RS55823B1 - Sintetički peptidoglikani koji vezuju hijaluronsku kiselinu, priprema i postupci upotrebe - Google Patents

Sintetički peptidoglikani koji vezuju hijaluronsku kiselinu, priprema i postupci upotrebe

Info

Publication number
RS55823B1
RS55823B1 RS20170300A RSP20170300A RS55823B1 RS 55823 B1 RS55823 B1 RS 55823B1 RS 20170300 A RS20170300 A RS 20170300A RS P20170300 A RSP20170300 A RS P20170300A RS 55823 B1 RS55823 B1 RS 55823B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
synthetic
hyaluronic acid
peptidoglycan
collagen
matrix
Prior art date
Application number
RS20170300A
Other languages
English (en)
Inventor
Shaili Sharma
Alyssa Panitch
Jonathan C Bernhard
John E Paderi
Original Assignee
Symic Ip Llc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Symic Ip Llc filed Critical Symic Ip Llc
Publication of RS55823B1 publication Critical patent/RS55823B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K9/00—Peptides having up to 20 amino acids, containing saccharide radicals and having a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/08—Peptides having 5 to 11 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/10—Peptides having 12 to 20 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/1703—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • A61K38/1709—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/39—Connective tissue peptides, e.g. collagen, elastin, laminin, fibronectin, vitronectin, cold insoluble globulin [CIG]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/3641—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix characterised by the site of application in the body
    • A61L27/3645—Connective tissue
    • A61L27/3654—Cartilage, e.g. meniscus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/40—Composite materials, i.e. containing one material dispersed in a matrix of the same or different material
    • A61L27/44—Composite materials, i.e. containing one material dispersed in a matrix of the same or different material having a macromolecular matrix
    • A61L27/48—Composite materials, i.e. containing one material dispersed in a matrix of the same or different material having a macromolecular matrix with macromolecular fillers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
    • A61L27/54—Biologically active materials, e.g. therapeutic substances
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4725—Proteoglycans, e.g. aggreccan
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/78—Connective tissue peptides, e.g. collagen, elastin, laminin, fibronectin, vitronectin or cold insoluble globulin [CIG]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
    • C08B37/006—Heteroglycans, i.e. polysaccharides having more than one sugar residue in the main chain in either alternating or less regular sequence; Gellans; Succinoglycans; Arabinogalactans; Tragacanth or gum tragacanth or traganth from Astragalus; Gum Karaya from Sterculia urens; Gum Ghatti from Anogeissus latifolia; Derivatives thereof
    • C08B37/0063—Glycosaminoglycans or mucopolysaccharides, e.g. keratan sulfate; Derivatives thereof, e.g. fucoidan
    • C08B37/0069—Chondroitin-4-sulfate, i.e. chondroitin sulfate A; Dermatan sulfate, i.e. chondroitin sulfate B or beta-heparin; Chondroitin-6-sulfate, i.e. chondroitin sulfate C; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
    • C08B37/006—Heteroglycans, i.e. polysaccharides having more than one sugar residue in the main chain in either alternating or less regular sequence; Gellans; Succinoglycans; Arabinogalactans; Tragacanth or gum tragacanth or traganth from Astragalus; Gum Karaya from Sterculia urens; Gum Ghatti from Anogeissus latifolia; Derivatives thereof
    • C08B37/0063—Glycosaminoglycans or mucopolysaccharides, e.g. keratan sulfate; Derivatives thereof, e.g. fucoidan
    • C08B37/0072—Hyaluronic acid, i.e. HA or hyaluronan; Derivatives thereof, e.g. crosslinked hyaluronic acid (hylan) or hyaluronates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Oral & Maxillofacial Surgery (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Marine Sciences & Fisheries (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Composite Materials (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Description

