RS56242B1 - Wnt antagonisti i metode tretiranja - Google Patents

Wnt antagonisti i metode tretiranja

Info

Publication number
RS56242B1
RS56242B1 RS20170848A RSP20170848A RS56242B1 RS 56242 B1 RS56242 B1 RS 56242B1 RS 20170848 A RS20170848 A RS 20170848A RS P20170848 A RSP20170848 A RS P20170848A RS 56242 B1 RS56242 B1 RS 56242B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
seq
wnt
tumor
fzd8
polypeptide
Prior art date
Application number
RS20170848A
Other languages
English (en)
Inventor
Sanjeev H Satyal
Satyajit Sujit Kumar Mitra
Austin L Gurney
Original Assignee
Oncomed Pharm Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Oncomed Pharm Inc filed Critical Oncomed Pharm Inc
Publication of RS56242B1 publication Critical patent/RS56242B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/28—Compounds containing heavy metals
    • A61K31/282—Platinum compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
    • A61K31/337—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having four-membered rings, e.g. taxol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/47—Quinolines; Isoquinolines
    • A61K31/4738—Quinolines; Isoquinolines ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems
    • A61K31/4745—Quinolines; Isoquinolines ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems condensed with ring systems having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. phenantrolines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7042—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings
    • A61K31/7052—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides
    • A61K31/706—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom
    • A61K31/7064—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom containing condensed or non-condensed pyrimidines
    • A61K31/7068—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom containing condensed or non-condensed pyrimidines having oxo groups directly attached to the pyrimidine ring, e.g. cytidine, cytidylic acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/177—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39591—Stabilisation, fragmentation
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5011—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing antineoplastic activity
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/32—Fusion polypeptide fusions with soluble part of a cell surface receptor, "decoy receptors"
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Description

