RS56153B1

RS56153B1 - Varijante anti-cd40 antitela sa utišanim fc

Info

Publication number: RS56153B1
Application number: RS20170651A
Authority: RS
Inventors: Christoph Heusser; James Rush; Karen Vincent
Original assignee: Novartis Ag
Priority date: 2010-11-15
Filing date: 2011-11-14
Publication date: 2017-11-30
Also published as: TWI531581B; PL2640749T3; DK3502138T3; CN103209996B; TW201623335A; EP3222636A1; KR101632775B1; MY159316A; US8828396B2; US11124578B2; CN105949314A; MX336633B; EP4023676A1; AU2011331288A1; AR122999A2; WO2012065950A1; PT2640749T; CL2013001124A1; PT3502138T; AR083847A1

Description

Opis

[0001] Ovaj pronalazak se odnosi na varijante anti-CD40 antitela sa utišanim (silent) konstantnim fragmentom (Fc) i kompozicije i načine upotrebe pomenutih antitela za lečenje patoloških poremećaja kao što su autoimunski i inflamacijski poremećaji i/ili za sprečavanje ili redukovanje rizika od odbacivanja grafta u transplantaciji.

Uprkos dostupnosti nekoliko imunosupresivnih tretmana za autoimunske bolesti, postoji velika, za sada nezadovoljena, potreba za efikasnijim i bezbednijim lekovima kod velikog broja ovih pacijenata. Na primer, uprkos pokazanoj efikasnosti terapija koje uklanjaju/inhibiraju B ćelije kao što su Rituximab i Belimumab u reumatoidnom artritisu, sistemskom eritemskom lupusu, Sjogren-ovom sindromu i multiploj sklerozi, ove terapije su efikasne jedino kod jednog broja obolelih pojedinaca, a u slučaju Rituximab-a postoji prateći rizik od razvoja progresivne multifokalne leukoencefalopatije. Osim toga, mnogi drugi tipovi leukocitnih ćelija, kao što su makrofage, dendritske ćelije i T ćelije, su često uključeni u patologiju ovih autoimunskih bolesti, zbog toga bi terapijska intervencija koja je ciljano usmerena prema dodatnim tipovima ćelija ili ključnim imunskim putevima, koja bi mogla da inhibira funkciju navedenih ćelija, mogla da bude od koristi. Polazeći od višestrukih imunološki relevantnih uloga interakcije CD40-CD154 u aktivaciji i funkciji navedenih tipova ćelija, verovatno je da bi anti-CD40 antitelo moglo da obezbedi terapijsku korist, iznad nivoa koji im obezbeđuju trenutne terapije, pacijentima koji boluju od gore navedenih autoimunskih bolesti. Osim toga, centralna uloga interakcije CD40-CD154 u inflamacijskim poremećajima creva kao što su Crohn-ova bolest i ulcerozni kolitis, i povezanosti CD40 puta sa patologijom u ređim bolestima kao što su autoimunski vaskulitis, pemfigus vulgaris i ITP takođe naglašavaju potencijal pozitivnog delovanja anti-CD40 antitela u ovim indikacijama.

[0002] Trenutno dostupni imunosupresivi koji se koriste nakon transplantacije solidnih organa obezbeđuju odličnu kratkotrajnu efikasnost. Akutna odbacivanja u okviru de novo perioda su zapažena u 5% - 20% primalaca (zavisno od organa, populacije pacijenata i protokola) i udeo gubitka graftova zbog akutnog odbacivanja u okviru de novo perioda je ispod 5% u svim okolnostima. Trenutno, ključna nezadovoljena potreba je postizanje tolerancije prema imunosupresiji i dugotrajno preživljavanje pacijenata i grafta. Nakon transplantacije bubrega, 33% pacijenata umre i/ili izgubi graft unutar 5 godina nakon transplantacije; prosečna starost umrlih primalaca transplantata je 58 godina. Inhibitori kalcineurina (CNI) ostaju okosnica imunosupresivne terapije za veliku većinu transplantiranih pacijenata. Iako su nefrotoksičnost i kardiovaskularni morbiditet povezani sa CNI jedan od induktora hronične nefropatije alografta (nefrotoksičnost) kao i smrti pacijenta sa funkcionalnim graftom (kardiovaskularni morbiditet), alternativna primarna imunosupresija nije bila u stanju da zameni CNI. Sveukupno, još uvek ima prostora za poboljšanje u dugotrajnoj imunosupresiji u transplantaciji. Imunološko oštećenje transplantiranih bubrega koje je posredovano delovanjem B ćelija može biti uzrok loših ishoda, posebno dugoročno gledano, zbog toga medicinska zajednica sve više prepoznaje potrebu za novim agensima koji će delovati ciljano na odbacivanje transplantata posredovano B ćelijama.

[0003] Chir12.12 je u potpunosti humanizovano, ne-agonističko anti-CD40 antitelo (IgG1, kapa) koje blokira aktivaciju leukocita posredovanu delovanjem CD154 (takođe poznatog kao CD40 ligand; CD40L) i može da dovede do reakcije od antitela- zavisne ćelijske citotoksičnosti (ADCC) humanih leukocita i B ćelija limfoma in vitro (videti WO2006/073443). WO2005/044306 takođe opisuje anti-CD40 antagonistička antitela, uključujući Chir12.12 naročito za upotrebu u lečenju autoimunskih i inflamacijskih poremećaja. Dalje, Chir12.12 je efikasno u odlaganju reakcije odbacivanja alografta bubrega kada je dozirano kao monoterapija u Macaca fascicularis (Cynomolgus majmuni) [Li i sar. (2008) Transplantation; 86 (1):10-15]. Međutim, Chir12.12 može takođe da dovede do deplecije (uklanjanja) perifernih B ćelija kod ne-humanih primata (NHP).

[0004] Procenjuje se da anti-CD40 monoklonska antitela (mAbs) sa utišanom ADCC aktivnošću imaju poboljšan bezbednosni profil u odnosu na roditeljska anti-CD40 antitela, i da naročito mogu biti pogodnija za upotrebu u ne-onkološkim indikacijama, kao što su autoimunske bolesti i transplantacija.

[0005] Stoga, ovaj pronalazak obezbeđuje anti-CD40 monoklonska antitela sa utišanim Fc koja zadržavaju ne-agonistička, CD40L blokirajuća svojstva roditeljskog anti-CD40 antitela Chir12.12.

[0006] Naročito, pronalazak obezbeđuje izolovano antitelo ili protein koji sadrži antigenvezujući deo antitela usmeren prema ciljnom CD40 polipeptidu (SEQ ID NO:28), karakterisan time što pomenuto antitelo ili protein

a) vezuje polipeptid CD40 sa KD od 10 nM ili manje i

b) sadrži utišan Fc region IgG.

[0007] U jednom izvođenju, pomenuto antitelo ili protein inhibira signalizaciju indukovanu delovanjem CD40L sa IC50 od 50 ng/ml ili manje.

[0008] U drugom izvođenju, izolovano antitelo ili protein prema ovom pronalasku nema ili ima nisku agonističku aktivnost u odnosu na CD40 signalizaciju<.>

[0009] U drugom izvođenju, antitelo ili protein prema ovom pronalasku sadrži utišani Fc region IgG izabran iz grupe koja obuhvata aminokiselinske sekvence: SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18 ili SEQ ID NO:19.

[0010] U drugom izvođenju, izolovano antitelo ili protein ovog pronalaska sadrži varijabilne regione teškog lanca (VH) i lakog lanca (VL) koji imaju najmanje 60, 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98, 99 ili 100 procenata identičnosti sekvence sa VH antitela Chir12.12 (SEQ ID NO:9), odnosno VL antitela Chir12.12 (SEQ ID NO:10).

[0011] Specifičan primer antitela prema ovom pronalasku je

- mAb1 koje sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 11 teškog lanca i aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:12 lakog lanca.

[0012] Izolovano antitelo prema ovom pronalasku može biti korišćeno kao lek. Naročito, oni su pogodni za upotrebu u lečenju autoimunskih poremećaja, inflamacijskih poremećaja i/ili u sprečavanju ili redukovanju rizika od odbacivanja grafta u transplantaciji.

[0013] Izolovano antitelo prema ovom pronalasku može biti korišćeno naročito u lečenju multiple skleroze, sistemskog eritemskog lupusa, Sjogren-ovog sindroma, reumatoidnog artritisa i bolesti kalema protiv domaćina.

[0014] Pronalazak se takođe odnosi i na farmaceutske kompozicije koje sadrže gore navedeno antitelo prema ovom pronalasku, najmanje u kombinaciji sa farmaceutski prihvatljivom pomoćnom supstancom (ekscipientom), diluentom ili nosačem. Pomenute farmaceutske kompozicije mogu dodatno da sadrže druge aktivne sastojke.

[0015] Pronalazak se takođe odnosi na tečnu formulaciju antitela prema ovom pronalasku.

[0016] Pronalazak se dalje odnosi na izolovane nukleinske kiseline koje kodiraju antitelo ili protein prema ovom pronalasku i odgovarajući vektor za kloniranje ili ekspresiju koji sadrži nukleinske kiseline SEQ ID NO: 22 i 23.

[0017] Pronalazak se takođe odnosi na ćeliju domaćina koja sadrži jedan ili više vektora za kloniranje ili ekspresiju kako je prethodno definisano.

[0018] Pronalazak dalje obezbeđuje proces za produkovanje antitela iz ovog pronalaska, uključujući kultivaciju ćelije domaćina kako je prethodno definisano, prečišćavanje i prinos navedenog antitela ili proteina.

[0019] U cilju lakšeg razumevanja ovog pronalaska prvo su definisani određeni pojmovi. Dodatne definicije su navedene tokom daljeg detaljnog opisa.

[0020] Termin "imunski odgovor" odnosi se na delovanje, na primer, limfocita, antigen prezentujućih ćelija, fagocitnih ćelija, granulocita i solubilnih makromolekula koje produkuju napred navedene ćelije ili jetra (uključujući antitela, citokine i komplement) koje prouzrokuje selektivno oštećenje, destrukciju ili uklanjanje patogena napadača, ćelija ili tkiva koji su inficirani patogenima, kancerskih ćelija, iz organizma čoveka ili, u slučajevima autoimunosti ili patološke inflamacije, selektivno oštećenje, destrukciju ili uklanjanje normalnih humanih ćelija ili tkiva.

[0021] "Put prenosa signala" ili "signalna aktivnost" odnosi se na biohemijsku uzročnu povezanost koja generalno započinje interakcijom protein-protein kao što je vezivanje faktora rasta za receptor, što dovodi do prenosa (transmisije) signala iz jednog dela ćelije u drugi deo ćelije. Uopšteno, transmisija podrazumeva specifičnu fosforilaciju jednog ili više ostataka tirozina, serina ili treonina na jednom ili više proteina u nizu reakcija koje uzrokuju prenos signala. Predposlednji procesi tipično uključuju događaje u jedru, koji rezultiraju promenom u ekspresiji gena.

[0022] Termin CD40 odnosi se na humani CD40 antigen, na primer kao što je definisano u SEQ ID NO: 28, osim ukoliko nije drugačije opisano.

[0023] Termin "antitelo" kako se koristi u ovom tekstu odnosi se na čitava (neokrnjena) antitela i bilo koje antigen-vezujuće fragmente (tj. "antigen-vezujući deo") ili njihove pojedinačne (jednostruke) lance.

[0024] Prirodno "antitelo" je glikoprotein koji se sastoji iz najmanje dva teška (H) lanca i dva laka (L) lanca međusobno povezana disulfidnim vezama. Svaki teški lanac je sagrađen od varijabilnog regiona teškog lanca (ovde označen skraćenicom VH) i konstantnog regiona teškog lanca. Konstantni region teškog lanca se sastoji od tri domena, CH1, CH2 i CH3. Svaki laki lanac se sastoji iz varijabilnog regiona lakog lanca (ovde skraćeno kao VL) i konstantnog regiona lakog lanca. Konstantni region lakog lanca se sastoji od jednog domena, CL. Regioni VH i VL mogu dalje biti podeljeni u regione hipervarijabilnosti, nazvane regioni koji određuju komplementarnost (CDR), između kojih se nalaze regioni koji su više konzervirani, nazvani okvirni (framework) regioni (FR). Svaki VH i VL sadrži tri CDR i četiri FR koji su počev od aminoterminalnog ka karboksi-terminalnom delu lanca raspoređeni u sledećem poretku: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Varijabilni regioni lakih i teških lanaca sadrže vezujući domen koji prepoznaje antigen. Konstantni regioni antitela mogu da učestvuju u vezivanju imunoglobulina za tkiva ili faktore domaćina, uključujući različite ćelije imunskog sistema (npr., efektorske ćelije) i prvu komponentu (Clq) klasičnog sistema komplementa.

[0025] Termin "antigen-vezujući deo" antitela (ili jednostavno "antigenski deo"), kako se koristi u ovom tekstu, odnosi se na punu dužinu antitela ili na jedan ili više fragmenata antitela koji zadržavaju sposobnost da se specifično vežu za antigen (npr., deo CD40 molekula). Pokazano je da antigen-vezujuću funkciju antitela mogu da izvrše fragmenti antitela pune dužine. Primeri vezujućih fragmenata obuhvaćeni terminom "antigen-vezujući deo" antitela uključuju Fab fragment, monovalentni fragment koji se sastoji iz VL, VH, CL i CH1 domena; F(ab)2 fragment, bivalentni fragment koji se sastoji iz dva Fab fragmenta povezana disulfidnim mostom u regionu zgloba; Fd fragment koji se sastoji iz VH i CH1 domena; Fv fragment koji se sastoji iz VL i VH domena jednog kraka antitela; dAb fragment (Ward i sar., 1989 Nature 341:544-546), koji se sastoji iz VH domena i izolovani region koji određuje komplementarnost (CDR), ili bilo koji fuzioni proteini koji sadrže takav antigen-vezujući deo.

[0026] Osim toga, iako su dva domena Fv fragmenta, VLi VH, kodirana odvojenim genima, oni mogu biti spojeni, korišćenjem postupaka rekombinacije, primenom sintetskog spojnika (linkera) koji omogućava da oni budu načinjeni kao jednolančani protein u kome su VL i VH regioni upareni i obrazuju monovalentne molekule (poznate kao jednolančani Fv (scFv); videti npr., Bird i sar., 1988 Science 242:423-426; i Huston i sar., 1988 Proc. Natl. Acad. Sci.

85:5879-5883). Podrazumeva se da su takva jednolančana antitela takođe obuhvaćena terminom "antigen-vezujući deo" antitela. Ovi fragmenti antitela su dobijeni korišćenjem konvencionalnih tehnika koje su poznate onima koji su umešni u struci, a upotrebljivost fragmenata je ispitivana na isti način kao što je ispitivana korisnost intaktnih antitela.

[0027] Kako se koristi u ovom tekstu, termin "Fc region IgG" je korišćen da definiše C-terminalni region teškog lanca imunoglobulina, uključujući Fc region sa nativnim sekvencama i varijante Fc regiona. Humani Fc region teškog lanca IgG je generalno definisan kao region koji obuhvata aminokiselinske ostatke od pozicije C226 ili od P230 do karboksi-terminalnog kraja IgG antitela. Numerisanje ostataka u Fc regionu je prema Kabat-ovom EU indeksu. C-terminalni lizin (aminokiselinski ostatak K447) Fc regiona može biti uklonjen, na primer, tokom produkcije ili prečišćavanja (purifikacije) antitela. Shodno tome, kompozicija antitela ovog pronalaska može da sadrži populacije antitela u kojima su uklonjeni svi ostaci K447, populacije antitela u kojima ostaci K447 nisu uklonjeni, i populacije antitela koje obuhvataju mešavinu antitela sa i bez ostatka K447.

[0028] "Izolovano antitelo", kako se koristi u ovom tekstu, odnosi se na antitelo koje je suštinski oslobođeno prisustva (bez primesa) drugih antitela koja imaju drugačije antigenske specifičnosti (npr., izolovano antitelo koje se specifično vezuje za CD40 je suštinski bez prisustva antitela koja se specifično vežu za druge antigene, različite od CD40). Međutim, izolovano antitelo koje se specifično veže za CD40 može imati unakrsnu reaktivnost prema drugim antigenima, kao što su CD40 molekuli drugih (ne-humanih) vrsta. Šta više, izolovano antitelo može biti suštinski oslobođeno prisustva drugog ćelijskog materijala i/ili hemikalija.

[0029] Termin "monoklonsko antitelo" ili "kompozicija monoklonskog antitela" kako se koristi u ovom tekstu odnosi se na preparat molekula antitela kojeg čini kompozicija jednog tipa molekula monoklonskog antitela. Kompozicija monoklonskog antitela pokazuje jedinstvenu specifičnost vezivanja i afinitet za jedan određeni epitop.

[0030] Termin "humanizovano antitelo", kako se koristi u ovom tekstu, podrazumeva se da se odnosi na antitela koja sadrže minimalnu sekvencu izvedenu iz sekvenci imunoglobulina nehumanog porekla. Najvećim delom, humanizovana antitela su humani imunoglobulini (antitelo primalac - recipijentno antitelo) u kojima su ostaci iz hipervarijabilnog regiona (takođe poznatog kao region koji određuje komplementarnost ili CDR) antitela primalaca zamenjeni ostacima iz hipervarijabilnog regiona ne-humanih vrsta (antitelo davalac – donorsko antitelo) kao što su miš, pacov, zec (kunić) ili ne-humani primati koji imaju željenu specifičnost, afinitet i kapacitet. Fraza "region koji određuje komplementarnost" odnosi se na aminokiselinske sekvence koje zajedno definišu afinitet vezivanja i specifičnost prirodnog Fv regiona veznog mesta nativnog imunoglobulina. Videti, npr., Chothia i sar. (1987) J. Mol. Biol.196:901-917: Kabat i sar. (1991) US Dept. of Health and Human Services, NIH Publikacija No. 91-3242). Fraza "konstantni region" odnosi se na deo molekula antitela koji omogućava efektorske funkcije. U prethodnom radu, koji je bio usmeren ka produkovanju ne-imunogenih antitela za upotrebu u terapiji humane bolesti, konstantni regioni antitela miša su bili zamenjeni konstantnim regionima antitela čoveka. Konstantni regioni humanizovanih antitela o kojima je reč su dobijeni iz humanih imunoglobulina. Humanizacija može biti učinjena sledeći postupak koji su primenili Winter i saradnici (Jones i sar. (1986) Nature 321:522-525; Riechmann i sar. (1988) Nature 332:323-327: Verhoeyen i sar. (1988) Science 239: 1534-1536), zamenom CDR-ova ili CDR sekvenci glodara ili mutiranih glodara odgovarajućim sekvencama humanog antitela. U nekim slučajevima, ostaci unutar okvirnih (framework) regiona jednog ili više varijabilnih regiona humanog imunoglobulina su zamenjeni odgovarajućim ne-humanim ostacima (videti, na primer, US Patent Br 5,585,089; 5,693,761; 5,693,762; i 6,180,370). Osim toga, humanizovana antitela mogu da sadrže ostatke koji nisu nađeni u antitelu primaocu ili u antitelu davaocu. Humanizovana antitela predmetnog pronalaska će takođe sadržavati najmanje deo konstantnog regiona imunoglobulina (Fc). Tipično, humanog imunoglobulina i u ovom slučaju utišan Fc region IgG.

[0031] Antitela ovog pronalaska mogu da uključe aminokiselinske ostatke koji nisu kodirani humanim sekvencama (npr., mutacije uvedene slučajnim ili mesto-specifičnim mutagenezama in vitro ili somatskim mutacijama in vivo). Naročito, termin "humanizovano antitelo" uključuje antitela koja sadrže utišanu varijantu Fc regiona IgG.

[0032] Termin "humanizovano monoklonsko antitelo" odnosi se na antitela koja pokazuju jednostruku specifičnost vezivanja, koja imaju varijabilne regione u kojima su varijabilni regioni humanizovani ubacivanjem sekvenci ne-humanog porekla.

[0033] Termin "rekombinantno antitelo", kako se koristi u ovom tekstu, uključuje sva humana ili humanizovana antitela koja su pripremljena, ispoljena, kreirana ili izolovana pomoću tehnologije rekombinacija, kao što su antitela izolovana iz životinje (npr., miša) koja je transgenična ili transhromozomalna za gene humanih imunoglobulina ili hibridomskih ćelija napravljenih od ovih životinja, antitela izolovana iz ćelija domaćina transformisanih da produkuju humano ili humanizovano antitelo, npr., antitela iz transfektoma, antitela izolovana iz rekombinantne, kombinatorijalne biblioteke humanih antitela, i antitela pripremljena ispoljena, kreirana ili izolovana na bilo koji drugi način koji uključuje splajsovanje svih ili delova sekvenci, gena za humani imunoglobulin sa drugim DNK sekvencama. Takva rekombinantna humana ili humanizovana antitela imaju varijabilne regione u kojima okvirni (framework) regioni i CDR regioni mogu biti dobijeni iz germinativnih sekvenci humanog imunoglobulina. U određenim izvođenjima, međutim, takva rekombinantna humana ili humanizovana antitela mogu biti podvrgnuta in vitro mutagenezi (ili kada je korišćena životinja transgenična za sekvence humanog Ig, u in vivo somatskoj mutagenezi) tako da su aminokiselinske sekvence VH i VL regiona rekombinantnih antitela sekvence koje (iako su nastale iz i u vezi su sa germinativnim sekvencama za humani VH i VL) ne moraju prirodno postojati u germinativnom repertoaru za humana antitela in vivo.

[0034] Kako se koristi u ovom tekstu, "izotip" se odnosi na klasu antitela (npr., IgM, IgE, IgG kao što je IgG1 ili IgG4) koja je određena genima za konstantni region teškog lanca. Različti izotipovi imaju različite efektorske funkcije. Na primer, nemodifikovani (wild) tip humanog IgG1 i IgG3 izotipa može da dovede do reakcije od antitela- zavisne ćelijama- posredovane citotoksičnosti (ADCC).

[0035] Fraze "antitelo koje prepoznaje antigen" i "antitelo specifično za antigen" i "antitelo usmereno prema antigenu" se u ovom tekstu koriste naizmenično sa terminom "antitelo koje se specifično vezuje za antigen".

[0036] Kako se koristi u ovom tekstu, antitelo ili protein koji se "specifično vezuje za CD40 polipeptid" podrazumeva se da se odnosi na antitelo ili protein koji se vezuje za humani CD40 polipeptid sa KD od 100 nM ili manje, 10 nM ili manje, 1 nM ili manje.

[0037] Antitelo koje "unakrsno reaguje sa antigenom koji nije CD40" podrazumeva se da se odnosi na antitelo koje se vezuje za taj antigen sa KD od 1 μM ili manje, 100 nM ili manje, 10 nM ili manje, 1 nM ili manje. Antitelo koje "nije unakrsno reaktivno sa određenim antigenom" podrazumeva se da se odnosi na antitelo koje se vezuje za taj antigen, sa KD od 100 nM ili većom, ili KD od 1 μM ili većom, ili KD od 10 μM ili većom. U nekim izvođenjima, takva antitela koja nisu unakrsno-reaktivna sa antigenom ispoljavaju praktično nedetektabilno vezivanje za ove proteine u standardnim testovima vezivanja.

[0038] Termin "Kasoc" ili "Ka", kako se koristi u ovom tekstu, podrazumeva se da se odnosi na brzinu asocijacije određene interakcije antitelo antigen, dok se termin "Kdis" ili "Kd," kao što se koristi u ovom tekstu, odnosi na brzinu disocijacije određene interakcije antitelo-antigen.

[0039] Termin "KD", kako se koristi u ovom tekstu, podrazumeva se da se odnosi na konstantu disocijacije, koja je dobijena iz odnosa Kd i Ka (tj. Kd/Ka) i iskazana je kao molarna koncentracija (M). Vrednosti KD za antitela mogu da se odrede korišćenjem postupaka koji su dobro poznati u struci. Za određivanje KD antitela korišćena je tehnika površinske plazmonske rezonance (surface plasmon resonance) ili biosenzorni sistem kao što je Biacore® sistem.

[0040] Kako se koristi u ovom tekstu, termin "Afinitet" se odnosi na jačinu interakcije između antitela i antigena na nivou jednog antigenskog (antigen-vezujućeg) mesta. Unutar svakog antigenskog (antigen-vezujućeg) mesta, varijabilni region "kraka" antitela reaguje posredstvom slabih nekovalentnih sila sa antigenom na brojnim mestima; što je više interakcija, afinitet je jači.

[0041] Kako se koristi u ovom tekstu, termin "Aviditet" odnosi se na informativnu meru ukupne stabilnosti ili snage antitelo-antigen kompleksa. Njega kontrolišu tri glavna faktora: afinitet antitela za epitop; valentnost i antigena i antitela; i strukturno uređenje delova koji su u kontaktu. Konačno, ovi faktori definišu specifičnost antitela, odnosno, verovatnoću da se određeno antitelo veže za tačan (precizan) epitop antigena.

[0042] Kako se koristi u ovom tekstu, termin "CD40 antagonista" podrazumeva se da se odnosi na antitelo ili protein koji inhibira signalnu aktivnost indukovanu CD40, u prisustvu CD40L u testu sa humanim ćelijama kao što je test CD40L– posredovane proliferacije PBMC. Takav test je detaljnije opisan u odeljku Primeri u delu teksta koji sledi. U nekim izvođenjima, antitela ili proteini ovog pronalaska inhibiraju CD40L- indukovane signale sa IC50 od 500 ng/ml ili manje, poželjno sa IC50 od 50 ng/ml ili manje, na primer sa IC50 od 20 ng/ml ili manje, kao što je izmereno u testu CD40L– posredovane proliferacije PBMC.

[0043] Kako se koristi u ovom tekstu, antitelo koje "nema agonističku aktivnost" podrazumeva se da se odnosi se na antitelo koje značajno ne povećava CD40 -posredovanu signalnu aktivnost u odsustvu CD40L u ćelijskom testu, kao što je test CD40L- posredovane proliferacije PBMC. Takav test je opisan detaljnije u odeljku Primeri u delu teksta koji sledi.

[0044] Kako se koristi u ovom tekstu, termin "ADCC" ili "od antitela- zavisna ćelijska citotoksičnost" odnosi se na aktivnost deplecije (uklanjanja) ćelija. ADCC aktivnost se može meriti testom ADCC kao što je detaljnije opisano u odeljku teksta Primeri, koji sledi.

[0045] Kako se koristi u ovom tekstu, termin "utišano (silent)" antitelo se odnosi na antitelo koje ne ispoljava ili ispoljava slabu aktivnost ADCC kako je izmereno u testu ADCC kao što je opisano u Primerima.

[0046] U jednom izvođenju, termin "bez ili sa slabom ADCC aktivnošću" znači da utišano antitelo ispoljava ADCC aktivnost koja je manja od 50% specifične lize ćelije, na primer manja od 10% specifične lize ćelije kako je izmereno u ADCC testu kao što je opisano u Primerima. Odrednica bez ADCC aktivnosti znači da utišano antitelo ispoljava ADCC aktivnost (specifičnu lizu ćelije) koja je manja od 1%. U određenom izvođenju, utišano antitelo prema ovom pronalasku ne ispoljava bilo kakvu značajnu ADCC aktivnost kako je izmereno u ADCC testu, kao što je opisano u Primerima.

[0047] Utišane efektorske funkcije mogu biti dobijene mutacijama u Fc regionu antitela i opisane su u struci: LALA i N297A (Strohl, W., 2009, Curr. Opin. Biotechnol. vol. 20(6):685-691); i D265A (Baudino i sar., 2008, J. Immunol. 181: 6664-69; Strohl, W., supra). Primeri antitela sa utišanim Fc IgG1 uključuju takozvani LALA mutant koji sadrži L234A i L235A mutaciju u aminokiselinskoj sekvenci Fc IgG1. Drugi primer utišanog IgG1 antitela sadrži D265A mutaciju. Još jedno utišano IgG1 antitelo sadrži N297A mutaciju, što rezultira u aglikoziliranim/neglikoziliranim antitelima.

[0048] Kako se koristi u ovom tekstu, termin "selektivnost" za antitelo ili protein ovog pronalaska odnosi se na antitelo ili protein koji se vezuje za određeni ciljni polipeptid ali ne i za blisko srodne polipeptide.

[0049] Kako se koristi u ovom tekstu, termin "visok afinitet" za antitelo odnosi se na antitelo koje ima KD od 1 nM ili manju za ciljni antigen. Kako se koristi u ovom tekstu, termin "subjekat" uključuje čoveka ili životinju.

[0050] Termin "životinja" uključuje sve kičmenjake, npr., sisare i ne-sisare, kao što su nehumani primati, ovce, psi, mačke, konji, krave, kokoške, vodozemci, gmizavci, itd.

[0051] Kako se koristi u ovom tekstu, termin "optimizovan" znači da je nukleotidna sekvenca izmenjena da kodira aminokiselinsku sekvencu na način da se koriste kodoni koji su poželjni za ćeliju ili organizam koji ih produkuje, generalno eukariotske ćelije, na primer za ćeliju Pichia, za ćeliju Trichoderma, za jajnu ćeliju kineskog hrčka (CHO) ili za humane ćelije. Optimizovana nukleotidna sekvenca je konstruisana tako da u potpunosti ili najviše što je moguće zadrži aminokiselinsku sekvencu originalno kodiranu startnom nukleotidnom sekvencom, koja je takođe poznata kao "roditeljska" sekvenca. Optimizovane sekvence u ovom pronalasku su konstruisane tako da imaju kodone koji su poželjni u CHO ćelijama sisara, međutim u ovom pronalasku je takođe predviđena optimizovana ekspresija ovih sekvenci i u drugim eukariotskim ćelijama. Aminokiselinske sekvence kodirane optimizovanim nukleotidnim sekvencama takođe se nazivaju optimizovane aminokiselinske sekvence.

[0052] Kako se koristi u ovom tekstu, procenat identičnosti između dve sekvence je funkcija broja identičnih pozicija koje dele sekvence (tj. % identičnosti = broj identičnih pozicija/ukupan broj pozicija x 100), uzimajući u obzir broj praznina i dužinu svake praznine, što treba da bude uračunato za optimalno poravnanje dve sekvence. Poređenje sekvenci i određivanje procenta identičnosti između dve sekvence može biti urađeno korišćenjem matematičkog algoritma, kao što je kasnije opisano.

