RS55734B1

RS55734B1 - Molekuli antitela koji imaju specifično vezivanje za humani il-13

Info

Publication number: RS55734B1
Application number: RS20170163A
Authority: RS
Inventors: Neil Gozzard; Alastair David Griffiths Lawson; Daniel John Lightwood; Roger Thomas Palframan; Bryan John Smith; Kerry Louise Tyson
Original assignee: Ucb Biopharma Sprl
Priority date: 2009-03-11
Filing date: 2010-03-10
Publication date: 2017-07-31
Also published as: US20100260773A1; MX2011009390A; PT2406283T; EP3168235A1; TWI476004B; CN102388066A; IL215014A; JP5836130B2; EA032222B1; JP2012520067A; EP2406283A1; IL215014A0; CA2754539A1; US9394361B2; HUE031923T2; US9957320B2; AR075849A1; PL2406283T3; UY32489A; AU2010222693B2

Description

Opis pronalaska

[0001] Prisutni pronalazak se odnosi na antitela interteukina IL-13 i njihove fragmente kao sto su vezujući fragmenti, kompozicije koje ih sadrže, i konkretno na upotrebu ovih antitela u prevenciji i/ili lečenju različitih oboljenja, uključujući astmu, alergije, COPD, fibrozu i/ili kancer.

Pozadina pronalaska

[0002] IL-13 je kratki lanac citokina koji đeti 259«identičnosti sekvence sa IL-4. Obuhvata približno 132-e arrrino kiseline, formirajući sekudarne strukture od četiri spirale koje obuhvataju reziduume od10 do 21 (spirala A), od 43 do 52 (spirala B), od 61 do 69 (spirala c) i od 92 do 110 (spirala D), zajedno sa dve B-niti koje obuhvataju reziduume od 33 do 36 i od 87 do 90. Time je struktura rastvora IL-13 rešena, otkrivajući predvidjene gore-gore-dole-dole 4 spirale paketa sto je potvdjeno i posmatranjem IL-4 (Ajzen-maser 2001).

[0003] Humani IL-13je17-kDa glikoprotein je kloniran iz aktivirane T ćelije (Zutavvski i đe Vries 1994 Immunol Today 1519-26), i proizveden aktiviranjem T ćelije Th2 soja, iako ThO i Th1 CD4+ T ćelije, CD8+ T ćelije, i nekoliko populacija ne-T ćelija kao što su mast ćelije (mastociti) takodje proizvode IL-13 (Zurawski i de Vries 1994 Immunol Today 13 19-26).

[0004] Funkcija IL-13 uključuje: . imunoglobulin izotopa koji prebacuje IgE u humane 8 ćelije (Punnonen, Averse i drugi 1993 Proc Natl Acad Sci USA 90 3730-4) i • suzbijanje proizvodnje zapaljivih citokina u ljudima i miševima (de Waal Malefyt, Figdor i drugi 1993 J Immunol 151 6370 - 81; Dohertv, Kastelein i drugi 1993 J immunol 151 7151-60),

[0005J IL-13 vezuje za površinske ćelije receptore IL-13 Ralphal i IL-13 Ralpha2. IL-13Ralpha1 interaguje sa IL-13 niskim afinitetom (KD-10nM>, što je praćeno upošljavanjem IL-4Ra za formiranje visokog afiniteta (KD - 0.4nM) signalizacijom heterodimeričnog receptor kompleksa (Aman, Tayebi i drugi 1996 J Biol Chem 271 29265-70; Hilton, Zhang i drugi 1996 Proc Natl Acad Sci USA 93 497-501).

[0006] IL-4R/IL-13Ralpha1 kompleks je izražen na mnogim tipovima ćelija kao što su B ćelije, monociti/makrofage, dendrične ćelije, eosinofili, bazofili, fibroblaste, endotelne ćelije, epitelne ćelije disajnih puteva i ćelije glatkih mišića disajnih puteva (Graber, Gretener i drugi 1998 EurJImmunol 28 4286-98; Murata, Husein i drugi 1998 Int Immunol 10 1103-10; Akaiwa, Yu i drugi 2001 Cvtokine 13 75-84).

[0007] Vezivanje IL-13Ratpha1/IL-4 receptora kompleksa rezultira u aktiviranju raznolikih putanja signalne transdukcije uključujući transduktor (sondu) signala i aktivator prepisa (STAT 6) i insulin supstrat-2 (IRS -2) receptor putanje (Wang, Michieli i drugi 1995 Blood 864218-27; Takeda, Kamanaka i drugi 1996 J Immunol 157 3220-2).

[0008] IL-13Ralpha2 lanac ima visoki afinitet (KD - 0,25-0.4nM) za IL-13, i funkcije oba, i mamac receptora negativnim regulisanjem IL-13 vezivanja (Donaldson, Whitters i drugi 1998 J Immunol 161 2317-24), i signalnog receptora koji izaziva sintezu TGF-b i fibrozu preko AP-ja putanja u mikrofagi, i eventualno drugih tipova ćelija (Fichtera-Fejgla, Strober i drugi Nat Med 12 99-106).

[0009] Nekoliko studija (istraživanja) koje su sprevedene u prekiiničkim životinjskim modelima astme ukazuju da IL-13 igra važnu ulogu u astmi. Ovi podaci uključuju otpornost na strnu u IL-13 mokaut miševa, jednako dobro kao i inhibiciju astme fenotipa sa antagonistima IL-13 (rastvorljivi IL-13 receptori, anti-IL-13 mAbs, itd.) u različitim modelima miša (Sela 1999 Harefuah 137 317-9; VVills-Karp i Chiaramonte 2003 Curr Opin Pulm Med 9 21-7; WUts-Karp 2004 Immunol Rev 202 175-90). Mnogobrojna istraživanja su pokazala da farmakološka administracija rekombinovanog IL-13 u pućima miševa, jednako dobro kao i zamorcima izaziva hiper-sekreciju sluzi disajnih puteva, eosinofiliju i AHR (Grunig, Varnok i drugi 1998 Science 282 2261-3; WiUs-Karp, Luyimbazi i drugi 1998 Science 282 2258-61; Kibe, Inoue i drugi 2003 Am J Respir Oit Care Med 167 50-6; Vargaftig i Singer 2003 Am J Physiol Lung Cell Mol Phvsiot 284 L260-9; Vargaftig i Singer 2003 Am J Respir Cell Mol Biol 28 410-9).

[0010] Ovi efekti IL-13 se reprodukuju u sistemima transgemcnog (ukrštenog) miša sa ili konstruktivnim ili rnđueibilnim (uvedenim) izrazom IL-13 (Zhu, Homer i drugi 1999 J Clin Invest 103 779-88; Zhu, Lee i drugi 2001 Am J Respir Crit Care Med 164 S67-70; Lanone, Zheng i drugi 2002 J Clin Invest 110463-74). Hronično previše izraženi transgenični IL-13 takodje izaziva subepitelne fibroze i emfizeme. U miševima deficitarnim u IL-13 (i IL-4) signalnom molekulu STAT 6 ne uspevaju da razviju alergenom izazvani AHR i preteranu proizvodnju sluzi (Kuperman, Huang i drugi 2002 Nat Med 8 885-9). Studija upotrebom rastvorljivog IL-13 receptora fuzionog proteina (sDL-13Ralpha2Fc) pokazala je ključnu ulogu ovog citokina u eksperimentalnom alergenu ovalbumfna (jaje albumina) (OVA)-izazvanoj bolesti disajnih puteva (gruning, Varnok i drugi 1998 Science 282 2261-3; Eills-Karp, Luyimbazi i drugi 1998 Science 282 2258-61; Taube, Duez i drugi 2002 J Immunol 169 6482-9).

[0011]Efikasnost tretmana anti-lL-13 se takodje pokazala u modelu hronične astme murine. Pored izloženih karakteristika hiper-sebuma sluzi i AHR-a, ovaj model hronične astme pokazuje nekoliko obeležja ljudske bolesti koje nedostaju u više akutnih modela. Medju njima su eosinofilija tkiva pluća koja se nalazi u inter-epitelnim prostorima, kao i glatko mišićna fibroza merena povećanjem tatoženja kalogena. Model hronične astme je izazvan ponovljenim izazovima disajnih puteva sa OVA u OVA-osetljivim miševima jedanput nedeljno za ukupno 4 nedelje. Antitelo Anti-IL-13 je administracijom u poslednje dve nedelje OVA izazovima (obaveštenjem od 36 dana sa efikasnošću procenjivanom na 53. Dan istraživanja), značajno inhibiralo AHR, plućna zapaljenja, hiperplaziju goblet (peharastih) ćelija, povišenu sekreciju sluzi i fibrozu disajnih puteva (Yang, Lija i drugi 2005 J Pharmacol Exp Ter).

[0012] Terapeutski efekat antagonista IL-13 je takodje pokazao da sprečava AHR u primat modelima astme, (American Thoracic Societv, San Diego 2005).

[0013]IL-13 je upleten u patogenezu ljudske astme povišenim nivoima IL-13 mRNK i proteina otkrivenog u plućima astmatičnog pacijenta, a što je uzajamno povezano sa ozbiljnošću oboljenja (Huang, Xiao i drugi 1995 J Immunol 155 2688-94). Pored toga, otkriveno je da se humani IL-13 genetski polimorfizmi, koji vode do povišenih nivoa IL-13, udružuju sa astmom i atopičnim sindromima (Heinzmann, Mao i drugi 2000 Hum Mol Genet 9 549-59; Hoerauf, Kruse i drugi 2002 Microbes Infect 4 37-42; Vercelli 2002 Curr Opin AUergy Clin Immunol 2 389-93; Heinzmann, Jerkic i drugi 2003 J Allergy Clin Immunol 112 735-9; Chen, Ericksen i drugi 2004 J Altergy Clin immunol 114 553-60; Vladich, BraztUe i drugi 2005 J Clin Invest), a otkriveni su i povišeni nivoi IL-13 u plućima astmatičnih pacijenata (Huang, Xiao i drugi 1995 J Immunol 155 2688-94; Arima, i drugi Umeshita-Suvama i drugi 2002 J AUergy Clin Immunol 109 980-7; Berry, Parker i drugi 2004 J AHergy Clin Immunol 114 1106-9). Genetska povezanost izmedju IL-13 i astme se takodje dokazana kao individualna i sa polimorfizmom u IL-13 genu koji izaziva veće plazma nivoe IL-13 i povećava rizik za atopiju i astmu (Wills Karp 2000 Respir Res 1 19-23).

[0014]WO2006/055638 opisuje nekoliko humanih antagonističkih antitela anti-IL-13, od kojih se jedan pokazao da preokreće ovalbumin, ili hiper-reakciju disajnih puteva izazvanu česticama kućne prašine u murina modelu astme.

[0015] Zahvaljujući poznavanju uloge humanog IL-13 u raznim ljudskim oboljenjima, terapeutske strategije osmišljene su tako da spreče ili da se suprotstave aktivnosti IL-13. Posebno su tražena ona antitela koja se vezuju, i neutrališu IL-13, kao sredstvo za inhibiranje aktivnosti IL-13. Medjutim, postoji stručna potreba za pogodnim i/ili poboljšanim antitelima sposobnim za vezivanje IL-13, posebno humanog IL-13. Naročito su tražena antitela sposobna da neutrališu humani IL-13. Prisutni pronalazak obezbedjuje nove familije vezujućih proteina, CDR kalemljenih antitela, humanizovanih antitela i njihovih fragmenata, sposobnih za vezivanje humanog IL-13, vezivanje sa visokim afinitetom i vezivanje i neutralisanje humanog IL-13.

Rezime pronalaska

[0016]Ovaj pronalazak se odnosi na nova specifična antitela IL-13 i fragmente, na primer IL-13 vezujuće fragmente istih, a posebno na neutrališuća antitela i fragmente koji imaju teški lanac koji sadrži sekvencu datu u SEQ ID BR: 31 i laki lanac koji sadrži sekvencu datu u SEQ ID BR: 23.

Kratakoptscrteža

[0017] Slika 1prikazuje: sekvencu aminokiseline za svaki od CDR-ova 1,2, 3 teškog tanca (CDR H) i CDR 1, 2, 3 lakog lanca (CDR L) sekvencu aminokiseline za antitelo pacova lakog lanca varijabilnog regiona DNK sekvence za antitelo pacova lakog lanca varijabilnog regiona, i sekvencu aminokiseline za antitelo pacova lakog lanca varijabilnog regiona sa signalnom sekvencom,Slika 2prikazuje DNK sekvencu za antitelo pacova lakog lanca varijabilnog regiona sa signalnom sekvencom, sekvencu aminokiseline za antitelo pacova lakog lanca varijabilnog i konstantnog regiona DNK sekvence za antitelo pacova lakog lanca varijabilnog i konstantnog regiona sekvence aminokiseline za antitelo pacova lakog lanca sa signalnom sekvencomSlika 3prikazuje DNK sekvencu za antitelo pacova lakog lanca sa signalnom sekvencom sekvence aminokiseline za antitelo pacova teškog lanca varijabilnog regiona DNK sekvence za antitelo pacova teškog lanca varijabilnog regiona sekvence aminokiseline za antitelo pacova teškog lanca varijabilnog regiona sa signalnom sekvencomSlika 4prikazuje DNK sekvencu za antitelo pacova teškog lanca varijabilnog regiona sa signalnom sekvencom aminokiseline za antitelo pacova teškog lanca varijabilnog i konstantnog regionaSlika5 prikazuje DNK sekvencu za antitelo pacova teškog lanca varijabilnog i konstantnog regiona sekvence aminokiseline za antitelo pacova teškog lanca varijabilnog i konstantnog regiona sa signalnom sekvencomSlika6 prikazuje DNK sekvencu za antitelo pacova teškog lanca varijabilnog i konstantnog regiona sa signalnom sekvencom Slika 7 prikazuje sekvencu aminokiseline za humanizovano antitelo lakog lanca varijabilnog regiona DNK sekvence za humanizovano antitelo lakog lanca varijabilnog regiona sekvence aminokiseline za humanizovano antitelo varijabilnog regiona lakog lanca sa signalnom sekvencom DNK sekvence za humanizovano antitelo varijabilnog regiona lakog lanca sa signalnom sekvencom sekvence aminokiseline za humanizovano antitelo lakog lanca varijabilnog i konstantnog regiona Slika 8 prikazuje DNK sekvencu za humanizovano antitelo lakog lanca varijabilnog i konstantnog regiona sekvence aminokiseline za humanizovano antitelo lakog lanca varijabilnog i konstantnog regiona sa signalnom sekvencom DNK sekvence za humanizovano antitelo lakog lanca varijabilnog i konstantnog regiona sa signalnom sekvencom Slika 9 prikazuje sekvencu aminokiseline za humanizovano antitelo teškog lanca varijabilnog regiona DNK sekvence za humanizovano antitelo teškog lanca varijabilnog regiona sekvence aminokiseline za humanizovano antitelo teškog lanca varijabilnog regiona sa signalnom sekvencom DNK sekvence za humanizovano antitelo teškog lanca varijabilnog regiona sa signalnom sekvencom sekvence aminokiseline za humanizovano antitelo teškog lanca varijabilnog i konstantnog regiona Slika 10 prikazuje DNK sekvencu za humanizovano antitelo teškog lanca varijabilnog i konstantnog regiona sekvence aminokiseline za humanizovano antitelo teškog lanca varijabilnog i konstantnog regiona sa signalnom sekvencom DNK sekvence za humanizovano antitelo teškog lanca varijabilnog i konstantnog regiona.

Slika 11 prikazuje aminokiseline i DNK sekvence za humani VK 1 2-1 -(-1)02 JK4 aceptor okvir i VH2 3-1 2-26 JH4 aceptor okvir

Slika 12 prikazuje poravnjanje za lake lance pacova, aceptor okvira i humanizovane teške lance, kao i teške lance. CDR-ovi su podebljani i podvučeni, donator reziduumi G49 i R71 su podebljani, kurzivom i istaknuti.

Slika 13 Efekat Ab652 na BAL eotaksin-3 meren na 24 časa nakon alergen izazova. Podaci su izraženi oznakom ± SEM, n = 4-8 po grupi.

Slika 14 Efekat Ab652 na BAL eosinofil izračunat merenjem 24 časa nakon alergen izazova. Podaci su normalizovani za BALeosinofil i izračunati merenjem u istraživačkoj fazi skrininga. Oznakom ± SEM, n = 4-8 po grupi.

Slika 15. Efekat Ab652 na vrhuncu opstrukcije meren 15 minuta nakon alergen izazova. Podaci su izraženi oznakom ± SEM, n = 4-8 po grupi.

Slika 16. Efekat Ab652 na opstrukciju je meren 24 časa nakon alergen izazova. Podaci su normalizovani za opstrukciju merenu pre izlaganja alergenu. Oznakom ± SEM, n = 4-8 po grupi.

[0018] Reziduumi u varijabilnom domenu antitela su konvencionalno numerisani prema sistemu osmišljenom u Kabat-u, i drugim. Ovaj sistem je postavljen u Kabat i drugi, 1987, in Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Department of Health and Human Services, NIH, USA (kasnije u ovom dokumentu "Kabat i drugi (iznad)"). U prisutnoj specifikaciji se koristi ovaj sistem numerisanja, osim ako je drugačije naznačeno.

[0019] "Kabat" oznake reziduuma nisu uvek direktno podudarne sa linearnim numerisanjem reziduuma aminokiselina. Stvarna Linearna sekvenca aminokiselina može da sadrži manje ili više aminokiselina nego što je strogo odredjeno Kabatovim sistemom numerisanja, odgovarajućim skraćivanjem, ili umetanjem u strukturnu komponentu okvirnog ili komplementarno determinisanog regiona (CDR), osnovnog varijabilnog domena strukture. Ispravno Kabat numerisanje reziduuma može biti utvrdjeno na odredjenom aantitelu porevnjanjem reziduuma homologa u sekvenci za antitelo sa stardandnim Kabatovim numerisanjem sekvence.

