RS55906B1 - Mutanti fc antitela koji su otporni na aktivnu proteazu - Google Patents

Description

Opis

STANJE TEHNIKE

Oblast pronalaska

[0001] Pronalazak se odnosi na konstantne regione humanog IgG antitela, posebno Fc regione, koji su mutirani tako da izmenjena proteolitička mesta isecanja obezbeđuju otpornost na unutrašnje proteaze i proteaze poreklom od patogena i koja su dodatno izmenjena tako da se specifično vezuju Fcγ receptore i aktiviraju mitogene odgovore imunskih ćelija ukrštenim povezivanjem posredovanim Fc receptorom ili aktivacijom kaskade komplementa. Nove sekvence se ugrađuju u kompozicije terapeutskih antitela kod kojih je poželjna otpornost na proteolizu i citotoksična efektorska funkcionalnost.

Diskusija oblasti pronalaska

<[0002]>IgG izotip humanih antitela se sastoji od subtipova IgG1, IgG2, IgG3, i IgG4, gde svaki sadrži dve antigen vezujuće ruke (Fab-ovi) koje se vezuju za jedan Fc domen preko regiona zgloba. IgG1, je dominantna subklasa terapeutskih monoklonskih antitela, i to su stabilni molekuli sa dugim poluživotom u krvi od 17,6 do 56,2 dana (Salfeld, Nat Biotechnol 25(12):1369-72, 2007). Međutim, IgG1 je podložan proteolizi u predelu regiona zgloba brojnim fiziološko važnim proteazama koje su udružene sa invazivnim kancerom (npr. matriksne metaloproteinaze) i patološkim mikroorganizmima. Isecanje iznad disulfidnih veza (centar zgloba) između teških lanaca, oslobađa monovalentni Fab i bilateralno isecanje ispod disulfidnih veza oslobađa bivalentnu F(ab’)2 strukturu fragmenta. Nekoliko metaloproteinaza i dva bakterijska enzima, glutamil endopeptidaza V8 Staphylococcus aureus (GluV8) i enzim koji degradira imunoglobulin iz Streptococcus pyogenes (IdeS), deluju na IgG1 u nižem regionu zgloba (ispod disulfidnih veza (Sl.1) i proizvode F(ab’)2 i Fc fragment (Ryan et al., Mol Immunol 45(7): 1837-462008).

[0003] Efikasnost terapeutskih monoklonskih antitela (mAt) koja su usmerena na ćelijske antigene je povezana sa eliminacijom ciljane ćelije, "efektorske funkcije" koje se ostvaruju preko Fc domena su očigledno obuhvaćene i važne u sveukupnom terapeutskom delovanju antitela. (Bibeau et al., J Clin oncol 27. 1122-11292009; Cartron et al., Blood 99:754-7582002; and Musolino et al., J Clin Oncol 26: 1789-1796 2008). Fc domen antitela interaguje sa Fc gama receptorima (FcγR) koji su eksprimirani na imunskim ćelijama, kao što interakcije Fc domena sa komplementom doprinose delovanju nekoliko monoklonskih antitela (mAt) koja su usmerena na antigene površine ćelije Ove interakcije mogu da dovedu do eliminacije ćelija koje su ciljane mAt preko citotoksičnosti koja zavisi od antitela (ADCC), fagocitoze koja zavisi od antitela (ADCP), i citotoksičnosti koja zavisi od komplementa (CDC)

,

<[0004]>WO 2006/071877 opisuje antitela koja se daju oralno i anti-toksinska antitela.

[0005] Armour et al. (1999) European Journal of Immunology 29(08):2613-2614 opisuje rekombinantne humane IgG molekule koji nemaju sposobnost vezivanja za Fcγ receptor I monocita i pokretanja njihovih aktivnosti.

[0006] US 2010/298542 opisuje modifikovani konstantni region antitela.

<[0007]>Nedavno je pokazano da jedno proteolitičko isecanje u jednom od polipeptida teškog lanca IgG1, ne remeti povezanost lanaca i stoga održava trajnost, sposobnost vezivanja antigena u cirkulaciji; ali uzrokuje gubitak sposobnosti IgG da se veže za FcγR-e i da pokrene efektorske funkcije koje su Fc posredovane (Brezski et al., Proc Natl Acad Sci USA 106:17864-178692009). Jedno isecanje kao i višestruka isecanja terapeutskih monoklonskih antitela mogu da vode do vrsta koje vezuju ciljanu metu ali su delimično ili potpuno izgublili efikasnost. Stoga, projektovanje Fc platformi koje su proteazno rezistentne, ali sa pojačanim efektorskim funkcijama može da obezbedi značajnu prednost u unapređenju efikasnosti lekova protiv kancera i anti-infektivnih lekova između ostalih primena u kojima je uništenje ciljanih ćelija ili tkiva poželjno.

SAŽETAK PRONALASKA

[0008] Pronalazak obezbeđuje modifikovani Fc molekul koji je otporan na proteolitičku degradaciju u odnosu na IgG1 divlji tip molekula koji sarži Fc, koji obuhvata Fc domen antitela sa mutiranim IgG1 konstantnim regionom, u kome je sekvenca E233-L234-L235-G236 humanog IgG1 zamenjena sa P233-V234-A235 sa G236 koji je izbrisan, kao što je definisano EU obeležavanjem, i dalje sadrži jednu ili više substitucija iz divljeg tipa humane IgG1 sekvence koja se bira od S239D/I332E; K326A/E333A; E333A/K334A; H268F/S324T/I332E; F243L/R292P/Y300L; S239D/H268F/S324T/I332E; S267E/H268F/S324T/I332E; K326A/I332E/E333A; S239D/K326A/E333A; S267E/I332E; i G237X/S239D/I332E gde X je A, D, P, Q OR S.

<[0009]>Pronalazak takođe obezbeđuje izolovani vezujući molekul što je rekombinantni polipeptid koji obuhvata: (i) vezujući domen koji može da veže za ciljni molekul ili vezan za ćeliju, i (ii) Fc region IgG1, u kome ostaci od 214 do 238, kako se definiše sistemom EU obeležavanja, sadrže sekvencu koja se bira od SEQ ID NO: 4 i 5, sa G236 koji je izbrisan; naznačeno time da je vezujući molekul sposoban da veže ciljni molekul na ciljnoj ćeliji i da molekul stvara komplement zavisnu lizu koja može da se izmeri, ili ćelijski posredovano uništavanje ciljane ćelije u prisustvu neophodnog tipa efektorske ćelije.

[0010] Pronalazak takođe obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja obuhvata molekul pronalaska.

<[0011]>Sadašnji pronalazak obezbeđuje kompozicije modifikovanih konstantnih domena imunoglobulina koji su korisni u konstrukciji antitela ili lekova sličnih antitelima. Imunoglobulini IgG klase koji se koriste kao lekovi, koji obuhvataju Fc region i ciljane ligande na površini ćelije, posebni su kandidati za modifikaciju korišćenjem sadašnjih kompozicija. Modifikovani imunoglobulini pronalaska su otporni na proteolitičke enzime u sredini koja je ciljana antigen vezujućim domenom IgG, na primer, u intratumorskoj sredini koja obuhvata ćeliju kancera ili antigen koji je povezan sa vaskulaturom tumora, a ipak zadržavaju važne efektorske funkcije koje povezane sa Fc regionom antitela.

<[0012]>U skladu sa pronalaskom, obezbeđen je način za stvaranje proteazno-rezistentnih IgG1 monoklonskih antitela umetanjem mutacija u Fc region IgG1 koje daju otpornost na proteazu. U sledećem aspektu, funkcionalne aktivnosti se mogu biti obnoviti u IgG molekulima koji sadrže takve mutacije uvođenjem dodatnih promena aminokiselina u distalnim pozicijama u Fc region.

<[0013]>Kompozicija pronalaska je proteazno-rezistentno IgG1 antitelo koje obuhvata izmenjene ostatke aminokiselina u donjem zglobu IgG1, čiji su ostaci uključeni u Fc angažovanju FcγR i kao identifikova mesta fiziološki relevantnog proteolitičkog isecanja. U jednom aspektu, ostaci humanih IgG1 subklasa se zamenjuju sa odgovarajućim ostacima donjeg zgloba humanog IgG2. U jednom izvođenju, sekvenca E233-L234-L235-G236 humanog IgG1 se zamenjuje sa IgG2 P233-V234-A235 sa G236 koji je izbrisan (EU obeležavanje (Edelman i dr., Proc Natl Acad Sci USA 63:78-85 1969)). U drugom izvođenju, IgG1 ostaci E233-L234-L235-G236-G237 se zamenjuju sa P233-V234-A235 sa G236 koji je izbrisan, i G237 je zamenjen aminokiselinom koja se bira iz A, D, P, Q ili S. U još jednom izvođenju, svi ostaci konstantnog domena IgG1 koji odgovaraju ostacima 214-236, KVEPKSCDKT HTCPPCPAPEL LG (SEQ ID NO: 3), su zamenjeni sa sekvencom odgovarajuće pozicije humanog IgG2 ili TVERKCCVECPPCPAPPVA (SEQ ID NO: 4).

[0014] U drugom aspektu, sposobnost mutanta IgG1 koji je rezistentan na proteazu u ovom pronalasku da koristi FcγR i/ili komplement može da bude obnovljena umetanjem dodatnih mutacija. Prema tome, bez dodatnih supstitucija, mutant IgG1 koji je rezistentan na proteazu sadrži region zgloba koji je rezistentan na proteazu, koji obuhvata P233-V234-A235 sa G236 koji je izbrisan, ili mutant u kome su sve sekvence konstantnog regiona IgG1 od ostataka 214-236 zamenjene sa odgovarajućim sekvencama IgG2 (SEQ ID NO: 4), ima smanjenu sposobnost korišćenja FcγR. Da bi se prevazišao gubitak efektorske funkcije koja se odnosi na FcR i korišćenje C1q, dodatne mutacije se inkorporiraju u konstantni region izvan zgloba, gde modifikovani IgG1 molekul zadržava merljivu ili čak povećanu sposobnost da koristi FcγR u poređenju sa divljim tipom humanog IgG1. Prema tome, u jednom izvođenju pronalaska, IgG1 koji je rezistantan na proteazu obuhvata ove molekule koji se sastoje iz Fc domena koji imaju sekvencu humanog IgG1 u regionu zgloba i CH2 regionima, od približnih EU ostataka 214 do približno ostatka 330, gde su barem ostaci 233-237 supstituisani sa PVA/(G236 delecija), i dodatno, specifične supstitucije odabrane od S239D/I332E; K236A-E333A; H268F/S324T/I332E; F234L/R292P/Y300L; S239D/H268F/S324T/I332E; S267E/H268F/S324T/I332E; E333A/K334A; G237A/S239D/I332E; i G237S/S239D/I332E; S298A/E33A/K334A; S239D/K326A/E333A i S267E/I332E. U specifičnom izvođenju IgG molekul koji je se dobija iz divljeg tipa IgG1 sekvenci konstantnih domena obuhvata SEQ ID No: 6. U drugom izvođenju, IgG koji je rezistentan na proteazu se dobija iz konstantnih domena divljeg tipa IgG2 sa supstitucijama u od S239D i I332E. Prema tome, ubacivanje ovih dodatnih mutacija omogućava Fc funkcije dok održava otpornost na proteazu, i u nekim slučajevima, unapređuje posredovane Fc efektorske funkcije u odnosu na divlji tip IgG1 u in vitro FcγR testovima vezivanja kao i in vitro ćelijskim testovima kao što su ćelijska citotoksičnost zavisna od antitela (ADCC). Monoklonsko antitelo koje je rezistentno na proteazu sa inkorporiranom efektorskom funkcijom u Fc domenu predmetnog pronalaska korisno je za lekove protiv kancera i anti-mikrobne lekove, gde je isecanje IgG usled povećanog lokalnog prisustva proteaze na mestima rasta tumora ili infekcija.

[0015] U drugom aspektu, kompozicije kako se ovde opisuju nalaze primenu kao sastavni delovi terapeutskih molekula koji se daju subjektima sisarima kada je to potrebno. U jednom postupku korišćenja kompozicije, antitelo koje obuhvata humane sekvence IgG1 divljeg tipa i domen za vezivanje liganda koji se koristi u lečenju subjekata, gde je to potrebno, modifikovan je da uključi sekvence zgloba koje su rezistentne na proteazu P233-V234-A235 sa G236 koji je izbrisan, i gde je željeno, modifikacije koje obnavljaju efektorske funkcije odabrane od S239D/I332E; K326A/E332A; H268F/S324T/I332E; F243L/R292P/Y300L; K326A/I332E/E333A, S239D/K326A/E333A i S267E/I332E S239D/H268F/S324T/I332E; S267E/H268F/S324T/I332E; E333A/K334A; G237A/S239D/I332E; i G237S/S239D/I332E. U jednom izvođenju, kompozicija Fc IgG1 mutanta se koristi kao pokazatelj gde je aktivacija FcγR-a udružena sa imunskim i efektorskim funkcijama kao što su i) citotoksičnost koja zavisi od antitela (ADC), ii) citotoksičnost koja zavisi od komplementa (CDC), iii) ćelijska fagocitoza koja zavisi od antitela (ADCP) iv) FcR posredovana aktivacija ćelije (npr. oslobađanje citokina preko unakrsnog povezivanja FcR), i v) FcR posredovana aktivacija/trošenje trombocita neophodna je za efikasnost kompozicije. U jednom aspektu, Fc mutacije IgG1 su uključene u terapeutska antitela ili Fc fuzije multivalentnih povezivača ciljanih liganada na ćelijama proliferativnih poremećaja, kao što su ćelije tumora; ćelije vaskulature tumora; fibroblasti; aktivirane B ćelije ili T ćelije, ili prema patogenom domaćinu ili ćelijama koje nisu poreklom od domaćina, naročito bakterijske ćelije.

[0016] U drugom izvođenju Fc mutant IgG1 obuhvata farmaceutsku kompoziciju. U drugom izvođenju Fc mutant IgG1 obuhvata deo molekula koji je farmaceutski aktivan. Farmaceutske kompozicije koje obuhvataju IgG1 Fc mutant ili aktivne IgG1 molekule koje obuhvataju Fc mutant su korisne u tretmanu bolesti koje se karakterišu nepoželjnom ili nekontrolisanom proliferacijom ili migracijom ćelija. U jednom aspektu, kompozicije pronalaska konstantnih domena, koji su rezistentni na proteazu, koje se kombinuju sa ligand vezujućim domenima, se daju subjektu kome je to potrebno koristeći način davanja u deo tela gde je jedna ili više proteaza sposobna da degradira IgG1 subklasu molekula pomoću postupaka sistemske isporuke ili postupaka lokalne isporuke.