Opis
OBLAST PRONALASKA
[0001] Dati pronalazak daje nove sastave i metode za tretiranje kancera i drugih Wnt-vezanih bolesti ili poremećaja, kao i nove skrining metode za identifikaciju dodatnih novih terapeutskih agenasa. Posebno, dati pronalazak daje Wnt antagoniste uključujući rastvorljive proteine receptora korisne za tretiranje čvrstih tumora i drugih Wnt-vezanih bolesti i stanja.
POZADINA PRONALASKA
[0002] Kancer je jedan od vodećih uzroka smrti u razvijenom svetu, gde je više od milion ljudi dijagnostikivano sa kancerom i 500.000 umrlih godišnje samo u Sjedinjenim Državama. Ukupno gledano, procenjuje se da će više od 1 od 3 osobe razviti neku vrstu kancera tokom svog života. Postoji više od 200 različitih vrsta kancera, od kojih četiri - grudni, plućni, kolorektalni i prostatni -čine više od polovine novih slučajeva (Jemal et al., 2009, Cancer J. Clin., 58: 225-249 ).
[0003] Wnt signalni put je identifikovan kao potencijalni cilj za terapiju kancera. Wnt signalni put je jedan od nekoliko kritičnih regulatora formiranja embrionalnih šablona, održavanja post-embrionalnog tkiva i biologije matičnih ćelija. Konkretnije, Wnt signaliziranje igra važnu ulogu u stvaranju polariteta ćelija i specifikacije ćelijske sudbine, uključujući i samoobnavljanje populacija matičnih ćelija. Neregulisana aktivacija Wnt puta vezana je sa brojnim kancerima čoveka, gde može da promeni razvojnu sudbinu ćelija tumora da bi ih održala u nediferenciranom i proliferativnom stanju. Stoga karcinogeneza se može nastaviti uzurpiranjem homeostatskih mehanizama koji kontrolišu normalan razvoj i popravku tkiva matičnim ćelijama (razmotreno u Reya & Clevers, 2005, Nature, 434:843-50; Beachy et al., 2004, Nature, 432:324-311).
[0004] Wnt signalni put je objašnjen prvi put u Drosophila razvojnom beskrilnom mutantu (wg) i iz mišjeg protoonkogena int-1, sada Wnt1 (Nusse & Varmus, 1982, Cell, 31:99-109; Van Ooyen & Nusse, 1984, Cell, 39:233-40; Cabrera et al., 1987, Cell, 50:659-63; Rijsewijk et al., 1987, Cell, 50:649-57). Wnt geni kodiraju sekretirane lipidno modifikovane glikoproteine od kojih je 19 identifikovano kod sisara. Ovi izlučeni ligandi aktiviraju kompleks receptora koji se sastoje od Frizzeld (FZD) člana porodice receptora i lipoproteina male gustine (LDL) receptora vezanih proteina 5 ili 6 (LRP5/6). FZD receptori su sedam transmembranskih domena proteini superfamilije G-protein vezanih receptora (GPCR) i sadrže veliki ekstracelularni N-terminalni domen za vezivanje liganda sa 10 konzerviranih cisteina, poznati kao cistein-bogati domen (CRD) ili pod domen. Postoji deset ljudskih FZD receptora, FZD1, FZD2, FZD3, FZD4, FZD5, FZD6, FZD7, FZD8, FZD9 i FZD10. Različiti FZD CRD imaju različite afinitete vezivanja za specifične Wnt (Wu & Nusse, 2002, J. Biol. Chem., 277:41762-9) i FZD receptori su grupisani u one koje aktiviraju kanonički β-katenin put i one koji aktiviraju ne-kanonske puteve opisane u nastavku (Miller et al., 1999, Oncogene, 18:7860-72). Da bi se formirao kompleks receptora koji se vezuje na FZD liganad, FZD receptori interaguju sa LRP5/6 jednodelnim dodavanjem transmembranskih proteina sa četiri vanćelijska EGF-nalik domena sa odvojenih šest IVTD ponavljanja amino kiseline (Johnson et al., 2004, J. Bone Mineral Res ., 19: 1749).
[0005] Kanonički Wnt signalni put se aktivira pri vezivanju receptora posreduje citoplazmični protein Disheveled (Dsh) koji direktno uzajamno deluje sa FZD receptorom i rezultira u stabilizaciji citoplazme i akumulaciji β-katenina. U odsustvu Wnt signala, β-katenin je lokalizovan u kompleksu citoplazmičnog brisanja koji uključuje adenomatozne polipoze kolije (APC) i Aksin tumora supresornih proteina. Ovi proteini funkcionišu kao kritične skele kako bi se glikogen sintaza kinaza-3β (GSK3β) vezala i fosforilirala β-katenin, označavajući ga za degradaciju sa putem ubikitina/proteasoma. Aktivacija Dsh rezultira fosforilacijom GSK3β i disocijacijom destruktivnog kompleksa. Akumulirani citoplazmični β-katenin se onda transportuje u jezgro gde uzajamno deluje sa DNK vezujućim proteinom TCF/LEF familije kako bi aktivirao transkripciju.
[0006] Osim kanoničkog signalnog puta, Wnt ligandi takođe aktiviraju puteve nezavisne od β-katenina (Veeman et al., 2003, Dev. Cell, 5: 367-77). Ne-kanoničko signaliziranje Wnt je implicirano u brojnim procesima, ali najpogodnije u pokretima gastrulacije putem mehanizma sličnim Drosophila planarnoj ćelijskoj polarnosti (PCP). Drugi potencijalni mehanizmi ne-kanoničkog Wnt signaliziranja uključuju kalcijum fluks, JNK, i male i heterotrimerne G-proteine. Antagonizam se često posmatra između kanoničkih i ne-kanoničkih puteva, a neki dokazi ukazuju na to da ne-kanoničko signaliziranje može potisnuti formiranje kancera (Olson & Gibo, 1998, Exp. Cell Res., 241:134; Topol et al., 2003, J. Cell Biol., 162:899-908). Tako u određenim kontekstima, FZD receptori deluju kao negativni regulatori kanoničkog Wnt signalnog puta. Na primer, FZD6 potiskuje kanonsko signaliziranje indukovano sa Wnt3a kada je koekspresirana sa FZD1 preko puta TAK1-NLK (Golan et al., 2004, JBC, 279: 14879-88). Slično tome, pokazano je da FZD2 antagonizuje kanoničko Wnt signaliziranje u prisustvu Wnt5a preko Task1-NLK MAPK kaskade (Ishitani et al., 2003, Mol. Cell. Biol., 23:131-39).
[0007] Kanonički Wnt signalni put takođe ima centralnu ulogu u održavanju populacija matičnih ćelija u tankom crevu i debelom crevu, a neodgovarajuća aktivacija ovog puta ima značajnu ulogu u kolorektalnim kancerima (Reya & Clevers, 2005, Nature, 434:843). Apsorpcijski epitel creva je raspoređen u nazubljenja i kripte. Matične ćelije se nalaze u kriptama i polako se dele da bi proizvele brze proliferirajuće ćelije koje dovode do sve diferenciranje populacije ćelija koje se kreću iz kripta da bi zauzele intestinalna nazubljenja. Kaskada Wnt signaliziranja ima dominantnu ulogu u kontrolisanju ćelijske sudbine duž osovine kript-nazubljenje i od suštinskog je značaja za održavanje populacije matičnih ćelija. Poremećaj Wnt signaliziranja bilo genetskim gubitkom TCF7/2 homolognom rekombinacijom (Korinek et al., 1998, Nat Genet., 19: 379) ili prekomernom ekspresijom Dickkopf-1 (Dkkl), snažnog sekretiranog Wnt antagonista (Pinto et al., 2003, Genes Dev., 17:1709-13; Kuhnert et al., 2004, PNAS, 101:266-71) dovodi do smanjenja populacije crevnih matičnih ćelija.
[0008] Uloga Wnt signaliziranja u kanceru prvi put je otkrivena identifikacijom Wnt1 (izvorno int1) kao onkogena u tumorima sisara transformisanih u blizini ubacivanja mišjeg virusa (Nusse & Varmus, 1982, Cell, 31: 99-109). Dodatni dokazi o ulozi Wnt signaliziranja kod kancera dojke se od tada akumuliraju. Na primer, transgenska prekomerna ekspresija β-katenina u mlečnim žlezdama rezultira hiperplazijama i adenokarcinomima (Imbert et al., 2001, J Cell Biol., 153:555-68; Michaelson & Leder, 2001, Oncogene, 20:5093-9), dok gubitak Wnt signala ometa normalan razvoj mlečne žlezde (Tepera et al., 2003, J. Cell Sci., 116:1137-49; Hatsell et al., 2003, J. Mammary Gland Biol. Neoplasia, 8:145-58). U skorije vreme, pokazano je da su matične ćelije za sisare aktivirane Wnt signaliziranjem (Liu et al., 2004, PNAS, 101: 4158-4163). Kod kancera dojke čoveka, akumulacija β-katenina implicira aktivirano Wnt signaliziranje u preko 50% kancera, iako specifične mutacije nisu identifikovane, upoređena je ekspresija Frizzled receptora (Brennan & Brown, 2004, J. Mammary Gland Neoplasia, 9:119-31; Malovanovic et al., 2004, Int. J. Oncol., 25:1337-42).
[0009] Kolorektalni kancer se najčešće pokreće aktiviranjem mutacija u Wnt signalnoj kaskadi. Približno 5-10% svih kolorektalnih kancera su nasledni sa jednim od glavnih oblika familijarne adenomatozne polipoze (FAP), autosomalne dominantne bolesti u kojoj oko 80% pogođenih pojedinaca sadrži mutaciju germinalne linije u genomu adenomatoznog polipoze kolija (APC). Mutacije su takođe identifikovane u drugim komponentama Wnt puta, uključujući Axin i β-katenin. Pojedinačni adenomi su klonalni izvori epitelnih ćelija koji sadrže drugi neaktivirani alel, a veliki broj FAP adenomova neizbežno dovodi do razvoja adenokancera putem dodatnih mutacija u onkogenima i/ili genu supresora tumora. Osim toga, aktiviranje Wnt signalnog puta, uključujući mutacije za pridobijanje funkcije u APC i β-katenin, može izazvati hiperplastični razvoj i rast tumora u modelima miša (Oshima et al., 1997, Cancer Res,. 57:1644-9; Harada et al., 1999, EMBO J., 18:5931-42). Dokument WO2008031009 opisuje Wnt antagonista koji sadrži Frizzledovu domensku komponentu iz Frizzled proteina, veznika i Fc domena i metodu tretiranja kancera koristeći Wnt antagonist.
KRATAK REZIME PRONALASKA
[0010] Kolorektalni kancer se najčešće pokreće aktiviranjem mutacija u Wnt. Pronalazak u najširem smislu je definisan u nezavisnim patentnim zahtevima. Tako pronalazak obezbeđuje polipeptid koji sadrži: (i) Wnt-vezujući agens koji sadrži sekvencu amino kiseline SEQ ID Br: 53; i (ii) signalnu sekvenca izabranu iz grupe koju čine: SEQ ID Br: 72, SEQ ID N0: 70, SEQ ID Br: 71, SEQ ID Br: 73 i SEQ ID Br: 74. Pronalazak dalje daje polinukleotid koji sadrži polinukleotid koji kodira navedeni polipeptid, i ćeliju koja proizvodi navedeni polipeptid ili sadrži naveden polinukleotid. Dalje, pronalazak obezbeđuje sastav koji sadrži Wnt-vezujući agens koji sadrži sekvencu amino kiseline SEQ ID Br: 53, gde najmanje 80% navedenog Wnt-vezujućeg agensa ima N-terminalnu sekvencu amino kiseline Ala Ser Ala (ASA); gde sastav može biti farmaceutski sastav koji sadrži farmaceutski prihvatljiv nosač. Pronalazak takođe sadrži navedeni sastav za upotrebu pri tretiranju kancera ili za primenu pri tretiranju bolesti vezane sa kanoničkom aktivacijom Wnt signala. Pronalazak takođe daje in vitro metodu za proizvodnju takvog sastava, pri čemu navedena metoda sadrži ekspresiju u ćeliji polipeptida koji sadrži SEQ ID Br: 53 i signalnu sekvencu izabranu iz grupe koju čine: SEQ ID Br: 72, SEQ ID N0: 70, SEQ ID Br: 71, SEQ ID Br: 73 i SEQ ID Br: 74, pri čemu najmanje oko 80% Wntvezujućeg agensa proizvedenog u ćeliji ima N-terminalnu sekvencu amino kiselina Ala Ser Ala (ASA). Takođe se daje pronalaskom in vitro metoda proizvodnje Wnt-vezujućeg polipeptida koji sadrži sekvencu amino kiseline SEQ ID Br: 53, metoda koji sadrži: (i) ekspresiju u ćeliji domaćina polipeptida koji sadrži Wnt-vezujući agens koji sadrži sekvencu amino kiselina SEQ ID Br: 53 i signalnu sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID Br: 72, SEQ ID N0: 70, SEQ ID Br: 71, SEQ ID Br: 73 i SEQ ID Br: 74, u uslovima u kojima se signalna sekvenca odvaja od strane ćelije domaćina; i prečišćavanje Wnt-vezujućeg polipeptida SEQ ID Br: 53, kao i Wnt-vezujući polipeptid koji sadrži sekvencu amino kiseline SEQ ID Br: 53 i proizveden tom metodom. Sadašnje obelodanjivanje obezbeđuje različite agense koji se vezuju za jedan ili više ljudskih Wnt proteina, uključujući, ali bez ograničenja, rastvorljive FZD receptore i druge agense koji sadrže Fri domen i metode korišćenja tih agenasa. Obelodanjivanje dalje daje metode upotrebe agenasa pri tretiranju kancera davanjem agensa subjektu kojem je to potrebno. U nekim aspektima, metode uključuju inhibiranje rasta ćelija kancera. Wnt-vezujući agens je Wnt antagonist. Takođe su opisane nove skrining metode za takve Wnt-vezivne agense. Polinukleotidi koji kodiraju agense, metode izrade agensa i razne kompozicije koje sadrže agense, takođe su date.
[0011] Tako, u jednom aspektu, obelodanjivanje daje metodu inhibiranja rasta tumora. U određenim aspektima, metoda obuhvata dovođenje tumora u kontakt sa efektivnom količinom agensa koji se vezuje za jedan ili više Wnt protein (npr., ljudski Wnt protein). Metoda može biti in vivo ili in vitro. U određenim aspektima, tumor je u subjektu, a dovođenje tumora u kontakt sa agensom obuhvata davanje terapeutski efektivne količine Wnt-vezujućeg agensa subjektu.
[0012] U drugom aspektu, obelodanjivanje daje metodu za smanjenje učestalosti matičnih ćelija kancera u tumoru koji sadrži matične ćelije kancera. Shodno tome, obelodanjivanje takođe obezbeđuje metode smanjivanja tumorigencije tumora. U nekim aspektima, metode obuhvataju dovođenje tumora u kontakt sa efektivnom količinom agensa koji se vezuje za jedan ili više Wnt proteina (npr., ljudski Wnt proteini). Metoda može biti in vivo ili in vitro. Na primer, dovođenje u kontakt može sadržati davanje efektivne količine Wnt-vezujućeg agensa čoveku koji ima tumor.
[0013] U drugom aspektu, obelodanjivanje daje metod za indukovanje ćelija u tumoru radi diferenciranja ili indukovanja ekspresije markera diferencijacije u tumoru. U određenim aspektima, metoda obuhvata dovođenje tumora u kontakt sa efektivnom količinom agensa koji se vezuje za jedan ili više Wnt proteina (npr., ljudske Wnt proteine). Metoda može biti in vivo ili in vitro.
[0014] U još jednom aspektu, obelodanjivanje obezbeđuje metodu tretiranja kancera kod subjekta, koji obuhvata davanje terapeutski efektivne količine Wnt-vezujućeg agensa subjektu.
[0015] U dodatnom aspektu, obelodanjivanje obezbeđuje metodu tretiranja bolesti kod subjekta kod koga je bolest vezana sa aktivacijom Wnt signala, koja obuhvata davanje terapeutski efektivne količine Wnt-vezujućeg agensa subjektu.
[0016] U još jednom aspektu, obelodanjivanje obezbeđuje metodu tretiranja poremećaja kod subjekta, pri čemu je poremećaj naznačen povećanim nivoom matičnih ćelija i/ili progenitorskih ćelija, koji obuhvata davanje terapeutski efektivne količine Wnt-vezujućeg agensa subjektu.
[0017] Wnt vezujući agens je polipeptid. Agens je rastvorljivi receptor.
[0018] U navedenim aspektima, kao i drugim aspektima koji su ovde navedeni, agens sadrži Fri domen FZD receptora ili fragment FZD Fri domena koji vezuje jedan ili više Wnt proteina. U određenim aspektima, FZD receptori su ljudski FZD receptori. Na primer, Fri domen može biti iz ljudskog FZD4 ili ljudskog FZD5. U određenim alternativnim aspektima, agens može sadržati Fri domen ljudskog FZD8 receptora ili fragment tog domena Fri koji vezuje jedan ili više Wnt proteina. U određenim aspektima, Wnt-vezujući agens je rastvorljiv FZD receptor. U alternativnim aspektima, Wnt-vezujući agens ne obuhvata Fri domen FZD receptora.
[0019] Agens za vezivanje Wnt (pre raspada signalne sekvence) sadrži SEQ ID Br: 53 i signalnu sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID Br: 70, SEQ ID Br: 71, SEQ ID Br: 72, SEQ ID Br: 73, i SEQ ID Br: 74. U nekim otelotvorenjima, Wnt-vezujući agens (pre raspada signalne sekvence) sadrži SEQ ID Br: 53 i SEQ ID Br: 71.
[0020] U određenim aspektima svakog od prethodno navedenih aspekata, kao i drugih aspekata koji su ovde navedeni, Wnt-vezujući agens se vezuje za jedan ili više, dva ili više, tri ili više ili četiri ili više ljudskih Wnt proteina izabranih iz grupe koja se sastoji iz Wnt1, Wnt2, Wnt2b, Wnt3, Wnt3a, Wnt7a, Wnt7b, Wnt8a, Wnt8b, Wnt10a i Wnt10b. U određenim otelotvorenjima, agens se vezuje za Wnt1, Wnt2, Wnt3, Wnt3a i Wnt7b.
[0021] Agens je Wnt antagonist. U određenim otelotvorenjima, agens inhibira Wnt signaliziranje. U određenim aspektima, agens inhibira Wnt kanoničko Wnt signaliziranje.
[0022] U određenim otelotvorenjima svakog od prethodno navedenih aspekata, kao i drugih aspekata koji su ovde navedeni, tumor ili kancer je tumor/kancer izabran iz grupe koju čine kolorektalni tumor/kancer, tumor/kancer pankreasa, tumor/kancer pluća, tumor/kancer jajnika, tumora/kancer jetre, tumor/kancer dojke, tumor/kancer bubrega, tumor/kancer prostate, gastrointestinalni tumor/kancer, melanom, tumor/kancer grlića materice, tumor mokraćne bešike, glioblastom i tumor/kancer glave i vrata.
[0023] U određenim aspektima svakog od prethodno navedenih aspekata, kao i drugih aspekata koji su ovde navedeni, metode dalje obuhvataju dovođenje tumora u kontakt sa drugim terapeutskim agensom ili davanje drugog terapeutskog agensa subjektu. U nekim otelotvorenjima, drugi terapeutski agens je hemoterapeutski agens. U određenim otelotvorenjima, drugi hemoterapeutski agens je antimetabolit (npr., gemcitabin) ili antimitotski agens (na primer, taksan kao što je paklitaksel).
KRATAK OPIS CRTEŽA/SLIKA
[0024]
Slika 1. Farmakokinetika FZD8-Fc (54F03) kod pacova. Upotreba pojedinačne doze (10 mg/kg) FZD8-Fc praćena je procenom farmakokinetskih osobina FZD8-Fc. Koncentracije seruma FZD8-Fc su određene pri 1, 24, 48, 72, 96, 168, 240 i 336 časova.
Slika 2. Inhibicija rasta tumora pankreasa PN4 pomoću FZD8-Fc (54F03) tretiranja. PN4 pankreas tumorske ćelije su injektirane subkutano u NOD/SCID miševe. Miševi su tretirani sa FZD8-Fc (-▲-), gemcitabinom (-■-), kombinacijom FZD8-Fc i gemcitabina (-Δ-) ili kontrolnim antitelom (-●-). Podaci se prikazuju kao zapremina tumora (mm<3>), tokom dana nakon tretiranja.
Slika 3. Redukcija populacije CD44hi ćelija u tumorima PN4 tretiranim sa FZD8-Fc (54F03). Oboljenje površine ćelija za ESA i CD44 na tumorskim ćelijama tretiranim kontrolnim antitelom, FZD8-Fc, gemcitabinom ili kombinacijom FZD8Fc i gemcitabina. Za svaku grupu tretiranja, suspenzije pojedinačnih ćelija iz pet tumora bile su objedinjene pre bojenja.
Slika 4. In vivo ograničavanje analize razređivanja FZD8-Fc (54F03)-obrađenih PN4 pankreasnih tumora.
Slika 5. Povećana diferencijacija ćelija tumora pankreasa PN4 tretiranih sa FZD8-Fc (54F03). Parafinski ugrađeni delovi tumora PN4 tretirani kontrolnim antitelom, FZD8-Fc, gemcitabinom ili kombinacijom FZD8-Fc i gemcitabina obojeni su alcijanskom plavom, da bi se otkrile ćelije koje vrše ekspresiju mucina.
Slika 6. Povećana diferencijacija ćelija tumora pankreasa PN8 tretiranih sa FZD8-Fc (54F03). Parafinski ugrađeni delovi tumora PN8 tretirani kontrolnim antitelom, FZD8-Fc, gemcitabinom ili kombinacijom FZD8-Fc i gemcitabina su obojeni alcijanskom plavom za otkrivanje ćelija koje vrše ekspresiju mucina.
Slika 7. Povećana diferencijacija ćelija i smanjena proliferacija kod tumora pankreasa PN13 posle tretiranja sa FZD8-Fc (54F03). Parafinski ugrađeni delovi tumora PN13 tretirani kontrolnim antitelom ili FZD8-Fc su obojeni alcijanskom plavom za otkrivanje ćelija koje vrše ekspresiju mucina. Pored toga, sekcije su obojene za Ki67, marker aktivno proliferujućih ćelija.
Slika 8. Povećano Muc16 bojenje u tumorima pankreasa PN13 posle tretiranja sa FZD8-Fc (54F03). Parafinski ugrađeni delovi tumora PN13 tretirani kontrolnim antitelom ili FZD8-Fc su obojeni za Muc 16 protein.
Slika 9. Povećano bojenje CK20 u tumorima pankreasa PN13 nakon tretiranja sa FZD8-Fc (54F03). Parafinski ugrađeni delovi tumora PN13 tretirani kontrolnim antitelom ili FZD8-Fc su obojeni za CK20 protein.
Slika 10. Inhibicija rasta tumora dojke PE13 posle tretiranja sa FZD8-Fc (54F03) u kombinaciji sa paklitakselom. PE13 ćelije tumora dojke su subkutano injektirane u NOD/SCID miševe. Miševi su tretirani sa kontrolnim antitelom (-●-), FZD8-Fc (□), paklitakselom (-▲-) ili kombinacijom FZD8-Fc i paklitaksela (-○-). Podaci se prikazuju kao zapremina tumora (mm<3>) tokom dana nakon tretiranja.
Slika 11. inhibicija rasta C28 tumora zavisna od doze sa FZD8-Fc (54F03). C28 ćelije tumora debelog creva su subkutano injektirane u NOD/SCID miševe. Miševi su tretirani sa FZD8-Fc 1.5mg/kg dva puta nedeljno (-▲-), 5mg/kg jednom nedeljno (-▼-), 5mg/kg dva puta nedeljno (-○-), 15mg/kg jednom nedeljno (-□-) ili 15 mg/kg dvaput nedeljno (-Δ-) ili kontrolnim antitelom (-■-). Podaci se prikazuju kao zapremina tumora (mm<3>) tokom dana nakon tretiranja (slika 11A). Inhibicija rasta tumora debelog creva sa FZD8-Fc u kombinaciji sa irinotekanom. Miševi su tretirani sa FZD8-Fc (-▲-), irinotekanom (-▼-), kombinacijom FZD8-Fc i irinotekana (-●-) ili kontrolnim antitelom (-■-). Podaci se prikazuju kao zapremina tumora (mm3) tokom dana nakon tretiranja (slika 11B).
Slika 12. Povećano bojenje CK20 u C28 tumorima nakon tretiranja sa FZD8-Fc (54F03). Parafinski ugrađeni delovi C28 tumora koji su tretirani kontrolnim antitelom ili FZD8-Fc su obojeni za CK20 protein.
Slika 13. Inhibicija rasta tumora pankreasa PN21 i smanjenje frekvencije matičnih ćelija kancera pomoću FZD8-Fc (54F03) tretiranja. PN21 pankreasne tumorske ćelije su injektirane subkutano u NOD/SCID miševe. Miševi su tretirani sa FZD8-Fc (-▼-), gemcitabinom -▲-), kombinacijom FZD8-Fc i gemcitabina (-■-) ili kontrolnim antitelom (-●-). Podaci se prikazuju kao zapremina tumora (mm<3>), tokom dana nakon tretiranja (slika 13A). In vivo ograničavajući test razblaženja FZD8-Fc lečenih PN21 tumorima pankreasa (Slika 13B).
Slika 14. Povećana diferencijacija ćelija tumora pankreasa PN21 posle tretiranja sa FZD8-Fc (54F03). Parafinski ugrađeni delovi tumora PN21 tretirani kontrolnim antitelom ili FZD8-Fc su obojeni alcijanskom plavom za detekciju mucina.
Slika 15. Povećana diferencijacija ćelija i smanjena proliferacija tumora pankreasa PN21 nakon tretiranja sa FZD8-Fc (54F03). Parafinski ugrađeni delovi tumora PN21 tretirani kontrolnim antitelom, FZD8-Fc, gemcitabinom ili kombinacijom FZD8-Fc i gemcitabina su obojili alcijanskom plavom za detekciju mucina. Pored toga, sekcije su obojane za Ki67, marker aktivno proliferujućih ćelija.
Slika 16. Farmakokinetika varijanti FZD8-Fc kod majmuna. Upotreba pojedinačne doze (30 mg/kg) FZDB-Fc varijanti 54F15 i 54F16 bila je praćena procenom farmakokinetskih osobina varijanti. Koncentracije seruma od 54F15 (-○-) i 54F16 (-♦-) su određene na 1, 6, 12, 24, 48, 72, 96, 168, 240 i 336 satu nakon primene.
Slika 17. Inhibicija rasta C28 tumora debelog creva posle tretiranja sa varijantama FZD8-Fc. Ćelijske tumorske ćelije C28 su subkutano injektirane u NOD/SCID miševe. Miševi su tretirani kontrolnim antitelom (-X-), 54F03 (-□-), 54F09 (-▲-), 54F12 (-▼-), 54F13 (-♦-), 54F15 (-○-) ili 54F16 -Δ-). Podaci se prikazuju kao zapremina tumora (mm<3>) tokom dana nakon tretiranja.
Slika 18. Inhibicija rasta tumora pankreasa PN4 posle tretiranja sa varijantama FZD8-Fc. PN4 ćelije tumora debelog creva su subkutano injektirane u NOD/SCID miševe. Miševi su tretirani kontrolnim antitelom (-●-), 54F03 (-■-), 54F09 (-▼-), 54F12 (-○-), 54F13 (-▲-), 54F15 (-□-) ili 54F16 -♦-). Podaci se prikazuju kao zapremina tumora (mm<3>) tokom dana nakon tretiranja.
Slika 19. Redukcija CD44<hi>i CD44<+>CD201<+>ćelija u tumorima PN4 tretiranih sa FZD8-Fc varijantama 54F03 i 54F16. Površinska obrada ćelija za ESA, CD44 i CD201 na tumorskim ćelijama tretirane kontrolnim antitelom, varijanta FZD8-Fc 54F03 ili varijantom 54F16 je izvršena i analizirana FACS.
Slika 20. Karakterizacija N-termini FZD8-Fc proteina. FZD8-Fc varijante su analizirane masenom spektrometrijom i prikazani su rezultati za 54F16 (Slika 20A), 54F26 (Slika 20B), 54F28 (Slika 20C), 54F30 (Slika 20D) i 54F32 (Slika 20E).
Slika 21. Inhibicija rasta C28 tumora debelog creva posle tretiranja sa varijantama FZD8-Fc. C28 ćelije tumora debelog creva su subkutano injektirane u NOD/SCID miševe. Miševi su tretirani kontrolnim antitelom (-■-), 54F03 (-Δ-), 54F23 -▼-) ili 54F26 (-○-). Podaci se prikazuju kao zapremina tumora (mm3) tokom dana nakon tretiranja.
DETALJAN OPIS PRONALASKA
[0025] Pronalazak u najširem smislu je opisan u nezavisnim patentnim zahtevima
[0026] Dato obelodanjivanje daje nove agense, uključujući, ali ne ograničavajući se na, polipeptide koji sadrže Fri domen ljudskih Frizzled (FZD) receptora, ljudskih sekretiranih Frizzled vezanih proteina (SFRP) ili Ror proteina koji se vezuju za jedan ili više ljudskih Wnt. Srodni polipeptidi i polinukleotidi, sastavi koji sadrže Wnt vezujuće agense, kao i metode izrade Wnt-vezujućih agenasa takođe su dati. Dalje su dati načini upotrebe Wnt-vezivnih agenasa, kao što su metode inhibicije rasta tumora, tretiranje kancera, induciranje diferencijacije i smanjenje tumorigencije. Takođe su date i skrining metode za identifikaciju novih Wnt-vezujućih agenasa sa anti-tumorskom aktivnošću i/ili aktivnošću antikancerogenih ćelija.
[0027] Wnt-vezujući agens koji sadrži Fri domen ljudskog FZD8 i Fc domena je proizveden i ovde je označen kao FZD8-Fc ili FZD8-Fc (54F03) (Primer 1). Izvedeno je više varijanti FZD8-Fc proteina (Primer 10). Izrađeni su FZD8-Fc proteini koji su pokazali da su približno 95% ili više homogeni u N-krajevima (Primer 16). Farmakokinetska ispitivanja uz pomoć nekoliko varijanti FZD8-Fc su urađena kod pacova koji pokazuju da je polu raspad FZD8-Fc varijanti bilo najmanje 100 sati (Primeri 2 i 12, Slika 1 i Tabela 4). Farmakokinetsko ispitivanje je sprovedeno kod majmuna sa varijantama FZD8-Fc 54F15 i 54F16, što je pokazalo da su ovi proteini imali polu-raspad od najmanje 100 sati (Primer 13 i Tabela 5). Pokazano je da tretiranje sa FZD8-Fc (54F03) bilo samo ili u kombinaciji sa hemoterapeutskim agensom smanjuje rast tumora pankreasa, tumora dojke i tumora debelog creva (Primeri 3, 5, 6 i 8 i Slike 2, 10, 11B, i 13A). Pored toga, pokazalo se da se terapija smanjuje procenat CD44<+>ćelija i smanjuje učestalost matičnih ćelija kancera u pankreasnom modelu (primeri 3 i 8 i slike 3, 4 i 13B). Pokazano je da tretiranje sa FZD8-Fc (54F03) bilo samim ili u kombinaciji sa hemoterapeutskim agensom povećava ćelijsku diferencijaciju ćelija tumora pankreasa i ćelija tumora ćelija (Primeri 4, 7 i 9 i Slike 5-9, 12, 14 i 15). Tretman sa FZD8-Fc varijantama demonstrirao je inhibiciju rasta tumora debelog creva i tumora pankreasa, sa stepenom inhibicije u zavisnosti od varijante (primeri 14, 15 i 17 i slike 17, 18 i 21). Pokazano je da tretiranje sa FZD8-Fc varijantom 54F03 i varijantom 54F16 smanjuje procenat CD44<hi>ćelija, kao i CD44<+>CD202<+>ćelije u tumorima pankreasa (Primer 15 i Slika 19).
I. Definicije
[0028] Termin „antagonist“ se ovde koristi da uključi bilo koji molekul koji delimično ili potpuno blokira, inhibira ili neutrališe ekspresiju ili biološku aktivnost proteina (npr. marker matičnih ćelija karcinoma). Blokiranje, inhibiranje i/ili neutralizacija biološke aktivnosti uključuje, ali nije ograničena na, inhibiciju rasta tumora. Termin „antagonist“ uključuje svaki molekul koji delimično ili potpuno blokira, inhibira ili neutrališe biološku aktivnost Wnt puta. Pogodni antagonistički molekuli uključuju, ali nisu ograničeni na, fragmente i/ili varijante sekvenci amino kiselina izvornih proteina FZD receptora, uključujući rastvorljive FZD receptore, kao i derivate SFRP i derivate Ror proteina.
[0029] Polipeptid, antitelo, polinukleotid, vektor, ćelija ili sastav koji je „izolovan“ je polipeptid, antitelo, polinukleotid, vektor, ćelija ili sastav koji je u obliku koji se ne nalazi u prirodi. Izolovani polipeptidi, antitela, polinukleotidi, vektori, ćelije ili sastavi uključuju one koji su prečišćeni u tolikoj meri da nisu više u obliku u kome se nalaze u prirodi. U nekim otelotvorenjima, antitelo, polinukleotid, vektor, ćelija ili sastav koji je izolovan je u suštini čista.
[0030] Kao što je ovde korišćeno, „suštinski čist“ odnosi se na materijal koji je najmanje 50% čist (tj. bez zagađujućih materija), poželjnije najmanje 90% čist, poželjnije najmanje 95% čist, poželjnije najmanje 98% čist, poželjnije najmanje 99% čist.
[0031] Kao što je ovde korišćeno, termin „rastvorljivi receptor“ odnosi se na N-terminalni vanćelijski fragment proteina receptora koji prethodi prvom transmembranskom domenu receptora koji se može izlučiti iz ćelije u rastvorljivom obliku. U nekim otelotvorenjima, receptorski protein je FZD receptor. U nekim otelotvorenjima, receptorski protein je Ror receptor.
[0032] Kako je ovde korišćeno termin „FZD rastvorljivi receptor“ se odnosi na N-terminalni vanćelijski fragment ljudskog FZD receptora protein koji prethodi prvom transmembranski domen receptora koja se može izlučuju ćelije u rastvoreni oblik. Oba FZD rastvorljiva receptora sadrže ceo N-terminalni vanćelijski domen (ECD) (ovde označen kao „FZD ECD“) kao i manji fragmenti su predviđeni. FZD rastvorljivi receptori koji sadrže Fri domen (ovde se nazivaju „FZD Fri“) takođe su otkriveni. FZD Fri rastvorljivi receptori mogu pokazati izmenjenu biološku aktivnost, (npr., povećan polu raspad proteina) u poređenju sa rastvorljivim receptorima koji sadrže čitav FZD ECD. Polu raspad proteina može se dodatno povećati kovalentnom modifikacijom polietilenglikola (PEG) ili polietilen oksida (PEO). FZD rastvorljivi receptori uključuju FZD ECD ili Pet domena vezan u ramu sa drugim funkcionalnim i strukturalnim proteinima, uključujući, ali ne ograničavajući na, ljudski Fc region (npr. ljudski Fc izveden iz imunoglobuline IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgD, IgE ili IgM); oznake proteina (npr., myc, FLAG, GST); druge endogene proteine ili fragmenti proteina; ili bilo koju drugu korisnu proteinsku sekvencu koja uključuje bilo koji veznik region između FZD ECD ili Fri domena i vezanog proteina. U određenim otelotvorenjima, domen Fria FZD receptora je direktno vezan sa ljudskim regionom Fc. U određenim otelotvorenjima, Fri domen FZD receptora je vezan sa ljudskim IgG1 Fc (ovde označen kao „FZD Fri.Fc“). U nekim otelotvorenjima, domen Fria FZD receptora vezan je za ljudski Fc region sa peptidnim veznikom. FZD rastvorljivi receptori takođe uključuju varijante proteina koji sadrže amino kiselinsko unošenje, brisanje, supstitucije i/ili konzervativne supstitucije.
[0033] Kao što je ovde korišćeno, termin „veznik“ ili „oblast vezivanja“ odnosi se na veznik ubačen između prvog polipeptida (npr., FZD komponente) i drugog polipeptida (npr., regiona Fc). U nekim otelotvorenjima, veznik je peptidni veznik. Veznici ne bi trebalo da negativno utiču na ekspresiju, sekreciju ili bioaktivnost polipeptida. Poželjno, veznici nisu antigeni i ne izazivaju imunološki odgovor.
[0034] Kao što je ovde korišćeno, termini „kancer“ i „kancerogen“ odnose se na ili opisuju fiziološko stanje kod sisara u kojima se populacija ćelija karakteriše neregulisanim rastom ćelija. Pod pojmom kancer obuhvaćeni su Wnt-zavisni kanceri. Primeri kancera uključuju, ali nisu ograničeni na karcinom, limfom, blastom, sarkom i leukemiju. Posebniji primeri takvih kancera su kancer pljuvačnih ćelija, kancer malih ćelija pluća, kancer velikih ćelija pluća, adenokarcinom pluća, skvamozni kancer pluća, kancer peritoneuma, hepatocelularni kancer, gastrointestinalni kancer, kancer pankreasa, glioblastom, grlić materice, kancer jajnika, kancer jetre, kancer mokraćne bešike, hepatoma, kancer dojke, kancer debelog creva, kolorektalni karcinom, kancer kože, melanom, endometrijum ili kancer materice, kancer pljuvačke žlezde, kancer bubrega, kancer jetre, kancer prostate, hepatičnog kancera i različitih vrsta kancera glave i vrata.
[0035] Izrazi „proliferativni poremećaj“ i „proliferativna bolest“ odnose se na poremećaje vezane sa abnormalnom proliferacijom ćelija kao što je kancer.
[0036] „Tumor“ i „neoplazma“, kako se ovde koriste, odnose se na bilo koju masu tkiva koja je posledica prekomernog rasta ćelija ili proliferacije, bilo benignih (nekancerogenih) ili malignih (kancerogenih) uključujući pred-kancerogene lezije. U određenim otelotvorenjima, tumor je epitelni tumor. U određenim otelotvorenjima, tumor je Wnt-zavisni tumor.
[0037] Kao što je ovde korišćeno, izraz „subjekt“ odnosi se na bilo koju životinju (npr. sisara), uključujući, ali ne ograničavajući se na ljude, neljudske primate, pse, mačke, glodare i slično, koji će biti primaoci posebnog tretiranja. Uobičajeno, termini „subjekt“ i „pacijent“ se naizmenično koriste ovde u vezi sa ljudskim subjektom.
[0038] Izrazi „matične ćelije kancera“ i „CSC“ i „matične ćelije tumora“ i „matične ćelije čvrstog tumora“ se ovde naizmenično koriste i odnose se na populaciju ćelija čvrstog tumora koji: (1) imaju veliki proliferativni kapacitet; (2) sposobni su za asimetričnu podelu ćelija i da generišu jednu ili više vrsta diferenciranih potomaka sa smanjenim proliferativnim ili razvojnim potencijalom; i (3) sposobni su za simetričnu podelu ćelija za samoobnavljanje ili samoodržavanje. Ove osobine „matičnih ćelija kancera“, „CSC“, „matičnih ćelija tumora“ ili „matičnih ćelija čvrstih tumora“ daju onim matičnim ćelijama kancera mogućnost formiranja palpabilnih tumora na serijskoj transplantaciji u imunokompromitovanom domaćinu (npr. mišu ) u poređenju sa većinom ćelija tumora koje ne uspevaju da stvore tumore. Matične ćelije kancera podležu samoobnavljanju u odnosu na različitosti na haotičan način da bi se formirali tumori sa abnormalnim tipovima ćelija koje se mogu menjati tokom vremena kako se pojavljuju mutacije.
[0039] Izrazi „ćelije kancera“ i „tumorske ćelije“ i gramatički ekvivalenti odnose se na ukupnu populaciju ćelija izvedenih iz tumora uključujući i ne-tumorigenske ćelije, koje čine većinu populacije ćelija tumora, a tumorigenske matične ćelije koje se ovde pominju kao matične ćelije kancera.
[0040] Termin „tumorigeni“ odnosi se na funkcionalne osobine čvrste matične ćelije tumora uključujući i osobine samoobnavljanja (što dovodi do dodatnih tumorigenih matičnih ćelija kancera) i proliferaciju da generišu sve druge tumorske ćelije (što dovodi do diferencijacije i, prema tome, tumorigene tumorske ćelije) koje omogućavaju čvrste tumorske matične ćelije da formiraju tumor. Ove osobine samoobnavljanja i proliferacije da bi se generisale sve druge tumorske ćelije prenose matičnim ćelijama kancera sposobnost formiranja palpabilnih tumora nakon serijske transplantacije u imunokompromitovanom domaćinu (npr. miš) u poređenju sa netumorogenim tumorskim ćelijama koje ne mogu da formiraju tumore nakon serijske transplantacije. Uočeno je da netumorogene tumorske ćelije mogu formirati tumor nakon primarne transplantacije u imunokompromitovanom domaćinu (npr. miš) nakon dobijanja ćelija tumora iz čvrstog tumora, ali one netumorogene tumorske ćelije ne izazivaju tumor na serijskoj transplantaciji.
[0041] Kao što je ovde korišćeno, „prihvatljiv farmaceutski nosač“ ili „farmaceutski prihvatljiv nosač“ odnosi se na bilo koji materijal, koji, u kombinaciji sa aktivnim sastojkom farmaceutskog sastava, kao što je terapeutski polipeptid, dozvoljava terapeutskom polipeptidu, na primer, da zadrži svoju biološku aktivnost. Pored toga, „prihvatljiv farmaceutski nosač“ ne pokreće imunološki odgovor u subjektu primaoca. U nekim otelotvorenjima, termin „farmaceutski nosač“ zamenjuje se sa „farmaceutskim nosačem“. Primeri uključuju, ali nisu ograničeni na, bilo koji od standardnih farmaceutskih nosača, kao što jeposfatni pufer fiziološkog rastvora, voda i razne emulzije ulja/vode. Primeri razblaživača za aerosol ili parenteralnu primenu su fiziološki rastvor fiziološki ili fiziološki (0,9%) fiziološki rastvor.
[0042] Termin „terapeutski efektivna količina“ odnosi se na količinu agensa (na primer, rastvorljivog receptora ili drugog leka) koja je efektivna pri „tretiranju“ bolesti ili poremećaja kod subjekta ili sisara. U slučaju kancera, terapeutski efektivna količina agensa (npr., rastvorljivog receptora) može smanjiti broj ćelija kancera; smanjiti veličinu tumora; smanjiti frekvenciju kancera matičnih ćelija; inhibirati i/ili zaustaviti infiltracije ćelija kancera u periferne organe; inhibirati i/ili zaustaviti metastazu tumora; inhibirati i/ili zaustaviti rast tumora; i/ili u određenoj meri osloboditi jedan ili više simptoma vezanih sa kancerom. U meri u kojoj agens (npr., rastvorljiv receptor) sprečava rast i/ili briše postojeće ćelije kancera, može se nazvati citostatskim i/ili citotoksičnim.
[0043] Kao što se ovde koristi, termin „inhibiraju rast tumora“ odnosi se na bilo koji mehanizam pomoću koga se rast ćelija tumora može inhibirati. U određenim otelotvorenjima, rast ćelija tumora je inhibiran usporavanjem proliferacije ćelija tumora. U određenim otelotvorenjima, rast ćelija tumora je inhibiran zaustavljanjem proliferacije ćelija tumora. U određenim aspektima, rast tumora ćelija je inhibiran brisanjem ćelija tumora. U određenim otelotvorenjima rast ćelija tumora je inhibiran induciranjem apoptoze ćelija tumora. U određenim otelotvorenjima, rast ćelija tumora je inhibiran induciranjem diferencijacije ćelija tumora. U određenim otelotvorenjima rast ćelija tumora je inhibiran lišenjem ćelija tumora hranljivih materija. U određenim otelotvorenjima, rast tumora ćelija je inhibiran sprečavanjem migracije ćelija tumora. U određenim otelotvorenjima, rast ćelija tumora je inhibiran sprečavanjem invazije ćelija tumora.
[0044] Termini kao što su „tretirati“ i „tretiranje“ i „da se tretira“ i „ublažavanje“ i „da se ublaži“ odnose se na 1) terapeutske mere koje leče, usporavaju, smanjuju simptome i/ili zaustavljaju progresiju dijagnostikovanog patološkog stanja ili poremećaja, i 2) profilaktičke ili preventivne mere koje sprečavaju ili usporavaju razvoj ciljanog patološkog stanja ili poremećaja. Stoga, oni koji trebaju tretiranje uključuju one koji već imaju poremećaj; oni koji su skloni da imaju poremećaj; i oni u kojima je poremećaj sprečen. U određenim otelotvorenjima, subjekat se uspešno „leči“ od kancera u skladu sa metodama prema ovom pronalasku ako pacijent pokazuje jedno ili više od sledećih: smanjenje broja ili potpunog odsustva kancera ili ćelija tumora; smanjenje veličine tumora; inhibicija ili odsustvo infekcije tumora ili kancera tumora u periferne organe uključujući, na primer, širenje kancera u mekom tkivu i kost; inhibicija ili odsustvo tumorskih metastaza; inhibicija ili odsustvo tumora ili kancera; olakšanje jednog ili više simptoma vezanih sa specifičnim kancerom; smanjenje morbiditeta i mortaliteta; poboljšanje kvaliteta života; smanjenje tumorogeneze, tumorgenske frekvencije ili tumorgenskog kapaciteta tumora; smanjenje broja ili učestalosti matičnih ćelija kancera u tumoru; diferencijacija tumorigenskih ćelija u ne-tumorigenskih stanja; ili neke kombinacije ovih efekata.
[0045] Kako je ovde korišćeno, termini „polinukleotid“ i „nukleinska kiselina“ odnose se na polimer koji se sastoji od više nukleotidnih jedinica (ribonukleotid ili deoksiribonukleotid ili srodne strukturne varijante) vezanih preko fosfodiestarskih veza, uključujući ali ne ograničavajući se na, DNK ili RNK. Izraz obuhvata sekvence koje uključuju bilo koji od poznatih baznih analoga DNK i RNK, uključujući, ali ne ograničavajući se, 4-acetilcitozin, 8-hidroksi-N6-metiladenozin, aziridinilcitozin, pseudoisocitozin, 5-(karbokihidrokil-metil) uracil, 5-fluorouracil, 5-bromuracil, 5-karboksimetilaminometil-2-tiuracil, 5-karboksimetil-aminometiluracil, dihidrouracil, inozin, N6-izopentenladenin, 1-metiladenin, 1-metilpseudo-uracil, 1-metilgvanin, dimetil-guanin, 2-metiladenin, 2-metilguanin, 3-metilcitozin, 5-metilcitozin, N6-metiladenin, 7-metilguanin, 5-metilaminomethiluracil, 5-metoksi-amino-metil-2-tiouracil, beta D-mannosilkueozin, 5’-metoksikarbonilmetiluracil, 5-metoksiuricil, 2-metiltio-N6-izopentenladenin, metilester uracil-5-oksiocetnu kiselinu, uracil-5-oksiocetnu kiselinu, oksibutoksozin, pseuduracil, kueozin, 2-tiocitozin, 5-metil-2-tiouracil, 2-tiouracil, 4-tiouracil, 5-metiluracil, metilester N-uracil-5-oksiocetnu kiselinu, uracil-5oksicetnu kiselinu, pseudouracil, kueozin, 2-tiocitozin, i 2,6-diaminopurin. Sekvence nukleotida mogu biti prekinute sa ne-nukleotidnim komponentama. Polinukleotid se može dalje modifikovati nakon polimerizacije, kao što je konjugacija sa označavajućom komponentom. Druge vrste modifikacija uključuju, na primer, „čepove“; zamena jednog ili više prirodnih nukleotida sa analogom; internukleotidne modifikacije poput nenaelektrisanih veza (npr, metil fosfonata, fosfotriestre, fosfoamidati, karbamata, itd) i naelektrisanih veza (npr, fosforotioati, fosforoditioati, itd); prateće grupe, kao što su proteini (npr. nukleaze, toksini, antitela, signalni peptidi, poli-L-lizinom, itd); interkalatori (npr. akridin, psoralen, itd.); helatore (npr. metali, radioaktivni metali, bor, oksidativni metali, itd.); alkilatore; modifikovane veze (npr., alfa anomerne nukleinske kiseline, itd.); kao i nemodifikovane forme polinukleotida. Dalje, bilo koja hidroksilna grupa obično prisutna u šećerima može biti supstituisana, na primer, fosfonatnim grupama, koje su zaštićene standardnim zaštitnim grupama ili aktivirane za dobijanje dodatnih veza sa dodatnim nukleotidima, ili mogu biti konjugovane za čvrste nosače. 5’ i 3’ terminalni OH mogu biti fosforilovani ili supstituisani sa aminima ili grupama organskih ograničavajućih grupa od 1 do 20 atoma ugljenika. Ostali hidroksili mogu takođe biti derivatizovani u standardne zaštitne grupe. Polinukleotidi mogu takođe sadržati analogne oblike šećera riboze ili deoksiriboze koji su generalno poznati u struci, uključujući, na primer, 2’-O-metil-, 2’-O-alil, 2’fluoro- ili 2’-azido-riboza, karbociklične šećerne analoge, alfaanomerne šećere, ePRIMERne šećere kao što je arabinoza, ksiloza ili liksoza, piranozne šećere, furanozne šećeri, heptuloses, acikličnih analoge i abasic analozima nukleozida, kao što je metil ribozid. Jedna ili više fosfodiesterskih veza mogu biti supstituisane alternativnim vezujućim grupama. Ove alternativne vezujuće grupe uključuju, ali nisu ograničene na, aspekte gde je fosfat supstituisan sa P(O)S ( „tioate“), P(S)S ( „ditioate“), (O)NR2 ( „amidat“), P(O)R, P(O)oR’, CO ili CH2( „formacetal“), u kojima svaki R ili R’ je nezavisno H ili supstituisani ili nesupstituisani alkil (120 C) opciono sadrži etar (-O-) vez, aril, alkenil, cikloalkil, cikloalkenil ili araldil. Sve veze u polinukleotidu ne moraju biti identične.
[0046] Kao što je ovde korišćeno, termin „vektor“ se upotrebljava pri pozivanju na molekule nukleinske kiseline koji prenose DNK segment(e) iz jedne ćelije u drugu. Termin „vektor“ označava konstrukt koji je sposoban da isporučuje i poželjno vrši ekspresiju jednog ili više gena ili sekvenci koje su od interesa za ćeliju domaćina. Primeri vektora obuhvataju, ali nisu ograničeni na, viralne vektore, vektore ekspresije golih DNK ili RNK, plazmidne, fagemidne, kosmidne ili fagne vektore, vektore ekspresije DNK ili RNK, vezane sa katjonskim kondenzacionim agensima, i vektorima ekspresije DNA ili RNK koji su inkapsulirani u lipozomima .
[0047] Izrazi „polipeptid“ i „peptid“ i „protein“ i „proteinski fragment“ se ovde naizmenično koriste da bi se odnosili na polimer ostataka amino kiseline bilo koje dužine. Pojmovi se odnose na polimere amino kiseline u kojima je jedan ili više ostataka amino kiseline u polimeru veštački hemijski mimetik odgovarajuće prirodne amino kiseline, kao i na prirodne polimere amino kiselina i polimere amino kiselina koji se ne pojavljuju u prirodi. Polimer može biti linearan ili razgranat, može sadržati modifikovane amino kiseline i može se prekinuti ne-amino kiselinama. Termini takođe obuhvataju polimer amino kiselina koji je modifikovan prirodno ili intervencijom; na primer, formiranje disulfidnih veza, glikozilacija, lipidacija, acetilacija, fosforilacija ili bilo koja druga manipulacija ili modifikacija, kao što je konjugacija sa etiketirajućom komponentom. Takođe uključeni u definiciju su, na primer, polipeptidi koji sadrže jedan ili više analoga amino kiseline (uključujući, na primer, neprirodne amino kiseline itd.), kao i druge modifikacije poznate u struci. Razumljivo je da, pošto se polipeptidi datog pronalaska zasnivaju, barem delimično, na antitelima, u određenim otelotvorenjima, polipeptidi mogu nastati kao pojedinačni lanci ili vezani lanci.
[0048] Termin „amino kiselina“ odnosi se na prirodne i sintetičke amino kiseline, kao i na analoge amino kiselina i amino kiseline mimetike koji funkcionišu slično prirodnim amino kiselinama. Prirodne amino kiseline su one kodirane genetskim kodom, kao i one amino kiseline koje su kasnije modifikovane, npr., hidroksiprolin, gamakarboksiglutamat i O-fosfoserin. Analozi amino kiselina se odnose na jedinjenja koja imaju istu osnovnu hemijsku strukturu kao prirodnu amino kiselina, npr. alfa ugljenik koji je vezan za vodonik, karboksilnu grupu, amino grupu i R grupu, npr. homoserin, norleucin, metionin sulfoksid, metionin metil sulfonijum. Takvi analozi mogu imati modifikovane R grupe (npr., norleucin) ili modifikovane peptidne kičme, ali zadržavaju istu osnovnu hemijsku strukturu kao prirodna amino kiselina. Amino kiselina mimetik se odnosi na hemijska jedinjenja koja imaju strukturu koja se razlikuje od opšte hemijske strukture amino kiseline, ali ona funkcioniše slično prirodnoj amino kiselini.
[0049] Da se polipeptid ili drugi agens „specifično vezuje“ za protein znači da polipeptid ili drugi agens vezuje češće, brže, sa većim trajanjem, sa većim afinitetom ili sa nekom gore navedenom kombinacijom prema proteinu nego sa alternativom supstance, uključujući nevezane proteine. U određenim otelotvorenjima, „specifično vezivanje“ znači, na primer, da se agens vezuje za protein sa KDod oko 0.1mM ili manje, ali obično manje od oko 1mM. U određenim otelotvorenjima, „specifično vezivanje“ znači da se neki agens vezuje za protein u nekim slučajevima sa KD od najmanje oko 0,1 mM ili manje, najmanje oko 0,01 mM ili manje, a u drugim vremenima najmanje oko 1nM ili manje. Zbog identiteta sekvence između homolognih proteina u različitim vrstama, specifično vezivanje može uključiti agens koje prepoznaje određeni protein kao što je Wnt protein u više od jedne vrste. Isto tako, zbog homologije između različitih Wnt proteina u određenim regionima sekvenci Wnt, specifično vezivanje može uključivati polipeptid (ili drugi agens) koji prepoznaje više od jednog Wnt proteina. Razume se da agens koji se specifično vezuje za prvu metu može ili ne mora posebno vezati za drugu metu. Kao takvo, „specifično vezivanje“ ne zahteva nužno (iako može uključiti) ekskluzivno vezivanje, tj. obavezivanje na jedinstvenu metu. Prema tome, agens se u određenim otelotvorenjima specifično vezuje za više od jedne ciljane (npr., više različitih ljudskih Wnt). Generalno, ali ne i nužno, referenca na vezujuće agense za specifično vezivanje.
[0050] Izrazi „identičan“ ili „procenat identiteta“ u kontekstu dve ili više nukleinskih kiselina ili polipeptida, odnose se na dve ili više sekvenci ili podsekvence koje su iste ili imaju specifičan procenat nukleotida ili ostataka amino kiseline koje su iste, kada se uporede i podudaraju se (uvodeći praznine, ako je potrebno) za maksimalnu korespondenciju, ne uzimajući u obzir konzervativne supstitucije amino kiselina kao deo identiteta sekvence. Procenat identiteta se može izmeriti korišćenjem softvera ili algoritma za upoređivanje sekvence ili vizuelnim pregledom. Različiti algoritmi i softver koji se mogu koristiti za dobijanje poravnanja amino kiselinskih ili nukleotidnih sekvenci su poznati u struci. Jedan od takvih neograničavajućih primera algoritma poravnanja sekvence je algoritam opisan u Karlin et al, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci., 87:2264-2268, kao što je promenjeno u Karlin et al., 1993, PNAS, 90:5873-5877, i inkorporirana u programe NBLAST i XBLAST (Altschul et al., 1991, Nucleic Acids Res., 25:3389-3402). Dodatni javno dostupni softverski programi koji se mogu koristiti za usklađivanje sekvenci uključuju, ali bez ograničenja, Gapped BLAST, BLAST-2, WU-BLAST-2 (Altschul et al., 1996, Methods in Enzymology, 266:460-480), ALIGN, ALIGN-2 (Genentech, South San Francisco, California), Megalign (DNASTAR), i Bestfit program (Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, WI 53711).
[0051] U nekim otelotvorenjima dve nukleinske kiseline ili polipeptidi prema pronalasku su u suštini identični, što znači da imaju najmanje 70%, najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, a u nekim otelotvorenjima najmanje 95%, 96%, 97%, 98%, 99% nukleotida ili identiteta amino kiselina u poređenju i poravnanju za maksimalnu korespondenciju, merenu korišćenjem algoritma za upoređivanje sekvence ili vizuelnim pregledom. U nekim otelotvorenjima identitet postoji u oblasti sekvenci koja je najmanje oko 10, najmanje oko 20, najmanje oko 40-60, najmanje oko 60-80 ostataka u dužini ili bilo kojoj integralnoj vrednosti između njih. U nekim otelotvorenjima identitet postoji u dužem regionu od 60-80 ostataka, kao što je barem oko 90-100 ostataka. U nekim otelotvorenjima sekvence su u suštini identične u odnosu na punu dužinu sekvenci koje se upoređuju, kao što je kodirajuća oblast nukleotidne sekvence.
[0052] „Konzervativna supstitucija amino kiselina“ je ona u kojoj je jedan ostatak amino kiseline supstituisan sa drugim ostatkom amino kiseline koji ima sličan bočni lanac. Porodice kiselinskih ostataka amino koji imaju slične bočne lance su definisane u tehnici, uključujući bazne bočne lance (npr. lizin, arginin, histidin), kisele bočne lance (npr. asparaginsku kiselinu, glutaminsku kiselinu), nenapunjene polarne bočne lance (npr. glicin, asparagin, glutamin, serin, treonin, tirozin, cistein), nepolarne bočne lance (npr. alanin, valin, leucin, izoleucin, prolin, fenilalanin, metionin, triptofan), beta-razgranate bočne lance (npr. treonin, valin, izoleucin) i aromatične bočne lance (npr. tirozin, fenilalanin, triptofan, histidin). Na primer, supstituisanje fenilalanina za tirozin je konzervativna supstitucija. Poželjno, konzervativne supstitucije u sekvenci polipeptida i drugih agenasa iz pronalaska ne poništava vezivanje polipeptida koji sadrži sekvencu amino kiseline, na metu(ama), odnosno jedan ili više Wnt za koje se polipeptid ili drugi agens vezuje. Metode identifikacije nukleotida i amino kiselina konzervativne supstitucije koje ne eliminišu vezivanje cilja su dobro poznate u struci (vidi, npr. Brummell et al., 1993, Biochem., 32: 1180-87; Kobayashi et al., 1999, Protein Eng. 12:879-84; and Burks et al., 1997, PNAS, 94:412-17).
[0053] Kao što je ovde upotrebljeno „oko“ se odnosi na plus ili minus 10% ukazanog broja. Na primer, „oko 10%“ ukazuje na opseg od 9% do 11%.
[0054] Kao što je upotrebljeno u datom pronalasku i patentnim zahtevima, jedinstvene forme „a“ „an“ i „the“ uključuju pluralne forme osim ako kontekst ne ukazuje drugačije.
[0055] Podrazumeva se da bilo gde da su otelotvorenja opisana jezikom „sadrži“, osim ako analogna otelotvorenja opisana sa terminima „sastoji iz“ i/ili „sastoji suštinski iz“ su takođe data.
[0056] Izraz „i/ili“ koji se koristi u frazi kao što je „A i/ili B“ u ovom tekstu ima za cilj da uključi i A i B; A ili B; A (sam) i B (samo). Isto tako, izraz „i/ili“ koji se koristi u frazi kao što su „A, B i/ili C“ ima za cilj da obuhvati svaki od sledećih rešenja: A, B i C; A, B ili C; A ili C; A ili B; B ili C; A i C; A i B; B i C; A (sam); B (sam); i C (samo).
II. Wnt-vezujući agensi
[0057] Dati pronalazak daje agense koji vezuju (npr., specifično vezuju) jedan ili više ljudskih Wnt proteina (Wnt-i). Ti agensi se ovde nazivaju „Wnt-vezujući agensi“. U određenim otelotvorenjima, agensi specifično vezuju jedan, dva, tri, četiri, pet, šest, sedam, osam, devet, deset ili više Wnt proteina. Kao neograničavajući primer, Wnt-vezujući agens može vezati Wnt1, Wnt2, Wnt2b, Wnt3, Wnt3a, Wnt7a, Wnt7b, Wnt8a, Wnt8b, Wnt10a, i/ili Wnt10b. U određenim otelotvorenjima, Wntvezujući agens veže Wnt1, Wnt2, Wnt3, Wnt3a i Wnt7b.
[0058] U određenim otelotvorenjima Wnt-vezujući agens je Wnt antagonist. U određenim otelotvorenjima, agens inhibira Wnt-signaliziranje. U nekim otelotvorenjima, agens inhibira kanoničko Wnt signaliziranje.
[0059] U određenim otelotvorenjima, Wnt-vezujući agens je polipeptid. U određenim otelotvorenjima Wnt-vezujući agens je rastvorljiv receptor.
[0060] U određenim otelotvorenjima, Wnt-vezujući agens obuhvata ekstracelularni domen FZD receptora. U nekim otelotvorenjima, Wnt-vezujući agens obuhvata Fri domen FZD receptora. U određenim otelotvorenjima, FZD receptor je ljudski FZD receptor. U određenim otelotvorenjima, ljudski FZD receptor je FZD1, FZD2, FZD3, FZD4, FZD5, FZD6, FZD7, FZD8, FZD9 ili FZD10. U nekim alternativnim otelotvorenjima Wnt-vezujući agens sadrži deo SFRP. U nekim otelotvorenjima, Wnt-vezujući agens obuhvata Fri dom SFRP. U određenim aspektima, SFRP je ljudski SFRP. U nekim otelotvorenjima, ljudski SFRP je SFRP1, SFRP2, SFRP3, SFRP4 ili SFRP5. U drugim alternativnim otelotvorenjima Wnt-vezujući agens obuhvata vanćelijski domen Ror proteina. U nekim otelotvorenjima, Wnt-vezujući agens obuhvata Fri domen Ror proteina. U nekim otelotvorenjima, Ror je ljudski Ror. U nekim otelotvorenjima, ljudski Ror je Ror1 ili Ror2.
[0061] U određenim otelotvorenjima Wnt-vezujući agens je rastvorljiv receptor. U nekim otelotvorenjima Wnt-vezujući agens je rastvorljiv protein. U određenim otelotvorenjima Wnt-vezujući agens je rastvorljiv FZD receptor. Neograničavajući primeri topivih FZD receptora mogu se naći u američkom patentu broj 7,723,477. U određenim otelotvorenjima, Wnt-vezujući agens je rastvorljiv SFRP ili rastvorljiv Ror receptor.
[0062] Fri domen FZD1 uključuje približno amino kiseline 87-237 iz SEQ ID Br: 27. Fri domen FZD2 uključuje približno amino kiseline 24-159 iz SEQ ID Br: 28. Fri domen FZD3 uključuje približno amino kiseline 23-143 SEQ ID Br: 29. Fri domen FZD4 uključuje približno amino kiseline 40-170 SEQ ID Br: 22. Fri domen FZD5 uključuje približno amino kiseline 27-157 iz SEQ ID Br: 23. Fri domen FZD6 uključuje približno amino kiseline 19-146 iz SEQ ID Br: 24. Fri domen FZD7 uključuje približno amino kiseline 33-170 SEQ ID Br: 25. Fri domen FZD8 uključuje približno amino kiseline 28-158 iz SEQ ID Br: 30. Fri domen FZD9 uključuje približno amino kiseline 23-159 iz SEQ ID Br: 31. Fri domen FZD10 uključuje približno amino kiseline 21-154 iz SEQ ID Br: 26. Odgovarajući, predviđeni Fri domeni za svaki od ljudski FZD receptora su navedeni kao SEQ ID Br: 32-41. Minimalno, jezgra Fri domena sekvence za svaki od ljudskih FZD receptora (FZD1-10) su date kao SEQ ID Br: 3-12. Minimalno, jezgra Fri domena sekvence za svaku od ljudskih SFRP (SFRP1-5) su date kao SEQ ID Br: 13-17. Minimalno, jezgra Fri domena sekvenci čoveka Ror1 i Ror2 su obezbeđene kao SEQ ID Br: 58 i SEQ ID Br: 59. Stručnjaci u tehnici mogu se razlikovati u shvatanju tačnih amino kiselina koji odgovaraju različitim domenima Fri. Tako se N-kraj ili C-kraj domena opisanih iznad i ovde može produžiti ili biti skraćen za 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili čak 10 amino kiselina.