[0053] Procenat identičnosti između dve aminokiselinske sekvence može biti određen korišćenjem algoritma E. Meyers-a i W. Miller-a (Comput. Appl. Biosci., 4:11-17, 1988) koji je sastavni deo programa ALIGN (verzija 2.0), korišćenjem tabele masa aminokiselinskih ostataka PAM120 i parametara: penal za dužinu praznine (gap lenght) od 12 i penal za prazninu od 4. Alternativno procenat identičnosti između dve aminokiselinske sekvence može biti određen korišćenjem algoritma Needleman-a i Wunsch-a (J. Mol, Biol.48:444-453, 1970) koji je sastavni deo programa GAP u GCG softverskom paketu (dostupno na http://www.gcg.com), korišćenjem ili Blossom 62 matrice ili PAM250 matrice i parametara: težina praznine (gap weight) od 16, 14, 12, 10, 8, 6 ili 4 i težina dužine (lenght weight) od 1, 2, 3, 4, 5, ili 6.

[0054] Procenat identičnosti između dve nukleotidne sekvence može takođe biti određen korišćenjem, na primer, algoritama kao što je BLASTN program za sekvence nukleinske kiseline korišćenjem kao zadatih parametre: dužina reči (W) od 11, očekivanje (E) od 10, M=5, N=4, i poređenjem oba niza.

Rekombinanta antitela

[0055] Antitela ovog pronalaska uključuju humanizovana rekombinantna antitela mAb1-mAb3, izolovana i strukturno okarakterisana aminokiselinskim sekvencama pune dužine njihovih teških i lakih lanaca kako je navedeno u Tabeli 1:

Tabela 1: Aminokiselinske sekvence pune dužine teškog i lakog lanca mAb1-mAb3

[0056] Sve aminokiselinske sekvence odgovarajućih varijabilnih regiona, VHi VL, ovih izolovanih antitela mAb1-mAb3 ovog pronalaska potiču iz istog antitela Chir12.12. koje je ranije opisano na primer u WO2006/073443 i koje sadrži VHsa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO:7 i VLsa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO:8.

[0057] Jedna važna razlika antitela iz ovog pronalaska u poređenju sa originalnim CHIR12.12 antitelom je da antitela iz ovog pronalaska imaju Fc region koji obuhvata utišani Fc region IgG, na primer utišani Fc region IgG1.

[0058] Posebno, Tabela 2 sumarno prikazuje izmene Fc regiona IgG1 učinjene u cilju dobijanja antitela mAb1-mAb3 u poređenju sa originalnim CHIR12.12 antitelom.

Tabela 2: Izmena Fc regiona IgG1 u cilju dobijanja mAb1-mAb3

[0059] Druga antitela ovog pronalaska uključuju ona koja imaju aminokiseline koje su mutirane uklanjanjem (delecijom) aminokiseline, umetanjem (insercijom) aminokiseline ili zamenom (substitucijom) aminokiseline, ipak ova antitela imaju najmanje 60, 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98, 99 ili 100 procenata identičnosti sa VH i VL regionima CHIR12.12 antitela, odnosno SEQ ID NO:7 (region VH) i SEQ ID NO:8 (region VL) i sadrže utišan Fc region IgG, na primer utišan Fc region IgG1.

[0060] U nekim izvođenjima, antitelo ovog pronalaska je mutirana varijanta bilo kog od mAb1-mAb3, u kome navedena mutirana varijanta antitela uključuje mutirane aminokiselinske sekvence pri čemu je ne više od 1, 2, 3, 4 ili 5 aminokiselina mutirano uklanjanjem (delecijom), umetanjem (insercijom) ili zamenom (substutucijom) u VH i VL regionima kada se poredi sa VH<i V>L<regionima CHIR12.12, odnosno SEQ ID NO:7 (region V>H<) i SEQ ID NO:8 (region V>L<) i>takvo mutirano antitelo zadržava iste konstantne regione kao mAb1, mAb2 ili mAb3.

[0061] Nukleotidne sekvence koje kodiraju punu dužinu lakog i teškog lanca mAb1-mAb3 su prikazane u Tabeli 3 koja sledi.

Tabela 3: DNK sekvence koje kodiraju punu dužinu teškog i lakog lanca

[0062] Druge nukleinske kiseline koje kodiraju antitela ovog pronalaska uključuju nukleinske kiseline koje su mutirane uklanjanjem (delecijom) nukleotida, umetanjem (insercijom) nukleotida ili zamenom (substutucijom) nukleotida, a ipak imaju najmanje 60, 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98, 99 ili 100 procenata identičnosti sa sekvencama koje kodiraju odgovarajuće VHi VLregione CHIR12.12, kao što je prikazano u sekvencama opisanim na primer u SEQ ID NO:20 (VHregion), odnosno SEQ ID NO:21 (VLregion) i sadrže i sekvencu koja kodira utišani Fc region IgG, na primer, utišani Fc region IgG1.

[0063] U nekim izvođenjima, uključene su varijante nukleinskih kiselina pri čemu je ne više od 1, 2, 3, 4 ili 5 nukleotida promenjeno uklanjanjem (delecijom) nukleotida, umetanjem (insercijom) nukleotida ili zamenom (substutucijom) nukleotida, u regionima koji kodiraju VHi VLtako da ovako izmenjena antitela imaju regione VHi VLkodirane sekvencama opisanim na primer u SEQ ID NO:20 (VHregion), odnosno SEQ ID NO:21 (VLregion), i zadržavaju iste kodirajuće sekvence konstantnih regiona mAb1, mAb2 ili mAb3 koje odgovaraju nabrojanim antitelima.

Homologna antitela

[0064] Osim rekombinantnih antitela ovog pronalaska, mAb1-mAb3, pronalazak takođe obuhvata homologna antitela ili proteine koji zadržavaju željene funkcionalne osobine mAb1-mAb3 antitela.

[0065] Posebno, navedena homologna antitela ili proteini prema ovom pronalasku su antitela ili proteini koji sadrže antigen-vezujući deo antitela usmeren prema ciljnom CD40 polipeptidu (SEQ ID NO:28), naznačeno time što se navedeno antitelo ili protein

a) vezuje za CD40 polipeptid sa KD od 10 nM ili manje i,

b) sadrži utišani Fc region IgG

i gde pomenuta homologna antitela ili proteini zadržavaju željena funkcionalna svojstva originalnih mAb1-mAb3 antitela.

[0066] Željena funkcionalna svojstva originalnih mAb1-mAb3 antitela mogu biti izabrana iz jednog ili više od sledećih svojstava:

(i) specifično se vezuje za CD40, na primer, sa KD koja je 100 nM ili manje, 10 nM ili manje, ili 1 nM ili manje, mereno testom Biacore;

(ii) antagonista je CD40, na primer, inhibira CD40L indukovanu signalizaciju kako je izmereno u testu CD40L posredovane proliferacije PBMC;

(iii) ne ispoljava ili ispoljava nisku agonističku aktivnost, kako je izmereno u testu CD40L posredovane proliferacije PBMC;

(iv) unakrsno reaguje sa CD40 polipeptidom Cynomolgus majmuna;

(v) nema ili ima slabu ADCC aktivnost; i,

(vi) ima svojstva prikladna za razvoj leka.

[0067] U jednom specifičnom izvođenju, navedena homologna antitela ili proteini prema ovom pronalasku sadrže utišan Fc region IgG1, na primer, utišan Fc region IgG1 izabran iz grupe koja obuhvata SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18 ili SEQ ID NO:19.

[0068] U jednom specifičnom izvođenju, pronalazak se odnosi na antitelo ili protein koje ima nukleotidne sekvence varijabilnog regiona teškog i lakog lanca, ili aminokiselinske sekvence varijabilnog regiona teškog i lakog lanca, ili aminokiselinske sekvence ili nukleotidne kodirajuće sekvence svih 6 CDR-ova koje su homologne odgovarajućim aminokiselinskim ili nukleotidnim sekvencama gore opisanih mAb1-mAb3 antitela, posebno u Tabeli 1, a pomenuto antitelo ili protein sadrži utišani Fc region IgG izabran iz grupe koja obuhvata Fc region mAb1 (SEQ ID NO:17), Fc region mAb2 (SEQ ID NO:18) i Fc region mAb3 (SEQ ID NO:19), gde se pomenuto homologno antitelo ili protein specifično vezuje za CD40, i antitelo ili protein ispoljavaju sledeća funkcionalna svojstva: antagonist je CD40, nema ili ispoljava nisku agonističku aktivnost, i nema ili ima slabu ADCC aktivnost.

[0069] Na primer, pronalazak se odnosi na antitela ili proteine homologne mAb1-mAb3, koja sadrže utišani Fc region IgG izabran iz grupe koja obuhvata Fc region mAb1 (SEQ ID NO:17), Fc region mAb2 (SEQ ID NO:18) i Fc region mAb3 (SEQ ID NO:19), i sadrže sekvence varijabilnog dela teškog lanca (VH) i varijabilnog dela lakog lanca (VL) u kojima CDR sekvence dele najmanje 60, 70, 90, 95, 96, 97, 98, 99 ili 100 procenata identičnosti sekvence sa odgovarajućim CDR sekvencama mAb1-mAb3, odnosno SEQ ID NO:1-6, pri čemu se pomenuto homologno antitelo ili protein specifično veže za CD40 i homologno antitelo ili protein ispoljava sledeća funkcionalna svojstva: antagonista je CD40, nema ili ispoljava nisku agonističku aktivnost i nema ili ima slabu ADCC aktivnost.

[0070] U sličnom specifičnom izvođenju, homologno antitelo ili protein

a) se veže za CD40 sa KD od 1 nM ili manje;

b) inhibira CD40L- indukovanu signalizaciju sa IC50 od 50ng/ml ili manje kako je izmereno testom CD40L- indukovane proliferacije PBMC kao što je opisano u Primerima;

c) nema ili ima nisku agonističku aktivnost kako je izmereno u bioeseju kao što je test CD40L-posredovane proliferacije PBMC kao što je opisano u Primerima i,

d) nema ili ima slabu ADCC aktivnost.

[0071] Pronalazak se dalje odnosi na antitela ili proteine homologne mAb1-mAb3, koji sadrže utišani Fc region IgG izabran iz grupe koja obuhvata Fc region mAb1 (SEQ ID NO:17), Fc region mAb2 (SEQ ID NO:18) i Fc region mAb3 (SEQ ID NO:19), i sadrže sekvence varijabilnog dela teškog lanca (VH) i varijabilnog dela lakog lanca (VL) koje dele najmanje 80, 90, 95, 96, 97, 98, 99 ili 100 procenata identičnosti sa sekvencama odgovarajućih (VH) i (VL) regiona mAb1-mAb3, SEQ ID NO:7 (VH region), odnosno SEQ ID NO:8 (VL region), pri čemu se pomenuto homologno antitelo ili protein specifično veže za CD40, i antitelo ili protein ispoljava sledeća funkcionalna svojstva: antagonista je CD40, nema ili ispoljava nisku agonističku aktivnost, nema ili ima slabu ADCC aktivnost.

[0072] U sličnom specifičnom izvođenju, pomenuto homologno antitelo ili protein

a) se vezuje za CD40 sa KD od 1 nM ili manje;

b) inhibira signal koji indukuje CD40L sa IC50 od 50 ng/ml ili manje kako je izmereno testom CD40L- posredovane proliferacije PBMC koji je opisan u Primerima;

c) nema ili ima nisku agonističku aktivnost kako je izmereno u bioeseju kao što je test CD40L-posredovane proliferacije PBMC koji je opisan u Primerima i,

d) nema ili ima slabu ADCC aktivnost.

[0073] U drugom primeru, pronalazak se odnosi na antitela ili proteine homologne mAb1-mAb3 koja sadrže utišan Fc region IgG izabran iz grupe koja obuhvata Fc region mAb1 (SEQ ID NO:17), Fc region mAb2 (SEQ ID NO:18) i Fc region mAb3 (SEQ ID NO:19), pri čemu su: varijabilni regioni teških i lakih lanaca kodirani nukleotidnim sekvencama koje su najmanje 80%, najmanje 90%, najmanje 95% ili 100% identične sa odgovarajućim kodirajućim nukleotidnim sekvencama varijabilnih regiona teških i lakih lanaca mAb1-mAb3, pri čemu se pomenuto homologno antitelo ili protein specifično vezuju za CD40 i antitelo ili protein ispoljava sledeća funkcionalna svojstva: antagonista je CD40, nema ili ispoljava nisku agonističku aktivnost i nema ili ima slabu ADCC aktivnost.

[0074] U sličnom specifičnom izvođenju, pomenuto homologno antitelo ili protein

a) se vezuje za CD40 sa KD od 1 nM ili manje;

b inhibira signal koji indukuje CD40L sa IC50 od 50 ng/ml ili manje kako je izmereno testom CD40L- posredovane proliferacije PBMC koji je opisan u Primerima;

d) nema ili ima slabu ADCC aktivnost.

[0075] Antitela sa mutiranim aminokiselinskim sekvencama mogu biti dobijena mutagenezom (npr., ciljanom (site-directed) ili PCR- posredovanom mutagenezom) kodirajućih molekula nukleinske kiseline, sledstvenim testiranjem da li je kodirano izmenjeno antitelo zadržalo funkciju (tj. niz funkcija naveden u prethodnom delu teksta) korišćenjem funkcionalnih testova opisanih u Primerima koji su navedeni u delu teksta koji sledi.

[0076] U nekim izvođenjima, antitela ili proteini homologni mAb1-mAb3 kao što je opisano u prethodnom delu teksta imaju konzervativne modifikacije sekvenci.

[0077] Kako se ovde koristi, termin "konzervativne modifikacije sekvenci" podrazumeva se da se odnosi na zamene (substitucije) aminokiselina u kojima je aminokiselinski ostatak zamenjen aminokiselinskim ostatkom koji ima sličan bočni lanac. Familije aminokiselinskih ostataka koje imaju slične bočne lance su definisane u struci. Ove familije uključuju aminokiseline sa baznim bočnim lancima (npr., lizin, arginin, histidin), kiselim bočnim lancima (npr., asparaginska kiselina, glutaminska kiselina), nejonizovanim polarnim bočnim lancima (npr., glicin, asparagin, glutamin, serin, treonin, tirozin, cistein, triptofan), nepolarnim bočnim lancima (npr., alanin, valin, leucin, izoleucin, prolin, fenilalanin, metionin), beta-razgranatim bočnim lancima (npr., treonin, valin, izoleucin) i aromatičnim bočnim lancima (npr., tirozin, fenilalanin, triptofan, histidin). Prema tome, jedan ili više aminokiselinskih ostataka unutar CDR regiona antitela ovog pronalaska mogu biti zamenjeni drugim aminokiselinskim ostatkom (ostacima) iz iste familije bočnog lanca i izmenjeno antitelo može biti testirano da li je zadržalo funkcionalne osobine korišćenjem u ovom tekstu opisanih funkcionalnih testova.

[0078] Modifikacije antitela ovog pronalaska mogu biti izvršene standardnim tehnikama poznatim u struci, kao što su ciljana (site-directed) mutageneza i PCR- posredovana mutageneza.

Molekuli nukleinskih kiselina koji kodiraju antitela ili proteine ovog pronalaska

[0079] Drugi aspekt ovog pronalaska odnosi se na molekule nukleinskih kiselina koji kodiraju antitela ili proteine pronalaska kako je opisano u prethodnom delu ovog teksta.

[0080] Primeri nukleotidnih sekvenci lakih i teških lanaca bilo kog od mAb1 do mAb3 mogu biti izvedeni iz Tabele 3 (koja prikazuje celokupne kodirajuće nukleotidne sekvence teških i lakih lanaca od mAb1 do mAb3).

[0081] Drugi primeri nukleotidnih sekvenci lakih i teških lanaca prema ovom pronalasku su bilo koja sekvenca koja kodira aminokiselinske sekvence za punu dužinu teškog i/ili lakog lanca mAb1, mAb2 ili mAb3 kako je opisano u Tabeli 1.

[0082] Pronalazak se takođe odnosi na molekule nukleinskih kiselina koji nastaju iz onih sekvenci koje su optimizovane za ekspresiju proteina u ćelijama sisara, na primer, CHO ćelijskim linijama.

[0083] Nukleinske kiseline mogu biti prisutne u kompletnim ćelijama, u lizatu ćelija, ili mogu biti nukleinske kiseline u delimično prečišćenoj ili suštinski čistoj formi. Nukleinska kiselina je "izolovana" ili "učinjena suštinski čistom (nezagađenom)" kada je prečišćena izvan prisustva drugih ćelijskih komponenti ili drugih kontaminanata, npr., drugih ćelijskih nukleinskih kiselina ili proteina, standardnim tehnikama, uključujući alkalni/SDS tretman, CsCl izolacija plazmidne DNK (banding), hromatografiju na koloni, elektroforezu na agaroznom gelu i drugim dobro poznatim u struci. Videti, F. Ausubel, i sar., izd.1987 Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York. Nukleinska kiselina ovog pronalaska može biti, na primer, DNK ili RNK i može ili ne mora da sadrži intronske sekvence. U jednom izvođenju, nukleinska kiselina je molekul cDNK. Nukleinska kiselina može biti prisutna u bakteriofagu kao vektoru ili u rekombinantnom plazmidu kao vektoru.

[0084] Nukleinske kiseline ovog pronalaska mogu biti dobijene korišćenjem standardnih tehnika molekularne biologije. Kada se jednom dobiju DNK fragmenti koji kodiraju, na primer, VH i VL segmente, ovi fragmenti DNK mogu dalje biti promenjeni standardnim tehnikama rekombinantne DNK, na primer, može biti učinjena konverzija gena za varijabilni region u gene za punu dužinu lanca antitela, u gene Fab fragmenta ili scFv gene. U ovim manipulacijama, fragment DNK koji kodira VL ili VH je operativno povezan sa drugim molekulom DNK ili sa fragmentom koji kodira konstantni region antitela mAb1-mAb3 koji sadrži Fc region kako je definisan u SEQ ID NO:17-19.

[0085] Termin "operativno povezan", kako se koristi u ovom kontekstu, podrazumeva se da znači da su dva DNK fragmenta spojena na funkcionalan način, na primer, tako da aminokiselinske sekvence koje kodiraju dva DNK fragmenta ostaju u okviru čitanja (in-frame), ili tako da je protein ispoljen pod konrolom željenog promotora.

[0086] Izolovana DNK koja kodira VHregion može biti konvertovana u gen za punu dužinu teškog lanca operativnim povezivanjem DNK koja kodira VH sa drugim DNK molekulom koji kodira konstantne regione teškog lanca (CH1, CH2 i CH3). Sekvence gena za konstantni region humanog teškog lanca su poznate u struci (videti npr., Kabat, E. A., i sar., 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, peto izdanje, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication br. 91-3242) i DNK fragmenti koji obuhvataju ove regione mogu biti dobijeni standardnom PCR amplifikacijom. Konstantni region teškog lanca može biti izabran među izotipovima IgG1 koji sadrže Fc region kako je definisan u SEQ ID NO:17-19.

[0087] Izolovana DNK koja kodira VLregion može biti konvertovana u gen za punu dužinu lakog lanca (kao i u gen za Fab laki lanac) operativnim povezivanjem DNK koja kodira VL sa drugim DNK molekulom koji kodira konstantni region lakog lanca, CL. Sekvence gena za konstantni region humanog lakog lanca su poznate u struci (videti npr., Kabat, E. A., i sar., 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, peto izdanje, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication br.91-3242) i DNK fragmenti koji obuhvataju ove regione mogu biti dobijeni standardnom PCR amplifikacijom. Konstantni region lakog lanca može biti konstantni region kapa ili lambda.

Generisanje transfektoma koji produkuju monoklonska antitela

[0088] Antitela ili proteini ovog pronalaska mogu biti produkovani u transfektomskim ćelijama domaćina korišćenjem, na primer, kombinacije tehnika rekombinantne DNK i metoda transfekcije gena kao što je dobro poznato u struci (npr., Morrison, S. (1985) Science 229:1202).

[0089] Na primer, da bi se eksprimirala antitela, DNK koje kodiraju parcijalnu ili punu dužinu lakih i teških lanaca mogu biti dobijene standardnim tehnikama molekularne biologije ili biohemije (npr., hemijskom sintezom DNK, PCR amplifikacijom ili kloniranjem cDNK korišćenjem hibridoma koji eksprimiraju antitelo od interesa) i ove DNK mogu biti umetnute u vektore za ekspresiju tako da su geni operativno povezani sa sekvencama koje kontrolišu transkripciju i translaciju. U ovom kontekstu, termin "operativno povezan" podrazumeva se da znači da je gen antitela spojen u vektoru tako da sekvence koje kontrolišu transkripciju i translaciju unutar vektora obavljaju svoju namenjenu funkciju regulacije transkripcije i translacije gena za antitelo. Vektor za ekspresiju i sekvence koje kontrolišu ekspresiju su odabrane tako da budu kompatibilni sa ćelijom domaćina koja se koristi za ekspresiju. Gen za laki lanac antitela i gen za teški lanac antitela mogu biti umetnuti u odvojene vektore ili, tipičnije, oba gena se insertuju u isti vektor za ekspresiju.

[0090] Geni antitela se ubacuju u vektor za ekspresiju standardnim metodama (npr., spajanjem (ligacijom) komplementarnih restrikcionih mesta na genskom fragmentu koji kodira antitelo i vektora, ili ukoliko restrikciona mesta nisu prisutna spajanjem tupih krajeva). Varijabilni regioni lakog i teškog lanca antitela koja su ovde opisana mogu biti korišćeni za kreiranje gena za antitelo pune dužine tako što bi se izvršilo njihovo ubacivanje u vektor za ekspresiju koji već kodira konstantne regione teškog i konstantne regione lakog lanca koji sadrže željene sekvence koje odgovaraju pomenutim konstantnim regionima mAb1, mAb2 ili mAb3 tako da se VH segment operativno poveže sa CH segmentom(ima) unutar vektora i da se VL segment operativno poveže sa CL segmentom unutar vektora. Dodatno ili alternativno, rekombinantni vektor za ekspresiju može da kodira signalni peptid koji olakšava sekreciju lanca antitela iz ćelije domaćina. Gen za lanac antitela može biti kloniran u vektoru tako da je signalni peptid povezan u okviru čitanja (in frame) sa genom za aminoterminalni deo lanca antitela. Signalni peptid može biti imunoglobulinski signalni peptid ili heterologni signalni peptid (tj., signalni peptid proteina koji nije imunoglobulin).

[0091] Osim gena za lanac antitela, rekombinantni vektori za ekspresiju ovog pronalska nose regulatorne sekvence koje kontrolišu ekspresiju gena za lanac antitela u ćeliji domaćina. Termin "regulatorna sekvenca" podrazumeva se da obuhvata promotore, enhansere i druge elemente kontrole ekspresije (npr., signale za poliadenilaciju) koji kontrolišu transkripciju ili translaciju gena za lanac antitela. Takve regulatorne sekvence su opisane, na primer, u Goeddel (Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA 1990). Onima koji su stručni u ovoj oblasti značiće da konstrukcija vektora za ekspresiju, uključujući odabir regulatornih eskvenci, može da zavisi od faktora kao što su izbor ćelije domaćina koja treba da bude transformisana, nivoa ekspresije željenog proteina itd. Regulatorne sekvence za ekspresiju u ćelijama domaćina sisara uključuju elemente virusa koji dovode do visokog nivoa ekspresije proteina u ćelijama sisara, kao što su promotori i/ili enhanseri koji potiču od citomegalovirusa (CMV), Simian virusa 40 (SV40), adenovirusa (npr., glavni kasni promotor adenovirusa (AdMLP)) i polioma virusa. Alternativno, mogu biti korišćene i nevirusne regulatorne sekvence, kao što su ubikvitin promotor ili P-globin promotor. Dalje, mogu biti korišćeni, regulatorni elementi sačinjeni od sekvenci iz različitih izvora, kao što je SRa promotorski sistem, koji sadrži sekvence od SV40 ranog promotora i dugačak terminalni ponovak virusa tipa 1 humane leukemije T ćelija (Takebe, Y. i sar., 1988 Mol. Cell. Biol.8:466-472).

[0092] Osim gena za lanac antitela i regulatornih sekvenci, rekombinantni vektor za ekspresiju ovog pronalaska može da nosi dodatne sekvence, kao što su sekvence koje regulišu replikaciju vektora u ćelijama domaćina (npr., mesto početka replikacije) i gene za selektabilne markere. Gen za selektabilni marker olakšava selekciju ćelija domaćina u koje je vektor unet (videti, npr., U.S. Patent brojevi. 4,399,216, 4,634,665 i 5,179,017, svi od Axel-a i sar.). Na primer, tipično gen za selektabilni marker obezbeđuje rezistenciju na lekove, kao što su G418, higromicin ili metotreksat, ćelije domaćina u koju je vektor unet. Geni za selektabilne markere uključuju gen za dihidrofolat reduktazu (DHFR) (za upotrebu u dhfr- ćelijama domaćina sa metotreksat selekcijom/amplifikacijom) i neo gen (za G418 selekciju).

[0093] Za ekspresiju lakih i teških lanaca, vektor(i) za ekspresiju koji kodira(ju) teške i lake lance su transfektovani u ćeliju domaćina standardnim tehnikama. Različite forme termina "transfekcija" podrazumeva se da obuhvataju širok niz tehnika koje se uobičajeno koriste za uvođenje egzogene DNK u prokariotsku ili eukariotsku ćeliju domaćina, npr., elektroporacija, precipitacija kalcijum-fosfatom, transfekcija DEAE-dekstran-om i tome slično. Teorijski je moguće eksprimirati antitela ovog pronalaska i u prokariotskim i u eukariotskim ćelijama domaćina. Razmatrana je ekspresija antitela u eukariotskim ćelijama, na primer ćelijama sisara kao domaćina, kvasnicama ili filamentoznim gljivama, jer takve eukariotske ćelije, a posebno ćelije sisara, u poređenju sa prokariotskim ćelijama imaju bolju mogućnost za sklapanje i sekreciju pravilno uvijenog i imunološki aktivnog antitela.

[0094] U jednom specifičnom izvođenju, vektor za kloniranje ili ekspresiju prema ovom pronalasku obuhvata najmanje jednu od sledećih kodirajućih sekvenci (a)-(c), operativno povezanih sa prikladnim promotorskim sekvencama:

(a) SEQ ID NO:22 i SEQ ID NO:23 koje kodiraju teške (SEQ ID NO:22), odnosno lake lance (SEQ ID NO:23) pune dužine mAb1;

(b) SEQ ID NO:24 i SEQ ID NO:25 koje kodiraju teške (SEQ ID NO:24), odnosno lake lance (SEQ ID NO:25) pune dužine mAb2; ili,

(c) SEQ ID NO:26 i SEQ ID NO:27 koje kodiraju teške (SEQ ID NO:26), odnosno lake lance (SEQ ID NO:27) pune dužine mAb3.

[0095] Ćelije domaćina sisara za ekspresiju rekombinantnih antitela ovog pronalaska uključuju ćelije ovarijuma kineskog hrčka (CHO ćelije) (uključujući dhfr- CHO ćelije, koje su opisali Urlaub i Chasin, 1980 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220 korišćene sa DH FR selektabilnim markerom, npr., kako je opisano u R.J. Kaufman i P.A. Sharp, 1982 Mol. Biol.

159:601-621), CHOK1 dhfr+ ćelijske linije, NSO mijelomske ćelije, COS ćelije i SP2 ćelije. Naročito, za upotrebu sa NSO mijelomskim ćelijama, drugi sistem za ekspresiju je GS sistem za ekspresiju gena prikazan u PCT publikacijama WO 87/04462, WO 89/01036 i EP 0338 841.

[0096] Kada su rekombinantni vektori za ekspresiju koji kodiraju gene antitela insertovani u ćelije domaćina sisara, antitela su produkovana kultivacijom ćelija domaćina tokom vremena koje je dovoljno da omogući ekspresiju antitela u ćelijama domaćina ili sekreciju antitela u medijum za kultivaciju u kome su rasle ćelije domaćina. Antitela se mogu izdvojiti iz medijuma za kultivaciju korišćenjem standardnih metoda prečišćavanja proteina (Videti na primer Abhinav i sar.2007, Journal of Chromatography 848: 28-37).

[0097] U jednom specifičnom izvođenju, ćelije domaćina ovog pronalaska su ćelije domaćina transfektovane vektorom za ekspresiju koji ima kodirajuće sekvence izabrane iz grupe u čiji sastav ulaze sekvence (a)-(c) pogodne za ekspresiju mAb1-mAb3, (a), (b), (c) pogodne za ekspresiju, mA1, odnosno mAb2, odnosno mAb3 operativno povezane sa odgovarajućim promotorskim sekvencama:

(a) SEQ ID NO:22 i SEQ ID NO:23;

(b) SEQ ID NO:24 i SEQ ID NO:25 i

(c) SEQ ID NO:26 i SEQ ID NO:27.

[0098] Ćelije domaćina opisane u prethodnom segmentu mogu onda biti dalje kultivisane pod odgovarajućim pogodnim uslovima za ekspresiju i produkciju antitela ovog pronalaska izabranih iz grupe koju sačinjavaju mAb1-mAb3, mA1, odnosno mAb2, odnosno mAb3.

Bispecifični molekuli

[0099] U drugom aspektu, ovaj pronalazak karakteriše bispecifične ili multispecifične molekule koji sadrže anti-CD40 antitelo ili protein ovog pronalaska. Antitelo ili protein ovog pronalaska može biti derivatizovan ili povezan sa drugim funkcionalnim molekulom, npr., drugim peptidom ili proteinom (npr., drugim antitelom ili ligandom za receptor) u cilju generisanja bispecifičnog molekula koji se vezuje za najmanje dva različita vezna mesta ili ciljna molekula. Antitelo ovog pronalaska može zapravo biti derivatizovano ili povezano sa više od jednog drugih funkcionalnih molekula u cilju generisanja multi-specifičnih molekula koji se vežu za više od dva različita vezna mesta i/ili ciljne molekule; podrazumeva se da su ovakvi multispecifični molekuli takođe obuhvaćeni terminom "bispecifični molekul" kako se koristi u ovom tekstu. Da bi se kreirao bispecifični molekul ovog pronalaska, antitelo ili protein ovog pronalaska može biti funkcionalno povezan (npr., hemijskim kuplovanjem, genetskom fuzijom, nekovalentnom vezom ili na drugi način) za jedan ili više drugih vezujućih molekula, kao što su drugo antitelo, fragment antitela, imitator peptida ili vezivanja, tako da se kreira bispecifični molekul.