SINTETIČKI PEPTIDOGLIKANI KOJI VEZUJU HIJALURONSKU KISELINU,
PRIPREMA I POSTUPCI UPOTREBE
Oblast tehnike
[0001]Pronalazak se odnosi na oblast sintetičkih peptidoglikana koji vezuju hijaluronsku kiselinu i postupke dobijanja i upotrebe.
STANJE TEHNIKE I SUŠTINA PRONALASKA
[0002]Zglobna hrskavica je važna zaštitna komponenta kostiju u telu. Posebno, zglobna hrskavica štiti zglobne kosti od oštećenja obezbeđivanjem bliskih površina koje nemaju trenje pri kretanju kostiju i dodatno omogućava čvrstoću na pritisak zglobovima. Zglobna hrskavica široko obuhvata vanćelijski matriks (VĆM) koji se dobija iz tri glavne komponente: od: skele kolagena, hijaluronske kiseline (HK), i agrekana. Kompozicija materijala zglobne hrskavice određuje biološka, hemijska i mehanička svojstva tkiva. Vanćelijski matriks zdrave hrskavice se sastoji u osnovi iz mreže kolagenskih vlakana (15-22% vlažne mase kolagena tipa II), proteoglikana (4-7% vlažne mase), glikoproteina, vode (60-85%) i elektrolita, što formira viskoelastično tkivo sa strukturnom i mehaničkom anizotropijom koja zavisi od dubine tkiva.
[0003]Razaranje hrskavice i trošenje je obeležje osteoartritisa (OA). Tokom početnih faza OA, agrekan, glavni peptidoglikan u hrskavici, je rana komponenta koja se degradira. Monomer agrekana je jezgro proteina sa kovalentno vezanim glikozaminoglikanskim (GAG) bočnim lancima koji se vezuju za filamentoznu hijaluronsku kiselinu preko globularnih domena i veznim proteinom. Proteaze, kao što su agrekanaze, presecaju agrekan na specifičnim mestima i stvaraju fragmente proteina i slobodne GAG lanace koji ne mogu da se ponovo vežu za HK. Umesto toga, ovi slobodni GAG lanci se istisnu iz matriksa, koji ne samo da smanjuje čvrstoću na pritisak, već takođe iniciraju povećanje u pro-inflamatornim citokinima i matriksnim metaloproteazama. Prisustvo agrekana smanjuje difuziju proteaza i štiti kolagena vlakna koja leže ispod od proteolitičkog isecanja. Gubitak agrekana se događa čak i u normalnoj hrskavici i nije neposredno u uzajamnoj vezi sa OA. Međutim, gubitak kolagena tipa II se smatra ireverzibilnim procesom, koji dovodi do prevremenog trošenja.
[0004]Osteoartritis je najčešći oblik artritisa, koji pogađa 27 miliona ljudi u SAD samo. Najviše zastupljeni simptomi osteoartritisa su ogroman bol, ukrućenje u zglobovima, i osetljivi zglobovi pod inflamacijom. Uznapredovane faze osteoartritisa dovode do kompletne degradacije zglobne hrskavice, i prouzrokuju nepokretnost zglobova i oštećenje kosti koja se nalazi ispod. Direktni troškovi artritisa u Sjedinjenim Državama su procenjeni na približno $185,5 milijardi svake godine.
[0005]lako se za lečenje osteoartritisa često primenjuju promene u životnom stilu i brojni lekovi, nema mnogo uspeha u regeneraciji oštećene hrskavice i slabljenju simptoma koji se uzrokuju gubitkom hrskavice. Nemogućnost da se zaustavi napredovanje osteoartritisa i popravi postojeće oštećenje tipično vodi do invazivne krajnje faze postupka zamene hrskavice. Stoga, alternativna metoda lečenja osteoartritisa je visoko poželjna.
[0006]Predmetni pronalazak opisuje unapređene biomaterijale za regeneraciju hrskavice, uključujući sintetičke peptidoglikane koji vezuju hijaluronsku kiselinu koji se koriste za obnovu oštećene hrskavice kod pogođenih pacijenata, zajedno sa postupcima obrazovanja i upotrebe sintetičkih peptidoglikana. Osim toga, sintetički peptidoglikani koji vezuju hijaluronsku kiselinu se prave tako da funkcionalno imitiraju agrekan, budu otporni na degradaciju agrekanazom, i ograniče proteolitičku degradaciju. Nedostatak prirodne sekvence aminokiselina koja se nalazi u agrekanu ove molekule čini manje podložnim proteolitičkom isecanju.
[0007]Predmetni pronalazak se odnosi na sintetički peptidoglikan koji vezuje hijaluronsku kiselinu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 15. Sledeća izvođenja koja su obeležena brojevima se razmatraju: 1. Sintetički peptidoglikan koji vezuje hijaluronsku kiselinu prema bilo kom od patentnih zahteva od 1 do 11 u kojima je glikan izabran iz grupe koja se sastoji od hondroitin sulfata i keratan sulfata. 2. Sintetički peptidoglikan koji vezuje hijaluronsku kiselinu prema bilo kom od patentnih zahteva od 1 do 11 ili izvođenju 1 u kome je sintetički peptidoglikan liofilizovan. 3. Projektovani matriks kolagena prema bilo kom od patentnih zahteva od 12 do 13 u kojima je kolagen izabran iz grupe koja se sastoji od kolagena tipa I, kolagena tipa II, kolagena tipa III, kolagena tipa IV, kolagena tipa IX, kolagena tipa XI i njihovih kombinacija.
4. Projektovani matriks kolagena u izvođenju 3 u kome matriks deluje kao tkivni kalem.
5. Projektovani matriks kolagena u izvođenju 4 u kome se tkivni graft implantira u pacijenta.
6. Projektovani matriks kolagena prema bilo kom od izvođenja od 3 do 5 u kojima je matriks u obliku gela.
7. Projektovani matriks kolagena u izvođenju 6 u kome se gel daje pacijentu injekcijom.
8. Projektovani matriks kolagena prema bilo kojim izvođenjima od 3 do 7 u kojima matriks deluje kao kompozicija za in vitro kulturu ćelija. 9. Projektovani matriks kolagena patentnog zahteva 13 u kome se ćelije biraju iz grupe koja se sastoji od hondrocita i matičnih stem ćelija. 10. Projektovani matriks kolagena u izvođenju 9 u kome se matične stem ćelije biraju iz grupe koja se sastoji od osteoblasta, osteogenih ćelija, i mezenhimalnih matičnih stem ćelija. 11. Projektovani matriks kolagena prema bilo kojim izvođenjima od 3 do 10 koji dodatno sadrži jednu ili više hranljivih materija. 12. Projektovani matriks kolagena prema bilo kojim izvođenjima od 3 do 11 koji dodatno sadrži jedan ili više faktora rasta. 13. Projektovani matriks kolagena prema bilo kojim izvođenjima od 3 do 12 u kojima je matriks sterilizovan. 14. Kompozicija za in vitro kulturu hondrocita ili matičnih stem ćelija koja obuhvata sintetičke peptidoglikane koji vezuju hijaluronsku kiselinu prema bilo kojim patentnim zahtevima od 1 do 11. 15. Kompozicija prema izvođenju 14 u kome se matične stem ćelije biraju iz grupe koja se sastoji od osteoblasta, osteogenih ćelija, i mezenhimalnih matičnih stem ćelija. 16. Kompozicija prema bilo kojim izvođenjima od 14 do 15 koja dodatno sadrži jednu ili više hranljivih materija. 17. Kompozicija prema bilo kojim izvođenjim od 14 do 16 koja dalje sadrži jedan ili više faktora rasta. 18. Kompozicija prema bilo kojim izvođenjima od 14 do 17 u kojima je kompozicija sterilizovana. 19. Aditiv za biomaterijal hrskavice ili kompozicija koja zamenjuje kost i obuhvata sintetičke peptidoglikane koji vezuju hijaluronsku kiselinu prema bilo kojim od patentnih zahteva 1 do 11
za dodavanje postojećem biomaterijalu hrskavice ili materijalu koji zamenjuje kost.
20. Sintetički peptidoglikan koji vezuje hijaluronsku kiselinu za upotrebu prema patentnom zahtevu
14 u kome sintetički peptidoglikan deluje kao lubrikant.
21. Sintetički peptidoglikan koji vezuje hijaluronsku kiselinu za upotrebu prema patentnom zahtevu 14 ili izvođenju 20 u kome sintetički peptidoglikan sprečava artikulaciju kost na kost ili sprečava
gubljenje hrskavice.
22. Postupak pripreme biomaterijala ili zamene kostne hrskavice, pomenuti postupak koji obuhvata korak kombinovanja sintetičkih peptidoglikana prema bilo kom od patentnih zahteva od 1 do 11
i postojeći biomaterijal ili materijal za zamenu hrskavice kosti.
23. Sintetički peptidoglikan koji vezuje hijaluronsku kiselinu prema bilo kom od patentnih zahteva od 1 do 11 za upotebu u postupku smanjenja ili sprečavanja degradacije hijaluronske kiseline kod pacijenta, pomenuti postupak obuhvata davanje pacijentu sintetičkog peptidoglikana koji
vezuje hijaluronsku kiselinu.
24. Sintetički peptidoglikan koji vezuje hijaluronsku kiselinu za upotrebu prema izvođenju 23 u kome se brzina degradacije hijaluronske kiseline smanjuje. 25. Sintetički peptidoglikan koji vezuje hijaluronsku kiselinu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 11 za upotrebu u postupku ispravljanja ili modifikovana defekta tkiva pacijenata koji obuhvata davanje sintetičkih peptidoglikana koji vezuju hijaluronsku kiselinu defektnom tkivu u
kome se defekt ispravlja ili modifikuje.
26. Sintetički peptidoglikan koji vezuje hijaluronsku kiselinu za upotrebu kao u izvođenju 25 u kome je defekt kozmetički defekt. 27. Sintetički peptidoglikan koji vezuje hijaluronsku kiselinu prema bilo kom od patentnih zahteva od 1 do 11 za upotrebu kao dermalni punilac. 28. Sintetički peptidoglikan koji vezuje hijaluronsku kiselinu prema bilo kom od patentnih zahteva od 1 do 11 za upotrebu u postupku smanjenja ili sprečavanja degradacije kolagena, pomenuti postupak obuhvata korake kontakta sintetičkih peptidoglikana koji vezuju hijaluronsku kiselinu u
prisustvu kolagena, i smanjenje ili sprečavanje degradacije kolagena.
29. Sintetički peptidoglikan koji vezuje hijaluronsku kiselinu za upotrebu kao u izvođenju 28 u kome je brzina degradacije hijaluronske kiseline smanjena. 30. Sintetički peptidoglikan koji vezuje hijaluronsku kiselinu prema bilo kom od patentnih zahteva od 1 do 11 za upotrebu u postupku povećanja veličine pore u projektovanom matriksu kolagena, pomenuti postupak obuhvata korake kombinovanja kolagena, hijaluronske kiseline, i sintetičkih
peptidoglikana koji vezuju hijaluronsku kiselinu i povećanja veličine pore u matriksu.
31. Sintetički peptidoglikan koji vezuje hijaluronsku kiselinu za upotrebu kao u izvođenju 30, u kome je matriks sterilizovan. 32. Sintetički peptidoglikan koji vezuje hijaluronsku kiselinu za upotrebu kao u izvođenjima 30 i 31, u kojima matriks dodatno sadrži hondrocite ili matične stem ćelije. 33. Sintetički peptidoglikan koji vezuje hijaluronsku kiselinu za upotrebu kao u izvođenju 32, u kome se matične stem ćelije uzimaju iz grupe koja se sastoji od osteoblasta, osteogenih ćelija, i
mezenhimalnih matičnih stem ćelija.
34. Sintetički peptidoglikan koji vezuje hijaluronsku kiselinu za upotrebu u izvođenjima od 30 do 33 u kojima matriks dodatno sadrži jednu ili više hranljivih materija. 35. Sintetički peptidoglikan koji vezuje hijaluronsku kiselinu za upotrebu kao u izvođenjima od 30 do
34 u kojima matriks sadrži jedan ili više fakora rasta.
36. Sintetički peptidoglikan koji vezuje hijaluronsku kiselinu prema bilo kojim od patentnih zahteva od 1 do 11 za upotrebu u postupku smanjenja ili sprečavanja degradacije hondroitin sulfata, pomenuti metod obuhvata korake kontakta sintetičkog peptidoglikana sa hijaluronskom
kiselinom u prisustvu kolagena, i smanjenja ili sprečavanja degradacije hondroitin sulfata.
37. Sintetički peptidoglikan koji vezuje hijaluronsku kiselinu za upotrebu prema izvođenju 36 u kome se brzina degradacije hondroitin sulfata smanjuje. 38. Sintetički peptidoglikan koji vezuje hijaluronsku kiselinu, jedinjenje, projektovani matriks kolagena, kompozicija, aditiv, postupak, ili dermalni punilac prema bilo kojim od patentnih zahteva od 1 do 15 ili bilo kojim prethodnim izvođenjima u kojima peptidna komponenta
sintetičkog peptidoglikana ima glicin-cistein (GC) vezan za N-kraj peptida.
39. Sintetički peptidoglikan koji vezuje hijaluronsku kiselinu, jedinjenje, projektovani matriks kolagena, kompozicija, aditiv, postupak, ili dermalni punilac prema bilo kojim od patentnih zahteva od 1 do 15 ili bilo kojim prethodnim izvođenjima u kojima peptidna komponenta
sintetičkog peptidoglikana ima glicin-cistein-glicin (GCG) vezan za N-kraj peptida.
40. Sintetički peptidoglikan, jedinjenje, projektovani matriks kolagena, kompozicija, aditiv, postupak, ili dermalni punilac prema bilo kojim od patentnih zahteva od 1 do 15 ili bilo kojim prethodnim izvođenjima u kojima je sintetički peptidoglikan otporan na matriksne
metaloproteaze.
41. Sintetički peptidoglikan, jedinjenje, projektovani matriks kolagena, kompozicija, aditiv, postupak, ili dermalni punilac izvođenja 40 u kome je matriksna metaloproteaza agrekanaza. 42. Sintetički peptidoglikan, jedinjenje, projektovani matriks kolagena, kompozicija, aditiv, postupak, ili dermalni punilac prema bilo kojim od patentnih zahteva od 1 do 15 ili bilo kojim prethodnim izvođenjima u kojima su doze sintetičkih peptidoglikana u rasponu koncentracija od oko 0,01 nM do oko lOOpM. 43. Sintetički peptidoglikan, jedinjenje, projektovani matriks kolagena, kompozicija, aditiv, postupak, ili dermalni punilac prema bilo kojim od patentnih zahteva od 1 do 15 ili bilo kojim prethodnim izvođenjima u kojima su doze sintetičkih peptidoglikana u rasponu koncentracije od oko 0,1 u.M do oko 10 u.M.
KRATAK OPIS SLIKA NACRTA
[0008]SLIKA 1 pokazuje šematsku reakciju za proizvodnju izvođenja sintetičkog peptidoglikana koji vezuje hijaluronsku kiselinu. Koraci reakcije su prikazani zadebljanim fontom. SLIKA 2 pokazuje standardnu krivu N-(B-mateimidopropionska kiselina)hidrazida, so trifluorosirćetne kiseline (u daljem tekstu "BMPH") apsorbancije (215nm) na osnovu količine (mg) ubrizganog BMPH. Standardna kriva se korsti da se odredi količina potrošenog BMPH za vreme reakcije vezivanja. SLIKA 3 pokazuje vezivanje sintetičkih peptidoglikana koji vezuju hijaluronsku kiselinu za imobilizovanu hijaluronsku kiselinu (HK). Devet peptida koji vezuju HK (npr., GAHWQFNALTVRGGGC; u daljem tekstu "GAH" ili "mAGC") se vezuju za funkcionalizovanu glikozaminoglikansku (npr., hondroitin sulfat, u daljem tekstu "HS") osnovu. Koncentracije sintetičkih glikozaminoglikana se povećavaju od 0,1 u.M do 100 u.M. SLIKA 4 pokazuje vezivanje sintetičkog peptidoglikana za HK kako se određuje oscilovanjem reološke frekvencije (Panel A). Modul za skladištenje smeša HK se analizira pri frekvenci oscilacija od 5.012 Hz. Na ovoj frekvenciji, se obezbeđuje primetno opterećenje dok se integritet lanaca HK održava. Statistička analiza (a=0,05) pokazuje da su HK+HS i HK značajno različiti (označeno<*>), i da su HK+ 10.5GAK-HS i HK+HS značajno različiti (označeno<**>). Panel B je alternativni prikaz identičnih podataka prikazanih u Panelu A. SLIKA 5 pokazuje kvalitativno određivanje zamućenosti kolagena tipa I plus grupa sa tretmanom u toku stvaranja vlakna kolagena. Apsorbancija na 313 nm se meri na svakih 3 minuta. Nakon jednog sata (tj., vremenska tačka broj 20), sve tretirane grupe imaju potpuno obrazovane mreže. Nema značajnih razlika (a=0,05) između tretiranih grupa u odnosu na maksimalnu apsorbancu ili u vremenu na pola maksimalne apsorbance. SLIKA 6 pokazuje opterećenje na projektovani pritisak koje podnose gelovi kolagena na osnovu primenjenog projektovanog naprezanja od 1% po sekundi. Statistička analiza (a=0,05) pokazuje da dodavanje 10.5GAH-HS ostvaruje značajnu razliku u piku projektovanog pritiska, uz projektovani pritisak koji se analizira projektovanim naprezanjima od 5%, 7,5%, i 10%. SIIKA 7 pokazuje modul skladištenja smeše kolagena koji se meri na oscilatornoj frekvenciji od 0.5012 Hz. Statistička analiza (a=0,05) pokazuje da dodavanje 10.5GAH-HS ostvaruje značajno povećanje u modulu skladištenja gela kolagena (označeno<*>). SLIKA 8 pokazuje procenat degradacije smeša HK zbog dodavanja hijaluronidaze smešama (Panel A). Procenat degradacije se određuje promenama u dinamici viskoziteta smeša HK. Merenja dinamike viskoziteta se inicijalno uzimaju iz smeša, i služe kao odrednica od koje se računaju procenti degradacije. Vremenska tačka 0 sata se uzima nakon dodavanja hijaluronidaze, dovoljnog mešanja uzoraka, i pipetiranja na postolje reometra, sa razmakom od približno 2 minuta između dodavanja hijaluronidaze i merenja dinamike viskoziteta. Statističke analize pokazuju značajne razlike (a=0,05) u procentu degradacije za 10.5GAH-HS uzorak i tokom vremenskih tačaka 0 sata i 2 sata. Panel B prikazuje iste podatke predstavljene kao normalizovani dinamični viskozitet (srednja vrednost -+ SE, n=3) smeša HK zbog dodavanja hijaluronidaze. Merenja dinamike viskoziteta se inicijalno vrše od smeša pre nego što se hijaluronidaza doda, i ove vrednosti služe kao odrednica od koje se računaju normalizovane vrednosti dinamike viskoziteta. Normalizovane dinamike viskoziteta se određuju uzimanjem svake izmerene dinamike viskoziteta nakon dodavanja hijaluronidaze i deljenjem ove vrednosti inicijalnim dinamičnim viskozitetom tog uzorka. Statistička analiza (a=0,05) se radi, i značajne razlike se uoče u normalizovanoj degradaciji za uzorak 10.5GAH-HS na vremenskim tačkama 0 h i 2 h. SLIKA 9 pokazuje reprezentativne krio-SEM slike (10 000x uvećanje sa 5 \ im skalom) od Cl skele udružene sa svakim repilikatom VĆM. Panel A predstavlja Cl kontrolu. Panel B predstavlja CI+HK+HS. Panel C predstavlja CI+HK+10.5GAH-HS. SLIKA 10 pokazuje procenat degradacije (srednja vrednost-+SE, n=3) Cl u VĆM replikatima koji se izlažu MMP-I u toku 50 časovnog trajanja. Statistička analiza (p<0,05) različitih tretmana pokazuje da se sva tri tretmana (Cl kontrola, CI+HK+HS, i CI+HK+10.5GAH-HS) značajno razlikuju jedni od drugih. SLIKA 11 pokazuje ukupni gubitak hondroitin sulfata (HS) tokom osmo-dnevnog perioda kultivacije u medijumu koji se stimuliše sa ili bez IL-1B. Gubitak HS se meri DMMB testom. Dodavanje mAGC ima značajni efekat na gubitak HS iz skela (p<0,001).<**>označava statističku značajnost između skela koje se pripremaju bez imitatora agrekana i onih koje se pripremaju sa mAGC. + označava statističku značajnost između skele tretirane sa ili bez IL-1B (p<0,05). Stubovi prestavljaju prošek -+ SEM (n=3). SLIKA 12 pokazuje ukupno razlaganje kolagena tokom osmo-dnevnog perioda kultivacije u medijumu koji se stimuliše sa ili bez IL-lB. Razlaganje kolagena se meri Sircol testom. Dodavanje imitatora agrekana ima značajni efekat na gubitak kolagena iz skela (p<0,02).<**>označava statističku značajnost između skele koja se priprema bez imitatora agrekana i onih koje se pripremaju sa mAGC. + označava statističku značajnost između skele koja se tretira sa ili bez IL-1B (p<0,05). Stubovi predstavljaju prošek - + SEM (n=3). SLIKA 13 pokazuje platformu za proučavanje delotvornosti peptidoglikana ex vivo. 0,5% tripsin se koristi za uklanjanje prirodnog agrekana iz eksplanata goveđe hrskavice. Uklanjanje agrekana se potvrđuje DMMB testom. Grafici predstavljaju količinu uklonjenog agrekana u poređenju sa pozitivnom kontrolom. SLIKA 14 pokazuje test kojim se prati difuzija peptidoglikana kroz matriks hrskavice. Y-osa prikazuje razliku vrednosti apsorbance iz DMMB testa koje se čitaju sa delova hrskavice koja je osiromašena agrekanom i tretirana sa/bez peptidoglikana. X-osa prikazuje udaljenost od površine zglobne hrskavice do subhondralne kosti. Stubovi predstavljaju prošek razlike -+SEM (n=3). SLIKA 15 pokazuje Safranin O i Avidin-Biotin bojenja eksplanata goveđe hrskavice. Srednje sagitalni rez se pravi kroz matriks i testira na prisutni agrekan (gornji panel, tamno bojenje) i biotin (donji panel, tamno bojenje) redom. Kolagen tip II koji vezuje peptidoglikan [WYRGRLGC; "mAG(ll)C"] je difuzno rasprostranjen kroz eksplant. Jače uvećanje (20X) ovog tkivnog preseka prikazuje da mAG(ll)C prodire približno 200 nm u tkivo. SLIKA 16 pokazuje Avidin-Biotin bojenja eksplanata hrskavice. Peptidoglikani (mAG(ll)C i mAGC) se difuzno prostiru kroz eksplant hrskavice. Slike prikazuju dubinu prodiranja svakog (tamno bojenje). SLIKA 17 pokazuje da dodavanje peptidoglikana eksplantima koji su osiromašeni agrekanom (AO) povećava krutost na pritisak. Dodavanjem peptidoglikana koji vezuje HK (mAGC) značajno se obnavlja krutost eksplanata hrskavice u većoj meri u poređenju sa kolagen tip II vezujućim peptidoglikanom (mAG(ll)C). Značajnost, označena kao *, navedena je za povećanje u krutosti na pritisak između AD i AD+mACG povećanih eksplanata (p<0.005). Podaci se prezentuju kao srednja vrednost -+SEM (n=5). SLIKA 18 (A) pokazuje šematski prikaz probe vezane za MMP-13. BHO.-3 crna rupa gasilac 3 i CY5.5 apsorbuju i emituju na 695 nm redom. Strele i italici pokazuju mesta isecanja. (B) pokazuje koncentracioni profil proba ili aktivnosti proba sa ili bez MMP-13: Levo, sekcije fluorescentnog snimanja mikroploče sa 96 bunarića; Desno, oporavak fluorescencije emisionog intenziteta (695 nm). SLIKA 19 pokazuje opseg inflamacije pomoću MMP-13 probe u Sprague-Dawley pacovima koji se tretiraju sa ili bez peptidoglikana na četiri, šest i osam nedelja posle operacije. SLIKA 20 pokazuje slike x-zračenja zglobova kolena Sprague-Davvlev pacova sa prikazom povređenog kolena nakon 6 nedelja i 8 nedelja prateći stvaranje OA (Paneli A i D, redom), povređeno koleno sa tretmanom peptidoglikana (Paneli B i E, redom), i normalno koleno (Panel C) šest nedelja nakon operacije koja indukuje osteoartritis. SLIKA 21 pokazuje mikroCT Sprague-Davvlev pacova što pokazuje ponovni rast nove hrskavice šest i osam nedelja nakon operacije koja indukuje OA. Povređena kolena 6 nedelja i 8 nedelja prateći OA indukciju se prikazuju Panelima A i D, redom. Povređena kolena sa peptidoglikanskim tretmanom prikazana su u Panelima B i E, redom. Normalno koleno se prikazuje u panelu C. SLIKA 22 pokazuje da dodavanje mAGC skelama kolagena povećava modul skladištenja i čvrstoću na pritisak. Oscilovanje frekvencije (A) preko skela kolagena indukuje povećanje u modulima skladištenja u opsegu od 0.1-2.0 Hz. Slično, krutost na pritisak (B) pokazuje povećanje u vrednostima kada se skela priprema sa dodavanjem mAGC. Značajnost je označena kao * (p<0,0001). Podaci se prikazuju kao srednja vrednost -+ SEM (n=5). SLIKA 23 pokazuje ukupni gubitak hondroitin sulfata (HS) tokom osmodnevnog perioda kultivacije u medijumu koji se stimuliše sa i bez IL-lB. Gubitak HS se meri DMMB testom. Kompozicije skela (A-H) se opisuju u Tabeli 3. Dodavanje mAGC ima značajan efekat na gubitak HS iz skela (p<0,001).<*>označava statističku značajnost između skele A i C, i skele E i G. (p<0,05). Stubovi prestavljaju prošek -+SEM (n=3). SLIKA 24 pokazuje ukupno razaranje kolagena tokom osmodnevnog perioda kultivacije u medijumu koji se stimuliše sa i bez IL-lB. Razaranje kolagena se meri Sircol testom. Kompozicije skela (A-H) se opisuju u Tabeli 3. Dodavanje imitatora agrekana ima značajni efekat na gubitak kolagena iz skela (p<0,02). * označava statističku značajnost između skele A i C, i skele E i G. (p<0,05). Stubovi predstavljaju prošek - +SEM (n=3). SLIKA 25 pokazuje PCR analizu u realnom vremenu za agrekan i kolagen tip II eksprimiranim u goveđim hondrocitima koji se kultivišu u neporavnanim (A) i poravnanim (B) skelama kolagena. Vrednosti se normalizuju prema endogenoj GAPDH ekspresiji. Dodavanjem mAGC statistički menja ekspresiju agrekana i kolagena tipa II (pagrekan<0,02 i pkoiagen<0,001) redom. Utvrđena je i statistička razlika u ekspresiji agrekana i kolagena tipa II između neporavnanih i poravnanih skela (p<0,001). Slično, ekspresija agrekana i kolagena tipa II se razlikuje između skela tretiranim sa ili bez IL-lB (p<0,01). Kompozicije skela (A-H) se opisuju u Tabeli 3. Stubovi prikazuju prošek -+SEM (n=4).
DETAUNI OPIS PRIMERA IZVOĐENJA
[0009]Kako se ovde koristi, "sintetički peptidoglikan koji vezuje hijaluronsku kiselinu" označava sintetički peptid koji je konjugovan sa glikanom u kome peptid sadrži sekvencu koja vezuje hijaluronsku kiselinu.
[0010]Različita izvođenja pronalaska se ovde opisuju na sledeći način. U jednom izvođenju koje se ovde opisuje, obezbeđuje se sintetički peptidoglikan koji vezuje hijaluronsku kiselinu. Sintetički peptidoglikan koji vezuje hijaluronsku kiselinu sadrži sintetički peptid koji je konjugovan sa glikanom u kome sintetički peptid obuhvata sekvencu koja vezuje hijaluronsku kiselinu.
[0011]U drugom izvođenju, jedinjenje formule PnG„ se opisuje u kome je n od 1 do 20; u kome je x od 1 do 20; u kome je P sintetički peptid od oko 5 do oko 40 aminokiselina i sadrži sekvencu koja vezuje hijaluronsku kiselinu i u kome je G glikan.
[0012]U još jednom načinu izvođenja, opisuje se jedinjenje formule (P„L)XG
u kome je n od 1 do 20;
u kome je x od 1 do 20;
u kome je P sintetički peptid od oko 5 do 40 aminokiselina i obuhvata sekvencu koja vezuje hijaluronsku kiselinu;
u kome je L linker; i u kome je G glikan.
[0013]U drugom načinu izvođenja, opisuje se jedinjenje formule P(LGn)x
u kome je n od 1 do 20;
u kome je x od 1 do 20;
u kome je P sintetički peptid od oko 5 do 40 aminokiselina i obuhvata sekvencu koja vezuje hijaluronsku kiselinu;
u kome je L linker; i u kome je G glikan.
[0014]U još jednom načinu izvođenja, opisuje se jedinjenje formule PnG,
u kome n je MWG/1000;
u kome MWG je molekulska težina od G zaokružena blizu 1 kDa;
u kome x je od 1 do 20;
u kome P je sintetički peptid od oko 5 do 40 aminokiselina i obuhvata sekvencu koja vezuje hijaluronsku kiselinu; i
u kome G je glikan.
[0015]U drugom načinu izvođenja, opisuje se jedinjenje formule (PnL)xG
u kome n je MVVG/1000;
u kome MWG je molekulska masa od G zaokružena blizu 1 kDa;
u kome x je od 1 do 20;
u kome P je sintetički peptid od oko 5 do 40 aminokiselina i obuhvata sekvencu koja vezuje hijaluronsku kiselinu;
u kome L je linker; i
u kome G je glikan.
[0016]Za svrhu ovog opisa, sintetički peptidoglikani koji vezuju hijaluronsku kiselinu i jedinjenja koja su opisana u prethodnim paragrafima se kolektivno zovu "sintetički peptidoglikani koji vezuju hijaluronsku kiselinu" ili "sintetički peptidoglikani."
[0017]U svakom od gornjih izvođenja peptida, sintetički peptidoglikan sadrži 5-15 molekula peptida (n je 5-15), 5-20 molekula peptida (n je 5-20), 1-20 molekula peptida (n je 1-20), ili 1-25 molekula peptida (n je 1-25). U jednom izvođenju, n se bira iz grupe koja se sastoji iz 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14,15,16,17,18,19, 20, 21, 22, 23, 24, i 25 molekula peptida.
[0018]U drugom primeru izvođenja koje se ovde opisuje, obezbeđuje se projektovani matriks kolagena. Matriks se sastoji iz polimerizovanog kolagena, hijaluronske kiseline, i sintetičkog peptidoglikana koji vezuje hijaluronsku kiselinu. U drugom izvođenju, kompozicija zain vitrokulturu hondrocita ili matičnih stem ćelija se obezbeđuje. Kompozicija obuhvata bilo koje od sintetičkih peptidoglikana koji vezuju hijaluronsku kiselinu koji se opisuju u ovom načinu izvođenja.
[0019]U drugom izvođenju koje se ovde opisuje, postupak kojim se povećava veličina pore u projektovanom matriksu kolagena se obezbeđuje. Postupak obuhvata korake kombinovanja kolagena, hijaluronske kiseline, i sintetičkih peptidoglikana koji vezuju hijaluronsku kiselinu i povećanje veličine pore u matriksu.
[0020]U jednom drugom primeru izvođenja, postupak za smanjenje oštećenja ili erozije hrskavice kod pacijenata je obezbeđen. Sintetički peptidoglikan koji vezuje hijaluronsku kiselinu se koristi u postupku smanjenja oštećenja ili erozije hrskavice. U jednom izvođenju, erozija hrskavice ili oštećenje se uzrokuje artritisom. U jednom izvođenju, erozija hrskavice ili oštećenje nastaju starenjem, gojaznošću, traumom ili povredom, anatomskom anomalijom, genetskim bolestima, metaboličkim neravnotežama, inflamacijom ili slično.
[0021]U drugom primeru izvođenja, sintetički peptidoglikan koji vezuje hijaluronsku kiselinu se koristi u lečenju artritisa kod pacijenta. Sintetički peptidoglikan koji vezuje hijaluronsku kiselinu se koristi u postupku, u kome sintetički peptidoglikan smanjuje simptome koji su udruženi sa artritisom.
[0022]U drugom primeru izvođenja, postupak za smanjenje ili sprečavanje degradacije hijaluronske kiseline kod pacijenata se obezbeđuje. Postupak obuhvata davanje sintetičkog peptidoglikana koji vezuje hijaluronsku kiselinu pacijentu.
[0023]U drugom primeru izvođenja, postupak za smanjenje ili sprečavanje degradacije kolagena se obezbeđuje. Metod obuhvata korake kontakta sintetičkog peptidoglikana koji vezuje hijaluronsku kiselinu sa hijaluronskom kiselinom u prisustvu kolagena, i redukovanja ili sprečavanja degradacije kolagena.
[0024]U jednom drugom primeru izvođenja, postupak za ispravljanje ili modifikovanje defekta tkiva kod pacijenta se dobija. Postupak obuhvata davanje defektnom tkivu sintetičkog peptidoglikana koji vezuje hijaluronsku kiselinu gde se defekt ispravlja ili modifikuje. U jednom drugom primeru izvođenja, koji se ovde opisuje, dobija se dermalni punilac. Punilac se sastoji iz sintetičkog peptidoglikana koji vezuje hijaluronsku kiselinu. U jednom izvođenju, punilac dodatno obuhvata i hijaluronsku kiselinu.
[0025]U jednom drugom izvođenju, aditiv za biomaterijal kompozicije koja zamenjuje hrskavicu ili kost se dobija. Aditiv obuhvata sintetički peptidoglikan koji se vezuje za hijaluronsku kiselinu za dodavanje postojećim biomaterijalu koji zamenjuje hrskavicu ili kost.