[0020] CDR-ovi teškog lanca varijabilnog domena nalaze se na reziduumima od 31 do 35 (CDR-H1), reziduumima od 50 do 65 (CDR-H2) i reziduumima od 95 do 102 (CDR-H3) prema Kabatovom sistemu numerisanja. Medjutim, prema Chothia (Chothia, c. I Lesk, A.M. J. Mol. Biol., 196, 901-917 (1987), ekvivalent petlje za CDR-H1 proširen je iz reziduuma 26 na reziduum 32. Stoga, CDR-H1, kao što se upotrebljava u ovom dokumentu, sastoji se od reziduuma od 26 do 35, kao što je opisan kombinacijom Kabatovog sistemom numerisanja i Chothia definicijom topološke petlje.

[0021] CDR-ovi lakog lanca varijabilnog domena se nalaze na reziduumima od 24 do 34 (CDR-L1), reziduumima od 50 do 56 (CDR-L2) i rezduumima od 89 do 97 (CDR-L3) prema Kabatovom sistemu numerisanja.

[0022] U jednoj instanci antitelo je antagonističko antitelo.

[0023] Termin "antagonističko antitelo", kao Što se upotrebljava ovde u dokumentu, opisuje antitelo koje je sposobno da inhibira i/ili neutrališe biološke signalne aktivnosti IL-13, na primer blokiranjem vezivanja ili znatnim smanjenjem vezivanja IL-13 za IL-13 receptor i samim tim inhibira aktiviranje receptora.

[0024] Antitela za upotrebu u prisutnom pronalasku mogu se dobiti upotrebom bilo koje odgovarajuće metode poznate u struci. IL-13 polipeptid, uključujući fuzioni polipeptid koji sadrži IL-13, ili ćelije (rekombinovane) koje izražavaju polipeptid, takodje se mogu upotrebiti za proizvodnju antitela koja izričito prepoznaju IL-13. IL-13 polipeptid može biti "zreli" polipeptid ili biološki aktivni fragment ili derivat istih. IL-13 polipeptidi mogu biti pripremljeni procesima koji su dobro pozati u struci iz genetski modifikovane ćelije domaćina koje sadrže sisteme izraza ili mogu biti otkriveni iz prirodnih izvora. U prisutnoj aplikaciji, termin "polipeptidi" uključuje peptide, polipeptide i proteine. Oni se upotrebljavaju sa istim značenjem, osim ako nije drugačije navedeno. Polipeptid IL-13 u nekim slučajevima (instancama) može biti deo većeg proteina kao što je fuzioni protein na primer koji je fuzionisan (pripojen) za marker afiniteta.

[0025] Antitela generisana protiv polipeptida IL-13 se mogu dobiti, tamo gde je imunizacija životinja neophodna, administracijom polipeptida na životinju, po mogućstvu ne-humanih životinja, upotrebom dobro poznatih i rutinskih protokola, videti za primer Priručnik za eksperimentalnu imunologiju, D.M. Weir (izdanje), Vol 4, Blackvvell Scientific Publishers, Oxford, England, 1986). Mnoge toplokrvne životinje, kao što su zečevi, miševi, pacovi, ovce, krave, kamile ili svinje mogu biti vakcinisane. Medjutim, miševi, zečevi, svinje i pacovi generalno najviše odgovaraju.

[0026]Antitela za upotrebu u prisutnom pronalasku uključuju sva antitela i funkcionalno aktivne fragmente ili derivate istih, i mogu biti, ali nisu ograničeni na, monoklonalna, humanizovana, u potpunosti humana ili himerična antitela.

[0027] Monoklonalna antitela mogu biti pripremljena bilo kojom metodo poznatom u struci kaao što je hidrama tehnika (Kohler&Mitstein, 1975, Nature, 256;495-497), trioma tehnika, hidroma tehnika humane B ćelije (Kozbor i drugi, 1983, Immunologv Today, 4:72) i EBV-hidroma tehnika (Cole i drugi, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapv, pp77-96, Alan RLis, Inc., 1985).

[0028]Antitela za upotrebu u predmetnom pronalasku mogu se takodje generisati upotrebom jednog linfocita antitela metodama kloniranja i izrazom imunoglobulina varijabilnog regiona cDNK-a generisanog iz jednog limfocita izabranog za proizvodnju specifičnih antitela na primer metodama opisanim u Babcook, J. I drugi, 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93(15):7843-78481; WO92/02551; WO2O04/O51268 i Medjunarodnoj Patent Aplikaciji Broj WO2004/106377.

[0029] Skrining za antitela se može izvršiti upotrebom testova za merenje vezivanja IL-13 i/iti testova za merenje mogućeg blokiranja vezivanja IL-13, koji je nepomičan na pločama, i upošljava sekundarno antitelo da detektuje antitela anti-IL-13 vezana za IL-13. Primer za test blokiranja je protočna citometrija zasnovana na testu merenja blokiranja IL-13 ligand proteina u vezivanju za IL-13R. Fluorescentno obeleženo sekundarno antitelo se upotrebljava za otkrivanje količine IL-13 ligand proteina vezanog za IL-13R. [0030J Humanizovana antitela (što uključuje CDR-kalemljena antitela) su molekule koje imaju jedan ili više komplementarno determinisanih regiona (CDR-ova) od ne-humanih vrsta i okvirni region iz humanog molekula imunoglobulina (videti, na primer US 5,585,089; W091 /09967). Procenjeno je da može biti neophodno preneti samo posebno determinisane reziduume CDR-ova, a ne čitave CDR-ove (videti na primer, Kashmiri i drugi, 2005, Methods, 36, 25-34). Humanizovana antitela opcionalno mogu dalje sadržavati jedan ili više okvirnih reziduuma izvedenih iz ne-humanih vrsta iz kojih su dobijeni (izvedeni) CDR-ovi.

[0031]Himerična antitela su sastavljena od elemenata izvedenih iz dve različite vrste, takve da element zadržava karakteristike vrste iz koje je izveden. Generalno, himerična antitela sastojaće se od varijabilnog regiona iz jedne vrste, na primer miša, pacova, zeca ili slično i onstantnog regiona iz druge vrste, kao na primer čoveka.

[0032] Antitela za upotrebu u prisutnom pronalasku mogu takodje biti generisana upotrebom različitih metoda faga prikaza poznatih u struci, uključujući i one otkrivene i Brinkman i drugi, (u J. Immunol, 1994, 182;41-50), Ames i drugi, (J. (mmunot. Methods, 1995, 184; 177-186), Kettleborought i drugi (Eur. J. Immunol, 1994, 24:952-958), Persic i drugi (Gene, 1997, 187 9-18), Burton i drugi (Advances tn Immunologv, 1994, 57:191-280) i W0 90/02809; W0 91/10737; WO 92/01047; WO 92/18619; WO 93/11236; W0 95/20401; i US 5,698,426; 5,223,409; 5,403,484; 5,580,717; 5,427,908; 5,750,753; 5,821,047; 5,571,698; 5,427,908; 5,516,637; 5,780,225; 5,658,727; 5,733,743 i 5,969,108.

[0033]U potpunosti humana antitela su ona antitela u čijim varijabilnim regionima i konstantnim regionima (kada su prisutni) su oba, i teški i laki lanci, humanog porekla ili znatno identični sekvenci humanog porekla, ali ne nužno Iz istog antitela. Primeri u potpunosti humanih antitela mogu uključivati antitela proizvedena, na primer metodama faga prikaza, što je opisano gore u dokumentu i antitela proizvedena iz miša u kojima je imunoglobulin murine varijabla (promenljiva) i opcionalno konstantni region gena je zamenjen sa njihovim humanim ekvivalentima, na primer, kao što je opisano u opštim uslovima u EP 0546073, US 5,545,806, US 5,569,825, US 5,625,126, US 5,633,425, US 5,661,016, US 5,770,429, EP 043 8474 i EP 0463151.

[0034]Antagonističko antitelo je ono koje ima specifičnosti za humani IL-13 i može da obuhvata teški lanac, gde se varijabilni domen teškog lanca sastoji od najmanje jednog CDR-a imajući sekvencu datu u Slika 1, SEQ ID BR: 1 za CDR-H1, CDR-a imajući sekvencu datu u SEQ IO BR: 2 za CDR-H2 i/ili CDR-a imajući sekvencu datu u SEQ ID BR: 3 za CDR-H3.

[0035] Antagonističko antitelo koje ima specifičnosti za humani IL-13 koji može da obuhvata teški lanac, gde su najmanje dva od CDR-H1, CDR-H2 i CDR-H3 varijabilnih domena teškog lanca izabrana iz sledećih: sekvence date u SE0JD BR: 1 za CDR-H1, sekvence date u SEQ ID BR: 2 za CDR-H2 i sekvence date u SEQ ID BR: 3 za CDR-H3. Na primer, antitelo može da obuhvata teški lanac gde CDR-H1 ima sekvencu datu u SEQ ID BR: 1, i CDR-H2 ima sekvencu datu u SEQ. ID BR: 2, Alternativno, antitelo može da obuhvata teški lanac gdeCDR-H1 ima sekvencu datu u SE0JD BR; 1 i CD-H3 ima sekvencu datu u SEQ ID BR: 3 ili antitelo može da obuhvata teški lanac gde CDR-H2 ima sekvencu datu u SEQ. ID BR: 2 i CDR-H3 ima sekvencu datu u SEQ ID BR: 3. Za izbegavanje sumnje, razumljivo je, da su sve permutacije uključene.

[0036]Antagonističko antitelo koje ima specifičnosti za humani IL-13 je obezbedjeno, gde varijabilni domen teškog lanca obuhvata sekvencu datu u SEQ ID BR: 1 za CDR-H1, sekvencu datu u SEQ ID BR: 2 za CDR-HZ i sekvencu datu u SEQ ID BR: 3 za CDR-H3.

[0037] Antagonističko antitelo koje ima specifičnosti za humani IL-13 može da obuhvata laki lanac, gde varijabilni domen lakog lanca obuhvata najmanje jedan CDR koji ima sekvencu datu u Slika 1, SEQ ID BR: 4 za CDR-L1, CDR koji ima sekvencu datu u SEQ ID BR: 5 za CDR-L2 i/ili CDR koji ima sekvencu datu u SECl ID BR: 6 za CĐR-L3.

[0038] Antagonističko antitelo koje ima specifičnosti za humani IL-13 može da obuhvata laki lanac, gde su najmanje dva od CDR-L1, CDR-L2 i CDR-L3 varijabilnih domena lakog lanca izabrana iz sledećih: sekvence date u SEQ ID BR: 4 za CDR-L1, sekvence date u SEQ ID BR: 5 za CDR-L2 i sekvence date u SEQ ID BR: 6 za CDR-L3. Na primer, antitelo može da obuhvata laki lanac gde CDR-L1 ima sekvencu datu u SEQ ID BR: 4, i CDR-L2 sekvencu datu u SEOJD BR: 5. Atternativno, antitelo može da obuhvata laki lanac gde CDR-L1 ima sekvencu datu u SEQ ID BR: 4 i CDR-L3 ima sekvencu datu u 5EQ ID BR: 6 ili antitelo može da obuhvata laki lanac gde CDR-L2 ima sekvencu datu u SEQ_ ID BR: 5, i CDR-L3 sekvencu datu u SEQ ID BR: 6. Za izbegavanje sumnje, razumljivo je, da su sve permutacije uključene.

[0039] Antagonističko antitelo koje ima specifičnosti za humani IL-13 je obezbedjeno, gde varijabilni domen lakog tanca obuhvata sekvencu datu u SEQ ID BR: 4 za CDR-L1, sekvencu datu u SEQ ID BR: 5 za CDR-L2 i sekvencu datu u SEQ ID BR: 6 za CDR-L3. [0O40] Molekule antitela prisutnog pronalaska pogodno obuhvataju komplementarni laki lanac, odnosno, ili komplementarni teški lanac.

[0041] Antitelo prema prisutnom pronalasku obuhvata teški lanac, gde varijabilni domen teškog lanca obuhvata sekvencu datu u SEO.ID BR: 1 za CDR-H1, sekvencu datu u SEQ ID BR: 2 za CDR-H2 i sekvencu datu u SEQ ID BR: 3 za CDR-H3 i laki lanac gde varijabilni domen lakog lanca obuhvata sekvence date u SECi ID BR: 4 CDR-L1, sekvencu datu u SEQ ID BR: 5 za CDR-L2 i sekvence date u SEQ ID BR: 6 za CDR-L3.

[0042] Procenjeno je da jedna ili više substitucija aminokiselina, dopuna i/ili brisanja mogu biti napravljeni na CDR-ovima obezbedjenim prisutnim pronalaskom bez značajnog menjanja sposobnosti antitela da vežu za IL-13 i neutrališu aktivnosti IL-13. Efekat bilo koje substitucije aminokiselina, dopune i/ili brisanja može lako očitati testiranjem bilo ko stručan iz ove oblasti, na primer metodama opisanim u ovom dokumentu, posebno onih ilustrovanih u primerima, za odredjivanje IL-13 vezivanja i inhibicije za IL-13/IL-13 receptor interakcija.

[0043] Shodno tome, antitelo koje ima specifičnosti za humani IL-13 može da obuhvata jedan ili više CDR-ova izabranih izCDRH-1(SEQ IDBR:1 >, CDRH-2 <SEQ ID BR: 2), CDRH-3 (SEQ IDBR:3), CDRL-1(SE0_IĐBR: 4),CDRL-2 (SEQID BR:5) i CDRL-3 (SEQ ID BR: 6) u kome je jedna ili više aminokiselina u jednom ili više CDR-ova substituisana sa drugom a mino kiselinom, na primer sličnoj aminokiselini kao što je definisano u ovom dokumentu ispod.

[0044] Antitelo koje ima specifičnosti za humani 1-13 može obuhvatati CDRH-1 (SEQ_ ID BR: 1), CDRH-2 (SEQ ID BR: 2 ili SEQ ID BR: 20), CDRH-3 (SEQ ID BR: 3), CDRL-1 (SEQ ID BR: 4), CDRL-2 (SEQ. ID BR: 5) i CDRL-3 (SEQ ID BR: 6), na primer u kome je jedna ili više aminokiselina u jednom ili više CDR-ova substituisana sa drugom aminokiselinom, kao što je slična aminokiselina kao što je definisano u ovom dokumentu ispod.

[0045] Antitelo koje ima specifičnosti za humani IL-13 može da obuhvata teški lanac, gde varijabilni domen teškog lanca obuhvata tri CDR-a gde sekvenca CDRH-1 ima najmanje 60% identiteta ili sličnosti sa sekvencom datom u SEQ ID BR: 1, CDRH-2 ima najmanje 60* identiteta ili sličnosti sa sekvencom datom u SECJ ID BR: 2 i/iti CDRH-3 ima najamanje 60% identiteta ili sličnosti sa sekvencom datom u SEQ ID BR: 3. Takvo antitelo može obuhvatati teški lanac, gde varijabilni domen teškog lanca obuhvata tri CDR-a gde sekvenca CDRH-1 ima najmanje 70%, 80%, 90%, 95% ili 98% identiteta ili sličnosti sa sekvenco datom u SEQ ID BR: 1, CDRH-2 ima najmanje 70%, 80%, 90%, 95% ili 98% identiteta ili sličnosti sa sekvencom datom u SEQ ID BR: 2 i/ili CDRH-3 ima najmanje 70%, 80%, 90%, 95% ili 98% identiteta ili sličnosti sa sekvencom datom u SEQ ID BR: 3.

[0046] "Identitet", kao što se upotrebljava u ovom dokumentu, ukazuje da je na bilo kom određenom položaju u poravnatim sekvencama, reziduum aminokiselina identičan između sekvenci. "Sličnosti", kao što se upotrebljava u ovom dokumentu, ukazuje na to, da je na bilo kom određenom položaju u poravnatim sekvencama, reziduum aminokiselina sličnog tipa između sekvenci. Na primer, leudn može biti zamena za izoleucin i Valin. Ostale aminokiseline koje često mogu biti zamena za neke druge uključuju, ali nisu ograničene na: fenitatanin, tirozin i triptofan (aminokiseline koje imaju aromatične bočne lance);

lizin, arginin i histidin (aminokiseline koje imaju osnovne bočne lance);

aspartat i gtutaminat (aminokiseline koje imaju kisete bočne lance);

asparagin i glutamin (aminokiseline koje imaju amid bočne lance); i

cistein i metionin (aminokiseline koje imaju bočne lance sumpornog sadržaja).

Stepeni identiteta i sličnosti mogu se lako izračunati (Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., izd., Oxford L)niversity Press, New York, 1988; Biocomputing. Informatics i Genome Projects, Srnith, D.W., izd., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, Griffin, A.M., i Griffin, H.G., izdanja., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987, Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. i Devereux, J., izdanja., M Stockton Press, New York, 1991, the BLAST™ softver dostupan iz NCBI (Altschul, S.F. i drugi, 1990, J. Mol. Biol. 215:403-410; Gish, W. a States, DJ. 1993, Nature Genet. 3:266-272. Madden, T.L. i drugi, 1996, Meth. Enzvmol. 266:131-141; Altschul, S.F. i drugi., 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402; Zhang, J. & Madden, T.L. 1997, Genome Res. 7:649-656,).

[0047] Antitelo koje ima specifičnosti za IL-13 može da obuhvata laki lanac, gde varijabilni domen lakog lanca obuhvata tri CDR-a gde sekvenca CDRL-1 ima najmanje 60% identiteta ili sličnosti sa sekvencom datom u SEQ ID BR: 4, CDRL-2 ima najmanje 60% identiteta ili sličnosti sa sekvencom datom u SEQ ID BR:5 i/ili CDRL-3 ima najmanje 60% identiteta ili sličnosti sa sekvencom datom u SEQ ID BR: 6. Takvo antitelo može da obuhvata laki lanac, gde varijabilni domen lakog lanca obuhvata tri CDR-a gde sekvenca CDRL-1 ima najmanje 70%, 80%, 90%, 95% ili 98% identiteta ili sličnosti sa sekvencom datom u SEQ ID BR: 4, CDRL-2 ima najmanje 70%, 80%, 90%, 95% ili 98% identiteta ili sličnosti sa sekvencom datom u SEQ ID BR: 5 i/ili CDRL-3 ima najmanje 70%, 80%, 90%, 95% ili 98% identiteta ili sličnosti sa sekvencom datom u

SEOJD BR:6.

[0048] U jednoj instanci antitelo obezbedjeno prisutnim pronalaskom je monoktonalno antitelo.