[0063] U određenim otelotvorenjima Wnt-vezujući agens sadrži Fri domen humanog FZD receptora ili fragment ili varijantu domena Fri koji vezuje jedan ili više ljudskih Wnt proteina. U određenim otelotvorenjima, ljudski FZD receptor je FZD1, FZD2, FZD3, FZD4, FZD5, FZD6, FZD7, FZD8, FZD9 ili FZD10. U određenim otelotvorenjima, ljudski FZD receptor je FZD4. U određenim alternativnim otelotvorenjima, ljudski FZD receptor je FZD5. U određenim alternativnim otelotvorenjima, ljudski FZD receptor je FZD8. U određenim otelotvorenjima, FZD je FZD4, a Wntvezujući agens sadrži SEQ ID Br: 6 ili sadrži približno amino kiseline 40 do 170 iz SEQ ID Br: 19. U određenim otelotvorenjima, FZD je FZD5, a Wnt-vezujući agens sadrži SEQ ID Br: 7 ili sadrži približno amino kiseline 27-157 iz SEQ ID Br: 20. U određenim otelotvorenjima, FZD je FZD7, a Wnt-vezujući agens sadrži SEQ ID Br: 9 ili sadrži približno amino kiseline 33 do 170 SEQ ID Br: 25. U određenim otelotvorenjima, FZD je FZD8, a Wnt-vezujući agens sadrži SEQ ID Br: 10 ili sadrži približno amino kiseline 28-158 iz SEQ ID Br: 21. U određenim otelotvorenjima, FZD je FZD10, a Wnt-vezujući agens sadrži SEQ ID Br: 12 ili sadrži približno amino kiseline 21-154 iz SEQ ID Br: 26.
[0064] U određenim otelotvorenjima, Wnt-vezujući agens sadrži minimalnu sekvencu Fri domena izabranu iz grupe koju čine SEQ ID Br: 3-12. U određenim otelotvorenjima, Wnt-vezujući agens sadrži minimalnu sekvencu Fri domena izabranu iz grupe koju čine SEQ ID Br: 13-17. U određenim otelotvorenjima Wnt-vezujući agens sadrži minimalnu sekvencu Fri domena izabranu iz grupe koju čine SEQ ID Br: 58 i SEQ ID Br: 59.
[0065] U određenim otelotvorenjima Wnt-vezujući agens sadrži varijantu bilo koje od prethodno navedenih FZD Fri domenskih sekvenci koja sadrži jedan ili više (npr. jedan, dva, tri, četiri, pet, šest, sedam, osam, devet, deset, itd.) konzervativne supstitucije i sposobne za vezivanje Wnt(a).
[0066] U određenim alternativnim otelotvorenjima Wnt-vezujući agens obuhvata Fri domen ljudskog SFRP ili fragment ili varijantu takvog domena Fri koji se vezuje za jedan ili više ljudskih Wnt proteina. Na primer, u određenim otelotvorenjima, agens sadrži minimalnu SFRP Fri domenu sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji iz SEQ ID Br: 13-17. U određenim aspektima Wnt-vezujući agens sadrži varijantu bilo koje od prethodno navedenih SFRP Fri domenskih sekvenci koja sadrži jedan ili više (npr. jedan, dva, tri, četiri, pet, šest, sedam, osam, devet, deset, itd.) Konzervativne supstitucije i održava sposobnost vezivanja Wnt(a).
[0067] U određenim alternativnim otelotvorenjima Wnt-vezujući agens sadrži Fri domen ljudskog Ror proteina ili fragment ili varijantu takvog domena Fri koji se vezuje za jedan ili više ljudskih Wnt proteina. Na primer, u određenim otelotvorenjima, agens sadrži minimalnu Ror Fri domensku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID Br: 58 i SEQ ID Br: 59. U određenim aspektima Wntvezujući agens sadrži varijantu bilo koje od prethodno navedenih Ror Fri domenskih sekvenci koja sadrži jedan ili više (npr. jedan, dva, tri, četiri, pet, šest, sedam, osam, devet, deset, itd.) Konzervativne supstitucije i održava sposobnost vezivanja Wnt (a).
[0068] U određenim aspektima Wnt-vezujući agens, kao što je agens koje sadrži minimalni Fri domen ljudskog FZD receptora ili drugog rastvorljivog FZD receptora, dalje sadrži ljudski Fc region (npr., ljudski IgG1 Fc region). Fc region se može dobiti iz bilo koje klase imunoglobulina, IgG, IgA, IgM, IgD i IgE. U nekim otelotvorenjima, Fc region je Fc region divljeg tipa. U nekim otelotvorenjima Fc region je mutirani Fc region. U nekim otelotvorenjima region Fc se skraćuje na N-kraju za 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10 amino kiselina, (npr., u domenu zgloba). U nekim otelotvorenjima, amino kiselina u domenu šarke se menja kako bi sprečila neželjeno formiranje disulfidnih veza. U nekim otelotvorenjima, cistein se zamenjuje serinom da bi ometao neželjeno formiranje disulfidnih veza. U određenim otelotvorenjima Fc region sadrži ili se sastoji iz SEQ ID Br: 18, SEQ ID Br: 42 ili SEQ ID Br: 43.
[0069] U određenim otelotvorenjima Wnt-vezujući agens je fuzioni protein koji sadrži najmanje minimalni Fri domen FZD receptora, SFRP ili Ror protein i Fc region. Kao što je ovde korišćeno, „fuzioni protein“ je hibridni protein izražen molekulom nukleinske kiseline koja sadrži nukleotidne sekvence od najmanje dva gena. U nekim otelotvorenjima, C-kraj prvog polipeptida je vezan sa N-terminusom regiona Fc imunoglobulina. U nekim otelotvorenjima, prvi polipeptid (npr., domen FZD Fri) je direktno vezan sa regionom Fc (tj. bez interventnog peptidnog veznika). U nekim otelotvorenjima, prvi polipeptid je vezan sa regionom Fc putem peptidnog veznika.
[0070] Kao što je ovde korišćeno, termin „veznik“ se odnosi na veznik ubačen između prvog polipeptida (npr., FZD komponente) i drugog polipeptida (npr., regiona Fc). U nekim otelotvorenjima, veznik je peptidni veznik. Veznici ne bi trebalo da negativno utiču na ekspresiju, sekreciju ili bioaktivnost polipeptida. Veznici ne bi trebali biti antigeni i ne bi trebali izazvati imunološki odgovor. Pogodni veznici su poznati stručnjacima u struci i često uključuju mešavine ostataka glicina i serina i često uključuju amino kiseline koji su sterično neometani. Druge amino kiseline koje se mogu inkorporirati u korisne veznike uključuju ostatke treonina i alanina. Veznici mogu biti dužine, na primer od dužine od 1 do 50 amino kiselina, dužine 1-22 amino kiselina, dužine 1-10 amino kiselina, dužine 1-5 amino kiselina ili dužine 1-3 amino kiselina. Veznici mogu uključivati, ali bez ograničenja na, SerGly, GGSG, GSGS, GGGS, S(GGS)n, gde je n 1-7, GRA, poli(Gli), poli(Ala), ESGGGGVT (SEQ ID Br:60), LESGGGGVT (SEQ ID Br:61), GRAQVT (SEQ ID Br:62), WRAQVT (SEQ ID Br:63) i ARGRAQVT (SEQ ID Br:64). Kao što je ovde korišćeno, veznik je intervencionisana peptidna sekvenca koja ne uključuje ostatke amino kiselina ili iz C-kraj prvog polipeptida (npr. FZD Fri domena) ili N-kraj drugog polipeptida (npr. Fc region).
[0071] FZD receptori, SFRP i Ror proteini sadrže signalnu sekvencu koja usmerava transport proteina. Signalne sekvence (koje se takođe nazivaju signalni peptidi ili liderske sekvence) nalaze se na N-kraju nastalih polipeptida. Oni polažu polipeptid na endoplazmatski retikulum i proteini se sortiraju do njihovih odredišta, na primer, na unutrašnji prostor organele, na unutrašnju membranu, na spoljašnju membranu ćelije, ili na spoljašnjost ćelije putem sekrecije. Većina signalnih sekvenci se odvajaju iz proteina signalnom peptidazom nakon što se proteini transportuju do endoplazmatičnog retikuluma. Odvajanje signalne sekvence iz polipeptida obično se javlja na specifičnom mestu u amino kiselinskoj sekvenci i zavisi od ostataka amino kiselina unutar signalne sekvence. Iako obično postoji jedno specifično mesto cepanja, više od jednog mesta cepanja može se prepoznati i/ili koristiti signalnom peptidazom, što rezultira nehomogenim N-kraju polipeptida. Na primer, upotreba različitih mesta cepanja unutar signalne sekvence može rezultirati polipeptidom izraženim različitim N-terminalnim amino kiselinama. Shodno tome, u nekim otelotvorenjima, polipeptidi kao što je ovde opisan mogu sadržati mešavinu polipeptida sa različitim N-krajevima. U nekim otelotvorenjima N-krajevi se razlikuju u dužini od 1, 2, 3, 4 ili 5 amino kiselina. U nekim otelotvorenjima polipeptid je u suštini homogen, tj. polipeptidi imaju isti N-kraj. U nekim otelotvorenjima signalna sekvenca polipeptida sadrži jednu ili više (npr., jedan, dva, tri, četiri, pet, šest, sedam, osam, devet, deset, itd.) amino kiselinskih supstitucija i/ili brisanje. U nekim otelotvorenjima signalna sekvenca polipeptida sadrži supstitucije amino kiselina i/ili brisanje koje omogućavaju dominaciju jedne lokacije cepanja, čime se dobija u suštinski homogeni polipeptid sa jednim N-krajem. U nekim otelotvorenjima, signalna sekvenca je SEQ ID Br: 67 (amino kiseline 1-27 SEQ ID Br: 30). U nekim otelotvorenjima, amino kiseline 25 i/ili 26 iz SEQ ID Br: 67 su supstituisane sa različitim amino kiselinama. U nekim otelotvorenjima amino kiseline 17, 18, 19, 23, 24, 25 i/ili 26 iz SEQ ID Br: 67 su supstituisane sa različitim amino kiselinama. U nekim otelotvorenjima, amino kiseline 17, 23, 24, 25 i 26 iz SEQ ID Br: 67 su supstituisane sa različitim amino kiselinama. U nekim otelotvorenjima, amino kiselina 17 SEQ ID Br: 67 je supstituisana sa fenilalaninom ili leucinom. U nekim otelotvorenjima, amino kiselina 23 SEQ ID Br: 67 zamenjuje sa prolinom. U nekim otelotvorenjima, amino kiselina 24 SEQ ID Br: 67 supstituisana je sa izolevcinom ili fenilalanin. U nekim otelotvorenjima, amino kiselina 25 SEQ ID Br: 67 je supstituisana sa valin, izoleucin ili alanin. U nekim otelotvorenjima, amino kiselina 26 SEQ ID Br: 67 supstituisana je sa histidinom, tirozinom ili histidinom. U nekim otelotvorenjima, amino kiselina 25 iz SEQ ID Br: 67 je supstituisana sa valin. U nekim otelotvorenjima, amino kiselina 26 u SEQ ID Br: 67 je supstituisana leucinom. U nekim otelotvorenjima signalna sekvenca polipeptida sadrži ili se sastoji od sekvence izabrane iz grupe koja je navedena u Tabeli 1.
Tabela 1
[0072] U određenim otelotvorenjima, Wnt-vezujući agens obuhvata prvi polipeptid koji sadrži FZD domensku komponentu i Fc region. U nekim otelotvorenjima komponenta domena FZD je iz FZD1, FZD2, FZD3, FZD4, FZD5, FZD6, FZD7, FZD8, FZD9 ili FZD10. U nekim otelotvorenjima Fc region je iz IgG1 imunoglobulina. U nekim otelotvorenjima Wnt-vezujući agens obuhvata:
(a) prvi polipeptid koji se sastoji uglavnom od amino kiselina izabranih iz grupe koju čine: X1 do Y1 iz SEQ ID Br:27, X2 do Y2 iz SEQ ID Br:28, X3 do Y3 iz SEQ ID Br:29, X4 do Y4 of SEQ ID Br:22, X5 do Y5 iz SEQ ID Br:23, X6 do Y6 iz SEQ ID Br:24, X7 do Y7 iz SEQ ID Br:25, X8 do Y8 iz SEQ ID Br:30, X9 do Y9 iz SEQ ID Br:31, i X10 do Y10 iz SEQ ID Br:26; i
(b) drugi polipeptid koji se sastoji uglavnom od amino kiselina A do B SEQ ID Br: 43; gde
X1 = amino kiselina 69, 70, 71,72, 73, 74, 75, ili 76
Y1 = amino kiselina 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, ili 243
X2 = amino kiselina 22, 23, 24, 25, 26, 27 ili 28
Y2 = amino kiselina 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171 ili 172
X3 = amino kiselina 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, ili 25
Y3 = amino kiselina 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, ili 149
X4 = amino kiselina 38, 39, 40, 41, ili 42
Y4 = amino kiselina 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175 ili 176
X5 = amino kiselina 25, 26, 27, 28 ili 29
Y5 = amino kiselina 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, ili 164
X6 = amino kiselina 19, 20, 21, 22, 23, ili 24
Y6 = amino kiselina 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151 ili 152
X7 = amino kiselina 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, ili 34
Y7 = amino kiselina 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, ili 186
X8 = amino kiselina 25, 26, 27, 28, 29, 30, ili 31
Y8 = amino kiselina 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, ili 164
X9 = amino kiselina 21, 22, 23, ili 24
Y9 = amino kiselina 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, ili 146
X10 = amino kiselina 20, 21, 22, 23, 24, ili 25
Y10 = amino kiselina 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, ili 160
A = amino kiselina 1, 2, 3, 4, 5, ili 6
B = amino kiselina 231 ili 232
U nekim otelotvorenjima, prvi polipeptid je direktno vezan sa drugim polipeptidom. U nekim otelotvorenjima, prvi polipeptid je vezan sa drugim polipeptidom preko peptidnog veznika. U nekim otelotvorenjima, prvi polipeptid je vezan sa drugim polipeptidom preko peptidnog veznika GRA. Polipeptid (npr. prvi ili drugi polipeptid) koji se „u suštini sastoji od“ određenih amino kiselina ili se „sastoji uglavnom od“ određenih amino kiselina može u nekim otelotvorenjima uključiti jedan ili više (npr. jedan, dva, tri, četiri ili više) dodatnih amino kiselina na jednom ili oba kraja, sve dok dodatne amino kiseline ne utiču na funkciju Wnt-vezujućeg .
[0073] U određenim otelotvorenjima Wnt-vezujući agens sadrži: (a) prvi polipeptid koji se sastoji uglavnom od amino kiselina X do Y SEQ ID Br: 30; i (b) drugi polipeptid koji se sastoji uglavnom od amino kiselina A do B iz SEQ ID Br: 43; gde je prvi polipeptid direktno vezan sa drugim polipeptidom; Y gde X = amino kiselina 25, 26, 27, 28, 29, 30 ili 31
Y = amino kiselina 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, ili 164
A = amino kiselina 1, 2, 3, 4, 5, ili 6
B = amino kiselina 231 ili 232.
U nekim otelotvorenjima, prvi polipeptid se sastoji od amino kiselina 25-158 iz SEQ ID Br: 30. U drugim otelotvorenjima, prvi polipeptid se sastoji od amino kiselina 25-158 SEQ ID Br: 30. U nekim otelotvorenjima, prvi polipeptid se sastoji u suštini od amino kiselina 28-158 iz SEQ ID Br: 30. U drugim otelotvorenjima, prvi polipeptid se sastoji od amino kiselina 28-158 iz SEQ ID Br: 30. U nekim otelotvorenjima, prvi polipeptid se sastoji od amino kiselina 31-158 iz SEQ ID Br: 30. U nekim otelotvorenjima, drugi polipeptid se sastoji od amino kiselina 1-232 iz SEQ ID Br: 43. U nekim otelotvorenjima, drugi polipeptid se sastoji od amino kiselina 3-232 iz SEQ ID Br: 43. U nekim otelotvorenjima, drugi polipeptid se sastoji od amino kiselina 6-232 iz SEQ ID Br: 43. U nekim otelotvorenjima, prvi polipeptid je SEQ ID Br: 39, a drugi polipeptid je SEQ ID Br: 43. U nekim otelotvorenjima, prvi polipeptid je SEQ ID Br: 39, a drugi polipeptid je SEQ ID Br: 42. U nekim otelotvorenjima, prvi polipeptid je SEQ ID Br: 39, a drugi polipeptid je SEQ ID Br: 18.
[0074] U nekim otelotvorenjima Wnt-vezujući agens je polipeptid koji sadrži prvi polipeptid i drugi polipeptid, pri čemu su polipeptidi odabrani iz Tabele 2.
Tabela 2
[0075] U nekim otelotvorenjima, Wnt-vezujući agens sadrži sekvencu amino kiseline izabranu iz grupe koja se sastoji iz: SEQ ID Br:1, SEQ ID Br:45, SEQ ID Br:46, SEQ ID Br:47, SEQ ID Br:48, SEQ ID Br:49, SEQ ID Br:50, SEQ ID Br:51, SEQ ID Br:53, SEQ ID Br:54, SEQ ID Br:55, SEQ ID Br:65 i SEQ ID Br:66.
[0076] U određenim otelotvorenjima, Wnt-vezujući agens sadrži sekvencu SEQ ID Br: 1. U određenim alternativnim otelotvorenjima, agens sadrži sekvencu SEQ ID Br: 1, koja sadrži jednu ili više (npr. jedan, dva, tri, četiri, pet, šest, sedam, osam, devet, deset, itd.) konzervativnih supstituciji. U određenim otelotvorenjima, agens sadrži sekvencu koja ima najmanje oko 90%, oko 95% ili oko 98% identičnosti sekvence sa SEQ ID Br: 1. U određenim otelotvorenjima, varijante SEQ ID Br: 1 održavaju sposobnost da se vezuju za jedan ili više ljudskih Wnt.
[0077] U određenim otelotvorenjima, Wnt-vezujući agens sadrži sekvencu SEQ ID Br: 46. U nekim otelotvorenjima Wnt-vezujući agens je SEQ ID Br: 46. U određenim alternativnim otelotvorenjima, agens sadrži sekvencu SEQ ID Br: 46, koja sadrži jednu ili više (npr. jedan, dva, tri, četiri, pet, šest, sedam, osam, devet, deset, itd.) konzervativne supstitucije. U određenim otelotvorenjima, agens sadrži sekvencu koja ima najmanje oko 90%, oko 95% ili oko 98% identiteta sekvence sa SEQ ID Br: 46. U određenim otelotvorenjima, varijante SEQ ID Br: 46 održavaju sposobnost vezivanja jednog ili više ljudskih Wnt.
[0078] U određenim otelotvorenjima, Wnt-vezujući agens sadrži sekvencu SEQ ID Br: 48. U nekim otelotvorenjima Wnt-vezujući agens je SEQ ID Br: 48. U određenim alternativnim otelotvorenjima, agens sadrži sekvencu SEQ ID Br: 48, koja sadrži jednu ili više (npr. jedan, dva, tri, četiri, pet, šest, sedam, osam, devet, deset, itd.) konzervativne supstitucije. U određenim otelotvorenjima, agens sadrži sekvencu koja ima najmanje oko 90%, oko 95% ili oko 98% identičnosti sekvence sa SEQ ID Br: 48. U određenim otelotvorenjima, varijante SEQ ID Br: 48 zadržavaju sposobnost vezivanja jednog ili više ljudskih Wnt.
[0079] U određenim otelotvorenjima, Wnt-vezujući agens sadrži sekvencu SEQ ID Br: 50. U nekim otelotvorenjima Wnt-vezujući agens je SEQ ID Br: 50. U određenim alternativnim otelotvorenjima, agens sadrži sekvencu SEQ ID Br: 50, koja sadrži jednu ili više (npr. jedan, dva, tri, četiri, pet, šest, sedam, osam, devet, deset, itd.) konzervativne supstitucije. U određenim otelotvorenjima, agens sadrži sekvencu koja ima najmanje oko 90%, oko 95% ili oko 98% identičnosti sekvence sa SEQ ID Br: 50. U određenim otelotvorenjima, varijante SEQ ID Br: 50 zadržavaju sposobnost vezivanja jednog ili više ljudskih Wnt.
[0080] U određenim otelotvorenjima, Wnt-vezujući agens sadrži sekvencu SEQ ID Br: 53. U nekim otelotvorenjima Wnt-vezujući agens je SEQ ID Br: 53. U određenim alternativnim otelotvorenjima, agens sadrži sekvencu SEQ ID Br: 53, koja sadrži jednu ili više (npr. jedan, dva, tri, četiri, pet, šest, sedam, osam, devet, deset, itd.) konzervativne supstitucije. U određenim otelotvorenjima, agens sadrži sekvencu koja ima najmanje oko 90%, oko 95% ili oko 98% identičnosti sekvence sa SEQ ID Br: 53. U određenim otelotvorenjima, varijante SEQ ID Br: 53 zadržavaju sposobnost vezivanja jednog ili više ljudskih Wnt.
[0081] U nekim otelotvorenjima, Wnt-vezujući agensi kao što je ovde opisano inhibiraju rast tumora ili ćelija tumora. U nekim otelotvorenjima, Wnt-vezujući agensi indukuju ćelije u tumoru da bi se razlikovali. U nekim otelotvorenjima, Wnt-vezujući agensi indukuju ekspresiju markera diferencijacije u tumoru ili tumorsku ćeliju. U određenim otelotvorenjima, Wnt-vezujući agensi smanjuju učestalost matičnih ćelija kancera u tumoru. U nekim otelotvorenjima Wnt-vezujući agens koji sadrži SEQ ID Br: 46 inhibira rast tumora u većoj meri nego Wnt-vezujući agens koji sadrži SEQ ID Br: 1. U nekim otelotvorenjima Wnt-vezujući agens koji sadrži SEQ ID Br: 48 inhibira rast tumora u većoj meri nego Wnt-vezujući agens koji sadrži SEQ ID Br: 1. U nekim otelotvorenjima Wnt-vezujući agens koji sadrži SEQ ID Br: 50 inhibira rast tumora u većoj meri nego Wnt-vezujući agens koji sadrži SEQ ID Br: 1. U nekim otelotvorenjima Wnt-vezujući agens koji sadrži SEQ ID Br: 53 inhibira rast tumora u većoj meri nego Wnt-vezujući agens koji sadrži SEQ ID Br: 1. U nekim otelotvorenjima Wnt-vezujući agens kao što je ovde opisan inhibira rast tumora u većoj meri nego Wnt-vezujući agens koji sadrži FZD domensku komponentu, Fc domen i veznik komponentu koja vezuje domenu FZD domene i Fc domenu. U nekim otelotvorenjima, veznik komponenta je interferentni peptidni veznik.
[0082] U određenim otelotvorenjima, Wnt-vezujući agensi kao što je ovde opisano inhibiraju rast Wnt-zavisnog tumora. U nekim otelotvorenjima, tumor je izabran iz grupe koja se sastoji od kolorektalnog tumora, tumora debelog creva, tumora pankreasa, plućnog tumora, tumora jajnika, tumora jetre, tumora dojke, tumora bubrega, tumora prostate, gastrointestinalnog tumora, melanoma, grlića materice Tumor, tumor mokraćne bešike, glioblastom i tumor glave i vrata. U određenim otelotvorenjima, tumor je kolorektalni tumor. U određenim otelotvorenjima, tumor je tumor pankreasa. U nekim otelotvorenjima, tumor je tumor dojke.
[0083] U nekim otelotvorenjima polipeptid koji sadrži sekvencu amino kiselina izabran iz grupe koju čine SEQ ID Br: 1, SEQ ID Br: 45, SEQ ID Br: 46, SEQ ID Br: 47, SEQ ID Br: 48, SEQ ID NO : 49, SEQ ID Br: 50, SEQ ID Br: 51, SEQ ID Br: 53, SEQ ID Br: 54, SEQ ID Br: 55, SEQ ID Br: 65 i SEQ ID Br: 66. U određenim otelotvorenjima, polipeptid sadrži sekvencu amino kiseline izabranu iz grupe koju čine SEQ ID Br: 1, SEQ ID Br: 46, SEQ ID Br: 48, SEQ ID Br: 50 i SEQ ID Br: 53. U nekim otelotvorenjima polipeptid se sastoji od sekvence amino kiseline izabrane iz grupe koju čine SEQ ID Br: 1, SEQ ID Br: 46, SEQ ID Br: 48, SEQ ID Br: 50 i SEQ ID Br: 53. U određenim otelotvorenjima, polipeptid sadrži sekvencu amino kiseline SEQ ID Br: 50. U nekim otelotvorenjima, polipeptid je SEQ ID Br: 50. U određenim otelotvorenjima, polipeptid sadrži sekvencu amino kiseline SEQ ID Br: 53. U nekim otelotvorenjima, polipeptid je SEQ ID Br: 53.
[0084] U određenim otelotvorenjima, polipeptid (pre razdvajanja signalne sekvence) sadrži SEQ ID Br: 50 i signalnu sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID Br: 67, SEQ ID Br: 68, SEQ ID Br: 69, SEQ ID Br: 70, SEQ ID Br: 71, SEQ ID Br: 72, SEQ ID Br: 73 i SEQ ID Br: 74. U određenim otelotvorenjima, polipeptid (pre raspada signalne sekvence) sadrži SEQ ID Br: 50 i signalnu sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID Br: 70, SEQ ID Br: 71, SEQ ID Br: 72, SEQ ID Br: 73 i SEQ ID Br: 74. U nekim otelotvorenjima, polipeptid (pre raspada signalne sekvence) sadrži SEQ ID Br: 53 i signalnu sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID Br: 67, SEQ ID Br: 68, SEQ ID Br: 69, SEQ ID Br: 70, SEQ ID Br: 71, SEQ ID Br: 72, SEQ ID Br: 73 i SEQ ID Br: 74. U nekim otelotvorenjima, polipeptid (pre raspada signalne sekvence) sadrži SEQ ID Br: 53 i signalnu sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID Br: 70, SEQ ID Br: 71, SEQ ID Br: 72, SEQ ID Br: 73 i SEQ ID Br: 74. U nekim otelotvorenjima polipeptid sadrži SEQ ID Br: 71 i SEQ ID Br: 50. U nekim otelotvorenjima polipeptid sadrži SEQ ID Br: 71 i SEQ ID Br: 53. U nekim otelotvorenjima polipeptid sadrži SEQ ID Br: 75. U nekim otelotvorenjima polipeptid se sastoji u suštini iz SEQ ID Br: 75.
[0085] U nekim otelotvorenjima polipeptid je u suštini prečišćeni polipeptid koji sadrži sekvencu amino kiselina izabranu iz grupe koju čine SEQ ID Br: 1, SEQ ID Br: 46, SEQ ID Br: 48, SEQ ID Br: 50 i SEQ ID NO : 53. U određenim otelotvorenjima, suštinski prečišćen polipeptid se sastoji od najmanje 90% polipeptida koji ima N-terminalnu sekvencu ASA. U nekim otelotvorenjima, polazeći polipeptid sadrži signalnu sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID Br: 67-74. U nekim otelotvorenjima, polazeći polipeptid sadrži signalnu sekvencu SEQ ID Br: 71. U nekim otelotvorenjima, polazeći polipeptid sadrži signalnu sekvencu koja rezultira u suštinski homogenom polipeptidnom proizvodu sa jednom N-terminalnom sekvencom.
[0086] U određenim alternativnim otelotvorenjima, agens ne sadrži Fri domen FZD receptora.
[0087] U određenim otelotvorenjima, Wnt-vezujući agens jeste antitelo (npr. antitelo koje se specifično vezuje za jedan ili više Wnt proteina).
[0088] U određenim otelotvorenjima, Wnt-vezujući agens obuhvata Fc region imunoglobulina. Stručnjaci u ovoj oblasti će prihvatiti da vezujući agensi datog pronalaska sadrže fuzione proteine u kojima je bar jedan deo Fc regiona izbrisan ili na drugi način izmenjen tako da obezbeđuje željene biohemijske karakteristike, kao što je povećana lokalizacija ćelija kancera, povećana penetracija tumora, smanjenom polu raspadu u serumu ili povećanom polu raspadu u serumu, u poređenju sa fuzionim proteinom približno iste imunogenosti koja sadrži prirodni ili nepromenjeni konstantni region. Modifikacije regiona Fc mogu uključivati dodavanje, brisanje ili supstituciju jedne ili više amino kiselina u jednom ili više domena. Modifikovani proteini fuzije opisani ovde mogu sadržavati izmene ili modifikacije jedne ili više od dva konstanta domena teškog lanca (CH2 ili CH3) ili u oblasti zgloba. U drugim otelotvorenjima, celokupan CH2 domen je uklonjen (DCH2 konstrukti). U nekim otelotvorenjima, izostavljeni domen konstantnog regiona zamenjuje se kratkim amino kiselinskim distancerom (npr. 10 aa ostataka) koji obezbeđuje neku molekularnu fleksibilnost koja se tipično prenosi bez prisutnog domena konstantnog regiona.
[0089] U nekim otelotvorenjima modifikovani proteini fuzije su projektovani da povežu domen CH3 direktno sa zavisnim regionom antitela. U drugim otelotvorenjima, između zavisnog i modifikovanog CH2 i/ili CH3 domena ubačen je peptidni distancer. Na primer, konstrukti mogu vršiti ekspresiju gde je CH2 domen izbrisan, a preostali CH3 domen (modifikovan ili nemodifikovan) je spojen sa zglobnim regionom sa distancerom od 5-20 amino kiselina. Takav distancer se može dodati kako bi se osiguralo da regulatorni elementi konstantnog domena ostaju slobodni i dostupni ili da region zgloba ostaje fleksibilan. Međutim, treba napomenuti da se distanceri amino kiselina mogu pokazati, u nekim slučajevima, da su imunogeni i mogu izazvati neželjeni imuni odgovor na konstrukciju. Shodno tome, u određenim otelotvorenjima, bilo koji distancer koji se dodaje konstruktu će biti relativno neimunogeni, kako bi se održali željeni biološki kvaliteti modifikovanih antitela.
[0090] U nekim otelotvorenjima modifikovani proteini fuzije mogu imati samo delimično brisanje konstantnog domena ili supstituciju nekoliko ili čak jedne amino kiseline. Na primer, mutacija jedne amino kiseline u odabranim regionima CH2 domena može biti dovoljna da značajno smanji vezivanje Fc i time poveća lokalizaciju ćelija kancera i/ili penetraciju tumora. Slično tome, može biti poželjno jednostavno izbrisati taj deo jednog ili više domena konstantnog regiona koji kontrolišu specifičnu efektorsku funkciju (npr., komplimentiranje Clq vezivanja) koja se modulira. Ovakva delimična brisanja konstantnih regiona mogu poboljšati odabrane karakteristike antitela (npr., polu-raspad u serumu) dok ostavljaju druge poželjne funkcije vezane sa domenom predmetne konstantne oblasti netaknute. Štaviše, kako je navedeno u prethodnom tekstu, konstantni regioni otkrivenih fuzionih proteina mogu se modifikovati putem mutacije ili supstitucije jedne ili više amino kiselina koja poboljšava profil nastalog konstrukta. U tom pogledu može biti moguć poremećaj aktivnosti obezbeđene od strane konzerviranog mesta vezivanja (npr. vezivanje Fc), dok se u suštini održava konfiguracija i imunogeni profil modifikovanog antitela. U određenim otelotvorenjima modifikovani fuzioni proteini sadrže dodavanje jedne ili više amino kiselina u konstantni region radi poboljšanja poželjnih karakteristika kao što je smanjenje ili povećanje efektorske funkcije ili obezbeđuju više vezivanja citotoksina ili ugljenih hidrata.
[0091] U struci je poznato da konstantni region posreduje u nekoliko efektorskih funkcija. Na primer, vezivanje C1 komponente komplementa Fc regionu IgG ili IgM antitela (vezanih za antigen) aktivira sistem komplementa. Aktivacija komplementa je važna u opsonizaciji i lizi ćelijskih patogena. Aktivacija komplementa takođe stimuliše inflamatorni odgovor i takođe može biti uključena u autoimunsku preosetljivost. Pored toga, Fc region antitela može se vezati za ćeliju koja vrši ekspresiju Fc receptora (FcR). Postoji nekoliko Fc receptora koji su specifični za različite klase antitela, uključujući IgG (gama receptore), IgE (epsilon receptore), IgA (alfa receptore) i IgM (mu receptore). Vezivanje antitela na Fc receptore na površinama ćelija pokreće niz važnih i raznovrsnih bioloških odgovora uključujući obuhvatanje i brisanje čestica obloženih antitelima, čišćenje imunskih kompleksa, lizu ciljanih ćelija obloženih antitelima pomoću ćelija ubica (antitela-zavisna ćelijsko posredovana citotoksičnost ili ADCC), oslobađanje inflamatornih medijatora, placentalni transfer i kontrolu proizvodnje imunoglobulina.
[0092] U nekim otelotvorenjima, Wnt-vezujući agensi obezbeđuju izmenjene efektorske funkcije koje, za uzvrat, utiču na biološki profil datog agensa . Na primer, u nekim otelotvorenjima, brisanje ili neaktivacija (preko tačaka mutacija ili drugih agenasa) domena konstantnog regiona može smanjiti vezivanje Fc receptora cirkulirajućeg modifikovanog (npr. Wnt-vezujućeg ) čime se povećava lokalizacija ćelija kancera i/ili penetracija tumora. U drugim otelotvorenjima modifikacije konstantnog regiona povećavaju ili umanjuju polu-raspad u serumu agensa. U nekim otelotvorenjima konstantni region je modifikovan da eliminiše disulfidne veze ili oligosaharidne grupe.
[0093] U određenim otelotvorenjima, Wnt-vezujući agens nema jednu ili više efektorskih funkcija koje su obično vezane sa Fc regionom. U nekim otelotvorenjima, agens nema ADCC aktivnost, i/ili nema aktivnosti vezanu za citotoksičnost (CDC) zavisno od komplementa. U određenim otelotvorenjima, agens se ne vezuje za Fc receptor i/ili faktore komplementa. U određenim otelotvorenjima, agens nema efektorsku funkciju.
[0094] U nekim otelotvorenjima, Wnt-vezujući agensi opisani ovde su modifikovani da bi smanjili imunogenost. Uopšte, imuni odgovori na potpuno normalne ljudske proteine su retki kada se ti proteini koriste kao terapija. Međutim, iako mnogi fuzioni proteini sadrže polipeptidne sekvence koje su iste kao i sekvence koje se nalaze u prirodi, pokazano je da su nekoliko terapeutskih fuzionih proteina imunogene kod sisara. U nekim studijama, utvrđeno je da fuzioni protein koji sadrži veznik je više imunogen od fuzionog proteina koji ne sadrži veznik. Shodno tome, u nekim otelotvorenjima, polipeptidi prema pronalasku se analiziraju pomoću metoda izračunavanja za predviđanje imunogenosti. U nekim otelotvorenjima, polipeptidi se analiziraju za prisustvo epitopa T-ćelija i/ili B-ćelija. Ako se identifikuju i/ili predviđaju bilo koji T-ćelijski ili B-ćelijski epitopi, modifikacije ovih područja (npr. zamene amino kiselina) mogu se napraviti da bi se poremetili ili izbrisali epitopi. Različiti algoritmi i softver koji se mogu koristiti za predviđanje epitopa T-ćelija i/ili B ćelija su poznati u struci. Na primer, svi programi SIFPEITHI, HLA Bind, PEPVAC, RANKPEP, DiscoTope, ElliPro i Antibody Epitope Prediction jesu javno dostupni.
[0095] U nekim otelotvorenjima obezbeđuje se ćelija koja proizvodi bilo koji Wnt-vezujući agens ili polipeptide opisane ovde. U nekim otelotvorenjima obezbeđen je sastav koji sadrži bilo koji Wntvezujući agens ili polipeptide opisane ovde. U nekim otelotvorenjima, sastav sadrži polipeptid gde najmanje 80%, 90%, 95%, 97%, 98% ili 99% polipeptida ima N-terminalnu sekvencu ASA. U nekim otelotvorenjima, sastav sadrži polipeptid u kojem 100% polipeptida ima N-terminalnu sekvencu ASA.
U nekim otelotvorenjima, sastav sadrži polipeptid gde najmanje 80% polipeptida ima N-terminalnu sekvencu ASA. U nekim otelotvorenjima, sastav sadrži polipeptid gde najmanje 90% polipeptida ima N-terminalnu sekvencu ASA. U nekim otelotvorenjima, sastav sadrži polipeptid gde najmanje 95% polipeptida ima N-terminalnu sekvencu ASA.
[0096] Polipeptidi prema datom pronalasku mogu biti rekombinantni polipeptidi, prirodni polipeptidi ili sintetički polipeptidi. Biće prihvaćeno u struci da neke sekvence amino kiseline pronalaska mogu varirati bez značajnog uticaja na strukturu ili funkciju proteina. Ako se razmatraju takve razlike u sekvenci, treba zapamtiti da će na proteinu biti kritične oblasti koje određuju aktivnost. Prema tome, pronalazak dalje uključuje varijacije polipeptida koji pokazuju značajnu aktivnost ili koji uključuju regione proteina FZD, SFRP proteina ili Ror proteina kao što su delovi proteina koji su ovde razmotreni. Takvi mutanti uključuju brisanje, umetanje, inverzije, ponavljanje i zamene tipa. Kao što je navedeno u daljem tekstu, smernice o tome koje promene amino kiselina verovatno mogu biti fenotipski nečujne mogu se naći u Bowie, et al., 1990, Science, 247:1306-10.
[0097] Naravno, broj amino kiselinskih supstitucija koji će napraviti onaj ko je stručan u ovoj oblasti zavisi od mnogih faktora, uključujući i one opisane iznad. U određenim otelotvorenjima, broj supstitucija za bilo koji dati rastvorljivi receptivni polipeptid neće biti veći od 50, 40, 30, 25, 20, 15, 10, 5 ili 3.
[0098] Fragmenti ili delovi polipeptida prema datom pronalasku mogu se koristiti za proizvodnju odgovarajućeg polipeptida pune dužine sintezom peptida; zbog toga, fragmenti se mogu koristiti kao intermedijeri za proizvodnju polipeptida u punoj dužini. Ovi fragmenti ili delovi polipeptida mogu se takođe nazvati „fragmenti proteina“ ili „fragmenti polipeptida“.
[0099] Proteinski fragment datog pronalaska je deo ili svi proteini koji se mogu vezati za jedan ili više ljudskih Wnt proteina (npr. ljudski FZD receptor, ljudski SFRP ili Ror protein). U nekim otelotvorenjima, fragment ima visok afinitet za jedan ili više ljudskih Wnt proteina. Neki fragmenti fuzionih proteina koji su ovde opisani su fragmenti proteina koji sadrže bar deo vanćelijskog dela FZD receptora, SFRP ili vanćelijskog deo Ror proteina koji sadrži vezujući domen vezan sa najmanje jednim delom konstantnog regiona imunoglobulina (npr. Fc region). Vezujući afinitet proteinskog fragmenta može biti u opsegu od oko 10-11 do 10-12 M, iako afinitet može značajno da varira sa fragmentima različitih veličina, u rasponu od 10-7 do 10-11 M. U nekim otelotvorenjima, fragment je dužine oko 100 do oko 200 amino kiselina i sadrži vezujući domen vezan sa najmanje jednim delom konstantnog regiona imunoglobulina.
[0100] Wnt-vezujući agensi prema datom pronalasku mogu se analizirati za specifično vezivanje bilo kojom metodom poznatom u stanju tehnike. Imuno analize koje se mogu koristiti uključuju, ali se ne ograničavaju na, konkurentne i nekonkurentne sisteme analize koristeći tehnike kao što su BIAcore analiza, FACS analiza, imunofluorescencija, imunocitokemija, zapadni blot, radioimuno analize, ELISA, imunološki testovi „sendvič“, imunoprecipitacije, reakcije padavina, reakcije na gel difuziju, ispitivanja imunodifuzije, analize aglutinacije, analize vezivanja komplementa, imunoradiometrijske analize, fluorescentne imunoanalize i imunopropusne protein A. Takvi testovi su rutinski i dobro poznati u struci (videti, npr., Ausubel et al, eds, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., New York.
[0101] Na primer, specifično vezivanje polipeptida na ljudski Wnt može se odrediti pomoću ELISA. Analiza ELISA obuhvata pripremu antigena, obloženih otvora sa mikrotitarskom pločicom od 96 otvora sa antigenom, dodajući polipeptid (npr. Wnt-vezni agens) konjugovan sa detektabilnim jedinjenjem kao što je enzimski supstrat (npr. horseradish perokidase ili alkalna fosfataza) do otvora, inkubira se u određenom vremenskom periodu i detektuje prisustvo agensa. U nekim otelotvorenjima, polipeptid (npr., Wnt-vezujući agens) nije konjugovan sa detektabilnim jedinjenjem, ali umesto drugog konjugovanog antitela koji prepoznaje polipeptid se dodaje u otvor. U nekim otelotvorenjima, umesto oblaganja otvora sa antigenom, polipeptidom (npr. Wnt-vezujući agens) se može obložiti otvor, a drugo antitelo konjugovano sa detektabilnim jedinjenjem može se dodati nakon dodavanja antigena u obloženi otvor. Onaj ko je stručan u ovoj oblasti bio bi upoznat sa parametrima koji se mogu modifikovati kako bi se povećao otkriveni signal, kao i druge varijacije ELISA-e poznate u struci (vidi npr. Ausubel et al, eds, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., New York at 11.2.1).
[0102] Afinitet vezivanja za Wnt i off-rate interakcije vezujućeg agensa-antigena mogu se odrediti pomoću kompetetivnih vezivanja. Jedan primer kompetetivnog testa vezivanja je radioimunsko ispitivanje koje obuhvata inkubaciju označenog antigena (npr. 3H ili 125I), ili njegov fragment ili varijantu, sa vezujućim agensom od interesa u prisustvu povećanih količina neoznačenog antigena, nakon čega sledi detekcija antitelo vezano za označeni antigen. Afinitet vezujućeg agensa protiv Wnt i obavezne off-rate mogu se odrediti iz podataka pomoću Scatchard analize parcele. U nekim otelotvorenjima, BIAcore kinetička analiza se koristi za određivanje vezivanja i isključivanja stopa agenasa koji vezuju jedan ili više ljudskih Wnr. BIAcore kinetička analiza obuhvata analizu vezivanja i disocijacije antitela od čipova sa imobilisanim Wnt antigenom na njihovoj površini.
[0103] U određenim otelotvorenjima, Wnt-vezujući agens se vezuje za najmanje jedan Wnt sa konstantom disociacije (KD) od oko 1mM ili manje, oko 100nM ili manje, oko 40nM ili manje, oko 20nM ili manje, ili oko 10nM ili manje.
[0104] U određenim otelotvorenjima Wnt-vezujući agens (npr. FZD8-Fc) je antagonist od najmanje jednog Wnt (tj., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10 Wnt) vezan od strane agensa. U određenim otelotvorenjima, agens inhibira najmanje oko 10%, najmanje oko 20%, najmanje oko 30%, najmanje oko 50%, najmanje oko 75%, najmanje oko 90% ili oko 100% jednog ili više više aktivnosti vezanih ljudskih Wnt (a).
[0105] In vivo i in vitro testovi za određivanje da li Wnt-vezujući agens (ili kandidat Wnt-vezujući agens) inhibira Wnt signaliziranje su poznati u stanju tehnike. Na primer, testovi reportera luciferaze bazirani na ćeliji koristeći TCF/Luc reporter vektor koji sadrži više kopija TCF vezujućeg domena uzvodno od reporterg gen gena luciferaze, može se koristiti za merenje kanonskih nivoa signaliziranja Wnt in vitro (Gazit et al., 1999, Oncogene 18; 5959-66). Nivo signaliziranja Wnt u prisustvu jedne ili više Wnt (npr. Wnt (a) izraženih transfektovanim ćelijama ili obezbeđenim Wnt-uslovljenim medijima) sa prisutnim Wnt vezujućim agensom se upoređuje sa nivoom signala bez Wnt-vezujući agens je prisutan. Pored analize TCF/Luc reportera, efekat Wnt-vezivnog agensa (ili potencijalnog agensa) na kanoničku Wnt signaliziranje može se meriti in vitro ili in vivo merenjem efekta agensa na nivo ekspresije β-( Tetsu et al., Nature, 398:422-6 (1999)) i/ili fibronektin (hematopoietin), kao što su c-myc (He et al., Science, 281: 1509-12 (1998) (Gradl et al., Cell Biol., 19: 5576-87 (1999)). U određenim otelotvorenjima, uticaj agensa na Wnt signaliziranje takođe može biti procenjen merenjem efekta agensa na stanje fosforilacije Disheveled-1, Disheveled-2, Disheveled-3, LRP5, LRP6 i/ili βkatenin .
[0106] Ovde opisani polipeptidi mogu da se proizvedu bilo kojom pogodnom metodom koja je poznata u struci. Takve metode variraju od direktnih metoda sinteze proteina do konstrukcije sekvenci DNK koji kodiraju polipeptidne sekvence i vrše ekspresiju te sekvence u pogodnom domaćinu. U nekim otelotvorenjima, DNK sekvenca se konstruiše upotrebom rekombinantne tehnologije izolovanjem ili sintetizacijom DNK sekvence koja kodira poželjni protein divljeg tipa. Opciono, sekvenca se može mutagenizovati mutagenezom specifične za lokaciju da bi se obezbedili funkcionalni analogi. Vidi, npr., et al., 1984, PNAS, 81:5662-66 i U.S. Pat. No. 4,588,585. U nekim otelotvorenjima, DNK sekvenca se konstruiše korišćenjem rekombinantne tehnologije izolujući više od jedne DNK sekvence koja kodira dva polipeptida od interesa i ligirajući ove DNK sekvence zajedno da generiše fuzioni protein. U nekim otelotvorenjima, fuzija dva polipeptida dodaje dodatne amino kiseline u spoju između dva polipeptida (tj., mesto ligacije za DNK sekvence). Ove dodatne amino kiseline se smatraju vezivačem. U nekim otelotvorenjima, između dva polipeptida fuzionog proteina ubacuje se peptidni veznik.
[0107] U nekim otelotvorenjima, sekvenca DNK koja kodira polipeptid od interesa može se konstruisati hemijskom sintezom koristeći sintisajzer oligonukleotida. Takvi oligonukleotidi mogu se dizajnirati na bazi sekvence amino kiseline željenog polipeptida. U nekim otelotvorenjima, oligonukleotidi su dizajnirani da biraju kodone koji su poželjniji u ćeliji domaćina u kojoj će biti proizveden rekombinantni polipeptid koji je od interesa. Standardne metode mogu se primeniti za sintetisanje polinukleotidne sekvence koja kodira polipeptid koji je od interesa. Na primer, potpuna amino kiselinska sekvenca se može koristiti za konstrukciju pozadinskog-prevedenog gena. Nadalje, može se sintetisati DNK oligomer koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira određeni polipeptid. Na primer, nekoliko malih oligonukleotida koji kodiraju delove željenog polipeptida mogu se sintetizovati i zatim ligirati. Pojedinačni oligonukleotidi obično sadrže 5’ ili 3’ krajeve za komplementarno sklapanje. U nekim otelotvorenjima nukleotidna sekvenca koja kodira željeni protein fuzije se sintetiše tako da su dva polipeptida direktno vezana bez interferentnog peptidnog veznika.
[0108] Nakon sastavljanja (sintezom, mutagenezom usmerenom na mesto, rekombinantnom tehnologijom ili nekom drugom metodom), polinukleotidne sekvence koje kodiraju određeni polipeptid od interesa mogu se ubaciti u ekspresioni vektor i operativno vezati sa kontrolnom sekvencom ekspresije pogodnom za ekspresiju polipeptida u željenom domaćinu. Pravilna montaža se može potvrditi sekvenciranjem nukleotida, mapiranjem ograničenja i/ili ekspresijom biološki aktivnog polipeptida u odgovarajućem domaćinu. Kao što je dobro poznato u struci, kako bi se postigli visoki nivoi ekspresije transfektovanog gena u domaćinu, gen mora biti operativno vezan za sekvence transkripcionog i translacionog ekspresivnog ekspresije koji su funkcionalni u izabranom izraznom domaćinu.
[0109] U određenim otelotvorenjima, rekombinantni ekspresioni vektori su korišćeni za pojačavanje i ekspresiju DNK koja enkodira Wnt-vezujuće agense i polipeptide, ovde opisanih. Na primer, rekombinantni ekspresioni vektori mogu biti ponovljivi DNK konstrukti koji imaju sintetičke ili cDNK-izvedene DNK fragmente koji enkodiraju fuziju proteina koji sadrži FZD Fri domen i Fc region, operativno vezane sa pogodnim transkripcijskim ili translatornim regulatornim elementima koji su dobijeni iz gena sisara, mikroba, virusa ili insekata. Transkripciona jedinica obično se sastoji iz sklopa od (1) genetskog elementa ili elemenata koji imaju regulatornu ulogu u ekspresiji gene, na primer, transkripcioni promoteri i/ili pojačivači, (2) strukturalne ili kodirajuće sekvence koja je transkribovana u mRNK i translirana u protein, i (3) odgovarajuće transkripcijske i translatorne inicijacije i završnih sekvenci. Regulatorni elementi mogu uključiti operatorsku sekvencu za kontrolu transkripcije. Mogućnost ponavljanja u domaćinu, koja je obično dodeljena sa poreklom ponavljanja, i odabir gena kako bi se stvorilo prepoznavanje transformanata takođe može biti dodatno uključeno. DNK regioni su „operativno vezani“ kada su funkcionalno vezani jedan za drugi. Na primer, DNK za signalni peptid (sekretorni vodeći) operativno je vezan sa DNK za polipeptid ukoliko je izražen kao prekursor koji učestvuje u sekretaciji polipeptida; promoter je operativno vezan sa kodirajućom sekvencom ukoliko kontroliše transkripciju sekvence; ili je mesto vezivanja ribozoma operativno vezano za kodirajuću sekvencu ukoliko je tako postavljeno da dozvoljava translaciju. Generalno, operativno vezan znači susedni, a u slučaju sekretornih vodećih peptida, znači susedni i u okviru očitavanja. U nekim otelotvorenjima, strukturalni elementi koji su namenjeni za upotrebu u sistemima za ekspresiju kvasca mogu sadržati vodeći sekvencu što omogućuje ekstracelularnu sekretaciju transliranog proteina od strane ćelije domaćina. U nekim otelotvorenjima, gde postoji ekspresija rekombinantnog proteina bez vodeće ili transportne sekvence, može biti uključen N-terminal metionin rezidual. Ovaj rezidual se opciono može otcepiti od izraženog rekombinantnog proteina kako bi se dobio krajnji proizvod.
[0110] Odabir ekspresione kontrolne sekvence i ekspresionog vektora zavisi od odabira domaćina. Velika raznolikost kombinacija ekspresija domaćin/vektor može biti iskorišćena. Korisni ekspresioni vektori za eukariotske domaćine uključuju, na primer, vektore koji se sastoje iz ekspresionih kontrolnih sekvenci od SV40, goveđeg papiloma virusa, adenovirusa i citomegalovirusa. Korisni ekspresioni vektori za bakterijske domaćine uključuju poznate bakterijske plazmide, kao što su plazmidi iz E. coli, uključujući pCR1, pBR322, pMB9 i njihove derivate, i širi opseg vektora domaćina, kao što su M13 i drugi filamentozni jednolančani DNK fagi.
[0111] Pogodne ćelije domaćina za ekspresiju Wnt-vezujućeg agensa uključuju prokariote, kvasac, insekt, ili više eukariotske ćelije pod kontrolom odgovarajućih promotera. Prokariote uključuju gramnegativne ili gram-pozitivne organizme, na primer E. coli ili bacile. Više eukariotske ćelije uključuju uspostavljene ćelijske linije sisarskog porekla kao što je opisano ispod. Sistemi translacije bez ćelija se takođe mogu upotrebiti. Odgovarajući klonirajući ekspresioni vektori za upotrebu kod bakterija, gljiva, kvasca i domaćina sa sisarskim ćelijama opisani su od strane Pouwels et al., 1985, Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, N.Y.
[0112] Različiti sistemi ćelijskih kultura sisara ili insekata korišćeni su za ekspresiju rekombinantnih polipeptida. U nekim otelotvorenjima, ekspresija rekombinantnih proteina u ćelijama sisara je poželjnije zato što su takvi proteini generalno pravilno savijeni, prikladno modifikovani i potpuno funkcionalni. Primeri pogodne ćelije sisara za domaćina uključuju COS-7 (izvedena iz bubrega majmuna), L-929 (izvedena iz firoblasta miša), C127 (izvedena iz tumora dojke miša), 3T3 (izvedena iz firoblasta miša), CHO (izvedena iz jajnika kineskog hrčka), HeLa (izvedena iz cervikalnog kancera čoveka) i BHK (izvedena iz firoblasta bubrega hrčka) ćelijske linije. Sisarski ekspresioni vektori mogu se sastojati iz ne-transkribovanih elemenata kao što su poreklo ponavljanja, pogodni promoter i pojačivač vezan sa genom koji treba da se izrazi i druge 5’ ili 3’ bočne ne-transkribovane sekvence, i 5’ ili 3’ ne-translirane sekvence, kao što su neophodna mesta vezivanja ribozoma, mesto poliadenilacije, mesto spajanja donora i akceptora, i transkripcijske završne sekvence. Bakulovirus sistemi za proizvodnju heterologus proteina kod insekata su poznati onima koji su stručni u ovoj oblasti i to je razmotreno od strane Luckow and Summers, 1988, Bio/Technology, 6:47.
[0113] Proteini koji su proizvedeni od strane transformisanog domaćina mogu biti prečišćeni u skladu sa bilo kojom pogodnom metodom. Takve standardne metode uključuju hromatografiju (npr., razmena jona, afinitet, i hromatografija na koloni), centrifugiranje, diferencijalnu rastvorljivost, ili bilo koju drugu standardnu tehniku za prečišćavanje proteina. Oznake afiniteta kao što su heksahistidin, domen vezivanja maltoze, sekvenca gripa, i glutation-S-transferaza mogu se vezati za protein kako bi se omogućilo lako prečišćavanjem prolazom preko odgovarajuće kolone afiniteta. Izolovani proteini takođe mogu biti fizički okarakterisani upotrebom tehnika kao što su proteoliza, masena spektometrija (MS), tečna hromatografija visokih performansi (HPLC), nuklearna magnetna rezonanca (NMR), i rendgenska kristalografija.
[0114] U nekim otelotvorenjima, supernatantni iz ekspresionih sistema koji vrše sekretaciju rekombinantnog proteina u sredinu kulture mogu se prvo koncentrovati upotrebom komercijalno dostupnih proteinskih koncentracionih filtera, na primer, Amicon ili Millipore Pellicon ultrafiltracionom jedinicom. Nakon koraka koncentrovanja, koncentrat može biti nanet na pogodnu matricu prečišćavanja. U nekim otelotvorenjima, smola razmene anjona može se iskoristiti, na primer, matrica ili supstrat koji ima privezane dietilaminoetil (DEAE) grupe. Matrice mogu biti akrilamid, agaroza, dekstran, celuloza, ili drugi tipovi koji se obično koriste kod prečišćavanja proteina. U nekim otelotvorenjima, korak razmene katjona se može koristiti. Pogodni razmenjivači katjona uključuju različite nerastvorljive matrice koje sadrže sulfopropil ili karboksimetil grupe. U nekim otelotvorenjima, hidroksipapit (CHT) sredina se može koristiti, uključujući ali neograničavajući se na, keramički hidroksipapit. U nekim otelotvorenjima, jedan ili više koraka reverzne faze HPLC koja koristi hidrofobnu RP-HPLC sredinu, npr., silicijum dioksid gel i koje imaju privezani metil ili druge alifatne grupe, mogu se iskoristiti za prečišćavanje fuzionog proteina. Neki ili svi od prethodnih koraka prečišćavanja, u različitim kombinacijama, takođe se mogu iskoristiti kako bi se dobio homogeni rekombinantni protein.
[0115] U nekim otelotvorenjima, rekombinantni protein proizveden u bakterijskoj kulturi može se izolovati, na primer, inicijalnom ekstrakcijom iz ćelijskih peleta, što je praćeno jednom ili više puta koncentracijom, uklanjanjem soli, razmenom vodenih jona, i/ili koracima hromatografije isključenja veličine. HPLC se može iskoristiti za konačne korake prečišćavanja. Mikrobne ćelije korišćene u ekspresiji rekombinantnog proteina se mogu prekinuti bilo kojom konvencionalnom metodom, uključujući cikluse zamrzavanja-odmrzavanja, sonikaciju, mehaničko prekidanje, ili upotrebu agenasa za liziranje ćelija.
[0116] Metode poznate u struci za prečišćavanje antitela i drugih proteina takođe uključuju, na primer, one opisane u patentnoj prijavi SAD br.2008/0312425; 2008/0177048; i 2009/0187005.
[0117] Ovde opisani polipeptidi mogu se dalje modifikovati kako bi sadržali dodatne hemijske grupe koje obično nisu deo proteina. Ove izvedene grupe mogu da poboljšaju rastvorljivost, biološki polu život, ili apsorpciju proteina. Grupe takođe mogu da smanje ili eliminišu bilo koje neželjene nuspojave proteina i slično. Pregled ovih grupa može se pronaći u Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition, University of the Sciences, Philadelphia, 2005.
[0118] Hemijske grupe najpogodnije za derivatizaciju uključuju polimere koji se rastvaraju u vodi.
Polimer koji se rastvara u vodi poželjan je zato što protein za koji se vezuje ne precipitira u vodenom okruženju, kao u fiziološkom okruženju. U nekim otelotvorenjima, polimer će biti farmaceutski prihvatljiv za pripremanje terapeutskog proizvoda ili sastava. Onaj ko je stručan u ovoj oblasti će biti u stanju da izabere željeni polimer na osnovu razmatranja o tome da li će se polimer/protein konjugat koristiti terapeutski, i ukoliko da, željenu dozu, vreme cirkulacije, otpornost na proteolizu, i druga razmatranja. Efektivnost derivatizacije se može utvrditi davanjem derivata, u željenoj formi (npr., osmotskom pumpom, ili injekcijom ili infuzijom, ili dalje formulisanim za oralne, plućne ili druge puteve isporuke), i određivanjem njene efektivnosti. Pogodni polimeri koji se rastvaraju u vodi uključuju, ali nisu ograničeni na, polietilen glikol (PEG), kopolimere etilen glikol/propilen glikola, karboksimetilcelulozu, dekstran, polivinil alkohol, polivinil pirolidon, poli-1,3-dioksolan, poli-1,3,6-trioksan, etilen/maleinski anhidrid kopolimer, poliamino kiseline (ili homopolimere ili nasumične kopolimere), dekstran, poli(n-vinil pirolidon)-polietilen glikol, propropilen glikol homopolimere, prolipropilen oksid/etilen oksid kopolimere, polioksietilisane poliole (npr., glicerol), polivinil alkohol, i njihove smeše. Polietilen glikol propionaldehid može imati prednosti pri proizvodnju usled stabilnosti u vodi.
[0119] Broj molekula polimera za vezivanje može biti različit, i onaj ko je stručan u ovoj oblasti će biti u stanju da proceni efekat na funkciju. Može da mono-derivatizuje, ili može da pruži di-, tri-, tetra- ili neku kombinaciju derivatizacije, sa istim ili različitim hemijskim grupama (npr., polimeri, kao što su različite težine polietilen glikola). Proporcija molekula polimera i molekula proteina (ili peptida) može se razlikovati, kao što će se i njihove koncentracije u reakcionoj smeši. Generalno, optimalni odnos (u vidu efikasnosti reakcije u kojoj ne postoji višak proteina ili polimera koji ne reaguju) će biti određen faktorima kao što su željeni stepen derivatizacije (npr., mono-, di-, tri-, itd.), molekularna masa izabranog polimera, bez obzira da li je polimer granat ili nije, i reakcioni uslovi.
[0120] Polietilen glikol molekuli (i druge hemijske grupe) bi trebalo da budu vezane sa proteinom uz razmatranje na efekte na funkcionalne ili antigene domene proteina. Postoji broj metoda vezivanja koje su dostupne onima koji su stručni u ovoj oblasti. Videti na primer, EP 0401384, (spajanje PEG sa G-CSF), videti takođe Malik et al., 1992, Exp. Hematol., 20:1028-35 (izveštavanje o pegilaciji GM-CSF pomoću tresil hlorida). Na primer, polietilen glikol se konvencionalno može vezati preko reziduala amino kiselina putem reaktivnih grupa, kao što su, slobodne amino ili karboksilne grupe. Reaktivne grupe su one za koje se aktivirani polietilen glikol molekul može vezati. Reziduali amino kiselina koji imaju slobodnu amino grupu mogu da uključuju reziduale lizina i reziduale N-terminalnih amino kiselina. Oni koji imaju slobodnu karboksilnu grupu takođe mogu da uključuju reziduale asparaginske kiseline, reziduale glutaminske kiseline, i reziduale C-terminalne amino kiseline. Sulfhidril grupe se takođe mogu koristiti kao reaktivne grupe za vezivanje molekula polietilen glikola. Za terapeutski svrhe, vezivanje amino grupe, kao što je vezivanje N-terminus ili lizin grupe može biti izvršeno. vezivanje sa rezidualima značajnim za vezivanje receptora bi trebalo izbegavati ukoliko je željeno vezivanje receptora.
[0121] Neko može posebno dizajnirati amino-terminalni hemijski modifikovani protein. Upotrebom polietilen glikola kao prikaza datog sastava, može se izabrati iz različitih polietilen glikol molekula (različite molekulske mase, granatosti, itd.), proporcija polietilen glikol molekula i molekula proteina (ili peptida) u reakcionoj smeši, tip pegilacione reakcije koja se vrši, i metoda za dobijanje izabranog N-terminalno pegilovanog proteina. Metode dobijanja N-terminalno pogilovanog proteina (npr., razdvajanjem ove grupe od drugih monopegilovanih grupa ukoliko je to neophodno) mogu biti putem prečišćavanja N-terminalno pegilovanog materijala od populacije pegilovanih molekula proteina. Selektivne N-terminalne modifikacije se mogu dobiti reduktivnom alkilacijom koja eksploatiše diferencijalnu reaktivnost različitih tipova primarnih amino grupa (lizin naspram N-terminala) dostupnih za derivatizaciju u određenom proteinu. Pod odgovarajućim reakcionim uslovima, suštinski selektivna derivatizacija proteina na N-terminusu sa karbonil grupom koja sadrži polimer je ostvarena. Na primer, može se selektivno N-termalno pegilovati protein vršenjem reakcije pri pH vrednosti koja dozvoljava ostvarenje prednosti od pKa razlika između epsilon amino grupa reziduala lizina i onih od alfa amino grupa N-terminalnog reziduala proteina. Takvom selektivnom derivatizacijom, vezivanje polimera koji je rastvorljiv u vodi sa proteinom je kontrolisano, npr., konjugacija sa polimerom se odvija pretežno na N-terminusu proteina i nema značajnih modifikacija drugih reaktivnih grupa, kao što su lizin amino grupe bočnog lanca, koje se pojavljuju. Upotrebom reduktivne alkilacije, polimer koji se rastvara u vodi može biti tipa kao što je gore opisano, i trebalo bi da ima jedan reaktivni aldehid za spajanje sa proteinom. Može se koristiti polietilen glikol propionaldehid, koji sadrži jedan reaktivni aldehid.
