon-beta-1-a) ili interefron-alfa.
Zato što polimerne modifikacije na PGC iz ovog opisa smanjuju antigenske odgovore, da bi se koristio kao terapuetsko sredstvo, strani peptid ne treba da je potpuno analogan. Na primer, peptid, kao što je interferon, koji se koristi za dobijanje polimernih konjugata, može se dobiti iz ekstrakta sisara, kao što je humani, preživarski ili goveđi interferon, ili može biti proizveden sintetski ili rekombinantno.
Na primer, u jednom aspektu, ovaj opis je usmeren na jedinjenja i postupke za tretiranje stanja podložnih tretmanu interferonom alfa ili beta. Ordiniranje polialkilenglikola konjugovanog sa interferonom-beta (u nastavku "PGC IFN-beta", "PGC IFN-p", npr. "PEG IFN-beta", "PEG-ilovani IFN-beta" ili "PEG-ilovani IFN-p") daje poboljšane terapeutske efekte, uz suštinsko umanjenje ili potpuno eliminisanje nepoželjnih sporednih efekata, koji su normalno povezani sa konvencionalnom primenom režima tremana interferonom-alfa ili -beta.
PGC IFN-beta se može dobiti pripajanjem polialkilenskog polimera za krajnju amino grupu molekula IFN-beta. Jednostruko aktivirani molekul polialkilenglikola se može konjugovati sa N-krajem IFN-beta reakcijom redukcionog alkilovanja.
Konjugat PGC-IFN-beta se može formulisati, na primer, kao tečnost ili kao liofilizovani prah za injekcije. Smisao konjugvanja IFN-beta sa PGC je da se poboljša oslobađanje proteina značajnim produžavanjem njegovog poluvremena u plazmi, čime sedobija produžena aktivnost IFN-beta.
Naziv "interferon" ili "IFN", kako se ovde koristi, označava familiju visoko homolognih vrsta specifičnih proteina koji inhibiraju reprodukciju virusa i ćelijsku proliferaciju, i modulišu imuno odgovor. Humani interferoni su grupisani u dve klase; Tip 1, uključujući a- i p-interferon, i Tip II, koga predstavlja samo y-interferon. Razvijeni su rekombinantni oblici svake ove grupe, i komercijalno su pristupačni. Podvrste svakog od ovih tipova se zasnivaju na antigensko/ strukturnim karakteristikama.
Nazivi "beta interferon", "beta-interferon", "beta IFN", beta-IFN", "p interferon", "p-interferon", "IFN beta", "IFN-beta", "IFN p", "IFN-p" i "interferon humanog fibroplasta" ovde se naizmenično koriste, da opišu članove grupe interferona beta, koji imaju različitu sekvenciju aminokiselina, zato što su ilzolovani i sekvencionirani DNK kodirani peptidi.
Pored toga, nazivi "beta interferon 1a", "beta interferon-1a", "beta-interferon 1a",
"beta-interferon-1a", "beta IFN 1a", "beta IFN-1a", "beta-IFN 1a","beta-IFN-1a", "p interferon 1a", "p interferon-1a", "p-interferon 1a", "P-interferon-1a", "<p>IFN 1a", "p IFN-1a", "p-IFN 1a", "p-IFN-1a", "interferon beta 1a", "interferon beta-la", "interferon-beta 1a", "interferon-beta-1a", "interferon p 1a", "interferon p-1a", "interferon-p 1a", "interferon-p-1a", "IFN p 1a", "IFN<p->1a", "IFN-p 1a", "IFN-P 1a", ovde se koriste naizmenično, da opišu rekombinantno- ili sintetski-dobijeni interferon-beta, koji ima sekvienciju aminokiselina koja se nalazi u prirodi (divlji tip).
Pojava tehnologije rekombinantne DNK, primenjena na proizvodnju interferona, dozvolila je da se nekoliko humanih interferona uspešno sintetizuju, čime je omogućena masovna fermentacija, proizvodnja, izolovanje i prečišćavanje raznih interferona do homogenosti. Rekombinantno proizvedeni interferon zadržava neke ili većinu njegovihin vitroiin vivoantivirusnih i imunomodulatornih aktivnosti. Podrazumeva se takođe, da rekombinantne tehnike mogu takođe da obuhvate mesto za glikozilovanje prilikom adicije ostatka ugljenog hidrata na rekombinantno izvedenom pilpeptidu.
Podrazumeva se takođe, da konstrukcija plazmida rekombinantne DNK, sadrži sekvencije koje kodiraju najmanje jedan deo interferona humanog fibroplasta i ekspresiju polipeptida koji ima imunološku ili biološku aktivnost interferona humanog fibroplasta. Konstrukcija hibridnih gena beta-interferona, koja sadrži kombinacije raznih podvrsta sekvencija, može da se obavi tehnikama koje su poznate onima koji su verzirani u stanje tehnike.
Tipični pogodni rekombinantni beta-interfereoni, koji se mogu koristiti za praktikovanje ovog pronalaska, su, ali bez ograničavanja, interferon beta-1a, kao što je AVONEX<®>, dostupan iz firme Biogen, Inc., Cambridge , MA i interferon-beta-1b, kao što je BETASERON<®>, dostupan iz firme Berlex, Richmond, CA.
Postoje mnogi mehanizmi po kojima genski proizvodi, izazvani sa IFN, obezbeđuju zaštitne efekte protiv virusne infekcije. Ti inhibitorni virusni efekti dešavaju se u raznim fazama ciklusa života virusa. Videti U.S. Patent No. 6,030,785. Na primer, IFN može da inhibira otkrivanje virusnih čestica, penetraciju i/ili spajanje izazvano virusima.
Uslovi koji se mogu tretirati u skladu sa ovim pronalaskom su obično takvi da su osetljivi na tretman sa interferonom. Na primer, osetljivi uslovi su oni koji bi pozitivno ili povoljno odgovorili (pošto su ovi nazivi poznati u stanju tehnike u medicini) na terapiju zasnovanu na interferonu-beta. Za svrhe ovog pronalaska, uslovi koji se mogu tretirati terapijom sa interferonom-beta, koji su ovde opisani, su oni uslovi u kojima tretman sa interferonom-beta pokazuje izvesnu efikasnost, ali gde negativni sporedni efekti tretmana sa intereferonom-p prevagnjuju nad korisnim. Tretman u skladu sa postupcima iz ovog opisa dovodi suštinski do umanjenja ili eliminisanja sporednih efekata, u poređenju sa konvencionalnim tretmanom sa interferonom-beta. Pored toga, uslovi za koje se tradicionalno misli da su nepodesni na treman sa interferonom-beta, ili oni za koje je nepraktično tretiranje sa podnošljivim dozama IFN-p, mogu se tretirati u skladu sa postupcima iz ovog opisa.
Jedinjenja PGC IFN-p iz ovog opisa mogu se koristiti sama ili u kombinaciji sa jednim ili više agenasa koji su korisni za tretiranje posmatranog stanja. Obavljeno je najmanje jedno probno ispitivanje rekombinantnog interferona beta-1a za tretman hroničnog hepatitisa C. Videti uopšteno, Habersetzer et al.,Liver,2000, 30, 437-441.
Na primer, ova jedinjenja se mogu ordinirati u kombinaciji sa dobro poznatim antivirusnim agensima za tretiranje virusnih infekcija. Videti Kakumu et al.,Gastroenterology,1993, 105, 507.12, i Pepinskv et al.,J. Pharmacology and Experimental Therapeutics,2001, 297, 1059-1066.
Kako se ovde koristi, naziv "antivirusni agensi" može da obuhvati na primer, male molekule, peptide, šećere, proteine, molekule izvedene iz virusa, inhibitore proteaze, analoge nukleotida i/ili analoge nukleozida. Kako se ovde koristi, naziv "mali molekul" se odnosi na organski molekul sa manje od oko 2500 amu (atomske masene jedinice), poželjno sa manje od oko 1000 amu. Primeri pogodnih antivirusnih jedinjenja su, ali bez ograničavanja, ribavirin, levovirin, MB6866, zidovudine 3TC, FTC, acvclovir, gancvđovir, viramide, VX-497, VX-950 i ISI-14803.
Egzemplarna stanja koja se mogu tretirati sa interferonom su, ali bez ograničavanja, poremećaji proliferacije ćelije, naročito multipla skleroza, kancer (npr. leukemija ćelija dlake, Kaposi-ev sarkom, hronična mijelogena leukemija, multipli melanom, karcinom bazalnih ćelija i maligni melanomi, kancer jajnika, limfom T ćelija kože) i virusne infekcije. Bez ograničavanja, tretman interferonom može da se koristi za tretiranje stanja koja bi profitirala iz inhibiranja replikacije virusa osetljivih na interferon. Na primer, interferon se može koristiti sam ili u kombinaciji sa AZT u tretmanu virusa humane imunodeficitarnosti (HIV)/SIDA ili u kombinaciji sa ribavirinom, prilikom tretmana HCV. Virusne infekcije, koje se mogu tretirati u skladu sa ovim pronalaskom su, ali bez ograničavanja, hepatitis A, hepatisi B, hepatitis C, drugi hepatitisi koji nisu A/B, virus herpesa, Epstein-Barr-ov virus (EBV), citomegalovirus (CMV), herpes simpleks, humani virus herpesa tip 6 (HHV-6), papiloma, virus boginja, picorna virus, adenovirus, rinovirus, humani T lumfotropni virus- tip 1 i 2 (HTLV-1/-2), humani rotavirus, besnilo, retrovirusi uključujući HIV, encefalitis i respiratorne virusne infekcije. Postupci iz ovog opisa mogu se takođe koristiti za modifikaciju raznih imuno odgovora.
Opažena je korelacija između genotipa HCV i odgovora na terapiju interferonom. Videti U.S. Patent No. 6,030,785; Enomoto et al.,J. Med.1996, 334, 77-81; Enomoto et al.J. Clin. Invest.1995, 96, 224-30. Procenat odgovora kod pacijenata inficiranih sa HCV-1b je manji od 40%. Videti U.S. Patent No. 6,030,785. Slični, niski procenti odgovora su opaženi kod pacijenata inficiranih sa HCV-1a. Videti,ibidum,i Hoofnagel et al.,lntervirology,1994, 37, 87-100. Međutim, procenat odgovora kod pacijenata inficiranih sa HCV-2 je skoro 80%. Videti U.S. Patent No. 6,030,785; Fried et al.,Semin. LiverDis.1995, 15, 82-91. Ustvari, nađeno je da sekvencija aminokiselina diskretnog regiona NS5A proteina genotipa HCV 1b korelira sa osetljivošću na interferon. Videti U.S. Patent No. 6,030,785. Videti takođe, Enomoto et al., 1996; Enomoto et al., 1995. Ovaj region je identifikovan kao region koji određuje osetljivost na interferon (ISDR). Videti,ibidum.
Konjugat PGC IFN-beta se ordinira u farmakološki efikasnoj količini za tretiranje bilo kog od stanja opisanih gore, a zasniva se na aktivnosti IFN beta ovog polimernog konjugata. Naziv "farmakološki efikasna količina" označava količinu leka ili farmaceutskog agensa koja će izazvati biološki ili medicinski odgovor tkiva, sistema, animalnog ili humanog bića, koji zahteva istraživač ili lekar. To je količina koja je dovoljna da izazove značajan pozitivan klinički odgovor, uz održavanje smanjenog iznosa sporednih efekata. Količina PGC IFN-beta koja se može ordinirati subjektu kome je to potrebno, je u opsegu od 0,01-100 ug/kg, ili poželjnije od 0,01-10 ug/kg, ordinirana u jednoj ili u podeljenim dozama.
Ordiniranje opisanih doza može biti svaki drugi dan, ali poželjno je da se odigrava jedanput nedeljno ili jedanput svake druge nedelje. Doze se ordiniraju injekcijama u periodu od najmanje 24 nedelje
Ordiniranje ove doze može biti oralno, površinsko, intravenozno, potkožno, untramuskularno ili nekim drugim prihvatljivim sistemskim postupkom. Na osnovu procene ordinirajućeg lekara, količina ordiniranog leka i režim tretmana koji se koriste, naravno da će zavisiti od starosti, pola i istorije bolesti pacijenta koji se tretira, broja neutrofila (npr. ozbiljnosti neutropenije), ozbiljnosti specifičnog stanja bolesti i tolerancije pacijenta prema tretmanu, što se pokazuje preko lokalne toksičnosti i sistemskih sporednih efekata.
U praksi, konjugati iz ovog opisa, uključujući prikazani pronalazak se ordiniraju u količinama koje su dovoljne da inhibiraju ili spreče neželjena medicinska stanja ili bolest kod subjekta, kao što je sisar, a koriste se u obliku koji je najpogodniji za tu svrhu. Poželjno je da su preparati pogodni za internu upotrebu, pa obuhvataju efikasnu količinu farmakološki aktivnog jedinjenja iz ovog opisa, samog ili u kombinaciji sa drugim aktivnim agensom, zajedno sa jednim ili više farmaceutski prihvatljivih nosača. Ova jedinjenja su naročito korisna zbog toga što imaju vrlo nisku, ukoliko je uopšte imaju, toksičnost.
Ovde opisani konjugati mogu činiti aktivan sastojak farmaceutskog preparata i tipično se ordiniraju u smeši sa pogodnim farmaceutskim razblaživačima, dodacima ili nosačima (kolektivno će se ovde nazivati materijalima "nosača"), koji se pogodno biraju u skladu sa namenjenim oblikom ordiniranja, tj. oralnim, tabletama, kapsulama, eliksirima, sirupima. Ovi preparati tipično sadrže efikasnu količinu aktivnog jedinjenja ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, a pored toga, mogu takođe da sadrže bilo koji od materijala nosača, koji se uobičajeno koriste u farmaceutskoj nauci. Zavisno od namenjenig načina ordiniranja, ovi preparati mogu biti čvrsti, polu-čvrsti, ili tečni, kao oblik za doziranje, kao što su na primer, sredstva za injektiranje, tablete, supozitorije, pilule, kapsule sa vremenskim oslobađanjem, prahovi, tečnosti, suspenzije ili slično, poželjno u jediničnim dozama.
Konvencionalni farmaceutski preparati, koji sadrže farmakološki efikasnu količinu nekog konjugata, npr. PGC IFN-beta, zajedno sa farmaceutski prihvatljivim nosačima, adjuvantima, razblaživačima, prezervativima i/ili solubilizatorima, mogu se koristiti u praksi prema ovom opisu, uključujući prikazani pronalazak. Farmaceutski preparati interferona obuhvataju razblaživače različitih pufera (npr. arginin, Tris-HCI, acetat, fosfat), koji imaju opseg pH i jonskih jačina, nosače (npr. serum humanog albumina), solubilizatore (npr. Tween, polisorbat) i prezervative (npr. benzilalkohol). Videti na primer U.S. Pat. No. 4,496,537.
Ordiniranje ovde opisanih aktivnih jedinjenja ide preko bilo koga od prihvaćenih načina ordiniranja terapeutskih agenasa. Ovi postupci obuhvataju sistemsko ili lokalno ordiniranje, kao što su oralno, nazalno, parenteralno, transdermalno, potkožno ili površinsko ordiniranje.
Na primer, za oralno ordiniranje u obliku tablete ili kapsule (npr. žeiatinska kapsula), komponenta aktivnog leka se može kombinovati sa oralnim, netoksičnim, farmaceutski prihvatljivim, inertnim nosačem, kao što su etanol, glicerin, voda. Pored toga, ukoliko se želi ili je neophodno, u smešu mogu biti takođe ugrađeni: pogodna veziva, lubrikanti, dezintegracioni agensi i agensi za bojenje. Pogodna veziva su škrob, magnezijum-aluminijum-silikat, škrobna pasta, želatin, metilceluloza, natrijum-karboksimetilceluloza i/ili polivinilpirolidon, šećeri, kukuruzni zaslađivači, prirodne i sintetske gume, kao što su akacija, tragant ili natrijum-alginat, polietilenglikol, voskovi. Lubrikanti, koji se koriste u ovim oblicima za doziranje su natrijum-oleat, natrijum-stearat, magnezijum-stearat, natrijum-benzoat, natrijum-acetat, natrijum-hlorid, silicijum-dioksid, talk, stearinska kiselina, njena magnezijumova ili kalcijumova so, i/ili polietilenglikol. Dezintegranti su, ali bez ograničavanja, škrob, metiiceluloza, agar, bentonit, ksantan guma, škrobovi, agar, alginska kiselina ili njena natrijumova so, ili smeše za penušanje. Razblaživači su, npr. laktoza, dekstroza, saharoza, manitol, sorbitol, celuloza i/ili glicin.
Konjugati iz ovog opisa, uključujući prikazani pronalazak se mogu takođe ordinirati u takvim oralnim oblicima za doziranje, kao što su, sa vremenskim oslobađanjem ili uzdržanim oslobađanjem, u tabletama ili kapsulama, pilulama, prahovima, granulama, eliksirima, tinkturama, suspenzijama, sirupima i emulzijama.
Tečni, a naročito injektibilni preparati, mogu na primer, da se dobiju rastvaranjem, dispergovanjem itd. Aktivno jedinjenje se rastvori u, ili pomeša sa farmaceutski prihvatljivim rastvaračem, kao što su na primer, voda, rastvor soli, dekstroza u vodi, glicerin, etanol, formirajući oblik injektibilnog rastvora ili suspenzije. Pored toga, mogu se formulisati i čvrsti oblici, pogodni za rastvaranje u tečnosti, pred injektiranje. Injektibilni preparati su poželjni u izotoničnim rastvoroma ili suspenzijama u vodi. Preparati se mogu sterilisati i/ili da sadrže adjuvante, kao što su agensi za prezervaciju, stabilizaciju, kvašenje ili emulgovanje, promoteri rastvaranja, soli za regulisanje osmotskog pritiska i/ili puferi. Pored toga, oni mogu takođe da sadrže druge terapeutski vredne supstance.
Konjugati iz ovog opisa, uključujući prikazani pronalazak mogu se ordinirati intravenozno (npr. kao bolus ii kao infuzija), intraperitonealno, potkožno ili intramuskularno, a svi ovi oblici su poznati onima koji su uobičajeno verzirani u stanje tehnike u farmaciji. Injektibilni preparati se mogu dobiti u konvencionalnim oblicima, kao tečni rastvori ili kao siuspenzije.
Parenteralno ordiniranje injektibilnih preparata koristi se obično za potkožne, intramuskularne ili intravenozne injekcije i infuzije. Na primer, ako se koristi potkožna injekcija, oslobađa se 0,01-100 ug/kg-ili poželjnije 0,01-10 ug/kg PEG-ilovanog IFN-beta tokom nedelju dana, dve injekcije od 0,005-50 ug/kg, ili poželjnije 0,005-5 ug/kg, respektivno, mogu se ordinirati unutar 0 do 72 h. Pored toga, jedan od pristupa parenteralnog ordiniranja koristi implantaciju sistema koji se sporo oslobađa ili zadržano oslobađa, koji predpostavlja da se održava konstantan nivo doziranja, u skladu sa U.S. Patent No. 3,710,795.
Pored toga, poželjni konjugati iz ovog opisa, uključujući prikazani pronalazak mogu se ordinirati u intranazalnom obliku, preko površinske upotrebe u pogodnim intranazalnim tečnim nosačima, ili transdermalnim putevima, koristeći oblike transdermalnih flastera za kožu koji su dobro poznati onima koji su verzirani u stanje tehnike. Da bi se ordiniralo u obliku transdermalnog sistema za oslobađanje, ordiniranje doze će, naravno, tokom režima doziranja biti kontinualno, a ne sa prekidima. Drugi poželjni površinski preparati su kreme, losioni, aerosoli, sprejovi i gelovi, gde je ordinirana doza 10-100 puta veća od doze koja se tipično daje parenteralnim ordiniranjem.
Za čvrste preparate, dodaci koji se koriste su manitol, laktoza, škrob, magnezijum-stearat, natrijum-saharinat, talk, celuloza, glukoza, saharoza, magnezijum-karbonat, farmaceutskog kvaliteta. Gore definisano aktivno jedinjenje može se takođe formulisati kao supozitorije, koristeći kao nosač na primer, polialkilenglikole, kao što je na primer propilenglikol. U nekim slučajevima, pogodno je da se ove supozitorije pripremaju iz masnih emulzija ili suspenzija.
