RS55713B1 - Vezikule koje obuhvataju epidermalni faktor rasta i supstance koje isti sadrže - Google Patents

Description

Oblasti tehnike

[0001]Ovaj pronalazak spada u oblasti ljudske i veterinarske medicine, kozmetike i inženjeringa tkiva, posebno u oblast sistema za otpuštanje vezikularnog tipa koji u svom sastavu obuhvataju epidermalni faktor rasta (EGF). Vezikule iz ovog pronalaska imaju poboljšanu terapijsku efikasnost u odnosu na slobodni EGF.

Prethodno stanje tehnike

[0002]Sistemi za isporuku leka zasnovani na vezikularnim sistemima, obično lipozomima, sastavljeni od amfifilnih molekula koji obuhvataju terapijski aktivnu supstancu, čine jedan od najšire korišćenih sistema u farmaceutskom sektoru, zato što mogu da obezbede povećanu stabilnost na aktivni princip, poveća njegovu permeabilnost kroz biološke membrane, i omoguće sporo ispuštanje aktivnog sastojka bez potrebe za ponovljenim primenama.

[0003]EGF je jedan od glavnih faktora rasta koji stimuliše proliferaciju i pokretljivost ćelija tokom regeneracije tkiva. Takođe pomaže da se zadrži hemostaza tkiva kroz regulaciju proliferacije i migracije ćelija epitela. Pored toga, EGF indukuje angiogenezu, koja obezbeđuje nutritivnu podršku za tkivo (Hudson and McCawley, Microsc. Res. Tech. 1998, 43: 444-455; Koivisto et al., Exp. Cell Res. 2006, 312: 2791-2805; Liang et al., Wound Repair Regen. 2008, 16: 691-698J. Ovaj faktor rasta ima više aplikacija u oblasti farmacije (Wong et al., Biotechnol. Genet. Eng. Rev. 2001, 18: 51-71; Girdler et al., Am. J. Clin. Oncol. 1995, 18: 403-406; Haedo et al., Rev. Esp. Enferm. Dig. 1996, 88: 409-413; Majima, Ophthalmologica 1998, 212:250-256); u kozmetici (Hasegavva and Yamamoto, Mech. Ageing. Dev. 1992, 66:107-114,Patent No.US 5.618.544) i inženjeringu tkiva (Christopher et al., Biomacromolecules 2011, 12: 3139-3146J.

[0004]Razvijene su formulacije epidermalnog faktora rasta (EGF) koje koriste različite lipozomne sisteme. Neki primeri su EGF integracija u unilamelarnim lipozomima koji obuhvataju fosfatidilglicerol (PG), fosfatidilholin (PC) i holesterol (Brown et al., Ann. Surg. 1988, 208: 788-794J. Uključivanje epidermalnog faktora rasta (EGF) je takođe prijavljeno u lipozomima koji se sastoje od više ploča (višelamelarnim) takođe obuhvata PC, holesterol i hijaluronsku kiselinu (Yerushalmi, et al., Arch. Biochem. Biophvs. 1994, 313: 267-273); ili obuhvataju holesterol i dipalmitoilfosfatidilholin (DPPC)fAlemdaroglu et al., J.Biomed. Mater.Res. A 2008, 85A: 271-283; Degim et al., Int. Wound. J. 2011, 8: 343-354). Još jedna klasa lipozoma koji su registrovani jesu multivezikularni viševezikularni lipozomi koji obuhvataju dioloilfosfatidilholin (DOPC), dimiristoil fosfatidilglicerol (DMPG), holesterol i triolein (Li et al., Arch. Pharm. Res. 2005, 28: 988-994J.

[0005]Sa druge strane, registrovani su lipozomi koji obuhvataju katjonske lipide konjugovane na EGF (Kikuchi et al., Biochem. Biophvs. Res. Commun. 1996, 227: 666-671); polietilen glikolom (PEG) obloženi lipozomi, koji takođe obuhvataju holesterol i dioloilfosfatidiletanolamin (DOPE) u kombinaciji sa PC ili DPPC (li et al., Int. J. Pharm. 2003, 258: 11-19). Lipozomi obuhvataju DPPC i lizofosfatidilholin (LPC) su takođe prijavljeni (Saddi et al., The Angle Orthodontist 2008, 78: 604-609; Alves et al., Life Sci. 2009, 85: 693-699).

[0006]EGF formulacije koje koriste lipozomne sisteme su takođe zaštićene patentima, tako da ona koja opisuje gel supstancu od EGF/lipozoma i postupke koji obuhvataju hvatanje EGF u lipozome koji obuhvataju neutralne i negativno naelektrisane fosfolipide (Patent No. US 4944948); gel supstancu lipozoma i postupke koji koriste negativno naelektrisane lipozome i EGF, i obuhvataju negativno naelektrisane lipide, kao što je: PG, PC i holesterol (međunarodna prijava patenta br. WO 9009782). Još jedna prijava patenta koja se odnosi na topikalnu primenu EGF u lipozomima da se spreči amputacija dijabetesnog stopala, a koriste se i lipozomi koji obuhvataju PC i natrijum deoksiholat. Ova prijava patenta je ograničena na upotrebu bilo kog tipa lipozoma/niozoma EGF za topikalnu terapiju ishemijskih lezija stepena IV i V dijabetesnog stopala (međunarodna prijava patenta. WO 2007/073704). U prethodnom stanju tehnike, integraciju epidermalnog faktora rasta (EGF) u vezikularnih sisema su činili holesterol i katjonski surfaktanti nisu pronađeni.

[0007]Tradicionalni postupci za dobijanje lipozoma, kao što je tankoslojna evaporacija (Agravval et al., J. Liposome Res. 2005, 15: 141-155), dehidracija-rehidracija (Kirby and Gregoriadis, Nat. Biotechnol. 1984, 2: 979-984), zamrzavanje-otapanje (Ristori et al., Biophvs. J. 2005, 88: 535-547) i ekstruzija (MacDonald et al., Biochim. Biophvs. Acta 1991, 1061: 297-303) imaju izvesne nedostatke. Neki od ovih nedostataka se povezuju sa upotrebom velikih količina rastvarača, koji se teško eliminiše posle toga, ili sa visokim temperaturama neophodnim za neke od ovih postupaka, ograničavaju njihovu upotrebu na toplotno stabilne supstance. Sa druge strane, veličina i nanostrukturisanje materijala se teško kontrolišu i ovi postupci imaju slabu reproduktivnost tokom proporcionalnog povećanja (procesi iz više faza). Još jedan problem sa preparatima lipozoma je njihova slaba stabilnost.

[0008]U preradu materijala sa komprimovanim fluidima (CFs), ili gustim gasovima, i u tečnom ili superkritičnom stanju, kao rastvarača, ohrabruje velika očekivanja na akademskom i na industrijskom nivou, za pripremu mikro i nanostrukturisanih materijala kao što su: materijali čestica, vezikularni sistemi, kompozitne čestice, strukturisane površine, itd., sa većom strukturnom homogenošću nego što je postignuto uobičajenim postupcima prerade (Holmes et al., Chem. Eur. J. 2003, 9: 2144-2150; Cooper, Adv. Mater. 2001, 13: 1111-1114; Cooper, Adv. Mater. 2003, 15: 1049-1059and VVoodset al., J. Mater. Chem. 2004, 14: 1663-1678). CF ili gusti gas je supstanca koja pri normalnim uslovima pritiska i temperature postoji kao gas ali povećanje pritiska može biti pretvoreno u tečnosti ili superkritične fluide, i može se koristiti kao podloga sa rastvaračem za hemijsku preradu i za preradu materijala. Najčešće korišćeni CF je ugljen dioksid (CO2), klasifikovan kao zeleni rastvarač, zato što je netoksičan, nezapaljiv, lako se uklanja, ne ostavlja ostatke u česticama, nije skup i lako se oporavlja. Još od ranih 90-tih godina XX veka, razvijen je niz metodologija koja koristi CF za pripremu fino podeljenih materijala, sa mikro, submikro i nanoskopskim veličinama čestica fJung and Perrut, J. Supercrit. Fluid, 2001, 20: 179-219). Rastvarajuća snaga CF može biti modifikovana promenama temperature i sastava, kao u slučaju uobičajenih tečnih rastvarača, i takođe promenama pritiska, koje se prenose mnogo brže unutar rastvora. Samim tim, ovi postupci taloženja imaju zajedničku mogućnost postizanja veoma visokih klasa supersaturacije u veoma kratkim vremenskim intervalima, unapređenje nukleacije iznad kristalnog rasta i time dobijanjem mikro ili nanočestica sa veoma uskim raspodelama veličine, kontrolisanom unutrašnjom strukturom i organizacijom supramodela.

[0009]Jedan od procesa da se dobiju mikrostrukturisani ili nanostrukturisani materijali sa CF je postupak koji se zove DELOS-SUSP Deprezurizacija ekspandirane suspenzije tečnog organskog rastovra-(međunarodna prijava patenta br. WO 2006/079889;Patent No.EP 1843836; Cano-Sarabia et al., Langmuir 2008, 24: 2433-2437), koja se zasniva na otpuštanju pritiska organskog rastvora prethodno ekspandiranog pomoću CF, koji proizvodi bilo mikrodispergovani ili nanodispergovani sistem pomoću pomenute deprezurizacije. U ovom postupku, CF deluje kao ko-rastvarač, potpuno mešljiv, pod izvesnim uslovima pritiska i temperature, sa organskim rastvorom rastvarača koji treba stabilizovati kao mikrodispergovani ili nanodispergovani sistem. Pomenuta stabilizacija se postiže u prisustvu aditiva u podlozi, obično vodenih, na kojima se izvodi uklanjanje pritiska ekspandiranog rastvora. Aditivi mogu biti amulzifikatori, jonski i nanojonski deterdženti, površinska sredstva, koloidni stabilizatori i protektori. Upotrebom ovog postupka mogu se dobiti mikrodispergovani sistemi i/ili danodispergovani sistemi, kao što su lipozomi, emulzije ili suspenzije. Lipozomi ili vezikule se sastoje od holesterola i drugih agenasa membrane, kao što su fosfolipidi i surfaktanti, i njihova priprema zahteva rastvaranje holesterola i/ili drugih lipida u ekspandiranom organskom rastvoru i a uklanjanje pritiska u vodenom rastvoru surfaktanta.

[0010]Za moguće obuhvatanje aktiva u vezikule ili lipozome od strane DELOS-SUSP, i da se generišu odgovarajuće vezikule, neophodno je rastvoriti aktivni sastojak u početno proširenom rastvoru, ili u vodenom rastvoru, u kom se izvodi uklanjanje pritiska (deprezurizacija) pomenutog proširenog rastvora i u oba slučaja, ovaj rastvor mora da se izvede u prisustvu lipida, deterdženata ili površinski aktivnih agenasa.

[0011]Među katjonskim surfaktantima, taj tip četvorovalentnog amonijaka (QUATs) se naširoko koristi u farmaciji i kozmetici. U oblasti farmacije, oni se koriste kao tropske, oftalmičke, oralne, bukalne i nazalne putanje primene leka. Prethodno, priprema holesterokcetiltrimetilamonijak bromid (CTAB) nanovesikule uz korišćenje DELOS- SUSP tehnologije je prijavljeno. Jedan primer inkorporacije jedinjenja rastvorljivih u vodi ovom tehnologijom se opisuje u referenci "Lipozomi i drugi vezikularni sistemi: strukturne karakteristike postupaka pripreme, i upotreba u nanomedicini (Liposomes and other vesicular svstems: structural characteristics, methods of preparation, and use in nanomedicine)" (Napredak u moelkularnoj biologiji i translacionoj nauci (Progress in Molecular Biologv and Translational Science), Elsevier, 2011, vol. 104, pp. 1-52), gde se koriste holesteroLCTAB vezikule za enkapsulaciju i primenu antibiotika gentamicina. Mora se naglastiti da je registrovana enkapsulacija gentamicina veoma niska (<2%). Ovaj tip vezikule nikada nije korišćen da obuhvati proteine. Poznato je da su jonski deterdženti agensi koji prouzrokuju denaturaciju proteina (Akin et al., Anal. Biochem. 1985, 145: 170-176; Andersen et al., J. Mol. Biol. 2009, 391: 207-226). Denaturacija ljudskog seruma albumina posle dodatka CTAB je nedavno prikazana pomoću Raman spektroskopije (Vlasova and Saletskv, Laser Phys. 2011, 21: 239-244). Denaturaciju, po pravilu, prati gubitak funkcionalnih svojstava proteina.

[0012]Zbog svih gore pomenutih razloga, i dalje je od interesa postići nove sisteme otpuštanja EGF, lake za standardizovanje, sa visokom homogenošću na strukturnom nivou i njihovim fizičko-hemijskim svojstvima, koja poboljšavaju farmakološka svojstva i/ili povećavaju terapijsku aktivnost EGF.

Kratak opis pronalaska

[0013]Ovaj pronalazak se odnosi na vezikule, kao sistem isporuke leka, koje obuhvataju EGF, katjonski surfaktant i holesterol ili jedan od njegovih derivata i imaju veću terapijsku delotvornost od onih koji su prethodno opisani.