[0122] Pegilacija se može izvršiti bilo kojom od pegilacionih reakcija poznatim u struci. Videti, npr., Focus on Growth Factors, 1992, 3: 4-10; EP 0154316, EP 0401384; i druge objave koje su ovde navedene a vezane su sa pegilacijom. Pegilacija se može izvršiti pomoću akilacione reakcije ili alkilacione reakcije sa reaktivnim polietilen glikol molekulom (ili na analognom reaktivnom polimeru koji je rastvorljiv u vodi).
[0123] Stoga, pretpostavlja se da rastvorljivi receptorski polipeptidi koji se koriste u skladu sa datim pronalaskom mogu sadržati pegilovane rastvorljive receptorske proteine ili varijante, gde je PEG grupa(e) vezana preko acil ili alkil grupa. Takvi proizvodi mogu biti mono-pegilovani ili poli pegilovani. PEG grupe generalno su vezane za protein pri α ili ε amino grupama amino kiselina, ali se takođe pretpostavlja da se PEG grupe mogu vezati za bilo koju amino grupu vezanu za protein, koji je dovoljno reaktivan da bi postao vezan za PEG grupu pod stabilnim reakcionim uslovima.
[0124] Molekuli polimera koji se koriste u oba, akilacionom i alkilacionom pristupu mogu se izabrati iz polimera koji su rastvorljivi u vodi, kao što je opisano iznad. Izabrani polimeri bi trebalo da budu modifikovani kako bi imali jednu reaktivnu grupu, kao što je aktivan ester za akilaciju ili aldehid za alkilaciju, tako da se stepen polimerizacije može kontrolisati kao što je u datim metodama. Primerni reaktivni PEG aldehid je polietilen glikol propionaldehid koji je rastvorljiv u vodi, ili mono C1-C10 alkoksi ili ariloksi derivati istog (videti pat. SAD br. No. 5,252,714). Polimer može biti granat ili ne mora. Za akilacione reakcije, izabrani polimer(i) bi trebalo da ima jednu reaktivnu ester grupu. Za dati reduktivnu alkilaciju, izabrani polimer(i) bi trebalo da ima reaktivnu aldehid grupu. Uopšteno, polimeri koji se rastvaraju u vodi neće biti izabrani iz glikozil reziduala koji se javljaju u prirodi zbog toga što se oni konvencionalnije prave rekombinantnim ekspresionim sistemima sisara. Polimer može biti bilo koje molekulske mase, i može biti granat ili ne mora. Jedan polimer koji se rastvara u vodi za upotrebu je polietilen glikol. Kao što se ovde koristi, polietilen glikol ima nameru da obuhvati bilo koju formu PEG koja je bila korišćena da derivatizuje druge proteine, kao što su mono (C1-C10) alkoksi- ili ariloksi-polietilen glikol.
[0125] Drugi reakcioni parametri, kao što su rastvarač, vremena reakcije, temperature, itd., i vidovi prečišćavanja proizvoda mogu se odrediti od slučaja do slučaja na osnovu objavljenje informacije u vezi sa derivatizacijom proteina sa polimerima koji se rastvaraju u vodi (videti ovde navedene objave). U određenim otelotvorenjima, Wnt-vezujući agens je polipeptid koji nije izveden iz ljudskog FZD ili SFRP. Mnoge metode za identifikaciju i proizvodnju polipeptida koji se vezuju sa visokim afinitetom za ciljani protein su poznati u struci. Videti, npr., Skerra, 2007, Curr. Opin. Biotechnol., 18:295-304; Hosse et al., 2006, Protein Science, 15:14-27; Gill et al., 2006, Curr. Opin. Biotechnol., 17:653-58; Nygren, 2008, FEBS J., 275:2668-76; and Skerra, 2008, FEBS J., 275:2677-83. U određenim otelotvorenjima, tehnologija prikazivanja faga je korišćena za identifikaciju/proizvodnju Wntvezujućih polipeptida. U određenim otelotvorenjima, polipeptid se sastoji iz proteinsku skelu tipa izabranih iz grupe koju čine protein A, lipokalin, fibronektin domen, ankirin konsenzus ponovljivi domen, i tioredoksin.
[0126] U nekim otelotvorenjima, Wnt-vezujući agens je ne-proteinski molekul. U određenim otelotvorenjima, agens je mali molekul. Kombinatorijalne hemijske biblioteke i tehnike koje su od koristi pri identifikaciji ne-proteinskih Wnt-vezujućih agenasa su poznate onima koji su stručni u ovoj oblasti. Videti, npr., Kennedy et al., 2008, J. Comb. Chem., 10:345-54; Dolle et al, 2007, J. Comb. Chem., 9:855-902; and Bhattacharyya, 2001, Curr. Med. Chem., 8:1383-404. U određenim daljim otelotvorenjima, agens je ugljeni hidrat, glikosaminoglican, glikoprotein, ili protoglikan.
[0127] U određenim otelotvorenjima, agens je aptamer nukleinske kiseline. Aptameri su polinukleotidni molekuli koji su izabrani (npr., Iz slučajnih ili mutagenizovanih grupa) na osnovu njihove sposobnosti da vežu drugi molekul. U nekim otelotvorenjima, aptamer sadrži DNK polinukleotid. U određenim alternativnim otelotvorenjima, aptamer sadrži RNK polinukleotid. U određenim otelotvorenjima, aptamer sadrži jedan ili više modifikovani rezidual nukleinske kiseline.
Metode za generisanje i skrining metode aptamera nukleinske kiselina na vezivanje za proteine je dobro poznato u struci. Videti, npr., patent SAD br. 5,270,163; 5,683,867; 5,763,595; 6,344,321; 7,368,236; 5,582,981; 5,756,291; 5,840,867; 7,312,325; i 7,329,742, objavu međunarodnog patenta br. WO 02/077262 i WO 03/070984, objavu prijave patenta SAD br. 2005/0239134; 2005/0124565; i 2008/0227735.
[0128] U određenim otelotvorenima, Wnt-vezujući agens ima cirkulacioni polu život kod miševa, cinomolgus majmuna, ili ljudi barem oko 5 sati, barem oko 10 sati, barem oko 24 sata, barem oko 3 dana, barem oko 1 nedelju, ili barem oko 2 nedelje. U određenim otelotvorenjima Wnt-vezujući agens je IgG (npr., IgG1 ili IgG2) antitelo koje ima cirkulacioni polu život kod miševa, cinomolgus majmuna, ili ljudi barem oko 10 sati, barem oko 24 sata, barem oko 3 dana, barem oko 1 nedelju, barem oko 2 nedelje. Metode za povećavanje polu života agenasa kao što su polipeptidi ili antitela poznate su u struci. Na primer, poznate metode povećavanja cirkulacionog polu života IgG antitela uključuju uvođenje mutacija u Fc region što povećava pH zavisno vezivanje antitela za neonatalni Fc receptor (FcRn) pri pH 6.0 (videti, npr., obj. pat. SAD br. 2005/0276799, 2007/0148164, i 2007/0122403). Poznate metode za povećanje cirkulacionog polu života fragmenata antitela koji nemaju Fc region uključuju tehnike kao što su pegilacija.
[0129] U određenim otelotvorenjima, Wnt-vezujući agensi i polipeptidi kao što su ovde opisani imaju polu život barem od 50 sati kod pacova kada se daju preko vene u repu pri dozama koje su u opsegu od oko 2mg/kg do oko 10mg/kg. U određenim otelotvorenjima, Wnt-vezujući agens ili polipeptid ima polu život barem od 50 sati kod pacova kada se daje preko vene u repu pri dozi od oko 10mg/kg. U određenim otelotvorenjima Wnt-vezujući agens ili polipeptid ima polu život barem od 100 sati kod pacova kada se daje pre vene u repu pri dozi u opsegu od oko 2mg/kg do oko 10mg/kg. U određenim otelotvorenjima, Wnt-vezujući agens ili polipeptid ima polu život barem od 100 sati kod pacova kada se daje preko vene u repu pri dozi od oko 10mg/kg. U određenim otelotvorenjima, Wnt-vezujući agens ima polu život barem od 120 sati kod pacova kada se daje preko vene u repu pri dozi u opsegu od oko 2mg/kg do oko 10mg/kg. U određenim otelotvorenjima, Wnt-vezujući agens ima polu život barem od 150 sati kod pacova kada se daje preko vene u repu pri dozi u opsegu od oko 2mg/kg do oko 10mg/kg.
[0130] U određenim otelotvorenjima, agens je rastvorljivi FZD receptor koji sadrži Fri domen ljudskog FZD receptora (ili fragment ili varijantu Fri domena koja vezuje jedan ili više Wnt) i ljudski Fc region i ima polu život in vivo (npr., kod miša ili pacova) koji je duži nego kod rastvorljivog FZD receptora koji sadrži ekstracelularni domen FZD receptora i ljudski Fc region.
[0131] Ćelije koje proizvode Wnt-vezujuće agense ili polipeptide ovde opisane su date. U nekim otelotvorenjima, ćelija proizvodi rastvorljivi Wnt-vezujući agens koji sadrži Fri domen ljudskog FZD8, gde barem oko 80% Wnt-vezujućeg agensa ima N-terminalnu sekvencu ASA. U nekim otelotvorenjima, ćelija proizvodi rastvorljivi Wnt-vezujući agens koji sadrži Fri domen ljudskog FZD8, gde barem oko 85%, barem oko 90%, barem oko 95%, ili barem oko 98% Wnt-vezujućeg agensa ima N-terminalnu sekvencu ASA. U nekim otelotvorenjima, ćelija je ćelija sisara. U nekim otelotvorenjima, ćelija proizvodi Wnt-vezujući agens koji sadrži ljudski Fc region. U nekim otelotvorenjima, ćelija proizvodi Wnt-vezujući agens koji sadrži sekvencu amino kiseline izabranu iz grupe koju čine SEQ ID Br:53, SEQ ID Br:50, SEQ ID Br:46, SEQ ID Br:48, i SEQ ID Br:1. U nekim otelotvorenjima, ćelija proizvodi Wnt-vezujući agens koji sadrži sekvencu amino kiseline SEQ ID Br:53. U nekim otelotvorenjima, ćelija proizvodi Wnt-vezujući agens koji sadrži sekvencu amino kiseline SEQ ID Br:50.
[0132] Wnt-vezujući agens koji je proizveden od strane ćelija ovde opisan je dat.
[0133] Sastavi koji sadrže Wnt-vezujuće agense ili polipeptide ovde opisane takođe su dati. U nekim otelotvorenjima, sastav sadrži Wnt-vezujući agens koji sadrži Fri domen ljudskog FZD8, gde barem 80% Wnt-vezujućeg agensa ima N-terminalnu sekvencu ASA. U nekim otelotvorenjima, sastav sadrži rastvorljivi Wnt-vezujući agens koji sadrži Fri domen ljudskog FZD8, gde barem oko 85%, barem oko 90%, barem oko 95%, ili barem oko 98% Wnt-vezujućeg agensa ima N-terminalnu sekvencu ASA. U nekim otelotvorenjima, sastav sadrži Wnt-vezujući agens koji sadrži ljudski Fc region. U nekim otelotvorenjima, sastav sadrži Wnt-vezujući agens koji sadrži sekvencu amino kiseline izabranu iz grupe koju čine SEQ ID Br:53, SEQ ID Br:50, SEQ ID Br:46, SEQ ID Br:48, i SEQ ID Br:1. U nekim otelotvorenjima, sastav sadrži Wnt-vezujući agens koji se sastoji iz sekvence amino kiseline SEQ ID Br:53. U nekim otelotvorenjima, sastav sadrži Wnt-vezujući agens koji sadrži sekvencu amino kiseline SEQ ID Br:50. U nekim otelotvorenjima, sastav kao što je ovde opisan dalje sadrži farmaceutski prihvatljiv nosač.
[0134] Metode za upotrebu sastava koji sadrže Wnt-vezujuće agense ili polipeptide ovde opisane je takođe data.
III. Polinukleotidi
[0135] U određenim otelotvorenjima, pronalazak obuhvata polinukleotide koji sadrže polinukleotide koji enkodiraju polipeptid koji posebno vezuje ljudski Wnt protein ili fragment takvog polipeptida. Na primer, pronalazak daje polinukleotid koji sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja enkodira rastvorljivi FZD receptor ili enkodira fragment takvog rastvorljivog receptora. U nekim otelotvorenjima, pronalazak daje polinukleotid koji sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja enkodira rastvorljiv SFRP, rastvorljiv Ror protein ili enkodira fragment takvog rastvorljivog proteina. U nekim otelotvorenjima, polinukleotidi sadrže polinukleotide koji enkodiraju bilo koji Wnt-vezujući agens kao što je ovde opisano. Polinukleotidi prema pronalasku mogu biti u formi RNK ili u formi DNK. DNK uključuje cDNK, genomsku DNK, i sintetsku DNK; i može biti dvolančana ili jednolančana, a ukoliko je jednolančana može biti kodirajući lanac ili ne-kodirajući (antismisao) lanac.
[0136] U određenim otelotvorenjima, polinukleotidi su izolovani. U određenim otelotvorenjima, polinukleotidi su suštinski čisti.
[0137] Pronalazak daje polinukleotid koji sadrži polinukleotid koji enkodira polipeptid koji sadrži sekvence SEQ ID Br:1, SEQ ID Br:45, SEQ ID Br:46, SEQ ID Br:47, SEQ ID Br:48, SEQ ID Br:49, SEQ ID Br:50, SEQ ID Br:51, SEQ ID Br:52, SEQ ID Br:53, SEQ ID Br:54, SEQ ID Br:55, SEQ ID Br:65, SEQ ID Br:66 i SEQ ID Br:75. U nekim otelotvorenjima polinukleotid dalje sadrži polinukleotid koji enkodira polipeptid signalnu sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID Br:67, SEQ ID Br:68, SEQ ID Br:69, SEQ ID Br:70, SEQ ID Br:71, SEQ ID Br:72, SEQ ID Br:73, i SEQ ID Br:74. U nekim otelotvorenjima, polinukleotid dalje sadrži polinukleotid koji enkodira polipeptid signalnu sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID Br:70, SEQ ID Br:71, SEQ ID Br:72, SEQ ID Br:73, i SEQ ID Br:74. U nekim otelotvorenjima, polinukleotid sadrži polinukleotid koji enkodira polipeptid koji ima sekvencu SEQ ID Br:71 i SEQ ID Br:50. U nekim otelotvorenjima polinukleotid sadrži polinukleotid koji enkodira polipeptid koji ima sekvencu SEQ ID Br:71 i SEQ ID Br:53. U nekim otelotvorenjima polinukleotid sadrži polinukleotid koji enkodira polipeptid koji ima sekvencu SEQ ID Br:75. Pronalazak dalje daje polinukleotid koji sadrži sekvencu SEQ ID Br:2.
[0138] Dati pronalazak daje polinukleotid koji sadrži polinukleotid koji enkodira polipeptid koji sadrži: signalnu sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID Br:71, SEQ ID Br:70, SEQ ID Br:72, SEQ ID Br:73, i SEQ ID Br:74; Fri domen ljudskog FZD8; i ljudski Fc region. U nekim otelotvorenjima, polinukleotid sadrži polinukleotid koji enkodira polipeptid koji sadrži signalnu sekvencu SEQ ID Br:71; Fri domen ljudskog FZD8; i ljudski Fc region.
[0139] Takođe je dat polinukleotid koji sadrži polinukleotid koji hibridizuje u polinukleotid koji ima sekvencu SEQ ID Br:2 i/ili u polinukleotid koji ima sekvencu SEQ ID Br:1, SEQ ID Br:45, SEQ ID Br:46, SEQ ID Br:47, SEQ ID Br:48, SEQ ID Br:49, SEQ ID Br:50, SEQ ID Br:51, SEQ ID Br:52, SEQ ID Br:53, SEQ ID Br:54, SEQ ID Br:55, SEQ ID Br:65, SEQ ID Br:66 i SEQ ID Br:75. U određenim otelotvorenjima, hibridizacija je pod uslovnima visoke strogosti.
[0140] U određenim otelotvorenjima, polinukleotidi sadrže kodirajuću sekvencu za zrele polipeptide spojene u isti okvir čitanja u polinukleotidu koji pomaže, na primer, ekspresiju i sekretaciju polipeptida iz ćelije domaćina (npr., vodeća sekvenca ili signalna sekvenca koje imaju funkciju kao sekretirajuća sekvenca za kontrolisanje transporta polipeptida iz ćelije). Polipeptid koji ima vodeću sekvencu je proprotein i može da ima vodeću sekvencu cepanu od strane ćelije domaćina kako bi se formirala zrela forma polipeptida. Polinukleotidi takođe mogu da enkodiraju za proprotein što je zreli protein plus dodati 5’ amino reziduali. Zreli protein koji ima prosekvencu je proprotein i predstavlja neaktivnu formu proteina. Kada je prosekvenca probijena aktivni zreli protein ostaje.
[0141] U određenim otelotvorenjima, polinukleotidi sadrže kodirajuću sekvencu za zrele polipeptide spojene u isti okvir čitanja u obeležavajućim sekvencama koji dozvoljavaju, na primer, prečišćavanje enkodiranog polipeptida. Na primer, obeležavajuća sekvenca može biti heksahistidin oznaka sa pQE-9 vektorom kako bi se omogućilo prečišćavanje zrelog polipeptida spojenog sa obeleživačem u slučaju da je bakterija domaćin, ili obeležavajuća sekvenca može biti hemagglutinin (HA) oznaka dobijena iz influenza hemagglutin proteina u slučaju da je sisar domaćin (npr., COS-7 ćelije).
[0142] Dati pronalazak se dalje odnosi na varijante od ovde iznad opisanih polinukleotida koji enkodiraju, na primer, fragmente, analoge, i derivati. Fragmenti ili delovi polinukleotida prema datom pronalasku mogu se koristiti da sintetišu punu dužinu polinukleotida prema datom pronalasku.
[0143] U određenim otelotvorenjima, dati pronalazak daje izolovane polinukleotide koji sadrži polinukleotide koji imaju nukleotidnu sekvencu barem 80% identičnu, barem 85% identičnu, barem 90% identičnu, barem 95% identičnu, i u nekom otelotvorenjima, barem 96%, 97%, 98% ili 99% identičnu polinukleotidu koji enkodira polipeptid koji sadrži rastvorljivi FZD receptor ili drugo Wntvezujući agens koji je ovde opisan.
[0144] Sa nukleotidom koji ima nukleotidnu sekvencu barem, na primer, 95% „identičnu“ referentnoj nukleotidnoj sekvenci namerava se da nukleotidna sekvenca polinukleotida bude identična referentnoj sekvenci ali da polinukleotidna sekvenca može da uključuje do pet tačaka mutacije na svakih 100 nukleotida referentne nukleotidne sekvence. Drugim rečima, za dobijanje polinukleotida koji ima nukleotidnu sekvencu barem 95% identičnu referentnoj nukleotidnoj sekvenci, do 5% nukleotida u referentnoj sekvenci može biti uništeno ili supstituisano sa drugim nukleotidom, ili broj nukleotida do 5% od ukupnog broja nukleotida u referentnoj sekvenci može biti unet u referentnu sekvencu. Ove mutacije referentne sekvence se mogu desiti na amino- ili karboksitermalnim pozicijama referentne nukleotidne sekvence ili bilo gde između tih terminalnih pozicija, rasprostranjenih ili pojedinačno između nukleotida u referentnoj sekvenci ili u jednoj ili više susednih grupa unutar referentne sekvence.
[0145] Varijante polinukleotida mogu sadržati izmene u kodirajućim regionima, ne-kodirajućim regionima, ili u oba. U nekim otelotvorenjima polinukleotidne varijante sadrže izmene koje proizvode tihe supstitucije amino kiselina, dodatne, ili uništavanja, ali ne menjanju svojstva ili aktivnosti enkodiranog polipeptida. U nekim otelotvorenjima, nukleotidne varijante su proizvedene tihim supstitucijama usled degeneracije genetičnog koda. U nekim otelotvorenjima, nukleotidne varijante sadrže nukleotidne sekvence što se ispoljava u razlikama u ekspresiji (npr., povećana ili smanjena ekspresija), bez obzira što se sekvenca amino kiseline nije izmenila. Polinukleotidne varijante se mogu proizvesti za različite svrhe, npr., za optimizovanje ekspresije kodona za određenog domaćina (promena kodona u ljudskoj mRNK do onih poželjnih od strane bakterijskog domaćina kao što je E. coli).
[0146] Polinukleotidi koji su ovde opisani se mogu proizvesti sa bilo kojom pogodnom metodom poznatoj u struci. Kao što je opisano ovde u nekim otelotvorenjima, DNK sekvenca je napravljena upotrebom rekombinantne tehnologije izolovanjem ili sintetisanjem DNK sekvence koja enkodira divlji-tip proteina o kome se radi. U nekim otelotvorenjima, DNK sekvenca je napravljena upotrebom rekombinantne tehnologije izolovanjem više od jedne DNK sekvence koja enkodira dva polipeptida o kojima se radi i vezivanjem ovih DNK sekvenci zajedno kako bi se stvorio fuzioni protein.
[0147] U nekim otelotvorenjima, DNK sekvenca može biti napravljena hemijskom sintezom upotrebom oligonukleotidnog sintetizatora. Takvi oligonukleotidi mogu biti dizajnirani na osnovu sekvence amino kiseline željenog polipeptida. Standardne metode se mogu upotrebiti za sintetisanje polinukleotidne sekvence koja enkodira polipeptid o kome se radi. Na primer, kompletna sekvenca amino kiseline se može koristiti za pravljenje nazad-transliranog gena. Dalje, DNK oligomer koji sadrži nukleotidnu sekvencu kodira određeni polipeptid se može sintetisati. Na primer, više malih oligonukleotida koji kodiraju pozicije željenih polipeptida mogu biti sintetisani a zatim vezani. Pojedinačni oligonukleotidi obično imaju 5’ ili 3’ viseće krajeve za komplementarni sklop. U nekim otelotvorenjima, nukleotidna sekvenca kodira za željeni fuzioni protein je sintetisana tako da su dva polipeptida direktno vezani bez intervenisanja peptidnog veznika.
[0148] Kada je sastavljena (sintezom, prema mestu, mutagenezom, rekombinantom tehnologijom, ili drugom metodom), polinukleotidna sekvenca koja enkodira određeni polipeptid od interesa se može uneti u ekspresioni vektor i operativno vezati za ekspresionu kontrolnu sekvencu odgovarajuću za ekspresiju polipeptida u željenom domaćinu. Odgovarajući sastav se može potvrditi sa sekvenciranjem nukleotida, restriktivnim mapiranjem, i/ili ekspresijom biološki aktivnog polipeptida u pogodnom domaćinu. Dobro je poznato u struci, da bi se dobili visoki ekspresioni nivo transfektovanog gena u domaćinu, gen mora da bude operativno vezan za transkripcione i translatorne ekspresione kontrolne sekvence koje su funkcionalne u izabranom ekspresionom domaćinu.
[0149] Vektori koji čine polinukleotide koji su ovde opisani su dati. Ćelije koje čine vektore ili polinukleotide ovde opisane su takođe dati.
IV. Farmaceutski sastavi
[0150] Dati pronalazak dalje daje farmaceutske sastave koje sadrže agense (npr., rastvorljive FZD receptore) koji vezuju jedan ili više Wnt proteina i/ili Wnt antagoniste. U nekim otelotvorenjima, farmaceutski sastavi sadrže Wnt-vezujuće agense i polipeptide kao što je ovde opisano. Ovi farmaceutski sastavi pronalaze upotrebu u inhibiranju rasta ćelija tumora i tretiranju kancera kod ljudskih pacijenata. U nekim otelotvorenjima, Wnt-vezujući agensi kao što su ovde opisani pronalaze upotrebu u proizvodnju medikamenata za tretiranje kancera.
[0151] Formulacije su pripremljene za čuvanje i upotrebu kombinovanjem prečišćenih agenasa ili antagonista prema datom pronalasku sa farmaceutski pogodnim nosačem, ekscipijentom, i/ili stabilizatorom kao što su sterilni liofilizovani puderi, vodeni rastvori itd. (Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition, University of the Sciences, Philadelphia, 2005). Pogodni nosači, ekscipijenti, ili stabilizatori sadrži netoksične pufere kao što su fosfat, citrat, i druge organske kiseline; soli kao što su natrijum hlorid; antioksidanse koji uključuju askorbinsku kiselinu i metionin; konzervanse (npr., oktade- cildimetilbenzil amonijum hlorid; heksametonium hlorid; benzalkonium hlorid, benzetonium hlorid; fenol, butil ili benzil alkohol; alkil parabene, kao što su metil ili probil paraben; katehol; resorcinol; cikloheksanol; 3-pentanol; i m kresol); polipeptide niske molekulske mase (kao što je manje od 10 reziduala amino kiseline); proteine kao što su serum albumin, želatin, ili imunoglobulini; hidrofilni polimeri kao što su polivinilpirolidon; amino kiseline kao što su glicinska, glutaminska, asparaginska, histidinska, argininska, ili lizinska; karboksihidrate kao što su monosaharidi, disaharidi, glukoza, manoza, ili dekstrini; helatirajuće agense kao što su EDTA; šećere kao što su sukroza, manitol, trehaloza ili sorbitol; kontrajone koji formiraju soli kao što je natrijum; metalne komplekse (npr., Zn-protein kompeksi); i/ili netoksične surfaktante kao što je TWEEN ili polietilen glikol (PEG).
[0152] Farmaceutski sastavi prema datom pronalasku se mogu dati na bilo koji način za ili lokalno ili sistemsko tretiranje. Davanje može biti topikalno (kao što je u sluzokožne membrane uključujući vaginalno i rektalno davanje) kao što su transdermalni flasteri, masti, losioni, kreme, gelovi, kapi, supozitorije, sprejevi, tečnosti i puderi; plućno (npr., inhaliranjem ili insuflacijom praha ili aerosoli, uključujući nebulizatorom, intratrahealno, intranazalno, epidermalno i transdermalno); oralno; ili parenteralno uključujući intravenoznu, intraarterijalnu; subkutanu, intraperitonealnu ili intramuskularnu injekciju ili infuziju; ili intrakranijalno (npr., intratekalno ili intraventrikularno) davanje.
[0153] Terapeutske formulacije mogu biti u jediničnim doznim formama. Takve formulacije uključuju tablete, pilule, kapsule, pudere, granule, rastvore ili suspenzije u vodi ili ne-vodenoj sredini, ili supozitorije za oralnu, parenteralnu, ili rektalnu upotrebu ili za upotrebu putem inhalacije. Čvrsti sastavi kao što su tablete glavni aktivni sastojci su pomešani sa farmaceutskim nosačem. Konvencionalni sastojci za tablete uključuju kukuruzni skrob, laktozu, sukrozu, sorbitol, talk, stearinsku kiselinu, magnezijum stearat, dikalcijum fosfat ili gume, i druge diluente (npr., vodu) kako bi formirali čvrsti preformulisani sastav koji sadrži homogenu smešu jedinjenja prema datom pronalasku, ili ne-toksičnu farmaceutski prihvatljivu so istog. Čvrsta preformulacija sastava je zatim podeljena u jedinične dozne forme tipa opisanog iznad. Tablete, pilule, itd., novi sastav može biti pokriven ili na drugi način ujedinjen da bi se dobila dozna forma koja daje prednost produženom dejstvu. Na primer, tableta ili pilula može sadržati unutrašnji sastav koji je prekriven sa spoljašnjom komponentom. Štaviše, dve komponente mogu biti razdvojene enteričnim slojem koju služi da se odupre dezintegraciji i dozvoljava unutrašnjim komponentama da prođu netaknute kroz stomak ili da imaju odloženo ispuštanje. Različiti materijali se mogu koristiti za takve enterične slojeve ili obloge, uključujući broj polimerskih kiselina i smeša polimerskih kiselina sa takvim materijalima kao što su šelak, cetil alkohol i celuloza acetat.
[0154] Farmaceutske formulacije uključuju antagoniste (npr., Wnt-vezujuće agense) prema datom pronalasku koji su kompleksirani sa lipozomima (Epstein et al., 1985, PNAS, 82:3688; Hwang et al., 1980, PNAS, 77:4030; i patenti SAD br. 4,485,045 i 4,544,545). Lipozomi sa poboljšanim vremenom cirkulacije su obelodanjenu u patentu SAD 5,013,556. Lipozomi mogu biti stvoreni evaporacijom reverzne faze sa lipidnim sastavom koji sadrži fosfatidilholin, holesterol, i PEG-izvedene fosfatidiletanolamin (PEG-PE). Lipozomi su ekstradirani kroz filtere definisane veličine pora kako bi dali lipozome sa željenim prečnikom.
[0155] Antagonista (npr., Wnt-vezujući agens) može takođe biti sadržan u mikrokapsulama. Takve mikrokapsule su pripremljene, na primer, tehnikama koacervacije ili graničnom polimerizacijom, na primer, hidroksimetilclulozne ili želatinske-mikrokapsule i poli-(metilmetacilat) mikrokapsule, respektivno, u koloidnim sistemima za isporuku lekova (na primer, lipozomi, albumin mikrosfere, mikroemulzije, nanočestice i nanokapsule) ili u makroemulzijama kao što je opisano u Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition, University of the Sciences, Philadelphia, 2005.
[0156] Dodatno, preparati sa zadržanim ispuštanjem mogu biti pripremljeni. Pogodni primeri preparata sa zadržanim ispuštanjem uključuju poluprovodljive matrice od čvrstih hidrofobnih polimera koji sadrže agens, gde su matrice u formi oblikovanih predmeta (npr., filmovi ili mikrokapsule). Primeri matrica sa zadržanim ispuštanjem uključuju poliestere, hidrogelove kao što su poli(2-hidroksietil-metacrilat) ili poli(vinilalkohol), polilaktide (patent SAD br. 3,773,919), ko- polimere od L-glutaminske kiseline i 7 etil L-glutamat, ne-razgradive etilen-vinil acetat, razgradivi kopolimeri mlečne kiseloglikonske kiseline kao što je LUPRON DEPOT™ (injektibilne mikrosfere napravljene od kopolimera mlečne kiseloglikonske kiseline i leuprolid acetata), sukroza acetat izobutilrat, i poli-D-(-)-3-hidroksibutirična kiselina.
V. Metode za primenu
[0157] Wnt-vezujući agensi (uključujući rastvorljive receptore) prema pronalasku su od koristi u različitim primenama uključujući, ali ne ograničavajući se na, terapeutske metode tretiranja, kao što su tretiranje kancera. U određenim otelotvorenjima, agensi su od koristi za inhibiranje Wnt signaliziranja (npr., kanoničko Wnt signaliziranje), inhibiranje rasta tumora, uključujući diferencijaciju, smanjenje zapremina tumora, smanjenje frekvence kancera matičnih ćelija, i/ili smanjenje tumorigenicnosti tumora. Metode za primenu mogu biti in vitro, ex vivo, ili in vivo metode. U određenim otelotvorenjima, Wnt-vezujući agens ili polipeptid je antagonista jednog ili više ljudskog Wnt proteina za koji se vezuje.
[0158] U određenim otelotvorenjima, Wnt-vezujući agens ili antagonista je korišćen za lečenje bolesti vezane sa aktivacijom Wnt signaliziranja. U određenim otelotvorenjima, bolest je bolest zavisna na Wnt signaliziranju. U određenim otelotvorenjima, Wnt signaliziranje je kanoničko Wnt signaliziranje. U određenim otelotvorenjima, Wnt-vezujući agensi ili antagonisti su korišćeni pri tretiranju poremećaja okarakterisanim povećanim nivoima matičnih ćelija i/ili progenitor ćelija.
[0159] U određenim otelotvorenjima, bolest koja se tretira sa Wnt-vezujućim agensom ili antagonistom (npr., rastvorljivi FZD receptor, SFRP-izvedeni protein, ili rastvorljivi Ror receptor) je kancer. U određenim otelotvorenjima, kancer je okarakterisan sa Wnt-zavisnim tumorima. U određenim otelotvorenjima, kancer je okarakterisan tumorima koji vrše ekspresiju jednog ili više Wnt za koji se Wnt-vezujući agens (npr., rastvorljivi receptor) vezuje.
[0160] U određenim otelotvorenjima, bolest koja se tretira sa Wnt-vezujućim agensom ili antagonistom nije kancer. Na primer, bolesti može da bude poremećaj metabolizma kao što je gojaznost ili dijabetes (npr., tip II dijabetes) (Jin T., 2008, Diabetologia, 51:1771-80). Alternativno, bolest može biti poremećaj kosti kao što su osteoporoza, osteoartritis, ili reumatoidni artritis (Corr M., 2008, Nat. Clin. Pract. Rheumatol., 4:550-6; Day et al., 2008, Bone Joint Surg. Am., 90 Suppl 1:19-24). Bolest takođe može biti poremećaj bubrega kao što je policistička bolest bubrega (Harris et al., 2009, Ann. Rev. Med., 60:321-37; Schmidt-Ott et al., 2008, Kidney Int., 74:1004-8; Benzing et al., 2007, J. Am. Soc. Nephrol., 18:1389-98). Alternativno, poremećaji očiju, ali ne ograničavajući se na, makularnu degeneraciju i porodičnu eksudativnu vitreoretinopatiju mogu se tretirati (Lad et al., 2009, Stem Cells Dev., 18:7-16). Kardiovaskularni poremećaji, uključujući, infarkt miokarda, aterosklerozu i poremećaj zalizaka, se takođe mogu tretirati (Al-Aly Z., 2008, Transl. Res., 151:233-9; Kobayashi et al., 2009, Nat. Cell Biol., 11:46-55; van Gijn et al., 2002, Cardiovasc. Res., 55:16-24; Christman et al., 2008, Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol., 294:H2864-70). U nekim otelotvorenjima, bolest je plućni poremećaj kao što su idiopatska plućna arterijska hipertenzija ili plućna fibroza (Laumanns et al., 2008, Am. J. Respir. Cell Mol. Biol., 2009, 40:683-91; Königshoff et al., 2008 PLoS ONE, 3:e2142). U nekim otelotvorenjima, bolest koja se tretira sa Wnt-vezujućim agensom je bolest jetre kao što je ciroza ili fibroza jetre (Cheng et al., 2008, Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol., 294:G39-49).
[0161] Ovaj pronalazak daje metode za tretiranje kancera koje obuhvataju davanje terapeutski efektivne količine Wnt-vezujućeg agensa subjektu (npr., subjektu kojem je potrebno tretiranje). U određenim otelotvorenjima, kancer je izabran iz grupe koja se sastoji od kolorektalnog karcinoma, kancera pankreasa, karcinoma pluća, kancera jajnika, kancera jetre, kancera dojke, kancera bubrega, kancera prostate, gastrointestinalnog karcinoma, melanoma, kancera grlića materice, kancera bešike, glioblastoma i kancera glave i vrata. U određenim otelotvorenjima, kancer je kancer pankreasa. U određenim otelotvorenjima, kancer je kolorektalni kancer. U određenim otelotvorenjima, kancer je kancer dojke. U određenim otelotvorenjima, subjekt je čovek.
[0162] Dati pronalazak dalje daje metode za inhibiranje rasta tumora korišćenjem Wnt-vezujućih agenasa opisanih ovde. U određenim otelotvorenjima, postupak inhibicije rasta tumora sadrži dovođenje tumora ili tumorske ćelije u kontakt sa Wnt-vezujućim agensom in vitro. Na primer, imortalizovana ćelijska linija ili linija ćelija kancera koja izražava ciljane Wnt, se kultiviše u medijumu kojem se dodaje Wnt-vezujući agens za inhibiranje rasta tumorskih ćelija. U nekim otelotvorenjima tumorske ćelije se izoluju iz uzorka pacijenta, kao što je, na primer, biopsija tkiva, pleuralni izliv ili uzorak krvi i kultivišu se u medijumu u koji se dodaje Wnt-vezujući agens za inhibiranje rasta tumorskih ćelija.
[0163] U nekim otelotvorenjima, postupak inhibicije rasta tumora sadrži dovođenje tumora ili tumorskih ćelija u kontakt sa Wnt-vezujućim agensom (npr., rastvorljivi FZD receptora) in vivo. U određenim otelotvorenjima, dovođenje tumora ili tumorske ćelije u kontakt sa Wnt-vezujućim agensom sprovodi se u životinjskom modelu. Na primer, Wnt-vezujući agensi mogu se davati ksenograftovima koji vrše ekspresiju jednog ili više Wnt koji su uzgajani u imunokompromitovanim miševima (npr.. NOD/SCID miševi) da bi inhibiralo rast tumora. U određenim otelotvorenjima, matične ćelije raka izoluju se iz uzorka pacijenta, kao na primer, biopsija tkiva, pleuralni izliv ili uzorak krvi i injektiraju se u imunokompromitovane miševe kojima se zatim daju Wnt-vezujući agensi radi inhibiranja rasta tumorskih ćelija. U nekim otelotvorenjima, Wnt-vezujući agens se primenjuje istovremeno ili ubrzo nakon unošenja tumorigenih ćelija u životinju radi sprečavanja rasta tumora. U nekim otelotvorenjima Wnt-vezujući agens se daje kao terapeutski agens nakon što tumorigenske ćelije prerastu u tumor određene veličine.
[0164] U određenim otelotvorenjima, postupak inhibicije rasta tumora obuhvata davanje subjektu terapeutski efikasne količine Wnt-vezujućeg agensa. U određenim otelotvorenjima, subjekt je čovek. U određenim otelotvorenjima, subjekt ima tumor ili mu je tumor uklonjen.
[0165] Pronalazak takođe daje metode za smanjenje frekvencije matičnih ćelija kancera u tumoru koji sadrži matične ćelije kancera, metoda obuhvata davanje terapeutski efektivne količine Wnt-vezujućeg agensa subjektu. Pored toga, date su metode uzrokovanja diferencijacije tumorskih ćelija kod subjekta, pri čemu metoda sadrži davanje terapeutski efektivne količine Wnt-vezujućeg agensa subjektu. U nekim otelotvorenjima, postupci za uzrokovanje ekspresije markera diferencijacije u tumoru obuhvataju davanje terapeutski efektivne količine Wnt-vezujućeg agensa subjektu. U određenim otelotvorenjima, subjekat je čovek.
[0166] U određenim otelotvorenjima, tumor je tumor u kojem je Wnt signaliziranje aktivno. U određenim otelotvorenjima Wnt signaliziranje koje je aktivno je kanoničko Wnt signaliziranje. U određenim otelotvorenjima, tumor je Wnt-zavisni tumor. Na primer, u nekim otelotvorenjima, tumor je osetljiv na prekomernu ekspresiju aksina. U određenim otelotvorenjima, tumor ne sadrži neaktivirajuću mutaciju (npr., skraćivanje mutacije) u adenomatoza polipoza coli (APC) tumor supresorskom genu ili aktivirajuću mutaciju u beta-katenin genu. U određenim otelotvorenjima, tumor izražava jedan ili više gena u Wnt genskom potpisu. U određenim otelotvorenjima, kancer za koji se subjekt tretira podrazumeva takav tumor.
[0167] U određenim otelotvorenjima, tumor vrši ekspresiju jednog ili više ljudskih Wnt proteina na koje se vezuju Wnt-vezujući agensi. U određenim otelotvorenjima, tumor vrši prekomernu ekspresiju ljudskih Wnt.
[0168] U određenim otelotvorenjima tumor je izabran iz grupe koja se sastoji od kolorektalnog tumora, tumora pankreasa, tumora pluća, tumora jajnika, tumora jetre, tumora dojke, tumora bubrega, tumora prostate, gastrointestinalnog tumora, melanoma, tumora grlića materice, tumora mokraćne bešike, glioblastoma, tumora glave i vrata. U određenim otelotvorenjima, tumor je kolorektalni tumor. U određenim otelotvorenjima, tumor je tumor pankreasa. U nekim otelotvorenjima, tumor je tumor dojke.
[0169] Pronalazak takođe daje metodu za inhibiranje Wnt signaliziranje u ćeliji koja obuhvata dovođenje ćelije u kontakt sa efektivnom količinom Wnt-vezujućeg agensa. U određenim otelotvorenjima, ćelija je tumorska ćelija. U određenim otelotvorenjima, metoda je in vivo metoda gde korak dovođenja ćelije u kontakt sa agensom obuhvata davanje terapeutski efektivne količine agensa subjektu. U nekim alternativnim otelotvorenjima, metoda je in vitro ili ex vivo metoda. U određenim otelotvorenjima Wnt signaliziranje koje je inhibirano je kanoničko Wnt signaliziranje. U određenim otelotvorenjima, Wnt signaliziranje je signaliziranje sa Wnt1, Wnt2, Wnt3, Wnt3a, Wnt7a, Wnt7b, i/ili Wnt10b. U određenim otelotvorenjima, Wnt signaliziranje je signaliziranje sa Wnt1, Wnt3a, Wnt7b, and/or Wnt10b.
[0170] Osim toga, pronalazak daje metodu za smanjenje tumorigencije tumora kod subjekta, koja obuhvata davanje terapeutski efektivne količine Wnt-vezujućeg agensa subjektu. U određenim otelotvorenjima, tumor sadrži matične ćelije kancera. U nekim otelotvorenjima, tumorigeničnost tumora se smanjuje smanjenjem frekvencije matičnih ćelija karcinoma u tumoru. U određenim otelotvorenjima, frekvencija matičnih ćelija kancera u tumoru smanjuje se primenom Wnt-vezujućeg agensa. U određenim otelotvorenjima, agens ili antitelo može da smanji tumorigeničnost tumora koji sadrži matične ćelije kancera u životinjskom modelu, kao što je model ksenografta miša. U određenim otelotvorenjima, broj ili frekvencija matičnih ćelija kancera u tumoru je smanjena za najmanje oko dva puta, oko tri puta, oko pet puta, oko deset puta, oko 50 puta, oko 100 puta, ili oko 1000 puta. U određenim otelotvorenjima, smanjenje broja ili frekvence matičnih ćelija karcinoma određuje se testom ograničavanja dilucije upotrebom modela životinja.
Dodatni primeri i smernice u vezi s upotrebom testa ograničavanja dilucije za određivanje smanjenja broja ili frekvencije matičnih ćelija u tumoru mogu se naći, npr., u međunarodnoj objavi broj 2008/042236, objavi prijave patenta SAD br. 2008/0064049, i objavi prijave patenta SAD br.
2008/0178305.
[0171] Stoga pronalazak takođe daje metodu za smanjivanje frekvencije matičnih ćelija kancera u tumoru koji sadrži matične ćelije kancera, metoda obuhvata dovođenje tumora u kontakt sa efektivnom količinom Wnt-vezujućeg agensa (npr., rastvorljivi FZD receptor, rastvorljivi Ror receptor ili SFRP-Fc fuzija).
[0172] Pronalazak dalje daje metode za diferenciranje tumorigenih ćelija u ne-tumorigenske ćelije koje obuhvataju dovođenje tumorigenskih ćelija u kontakt sa Wnt-vezujućim agensom (na primer, davanje Wnt-vezujućeg agensa subjektu koji ima tumor koji sadrži tumorigenske ćelije ili kojima je takav tumor uklonjen). U određenim otelotvorenjima, tumorigene ćelije su tumorske ćelije pankreasa. U određenim alternativnim otelotvorenjima, tumorigene ćelije su ćelije tumora debelog creva.
[0173] Upotreba Wnt-vezujućih agenasa opisana ovde za uzrokovanje diferencijacije ćelija, uključujući, ali bez ograničenja, tumorske ćelije, takođe je data. Na primer, metode za uzrokovanje ćelija se diferenciraju uključuju dovođenje ćelija u kontakt sa efektivnom količinom Wnt-vezujućeg agensa (npr., rastvorljivog FZD receptora, rastvorljivog Ror receptora ili SFRP-Fc fuzije) koji su ovde opisani. Metode za uzrokovanje ćelija u tumoru kod subjekta da se diferenciraju obuhvataju davanje terapeutski efektivne količine Wnt-vezujućeg agensa subjektu takođe s date. U određenim otelotvorenjima, tumor je tumor pankreasa. U nekim drugim otelotvorenjima, tumor je tumor debelog creva.
[0174] Metode tretiranja bolesti ili poremećaja kod subjekta, gde je bolest ili poremećaj vezan sa aktivacijom Wnt signaliziranja i/ili se karakteriše povećanim nivoom matičnih ćelija i/ili progenitorskih ćelija. U nekim otelotvorenjima, postupci tretiranja obuhvataju davanje terapeutski efektivne količine Wnt-vezujućeg agensa subjektu. U određenim otelotvorenjima Wnt signaliziranje je kanoničko Wnt signaliziranje.
[0175] Wnt-vezujući agensi ili antagonisti se daju kao odgovarajući farmaceutski sastav ljudskom pacijentu u skladu sa poznatim metodama. Pogodni metode primene uključuju, ali nisu ograničene na, intravenozne (davanje kao bolus ili kontinuirana infuzija tokom jednog vremenskog perioda), intramuskularne, intraperitonealne, intracerobrospinalne, subkutane, intraartikularne, intrasinovske, intratekalne, oralne, topikalne ili inhalacione vidove davanja.
[0176] U određenim otelotvorenjima, pored davanja Wnt-vezujućeg agensa, metoda ili tretiranje dalje obuhvata davanje drugog terapeutskog agensa (npr. anti-kancer agens) pre, istovremeno sa i/ili nakon davanja Wnt-vezujućeg agensa. Farmaceutski sastavi koji sadrže Wnt-vezujući agens i drugi terapeutski agens takođe su dati.
[0177] Biće prihvaćeno da kombinacija Wnt-vezujućeg agensa i drugog terapeutskog agensa može biti primenjena u bilo kojem redu ili istovremeno. U odabranim otelotvorenjima, Wnt-vezujući agensi će se davati pacijentima koji su prethodno bili podvrgnuti terapiji sa drugim terapeutskim agensom. U nekim drugim otelotvorenjima, Wnt-vezujući agens i drugi terapeutski agens će se primenjivati u suštini zajedno ili istovremeno. Na primer, subjektu se može dati Wnt-vezujući agens dok prolazi kroz terapiju sa drugim terapeutskim agensom (npr., hemoterapija). U određenim otelotvorenjima, Wntvezujući agens će se davati u roku od 1 godine od tretmana sa drugim terapeutskim agensom. U određenim alternativnim otelotvorenjima, Wnt-vezujući agens će se primenjivati u roku od 10, 8, 6, 4 ili 2 meseca od bilo kog tretmana sa drugim terapeutskim agensom. U nekim drugim otelotvorenjima, Wnt-vezujući agens će biti primenjen u roku od 4, 3, 2 ili 1 nedelje od bilo kog tretmana sa drugim terapeutskim agensom. U nekim otelotvorenjima, Wnt-vezujući agens će se primenjivati u roku od 5, 4, 3, 2 ili 1 dana od bilo kog tretmana sa drugim terapeutskim agensom. Dalje će biti prihvaćeno da se dva agensa ili tretiranja mogu davati subjektu u roku od nekoliko sati ili minuta (tj. u suštini zajedno).
[0178] Kombinovana terapija sa najmanje dva terapijska agensa često koristi agense koji rade sa različitim mehanizmima delovanja, iako to nije potrebno. Kombinovana terapija sa agensima sa različitim mehanizmima delovanja može rezultirati dodatnim ili sinergijskim efektima. Kombinovana terapija može dozvoliti manje doze svakog agensa nego što se koristi u monoterapiji, čime se smanjuju neželjeni toksični efekti. Kombinovana terapija može smanjiti verovatnoću da će se razviti otporne ćelije kancera. U nekim otelotvorenjima kombinovana terapija sadrži terapeutski agens koji utiče na (npr., inhibira ili ubija) ne-tumorigene ćelije i terapeutski agens koji utiče na (na primer, inhibira ili ubija) tumorigene CSC.
[0179] Korisne klase terapeutskih (npr. anti-kancer) agenasa uključuju, na primer, antitubulinske agense, auristatine, veznike manjih DNK žljebova, inhibitore replikacije DNK, agense za alkilovanje (npr. kompleksi platine kao što su cis-platin, mono(platina), bis(platina) i tri-nuklearni kompleksi platine i karboplatina), antracikline, antibiotike, antifolate, antimetabolite, senzitizatore za hemoterapiju, duokarmicine, etopozide, fluorirane pirimidine, jonofore, lekitropsine, nitrosuree, platinole, aktivne supstance, purinske antimetabolite, puromicine, steroide, taksane, inhibitore topoizomeraze, vinca alkaloide ili slično. U određenim otelotvorenjima, drugi terapeutski agens je antimetabolit, antimitotik, inhibitor topoizomeraze ili inhibitor angiogeneze.
[0180] Terapeutski agensi koji se mogu primenjivati u kombinaciji sa Wnt-vezujućim agensima uključuju hemoterapeutske agense. Prema tome, u nekim otelotvorenjima, metoda ili tretiranje podrazumeva kombinovanu primenu Wnt-vezujućeg agensa prema datom pronalasku i hemoterapeutski agens ili koktel od više različitih hemoterapeutskih agenasa. Tretiranje sa Wntvezujućim agensom može se odvijati pre, istovremeno sa ili nakon primene hemoterapije. Hemoterapije prema ovom pronalasku obuhvataju hemijske supstance ili lekove koji su poznati u struci i dostupni su na tržištu, kao što su gemcitabin, irinotekan, doksorubicin, 5-fluorouracil, citozin arabinozid („Ara-C“), ciklofosfamid, tiotepa, busulfan, citoksin , paklitaksel, metotreksat, cisplatin, melfalan, vinblastin i karboplatin. Kombinovano davanje može uključiti zajedno davanje, bilo u jednoj farmaceutskoj formulaciji ili upotrebom odvojenih formulacija, ili uzastopno davanje u bilo kojem redu, ali uglavnom u vremenskom periodu tako da svi aktivni agensi mogu istovremeno vršiti svoje biološke aktivnosti. Priprema i rasporeda doziranja za takve hemoterapeutske agense mogu se izvršiti prema uputstvima proizvođača ili kao što je empirijski određeno od strane stručnjaka. Priprema i rasporeda doziranja za takvu hemoterapiju su takođe opisani u Chemotherapy Service Ed., M. C. Perry, Williams & Wilkins, Baltimore, Md. (1992).
[0181] Hemoterapeutski agensi koji su od koristi za ovaj pronalazak takođe uključuju, ali bez ograničenja, agense za alkilovanje kao što su tiotepa i ciklosfosfamid; alkil sulfonate kao što su busulfan, improsulfan i piposulfan; aziridine kao što su benzodopa, karbo-kun, meturedopa i uredopa; etileniniine i metilameline, uključujući altretamin, trietilenemelamin, trietilenfosforamid, trietilenetiofosforamid i trimetilolomelamim; azotne iperite kao što su hlorambucil, hlornafazin, holofosfamid, estramustin, ifosfamid, mehloretamin, mehloretamin oksid hidrohlorid, melfalan, novembikin, fenestarin, prednimustin, trofosfamid, uramustin; nitrosuree kao što su karmustin, hlorozotocin, fotemustin, lomustin, nimustin, ranimustin; antibiotike kao što su aclacinomizini, aktinomicin, autramicin, azaserin, bleomicini, kaktinomicin, kalicheamicin, karabicin, kaminomicin, karzinofilin, hromomicini, daktinomicin, daunorubicin, detorubicin, 6-diazo-5-okso-L-norlucin, doksorubicin, epirubicin, esorubicin, idarubicin , marcelomicin, mitomicin, mikofenolna kiselina, nogalamicin, olivomicini, peplomicin, potfiromicin, puromicin, kuelamicin, rodorubicin, streptonigrin, streptozocin, tubercidin, ubenimeks, zinostatin, zorubicin; anti-metabolite kao što su metotreksat i 5-fluorouracil (5-FU); analoge folne kiseline kao što su denopterin, metotreksat, pteropterin, trimetreksat; analogi purina kao što su fludarabin, 6-merkaptopurin, tiamiprin, tioguanin; analoge pirimidina kao što su ancitabin, azacitidin, 6-azauridin, karmofur, citarabin, dideoksiuridin, doksifluridin, enocitabin, floksuridin, 5-FU; androgene kao što su kalusteron, dromostanolonski propionat, epitiostanol, mepitiostan, testolakton; anti-adrenaline kao što su aminoglutetimid, mitotan, trilostan; obnavljače folne kiseline kao što je frolinska kiselina; aceglatone; aldofosfamidne glikozide; aminolevulinične kiseline; amsacrin; bestrabucil; bisantren; edatrakat; defofamin; demekolcin; diazikon; elformitin; eliptinijum acetat; etoglucid; galijum nitrat; hidroksiureu; lentinan; lonidamin; mitoguazon; mitoksantron; mopidamol; nitratin; pentostatin; fenamet; pirarubicin; podofilinsu kiselinu; 2-etilhidrazid; prokarbazin; PSK.; razoksan; sizofuran; spirogermanijum; tenuazonsku kiselinu; triazikuon; 2,2’,2“-trihlorotrietilamin; uretan, vindesin, dakarbazin, manomustin; mitobronitol, mitolaktol; pipobroman, gacitoz; arabinozid („Ara- C“); ciklofosfamid; tiotepa; taksoide npr., paklitaksel (TAXOL) i docetaksel (TAXOTERE), hlorambucil, gemcitabin, 6-tioguanin, merkaptopurin, metotreksat, analoge platine kao što su cisplatin i karboplatin, vinblastin, platina, etopozid (VP-16), ifosfamid, mitomicin C, mitokantron, vinkristin, vinorelbin, navelbin, novantron, tenipozid; daunomicin; aminopterin, keloda, ibironat; CPT11, inhibitor topoizomeraze RFS 2000; difluorometilomitin (DMFO); retinoičnu kiselinu; esperamicine; kapecitabin;. i farmaceutski prihvatljive soli, kiseline ili derivate bilo kojeg od gore navedenih. Hemoterapeutski agensi takođe uključuju anti-hormonalne agense koji deluju tako da regulišu ili inhibiraju hormonsko dejstvo na tumore kao što su anti-estrogeni uključujući na primer tamoksifen, raloksifen, aromatazu koja inhibira 4(5)-imidazol, 4-hidroksitamoksifen, trioksifen, keoksifen, LY117018, onapriston i toremifen (Fareston); i antiandrogene kao što su flutamid, nilutamid, bikalutamid, leuprolid i goserelin; i farmaceutski prihvatljive soli, kiseline ili derivate bilo kojeg od gore navedenih.
[0182] U određenim otelotvorenjima, hemoterapeutski agens je inhibitor topoizomeraze. Inhibitori topoizomeraze su hemoterapijski agensi koja ometaju delovanje enzima topoizomeraze (npr., topoizomeraza I ili II). Inhibitori topoizomeraze uključuju, ali nisu ograničeni na, doksorubicin HCl, daunorubicin citrat, mitoksantron HCl, aktinomicin D, etopozid, topotekan HCl, tenipozid (VM-26) i irinotekan. U nekim otelotvorenjima, drugi terapeutski agens je irinotekan. U određenim otelotvorenjima, tumor koji se tretira je kolorektalni tumor, a drugi terapeutski agens je inhibitor topoizomeraze, kao što je irinotekan. U nekim otelotvorenjima Wnt-vezujući agens sadrži SEQ ID Br:53, a drugi terapeutski agens je irinotekan. U nekim otelotvorenjima Wnt-vezujući agens sadrži SEQ ID Br:75, a drugi terapeutski agens je irinotekan.
[0183] U određenim aspektima, hemoterapeutski agens je anti-metabolit. Anti-metabolit je hemikalija sa strukturom koja je slična metabolitu koji je potreban za normalne biohemijske reakcije, ali ipak dovoljno različit da bi ometao jednu ili više normalnih funkcija ćelija, kao što je deljenje ćelija. Antimetaboliti obuhvataju, ali bez ograničenja, gemcitabin, fluorouracil, kapecitabin, metotreksat natrijum, ralitreksed, pemetreksed, togfur, citozin arabinozid, tioguanin, 5-azacitidin, 6-merkaptopurin, azatioprin, 6-tioguanin, pentostatin, fludarabin fosfat, i kladribin, kao i farmaceutski prihvatljive soli, kiseline ili derivate bilo kojeg od njih. U nekim otelotvorenjima, drugi terapeutski agens je gemcitabin. U određenim otelotvorenjima, tumor koji se tretira je tumor pankreasa, a drugi terapeutski agens je anti-metabolit (npr., gemcitabin). U nekim otelotvorenjima Wnt-vezujući agens sadrži SEQ ID Br:53, a drugi terapeutski agens je gemcitabin. U nekim otelotvorenjima Wnt-vezujući agens sadrži SEQ ID Br:75, a drugi terapeutski agens je gemcitabin.
[0184] U određenim otelotvorenjima, hemoterapeutski agens je antimitotični agens, uključujući, ali bez ograničenja, agense koja se vezuju za tubulin. Kao neograničavajući primer, agent sadrži taksan. U određenim otelotvorenjima, agens sadrži paklitaksel ili docetaksel, ili farmaceutski prihvatljivu so, kiselinu ili derivat paklitaksela ili docetaksela. U određenim otelotvorenjima, agens je paklitaksel (TAXOL), docetaksel (TAXOTERE), paklitaksel vezan za albumin (ABRAX- ANE), DHA-paklitaksel ili PG-paklitaksel. U određenim alternativnim otelotvorenjima, antimitotički agens sadrži vinka alkaloid, kao što su vinkristin, binblastin, vinorelbin ili vindezin, ili farmaceutski prihvatljive soli, kiseline ili derivate istih. U nekim otelotvorenjima, antimitotički agens je inhibitor Eg5 kinezina ili inhibitor mitotske kinaze, kao što je Aurora A ili Plk1. U određenim otelotvorenjima gde je hemoterapeutski agens koji se daje u kombinaciji sa Wnt-vezujućim agensom ili polipeptidom sadrži antimitotički agens, kancer ili tumor koji se tretira je kancer dojke ili tumor dojke. U određenim otelotvorenjima, tumor koji se tretira je tumor dojke, a drugi terapeutski agens je paklitaksel. U nekim otelotvorenjima Wnt-vezujući agens sadrži SEQ ID Br:53, a drugi terapeutski agens je paklitaksel. U nekim otelotvorenjima Wnt-vezujući agens sadrži SEQ ID Br:75, a drugi terapeutski agens je paklitaksel.
[0185] U određenim otelotvorenjima, terapija podrazumeva kombinovanu primenu Wnt-vezujućeg agensa prema ovom pronalasku i terapiju zračenjem. Tretiranje sa Wnt-vezujućim agensom može se javiti pre, istovremeno sa ili nakon primene zračenja. Bilo koji raspored doziranja za takvu terapiju zračenjem se može koristiti kako je to odredio stručni lekar.
[0186] U nekim otelotvorenjima, drugi terapeutski agens sadrži antitelo. Prema tome, tretiranje može obuhvatiti kombinovano davanje Wnt-vezujućih agenasa iz ovog pronalaska sa antitelima protiv antigena vezanih sa tumorom uključujući, ali bez ograničenja, antitela koja se vezuju za EGFR, ErbB2, HER2, DLL4, Notch, i/ili VEGF. Primeri, anti-DLL4 antitela su opisana, na primer, u patentu SAD br. 7,750,124. Dodatna anti-DLL4 antitela opisana su, npr., u međunarodnoj objavi patenta br. WO 2008/091222 i WO 2008/0793326, i objavi prijave patenta SAD br US 2008/0014196, US 2008/0175847, US 2008/0181899, i US 2008/0107648. U određenim otelotvorenjima, drugi terapeutski agens je antitelo koje je inhibitor angiogeneze (npr. anti-VEGF antitelo). U nekim otelotvorenjima Wnt-vezujući agens sadrži SEQ ID Br:53, a drugi terapeutski agens je anti-VEGF antitelo. U nekim otelotvorenjima Wnt-vezujući agens sadrži SEQ ID Br:75, a drugi terapeutski agens je anti-VEGF antitelo. U nekim otelotvorenjima, drugi terapeutski agens je inhibitor Notch signaliziranja. U nekim otelotvorenjima, drugi terapeutski agens je anti-Notch antitelo. Primeri anti-Notch antitela opisani su, na primer, u objavi prijave patenta SAD br. US 2008/0131434. U nekim otelotvorenjima, drugi terapeutski agens je bevacizumab (AVASTIN), trastuzumab (HERCEPTIN), panitumumab (VECTIBIKS) ili cetuksimab (ERBITUKS). Kombinovano davanje može uključiti zajedno davanje, bilo u jednoj farmaceutskoj formulaciji ili koristeći odvojene formulacije, ili uzastopnu primenu u bilo kojem redu, ali uglavnom u vremenskom periodu tako da svi aktivni agensi mogu istovremeno vršiti svoje biološko dejstvo.
[0187] Štaviše, tretiranje može uključiti i primenu jednog ili više citokina (npr. limfokina, interleukina, faktora nekroze tumora i/ili faktore rasta) ili mogu biti praćene hirurškim uklanjanjem tumora ili ćelija karcinoma ili bilo koje druge terapije koja se smatra neophodnim od strane lekara.
[0188] Za tretiranje bolesti, odgovarajuća doza agensa prema datom pronalasku zavisi od vrste bolesti koju treba tretirati, težine i toka bolesti, odzivnosti bolesti, bilo da se agens daje u terapeutske ili preventivne svrhe, prethodne terapije, kliničke istorije pacijenta i tako dalje, određuje se po odluci lekara. Agens se može davati jednokratno ili preko serije tretiranja koji traju od nekoliko dana do nekoliko meseci ili dok se pacijent ne izleči ili se postigne smanjenje stanja bolesti (npr., smanjenje veličine tumora). Optimalni raspored doziranja može se odrediti na osnovu merenja akumulacije leka u telu pacijenta i može varirati u zavisnosti od relativnog potencijala pojedinačnog agensa. Lekar koji vrši tretiranje može lako odrediti optimalne doze, metodologije doziranja i stope ponavljanja. U određenim otelotvorenjima, doza je od 0.01mg do 100mg na kg telesne težine i može se davati jednom ili više puta dnevno, nedeljno, mesečno ili godišnje. U određenim otelotvorenjima, doza rastvorljivog receptora ili drugog Wnt-vezujućeg agensa je od oko 0.1mg do oko 20mg po kg telesne težine. U određenim otelotvorenjima, Wnt-vezujući agens se daje jednom nedeljno. U određenim otelotvorenjima, Wnt-vezujući agens se daje jednom na dve nedelje ili jednom svake tri nedelje. Lekar koji vrši tretiranje može da proceni stopu ponavljanja doziranja na osnovu merenih vremena boravka i koncentracija leka u telesnim tečnostima ili tkivima.