[0026]U različitim izvođenjima, komponenta peptida sintetičkog peptidoglikana obuhvata sekvencu aminokiselina formule B1-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-B2,
u kojoj X8 je prisutan ili nije prisutan,
u kojoj Bije bazna aminokiselina,
u kojoj B2 je bazna aminokiselina, i
u kojoj Xl-X8 su ne-kisele aminokiseline.
[0027]U jednom drugom izvođenju komponenta peptida sintetičkog peptidoglikana obuhvata ili može da bude sekvenca aminokiseline formule B1-X1-B2-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-B3,
u kojoj X9 je prisutan ili nije prisutan,
u kojoj Bije bazna aminokiselina,
u kojoj B2 je bazna aminokiselina,
u kojoj B3 je bazna aminokiselina, i
u kojoj Xl-X9 su ne-kisele aminokiseline.
[0028]U jednom drugom izvođenju, sintetički peptid može da obuhvati ili može da bude sekvenca aminokiseline formule B1-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-B2-X9-B3,
u kojoj X8 je prisutan ili nije prisutan,
u kojoj Bije bazna aminokiselina,
u kojoj B2 je bazna aminokiselina, i
u kojoj B3 je bazna aminokiselina, i
u kojoj Xl-X9 su ne-kisele aminokiseline.
[0029]Kako se ovde koristi, "bazna aminokiselina" se bira iz grupe koja se sastoji iz lizina, arginina, ili histidina. Kako se ovde koristi, "ne-kisela aminokiselina" se bira iz grupe koja se sastoji iz alanina, arginina, aspragina, cisteina, glutamina, glicina, histidina, izoleucina, leucina, lizina, metionina, fenilanalina, prolina, serina, treonina, triptofana, tirozina i valina.
[0030]U različitim ilustrativnim izvođenjima koji su opisani ovde, komponenta peptida sintetičkog peptidoglikana može da obuhvati sekvencu aminokiselina koja se bira iz grupe koja se sastoji iz: U svakom od gornjih peptidnih izvođenja, peptid može da ima glicin-cistein vezan za C-kraj peptida. i/ili glicin-cistein-glicin (GCG) vezan za N-kraj peptida. U različitim izvođenjima, koja su ovde opisana, komponenta peptida sintetičkog peptidoglikana obuhvata bilo koju sekvencu aminokiseline koja se ovde opisuje u prethodnom paragrafu ili sekvencu aminokiseline sa 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, ili 100% homologije prema bilo kojoj od ovih sekvenci aminokiselina.
[0031]Dodatni peptidi koji mogu da budu uključeni kao peptidne komponente sintetičkih peptidoglikana koji vezuju hijaluronsku kiselinu obuhvataju peptide koji su opisani u Amemiva et al., Biochem. Biophvs. Acta, vol. 1724, pp. 94-99 (2005). Ovi peptidi imaju Arg-Arg motiv i obuhvataju peptide koji su odabrani iz grupe koja se sastoji iz: U svakom od gore navedenih peptidnih izvođenja, peptid može da ima glicin-cistein vezan za C-kraj peptida. U svakom od gore navedenih peptidnih izvođenja, peptid može da ima glicin-cistein-glicin (GCG) vezan za N-kraj peptida. U različitim izvođenjima koja su ovde opisana, komponenta peptida sintetičkog peptidoglikana obuhvata bilo koju sekvencu aminokiselina koja se ovde opisuje u prethodnom paragrafu ili sekvencu aminokiselina sa 80%, 85%, 90%, 95%, 98% ili 100% homologije prema bilo kojoj od ovih sekvenci aminokiselina.
[0032]U drugim izvođenjima, peptidi koji su opisani u Yang et al., EMBO Journal, vol. 13, pp. 286-296
(1994), i Goetinck et al., J. Cell. Biol., vol. 105, pp. 2403-2408 (1987), mogu da se koriste u sintetičkim peptidoglikanima koji vezuju hijaluronsku kiselinu kao što se ovde opisuje uključujući peptide koji se biraju iz grupe koja se sastoji iz RDGTRYVQKGEYR, HREARSGKYK, PDKKHKLYGV, i WDKERSRYDV. U svakom od ovih izvođenja peptid može da ima glicin-cistein koji je vezan za C-kraj peptida. U svakom od ovih izvođenja, peptid može da ima glicin-cistein-glicin (GCG) koji je vezan za N-kraj peptida. U drugim izvođenjima, komponenta peptida sintetičkog peptidoglikana koji vezuje hijaluronsku kiselinu obuhvata sekvencu aminokiselina sa 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, ili 100% homologije prema bilo kojoj od ovih sekvenci aminokiselina.
[0033]U različitim izvođenjima, komponenta peptida sintetičkog peptidoglikana kao što je ovde opisano se može modifikovati uključivanjem jedne ili više konzervativnih aminokiselinskih supstitucija. Kao što je dobro poznato stručnjacima u stanju tehnike, menjanje bilo koje nekritične aminokiseline peptida konzervativnom supstitucijom neće značajno da promeni aktivnost tog peptida zbog toga što bočni lanac aminokiseline koja je zamena treba da obrazuje slične veze i kontakte kao bočni lanac aminokiseline koja je zamenjena. Ne-konzervativne supstitucije su moguće pod uslovom da ne utiču preterano na aktivnost peptida u vezivanju hijaluronske kiseline.
[0034]Kao što je dobro poznato u stanju tehnike "konzervativna supstitucija" aminokiseline ili "varijanta konzervativna supstitucija " peptida se odnosi na supstituciju amino kiseline koja održava: 1) sekundarnu strukturu peptida 2) naelektrisanje ili hidrofobnost amino kiseline; i 3) masivnost bočnog lanca ili jednu ili više ovih karakteristika. Kao ilustracija, dobro poznate terminologije "hidrofilni ostaci" se odnose na serin ili treonin. "Hidrofobni ostaci" se odnose na leucin, izoleucin, fenilalanin, valin ili alanin ili slično. "Pozitivno naelektrisani ostaci" se odnose na lizin, arginin, omitin, ili histidin. "Negativno naelektrisani ostaci" se odnose na asparaginsku kiselinu ili glutaminsku kiselinu. Ostaci koji imaju "masivne bočne lance" se odnose na fenilalanin, triptofan ili tirozin ili slične. Spisak ilustrativnih konzervativnih supstitucija aminokiselina se prikazuje u TABELI 1.
[0035]U jednom izvođenju, konzervativne supstitucije aminokiselina se primenjuju na molekule koji se ovde opisuju bez promena u motivima koji se sastoje iz B1-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-B2 formule, B1-X1-B2-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-B3 formule, B1-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-B2-X9-B3 formule, ili Arg-Arg motiva.
[0036]U različitim izvođenjima koja se ovde opisuju, glikan (npr. glikozaminoglikan, skraćeno GAG, ili polisaharid) komponenta sintetičkog peptidoglikana koji se ovde opisuje može da se odabere iz grupe koja se sastoji od dekstrana, hondroitina, hondroitin sulfata, dermatana, dermatan sulfata, heparana, heparina, keratana, keratan sulfata, i hijaluronske kiseline. U jednom izvođenju, glikan je odabran iz grupe koja obuhvata hondroitin sulfat i keratan sulfat. U drugom primeru izvođenja, glikan je hondroitin sulfat.
[0037]U jednom izvođenju koje se ovde opisuje, sintetički peptidoglikan koji vezuje hijaluronsku kiselinu obuhvata (GAHWQFNALTVRGG)10konjugovanu sa hondroitin sulfatom u kome je svaki peptid peptidoglikanskog molekula odvojeno vezan za hondroitin sulfat. U drugom izvođenju koje se ovde opisuje, sintetički peptidoglikan koji vezuje hijaluronsku kiselinu obuhvata (GAHWQFNALTVRGGGC)11konjugovanu sa hondroitin sulfatom u kome je svaki peptid u peptidoglikanskom molekulu odvojeno vezan sa hondroitin sulfatom. U svakom od gornjih izvođenja, broj peptida može da se odabere iz grupe koja se sastoji od 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, i 25 peptidnih molekula.
[0038]U različitim izvođenjima koja se ovde opisuju, sintetički peptidoglikan je otporan na agrekanazu. Agekanaza se u oblasti tehnike opisuje kao enzim koji iseca agrekan.
[0039]U jednom primeru izvođenja, sintetički peptidoglikan koji vezuje hijaluronsku kiselinu može da bude sterilizovan. Kao što je ovde opisano "sterilizacija" ili "sterilisati" ili "sterilizovano" označava dezinfekciju sintetičkih peptidoglikana koji vezuju hijaluronsku kiselinu uklanjanjem nepoželjnih kontaminanata uključujući, ali ne ograničeno na, endotoksine i infektivne agense.
[0040]U različitim primerima izvođenja, sintetički peptidoglikan koji vezuje hijaluronsku kiselinu se može dezinfektovati i/ili sterilisati upotrebom konvencionalnih tehnika sterilizacije uključujući tretiranje propilen oksidom ili etilen oksidom, sterilizaciju gas plazmom, gama radijacijom (npr. l-4Mrada gama zračenja ili 2.5Mrada gama zračenja), elektronskim snopom, i/ili sterilizaciju peracidom, kao što je persirćetna kiselina. Tehnike sterilizacije koje nemaju nepovoljan uticaj na strukturu i biotropna svojstva sintetičkih peptidoglikana koji vezuju hijaluronsku kiselinu se koriste. U jednom izvođenju, sintetički peptidoglikan koji vezuje hijaluronsku kiselinu se izlaže jednom ili više procesu sterilizacije. U drugom primeru izvođenja, sintetički peptidoglikan koji vezuje hijaluronsku kiselinu se izlaže sterilnoj filtraciji. Sintetički peptidoglikan koji vezuje hijaluronsku kiselinu može da bude obmotan i da se čuva u bilo kojoj vrsti kontejnera uključujući plastični omot ili omot od folije, i ostaje i dalje sterilan. Sterilni peptidoglikan koji vezuje hijaluronsku kiselinu se priprema pod sterilnim uslovima, na primer, liofilizacijom, koja se lako postiže korišćenjem standardnih postupaka koji su dobro poznati stručnjacima u oblasti tehnike.
[0041]U različitim izvođenjima koja se ovde opisuju, sintetički peptidoglikani koji vezuju hijaluronsku kiselinu se kombinuju sa mineralima, aminokiselinama, šećerima, peptidima, proteinima, vitaminima (kao što je askorbinska kiselina), ili lamininom, kolagenom, fibronektinom, hijaluronskom kiselinom, fibrinom, elastinom, ili agrekanom, ili faktorima rasta kao što je epidermalni faktor rasta, faktor rasta poreklom iz trombocita, transformišući faktor rasta beta, ili faktor rasta fibroblasta, i glukokortikoidima kao što je deksametazon ili agensima koji menjanju viskoelastičnost, poput jonskih i ne-jonskih polimera rastvorljivih u vodi; hidrofilnih polimera kao što su oksidi polietilena, polioksietilen-polioksipropilen kopolimeri, i polivinilalkohol; celuloznim polimerima i derivatima celulozniih polimera kao što su hidroksipropilceluloza, hidroksietil celuloza, hidroksipropil metilceluloza, hidroksipropil metilceluloza ftalat, metil celuloza, karboksimetil celuloza, i eterifikovana celuloza; poli(mlečna kiselina), poli(glikolna kiselina), kopolimeri mlečnih i glikolnih kiselina, ili drugi polimerni agensi i prirodni i sintetički.
[0042]U različitim izvođenjima koja se ovde opisuju, peptidna komponenta sintetičkog peptidoglikana se sintetiše prema protokolima za sintezu peptida čvrste faze koji su poznati stručnjacima u oblasti. U jednom izvođenju, peptidni perkursor se sintetiše na čvrstoj podlozi prema poznatom Fmoc protokolu, iseca se sa podloge trifluorosirćetnom kiselinom i prečišćava hromatografijom prema postupcima koji su poznati stručnjacima u oblasti.
[0043]U različitim izvođenjima koja se ovde opisuju, peptidna komponenta sintetičkog peptidoglikana se sintetiše korišćenjem metoda biotehnologije koje su dobro poznate stručnjacima u oblasti. U jednom izvođenju, DNK sekvenca koja kodira informaciju aminokiselinske sekvence željenog peptida je vezana tehnikama rekombinantne DNK poznate stručnjacima u oblasti za ekspresioni plazmid (na primer, plazmid koji uključuje obeleživač afiniteta za afinitetno prečišćavanje peptida), plazmid se transfektira u organizam domaćina radi ekspresije, i peptid se zatim izoluje iz organizma domaćina ili medijuma za rast prema metodama koje su poznate stručnjacima u oblasti (npr. putem afinitetnog prečišćavanja). Metode rekombinantne DNK tehnologije se opisuju u Sambrook et al., "MolecularCIoning: A Laboratorv Manual", 3rd Edition, Cold Spring Harbor Laboratorv Press, (2001), i dobro su poznate stručnjacima u oblasti.
[0044]U različitim izvođenjima koja se ovde opisuju, peptidna komponenta sintetičkog peptidoglikana koji vezuje hijaluronsku kiselinu je konjugovana sa glikanom reakcijom slobodne aminokiselinske grupe peptida sa aldehidnom funkcionalnom grupom glikana u prisustvu redukujćeg agensa, korišćenjem metoda poznatih stučnjacima u oblasti, da se dobije konjugat peptidnog glikana. U jednom izvođenju aldehidna funkcija glikana (npr. polisaharid ili glikozaminoglikan) se obrazuje reakcijom glikana sa natrijum perjodatom prema metodama koje su poznate stručnjacima u oblasti.
[0045]U jednom izvođenju, peptidna komponenta sintetičkog peptidoglikana je konjugovana za glikan reakcijom aldehidne funkcionalne grupe glikana sa 3-(2-piridilditio)propionil hidrazidom (PDPH) radi obrazovanja intermerijera glikana i daljeg reagovanja intermedijernog glikana sa peptidom koji ima slobodnu tiolnu grupu da se dobije konjugat peptidnog glikana. U drugom izvođenju, sekvenca peptidne komponente sintetičkog peptidoglikana se modifikuje tako da uključi glicin-cistein segment koji obezbeđuje tačku vezivanja za glikan ili glikan-vezani konjugat. U bilo kojim izvođenjima koja se ovde opisuju, umreživač može da bude /V-[B-maleimidopropionska kiselinajhidrazid (BMPH).
[0046]lako se specifična izvođenja opisuju u prethodnim paragrafima, sintetički peptidoglikani koji vezuju hijaluronsku kiselinu koji se ovde opisuju se mogu napraviti korišćenjem bilo kog postupka poznatog u tehnici za konjugaciju peptida sa glikanom (npr. polisaharid ili glikozaminoglikan). Ovo uključuje kovalentno, jonsko, ili vezivanje vodonika, ili direktno ili indirektno preko vezne gupe kao što je divalentni linker. Konjugat se obično obrazuje kovalentnim vezivanjem peptida za glikan obrazovanjem amidnih, estarskih, ili imino veza između kiseline, aldehida, hidroksi, amino, ili hidrazo grupa na odgovarajućim komponentama konjugata. Svaki od ovih postupaka su poznati u tehnici ili su dodatno opisani u Examples section of this application or in Hermanson G.T., Bioconjugate Techniques,Academic Press, pp.169-186 (1996). Linker se uobičajeno sastoji od približno 1 do 30 ugljenikovih atoma, uobičajeno od približno 2 do približno 20 ugljenikovih atoma. Niža molekulska masa linkera (tj. onih sa približnom molekulskom masom od približno 20 do približno 500) se uglavnom koristi.
[0047] Dodatno, strukturne modifikacije u poziciji linkera konjugata se ovde razmatraju. Na primer, aminokiseline mogu da budu uključene u linker i broj aminokiselinskih supstitucija mogu da budu u linkerskoj porciji konjugata, uključujući ali ne ograničeno na aminokiseline koje se prirodno nalaze, kao i na one koje su dostupne iz konvencionalnih postupaka sinteze. U drugom aspektu, beta, gama i duži lanci aminokiselina se mogu koristiti umesto jedne ili više alfa aminokiselina. U drugom aspektu, linker može da bude skraćen ili produžen, bilo promenom broja aminokiselina koje ga obrazuju ili uključujući više ili manje beta, gama, ili aminokiselina dužih lanaca. Slično, dužina i oblik drugih hemijskih fragmenata linkera koji se ovde opisuju se mogu modifikovati.
[0048] U različitim izvođenjima koja se ovde opisuju, linker može da uključi jedan ili više bivalentnih fragmenata odabranih nezavisno u svakom slučaju iz grupe koja se sastoji iz alkilena, heteroalkilena, cikloalkilena, cikloheteroalkilena, arilena, i heteroarilena, od kojih je svaki po potrebi supstituisan. Kako se ovde koristi heteroalkilen predstavlja grupu koja je rezultat zamene jednog ili više atoma ugljenika linearnim ili razgranatim alkilenskim grupama sa atomom koji se nezavisno bira u svakom primeru iz grupe koja obuhvata kiseonik, azot, fosfor, i sumpor. U alternativnom izvođenju, linker nije prisutan.
[0049] U jednom izvođenju koje se ovde opisuje, dobija se projektovani matriks kolagena. Prethodno opisana izvođenja sintetičkih peptidoglikana koji vezuju hijaluronsku kiselinu se primenjuju za projektovani matriks kolagena koji se ovde opisuje. U jednom izvođenju, projektovani matriks kolagena se sastoji iz polimerizovanog kolagena, hijaluronske kiseline, i sintetičkih peptidoglikana koji vezuju hijaluronsku kiselinu. U jednom izvođenju, projektovani matriks kolagena se sastoji iz polimerizovanog kolagena i sintetičkih peptidoglikana koji vezuju hijaluronsku kiselinu. U različitim primerima izvođenja, agensi koji umrežavaju, kao što su karbodiimidi, aldehidi, lizil-oksidaza, N-hidroksisukcinimid estri, imidoestro, hidrazidi, i maleimidi, kao i različiti prirodni agensi koji umrežavaju, uključujući genipin, i slično, mogu da se dodaju pre, tokom, i posle polimerizacije kolagena u rastvoru.
[0050] U različitim primerima izvođenja, kolagen koji se ovde koristi za pripremu projektovanog matriksa kolagena može da bude bilo koji tip kolagena, uključujući tipove kolagena od I do XXVIII, samostalno ili u kombinaciji, na primer, mogu se koristiti tipovi kolagena I, II, III, i/ili IV. U nekim izvođenjima, kolagen koji se koristi za pripremu projektovanog matriksa kolagena je selektovan iz grupe koja se sastoji iz tipa I kolagena, kolagena tipa II, kolagena tipa III, kolagena tipa IV, kolagena tipa IX, kolagena tipa XI, i njihovih kombinacija. U jednom izvođenju, projektovani matriks kolagena se obrazuje korišćenjem komercijalno dostupnog kolagena (npr., Sigma, St. Louis, MO). U alternativnom izvođenju, kolagen može da se izoluje iz tkivnog materijala koji sadrži submukozu kao što su creva, mokraćna bešika, ili tkivo stomaka. U daljem izvođenju, kolagen može da se prečisti od kraja tetive. U dodatnom izvođenju, kolagen može da se izoluje iz kože. U različitim aspektima, kolagen može da dodatno sadrži unutrašnje i spoljašnje ne-kolagene proteine uz sintetičke peptidoglikane koji vezuju hijaluronsku kiselinu, kao što je fibronektin ili proteini svile, glikoproteini, i polisaharidi, ili slično. Projektovani matriks kolagena koji se pravi postupcima koji se ovde opisuju može da bude u obliku grafta tkiva (npr. u oblku gela) i koji može da primi karakteristične funkcije tkiva sa kojima se udružuje na mestu implantacije ili injekcije. U jednom izvođenju, projektovani matriks kolagena je tkivni graft koji može da se implantira u pacijenta. U drugom izvođenju, projektovani matriks kolagena se daje injekcijom pacijentu. U svakom izvođenju matriks može da bude u obliku gela ili praha , na primer.
[0051]U jednom izvođenju, kolagen u projektovanom matriksu kolagena obuhvata približno oko 40 do 90 % suve težine matriksa, približno oko 40 do 80 % suve mase matriksa, približno oko 40 do 70 % suve mase matriksa, približno oko 40 do 60 % suve mase matriksa, približno oko 50 do 90 % suve mase matriksa, približno oko 50 do 80 % suve mase matriksa, približno oko 50 do 75 % suve mase matriksa, približno 50 do 70 % suve mase matriksa ili približno oko 60 do 75 % suve mase matriksa. U drugom izvođenju, kolagen u projektovanom matriksu kolagena obuhvata približno oko 90 % suve mase, oko 50 % suve mase, oko 45 % suve mase, oko 40 % suve mase, ili oko 30 % suve mase matriksa.
[0052]U jednom izvođenju finalna koncentracija kolagena u matriksu u obliku gela je 0,5 do približno 6 mg po mL, približno 0,5 do približno 5 mg po mL, približno 0,5 do približno 4 mg po mL, približno 1 do približno 6 mg po mL, približno 1 do približno 5 mg po mL, ili približno 1 do približno 4 mg po mL. U jednom izvođenju, finalna koncentracija kolagena u matriksu je približno 0,5 mg po mL, približno 1 mg po mL, približno 2 mg po mL, približno 3 mg po mL, približno 4 mg po mL, ili približno 5 mg po mL.
[0053]U jednom izvođenju sintetički peptidoglikan koji vezuje hijaluronsku kiselinu u projektovanom matriksu kolagena obuhvata približno 2 do približno 60 % suve mase matriksa, približno 2 do približno 50 % suve mase matriksa, približno 5 do približno 50 % suve mase matriksa, približno 10 do približno 50 % suve mase matriksa, približno 10 do približno 20 % suve mase matriksa,približno 10 do približno 30 % suve mase matriksa, približno 10 do približno 25 % suve mase matriksa, približno 15 do približno 30 % suve mase matriksa, ili približno 15 do približno 45 % suve mase matriksa. U drugom izvođenju, sintetički peptidoglikani koji vezuju hijalurnosku kiselinu u projektovanom matriksu kolagena obuhvataju približno 2% suve mase, približno 5 % suve mase, približno 10% suve mase, približno 15 % suve mase, približno 20 % suve mase, približno 25 % suve mase, približno 30 % suve mase, približno 35 % suve mase, približno 40 % suve mase, približno 45% suve mase, ili približno 50 % suve mase matriksa.
[0054]U drugom izvođenju, projektovani matriks kolagena obuhvata hijaluronsku kiselinu u projektovanom matriksu kolagena i predstavlja približno 2 do približno 60 % suve mase matriksa, približno 2 do približno 50 % suve mase matriksa, približno 5 do približno 50 % suve mase matriksa, približno 10 do približno 50 % suve mase matriksa, približno 10 do približno 20 % suve mase matriksa, približno 10 do približno 30 % suve mase matriksa, približno 10 do približno 25 % suve mase matriksa, približno 15 do približno 30 % suve mase matriksa, ili približno 15 do približno 45 % suve mase matiksa. U drugom izvođenju hijaluronska kiselina u projektovanom matriksu kolagena obuhvata približno 2 % suve mase, približno 5 % suve mase, približno 10 % suve mase, približno 15 % suve mase, približno 20 % suve mase, približno 25 % suve mase, približno 30 % suve mase, približno 35 % suve mase, približno 40 % suve mase, približno 45 % suve mase, ili približno 50% suve mase matriksa.
[0055]U jednom izvođenju, projektovani matriks kolagena obuhvata hijaluronsku kiselinu i sintetičke peptidoglikane koji vezuju hijaluronsku kiselinu. Hijaluronska kiselina i sintetički peptidoglikani koji vezuju hijaluronsku kiselinu u projektovanom matriksu kolagena obuhvataju približno 10 do približno 60 % suve mase matriksa, približno 20 do približno 60 % suve mase matriksa, približno 30 do približno 60 % suve mase matriksa, približno 40 do približno 60 % suve mase matriksa, približno 10 do približno 50% suve mase matriksa, približno 20 do približno 50 % suve mase matriksa, približno 25 do približno 50 % suve mase matriksa, približno 30 do približno 50 % suve mase matriksa, ili približno 25 do približno 40 % suve mase matriksa. U drugom izvođenju, hijaluronska kiselina i sintetički peptidoglikani koji vezuju hijaluronsku kiselinu u projektovanom matriksu kolagena obuhvata približno 10 % suve mase, približno 15 % suve mase, približno 20 % suve mase, približno 25 % suve mase, približno 30 % suve mase, približno 35 % suve mase, približno 40 % suve mase, približno 50 % suve mase, približno 55 % suve mase, približno
60 % suve mase, ili približno 70 % suve mase matriksa.
[0056]U jednom primeru izvođenja, projektovani matriks kolagena može da bude strerilizovan. Kako se ovde koristi "sterilizacija" ili "sterilisati" ili "sterilisan" označava dezinfekciju matriksa uklanjanjem nepoželjnih kontaminanata uključujući, ali ne ograničeno na, endotoksine, kontaminante nukleinskih kiselina, i infektivnih agenasa.
[0057]U različitim primerima izvođenja, projektovani matriks kolagena može da se dezinfikuje i/ili steriliše korišćenjem konvencionalnih tehnika sterilizacije koje uključuju tretiranje glutaraldehidom, tretiranje formaldehidom na kiselom pH, tretiranje propilen oksidom ili tretman etilen oksidom, sterilizacija gasnom plazmom, gama radijacijom (npr., 1-4 Mrada gama zračenja ili 1-2.5 Mrada gama zračenja), elektronskim snopom, i/ili sterilizacija peracidom, kao što je persirćetna kiselina. Tehnike sterilizacije koje ne utiču negativno na strukturu i biotropična svojstva matriksa se mogu koristiti. U jednom izvođenju, projektovani matriks kolagena se izlaže jednom ili više procesu sterilizacije. U primerima izvođenja, kolagen u rastvoru, pre polimerizacije takođe se steriliše ili dezinfikuje. Projektovani matriks kolagena se može obmotati bilo kojim tipom zaštite, uključujući plastični kontejner ili foliju i može dalje da bude sterilna.
[0058]U svakom od ovih izvođenja projektovani matriks kolagena dodatno sadrži spoljašnju populaciju ćelija. Dodatna populacija ćelija da sadrži jednu ili više populacija ćelija. U različitim izvođenjima, populacija ćelija obuhvata populaciju ne-keratinizovanih ili keratinizovanih epitelijalnih ćelija ili populaciju ćelija koja se odabira iz grupe koju čine endotelijalne ćelije, ćelije poreklom od mezoderma, mezotelne ćelije, sinoviciti, neuralne ćelije, glijalne ćelije, osteoblasti, fibroblasti, hondrociti, tenociti, glatke mišićne ćelije, skeletne mišićne ćelije, srčane mišićne ćelije, multi-potentne progenitorske ćelije (npr., matične stem ćelije, uključujući ćelije progenitore kosne srži), i osteogene ćelije. U nekim izvođenjima, matične stem ćelije su odabrane iz gupe koja se sastoji od hondrocita i matičnih stem ćelija. U nekim izvođenjima, matične stem ćelije su odabrane iz grupe koja sadrži osteoblaste, osteogene ćelije, i mezenhimalne matične stem ćelije. U različitim izvođenjima, projektovani matriks kolagena se zaseje jednim ili većim brojem tipova ćelija u kombinaciji.
[0059]U različitim aspektima, projektovani matriksi kolagena ili projektovani konstrukti grafta, predmetnog pronalaska se kombinuju sa hranljivim materijama, uključujući minerale, aminokiseline, šećere, peptide, proteine, vitamine (kao što je askorbinska kiselina), ili lamininom, fibronektinom, hijaluronskom kiselinom, fibrinom, elastinom ili agrekanom, ili faktorima rasta kao što su epidermalni faktor rasta, faktor rasta poreklom od trombocita, transformišući faktor rasta beta, ili faktor rasta fibroblasta i glukokoritikoidima kao što je deksametazon ili agensima koji menjaju viskoelastičnost, kao što su jonski i ne-jonski polimeri rastvorljivi u vodi; polimeri akrilne kiseline; hidrofilni polimeri kao što su oksidi polietilena, polioksietilen-polioksipropilen kopolimeri, i polivinilalkohol; polimeri celuloze i derivati celuloznog polimera kao što su hidroksipropilceluloza, hidroksietilceluloza, hidroksipropil metilceluloza, hidroksipropil metilcelulozni ftalat, metil celuloza, karboksimetil celuloza, i eterifikovana celuloza; polifmlečna kiselina), poli(glikolna kiselina), kopolimeri mlečne i glikolne kiseline, ili bilo kojim drugim polimernim agensima kako prirodnim tako i sintetičkim. U drugim primerima izvođenja, agensi koji umrežavaju, kao što su karbodiimidi, aldehidi, lisil-oksidaza, N-hidroksisukcinimid estri, imidoestri, hidrazidi, ili maleimidi, kao i prirodni agensi koji umrežavaju, uključujući genipin, i slični se dodaju pre, istovremeno sa ili nakon dodavanja ćelija.
[0060]Kao što je ranije opisano, u skladu sa jednim izvođenjem, ćelije se dodaju projektovanom matriksu kolagena ili projektovanom konstuktu grafta nakon polimerizacije kolagena ili tokom polimerizacije kolagena. Projektovani matriks kolagena obuhvata ćelije koje se naknadno injektuju ili implantiraju u domaćina za upotrebu kao projektovani konstrukti grafta. U drugom izvođenju, ćelije na ili unutar projektivanog matriksa kolagena se kultivišuin vitroza unapred određenu dužinu vremena, da se poveća broj ćelija ili da se indukuje željeno remodelovanje pre implantacije ili injekcije u pacijenta.
[0061]U jednom izvođenju koje se ovde opisuje, kompozicija zain vitrokulturu hondrocita, ili matičnih stem ćelija se dobija (tj., zain vitrokulturu ćelija za implantaciju ili injekciju u pacijenta). Kompozicija zain vitrokulturu obuhvata sintetički peptidoglikan koji vezuje hijaluronsku kiselinu. Prethodno opisana izvođenja sintetičkih peptidoglikana koji vezuju hijaluronsku kiselinu se primenjuju na kompoziciju zain vitrokultivaciju koja se ovde opisuje.
[0062]U različitim aspektima, kompozicija zain vitrokulturu predmetnog pronalaska se kombinuje sa hranljivim materijama uključujući minerale, aminokiseline, šećere, peptide, proteine, vitamine (kao što je askorbinska kiselina), ili lamininom, fibronektinom, hijaluronskom kiselinom, fibrinom, elastinom, ili agrekanom, ili faktorima rasta, kao što su epidermalni faktor rasta, faktor rasta poreklom od trombocita, transformišući faktor rasta beta, ili faktor rasta fibroblasta, i glukokortikoidi kao što je deksametazon.
[0063]U nekim izvođenjima, kompozicija zain vitrokulturu uključuje matične stem ćelije koje se selektuju iz grupe koju čine osteoblasti, osteogene ćelije, i mezenhimske stem ćelije. U različitim izvođenjima, kompozicija zain vitrokulturu se zaseje jednim ili većim brojem tipova ćelija u kombinaciji.