KRATAK OPIS NACRTA

[0017]

Slika 1 je prikaz humanog IgG1 antitela zajedno sa aminokiselinsom sekvencom koja se nalazi u regionu zgloba, kritičnom regionu za interakciju sa FcγR-a i komplementom, i obeleženim tačkama isecanja proteazom.

Slika 2 pokazuje poravnanje sekvenci aminokiselina delova konstantnih regiona divljeg tipa humanog IgG1 (SEQ ID NO: 1) i IgG2 (SEQ ID NO : 2) koji su poravnati sa novim konstruktima 2h S239D/I332E (SEQ ID NO: 8) i 2h E333A/K334A (SEQ ID NO: 9) sa odgovarajućim EU obeležavanjem za svaki ostatak; gde region zgloba i IgG1 i IgG2 zajedno sadrži ostatke cisteina u EU ostatku 226 i 229 kao i novi konstrukti.

Slike 3A-B pokazuju analize digestije antitela koje obuhvataju različite IgG izotipove (A) i njihove nove konstukte kao što je opisano u sl.2 (B) sa proteazom IdeS u različitim vremenskim tačkama.

Slika 4A-D pokazuje digestiju IgG konstrukata sa IdeS (A) GluV8 (B), MMP-3 (C), i MMP-12 (D) nakon 24-časovne inkubacije (n=2).

Slike 5A-G pokazuju rezultate FcγR vezivanja od ALPHASCREEN analiza za grupe mAt konstrukta koji su rezistentni proteazu: FcγRI (A), FcγRIIa (B i C), FcγRIIb (D i E), i FcγRIIIa (F i G) gde smanjenje od % Maksimalnog Signala predstavlja sposobnost neobeleženog konstrukta da bude u kompeticiji sa biotinilovanim IgG1 iz vezivanja (n=2).

Slika 6A-C su grafici iz odvojenih ADCP testova koji se izvode sa konstruktima mAt koji su rezistentni na proteazu i divljem tipu IgG1 i IgG2 gde je % fagocitoze na Y-osi u odnosu na ukupan broj uzorkovanih ćelija.

SLIKA 7A-C su grafici iz odvojenih ADCC testova koji se izvode na konstruktima mAt koja su rezistentna na proteazu i divljem tipu IgG1 i IgG2 gde je % lize na Y-osi u odnosu na 100% lizu istog broja ćelija (detergent-om) (n=2).

Slika 8 je grafik od CDC testa koji se izvodi sa konstruktima mAt koja su rezistentna na proteazu i divljem tipu IgG1 i IgG2 gde je % lize na Y-osi u odnosu na 100% lizu istog broja ćelija (deterdžentom) (n=2).

KRATAK OPIS SEKVENCI

DETALJNI OPIS PRONALASKA

Skraćenice

[0018] ADCC= ćelijska citotoksičnost koja zavisi od od antitela; ADCP, ćelijska fagocitoza koja zavisi od antitela; CDC – citotoksičnost koja zavisi od komplementa; FDCR – oslobađanje citokina koje zavisi od Fc; FcγR ili FcgamaR = Fc gama receptor; GluV8 = glutamil endopeptidaza V8 iz Staphylococcus aureus; IdeS = enzim koji degradira imunoglobulin iz Streptococcus pyogenes IgG = imunoglobulin G; ITAM = imunoreceptorski tirozinski aktivirajući motiv; ITIM = imunoreceptorski tirozinski inhibirajući motiv; Mab = monoklonsko antitelo; MMP = matriksne metaloproteinaze; termin proteaza je ekvivalentan sa proteinaza i koriste se naizmenično; PR = rezistentan na proteazu.

Definicije & Objašnjenje Terminologije

[0019] “Ćelijska citotoksičnost koja zavisi od antitela“ “ Ćelijski posredovana citotoksičnost koja zavisi od antitela“ ili ADCC je oblik citotoksičnosti u kojoj se sekretovani Ig vezuje sa Fc receptore (FcR-e) koji su prisutni na određenim citotoksičnim ćelijama (npr prirodne ćelije ubice (NK), neutrofili, i makrofagi) omogućavaju specifično vezivanje ovih citotoksičnih efektorskih ćelija za ciljnu ćeliju koja nosi antigen i posledično ubiju ciljnu ćeliju pomoću citotoksina. Ligand specifična IgG antitela sa visokim afinitetom se usmeravaju prema površini ciljnih ćelija i stimulišu citotoksične ćelije i apsolutno su neophodna za takvo ubijanje. Liza ciljne ćelije je vanćelijska, zahteva direktni ćelija-ćelija kontakt i ne uključuje komplement.

[0020] Sposobnost nekog posebnog antitela da posreduje u lizi ciljne ćelije pomoću ADCC može da se testira. Za procenu ADCC aktivnosti, antitelo od interesa se dodaje ciljnim ćelijama koje prikazuju ciljni ligand u kombinaciji sa imunskim efektorskim ćelijama, koje mogu da se aktiviraju pomoću kompleksa antigen antitelo što dovodi do citolize ciljnih ćelija. Citoliza se generalno detektuje pomoću oslobađanja boje (npr. radioaktivnih supstrata, fluorescentnih boja ili prirodnih unutarćelijskih proteina iz ćelija koje su lizirane. Korisne efektorske ćelije za takve testove su mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC) i ćelije prirodne ubice. Specifični primeri in vitro ADCC testova se opisuju u Wisecarver i dr., 1985, 19:211; Bruggemann i dr., 1995 j Immunol methods 184:29. Alternativno ili dodatno, ADCC aktivnost antitela od interesa može da se proceni in vivo, npr., u životinjskim modelima kao što je opisano u Clynes i dr, 1998, PNAS USA 95:652. Kada efektorske ćelije deluju u velikoj meri kroz fagocitozu, proces se opisuje kao ćelijska fagocitoza koja zavisi od antitela (ADCP).

[0021] “Citotoksičnost usmerena pomoću komplementa“ ili CDC se odnosi na formu citotoksičnosti u kojoj se kaskada komplementa aktivira pomoću komponente komplementa C1q koja se vezuje za Fc antitela.

[0022] Termin “efektorske funkcije“ uključuje one interakcije Fc sa Fc gama receptorima (FcγR) koji se eksprimiraju na imunskim ćelijama, kao i interakcije Fc domena sa komplementom koje dovode do eliminacije ćelije koja eksprimira antigen pomoću litičkih procesa ili fagocitozom od strane efektorskih ćelija i komponenti komplementa.

[0023] Termini, "Fc," "protein koji sadrži -Fc" ili "molekul koji sadrži-Fc" kako se ovde koristi se odnosi na monomerni, dimerni, ili heterodimerni protein koji ima najmanje CH2 i CH3 domene imunoglobulina. CH2 i CH3 domeni mogu da formiraju najmanje deo dimernog regiona od proteina/molekula (npr., antitelo).

[0024] Termin “antitelo“ kako se ovde koristi je specifičnan oblik proteina koji sadrži Fc i obuhvata najmanje jedan domen za vezivanje liganda koji sadrži ili zadržava značajnu homologiju sa najmanje jednim teškim ili lakim lancom varijabilnog domena antitela od najmanje jedne vrste životinjskih antitela.

[0025] Konstantne sekvence divljeg tipa subklase humanog IgG se unose u katalog u UniProt databazu koja je dostupna na mreži kao P01857 (IgG1), P01859 (IgG2), P01860 (IgG3) i P01861 (IgG4). Kako se ovde koristi, “divlji tip humanog Fc regiona IgG1“ se odnosi na humani Fc region IgG koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 1 ili fragment, koji je od ostatka K214 do ostatka K447 humanog IgG teškog lanca, prema EU Kabat obeležavanju. Aminokiseline u konstantnom regionu se obeležavaju poravnanjem sa humanim IgG1 antitelom, EU (vidi Cunningham i dr., 1970Biohemija., :3161-70). To jest, teški i laki lanci antitela se poravnaju sa teškim i lakim lancima EU da bi se doveo do maksimuma identitet aminokiselinske sekvence i svakoj aminokiselini u antitelu se dodeljuje isti broj kao odgovarajućoj aminokiselini u EU. EU sistem obeležavanja se konvencionalno koristi u tehnici (vidi generalno, Kabat et al, Sequences of Protein of Immunological Interest, NIH Publication No. 91-3242, US Department of Health and Human Services (1991)). Prema konvenciji, poravnanje između divljeg tipa IgG2 konstantnog regiona i sa onim prema EU ima za rezultat praznu aminokiselinu na pozicijama 221-223 i 236 (Sl.2, SEQ ID NO: 2).

[0026] Sekvence konstantnog domena teškog lanca sisarskog IgG su označene u sekvenci kao CH1-zglob-CH2-CH3. “Zglob“, “region zgloba“ ili “domen zgloba“ IgG se generalno definiše sa uključujući Glu216 i završava sa Pro230 humanog IgG1 prema Kabat sistemu ali funkcionalno, fleksibilni deo lanca može da uključi dodatne ostatke koji su označeni u gornjim i donjim regionima zgloba, kao od Glu216 do Gly237 (Roux i dr. J Immunol. 1998, 161:4083) i donji zglob se odnosi na ostatak 233 do 239 iz Fc regiona gde se vezivanje sa FcgamaR uglavnom pripisuje. Regioni zgloba u drugim izotipovima IgG mogu da budu u poravnanju sa sekvencom IgG1 postavljanjem prvih i poslednjih ostataka cisteina koji formiraju S--S veze između-teškog lanca. Iako granice mogu da se neznatno razlikuju, kako je obeleženo prema Kabat sistemu, CH1 domen je pored VH domena i amino kraja prema regionu zgloba teškog lanca imunoglobulinskog molekula i uključuje prvi (većinom amino terminalni) konstantni region domena teškog lanca imunoglobulina, npr., od oko EU pozicija 118-225. Fc domen se produžuje od amino kiseline 231 do amino kiseline 447; CH2 domen je od oko Ala231 to Lys340 ili Gly341 i CH3 od oko Gly341 ili Gln342 do Lys447. Ostaci teškog lanca IgG konstantnog regiona od CH1 regiona se prekidaju u Lys.

[0027] Termin “rezistentan na proteazu“ se odnosi na sposobnost molekula kog čine peptidne veze da bude otporan na proteolitičko isecanje jedne ili više njegovih peptidnih veza u prisustvu proteolitičkog enzima. Otpornost prema proteolitičkim enzimima je relativna osobina i uporediva je sa molekulom koji ima manju sposobnost da izdrži hidrolitičko isecanje jedne ili više peptidnih veza u toku određenog vremenskog perioda i pod specifičnim uslovima, uključujući pH i ili temperaturu na kojoj se testira otpornost na isecanje. Rezultat proteolitičkog isecanja koji ukazuje da se isecanje događa je proizvodnja manjih fragmenata (niža molekulska masa) u poređenju sa molekulskom težinom intaktnog, neisečenog roditeljskog molekula.

[0028] Termin “terapeutski efikasna količina“ se odnosi na količinu terapeutskog agensa kako se ovde opisuje koja obuhvata Fc-domen koji može biti antitelo, fragment antitela, ili njihov derivat za lečenje bolesti ili poremećaja subjekta.

Pregled

[0029] Predmetni pronalazak je motivisan interesom za identifikaciju Fc domena za upotrebu u proizvodnji terapeutskog antitela, Fc-fuzija, i sličnim biolekovima sa poboljšanom otpornošću na in situ proteolizu i sa zadržanom sposobnošću da izazove oslobađanje citokina ili oštećenje ili ubijanje ćelija koje eksprimiraju ciljni antigen i tkiva koja okružuju ciljne ćelije.

[0030] Proteaze se dele na pet velikih grupa prema strukturi katalitičkog mesta i aminokiselini (kao jednom od konstituenata) koji su esencijalni za njegovu aktivnost: serin proteinaze, treonin proteinaze, cistein (tiol) proteinaze, asparaginske proteinaze, i metaloproteinaze.

[0031] Razne vanćelijske proteaze funkcionišu u telu i u delovima tela gde obavljaju kritične regulatorne i metaboličke procese. Proteaze koje su rezistentne na kiselinu luče se u stomak (kao što je pepsin) i serin proteaze koje su prisutne u duodenumu (tripsin i himotripsin) omogućuju degradaciju proteina hrane unutar gastrointestinalnog trakta; proteaze koje su prisutne u krvi ili serumu (trombin, plazmin, Hagemanov faktor itd.) imaju važnu ulogu u zgrušnjavanju krvi, kao i lizi (razlaganju) ugrušaka, i regulaciji ćelija imunskog sistema. Proteaze su prisutne u ili se oslobođaju iz leukocita (elastaza, katepsin G). Proteaze određuju trajanje drugih proteina prema tome imaju važnu metaboličku ulogu. Suprotno od hormona, interleukina ili hemokina, unutarćelijska signalizacija ili promena u mašineriji za ekspresiju proteina nije potrebna, što proteolitičku kontrolu čini jednom od najbržih regulatorno prekidačkih mehanizama. Osim toga, kooperativno delovanje proteaza kao u kaskadnim reakcijama rezultuje brzim i efikasnim umnožavanjem odgovora organizma na fiziološki signal.

[0032] Humani IgG izotipovi (subklase zrelih gama globulinskih G klasa antitela; IgG1, IgG2, IgG3 i IgG4) ispoljavalju različiti kapacitet za regrutovanje imunskih funkcija. Kao primer, ćelijska citotoksičnost koja zavisi od antitela (ADCC) se ostvaruje preko IgG1 i IgG3, ćelijska fagocitoza koja zavisi od antitela (ADCP) se ostvaruje preko IgG1, IgG2, IgG3 i IgG4, i citotoksičnost koja zavisi od komplementa (CDC) se ostvaruje preko IgG1 i IgG3. Angažovanje takvih imunskih funkcija koje su izotip-specifične se zasniva na selektivnosti prema Fc receptorima na različitim imunskim ćelijama i sposobnosti da vežu C1q čime aktiviraju sklapanje kompleksa koji oštećuje membranu (MAC). Među različitim izotipovima, relativni afinitet za Fcγ receptore, koji uključuju FcγRI, FcγRIIa/b/c, i FcγRIIIa/b; je visok za IgG1 i IgG3. Međutim, Fcγ afinitet za IgG2 je znatno niži sa odstupanjem od FcγRIIa H131 polimorfizmom i IgG4 koji jedini ima afinitet prema FcγRI koji se može izmeriti. Koristeći uporednu analizu sekvence i ko-kristalnih struktura, ključni ostaci kontakta za vezivanje receptora su mapirani prema aminokiselinskim ostacima koji obuhvataju donji zglob i CH2 region ( Hezereh et al., J Virol 75: 12161-121682001; Shields et al., J Biolo Chem 276:6591-66042001).