Konjugati iz ovog opisa, uključujući prikazani pronalazak se mogu takođe ordinirati u obliku lipozomskog sistema za oslobađanje, kao mali unilamelarni mehurići, veliki unilamelarni mehurići i multilamelarni mehurići. Lipozomi se mogu formulisati iz raznih fosfolipida, koji sadrže holesterol, stearilamin ili fosfatidilholine. U nekim realizacijama film lipidnih komponenata je hidratisan sa vodenim rastvorom leka, formirajući lipidni sloj koji kapsulira lek, kao što je opisano u U.S. Patent-u No. 5,262,564.
Konjugati iz ovog opisa se mogu takođe oslobađati upotrebom imunoglobulinskih fuzija, kao individualnih nosača, sa kojima se kupluju molekuli ovog jedinjenja.
Jedinjenja iz ovog opisa se mogu takođe kuplovati sa rastvornim polimerima, kao nosačima leka na cilj. Ti polimeri mogu biti polivinilpirolidon, kopolimer pirana, polihidroksipropil-metakrilamid-fenol, polihidroksietil-aspanamidfenol ili polietilenoksidpolilizin, supstituisan sa palmitoil ostacima. Ovi konjugati se mogu takođe kuplovati na proteine, kao što su na primer, receptorski proteini i albumin. Pored toga, jedinjenja iz ovog opisa se mogu kuplovati na klasu biodegradabilnih polimera, koji su korisni za ostvarivanje kontrolisanog oslobađanja leka, kao što su na primer, polimlečna kiselina, poliepsilon-kaprolakton, polihidroksibuterna kiselina, poliortoestri, poliacetali, polihidroksipirani, policijanoakrilati i umreženi ili amfipatični blok kopolimeri hidrogelova.
Ukoliko se želi, farmaceutski preparati se mogu ordinirati tako da sadrže manje količine netoksičnih pomoćnih supstanci, kao što su agensi za vlaženje ili emulgovanje, agensi za puferovanje pH i druge supstance, kao što su na primer, natrij u m-acetat, trietanolaminoleat itd.
Režim doziranja koji koristi ove konjugate bira se u skladu sa raznim faktorima, uključujući tip, vrstu, starost, masu, pol i medicinsko stanje pacijenta, ozbiljnost stanja koje treba da se tretira, put ordiniranja, bubrežne i jetrene funkcije pacijenta i naročito jedinjenje ili so koji se koriste. Posmatraju se takođe aktivnost jedinjenja iz ovog opisa i osetljivost pacijenta na sporedne efekte. Uobičajeno verziran lekar ili veterinar može lako da odredi i prepiše efiksanu količinu leka potrebnu za prevenciju, suprotstavljanje ili zaustavljanje napredovanja stanja.
Oralne doze iz ovog opisa, kada se koriste za indicirane efekte, kreću se između oko 0,01-100 ug/kg/dan oralno, ili poželjnije 0,01-10 ug/kg/dan oralno. Poželjno je da se ovi preparati daju u obliku tableta koje sadrže 0,5-5000 ug, ili poželjnije 0,5-500 ug aktivnog sastojka.
U bilo kome od puteva ordiniranja mogu se koristiti podeljene ili jednostruke doze. Na primer, jedinjenje iz ovog pronalaska se može ordinirati dnevno ili nedeljno, jednom dozom ili se ukupna doza može ordinirati u podeljenim dozama, dve, tri ili četiri.
Bilo koji od gornjih farmaceutskih preparata može da sadrži kao aktivan sastojak 0,1-99%, 1-70% ili poželjno 1-50% aktivnih jedinjenja iz ovog opisa.
Kao što je gore opisano, tok bolesti i odgovor na tretman lekom mogu se pratiti kliničkim ispitivanjem i laboratorijskim nalazima. Efikasnost terapije iz ovog pronalaska se određuje domašajem do koga su ranije opisani znaci i simptomi nekog stanja, npr. hroničnog hepatitisa, ublaženi, i domašajem do koga su umanjeni ili potpuno eliminisani normalni sporedni efekti od interferona (tj. simptomi nalik gripu, kao što su groznica, glavobolja, jeza, mijalgija, zamor itd., kao i simptomi povezani sa centralnim nervnim sistemom, kao što su depresija, parestezija, neusaglašene kontrakcije itd.).
U nekim realizacijama, polialkilovano jedinjenje iz ovog opisa (npr. PEG-ilovani interferon) se ordinira zajednički sa jednim ili više farmaceutskih agenasa koji su korisni za tretiranje tog posebnog stanja. Na primer, polialikolvani protein se može ordinirati u kombinaciji sa dobro poznatim antivirusnim agensom, ili sa agensom za tretman virusne infekcije. Ova antivirusna jedinjenja su naprimer, ribavirin, levovirin, MB6866 i zidovudin 3TC, FTC, acvclovir, gancvclovir, viramide, VX-497, VX-950 i ISIS-14803.
Konjugat i antivirusni agens se mogu ordinirati simultano (npr. ovi agensi se zajedno ordiniraju pacijentu), sekvencijalno (npr. agensi se ordiniraju pacijentu jedan posle drugog) ili alternativno (npr. agensi se ordiniraju pacijentu u ponovljenim serijama, kao što su: agens A, zatim agens B, zatim agens A, itd.)
U praktikovanju ovog opisa, poželjni PGC IFN-beta (npr. PEG IFN-beta) može se ordinirati pacijentima inficiranim sa virusom hepatitisa C. Poželjna je upotreba PEG IFN-beta-1a.
Za tretman, pacijenti se biraju među pacijentima sa pozitivnim antitelima na anti-HCV, sa aktivnim hepatitisom, koji je dokumentovan biopsijom.
Da bi se pratio tok replikacije HCV kod subjekata, kao odgovor na tretman iekom, mogu se meriti HCV RNK u uzorcima seruma, na primer, pomoću testa reakcije ugneždenog lanca polimeraze, koji koristi dva seta prajmera, koji se izvode iz NS3 i NS4 nestrukturalnih regiona gena iz genoma HCV. Videti Farci et al,New Engl. J. Med.1991, 325, 98-104; Ulrich et al.,J. Clin. Invest1990, 86, 1609-1614.
Antivirusna aktivnost se može meriti promenama titra HCV-RNK. Podaci o HCV-RNK se mogu analizirati poređenjem titara na kraju tretmana, sa osnovnim merenjima pre tretmana. Smanjenje HCV-RNK za 4 nedelje pruža dokaz anti-virusne aktivnosti nekog jedinjenja. Videti Kleter et al.,Antimicrob. Agents Chemother.1993, 37(3), 595-97; Orito etal..J. Medical. Virology,1995, 46, 109-115. Promene za najmanje dva reda veličina (>2 log) interpretiraju se kao dokaz anti-virusne aktivnosti.
Osoba koja pati od infekcije hroničnim hepatitisom C može da pokazuje jedan ili više od sledećih znakova ili simptoma: (a) povišenu alanin aminotransferazu (ALT) u serumu, (b) pozitovan test na anti-HCV antitela, (c) prisustvo HCV, koje se pokazuje pozitivnim testom na HCV-RNK, (d) klinička obeležja hronične bolesti jetre, (e) hepatoćelijsko oštećenje. Ovi kriterijumi se ne moraju koristiti samo za dijagnozu hepatitisa C, nego se mogu koristiti i za ocenjivanje odgovora pacijenta na tretman Iekom.
Povišena alanin aminotransferaza (ALT) i asparagin aminotransferaza (AST), poznato je da prate nekontrolisani hepatitis C, a kompletan odgovor na tretman obično se definiše kao normalizacija ovih enzima u serumu, a naročito ALT. Videti Daviš et al.,New. Eng. J. Med.1989, 321, 1501-1506. ALT je enzim koji se oslobađa kada se uništavaju ćelije jetre i simptomatičan je za infekciju sa HCV. Interferon izaziva sintezu enzima 2',5'-oligoadenilat sintetaze (2'5'OAS), koja zatim dovodi do degradacije mRNK virusa. Videti Houglum,Clinical Pharmacology,1983, 2, 20-28. Povišenje sadržaja 2'5'OAS u serumu koincidira sa smanjenjem saržaja ALT.
Histološko ispitivanje uzoraka biopsije jetre može se koristiti kao drugi kriterijum za ocenjivanje. Videti npr. Knodell et al.,Hepatology,1981, 1_, 431-435, čiji Indeks histološke aktivnosti (portalna inflamacija, delimična ili premošćujuća nekroza, povrede režnjeva i fibroza) pružaju metodu za ocenjivanje aktivnosti bolesti.
Bezbednost i tolerabilnost tretmana se mogu odrediti kliničkim ocenjivanjima i brojanjem belih krvnih zrnaca i neutrofila. Ovo se može ocenjivati periodičnim praćenjem hematoloških parametara, npr. brojem belih krvnih zrnaca, neutrofila, trombocita i crvenih krvnih zrnaca.
Razne druge formulacije za produženo ili uzdržano oslobađanje mogu se dobiti koristeći konvencionalne postupke, koji su dobro poznati u stanju tehnike.
PRIMERI
Primer 1
Sinteza aktiviranih polialkilenglikola
A ) Alkilovanie alkohola
Aktivirani polialkilenglikoli se sintetizuju alkilovanjem polialkilenglikola koji na slobodnom kraju imaju hidroksil funkcionalnost. Generička reakcija je skicirana u Shemi I:
Polialkilenglikol (P-OH) reaguje sa alkilhalidom (A), formirajući etar (B). Jedinjenje B se zatim hidroksiluje, formirajući alkohol (C), koji se oksidiše do aldehida (D). U ovim jedinjenjima n je ceo broj od nula do pet, a Zje zasićena ili nezasićena C1-C20alkil ili heteroalkil grupa ravnog ili račvastog lanca. Z može takođe da bude zasićeni ili nezasićeni C3-C7ciklični alkil ili ciklični heteroalkil, supstituisana ili nesupstituisana aril ili heteroari grupa, ili supstituisana ili nesupstituisana alkaril (alkil je zasićeni ili nezasićeni C1-C20alkil) ili heteroalkaril grupa. Za supstituisana jedinjenja supstituenti mogu biti halogen, hidroksil, karbonil, karboksilat, estar, formil, acil, tiokarbonil, tioestar, tioacetat, tioformijat, alkoksil, fosforil, fosfonat, fosfinat, amino, amido, amidin, imin, cijano, nitro, azido, sulfhidril, sulfat, sulfonat, sulfamoil, sulfonamido, sulfonil, heterociklil, aralkil, aromatični ostatak, heteroaromatični ostatak, imino, silil, etar ili alkiltio. Tipično, P-OH je polietilenglikol (PEG) ili monometoksipolietilenglikol (mPEG), koji ima molekulsku težinu od 5.000 do 40.000 Daltona (Da).
Na primer, sinteza mPEG-O-2-metilpropionaldehida je skicirana u Shemi II.
Tretira se mPEG-OH, molekulske težine 20.000 Da (mPEG-OH 20 kDa; 2,0 g, 0,1 mmol, Sunibo) sa NaH (12 mg, 0,5 mmol) u THF (35 ml_). Zatim se u ovu smešu doda 50 ekvivalenata 3-bromo-2-metilpropena (3,34 g, 5 mmol) i katalitička količina Kl. Dobijena smeša se 16 h mesa pod refluksom. Zatim se doda voda (1 ml_), a rastvarao ukloni pod vakuumom. U ostatak se doda CH2CI2(25 ml_), pa odvoji organski sloj, osuši iznad anhidrovanog natrijum-sulfata, a zapremina se smanji na približno 2 ml_. Ovaj CH2Cl2-ski rastvor se u kapima dodaje u etar (150 mL). Sakupi se dobijeni beli talog, dajući 1,9 g jedinjenja 1.
1H NMR(CDCI3, 400 MHz) opaženo S: 4,98 (s, 1H), 4,91 (s, 1H), 1,74 (s, 3H).
Doda se jedinjenju 1 (1,9 g, 0,1 mmol) u THF (20 mL) i CH2CI2(2 mL), na 0°C, BH3u THF (1,0 M, 3,5 mL). Ova smeša se 1 h meša u kupatilu sa ledom. Ovoj smeši lagano se dodaje NaOH (2,0 M, 2,5 mL), a zatim 30% H202(0,8 mL). Reakcija se zagreje na sobnu temperaturu i meša 16 h. Sledi se gornja procedura obrade (CH2CI2, taloženje iz etra), dajući 1,8 g 2, kao belu čvrstu supstancu
<1>H NMR (CDCI3, 400 MHz) opaženo 5 1,80 (m, 1H), 0,84 (d, 3H).
Jedinjenje 2 (250 mg) se rastvori u CH2CI2(2,5 mL), pa se doda Dess-Martin-ov perjodinat (DMP, 15 mg), i 30 min meša na sobnoj temperaturi. U ovu smešu se doda zasićeni NaHC03i Na2S203(2 mL), pa se smeša 1 h meša na sobnoj temperaturi. Sledi se gornja procedura obrade, dajući 3 (mPEG-O-2-metilpropionaldehid, 120 mg) kao belu čvrstu supstancu.
<1>H NMR(CDCI3, 400 MHz) opaženo 5 9,75 (s, 1H), 2,69 (m, 1H), 1,16 (d, 3H).
Slična procedura se sledi za aromatične alkohole, kao Što pokazuje Shema III.
Obično, reaguje aromatični alkohol (E) sa alkilhalidom (A), formirajući monoetar (F). Preostala alkoholna grupa u jedinjenju F se zatim konvertuje u halid (npr. bromid) u Jedinjenju G, koje reaguje sa polialkilenglikolom (P-OH), dajući etar (H). Ovo jedinjenje se zatim konvertuje u aldehid (J), preko hidroborovanja u primami alkohol (I), posle čega sledi oksidacija. U ovim jedinjenjima, n predstavlja ceo broj od nula do pet, d je nula ili ceo broj od jedan do četiri, a Z je zasićena ili nezasićena C1-C20alkil ili heteroalkil grupa ravnog ili račvastog lanca. Z može takođe da bude zasićeni ili nezasićeni C3-C7ciklični alkil ili ciklični heteroalkil, supstituisana ili nesupstituisana aril ili heteroari grupa, ili supstituisana ili nesupstituisana alkaril (alkil je zasićeni ili nezasićeni CVC20 alkil) ili heteroalkaril grupa. Za supstituisana jedinjenja supstituenti mogu biti halogen, hidroksil, karbonil, karboksilat, estar, formil, acil, tiokarbonil, tioestar, tioacetat, tioformijat, alkoksil, fosforil, fosfonat, fosfinat, amino, amido, amidin, imin, cijano, nitro, azido, sulfhidril, sutfat, sutfonat, sulfamoil, sulfonamido, sulfonil, heterociklil, aralkil, aromatični ostatak, heteroaromatični ostatak, imino, silil, etar ili alkiltio. Pored toga, Tii T2su, nezavisno, odsutni ili zasićena ili nezasićena C1-C20alkil ili heteroalkil grupa ravnog ili račvastog lanca, a mogu biti jedan u odnosu na drugi u orto, meta ili para položaju. Svaki L (ukoliko je prisutan) je nezavisno, zasićena ili nezasićena C1-C20alkil ili heteroalkil grupa ravnog ili račvastog lanca, zasićeni ili nezasićeni C3-C7ciklični alkil ili ciklični heteroalkil, supstituisana ili nesupstituisana aril ili heteroari grupa, ili supstituisani ili nesupstituisani alkaril, gde je alkil zasićeni ili nezasićeni C1-C20alkil, ili heteroalkaril grupa. Za supstituisana jedinjenja supstituenti mogu biti halogen, hidroksil, karbonil, karboksilat, estar, formil, acil, tiokarbonil, tioestar, tioacetat, tioformijat, alkoksil, fosforil, fosfonat, fosfinat, amino, amido, amidin, imin, cijano, nitro, azido, sulfhidril, sulfat, sulfonat, sulfamoil, sulfonamido, sulfonil, heterociklil, aralkil, aromatični ostatak, heteroaromatični ostatak, imino, silil, etar ili alkiltio.
Obično P-OH je polietilenglikol (PEG) ili monometoksipolietilenglikol (mPEG), koji ima molekulsku težinu 5.000 do 40.000 Da.
Na primer, sinteza mPEG-O-jD-metilfenil-O-2-metilpropionaldehida (8), pokazana je u Shemi IV:
U rastvor 4-hidroksibenzilalkohola (2,4 g, 20 mmol) u THF (50 mL) i vodi (2,5 mL), prvo se doda natrijum-hidroksid (1,5 g, 37,5 mmol), a zatim 3-bromo-2-metilpropen (4,1 g, 30 mmol). Ova reakciona smeša se 16 h zagreva pod refluksom. U smešu se doda 10% limunska kiselina (2,5 mL), pa se rastvarač ukloni pod vakuumom. Ostatak se ekstrahuje etilacetatom (3*15 mL), a kombinovani organski slojevi se operu zasićenim NaCI (10 mL), osuše i koncentrišu, dajući jedinjenje 4 (3,3 g, 93%).
<1>H NMR (CDCb, 400 MHz) opaženo 5 7,29 (m, 2H), 6,92 (m, 2H) 5,14 (s, 1H), 5,01 (s, 1H), 4,56 (s, 2H), 4,46 (s, 2H), 1,85 (s, 3H).
Dodaju se mezilhlorid (MsCI, 2,5 g, 15,7 mmol) i trietilamin (TEA, 2,8 mL, 20 mmol) u rastvor jedinjenja 4 (2,0 g, 11,2 mmol) u CH2CI2(25 mL), na 0°C, pa se reakcija drži u frižideru 16 h. Uobičajena obrada daje svetložuto ulje (2,5 g, 87%).<1>H NMR (CDCb, 400 MHz) opaženo 8 7,31 (m, 2H), 6,94 (m, 2H), 5,16 (s, 1H), 5,01 (s, 1H), 5,03 (s, 2H), 4,59 (s, 2H), 4,44 (s, 2H), 3,67 (s, 3H), 1,85 (s, 3H). Ovo ulje (2,4 g, 9,4 mmol) se rastvori u THF (20 mL), pa se doda LiBr (2,0 g, 23,0 mmol). Reakciona smeša se 1 h zagreva pod refluksom, pa se ohladi na sobnu teperaturu. U smešu se doda voda (2,5 mL), a rastvarač ukloni pod vakuumom. Ostatak se ekstrahuje etilacetatom (3*15 mL), a sjedinjeni organski slojevi operu zasićenim NaCI (10 mL), osuše iznad anhidrovanog Na2S04i koncentrišu, dajući željeni bromid 5 (2,3 g, 96%), kao svetložuto ulje.
<1>H NMR (CDCb, 400 MHz) opaženo 5 7,29 (m, 2H), 6,88 (m, 2H), 5,11 (s, 1H), 4,98 (s, 1H), 4,53 (s, 2H), 4,44 (s, 2H), 1,83 (s, 3H).
Tretira se m-PEG-OH 20 kDa (2,0 g, 0,1 mmol, Sunbio) sa NaH (12 mg, 0,5 mmol) u THF (35 mL), pa se u smešu doda jedinjenje 5 (0,55 g, 22,8 mmol) i katalitička količina Kl. Dobijena smeša se 16 h zagreva pod refluksom. U smešu se doda voda (0,1 mL), pa se rastvarač ukloni pod vakuumom. U ostatak se doda CH2CI2(25 mL), pa se odvoji organski sloj, osuši iznad anhidrovanog Na2S04, a zapremina smanji na približno 2 mL. Ukapavanje etarskog rastvora
(150 mL) vodi stvaranju belog taloga koji se sakupi, dajući 6 (1,5 g), kao beli prah.
<1>H NMR (CDCb, 400 MHz) opaženo 5 7,21 (d, 2H), 6,90 (d, 2H), 5,01 (s, 1H), 4,99 (S, 1H), 4,54 (s, 2H), 4,43 (s, 2H), 1,84 (s, 3H).
U rastvor jedinjenja 6 (1,0 g, 0,05 mmol) u THF (10 mL) i CH2CI2(2 mL), ohlađen na 0<o>C, doda se BH3/THF (1,0 M; 3,5 mL), pa se reakcija meša 1 h. Lagano se dodaje 2,0 M rastvor NaOH (2,5 mL), a zatim 30% H202(0,8 mL). Reakciona smeša se ostavi da se zagreje na sobnu temperaturu, pa se meša 16 h. Sledi se gornja procedura obrade (CH2CI2, taloženje iz etra), dajući 7 (350 mg), kao belu čvrstu supstancu.<1>H NMR (CDCb, 400 MHz) opaženo 5 7,21 (d, 2H), 6,84 (d, 2H), 4,54 (s, 2H), 2,90 (m, 2H), 1,96 (d, 3H).