[0064]U jednom ilustrativnom aspektu, kompozicija zain vitrokulturu se sterilizuje. U jednom ilustrativnom aspektu, projektovani matriks kolagena se strerilizuje. Kako se ovde koristi "sterilizacija" ili "sterilisati" ili "sterilisan" označava dezinfekciju kompozicije uklanjanjem nepoželjnih kontaminanata uključujući, ali ne ograničeno na, endotoksine, kontaminante nukleinskih kiselina, i infektivnih agenasa. Procedure sterilizacije, postupci i izvođenja kako su u prethodnim paragrafima navedeni takođe važe za kompozicju zain vitrokulturu koja se ovde opisuje. Kompozicijain vitrokulture se koristi za proširenje populacija ćelija koje se koriste za implantaciju ili davanje injekcijom pacijentima.
[0065]U jednom izvođenju, koje se ovde opisuje, aditiv biomaterijalu zamene hrskavice se obezbeđuje. Aditiv obuhvata sintetičke peptidoglikane koji vezuju hijaluronsku kiselinu kao dodatak biomaterijalu koji zamenjuje hrskavicu. Prethodno opisana izvođenja sintetičkih peptidoglikana koji vezuju hijaluronsku kiselinu važe za ovde opisani aditiv.
[0066]Kako se koristi, fraza "postojeći biomaterijal zamene materijala hrskavice" označava biološki kompatibilnu kompoziciju koja se može koristiti za zamenu oštećene, defektne, ili hrskavice koja nedostaje u telu. Različiti tipovi postojećih biomaterijala za zamenu hrskavice su dobro poznati u tehnici i razmatraju se. Na primer, postojeći biomaterijal koji zamenjuje hrskavicu ili kompozicije koje zamenjuju kost uključuju DeNovo<*>NT Natural Tissue Graft (Zimmer), MaioRegen™ (JRI Limited), ili kolekciju kriosačuvanih osteoartikularnih tkiva proizvedenih od Biometa.
[0067]U jednom izvođenju, postupak za pripremu biomaterijala ili zamene kostne hrskavice se obezbeđuje. Postupak obuhvata korak kombinovanja sintetičkih peptidoglikana i postojećeg biomaterijala ili materijala zamene kostne hrskavice. Prethodno opisana izvođenja sintetičkih peptidoglikana koji vezuju hijaluronsku kiselinu se primenjuju u postupku koji se ovde opisuje.
[0068]U jednom izvođenju, sintetički peptidoglikani koji vezuju hijaluronsku kiselinu se koriste u postupku lečenja artritisa kod pacijenta. Postupak obuhvata korak davanja pacijentu sintetičkih peptidoglikana koji vezuju hijaluronsku kiselinu, gde sintetički peptidoglikani umanjuju jedan ili više simptoma koji se vezuju za artritis. Prethodno opisana izvođenja sintetičkih peptidoglikana koji vezuju hijaluronsku kiselinu se primenjuju u postupku koji se ovde opisuje.
[0069]U različitim izvođenjima, sintetički peptidoglikan se koristi u postupcima lečenja artritisa umanjuje jedan ili više simptoma koji su u vezi sa artritisom. Brojni simptomi su poznati u stanju tehnike koji su u vezi sa artritisom uključujući, ali ne ograničeno na bol, ukočenost, osetljivost, zapaljenje, oticanje, crvenilo, toplota, smanjena pokretljivost. Simptomi artritisa su prisutni u zglobu, tetivi, ili drugim delovima tela. Kako se ovde koristi "umanjivanje" znači sprečavanje ili u potpunosti ili delimično ublažavanje simptoma artritisa.
[0070]U različitim izvođenjima artritis je osteoartritis ili reumatoidni artritis. Patogeneza i klinički simptomi osteoartritisa i reumatoidnog artritisa su dobro poznati u stanju tehnike. U jednom izvođenju postupka, sintetički peptidoglikani deluju kao lubrikanti nakon primene ili sprečavaju gubitak hrskavice. U drugom izvođenju, sintetički peptidoglikani sprečavaju artikulaciju kostiju kod pacijenata. Na primer, sintetički peptidoglikani inhibiraju artikulaciju kost na kost kod pacijenata sa smanjenom ili oštećenom hrskavicom.
[0071]U jednom izvođenju, sintetički peptidoglikan koji vezuje hijaluronsku kiselinu se koristi u postupku smanjenja ili sprečavanja degradacije komponenti VĆM kod pacijenata. Na primer, postupak smanjenja ili sprečavanja degradacije komponenti VĆM u hrskavici kod pacijenata se obezbeđuje. Postupak obuhvata davanje pacijentu sintetičkog peptidoglikana koji vezuje hijaluronsku kiselinu. Prethodno opisana izvođenja sintetičkh peptidoglikana koji vezuju hijaluronsku kiselinu se primenjuju na postupak koji se ovde opisuje. U jednom izvođenju, sintetički peptidoglikan je otporan na matriksne metaloproteaze, npr., agrekanazu.
[0072]U drugom izvođenju, sintetički peptidoglikan koji vezuje hijaluronsku kiselinu se koristi u postupku smanjenja ili sprečavanja degradacije hijaluronske kiseline kod pacijenata. Prethodno opisana izvođenja sintetičkih peptidoglikana koji vezuju hijaluronsku kiselinu važe za postupak koji se ovde opisuje.
[0073]U drugom izvođenju, sintetički peptidoglikan koji vezuje hijaluronsku kiselinu, se koristi u postupku smanjenja ili sprečavanja degradacije kolagena. Postupak obuhvata korake kontakta sintetičkih peptidoglikana koji vezuju hijaluronsku kiselinu sa hijaluronskom kiselinom u prisustvu kolagena, i smanjenje ili sprečavanje degradacije kolagena. Prethodno opisana izvođenja sintetičkog peptidoglikana koji vezuje hijaluronsku kiselinu važe za postupak koji je se ovde opisuje.
[0074]U drugom izvođenju, sintetički peptidoglikan koji vezuje hijaluronsku kiselinu se koristi u postupku smanjenja ili sprečavanja degradacije hondroitin sulfata. Postupak obuhvata korake kontakta sintetičkih peptidoglikana koji vezuju hijaluronsku kiselinu u prisustvu kolagena, i smanjenje ili sprečavanje degradacije hondroitin sulfata. Prethodno opisana izvođenja sintetičkih peptidoglikana koji vezuju hijaluronsku kiselinu važe za postupak koji se ovde opisuje.
[0075]"Smanjivanje" degradacije komponenti VĆM, npr., hijaluronske kiseline, kolagena, ili degradacije hondroitin sulfata znači potpuno ili delimično smanjivanje degradacije hijaluronske kiseline, kolagena, ili hondroitin sulfata.
[0076]U jednom izvođenju, smanjivanje degradacije hijaluronske kiseline kod pacijenata znači smanjivanje brzine degradacije hijaluronske kiseline. Kao primer, Slika 8 u sekciji primera aplikacije pokazuje da je brzina degradacije hijaluronske kiseline u smeši hijaluronske kiseline i sintetičkih peptidoglikana koji vezuju hijaluronsku kiselinu značajno smanjena nakon dodavanja sintetičkog peptidoglikana.
[0077]U jednom izvođenju, smanjivanje degradacije kolagena znači smanjivanje brzine degradacije kolagena. Kao primer, Slika 10 opisana u sekciji primera aplikacije pokazuje da je stopa degradacije kolagena u prisustvu hijaluronske kiseline i sintetičkog peptidoglikana koji vezuje hijaluronsku kiselinu značajno smanjena nakon dodavanja sintetičkog peptidoglikana.
[0078]U jednom izvođenju, smanjivanje degradacije hondroitin sulfata znači smanjivanje brzine degradacije hondroitin sulfata. Kao primer, Slika 11 u sekciji primera aplikacije pokazuje da je brzina degradacije hondroitin sulfata u prisustvu sintetičkih peptidoglikana koji vezuju hijaluronsku kiselinu značajno smanjena nakon dodavanja sintetičkog peptidoglikana.
[0079]U jednom izvođenju koji se ovde opisuje, sintetički peptidoglikan koji vezuje hijaluronsku kiselinu se koristi u postupku kojim se ispravlja ili modifikuje tkivni defekt kod pacijenta. Postupak obuhvata davanje hijaluronske kiseline u defektno tkivo i sintetičkog peptidoglikana koji vezuje hijaluronsku kiselinu u kome se defekt ispravlja ili modifikuje. Prethodno opisana izvođenja sintetičkog peptidoglikana koji vezuje hijaluronsku kiselinu važe za postupak koji se ovde opisuje. U jednom izvođenju, tkivni defekt je kozmetički defekt.
[0080]Sledeći primeri izvođenja važe za postupke koji se ovde opisuju gde sintetički peptidoglikan koji vezuje hijaluronsku kiselinu se daje pacijentu. U različitim izvođenjima, sintetički peptidoglikan koji vezuje hijaluronsku kiselinu se injecira ili implantira (tj. ugrađuje u kompoziciju ili spravu za popravku hrskavice). U nekim izvođenjima koji se ovde opisuju, injekcija je intraartikularna injekcija. U drugom izvođenju, koji se ovde opisuje, injekcija se daje u kapsulu zgloba pacijenta. U drugom izvođenju, injekcija je subkutana injekcija, kao u slučaju dermalnih punjača. Pogodna sredstva za injekciju uključuju iglu (uključujući mikroiglu) injektor ili spravu za infuziju.
[0081]U primeru izvođenja, farmaceutske formulacije za upotrebu sa sintetičkim peptidoglikanima koji vezuju hijaluronsku kiselinu koja se daje pacijentu obuhvataju: a) farmaceutski aktivnu količinu sintetičkog peptidoglikana koji vezuje hijaluronsku kiselinu; b) farmaceutski prihvatljiv agens pH pufera da obezbedi pH u opsegu oko pH 4,5 do približno pH 9; c) agensi koji modifikuju jonsku jačinu u opsegu koncentacija od oko 0 do približno 300 milimola; i d) agensi rastvorljivi u vodi koji modifikuju viskoznost u opsegu koncentracija oko 0,25 % do približno 10 % ukupne mase formule ili bilo koje individualne komponente a), b), c), ili d) ili bilo kojih kombinacija a), b), c), i d).
[0082]U različitim izvođenjima koja se ovde opisuju, agensi za pH pufer su agensi poznati stručnjacima i uključuju, na primer, acetatne, boratne, karbonatne, citratne, i fosfatne pufere, kao i hlorovodoničnu kiselinu, natrijum hidroksid, magnezium oksid, monokalijumfosfat, bikarbonat, amonijak, ugljenu kiselinu, hlorovodoničnu kiselinu, natrijum citrat, limunsku kiselinu, sirćetnu kiselinu, dinatrijum hidrogen fosfat, boraks, bornu kiselinu, natrijum hidroksid, dietil barbiturnu kiselinu, i proteine, kao i različite biološke pufere, na primer, TAPS, Bicin, Tris, Tricin, HEPES, TES, MOPS, PIPES, kakodilat, ili MES.
[0083]U različitim izvođenjima koja se ovde opisuju, jonska jačina agenasa koji modifikuju uključuje one agense koji su poznati u oblasti tehnike, na primer glicerin, propilen glikol, manitol, glukoza, dekstroza, sorbitol, natrijum hlorid, kalijum hlorid, i drugi elektroliti.
[0084]Korisni agensi koji modifikuju viskoznost uključuju, ali nisu ograničeni na jonske i ne-jonske polimere rastvorljive u vodi; umrežene polimere akrilne kiseline kao što je "karbomer" familija polimera, npr. karboksipolialkileni koji se komercijalno dobijaju pod Carbopol<*>žigom; hidrofilni polimeri, kao što su oksidi polietilena, polietilen-polioksipropilen kopolimeri, i polivinilalkohoi; polimeri celuloze i derivati polimera celuloze kao što su hidroksipropil celuloza, hidroksietilceluloza, hidroksipropil metilceluloza, hidroksipropil metilceluloza ftalat, metil celuloza, karboksimetilceluloza, i eterifikovana celuloza ; gume kao što su tragakant i ksantan guma; natrijum alginat, želatin, hijaluronska kiselina i soli, hitozani, želatini ili bilo koje kombinacije. Uglavnom, nekiseli agensi koji pojačavaju viskoznost, kao što su neutralni ili bazni agensi se koriste da bi olakšaju postizanje željenog pH formulacije.
[0085]U različitim izvođenjima koja se ovde opisuju, formulacije za injekciju se pogodno formulišu kao sterilni ne-vodeni rastvori ili u suvom obliku (npr. liofilizovani) koje se koriste u sprezi sa odgovarajućim nosačem kao što je sterilna, voda bez pirogena. Priprema formulacija za injekciju pod sterilnim uslovima, na primer, liofilizacijom, se lako postiže korišćenjem standardnih farmaceutskih tehnika koje su dobro poznate stručnjacima u oblasti tehnike. U jednom izvođenju, viskoznost rastvora koji sadrži hijaluronsku kiselinu se povećava dodavanjem sintetičkih peptidoglikana koji vezuju hijaluronsku kiselinu.
[0086]U različitim izvođenjima koja se ovde opisuju, rastvorljivost sintetičkih peptidoglikana koji vezuju hijaluronsku kiselinu se koristi u pripremi formulacija za davanje injekcijom i povećava se upotrebom prikladnih tehnika formulacije, kao što je uključivanje kompozicija koje povećavaju rastvorljivost kao što su manitol, etanol, glicerin, polietilenski glikoli, glikol propilen, poloksomeri, i drugi poznati stručnjacima u oblasti tehnike.
[0087]U različitim izvođenjima koja se ovde opisuju, formulacije za davanje putem injekcija, se formulišu za neposredno i/ili modifikovano oslobađanje. Formulacije modifikovanog oslobađanja uključuju odložene, neprekidne, pulsirane, kontrolisane, ciljane i programirane formulacije oslobađanja. Stoga, sintetički peptidoglikan koji vezuje hijaluronsku kiselinu se formuliše kao čvrsta, polu-čvrsta ili tiksotropna tečnost za primenu kao implantirano skladište koje pruža modifikovanim oslobađanjem aktivno jedinjenje. Ilustrativni primeri takvih formulacija uključuju stentove obeležene lekom i kopolimerne (di-mlečna, glikolna)kiselina (PGLA) mikrosfere. U drugom izvođenju, sintetički peptidoglikani koji vezuju hijaluronsku kiselinu ili kompozicije koje obuhvataju sintetičke peptidoglikane koji vezuju hijaluronsku kiselinu se primenjuju kontinuirano gde je potrebno.
[0088]U bilo kom od izvođenja koja se ovde opisuju, sintetički peptidoglikan koji vezuje hijaluronsku kiselinu se daje pojedinačno ili u kombinaciji sa odgovarajućim farmaceutskim nosačima ili rastvaračima. Rastvarač ili sastojci nosača se koriste u formulaciji sintetičkih peptidoglikana koji vezuju hijaluronsku kiselinu selektuju se tako da ne umanjuju željene efekte sintetičkih peptidoglikana koji vezuju hijaluronsku kiselinu. Formulacija sintetičkog peptidoglikana koji vezuje hijaluronsku kiselinu je u bilo kom odgovarajućem obliku. Primeri odgovarajućih doznih oblika uključuju vodene rastvore sintetičkih peptidoglikana koji vezuju hijaluronsku kiselinu, na primer, rastvor u izotoničnom slanom rastvoru, 5% glukoza ili drugi dobro poznati farmaceutski prihvatljivi nosači kao što su alkoholi, estri i amidi.
[0089]Odgovarajuće doze sintetičkih peptidoglikana koji vezuju hijaluronsku kiselinu se mogu odrediti standardnim postupcima, na primer uspostavljanjem kriva doznih odgovora kod laboratorijskih životinjskih modela ili u kliničkim ispitivanjima. U različitim izvođenjima, koja se ovde opisuju, doza sintetičkog peptidoglikana koji vezuje hijaluronsku kiselinu, značajno se razlikuje u zavisnosti od stanja pacijenta, stanja bolesti koja se leči, načina primene i distribucije do tkiva, i mogućnosti istovremene upotrebe drugih terapeutskih tretmana. Kao ilustracija, odgovarajuće doze sintetičkih peptidoglikana koji vezuju hijaluronsku kiselinu (administrira se u jednom bolusu ili preko vremena) uključuje od oko 1 ng/kg do oko 10 mg/kg, od oko 100 ng/kg do oko 1 mg/kg, od oko 1 ug/kg do oko 500 ug/kg, ili od oko 100 ug/kg do oko 400 ug/kg. U svakom od ovih izvođenja, doza/kg se odnosi na dozu po kilogramu mase pacijenta ili težine tela. U drugim ilustrativnim primerima, efikasne doze mogu biti u opsegu od oko 0.01 ug do oko 1000 mg po dozi, od oko 1 pg do oko 100 mg po dozi, ili od oko 100 pg do oko 50 mg po dozi, ili od oko 500 ug do oko 10 mg po dozi, ili od oko 1 mg do 10 mg po dozi, ili od oko 1 do oko 100 mg po dozi, ili od oko 1 mg do 5000 mg po dozi, ili od oko 1 mg do 3000 mg po dozi, ili od oko 100 mg do 3000 mg po dozi, ili od oko 1000 mg do 3000 mg po dozi. U jednom izvođenju, odgovarajuće doze sintetičkih peptidoglikana koji vezuju hijaluronsku kiselinu uključuju koncentracije koje variraju od oko 0,01 pM do oko 100 pM, oko 0,05 do oko 100 pM, oko 0,1 u.M do oko 100 pM, oko 0,1 pM do oko 50 pM, oko 0,1 pM do oko 20 pM, oko 0,1 pM do oko 10 pM, oko 0,5 pM do oko 10 uM, oko 0,5pM do oko 50 pM, i oko 0,5 pM do oko 100 pM. U drugom izvođenju, odgovarajuće doze sintetičkih peptidoglikana koji vezuju hijaluronsku kiselinu uključuju koncentracije od oko 0,01 pM, 0,1 pM, 0,2 pM, 0,5 pM, 1 pM, 2 pM, 5 pM, 10 pM, 20 pM, 50 pM, i 100 pM.
[0090]Sintetički peptidoglikani koji vezuju hijaluronsku kiselinu se mogu formulisati pomoćnim sredstvima. U bilo kom izvođenju koji se ovde opisuje, pomoćno sredstvo ima koncentraciju opsega od oko 0,4 mg/mL do oko 6 mg/mL. U različitim izvođenjima, koncentracija pomoćnog sredstva ima opseg od oko 0,5 mg/mL do oko 10 mg/mL, od oko 0,1 mg/mL do oko 6 mg/mL, od oko 0,5 mg/mL do oko 3 mg/mL, od oko 1 mg/mL do oko 3 mg/mL, od oko 0,01 mg/mL do oko 10 mg/mL, i od oko 2 mg/mL do oko 4 mg/mL.
[0091]U izvođenjima gde je sintetički peptidoglikan koji vezuje hijaluronsku kiselinu implantiran kao deo kompozicije popravke hrskavice ili sprave (npr. gel za implantaciju), bilo koja pogodna formulacija gore opisana se koristi.
[0092]Bilo koji efikasni režim primene sintetičkih peptidoglikana koji vezuju hijaluronsku kiselinu se koristi. Na primer, sintetički peptidoglikan koji vezuje hijaluronsku kiselinu se daje kao jedna doza ili u više doza po dnevnom režimu. Dodatno, razdvojeni režimi, na primer, jedan do pet dana po nedelji se koriste kao alternativa dnevnom tretmanu.
[0093]U različitim izvođenjima koja se ovde opisuju, pacijent se višestruko tretira injekcijama sintetičkog peptidoglikana koji vezuje hijaluronsku kiselinu. U jednom izvođenju, pacijentu se daje injekcija više puta (npr. oko 2 puta do oko 50 puta) sa sintetičkim peptidoglikanom koji vezuje hijaluronsku kiselinu, na primer u 12-72 časovnom intervalu ili u 48-72 časovnom intervalu. Dodatne injekcije sintetičkog peptidoglikana koji vezuje hijaluronsku kiselinu se daju pacijentu u intervalima dana ili meseci nakon inicijalne injekcije(a).
[0094]U svakom izvođenju, koji se ovde opisuje treba razumeti da se kombinacija dva ili više sintetičkih peptidoglikana koji vezuju hijaluronsku kiselinu, sa razlikama u porcijama peptida, porcijama glikana, ili zajedno, može da se koristi umesto sintetičkog peptidoglikana koji vezuje jednu hijaluronsku kiselinu.
[0095]Takođe se prihvata u daljim izvođenjima, da određeni aspekti jedinjenja, kompozicija i postupaka su prisutni kao alternative u listama, kao što je, ilustrativno, odabir za jedan ili više G i P. Stoga treba shvatiti da različita alternativna izvođenja uključuju individualne članove tih lista, kao i razne podsetove tih lista. Svaka od tih kombinacija se razume i opisuje ovde putem lista.
[0096]U sledećim ilustrativnim primerima, termini "agrekansko imitiranje" i "imitiranje" se koriste kao sinonimi sa terminom "sintetički peptidoglikan koji vezuje hijaluronsku kiselinu."
PRIMERI
Sinteza peptida
[0097]Svi peptidi se sintetišu upotrebom Symphony sintezera peptida (Protein Technologies, Tucson, AZ), uz upotrebu FMOC protokola na Knorr smoli. Sirovi peptid se oslobađa od smole sa TFA i pročišćava reverzno faznom hromatografijom na AKTAexplorer (GE Healthcare, Piscataway, NJ) uz upotrebu Grace-Vydac 218TPC-18 reverzno fazne kolone i gradijentom voda/acetonitril 0,1%TFA. Dansil-modifikovani peptidi se pripremaju dodavanjem koraka kuplovanja sa danzil-Gly (Sigma) pre oslobađanja sa smole. Strukture peptida se potvrđuju masenom spektometrijom. Sledeći peptidi pripremljeni su kako se gore opisuje: GAHWQFNALTVRGGGC, KQKIKHWKLKGC, i KLKSQLVKRKGC.
PRIMER 2
Funkcionalizacija hondroitin sulfata i obrazovanje sintetičkih peptidoglikana
[0098]Reakciona šema za stvaranje imitatora agrekana (tj. GAH) se vidi na Slici 1. Funkcionalizacija hondroitin sulfata (HS) (Sigma, St. Louis, MO) se postiže korišćenjem natrijum perjodata (Thermo Scientific, VValtham, MA) da oksiduje HS. Menjanjem trajanja reakcije i koncentracije natrijum perjodata, kontroliše se broj aldehidnih grupa koje se stvaraju reakcijom oksidacije, vrednosti se prikazuju u Tabeli 2. Tabela 2 daje detalje koncentracije natrijum perjodata i trajanja reakcije potrebne da se dobije željeni broj aldehida po HS lancu. Kroz progresivne hemijske reakcije, koje prikazuje šema na Slici 1, broj BMPH vezanih po HS lancu pretpostavlja se da je jednak broj aldehida koji se dobijaju i broju vezanih peptida koji vezuju hijaluronsku kiselinu. Na osnovu trajanja reakcije i koncentracije natrijum perjodata, broj peptida (prošek) po HS lancu se prikazuje u Tabeli 2.
[0099]Koncentracija HS se održava konstantnom na 20 mg po mL za sve reakcije oksidacije. Merene količine HS i natrijum perjodata reaguju i zaštićene su od svetlosti u 0,1 M natrijum acetatnom puferu (pH 5,5) u određenom trajanju. Završetak reakcije se dobija uklanjanjem natrijum perjodata izvođenjem gel filtracione hromatografije sa kolonom Bio-Scale Mini Bio-Gel pakovanom sa poliakrilamidnim kuglicama (Bio-Rad Laboratories, Hercules,CA) korišćenjem AKTA Purifier FPLC (GE Healthcare, Piscataway, NJ). Pufer koji se koristi za proces odstanjivanja soli je IX fosfatni rastvor (PBS, pH 7,4 , InvitrogenCarlsbad, CA).
[0100]W-[R-Maleimidopropionska kiselinajhidrazid, so trifluorosirćetrne kiseline (BMPH, Pierce, Rockford, IL) reaguju u 50 M višku sa odsoljenim, oksidovanim HS u IX PBS. Kraj hidrazida BMPH reaguje kovalentnim vezivanjem za funkcionalizovani HS, preko novoformiranih aldehida da se obrazuje intermedijer Šifove baze. Natrijum cijanoborhidrid (5M, Pierce) se dodaje u reakciju da redukuje intermedijer Šifove baze imin u više stabilni amin. Višak BMPH se uklanja iz rastvora odstranjivanjem soli preko FPLC u dejonizovanoj vodi. Detektovanjem apsorbancije na AKTA prečišćivaču FPLC, meri se količina BMPH u višku. Mala veličina i niska molekulska masa BMPH (297,19 g/mol) dovodi do njegovog ispiranja sa kolone u odvojenoj, mnogo kasnijoj vremenskoj tački. Uz prisustvo njegovih brojnih jednostrukih veza i povremeno dvostrukih veza, BMPH proizvodi snažni spektar apsorbancije na 215 nm talasne dužine (karakteristično za jednostruke veze) i 254 nm talasne dužine (karakteristično za dvostruke veze). Stoga, se pravi standardna kriva, u korelaciji poznatih BMPH masa sa integrisanom oblasti od 215 nm spektra apsorbancije, Slika 2. Sa ovom standardnom krivom, se određuje masa BMPH u višku. Oduzimanje mase BMPH u višku od originalne reakcione mase omogućava da se odredi masa BMPH koji se iskoristi u reakciji. Korišćenjem upotrebljene mase, broj BMPH veza sa oksidovanim HS se računa. Sakupljeni HS-BMPH proizvod se zamrzava, liofilizuje, i skladišti na -80° Celzijusa.
[0101]Sekvenca peptida koja vezuje HK se određuje od strane Mummert-a. Blage modifikacije prema identifikovanoj sekvenci daju specifičnu sekvencu koja vezuje HK. GAHWQFNALTVRGGGC (označeno kao GAH), se koristi u istraživanju. Peptid se proizvodi i kupuje od Genscript (Piscatavvav, NJ). Aminokiselina cistein se uključuje da omogući kuplovanje, obrazovanjem tioetarske veze sa malimidnom grupom BMPH. Ova reakcija se događa u odnosu 1:1, pod predpostavkom da se BMPH vezuje za funkcionalizovani HS i da je jednak broju vezanih GAH peptida. GAH peptid, koji je u jednomolarnom višku prema broju BMPH kuplovanih po lancu, rastvara se u dimetil sulfoksidu (DMSO, Sigma) i dodaje se rastvoru HS-BMPH u 15 minutnim intervalima, u četvrtini zapremine tokom vremena. Nakon poslednjeg dodavanja GAH peptida, reakciji je određeno tajanje od 2 sata. Tokom ovog perioda višak GAH peptida obrazuje čestice. Pre prečišćavanja rastvora radi dobijanja GAH funkcionalizovan HS, rastvor se propušta kroz Acrodisc filter sa 0,8 mm prečnikom pora (Pali, Port VVashington, NY) da se odstrani višak čestica peptida. Rastvor se potom propušta, sa dejonizovanom vodom, kroz AKTA Prečišćivač FPLC da pročisti GAH-HS jedinjenje. Sakupljena jedinjenja se zamrzavaju na -80° Celzijusa i liofilizuju da se dobije željeni imitator-agrekana. Po laboratorijskoj konvenciji, imitator agrekana se imenuje sa (# vezanih peptida)
(prva tri slova peptidne sekvence) - (GAG skraćenica koja je funkcionalizovana) tj. za imitator agrekana, 3GAH-HS za 3 GAH HK vezujuća peptida funkcionalizovana sa hondroitin sulfatnim GAG stukturnom osnovom.
PRIMER 3
Vezivanje sintetičkog peptidoglikana za hijaluronsku kiselinu
Vezivanje sintetičkog peptidoglikana za imobilizovanu hijaluronsku kiselinu
[0102]Hijaluronska kiselina (HK, izStreptococcus equi,Sigma) koncentracije 4 mg po mL, imobilizovana je za ploču sa 96 bunarčiča (Costar, blk/dr, Corning, Corning, New York) u toku noći na 4° Celzijusa. GAH peptidi obeleženi biotinom se vezuju putem BMPH, za funkcionalizovani HS u koncentraciji od 1 biotin-GAH po HS lancu. Neobeleženi GAH peptidi se vezuju za ostale aldehide HS koji nisu odreagovali. Standardni biotin-steptavidin postupci obeležavanja se koriste za određivanje stepena vezivanja imitatora agrekana za imobilizovanu HK. Blokiranje HK površine se radi 1 sat sa1%albuminom iz serum govečeta (BSA, Sera Care Life Sciences, Milford, MA) u IX PBS rastvoru. Nakon ispiranja IX PBS-om, imitator agrekana obeležen biotinom se inkubira u bunarčiću 30 minuta i onda ispira IX PBS-om. Streptavidin-peroksidaza rena (R&D Svstems, Minneapolis, MN) rastvor se dodaje direktno u svaki bunar, i dozvoljeno je da reaguje 20 minuta. Nakon završetka reakcije i ispiranja, dodaje se hromogeni supstrat (Substrate Reagent Pack,R&D Svstems) i razvija se 15 min. U 15 min., sumporna kiselina (Sigma) se dodaje direktno u svaki bunarčić da bi se reakcija zaustavila. Ploča sa bunarčićima se potom čita na M5 SpectraMax Čitaču ploča (Molecular Devices, Sunnvvale, CA) na 450 nm i 540 nm talasnim dužinama. Oduzimanjem apsorbanci iz dva čitanja, se određuje apsorbanca biotinom obeleženog vezanog agrekanskog imitatora.
[0103]Jedan GAH peptid po imitatoru agrekana se zamenjuje sa biotin-obeleženim GAH peptidom i obeleženi imitator agrekana se inkubira sa imobilizovanom HK. Komercijalno dostupni proizvodi za detekciju biotina (kroz streptavidin i HRP) pokazuju stepen vezivanja imitatora za imobilizovanu HK (vidi Sliku 3). Početnom koncentracijom od lpM, imitator agrekana ima dozno zavisno povećanje u prisustvu imobilizovane HK, čime pokazuje da se imitator vezuje za HK. Međutim, određivanje afiniteta vezivanja imitatora se ne dobija zbog neodređenosti količine koja se vezuje za HK.
Vezivanje sintetičkih peptidoglikana za hijaluronsku kiselinu određeno reometrom
[0104]Rastvori HK se prave da testiraju sposobnost imitatora agrekana da veže HK u situacijama sličnijim fiziološkim. Sposobnost imitatora agrekana da veže HK je izvedena unapređenjem modusa skladištenja rastvora, što ukazuje na HK umrežavanje imitatorom. Višestruki tretmani se stvaraju u IX PBS pH 7,4 da se testira sposobnost imitatora agrekana da veže HK: 2,5 mas. % HK kontrola, HK+HS u 25:1 molarnom odnosu sa HS:HK, HK+3GAH-HS u 25:1, HK+7.2GAH-HS u 25:1, HK+10.5GAH-HSu 25:1.
[0105]Upotrebom AR-G2 reometra (TA Instruments, New Castle, DE), oscilovanjem frekvencije (0.1 - 100 Hz, 2.512 Pa) i pritiska (0.1 -100 Pa, 1.0 Hz) se mere moduli skladištenja svakog rastvora.
[0106]Reološka istraživanja toka supstance kao odgovor na primenjene sile se često koriste kada se mere viskoelastični materijali. Posebno, reometar određuje module skladištenja i gubitak modula na osnovu odgovora supstance na primenjenu silu. Modul skladištenja je mera količine energije koja se elastično apsorbuje od supstance i gubitak modula oslikava količinu izgubljene energije kroz toplotu. Veliki modul skladištenja je indikativan za supstancu sličnu gelu sa više rigidnom, elastičnom strukturom, dok mali modul skladištenja i veliki gubitak modula indukuju viskozni materijal koji ne zadržava elastično primenjeno opterećenje. Velika molekulska masa HK (~1.5MDa) je veoma viskozni materijal koji elastično zadržava porciju primenjenog opterećenja zbog obrazovanog pseudo-gela preko HK umrežavanja. Kreirani imitator agrekana sadrži brojne HK vezujuće peptide koji mogu da deluju kao umreživači HK lanca pod pretpostavkom da se agrekanski imitator adekvatno vezao za HK. U rastvoru gde je HK sa visokom molekulskom masom, pretpostavlja se da imitator agrekana povećava rigidnost rastvora i stvara veće module skladištenja. Veći moduli skladištenja ukazuju na intenzivno umrežavanje HK, što dokazuje jak afinitet vezivanja između imitatora agrekana i lanaca HK koji su prisutni u mešavini. Različite verzije imitatora agrekana se testiraju, koji se razlikuju u broju GAH peptida (u prošeku ili 3, 7,2, ili 10,5) vezanih po funkcionalizovanom HS lancu.
[0107]Rezultati eksperimenta, na Slici 4, pokazuju da dodavanje HS značajno (a=0,05) snižava module skladištenja u rastvoru HK. Dodavanje gustih negativnih šarži udruženih sa HS pomaže širenje HK lanaca, olakšavajući stepen umrežavanja i uklanjanja pseudo-gela koji skladišti primenjenu energiju. Potvrđivanje hipoteze, da se broj GAH peptida po HS povećava od 3 do 10,5 , takođe se povećavaju moduli skladištenja mešavine. Ovo povećanje se može pripisati korisnim osobinama da imaju veći broj GAH peptida po imitatoru agrekana. Prvo, što više GAH peptida je vezano za HS to je veći avidited imitatora, što dovodi do jačeg vezivanja imitatora za molekul HK. Drugo, što je više GAH peptida vezano po HS, veća je verovatnoća da imitator deluje kao umreživač između molekula HK. Oba efekta doprinose više smeši sličnoj gelu, što dovodi do većih izmerenih modula skladištenja. Slabije vezivanje između imitatora i HK neće vratiti pseudo-gel i neće moći da skladišti primenjenu energiju iz reometra. Povećanje u modulima skladištenja potvrđuje snažno vezivanje imitatora za imobilozovanu HK prikazanu u Slici 3. Naročito, na 10,5 GAH peptida po lancu, modul skladištenja je značajno (a=0,05) veći nego kod HK+HS kontrole, dostiže prošek u modulu skladištenja sličan HK kontroli.