[0100] Shodno tome, ovaj pronalazak uključuje bispecifične molekule koji poseduju najmanje jedno primarno (prvo) mesto specifičnog vezivanja (primarna-prva specifičnost vezivanja) za prepoznavanje CD40, na primer, jedno antigen-vezno mesto bilo kog od mAb1-mAb3 i sekundarno (drugo) mesto specifičnog vezivanja (sekundarna-druga specifičnost vezivanja) za prepoznavanje drugog ciljnog epitopa. Na primer, drugi ciljni epitop je drugi epitop CD40 koji je različit od prvog ciljnog epitopa. Drugi primer je bispecifični molekul koji sadrži najmanje jedno primarno mesto specifičnog vezivanja za CD40, na primer, jedan antigen-vezujući deo bilo kog od mAb1-mAb3 i sekundarno mesto specifičnog vezivanja za drugi epitop unutar CD40.

[0101] Dodatno, za pronalazak u kome je bispecifični molekul multi-specifičan, molekul može dodatno da poseduje treće mesto specifičnog vezivanja (treću specifičnost vezivanja), kao dodatak prvom i drugom ciljnom epitopu.

[0102] Bispecifične molekule ovog pronalaska moguće je dobiti konjugacijom mesta specifičnih vezivanja koja su sastavni deo navedenog molekula (konstituentna mesta vezivanja), korišćenjem metoda koje su poznate u struci. Na primer, svako mesto specifičnog vezivanja bispecifičnog molekula može biti generisano odvojeno i potom konjugovano jedno sa drugim. Kada su mesta specifičnih vezivanja proteini ili peptidi, za kovalentnu konjugaciju može biti korišćen niz agenasa koji imaju sposobnost kuplovnja ili unakrsnog povezivanja. Primeri agenasa koji imaju sposobnost unakrsnog povezivanja su protein A, karbodiimid, N-sukcinimidil-S-acetil-tioacetat (SATA), 5,5’-ditiobis(2-nitrobenzoeva kiselina) (DTNB), ofenilendimaleimid (oPDM), N-sukcinimidil-3-(2-piridilditio)propionat (SPDP), i sulfosukcinimidil 4-(N-maleimidometil) cikloheksan-I-karboksilat (sulfo-SMCC) (videti npr., Karpovsky i sar., 1984 J. Exp. Med.160:1686; Liu, MA i sar., 1985 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8648). Druge metode uključuju one koje su opisali Paulus, 1985 Behring Ins. Mitt. No.78,118-132; Brennan i sar., 1985 Science 229:81-83), i Glennie i sar., 1987 J. Immunol.139: 2367-2375). Agensi za konjugaciju su SATA i sulfo-SMCC, oba se mogu nabaviti od Pierce Chemical Co. (Rockford, IL).

[0103] Kada su mesta specifičnog vezivanja antitela, ona mogu biti konjugovana sulfidrilnim vezama između C-terminalnih krajeva regiona zgloba dva teška lanca. U određenom izvođenju, region zgloba je modifikovan da pre konjugacije sadrži neparan broj sulfhidrilnih ostataka, na primer jedan,.

[0104] Alternativno, oba mesta specifičnog vezivanja za ciljni epitop mogu biti kodirana u istom vektoru i ispoljena i sklopljena u istoj ćeliji domaćina. Ovaj metod je naročito koristan kada je bispecifični molekul fuzioni protein mAb x mAb, mAb x Fab, Fab x F(ab’)2 ili ligand x Fab. Bispecifični molekul ovog pronalaska može biti jednolančani molekul koji sadrži jednolančano antitelo i vezujuću determinantu ili jednolančani bispecifični molekul koji sadrži dve vezujuće determinante. Bispecifični molekuli mogu da sadrže najmanje dva jednolančana molekula. Postupci za pripremanje bispecifičnih molekula su opisani na primer u U.S. Patentu broj 5,260,203; U.S. Patentu broj 5,455,030; U.S. Patentu broj 4,881,175; U.S. Patentu broj 5,132,405; U.S. Patentu broj 5,091,513; U.S. Patentu broj 5,476,786; U.S. Patentu broj 5,013,653; U.S. Patentu broj 5,258,498; i U.S. Patentu broj 5,482,858.

[0105] Vezivanje bispecifičnih molekula za njihove specifične ciljeve vezivanja može biti potvrđeno primenom, na primer, za enzimskog imunosorbentnog testa (ELISA), radioimunotesta (REA), FACS analize, biotestova (npr., inhibicije rasta), ili Western blot testa. Svaki od ovih testova generalno detektuje prisustvo kompleksa protein-antitelo od posebnog interesa upotrebom obeleženog reagensa (npr., antitelo) specifičnog za kompleks od interesa.

Multivalentna antitela

[0106] U drugom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje multivalentna antitela koja sadrže najmanje dva identična ili različita antigen-vezujuća dela antitela ovog pronalaska koja se vezuju za CD40, na primer, izabrana iz antigen-vezujućih delova bilo kog od mAb1-mAb3. U jednom izvođenju, multivalentna antitela obezbeđuju najmanje dva, tri ili četiri antigenvezujuća dela antitela. Antigen-vezujući delovi mogu biti zajedno povezani fuzijom proteina ili kovalentnom ili nekovalentnom vezom. Alternativno, postupci spajanja su opisani za bispecifične molekule. Tetravalentni spojevi mogu biti dobijeni na primer unakrsnim povezivanjem antitela ovog pronalaska sa antitelom koje se veže za konstantne regione antitela pronalaska, na primer Fc ili region zgloba.

Postupci terapije primenom antagonističkih anti-CD40 antitela ovog pronalaska

[0107] Postupci ovog pronalaska su usmereni na upotrebu anti-CD40 antitela ili proteina ovog pronalaska za lečenje subjekata (tj. pacijenata) koji imaju autoimunsku bolest i/ili inflamacijsku bolest, ili predispoziciju (sklonost) da razviju autoimunsku bolest i/ili inflamacijsku bolest, pri čemu je bolest i/ili inflamacija posredovana CD40 signalima koji nastaju nakon vezivanja CD40L za CD40 na ćelijama koje ispoljavaju CD40 antigen.

[0108] Postupci za detekciju CD40 ekspresije na ćelijama su dobro poznati u struci i uključuju, ali nisu ograničeni na, tehnike PCR, imunohistohemiju, protočnu citometriju, Western blot, ELISA-u i slične.

[0109] Postupci ovog pronalaska su posebno korisni za lečenje inflamacijskih i/ili autoimunskih bolesti u kojima je uključena CD40L- posredovana stimulacija CD40.

[0110] Inflamacijske bolesti odlikuje inflamacija i destrukcija tkiva ili njihova kombinacija. "Inflamacijska bolest" uključuje bilo koji inflamacijski, imunskim mehanizmima- posredovan, proces u kome inicijalni događaj ili meta delovanja imunskog odgovora obuhvata nesopstveni(e) antigen(e), uključujući, na primer, aloantigene, ksenoantigene, antigene virusa, antigene bakterija, nepoznate antigene ili alergene.

[0111] Osim toga, za potrebe ovog pronalaska, termin "inflamacijska bolest(i)" uključuje "autoimunsku(e) bolest(i)". Onako kako se koristi u ovom tekstu, termin "autoimunost" se generalno razume da obuhvata inflamacijske, imunskim mehanizmima-posredovane, procese koji uključuju "sopstvene" antigene. U autoimunskim bolestima, sopstveni antigen(i) izaziva(ju) imunske odgovore domaćina.

[0112] Takođe, ovaj pronalazak uključuje lečenje inflamacije povezane sa odbacivanjem transplantata tkiva. "Odbacivanje transplantata" ili "odbacivanje grafta" odnosi se na bilo koji imunski odgovor protiv grafta koji se razvija u primaocu (domaćinu) uključujući, ali bez ograničenja na, HLA antigene, antigene krvnih grupa i slično.

[0113] Predmetni pronalazak takođe može biti upotrebljen za lečenje bolesti kalema (grafta) protiv domaćina, kao što je na primer bolest povezana sa transplantacijom kostne srži. U takvoj bolesti kalema protiv domaćina, kostna srž davaoca sadrži limfocite i ćelije koje sazrevaju u limfocite. Limfociti davaoca prepoznaju antigene primaoca kao strane (nesopstvene) i razvijaju inflamacijski imunski odgovor. Stoga, kako se koristi u ovom tekstu, "bolest kalema (grafta) protiv domaćina" ili "reakcija kalema (grafta) protiv domaćina" odnosi se na bilo koji T-ćelijamaposredovan imunski odgovor u kome limfociti davaoca reaguju sa antigenima primaoca (domaćina).

[0114] Antagonistička anti-CD40 antitela ili proteini koji su opisani u ovom tekstu, na primer mAb1, mAb2 ili mAb3, mogu biti korišćeni u saglasnosti sa postupcima ovog pronalaska za lečenje autoimunskih i/ili inflamacijskih poremećaja uključujući, ali bez ograničenja na, sistemski eritemski lupus (SLE), diskoidni lupus, lupus nefritis, sarkoidozu, inflamacijski artritis, uključujući juvenilni artritis, reumatoidni artritis, psorijazni artritis, Reiter-ov sindrom, ankilozirajući spondilitis i giht, odbacivanje transplaniranog organa ili tkiva, hiperakutno, akutno ili hronično odbacivanje i/ili bolest kalema protiv domaćina, multiplu sklerozu, hiper IgE sindrom, poliarteritis nodozu, primarnu bilijarnu cirozu, inflamacijsku bolest creva, Crohn-ovu bolest, celijačnu bolest (gluten-senzitivnu enteropatiju), primarni Sjogren-ov sindrom (pSS), autoimunski hepatitis, pernicioznu anemiju, autoimunsku hemolitičku anemiju, psorijazu, sklerodermu, miasteniju gravis, autoimunsku trombocitopenijsku purpuru, autoimunski tireoiditis, Grave-sovu bolest, Hashimoto-ov tireoiditis, bolest imunskih kompleksa, hronični zamor, sindrom imunske disfunkcije (CFIDS), polimiozitis i dermatomiozitis, krioglobulinemiju, trombolizu, kardiomiopatiju, pemfigus vulgaris, intersticijalnu fibrozu pluća, tip I i tip II diabetes melitusa, tip 1, 2, 3, i 4 kasnog tipa preosetljivosti, alergiju ili alergijske poremećaje, neželjene/nenamerne imunske odgovore na terapijske proteine (videti na primer, U. S. patentnu aplikaciju br. US 2002/0119151 i Koren, i sar. (2002) Curr. Pharm. Bio-technol. 3: 349-60), astmu, Churg-Strauss-ov sindrom (alergijsku granulomatozu), atopski dermatitis, alergijski i iritantni kontaktni dermatitis, urtikariju, IgE- posredovanu alergiju, aterosklerozu, ANCA- asocirane vaskulitise, vaskulitis, idiopatske inflamacijske miopatije, hemolitičku bolest, Alzheimer-ovu bolest, hroničnu inflamacijsku demijelinizirajuću polineuropatiju i slično.

[0115] Ranije je pokazano da genetska ablacija ili farmakološka inhibicija puta CD40-CD154 ima terapijsku korist ili u kliničkim ili u prekliničkim modelima SLE, pSS, ITP, MS, Crohn-ove bolesti, pemfigus vulgarisa, autoimunskog vaskulitisa i RA (Law CL, Grewal IS. (2009). Adv. Exp. Med. Biol. 2009;647:8-36); medicinska potreba ove inhibicije je detaljno opisana u nastavku.

[0116] U poželjnim izvođenjima anti-CD40 antitela ili proteini ovog pronalaska su korisni u lečenju: (i) sistemskog eritemskog lupusa (lupus nefritisa), poželjno u obezbeđivanju efikasnih terapija u kojima se „štedi“ steroid odnosno smanjuje količina steroida za indukciju i održavanje remisije i prevenciju (sprečavanje) krajnjeg stadijuma renalne bolesti; (ii) primarnog Sjogren-vog sindroma, poželjno u sprečavanju destrukcije pljuvačne i suzne žlezde i indukciji i održavanju remisije vanćelijskih manifestacija; (iii) autoimunske trombocitopenijske purpure, poželjno u lečenju pacijenata refraktornih (neosetljivih) na standardnu terapiju; (iv) ANCA-asociranih vaskulitisa, poželjno za indukciju i održavanje remisije kod pacijenata koji su neosetljivi na delovanje kortikosteroida i tretman agensima koji štede steroide; (v) pemfigusu vulgarisu, poželjno u indukciji i održavanju remisije kod pacijenata koji su neosetljivi na delovanje kortikosteroida i tretman agensima koji štede steroide; (vi) multiploj sklerozi, poželjno u obezbeđivanju efikasnije terapije za prevenciju relapsa i onemogućenje progresije i postizanje statusa bez bolesti; i (vii) Crohn-ove bolesti, poželjno u obezbeđivanju efikasnijih terapija za održavanje remisije i lečenje pacijenata neosetljivih na delovanje anti-TNF.

[0117] U nekim drugim izvodjenjima, anti-CD40 antitela ili proteini ovog pronalaska su korisni u lečenju plućne inflamacije uključujući ali bez ograničenja na odbacivanje transplantata pluća, astme, sarkoidoze, emfizema, cistične fibroze, idiopatske plućne fibroze, hroničnog bronhitisa, alergijskog rinitisa i alergijskih bolesti pluća kao što su hipersenzitivni pneumonitis, eozinofilna pneumonija, obliterantni bronhiolitis kao posledica transplantacije kostne srži i/ili pluća ili posledica drugih uzroka, graft ateroskleroze/graft fleboskleroze, kao i plućne fibroze koja je posledica bolesti kolagena, vaskularnih i autoimunskih bolesti kao što su reumatoidni artritis, skleroderma i eritemski lupus.

[0118] "Lečenje (tretman)" je u ovom tekstu definisano kao primena ili davanje anti-CD40 antitela ili proteina prema ovom pronalasku, na primer, mAb1, mAb2 ili mAb3 antitela, subjektu, ili primena ili davanje farmaceutske kompozicije koja sadrži pomenuto anti-CD40 antitelo ili protein ovog pronalaska na izolovanom tkivu ili ćelijskoj liniji subjekta, pri čemu subjekt ima autoimunsku bolest i/ili inflamacijsku bolest, simptom povezan sa autoimunskom bolešću i/ili inflamacijsku bolest ili predispoziciju (sklonost) da razvije autoimunsku bolest i/ili inflamacijsku bolest, pri čemu je cilj ozdravljenje, zaceljenje, olakšanje, ublažavanje, promena, izlečenje, poboljšanje, popravljanje ili delovanje na autoimunsku bolest i/ili inflamacijsku bolest, bilo koje simptome povezane sa autoimunskom bolešću i/ili inflamacijskom bolešću ili na sklonost ka razvoju autoimunske bolesti i/ili inflamacijske bolesti.

[0119] Pod "lečenjem (tretmanom)" se takođe podrazumeva primena ili davanje farmaceutske kompozicije koja sadrži anti-CD40 antitela ili protein ovog pronalaska, na primer, mAb1, mAb2 ili mAb3 antitelo subjektu, ili primena ili davanje farmaceutske kompozicije koja sadrži pomenuto anti-CD40 antitelo ili protein ovog pronalaska na izolovanom tkivu ili ćelijskoj liniji subjekta, pri čemu subjekt ima autoimunsku bolest i/ili inflamacijsku bolest, simptom povezan sa autoimunskom bolešću i/ili inflamacijskom bolešću, ili sklonost ka razvoju autoimunske bolesti i/ili inflamacijske bolesti, pri čemu je cilj ozdravljenje, zaceljenje, olakšanje, ublažavanje, promena, izlečenje, poboljšanje, popravljanje ili delovanje na autoimunsku bolest i/ili inflamacijsku bolest, bilo koje simptome povezane sa autoimunskom bolešću i/ili inflamacijskom bolešću ili na sklonost ka razvoju autoimunske bolesti i/ili inflamacijske bolesti.

[0120] Pod "anti-inflamacijskom aktivnošću" se podrazumeva smanjenje ili sprečavanje inflamacije. Terapija najmanje jednim anti-CD40 antitelom ili proteinom shodno ovom pronalasku uzrokuje fiziološki odgovor koji je delotvoran u pogledu lečenja autoimunske bolesti i/ili inflamacijske bolesti, pri čemu bolest karakteriše prisustvo ćelija koje ispoljavaju CD40 antigen. Pokazano je da postupci ovog pronalaska mogu biti korisni u sprečavanju fenotipskih promena u ćelijama kao što su proliferacija, aktivacija i slično.

[0121] U saglasnosti sa postupcima ovog pronalaska, najmanje jedno anti-CD40 antitelo ili protein ovog pronalaska kako je definisano u prethodnom delu ovog teksta se koristi da dovede do pozitivnog terapijskog odgovora u odnosu na lečenje ili prevenciju autoimunske bolesti i/ili inflamacijske bolesti.

[0122] Pod "pozitivnim terapijskim odgovorom" u odnosu na autoimunsku bolest i/ili inflamacijsku bolest podrazumeva se da se odnosi na poboljšanje bolesti u sadejstvu sa antiinflamacijskom aktivnošću ovih antitela ili proteina i/ili poboljšanju simptoma povezanih sa bolešću. Odnosno, mogu biti zapaženi anti-proliferacijski efekat, sprečavanje dalje proliferacije ćelija koje ispoljavaju CD40, redukcija inflamacijskog odgovora uključujući, ali bez ograničenja na, redukciju produkcije (sekrecije) inflamacijskih citokina, adhezivnih molekula, proteaza, imunoglobulina (u slučajevima gde je ćelija koja ispoljava CD40 B ćelija), njihove kombinacije i slično, povećanu produkciju anti-inflamacijskih proteina, redukciju broja autoreaktivnih ćelija, povećanje imunske tolerancije, inhibiciju preživljavanja autoreaktivnih ćelija i/ili smanjenje jednog ili više simptoma koji su posredovani stimulacijom ćelija koje ispoljavaju CD40. Takvi pozitivni terapijski odgovori nisu ograničeni načinom primene (putem davanja) i mogu uključiti davanje davaocu (donoru), tkivu donora (kao što je na primer perfuzija organa), davanje primaocu, bilo koju kombinaciju navedenog i slično.

[0123] Klinički odgovor može biti procenjivan korišćenjem skrining tehnika kao što su skeniranje magnetnom rezonancom (MRI), skeniranje x-radiografskim snimanjima, skeniranje kompjuterizovanom tomografijom (CT), protočna citometrija ili analiza na fluorescencomaktiviranom razvrstaču (sorteru) ćelija (FACS), histologija, sveobuhvatna patologija i biohemijska analiza krvi, uključujući ali bez ograničenja na promene koje su detektabilne primenom tehnika ELISA, RIA, hromatografija i slično. Osim ovih pozitivnih terapijskih odgovora, subjekt koji je pod terapijom primenom antagonističkog anti-CD40 antitela ili proteina ovog pronalaska može da oseti delotvoran efekat na poboljšanje simptoma koji su povezani sa bolešću.

[0124] Pod "terapijski efikasnom dozom ili količinom" ili "efikasnom količinom" podrazumeva se količina anti-CD40 antitela ili proteina ovog pronalaska koja, kada se primeni, prouzrokuje pozitivan terapijski odgovor u odnosu na lečenje subjekta obolelog od autoimunske bolesti i/ili inflamacijske bolesti.

[0125] U nekim izvođenjima ovog pronalaska, terapijski efikasna doza anti-CD40 antitela ili proteina ovog pronalaska, na primer, mAb1, mAb2 ili mAb3 je u opsegu od 0.01 mg/kg do 40 mg/kg, od 3 mg/kg do 20 mg/kg ili od 7 mg/kg do 12 mg/kg. Prihvaćen postupak lečenja može uključiti jednokratno davanje terapijski efikasne doze ili višekratna davanja terapijski efikasne doze antagonističkog anti-CD40 antitela ili proteina ovog pronalaska.

[0126] Dodatno izvođenje ovog pronalaska je upotreba anti-CD40 antitela ili proteina ovog pronalaska za dijagnostičko praćenje nivoa proteina u tkivu kao deo procedure kliničkog testiranja, npr., za određivanje efikasnosti primenjenog protokola lečenja. Detekcija može biti olakšana kuplovanjem antitela za detektabilnu supstancu. Primeri detektabilnih supstanci su različiti enzimi, prostetske grupe, fluorescentni materijali, luminiscentni materijali, bioluminiscentni materijali i radioaktivni materijali. Primeri podesnih enzima su peroksidaza iz rena, alkalna fosfataza, P-galaktozidaza ili acetilholinesteraza; primeri pogodnih kompleksa prostetske grupe uključuju streptavidin/biotin i avidin/biotin; primeri pogodnih fluorescentnih materijala uključuju umbeliferon, fluorescein, fluorescein izotiocijanat, rodamin, dihlorotriazinilamin fluorescein, danzil hlorid ili fikoeritrin; primer luminiscentnog materijala je luminol; primeri bioluminiscentnih materijala su luciferaza, luciferin i ekvorin; i primeri pogodnih radioaktivnih emitera su<125>I,<131>I,<35>S ili<3>H.

[0127] Anti CD40 antitela ili proteini ovog pronalaska, na primer, mAb1, mAb2 ili mAb3 mogu da se koriste u kombinaciji sa bilo kojim poznatim terapijama za lečenje autoimunskih i inflamacijskih bolesti, uključujući bilo koji agens ili kombinaciju agenasa za koje je poznato da su korisni, ili koji su korišćeni ili se trenutno koriste za lečenje autoimunskih i inflmacijskih bolesti. Takve terapije i terapijski agensi uključuju, ali bez ograničenja na, hirurgiju ili hirurške intervencije (npr. splenektomija, limfadenektomija, tireoidektomija, plazmafereza, leukofereza, transplantacija ćelija, tkiva ili organa, intestinalne procedure, perfuzija organa i slično), zračnu (radijacionu) terapiju, terapiju kao što je terapija steroidima i terapija nesteroidima, hormonsku terapiju, terapiju citokinima, terapiju dermatološkim agensima (na primer, topikalni agensi koji se koriste u lečenju kožnih poremećaja kao što su alergije, kontaktni dermatitis i psorijaza), terapiju imunosupresivima, drugu anti-inflamacijsku terapiju monoklonskim antitelom i slično. Na ovaj način, antagonistička anti-CD40 antitela ili proteini opisani u ovom tekstu su davani (primenjivani) u kombinaciji sa najmanje jednom drugom terapijom, uključujući, ali bez ograničenja na, operaciju, perfuziju organa, zračnu terapiju, terapiju steroidima, terapiju nesteroidima, terapiju antibioticima, antifungalnu terapiju, hormonsku terapiju, terapiju citokinima, terapiju dermatološkim agensima (na primer, topikalnim agensima koji se koriste za lečenje kožnih poremećaja kao što su alergije, kontaktni dermatitis i psorijaza), terapiju imunosupresivima, drugu anti- inflamacijsku terapiju monoklonskim antitelom, njihovu kombinaciju i slično.

[0128] Tako, kada kombinovane terapije obuhvataju davanje anti-CD40 antitela ili proteina ovog pronalaska kao što su mAb1, mAb2 ili mAb3 antitelo, u kombinaciji sa davanjem drugog terapijskog agensa, na primer sa steroidima kao jedan primer, postupci ovog pronalaska obuhvataju zajedničko davanje, korišćenjem odvojenih formulacija ili jedne farmaceutske formulacije i uzastopno davanje bilo kojim redosledom. Kada postupci ovog pronalaska uključuju kombinovane terapijske protokole, ove terapije mogu biti date istovremeno, tj., anti-CD40 antitelo ili protein ovog pronalaska je dato istovremeno ili u istom vremenskom okviru kao druga terapija (tj., terapije se dešavaju istovremeno, ali anti-CD40 antitelo ili protein ovog pronlaska nije dato tačno u isto vreme kao druga terapija). Alternativno, anti-CD40 antitelo ovog pronalaska ili protein pronalaska mogu takođe da se daju pre ili posle druge terapije.

[0129] Sekvencijalno (jedno po jedno) davanje različitih terapija može biti izvedeno nezavisno od toga da li subjekt, koji je primio terapiju, reaguje na prvi ciklus terapije u cilju smanjenja mogućnosti remisije ili relapsa.

[0130] U nekim izvođenjima ovog pronalaska, anti-CD40 antitela ili proteini ovog pronalaska, na primer mAb1, mAb2 ili mAb3 antitelo, su dati u kombinaciji sa imunosupresivnim lekovima ili anti-inflamacijskim lekovima, pri čemu antitelo ili protein i terapijski agens(i) može(gu) biti dat(i) sekvencijalno (jedan po jedan), bilo kojim redosledom, ili istovremeno (tj., istovremeno ili u istom vremenskom okviru). Primeri pogodnih imunosupresivnih lekova koji mogu biti dati (primenjeni) u kombinaciji sa antagonističkim anti-CD40 antitelima ili proteinima ovog pronalaska, na primer mAb1, mAb2 ili mAb3 antitelom, uključuju, ali bez ograničenja na, metotreksat, ciklofosfamid, mizoribin, hlorambucil, ciklosporin, kao što je, na primer, ciklosporin u obliku aerosola (videti, U. S. Patentna Aplikacija Publikacija Br. US 2002/0006901), takrolimus (FK506 ; ProGrafrM), mikofenolat mofetil i azatioprin (6-merkaptopurin), sirolimus (rapamicin), deoksispergvalin, leflunomid i njegove malononitriloamidne analoge; i imunosupresivne proteine, uključujući, na primer, anti-CTLA4 antitela i Ig fuzione agense, antitela koja neutrališu stimulator B limfocita (npr., LYMPHOSTAT-BTM) i Ig fuzione agense (BLyS-Ig), anti-CD80 antitela i etanercept (Enbrel (RTM)), kao i antitela koja prepoznaju T limfocite (anti-T antitela) kao što su anti-CD3 (OKT3), anti-CD4 i slično. Primeri pogodnih anti-inflamacijskih agenasa uključuju, ali bez ograničenja na, kortikosteroide kao što su, na primer, klobetazol, halobetazol, hidrokortizon, triamcinolon, betametazon, fluocinol, fluocinonid, prednizon, prednizolon, metilprednizolon; nesteroidne anti-inflamacijske lekove (NSAID) kao što su, na primer, sulfasalazin, lekovi koji sadrže mesalazin (poznati kao 5-ASA agensi), celekoksib, diklofenak, etodolak, fenprofen, flurbiprofen, ibuprofen, ketoprofen, meklofamat, meloksikam, nabumeton, naproksen, oksaprozin, piroksikam, rofekoksib, salicilati, sulindak, i tolmetin; inhibitore fosfodiesteraze-4, anti-inflamacijska antitela kao što su adalimumab (HUMERA (RTM), antagonist TNF-α) i infliksimab (Remicade, antagonista TNF-α) i slična. Takođe uključeni su agensi koji moduliraju imunski sistem koji se trenutno koriste ili potencijalno mogu koristiti u lečenju autoimunske bolesti, kao što je talidomid ili njegovi analozi kao što je lenalidomid.

[0131] Odbacivanje trasnsplantata i bolest kalema protiv domaćina može biti hiperakutno (humoralno), akutno (posredovano T ćelijama) ili hronično (nepoznate etiologije) ili njihova kombinacija. Tako, anti-CD40 antitela ili proteini ovog pronalaska, na primer mAb1, mAb2 ili mAb3 antitelo, su korišćeni u nekim izvođenjima da spreče i/ili poboljšaju odbacivanje i/ili simptome povezane sa hiperakutnim, akutnim i/ili hroničnim odbacivanjem transplantata bilo kog tkiva, uključujući, ali bez ograničenja na, jetru, bubreg, pankreas, ćelije pankreasnih ostrvaca, tanko crevo, pluća, srce, rožnjače, kožu, krvne sudove, kost, kostnu srž heterolognu ili autolognu i slično. Tkiva grafta mogu biti dobijena od bilo kog davaoca i transplantirana (presađena) u bilo kog domaćina primaoca i tako procedura transplantacije može da obuhvata transplantaciju animalnog tkiva ljudima (npr. ksenografti), transplantaciju tkiva sa jednog čoveka drugom čoveku (npr. alografti) i/ili transplantaciju tkiva sa jednog dela tela čoveka na drugi deo tela istog čoveka (npr. autografti).

[0132] Lečenje antitelima ili proteinima ovog pronalaska može takođe da redukuje sekvele transplantacije kao što su temperatura, anoreksija, hemodinamske abnormalnosti, leukopenija, infiltracija transplantiranog organa/tkiva belim krvnim ćelijama, kao i oportunističke infekcije.

[0133] U nekim izvođenjima, anti-CD40 antitela ili proteini ovog pronalaska, na primer mAb1, mAb2 ili mAb3 antitelo, mogu biti korišćeni samostalno ili u kombinaciji sa imunosupresivnim lekovima za lečenje i/ili sprečavanje odbacivanja transplantata kao što je hiperakutno, akutno i/ili hronično odbacivanje i/ili bolest kalema protiv domaćina.

[0134] Tako, u nekim izvođenjima gde su anti-CD40 antitela ili proteini ovog pronalaska korišćeni za lečenje odbacivanja grafta, antitela, na primer mAb1, mAb2 ili mAb3 antitelo, mogu biti korišćena u kombinaciji sa pogodnim imunosupresivnim lekovima, uključujući, ali bez ograničenja na, metotreksat; ciklofosfamid; mizoribin; hlorambucil; ciklosporin, kao što je, na primer, ciklosporin u obliku aerosola (videti, U. S. Patentnu Aplikaciju Publikacija Br. US20020006901), takrolimus (FK506; ProGrafm), mikofenolat mofetil i azatioprin (6-merkaptopurin), sirolimus (rapamicin), deoksispergvalin, leflunomid i njegove malononitriloamidne analoge; imunske modulatore, uključujući na primer talidomid i njegove analoge i imunosupresivne proteine, uključujući, na primer anti-CTLA antitela i Ig fuzione agense, antitela koja neutrališu stimulator B limfocita (npr., LYMPHOSTAT-BTM) i Ig fuzione agense (BLyS-Ig), anti-CD80 antitela i etanercept (Enbrel (RTM)), kao i antitela koja prepoznaju T ćelije (anti-T antitela) kao što su anti-CD3 (OKT3), anti-CD4 i slično.