[0014]Ovaj se pronalazak takođe odnosi na postupak za pripremu pomenutih vezikula koji obuhvata EGF, katjonski surfaktant i holesterol ili njegove derivate, koji obuhvata: a) pripremu vodenog rastvora EGF i katjonski surfaktant, b) rastvaranje holesterola, ili jednog od njegovih derivata, u organskom rastvaraču ekspandiranom sa komprimovanim fluidom (CF), c) sinteza vezikula pomoću deprezurizacije rastvora koji nastaje iz faze b) na rastvoru koji se dobija kao rezultat iz faze a).

[0015]Farmaceutska supstanca naznačena time što obuhvata vezikule koje obuhvataju epidermalni faktor rasta (EGF), katjonski surfaktant i holesterol, ili njihove derivate, i barem jedan farmaceutski prihvatljiv ekscipijent je takođe predmet ovog pronalaska. Još jedan cilj pronalaska je upotreba pomenutih vezikula za proizvodnju lekova i kozmetičkih sredstava.

[0016]Farmaceutske supstance iz ovog pronalaska, koje sadrže vezikule epidermalnog faktora rasta (EGF) sa drugim komponentama, su korisne kao lekovi da ubrzaju postupak izlečenja čireva dijabetesnog stopala i drugih kompleksnih rana, kao što su: venski čirevi, dekubitusni čirevi, opekotine, između ostalog; za popravku struktura prednje komore kod oštećenih očiju, za sistemski mukozitis i za sve druge bolesti gastrointestinalnog trakta koje obuhvataju potrebu da se regeneriše mukoza i submukoza. Preciznije, utvrđeno je da ove vezikule imaju značajno veću terapijsku delotvornost za lečenje čireva dijabetesnog stopala, i venskih čireva, u odnosu na prethodno opisano u stanju tehnike.

[0017]Ovaj se pronalazak takođe odnosi na kozmetički proizvod naznačen time da obuhvata vezikule EGF, katjonski surfaktant i holesterol ili njihove derivate.

Kratak opis slika nacrta

[0018]Slika 1.Šematski prikaz opreme za dobijanje vezikula koje sadrže EGF, katjonski surfaktant i holesterol ili derivat holesterola gde: C, Kolektor; H, Izmenjivač toplote; P, Pumpa; R, Reaktor; V, Ventil; RD, Sigurnosni disk; ST, Mešač; FL, Filter; TI, Indikator temperature; Pl, Indikator pritiska; PIC, Regulator indikatora pritiska; F, Merač protoka.

Slika 2.Raspodela veličine čestica dinamičkim raspršenjem svetlosti (DLS) vezikula koji drže konstantan odnos CTAB:holesterol na 1 M:1 M i promenljivi odnos EGF:holesterola (0 pM:1 M ( —&—

), 5uM:1M (--■▼-- -), 15 uM:1 M ( O ), 25 uM:1 M (—i—) i 40 uM:1 M (- *- -) (A); i drže u konstantnom odnosu tetradecil metilamonijak bromid (cetrimid):holesterol na 1 M:1 Mi variranje odnosa EGF: holesterola (0 uM:1M (--*■--). 5 uM:1 M (—&—), 15 pM:1 M (- *■ -), 25 pM:1 M (—i—) i 40 pM:1 M(—*—) (B).

Slika3. Slike krio-prenosne elektronske mikroskopije (Cryo-TEM) EGF vezikula sa holesterolom: CTAB:EGF supstanca (A), holesterol:cetrimid:EGF (B), holesterohbenzalkonijum hlorid (BKC):EGF supstanca (C) i (3-Sitosterol:CTAB:EGF(D)sa QUAT:holesterol ili (3-Sitosterol odnos od 1M:1M i EGF:holesterol ili p-Sitosterol u odnosu od 5 uM:1 M.

Slika 4.Specifična biološka aktivnost različitih EGF preparata u ogledu sa proliferacijom ćelije, pri čemu slobodni EGF, DPPC:holesterol lipozomi (u odnosu DPPC:holesterol 1M:1M i EGF:holesterol 25 uM:1M) i CTAB:holesterol vezikule (A) i cetrimid:holesterol vezikule (B), koje drže u konstantnom odnosu QUATs:holesterol 1M:1M i promenljivim odnos EGF:holesterol (5 uM:1M, 15 uM:1M i 25

uM:1M) odnosi se porede.

Slika 5.Profil proteolitske degradacije, posle izloženosti tripsinu na 37 °C tokom različitih vremenskih intervala, slobodnog EGF i različitih preparata vezikule drže u konstantnom odnosu CTAB:holesterol (A) i odnos cetrimid:holesterola (B) na 1M:1M i promenljivi odnos EGF:holesterola (5 uM:1 M, 15 uM:1 Mi25uM:1 M).

Slika 6.Fotografije evolucije zaceljivanja čireva dijabetesnog stopala odgovaraju pacijentu sa JLG na početku terapije (A), posle 4 nedelje (B) i 8 nedelja (C) terapije formulacijom u vidu topikalnog spreja koja sadrži vezikule gde je odnos CTAB:holesterol od 1 M:1 M i odnos EGF:holesterola od 5 uM:1 M, sa EGF ekvivalentnom koncentracijom od 15 ug/mL.

Slika 7.Fotografije napretka zaceljivanja čira dijabetesnog stopala odgovaraju pacijentu ZEM na početku lečenja (A), posle 4 nedelje (B) i 8 nedelja (C) lečenja. Tokom prve 4 nedelje lečenje je izvedeno infiltranjem sa roditeljskom formulacijom koja sadrži vezikule gde je odnos BKC:holesterol 1 M:1 M i odnos EGF:holesterol 5 uM:1 M, sa ekvivalentnom koncentracijom EGF od 75 ug/mL. Druge 4 nedelje, da se upotpuni 8 nedelja, lečenje je izvedeno korišćenjem formulacije topikalnog spreja koja sadrži vezikule sa odnosom CTAB:holesterola 1 M:1M i odnos EGF:holesterol 5 uM:1 M, sa ekvivalentnom koncentracijom EGF od 15 ug/mL.

Detaljan opis ovog pronalaska

[0019]Ovaj pronalazak obezbeđuje vezikule koje karakteriše sadržavanje epidermalnog faktora rasta (EGF), katjonskog surfaktanta i holesterola ili njihovih derivata. U jednom izvođenju ovog pronalaska, katjonski surfaktant je tipa četvorovalentnog amonijaka.

[0020]U kontekstu ovog pronalaska pojam "EGF" se odnosi na bilo koju varijantu EGF molekula koja zadržava njihovu biološku aktivnost; na primer, molekuli zarubljeni na C terminalu (Calnan et al., Gut 2000, 47: 622-627J; ili molekuli zarubljeni na N terminalu (Svodoca et. al., Biochim. Biophvs. Acta 1994, 1206: 35-41; Shin et al., Peptides 1995, 16:205-210). EGF je moguće dobiti rekombinantnom DNK tehnologijom korišćenjem kvasaca kaoSaccharomyces(Valdes et al., Biotecnol. Apl. 2009, 26: 1-9J iliPichia pastoris(Research Journal of International Studies 2009, 10: 36-46); korišćenjem bakterija, kao što jeEscherichia coli(Yoon et al., Biotechnol. Bioprocess Eng. 1997, 2: 86-89; Abdull Razis et al., Appl. Biochem. Biotechnol. 2008, 144: 249-261); ili postupcima hemijske sinteze (Shin et al., Peptides 1995, 16: 205-21 Oj. EGF objekat iz ovog pronalaska takođe obuhvata koja god da je varijanta dobijena prethodno opisanim postupcima, posle modifikovanja bilo kojim postupkom iz prethodnog stanja tehnike, kao što je: supstitucija amino kiseline (Shiah et al., J. Biol. Chem. 1992, 267:24034-24040; Lahti et al., FEBS Lett. 2011, 585: 1135-1139; međunarodna prijava patenta br. WO 2007/065464J, i povezivanje polietilen glikola (Thomas et al., Bioconjugate Chem. 2001, 12: 529-537; Lee et al., Pharm. Res. 2003, 20: 818-825j, ili bilo kojim drugim postupkom hemijske ili genetske modifikacije.

[0021]Pojam "katjonski surfaktant" se odnosi na one surfaktante sa barem jednim pozitivnim naelektrisanjem u molekulu i takođe obuhvata kombinaciju jednog ili više katjonskih surfaktanata. Na primer, prema ovom pronalaskku, moguće je koristiti katjonski surfaktanti tipa soli tercijarnog amina, so četvorovalentnog amonijaka i alkil amonijak u zasićenim i nezasićenim heterociklima.

[0022]U ovom pronalasku, pojam "tip četvorovalentnog amonijaka (QUATs) katjonski surfaktant" se odnosi na soli četvorovalentnog amonijaka u kojima barem jedan supstituent azota jeste dugi lanac. Jedinjenja kao što je CTAB, cetrimid i BKC ili njihova mešavina su obuhvaćena među QUATs. U preporučenom izvođenju ovog pronalaska, katjonski surfaktant korišćen kao surfaktant prihvatljiv u farmaciji. QUAT kao i ostatale katjonske surfaktante moguće je dobiti iz komercijalno dostupnih izvora, sa farmaceutskim i kozmetičkim kvalitetima.

[0023]U ovom pronalasku, pojam "vezikules" se odnosi na koloidne mikročestice i nanočestice, koje su između 25 nm i 5 um i formulišu se pomoću jednog ili više dvostrukih slojeva amfifilnih molekula koji sadrže vodenu fazu.

[0024]U jednom izvođenju pronalaska, vezikule imaju molarni odnos katjonskih surfaktanata prema holesterolu (ili njihovih derivata) u opsegu od 10 M:1 M do 1 M:5 M i molski odnos od EGF prema holesterolu (ili njegovim derivatima) koji je u opsegu od 0,5 uM:1 M do 100 uM:1 M.

[0025]Pojam "derivati" holesterola, u ovom pronalasku, se odnosi na molekule familije steroida, generalno su dobijeni iz molekula prethodnika holesterola i imaju lipofilni karakter.

[0026]U jednom izvođenju ovog pronalaska, vezikule koje sadrže EGF karakteriše to što imaju unilamelarnu strukturu i približnu srednju veličinu između 25 i 500 nm, preporučlijvo između 50 i 300 nm. U specifičnom izvođenju, ovaj se pronalazak odnosi na vezikule u kojima se EGF ugrađuje u dvostruki sloj vezikule. Približna veličina i morfologija vezikula se procenjuje na Cryo-TERM i raspodela veličine vezikule se karakteriše pomoću DLS.

[0027]Neočekivana je činjenica da vezikule iz ovog pronalaska pokazuju značajno povećanje biološke potentnosti EGF (izmerenoin vitro)u poređenju sa slobodnim EGF i EGF u holesterohDPPC lipozomima. Pored toga, ove vezikule su sposobne da štite EGF od napada proteaze, veoma važna karakteristika za postizanje odgovarajuće biodostupnosti EGF na mestu aktivnosti, samim tim, povećanje njegove terapijske delotvornosti.

[0028]Kod ovog pronalaska, po prvi put, sintetisane su EGF vezikule koje poboljšavaju neke od farmaceutskih i farmakoloških svojstava ovog faktora rasta, kao što je njegova jačina i stabilnost. Pokazano je da stepen ugradnje EGF u strukturi vezikula ostaje stabilan tokom barem jedne godine. Pored toga, one omogućavaju povećanje permeabilnosti kroz biološke membrane.

[0029]Vezikule iz ovog pronalaska imaju dodatnu prednost antimikrobnog i antifungicidnog dejstva, koje je poželjno za supstance koje se koriste za lečenje složenih rana i drugih lezija koje su prijemčive na terapiju epidermalnim faktorom rasta (EGF).

[0030]Kod jednog izvođenja ovog pronalaska, vezikule koje sadrže EGF se dobijaju tehologijom komprimovanog fluida (CF). U određenom izvođenju, tehnologija komprimovanog fluida (CF) koja se koristi da se dobiju vezikule obuhvata postupak koji obuhvata a) pripremu vodenog rastvora EGF i katjonski surfaktant; b) rastvaranje holeserola i njegovih derivata u organskom rastvaraču ekspandiranom sa komprimovanim fluidom (CF), i c) sintezu vezikkula uklanjanjem pritiska rastvora koji nastaje kao rezultat iz faze b) na rastvorima koji se dobijaju iz faze a). U preporučenom izvođenju, katjonski surfaktant korišćen u fazi a) pripada tipu četvorovalentnog amonijaka.

[0031]Ovaj se pronalazak takođe obezbeđuje postupak za pripremu vezikula koji obuhvata EGF, katjonski surfaktant i holesterol ili njihove derivate naznačene time što sadrže a) preparat iz vodenog rastvora EGF i katjonskog surfaktanta, b) rastvaranje holesterola ili njegovih derivata u organskom rastvaraču ekspandiranom sa komprimovanim fluidom (CF), i c) sintezu vezikula deprezurizacijom rastvora koji nastaje kao rezultat iz faze b) na rastvoru koji se dobija iz faze a). U jednom izvođenju ovog pronalaska, gore opisani postupak obuhvata katjonski surfaktant tipa četvorovalentnog amonijaka.