Jedinjenje 7 (150 mg, 0,0075 mmol) se rastvori u CH2CI2(1,5 mL), pa se doda DMP (15 mg), a reakciona smeša se 1,5 h meša na sobnoj temperaturi.<1>H NMR (CDCb, 400 MHz) opaženo 8 9,76 (s, 1H), 7,21 (d, 2H), 6,78 (d, 2H), 4,44 (s, 2H), 4,14 (m, 2H), 2,85 (m, 1H), 1,21 (d, 3H). U smešu se doda zasićeni NaHC03(0,5 mL) i Na2S203(0,5 mL), pa se nastavi još 1 h sa mešanjem na sobnoj temperaturi. Sledi se gornja procedura obrade (rastvaranje u CH2CI2, taloženje iz etra), dajući 8 (92 mg) kao belu čvrstu supstancu.
Slično se sintetizuje mPEG-O-m-metilfenil-O-2-metilpropionaldehid (9), kao što je skicirano u Shemi V.
U rastvor 3-hidroksibenzilalkohola (2,4 g, 20 mmol) u THF (50 mL) i vodi (2,5 mL) prvo se doda natrijum-hidroksid (1,5 g, 37,5 mmol), a zatim 3-bromo-2-metilpropen (4,1 g, 30 mmol). Reakciona smeša se 16 h zagreva pod refluksom U smešu se doda 10% limunska kiselina (2,5 mL), pa se rastvarač ukloni pod vakuumom. Ostatak se ekstrahuje etilacetatom (3x15mL), a sjedinjeni organski slojevi se operu zasićenim NaCI (10 mL), osuše i koncentrišu, dajući jedinjenje 10 (3,2 g, 90%).<1>H NMR (CDCb, 400 MHz) opaženo 5 7,26 (m, 1H), 6,94 (m, 2H), 6,86 (m, 1H), 5,11 (s, 1H), 5,01 (s, 1H), 4,61 (S, 1H), 4,44 (s, 2H), 1,82 (s, 3H).
Doda se MsCI (2,5 g, 15,7 mmol) i TEA (2,8 mL, 20 mmol) u rastvor jedinjenja 10 (2,0 g, 11,2 mmol) u CH2CI2(25 mL), na 0°C, pa se reakcija drži u frižideru 16 h. Uobičajena obrada daje svetložuto ulje (2,5 g, 87%).<1>H NMR (CDCb, 400 MHz) opaženo 5 7,31 (m, 1H), 7,05 (m, 2H), 6,91 (m, 1H), 5,16 (s, 1H), 5,04 (s, 1H), 4,59 (s, 1H), 4,46 (s, 2H), 3,71 (s, 3H), 1,84 (s, 3H). Ovo ulje (2,4 g, 9,4 mmol) se rastvori u THF (20 mL), pa se doda LiBr (2,0 g, 23,0 mmol). Reakciona smeša se 1 h zagreva pod refluksom, a zatim ohladi na sobnu temperaturu. U smešu se doda voda (2,5 mL), pa se rastvarač ukloni pod vakuumom. Ostatak se ekstrahuje etilacetatom (3x15 mL), a sjedinjeni organski slojevi operu zasićenim NaCI (10 mL), osuše iznad anhidrovanog Na2S04i koncentrišu, dajući željeni bromid 11 (2,2 g, 92%), kao svetložuto ulje.<1>H NMR (CDCb, 400 MHz) opaženo 5 7,29 (m, 1H), 6,98 (m, 2H), 6,85 (m, 1H), 5,14 (s, 2H), 4,98 (s, 2H), 4,50 (s, 2H), 4,44 (s, 2H), 1,82 (d, 3H).
Tretira se m-PEG-OH 20 kDa (2,0 g, 0,1 mmol, Sunbio) sa NaH (12 mg, 0,5 mmol) u THF (35 mL), pa se u smešu doda jedinjenje 11 (0,55 g, 22,8 mmol) i katalitička količina Kl. Dobijena smeša se 16 h zagreva pod refluksom. U smešu se doda voda (1,0 mL), pa se rastvarač ukloni pod vakuumom. U ostatak se doda CH2CI2(25 mL), pa se odvoji organski sloj, osuši iznad anhidrovanog Na2S04, a zapremina smanji na približno 2 mL. Ukapavanje etarskog rastvora (150 mL) vodi stvaranju belog taloga koji se sakupi, dajući 12 (1,8 g), kao beli prah.<1>H NMR (CDCb, 400 MHz) opaženo 6 7,19 (m, 1H), 6,88 (m, 2H), 6,75 (m, 1H), 4,44 (s, 2H), 4,54 (s, 2H), 4,10 (m, 2H), 1,82 (d, 3H).
U rastvor jedinjenja 12 (1,0 g, 0,05 mmol) u THF (7,5 mL) i CH2CI2(2,5 mL), ohlađen na 0°C, doda se BH3/THF (1,0 M; 3,5 mL), pa se reakcija meša 1 h. Lagano se dodaje 2,0 M rastvor NaOH (3 mL), a zatim 30% H202(0,85 mL). Reakciona smeša se ostavi da se zagreje na sobnu temperaturu, pa se meša 16 h. Sledi se gornja procedura obrade (CH2CI2, taloženje iz etra), dajući 13 (450 mg), kao belu čvrstu supstancu.<1>H NMR (CDCb, 400 MHz) opaženo 8 7,15 (m, 1H), 6,84 (m, 2H), 6,69 (m, 1H), 4,50 (s, 2H), 2,90 (m, 2H), 1,95 (d, 3H). Jdinjenje 13 (200 mg, 0,01 mmol) se rastvori u CH2CI2(1,5 mL), pa se doda DMP (20 mg), a reakciona smeša se 1 h meša na sobnoj temperaturi.<1>H NMR (CDCb, 400 MHz) opaženo 6 9,74 (s, 1H), 7,17 (m, 1H), 6,86 (m, 2H), 6,74 (m, 1H), 4,48 (s, 2H), 4,15 (m, 2H), 2,78 (m, 1H), 1,22 (d, 3H). U ovu smešu se doda zasićeni NaHC03(0,5 mL) i Na2S203(0,5 mL), pa se nastavi još 1 h sa mešanjem na sobnoj temperaturi. Sledi se gornja procedura obrade (rastvaranje u CH2Cl2, taloženje iz etra), dajući 9 (142 mg) kao belu čvrstu supstancu.
B ) Genehsanie reakcijom sa aromatičnim alkoholima
Aktivirani polialkilenglikoli se sintetizuju Mitsunobu-ovom reakcijom između polialkilenglikola, koji ima na slobodnom kraju hidroksilnu funkcionalnost, i aromatičnog alohola. Reakciona shema je skicirana u Shemi VI.
Polialkilenglikol (P-OH) reaguje sa alkoholom (K), formirajući etar (L). U ovim jedinjenjima m je nula ili jedan, d je nula ili ceo broj od jedan do četiri, i n je nula ili ceo broj od jedan do pet. Y je 0, S; CO, C02, COS, SO, S02, CONR', S02NR' i NR'. Tii T2su, nezavisno, adsutni ili su zasićena ili nezasićena CrC^ alkil ili heteroalkil grupa ravnog ili račvastog lanca. R' i Z su, nezavisno, vodonik, zasićena ili nezasićena C1-C20alkil ili heteroalkil grupa ravnog ili račvastog lanca. Svaki L (ukoliko je prisutan), nezavisno, je zasićena ili nezasićena C1-C20alkil ili heteroalkil grupa ravnog ili račvastog lanca, zasićeni ili nezasićeni C3-C7ciklični alkil ili ciklični heteroalkil, supstituisana ili nesupstituisana aril ili heteroari grupa, ili supstituisani ili nesupstituisani alkaril. Alkil je zasićena ili nezasićena C1-C20alkil ili heteroalkaril grupa, a supstituenti mogu biti halogen, hidroksil, karbonil, karboksilat, estar, formil, acil, tiokarbonil, tioestar, tioacetat, tioformijat, alkoksil, fosforil, fosfonat, fosfinat, amino, amido, amidin, imin, cijano, nitro, azido, sulfhidril, sulfat, sulfonat, sulfamoil, sutfonamido, sulfonil, heterociklil, aralkil, aromatični ostatak, heteroaromatični ostatak, imino, silil, etar ili alkiltio.
P je polimer polialkilenglikola. Obično, P-OH je polialkilenglikol (PEG) ili monometoksipolialkilenglikol (mPEG), koji ima molekulsku težinu 5.000 do 40.000 Da.
Na primer sinteza mPEG-O-p-fenilacetaldehida (16) je skicirana u Shemi VII.
Sintetizuje se 4-hidroksifenilacetaldehid (15) kao što je opisano uHetenocycle$,2000, 53, 777-784. Rastvori se 4-hidroksifenetilalkohol (Jedinjenje 14, 1,0 g, 7,3 mmol, Aldrich) u dimetilsulfoksidu (8 mL, Aldrich). Uz mešanje, lagano se dodaje TEA (2,2 mL, 16 mmol, Aldrich), Potpuno se rastvori kompleks piridin/sumpor-trioksid (S03py) (2,5 g, 16 mmol, Aldrich) u dimetilsulfoksidu (9 mL, Aldrich), pa se ovaj rastvor u kapima dodaje u alkohol, uz snažno mešanje. Posle 1 h mešanja na sobnoj temperaturi, reakcija se razblaži sa CH2CI2, a zatim opere vodom ohlađenom u ledu. Osuši se organski sloj iznad Na2S04, filtrira i koncentriše do suva. Prečišćavanje koristi hromatografiju na silikagelu, sa heksan-etilacetatom kao eluentom (5:1, a zatim 2:1), dajući 488 mg (49%) 4-hidroksifenilacetaldehida (15).
Azeotropiraju se četiri puta sa toluenom mPEG-OH 20 kDa (101 mg, 0,005 mmol) i 4-hidroksifenilacetaldehid (15) (39 mg, 0,29 mmol), a zatim razmute u anhidrovanom CH2CI2(2 mL, Aldrich). Ovom rastvoru se doda trifeniffosfin (PPh3, 66 mg, 0,25 mmol, Aldrich), a zatim, uz mešanje, diizopropilazodikarboksilat (DIAD, 49 uL, 0,25 mmol, Aldrich). Posle 3 dana mešanja na sobnoj temperaturi, reakciona smeša se u kapima dodaje, uz snažno mešanje, dietiletru. Nastali talog se izoluje filtriranjem, pa tri puta opere dietiletrom. Sirovi materijal se razmuti u CH2CI2i opere vodom. Organski sloj se osuši iznad Na2S04, filtrira i koncentriše do suva. Ovaj materijal se razmuti u minimumu CH2CI2, a zatim, uz mešanje, istaloži ukapavanjem dietiletra. Ovaj materijal se sakupi filtriranjem opere tri puta dietiletrom i osuši, dajući 63 mg (62%) mPEG-O-p-fenilacetaldehida (16).
Sinteza mPEG-O-p-fenilpropionaldehida (17) se obavlja na sličan način.
Analogno 4-hidroksrfenilacetaldehidu( Heterocycles,2000, 53, 777-784) sintetizuje se 4-hidroksifenilpropionaldehid. Rastvori se 3-(4-hidroksifenil)-1-propanol (1,0 g, 6,6 mmol, Aldrich) u dimetilsulfoksidu (8 mL, Aldrich). Uz mešanje, lagano se dodaje TEA (2,0 mL, 14 mmol, Aldrich). Potpuno se rastvori kompleks piridin/sumpor-trioksid (SO-py) (2,3 g, 15 mmol, Aldrich) u dimetilsulfoksidu (9 mL, Aldrich), pa se ovaj rastvor u kapima dodaje u alkohol, uz snažno mešanje. Posle 1 h mešanja na sobnoj temperaturi, reakcija se razblaži sa CH2CI2, a zatim opere vodom ohlađenom u ledu. Organski sloj se osuši iznad Na2S04, filtrira i koncentriše do suva. Prečišćavanje, koristeći gel hromatografiju, sa heksan-etilacetatom kao eluentom (5:1, a zatim 2:1), daje 745 mg (75%) 4-hiđroksrfenilpropionaldehida.
Azeotropiraju se četiri puta sa toluenom mPEG-OH 20 kDa (100 mg, 0,005 mmol) i 4-hidroksifenilpropionaldehid (40 mg, 0,27 mmol), a zatim razmute u anhidrovanom ChfeCb (2 mL, Aldrich). Ovom rastvoru se uz mešanje dodaju trifenilfosfin (66 mg, 0,25 mmol, Aldrich), a zatim diizopropilazodikarboksilat (49 uL, 0,25 mmol, Aldrich). Posle 3 dana mešanja na sobnoj temperaturi, reakciona smeša se ukapava, uz snažno mešanje, u dietiletar. Nastali talog se izoluje filtriranjem, pa tri puta opere dietiletrom. Sirovi materijal se razmuti u CH2Cb i opere vodom. Organski sloj se osuši iznad Na2S04, filtrira i koncentriše do suva. Ovaj materijal se razmuti u minimumu CH2CI2, a zatim taloži ukapavanjem dietiletra, uz mešanje. Ovaj materijal se sakupi filtriranjem, tri puta opere dietietrom i suši, dajući 60 mg (60%) mPEG-O-p-fenilpropionladehida (17).
Na ovaj način se dobija takođe mPEGO-m-fenilacetaldehid (18).
Analogno 4-hidroksrfenilacetaldehidu( Heterocycles,2000 53, 777-784), dobija se 3-hidroksifenilacetaldehid. Rastvori se 3-hidroksifenetil alkohol (1,0 g, 7,5 mmol, Aldrich) u dimetilsulfoksidu (8 mL, Aldrich). Uz mešanje, lagano se dodaje TEA (2,0 mL, 14 mmol, Aldrich). Poptuno se rastvori kompleks piridin/sumpor-trioksid (SO3 py) (2,4 g, 15 mmol, Aldrich) u dimetilsulfoksidu (8 mL, Aldrich), pa se ovaj rastvor u kapima dodaje alkoholu, uz snažno mešanje. Posle 1 h mešanja na sobnoj temperaturi, reakcija se tretira vodom ohlađenom u ledu, pa ekstrahuje sa CH2CI2. Organski sloj se osuši iznad Na2S04, filtrira i koncentriše do suva. Prečišćavanje je hromatografijom na silikagelu, sa heksan-etilacetatom kao eluentom (3:1, pa 1:1), dajući 225 mg (22%) 3-hidroksrfenilacetaldehida.
Azeotropiraju se četiri puta sa toluenom mPEG-OH 20 kDa (307 mg, 0,015 mmol) i 3-hidroksifenilacetaldehid (117 mg, 0,86 mmol), a zatim razmute u anhidrovanom CH2CI2(5 mL, Aldrich). Ovom rastvoru se uz mešanje dodaju trifenilfosfin (200 mg, 0,76 mmol, Aldrich), a zatim diizopropilazodikarboksilat (147 uL, 0,75 mmol, Aldrich). Posle 3 dana mešanja na sobnoj temperaturi, reakciona smeša se ukapava, uz snažno mešanje, u dietiletar. Nastali talog se izoluje filtriranjem, pa tri puta opere dietiletrom i suši, dajući 284 mg (93%) mPEG-O-m-fenilacetadehida (18).
Hiralna jedinjenja PEG-cinamat-N-hidroksi-sukcinamida (NHS) se generišu, na primer, kao što je pokazano u Shemama VIII i IX:
Jedinjenja PEG-dihidrourokanat-NHS takođe su generisana, preko Mitsunobu-ove reakcije, kao što je pokazano u Shemi X:
Jedinjenja PEG-dihidrocinamat-NHS su takođe generisana, iz aromatičnog alkohola, kao što je pokazano u Shemi XI:
Generisani su PEG-benzofurani i PEG-indoli, kao što pokazuju Sheme XII i XIII:
C ) Genehsanie reakcijom PEG - amina
Reaguju PEG-amini sa alkilhalidima, generišući PEG-amide. Primer generisanja PEG-amid-biciklooktan-NHS konjugata je pokazan u Shemi XIV:
Konjuguje se PEG-primami amin sa arilhalidom, formirajua konjugat PEG-sekundami amin, koji zatim reaguje pod Heck-ovim uslovima (stereospecifično kuplovanje, katalizovano paladijumom, alkena sa organskim halidima ili triflatima, koji nemaju sp<3>hibridizovane p-vodonike) sa NHS-alkenom, formirajući željeni PEG-konjugat. Sinteza konjugata koji sadrži pirimidin, je pokazana u Shemi XV:
Na ovaj način su sintetizovani takođe konjugati PEG-suffonamid, kao što je pokazano u Shemi XVI:
D ) Jedinienia<g>enerisana reakcijom sa heterociklima
PEG jedinjenja reaguju sa azotima heterocikla, koji su u prstenu ili koji nisu u prstenu, formirajući reaktivne vrste PEG. Reprezentativne reakcije su pokazane u Shemama XVII za aminopirolidin, i u XVIII za razne piperazine:
Primer 2
Pobijanje peptidnih koniugata
Peptidni konjugati, u skladu sa ovim opisom, mogu se dobiti reagovanjem proteina sa aktiviranim molekulom PEG. Na primer, interferon (IFN) može da reaguje sa PEG-aldehidom, u prisustvu rdukcionog sredstva (npr. natrijum-cijanoborohidrida), pomoću redukcionog alkilovanja, dajući preko aminske veze konjugat PEG-protein. Videti npr. European Patent 0154316 BI.
Humani IFN-p-1a se PEG-iluje sa sledećim aktiviranim polialkilengikolima iz ovog opisa: 20kDa mPEG-O-2-metilpropionaldehidom, 20 kDa mPEG-O-p-metilfenil-O-2-metilpropionaldehidom, 20 kDa mPEG-O-m-metilfenil-O-2-metilpropionaldehidom, 20 kDa mPEG-O-p-fenilacetaldehidom, 20 kDa mPEG-O-p-fenilpropionaldehidom i 20 kDa mPEG-O-m-fenilacetaldehidom. PEG-ilovani proteini se pročišćavaju do homogenosti iz njihovih respektivnih reakcionih smeša, pa se podvrgavaju nizu testova karakterizacije, da se utvrdi njihov identitet, čistoća i moć modifikovanih proteina.
sa 20kDa mPEG-O-2-metilpropionaldehidom, sa 20 kDa mPEG-O-m-metilfenil-O-2-metilpropionaldehidom i sa 20 kDa mPEG-O-p-fenilacetaldehidom.
A ) Pobijanje i karakterizaciia 20 kDa mPEG - O - 2 - metilDfVDionaldehid -
modlfikovanoa IFN - B - 1a
Humani IFN-p-1 se PEG-iluje na njegovom N-kraju sa 20 kDa mPEG-O-2-metilpropionaldehidom. Proizvod hernije redukcionog alkilovanja se koristi da se ugradi PEG u skelet IFN-p-1 a, što za rezultat daje stvaranje aminske veze koja je krajnje stabilna protiv razgradnje. Ovaj PEG-ilovani IFN-p-1 a se podvrgne ekstenzivno] karakterizaciji, uključujući analizu SDS-PAGE, hromatografiju sa isključivanjem po veličini (SEC), dobijanje mape peptida i ocenu aktivnosti u antivirusnom testuin vitro.Čistoća proizvoda, merena pmoću SDS-PAGE i SEC je veća od 90%. U PEG-ilovanom uzorku nema podataka o agregatima. Zaostali nivo nemodifikovanog IFN-p-1 a u proizvodu bio je ispod granice kvantitativnog određivanja, i smatra se da predstavlja oko 1% proizvoda. Specifična aktivnost PEG-ilovanog IFN-p-1 a u testu anti-virusne aktivnosti je približno dva puta umanjena, u odnosu na nemodifikovani IFN-p-1 a (EC50= 32 pg/mL za 20 kDa mPEG-O-2-metilproionaldehid-modifikovani IFN-p-1a, u odnosu na EC50= 14 pg/mL za nemodifikovani IFN-p-1 a). Masa PEG-ilovanog IFN-p-1 a se formuliše sa 40 ug/mL u slanom fosfatnom puferu (PBS) sa pH 7,3, koji sadrži 14 mg/ml seruma humanog albumina (HSA), slično formulaciji koja se koristi za AVONEX<®>
(Biogen, Cambridge, MA), koji je podvrgnut ekstenzivnoj karakterizaciji. Materijal se isporučuje kao smrznuta tečnost, koja se čuva na -70°C.