[0135] Kao takvo, posebno je naglašeno da su kompozicije i postupci ovog pronalaska korišćeni u kombinaciji sa drugim lekovima da dodatno poboljšaju simptome i ishode kod primaoca transplantata, kao što su na primer oni kojima je transplantiran graft pluća ili bubrega. Tako, u pojedinim izvođenjima, anti-CD40 antitela ili proteini ovog pronalaska, na primer mAb1, mAb2 ili mAb3 antitelo, su samostalno korišćeni za lečenje odbacivanja transplantata (kao što je, na primer hiperakutno, akutno i/ili hronično odbacivanje ili bolest kalema protiv domaćina kod primaoca transplantata pluća ili bubrega) ili su korišćeni u kombinaciji sa parenteralno i/ili neparenteralno datim ciklosporinom, uključujući na primer ciklosporin koji se uzima oralnim putem, ciklosporin koji se dobija putem injekcije, ciklosporin koji se dobija u obliku aerosola (npr. inhaliran) i njihove kombinacije. U nekim kombinacijama u kojima je najmanje jedna komponenta terapije ciklosporin u obliku aerosola, ciklosporin se doprema u pluća primaoca inhalacijom ciklosporina koji se nalazi u formi aerosol spreja, na primer, u spravi pod pitiskom ili raspršivaču. Ciklosporin može biti dat ili u formi suvog praha ili u tečnoj formi. Ciklosporin može biti dat u subterapijskoj dozi.

[0136] U nekim drugim izvođenjima, anti-CD40 antitela ili proteini ovog pronalaska, na primer mAb1, mAb2 ili mAb3 antitelo, mogu biti korišćeni samostalno ili u kombinaciji sa imunosupresivnim lekovima za lečenje i/ili prevenciju reumatoidnog artritisa. Tako u nekim izvođenjima u kojima se anti-CD40 antitela ili proteini ovog pronalaska; na primer mAb1, mAb2 ili mAb3 antitelo, koriste za lečenje reumatoidnog artritisa, pomenuta antitela ili proteini mogu biti korišćeni u kombinaciji sa pogodnim imunosupresivnim lekovima, uključujući, ali bez ograničenja na, metotreksat, ciklofosfamid, mizoribin, hlorambucil, ciklosporin, takrolimus (FK506; PROGRAFTM), mikofenolat mofetil i azatioprin (6-merkaptopurin), sirolimus (rapamicin), deoksispergvalin, leflunomid i njegove malononitriloamidne analoge; i imunosupresivne proteine, uključujući, na primer, anti-CTLA antitela i Ig fuzione agense, antitela koja neutrališu stimulator B limfocita (npr., LYMPHOSTAT-BTM) i Ig fuzione agense (BLyS-Ig), anti-CD20 antitela (npr. RITUXAN (g)); u potpunosti humano antitelo HuMax-CD20, R-1594, IMMU-106, TRU-015, AME-133, tositumomab/1-131, tositumomab (Bexxar (D), ibritumomab tituxetan (Zcvalin (RTM)); anti-CD80 antitela i etanercept (ENBREL), kao i antitela koja prepoznaju T ćelije (anti-T antitela) kao što su anti-CD3 (OKT3), anti-CD4 i slično. Kako je napred razmotreno, efikasnost lečenja može biti procenjena korišćenjem bilo kog sredstva i uključuje, ali bez ograničenja na, efikasnost merenu prema kriterijumima kliničkog odgovora koje je definisao Američki koledž za reumatologiju (American College of Rheumatology), kriterijumima Evropske lige za reumatizam (European League of Rheumatism), ili bilo kojim drugim kriterijumima. Videti na primer, Felson i sar. (1995) Arthritis. Rheum.38 : 727-35 i van Gestel i sar. (1996) Arthritis Rheum.39: 34-40.

[0137] U nekim drugim izvođenjima, anti-CD40 antitela ili proteini ovog pronalaska, na primer mAb1, mAb2 ili mAb3 antitelo, mogu biti korišćeni samostalno ili u kombinaciji sa imunosupresivnim lekovima za lečenje i/ili prevenciju multiple skleroze. Tako u nekim izvođenjima gde se anti-CD40 antitela ili proteini ovog pronalaska, na primer mAb1, mAb2 ili mAb3 antitelo, koriste za lečenje multiple skleroze, antitela mogu da se koriste u kombinaciji sa pogodnim imunosupresivnim lekovima, uključujući, ali bez ograničenja na, metotreksat, ciklofosfamid, mizoribin, hlorambucil, ciklosporin, takrolimus (FK506; PROGRAFTM), mikofenolat mofetil i azatioprin (6-merkaptopurin), sirolimus (rapamicin), deoksispergvalin, leflunomid i njegove malononitriloamidne analoge; i imunosupresivne proteine, uključujući, na primer anti-CTLA antitela ili Ig fuzione agense, antitela koja neutrališu stimulator B limfocita (npr., LYMPHOSTAT-BTM) i Ig fuzione agense (BLyS-Ig), anti-CD20 antitela (npr., RITUXAN (D); u potpunosti humano antitelo HuMax-CD20, R-1594, IMMIJ-106, TRU-015, AME-133, tositumomab/1-131, tositumomab (Bexxar (RTM)), ibritumomab tituxetan (Zevalin (RTM)); anti-CD80 antitela i etanercept (ENBREL), kao i antitela koja prepoznaju T ćelije (anti-T antitela) kao što su anti-CD3 (OKT3), anti-CD4, agense uključene u modulaciju S1P receptora, uključujući na primer fingolimod i slično.

Farmaceutske formulacije i načini davanja (primene)

[0138] Anti-CD40 antitela ili proteini ovog pronalaska su davani u terapijski efikasnoj koncentraciji koja se upotrebljava za prevenciju ili lečenje autoimunskih bolesti i/ili inflamacijskih bolesti i/ili za prevenciju ili redukovanje rizika povezanih sa odbacivanjem grafta u transplantaciji.

[0139] Za postizanje ovog cilja, antitela mogu biti formulisana korišćenjem niza prihvatljivih ekscipijenasa (pomoćnih supstanci) koji su poznati u struci. Tipično, antitela ili proteini su davani putem injekcije, na primer, ili intravenski (u venu), intraperitonealno (u peritoneum), ili subkutano (pod kožu). Postupci kojima se postižu ovi načini davanja su poznati onima koji poseduju uobičajenu veštinu u struci. Takođe, moguće je napraviti i kompozicije koje mogu biti primenjene topikalno ili oralno, ili koje mogu biti sposobne da prođu mukozne membrane.

[0140] Poželjno intravensko davanje je putem infuzije tokom perioda od oko 1 do oko 10 časova, poželjnije tokom oko 1 do oko 8 časova, čak još poželjnije tokom oko 2 do oko 7 časova, ipak još poželjnije tokom oko 4 do oko 6 časova, u zavisnosti od toga da li su dati anti-CD40 antitelo ili protein. Inicijalna infuzija farmaceutske kompozicije može biti data tokom perioda od oko 4 do oko 6 časova sa sledstvenim infuzijama koje se daju brže. Sledstvene infuzije mogu biti date tokom perioda od oko 1 do oko 6 časova, uključujući, na primer, vreme od oko 1 do oko 4 časa, oko 1 do oko 3 časa, ili oko 1 do oko 2 časa.

[0141] Farmaceutska kompozicija ovog pronalaska formulisana je da bude kompatibilna sa planiranim putem davanja. Primeri mogućih puteva davanja uključuju parenteralno, (npr., intravensko (IV), intramuskularno (IM), intradermalno, subkutano (SC) ili infuziju), oralno i plućno (npr., inhalacija), nazalno, transdermalno (topikalno), transmukozno i rektalno davanje. Rastvori ili suspenzije korišćeni za parenteralnu, intradermalnu ill subkutanu primenu mogu da uključe sledeće komponente: sterilni rastvarač kao što su voda za injekcije, fiziološki rastvor, masna ulja, polietilen glikole, glicerin, propilen glikol ili druge sintetičke rastvarače; antibakterijske agense kao što su benzil alkohol ili metil parabeni; antioksidanse kao što su askorbinska kiselina ili natrijum bisulfit; helirajuće agense kao što su etilen-diamin-tetrasirćetna kiselina; pufere kao što su acetatni, citratni ili fosfatni i agense za podešavanje osmolarnosti kao što su natrijum hlorid ili dekstroza. pH može biti podešen kiselinama ili bazama, kao što su hlorovodonična kiselina ili natrijum hidroksid. Preparat za parenteralnu primenu može biti pakovan u ampulama, špricevima za jednokratnu upotrebu, ili staklenim ili plastičnim bočicama za višekratnu upotrebu (više doza).

[0142] Anti-CD40 antitela ili proteini ovog pronalska su tipično obezbeđeni standardnim tehnikama u farmaceutski prihvatljivom puferu, na primer, sterilnom fiziološkom rastvoru, sterilnoj puferovanoj vodi, propilen glikolu, kombinacijama navedenog itd. Postupci za pripremu agenasa koji se primenjuju parenteralno su opisani u Remington-ovoj Pharmaceutical Sciences (18th izd.; Mack Publishing Company, Eaton, Pennsylvania, 1990). Videti takođe, na primer, WO 98/56418, koji opisuje farmaceutske formulacije stabilizovanog antitela pogodne za upotrebu u postupcima ovog pronalaska.

[0143] Količinu najmanje jednog antagonističkog anti-CD40 antitela ili proteina ovog pronalaska koja će se primeniti lako određuje neko ko poseduje uobičajeno iskustvo u struci. Faktori koji utiču na način davanja i odgovarajuću količinu najmanje jednog antagonističkog anti-CD40 antitela ili proteina uključuju, ali bez ograničenja na, terapiju koja se sprovodi za određenu bolest, jačinu bolesti, istoriju bolesti, starost, visinu, težinu, zdravstveno stanje i fizičko stanje pojedinca koji se podvrgava terapiji. Slično ovome, količina antagonističkog anti-CD40 antitela ili proteina koji treba da se primeni će zavisiti od načina davanja i toga da li će subjekt primiti pojedinačnu dozu ili više doza ovog agensa. Generalno, veća doza anti-CD40 antitela ili proteina je poželjna sa povećanjem težine pacijenta koji se podvrgava terapiji. Doza anti-CD40 antitela ili proteina koji će biti primenjen je u opsegu od oko 0.003 mg/kg do oko 50 mg/kg, poželjno u opsegu od 0.01 mg/kg do oko 40 mg/kg.

[0144] Tako, na primer, doza može biti 0.01 mg/kg, 0.03 mg/kg, 0.1 mg/kg, 0.3 mg/kg, 0.5 mg/kg, 1 mg/kg, 1.5 mg/kg, 2 mg/kg, 2.5 mg/kg, 3 mg/kg, 5 mg/kg, 7 mg/kg, 10 mg/kg, 15 mg/kg, 20 mg/kg, 25 mg/kg, 30 mg/kg, 35 mg/kg, 40 mg/kg, 45 mg/kg, ili 50 mg/kg.

[0145] U drugom izvođenju ovog pronalaska, postupak obuhvata davanje višestrukih doza antagonističkog anti-CD40 antitela ili njegovog fragmenta. Postupak može uključiti davanje 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40 ili više terapijski efikasnih doza farmaceutske kompozicije koja sadrži antagonističko anti-CD40 antitelo ili njegov fragment. Učestalost i trajanje davanja višestrukih doza farmaceutskih kompozicija koje sadrže anti-CD40 antitelo ili protein može lako da odredi neko ko poseduje iskustvo u struci. Šta više, lečenje subjekta terapijski efikasnom količinom antitela ili proteina može da uključi jednokratan tretman ili, poželjno, može da uključi serije tretmana. U poželjnom primeru, subjekt je lečen antagonističkim anti-CD40 antitelom ili proteinom ovog pronalaska u opsegu između oko 0.1 do 20 mg/kg telesne težine, jednom nedeljno, tokom između oko 1 do 10 nedelja, poželjno između oko 2 do 8 nedelja, poželjnije između oko 3 do 7 nedelja i čak još poželjnije tokom oko 4, 5 ili 6 nedelja. Lečenje može da se dešava jednom godišnje da bi se sprečio relaps ili nakon indikacije relapsa. Korisno je znati da se efikasna doza antitela ili njegovog fragmenta koji vezuje antigen, korišćena za lečenje, može povećati ili smanjiti tokom trajanja određenog tretmana. Promene u dozi mogu biti posledica i postati očigledna potreba iz rezultata dijagnostičkih testova kao što je opisano u ovom tekstu.

[0146] Tako, u jednom izvođenju, protokol doziranja uključuje prvo davanje terapijski efikasne doze najmanje jednog anti-CD40 antitela ili proteina ovog pronalska u danima 1, 7, 14, i 21 perioda lečenja. U drugom izvođenju, protokol doziranja uključuje prvo davanje terapijski efikasne doze najmanje jednog anti-CD40 antitela ili proteina ovog pronalaska u danima 1, 2, 3, 4, 5, 6 i 7 u nedelji perioda lečenja u kojoj se sprovodi tretman. Dodatna izvođenja uključuju protokol doziranja u kome je prvo davanje terapijski efikasne doze najmanje jednog anti-CD40 antitela ili proteina ovog pronalaska u danima 1, 3, 5 i 7 u nedelji perioda lečenja u kojoj se sprovodi tretman; protokol doziranja uključujući prvo davanje terapijski efikasne doze najmanje jednog anti-CD40 antitela ili proteina ovog pronalaska u danima 1 i 3 u nedelji perioda lečenja u kojoj se sprovodi tretman; i protokol doziranja koji se preporučuje uključuje prvo davanje terapijski efikasne doze najmanje jednog anti-CD40 antitela ili proteina ovog pronalaska na dan 1 u nedelji perioda lečenja u kojoj se sprovodi tretman. Periodi lečenja mogu trajati 1 nedelju, 2 nedelje, 3 nedelje, mesec dana, 3 meseca, 6 meseci ili godinu dana. Periodi lečenja mogu slediti jedan drugi uzastopno ili mogu biti odvojeni jedan od drugog jednim danom, jednom nedeljom, 2 nedelje, mesec dana, 3 meseca, 6 meseci ili godinu dana. Opsezi doza se kreću od 0.003 mg/kg do 50 mg/kg, od 0.01 mg/kg do 40 mg/kg, od 0.01 mg/kg do 30 mg/kg, od 0.1 mg/kg do 30 mg/kg, od 0.5 mg/kg do 30 mg/kg, od 1 mg/kg do 30 mg/kg, od 3 mg/kg do 30 mg/kg, od 3 mg/kg do 25 mg/kg, od 3 mg/kg do 20 mg/kg, od 5 mg/kg do 15 mg/kg ili od 7 mg/kg do 12 mg/kg. Tako, na primer, doza bilo kog antagonističkog anti-CD40 antitela ili njegovog fragmenta koji vezuje antigen, na primer anti-CD40 monoklonskog antitela ili proteina ovog pronalaska, može biti 0.003 mg/kg, 0.01 mg/kg, 0.03 mg/kg, 0.1 mg/kg, 0.3 mg/kg, 0.5 mg/kg, 1 mg/kg, 1.5 mg/kg, 2 mg/kg, 2.5 mg/kg, 3 mg/kg, 5 mg/kg, 7 mg/kg, 10 mg/kg, 15 mg/kg, 20 mg/kg, 25 mg/kg, 30 mg/kg, 35 mg/kg, 40 mg/kg, 45 mg/kg, 50 mg/kg, ili druge takve doze koje se nalaze u opsegu od 0.003 mg/kg do 50 mg/kg. Ista terapijski efikasna doza anti-CD40 antitela ili proteina ovog pronalska može biti primenjena tokom svake nedelje doziranja antitela.

[0147] Alternativno, različite terapijski efikasne doze antagonističkog anti-CD40 antitela ili proteina ovog pronalska mogu biti korišćene tokom trajanja perioda lečenja.

[0148] U nekim izvođenjima, inicijalna (početna) terapijski efikasna doza antagonističkog anti-CD40 antitela ili njegovog fragmenta koji vezuje antigen kako je deifinisana na drugom mestu ovog teksta može biti u nižem doznom opsegu (tj., 0.003 mg/kg do 20 mg/kg) sa sledstvenim dozama koje se nalaze u višem doznom opsegu (tj., od 20 mg/kg do 50 mg/kg).

[0149] U alternativnim izvođenjima, inicijalna (početna) terapijski efikasna doza antagonističkog anti-CD40 antitela ili njegovog fragmenta koji vezuje antigen kako je deifinisan na drugom mestu ovog teksta može biti u gornjem doznom opsegu (tj., 20 mg/kg do 50 mg/kg) sa sledstvenim dozama koje se nalaze u donjem doznom opsegu (tj., 0.003 mg/kg do 20 mg/kg). Tako, u jednom izvođenju, inicijalna terapijski efikasna doza antagonističkog anti-CD40 antitela ili njegovog fragmenta koji vezuje antigen je 20 mg/kg do 35 mg/kg, uključujući oko 20 mg/kg, oko 25 mg/kg, oko 30 mg/kg i oko 35 mg/kg a sledstvene terapijski efikasne doze antagonističkog anti-CD40 antitela ili proteina ovog pronalaska su oko 5 mg/kg do oko 15 mg/kg, uključujući oko 5 mg/kg, 8 mg/kg, 10 mg/kg, 12 mg/kg i oko 15 mg/kg.

[0150] U nekim izvođenjima ovog pronalaska, anti-CD40 terapija je započeta davanjem "početne doze" antitela ili proteina ovog pronalaska subjektu kome je neophodna terapija anti-CD40. Pod "početnom dozom" podrazumeva se inicijalna doza anti-CD40 antitela ili proteina ovog pronalaska koji se daje subjektu, pri čemu se data doza antitela ili proteina ovog pronalaska nalazi u višem doznom opsegu (tj., od oko 20 mg/kg do oko 50 mg/kg). "Početna doza" može biti primenjena jednokratno, na primer, jedna infuzija gde su antitelo ili njegov fragment koji veže antigen dati IV, ili višekratno, na primer, više infuzija gde su antitelo ili njegov fragment koji veže antigen dati IV, sve dok se kompletna "početna doza" ne primeni u periodu unutar oko 24 časa. Nakon davanja "početne doze", subjekt dobija jednu ili više dodatnih terapijski efikasnih doza anti-CD40 antitela ili proteina ovog pronalaska. Sledstvene terapijski efikasne doze se mogu dati, na primer, prema nedeljnom rasporedu doziranja, ili jednom u dve nedelje, jednom u tri nedelje ili jednom u četiri nedelje. U takvim izvođenjima, sledstvene terapijski efikasne doze generalno se nalaze unutar nižeg doznog opsega (tj.0.003 mg/kg do 20 mg/kg).

[0151] Alternativno, u nekim izvođenjima, nakon "početne doze", sledstvene terapijski efikasne doze anti-CD40 antitela ili proteina ovog pronalaska su davane prema "protokolu održavanja", gde je terapijski efikasna doza antitela ili proteina ovog pronalaska davana jednom nedeljno, jednom u 6 nedelja, jednom na svaka dva meseca, jednom na svakih 10 nedelja, jednom na svaka tri meseca, jednom na svakih 14 nedelja, jednom na svaka četiri meseca, jednom na svakih 18 nedelja, jednom na svakih pet meseci, jednom na svake 22 nedelje, jednom na svakih šest meseci, jednom na svakih 7 meseci, jednom na svakih 8 meseci, jednom na svakih 9 meseci, jednom na svakih 10 meseci, jednom na svakih 11 meseci ili jednom na svakih 12 meseci. U takvim izvođenjima, terapijski efikasne doze anti-CD40 antitela ili proteina ovog pronalaska nalaze se u nižem doznom opsegu (tj., 0.003 mg/kg do oko 20 mg/kg), naročito kada su sledstvene doze davane u češćim intervalima, na primer, jednom na svake dve nedelje do jednom na svaki mesec ili kada su sledstvene doze davane u višem doznom opsegu (tj., od 20 mg/kg do 50 mg/kg), posebno kada su sledstvene doze davane u manje čestim intervalima, na primer, kada su sledstvene doze davane sa razmakom od jedan mesec do 12 meseci.

[0152] Bilo koja farmaceutska kompozicija koja sadrži anti-CD40 antitelo ili protein ovog pronalaska koja poseduje željene funkcionalne osobine, opisane u ovom tekstu kao terapijski aktivna komponenta, može biti korišćena u postupcima ovog pronalaska. Tako tečne, liofilizovane ili kompozicije koje su sušene raspršivanjem koje sadrže jedno ili više anti-CD40 antitela ili proteina ovog pronalaska, na primer, mAb1, mAb2 ili mAb3 antitela, mogu biti pripremljene kao vodeni ili nevodeni rastvori ili suspenzije za sledstveno davanje subjektu u saglasnosti sa postupcima ovog pronalaska.

[0153] Svaka od ovih kompozicija će sadržati najmanje jedno od anti-CD40 antitela ili proteina ovog pronalaska kao terapijski ili profilaktički aktivnu komponentu.

0154] Pod "terapijski ili profilaktički aktivnom komponentom" podrazumeva se da je anti-CD40 antitelo ili protein ovog pronalaska specifično ugrađen u kompoziciju sa ciljem da dovede do željenog terapijskog ili profilaktičkog odgovora subjekta kome je data ova farmaceutska kompozicija kao vid lečenja, prevencije ili dijagnoze bolesti ili stanja. Poželjno farmaceutske kompozicije sadrže odgovarajuće agense za stabilizaciju, agense za punjenje ili oba tipa agenasa da bi se minimalizovali problemi povezani sa gubitkom stabilnosti proteina i gubitkom biološke aktivnosti tokom pripreme i skladištenja.

[0155] Formulanti se mogu dodati farmaceutskim kompozicijama koje sadrže anti-CD40 antitelo ili protein ovog pronalaska. Ovi formulanti mogu da uključe, bez ograničenja na, ulja, polimere, vitamine, ugljenihidrate, amino kiseline, soli, pufere, albumin, surfaktante ili sredstva za punjenje. Poželjno ugljenihidrati uključuju šećer ili šećerne alkohole kao što su mono-, di-, ili polisaharidi ili u vodi rastvorljive glukane. Saharidi ili glukani mogu da uključe fruktozu, glukozu, manozu, sorbozu, ksilozu, maltozu, sukrozu, dekstran, pululan, dekstrin, α i β ciklodekstrin, rastvorljivi skrob, hidroksietil skrob i karboksimetil celulozu ili njihove mešavine.

[0156] "Šećerni alkohol" je definisan kao ugljovodonik sa C4 do C8 koji ima hidroksilnu grupu i uključuje galaktitol, inozitol, manitol, ksilitol, sorbitol, glicerol i arabitol. Ovi šećeri ili šećerni alkoholi mogu biti korišćeni pojedinačno ili u kombinaciji. Koncentracija šećera ili šećernog alkohola može biti između 1.0% i 7% w/v, poželjnije između 2.0% i 6.0% w/v. Na primer, amonokiseline uključuju levorotatorne (L) forme karnitina, arginina i betaina; međutim, druge aminokiseline mogu biti dodate. Poželjni polimeri uključuju polivinilpirolidon (PVP) sa prosečnom molekulskom težinom između 2,000 i 3,000 ili polietilen glikol (PEG) sa prosečnom molekulskom težinom između 3,000 i 5,000. Surfaktanti koji mogu biti dodati u formulaciju su prikazani u EP Br.270,799 i 268,110.

[0157] Dodatno, antitela mogu biti hemijski modifikovana kovalentnim konjugacijama u polimer da bi se, na primer, povećao njihov poluživot i cirkulaciji. Poželjni polimeri i postupci njihovog vezivanja za peptide su prikazani u U.S. Patentima Br. 4,766,106; 4,179,337; 4,495,285; i 4,609,546. Poželjni polimeri su polioksietilovani polioli i polietilen glikol (PEG). PEG je rastvorljiv u vodi na sobnoj temperaturi i ima opštu formulu: R (O-CH2--CH2) n O--R gde R može biti vodonik, ili zaštitna grupa kao što je alkil ili alkanol grupa. Poželjno, zaštitna grupa ima između 1 i 8 ugljenika, poželjnije ona je metil grupa. Simbol n je pozitivni ceo broj, poželjno između 1 i 1,000, poželjnije između 2 i 500. PEG ima poželjnu prosečnu molekulsku težinu između 1,000 i 40,000, poželjnije između 2,000 i 20,000, najpoželjnije između 3,000 i 12,000. Poželjno, PEG ima najmanje jednu hidroksilnu grupu, poželjnije to je terminalna hidroksilna grupa. To je ona hidroksilna grupa koja je preferencijalno aktivisana da reaguje sa slobodnom amino grupom na inhibitoru. Međutim, podrazumeva se da tip i broj reaktivnih grupa mogu da variraju da bi se ostvarila kovalentna konjugacija PEG/antitelo ovog pronalaska.

[0158] U vodi rastvorljivi polioksietilovani polioli su takođe svrsishodni u ovom pronalasku.

[0159] Oni uključuju polioksietilovani sorbitol, polioksietilovanu glukozu, polioksietilovani glicerol (POG) i slično. POG je poželjan. Jedan razlog je taj što je glicerolska okosnica polioksietilovanog glicerola ista okosnica koja se dešava u prirodi u, na primer, životinjama i ljudima u mono-, di-, trigliceridima. Zbog toga, ovo račvanje organizam ne mora nužno da „vidi“ kao strani agens. POG ima poželjnu molekulsku težinu u istom opsegu kao i PEG. Struktura POG-a je pokazana u Knauf i sar. (1988, J. Bio. Chem. 263: 15064-15070) a razmatranje POG/IL-2 konjugata se nalazi u U. S. Patentu Br.4,766, 106.

[0160] Drugi sistem „isporuke“ leka za povećanje poluživota leka u cirkulaciji je lipozom.

[0161] Postupci za pripremanje lipozomalnih sistema za „isporuku“ su razmotreni u Gabizon i sar. (1982) Cancer Research 42: 4734; Cafiso (1981) Biochem Biophys Acta 649: 129; i Szoka (1980) Ann. Rev. Bioplays. Eng. 9: 467. Drugi sistemi „isporuke“ leka su poznati u struci i opisani u npr., Poznansky i sar. (1980) Drug Delivery Systems (R. L. Juliano, ured., Oxford, N. Y.) str.253-315; Poznansky (1984) Pharm Revs 36: 277.

[0162] Formulant koji se ugrađuje u farmaceutsku kompoziciju treba da obezbedi stabilnost antagonističkom anti-CD40 antitelu ili proteinu ovog pronalaska. Odnosno, anti-CD40 antitelo ili protein ovog pronalaska treba da zadrži njegovu fizičku i/ili hemijsku stabinost i da ima željena svojstva tj., jednu ili više željenih funkcionalnih osobina koje su definisane u prethodnom tekstu.

[0163] Postupci za praćenje stabilnosti proteina su dobro poznate u struci. Videti, na primer, Jones (1993) Adv. Drug Delivery Rev.10: 29-90; Lee, ured. (1991) Peptide and Protein Drug Delivery (Marcel Dekker, Inc., New York, New York); i testovima za procenu stabilnosti koji su opisani u nastavku ovog teksta. Generalno, stabilnost proteina se meri na odabranoj temperaturi tokom određenog vremena. U poželjnim izvođenjima, stabilna farmaceutska formulacija antitela obezbeđuje stabilnost antagonističkog anti-CD40 antitela ili proteina ovog pronalaska kada se skladišti na sobnoj temperaturi (oko 25°C) najmanje 1 mesec, najmanje 3 meseca ili najmanje 6 meseci i/ili je stabilan na oko 2-8 C najmanje 6 meseci, najmanje 9 meseci, najmanje 12 meseci, najmanje 18 meseci, najmanje 24 meseca.

[0164] Smatra se da protein kao što je antitelo, kada je formulisan u farmaceutskoj kompoziciji, zadržava fizičku stabilnost u datom vremenskom trenutku ukoliko ne pokazuje vizuelne znakove (tj., prebojenost ili zamućenost) ili merljive znakove (na primer, korišćenjem gel filtracije ili hromatografije na hromatografskim sitima (size-exclusion chromatography) (SEC) ili metode na principu rasipanja UV svetlosti) precipitacije, agregacije i/ili denaturacije u datoj farmaceutskoj kompoziciji. U pogledu hemijske stabilnosti, smatra se da protein kao što je antitelo, kada je formulisan u farmaceutskoj kompoziciji, zadržava hemijsku stabilnost u datom vremenskom trenutku ukoliko merenja hemijske stabilnosti ukazuju da protein (tj. antitelo) zadržava biološku aktivnost koja je od interesa u datoj farmaceutskoj kompoziciji. Postupci za praćenje promena u hemijskoj stabilnosti su dobro poznati u struci i uključuju, ali bez ograničenja na, metode za detekciju hemijski izmenjenih formi proteina kao što su forme koje su rezultat isecanja, korišćenjem, na primer, SDS-PAGE, SEC i/ili masene spektrometrije -desorpcija laserom iz matrice/na bazi vremena preleta (matrix-assisted laser desorption ionization/time of flight); i degradacije povezane sa promenama u molekularnom naelektrisanju (na primer, povezano sa deamidacijom), korišćenjem, na primer, jonoizmenjivačke hromatografije. Videti, na primer, postupke opisane u nastavku ovog teksta.

[0165] Smatra se da anti-CD40 antitelo ili protein predmetnog pronalaska, kada je formulisan u farmaceutskoj kompoziciji, zadržava željenu biološku aktivnost u datom vremenskom trenutku ukoliko je željena biološka aktivnost u tom vremenu unutar oko 30%, poželjno unutar oko 20% željene biološke aktivnosti ispoljene u vremenu kada je farmaceutska kompozicija pripremljena kako je utvrđeno pogodnim testom za merenje željene biološke aktivnosti. Testovi za merenje željene biološke aktivnosti antagonističkih anti-CD40 antitela ili proteina koji su prikazani u ovom tekstu, mogu se izvesti kao što je opisano u Primerima ovog teksta. Videti takođe testove opisane u Schutze i sar. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 8200-8204; Denton i sar., (1998) Pediatr Transplant.2: 6-15; Evans i sar., (2000) J: Immunol.164: 688-697; Noelle (1998) Agents Actions Suppl. 49: 17-22; Lederman i sar., (1996) Curr Opin. Hematol.3: 77-86; Coligan i sar., (1991) CurrentProtocols in Immunology 13: 12; Kwekkeboom i sar., (1993) Immunology 79: 439-444; i U. S. Patent br.5,674, 492 i 5,847, 082.

[0166] U nekim izvođenjima ovog pronalaska, anti-CD40 antitelo, na primer, izabrano između mAb1-mAb3 rekombinantnih antitela, je formulisano u tečnoj farmaceutskoj formulacij. Anti-CD40 antitelo ili protein ovog pronalaska može biti pripremljeno korišćenjem bilo kog postupka poznatog u struci, uključujući one postupke koji su opisani u prethodnom delu ovog teksta. U jednom izvođenju, anti-CD40 antitelo, na primer, izabrano između mAb1-mAb3 antitela, je proizvedeno rekombinantnim postupcima u CHO ćelijskoj liniji.