PRIMER 4
Istraživanja kompresije sintetičkog peptidoglikana
Obrazovanje gela kolagena i zamućenost
[0108]Radi podražavanja prirodnog vanćelijskog matriksa hrskavice, kolagen se koristi da uhvati u zamku HK i agregate imitatora agregata unutar prirodne skele. Kolagen tipa II (Cll) se dobija iz dva različita komercijalna izvora (Affymetrix,Santa Clara, CA and Sigma). Smeše komponenti hrskavice VĆM se spremaju u TES puferu (60 mM TES, 20mM Na2HP04, 0,56 M NaCI, hemikalije iz Sigma) pH 7,6 prema prirodnim komponentama razgradnje, gde se Cll sastoji iz 70 % suve mase i kombinacije HK i imitator agrekana/HS kontrola koja obrazuje preostalih 30 % suve mase smeše. Finalna koncentracija Cll u gelu je 2 mg po mL. Uzorci se sastoje iz Cll kontrole, CII+HK+HS kontrole, i CII+HK imitatora agrekana (10,5GAH-HS). Da se spreči prevremena fibrilogeneza i obrazovanje gela, rastvori se drže na ledu i kiselom pH. Smeše rastvora komponenti postavljaju se u ploču sa 384 bunarčića (Greinierblk/clr, Monroe, NC) na 37° C i fiziološkom pH da se inicira fibrilogeneza, i prate se na 313 nm u M5 SpectraMax da se odredi obrazovanje gela. Cll nije mogao da obrazuje gelove kada je uključen sa različitim tretmanima (Vidi dopunsku informaciju). Stoga, kolagen tip I (Cl, Visoka Koncentracija kolagena tipa 1, repa pacova BD Biosciences, Bedford, MA) se koristi za obrazovanje gela. Identični tretmani i procedure se koriste sa Cl, osim toga da se mase komponente menjaju za finalnu koncentraciju Cl od 4 mg po mL. Cl se koristi za sve sledeće eksperimente.
[0109]Zamućenost sa Cl radi se da se izmeri obrazovanje hrskavice koja se reprodukuje, rezultati se prikazani na Slici 5. Kako je pokazano, dodavanje HK+10.5GAH-HS ne utiče na fibrilogenezu vlakana kolagena. Svi tretmani prate sličnu krivu i dostižu slične vrhove apsorbance otprilike u isto vreme. Tretmani HK+10.5GAH-HS imaju veću početnu apsorbancu zbog toga što imitatori agrekana imaju sklonost da obrazuju spostvene agregate u IX PBS rastvoru, ne zbog prevremenog obrazovanja Cl vlakana. Agregati 10.5GAH-HS se prepoznaju tokom početnih reometarskih testova HK, ali agregati ne inhibiraju sposobnost imitatora agrekana da se veže za HK.
Ispitivanje osobina gela kolagena
[0110]Testovi sabijanja gela na bazi kolagena i oscilovanje frekvencija se sprovode AR-G2 reometrom korišćenjem 20-milimetarske paralelne geometrijske ploče (TA instrumenti). Smeše gela od 375 pL se spremaju na ledu i pipetiraju na baznu ploču reometra. Geometrija se snižava na rastojanje procepa od lmm i rastvor se zagreva do 37° Celzijusa. Klopka za vlažnost se koristi da speči dehidrataciju gela dok je smeša obrazuje gel preko dva sata. Ova vrednost od dva sata se određuje pokazanim vremenom za podatke gelacije iz podataka zamućenosti. Nakon perioda od dva sata, gelovi su kompresovani ili oscilirani u zavisnosti od testa. Testovi kompresije dolaze na projektovanoj deformaciji pri naprezanju 1% (10 pm) po sekundi. Rastojanje pukotine i normalna sila se mere na geometrijskoj glavi. Oscilovanje frekvence se meri na modulima skladištenja stvorenih gelova tokom deseto logaritamskog baznog povećanja u frekvenciji od 0.1 do 1 Hz.
[0111]Istovremena normalna sila i izmeštanje se mere i projektovani napor i naprezanje se računaju iz tretmana. Kako je prikazano na Slici 6, uključivanje imitatora agrekana značajno (a=0,05) povećava kompresivnu snagu kompleksa gela. Pik projektovanog pritiska kolagena+HK+AGG mimika dostiže 7.5 kPa u projektovanom naprezanju od 9%, gde kolagen+HK+HS kontrola dostiže pik od 4.8 kPa na 4 %, i kontrola kolagena dostiže pik od 4.2 kPa na 15% naprezanja.
[0112]Dva faktora doprinose povećanju kompresivne jačine CI+HK+10.5 gela, prvi koji je sposobnost imitatora da privuče vodu i drugi koji je sposobnost ukrštanja imitatora agrekana. U prirodnoj hrskavici, naglašavanje zarobljenih negativnih šarži se obezbeđuje HK i HS koji privlače vodu i zadržavaju njenu difuziju iz hrskavice. Kada se sila pritiska primeni na hrskavicu, voda ne može da se raširi u sinovijalnu kapsulu. Zadržavanje ove vode otporne na pritisak povećava jačinu pritiska strukture. Slično u testiranim kompleksima gela, uključivanje negativnih naelektrisanja povezanih sa HS u gelu obezbeđuju isto privlačenje. Kako se vidi na Slici 6, zajedno i HS i 10.5GAH-HS tretmani imaju povećanu snagu pritiska. Tretman HS nije fiksiran sa Cl kompleksom (nije vezan za HK) i stoga nakon male deformacije pritiska, HS i njegova privučena voda se šire izvan kompleksa u tečnost iz okruženja. Difuzija CS i vode iz kompleksa umanjuje kompresivnu snagu kompleksa, i uzrokuje da rezultujući kompresivni profil gela da liči onom kontrole skele kolagena. Suprotno, 10.5GAH-CS se vezuje za umreženu HK. Stoga, mnogo veći kompresioni pritisak je neophodan da se prevaziđe vezivanje imitatora za HK i uzrokuje difuzuja HS i privučene vode iz kompleksa.
[0113] Drugo, sposobnost imitatora agrekana da deluje kao umreživač HK dovodi do većeg stepena zarobljavanja HK i imitatora. Efektno, priroda umrežavanja HK stvara velike agregate unutar kompleksa kolagena slično prirodnim agrekan/HK agregatima. Glavna razlika između imitatora agrekana i prirodnog agrekana je u veličini molekula. Proteinska osnova agrekana samog ima masu <220 kDa, dok kao imitatora agrekana u celosti, ima masu samo oko 30 kDa. Stoga, prirodni kompleks agregata, sa preko 100 molekula agrekana vezanih za HK, obrazuje mnogo veće agregate nego što imitator agrekana može da stvori. Međutim, kada deluje kao umreživač između lanaca HK, imitator agrekana obrazuje spostveni oblik agregata koji takođe oslikava glavne karakteristike prirodnih agregata; voluminozne, negativno naelektrisane strukture. Uloga imitatora agrekana kao umreživača HK se dalje ispituje primenom smaknutih opterećenja kroz reološke testove na Cl gelove opisane gore. Rezultati ovih eksperimenata su na Slici 7.
[0114]Uključivanje 10.5GAH-HS značajno (a=0,05) povećava module skladištenja u obrazovanom gelu. Mreža koja se kreira vezivanjem imitatora za HK dopunjenu postojeću čvrstoću Cl matriksa, dopuštajući povećanu elastičnu apsorpciju energije primenjene smaknutim opterećenjem. Ovo istraživanje je važno kako utvrđuje sposobnost umrežavanja 10.5GAH-HS i stvaranja alternativnih oblika agregata.
PRIMER 5
Zaštita razlaganja hijaluronske kiseline sintetičkim peptidoglikanima
[0115] Vrednosti dinamičkog viskoziteta rastvora HK se određuju korišćenjem AR-G2. Visoka molekulska masa rastvora HK ima veliki viskozitet zbog obimnog uplitanja lanca uzrokovanog velikom dužinom lanca. Hijaluronidaza (Tip II iz Sheep Testes, Sigma) seče lanac HK, i kreira kraće lance sa manjim umrežavanjem. Skraćeni lanci HK imaju merljivo sniženi viskozitet. Rastvori HK se inkubiraju sa 100 jedinica/ml hijaluronidaze. Dinamični viskozitet se određuje korišćenjem vremena oscilovanja sa konstantnom ugaonom frekvencijom i oscilatornim pritiskom inicijalno i vremenskim tačkama od 2h i 4h. Uzorci (sa 0,5 % mase HK) se sastoje iz HK, HK+HS, i and HK+10.5GAH-HS. Vrednosti tretmana dodati su u 75:1 tretman prema HK molarnom odnosu. Procenat razlaganja se računa za svako merenje deljenjem individualnog viskoziteta od razlike merenog viskoziteta minus inicijalni viskozitet.
[0116] Rad Pratta i dr. i Little i dr. pokazuje važnost agrekana u sprečavanju razlaganja komponente hrskavice. Razaranje matriksa hrskavice u osteoartritisu počinje isecanjem agrekanskih proteoglikana. Uklanjanjem GAG-bogatog regiona iz proteoglikana izlažu se komponente koje ostaju, Cll i HK enzimima koji ih razlažu. Sa znanjem važnosti koje ima agrekan u sprečavanju razlaganja vrše se istraživanja da se odredi sposobnost agrekanskog imitatora da spreči razlaganje HK.
[0117] Viskozitet rastvora HK zavisi od veličine lanaca HK. Zbog umrežavanja, veći lanci HK daju veći viskozitet. Kada se izlože hijaluronidazi, lanac HK se seče u manje delove. Stoga, veličina HK i količina umrežavanja HK opada. Ovo opadanje izaziva slično opadanje u merenom viskozitetu. Procenat promene u viskozitetu rastvora HK u prisustvu hijaluronidaze obezbeđuje ključnu informaciju za količinu degradacije pod kojom je HK. Slika 8 predstavlja procenat degradacije kontrole HK u odnosu na udružene tretmane. Kako se može videti, AGG imitator, GAH značajno smanjuje brzinu degradacije HK, što indukuje da se ponaša slično prirodnom AGG u njegovoj zaštiti komponenti VĆM.
[0118]Viskoziteti svakog tretmana bez hijaluronidaze (TES pufer zamenjuje zapreminu hijaluronidaze) početno se mere i služe kao osnova za izračunavanja procenta degradacije. Vremenska tačka u 0 h uključuje dodavanje hijaluronidaze, mešanje rastvora, pipetiranje na reometar, i početak operacije dovođenja u ravnotežu mašine. Stoga, vremenska tačka 0 h se događa približno dva minuta nakon dodavanja hijaluronidaze. Visoka koncentracija hijaluronidaze (25 jedinica po mL) se koristi da ponovi najgori mogući scenario. Dodatno, molekuli HK su dispergovani u rastvoru, pre negotesno umreženi u mrežu kolagena. Kao što se vidi na Slici 8, zajedno HK kontrola i tretman HK+HS imaju skoro potpuno razlaganje rastvora HK u 0 h vremeskoj tački. Suprotno, dodavanje 10.5GAH-HS značajno (a=0,05) umanjuje količinu razlaganja HK. Zapravo, prisustvo 10.5GAH-HS povećava viskozitet iznad osnovih vrednosti. Veruje se da dodavanje hijaluronidaze seče neke od viškova HK. Ovo omogućava 10.5GAH-HS da bolje umreži preostale nedirnute lance, i stvori gušći gel koji daje veći viskozitet.
[0119]U vremenskoj tački 2 h, zajedno kontrola HK i HK+HS se potpuno degraduje sa procentom degradacije preko 90 %, ali rastvor HK sa 10.5GAH-HS ima značajno (a=0,05) niži procenat degradacije. Na kraju, u vremenskoj tački 4 h, svi tretmani se degraduju, sa procentom degradacije svih preko 90 %. Između tri vremenske tačke, 10.5GAH-HS nije mogao da u potpunosti spreči degradaciju HK, ali je drastično smanjio brzinu degradacije u poređenju sa degradacijama kontrole HK i HK+HS. Ova smanjena brzina pokazuje da 10.5GAH-HS sprečava degradaciju HK lanaca. Veruje se da se ovo sprečavanje postiže putem kompetitivne inhibicije tačke isecanja hijaluronidaze na lancu HK. Ne-kovalentno vezivanje imitatora za HK lanac spojeno sa postepenom brzinom degradacije lanaca HK izgleda da potvrđuje ovo verovanje. Dodatno, brzina degradacije rastvora 10.5GAH-HS je neprirodno visoka. Nakon inkubacije imitatora u rastvoru HK, obrazuju se agregati HK+10.5GAH-HS. Međutim, ovi agregati se ne šire ravnomerno kroz zapreminu rastvora. Stoga, rastvori se mešaju, slično drugim uzorcima, pre merenja. Mešanje rastvora razdvaja nakupine, odvaja 10.5GAH-HS i otvara mesto isecanja za hijaluronidazu. I nakon vremenske tačke 4 h, kada se pretpostavljeno kompletna degradacija događa, još uvek se dešava stvaranje znatnih HK+10.5GAH-HS nakupina. U kompaktnom matriksu kao što je VĆM hrskavice, moguće je da 10.5GAH-HS ne redukuje značajno samo brzinu degradacije, već da suprimira degradaciju HK.
PRIMER 6
Elektronska mikroskopiiia krioskeniranjem ( SEM)
[0120]Konstrukti sa osnovom VĆM, kako su opisani za merenja zamućenosti, se obrazuju na SEM ploči na 37°C preko noći. SEM ploče se osiguraju u držaču, i ubace se u zamaz tečnog nitrogena. Vakuum se povuče na uzorak kako se prebaci u pretkomoru Gatan Alto 2500. Unutar komore, hladi se na -170°C, ohlađeni skalpel se koristi da napravi slobodnu površinu na uzorku. Uzorak se podvrgne sublimaciji na - 85°C na 15 minuta u pratnji raspršenog premaza platine za 120 sekundi. Nakon raspršenog premaza, uzorak se prebaci na fazu mikroskopa i uzmu se slike na -130°C.
[0121] Odgovarajuće slike se dobiju na uvećanju od 10000X, kako je prikazano na Slici 9. Panel A prikazuje Cl kontrolu, i karakteriše se intenzivnim umrežavanjem između velikih vlakana, i relativno malih pora matriksa. Panel B prikazuje CI+HK+HS, i sadrži intenzivno umrežavanje, ali veću veličinu pora, zbog prisustva velikih lanaca HK. Panel C prikazuje CI+HK+10.5GAH-HS i ilustruje primetno manji stepen umrežavanja pored veoma velike veličine pora. AGG imitator se veže za HK i stvara relativno veliki, glomazni kompleks koji sprečava Cl umrežavanje.
[0122]Kao što se može kvalifikovati u odgovarajućim slikama, dodavanje HK+HS nema efekat na variranje prečnika fibrila kolagena, ali HK+HS uzorak ima veći reprezentativni prazni prostor. U poređenju sa kontrolnim grupama, dodavanje AGG imitatora sa HK dovodi do manjeg variranja prečnika kolagenog vlakna zbog ograničenog broja prečnika malih vlakana, i sveukupnog povećanja u praznom prostoru uzorka. Vezivanje AGG imitatora za molekul HK stvara kompleks nakupina koji je zarobljen u skeli kolagena i odstranjuje obrazovanje manjeg vlakna između većih vlakana zbog prostorne prepreke.
PRIMER 7
Zaštita kolagena
[0123]Konstrukti na osnovu VĆM koji sadrže samo kolagen, kolagen+HK+HS, ili kolagen+HK+10.5GAH-HS se prave u 8-komornim dijapozitivima kao što je prethodno opisano. Finalna zapremina uzorka je 200 mL koja se sastoji iz 0,8mg kolagena tipa I, matriksne metaloproteaze-l [MMP-I, R&D Svstems, Minneapolis, MN) koncentracije 0,133 mg/mL koja se aktivira prema protokolu sa detaljnim objašnjenjem prema uputstvima proizvođača. Ukratko, MMP-1 već rastvorena u puferu proizvođača (50 mM Tris, 10 mM CaCI2,150 mM NaCI, 0,05% Brij-35, pH 7,5), se kombinuje sa jednakom zapreminom 25 mM APMA (Sigma) u DMSO na 37°C za 2 h da se enzim aktivira. Nakon aktivacije, rastvor MMP-1 se dvostruko razblažuje u vodi i dodaje uzorku kao 100 pL supernatant. Uzorci se inkubiraju na 37°C uz nežno mešanje. Dvadestet-pet sati nakon dodavanja inicijalnog rastvora enzima, supernatant se odstanjuje i zamenjuje svežom dozom enzima. Nakon ukupno 50 h inkubacije sa enzimom, preostali gelovi se uklanjaju sa slajdova komore, ispiraju dejonizovanom vodom da se otkloni bilo koji rastvor enzima ili produkt degradacije, i ponovo se rastvori u 12 M HCI. Uzorci se razblažuju u vodi da dostignu konačnu koncentraciju od 6 M HCI, i hidrolizuju se u toku noći na 110°C. Prateći hidrolizu, količina hidroksiprolina (hyp) se analizira prema protokolu Reddy i dr., (Clin Biochem, 1996, 29: 225-9). Ukratko, hidrolizovani uzorci se inkubiraju sa Hloramin T rastvorom (0,56 M) na 25 minuta na sobnoj temperaturi pre dodavanja Erlihovog reagensa i prati se razvoj hlorofore za 20 minuta na 65°C. Nakon razvijanja hlorofore, uzorci se čitaju na spektrofotometru na talasnoj dužini od 550nm. Očitavanja apsorbance se upoređuju sa onim koji se dobijaju od poznatih koncentracija kolagena da bi se odredila količina kolagena koja ostaje u svakom uzorku.
[0124]Svaki replikat uzorka se pravi sa 0,8 mg Cl, i nakon degradacije, ostatak Cl količine se određuje protokolom napravljenim od Reddy i dr., pretvaranjem Cl količine preko seta Cl standarda. Procenat degradacije se određuje oduzimanjem ostatka Cl od inicijalnog Cl, deljenjem sa inicijalnim Cl i množenjem sa 100. Pocenat degradacije u tretmana prikazan je na Slici 10. Svi tretmani se značajno razlikuju jedan od drugog (p<0,05). Posebno, procentat degradacije AGG imitatora uzorka (CI+HK+10.5GAH-HS = 41,0 %) značajno je manji (p<0,05) nego kod druga dva tretmana (Cl=64,5%i CI+HK+HS=74,7%). Prisustvo AGG imitatora značajno smanjuje Cl degradaciju. Prisustvo AGG imitatora može da deluje kao prepreka ka mestima isecanja za enzime koji vrše degradaciju. Stvaranjem velikih agregata sa HK koji su čvrsto zarobljeni unutar skele kolagena, AGG mimik može da zauzme prostor u blizini kolagena, i spreči pristup enzima mestima degradacije.
PRIMER 8
Difuzija peptidoglikana kroz matriks hrskavice
[0125]Eksplanti hrskavice se dobijaju iz noseće oblasti zglobova kolena tri meseca starog govečeta. Prirodni agrekan se otklanja iz sakupljenih eksplanata hrskavice i ostavlja se matriks koji se primarno sastoji iz kolagena tipa II i ostatka GAG. Ovo se postiže tretiranjem eksplanata sa 0,5% (w/v) tripsinom u HBSS na 3 sata na 37 °C (Slika 13). Nakon tretiranja tripsinom eksplanti se ispiraju tri puta HBSS-om i inkubiraju sa 20 % FBS da se inaktiviraju ostaci aktivnosti tripsina. Peptidoglikan se rastvara u destilovanoj vodi na lOmM koncentracije i prostire se kroz zglobnu površinu eksplanata hrskavice postavljanjem lOmL rastvora na površinu svakih 10 min za jedan sat na sobnoj temperaturi (Slika 14). Normalna hrskavica i hrskavica bez agrekana tretiraju se sa IX PBS kao pozitivne i negativne kontrole redom. Nakon difuzije, eksplanti se ispiraju tri puta sa IX PBS i čuvaju na -20°C do daljnjeg testiranja. Difuzija peptidoglikana se potvrđuje bojenjem srednje-sagitalnog dela tkiva sa bojom streptavidin-peroksidaze rena. Boja streptavidin se vezuje za obeleženi molekul biotina i oslikava se kao braon boja (Slike 15 i 16).
PRIMER 9
Najveće testiranje kompresije
[0126]Pomeranjem-kontrolisana neograničena kompresija se izvodi na AR-G2 reometru sa prenosiocima sile koji su sposobni da detektuju normalne sile u opsegu od 0,01-50 N (TA instrumeti). Eksplanti se zalepe na hidrofobno štampani klizač (Tekdon) i pokriju u IX PBS kadi. Paralelna ploča geometrijske glave od nerđajućeg čelika prečnika 20mm spušta se dok se ne napravi inicijalni kontakt. Visina eksplanta se meri upotrebom digitalnog mikrometra (Duratool). Kompresivna opterećenja od 0-30% nominalnog naprezanja (u 5% intervalima) primenjuju se na eksplante kroz postepeno naprezanje koje uljučuje trajanje ulaza od 5 sek (tj., deformacija pri naprezanju od 1,0 %/sek) i vreme pauze od 30 sek. Vrednosti kompresivne čvrstine dobiju se korišćenjem nagiba uravnoteženih vrednosti pritiska, koje su računate u svakoj sekciji pauze u odnosu na odgovarajuće vrednosti pritiska, koje se zasnivaju na linearnom modelu uklapanja. Skele koje se testiraju na najveći pritisak uključuju : 1) Normalnu hrskavicu, 2) Hrskavicu bez agrekana (AD), i 3) AD+mAGC (Slika 17). Dodavanje HK vezane peptidoglikanima (mAGC) značajno obnavlja jačinu eksplanata hrskavice do većeg stepena u poređenju sa vezivanjem kolagena tipa II vezanog za peptidoglikan (mAG(ll)C).
PRIMER 10
Životinjski model
[0127]Sprague-Davvlev pacovi (250~300g) se koriste za operaciju. Patelarna tetiva, prednji zadnji ukršteni ligamenti i srednji, bočni kolateralni ligamenti se presecaju. Srednji bočni meniskusi se u potpunosti menisektomiziraju. Kapsula zgloba kolena se obnavlja šavom koji apsorbuje i koža se zatvara sa 4-0 jednofilamentnim najlonom. Sa početkom u nedelji 4,10 pl od 1 pm mAGC se daje nedeljno.
[0128]Opseg zapaljenja je naznačen MMP-13 probom (Slika 18) u Sprague-Davvlev pacovima tretiranim sa ili bez peptidoglikana u četvrtoj, šestoj, i osmoj nedelji nakom operacije (Slika 19). Slike X-zračenja zglobova kolena Sprague-Davvlev pacova prikazuju povređeno koleno 6 nedelja i 8 nedelja prateći uspostavljanje OA (Slika 20, Paneli A i D, redom), povređeno koleno sa tretmanom peptidoglikana (Slika 20, Paneli B i E, redom), i normalno koleno (Slika 20, Panel C) šest nedelja nakon operacije indukovanja osteoartritisa. MikroCT Sprague-Davvlev pacova pokazuju ponovni rast nove hrskavice šest i osam nedelja nakon operacije indukcije OA. Prikazana su povređena kolena 6 nedelja i 8 nedelja prateći indukciju OA (Slika 21, Paneli A i D, redom), povređena kolena prateći tretman peptidoglikanom (Slika 21, Paneli B i E redom), i normalno koleno (Slika 21, Panel C).
PRIMERU
Reagensi
[0129]Peptid GAHWQFNALTVRGGGC (GAH) se kupuje od Genscript (Piscatavvav, NJ). N-[B-maleimidopropionskakiselina] hidrazid, so trifluorosirćetne kiseline (BMPH) se kupuje od Pierce (Rockford, IL). Pacovski tip I kolagen repa se kupuje od BD Biosciences (Bedford, MA). Humani rekombinantni interleukin-lB se kupuje od Peprotech (Rockv Hill, NJ). Sve druge zalihe se kupuju od VWR (West Chester, PA) ili Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) ukoliko nije drugačije naznačeno.
PRIMER 12
Sinteza skele kolagena
[0130] Skele kolagena se pripremaju u TES puferu (60 mM TES, 20 mM Na2P04, 0,56 M NaCI) na pH od 7,6. Kompozicija skele za mehaničko testiranje iin vitrotestiranje zapaljenskih modela se opisuju u odgovarajućim sekcijama. Svi rastvori se drže na ledu dok ne počne fibrilogeneza na 37<*>C. Poravnane skele kolagena se prave postavljanjem rastvora kolagena u izocentar od 9.4 Teslinog magneta (Chemagnetics CMX400) na 37 °C na jedan sat, gde se neporavnani gelovi pripremaju slično ali bez izlaganja magnetu. Klizač koji sadrži rastvor kolagena se postavlja paralelno prema magnetnom polju, orijentisanjem vlakana kolagena u perpendikularnom pravcu prema dnu klizača. Gelovi se potom održavaju na 37 "C 24 sata u komori koja kontroliše vlažnost da se spreči evaporacija.
PRIMER 13
Reološko mehaničko testiranje
[0131]Testiranje smicanja i kompresije se izvodi na AR-G2 reometru sa kontrolisanim pritiskom (TA instrumenti) pomoću paralelne ploče sa geometrijskom glavom od nerđajućeg čelika prečnika 20mm. Skele kolagena se pripremaju na hidrofobno štampanim klizačima prečnika 20 mm (Tekdon). Za testove smicanja, geometrijska glava se spušta sve dok kontakt ne napravi procep visine 950 pm Preliminarna osciiovanja frekvencije i pritisaka se vrše da se odredi opseg modula skladištenja linearnih i nezavisnih od pritiska. Oscilovanje frekvencije se potom izvode na svim gelovima sa oscilatornim pritiscima od 0.2 Pa preko opsega frekvencije od 0.1 do 2 Hz. Za testove kompresije, geometrijska glava se snižava sve dok se kontakt ne napravi sa skelom na procepu visine od 1000 pm. Kompresivna opterećenja od 0-30% nominalnog naprezanja (od 5% intervala) primenjuju se na skelu kolagena kroz višestepeno opterećenje koje obuhvata trajanje rampe od 5 sek (tj. deformacije pri naprezanju od 1,0% sek) i vremenom zadržavanja od 30s. Vrednosti kompresivne krutosti se dobijaju upotrebom nagiba ravnotežnih vrednosti pritiska, koji se računaju tokom svake sekcije zadržavanja, u odnosu na odgovarajuće vrednosti deformacija, na osnovu modela linearnog uklapanja. Kompozicija skele kolagena za mehaničke testove su: 1) Neporavnani kolagen, 2) Poravnani kolagen, 3) Neporavnani kolagen+mAGC and 4) Poravnani kolagen+mAGC.
[0132]Najveća mehanička analiza:imitator agrekana, mAGC, pojačava najveća mehanička svojstva skela, bez obzira na poravnanje vlakana (Slika 22). Za testiranje smicanja, vrednosti modula skladišta od 0.5 Hz za neporavnane i poravnane gelove kolagena su 104.1+-63.6 Pa i 49.9 +-65.4 Pa redom. Dodavanje mAGC skeli kolagena pokazuje značajno povećanje u modulima skladištenja neporavnanih i poravnanih gelova do 113.96+-4.6 Pa i 76.6+-3.6 Pa redom (p<0,001). Neporavnani gelovi pokazuju veći modul skladištenja u poređenju sa poravnanim gelovima (p<0,0001). Za testiranje kompresije, kompresiona jačina za poravnane skele (2478+-250) Pa je niža nego kod neporavnanih skela (3564+-315 Pa) (p<0.001). Dodavanje mAGC ovim sistemima skela povećava kompresionu jačinu proravnanih i neporavnaninih skela do 4626+-385 Pa i 5747+-306 Pa, redom (p<0.0001).
PRIMER 14
In vitro model zapaljenja
[0133]Mreže kolagena se zaseju hondrocitima i stimulišu IL-B i procenjuju se za produkte degradacije.
[0134]Izolacija hondrocita:Primarni hondrociti se pokupe iz zglobova kolena tri meseca starog govečeta koji se dobija iz klanice u okviru 24 časa nakon klanja (Dutch Vallev Veal). Preseci hrskavice, debljine 150-200pm su dobijeni iz bočne femoralne kondile i oprani tri puta u medijumu DMEM/F-12 bez seruma (50 pg/mL askorbinske kiseline 2-fosfat, 100 pg/mL natrijum piruvat, 0,1 % albumin iz seruma govečeta, 100 jedinica/mL penicilin, 100 pm/mL streptomicin i 25 mM HEPES) pre razlaganja 3% serumom fetusa govečeta (FBS) i 0,2% kolagenazom-P (Roche Pharmaceuticals) na 37°C po šest sati. Oslobođeni hondrociti se filtriraju kroz 70 mm ćelijsko sito i centrifugiraju na 1000 rpm tri puta po 5 min svaki u gore navedenom medijumu dopunjenom sa 10% FBS. Ćelijski talog se resuspenduje u 10% FBS dopunjenom medijumu i postavlja u posude od 10 cm sa 10000 ćelija/mL u 37 °C, 5%C02vlažnom inkubatoru do postizanja konfluentnosti.
[0135]Fabrikacija skele:Nakon postizanja konfluentnosti, ćelije se tripsinizuju i obuhvataju lOOOOćelija/mL u skelama kolagena (Tabela 3) i dozvoljeno je da se uravnoteže po 3 dana pred tretman.
[0136]Model zapaljenja:Konstrukti se inkubiraju sa ili bez 20 ng/mL IL-lB u hemijski definisanom medijumu dopunjenom sa 5% FBS i antibioticima (100 jedinica/mL penicilina i 100 pg/mL streptomicina). Medijum kulture se zamenjuje svaka dva dana. Uklonjeni ekstrakti medija se čuvaju na -80°C do daljeg testiranja.
[0137]Test degradacije:Degradacija GAG se prati merenjem oslobođenog HS u medijumu kulture ćelija upotrebom dimetilmetilensko plavo (DMMB) bojom testa i sračunato sa standardnom krivom hondroitin-6-sulfata. Slično, degradacija kolagena tip I u kulturi ćelija se prati upotrebom Sircol Kolagen Testa korišćenjem protokola koji se određuje prema proizvođaču (Bio-Colol). GAG i degradacija kolagena se prikazuju kao ukupno oslobađanje tokom osmodnevnog perioda kultivacije.
[0138]Analiza proteolitičke degradacije:Količina HS i kolagena koji se oslobađaju u medijum ćelijske kulture se značajno smanjuje kada skele sadrže mAGC (Slike 11, 12, 23 i 24) (pHS<0,001 iPkOiagen<0,02 , redom). Poravnani gelovi kolagena pokazuju statistički veće oslobađanje HS i kolagena u medijum u poređenju sa neporavnanim vlaknima kolagena (p<0,001).
[0139]Kao što je ovde opisano, sintetički peptidoglikan koji vezuje hijaluronsku kiselinu može da zaštiti HK i vlakna kolagena koja se nalaze ispod u skeli od proteolitičkog isecanja. Sinteza sintetičkog peptidoglikana koji vezuje hijaluronsku kiselinu se koristi za hondrozaštitine prednosti HS. HS pokazao da ograničava stvaranje matriksnih metaloproteinaza. Naš dizajn sintetičkih peptidoglikana kako je ovde opisano omogućava lancima HS da se zakače za HK, spreče degradaciju oba molekula. Postavljanjem sintetičkih peptidoglikana u okruženje koje je bogato proteolitičkim enzimima, pokazuje se njegova sposobnost da spreči prekomerni gubitak komponenti VĆM.
PRIMER 15
PCR u realnom vremenu
[0140] Sledeći ispitivanje ćelijske kulture, konstrukti se čuvaju u kasnom rastvoru RNK (Ambion) na 4 °C na manje od jedne nedelje. Totalna iRNK se izoluje korišćenjem Nucleospin RNA II (Clontech) prema protokolima proizvođača. Izolovana iRNK iz svih uzoraka se kvantifikuje korišćenjem Nanodrop 2000 spektrofotometra (Thermo Scientific) i reverzno transkribuje u cDNK korišćenjem kita Visokog Kapaciteta cDNK Reverzne Transkriptaze (Applied Biosvstems). PCR u realnom vremenu se izvodi korišćenjem testova Taqman genske ekspresije (Applie Biosvstems) sa sledećim prajmerima: GAPDH
(Bt03210913_gl), agrekan (Bt03212186_ml) i kolagen tip II (Bt03251861_ml). 60ng cDNK templejta se pravi po 20 ul reakciji za dva gena od interesa i unutrašnjeg gena. Analiza PCR-a u realnom vremenu se izvodi upotrebom Taqman PCR Master Mix-a i 7500 Sistema PCR-a u realnom vremenu (Applied Biosvstems). Dobijeni podaci se normalizuju prema GAPDH ekspresiji gena.
[0141]Analiza ekspresije iRNK:Pravnanje kolagena, prisustvo imitatora agrekana i stimulacija sa IL-lB značajno utiče na agrekan (PporaVnanja<<>0,001, ppeptidogiikana<0,02 i PIL-ip<0,001) i ekspresija kolagena tipa II (Poravnanja <0,01, peptidoglikana <0,001 i plL-lB<0,015). Prisustvo mAGC ograničava prekomerni gubitak HS iz skele, što za rezultat ima sniženu ekspresiju agrekana (p<0,02) (Slika 25). Prisustvo mAGC takođe ograničava degradaciju kolagena (Slika 25). Međutim, ekspresija kolagena tipa II zavisi od stepena u kom se kolagen gubi tokom degradacije (Slika 25). U neporavnanim skelama, nivo ekspresije kolagena tipa II je veći u skelama koje su pripremljene bez mAGC, dok u poravnanim skelama kolagena, nivo kolagena tipa II je veći u skelama pripremljenim sa mAGC (p<0,05).
PRIMER 16
Statistička analiza
[0142] Svaki eksperiment se ponavlja dvaput, sa najmanje n=3 u svakom skupu podataka. Statistička značajnost za podatke mehaničkog testiranja se analizira jednostuki ANOVA testom sa poravnanjem i dodavanjem peptidoglikana kao faktorima. Podaci ćelijske kulture se analiziraju upotrebom trostruki ANOVA sa poravnanjem dodavanjem peptidoglikana, i tretiranjem sa IL-lB kao faktorima. Naknadno upoređivanje parova Tukev analizom (a= 0,05) se koristi da direktno uporedi skele koje se pripremaju sa ili bez imitatora agrekana u svakom sistemu.