[0049]Antitelo može biti molekul CDR-kalemljenog antitela koji sadrži jedan ili više CDR-ova obezbeđenih u SEQ ID Brojevi: 1, 2, 3, 4, 5, 6 ili varijanti istih. Kao u ovom dokumentu upotrebljava, termin "molekul CDR-kalemljenog antitela" odnosi se na molekul antitela gde teški i/ili laki lanac sadrži jedan ili više CDR-ova (uključujući, ako je poželjno, jedan ili više izmenjenih tj. modifikovanih CDR-ova) iz antitela donatora (na primer monoklonalno antitelo murine ili pacova) kalemljeno u teški i/ili laki lanac varijabilnog regiona okvirnog antitela aceptora (na primer za humano antitelo). Za pregled, videti Vaughan i drugi, Nature Biotechnology, 16, 535-539, 1998.

[0050]Kada su CDR-ovi ili specifično determinisani reziduumi kalemljeni, na bilo kojoj odgovarajućoj sekvenci varijabilnog regiona okvirno se mogu upotrebiti imajući obzira na klasu/tip antitela donatora iz kojeg su izvedeni CDR-ovi, uključujući miša, primate i humane okvirne regione. Prikladno, CDR-kalemljeno antitelo ima varijabilni domen koji sadrži humani aceptor okvirnih regiona, jednako kao jedan ili više CDR-ova ili specifično đeterminisanih reziduuma, kao što je opisano gore u ovom dokumentu. Stoga, obezbedjeno u jednoj instanci je neutrališuće CDR-kalemljeno antitelo gde varijabilni domen sadrži humani aceptor okvirnih regiona i CDR-ove ne-humanog donatora.

[0051]Primeri humanog okvira koji se može upotrebiti u prisutnom pronalasku su Kole, NEWM, REI, EU, TUR, TEI, LAY i POM (Kabat i drugi, gore). Na primer, KOLi NEVVM mogu se upotrebiti za teški lanac, REI se može upotrebiti za laki lanac i EU, LAY i POM mogu se upotrebiti za teški lanac i laki lanac. Alternativno, mogu se upotrebiti humane embrionske sekvence; dostupne na: htt ://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/

[0052]U CDR-kalemljenom antitelu, aceptor teških i lakih lanaca nije neophodno izvesti iz istog antitela i može, ako je poželjno, obuhvatati složene lance koji imaju okvirne regione izvedene iz različitih lanaca.

[0053]Pogodan okvirni region za teške lanac CDR-kalemljenog antitela je izveden iz humane pod-grupe VH2 sekvence 3-1 2-26 zajedno sa JH4 (SEQ_ ID BR: 41). Shodno tome, obezbedjeno je neutrališuće CDR-kalemljeno antitelo koje sadrži najmanje jedan CDR ne-humanog donatora gde je okvirni region teškog lanca izveden iz humane podgrupe sekvence VH2 3-1 2-26 zajedno sa JH4. Sekvenca humanog JH4 je kao što sledi: (YFDY) WGQGTLVTVS (Seq ID Br: 43). YFDY motiv je deo C0R-H3 i nije deo okvira 4 (Ravetch, JV. i drugi, 1981, Cell, 27, 583-591).

[0054]Pogodan okvirni region za laki lanac CDR-kalemljenog antitela je izveden iz humane bacil linije sub-grupe VK1 sekvence 2-1 1-02 zajedno sa JK4 (SEQ. ID BR: 39). Shodno tome, obezbedjeno je neutrališuće CDR-kalemljeno antitelo koje sadrži najmanje jedan CDR ne humanog donatora gde je laki lanac okvirnog regiona izveden iz humane podgrupe sekvence 2-1 1-02 zajedno sa JK4. JK4 sekvenca je kao što sledi: (LT)FGGGTKVEIK (Seq ID BR: 44). LT motiv je deo CDR-L3 i nije deo okvira 4 (Hieter, PA., i drugi, 1982, J. Biol. Chem., 257,1516-1522).

[0055]U jednoj instanci laki i/ili teške okvir je izabran iz sekvence kao što je prikazano u SEQ_ ID Br: 39 za 42.

[0056]Takođe, u CDR-kalemljenom antitelu, okvirni regioni nije potrebno da imaju potpuno iste sekvence kao što

su one u antitelu aceptora. Na primer, neobični reziduumi mogu biti promenjeni češće-javljanim reziduumima za aceptor lanac klasu ili tip. Alternativno, izabrani reziduumi u aceptor okvirnim regionima može biti promenjeni tako da oni odgovaraju reziduumima nadjenim na istoj poziciji u antitelu donatora (vidi Reichmann i drugi,1998, Nature, 332, 323-324), Takve promene trebalo bi održati na minimumu neophodnom za oporavak afiniteta antitela donatora. Protokol za izbor reziduuma u okvirnim regionima aceptora koji mogu biti potrebni za promenu izložen je u W0 91/09967.

[0057] U molekulu CDR-kalemljenog antitela molekulu prisutnog pronalaska, ako teški lanac aceptora ima humane VH2 sekvence 3-12-26 zajedno sa JH4, onda okvirni region aceptora teškog lanca obuhvata, pored jednog ili više CDR-a davaoca, donator reziduuma na najmanje jednoj od pozicija 49 i 71 (prema Kabat, i ostali, (gore)) (PogledatiFiguru12).

[0058]Shodno tome, obezbedjeno je CDR-kalemljeno antitelo, gde su najmanje reziduumi na pozicijama 49 i 71 varijabilnog domena teškog lanca, reziduumi donatora.

[0059]Reziduumi donatora su reziduumi iz antitela donatora, odnosno antitelo iz kojeg su CDR-ovi prvobitno izvedeni. Po mogućstvu, reziduumi su Glicin i Arginin na pozicijama 49 i 71 odnosno.

[0060] U jednoj instanci, antitelo prisutnog pronalaska obuhvata teški lanac, gde varijabilni domen teškog lanca obuhvata sekvencu datu u SEQ_ ID BR: 31

[0061]Ocenjeno je da jedan ili više substituenata aminokiselina, dodataka i/ili brisanja može biti za antitelo varijabilnog domena, obezbedjeno prisutnim pronalaskom, bez značajnog menjanja sposobnosti vezivanja antitela za IL-13 i neutralizovanje IL-13 aktivnosti. Efekti bilo kojih substituisanih amino kiselina, dodataka i/ili brisanja mogu lako biti testirani od strane stručnih u ovoj oblasti, na primer pomoću metoda opisanih u primerima za utvrdjivanje IL-13 vezivanja i/ili blokiranja ligand/receptora.

[0062]Antitelo može obuhvatati teški lanac, gde se varijabilni domen teškog lanca sastoji od sekvence koja ima najmanje 7036, 80%, 90%, 95% ili 98% identiteta ili sličnosti sa sekvencom datom u SEQ ID BR: 31.

[0063]U jednoj instanci, antitelo prisutnog pronalaska obuhvata laki lanac, gde varijabilnidomenlakog lanca obuhvata sekvencu datu u SEQ ID BR: 23.

[0064]Antitelo može obuhvatati laki lanac, gde varijabilni domen lakog lanca obuhvata sekvencu koja ima najmanje 70%, 80%, 90%, 95% ili 98% identiteta ili sličnosti sa sekvencom datom u SEQ ID BR: 23.

[0065]U jednoj instanci antitelo prisutnog pronalaska obuhvata teški lanac, gde varijabilni domen teškog lanca obuhvata sekvencu datu u SEQ ID BR: 31 i laki lanac, gde varijabilni domen lakog tanca obuhvata sekvencu datu u SEQ ID BR: 23.

[0066]Antitelo može da obuhvata teški lanac i laki lanac, gde varijabilni domen teškog lanca obuhvata sekvencu koja ima najmanje 60% identiteta ili sličnosti sa sekvencom datom u SEQ ID BR: 31 i varijabilni domen lakog lanca obuhvata sekvencu koja ima najmanje 60% identiteta ili sličnosti sa sekvencom datom u SEQ ID BR: 23. Odgovarajuće, antitelo obuhvata teški lanac, gde varijabilni domen teškog lanca obuhvata sekvencu koja ima najmanje 70%, 80%, 90%, 95% ili 98% identiteta ili sličnosti sa sekvencom datom u SEQ ID BR: 31 i laki lanac, gde varijabilni domen lakog lanca obuhvata sekvencu koja ima najmanje 70%, 80%, 90%, 95% ili 98% identiteta ili sličnosti sa sekvencom datom u SEQ ID BR: 23.

[0067] Molekule antitela prisutnog pronalaska mogu obuhvatati kompletan molekul antitela koji Ima punu dužinu teških i lakih lanaca ili fragmente istih i mogu biti, ali nisu ograničeni na Fab, modifikovani Fab, Fab', modifikovani Fab', F(ab')2, Fv, jedan domen antitela (na primer VH ili VL ili VHH), scFv, dvo-, tro- ili četvoro-valentna antitela, Bis-scFv, dvojna antitela, trojna antitela, četvoro antitela i epitope-vezujućih fragmenata bilo kojeg od navedenih (videti za primer Holliger i Hudson, 2005, Nature Biotech. 23 (9): 1126-1136; Adair i Lavvson, 2005, Drug Design Reviews - Online 2(3), 209-217). Metode za kreiranje i proizvodnju ovih fragmenata antitela su poznati u struci (videti za primer Verma i drugi, 1998, Journal of Immunological Methods, 216, 165-181). Ostali fragmenti (delovi) antitela za upotrebu u prisutnom pronalasku uključuju Fab i Fab' fragmente opisane u međunarodnim patentima WO 2005/003169, WO 2005/003170 i WO 2005/003171 i Fab-đAb fragmente što je opisano u međunarodnom patentu VVO2009/040562. Više-valentna antitela mogu obuhvatati više specifičnosti ili mogu biti monospecifična (videti za primer WO 92/22853 i WO 05/113605).

[0068]Domeni konstantnog regiona molekule antitela prisutnog pronalaska, ako su prisutni, mogu biti izabrani imajući obzira na predloženu funkciju molekula antitela, a posebno na efektor funkcije koje mogu biti potrebne. Na primer, domeni konstantnog regiona mogu biti humani IgA, IgD, IgE, ICT ili IgM domeni. Odgovarajući, humani ICT domeni konstantnog regiona se mogu upotrebiti, naročito IgC 1 i lgG3 izotopi kada je molekul antitela namenjen u terapijske svrhe i kada je potrebno antitelo efektor funkcija. Alternativno, lgG2 i lgG4 izotopi se mogu upotrebiti kada molekul antitela služi u terapijske svrhe i kada antitelo efektor funkcija nije potrebno, na primer za jednostavno blokiranje aktivnosti IL-13. Ocenjeno je da se sekvenca varijanti ovih domena konstantnog regiona može takodje upotrebiti. Na primer, mogu se upotrebiti lgG4 molekuli u kojem je serin na poziciji 241 promenjen u prolin kao što je opisano u Angal i drugi, Molecular lmmunology, 1993, 30 (1), 105-108. Takodje će biti shvaćeno od strane stručnih u ovoj oblasti da antitela mogu prolaziti kroz različite posttranslacionalne modifikacije. Vrsta i obim ove modifikacije često zavise od reda ćelije domaćina upotrebijenog za izraz antitela kao uslova kulture. Takve modifikacije mogu da uključuju varijacije u glikozilaciji, metionin oksidaciji, diketopiperazin formaciji, aspartat izomerizaciji i asparagin deamidaciji. Učestalom modifikacijom gubi se karboksi-terminal osnovnog reziduuma (kao što je tizin ili arginin) usled dejstva karboksipeptidaza (kao što je opisano u Harris, RJ. Journal of Chromatography 705:129-134, 1995). Međutim, nema C-terminala Lizina niti teškog niti lakog lanca Ab652 instance predmetnog pronalaska.

[0069]U jednoj instanci antitelo teškog lanca obuhvata CH1 domen i antitelo lakog lanca obuhvata CL domen, ili kappa (k) ili (ambda (A).

[0070]U jednoj instanci antitelo obezbedjeno prisutnim pronalaskom je antagonističko antitelo koje ima specifičnosti (posebnosti) za humani IL-13 u kom teški lanac konstantnog regiona obuhvata modifikovani zglobni region. Shodno tome, prisutni pronalazak obezbedjuje antitelo u kojem teški lanac obuhvata ili se sastoji od sekvence date u SEQ ID BR: 35.

[0071] Ocenjeno je da jedan ili više substituenata aminokiseline, dodataka i/ili brisanja može biti proizvedeno za antitelo varijabilnog i/ili konstantnog domena obezbedjeno prisutnim pronalaskom bez značajnog menjanja sposobnosti antitela za vezivanje sa IL-13 i za neutralizovanje aktivnosti IL-13. Efekat bilo substituenata amino kiselina, bilo dodaka i/ili brisanja može biti lako testiran od strane stručnih u ovoj oblasti, na primer pomoću metoda opisanih u ovom dokumentu, posebno onih ilustrovanih u Prlmerima, za određivanje IL-13 vezujuće i blokirajuće interakcije IL-13/IL-13 receptora.

[0072] Antitelo može da obuhvata teški lanac, gde teški lanac sadrži sekvencu koja ima bar 60% identiteta ili sličnosti sa sekvencom datom u SEQ ID BR: 35. Odgovarajuće, antitelo obuhvata teški lanac, gde teški lanac sadrži sekvencu koja ima najmanje 70%, 80%, 90%, 95% ili 98% identiteta ili sličnosti sa sekvencom datom u SEQ ID BR: 35.

[0073]U jednoj instanci molekul antitela prema prisutnom pronalasku obuhvata laki lanac koji sadrži sekvencu datu u SEQ ID BR: 27.

[0074]Antitelo može da obuhvata laki lanac, gde laki lanac sadrži sekvencu koja im bar 60% identiteta ili sličnosti sa sekvencom datom u SEQ ID BR: 27. Na primer, antitelo obuhvata laki lanac, gde laki lanac sadrži sekvencu koja ima najmanje 70%, 80%, 90%, 95% ili 98% identiteta ili sličnosti sa sekvencom datom u SEQ ID BR: 27.

[0075]U jednoj instanci prisutni pronalazak obezbedjuje antitelo u kom teški lanac obuhvata ili se sastoji od sekvence date u SEQ ID BR: 35 i laki lanac koji obuhvata ili se sastoji od sekvence date u SEQ.IDBR: 27.

[0076]Antitelo može da obuhvata teški lanac i laki lanac, gde teški lanac sadrži sekvencu koja ima najmanje 60% identiteta ili sličnosti sa sekvencom datom u SEQ ID BR: 35 i laki lanac koji sadrži sekvencu koja ima najmanje 60% identiteta ili sličnosti sa sekvencom datom u SEQ ID BR: 27. Generalno, antitelo obuhvata teški lanac, gde teški lanac sadrži sekvencu koja ima najmanje 70%, 80%, 90%, 95% ili 98% identiteta ili sličnosti sekvencom datom u SEQ_ ID BR: 35 i laki lanac, gde laki lanac sadrži sekvencu koja ima najmanje 70%, 80%, 90%, 95% ili 98% identiteta ili sličnosti sa sekvencom datom SEOJD BR:27.

[0077]Biološke molekule, kao što su antitela ili fragmenti, sadrže kisele i/ili bazne funkcionalne grupe, pružajući tako molekul neto pozitivnog ili negativnog naelektrisanja. Iznos ukupnog "posmatranog" naelektrisanja će zavisiti od apsolutne sekvence aminokiseline entiteta, lokalnog okruženja naelektrisanih grupa u 3D strukturi i ekoloških uslova molekule. Izoelektrična tačka (pl) je pH na kojoj određeni molekul ili površina ne nosi neto električno naelektrisanje. U jednoj instanci antitelo ili fragment prema prisutnom pronalasku ima izoelektričnu tačku (pl) od najmanje 7. U jednoj instanci antitelo ili fragment je jedna izoelektrična tačka najmanje 8, kao što je 8.5, 8.6, 8,7, 8.8 ili 9. U jednoj instanci pi antitela je 8.

[0078] IL-13 antitelo i fragmenti predmetnog pronalaska mogu biti projektovani da imaju odgovarajuću izoelektričnu tačku. Ovo može dovesti do antitela i/iti fragmenata sa ojačanim svojstvima, posebno pogodne rastvorijivosti i/ili stabilnosti profila.

[0079] Stoga u jednom aspektu humanizovanog IL-13 antitela može biti projektovana (mođifikovana) jedna izoelektrična tačka koja se razlikuje od prvobitno identifikovanog antitela. Antitelo može, na primer biti projektovano substitucijom reziduuma amino kiseline kao što su substituisani reziduumi kisele aminokiseline sa jednim ili više reziduuma bazne aminokiseline. Alternativno, može se dodati reziduum bazne amino kiseline ili se može ukloniti reziduum kisele amino kiseline. Isto tako, ako motekul ima neprihvatljivo visoku pl vrednost kiseli reziduumi se mogu uvesti za niži pH, po potrebi. Pl projektovanog (modifikovanog) antitela ili fragmenta može, na primer biti 8 ili iznad, kao što su 8,5 ili 9. To je važno da kada se radi sa pl, mora se preduzeti da zadrži poželjnu aktivnost antitela ili fragmenta. Zato u jednoj instanci modifikovano antitelo ili fragment ima iste ili suštinski iste aktivnosti kao "nemodifikovano" antitelo ili fragment.

[0080] Programi kao što su " ExPASY http;// www. expasy. ch/ tools/ pi tool. html. and htt :// vww. iut- arles. up. univ-mrs. fr/ vy3bb/ d a, bim7compo- p. htmt. mogu se upotrebiti za predviđanje izoelektrične tačke antitela ili fragmenta.

[0081]U jednoj instanci antitela prisutnog pronalaska su pogodna za udisajnu dostavu, na primer, nebulizacijom (raspršavanjem). U jednom primeru, fizička svojstva antitela prisutnog pronalaska na primer, afinitet vezivanja 1 potencija nisu znatno promenjeni raspršavanjem. U jednom primeru antitela prisutnog pronalaska su vrlo stabilna. Jedna od mera stabilnosti antitela je temperatura topljenja (Trn). Temperatura topljenja može biti određena bilo koji kojom pogodnom metodom poznatom u struci, na primer, upotrebom Thermofluora (Ericsson i drugi, Analytical Biochemistry 357 (2006) 289-298) or DSC (Diferencijalna skenirajuća kalorimetrija). Odgovarajuća antitela obezbedjena prisutnim pronalaskom imaju visoke temperature topljenja (Trn), tipično najmanje 75' C. U jednom primeru antitelo prisutnog pronalaska ima Tm od najmanje 75<*>C. U jednom primeru antitelo prisutnog pronalaska ima Trn od najmanje 80<*>C. U jednom primeru antitelo prisutnog pronalaska ima Tm od najmanje 83" C.