[0033] Mnoge prethodne studije su pokazale da supstitucije ostataka u donjem zglobu IgG2 (EU pozicija 233-235) ukidaju FcγR-posredovanu funkciju i aktivaciju komplementa. U jednom izveštaju, supstitucija E233P-L234V-L235A sa G236 koji je izbrisan u donjem zglobu IgG1 je jedan od panela Fc konstrukta humanog IgG1 koji ima izgubljene Fc-posredovane efektorske funkcije (Armour i dr.,1999 Eur J Immunol 29: 2613-2624). Ova informacija predlaže da zamena ostataka u ili blizu zgloba IgG1 sa odgovarajućim IgG2 ostacima ima za rezultat značajno gubljenje afiniteta za vezivanje sa FcγR-a i gubljenje sposobnosti da utiče na fiksaciju komplementa i ubijanje ćelije.

[0034] Drugo, nekoliko od istih pozicija ostataka su gde proteaze isecaju IgG1 (Sl.1) sekvencu i koje su okružene različitim aminokiselinama u proteolitički više rezistentnoj IgG2 sekvenci kako se pokazuje poravnanjem humanog IgG1 i IgG2 (sl.2). Pronalazači su iskoristili ovu informaciju kao početnu tačku za stvaranje IgG-Fc koji je rezistentan na proteazu, ali sa sačuvanom efektorskom funkcijom.

[0035] Predmetni pronalazak je demonstracija po prvi put supstitucija u brojnim pozicijama IgG1 konstantnih regiona (Fc) koje neočekivano obezbeđuju proteazno-rezistentne i funkcionalne (FcgR-angažovane) Fc domene. Kako je poznato u tehnici, jednom kada su svojstva Fc-domena sa specifičnom aminokiselinskom sekvencom poznata, informacija se primenjuje za stvaranje ili modifikaciju postojećih antitela projektovanjem ili fuzijom Fc polipeptida. Proteazna rezistencija koja se dobija kompozicijama pronalaska uključuje, na primer proteaze koje seku kod ostataka regiona zgloba IgG1 koji su supstituisani alternativnim aminokiselinama koje se dobijaju iz odgovarajućih ostataka IgG2, kao što su MMP-3, MMP-7, MMP-12, HNE, plazmin, katepsin G, pepsin, IdeS, ili glutamil endopeptidaza I iz Staph aureus (Sl.1) (Ryan et al.2008 supra).

[0036] Višestruko-supstituisani IgG1 mutanti se selektuju na osnovu njihovih relativnih afiniteta za humane FcR-e (FcgRI, FcgRIIa, FcgRIIIb, FcgRIIIa procenjeno AlphaScreen® testovima kompeticije). Ovi mutanti se dodatno testiraju u odgovarajućim ćelijskim sistemima za njihovu sposobnost da pokrenu ADCC pomoću PBMCs i ADCP pomoću in vitro diferenciranih makrofaga. U eksperimentalnim podacima koji se ovde dobijaju, IgG1 sa mutacijama koje se specifično insertuju (Tabela 2) konstruišu proteazno rezistentni mAt koja su izvedena od IgG1 sa mutacijom koja pojačava Fc.

[0037] Alternativne kompozicije prema IgG1 ostataka 214-237 u regionu zgloba prema EU sistemu numeracije (SEQ ID NO: 3) se prave pomoću divljeg tipa (wt) humanog IgG1 (SEQ ID NO: 1) i dodeljenom otpornosti na proteazu obuhvata ili zamenu kompletne IgG2 sekvence (SEQ ID NO: 4) zgloba ili himeričnog zgloba (SEQ ID NO: 5) sa samo ostacima 233-235 koji su izmenjeni kao što je prikazano u Tabeli 1.

Tabela 1.

[0038] Mutacije kojima se kompenzuje efektorska funkcija regiona koji se poboljšavaju može se odabrati iz prethodno opisanih supstitucija kao što je pokazano ispod u Tabeli 2.

Tabela 2.

[0039] Pojačana Fc funkcija konstrukata, koja je prethodno navedena od:

1. Lazar, Proc Natl Acad Sci USA 103:4005-4010 (2006)

2. Idusogie, J Immunol 166:2571-2575 (2001)

3. Stavenhagen, Cancer Res 67(18):8882-90 (2007)

4. Moore, et al. Mabs2(2):181-189 (2010)

5. Shields et al., J Biol Chem 276:6591-6604 (2001)

[0040] Pomoću različitih merenja Fc funkcija na osnovu in vitro testova, identifikuje se nekoliko Fc sekvenci koje su rezistentne na proteazu, koje kada se ubace u kompletnu strukturu IgG (H2L2), obezbeđuju rezistenciju prema jednoj ili više proteaza koje deluju na donjim ostacima zgloba (EU232-237) dok imaju sposobnost da vežu FcγR ili pokrenu citolizu. Promene u aktivnostima selektovanih konstrukata koje se vezuju za Fc obuhvataju promenu u zglobu kao i u CH2 regionu i kategorišu se prema afinitetu receptora i in vitro bioaktivnosti kako je pokazano u Tabeli 3.

Tabela 3

Postupak pravljenja izmenjenih Fc molekula

[0041] Mesta za supstituciju se biraju na osnovu želje da se proizvede kompozicija koja ima strukturne karakteristike prirodnih Fc antitela, održi stabilnost, zadrži vezivanje za FcR i kapacitet kojim se pokreće kaskada komplementa, ćelijska liza, ćelijska fagocitoza ili oslobađanje citokina. Proteini, naročito multimeri dugih polipeptidnih lanaca, sa izmenjenim ili mutiranim aminokiselinama se povoljno prave modifikacijom nukleinske kiseline u ekspresionom vektoru koji kodira roditeljsku sekvencu da bi se promenio odgovarajući genetički kodon za željenu aminokiselinu. Genski kod i takve metode su dobro poznate u tehnici. Kada se stvara himerna sekvenca, kao što Fc prema pronalasku obuhvata delove IgG1 i delove IgG2, veći segmenti odgovarajućih kodirajućih nukleinskih kiselina mogu da se splajsuju zajedno ili su segmenti zamenjeni pomoću standardnih tehnika kloniranja.

Testiranje proteolize

[0042] U cilju određivanja da li je jedna kompozicija koja sadrži Fc ili antitelo proteolitički više rezistentno nego drugo, ili od kompozicije divljeg tipa stopa ili obim do kog proteolitički enzim degradira različite izolovane kompozicije koje sadrže Fc ili antitela se procenjuje. Nakon posle vremenskog perioda, degradacija se meri za različite kompozicije pomoću metode kojom se određuje ili direktno presecanje lanca, kao što je obrazovanje jedinstvene strukture mesta isecanja, ili merenje novoformiranih fragmenata. Alternativno, gde isecanje za rezultat ima gubitak aktivnosti, može da se uradi test funkcije (funkcionalna analiza), uključujući i test vezivanja.

[0043] Proteolitičko isecanje IgG1 može da se desi na bilo kojem od četiri polipeptidnih lanaca u dimernoj heterodimernoj strukturi. Isecanje IgG1 za rezultat ima stvaranje fragmenata koji su dobro okarakterisani kao što su Fab, (Fab)2,i Fc fragmenta približnih ali jedinstvenih molekulskih masa Razdvajanje takvih fragmenata koji nastaju u proteolitičkom eksperimentu postiže se pomoću ekskluzione hromatografije (SEC), gel elektroforeze, MALDI-TOF-MS (matriksni laser/desorpciono vreme jonizacije flight masena spektrometrija) analiza posle deglikozilacije korišćenjem PGNaze F (peptid N-glikozidaza F) kao što je prethodno opisano (WO2007024743A2, WO2009045894A1).

[0044] Stoga, šta se podrazumeva pod kompozicijom koja sadrži Fc koja je otporna na proteolitičku degradaciju jeste manja verovatnoća da će takva kompozicija biti degradirana, izgubiti aktivnost, izgubiti afinitet za Fc-vezujućeg partnera kao što je FcR pri izlaganju proteolitičkom enzimu nego kod komparatornog molekula, kao što je divlji tip humanog IgG1.

Biološka karakterizacija mutanata

[0045] Proteini koji sadrže Fc mogu mogu da se uporede prema funkcionalsnosti pomoću nekoliko dobro poznatih in vitro testova. Posebno je od interesa afinitet za članove FcγRI, FcγRII, i FcγRIII familije Fcγ receptora je od interesa. Ova merenja se mogu uraditi pomoću rekombinantnih rastvornih formi receptora ili formi receptora koji su u vezi sa ćelijama. Dodatno, afinitet za FcRn, receptor pomoću koga se produžuje poluživot IgG-a koji cirkuliše, može da se izmeri, na primer korišćenjem formata kuglice sa vezanim ligandom kao što je “ALPHASCREEN“ sa rekombinantnim rastvornim FcRn. AlphaScreen®, koji je korišćen u dubinskom skriningu(pretraživanju), je tehnologija homogenog testa koji omogućava detekciju molekulskih događanja kao što je vezivanje. Obložene “Donor“ i “Akceptor“ kuglice su osnova tehnologije testa AlphaScreen®. AlphaScreen®, test koji ima osnovu u kuglicama, funkcioniše kroz interakcije kuglica koje se približavaju jedna drugoj, a za rezultat imaju kaskadu hemijskih reakcija koje deluju da se proizvodi znatno pojačan signal. Direktna ili indirektna, merenja npr., kompetitivnih vezivanja, mogu se primenti za procenjivanje relativnih afiniteta i aviditeta između proteina.

[0046] Prirodna evolucija se dogodila kod humanih izotipova IgG (npr. IgG1, IgG2, IgG3 IgG4), gde svaki ispoljava različit spektar kapaciteta da pokrene imunske funkcije, kao što su ćelijska citotoksičnost koja zavisi od antitela (ADCC, npr. IgG1 i IgG3), ćelijska fagocitoza koja zavisi od antitela (ADCP, npr. IgG1, IgG2, IgG3 i IgG4), i citotoksičnost koja zavisi od komplementa (CDC, npr. IgG1, IgG3). Angažovanje ovih funkcija pomoću izotipske specifičnosti ima osnovu u različitoj selektivnosti za Fc receptore koji se nalaze na posebnim imunskim ćelijama i sposobnosti da vežu C1q i aktiviraju sklapanje kompleksa koji napada membranu (MAC) koji za rezultat ima CDC i CDP (fagocitozu koja zavisi od komplementa) vezivanjem specifičnih receptora efektorskih makrofaga sa komponentama komplementa. Hijerarhija u spospobnosti da se veže inicijalna komponenta, C1q, kaskade komplementa humanih izotipova je IgG1>IgG3>IgG2>IgG4 iako je aktivacija komplementa pomoću IgG2 i IgG4 kod infekcija mokroorganizmima dobro zabeležena.

[0047] Testovi funkcije zasnovani na ćeliji, kao što su ADCC testovi i CDC testovi obezbeđuju uvid u verovatnoću funkcionalnih posledica u funkciji posebnih struktura konstrukta. Antitelo-zavisna ćelijski-posredovana citotoksičnost (ADCC) je reakcija koja je posredovana ćelijama u kojoj nespecifične citotoksične ćelije koje eksprimiraju Fc receptore (FcR-e) (npr., prirodne ćelije ubice (NK), neutrofili i makrofagi) prepoznaju vezano antitelo na ciljanoj ćeliji i subsekventno podstiču lizu ciljane ćelije. U jednom izvođenju, test ADCC je podešen tako da ima NK ćelije kao primarne efektorske ćelije, pomoću kojih se pokazuju funkcionalni efekti na FcγRIIIa koji je jednini aktivirajući Fcγ-tip receptora za koga je poznato da se eksprimira od strane ovih ćelija.

[0048] Testovi fagocitoze mogu da se koriste za poređenje imunskih efektorskih funkcija različitih mutanata, kao što mogu i testovi koji mere ćelijske odgovore, kao što je oslobađanje superoksida ili inflamatornog medijatora. In vivo modeli mogu da se koriste, na primer, u slučaju korišćenja mutanata anti-CD3 antitela da se izmeri T ćelijska aktivacija kod miševa, aktivnost koja je zavisi od Fc domena koji angažuju specifične ligande kao što su Fcγ receptori. Antitelima usmerena aktivacija makrofaga posreduje u antitelo zavisnoj ćelijskoj fagocitozi (ADCP), i uzrokuje da opsonizovane ciljane ćelije budu progutane i digestirane makrofagima. In vitro, diferencirani makrofagi eksprimiraju visoke nivoe FcR-a mogu da se diferenciraju u M1 fenotip pomoću INFγ ili GM-CSF za eksprimiranje povećanih nivoa svih FcR-a (FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIIa) u poređenju sa monocitima.

Proizvodnja mutanata antitela

[0049] Kompozicije pronalaska su kompleksni proteini koji se najpogodnije proizvode u projektovanim ćelijama domaćina. Kao što je ovde opisano, izabrana ćelija domaćin za ekspresiju rekombinantnog proteina koji sadrži Fc ili monoklonskih antitela značajno doprinosi krajnjoj kompoziciji, uključujući, bez ograničenja, varijaciju u kompoziciji oligosaharidnih grupa koje uređuju protein u imunoglobulinskom CH2 domenu. Stoga, jedan aspekt opisa obuhvata selekciju odgovarajućih ćelija domaćina koje obuhvataju polinukleotidne sekvence koje kodiraju konstrukte koji sadrže Fc prema opisu za upotrebu kao ili razvijanje proizvodnje ćelije koja eksprimira željeni terapeutski protein.