[0189] Dati pronalazak dalje obezbeđuje skrining metode efikasnosti pri inhibiciji Wnt signaliziranja, na antitumorsko dejstvo i/ili dejstvo protiv matičnih ćelija kancera. U određenim otelotvorenjima, postupak sadrži upoređivanje nivoa jednog ili više diferencijacijskih markera i/ili jednog ili više matičnih markera u prvom čvrstom tumoru (npr. čvrst tumor koji sadrži matične ćelije kancera) koji je bio izložen agensu i nivoa jednog ili više markera diferencijacije u drugom čvrstom tumoru koji nije bio izložen agensu. U nekim otelotvorenjima metoda obuhvata: (a) izlaganje prvom čvrstom tumoru, ali ne i drugom čvrstom tumoru, agensu; (B) procenjivanje nivoa jednog ili više markera diferencijacije i/ili jednog ili više matičnih markera u prvom i drugom čvrstom tumoru; i (c) upoređivanje nivoa jednog ili više markera diferencijacije u prvom tumoru i nivoa jednog ili više diferencijacijskih markera u drugom čvrstom tumoru. U određenim otelotvorenjima, (a) povećani nivoi jednog ili više diferencijacijskih markera u prvom čvrstom tumoru u odnosu na nivoe jednog ili više diferencijacijskih markera u drugom čvrstom tumoru ukazuju na anti-tumorsko (ili anti-kancer matične ćelije) dejstvo; i (b) smanjeni nivoi jednog ili više matičnih markera ukazuju na tumorsko dejstvo (ili anti-kancer matične ćelije). U određenim otelotvorenjima, agens vezuje jedan ili više Wnt proteina. U određenim otelotvorenjima, agens je FZD rastvorljiv receptor. U određenim otelotvorenjima, agens je antitelo, kao što je anti-Wnt antitelo.
[0190] Dodatne skrining metode agenasa uključuju, ali nisu ograničeni na, metode koje sadrže upoređivanje nivoa jednog ili više diferencijacijskih markera u prvom čvrstom tumoru koji je bio izložen agensu sa nivoima jednog ili više diferencijacijskih markera u drugom čvrstom tumoru koji nije bio izložen agensu. U određenim otelotvorenjima, postupci obuhvataju: (a) izlaganje prvog čvrstog tumora, ali ne i drugog čvrstog tumora, agensu; (B) procenjivanje nivoa jednog ili više markera za diferencijaciju u prvom i drugom čvrstom tumoru; i (c) upoređivanje nivoa jednog ili više markera diferencijacije u prvom tumoru sa nivoima jednog ili više diferencijacijskih markera u drugom čvrstom tumoru. U određenim otelotvorenjima, agens je Wnt-vezujući agens. U određenim aspektima, agens je inhibitor kanonskog Wnt signalnog puta. U određenim otelotvorenjima, agens inhibira vezivanje jednog ili više ljudskih Wnt proteina na jedan ili više ljudskih FZD receptora. U određenim otelotvorenjima, povećani nivoi jednog ili više diferencijacijskih markera u prvom čvrstom tumoru u odnosu na nivoe jednog ili više diferencijacijskih markera u drugom čvrstom tumoru ukazuju na efikasnost u odnosu na čvrste tumorske matične ćelije (CSC). U određenim alternativnim otelotvorenjima, smanjeni nivoi jednog ili više diferencijacijskih markera (tj. negativnih markera za diferencijaciju) u prvom čvrstom tumoru u odnosu na nivoe jednog ili više diferencijacijskih markera u drugom čvrstom tumoru ukazuju na efikasnost u odnosu na čvrste tumorske matične ćelije.
[0191] U određenim otelotvorenjima, čvrst tumor u skrining metodi je tumor pankreasa. U određenim otelotvorenjima, čvrsti tumor je tumor pankreasa i jedan ili više diferencijacijskih markera mogu da sadrže jedan ili više mucina (npr., Muc16), jedan ili više citokretina (npr., CK20) i/ili hromogranin A (CHGA).
[0192] U određenim alternativnim otelotvorenjima, čvrsti tumor u skrining metodi je tumor debelog creva. U nekim otelotvorenjima, čvrsti tumor je tumor debelog creva i jedan ili više diferencijacijskih markera mogu da sadrže jedan ili više citokeratina (npr., Citokeratin 7 ili CK20).
[0193] U određenim otelotvorenjima, jedan ili više matičnih markera koji su korišćeni u skrining metodi ovde opisanoj sadrže ALDH1A1, APC, AXIN2, BMI1, CD44, FGF1, GJB1, GJB2, HES1, JAG1, LGR5, LHX8, MYC, NANOG, NEUROD1, NEUROG2, NOTCH1, NOTCH2, NOTCH3, NOTCH4, PROCR, RARRES1, RARRES3, RBP2, SOX1, SOX2, ASCL2,TDGF1, OLFM4, MSI1, DASH1, EPHB3 i/ili EPHB4. U određenim otelotvorenjima, dva ili više matična markera, tri ili više matičnih markera, četiri ili više matičnih markera, pet ili više matičnih markera, šest ili više, ili deset ili više matičnih markera su izabrani iz grupe koju čine ALDH1A1, APC, AXIN2, BMI1, CD44, FGF1, GJB1, GJB2, HES1, JAG1, LGR5, LHX8, MYC, NANOG, NEUROD1, NEUROG2, NOTCH1, NOTCH2, NOTCH3, NOTCH4, PROCR, RARRES1, RARRES3, RBP2, SOX1, SOX2, ASCL2,TDGF1, OLFM4, MSI1, DASH1, EPHB3 i EPHB4.
[0194] U određenim otelotvorenjima, jedan ili više diferencijacijskih markera koji su korišćeni u skrining metodama sadrže ALDOB, BMP2, BMP7, BMPR1B, CEACAM5, CEACAM6, CDX1, CDX2, CLCA2, COL1A2, COL6A1, CHGA, CSTA, CST4, CK20, DAB2, FABP4, GST1, KRT4, KRT7, KRT15, KRT17, KRT20, LAMA1, MUC3A, MUC4, MUC5AC, MUC5B, MUC13, MUC15, MUC16, MUC17, NDRG2, PIP, PLUNC, SPRR1A, REG4, VSIG1, i/ili XAF1. U određenim otelotvorenjima, jedan ili više, tri ili više, četiri ili više, pet ili više, šest ili više, deset ili više diferencijacijskih markera koji su korišćeni u skrining metodama sadrže ALDOB, BMP2, BMP7, BMPR1B, CEACAM5, CEACAM6, CDX1, CDX2, CLCA2, COL1A2, COL6A1, CHGA, CSTA, CST4, CK20, DAB2, FABP4, GST1, KRT4, KRT7, KRT15, KRT17, KRT20, LAMA1, MUC3A, MUC4, MUC5AC, MUC5B, MUC13, MUC15, MUC16, MUC17, NDRG2, PIP, PLUNC, SPRR1A, REG4, VSIG1, i XAF1.
[0195] Drugi potencijalni diferencijalni markeri za pankreas i debelo crevo, kao i za druge tipove tumora poznati su onima koji su stručni u ovoj oblasti. Pored toga, korisnost potencijalnih diferencijacijskih markera u skrining metodi može lako proceniti onaj ko je stručan u ovoj oblasti tretiranjem željenog tipa tumora sa jednim ili više rastvorljivih FZD receptora koji su ovde opisani, kao što je FZD8-Fc, a zatim procenjivanjem promena u ekspresiji markera od tretiranog tumora u odnosu na kontrolu. Neograničavajući primeri takvih metoda, na primer, mogu se naći u konkretnim Primerima u nastavku.
[0196] Dati pronalazak dalje daje metode za proizvodnju rastvorljivih Wnt-vezujućih agenasa. U određenim otelotvorenjima, postupak obuhvata stvaranje rastvorljivog Wnt-vezujućeg agensa koji sadrži domen Fri ljudskog FZD8 u ćeliji, pri čemu najmanje 80% Wnt-vezujućeg agensa ima N-terminalnu sekvencu ASA, metoda koja obuhvata upotrebu signalne sekvence koja je izabrana iz grupe koju čine: SEQ ID Br:71, SEQ ID Br:70, SEQ ID Br:72, SEQ ID Br:73 i SEQ ID Br:74 za proizvodnju Wnt-vezujućeg agensa. U nekim otelotvorenjima metode, signalna sekvenca je SEQ ID Br:71. U nekim otelotvorenjima, najmanje oko 90%, najmanje oko 95% ili najmanje oko 98% Wntvezujućeg agensa ima N-terminalnu sekvencu ASA. U nekim otelotvorenjima, ćelija je ćelija sisara. U nekim otelotvorenjima Wnt-vezujući agens obuhvata ljudski Fc region. U nekim otelotvorenjima Wntvezujući agens sadrži sekvencu amino kiseline izabranu iz grupe koju čine: SEQ ID Br:53, SEQ ID Br:50, SEQ ID Br:46, SEQ ID Br:48 i SEQ ID Br:1. U nekim otelotvorenjima Wnt-vezujući agens sadrži SEQ ID Br:53. U nekim otelotvorenjima Wnt-vezujući agens sadrži SEQ ID Br:50. U nekim otelotvorenjima, ćelija sadrži polinukleotid koji sadrži polinukleotid koji kodira polipeptid koji ima sekvencu SEQ ID Br:75.
PRIMERI
[0197] Jasno je da su primeri i otelotvorenja ovde opisani samo za ilustrativne svrhe.
PRIMER 1
Proizvodnja FZD8-Fc
[0198] cDNK koja kodira FZD8-Fc (54F03) je subklonirana u ekspresioni vektor pEE14.4 (Lonza) koji je digestiran sa HindIII i EcoRI. Nakon kloniranja, pEE14.4-FZD8-Fc DNK je linearizovan digestijom sa PvuI i zatim je uveden u ćelije GS-CHOK1 elektroporacijom koristeći standardne postupke. Stabilni klonovi koji koji vrše ekspresiju FZD8-Fc su dobijeni i prošireni u medijum bez seruma. FZD8-Fc je prečišćen afinitetnim hvatanjem pomoću proteina A-konjugovane smole. Analiza SDS-PAGE otkrila je veću čistoću od 98% i nivo endotoksina bio je manji od 1 EU/mg proteina.
[0199] Sekvenca amino kiseline FZD8-Fc je SEQ ID Br:1 i polinukleotidna sekvenca koja enkodira FZD8-Fc je SEQ ID Br:2.
PRIMER 2
Farmakokinetika FZD8-Fc u pacovu
[0200] Farmakokinetika FZD8-Fc (54F03) je procenjena kod pacova u ispitivanju farmakokinetike (PK) od dve nedelje korišćenjem doza od 2 mg/kg i 10 mg/kg. Sprague Dawley pacovi, pet mužjaka u svakoj grupi, bili su dozirani sa FZD8-Fc preko vene u repu sa 2 mg/kg ili 10 mg/kg i nakon dve nedelje uzorci su praćeni i sakupljeni u vremenskim tačkama od 1, 24, 48, 72, 96, 168, 240 i 336 sati. U svakom vremenskom trenutku, 1 ml krvi je sakupljeno u cevi kalijum-EDTA i centrifugirano je. Supernatanti plazme su sakupljeni i zamrznuti dok se uzorci nisu analizirali.
[0201] Nivo fuzionog proteina FZD8-Fc prisutan u plazmi u svakoj vremenskoj tački je kvantifikovan, a polu-život FZD8-Fc izračunat je za dve doze. Kao što je prikazano na Slici 1, polu život FZD8-Fc je procenjen da iznosi 163 sata za 2 mg/kg i iznosi 157 sati za 10 mg/kg.
PRIMER 3
Anti-tumorno dejstvo FZD8-Fc kod modela tumora pankreasa
[0202] Inhibicija rasta tumora FZD8-Fc u modelu tumora pankreasa. Anti-tumorna aktivnost FZD8-Fc (54F03) je procenjena u modelu ksenografta tumora pankreasa. Odvojene OMP-PN4 ćelije (50.000 po životinji) su subkutano injektirane u 6 i 8 nedelja stare mužjake NOD/SCID miševe. Rast tumora praćen je nedeljno i merenja tumora započela su kada su tumori bili opipljivi. Na dan 50, miševi sa prosečnim zapreminama tumora 137mm3 su nasumično podeljeni u 4 grupe od po 10 životinja. Životinje su injektirane ili kontrolnim antitelom, FZD8-Fc (15 mg/kg), gemcitabinom (2 mg/kg) ili kombinacijom FZD8-Fc i gemcitabina. Davanje FZD8-Fc i gemcitabina je izvršeno injektiranjem u intra-peritonealnu šupljinu, jednom nedeljno (gemcitabin) ili dva puta nedeljno (FZD8-Fc). Tumori su mereni dva puta nedeljno, a zapremina tumora određena je korišćenjem formule ©(a x b<2>); Gde je a = dužina i b = širina. Podaci su izraženi kao srednja i srednja 6 S.E.M. Grupna sredstva su upoređena pomoću studentskog dvostrukog, neuparenog t testa. Verovatnoća (p) vrednosti <0.05 se tumače kao značajno drugačije.
[0203] Tretiranje sa FZD8-Fc se ispoljilo sa smanjenjem rasta tumora od 66%, kao što je prikazano na Slici 2 (p < 0.001). Osim toga, tretiranje sa FZD8-Fc i gemcitabinom dovelo je do smanjenja rasta tumora od 29% u odnosu na tretiranje samo sa FZD8-Fc (p = 0.04 nasuprot samo FZD8-Fc) (Slika 2). Tako je FZD8-Fc pokazao dejstvo tumorskog rasta u PN4 modelu tumorskom pankreasa kao jedinstvenom agensu kao i u kombinaciji sa gemcitabinom.
[0204] Redukcija CD44hi populacije u PN4 tumorima tretiranim sa FZD8-Fc. Kontrolni i tretirani tumori iz OMP-PN4 ksenograft ispitivanja opisani gore sakupljeni su na kraju ispitivanja (dan 85). Tumori su obrađeni i podeljeni u pojedinačne ćelije. Suspenzije iz pojedinačnih ćelija izvedene iz 5 tumora svake terapijske grupe su objedinjene, a objedinjeni uzorci su zatim inkubirani na ledu u trajanju od 30 minuta sa antitelima koja selektivno vezuju ćelije miševa (α-miš CD45-biotin 1:200 razređivanje i pacov α-miš H2Kd -biotin 1:100 razređivanje, BioLegend, San Diego, CA), nakon čega sledi dodavanje magnetnih zrna sa oznakom streptavidina (Invitrogen, Carlsbad, CA). Ćelije miševa su uklonjene pomoću magneta. Za analizu površinskih markera ćelija kod ljudi, suspenzija pojedinačnih tumora ćelija je obojena anti-ESA (Biomeda, Hayward, CA) i anti-CD44 (BD Biosciences, San Jose, CA) antitelima koja su direktno konjugovana do fluorohroma. Mrtve ćelije su isključene korišćenjem DAPI održive boje. Protočna citometrija je izvedena pomoću instrumenta FACS Aria (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ). Za eliminaciju ćelijskih grudva korišćeni su bočni rastureni i napredni profili.
[0205] Analiza tumora tretiranih kontrolnim antitelima otkrila je da 12.7% ukupne populacije tumora vrši ekspresiju oba ESA i CD44 pri visokim nivoima. Na dvostruku pozitivnu populaciju nije značajno uticalo lečenje samo sa gemcitabinom (13.9%), kao što je prikazano na Slici 3, ali tretiranje sa FZD8-Fc ili kombinacijom FZD8-Fc sa gemcitabinom smanjuje dvostruku pozitivnu populaciju (1.9% i 1.7% redom).
[0206] Analiza PN4 tumora tretiranih sa FZD8-Fc testom ograničavanja dilucije. Testovi ograničavanja dilucije (LDA) mogu se koristiti za procenjivanje efekta terapeutskih agenasa na matične ćelije tumora čvrstog tumora i tumorigeničnosti tumora koji sadrži matične ćelije kancera. Takvi testovi mogu se koristiti za određivanje frekvencije matičnih ćelija karcinoma u tumoru kod životinja tretiranih sa FZD8-Fc fuzionisanim proteinom ili drugim agensom i za upoređivanje te frekvencije sa frekvencijom matičnih ćelija raka u tumorima kod kontrolnih životinja.
[0207] Kontrolni i tretirani tumori iz PN4 ksenograft ispitivanja koji su gore opisani sakupljeni su na kraju ispitivanja (dan 85). Tumori su obrađeni i odvojeni u pojedinačne ćelije. Suspenzije iz pojedinačnih ćelije izvedene iz 5 tumora svake terapijske grupe su objedinjene, a objedinjeni uzorci su zatim inkubirani na ledu u trajanju od 30 minuta sa antitelima koja selektivno vezuju ćelije miša (α -miš CD45-biotin 1:200 razređivanje i pac α -miš H2Kd-biotin 1:100 razređivanje, BioLegend, San Diego, CA.), nakon čega sledi dodavanje magnetnih zrna sa oznakom streptavidina (Invitrogen, Carlsbad, CA). Ćelije miša su uklonjene pomoću magneta. Ljudske ćelije u suspenziji su sakupljene, prebrojane i obojene površinskim markerima za ćelijske i odgovarajuće doze ćelija (30, 90 i 270 ćelija) u FACS puferu su mešane u smeši 1:1 sa Matrigelom i subkutano injektirane u NOD/SCID Miševe (10 miševa po dozi ćelije po grupi tretiranja). Tumori mogu rasti do 4 meseca.
[0208] U željenoj vremenskoj tački, procenat miševa sa uočljivim tumorima utvrđen je u svim grupama injektovanim sa tumorskim ćelijama tretiranim sa FZD8-Fc i upoređen je sa procentom miševa sa uočljivim tumorima u kontrolama. Na primer, određuje se broj miševa injektiranih sa 125 kontrolnih tumora koji su tretirani sa antitelima koja imaju uočljive tumore i upoređuje se sa brojem miševa injektiranih sa 125 ćelija tretiranih sa FZD8-Fc tumorom koje imaju uočljive tumore.
[0209] Na dan 75 nakon injekcije ćelija, stope uzimanja tumora u različitim grupama bile su sledeće: kontrola - 7 miševa od 30 miševa; FZD8-Fc - 3 miša od 30 miševa; gemcitabin - 7 miševa od 30 miševa; FZD8-Fc i gemcitabin - 0 miševa od 30 miševa (Slika 4). Smanjena stopa uzimanja tumora u FZD8-Fc i u kombinovanim tretiranim grupama pokazala je da je frekvenca matičnih ćelija kancera smanjena kod PN4 FZD8-Fc tumora pankreasa. Dokazi iz procene oba, CD44 ekspresije i analize ograničavajuće doze dilucije pokazuju da tretman sa FZD8-Fc smanjuje frekvenciju matičnih ćelija kancera u PN4 tumorima pankreasa.
[0210] Frekvenca matičnih ćelija kancera (CSC) može se izračunati pomoću softvera L-CalcTM (StemCell Technologies Inc.; www.stemcell.com). Ukratko, na osnovu statistike Poisson-a, tačno jedna matična ćelija kancera postoji među poznatim brojem injektiranih ćelija, ukoliko 37% životinja ne razvije tumore. CSC frekvencija za grupu koja je tretirana sa kontrolnim antitelom bila je 1:280, frekvencija CSC za grupu tretiranu sa gemcitabinom je bila 1:476, frekvencija CSC za FZD8-Fc tretiranu grupu je bila 1:881, a frekvenca CSC za grupu tretiranu sa kombinacijom FZD8-Fc i gemcitabina je izračunata da je manja od 1:3763. Ovaj broj nije mogao biti precizno određen zato što je stopa tumora u ovoj grupi bila nula, čak i kod najveće doze ćelija.
PRIMER 4
Povećana ćelijska diferencijacija tumora pankreasa sa FZD8-Fc
[0211] Povećana diferencijacija ćelija PN4 i PN8 tumora tretiranjem sa FZD8-Fc. Kontrolni i tretirani tumori iz OMP-PN4 ksenograft ispitivanja koji su opisani iznad (Primer 3) sakupljeni su na kraju ispitivanja (dan 85). Tumori su bili fiksirani u formalinu, ugrađeni u parafin, a delovi tumora debljine 4mm su isečeni. Nakon deparafinizacije i hidratacije, delovi su tretirani sa vodenim rastvorom sirćetne kiseline 5 minuta na sobnoj temperaturi. Delovi su zatim tretirani sa 1% alcian plave u 3% vodenoj sirćetnoj kiselini u trajanju od 30 minuta i isprani vodom. Delovi su suprotno obojeni neutralnom brzom crvenom, dehidrirani i postavljeni. Koristeći ovu metodu, sialomucini u uzorcima tkiva su plavi i pozadina se pojavljuje kao ružičasta ili crvena.
[0212] Tretiranje PN4 tumora sa FZD8-Fc prouzrokovalo je povećanje ekspresije sialomukina u ćelijama u poređenju sa tumorima tretiranim kontrolnim antitelom ili gemcitabinom (Slika 5, gde se sialomucini pojavljuju kao tamno sivi). Kombinovano tretiranje sa FZD8-Fc i gemcitabinom takođe je povećalo ekspresiju sialomucina u PN4 tumorima pankreasa. Prema tome, FZD8-Fc tretiranje PN4 tumora povećalo je frekvenciju diferenciranih ćelija koje vrše ekspresiju mucina. Slični rezultati su prikazani u ksenograft modelu tumora pankreasa (Slika 6).
[0213] Povećana ćelijska diferencijacija PN13 tumora sa tretiranjem sa FZD8-Fc. Kapacitet diferencijacije ćelija FZD8Fc takođe je procenjen u ksenograft OMP-PN13 modelu tumora pankreasa. Odvojene OMP-PN13 ćelije (50.000 po životinji) su subkutano ubačene u muške NOD/SCID miševe od 6-8 nedelja. Rast tumora je nedeljno praćen i merenja tumora su započela kada su tumori bili uočljivi. Na dan 40 miševi sa prosečnom zapreminom tumora 114 mm3 nasumično podeljeni u 4 grupe od po 10 životinja. Životinje su injektirane sa kontrolnim antitelom ili FZD8Fc (15 mg / kg). Davanje FZD8-Fc i kontrolnog antitela izvršeno je injekcijom u intraperitonealnu šupljinu, dva puta nedeljno. Posle 19 dana lečenja, tumori su uklonjeni i imunohistohemijska analiza je izvršena korišćenjem standardnih tehnika. Ukratko, tumori su bili fiksirani u formalinu, ugrađeni u parafin, a delovi tumora debljine 4mm su isečeni. Nakon deparafinizacije i hidracije, delovi tumora su podvrgnuti procesu preuzimanja antigena u Tris puferu (pH 9.5). Delovi su inkubirani vodonik peroksidu (Sigma-Aldrich, St Louis, MO) 10 minuta da bi blokirali endogene peroksidaze. U svaki od delova dodato je Anti-Ki67 antitelo (Dako, klon MIB-1) sa razblaživanjem 1:200 u blokirajućem puferu (3% NHS, 1% BSA, 0.1% Tween-20, u PBS) i inkubirano 1 čas. Slajdovi su isprani 3 puta sa PBST po 5 minuta. Anti-miš sekundarno antitelo konjugovano sa HRP (ImmPRESS™ anti-mouse, Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA) dodato je u slajdove i inkubirano 30 minuta. Posle višestrukog ispiranja sa PBST, supstrat Vector Nova Red (Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA) je dodat za lokalizaciju antigena Ki67. Delovi su tretirani vodenim rastvorom sirćetne kiseline 5 minuta na sobnoj temperaturi. Delovi su zatim tretirani sa 1% alcian plave u 3% vodenoj sirćetnoj kiselini u trajanju od 30 minuta i isprani su sa vodom. Delovi su kontra-obojeni u neutralnu brzu crvenu, dehidrirani i postavljeni. Koristeći ovu metodu, sijalomucini u uzorcima tkiva plave i proliferirajuće ćelije označene su tamno crvenim.
[0214] Tretiranje PN13 tumora sa FZD8-Fc dovelo je do povećanja ekspresije ćelija sialomucina u odnosu sa tumorima tretiranim sa kontrolnim antitelima. Tretiranje PN13 tumora sa FZD8-Fc takođe je rezultiralo smanjenjem proliferacionih ćelija, kao što je označeno ekspresijom Ki67. Slika 7 pokazuje jasan pad broja ćelija proliferacije (identifikovanih crnim tačkama) u tkivu iz tumora koji su tretirani sa FZD8-Fc. Zbog toga tretiranje PN13 tumora sa FZD8-Fc smanjuje proliferaciju ćelija i povećava učestalost ekspresije ćelija difuznih mucina.
[0215] Povećano Muc16 bojenje u Pn13 tumorima sa FZD8-Fc. Delovi tumora od PN13 tumora tretiranih sa kontrolnim antitelom ili FZD8-Fc su dobijeni i tretirani kako je gore opisano. U ovom primeru antitelo anti-Muc16 (Abcam, Cambridge, MA) u blokirajućem puferu sa razređivanjem 1:200 (3% NHS, 1% BSA, 0.1% Tween-20 u PBS) je dodato i inkubirano 1 sat . Vezano antitelo je detektovano upotrebom protokol imunohistohemije koji je opisan iznad.
[0216] Tretiranje PN13 tumora sa FZD8-Fc rezultiralo je povećanjem ćelija koje su vršile ekspresiju Muc16 u odnosu na tumore tretirane kontrolnim antitelima (Slika 8, tamno bojenje).
[0217] Povećano CK bojenje u Pn13 tumorima sa FZD8-Fc. Delovi tumora su dobijeni i tretirani kao što je gore opisano. U ovom primeru antitelo anti-CK20 (klon Ks20.8, Dako, Carpinteria, CA) u blokirajućem puferu sa razblaživanjem 1: 200 (3% NHS, 1% BSA, 0.1% Tween-20, in PBS) je dodato u svaki deo i inkubirano 1 sat. Vezano antitelo je detektovano upotrebom protokol imunohistohemije opisan gore.
[0218] Tretiranje PN13 tumora sa FZD8-Fc rezultiralo je povećanjem ćelija koje su vršile ekspresiju CK20 u odnosu na tumore tretirane kontrolnim antitelima (Slika 9, tamno bojenje).
PRIMER 5
Inhibicija rasta tumora dojke in vivo sa FZD8-Fc
[0219] Odvojene PE13 ćelije tumora dojke (50.000 po životinji) su subkutano injektirane u masno tkivo dojke NOD/SCID miševa. Miševi su praćeni nedeljno, a tumorima su ostavljeni da rastu dok nisu bili približno 106mm<3>. Na dan 27 nakon injekcije u ćelije miševi su nasumično podeljeni u četiri grupe za tretiranje (n = 10 miševa/grupa) i tretirani su sa kontrolnim antitelom, FZD8-Fc (54F03), taksolom ili kombinacijom FZD8-Fc i taksola. Taksol je davan intraperitonealno u dozi od 7.5 mg/kg jednom nedeljno, a FZD8-Fc je davan intraperitonealno u dozi od 5 mg/kg dva puta nedeljno. Tumori su mereni na dane koji su navedeni na Slici 10.
[0220] Praćeno je tretiranje sa FZD8-Fc koje smanjuje rast tumora za 20% (p = 0.002) kao pojedinačni agens u odnosu na kontrolnu grupu antitela. Osim toga, tretiranje sa kombinacijom FZD8-Fc i taksola smanjuje rast tumora za 55% (p = 0.003) u poređenju sa tretiranjem samo sa taksolom (Slika 10).
PRIMER 6
Inhibicija rasta tumora debelog creva in vivo sa FZD8-Fc
[0221] Analiziran je efekat višestrukih doza i režima doziranja FZD8-Fc (54F03) na rast C28 tumora debelog creva ksenografta. Odvojene C28 ćelije (10.000 po životinji) subkutano su injektirane u 6 i 8 nedelja stare mužjake NOD/SCID miševa. Na dan 2, miševi su nasumično podeljeni u 6 grupa od po 10 životinja. Životinje su injektirane sa kontrolnim antitelom ili FZD8-Fc u dozama od 1.5 mg/kg (dvaput nedeljno), 5 mg/kg (jednom i dvaput nedeljno) i 15 mg/kg (jednom i dva puta nedeljno). Davanje antitela i FZD8-Fc izvršeno je injekcijom u intraperitonealnu šupljinu. Rast tumora je nedeljno praćen i merenja tumora su započela kada su tumori bili uočljivi. Tumori su mereni dva puta nedeljno, a zapremina tumora je određena kao što je ovde opisano.
[0222] Tretiranje sa 15 mg/kg FZD8-Fc (dva puta nedeljno) ispoljilo se u smanjenju rasta tumora od 83% tokom tretiranja sa kontrolnim antitelima, kao što je prikazano na Slici 11A (p <0.001). Pored toga, tretiranje sa FZD8-Fc pri najnižim procenjenim dozama (1.5 mg/kg davano dva puta nedeljno) takođe se ispoljilo u smanjenjem rasta od 52% u odnosu na kontrolne grupe antitela za tretiranje (Slika 11A). Tako je FZD8-Fc pokazalo dejstvo anti-tumorskog rasta u OMP modelu tumora debelog creva kao jedinstveni agens na način koji zavisi od doze.
[0223] Analizirano je dejstvo FZD8-Fc u kombinaciji sa hemoterapeutskim agensom na rast C28 tumora debelog creva ksenografta. Odvojene ćelije C28 tumora debelog creva (10.000 ćelija) injektirane su subkutano u mužjake NOD/SCID miševa starosti 6-8 nedelja. Tumorima je dozvoljeno da rastu 21 dan dok nisu dostigli prosečnu zapreminu od 128mm3. Miševi su nasumično podeljeni (n = 10 po grupi) i tretirani sa FZD8-Fc (54F03) (15 mg/kg jednom nedeljno), irinotekanom (15 mg/kg jednom nedeljno), kombinacijom FZD8-Fc i irinotekana ili kontrolnim antitelima. Davanje FZD8-Fc, irinotekana i kontrolnog antitela vršena je injektiranjem u intraperitonealnu šupljinu. Rast tumora je praćen i zapremine tumora merene su pomoću elektronskih instrumenata u navedenim vremenskim tačkama. Podaci su izraženi kao srednja vrednost 6 S.E.M.
[0224] Kao što je prikazano na Slici 11B, tretiranje sa FZD8-Fc kao jedinstvenim agensom (-m-) ispoljilo se u smanjenju tumora do 66% tokom u odnosu na tretiranje sa kontrolnim antitelom (-j-) (p <0.001). Pored toga, tretiranje sa FZD8-Fc u kombinaciji sa irinotekanom (-●-) rezultiralo je u 76% redukciji rasta u odnosu na grupu kontrolnih antitela za tretiranje (p <0.001), što je bilo veće od bilo kog agensa pojedino. Tako je FZD8-Fc pokazao dejstvo anti-tumor rasta kod OMP-C28 tumora debelog creva kao jedinstvenog agensa, kao i u kombinaciji sa hemoterapeutskim agensom.
PRIMER 7
Povećana ćelijska diferencijacija tumora debelog creva FZD8-Fc
[0225] Povećano CK bojenje kod C28 tumora sa FZD8-Fc. Kontrolni i tretirani tumori iz C28 ksenograft ispitivanja opisani su iznad (Primer 6) su sakupljeni su na kraju ispitivanja. Tumori su podeljeni i imunohistokemijska analiza je izvršena korišćenjem standardnih tehnika. Ukratko, tumori su bili fiksirani u formalinu, ugrađeni u parafin, a delovi tumora debljine 4um su isečeni. Nakon deparafinizacije i hidracije delovi tumora su podvrgnuti procesu povlačenja antigena u Tris puferu (pH 9.5). Delovi su inkubirani vodonik peroksidom (Sigma-Aldrich, St Louis, MO) 10 minuta da bi se blokirala endogena peroksidaza. Anti-CK20 (klon Ks20.8, Dako, Carpinteria, CA) antitelo u blokirajućem puferu sa razblaživanjem 1:200 (3% NHS, 1% BSA, 0.1% Tween-20, u PBS) je dodato u svaki deo i inkubirno za 1 sat. Slajdovi su isprani 3 puta sa PBST po 5 minuta. Anti-miš sekundarno antitelo konjugovano sa HRP (ImmPRESS™ anti-mouse Ig, Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA) dodato je slajdovima i inkubirano je 30 minuta. Posle višestrukog ispiranja sa PBST, substrat Vector Vector Red (Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA) je dodat za lokalizaciju CK20 antigena.
[0226] Tretiranje C28 tumora sa FZD8-Fc ispoljilo se povećanjem ćelija koje vrše ekspresiju CK20 u odnosu na tumore tretirane kontrolnim antitelima (Slika 12, tamno bojenje).
PRIMER 8
Anti-tumorno dejstvo FZD8-Fc u modelu tumora pankreasa
[0227] Inhibicija rasta tumora sa FZD8-Fc u PN21 modelu tumora pankreasa. Anti-tumorno dejstvo FZD8-Fc (54F03) je procenjeno u ksenograft modelu tumora pankreasa. Odvojene OMP-PN21 ćelije (50.000 po životinji) su subkutano injektirane u mužjake NOD/SCID miša starosti 6-8 nedelja. Rast tumora je nedeljno praćen i merenja tumora su započela kada su tumori bili uočljivi. Na dan 36, miševi sa prosečnim zapreminama tumora od 144mm<3>su nasumično podeljeni u 4 grupe od po 9 životinja. Životinje su injektirane kontrolnim antitelom, FZD8-Fc (15mg/kg), gemcitabinom (2mg/kg) ili kombinacijom FZD8-Fc i gemcitabina. Davanje FZD8-Fc i gemcitabina izvršena je injektiranjem u intraperitonealnu šupljinu, jednom nedeljno. Tumori su mereni dva puta nedeljno, a zapremina tumora određena je kao što je ovde opisano.
[0228] Tretiranje sa FZD8-Fc ispoljilo se u smanjenju rasta tumora za 66% u odnosu na kontrolu, kao što je prikazano na slici 13A (p <0.001). Osim toga, tretiranje sa kombinacijom FZD8-Fc i gemcitabina ispoljilo se većim smanjenjem rasta tumora u odnosu na bilo koji agens pojedinačno (p = 0.001 u odnosu na gemcitabin). Tako je FZD8-Fc pokazao dejstvo anti-tumor rasta u PN21 modelu tumora pankreasa kao jedinstvenom agensu kao i u kombinaciji sa gemcitabinom.
[0229] Analiza PN21 tumora tretiranih sa FZD8-Fc testom ograničavanja dilucije. Kao što je prethodno opisano u Primeru 3, korišćen je test ograničavanja dilucije za procenu efekta tretiranja sa FZD8-Fc samim ili u kombinaciji sa gemcitabinom na matičnim ćelijama kancera čvrstog tumora u PN21 modelu tumora pankreasa.
[0230] Kontrolni i tretirani tumori iz PN21 ksenograft ispitivanja opisani iznad su sakupljeni na kraju ispitivanja. Tumori su obrađeni i podeljeni u pojedinačnih ćelije. Suspenzije pojedinačnih ćelije izvedene iz 5 tumora svake terapijske grupe su objedinjene, a objedinjeni uzorci su zatim inkubirani na ledu u trajanju od 30 minuta sa antitelima koja selektivno vezuju ćelije miševa (razblaživanje CD45-biotina 1:200 i α-miš H2Kd -biotin 1:100 razblaživanje, BioLegend, San Diego, CA), nakon čega je sledilo dodavanje magnetnih zrna sa oznakom streptavidina (Invitrogen, Carlsbad, CA). Ćelije miša su uklonjene pomoću magneta. Ljudske ćelije u suspenziji su sakupljene, prebrojane i površinski obojene oznakama i odgovarajuće doze ćelija (30, 90 i 270 ćelija) u FACS puferu su mešane u smeši 1:1 sa Matrigelom i subkutano injektirane u NOD/SCID miševe (10 miševa po dozi ćelije po grupi tretiranja). Tumori su ostavljeni da rastu i do 4 meseca.
[0231] U željenoj vremenskoj tački, procenat miševa sa uočljivim tumorima je određen u svim grupama koje su injektirane sa tretiranim tumorskim ćelijama i upoređivan je sa procentom miševa sa uočljivim tumorima u kontrolisanim tretiranim ćelijama. Na primer, određuje se broj miševa injektiranih sa 125 kontrolnih tumora koji su tretirani sa antitelima koji imaju uočljive tumore i upoređuje se sa brojem miševa injektiranih sa 125 ćelija tumora koje su tretirane sa FZD8-Fc koji imaju uočljive tumore.
[0232] Na dan 72. nakon injektiranja sa ćelijama utvrđene su stope uzimanja tumora u različitim grupama, a frekvenca matičnih ćelija kancera izračunata je pomoću softvera L-CalcTM (StemCell Technologies Inc.; www.stemcell.com). Kao što je prikazano na Slici 13B, tretiranje sa FZD8-Fc smanjuje frekvencu matičnih ćelija kancera na 1:976, približno četiri puta smanjenje u odnosu na tretiranje sa kontrolnim antitelom. Nasuprot tome, lečenje sa gemcitabinom malo je povećalo frekvenciju matičnih ćelija kancera. Značajno je da je tretiranje sa kombinacijom FZD8-Fc i gemcitabina smanjilo frekvenciju matičnih ćelija raka na 1:5472, smanjenje gotovo 25 puta u odnosu na tretiranje sa kontrolom. Iznenađujuće, tretiranje sa kombinacijom FZD8-Fc i gemcitabina smanjilo je frekvencu matičnih ćelija kancera približno 5.5 puta više od lečenja sa FZD8-Fc i uprkos činjenici da je gemcitabin stvarno povećao frekvencu matičnih ćelija kancera.
PRIMER 9
[0233] Povećana diferencijacija ćelija PN21 tumora sa FZD8-Fc. Funkcija diferencijacije ćelija FZD8-Fc takođe je procenjena u OMP-PN21 ksenograft modelu tumora pankreasa. PN21 tumori iz ispitivanja opisanog u Primeru 8 sakupljeni su, fiksirani u formalinu, ugrađeni u parafin, a delovi tumora debljine 4mm su isečeni. Nakon deparafinizacije i hidracije, delovi tumora su podvrgnuti procesu pronalaska antigena u Tris puferu (pH 9.5). Delovi su inkubirani sa vodonik peroksidom (Sigma-Aldrich, St Louis, MO) tokom 10 munuta kako bi se blokirala endogena peroksidaza. Anti-Ki67 antitela (klon MIB-1, Dako, Carpinteria, CA) u blokirajućem puferu (3% NHS, 1% BSA, 0.1% Tween20 u PBS) pri razblaženju 1:200 su dodata u svaki deo i inkubirana su tokom 1 sata. Slajdovi su isprani 3 puta sa PBST po 5 minuta. Anti-miš sekundarna antitela konjugovana sa HRP (ImmPRESS™ anti-mouse, Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA) dodata su u slajdove i inkubirana 30 minuta. Posle višestrukog ispiranja sa PBST, supstrat Vektor Nova Red (Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA) je dodat za lokalizaciju antigena Ki67. Delovi su tretirani vodenim rastvorom sirćetne kiseline 5 minuta na sobnoj temperaturi. Delovi su zatim tretirani sa 1% alcian plave u 3% vodeni sirćetnoj kiselini u trajanju od 30 minuta i isprani su sa vodom. Delovi su kontraobojene neutralnom brzom crvenom, dehidrirani i postavljeni. Koristeći ovu metodu, sialomucini u uzorcima tkiva su plavi i pozadina se pojavljuje kao ružičasta ili crvena.
[0234] Tretiranje PN21 tumora sa FZD8-Fc dovelo je do povećanja ćelija koje su vršile ekspresiju sialomucina u poređenju sa tumorima tretiranim sa kontrolnim antitelima (Slika 14, tamno sivo bojenje). Tretiranje PN21 tumora sa FZD8-Fc ili FZD-Fc u kombinaciji sa gemcitabinom dovelo je do povećanja ćelija koje su vršile ekspoataciju sialomucina u odnosu na tumore tretirane sa kontrolnim antitelom ili samo sa gemcitabinom (Slika 15). Tretiranje PN21 tumora sa FZD8-Fc ili kombinacijom FZD8-Fc i gemcitabinom takođe se ispoljilo u smanjenju proliferirajućih ćelija označenih ekspresijom Ki67. Stoga tretiranje PN21 tumora sa FZD8-Fc, bilo samim ili u kombinaciji sa gemcitabinom, smanjuje proliferaciju ćelija i povećava frekvenciju diferencijacijskih ćelija koje vrše ekspresiju mucina.
PRIMER 10
Proizvodnja FZD8-Fc varijanti
[0235] Prozivodnja FZD8-Fc varijanti. FZD8-Fc varijante su proizvedene sa DNK2.0 (Menlo Park, CA). DNK2.0 sintetisani i napravljeni kratki jednolančani oligonukleotidi kako bi se proizveli različiti FZD8-Fc varijantni proteini, 54F05, 54F08, 54F09, 54F12, 54F13, 54F14, 54F15, 54F16, 54F17, 54F18, 54F19, 54F20, 54F21 i 54F22. Sklopljeni oligonukleotidi su zatim klonirani i verifikovana im je sekvenca.
PRIMER 11
Inhibicija Wnt signaliziranja sa FZD8-Fc varijantama
[0236] Sposobnost FZD8-Fc varijanti da blokiraju ili inhibiraju aktivaciju Wnt signalizirajućeg puta utvrđeno je in vitro koristeći test reportera luciferaze. STF293 ćelije su kultivisane u DMEM dopunjenom sa antibiotikom i 10% FCS. STF293 ćelije stabilno su transfektovane sa vektorima reportera koji sadrže sedam primeraka TCF transkripcijskog odgovora vezanog sa promotorom uzvodno od gena reportera luciferaze svica. Ovaj konstrukt meri aktivnost kanoničkog Wnt signalizirajućeg puta. Ćelije su dodate u ploče kultura pri 10.000 ćelija po otvoru. Nakon inkubacije preko noći, varijante FZD8-Fc ili kontrolni JAG1-Fc miša su dodati u kombinaciji sa Wnt3a održavanim medijumom. Varijante FZD8-Fc i JAG1-Fc su korišćene u koncentracijama od 20, 4, 0.8, 0.16, 0.03, 0.006, 0.0012 i 0.0003 ug/ml.
Ćelije su inkubirane u 25% Wnt3A održavanom medijumu koji je pripremljen iz L ćelija koji stabilno vrše ekspresiju Wnt3a. Nakon inkubacije preko noći (otprilike 18 sati), nivoi luciferaze su mereni pomoću paketa za test luciferase Steady-Glo® (Promega, Madison, WI).
[0237] Dejstvo blokiranja FZD8-Fc varijanti je određeno i prikazano je u Tabeli 3 kao relativno dejstvo u poređenju sa istim referentnim standardom u svakom testu koji je postavljen na 100%.
Tabela 3
PRIMER 12
Farmakokinetika FZD8-Fc varijanti kod pacova
[0238] Farmakokinetika nekoliko varijanti FZD8-Fc procenjena je na pacovima u ispitivanju farmakokinetike (PK) u trajanju od dve nedelje. Procenjene varijante FZD8-Fc bile su 54F03, 54F09, 54F12, 54F13, 54F15 i 54F16. Sprague Dawley pacovi, pet mužjaka u svakoj grupi, su dozirani sa FZD8-Fc varijantama preko vene u repu sa 10 mg/kg i praćeni su tokom dve nedelje sa uzorcima sakupljenim u vremenskim tačkama pri 1, 24, 48, 72, 96, 168, 240, i 336 sati. U svakom vremenskom trenutku, 1 ml krvi je sakupljeno u cevi kalijum-EDTA i izložene su centrifugi. Supernatanti plazme su sakupljeni i zamrznuti dok se uzorci nisu analizirali.
[0239] Nivo varijante proteina FZD8-Fc prisutan u plazmi u svakoj vremenskoj tački je kvantifikovan i izračunat je polu život za svaku varijantu FZD8-Fc. Polu život varijanti FZD8-Fc prikazan je u Tabeli 4.
Tabela 4
PRIMER 13
Farmakokinetika FZD8-Fc varijanti kod cinomolgus majmuna
[0240] Četiri mlada odrasla/odrasla mužjaka naivnih cinomolgus majmuna nasumično su podeljeni u dve grupe od po dva, a dati im je intravenozni (IV) bolus od FZD-Fc varijante 54F15 ili varijante 54F16 u dozi od 30 mg/kg. Dva puta dnevno (pre podne i posle podne) životinje su primećene za smrtnost i znake bola i stresa. Opservacije u kavezu za opšte zdravlje i izgled vršene su jednom dnevno. Na dan doziranja, svaka životinja je posmatrana na otprilike 1 i 4 sata posle doziranja za smrtnost i znake bola i stresa. Bilo koja neuobičajena opservacija zabeležena u toku trajanja ispitivanja je zabeležena. Telesna težina je merena na dan primene doze i na kraju sakupljanja krvi. Krv (otprilike 0.5 ml) sakupljena je iz femoralne vene pomoću šprica i igle i prebačena je u epruvete koje su sadržale EDTA K3 antikoagulantnu pred dozu i na 1, 6, 12, 24, 48, 72, 96, 168, 240 i 336 sati naknadnu doza za PK analizu. Pored toga, krv (približno 0.5 ml) je sakupljena iz femoralne vene pomoću šprica i igle i premeštena u epruvete koje nisu sadržale antikoagulantnu pred dozu i 336 časova posle naknadnu doziranja za analizu anti-lek antitela (ANA). Supernatanti plazme su sakupljeni i zamrznuti dok se uzorci nisu analizirali. HTRF (homogena vremenski određena fluores- cencija) imunološki testovi su izvedeni kako bi se odredila koncentracija FZD-Fc u uzorcima životinjske plazme za PK analizu i koncentraciju anti-lek antitela u serumu. Koncentracija FZD-Fc u plazmi u odnosu na vreme analizirana je nekompartatnom analizom (NCA) sa Phoenix™ WinNonlin® Version 6.0, koristeći model bolus IV administracije.
[0241] Nivo FZD8-Fc varijanti prisutnih u plazmi u svakoj vremenskoj tački je kvantifikovan (Slika 16) i izračunat je polu život FZD8-Fc varijanti 54F15 i 54F16. Kao što je prikazano u Tabeli 5, polu život FZD8-Fc varijante 54F15 je procenjen na 102 sata pri 30 mg/kg, a polu život FZD-Fc8 varijante 54F16 je procenjen na 137 sati pri 30 mg/kg.
Tabela 5
PRIMER 14
Inhibicija rasta tumora debelog creva sa FZD8-Fc varijantama
[0242] Odvojene ćelije C28 tumora debelog creva (10.000 ćelija) injektirane su subkutano u mužjake NOD/SCID miševa starosti 6-8 nedelja. Tumori su ostavljeni da rastu 28 dana dok nisu dostigli prosečnu zapreminu od 145mm3. Miševi su nasumično podeljeni (n = 9 po grupi) i tretirani su sa varijantama FZD8-Fc ili kontrolnim antitelom u dozi od 15 mg/kg po dva puta nedeljno. Davanje varijanti FZD8-Fc i kontrolno antitelo izvršeno je sa injekcijom u intraperitonealnu šupljinu. Rast tumora je posmatran i zapremine tumora su merene pomoću elektronskih instrumenata u navedenim vremenskim tačkama. Podaci su izraženi kao srednja vrednost 6 S.E.M.
[0243] Varijante 54F12 i 54F13 nisu imale očigledan uticaj na rast tumora, sa zapreminom tumora koja je u suštini ista kao i tumora kod miševa tretiranih sa kontrolnim antitelima. Nasuprot tome, tretman sa varijantama 54F03, 54F09, 54F15 i 54F16 ispoljio je smanjenje rasta tumora približno za 56%, 70%, 64% i 70% (respektivno) u odnosu na tretman sa kontrolnim antitelima, kao što je prikazano na Slici 17. Stoga, dejstvo anti-tumorskog rasta FZD8-Fc varijanti je uticala na sekvencu amino kiseline na spoju između dela FZD8 i dela Fc. Pored toga, deluje da je dejstvo anti-tumorskog rasta uticalo na izvor regiona Fc, jer obe varijante koji su fuzioni proteini IgG2 (54F12 i 54F13) nisu inhibirale rast tumora u ovom modelu.
PRIMER 15
Inhibicija rasta tumora pankreasa sa FZD8-Fc varijantama
[0244] Odvojene ćelije PN4 tumora pankreasa (10.000 ćelija) su subkutano injektirane u mužjake NOD/SCID miševa starosti od 6-8 nedelje. Tumorima su ostavljeni da rastu 36 dana dok nisu dostigli prosečnu zapreminu od 112mm3. Miševi su nasumično podeljeni (n = 10 po grupi) i tretirani sa varijantama FZD8-Fc ili kontrolnim antitelom u dozi od 15 mg/kg po dva puta nedeljno. Davanje varijanti FZD8-Fc i kontrolnog antitela izvršeno je injekcijom u intraperitonealnu šupljinu. Rast tumora je posmatran i zapremine tumora su merene pomoću elektronskih instrumenata u navedenim vremenskim tačkama. Podaci su izraženi kao srednja vrednost 6 S.E.M.
[0245] Varijante 54F12 i 54F13 su smanjile rast tumora za manje od 20% u odnosu na tumore kod miševa tretiranih kontrolnim antitelima. Tretiranje sa varijantama FZD8-Fc 54F03, 54F09, 54F15 i 54F16 smanjilo je rast tumora za oko 20% do 60% u odnosu na tretman sa kontrolnim antitelima. Kao što je prikazano na Slici 18, varijante 54F09 i 54F16 su najviše smanjile rast tumora, 45% (p <0,001) i 60% (p <0,001), respektivno. Stoga je dejstvo anti-tumorskog rasta FZD8-Fc varijanti uticala na sekvencu amino kiseline na spoju između dela FZD8 i dela Fc. Kao što se vidi u Primeru 14, dejstvo anti-tumorskog rasta takođe je uticalo na izvor regiona Fc, pošto su obe varijante koji su IgG2 fuzioni proteini (54F12 i 54F13) imale slabije anti-tumorsku dejstvo od varijanti FZD8-Fc koje su IgG1 fuzioni proteini.
[0246] Ćelije tumora pankreasa od miševa koji imaju tumor opisanih iznad su sakupljene i samlevene otprilike u fragmente od 1 mm<3>, što je praćeno enzimskom digestijom pri 1 gramu na 10 ml 300 mg/ml kolagenaze i 200 U/ml DNaze I tokom 2 sata na 37 ° C/5% CO2 sa intermitentnim mešanjem sa pipetom od 10 ml za disperzu ćelija. Digestija je zaustavljena dodavanjem jednake zapremine FACS pufera (1x Hanks puferisani fiziološki rastvor (HBSS), 2% toplotno inaktiviran serum fetalnog tela (FCS) i 2mM HEPES pH 7.4). Ćelije su filtrirane kroz 40mm najlonske filtere i sakupljene su centrifugom na 150 xg tokom 5 minuta. Crvene krvne ćelije su lizirane u hipotoničnom puferu koji sadrži amonijum hlorid tokom 2 minuta na ledu, a ćelije su ponovo isprane pomoću viška FACS pufera i resuspendovane su sa FACS puferom pri 1x10<7>cells/ml.
[0247] Sveže pripremljene pojedinačne ćelijske suspenzije su bojene 20 minuta na ledu sa biotinilovanim anti-miš H-2Kd (klon SF1-1.1, Biolegend, San Diego, CA) sa 5 mg/ml, biotinilovani anti-miš CD45 (30-F11, Biolegend ) na 2.5 mg/ml, i streptavidin-PerCP-Ci5.5 (eBioscience, San Diego, CA) sa razređivanjem od 1:200. Nevezano antitelo je uklonjeno dva puta pranjem sa 10 zapremina FACS pufera. Za analizu površinskih markera na ćelijama kod ljudi, suspenzije pojedinačnih tumorske ćelije su obojene sa anti-ESA-FITC (Miltenyi Biotec, Auburn, CA) u razređivanju 1:50, anti-ljudski CD44-PE-Ci7 (eBioscience, San Diego, CA ) Sa razblaživanjem 1:100 i anti-ljudski CD201-PE (BD Biosciences) sa razređivanjem 1:5. Ćelije su isprane i resuspendovane u FACS puferu koji sadrži 2.5g/ml 4’-6-Diamidino-2-phenilindola (DAPI). Ćelije obojene jednom fluorescentnom bojom korišćene su za kalibraciju instrumenta. Bilo koje preostale ćelije miša (pozitivne za H-2Kd i CD45) i mrtve ćelije (DAPI-pozitivne) bile su isključene tokom sortiranja ćelija. Dubleti ćelija i grudvice ćelija su isključene korišćenjem dubletske diskriminacije.
[0248] Kao što je prikazano na Slici 19, tretiranje miševa koji imaju tumor sa FZD8-Fc varijantama 54F03 i 54F16 smanjilo je procenat CD44hi ćelija u poređenju sa miševima koji su tretirani kontrolnim antitelom. Iako je procenat CD201<+>CD44<+>ćelija bio mali, tretiranje miševa koji imaju tumor sa FZD8-Fc varijantama 54F03 i 54F16 smanjilo je procenat CD201<+>CD44<+>ćelija u poređenju sa miševima tretiranim sa kontrolnim antitelom. Pokazano je da CD44 označava tumorigenske ćelije (npr. matične ćelije kancera). Pored toga, u nekim otelotvorenjima, ćelije koje su CD44hiCD201<+>pokazale su da su tumorigeničnije od CD44hiCD201<->ćelija. Stoga je važno da varijante FZD8-Fc budu u stanju da smanjuju procenat i CD44hi i CD44hiCD201<+>ćelijskih populacija, čime se smanjuje procenat ili broj tumorigenih ćelija u lečenim miševima.
PRIMER 16
Karakterizacija N-termini
[0249] Predviđeno je da se tačno mesto cepanja u signalnoj sekvenci u proteinu FZD8 nalazi između amino kiseline 25 (alanin) i amino kiseline 26 (alanin); cepanje na ovoj lokaciji ostavlja N-termini ASA. Analiza masnom spektometrijom korišćena je za određivanje mase FZD8-Fc proteina u poređenju sa teorijskom masom proteina FZD8-Fc koji se cepa na predviđenom mestu.
[0250] Dodatne varijante FZD8-Fc sa modifikovanim signalnim sekvencama proizvedene su na DNK2.0 (Menlo Park, CA) kao što je gore opisano. DNA2.0 sintetisani i sklopljeni kratki jednolančani oligonukleotidi da bi se proizvele FZD8-Fc varijante proteina, 54F23 do 54F35. Sastavljeni oligonukleotidi su kasnije klonirani i sekvenca je verifikovana.
[0251] Plazmidna DNK svake FZD8-Fc varijante je pripremljena pomoću QIAGEN maksimalno preporučenih kompeta prema protokolu proizvođača. Ekspresija svake varijante izvršena je pomoću FreeStyle™ MAX reagensa (Life Technologies) i 293FS ćelija. Ćelije su puštene da rastu do faze evidencije i razblažene su do 1x10<6>ćelija/ml. Za svaku reakciju, 315ug plazmidne DNK je razređeno u 5ml OptiMEM Pro. U drugoj cevi, 315l FreeStyle™ MAKS reagensa je razređeno u 5ml OptiMem Pro. Plazmidna DNK je kompleksirana sa FreeStile™ MAX reagensom dodavanjem razblaženog reagensa kap po kap u DNK, nakon čega je sledila inkubacija od 15 minuta na sobnoj temperaturi. Kompleks DNA-reagensa je zatim dodat u 250ml 293FS ćelija. Reakcijama ekspresije je bilo dozvoljeno da rastu 7-10 dana, a zatim su skupljene centrifugiranjem i filtracijom. Svaka Fzd8-Fc varijanta je prečišćena afinitetnim prečišćavanjem pomoću 5ml HiTrap MAbSelect SURE kolone. Ukratko, prikupljeni mediji su prošli kroz kolone koje su bile uravnotežene sa puferom za vezivanje. Kolone su isprane puferom za vezivanje kako bi se uklonio nevezani materijal, a zatim je FZD8-Fc protein eluiran sa puferom za eluiranje. Elutirani uzorci su zatim dijalizovani u pufer pogodan za masenu spektrometriju.
[0252] Približno 250 mg svakog FZD8-Fc uzorka je redukovano sa Tris (2-karboksietil) fosfinom (TCEP) tokom 30 minuta na 37 °C da bi se razdvojili teški i laki lanci antitela. Redukovani uzorci su zatim alkilovani tretmanom jodoacetamidom tokom 30 minuta na 37 °C. Uzorci su preneti preko NAP-5 kolona (GE Health Care) kako bi se promenio pufer na 10 mM Tris-HCL (pH 7.4). Razmenjivanjem pufera praćene je deglikozilovanje endoglikozidazom PNGaza F. Uzorci su inkubirani preko noći na 37 °C u odnosu 1:200 (enzim:uzorak). Reakcije su zaustavljene dodavanjem kiseline. Umanjeni, alkilovani i deglikozilovani FZD8-Fc uzorki su stavljeni u bočice za analizu tečne hromatografije-masene spektrometrije (LC/MS) korišćenjem Waters UPLC™ i elektrosprej- QToF masene sektometrije. Masena kalibracija svake analize uzoraka korišćenjem jonskih klastera sa trifluorosirćetnom kiselinom obavljena je sa Waters LockSpray™ dvostrukim elektrosprejskim jonskim izvorima.
[0253] Kao što je prikazano na Slici 20A, FZD8-Fc protein (54F16) sa signalnom sekvencom koja je bila ista sekvenca kao prirodna sekvenca proizvedena je kao heterogena smeša u odnosu na N-terminalnu sekvencu. Proporcionalni protein koji je prisutan u uzorku bio je ekvivalentan u masi proteinu koji se cepa na amino kiselinama 25 i 26 (vrh na 41704.0) sa N-terminalnom sekvencom ASA. Međutim, više od 50% proteina je bilo prisutno u formi različite mase (vrh na 41918.2). Ovaj vrh najverovatnije predstavlja protein koji se cepa na amino kiselinama 22 i 23; cepanje na ovoj lokaciji ostavlja N-terminalnu sekvencu AAAASA (SEQ ID Br: 76).
[0254] FZD8-Fc varijante sa signalnim sekvencama od SEQ ID Br:68 do SEQ ID Br:74 su generisane, prečišćene iz ćelijske kulture i analizirane masnom spektrometrijom kao što je gore opisano. Uočeno je da varijante sa signalnim sekvencama od SEQ ID Br:70 do SEQ ID Br:74 proizvode skoro potpuno homogeni uzorak proteina (nekoliko reprezentativnih rezultata su prikazani na Slikama 20B-20E). FZD8-Fc varijanta 54F26 koja sadrži SEQ ID Br:53 sa signalnom sekvencom SEQ ID Br:71 je prisutna pretežno (više od 95%) kao protein koji se cepa na amino kiselinama 25 i 26 (vrh 41930.1) sa N-terminalnom sekvencom ASA (slika 20B). Slični rezultati su takođe uočljivi sa varijantom koja sadrži SEQ ID Br:53 i signalnu sekvencu SEQ ID Br:72 (54F28, Fig.20C), varijantu koja sadrži SEQ ID Br:53 i signalnu sekvencu SEQ ID Br:73 (54F30, Fig 20D) i varijantu koja sadrži SEQ ID Br:53 i signalnu sekvencu SEQ ID Br:74 (54F32, slika 20E). Slični rezultati su primećeni kod proteina proizvedenim iz prolaznih i stabilnih transfekcija.
PRIMER 17
Inhibicija rasta tumora debelog creva in vivo sa FZD8-Fc varijantama
[0255] Odvojene ćelije C28 tumora debelog creva (10.000 ćelija) injektirane su subkutano u mužjake NOD/SCID miša starosti od 6-8 nedelja. Tumorima su ostavljeni da rastu 56 dana dok nisu dostigli prosečnu zapreminu od 175mm3. Miševi su nasumično podeljeni (n = 10 po grupi) i tretirani sa FZD8-Fc konstruktima 54F03, 54F23, 54F26 ili kontrolnim antitelom u dozi od 15 mg/kg po dva puta nedeljno. Primena varijanti FZD8-Fc i kontrolno antitelo izvršeno je sa injekcijom u intraperitonealnu šupljinu. Rast tumora je praćen i zapremine tumora su merene pomoću elektronskih instrumenata u navedenim vremenskim tačkama. Podaci su izraženi kao srednja vrednost 6 S.E.M.
[0256] Varijante FZD8-Fc 54F23 i 54F26 proizvedene su kao pretežno homogeni protein sa N-terminusom amino kiselina ASA, dok je 54F03 proizveden kao heterogena proteinska smeša sa N-termini amino kiselinama ASA i AAAASA. Kao što je prikazano na Slici 21, tretiranje sa varijantama FZD8-Fc 54F03, 54F23 i 54F26 smanjuje rast tumora za 48%, 57% i 52%, u poređenju sa tretmanom sa kontrolnim antitelima posle tri nedelje tretiranja.
SEKVENCE
[0257]
FZD8-Fc sekvenca amino kiseline-varijanta 54F03 (bez predviđene signalne sekvence; „GRA“ vezujuća sekvenca sequence be10 tween FZD8 sekvenca i Fc sekvenca funzionog proteina je podvučena) (SEQ ID Br:1)
FZD8-Fc kodirajuća sekvenca (nukleotidi koji enkodiraju FZD8-izvedenu sekvencu su podvučeni) (SEQ ID Br:2)
Minimum FZD i SFRP Fri domen sekvence h-FZD1 amino kiselina 116-227 (SEQ ID Br:3)
h-FZD2 amino kiseline 39-150 (SEQ ID Br:4)
h-FZD3 amino kiseline 28-133 (SEQ ID Br:5)
h-FZD4 amino kiseline 48-161 (SEQ ID Br:6)
10 h-FZD5 amino kiseline 33-147
Ljudski IgG1 Fc region (SEQ ID Br:42)
Ljudski IgG1 Fc region (SEQ ID Br:43)
Ljudski IgG2Fc region (SEQ ID Br:44)
FZD Fri domen sekvence
[0259]
Ljudski FZD4 Fri domen (predviđene signalne sekvence su podvučene) (SEQ ID Br:19)
Ljudski FZD5 Fri domen (predviđene signalne sekvence su podvučene) (SEQ ID Br:20)
Ljudski FZD8 Fri domen (predviđene signalne sekvence su podvučene) (SEQ ID Br:21)
Ljudski FZD1 Fri domen sekvence amino kiseline bez predviđene signalne sekvence (SEQ ID Br:32; amino kiseline 87-237 od SEQ ID Br:27)
30 Ljudski FZD2 Fri domen sekvence amino kiseline bez predviđene signalne sekvence SEQ ID Br:33; amino kiseline 24-159 od SEQ ID Br:28)
Ljudski FZD3 Fri domen sekvence amino kiseline bez predviđene signalne sekvence (SEQ ID Br:34; amino kiseline 23-143 od SEQ ID Br:29)
Ljudski FZD4 Fri domen sekvence amino kiseline bez predviđene signalne sekvence (SEQ ID Br:35; amino kiseline 40-170 od SEQ ID Br:22)
Ljudski FZD5 Fri domen sekvence amino kiseline bez predviđene signalne sekvence (SEQ ID Br:36; amino kiseline 27-157 od SEQ ID Br:23)
Ljudski FZD6 Fri domen sekvence amino kiseline bez predviđene signalne sekvence (SEQ ID Br:37; amino kiseline 19-146 od SEQ ID Br:24)
Ljudski FZD7 Fri domen sekvence amino kiseline bez predviđene signalne sekvence (SEQ ID Br:38; amino kiseline 1533-170 od SEQ ID Br:25)
Ljudski FZD8 Fri domen sekvence amino kiseline bez predviđene signalne sekvence (SEQ ID Br:39; amino kiseline 28-158 od SEQ ID Br:30)
30 Ljudski FZD9 Fri domen sekvence amino kiseline bez predviđene signalne sekvence (SEQ ID Br:40; amino kiseline 23-159 od SEQ ID Br:31)
Ljudski FZD10 Fri domen sekvence amino kiseline bez predviđene signalne sekvence (SEQ ID Br:41; amino kiseline 21-154 od SEQ ID Br:26)
FZD ekstracelularni domen (ECD) sekvence
[0260]
Ljudski FZD1 ECD sa signalnom sekvencom (SEQ ID Br:27)
Ljudski FZD2 ECD sa signalnom sekvencom (SEQ ID Br:28)
Ljudski FZD3 ECD sa signalnom sekvencom (SEQ ID Br:29)
Ljudski FZD4 ECD sa signalnom sekvencom (SEQ ID Br:22)
Ljudski FZD5 ECD sa signalnom sekvencom (SEQ ID Br:23)
Ljudski FZD6 ECD sa signalnom sekvencom (SEQ ID Br:24)
Ljudski FZD7 ECD sa signalnom sekvencom (SEQ ID Br:25)
Ljudski FZD8 ECD sa signalnom sekvencom (SEQ ID Br:30)
Ljudski FZD9 ECD sa signalnom sekvencom (SEQ ID Br:31)
Ljudski FZD10 ECD sa signalnom sekvencom (SEQ ID Br:26)
FZD8-Fc varijante
[0261]
FZD8-Fc varijanta 54F03 sekvence amino kiseline (bez predviđene signalne sekvence; alternativno cepanje) (SEQ ID Br:45)
FZD8-Fc varijanta 54F09 sekvence amino kiseline (bez predviđene signalne sekvence) (SEQ ID
FZD8-Fc varijanta 54F09 sekvence amino kiseline (bez predviđene signalne sekvence; alternativno cepanje) (SEQ ID Br:47)
FZD8-Fc varijanta 54F15 sekvence amino kiseline (bez predviđene signalne sekvence) (SEQ ID
FZD8-Fc varijanta 54F15 sekvence amino kiseline (bez predviđene signalne sekvence; alternativno cepanje) (SEQ ID Br:49)
SPGK FZD8-Fc varijante 54F16, 54F17, 54F18, 54F23, 54F25, 54F27, 54F29, 54F31, i 54F34 sekvence amino kiseline (bez predviđene signalne sekvence) (SEQ ID Br:50)
FZD8-Fc varijanta 54F16 sekvenca amino kiseline (bez predviđene signalne sekvence; alternativno cepanje) (SEQ ID Br:51)
FZD8-Fc varijanta 54F16 sekvence amino kiseline (sa signalnom sekvencom) (SEQ ID Br:52)
FZD8-Fc varijante 54F19, 54F20, 54F24, 54F26, 54F28, 54F30, 54F32, 54F34 i 54F35 sekvence amino kiseline (bez predviđene signalne sekvence) (SEQ ID Br:53)
FZD8-Fc varijanta 54F19 sekvence amino kiseline (bez predviđene signalne sekvence; alternativno cepanje) (SEQ ID Br:54)
FZD8-Fc varijanta 54F20 sekvence amino kiseline (bez predviđene signalne sekvence; alternativno cepanje) (SEQ ID Br:55)
FZD8-Fc varijanta 54F34 sekvence amino kiseline (bez predviđene signalne sekvence) (SEQ ID
FZD8-Fc varijanta 54F33 sekvence amino kiseline (bez predviđene signalne sekvence) (SEQ ID
Ljudski ROR1 ECD sa signalnom sekvencom (SEQ ID Br:56)
Ljudski ROR2 ECD sa signalnom sekvencom (SEQ ID Br:57)
h-ROR1 minimalni Fri domen (SEQ Br:58)
h-ROR2 minimalni Fri domen (SEQ ID Br:59)
Veznik (SEQ ID Br:60)
ESGGGGVT Veznik (SEQ ID Br:61)
LESGGGGVT
Veznik (SEQ ID Br:62)
GRAQVT
Veznik (SEQ ID Br:63)
WRAQVT
Veznik (SEQ ID Br:64)
ARGRAQVT
Signalna sekvenca (SEQ ID Br:67) MEWGYLLEVTSLLAALALLQRSSGAAA
Signalna sekvenca (SEQ ID Br:68) MEWGYLLEVTSLLAALALLQRSSGALA
Signalna sekvenca (SEQ ID Br:69) MEWGYLLEVTSLLAALALLQRSSGVLA
Signalna sekvenca (SEQ ID Br:70) MEWGYLLEVTSLLAALLLLQRSPIVHA
Signalna sekvenca (SEQ ID Br:71) MEWGYLLEVTSLLAALFLLQRSPIVHA
Signalna sekvenca (SEQ ID Br:72) MEWGYLLEVTSLLAALLLLQRSPFVHA
Signalna sekvenca (SEQ ID Br:73) MEWGYLLEVTSLLAALLLLQRSPIIYA
Signalna sekvenca (SEQ ID Br:74) MEWGYLLEVTSLLAALLLLQRSPIAHA FZD8-Fc varijanta sa signalnom sekvencom (SEQ ID Br:75)
N-terminalna sekvenca (SEQ ID Br:76)
AAAASA