[0082] Takođe obezbedjen je specifični region ili epitop humanog IL-13 koji je vezan za antitelo obezbedjeno prisutnim pronalaskom, posebno antitelo koje sadrži teški lanac sekvence (SEQ ID BR: 35) i/ili laki lanac sekvence (SEQ ID BR: 27).

[0083]Ovaj specifični region ili epitop humanog IL-13 polipeptida moguće je prepoznati pomoću bilo koje odgovarajuće metode mapiranja epitopa poznate u struci u kombinaciji sa bilo kojim antitelom obezbedjenim prisutnim pronalaskom. Primeri takvih metoda uključuju skrining peptida različitih dužina izvedenih iz vezivanja IL-13 za antitelo prisutnog pronalaska, najmanjim fragmentom koji se može specifično vezati za antitelo koje sadrži sekvencu epitopa koju antitelo prepoznaje. IL-13 peptidi mogu biti proizvedeni sintetički ili proteolitičkim varenjem IL-13 polipeptida. Peptide koji vezuju antitelo moguće je prepoznati pomoću, na primer, masa spektrometrijske analize. U drugom primeru, NMR spektroskopija ili rendgenska kristalografija mogu da se upotrebiti za identifikaciju epitopa vezanog za antitelo prisutnog pronalaska. Jednom identifikovan, epitopični fragment koji je vezan za antitelo prisutnog pronalaska može da se upotrebi, ako je potrebno, kao imunogen za dalje dobijanje antagonističkih antitela koja vezuju isti epitop.

[0084]Antitela koja unakrsno-blokiraju vezivanje antitela prema prisutnom pronalasku posebno, antitelo koje sadrži teški lanac sekvence (SEQ ID BR: 31) i laki lanac sekvence (SEQ. ID BR: 27) mogu biti korisna i u antagonističkoj IL-13 aktivnosti.

[0085]Unakrsno-blokirajuća antitela moguće je identifikovati odgovarajućom metodom iz ove oblasti, na primer upotrebom konkurentnih ELISA ili BlAcore eseja, gde se vezivanje unakrsno-blokiranih antitela za humani IL-13 sprečava vezivanjem antitela prisutnog pronalaska ili obrnuto (vice versa).

[0086]Molekule antitela prisutnog pronalaska odgovarajuće imaju visoki afinitet vezivanja, posebno pikomolarni afinitet. Afinitet može biti meren upotrebom bilo koji pogodne metode poznate u struci, uključujući površinsku Plazmon rezonancu, uključujući BlAcore kao što je opisano u Primerima u ovom dokumentu upotrebom izolovanog prirodnog ili rekombinovanog IL-13. U jednom primeru afinitet je izmeren upotrebom rekombinovanog humanog IL-13, kao što je opisano u Primerima u ovom dokumentu. U jednoj instanci molekul antitela prisutnog pronalaska ima afinitet vezivanja od oko 100 pM ili bolje. U jednoj instanci molekul antitela prisutnog pronalaska ima afinitet vezivanja od oko 50 pM ili bolje. U jednoj instanci molekul antitela prisutnog pronalaska ima afinitet vezivanja od oko 40 pM ili bolje. U jednoj instanci molekul antitela prisutnog pronalaska ima afinitet vezivanja od oko 30 pM ili bolje. U jednoj instanci molekul antitela prisutnog pronalaska ima afinitet vezivanja od oko 20 pM ili bolje. U jednoj instanci motekul antitela prisutnog pronalaska je u potpunosti humani ili humanizovani i ima afinitet vezivanja od oko 100 pM ili bolje. U jednoj instanci molekul antitela prisutnog pronalaska je u potpunosti humani ili humanizovani i ima afinitet vezivanja od 30 pM ili bolje.

[0087]Procenjeno je da afinitet antitela obezbedjenih prisutnim pronalaskom može biti promenjen upotrebom bilo koji pogodane metode poznate u struci. Prisutno otkriće se stoga takođe odnosi na varijante molekula antitela prisutnog pronalaska, koje imaju poboljšani afinitet prema IL-13. Takve varijante mogu se dobiti brojem za afinitet sazrevanja protokola uključujući mutiranje CDR-ova (rang i drugi, J. Mol. Biol., 254, 392-403, 1995), teturajući tanac (oznake et A(, biografiju/tehnologija, 10, 779-783, 1992), upotreba mutacionog soja E. Coli (Low i drugi, J. Mol. Biol., 250, 359-368, 1996), teturajući DNK (Paten i drugi, Curr. Opin. Biotechnol., 8, 724-733, 1997), faga prikaza (Thompson i drugi, J. Mol. Biol., 256, 77-88, 1996) i seksualni PCR (Crameri i drugi, Nature, 391,288-291, 1998). Vaughan i drugi (gore) opisuje ove metode za afinitet sazrevanja.

[0088]U jednoj instanci molekule antitela prisutnog pronalaska blokiraju interakciju između IL-13 i IL-13 receptora

posebno molekule antitela prisutnog pronalaska blokiraju interakciju između IL-13 i IL-13Ra1 i interakciju između IL-13 i IL-13 Ro.2. Brojni testovi pogodni za određivanje sposobnosti antitijela da blokira ovu interakciju su opisani u primerima u ovom dokumentu. U jednoj instanci prisutni pronalazak obezbedjuje neutrališuće antitelo koje ima specifičnosti za humani IL-13. U jednoj instanci humani IL-13 receptor upotrebljen u testu je prirodni humani IL-13 Ra1 ili prirodni humani IL-13Ra2. U jednoj instanci humani IL-13 receptor upotrebljen u testu je rekombinovani humani IL-13 Ra1 ili rekombinovani humani IL-13Ra2. U jednoj instanci humani IL-13 upotrebljen u testu je rekombinovani humani IL-13. U jednoj instanci neutrališuće antitelo je humanizovano ili u potpunosti humano antitelo ili fragment istog.

[0089]Ako je to poželjno, antitelo za upotrebu u prisutnom pronalasku može biti konjugovano (spareno) sa jednim ili više efektor molekulom (-ama). Procenjeno je da efektor molekul može da obuhvata jedan efektor molekul ili dva ili više takvih molekula vezanih kao po obrascu za jedan deo molekule koja se može priložiti antitelu prisutnog pronalaska. Gde je to poželjno za dobijanje jednog fragmenta antitela vezanog za efektor molekul, to može biti pripremljeno standardnim hemijskim ili kombinovanim DNK procedurama u kojim je fragment antitela vezan direktno ili putem agensa za spajanje za efektor molekul. Tehnike konjugacije (spajanja) takvih efektor molekula za antitela dobro su poznati u struci (videti, Helstorm i drugi, Controlled Drug Delivery, 2-go izdanje, Robinson i drugi, izdanja, 1987, str. 623-53; Thorpe i drugi, 1982, Immunol. Rev., 62:119-58 i Dubovvchik i drugi, 1999, Pharmacologv and Therapeutics, 83, 67-123). Odredjene hemijske procedure uključuju, na primer, one koje su opisane u WO 93/06231, WO 92/22583 , WO 89/00195 , WO 89/01476 i WO 03031581. Alternativno, gde je efektor molekul protein ili polipeptid, vezivanje može biti postignuto upotrebom re kom bi nova ni h DNK procedura, na primer, kao što je opisano u WO 86/01533 i EP 0392745.

[0090]Termin efektor molekul kao što je upotrebljeno u ovom dokumentu uključuje, na primer, antineoplastfčne agense, lekove, toksine, biološki aktivne proteine, na primer enzime, drugo antitelo ili fragmente antitela, sintetičke ili prirodane pojave polimera, nukleinske kiseline i fragmente istih, na primer, DNK, RNK i fragmenti istih, radionuklide, posebno radiojodide, radioizotope, helirane metale, nanočestice i grupe reportere kao što su fluorescentna jedinjenja ili jedinjenja koje mogu biti detektovana NMR ili ESR spektroskopijom.

[0091] Primeri efektor molekula mogu da uključuju citotoksine ili citotoksične agense, uključujući i bilo koji drugi agens koji je štetan za ćelije (na primer ubija ih). Primeri su combrestatini, dolastatini, epotiloni, staurosporini, maitansinoidi, spongistatini, rizoksin, halihondrini, roridini, hemiasterlini, taksol, citohalasin B, gramicfdin D etidijum bromid, emetin, mitomicin, etopozid, tenopozid, vinkristin, vinbtastin, kolhicin, doksorubicin, daunorubicin, dihidroksi antracin dion, mitoks-antron, mitramicin, aktinomicin D, 1-dehidrotestosteron, glukokortikoidi, prokain, tetrakain, lidokain, propranolol, i puromicin i analozi ili homolozi istih.

[0092]Efektor molekuli takođe uključuju, ali nisu ograničeni na, antimetabolite (na primer, metotreksate, 6-merkaptopurin, 6-tioguanin, citarabin, 5-fluorouracil dekarbazin), alkalni agensi (na primer mehloretamin, tioepa hlorambucil, melfalan, karmustin (BSNU) i lomustin (CCNU), ciklotosfamid, busulfan, dibromomanitol, streptozotocin, mitomicin C i cis-dihlorodiamin platina (II) (DDP) cisplatin), antraciklini (na primer daunorubicin (nekadašnji dauno-micin) i doksorubicin), antibiotici (na primer daktinomicin (nekadašnji aktinomicin), bleomicin, mitramicin, antramicin (AMC), caliheamicini ili duokarmicini) i anti-mitotički agensi (na primer vinkristin i vinblastin).

[0093] Drugi efektor molekuli mogu da uključuju helatne radionuklide kao što su '"ln i ?, Lu<177>, Bizmut213, Kalif orni jum151, Iridijum"<2>i Tungsten'"/Renium<1s>>; ili lekove kao što su, ali ne ograničavajući na, alkilfosfoholine, topoizomeraze l inhibitora, taksoide i suramin.

[0094]Druge efektor molekule uključuju proteine, peptide i enzime. Enzimi od interesa uključuju, ali nisu ograničeni na, proteolitičke enzime, hidrolaze, liaze, izomeraze, transferaze. Proteini, polipeptidi i peptidi od uticaja uključuju, ali se ne ograničavaju na, imunoglobuline, toksine kao što su abrin, ricin A, pseudomonas egzsotoksin, ili toksin difterija, protein kao što je insulin, faktor nekroze tumora, o-interferon, 8-interferon, nervni faktor rasta, izvedeni faktor rasta trombocita ili aktivator plazminogen tkiva, trombotik agens ili agens anti-angiogenik, na primer angiostatin ili en-dostatin, ili, biološki modifikator odgovora kao što su limfokin, interleukin-1 (IL-1), interleukin-2 (IL-2), granulocit makrofage kolonija stimulisanog faktora (GM-CSF), granulocit kolonija stimulisanog faktora (G-CSF), nervni faktor rasta (NGF) ili drugi faktor rasta i imunoglobulini.

[0095] Druge efektor molekule mogu da uključuju detektabilne (uočljive) supstance korisne na primer, u dijagnozi. Primeri detektabilnih supstanci uključuju razne enzime, prostetik grupe, fluorescentne materijale, luminescentne materijale, bioluminescentne materijale, radioaktivne nuklide, pozitron emitujuće metale (za upotrebu u pozitron emisionoj tomografiji) i neradioaktivne paramagnetike metalnih jona. Videti opšti američki Patent br. 4,741,900 za metalne jone, koji mogu biti konjugovani (spareni) sa antitelom za upotrebu u dijagnostici. Odgovarajući enzimi uključuju Renom peroksidaze, alkalne fosfataze, beta-galaktoksidaze ili acetilholinesteraze; odgovarajuće protetičke grupe uključuju streptavidin, avidin and biotin; odgovarajući fluorescentni materijali uključuju umbeliferon, fluoroscein, izotiocianat fluoroscein, rodamin, dihlorotriazinilamin fluoroscein, danzil hlorid i phicoerithrin; odgovarajući luminescentni materijali uključuju luminol; odgovarajući bioluminescentni materijali uključuju tuciferaze, luciferin i aekvorin; i odgovarajući radioaktivni nuklidi uljučuju '"I, "'I, '"ln i<**>Tc. 0096]U drugom primeru efektor molekul može povećati polu-život za antitelo in vivo, i/iti smanjiti imunogenicit antitela i/ili poboljšati isporuku antitela preko epitelnih barijera na imuni sistem. Primeri odgovarajućih efektor molekula ovog tipa uključuju polimere, albumin, albumin vezivanja proteina ili albumin vezivanja jedinjenja poput onih opisanih u W0 05/117984.

[0097] Gde je efektor molekul polimer to može, generalno gledano, biti sintetički ili prirodni polimer, na primer opcionalno substituisani ravni ili razgranati lanac polialkilena, polialkenilena ili polioksialkilena polimera ili razgranatih ili nerazgranatih polisaharida, na primer homo- ili hetero-polisaharida.

[0098]Specifični opcionalni substituenti koji mogu biti prisutni na gorepomenutim sintetičkim polimerima uključuju jednu ili više hidroksi, metil ili metoksi grupa.

[0099]Specifični primeri sintetičkih polfmera uključuju opcionalno substituisani ravni ili razgranati lanac polifetill-eneglikol), poli(propileneglikol) poli(vinilalkohol) ili derivate istih, naročito opcionalno substituisani poli(etil-eneglikol) kao što je metoksipoli(etilenegiikol) ili derivati istih.

[0100]Specifični prirodni polimeri uključuju laktozu, amilozu, dekstran, glikogen ili derivate istih.

[0101]"Derivati" kao što se upotrebljava u ovom dokumentu ciljano uključuje reaktivne derivate, na primer tiol-selektivno reaktivne grupe kao što su maleimidi i slično. Reaktivna grupa možda biti vezana direktno ili putem linker segmenta za polimer. Procenjeno je da reziduum ovakve grupe u nekom slučajevima obrazuje (formira) proizvod kao što je grupa vezivanja između fragmenta antitela i polimera.

[0102] Veličina polimera može biti različita prema želji, ali će generalno biti u opsegu prosečne molekularne težine od 500Da do 50000Da, na primer od 5000 do 40000Da poput onih od 20000 do 4OOO0Da. Veličina polimera posebno može biti izabrana na osnovu namenjene upotrebe proizvoda na primer, sposobnosti da se locira u pojedina tkiva kao što su tumori ili da produži cirkulaciju polu-života (za pregled videti Chapman, 2002, Advanced Drug Deliverv Revievvs, 54 , 531-545). Stoga, na primer, gde je proizvod namenjen da napusti cirkulaciju i prodre u tkivo, može biti povoljno upotrebiti polimer male molekularne težine, na primer sa molekularnom težinom od oko 5000Da. Za aplikacije, gde je proizvod ostaje u cirkulaciji, može biti povoljno upotrebiti polimer veće molekularne težine, na primer sa molekularnom težinom u opsegu od 20000Da da 40000Da.

[0103]Odgovarajući polimeri uključuju polialkiten polimer, kao što je poli(etileneglikol) ili, naročito, metoksipo-li(etileneglikol) ili derivate istih, a naročito sa molekularnom težinom u opsegu od oko 150000a da oko 40000Da.

[0104]U jednom primeru antitela za upotrebu u prisutnom pronalasku su pripojena za deo molekule poli(etileneglikol)-a (PEG). U jednom odredjenom primeru antitelo je fragment antitela i PEG molekule mogu biti pripojene kroz svaki dostupan bočni lanac aminokiseline ili terminal funkcionalne grupe aminokiseline koja se nalazi u fragment antitela (na primer svaki slobodna amino, imino, tiot, hidroksil ili karboksil grupa). Takve aminokiseline prirodno se može javiti u fragmentu antitela ili može biti modifikovana u fragment upotrebom metoda rekombinovanja DNK (videti na primer U.S. 5,219,996; U.S. 5,667,425; WO 98/25971). U jednom primeru molekul antitela prisutnog pronalaska je modifikovani Fab fragment gde to modifikovanje dodatak na kraju C-terminala, na teškom lancu jedne ili više amio kiseline, da bi se dozvolilo prilaganje efektor molekule. Odgovarajuće, dodatne aminokiseline formiraju modifikovani zavisni region koji sadrži jedan ili vrše cistein reziduuma na koje može biti priložen efektor molekul. Više lokacija može biti upotrebljeno za prilaganje dva ili više PEG molekula.

[0105]Odgovarajuće PEG molekule mogu biti kovalentno vezane kroz tiol grupu za najmanje jedan cistein reziduum, koji se nalazi u fragmentu antitela. Svaka polimer molekula priložena za modifikovani fragment antitela može biti kovalentno vezana za cistein reziduum atoma sumpora koji se nalazi u fragmentu. Kovalentno vezivanje će generalno biti disulfid veza ili, preciznije, sumpor-ugljenik veza. Gde je tiol grupa upotrebljena kao tačka priloganja odgovarajućih aktiviranih efektor molekula, na primer mogu se upotrebiti tiol selektivni derivati kao što su maleimidi i cistein derivati. Jedan aktivirani polimer se može upotrebiti kao početni materijal u pripremi polimer-modifikovanih fragamenata antitela, kao što je opisano iznad. Aktivirani polimer može biti bilo koji polimer koji sadrži tiol reaktivne grupe kao što je-halokarboksilne kiseline ili ester, na primer jodoacetamid, imid, na primer mateimid, vinil sulfon ili disulfid. Takvi početni materijali mogu se dobiti komercijalno (na primer iz Nektar, nekadašnji Shearvvater Polymers Inc., Hantsvila, AL, USA) ili mogu biti pripremljeni iz komercijalno dostupnih početnih materijala upotrebom konvencionalnih hemijskih procedura. Određene PEG molekule uključuju 20K metoksi-PEG-amina (dobijeno iz Nektar, nekadašnji Shearvvater; Rapp Potymere; i SunBio) i M-PEG-SPA (dobijeno iz Nektar, nekadašnji Shearwater).