[0167] Nakon proizvodnje i prečišćavanja, anti-CD40 antitelo može biti formulisano kao tečna farmaceutska formulacija na način koji je pokazan u ovom tekstu. Kada antagonističko anti-CD40 antitelo treba da se čuva pre nego što se podvrgne formulaciji, ono može biti zamrznuto, na primer, na -20°C i onda otopljeno na sobnoj temperaturi za dalju formulaciju.

[0168] Tečna farmaceutska formulacija sadrži terapijski efikasnu količinu anti-CD40 antitela ili proteina ovog pronalaska, na primer, mAb1, mAb2 ili mAb3 antitela. Količina antitela koja je prisutna u formulaciji usaglašena je sa načinom primene i volumenom željene doze.

[0169] Na ovaj način, tečna farmaceutska kompozicija sadrži anti-CD40 antitelo, na primer, mAb1, mAb2 ili mAb3 antitelo, u koncentraciji od 0.1 mg/ml do 300.0 mg/ml, 1.0 mg/ml do 200 mg/ml, 5.0 mg/ml do 100.0 mg/ml, 7.5 mg/ml do 50 mg/ml, ili 15.0 mg/ml do 25.0 mg/ml.

[0170] Tečna farmaceutska kompozicija sadrži anti-CD40 antitelo, na primer, mAb1, mAb2 ili mAb3 antitelo i pufer koji održava pH vrednost formulacije u opsegu od pH 5.0 do pH 7.0.

[0171] Bilo koji pogodan pufer koji održava pH vrednost formulacije anti-CD40 antitela u tečnom obliku u opsegu od oko pH 5.0 do oko pH 7.0 može biti korišćen u formulaciji, onoliko dugo koliko se fizičko-hemijska stabilnost i željena biološka aktivnost antitela zadržavaju u definisanim vrednostima kao što je pomenuto u prethodnom delu ovog teksta. Pogodni puferi uključuju, ali bez ograničenja na, konvencionalne kiseline i njihove soli, gde kontrajon može biti, na primer, natrijum, kalijum, amonium, kalcijum ili magnezijum. Primeri konvencionalnih kiselina i njihovih soli koji mogu biti korišćeni za puferovanje farmaceutske formulacije u tečnom obliku uključuju, ali bez ograničenja na, sukcinsku (ćilibarnu) kiselinu ili sukcinat, histidin ili histidin hidrohloride, limunsku kiselinu ili citrate, sirćetnu kiselinu ili acetate, vinsku kiselinu ili tartarate, fosfornu kiselinu ili fosfate, glukonsku kiselinu ili glukonate, glutaminsku kiselinu ili glutamate, asparaginsku kiselinu ili aspartate, maleinsku kiselinu ili maleate i jabučnu kiselinu ili malatne pufere. Koncentracija pufera u formulaciji može biti od 1 mM do 50 mM, uključujući oko 1 mM, 2 mM, 5 mM, 8 mM, 10 mM, 15 mM, 20 mM, 25 mM, 30 mM, 35 mM, 40 mM, 45 mM, 50 mM ili druge takve vrednosti u opsegu od 1 mM do 50 mM.

[0172] U nekim izvođenjima ovog pronalaska, tečna farmaceutska formulacija sadrži terapijski efikasnu količinu anti-CD40 antitela, na primer, mAb1, mAb2 ili mAb3 antitelo i sukcinatni pufer ili citratni pufer ili histidinski pufer ili histidin hidrohloridni pufer u koncentraciji koja održava pH vrednost formulacije u opsegu od oko pH 5.0 do pH 7.0. Pod "sukcinatni pufer" ili "citratni pufer" podrazumeva se da se odnosi na pufer koji sadrži so sukcinske kiseline, odnosno so limunske kiseline. Pod "histidinski pufer" podrazumeva se da se odnosi na pufer koji sadrži so aminokiseline histidina.

[0173] U poželjnom izvođenju, pufer je histidinski pufer, npr., histidin hidrohlorid. Kao što je navedeno u prethodnom delu teksta, koncentracija histidinskog pufera u formulaciji može biti od 1 mM do 50 mM, uključujući oko 1 mM, 2 mM, 5 mM, 8 mM, 10 mM, 15 mM, 20 mM, 25 mM, 30 mM, 35 mM, 40 mM, 45 mM, 50 mM ili druge takve vrednosti u opsegu od 1 mM do 50 mM.

[0174] U poželjnom izvođenju, sukcinatni ili citratni kontrajon je natrijum katjon, tako da je pufer natrijum sukcinat, odnosno natrijum citrat. Međutim, očekuje se da svaki katjon bude efikasan. Drugi mogući sukcinatni ili citratni katjoni uključuju, ali bez ograničenja na, kalijum, amonijum, kalcijum i magnezijum. Kao što je navedeno u prethodnom delu teksta, koncentracija sukcinatnog ili citratnog pufera u formulaciji može biti od 1 mM do 50 mM, uključujući oko 1 mM, 2 mM, 5 mM, 8 mM, 10 mM, 15 mM, 20 mM, 25 mM, 30 mM, 35 mM, 40 mM, 45 mM, 50 mM ili druge takve vrednosti u opsegu od 1 mM do 50 mM.

[0175] U drugim izvođenjima, tečna farmaceutska formulacija sadrži antagonističko anti-CD40 antitelo, na primer, mAb1, mAb2 ili mAb3 antitelo, u koncentraciji od 0.1 mg/ml do 300.0 mg/ml, ili 1.0 mg/ml do 200 mg/ml, 5.0 mg/ml do 100.0 mg/ml, 7.5 mg/ml do 50 mg/ml, ili 15.0 mg/ml do 25.0 mg/ml i histidinski ili sukcinatni ili citratni pufer, na primer, natrijum sukcinat ili natrijum citratni pufer ili histidin hidrohlorid, u koncentraciji od 1 mM do 50 mM, 5 mM do 40 mM, 10mM do 35mM, poželjno oko 30 mM.

[0176] Kada je poželjno da tečna farmaceutska formulacija bude približno izotonična, tečna farmaceutska formulacija sadrži terapijski efikasnu količinu anti-CD40 antitela ili proteina ovog pronalaska, na primer, mAb1, mAb2 ili mAb3 antitela, a pufer za održavanje pH vrednosti formulacije u opsegu od oko pH 5.0 do oko pH 7.0 može dodatno da sadrži udeo agensa za izotonizaciju dovoljan da formulaciju učini približno izotoničnom. Pod "približno izotoničan" podrazumeva se da znači da vodena formulacija ima osmolarnost od 240 mmol/kg do 800 mmol/kg, poželjno oko 240 do oko 600 mmol/kg, poželjnije oko 240 do oko 440 mmol/kg, poželjnije oko 250 do oko 330 mmol/kg, čak poželjnije oko 260 do oko 320 mmol/kg, još poželjnije oko 270 do oko 310 mmol/kg.

[0177] Postupci za određivanje izotoničnosti rastvora su poznati onima koji su umešni u struci. Videti, na primer, Setnikar i sar. (1959) J. Am. Pharm. Assoc. 48:628. Oni koji su umešni u struci su upoznati sa nizom farmaceutski prihvatljivih supstanci koje se rastvaraju a koje su korisne za postizanje izotoničnosti farmaceutskih kompozicija. Agens za izotonizaciju može biti bilo koji reagens pomoću koga je moguće podesiti osmotski pritisak tečne farmaceutske formulacije ovog pronalaska na vrednost približno jednaku onoj koja postoji u telesnoj tečnosti. Poželjno je koristiti fiziološki prihvatljiv agens za izotonizaciju.

[0178] Prema tome, tečna farmaceutska formulacija sadrži terapijski efikasnu količinu antagonističkog anti-CD40 antitela, na primer, mAb1, mAb2 ili mAb3 antitelo, a pufer za održavanje vrednosti formulacije u opsegu od oko pH 5.0 do oko pH 7.0, može dodatno da sadrži komponente koje mogu biti korišćene da obezbede izotoničnost, na primer, natrijum hlorid, aminokiseline kao što su alanin, valin i glicin; šećere i šećerne alkohole (polioli), uključujući, ali bez ograničenja na, glukozu, dekstrozu, fruktozu, sukrozu, maltozu, manitol, trehalozu, glicerol, sorbitol i ksilitol; sirćetnu kiselinu, druge organske kiseline ili njihove soli, i relativno minorne količine citrata ili fosfata. Osoba koja poseduje uobičajenu veštinu u struci će znati dodatne agense koji su pogodni za postizanje optimalne toničnosti tečne formulacije.

[0179] U nekim poželjnim izvođenjima, tečna farmaceutska kompozicija sadrži terapijski efikasnu količinu anti-CD40 antitela, na primer, mAb1, mAb2 ili mAb3 antitelo, a pufer za održavanje pH vrednosti formulacije u opsegu od oko pH 5.0 do oko pH 7.0, dodatno sadrži natrijum hlorid kao agens za izotonizaciju.

[0180] Koncentracija natrijum hlorida u formulaciji će zavisiti od uticaja drugih komponenti na toničnost. U nekim izvođenjima, koncentracija natrijum hlorida je 50 mM do 300 mM. U jednom takvom izvođenju, koncentracija natrijum hlorida je oko 150 mM. U drugim takvim izvođenjima, koncentracija natrijum hlorida je oko 150 mM, pufer je natrijum sukcinat ili natrijum citratni pufer u koncentraciji od 5 mM do 15 mM, tečna farmaceutska formulacija sadrži terapijski efikasnu količinu anti-CD40 antitela ili proteina ovog pronalaska, na primer, mAb1, mAb2 ili mAb3 antiboda, i formulacija ima pH vrednost od 5.0 do pH 7.0.

[0181] U drugim izvođenjima, tečna farmaceutska formulacija sadrži anti-CD40 antitelo ili protein ovog pronalaska, na primer, mAb1, mAb2 ili mAb3 antitelo, u koncentraciji od 0.1 mg/ml do 50.0 mg/ml ili 5.0 mg/ml do 25.0 mg/ml, oko 150 mM natrijum hlorida i oko 10 mM, 20 mM, 30 mM, 40 mM ili 50mM natrijum sukcinata ili natrijum citrata i ima pH vrednost od oko pH 5.5.

[0182] Degradacija proteina kao posledica zamrzavanja, odmrzavanja ili mehaničkih oštećenja tokom obrade tečne farmaceutske formulacije ovog pronalaska može biti inhibirana ubacivanjem surfaktanata u formulaciju u cilju snižavanja površinskog napona na dodirnoj površini solucije i vazduha. Tako, u nekim izvođenjima, tečna farmaceutska formulacija sadrži terapijski efikasnu količinu anti-CD40 antitela ili proteina predmetnog pronalaska, na primer, mAb1, mAb2 ili mAb3 antitelo, pufer za održavanje pH vrednosti formulacije u opsegu od oko pH 5.0 do oko pH 7.0 i dodatno sadrži surfaktant. U drugim izvođenjima, tečna farmaceutska formulacija sadrži terapijski efikasnu količinu anti-CD40 antitela ili proteina predmetnog pronalaska, na primer, mAb1, mAb2 ili mAb3 antitelo, pufer za održavanje pH vrednosti formulacije u opsegu od oko pH 5.0 do oko pH 7.0, agens za izotonizaciju kao što je natrijum hlorid u koncentraciji od oko 50 mM do oko 300 mM, i dodatno sadrži surfaktant.

[0183] Tipični korišćeni surfaktanti su nejonski surfaktanti, uključujući polioksietilen sorbitol estre kao što su polisorbat 80 (Tween 80) i polisorbat 20 (Tween 20); polioksipropilenpolioksietilen estre kao što je Pluronic F68; polioksietilen alkohole kao što je Brij 35; simetikon; polietilen glikol kao što je PEG400; lizofosfatidilholin i polioksietilen-p-t-oktilfenol kao što je Triton X-100.

[0184] Klasična stabilizacija farmaceutika surfaktantima ili emulgatorima je opisana, na primer, u Levine i sar., (1991) J. Parenteral Sci. Technol.45 (3): 160-165, navedenom u ovom tekstu u odeljku Literatura. Surfaktant koji je primarno korišćen u praktičnom delu ovog pronalaska je polisorbat 80. Kada je surfaktant uključen, on je tipično dodavan u količini od 0.001 % do 1.0% (w/v).

[0185] Prema tome, u nekim izvođenjima, tečna farmaceutska formulacija sadrži terapijski efikasnu količinu anti-CD40 antitela ili proteina ovog pronalaska, na primer, mAb1, mAb2 ili mAb3 antitelo, pufer je natrijum sukcinat ili natrijum citrat ili histidinski pufer ili histidin hidrohloridni pufer u koncentraciji od 1 mM do 50 mM, 3 mM do 40 mM, ili 5 mM do 35 mM; ili 7.5 mM do 30mM; formulacija ima pH vrednost od pH 5.0 do pH 7.0 i formulacija dodatno sadrži surfaktant, na primer, polisorbat 80, u količini od 0.001% do 1.0% ili 0.001% do 0.5%. Takve formulacije mogu po potrebi da sadrže agens za izotonizaciju, kao što je natrijum hlorid u koncentraciji od 50 mM do 300 mM, 50 mM do 200 mM, ili 50 mM do 150 mM.

[0186] U drugim izvođenjima, tečna farmaceutska formulacija sadrži anti-CD40 antitelo ili protein ovog pronalaska, na primer, mAb1, mAb2 ili mAb3 antitelo, u koncentraciji od 0.1 mg/ml do 200.0 mg/ml ili 1 mg/ml do 100.0 mg/ml ili 2 mg/ml do 50.0 mg/ml ili 5.0 mg/ml do 25.0 mg/ml, uključujući oko 20.0 mg/ml; 50 mM do 200 mM natrijum hlorida, uključujući oko 150 mM natrijum hlorida; natrijum sukcinat ili natrijum citrat u koncentraciji od 5 mM do 20 mM, uključujući oko 10 mM natrijum sukcinata ili natrijum citrata; natrijum hlorid u koncentraciji od 50 mM do 200 mM, uključujući oko 150 mM; histidin ili histidin hlorid u koncentraciji od 5 mM do 50 mM, uključujući oko 30 mM histidina ili histidin hlorida; i po potrebi surfaktant, na primer, polisorbat 80, u količini od 0.001% do 1.0%, uključujući 0.001% do 0.5%; pri čemu tečna farmaceutska formulacija ima pH vrednost od oko pH 5.0 do oko pH 7.0.

[0187] Tečna farmaceutska formulacija može biti praktično oslobođena prisustva bilo kog od konzervansa i drugih nosača, ekscipijenasa (pomoćnih susptanci) ili stabilizatora koji su navedeni u prethodnom delu ovog teksta. Alternativno, formulacija može da sadrži jedan ili više konzervanasa, na primer, antibakterijske agense, farmaceutski prihvatljive nosače, ekscipijense ili stabilizatore opisane u prethodnom delu ovog teksta pod pretpostavkom da oni ne utiču negativno na fizičkohemijsku stabilnost antagonističkog anti-CD40 antitela ili njegovog fragmenta koji vezuje antigen. Primeri prihvatljivih nosača, ekscipijenasa i stabilizatora uključuju, ali bez ograničenja na, dodatne agense za puferovanje, dodatke za rastvarače, surfaktante, antioksidanse uključujući askorbinsku kiselinu i metionin, helirajuće agense kao što je EDTA, komplekse metala (na primer, Zn-protein komplekse), i biorazgradive polimere kao što su poliestri. Temeljno razmatranje pripreme formulacija i odabira farmaceutski prihvatljivih nosača, stabilizatora i izomolita može biti nađeno u Remington-ovoj Pharmaceutical Sciences (18th izd.; Mack Publishing Company, Eaton, Pennsylvania, 1990).

[0188] Kada se tečna farmaceutska formulacija ili druga farmaceutska kompozicija koja je ovde opisana pripremi, ona može biti liofilizovana da bi se sprečila degradacija. Postupci za liofiliziranje tečnih kompozicija su poznati onima koji poseduju uobičajenu veštinu u struci. Neposredno pre upotrebe, kompozicija može biti rekonstituisana dodatkom sterilnog diluenta (Ringer-ov rastvor, destilovana voda ili sterilni fiziološki rastvor, na primer) koji može da uključi dodatne sastojke.

[0189] Nakon rekonstitucije, kompozicija je poželjno data subjektima primenom postupaka aplikacije koji su poznati onima koji su iskusni u struci.

Upotreba antagonističkih anti-CD40 antitela u proizvodnji lekova

[0190] Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje antagonističko anti-CD40 antitelo ili proteine pronalaska za upotrebu u lečenju autoimunskih i/ili inflamacijskih bolesti subjekata kod kojih se primenjuje, pri čemu je lek (medikament) usaglašen (koordiniran) sa najmanje jednom drugom terapijom.

[0191] Pod "usaglašen (koordiniran)" se podrazumeva da se medikament koristi ili pre, tokom ili nakon lečenja (tretmana) subjekta sa najmanje jednom drugom terapijom. Prmeri drugih terapija uključuju, ali bez ograničenja na, one terapije koje su prethodno opisane u ovom tekstu, tj., hirurgiju ili hirurške procedure (npr. splenektomiju, limfadenektomiju, tireoidektomiju, plazmaferezu, leukoferezu, transplanatciju ćelija, tkiva ili organa, perfuziju organa, intestinalne procedure i slično), zračnu (radijacionu) terapiju, terapiju kao što je terapija steroidima i nesteroidima, hormonsku terapiju, terapiju citokinima, terapiju dermatološkim agensima (na primer, topikalnim agensima koji se koriste za lečenje kožnih poremećaja kao što su alergije, kontaktni dermatitis i psorijaza), imunosupresivnu terapiju, terapiju drugim monoklonskim antitelima sa anti-inflamacijskim delovanjem i slično, pri čemu se lečenje dodatnom terapijom ili dodatnim terapijama dešava pre, tokom ili nakon lečenja subjekta davanjem medikamenta koji sadrži antagonističko anti-CD40 antitelo ili proteine ovog pronalaska kako je naznačeno u prethodnom delu ovog teksta.

[0192] U jednom takvom izvođenju, ovaj pronalazak obezbeđuje mAb1, mAb2 ili mAb3 antitelo za upotrebu u lečenju autoimunske bolesti i/ili inflamacijske bolesti subjekta, pri čemu je upotreba medikamenta usaglašena (koordinirana) sa najmanje jednom drugom terapijom kao što je naznačeno u prethodnom delu ovog teksta.

[0193] U nekim izvođenjima, medikament koji sadrži antagonističko anti-CD40 antitelo, na primer, monoklonsko antitelo mAb1, mAb2 ili mAb3 prikazano u ovom tekstu, ili njegov fragment koji vezuje antigen je usaglašen (koordiniran) sa lečenjem koje se sprovodi primenom dve druge terapije.

[0194] Kada je medikament koji sadrži antagonističko anti-CD40 antitelo usaglašen (koordiniran) sa dve druge terapije, upotreba medikamenta može biti pre, tokom ili posle lečenja (tretmana) subjekta sa jednom ili obe druge terapije.

[0195] Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje antagonističko anti-CD40 antitelo, na primer, antitelo mAb1, mAb2 ili mAb3 prikazano u ovom tekstu, za upotrebu u lečenju autoimunske bolesti i/ili inflamacijske bolesti subjekta, pri čemu se medikament primenjuje kod subjekta koji je prethodno primio (pretretiran) najmanje jednu drugu terapiju.

[0196] Pod terminima "pretretiran" ili "pretretman" podrazumeva se da je subjekt primio (bio tretiran) jednu ili više drugih terapija pre nego što je primio medikament koji sadrži antagonističko anti-CD40 antitelo ili protein ovog pronalaska.

[0197] Sledeći primeri su dati kao ilustracija a ne kao ograničenje.

LEGENDE SLIKA

[0198]

Slika 1 prikazuje ugradnju<3>H-timidina u PBMC nakon 72 časovne kultivacije humanih PBMC stimulisanih u doznom opsegu u kom se postiže odgovor delovanjem Chir12.12 (prazan krug), mAb1 (ispunjen krug), mAb2 (ispunjen kvadrat), mAb3 (ispunjen trougao) ili humanog CD40L (prazan kvadrat).

Slika 2 prikazuje ugradnju<3>H-timidina u PBMC nakon 72 časovne kultivacije humanih PBMC stimulisanih u doznom opsegu u kom se postiže odgovor delovanjem Chir12.12 (prazan krug), mAb1 (ispunjen krug), mAb2 (ispunjen kvadrat), mAb3 (ispunjen trougao), humanog CD40L (prazan kvadrat), izotipske kontrole (ispunjen romb), ko-stimulisanih u prisustvu ili 5 μg/ml anti-IgM F(ab’)2 ili 1 μM CpG2006.

Slika 3 prikazuje ugradnju<3>H-timidina u PBMC nakon 72 časovne kultivacije humanih PBMC stimulisanih u doznom opsegu u kom se postiže odgovor delovanjem Chir12.12 (prazan krug), mAb1 (ispunjen krug), mAb2 (ispunjen kvadrat), mAb3 (crni trougao), humanog CD40L (prazan kvadrat), izotipske kontrole (ispunjen romb), ko-stimulisanih u prisustvu 75 ng/ml IL-4.

Slika 4 prikazuje ugradnju<3>H-timidina u PBMC nakon 72 časovne kultivacije humanih PBMC stimulisanih delovanjem 20 μg/ml CD40L, i delovanjem u doznom opsegu u kom se postiže odgovor Chir12.12 (prazan krug), mAb1 (ispunjen krug), mAb2 (ispunjen kvadrat), mAb3 (crni trougao) ili humanog CD40L (prazan kvadrat).

Slika 5 prikazuje dozno-zavisno vezivanje anti-humanih CD40 antitela za ćelije BJAB ćelijske linije i to Chir12.12 (ispunjen krug), mAb1 (prazan kvadrat), mAb2 (prazan trougao), mAb3 (ispunjen trougao).

PRIMERI

Materijali

1. Monoklonska antitela

[0199] Chir12.12 (1.9 mg/ml), mAb1 (0.88 mg/ml), mAb2 (1.9 mg/ml) i mAb3 (1.9 mg/ml) su obezbeđeni u 50 mM citratu pH 7.0, 140 mM NaCl. U odabranim eksperimentima je takođe korišćena IgG izotipska kontrola (Sigma, St. Louis, SAD).

2. Stimulusi za aktivaciju B ćelija

[0200] AfiniPure F(ab’)2 fragment kunećeg anti-humanog IgM je dobijen od Jackson Immuno Research (Suffolk, Velika Britanija), a CpG2006 je dobijen od Microsynth (Balgach, Švajcarska). Rekombinantni humani CD40L je generisan korišćenjem standardnih procedura koje su poznate onima koji poseduju uobičajenu veštinu u struci. Supernatant koji sadrži humani IL-4 je generisan korišćenjem standardnih procedura koje su poznate onima koji poseduju uobičajenu veštinu u struci.

3. Reagensi za in vitro kulturu tkiva

[0201] Medijum za kultivaciju PBMC: RPMI-1640, 10% FBS, 1% penicilin/streptomicin, 1% neesencijalne aminokiseline, 1% natrijum piruvat, 5 mM β-merkaptoetanol (svi od Invitrogen-a, San Diego, SAD).

Postupci

1. Test CD40L- posredovane proliferacije PBMC

1.1 Prečišćavanje humanih mononuklearnih ćelija periferne krvi (PBMC)

[0202] Primarne PBMC su izdvojene iz koncentrovanih ćelijskih elemenata ukupne periferne krvi (buffy coats) dobijenih od zdravih dobrovoljaca (Blutspendezentrum, Basel). Koncentrovane ćelije ukupne periferne krvi su razblažene 1:4 sa PBS koji je oslobođen Ca2+ i Mg2+ a sadrži 5 mM EDTA i 25 ml ove suspenzije je alikvotirano u Falcon-ove epruvete od 50 ml. Ispod razblaženih koncentrata krvi (buffy coats) je naneto 14 ml gradijenta Ficoll-Plaque Plus (GE Healthcare) po jednoj Falkon-ovoj epruveti i epruvete su centrifugirane na sobnoj temperaturi tokom 20 min na 2250 rpm (bez kočenja). Nakon centrifugiranja, međufazni sloj je prebačen u jednu Falcon-ovu epruvetu od 50 ml. Međufazni slojevi iz više epruveta (od jednog davaoca) su spajani do volumena od 30 ml. PBS sa dodatkom 5 mM EDTA je dodat i ćelije su centrifugirane na sobnoj temperaturi tokom 5 min na 2250 rpm. Supernatant je odliven pre dodatka 15 ml pufera za liziranje eritrocita (RBC) koji je inkubiran na sobnoj temperaturi tokom 5 min. Nakon toga dodato je 20 ml PBS/5 mM EDTA i ćelije su opet centrifugirane (RT/5 min na 2250 rpm). Ćelije su dva puta isprane u PBS/5 mM EDTA (sa centrifugiranjima u međukoracima) i resuspendovane u 35 ml medijuma za PBMC pre određivanja broja vijabilnih ćelija korišćenjem boje Tripan-plavo. Ćelije koje nisu odmah korišćene za in vitro stimulaciju su zamrzavane.

1.2 Test stimulacije PBMC in vitro

[0203] Napravljena je serija dvostrukih razblaženja za krivu dozne zavisnosti sa sedam tačaka, svakog anti-CD40 ili monoklonskog antitela izotipske kontrole u triplikatima, i postavljena u Costar-ove ploče od 96 mesta u prisustvu ili odsustvu konstantne doze od 5 μg/ml anti-IgM F(ab’)2, 1 μM CpG2006, supernatanta koji sadrži humani IL-4 (75 ng/ml) ili 40 μg/ml rekombinantnog huCD40L (naznačene su finalne koncentracije). Startne koncentracije svakog anti-CD40 mAb su bile u opsegu od 20 μg/ml do 100 μg/ml u zavisnosti od eksperimenta. CD40L je korišćen u doznom opsegu odgovora kao pozitivna kontrola u svim eksperimentima. Doze anti-IgM, CpG2006, IL-4 i CD40L su odabrane na osnovu prethodnih eksperimenata u kojima je procenjivana njihova sposobnost (pojedinačno ili u kombinaciji) da indukuju proliferaciju PBMC ili B ćelije u doznom opsegu odgovora (rezultati nisu prikazani). PBMC (finalni broj ćelija 8x10<4>po polju ploče) su sledstveno dodate u svako polje ploče pre inkubacije u trajanju od 3 dana na 37°C / 5 % CO2.<3>H-timidin (1 μCi/50 μl/polju ploče) je dodat u svako polje u poslednjih 6 časova kultivacije pre „skidanja“ kulture i određivanja ugradnje timidina korišćenjem MicroBetaTrilux scintilacionog brojača. Obratiti pažnju da su ćelije sa medijumom i ćelije sa medijumom i sa anti-IgM, IL-4, CpG2006 ili CD40L kontrolnim kulturama (u odsustvu svih testiranih anti-CD40 mAbs) uključene u svaki eksperiment.

[0204] Podaci dobijeni na ovaj način (nakon očitavanja na scintilacionom brojaču) su analizirani korišćenjem Excel-a i GraphPad Prism-a softvera. Rezultati su prikazani kao srednja vrednost broja otkucaja u minuti (cpm) ( ± standardna greška) u zavisnosti od logaritma koncentracije anti-CD40 mAb. Na svakom grafikonu su naznačene pozitivne kontrole i nespecifični (background) nivoi. IC50 ili EC50 vrednosti su izračunate obradom podataka u skladu sa uspešnim fitovanjem koeficijenata funkcije krive dozne zavisnosti pomoću programa Prism.

[0205] PBMC su stimulisane sa 20 μg/ml CD40L u prisustvu ili odsustvu anti-CD40 mAb u opsegu dozne zavisnosti, tokom 3 dana kako je naznačeno u napred navedenom tekstu. Proliferacija je procenjivana na osnovu ugradnje<3>H-timidina nakon 72 časa kultivacije. Rezultati su prikazani kao srednja vrednost triplikata kultura sa SEM i predstavljaju rezultate od 4 davaoca (nezavisni eksperimenti). IC50 vrednosti za inhibiciju posredovanu delovanjem anti-CD40 mAb su prikazane tabelarno u μg/ml.

2. In vitro PBMC agonistički test

[0206] Humane PBMC su, kao što je naznačeno u napred navedenom odeljku 1.2, stimulisane delovanjem Chir12.12, mAb1, mAb2 ili mAb3 u doznom opsegu odgovora, tokom 3 dana ili u odsustvu kostimulacije ili u prisustvu ili 5 μg/ml anti-IgM F(ab’)2 ili 1 μM CpG2006. Proliferacija je procenjivana merenjem ugradnje<3>H-timidina nakon 72 časa kultivacije. Rezultati su prikazani kao srednja vrednost triplikata kultura sa SEM i predstavljaju rezultate od 4 davaoca (nezavisni eksperimenti).

3. ADCC test

[0207] U ploču sa U dnom (Corning Incorporated – Costar #3790) dodato je 50 μl suspenzije PBMC (10x10<6>ćelija/mL), 50 μl Raji ćelija obeleženih kalceinom (2x10<5>ćelija/mL) i 100 μl razblaženog antitela ili kontrole. Maksimum lize je određen u 2% Triton-u 100.

[0208] Ćelije su istaložene centrifugiranjem na dnu ploče (3 minuta na 250g) i inkubirane tokom 1 čas na 37°C u vlažnoj sredini sa atmosferskim CO2 (5%). Ćelije su odvojene iz medijuma centrifugiranjem (3 minuta na 750g) i 100 μl supernatanta je prebačeno u crne ploče sa prozirnim dnom (Corning Incorporated - Costar #3904) za merenje.

[0209] Fluorescenca je merena na spektrometru SpectraMax Gemini (Molecular Devices) na 535 nm, nakon ekscitacije na 485 nm. Specifična liza je izračunata primenom sledeće formule:

(eksperimentalno oslobađanje – spontano oslobađanje) / (maksimalno oslobađanje - spontano oslobađanje) x 100.