[0032]U jednom izvođenju ovog pronalaska, organski rastvarač u fazi b) gore pomenutog procesa je rastvarač izabran iz grupe formirane pomoću monohidridnih alkohola, kao što je: etanol, metanol, 1-propanolol, 2-propanolol, 1-butanol, 1-heksanol, 1-oktanol i trifluoroetanol; polihidroksilnih alkohola, kao što je: propilen glikol, PEG 400 i 1,3- propandiol; ketoni, kao što je aceton, metil etil keton i metil izobutil keton; etilendiamin, acetonitril, etil acetat i njihove mešavine. U svakom slučaju, kakva god da je priroda organskog rastvarača, komponenta lipida mora da bude rastvorljiva u njoj i dalje, pomenuti rastvarač mora da bude neizostavno mešljiv u komprimovanom fluidu i vodi. Pored toga, izabrani organski rastvarač mora da ima relativno nisku toksičnost.

[0033]Relativna koncentracija EGF i surfaktanta u početnom puferskom rastvoru i koncentraciji holesterola u organskom rastvaraču se određuje željenim odnosom holesterokkatjonski surfaktant:EGF u finalnoj vezikuli. Generalno, odnos holesterol: katjonski surfaktant:EGF može uticati na fizikohemijska i biološka svojstva različitih vezikula koje su dobijene.

[0034]U drugom izvođenju ovog pronalaska, komprimovani fluid (CF) korišćen u postupku opisanom prethodno je komponenta izabrana između CO2, etana, propana, hidrohlorofluorougljenika (npr., CFC-22), i hidrofluorougljenika (npr., HFC-134A). Preporučljivo, komprimovani fluid (CF) u fazi b) jeste CO2, se smatra ekološkim rastvaračem, jer je netoksičan, nezapaljiv, nekorozivan, i nije štetan za okolinu i štaviše, u prirodi ga ima u izobilju.

[0035]U jednom izvođenju ovog pronalaska, postupak za pipremu vezikule epidermalnog faktora rasta (EGF) se izvodi u aparatu, kao što je prikazano na Slici 1. Sastoji se od reaktora pod visokim pritiskom (R) na koji se dodaje rastvor holesterola u etanolu u koncentraciji (Ci) na atmosferskom pritisku i radnoj temperaturi (T=TW). U drugoj fazi, komprimovani CO2se dodaje sve dok se radni pritisak (P=Pw) ne dostigne, proizvodnja volumetrijske ekspanzije rastvora u molarnoj frakciji Xqq2- Dodavanje se vrši kroz ventil V-1 korišćenjem pumpe P1, drži se ostatak ventila zatvorenim. Ovaj sistem se zadržava na pritisku Pwi temperaturi Tw, tokom navedenog vremena, da se osigura potpuna homogenizacija i toplotna ravnoteža. Posle ovog vremena, V-4 se odvara da se spoji reaktor R na filter FL, koji je prethodno stavljen pod pritisak sa N2do Pwtako što se ostali ventili drže zatvorenim. Otvaranje V-6 omogućava otpuštanje pritiska volumetrijski ekspandiranog rastvora na vodenom EGF rastvoru pri koncentraciji (C2) i surfaktant pri koncentraciji (C3) upumpanoj kroz P2. U ovoj finalnoj fazi, tok N2, je dodat kroz V-2 na Pw, je korišćen kao klip da se pritisne ekspandirani rastvor i da se drži konstantni pritisak unutar reaktora tokom faze uklanjanja pritiska. Prisustvo filtera FL omogućava prikupljanje bilo kakvog taloga koji može biti formiran tokom ovog postupka. Formirane vezikule su prikupljene u posudi C i naknadno čuvane u staklenim bocama na 4°C. Jednom kada se otpuštanje pritiska završi, V-6 i V-2 se zatvaraju i otpuštanje pritiska opreme se nastavlja ponovnim otvaranjem V-6.

[0036]Kod jednog izvođenja ovog pronalaska, odnos između količine komprimovanog fluida i organskog rastvarača odgovara molarnoj frakciji komprimovanog fluida od približno 0,3 do 0,95; preporučljivo od 0,5 do 0,8. U jednom određenom izvođenju, rastvaranje holesterola (ili njihovih derivata) u komprimovanom fluidu (CF) se izvodi u reaktoru pod pritiskom Pwod približno 1 do 30 MPa, i Twod približno 10 do 70 °C. Preporučljivo približna temperatura reaktora je između 10 i 50 °C.

[0037]U postupku prema ovom pronalasku, EGF se rastvara u vodenom rastvoru koji sadrži katjonski surfaktant (tenzid), čija je koncentracija iznad za njega kritične koncentracije micela.

[0038]Iznoenađuje činjenica da holesterol:QUAT:EGF vezikule sintetisane korišćenjem gore opisanog proesa, imaju prinose od ugradnje EGF vezikule veoma blizu 100%, što je značajno više od onih koji su očekivani za ugradnju bilo kog u vodi rastvorljivog molekula, imjući u obzir rezultate prethodno prijavljene za gentamicin. Ovi prinosi za holesterol:QUAT:EGF vezikule su takođe značajno viši nego prinosi dobijeni za ugradnju drugih proteina sa strukturnim svojstvima sličnim EGF, kao u vodi rastvorljiv protein goveđeg seruma albumina (BSA). Ovo se javlja čak i kada se prethodno opisan postupak DELOS-SUSP koristi za inkorporiranje pomenutog BSA, jer se dobija samo prinos inkorporiranja od 42%.

[0039]Pored toga, a i kao dodatna potvrda, ovi prinosi za EGF inkorporiranje u holesterol:QUAT vezikule su jasno veći od onih dobijenih za holesterol:DPPC:EGF vezikule, čak i ako se DELOS-SUSP proces koristi da ih pripremi.

[0040]Još jedno varijantno rešenje ovog pronalaska je farmaceutska supstanca koja obuhvata vezikule koje obuhvataju EGF, katjonski surfaktant i holesterol ili njihove derivate i barem jedan farmaceutski prihvatljiv ekscipijent. Farmaceutski prihvatljiv ekscipijent ili ekscipijenti, koje formiraju deo farmaceutske supstance iz ovog pronalaska, mogu da povećaju aktivnost vezikule. Alternativno, oni mogu pomći da se rukuje i obrađuje supstanca iz ovog pronalaska. EGF vezikule iz ovog pronalaska mogu biti formulisane u nekoliko farmaceutskih oblika, kao što je injektibilni oblik, sprej, gelovi, viskozni rastvori, kreme, masti, transdermalni flasteri, depoi, inhalirane formulacije i drugi oblici poznati onima koji su vešti u ovoj oblasti tehnike.

[0041]Različite ekscipijente je moguće umešati tokom sinteze vezikula iz ovog pronalaska ili pošto formira pogodan materijal za gore pomenute oblike doziranja. Generalno, ekscipijenti; kao što su sredstva za rastvaranje ili rastvarači, surfakttanti, pH modifikatori, antioksidansi, razblaživači, matrični sistemi, agensi za stvaranje kompleksa, pospešivači viskoznosti, disperzanti, humektanit, koloranti, srestva za poboljšanje arome, konzervansi, pospešivači permeabilnosti i drugi, moguće je koristiti za uobičajene svrhe u tipičnim količinama bez uticaja na karakteristike supstanci iz ovog pronalaska, kao što zna stručnjak u ovoj oblasti tehnike iz priručnika za farmaceute Remington (Remington's Pharmaceutical Sciences (1995)). Dodatni primeri ekscipijenata koje je moguće koristiti u farmaceutskim formulacijama EGF vezikula moguće je naći u šestom izdanju Priručnika farmaceutskih ekscipijenata (Handbook of Pharmaceutical Excipients 6th editionj.

[0042]U izvođenju iz ovog pronalaska, kao oblik farmaceutska supstanca ima kontrolisano otpuštanja ili zadržano otpuštanje. Oblici zadržanog ili kontrolisanog otpuštanja obično obuhvataju matrične sisteme, jonoizmenjivačke smole, ili pojedinačne prepreke da se reguliše difuzija EGF vezikula.

[0043]U jednom izvođenju ovog pronalaska, za pripremu farmaceutskih supstanci, EGF vezikule se uslovljavaju postupkom koncentracije-diafiltracije, korišćenjem poznatog aparata u ovoj grani tehnike. Farmaceutske supstance iz ovog pronalaska moguće je primeniti razlčitim putevima, između ostalog: sistemske, intralezione, mukozne, topikalne, transdermalne, oftalmičke, ili inhalirane formulacije

[0044]U drugom varijantnom rešenju, ovaj pronalazak obuhvata vezikule EGF, katjonski surfaktant, i holesterol ili njegove derivate za upotrebu kao lek. U jednom izvođenju ovog pronalaska, pomenuti lek je predviđen za lečenje bolesti kod kojih je neophodna pomoć za procese lečenja i regeneracije tkiva kod bilo koje vrste iz porodice sisara, pri čemu su katjonski surfaktani, holesterol i EGF koji formiraju pomenute vezikule su prihvatljivi u farmaciji. U preporučenom izvođenju, sisar je čovek.

[0045]Pomenuta medicinska upotreba obuhvata primenu delotvorne količine pomenutih veziikula za lečenje bolesti koja zahteva eksogenu EGF primenu da se regulišu procesi proliferacije, rasta i migracije epitelnih ćelija ili da se indukuje angiogeneza.

[0046]Generalno, smatra se da bi delotvorna koncentracija za primenu EGF vezikula iz ovog pronalaska (ili supstance koja ih sadrži) bila 1,0 do 200 ug/mL EGF ekvivalenata, preporučljivo 5,0 do 100 ug/mL EGF ekvivalenata po primeni. Zapremina i frekvencija primene zavisi od tipa lezije, njene veličine i korišćenog uređaja primene, i dobro je poznata ekspertima u ovoj stručnoj oblasti. Može takođe biti prikladno primeniti potrebnu dozu u dve, tri, četiri ili više poddoza u odgovarajućim intervalima tokom dana.

[0047]Tačna doza i učestalost primene zavisi od određenog stanja koje se leči i njegove ozbiljnosti, starosnog doba, težine, pola, nivoa bolesti, i opšteg fizičkog stanja pacijenta, kao i od drugih istovremenih lekova koji se primenjuju pojedincu, što je sve dobro poznato stručnjacima u ovoj oblasti. Pored toga, očigledno je da delotvorna dnevna količina može da se smanji ili poveća, zavisno od toga kako pacijent odgovara na lek, i/ili procene koju uradi lekar koji je prepisao lek iz ovog pronalaska. Dakle, gore dnevne delotvorne količine navedene koje treba razmatrati kao vodiče ili preporuke.

[0048]U jednom izvođenju ovog pronalaska, lek proizveden sa vezikulama iz ovog pronalaska se koristi za lečenje složenih rana bilo kog perifernog mekog tkiva. U nekom određenom izvođenju, složena rana je čir dijabetesnog stopala. U drugom određenom izvođenju, lek se koristi za lečenje venskih čireva, dekubitusnih čireva ili opekotina.

[0049]U još jednom izvođenju ovog pronalaska, lek se koristi za lečenje bolesti kao što je sindrom otežanog disanja kod odraslih. Lek proizveden sa vezikulama iz ovog pronalaska je takođe koristan za lečenje lezija digestivnog trakta kao što je ulcerativni kolitis, čirevi dvanaestopalačnog creva (duodenuma) i distalni kolitis. U još jednom izvođenju, lek se koristi za lečenje lezija oka.

[0050]Kozmetički proizvod naznačeni time što obuhvata vezikule EGF, katjonski surfaktant, i holesterol ili njihove derivate, i barem jedan prihvatljiv ekscipijent za lekove u kozmetici i detmatologiji je takođe deo ovog pronalaska. U ovom varijantnom rešenju pronalaska, katjonski surfaktanti, holesterol (ili njegovi derivati) i EGF su prihvatljivi za lekove i kozmetiku.

[0051]EGF vezikule iz ovog pronalaska moguće je formulisati u razlčitim kozmetičkim ili dermalnim farmaceutskim oblicima, kao čvrste supstance, tečnosti i polučvrste supstance, kao što su i bez ograničavanja na: injekcije, tečnosti atomizovane u sprej, gelovi, kreme, višestruke emulzije, vodene disperzije, mleka, balzami, losioni, pene, serumi, masti, transdermalni flasteri, brisači, depoi, balzami, prahovi, pločice, formulacije za inhaliranje i slično, u svim slučajevima, uključujući ispiranje i trajne formulacije.

[0052]Generalno, kozmetička ili dermatološka farmaceutska supstanca iz ovog pronalaska može sadržati ekscipijente kao što su, ali bez ograničavanja na, sredstva za rastvaranje ili rastvarače, surfaktanti, modifikatori pH vrednosti, antioksidansi, razblaživači, matrični sistemi, sredstva za izgradnju kompleksa, poboljšivači viskoznosti, disperzanti, ovlaživači, polimeri za želiranje, zgušnjivači, omekšivači, stabilizatori, apsorberi neprijatnog mirisa, helirajući agensi, ekstrakti biljke, esencijalna ulja, ekstrakti iz mora (ili okeana), sredstva koja dolaze iz procesa biofermentacije, mineralne soli, ekstrakti ćelije i filteri za sunce (fotozaštitni agensi organske ili mineralne prirode, aktivni naspram A i/ili B ultraljubičastih zraka), pigmenti ili boje, agensi za poboljšanje arome, konzervansi, pospešivači permeabilnosti i drugi, i njihove mešavine, ukoliko su fizički ili hemijski kompatibilni sa drugim supstancama iz ovog pronalaska. Ove ekscipijente je moguće koristiti za uobičajene svrhe i u uobičajenim količinama a da se ne utiče na karakteristike supstanci iz ovog pronalaska, kao što je poznato stručnjacima u ovoj oblasti tehnike (Dodatne primere je moguće opisati u CTFA Priručniku za kozmetičke sastojke (Cosmetic Ingredient Handbook, Twelfth Edition (2008)). Priroda takivh dodatnih ađuvansa može imati sintetičko ili prirodno poreklo, kao na primer ekstrakti biljke, ili potiče iz procesa biofermentacije.