[0106]U jednoj instanci, antitelo je modifikovani Fab fragment ili diFab što je PEG-ilatirani, odnosno koji ima PEG (poli(etileneglikol)) covatentno vezane za njih, na primer metodom otkrivenom u EP 0948544 ili EP 1090037 [videti takodje "Poti(etileneglikol) Chemistry, Biotechnical i Biomedical Applications", 1992, J. Milton Harris (izdanje), Plenum Press, New York, "Poli(etileneglikol) Chemistrv i Biological Applications", 1997, J. Milton Harris i S. Zalipsky (izdanja), American Chemical Society, Washington DC i "Bioconjugation Protein Coupling Techniques for the Biomedical Sciences", 1998, M. Astam i A. Dent, Grove Publishers, New York; Chapman, A. 2002, Advanced Drug Delivery Revievvs 2002, 54:531-545]. U jednom primeru PEG je priložen za cistein u zglobnom regionu. U jednom primeru, PEG modifikovani Fab fragment Ima maleimid grupu kovalentno vezanu sa jednom tiol grupom u modifikovanom zglobom regionu. Lizin residuum može biti kovalentno vezan za maleimid grupu, i svakoj amino grupi na lizin reziduumu može biti priložen metoksi poli (etileneglikol) polimer koji ima molekularnu težinu približno 20,0O0Da. Ukupna molekularna težina PEG-a priloženog za Fab fragment može zbog toga biti približno 40,OOODa.

[0107] U jednoj instanci, prisutni pronalazak obezbedjuje molekul antagonističkog antitela koji ima specifičnosti (posebnosti) za humani IL-13, koji je modifikovani Fab' fragment koji ima teški lanac koji sadrži sekvencu datu u SEOJD BR: 35 i laki lanac koji sadrži sekvencu datu u SEQ ID BR: 27 i koji ima na kraju C-terminala teškog lanca modifikovani zglobni regiona koji sadrži najmanje jedan cistein reziduum kojem je priložen efektor molekul. Odgovarajuća efektor molekula je PEG i priložena je upotrebom metode opisane u (W0 98/25971 i W0 2004072116 ili u W0 2007/003898. Efektor molekuli mogu biti priložiti za fragmenate antitela upotrebom metoda opisanih u međunarodnim patentima WO Z0O5/003169, WO 2005/003170 i WO 2005/003171.

[0108] U jednoj instanci antitelu ili fragmentu nije priložena efektor molekula.

[0109] Prisutni pronalazak takodje obezbeđuje izolovanu DNK sekvencu kodiranja teškog i/ili lakog lanca(-aca) molecule antitela prisutnog pronalaska. Odgovarajuća je, DNK sekvenca kodiranja teškog ili lakog lanca molekule antitela prisutnog pronalaska. DNK sekvenca prisutnog pronalaska može da obuhvata sintetički DNK, na primer proizveden hemijskom obradom, cDNK, genomska DNK ili kombinacija istih.

[0110] DNK sekvenca koje kodira jedan molekul antitela prisutnog pronalaska može se dobiti metodama koje su dobro poznate stručnima u ovoj oblasti. Na primer, DNK sekvence za kodiranje dela ili celog antitela teških i lakih lanaca može biti sintetizovata po želji iz determinisanih (odredjenih) DNK sekvenci ili na osnovu odgovarajućih sekvenci aminokiselina.

[0111] DNK kodovi za aceptor okvir sekvenci su široko dostupni stručnjacima iz ove oblasti i mogu se lako sintetizovati na osnovu njima poznatih sekvenci aminokiselina.

[0112] Standardne tehnike molekularne biologije mogu biti upotrebljene za pripremu DNK sekvenci kodiranja za molekut antitela prisutnog pronalaska. Željene DNK sekvence mogu biti sintetizovane potpuno Ili delimično upotrebom tehnike sinteze oligonukleotida . Mogu se upotrebiti mutageneze i polimeraze tokacijom-usmerene tehnike lančane reakcije (PCR) kao odgovarajuće.

[0113] Primeri pogodnih sekvenci obezbeđeni su u ovom dokumentu. Pogodni signalni peptid za teški lanac može biti kodiran kao što je signalni peptid murine MEVVSVVVFLFF LSVTTGVHS {SEOJD BR: 45). Pogodan signalni peptid za laki lanac može biti kodiran kao što je signalni peptid murine MSVPTOVLGL LLLVVLTDARC (SEQ ID BR: 46) koja cepanjem daje jedan molekul antagonističkog antitela prisutnog pronalaska. Prisutni pronalazak takođe obezbedjuje izolovani DNK sekvence kodiranja teškog lanca antitela prisutnog pronalaska koji obuhvata SE0. ID BR: 32, 34 ili 36 ili 38. Prisutni pronalazak takođe obezbedjuje izolovani DNK sekvence kodiranja lakog lanca antitela prisutnog pronalaska koji obuhvata SEQ ID BR: 24, 26, 28 ili 30.

[0114] OpŠte metode pomoću kojih mogu biti izgradjeni vektori, transfektione metode i metode kulture su dobro poznate stručnjacima u ovoj oblasti. U tom smislu, napravljena je referenca2a "Current Protocols in Molecular Biology", 1999, F. M. Ausubel (izdanje), Wiley Interscience, New York i Maniatis Manual koji je proizveden od strane Cold Spring Harbor Publishing

[0115] Takođe obezbedjuje ćeliju domaćina koja sadrži jedno ili više kloniranja ili vektora izraza koji sadrže jednu ili više DNK sekvenci kodiranja antitela prisutnih pronalaska. Svaka pogodna ćelija domaćina/vektor sistema može se upotrebiti za izražavanje DNK sekvence kodiranja molekule antitela prisutnog pronalaska. Bakterija, na primer Ešerihija koli, i drugi mikrobni sistemi mogu biti upotrebljeni ili eukariotik, na primer sisar, ćelija domaćina sistema izraza se takodje može upotrebiti. Pogodne ćelije domaćina sisara uključuju CHO, mijeloma ili hidroma ćelije.

[0116] Prisutni pronalazak takođe obezbedjuje procese za proizvodnju molekule antitela prema prisutnom pronalasku koji sadržre kulture ćelija domaćina koje sadrže vektor prisutanog pronalaska pod uslovima koji pogodno dovode do izraza proteina iz DNK kodiranja molekule antitela prisutnog pronalaska, i izolovanja molekule antitela.

[0117] Molekul antitela može da obuhvata samo teški ili laki lanac polipeptida, gde u tom slučaju samo teški lanac ili laie lanac polipeptida kodirajuće sekvence treba da se upotrebi za transfekt ćetije domaćina. Za proizvodnju proizvoda koji sadrže oba, teške i lake lance, red ćelija može biti transfektovan sa dva vektora, prvi vektor kodiranja lakog lanca polipeptida i drugi vektor kodiranja teškog tanca polipeptida. Alternativno, jedan vektor se može upotrebiti, vektor koji uključuje sekvence kodiranja lakog tanca i teškog lanca polipeptida.

[0118] Antitela i fragmenti prema prisutnom pronalasku su izraženi na dobrim nivoima u ćelijama domaćina. Tako se svojstva antitela i/ili fragmentata pojavljuju optimizovano i pogodno za komercijalnu obradu.

[0119] Antitela prisutnog pronalaska su korisna u tretmanu i/ili profilaksi patoloških stanja, prisutni pronalazak takodje obezbeđuje i farmaceutske ili dijagnostičke kompozicije koji sadrže molekul antitela prisutnog pronalaska u kombinaciji sa jedanim ili više farmaceutski prihvatljivih ekscipienata, rastvarača ili nosača. Shodno tome, obezbedena je upotreba antitela prisutnog pronalaska za proizvodnju medikamenta. Kompozicija (sastav) će obično biti obezbeđen u sklopu sterilne, farmaceutske kompozicije koji će normalno uključivati farmaceutski prihvatljiv nosač. Farmaceutska kompozicija prisutnog pronalaska može dodatno obuhvatati farmaceutski prihvatljivo pomoćno sredstvo.

[0120] Prisutni pronalazak takođe obezbedjuje postupke za pripremanje farmaceutske ili dijagnostičke kompozicije koji sadrže dodavanje i mešanje molekule antitela prisutnog pronalaska zajedno sa jednim ili više farmaceutski prihvatljivih ekscipienata, rastvarača ili nosača.

[0121] Motekul antitela može biti jedini aktivni sastojak farmaceutskih ili dijagnostičkih kompozicija ili može biti u pratnji drugih aktivnih sastojaka uključujući ostale sastojake antitela, na primer anti-TNF, anti-IL-1 B, anti-T ćelije, anti-IFNy ili anti-LPS antitela, ili ne-antiteta sastojka kao što je ksantin. Drugi odgovarajući aktivni sastojci uključuju antitela sposobna za izazivanje tolerancije, na primer, anti-CD3 ili anti-CD4 antitela.

[0122]U daljoj instanci antitelo, fragment ili kompozicija prema ovom otkriću je uposlena u kombinaciji sa ostalim farmaceutski aktivnim agensima, na primer kortikosteroidom (kao što je flutikazon propionat) i/iti beta-2-receptorom (kao što je Salbutamola, satmeterol iti formoterol) i(i inhibitorima rasta ćetije i proliferacijom (kao što je rapamicin, ciklophosfmid, metotreksat) ili alternativno CD28 i/ili CD40 inhibitorom. U jednoj instanci inhibitor je mala molekula. U drugoj instanci inhibitor je antitelo specifično za metu.

[0123]Pogodne farmaceutske kompozicije obuhvataju terapeutski efektivni iznos (količinu) antitela predmetnog pronalaska. Termin "terapeutski efektivni iznos" kao što se upotrebljava u ovom dokumentu se odnosi na količinu terapeutskog agensa potrebnog za tretiranje, poboljšanje ili prevenciju ciljanog oboljenja ili stanja, ili za ispotjavanje detektabitnog terapijskog iti preventivnog efekta. Za bilo koje antitelo, terapeutski efektivni iznos može biti procenjen u početku bilo u testovima kulture ćelije ili u životinjskim modelima, obično u glodarima, zečevirrta, psima, svinjama ili primatima. Model životinje se takođe može upotrebiti za određivanje opsega odgovarajuće koncentracije i rutu administracije (način davanja). Takve informacije se zatim mogu upotrebiti za određivanje korisnih doza i rute za administraciju kod ljudi.

[0124]Precizni terapeutski efektivni iznos za ljudski subjekt će zavisiti od ozbiljnosti stadijuma oboljenja, opšteg zdravlje subjekta, starosti, težine i pola subjekta, dijeta, vremena i frekvencije administracije, kombinacije tekova, reakcija osetljivosti i tolerancije/odgovora na terapiju. Ovaj iznos može biti utvrdjen rutinskim eksperimentisanjem i u okviru procene ktiničara. Uopšte, terapeutski efektivni iznos će biti od 0,01 mg/kg do 50 mg/kg, na primer 0,1 mg/kg do 20 mg/kg. Alternativno, doza može biti 1 do 500mg dnevno, kao što su 10 do 100, 200, 300 ili 400 mg dnevno. Farmaceutske kompozicije može biti odgovarajuće predstavljene u obliku jedinice doze koja sadrži odredjeni iznos aktivnog agensa predmetnog pronalaska.

[0125]Kompozicije može biti davane pojedinačno pacijentu ili mogu biti date u kombinaciji (na primer istovremeno, uzastopno ili zasebno) sa drugim agensima, lekovima ili hormonima.

[0126]Doza molekule antitela prisutnog pronalaska koja se daje zavisi od prirode stanja koja treba tretirati, obima prisutnog zapatjenja i o tome da li se molekul antitela upotrebljava profilaktički ili za tretiranje postojećeg stanja.

[0127]Učestalost doze će zavisiti od polu-života molekule antitela i trajanja efekta (delovanja). Ako molekul antitela ima kratak polu-život (na primer 2 do 10 časova) može biti neophodno dati jednu iti više doza dnevno. Alternativno, ukoliko molekul antitela ima dug polu-život (na primer 2 do 15 dana) može biti neophodno dati dozu samo jednom dnevno, jednom u nedelju dana ili čak i jednom u 1 ili 2 meseca.

[0128]Farmaceutski prihvatljiv nosač ne bi trebalo da sam može izazivati proizvodnju antitela štetnih za pojedinca koji prima kompoziciju i ne treba da bude otrovan. Pogodan nosači mogu biti velike, polako metabolisane makro molekule poput proteina, polipeptida, lipozoma, potisaharida, polilaktične kiseline, poliglikotne kiseline, polimerne aminokiseline, aminokiseline kopolimera i čestice neaktivnog virusa.

[0129]Farmaceutski prihivatljive soli mogu biti upotrebljene, na primer soli mineralnih kiselina, kao što su hidrohloridi, hidrobromidi, fosfati mi i sulfati, ili soli organskih kiselina, kao što su acetati, propionati, matonati i benzoati.

[0130]Farmaceutski prihvatljivi nosači u terapeutskim kompozicijama mogu dodatno da sadrže tečnosti kao što su voda, slani rastvor, gticerol i etanol. Pored toga, pomoćne supstance, kao što su kvas ili emulzivni agensi ili supstance pH puferovanja (poliranja), takodje mogu biti prisutne u ovim kompozicijama. Takvi nosači omogućavaju farmaceutskim kompozicijama da budu oblikovane kao tablete, pilule, konfete, kapsute, tečnosti, gelovi, sirupi, kaše i suspenzije, za gutanje od strane pacijenta.

[0131]Odgovarajući oblici administracije uključuju obrasce pogodne za parenteralnu administraciju, na primer injekciju ili infuziju, na primer davanjem injekcije ili neprekidne infuzije. Gde je proizvod injekcija ili infuziju, može se uzeti u obliku suspenzije, rastvora iti emulzije u uljanoj ili vodenoj sredini i može da sadrži agense formulisanja (oblikovanja), kao što su suspenzioni, prezervativni, stabilizacioni i/ili disperzioni agensi. Alternativno, molekul antitela može biti u suvom obliku, za rekonstituciju pre upotrebe sa odgovarajućom sterilnom tečnošću.

[0132]Jednom formulisane, kompozicije predmetnog pronalaska može biti date direktno subjektu. Subjekti koji će se tretirati mogu biti životinje. Međutim, u jednoj ili više instanci kompozicija je prilagođena za administraciju na ljudskom subjektu.

[0133]U jednoj instanci, u formulacijama prema prisutnom otkriću, pH vrednost konačne formulacije nije slična vrednosti izoelektrične tačke antitela ili fragmenta, jer pH vrednost formulacije je 7 pl kada pl od 8-9 ili iznad može biti odgovarajući. Dok se ne želimo vezati za teoriju, smatra se da ovo može na kraju dati konačnu formulaciju sa poboljšanom stabilnošću, na primer antitela ili fragmenta koje ostaje u rastvoru.

[0134]Farmaceutske kompozicije ovog pronalaska mogu biti date bilo kojom od brojnih ruta (načina), uključujući, ali ne ograničavajući se na, oralne, intravenozne, intramuskularne, unutar-arterijske, intramedularne, intratekalne, intraventrikularne, transdermalne, kroskožne (na primer, videti VVO98/20734), potkožne, intraperitonealne, intranazalne, enteralne, topikalne, sublingvalne, intravaginatne ili rektalne rute. Hiposprajevi se takodje mogu upotrebiti za administraciju farmaceutske kompozicije predmetnog pronalaska. Obično, terapeutske kompozicije mogu biti pripremljene kao ubrizgavaj uče, bilo kao tečni rastvori ili kao suspenzije. Čvrsti oblici pogodni za rastvoranje u, ili suspenziji u, tečnih oblika pre ubrizgavanja mogu biti prepremtjeni. Po mogućstvu molekuli antitela prisutnog pronalaska se mogu administrirati subkutanozno (ubacivanjem), udisanjem ili lokalno.

[0135]Direktna isporuka kompozicija će generalno biti ostvarena injekcijom, ubacivanjem, intraperitonealno, intravenozno iti intramuskutarno, ili isporukom na intersticijalni prostor tkiva. Kompozicije se takodje mogu administrirati u specifičnom tkivu od interesa. Doza tretman može biti rasporedjena u jednu dozu ili rasporedjena u više doza.

[0136]Procenjeno je da će aktivni sastojak u komoziciji biti jedan molekul antitela. Kao takav biće podložan degradaciji u probavnom traktu. Stoga, ako administraciju kompozicije vršimo putem koji koristi probavni trakt, kompozicija će morati da sadrži agense koji štite antitelo od degradacije pre nego što se antitelo jednom apsorbuje u probavnom traktu.

[0137]Detaljna diskusija o farmaceutski prihvatljivim nosiocima dostupna je u Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Company, NJ. 1991).

[0138]U jednoj instanci formulacija je obezbedjena kao formulacija tematske administracije, uključujući inhalaciju.

[0139]Odgovarajuće inhalacijske pripreme uključuju inhalacioni prah, tnerenja aerosola koji sadrže pogonske gasove ili inhalacioni rastvori bez pogonskih gasova (kao što su rastvori raspršivača ili suspenzije). Inhatacioni prahovi prema ovom otkriću sadrže aktivne supstance koje mogu da se sastoje isključivo od gorepomenutih aktivnih supstanci ili mešavine gore navedenih aktivnih supstanci sa fiziološki prihvatljivim ekscipientom.

[0140] Ovi inhalacioni prahovi može da sadrži monosaharide (na primer glukozu ili arabinozu), disaharide (na primer laktozu, saharozu, maltozu), oligo ■ i polisaharide (na primer dekstrane), polialkohole (na primer sorbitol, manitol, ksilitol), soli (na primer natrijum htorid, kalcijum karbonat) ili smeše ovih jednih sa drugim. Mono - ili disaharidi se prikladno koriste, upotrebom laktoze ili glukoze, naročito, ali ne isključivo u vidu njihovih hidrata.

[0141]čestice za depozicioniranje u plućima zahtevaju da je čestica veličine manje od 10 mikrona, kao što je 1-9 mikrona na primer od 0,1 do 5 pm, naročito od 1 do 5 um. Čestica veličine aktivne (kao što je antitelo ili fragment je od primarnog značaja).