Svojstva 20 kDa mPEG-O-2-metilpropionaldehid-modifikovanog IFN-p-1 a su sabrana u Tabeli 1:
1. Dobijanje 20 kDa mPEG- O- 2- metilpropionaldehid- modifiokvanog IFN- fi- 1a
Razblaži se 10 mL neformulisanog AVONEX<®->a (masa IFN-p-1 a intermedijara, masa kliničke šarže leka je prošla sve testove za upotrebu humanih bića, sa 250 ug/mL u 100 mM natrijum-fosfatu, pH 7,2, i 200 mM NaCI) sa 12 mL 165 mM MES, pH 5,0, i 50 uL 5 M HCI. Ovaj uzorak se prebaci u kolonu od 300 uL SP-Sepharose FF (Pharmacia). Kolona se opere sa 3*300 uL 5 mM natrijum-fosfata, sa pH 5,5 i 75 mM NaCI, pa se protein eluira sa 5 mM natrijum-fosfataom, pH 5,5 i 600 mM NaCI. Analiziraju se frakcije od eluiranja, preko njihove absorbancije na 280 nm, pa se ocenjuje koncentracija lFN-p-lau uzorcima, korišćenjem vrednosti 1,51 za koeficijent ekstinkcije, u rastvoru od 1 mg/mL. Sakupe se frakcije pika, dajući IFN-p-1 a koncentracije 3,66 mg/mL, koje se zatim razblaže vodom na 1,2 mg/mL.
U 0,8 mL IFH-p-1a, iz sjedinjenog razblaženog eluata SP-Sepharose, dodaje se 0,5 M natrijum-fosfat, pH 6,0 do 50 mM, natrijum-cijanoborohidrid (Aldrich) se dodaje do 5 mM, a 20 kDa mPEG-O-2-metilpropionaldehid se dodaje do 5 mg/mL. Uzorak se inkubira 16 h na sobnoj temperaturi, u mraku. PEG-ilovani IFN-p-1 a se prečišćava iz ove reakcione smeše na koloni od 0,5 mL SP-Sepharose FF, kao što sledi: razblaži se 0,6 mL reakcione smeše sa 2,4 mL 20 mM MES, pH 5,0, pa se prebaci u kolonu SP-Sepharose. Ova kolona se pere sa natrijum-fosfatom, pH 5,5, 75 mM NaCI, a zatim se PEG-ilovani IFN-p-1 a eluira iz kolone sa 25 mM MES, pH 6,4 i 400 mM NaCI. PEG-ilovani IFN-p-1 a se dalje prečišćava na koloni Superose 6 HR 10/30 FPLC sizing, sa 5 mM natrijum-fosfatom, pH 5,5 i 150 mM NaCI, kao mobilnom fazom. Ova kolona za razdvajanje po veličini (25 mL) se ispire sa 20 mL/h, a sakupljaju se frakcije od 0,5 mL. Frakcije od eluiranja se analiziraju na sadržaj proteina, preko absorbancije na 280 nm, pa se sakupe i odredi koncentracija proteina u sakupljenom eluatu. Koncentracija PEG-ilovanog IFN-p-1 a se daje u ekvivalentima IFN, zato što ostatak PEG ne doprinosi absorbaciji na 280 nm. Uzmu se uzorci sakupljenog eluata radi analize, a ostatak se razblaži na 30 ug/mL sa puferom za formulisanje koji sadrži HSA, i podeli u alikvote od 0,25 mL/fiola, koji se čuvaju na -70°C.
2. UV spektar prečišćenog
20 kDa mPEG- O- 2- metilpropionaldehid- modifikovanog IFN- fi- 1a
UV spektar (240-340 nm) 20 kDa mPEG-O-2-metilpropionaldehid-modrfikovanog IFN-p-1 a dobije se korišćenjem uzorka mase, koja je prethodno formulisana sa HSA. PEG-ilovani uzorak pokazuje maksimum absorpcije na 278-279 nm, a minimum absorpcije na 249-250 nm, što je saglasno sa istim za masu nemodifikovanog intermedijara IFN-p-1 a. Koncentracija proteina u PEG-ilovanom proizvodu je ocenjivana iz spektra, koristeći za koeficijent ekstinkcije vrednost£28o<0>,<1%>= 1,51. Koncentracija proteina PEG-ilovane mase je 0,23 mg/mL. Nije opaženo zamućenje u uzorku, jer nedostaje absorbancija na 320 nm.
3. Karakterizacija 20 kDa mPEG- O- 2- metilpropionaldehid- modiftkovanog
IFN- p- 1 a pomoću SDS- PAGE
Podvrgne se 4 pg nemodifikovanog i 20 kDa mPEG-O-2-metilproiponaldehid-modifikovani IFN-p-1 a analizi SDS-PAGE, pod redukcionim uslovima, sa 10-20% gradijentom gela. Gel je obojen sa Coomassie-vim brilijant plavim R-250, i pokazan je na Slici 1 (red A, markeri molekulske težine (odozgo na dole: 100 kDa, 68 kDa, 45 kDa, 27 kDa i 18 kDa, respektivno); Red B je nemodifikovani IFN-p-1 a; Red C je 20 kDa mPEG-O-2-metilpropionaldehid-modifikovani IFN-p-1a). SDS-PAGE analiza 20 kDa mPEG-O-2-metilpropionaldehid-modrfikovanog IFN-p-1aje otkrila jednu glavnu traku, prividne mase 55 kDa, stoje saglasno sa modifikacijom sa jednim PEG. Nisu detektovani oblici više mase, koji bi poticali od prisustva dodatnih PEG grupa. U prečišćenom PEG-ilovanom proizvodu otkriven je nemodifikovani IFN-p-1 a; međutim, količina je ispod granice kvantitativnog određivanja. Sadržaj nemodifikovanog IFN-p-1 a u preparatu je procenjen da iznosi samo oko 1% od ukupnog proteina.
4. Karakterizacija 20 kDa mPEG- O- 2- metilpropionaldehid- modifikovanog
\ FN- p- 1a pomoću hromatografije sa isključivanjem po veličini ( SEC)
Nemodifikovani i 20 kDa mPEG-O-2-metilpropionaldehid-modifikovani IFN-p-1a su podvrgnuti SEC na analitičkoj koloni Superose 6 HR 10/30 FPLC sizing, koristeći PBS, pH 7,2, kao mobilnu fazu. Kolona se ispira sa 20 ml_/h, a eluat se prati preko absorbancije na 280 nm, kao što pokazuje Slika 2. Slika 2A: standardi molekulske težine (tiroglobulin od 670 kDa; gama-globulin od 158 kDa; ovalbumin od 44 kDa; mioglobin od 17 kDa; vitamin B12 od 1,3 kDa). Slika 2B: 20 kDa mPEG-O-2-metilpropionaldehid-modifikovani IFN-p-1 a; Slika 2C: nemodifikovani IFN-p-1 a. 20 kDa mPEG-O-2-metilpropionaldehid-modifikovani IFN-p-1 a se eluira kao jedan oštar pik, sa prividnom molekulskom težinom od približno 200 kDa, što je saglasno sa velikom hidrodinamičkom zapreminom PEG. Nije opaženo prisustvo agregata. Nemodifikovani IFN-p-1 a je detektovan, ali ispod granice kvantitativnog određivanja. Na bazi veličine pika, nemodifikovani IFN-p-1 a iznosi 1% ili manje od proizvoda, što je saglasno sa opažanjem pri korišćenju SDS-PAGE.
5. Analiza 20 kDa mPEG- O- 2- metilpropionaldehid- modifikovanog
IFN- p- 1 a pomoću mape peptida.
Specifičnost reakcije PEG-ilovanja je ocenjivana preko mape peptida. Nemodifikovani i 20 kDa mPEG-O-2-metilpropionaldehid-modifikovani IFN-p-1 a se razlažu endo protein azom Lys-C izAchromobacter- a(VVako Bioproducts), a dobijeni proizvodi cepanja se frakcionišu pomoću HPLC sa reversnom fazom, na koloni Vydac C4, koristeći 30 min gradijent od 0 do 70% acetonitrila u 0,1% TFA. Eluat iz kolone je praćen preko absorbancije na 214 nm.
Svi predviđeni peptidi iz lizata IFN-p-1 a pomoću endoproteinaze Lys-C, identifikovani su ranije pomoću sekvencioniranja N-kraja i masenom spektrometrijom (Pepinsky et al.,J. Pharmacology and Experimental Therapeutics,2001, 297. 1059), a od ovih, samo je peptid koji sadrži N-kraj IFN-p-1a promenjem modifikovanjem sa 20 kDa mPEG-O-2-metilpropionaldehidom; što je vidljivo preko njegovog nestanka iz mape peptida. Prema tome, podaci iz mape pokazuju da je PEG ostatak specifično spojen sa ovim peptidom. Ovi podaci još pokazuju da PEG modifikacija cilja na N-kraj proteina, zato što samo modifikacija N4<raja dovodi do specifičnog gubitka ovog peptida.
B ) Pobijan je i karakterizacija 20 kDa mPEG - O - m - metilfenii - O - 2 -
metilpropionaldehid - modifikovanoa IFN - 0 - 1a
Humani IFN-p-1 a je PEG-ilovan sa N-kraja, sa 20 kDa mPEG-O-m-metilfenil-O-2-metilproionaldehidom. Ovaj proizvod hernije redukcionog alkilovanja se koristi za ugrađivanje PEG u skelet IFN-p-1 a, što dovodi do stvaranja aminske veze, koja je krajnje stabilna prema razgradnji. PEG-ilovani IFN-p-1 a se podvrgne ekstenzivnoj karakterizaciji, uključujući analizu SDS-PAGE, SEC, mapu peptida i ocenu aktivnosti u anti-virusnom testuin vitro.Čistoća proizvoda, merena pomoću SDS-PAGE i SEC, bila je veća od 95%. U uzorku PEG-ilovanog IFN-p-1a nije bilo dokaza o agregatima. Zaostali sadržaji nemodifikovanog IFN-p-1 a u proizvodu bili su ispod granice kvantitativnog određivanja, ali smatra se da predstavljaju oko 1% od proizvoda. Specifična aktivnost PEG-lovanog lFN-p-la u testu anti-virusne aktivnosti je približno dvostruko smanjenja u odnosu na nemodifikovani IFN-p-1 (EC50= 31 pg/mL za 20 kDa mPEG-O-m-metilfenil-O-2-metilproionaldehid-modifikovani IFN-p-1 a, u odnosu na EC50= 14 pg/mL za nemodifikovani IFN-p-1 a). Masa PEG-ilovanog lFN-p-1a se formuliše sa 30 ug/mL u PBS, pH 7,2, koji sadrži 15 mg/mL HSA, slično formulaciji koja se koristi za AVONEX<®>, koji je bio podvrgnut ekstenzivnoj karakterizaciji. Materijal se isporučuje kao smrznuta tečnost, koja se čuva na -70°C.
Svojstva 20 kDa mPEG-O-m-metirfenil-O-2-metilproionaldehid-modifikovanog IFN-p-1 a su sabrana u Tabeli 2.
1. Dobijanje 20 kDa mPEG- O- m- metilfenil- O- 2- metilpropionaldehid-
modifikovanog IFN- p- 1 a
Razblaži se 80 mL neformulisanog AVONEX<®->a (IFN-p-1a masa intermedijara, masa kliničke šarže leka je prošla sve testove za upotrebu humanih bića, sa 254 ug/mL u 100 mM natrijum-fosfatu, pH 7,2, i 200 mM NaCI) sa 96 mL 165 mM MES, pH 5,0, i 400 uL 5 M HCI. Ovaj uzorak se prebaci u kolonu od 1,2 mL SP-Sepharose FF (Pharmacia). Ova kolona se opere sa 6,5 mL 5 mM natrijum-fosfata, sa pH 5,5 i 75 mM NaCI, pa se protein eluira sa 5 mM natrijum-fosfataom, pH 5,5 i 600 mM NaCI Analiziraju se frakcije od eluiranja, preko njihove absorbancije na 280 nm, pa se ocenjuje koncentracija IFN-p-1 a u uzorcima, korišćenjem vrednosti 1,51 za koeficijent ekstinkcije, u rastvoru od 1 mg/mL. Sakupe se frakcije pika, dajući koncentracije IFN-p-1 a od 4,4 mg/mL. U 2,36 mL sjedinjenog eluata iz SP-Sepharose sa 4,4 mg/mL IFN-p-1 a, dodaje se 0,5 M natrijum-fosfat, pH 6,0 do 50 mM, natrijum-cijanoborohidrid (Aldrich) se dodaje do 5 mM, a 20 kDa mPEG-O-m-metilfenil-O-2-metilpropionaldehid se dodaje do 10 mg/mL. Uzorak se inkubira 21 h na sobnoj temperaturi, u mraku. PEG-ilovani IFN-p-1 a se prečišćava iz ove reakcione smeše na koloni od 8,0 mL SP-Sepharose FF, kao što sledi: razblaži se 9,44 mL reakcione smeše sa 37,7 mL 20 mM MES, pH 5,0, pa se prebaci u kolonu SP-Sepharose. Ova kolona se pere sa natrijum-fosfatom, pH 5,5, 75 mM NaCI, a zatim se PEG-ilovani IFN-p-1 a eluira iz kolone sa 25 mM MES, pH 6,4 i 400 mM NaCI. PEG-ilovani IFN-p-1 a se dalje prečišćava na koloni Superose 6 HR 10/30 FPLC sizing, sa 5 mM natrijum-fosfatom, pH 5,5 i 150 mM NaCI, kao mobilnom fazom. Ova kolona za razdvajanje po veličini (25 mL) se ispire sa 24 mL/h, a sakupljaju se frakcije od 0,25 mL. Sjedinjene frakcije od eluiranja se analiziraju na sadržaj proteina, pomoću SDS-PAGE, pa se određuje koncentracija proteina u sjedinjenom eluatu. Koncentracija PEG-ilovanog IFN-p-1 a se daje u ekvivalentima IFN, posle podešavanja doprinosa PEG absorbanciji na 280 nm, koristeći za koeficijent ekstinckije 2, pri 1 mg/mL u rastvoru PEG-ilovanog IFN-p-1 a. Uzmu se uzorci sakupljenog eluata radi analize, a ostatak se razblaži na 30 pg/mL sa puferom za formulisanje koji sadrži HSA, podeli u alikvote od 0,25 mL/fiola, i čuva na -70°C.
2. UV spektar prečišćenog
20 kDa rnPEG- O- m- metilfenil- O- 2- metilpropionaldehid- modifikovanog \ FN- p- 1a
UV spektar (240-340 nm) 20 kDa mPEG-O-m-metirfenil-O-2-metilpropionaldehid-modifikovanog IFN-p-1 a dobije se korišćenjem uzorka mase koji je prethodno formulisan sa HSA. PEG-ilovani uzorak pokazuje maksimum absorpcije na 278-279 nm, a minimum absorpcije na 249-250 nm, što je saglasno sa istim za masu nemodifikovanog intermedijara IFN-p-1 a. Koncentracija proteina u PEG-ilovanom proizvodu je ocenjivana iz spektra, koristeći za koeficijent ekstinkcije vrednost £280°'1% = 2,0. Koncentracija proteina PEG-ilovane mase je 0,42 mg/mL. Nije opaženo zamućenje u uzorku, jer nedostaje absorbancija na 320 nm.
3. Karakterizacija 20 kDa mPEG- O- m- metilfenil- O- 2- metilpropionaldehid-
modifikovanog IFN- fi- 1a pomoću SDS- PAGE
Podvrgne se 2,1 ug 20 kDa mPEG-O-m-metilfenil-O-2-metilproiponaldehid-modifikovanog IFN-p-1 a analizi SDS-PAGE, pod redukcionim uslovima, sa 4-20% gradijentom gela. Gel je obojen sa Coomassie-vim brilijant plavim R-250. SDS-PAGE analiza 20 kDa mPEG-O-m-metitfenil-O-2-metilpropionaldehid-modifikovanog IFN-p-1 a je otkrila jednu glavnu traku, prividne mase 55 kDa, što je saglasno sa modifikacijom sa jednim PEG. U prečišćenom PEG-ilovanom proizvodu otkrivenje nemodifikovani IFN-p-1 a; međutim, količina je ispod granice kvantitativnog određivanja. Sadržaj nemodifikovanog IFN-p-1 a u preparatu je procenjen da iznosi samo oko 1% od ukupnog proteina.
4. Karakterizacija 20 kDa mPEG- O- m- metilfenil- O- 2- metilpropionaldehid-
modifikovanog lFN- p- 1a pomoću hromatografije sa
isključivanjem po veličini ( SEC)
Podvrgne se 20 kDa mPEG-O-m-metilfenil-O-2-metilpropionaldehid-modifikovanog IFN-p-1 a SEC na analitičkoj koloni Superose 6 HR 10/30 FPLC sizing, koristeći PBS, pH 7,2, kao mobilnu fazu. Kolona se ispire sa 24 mL/h, a eluat se prati preko absorbancije na 280 nm. PEG-ilovani IFN-p-1 a se eluira kao jedan oštar pik, bez dokaza o prisustvu agregata (Slika 3).
5. Analiza 20 kDa mPEG- O- m- metilfenil- O- 2- metilpropionaldehid- modifikovanog
lFN- p- 1a pomoću mape peptida.
Specifičnost reakcije PEG-ilovanja je ocenjivana preko mape peptida. Lizuje se 13,3 pg nemodifikoanog i 20 kDa mPEG-O-m-metilfenil-O-2-metilpropionaldehid-modifikovanog IFN-p-1 a sa 20 mas% endoproteinaze Lys-C izAchromobacter- a(Wako Bioproducts), u PBS koji sadrži 5 mM DTT, 1 mM EDTA, pri pH 7,6, na sobnoj temperaturi, u trajanju 30 h (krajnja zapremina = 100 pL). Zatim se dodaju 4 uL 2M DTT i 100 pL 8M uree, pa se uzorci 1 h inkubiraju na sobnoj temperaturi. Ovi peptidi se odvoje pomoću HPLC sa reversnom fazom, na koloni Vydac C18(214TP51), koristeći 70 min gradijent od 0 do 63% acetonitrila u 0,1% TFA Eluat iz kolone je praćen preko absorbancije na 214 nm.
Svi predviđeni peptidi iz lizata IFN-p-1 a pomoću endoproteinaze Lys-C, identifikovani su ranije pomoću sekvencioniranja N-kraja i masenom spektrometrijom (Pepinsky et al.,J. Pharmacology and Expehmental Therapeutics,2001, 297, 1059), a od ovih, samo je peptid koji sadrži N-kraj IFN-p-1 a promenjem modifikovanjem sa 20 kDa mPEG-O-m-metilfenil-O-2-metilpropionaldehidom; što je vidljivo preko njegovog nestanka iz mape peptida. Prema tome, podaci iz mape pokazuju da je PEG ostatak specifično spojen sa ovim peptidom.Ovi podaci još pokazuju da PEG modifikacija cilja na N-kraj proteina, zato što samo modifikacija N-kraja dovodi do specifičnog gubitka ovog peptida.
C ) Pobijanje i karakterizacija 20 kDa mPEG - O - p - fenilacetaldehid - modifikovanoa
IFN - Q - 1a
Humani IFN-p-1 a je PEG-ilovan sa N-kraja, sa 20 kDa mPEG-O-p-fenilacetaldehidom. Ovaj proizvod hernije redukcionog alkilovanja se koristi za ugrađivanje PEG u skelet IFN-p-1 a, što dovodi do stvaranja aminske veze, koja je krajnje stabilna prema razgradnji. PEG-ilovani IFN-p-1 a se podvrgne ekstenzivnoj karakterizaciji, uključujući analizu SDS-PAGE, SEC, mapu peptida i ocenu aktivnosti u antivirusnom testuin vitro.Čistoća proizvoda, merena pomoću SDS-PAGE i SEC, bila je veća od 95%. U uzorku PEGnlovanog IFN-p-1 a nije bilo dokaza o agregatima. Zaostali sadržaji nemodifikovanog IFN-p-1 a u proizvodu bili su ispod granice kvantitativnog određivanja, ali smatra se da predstavljaju oko 1% od proizvoda. U testu stabilnosti nije dokazana agregacija ili razgradnja 20 kDa mPEG-O-p-fenilacetaldehid-modrfikovanog IFN-p-1 a, u puferu Tris od pH 7,4, nakon 7 dana inkubacije na 37°C. Specifična aktivnost PEG-lovanog IFN-p-1 a u testu anti-virusne aktivnosti je približno dvostruko smanjenja u odnosu na nemodifikovani iFN-p-1 (EC50= 31 pg/mL za 20 kDa mPEG-O-p-fenilacetaldehid-modifikovani IFN-p-1 a, u odnosu na EC50= 14 pg/mL za nemodifikovani IFN-p-1a). Masa PEG-ilovanog IFN-p-1a se formuliše sa 30 ug/mL u PBS, pH 7,3, koji sadrži 14 mg/mL HSA, slično formulaciji koja se koristi za AVONEX<®>, koji je bio podvrgnut ekstenzivnoj karakterizaciji. Materijal se isporučuje kao smrznuta tečnost, koja se čuva na -70° C.