[0053]Samim tim, upotreba EGF vezikula prethodno opisana za proizvodnju kozmetičkog proizvoda je takođe cilj ovog pronalaska. U izvođenju ovog pronalaska, kozmetički proizvod je za sprečavanje propadanja kože kao u slučaju senescencija i starenja kože.

Primeri

[0054]Sledeći primeri su prikazani u ilustrativne svrhe i ne treba ih posmatrati kao ograničenja ovog pronalaska

Primer 1. Sinteza holesterola:DPPC:EGF vezikula koršćenjem tehnologije komprimovanog fluida

[0055]Prvo, rastvor 12 mg holesterola i 24 mg od DPPC u 1,2 mL etanola se uvodi u reaktor pod visokim pritiskom od 6 mL zapremine, na atmosferskom pritisku i temperaturi (Tw= 35 °C). Komprimovani CO2se dodaje, što prouzrokuje ekspanziju rastvora da dostigne molarnu frakciju Xq02= 0,7 i radni pritisak Pyv = 10 MPa. Ovaj se sistem ostavi da se meša tokom približno 60 minuta na 10 MPa i 35 °C, da se dostigne potpuna homogenizacija i toplotna ravnoteža. Najzad, ekspandiranom organskom rastvoru se ispusti pritisak od radnog pritiska na atmosferski pritisak, na 24 mL vodenog rastvora EGF pri željenoj koncentraciji (između 15 uM i 40 uM). U ovom poslednjem koraku, struja N2na 10 MPa se koristi kao klip da pritisne volumetrijski ekspandirani rastvor da drži konstantan radni pritisak u reaktoru tokom uklanjanja pritiska.

[0056]Naknadno, vezikule se prenose na hermetički zaptivenu posudu i čuvaju sve do upotrebe na 5 ± 3

°C

[0057]Kao rezultat, DPPC:holesterol (1:1) vezikule su dobijene, sa EGF inkorporiranim pri koncentraciji između 15 uM i 40 uM. Fizički izgled, srednja veličina, raspodela veličine čestica i Z potencijal su prikazani u Tabeli 1. Srednja veličina, raspodela veličine čestica i Z potencijal su određeni pomoću DLS.

[0058]Može se odrediti da različiti preparati vezikule imaju kratkotrajne probleme stabilnosti, i imaju relativno malu srednju veličinu i indeks poludisperznosti (PDI), što ih čini atraktivnim sa farmaceutske tačke gledišta. Međutim, apsolutni Z potencijal je veoma mali (< +10 mV), prilično ispod vrednosti za koje se smatra da dozvole koloidnu stabilnost dispergovanih sistema, koji su normalno apsolutne vrednosti iznad 30 mV (Carrion et al., J. Colloid. Interface Sci. 1994, 164: 78-87J. Ova karakteristika označava da dugoročna stabilnost ovog sistema vezikule može biti kompromitovana.

Primer 2. Sinteza holesterol:CTAB:EGF vezikula koršćenjem tehnologije komprimovanog fluida

[0059]Prvo, rastvor 76 mg holesterola u 2,88 mL etanola se uvodi u reaktoru pod visokim pritiskom koji ima zapreminu od 6 mL, na atmosferskom pritisku i radnoj temperaturi (Tw= 35 °C). Komprimovani CO2se dodaje, što prouzrokuje volumetrijsku ekspanziju rastvora da dostigne molarnu frakciju Xq02= 0,7 i radni pritisak Pw= 10 MPa. Da se postigne potpuna homogenizacija i toplotna ravnoteža, sistem se ostavlja da se odmori tokom oko 60 minuta na 10 MPa i 35 °C. Najzad, ekspandiranom organskom rastvoru se uklanja pritisak od radnog pritiska do atmosferskog pritiska, na 24 mL rastvora CTAB u mQ vode (C= 2,83 mg/mL) sadrži EGF pri željenoj koncentraciji (između 1 i 40 uM). U ovom poslednjem koraku, struja N2na 10 MPa se koristi kao klip za pritiskanje holesterola u rastvoru etanola da zadrži konstantan radni pritisak u reaktoru tokom uklanjanja pritiska. Zatim, vezikule se prenose na hermetički zaptivenu posudu i čuvaju sve do upotrebe na 5 ± 3 °C.

[0060]Morfologija vezikula se procenjuje na cryo-TEM, prema postupku koji je prethodno opisan (Napredak u molekularnoj biologiji i translacionoj nauci (Progress in Molecular Biologv and Translational Science, Elsevier, 2011, vol. 104, pp. 1-52JJ.

[0061]Dobijene su CTAB:holesterol (1:1) vezikula, sa EGF inkorporiranim u koncentraciji između 1 uM i 40 uM. Rezultati za fizički izgled, srednja veličina i Z potencijal su prikazani u Tabeli 2, raspodela veličine čestica, na Slici 2A i veličina i morfologija, pomoću cryo-TEM, na Slici 3A. Kao što se vidi iz Tabele 2, različiti preparati, sa različitim proporcijama EGF holesterola, su bili stabilni. Z potencijali svih preparata su bili pozitivni, i daleko iznad + 30 mV, što predviđa povišenu dugoročnu stabilnost. Povećanje srednje veličine i PDI sa povećanje u proporciji EGF:holesterol je takođe moguće primetiti. Na slici 2A, primećuju se veoma visoko homogene raspodele veličine čestica koje imaju prosečan prečnik koji ne prelazi 200 nm. Slika 3A pokazuje da su preovladavali u vezi sa morfologijom vezikule proučavane pomoću cryo-TEM, sferoidni oblici sa unilamelarnom strukturom. Pomenute karakteristike različitih preparata, vezikule čine veoma privlačnim sa farmaceutske tačke.

Primer 3. Sinteza holesterol:cetrimid:EGF vezikula koršćenjem tehnologije komprimovanog fluida

[0062]Ove vezikule su sintetisane na sličan način sa onima u Primeru 2, ali u ovom slučaju, korišćen je vodeni rastvor cetrimida sa koncentracijom 2,61 mg/mL Dobijene su vezikule cetrimid:holesterol (1:1), sa EGF ugrađenim pri koncentraciji između 1 uM i 40 uM. Rezultati za fizički izgled, srednju veličinu i Z potencijal su prikazani u Tabeli 3, raspodela veličine čestica, može se primetiti na Slici 2B, i veličina i morfologija, pomoću cryo-TEM, na Slici 3B. Kao što se može videti u Tabeli 3, svi preparati su bili stabilni sa malom srednjom veličinom i PDI vrednostima. Srednja veličina, raspodela veličine čestica i Z potencijal su određeni pomoću DLS. Z potencijal od svih preparata je pozitivan, i daleko iznad + 30 mV, što predviđa povišenu dugoročnu stabilnost. Slika 2B pokazuje da raspodele veličine čestica jesu visoko jednoobrazne, i njihov prosečan prečnik ne prelazi 200 nm. Slika 3B pokazuje da preovladavaju sferoidni oblici unilamelarne strukture, prema cryo-TEM. Različiti preparati vezikule takođe imaju karakteristike koje ih čine veoma privlačnim sa farmaceutske tačke.

Primer 4. Sinteza holesterola:BKC:EGF vezikula koršćenjem tehnologije komprimovanog fluida

[0063]Ove vezikule su sintetizovane na sličan način onima u Primeru 2, ali u ovom primeru, sa jedne strane, korišćen je rastvor od 81,46 mg holesterola u 2,88 mL etanola, a sa druge strane, vodeni rastvor 3,0 mg/mL BKC i EGF u željenoj koncentraciji je korišćen. Dobijene su vezikule BKC:holesterol (1:1), sa EGF inkorporiranim u koncentraciji od 5 uM. Rezultati za fizički izgled, srednju veličinu, i Z potencijal su prikazani u Tabeli 4. Može se primetiti da je priprema vezikule stabilna i da ima relativno malu srednju veličinu i PDI. Srednja veličina, raspodela veličine čestica i Z potencijal su određeni pomoću DLS. Pored toga, slično gore pomenutim preparatima vezikula, koje obuhvataju u svom sastavu katjonski surfaktant tipa četvorovalentnog amonijaka, oni imaju pozitivne vrednosti Z potencijala mnogo više od + 30 mV, što za njih predviđa visoku dugoročnu stabilnost. Slika 3C pokazuje da preovladavaju sferoidni oblici unilamelarne strukture, prema proučavanju morfologije vezikule izvedenom pomoću cryo-TEM. Ove vezikule takođe imaju karakteristike koje ih čine veoma atraktivnim sa farmaceutske tačke gledišta.

Primer 5. Sinteza holesterola:CTAB:BSA vezikula koršćenjem tehnologije komprimovanog fluida

[0064]Ove vezikule su sintetisane na sličan način sa onima u Primeru 2, ali u ovom slučaju BSA protein je, korišćen u vodenom rastvoru. Dobijene su vezikule CTAB:holesterol (1:1) sa BSA inkorporiranim u koncentraciji od 0,37 uM, što odgovara sa 25 ug/mL. Rezultati za fizički izgled, srednju veličinu, i Z potencijal su prikazani u Tabeli 5. Može se primetiti daje priprema vezikule stabilna i da imaju relativno malu srednju veličinu i PDI. Srednja veličina, raspodela veličine čestica i Z potencijal su određeni pomoću DLS. One takođe ispoljavaju pozitivne vrednosti Z potencijala, prilično iznad + 30 mV, što predviđa visoku dugoročnu stabilnost.

Primer 6. Određivanje efikasnosti inkorporacije proteina u vezikule

[0065]Da bi se odredila efikasnost ugradnje EGF u vezikule, postupak ultracentrifugiranja je korišćen za odvajanje slobodnih EGF vezikula. Iz procena različitih suspenzija vezikule, 1,0 mL je uzeto; postavljeno u bočice i centrifugirano visokom brzinom (100.000 x g) tokom 60 min na 4 ° C. Naknadno, sadržaj proteina u supernatantu (slobodni EGF) je određen čvrstom fazom imunoenzimskog testa (ELISA) (Vazquez et al., Biotecnol. Apl. 1990, 7: 42-49J. Efikasnost ugradnje EGF u vezikule je određena sledećom izrazom:

[0066]Ovi rezultati su prikazani u Tabeli 6. Prikazani su rezultati efikasnosti ugradnja EGF u vezikule sa supstancom DPPC:holesterol (dobijeno u Primeru 1), supstancom CTAB:holesterol (dobijena u Primeru 2) i supstanca cetrimid:holesterol (dobijena u Primeru 3). Takođe, procenjeno je dejstvo koncentracije EGF (odnos EGF:holesterol).. Vrednosti efikasnosti visoke EGF inkorporacije (blizu 100%) moguće je primetiti u sistemima QUAT:holesterol, za širok opseg EGF koncentracija (odnos EGF:holesterol). Međutim, rezultati efikasnosti ugradnje EGF u sistem DPPC:holesterol su bili veoma niski, jer maksimalna efikasnost ugradnje nije premašila 10%, za najvišu EGF koncentraciju.

[0067]U određenom slučaju vezikula koje sadrže BSA, korišćen je isti postupak opisan za EGF, osim što je kvantifikacija proteina izvedena pomoću postupka bicinhoninske kiseline (Micro-BCA) (Smith et al., Anal. Biochem. 1985, 150: 76-85). Efikasnost BSA ugradnje u vezikule CTAB:holesterol, pripremljene kako je opisano u Primeru 5, je bila samo 42 ± 5%. Kada je efikasnost ugradnje BSA upoređena sa ugradnjom epidermalnog faktora rasta (EGF) (prikazano u Tabeli 6), u vezikulama sa istom supstancom CTAB:holesterol, može se primetiti daje EGF ugradnja bila značajno viša.

Primer 7. Reproduktibilnost sinteze holesterola:CTAB:EGF vezikula koršćenjem tehnologije

komprimovanog fluida

[0068]U cilju ispitivanja robusnosti i reproduktibilnosti metodologije korišćene za sintezu EGF vezikula, srednja veličina čestica, PDI, Z potencijal i efikasnost EGF inkorporacije su određeni u nekoliko šarži od 5 uM:1 M i 15 uM:1 M supstance EGF:holesterol, pripremljene različitih datuma. U Tabelama 7 i 8 su prikazani dobijeni rezutlati. Srednja veličina čestice, PDI i Z potencijal su određeni pomoću DLS. Efikasnost ugradnje EGF je određena kako je opisano u Primeru 6.