Claims (18)

Patentni zahtevi
1. Polipeptid sadrži:
(i) Wnt-vezujući agens koji sadrži sekvence amino kiseline SEQ ID Br: 53; i
(ii) signalne sekvence izabrane iz grupe koju čine: SEQ ID Br:72, SEQ ID Br:70, SEQ ID Br:71,SEQ ID Br:73, i SEQ ID Br:74.
2. Polipeptid prema patentnom zahtevu 1 koji sadrži SEQ ID Br: 72 i SEQ ID Br: 53.
3. Izolovani polinukleotid sadrži polinukleotid koji enkodira polipeptide prema patentnom zahtevu 1 ili 2.
4. Ćelija:
(i) koja proizvodi polipeptide prema bilo kojem od patentnih zahteva 1 ili 2; ili
(ii) koja sadrži polinukleotid prema patentnom zahtevu 3.
5. Sastav koji sadrži Wnt-vezujući agens koji sadrži sekvencu amino kiseline SEQ ID Br: 53, gde barem 80% navedenog Wnt-vezujućeg agensa ima N-terminalnu sekvencu amino kiseline Ala Ser Ala (ASA).
6. Sastav prema patentnom zahtevu 5 koji je farmaceutski sastav koji sadrži farmaceutski prihvatljiv nosač.
7. Sastav prema patentnom zahtevu 5 ili 6 za upotrebu pri tretiranju kancera ili za upotrebu pri tretiranju bolesti vezane sa kanoničkom aktivacijom Wnt signaliziranja.
8. Sastav za upotrebu prema patentnom zahtevu 7, gde je kancer kancer pankreasa, hepatocelularni kancer, ili kancer jajnika.
9. Sastav za upotrebu prema patentnom zahtevu 7 ili 8, gde se Wnt-vezujući agens daje zajedno sa terapeutskim agensom.
10. Sastav za upotrebu prema patentnom zahtevu 9, gde je drugi terapeutski agens hemoterapeutski agens.
11. Sastav za upotrebu prema patentnom zahtevu 10, gde je hemoterapeutski agens paklitaksel, albumin-vezani paklitaksel, karboplatin, irinotekan, ili gemcitabin.
12. Sastav za upotrebu prema patentnom zahtevu 10, gde je hemoterapeutski agens gemcitabin i kancer je kancer pankreasa.
13. Sastav za upotrebu prema patentnom zahtevu 10, gde je hemoterapeutski agens paklitaksel i kancer je kancer pankreasa.
14. Sastav za upotrebu prema patentnom zahtevu 9, gde je drugi terapeutski agens inhibitor angiogeneze.
15. Sastav za upotrebu prema patentnom zahtevu 14, gde je inhibitor angiogeneze anti-VEGF antitelo.
16. In vitro metoda za proizvodnju sastava prema patentnom zahtevu 5,
koja metoda obuhvata ekspresiju u ćeliji polipeptida koji sadrži SEQ ID Br: 53 i signalnu sekvencu izabranu iz grupe koju čine: SEQ ID Br:72, SEQ ID Br:70, SEQ ID Br:71, SEQ ID Br:73, i SEQ ID Br:74,
gde barem 80% Wnt-vezujućeg agensa proizvedeno od strane ćelije ima N-terminalnu sekvencu amino kiseline Ala Ser Ala (ASA).
17. In vitro metoda za proizvodnju Wnt-vezujućih polipeptida koji sadrži sekvencu amino kiseline SEQ ID Br:53, koja metoda obuhvata:
(i) ekspresiju u ćeliji domaćina polipeptida prema patentnom zahtevu 1 ili 2 pod uslovima da se signalna sekvenca cepa sa ćelijom domaćina;
(ii) prečišćavanje Wnt-polipeptida od SEQ ID Br:53.
18. Wnt-vezujući polipeptid koji sadrži sekvencu amino kiseline SEQ ID Br: 53 proizvedenu metodom prema patetnom zahtevu 17.
RS20170848A 2010-01-12 2011-01-12 Wnt antagonisti i metode tretiranja RS56242B1 (sr)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US29427010P 2010-01-12 2010-01-12
US39367510P 2010-10-15 2010-10-15
US201061424408P 2010-12-17 2010-12-17
EP11733316.1A EP2523678B1 (en) 2010-01-12 2011-01-12 Wnt antagonists and methods of treatment
PCT/US2011/020994 WO2011088123A2 (en) 2010-01-12 2011-01-12 Wnt antagonists and methods of treatment and screening