Svojstva 20 kDa mPEG-O-p-fenilacetaldehid-modifikovanog IFN-p-1 a su sabrana u Tabeli 3.
1. Dobijanje 20 kDa mPEG- O- p- fenilacetaldehid- modifiokvanog IFN- p- 1a
Razblaži se 20 mL neformulisanog AVONEX<®->a (masa IFN-p-1a intermedijara, masa kliničke šarže leka je prošla sve testove za upotrebu humanih bića, sa 250 ug/mL u 100 mM natrijum-fosfatu, pH 7,2, i u 200 mM NaCI) sa 24 mL 165 mM MES, pH 5,0, i 100 uL 5 M HCI i 24 uL vode. Ovaj uzorak se prebaci u kolonu od 600 uL SP-Sepharose FF (Pharmacia). Ova kolona se opere 2*900uL sa 5 mM natrijum-fosfatom, sa pH 5,5 i 75 mM NaCI, pa se protein eluira sa 5 mM natrijum-fosfataom, pH 5,5 i 600 mM NaCI. Analiziraju se frakcije od eluiranja, preko njihove absorbancije na 280 nm, pa se ocenjuje koncentracija IFN-p-1 a u uzorcima, korišćenjem vrednosti 1,51 za koeficijent ekstinkcije, u rastvoru od 1 mg/mL. Sjedine se frakcije pika, dajući koncentraciju IFN-p-1 a od 2,3 mg/mL. U 1,2 mL sjedinjenog eluata IFN-p-1a iz SP-Sepharose, dodaje se 0,5 M natrijum-fosfat, pH 6,0 do 50 mM, natrijum-cijanoborohidrid (Aldrich) se dodaje do 5 mM, a 20 kDa mPEG-O-p-fenilacetaldehid se dodaje do 10 mg/mL. Uzorak se inkubira 18 h na sobnoj temperaturi, u mraku. PEG-ilovani IFN-p-1 a se prečišćava iz ove reakcione smeše na koloni od 0,75 mL SP-Sepharose FF, kao što sledi: razblaži se 1,5 mL reakcione smeše sa 7,5 mL 20 mM MES, pH 5,0, 7,5 mL vode i 5 uL 5M HCI, pa se prebaci u kolonu SP-Sepharose. Ova kolona se pere sa natrijum-fosfatom, pH 5,5, 75 mM NaCI, a zatim se PEG-ilovani IFN-p-1 a eluira iz kolone sa 20 mM MES, pH 6,0 i 600 mM NaCI. PEG-ilovani IFN-p-1a se dalje prečišćava na koloni Superose 6 HR 10/30 FPLC sizing, sa 5 mM natrijum-fosfatom, pH 5,5 i 150 mM NaCI, kao mobilnom fazom. Ova kolona za razdvajanje po veličini (25 mL) se ispire sa 20 mL/h, a sakupljaju se frakcije od 0,5 mL. Jedinjene frakcije od eluiranja se analiziraju na sadržaj proteina, pomoću absorbancije na 280 nm, pa se određuje koncentracija proteina u sjedinjenom eluatu. Koncentracija PEG-ilovanog IFN-p-1 a se daje u ekvivalentima IFN, posle podešavanja doprinosa PEG (20 kDa mPEG-O-p-fenilacetaldehid ima koeficijent ekstinckije na 280 nm jednak 0,5, u rastvoru od 1 mg/mL) absorbanciji na 280 nm, koristeći za koeficijent ekstinckije 2, u rastvoru od 1 mg/mL PEG-ilovanog IFN-p-1 a. Uzmu se uzorci sakupljenog eluata radi analize, a ostatak se razblaži na 30 ug/mL sa puferom za formulisanje koji sadrži HSA, i podeli u alikvote od 0,25 mL/fiola, i čuva na -70°C.
2. UV spektar prečišćenog
20 kDa mPEG- O- p- fenilacetaldehid- rnodifikovanog iFN- p- 1 a
UV spektar (240-340 nm) 20 kDa mPEG-O-p-fenilacetaldehid-modifikovanog IFN-p-1 a dobije se korišćenjem uzorka mase koji je prethodno formulisan sa HSA. PEG-ilovani uzorak pokazuje maksimum absorpcije na 278-279 nm, a minimum absorpcije na 249-250 nm, što je saglasno sa istim za masu nemodifikovanog intemnedijara IFN-p-1 a. Koncentracija proteina u PEG-ilovanom proizvodu je ocenjivana iz spektra, koristeći za koeficijent ekstinkcije vrednost£28o<0,1%>= 2,0. Koncentracija proteina PEG-ilovane mase je 0,10 mg/mL Nije opaženo zamućenje u uzorku, jer nedostaje absorbancija na 320 nm.
3. Karakterizacija 20 kDa mPEG- O- p- fenilacetaldehid-
modifikovanog IFN-( 3- 1a pomoću SDS- PAGE
Podvrgne se 2,5 ug 20 kDa mPEG-O-p-fenilacetaldehid-modrfikovanog IFN-p-1 a analizi SDS-PAGE, pod redukcionim uslovima, sa 10-20% gradijentom gela. Gel je obojen sa Coomassie-vim brilijant plavim R-250 i prikazan je na Slici 4 (red A: 20 kDa mPEG-O-p-fenilacetaldehid-modrfikovani IFN-p-1 a; Red B: nemodifikovani IFN-p-1 a; Red C: markeri molekulske težine (odozdo na gore: 100 kDA, 68 kDa, 45 kDa, 27 kDa i 18 kDa, respektivno). SDS-PAGE analiza 20 kDa mPEG-O-p-fenilacetaldehid-modifikovanog IFN-p-1 a je otkrila jednu glavnu traku, prividne mase 55 kDa, što je saglasno sa modifikacijom sa jednim PEG. Nisu detektovati viši oblici, koji bi proistekli iz prisustva dodatnih PEG grupa. U prečišćenom PEG-ilovanom proizvodu otkriven je nemodifikovani IFN-p-1 a; međutim, količina je ispod granice kvantitativnog određivanja. Sadržaj nemodifikovanog IFN-p-1 a u preparatu je procenjen da iznosi samo oko 1% od ukupnog proteina.
4. Karakterizacija 20 kDa mPEG- O- p- fenilacetaldehid- modifikovanog IFN- fi- 1a
pomoću hromatografije sa isključivanjem po veličini ( SEC)
Podvrgne se 20 kDa mPEG-O-p-fenilacetaldehid-modifikovani IFN-p-1 a SEC na analitičkoj koloni Superose 6 HR 10/30 FPLC sizing, koristeći PBS, pH 7,2, kao mobilnu fazu. Kolona se ispire sa 20 mL/h, a eluat se prati preko absorbancije na 280 nm, kao što pokazuje Slika 5: Slika 5A: standardi molekulske težine (670 kDa tiroglobulin; 158 kDa gamaglobulin; 44 kDa ovalbumin; 17 kDa mioglobin; 1,3 kDa vitamin B12); Slika 5B: 20 kDa mPEG-O-p-fenilacetaldehid-modifikovani IFN-p-1 a . PEG-ilovani IFN-p-1 a se eluira kao jedan oštar pik, prividne molarne mase od 200 kDa, što je saglasno sa velikom hidrodinamičkom zapreminom PEG. Nema dokaza o prisustvu agregata. Otkriven je nemodifikovani IFN-p-1a u preparatu, ali je bio ispod ganice kvantitativnog određivanja. Na osnovu veličine pika, nemodifikovani IFN-p-1 a iznosi 1% proizvoda ili manje, što je saglasno sa opažanjem koje je koristilo SDS-PAGE.
5.Analiza 20 kDa mPEG- O- p- fenilacetaldehid- modifikovanog
IFN- p- 1a pomoću mape peptida.
Specifičnost reakcije PEG-ilovanja je ocenjivana preko mape peptida. Lizuju se nemodifikovani i 20 kDa mPEG-O-p-fenilacetaldehid-modifikovani IFN-p-1 a sa endoproteinazom Lys-C izAchromobacter- a(VVako Bioproducts), a prozvodi cepanja se frakcionišu pomoću HPLC sa reversnom fazom, na koloni Vydac Cis, koristeći 30 min gradijent od 0 do 70% acetonitrila u 0,1% TFA. Eluat iz kolone je praćen preko absorbancije na 214 nm.
Svi predviđeni peptidi iz lizata IFN-p-1a pomoću endoproteinaze Lys-C, identifikovani su ranije pomoću sekvencioniranja N-kraja i masenom spektrometrijom (Pepinsky et al.,J. Pharmacology and Experimental Therapeutics,2001, 297, 1059), a od ovih, samo je peptid koji sadrži N-kraj IFN-p-1 a promenjem modifikovanjem sa 20 kDa mPEG-O-p-fenilacetaldehidom; što je vidljivo preko njegovog nestanka iz mape peptida. Prema tome, podaci iz mape pokazuju da je PEG ostatak specifično spojen sa ovim peptidom. Ovi podaci još pokazuju da PEG modifikacija cilja na N-kraj proteina, zato što samo modifikacija N-kraja dovodi do specifičnog gubitka ovog peptida.
6. Stabilnost 20 kDa mPEG- O- p- fenilacetaldehid- modiftkovanog IFN- fi- 1a
Da bi se testirala stabilnost 20 kDa mPEG-O-p-fenilacetaldehid-modifikovanog IFN-p-1 a, uzorci se razblaže na 0,1 pg/mL sa 100 mM puferom Tris-HCI, pH 7,4, pa se inkubiraju do 7 dana na 37°C. Uzorak od 20 pL (2 pg) se uzima u dane 0, 2, 5 i 7, pa se analizira pomoću SDS-PAGE pod redukcionim uslovima, kao što pokazuje Slika 6. Red A: markeri molekulske težine (odozgo na dole: 100 kDa, 68 kDa, 45 kDa, 27 kDa, 18 kDa i 15 kDa, respektivno); Redovi B, C, D i E: mPEG-O-p-fenilacetaldehid modifikovani IFN-p-1 a, uzet 0, 2, 5 i 7 dana, respektivno. Nema dokaza o agregaciji ili razgradnji PEG-ilovanog IFN-p-1 a, u opažanju čak posle 7 dana, na 37°C
Primer 3
Specifična aktivnost PEG- ilovanog humanog IFN- P- 1 a
u anti- virusnom testuin vitro
Specifična anti-virusna aktivnost uzoraka PEG-ilovanog IFN-p-1 a testirana je na karcinomu humanih ćelija pluća (ćelije A549), koje su bile izložene virusu encefalomiokarditisa (EMC), korišćenjem metaboličke boje 2,3-bis[2-metoksi-4-nitro-5-sulfo-fenil]-2H-tetrazolijum-5-karboksianilida (MTT; M-5655, Sigma, St. Louis, MO) kao mere metabolički aktivnih ćelija zaostalih posle izlaganja ovom virusu. Ukratko, ćelije A549 se prethodno tretiraju 24 h sa ili nemodifikovanim ili sa PEG-ilovanim IFN-p-1 a (polazi se od 66,7 pg/mL, pa se serijski razblažuje 1,5 puta, do 0,8 pg/mL), pre zaražavanja virusom. Ove ćelije se zatim 2 dana inkubiraju sa EMC virusom, pri razblaženju koje za rezultat daje potpunu smrt ćelije u odsustvu IFN. Ploče se zatim razvijaju sa MTT. Početni rastvor MTT se priprema sa 6 mg/mL u PBS, sterilno filtrira, pa se 50 uL ovog rastvora razblažuje u ćelijske kulture (100 pL po bazenčiću). Posle 30-60 min inkubacije na sobnoj temperaturi, rastvor MTT/medijum se odbaci, ćelije operu sa 100 pL PBS i konačno se rastvori metabolizovana boja sa 100 uL 1,2 M HCI u izopropanolu. Vitalne ćelije (što se određuje prisustvom boje) se kvantitativno određuju preko absorbancije na 450 nm. Podaci se analiziraju nanošenjem absorbancije prema koncentraciji IFN-p-1 a, a aktivnost IFN-p-1 a se defniše koncentracijom pri kojoj je 50% ćelija usmrćeno, tj. sa 50% citopatičkim efektom (EC50) ili pri 50% od maksimalne OD450. Ovaj test je obavljen osam puta za nemodifkovani iFN-p-1 a, a tri do četiri puta za razne uzorke PEG-ilovanog IFN-p-1a. U svakom testu su duplirani podaci za svaku tačku, za svaku koncentraciju proteina. Reprezentativni dijagrami vitalnosti ćelija u odnosu na koncentraciju nemodifikovanog ili PEG-ilovanog IFN-p-1 a prikazani su na Slikama 7A i 7B. Na slici 7A simboli su kao što sledi, nemodifikovani IFN-p-1 a (o), 20 kDa mPEG-O-2-metilpropionaldehid-modrfikovani IFN-p-1 a (U), 20 kDa mPEG-O-p-metilfenil-O-2-metilpropionaldehid-modifikovani IFN-p-1 a (trougiovi) i 20 kDa mPEG-O-m-metirfenil-O-2-metilpropionaldehid-modifikovani IFN-p-1 a (rombovi). Na Slici 7B simboli su kao što sledi: nemodfikovani IFN-p-1 a (o), 20 kDa mPEG-O-p-fenilacetaldehid-modifikovani IFN-p-1 a (U), 20 kDa mPEG-O-p-fenilpropion-aldehiđ-modifikovani IFN-p-1 a (trougiovi) i 20 kDa mPEG-O-m-fenilacetaldehid-modifikovani IFN-p-1 a (rombovi).
Vrednosti EC50(koncentracija pri polovini maksimalne zaštite virusa) za IFN-p-1 a modifikovan sa 20 kDa mPEG-O-2-metilpropionaldehidom, 20 kDa mPEG-O-p-metirfenil-O-2-metilpropionaldehidom, 20 kDa mPEG-O-m-metilfenil-O-2-metilpropionaldehidom, 20 kDa mPEG-O-p-fenilacetaldehidom, 20 kDa mPEG-O-p-fenilpropionaldehidom i 20 kDa mPEG-O-m-fenilacetaldehidom, prikazane su na Slici 4. Svi PEG-ilovani IFN-p-1 a su modifikovani i prečišćeni do homogenosti, kao što je suštinski objašnjeno za 20 kDa mPEG-O-2-metilpropionaldehid-modifikovani IFN-p-1 a, 20 kDa mPEG-O-m-metilfenil-O-2-metilpropionaldehid-modrfikovani iFN-p-1 a i 20 kDA mPEG-iO-p-fenilacetaldehiđ-modifikovani IFN-p-1 a, i opisano gore.
Primer 4
Farmakokinetika intravenozno ordiniranog nemodifikovanog i
PEG- ilovanih IFN- p- 1 a, kod pacova
Ženke pacova soja LEVVIS sa kanilom, injektirane su intravenozno ili sa 80 pg/kg nemodifikovanog IFN-p-1 a, ili sa 24 pg/kg sledećih PEG-ilovanih IFN-p-1 a: 20
kDa mPEG-O-2-metilpropionaldehid-modifikovani IFN-p-1 a, 20 kDa mPEG-O-p-metilfenil-O-2-metilpropionaldehid-modifikovani IFN-p-1 a, 20 kDa mPEG-O-p-fenilacetaldehid-modifikovani IFN-p-1 a, 20 kDa mPEG-O-p-fenilpropionaldehid-modrfikovani IFN-p-1 a, 20 kDa mPEG-O-m-fenilacetaldehid-modifikovani IFN-p-1a i 20 kDa mPEG-O-m-metirfenil-O-2-metilpropionaldehid-modifikovani IFN-p-1a. I nemodifikovani i PEG-ilovani proteini su formulisani u prisustvu 14-15 mg/mL HSA, kao nosača. Za nemodifiovani protein, krv (0,2 mL) se dobija kroz kanilu u različitim vremenskim tačkama: neposredno pred ordiniranje, i 0,083, 0,25, 0,5, 1,25, 3 i 5 h posle ordiniranja. Za PEG-ilovane proteine krv (0,2 mL) se dobija kroz kanilu neposredno pred ordiniranje, i 0,083, 0,25, 0,5, 1,25, 3, 24, 48 i 72 h posle ordiniranja. Celokupna krv se sakupi u epruvete za separaciju seruma (Beckton Dickinson No. 365956), pa se inkubiraju 60 min na sobnoj temperaturi da se omogući koagulacija. Koagulisana krv se centrifugira 10 min na 4°C, odvoji serum, i čuva na -70°C do vremena testiranja.
Uzorci seruma se zatim otkrave i testiraju u antivirusnim testovima. Uzorci seruma se razblaže 1:50 u medijumu koji sadrži serum (Dulbecco-ov modrrlkovani Eagles medijum, koji sadrži 10 vol% seruma goveđeg fetusa, po 100 jed. penicilina i streptomicina i 2 mM L-glutamin), pa se testiraju u anti-Ovirusnim testovima. Uzorci se titrišu u označenim bezenčićima ploče za kultivisanje tkiva sa 96 bazenčića, koji sadrže ćelije karcinoma humanih pluća (A549, CCL-185, ATCC, Rockville, MD). Razblaženja standarda (66,7, 44,4, 29,6, 19,8, 13,2, 8,8, 5,9, 3,9, 2,6, 1,7, 1,2 i 0,8 pg/mL istog oblika IFN-p-1a, ordiniranih pacovu) i tri uzorka seruma, se testiraju na svakoj ploči. Ćelije A549 se prethodno tretiraju sa razblažeim uzorcima seruma, 24 h pre zaražavanja sa virusom encefalomijelokarditisa (EMC). Posle 2 dana inkubacije virusom, vitalne ćelije se 1 h boje rastvorom MTT (sa 5 mg/mL u fosfatnom puferu), operu fosfatnim puferom i solubilizuju sa 1,2 M HCI u izopropanolu. Bazenčići se zatim očitavaju na 450 nm. Načine se standardne krive nemodifikovanog ili PEG-ilovanog IFN-p-1-a za svaku ploču, pa se koriste za određivanje količine nemodifikovanog ili PEG-ilovanog IFN-p-1-a u savkom uzorku. Farmakokinetički parametri se zatim izračunavaju korišćenjem ne-kompatrmentalne analize, sa softverskom verzijom VVinNonlJn 3,0 ili 3.3.
Slika 8A pokazuje krive koncentracija-vreme za nemodifikovani IFN-p-1 a (Gornji dijagram) i za IFN-p-1 a modifikovan sa 20 kDa mPEG-O-2-metilpropionaldehida (donji dijagram), a Slika 8B pokazuje krive koncentracija-vreme sa IFN-p-1 a modifikovan sa 20 kDa mPEG-O-p-metilfenil-O-2-metilpropionaldehidom (gornji dijagram) i sa 20 kDa mPEG-O-p-fenilacetaldehidom (donji dijagram). Tačke podataka su prosečne vrednosti merenja na 3 pacova.
Tabela 5 poazuje farmakokinetičke parametreCmax(maksimalna opažena koncentracija), tic(poluvreme eliminisanja) AUC (površna ispod krive), Vss (distribuciona zapremina stacionarnog stanja), brzina čišćenja i MRT (srednje vreme zadržavanja) za nemodifikovani IFN-p-1 a i ove oblike PEG-ilovanog IFN-p-1 a. Podaci, koji su prikazani na Slikama 8A i 8B i u Tabeli 5 su dobijeni u istom ispitivanju.
Slika 9A pokazuje krive koncentracija-vreme za nemodifikovani IFN-p-1 a (gornji dijagram) i IFN-p-1 a modifikovan sa 20 kDa mPEG-O-p-fenilproionaldehidom (donji dijagram). Podaci za tačke su srednje vrednosti meranja na 2 pacova. Slika 9B pokazuje krive koncentracija-vreme sa IFN-p-1 a modifikovanim sa 20 kDa mPEG-O-m-fenilacetaldehida (gornji dijagram) i sa 20 kDa mPEG-O-m-metilfenil-O-2-metilpropionaldehida (donji dijagram). Podaci za tačke su srednje vrednosti merenja na 3 pacova.