[0142]Pogonski gasovi koji se mogu upotrebiti za pripremanje inhalacionih aerosola su poznati u struci. Odgovarajući pogonski gasovi su izabrani medu ugljovodonicima kao što su n-propan, n-Butan ili izobutan i halougljovodonik kao što hlorisani i/iti fluorisani derivati metana, etana, propana, butana, ciklopropana ili ciklobutana. Gorepomenuti pogonski gasovi mogu se upotrebiti pojedinačno ili u smeši Istih.

[0143]Naročito pogađani pogonski gasovi su halogenovani derivati alkana, izabrani među TG 11, TG 12, TG 134a i TG227. Od gorepomenutih halogenovanih ugljovodonika, TG134a (1,1,1,2-tetrafluoroetan) i TG227 (1,1,1,2,3,3,3-heptafluoropropan) i mešavine istih su naročito prikladne.

[0144]Pogonski-gas-koji sadrži inhalacione aerosole može takodje da sadrži i druge sastojke kao što su korastvarači, stabilizatori, površinsko-aktivni agensi (surfaktanti), antioksidansi, maziva i sredstva za prilagođavanje pH. Svi ovi sastojci su poznati u struci.

[0145]Pogonski-gas-koji sadrži inhalacione aerosole prema predmetnom pronalasku može da sadrži do5%težine aktivne supstance. Aerosoli prema predmetnom pronalasku sadrže, na primer, 0.002 do 5% težine, 0,01 do 3% težirve, 0.015 do2%težine, 0,1 do 2% težine, 0,5 do2%težine ili 0,5-1% težine aktivno.

[0146]Alternativno tematska administracija u pluća može takodje biti administracijom tečnog rastvora ili suspenzije formulacije, na primer upošljavanjem uređaja kao što je inhalator, na primer, raspršivač povezan na kompresor (na primer, Pari LC-Jet Plus(R) raspršivač povezan na Pari Master(R) kompresor proizvedenog u Pari Respiratorv Equipment, Inc., Richmond, Virginia.).

[0147]U jednoj instanci formulacija je obezbeđena kao diskretne ampule koja sadrže dozu jedinica za dostavu raspršivanjem.

[0148]U jednoj instanci antitelo se isporučuje u liofilizovanom obliku, za rekonstitutisanje ili alternativno kao suspen ziona formulacija.

[0149]Antitelo predmetnog pronalaska može da se isporučuje dispergovanjem (rasturanjem) u rastvaraču, na primer, u obliku rastvora ili suspenzije. To može da bude suspendovano u nekom odgovarajućem fiziološkom rastvoru, na primer, fiziološkom stanom rastvoru, farmakološki prihvatljivom rastvoru ili puferovanom (ublaženom) rastvoru. Puferovani rastvori, poznati u struci mogu da sadrže 0,05 mg do 0,15 mg disodijum edetata, 8.0 mg do 9.0 mgNaCl, 0,15 mg do 0,25 mg polisorbata, 0,25 mg do 0,30 mg bezvodne limunske kiseline i 0.45 mg do 0.55 mg natrijum citrata po 1 ml vode kako bi se postiglo pH od oko 4.0 ili 5.0. Kao što je pomenuto gore u dokumentu suspenzija se može napraviti, na primer, od liofitizovanog antitela.

[0150]Terapeutske formulacije suspenzije ili rastvora takođe mogu da sadrže jedan ili više ekscipijenata. Ekscipijenti su poznati u struci i uključuju pufere (na primer, citrat pufer, pufer fosfat, acetat pufer i bikarbonat pufer) amino kiseline, urea, alkoholi, askorbinske kiseline, fosfoliptdi, proteini (na primer, serum albumin), EDTA, natrijum hlorid, lipozomi, manitol, sorbitol i glicerol. Rastvori ili suspenzije mogu biti inkapsulirani u lipozomima ili biorazgradivim mikrosferama. Formulacija će generalno biti obezbeđena u bitnom sterilnom obliku upošljavanjem sterilnih postupaka proizvodnje.

[0151]Ovo može uključivati proizvodnju i sterilizaciju filtracijom rastvora puferovanog rastvarača upotrebom za formulaciju, aseptične suspenzije antitela u sterilnom rastvoru puferovanog rastvarača, i nanošenjem formulacije u sterilnu posudu metodama poznatim stručnima u ovoj oblasti.

[0152]RasprŠavajuće formulacije prema prisutnom otkriću mogu biti obezbedjene, na primer, kao pojedinačna doza jedinice (na primer, zapečaćene plastične posude ili ampule) pakovane u omot-folije. Svaka bočica sadrži dozu jedinice u volumenu, na primer, 2 ml, rastvarača/rastvoru pufera.

[0153]Antitela prisutnog pronalaska se smatraju pogodnim za dostavu putem raspršavanja.

[0154]To takođe predviđa da antitelo prisutnog pronalaska može da se administrira upotrebom genske terapije. Da bi se ovo postiglo, DNK sekvence kodiranja teških i lakih lanaca molekula antitela koji su pod kontrolom odgovarajuće komponente DNK, uvedene su u pacijenta tako da su lanci antitela izraženi iz DNK sekvenci i sastavljeni na jednom mestu (in situ).

[0155]Prisutni pronalazak takođe obezbedjuje jedan molekul antitela (ili kompozicije koje sadrže isti) za upotrebu u kontroli zapatjenskih oboljenja, na primer akutnih iti hroničnih zapatjenskih oboljenja. Prikladno, molekul antitela (ili kompozicije koje sadrže isti) može se upotrebiti za umanjenje zapatjenskih procesa ili za prevenciju zapatjenskih procesa. U jednoj instaanci je obezbedeno testiranjem in vivo smanjenje aktiviranih T ćelija, posebno onih koje učestvuju u neprikladnim zapaljensko imunim odgovorima, na primer regrutovanih za blizinu/lokaciju takvih odgovora.

[0156]Smanjenje aktiviranih T ćelija, koje su uposlene ovde, može biti umanjeno, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 ili više procenata u poređenju sa tim pre terapije ili bez terapije.

[0157]Povoljno, tretman antitelom, fragmentom ili kompozicijom prema prisutnom pronalasku, može dozvoliti smanjenje nivoa aktiviranih T ćelija, bez umanjivanja u pacijentu opšteg nivoa T ćelija (neaktivnih T ćelija). Ovo može rezultirati sa manje sporednih efekata (nus pojava) i mogućom prevencijom trošenja T ćelije u pacijentu.

[0158]Prisutni pronalazak takođe obezbedjuje molekul antitela prisutnog pronalaska za upotrebu u tretmanu ili profilaksi patotoških poremećaja koji posreduju IL-13 ili su udruženi sa povećanim nivoom IL-13.

[0159]Patološko stanje ili poremećaj, može se na primer, izabrati iz grupe koja se sastoji od infekcija (virusne, bakterijske, gljivične i parazitske), endotoksičnog šoka pridružene infekcije, artritisa, kao što su reumatoidnt artritis, astma, kao što su ozbiljna astma, hronična opstruktivna bolest pluća (HOPB), zapaljensko oboljenje karike, Alchajmerova bolest, inflamatorno oboljenje creva, Kronova bolest, Ulcerozni kolitis, Pejronijeva bolest, celijakija oboljenje, oboljenje žučne kese, Pilonidaleva bolest, upala trbušne maramice, psorijaza, vaskutitis, hirurške adhezije, šlog,dijabetes Tip I, Lajmska bolest, meningoencefalitis, autoimuni uveitis, imuno posredovani zapaljivi poremećaji centralnog i perifernog nervnog sistema kao što je Multipla skleroza, lupus (kao što je sistemski lupus ertematozus) i Guilain-Bar sindrom, atopični dermatitis, autoimuni hepatitis, fibrozni alveolitis, Gravezova bolest, IgAnefropatija, idiopatska trombocitopenična purpura, Menijerova bolest, pemfigus, primarna bilijarna ciroza, sarkoidoza, sklerodermija, Wegener-ova granulomatoza, druge autoimune bolesti, pankreatitis, traume (operacije), graft-versus-host bolesti, transplanter odbijanje, bolesti srca uključujući i ishamijsku bolest kao što je infarkt miokarda, kao i ateroskleroze, intravaskularne koagulacije, resorpcija kostiju, osteoporoza, osteoartritis, parodontopatija i hipohlorhidija.

[0160]Prisutni pronalazak takođe obezbedjuje jedan molekul antitela prema prisutnom pronalasku za upotrebu u tretmanu ili profilaksi bola, odredjenog bola posebno povezanog sa zapaljenjima.

[0161]U jednoj instanci antitelo prema predmetnom pronalasku smanjuje otpornost na tretman zapaljenja, posebno otpornosti pluća na tretman zapaljenja.

[0162]U jednoj instanci antitelo prema predmetnom pronalasku smanjuje nivo IL-13 proteina u bronhijalnom tkivu, na primeru poređenju sa nivoima pre tretmana. Smanjenje može biti 5, 10, 20, 30, 40% ili više.

[0163]U jednoj instanci antitelo prema predmetnom pronalasku smanjuje nivo IL-13 proteina u nosnoj tečnosti i/ili bronhoalveotarnoj tečnosti, na primer, u poređenju sa nivoima pre tretmana. Smanjenje može biti 5, 10, 20, 30, 40% ili više.

[0164]U jednoj instanci antitelo prema predmetnom pronalasku smanjuje priliv eosinofila, na primer, u poređenju sa nivoima pre tretmana. Smanjenje može biti 5, 10, 20, 30, 40% ili više, na primer, ako se koristi pravilno 1,2, 3, 4, 5, 6 ili više nedelja.

[0165]U jednoj instanci antitelo prema predmetnom pronalasku pogodno jeza smanjenje neodgovarajućih nivoa goblet (peharastih) ćelija, na primer u liječenju hiperplazija goblet ćelija, kao Što su hronična hiperplazija goblet ćelija. Smanjenje može da se vidi nakon tretmana 1,2, 3, 4, 5, 6 ili vise nedelja.

[0166]U jednoj instanci antitelo prema predmetnom pronalasku pogodno je za smanjenje nivoa izdahnog azotnog oksida (FeNO), u poređenju sa nivoima pre tretmana. Za izdahni azot-oksid se smatra da je faktor rizika ili marker zapaljenja pluća.

[0167]U jednoj instanci antitelo prema predmetnom pronalasku pogodno je za prevenciju neodgovarajućih taloženja kolagena povezanog sa zapaljenskim reakcijama, u određenom peribronhijalnom taloženju kotagena.

[0168] Ujednoj instanci antitelo prema predmetnom pronalasku pogodno je za sprečavanje neodgovarajućih angiogeneza povezanih sa zapaljenskim reakcijama.

[0169]Stoga je obezbedeno antitelo prema predmetnom pronatasku jednako uposleno za upotrebu u tretmanu i metodama tečenja.

[0170]Antitelo prema predmetnom pronalasku koje je ovde uposleno, takodje odgovara za fragmente i derivate otkrivene u specifikaciji.

[0171]Prisutni pronalazak dodatno omogućava upotrebu molekule antitela, fragmenta iti kompozicije prema prisutnom pronatasku u proizvodnji medikamenata za tečenje ili profilaksu patoloških poremećaja koji posreduju IL-13 ili su pridruženi povećanim nivoima IL-13, na primer kao što je opisano u ovom dokumentu, naročito za patološki poremećaj kao što je reumatoidni artritis , astma ili HOPB.

[0172]Prisutni pronalazak dodatno obezbedjuje upotrebu molekule antitela, fragmenta ili kompozicije prema prisutnom pronalasku u proizvodnji medikamenata za tečenje ili profilaksu jedne ili više medicinskih indikacija opisanih u ovom dokumentu.

[0173]Molekul antitela, fragment ili kompozicija prisutnog pronalaska može biti upotrebljen u bilo kojoj terapiji u kojoj je poželjno da se smanje efekti IL-13 u telu čoveka ili životinje. IL-13 može cirkulisati u organizmu, ili može biti prisutan u nepoželjno visokom nivou na određenoj lokaciji u organizmu, na primer lokaciji zapaljenja.

[0174]U jednoj instanci molekul antitela prisutnog pronalaska ili kompozicija koja sadrži isti upotrebljava se za kontrolu zapaljenskih oboljenja, na primer kao što je opisano u ovom dokumentu.

[0175]Prisutni pronalazak takođe obezbeđuje metod tretiranja ljudskih ili životinjskih subjekata koji pate od ili su rizični za poremećaje koje posreduje IL-13, metod sadrži administraciju subjektu efektivnog iznosa molekula antitela prisutnog pronalaska, ili kompozicije koja sadrži. U jednom primeru molekul antitela se administrira inhalacijom.

[0176]U jednom primeru poremećaj je izabrana iz bilo koje medicinske indikacije navedene gore u dokumentu. U jednom primeru poremećaj je izabran iz grupe koja se sastoji od: astmatičnih poremećaja, atopičnih poremećaja, hronične opstruktivne bolesti pluća (HOPB), stanja koja uključuju upalu disajnih puteva, eosinofilija, fibroza i proizvodnja viška sluzi, zapaljenska stanja, autoimuna stanja, tumori ili kanceri, virusne infekcije i suzbijanje izražavanja zaštite tipa 1 imunog odgovora.

[0177]U jednoj instanci obezbeđjeni su procesi za prečišćavanje antitela (posebnog antitela iti fragmenta prema predmetnom pronalasku).

[0178]U jednoj instanci obezbeđjeni su procesi za pročišćavanje antitela (odredjenog antitela ili fragmenta prema predmetnom pronalasku) koji sadrže korake: obavljanja anjonske jonoizmenjivačke hromatografije u režimu ne-vezivanja takvog da se nečistoće zadržavaju na koloni i antitelo se održava u nevezujućem razlomaku (frakciji). Korak se može, na primer obaviti u pH oko 6-8.

[0179]Procesi mogu dalje obuhvatati početno snimanje koraka uposlenog katjona razmene hromatografije, obavljenih na primer u pH oko 4 do 5.

[0180]Procesi mogu dalje obuhvatati dodatni korak (-e) hromatografije za osiguravanje proizvoda i procesa od nečistoća koje su na odgovarajući način rešene tokom proizvoda.

[0181]Procesi prečišćavanja mogu takođe sadržati jedan ili vise koraka ultra-filtriranja, kao što su korak koncentracije i diafiltracije.

[0182]Stoga u jednoj instanci je obezbedjeno pročišćeno IL-13 antitelo ili fragment, na primer humanizovanog antitela iti fragmenta, posebno antitela ili fragmenta prema predmetnom pronalasku, u znatno pročišćenom obliku, posebno slobodan ili znatno slobodan endotoksin i/ili protein ćelije domaćina ili DNK. imajući ovo, antitela prema prisutnom pronalasku će generalno biti pripremljena u ćelijama sisara i samim tim endotoksin sadržaj generalno nije sporno pitanje. Zapravo, endotoksin sadržaj je više za razmatranje kada su antitela pripremljena u bakterijskim ćelijama.

[0183]Pročišćeni oblik, kao što se koristi gore u dokumentu, ciljano se odnosi na najmanje 90% čistoće, kao što je 91,92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% w/w ili čistije.

[0184]Znatno slobodan endotoksin generalno se ciljano odnosi na sadržaj endotoksina od 1 EU po mg antitela proizvoda ili manje kao što je 0.5 ili 0,1 EU po mg proizvoda.

[0185]Znatno slobodan protein ćelije domaćina ili DNK generalno se ciljano odnosi na protein ćelije domaćina i/iti DNK sadržaja 400 ug po mg antitela proizvoda ili manje kao što su 100 ug po mg antitela ili manje, naročito 20 ug po mg antitela, prema potrebi.

[0186]Molekul antitela prisutnog pronalaska može takodje biti upotrebljen u dijagnozi, na primer u in vivo testovima dijagnoza i obradi slika stanja bolesti koje uključuju IL-13.

[0187]Pogodni in vivo testovi za svojstva antitela prema predmetnom pronatasku uključuju: model hronične kućne prašine, hiperodgovorni metaholin i/ili ovalbumin model atergijske upale pluća.

[0188]Obuhvatajući u kontekstu prisutne specifikacije ima za cilj značenje, uključujući.

[0189]Gde se tehnički odgovarajuće instance za pronalazak mogu kombinovati.

[0190]Instance su opisane u ovom dokumentu, tako da obuhvataju određene funkcije/elemente. Otkriće se takodje proširuje na razdvojene instance koji sadrže ili u suštini sadrže pomenute funkcije/elemenate.