[0050] Dodatno, ćelja domaćin može da bude porekla iz sisara ili može da bude selektovana od COS-1, COS-7, HEK293, BHK21, CHO, BSC-1, Hep G2, 653, SP2/0, 293, HeLa, mijeloma, limfoma, kvaščevih, insektnih, ili biljnih ćelija, ili njihovih derivata, imortalizovanih ili transformisanih ćelija.

[0051] Alternativno, ćelija domaćina može da bude selektovana iz vrste ili organizma koji ne može da vrši glikozilaciju polipeptida, npr., prokariotska ćelija ili organizam, kao što je i prirodna ili modifikovana E. coli spp. Klebsiella spp., ili Pseudomonas spp., modifikovane biljne ili ćelije insekta.

[0052] Glikozilacija na mestima koja su prirodno mesta glikozilacije unutar teškog lanca IgG (N297, EU numeracija) takođe doprinose Fc afinitetu vezivanja za FcγR. Kako konstantni regioni variraju sa izotipom, svaki izotip poseduje različit niz N-vezanih ugljenohidratnih struktura, koje promenljivo utiču na sklapanje proteina, lučenje ili funkcionalnu aktivnost (Wright, A., i Morrison, S. L., Trendovi u Biotehn.15:26-32 (1997)). Stuktura prikačenih N-vezanih ugljenohidrata značajno varira, u zavisnosti od stepena obrade, i može uključiti visoku manozu, višestruko razgranate kao i biantenarne kompleksne oligosaharide i sijalinsku kiselinu (N-acetil neuraminsku kiselinu ili NANA), fukozu, galaktozu i GlcNAc (N-acetil glukozamin) ostatke kao terminalne šećere. Poznat je uticaj na efektorske funkcije u ćelijama domaćina i oligosaharidni sastav (Lifely, M. R., et al., 1995 Glycobiology 5:813-822; Jefferis,R., et al., 1998 Immunol Rev. 163:59-76; Wright, A. and Morrison, S. L., supra; Presta L. 2003. Curr Opin Struct Biol.13(4):519-25). Osim toga, što se tiče šećernih lanaca u antitelu, poznato je da dodavanje ili modifikacije fukoze kod proksimalnog N-acetilglukozamina na redukujućem kraju u N-glikozidno vezanog lanca šećera antitela značajno menja ADCC aktivnost antitela (WO00/61793).

[0053] Osim toga, relativni doprinosi galaktozilacije biantenarnih oligosharida, prisustvo račvajućih ukrštenih) GlcNac, i fukozilacija ukazuju da nefukozilovana mAt-a imaju veći kapacitet da povećaju ADCC kako je mereno in vitro i in vivo nego druge modifikacije u N-vezanim biantenarnim oligosaharidnim strukturama (Shields, i dr.2002. J Biol Chem.277: 26733-40; Niwa, i dr.2004. Cancer Res.64:2127-2133).

[0054] Eksprimirano ili napravljeno mAt pronalaska koje je rezistentno na proteazu pomoću ćelije domaćina sposobne da, i projektovane da (ili izbacivanjem ili utišavanjem specifičnih enzima Shinkawa, i dr. 2003 J. Biol. Chem., 278: 3466-3473; EP1176195A1) ili indukovane npr., manipulacijom spoljašnje sredine ili hranljivih materija da bi se proizvelo mAt sa niskim sadržajem fukoze je unutar područja predmetnog pronalaska.

Antitela, Fc i Fc-fuzioni proteini

[0055] Domeni koji vezuju antitelo ili njihovi fragmenti mogu da se proizvedu pomoću postupaka koji su poznati stručnjacima u ovoj oblasti u kombinaciji sa informacijom koja je obezbeđena ovde mogu da uključuje sekvence ili da bude poreklom od bilo kog sisara, kao što je, ali bez ograničenja na, humana, mišja, zečija, pacovska, primatska, kozja ili bilo koja data kombinacija. Takva antitela mogu da obezbede osnovne strukture i komponente vezujućih domena koja će biti od koristi u proizvodnji konstrukata antitela predmetnog pronalaska. I jednom aspektu, vezujući domeni antitela se dobijaju iz hibridoma koji se pripremaju imunizacijom miša ili druge životinje ciljanim peptidima, ćelijama ili tkivnim ekstraktima. Antitela se mogu dobiti korišćenjem bilo koje tehnike hibridoma koja je poznata tehnologiji, vidi, npr., Harlow and Lane, antibodies, a LaboratoryManual, Cold Spring Harbor, NY (1989) ili selekcijom limfocita koji proizvodi antitelo i kloniranjem kodirajućih sekvenci nukleinske kiseline za domene vezivanja pomoću metoda koje su poznate u tehnici.

[0056] Predmetni pronalazak se odnosi na konstantni region humanog IgG. Stoga bilo koje antitelo ili fuzioni protein koji sadrži humani Fc domen u kome je poželjno da finalna kompozicija sadrži i proteolitičku otpornost (kako se ovde opisuje) i sposobnost za vezivanje FcgR i pokretanje ADCC, ADCP i/ili CDC u in vitro testu se obuhvata predmetnim pronalaskom. Ciljni deo uključuje ali bez ograničenja na Fv antitela ili jedinog varijabilnog domena mogu da budu spojeni u Fc kompoziciji prema želji. “Fv“ se sastoji iz dimera jednog teškog i jednog lakog lanca regiona varijabilnog domena u čvrstoj, ne-kovalentnoj asocijaciji. Prema načinu savijanja ova dva domena dobija se šest hipervarijabilnih petlji (3 petlje svaka sa H lanca i L lanca) koje omogućuju aminokiselinskim ostacima da vežu antigen i daju antitelu specifičnost u vezivanju antigena. Međutim, čak i jedan varijabilni domen ( ili pola Fv koji obuhvata samo tri CDRs specifične za antigen) ima sposobnost da prepozna i veže antigen, iako često nižim afinitetom u odnosu na celo antigen vezujuće mesto. “Jednolančani Fv“ takođe skraćeno kao “sFv“ ili “scFv“ su fragmenti antitela koji sadrže VH i VL domene antitela koji su povezani u jedan polipeptidni lanac. scFv polipeptid generalno uključuje polipeptidni linker između VH i VL. Ciljani deo takođe može da se selektuje iz paratopa antitela (ostaci koji vezuju i koji nisu ograničeni na CDRs ili strukture varijabilnih domena); enzim; hormon; receptor; citokin; površinski antigen imunskih ćelija; i adhezioni molekul kada se konstrukt proizvodi u potpunosti rekombinantnim metodama. Ciljani deo može takođe da bude neproteinske prirode kao što je ugljeni hidrat, lipid, lipopolisaharid, organski molekul ili metal ili kompleks metala. Uopšteno, kada je prisutan, ciljani molekul je povezan za Fc linkerom koji može da bude polipeptid ili ne-polipeptid.

[0057] Proteini koji sadrže Fc ili Fc fragmenti koji se ovde opisuju mogu da nastanu na nekoliko načina koji su dobro poznati u tehnici. Vezujući domeni antitela ili Fc-fuzioni proteini ili njihove komponente i domeni se mogu dobiti selektovanjem iz biblioteka takvih domena ili komponenti npr., fagna biblioteka. Fagna biblioteka nastaje ubacivanjem biblioteke nasumičnih oligonukleotida ili biblioteke polinukleotida koja sadrži sekvence od interesa, kao što su B ćelije životinja ili ljudi koji su imunizovani (Smith, G.P 1985 Science 228: 1315-1317). Fagne biblioteke antitela sadrže parove teškog (H) i lakog (L) lanca varijabilnih regiona u jednom fagu i omogućuju ekspresiju jednolančanih Fv fragmenata ili Fab fragmenata (Hoogenboom, et al. 2000, Immunol. Today 21(8) 371-8). Raznovrsnošću fagnih biblioteka može se manipulisati da se poveća i/ili promeni imunospecifičnost monoklonskih antitela biblioteke da bi se proizveli i zatim postepeno identifikuju dodatna, poželjna, humana monoklonska antitela. Na primer, geni koji kodiraju teški lanac (H) i laki lanac (L) imunoglobulinskog molekula mogu da se nasumice izmešaju (shuffled) da nastanu novi HL parovi u sastavljenom imunoglobulinskom molekulu. Dodatno, jedan ili drugi ili oba gena koji kodiraju H i L lanac mogu da budu mutirana u regionima koji određuju komplementarnost (CDR) varijabilnog regiona imunoglobulinskog polipeptida, i postepeno da se pretraže prema željenom afinitetu i sposobnostima neutralizacije. Biblioteke antitela ili Fc mogu se takođe kreirati sintetički selekcijom jedne ili više humanih okvirnih sekvenci i ubacivanjem kolekcija CDR kaseta koje su poreklom od repertoara humanih antitela ili pomoću kreirane varijacije (Kretzschmar and von Ruden 2000, Current Opinion in Biotechnology, 13:598-602). Pozicije raznovrsnosti nisu ograničene na CDRs, mogu takođe da uključe okvirne segmente varijabilnih regiona ili mogu da uključe osim varijabilnih regiona antitela poput peptida. U jednom aspektu, fagna biblioteka može da prikaže dimerne Fc strukture koje su vezane proteinom fagnog omotača pIX kako što se opisuje u prijavi podnosioca zahteva (U.S Serial No. 61/261767) može da se upotrebi za selektovanje novih struktura koje sadrže Fc prema predmetnom pronalasku.

[0058] Biblioteke ciljanih vezujućih komponenti, koje mogu da uključe komponente ciljanog vezivanja osim varijabilnih regiona antitela, mogu da uključe prikaz ribozomskih biblioteka, prikaz kvaščevih biblioteka, i prikaz bakterijskih biblioteka. Ribozomski prikaz je postupak u kome se iRNK translatiraju u odgovarajuće proteine dok se protein zakačen za RNK zadržava. Kodirajuća sekvenca nukleinske kiseline se dobija RT-PCR-om (Mattheakis, L.C. et al. 1994 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 9022). Kvaščev prikaz je zasnovan na konstrukciji fuzionih proteina od alfa-aglutinin adhezionog receptora kvasca koji je udružen sa membranom, aga1 i aga 2, koji pripada ’mating type’ sistemu. (Broder, et al.

1997 Nature Biotechnology, 15:553-7). Bakterijski prikaz je zasnovan na fuziji cilja s eksportovanim bakterijskim proteinima koji su udruženi sa ćelijskom membranom ili ćelijskim zidom (Chen and Georgiou 2002. Biotechnol Bioeng, 79:496-503).

[0059] Ovde se takođe opisuju nukleinske kiseline koje kodiraju kompozicije prema opisu kao izolovane polinukleotide ili kao delove ekspresionih vektora koji uključuju vektore koji su kompatibilni sa prokariotskom, eukariotskom ili filamentoznom fagnom ekspresijom, sekrecija i/ili prikazom kompozicija ili njihovih usmerenih mutagena.

Upotreba molekula koji sadrže Fc

[0060] Kompozicije (antitelo, Fc-fuzije, Fc fragmenti) koji nastaju pomoću bilo koje od gore opisanih metoda mogu da se koristite za dijagnozu, lečenje, otkrivanje ili moduliranje humane bolesti ili specifičnih patologija u ćelijama, tkivima, organima, tečnosti, ili uopšte domaćinu. Kao što se opisuje ovde, modifikacijom Fc dela antitela, Fc-fuzionog proteina ili Fc fragmenta se smanjuje ili uklanja proteolitička degradacija dok se zadržava merljivo vezivanje za Fc gama receptor ili specifične efektorske funkcije koje mogu da se kombinuju sa vezujućim domenom, kao što je paratop antitela ili ligand vezujući domen, koji zadržava originalnu ciljanu specifičnost i biološku aktivnost. Primeri vezujućih domena predstavljaju paratop antitela, jedan ili više CDR-a antitela, jedan ili više varijabilnih domena antitela; enzim; hormon; receptor; unutarćelijski domen membranskog receptora; citokin; površinski antigen imunske ćelije; adhezioni molekul. Dobijeni konstrukti obezbeđuju antitela i Fc-konstrukte sa superiornim spektrom aktivnosti, biofizičkim svojstvima stabilnosti i sposobnosti trajanja u telu domaćina.

[0061] Pronalazak Fc sekvenci podnosioca sa jedinstvenom kombinacijama otpornosti prema fiziološki-značajnim proteazama i sposobnosti ili nesposobnosti da se angažuje jedan ili više Fc gama receptora i/ili sposobnost da se pokrene liza ćelija kultivacijom efektorskih ćelija ili komplementom predviđaju mogućnost namene vezujućeg molekula za maksimalnu efikasnost u određenoj indikaciji. Na primer, sposobnost ciljanja aberantnih ćelija domaćina kao što su one uključene u neoplaziju ili druge nepoželjne proliferacije kao što je nesvojstvena angiogeneza, nesvojstvena fibroza najbolje bi odgovarala molekulu koji se sastoji iz eukariotskog proteazno rezistentnog Fc predmetnog pronalaska koji ima sposobnost za ADCC i ADCP. Suprotno, bakterijske ćelije se brzo unište mehanizmima koji su posredovani komplementom. Stoga, bakterijske infekcije se tretiraju odgovarajućim Fc konstruktom pronalaska koji je otporan prema bakterijskim proteazama i ima sposobnost da pokrene CDC.

[0062] Podnosioci su identifikovali postupke selektovanja Fc sa odgovarajućom kombinacijom svojstava i obezbedili radne primere svrsishodno specifično modifikovanih molekula koji sadrže Fc. Molekuli koji su rezistentni na eukariotsku proteazu i sposobni za jedan ili više ADCC, ADCP i CDC obuhvataju Fc domen sa sekvencom humanog IgG1 u zglobu i CH2 regionima, od oko EU ostataka 214 do oko ostatka 330 gde su najmanje ostaci 233-237 supstituisani sa PVA/(G236 delecija) i dalje obuhvataju jednu ili više supstitucija u CH2 domenu gde molekul sposoban za jednu ili više ADCC, ADCP i CDC uključuje konstrukte 5, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 15, 16, i 17. U posebnom izvođenju, takvi molekuli uključuju supstitucije selektivane od I332E u kombinaciji sa drugim supstitucijama kao što je S239/I332E (5, 14), S239D/H268F/I332E (ne prave), H268F/S324T/I332E (8), S239D/H268F/S324T/I332E (9), S267E/H268F/S324T/I332E (10), G237X/S239D/I332E gde X je A ili S (12); K362A/I332E/E333A (15), i S267E/I332E (17).