Tabela 6 pokazuje farmakokinetičke parametre za nemodifikovani IFN-p-1 a i ove oblike PEG-ilovanog IFN-p-1 a. Podaci prikazani ns Slikama 9A i 9B i u Tabeli 6 dobijeni su u istom ispitivanju, nezavisno od podataka prikazanih na Slikama 8A i 8B i u Tabeli 5
Kao što je jasno iz podataka prikazanih na Slikama 8A, 8B, 9A i 9B, i u Tabelama 5 i 6, PEG-ilovanje IFN-p-1 a sa molekulima PEG iz ovog opisa poboljšava farmakokinetička svojstva IFN-p-1 a. U svim slučajevima PEG-ilovani proteini čiste se iz tela manje brzo, nego nemodifiovani IFN-P-1 a, što se odražava na brzine čišćenja od 3,9-8,3 mL/h/kg, u poređenju sa 160-170 mL/IVkg za nemodifikovani protein. Kao posledica umanjenih brzina čišćenja, srednje vreme zadržavanja (MRT) je poraslo od približnoo 1 h za nemodifikovani protein, na 4,8-7,6 h za PEG-ilovane proteine. Slično, poluvreme eliminacije (t.1/2) je poraslo sa približno 1 h za nemodifikovani protein, na 5,2-13 h za PEG-ilovane proteine. Vrednosti površine ispod krive (AUC) takođe su značajno porasle posle PEG-ilovanja IFN-p-1 a. Za nemodifikovani IFN-p-1 a, AUC je približno 0,5 p<g>h/mL, dok se za PEG-ilovane proteine vrednosti AUC kreću od približno 3 do 6 pg h/mL, uprkos činjenici da su PEG-ilovani proteini dozirani sa 3,3-puta manjim sadržajem, nego nemodifikovani protein. Maksimalne opažene koncentracije (Cmax) obično su više za nemodifikovani IFN-p-1a, nego za PEG-ilovane proteine, što reflektuje ordiniranje nižih doza modifikovanih proteina. Za zapeminu distribucije u stacionarnom stanju (Vss), vrenosti za sve PEG-ilovane proteine bile su niže nego za nemodifikovane IFN-p-1a, što ukazuje na restrikciju njihovog svojstva da uđu u krvotok.
Primer 5
Komparativna farmakokinetika i farmakodinamika nemodifikovanog i
PEG- ilovanog humanog ! FN- p- 1a kod ne- humanih primata
Komparativna ispitivanja sa jednom i ponovljenim dozama su obavljena sa nemodifikovanim i PEG-ilovanim IFN-p-1 a, da bi se odredila njihova relativna stabilnost i aktivnost kod ne-humanih primata. U ovim ispitivanjima poredi se farmakokinetika i farmakodinamika konjugata PEG-ilovanog IFN-p-1 a sa nemodifikovanim IFN-p-1 a, s obzirom na interferencije koje se mogu proširiti na humana bića.
Životnie i postupci
1. isptivanje ( ponovljena doza)
Ovo je paralelna grupa ispitivanja ponovljene doze da se oceni uporedna farmakokinetika i farmakodinamika nemodifikovanog IFN-p-1a i PEG-ilovanog IFN-P-1 a. U ovom ispitivanju se koriste zdravi primati (npr. rezus majmuni). Pre doziranja sve životinje laboratorijski veterinar procenjuje u pogledu znakova bolesti u dva navrata unutar 14 dana, pre ordiniranja testiranog agensa; jedno ocenjivanje mora biti unutar 24 h pre prvog ordiniranja testiranog agensa. Samo zdrave životinje dobijaju testirani agens. Ocenjivanje obuhvata opšte fizičko ispitivanje i isptivanje krvi pre doziranja, za polazni podatak o kliničkoj patologiji i polazni podatak o sadržaju antitela na IFN-p-1 a. Svim životinjama je izmerena masa i telesna temperatura i registrovana 24 h pre ordiniranja testiranog agensa. Uključeno je dvanaest subjekata i podeljeno u grupe od po tri, pa su primili 1*10<6>jed/kg nemodifikovanog ili PEG-ilovanog IFN-p-1 a, ali inače identičnog IFN-p-1a. Ordiniranje je ili potkožnim (sc) ili intravenoznim (iv) putem. Šest mužjaka životinja dobija testirani agens iv puten (3 po tretmanu), a drugih 6 mužjaka životinja dobije testirani agens sc putem (3 po tretmanu). Sve životinje moraju biti bezazlene na tretman sa IFN-p. Svaka životinja se dozira u dva navrata, a doze su razdvojene četiri nedelje. Zapremina doze je 1,0 mL/kg, Za farmakokinetička ispitivanja krv se uzima 0, 0,083, 0,25, 0,5, 1, 1,5, 2, 4, 6, 8, 12, 24. 48, 72 i 96 h nakon svake injekcije. Uzorci krvi za merenje markera biološkog odgovora izazvanog sa IFN, serumskog neopterina, uzimaju se 0, 24, 48, 72, 96, 168, 336 i 504 h nakon ordiniranja ispitivanog leka. Ocenjivanja tokom perioda ispitivanja obuhvataju klinička posmatranja, obavljena 30 min i 1 h posle doze, u pogledu znakova toksičnosti. Obavljaju se svakodnevna posmatranja u kavezu, a opšti izgled, znakovi toksičnosti, nelagodnosti i promene u ponašanju se registruju. Telesna masa i telesna temperatura se registruju u pravilnim intervalima tokom 21 dan posle doze.
2. ispitivanje ( jedna doza)
Ovo je paralelna grupa ispitivanja sa jednom dozom, da se oceni komparativna farmakokinetika i farmakodinamika nemodifikovanog i PEG-ilovanog IFN-p-1 a. U ovom ispitivanju se koriste zdravi primati (npr. rezus majmuni). Pre doziranja sve životinje laboratorijski veterinar procenjuje u pogledu znakova bolesti u dva navrata unutar 14 dana, pre ordiniranja testiranog agensa; jedno ocenjivanje mora biti unutar 24 h pre prvog ordiniranja testiranog agensa. Samo zdrave životinje dobijaju testirani agens. Ocenjivanje obuhvata opšte fizičko ispitivanje i isptivanje krvi pre doziranja, za polazni podatak o kliničkoj patologiji i polazni podatak o sadržaju antitela na IFN-p-1a. Svim životinjama je izmerena masa i telesna temperatura i registrovana 24 h pre ordiniranja testiranog agensa. Uključeno je dvadeset subjekata i podeljeno u pet grupa po četiri životinje (2 ženke i 2 mužjaka po grupi), pa su primili 1*106 jed/kg nemodifikovanog ili PEG-ilovanog IFN-p-1 a intramuskularno (im), ili 2*10<5>jed/kg, 1*10<6>jed/kg ili 5*10<6>jed/kg PEG-ilovanog IFN-p-1 a intravenozno (iv). Sve životinje moraju biti bezazlene na tretman sa IFN-p. Svaka životinja se dozira u dva navrata, a doze su razdvojene za četiri nedelje. Zapremina doze obično je 1,0 mL/kg. Za farmakokinetička ispitivanja krv se uzima 0, 0,5, 1, 2, 4, 6, 8, 12, 24, 36, 48 i 96 h nakon ordiniranja ispitivanog leka. Uzorci krvi za merenje markera biološkog odgovora izazvanog sa IFN, 2',5'-oligoadenilat sintaze (2',5'-OAS), uzimaju se 0, 12, 24, 48, 72 i 96 h i 7, 14, 21 i 18 dana nakon ordiiranja ispitivanog leka. Ocenjivanja tokom perioda ispitivanja obuhvataju klinička posmatranja, obavljena 30 min i 1 h posle doze, u pogledu znakova toksičnosti. Obavljaju se svakodnevna posmatranja u kavezu, a registruju se opšti izgled, znakovi toksičnosti, nelagodnosti i promene u ponašanju. Telesna masa i telesna temperatura se registruju u pravilnim intervalima tokom 28 dana posle doze.
Metode testiranja
Sadržaji IFN-p-1 a u serumu se kvantitativno određuju korišćenjem biotesta citopatičkog efekta (CPE). Test CPE meri nivoe anti-virusne aktivnosti posredovane sa IFN. Nivo anti-virusne aktivnosti u uzorku reflektuje broj molekula aktivnog IFN koji se sadrži u tom uzorku u vreme kada se uzima krv. Ovaj pristup je standardna metoda za ocenjivanje farmakokinetike IFN-p. Test CPE detektuje sposobnost IFN-p za zaštiti ćelije karcinoma humanih pluća (A549, #CCL-185, ATCC, Rockville, MD) od citotoksičnosti virusa encefalomijokarditisa (EMC). Ove ćelije se prethodno inkubiraju 15-20 h sa uzorcima seruma, kako bi se omogućila indukcija i sinteza proteina koji se mogu indukovati sa IFN, koji su odgovorni za antivirusni odgovor. Zatim se doda EMC virus, pa se inkubira još 30 h, pre nego što se obavi ocenjivanje citotoksičnosti korišćenjem bojenja sa kristalvioletom. Interni standard za IFN-p, kao i interni standard za PEG-ilovani IFN-P-1 a testiraju se paralelno sa uzorcima u svakoj ploči za testiranje. Ovaj standard se kalibriše prema referentnom standardu prirodnog humanog fibroplasta IFN WHO Second International Standard for Interferon,Human Fibroplast,Gb-23-902-53). Svaka ploča za testiranje sadrži takođe kontrolne bazenčiće za rast ćelija, koji ne sadrže ni IFN-p bilo koje vrste, niti EMC, i kontrolne bazenčiće za virus, koji sadrže ćelije i EMC, ali ne i IFN-p. Kontrolne ploče, koje sadrže standard i uzorke, takođe se pripreme za određivanje efekta, ukoliko ga ima, ovih izoraka na rast ćelija. Ove ploče se boje bez dodavanja virusa. Uzorci i standardi se testiraju u duplikatu na svakoj od dva duplikata ploča za testiranje, dajući Četiri tačke za podatak po uzorku. SaopŠtava se srednja geometrijska koncentracija za ova četiri replikata. Granica detekcije u ovom ispitivanju je 10 jed/mL. Koncentracije neopterina u serumu se određuju u kliničkim farmakološkim jedinicama, koristeći komercijalno dostupne testove. Koncentracije u serumu 2',5-OAS određivane su u uslužnoj laboratoriji, korišćenjem valjanog, komercijalno-dostupnog testa,
Farmakokinetičke i statističke metode
Softver Rstrip™ (MicroMath, Inc., Salt Lake City, UT) se koristi za fitovanje podataka u farmakokinetičkim modelima. Dobije se kriva srednja geometrijska koncentracija-vreme za svaku grupu. Pošto se rezultati testa iskazuju kao razblaženja, smatra se da geometrijske srednje vrednosti bolje odgovaraju, nego aritmetičke srednje vrednosti. Sadržaji IFN u serumu se podešavaju prema vrednostima sa osnovne linije, a koncentracije seruma koje se nemogu detektovati su na 5 jed/mL, što predstavlja polovinu od donje granice detekcije. Za podatke iv infuzije, fituje se dvodelni iv infuzioni model za koncentracije seruma koje se mogu detektovati u svakom subjektu, pa se SC podaci fituju u dvodelni model za injekcije.
Izračunavaju se sledeći farmakokinetički parametri:
(i) opažena koncentracija pika , Cmax(jed/mL); (ii) površina pod krivom od 0 do 48 h, AUC (jedxh/mL) koristeći pravilo trapeza; (iii) poluvreme eliminacije (h); i iz podataka za iv infuziju (ako se iv koristi); (iv) poluvreme raspodele (h);
(v) čišćenje (mL/h/kg)
(vi) prividna zapremina raspodele, Vd (ml/kg).
Za izračunavanje poluvremena eliminacije posle iv i sc injekcije, koristi se softver VVinNonlin (verzija 1,0, Scientific Consulting Inc., Apex, NC). Za neopterin i 2',5'-OAS, aritmetičke sredine u vremenu se daju za svaku grupu, izračunava se Emax, maksimalna promena u odnosu na osnovnu liniju. Cmax, AUC i Emaxse podvrgavaju jednosmernoj analizi varijancije, da bi se uporedile grupe za doziranje. Cmaxi AUC se logaritamski transformišu pre analize; iskazuju se geometrijske srednje vrednosti.
Primer 6
Anti- angiogeni efekti PEG- ilovanog humanog IFN- P- 1a; svojstvo PEG- ilovanog
IFN- f3- 1a da inhibirain vitroproliferaciiu ćelija endoteliiuma
Humane ćelije venskog endotelijuma (Cell Svstemsm Cat. 2V0-P75) i humane ćelije dermalnog mikrovaskularnog endotelijuma (Cell Svstems, Cat. #2M1-C25) drže se u kulturi sa kompletom CS-Cmedijuma (Cell Svstems, Cat. #4Z0-500). Ćelije se 24 h pre eksperimenta tripsinizuju, pa resuspenduju u medijumu za testiranje, 90% M199 i 10% serumu goveđeg fetusa (FBS), pa se podese na željenu gustinu ćelija. Ćelije se zatim zaseju na ploče, sa 96 bazenčića obloženih želatinom, i to ili sa 12.500 ćelija/bazenčić ili sa 2.000 ćelija/bazenčić, respektivno. Posle inkubacije preko noći, medijum za testiranje se zameni svežim medijumom, koji sadrži 20 ng/mL humanog rekombinantnog baznog faktora rasta fibroplasta (bFGF) (Becton Dickinson, Cat. # 40060), pa se dodaju razne koncentracije nemodifikovanog ili PEG-ilovanog IFN-p-1 a iz ovog opisaa, ili pozitivna kontrola (kao pozitivna kontrola može se koristiti endostatin, kao što može i antitelo umesto bFGF). Krajnja zapremina se podesi na 0,5 mL na ploči sa 24 bazenčića, ili na 0,2 na ploči sa 96 bazenčića. Posle 72 h ćelije se tripsinizuju, za brojanje na Coultier-u, smrznu za očitavanje fluorescencije na uređaju CyQuant, ili se obeleže sa [<3>H]-timidinom. U ovomin vitrotestu, proveravaju se molekuli PEG-ilovanog humanog IFN-p-1 a iz ovog pronalaska u pogledu efekta na proliferaciju ćelija endotelijuma, što može biti indikacija anti-angiogenih efekatain vivo.Videti 0'Reilly et al.,Cell, 1997,88, 277-285.
Primer 7
Modeliin vivoza testiranje anti- angiogenih i neovaskularizacionih efekata
PEG- ilovanog humanog IFN- P- 1a i PEG- ilovanog glodarskog IFN- P
Nemodifikovani IFN-p-1a i 20 kDa mPEG-O-2-metilpropionaldehid-modifikovani IFN-p-1 a su testirani u pogledu njihove sposobnosti da inhibiraju stvaranje radijalno orijentisanih krvnih sudova koji ulaze u periferiju SK-MEL-1 humanih malignih tumora melanoma, kod atimičnih golih homozigotnih miševa( nu/ nu).Ćelije SK-MEL-1 rastu u kulturi do 80% konfluencije, a zatim se inokulira 2*10<6>ćelija intradermalno (zapremina 0,1 mL, nultog dana) u slabinu ispod sredine pazuha, tri nedelje starih atimičkih golih homozigotnih( nu/ nu)NCR miševa (Taconic, Germantovvn, NY). Posle 24 h (1. dan) svaka od tri grupe miševa primi sledeće potkožne doze: kontrolnog tečnog nosača, nemodifikovanog IFN-pia ili 20 kDa mPEG-O-2-metilpropionaldehid-modifikovanog INF-(3-1a: Gru<p>a A: 0,1 mL 45,6 mg/mL seruma humanog albumina (kontrolni tečni nosač), samo jedanput 1. dana
Grupa B: 0,1 mL 45,6 mg/mL seruma humanog albumina koji sadrži 1 MU (5 pg) nemodifikovanog IFN-p-1 a, svakodnevno u dane 1-9, zaključno
Gru<p>a C: 0,1 mL 45,6 mg/mL seruma humanog albumina koji sadrži 1 MU jedinica (10 pg) 20 kDa mPEG-O-2-metilpropionaldehid-mođifikovanog IFN-p-1a, jednaput, samo 1. dana
Grupa D: 0,1 mL 45,6 mg/mL seruma humanog albumina (kontrolni tečni nosač) svakodnevno u dane 1-9, zaključno.
Miševi se žrtvuju 10. dana (Avertin, 0,5 mL intraperitonealno), pa se ocenjuje mesto inokulacije tumora u pogledu neovaskularizacije, koje meri nezavisni posmatrač grupe koja se tretira. Boje se krvni sudovi pod fiksiranim uveličanjem, mikroskopa za seciranje. Svaki radijano orijentisan krvni sud, koji ulazi u periferiju tumora broji se kao jedan krvni sud. Svaku grupu čine tri miša.
Kao što pokazuje Slika 10, jedno ordiniranje 1 MU 20 kDa mPEG-O-2-metilpropionaldehid-modifikovanog IFN-p-1a (grupa C) bilo je efikasno u pogledu smanjenja broja novih krvnih sudova, kao i svakodnevno ordiniranje 1MU nemodifikovanog IFN-p-1a (grupa B). Međutim, efekat 20 kDa mPEG-O-2-petilpropionaldehid-modifikovanog IFN-p-1a je izraženiji ako se uzme u obzir da je svakodnevno ordiniranje samog tečnog nosača imalo neki inhibitorski efekat (uporediti grupu A, kada je tečni nosač dat jedanput, sa grupom D, gde je tečni niosač davan svakodnevno).
Razvijeni su razni drugi modeli, koji se mogu koristiti za testiranje anti-angiogenih i anti-neovaskularizacionih efekata PEG-ilovanih molekula iz ovog proalaska. Neki od ovih modela su opisani u United States Paten-ima 5,733,876 (31. mart 1998: "Method of inhibiting angiogenesis") i 5,135,919 (4. avgust 1992: "Method and a pharmaceutical composition for inhibiting of angiogenesis"). Drugi testovi su test horiolantoinske membrane bez ljuske (CAM) koji su predložili Taylor i Folkman,Nature,1982, 297-307, i Crum et al.,Science,1985, 230, 1375; model anti-angiogeneze je metoda metoda leđne vazdušne kese miša Folkman-a etal.,J. Exp. Med.1971, 133, 275, i test mikrodžepa rožnjače kod pacova Gimbrone-a et al.J. Natl. Cancer Inst.1974, 52, 413, gde se izaziva vaskularizacija rožnjače kod odraslih mužjaka pacova soja Sprague-Dawley (Charles River, Japan) implantacijom u svaku rožnjaču 500 ng bFGF (goveđi, R&D Systems, Inc.) impregniranog u pelete kopolimera etilen-vinilacetata. Pored toga, postoji model u kome se angiogeneza izaziva u miševima NIH-Swiss ili atimičnim golim{ nu/ nu)miševima, posle implantacije ćelija MCF-7 karcinoma dojke, ili NIH-OVCAR-3 karcinoma jajnika, kao što su opisali Lindner i Borden,Int. J. Cancer1997, 71., 456. Za izazivanje angiogeneze, kao što je opisana gore, mogu se takođe koristiti i drugi sojevi ćelija tumora, kao što su (ali bez ograničavanja) SK-MEL-1 humane ćelije malignog melanoma. Različite doze, sa različitim učestanostima doziranja i u raznom trajanju mogu da se testiraju i za nemodifikovane i PEG-ilovane IFN-8-1a proteine iz ovog opisa.
Druge metode testiranja PEG-ilovanog mišjeg i pacovskog IFN-p na anti-angiogene efekte na animalnom modelu su (ali bez ograničavanja) protokoli za odabir novih potencijalnih anti-kancer agenasa, kao što je opisano u originalu uCancer Chemotherapy Reports,Deo 3, Vo!. 3, No. 2, septembar 1972, i u dodatku "In Vivo Cancer Models", 1976-1982, NIH Publication No. 84-2635, februara 1984. Zbog specifičnosti vrste interferona Tip I, da bi se ocenila anti-angiogena aktivnost PEG-ilovanog IFN-p na modelima glodara, generišu se preparati PEG-ilovanih glodarskih IFN-p (npr. miševa i pacova). Ovakve metode odabira su date za primer preko protokola za testiranje ani-angiogenih efekata PEG-ilovanog mišjeg IFN-p, na potkožno implantiranom Lewis-ovom karcinomu pluća.
Poreklo tumora
Ovaj soj tumora se spontano pojavio 1951, kao karcinom pluća kod miševa C57BL/6.