Claims (15)

1. Sintetički peptidoglikan koji vezuje hijaluronsku kiselinu i koji sadrži sintetički peptid konjugovan sa glikanom, gde sintetički peptid obuhvata sekvencu koja vezuje hijaluronsku kiselinu.
2. Sintetički peptidoglikan prema zahtevu 1, gde je sintetički peptidoglikan kovalentno konjugovan sa glikanom.
3. Sintetički peptidoglikan prema zahtevu 1 ili 2, gde je glikan selektovan iz grupe koja se sastoji iz dekstrana, hondroitina, hondroitin sulfata, dermatana, dermatan sulfata, heparana, heparina, keratina i keratin sulfata.
4. Sintetički peptidoglikan prema bilo kom zahtevu 1-3 koji ima formulu PnGu gde je G glikan a P je sintetički peptid od oko 5 do oko 40 amino kiselina koji sadrži sekvencu koja vezuje hijaluronsku kiselinu.
5. Sintetički peptidoglikan prema zahtevu 4, gde je x od 1 do 20, i po potrebi, gde je n od 1 do 20.
6. Sintetički peptidoglikan prema bilo kom od zahteva 1-5, gde sintetički peptid obuhvata sekvencu aminokiseline formule B1-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-B2, gde X8 je prisutan ili nije prisutan, gde BI je bazna amino kiselina, gde B2 je bazna amino kiselina, i gde Xl-X8 su ne-kisele aminokiseline.
7. Sintetički peptidoglikan prema bilo kom od zahteva 1 do 6, gde komponenta peptida sintetičkog peptidoglikana obuhvata sekvencu aminokiseliine odabranu iz grupe koju čine:
8. Sintetički peptidoglikan prema bilo kom od zahteva 1 do 6, gde sintetički peptid obuhvata sekvencu aminokiseline selektovanu iz grupe koju čine: sekvenca aminokiseline modifikovane od bilo koje od SEQ ID NO:2-34 uključujući jednu ili više konzervativnih supstitucija amino kiselina.
9. Sintetički peptidoglikan prema bilo kom od zahteva 1 do 8, gde je sintetički peptidoglikan otporan na agrekanazu.
10. Sintetički peptidoglikan prema bilo kom od zahteva 1 do 9, gde komponenta peptida od sintetičkog peptidoglikana ima glicin-cistein koji je vezan za za C-kraj peptida.
11.Sintetički peptidoglikan prema bilo kom od zahteva 1 do 10, gde je sintetički peptidoglikan otporan na matriksne metaloproteaze.
12. Projektovani matriks kolagena koji obuhvata polimerizovani kolagen, hijaluronsku kiselinu, i sintetički peptidoglikan koji vezuje hijaluronsku kiselinu prema bilo kom od zahteva 1-11.
13. Projektovani matriks kolagena iz zahteva 12, gde matriks dalje sadrži egzogenu populaciju ćelija.
14. Sintetički peptidoglikan koji vezuje hijaluronsku kiselinu prema bilo kom od zahteva 1-11 za upotrebu u postupku lečenja atritisa kod pacijenta.
15. Sintetički peptidoglikan koji vezuje hijaluronsku kiselinu za upotrebu prema zahtevu 14, gde je artritis osteoartritis ili reumatoidni artritis.
RS20170300A 2011-05-24 2012-05-24 Sintetički peptidoglikani koji vezuju hijaluronsku kiselinu, priprema i postupci upotrebe RS55823B1 (sr)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201161489602P 2011-05-24 2011-05-24
US201161550621P 2011-10-24 2011-10-24
EP12788776.8A EP2714718B1 (en) 2011-05-24 2012-05-24 Hyaluronic acid-binding synthetic peptidoglycans, preparation, and methods of use
PCT/US2012/039404 WO2012162534A2 (en) 2011-05-24 2012-05-24 Hyaluronic acid-binding synthetic peptidoglycans, preparation, and methods of use