[0191]Prisutni pronalazak je dalje opisan ovim ilustracijama samo u sledećim primerima, koji se odnose na prateće Slike, u kojima:Slika1 prikazuje: sekvencu amino kiseline za svaki od CDR 1,2, 3 iz teškog lanca (CDR H) i CDR 1,2, 3 iz lakog lanca (CDR L) (SEQ_ ID brojevi 1-6) sekvencu amino kiseline za antitelo pacova lakog lanca varijabilnog regiona

(SEQ ID BR: 7)

sekvencu DNK za antitelo pacova lakog lanac varijabilnog regiona (SEQ ID BR: 8) , i sekvencu amino kiseline za antitelo pacova lakog lanac varijabilnom region sa signanoml sekvencom (SEQ. IDBR: 9)

Slika 2pokazuje sekvencu DNK za antitelo pacova lakog lanca varijabilnog regiona sa signalnom sekvencom

(SEQ ID BR: 10)

sekvencu amino kiselin za antitelo pacova lakog lanca varijabilnog i konstantnog regiona (SEQ ID BR: 11) sekvencu DNK za antitelo pacova lakog lanca varijabilnog i konstantnog regiona (SEQ ID BR: 12)

sekvencu amino kiseline za antitelo pacova lakog lanca sa signalnom sekvencom (SEQ ID BR: 13)

Slika 3 prikazuje sekvencu DNK za antitelo pacova lakog lanca sa signalnom sekvencom (SEOJD BR: 14)

sekvencu aminokiseline za antitelo pacova teškog tanca varijabilnog regiona (SEQ ID BR: 15)

sekvencu DNK za antitelo pacova teškog lanca varijabilnog regiona (SEOJD BR: 16)

sekvencu amino kiseline za antitelo pacova teškog lanca varijabilnog regiona sa signalnom sekvencom (SEQ ID BR: 17)

Slika 4 prikazuje sekvencu DNK antitela pacova teškog lanca varijabilnog regiona sa signalnom sekvencom (SEQ ID BR: 18) sekvence aminokiselina za antitelo pacova teškog tanca varijabilnog i konstantnog regiona (SEQ ID BR: 19)

Slika 5 prikazuje sekvencu DNK za antitelo pacova teškog lanca varijabilnog i konstantnog regiona (SECi ID BR: 20)

sekvencu aminokiseline za antitelo pacova teškog lanca varijabilnog i konstantnog regiona sa signalnom sekvencom (SE0_ ID BR: 21)

Slika 6 prikazuje sekvencu DNK antitela pacova teškog lanca varijabilnog i konstantnog regiona sa signalnom sekvencom (SEQ ID BR: 22)

Slika 7 prikazuje sekvencu aminokiselina za humanizovano antitelo lakog tanca varijabilnog regiona (SEQ ID BR: 23)

sekvencu DNK za humanizovano antitelo lakog lanca varijabilnog regiona (SEQ ID BR: 24)

sekvencu aminokiseline za humanizovano antitelo lakog lanca varijabilnog regiona sa signalnom sekvencom (SEQ ID BR: 25) sekvencu DNK za humanizovano antitelo lakog lanca varijabilnog regiona sa signalnomom sekvencom (SEO. ID BR: 26) sekvencu aminokiseline za humanizovano antitelo lakog lanca varijabilnog i konstantnog regiona

(5EQ ID BR: 27)

Slika 8 prikazuje sekvencu DNK za humanizovano antitelo lakog lanca varijabilnog i konstantnog regiona (SEQ ID BR: 28)

sekvencu aminokiseline za humanizovano antitelo lakog lanca varijabilnog i konstantnog regiona sa signalnom sekvencom (SEQ ID BR: 29) sekvencu DNK za humanizovano antitelo lakog tanca varijabilnog 1 konstantnog regiona sa signalnom sekvencom (SEQ ID BR: 30)

Slika 9 prikazuje sekvencu aminokiseline za humanizovano antitelo teškog lanca varijabilnog regiona (SEQ. ID BR: 31)

sekvencu DNK za humanizovano antitelo teškog lanca varijabilnog regiona (SEO. ID BR: 32)

sekvencu aminokiseline za humanizovano antitelo teškog lanca varijabilnog regiona sa signalnom sekvencom (SEQ ID BR: 33) sekvencu DNK za humanizovano antitelo teškog lanca varijabilnog regiona sa signalnom sekvencom (SECi ID

BR: 34) sekvencu aminokiseline za humanizovano antitelo teškog lanca varijabilnog i konstantnog regiona (SEO.

ID BR: 35)

Slika 10 prikazuje sekvencu DNK za humanizovano antitelo teškog lanca varijabilnog i konstantnog regiona (SEQ ID BR: 36) sekvencu aminokiseline za humanizovano antitelo teškog tanca varijabilnog i konstantnog regiona sa signalnom sekvencom (SEQ ID BR: 37) sekvencu DNK za humanizovano antitelo teškog lanca varijabilnog i konstantnog regiona (SEQ ID BR: 38)

Slika 11 prikazuje sekvence aminokiselina i DNK za humani VK 1 2-1-(1)02 JK4 aceptor okvir (SEQ ID BR: 39 i SEQ ID BR: 40) i VH2 3-1 2-26 JH4 aceptor okvir (SEQ ID BR: 41 i SEQ ID BR: 42)

Slika 12 prikazuje poravnavanje lakih lanaca pacova, aceptor okvira i humanizovanih lakih lanaca i takođe teških lanaca. CDR-ovi su u podebljani i podvučeni. Donator reziduumi G49 i R71 su u podebljani, kurziv i Istaknuti.

Slika 13 Efekat Ab652 na BAL eotaksin-3 meren 24h nakon alergen izazova u ne-humanom primat modelu astme. Podaci su izraženi oznakom ± SEM, n = 4-8 po grupi.

Slika 14. Efekat Ab652 na BAL eosinofil izračunat merenjem 24h nakon alergen izazova u ne-humanom primat modelu astme. Podaci su normalizovali za izračunavanje BAL eosinofita merenjem u fazi skrininga u radnoj sobi. Oznakom ± SEM, n = 4-8 po grupi.

Slika 15. Efekat Ab652 na vrhuncu opstrukcije izmeren do 15 minuta nakon alergen izazova u ne-humanom primat modelu astme. Podaci su izraženi oznakom ± SEM, n = 4-8 po grupi.

Slika 16. Efekat Ab652 na opstrukciju izmeren 24 h nakon alergen izazova u ne-humanom primat modelu astme. Podaci su normalizovali za opstrukciju izmerenu pre izlaganja alergenu. Oznakom t SEM, n = 4-8 po grupi.

PRIMERI

LTerapeutsko Antitelo Generlsanje/Selekcija

[0192]Pacovi su imunizovani sa ili prečišćenim humanim IL-13 (Peprotek) ili fibroblastama pacova koje izražavaju humani IL-13 (izražava oko 1 ug/mt u kulturi supernatanta), ili u nekim slučajevima, kombinacijom dva. Nakon 3 do 6 snimaka, životinje su žrtvovane i PBMC, slezina, koštana srž i limfni čvorovi ubrani. Sera je praćena vezivanjem za humani IL-13 u ELISI, i takodje sposobnošću da neutrališeiz hlL-13 u HEK-293 STAT-6 reporter ćelijie testa (HEK - Blue assay, Invivogen).

[0193] SLAM kulture (kulture B ćelija) su pripremljene metodom sličnom onima koje su opisane od strane Zubler i drugi (J. Immunol. 1985). Ukratko, 500-5000 splenocita ili PBMC-a imunizovanih životinja su kultivisane u grupama od stotine 96-ležišta za ćelije sa 200 ul/po ležištu RPM11640 medijuma (Gibko BRL) upotpunjeno sa 10% FCS (PAA laboratories Ud), 2% HEPES (Sigma Aldrich), 1% L-glutamina (Gibko BRL), 1% penicilin/streptomicina rastvora (Gibko BRL), 0,1% (3-merkaptoetanola (Gibko BRL), 3% aktivirane splenocit kulture supernatanta zeca i gama-ozračenog EL-4-B5 timoma ćelije murine (5 x 10A4/pa) za 7 dana na 37<*>C u atmosferi od 5% C02. Kulture B ćelije supernatanta testirani su u skrining testu i pozitivan! supernatanti pripojeni su u masterpločice. Kultivisane B ćelije su zamrznute na -80 °C u 100 ul10%DMSOuFCS.

[0194]SLAM kulture supernatanta su prvo testirane na njihovu sposobnost da vežu hlL-13 u perla-baziranom testu u FMAT. Ovo je bio homogenizovani test upotrebom biotinitatizovanog humanog IL-13 presvučenog na streptavidin perlama i srodnog koza anti-pacov Fc-Cy5 . Pozitivi iz ovog testa se zatim unose u HEK-293 IL-13R-STAT-6 reporter test ćeliju (HEK-Blue test, Invivogen) za identifikaciju neutralizatora. Neutralisani supernatanti su zatim profilisani u Biacore-u za procenu stope, kao i za odredjivanje odredjenih sposobnosti modusa akcije za neutralizaciju. Neutralizacija je svrstana (kategorisana) kao ili bin 1 ili bin 2. Bin 1 predstavlja antitelo koja se vezuje za humani IL-13 i sprečava vezivanje IL-13Ra1, i kao rezultat takođe blokira u IL-4R vezivanje. Bin 2 predstavlja antitelo koje vezuje hlL-13 na takav način koji omogućava povezivanje sa IL-13Ra1, ali sprečava regrutovanje IL-4R u kompleks. Mi ćemo izabrati antitela koja deluju preko bin 1.

[0195]Približno 7500 IL 13-specifičnih pozitiva identif i kovani su u primarnoj FMATproveri od ukupno 27 x 100-pločica SLAM eksperimenata. 800 ležišta demonstrira neutralizaciju u HEK-blue testu. 170 ležišta imalo je poželjne Biacore profile, odnosno bin 1 antitela sa stopom < 5x 10-4 s-1. Varijabilni region kloniranja iz ovih 170 ležišta je pokušano i 160 je uspješno dalo fluorescentni fokus (centar). 100 ležišta generisanog teškog i lakog lanca varijabilnog regiona gen parova prati obrnuti prepis (RT)-PCR. Geni ovih V-regiona su klonirani kao miš lgG1 pune-dužine antitela i ponovo izraženi u sistemu prolaznog izraza HEK-293. Analiza sekvence je otkrila da je da ih je bilo 27 jedinstvenih porodica anti-humanog IL-13 antitela. Ova rekombinovana antitela se zatim ponovo testiraju na njihovu sposobnost da blokiraju rekombinovani hlL-13 (E. Coli-izvedeni i sisar- izvedeni), rekombinovane varijante hlL-13 (R130Q) (E. Coli-izvedeni), prirodni divlji tip i varijante hlL-13 (humanog donatora-izvedene) 1 cinomolgus IL-13 (sisara-izvedene) u osnovnoj test ćeliji. Rekomblnanovana antitela se takodje testiraju na njihovu sposobnost da vežu varijantu humanog IL-13 (R130OJ i cinomolgusa IL-13 u u Biacore-u. Daljom karakterizacijom, 5 porodica antitela ispunilo je naše kriterijume, odnosno sub-100 pM antitelo sa minimalnim odbacivanjem u potenciji i afinitetu za sve humane i cinomolgus IL-13 pripreme.

[0196]Humanizacija svih 5 porodica je izvršena. Zasnovano na neutralizaciji potencije, afiniteta i donator sadržaja u humanizovanim graftima (kalemovima), humanizovani CA154^652 (videti dole) izabran je za dalje napredovanje.

1.1 Humanizacija

[0197] Humanizovano antitelo koje služi ovde kao primer (Ab652) je pripremljeno kalemljenjem CDR-ova iz antitela pacova V-regiona (Seq ID Brojevi 7 i 15) (CDR-ova izloženih ovde u sekvencama od 1 do 6) na humanom Gremlin antitelu V-regiona okvira. Poravnanja sekvenci antitela pacova (donatora) V-regiona sa sekvencama humanog Gremlin antitelom (aceptora) V-regiona prikazani su u Slika 12, zajedno sa dizajniranom humanizovanom sekvencom. CDR-ovi kalemljeni Iz donatora za aceptor sekvencu su kao što je definisano Kabat-om (Kabat i drugi Sequence of Proteins of Immunological interest (1987). Bethesda MD, National Institutes of Health, U.S.), sa izuzetkom CDR-H1 gde se koristi kombinovana definicija Chothia/Kabat (pogledajte Adair i drugi (1991) Humanised antibodies WO 91/09967). Humani VH2 V-region 3-12-26 plus JH4 J-region (V BASE, http:// vbase. rnrc- cpg. cam- ac. uk/1 je izabran kao aceptor za teški lanac CDR-ova. Reziduumi okvfra za teški lanac su svi iz humanog Gremlin gena, sa izuzetkom reziduuma 49 f 71 (Kabat-ovog sistema numerisanja), odnosno, gde su reziduumi donatora Glicin (G49) i Arginin (R71) zadržani. Zadržavanje ovih reziduuma dva donatora je od suštinskog značaja za potpunu aktivnost humanizovanog antitela. Humani 2-1-(1) V-region VK1 02 plusJK4J-region (V BASE,h ttp:// vbase. mrc- cpe. cam. ac. Uk/lizabran je kao aceptor na lakom lancu CDR-ova. Reziduumi okvira za laki lanac su svi iz humanog Gremlin gena.

[0198]Geni kodiranja početne sekvence V-regiona projektovani su i konstruisani automatskom sintezom

pristupa od strane Entelechon GmbH. Brojne različite varijante teškog lanca su kreirane modifikacijom VH gena od strane oligonudeotid-usmerenih mutageneza. Sekvenca gL1 gena je klonirana u na UCB-Celltech humanom lakom lancu vektora izraza pKH10.1, koja sadrži DNK kodiranja humanog Kappa lanca konstantnog regiona (Km3 alotip) - videti SEQ ID BR: 26 i SEQ ID BR: 30. Osam kalemljenih VH gena (gH1 do gH8) su klonirani u UCB-Celltech humanom gama-4 teškom lancu vektora izraza pVhy4P FL, koja sadrži DNK kodiranja gama-4 teškog lanca konstantnog regiona sa šarka stabillzacionom mutacijom S241P (Angat i drugi, Mol Immunol 1993., 30(1): 105-8). GH2 VH gen izabran je kao optimalno teški lanac kalema za potencijal i biofizičke karakteristike (opisane u ovom dokumentu), i onda je sub-kloniran u UCB-Celltech humanom gama-1 pVhy1F vektoru, koji sadrži DNK kodiranja humanog gama-1 CH1 domena (Glm17 alotip) (SEQ.

ID BR: 38). Kotransfekcija plazmida teškog lanca sa plazmidom lakog lanca, u CHO-L761h ćeliji rezultirali su izrazom humanizovanog antitela u potrebnom Fab formatu. Ovo antitelo se odnosi na ovde u dokumentu opisano kao Ab652 (takođe poznat kao Ab652 Fab).

[0199] Da bi se olakšala nova generacija reda stabilnih ćelija koja izražava antitelo Ab652, jedan plasmid koji sadrži DNK kodiranja oba i teškog i lakog lanca izrazom kaseta i glutamin sintetaze (GS), generisan je selekcioni marker. GS gen omogućava selekciju rekombinovanih CHO ćelija dozvoljavajući im rast u medijumu dopunjenom sa GS inhibitorom metionin sulfoksimina (Bebbington i drugi, Biotechnot. 1992, 10(2): 169-175).

1.2 Merenje afiniteta za vezivanje

[0200] BlAcore tehnologija nadgleda vezivanje između biomoiekula u realnom vremena, bez potrebe za obeležavanjem. Jedan od interaktanata (učesnika u reakciji), termina ligand, je direktno nepokretan ili zarobljen na nepokretnoj površini, dok drugi, termina analit, prelazi u rastvor preko zarobljene površine. Senzor otkriva promenu u masi na površini senzora kao što je analit koji se vezuje za ligand za formiranje kompleksa na površini. Ovo odgovara procesu udruživanja. Odvajanje analita od Uganda je nadgledano kad je analit zamenjen puferom. U BlAcore testu afiniteta, ligand je Ab652 i analit je humani IL-13.

1.3 Test receptorom unakrsnog-bloklranja

[0201] Testiranje na Biacore receptom unakrsnog-blokiranja zahteva hvatanje anti-IL-13 Fab praćeno sa IL-13 (kao prvog analita) koje protiče preko uhvaćenog liganda za formiranje stabilnog kompleksa na površini senzora. Drugi analit (rekombinovani rastvorljivi IL-13 receptor) zatim protiče preko ovog stabilnog kompleksa. Nadgleda se količina vezivanja drugog analita za stabilni kompleks. Anti IL-13 antitela ne dozvoljavaju drugom analitu da se veže za stabilno antitelo: IL-13 kompleksi su klasifikovani kao Sajt 1 (lokacija 1) konkurenata. Ona anti IL-13 antitela koja omogućavaju drugom analitu da se veže za stabilno antitelo: IL-13 kompleksi su klasifikovani kao Sajt 2 (lokacija 2) konkurenata.

Materijali

Instrument

[0202] Biacore »3000, Biacore AB, Upsali, Švedska

Senzor ćip

[0203] CMS (istraživanj stepena) Kataloški broj: BR-1001-14, Biacore AB, Upsali, Švedska. Čipovi su uskladišteni na 4'C.

Oprema za spajanje amina

[0204] Kataloški broj: BR-1000-50, Biacore AB, Upsali, Švedska.

[0205] Etil-3-(3-dimetilaminopropil) karbodimid hidrohlorid (EDC). Napravljen u 75 mg/mL destilovane vode i uskladišten u 200 pl ali kvota na -70 'C.

[0206] N-Hidroksisucinimid (NHS). Napraviljen u 11.5 mg/ml destilovane vode i uskladišten u 200 pl alikvota na -70 °C.

1 M Etanolamin hidrohlorid-NaOHPH 8,5. Uskladišten u 200 pl alikvota na -70" C.

Puferi

[0207] Pokretni pufer: HB-OVCI-EP (biće 0,01 M HEPES pH 7,4, 0,15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0,005% surfaktantant P20). Kataloški broj: BR-1001 - 88, Biacore AB, Upsali, u Švedskoj. Pufer uskladišten na 4 'C.

[0208] Nepokretni pufer: acetat 5.0 (biće 10 mM natrijum acetat pH 5.0). Kataloški broj: BR-1003-51, Biacore AB, Upsali, u Švedskoj. Pufer uskladišten na 4 °C.

Ligand snimanje

[0209] Afinipur F(ab')2 fragmenta anti-humanog IgG koze, specifični fragment F(ab')2. Jackson ImmunoResearch Ine (Pennsvlvania, USA) Kataloški broj: 109-006-097. Reagens uskladišten na 4 "C.

Ugaorl

[0210] Ab652 (2.51, 21.7 i 3.86 mg/ml Fab), skladišten u 4'C.

[0211] Anti-hlL-13 mlgG (RdO Svstems Europe Ltd, Abingdon, Okson. Kataloški broj MAB-213, Lot broj RL04).

Analiti

[0212] Rekombinovani IL-13 (0,2 mg/ml iz D.Lightvvood; R&D sistemi Evropi Ltd,Abingdon, Okson. Kataloški broj 213-IL-050), uskladišten na -70 "Ci otopiljen jednom za svaki test.

[0213] Rekombinovani humani IL-13 receptorl hFc (R&D Svstems Europe Ltd, Abingdon, Okson. Kataloški broj 146-IL-100). Uskladišten na -70 "Ci otopljen jednom za svaki test.

[0214] Rekombinovani humani IL-13 receptor2 hFc (R&D Svstems Europe Ltd, Abingdon, Okson. Kataloški broj 614-IL-100). Uskladišten na -70 'Ci otopljen jednom za svaki test.

Receneraclia rastvora

[0215] 40 mM HCl priprema se razb laži van jem destilovanom vodom iz 11.6 M rastvora zalihe (BDH, Poole, Engleska. Kataloški broj:101254H).