Pregled procedure testa
Fragment tumora se implantira potkožno u oblast ispod pazuha miša B6D2F1. Agens za testiranje (tj. PEG-ilovani interferon iz ovog pronalaska), ordinira se različitim dozama, potkožno (sc) ili intrapeirtonealno (ip) tokom više dana posle implantacije tumora. Parametar koji se meri je medijana vremena preživljavanja. Rezultati se iskazuju kao procent vremena preživljavanja prema kontroli.
Životinje
Propagacija: C57B/6 miševi
Testiranje: B6D2F1 miševi
Masa: Miševi su unutar 3 g mase, sa minimalnom težinom d 18 g za
mužjake, a 17 g za ženke.
Pol: Koristi se jedan pol za sve testirane i kontrolne životinje u jednom
eksperimentu.
Izvor: Isti izvor, ukoliko je moguće, za sve životinje u jednom
eksperimentu.
Veličina eksperimenta
Deset životinja u testiranoj grupi.
Prenos tumora
Propagacija:
Fragment: Prepariše se fragment od 2-4 mm sc donora tumora.
Vreme: 13-15 dana.
Mesto: Implantira se fragment sc u oblast ispod pazuha, sa punkturom u
oblasti prepone.
Testiranje:
Fragment: Prepariše se fragment od 2-4 mm sc donora tumora.
Vreme: 13-15 dana.
Mesto: Implantira se fragment sc u oblast ispod pazuha, sa punkturom u
oblasti prepone.
Procedura testiranja:
Dan 0: Implantira se tumor. Traže se bakterijske kulture. Testira se jedinjenje pozitivne kontrole u svakom neparno obeleženom eskperimentu. Pripreme se materijali. Svakodnevno se registruju smrti.
Dan 1: Provere se kulture. Ukoliko je zaražena, eksperiment se odbaci. Nasumice se rasporede životinje. Tretman prema instrukcijama (1. dana i u dane koji slede).
Dan 2: Ponovo se provere kulture. Ukoliko je zaražena, eksperiment se odbaci.
Dan 5: Izmeri se masa 2. dana i na dan početka testa ocenjivanje toksičnosti testa.
Dan 14: Kontroliše se dan preprane smrti.
Dan 48: Kontroliše se dan kada se ne uzima.
Dan 60: Završava se i ocenjuje eksperiment. Ispituje se tumor u plućima.
Kontrola kvaliteta
Isplanira se jedinjenje pozitivne kontrole {NSC 26271; Cytoxan sa dozom od 100 mg/kg/injekcija) u svakom neparno-obeleženom eksperimentu, režimi koji su intraperitonealni samo 1. dana. Donja granica testiranja/kontrole za pozitivnu kontrolu je 140%. Prihvatljiva medijana vremena preživljavanja za netretiranu kontrolu je 19-35,6 dana.
Ocenjivanje
Parametar koji se meri je medijana vremena preživljavanja. Izračuna se srednja masa tela životinje 1. dana i 5. dana, izračuna se odnos test/kontrola za sve testirane grupe. Izračunaju se srednja masa tela životinje početnog dana i na dan konačnog ocenjivanja. Izračuna se odnos test/kontrola za sve testirane grupe sa više od 65% preživelih u 5 danu. Vrednost odnosa test/kontrola <86% ukazuje na toksičnost. Povećana razlika u promeni mase tela (testirani minus kontrolni) može se takođe koristiti za ocenjivanje toksičnosti.
Kriterijumi aktivnosti
Početni odnos testfkontrola veći ili jednak 140% smatra se neophodnim za pokazivanje umerene aktivnosti. Reproduktibilan odnos test/kontrola sa vrednošću većom ili jednakom 150% smatra se značajnom aktivnošću.
Primer 8
Modeliin vivoza testiranje anti- proiiterativnih i anti- tumorskih efekata
PEG- ilovanog humanog IFN-[ 3- 1a i PEG- ilovanog glodarskog IFN-<p>
Dostupni su razni modeliin vivoza testiranje anti-proliferativnih i anti-tumorskih efekata nemodifikovanog i PEG-ilovanog humanog IFN-p-1 a iz ovog opisa. U modelu, koji su opisali Bailon et al.,Bioconjugate Chemistry,2001, 12, 195, atimički goli miševi (Harlan) se potkožno implantiraju sa 2x10<6>ćelija humanog renalog A498, humanog renalnog ACHN ili humanog renalnog G402, u zadnju slabinu, pa se ostave 3-6 nedelja da se tumor razvije. Zatim se ordinira nemodifikovani ili PEG-ilovani IFN-P-1 a sa raznim dozama, sa raznim učestanostima doziranja i raznim trajanjem, pa se meri zapremina tumora i poredi između tretmana. U drugom modelu, koji su opisali Lindner i Borden, uJ. Inteferon Cytokine Res.1997, 17, 681, implantiraju se atimične, gole( nu/ nu),sa oofohisterektomijom ženke miševa (BALB), sa 2*10<6>MCF-7 (plus estradiol), MDA-MB-231, MDA-MB-468 ili BT-20 ćelija humanog karcinoma dojke, ćelija NIH-OVCAR-3 humanog karcinoma jajnika, ćelija HT-29 humanog karcinoma debelog creva ili SK-MEL-1 ili FEMX ćelija humanog malignog melanoma, u kožu koja prekriva mlečne žlezde najbliže pazuhu, pa se ocenjuje veličina tumora u funkciji vremena. Zatim se ordinira nemodifikovani i PEG-ilovani humani IFN-p-1a sa raznim dozama, sa raznim učestanostima doziranja i u raznom trajanju, pa se meri zapremina tumora i poredi između tretmana. Drugi modeli testiranja anti-proliferativnih i anti-tumorskih efekata PEG-ilovanog humanog IFN-p-1 a su (ali bez ograničavanja) modeli lokalnog i metastazi ranog kancera pluća, koje su opisali Quin et al, uMolecular Therapy,2001, 4, 356, i modeli ksenografta humanog kolorektanog kancera sa mestatazama na jetri kod golih miševa, koje su opisali Tada et al., uJ. Clinical Investigation2001, 108, 83.
Druge metode testiranja PEG-ilovanog mišjeg i pacovskog IFN-b na anti-proliferativne i anti-tumorske efekte na modelima životinja su (ali bez ograničavanja) mišji model malignog mezotlioma, koji su opisali Odaka et al., uCancer Res.2001, 61., 6201, modeli lokalnog i metastaziranog kancera pluća, opisan od Quin et al, uMolecular Therapy,2001, 4, 356, i modeli kolorektalnog kancera sa metastazom na jetri kod izogenih miševa, koje su opisali Tada et al., uJ. Clinical Investigation2001, 108, 83.
Primer 9
Modeliin vivoza testiranje anti- virusnih efekata PE- ilovanoh mišjeg IFN- B
i PEG- ilovanog humanog IFN- b- 1a
Dostupan jemišjiin vivomodel za testiranje efekta nemodifiovanog i PEG-ilovanog mišjeg IFN-p na nivoe virusa humanog hepatitisa B (HBV) kod HBV-transgenih SCID miševa. Larkin et al.,Nature Medicine,1999, 5, 907. U ovom modelu, transgeni SCID miševi, koji nose dimer glava-rep humanog HBV genoma, imaju detektabilne nivoe replikativnih oblika HBV i pre-genomske RNK u jetri, i virus HBV u serumu. Hepatociti iz ovih transgenih miševa su takođe pozitivni na HbsAg, HbcAg i HbxAg proteine, što je indikativno za replikaciju virusa. Primer protokola za poređenje nemodifikovanog i PEG-ilovanog sa mišjim IFN-p u ovom odelu, dat je niže:
30 miševa (5 grupa sa 5 i esktra 5), sa uporedivim titrom virusa, titrišu se u dve nezavisne vremenske tačke (razdvojene najmanje 1 nedelju dana), da se utvrdi osnovna linija titra i da se obezbedi da njihovi titri ostaju konstantni pre doziranja sa mišjim IFN-p. Grupe od 5 miševa se doziraju 3 puta nedeljno (ponedeljak, sreda i petak), potkožno sa sledećim uzorcima, koji su dati u Tabeli 7.
Titri virusa se određuju nedeljno tokom doziranja i nedejno do dvonedeljno tokom 6 meseci nakon doziranja. Konstruišu se krive titar virusa-vreme radi poređenja tretmana životinja sa tečnim nosačem i sa IFN-p, u pogledu čišćenja i ponovnog uspostavljanja titra virusa. Zatim se obavi drugo ispitivanje, sa odgovarajućim dozama nemodifikovanog i PEG-ilovanog mišjeg IFNp, sa 10-20 miševa u grupi, na ukupno 30-60 miševa (10-20 za kontrolu, 10-20 za nemodifikovani mišji IFN-p i 10-20 za PEG-ilovani mišji IFN-p). Testiraju se titri virusa kao gore i posle žrtvovanja, analizira se serum na titar virusa, kao i na HbsAg, pomoću SDS-PAGE i VVestern bloting metoda. Uklone se takođe jetre, smrznu i fiksiraju kao što je neophodno, pa se boje na prisustvo HbsAg, HbcAg i HbxAg. Na uzorcima seruma i tkiva mogu se obaviti i drugi odgovarajući histološki, histohemijski ili biohemijski testovi, koji su poznati onima koji su verzirani u stanje tehnike.
Mišjiin vivomodel je takođe dostupan za testiranje efekta nemodifikovanog i PEG-ilovanog humanog IFN-p-1 a na nivoe virusa humanog hepatitisa C (HVC) kod miševa koji nose himerične humane jetre. Mercer et al.,Nature Medicine,2001, 7, 927. U ovom modelu graftuju se normalni humani hepatociti u SCID miševe koji nose plazminogen aktivator transgena( Alb- uPa),pa se ovi miševi inokuliaju serumom iz humanih bića inficiranih raznim genotipovima HCV. Ćelije graftovane humane jetre postaju inficirane ovim virusom i virus se replicira. Nivoi HCV RNK u serumu se kvantitativno odrede pomoću PCR, kao i nivoi pozitivne i negativne (replikativni oblici) RNK u ćelijama jetre. Sledi se odgovarajući protokol ispitivanja, koji je sličan (ali bez ograničavanja) onome koji je opisan gore za nemodifikovani i PEG-ilovani mišji IFN-p kod transgenih HBV SCID miševa, da se oceni efikasnost nemodifikovanog i PEG-ilovanog humanog IFN-p-1 a u ovom modelu, tj. da se odredi efekat tretmana titra na HCV, histologija jetre, nivoi ALT u serumu, i prisustvo replikativnih oblika HCV u tkivu graftovane humane jetre. Na uzorcima seruma i tkiva mogu se obaviti i drugi odgovarajući histološki, histohemijski ili biohemijski testovi, koji su poznati onima koji su verzirani u stanje tehnike.

Claims (24)

1. Konjugat koji ima strukturu u skladu sa Formulom XXIIa: naznačen time, što je P polialkilen glikol polimer X jeO; Z je zasićena ili nezasićena C1-C20alkil ili heteroalkil grupa ravnog ili račvastog lanca, zasićen ili nezasićen C3-Ceciklični alkil ili ciklični heteroalkil, supstituisana ili nesupstituisana aril ili heteroaril grupa, ili supstituisan ili nesupstituisan alkaril, gde alkil predstavlja zasićenu ili nezasićenu C1-C20alkil ili heteroalkaril grupu, gde se supstituenti biraju iz grupe koju čine halogen, hidroksil, karbonil, karboksilat, estar, formil, acil, tiokarbonil, tioestar, tioacetat, tioformijat, alkoksil, fosforil, fosfonat, fosfinat, amino, amido, amidin, imin, cijano, nitro, azido, sulfhidril, sulfat, sulfonat, sulfamoil, sulfonamido, sulfonil, heterociklil, aralkil, aromatični ostatak, heteroaromatični ostatak, imino, silil, etar i alkiltio; R<*>je ostatak za povezivanje obrazovan reakcijom ostatka izabranog iz grupe koju čine aldehid, aldehid hidrat i acetal sa biološki aktivnim jedinjenjem; B je biološki aktivno jedinjenje, gde je biološki aktivno jedinjenje interferon-beta; i n svaki je 0 ili ceo broj od 1 do 5.;
2. Konjugat prema Zahtevu 1, naznačen time, što P predstavlja polietilenglikol koji ima strukturu u skladu sa Formulom II: gde E predstavlja vodonik, CrC2oalkil grupa ravnog ili račvastog lanca ili obeležje koje se može detektovati, i a je ceo broj od 4 do 10.000.;
3. Konjugat prema zahtevu 2 naznačen time, što E predstavlja metil.;
4. Konjugat prema zahtevu 2, naznačen time, što E predstavlja obeležje koje se može detektovati.;
5. Konjugat prema Zahtevu 4, naznačen time, što se E bira iz grupe koju čine radioaktivni izotopi, fluorescentni ostaci, fosforescentni ostaci, hemiluminiscentni ostaci i kvantne tačke.;
6. Konjugat prema bilo kom od prethodnih zahteva, naznačen time, što Z je metil i n je jedan.;
7. Konjugat prema bilo kom od prethodnih zahteva, naznačen time, što R<*>predstavlja metilen, a Bje interferon-beta vezan peko amina.
8. Konjugat prema zahtevu 7, naznačen time, što amin predstavlja amino kraj interferona-beta.
9. Konjugat prema bilo kom od prethodnih zahteva, naznačen time, što interferon-beta predstavlja interferon-beta-1 a.
10. Konjugat prema zahtevu 1, naznačen time, što je 20 kDa mPEG-O-2-metilpropionaldehid-modifikovani interferon-beta-1 a, gde interferon-beta-1 a je vezan preko amina na svom N-kraju za 20 kDa mPEG-O-2-metilpropionaldehid.
11. Farmaceutski preparat, naznačen time, što sadrži konjugat prema bilo kom Zahtevu 1-10 i farmaceutski prihvatljiv nosač.
12. Konjugat prema bilo kom od patentnih zahteva 1-10, za upotrebu u lečenju pacijenta podložnog virusnoj infekciji.
13. Konjugat za upotrebu prema Zahtevu 12, naznačen time, što lečenje dalje obuhvata davanje antivirusnog sredstva izabranog iz grupe koju čine ribavirin, levovirin, 3TC. FTC, MB6866, zidovudin, aciklovir, ganciklovir, viramid, VX-497, VX-950 i ISIS 14803.
14. Konjugat za upotrebu prema zahtevu 12, naznačen time, što je virusna infekcija hronični hepatitis C.
15. Konjugat prema bilo kom od zahteva 1-10 za upotrebu u lečenju pacijenta sa autoimunom bolešću.
16. Konjugat za upotrebu prema zahtevu 15, naznačen time, što je autoimuna bolest multipla skleroza.
17. Konjugat prema bilo kom od zahteva 1-10 za upotrebu u terapiji.
18. Upotreba konjugata prema zahtevu 1 u postupku za dobijanje leka za lečenje virusne infekcije.
19. Upotreba prema zahtevu 18, naznačen time, što B predstavlja interferon-beta-1-a.
20. Upotreba prema zahtevu 18, naznačen time, što preparat sadrži još i antivirusni agens izabran iz grupe koju čine ribavirin, levovirin, 3TC, FTC, MB6866, zidovudin, aciklovir, ganciklovir, viramid, VX-497, VX-950 i ISIS 14803.
21. Upotreba prema zahtevu 18, naznačen time, što virusnu infekciju predstavlja hronični hepatitis C.
22. Upotreba konjugata prema zahtevu 1 u postupku dobijanja leka za lečenje multipla skleroze.
23. Upotreba prema zahtevu 22, naznačen time, što je B interferon-beta.
24. Upotreba prema zahtevu 22, naznačena time, što je B interferon-beta 1a.
YU63504A 2002-01-18 2003-01-17 Polimerna jedinjenja polialkilena i njihova upotreba RS55578B1 (sr)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US34991702P 2002-01-18 2002-01-18
PCT/US2003/001559 WO2003061577A2 (en) 2002-01-18 2003-01-17 Polyalkylene glycol with moiety for conjugating biologically active compound

Publications (2)

Publication Number Publication Date
RS63504A RS63504A (sr) 2007-02-05
RS55578B1 true RS55578B1 (sr) 2017-06-30

Family

ID=27613339

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
YU63504A RS55578B1 (sr) 2002-01-18 2003-01-17 Polimerna jedinjenja polialkilena i njihova upotreba

Country Status (35)

Country Link
US (2) US8017733B2 (sr)
EP (3) EP3025726B1 (sr)
JP (5) JP2005526151A (sr)
KR (1) KR100964411B1 (sr)
CN (2) CN101700401B (sr)
AU (1) AU2003210564B2 (sr)
BE (1) BE2016C040I2 (sr)
BG (1) BG66525B1 (sr)
BR (1) BRPI0306993B8 (sr)
CA (4) CA2473526C (sr)
CY (3) CY1117349T1 (sr)
CZ (1) CZ2004877A3 (sr)
DK (2) DK1476181T3 (sr)
EA (2) EA011829B1 (sr)
EE (1) EE05509B1 (sr)
ES (2) ES2774801T3 (sr)
FR (1) FR16C0034I2 (sr)
GE (2) GEP20064024B (sr)
HU (4) HU230473B1 (sr)
IL (1) IL163006A (sr)
IS (1) IS2989B (sr)
LU (1) LU93162I2 (sr)
ME (2) MEP35608A (sr)
MX (1) MXPA04006855A (sr)
NL (1) NL300826I2 (sr)
NO (4) NO339857B1 (sr)
NZ (1) NZ534708A (sr)
PL (2) PL397261A1 (sr)
PT (1) PT3025726T (sr)
RS (1) RS55578B1 (sr)
SI (2) SI1476181T1 (sr)
SK (1) SK3102004A3 (sr)
UA (1) UA82184C2 (sr)
WO (1) WO2003061577A2 (sr)
ZA (1) ZA200406555B (sr)

Families Citing this family (37)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20150246097A9 (en) * 2002-01-18 2015-09-03 Biogen Idec Ma Inc. Polyalkylene Polymer Compounds and Uses Thereof
EE05509B1 (et) * 2002-01-18 2012-02-15 Biogen@Idec@Ma@Inc Aktiveeritud polalkleenglkoolpolmeer ja seda sisaldavad kompositsioonid
NZ540490A (en) 2002-09-09 2007-10-26 Nektar Therapeutics Al Corp Water-soluble polymer alkanal conjugates with human growth hormone
US8129330B2 (en) 2002-09-30 2012-03-06 Mountain View Pharmaceuticals, Inc. Polymer conjugates with decreased antigenicity, methods of preparation and uses thereof
NZ541122A (en) * 2002-12-26 2008-09-26 Mountain View Pharmaceuticals Polymer conjugates of cytokines, chemokines, growth factors, polypeptide hormones and antagonists thereof with preserved receptor-binding activity
EA008866B1 (ru) 2002-12-26 2007-08-31 Маунтин Вью Фамэсьютикэлс, Инк. ПОЛИМЕРНЫЙ КОНЪЮГАТ МОДИФИКАЦИЙ ИНТЕРФЕРОНА-β, ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЕ ПРОДУКТЫ НА ЕГО ОСНОВЕ И СПОСОБ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ
US7432331B2 (en) 2002-12-31 2008-10-07 Nektar Therapeutics Al, Corporation Hydrolytically stable maleimide-terminated polymers
WO2004060965A2 (en) 2002-12-31 2004-07-22 Nektar Therapeutics Al, Corporation Hydrolytically stable maleimide-terminated polymers
JP5229768B2 (ja) 2003-06-26 2013-07-03 シヴィダ・ユーエス・インコーポレイテッド Ｉｎ−Ｓｉｔｕゲル化薬物輸送システム
JP5628467B2 (ja) 2003-06-26 2014-11-19 シヴィダ・ユーエス・インコーポレイテッドＰｓｉｖｉｄａ Ｕｓ， Ｉｎｃ． 生体分解性徐放性ドラッグデリバリーシステム
WO2005118537A2 (en) * 2004-05-31 2005-12-15 Ranbaxy Laboratories Limited Arylpiperazine derivatives as adrenergic receptor antagonists
ATE494012T1 (de) 2004-12-21 2011-01-15 Nektar Therapeutics Stabilisierte polymer-thiol-reagenzien
US20070004635A1 (en) * 2005-06-02 2007-01-04 Schering Corporation Method of treating interferon non-responders using HCV protease inhibitor
SG163565A1 (en) * 2005-07-08 2010-08-30 Elan Pharm Inc Preparation of polymer conjugates of therapeutic, agricultural, and food additive compounds
TW200817369A (en) * 2006-05-22 2008-04-16 Elan Pharm Inc Preparation of polymer conjugates of therapeutic, agricultural and food additive compounds
WO2008066816A2 (en) * 2006-11-28 2008-06-05 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Derivatization or ligaton of peptides
TW200922624A (en) * 2007-07-11 2009-06-01 Enzon Pharmaceuticals Inc Polymeric drug delivery system containing a multi-substituted aromatic moiety
US20090017004A1 (en) * 2007-07-11 2009-01-15 Enzon Pharmaceuticals, Inc. Polymeric drug delivery systems containing an aromatic allylic acid
CL2008002399A1 (es) * 2007-08-16 2009-01-02 Pharmaessentia Corp Conjugado sustancialmente puro que posee una porcion polimerica, una porcion proteica (interferon alfa 2b) y un ligante alifatico de 1 a 10 atomos de carbono, util en el tratamiento de las hepatitis b o c.