[0069]Iz vrednosti prijavljenih u Tabelama 7 i 8, moguće je zaključiti da vezikule imaju slične karakteristike, nezavisno od datuma pripreme, što omogućava da se tvrdi da je DELOS-SUSP postupak

ponovljiv i daje robustan za pripremu EGF vezikula.

Primer 8. Skaliranje sinteze holesterol:CTAB:EGF vezikula korišćenjem tehnologije

komprimovanog fluida

[0070]Vezikule su sintetisane kao u Primeru 2, ali u 50 puta uvećanoj razmeri. Prvo, rastvor 3,8 g holesterola u 144 mL etanola se uvodi u reaktor pod visokim pritiskom od 300 mL zapremine na atmosferskom pritisku i radnoj temperaturi (Tw = 35 °C). Komprimovani CO2se dodaje, što prouzrokuje volumetrijsku ekspanziju rastvora da dostigne molarnu frakciju Xq02= 0,7 i radni pritisak Pw= 10 MPa. Da bi se postigla potpuna homogenizacija i toplotna ravnoteža, sistem se ostavlja na oko 60 minuta na 10 MPa i 35 °C. Najzad, iz ekspandiranog tečnog rastvora se uklanja pritisak iz radnog pritiska na atmosferski pritisak, na 1200 mL rastvora CTAB u mQ vode (C = 2,83 mg/mL) sadrži EGF u željenoj koncentraciji (5 i 12 uM). U ovom poslednjem koraku, struja N2na 10 MPa se koristi kao klip da pritisne holesterol u rastvoru etanola da drži stalan radni pritisak u reaktoru tokom uklanjanja pritiska. Zatim se vezikule prenose na hermetički zaptivenu posudu i čuvaju sve do upotrebe na 5 ± 3 °C. Dobijene su CTAB:holesterol (1:1) vezikule sa ugrađenim EGF u koncentraciji od 5 uM i 12 uM. Rezultati za fizički izgled, srednju veličinu, PDI i Z potencijal su prikazani u Tabeli 9. Srednja veličina čestice, PDI i Z potencijal su određeni pomoću DLS.

[0071]Tabela 9 pokazuje da su vezikule EGF:CTAB:holesterol stabilne u proporcijama od 5 uM:1 M i 12 uM:1 M. Može se videti i da postupak uvećanja u razmeri za dobijene čestice imaju fizičko-hemijske karakteristike uporedive sa onima dobijenim za proporcionalnu razmeru za 6 mL (Primer 2). U oba slučaja, srednje veličine dobijenih čestica su ispod 200 nm.

Primer 9. Biološka aktivnost vezikula, procenjena testom proliferacije ćelije kod mišjih A31 3T3

fibroblasta

[0072]Biološka aktivnost EGF vezikula, pripremljenih kako je opisano u Primerima 1 do 3, je određena korišćenjem testa proliferacije ćelije (Mire-Sluis and Page, J. Immunol. Methods 1995, 187: 191-199). U ovom slučaju, procenjena je sposobnost slobodnih EGF, EGF lipozoma i različitih vezikula koje sadrže EGF da povećaju proliferaciju ćelije linije A31 3T3 mišjih fibroblasta. Biološka aktivnost razlčitih vezikularnih suspenzija je procenjena primenom odgovarajućeg rastvora ove suspenzije direktno na ćelije koje se testiraju, na način da je apsorpcija uzoraka bila unutar opsega krivulje radnog referentnog materijala, koji je prethodno kalibriran prema međunarodnom referentnom materijalu EGF 91/550, koji je dao Nacionalni institut za biološke standarde i kontrolu (National Institute for Biological Standards and Control) (NIBSC, United Kingdom).

[0073]Sa ciljem upoređivanja jačine različitih preparata EGF vezikule sa slobodnim EGF, specifična aktivnost različitih preparata je izračunata iz rezultata biološke aktivnosti, pomoću sledećeg izraza:

[0074]Biološka aktivnost se meri pomoću opisanog testa i koncentracija proteina se daje pomoću nominalne vrednosti (u mg/mL) ekvivalenta EGF koncentracije različitih preparata vezikule.

[0075]Kao kontrola u ogledu proliferacije ćelije, korišćene su prazne vezikule (bez dodavanja EGF), u skladu sa različitim testiranim varijantama. U ovim uzorcima, pri razblaženjima nižim od onih koja su korišćena za vezikule sa EGF, nije detektovano ni citotoksično dejstvo niti povećanje u proliferaciji.

[0076]Slika 4A pokazuje da EGF vezikule sa supstancom CTAB:holesterol ispoljavaju povećanu specifičnu aktivnost u poređenju sa sobodnim EGF i EGF u vezikulama sa supstancom DPPC:holesterol. Na Slici 4B, rezultat sličan prethodonm se takođe primećuje kada je korišćen cetrimid, umesto CTAB, u supstanci vezikula pripremljenih istim postupkom. Svrha ove procene je bila da se odredi da li su komponente ili postupak sinteze pomenutih vezikula uticale na biološku funkciju epidermalnog faktora rasta (EGF). Međutim, za vezikule sa supstancom QUAT:holesterol, utvrđeno je neočekivano povećanje u specifičnoj biološkoj aktivnosti epidermalnog faktora rasta (EGF).

Primer 10. Otpornost proteaze EGF integrisanog u QUAT; vezikule holesterola

[0077] Korišćene suEGF vezikule sa supstancama QUAT:holesterol (1:1), pripremljene kao u Primerima 2 i 3 ovog pronalaska. Ovaj eksperiment je izveden da proceni sposobnost vezikula QUAT:holesterol da sačuvaju stabilnost integrisanog EGF protiv proteaza. Poznato je da hronične rane, kao što su čirevi dijabetesnog stopala, imaju proteolitička okruženja koja mogu da utiču na biodostupnost lekova korišćenih za njihovo lečenje (Bennett and Schultz, Am. J. Surg. 1993, 166: 74-81).

[0078]Za ovu procenu, tripsin je korišćen kao model proteaze. U puferskom sredstvu sa pH 8,5 i koncentracijom 20 mM je pripremljena enzimska reakcija u Tris-HCI, koja je sadržala finalnu koncentraciju 0,5 ug/mL tripsina. Finalna koncentracija slobodnog EGF ili EGF ekvivalenta u različitim preparatima vezikula je bila 125 ug /mL. Inkubacija uzoraka je izvedena za period od 4, 8, 16 ili 24 sata na 37 °C. Trifluorosirćetna kiselina (TFA), na finalnoj koncentraciji od 0,1 % (v/v) je korišćena da zaustavi enzimatsku reakciju.

[0079]Posle zaustavljanja reakcije, uzorci su razblaženi u apsolutnom metanolu, do finalne koncentracije metanola od 80% (v/v), mešani i centrifugirani u tabeli centrifugiranja na 10 000 ob./min tokom 5 minuta. Na kraju, supernatanti centrifugiranja su filtrirani kroz polikarbonatne filtere veličine pore od 0,2 um i zatim naneti na HPLC sistem (Merck, Germanv). Analizirani su EGF standardni uzorci i uzorci vezikule korišćenjem C18 reverzno fazne hromaografije na koloni (Vydac, Hesperia, CA, USA) i detektovane na 226 nm. Da bi se ovo izvelo, korišćen je linearni gradijent od 20% do 40% iz B tokom 28 minuta. Mobilna faza A se sastoji od 0,1% TFA/vode i mobilna faza B se sastoji od 0,05% TFA/ Acetonitrila. Analizirana zapremina injekcije je bila 5,0 mL, koja odgovara oko 20 ug EGF. Korišćena brzina protoka je bila 1,0 mL/minuti. EGF koncentracija u uzorcima je kvantifikovana interpolacijom korišćenjem kalibracione krivulje od EGF u području pod glavnom najvišom dostignutom vrednošću (pik) i EGF koncentracijama poznatih uzoraka, iz hromatograma dobijenih na 226 nm. Procenat EGF koji je preostao u svakom uzorku, posle inkubacije sa tripsinom, je izračunat korišćenjem sledećeg izraza:

[0080]Slika 5A pokazuje da EGF vezikule sa supstancom CTAB:holesterol ispoljavaju povećanu stabilnost u odnosu na tripsin, u poređenju sa slobodnim EGF, tokom perioda od 24 sata. Slično, Slika 5B, pokazuje da EGF vezikule sa supstancom cetrimid:holesterol pokazuju slično ponašanje kao i one opisane gore. Nisu utvrđene značajne razlike između različitih procenjenih punjenja epidermalnog faktora rasta (EGF) (odnos EGF:holesterol).

[0081]Rezultati stabilnosti na proteaze, EGF je inikorporiran u vezikule QUAT:holesterol, je pokazao da vezikule epidermalnog faktora rasta (EGF) imaju mnogo veću stabilnost od slobodnog epidermalnog faktora rasta (EGF).

Primer 11. Prikaz antimikrobne aktivnosti vezikula QUAT:holesterol

[0082]Procenjene su vezikule suspenzija koje sadrže QUAT:holesterol da se odredi da li su pokazale antimikrobnu aktivnost. Ova aktivnost je određena korišćenjem postupka difuzije na agaru (Manual ofClinicalMicrobiologv. 6th ed. VVashington, DC: ASM; 1995). Delotvornost različitih suspenzija je testirana na gram pozitivne bakterije( Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus),gram-negativne bakterije( E. coli, Proteus mirabilis),i na gljivice( Candida albicans, Aspergillus niger)korišćenjem tehnika izbušenih otvora u hranljivim agar pločama. Ovi mikroorganizmi su identifikovani i dobijeni su pomoću zbirke mikroorganizama BCCM/LMG (Belgija). Bakterije su rasle tokom noći na 37 °C u Trvptone Soy Broth kašastoj podlozi od soje (Oxoid), i gljivice su inkubirane tokom 72 sata na 28 °C u Sabouraud Dextrose Broth kašastoj podlozi od dekstroze (Oxoid). Ove suspenzije su korišćene kao inokule. Finalni inokulum, korišćenjem 100 ul suspenzije koje sadrže formiranje 108 kolonija jedinica/ml bakterija, ili 104 spora/ml fungusa, je raširen na Tripton Soy Agar i Sabouraud Dekstrozni Agar (Oksoid) ploče, kao što je navedeno. Disk (6 mm u prečniku) je impregniran sa svakim od različitih suspenzija vezikula koje treba testirati. Ciprofloksacin i flukonazol (100 ug/ml) su korišćeni kao pozitivne kontrole za bakterije i gljive, respektivno. Ploče za test su inkubirane na 37 °C tokom 24 sati za bakterije, i 28 °C tokom 72 sati za gljive, zavisno od vremena inkubacije potrebnog za vidljiv rast.

[0083]Tabela 10 pokazuje da su različite suspenzije vezikula imale antimikrobno dejstvo protiv gram-negativnih bakterija i gljiva. Generalno, mikroorganizmi su osetljiviji na vezikularne suspenzije cetrimid:holesterol u odnosu na one CTAB:holesterol. Neke vezikularne suspenzije su pokazale antibakterijsku i antigljivičnu aktivnost na izvesne mikroorganizme u poređenju sa ciprofloksacinom i flukonazolom, prema navedenom redosledu.

Primer 12. Proizvodnja tečne raspršujuće formulacije atomizera koja sadrži EGF vezikule

[0084]Suspenzija vezikule CTAB:holesterol (1:1) sa supstancom EGF:holesterol od 5 uM: 1 M, dobijeno kao u Primeru 2, sa EGF ekvivalentne koncentracije od 25 ug/mL, je razblažen na EGF ekvivalentna koncentracija 15 ug/mL u 10 mM natrijum fosfata pH 7.2. Ovaj finalni rastvor takođe sadrži 17% (v/v) glicerol, 10% (v/v) etanol, 0,02% (w/v) butil hidroksitoluen (BHT), 0,18% (w/v) metil paraben i 0,02% (w/v) propil parabena. Disperzija dobijena kao rezultat je filtrirana kroz 0,2 pm celuloznih acetatnih filtera za sterilizaciju, i razdeljena je u staklene bočice pod atmosferom azota.

Primer 13. Proizvodnja formulacije gela koja sadrži EGF vezikule

[0085]Suspenzija vezikule cetrimid: holesterol (1:1) sa supstancom EGF:holesterol od 5 uM: 1 M, je dobijena kao u Primeru 3, sa EGF ekvivalentna koncentracija 25 ug/mL, je razblažena na ekvivalentnu koncentraciju 15 ug/mL Ova formulacija sadrži 10 mM Tris-HCI puferskim sredstvom pH 7.2, i Karbomer (Carbopol 940), u finalnu koncentraciju 1,25% (w/v); glicerol, 3% (w/v) i 20 mM L-metionin. Pored toga, ova formulacija sadrži 0,02% (w/v) BHT, i antimikrobni konzervans 0,18% (w/v) metil paraben i 0,02%

(w/v) propil paraben.