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS56242B1 true RS56242B1 (sr) 2017-11-30

Family

ID=44352276

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20170848A RS56242B1 (sr) 2010-01-12 2011-01-12 Wnt antagonisti i metode tretiranja

Country Status (27)

Country Link
US (3) US9157904B2 (sr)
EP (2) EP2523678B1 (sr)
JP (2) JP5956349B2 (sr)
KR (1) KR101774272B1 (sr)
CN (2) CN106084040A (sr)
AR (1) AR079889A1 (sr)
AU (2) AU2011205405B2 (sr)
CA (1) CA2786699A1 (sr)
CY (1) CY1119286T1 (sr)
DK (1) DK2523678T3 (sr)
ES (1) ES2638278T3 (sr)
HR (1) HRP20171352T1 (sr)
HU (1) HUE034466T2 (sr)
IL (1) IL220788A (sr)
LT (1) LT2523678T (sr)
ME (1) ME02952B (sr)
MX (1) MX339709B (sr)
NZ (1) NZ601065A (sr)
PL (1) PL2523678T3 (sr)
PT (1) PT2523678T (sr)
RS (1) RS56242B1 (sr)
RU (1) RU2593947C2 (sr)
SG (1) SG182436A1 (sr)
SI (1) SI2523678T1 (sr)
SM (1) SMT201700451T1 (sr)
TW (1) TWI535445B (sr)
WO (1) WO2011088123A2 (sr)

Families Citing this family (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7723477B2 (en) 2005-10-31 2010-05-25 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting Wnt-dependent solid tumor cell growth
SG190568A1 (en) 2008-09-26 2013-06-28 Oncomed Pharm Inc Frizzled-binding agents and uses thereof
TWI535445B (zh) 2010-01-12 2016-06-01 安可美德藥物股份有限公司 Ｗｎｔ拮抗劑及治療和篩選方法
CA2794674A1 (en) 2010-04-01 2011-10-06 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Frizzled-binding agents and uses thereof
DK2585098T3 (da) * 2010-06-28 2014-11-03 Five Prime Therapeutics Inc Ekstracellulære FZD8-domæner og fusionsmolekyler fraekstracellulære FZD8-domæner til anvendelse ved behandling afobesitet og obesitet-relaterede lidelser
EP3281640A1 (en) 2011-06-17 2018-02-14 President and Fellows of Harvard College Frizzled 2 as a target for therapeutic antibodies in the treatment of cancer
JP6185463B2 (ja) 2011-07-15 2017-08-23 オンコメッド ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド Ｒｓｐｏ結合剤およびその使用法
KR101399062B1 (ko) * 2011-08-18 2014-05-27 한양대학교 산학협력단 Ｗｎｔ 유인 수용체를 포함하는 항암 조성물
EP2788378A4 (en) * 2011-12-09 2015-09-09 Oncomed Pharm Inc COMBINATION THERAPY FOR CANCER TREATMENT
US9352039B2 (en) 2012-02-09 2016-05-31 The Regents Of The University Of Michigan Method of reducing the number of EMT and MET type breast cancer stem cells
AU2013334790A1 (en) 2012-10-23 2015-04-30 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Methods of treating neuroendocrine tumors using Wnt pathway-binding agents
AU2014212081A1 (en) 2013-02-04 2015-08-13 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Methods and monitoring of treatment with a Wnt pathway inhibitor
TWI582239B (zh) 2013-03-11 2017-05-11 諾華公司 與ｗｎｔ抑制劑相關之標記
US9168300B2 (en) 2013-03-14 2015-10-27 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. MET-binding agents and uses thereof
ES2728305T3 (es) * 2013-04-29 2019-10-23 Ogd2 Pharma Uso como diana del gangliosido GD2 O-acetilado como una nueva estrategia terapéutica y de diagnóstico para cáncer de células madre cancerosas
CN103926409B (zh) * 2013-05-07 2015-11-25 上海良润生物医药科技有限公司 Cystatin S和AFP在制备诊断和预示肝癌标志物中的应用
CA2931975A1 (en) 2013-12-02 2015-06-11 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Identification of predictive biomarkers associated with wnt pathway inhibitors
WO2015106129A1 (en) * 2014-01-10 2015-07-16 Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. Diagnosis of chronic liver diseases
CN106488775A (zh) * 2014-07-11 2017-03-08 基因泰克公司 Notch途径抑制
WO2017132494A1 (en) * 2016-01-28 2017-08-03 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Wnt compositions and methods for serum-free synthesis
UY39587A (es) 2020-12-23 2022-07-29 Univ Muenchen Ludwig Maximilians Conjugados anticuerpo-droga mejorados dirigidos contra cd30 y usos de los mismos
KR102865138B1 (ko) * 2022-06-14 2025-09-29 연세대학교 산학협력단 높은 sfrp4의 발현을 보이는 암의 치료방법
CN117756910A (zh) * 2023-12-22 2024-03-26 首都医科大学附属北京口腔医院 Sfrp2功能多肽及其应用