JP2011522834A (ja) * 2008-06-05 2011-08-04 ザイモジェネティクス リミテッド ライアビリティ カンパニー Ｃ型肝炎の治療のためのペグ化ｉｉｉ型インターフェロンの使用
MY156568A (en) * 2008-07-31 2016-03-15 Pharmaessentia Corp Peptide-polymer conjugates
GB0823309D0 (en) * 2008-12-19 2009-01-28 Univ Bath Functionalising reagents and their uses
US20120072207A1 (en) 2009-06-02 2012-03-22 Panasonic Corporation Down-mixing device, encoder, and method therefor
UA109646C2 (uk) * 2009-12-10 2015-09-25 Терапевтичне застосування кон'югатів білка з полімером
US20130225789A1 (en) * 2012-02-29 2013-08-29 Yi Sun Polyethylene Glycol Having Hetero Multiple Functional Groups
US8993614B2 (en) 2012-03-15 2015-03-31 F. Hoffmann-La Roche Ag Substituted pyrrolidine-2-carboxamides
KR101475630B1 (ko) * 2013-05-31 2014-12-22 동국대학교 산학협력단 포도근 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 c형 간염의 예방 또는 치료용 조성물
WO2016013911A1 (ko) * 2014-07-24 2016-01-28 에이비온 주식회사 페길화된 인터페론 -베타 변이체
SI3183264T1 (sl) 2014-08-19 2021-03-31 Biogen Ma Inc. Metoda pegilacije
GB201419108D0 (en) 2014-10-27 2014-12-10 Glythera Ltd Materials and methods relating to linkers for use in antibody drug conjugates
US11559567B2 (en) 2014-11-06 2023-01-24 Pharmaessentia Corporation Dosage regimen for pegylated interferon
ES2831079T3 (es) * 2017-06-28 2021-06-07 Construction Research & Technology Gmbh Dispersante para partículas inorgánicas
US11472894B2 (en) 2018-07-23 2022-10-18 Carnegie Mellon University Enzyme-assisted ATRP procedures
US12053529B2 (en) 2018-08-01 2024-08-06 Carnegie Mellon University Amino-reactive positively charged ATRP initiators that maintain their positive charge during synthesis of biomacro-initiators
CN109232898A (zh) * 2018-08-02 2019-01-18 张玲 一种具有抗凝血功能的聚酰亚胺新材料的制备方法
CN111534458B (zh) * 2020-04-13 2022-01-14 浙江工业大学 无色杆菌tbc-1及其在降解1,3,6,8-四溴咔唑中的应用
CN113716982B (zh) * 2021-08-24 2022-05-06 重庆云瑞肥业有限公司 一种食品垃圾回收用发酵制肥装置

Family Cites Families (81)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3710795A (en) 1970-09-29 1973-01-16 Alza Corp Drug-delivery device with stretched, rate-controlling membrane
US4179337A (en) 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
US4002531A (en) 1976-01-22 1977-01-11 Pierce Chemical Company Modifying enzymes with polyethylene glycol and product produced thereby
DE3262575D1 (en) 1981-12-23 1985-04-18 Schering Corp Stabilised interferon formulations and their preparation
WO1985003934A1 (fr) * 1984-03-06 1985-09-12 Takeda Chemical Industries, Ltd. Proteine modifiee chimiquement et son procede de preparation
GB8334102D0 (en) 1983-12-21 1984-02-01 Searle & Co Interferons with cysteine pattern
EP0154316B1 (en) 1984-03-06 1989-09-13 Takeda Chemical Industries, Ltd. Chemically modified lymphokine and production thereof
DE3675588D1 (de) 1985-06-19 1990-12-20 Ajinomoto Kk Haemoglobin, das an ein poly(alkenylenoxid) gebunden ist.
US4917888A (en) 1985-06-26 1990-04-17 Cetus Corporation Solubilization of immunotoxins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation
DE3676670D1 (de) 1985-06-26 1991-02-07 Cetus Corp Solubilisierung von proteinen fuer pharmazeutische zusammensetzungen mittels polymerkonjugierung.
US4766106A (en) 1985-06-26 1988-08-23 Cetus Corporation Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation
JP2514950B2 (ja) 1986-03-10 1996-07-10 エフ・ホフマン―ラ ロシユ アーゲー 化学修飾蛋白質，その製造法および中間体
US4894226A (en) 1986-11-14 1990-01-16 Cetus Corporation Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polyproline conjugation
US5080891A (en) 1987-08-03 1992-01-14 Ddi Pharmaceuticals, Inc. Conjugates of superoxide dismutase coupled to high molecular weight polyalkylene glycols
US5135919A (en) 1988-01-19 1992-08-04 Children's Medical Center Corporation Method and a pharmaceutical composition for the inhibition of angiogenesis
US5116964A (en) 1989-02-23 1992-05-26 Genentech, Inc. Hybrid immunoglobulins
US5286637A (en) * 1989-08-07 1994-02-15 Debiopharm, S.A. Biologically active drug polymer derivatives and method for preparing same
US5252714A (en) * 1990-11-28 1993-10-12 The University Of Alabama In Huntsville Preparation and use of polyethylene glycol propionaldehyde
US5595732A (en) 1991-03-25 1997-01-21 Hoffmann-La Roche Inc. Polyethylene-protein conjugates
US5281698A (en) 1991-07-23 1994-01-25 Cetus Oncology Corporation Preparation of an activated polymer ester for protein conjugation
WO1993012145A1 (en) 1991-12-19 1993-06-24 Baylor College Of Medicine Pva or peg conjugates of peptides for epitope-specific immunosuppression
ZA933926B (en) 1992-06-17 1994-01-03 Amgen Inc Polyoxymethylene-oxyethylene copolymers in conjuction with blomolecules
US5382657A (en) * 1992-08-26 1995-01-17 Hoffmann-La Roche Inc. Peg-interferon conjugates
US5262564A (en) 1992-10-30 1993-11-16 Octamer, Inc. Sulfinic acid adducts of organo nitroso compounds useful as retroviral inactivating agents anti-retroviral agents and anti-tumor agents
US5298410A (en) 1993-02-25 1994-03-29 Sterling Winthrop Inc. Lyophilized formulation of polyethylene oxide modified proteins with increased shelf-life
US5359030A (en) 1993-05-10 1994-10-25 Protein Delivery, Inc. Conjugation-stabilized polypeptide compositions, therapeutic delivery and diagnostic formulations comprising same, and method of making and using the same
US5681811A (en) 1993-05-10 1997-10-28 Protein Delivery, Inc. Conjugation-stabilized therapeutic agent compositions, delivery and diagnostic formulations comprising same, and method of making and using the same
US5874075A (en) 1993-10-06 1999-02-23 Amgen Inc. Stable protein: phospholipid compositions and methods
KR960705579A (ko) 1993-11-10 1996-11-08 에릭에스. 딕커 개선된 인터페론 중합체 결합체(Improved interferon polymer conjugates)
US5951974A (en) 1993-11-10 1999-09-14 Enzon, Inc. Interferon polymer conjugates
US5446090A (en) 1993-11-12 1995-08-29 Shearwater Polymers, Inc. Isolatable, water soluble, and hydrolytically stable active sulfones of poly(ethylene glycol) and related polymers for modification of surfaces and molecules
US5639725A (en) 1994-04-26 1997-06-17 Children's Hospital Medical Center Corp. Angiostatin protein
US5730990A (en) * 1994-06-24 1998-03-24 Enzon, Inc. Non-antigenic amine derived polymers and polymer conjugates
US5650234A (en) 1994-09-09 1997-07-22 Surface Engineering Technologies, Division Of Innerdyne, Inc. Electrophilic polyethylene oxides for the modification of polysaccharides, polypeptides (proteins) and surfaces
US5824784A (en) 1994-10-12 1998-10-20 Amgen Inc. N-terminally chemically modified protein compositions and methods
US5738846A (en) 1994-11-10 1998-04-14 Enzon, Inc. Interferon polymer conjugates and process for preparing the same
FI972443L (fi) 1994-12-07 1997-06-09 Novo Nordisk As Polypeptidi, jonka allergeenisuus on vähentynyt
US5932462A (en) 1995-01-10 1999-08-03 Shearwater Polymers, Inc. Multiarmed, monofunctional, polymer for coupling to molecules and surfaces
US5672662A (en) 1995-07-07 1997-09-30 Shearwater Polymers, Inc. Poly(ethylene glycol) and related polymers monosubstituted with propionic or butanoic acids and functional derivatives thereof for biotechnical applications
SE9503380D0 (sv) * 1995-09-29 1995-09-29 Pharmacia Ab Protein derivatives
EP0856026A1 (en) * 1995-10-19 1998-08-05 Receptagen Corporation Discrete-length polyethylene glycols
US5702717A (en) 1995-10-25 1997-12-30 Macromed, Inc. Thermosensitive biodegradable polymers based on poly(ether-ester)block copolymers
US5908621A (en) 1995-11-02 1999-06-01 Schering Corporation Polyethylene glycol modified interferon therapy
US5747639A (en) 1996-03-06 1998-05-05 Amgen Boulder Inc. Use of hydrophobic interaction chromatography to purify polyethylene glycols
DE69800640T2 (de) 1997-01-29 2001-07-05 Polymasc Pharmaceuticals Plc, London Pegylationsverfahren
JP2001514508A (ja) 1997-03-05 2001-09-11 ユニバーシティー オブ ワシントン Ｃ型肝炎ウイルスの複製を選択的に抑制する薬剤を同定するための新規なスクリーニング法
US5990237A (en) 1997-05-21 1999-11-23 Shearwater Polymers, Inc. Poly(ethylene glycol) aldehyde hydrates and related polymers and applications in modifying amines
US6448369B1 (en) 1997-11-06 2002-09-10 Shearwater Corporation Heterobifunctional poly(ethylene glycol) derivatives and methods for their preparation
US7642323B2 (en) 1997-11-06 2010-01-05 Nektar Therapeutics Heterobifunctional poly(ethylene glycol) derivatives and methods for their preparation
WO1999030727A1 (en) * 1997-12-17 1999-06-24 Enzon, Inc. Polymeric prodrugs of amino- and hydroxyl-containing bioactive agents
US6180095B1 (en) 1997-12-17 2001-01-30 Enzon, Inc. Polymeric prodrugs of amino- and hydroxyl-containing bioactive agents
US5981709A (en) 1997-12-19 1999-11-09 Enzon, Inc. α-interferon-polymer-conjugates having enhanced biological activity and methods of preparing the same
US5985263A (en) 1997-12-19 1999-11-16 Enzon, Inc. Substantially pure histidine-linked protein polymer conjugates
US5965119A (en) 1997-12-30 1999-10-12 Enzon, Inc. Trialkyl-lock-facilitated polymeric prodrugs of amino-containing bioactive agents
DK1411075T3 (da) * 1998-03-12 2008-10-27 Nektar Therapeutics Al Corp Fremgangsmåde til fremstilling af polymerkonjugater
WO1999055377A2 (en) 1998-04-28 1999-11-04 Applied Research Systems Ars Holding N.V. Polyol-ifn-beta conjugates
US6703381B1 (en) 1998-08-14 2004-03-09 Nobex Corporation Methods for delivery therapeutic compounds across the blood-brain barrier
DK1656952T3 (da) 1998-10-16 2014-01-20 Biogen Idec Inc Polyalkylenglycolkonjugater af interferon beta-1A og anvendelser deraf
KR100698559B1 (ko) * 1999-06-11 2007-03-21 넥타르 테라퓨틱스 에이엘, 코포레이션 키토산 및 폴리(에틸렌 글리콜) 또는 관련 폴리머로부터유래되는 하이드로겔
HUP0302674A2 (hu) 1999-08-27 2003-11-28 Maxigen Aps. Új, béta-interferon-szerű molekulák
US7144574B2 (en) 1999-08-27 2006-12-05 Maxygen Aps Interferon β variants and conjugates
US6531122B1 (en) 1999-08-27 2003-03-11 Maxygen Aps Interferon-β variants and conjugates
AU781839B2 (en) 1999-12-22 2005-06-16 Nektar Therapeutics Sterically hindered derivatives of water soluble polymers
US6413507B1 (en) * 1999-12-23 2002-07-02 Shearwater Corporation Hydrolytically degradable carbamate derivatives of poly (ethylene glycol)
US7052686B2 (en) * 2000-09-29 2006-05-30 Schering Corporation Pegylated interleukin-10
US7053150B2 (en) 2000-12-18 2006-05-30 Nektar Therapeutics Al, Corporation Segmented polymers and their conjugates
TW593427B (en) 2000-12-18 2004-06-21 Nektar Therapeutics Al Corp Synthesis of high molecular weight non-peptidic polymer derivatives
UA82983C2 (ru) * 2001-02-01 2008-06-10 Байоджен Айдек Ма Інк. Полимерные коньюгаты найбластина и способы их использования
EP2080771A3 (en) 2001-02-27 2010-01-06 Maxygen Aps New interferon beta-like molecules
US7009033B2 (en) 2001-07-02 2006-03-07 Polymer Source Inc. Heterofunctional polyethylene glycol and polyethylene oxide, process for their manufacture
ES2654819T3 (es) * 2001-10-18 2018-02-15 Nektar Therapeutics Conjugados poliméricos de antagonistas de opioides
AP2004003050A0 (en) * 2001-11-20 2004-06-30 Pharmacia Corp Chemically modified human growth hormone conjugates
KR100488351B1 (ko) 2001-12-11 2005-05-11 선바이오(주) 신규한 폴리에틸렌글리콜-프로피온알데히드 유도체
US6916962B2 (en) 2001-12-11 2005-07-12 Sun Bio, Inc. Monofunctional polyethylene glycol aldehydes
US6956135B2 (en) 2001-12-11 2005-10-18 Sun Bio, Inc. Monofunctional polyethylene glycol aldehydes
US7041855B2 (en) 2001-12-11 2006-05-09 Sun Bio, Inc. Monofunctional polyethylene glycol aldehydes
AU2002357806A1 (en) * 2001-12-11 2003-06-23 Sun Bio, Inc. Novel monofunctional polyethylene glycol aldehydes
EE05509B1 (et) * 2002-01-18 2012-02-15 Biogen@Idec@Ma@Inc Aktiveeritud polalkleenglkoolpolmeer ja seda sisaldavad kompositsioonid
NZ540490A (en) 2002-09-09 2007-10-26 Nektar Therapeutics Al Corp Water-soluble polymer alkanal conjugates with human growth hormone
EA008866B1 (ru) 2002-12-26 2007-08-31 Маунтин Вью Фамэсьютикэлс, Инк. ПОЛИМЕРНЫЙ КОНЪЮГАТ МОДИФИКАЦИЙ ИНТЕРФЕРОНА-β, ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЕ ПРОДУКТЫ НА ЕГО ОСНОВЕ И СПОСОБ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ
US20110165122A1 (en) * 2009-11-10 2011-07-07 The Regents Of The University Of California Method for targeted and sustained antiviral therapy

Also Published As

Publication number Publication date
EP3025726A1 (en) 2016-06-01
CA2952488A1 (en) 2003-07-31
US20120014916A1 (en) 2012-01-19
LU93162I2 (fr) 2016-10-03
EA009783B1 (ru) 2008-04-28
NO2017013I1 (no) 2017-04-10
NL300826I2 (sr) 2017-03-16
DK3025726T3 (da) 2019-12-09
MXPA04006855A (es) 2005-04-19
NO2026002I1 (no) 2026-01-13
US8524660B2 (en) 2013-09-03
CY1117349T1 (el) 2017-04-26
PL213322B1 (pl) 2013-02-28
IS2989B (is) 2017-11-15
HK1072721A1 (zh) 2005-09-09
WO2003061577A2 (en) 2003-07-31
EP3669887A1 (en) 2020-06-24
EP1476181B1 (en) 2016-03-23
EP3025726B1 (en) 2019-11-20
EA200701386A1 (ru) 2007-10-26
AU2003210564B2 (en) 2008-10-23
BRPI0306993B8 (pt) 2021-05-25
FR16C0034I1 (sr) 2016-09-23
BG66525B1 (bg) 2016-04-28
CA2473526C (en) 2013-10-22
JP2013136756A (ja) 2013-07-11
ME00239B (me) 2011-05-10
GEP20064024B (en) 2007-01-10
US20050107277A1 (en) 2005-05-19
KR20040081463A (ko) 2004-09-21
EE05509B1 (et) 2012-02-15
HUE028163T2 (en) 2016-11-28
ZA200406555B (en) 2005-11-30
JP2012255156A (ja) 2012-12-27
PL397261A1 (pl) 2012-03-26
SI1476181T1 (sl) 2016-10-28
CY2016027I1 (el) 2017-06-28
HUP0500457A2 (hu) 2005-08-29
CY1122841T1 (el) 2021-10-29
BG108839A (bg) 2005-04-30
GEP20074024B (en) 2007-01-10
HUE047557T2 (hu) 2020-04-28
IL163006A (en) 2011-01-31
EP1476181A4 (en) 2008-11-19
CA2753899A1 (en) 2003-07-31
PT3025726T (pt) 2020-01-09
HU230473B1 (hu) 2016-07-28
IS7353A (is) 2004-07-15
EE200400105A (et) 2004-12-15
EA200400962A1 (ru) 2005-06-30
EA011829B1 (ru) 2009-06-30
ES2774801T3 (es) 2020-07-22
SK3102004A3 (sk) 2005-01-03
WO2003061577A8 (en) 2008-11-20
BR0306993A (pt) 2005-09-06
CN101700401A (zh) 2010-05-05
JP2016014022A (ja) 2016-01-28
DK1476181T3 (en) 2016-05-23
CA2840490A1 (en) 2003-07-31
CA2753899C (en) 2014-03-25
MEP35608A (hr) 2011-02-10
NO2017013I2 (no) 2018-08-20
NZ534708A (en) 2007-05-31
SI3025726T1 (sl) 2020-03-31
HUP0500457A3 (en) 2012-09-28
HK1143553A1 (zh) 2011-01-07
WO2003061577A3 (en) 2003-10-02
NO20151082A1 (no) 2015-08-26
JP2005526151A (ja) 2005-09-02
ES2566797T3 (es) 2016-04-15
CN1630530A (zh) 2005-06-22
CY2016027I2 (el) 2017-06-28
CA2952488C (en) 2019-05-07
US8017733B2 (en) 2011-09-13
HUS1600035I1 (hu) 2016-10-28
KR100964411B1 (ko) 2010-06-15
NO339857B1 (no) 2017-02-06
CZ2004877A3 (cs) 2004-12-15
NO344612B1 (no) 2020-02-10
JP6030717B2 (ja) 2016-11-24
UA82184C2 (uk) 2008-03-25
FR16C0034I2 (fr) 2019-10-04
PL372728A1 (en) 2005-08-08
CA2840490C (en) 2017-02-28
BRPI0306993B1 (pt) 2020-03-10
BE2016C040I2 (sr) 2022-05-17
CA2473526A1 (en) 2003-07-31
RS63504A (sr) 2007-02-05
NO20043422L (no) 2004-10-11
JP2009235409A (ja) 2009-10-15
JP5275125B2 (ja) 2013-08-28
HK1224185A1 (en) 2017-08-18
EP1476181A2 (en) 2004-11-17
CN101700401B (zh) 2013-08-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RS55578B1 (sr) Polimerna jedinjenja polialkilena i njihova upotreba
AU2003210564A1 (en) Polyalkylene glycol with moiety for conjugating biologically active compound
JP2005526151A5 (sr)
US20170049904A1 (en) Polyalkylene polymer compounds and uses thereof
HK1224185B (en) Polyalkylene polymer compounds and uses thereof
HK1072721B (en) Polyalkylene polymer compounds and uses thereof