[0063] Molekuli koji su rezistentni na prokariotsku proteazu i sposobni za CDC uključuju one molekule koji sadrže Fc domen koji ima sekvencu humanog IgG1 u regionima zgloba i CH2, od oko EU ostataka 214 do oko ostatka 330 gde su najmanje ostaci 233-237 supstituisani sa PVA/(G236 brisanje) i dalje obuhvataju jednu ili više supstitucija u CH2 domenu koji je selektovan iz K236A/E33A (11), S267E/H268F/S324T/I332E (10), K326A/I332E/E333A (15), S239D/K326A/E333A (16), i S267E/I332E (17).

[0064] Molekuli koji su rezistentni na eukariotsku proteazu ali ne pokreću ciljanu ćelijsku lizu mogu takođe da budu korisni za lečenje bolesti ili stanja u kome modulacija ciljane ćelije a ne ciljana ćelijska destrukcija je cilj korišćenjem antitela ili drugog Fc-konstrukta kako se ovde opisuje koje je rezistentno na proteazu ali ima smanjen ADCC, ADCP, ili CDC u poređenju sa divljim tipom IgG1. Molekuli koji obuhvataju ne-prirodne, ne-divljih tipova, Fc domene koji su rezistentni na proteazu uključuju takve molekule koji obuhvataju Fc domen sa sekvencom humanog IgG1 u regionima zgloba i CH2, od oko EU ostataka 214 do oko ostatka 330 gde su najmanje ostaci 233-237 supstituisani sa PVA/ (G236 delecija).

[0065] Stoga, na osnovu ovde datih tumačenja i primera, trenutno omogućeni konstrukti koji sadrže Fc koji ispoljavaju povećanu rezistenciju na proteazu koji se pojavljuju u subjektima sisarima i, opciono, imaju sposobnost ciljanja i antigen na ćeliji obezbeđuje unapređene terapeutske molekule u odnosu na terapeutski molekul koji nije rezistentan na proteazu.

Davanje

[0066] Proteolitički enzimi se lokalizuju prema njihovoj brzini obrazovanja ili akumulacije, na primer pepsin u digestivnom traktu, ili matriksnemetaloproteinaze (MMPs) u regionima gde se tkivo remodeluje ili malignog rasta, kompozicije pronalaska su posebno pogodne za primene u delovima tela za koje se zna da sadrže proteaze ili abnormalno visok sadržaj proteaza.

[0067] Pronalazak obezbeđuje stabilne formulacije kompozicije IgG koja je rezistentna na proteazu kao što je antitelo, koja je poželjno vodeni fosfatni pufer ili mešoviti rastvor soli, kao i očuvani rastvori i formulacije kao i višenamenske sačuvane formulacije koje su pogodne za farmaceutsku ili upotrebu u veterini, koje obuhvataju najmanje jedno antitelo rezistentno na proteazu u farmaceutski prihvatljivoj formulaciji. Pogodni nosači i njihove formulacije, uključujući druge humane proteine, npr., humani albumin seruma, opisuju se, na primer u Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition, Troy, D.B. ed., Lipincott Williams and Wilkins, Philadelphia, PA 2006, Part 5, Pharmaceutical Manufacturing pp 691-1092, Vidi posebno pp 958-989.

[0068] Kompozicija IgG koja je proteazno rezistentna sa efektorskom funkcijom u stabilnim ili očuvanim formulacijama kako se ovde opisuje ili je poznato u tehnici, može se dati pacijentu shodno predmetnom pronalasku pomoću različitih načina davanja uključujući intravenozni (I. V.), intramuskularni (I. M.); subkutani (S.C.); transdermalni; pulmonalni; transmukozni; koristeći formulaciju kao implant, osmotsku pumpu, kasetu, mikropumpu; ili druge načine koji su poznati veštim stručnjacima u oblasti tehnike.

[0069] Za davanje koje je specifično za mesto u delu tela ili šupljini, davanje može da bude intraartikularno, intrabronhijalno, intraabdominalno, intrakapsularno, preko hrskavice, intrakavitarno, intracelijalno, intracelebralno, intracerebroventrikularno, intrakolično, intracervikalno, intragastrično, intrahepatično, intramiokardijalno, intraostealno, intrapelvično, intraperikardijalna, intraperitonealna, intrapleularna, intraprostatična, intrapulmonarna, intrarektalno, intrarenalno, intraretinalno, intraspinalno, intrasinovijalno, intratoraksno, intrautrerusno, intravezikularno, intralezionalno, vaginalno, rektalno, bukalno, sublingvalno, intranazalno, ili transdermalnim sredstvima.

[0070] Bolesti ili patologije koje su podložne lečenju korišćenjem kompozicije obezbeđene pronalaskom uključuju ali bez ograničenja bolesti u kojima nepoželjna proliferacija, aktivacija ili migracija ćelija je štetna kao što su malignitet, hiper-aktivni ili neuravnoteženi imunski odgovori, stvaranje formacije fibroznog tkiva, ili infekcije jer kompozicije obezbeđuju aktivaciju citotoksičnih ili citolitičkih mehanizama imunskog sistema domaćina preko FcγR -posredovanih mehanizama. Takve bolesti uključuju malignitete: leukemija, akutna leukemija, akutna limfoblastična leukemija (ALL), B-ćelijska, T-ćelijska ili FAB ALL, akutna mijeloidna leukemija (AML), hronična mijelocitna leukemija (CML), hronična limfocitna leukemija (CLL), leukemija dlakavih ćelija, mijelodiplastični sindrom (MDS), limfoproliferativna bolest, kutani T-ćelijski limfom, Hodčkinova bolest, Kastelmanova bolest, gliom, glioblastom, astracitom, maligni limfom, ne-Hodčkinov limfom, Burkitov limfom, multipli mijelom, Kapošijev sarkom, kolorektalni karcinom, pankreasni karcinom, karcinom renalnih ćelija, kancer grudi, duktalni kancer, lipom, nazofaringealni kancer, kancer prostate, kancer testisa, kancer ovarijuma, retinoblastom, maligne histiocitoze, hiperkalcemija maligniteta, plazmacitomi, hondrosarkomi, sarkomi, karcinomi skvamoznih ćelija, sarkomi, kancer Merkelovih ćelija, hepatocelularni karcinom, hepatom, kancer bazalnih ćelija, adenokarcinomi, karcinomi skvamoznih ćelija, sarkomi ( kao što je Ewingov, Kapošijev, mekih tkiva ranog doba, odrasli), melanomi, metastazirajući melanomi, hemangiomi, metastazirajuće bolesti, osteosarkomi, rabdomisarkomi, timomi i timični karcinomi, resorpcija kostiju povezana sa kancerom, endometrijski kancer, vaginallni kancer, materični kancer, Wilmsovi tumori, bol kostiju povezan sa kancerom, i slično.

[0071] Ciljani molekuli koji su sposobni da vežu antigene malignih limfocita uključuju B-ćelijske antigene kao što su CD19, CD20, i CD22. Solidni tumori epidermalnog tkivnog porekla često ispoljavaju i stimulisani su vezivanjem liganda za poznate receptore epidermalnog faktora rasta ErbB1, ErbB2, ErbB3 i drugi receptori sposobni za signalizaciju ili pokretanje proliferativnog odgovora ili anti-apoptotskog odgovora koji vodi do neproverenog rasta tumora. Drugi zajdenički antigeni na čvrstim tumorima su tkivni faktor ili RON.

[0072] Kompozicije kada se kombinuju sa odgovarajućim ciljnim vezivnim domenima, su takođe korisne u lečenju infektivnih bolesti koje su urokovane bakterijskim (kao što su Streptococcus, Staphylococcus, i E.coli), virusnim (kao što su influenca, AIDS, RSV, SARS; i Virus Zapadnog Nila), gljivičnim (kao što su Aspergiloze, Coccidiomikoze, Criptomikoze, Criptococcidoze, ili Kandidijaze), ili infekcije protozoama kao što su (tripanozomijaze, toksoplazmoze, Giardija, ili malarija).

[0073] Kompozicije su korisne u lečenju opštih imunoloških i autoimunskih poremećaja uključujući ali bez ograničenja na reumatske bolesti, psorijazu i sklerodermu.

[0074] Kompozicije su pogodne za lečenje poremećaja koji su udruženi sa nesvojstvenom angiogenezom. Angiogeneza je proces u kome se stvaraju novi krvni sudovi kapilara i nastaje pomoću aktivirane proliferacije endotelskih ćelija. Neovaskularizacija je čvrsto regulisana i dešava se jedino u toku razvoja embriona, remodelovanja tkiva, zarastanja rane i cikličnim periodima razvoja corpus luteuma (Folkman and Cotran, Relation of vascular proliferation to tumor growth,Int. Rev. Exp. Pathol.’16, 207-248(1976)). Endotelne ćelije normalno proliferišu znatno sporije od drugih tipova ćelija u telu. Međutim, ukoliko stopa proliferacije ovih ćelija postane neregulisana, može da nastane patološka angiogeneza. Patološka angiogneza je deo mnogih bolesti. Na primer, kardiovaskularne bolesti kao što su angiom, angiofibrom, vaskularni deformitet, ateroskleroza, sinehija, i edemska skleroza; i oftamološke bolesti kao što je neovaskularizacija nakon implantacije kornee, neovaskularni glaukom, dijabetička retinopatija, angiogenska bolest rožnjače, makularna degeneracija, pterigijum, retinalna degeneracija, retrolentalna fibroplazija, i granularni konjuktivitis su povezani sa angiogenezom. Hronične inflamatorne bolesti kao što je artritis; dermatološke bolesti kao što je psorijaza, telangiektaza, piogeni granulom, seboreični dermatitis, venuous ulceri, akne, rozacea (akne rozacea ili eritematoza), bradavice (verrucas), ekcem, hemangiomi, limfangiogeneze su takođe zavisne od angiogeneze.

[0075] Dijabetičarska retionopatija može da ima jedan od dva oblika, ne-proliferativni ili proliferativni. Proliferativna retinopatija se karakteriše stvaranjem abnormalnih novih sudova (neovaskularizacija), koji rastu na staklastoj površini ili se protežu u staklastu šupljinu. Makularna degeneracija, isto tako, ima dve forme, suvu i mokru. U ekskudativnoj makularnoj degeneraciji (vlažna forma) koja je mnogo manje zastupljena, tu je obrazovanje subretinalne mreže horoidne vaskularizacije često udrženo sa intraretinalnom hemoragijom, subretinalnom tečnošću, odvajanjem epitelnog pigmenta i hiperpigmentacijom. Neovaskularni glaukom se javlja kod pacijenata sa dijabetesom, ili okluzijom centralne retinalne vene ili inflamatornim precipitatima koji su udruženi sa uveitisom koji povlači zenicu gore u ugao (Ch.99. The Merck Manulal 17th Ed.1999).

[0076] Reumatoidni artritis, je inflamatorna bolest, koja takođe dovodi do neadekvatne angiogeneze. Rast vaskularnih endotelnih ćelija u sinovijalnoj šupljini se aktivira pomoću inflamatornih citokina, i dovodi do razaranja hrskavice i zamene sa panusom u mestu spajanja (Koch AK, Polverini PJ and Leibovich SJ Arth; 15 Rhenium, 29, 471-479(1986); Stupack DG, Storgard CM and Cheresh DA, Braz. J. Med. Biol. Res., 32, 578-581(1999); Koch AK, Arthritis Rheum, 41, 951962(1998)).

[0077] Kompozicije su korisne u lečenju psorijaze, koja za uzrok ima nekontrolisanu proliferacijom ćelija kože. Brzo rastuće ćelije zahtevaju dovoljne količine krvi, i abnormalna angiogeneza je indukovana u psorijazi. (Folkman J., J. Invest. Dermatol.59, 40- 48 (1972)).

[0078] Brojni faktori su uključeni u procese i događaje koji dovode do angiogeneze: ćelijski adhezioni molekuli, integrini, vaskularni endotelni faktor rasta (VEGF), TNFalfa, bFGF i citokini uključujći IL-6 i IL-12. Na primer, za srodne ali različiti integrine alfaVbeta3 i aVb5 dokazano je da posreduju u procesima angiogeneze nezavisnim putevima. Anitelo sintetisano prema alfaVbeta3 blokiralo je angiogenezu stimulisanu osnovnim faktorom rasta fibroblasta (bFGF) (Eliceiri, et al., J. Clin. Invest.103: 1227-1230 (1999); Friedlander et al., Science 270: 1500-1502 (1995)). Stoga, pronalazak obuhvata upotrebu ciljajućih vezujućih domena koji su usmereni prema ovim ciljevima u kompozicijama pronalaska za upotrebu u lečenju bolesti u kojima je naznačena inhibicija angiogeneze.

[0079] Objavljena međunarodna patentna prijava WO2009023457A1 prijavioca otkriva strategiju za vraćanje efektorskih funkcija isečenih IgGa pomoću epitopa anti-zglobnog mesta specifičnih monoklonskih antitela. Pripajanjem proteazno-rezistentnog i efektorskih funkcija kompetentnog Fc u skladu sa predmetnim pronalaskom sa anti-zglobnim domenima da se proizvede bivalentno antitelo će proizvesti terapeutsko mAt koje je sposobno da zajedno vrati Fc-efektorsku funkciju isečenim IgG-a dok bi se zadržala terapeutska otpornost prema utišavanju pomoću proteolitičkog isecanja. Prema tome, predmetni pronalazak obuhvata ubacivanje Fc konstantnog regiona koji je otporan na proteolitičko isecanje pronalaska sa anti-zglobnim varijabilnom regionom mAt kao što je opisano.

[0080] Dok se pronalazak opisuje opštim terminima, izvođenja pronalaska koja se dalje prikazuju u primerima koji slede ne treba da se tumače kao ograničenja obima patentnih zahteva.

PRIMER 1: KONSTRUKCIJA I TESTIRANJE Fc MUTANATA

[0081] Serije konstrukata (prikazane na Slici 2 i u kombinaciji sa regionom zgloba u Tabeli 1 sa mutacijama koje vraćaju aktivnost u CH2 regionu izabranim iz Tabele 2) nastaju korišćenjem standardne rekombinantne tehnologije. Oznaka 2hc označava da je konstantni region IgG1 odgovara Kabat numeraciji EU antitela (EU numeracija) od 214 do 236 (SEQ ID NO: 3) zamenjen sa odgovarajućom IgG2 sekvencom (SEQ ID NO:4). Oznaka 2h označava da su ostaci od IgG1 E233-L234-L235-G236 zamenjeni sa odgovarajućim ostacima od IgG2 P233-V234-A235 sa G235 koji je izbrisan.