Primer 14. Proizvodnja parenteralne formulacije gela koja sadrži EGF vezikule

[0086]Suspenzija vezikule od BKC:holesterol (1:1), sa EGF:holesterol 5 uM:1 M supstance, dobijena kao u Primeru 4, sa EGF ekvivalentnom koncentracijom 25 ug/ mL, je uveden u ćeliji tangencijalnog protoka ultrafiltracije uređaj Sartocon Sliče 200. Za ultrafiltraciju vezikula, korišćene su kasete sa Hvdrosart® membrane pora veličine 30 kDa. Proces koncentracije-diafiltracija se sprovede na temperaturi od 25 ± 3 °C i maksimalan pad pritiska na ulazu kasete je održan nižim od 4 bara. Tokom ovog postupka, suspenzija je koncentrovana 5 puta (finalne ekvivalente koncentracije za EGF od 125 ug/mL). Posle koraka koncentracije, vezikule su razblažene u 10 mM puferskog sredstva natrijum fosfata pH 7,2, do ekvivalentne koncentracije od 75 ug/mL epidermalnog faktora rasta (EGF). Ova formulacija takođe sadrži 20 mM L metionina i 0,02% (w/v) butilhldroksitoluena (BHT). Disperzija dobijena kao rezultat je filtrirana kroz 0,2 pm celuloznih acetatnih filtera za sterilizaciju, i razdeljena je u staklene bočice pod atmosferom azota.

Primer 15. Poređenje farmakodinamičkog dejstva lipozoma i vezikula koje sadrže EGF na

modelima životinja sa zaceljivanjem rana

Eksperimentalna metodologija

[0087]Da bi se procenila farmakološka efikasnost dole navedenih formulacija, eksperimentalni model hroničnog čira ukupne debljine je razvijen na crnim pacovima. Korišćeni su laboratorijski (Sprague-Dawley) pacovi težine 250-270 grama, koji su nasumično raspoređeni da formiraju 7 eksperimentalnih grupa, od 10 životinja u svakoj. Pacovi su bili intraperitonealno anestezirani sa kombinacijom ketamina/ksilazina da im se opsežno depilira leđni region. Dva simetrična dvostrana čira sa između lopatica ramena (retroskapularni čirevi između lopatica ramena) su napravljena od 8 mm prečnika i ukupne debljine od do gornje fascije, koja je očuvana. Počela je neposredna primena triamcionolon acetonida, kao kompresa, jednom tokom dana tokom prva tri dana, da se zaustavi zaceljivanje i da se izazovu karakteristične promene hroničnosti. Posle 7 dana, prekid procesa zaceljenja i hroničnosti čireva su potvrđeni odsustvom granulacije tkiva i hipertrofije epitelnih ivica. Od ovog trenutka, primena proučavanih terapija je počela kako je opisano dole u tekstu: Grupa 1: koja nije lečena (fiziološki rastvor). Oni su podvrgnuti istim uslovima rukovanja i manipulacije kao i ostatak grupa. Sterilni fiziološki slani rastvor je nanet u raspršenom obliku.

Grupa 2: prazni DPPC holesterol lipozomi,

Grupa 3: prazne vezikule CTAB-holesterol,

Grupa 4: prazne vezikule cetrimid holesterola,

Grupa 5: Lipozomi DPPC-holesterol napunjeni sa EGF pri koncentraciji od 25 ug/ml,

Grupa 6. Vezikule CTAB-holesterol napunjene sa EGF pri 25 ug/ml,

Grupa 7. Vezikule cetrimid-holesterol napunjene sa EGF pri 25 ug/ml.

[0088]Rane su čišćene dnevno. Posle dezinfekcije rana, svakoj grupi je data suspenzija navedena u svakom slučaju. Primena suspenzija je izvedena dvaput dnevno, tokom 14 dana. Eksperimentalni sistemi su tretirani topikalnom primenom suspenzija vezikula, ili lipozoma, nebulizacijom. Sve životinje su podvrgnute autopsiji i uzimanju uzorka 14 dana posle pojave terapije dodeljene svakoj grupi. Uzorci su fiksirani u 10% neutralnog formalina, i 72 sata kasnije su ravnomerno podeljeni, za kasnije uključivanje parafina. Korišćeni sojevi su bili: hematoksilin-eozin, Malorijeva trihroma reakcija, Verhoefov i Gomorijev

postupak retikuluma. Uzorci su slepo analizirani od strane dva nezavisna istraživača.

Rezultati:

[0089]Nije bilo neophodno isključiti kontaminirane čireve, dakle, 20 lezija je korišćeno za svaku od ovih 6 eksperimentalnih grupa. Ukratko, potvrđeno je da su sve farmaceutske prezentacije EGF vezikula značajno stimulisale ukupan proces zaceljivanja, kada se uporedi sa grupama sa vezikulama bez epidermalnog faktora rasta (EGF) (prazne), lipozomima napunjenim sa EGF pri 25 ug/ml, i eksperimentalnom kontrolnom grupom lečenom fiziološkim rastvorom. Registrovani podaci se odnose na prosečne dve nezavisne studije urađene u različitim vremenskim periodima. Men-Vitni U i Studentski t test su korišćeni za upoređivanje. Svi parametri su ispunili kriterijume normalne raspodele. Parametri su proučavani i rezultati su prikazani u Tabeli 11.

[0090]Eksperiment pokazuje da su vezikule CTAB-holesterol i cetrimid-holesterol vezikule napunjene epidermalnim faktorom rasta (EGF) imale snažno zaceljujuće dejstvo. Anitinflamatorno dejstvo primećeno za grupe 6 i 7 je primetno u poređenju sa drugim terapijama. Moguće je da se dejstvo unapređenja fibrioangiogeneze i stezanje povezuje sa smanjenjem ravnoteže imuno-inflamatornih ćelija koje se infiltriraju u neodermis. Slično, označeno dejstvo unapređenja epitelne migracije je potvrđeno, mikroskopsko demonstriranje prisustva stratificiranog epidermisa. Odgovor dobijen za grupu lečenu sa lipozomima napunjenim epidermalnim faktorom rasta (EGF) je bio manji od jednog detektovanog u grupama 6 i 7. Superiornost terapija uključujući suspenzije vezikula napunjene sa EGF, primenjena u grupama 6 i 7, je takođe otkrivena u sičnom eksperimentu su bili hroničnost u ranama je bila indukovana topikalnom primenom metilglioksala.

Primer 16. Terapije zasnovane na topikalnoj primeni vezikula koje su obuhvatale EGF kod

pacijenata sa čirevima sa dijabetesnim stopalom

[0091]U kliničkim slučajevima, većina lečenih lezija je prekoračila 90% verovatnoća neophodnosti amputacije, prema skali Univerziteta u Teksasu. Lečenja su primenjena topikalno.

[0092]Opšte karakteristike lečenih pacijenata: Oni su imali dijabetes melitus tipa I ili tipa II ili dugu evoluciju i lečeni su insulinom, sulfonilureama, ili biguanidima, kao oralni hipoglicemijski agensi. Oni su imali ličnu istoriju loših ožiljaka, pri čemu su neki imali prethodno kontralateralnu amputaciju. Sve lečene povrede donjeg ekstremiteta su odgovarale ishemijskom ili neuropatskom dijabetesnom stopalu. Lezije, u celini, su klasifikovane kao hronične, kompleksne i nepopustljive. Period evolucije lezija je bio u opsegu između manje od jednog meseca i sedam godina. Veličina lečenih lezija je bila u opsegu između 20 i 80 kvadratnih centimetara. Dubina kod nekih lezija je čak obuhvatila periosteum. Sa anatomske tačke gledišta, lečene lezije su bile u bočnom regionu, regionu petne kosti i/ili metatarzalnom regionu. Svi pacijenti su primili prve terapije hospitalizovano, dok god su postupci eksereze pod anestezijom, kao i parenteralna terapija antibioticima bili neophodni. Posle zaceljenja, ili totalne granulacije rane sa dokazom epitelne migracije, pacijenti su podvrgnuti dispanzerskom režimu i kontroli svakog drugog dana za izlečenje i lek. Posle završetka zarastanja rana, svaki pacijent je praćen tokom 12 meseci posle lečenja. Procena pojave pogoršanja zdravstvenog stanja, registar neželjenih reakcija,i procena opšteg statusa pacijenta su izvedeni u tu svrhu.

[0093]Tabela 12 pokazuje demografske i epidemiološke karakteristike skupine pacijenata koji su primali topikalno lečenje.

[0094]Usledilo je lečenje za svakog od pacijenata kako je opisano dole u tekstu: Pacijent JLG. Muškarac, 56 godina star, je kontrolisan insulinom i bez drugih klinički manifestovanih komplikacija dijabetesa. Ima sveobuhvatnu frontalnu leziju sa ishemijskom komponentom, koja ostaje i dve godine posle transmetatarzalne amputacije. Nije bilo nikakvog postupka granulacije i zarastanja rana posle uspostavljanja antimikrobne terapije i ozonske terapije tokom dve godine. Posle izvođenja hirurškog čišćenja i stimulacije ivica, lečenje je započeto svakog drugog dana korišćenjem topikalne formulacije u spreju opisane u Primeru 12 koja je sadržala vezikule EGF:CTAB:holesterol. Tokom osam nedelja lečenja, postignuta je potpuna epitelizacija lezije. Rezultati su prikazani na Slici 6. Pacijent OFS. Žena, pušač, gojazna, sa istorijom visokog krvnog pritiska, kontrolisana sa oralnim hipoglicemijskim agensima. Brzo napredovanje nekroze mekog tkiva i mišića tetiva se razbije od ujeda lokalnog insekta. Izvodi se hirurška eksereza nekrotičnog materijala. Antimikrobna terapija je započeta i lezija se leči svakog drugog dana. Zato što je 14 dana posle intervencije, proces granulacije trom i spor, primena terapije počinje svakog drugog dana korišćenjem formulacije topikalnog spreja opisane u Primeru 12, koji sadrži vezikule EGF:CTAB: holesterol. Tokom osam nedelja lečenja, postignuta je puno zarastanje rane lezije. Pacijent AVL. Muškarac, 52 godine starosti, je kontrolisan sa glibenklamidom, Čarkotova (Charcot) neuropatska lezija tabana stopala koja je granulisana tokom 7 godina, bez dokaza o skupljanju/ zarastanju rana. Posle hirurškog čišćenja i stimulacije ivica, lečenje je započeto svakog drugog dana korišćenjem topikalne formulacije u obliku gela opisanog u Primeru 13, koji sadrži vezikule EGF:cetrimid:holesterol. Tokom osam nedelja lečenja, postignuto je potpuno zalečenje rane lezije. Pacijent PAT. Muškarac. 47 godina star, bez drugih pratećih morbiditeta ili klinički manifestovanih komplikacija dijabetesa, čak pošto je detektovana periferna arterijska bolest. Kao rezultat lokalne traume, razvio se transmembranski apces koji je doveo do likvefaktivne nekroze skoro celog prednjeg dela stopala sa vidljivm flogističkim znacima. Transmembralna amputacija je izvedena i započeta je antibiotska terapija. Kao rezultat amputacije nezadovoljavajući napredak preostale baze posle 30 dana, moraju da se izvedu sveobuhvatna čišćenja rane zbog prisustva ishemijskih mikroplakova; intervencija je započeta sa topikalnm formulacijom u obliku gela opisanom u Primeru 13, koja je sadržala EGF:cetrimid:holesterol vezikule. Formulacija je naneta na ivice i površinu rane. Lečenja su izvedena svakog drugog dana i produžena tokom 4 nedelje. Od prve primene leka, prisustvo ishemijskih plaka je eliminisano i proizvoda i krvareća granulacija tkiva je počela da se razvija, što je kasnije olakšalo primenu delimične debljine grafta bez kože. Pacijent GMA. Muškarac, 69 godina star, je kontrolisan insulinom i bez klinički manifestovanih komplikacija dijabetesa. Pacijent je imao frontalnu preostalu leziju koja je opstajala šest meseci posle transmetatarzalne amputacije. Nije bilo nikakvog postupka granulacije i epitelizacije posle 3 meseca antimikrobne terapije i ozonske terapije. Posle izvođenja hirurškog čišćenja, lečenje je izvedeno svakog drugog dana sa formulacijom topikalnog spreja opisanom u Primeru 12, koja je sadržala EGF:CTAB:holesterol vezikule. Tokom šest nedelja lečenja, postignuta je potpuno zalečenje rane lezije.

Primer 17. Terapije zasnovane na ravnomernom uvlačenju EGF vezikula kod pacijenata sa čirevima sa dijabetesnim stopalom

[0095] U kliničkim slučajevima, većina lečenih lezija je prekoračila 90% verovatnoća neophodnosti amputacije, prema skali Univerziteta u Teksasu. Lečenja su primenjena infiltracijom. Opšte karakteristike lečenih pacijenata odgovaraju opisanom u Primeru 16.

[0096] Parenteralna formulacija koja se pominje u primeru 14, koja korsti EGF:BKC:holesterol vezikule je korišćena za terapiju sa ravnomernim raspoređivanjem. Suština ove terapije se sastoji u intra i perilezionoj internoj injekciji u ivicama i dnu lezije, na tačkama koje su jednako udaljene. Materijal se nataložio usmeravanjem igle na bazu čira ili dubinu komada ugla od 15-45 stepeni, uvek uključujući dermalno-epidermalni spoj da se stimuliše stezanje ivica. U svakoj tački između 100 i 1000 uL se nataložilo, zavisno od kliničkog izgleda tkiva i njegovih karakteristika. Ovo je izvođeno dva do tri puta nedeljno. Lezije su lečene i demografske karakteristike lečene populacije su opisane u Tabeli 13. Kod svih lečenih slučajeva, manje ili veće amputacije su bile sprečene.