[0216] 5 mM NaOH priprema se razb laži van jem destilovanom vodom iz 50 mM rešenja zalihe. Kataloški broj: BR-1003-58,B1acore AB, Upsali, Švedska.

Ključna oprema

[0217] Biacore 3000 Biosensor, GE Healthcare Ltd, Amersham Place, Little Chalfont, Buckinghamshire, HP7 9NA. Instrument se održava prema protokolima proizvođača.

1,4 Meren ja afiniteta vezivanja Ab652

[0218J Format testa je bio hvatanje Ab652 sa nepokretnim anti-humanim F(ab )2 zatim titracija humanog hiL-13 preko uhvaćene površine.

[0219] BIA (Biomolekularna Interakcijska Analiza) izvršena je pomoću BlAcore 3000 (BlAcore AB). Afinipur F(ab')2Fragment, anti-humanog IgG koze, F(ab')z specifični fragment (Jackson ImmunoResearch) su pričvršćeni na CM5 Senzor Čip preko amino hemijskog spajanja za hvatanje nivoa = 4000 odgovornih jedinica (RUs). Prazne površine su pripremljene na sličan način, izostavljajući F(ab')2 fragment iz procedure. HB-OVCI EP pufer (10mM HEPES pH 7,4, 0,15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0,005% Surfaktant P20, BlAcore AB) je upotrebljen kao pokretni pufer sa stopom protoka od 10 u(/min. 10 ml injekcije Ab652 Fab u -0.2ug/ml je upotrebtjeno za hvatanje nepokretnog anti-humanog IgG-F(ab'), za dozvoljavanje dovoljnog IL-13 za vezivanje, ali takodje za smanjenje transporta mase ograničavajući efekat vezivanja. Humani ILI 3 je titran preko uhvaćenih Ab652 raznim koncentracijama (10nM do 0.31 nM) brzinom protoka od 30 ul/min. Površina je regenerisana (obnovljena) lOpl injekcijom od 40 mM HCl, zatim injekcijom 5 pl od 5 mM NaOH za protok od lOml/min.

[0220] Pozadina substrakcije krive vezivanja su analizirane pomoću BlAevaluation softvera (verzija 3.2) praćeno standardnim procedurama. Kinetički parametri su determinisani (određeni) iz okvira (okova) algoritma.

1.5 Studije unakrsnog-blokiranja IL-13 receptora

[0221] Na BlAcore receptoru unakrsnog-blokiranja test zahteva hvatanje anti-IL-13 Fab praćeno IL-13 (kao prvog analita) protiče preko hvatanja Uganda za formiranje stabilnog kompleksa na površini senzora. Drugi analit (rekombinovani rastvorljivi IL-13 receptor) onda protiče preko ovog stabilnog kompleksa. Onda se nadzire količina vezivanja drugog analita za stabilan kompleks. Anti-IL-13 antitela ne dozvoljavaju drugom analitu da se veže za stabilno antitelo: IL-13 kompleks se klasifikuje kao Osa 1 konkurenti. Ona anti-IL-13 antitela koja omogućavaju drugom analitu da se veže za stabilno antitelo: IL-13 kompleks se klasifikuje kao Osa 2 konkurenti.

[0222] Svi eksperimenti su izvršeni pomoću Biacore 3000 biosenzora na 25 °C. HB-OVCI EP pufer je upotrebljen kao pokretni pufer sa stopom protoka od 10 pl po minutu (min). Isti senzori površine su upotrebljeni kao što su opisani za odredjivanje afiniteta.

[0223] 10 pl injekcije od -0.2 pg/ml anti humanog IL-13 Fab je upotrebljeno za hvatanje koza F(ab')2 IgG, anti-humanog F(ab')2-fragment specifičnog senzora površina. Anti-humanf IL-13 Fab u 0.2ug /ml daje dovoljno anti-humanog IL-13 vezivanja. Humanog IL-13, 25 nM je ubrizgano preko uhvaćenog antitela neposredno praćeno rastvorljivim humanim IL - 13 receptorom od 100 nM brzinom protoka od 10 ul/min. Površina se regeneriše od strane dve 30ul injekcije od 40 mM HCl, praćeno injekcijom 5 pl od 5 mM NaOH brzinom protoka od 30ul/min.

[0224]Pozadina substrahovanog vezivanja krivih analizira su upotrebom BIA softvera procene, obezbedjenog od proizvodjača (verzija 3.2) praćeno standardnim procedurama.

[0225]iL-13 interaguje sa bilo kojim od dva receptora (IL-13Ra1 i IL-13Ra2) za formiranje kompleksa. Samo hlL-13/hlL-13 a1 je signalni kompleks. Stoga, anti-IL13 antitela koja inhibiraju IL-13 zavisnim signaliziranjem mogu posredovati ovaj efekat blokiranjem interakcije sa hlL-13 a1. Sajt (lokacija) interakcije Ab652 na humani IL-13 bi trebalo da se determiniše u BlAcore testu. Ab652 je uhvaćen od strane površine nepokretnog anti-humanog F(ab')2 1 onda se hlL-13 zauzvrat uhvati u Ab652. Vezivanje rastvorljivog IL-13 Ra1 za hvatanje kompleksa IL-13/antitela je procenjeno. Za test je ponovljeno sa substituisanim hlL-13Ra2 za hlL-13Ra1. IL-13 predstavljen sa Ab652 koji ne može da veže ni IL-13 receptore, ali komercijalno kontroliše antitelo anti-IL-13 (mAb 213) koje je bilo sposobno da predstavi IL-13 za rastvorljivi IL-13 receptor. Na zaključku, Ab652 inhibira IL-13 vezivanje za obe hlL-13 receptor podjedtnice, definisane kao konkurenti na Osi 1.

[0226] Afinitet Ab652 za hlL-13 određen je testom u Biacore preko tri odvojena testiranja. Afinitet je bio u opsegu od 9-24 pM sa oznakom od 13.4 (+4.8)pM

1.6. Ćelijski-bazirani potencijal

[0227] Ogledni (in vitro ) potencijal Ab652 Fab za neutralisanje IL-13 je istražen upotrebom HEK-BLUE<*>STAT-6 testa (Invivogen). Test obuhvata HEK293 ćelije stabilno izraženog humanog STAT-6 i stabilno izraženog lučenja embrionalne alkatne fosfataze (SEAP) pod kontrolom 1FN-B minimalnog promotera stapanja (fuzije) za četiri sajta (lokacije) vezivanja STAT-6. Neutralizacija potencije (IC50) Ab652 je razmotrena upotrebom različitih tipova humanog IL-13, upotrebljenog u testu sa 250 pg/mi. Neutralizacija potencije je razmotrena protiv rekombinantnog divljeg-tipa humanog IL-13 proizvedenog iz bakterijske (E. coli) i ćelija domaćina sisara (fibroblaste pacova). Neutralizacija potencije razmotrena protiv prirodnog divljeg-tipa i varijante R130Q humanog IL-13 je proizvedena iz humanih T-limfocita, a protiv rekombinovanog cinomotgusa majmuna IL-13 proizvedenog u ćelijama sisara. R130Q.hlL-13 nije pročišćen i koncentracija je određena sa ELISAhlL-13. Cinomolgus IL-13 nije pročišćen i upotrebljen je u koncentraciji dajući ekvivalentni odgovor u testu kao 250 pg/ml hlL-13. Pored toga, njegov potencijal za neutralizaciju CA154_652.g2 Fab je izmeren nakon raspršavanja pomoću PARI eFLOW® mrežnog raspršivača. Tabela 4: IC50 vrednosti Ab652 Fab protiv nekoliko različitih vrsta IL-13 u HEK Blue Testu. Za određivanje funkcionalnog afiniteta IL-13, titracije su obavljene u prisustvu osnovnih koncentracija Ab652. 5ild-splet analize su primenjene na podatke da bi determinisale KD vrednosti za neutralizaciju rekombinovanog humanog divlji-tip IL-13 i rekombinovanog cinomotgusa majmuna IL-13. Tabela 5: IC50 i KD vrednosti Ab652 Fab protiv više različitih vrsta IL-13 u HEK Blue Testu.

[0228] Sve u svemu, ovi podaci pokazuju da je Ab652 Fab sličnog potencijala za neutralisanje rekombinovanog i prirodnog humanog IL-13 proizvedenog iz bakterija i izvora sisara. Potencijal CAl54_652.g2 protiv cinomolgusa IL - 13 u ovom testu je ne više od 3-foldera niži od njegovog potencijala protiv humanog IL-13 takode generisanog iz fibroblasta pacova. Potencijal CA154_652.g2 je nepromenjen posle raspršavanja pomoću PARI eFLOV<T>raspršivača.

1.7 Fizička karakterfzaclja Ab652

[0229] Kao što je opisano iznad 8 različitih antitela kalemljenih varijabilnih regiona generisano je pomoću CDR-ova izvedenih iz izabranog antitela pacova (SEQ id brojevi: 1-6, Slika 1). Izbor Ab652 (gL1gH2) iz ovih 8 kalema je zasnovan na potencijalu kao što je opisano iznad, a na biofizičkim karakteristikama.

[0230] Na osnovu generisanih podataka za sve testirane kalemljene varijabilne regione, antitelo 652 izabrano je zato što:

• Održava najveći afinitet protiv hlL-13 i varijante IL-13

■ Imalo je najvišu temperaturu topljenja, Tm (pokazatelj veće stabilnosti)

- Najveći pH stabilnosti (by Circular Dichroism) odnosno pokazalo je manje nereda u niskom pH

■ Bez agregacije na mućkanje ili kada je raspršen

[0231] Nasuprot tome, neki drugi katemovi testiranjem pokazuju smanjenje u afinitetu vezivanja, slabu pH stabilnost i agregaciju na mućkanje i/ili raspršavanje.

1.7.1 Efekat raspršavanja

[0232] Za determinisanje (utvrdjivanje) da li je Ab652 pogodno za raspršavanje upotrebljava se PARI eFLOVV<*>raspršivač. Zapremine od 2.5 ml Ab652 rastvora u 50mM natrijum acetata / 125mM natrijum hlorida pH5 se raspršavaju na temperaturi okoline (oko 21 *C) i prikupiljaju se kondenzovanjem nebulizata u hladnim cevima za sakupljanje. Naredne analize pokazale su da nema vidljive degradacije. U studiji je takođe ponovljeno upotrebom rastvora u PBS, pH 7. Pozitivna kontrola lgG4 je uključena, kako bi se pronašlo da agregira tokom raspršavanja. Analiza uzoraka raspršavanja je veličina isključenosti, SDS - PAGE, dinamički lako rasipanje i ligand vezivanje, sa određenim ciljem otkrivanja prisutnog nagomilanog materijala. Nema promena što je očigledno u bilo kojoj od ovih tehnika pokazujući da je Ab652 otpora no na oštećenja tokom raspršavanja.

1.7.2 Rezime Fizičkih Karakteristika Ab652

[0233] pl (izoelektrična tačka) 8 (prošek dva determinisanja/odredjivanja)

Termalna stabilnost Tm 84<*>C

Nema agregacije Abć52 što je primećeno kada antitelo biva podvrgnuto agitaciji/mućkanju ili raspršavanju

2. Efekat Abć52 u ne-humanom primat modelu astme

Cilj pronalaska

[0234] Cilj ovog istraživanja je bio da se proceni efikasnost Ab652 u ne-humanom primat modelu astme. Primarne krajnje tačke uključuju efekte na bronhoalveolamom ispiranju (BAL) ćelijskih tačaka, nivoi hemokina i ranim i kasnim promenama plućne funkcije kao što je procenjeno otporom pluća (RL).

Metode pronalaska

[0235] Ab652 je dostavljeno upotrebom mreže raspršivača. Studije za simutaciju daha sprovedene su upotrebom tipičnih parametara ventilatora i cevi podešene za upotrebu u studiji postrojenja. Rezultati studije za simulaciju daha naznačavaju da se 40.4% punjenja materijala u raspršivač u isporučuje na nivou endotrahealne cevi.

[0236] Studija životinja je izabrana na osnovu istorijskfh vrednosti plućnih funkcija i BAL datoteke eozinofita. U sesiji skrininga, životinje su podvrgnute Ascaris suum (A. suum) antigenu izazova pre nego što se rasporede u grupe za tretman kako bi se okarakterisali njihovi normalni (netretirani) odgovori na A, suum. Nakon ove sesije skrininga, životinje su rasporedjene u nekoliko grupa na osnovu BAL datoteke ćelija i podataka plućnih funkcija iz sesije skrininga. U sesiji tretmana, životinje primaju ili medtjume bez terapeutskog učinka raspršivača (PBS), ili raspršeni Ab652 na nivou doza u raspršivaču od 0.1, 1, 10 i 60 mg/životinja/po danu. Doze su administrirane preko raspršivača danima -2, -1, 1,2 i 3. Na dane 1 i 2, administracije tretmana je došlo otprilike 30 minuta pre A. suum izazov.

[0237] Procedure izazova su identične za obe sesije. Svaka životinja bila je izazvana na dane 1 i 2, i vrednosti plućne funkcije (RL) su snimljene najmanje15 minuta posle svakog antigen izazova i na 24 časa nakon svakog alergen izazova. BAL tečnost je prikupljena pre prvog izazova i otprilike 24 časa nakon drugog izazova za procenu ukupnog broja ćelija, morfologije, i diferencijalnog računa u svrhu procene stepena plućnog zapaljenja. Uzorci BAL supernatanta se sakupljaju i analiziraju za određivanje koncentracije hemokina.

Rezultati pronalaska

[0238]Raspršeni Ab652 značajno inhibira povećanje BAL eotaksin-3 za niske doze mg/danu (Slika 13). Raspršeni Ab652 izazvao je dozno-zavisne inhibicije povećanja BAL eozinofila kako je izmereno između skrininga i tretmana sesija (Slika 14). Raspršeni Ab652 značajno i dozno-zavisno inhibira na vrhuncu rane faze odgovora na dan 2 mereno do 15 minuta posle Ascaris izazova u tretmanu sesija (Slika 15). Raspršeni Ab652 značajno i dozno-zavisno inhibira mereno u kasnoj fazi 24 sata na dan 2 posle alergen izazova (Slika 16).

Zaključd pronalaska

[0239]Podaci generisani sa raspršenog Ab652 u Ascaris modelu astme u cinomolgusima majmuna demonstriraju da je IL 13-vodjen alergijom zapaljenja pluća osetljiv na farmakološke modulacije neutralizacije anti-IL-13 Fab fragment isporučenog direktno vazdušnim putevima u aerosol. Značajno Ab652 je potentan, demonstrirajući efikasnost u nižim mg/dan dozama.

Claims

1. Antagonističko antitelo koje vezuje humani IL-13 obuhvatajući teški lanac, pri čemu varijabilni domen teškog lanca obuhvata sekvencu datu u SEQ ID BR: 31, i dodatno obuhvata laki lanac, pri čemu varijabilni domen lakog lanca obuhvata sekvencu datu u SEQ ID BR: 23.

2. Molekul antagonističkog antitela prema patentnom zahtevu 1, pri čemu je molekul antitela izabran iz grupe koja se satoji od: kompletnog molekula antitela teških ili lakih lanaca pune dužine ili fragmenata istih, kao što je Fab, modifikovani Fab', Fab', Ffab'jj, Fv ili scFv fragmenata.

3. Antagonističko antitelo koje vezuje humani IL-13 imajući teški lanac obuhvatajući sekvencu datu u SECi ID BR: 35 i laki lanac obuhvatajući sekvencu datu u SEQ ID BR: 27.

4. Molekul antagonističkog antitela prema bilo kom od patentnih zahteva od 1 do 3, imajući efektor ili reporter molekula vezanog za njega.

5. Antagonističko antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva od 1 do 4, imajući afinitet vezivanja za izolovani humani IL-13 od 30pM ili bolje kao što je izmereno površinskom plazmon rezonancom.

6. Izolovana DNK sekvenca koja kodira teški ili laki lanac (lance) antitela prema bilo kom od patentnih zahteva od 1 do 5.

7. Kloniranje ili ekspresioni vektor obuhvatajući DNK sekvencu prema patentnom zahtevu 6.

8. Vektor prema patentnom zahtevu 7, pri čemu vektor obuhvata sekvence date u SEQ ID BR: 36 i SE0_ ID BR: 28.

9. Ćelija domaćina za ekspresiju antitela prema bilo kom od patentnih zahteva od 1 do 5 obuhvatajući: i) DNK sekvencu koja kodira teški lanac pomenutog antitela, i ii) DNK sekvencu koja kodira laki lanac pomenutog antitela gde su DNK sekvence date u jednom ili više kloniranja ili ekspresionih vektora.

10. Ćelija domaćina prema patentnom zahtevu 9, obuhvatajući jedan ili više kloniranja ili ekspresionih vektora prema patentnom zahtevu 7 ili patentnom zahtevu 8.

11. Postupak za proizvodnju antitela prema bilo kom od patentnih zahteva od 1 do 5, obuhvatajući gajenje ćelije domaćina prema patentnom zahtevu 10 i izotovanje antitela.

12. Farmaceutska kompozicija obuhvatajući antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva od 1 do 5, u kombinaciji sa jednim ili više farmaceutski prihvatljivih ekscipijenata, rastvarača ili nosača.

13. Farmaceutska kompozicija prema patentnom zahtevu 12, dodatno obuhvatajući druge aktivne sastojke.

14. Antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva od 1 do 5 ili farmaceutska kompozicija prema patentnom zahtevu 12 ili patentnom zahtevu 13, za upotrebu u terapiji.

15. Antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva od 1 do 5 ili farmaceutska kompozicija prema patentnom zahtevu 12 ili patentnom zahtevu 13, za upotrebu u tretmanu ili profilaksi patoloških poremećaja posredovanih od IL-13, ili koje je povezano sa povećanim nivoom IL-13 gde je patološki poremećaj izabran iz grupe koja se sastoji od: astmatičnog poremećaja, atopijskog poremećaja, hronične obstruktivne bolesti pluća (COPD), stanja koja uključuju upalu disajnih puteva, eozinofitije, fibroze i proizvodnje viška sluzi, upalna stanja, autoimuna stanja, tumori ili kanceri i virusne infekcije.

16. Antitelozaupotrebu prema patentnom zahtevu 15 gde je antitelo Fab ili Fab' fragment.