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS55823B1 true RS55823B1 (sr) 2017-08-31

Family

ID=47218093

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20170300A RS55823B1 (sr) 2011-05-24 2012-05-24 Sintetički peptidoglikani koji vezuju hijaluronsku kiselinu, priprema i postupci upotrebe

Country Status (24)

Country Link
US (4) US9217016B2 (sr)
EP (2) EP3208278B1 (sr)
JP (3) JP6069307B2 (sr)
KR (1) KR102006036B1 (sr)
CN (2) CN106117318A (sr)
AU (1) AU2012258706B2 (sr)
BR (1) BR112013030086A2 (sr)
CA (1) CA2837096A1 (sr)
CY (1) CY1118885T1 (sr)
DK (1) DK2714718T3 (sr)
ES (2) ES2619688T3 (sr)
HR (1) HRP20170482T1 (sr)
HU (1) HUE031596T2 (sr)
IL (1) IL229539B (sr)
LT (1) LT2714718T (sr)
MX (1) MX349693B (sr)
PL (1) PL2714718T3 (sr)
PT (1) PT2714718T (sr)
RS (1) RS55823B1 (sr)
RU (1) RU2617844C2 (sr)
SG (2) SG10201604171WA (sr)
SI (1) SI2714718T1 (sr)
SM (1) SMT201700169T1 (sr)
WO (1) WO2012162534A2 (sr)

Families Citing this family (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
HRP20190691T1 (hr) 2008-03-27 2019-07-12 Purdue Research Foundation Sintetički peptidoglikani koji vezuju kolagen, priprema, i postupci upotrebe
EP3208278B1 (en) 2011-05-24 2018-10-31 Symic IP, LLC Hyaluronic acid-binding synthetic peptidoglycans, preparation, and methods of use
MX365599B (es) 2012-11-08 2019-06-07 Phi Pharma Sa Moleculas de transporte especificas de proteoglicano c4s.
WO2014144969A1 (en) * 2013-03-15 2014-09-18 Purdue Research Foundation Extracellular matrix-binding synthetic peptidoglycans
EP2994484A4 (en) * 2013-05-09 2016-11-16 Agency Science Tech & Res MODIFIED COLLAGEN MOLECULES
WO2015164822A1 (en) 2014-04-25 2015-10-29 Purdue Research Foundation Collagen binding synthetic peptidoglycans for treatment of endothelial dysfunction
WO2015175565A2 (en) * 2014-05-12 2015-11-19 Purdue Research Foundation Selectin and icam/vcam peptide ligand conjugates
WO2016061145A1 (en) 2014-10-13 2016-04-21 Symic Biomedical, Inc. Synthetic proteoglycans for preventing tissue adhesion
JP6693728B2 (ja) * 2014-11-14 2020-05-13 興和株式会社 新規な機能性ペプチド
BR112017021970A2 (pt) * 2015-04-17 2018-07-10 Symic Ip Llc bioconjugados e usos dos mesmos
US10696722B2 (en) 2016-08-10 2020-06-30 Ajou University Industry-Academic Cooperation Foundation Heterodimeric Fc-fused cytokine and pharmaceutical composition comprising the same
JP2020526493A (ja) 2017-07-07 2020-08-31 サイミック アイピー， エルエルシー 化学的に修飾された主鎖を有するバイオコンジュゲート
AU2018298224B2 (en) 2017-07-07 2024-08-15 Symic Ip, Llc Synthetic bioconjugates
CN109260457B (zh) * 2017-07-18 2023-06-13 苏州高泓利康生物科技有限公司 一种透明质酸-白介素10复合物、其制备方法及其应用
SG11202104136YA (en) 2018-10-23 2021-05-28 Dragonfly Therapeutics Inc Heterodimeric fc-fused proteins
US12576190B2 (en) * 2019-08-15 2026-03-17 Axogen Corporation Tissue repair membrane adapted for adhesion and lubrication, and methods for preparing the same
AU2020346613B2 (en) * 2019-09-09 2025-11-06 Computer Reel Designs Pty Limited Article and dressing for improved healing and methods of use
MX2022013112A (es) 2020-04-22 2023-01-16 Dragonfly Therapeutics Inc Fórmulacion, regimen de dosificación y proceso de manufactura de proteínas heterodiméricas fusionadas con fc.
US20240101621A1 (en) * 2021-01-26 2024-03-28 Immunis, Inc. Molecular superstructure and methods of use thereof
US12059430B2 (en) 2022-09-29 2024-08-13 Adora Animal Health Corporation Storage stable formulations of sulfated glycosaminoglycans and fragments derived therefrom for the treatment of pain and other medical conditions
KR102912013B1 (ko) * 2025-04-16 2026-01-15 주식회사 와이유 주사용 바이오 스티뮬레이터 겔의 제조 방법