Tabela 4.

[0082] Varijabilni regioni jednog seta konstrukata antitela se vežu za CD142 (tkivni faktor) koji omogućava testiranje ubijanje ćelija antitelima koje zavisi od Fc u ćelijskim testovima pomoću MDA-MB-231 (ATCC, HTB-26™) eksprimiranog tkivnog faktora (Brezski et al., Proc Natl Acad Sci USA 106:17864-178692009). Dodatni panel se stvara sa varijabilnim regionima koji se vežu za CD20 što omogućava testiranje CDC aktivnosti pomoću WIL2-S ćelija koje eksprimiraju CD20 (ATCC, CRL-8885)(Brezski et al., Proc Natl Acad Sci USA 106:17864-17869 2009). Sva antitela se prolazno eksprimiraju u 293T ćelijama korišćenjem standardnih metoda i postupaka kloniranja. MAt se prečišćavaju pomoću kolona sa proteinim A sa više od 95 % čistoće pre eksperimentalne analize.

Proteazna digestija divljeg tipa i konstrukata mAt

[0083] Proteazne digestije prečišćenih IgG-a se izvode na pH 7,5 u fosfatnom puferu (PBS), ili, za MMP-e (MMP-3, MMP-7, MMP-12 i MMP-13 sve se dobijaju od Enzo Life Sciences), Tris puferu, na 37 °C. IdeS se dobija od Genovis, i GluV8 se dobija od Pierce. CaCl2se uključuje u MMP reakcije sa 5 mM za sve testirane MMP-e. Koncentracije antitela su 0,5 mg/mL i reakcije se iniciraju dodavanjem enzima u približno 1-2% (w/w) odnosu sa IgG ukoliko nije drugačije naznačeno. IgG isecanje se procenjuje analizom elektroforograma nakon Agilent Biosizing mikrokapilarne elektroforeze (Agilent Technologies). Sve digestije se izvode u duplikatima.

ALPHASCREEN® testovi kompetitivnog vezivanja

[0084] Studije kompetitvnog vezivanja se izvode u zapremini od pola bunarića u neprozirnoj ploči sa 96 bunarića (Corning) u test puferu (PBS, 0,05% BSA, 0,01% Tween-20) na pH 7,4. Sve studije kompeticije se izvode prema biotinilovanom IgG1 (1 IgG: 2 biotin, koristeći EZ Link™ NHS-LC-biotin, Pierce) u fiksnoj koncentraciji u kompeticiji sa divljim tipom i proteazno rezistentnim konstruktima u serijskim 3-strukim razblaženjima. Koncentracije FcγR su 0,2 µg/ml u finalnoj koncentraciji u testovima. Biotinilovani IgG1 (0.2 µg/ml finalno) i divlji tip i antitela koja su rezistentna na proteazu (10 µl) se redom dodaju u svaki red ploče sa 96 bunarića u duplikatima. Posle toga, označeni FcγR-i se dodaju prateći redom dodavanje 10 µl svaki od 1/50 razblaženih nikl-helatnih (Ni) akceptorskih kuglica i donorskih streptavidin (SA) kuglica. Neprozirna ploča se pokrije aluminijumskom zaštitom da se održe uslovi koji obezbeđuju zaštitu od svetla dok se blago meša 30 minuta na Orbital mešalici. Nakon toga, zaštita se sklanja i flurescencija se očitava na ENVISION™ čitaču ploča (PerkinElmer) koji je opremljen sa odgovarajućim filter setom od AlphaScreen® ekscitacionog/emisionog spektra. Grubi podaci se premeštaju na GraphPad PRISM™ softver i normalizuju za maksimalni signal i krive kompeticije se konstruišu pomoću softvera koji vrši nelinearno podešavanje regresione krive.

Rezultati

[0085] Od početnog interesa je da se da se odredi osetljivost konstrukata mAt prema brojnim fiziološki važnim proteazama za koje se prethodno pokazuje da isecaju IgG1 i donjem regionu zgloba; MMP-3, MMP-7, MMP-12, MMP-13, GluV8 i IdeS. Konstrukti 1-5, 7, 9-11, 12 (G237A), 13-14 se testiraju kao antitela koja vezuju CD142. Proteaze su isecale IgG u različitom stepenu u toku 24h. S obzirom da MMP-3, MMP-12, IdeS uklanjaju sve intaktne IgG1 (konstrukt 1) u toku 24 časova, MMP-7 iseca približno 30%, MMP-13 približno 40% i GluV8 približno 60%. Konstrukt 4 (2h) i oni konstrukti koji imaju 2h modifikaciju donjeg zgloba su otporni na sve MMP-e, u manje-više istom stepenu. Konstrukt 4 je otporan na GluV8 ali ne na IdeS. Konstrukt 2 je takođe otporniji na digestiju GluV8.

[0086] IdeS je pokazao da iseca sve izotipove humanog IgG (von Pawel-Rammingen et al., EMBO 21:1607-16152002). Podaci iz studijskog programa vremena (Slika 3A) pokazuju da IdeS brzo konvertuje IgG1 (1) i IgG2 (2) u F(ab’)2 fragment (u okviru 5min inkubacije) dok IgG12h uzorak (4) ima jednom isečeni intermedijer u toku 120 minuta. Od testiranih konstrukata, 2h S239D/I332E (5) je konstrukt sa najvećim stepenom rezistencije na IdeS proteolizu (Slika 3B), gde se intaktni IgG detektuje i nakon inkubacije od 24 sata (drugi konstrukti antitela nisu imali detektovani intaktni Igg molekul u toku 5 minuta). Mutacija S239D u (5) koja je blizu tačke isecanja IdeS između G236 i G237, može da doprinese dodatnoj otpornosti na proteazu u odnosu na IgG12h (4).

[0087] Panel od 12 anti-CD142 konstrukata antitela (1-5, 7, 9-13, i 14) se testira zajedno sa njihovim odgovarajućim divljim tipom IgG1 i IgG2 na proteolitičku osetljivost od IdeS, GluV8, MMP-3, i MMP-12. Podaci za netaknuti IgG ostaju nakon 24h inkubacije se računaju iz elektroforograma i prikazani su u slici 4A-D.

[0088] Podaci pokazuju da su IgG1 wt (1), IgG2 wt (2), 2hc (3), IgG12h (4), 2hc S239D/I332E (13), IgG2S239D/I332E (14), i 2h K326A/E333A (11) osetljivi na proteolizu IdeS-om posle 24h inkubacije. Suprotno, konstrukti 2h S239D/I332E (5), 2h G237A/S239D/I332E (12), 2h F243L/R292P/Y300L (7), 2hS239D/H268F/S324T/I332E (9), i 2h S267E/H268F/S324T/I332E (10) su otporni na proteolizu IdeS-om. Neočekivano, konstrukti sa više supstitucija u regionu zgloba IgG2 (koji obuhvata SEQ ID NO: 4) nisu otporni na proteolizu IdeS-om. Konstrukt IgG2 S239D/I332E ima manje od 40 % čitavog IgG koji ostaje nakon 24h digestije sa IdeS.

[0089] Digestija sa GluV8 proteazom iz Staph aureus ukazuje da konstrukti IgG2 S239D/I332E (14),2h S239D/I332E (5), 2h G237A/S239D/I332E (12), i 2h F243L/R292P/Y300L (7) imaju raspon od 40-60% netaknutog IgG koji ostaje nakon 24h digestije, slično opsegu isecanja koji se uočava za IgG1 wt (1). Konstrukti IgG2 wt (2),2hc (3), 2hc S239D/I332E (14), IgG1 2h (4), IgG1 2h K326A/E333A (11), 2h S239D/H268F/S324T/I332E (9), i 2hS267E/H268F/S324T/I332E (10) pokazuju povećanu otpornost na proteolizu GluV8 (svi imaju više od 75% netaknutog IgG koji ostaje) u odnosu na IgG1 wt.

[0090] MMP-3 i MMP-12 predstavljaju dva tipa proteaza koja su udružena sa kancerom. Manje od 5% netaknutog IgG1 wt se uočava posle digestije sa MMP-3 i MMP-12 zajedno. Suprotno, humani IgG2 wt i svi konstrukti koji su testirani pokazuju povećanu otpornost na proteazu na zajedno MMP-3 i MMP-12 kao što se pokazuje sa više od 60 % intaktnog IgG1 nakon koji ostaje nakon 24 časovne digestije.

Rezultati vezivanja Fcγ receptora

[0091] Sposobnost nekih Fc konstrukata da se takmiče za vezivanje receptora Fcγ familije sa wt IgG1 se procenjuje. Sposobnost konstrukata da smanje maksimalni signal koji se dobija biotinilovanim IgG1 pokazuje se na Sl. 5A-G. Početna proveravanja uključuju konstrukte 1-2, 4-6. Za početnu grupu konstrukata koji se testiraju, IgG2 (2), IgG1 2h (4), i 2h E333A/K334A (6) ne pokazuju vezivanje za FcγRI visokog afiniteta koje se može uočiti, dok divlji tip IgG1 pokazuje snažno vezivanje. 2h S239D/I332E (5) pokazuje vezivanje za FcγRI koje se može uočiti ali je smanjeno u odnosu na IgG1. IgG1 2h (4) i 2h E333A/K334A (6) ne pokazuje vezivanje za FcγRIIa koje se može uočiti, dok 2h S239D/I332E (5) konstrukt pokazuje vezivanje koje se može uporediti sa IgG1 wt (Sl. 5B). Tri konstrukta: IgG2 (2), IgG12h (4), i 2h E333A/K334A (6) ne pokazuju vezivanje koje se može uočiti za FcγRIIb, dok IgG1 (1) i 2h S239D/I332E (5) pokazuju vezivanje koje se može uporediti (Sl. 5D). IgG2 (2),IgG12h (4), i 2h E333A/K334A (6) vezivanje koje se može uporediti, ali smanjeno za FcγRIIIa u poređenju sa IgG1.2hS239D/I332E (5) konstrukt ispoljava najveći nivo vezivanja za FcγRIIIa čak veće nego IgG1 wt (sl.5F).

[0092] Dodatno, 2h S239D/H268F/S324T/I332E (9) konstrukt ispoljava vezivanje za IgG1 koje može da se uporedi, u kome 2h S267E/H268F/S324T/I332E (10) konstrukt ima povećano vezivanje za FcγRIIa u odnosu IgG1 wt (Sl 5C). Oba konstrukta 2h S239D/H268F/S324T/I332E (9) i 2h S267E/H268F/S324T/I332E (10) ispoljavaju povećano vezivanje za FcγRIIb u odnosu na IgG1 wt (sl 5E). Konstrukt 2h K326A/E333A (11) pokazuju minimalno detektabilno vezivanje zajedno za FcγRIIa (Sl 5C) i FcγRIIb (Sl 5E).

[0093] Konstrukt 2h S267E/H268F/S324T/I332E (10) pokazuje malo smanjeno vezivanje za FcγRIIIa u poređenju sa IgG1 wt, gde konstrukt 2h S239D/H268F/S324T/I332E (9) ima smanjeno vezivanje za FcγRIIIa (Slika 5G).2h K326A/E333A (11) ispoljava slabo vezivanje za FcγRIIIa u poređenju sa IgG1 wt (slika 5G).

Kratak pregled

[0094] Ovi rezultati ukazuju da konstrukti koji su otporni na proteolitičku razgradnju obuhvataju 2h S239D/I332E (5), 2hS239D/H268F/S324T/I332E (9), i 2h S267E/H268F/S324T/I332E (10) mogu da vežu FcγRIIa, IIb, i IIIa u različitim stepenima, i da sva tri konstrukta imaju povećano vezivanje u odnosu na samu 2h (4) mutaciju. Mutacija ostataka u donjem zglobu IgG1 u kombinaciji sa drugim CH2 mutacijama, koje povećavaju afinitet vezivanja prema FcγRIIa preko IgG1 wt kao sa konstruktom 2h S267E/H268F/S324T/I332E (10), povećani afinitet 2hS239D/H268F/S324T/I332E (9) i 2h S267E/H268F/S324T/I332E (10) za FcγRIIb, povećani afinitet vezivanja FcγRIIIa preko IgG1 wt kao sa konstruktima 2h S239D/I332E (5) i 2h S239D/H268F/S324T/I332E (9) predstavljaju rezultate koji su neočekivani.

PRIMER 2. ĆELIJSKA FAGOCITOZA KOJA ZAVISI OD ANTITELA (ADCP)

[0095] Da bi se ispitala sposobnost mAt-a koja su rezistentna na proteazu da posreduju u in vitro ćelijskom ubijanju koje zavisi od Fc, izvode se ADCP testovi. U ovom testu fagocitne ćelije se regrutuju na ćeliju koja ispoljava ciljni antigen vezivanjem antitela i meri se uništenje ciljne ćelije.

Postupak

[0096] PBMCs se izoluju od normalnih humanih donora pomoću centrifugiranja na gradijentu fikola. CD14pos monociti su prečišćeni iz PBMCs negativnim trošenjem pomoću CD14 testa za izolaciju koji ne troši CD16pos monocite (Stem Cell Technologies). Monociti se nanose 0,1x106 ćelija/cm<2>u X-VIVO-10 medijumu (Lonza) koji sadrži 10% FBS i 20 ng/ml GM-CSF (R&D Systems) na 7 dana. 100 ng/ml of IFNγ (R&D Systems) se dodaje za finalnih 24h diferencijacije. Ciljane ćelije za ADCP test su MDA-MB-231 ćelije koje eksprimiraju GFP. Izolovani makrofagi se inkubiraju sa MDA-MB-231 koje eksprimiraju GFP u odnosu 4:1 na 4h sa ili bez divljeg tipa i mAt konstruktima koji su otporni na proteazu u pločama sa 96 bunarića i U dnom. Posle inkubacije, ćelije se uklanjaju sa ploča koje imaju 96 bunarića pomoću Accutase (Sigma). Makrofagi se identifikuju pomoću anti-CD11b i anti-CD14 antitela (oba iz BDBiosciences) koja su kuplovana sa AlexaFluor 647 (Invitrogen), i potom se ćelije dobijaju na FACs Calibur (BD Biosciences). Podaci se analiziraju pomoću FloJo Software (Tree Star). Procenat fagocitoze se određuje sledećom jednačinom ((GFPpos, CD11bpos, CD14pos ćelije) / (GFPpos, CD11bpos, CD14pos ćelije plus GFPpos same ćelije) x 100%.