4. Vezivanje varijanti anti-humanog CD40 antitela za humanu BJAB ćelijsku liniju

[0210] Protočna citometrija je urađena da bi se uporedilo vezivanje anti-CD40 antitela sa različitim varijantama Fc za humane BJAB ćelije. U tom cilju, BJAB ćelije su postavljene u ploču od 96 mesta sa V dnom u koncentraciji 2 x 10<5>ćelija po polju ploče. Ploče su isprane dva puta sa 200 μL of FACS pufera (PBS, 5 % FCS, 2 mM EDTA) centrifugiranjem 2 min na 4°C na 1350 x g. Supernatanti su odliveni i ćelije su resuspendovane u 100 mL FACS pufera koji sadrži 8 % humani serum (InVitromex, Kat. br. S4190) i inkubirane 10 min. Nakon dva ispiranja dodate su varijante anti-humanih CD40 sa izmenjenim Fc u 50 μL FACS pufera sa 1 % humanim serumom počev od koncentracije 10 μg/mL u razblaženju 1:2. Ćelije su inkubirane tokom 30 min na ledu i nakon toga dva puta isprane. U svako polje je dodato 50 μL poliklonskog kunećeg anti-humanog IgG FITC, F(ab’)2 (DAKO, Kat. br. F 0315) i inkubirano tokom 30 min na ledu. Nakon kraja inkubacije ćelije su isprane dva puta, resuspendovane u 100 μL FACS pufera i fluorescenca je očitana na FACS Cantoll.

[0211] Nakon čitanja uzoraka, obradom u programu FloJo očitan je srednji intezitet fluorescence FITC kanala. Grafička i matematička obrada podataka (curve-fitting) je izvedena pomoću programa GraphPad Prism 5.0. Zbog promena inteziteta između pojedinačnih eksperimenata, dobijene vrednosti su normalizovane. Zbog toga je najveća vrednost svake serije testiranih antitela smatrana kao 100%. U obradi rezultata fitovanje koeficijenta nelinearne funkcije (krive) je urađeno sa vrednostima procenata.

5. Test CD40L- posredovane produkcije citokina od strane dendritskih ćelija monocitnog porekla (MoDCs)

5.1 Priprema humanih dendritskih ćelija monocitnog porekla

[0212] Humane PBMC su pripremljene iz humanih koncentrovanih ćelijskih elemenata ukupne periferne krvi (buffy coats) dobijenih od švajcarskog Crvenog krsta. Ćelije su razblažene 1:5 u PBS (Invitrogen, kat. br. 20012019) i raspoređene u Falcon-ove epruvete od 50 mL u zapremini od 35 mL. Ćelije su nakon toga postavljene na gradijent, dodavanjem 13 mL gradijenta Ficoll (GE Healthcare, kat. br.171440-02) ispod ćelija u svakoj epruveti. Ćelije su centrifugirane na 1680 x g na sobnoj temperaturi (RT) tokom 20 min bez kočenja. Sakupljen je sloj u kome su se nalazile PBMC i ćelije su isprane dva puta u velikoj zapremini PBS tokom 5 min na 1000 x g. Konačno, ćelije su resuspendovane u 10 mL PBS i izbrojane.

[0213] Humani monociti su izolovani kao „negativna frakcija“ iz 100 x 10<7>PBMC korišćenjem Miltenyi-jevog kita II za izolaciju humanih monocita (Miltenyi, Nemačka, kat. br.130-091-153) na magnetu AutoMACS prema instrukcijama proizvođača. Nakon izolacije ćelije su isprane dva puta tokom 5 min na 1000 x g na 4°C u medijumu za kultivaciju (RPMI1640 (Invitrogen, kat. br. 61870010), 10 % FCS (Invitrogen, kat. br.16000044, SAD porekla), 1 mM natrijum piruvat (Invitrogen, kat. br. 11360039), 1 x NEAA (Invitrogen, kat.br. 11140035) 1 x penicilin/streptomicin (Invitrogen, kat. br. 15140122)). Izolovani monociti su izbrojani, postavljeni u ploču sa 6 mesta u koncentraciji od 0.4 x 10<6>/mL i kultivisani tokom sedam dana na 37°C, 5 % CO2. U cilju diferentovanja monocita u dendritske ćelije u medijum za kultivaciju na početku kultivacije su dodati rekombinantni humani IL-4 [80 ng/mL] i humani GM-CSF [100 ng/mL] (oba napravljena u našim laboratorijama).

5.2 Stimulacija produkcije citokina od strane dendritskih ćelija (DC)

[0214] Nezrele DC (iDC) su sakupljene nakon 7 dana kultivacije iz ploča sa 6 mesta, ispiranjem polja, spajanjem ćelija iz svih polja i ispiranjem sakupljenih ćelija dva puta tokom 5 min na 1400 x g u medijumu za kultivaciju. Sledstveno, 2 x 10<5>iDC su postavljene u ploče sa ravnim dnom od 96 mesta (Becton Dickinson, kat. br.353072) u 100 µL. Za pozitivnu kontrolu ćelije su stimulisane sa MegaCD40L (Alexis, kat. br. ALX-522-110-C010) u koncentraciji od 1 µg/mL, dok su negativnu kontrolu činile iDC kultivisane samo u medijumu. U testu za procenu antagonističke aktivnosti, varijante anti-humanih CD40 antitela sa izmenjenim Fc su dodate u koncentraciji od 10 µg/mL u razblaženju 1:2 zajedno sa 1 µg/mL MegaCD40L za određivanje dozne zavisnosti. Supernatanti stimulisanih ćelija su sakupljeni 24 h kasnije u cilju merenja produkcije TNFα. U testu za procenu agonističke aktivnosti su dodate jedino varijante antihumanih CD40 antitela sa izmenjenim Fc u koncentraciji od 10 µg/mL u razblaženju 1:2 i supernatanti su sakupljeni nakon 48 h za merenje produkcije TNFα. U svim testovima, ćelije su postavljene i stimulisane u triplikatima kulture.

5.3 Merenje TNF alfa primenom ELISA-e

[0215] Da bi izmerili količinu TNFα u supernatantima, urađena je ELISA na sledeći način. Anti-TNFα „hvatajuće“ antitelo (BD Pharmingen, kat. br. 551220) je naneto, u cilju oblaganja, u ELISA ploče (Greiner, Nunc F96 Maxisorp, kat. br.442404) u koncentraciji od 5 µg/mL u 50 µL po polju ploče, preko noći, na 4°C. U svakom koraku ispiranja ploče su isprane 3 x sa 250 µL u ispiraču za ploče BioTek ELx 405. Posle prvog ispiranja, ploče su inkubirane sa 200 µL Superblock TBS (Thermo Scientific, Pierce, kat. br.37535) tokom 1 h na 37°C. Zatim su dodati TNFα standard (rekombinantni humani TNFα, R&D Systems, kat. br.210-TA) ili uzorak u 25 µl. Standard je postavljen u seriji 1:2 razblaženja počev od startne koncentracije od 20 ng/mL finalno. Dalje, 25 µL detektujućeg antitela (anti-humani TNFα biotin, BD Pharmingen, kat. br.

554511) je dodato u razblaženju 1:500. Ploče su inkubirane preko noći na 4°C. Nakon ispiranja, avidin-POD konjugat (ExtrAV alkalna fosfataza, Sigma, kat. br. E-2636) je razblažen 1:5000 u Superblock TBS, dodat u 50 µL i inkubiran tokom 1 h na RT. Ploče su isprane i dodato je 50 µL supstrata p-nitrofenilfosfata (Sigma, kat. br. C-3041) za razvijanje reakcije tokom 15 min. ELISA ploče su očitane na 450 nm pomoću softvera SoftMax Pro na SpectraMax M5 (Molecular Devices).

6. Toksikološka studija

[0216] Primarna inicijalna svrha toksikoloških studija je bila da se ispita potencijalna toksičnost visoke doze (100 mg/kg) mAb1 u poređenju sa Chir12.12.

[0217] Trideset cynomolgus majmuna sa Mauricijusa su korišćeni u ovoj studiji. Na početku doziranja, životinje su bile stare približno 4 do 5 godina i njihova težina je iznosila 4.5 do 6.6 kg za mužjake i 3.1 do 4.3 kg za ženke.

[0218] mAb1 (50 mg/mL) je dato intravenski jednoj grupi cynomolgus majmuna (5 mužjaka/5 ženki; grupa 2) u dozi od 100 mg/kg i zapremini od 2 mL/kg jednom nedeljno tokom 5 nedelja (u danima 1, 8, 15, 22, 29, i 36). Dodatna grupa cynomolgus majmuna (5 mužjaka/5 ženki; grupa 3) primila je roditeljsko antitelo Chir12.12 intravenski u sporoj bolus infuziji u dozi od 100 mg/kg i zapremini od 5 mL/kg. mAb1 placebo u zapremini doze od 2 mL/kg je dato drugoj grupi cynomolgus majmuna koja je predstavljala kontrolu (5 mužjaka/5 ženki; grupa 1). Obdukcija svih životinja je urađena jedan ili dva dana nakon primanja poslednje doze.

[0219] U cilju procene efikasnosti oba anti-CD40 antitela, odlučeno je da se uradi imunizacija sa hemocijaninom iz morskih puževa (Keyhole Limpet Hemocyanin - KLH). Drugog dana životinje su imunizovane sa 1 mg KLH u alumu nakon čega je sledila buster injekcija od 0.5 mg KLH u alumu 23. dana. Serum je sakupljan pre imunizacije/bustera kao i 7. i 14. dana nakon imunizacije, odnosno bustera. KLH specifični IgM/IgG titri su određeni pomoću ELISA testova korišćenjem anti KLH IgM/IgG referentnog seruma cynomolgus majmuna kao standarda. Krv je sakupljena u 3 navrata pre doziranja i posle, u danima 15, 29 i u momentu obdukcije (dan 37/38) za imunofenotipizaciju naivnih B ćelija (CD20+CD21+CD27-). Apsolutni brojevi naivnih CD20 B ćelija su izračunati iz ukupnog broja limfocita u uzorku krvi i relativnog broja naivnih CD20 B ćelija određenog pomoću protočne citometrije.

Tabela 4: Sažetak toksikološke studije

* Na osnovu poslednjih izmerenih podataka o individualnoj telesnoj težini

[0220] Procena toksičnosti je bazirana na smrtnosti, kliničkim zapažanjima (kliničkim znacima uključujući zapažanja nakon aplikacije doze, evaluaciji fecesa, pregledu krzna i uzimanju hrane), telesnim težinama, oftalmološkim pregledima, kardiovaskularnim ispitivanjima, kliničkoj patologiji (uključujući koagulaciju, ispitivanja spoljašnje aktivacije trombocita, hematologiju, kliničku hemiju i analizu urina), težini organa i makroskopskim i mikroskopskim nalazima na obdukciji. Imunofenotipska analza krvi je urađena tri puta pre doziranja, u 15 i 29 danu u periodu doziranja kao i na dan žrtvovanja. Osim toga, imunofenotipizacija tkiva slezine i drenirajućih limfnih čvorova sa mesta ubrizgavanja hemocijanina iz morskih puževa (KLH) je urađena na obdukciji. Zatim, ispitan je T-zavisni humoralni odgovor (produkcija antitela) (TDAR) na KLH da bi se direktno uporedilo delovanje Chir12.12 antitela koje indukuje potpunu ADCC reakciju sa delovanjem mAb1. Krv je sakupljena iz svih životinja za evaluaciju tokisikokinetičkih parametara i za procenu prisustva mogućeg anti-lek-antitela (ADA).

7. Dodatno in vitro profilisanje mAb1

7.1 Prečišćavanje PBMC

[0221] Mononuklearne ćelije periferne krvi su pripremljene kako je prethodno opisano u odeljku 1.1.

7.2 Prečišćavanje B ćelija iz humane tonzile

[0222] Uklonjena je kapsula i vezivno tkivo tonzile i ostatak tonzilarnog tkiva je iseckan u parčiće veličine oko 5 mm pre nego što je izgnječen kroz metalnu mrežicu za ćelije, uz ispiranje medijumom za B ćelije. Tonzilarne ćelije su potom dva puta filtrirane kroz mrežicu za ćelije promera 70 μM da bi se uklonio ćelijski „otpad“. B ćelije su izolovane iz svežih PBMC korišćenjem kita za izolaciju obogaćene frakcije B ćelija u negativnoj frakciji - EasySep Negative Selection Human B cell Enrichment Kit (Stemcell Technologies, Vankuver, BC, Kanada). B ćelije su prečišćene korišćenjem EasySep Negative Selection Human B cell Enrichment Kit- a prema uputstvima proizvođača (Stemcell Technologies, Vankuver, BC, Kanada).

7.3 Procena EC50 vrednosti vezivanja CD40 korišćenjem PBMC ili B ćelija humanog porekla ili porekla ne-humanih primata

[0223] PBMC (rhesus, cynomolgus ili humane) ili B ćelije iz tonzila (samo humane) su inkubirane na 4°C tokom 30 min sa purifikovanim obeleženim mAb1 ili antitelima izotipske kontrole u opsegu dozne zavisnosti (opseg finalne koncentracije 2.5 μg/ml - 0.00125 μg/ml). Ćelije su sledstveno isprane pre nego što su inkubirane sa anti-humanim (unakrsno reaktivnim sa ne-humanim primatima) i biotinom-obeleženim anti-humanim IgG antitelom sa minimalnom unakrsnom reaktivnošću sa NHP (R10; notirati da je moguće razlikovati humane B ćelije koje ispoljavaju membranski IgG ili uključivanjem anti-IgM bojenja ili posredstvom različitog inteziteta FACS obeležavanja). Ćelije su ponovo inkubirane na 4°C tokom 30 min pre nego što su isprane i podvrgnute finalnom obeležavanju primenom streptavidin- FITC-a tokom 20 min na 4°C. Sledstveno, ćelije su isprane i ekspresija CD40 je procenjena na CD20+ ćelijama pomoću protočne citometrije.

7.4 Procena inhibicije CD154- indukovane proliferacije PBMC ili B ćelija humanog porekla ili porekla ne-humanih primata

[0224] Napravljena je serija dvostrukih razblaženja za krivu dozne zavisnosti sa sedam tačaka, svakog anti-CD40 antitela ili monoklonskog antitela izotipske kontrole u triplikatima i postavljena u ploče sa 96 mesta u prisustvu EC80 koncentracija humanog rekombinantnog CD154 i IL-4. Startne koncentracije svakog anti-CD40 mAb su bile u opsegu od 20 μg/ml do 100 μg/ml u zavisnosti od eksperimenta. Ćelijske i medijumske kontrole su korišćene kao negativne kontrole u svim eksperimentima. PBMC (rhesus, cynomolgus ili humane) ili tonzilarne B ćelije (samo humane) su sledstveno dodate u svako polje ploče nakon čega su ploče inkubirane tokom 3 dana na 37°C / 5 % CO2.<3>H-timidin (1 μCi/50μl/polju) je dodat u svako polje ploče u finalnih 6 časova kultivacije pre „skidanja“ kulture i određivanja ugradnje timidina korišćenjem scintilacionog brojača.

8. Efikasnost mAb1 u kombinaciji sa ciklosporinom A u alo-transplantaciji bubrega na modelu cynomolgus majmuna

8.1 Životinje

[0225] Svi korišćeni cynomolgus majmuni (Macaca fascicularis) su bili mužjaci starosti 7.5 - 9 godina (#5529/ #5533, #5523/#5524 i #5536/#5538), odgajani u zarobljeništvu, težine 7.7± 0.9 kg i poticali su sa Filipina (Siconbrec, Makati City, Filipini). U momentu transplantacije, životinje su imale normalnu hematološku sliku, biohemiju serum-a/urin-a i bile su negativne u ispitivanjima na prisustvo tuberkuloze, prisustvo salmonele/šigele, prisustvo antitela specifičnih za virusne agense (herpes B, simian virus leukemije T-ćelija, simian virus imunodeficijencije, simian tip D retrovirus, hepatitis B) i za relevantne ekto/endoparazite. Međutim, sve životinje su imale antitela prema citomegalovirusu i hepatitis A virusu (HAV) (testirano 2010 godine; životinja #5536 je bila negativna na HAV). U decembru 2010. koprološki test životinje #5523 je bio pozitivan za prisustvo Balantidium coli.

[0226] Tokom prve post-operativne nedelje, životinje su držane u pojedinačnim telemetrijskim kavezima koji su omogućavali vizuelni kontakt sa drugim jedinkama. Ostatak vremena, životinje #5536/#5538 su držane zajedno i 4 preostale životinje su držane izolovano tokom čitavog eksperimenta (nekompatibilne životinje). Sve životinje su držane pod održavanom temperaturom (20-24°C), vlažnošću od najmanje 40% i prirodnim ciklusom svetlosti. Sve životinje su hranjene najmanje dva puta dnevno mešavinom voća i povrća. Voda i briketirana hrana Kliba Nafag 3446 (Kaiseraugst, Nemačka) je obezbeđena ad libitum.

[0227] Svi eksperimenti su sprovedeni prema Švajcarskim propisima o dobrobiti životinja i uz dozvolu BS1555.

T l : K r k ri ik živ in

8.2 Eksperimentalni uslovi

8.2.1 Transplantacija bubrega i postoperativno praćenje

[0228] Parovi davalac/primalac su izabrani na osnovu kompatibilnosti ABO, DRB egzon2 nekompatibilnosti (Blancher A, Tisseyre P, Dutaur M, i sar. (2006) Immunogenetics; 58(4):269-82) i odgovora u jednosmernoj reakciji pomešanih limfocita (MLR), u kojoj su indeksi stimulacije MLR (MLR-Sl) >7 i <47 (Bigaud M, Maurer C, Vedrine, i sar. (2004) J. Pharmacol. Toxicol. Methods; 50(2):153-9). Rezultati ove selekcije su prikazani na Tabeli 6 i predstavljaju dvojne transplantacije (razmene transplantata između dva davaoca). Svakom primaocu je implantirana telemetrijska proba (sonda) (Data Sciences Inc, SAD) za praćenje arterijskog krvnog pritiska, otkucaja srca i motorne aktivnosti.

[0229] Opšta anestezija za operaciju je indukovana ketaminom; 10 mg/kg, intramuskularno, (i.m.) zajedno sa atropinom (0.05 mg/kg i.m.) i održavana ventiliranjem sa N2O/O2 (50:50) i propofolom intravenski (i.v.) (4-10 mg/kg/h; dopunjenim bolusom od 5-10 mg kada god je bilo neophodno). Bubrezi davaoca su uzeti, isprani hladnim (4°C) rastvorom Univerziteta u Viskonsinu (vreme hladne prezervacije ≤ 4 časa) i transplantirani heterotopično, korišćenjem standardnih mikrovaskularnih tehnika u kreiranju anastomoza po tipu „kraj sa stranom“ (endto-side) između renalne vene grafta i vene kave primaoca i između renalne arterije grafta i distalne aorte primaoca (vreme anastomoza ≤ 40 minuta). Uretero-cistoneostomija je izvedena nakon pojave urina iz grafta. Prirodni bubrezi su uklonjeni. Post -operativna analegezija je obezbeđena primenom bufenorfina, 0.01- 0.02 mg/kg, i.m., tri puta dnevno; antibiotici (cefotaksim, 25 mg/kg, i.m., dva puta dnevno ili ceftriakson, 50 mg/kg, i.m. u 1% lidokainu, četiri puta dnevno). Analgezija i antibiotici su obezbeđeni tokom 5 dana. Kada god je broj trombocita značajno porastao ili pao, davan je aspirin u dozi od 5 mg/kg i.m. dnevno (Aspegic, Sanofi-Aventis, Meyrin, Švajcarska).

[0230] Kod primaoca su praćene promene u kliničkom stanju i kardiovaskularnim pokazateljima, telesna težina, uzimanje hrane i vode (dopunjeni do maks. 100-150 ml/kg/dnevno), produkcija urina, hematologija (korišćenjem Beckmann Coulter ACT5Diff), biohemijski parametri u serumu i urinu (korišćenjem Vetscan analizatora za dnevno određivanje SCrea/SUrea/SAmilaze i Beckmann Synchron CX5 analizatora za finalnu konfirmaciju uzoraka seruma i urina). Kreatinin u serumu (SCrea) i nivoi uree (SUrea) su korišćeni kao pokazatelji funkcije grafta. Transkutane ultrazvučno- vođene biopsije su izvedene sa iglama promera 16G, kao što je ranije opisano (Gaschen L, Kunkler A, Menninger K, i sar. (2001) Vet. Radiol. Ultrasound; 42(3):259-64), pod opštom anestezijom na dan 30 (jedino životinje #5529 i #5533). Dodatno, izvedeno je i specijalno praćenje za koagulabilnost krvi i agregaciju trombocita u životinjama #5529/#5533 i #5523/#5524 pre i nakon transplantacije. Primaoci su na kraju eutanazirani u slučaju (i) teške insuficijencije grafta (npr. Screa >500 μmol/l ili Surea >20 mmol/l) povezanog ili ne sa propratnim (povećanim) ultrazvučnim skorom ili, (ii) opštih zdravstvenih problema i/ili kliničkih znakova opasnosti. Na obdukciji su sakupljeni alograftovi bubrega (uključujući ureter i anastomoze), zajedno sa svim drugim ključnim organima i pripremljeni za sledstvenu histološku analizu.

Tabela 6: Opšte informacije o kombinacijama davalac/primalac i primenjenim protokolima lečenja

8.2.2 Tretmani mAb1 i ciklosporinom A (CsA)

[0231] mAb1 je obezbeđeno u tečnom obliku i sveže je odmrznuto sa -80°C na dan infuzije. Davano je jednom nedeljno 30 mg/kg/i.v., osim prve tri doze koje su date u danima -1, 0 i 1 (pre- i post-transplantaciono). CsA za oralnu primenu (p.o.) je bio u obliku prekoncentrovane mikroemulzije (Sandimmun Neoral (RTM) rastvor za pijenje, 100 mg/ml, Novartis Pharma AG). CsA je primenjen u dnevnoj dozi (počev od dana -1) u koncentraciji 20 mg/kg/p.o., u kombinaciji sa mAb1 (videti Tabelu 6).

8.2.3 Praćenje farmakokinetike (PK), imunogenosti (primat anti-humano antitelo) i farmakodinamike (PD) mAb1

[0232] Uzorci krvi (500 μl seruma) su sakupljeni (pre i.v. doziranja) za određivanje prisustva mAb1 u danima -1, 3, 7 (bazalni nivo i 15 min), 14, 28, 42, 56, 70, 84 i 100. Za određivanja CsA, uzorci krvi su sakupljeni pre oralnog doziranja ili CsA (C0/C24) i 2 časa nakon aplikacije (C2). C2 odgovara maksimalnim nivoima apsorpcije CsA. Svi uzorci su uskladišteni na -80°C i čuvani do dalje obrade (CsA kit za detekciju, Hot Star Taq Master Mix, Qiagen Minnesota, SAD). Uzorci za određivanje imunogenosti mAb1 su sakupljeni (50 μl seruma) u danima -1, 7, 14, 28, 42, 56, 70, 84 i 100 i držani zamrznuti na -80°C. Ukratko, mikrotitarske ploče sa devedeset šest mesta su obložene sa rekombinantnim humanim CD40. Ploče su držane na 4°C nominalno preko noći. Nakon blokiranja ploča, u ploču su dodati kalibracioni standardi (Cs), uzorci za kontrolu kvaliteta (QC) i uzorci za testiranje koji sadrže mAb1. Ploča je inkubirana na 25°C nominalno tokom 120 minuta uz mućkanje. Nakon ispiranja ploče, u ploču su dodati mišje antitelo specifično za humani kapa laki lanac i nakon njega konjugat HRP koziji anti mišji (H+L) u cilju detekcije bilo kog mAb1 vezanog za rekombinantni CD40. Reakcija je vizualizovana dodatkom hromogenog supstrata (TMB) a intezitet produkovane boje (absorbanca) je bila direktno proporcionalna koncentraciji prisutnog mAb1. Koncentracija mAb1 u uzorcima je nakon toga izračunata pomoću kalibracione krive. Uzorci za PD su dobijeni na 2-3 dana pre transplantacije kao bazalni nivo (0.5 ml u heparinu). Posle toga, uzorci za PD su prošli istu proceduru kao i uzorci za PK. CD20+ i CD3+ ćelije su brojane korišćenjem TruCount epruveta (Becton Dickinson, kat# 340334) prema uputstvima proizvođača uz korišćenje anti-humanog CD40-APC mAb (Klon 5C3, Becton Dickinson, kat# 555591) i antihumanog CD3-PerCP (Klon SP34-2, Becton Dickinson, kat# 552851) i anti-humanog CD20-FITC mAb (Klon LT20, Immunotools, kat# 21279203X2). Podaci su dobijeni korišćenjem LSRII protočnog citometra (Becton Dickinson Biosciences) primenom DIVA (verzija 6.1.1) softvera. Limfociti i kuglice su „gejtovani“ u FSC/SSC dvoparametarskom histogramu (dot blot) u kome se ćelije grupišu prema veličini i granuliranosti i dalje je analizirana ekspresija CD20 i CD3 molekula na selektovanim ćelijama.

8.2.4 Histologija

[0233] Sva sakupljena tkiva (bioptati grafta ili tkiva dobijena na obdukciji) su makroskopski ispitana i fiksirana u 4% puferovanom formalinu. Nakon dehidracije, tkiva su ukalupljena u parafinski vosak.

[0234] Preseci debljine tri μm su isečeni iz parafinskih blokova i obojeni hematoksilinom i eozinom (HE). Izvršena su tri dodatna bojenja preseka tkiva bubrega (perjodna kiselina Schiffovo bojenje, trihromno bojenje i Verhoeff-ovo bojenje). Uzorke sa biopsije i obdukcije je pregledao iskusan patolog i skorirao prema kategorijama klasifikacije patologije alografta bubrega Banff 07 (Solez K, Colvin RB, Racusen LC, i sar. (2008) Am. J. Transplant; 8(4):753-60). Takođe, dobijini rezultati su provereni od strane eksternih eksperata kontrolora.

[0235] Dodatno, imunohistohemijska analiza prisustva komplementnog proteina C4d je urađena primenom polivalentnog anti-C4d antitela pogodnog za bojenje parafinskih preseka (Regele H, Exner M, Watschinger B, i sar. 2001, Nephrol. Dial. Transplant; 16: 2058-2066). C4d se smatra stabilnim i pouzdanim markerom akutnog humoralnog odbacivanja (AHR). Nakon fiksacije i ukalupljavanja u parafinski vosak, pripremljene su staklene pločice (SuperFrostPlus, RTM, Menzel-Glaeser, Nemačka) sa presecima tkiva debljine 3 μm i osušene preko noći u pećnici na 37°C za optimalno prijanjanje tkiva za pločice. Kao pozitivna kontrola dodati su preseci tkiva odbačenih humanih bubrega. Pre upotrebe pločice su deparafisane u ksilenu (10 min), rehidrirane provlačenjem kroz gradijent etanola i stavljene u destilovanu vodu. Demaskiranje antigena je izvršeno kuvanjem pod pritiskom tokom 10 min na 1 bar u citratnom puferu (pH 6.0) kao što je ranije opisano (Segerer S, Mack M, Regele H, Kerjaschki D, Schlöndorff D. Kidney Int. 1999; 56: 52-64). Za imunobojenje je korišćena sledeća procedura: (i) inaktivisati endogenu peroksidazu pomoću 0.5% H2O2 u apsolutnom metanolu tokom 20 min na sobnoj temperaturi; (ii) isprati pločice u 0.01 M PBS, pH 7.4 (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Nemačka); (iii) inkubirati pločice sa 4% mlekom u prahu bez masnoća "Rapilait" u PBS, (Migros Genossen-schaftsbund, Švajcarska) tokom 60 min na sobnoj temperaturi; otresti pločicu, ne ispirati; (iv) inkubirati jednu pločicu sa pAb kunećim antihumanim C4d (Biomedica Medizinprodukte, Vienna, Austrija) 1:40 u PBS koji sadrži 1% NGtS preko noči na 4°C. Na drugu pločicu je stavljena kuneća izotipska kontrola (Zymed Laboratories Inc, USA) umesto primarnog antitela i ona služi kao negativna kontrola; (v) isprati pločice u 0.01 M PBS , pH 7.4; (vi) inkubirati sve pločice sa kozjim anti-kunećim IgG obeleženim biotinom(Vector Laboratories, Inc. SAD) 1:200 u PBS koji sadrži 1% NGtS tokom 30 min na sobnoj temperaturi; (vii) isprati pločice u 0.01M PBS, pH 7.4; (viii) inkubirati sa streptavidin/HRP (Vector Laboratories, Inc. SAD) u PBS tokom 30 min na sobnoj temperaturi, (ix) razviti HRP aktivnost sa AEC+ (DakoCytomation Corp., Carpenteria, SAD) tokom 8-10 min, kontrolisati intezitet bojenja gledanjem pločice pod mikroskopom, isprati u destilovanoj vodi, (x) kontrastirati sa Dako (RTM) Automation Hematoxylin-om (DakoCytomation Corp., Carpenteria,SAD) tokom 2 min i pod tekućom vodom tokom 5 min da bi se pojavila plava boja; (xi) montirati preparat pomoću medijuma za montiranje koji se rastvara u vodi (Medite Medizintechnik AG, Švajcarska).

Primer 1: Procena agonističke aktivnosti mAb1, mAb2 i mAb3

[0236] Eksperimentalni podaci su bazirani na korišćenju izolovanih, nefrakcionisanih primarnih humanih PBMC. Ukupne ćelije PBMC (umesto prečišćenih B ćelija ili monocita) mnogo bolje imitiraju situaciju in vivo gde anti-CD40 mAb može imati višestruke direktne i indirektne efekte na različite tipove leukocitnih ćelija. Korišćenjem ovog testa proliferacije PBMC utvrđeno je da su aglikozilovana anti-CD40 monoklonska antitela (mAbs) mAb1 (N297A) i mAb2 (D265A), koja su zadržala nepromenjenu aminokiselinsku sekvencu antigen-vezujućeg dela roditeljskog Chir12.12 antitela, zadržala ne-agonistička, CD40L -blokirajuća svojstva roditeljskog Chir12.12 mAb. Antitelo mAb3 (LALA mutant) je bilo slabo agonističko u prisustvu IL-4.

[0237] Posebno, eksperimentalni podaci pokazuju da nijedno od anti-CD40 mAbs sa utišanim Fc fragmentom nije sposobno da stimuliše deobu humanih PBMC ćelija (n = 4 davaoca), rezultat sličan onom koji je zapažen u testu sa roditeljskim Chir12.12 mAb (videti Sliku 1). PBMC su proliferisale u odgovoru na CD40L. Ni mAb1 ni mAb2 nisu mogli da povećaju CpG2006- indukovanu ili anti-IgM F(ab’)2 - indukovanu proliferaciju PBMC (Slika 2). Dodatno, Chir12.12 antitelo nije uspelo da poveća anti-IgM F(ab’)2 -indukovanu proliferaciju PBMC, iako je za razliku od mAb1 i mAb2, Chir12.12 antitelo potpuno inhibiralo CpG- indukovanu proliferaciju PBMC.