Family Cites Families (286)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3687808A (en) 1969-08-14 1972-08-29 Univ Leland Stanford Junior Synthetic polynucleotides
US3773919A (en) 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
US4109496A (en) 1977-12-20 1978-08-29 Norris Industries Trapped key mechanism
US4323546A (en) 1978-05-22 1982-04-06 Nuc Med Inc. Method and composition for cancer detection in humans
US4411990A (en) 1979-06-13 1983-10-25 University Patents, Inc. Primary bioassay of human tumor stem cells
US4873191A (en) 1981-06-12 1989-10-10 Ohio University Genetic transformation of zygotes
US4485045A (en) 1981-07-06 1984-11-27 Research Corporation Synthetic phosphatidyl cholines useful in forming liposomes
US4612282A (en) 1981-12-15 1986-09-16 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Monoclonal antibodies reactive with human breast cancer
US4670393A (en) 1982-03-22 1987-06-02 Genentech, Inc. DNA vectors encoding a novel human growth hormone-variant protein
US4588585A (en) 1982-10-19 1986-05-13 Cetus Corporation Human recombinant cysteine depleted interferon-β muteins
US4544545A (en) 1983-06-20 1985-10-01 Trustees University Of Massachusetts Liposomes containing modified cholesterol for organ targeting
DE3572982D1 (en) 1984-03-06 1989-10-19 Takeda Chemical Industries Ltd Chemically modified lymphokine and production thereof
US5019497A (en) 1984-11-09 1991-05-28 Lennart Olsson Human squamous lung carcinoma cell specific antigens and antibodies
US5034506A (en) 1985-03-15 1991-07-23 Anti-Gene Development Group Uncharged morpholino-based polymers having achiral intersubunit linkages
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
US5080891A (en) 1987-08-03 1992-01-14 Ddi Pharmaceuticals, Inc. Conjugates of superoxide dismutase coupled to high molecular weight polyalkylene glycols
US5087570A (en) 1988-05-10 1992-02-11 Weissman Irving L Homogeneous mammalian hematopoietic stem cell composition
US4981785A (en) 1988-06-06 1991-01-01 Ventrex Laboratories, Inc. Apparatus and method for performing immunoassays
US4968103A (en) 1988-07-22 1990-11-06 Photofinish Cosmetics Inc. Method of making a brush
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
US5994617A (en) 1988-09-19 1999-11-30 Hsc Research Development Corporation Engraftment of immune-deficient mice with human cells
US5534617A (en) 1988-10-28 1996-07-09 Genentech, Inc. Human growth hormone variants having greater affinity for human growth hormone receptor at site 1
US5688666A (en) 1988-10-28 1997-11-18 Genentech, Inc. Growth hormone variants with altered binding properties
WO1990006952A1 (fr) 1988-12-22 1990-06-28 Kirin-Amgen, Inc. Facteur de stimulation de colonies de granulocytes modifies chimiquement
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
GB8901778D0 (en) 1989-01-27 1989-03-15 Univ Court Of The University O Manipulatory technique
US6583115B1 (en) 1989-10-12 2003-06-24 Ohio University/Edison Biotechnology Institute Methods for treating acromegaly and giantism with growth hormone antagonists
US5013556A (en) 1989-10-20 1991-05-07 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
US5061620A (en) 1990-03-30 1991-10-29 Systemix, Inc. Human hematopoietic stem cell
US5705337A (en) 1990-06-11 1998-01-06 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: chemi-SELEX
US5683867A (en) 1990-06-11 1997-11-04 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: blended SELEX
US6344321B1 (en) 1990-06-11 2002-02-05 Gilead Sciences, Inc. Nucleic acid ligands which bind to hepatocyte growth factor/scatter factor (HGF/SF) or its receptor c-met
US5270163A (en) 1990-06-11 1993-12-14 University Research Corporation Methods for identifying nucleic acid ligands
US5496938A (en) 1990-06-11 1996-03-05 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Nucleic acid ligands to HIV-RT and HIV-1 rev
US5614396A (en) 1990-06-14 1997-03-25 Baylor College Of Medicine Methods for the genetic modification of endogenous genes in animal cells by homologous recombination
US5602240A (en) 1990-07-27 1997-02-11 Ciba Geigy Ag. Backbone modified oligonucleotide analogs
US5489677A (en) 1990-07-27 1996-02-06 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleoside linkages containing adjacent oxygen and nitrogen atoms
US5252714A (en) 1990-11-28 1993-10-12 The University Of Alabama In Huntsville Preparation and use of polyethylene glycol propionaldehyde
CA2095633C (en) 1990-12-03 2003-02-04 Lisa J. Garrard Enrichment method for variant proteins with altered binding properties
US5840867A (en) 1991-02-21 1998-11-24 Gilead Sciences, Inc. Aptamer analogs specific for biomolecules
IL101728A (en) 1991-05-03 2007-08-19 Univ Yale Human Abandonment and Delta, Restrictive Areas of Effect in Tophoric Proteins, and Methods Based on Them
IE20030749A1 (en) 1991-05-03 2003-11-12 Indiana University Foundation Human notch and delta binding domains in torporythmic proteins, and methods based thereon
US5856441A (en) 1991-05-03 1999-01-05 Yale University Serrate fragments and derivatives
US6429186B1 (en) 1991-05-10 2002-08-06 Genentech, Inc. Ligand antagonists for treatment of breast cancer
US5714331A (en) 1991-05-24 1998-02-03 Buchardt, Deceased; Ole Peptide nucleic acids having enhanced binding affinity, sequence specificity and solubility
US5539082A (en) 1993-04-26 1996-07-23 Nielsen; Peter E. Peptide nucleic acids
US5719262A (en) 1993-11-22 1998-02-17 Buchardt, Deceased; Ole Peptide nucleic acids having amino acid side chains
WO1994004679A1 (en) 1991-06-14 1994-03-03 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
US5750376A (en) 1991-07-08 1998-05-12 Neurospheres Holdings Ltd. In vitro growth and proliferation of genetically modified multipotent neural stem cells and their progeny
US5582981A (en) 1991-08-14 1996-12-10 Gilead Sciences, Inc. Method for identifying an oligonucleotide aptamer specific for a target
US5565332A (en) 1991-09-23 1996-10-15 Medical Research Council Production of chimeric antibodies - a combinatorial approach
US5753229A (en) 1991-09-25 1998-05-19 Mordoh; Jose Monoclonal antibodies reactive with tumor proliferating cells
US6353150B1 (en) 1991-11-22 2002-03-05 Hsc Research And Development Limited Partnership Chimeric mammals with human hematopoietic cells
US6004924A (en) 1991-12-11 1999-12-21 Imperial Cancer Research Technology, Ltd. Protein sequences of serrate gene products
US5869282A (en) 1991-12-11 1999-02-09 Imperial Cancer Research Technology, Ltd. Nucleotide and protein sequences of the serrate gene and methods based thereon
EP0552108B1 (en) 1992-01-17 1999-11-10 Lakowicz, Joseph R. Energy transfer phase-modulation fluoro-immunoassay
US5376313A (en) 1992-03-27 1994-12-27 Abbott Laboratories Injection molding a plastic assay cuvette having low birefringence
US5786158A (en) 1992-04-30 1998-07-28 Yale University Therapeutic and diagnostic methods and compositions based on notch proteins and nucleic acids
NZ256154A (en) 1992-07-27 1997-02-24 California Inst Of Techn Production of mammalian multipotent neural stem cells, antibodies
US5849553A (en) 1992-07-27 1998-12-15 California Institute Of Technology Mammalian multipotent neural stem cells
US5672499A (en) 1992-07-27 1997-09-30 California Institute Of Technology Immoralized neural crest stem cells and methods of making
US5654183A (en) 1992-07-27 1997-08-05 California Institute Of Technology Genetically engineered mammalian neural crest stem cells
US5589376A (en) 1992-07-27 1996-12-31 California Institute Of Technology Mammalian neural crest stem cells
US5756291A (en) 1992-08-21 1998-05-26 Gilead Sciences, Inc. Aptamers specific for biomolecules and methods of making
WO1994010300A1 (en) 1992-10-30 1994-05-11 The General Hospital Corporation Interaction trap system for isolating novel proteins
GB9223084D0 (en) 1992-11-04 1992-12-16 Imp Cancer Res Tech Compounds to target cells
JP3106021B2 (ja) 1992-11-30 2000-11-06 キヤノン株式会社 パターンデータの圧縮方法及び装置と出力方法及び装置
KR100283601B1 (ko) 1993-02-19 2001-03-02 아만 히데아키 글리세롤 유도체, 디바이스 및 의약 조성물
US5643765A (en) 1993-04-06 1997-07-01 University Of Rochester Method for quantitative measurement of gene expression using multiplex competitive reverse transcriptase-polymerase chain reaction
US5876978A (en) 1993-04-06 1999-03-02 Medical College Of Ohio Method for quantitative measurement of gene expression using multiplex competitive reverse transcriptase-polymerase chain reaction
US5639606A (en) 1993-04-06 1997-06-17 The University Of Rochester Method for quantitative measurement of gene expression using multiplex competitive reverse transcriptase-polymerase chain reaction
US5538848A (en) 1994-11-16 1996-07-23 Applied Biosystems Division, Perkin-Elmer Corp. Method for detecting nucleic acid amplification using self-quenching fluorescence probe
US5599677A (en) 1993-12-29 1997-02-04 Abbott Laboratories Immunoassays for prostate specific antigen
ATE336587T1 (de) 1994-06-10 2006-09-15 Genvec Inc Adenoviren-vektor systeme und zelllinien
US6156305A (en) 1994-07-08 2000-12-05 Baxter International Inc. Implanted tumor cells for the prevention and treatment of cancer
US5650317A (en) 1994-09-16 1997-07-22 Michigan State University Human breast epithelial cell type with stem cell and luminal epithelial cell characteristics
DE69534166T2 (de) 1994-10-28 2006-03-09 Trustees Of The University Of Pennsylvania Rekombinanter adenovirus und methoden zu dessen verwendung
US6218166B1 (en) 1994-12-09 2001-04-17 John Wayne Cancer Institute Adjuvant incorporation into antigen carrying cells: compositions and methods
US5736396A (en) 1995-01-24 1998-04-07 Case Western Reserve University Lineage-directed induction of human mesenchymal stem cell differentiation
US5872154A (en) 1995-02-24 1999-02-16 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Method of reducing an immune response to a recombinant adenovirus
US5707618A (en) 1995-03-24 1998-01-13 Genzyme Corporation Adenovirus vectors for gene therapy
US5633161A (en) 1995-03-29 1997-05-27 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Murine gene fomy030 coding for tumor progression inhibitor
US5821108A (en) 1995-04-07 1998-10-13 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Enrichment for a thymocyte subset having progenitor cell activity using c-kit as a selection marker
US5739277A (en) 1995-04-14 1998-04-14 Genentech Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US6019978A (en) 1995-06-05 2000-02-01 The Wistar Institute Of Anatomy And Biology Replication-defective adenovirus human type 5 recombinant as a vaccine carrier
IL160406A0 (en) 1995-06-15 2004-07-25 Crucell Holland Bv A cell harbouring nucleic acid encoding adenoritus e1a and e1b gene products
US6117985A (en) 1995-06-16 2000-09-12 Stemcell Technologies Inc. Antibody compositions for preparing enriched cell preparations
DE69638023D1 (de) 1995-06-28 2009-10-22 Univ Yale Nukleotid- und proteinsequenzen von delta-genen von vertebraten und darauf basierende methoden
DK0851925T3 (da) 1995-09-21 2005-11-28 Genentech Inc Humane Væksthormonvarianter
US5780300A (en) 1995-09-29 1998-07-14 Yale University Manipulation of non-terminally differentiated cells using the notch pathway
US5986170A (en) 1995-11-13 1999-11-16 Corixa Corporation Murine model for human carcinoma
US6337387B1 (en) 1995-11-17 2002-01-08 Asahi Kasei Kabushiki Kaisha Differentiation-suppressive polypeptide
CA2239957A1 (en) 1995-12-22 1997-07-03 Abbott Laboratories Fluorescence polarization immunoassay diagnostic method
US5994316A (en) 1996-02-21 1999-11-30 The Immune Response Corporation Method of preparing polynucleotide-carrier complexes for delivery to cells
DE69713336T2 (de) 1996-03-30 2002-12-05 Science Park Raf S.P.A., Milano Verfahren zur Herstellung von aktivierten markierten tumorspezifischen T-Zellen und deren Verwendung in der Behandlung von Tumoren
US5753506A (en) 1996-05-23 1998-05-19 Cns Stem Cell Technology, Inc. Isolation propagation and directed differentiation of stem cells from embryonic and adult central nervous system of mammals
US6716974B1 (en) 1996-05-31 2004-04-06 Maine Medical Center Research Institute Therapeutic and diagnostic methods and compositions based on jagged/notch proteins and nucleic acids
CA2256481A1 (en) 1996-05-31 1997-12-04 The National American Red Cross Therapeutic and diagnostic methods and compositions based on jagged/notch proteins and nucleic acids
US5885529A (en) 1996-06-28 1999-03-23 Dpc Cirrus, Inc. Automated immunoassay analyzer
FR2751986B1 (fr) 1996-08-01 1998-12-31 Inst Nat Sante Rech Med Gene implique dans le cadasil, methode de diagnostic et application therapeutique
US5935792A (en) 1996-08-29 1999-08-10 The Regents Of The University Of California KUZ, a novel family of metalloproteases
EP0932678B2 (en) 1996-09-24 2010-03-10 Genentech, Inc. A family of genes encoding apoptosis-related peptides, peptides encoded thereby and methods of use thereof
ATE229810T1 (de) 1996-10-11 2003-01-15 Univ California Krebs immuntherapie unter verwendung von tumorzellen kombiniert mit lymphozytmischungen
US5994132A (en) 1996-10-23 1999-11-30 University Of Michigan Adenovirus vectors
DE69738075T2 (de) 1996-11-27 2008-05-21 Genentech, Inc., South San Francisco Affinitätsreinigung von polypeptiden an einer protein a-matrix
US5859535A (en) 1997-02-12 1999-01-12 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy System for determining size and location of defects in material by use of microwave radiation
DE69837839T2 (de) 1997-03-07 2007-12-13 Clare Chemical Research LLC, Denver Fluorometrischer Nachweis mit sichtbarem Light
US6080912A (en) 1997-03-20 2000-06-27 Wisconsin Alumni Research Foundation Methods for creating transgenic animals
US5861832A (en) 1997-03-27 1999-01-19 Lucent Technologies Inc. Analog-to-digital converter having amplifier and comparator stages
US20020137890A1 (en) 1997-03-31 2002-09-26 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
US6121045A (en) 1997-04-04 2000-09-19 Millennium Biotherapeutics, Inc. Human Delta3 nucleic acid molecules
US20030180784A1 (en) 1997-04-04 2003-09-25 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Novel human Delta3 compositions and therapeutic and diagnostic uses therefor
AU6952498A (en) 1997-04-04 1998-10-30 Millenium Pharmaceuticals, Inc. Novel human delta3 compositions and therapeutic and diagnostic uses therefor
US5830730A (en) 1997-05-08 1998-11-03 The Regents Of The University Of California Enhanced adenovirus-assisted transfection composition and method
US6664098B1 (en) 1997-05-14 2003-12-16 Asahi Kasei Kabushiki Kaisha Differentiation inhibitory agent
AU7704498A (en) 1997-05-29 1998-12-30 Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, The Human frp and fragments thereof including methods for using them
US6379925B1 (en) 1997-06-18 2002-04-30 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Angiogenic modulation by notch signal transduction
WO1998057621A1 (en) 1997-06-18 1998-12-23 The Trustees Of Columbia University In The City Ofnew York Angiogenic modulation by notch signal transduction
US6136952A (en) 1997-06-25 2000-10-24 University Of Washington Human jagged polypeptide, encoding nucleic acids and methods of use
NZ500657A (en) 1997-07-11 2002-11-26 Introgene B Interleukin-3 gene therapy for cancer
US7361336B1 (en) 1997-09-18 2008-04-22 Ivan Bergstein Methods of cancer therapy targeted against a cancer stem line
US6004528A (en) 1997-09-18 1999-12-21 Bergstein; Ivan Methods of cancer diagnosis and therapy targeted against the cancer stemline
US6197523B1 (en) 1997-11-24 2001-03-06 Robert A. Levine Method for the detection, identification, enumeration and confirmation of circulating cancer and/or hematologic progenitor cells in whole blood
US20060057573A1 (en) 2002-02-15 2006-03-16 Somalogic, Inc Methods and reagents for detecting target binding by nucleic acid ligands
US6506559B1 (en) 1997-12-23 2003-01-14 Carnegie Institute Of Washington Genetic inhibition by double-stranded RNA
US6551795B1 (en) 1998-02-18 2003-04-22 Genome Therapeutics Corporation Nucleic acid and amino acid sequences relating to pseudomonas aeruginosa for diagnostics and therapeutics
US5981225A (en) 1998-04-16 1999-11-09 Baylor College Of Medicine Gene transfer vector, recombinant adenovirus particles containing the same, method for producing the same and method of use of the same
US6252050B1 (en) 1998-06-12 2001-06-26 Genentech, Inc. Method for making monoclonal antibodies and cross-reactive antibodies obtainable by the method
EP1100899A2 (en) 1998-07-27 2001-05-23 Amgen Inc. Delta-related polypeptides
CA2340682A1 (en) 1998-08-14 2000-02-24 Aventis Pharmaceuticals Products Inc. Adenovirus formulations for gene therapy
CN1257286C (zh) 1998-08-27 2006-05-24 森泰莱昂公司 用于递送异源基因的定向腺病毒载体
GB9819681D0 (en) 1998-09-09 1998-11-04 Smithkline Beecham Plc Novel compounds
US6660843B1 (en) 1998-10-23 2003-12-09 Amgen Inc. Modified peptides as therapeutic agents
WO2000025725A2 (en) 1998-11-02 2000-05-11 Biogen, Inc. Functional antagonists of hedgehog activity
US6291516B1 (en) 1999-01-13 2001-09-18 Curis, Inc. Regulators of the hedgehog pathway, compositions and uses related thereto
US20030054360A1 (en) 1999-01-19 2003-03-20 Larry Gold Method and apparatus for the automated generation of nucleic acid ligands
US20030003572A1 (en) 1999-03-05 2003-01-02 David J. Anderson Isolation and enrichment of neural stem cells from uncultured tissue based on cell-surface marker expression
US20030119029A1 (en) 1999-04-30 2003-06-26 Regents Of The University Of Michigan Compositions and methods relating to novel benzodiazepine compounds and targets thereof
AU782493B2 (en) 1999-06-01 2005-08-04 Curis, Inc. Polymer conjugates of hedgehog proteins and uses
EP1194549A2 (en) 1999-07-02 2002-04-10 Chiron Corporation Human genes and gene expression products
US6703221B1 (en) 1999-08-19 2004-03-09 Chiron Corporation Notch receptor ligands and uses thereof
CA2384713A1 (en) 1999-09-29 2001-04-05 Human Genome Sciences, Inc. Colon and colon cancer associated polynucleotides and polypeptides
AU1194501A (en) 1999-10-14 2001-04-23 Wistar Institute, The Inhibition of tumorigenic properties of melanoma cells
US6380362B1 (en) 1999-12-23 2002-04-30 Genesis Research & Development Corporation Ltd. Polynucleotides, polypeptides expressed by the polynucleotides and methods for their use
US20040048249A1 (en) 2000-01-21 2004-03-11 Tang Y. Tom Novel nucleic acids and secreted polypeptides
JP2003520266A (ja) 2000-01-24 2003-07-02 メルク シャープ エンド ドーム リミテッド γ−セクレターゼ阻害薬
HUP0204475A2 (en) 2000-02-11 2003-04-28 Merck Patent Gmbh Enhancing the circulating half-life of antibody-based fusion proteins
US7115653B2 (en) 2000-03-30 2006-10-03 Curis, Inc. Small organic molecule regulators of cell proliferation
WO2001098537A2 (en) 2000-06-17 2001-12-27 Third Wave Technologies, Inc. Nucleic acid accessible hybridization sites
AU2001272974A1 (en) 2000-06-21 2002-01-02 Incyte Genomics, Inc. Human receptors
US6632620B1 (en) 2000-06-22 2003-10-14 Andrew N. Makarovskiy Compositions for identification and isolation of stem cells
DE10031380A1 (de) 2000-06-28 2002-01-10 Merck Patent Gmbh Verfahren zur Übertragung von Alkyliden-Gruppen auf organischen Verbindungen
GB0016681D0 (en) 2000-07-06 2000-08-23 Merck Sharp & Dohme Therapeutic compounds
WO2002008765A2 (en) 2000-07-26 2002-01-31 Stanford University Basal cell markers in breast cancer and uses thereof
US8044259B2 (en) 2000-08-03 2011-10-25 The Regents Of The University Of Michigan Determining the capability of a test compound to affect solid tumor stem cells
US6984522B2 (en) 2000-08-03 2006-01-10 Regents Of The University Of Michigan Isolation and use of solid tumor stem cells
US20020151487A1 (en) 2000-08-31 2002-10-17 Loyola University Chicago Method and reagents for epithelial barrier formation and treatment of malignant and benign skin disorders by modulating the notch pathway
US6689744B2 (en) 2000-09-22 2004-02-10 Genentech, Inc. Notch receptor agonists and uses
US7312325B2 (en) 2000-09-26 2007-12-25 Duke University RNA aptamers and methods for identifying the same
US7083784B2 (en) 2000-12-12 2006-08-01 Medimmune, Inc. Molecules with extended half-lives, compositions and uses thereof
BR0116138A (pt) 2000-12-13 2003-09-23 Borean Pharma As Bibliotecas combinatóriais de proteìnas tendo a estrutura de andaime de domìnios tipo lectina tipo c
US7413873B2 (en) 2001-01-30 2008-08-19 The Regents Of The University Of California Method of detection and treatment of colon cancer
US20020169300A1 (en) 2001-01-30 2002-11-14 Waterman Marian L. Method of detection and treatment of colon cancer by analysis of beta-catenin-sensitive isoforms of lymphoid enhancer factor-1
US20030064384A1 (en) 2001-04-02 2003-04-03 Mien-Chie Hung Beta-catenin is a strong and independent prognostic factor for cancer
IL142481A0 (en) 2001-04-05 2002-03-10 Yissum Res Dev Co A method for identifying consitutively active mutants of mitogen activated protein kinases (mapk) and uses thereof
AU2002307494A1 (en) 2001-04-24 2002-11-05 Bayer Corporation Human timp-1 antibodies
AU2002308557A1 (en) 2001-05-01 2002-11-11 The Regents Of The University Of California Wnt and frizzled receptors as targets for immunotherapy in head and neck squamous cell carcinomas
US20030044409A1 (en) 2001-05-01 2003-03-06 Carson Dennis A. Immunologic compositions and methods for studying and treating cancers expressing frizzled antigens
US7713526B2 (en) 2001-05-01 2010-05-11 The Regents Of The University Of California Wnt and frizzled receptors as targets for immunotherapy in head and neck squamous cell carcinomas
US7514594B2 (en) 2001-05-11 2009-04-07 Wyeth Transgenic animal model of bone mass modulation
US20030096852A1 (en) 2001-06-15 2003-05-22 Genentech, Inc. Human growth hormone antagonists
US7171311B2 (en) 2001-06-18 2007-01-30 Rosetta Inpharmatics Llc Methods of assigning treatment to breast cancer patients
US20040023244A1 (en) 2001-06-21 2004-02-05 Griffin Jennifer A Receptors
ATE371018T1 (de) 2001-06-22 2007-09-15 Stemcells Inc Le-zellen (liver engrafting cells), assays und verwendungen davon
WO2003000893A2 (en) 2001-06-26 2003-01-03 Decode Genetics Ehf. Nucleic acids encoding g protein-coupled receptors
EP1561464A3 (en) 2001-07-02 2007-04-25 Sinan Tas Use of cyclopamine in the treatment of basal cell carcinoma and other tumors
EP1411938B1 (en) 2001-07-02 2005-07-06 Tas, Sinan Use of cyclopamine for the manufacture of a medicament for the treatemnt of psoriasis
AU2002317105A1 (en) 2001-07-05 2003-01-21 University Of British Columbia Methods for identifying therapeutic agents for treating diseases involving wnt polypeptides and wnt receptors
WO2003053921A2 (en) 2001-07-18 2003-07-03 American Red Cross Mutant proteinase inhibitors and uses thereof
AR034390A1 (es) 2001-08-03 2004-02-25 Schering Corp Derivados de 1-sulfonil-tetrahidro quinolinas sustituidas, composiciones farmaceuticas y el uso de las mismas para la elaboracion de medicamentos como inhibidores de la gama secretasa
AU2002355477B2 (en) 2001-08-03 2008-09-25 Medical Research Council Method of identifying a consensus sequence for intracellular antibodies
US7138370B2 (en) 2001-10-11 2006-11-21 Amgen Inc. Specific binding agents of human angiopoietin-2
WO2003042246A2 (en) 2001-11-14 2003-05-22 Lorantis Limited Inhibitors of the notch signalling pathway for use in the treatment of cancer
AU2002352967A1 (en) 2001-11-29 2003-06-10 The Trustees Of Princeton University Increased emission efficiency in organic light-emitting devices on high-index substrates
US20070237770A1 (en) 2001-11-30 2007-10-11 Albert Lai Novel compositions and methods in cancer
AU2002364537A1 (en) 2001-12-07 2003-06-23 Regents Of The University Of Michigan Prospective identification and characterization of breast cancer stem cells
WO2003057829A2 (en) 2001-12-26 2003-07-17 Immunomedics, Inc. Methods of generating multispecific, multivalent agents from vh and vl domains
US6713206B2 (en) 2002-01-14 2004-03-30 Board Of Trustees Of University Of Illinois Electrochemical cells comprising laminar flow induced dynamic conducting interfaces, electronic devices comprising such cells, and methods employing same
GB0201674D0 (en) 2002-01-25 2002-03-13 Lorantis Ltd Medical treatment
US20030185829A1 (en) 2002-03-12 2003-10-02 Erich Koller Jagged 2 inhibitors for inducing apoptosis
AU2003210060B2 (en) 2002-03-22 2010-02-25 Aprogen, Inc. Humanized antibody and process for preparing same
CA2484930A1 (en) 2002-05-06 2003-11-13 The Government Of The United States Of America, Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Identification of novel broadly cross-reactive neutralizing human monoclonal antibodies using sequential antigen panning of phage display libraries
CA2485184A1 (en) 2002-05-24 2003-12-04 Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals, Inc. Methods for the identification of ikkalpha function and other genes useful for treatment of inflammatory diseases
EP2365004B1 (en) 2002-06-21 2016-01-06 Johns Hopkins University School of Medicine Membrane associated tumor endothelium markers
US7803370B2 (en) 2002-08-30 2010-09-28 Oncotherapy Science, Inc. Method for treating synovial sarcoma
AU2003256079A1 (en) 2002-08-30 2004-03-19 Japan As Represented By President Of The University Of Tokyo Method for treating synovial sarcoma
US20040058217A1 (en) 2002-09-20 2004-03-25 Ohlsen Leroy J. Fuel cell systems having internal multistream laminar flow
GB0221952D0 (en) 2002-09-20 2002-10-30 Novartis Forschungsstiftung Wnt mediated ErbB1 signalling,compositions and uses related thereto
WO2004032838A2 (en) 2002-10-04 2004-04-22 The Regents Of The University Of California Methods for treating cancer by inhibiting wnt signaling
US7365168B2 (en) 2002-10-15 2008-04-29 Pdl Biopharma, Inc. Alteration of FcRn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis
US20050124565A1 (en) 2002-11-21 2005-06-09 Diener John L. Stabilized aptamers to platelet derived growth factor and their use as oncology therapeutics
US7803783B2 (en) 2002-12-06 2010-09-28 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Use of WNT inhibitors to augment therapeutic index of chemotherapy
US20040171559A1 (en) 2002-12-06 2004-09-02 Irving Weissman Protection of stem cells from cytotoxic agents by modulation of beta-catenin signaling pathways
WO2004073657A2 (en) 2003-02-19 2004-09-02 Protein Design Labs, Inc. Methods of diagnosis of cancer and other diseases, composition and methods of screening for modulators of cancer and other diseases
TWI353991B (en) 2003-05-06 2011-12-11 Syntonix Pharmaceuticals Inc Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids
US20060019256A1 (en) 2003-06-09 2006-01-26 The Regents Of The University Of Michigan Compositions and methods for treating and diagnosing cancer
JP4691626B2 (ja) 2003-07-11 2011-06-01 オンコセラピー・サイエンス株式会社 滑膜肉腫の治療方法
WO2005024042A2 (en) 2003-09-04 2005-03-17 The Regents Of The University Of California Aptamers and methods for their in vitro selection and uses thereof
US20050130199A1 (en) 2003-09-22 2005-06-16 Regents Of The University Of California Mutations in WNT-frizzled signaling pathways associated with osteoarthritis
US6894522B2 (en) 2003-10-06 2005-05-17 International Business Machines Corporation Specific site backside underlaying and micromasking method for electrical characterization of semiconductor devices
WO2005047327A2 (en) 2003-11-12 2005-05-26 Biogen Idec Ma Inc. NEONATAL Fc RECEPTOR (FcRn)-BINDING POLYPEPTIDE VARIANTS, DIMERIC Fc BINDING PROTEINS AND METHODS RELATED THERETO
FR2867784B1 (fr) 2004-03-17 2006-06-09 Commissariat Energie Atomique Aptameres selectionnes a partir de cellules vivantes tumorales et leurs applications
US20050239134A1 (en) 2004-04-21 2005-10-27 Board Of Regents, The University Of Texas System Combinatorial selection of phosphorothioate single-stranded DNA aptamers for TGF-beta-1 protein
CA2566498A1 (en) 2004-05-14 2005-12-08 The Regents Of The University Of California Methods for treating cancer using anti-wnt2 monoclonal antibodies and sirna
CA2581208A1 (en) 2004-08-30 2006-03-09 Lonza Biologics Plc. Affinity- plus ion exchange- chromatography for purifying antibodies
WO2006036175A2 (en) 2004-09-21 2006-04-06 Rhode Island Hospital, A Lifespan-Partner Wnt proteins and detection and treatment of cancer
WO2006034328A2 (en) 2004-09-21 2006-03-30 Rhode Island Hospital, A Lifespan-Partner Wnt proteins and detection and treatment of cancer
US7867705B2 (en) 2004-09-21 2011-01-11 Rhode Island Hospital, A Lifespan-Partner Frizzled proteins and detection and treatment of cancer
WO2006036834A2 (en) 2004-09-24 2006-04-06 Amgen Inc. MODIFIED Fc MOLECULES
DE102004050620A1 (de) 2004-10-13 2006-04-20 Eberhard-Karls-Universität Tübingen Monoklonaler Antikörper gegen Frizzled-Rezeptoren
NZ555216A (en) * 2004-11-10 2010-05-28 Hubrecht Lab Treatment of an intestinal adenoma and/or adenocarcinoma by inhibition of notch pathway activation
US8809287B2 (en) 2004-11-15 2014-08-19 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Compositions and methods for altering Wnt autocrine signaling
WO2006056340A2 (en) 2004-11-24 2006-06-01 F. Hoffmann-La Roche Ag Method for determining genotoxicity
US7635530B2 (en) 2005-03-21 2009-12-22 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Membraneless electrochemical cell and microfluidic device without pH constraint
US20090311243A1 (en) 2005-05-30 2009-12-17 Astrazeneca Ab Methods for Identifying FZD8 Modulators and the Use of such Modulators for Treating Osteoarthritis
US20070014776A1 (en) 2005-06-09 2007-01-18 Gimeno Ruth E Identification of adiponutrin-related proteins as esterases and methods of use for the same
EP2083081A1 (en) * 2005-07-22 2009-07-29 Five Prime Therapeutics, Inc. Compositions and methods of treating disease with FGFR fusion proteins
US20070072239A1 (en) 2005-09-26 2007-03-29 Wyeth Pharmaceutical compositions and methods of using secreted frizzled related protein
JP2009510093A (ja) * 2005-09-28 2009-03-12 ザイモジェネティクス， インコーポレイテッド Ｉｌ−１７ａおよびｉｌ−１７ｆアンタゴニストならびにその使用方法
US7723477B2 (en) 2005-10-31 2010-05-25 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting Wnt-dependent solid tumor cell growth
CA2628221A1 (en) 2005-10-31 2007-05-10 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Anti-frizzled receptor antibodies for treating cancer
CA2628255C (en) 2005-10-31 2016-04-19 The Regents Of The University Of Michigan Compositions and methods for treating and diagnosing cancer
DOP2006000277A (es) 2005-12-12 2007-08-31 Bayer Pharmaceuticals Corp Anticuerpos anti mn y métodos para su utilización
CA2630839C (en) 2005-12-16 2017-01-17 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Therapeutic methods for inhibiting tumor growth with dll4 antagonists
AR060017A1 (es) 2006-01-13 2008-05-21 Novartis Ag Composiciones y metodos de uso para anticuerpos de dickkopf -1
US20080171319A1 (en) 2006-02-06 2008-07-17 Mickey Urdea Osteoporosis associated markers and methods of use thereof
NZ570381A (en) 2006-02-09 2011-02-25 Daiichi Sankyo Co Ltd Anti-cancer pharmaceutical composition
GB0603683D0 (en) 2006-02-23 2006-04-05 Novartis Ag Organic compounds
EA200802348A1 (ru) 2006-05-24 2009-08-28 Байер Шеринг Фарма Акциенгезельшафт ЧЕЛОВЕЧЕСКИЙ ВЫСОКОАФФИННЫЙ И ГУМАНИЗИРОВАННЫЙ АНТИ-α5β1 ИНТЕГРИН С ФУНКЦИЕЙ БЛОКИРУЮЩЕГО АНТИТЕЛА С ОСЛАБЛЕННОЙ ИММУНОГЕННОСТЬЮ
NZ572177A (en) 2006-06-06 2012-02-24 Genentech Inc Anti-dll4 antibodies and methods using same
EP2029159A2 (en) 2006-06-06 2009-03-04 Genentech, Inc. Compositions and methods for modulating vascular development
ES2413087T3 (es) 2006-06-13 2013-07-15 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Composiciones y métodos para el diagnóstico y tratamiento del cáncer
EP2386577A3 (en) 2006-06-21 2012-05-02 Oncotherapy Science, Inc. Tumor-targeting monoclonal antibodies to FZD10 and uses thereof
TW200815469A (en) 2006-06-23 2008-04-01 Astrazeneca Ab Compounds
CA2698597A1 (en) 2006-09-07 2008-03-13 Stemline Therapeutics, Inc. Monitoring cancer stem cells
AU2007292242A1 (en) 2006-09-08 2008-03-13 Genentech, Inc. Wnt antagonists and their use in the diagnosis and treatment of Wnt-mediated disorders
CN101600449A (zh) * 2006-09-08 2009-12-09 健泰科生物技术公司 Wnt拮抗剂及其在wnt介导的病症的诊断和治疗中的用途
WO2008082730A2 (en) 2006-09-19 2008-07-10 Novartis Ag Biomarkers of target modulation, efficacy, diagnosis and/or prognosis for raf inhibitors
WO2008039071A2 (en) 2006-09-29 2008-04-03 Agendia B.V. High-throughput diagnostic testing using arrays
DK2066694T3 (en) 2006-09-29 2016-02-08 Oncomed Pharm Inc Compositions and Methods for Diagnosing and Treating Cancer
WO2008057459A2 (en) 2006-11-07 2008-05-15 Merck & Co., Inc. Antagonists of pcsk9
WO2008061020A2 (en) 2006-11-14 2008-05-22 Novartis Ag Methods of treating, diagnosing or detecting cancer
RU2448979C2 (ru) 2006-12-14 2012-04-27 Ридженерон Фармасьютикалз, Инк. Антитела человека к дельта-подобному лиганду-4 человека
EP2120996A2 (en) 2006-12-20 2009-11-25 Vasgene Therapeutics, Inc. Methods for using and identifying modulators of delta-like 4
EP3345607B1 (en) 2006-12-29 2022-10-26 Ossifi-Mab LLC Methods of altering bone growth by administration of sost or wise antagonist or agonist
US7691980B2 (en) 2007-01-09 2010-04-06 Bio-Rad Laboratories, Inc. Enhanced capacity and purification of antibodies by mixed mode chromatography in the presence of aqueous-soluble nonionic organic polymers
JP2010517944A (ja) 2007-01-26 2010-05-27 バイオインヴェント インターナショナル アーベー Ｄｌｌ４シグナリング阻害薬およびその使用
JP5363350B2 (ja) 2007-03-19 2013-12-11 武田薬品工業株式会社 Ｍａｐｋ／ｅｒｋキナーゼ阻害剤
US20090082328A1 (en) 2007-05-11 2009-03-26 Bayer Schering Pharma Aktiengesellschaft Substituted phenylamino-benzene derivatives useful for treating hyper-proliferative disorders and diseases associated with mitogen extracellular kinase activity
JP5580735B2 (ja) 2007-06-12 2014-08-27 ジェネンテック， インコーポレイテッド Ｎ−置換アザインドール類及び使用方法
CA2693232A1 (en) 2007-07-18 2009-01-22 Novartis Ag Bicyclic heteroaryl compounds and their use as kinase inhibitors
CA2924436A1 (en) 2007-07-30 2009-02-05 Ardea Biosciences, Inc. Pharmaceutical combinations of n-(3,4-difluoro-2-(2-fluoro-4-iodophenylamino)-6-methoxyphenyl)-1-(2,3-dihydroxypropyl)cyclopropane-1-sulfonamide as inhibitors of mek and methods of use
EA032294B1 (ru) 2007-07-30 2019-05-31 Арди Байосайенсиз, Инк. Способ получения полиморфной формы производного n-(ариламино)сульфонамида, фармацевтическая композиция, содержащая указанное производное, и способ лечения с помощью указанного производного
CA2715078C (en) 2007-09-26 2019-07-23 Intrexon Corporation Synthetic 5'utrs, expression vectors, and methods for increasing transgene expression
TWI489993B (zh) 2007-10-12 2015-07-01 Novartis Ag 骨硬化素（ｓｃｌｅｒｏｓｔｉｎ）抗體組合物及使用方法
BRPI0820327A2 (pt) 2007-11-02 2020-10-06 Novartis Ag moléculas e métodos para modulação de proteína relacionada ao receptor de lipoproteína de baixa densidade 6 (lrp6)
US20100267626A1 (en) 2007-11-05 2010-10-21 Novartis Ag Methods and compositions for measuring wnt activation and for treating wnt-related cancers
ES2456966T3 (es) 2007-11-12 2014-04-24 Takeda Pharmaceutical Company Limited Inhibidores de MAPK/ERK cinasa
EP2238154B1 (en) 2008-01-18 2015-09-16 Bio-Rad Laboratories, Inc. Enhanced purification of phosphorylated and non-phosphorylated biomolecules by apatite chromatography
EP2260102A1 (en) 2008-03-25 2010-12-15 Novartis Forschungsstiftung, Zweigniederlassung Friedrich Miescher Institute For Biomedical Research Treating cancer by down-regulating frizzled-4 and/or frizzled-1
DE202008004821U1 (de) 2008-04-07 2008-06-12 Heil, Roland Siebdruckform
FR2936255B1 (fr) 2008-09-19 2010-10-15 Galderma Res & Dev Modulateurs de fzd2 dans le traitement de l'alopecie
SG190568A1 (en) 2008-09-26 2013-06-28 Oncomed Pharm Inc Frizzled-binding agents and uses thereof
US20130295106A1 (en) 2008-09-26 2013-11-07 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Frizzled-Binding Agents And Uses Thereof
US20110237514A1 (en) 2008-09-30 2011-09-29 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR TREATING BONE DISEASES WHICH COMPRISES PROTEIN COMPRISING Frizzled1, Frizzled2 OR Frizzled7 EXTRACELLULAR CYSTEINE-RICH DOMAIN
US20100169025A1 (en) 2008-10-10 2010-07-01 Arthur William T Methods and gene expression signature for wnt/b-catenin signaling pathway
WO2010105110A1 (en) 2009-03-11 2010-09-16 Ardea Biosciences, Inc. Pharmaceutical combinations comprising rdea119/bay 869766 for the treatment of specific cancers
TWI535445B (zh) 2010-01-12 2016-06-01 安可美德藥物股份有限公司 Ｗｎｔ拮抗劑及治療和篩選方法
UY33227A (es) 2010-02-19 2011-09-30 Novartis Ag Compuestos de pirrolopirimidina como inhibidores de la cdk4/6
BR112012022801B8 (pt) 2010-03-09 2019-10-29 Dana Farber Cancer Inst Inc método de identificar um indivíduo que tem câncer que é provável beneficiar-se do tratamento com uma terapia de combinação com um inibidor de raf e um segundo inibidor e uso de um inibidor de raf e um segundo inibidor para a fabricação de um medicamento para tratar câncer
CA2794674A1 (en) 2010-04-01 2011-10-06 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Frizzled-binding agents and uses thereof
DK2585098T3 (da) * 2010-06-28 2014-11-03 Five Prime Therapeutics Inc Ekstracellulære FZD8-domæner og fusionsmolekyler fraekstracellulære FZD8-domæner til anvendelse ved behandling afobesitet og obesitet-relaterede lidelser
UY33469A (es) 2010-06-29 2012-01-31 Irm Llc Y Novartis Ag Composiciones y metodos para modular la via de señalizacion de wnt
CA2815181C (en) 2010-10-27 2020-09-15 William Gleason Richards Dkk1 antibodies and methods of use
AU2013334790A1 (en) 2012-10-23 2015-04-30 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Methods of treating neuroendocrine tumors using Wnt pathway-binding agents
AU2014212081A1 (en) 2013-02-04 2015-08-13 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Methods and monitoring of treatment with a Wnt pathway inhibitor

Also Published As

Publication number Publication date
RU2012130364A (ru) 2014-02-20
US9579361B2 (en) 2017-02-28
CN102917721B (zh) 2016-07-06
MX339709B (es) 2016-06-07
LT2523678T (lt) 2017-09-25
CN102917721A (zh) 2013-02-06
PT2523678T (pt) 2017-08-30
TW201138787A (en) 2011-11-16
CY1119286T1 (el) 2018-02-14
US20110305695A1 (en) 2011-12-15
US20130034551A2 (en) 2013-02-07
SI2523678T1 (sl) 2017-10-30
AR079889A1 (es) 2012-02-29
MX2012008045A (es) 2012-10-03
US9157904B2 (en) 2015-10-13
SG182436A1 (en) 2012-08-30
AU2011205405A1 (en) 2012-07-26
IL220788A (en) 2016-12-29
NZ601065A (en) 2014-10-31
CA2786699A1 (en) 2011-07-21
EP2523678B1 (en) 2017-06-21
CN106084040A (zh) 2016-11-09
AU2011205405B2 (en) 2015-07-09
EP2523678A2 (en) 2012-11-21
DK2523678T3 (en) 2017-08-07
JP5956349B2 (ja) 2016-07-27
KR101774272B1 (ko) 2017-09-04
JP2016196456A (ja) 2016-11-24
EP2523678A4 (en) 2013-11-20
JP2013518561A (ja) 2013-05-23
AU2015238849A1 (en) 2015-10-29
EP3257521A1 (en) 2017-12-20
HRP20171352T1 (hr) 2017-11-03
PL2523678T3 (pl) 2017-11-30
SMT201700451T1 (it) 2017-11-15
US20160082079A1 (en) 2016-03-24
TWI535445B (zh) 2016-06-01
WO2011088123A3 (en) 2011-10-13
US20170218041A1 (en) 2017-08-03
ES2638278T3 (es) 2017-10-19
RU2593947C2 (ru) 2016-08-10
KR20120125493A (ko) 2012-11-15
WO2011088123A2 (en) 2011-07-21
HUE034466T2 (en) 2018-02-28
ME02952B (me) 2018-07-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP2523678B1 (en) Wnt antagonists and methods of treatment
JP5837466B2 (ja) 癌を診断し処置するための組成物および方法
WO2018027025A1 (en) Cd40-binding agents and uses thereof
CA2892831A1 (en) Immunotherapy with binding agents
JP2015536933A (ja) Ｗｎｔ経路結合剤を用いて神経内分泌腫瘍を処置する方法
WO2019032945A1 (en) CD40 BINDING AGENT AND USES THEREOF
HK1229826A (en) Wnt antagonists, composition comprising thereof and methods of treatment and production
HK1229826A1 (en) Wnt antagonists, composition comprising thereof and methods of treatment and production
HK1180612B (en) Wnt antagonists and methods of treatment and screening
HK1180612A (en) Wnt antagonists and methods of treatment and screening
JP2017526356A (ja) Ｒｓｐｏ１結合剤およびその使用