[0097] Izolovani monociti diferenciraju in vitro pomoću GM-CSF i IFNγ kako je opisano. Kako drugi pokazuju, diferencirani makrofagi eksprimiraju sve FcγR-e (FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIb, and FcγRIIIa) (podaci nisu prikazani).

Rezultati

[0098] Podatak koji se prikazuje u slici 6A pokazuje da IgG1 wt (1) i 2h S239D/I332E (5) dostižu najveći nivo ADCP. ADCP kapacitet IgG2 wt (2), IgG12h (4), i 2h E333A/K334A (6) proizvodi nizak ali ADCP kapacitet koji može da se detektuje. Ovi rezultat pokazuju da konstrukt 2h S239D/I332E (5) koji je rezistentan na proteazu može da vrši fagocitozu tumorskih ćelija na nivou koji je uporediv sa IgG1 wt. U odvojenom eksperimentu, dodatni panel konstrukata CH2 koji sadrže IgG12h region zgloba se testiraju za kapacitet ADCP (Slika 6B). U ovoj grupi, konstrukti 2hS239D/I332E (5), 2h F243L/R292P/Y300L (7), i 2h S239D/H268F/S324T/I332E (9) imaju slične ADCP kao IgG1 wt(1), gde konstrukti 2h S267E/H268F/S324T/I332E (10), 2h H268F/S324T/I332E (8), i 2hG237A/S239D/I332E (12) imaju malo smanjenu maksimalnu fagocitozu u odnosu na IgG1 wt. Konstrukti 2hK326A/E333A (11) imaju nizak ali ADCP koji se može uočiti, slično IgG2 wt (2) i IgG12h (4). Konačno, konstrukti koji sadrže kompletan zglob IgG2 se testiraju na ADCP. Konstrukt IgG2 S239D/I332E (14) ispoljava sličan ADCP kao IgG1 gde konstrukti 2hc (3) i 2hc S239D/I332E (13) ispoljavaju nizak ali ADCP koja može da se uoči.

PRIMER 3. ĆELIJSKA CITOTOKSIČNOST KOJA ZAVISI OD ANTITELA (ADCC)

[0099] U ovom testu, mononuklearne ćelije se regrutuju na ćeliju koja ispoljava ciljani antigen i meri se destrukcija ciljane ćelije.

Postupak

[0100] ADCC testovi se izvode kako se prethodno opisuje (Scallon et al., Mol Immunol 44:1524-1534 2007). Ukratko, PBMCs se prečiste iz humane krvi fikolnim gradijentima i koriste se kao efektorske ćelije za ADCC testove. MDAMB-231 Ćelije humanog karcinoma grudi (ATCC HTB-26) se koriste kao ciljane ćelije u odnosu 1 ciljana ćelija prema 50 efektorskih ćelija. Ciljane ćelije se prethodno obeležavaju sa BATDA (PerkinElmer) 20 min na 37°C, operu dva puta i resuspenduju u DMEM-u, 10% FBS koji se inaktivira toplotom, 2mM L-glutaminom (svi od Invitrogen-a). Ciljane (1 X 10<4>ćelije) i efektorske ćelije (0.5 X 10<6>ćelije) se kombinuju i 100µl ćelija se dodaju u bunariće ploča sa 96 bunarića koji imaju U dno. Dodatnih 100µl se daje sa ili bez konstrukata divljih tipa i mAt koja su rezistentna na proteazu. Svi uzorci se rade u duplikatima. Ploče se centrifugiraju na 200g 3 min, inkubiraju na 37°C na 2 sata, i onda ponovo centrifugiraju na 200g 3 min. Ukupno 20µl supernatanta se uklanja po bunariću i ćelijska liza se meri dodavanjem 200µl DELPHIA Reagens na bazi europijuma (PerkinElmer). Fluorescencija se meri pomoću Envision 2101Multilabel čitača (PerkinElmer). Podaci se normalizuju prema maksimalnoj citotoksičnosti sa 0,67 % Triton X-100 (Sigma Aldrich) i minimalnoj kontroli koja se određuje spontanim oslobađanjem BATDA iz ciljanih ćelija u odsustvu bilo kog antitela. Podaci se uklapaju u sigmoidalni model doznog odgovora pomoću GraphPad Prism v5.

Rezultati

[0101] Podaci se predstavljaju tako da se nivo ćelijske lize prikazuje na Y-osi kao funkcija koncentracije antitela. Podaci koji se prikazuju na Slici 7A pokazuju da 2h S239D/I332E (5) konstrukt ima najveći nivo ADCC kapaciteta koji je približno 8-struki (što se dokazuje promenom u vidljivom EC50) poboljšanju preko IgG1 wt u prikazanom testu.

[0102] U drugom eksperimentu, kapacitet ADCC produženog panela konstrukata se upoređuje. Slika7B prikazuje krive koje stvaraju podaci. Tri konstrukta (2h S239D/I332E (5), 2h F243L/R292P/Y300L (7), i 2hS239D/H268F/S324T/I332E (9) imaju povećan ADCC kapacitet u odnosu na IgG1 wt. 2h G237A/S239D/I332E (12) i 2h H268F/S324T/I332E (8) konstrukti imaju malo povećan ADCC preko IgG1 wt, gde konstrukti 2hK326A/E333A (11) i 2h S267E/H268F/S324T/I332E (10) ADCC koji je smanjen ali može da se uoči u odnosu na IgG1 wt. Slika 7C prikazuje rezultate ADCC iz panela konstrukata koji sadrže kompletni region zgloba IgG2. IgG2S239D/I332E (14) konstrukt ima niži EC50 nego IgG1 wt, ali takođe nižu maksimalnu lizu. Konstrukti 2hc (3) i 2hc S239D/I332E (13) imaju ADCC koja se uočava iznad IgG2 wt, ali niže nego IgG1 wt. Zajedno, ovi rezultati pokazuju da mutacija kritičnih ostataka u donjem zglobu može da se nadoknadi vraćanjem ADCC i FcγR vezivanja brojnim mutacijama CH2. Međutim, nisu sve testirane CH2 mutacije napravljene u CH2 IgG1 2h (3) osnovi mogle da povrate/povećaju ADCC u odnosu na IgG1 wt.

[0103] Ovi rezultati su u skladu sa testom vezivanja FcγRIIIa (Slika 5F-G) pokazuju povećan afinitet 2hS239D/I332E (5) i 2h S239D/H268F/S324T/I332E (9), zbog toga što se smatra da su NK ćelije koje eksprimiraju FcγRIIIa relevantne efektorske ćelije u ADCC.

PRIMER 4. CITOTOKSIČNOST KOJA ZAVISI OD KOMPLEMENTA (CDC)

[0104] U ovom testu komponente komplementa se regrutuju na ćeliju koja ispoljava ciljani antigen i meri se destrukcija ciljane ćelije.

Postupak

[0105] CDC testovi se izvode kao što je prethodno opisano (Brezski et al. J Immunol. 181(5):3183-31922008). WIL2-S ćelije se koriste kao ciljane ćelije za testove CDC.50µl ćelija se dodaje u bunariće ploča sa 96 bunarića u finalnoj koncentraciji 8 x 10<4>ćelija po bunariću u RPMI, 5 % FBS koji je inaktiviran toplotom, 0,1 mM neesencijalnim aminokiselinama, 1mm natrijum piruvat (svi iz Invitrogen-a). Dodatnih 50 µl se dodaje u bunariće sa ili bez antitela i ploče se inkubiraju na sobnoj temperaturi za 2 sata. 50µl od 10% komplementa zeca (Invitrogen) se dodaje u bunariće i ploče se inkubiraju 20 min na 37°C. Svi uzorci se izvode u duplikatu. Ploče se centrifugiraju na 200g 3 min i 50µl supernatanta se prebacuje u odvojene ploče i meri se CDC sa LDHG testom koji detektuje citotoksičnost (Roshe). Apsorbanca se meri pomoću Spectra max Plus 384 (PerkinElmer). Podaci se normalizuju prema maksimalnoj citotoksičnosti sa Triton X-100 (Sigma Aldrich) i minimalnoj kontroli koja sadrži samo ćelije i komplement. Podaci su uklopljeni u sigmoidalni model doze-odgovora pomoću GraphPad Prism v5.

Rezultati

[0106] Podaci koji su pokazani na Slici 8 pokazuju da konstrukti 2h S267E/H268F/S324T/I332E (10) i 2hK326A/E333A (11) zajedno dostižu slične niove ćelijske lize kao IgG1 wt. Konstrukti IgG12h (4), 2h S239D/I332E(5), 2h F243L/R292P/Y300L (7), i 2h S239D/H268F/S324T/I332E (9) imaju minimalni CD kapacitet koji je sličan onom koji se meri za IgG2 wt (2).

Primer 5: DODATNI KONSTRUKTI KOJI SU REZISTENTNI NA PROTEAZU

[0107] Samo dve CH2 mutacije, u kombinaciji sa E233P/L234V/L235A sa G236 koji je izbrisan, su sposobne za CDC aktivnost u poređenju sa IgG1 wt, odnosno 2h K326A/K334A (11) i 2h S267E/H268F/S324T/I332E (10). Međutim, 2h K326A/K334A (11) ima minimalni ADCC i ADCP aktivnost, i 2h S267E/H268F/S324T/I332E (10) ima smanjenuADCC aktivnost u odnosu na IgG1 wt. Bilo bi korisno da se projektuju konstrukti koji su rezistentni na proteazu a da imaju sve tri aktivnosti (ADCC, ADCP, i CDC). Same H268F/S324T mutacije prvenstveno nisu imale povećan afinitet prema FcγR-a (Moore et al.), gde konstrukt 2h H268F/S324T/I332E ima povećan ADCC u odnosu na 2h. Stoga sama mutacija I332E može da povrati ADCC prema 2hc konstruktom sa zglobom koji je rezistentan na proteazu. Stoga, stvoriće se konstrukti koji kombinuju zajedno povratak ADCC/ADCP sa CDC povratkom u 2hc roditeljski zglob uključujući 2hK326A/I332E/E333A (15) (SEQ ID NO: 18), S239D/K326A/E333A (SEQ ID NO: 19) (16), i S267E/I332E (17) (SEQID NO: 20).

[0108] Tri konstrukta se testiraju pomoću materijala i postupaka koji se opisuju i primeru 1. Tri konstrukta ispoljavaju otpornost na MMP-3 i MMP-12 u poređenju sa IgG1 wt.

[0109] Kako se prethodno pokazuje IgG2 wt (2) je otporan na GluV8, gde IgG1 wt (1) ima manje od 60% intaktnog IgG1 koji ostaje nakon 24 časovne digestije. Tri konstrukta imaju povećanu otpornost na GluV8 u poređenju sa IgG2 wt, dok 2h S239D/K326A/E333A (16) ima otpornost koja je uporediva sa IgG2 wt. Ovi podaci sugerišu da mutacije kojima se uvodi dodatni Glu u CH2 u kombinaciji sa mutacijama u donjem zglobu stvaraju novo mesto isecanja za GluV8 (npr., 2h S239D/I332E (5), 2h K326A/I332E/E333A (15) i 2h S267E/I332E (17)), gde mutacije koje ne sadrže Glu u CH2 ispoljavaju otpornost prema Gluv8 slično kao IgG2 wt (npr.2h K326A/E333A(11) i 2h S239D/K326A/E333A (16)).

[0110] Zajedno IgG1 wt i IgG2 wt su osetljivi na proteolizu IdeS-om. Dva konstrukta 2h K326A/I332E/E333A(15) i 2h S267E/I332E (17) imaju više od 90 % intaktnog IgG1 koji ostaje nakon 24 časovne inkubacije sa IdeS, gde konstrukt 2h S239D/K326A/E333A (16) ima manje od 20 % intaktnog IgG koji ostaje. Ovi rezultati sugerišu da dodavanje Glu i CH2 u kombinaciji sa mutacijom u donjem zglobu povećava proteaznu otpornost prema IdeS, svojstvo koje sama mutacija u donjem zglobu 2h (4), ne daje.

[0111] Sva tri konstrukta se testiraju na sposobnost da ostvare ADCP, ADCC, i CDC. Tri konstrukta imaju povećan ADCP kapacitet u poređenju sa zajedno IgG2 wt i 2h (4), ali smanjen maksimum ADCP u poređenju sa IgG1 wt. Dva konstrukta, 2h K326A/I332E/E333A (15) i 2h S239D/K326A/E333A (16) imaju malo povećan ADCC u odnosu na IgG1 wt. Konstrukt 2h S267E/I332E (17) ima smanjeni ADCC u odnosu na IgG1 wt, ali povećan ADCC u odnosu na IgG2 wt i 2h (4). Sva tri konstrukta imaju povećan CDC kapacitet u odnosu na IgG2 wt i 2h (4); međutim, CDC za sva tri konstrukta je malo smanjen u odnosu na IgG1 wt.

PRIMER 6: KRATAK PREGLED KORISNIH MUTACIJA

[0112] Sledećih jedanaest Fc varijanti obezbeđuju kompoziciju antitela koja je otporna na jednu ili više proteaza koje mogu da isecaju IgG1 u donjem zglobu dok obezbeđuju jednu ili viš efektorskih funkcija koje se izlažu divljim tipom humanog IgG1. Simbol 2h označava IgG1 sa E233P/L234V/L235A -G236 koji je izbrisan.

Tabela 5.

[0113] Gde su dovoljni podaci dostupni, EC50 vrednosti se računaju kada je ubijanje ćelije završeno ili blizu završetka za in vitro testove koji se koriste kao zastupnici različitih efektorskih funkcija koje se prikazuju ispod. Podaci koji su prikazani u tabelama 6A i 6B nastaju pod identičnim uslovima osim što se razlikuje donor PBMC izvora. Stoga, slaganje promene od IgG1 wt (1) u svakom eksperimentu se koristi da se standardizuje relativna biološka aktivnost.