[0238] Zapaženo je da mAb3 (LALA mutacija), u prisustvu IL-4, indukuje niske ali reproducibilne (n = 4 davaoca) nivoe ugradnje timidina, iznad onih koje indukuje sam IL-4, dok mAb1, mAb2 i Chir12.12 antitela ovo ne čine (Slika 3). Sveukupno, ovi rezultati su ukazali da, sa izuzetkom mAb3 (u prisustvu IL-4), ni jedno od anti-CD40 mAbs nije posedovalo agonističku aktivnost.

[0239] Rezultati opisani u napred navedenom delu ovog teksta takođe jasno pokazuju da mAb1 i mAb2 nemaju agonističku aktivnost u prisustvu kostimulacijskih signala. Ovo je važan nalaz jer je verovatno da leukociti pacijenata koji imaju hroničnu autoimunsku bolest mogu imati aktivisani ili delimično aktivisani fenotip i zbog toga mogu biti osetljivi na signalizaciju preko CD40 ili drugog stimulusa. Zapaženo je da je Chir12.12 antitelo (ali ne i mAbs sa utišanim Fc ili CD40L) kompletno inhibiralo proliferaciju PBMC indukovanu delovanjem CpG2006. CpG2006 je sintetički ligand za receptor 9 sličan Toll-u (TLR9), receptor za koga je pokazano da vezuje patogen i jednolančanu DNK (ssDNK) koja potiče od domaćina. Kod ljudi, TLR9 je ispoljen na B ćelijama i (u manjem stepenu) monocitima u perifernoj krvi. Kako je prethodno pokazano da CpG koji sadrži ODN pojačava ADCC reakciju (Moga, i sar., 2008), može se spekulisati da je CpG2006 sposoban da pojača ADCC reakciju posredovanu delovanjem germinativnog Fc IgG1 dela roditeljskog Chir12.12 mAb.

Primer 2: Procena sposobnosti anti-CD40 mAbs sa utišanim Fc da blokiraju CD40L-posredovanu proliferaciju PBMC

[0240] Prethodni podaci ukazuju da Chir12.12 može blokirati CD40L- posredovanu proliferaciju primarnih humanih B ćelija i ćelijskih linija limfoma humanih B ćelija. Merili smo inhibiciju CD40L- posredovane proliferacije PBMC do koje dovode Chir12.12 i tri antitela prema ovom pronalasku mAb1, mAb2, mAb3. Tabela 7, u narednom delu teksta, prikazuje IC50 vrednosti za svaku inhibiciju izražene u μg/ml (rezultati su prikazani kao srednje vrednosti triplikata kultura sa SEM i predstavljaju rezultate 4 davaoca, nezavisni eksperimenti). Rezultati pokazuju da Chir12.12 takođe može da inhibira CD40L- posredovanu proliferaciju PBMC. Dodatno, mAb1, mAb2 i mAb3 takođe kompletno blokiraju CD40L- posredovanu deobu PBMC potentnošću sličnom onoj koju ima Chir12.12. Ni jedno od anti-CD40 mAbs ne blokira proliferaciju PBMC indukovanu delovanjem anti-IgM IL-2 (podaci nisu prikazani) što ukazuje da blokirajuća aktivnost anti-CD40 mAbs zavisi od mete (cilja) delovanja (i nije povezana sa Fc funkcijom).

Tabela 7: IC50 vrednosti ( μg/ml) za anti-CD40 mAb- indukovanu inhibiciju CD40L–

posredovane proliferacije PMBC.

Primer 3: Vezivanje varijanti anti-humanog CD40 antitela za humanu BJAB ćelijsku liniju

[0241] U cilju isključenja mogućih promena u specifičnom vezivanju za CD40, testirano je vezivanje tri varijante mAb1, mAb2 i mAb3 u poređenju sa roditeljskim Chir12.12 na B ćelijskoj liniji, BJAB, koja konstitutivno ispoljava CD40. Vezivanje je testirano u opsegu titracije doze počev od 10 μg/ml u razblaženju 1:2.

[0242] Da bi uporedili rezultatske krive iz različitih eksperimenata, najveća srednja vrednost (medijana) inteziteta fluorescence svake pojedinačne titracije doze je uzimana kao 100% vezivanje, a modelovanje eksperimentalnih podataka je urađeno prema formuli za nelinearnu krivu. U dva odvojena eksperimenta sve četiri varijante antitela Chir12.12, mAb1, mAb2 i mAb3 su pokazale ekvivalentne krive vezivanja za BJAB ćelije (Slika 5). Različite mutacije Fc vezujućeg regiona Chir12.12 nisu dovodile do promena u sposobnosti vezivanja testiranih varijanti antitela.

[0243] Prethodno navedeni rezultati su pokazali da mutacija Fc vezujućeg mesta nije uticala na mesto za vezivanje CD40 u varijabilnim regionima roditeljskog Chir12.12. mAb1, mAb2 i mAb3 antitela su zadržala sposobnost ekvivalentnog vezivanja za CD40 na BJAB ćelijama.

Primer 4: Stimulacija/inhibicija produkcije TNF alfa od strane humanih dendritskih ćelija monocitnog porekla pod uticajem varijanti anti-CD40 antitela sa izmenjenim Fc Stimulacija produkcije TNF alfa od strane humanih MoDC pod uticajem varijanti anti-CD40 antitela sa izmenjenim Fc

[0244] Za neka anti-humani CD40 antitela je pokazano da imaju agonističke efekte na populacije različitih ćelija (Gruber 1989). Da bi isključili mogućnost da varijante mAb1, mAb2, mAb3 sa izmenjenim Fc i Chir12.12 dovode do aktivacije MoDC, ispitali smo da li antitela sama po sebi indukuju oslobađanje TNFα kada se inkubiraju 48 h sa ćelijama. Nasuprot antagonostičkom testu, sedam dana stare humane MoDC su kultivisane 48 h jedino u prisustvu sve četiri varijante anti-CD40 u koncentracijama iz opsega dozne zavisnosti počev od 10 μg/mL. Sledstveno je u supernatantima kultura određivana količina TNFα primenom ELISA. Ni jedna od anti-CD40 varijanti mAb1, mAb2, mAb3 i Chir12.12 nije indukovala produkciju TNFα od strane MoDCs u poređenju sa CD40L -indukovanom stimulacijom kao pozitivnom kontrolom (rezultati nisu prikazani). Nije se mogla zapaziti dozna zavisnost testiranog odgovora sve četiri varijante antitela. Količine detektovanog TNFα nisu bile statistički iznad nivoa produkcije od strane nestimulisanih MoDC (rezultati nisu prikazani). Na osnovu ovih nalaza je agonistička aktivnost ova četiri antitela mogla biti isključena.

Inhibicija produkcije TNF alfa od strane humanih MoDCs pod uticajem varijanti anti-CD40 sa izmenjenim Fc

[0245] Roditeljsko antitelo Chir12.12 blokira interakciju CD40-CD40L i stoga bi trebalo da blokira i aktivaciju ćelije. Stimulacija CD40 na humanim dendritskim ćelijama monocitnog porekla pomoću CD40L trimera dovodi, na primer, do oslobađanja pro-inflamacijskih citokina kao što je TNFα (Ma 2009). Ponovimo, promene u Fc regionu ne bi trebalo da utiču na blokirajuću funkciju varijanti antitela u poređenju sa Chir12.12. Sva četiri antitela bi trebalo da inhibiraju CD40L- posredovanu produkciju TNFα od strane humanih MoDCs sa ekvivalentnim IC50.

[0246] Zbog toga su sedam dana stare humane MoDC stimulisane tokom 24h sa MegaCD40L, dvostrukim trimernim, rekombinantnim konstruktom u prisustvu sve četiri varijante blokirajućih anti-CD40 antitela. Sledstveno je testirana količina TNF α u supernatantima primenom ELISA. Sve varijante antitela sa mutiranim Fc, mAb1, mAb2 i mAb3, su pokazale istu dozno zavisnu inhibiciju kao Chir12.12 u tri nezavisna eksperimenta (rezultati nisu prikazani). Preliminarni rezultati takođe pokazuju sličnu inhibiciju produkcije IL-23 od strane humanih MoDC (rezultati nisu prikazani).

[0247] Za procenu IC50 sva četiri antitela primenjeno je fitovanje koeficijenata nelinearne funkcije (krive) i izračunata je prosečna vrednost za IC50 iz eksperimenata. Prosečna vrednost IC50 četiri varijante antitela za produkciju TNFα od strane humanih MoDC je bila u opsegu između 32 ng/mL i 40 ng/mL (Tabela 8). Ukratko, mutacije Fc regiona nisu uticale na antagonističke efekte varijanti antitela.

Tabela 8: IC50 različitih antitela sa variantama Fc za inhibiciu TNF alfa

[0248] IC50 u ng/mL za različita anti-humana CD40 sa varijantama Fc iz tri nezavisna eksperimenta. Fitovanje koeficijenata nelinearne funkcije (krive) u eksperimentu #1 za Chir12.12 nije dopustilo validnu procenu IC50 (n. c. = nije izračunato).

[0249] Napred navedeni rezultati su pokazali da su sve četiri varijante antitela neaktivne u indukciji produkcije TNFα od strane MoDC. Što je još važnije, sve varijante antitela mAb1, mAb2 i mAb3 inhibiraju CD40L- posredovanu produkciju citokina od strane humanih MoDC in vitro sličnom efikasnošću u poređenju sa Chir12.12.

Primer 5: Sažetak podataka

[0250] Tabela 9 koja sledi sumarno prikazuje neka od važnih svojstava antitela mAb1, mAb2 i mAb3 ovog pronalaska u poređenju sa roditeljskim antitelom Chir12.12.

Tabela 9: Uporedni podaci

Primer 6: Kratak opis korisnih aminokiselinskih i nukleotidnih sekvenci za praktičnu primenu ovog pronalaska

[0251]

Primer 7: Korisne aminokiselinske i nukleotidne sekvence za praktičnu primenu ovog pronalaska

[0252]

(nastavljeno)

nastavleno

(nastavljeno)

Primer 8: Toksikološki rezultati

[0253] Primarni cilj toksikološke studije je bio da odredi toksičnost mAb1, nakon intravenskog davanja (jednom nedeljno) ovog antitela cynomolgus majmunu tokom 5 nedelja (dato 6 test doza). Neizmenjena verzija ovog antitela (Chir12.12) (koja nije utišana i koja izaziva reakciju ADCC) je takođe korišćena da bi se uporedili efekti antitela koje dovodi do pune reakcije ADCC (aktivno antitelo) sa verzijom antitela (mAb1) koja izaziva utišanu ADCC (utišano antitelo).

[0254] Dodatno, životinje su imunizovane sa KLH da bi se procenila efikasnost oba anti-CD40 antitela.

[0255] Nije bilo mortaliteta ili promena u telesnim težinama, kliničkim znacima i procenjenoj količini pojedne hrane koje bi se mogle pripisati delovanju mAb1 ili Chir12.12. Lokalne reakcije na mestu aplikacije KLH su bile uporedive u svim grupama.

[0256] Takođe, nije bilo promena u oftalmološkim ili kardiovaskularnim nalazima koje bi se mogle pripisati delovanju primenjenih antitela.

[0257] U hematološkim nalazima zapaženo je malo ali statistički značajno smanjenje procenta i apsolutnih brojeva bazofila u životinjama koje su primile antitela mAb1 i Chir12.12: ne može se isključiti da je ovo smanjenje povezano sa tretmanom antitelima. Analiza urina je pokazala prisustvo ketona u urinu 1/5 mAb1- tretiranih ženki i 2/5 Chir12.12- tretiranih ženki pri čemu nije jasna povezanost ovog nalaza sa doziranjem. U rezultatma kliničke hemije zapažen je blag trend povećanja koncentracija lipaze u uzorcima Chir12.12- tretiranih mužjaka kao i kod jedne ženke tretirane sa Chir12.12, međutim smatra se da ovaj nalaz ima limitiran toksikološki značaj.

[0258] Tretman antitelima mAb1 ili Chir12.12 nije uticao na koagulaciju krvi, procenjeno na osnovu protrombinskog vremena, aktivisanog parcijalnog protrombinskog vremena i fibrinogena. Broj trombocita je bio u opsegu normalnih vrednosti. Koncentracije P-selektina ili sCD40L u plazmi nisu ukazivale na aktivaciju trombocita.

[0259] Rezultati imunofenotipizacije krvi životinja koje su primile Chir12.12 su pokazali prominentno smanjenje CD20<+>B-ćelija, što je bilo očekivano farmakološko delovanje ovog antitela. Posebno su aplikacijom Chir12.12 antitela bile depletirane CD20<slabo+>CD21<+>B-ćelije (za koje se smatra da su CD40<jako+>). Međutim, značajno su bile smanjene i CD20<jako+>CD21<->B-ćelije posebno u završnoj fazi studije. Preferencijalno su delovanjem ADCC-aktivnog Chir12.12 antitela (koje izaziva neumenjenu ADCC) bile depletirane CD20<+>CD21<+>CD27-naivne B-ćelije, dok su značajno bile bogođene i CD20<+>CD21<+>CD27<+>memorijske B ćelije. Takođe, u životinjama koje su primile Chir12.12 antitelo postojalo je približno smanjenje od 50% u apsolutnom broju CD16<+>NK ćelija. Kao što je i očekivano, nakon aplikacije ADCC-utišanog mAb1 antitela, nije zapaženo prominentno smanjenje CD20<+>B-ćelija niti je zapaženo bilo kakvo smanjenje u apsolutnim brojevima CD16<+>NK-ćelija. Jedine B ćelije koje su pokazale umerenu redukciju broja tokom doziranja su bile CD20<jako+>CD21<->B-ćelije. Poznato je da su ove ćelije, koje vode poreklo iz germinativnog centra, specifične za macaque majmune, tako da se ovaj nalaz ne smatra relevantnim za tumačenje u humanoj populaciji.

[0260] Imunofenotipizacijom ćelija slezine i KLH- drenirajućih limfnih čvorova na obdukciji je pokazana slična slika. Zapaženo je smanjenje relativnog broja CD20<+>B-ćelija kod životinja kojima je aplikovano Chir12.12, međutim, kod životinja kojima je aplikovano mAb1 nije zapažena relevantna redukcija CD20<+>B-ćelija ali jeste blaga do umerena redukcija CD21<->Bćelija (u limfnim čvorovima oba pola, slezini jedino kod mužjaka). Nije bilo razlika u rezultatima imunofenotipizacije ćelija desnog i levog limfnog čvora koji dreniraju mesto injektovanja KLH.

[0261] Analizom T- zavisnog humoralnog imunskog odgovora, odnosno produkcije antitela koja je zavisna od T ćelija (TDAR) pokazano je da, u poređenju sa kontrolnom grupom, u životinjama kojima su aplikovana mAb1 ili Chir12.12 antitela nije zapažen IgG i IgM odgovor na KLH. Kako je blokiranje aktivacije B ćelije koje nastaje nakon inhibicije interakcije CD40 -CD40 ligand ciljano farmakološko delovanje mAb1, i kako Chir12.12 deluje depletirajući B ćelije, ovaj nalaz (odsustvo IgG i IgM odgovora) se ne smatra relevantnim u toksikološkom smislu.

[0262] Toksikokinetskom evaluacijom je pokazano da su se minimalne koncentracije antitela u krvi povećale tokom trajanja sudije što ukazuje na akumulaciju mAb1 i Chir12.12. Srednje vrednosti minimalne koncentracije nakon četvrte i pete doze su bile slične, što je ukazivalo da je stanje nakon pete doze mAb1 i Chir12.12 blisko stanju dinamičke ravnoteže. Srednje vrednosti ekspozicije (oba pola) tokom doznog intervala (AUCT) nakon četvrte i pete doze su bile 906, odnosno 990 h.mg/mL, za mAb1, i 757, odnosno 751 h.mg/mL, za Chir12.12. I AUCT vrednosti su takođe bile takve da su išle u prilog viđenju da se nakon pete doze postižu uslovi bliski uslovima dinamičke ravnoteže.

[0263] Makroskopskim ispitivanjima nisu nađeni bilo kakvi dokazi toksičnog delovanja na ciljni organ, i težine organa su takođe bile unutar normalnog opsega vrednosti za ovu vrstu.

[0264] Mikroskopski, dobijeni su nalazi koji govore o delovanju oba testirana antitela u svim limfnim organima (slezini i limfnim čvorovima (mezenteričnim, mandibularnim, aksilarnim i ingvinalnim)), gde mAb1 i Chir12.12 dovode do kompletne supresije razvoja germinativnog centra u kortikalnim B-ćelijskim područjima. Obeležavanjem ćelija tkiva slezine i limfnih čvorova (drenirajućih i kontralateralnih) u regiji aplikacije KLH, primenom imunobojenja kojim se detektuje CD20, pokazana je redukovana veličina limfnih folikula u slezini kao i deplecija B ćelija u slezini i limfnim čvorovima, efekat koji je bio mnogo izraženiji u Chir12.12- tretiranim životinjama u poređenju sa životinjama koje su tretirane antitelom mAb1. Nalazi u germinativnom centru kod mAb1- tretiranih životinja odgovaraju redukciji CD21<->B-ćelija koja je viđena prilikom imunofenotipizacije. Imunobojenje ćelija koje ispoljavaju CD40 je pokazalo značajnu redukciju prisustva CD40 u limfnim čvorovima i slezini nakon tretmana bilo mAb1 bilo Chir12.12 antitelom.

[0265] U zaključku, na osnovu rezultata ove studije, intravensko davanje mAb1 ili Chir12.12 jednom nedeljno tokom 5 nedelja (6 davanja) u koncentraciji od 100 mg/kg mužjacima i ženkama cynomolgus majmuna je bilo dobro tolerisano. Imunofenotipizacijom je pokazana deplecija B ćelija u životinjama koje su tretirane Chir12.12 antitelom ali ne i životinjama koje su tretirane mAb1 antitelom sa izuzetkom CD21<->B ćelija, međutim, TDAR je pokazao odsustvo IgG i IgM reakcije nakon KLH imunizacije i u mAb1- tretiranim i u Chir12.12-tretiranim životinjama. Histopatološkim ispitivanjima je pokazan nedostatak germinativnih centara u slezini i limfnim čvorovima životinja koje su tretirane mAb1 antitelom i Chir12.12 antitelom. Efekti na B ćelije u željena farmakološka delovanja antitela i zbog toga se ne mogu smatrati štetnim. Smatra se da je najveći nivo primenjenog antitela bez primetnog štetnog efekta na normalne biološke funkcije (no-observable-adverse-effect level) (NOAEL) koncentracija od 100 mg/kg za oba antitela i mAb1 i Chir12.12 pod uslovima koji su postojali u ovoj studiji.

Primer 9: Dodatno in vitro profilisanje mAb1

[0266] Vezivanje i funkcionalna unakrsna reaktivnost mAb1, je ispitvana na leukocitima čoveka, Rhesus-a i Cynomolgus-a. Tabela 10 prikazuje direktno poređenje EC50 vezivanja mAb1 za leukocite iz sve tri vrste.

Tabela 10: Unakrsna reaktivnost mAb1 između humanog i NHP sistema

[0267] Antitelo mAb1 se vezuje za CD20<+>ćelije (B ćelije) sve tri ispitane vrste (primata i nehumanih primata) sa uporedivom EC50. Dodatno, mAb1 je moglo da inhibira proliferaciju humanih tonzilarnih B ćelija indukovanu delovanjem CD154+IL-4 kao i majmunskih PBMC izolovanih iz Cynomolgus-a i Rhesus-a. Sveukupno, ovi rezultati su ukazali da je sposonost mAb1 da se veže za CD40 i inhibira CD154- indukovanu proliferaciju humanih B ćelija ili proliferaciju PBMC ne-humanih primata bila vrlo slična. Dostupnost podataka o „zauzetosti“ receptora in vitro (RO) i podataka o funkcionalnoj inhibiciji omogućili su određivanje povezanosti između ove dve varijable za svaku vrstu (Tabela 11).

Tabela 11: Povezanost između mAb1 RO i funkcionalne inhibicije

[0268] Rezultati ukazuju da je neophodna približno 2-struko manja RO na Rhesus-ovim PMBC od strane mAb1 da bi se indukovala 50% inhibicija proliferacije PBMC u poređenju sa humanim B ćelijama. Kod humanih ćelija, puna inhibicija je mogla biti dobijena sa približno.75% (in vivo predviđanje) RO.

Primer 10: Transplantacijska studija

Preživljavanje grafta

[0269] Kombinovani tretman sa mAb1 (30 mg/kg i.v.) i ciklosporinom A, 20 mg/kg koji je davan oralno tokom alogene transplantacije bubrega imao je za posledicu značajno prolongiranje preživljavanja 6 životinja uključenih u studiju. Graftovi su bili funkcionalni tokom >91*, 31, >92*, >92*, >98* i >98* dana (srednja vrednost: >83.6 dana) u životinjama #5529 (91 dan), #5533 (31 dan), #5523 (92 dana), #5524 (92 dana), #5536 (98 dana) i #5538 (98 dana), (* završetak protokola). Preživljavanje netretiranih životinja (ili tretiranih sub-terapijskim IS-dozama) kretalo se u opsegu 7-10 dana (istorijski podatak).

[0270] Životinja #5533 je eutanazirana 31 dan nakon transplantacije zbog akutne bubrežne insuficijencije i anurije. Ova patologija se pojavila nakon održavanog perioda hipertenzije i anestezije koja je data zbog uzimanja uzoraka za biopsiju.

Praćenje nakon transplantacije (post-transplantacijsko)

(a) Koncentracije kreatinina u serumu (SCrea) i uree u serumu (Surea)

[0271] SCrea je glavni parametar koji se koristi za procenu funkcije bubrega. U svih 6 životinja, nivoi SCrea su bili povećani, iznad bazalnih nivoa, jedan dan nakon transplantacije (od 81.8 ± 14.6 do 221.5 ± 37.1 μmol/l). Ovakvo povećanje u koncentraciji SCrea je uobičajena odlika tokom prve nedelje nakon transplantacije (Tabela 12).

Tabela 12: Promene u SCrea zabeležene u primaocima NHP alografta bubrega koji su tretirani kombinovanom terapijom mAb1 (30 mg/kg) i CsA (20 mg/kg)

(nastavljeno)

[0272] Tokom prve nedelje, zabeleženi su brzi porasti koncentracija Surea iznad bazalnog nivoa izmerenog na dan 0 (4.5 ± 1.3 mmol/l) (Tabela 13). U životinjama #5529/#5533 i #5536/#5538, nivoi SUrea su bili 16-20 mmol/l (dan 3-5), dok su u životinjama #5523 i #5524 bili 9 mmol/l (#5523) ili 8 mmol/l (#5524) mmol/l (dan 7).

Table 13: Promene u SUrea zabeležene u primaocima NHP alografta bubrega koji su tretirani kombinovanom terapijom mAb1 (30 mg/kg) i CsA (20 mg/kg)

(nastavljeno)

[0273] Jednu nedelju nakon transplantacije, funkcija bubrega ima tendenciju normalizacije i nivoi SCrea/Surea postaju bliži bazalnim vrednostima. Međutim, kod životinja #5533, #5523 i #5524 (ali ne #5529, #5536 i #5538) je zabeleženo dodatno povećanje SCrea/SUrea između dana 7 i 19-25 nakon transplantacije, što je ukazivalo na poremećaj funkcije bubrega. Tokom tog perioda mogli su biti zapaženi znaci poput polidipsije/poliurije (#5523 i #5524), održavanje visokog nivoa kalcijuma u serumu (SCa) (#5533) ili povećanje volumena grafta (#5523 i #5524).

[0274] Nakon dana 20-25, rezultati životinja #5529, #5523, #5524, #5536 i #5538 su se poboljšali i one su pokazale odličnu funkciju bubrega do kraja studije. Međutim, na dan 31, životinja #5533 je ispoljila izraženo povećanje nivoa SCrea/SUrea, što je potvrđujući znak za akutnu bubrežnu insufucijenciju (SCrea; 629 µmol/l i SUrea; 18 mmol/l). Ova patologija se desila nakon perioda hipertenzije koji se održavao i procedure biopsije jedan dan pre eutanazije. Tokom ovog perioda zabeleženi su skokovi pritiska (~170 mmgHg sistolni) i epizode niskog pritiska (hipotenzije) (~40 mmgHg sistolni).

(b) Koncentracije amilaze, lipaze u serumu, telesna težina i broj trombocita

[0275] Koncentracije amilaze u serumu su se neznatno povećale kod svih životinja i to oko 1.3 puta u danima 1-7 nakon transplantacije (311 ± 53 U/L na dan 0 i 418 ± 66.8 U/L na dan 7 nakon transplantacije) (Tabela 14). Životinja #5533 je imala najveću zapaženu koncentraciju amilaze u studiji na dan 1 nakon transplantacije (1050 U/L). Pre transplantacije, nije zapažena razlika između nivoa amilaze zabeleženih pre davanja prve doze mAb1 i 24 časa kasnije (dan -1 i dan 0).

Tabela 14: Koncentracije amilaze u serumu (U/L) kod životinja kojima je transplantiran bubreg a koje su tretirane kombinacijom mAb1 (30 mg/kg i.v.) i CsA (20 mg/kg p.o.)

[0276] Koncentracije lipaze u serumu, u proseku, su se malo menjale pre i posle transplantacije (Tabela 15). Jedino na kraju eksperimentalnog protokola, moglo se videti minorno povećanje (dan 84; 2.18 puta). Kod životinje #5533 je pokazana najveća koncentracija lipaze izmerena na dan 1 (284.4 U/L). Podaci o lipazi za životinju #5536 i #5538 nisu bili dostupni. Promene u koncentracijama amilaze i lipaze su bile slične nivoima koji su nađeni u drugim transplantacijskim eksperimentima u kojima su korišćena različita antitela ili jedinjenja male molekulske težine (podaci nisu prikazani).

Tabela 15: Koncentracije lipaze u serumu (U/L) kod četiri životinje kojima je transplantiran bubreg koje su tretirane kombinacijom mAb1 (30 mg/kg i.v.) i CsA (20 mg/kg p.o.)

[0277] Brz i upadljiv gubitak telesne težine uglavnom je bio zapažen kod životinja #5529, #5533 i #5536. Kod svih šest transplantiranih životinja, gubitak težine se kretao u opsegu od 4 do -18% tokom prvih 21 dana nakon transplantacije. Međutim, gubitak telesne težine je imao tendenciju oporavka nakon tog momenta, ka kraju perioda ispitivanja.

[0278] Vrednosti trombocita su bile normalne (300-400 ćelija x 10<3>/ μl) ili povećane tokom posttransplantacijskog perioda 600-800 ćelija x 10<3>/ μl. Životinja #5529 je dobijala aspirin tokom 3 dana (dani 7-9) zbog brzog porasta broja trombocita. Kod životinje #5533 je postojala dugotrajna trombocitoza (>1000 ćelija x 10<3>/ μl) i ona je primala aspirin u periodu između dana 7- 26.

(c) Nivoi mAb1 u krvi i vrednosti (broj) B ćelija

[0279] Prethodno je sprovedena referentna PK/PD studija i analiza u kojoj je majmunima cynomolgus data jedna intravenska doza antitela u koncentraciji od 10 mg/kg (podaci nisu prikazani). U toj studiji, profili koncentracija vs. vreme su pokazali da vezivanje antitela za ciljno mesto utiče na njegovu raspoloživost (target mediated disposition -TMD), gde je kod jedne životinje pokazan brži klirens u poređenju sa drugom životinjom, verovatno kao posledica većeg nivoa ispoljavanja ciljnog mesta za vezivanje, što naglašava ulogu nivoa ispoljavanja ciljnog mesta za vezivanje antitela u PK analizi. Ovom studijom takođe je utvrđeno da kada je koncentracija mAb1 u serumu iznad približno 5 microg/mL, antitelo je vezano za skoro 100% CD40 receptora.

[0280] Dizajn transplantacijske studije (nedeljni i visoki nivoi doze mAb1 - 30 mg/kg, bez sprovođenja faze oporavka i ispiranja) nije omogućio isti nivo analize i modelovanja kao prethodno sprovedena PK/PD studija. Ipak, opisana su sledeća zapažanja (sumirana na Tabeli 16); i) mAb1 nije bilo detektovano u uzorcima koji su sakupljeni pre prve doze, ii) mAb1 je bilo detektovano tokom faze doziranja za svaku primenjenu dozu, iii) u svim sakupljenim uzorcima i interindividualno razlike u minimalnim koncentracijama antitela su bile promenljive (1200 - 2500 microg/mL za cynomolgus 5524, 1000 - 2000 microg/mL za cynomolgus 5523 i 850 - 2400 microg/mL za cynomolgus 5529). Sve vrednosti ekspozicije su bile značajno iznad (170- do 500- struko) koncentracija koje su bile neophodne za postizanje potpune zauzetosti receptora u majmunu cynomolgus.

Tabela 16: Koncentracije mAb1 u serumu cynomolgus majmuna #5533, #5529, #5523 i

#5524

[0281] Testiranja imunogenosti (majmunska anti-mAb1 antitela) su takođe procenjena u ovoj studiji. Pokazalo se da su svi uzorci bili negativni, ali su visoki nivoi mAb1 u ovim uzorcima, mogli potencijalno da spreče njihovu (misli se na anti-mAb1 antitela) detekciju zbog međusobne interferencije među lekovima.

[0282] Parcijalna deplecija CD20+ ćelija je mogla biti zapažena tokom vremena u svim tretiranim životinjama. Slična zapažanja su viđena u prethodno sprovedenoj PK/PD studiji (podaci nisu prikazani).

Histološki rezultati

[0283] Histopatološka procena alografta bubrega pokazala je da nema znakova akutnog i hroničnog odbacivanja u graftovima #5523, #5524, #5529 i #5538, i pokazala je granične promene u graftu #5536 koji je dočekao kraj eksperimenta, tj. (rezultati sumirani u Tabeli 17). Zapaženi su minimalni perivaskularni ili intersticijalni infiltrati kod životinja #5523 #5524 i #5538, i minimalna hipercelularnost glomerula kod životinje #5529.