Family Cites Families (132)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4683298A (en) 1985-01-10 1987-07-28 British Columbia Research Council Process for the preparation of aminated polysaccharide derivatives
US5547936A (en) 1985-06-17 1996-08-20 La Jolla Cancer Research Foundation Inhibition of cell migration with synthetic peptides
AU628910B2 (en) 1988-12-20 1992-09-24 La Jolla Cancer Research Foundation Polypeptide-polymer conjugates active in wound healing
US5693625A (en) 1989-03-09 1997-12-02 Therapeutiques Substitutives Method of regenerating cells and tissues using functionalized dextrans
FR2644066B1 (fr) 1989-03-09 1994-05-13 Therapeutiques Substitutives Compositions stabilisees comprenant des fgfs, leur procede d'obtention et leurs applications therapeutiques, chirurgicales et cosmetologiques
DE69230136T2 (de) 1991-01-14 2000-05-25 New York University, New York Cytokin-induziertes protein, tsg-6, seine dna und verwendung
JP2901787B2 (ja) 1991-07-15 1999-06-07 日本メジフィジックス株式会社 核磁気共鳴造影剤
FR2718023B1 (fr) 1994-03-30 1996-08-14 Paris Val Marne Universite Médicament et composition pharmaceutique pour le traitement de lésions du tractus digestif.
WO1997022371A1 (en) 1995-12-18 1997-06-26 Collagen Corporation Crosslinked polymer compositions and methods for their use
CA2299687C (en) 1997-08-04 2009-10-27 Bio Syntech Ltd. Temperature-controlled ph-dependant formation of ionic polysaccharide gels
US5997895A (en) 1997-09-16 1999-12-07 Integra Lifesciences Corporation Dural/meningeal repair product using collagen matrix
JP2002536958A (ja) 1997-11-21 2002-11-05 ジェンセット Ｃｈｌａｍｙｄｉａｐｎｅｕｍｏｎｉａｅゲノム配列およびポリペプチド、それらのフラグメント、ならびに特に感染症の診断、予防および治療のためのそれらの使用
US7691829B2 (en) 1998-03-24 2010-04-06 Petito George D Composition and method for healing tissues
FR2781485B1 (fr) 1998-07-21 2003-08-08 Denis Barritault Polymeres biocompatibles leur procede de preparation et les compositions les contenant
JP3103531B2 (ja) 1998-09-30 2000-10-30 延也 柳内 ヒト尿由来細胞接着糖蛋白質及びその製造方法
US6822071B1 (en) 1998-11-12 2004-11-23 The Regents Of The University Of California Polypeptides from Chlamydia pneumoniae and their use in the diagnosis, prevention and treatment of disease
US6703491B1 (en) 1999-03-17 2004-03-09 Exelixis, Inc. Drosophila sequences
US6864235B1 (en) * 1999-04-01 2005-03-08 Eva A. Turley Compositions and methods for treating cellular response to injury and other proliferating cell disorders regulated by hyaladherin and hyaluronans
US20110214206A1 (en) 1999-05-06 2011-09-01 La Rosa Thomas J Nucleic acid molecules and other molecules associated with plants
US20090087878A9 (en) 1999-05-06 2009-04-02 La Rosa Thomas J Nucleic acid molecules associated with plants
FR2794976B1 (fr) 1999-06-16 2004-05-07 Solutions Compositions pharmaceutiques a action cicatrisante ou anti-complementaire comprenant un derive de dextrane
DE60043736D1 (de) 1999-09-15 2010-03-11 Euclid Systems Corp Zusammensetzung zur stabilisierung des corneagewebon kontaktlinsen
FR2799465B1 (fr) 1999-10-12 2004-02-13 Centre Nat Rech Scient Peptides ayant une activite de stimulation de la reponse immunitaire et de regeneration tissulaire
US20030158302A1 (en) 1999-12-09 2003-08-21 Cyric Chaput Mineral-polymer hybrid composition
ATE243049T1 (de) 1999-12-09 2003-07-15 Biosyntech Canada Inc Mineral-polymer hybrid-zusammensetzung
US7671018B2 (en) 2000-08-30 2010-03-02 University Of Delaware Delivery system for heparin-binding growth factors
WO2002018423A1 (en) 2000-08-31 2002-03-07 University Of Delaware Bioactive peptide for cell adhesion
AU2002211517A1 (en) 2000-10-04 2002-04-15 California Institute Of Technology Magnetic resonance imaging agents for in vivo labeling and detection of amyloid deposits
WO2002040070A2 (en) 2000-11-15 2002-05-23 Bio Syntech Canada Inc. Method for restoring a damaged or degenerated intervertebral disc
AU2002359236A1 (en) 2001-07-13 2003-04-14 Advanced Research And Technology Institute Peptidoglycan recognition protein encoding nucleic acids and methods of use thereof
EP1423133B1 (en) 2001-08-15 2009-01-14 Brown University Research Foundation Treatment of muscular dystrophies and related disorders
EP1448607B1 (en) 2001-11-15 2011-01-05 Biosyntech Canada Inc. Composition and method to homogeneously modify or cross-link chitosan under neutral conditions
CA2412012C (en) * 2001-11-20 2011-08-02 Ed. Geistlich Soehne Ag Fuer Chemische Industrie Resorbable extracellular matrix containing collagen i and collagen ii for reconstruction of cartilage
US20090158452A1 (en) 2001-12-04 2009-06-18 Johnson Richard G Transgenic plants with enhanced agronomic traits
US20090100536A1 (en) 2001-12-04 2009-04-16 Monsanto Company Transgenic plants with enhanced agronomic traits
US20050108791A1 (en) 2001-12-04 2005-05-19 Edgerton Michael D. Transgenic plants with improved phenotypes
JP4489437B2 (ja) * 2002-02-21 2010-06-23 エンセル，インコーポレイテッド 表面コーティングとしての固定化生物活性ヒドロゲルマトリックス
US20030220253A1 (en) 2002-03-08 2003-11-27 Lasser Gerald W. Inhibitors for use in hemostasis
US7666852B2 (en) 2002-04-22 2010-02-23 Agenta Biotechnologies, Inc. Wound and cutaneous injury healing with a nucleic acid encoding a proteoglycan polypeptide
JP2005185101A (ja) 2002-05-30 2005-07-14 National Institute Of Agrobiological Sciences 植物の全長ｃＤＮＡおよびその利用
US8673333B2 (en) 2002-09-25 2014-03-18 The Johns Hopkins University Cross-linked polymer matrices, and methods of making and using same
US7862831B2 (en) 2002-10-09 2011-01-04 Synthasome, Inc. Method and material for enhanced tissue-biomaterial integration
US20090183270A1 (en) 2002-10-02 2009-07-16 Adams Thomas R Transgenic plants with enhanced agronomic traits
CA2501238A1 (en) 2002-10-04 2004-04-22 Regents Of The University Of Minnesota Nucleic acid and polypeptide sequences from lawsonia intracellularis and methods of using
FR2846659B1 (fr) 2002-10-30 2005-02-18 Centre Nat Rech Scient Fragments peptidiques du facteur harp inhibant l'angiogenese
AU2003294318A1 (en) 2002-11-15 2004-06-15 Arizona Board Of Regents Arizona State University Therapeutic bioconjugates
WO2004085418A2 (en) 2003-03-24 2004-10-07 Luitpold Pharmaceuticals, Inc. Xanthones, thioxanthones and acridinones as dna-pk inhibitors
RU2249462C1 (ru) * 2003-08-21 2005-04-10 Севастьянов Виктор Иванович Универсальный гетерогенный коллагеновый матрикс для имплантации и способ его получения
WO2005019429A2 (en) 2003-08-22 2005-03-03 Potentia Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for enhancing phagocytosis or phagocyte activity
CA2543530C (fr) 2003-10-28 2014-02-04 Denis Barritault Utilisation de polymeres biocompatibles pour la preparation d'une composition ou d'un dispositif medical
FR2861308A1 (fr) 2003-10-28 2005-04-29 Organes Tissus Regeneration Re Utilisation de polymeres biocompatibles pour la preparation d'une composition pharmaceutique, dermatologique ou cosmetique destinee a la prevention, au soulagement ou au traitement des genes, desagrements et douleurs
EP1694247A2 (en) 2003-12-15 2006-08-30 Technion Research And Development Foundation, Ltd. Therapeutic drug-eluting endoluminal covering
US7842667B2 (en) 2003-12-22 2010-11-30 Regentis Biomaterials Ltd. Matrix composed of a naturally-occurring protein backbone cross linked by a synthetic polymer and methods of generating and using same
EP1722834B1 (en) 2003-12-22 2012-06-27 Regentis Biomaterials Ltd. Matrix comprising naturally-occurring crosslinked protein backbone
US7709439B2 (en) 2004-02-20 2010-05-04 Boston Scientific Scimed, Inc. Biomaterials for enhanced healing
US20060041961A1 (en) 2004-03-25 2006-02-23 Abad Mark S Genes and uses for pant improvement
EP1758931A1 (en) 2004-05-31 2007-03-07 National University of Singapore Peptides derived from decorin leucine rich repeats and uses thereof
US20060075522A1 (en) 2004-07-31 2006-04-06 Jaclyn Cleveland Genes and uses for plant improvement
EP1796690A4 (en) 2004-09-22 2011-08-03 Cartilix Inc KNORPELFÜLLVORRICHTUNG
JP5042025B2 (ja) 2004-09-29 2012-10-03 ナショナル ユニヴァーシティー オブ シンガポール 複合物、複合物の製造方法、およびその使用方法
US20060241022A1 (en) 2004-10-06 2006-10-26 Bowen Benjamin P Selectin targeting bioconjugates
US20080102438A1 (en) 2004-10-27 2008-05-01 Yannas Ioannis V Novel Technique to Fabricate Molded Structures Having a Patterned Porosity
US8283414B2 (en) 2004-11-23 2012-10-09 The Johns Hopkins University Compositions comprising modified collagen and uses therefor
EP1853278A4 (en) 2005-02-18 2011-12-28 Cartilix Inc MATERIALS COMPRISING GLUCOSAMINE
WO2006089119A2 (en) 2005-02-18 2006-08-24 Cartilix, Inc. Biological adhesive
WO2006096614A2 (en) 2005-03-04 2006-09-14 Northwestern University Angiogenic heparin binding peptide amphiphiles
GB2424223C (en) 2005-03-07 2011-02-02 Massachusetts Inst Technology Biomaterial.
US7737131B2 (en) 2005-03-31 2010-06-15 University Of Delaware Multifunctional and biologically active matrices from multicomponent polymeric solutions
US8415325B2 (en) 2005-03-31 2013-04-09 University Of Delaware Cell-mediated delivery and targeted erosion of noncovalently crosslinked hydrogels
US8367639B2 (en) 2005-03-31 2013-02-05 University Of Delaware Hydrogels with covalent and noncovalent crosslinks
US8338390B2 (en) 2005-03-31 2012-12-25 University Of Delaware Multifunctional and biologically active matrices from multicomponent polymeric solutions
US7732427B2 (en) 2005-03-31 2010-06-08 University Of Delaware Multifunctional and biologically active matrices from multicomponent polymeric solutions
EP2478760A1 (en) 2005-05-10 2012-07-25 Monsanto Technology LLC Genes and uses for plant improvement
CA2610791C (en) * 2005-06-08 2015-12-01 Cangene Corporation Hyaluronic acid binding peptides enhance host defense against pathogenic bacteria
US20080069774A1 (en) 2005-11-17 2008-03-20 Lance Liotta Proteomic antisense molecular shield and targeting
CN101374860A (zh) * 2005-12-23 2009-02-25 技术转让合伙人公司 用作神经递质分泌抑制剂和肌肉松弛诱导物的合成肽
EP1996115B1 (en) 2006-03-07 2014-11-26 Axle International Bioactive scaffold for therapeutic and adhesion prevention applications
US20070212385A1 (en) 2006-03-13 2007-09-13 David Nathaniel E Fluidic Tissue Augmentation Compositions and Methods
US7919111B2 (en) 2006-03-15 2011-04-05 Surmodics, Inc. Biodegradable hydrophobic polysaccharide-based drug delivery implants
CA2644273A1 (en) 2006-04-05 2008-03-27 Metanomics Gmbh Process for the production of a fine chemical
GB0610395D0 (en) 2006-05-25 2006-07-05 Ge Healthcare Ltd Novel imaging agents
US20090162436A1 (en) 2006-06-14 2009-06-25 Carson Daniel D Compositions and methods for repair of tissues
PL2068918T5 (pl) 2006-09-26 2024-12-02 Access To Advanced Health Institute Kompozycja szczepionki zawierająca syntetyczny adiuwant
US7592009B2 (en) 2006-10-10 2009-09-22 Ecole Polytechnique Federale De Lausanne (Epfl) Polypeptide ligands for targeting cartilage and methods of use thereof
US8114834B2 (en) 2006-11-09 2012-02-14 Northwestern University Self-assembling peptide amphiphiles
US8114835B2 (en) 2006-11-09 2012-02-14 Northwestern University Self-assembling peptide amphiphiles for tissue engineering
WO2008066816A2 (en) 2006-11-28 2008-06-05 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Derivatization or ligaton of peptides
WO2008136869A2 (en) 2006-12-06 2008-11-13 Burnham Institute For Medical Research Methods and compositions related to targeting wounds, regenerating tissue, and tumors
WO2008070179A2 (en) 2006-12-06 2008-06-12 Monsanto Technology, Llc Genes and uses for plant improvement
TR201809112T4 (tr) 2007-04-16 2018-07-23 Regentis Biomaterials Ltd İskele oluşturmak i̇çi̇n bi̇leşi̇mler ve yöntemler.
US20100119577A1 (en) 2007-05-06 2010-05-13 Byoung-Hyun Min Therapeutic composite for cartilage disorder using extracellular matrix (ecm) scaffold
WO2008152639A2 (en) 2007-06-12 2008-12-18 Bypass, Inc. Pressure pulse actuating device for delivery systems
US20090075281A1 (en) 2007-07-10 2009-03-19 Regents Of The University Of California Mtbe genes
US7993679B2 (en) 2007-09-25 2011-08-09 Integra Lifesciences Corporation Flowable wound matrix and its preparation and use
WO2009048280A2 (en) 2007-10-09 2009-04-16 Postech Academy-Industry Foundation Long acting hyaluronic acid - peptide conjugate
US9029636B2 (en) 2008-02-05 2015-05-12 Monsanto Technology Llc Isolated novel nucleic acid and protein molecules from soy and methods of using those molecules to generate transgenic plants with enhanced agronomic traits
HRP20190691T1 (hr) 2008-03-27 2019-07-12 Purdue Research Foundation Sintetički peptidoglikani koji vezuju kolagen, priprema, i postupci upotrebe
US8343942B2 (en) 2008-04-04 2013-01-01 University Of Utah Research Foundation Methods for treating interstitial cystitis
AU2009231634B2 (en) 2008-04-04 2014-05-15 University Of Utah Research Foundation Alkylated semi-synthetic glycosaminoglycosan ethers, and methods for making and using thereof
US20100004196A1 (en) 2008-06-17 2010-01-07 Hopitaux Universitaires De Geneve Heparan sulfate proteoglycan composition and use thereof
US8207264B2 (en) * 2008-07-11 2012-06-26 Tyco Healthcare Group Lp Functionalized inclusion complexes as crosslinkers
WO2010011857A2 (en) 2008-07-23 2010-01-28 The Johns Hopkins University Parenteral administration of a glucosamine
US20110269208A1 (en) 2008-08-15 2011-11-03 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Cross-linked polymer network formed by sequential cross-linking
US20130014292A1 (en) 2008-09-17 2013-01-10 Pennell Roger I Transgenic plants having increased biomass
FR2936247B1 (fr) 2008-09-24 2010-10-22 Ct Hospitalier Universitaire De Dijon Proteines recombinantes a activite hemostatique capables d'induire l'agregation plaquettaire.
US9072688B2 (en) 2008-10-31 2015-07-07 The Invention Science Fund I, Llc Compositions and methods for therapeutic delivery with frozen particles
EP2358758B1 (de) 2008-11-28 2012-09-05 Zetascience GmbH Bioaktives hydrogel
KR101062068B1 (ko) 2008-12-01 2011-09-02 포항공과대학교 산학협력단 유착방지용 조성물
IL195764A0 (en) 2008-12-07 2009-11-18 Technion Res & Dev Foundation Compositions and methods for drug delivery
US9012723B2 (en) 2009-01-16 2015-04-21 Monsanto Technology Llc Isolated novel acid and protein molecules from soy and methods of using those molecules to generate transgene plants with enhanced agronomic traits
US20110182862A1 (en) 2009-04-03 2011-07-28 Green Wayne A Endophytic fungus and uses therefor
MX2011010780A (es) 2009-04-13 2011-10-28 Univ Northwestern Andamios novedosos basados en peptido para la regeneracion de cartilagos y metodos para su uso.
FI20095452A0 (fi) 2009-04-23 2009-04-23 Suomen Punainen Risti Veripalv Uudet haaraiset sokerianalyysit
US20120100106A1 (en) 2009-05-04 2012-04-26 Purdue Research Foundation Collagen-binding synthetic peptidoglycans for wound healing
GB0909671D0 (en) * 2009-06-04 2009-07-22 Xention Discovery Ltd Compounds
CN101906163B (zh) * 2009-06-05 2012-06-27 上海交通大学医学院 一种免疫避孕的合成肽和嵌合肽及其应用
EP2499167A4 (en) 2009-11-09 2013-07-10 Univ Drexel COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATING AN ILLNESS OR MALFUNCTION IN SOFT TISSUE
CA2781309A1 (en) 2009-12-04 2011-06-09 Euclid Systems Corporation Composition and methods for the prevention and treatment of macular degeneration, diabetic retinopathy, and diabetic macular edema
DK2513294T3 (en) 2009-12-16 2016-06-06 Regentis Biomaterials Ltd SKELETS FOR POLYMER-PROTEIN CONJUGATES, PROCEDURES FOR GENERATION THEREOF AND APPLICATIONS THEREOF
WO2011094149A1 (en) 2010-01-26 2011-08-04 University Of Utah Research Foundation Methods for treating or preventing the spread of cancer using semi-synthetic glycosaminoglycosan ethers
US9180161B2 (en) 2010-02-26 2015-11-10 Sanford Burnham Prebys Medical Discovery Institute CAR peptide for homing, diagnosis and targeted therapy for pulmonary and fibrotic disorders
WO2011163492A1 (en) 2010-06-23 2011-12-29 Purdue Research Foundation Collagen-binding synthetic peptidoglycans for use in vascular intervention
US9173919B2 (en) 2011-02-16 2015-11-03 Purdue Research Foundation Collagen-targeted nanoparticles
US20130101628A1 (en) 2011-04-29 2013-04-25 Northwestern University Novel vegf mimetic peptide-based scaffolds for therapeutic angiogenesis and methods for their use
EP3208278B1 (en) 2011-05-24 2018-10-31 Symic IP, LLC Hyaluronic acid-binding synthetic peptidoglycans, preparation, and methods of use
EP2804586A4 (en) 2012-01-19 2016-03-16 Univ Johns Hopkins BIOMATERIALS CONTAINING HYALURONIC ACID BINDING PEPTIDES AND BIFUNCTIONAL BIOPOLYMERMOLUCKS FOR HYALURONIC ACIDIC TREATMENT AND TISSUE RENEWAL APPLICATIONS
US9827321B2 (en) 2012-08-14 2017-11-28 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Stabilizing shear-thinning hydrogels
WO2014038866A1 (ko) 2012-09-05 2014-03-13 아주대학교산학협력단 연골세포 유래 세포외 기질막을 이용한 신생혈관질환 치료용 조성물 및 각막 또는 결막 이식재
DE102012108560B4 (de) 2012-09-13 2018-12-20 Leibniz-Institut Für Polymerforschung Dresden E.V. Nichtkovalente selbstorganisierende Hydrogelmatrix für biotechnologische Anwendungen
US20150291672A1 (en) 2012-11-01 2015-10-15 The Johns Hopkins University Contact Lens Surface Modification with Hyaluronic Acid (HA) Binding Peptide for HA Accumulation and Retention
TW201427989A (zh) 2012-12-18 2014-07-16 Novartis Ag 長效性蛋白質之組合物及方法
WO2014144969A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Purdue Research Foundation Extracellular matrix-binding synthetic peptidoglycans

Also Published As

Publication number Publication date
IL229539A0 (en) 2014-01-30
CN103732614B (zh) 2016-08-17
RU2013157191A (ru) 2015-06-27
SG10201604171WA (en) 2016-07-28
LT2714718T (lt) 2017-04-10
SI2714718T1 (sl) 2017-06-30
JP2019142877A (ja) 2019-08-29
DK2714718T3 (en) 2017-04-24
CN103732614A (zh) 2014-04-16
WO2012162534A3 (en) 2013-07-11
US20210188915A1 (en) 2021-06-24
SMT201700169T1 (it) 2017-05-08
IL229539B (en) 2019-08-29
JP2017095475A (ja) 2017-06-01
HRP20170482T1 (hr) 2017-05-19
CN106117318A (zh) 2016-11-16
EP2714718A2 (en) 2014-04-09
US20190330276A1 (en) 2019-10-31
NZ618430A (en) 2016-05-27
ES2619688T3 (es) 2017-06-26
MX2013013706A (es) 2015-02-04
US20140301983A1 (en) 2014-10-09
JP6502311B2 (ja) 2019-04-17
EP3208278B1 (en) 2018-10-31
AU2012258706B2 (en) 2017-05-18
ES2708076T3 (es) 2019-04-08
HUE031596T2 (en) 2017-07-28
JP6069307B2 (ja) 2017-02-01
RU2617844C2 (ru) 2017-04-28
US20160222064A1 (en) 2016-08-04
WO2012162534A2 (en) 2012-11-29
EP2714718A4 (en) 2015-01-14
PT2714718T (pt) 2017-04-19
BR112013030086A2 (pt) 2022-03-03
AU2012258706A1 (en) 2013-12-19
CA2837096A1 (en) 2012-11-29
US9217016B2 (en) 2015-12-22
CY1118885T1 (el) 2018-01-10
EP2714718B1 (en) 2017-01-11
KR102006036B1 (ko) 2019-07-31
JP2014518879A (ja) 2014-08-07
PL2714718T3 (pl) 2017-11-30
EP3208278A1 (en) 2017-08-23
MX349693B (es) 2017-08-09
KR20140041579A (ko) 2014-04-04
SG195114A1 (en) 2013-12-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RS55823B1 (sr) Sintetički peptidoglikani koji vezuju hijaluronsku kiselinu, priprema i postupci upotrebe
Broguiere et al. Factor XIII cross-linked hyaluronan hydrogels for cartilage tissue engineering
AU2015230796B2 (en) Collagen-binding synthetic peptidoglycans, preparation, and methods of use
DK2513294T3 (en) SKELETS FOR POLYMER-PROTEIN CONJUGATES, PROCEDURES FOR GENERATION THEREOF AND APPLICATIONS THEREOF
EP3185922B1 (en) Collagen-based therapeutic delivery systems
KR20150130419A (ko) 세포외 기질 결합성 합성 펩티도글리칸
EP3013377B1 (en) Compositions comprising a polymer-protein conjugate and an environmentally-responsive polymer and uses thereof
HK1231093A1 (en) Hyaluronic acid-binding synthetic peptidoglycans, preparation, and methods of use
HK1196839B (en) Hyaluronic acid-binding synthetic peptidoglycans, preparation, and methods of use
HK1196839A (en) Hyaluronic acid-binding synthetic peptidoglycans, preparation, and methods of use
NZ618430B2 (en) Hyaluronic acid-binding synthetic peptidoglycans, preparation, and methods of use
de Sousa Biological Characterization of a Decellularized Nucleus Pulposus (NP)-Based Hydrogel
김범석 Functionalized and Structurally Enhanced ECM Scaffolds: Advancing Regenerative Medicine
Vazquez-Portalatin The Use of Biopolymers for Tissue Engineering
Simionescu et al. Shape-memory sponge hydrogel biomaterial
HK1173469B (en) Scaffolds formed from polymer-protein conjugates, methods of generating same and uses thereof
HK1220411B (en) Compositions comprising a polymer-protein conjugate and an environmentally-responsive polymer and uses thereof