Tabela 6A

Tabela 6B

[0114] Efekat na ADCC i ACDP sa dodatnim modifikacijama na G237 u donjem zglobu zajedno sa S239D/I332E i 233PVA/236, se ispituje pomoću konstrukata koji su nabrojani u tabeli 7 ispod. G237A konstrukt se testira i nađeno je da ima otpornost prema MMPs, IdeS, i GluV8. Drugi konstrukti nisu procenjeni u testovima digestije. Ovi podaci ukazuju da se Ala(A) i Ser (S) tolerišu na 237, ali ne povećavaju citolitičku aktivnost Fc iznad one vrednosti koju ispoljava roditeljski molekul, 2h DE (5).

Tabela 7.

[0115] Kratki pregled kombinovane relativne otpornosti na proteazu (PR) za specifične relevantne proteaze i in vitro rezultati za proxy testove ukazuje na potencijalnu efektorsku funkciju (ADCC, ADCP, i CDC) prikazani su u tabeli 8 ispod gde su takvi konstrukti sa kombinovanom otpornosti na proteazu i jednim ili više efektorskih aktivnosti koje se mogu dokazati su u belom.

Tabela 8.

Kratak pregled rezultata

[0116] Proučavanje Fc konstrukata koje je ovde predstavljeno pokaazuje da supstitucija ostataka EU 233-236 with PVA/, mesta gde proteaze seku IgG1 molekul, proizvode Fc koji je otporan na MMP-3, MMP-12, and GluV8; proteaze koje seku između ostataka 232 i 234 (Sl. 1). Kada se kombinuju sa ovim supstitucijama, dodatne modifikacije proizvode rezistenciju prema stafilokoknoj proteazi IdeS bez obzira da li pozicije ostataka koji su zamenjeni uključuju modifikaciju na predpostavljenom mestu isecanja (EU236-237) ili na više udaljenoj poziciji.

[0117] Supstitucija ostataka EU 233-236 sa PVA/ (2h, konstrukt 4) sama za rezultat ima gubitak citolitičkih funkcija koje mogu izmeriti in vitro testovima koji su opisani za ADCC, ADCP, i CDC. U odnosu na kombinaciju modifikacija Fc IgG1 za koje je prethodno opisano da pojačavaju jednu ili više efektorskih funkcija (Tabela 2) sa supstitucijom PVA/ u donjem zglobu, neočekivano je vratila jednan ili više aspekata in vitro citolitičke aktivnosti. Stoga, nijedan konstrukt nije zajedno rezistentan na proteazu i ima aktivnost koja se može izmeriti ili povećanu aktivnost za sve tri efektorske funkcije koja se meri in vitro ubijanjem ćelija ili testovima ćeljske lize za ADCC, ADCP, i CDC.

1. Osam konstrukata imaju rezistenciju na proteazu i pojačanu ili uporedivu ADCC u poređenju sa IgG1 wt: 5, 7, 8, 9, 12, 14, 15, i 16. Šest od njih uključuju supstituciju I332E: uključujući IgG12h DE (5), IgG12h FTE (8), IgG12h DFTE (9), IgG12h ADE (12), IgG2 DE (14) i IgG12h AEA (15).

2. Tri PR konstrukta imaju sličnu ADCP u poređenju sa IgG1 wt uključujući IgG12h DE (5), IgG1 2h LPL (7), i IgG12h DFTE (9). Tri konstrukta ima blago smanjenu ADCP u poređenju sa IgG1 uključujući IgG12h FTE (8), IgG12h EFTE (10), IgG12h ADE (12), i IgG2 DE (14).

3. Pet PR mutacija je povratilo CDC kapacitet, IgG12h AA (11), IgG 2h EFTE (10), 2h AEA (15), 2h DAA (16), i 2h EE (17). Dodatno, svih pet imaju ADCP koji se može detektovati, ali je smanjen u odnosu na IgG1 wt. Dve varijante, 2h AEA (15),2h DAA (16), takođe pojačavaju ADCC u odnosu na IgG1 wt (1).

Dva konstrukta (8 i 9) koji obuhvataju H268F/S324T mutacije nisu povratila CDC kada je priustan zglob koji je rezistentan na proteazu. Mutacija S267E (EFTE (10)) je povratila CDC ali je smanjila vezivanje za FcγRIIIa (što je takođe ukazano od Moore et al. mAbs 20102(2):181.). S267E mutacija povećava afinitet prema FcγRIIb.

LISTA SEKVENCI

[0118]

<110> Janssen Biotech, Inc.

Brezski, Randall

Jordan, Robert

Strohl, William

<120> Fc MUTANTI ANTITELA KOJI SU OTPORNI NA AKTIVNU PROTEAZU

<130> CEN5304WOPCT

140> TBD

<141> Ovim

<150> 61/426619

<151> 2010-12-23

<150> 61/540882

<151> 2011-09-29

<160> 20

<170> Patentln u verziji 3,5

<210> 1

<211> 234

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 1

<211> 230

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (5)..(5)

<223> Početak kuke, ostatak EU 218 <220>

<221> DOMEN

<222> (5)..(5)

<400> 2

<211> 23

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 3

<210> 4

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 4

<210> 5

<211> 22

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Humana sekvenca IgG porekla <400> 5

<210> 6

<211> 230

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> humana IgG himerna sekvenca <400> 6

<211> 233

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> humana varijanta sekvence konstantnog regiona IgG <400> 7

<211> 233

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> humana varijanta sekvence IgG konstantnog regiona <400> 8

<211> 233

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> humani IgG konstantni region varijanta sekvence <400> 9

<211> 233

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca <220>

<223> humani IgG konstantni region varijanta sekvence <400> 10

<211> 233

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> humani IgG konstantni region varijanta sekvence <211> 233

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> humani IgG konstantni region varijanta sekvence <400> 12

<211> 233 <212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> humani IgG konstantni region varijante sekvence <400> 13

<211> 233

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> humani IgG konstantni region varijanta sekvence <400> 14

<211> 233

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> humani IgG Konstantni region varijant sekvence <220>

<221> MUTAGEN

<222> (23) .. (23)

<223> X može da bude Ala, Asp, Pro, Gln, ili Ser <400> 15

<211> 230

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> Humani IgG konstantni region varijanta sekvence <400> 16

<211> 230

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> humani IgG konstanti region varijante sekvence <400> 17

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> humani IgG konstantni region varijante sekvence <400> 18

<211> 233

<212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223humani IgG konstantni region varijante sekvence <400> 19

<211> 233 <212> PRT

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> humani IgG konstantni region varijanta sekvence <400> 20

Claims (1)

1. PATENTNI ZAHTEVI

   1. Modifikovani molekul koji sadrži Fc koji je otporan na proteolitičku degradaciju u poređenju sa divljim tipom IgG1 molekula koji sadrži Fc, koji obuhvata Fc domen antitela sa mutiranim IgG1 konstantnim regionom u kome je sekvenca E233-L234-L235-G236 humanog IgG1 zamenjena sa P233-V234-A235 sa G236 koji je izbrisan, kako se definiše po EU numeraciji, i dalje obuhvata jednu ili više supstitucija iz divljeg tipa humane IgG1 sekvence izabrane između S239D/1332E; K326A/E333A; E333A/K334A; H268F/S324T/1332E; F243L/R292P/Y300L; S239D/H268F/S324T/1332E; S267E/H268F/S324T/1332E; K326A/1332E/E333A; S239D/K326A/E333A; S267E/1332E; i G237X/S239D/1332E, gde je X A, D, P, Q ili S, kako se definiše po EU obeležavanju.

   2. Molekul koji sadrži Fc iz zahteva 1, u kome molekul koji sadrži Fc obuhvata supstitucije S239D/K326A/E333A iz divljeg tipa humane IgG1 sekvence, kako se definiše po EU obeležavanju.

   3. Molekul koji sadrži Fc iz zahteva 1, u kome je molekul koji sadrži Fc:

   i. otporan na degradaciju protezom koja može da iseče IgG1 molekul između ostataka 222-237 kako se definiše po EU obeležavanju, opciono gde je molekul koji sadrži Fc otporan na degradaciju MMP-3, MMP-7, MMP-12, MMP-13, katepsinom G, pepsinom, enzimom koji degradira imunoglobuline iz Strep. Pyrongenes (IdeS), ili glutamil endopeptidazom I iz Staph. aureus (GluV8), u poređenju sa divljim tipom IgG1, gde je molekul koji sadrži Fc otporan na degradaciju jednim ili više MMP-3, MMP-7, IdeS, ili GluV8 u poređenju sa divljim tipom IgG1;

   ii. sposoban da pokrene ADCP koji se meri u prisustvu CD14 pos i/ili CD11b pos mononuklearnih ćelija krvi, pri čemu molekul sadrži sekvencu koja je izabrana iz grupe SEQ ID NO: 8, 10-15, i 18-20, opciono sa dodatnim I332E kako se definiše po EU sistemu obeležavanja.

   iii. sposoban da pokrene ADCC koja se meri u prisustvu mononuklearnih ćelija krvi, opciono pri čemu molekul koji sadrži Fc obuhvata:

   a) dodatnu supstituciju I332E kako se definiše po EU sistemu obeležavanja; ili b) sekvencu koja se selektuje iz grupe SEQ ID NO: 8 i 10-12, i 15, 18-20; iv. sposoban da pokrene citotoksičnost koja zavisi od komplementa (CDC) koja se meri lizom ćelija u prisustvu komplementa, opciono pri čemu molekul koji sadrži Fc obuhvata sekvencu koja se selektuje iz grupe SEQ ID NO: 13, 14, i 18-20; v. sposoban da se veže za Fcγ receptor sa uporedivim ili većim afinitetom nego Fc domen IgG2 divljeg tipa; ili

   vi. sposoban da se veže za Fcγ receptor sa uporedivim ili većim afinitetom nego Fc domen IgG1 divljeg tipa.

   4. Molekul koji sadrži Fc, prema bilo kom od patentnih zahteva 1-3, gde je molekul koji sadrži Fc antitelo ili Fc fuzioni protein, opciono gde se antitelo veže za antigen na tumorskoj ćeliji, tumorskom matriksu, ili vaskulaturi tumora, na primer pri čemu se antitelo veže za jedan od CD20, ErbB1, ErbB2, ErbB3, VEGF, RON, i tkivni faktor.

   5. Molekul koji sadrži Fc prema patetnom zahtevu 1 ili zahtevu 2, pri čem sekvenca Fc domena ima najmanje 90 % istovetnosti sa divljim tipom humanog IgG1 od ostatka 214 do oko ostatka 340 u EU sistemu obeležavanja.

   6. Izolovani vezujući molekul koji je rekombinantni polipeptid koji obuhvata: (i) vezujući domen koji može da veže ciljani molekul koji je na ćeliji ili koji je vezan za ćeliju, i (ii) Fc region IgG1, pri čemu ostaci 214 do 238 kako se definišu EU sistemom obeležavanja, obuhvataju sekvencu koja se selektuje iz SEQ ID NO: 4 i 5, sa G236 koji je izbrisan; naznačen time da je vezujući molekul može da veže ciljani molekul na ciljanoj ćeliji i da molekul proizvodi lizu koja je zavisna od komplementa koja može da se izmeri, ili ćelijski posredovano ubijanje ciljnih ćelija u prisustvu potrebnog efektorskog ćelijskog tipa.

   7. Vezujući molekul prema patentnom zahtevu 6 u kome:

   i. Fc domen dalje obuhvata jednu ili više supstitucija iz sekvence divljeg tipa humanog IgG1 koje se selektuju iz S239D/I332E; K326A/E333A; E333A/K334A; H268F/S324T/I332E; F243L/R292P/Y300L; S239D/H268F/S324T/I332E; S267E/H268F/S324T/I332E; K326A/I332E/E333A; S239D/K326A/E333A;S267E/I332E; i G237X/S239D/I332E, gde X je A, D, P, Q ili S, kako se definiše EU sistemom obeležavanja;

   ii. Fc domen je otporan na degradaciju proteazom koja može da iseče IgG1 molekul između ostataka 222-237, koji su definisani EU sistemom obeležavanja, opciono pri čemu molekul koji sadrži Fc je otporan na degradaciju MMP-3, MMP-7, MMP-12, MMP-13, katepsinom G, pepsinom, IdeS, ili GluV8 u poređenju sa divljim tipom IgG1 ; ili

   iii. vezujući domen koji se selektuje iz domena koji obuhvata paratop antitela; enzim;

   hormon; receptor; citokin; površinski antigen imunske ćelije; adhezioni molekul.

   8. Vezujući molekul iz patentnog zahteva 7 (iii), u kome molekul obuhvata dva ili više domena za ciljno vezivanje i ispoljava aviditet.

   9. Vezujući molekul zahteva 8, pri čemu vezujući molekul obuhvata paratop antitela koje se vezuje za antigen na tumorskoj ćeliji ili vaskulaturi tumora.

   10. Vezujući molekul zahteva 9, pri čemu se vezujući molekul veže za jedan od CD20, ErbB1, ErbB2, ErbB3, VEGF, RON i tkivni faktor.

   11. Farmaceutska kompozicija koja se sadrži molekul prema bilo kojom od zahteva 1-10.

   12. Farmaceutska kompozicija prema patentnom zahtevu 11 za upotrebu u postupku lečenja bolesti koje su karakterisane nepoželjnom proliferacijom ili migracijom ćelija, pri čemu je bolest maligna bolest, fibrozna bolest, ili bolest koja se karakteriše nepoželjnom angiogenezom.

   14.

   15. Vezujući molekul prema zahtevu 6 za upotrebu u postupku lečenja bolesti naznačne time, što su infekcije prokariotskih organizama.

   16. Vezujući molekul za upotrebu prema zahtevu 14, pri čemu je Fc otporan na prokariotsku proteazu i sposoban za CDC.

   17. Vezujući molekul za upotrebu prema zahtevu 14, u kome vezujući molekul sadrži sekvencu koja se selektuje iz grupe SEQ ID NO: 13, 14, i 18-20.

   18. Vezujući molekul prema bilo kom patentnom zahtevu 6-10, farmaceutska kompozicija zahteva 11, farmceutska kompozicija za upotrebu prema zahtevu 12, vezujući molekul za upotebu prema zahtevu 14 ili zahtevu 15, u kome molekul koji sadrži Fc ili vezujući molekul sadrži supstitucije, kako se definiše EU sistemom obeležavanja, iz sekvence humanog IgG1 divljeg tipa.