Tabela 17: Histološki rezultati

(nastavljeno)

[0284] Kod životinje #5533 koja je eutanazirana na dan 31 nakon transplantacije uočena je dilatacija tubula, intersticijalni infiltrati i fibroza ali samo minimalni tubulitis. Osim toga, nađeni su i prominentni infiltrat eozinofila u blizini uretera i absces pored anastomoze. Svi ovi nalazi su ukazali na dugotrajnost postojanja slabe bubrežne funkcije ali odbacivanje nije moglo biti potvrđeno.

[0285] C4d imunoboljenje je bilo negativno u svim slučajevima.

[0286] Kod svih životinja je zapažen nedostatak razvoja germinativnog centra sa ili bez atrofije folikula u limfoidnim organima. Ceko-kolitis uzrokovan infekcijom Balantidium coli je dijagnostikovan kod životinja #5529 i #5533.

[0287] Nisu bile uočene druge sa tretmanom povezane promene.

Transplantacijska studija - diskusija

[0288] Cilj transplantacijske studije je bio da proceni, na modelu odbacivanja alografta bubrega kod ne-humanih primata, korisne efekte mAb1 kada se ovo antitelo primeni kao kombinovana terapija sa sub-terapijskom dozom ciklosporina A. Osim toga, bilo je značajno proceniti odsustvo sporednih efekata na modelu u kome je indukovana sistemska inflamacija.

[0289] Kada je bilo primenjeno kao kombinovana terapija sa sub-terapijskom dozom CsA (20 mg/kg p.o.), mAb1 je pokazalo efikasnost u povećanju preživljavanja alografta bubrega kod NHP. Prosečno vreme preživljavanja grafta je bilo >83.6 dana a 5 od 6 životinja su dosegle kraj ustanovljenog eksperimentalnog protokola (91-98 dana).

[0290] Specifično delovanje na CD40 antigen korišćenjem ne-agonističkog blokirajućeg anti-CD40 antitela (mAb1) dovelo je do produženja preživljavanja transplantiranog grafta bubrega ili ostrvca kod ne-humanih primata (NHPs). Osim toga, mogli smo da procenimo bolju efikasnost i bezbednost korišćenjem mAb1 (koje ima utišan Fc) u poređenju sa Chir12.12 čije je delovanje prethodno saopšteno (u potpunosti humano monoklonsko anti-CD40 antitelo IgG1/kapa izotipa koje ima osobine da izazove depleciju B ćelije i blokadu kostimulacije).

[0291] Tokom čitavog post-transplantacijskog perioda, nije bilo znakova bilo kakvih relevantnih patoloških događaja u kliničkom smislu (npr. minorni porast u nivoima amilaze/lipaze koji bi se mogao pripisati tipičnom oštećenju bubrežne funkcije nakon transplantacije). Međutim, životinje #5333, #5523 i #5524 su pokazale redukovanu bubrežnu funkciju između dana 7-19. Ovaj vremenski period je tipično bio karakterisan normalizacijom nivoa SCrea/Surea, normalizacijom vrednosti krvnog pritiska i volumena grafta u životinjama kojima je izvršena transplantacija. Kod ovih životinja, viđeni su znaci poremećene funkcije bubrega kao što su povećanje SCrea/SUrea (sve 3 životinje), prolazno povećanje volumena grafta (#5523, #5524) ili polidipsija/poliurija (#5523, #5524). Jedna hipoteza je mogla da bude da su te životinje razvile proces ranog odbacivanja, koji je postao kontrolisan nakon 3 nedelje primene mAb1 antitela. Ova abnormalnost u ranoj post-transplantacijskoj fazi je mogla da bude posledica razlika indukovanih imunskim načinom delovanja molekula (čiji je Fc utišan) koji specifično utiče na CD40 put.

[0292] Jedna životinja (#5533) je eutanazirana na dan 31 zbog akutne bubrežne insuficijencije (bez znakova odbacivanja). Ovakav ishod je bio uzrokovan nepotpunim oporavkom bubrežne funkcije nakon transplantacijske procedure. Znaci koji su ukazivali na slabost bubrežne funkcije su bili visoki nivoi SUrea (11-19 mmol/l) ili održavanje visokih koncentracija SCa (>2.8 mmol/l). Terminalni gubitak grafta je bio ubrzan hipertenzijom koja se održavala (>140 mmHg sistolni pritisak) u kombinaciji sa hipotenzijom koja je zapažena prilikom anestezije, koja je primenjena tokom sprovođenja procedure sakupljanja kolekcije bioptata, i visokih hipertenzivnih pikova koji su registrovani noć pre eutanazije (-170 mmHg sistolni) (Palmer BF (2002) N. Engl. J. Med; 347(16):1256-1261). Svi ovi događaji su mogli biti pripisani individualnim razlikama u post-transplantacijskoj fazi ali ne i delovanju primenjenog mAb1 antitela.

[0293] Visoka efikasnost kombinovane terapije je takođe mogla biti pokazana i histološki. Pet od šest graftova je pokazalo odličan kvalitet na kraju eksperimenta. U transplantacijskom eksperimentu sa Chir12.12 antitelom je takođe zapažen nedostatak razvoja germinativnog centra. Nisu zapažene druge, sa tretmanom povezane promene.

[0294] Jedna od životinja koja je preživela celu proceduru (#5529) je razvila ceko-kolitis uzrokovan infekcijom Balantidium coli. Iako je ova infekcija česta kod macaques majmuna i često asimptomatska, imunosupresija je mogla dovesti do pojave akutne bolesti (Schuster FL, Ramirez-Avila L, (2008) Clin. Microbiol. Rev; 21(4): 626-38). Kod ove životinje nisu zapaženi klinički znaci, kao što su dijareja ili gubitak telesne težine.

[0295] Kada je u pitanju praćenje broja B ćelija, kod svih tretiranih životinja je, tokom vremena, mogla biti zapažena parcijalna deplecija. Ova parcijalna depelcija verovatno nije bila posledica aktivne Fc-receptorom – posredovane deplecije jer je mAb1 utišano antitelo koje se ne vezuje za FcR niti dovodi do reakcije ADCC in vitro. Parcijalna deplecija može biti odraz nedostatka germinativnih centara, koji je zapažen u histološkim ispitivanjima na kraju eksperimenta. Ova parcijalna deplecija bi mogla biti posledica nedostatka signala za preživljavanje.

[0296] U zaključku, rezultati transplantacijske studije podržavaju upotrebu mAb1 kao validnog ciljnog sredstva u kombinovanoj terapiji za sprečavanje odbacivanja bubrega, sa odličnim profilom bezbednosti primene. Odličan profil bezbebednosti primene i efikasnost, dodatno podržavaju upotrebu antitela ovog pronalaska u lečenju autoimunskih poremećaja i/ili inflamacijskih poremećaja i prevenciji odbacivanja transplantata koji su posredovani CD40 signalimakoji su posledica vezivanja CD40L za CD40 na ćelijama koje ispoljavaju CD40 antigen

Rezime

[0297] Nije saopšteno da anti-CD40 antitela indukuju hemostatske događaje kod pacijenata, međutim kod pacijenata koji boluju od limfoma B ćelija, a koji su primili anti-CD40 antitelo Chir12.12, povećanja enzima pankreasa i mogući rizik od pankreatitisa onemogućavaju, iz razloga bezbednosti, upotrebu ovog anti-CD40 antitela, koje ima kompetentan Fc, u hroničnoj autoimunskoj bolesti i transplantaciji. Zbog toga smo mi generisali anti-CD40 antitela (mAb1, mAb2, i mAb3) koja imaju utišani Fc IgG1, koja nisu sposobna da izazovu od antitela zavisnu ćelijsku citotoksičnost (ADCC) ili od komplementa zavisnu citotoksičnost (CDC) ni in vitro ni in vivo. mAb1 je, u kombinaciji sa sub-terapijskim dozama ciklosporina, bilo sposobno da prolongira preživljavanje alografta bubrega kod ne-humanih primata. Osim toga, mAb1 je bilo sposobno da u potpunosti suprimira primarni i sekundarni humoralni odgovor (produkciju antitela) na imunizaciju antigenima prema kojima se humoralni odgovor razvija uz pomoć T-ćelija (T-zavisan). Od presudne važnosti je i podatak da nije bilo dokaza o hemostatskim poremećajima ili patološke histologije pankreasa ni u transplantacijskoj studiji ni u studiji imunizacije. Sveukupno, ovi rezultati ukazuju da bi mAb1 antitelo bilo bezbedan i efikasan lek, i da bi moglo da se koristi za lečenje pacijenata koji pate od autoimunske bolesti koja je posledica delovanja B limfocita i antigen prezentujućih ćelija ili za lečenje pacijenata koji su podvrgnuti alogenoj transplantaciji, gde su interakcije CD40-CD154 uključene u proces i doprinose razvoju patologije.

LISTA SEKVENCI

[0298]

<110> Novartis AG

<120> Varijatne anti-CD40 antitela sa utišanim Fc

<130> PAT54423

<150> US 61/413567

<151> 2010-11-15

<160> 28

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 5

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 1

Ser Tyr Gly Met His

1 5

<210> 2

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 2

Val Ile Ser Tyr Glu Glu Ser Asn Arg Tyr His Ala Asp Ser Val Lys

Gly

<210> 3

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 3

Asp Gly Gly Ile Ala Ala Pro Gly Pro Asp Tyr

1 5 10

<210> 4

<211> 16

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 4

Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp 1 5 10 15

<210> 5

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 5

Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser

1 5

<210> 6

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 6

Met Gln Ala Arg Gln Thr Pro Phe Thr

1 5

<210> 7

<211> 120

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 7

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ala Val Ile Ser Tyr Glu Glu Ser Asn Arg Tyr His Ala Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Ile Thr Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Asp Gly Gly Ile Ala Ala Pro Gly Pro Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 8

<211> 112

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 8

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Thr Val Thr Pro Gly 1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser 20 25 30

Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45

Pro Gln Val Leu Ile Ser Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro 50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala 85 90 95

Arg Gln Thr Pro Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Arg 100 105 110

<210> 9

<211> 450

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 9

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ala Val Ile Ser Tyr Glu Glu Ser Asn Arg Tyr His Ala Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Ile Thr Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Asp Gly Gly Ile Ala Ala Pro Gly Pro Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ala Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 225 230 235 240

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 325 330 335

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445

Gly Lys

450

<210> 10

<211> 219

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 10

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Thr Val Thr Pro Gly 1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser 20 25 30

Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45

Pro Gln Val Leu Ile Ser Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro 50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala 85 90 95

Arg Gln Thr Pro Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Arg 100 105 110

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 115 120 125

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 130 135 140

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 145 150 155 160

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 165 170 175

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 180 185 190

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 195 200 205

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 11

<211> 450

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 11

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ala Val Ile Ser Tyr Glu Glu Ser Asn Arg Tyr His Ala Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Ile Thr Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Asp Gly Gly Ile Ala Ala Pro Gly Pro Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 225 230 235 240

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg 290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 325 330 335

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445

Gly Lys

450

<210> 12

<211> 219

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 12

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Thr Val Thr Pro Gly 1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser 20 25 30

Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

Pro Gln Val Leu Ile Ser Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro 50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala 85 90 95

Arg Gln Thr Pro Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Arg 100 105 110

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 115 120 125

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 130 135 140

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 145 150 155 160

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 165 170 175

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 180 185 190

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 195 200 205

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 13

<211> 450

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 13

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ala Val Ile Ser Tyr Glu Glu Ser Asn Arg Tyr His Ala Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Ile Thr Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Asp Gly Gly Ile Ala Ala Pro Gly Pro Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 225 230 235 240

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Ala Val Ser His Glu 260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445

Gly Lys

450

<210> 14

<211> 219

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 14

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Thr Val Thr Pro Gly 1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser 20 25 30

Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45

Pro Gln Val Leu Ile Ser Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro 50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala 85 90 95

Arg Gln Thr Pro Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Arg 100 105 110

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 115 120 125

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 130 135 140

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 145 150 155 160

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 165 170 175

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 180 185 190

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 195 200 205

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 15

<211> 450

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 15

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ala Val Ile Ser Tyr Glu Glu Ser Asn Arg Tyr His Ala Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Ile Thr Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Asp Gly Gly Ile Ala Ala Pro Gly Pro Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly 225 230 235 240

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 325 330 335

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445

Gly Lys

450

<210> 16

<211> 219

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 16

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Thr Val Thr Pro Gly 1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser 20 25 30

Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45

Pro Gln Val Leu Ile Ser Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro 50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala 85 90 95

Arg Gln Thr Pro Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Arg 100 105 110

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 115 120 125

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 130 135 140

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 145 150 155 160

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 165 170 175

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 180 185 190

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 195 200 205

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 17

<211> 217

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 17

Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 1 5 10 15

Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 20 25 30

Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr 35 40 45

Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 50 55 60

Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 65 70 75 80

Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 85 90 95

Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln 100 105 110

Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met 115 120 125

Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 130 135 140

Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn 145 150 155 160

Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 165 170 175

Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val 180 185 190

Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 195 200 205

Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

210 215

<210> 18

<211> 217

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 18

Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 1 5 10 15

Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 20 25 30

Val Val Ala Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr 35 40 45

Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 50 55 60

Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 65 70 75 80

Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 85 90 95

Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln 100 105 110

Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met 115 120 125

Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 130 135 140

Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn 145 150 155 160

Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 165 170 175

Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val 180 185 190

Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 195 200 205

Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

210 215

<210> 19

<211> 217

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 19

Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 1 5 10 15

Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 20 25 30

Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr 35 40 45

Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 50 55 60

Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 65 70 75 80

Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 85 90 95

Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln 100 105 110

Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met 115 120 125

Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro

Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn 145 150 155 160

Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 165 170 175

Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val 180 185 190

Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 195 200 205

Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

210 215

<210> 20

<211> 1956

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 20

caggtgcagt tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt agctatggca tgcactgggt ccgccaggct 120 ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt atatcatatg aggaaagtaa tagataccat 180 gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagat cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctcag aactgaggac acggctgtgt attactgtgc gagagatggg 300 ggtatagcag cacctgggcc tgactactgg ggccagggaa ccctggtcac cgtctcctca 360 gcaagtacca agggcccatc cgtcttcccc ctggcgcccg ctagcaagag cacctctggg 420 ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 480 tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 540 ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 600 tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagag agttggtgag 660 aggccagcac agggagggag ggtgtctgct ggaagccagg ctcagcgctc ctgcctggac 720 gcatcccggc tatgcagtcc cagtccaggg cagcaaggca ggccccgtct gcctcttcac 780 ccggaggcct ctgcccgccc cactcatgct cagggagagg gtcttctggc tttttcccca 840 ggctctgggc aggcacaggc taggtgcccc taacccaggc cctgcacaca aaggggcagg 900 tgctgggctc agacctgcca agagccatat ccgggaggac cctgcccctg acctaagccc 960 accccaaagg ccaaactctc cactccctca gctcggacac cttctctcct cccagattcc 1020 agtaactccc aatcttctct ctgcagagcc caaatcttgt gacaaaactc acacatgccc 1080 accgtgccca ggtaagccag cccaggcctc gccctccagc tcaaggcggg acaggtgccc 1140 tagagtagcc tgcatccagg gacaggcccc agccgggtgc tgacacgtcc acctccatct 1200 cttcctcagc acctgaactc ctggggggac cgtcagtctt cctcttcccc ccaaaaccca 1260 aggacaccct catgatctcc cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg gacgtgagcc 1320 acgaagaccc tgaggtcaag ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg cataatgcca 1380 agacaaagcc gcgggaggag cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc gtcctcaccg 1440 tcctgcacca ggactggctg aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc aacaaagccc 1500 tcccagcccc catcgagaaa accatctcca aagccaaagg tgggacccgt ggggtgcgag 1560 ggccacatgg acagaggccg gctcggccca ccctctgccc tgagagtgac cgctgtacca 1620 acctctgtcc ctacagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg 1680 gaggagatga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc 1740 gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct 1800 cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctatagca agctcaccgt ggacaagagc 1860 aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac 1920 tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtaaa 1956

<210> 21

<211> 657

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 21

gatattgtga tgactcagtc tccactctcc ctgaccgtca cccctggaga gccggcctcc 60 atctcctgca ggtccagtca gagcctcctg tatagtaatg gatacaacta tttggattgg 120 tacctgcaga agccagggca gtctccacag gtcctgatct ctttgggttc taatcgggcc 180 tccggggtcc ctgacaggtt cagtggcagt ggatcaggca cagattttac actgaaaatc 240 agcagagtgg aggctgagga tgttggggtt tattactgca tgcaagctcg acaaactcca 300 ttcactttcg gccctgggac caaagtggat atcagacgaa ctgtggctgc accatctgtc 360 ttcatcttcc cgccatctga tgagcagttg aaatctggaa ctgcctctgt tgtgtgcctg 420 ctgaataact tctatcccag agaggccaaa gtacagtgga aggtggataa cgccctccaa 480 tcgggtaact cccaggagag tgtcacagag caggacagca aggacagcac ctacagcctc 540 agcagcaccc tgacgctgag caaagcagac tacgagaaac acaaagtcta cgcctgcgaa 600 gtcacccatc agggcctgag ctcgcccgtc acaaagagct tcaacagggg agagtgt 657

<210> 22

<211> 1350

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 22

caggtgcagc tggtggaatc tggcggcgga gtggtgcagc ctggccggtc cctgagactg 60 tcttgcgccg cctccggctt caccttctcc agctacggca tgcactgggt gcgacaggcc 120 cctggcaagg gactggaatg ggtggccgtg atctcctacg aggaatccaa cagataccac 180 gctgactccg tgaagggccg gttcacaatc tcccgggaca actccaagat caccctgtac 240 ctgcagatga actccctgcg gaccgaggac accgccgtgt actactgcgc cagggacgga 300 ggaatcgccg ctcctggacc tgattattgg ggccagggca ccctggtgac agtgtcctcc 360 gctagcacca agggcccctc cgtgttccct ctggccccct ccagcaagtc cacctctggc 420 ggcaccgccg ctctgggctg cctggtgaaa gactacttcc ccgagcccgt gaccgtgtcc 480 tggaactctg gcgccctgac ctccggcgtg cacacctttc cagccgtgct gcagtcctcc 540 ggcctgtact ccctgtcctc cgtggtgacc gtgccctcta gctctctggg cacccagacc 600 tacatctgca acgtgaacca caagccctcc aacaccaagg tggacaagcg ggtggaaccc 660 aagtcctgcg acaagaccca cacctgtccc ccctgccctg cccctgaact gctgggcgga 720 ccttccgtgt tcctgttccc cccaaagccc aaggacaccc tgatgatctc ccggaccccc 780 gaagtgacct gcgtggtggt ggacgtgtcc cacgaggacc ctgaagtgaa gttcaattgg 840 tacgtggacg gcgtggaagt gcacaacgcc aagaccaagc ccagagagga acagtacgcc 900 tccacctacc gggtggtgtc tgtgctgacc gtgctgcacc aggactggct gaacggcaaa 960 gagtacaagt gcaaggtctc caacaaggcc ctgcctgccc ccatcgaaaa gaccatctcc 1020 aaggccaagg gccagccccg cgagccacag gtgtacacac tgccccccag ccgggaagag 1080 atgaccaaga accaggtgtc cctgacctgt ctggtcaaag gcttctaccc ctccgatatc 1140 gccgtggagt gggagtccaa cggacagccc gagaacaact acaagaccac cccccctgtg 1200 ctggactccg acggctcatt cttcctgtac tccaagctga ccgtggacaa gtcccggtgg 1260 cagcagggca acgtgttctc ctgctccgtg atgcacgagg ccctgcacaa ccactacacc 1320 cagaagtccc tgtccctgag ccccggcaag 1350

<210> 23

<211> 657

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 23

gacatcgtga tgacccagtc ccccctgtcc ctgaccgtga cacctggcga gcctgcctct 60 atctcctgca gatcctccca gtccctgctg tactccaacg gctacaacta cctggactgg 120 tatctgcaga agcccggcca gtccccacag gtgctgatct ccctgggctc caacagagcc 180 tctggcgtgc ccgaccggtt ctccggctct ggctctggca ccgacttcac actgaagatc 240 tcacgggtgg aagccgagga cgtgggcgtg tactactgca tgcaggcccg gcagaccccc 300 ttcaccttcg gccctggcac caaggtggac atccggcgta cggtggccgc tcccagcgtg 360 ttcatcttcc cccccagcga cgagcagctg aagagcggca ccgccagcgt ggtgtgcctg 420 ctgaacaact tctacccccg ggaggccaag gtgcagtgga aggtggacaa cgccctgcag 480 agcggcaaca gccaggagag cgtcaccgag caggacagca aggactccac ctacagcctg 540 agcagcaccc tgaccctgag caaggccgac tacgagaagc ataaggtgta cgcctgcgag 600 gtgacccacc agggcctgtc cagccccgtg accaagagct tcaacagggg cgagtgc 657

<210> 24

<211> 1350

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 24

caggtgcagc tggtggaatc tggcggcgga gtggtgcagc ctggccggtc cctgagactg 60 tcttgcgccg cctccggctt caccttctcc agctacggca tgcactgggt gcgacaggcc 120 cctggcaagg gactggaatg ggtggccgtg atctcctacg aggaatccaa cagataccac 180 gctgactccg tgaagggccg gttcacaatc tcccgggaca actccaagat caccctgtac 240 ctgcagatga actccctgcg gaccgaggac accgccgtgt actactgcgc cagggacgga 300 ggaatcgccg ctcctggacc tgattattgg ggccagggca ccctggtgac agtgtcctcc 360 gctagcacca agggcccctc cgtgttccct ctggccccct ccagcaagtc cacctctggc 420 ggcaccgccg ctctgggctg cctggtgaaa gactacttcc ccgagcccgt gaccgtgtcc 480 tggaactctg gcgccctgac ctccggcgtg cacacctttc cagccgtgct gcagtcctcc 540 ggcctgtact ccctgtcctc cgtggtgacc gtgccctcta gctctctggg cacccagacc 600 tacatctgca acgtgaacca caagccctcc aacaccaagg tggacaagcg ggtggaaccc 660 aagtcctgcg acaagaccca cacctgtccc ccctgccctg cccctgaact gctgggcgga 720 ccttccgtgt tcctgttccc cccaaagccc aaggacaccc tgatgatctc ccggaccccc 780 gaagtgacct gcgtggtggt ggccgtgtcc cacgaggacc ctgaagtgaa gttcaattgg 840 tacgtggacg gcgtggaagt gcacaacgcc aagaccaagc ccagagagga acagtacaac 900 tccacctacc gggtggtgtc tgtgctgacc gtgctgcacc aggactggct gaacggcaaa 960 gagtacaagt gcaaggtctc caacaaggcc ctgcctgccc ccatcgaaaa gaccatctcc 1020 aaggccaagg gccagccccg cgagccacag gtgtacacac tgccccccag ccgggaagag 1080 atgaccaaga accaggtgtc cctgacctgt ctggtcaaag gcttctaccc ctccgatatc 1140 gccgtggagt gggagtccaa cggacagccc gagaacaact acaagaccac cccccctgtg 1200 ctggactccg acggctcatt cttcctgtac tccaagctga ccgtggacaa gtcccggtgg 1260 cagcagggca acgtgttctc ctgctccgtg atgcacgagg ccctgcacaa ccactacacc 1320 cagaagtccc tgtccctgag ccccggcaag 1350

<210> 25

<211> 657

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 25

<210> 26

<211> 1350

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 26

caggtgcagc tggtggaatc tggcggcgga gtggtgcagc ctggccggtc cctgagactg 60 tcttgcgccg cctccggctt caccttctcc agctacggca tgcactgggt gcgacaggcc 120 cctggcaagg gactggaatg ggtggccgtg atctcctacg aggaatccaa cagataccac 180 gctgactccg tgaagggccg gttcacaatc tcccgggaca actccaagat caccctgtac 240 ctgcagatga actccctgcg gaccgaggac accgccgtgt actactgcgc cagggacgga 300 ggaatcgccg ctcctggacc tgattattgg ggccagggca ccctggtgac agtgtcctcc 360 gctagcacca agggcccctc cgtgttccct ctggcccctt ccagcaagtc tacctccggc 420 ggcacagctg ctctgggctg cctggtcaag gactacttcc ctgagcctgt gacagtgtcc 480 tggaactctg gcgccctgac ctctggcgtg cacaccttcc ctgccgtgct gcagtcctcc 540 ggcctgtact ccctgtcctc cgtggtcaca gtgccttcaa gcagcctggg cacccagacc 600 tatatctgca acgtgaacca caagccttcc aacaccaagg tggacaagcg ggtggagcct 660 aagtcctgcg acaagaccca cacctgtcct ccctgccctg ctcctgaagc tgctggcggc 720 ccttctgtgt tcctgttccc tccaaagccc aaggacaccc tgatgatctc ccggacccct 780 gaagtgacct gcgtggtggt ggacgtgtcc cacgaggatc ctgaagtgaa gttcaattgg 840 tacgtggacg gcgtggaggt gcacaacgcc aagaccaagc ctcgggagga acagtacaac 900 tccacctacc gggtggtgtc cgtgctgacc gtgctgcacc aggactggct gaacggcaaa 960 gagtacaagt gcaaagtctc caacaaggcc ctgcctgccc ctatcgaaaa gacaatctcc 1020 aaggccaagg gccagcctag ggaaccccag gtgtacaccc tgccacccag ccgggaggaa 1080 atgaccaaga accaggtgtc cctgacctgt ctggtcaagg gcttctaccc ttccgatatc 1140 gccgtggagt gggagtctaa cggccagcct gagaacaact acaagaccac ccctcctgtg 1200 ctggactccg acggctcctt cttcctgtac tccaaactga ccgtggacaa gtcccggtgg 1260 cagcagggca acgtgttctc ctgctccgtg atgcacgagg ccctgcacaa ccactacacc 1320 cagaagtccc tgtccctgtc tcccggcaag 1350

<210> 27

<211> 657

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 27

<210> 28

<211> 277

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 28

Met Val Arg Leu Pro Leu Gln Cys Val Leu Trp Gly Cys Leu Leu Thr 1 5 10 15

Ala Val His Pro Glu Pro Pro Thr Ala Cys Arg Glu Lys Gln Tyr Leu

20 25 30

Ile Asn Ser Gln Cys Cys Ser Leu Cys Gln Pro Gly Gln Lys Leu Val

35 40 45

Ser Asp Cys Thr Glu Phe Thr Glu Thr Glu Cys Leu Pro Cys Gly Glu 50 55 60

Ser Glu Phe Leu Asp Thr Trp Asn Arg Glu Thr His Cys His Gln His

65 70 75 80

Lys Tyr Cys Asp Pro Asn Leu Gly Leu Arg Val Gln Gln Lys Gly Thr 85 90 95

Ser Glu Thr Asp Thr Ile Cys Thr Cys Glu Glu Gly Trp His Cys Thr 100 105 110

Ser Glu Ala Cys Glu Ser Cys Val Leu His Arg Ser Cys Ser Pro Gly 115 120 125

Phe Gly Val Lys Gln Ile Ala Thr Gly Val Ser Asp Thr Ile Cys Glu 130 135 140

Pro Cys Pro Val Gly Phe Phe Ser Asn Val Ser Ser Ala Phe Glu Lys 145 150 155 160

Cys His Pro Trp Thr Ser Cys Glu Thr Lys Asp Leu Val Val Gln Gln 165 170 175

Ala Gly Thr Asn Lys Thr Asp Val Val Cys Gly Pro Gln Asp Arg Leu 180 185 190

Arg Ala Leu Val Val Ile Pro Ile Ile Phe Gly Ile Leu Phe Ala Ile 195 200 205

Leu Leu Val Leu Val Phe Ile Lys Lys Val Ala Lys Lys Pro Thr Asn 210 215 220

Lys Ala Pro His Pro Lys Gln Glu Pro Gln Glu Ile Asn Phe Pro Asp 225 230 235 240

Asp Leu Pro Gly Ser Asn Thr Ala Ala Pro Val Gln Glu Thr Leu His 245 250 255

Gly Cys Gln Pro Val Thr Gln Glu Asp Gly Lys Glu Ser Arg Ile Ser 260 265 270

Val Gln Glu Arg Gln

275

Claims

Patentni zahtevi:

1. Izolovano antitelo usmereno prema ciljnom CD40 polipeptidu (SEQ ID NO:28), naznačeno time što navedeno antitelo sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 11 teškog lanca i aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 12 lakog lanca.

2. Izolovano antitelo iz patentnog zahteva 1, naznačeno time što navedeno antitelo inhibira signal koji indukuje CD40L, sa IC50 od 50 ng/ml ili manje.

3. Izolovano antitelo iz patentnih zahteva 1 ili 2, naznačeno time što navedeno antitelo nema ili ima nisku agonističku aktivnost u odnosu na CD40 signalizaciju.

4. Izolovano antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva od 1 do 3, za upotrebu kao medikament.

5. Izolovano antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva od 1 do 3, za upotrebu u lečenju autoimunskih poremećaja i/ili inflamacijskih poremećaja.

6. Izolovano antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva od 1 do 3, za upotrebu u prevenciji ili redukovanju rizika od odbacivanja grafta u transplantaciji.

7. Izolovano antitelo za upotrebu prema patentnom zahtevu 5, naznačeno time što se pod potrebom podrazumeva lečenje multiple skleroze, sistemskog eritemskog lupusa, lupus nefritisa, Sjogren-ovog sindroma, reumatoidnog artritisa i bolesti kalema protiv domaćina.

8. Farmaceutska kompozicija, koja sadrži antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva od 1 do 3, najmanje u kombinaciji sa farmaceutski prihvatljivim ekscipijensom, diluentom ili nosačem.

9. Farmaceutska kompozicija iz patentnog zahteva 8, dodatno sadrži druge aktivne sastojke.

10. Farmaceutska formulacija u tečnom obliku sadrži antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva od 1 do 3 najmanje sa puferom.

11. Izolovana nukleinska kiselina kodira antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva od 1 do 3.

12. Vektor za kloniranje ili ekspresiju sadrži jednu ili više nukleinskih kiselina prema patentnom zahtevu 11.

13. Vektor za kloniranje ili ekspresiju prema patentnom zahtevu 12 sadrži sekvence za kodiranje SEQ ID NO: 22 i SEQ ID NO: 23, operativno povezane za odgovarajuće promotorske sekvence.

14. Ćelija domaćina sadrži jedan ili više vektora za kloniranje ili ekspresiju prema patentnim zahtevima 12 i 13.

15. Proces produkcije antitela iz bilo kog od patentnih zahteva 1 do 3, obuhvata kultivaciju ćelija domaćina iz patentnog zahteva 14, prečišćavanje i prinos navedenog antitela.