[0097]Lečenje koje je usledilo za svakog od pacijenata je opisano dole u tekstu: Pacijent HCJQ. Ishemijski bez distalnog pulsa i blokiran iz sektora potkolenice. Lezija je lateralna amputacija preostale baze petog prsta stopala, pokazuje izložene kapsule i list jasno u ishemijskoj nekrozi. Lezija je klasifikovana kao klasa IV u skladu sa Vagnerovom skalom. Njena veličina je bila 10 x 4 centimetra. Lečenje je uspostavljeno, kada se, šestog dana od amputacije, preostla baza amputacije, nađe u kliničkoj atoniji i cijanozi, napredovanje na ovaj način tokom pet dana, uprkos svim sistemskim i lokalnim farmakološkim merama. Infiltracije su pokrenute posle hirurškog čišćenja rane od nekrotičkog materijala, očekivanje poboljšanja lokalnog mikrookruženja i poboljšanje razvoja granulacionog tkvia. Ovo je prvo primećeno posle pete sesije infiltracije. Pacijent je primio ukupno 12 sesija infiltracije. Lečenje je prednost dalo prisustvu tkiva produktivne i prokrvljene granulacije. Primećena je intenzivna centripetalna migracija epitela, iako nije bilo primetnog stezanja ivica. Posle 38 dana od početka lečenja, lezija je bila potpuno epitelizovana bez neophodnog transplanta (grafta). Nije bilo oštrih ili odloženih neželjenih reakcija. Sa 12 meseci, lezija je bila bez lokalnih pojava. Pacijent OFW. Neuropatski, 81 dana od evolucije sa transmetatarzalnom amputacijom preostale baze koja se klasifikuje kao Vagner IV u vreme prijema pacijenta. Veličina lezije je 14 x 7 kvadratnih centimetara. Primećuju se distalni impulsi sa ABI 0,9 uprkos tome što su vidljivi znaci disestezije. Lečenje se uspostavlja kada, tokom 42 dana lokalnih lekova i primene fizioloških kompresa sa slanim rastvorom, lezija kao odgovor pokazuje veoma slabu granulaciju. Počinje infiltracija i izvodi se dnevno tokom prve nedelje lečenja da se spasu lokalne ćelije. Naknadno, plan se nastavlja 2 puta nedeljno, tokom tri nedelje. Sa ovim planom, postiže se potpuno produktivna i prokrvljena granulacija. Tkivo je pokriveno delimično debelim transplantatom kože dobijenim iz kontralateralne prednje butine. Slično pacijentu prethodno opisanom, lečenje se dobro podnosi i posle godinu dana lezija je još uvek bila

epitelizovana.

Pacijent JIFM. Ženska osoba, bivši pušač, stara 61 godinu, ABI od 0,4 u donjem levom ekstremitetu, pokazuje nekrotizujuće fasciitise u metatarzalnom i plantarnom području stopala. Lezija se klasifikuje kao grupe IV na Vagnerovoj skali. Pacijent je lečen hirurški; izvedena je ekscizija celokupnog nekrotičnog tkiva i/ili kontaminiranog mekog tkiva i kosti. Uspostavljena je sistemska polivalentna antibiotska terapija. Posle 48 sati od hirurške operacije, urađena je prva inspekcija lezije, izvedeno je lokalno čišćenje, i započeto je infiltrativno lečenje sa vezikulama. Tokom prvih 10 dana, utvrđen je režim lečenja udarnih doza EGF vezikula, koji je kasnije moguće smanjiti na dve sesije infiltracije tokom 5 nedelja. Lečenje je pomoglo da se sačuva stopalo u odsustvu druge terapijske mogućnosti. Pacijent ima normalan hod i zadovoljavajuće motoričke sposobnosti nad distalnim delom uda.

Primer 18. Terapije zasnovane na kombinovanoj primeni infiltrativnih i topikalnih vezikula EGF

kod pacijenata sa čirevima dijabetesnog stopala

[0098]U kliničkim slučajevima, većina lečenih lezija je prekoračila 90% verovatnoća neophodnosti amputacije, prema skali koju je utvrdio Univerzitet u Teksasu. Lečenja su sprovedena kombinovanjem topikalnih i infiltrativnih putanja. Opšte karakteristike lečenih pacijenata odgovaraju opisanom u Primeru 16.

[0099]Za kombinovano lečenje, prvo je korišćena infiltracija, korišćenje parenteralne formulacije je obuhvatalo EGF vezikule (u vezi sa Primerom 14). Posle toga, alternativno su korišćeni za topikalnu primenu, sprej opisan u Primeru 12 i gel opisan u Primeru 13.

[0100]Demografske karakteristike lečene populacije i lezije su opisani u Tabeli 14. U svim slučajevima koji su lečeni sprečene su manje i veće amputacije.

[0101]Dole u tekstu, lečenje je usledilo a svaki od pacijenata je opisan:

[0102]Pacijent AFG. Muškarac sa dugom istorijom dijabetesa i istorijom lošeg pridržavanja lečenja. Pacijent je pokazao obrazac blokade potkolenice uz odsustvo distalnih impulsa. Prve pojave lezije kao fliktene koja se kontaminira i brzo napreduje ka tome da nekrotizuje sva meka tkiva petnog regiona. Tokom prvog hirurkog zahvata uklonjena su meka tkiva. Posle pet dana, još jedan hirurški zahvat je neophodan, što dovodi do upropašćavanja materijala kosti. Uspostavlja se intenzivna polivalentna antibiotska teraija i posle 20 dana posle prvog hirurškog zahvata, započinje se infiltrativno lečenje sa EGF vezikulama. Dnevne sesije terapije i lokalni lek se utvrde za prve dve nedelje. Posle ovoga slede lekovi i terapija svakog drugog dana korišćenjem formulacije topikalnog gela opisane u Primeru 13 koja sadrži EGF:cetrimid:holesterol vezikule pripremljene prema Primeru 3, na ivicama površine rane, tokom sledećih 8 nedelja. Posle 10 nedelja lečenja, lezija je potpuno epitelizovana.

[0103]Pacijent LATR. Ishemijski, nema distalnih impulsa i sa makrovaskularnim oboljenjem oba donja uda. ABI je 0,6, bez mogućnosti revaskularizacionog hirurškog zahvata usled kalcifikacija. Prethodna kontralateralna amputacija je izvedena tri godine ranije. Ima trombozu fine arterije u četvrtom i petom prstu noge, koji su amputirani sa ekstenzivnim dubokim bočnim klinom. Dve nedelje posle hirurškog zahvata, amputacija preostale baze je pokazala znake atonije i bila je refraktorna do granulacije. Samim tim, u trećoj nedelji, započeto je lečenje vezikualma, u početku infiltrativnim lečenjem sa dozom između 25 i 125 pg EGF po mestu injekcije, deponovano u ivicama i dnu hirurškog područja. Ovaj modalitet lečenja se koristi sve dok se sve šupljine i tuneli ne ispune sa granulacionim tkivom, za šta je bilo potrebno približno tri nedelje. Naknadno, odluka je doneta da se nastavi lečenje topikalno, korišćenjem gela sa supstancom opisanom u Primeru 13, koja sadrži EGF:cetrimid:holesterol vezikule. Lečenje se izvodi na ivicama i površini rane, posebno se usredsređuje na dermo-epitelnu ivicu rana da se stimuliše ponovna epitelizacija. Lečenje je izvedeno svakog drugog dana sve do potpune epitelizacije tokom 5 nedelja.

[0104]Pacijent ZEM. Ženska osoba, 57 godina starosti, sa lezijom grupe III Vagnerove skale i dokazom o neuropatiji, plantarna lezija je granulisana tokom 7 godina, ali nije bilo dokaza o skupljanju/epitelizaciji. Posle hirurškog čišćenja i stimulacije ivice, infiltrativna terapija je izvedena sa dozom od 75 pg ekvivalentno EGF po mestu ubrizgavanja, korišćenjem formulacije opisane u Primeru 14 koji sadrži EGF:BKC :holesterol vezikule, nataložene na ivicama hirurškog područja. Ovaj modalitet terapije je primenjen tokom prve četiri nedelje svakog drugog dana. Naknadno, odluka je doneta da se nastavi korišćenje terapije svakog drugog dana sa topikalnom formulacijom spreja opisanom u Primeru 12, koja sadrži EGF:CTAB:holesterol vezikule. EGF vezikule se atomizuju na ivicama i površini lezije, sa specijalnim fokusom na dermo-epitelnoj granici rane da se stimuliše ponovna epitelizacija, lečenje se izvodi svakog drugog dana sve do potpune epitelizacije tokm 8 nedelja. Evolucija postupka izlečenja je

prikazana na Slici 7.

[0105]Pacijent JLHB. Neuropatski, razvijena ekstenzivna infektivna lezija kao posledica suve opekotine na stopalu desne noge (desnog donjeg ekstremiteta). To najzad dovodi do transmetatarzalne amputacije, kojoj se dodaje 10-centimetarski bočni klin. Lečenje se počinje sa intravenoznim antibioticima i sistematskim lokalnim lekovima svakih 48 sati. Lezija je pokazala tendenciju ka veoma sporoj granulaciji i atoniji ivica 20 dana posle hirurškog zahvata. Infiltrativno lečenje je pokrenuto sa vezikulama napunjenim sa 75 pg EGF svakog drugog dana u rezidualnoj osnovi, kao i klinu. Do treće nedelje terapije počinje primena svakog drugog dana, topikalna formulacija spreja opisana u Primeru 12 sadrži EGF:CTAB:holesterol vezikule, koje dolaze u duboku zonu bočnog klina. Kombinacija lečenja je ubrzala ukupnu granulaciju i spontanu epitelizaciju tokom područja većeg od 60 kvadratnih centimetara.

Primer 19. Prikaz terapijske efikasnosti upotrebe EGF vezikula u na letalnom modelu akutne

povrede pluća akutne povrede pluća (ALI) ili sindroma otežanog disanja kod odraslih (ARDS),

na pacovima

[0106]Korišćeni su mužjaci laboratorijskih (Sprague Dawley) pacova sa telesnom težinom između 250 i 280 grama. Povreda pluća je indukovana pod opštom anestezijom (ketamin/ksilazin) instilacijom (ukapanom kap po kap) u dušnik kombnacije lipopolisaharid (LPS)-zimosana. Odmah posle toga, životinje su nasumično podeljene u tri eksperimentalne grupe od 12 životinja po grupi.

Grupa A: je lečena fiziološkim slanim rastvorom.

Grupa B: je lečena sprejem EGF u fiziološkom slanom rastvoru pri koncentraciji od 25 pg/ml/kg. Grupa C: je lečena holesterol:BKC:EGF vezikulama opisanim u Primeru 4, sa ekvivalentnom koncentracijom od 25 ug/ml EGF, i prmenjena kao za grupu B.

[0107]Životinje su ostavljene da se razvijaju bez ikakve terapije sve do pojave prvih simtoma. Šest sati posle primene LPS/zimosana, pacovi su pokazali tahipneu povezanu sa prinudnim izdisanjem. U ovoj tački, životinje su pokazali arterijsku PO2saturaciju od 65% i jasnu respiratornu acidozu

[0108]Samim tim, terapije su započete približno 8 sati posle ukapavanja toksina. Eksperiment je imao za cilj procenu dejstva terapije sa obe EGF formulacije isključivo na akutnoj fazi ARDS. Terapije su izvedene orofacijalnom maskom prilagođenom iz mašine za isparljivu anesteziju. Terapije su izvođene dvaput dnevno. Životinje su takođe lečene jednom dnevno sa hidrokortizon acetatom (10 mg/kg) kao koađuvansna terapija.

[0109]Posle 72 sata od početka lečenja, studija je zaustavljena. Preostale životinje su anestezirane i podvrgnute dubokoj bronhoalveolarnoj lavaži u 5 ml sterilnog slanog rastvora za citološku i biohemijsku studiju, kao i za uzimanje uzorka arterijske krvi za određivanje parametara koji se odnose na kiseonik u krvi. Zatim je u pluća ubačeno 10 ml 10% neutralnog formalina i obrađena su za histološke nalaze. Tabela 15 je pokazala dnevne rezultate smrtnosti po grupi. Kao što se može videti, lečenje sa EGF nebulizacijom je regulisalo napredovanje akutne povrede pluća. Primetno, najbolje dejstvo u smislu opstanka je bilo u grupi koja je primila EGF ugrađen u vezikule. Ovo nagoveštava da angažovanje više EGF receptora u dužem vremenskom periodu ispoljava doslednije farmakološko dejstvo od EGF kao čestica u jednostavnom tečnom aerosolu u fiziološkom slanom rastvoru.

[0110]Rezultati bronhoalveolarne lavaže su potvrdili zaštitu koju je ispoljio EGF na alveolarni zid i septalni kapilarni endotel. Pored toga, primećeno je da je zaštita koju je dala terapija sa EGF ugrađenim u vezikule obuhvatila poboljšan kapacitet ventilacije ispoljen u većoj arterijskoj PO2stopi, i držanje arterijske pH veoma blizu normalnom. Ovi podaci su prikazani u Tabeli 16.

[0111]Histološka analiza pluća iz svake grupe je pokazala da je EGF terapiju, posebno u grupi koja je primala formulaciju vezikule štitila parenhim pluća. Ovo je pokazano prisustvom relativnog očuvanja odnosa alveolusa/septuma, smanjenjem permeabilnosti edema zida septuma, kao i prisustvo hemoragičkih fokusa (žiža???) i eozinofilnog materijala u alveolarnom lumenu. Manje inflamatorna reakcija je utvrđena kod životinja lečenih formlacijom u vezikulu ugrađenog epidermalnog faktora rasta (EFG), u poređenju sa onima koji su primali rastvor fiziološkog slanog rastvora. Eksperiment nam je omogućio da zaključimo da intervencija sa holesterol:BKC:EGF vezikulama, opisana u Primeru 4, ispoljava intenzivnije/produženo farmakološko dejstvo na parenhim pluća izložen poznatim induktorima ALI. Dobijena zaštita pokriva ne samo poboljšanje strukturnog integriteta pluća, već takođe predstavlja supstancijalnu korekciju funkcionalnih parametara.

Primer 20. Posvećena terapija sa EGF vezikulama kritično bolesnog pacijenta sa teškoćamasa

disanjem kod odraslih osoba)

Sindrom (ARDS)

[0112]Opis slučaja: Pacijent AGJ, mužjak, star 75 godina, bez patološke medicinske istorije, koji ima problema sa traumom u predelu abdomena koja se razvija u komplikacije usled sepse????šok septuma??? septički šok septic shock. ARDS se javlja kao evoluciona komplikacija, koja dovodi do teškoće sa disanjem sa dispneom ii cijanozom refraktornom na terapiju kiseonikom, niskim zasićenjem (11 mm Hg) i pH promenama u krvi. A radiološka slika pokazuje mesta od pamučne vune u parenhimi oba plućna krila. Odlučeno je da se započne lečenje sa pozitivnim pritiskom završetka izdisaja i drugim rutinskim lekovima. Kako bi se zaštitio parenhim pluća u akutnoj eksudativnoj fazi, holesterol: BKC:EGF vezikule opisane u Primeru 4 su primenjene u dozi od 200 pg ekvivalenata EGF po litri medicinskog kiseonika, dvaput dnevno. Merenja su omogućila preporučljivu progresivnu evoluciju pacijenta u normalnu, sprečavajući fibrozirajuću fazu alveolitisa. Trećeg dana terapije, pozitivan pritisak disanja putem ventilacije je mogao biti prekinut, i petog dana slika slična pamuku je bila potpuno obrisana.

Primer 21. Demonstracija terapijske efikasnosti upotrebe EGF vezikule kod pacijenata sa

distalnim levim

[0113]Ovo je skupina od 8 pacijenata sa dijagnozom distalnog ulcerativnog kolitisa, pošto je izvedeno nekoliko kolonoskopija i biopsija. Pacijenti su primili specijalnu medicinsku dijetu, kao i farmakološko lečenje sa azulfidinom ili sulfalazinom. Zato što je ova skupina ostala klinički aktivna tokom duže od 12 meseci i refraktorna za sve farmakološke intervencije, uključujući kortikoide, izvršena je procena da se leče posvećeno primenom niskog enema holesterol:cetrimid:EGF, vezikule oppisano u Primeru 3. Iz ovog razloga, holesterol:cetrimid:EGF vezikule se primenjuju u fiziološkom slanom rastvoru, u ekvivalentnoj EGF koncentraciji od 50 pg/ml u zapremini od 20 ml. primenjuju u fiziološkom slanom rastvoru, u ekvivalentnoj EGF koncentraciji od 50 pg/ml u zapremini od 20 ml. Enemi su primenjeni u levom lateralnom dekubitusu, svake noći pre spavanja. 7 dana posle pojave enema povezanih uz druge prethodne medicinske mere, nestale su melene (tamne mrlje od krvi u stolici), bol, i opšta slabost organizma (malaiza). Posle 10 dana od lečenja, izvodi se kolonoskopija, detektuje se značajno smanjenje mukozne upale, zaceljenje većine lezija i značajno smanjenje na indeksu Sveti Marko, Lečenje je prekinuto 21 dana posle početka, kada su kolonoskopije ponovljene, potvrdile dejstvo izlečenja i smanjenja upale do koje dolazi lečenjem sa enemima koji sadrže holesterol:cetrimid:EGF vezikule. Biopsije su uzete od 8 pacijenata, 21 dana od početka lečenja, pokazale su povlačenje kriptisisa.

Primer 22. Posvećena upotreba EGF vezikula za vraćanje mu kožnih lezija je prouzrokovana

kancernom hemoterapijom

[0114]Pacijent QED, muškarac, star 32 godine, koji je razvo hemoragijski mukozitis u bešici i donjim delovima urinarnog trakta, kao posledica ciklofosfamida i terapije busulfanom, posle transplantacije koštane srži. Posle 72 sata sa hematuriji i supstancijalnoj proteinuriji (400 mg/24 sat), pacijent je primio, zajedno sa opštim merama medicinske podrške, cistoklizu kroz koju je infuzija fiziološkog rastvora koja je sadržala holesterol:CTAB:EGF vezikule, pripremljena kao u Primeru 2 u ekvivalentnoj koncentraciji od 150 ug/mL od EGF. Po završetku prva 24 sata, detektovani su samo tragovi crvenih krvnih zrnaca u urinu i proteinurija od 170 mg/24 sata.

[0115]Pacijent IRT, žena, 27 godina starosti, razvija mukozitis gornjih delova gastrointestinalnog trakta, u toku polihemoterapije za lečenje ne-Hodžkinovog limfoma. Pojavila se potpuno razvijena klinička slika, uključujući aftozne manifestacije, sialoreu, čak i hematernezu, distenziju abdomena, opštu slabost orgnizma, groznica i drugii simptomi. Ovaj postupak počinje da se kontroliše farmakološkim merama, koje su obuhvatile inhibitore protonske pumpe, mukoprotektore, restituciju volemije i analgetičke parenteralne opijate. Dvadesetčetiri sata posle pojave kliničke slike, pacijent je primio oralne primene slanog rastvora koji je sadržao holesterol:cetrimid:EGF vezikule, pripremljen kao u Primeru 3 u ekvivalentnoj koncentraciji EGF od 50 pg/mL. Upotreba nazogastrinog katetera, zapremina od 250 ml ovog rastvora je ukapana kap po kap na svaka četiri sata. Hematemeza je prekinuta posle 24 sata od pojave gastrične irigacije, kao i distenzije i akutne pareze. Slično tome, potreba za podrškom u smislu kapaciteta i drugim merama kontrolisanja je progresivno smanjena.

Primer 23. Sinteza p-Sitosterol:CTAB:EGF vezikula korišćenjem tehnologije komprimovanog fluida

[0116]Ove vezikule su sintetisane na sličan način sa onima u Primeru 2, ali u ovom slučaju, korišćen je sa jedne strane rastvor 77,1 mg (3-Sitosterola u 2,88 mL etanola i; sa druge strane, vodeni rastvor od 2,83 mg/mL od CTAB i EGF, u željenoj koncentraciji. Dobijene su vezikule CTAB:(3-Sitosterol (1:1), sa EGF ugrađenim u koncentraciji od 5 pM. Rezultati za fizički izgled, srednju veličinu, i Z potencijal su prikazani u Tabeli 17. Može se primetiti da je priprema vezikule stabilna i da ima relativno malu srednju veličinu i PDI. Srednja veličina, raspodela veličine čestica i Z potencijal su određeni pomoću DLS. Pored toga, slično preparatima sa vezikulama prikazanim u prethodnim primerima, koji obuhvataju u svom sastavu katjonski surfaktant tipa četvorovalentnog amonijaka, oni imaju pozitivne vrednosti Z potencijala mnogo više od + 30 mV, što predviđa njihovu dugoročnu stabilnost. Slika 3D pokazuje da preovladavaju sferoidni oblici unilamelarne strukture, prema proučavanju morfologije vezikule izvedenom na cryo-TEM. Ove vezikule takođe imaju karakteristike koje ih čine veoma atraktivnim sa farmaceutske tačke gledišta.

Claims (20)

1. Vezikule obuhvataju epidermalni faktor rasta (EGF), katjonski surfaktant i holesterol ili njihove derivate.

2. Vezikule iz patentnog zahteva 1, pri čemu katjonski surfaktant pripada tipu četvorovalentnog amonijaka, preporučljivo pri čemu se katjonski surfaktant tipa četvorovalentnog amonijaka bira iz grupe koja obuhvata cetil trimetil amonijak bromid (CTAB), cetrimid i benzalkonijum hlorid (BKC).

3. Vezikule iz patentnih zahteva 1 ili 2, pri čemu molarni odnos između katjonskog surfaktanta i holesterola, ili njegovih derivata, jeste u opsegu od 10 M:1 M do 1 M:5 M, i molarni odnos između EGF i holesterola, ili njihovih derivata, u opsegu od 0,5 uM:1 M do 100 pM:1 M.

4. Vezikule iz bilo kog od patentnih zahteva 1-3, koje karakteriše to što imaju unilamelarnu strukturu i približnu srednju veličinu između 25 i 500 nm, preporučlijvo između 50 i 300 nm.

5. Vezikule iz bilo kog od patentnih zahteva 1-4, pri čemu se EGF inkorporira u dvostruki sloj vezikule.

6. Vezikule iz bilo kog od patentnih zahteva 1-5, koje se dobijaju pomoću tehnologije komprimovanog fluida, preporučljivo pri čemu CF tehnologija obuhvata postupak koji obuhvata: a) pripremu vodenog rastvora EGF i katjonskog surfaktanta, preporučljivo pri čemu katjonski surfaktant predstavlja tip četvorovalentnog amonijaka, b) rastvaranje holesterola, ili njegovih derivata, u organskom rastvaraču ekspandiranom sa CF, c) sinteza vezikula pomoću deprezurizacije rastvora nastaje iz faze b) na rastvoru koji se dobija kao rezultat iz faze a).

7. Postupak za pripremu vezikula koje sadrže EGF, katjonski surfaktant i holesterol, ili njihove derivate, naznačen time što obuhvata: a) pripremu vodenog rastvora EGF i katjonskog surfaktanta, pri čemu katjonski surfaktant preporučljivo predstavlja tip četvorovalentnog amonijaka, b) rastvor holesterola ili njegovih derivata u organskom rastvaraču ekspandiranom sa CF, pri čemu se rastvarač preporučljivo bira iz grupe koja obuhvata monohidridne alkohole, polihidridne alkohole, ketone, etilen diamin, acetonitirl, etil acetat i njihove mešavine, preporučljivo pri čemu je CF jedinjenje izabrano iz ugljen dioksida, etana, propana, hidrohlorofluorougljenika, i hidrofluorougljenika, c) sinteza vezikula pomoću deprezurizacije rastvora koji nastaje iz faze b) na rastvoru koji se dobija kao rezultat iz faze a).

8. Postupak iz patentnog zahteva 7, pri čemu odnos između količine CF i organskog rastvarača odgovara približnoj molskoj frakciji CF od 0,3 do 0,95, preporučljivo 0,5 do 0,8.

9. Postupak iz patentnog zahteva 7 ili 8, pri čemu se rastvaranje holesterola, ili njegovih derivata, u CF izvodi u reaktoru pri odgovarajućem pritisku od 1 do 30 MPa i približnoj temperaturi od oko 10 do 70 °C, preporučljivo između 10 i 50 °C.

10. Posupak iz bilo kog od patentnih zahteva 7-9, pri čemu se EGF rastvara u vodenom rastvoru koji obuhvata katjonski surfaktant sa koncentracijom iznad njegove kritične micelarne koncentracije.

11. Farmaceutska supstanca koja obuhvata vezikule iz bilo kog od patentnih zahteva 1-6, i barem jedan farmaceutski prihvatljiv ekscipijent.

12. Supstanca iz patentnog zahteva 11, za primenu sistemskim, intralezionalnim, mukoznim, topikalnim, transdermalnim, oftalmičkim putevima ili kao inhaliranu formulaciju.

13. Vezikule prema bilo kom od patentnih zahteva 1-6 za upotrebu kao lek.

14. Vezikule prema bilo kom od patentnih zahteva 1-6, za upotrebu u lečenju složenih rana perifernih mekih tkiva.

15. Vezikule za upotrebu prema patentnom zahtevu 14, pri čemu je složena rana čir dijabetesnog stopala, venski čir, dekubitus čir ili opekotina.

16. Vezikule prema bilo kom od patentnih zahteva 1-6, za upotrebu u lečenju respiratornih poteškoća kod odraslih.

17. Vezikule prema bilo kom od patentnih zahteva 1-6, za upotrebu u lečenju lezija digestivnog trakta, preporučljivo za upotrebu za lečenje mukozitisa, ulcerativnog kolitisa, čireva dvanaestopalačnog creva ili distalnog kolitisa.

18. Vezikule prema bilo kom od patentnih zahteva 1-6, za upotrebu u lečenju lezija oka.

19. Kozmetički proizvod koji obuhvata vezikule iz bilo kog od patentnih zahteva 1-6, i barem jedan ekscipijent.

20. Upotreba vezikula iz bilo kog od patentnih zahteva 1-6, u proizvodnji kozmetičkog proizvoda, preporučljivo da je kozmetički proizvod proizvod za sprečavanje propadanja kao u slučaju senescencije i starenja kože.